特表 2024-524875 疾患細胞を検出するための操作された微生物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-07-09

(54)【発明の名称】疾患細胞を検出するための操作された微生物

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/02 20060101AFI20240702BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240702BHJP

   A61P 1/04 20060101ALI20240702BHJP

   A61P 1/00 20060101ALI20240702BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20240702BHJP

   A61K 35/74 20150101ALI20240702BHJP

   A61K 31/573 20060101ALI20240702BHJP

   C12Q 1/42 20060101ALI20240702BHJP

   C12Q 1/66 20060101ALI20240702BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240702BHJP

   G01N 33/50 20060101ALI20240702BHJP

   G01N 33/68 20060101ALI20240702BHJP

   C07K 16/28 20060101ALN20240702BHJP

   C12N 15/13 20060101ALN20240702BHJP

   C12N 15/55 20060101ALN20240702BHJP

   C12N 15/53 20060101ALN20240702BHJP

   C12N 15/62 20060101ALN20240702BHJP

   C07K 19/00 20060101ALN20240702BHJP

   C12N 15/31 20060101ALN20240702BHJP

   C12N 15/63 20060101ALN20240702BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/02

A61P35/00 ZNA

A61P1/04

A61P1/00

A61K45/00

A61K35/74 A

A61K35/74 Z

A61K31/573

C12Q1/42

C12Q1/66

C12N1/21

G01N33/50 Z

G01N33/68

C07K16/28

C12N15/13

C12N15/55

C12N15/53

C12N15/62 Z

C07K19/00

C12N15/31

C12N15/63 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023575742

(86)(22)【出願日】2022-06-09

(85)【翻訳文提出日】2024-01-29

(86)【国際出願番号】 US2022032789

(87)【国際公開番号】W WO2022261290

(87)【国際公開日】2022-12-15

(31)【優先権主張番号】63/208,888

(32)【優先日】2021-06-09

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】523459815

【氏名又は名称】マイクロビアル マシーンズ， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】ワーグナー， ジェフリー

(72)【発明者】

【氏名】マーメルスタイン， フレッド

(72)【発明者】

【氏名】ノビナ， カール

(72)【発明者】

【氏名】ディステル， ロバート

(72)【発明者】

【氏名】ナイヤー， スティーブン

(72)【発明者】

【氏名】ポリスキー， バリー

【テーマコード（参考）】

2G045

4B063

4B065

4C084

4C086

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

2G045AA25

2G045AA28

2G045CA25

2G045CA26

2G045CB03

2G045CB04

2G045CB07

2G045CB30

2G045DA36

2G045FA11

2G045FA36

2G045FB03

4B063QA01

4B063QA19

4B063QQ03

4B063QQ22

4B063QQ33

4B063QQ79

4B063QR13

4B063QR80

4B063QS05

4B063QS33

4B063QS38

4B063QX02

4B065AA15X

4B065AA21X

4B065AA26X

4B065AA30X

4B065AA79X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA01

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA25

4B065CA46

4C084AA17

4C084NA14

4C084ZA66

4C084ZA68

4C084ZB26

4C084ZC78

4C086AA01

4C086AA02

4C086DA10

4C086MA01

4C086MA04

4C086NA20

4C086ZA66

4C086ZA68

4C086ZB26

4C086ZC78

4C087AA01

4C087AA10

4C087BC30

4C087CA09

4C087CA12

4C087NA20

4C087ZA66

4C087ZA68

4C087ZB26

4C087ZC78

4H045AA11

4H045AA30

4H045BA41

4H045CA40

4H045DA76

4H045EA51

4H045FA74

(57)【要約】

本発明は、とりわけ、（ｉ）疾患胃腸組織の上皮細胞の管腔側に特異的に露出している細胞膜受容体と特異的に相互作用する表面タンパク質と、（ｉｉ）分泌可能なバイオマーカーとを発現する操作された微生物に関する。本技術の操作された細菌は、疾患胃腸組織を検出するのに有用である。消化管（ＧＩ管）は食物を摂取し、食物を消化してエネルギーおよび栄養素を抽出および吸収し、残りの老廃物を糞便として排出する。消化器疾患（ＧＩ疾患）は、口、食道、胃および小腸、大腸および直腸を含む消化管を形成する器官が関与する疾患である。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

疾患上皮組織、および必要に応じて胃腸（ＧＩ）組織を検出するための方法であって、
（ａ）対象の前記上皮組織に、上皮の疾患細胞に特異的に侵入し、前記疾患細胞における分泌可能なバイオマーカーの発現を指示する操作された微生物を投与することと；
（ｂ）前記対象の生物学的試料を得ることと；
（ｃ）前記分泌可能なバイオマーカーの存在または量について前記試料を評価することと
を含む、方法。

【請求項2】

前記遺伝子操作された微生物が、疾患組織の上皮細胞の管腔側に特異的に露出している１またはそれを超える細胞膜受容体と特異的に相互作用する表面タンパク質をコードする外因性遺伝子を含み；ならびに
前記表面タンパク質は、前記疾患上皮細胞における前記微生物の結合および／または侵入を促進する、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記生物学的試料が、血液、血漿、血清、尿、糞便、唾液および粘液、またはこれらの任意の２もしくはそれを超える組み合わせから選択される、請求項１または請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記分泌可能なバイオマーカーが、粘液、唾液および尿から選択される生体液中に排泄される、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

前記遺伝子操作された微生物が非病原性である、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

前記遺伝子操作された微生物が、少なくとも１つの栄養要求性変異を有する、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記分泌可能なバイオマーカーが哺乳動物プロモーターから発現される、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記哺乳動物プロモーターがＧＩ管上皮細胞特異的発現を指示する、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

前記分泌可能なバイオマーカーが微生物プロモーターから発現され、前記分泌可能なバイオマーカーをコードするｍＲＮＡが前記疾患細胞において翻訳される、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

前記分泌可能なバイオマーカーをコードする前記ＲＮＡが、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）をさらに含む、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

前記遺伝子操作された微生物が、経口または直腸経路を介して投与される、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

前記分泌可能なバイオマーカーが、酵素、ペプチドホルモン、またはタンパク質もしくはペプチド抗原である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

前記分泌可能なバイオマーカーが、前記対象の前記生体液中に通常存在しない、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

前記分泌可能なバイオマーカーが、アルカリホスファターゼ、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、結腸がん分泌タンパク質２、カテプシンＢ、Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ（Ｇｌｕｃ）、Ｍｅｔｒｉｄｉａルシフェラーゼ（ＭＬｕｃ）、これらのサブユニット、これらの断片、およびこれらの任意の２またはそれを超える組み合わせから選択される分泌タンパク質である、請求項１２または請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

前記分泌可能なバイオマーカーが、体液中の分布（例えば、前記尿中への排泄の増加または前記血液中への蓄積の増加）に関して最適化される、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

前記分泌可能なバイオマーカーが、定性的に、定量的にまたは半定量的に測定され、必要に応じて、前記分泌可能なバイオマーカーが、結腸鏡、内視鏡、Ｘ線撮影装置、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャナ、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）機器、血液ガス分析装置および尿化学分析装置から選択される臨床検査装置を使用せずに、測定される、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項17】

前記分泌可能なバイオマーカーが、凝集、電流測定、原子吸光分析法、原子発光分析法、円二色性（ＣＤ）、化学発光、比色分析、ディップスティックアッセイ、ラテラルフローイムノアッセイ、蛍光定量法、電気泳動アッセイ、酵素アッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ガスクロマトグラフィー、重量測定、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、イムノアッセイ、免疫蛍光酵素アッセイ、質量分析、核磁気共鳴、ラジオイムノアッセイ、分光測定、滴定法、ウェスタンブロッティングまたはこれらの任意の２もしくはそれを超える組み合わせによって測定される、請求項１５に記載の方法。

【請求項18】

前記分泌可能なバイオマーカーが、ラテラルフローもしくはディップスティックイムノアッセイまたは酵素アッセイから選択されるアッセイによって測定される、請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

前記分泌可能なバイオマーカーが、携帯型および／または手持ち式機器を使用して測定される、請求項１５～１８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項20】

前記分泌可能なバイオマーカーの測定が数値をもたらす、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

前記分泌可能なバイオマーカーが分泌型アルカリホスファターゼを含み、必要に応じて、前記分泌型アルカリホスファターゼがヒト胎盤アルカリホスファターゼのトランケート型の形態である、請求項１４～２０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項22】

前記分泌型アルカリホスファターゼが、酵素アッセイを使用して測定される、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

前記分泌型アルカリホスファターゼが、比色、蛍光および／または化学発光読み出しを使用して測定される、請求項２２に記載の方法。

【請求項24】

前記アッセイが、ｐ－ニトロフェニルホスファート（ｐＮＰＰ）、４－メチルウンベリフェリルリン酸二ナトリウム塩（ＭＵＰ）およびクロロ－５－置換アダマンチル－１，２－ジオキセタンホスファート（ＣＳＰＤ）から選択される基質を使用する、請求項２３に記載の方法。

【請求項25】

前記分泌可能なバイオマーカーが、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、またはそのサブユニット、またはその断片を含む、請求項１４～２０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項26】

前記ｈＣＧ、または前記そのサブユニット、または前記その断片が、イムノアッセイを使用して測定される、請求項２５に記載の方法。

【請求項27】

前記ｈＣＧ、または前記そのサブユニット、または前記その断片が、抗ｈＣＧ抗体またはその断片を使用して測定される、請求項２６に記載の方法。

【請求項28】

前記イムノアッセイが、凝集アッセイ、ディップスティックアッセイ、ラテラルフローアッセイ、定量的イムノアッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、またはこれらの任意の２もしくはそれを超える組み合わせから選択される、請求項２７に記載の方法。

【請求項29】

前記ｈＣＧ、または前記そのサブユニット、または前記その断片が、化学発光、比色分析および／または蛍光を使用して測定される、請求項２８に記載の方法。

【請求項30】

前記生物学的試料が、血液、尿および唾液から選択される、請求項２５～２９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項31】

前記分泌可能なバイオマーカーがルシフェラーゼを含む、請求項１４～２０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項32】

前記ルシフェラーゼが、Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ（Ｇｌｕｃ）またはその誘導体である、請求項３１に記載の方法。

【請求項33】

ルシフェラーゼが、酵素アッセイを使用して測定される、請求項３１または請求項３２に記載の方法。

【請求項34】

前記酵素アッセイが、ルシフェリンを基質として使用する、請求項３３に記載の方法。

【請求項35】

前記ルシフェリンがセレンテラジンである、請求項３４に記載の方法。

【請求項36】

前記ルシフェラーゼが、発光読み出しを使用して測定される、請求項３１～３５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項37】

前記生物学的試料が、血液、尿および唾液から選択される、請求項３１～３６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項38】

前記分泌可能なバイオマーカーをコードする遺伝子が、少なくとも１つのイントロンを含む、請求項１～３７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項39】

前記少なくとも１つのイントロンがスプライソソームイントロンである、請求項３８に記載の方法。

【請求項40】

前記微生物が、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉから選択される、請求項１～３９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項41】

前記微生物がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉであり、必要に応じてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ １９１７またはその誘導体である、請求項４０に記載の方法。

【請求項42】

前記Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ １９１７またはその誘導体が、プラスミドｐＭＵＴ１および／もしくはプラスミドｐＭＵＴ２ならびに／またはこれらの誘導体を保有する、請求項４１に記載の方法。

【請求項43】

前記Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ １９１７またはその誘導体が、前記プラスミドｐＭＵＴ１および／または前記プラスミドｐＭＵＴ２をキュアリングされている、請求項４１に記載の方法。

【請求項44】

前記表面タンパク質が、胃腸組織の正常な上皮細胞の管腔側に露出していない１またはそれを超える細胞膜受容体と特異的に相互作用する、請求項２～４３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項45】

前記表面タンパク質が、インベイシンまたはその断片である、請求項４４に記載の方法。

【請求項46】

前記インベイシンが、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａインベイシン、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓインベイシン、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ＰａｇＮ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ Ａｌｓ３およびＥ．ｃｏｌｉインチミンから選択される、請求項４５に記載の方法。

【請求項47】

前記表面タンパク質が、がん性細胞および／または前がん性細胞の表面に特異的に結合するペプチドまたはタンパク質を含む、請求項４４に記載の方法。

【請求項48】

前記ペプチドまたはタンパク質が、レプチン、抗体、またはこれらの断片から選択される、請求項４７に記載の方法。

【請求項49】

前記抗体またはその断片が、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）およびｓｃＦｖ断片から選択される、請求項４８に記載の方法。

【請求項50】

前記ペプチドまたはタンパク質が、微生物の表面タンパク質上に提示される、請求項４７～４９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項51】

前記ペプチドまたはタンパク質が、前記微生物の表面タンパク質との融合タンパク質として発現される、請求項５０に記載の方法。

【請求項52】

前記微生物の表面タンパク質が、インベイシン、インチミンおよびアドヘシンから選択される、請求項５１に記載の方法。

【請求項53】

前記微生物が、エンドサイトーシス液胞を溶解することができる溶解素をコードする外因性遺伝子をさらに含む、請求項１～５２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項54】

前記溶解素が、リステリオリシンＯまたはその変異体誘導体である、請求項５３に記載の方法。

【請求項55】

前記表面タンパク質をコードする遺伝子および／または前記溶解素をコードする遺伝子が、前記微生物のゲノムに組み込まれている、請求項５３または５４に記載の方法。

【請求項56】

前記表面タンパク質をコードする遺伝子および前記溶解素をコードする遺伝子が、単一のゲノム部位に組み込まれている、請求項５５に記載の方法。

【請求項57】

前記単一のゲノム部位が、バクテリオファージの組み込み部位およびプラスミドの組み込み部位から選択される、請求項５６に記載の方法。

【請求項58】

前記表面タンパク質をコードする遺伝子および／または前記溶解素をコードする遺伝子がプラスミドに挿入されている、請求項５３または５４に記載の方法。

【請求項59】

前記分泌可能なバイオマーカーをコードする遺伝子が、前記微生物のゲノムに組み込まれているか、またはプラスミドに挿入されている、請求項１～５８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項60】

前記分泌可能なバイオマーカーをコードする遺伝子が、前記単一のゲノム部位に組み込まれている、請求項５９に記載の方法。

【請求項61】

前記分泌可能なバイオマーカーをコードする遺伝子がプラスミドに挿入されている、請求項５９に記載の方法。

【請求項62】

前記分泌可能なバイオマーカーをコードする遺伝子が、第２のプラスミドに挿入されている、請求項１～５７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項63】

前記微生物がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ １９１７またはその誘導体であり、ならびに前記プラスミドおよび／または前記第２のプラスミドが、前記プラスミドｐＭＵＴ１、前記プラスミドｐＭＵＴ２およびこれらの誘導体から選択される、請求項６２に記載の方法。

【請求項64】

前記プラスミドおよび／または前記第２のプラスミドが選択機構を含む、請求項６２または請求項６３に記載の方法。

【請求項65】

前記選択機構が、抗生物質耐性マーカー、毒素－抗毒素系、必須遺伝子における変異の相補性を引き起こすマーカー、シス作用遺伝要素、およびこれらの任意の２またはそれを超える組み合わせから選択される、請求項６４に記載の方法。

【請求項66】

前記選択機構が、カナマイシン耐性遺伝子およびテトラサイクリン耐性遺伝子から選択される抗生物質耐性マーカーである、請求項６４に記載の方法。

【請求項67】

前記選択機構が、プラスミドＲ１のｈｏｋ／ｓｏｋ系、プラスミドＲＫ２のｐａｒＤＥ系、ＦプラスミドのｃｃｄＡＢ、ＦプラスミドのｆｌｍＡＢ、プラスミドＲ１のｋｉｓ／ｋｉｄ系、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓのＸＣＶ２１６２－ｐｔａＲＮＡ１、腸管出血性Ｅ．ｃｏｌｉまたはＫｌｅｂｓｉｅｌｌａのａｔａＴ－ａｔａＲ、Ｅｒｗｉｎｉａ ｃａｒｏｔｏｖｏｒａのｔｏｘＩＮ系、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓのｐａｒＥ－ｐａｒＤ系、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓプラスミドＡＤ１からのｆｓｔ－ＲＮＡＩＩ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓプラスミドｐＳＭ１９０３５のε－ζ系およびこれらの任意の２またはそれを超える組み合わせから選択される毒素－抗毒素系である、請求項６４に記載の方法。

【請求項68】

前記選択機構が、必須遺伝子における変異の相補性を引き起こすマーカーであり、前記必須遺伝子産物は、
必須栄養素もしくは細胞壁成分の生合成に関与する酵素；および／または
ハウスキーピング機能
をコードする、請求項６４に記載の方法。

【請求項69】

前記必須遺伝子が、ｄａｐＡ、ｄａｐＤ、ｍｕｒＡ、ａｌｒ、ｄａｄＸ、ｍｕｒＩ、ｄａｐＥ、ｔｈｙＡおよびこれらの任意の２またはそれを超える組み合わせから選択され、必要に応じて、前記必須遺伝子がａｌｒおよびｄａｄＸであり、必要に応じて、前記遺伝子操作された微生物がａｌｒおよびｄａｄＸの不活性化を有し、ならびに前記選択機構が、前記ａｌｒおよびｄａｄＸの不活性化を補完するためのａｌｒ遺伝子を有するプラスミドである、請求項６８に記載の方法。

【請求項70】

前記ハウスキーピング機能が、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｉｎｆＡ、ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、細胞分裂タンパク質またはシャペロンタンパク質のサブユニットをコードする遺伝子、およびこれらの任意の２またはそれを超える組み合わせから選択される、請求項６８に記載の方法。

【請求項71】

前記選択機構が、ＣｏｌＥ１ ｃｅｒ遺伝子座およびｐＳＣ１０１ ｐａｒ遺伝子座から選択されるシス作用遺伝要素である、請求項６４に記載の方法。

【請求項72】

前記微生物が、ｄａｐＡ、ｄａｐＤ、ｄａｐＥ、ｍｕｒＡ、ａｌｒ、ｄａｄＸ、ｍｕｒＩ、ｔｈｙＡおよびａｒｏＣの１つまたはそれより多くの欠失、不活性化または変化した発現もしくは活性から選択される少なくとも１つの変異を有し、ならびに必要に応じて、ｄａｐＡ、ａｌｒおよびｄａｄＸの欠失または不活性化を含む、請求項１～６４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項73】

前記分泌可能なバイオマーカーをコードする遺伝子を保有するプラスミドが、ＤＮＡ結合タンパク質に対する少なくとも１つの結合部位を含む、請求項５９～７２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項74】

前記ＤＮＡ結合タンパク質に対する少なくとも１つの結合部位が、ＳＶ４０エンハンサー、転写因子結合部位および細菌のオペレーターから選択される、請求項７３に記載の方法。

【請求項75】

前記ＤＮＡ結合タンパク質が、１またはそれを超える核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む、請求項７３に記載の方法。

【請求項76】

前記ＮＬＳがＳＶ４０ Ｔ抗原ＮＬＳ配列（ＫＫＫＲＫＶ）である、請求項７５に記載の方法。

【請求項77】

前記微生物が、前記ＤＮＡ結合タンパク質をコードする遺伝子を含む、請求項７３～７６のいずれか一項に記載のいずれか一項に記載の方法。

【請求項78】

前記ＤＮＡ結合タンパク質がＮＦκＢである、請求項７３～７７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項79】

前記疾患が、前がん性病変、がん、潰瘍性大腸炎、クローン病、バレット食道、過敏性腸症候群および過敏性腸疾患から選択される、請求項１～７８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項80】

前記前がん性病変が、無茎性ポリープ、鋸歯状ポリープ（例えば、過形成性ポリープ、無茎性鋸歯状腺腫／ポリープ、および古典的鋸歯状腺腫）、無茎性鋸歯状ポリープ、平坦型ポリープ、亜有茎性ポリープ、有茎性ポリープ、およびこれらの組み合わせから選択されるポリープを含む、請求項７９に記載の方法。

【請求項81】

前記前がん性病変が、ＢｉｌＩＮ－１、ＢｉｌＩＮ－２、ＢｉｌＩＮ－３および胆管癌から選択される胆管上皮内新生物（ＢｉｌＩＮ）を含む、請求項７９に記載の方法。

【請求項82】

前記前がん性病変が、ＰａｎＩＮ－１、ＰａｎＩＮ－２、ＰａｎＩＮ－３および膵管腺癌（ＰＤＡＣ）から選択される膵臓上皮内新生物（ＰａｎＩＮ）を含む、請求項７９に記載の方法。

【請求項83】

前記前がん性病変が微小ポリープである、請求項７９～８２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項84】

前記前がん性病変が約０．０５ｍｍ～約３０ｍｍのサイズを有する、請求項７９～８２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項85】

前記前がん性病変が、約０．１ｍｍ未満、約０．２５ｍｍ未満、約０．５ｍｍ未満、約１ｍｍ未満、約２ｍｍ未満、約５ｍｍ未満、約８ｍｍ未満、約１０ｍｍ未満、約１５ｍｍ未満、約２０ｍｍ未満、約２５ｍｍ未満または約３０ｍｍ未満のサイズを有する、請求項８４に記載の方法。

【請求項86】

前記がんが、ポリープ、腺腫または明白ながんを含む、請求項７９に記載の方法。

【請求項87】

前記がんが、リンチ症候群がん、家族性腺腫性ポリポーシス、遺伝性非ポリポーシス結腸がん（ＨＮＰＣＣ）、膵管腺癌（ＰＤＡＣ）、胆管癌または散発性がんを含む、請求項７９に記載の方法。

【請求項88】

前記対象ががんに罹患しやすい、請求項１～７９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項89】

前記対象が、リンチ症候群、遺伝性非ポリポーシス結腸がん（ＨＮＰＣＣ）、家族性腺腫性ポリポーシス（ＦＡＰ）、ガードナー症候群、ターコット症候群、ＭＵＴＹＨ関連ポリポーシス、ポイツ・ジェガース症候群および若年性ポリポーシス症候群および大腸炎関連結腸直腸がん（ＣＡＣＣ）から選択される状態に罹患している、請求項８８に記載の方法。

【請求項90】

前記ステップ（ａ）、（ｂ）および／または（ｃ）が繰り返される、請求項１～８９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項91】

前記ステップ（ａ）、（ｂ）および／または（ｃ）が、毎月、隔月、６ヶ月ごともしくは毎年を超えない頻度で、または概ね毎月、隔月、６ヶ月ごともしくは毎年繰り返される、請求項９０に記載の方法。

【請求項92】

表面タンパク質をコードする遺伝子を含む、遺伝子操作された微生物であって、前記表面タンパク質は、疾患組織、および必要に応じて消化管の上皮組織である疾患組織の上皮細胞の管腔側に特異的に露出している１またはそれを超える細胞膜受容体と特異的に相互作用し、
前記表面タンパク質は、疾患組織の上皮細胞の結合および侵入を促進し、
前記微生物は、前記上皮細胞によって分泌可能である分泌可能なバイオマーカーをコードする遺伝子を含み、前記分泌可能なバイオマーカーをコードする前記遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されている、遺伝子操作された微生物。

【請求項93】

前記遺伝子操作された微生物が非病原性である、請求項９２に記載の遺伝子操作された微生物。

【請求項94】

前記遺伝子操作された微生物が少なくとも１つの栄養要求性変異を有する、請求項９２または請求項９３に記載の遺伝子操作された微生物。

【請求項95】

前記分泌可能なバイオマーカーが哺乳動物プロモーターから発現される、請求項９２～９４のいずれか一項に記載の遺伝子操作された微生物。

【請求項96】

前記哺乳動物プロモーターがＧＩ管上皮細胞特異的発現を指示する、請求項９５に記載の遺伝子操作された微生物。

【請求項97】

前記分泌可能なバイオマーカーが微生物プロモーターから発現される、請求項９２～９４のいずれか一項に記載の遺伝子操作された微生物。

【請求項98】

前記分泌可能なバイオマーカーをコードするＲＮＡが、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含む、請求項９７に記載の遺伝子操作された微生物。

【請求項99】

前記微生物プロモーターが、誘導性および／または抑制性である、請求項９７または９８に記載の遺伝子操作された微生物。

【請求項100】

前記分泌可能なバイオマーカーが、酵素、ペプチドホルモン、またはタンパク質もしくはペプチド抗原である、請求項９２～９９のいずれか一項に記載の遺伝子操作された微生物。

【請求項101】

前記分泌可能なバイオマーカーが、血液、尿または唾液から選択される対象の生体液中に通常存在しない、請求項１００に記載の遺伝子操作された微生物。

【請求項102】

前記分泌可能なバイオマーカーが、アルカリホスファターゼ、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、結腸がん分泌タンパク質２、カテプシンＢ、Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ（Ｇｌｕｃ）、Ｍｅｔｒｉｄｉａルシフェラーゼ（ＭＬｕｃ）、これらのサブユニット、これらの断片、およびこれらの任意の２またはそれを超える組み合わせから選択される、請求項９２～１０１のいずれか一項に記載の遺伝子操作された微生物。

【請求項103】

前記分泌可能なバイオマーカーが分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）である、請求項１０２に記載の遺伝子操作された微生物。

【請求項104】

前記分泌可能なバイオマーカーが、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、またはそのサブユニットもしくはその断片である、請求項１０２に記載の遺伝子操作された微生物。

【請求項105】

前記分泌可能なバイオマーカーがルシフェラーゼである、請求項１０２に記載の遺伝子操作された微生物。

【請求項106】

前記分泌可能なバイオマーカーが、ルシフェラーゼＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼ（Ｇｌｕｃ）またはその誘導体である、請求項１０５に記載の遺伝子操作された微生物。

【請求項107】

前記分泌可能なバイオマーカーをコードする前記遺伝子が少なくとも１つのイントロンを含む、請求項９２～１０６のいずれか一項に記載の遺伝子操作された微生物。

【請求項108】

前記微生物が、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉから選択される、請求項９２～１０７のいずれか一項に記載の遺伝子操作された微生物。

【請求項109】

前記微生物が、プロバイオティックＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ株またはその誘導体である、請求項１０８に記載の遺伝子操作された微生物。

【請求項110】

前記微生物が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ １９１７またはその誘導体である、請求項１０９に記載の遺伝子操作された微生物。

【請求項111】

前記Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ １９１７または前記その誘導体が、プラスミドｐＭＵＴ１および／もしくはプラスミドｐＭＵＴ２ならびに／またはこれらの誘導体を保有する、請求項１１０に記載の遺伝子操作された微生物。

【請求項112】

前記Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ １９１７または前記その誘導体が、前記プラスミドｐＭＵＴ１および／または前記プラスミドｐＭＵＴ２をキュアリングされている、請求項１１０に記載の遺伝子操作された微生物。

【請求項113】

前記表面タンパク質が、がん性細胞および／または前がん性細胞の表面に特異的に結合するペプチドまたはタンパク質を含む、請求項９２～１１２のいずれか一項に記載の遺伝子操作された微生物。

【請求項114】

前記表面タンパク質が、インベイシンまたはその断片である、請求項１１３に記載の遺伝子操作された微生物。

【請求項115】

前記インベイシンが、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａインベイシン、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓインベイシン、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ＰａｇＮ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ Ａｌｓ３およびＥ．ｃｏｌｉインチミンから選択される、請求項１１４に記載の遺伝子操作された微生物。

【請求項116】

前記ペプチドまたはタンパク質が、レプチン、抗体、またはこれらの断片から選択される、請求項１１３に記載の遺伝子操作された微生物。

【請求項117】

前記抗体またはその断片が、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）およびｓｃＦｖ断片から選択される、請求項１１６に記載の遺伝子操作された微生物。

【請求項118】

前記ペプチドまたはタンパク質が微生物の表面タンパク質上に提示される、請求項１１７に記載の遺伝子操作された微生物。

【請求項119】

前記ペプチドまたはタンパク質が、前記微生物の表面タンパク質との融合タンパク質として発現される、請求項１１８に記載の遺伝子操作された微生物。

【請求項120】

前記微生物の表面タンパク質が、インベイシン、インチミンおよびアドヘシンから選択される、請求項１１９に記載の遺伝子操作された微生物。

【請求項121】

前記微生物が、エンドサイトーシス液胞を溶解する溶解素をコードする外因性遺伝子をさらに含む、請求項９２～１２０のいずれか一項に記載の遺伝子操作された微生物。

【請求項122】

前記溶解素が、リステリオリシンＯまたはその変異体誘導体である、請求項１２１に記載の遺伝子操作された微生物。

【請求項123】

前記表面タンパク質をコードする前記遺伝子および／または前記溶解素をコードする前記遺伝子が、前記微生物のゲノムに組み込まれている、請求項１２１または請求項１２２に記載の遺伝子操作された微生物。

【請求項124】

前記表面タンパク質をコードする前記遺伝子および前記溶解素をコードする前記遺伝子が、単一のゲノム部位に組み込まれている、請求項１２１～１２３のいずれか一項に記載の遺伝子操作された微生物。

【請求項125】

前記単一のゲノム部位が、バクテリオファージの組み込み部位またはプラスミドの組み込み部位である、請求項１２４に記載の遺伝子操作された微生物。

【請求項126】

前記表面タンパク質をコードする前記遺伝子および／または前記溶解素をコードする前記遺伝子が、プラスミドに挿入されている、請求項１２１～１２３のいずれか一項に記載の遺伝子操作された微生物。

【請求項127】

前記分泌可能なバイオマーカーをコードする前記遺伝子が前記プラスミドに挿入されている、請求項１２６に記載の遺伝子操作された微生物。

【請求項128】

前記分泌可能なバイオマーカーをコードする前記遺伝子が前記微生物のゲノムに組み込まれており、必要に応じて、前記分泌可能なバイオマーカーをコードする前記遺伝子が前記単一のゲノム部位に組み込まれている、請求項９２～１２６のいずれか一項に記載の遺伝子操作された微生物。

【請求項129】

前記分泌可能なバイオマーカーをコードする前記遺伝子が、第２のプラスミドに挿入されている、請求項９２～１２６のいずれか一項に記載の遺伝子操作された微生物。

【請求項130】

前記プラスミドおよび／または前記第２のプラスミドが選択機構を含む、請求項１２５～１２９のいずれか一項に記載の遺伝子操作された微生物。

【請求項131】

前記選択機構が、抗生物質耐性マーカー、毒素－抗毒素系、必須遺伝子における変異の相補性を引き起こすマーカー、シス作用遺伝要素、およびこれらの任意の２またはそれを超える組み合わせから選択される、請求項１３０に記載の遺伝子操作された微生物。

【請求項132】

前記選択機構が、カナマイシン耐性遺伝子およびテトラサイクリン耐性遺伝子から選択される抗生物質耐性マーカーである、請求項１３０に記載の遺伝子操作された微生物。

【請求項133】

前記選択機構が、プラスミドＲ１のｈｏｋ／ｓｏｋ系、プラスミドＲＫ２のｐａｒＤＥ系、ＦプラスミドのｃｃｄＡＢ、ＦプラスミドのｆｌｍＡＢ、プラスミドＲ１のｋｉｓ／ｋｉｄ系、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓのＸＣＶ２１６２－ｐｔａＲＮＡ１、腸管出血性Ｅ．ｃｏｌｉまたはＫｌｅｂｓｉｅｌｌａのａｔａＴ－ａｔａＲ、Ｅｒｗｉｎｉａ ｃａｒｏｔｏｖｏｒａのｔｏｘＩＮ系、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓのｐａｒＥ－ｐａｒＤ系、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓプラスミドＡＤ１からのｆｓｔ－ＲＮＡＩＩ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓプラスミドｐＳＭ１９０３５のε－ζ系およびこれらの任意の２またはそれを超える組み合わせから選択される毒素－抗毒素系である、請求項１３０に記載の遺伝子操作された微生物。

【請求項134】

前記選択機構が、必須遺伝子における変異の相補性を引き起こすマーカーであり、前記必須遺伝子は、
必須栄養素もしくは細胞壁成分の生合成に関与する酵素；および／または
ハウスキーピング機能
をコードする、請求項１３０に記載の遺伝子操作された微生物。

【請求項135】

前記必須遺伝子が、ｄａｐＡ、ｄａｐＤ、ｍｕｒＡ、ａｌｒ、ｄａｄＸ、ｍｕｒＩ、ｄａｐＥ、ｔｈｙＡおよびこれらの任意の２またはそれを超える組み合わせから選択され、必要に応じて、前記必須遺伝子がａｌｒおよびｄａｄＸであり、必要に応じて、前記遺伝子操作された微生物がａｌｒおよびｄａｄＸの不活性化を有し、ならびに前記選択機構が、前記ａｌｒおよびｄａｄＸの不活性化を補完するためのａｌｒ遺伝子を有するプラスミドである、請求項１３４に記載の遺伝子操作された微生物。

【請求項136】

前記必須遺伝子が、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｉｎｆＡ、ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、細胞分裂タンパク質またはシャペロンタンパク質のサブユニットをコードする遺伝子、およびこれらの任意の２またはそれを超える組み合わせから選択されるハウスキーピング機能をコードする、請求項１２１に記載の遺伝子操作された微生物。

【請求項137】

前記必須遺伝子が、ＣｏｌＥ１ ｃｅｒ遺伝子座またはｐＳＣ１０１ ｐａｒ遺伝子座から選択されるシス作用遺伝要素である、請求項１１８に記載の遺伝子操作された微生物。

【請求項138】

前記微生物が、ｄａｐＡ、ｄａｐＤ、ｄａｐＥ、ｍｕｒＡ、ａｌｒ、ｄａｄＸ、ｍｕｒＩ、ｔｈｙＡおよびａｒｏＣの１つまたはそれより多くの欠失、不活性化または低下した発現もしくは活性から選択される少なくとも１つの変異を有し、前記微生物が、必要に応じて、ｄａｐＡ、ａｌｒおよびｄａｄＸの（ｏｒ）欠失または不活性化を含む、請求項９２～１３７のいずれか一項に記載の遺伝子操作された微生物。

【請求項139】

前記プラスミドまたは前記第２のプラスミドが、ＤＮＡ結合タンパク質に対する少なくとも１つの結合部位を含む、請求項１２９～１３８のいずれか一項に記載の遺伝子操作された微生物。

【請求項140】

前記ＤＮＡ結合タンパク質が、１またはそれを超える核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む、請求項１３９に記載の遺伝子操作された微生物。

【請求項141】

前記ＮＬＳがＳＶ４０ Ｔ抗原ＮＬＳ配列（ＫＫＫＲＫＶ）である、請求項１４０に記載の遺伝子操作された微生物。

【請求項142】

前記微生物が、前記ＤＮＡ結合タンパク質をコードする遺伝子を含む、請求項１３９～１４１のいずれか一項に記載のいずれか一項に記載の遺伝子操作された微生物。

【請求項143】

前記ＤＮＡ結合タンパク質がＮＦκＢである、請求項１３９～１４２のいずれか一項に記載の遺伝子操作された微生物。

【請求項144】

前記微生物が、前記ＤＮＡ結合タンパク質をコードする遺伝子を含む、請求項１３９～１４３のいずれか一項に記載の遺伝子操作された微生物。

【請求項145】

対象における疾患を診断および／または処置する方法であって、
（ｉ）請求項９２～１４４のいずれか一項に記載の遺伝子操作された微生物を前記対象の消化管に投与することと；
（ｉｉ）前記対象から生物学的試料を得ることと；
（ｉｉｉ）前記生物学的試料中の前記分泌可能なバイオマーカーを測定し、それにより、疾患上皮細胞を検出することと
を含み、
必要に応じて、前記方法は、前記対象に処置を施すことをさらに含む、方法。

【請求項146】

（ｉｖ）前記分泌可能なバイオマーカーの発現が観察された場合、処置のために前記対象を選択することをさらに含む、請求項１４５に記載の方法。

【請求項147】

前記疾患が、前がん性病変、がん、潰瘍性大腸炎、クローン病、バレット食道、過敏性腸症候群および過敏性腸疾患から選択される、請求項１４５または請求項１４６に記載の方法。

【請求項148】

前記前がん性病変が、
無茎性ポリープ、鋸歯状ポリープ、過形成性ポリープ、無茎性鋸歯状腺腫／ポリープ、古典的鋸歯状腺腫、無茎性鋸歯状ポリープ、平坦型ポリープ、亜有茎性ポリープ、有茎性ポリープおよびこれらの組み合わせから選択されるポリープ；
ＢｉｌＩＮ－１、ＢｉｌＩＮ－２、ＢｉｌＩＮ－３および胆管癌から選択される胆管上皮内新生物（ＢｉｌＩＮ）；ならびに／または
ＰａｎＩＮ－１、ＰａｎＩＮ－２、ＰａｎＩＮ－３および膵管腺癌（ＰＤＡＣ）から選択される膵臓上皮内新生物（ＰａｎＩＮ）を含む、請求項１４７に記載の方法。

【請求項149】

前記ポリープが微小ポリープである、請求項１４８に記載の方法。

【請求項150】

前記前がん性病変が約０．０５ｍｍ～約３０ｍｍのサイズを有する、請求項１４８に記載の方法。

【請求項151】

前記前がん性病変が、約０．１ｍｍ未満、約０．２５ｍｍ未満、約０．５ｍｍ未満、約１ｍｍ未満、約２ｍｍ未満、約５ｍｍ未満、約８ｍｍ未満、約１０ｍｍ未満、約１５ｍｍ未満、約２０ｍｍ未満、約２５ｍｍ未満または約３０ｍｍ未満のサイズを有する、請求項１５０に記載の方法。

【請求項152】

前記がんが、ポリープ、腺腫または明白ながんを含む、請求項１４７に記載の方法。

【請求項153】

前記がんが、リンチ症候群がん、家族性腺腫性ポリポーシス、遺伝性非ポリポーシス結腸がん（ＨＮＰＣＣ）、胆管癌、膵管腺癌（ＰＤＡＣ）または散発性がんを含む、請求項１４７に記載の方法。

【請求項154】

前記がんが、肛門の扁平上皮癌、肛門の低悪性度扁平上皮内病変（ＬＳＩＬ）、肛門の高悪性度扁平上皮内病変（ＨＳＩＬ）、結腸直腸がん、結腸直腸腺癌、家族性腺腫性ポリポーシス、遺伝性非ポリポーシス結腸直腸がん、結腸直腸ポリポーシス（例えば、ポイツ・ジェガース症候群、若年性ポリポーシス症候群、ＭＵＴＹＨ関連ポリポーシス、家族性腺腫性ポリポーシス／ガードナー症候群、クロンカイト・カナダ症候群）、カルチノイド、腹膜偽粘液腫、十二指腸腺癌、小腸の前悪性腺腫、遠位胆管癌、胆管上皮内新生物（ＢｉｌＩＮ）、ＢｉｌＩＮ－１、ＢｉｌＩＮ－２、ＢｉｌＩＮ－３または胆管癌、膵管腺癌（ＰＤＡＣ）、膵臓上皮内新生物（ＰａｎＩＮ）、ＰａｎＩＮ－１、ＰａｎＩＮ－２、ＰａｎＩＮ－３、胃癌、印環細胞癌（ＳＲＣＣ）、胃リンパ腫（ＭＡＬＴリンパ腫）、形成性胃組織炎（ブリントン病）、および食道の扁平上皮癌および腺癌から選択される、請求項１４７に記載の方法。

【請求項155】

対象におけるがんを処置するための方法であって、
（ｉ）請求項９２～１４４のいずれか一項に記載の遺伝子操作された微生物を前記対象の消化管に投与することと；
（ｉｉ）前記対象から生物学的試料を得ることと；
（ｉｉｉ）前記生物学的試料中の前記分泌可能なバイオマーカーを測定し、それにより、前記疾患上皮細胞を検出することと；
（ｉｖ）前記分泌可能なバイオマーカーの発現が観察された場合、処置を施すことと
を含む、方法。

【請求項156】

前記対象が、ポリープおよび／またはがんを発症しやすい、請求項１４５～１５５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項157】

前記対象が、リンチ症候群、遺伝性非ポリポーシス結腸がん（ＨＮＰＣＣ）、家族性腺腫性ポリポーシス（ＦＡＰ）、ガードナー症候群、ターコット症候群、ＭＵＴＹＨ関連ポリポーシス、ポイツ・ジェガース症候群および若年性ポリポーシス症候群および大腸炎関連結腸直腸がん（ＣＡＣＣ）から選択される状態に罹患している、請求項１５６に記載の方法。

【請求項158】

前記対象がリンチ症候群を有する、請求項１５７に記載の方法。

【請求項159】

前記処置が、結腸鏡検査、内視鏡検査、手術ならびに化学療法剤、細胞傷害剤、免疫チェックポイント阻害剤、免疫抑制剤、サルファ剤、コルチコステロイド、抗生物質およびこれらの任意の２またはそれを超える組み合わせからなる群から選択される治療剤の投与から選択される、請求項１４５～１５８のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

技術分野
本発明は、とりわけ、操作された微生物およびその使用に関する。

【背景技術】

【0002】

背景
消化管（ＧＩ管）は食物を摂取し、食物を消化してエネルギーおよび栄養素を抽出および吸収し、残りの老廃物を糞便として排出する。消化器疾患（ＧＩ疾患）は、口、食道、胃および小腸、大腸および直腸を含む消化管を形成する器官が関与する疾患である。ＧＩ疾患には、バレット食道、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、クローン病、潰瘍性大腸炎および前がん性症候群、およびがんが含まれる。

【0003】

ＧＩ疾患の診断は、症状および病歴から始まる。内視鏡検査、結腸鏡検査およびコンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャンのような技術は、ＧＩ管の管腔の観察を容易にすることによって診断を補助する。例えば、ＣＴスキャンでの限局性、不規則的および非対称性の消化管壁の肥厚は、悪性腫瘍を示唆する。分節性またはびまん性の消化管壁の肥厚は、虚血性、炎症性または感染性疾患を示し得る。しかしながら、内視鏡検査、結腸鏡検査などは侵襲的な手技であり、患者にとって、特にＧＩ管のがんのリスクが高い患者にとって不快である。より侵襲性の低いモニタリング技術が望ましい。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0004】

概要
したがって、様々な局面において、本発明は、胃腸（ＧＩ）組織または胃腸組織とつながっている管の上皮（例えば、胆管、膵管および総胆管を裏打ちする上皮組織）などの疾患上皮組織を検出するのに有用な組成物および方法を提供する。本発明の一局面は、胃腸（ＧＩ）組織および胃腸組織とつながっている管の上皮（例えば、胆管、膵管および総胆管を裏打ちする上皮組織）などの疾患上皮組織を検出するための方法に関する。様々な実施形態において、本方法は、体液または排泄された試料中のバイオマーカーの存在によって疾患組織の存在を検出することを可能にし、これにより、結腸鏡検査などのより侵襲的な技術の使用を回避することができる。これらの実施形態は、疾患モニタリングを補助するために、消化管のがん性病変を発症する遺伝的素因を有する個体にとって特に有利である。様々な実施形態において、本方法は、分泌可能なバイオマーカーの発現を疾患細胞（diseased cell）において特異的に指示する遺伝子操作された微生物を、投与することを必要とする対象の消化管に投与することを含む。いくつかの実施形態において、分泌可能なバイオマーカーは、疾患細胞によって分泌される。いくつかの実施形態において、分泌可能なバイオマーカーは、尿および唾液などの体液中に排泄される。したがって、分泌可能なバイオマーカーは、血液、血清、血漿、唾液または尿の試料から検出または測定され得る。したがって、本方法は、対象から生物学的試料を得ることと、生物学的試料中の分泌可能なバイオマーカーを測定し、それにより、疾患上皮細胞の存在を検出することとをさらに含む。

【0005】

様々な実施形態において、遺伝子操作された微生物は、疾患胃腸上皮細胞に特異的に存在する（すなわち、非疾患胃腸上皮細胞と比較して）１またはそれを超える細胞膜受容体と特異的に相互作用する発現された表面タンパク質を通じて、疾患上皮細胞と特異的に相互作用する。例えば、細胞膜受容体は、正常な胃腸組織の上皮細胞の管腔側に露出していなくてもよいが、疾患に罹患している対象中の胃腸組織の疾患上皮細胞の管腔側に露出している。表面タンパク質は、これにより、疾患上皮細胞における微生物の結合および侵入を促進する。様々な実施形態において、微生物は、プロモーターに作動可能に連結された分泌可能なバイオマーカーをコードする遺伝子を含む。それにより、様々な実施形態において、微生物は、疾患上皮細胞に核酸（例えば、ＤＮＡまたはｍＲＮＡ分子）またはタンパク質を送達する。様々な実施形態において、疾患上皮細胞は、分泌可能なバイオマーカーを分泌し、それにより、生体液（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｌｕｉｄ）試料の簡単な評価による疾患上皮細胞の簡便な検出を可能にする。様々な実施形態において、分泌可能なバイオマーカーは分泌タンパク質である。いくつかの実施形態において、分泌可能なバイオマーカーは、生体液中に排泄される。いくつかの実施形態において、生体液は、粘液、唾液および／または尿から選択される。いくつかの実施形態において、分泌可能なバイオマーカーは、血液または糞便試料中で検出される。

【0006】

様々な実施形態において、（例えば、消化管の）疾患上皮組織の検出は、対象から得られた生物学的試料中の分泌可能なバイオマーカーを測定することを含む。本明細書中に開示される実施形態のいずれにおいても、検出は、酵素試験またはイムノアッセイを使用して実施され得る。

【0007】

様々な実施形態において、遺伝子操作された微生物は、経口または直腸経路を介して投与される。様々な実施形態において、必要に応じて、結腸洗浄剤（ｃｏｌｏｎ ｃｌｅａｎｓｉｎｇ ａｇｅｎｔ）が、微生物の投与前および／または投与後に投与され得る。様々な実施形態において、本明細書に開示される方法は、前がん性病変、がん、またはリンチ症候群、潰瘍性大腸炎、クローン病、バレット食道、過敏性腸症候群および／もしくは過敏性腸疾患によって引き起こされる病変から選択される疾患胃腸（ＧＩ）組織を検出する。様々な実施形態において、遺伝子操作された微生物は、経口または直腸経路を介して投与される。様々な実施形態において、必要に応じて、結腸洗浄剤が、微生物の投与前および／または投与後に投与され得る。

【0008】

様々な実施形態において、対象は、ポリープおよび／またはがん（限定されないが、例えば、結腸直腸がん、膵管腺癌または胆管癌）を発症しやすい。いくつかの実施形態において、対象は、リンチ症候群、遺伝性非ポリポーシス結腸がん（ＨＮＰＣＣ）、家族性腺腫性ポリポーシス（ＦＡＰ）、ガードナー症候群、ターコット症候群、ＭＵＴＹＨ関連ポリポーシス、ポイツ・ジェガース症候群および若年性ポリポーシス症候群および大腸炎関連結腸直腸がん（ＣＡＣＣ）から選択される状態に罹患している。

【0009】

本発明の一局面は、遺伝子操作された微生物に関する。微生物は、胃腸組織の疾患上皮細胞の管腔側に露出している１またはそれを超える細胞膜受容体を介して疾患上皮細胞と特異的に相互作用する表面タンパク質をコードする遺伝子を含む。１またはそれを超える細胞膜受容体は、正常な胃腸組織の上皮細胞の管腔側で発現されず、したがって胃腸組織の疾患細胞または異常細胞に対する特異性を微生物に付与する。表面タンパク質は、疾患胃腸組織の上皮細胞の侵入を特異的に促進する。

【0010】

様々な実施形態において、微生物は非病原性である。様々な実施形態において、微生物は、少なくとも１つの栄養要求性変異を有する。様々な実施形態において、少なくとも１つの栄養要求性変異は、微生物の選択および封じ込めを可能にし、侵入に際して疾患哺乳動物細胞の内側での微生物の溶解も促進する。例示的な栄養要求性変異には、細胞壁合成のために必要とされる代謝産物の合成に関与する１またはそれを超える遺伝子の欠失、不活性化、または低下した活性もしくは発現が含まれる。細胞壁合成に関与する例示的な代謝産物としては、Ｄ－アラニンおよびジアミノピメリン酸が挙げられる。様々な実施形態において、微生物は、ファゴソームの溶解を引き起こす溶解素をコードする遺伝子をさらに含む。

【0011】

様々な実施形態において、微生物は、プロモーターに作動可能に連結された分泌可能なバイオマーカー（哺乳動物細胞によって分泌可能）をコードする遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、分泌可能なバイオマーカーは哺乳動物プロモーターから発現される。いくつかの実施形態において、哺乳動物プロモーターは、上皮発現またはＧＩ管上皮細胞特異的発現および／または胃腸組織とつながっている管の上皮（例えば、胆管、膵管および総胆管を裏打ちする上皮組織）における特異的発現に対して活性であるか、または特異的である。これらの実施形態において、微生物は、ＤＮＡ分子（例えば、プラスミド）を疾患上皮細胞に送達する。プラスミドは、単一コピープラスミドであり得、またはいくつかの実施形態においてマルチコピープラスミド（例えば、高コピー数プラスミド）であり得る。これらの実施形態において、ＤＮＡ分子は、必要に応じて、ＤＮＡ結合タンパク質のための少なくとも１つの結合部位を含む。これらの実施形態において、ＤＮＡ分子は、必要に応じて、外因性ＤＮＡ結合タンパク質のための少なくとも１つの結合部位を含む。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ結合タンパク質は、１またはそれを超える核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含み、したがって、疾患上皮細胞におけるＤＮＡ分子（例えば、プラスミド）の核移行を可能にする。これらの実施形態において、疾患上皮細胞は、微生物によって送達されたＤＮＡ分子（例えば、プラスミド）から分泌可能なバイオマーカーを発現し、それによって分泌可能なバイオマーカーの検出を可能にする。

【0012】

代替の実施形態において、分泌可能なバイオマーカーは、例えばＴ７またはＴ３プロモーターを含む微生物プロモーターから発現される。このような実施形態において、微生物は、Ｔ７またはＴ３ ＲＮＡポリメラーゼの遺伝子をさらに含み、発現する。他の適切な微生物プロモーターは、本明細書にさらに記載されており、当技術分野で公知である。これらの実施形態において、分泌可能なバイオマーカーをコードする遺伝子は、哺乳動物細胞内での翻訳のために構築される。いくつかの実施形態において、分泌可能なバイオマーカーをコードする遺伝子は、配列内リボソーム進入部位を含む。これらの実施形態において、微生物は、哺乳動物細胞内で翻訳されるｍＲＮＡ分子を疾患上皮細胞に送達する。これらの実施形態において、疾患上皮細胞は、微生物によって送達されたｍＲＮＡ分子から分泌可能なバイオマーカーを発現し、それにより、疾患上皮細胞の簡便な検出を可能にする。

【0013】

代替の実施形態において、プロモーターは微生物プロモーターであり、発現されたｍＲＮＡは細菌細胞内で翻訳される。これらの実施形態において、少なくとも１つの検出マーカーをコードする１またはそれを超える遺伝子は、哺乳動物の細胞質にのみ見出される代謝産物と接触すると蛍光性になるタンパク質を必要に応じてさらに含む。これらの実施形態において、微生物は、タンパク質分子を産生し、疾患上皮細胞に送達する。これらの実施形態において、疾患上皮細胞はタンパク質を産生しないが、代わりに、微生物によって産生されたタンパク質が哺乳動物細胞質にのみ見出される代謝産物に遭遇すると蛍光性になる。

【0014】

様々な実施形態において、分泌可能なバイオマーカーは、酵素、ペプチドホルモン、またはペプチドもしくはタンパク質抗原から選択される分泌タンパク質である。例としては、アルカリホスファターゼ、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、結腸がん分泌タンパク質２、カテプシンＢ、Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ（Ｇｌｕｃ）、Ｍｅｔｒｉｄｉａルシフェラーゼ（ＭＬｕｃ）、これらのサブユニット、これらの断片、およびこれらの任意の２またはそれを超える組み合わせが挙げられる。

【0015】

様々な実施形態において、微生物は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉから選択される。いくつかの実施形態において、微生物はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉである。例示的なＥ．ｃｏｌｉ株は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ １９１７またはその誘導体である。

【0016】

様々な実施形態において、分泌可能なバイオマーカーをコードする遺伝子は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ １９１７由来の天然の内因性プラスミド（すなわち、ｐＭＵＴ１、ｐＭＵＴ２および／またはそれらの誘導体）に挿入され得る。いくつかの実施形態において、プラスミドは選択機構を含む。いくつかの実施形態において、選択機構は、プラスミド維持のために抗生物質を必要としなくてよい。したがって、いくつかの実施形態において、選択機構は、抗生物質耐性マーカー、毒素－抗毒素系、必須遺伝子における変異の相補性を引き起こすマーカー、シス作用遺伝要素、およびこれらの任意の２またはそれを超える組み合わせから選択される。いくつかの実施形態において、分泌可能なマーカーをコードする遺伝子を運ぶプラスミドは、細胞壁合成のために必要とされる代謝産物の合成に関与する遺伝子を欠失または不活性化する栄養要求性変異などの栄養要求性変異を相補する。

【0017】

本発明の一局面は、対象における疾患を診断する方法であって、（ｉ）対象の関心対象の標的上皮細胞（消化管の上皮細胞など）に本明細書に開示されている遺伝子操作された微生物を投与することと、（ｉｉ）分泌可能なバイオマーカーの発現を検出し、それにより疾患上皮細胞の存在を検出することとを含む、方法に関する。

【0018】

本発明の一局面は、対象における疾患を診断および／または処置する方法であって、（ｉ）対象の標的上皮細胞（消化管の上皮細胞など）に本明細書に開示されている任意の実施形態の遺伝子操作された微生物を投与することと、（ｉｉ）対象から生物学的試料を得ることと、（ｉｉｉ）生物学的試料中の分泌可能なバイオマーカーを測定し、それにより、疾患上皮細胞の存在を検出することとを含む、方法に関する。疾患上皮細胞が検出される場合、この方法は、対象に処置を施すこと、ならびに／または疾患組織の位置を特定し、疾患組織を評価し、および／もしくは疾患組織を除去するために結腸鏡検査を行うことをさらに含み得る。

【0019】

本発明の一局面は、処置のために疾患に罹患しているかまたは罹患している疑いがある対象を選択する方法であって、（ｉ）対象の標的上皮細胞（消化管の上皮細胞など）に本明細書に開示されている任意の実施形態の遺伝子操作された微生物を投与することと、（ｉｉ）対象から生物学的試料を得ることと、（ｉｉｉ）生物学的試料中の分泌可能なバイオマーカーを測定し、それにより、疾患上皮細胞の存在を検出することと、（ｉｖ）分泌可能なバイオマーカーの発現が観察された場合に、処置のために対象を選択することとを含む、方法に関する。いくつかの実施形態において、処置は、必要に応じてポリープまたは病変切除を伴う結腸鏡検査を含む。いくつかの実施形態において、処置は、これに代えてまたはこれに加えて、化学療法、放射線療法、または免疫療法を含む。

【0020】

本発明の一局面は、患者におけるがんを処置するための方法であって、（ｉ）対象の標的上皮細胞（消化管の上皮細胞など）に本明細書に開示されている任意の実施形態の遺伝子操作された微生物を投与することと、（ｉｉ）分泌可能なバイオマーカーの発現を検出し、それにより、疾患上皮細胞の存在を検出することと、（ｉｉｉ）分泌可能なバイオマーカーの発現が観察された場合に、処置を施すこととを含む、方法に関する。様々な局面および実施形態において、処置は、手術または化学療法剤、細胞傷害剤、免疫チェックポイント阻害剤、免疫抑制剤、サルファ剤、コルチコステロイド、抗生物質およびこれらの任意の２もしくはそれを超える組み合わせからなる群から選択される治療剤の投与である。

【0021】

本発明の他の局面は、上記局面の方法において使用するための本明細書に開示される任意の実施形態の遺伝子操作された微生物を提供する。

【0022】

本明細書に開示されている任意の局面または実施形態は、本明細書に開示されている任意の他の局面または実施形態と組み合わせることができる。

【図面の簡単な説明】

【0023】

【図1】図１は、ＧＩ管上皮の疾患細胞の模式的表示を示す。基底外側および管腔側が示されている。中央の細胞は、管腔側に提示された誤った場所に局在化した受容体を示す疾患細胞である。他の疾患細胞は、誤った場所に局在化したおよび／または新規な哺乳動物膜受容体を有し得る。新規な受容体は、その細胞に通常見られない受容体または転座およびその他のゲノム再編成によって形成される受容体であり得る。

【図2】図２は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ １９１７（ＥｃＮ）株の模式的表示を示す。この株は、遺伝子操作された細菌を産生するのに有用な例示的な株である。染色体ならびに天然に存在するプラスミドｐＭＵＴ１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＭＷ２４０７１２）および／またはプラスミドｐＭＵＴ２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＰ０２３３４２）が異なるサイズの円によって表されている。

【図3】図３は、１またはそれを超える栄養要求性変異（Ｘによって示される）を有する遺伝子操作されたＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ １９１７（ＥｃＮ）株の基本株の一実施形態の模式的表示を示す。例示的な栄養要求性変異としては、ｄａｐＡΔ、ａｌｒΔおよびｄａｄＸΔが挙げられる。このような変異は、細菌細胞が体内または環境で増殖するのを防ぎ、それによって遺伝子操作された細菌の封じ込めを補助する。

【図4】図４Ａおよび図４Ｂは、ｄａｐＡΔ、ａｌｒΔ、ｄａｄＸΔ栄養要求性変異を有する遺伝子操作されたＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ １９１７（ＥｃＮ）株の成長要件および成長特性を示す。アラニンラセマーゼをコードする遺伝子であるａｌｒおよびｄａｄＸの二重欠失は、Ｄ－アラニン栄養要求性をもたらす。ｄａｐＡの欠失は、ジアミノピメリン酸に対する栄養要求性をもたらす。図４Ａのグラフは、Ｄ－アラニンおよびジアミノピメリン酸の両方を成長培地に添加した場合にのみこの株が成長することを実証している。図４Ｂのグラフは、Ｄ－アラニンおよびジアミノピメリン酸を培地に添加すると、この株が野生型株と同様に成長することを実証している。

【図5】図５は、表面タンパク質をコードする遺伝子およびゲノムに組み込まれたリステリオリシンＯを有する遺伝子操作された細菌Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ １９１７（ＥｃＮ）株の一実施形態の模式的表示を示す。例示的な表面タンパク質は、インベイシン（配列番号１）および細菌の足場上に発現されるナノボディ／受容体結合ペプチドである。リステリオリシンＯ（配列番号２）が発現され、エンドソームからの脱出が可能になる。

【図6】図６は、１またはそれを超える栄養要求性変異（Ｘによって示される）を有し、ゲノムに組み込まれた表面タンパク質およびリステリオリシンＯをコードする遺伝子をさらに有する遺伝子操作されたＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ １９１７（ＥｃＮ）誘導体の一実施形態の模式的表示を示す。この株はプラスミドｐＭＵＴ１を含有しない。

【図7】図７Ａおよび図７Ｂは、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ １９１７（ＥｃＮ）からの潜在プラスミドのキュアリングの結果を示す。図７Ａは、ｐＭｕｔ１、次いでｐＭｕｔ２の逐次キュアリングを示すアガロースゲルを示す。野生型Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ １９１７（ＥｃＮ）をキュアリングプラスミドで形質転換し、５ｍｇ／ｍｌアンピシリンの存在下で継代した。野生型Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ １９１７（ＥｃＮ）（レーンＡ）、ｐＭＵＴ１がキュアリングされたＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ １９１７（ＥｃＮ）（レーンＢ）ならびにｐＭＵＴ１およびｐＭＵＴ２がキュアリングされたＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ １９１７（ＥｃＮ）（レーンＣ）からのプラスミド調製物 図７Ｂは、最終株におけるｐＭＵＴ１およびｐＭＵＴ２のキュアリングを確認する定量的ＰＣＲの結果を示す。ｑＰＣＲは、ｒｐｏＡ（染色体マーカー）、ｐＭＵＴ１およびｐＭＵＴ２に対して特異的なプライマーを用いて行われ、増幅が設定された閾値を超えたサイクル数の逆数（Ｃｑ^－１）が示されている。データラベルは図７Ａと同様である。

【図8】図８は、本開示の遺伝子操作された細菌の非限定的な実施形態の模式的表示を示す。この株は、１またはそれを超える栄養要求性変異（Ｘによって示される）を有し、ゲノムに組み込まれた表面タンパク質およびリステリオリシンＯをコードする遺伝子をさらに有するＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ １９１７（ＥｃＮ）誘導体である。この株はプラスミドｐＭＵＴ１を含有しないが、選択機構として栄養要求性変異の少なくとも１つの相補性（例えば、プラスミド媒介性ａｌｒ遺伝子によるａｌｒおよびｄａｄＸの相補性）を用いて選択される、ｐＭＵＴ１ベースの誘導体であるプラスミドｐＳＲＸを含有する。プラスミドｐＳＲＸは、本明細書においてＧＦＰによって例示される検出マーカーも保有する。

【図9A】図９Ａ～図９Ｄは、理論に束縛されるものではないが、疾患胃腸（ＧＩ）組織を検出するための方法の模式的表示を示す。図９Ａは、ＧＩ管の管腔側に提示された誤った場所に局在化した受容体を示す、疾患上皮細胞（中央の細胞によって表される）への遺伝子操作された細菌の特異的結合を示す。このような結合は、遺伝子操作された細菌の、疾患上皮細胞（中央の細胞によって表される）における内部移行をもたらす。図９Ｂは、弱毒変異による細菌の溶解、およびＬＬＯの作用を通じたファゴソームの溶解を示す。図９Ｃは、遺伝子操作された細菌の溶解の際の、分泌可能なバイオマーカーを有するプラスミドの核局在化を示す。図９Ｄは、ＧＩ管の疾患上皮細胞（中央の細胞によって表される）による分泌可能なバイオマーカーの発現を示す。

【図9B-C】同上。

【図9D】同上。

【図10】図１０は、インビトロでＳＷ４８０結腸直腸がん細胞に侵入した後に細菌細胞によって発現される検出マーカー（ＧＦＰ）の発現を示す。ＳＷ４８０（結腸直腸がん由来細胞株）と１時間共インキュベートし、続いて細胞外細菌を洗い流した後の、インベイシン遺伝子なし（上のパネル）またはあり（下のパネル）のｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ（緑色蛍光タンパク質）を含有する細菌株。ＳＷ４８０細胞を蛍光顕微鏡法によって可視化し（左パネル）、プレートから取り除き、次いで、フローサイトメトリーによって分析して（右パネル）、細菌株による侵入が成功したＳＷ４８０細胞の一部を同定した。

【図11A-B】図１１Ａ～図１１Ｃは、本明細書に開示される疾患細胞に対する非侵襲性試験の模式的表示を示す。図１１Ａは、理論に束縛されるものではないが、ＤＮＡペイロードの送達機構を示す。図１１Ｂ（左パネル）は、遺伝子操作された細菌（限定されないが、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ １９１７）によって送達されたＤＮＡペイロードを有する標的がん細胞を示す。中央のパネルは、ＤＮＡペイロードによってコードされる検出マーカーの発現および分泌を示す。右パネルは、検出マーカーを有する血管を表す。いくつかの実施形態において、検出マーカーは尿中に分泌される。図１１Ｃは、検出マーカーが簡易な血液検査または尿検査で検出され得ることを示す。

【図11C】同上。

【図12A-B】図１２Ａ～図１２Ｄは、Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ（Ｇｌｕｃ）検出マーカーを使用する疾患細胞のインビトロ検出を実証する。図１２Ａは、哺乳動物プロモーター（配列番号３）の制御下にあるＧｌｕｃ遺伝子を有するプラスミドの構成を示す。プラスミドは、リステリオリシンＯ（溶解素）と選択マーカー、例えば、Ａｍｐ^Ｒまたはａｌｒをコードする遺伝子を有する。図１２Ｂは、図１２ＡのＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ １９１７をベースとした操作された細菌と接触させた細胞によるがんＧｌｕｃの発現を示す。図１２Ｃは、哺乳動物プロモーター（配列番号４）の制御下にあるイントロンを有するＧｌｕｃ遺伝子を有するプラスミドの構成を示す。プラスミドは、リステリオリシンＯ（溶解素）と選択マーカー、例えば、Ａｍｐ^Ｒまたはａｌｒをコードする遺伝子を有する。図１２Ｄは、図１２ＣのＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ １９１７をベースとした操作された細菌と接触させたがん細胞によるＧｌｕｃの発現を示す。

【図12C-D】同上。

【図13】図１３Ａ～図１３Ｃは、β－絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）検出マーカーを用いた疾患細胞のインビトロ検出を実証する。ＥＬＩＳＡベースの試験（図１３Ａ）および妊娠試験（図１３Ｂ）を用いた、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ １９１７をベースとする操作された細菌によるＤＮＡペイロードの送達時にがん細胞株によって産生されたｈＣＧの検出が示されている。

【発明を実施するための形態】

【0024】

詳細な説明
消化管内の異常に成長している細胞の現行の診断は、患者にとって快適ではなく、疾患細胞の検出に必ず成功するとは限らない侵襲的な結腸鏡検査に基づいている。異常な細胞および疾患組織を可視化し、除去する能力は、外科医の技能およびポリープまたは腫瘍の隆起に応じて異なる。ある種の異常に成長する細胞は、平坦であるか、または数が少なく、したがって、熟練した外科医によっても視覚化および除去されない。さらに、結腸直腸がんのリスクの増加を伴う状態を有する患者にとって、頻繁な結腸鏡検査はかなりの負担である。本開示は、体液試料の日常的な分析によって対象中の異常細胞を検出する目的で投与される操作された細菌細胞を提供する。操作された細菌細胞は、異常細胞に侵入し、分泌可能なバイオマーカーをコードする核酸を送達するように遺伝子改変されており、異常細胞が分泌可能なバイオマーカーを発現し、分泌することを可能にする。いくつかの実施形態において、分泌可能なバイオマーカーは、尿、粘液、唾液および糞便などの生物学的試料中に排泄される。いくつかの実施形態において、検出マーカーは血液中に分泌され、したがって、血液、血清または血漿などの試料中で検出され得る。様々な実施形態において、分泌可能なバイオマーカーは、酵素アッセイまたはイムノアッセイを使用して、必要に応じて凝集、発光または蛍光、ディップスティックアッセイ、およびラテラルフローイムノアッセイなどのモダリティを使用して検出される。

【0025】

いくつかの実施形態において、分泌可能なバイオマーカーは、体液中での分布（例えば、排泄の減少または増加および安定性のぞうか）に関して最適化される。いくつかの実施形態において、分泌可能なバイオマーカーは、血液中での分布に関して最適化される。いくつかの実施形態において、分泌可能なバイオマーカーは、尿中での分布に関して最適化される。したがって、いくつかの実施形態において、分泌可能なバイオマーカーは、（例えば、尿または糞便中での）排泄の増加に関して最適化される。代替の実施形態において、分泌可能なバイオマーカーは、排泄の減少に関して最適化され、分泌可能なバイオマーカーの血液中への蓄積をもたらす。いくつかの実施形態において、分泌可能なバイオマーカーは、蓄積の増加をもたらす安定性の増加（例えば、改善されたタンパク質フォールディングおよび／またはタンパク質分解に対する安定性）に関して最適化される。例示的な実施形態において、分泌可能なバイオマーカーは、安定性の増加および排泄の減少に関して最適化され、血液中への蓄積をもたらす。別の例示的な実施形態において、分泌可能なバイオマーカーは、安定性の増加および排泄の増加を有し、尿中への蓄積をもたらす。

【0026】

したがって、様々な局面において、本発明は、胃腸（ＧＩ）組織の上皮細胞または胃腸組織とつながっている管の疾患上皮（例えば、胆管、膵管および総胆管を裏打ちする上皮組織）などの疾患上皮細胞を検出するのに有用な組成物および方法を提供する。本発明の１つの局面は、胃腸（ＧＩ）組織の上皮細胞または胃腸組織とつながっている管の上皮細胞（例えば、胆管、膵管および総胆管を裏打ちする上皮組織）などの疾患上皮細胞を検出するための方法であって、（ｉ）遺伝子操作された微生物を、投与することを必要とする対象の（例えば、消化管の）標的上皮細胞に投与することと、（ｉｉ）対象から生物学的試料を得ることと、（ｉｉｉ）前記生物学的試料中の前記分泌可能なバイオマーカーを測定し、それにより、疾患上皮細胞の存在を検出することとを含む、方法に関する。いくつかの実施形態において、遺伝子操作された微生物は、非病原性、栄養要求性であり、１またはそれを超える細胞膜受容体と特異的に相互作用する表面タンパク質をコードする外因性遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、細胞膜受容体は、正常な胃腸組織の上皮細胞の管腔側に露出していないが、疾患に罹患している対象中の（例えば、胃腸組織の）疾患上皮細胞の管腔側に露出している。表面タンパク質は、疾患上皮細胞における微生物の結合および侵入を促進する。微生物は、哺乳動物または細菌による発現を駆動するためにプロモーターに作動可能に連結された分泌可能なバイオマーカーをコードする遺伝子も含む。いくつかの実施形態において、プロモーターは哺乳動物プロモーターであり得る。いくつかの実施形態において、哺乳動物プロモーターは、上皮特異的発現またはＧＩ管上皮細胞特異的発現および／または胃腸組織とつながっている管の上皮（例えば、胆管、膵管および総胆管を裏打ちする上皮組織）における特異的発現を指示する。遺伝子操作された微生物は、経口または直腸経路を介して投与され得る。この局面において、結腸洗浄剤は、必要に応じて、微生物の投与の前および／または後に投与され得る。本明細書中に開示される実施形態のいずれにおいても、生物学的試料は対象から得られ、（ｉｉｉ）分泌可能なバイオマーカーは、生物学的試料において測定され、それにより、疾患上皮細胞の存在を検出する。本明細書中に開示される実施形態のいずれにおいても、生物学的試料は、血液、血漿、血清、粘液、尿、糞便、唾液またはこれらの任意の２またはそれを超える組み合わせであり得る。いくつかの実施形態において、分泌可能なバイオマーカーは、結腸鏡、内視鏡、Ｘ線撮影装置（例えば、Ｘ線機器）、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャナ、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）機器、血液ガス分析装置および尿化学分析装置から選択される臨床検査装置を使用せずに測定される。本明細書中に開示される実施形態のいずれにおいても、分泌可能なバイオマーカーは、凝集、電流測定、原子吸光分析法、原子発光分析法、円二色性（ＣＤ）、化学発光、比色分析、ディップスティックアッセイ、ラテラルフローイムノアッセイ、蛍光定量法、電気泳動アッセイ、酵素アッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ガスクロマトグラフィー、重量測定、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、イムノアッセイ、免疫蛍光酵素アッセイ、質量分析、核磁気共鳴、ラジオイムノアッセイ、分光測定、滴定法、ウェスタンブロッティングまたはこれらの任意の２もしくはそれを超える組み合わせによって測定される。

【0027】

消化管の管腔を取り囲む消化管壁は、管腔から外側方向に配置された、粘膜、粘膜下組織、筋層および漿膜（組織が腹腔内である場合）／外膜（組織が腹膜後組織である場合）と呼ばれる４つの同心層で構成される。粘膜の特徴は器官に依存する。例えば、胃粘膜上皮は、単純な円柱状であり、分泌に対処するために胃小窩および腺に組織化されている。分泌細胞（例えば、杯細胞およびパネート細胞）、免疫細胞（例えば、腸管関連リンパ組織（ＧＡＬＴ）の樹状細胞およびＭ細胞）と混ざり合った腺上皮から構成される小腸粘膜は、絨毛内に配置され、刷子縁を形成し、吸収面積を増加させる。

【0028】

消化管の上皮細胞は、分極した連続層を形成する。上皮細胞は、密着結合および接着結合によって接続され、頂端表面にバリアを形成し、頂端組織区画と基底組織区画との間での溶質、イオンおよびタンパク質の選択的拡散を制御する。細胞の頂端表面はＧＩ管腔に面し、基底外側面は内側に面する基底膜に隣接して存在する。基底膜は、ラミニン、ＩＶ型コラーゲン、プロテオグリカンおよびナイドジェンを含む細胞外マトリックス（ＥＣＭ）である。上皮細胞は、ＥＣＭ成分および細胞内タンパク質に結合する膜内在性タンパク質である、インテグリンおよび膜貫通プロテオグリカンであるジストログリカンを介してＥＣＭと相互作用する。上皮細胞中で広く発現されているβ１インテグリンは、上皮細胞の極性を確立する上で中心的な役割を果たす。例えば、ＥＣＭ成分へのインテグリンの結合は、インテグリンによるシグナル伝達を活性化し、細胞骨格の組織化に影響を及ぼし、これは細胞極性に寄与する。

【0029】

極性およびバリア機能の破壊は疾患を引き起こす。例えば、腫瘍抑制因子ＡＰＣの不活性化後に、組織極性はがん進行中の極めて早期に失われる。例えば、Ｆａｔｅｈｕｌｌａｈら、Ｐｈｉｌｏｓ Ｔｒａｎｓ Ｒ Ｓｏｃ Ｌｏｎｄ Ｂ Ｂｉｏｌ Ｓｃｉ．３６８（１６２９）：２０１３００１４（２０１３）を参照されたい。したがって、反対側の基底表面ドメインへのインテグリンの場所を誤った局在化は、上皮構造の喪失およびがんの発達と相関していた。Ｋｒｉｓｈｎａｎら、Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｃｅｌｌ ２４（６）：８１８－３１（２０１３）。同様に、腸病原性Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉおよびＹ．ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓなどの病原体は、細胞極性を破壊し、基底外側膜タンパク質の頂端への移動を可能にする。Ｍｕｚａ－Ｍｏｏｎｓら、Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ．７１（１２）：７０６９－７０７８（２００３）；ＭｃＣｏｒｍｉｃｋら、Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ．６５（４）：１４１４－２１（１９９７）。さらに、クローン病、処置されていないセリアック病、過敏性腸症候群、および過敏性腸疾患などの疾患は、バリア機能の破壊を特徴とする。Ｍａｒｃｈｉａｎｄｏら、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐａｔｈｏｌ ５：１１９－１４４（２０１０）。したがって、誤った場所に局在化したおよび／または異常に発現した細胞表面分子の検出は、大きな診断価値を有する。

【0030】

胆管は、胆汁を運ぶ長い管状の構造である。小胆管は、小肝動脈分岐、？門脈分岐も含有する肝小葉の門脈三つ組において見ることができる。小型胆管は融合して、より大型の胆管を形成する。肝三つ組中のより大型の胆管は癒合して、肝臓の下面で融合して総胆管になる右および左肝管になる肝内胆管となる。総胆管の中ほどで、（胆嚢におよび胆嚢から胆汁を運ぶ）胆嚢管が胆嚢へと分岐する。総胆管は腸に開口する。肝内管、胆嚢管および総胆管は、高円柱上皮によって裏打ちされている。

【0031】

胆嚢は、肝臓から排出された胆汁を貯蔵する。円柱状粘膜は、粘膜固有層の上に折り重なって配置されており、伸長を可能にする。粘膜固有層の下には筋層があり、胆嚢を取り囲んでいるのは結合組織層および漿膜である。胆嚢粘膜は、胆汁中のナトリウムを外に輸送し、続いて塩化物および水を受動的に輸送する。したがって、肝臓によって排出され、胆嚢中に貯蔵された胆汁は、より濃縮される。胆嚢の筋層は、小腸の腸内分泌細胞によって排出されるホルモンであるコレシストキニンの影響を受けて収縮する。

【0032】

膵管、またはヴィルズング管（主膵管としても知られている）は、膵臓を総胆管に接続する管である。膵管は、ファーター膨大部の直前で総胆管に接続し、その後、両管は、大十二指腸乳頭で十二指腸の第２部の内側を穿通する。多くの希少な解剖学的変異形も存在する。膵管は、管腔の微絨毛および多糖外被ならびに小さな頂端細胞質ムチン液滴を有する円柱状細胞によって裏打ちされている。大きな膵管では、多くの上皮細胞は繊毛も有し、これは外分泌分泌物の下流への移動を補助するように機能する。

【0033】

したがって、様々な局面において、本発明は、ＧＩ組織の疾患上皮組織または胃腸組織とつながっている管の上皮細胞（例えば、胆管、膵管および総胆管を裏打ちする上皮組織）などの疾患上皮組織を検出するのに有用な組成物および方法を提供する。本発明の一局面は、疾患ＧＩ組織を検出するための方法であって、（ｉ）ＧＩ管の疾患上皮細胞または胃腸組織とつながっている管の上皮（例えば、胆管、膵管および総胆管を裏打ちする上皮組織）において、検出可能なマーカーの発現を特異的に指示するように操作された遺伝子操作された微生物を、投与することを必要とする対象の消化管に投与することと、（ｉｉ）分泌可能なバイオマーカーの発現を検出し、それにより疾患上皮細胞の存在を検出することとを含む方法に関する。様々な実施形態において、本方法は、分泌可能なバイオマーカーの発現を疾患細胞において特異的に指示する遺伝子操作された微生物を、投与することを必要とする対象のＧＩ管に投与することを含む。本方法は、分泌可能なバイオマーカーの発現を検出し、それにより、疾患上皮細胞の存在を検出することをさらに含む。いくつかの実施形態において、遺伝子操作された微生物は、非病原性、栄養要求性であり、１またはそれを超える細胞膜受容体と特異的に相互作用する表面タンパク質をコードする外因性遺伝子を含む。細胞膜受容体は、正常な上皮または胃腸組織の上皮細胞の管腔側に露出していないが、疾患に罹患している対象中の胃腸組織の疾患上皮細胞の管腔側に露出している。したがって、１またはそれを超える細胞膜受容体の発現および／または局在化は、上皮組織または胃腸組織の疾患細胞または異常細胞に対する特異性を微生物に付与する。したがって、表面タンパク質は、疾患上皮細胞における微生物の結合および侵入を促進する。表面タンパク質は、疾患上皮細胞における微生物の結合および侵入を促進する。微生物は、プロモーター（例えば、哺乳動物または細菌のプロモーター）に作動可能に連結された分泌可能なバイオマーカーをコードする遺伝子も含む。それにより、様々な実施形態において、微生物は、疾患上皮細胞に核酸（例えば、ＤＮＡまたはｍＲＮＡ分子）を送達する。様々な実施形態において、疾患上皮細胞は、分泌可能なバイオマーカーを発現し、それによって疾患上皮細胞の検出を可能にする。いくつかの実施形態において、プロモーターは哺乳動物プロモーターであり得る。いくつかの実施形態において、哺乳動物プロモーターは、ＧＩ管上皮細胞特異的発現および／または胃腸組織とつながっている管の上皮（例えば、胆管、膵管および総胆管を裏打ちする上皮組織）における特異的発現を指示する。

【0034】

遺伝子操作された微生物を使用して、および／または本明細書に開示されている方法を使用して診断され得る疾患には、前がん性病変、ＧＩ管がん、潰瘍性大腸炎、クローン病、バレット食道、過敏性腸症候群および過敏性腸疾患が含まれる。ＧＩ管がんおよび前がん性症候群には、肛門の扁平上皮癌、結腸直腸がん（結腸直腸腺癌、家族性腺腫性ポリポーシス、遺伝性非ポリポーシス結腸直腸がんを含むＣＲＣ）、結腸直腸ポリポーシス（ポイツ・ジェガース症候群、若年性ポリポーシス症候群、ＭＵＴＹＨ関連ポリポーシス、家族性腺腫性ポリポーシス／ガードナー症候群、およびクロンカイト・カナダ症候群を含む）、カルチノイド、腹膜偽粘液腫、十二指腸腺癌、遠位胆管癌、膵管腺癌、胃癌、印環細胞癌（ＳＲＣＣ）、胃リンパ腫（ＭＡＬＴリンパ腫）、形成性胃組織炎（ｌｉｎｉｔｉｓ ｐｌａｓｔｉｃ）（ブリントン病）、ならびに食道の扁平上皮癌および腺癌が含まれる。これらの適応症の１またはそれより多くに罹患している対象からの疾患上皮細胞は、本開示の遺伝子操作された微生物を使用して検出され得る。遺伝子操作された微生物は、胃腸組織の疾患上皮細胞の管腔側に露出している１またはそれを超える細胞膜受容体と特異的に相互作用することによって、疾患上皮細胞に特異的に結合する。異常細胞または疾患細胞において生じる１もしくはそれを超える細胞膜受容体または異常に発現されたタンパク質は胃腸組織または管組織の正常な上皮細胞の管腔側に露出していないので、遺伝子操作された微生物は正常（非疾患）上皮細胞に結合しない。いくつかの実施形態において、遺伝子操作された微生物は、分泌可能なバイオマーカーをコードする１またはそれを超える核酸を疾患上皮細胞（標的細胞）に送達する。これらの実施形態において、疾患上皮細胞（標的細胞）は分泌可能なバイオマーカーを発現し、生体液試料中での疾患上皮細胞（標的細胞）の検出を可能にする。例えば、疾患上皮細胞（標的細胞）は、血液、糞便、尿または唾液などの生物学的試料中の分泌可能なバイオマーカーの検出に基づいて同定され得る。疾患上皮細胞の確認または評価は、続いて、結腸鏡検査、内視鏡検査、磁気共鳴画像法、ＣＴスキャン、ＰＥＴスキャン、ＳＰＥＣＴスキャンなどのような適切な技術を使用して行われ得る。

【0035】

結腸直腸がん（ＣＲＣ）は、一般的でしばしば致死的な腫瘍である。結腸直腸腺腫は、最も頻繁な前がん性病変である。他の潜在的に前悪性の状態としては、慢性炎症性腸疾患ならびに、家族性腺腫性ポリポーシス、ポイツ・ジェガース症候群および若年性ポリポーシスなどの遺伝性症候群が挙げられる。これらの状態は、消化管の異なる部位を含み得る。すべてのこのような症例において、初期段階での疾患認識は、適切な予防がん戦略を考案するために不可欠である。

【0036】

結腸直腸腺腫は、無関係の症状のためにまたはＣＲＣスクリーニングのために行われた結腸鏡検査中に偶発的に発見されることが多い無症候性病変である。結腸鏡検査スクリーニングを受ける約２５％の男性および１５％の女性は、１またはそれを超える腺腫を有する。６０歳を超える人々の最大４０％が結腸鏡検査で示されるように結腸直腸腺腫性ポリープを有するが、すべての大腸ポリープが腺腫であるわけではなく、腺腫の９０％超ががんに進行しない。

【0037】

遺伝性非ポリポーシス結腸がん（ＨＮＰＣＣ）としても知られているリンチ症候群は、すべてのＣＲＣ症例の２～４％を占める。ＨＮＰＣＣを有する個体は、ＣＲＣを発症する約７５％の生涯リスクを有しており、いくつかのタイプのがんに罹患しやすい。結腸がんおよびポリープは、リンチ症候群患者において、散発性新生物を有する一般集団より若齢で発生し、腫瘍はより近位の位置で発生する。これらのがんは、しばしば低分化で粘液性である。ミュア・トール症候群は、ある種の皮膚腫瘍に対するさらなる素因を与える、リンチ症候群の変異形である。

【0038】

家族性腺腫性ポリポーシス（ＦＡＰ）は、１０，０００個体に１個体の有病率を有し、ＣＲＣに罹患しやすい２番目に一般的な遺伝的症候群である。予防的結腸切除術を受けていないＦＡＰに罹患している個体においてＣＲＣを発症する生涯リスクは１００％に近い。ＦＡＰの特徴的な特徴には、青年期初期に始まる数百から数千の結腸腺腫の発達が含まれる。ＦＡＰ患者におけるＣＲＣ診断の平均年齢（未処置の場合）は４０歳である；７％が２０歳までに腫瘍を発症し、９５％が５０歳までに腫瘍を発症する。軽症型ＦＡＰは、この疾患の重篤度がより低い形態であり、ＣＲＣの平均生涯リスクは７０％である。この群では、約３０個の腺腫性ポリープが結腸に発生し、結腸新生物は近位結腸に位置する傾向があり、がんはより高齢で発生する。ガードナー症候群およびターコット症候群は、ＦＡＰのまれな変異形である。ポリープに加えて、ガードナー症候群は、類表皮嚢胞、骨腫、歯の異常および／またはデスモイド腫瘍のような結腸外症状を引き起こす。ターコット症候群は、結腸直腸腺腫性ポリープ、および髄芽腫などの中枢神経系の悪性腫瘍を発症する素因を引き起こす。

【0039】

遺伝的状態であるＭＵＴＹＨ関連ポリポーシス、ポイツ・ジェガース症候群および若年性ポリポーシス症候群は、結腸ポリープおよびがんの素因を引き起こす他のよりまれな症候群である。ＭＵＴＹＨ関連ポリポーシス（ＭＡＰ）を有する患者は、結腸直腸の腺腫性ポリポーシスを発症し、８０％のＣＲＣのリスクを有する。ポイツ・ジェガースおよび若年性ポリポーシス症候群は、結腸直腸および他の悪性腫瘍のリスクの増加を示し、ＣＲＣの生涯リスクは約４０％である。

【0040】

胆管癌とも呼ばれる胆道がんは、膵臓がん、胆嚢がんおよび胆管のがんを含む胆管系の器官に生じる悪性腫瘍を指す。毎年、胆道がんの約７，５００の新規の症例が診断される。これらのがんには、約５，０００の胆嚢がんおよび２，０００～３，０００の胆管がんが含まれる。胆管および膵臓の前新生物病変および新生物病変は、分子的、組織学的および病態生理学的特徴に関して類似性を共有する。上皮内新生物は、胆道では胆管上皮内新生物（ＢｉｌＩＮ）として、膵臓では膵臓上皮内新生物（ＰａｎＩＮ）として報告されている。いずれも浸潤癌、それぞれ胆管癌（ＣＣＡ）および膵管腺癌（ＰＤＡＣ）に進行し得る。

【0041】

ＢｉｌＩＮは、通常、肝外胆管（ＥＨＢＤ）および大型肝内胆管（ＩＨＢＤ）を裏打ちする上皮内において発生し、胆嚢にも見出される場合がある。ＢｉｌＩＮは、多段階胆管発癌の過程に関与する、微小乳頭状、偽乳頭状または平坦な成長パターンを有する微視的な病変である。細胞および構造上の異型性の程度に基づいて、ＢｉｌＩＮは、胆管の非新生物性上皮と比較して最も軽度の変化を示すＢｉｌＩＮ－１（低悪性度異形成）；ＢｉｌＩＮ－１と比較して増加した核異型性および細胞極性の限局性異常を有するＢｉｌＩＮ－２（中程度の異形成）；通常、胆管癌領域の近くで同定されるＢｉｌＩＮ－３（高悪性度異形成または上皮内癌）という３つのカテゴリーに分類されてきた。

【0042】

毎年、膵臓がんの約３０，０００の新規の症例が米国で診断されている。初期症状は曖昧であり、膵臓がんを検出するためのスクリーニング検査が存在しないため、早期診断は困難である。膵臓上皮内新生物（ＰａｎＩＮ）は、微視的な平坦なまたは微小乳頭状の非侵襲性病変として定義される。これらの病変は、しばしば５ｍｍ未満のサイズであり、膵管腺癌（ＰＤＡＣ）の最も一般的な悪性前駆体と考えられている。より少ない割合のＰＤＡＣの症例は、膵管内乳頭粘液性新生物（ＩＰＭＮ）および粘液性嚢胞新生物（ＭＣＮ）にも由来する。ＰａｎＩＮも、細胞および構造上の異型性の程度に従って、軽度から中等度の細胞学的異型性および基底部限局性の核を有する低悪性度（以前はＰａｎＩＮ－１およびＰａｎＩＮ－２として分類されていた）ならびに重度の細胞学的異型性、極性および有糸分裂の喪失を有する高悪性度（以前はＰａｎＩＮ－３として分類されていた）に分類されている。

【0043】

炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、腸の非特異的慢性炎症性疾患の群であり、クローン病（ＣＤ）、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）および分類不能大腸炎を含む。ＩＢＤの病因は不明なままであり、長期持続性および再発性の腸炎症を特徴とする。米国におけるＵＣの発生率は、１０万人当たり９～１２人であり、１０万人当たり２０５～２４０人の有病率であると推定されている（Ｔａｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．１０６ Ｓｕｐｐｌ １：Ｓ２－Ｓ２５（２０１１））。ＵＣの病因は不明である。しかしながら、腸内微生物を含む腸内の内容物に対する異常な免疫応答は、遺伝的素因を有する個体において疾患を推進すると考えられている（Ｇｅｒｅｍｉａ ｅｔ ａｌ．，Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ Ｒｅｖ．１３：３－１０（２０１４））。大腸炎関連結腸直腸がん（ＣＡＣＣ）は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、特に潰瘍性大腸炎（ＵＣ）における最も重篤な合併症の１つであり、ＩＢＤ患者の全原因死亡率の約１５％を占める。散発性ＣＲＣよりもＣＡＣＣの方が予後が悪く、死亡率が高いため、早期のＣＡＣＣ検出が重要である。

【0044】

クローン病は、消化（ＧＩ）管の炎症を特徴とする。炎症は、口から肛門までＧＩ管内のどこにでも現れ得る。この疾患を有する人々は、症状の起伏を経験することが多い。この疾患を有する人々は、寛解期間を経験することさえある。診断遅延の長さは、少なくとも一部のクローン病（ＣＤ）患者にとって問題となり得る。しかしながら、クローン病は、軽度の症状から始まり、徐々に悪化する進行性疾患である。早期診断は、瘻孔、膿瘍または狭窄などの腸損傷の予防を補助するために重要である。

【0045】

過敏性腸症候群（ＩＢＳ）は、一連の慢性胃腸（ＧＩ）症状ならびに明らかな構造的および生化学的異常が存在しない場合の排便習慣の変化として現れる障害である。ＩＢＳは、世界的な有病率が１０～１５％であり、５０歳未満の個体においてより頻度が高い。Ｌｏｖｅｌｌ ａｎｄ Ｆｏｒｄ，Ｇｌｏｂａｌ Ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ ｏｆ ａｎｄ Ｒｉｓｋ Ｆａｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｉｒｒｉｔａｂｌｅ Ｂｏｗｅｌ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ：Ａ Ｍｅｔａ－ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ １０：７１２－７２１（２０１２）。排便習慣の変化は、最も一般的に報告されている臨床的特徴であり、主に便秘（ＩＢＳ－Ｃ）、下痢（ＩＢＳ－Ｄ）または両方の状態の混合（ＩＢＳ－Ｍ）を伴う症候群である。さらに、ＩＢＳ患者はしばしば腹痛を経験し、腹痛は感情的ストレスまたは摂食によって誘発され得、通常、便の通過によって緩和される。ＩＢＳの診断は、臨床経験および多国籍の専門家の委員会のコンセンサスに基づくローマ基準の最新版に従って確認される。

【0046】

バレット食道は、腸の裏打ちに類似する組織が食道を裏打ちする組織を置き換える状態である。バレット食道を有する人々は食道腺癌を発症し得る。バレット食道の正確な原因は不明であるが、胃食道逆流性疾患（ＧＥＲＤ）は、バレット食道を発症するリスクを増加させる。

【0047】

診断、特に早期診断は、前がん性病変、ＧＩ管がん、潰瘍性大腸炎、クローン病、バレット食道、過敏性腸症候群および／または過敏性腸疾患に罹患している個体の死亡率および罹患率を予防するために極めて重要である。

【0048】

様々な局面において、本発明は、消化管内の誤った場所に局在化したおよび／または異常に発現された細胞表面分子の検出において有用な遺伝子操作された微生物を提供し、それによって疾患状態を診断、予後診断または評価する。本明細書に開示されている遺伝子操作された微生物は、表面タンパク質をコードする遺伝子を含み、表面タンパク質は１またはそれを超える細胞膜受容体と特異的に相互作用し、１またはそれを超える細胞膜受容体は、正常な胃腸組織および／または胆管、膵管もしくは総胆管などを裏打ちする上皮組織の上皮細胞の管腔側に露出しておらず、ならびに１またはそれを超える細胞膜受容体は、疾患胃腸組織および／または胆管、膵管もしくは総胆管などを裏打ちする上皮組織の上皮細胞の管腔側に露出している。この局面では、いくつかの実施形態において、表面タンパク質は、本明細書に開示されている遺伝子操作された微生物による、疾患胃腸組織および／または胆管、膵管もしくは総胆管などを裏打ちする上皮組織の上皮細胞の結合および侵入を促進する。微生物は、プロモーターに作動可能に連結された、分泌可能なバイオマーカーをコードする１またはそれを超える遺伝子も含む。いくつかの実施形態において、微生物は、非病原性であり得、および／または少なくとも１つの栄養要求性変異を有する。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの栄養要求性変異は、細胞壁合成のために必要とされる代謝産物（例えば、遺伝的にコードされないアミノ酸）の合成に関与する遺伝子の欠失、不活性化または減少した発現もしくは活性を含む。例示的な実施形態において、遺伝子は、Ｄ－アラニンまたはジアミノピメリン酸の合成のために必要とされる。このような栄養要求性変異は、操作された微生物を選択するための手段を提供し、哺乳動物細胞内に入ると微生物の溶解も促進する。

【0049】

いくつかの実施形態において、本開示の遺伝子操作された微生物は、疾患上皮細胞（標的細胞）に核酸を送達する。分泌可能なバイオマーカーをコードする１またはそれを超える遺伝子は、分泌可能なバイオマーカーの発現を調節する、検出マーカー遺伝子に作動可能に連結された１またはそれを超える配列要素を含み得る。配列要素は、検出マーカーの転写、転写物安定性、翻訳、タンパク質安定性、細胞局在化および／または分泌を調節および制御し得る。いくつかの実施形態において、配列要素は、遺伝子操作された微生物による検出マーカーの発現を妨げ得る。代替の実施形態において、配列要素は、遺伝子操作された微生物による検出マーカーの発現（転写および／または翻訳）を可能にし得る。

【0050】

いくつかの実施形態において、本開示の遺伝子操作された微生物は、ＤＮＡ分子（例えば、本明細書でペイロードプラスミドとも呼ばれるプラスミドＤＮＡである）を疾患上皮細胞（標的細胞）に送達する。いくつかの実施形態において、ペイロードプラスミドは、細胞あたり複数コピー（約１～約３００コピー、約２０～約５０コピー、約２～約１０コピー、または約５～約１０コピーの範囲）で存在するか、または単一コピープラスミドである。コピー数は、プラスミドの特定の遺伝的特徴に依存する。いくつかの実施形態において、ペイロードプラスミドは、分泌可能なバイオマーカーをコードする１またはそれを超える遺伝子を有する。いくつかの実施形態において、分泌可能なバイオマーカーをコードする１またはそれを超える遺伝子は、哺乳動物プロモーターに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態において、分泌可能なバイオマーカーをコードする１またはそれを超える遺伝子は、細菌の転写を阻害するための微生物リプレッサー結合部位を含む。いくつかの実施形態において、分泌可能なバイオマーカーをコードする１またはそれを超える遺伝子はイントロンを含み、イントロンの除去は検出マーカーの機能的発現のために必要である。いくつかの実施形態において、分泌可能なバイオマーカーをコードする１またはそれを超える遺伝子は、微生物の転写ターミネーター（複数可）を含む。

【0051】

いくつかの実施形態において、細菌は、Ｔ７ＲＮＡＰ遺伝子によってコードされるＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７ＲＮＡＰ）を発現し、Ｔ７プロモーターの調節下において、本明細書に開示される検出マーカーをコードする遺伝子を有する。いくつかの実施形態において、Ｔ７ＲＮＡＰは細菌の染色体上に組み込まれる。いくつかの実施形態において、Ｔ７ＲＮＡＰはプラスミドに存在する。いくつかの実施形態において、Ｔ７ＲＮＡＰは誘導性プロモーター（例えば、ａｒａＢＡＤまたはｌａｃＵＶ５プロモーター）によって調節される。これらの実施形態において、細菌は、検出マーカーをコードするｍＲＮＡおよび／または検出マーカーを発現する。いくつかの実施形態において、これらの細菌は、検出マーカーをコードするｍＲＮＡを疾患上皮細胞に送達する。これらの実施形態において、疾患上皮細胞に送達される検出マーカーをコードするｍＲＮＡは、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含む。いくつかの実施形態において、これらの細菌は、検出マーカータンパク質を疾患上皮細胞に送達する。これらの実施形態において、疾患上皮細胞に送達される検出マーカーは、細胞の代謝産物と接触すると蛍光性になる。

【0052】

理論に拘束されるものではないが、ペイロードプラスミドＤＮＡ上に存在する分泌可能なバイオマーカーをコードする遺伝子中に必要に応じて存在する配列要素（複数可）（例えば、哺乳動物プロモーター、微生物リプレッサー結合部位（例えば、オペレーター）およびイントロン）は、哺乳動物細胞中での分泌可能なバイオマーカーの産生を可能にし、一方、遺伝子操作された微生物中での分泌可能なバイオマーカーの発現を妨げると考えられる。したがって、いくつかの実施形態において、遺伝子操作された微生物は、遺伝子操作された微生物中でのバックグラウンド発現なしに、疾患上皮細胞（標的細胞）の存在の真の読み出しを提供する。したがって、いくつかの実施形態において、分泌可能なバイオマーカーをコードする遺伝子は、哺乳動物プロモーターに作動可能に連結され得る。いくつかの実施形態において、哺乳動物プロモーターは、ＧＩ管上皮細胞特異的発現および／または胃腸組織とつながっている管の上皮（例えば、胆管、膵管および総胆管を裏打ちする上皮組織）における特異的発現を指示する。ＧＩ管上皮細胞特異的発現を指示する適切な哺乳動物プロモーターの実例は、ＭＵＣ２遺伝子プロモーター、Ｔ３^ｂ遺伝子プロモーター、腸型脂肪酸結合タンパク質遺伝子プロモーター、リゾチーム遺伝子プロモーターおよびビリン遺伝子プロモーターである。いくつかの実施形態において、哺乳動物プロモーターは、誘導性のＧＩ管上皮細胞特異的発現を指示する。いくつかの実施形態において、ＲＰＬ３８プロモーターは、膵臓の管上皮における特異的発現のために使用される。適切な誘導性哺乳動物プロモーターの実例は、β－ナフトフラボンなどの親油性生体異物に応答して転写的に上方制御されるシトクロムＰ４５０プロモーター要素であり得る。いくつかの実施形態において、誘導性哺乳動物プロモーターは、テトラサイクリン、クメートまたはエストロゲンによって制御可能である。いくつかの実施形態において、誘導性哺乳動物プロモーターは、Ｔｅｔ－ＯｎまたはＴｅｔ－Ｏｆｆプロモーターであり得る。したがって、いくつかの実施形態において、分泌可能なバイオマーカーをコードする遺伝子は、誘導性および／または抑制性であり得、誘導因子または抑制因子を患者に送達することによって、必要に応じて調節され得る。

【0053】

分泌可能なバイオマーカーをコードする遺伝子中に必要に応じて存在する微生物リプレッサー結合部位は、細菌中での分泌可能なバイオマーカーをコードする遺伝子の発現を抑制するが、哺乳動物細胞中ではそのような抑制効果を発揮しない。いくつかの実施形態において、リプレッサー配列は、１またはそれを超えるｌａｃオペレーター、１またはそれを超えるａｒａオペレーター、１またはそれを超えるｔｒｐオペレーター、１またはそれを超えるＳＯＳオペレーター、１またはそれを超える組み込み宿主因子（ＩＨＦ）結合部位、１またはそれを超えるヒストン様タンパク質ＨＵ結合部位およびこれらの２またはそれを超える組み合わせから選択され得る。

【0054】

微生物転写終結部位は、哺乳動物細胞中での分泌可能なバイオマーカーをコードする遺伝子の転写の途中での終結を引き起こすことなく、遺伝子操作された微生物中での分泌可能なバイオマーカーをコードする遺伝子の転写の途中での終結を引き起こす。いくつかの実施形態において、分泌可能なバイオマーカーをコードする遺伝子は、ｒｈｏ非依存性の微生物転写終結部位を含む。いくつかの実施形態において、分泌可能なバイオマーカーをコードする遺伝子は５’非翻訳領域を含み、５’非翻訳領域はｒｈｏ非依存性の微生物転写終結部位を含む。いくつかの実施形態において、ｒｈｏ非依存性の微生物転写終結部位は、短いヘアピンとそれに続く４～８個のＴ（例えば、ＴＴＴＴＴＴおよびＴＴＴＴＴ）の連続を含む。例示的なｒｈｏ非依存性の微生物転写終結部位は、Ｔ７ターミネーター、ｒｒｎＢターミネーターおよびＴ０ターミネーターである。

【0055】

代替の実施形態において、本開示の遺伝子操作された微生物は、分泌可能なバイオマーカーをコードするｍＲＮＡ分子を疾患上皮細胞（標的細胞）に送達し得る。したがって、これらの実施形態において、分泌可能なバイオマーカーをコードする遺伝子は、微生物プロモーターに作動可能に連結され得る。いくつかの実施形態において、微生物は、分泌可能なバイオマーカーをコードするｍＲＮＡを疾患上皮細胞の細胞質に送達し、疾患上皮細胞の細胞質はｍＲＮＡを翻訳してコードされた分泌可能なマーカーを産生することができる。いくつかの実施形態において、分泌可能なバイオマーカーをコードする遺伝子は、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含む。これらの実施形態において、配列内リボソーム進入部位は、微生物によって送達されるｍＲＮＡ分子の翻訳を促進する。いくつかの実施形態において、送達されるｍＲＮＡ配列は、ｍＲＮＡ分子に安定性を付与する要素を含む。ｍＲＮＡ分子に安定性を付与する要素の非限定的な例としては、５’ヘアピン構造および３’ポリＡテールが挙げられる。

【0056】

したがって、これらの実施形態において、分泌可能なバイオマーカーをコードする遺伝子は、微生物プロモーターに作動可能に連結され得る。適切な微生物プロモーターの実例としては、微生物（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）において機能する任意の染色体遺伝子、プラスミド遺伝子またはバクテリオファージ遺伝子の天然プロモーターが挙げられる。いくつかの実施形態において、微生物プロモーターは、プロモーターコンセンサス配列に由来する合成プロモーターであり得る。いくつかの実施形態において、微生物プロモーターは誘導性プロモーターであり得る。適切な誘導性微生物プロモーターの実例は、ａｒａＢＡＤプロモーターおよびｌａｃプロモーターである。したがって、いくつかの実施形態において、分泌可能なバイオマーカーをコードする遺伝子は、誘導性および／または抑制性であり得、誘導因子または抑制因子を患者に送達することによって、必要に応じて調節され得る。いくつかの実施形態において、プロモーターはＴ７またはＴ３プロモーターであり、操作された微生物は、分泌可能なマーカーの発現を支持するためにＴ７またはＴ３ ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を発現する。

【0057】

配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）は、キャップ非依存的な様式で翻訳開始を可能にするＲＮＡ要素である。いくつかの実施形態において、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）は、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）由来のＩＲＥＳ、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）由来のＩＲＥＳおよびコオロギ麻痺ウイルス（ＣｒＰＶ）由来のＩＲＥＳから選択され得る。いくつかの実施形態において、分泌可能なバイオマーカーをコードする遺伝子中に存在する配列内リボソーム進入部位は、遺伝子操作された微生物中で産生されたｍＲＮＡを使用して哺乳動物細胞中での分泌可能なバイオマーカーの産生を可能にする。

【0058】

分泌可能なバイオマーカーをコードする遺伝子中に必要に応じて存在するイントロン（複数可）は、分泌可能なバイオマーカーをコードするｍＲＮＡが遺伝子操作された微生物または哺乳動物細胞中で転写され得るかどうかにかかわらず、哺乳動物細胞中での分泌可能なバイオマーカーをコードする遺伝子の発現を可能にしながら、細菌中での分泌可能なバイオマーカーの機能的発現を妨げる。いくつかの実施形態において、イントロンは、スプライソソームイントロンであり得る。いくつかの実施形態において、イントロンは、分泌可能なバイオマーカーをコードするスプライシングされていないｍＲＮＡ中にフレームシフトまたは未成熟終止コドンを作り出す。したがって、いくつかの実施形態において、遺伝子操作された微生物は、遺伝子操作された微生物中での分泌可能なバイオマーカータンパク質のバックグラウンド発現なしに、疾患上皮細胞（標的細胞）の存在の真の読み出しを提供する。

【0059】

本明細書中に開示される実施形態のいずれにおいても、分泌可能なバイオマーカーをコードする遺伝子は、必要に応じて、コザック配列、２Ａペプチド配列、哺乳動物転写終結配列、ポリアデニル化配列（ｐＡ）、タンパク質分泌のためのリーダー配列およびこれらの任意の２またはそれを超える組み合わせから選択される配列要素をさらに含む。

【0060】

コザック配列は、ほとんどの真核生物ｍＲＮＡ転写物においてタンパク質翻訳開始部位として機能する核酸モチーフである。分泌可能なバイオマーカーをコードする遺伝子中に存在するコザック配列は、正しい翻訳開始を改善する。いくつかの実施形態において、コザック配列は、以下のヌクレオチド配列：５’－（ＧＣＣ）ＧＣＣＲＣＣＡＵＧＧ－３’を有する。

【0061】

２Ａペプチドは、存在する場合、２Ａペプチドの末端に見出されるグリシン残基とプロリン残基との間でのペプチド結合の合成を妨げることによって機能し、２Ａペプチドは、同じｍＲＮＡから等モルレベルの複数のタンパク質の産生を可能にする。２ＡペプチドはＣ末端上流タンパク質に結合するようになり、一方、下流タンパク質はプロリンで始まる。いくつかの実施形態において、２Ａペプチドは、Ｅ２Ａ（（ＧＳＧ）ＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ）、Ｆ２Ａ（（ＧＳＧ）ＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰ ＧＰ）、Ｐ２Ａ（（ＧＳＧ）ＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ）およびＴ２Ａ（（（ＧＳＧ）ＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥ ＮＰＧＰ）から選択される。いくつかの実施形態において、（括弧内に含まれる）ＧＳＧ配列は、必要に応じて存在し得る。

【0062】

ポリアデニル化配列（ｐＡ）は、ｍＲＮＡへのポリＡテールの付加を引き起こし、これはｍＲＮＡの核外輸送、翻訳および安定性にとって重要である。哺乳動物転写終結配列は転写を終結させ、ポリＡテールの付加を促進する。いくつかの実施形態において、分泌可能なバイオマーカーをコードする遺伝子は、哺乳動物の転写終結配列およびポリアデニル化配列の両方である配列要素を含む。いくつかの実施形態において、哺乳動物の転写終結配列およびポリアデニル化配列の両方であり得る配列要素は、ＳＶ４０ターミネーター、ｈＧＨターミネーター、ＢＧＨターミネーターおよびｒｂＧｌｏｂターミネーターから選択される。

【0063】

いくつかの実施形態において、分泌可能なバイオマーカーをコードする遺伝子は、哺乳動物の発現に関して最適化されたコドン使用頻度を含む。

【0064】

いくつかの実施形態において、遺伝子操作された微生物は、分泌可能なバイオマーカーをコードする１またはそれを超える核酸を疾患上皮細胞（標的細胞）に送達する。これらの実施形態において、疾患上皮細胞（標的細胞）は分泌可能なバイオマーカーを発現し、疾患上皮細胞（標的細胞）の検出を可能にする。いくつかの実施形態において、疾患上皮細胞（標的細胞）は分泌可能なバイオマーカーを分泌し、分泌可能なバイオマーカーを血液、血清または血漿中で検出可能にする。いくつかの実施形態において、分泌可能なバイオマーカーは、粘液、尿および唾液などの体液中に排泄され、分泌可能なバイオマーカーを体液中で検出可能にする。

【0065】

いくつかの実施形態において、分泌可能なバイオマーカーは胃腸組織の上皮細胞によって分泌可能である。したがって、これらの実施形態において、分泌可能なバイオマーカーは、分泌可能なバイオマーカーを発現する哺乳動物細胞中の分泌経路において合成され、選別される。いくつかの実施形態において、分泌可能なバイオマーカーは、必要に応じてＮ末端またはその近くに位置するＥＲシグナル配列を含む。いくつかの実施形態において、ＥＲシグナルは、分泌可能なバイオマーカーを合成しているリボソームを粗面ＥＲに向かわせる。いくつかの実施形態において、分泌可能なバイオマーカーは、天然のシグナルペプチドを含む。これに加えてまたはこれに代えて、いくつかの実施形態において、分泌可能なバイオマーカーは、異種のシグナル配列を含む。いくつかの実施形態において、異種のシグナル配列は、インターロイキン－２、ＣＤ５、免疫グロブリンκ軽鎖、トリプシノゲン、血清アルブミンおよびプロラクチンのシグナル配列から選択される。いくつかの実施形態において、Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ（Ｇｌｕｃ）は天然のシグナル配列を含む。これに加えてまたはこれに代えて、Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ（Ｇｌｕｃ）は異種のシグナル配列を含む。いくつかの実施形態において、βｈＣＧは天然のシグナル配列を含む。これに加えてまたはこれに代えて、βｈＣＧは異種のシグナル配列を含む。

【0066】

いくつかの実施形態において、分泌可能なバイオマーカーは、酵素、ペプチドホルモンまたはタンパク質もしくはペプチド抗原である。いくつかの実施形態において、分泌可能なバイオマーカーは、アルカリホスファターゼ、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、結腸がん分泌タンパク質２（ＣＣＳＰ－２）、カテプシンＢ、Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ（Ｇｌｕｃ）、Ｍｅｔｒｉｄｉａルシフェラーゼ（ＭＬｕｃ）、これらのサブユニット、これらの断片、およびこれらの任意の２またはそれを超える組み合わせから選択される分泌タンパク質（またはこれに由来するペプチドのサブユニット）である。いくつかの実施形態において、分泌可能なバイオマーカーは、血液、血清、血漿、粘液、尿および唾液などの生物学的試料中で検出され、それにより疾患上皮細胞の存在を検出する。

【0067】

いくつかの実施形態において、分泌可能なバイオマーカーは、酵素アッセイ（例えば、分泌可能なバイオマーカーが酵素活性を有する場合）またはイムノアッセイを使用することによって測定される。これらのまたは他の実施形態において、分泌可能なバイオマーカーは、凝集、電流測定、原子吸光分析法、原子発光分析法、円二色性（ＣＤ）、化学発光、比色分析、ディップスティックアッセイ、ラテラルフローイムノアッセイ、蛍光定量法、電気泳動アッセイ、酵素アッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ガスクロマトグラフィー、重量測定、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、イムノアッセイ、免疫蛍光酵素アッセイ、質量分析、核磁気共鳴、ラジオイムノアッセイ、分光測定、滴定法、ウェスタンブロッティングまたはこれらの任意の２もしくはそれを超える組み合わせから選択されるアッセイを使用して、試料において測定される。

【0068】

いくつかの実施形態において、分泌可能なバイオマーカーが生物学的試料において検出された場合、追加の試験（限定されないが、例えば、結腸鏡検査）が指示される。

【0069】

いくつかの実施形態において、分泌可能なバイオマーカーの発現は、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）、免疫組織化学、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ｍＲＮＡ蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＲＮＡ－ＦＩＳＨ）を含むＦＩＳＨ）および発色インサイチュハイブリダイゼーション（ＣＩＳＨ）から選択される技術を使用して生検試料において検出され得る。いくつかの実施形態において、疾患上皮もしくは胃腸（ＧＩ）組織および／または胃腸組織とつながっている管の上皮（例えば、胆管、膵管および総胆管を裏打ちする上皮組織）の場所を特定するために、分泌可能なバイオマーカーの発現が使用され得る。

【0070】

いくつかの実施形態において、分泌可能なバイオマーカーはヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）である。ｈＣＧは、２つのサブユニット：αおよびβサブユニットから構成されるホルモンである。いくつかの実施形態において、ヒト絨毛性ゴナドトロピンは、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのαサブユニット（αｈＣＧ）であり得る。いくつかの実施形態において、ヒト絨毛性ゴナドトロピンは、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのβサブユニット（βｈＣＧ）であり得る。ｈＣＧは主に肝臓によって異化されるが、約２０％は尿中に排泄される。ベータサブユニットは腎臓内で分解されて、尿ｈＣＧ試験によって測定されるコア断片を生成する。妊娠を通じた尿中のｈＣＧの排泄パターンは十分に確立されている。唾液中へのｈＣＧの排出も報告されている。したがって、いくつかの実施形態において、ｈＣＧは、血液、血清、血漿、尿および／または唾液を使用して測定される。

【0071】

いくつかの実施形態において、ｈＣＧ（例えば、βｈＣＧ）は、体液中での分布（例えば、排泄の減少または増加および安定性の増加）に関して最適化される。いくつかの実施形態において、ｈＣＧは、血液中での分布に関して最適化される。いくつかの実施形態において、ｈＣＧは、尿中での分布に関して最適化される。したがって、いくつかの実施形態において、ｈＣＧは、（例えば、尿または糞便中での）排泄の増加に関して最適化される。代替の実施形態において、ｈＣＧ（例えば、βｈＣＧ）は、排泄の減少に関して最適化され、血中へのｈＣＧの蓄積をもたらす。いくつかの実施形態において、ｈＣＧは、蓄積の増加をもたらす安定性の増加（例えば、改善されたタンパク質フォールディングおよび／またはタンパク質分解に対する安定性）に関して最適化される。例示的な実施形態において、ｈＣＧ（例えば、βｈＣＧ）は、安定性の増加および排泄の減少に関して最適化され、血液中への蓄積をもたらす。別の例示的な実施形態において、ｈＣＧ（例えば、βｈＣＧ）は、安定性の増加および排泄の増加を有し、尿中への蓄積をもたらす。

【0072】

いくつかの実施形態において、ｈＣＧは、１つの抗ｈＣＧ抗体またはその断片を使用して測定される。いくつかの実施形態において、ｈＣＧは、２つの抗ｈＣＧ抗体またはその断片（複数可）を使用して測定される。いくつかの実施形態において、２つの抗ｈＣＧ抗体またはその断片（複数可）は、異なるエピトープを結合する。いくつかの実施形態において、ｈＣＧは、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）などの免疫測定アッセイを使用して測定される。いくつかの実施形態において、ｈＣＧは、直接ＥＬＩＳＡ、間接ＥＬＩＳＡ、サンドイッチＥＬＩＳＡおよび競合ＥＬＩＳＡから選択されるＥＬＩＳＡを使用して測定される。いくつかの実施形態において、市販のｈＣＧ検出キットのいずれもが使用され得る。

【0073】

例示的な実施形態において、疾患上皮組織を検出するための方法は、（ｉ）ｈＣＧまたはその断片をコードする外因性遺伝子を含む本明細書に開示されている任意の実施形態の遺伝子操作された微生物を、投与することを必要とする対象の標的上皮組織（消化管の標的組織など）に投与することと、（ｉｉ）血液、血清、血漿、尿および唾液から選択される生物学的試料を対象から得ることと、（ｉｉｉ）対象から得られた生物学的試料中のｈＣＧまたはその断片を測定することとを含む。本明細書中に開示される実施形態のいずれにおいても、検出は、凝集アッセイ、化学発光、比色分析、蛍光定量法、定量的イムノアッセイ、ディップスティックアッセイ、ラテラルフローイムノアッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）またはこれらの任意の２もしくはそれを超える組み合わせを使用して行われる。

【0074】

いくつかの実施形態において、ｈＣＧまたはその断片が生物学的試料において検出された場合、追加の試験（限定されないが、例えば、結腸鏡検査）が指示される。

【0075】

いくつかの実施形態において、ｈＣＧまたはその断片の発現は、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）、免疫組織化学、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ｍＲＮＡ蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＲＮＡ－ＦＩＳＨ）を含むＦＩＳＨ）および発色インサイチュハイブリダイゼーション（ＣＩＳＨ）から選択される技術を使用して生検試料において検出され得る。いくつかの実施形態において、疾患上皮もしくは胃腸（ＧＩ）組織および／または胃腸組織とつながっている管の上皮（例えば、胆管、膵管および総胆管を裏打ちする上皮組織）の場所を特定するために、ｈＣＧの発現が使用され得る。

【0076】

いくつかの実施形態において、分泌可能なバイオマーカーはアルカリホスファターゼである。いくつかの実施形態において、アルカリホスファターゼは分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）である。アルカリホスファターゼは、通常、膜結合型であり、したがって分泌されない。理論に束縛されるものではないが、膜アンカードメインをコードする配列中への終止コドンの導入は、完全に活性な分泌型アルカリホスファターゼをもたらし得る。Ｌｏｗｅ，“Ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ＣＯＯＨ Ｔｅｒｍｉｎｕｓ ｏｆ Ｐｌａｃｅｎｔａｌ Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ：Ａ Ｓｉｎｇｌｅ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｃｈａｎｇｅ Ｃｏｎｖｅｒｔｓ ａ Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ－ｇｌｙｃａｎ－ａｎｃｈｏｒｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｏ ａ Ｓｅｃｒｅｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ” Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１１６（３）：７９９－８０７（１９９２）。

【0077】

いくつかの実施形態において、アルカリホスファターゼ（限定されないが、例えば、ＳＥＡＰ）は、血液試料からアッセイされ得る。いくつかの実施形態において、分泌型アルカリホスファターゼは、酵素アッセイを使用して測定される。いくつかの実施形態において、発色性、蛍光性、発光性および／または基質が、アッセイにおいて使用され得る。例示的な発色性アルカリホスファターゼ基質としては、５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリルホスファート（ＢＣＩＰ）、ｐ－ニトロフェニルホスファート（ｐＮＰＰ）および４－クロロ－２－メチルベンゼンジアゾニウム／３－ヒドロキシ－２－ナフトエ酸２，４－ジメチルアニリドホスファートが挙げられるが、これらに限定されない。例示的な発光性アルカリホスファターゼ基質としては、限定されないが、ジオキセタンホスファート（例えば、アダマンチルジオキセタンフェニルホスファートおよびクロロ－５－置換アダマンチル－１，２－ジオキセタンホスファート（ＣＳＰＤ））が挙げられ、例示的な蛍光性アルカリホスファターゼ基質としては、限定されないが、４－メチルウンベリフェリルホスファート二ナトリウム塩（ＭＵＰ）および６，８－ジフルオロ－７－ヒドロキシ－４－メチルクマリンホスファートが挙げられる。

【0078】

いくつかの実施形態において、アルカリホスファターゼ（限定されないが、例えば、ＳＥＡＰ）を検出するために、ｐ－ニトロフェニルホスファート（ｐＮＰＰ）、４－メチルウンベリフェリルリン酸二ナトリウム塩（ＭＵＰ）およびクロロ－５－置換アダマンチル－１，２－ジオキセタンホスファート（ＣＳＰＤ）から選択される基質が使用され得る。いくつかの実施形態において、酵素アッセイは、比色、蛍光および／または化学発光の読み出しを使用し得る。例示的な実施形態において、ｐ－ニトロフェニルホスファート（ｐＮＰＰ）が基質として使用され得、アルカリホスファターゼ（限定されないが、例えば、ＳＥＡＰ）は、比色読み出しを使用して生物学的試料からアッセイされ得る。別の例示的な実施形態において、４－メチルウンベリフェリルリン酸二ナトリウム塩（ＭＵＰ）が基質として使用され得、アルカリホスファターゼ（限定されないが、例えば、ＳＥＡＰ）は、蛍光読み出しを使用して生物学的試料からアッセイされ得る。さらに別の例示的な実施形態において、クロロ－５－置換アダマンチル－１，２－ジオキセタンホスファート（ＣＳＰＤ）が基質として使用され得、アルカリホスファターゼ（限定されないが、例えば、ＳＥＡＰ）は、化学発光読み出しを使用して生物学的試料からアッセイされ得る。

【0079】

例示的な実施形態において、疾患上皮組織もしくは胃腸（ＧＩ）組織および／または胃腸組織とつながっている管の疾患上皮（例えば、胆管、膵管および総胆管を裏打ちする上皮組織）を検出するための方法は、（ｉ）アルカリホスファターゼをコードする外因性遺伝子を含む本明細書に開示されている任意の実施形態の遺伝子操作された微生物を、投与を必要とする対象の標的上皮細胞（消化管の標的細胞など）に投与することと、（ｉｉ）血液、血清または血漿から選択される生物学的試料を対象から得ることと、（ｉｉｉ）対象から得られた生物学的試料中のアルカリホスファターゼを測定することとを含む。本明細書中に開示される実施形態のいずれにおいても、検出は、化学発光、比色分析、蛍光定量法、定量的イムノアッセイ、ラテラルフローイムノアッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）またはこれらの任意の２もしくはそれを超える組み合わせを使用して行われる。

【0080】

いくつかの実施形態において、アルカリホスファターゼが生物学的試料において検出された場合、追加の試験（限定されないが、例えば、結腸鏡検査）が指示される。

【0081】

いくつかの実施形態において、アルカリホスファターゼの発現は、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）、免疫組織化学、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ｍＲＮＡ蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＲＮＡ－ＦＩＳＨ）を含むＦＩＳＨ）および発色インサイチュハイブリダイゼーション（ＣＩＳＨ）から選択される技術を使用して生検試料において検出され得る。いくつかの実施形態において、疾患上皮もしくは胃腸（ＧＩ）組織および／または胃腸組織とつながっている管の上皮（例えば、胆管、膵管および総胆管を裏打ちする上皮組織）の場所を特定するために、アルカリホスファターゼの発現が使用され得る。

【0082】

いくつかの実施形態において、分泌可能なバイオマーカーはルシフェラーゼである。いくつかの実施形態において、ルシフェラーゼは、Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ（Ｇｌｕｃ）、Ｍｅｔｒｉｄｉａルシフェラーゼ（ＭＬｕｃ）、そのサブユニット、その断片である。Ｇｌｕｃは、哺乳動物細胞から活性形態で天然に分泌される。さらに、Ｇｌｕｃは、少なくとも尿中に排泄される。したがって、いくつかの実施形態において、Ｇｌｕｃは、血液、血清、血漿、尿および／または唾液を使用して測定され得る。

【0083】

いくつかの実施形態において、ルシフェラーゼは、Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ（Ｇｌｕｃ）またはその誘導体である。いくつかの実施形態において、ルシフェラーゼは酵素アッセイを用いて測定される。いくつかの実施形態において、ルシフェラーゼは、ルシフェリンを基質として用いて測定される。ルシフェリンは、限定されないが、ホタルルシフェリン、Ｌａｔｉａルシフェリン、細菌ルシフェリン、渦鞭毛藻類ルシフェリン、ヴァルグリンまたはフォックスファイアであり得る。いくつかの実施形態において、ＡＴＰが補因子であり得る。いくつかの実施形態において、ルシフェリンはセレンテラジンである。いくつかの実施形態において、ルシフェラーゼは発光読み出しを用いて測定される。いくつかの実施形態において、生物学的試料は、血液、尿および唾液から選択される。

【0084】

Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ（Ｇｌｕｃ）は、多数のジスルフィド結合を有する小さなルシフェラーゼである。Ｇｌｕｃは血清中で安定であるが、細菌環境はジスルフィド結合の形成を許容しないので、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞質中では活性ではない。したがって、いくつかの実施形態において、Ｇｌｕｃの発現は、疾患ヒト細胞によるＧｌｕｃの産生および分泌を示す。いくつかの実施形態において、Ｇｌｕｃをコードする遺伝子は、疾患ヒト細胞によるＧｌｕｃの産生および分泌を確実にするためにイントロンを含む。

【0085】

Ｇｌｕｃは、活性のための補因子（例えば、ＡＴＰ）を一切必要とせず、青色光（４８０ｎｍ）の発光をもたらす反応において基質セレンテラジンの酸化を触媒する。したがって、いくつかの実施形態において、Ｇｌｕｃは発光を使用して測定され得る。他の実施形態において、Ｇｌｕｃは、定量的イムノアッセイ、ラテラルフローイムノアッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）などのイムノアッセイを使用して測定され得る。

【0086】

いくつかの実施形態において、Ｇｌｕｃは、体液中での分布（例えば、排泄の減少または増加および安定性の増加）に関して最適化される。いくつかの実施形態において、Ｇｌｕｃは、血液中での分布に関して最適化される。いくつかの実施形態において、Ｇｌｕｃは、尿中での分布に関して最適化される。したがって、いくつかの実施形態において、Ｇｌｕｃは、（例えば、尿または糞便中での）排泄の増加に関して最適化される。代替の実施形態において、Ｇｌｕｃ（例えば、βＧｌｕｃ）は、排泄の減少に関して最適化され、血中へのＧｌｕｃの蓄積をもたらす。いくつかの実施形態において、Ｇｌｕｃは、蓄積の増加をもたらす安定性の増加（例えば、改善されたタンパク質フォールディングおよび／またはタンパク質分解に対する安定性）に関して最適化される。例示的な実施形態において、Ｇｌｕｃは、安定性の増加および排泄の減少に関して最適化され、血液中への蓄積をもたらす。別の例示的な実施形態において、Ｇｌｕｃは、安定性の増加および排泄の増加を有し、尿中への蓄積をもたらす。

【0087】

例示的な実施形態において、疾患上皮組織もしくは胃腸（ＧＩ）組織または胃腸組織とつながっている管の疾患上皮（例えば、胆管、膵管および総胆管を裏打ちする上皮組織）を検出するための方法は、（ｉ）Ｇｌｕｃまたはその断片をコードする外因性遺伝子を含む本明細書に開示されている任意の実施形態の遺伝子操作された微生物を、投与を必要とする対象の標的上皮細胞（消化管の標的細胞など）に投与することと、（ｉｉ）血液、血清、血漿、尿および唾液から選択される生物学的試料を対象から得ることと、（ｉｉｉ）対象から得られた生物学的試料中のＧｌｕｃまたはその断片を測定することとを含む。本明細書中に開示される実施形態のいずれにおいても、検出は発光アッセイを使用して行われる。

【0088】

いくつかの実施形態において、Ｇｌｕｃまたはその断片が生物学的試料において検出された場合、追加の試験（限定されないが、例えば、結腸鏡検査）が指示される。いくつかの実施形態において、Ｇｌｕｃまたはその断片の発現は、結腸鏡検査中に、発光に基づいて検出され得る。これらの実施形態において、セレンテラジンは、結腸鏡検査の前または間に対象に投与され得る。

【0089】

いくつかの実施形態において、Ｇｌｕｃまたはその断片の発現は、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）、免疫組織化学、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ｍＲＮＡ蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＲＮＡ－ＦＩＳＨ）を含むＦＩＳＨ）および発色インサイチュハイブリダイゼーション（ＣＩＳＨ）から選択される技術を使用して生検試料において検出され得る。いくつかの実施形態において、疾患胃腸（ＧＩ）組織および／または胃腸組織とつながっている管の疾患上皮（例えば、胆管、膵管および総胆管を裏打ちする上皮組織）の場所を特定するために、Ｇｌｕｃの発現が使用され得る。

【0090】

いくつかの実施形態において、分泌可能なバイオマーカーはヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）である。ＣＥＡは、いくつかの正常な成体組織および同じ自己抗原を発現する腫瘍において天然に発現される。いくつかの実施形態において、分泌可能なバイオマーカーは結腸がん分泌タンパク質２（ＣＣＳＰ２）である。ＣＣＳＰ２の発現は、一般に、正常な身体組織には存在しないが、結腸腺腫および結腸がんにおいて誘導される。いくつかの実施形態において、分泌可能なバイオマーカーはカテプシンＢである。カテプシンＢは、リソソームシステインプロテアーゼのファミリーに属し、細胞内タンパク質分解において重要な役割を果たす。カテプシンＢは、血清および尿の両方に見出される。

【0091】

本明細書に開示されている遺伝子操作された微生物は、表面タンパク質をコードする１またはそれを超える遺伝子を含み、表面タンパク質は、疾患胃腸組織の上皮細胞の管腔側に特異的に露出している１またはそれを超える細胞膜受容体と特異的に相互作用する。この局面では、いくつかの実施形態において、表面タンパク質は、遺伝子操作された微生物による疾患組織の上皮細胞の結合および侵入を特異的に促進する。

【0092】

いくつかの実施形態において、表面タンパク質は、インベイシンまたはその断片である。いくつかの実施形態において、表面タンパク質はインベイシンであり、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａインベイシン、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓインベイシン（配列番号１）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ＰａｇＮ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ Ａｌｓ３およびＥ．ｃｏｌｉインチミンから選択される。

【0093】

いくつかの実施形態において、表面タンパク質は、インベイシン（配列番号１）またはＹａｄＡ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａプラスミド接着因子）である。代替的な表面タンパク質としては、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ侵入因子ＲｉｃｋＡ（アクチン重合タンパク質）、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ＲａＩＦ（グアニン交換因子）、１もしくはそれを超えるＮｅｉｓｓｅｒｉａ侵入因子（例えば、ＮａｄＡ（ナイセリア接着／侵入因子）、ＯｐＡおよびＯｐＣ（不透明関連接着））、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ＩｎｌＡおよび／もしくはＩｎｌＢ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ侵入プラスミド抗原（例えば、ＩｐａＡ、ＩｐａＢ、ＩｐａＣ、ＩｐｇＤ、ＩｐａＢ－ＩｐａＣ複合体、ＶｉｒＡおよびＩｃｓＡ）の１つもしくはそれより多く、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ侵入因子（例えば、ＳｉｐＡ、ＳｉｐＣ、ＳｐｉＣ、ＳｉｇＤ、ＳｏｐＢ、ＳｏｐＥ、ＳｏｐＥ２およびＳｐｔＰ）の１つもしくはそれより多く、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ＦｎＢＰＡおよび／もしくはＦｎＢＰＢ、１もしくはそれを超えるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ侵入因子（ＡＣＰ、Ｆｂａ、Ｆ２、Ｓｆｂ１、Ｓｆｂ２、ＳＯＦおよびＰＦＢＰ）ならびに／またはＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓＦｉｍＢ（インテグリン結合タンパク質線毛（ｆｉｂｒｉａｅ））が挙げられる。いくつかの実施形態において、表面タンパク質は、インベイシン、ＹａｄＡ、ＲｉｃｋＡ、ＲａＩＦ、ＮａｄＡ、ＯｐＡ、ＯｐＣ、ＩｎｌＡ、ＩｎｌＢ、ＩｐａＡ、ＩｐａＢ、ＩｐａＣ、ＩｐｇＤ、ＩｐａＢ－ＩｐａＣ、ＶｉｒＡ、ＩｃｓＡ、ＳｉｐＡ、ＳｉｐＣ、ＳｐｉＣ、ＳｉｇＤ、ＳｏｐＢ、ＳｏｐＥ、ＳｏｐＥ２、ＳｐｔＰ、ＦｎＢＰＡ、ＦｎＢＰＢ、ＡＣＰ、Ｆｂａ、Ｆ２、Ｓｆｂ１、Ｓｆｂ２、ＳＯＦ、ＰＦＢＰおよびＦｉｍＢの１またはそれより多くの活性断片を含む。いくつかの実施形態において、断片は、本明細書に開示されている操作された微生物の表面、例えば接着足場上に発現される。いくつかの実施形態において、表面タンパク質は、インベイシンとインチミンとの融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、インチミンの３つのＣ末端の１またはそれを超えるドメイン（例えば、Ｄ１、Ｄ２およびＤ３）をインベイシンのＣ末端ドメインで置き換えることによって、インチミン－インベイシンが作製された。

【0094】

いくつかの実施形態において、表面タンパク質は、ＩＩＩ型分泌系またはその成分である。いくつかの実施形態において、表面タンパク質は、がん性細胞および前がん性細胞の表面に特異的に結合するペプチドまたはタンパク質を含み、必要に応じて、タンパク質は、ペプチド、レプチン、抗体、またはこれらの断片（例えば、Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）としても知られているｓｄＡｂおよびｓｃＦｖ断片）から選択される。いくつかの実施形態において、表面タンパク質は、レプチン、抗体、またはこれらの断片の１つまたはそれより多くを含む。抗体の断片の実例は、限定されないが、ラクダ科動物のナノボディを含む単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ、Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）としても知られる）またはｓｃＦｖ断片である。いくつかの実施形態において、レプチン、抗体、またはこれらの断片は、微生物の表面タンパク質との融合タンパク質として提示される。いくつかの実施形態において、微生物の表面タンパク質は、インベイシン、インチミンおよびアドヘシンから選択される。いくつかの実施形態において、ペプチドまたはラクダ科動物のナノボディは、がん細胞表面受容体に結合するその能力に関して選択される。いくつかの実施形態において、表面タンパク質は、がん性組織または前がん性病変（ポリープまたは腺腫）、涙およびびらん（バレット食道）または炎症性疾患中の誤った場所に局在化したタンパク質に特異的に結合するペプチドまたはタンパク質を含む。

【0095】

表面タンパク質の同一性により、本明細書に開示されている遺伝子操作された微生物は、天然の表面タンパク質の親和性を模倣し得る。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されている遺伝子操作された微生物は、口腔上皮細胞、舌の頬側上皮細胞、咽頭上皮細胞、粘膜上皮細胞、胃の内皮細胞、腸上皮細胞、結腸上皮などの１つまたはそれより多くに特異的に結合し得る。

【0096】

いくつかの実施形態において、本明細書に開示されている遺伝子操作された微生物は、エンドサイトーシス液胞を溶解し、それによってファゴソームのポア形成、破壊または分解に寄与する溶解素をコードする第２の外因性遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、溶解素は、コレステロール依存性細胞溶解素である。いくつかの実施形態において、溶解素は、リステリオリシンＯ、イバノリシンＯ、ストレプトリシン、パーフリンゴリシン、ボツリノリジン、ロイコシジンおよびこれらの変異体誘導体からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、溶解素は、リステリオリシンＯまたはその変異体誘導体である。いくつかの実施形態において、リステリオリシンＯの変異体誘導体は、分泌されず、細胞質に留まる誘導体（例えば、配列番号８）である。いくつかの実施形態において、リステリオリシンＯの変異体誘導体は、ペリプラズムにおいて分泌される誘導体（例えば、配列番号２）である。いくつかの実施形態において、リステリオリシンＯの変異体誘導体は、外膜の外側に分泌される誘導体である。

【0097】

本技術の遺伝子操作された微生物は、ヒトＧＩ管の正常フローラである非病原性微生物、またはヨーグルト、チーズ、パンなどの食品を介したヒトの摂取に安全であると一般に認識されている微生物などの任意の非病原性微生物に由来し得る。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されている実施形態の任意の１つの遺伝子操作された微生物は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ、ＢａｃｉｌｌｕｓおよびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉから選択される微生物に由来し得る。本明細書に開示されている実施形態の任意の１つの微生物を遺伝子操作するのに適した例示的な種としては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｎｉｍａｌｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｓｓｅｎｃｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆａｅｃｉｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ｓｕｂｓｐ．ｉｎｆａｎｔｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｓｅｕｄｏｌｕｎｇｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｏｕｌａｒｄｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｓｐ．Ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ ＧＧ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ、Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｒｏｐｒｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂｏｕｌａｒｄｉｉおよびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉが挙げられる。

【0098】

いくつかの実施形態において、本明細書に開示されている実施形態の任意の１つの遺伝子操作された微生物は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ １９１７、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｓｙｍｂｉｏｆｌｏｒ２（ＤＳＭ １７２５２）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ株Ａ０ ３４／８６、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｏ８３（Ｃｏｌｉｎｆａｎｔ）などのプロバイオティックＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ株に由来し得る。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されている実施形態の任意の１つの遺伝子操作された微生物は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ １９１７に由来する。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ １９１７の完全なゲノム配列は公知である。Ｒｅｉｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８７：１０６－７（２０１４）。

【0099】

いくつかの実施形態において、本明細書に開示されている実施形態の任意の１つの遺伝子操作された微生物は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ １９１７またはその誘導体である。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ １９１７は、２つの天然に存在する安定な潜在プラスミドｐＭＵＴ１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＭＷ２４０７１２）およびプラスミドｐＭＵＴ２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＰ０２３３４２）を含有する。いくつかの実施形態において、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ １９１７またはその誘導体は、プラスミドｐＭＵＴ１および／またはプラスミドｐＭＵＴ２および／または１もしくはそれを超えるこれらの誘導体を保有する。いくつかの実施形態において、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ １９１７またはその誘導体は、プラスミドｐＭＵＴ１および／またはプラスミドｐＭＵＴ２をキュアリングされている。

【0100】

いくつかの実施形態において、表面タンパク質をコードする遺伝子は、微生物のゲノムに組み込まれる。これに加えてまたはこれに代えて、溶解素をコードする遺伝子は、微生物のゲノムに組み込まれる。いくつかの実施形態において、表面タンパク質をコードする遺伝子および溶解素をコードする遺伝子は、単一のゲノム部位に組み込まれる。いくつかの実施形態において、単一のゲノム部位は、バクテリオファージの組み込み部位および／またはプラスミドの組み込み部位である。したがって、いくつかの実施形態において、分泌可能なバイオマーカーをコードする遺伝子は、バクテリオファージλ組み込み部位ａｔｔＢに挿入され得る。

【0101】

いくつかの実施形態において、表面タンパク質をコードする遺伝子は、微生物のプラスミドに組み込まれる。これに加えてまたはこれに代えて、溶解素をコードする遺伝子は、プラスミドに組み込まれる。いくつかの実施形態において、プラスミドは、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ １９１７などの微生物中に存在する天然に存在するプラスミドであるか、または操作されたプラスミドである。いくつかの実施形態において、表面タンパク質をコードする遺伝子および溶解素をコードする遺伝子は、単一のプラスミドに組み込まれる。

【0102】

いくつかの実施形態において、分泌可能なバイオマーカーをコードする遺伝子は、微生物（例えば、ｐＭＵＴ１、ｐＭＵＴ２および／またはそれらの誘導体などの、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ １９１７）由来の天然の内因性プラスミドに挿入され得る。いくつかの実施形態において、プラスミドは、本明細書中に記載されるような栄養要求性変異の相補性などの選択機構を含む。いくつかの実施形態において、プラスミドはマルチコピープラスミド（例えば、高コピー数プラスミド）であり、それにより、細胞侵入の際に高い核酸ペイロードを提供する。代替の実施形態において、表面タンパク質をコードする遺伝子は、同じまたは異なるプラスミドに挿入される。いくつかの実施形態において、溶解素をコードする遺伝子は、同じまたは異なるプラスミドに挿入される。

【0103】

これに加えてまたはこれに代えて、分泌可能なバイオマーカーをコードする遺伝子は、微生物のゲノムに組み込まれる。いくつかの実施形態において、表面タンパク質をコードする遺伝子、溶解素をコードする第２の遺伝子および分泌可能なバイオマーカーをコードする遺伝子は、単一のゲノム部位に組み込まれる。いくつかの実施形態において、単一のゲノム部位は、バクテリオファージの組み込み部位および／またはプラスミドの組み込み部位である。

【0104】

いくつかの実施形態において、プラスミドおよび／または第２のプラスミドは選択機構を含む。いくつかの実施形態において、選択機構は、プラスミド維持のために抗生物質を必要としなくてよい。したがって、いくつかの実施形態において、選択機構は、抗生物質耐性マーカー、毒素－抗毒素系、必須遺伝子における変異の相補性を引き起こすマーカー、シス作用遺伝要素、およびこれらの任意の２またはそれを超える組み合わせから選択される。

【0105】

いくつかの実施形態において、選択機構は、治療のためにヒトまたは動物では使用されないかまたはまれである抗生物質に対する耐性マーカーである。いくつかの実施形態において、プラスミドおよび／または第２のプラスミドの選択のために使用される選択機構は、カナマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子およびこれらの組み合わせから選択される抗生物質耐性マーカーである。これに加えてまたはこれに代えて、いくつかの実施形態において、プラスミドおよび／または第２のプラスミドの選択のために使用される選択機構は、プラスミドＲ１のｈｏｋ／ｓｏｋ系、プラスミドＲＫ２のｐａｒＤＥ系、ＦプラスミドのｃｃｄＡＢ、ＦプラスミドのｆｌｍＡＢ、プラスミドＲ１のｋｉｓ／ｋｉｄ系、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓのＸＣＶ２１６２－ｐｔａＲＮＡ１、腸管出血性Ｅ．ｃｏｌｉまたはＫｌｅｂｓｉｅｌｌａのａｔａＴ－ａｔａＲ、Ｅｒｗｉｎｉａ ｃａｒｏｔｏｖｏｒａのｔｏｘＩＮ系、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓのｐａｒＥ－ｐａｒＤ系、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓプラスミドＡＤ１からのｆｓｔ－ＲＮＡＩＩ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓプラスミドｐＳＭ１９０３５のε－ζ系およびこれらの任意の２またはそれを超える組み合わせから選択される毒素－抗毒素系である。これに加えてまたはこれに代えて、いくつかの実施形態において、プラスミドおよび／または第２のプラスミドの選択のために使用される選択機構は、細胞壁合成のために必要とされる必須栄養素もしくは基質（例えば、アミノ酸）の生合成および／またはハウスキーピング機能に関与する酵素をコードする必須遺伝子である。細胞壁合成のために必要とされる例示的なアミノ酸には、Ｄ－アラニンおよびジアミノピメリン酸が含まれる。いくつかの実施形態において、必須遺伝子は、ｄａｐＡ、ｄａｐＤ、ｍｕｒＡ、ａｌｒ、ｄａｄＸ、ｍｕｒＩ、ｄａｐＥ、ｔｈｙＡおよびこれらの任意の２またはそれを超える組み合わせから選択される。いくつかの実施形態において、必須遺伝子は、ａｌｒとｄａｄＸ（いずれもアラニンラセマーゼをコードする）の組み合わせである。いくつかの実施形態において、必須遺伝子はａｌｒとｄａｄＸの組み合わせであり、プラスミドは、機能的ａｌｒ遺伝子（ａｌｒ^＋、例えば野生型ａｌｒ遺伝子）を選択マーカーとして使用して選択される。いくつかの実施形態において、プラスミドおよび／または第２のプラスミドは、プラスミドおよび／または第２のプラスミドに存在する機能的ａｌｒ遺伝子によるａｌｒおよびｄａｄＸ変異の相補性によって選択される。いくつかの実施形態において、ハウスキーピング機能は、ｉｎｆＡ、ＲＮＡポリメラーゼのサブユニットをコードする遺伝子、ＤＮＡポリメラーゼ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、細胞分裂タンパク質、シャペロンタンパク質およびこれらの任意の２またはそれを超える組み合わせから選択される。これに加えてまたはこれに代えて、いくつかの実施形態において、プラスミドおよび／または第２のプラスミドの選択のために使用される選択機構は、ＣｏｌＥ１ ｃｅｒ遺伝子座またはｐＳＣ１０１からのｐａｒなどのシス作用遺伝要素である。

【0106】

いくつかの実施形態において、遺伝子操作された微生物が、分泌可能なバイオマーカーをコードする遺伝子のｍＲＮＡ分子を疾患上皮細胞（標的細胞）に送達する場合、分泌可能なバイオマーカーをコードする遺伝子は遺伝子操作された微生物のゲノムに組み込まれる。いくつかの実施形態において、遺伝子操作された微生物が分泌可能なバイオマーカーをコードする遺伝子のｍＲＮＡ分子を疾患上皮細胞（標的細胞）に送達する場合、分泌可能なバイオマーカーをコードする遺伝子はプラスミドに存在する。

【0107】

代替の実施形態において、遺伝子操作された微生物が、分泌可能なバイオマーカーをコードする遺伝子を含むＤＮＡ分子（例えば、プラスミド）を疾患上皮細胞（標的細胞）に送達する場合、分泌可能なバイオマーカーをコードする遺伝子はプラスミドに存在する。いくつかの実施形態において、分泌可能なバイオマーカーをコードする遺伝子を含むプラスミドは、ＤＮＡ結合タンパク質に対する少なくとも１つの結合部位をさらに含む。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ結合タンパク質のための結合部位は、ＤＮＡ結合タンパク質のための一群の複数の隣接する結合部位を形成する。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ結合タンパク質は、１またはそれを超える核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む。これらの実施形態において、ＤＮＡ結合タンパク質は、ＤＮＡ分子（例えば、プラスミド）を結合し、１またはそれを超える核局在化シグナル（ＮＬＳ）を介してＤＮＡ分子（例えば、プラスミド）の核移行を促進する。いくつかの実施形態において、ＮＬＳはＳＶ４０ Ｔ抗原ＮＬＳ配列（ＫＫＫＲＫＶ）である。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ結合タンパク質はＮＦκＢである。いくつかの実施形態において、微生物は、１またはそれを超える核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含むＤＮＡ結合タンパク質をコードする遺伝子を含む。理論に束縛されるものではないが、１またはそれを超える核局在化シグナルを含むＤＮＡ結合タンパク質は、少なくとも１つの検出マーカーをコードする１またはそれを超える遺伝子を含むプラスミド上のＤＮＡ結合タンパク質のための少なくとも１つの結合部位を結合し、１またはそれを超える核局在化シグナルの作用を介してプラスミドの核移行を促進すると考えられる。したがって、これらの実施形態において、疾患上皮細胞は、微生物によって送達されるＤＮＡ分子（例えば、プラスミド）から少なくとも１つの検出マーカーを発現し、それによって疾患上皮細胞の検出を可能にする。

【0108】

いくつかの実施形態において、少なくとも１つの結合部位に結合するＤＮＡ結合タンパク質は、微生物によって発現される。例示的な実施形態において、分泌可能なバイオマーカーをコードする遺伝子を含むプラスミドは、一群のｌａｃオペレーターまたはｔｅｔオペレーターをさらに含み、微生物は、核局在化シグナルを含むｌａｃリプレッサーまたはｔｅｔリプレッサーを過剰発現する。他の実施形態において、少なくとも１つの結合部位に結合するＤＮＡ結合タンパク質は、疾患上皮細胞によって発現される。例示的な実施形態において、分泌可能なバイオマーカーをコードする遺伝子を含むプラスミドは、一群のＮＦκＢ結合部位をさらに含み、疾患上皮細胞はＮＦκＢを発現する。

【0109】

いくつかの実施形態において、ＤＮＡ結合タンパク質をコードする遺伝子は、ゲノムに組み込まれているか、またはプラスミドに存在する。

【0110】

いくつかの実施形態において、微生物は、侵入の際に哺乳動物細胞内で微生物の溶解を促進する少なくとも１つの栄養要求性変異を有する。このような変異には、細胞壁合成に関与する遺伝子または細胞壁合成のために必要とされる代謝産物の欠失、不活性化または低下した発現もしくは活性、ならびにポリンなどの他のタンパク質の変化が含まれる。いくつかの実施形態において、微生物は、ｄａｐＡ、ｄａｐＤ、ｄａｐＥ、ｍｕｒＡ、ａｌｒ、ｄａｄＸ、ｍｕｒＩ、ｔｈｙＡ、ａｒｏＣ、ｏｍｐＣおよびｏｍｐＦから選択される遺伝子における欠失または変異を有する。いくつかの実施形態において、微生物は、ｄａｐＡ、ａｌｒおよびｄａｄＸ栄養要求性変異の組み合わせを有する。いくつかの実施形態において、プラスミドは、プラスミドに存在する機能的ａｌｒ遺伝子によるａｌｒおよびｄａｄＸ変異の相補性によって選択される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの栄養要求性変異は、侵入の際に疾患哺乳動物細胞内で微生物の溶解を促進する。いくつかの実施形態において、ｄａｐＡ栄養要求性変異は、侵入の際に疾患哺乳動物細胞内で微生物の溶解を促進する。

【0111】

いくつかの実施形態において、対象の種および診断または処置されている疾患または状態に応じて、約１０^３～約１０^１１個の生きた遺伝子操作された微生物が対象に投与される。いくつかの実施形態において、約１０^５～約１０^９個の本開示の生きた遺伝子操作された微生物が対象に投与される。

【0112】

本開示の遺伝子操作された微生物は、発現されたマーカーの検出前に１～約５０回投与してよい。遺伝子操作された微生物は、マーカー検出の前に約１～約２１回、または１～約１４回、または約１～約７回投与してよい。遺伝子操作された微生物は、マーカー検出の約１時間～約２ヶ月前に開始して投与してよい。遺伝子操作された微生物の投与は、マーカー検出の前、少なくとも約１時間、少なくとも約６時間、少なくとも約１２時間、少なくとも約２４時間、少なくとも約２日、少なくとも約３日、少なくとも約５日、少なくとも約７日、少なくとも約１０日、少なくとも約１５日、少なくとも約２０日、少なくとも約３０日、少なくとも約４０日、少なくとも約５０日または少なくとも約６０日までに開始してよい。

【0113】

本開示の遺伝子操作された微生物は、投与の際にそれらの標的細胞に侵入することができ、かつそれらのペイロードを送達することができる限り、任意の経路によって投与され得る。本開示の遺伝子操作された微生物が送達するペイロードは、一般に、分泌可能なバイオマーカーをコードする核酸分子である。いくつかの実施形態において、本技術の遺伝子操作された微生物は、経口および／または直腸経路によって投与される。

【0114】

本開示の遺伝子操作された微生物は、一般に、薬学的に許容され得る担体および／または希釈剤と共に投与される。使用される特定の薬学的に許容され得る担体および／または希釈剤は、本発明にとって重要ではない。希釈剤の例としては、リン酸緩衝食塩水、スクロースを含有するクエン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、重炭酸緩衝液（ｐＨ７．０）単独（Ｌｅｖｉｎｅら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．７９：８８８－９０２（１９８７）；およびＢｌａｃｋら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１５５：１２６０－１２６５（１９８７））、またはアスコルビン酸、ラクトース、および必要に応じてアスパルテーム（Ｌｅｖｉｎｅら、Ｌａｎｃｅｔ ２（８６０９）：４６７－７０（１９８８））を含有する重炭酸緩衝液（ｐＨ７．０）などの胃内の胃酸に対して緩衝するための緩衝液が挙げられる。担体の例としては、例えば脱脂乳に見出されるようなタンパク質、糖、例えばスクロース、またはポリビニルピロリドンが挙げられる。典型的には、これらの担体は、約０．１～３０％（ｗ／ｖ）の濃度で、好ましくは１～１０％（ｗ／ｖ）の範囲で使用されるであろう。

【0115】

送達のために使用され得る薬学的に許容され得る担体または希釈剤は、特定の投与経路に依存し得る。本開示の遺伝子操作された微生物が依然として標的細胞に侵入することができ、かつ本開示の遺伝子操作された微生物が運ぶペイロードを標的細胞に送達することができる限り、任意のこのような担体または希釈剤を本発明の遺伝子操作された微生物の投与のために使用することができる。適切な希釈剤および担体を決定するために、侵入性についてのインビトロまたはインビボ試験を行うことができる。本発明の組成物は、経口および／または直腸投与用に製剤化され得る。遺伝子操作された微生物が侵入性であり、かつ標的細胞との接触の際にまたは対象への投与の際に遺伝子操作された微生物のペイロードを送達することができる限り、凍結乾燥された形態も含まれる。技術および製剤は、一般に、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍｅａｄｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａに見出され得る。

【0116】

経口投与の場合、医薬組成物は、例えば、結合剤（例えば、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えば、ラクトース、微結晶セルロースまたはリン酸水素カルシウム）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ）；崩壊剤（例えば、ジャガイモデンプンまたはデンプングリコール酸ナトリウム）；または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）などの薬学的に許容され得る賦形剤を用いて、従来の手段によって調製された錠剤またはカプセル剤の形態を取り得る。錠剤は、当技術分野で周知の方法によってコーティングされ得る。経口投与用の液体調製物は、例えば、液剤、シロップ剤もしくは懸濁剤の形態を取り得、または使用前に水または他の適切なビヒクルで構成するための乾燥生成物として提供され得る。このような液体調製物は、懸濁化剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体、または硬化食用脂肪）；乳化剤（例えば、レシチンまたはアラビアゴム）；非水性ビヒクル（例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコール、または分別植物油）；および防腐剤（例えば、ｐ－ヒドロキシ安息香酸メチルもしくはプロピルまたはソルビン酸）などの薬学的に許容され得る添加剤を用いて従来の手段によって調製され得る。調製物は、適宜、緩衝塩、香味剤、着色剤および甘味剤も含有し得る。

【0117】

本明細書で提供される医薬組成物は、坐剤、膣坐薬、ペースト剤、粉剤・散剤（ｐｏｗｄｅｒ）、クリーム剤、軟膏剤、液剤、乳剤、懸濁剤、ゲル剤、フォーム剤、スプレー剤または浣腸剤の形態で直腸投与され得る。これらの剤形は、上記のＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙに記載されている従来の方法を使用して製造することができる。

【0118】

直腸坐剤は、直腸内に挿入するための固形物であり、常温では固体であるが、体温で融解または軟化して、本開示の遺伝子操作された微生物を直腸内に放出する。直腸坐剤において利用される薬学的に許容され得る担体としては、本明細書で提供される医薬組成物と共に製剤化された場合に、体温の付近で融点を生じさせる、硬化剤などの基剤またはビヒクル；ならびに亜硫酸水素塩およびメタ重亜硫酸ナトリウムを含む酸化防止剤が挙げられる。適切なビヒクルには、カカオバター（カカオ脂）、グリセリン－ゼラチン、カルボワックス（ポリオキシエチレングリコール）、鯨ろう、パラフィン、白蝋および黄蝋、ならびに脂肪酸のモノ－、ジ－およびトリグリセリドの適切な混合物、ポリビニルアルコール、ヒドロキシエチルメタクリラート、ポリアクリル酸などのヒドロゲル、グリセリン化ゼラチンが含まれるが、これらに限定されない。様々なビヒクルの組み合わせが使用され得る。直腸坐剤は、圧縮法または成形によって調製され得る。直腸坐剤の典型的な重量は、約２～約３ｇである。

【0119】

いくつかの実施形態において、本開示の遺伝子操作された微生物は、単一の組成物として投与されるか、または同じもしくは異なる時間に同じもしくは異なる投与経路（例えば、経口および直腸）を介して個別に投与される。いくつかの実施形態において、本開示の遺伝子操作された微生物は、直腸滴注に適した混合物または溶液で提供され、チオ硫酸ナトリウム、次没食子酸ビスマス、ビタミンＥおよびクロモリンナトリウムを含む。いくつかの実施形態において、本発明の治療用組成物は、坐剤形態で、ブチラート、およびグルタチオンモノエステル、グルタチオンジエチルエステルまたは他のグルタチオンエステル誘導体を含む。坐剤は、必要に応じて、チオ硫酸ナトリウムおよび／またはビタミンＥを含むことができる。医薬組成物はまた、例えばカカオバターまたは他のグリセリドなどの従来の坐剤基剤を含有する、坐剤または停留浣腸などの直腸組成物に製剤化され得る。

【0120】

いくつかの実施形態において、本開示の遺伝子操作された微生物は、浣腸製剤として製剤化される。浣腸製剤は、還元剤（または同様の作用様式を有する任意の他の作用物質）を含む。いくつかの実施形態において、本発明の浣腸製剤は、遺伝子操作された微生物を含む。浣腸製剤は、必要に応じて、ポリソルベート－８０（または任意の他の適切な乳化剤）、および／または酪酸ナトリウム（４個の炭素）、プロピオン酸ナトリウム（３個の炭素）、酢酸ナトリウム（２個の炭素）などの、結腸上皮エネルギー源としての任意の短鎖脂肪酸（例えば、５個、４個、３個または２個の炭素脂肪酸）、および／またはクロモリンナトリウム（ＧＡＳＴＲＯＣＲＯＭ）もしくはネドクロミルナトリウム（ＡＬＯＣＲＩＬ）などの任意の肥満細胞安定剤を含むことができる。

【0121】

いくつかの実施形態において、組成物は、本開示の約１０^５～約１０^９個の生きた遺伝子操作された微生物を含む。組成物がクロモリンナトリウムを含む場合、クロモリンナトリウムは約１０ｍｇ～約２００ｍｇ、または約２０ｍｇ～約１００ｍｇ、または約３０ｍｇ～約７０ｍｇの量で存在することができる。組成物がポリソルベート－８０を含む場合、ポリソルベート－８０は約１％（ｖ／ｖ）～約１０％（ｖ／ｖ）の濃度で提供され得る。組成物が酪酸ナトリウムを含む場合、酪酸ナトリウムは約５００～約１５００ｍｇの量で存在することができる。いくつかの実施形態において、浣腸としての投与に適した組成物は、本開示の遺伝子操作された微生物、クロモリンナトリウムおよびポリソルベート－８０を含むように製剤化される。いくつかの実施形態において、組成物は、アルファ－リポ酸および／またはＬ－グルタミンおよび／またはＮ－アセチルシステインおよび／または酪酸ナトリウム（１．１ｇｍ）をさらに含む。

【0122】

組成物は、所望であれば、活性成分を含有する１またはそれを超える単位剤形を含有し得るパックまたはディスペンサーデバイスおよび／またはキットで提供され得る。パックは、例えば、ブリスターパックなどの金属またはプラスチック箔を含み得る。パックまたはディスペンサーデバイスは、投与のための指示を伴い得る。

【0123】

様々な局面において、本発明は、胃腸（ＧＩ）組織の上皮組織および／または胃腸組織とつながっている管の疾患上皮（例えば、胆管、膵管および総胆管を裏打ちする上皮組織）などの疾患上皮組織を検出するための方法であって、（ｉ）本明細書に開示されている遺伝子操作された微生物を、投与することを必要とする対象の前記上皮組織に投与することと、（ｉｉ）前記分泌可能なバイオマーカーの発現を検出し、それにより、疾患上皮細胞の存在を検出することとを含む、方法を提供する。上述のように、微生物は、表面タンパク質をコードする外因性遺伝子を含み、前記表面タンパク質は、正常な胃腸組織の上皮細胞の管腔側に露出していないが、疾患に罹患している対象中の胃腸組織の疾患上皮細胞の管腔側に露出している１またはそれを超える細胞膜受容体と特異的に相互作用する。いくつかの実施形態において、表面タンパク質は、疾患上皮細胞における微生物の結合および侵入を促進する。微生物は、プロモーターに作動可能に連結された分泌可能なバイオマーカーをコードする遺伝子も含む。

【0124】

いくつかの実施形態において、分泌可能なバイオマーカーは哺乳動物プロモーターから発現される。いくつかの実施形態において、上皮発現またはＧＩ管上皮細胞特異的発現に対して活性であるか、または特異的である哺乳動物プロモーター。いくつかの実施形態において、哺乳動物プロモーターは、ＧＩ管上皮細胞特異的発現および／または胃腸組織とつながっている管の上皮（例えば、胆管、膵管および総胆管を裏打ちする上皮組織）に対して特異的な発現を指示する。これらの実施形態において、微生物は、ＤＮＡ分子（例えば、プラスミド）を疾患上皮細胞に送達する。いくつかの実施形態において、遺伝子操作された微生物は、経口または直腸経路を介して投与される。いくつかの実施形態において、本方法は、緩下剤を含む結腸洗浄剤の投与をさらに含む。いくつかの実施形態において、緩下剤を含む結腸洗浄剤は、微生物の投与前に投与される。

【0125】

疾患胃腸（ＧＩ）組織は、前がん性病変（複数可）、ＧＩ管がん、潰瘍性大腸炎、クローン病、バレット食道、過敏性腸症候群および過敏性腸疾患であり得る。例示的な前がん性病変（複数可）およびＧＩ管がんとしては、肛門の扁平上皮癌、肛門の低悪性度扁平上皮内病変（ＬＳＩＬ）、肛門の高悪性度扁平上皮内病変（ＨＳＩＬ）、結腸直腸がん、結腸直腸腺癌、家族性腺腫性ポリポーシス、遺伝性非ポリポーシス結腸直腸がん、結腸直腸ポリポーシス（例えば、ポイツ・ジェガース症候群、若年性ポリポーシス症候群、ＭＵＴＹＨ関連ポリポーシス、家族性腺腫性ポリポーシス／ガードナー症候群およびクロンカイト・カナダ症候群）、カルチノイド、腹膜偽粘液腫、十二指腸腺癌、小腸の前悪性腺腫、遠位胆管癌、胆管上皮内新生物（ＢｉｌＩＮ）、ＢｉｌＩＮ－１、ＢｉｌＩＮ－２、ＢｉｌＩＮ－３または胆管癌、膵管腺癌（ＰＤＡＣ）、膵臓上皮内新生物（ＰａｎＩＮ）、ＰａｎＩＮ－１、ＰａｎＩＮ－２、ＰａｎＩＮ－３、胃癌、印環細胞癌（ＳＲＣＣ）、胃リンパ腫（ＭＡＬＴリンパ腫）、形成性胃組織炎（ブリントン病）、および食道の扁平上皮癌および腺癌が挙げられる。

【0126】

いくつかの実施形態において、対象が前がん性病変、がん、潰瘍性大腸炎、クローン病、バレット食道、過敏性腸症候群または過敏性腸疾患に罹患しているので、胃腸（ＧＩ）組織および／または胃腸組織とつながっている管の上皮（例えば、胆管、膵管および総胆管を裏打ちする上皮組織）は、潜在的に疾患胃腸組織および／または疾患上皮であり得る。いくつかの実施形態において、前がん性病変は、無茎性ポリープ、鋸歯状ポリープ（例えば、過形成性ポリープ、無茎性鋸歯状腺腫／ポリープおよび古典的鋸歯状腺腫）、無茎性鋸歯状ポリープ、平坦型ポリープ、亜有茎性ポリープ、有茎性ポリープおよびこれらの組み合わせから選択されるポリープを含む。いくつかの実施形態において、ポリープは微小ポリープである。いくつかの実施形態において、前がん性病変は、ＢｉｌＩＮ－１、ＢｉｌＩＮ－２、ＢｉｌＩＮ－３および胆管癌から選択される胆管上皮内新生物（ＢｉｌＩＮ）を含む。いくつかの実施形態において、前がん性病変は、ＰａｎＩＮ－１、ＰａｎＩＮ－２、ＰａｎＩＮ－３および膵管腺癌（ＰＤＡＣ）から選択される膵臓上皮内新生物（ＰａｎＩＮ）を含む。いくつかの実施形態において、前がん性病変は約０．０５ｍｍ～約３０ｍｍのサイズを有する。いくつかの実施形態において、前がん性病変は、約０．１ｍｍ未満、約０．２５ｍｍ未満、約０．５ｍｍ未満、約１ｍｍ未満、約２ｍｍ未満、約５ｍｍ未満、約８ｍｍ未満、約１０ｍｍ未満、約１５ｍｍ未満、約２０ｍｍ未満、約２５ｍｍ未満または約３０ｍｍ未満のサイズを有する。

【0127】

いくつかの実施形態において、がんは、ポリープ、腺腫または明白ながんを含む。いくつかの実施形態において、がんは、リンチ症候群、家族性腺腫性ポリポーシス、遺伝性非ポリポーシス結腸がん（ＨＮＰＣＣ）または散発性がんを含む。いくつかの実施形態において、がんは、胆管上皮内新生物（ＢｉｌＩＮ）、ＢｉｌＩＮ－１、ＢｉｌＩＮ－２、ＢｉｌＩＮ－３または胆管癌）、膵臓上皮内新生物（ＰａｎＩＮ）、ＰａｎＩＮ－１、ＰａｎＩＮ－２、ＰａｎＩＮ－３または膵管腺癌（ＰＤＡＣ）を含む。

【0128】

いくつかの実施形態において、分泌可能なバイオマーカーは、蛍光タンパク質、生物発光タンパク質、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）用の造影剤、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）レポーター、酵素レポーター、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）において使用するための造影剤、単一光子放射型コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）レポーター、光音響レポーター、Ｘ線レポーター、超音波レポーター、およびイオンチャネルレポーター（例えばｃＡＭＰ活性化型カチオンチャネル）、ならびにこれらの任意の２またはそれを超える組み合わせから選択される。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される任意の実施形態の蛍光タンパク質、生物発光タンパク質、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）用の造影剤、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）レポーター、酵素レポーター、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）において使用するための造影剤、単一光子放射型コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）レポーター、光音響レポーター、Ｘ線レポーター、超音波レポーターおよびイオンチャネルレポーター（例えばｃＡＭＰ活性化型カチオンチャネル）が使用され得る。

【0129】

いくつかの実施形態において、方法は、少なくとも１つの生物発光タンパク質の１もしくはそれを超える基質、磁気共鳴画像法において使用するための少なくとも１つの造影剤の１もしくはそれを超える基質、１もしくはそれを超えるＰＥＴプローブ、酵素レポーターの１もしくはそれを超える基質、１もしくはそれを超えるＳＰＥＣＴプローブまたはこれらの任意の２もしくはそれを超える組み合わせの投与をさらに含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの生物発光タンパク質の１またはそれを超える基質、磁気共鳴画像法において使用するための少なくとも１つの造影剤の１またはそれを超える基質、１またはそれを超えるＰＥＴプローブ、酵素レポーターの１またはそれを超える基質、１またはそれを超えるＳＰＥＣＴプローブ、またはこれらの任意の２またはそれを超える組み合わせの投与は、マーカー検出の少なくとも約１時間、少なくとも約６時間、少なくとも約１２時間、少なくとも約２４時間、少なくとも約２日、少なくとも約３日前までに、マーカー検出の前に開始され得る。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの生物発光タンパク質の１もしくはそれを超える基質、磁気共鳴画像法において使用するための少なくとも１つの造影剤の１もしくはそれを超える基質、１もしくはそれを超えるＰＥＴプローブ、酵素レポーターの１もしくはそれを超える基質、１もしくはそれを超えるＳＰＥＣＴプローブまたはこれらの任意の２もしくはそれを超える組み合わせは、微生物の投与後に投与され得る。

【0130】

様々な局面において、本発明は、対象における疾患または障害の評価、モニタリング、診断および／または予後診断のための方法であって、（ｉ）本明細書に開示されている遺伝子操作された微生物を、投与することを必要とする対象の（例えば、消化管の）標的上皮組織に投与することと、（ｉｉ）対象から生物学的試料を得ることと、（ｉｉｉ）生物学的試料中の分泌可能なバイオマーカーを測定し、それにより、疾患上皮細胞の存在または非存在を検出することとを含む、方法を提供する。上述のように、微生物は、表面タンパク質をコードする外因性遺伝子を含み、前記表面タンパク質は、正常な胃腸組織の上皮細胞の管腔側に露出していないが、疾患に罹患している対象中の胃腸組織の疾患上皮細胞の管腔側に露出している１またはそれを超える細胞膜受容体と特異的に相互作用する。いくつかの実施形態において、表面タンパク質は、疾患上皮細胞における微生物の結合および侵入を促進する。微生物は、プロモーターに作動可能に連結された分泌可能なバイオマーカーをコードする遺伝子も含む。いくつかの実施形態において、分泌可能なバイオマーカーは哺乳動物プロモーターから発現される。いくつかの実施形態において、上皮発現（例えば、胃腸組織とつながっている管の上皮（例えば、胆管、膵管および総胆管を裏打ちする上皮組織））またはＧＩ管上皮細胞特異的発現に対して活性であるか、または特異的である哺乳動物プロモーター。いくつかの実施形態において、哺乳動物プロモーターは、ＧＩ管上皮細胞特異的発現を指示する。これらの実施形態において、微生物は、ＤＮＡ分子（例えば、プラスミド）を疾患上皮細胞に送達する。いくつかの実施形態において、遺伝子操作された微生物は、経口または直腸経路を介して投与される。いくつかの実施形態において、本方法は、緩下剤を含む結腸洗浄剤の投与をさらに含む。いくつかの実施形態において、緩下剤を含む結腸洗浄剤は、微生物の投与前に投与される。いくつかの実施形態において、遺伝子操作された微生物は非病原性である。いくつかの実施形態において、遺伝子操作された微生物は栄養要求性である。いくつかの実施形態において、遺伝子操作された微生物は、非病原性および栄養要求性である。

【0131】

様々な局面において、本発明は、対象における疾患または障害の診断および／または予後診断の方法において使用するための遺伝子操作された微生物であって、前記方法は、（ｉ）本明細書に開示される、投与することを必要とする対象の消化管に投与することと、（ｉｉ）検出マーカーの発現を検出することにより、疾患上皮細胞を検出することとを含む、微生物を提供する。上述のように、微生物は、表面タンパク質をコードする外因性遺伝子を含み、表面タンパク質は、正常な胃腸組織および／または胆管、膵管もしくは総胆管などを裏打ちする上皮組織の上皮細胞の管腔側に露出していないが、疾患に罹患している対象中の胃腸組織および／または胆管、膵管もしくは総胆管などを裏打ちする上皮組織の疾患上皮細胞の管腔側に露出している１またはそれを超える細胞膜受容体と特異的に相互作用する。いくつかの実施形態において、表面タンパク質は、疾患上皮細胞における微生物の結合および侵入を促進する。微生物は、プロモーターに作動可能に連結された少なくとも１つの検出マーカーをコードする１またはそれを超える遺伝子も含む。いくつかの実施形態において、プロモーターは哺乳動物プロモーターである。いくつかの実施形態において、哺乳動物プロモーターは、ＧＩ管上皮細胞特異的発現を指示する。いくつかの実施形態において、遺伝子操作された微生物は、経口または直腸経路を介して投与される。いくつかの実施形態において、本方法は、緩下剤を含む結腸洗浄剤の投与をさらに含む。いくつかの実施形態において、緩下剤を含む結腸洗浄剤は、微生物の投与前に投与される。いくつかの実施形態において、遺伝子操作された微生物は非病原性である。いくつかの実施形態において、遺伝子操作された微生物は栄養要求性である。いくつかの実施形態において、遺伝子操作された微生物は、非病原性および栄養要求性である。

【0132】

様々な局面において、処置のために、疾患に罹患しているかまたは罹患している疑いがある対象を選択する方法であって、（ｉ）対象の消化管に本明細書に開示されている実施形態の任意の１つの遺伝子操作された微生物を投与することと、（ｉｉ）対象から生物学的試料を得ることと、（ｉｉｉ）生物学的試料中の分泌可能なバイオマーカーを測定し、それにより、疾患上皮細胞を検出することと、（ｉｖ）分泌可能なバイオマーカーの発現が観察された場合に、処置のために対象を選択することとを含む、方法が本明細書に開示されている。いくつかの実施形態において、処置可能な疾患には、前がん性病変、がん、潰瘍性大腸炎、クローン病、バレット食道、過敏性腸症候群および過敏性腸疾患が含まれる。いくつかの実施形態において、処置は手術または治療剤の投与である。いくつかの実施形態において、手術は疾患組織を除去する。いくつかの実施形態において、治療剤は、化学療法剤、細胞傷害剤、免疫チェックポイント阻害剤、免疫抑制剤、サルファ剤、コルチコステロイド、抗生物質およびこれらの任意の２またはそれを超える組み合わせから選択される。

【0133】

いくつかの実施形態において、前がん性病変は、無茎性ポリープ、鋸歯状ポリープ（例えば、過形成性ポリープ、無茎性鋸歯状腺腫／ポリープおよび古典的鋸歯状腺腫）、無茎性鋸歯状ポリープ、平坦型ポリープ、亜有茎性ポリープ、有茎性ポリープおよびこれらの組み合わせから選択されるポリープを含む。いくつかの実施形態において、ポリープは微小ポリープである。いくつかの実施形態において、ポリープは微小ポリープである。いくつかの実施形態において、前がん性病変は、ＢｉｌＩＮ－１、ＢｉｌＩＮ－２、ＢｉｌＩＮ－３および胆管癌から選択される胆管上皮内新生物（ＢｉｌＩＮ）を含む。いくつかの実施形態において、前がん性病変は、ＰａｎＩＮ－１、ＰａｎＩＮ－２、ＰａｎＩＮ－３および膵管腺癌（ＰＤＡＣ）から選択される膵臓上皮内新生物（ＰａｎＩＮ）を含む。いくつかの実施形態において、前がん性病変は約０．０５ｍｍ～約３０ｍｍのサイズを有する。いくつかの実施形態において、前がん性病変は、約０．１ｍｍ未満、約０．２５ｍｍ未満、約０．５ｍｍ未満、約１ｍｍ未満、約２ｍｍ未満、約５ｍｍ未満、約８ｍｍ未満、約１０ｍｍ未満、約１５ｍｍ未満、約２０ｍｍ未満、約２５ｍｍ未満または約３０ｍｍ未満のサイズを有する。

【0134】

これに加えてまたはこれに代えて、いくつかの実施形態において、がんは、ポリープ、腺腫または明白ながんを含む。いくつかの実施形態において、がんは、リンチ症候群、家族性腺腫性ポリポーシス、遺伝性非ポリポーシス結腸がん（ＨＮＰＣＣ）または散発性がんを含む。

【0135】

様々な局面において、患者におけるがんを処置する方法も本明細書に開示されている。これらの方法は、（ｉ）請求項５７～１００のいずれか一項に記載の遺伝子操作された微生物を対象の消化管に投与することと、（ｉｉ）分泌可能なバイオマーカーの発現を検出し、それにより、疾患上皮細胞を検出することと、（ｉｉｉ）前記分泌可能なバイオマーカーの発現が観察された場合、処置を施すこととを含む。いくつかの実施形態において、処置は手術または治療剤の投与である。いくつかの実施形態において、治療剤は、化学療法剤、細胞傷害剤、免疫チェックポイント阻害剤、免疫抑制剤、サルファ剤、コルチコステロイド、抗生物質およびこれらの任意の２またはそれを超える組み合わせからなる群から選択される。

【実施例】

【0136】

実施例１．遺伝子操作された細菌株および設定
本研究の目的の１つは、消化管上皮中の疾患細胞を検出することができる細菌株を構築することであった。図１に示されるように、疾患上皮細胞は、新規な哺乳動物膜受容体の誤った場所への局在化および／または発現を示す。新規な受容体は、その細胞に通常見られない受容体または転座およびその他のゲノム再編成によって形成される受容体であり得る。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ １９１７に由来する細菌株が本明細書に開示される。図２に示されるように、この株は、単一の細菌染色体および２つの染色体外プラスミド（ｐＭＵＴ１およびｐＭＵＴ２）を含有する。図７のレーンＡを参照されたい。

【0137】

細菌株の封じ込めを可能にするために栄養要求性を導入した（図３参照）。栄養要求性株は、体内または環境中で繁殖することができない。さらに、栄養要求性は、抗生物質を用いないプラスミドの選択を可能にする。

【0138】

細菌の封じ込めのために、細菌の細胞壁の必須成分であるジアミノピメリン酸を産生するのに不可欠なｄａｐＡ遺伝子をノックアウトした。ΔｄａｐＡ株は、成長のために培地中にジアミノピメリン酸を必要とする。プラスミド選択のために、ａｌｒおよびｄａｄＸ遺伝子をノックアウトした。ａｌｒおよびｄａｄＸは、冗長なアラニンラセマーゼであり、成長のために、細菌株を、同じく細菌の細胞壁の成分であるアミノ酸Ｄ－アラニンの供給に依存させる。

【0139】

すべての栄養要求性は十分に確立されたλ－ｒｅｄ組換え系を用いて作製され、抗生物質マーカーを排除するような様式で行われた。Ｄａｔｓｅｎｋｏ ａｎｄ Ｗａｎｎｅｒ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．９７（１２）：６６４０－５（２０００）。その結果、最終的な株は、Ｅ，ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ １９１７株が感受性であるすべての抗生物質に対して感受性であり、成長のためにジアミノピメリン酸およびＤ－アラニンの添加を必要とすると予想される。

【0140】

得られた株（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ １９１７ΔｄａｐＡΔａｌｒΔｄａｄＸ）を、Ｄ－アラニンおよびジアミノピメリン酸を補充したＬＢ培地中で成長させた。（１）ＬＢ、（２）Ｄ－アラニンのみを補充したＬＢ、（３）ジアミノピメリン酸のみを補充したＬＢならびに（４）Ｄ－アラニンおよびジアミノピメリン酸を補充したＬＢで培養物を希釈し、３７℃でインキュベートし、成長をモニタリングした。図４Ａに示されるように、Ｄ－アラニンおよびジアミノピメリン酸の両方が培地に添加された場合にのみ、株が成長するに過ぎなかった。さらに、図４Ｂに示すように、Ｄ－アラニンおよびジアミノピメリン酸が培地に添加された場合、この株は、野生型株と類似の成長特性を示した。

【0141】

インベイシン（配列番号１）およびリステリオリシンＯ（配列番号２）を含有するシャーシを作製した。このインベイシンおよびリステリオリシンＯ遺伝子をプラスミド上で維持した。安定に組み込まれたインベイシンおよびリステリオリシンＯを有する細菌株が構築される（図５）。

【0142】

次に、プラスミドｐＭＵＴ１およびｐＭＵＴ２を標準的な手順を用いてキュアリングした（図６）。図７Ａは、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ １９１７（ＥｃＮ）誘導体からプラスミドｐＭＵＴ１およびｐＭＵＴ２をキュアリングするために行った実験の結果を示すアガロースゲルを示す。野生型Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ １９１７（ＥｃＮ）をキュアリングプラスミドで形質転換し、５ｍｇ／ｍｌアンピシリンの存在下で継代した。野生型Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ １９１７（ＥｃＮ）（レーンＡ）、ｐＭＵＴ１がキュアリングされたＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ １９１７（ＥｃＮ）（レーンＢ）ならびにｐＭＵＴ１およびｐＭＵＴ２がキュアリングされたＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ １９１７（ＥｃＮ）（レーンＣ）からのプラスミド調製物。プラスミドｐＭＵＴ１およびｐＭＵＴ２の予想位置が示されている。図７Ｂは、プラスミドがキュアリングされたことを確認するための定量的ＰＣＲ実験の結果を示す。データラベルは図７Ａと同じである。

【0143】

非抗生物質選択を有するｐＭＵＴ１ベースのプラスミドベクターを構築した。要約すると、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ １９１７のｄａｐＡ、ａｌｒ、ｄａｄＸ三重欠失体誘導体における選択として、Ｅ．ｃｏｌｉ ａｌｒ遺伝子（配列番号５）を使用した。ａｌｒを用いて選択された得られたプラスミド中にＧＦＰ遺伝子をクローニングした。このプラスミドをｐＳＲＸと命名した。図８は、本開示の遺伝子操作された細菌の実施形態の模式的表示を示す。この株は、１またはそれを超える栄養要求性変異（Ｘによって示される）を有し、ゲノムに組み込まれた表面タンパク質およびリステリオリシンＯをコードする遺伝子をさらに有するＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ １９１７（ＥｃＮ）誘導体である。この株は、プラスミドｐＭＵＴ１を含有しないが、選択機構として栄養要求性変異の相補性を用いて選択されるｐＭＵＴ１ベースの誘導体であるプラスミドｐＳＲＸを含有する。プラスミドｐＳＲＸは、本明細書においてＧＦＰによって例示される検出マーカーも保有する。

【0144】

実施例２．結腸直腸癌細胞のインビトロ検出
本開示の細菌は、疾患細胞を特異的に検出することができる。理論に拘束されるものではないが、疾患細胞の検出は４つの異なるステップを経て進行すると仮定される。図９Ａに示されているように、本開示の遺伝子操作された微生物は、誤った場所に局在化した受容体を介して疾患上皮細胞に結合し、内部移行を受ける。内部移行すると、図９Ｂに示されているように、細菌はｄａｐＡ弱毒変異による溶解を受け、これは細胞壁合成の欠陥を引き起こす。次いで、リステリオリシンＯ（ＬＬＯ、またはＨｌｙ；配列番号２）が放出され、ファゴソームを溶解するか、またはＥ．ｃｏｌｉ株から自然に排出される。図９Ｃに示されているように、分泌可能なバイオマーカーを有するプラスミドは核局在化を受け、これは天然に起こり得るか、または核局在化シグナルを含むタンパク質の結合によって誘導され得る。図９Ｄに示されているように、分泌可能なバイオマーカーを有するプラスミドは、ＧＩ管の疾患上皮細胞および／または胃腸組織とつながっている管の上皮（例えば、胆管、膵管および総胆管を裏打ちする上皮組織）において、分泌可能なバイオマーカーの発現を駆動する。

【0145】

このスキームを試験するために、侵入機構を含有する株を構築した。侵入機構は、哺乳動物細胞表面のタンパク質に結合し、細菌のエンドサイトーシスを促進する細菌表面タンパク質からなる。試験された最初の細菌表面タンパク質は、タンパク質インベイシンをコードするＹｅｒｓｉｎｉａ ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ由来のｉｎｖ遺伝子（配列番号１）であった。インベイシンは、哺乳動物細胞の表面のインテグリンに結合し、エンドサイトーシスを促進する。この株は、ＰｒｏＤ構成的プロモーターの調節下でｉｎｖを発現するｐＭＵＴ１由来プラスミドを有するＥ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ １９１７である。プラスミドは、細菌を容易に可視化し、哺乳動物細胞と識別可能にするために、同じＰｒｏＤプロモーターの調節下にあるＧＦＰ遺伝子も含んだ。この株由来の細菌をＳＷ４８０（結腸直腸がん由来の細胞株）と１時間共インキュベートした後、細胞外細菌を洗い流した。ＳＷ４８０細胞を蛍光顕微鏡法によって可視化し、プレートから取り除き、次いで、フローサイトメトリーによって分析して、細菌株による侵入が成功したＳＷ４８０細胞の一部を同定した。図１０に示されているように、ＳＷ４８０結腸直腸がん細胞は、侵入遺伝子を発現する細菌細胞によってのみ侵入された。これらの結果は、本技術の遺伝子操作された微生物がインビトロでがん細胞に侵入することができることを実証している。

【0146】

細菌がエンドサイトーシス液胞から逃れることを可能にする、インベイシン（ｉｎｖ）およびリステリオリシンＯ（ｈｌｙ）をコードする遺伝子を含む侵入機構は、ラムダファージ組み込み部位で細菌染色体に組み込まれる。組み込みは、組み込み後の抗生物質選択の排除を可能にするように行われる。図５は、遺伝子操作された細菌Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ １９１７（ＥｃＮ）株のこの実施形態の模式的表示を示す。この株は、必要に応じて、ｄａｐＡΔ、ａｌｒΔおよびｄａｄＸΔ（Ｘによって示される）などの１またはそれを超える栄養要求性変異を有する。

【0147】

実施例３．Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ（Ｇｌｕｃ）を使用するがん細胞のインビトロ検出
本明細書に開示されている操作された細菌は、それらが発現する表面タンパク質を介して疾患細胞を結合する。例えば、操作された細菌は、表面に発現されたインベイシンを介してβ１－インテグリンに結合する。この相互作用は、細菌の侵入をもたらす（図１１Ａ）。理論に束縛されるものではないが、細菌は溶解を受ける。リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）は、ファゴソームの溶解を媒介し、ＤＮＡペイロードが送達される（図１１Ａ）。次いで、がん細胞は、検出マーカーを発現および分泌する（図１１Ａ）。検出マーカーは血液媒介性になり得（図１１Ｂ）、簡易な血液または尿試験を介して疾患細胞の検出を容易にする（図１１Ｃ）。

【0148】

染色体中に組み込まれたインベイシン遺伝子（配列番号７）と、哺乳動物プロモーターの調節下にあるＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼａ（Ｇｌｕｃ）遺伝子（配列番号３）および細菌プロモーターの調節下にあるリステリオリシンＯ（溶解素；配列番号２）および選択マーカーを運搬保有する（ｃａｒｒｙｉｎｇ ｈａｒｂｏｒｉｎｇ）高コピープラスミドとを有するインベイシン^＋、リステリオリシン^＋、Ｇｌｕｃ^＋Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ １９１７ ｄａｐＡΔ実験株を構築した（図１２Ａ）。インベイシン^－、リステリオリシン^＋、Ｇｌｕｃ^＋Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ １９１７ ｄａｐＡΔ対照株（インベイシン遺伝子を欠くが、Ｇｌｕｃおよび溶解素遺伝子を有するプラスミドを保有する）も構築した。がん細胞を検出するために、インベイシン^＋、リステリオリシン^＋、Ｇｌｕｃ^＋実験細菌およびインベイシン^－、リステリオリシン^＋、Ｇｌｕｃ^＋対照細菌をＳＷ４８０細胞に同一の感染多重度で播種した。細菌および培地の両方を含有する試料を取り出し、ＧｌｕｃレベルをＧｌｕｃのバックグラウンドレベルとして測定した（０日目）。１時間のインキュベーション後、細胞をＰＢＳで洗浄し、抗生物質を添加してすべての細胞外細菌を死滅させた。細胞をさらに１、２または４日間インキュベートし、培地の試料をＧｌｕｃの測定のために取り出した。図１２Ｂに示されているように、インベイシン^＋、リステリオリシン^＋、Ｇｌｕｃ^＋実験細菌は、０日目から１日目、２日目および４日目まで増加した発光シグナルを産生した。対照的に、インベイシン^－、リステリオリシン^＋Ｇｌｕｃ^＋対照細菌はルシフェラーゼシグナルの増加をもたらさなかった。

【0149】

Ｇｌｕｃががん細胞によって作製されたことを確認するために、ｐＭＵＴ１由来の低コピープラスミド上のインベイシン遺伝子と、イントロンを有しおよび哺乳動物プロモーターの調節下にあるＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼａ（Ｇｌｕｃ）遺伝子（配列番号４）、細菌プロモーターの調節下にあるリステリオリシンＯ（溶解素；配列番号２）ならびに選択マーカーを運搬保有する高コピープラスミドとを有するインベイシン^＋、リステリオリシン^＋、Ｇｌｕｃ－イントロン^＋E.coli Ｎｉｓｓｌｅ １９１７ ｄａｐＡΔ株を構築した（図１２Ｃ）。同様のインベイシン^－、リステリオリシン^＋、Ｇｌｕｃ－イントロン^＋Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ １９１７ ｄａｐＡΔ対照株も構築した。インベイシン^＋、リステリオリシン^＋、Ｇｌｕｃ－イントロン^＋細菌およびインベイシン^－、リステリオリシン^＋、Ｇｌｕｃ－イントロン^＋対照細菌を、ＳＷ４８０細胞に同一の感染多重度で播種した。細菌および培地の両方を含有する試料を取り出し、ＧｌｕｃレベルをＧｌｕｃのバックグラウンドレベルとして測定した（０日目）。１時間のインキュベーション後、細胞をＰＢＳで洗浄し、抗生物質を添加してすべての細胞外細菌を死滅させた。細胞をさらに１、２または４日間インキュベートし、培地の試料をＧｌｕｃの測定のために取り出した。図１２Ｄに示されているように、インベイシン^＋、リステリオリシン^＋、Ｇｌｕｃ－イントロン^＋実験細菌は、０日目から１日目、２日目および４日目まで増加した発光シグナルを産生した。対照的に、インベイシン^－、リステリオリシン^＋Ｇｌｕｃ－イントロン^＋対照細菌はルシフェラーゼシグナルの増加をもたらさなかった。

【0150】

これらの結果は、本明細書に開示されている操作された細菌によるＤＮＡペイロードの送達の際に、がん細胞がＧｌｕｃを産生および分泌したことを実証している。

【0151】

まとめると、これらの結果は、本明細書に開示されている操作された細菌がＤＮＡペイロードをがん細胞に送達し、それががん細胞によるＧｌｕｃの産生および分泌をもたらし、それによってがん細胞の検出を促進したことを実証している。

【0152】

実施例４．ヒトβ－絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）を用いた結腸直腸癌細胞のインビトロ検出
ｐＭＵＴ１由来の低コピープラスミド上のインベイシン遺伝子と、哺乳動物プロモーターの調節下にある人工のイントロンを含有するヒトβ－絨毛性ゴナドトロピン（β－ｈＣＧ）遺伝子（配列番号６）、および細菌プロモーターの調節下にあるリステリオリシンＯ（溶解素；配列番号２）および選択マーカーを運搬保有する高コピープラスミドとを有するインベイシン^＋、リステリオリシン^＋、β－ｈＣＧ^＋Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ １９１７ ｄａｐＡΔ株を構築した。インベイシン^－、リステリオリシン^＋、β－ｈＣＧ^＋Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ １９１７ ｄａｐＡΔ対照株（インベイシン遺伝子を欠くが、β－ｈＣＧおよび溶解素をコードするプラスミド遺伝子を運搬する）も構築した。がん細胞を検出するために、インベイシン^＋、リステリオリシン^＋、β－ｈＣＧ^＋実験細菌およびインベイシン^－、リステリオリシン^＋、β－ｈＣＧ^＋対照細菌をＳＷ４８０細胞に同一の感染多重度で播種した。３時間のインキュベーション後、細胞をＰＢＳで洗浄し、抗生物質を添加してすべての細胞外細菌を死滅させた。細胞をさらに３日間インキュベートし、培地の試料をβ－ｈＣＧの測定のために取り出した。ＥＬＩＳＡベースのアッセイ（ＤＲＧ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌのβ－ｈＣＧ Ｅｌｉｓａ ＲＵＯキット）を使用して、ヒトβ－絨毛性ゴナドトロピン（β－ｈＣＧ）を測定した。図１３Ａに示されているように、ＥＬＩＳＡ試験によって示されたとおり、インベイシン^＋、リステリオリシン^＋、β－ｈＣＧ^＋株と接触した細胞は培養上清中にβ－絨毛性ゴナドトロピンを産生したが、インベイシン^－、リステリオリシン^＋、β－ｈＣＧ^＋株と接触した細胞は産生しなかった。培養上清はまた、一般用妊娠検査薬を用いてアッセイされた。要約すると、妊娠検査薬のウィック（ｗｉｃｋ）を、インベイシン^＋、リステリオリシン^＋、β－ｈＣＧ^＋株またはインベイシン^－、リステリオリシン^＋、β－ｈＣＧ^＋株で処理されたＳＷ４８０細胞の培地中に浸漬した。図１３Ｂに示されているように、インベイシン^＋、リステリオリシン^＋、β－ｈＣＧ^＋株と接触した細胞は最初の「妊娠」特定位置に線の出現を示し、培養上清中でのβ－絨毛性ゴナドトロピンの産生を示したが、インベイシン^－、リステリオリシン^＋、β－ｈＣＧ^＋株と接触した細胞は示さなかった。予想されたとおり、内部対照は、両検査での線の出現によって示された陽性反応を示した（図１３Ｂ）。

【0153】

これらの結果は、本明細書に開示されている操作された細菌がＤＮＡペイロードをがん細胞に送達し、それががん細胞によるβ－ｈＣＧの産生および分泌をもたらし、それによってがん細胞の検出を促進したことを実証している。

【0154】

実施例５．Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ（Ｇｌｕｃ）およびヒトβ－絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）検出マーカーを使用する結腸直腸癌細胞のインビボ検出
これらの実験は、結腸直腸がんのマウスモデルにおいて行われる。簡潔には、発癌を誘発するために、正常なまたはＡｐｃ^{Ｆｌ／Ｆｌ}；Ｖｉｌ－Ｃｒｅ－ＥＲＴ２マウスに３０μＭ ４－ＯＨタモキシフェンを投与する。浣腸および／または経管栄養（ｇａｖａｇｅ）を用いて、インベイシン^＋、リステリオリシン^＋、Ｇｌｕｃ^＋株またはインベイシン^－、リステリオリシン^＋、Ｇｌｕｃ^＋株の細菌をマウスに投与する。一部のマウスから血液および尿を回収し、ＥＬＩＳＡまたは活性アッセイを用いてＧｌｕｃを検出する。一部のマウスを屠殺し、結腸を切除し、洗浄し、免疫組織化学またはルミノメトリーによってＧｌｕｃを検出する。

【0155】

正常なマウスは、インベイシン^＋、リステリオリシン^＋、β－Ｇｌｕｃ^＋株を投与されるかまたはインベイシン^－、リステリオリシン^＋、β－Ｇｌｕｃ^＋株を投与されるかに関わらず、Ｇｌｕｃ発現を示さないことが予想される。他方、Ａｐｃ^{Ｆｌ／Ｆｌ}；Ｖｉｌ－Ｃｒｅ－ＥＲＴ２マウスは、血液、尿および／または結腸にβ－Ｇｌｕｃを示すと予想される。

【0156】

別の一連の実験では、発癌を誘発するために、Ａｐｃ^{Ｆｌ／Ｆｌ}；Ｖｉｌ－Ｃｒｅ－ＥＲＴ２マウスに３０μＭ４－ＯＨタモキシフェンを投与する。浣腸および／または経管栄養を用いて、インベイシン^＋、リステリオリシン^＋、β－ｈＣＧ^＋株またはインベイシン^－、リステリオリシン^＋、β－ｈＣＧ^＋株の細菌をマウスに投与する。一部のマウスから血液および尿を回収し、ＥＬＩＳＡおよび／または妊娠検査薬を用いてβ－ｈＣＧを検出する。一部のマウスを屠殺し、結腸を切除し、洗浄し、免疫組織化学によってβ－ｈＣＧを検出する。

【0157】

正常なマウスは、インベイシン^＋、リステリオリシン^＋、β－ｈＣＧ^＋株を投与されるかまたはインベイシン^－、リステリオリシン^＋、β－ｈＣＧ^＋株を投与されるかに関わらず、β－ｈＣＧ発現を示さないことが予想される。他方、Ａｐｃ^{Ｆｌ／Ｆｌ}；Ｖｉｌ－Ｃｒｅ－ＥＲＴ２マウスは、血液、尿および／または結腸にβ－ｈＣＧを示すと予想される。

【0158】

参照による組み入れ
本明細書で参照されるすべての特許および刊行物は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。

【0159】

本明細書中で論述される刊行物は、本出願の出願日より前のそれらの開示のためにのみ提供される。本明細書のいかなる記述も、先行発明によって、本発明がかかる刊行物に先行する権利を有しないことを認めたものと解釈してはならない。

【0160】

本明細書で使用される場合、すべての見出しは単に整理のためのものであり、決して本開示を限定することを意図するものではない。任意の個々のセクションの内容は、すべてのセクションに等しく適用可能であり得る。

【0161】

均等物
本発明は、その特定の実施形態に関連して開示されているが、さらなる修正が可能であり、本出願は、一般に、本発明の原理に従って、ならびに本発明が関連する技術分野内の公知のまたは従来の慣行に含まれるようなおよび以下に記載され、以下のとおり、添付の特許請求の範囲内の本質的特徴に適用され得るような本開示からの逸脱を含め、本発明の任意の変形、使用または改変を包含することが意図されることが理解されよう。

【0162】

表面タンパク質（インベイシンおよび類似体）の配列
配列番号１
インベイシンのアミノ酸配列

【化1】

配列番号７
インベイシン 染色体の配置（太字：コード領域、斜字体：ＰｒｏＤプロモーター）

【化2-1】

【化2-2】

溶解素の配列（例えば、リステリオリシンＯおよび誘導体）
配列番号２
リステリオリシンＯのアミノ酸配列

【化3】

配列番号８
ペリプラズム分泌シグナルを欠くリステリオリシンＯのアミノ酸配列

【化4】

例示的な選択マーカーの配列
配列番号５
プロモーターを有するアラニンラセマーゼ（太字：コード領域、斜字体：プロモーター領域）

【化5-1】

【化5-2】

例示的な分泌可能なバイオマーカーの配列
配列番号３
Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ構築物（太字：コード領域、斜字体：ＣＭＶプロモーター）

【化6】

配列番号４
Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ－イントロン構築物（太字：コード領域、斜字体：ＣＭＶプロモーター、下線：イントロン）

【化7】

配列番号６
β－ｈＣＧ構築物（太字：コード領域、斜字体：ＣＭＶプロモーター、下線：イントロン）

【化8-1】

【化8-2】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7A】

【図7B】

【図8】

【図9A】

【図9B-C】

【図9D】

【図10】

【図11A-B】

【図11C】

【図12A-B】

【図12C-D】

【図13】

【配列表】

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【国際調査報告】