特表 2024-524773 ＣＲＩＳＰＲを用いたプログラム可能なＲＮＡ編集

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-07-05

(54)【発明の名称】ＣＲＩＳＰＲを用いたプログラム可能なＲＮＡ編集

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20240628BHJP

   C12N 7/04 20060101ALN20240628BHJP

【ＦＩ】

C12N15/09 110

C12N7/04 ZNA

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024524974

(86)(22)【出願日】2022-07-08

(85)【翻訳文提出日】2024-03-06

(86)【国際出願番号】 US2022073538

(87)【国際公開番号】W WO2023283622

(87)【国際公開日】2023-01-12

(31)【優先権主張番号】63/219,722

(32)【優先日】2021-07-08

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】524012141

【氏名又は名称】モンタナ ステート ユニバーシティ

【氏名又は名称原語表記】ＭＯＮＴＡＮＡ ＳＴＡＴＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ

【住所又は居所原語表記】Ｃｕｌｂｅｒｔｓｏｎ Ｈａｌｌ， １００ Ｂｏｚｅｍａｎ， ＭＴ ５９７１７ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ

(74)【代理人】

【識別番号】100126572

【弁理士】

【氏名又は名称】村越 智史

(72)【発明者】

【氏名】ブレイク エー，ヴィーデンヘフト

(72)【発明者】

【氏名】ジョセフ イー，ニコルス

(72)【発明者】

【氏名】アンナ エー，ネムドライア

(72)【発明者】

【氏名】アルテム エー，ネムドリイ

【テーマコード（参考）】

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B065AA95X

4B065AA95Y

4B065BA02

4B065CA43

4B065CA44

(57)【要約】

ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、ＤＮＡの配列特異的操作に日常的に用いられている。ＣＲＩＳＰＲを用いたＤＮＡ編集は日常的に行われるようになったが、ＲＮＡ編集の類似手法はまだ確立されていない。ここでは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムの配列特異的切断のために、ＩＩＩ－Ａ型ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼを再利用する。ＩＩＩ型切断反応は、精製ウイルスＲＮＡを用いてインビトロで行われ、６、１２、１８あるいは２４ヌクレオチドの配列特異的切断をもたらす。切断された配列部分のライゲーションは切断を橋渡しするＤＮＡスプリントによって促進され、哺乳動物細胞へのトランスフェクションの前に、ＲＮＡリガーゼを用いてＲＮＡ生成物を連結する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡは感染性があり、ウイルスクローンを回収するために標準的なプラーク法が用いられる。本研究成果は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を含むＲＮＡウイルスの配列特異的編集およびより一般的な遺伝子治療に、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムを再利用できることを示す。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

リボ核酸（ＲＮＡ）分子を編集する方法であって、
前記ＲＮＡ分子からターゲット部分を切除するために、遺伝子工学的に操作されたＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔ）複合体を用いて前記ＲＮＡ分子を切断する工程を備え、
前記操作されたＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ複合体は、
前記ＲＮＡ分子のターゲット配列に相補的であるようにプログラムされたＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）配列と、
前記操作されたＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ複合体が前記ＲＮＡ分子に結合している時に、前記ターゲット部分で前記ＲＮＡ分子を特異的に切断するｃｒＲＮＡ誘導ヌクレアーゼとを有し、
前記方法は、前記切断されたターゲット部分を挟む前記ＲＮＡ分子の切断末端をライゲーションする工程をさらに備え、
前記ＲＮＡ分子は、前記切断されたターゲット部分および前記ライゲーションされた切断末端に基づいてプログラム編集される、方法。

【請求項2】

前記ＲＮＡ分子の前記切断された末端をライゲーションする工程は、両末端間に０個の付加的ヌクレオチドを挿入すること、および、前記ＲＮＡ分子の両末端をライゲーションして前記ターゲット部分を欠失させることを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記ＲＮＡ分子の前記切断された末端をライゲーションする工程は、両末端間に１つ以上の付加的ヌクレオチドを挿入すること、および、前記１つ以上の付加的ヌクレオチドと前記ＲＮＡ分子の前記両末端とをライゲーションして、前記ターゲット部分を前記１つ以上の付加的なヌクレオチドで置換することを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記ＲＮＡ分子の前記切断された末端をライゲーションする工程は、前記ＲＮＡ分子の両末端を橋渡しする核酸スプリントを使用することを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

前記核酸スプリントはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）スプリントを含む、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

前記ＲＮＡ分子の前記切断された末端をライゲーションする工程は、
両末端間に１つ以上の付加的ヌクレオチドを挿入し、前記１つ以上の付加的ヌクレオチドと前記ＲＮＡ分子の前記両末端とを一緒にライゲーションして、前記ターゲット部分を前記１つ以上の付加的なヌクレオチドで置換することを含み、
前記核酸スプリントは、前記１つ以上の付加的ヌクレオチドの配列に相補的な配列を含む、請求項４に記載の方法。

【請求項7】

前記操作されたＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ複合体はＣｓｍ複合体を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項8】

前記ｃｒＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、前記ＲＮＡ分子を、１以上のヌクレオチドの間隔で特異的に切断する、請求項１に記載の方法。

【請求項9】

前記１以上のヌクレオチドの間隔は、６ヌクレオチドの間隔である、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記間隔の数は前記ｃｒＲＮＡ配列の長さに依存する、請求項８に記載の方法。

【請求項11】

前記ｃｒＲＮＡ配列の長さは３６ヌクレオチドであり、前記１以上のヌクレオチドの間隔は６ヌクレオチドの間隔であり、前記間隔の数は３から４の間である、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

前記ＲＮＡ分子はウイルスであり、編集された前記ＲＮＡ分子は編集されたビリオンを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項13】

前記ウイルスはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスである、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

前記切断はインビトロで行われ、
前記方法は更に、
前記編集されたビリオンを回収する工程と、
回収された前記編集されたビリオンを宿主へと導入する工程と、を備える、請求項１２に記載の方法。

【請求項15】

前記ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ複合体を遺伝子工学的に操作するまたはプログラムする工程をさらに備える、請求項１に記載の方法。

【請求項16】

リボ核酸（ＲＮＡ）を編集するための、遺伝子工学的に操作されたＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔ）複合体を生成する方法であって、
複数の発現ベクターを生成する工程を備え、
前記複数の発現ベクターは、
（ｉ）ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）転写物およびｃｒＲＮＡ転写物を成熟ＲＮＡガイドに転写するＣＲＩＳＰＲサブユニットを有するＣＲＩＳＰＲアレイと、
（ｉｉ）前記ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ複合体の複数のタンパク質サブユニットと、を含み、
前記方法は更に、
前記複数の発現ベクターを宿主に共導入する工程と、
前記宿主において前記複数の発現ベクターの発現を誘導する工程と、
発現した前記複数の発現ベクターを前記宿主から精製する工程と、を備える方法。

【請求項17】

前記ｃｒＲＮＡガイドの予想されるサイズに基づいて精製物を選択する工程をさらに備える、請求項１５に記載の方法。

【請求項18】

前記予想されるサイズは４６ヌクレオチドである、請求項１６に記載の方法。

【請求項19】

前記複数の発現ベクターは、
前記ＣＲＩＳＰＲアレイを含む第１の発現ベクターと、
Ｃａｓ１０サブユニットおよびＣｓｍ２サブユニットを含む第２の発現ベクターと、
Ｃｓｍ３サブユニット、Ｃｓｍ４サブユニットおよびＣｓｍ５サブユニットを含む第３の発現ベクターと、を含む、請求項１５に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

（関連出願の相互参照）
本出願は、米国特許仮出願第６３／２１９，７２２号（出願日：２０２１年７月８日）に基づく優先権を主張し、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0002】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の出現と蔓延は世界的大流行を引き起こした。この新型コロナウイルスの全ゲノム配列が判明し、翌年発表された。その１年以上後、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の最初の遺伝子系が発表されたが、ウイルスのＲＮＡに部位特異的操作を行うための現在の方法は、時間がかかり、エラーを起こしやすい煩雑な多段階プロセスを含んでいた。

【発明の概要】

【0003】

本開示は、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ複合体を用いたプログラム可能なＲＮＡ編集に関する。例えば、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体は、ＲＮＡを編集するよう遺伝子操作することができる。ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体は、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のＩＩＩ－Ａ型Ｃｓｍ複合体（ＳｔｈＣｓｍ）であってもよい。遺伝子操作済のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体を、ＲＮＡに対して配列特異的改変を行うために使用することができる。「配列特異的改変」という用語は、ターゲットとする位置においてＲＮＡをＲＮＡの特定の配列へと変化させることを指す場合がある。改変とは、ＲＮＡからターゲット部分を除去する欠失、ターゲット部分を除去して合成ＲＮＡで置換する置換、塩基修飾および／またはＲＮＡに対するその他の変化が含まれる。

【0004】

ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ複合体は、６塩基間隔で相補的ＲＮＡを特異的に切断するＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）誘導ヌクレアーゼに依存している。ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ複合体を作成するには、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ複合体のＲＮＡ切断活性を遺伝子工学的に操作して、ターゲットＲＮＡの配列特異的領域を切除するか、配列特異的切断を導入する。ＲＮＡのターゲット部分のターゲット欠損については、スプリントライゲーションを使ってＲＮＡを修復する。このような修復はインビトロでも可能である。その結果、ターゲット部分が除去された編集済ＲＮＡが得られる。ターゲット部分の置換には、ライゲーションに先立ち合成ＲＮＡ相補体をスプリントし、ターゲット部分を合成ＲＮＡで置換する。

【0005】

試験と検証のために、本明細書の実施例では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムの配列特異的切断のためにＩＩＩ－Ａ型ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼの改変について記載する。ＩＩＩ型切断反応は精製ウイルスＲＮＡを用いてインビトロで行われ、６、１２、１８または２４ヌクレオチドの１つの位置での配列特異的切断または切除をもたらす。切断された配列部分のライゲーションは切断を橋渡しするＤＮＡスプリントによって促進され、哺乳動物細胞へのトランスフェクションの前に、ＲＮＡリガーゼを用いてＲＮＡ産物を連結する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡは感染性があり、ウイルスクローンを回収するために標準的なプラーク法が用いられる。しかしながら、ゲノムＲＮＡであれその他のタイプのＲＮＡであれ、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体は、本明細書の開示に基づいて、他のＲＮＡターゲットに対して部位特異的改変を行うように設計され得ることに留意すべきである。本明細書の開示は、ＲＮＡの配列特異的編集に使用することができ、これは、ＲＮＡウイルスおよび遺伝子治療一般に適用することができる。

【0006】

いくつかの例において、本明細書に記載される技術は、リボ核酸（ＲＮＡ）分子を編集する方法に関し、当該方法は、ＲＮＡ分子からターゲット部分を切除するために、遺伝子工学的操作によって作られたＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔ）複合体でＲＮＡ分子を切断することを含む。ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ複合体は、ＲＮＡ分子のターゲット配列に相補的であるようにプログラムされたＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）配列および遺伝子操作により作られたＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ複合体がＲＮＡ分子に結合している時にターゲット部分でＲＮＡ分子を特異的に切断するｃｒＲＮＡ誘導ヌクレアーゼを有する。方法は更に、切断されたターゲット部分に隣り合うＲＮＡ分子の切断末端をライゲーションすることを含む。ＲＮＡ分子は、切除されたターゲット部分とライゲーションされた切断末端に基づいてプログラムされた態様で編集される。

【0007】

いくつかの例において、本明細書に記載の技術は方法に関し、ＲＮＡ分子の切断された末端をライゲーションすることは、両末端間に０個の付加的ヌクレオチドを挿入すること、および、前記ＲＮＡ分子の両末端をライゲーションして前記ターゲット部分を欠失させることを含む。

【0008】

いくつかの例において、本明細書に記載の技術は方法に関し、ＲＮＡ分子の切断された末端をライゲーションすることは、両末端間に１以上の付加的に修飾ヌクレオチドまたは非修飾ヌクレオチドを挿入すること、および、１以上の付加的なヌクレオチドとＲＮＡ分子の両末端とを一緒にライゲーションしてターゲット部分を１以上の付加的なヌクレオチドで置換することを含む。

【0009】

いくつかの例において、本明細書に記載の技術は方法に関し、前記ＲＮＡ分子の前記切断された末端をライゲーションする工程は、前記ＲＮＡ分子の両末端を橋渡しする核酸スプリントを使用することを含む。

【0010】

いくつかの例において、本明細書に記載の技術は方法に関し、前記核酸スプリントはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）スプリントを含む。

【0011】

いくつかの例において、本明細書に記載の技術は方法に関し、前記ＲＮＡ分子の前記切断された末端をライゲーションする工程は、両末端間に１つ以上の付加的ヌクレオチドを挿入すること、および、前記１つ以上の付加的ヌクレオチドと前記ＲＮＡ分子の前記両末端とをライゲーションして、前記ターゲット部分を前記１つ以上の付加的なヌクレオチドで置換することを含み、前記核酸スプリントは、前記１つ以上の付加的ヌクレオチドの配列に相補的な配列を含む。

【0012】

いくつかの例において、本明細書に記載の技術は方法に関し、前記操作されたＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ複合体はＣｓｍ複合体を含む。

【0013】

いくつかの例において、本明細書に記載の技術は方法に関し、前記ｃｒＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、前記ＲＮＡ分子を、１以上のヌクレオチドの間隔で特異的に切断する。

【0014】

いくつかの例において、本明細書に記載の技術は方法に関し、前記１以上のヌクレオチドの間隔は、６ヌクレオチドの間隔である、

【0015】

いくつかの例において、本明細書に記載の技術は方法に関し、前記間隔の数は前記ｃｒＲＮＡ配列の長さに依存する。

【0016】

いくつかの例において、本明細書に記載の技術は方法に関し、前記ｃｒＲＮＡ配列の長さは４０ヌクレオチドであり、前記１以上のヌクレオチドの間隔は６ヌクレオチドの間隔であり、前記間隔の数は３から４の間である。

【0017】

いくつかの例において、本明細書に記載の技術は方法に関し、前記ＲＮＡ分子はウイルスゲノムを含み、編集された前記ＲＮＡ分子は編集されたビリオンを含む。

【0018】

いくつかの例において、本明細書に記載の技術は方法に関し、前記ウイルスはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスである。

【0019】

いくつかの例において、本明細書に記載の技術は方法に関し、前記切断はインビトロで行われ、前記方法は、前記編集されたビリオンを回収する工程と、回収された前記編集されたビリオンを宿主へと導入する工程と、を備える。

【0020】

いくつかの例において、本明細書に記載の技術は方法に関し、前記方法は、前記ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ複合体を遺伝子工学的に操作するまたはプログラムする工程を備える。

【0021】

いくつかの例において、本明細書に記載の技術は、リボ核酸（ＲＮＡ）を編集するための、遺伝子工学的に操作されたＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔ）複合体を生成する方法であって、複数の発現ベクターを生成する工程を備え、
前記複数の発現ベクターは、（ｉ）天然または遺伝子工学的操作されたＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）転写物およびプレＣＲＩＳＰＲ転写物を、成熟ｃｒＲＮＡガイド（すなわち、Ｃａｓ６またはＣａｓ７－１１）へとプロセシングするＣａｓサブユニットを有するＣＲＩＳＰＲアレイ、および（ｉｉ）ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ複合体の複数のタンパク質サブユニットを備え、前記方法は更に、前記複数の発現ベクターを宿主に共導入する工程と、前記宿主において前記複数の発現ベクターの発現を誘導する工程と、発現した前記複数の発現ベクターを前記宿主から精製する工程と、を備える。

【0022】

いくつかの例において、本明細書に記載の技術は方法に関し、前記ｃｒＲＮＡガイドの予想されるサイズに基づいて精製物を選択する工程を更に備える。

【0023】

いくつかの例において、本明細書に記載の技術は方法に関し、前記予想されるサイズは４６ヌクレオチドである、

【0024】

いくつかの例において、本明細書に記載の技術は方法に関し、前記複数の発現ベクターは、前記ＣＲＩＳＰＲアレイを含む第１の発現ベクターと、Ｃａｓ１０サブユニットおよびＣｓｍ２サブユニットを含む第２の発現ベクターと、Ｃｓｍ３サブユニット、Ｃｓｍ４サブユニットおよびＣｓｍ５サブユニットを含む第３の発現ベクターと、を含む。

【0025】

いくつかの例において、本明細書に記載の技術は方法に関し、前記複数の発現ベクターは、前記ＣＲＩＳＰＲアレイを含む第１の発現ベクターと、Ｃａｓ７－１１遺伝子を含む第２の発現ベクターと、を含む。

【図面の簡単な説明】

【0026】

本開示の特徴は、以下の図（同様の数字は同様の要素を示す）に例示されるが、これらに限定されるものではない。

【0027】

【図1】一実施態様に係る、ＩＩＩ型に基づくＲＮＡ編集の概略を示す。

【0028】

【図2A】一実施態様に係る、ストレプトコッカス・サーモフィラス（ＳｔｈＣｓｍ）複合体の精製の一例を示す。

【0029】

【図2B】一実施態様に係る、ＳｔｈＣｓｍのＳＥＣプロファイルを示す。

【0030】

【図3A】一実施態様に係る、ＣｓｍによるＲＮＡ中のターゲット部分のプログラム可能で特異的な切断を示す。

【0031】

【図3B】一実施態様に係る、Ｃｓｍによるプログラム可能な切断による分離物を示す尿素－ＰＡＧＥの一例を示す。

【0032】

【図4A】一実施態様に係る、ＲＮＡ中のターゲット部分のプログラム可能な欠失を示す。

【0033】

【図4B】一実施態様に係る、ＲＮＡ中のターゲット部分を合成ＲＮＡ分子でプログラム可能な置換を示す。

【0034】

【図5A】一実施態様に係る、配列決定に基づくターゲット部分欠失の検証を示す。

【0035】

【図5B】一実施態様に係る、ＰＣＲ増幅産物に基づいたターゲット部分欠失の検証を示す。

【0036】

【図6A】一実施態様に係る、大腸菌から精製されたＤｅｓｕｌｆｏｎｅｍａ ｉｓｈｉｍｏｔｏｎｉｉ Ｃａｓ７－１１タンパク質のＳＥＣプロファイルを示す。

【0037】

【図6B】一実施態様に係る、大腸菌から精製されたＳＥＣ精製Ｄｅｓｕｌｆｏｎｅｍａ ｉｓｈｉｍｏｔｏｎｉｉ Ｃａｓ７－１１タンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥを示す。

【0038】

【図6C】一実施態様に係る、精製されたＤｅｓｕｌｆｏｎｅｍａ ｉｓｈｉｍｏｔｏｎｉｉ Ｃａｓ７－１１タンパク質による配列特異的ターゲットＲＮＡ切断の尿素－ＰＡＧＥを示す。

【0039】

【図6D】一実施態様に係る、精製されたＤｅｓｕｌｆｏｎｅｍａ ｉｓｈｉｍｏｔｏｎｉｉ Ｃａｓ７－１１タンパク質による配列特異的ターゲットＲＮＡ切断の定量化を示す。

【発明を実施するための形態】

【0040】

本開示は、遺伝子操作により作られたＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ複合体を用いたＲＮＡ編集に関する。多くのＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、ＤＮＡの配列特異的操作に日常的に用いられている。しかしながら、ＲＮＡを編集するための類似の方法はまだ確立されていない。ＲＮＡを編集するためのＣＲＩＳＰＲシステムの使用は、特定の配列を意図的に欠失させたり挿入したりすることができないインビボを基本とするエディタに限られている。したがって、必要とされているのは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２およびその他のウイルス性ＲＮＡ病原体に対処するための特異的なＲＮＡ編集を可能にするＲＮＡ編集システムであり、より一般的には、遺伝子治療やその他の目的のためにあらゆるＲＮＡをプログラム可能に編集できるシステムである。

【0041】

「ＲＮＡ編集」、「ＲＮＡを編集する」および類似の用語は、ＲＮＡを意図的に改変することを指し得る。例えば、ＲＮＡ編集は、ＲＮＡの取り除きたい一部分を欠失させること、ＲＮＡの置換したい一部分を合成ＲＮＡ配列で置換すること、編集されたＲＮＡが置換されることなく合成ＲＮＡを含むように合成ＲＮＡを追加すること（いくつかの例では、ＲＮＡを取り除いた後に取り除いたＲＮＡを再び追加する場合もある）、合成ＲＮＡを追加すると共にＲＮＡの一部分を欠失させること、および／または、そうでなければ意図的な方法でＲＮＡを改変することを含み得る。いくつかの例では、ＲＮＡ編集は、ＩＩＩ－Ｅ型ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ７－１１複合体を介して実施され得る。ＲＮＡ編集はインビトロで行われてもよく、その場合、編集されたＲＮＡは宿主に導入されてもよい。ＲＮＡは、ゲノムＲＮＡ（ウイルスゲノムＲＮＡなど）および／またはその他のＲＮＡ分子を含み得る。

【0042】

「遺伝子工学的に操作された（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）」および類似の用語は、自然界に存在しない系を意図的に生成することを指し得る。遺伝子工学的操作には、遺伝子配列に１つ以上の変異を導入すること、遺伝子配列を設計すること、タンパク質、検出成分等の成分を組み合わせて自然界には存在しない組み合わせを生成すること、および／または、ＲＮＡ等の核酸を編集するために自然界には存在しない系を生成することが含まれる。

【0043】

遺伝子工学的操作により作られたＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ複合体は、プログラム可能であり得るＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）配列によって誘導される特定の部位でＲＮＡを切断するヌクレアーゼを含んでもよい。「プログラムされた」、「プログラム可能な」等の用語は、遺伝子工学的操作によって作成されたＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ複合体をＲＮＡ編集を実行するように設計することを指し得る。特に、プログラム可能なｃｒＲＮＡ配列とは、遺伝子工学的操作によって作成されたＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ複合体をＲＮＡ中の目的の特定のターゲット部分に誘導するように設計されることを指す。例えば、ｃｒＲＮＡの配列特異的なターゲティングは、合成スペーサー配列を設計することによって行うことができる。合成スペーサー配列は、繰り返し配列を分離する２０～６０ヌクレオチドの長さであってもよいし、自己切断リボザイムで終端してもよく、ｃｒＲＮＡが短い（２０～１００ｎｔ）ｃｒＲＮＡへと処理され、１つ以上のＣａｓタンパク質のアセンブリに組み込まれ、これらが一緒になって、ガイド（スペーサー）配列に相補的なＲＮＡに安定的に結合し切断するリボ核タンパク質複合体を形成する。スペーサー配列はターゲット配列に相補的であるように設計されており、その他の「非ターゲット」ＲＮＡとの相補性を避けるように意図的に設計されている。いくつかの例では、ｃｒＲＮＡガイドは、結合、切断または環状ヌクレオチド合成を促進するプロトスペーサーフランキング配列（ＰＦＳ）を含むように設計されている。他の例では、ＰＦＳはｃｒＲＮＡの５’リピート配列に相補的でない任意の配列である。したがって、プログラム可能なｃｒＲＮＡ配列は、１つ以上の特定の部位におけるＲＮＡの特異的切断を促進し、プログラム可能なＲＮＡ編集を可能にする。使用され得る遺伝子工学操作で作成されるＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ複合体の一例は、ＲＮアーゼ活性を有するＩＩＩ－Ａ型ＣＲＩＳＰＲ複合体であるＣｓｍ複合体である。Ｃｓｍ複合体は、Ｓ．サーモフィラス由来のＳｔｈＣｓｍであってもよい。

【0044】

本明細書に記載される様々な例は、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）のＲＮＡゲノム等のウイルスＲＮＡゲノムの編集について記載する。しかしながら、本明細書に開示されるＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ複合体および方法を用いて、任意のＲＮＡ分子を編集することができる。

【0045】

図１は、一実施態様による、遺伝子工学的操作により作成されるＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ複合体を用いたＲＮＡ編集の概略を示す。
複数のＲＮＡ分子が編集されることは理解されるであろうが、編集されるＲＮＡは、ターゲットＲＮＡまたはＲＮＡ分子とも称され得る。ＲＮＡ編集を行うために、ターゲットＲＮＡを精製してもよい。例えば、野生型ウイルスＲＮＡを、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した哺乳動物細胞培養物から精製することができる。

【0046】

精製されたターゲットＲＮＡを、遺伝子工学的操作により作成されたＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ複合体と共にインキュベートすることができる。プログラム可能なｃｒＲＮＡ配列をターゲットＲＮＡにハイブリダイズし、遺伝子工学的操作により作成されたＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲをターゲットＲＮＡに結合させることができる。ｃｒＲＮＡ配列によって誘導されるターゲット部位でターゲットＲＮＡを切断するｃｒＲＮＡ誘導ヌクレアーゼを用いて、結合したＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ複合体はインビトロでＲＮＡを切断することができる。ターゲット部位において、ｃｒＲＮＡ誘導ヌクレアーゼはターゲットＲＮＡをＮヌクレオチド単位で切断することができる。特に、ｃｒＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、ターゲットＲＮＡを１つの位置でまたは６ヌクレオチドの単位で切断することができる。切断の単位数は、ｃｒＲＮＡの長さ、複合体中のＣａｓタンパク質の組成または化学量論に依存する。典型的には、必ずしもそうではないが、合計１８から２４ヌクレオチドが切除されるように、ヌクレアーゼ活性サブユニット数は３から４である。

【0047】

切断後、切断末端を修復するためのＲＮＡリガーゼに適合させるためにＲＮＡ断片は処理される。例えば、ＲＮＡ断片をＴ４ ＰＮＫで処理して、切断末端をＴ４ ＲＮＡリガーゼ１と生化学的に適合させることができる。

【0048】

処理されたＲＮＡ断片は核酸オリゴヌクレオチドにアニーリングされ、２つのＲＮＡ断片を橋渡しする核酸スプリントとして機能する。核酸オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡオリゴヌクレオチドおよび／またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）オリゴヌクレオチドであってもよい。この場合、核酸スプリントは、ＲＮＡスプリントおよび／またはＤＮＡスプリントであってもよい。スプリントされた構造（処理されたＲＮＡ断片およびアニーリングされたＲＮＡスプリントおよび／またはＤＮＡスプリント）は、次に、二本鎖構造を認識し、切断された末端を修復するリガーゼで処理される。例えば、リガーゼはＴ４ ＲＮＡリガーゼ１であってもよく、これはスプリント構造の二本鎖構造を認識し、切断されたゲノム断片間にホスホジエステル結合を形成し、それによって末端をライゲーションする。このようなライゲーションにより、目的の遺伝子座が欠失するか（その例が図４Ａに示されている）または遺伝子座が合成配列で置換される（その例が（図４Ｂ）に示されている）ことに留意すべきである。ライゲーション後、編集されたＲＮＡを哺乳動物細胞などの宿主に導入することができる。編集されたビリオンは、標準的なプラーク精製技術を用いて精製される。

【0049】

いくつかのＩＩＩ型システム（ＩＩＩ－Ａ型やＩＩＩ－Ｂ型など）では、ヌクレアーゼはｃｒＲＮＡに沿って集合する複合体の１つのサブユニットの一部であることに注意すべきである。従って、ｃｒＲＮＡが長ければ長いほど、ヌクレアーゼのサブユニットが多くなり、切断イベントの数も多くなる。全ての切断イベントが同時に起こるわけではないため、切断は不均一になる可能性がある（すなわち、ｃｒＲＮＡ誘導複合体の中にはターゲットを４回切断するものもあれば、２回切断するものもある）。核酸スプリントは、特定の切断産物の両側に特定の配列を隣接させることにより、特定の切断イベントを強化するように設計されている。いくつかのＩＩＩ型システム（ＩＩＩ－Ｅ型）は単一のポリペプチドからなる。これらのシステムは一般に６ヌクレオチド離れた２つの位置でターゲットを切断するが、他のＩＩＩ型システムと同様に、リボヌクレアーゼ活性部位を変異させ、ターゲットＲＮＡを結合するが切断しない切断不全複合体を作製することもできるし、ＩＩＩ－Ｅ型複合体は２つの活性部位の一方を変異させ、ターゲットＲＮＡを特定の１箇所で切断するように設計することもできる。

【0050】

図２Ａは、実施態様に係るＳｔｈＣｓｍ複合体の精製の一例を示す。ＳｔｈＣｓｍ複合体は、Ｃｓｍ複合体の構成要素を発現する３つのクローニングベクターと、プログラム可能な誘導体およびＣａｓ６をコードするＣＲＩＳＰＲアレイとを共導入することによって大腸菌で発現され、Ｃａｓ６はｃｒＲＮＡ転写物（特異的に設計されたｃｒＲＮＡ配列を有する）を成熟ガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ配列とも呼ばれる）へとプロセシングする。発現ベクターの誘導後、これらの細胞を溶解し、これに限定されないが、溶解液をアフィニティーカラム（すなわち、ストレップカラム）にかけ次いでサイズ排除クロマトグラフィーを行うといった標準的な方法を用いてＣｓｍ複合体を精製する。

【0051】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２をターゲットとするように設計された誘導体を持つＩＩＩ－Ａ型Ｃｓｍ複合体を精製するために、合成ＣＲＩＳＰＲが作製された。この合成ＣＲＩＳＰＲは、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のＣＲＩＳＰＲリピートに挟まれた４つの同一の３６ヌクレオチド「スペーサー」を含む。このＣＲＩＳＰＲアレイはＴ７誘導的プロモータの制御下にある。このクローニングベクターには、Ｃａｓ６用のＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ遺伝子が含まれており、あるＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムにおいてｃｒＲＮＡ転写物を成熟ｃｒＲＮＡへとプロセシングする。Ｃｓｍ複合体のタンパク質サブユニットは、２つの発現ベクターに分割されることもある。Ｃａｓ１０とＣｓｍ２はｐＡＣＹＣ－ｄｕｅｔベクター上にあり、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５はｐＲＳＦ－１ｂベクター上にある。Ｃｓｍ３遺伝子にはＮ末端のＳｔｒｅｐ－２タグが含まれており、Ｓｔｒｅｐカラムクロマトグラフィーに使用される。これら３つのクローニングベクターは大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞に共導入される。これらの遺伝子の発現はＴ７プロモータの制御下にあり、イソプロピルβ－ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を用いて誘導される。発現ベクターの増殖と誘導後、ストレップカラムクロマトグラフィーに続いてサイズ排除クロマトグラフィーにより、これらの細胞からＣｓｍ複合体を精製した。

【0052】

図２Ｂは、実施態様に係るＳｔｈＣｓｍのＳＥＣプロファイルを示す。サイズ排除クロマトグラム（ＳＥＣ）、精製タンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥ、および、Ｃｓｍ複合体の精製成功を示す関連ｃｒＲＮＡの尿素－ＰＡＧＥを図２Ｂに示す。ＳｔｈＣｓｍのＳＥＣプロファイルは、ＳｔｈＣｓｍ複合体のＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびＳｔｈＣｓｍ複合体に関連する核酸の変性尿素アクリルアミドゲルと一緒に示されている。全長ｃｒＲＮＡガイドは４０ヌクレオチドであると予想される。しかし、その他の長さ（より短い、または長い）の場合もあり得る。例えば、ｃｒＲＮＡの混合物は、６ヌクレオチド刻みで変化するｃｒＲＮＡ種の群として作成することができる。ｃｒＲＮＡの長さは、ｃｒＲＮＡプロセシングの効率によって、または、リボザイムをｃｒＲＮＡの３’末端に組み込むことによって決定される（例えば、ＨＤ自己切断リボザイム）。細胞内でのｃｒＲＮＡの自然なプロセシングは非効率的なプロセスであり、その結果、典型的には２８から７２ヌクレオチドの範囲の６ヌクレオチド単位で様々なｃｒＲＮＡのライブラリが得られるが、その他の範囲も予想される。

【0053】

図３Ａは、一実施態様に係る、ＲＮＡ中のターゲット部分のＣｓｍによるプログラム可能で特異的な切断を示す。Ｃｓｍによる切断はプログラム可能で特異的である。ここで、インビトロ転写（ＩＶＴ）された１．５ｋｂ ＲＮＡ分子は、ＩＶＴ ＲＮＡ内のターゲット配列を認識するようにプログラムされたＳｔｈＣｓｍによって切断される。

【0054】

遺伝子工学的操作により作成されたＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ ＩＩＩ－Ａ型Ｃｓｍ複合体（本明細書では「Ｃｓｍ複合体」とも呼ぶ）によるＲＮＡターゲティングは、ｃｒＲＮＡガイドとの相補性に厳密に依存し、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に依存しないため、ガイド設計が簡素化され、ＰＡＭ分布による制約がなくなる。従って、Ｃｓｍ複合体はＲＮＡを、ゲノム内の６、１２、１８または２４ヌクレオチド配列を切除するように誘導することができる。その他の長さのヌクレオチド配列も同様に切除できる。ガイド配列は、ターゲットＲＮＡに相補的な３６ヌクレオチドを持つように設計されている。転写後、新生ｃｒＲＮＡ転写物はＣａｓ６および／またはその他のヌクレアーゼによってプロセシングされ、成熟ｃｒＲＮＡとなる。主要な種は、２０ヌクレオチド誘導体とＣＲＩＳＰＲのリピートに由来する８ヌクレオチドの５’配列からなる２８ヌクレオチドのｃｒＲＮＡである。このプロセシングには不均一性があり、その結果、サイズの異なる成熟ｃｒＲＮＡが混在する。Ｃｓｍ複合体は成熟ｃｒＲＮＡに沿って集合するため、ｃｒＲＮＡが小さければ、小さい複合体が集まる。このシステムでは、ほとんどのＣｓｍ複合体がターゲット領域で１２から２４ヌクレオチドを切断する。

【0055】

ターゲットＲＮＡの切断は、精製したＣｓｍ複合体をインビトロでターゲットＲＮＡとインキュベートすることによって行われる。２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭのＫＣｌ、０．１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、および、１Ｕ／ｕＬのマウスＲＮＡｓｅ阻害剤からなる緩衝液中で、２：１の複合体対ゲノムモル比で、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムをターゲットとするＳｔｈＣｓｍ複合体を精製ウイルスゲノムと３７℃で３０分間インキュベートした。Ｃｓｍ複合体に結合しているｃｒＲＮＡに依存して、この切断によりターゲット配列の６、１２、１８または２４ヌクレオチドが切断される。切断後、Ｍｏｎａｒｃｈ ＲＮＡクリーンナップ（ＮＥＢ）を用いてゲノム断片を精製する。

【0056】

図３Ｂは、一実施態様に係る、Ｃｓｍによるプログラム可能な切断による分離物を示す尿素－ＰＡＧＥの一例を示す。この切断により、１．０ｋｂと０．５ｋｂのサイズの切断物が得られることが尿素－ＰＡＧＥにより証明された。このプログラム可能な切断がＲＮＡ編集の基本である。

【0057】

図４Ａは、一実施態様に係る、ＲＮＡ中のターゲット部分のプログラム可能な欠失を示す。ターゲットＲＮＡ（ＲＮＡゲノムのような）のターゲット領域を欠失させるために、Ｃｓｍ切断が行われ、次いでスプリントライゲーションが行われる。スプリントは、ライゲーションされる切断物の末端に１５－２５ヌクレオチドの相補性を有するように設計される。ＰＮＫ処理後、切断されたターゲットＲＮＡ断片は、ターゲットＲＮＡ対スプリント比１：１でスプリントと混合される。その後、サーモサイクラーで混合物を９５℃まで短時間加熱し、４５分かけて温度を４℃まで下げることにより、スプリントはターゲットＲＮＡ断片から利用可能なものにアニーリングされる。このＲＮＡ：ＤＮＡ複合体をＲＮＡリガーゼ１（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（登録商標）から入手可能）で処理し、ターゲット欠失を持つ編集されたターゲットＲＮＡを得る。

【0058】

Ｃｓｍによる切断後、ゲノム断片をＴ４ ＰＮＫ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（登録商標）から入手可能）で処理する。Ｃｓｍは金属依存性ヌクレアーゼであり、３’切断物に２’－３’環状リン酸を残し、５’末端に水酸基を残す。切断されたゲノム断片を１Ｘ ＰＮＫ緩衝液中、３７℃で４０分間Ｔ４ ＰＮＫで処理することにより、２’－３’環状リン酸を２’ヒドロキシル基および３’ヒドロキシル基に置換する。反応液にＡＴＰを１ｍＭまで添加し、さらに３７℃で４０分間インキュベートして、５’ヒドロキシル基を５’一リン酸基に置換する。ＰＮＫ処理後、ＭＯＮＡＲＣＨ ＲＮＡ クリーンナップキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（登録商標）から入手可能）を用いてゲノム断片を精製する。

【0059】

スプリントライゲーションでは、まずＲＮＡ断片をＤＮＡオリゴヌクレオチドにアニーリングさせ、２つの切断物に塩基対を形成させて切断領域を橋渡しする。このスプリントされたＲＮＡ－ＤＮＡハイブリッドはＴ４ ＲＮＡリガーゼ１で処理され、２つの切断物をホスホジエステル結合でつなぐ。

【0060】

ＤＮＡオリゴヌクレオチドスプリントは、１Ｘ Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ緩衝液中で、ＰＮＫ処理したゲノム断片と１：１のスプリント対ゲノムモル比で混合される。断片をスプリントとアニーリングさせるために、混合物を９５℃で２分間加熱し、その後サーモサイクラーで４５分間かけて４℃までゆっくりと降温する。 切断されたゲノム断片にスプリントがアニーリングした後、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを、１０％のＰＥＧ ８０００と１Ｕ／ｕｌのマウスＲＮＡｓｅ阻害剤を添加した１Ｘリガーゼ緩衝液中で、製造者のプロトコールに従ってＴ４ ＲＮＡリガーゼ１（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（登録商標）から入手可能）で処理する。反応は２５℃で１時間インキュベートする。反応物を１ｕＬのＴＵＲＢＯ ＤＮａｓｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）で処理し、３７℃で１５分間インキュベートしてＤＮＡスプリントを除去する。その後、ＭＯＮＡＲＣＨ ＲＮＡクリーンナップキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（登録商標）から入手可能）を用いてＲＮＡを精製する。この結果、ターゲットＲＮＡが除去された編集済みＲＮＡゲノムが得られる。

【0061】

ＲＮＡ編集のためのこのような切断とスプリントライゲーションの手法は、ウイルスＲＮＡゲノムの領域を目的の合成ＲＮＡ配列で置き換えるために、さらに応用することもできる。これを達成するために、多重化されたガイドを持つＣｓｍ複合体（すなわち、ゲノム中の２つの部位を認識するガイドを持つ２つのＣｓｍ複合体）を用いて、置換したい領域を挟む２つの部位でＲＮＡゲノムを切断する。得られた切断物は、上記のようにＴ４ ＰＮＫで処理され、合成ＲＮＡ分子と混合される。ゲノム断片と合成ＲＮＡにハイブリダイズするように設計された２つのＤＮＡスプリントが、次にＲＮＡ分子にアニーリングされる。この構造体をＴ４ ＲＮＡリガーゼ１で処理すると、ゲノム断片と合成ＲＮＡの間の切れ目が封鎖され、その結果、合成ＲＮＡがウイルスゲノムに直接組み込まれる。ＲＮＡ編集のこの手法の概要を図４Ｂに示す。

【0062】

図４Ｂは、一実施態様に係る、ターゲットＲＮＡ（ＲＮＡゲノム等）中のターゲット部分を合成ＲＮＡ分子でプログラム可能に置換を示す図である。ターゲットＲＮＡの領域を合成ＲＮＡ分子で置換するために、１つ以上のＣｓｍ複合体を用いてターゲットＲＮＡを切断する。切断物をＰＮＫ処理し、目的の合成ＲＮＡを切断物にターゲットＲＮＡ対合成ＲＮＡの比１：１で加える。次に、切断されたターゲットＲＮＡ末端と合成ＲＮＡにハイブリダイズするように設計された２つのスプリントを混合物に加え、上記のようにゲノムと合成ＲＮＡにアニーリングさせる。このＲＮＡ：ＤＮＡ複合体をＲＮＡリガーゼ１（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（登録商標）から入手可能）で処理すると、合成ＲＮＡがＲＮＡターゲットに組み込まれる。

【0063】

図５Ａは、一実施態様に係る、配列決定に基づくターゲット部分欠失の検証を示す。ＳｔｈＣｓｍによる切断とスプリントライゲーション後、ＲＮＡを逆転写し、ＰＣＲ増幅し、Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅシークエンシングで塩基配列を決定した。配列決定の結果、ターゲット部位の配列深度が低下していることが示された。これは目的の１８ヌクレオチド欠失を示している。

【0064】

本手法を検証するために、我々は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＯＲＦ７ａ遺伝子をターゲットとするように設計された、ストレプトコッカス・サーモフィラス由来のＩＩＩ型Ａ Ｃｓｍ複合体の合成ＣＲＩＳＰＲを作成した。切断効率は、切断部位を挟むプライマー対を用いたＲＴ－ｑＰＣＲによって測定される。この手法により、我々は日常的に標的ＲＮＡの９８％以上を切断している。切断後、生成物はスプリントライゲーションにより再接続される。ライゲーションの効率は、同じＲＴ－ｑＰＣＲアッセイを用いて測定する。我々は日常的に２５％程度のライゲーション効率を達成している。この手法により期待される欠失をもたらすことを確認するために、ＲＮＡの編集領域全体のディープシークエンシングを行った。シークエンシングデータから、一次生成物が目的の１８ヌクレオチド欠失を含むＲＮＡであることが明らかになった（図５Ａ）。このことは、図５Ｂに示すように、編集後のＲＴ－ＰＣＲ生成物がより小さくなることでさらに確認された。

【0065】

図５Ｂは、一実施態様に係る、ＰＣＲ増幅産物に基づいたターゲット部分欠失の検証を示す。編集された領域をＰＣＲで増幅すると、編集した産物のサイズが減少していることがわかる。編集によって１８ヌクレオチドが切除されるので、このサイズの変化は予想されたものである。

【0066】

このＲＮＡ編集手順のもう一つの可能性は、哺乳類細胞によってコードされた宿主ＲＮＡリガーゼに依存する。具体的には、ＲＮＡ編集は哺乳類のｔＲＮＡリガーゼ複合体によって媒介される可能性がある。このことから、Ｃｓｍを介したＲＮＡ編集はインビボでも可能であり、哺乳類ｔＲＮＡリガーゼ複合体によって、ＰＮＫ処理、スプリントアニーリングおよびインビトロライゲーション工程への依存性を排除できる可能性がある。

【0067】

これらの結果を総合すると、ＣｓｍによるＲＮＡ編集とそれに続くスプリントライゲーションは、期待通りの編集物をもたらす効果的な手順であることが実証された。Ｃｓｍによる切断はプログラム可能であり、ＰＡＭに完全に依存しないことから、このＲＮＡ編集技術はあらゆるＲＮＡ分子に汎用可能であり、主な応用例としてはＲＮＡウイルスの簡便な編集が期待される。この手法はユニークであり、インビトロでＲＮＡ分子のプログラム可能な切断とライゲーションによってＲＮＡの編集を達成する方法は他に報告されていない。ヌクレアーゼ欠損ＩＩＩ型複合体は、塩基編集酵素やその他のＲＮＡ修飾酵素を特定のＲＮＡ配列に標的化するプラットフォームとしても機能し、切断を伴わない遺伝的・エピジェネティックな編集が可能になると期待される。

【0068】

ｃｒＲＮＡ配列は、ＲＮＡターゲット等の核酸の遺伝子座に相補的となるように操作されたＣＲＩＳＰＲガイド配列であってもよい。ｃｒＲＮＡ配列は、ターゲット核酸またはその他の関心領域の１つ以上の保存領域に基づいて選択されてもよい。例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス（またはその他のＲＮＡターゲット）の異なる複数のゲノムを互いにアラインメントして、保存領域を同定することができる。一般的に言えば、アライメントが少ない領域よりもアライメントが多い（塩基対の違いが少なく、アライメント長が長い）領域の方が、ＣＲＩＳＰＲガイド配列として使用する相補的配列を生成するためのより良い候補となる。

【0069】

ｃｒＲＮＡ配列は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の様々なサンプル、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の様々な株および／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２について利用可能なその他のサンプルにわたる保存領域に基づいて設計されてもよい。このような保存配列は、配列アライメントに基づいて決定することができる。ペアワイズマッチのアラインメント品質が、２つの配列のアライメントされた部分が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（またはその他のターゲット）のゲノム全体の配列中のヌクレオチドの保存を表すと決定するのに十分である場合に、ペアワイズマッチが考慮され得る。アライメント品質は、少なくとも約１塩基、約２塩基、約４塩基、約５塩基、約１０塩基、約１５塩基、約４０塩基、約２５塩基、約４０塩基、約４５塩基、約５０塩基、約５５塩基、約６０塩基、約６５塩基、約７０塩基、約７５塩基、約８０塩基、約８５塩基、約９０塩基、約９５塩基、または約１００塩基の最小重複を有するものとして規定され得る。これに代えてまたは加えて、アライメント品質は、少なくとも約５％、１０％、１５％、４０％、２５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上の最小アライメント一致率に基づいてもよい。場合によっては、少なくとも約７０％の一致率を持つ、少なくとも２５ｎｔの重複が基準として要求されることもある。

【0070】

本実施例では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシド（Ｎ）遺伝子およびＯＲＦ７ａ遺伝子をコードする配列決定が、ＣＲＩＳＰＲガイド配列を生成するための基礎として機能するように選択された。ＣＲＩＳＰＲガイド配列の例としては、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１〜ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４が挙げられる。
［配列表］

【0071】

本願には、「０６５８６９－０５７０００３＿ＰＣＴ＿ＳＥＱＵＥＮＣＥ＿ＬＩＳＴＩＮＧ．ｘｍｌ」（２０２２年７月７日作成、４．６６バイト）ＸＭＬ形式の配列表が添付されている。当該配列表は全体として参照により本明細書に組み込まれる。

【0072】

配列例

【表1】

【0073】

図６Ａは、一実施態様に係る、大腸菌から精製されたＤｅｓｕｌｆｏｎｅｍａ ｉｓｈｉｍｏｔｏｎｉｉ Ｃａｓ７－１１タンパク質のＳＥＣプロファイルを示す。ＤｉｓＣａｓ７－１１複合体は、単一ポリペプチドを発現する１つのクローニングベクターの共導入により大腸菌で発現される。発現ベクターの誘導後、これらの細胞を溶解し、これに限定されないが、溶解液をアフィニティーカラム（すなわち、ストレップカラム）にかけ、次いでサイズ排除クロマトグラフィーを行うといった標準的な方法を用いてＩＩＩ－Ｅ型複合体ポリタンパク質を精製する。

【0074】

この複合体は精製後、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座からのダイレクトリピート（３５ｎｔ）の全配列と、ターゲット配列に逆相補的な３１ｎｔのスペーサー配列を含む１．２倍濃度の未成熟ｃｒＲＮＡ（６６ｎｔ）と混合される。次に、Ｃａｓ７－１１ポリタンパク質を、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭのＫＣｌ、０．１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、１０ｍＭの酢酸マグネシウムおよび１Ｕ／ｕＬのマウスＲＮＡｓｅ阻害剤からなる緩衝液中で、３７℃で３０分間、未成熟ｃｒＲＮＡとインキュベートする。この反応により、Ｃａｓ７－１１タンパク質とｃｒＲＮＡの複合化が促進され、１５ｎｔの５’－タグを残してダイレクトリピート配列をトリミングするｃｒＲＮＡプロセシングが行われる。

【0075】

図６Ｂは、一実施態様に係る、大腸菌から精製されたＳＥＣ精製Ｄｅｓｕｌｆｏｎｅｍａ ｉｓｈｉｍｏｔｏｎｉｉ Ｃａｓ７－１１タンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥを示す。

【0076】

図６Ｃは、一実施態様に係る、精製されたＤｅｓｕｌｆｏｎｅｍａ ｉｓｈｉｍｏｔｏｎｉｉ Ｃａｓ７－１１タンパク質による配列特異的ターゲットＲＮＡ切断の尿素－ＰＡＧＥを示す。この切断により、０．９ｋｂと０．２５ｋｂのサイズの切断物が得られ、このことが尿素－ＰＡＧＥで証明された。ターゲットＲＮＡの切断は、精製したＤｉｓＣａｓ７－１１複合体をインビトロでターゲットＲＮＡとインキュベートすることにより行われる。２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭのＫＣｌ、０．１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、１０ｍＭの酢酸マグネシウムおよび１Ｕ／ｕＬのマウスＲＮＡｓｅ阻害剤からなる緩衝液中で、ＧＦＰ遺伝子のＤｉｓＣａｓ７－１１複合体ターゲット配列を、複合体対ゲノムの合成インビトロ転写ＲＮＡ断片（ＳＩＮＶ－ＧＦＰ）と５：１のモル比で、３７℃で６０分間インキュベートした。この切断は、Ｃｓｍ複合体に結合しているｃｒＲＮＡに依存し、ターゲット配列の６ヌクレオチドを切除する。切断後、ＲＮＡ断片をフェノール－クロロホルム抽出法でタンパク質から精製し、Ｕｒｅａ－ＰＡＧＥで分離した。

【0077】

図６Ｄは、一実施態様に係る、精製されたＤｅｓｕｌｆｏｎｅｍａ ｉｓｈｉｍｏｔｏｎｉｉ Ｃａｓ７－１１タンパク質による配列特異的ターゲットＲＮＡ切断の定量化を示す。ＲＮＡ切断物をＬｕｎａＳｃｒｉｐｔ ＲＴ ＳｕｐｅｒＭｉｘ Ｋｉｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で逆転写し、切断部位に隣接するプライマーを用いたリアルタイムＰＣＲで定量化した。データはｃｒＲＮＡを含まないコントロール反応に対して正規化し、切断効率は（１－ＲＮＡの相対量）＊１００％として計算した。反応はテクニカルデュプリケートで行い、データは平均値±１標準偏差でプロットした。

【0078】

ターゲットＲＮＡは被験体から得ることができる。例えば、ターゲットＲＮＡは、宿主生物に感染する生物のＲＮＡであってもよい。特に、ターゲットＲＮＡは、被験体に感染したウイルスのＲＮＡゲノムであってもよい。別の例では、ターゲットＲＮＡは被験体のＲＮＡであってもよい。被験体とは、哺乳動物種（好ましくはヒト）、鳥類（例えば鳥類）などの動物または植物等のその他の生物を指す場合がある。より具体的には、被験体は脊椎動物、例えば、マウス等の哺乳類、霊長類、類人猿またはヒトであり得る。動物には、家畜、スポーツ動物、ペット等が含まれる。被験体は、健康な個体、症状もしくは徴候を有する個体、または疾患もしくは疾患の素因を有することが疑われる個体、または、治療が必要な個体もしくは治療が必要であることが疑われる個体であり得る。

【0079】

遺伝子組換えシステムにおける遺伝子組換えまたは突然変異とは、核酸の変化、変異または多型のことであり、その結果、対応するタンパク質の機能が変化または無効になる可能性がある。参照ゲノム、被験体またはその他の個体に関して、このような変化、変異または多型があり得る。変異には、１つ以上の一塩基変異（ＳＮＶ）、挿入、欠失、反復、小挿入、小欠失、小反復、構造変異接合、可変長タンデム反復および／またはフランキング配列、ＣＮＶ、転座、遺伝子融合およびその他の転位もまた、遺伝的変異の形態とみなされ得る。変異は、塩基変化、挿入、欠失、反復、コピー数変異、転座またはそれらの組み合わせであり得る。

【0080】

「ポリヌクレオチド」、「核酸」、「核酸分子」または「オリゴヌクレオチド」はそれぞれ、ヌクレオシド間連結によって結合したヌクレオシド（デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシドまたはそれらの類似体を含む）のポリマーを指すことがある。典型的には、ポリヌクレオチドは少なくとも３つのヌクレオシドからなる。オリゴヌクレオチドの大きさは、数個の単量体単位、例えば、３－４個から数百個の単量体単位までであることが多い。ポリヌクレオチドが「ＡＵＧＣＣＵＧ」のような文字の配列で表される場合はいつでも、ヌクレオチドは左から右へ５’から３’の順序であり、特に断りのない限り、「Ａ」はアデノシン、「Ｃ」はシチジン、「Ｇ」はグアノシン、「Ｕ」はウラシルを示すことが理解されるであろう。文字Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＵ（またはＤＮＡ中のチミンを示す「Ｔ」）は、当技術分野で標準的であるように、塩基自体、ヌクレオシドまたは塩基を構成するヌクレオチドを指すのに使用され得る。

【0081】

上述または以下に引用された全ての特許出願、ウェブサイト、その他の刊行物、配列リスト、文献番号等は、個々の項目が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されている場合と同じ程度まで、あらゆる目的のためにその全体が参照により組み込まれる。

【0082】

ある配列の異なるバージョンが異なる時点で文献番号と関連付けられている場合、本出願の有効出願日において文献番号と関連付けられているバージョンを意味する。有効出願日とは、実際の出願日または該当する場合には文献番号に言及する優先権出願の出願日のいずれか早い方を意味する。同様に、出版物、ウェブサイト等の異なるバージョンが異なる時期に発行された場合、特に断りのない限り、本出願の有効出願日に発行された最新のバージョンを意味する。本開示の任意の特徴、ステップ、要素、実施形態または態様は、特に別段の指示がない限り、他のものと組み合わせて使用することができる。本開示は、明瞭性および理解を高める目的で、例示および実施例によってある程度詳細に説明されてきたが、添付の特許請求の範囲の範囲内で特定の変更および修正が実施され得ることは明らかであろう。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図3A】

【図3B】

【図4A】

【図4B】

【図5A】

【図5B】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図6D】

【配列表】

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【国際調査報告】