特表 2024-524882 微生物における飽和脂肪の製造

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-07-09

(54)【発明の名称】微生物における飽和脂肪の製造

(51)【国際特許分類】

   C12P 7/6463 20220101AFI20240702BHJP

   A23L 33/115 20160101ALI20240702BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20240702BHJP

   C12N 15/52 20060101ALI20240702BHJP

   A23K 20/158 20160101ALI20240702BHJP

   A23K 10/10 20160101ALI20240702BHJP

【ＦＩ】

C12P7/6463

A23L33/115 ZNA

C12N1/19

C12N15/52 Z

A23K20/158

A23K10/10

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023575910

(86)(22)【出願日】2022-06-10

(85)【翻訳文提出日】2024-02-01

(86)【国際出願番号】 AU2022050580

(87)【国際公開番号】W WO2022256882

(87)【国際公開日】2022-12-15

(31)【優先権主張番号】2021901766

(32)【優先日】2021-06-11

(33)【優先権主張国・地域又は機関】AU

(31)【優先権主張番号】2021903160

(32)【優先日】2021-10-01

(33)【優先権主張国・地域又は機関】AU

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】523334154

【氏名又は名称】ナリシュ イングリーディエンツ プロプライアタリー リミティド

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100123582

【弁理士】

【氏名又は名称】三橋 真二

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100141977

【弁理士】

【氏名又は名称】中島 勝

(74)【代理人】

【識別番号】100138210

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 達則

(74)【代理人】

【識別番号】100196977

【弁理士】

【氏名又は名称】上原 路子

(72)【発明者】

【氏名】アナ エル ターチー

(72)【発明者】

【氏名】ダワー フセイン

(72)【発明者】

【氏名】ペイ トン

(72)【発明者】

【氏名】ジェフリー ジョン ダムスデイ

(72)【発明者】

【氏名】ロバート チャールズ デ フェイター

(72)【発明者】

【氏名】スリンダー パル シン

(72)【発明者】

【氏名】ジェイムズ ロバートソン ペトリー

【テーマコード（参考）】

2B150

4B018

4B064

4B065

【Ｆターム（参考）】

2B150AC01

2B150AC15

2B150AC26

2B150AC37

2B150AD02

2B150AD14

2B150AE13

2B150BA01

2B150BC03

2B150BD01

2B150BD02

2B150BE01

2B150DA35

2B150DA37

2B150DA56

2B150DA58

2B150DC13

2B150DD12

2B150DD21

2B150DD26

2B150DE01

2B150DH35

4B018LB01

4B018LB02

4B018LB03

4B018LB04

4B018LB06

4B018LB07

4B018LB08

4B018LB09

4B018MD14

4B018MD81

4B018ME01

4B018MF01

4B018MF02

4B018MF14

4B064AD85

4B064CA06

4B064CA19

4B064CD07

4B064DA10

4B065AA79X

4B065AB01

4B065BA02

4B065BB08

4B065CA13

4B065CA27

4B065CA41

4B065CA43

(57)【要約】

本発明は、抽出された微生物の脂質、前記脂質を含む微生物細胞、及びこれらの抽出物に関する。本発明はまた、食物、飼料、及び飲料におけるこれらの脂質、細胞、及び抽出物の使用にも関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

飽和脂肪酸（ＳＦＡ）の総飽和脂肪酸含有量と、一価不飽和脂肪酸（ＭＵＦＡ）の総一価不飽和脂肪酸含有量とを含む総脂肪酸含有量を含む抽出された微生物脂質であって、ＳＦＡの少なくとも一部とＭＵＦＡの少なくとも一部とを含む総脂肪酸含有量の少なくとも一部がトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）の形態でエステル化されており、従って前記抽出された微生物脂質は総ＴＡＧ含有量を有し、そして、ここで、
（ｉ）前記抽出された微生物脂質の総ＳＦＡ含有量は、ステアリン酸（Ｃ１８：０）、パルミチン酸（Ｃ１６：０）、ミリスチン酸（Ｃ１４：０）、アラキジン酸（Ｃ２０：０）、ベヘン酸（Ｃ２２：０）、及びリグノセリン酸（Ｃ２４：０）を含み、従って、前記抽出された微生物脂質の総脂肪酸含有量の脂肪酸の少なくとも５０重量％はＳＦＡであり、
（ｉｉ）前記総脂肪酸含有量の２０重量％～８５重量％はステアリン酸であり、
（ｉｉｉ）前記抽出された微生物脂質の総ＭＵＦＡ含有量は、オレイン酸（Ｃ１８：１Δ９）及びパルミトレイン酸（Ｃ１６：１Δ９）、並びに任意選択的にＣ１６：１Δ７及び／又はＣ１７：１を含み、
（ｉｖ）前記抽出された微生物脂質の前記総脂肪酸（ＴＦＡ）含有量は、多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）が欠如しているか、又はリノール酸（Ｃ１８：２Δ９，１２）を含むＰＵＦＡ含有量を含み、ここで、前記ＰＵＦＡ含有量は前記総脂肪酸含有量の５重量未満であり、
（ｖ）前記抽出された微生物脂質は、リン脂質を含む極性脂質を含むか、又は極性脂質が欠如しているかのいずれかであり、
（ｖｉ）前記抽出された微生物脂質は２５℃で固体であり、そして
（ｖｉｉ）前記抽出された微生物脂質は微生物細胞から得られ、ここで前記微生物細胞は酵母細胞である、前記微生物脂質。

【請求項2】

飽和脂肪酸（ＳＦＡ）の総飽和脂肪酸含有量と、一価不飽和脂肪酸（ＭＵＦＡ）の総一価不飽和脂肪酸含有量とを含む総脂肪酸含有量を含む抽出された微生物脂質であって、ＳＦＡの少なくとも一部とＭＵＦＡの少なくとも一部とを含む総脂肪酸含有量の少なくとも一部がトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）の形態でエステル化されており、従って前記抽出された微生物脂質は総ＴＡＧ含有量を有し、そして、ここで、
（ｉ）前記抽出された微生物脂質の総ＳＦＡ含有量は、ステアリン酸（Ｃ１８：０）、パルミチン酸（Ｃ１６：０）、ミリスチン酸（Ｃ１４：０）、アラキジン酸（Ｃ２０：０）、ベヘン酸（Ｃ２２：０）、及びリグノセリン酸（Ｃ２４：０）を含み、従って、前記抽出された微生物脂質の総脂肪酸含有量の脂肪酸の少なくとも５０重量％はＳＦＡであり、
（ｉｉ）前記総脂肪酸含有量の２０重量％～８５重量％はステアリン酸であり、
（ｉｉｉ）前記抽出された微生物脂質の総ＭＵＦＡ含有量は、オレイン酸（Ｃ１８：１Δ９）及びパルミトレイン酸（Ｃ１６：１Δ９）、並びに任意選択的にＣ１６：１Δ７及び／又はＣ１７：１を含み、
（ｉｖ）前記抽出された微生物脂質の前記総脂肪酸（ＴＦＡ）含有量は、多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）が欠如しているか、又はリノール酸（Ｃ１８：２Δ９，１２）を含むＰＵＦＡ含有量を含み、ここで、前記ＰＵＦＡ含有量は前記総脂肪酸含有量の５重量未満であり、
（ｖ）前記抽出された微生物脂質は、リン脂質を含む極性脂質を含むか、又は極性脂質が欠如しているかのいずれかであり、そして
（ｖｉ）前記抽出された微生物脂質は２５℃で固体である、前記微生物脂質。

【請求項3】

請求項１又は２に記載の抽出された微生物脂質であって、前記脂質の若しくは前記ＴＡＧ含有量のＴＦＡ含有量又は両方が、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満、０．５％未満、若しくは０．２％未満、又は０．２％～５％、０．２％～４％、０．２％～３％、０．２％～２％、０．５％～５％、０．５％～４％、０．５％～３％、０．５％～２重量％のリノール酸（ＬＡ）を含むか、又はＬＡは、前記脂質の及び／又は前記ＴＡＧ含有量のＴＦＡ含有量には本質的に存在しない、前記微生物脂質。

【請求項4】

請求項１～３のいずれか１項に記載の抽出された微生物脂質であって、前記脂質の若しくは前記ＴＡＧ含有量のＴＦＡ含有量又は両方が、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満、０．５％未満、若しくは０．２％未満、又は０．２％～５％、０．２％～４％、０．２％～３％、０．２％～２％、０．５％～５％、０．５％～４％、０．５％～３％、０．５％～２重量％のＰＵＦＡを含むか、又はＰＵＦＡは、前記脂質の及び／又は前記ＴＡＧ含有量のＴＦＡ含有量には本質的に存在しない、前記微生物脂質。

【請求項5】

請求項１～４のいずれか１項に記載の抽出された微生物脂質であって、前記脂質のＴＦＡ含有量及び／又は前記ＴＡＧのＴＦＡ含有量が、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、１０％～５０％、１０％～４０％、１０％～３５％、１０％～３０％、又は２０％～３５重量％のオレイン酸を含む、前記微生物脂質。

【請求項6】

請求項１～５のいずれか１項に記載の抽出された微生物脂質であって、少なくとも１つの遺伝子改変が欠如した対応する微生物から得られた対応する抽出された微生物脂質と比較して、前記脂質のＴＦＡ含有量及び／又はＴＡＧ含有量中に、より多量の、総ＳＦＡ含有量、Ｃ１８：０含有量、Ｃ２０：０含有量、及びＣ２２：０含有量の１つ又はそれ以上を含む、前記微生物脂質。

【請求項7】

請求項１～６のいずれか１項に記載の抽出された微生物脂質であって、前記脂質のＴＦＡ含有量及び／又はＴＡＧ含有量が、３０重量％～９０重量％、３０重量％～８０重量％、３０重量％～７０重量％、３０重量％～６０重量％、又は３０重量％～５０重量％のＳＦＡを含む、前記微生物脂質。

【請求項8】

請求項７に記載の抽出された微生物脂質であって、前記総ＳＦＡ含有量が、前記脂質の脂質のＴＦＡ含有量及び／又は前記ＴＡＧのＴＦＡ含有量の少なくとも６０重量％である場合、ステアリン酸含有量が少なくとも４０重量％である、前記微生物脂質。

【請求項9】

請求項１～８のいずれか１項に記載の抽出された微生物脂質であって、前記脂質のＴＦＡ含有量又は前記脂質のＴＡＧ含有量又は両方の、１８個以上の炭素を含む総飽和脂肪酸と１６個以下の炭素を含む総飽和脂肪酸との比（Ｌ／Ｓ－ＳＦＡ比）が、少なくとも約１．５である、少なくとも約２である、少なくとも約２．５である、少なくとも約３である、少なくとも約４である、少なくとも約５である、少なくとも約６である、少なくとも約７である、少なくとも約８である、少なくとも約９である、少なくとも約１０である、又は約３～約１０である、前記微生物脂質。

【請求項10】

請求項１～９のいずれか１項に記載の抽出された微生物脂質であって、前記脂質は、少なくとも１つの遺伝子改変を含む微生物から抽出され、及び前記脂質のＴＦＡ含有量又はＴＡＧ含有量又は両方のＬ／Ｓ－ＳＦＡ比が、少なくとも１つの遺伝子改変が欠如した対応する微生物から得られた対応する抽出された微生物脂質と比較して、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、又は約３～約１０倍大きい、前記微生物脂質。

【請求項11】

請求項１～１０のいずれか１項に記載の抽出された微生物脂質であって、Ｃ２０：０脂肪酸の含有量が、前記抽出された脂質のＴＦＡ含有量又は抽出された脂質のＴＡＧ含有量又は両方の、少なくとも約１重量％、少なくとも約１．５重量％、少なくとも約２重量％、少なくとも約２．５重量％、又は少なくとも約３重量％であり、Ｃ２２：０脂肪酸の含有量が、少なくとも約１重量％、少なくとも約１．５重量％、少なくとも約２重量％、少なくとも約２．５重量％、少なくとも約３重量％、又は少なくとも約３．５重量％であり、及び／又はＣ２４：０脂肪酸の含有量が、少なくとも約１重量％、少なくとも約１．５重量％、少なくとも約２重量％、少なくとも約２．５重量％、少なくとも約３重量％、少なくとも約３．５重量％、又は少なくとも４重量％である、前記微生物脂質。

【請求項12】

請求項１～１１のいずれか１項に記載の抽出された微生物脂質であって、Ｃ２０：０、Ｃ２２：０、及びＣ２４：０脂肪酸が、前記抽出され脂質のＴＦＡ含有量又は前記脂質のＴＡＧのＴＦＡ含有量又は両方の、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９重量％を含み、これらは少なくとも炭素数２０以上である、前記微生物脂質。

【請求項13】

極性脂質を含む、請求項１～１２のいずれか１項に記載の抽出された微生物脂質であって、前記極性脂質のＴＦＡ含有量が、前記抽出された脂質のＴＦＡ含有量又はＴＡＧ含有量について、請求項２～１１に定義される１つ又はそれ以上の特徴を有する、前記微生物脂質。

【請求項14】

請求項１～１３のいずれか１項に記載の抽出された微生物脂質であって、ＴＡＧが、前記抽出した脂質の総脂質含有量の、少なくとも５０重量％、少なくとも６０重量％、少なくとも７０重量％、少なくとも８０重量％、少なくとも９０重量％、少なくとも９５重量％、少なくとも９６重量％、少なくとも９７重量％、少なくとも９８重量％、少なくとも９９重量％、又は１００重量％を含む、前記微生物脂質。

【請求項15】

ステロール及び／又はステロールエステル、好ましくはエルゴステロール及び／又はエルゴステロールエステルを含む、請求項１～１４のいずれか１項に記載の抽出された微生物脂質。

【請求項16】

含水率が２０重量％未満である、請求項１～１５のいずれか１項に記載の抽出された微生物脂質。

【請求項17】

揮発性溶媒含有量が１０重量％未満である、請求項１～１６のいずれか１項に記載の抽出された微生物脂質。

【請求項18】

請求項１～１７のいずれか１項に記載の抽出された微生物脂質であって、ここで、前記脂質が、それらのｓｎ－２位でエステル化されたＭＵＦＡ、好ましくはオレイン酸を含むＴＡＧ分子を含み、ここで、前記抽出された脂質中の、前記ｓｎ－２位でエステル化されたＭＵＦＡを含むＴＡＧ分子の数の比と、それらのｓｎ－２位でエステル化されたＭＵＦＡ以外の脂肪酸を含むＴＡＧ分子の数の比（ｓｎ－２におけるＭＵＦＡ：他のＦＡ比）が、約０．５０、約０．３０未満、約０．２０未満、約０．１０未満、約０．０５未満、約０．０４未満、約０．０３未満、又は約０．０２未満である、前記微生物脂質。

【請求項19】

少なくとも１つの遺伝子改変を含む微生物から抽出され、かつリン脂質を含む極性脂質を含む、請求項１～１８のいずれか１項に記載の抽出された微生物脂質であって、ここで、前記抽出された脂質中のホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、及びホスファチジルセリン（ＰＳ）の少なくとも２つ、好ましくは３つ、又は４つすべてが、少なくとも１つの遺伝子改変が欠如した対応する微生物から得られた対応する抽出された脂質よりも多量のＳＦＡを有する、前記微生物脂質。

【請求項20】

請求項１～１９のいずれか１項に記載の抽出された微生物脂質であって、前記脂質が、
（ａ）ＦＡＴＡ脂肪アシルチオエステラーゼをコードする外因性ポリヌクレオチド、
（ｂ）少なくとも１つの脂肪酸アシルトランスフェラーゼ、好ましくは少なくともジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）をコードする、少なくとも１つの外因性ポリヌクレオチド、及び
（ｃ）内因性Δ１２デサチュラーゼの発現及び／又は活性の低下をもたらす遺伝子改変、好ましくはΔ１２デサチュラーゼをコードする内因性遺伝子の遺伝子改変、より好ましくはΔ１２デサチュラーゼをコードする内因性遺伝子のヌル変異、最も好ましくはＦＡＤ２遺伝子のヌル変異、
を含む遺伝子改変を含む微生物から抽出されたものであり、
ここで、各ポリヌクレオチドは、前記微生物細胞内で前記ポリヌクレオチドの発現を指令することができる１つ又はそれ以上のプロモーターに作動可能に連結されている、前記微生物脂質。

【請求項21】

請求項２０に記載の抽出された微生物脂質であって、ここで、前記少なくとも１つのＤＧＡＴが、配列番号１４４～１５４のいずれか１つに記載の配列を、又は配列番号１４４～１５４のいずれか１つ又はそれ以上と、少なくとも７０％同一、好ましくは少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９７％同一であるヌクレオチド配列を、有するヌクレオチドを含み、及び／又は、ここで、前記ＦＡＴＡ脂肪アシルチオエステラーゼが、配列番号８４又は８６のいずれか１つに記載の配列を、又は配列番号８４又は８６のいずれか１つ以上と、少なくとも７０％同一、好ましくは少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９７％同一であるヌクレオチド配列を、有するヌクレオチドを含む、前記微生物脂質。

【請求項22】

前記微生物がさらに以下を含む、請求項２０又は２１に記載の抽出された微生物脂質：
アシル－ＣｏＡシンセターゼ（ＡＣＳ）をコードする外因性ポリヌクレオチドであって、任意選択的に、ＡＣＳは、配列番号８８～８９のいずれか１つとして示される配列を、又は配列番号８８～８９のいずれか１つ又はそれ以上と少なくとも７０％同一、好ましくは少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９７％同一であるヌクレオチド配列を、有するヌクレオチドを含む、前記ポリヌクレオチド；又は
リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）をコードする外因性ポリヌクレオチドであって、任意選択的に、ＬＰＡＡＴは配列番号９１のいずれか１つとして示される配列を、又は配列番号９１のいずれか１つ又はそれ以上と少なくとも７０％同一、好ましくは少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９７％同一であるヌクレオチド配列を、有するヌクレオチドを含む、前記ポリヌクレオチド。

【請求項23】

真核細胞、真菌細胞、細菌細胞、若しくは藻類細胞、生きた微生物細胞、死んだ微生物細胞、又はこれらの任意の混合物を含むか又はこれらからなる微生物細胞から得られる、請求項２～２２のいずれか１項に記載の抽出された微生物脂質。

【請求項24】

前記微生物細胞が、（ｉ）発酵に適したもの、（ｉｉ）油性細胞、（ｉｉｉ）非油性細胞、好ましくは遺伝子改変による油性細胞に由来する非油性細胞、及び（ｉｖ）従属栄養細胞の、１つ若しくはそれ以上又はすべてである、請求項２３に記載の抽出された微生物脂質。

【請求項25】

前記微生物細胞が酵母細胞である、請求項２３又は請求項２４に記載の抽出された微生物脂質。

【請求項26】

前記酵母細胞が、サッカロミセス・セレビッシェ、ヤローウィア・リポリティカ、ピキア・パストリス、及びこれらの任意の混合物からなる群から選択される、請求項２又は２５に記載の抽出された微生物脂質。

【請求項27】

前記酵母細胞がヤローウィア・リポリティカである、請求項２６に記載の抽出された微生物脂質。

【請求項28】

少なくとも５ｇ、少なくとも１０ｇ、少なくとも５０ｇ、又は少なくとも１００ｇの重量を有する、請求項１～２７のいずれか１項に記載の抽出された微生物脂質。

【請求項29】

５ｇ／ｌ未満、２ｇ／ｌ未満、１ｇ／ｌ未満のステアリン酸塩の存在下で培養されたか、又は培地にステアリン酸が添加されずに培養された微生物細胞から得られる、請求項１～２８のいずれか１項に記載の抽出された微生物脂質。

【請求項30】

請求項１～２９のいずれか１項で定義される脂質を含む微生物細胞。

【請求項31】

少なくとも１つの遺伝子改変を有する微生物細胞であって、ここで、前記微生物細胞は、少なくとも１つの遺伝子改変が欠如しており、同じ条件下で培養された対応する微生物細胞と比較した場合、各場合に、（ｉ）前記微生物細胞の総脂肪酸（ＴＦＡ）含有量、又は前記微生物細胞中のＴＡＧのＴＦＡ含有量、又は両方において、飽和脂肪酸（ＳＦＡ）含有量の増加、少なくとも１８個の炭素を有するＳＦＡ含有量の増加、ステアリン酸含有量の増加、Ｃ２０：０及びＣ２２：０脂肪酸含有量の増加、Ｃ２４：０脂肪酸含有量の増加、Ｌ／Ｓ－ＳＦＡ比の増加、又はこれらの任意の組み合わせ、及び（ｉｉ）トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）産生若しくは蓄積、又は両方の増加を有する、前記微生物細胞。

【請求項32】

前記細胞のＴＦＡ含有量、又は前記細胞のＴＡＧ含有量、又は両方が、前記抽出された脂質のＴＦＡ含有量又は前記ＴＡＧについて、請求項３～１２に定義された１つ又はそれ以上の特徴を有する、請求項３１に記載の微生物細胞。

【請求項33】

請求項３０～３２のいずれか１項に記載の微生物細胞であって、ここで、前記細胞のＴＦＡ含有量、前記細胞のＴＡＧ含有量、又は前記細胞の極性脂質、又はこれらの任意の組み合わせが、少なくとも１つの遺伝子改変が欠如しており、同じ条件下で培養された対応する微生物細胞と比較した場合、増加したＬ／Ｓ－ＳＦＡを有し、好ましくはここで、Ｌ／Ｓ－ＳＦＡ比が、少なくとも１つの遺伝子改変が欠如しており、同じ条件下で培養された対応する微生物細胞のＴＦＡ含有量、ＴＡＧ含有量、又は極性脂質におけるよりも、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、又は約３～約１０倍大きい、前記微生物細胞。

【請求項34】

ａ）ＦＡＴＡ脂肪アシルチオエステラーゼ、
ｂ）少なくとも１つの脂肪酸アシルトランスフェラーゼ、好ましくは少なくともジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）、又は
ｃ）ＦＡＴＡ及び少なくとも１つの脂肪酸アシルトランスフェラーゼ、好ましくは少なくともＤＧＡＴを、コードする外因性ポリヌクレオチドである少なくとも１つの遺伝子改変を含む、請求項３０～３３のいずれか１項に記載の微生物細胞であって、
ここで、各ポリヌクレオチドは、前記微生物細胞内で前記ポリヌクレオチドの発現を指令することができる１つ又はそれ以上のプロモーターに作動可能に連結されている、前記微生物細胞。

【請求項35】

リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）をコードする外因性ポリヌクレオチドをさらに含み、前記ポリヌクレオチドが、前記微生物細胞内で前記ポリヌクレオチドの発現を指令することができる１つ又はそれ以上のプロモーターに作動可能に連結されている、請求項３４に記載の微生物細胞。

【請求項36】

少なくとも１つのアシルトランスフェラーゼ、好ましくは少なくともＤＧＡＴが、パルミトイル－ＣｏＡと比較して、基質としてのステロイル－ＣｏＡ分子に対して少なくとも同等以上の活性を有する、請求項３４又は請求項３５に記載の微生物細胞。

【請求項37】

前記ＤＧＡＴが、配列番号８１に記載の配列を、又は配列番号８１と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を、有するアミノ酸を含む、請求項３４～３６のいずれか１項に記載の微生物細胞。

【請求項38】

前記ＤＧＡＴが酵母ＤＧＡ１である、請求項３４～３７のいずれか１項に記載の微生物細胞。

【請求項39】

前記ＤＧＡ１が、配列番号５３に記載の配列を、又は配列番号５３と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を、有するアミノ酸を含む、請求項３８に記載の微生物細胞。

【請求項40】

前記ＦＡＴＡが、配列番号８３若しくは配列番号８５に記載の配列を、又は配列番号８３及び配列番号８５の一方又は両方と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を、有するアミノ酸を含む、請求項３４～３９のいずれか１項に記載の微生物細胞。

【請求項41】

内因性Δ１２デサチュラーゼの発現及び／又は活性の低下をもたらす遺伝子改変、好ましくはΔ１２デサチュラーゼをコードする内因性遺伝子の遺伝子改変、より好ましくはΔ１２デサチュラーゼをコードする内因性遺伝子のヌル遺伝子改変を含む、請求項３０～４０のいずれか１項に記載の微生物細胞。

【請求項42】

前記遺伝子改変が、内因性Δ１２デサチュラーゼをコードする遺伝子における変異、好ましくはＦＡＤ２遺伝子のヌル変異である、請求項４１に記載の微生物細胞。

【請求項43】

基質として、ステアロイル－ＣｏＡと比較してＰＵＦＡ－ＣｏＡに対して優先性を有するか、又はステアロイル－ＣｏＡと比較してパルミトイル－ＣｏＡに対して優先性を有するか、又は両方である、ＤＧＡＴをコードする内因性遺伝子、好ましくはＤＧＡ２遺伝子の、発現又は活性又は両方の低下をもたらす遺伝子改変を含む、請求項３０～４２のいずれか１項に記載の微生物細胞。

【請求項44】

以下を有する、請求項３０～４３のいずれか１項に記載の微生物細胞：
１）ＦＡＴＡ脂肪アシルチオエステラーゼをコードする外因性ポリヌクレオチド、及び内因性Δ１２デサチュラーゼ遺伝子の発現及び／又は活性の低下をもたらす遺伝子改変、
２）脂肪酸アシルトランスフェラーゼ、好ましくはジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）をコードする外因性ポリヌクレオチド、及び内因性Δ１２デサチュラーゼ遺伝子の発現及び／又は活性の低下をもたらす遺伝子改変、
３）ＦＡＴＡ脂肪アシルチオエステラーゼ及び脂肪酸アシルトランスフェラーゼ、好ましくはジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）をコードする外因性ポリヌクレオチド、及び内因性Δ１２デサチュラーゼ遺伝子の発現及び／又は活性の低下をもたらす遺伝子改変、
４）ＦＡＴＡ脂肪アシルチオエステラーゼをコードする外因性ポリヌクレオチド、及び内因性ＤＧＡ２遺伝子の発現及び／又は活性の低下をもたらす遺伝子改変、
５）脂肪酸アシルトランスフェラーゼ、好ましくはジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）をコードする外因性ポリヌクレオチド、及び内因性ＤＧＡ２遺伝子の発現及び／又は活性の低下をもたらす遺伝子改変、
６）ＦＡＴＡ脂肪アシルチオエステラーゼ及び脂肪酸アシルトランスフェラーゼ、好ましくはジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）をコードする外因性ポリヌクレオチド、及び内因性ＤＧＡ２遺伝子の発現及び／又は活性の低下をもたらす遺伝子改変、
７）ＦＡＴＡ脂肪アシルチオエステラーゼをコードする外因性ポリヌクレオチド、内因性Δ１２デサチュラーゼ遺伝子の発現及び／又は活性の低下をもたらす遺伝子改変、及び内因性ＤＧＡ２遺伝子の発現及び／又は活性の低下をもたらす遺伝子改変、
８）脂肪酸アシルトランスフェラーゼ、好ましくはジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）をコードする外因性ポリヌクレオチド、内因性Δ１２デサチュラーゼ遺伝子の発現及び／又は活性の低下をもたらす遺伝子改変、及び内因性ＤＧＡ２遺伝子の発現及び／又は活性の低下をもたらす遺伝子改変、又は
９）ＦＡＴＡ脂肪アシルチオエステラーゼ及び脂肪酸アシルトランスフェラーゼ、好ましくはジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）をコードする外因性ポリヌクレオチド、内因性Δ１２デサチュラーゼ遺伝子の発現及び／又は活性の低下をもたらす遺伝子改変、及び内因性ＤＧＡ２遺伝子の発現及び／又は活性の低下をもたらす遺伝子改変、
ここで、各ポリヌクレオチドは、前記微生物細胞内で前記ポリヌクレオチドの発現を指令することができる１つ又はそれ以上のプロモーターに作動可能に連結されている。

【請求項45】

ＦＡＴＡ脂肪アシルチオエステラーゼ、脂肪酸アシルトランスフェラーゼ、好ましくはジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）をコードする外因性ポリヌクレオチド、及び内因性Δ１２デサチュラーゼ遺伝子の発現及び／又は活性の低下をもたらす遺伝子改変、好ましくは内因性Δ１２デサチュラーゼをコードする遺伝子の変異、より好ましくはＦＡＤ２遺伝子のヌル変異を含む、請求項３０～４４のいずれか１項に記載の微生物細胞。

【請求項46】

請求項４５に記載の微生物細胞であって、前記ＤＧＡＴが、配列番号１４４～１５４のいずれか１つに記載の配列を、又は配列番号１４４～１５４のいずれか１つ又はそれ以上と少なくとも７０％同一、好ましくは少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９７％同一であるヌクレオチド配列を、有するヌクレオチドを含み、及び／又は前記ＦＡＴＡ脂肪アシルチオエステラーゼが、配列番号８４又は８６のいずれか１つに記載の配列を、又は配列番号８４又は８６のいずれか１つ又はそれ以上と少なくとも７０％同一、好ましくは少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９７％同一であるヌクレオチド配列を、有するヌクレオチドを含む、前記微生物細胞。

【請求項47】

アシル－ＣｏＡシンセターゼ（ＡＣＳ）をコードする外因性ポリヌクレオチドを、又はリゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）をコードする外因性ポリヌクレオチドを、さらに含む請求項４５又は４６に記載の微生物細胞であって、
任意選択的に、前記ＡＣＳが配列番号８８～８９のいずれか１つに記載の配列を、又は、配列番号８８～８９のいずれか１つ又はそれ以上と少なくとも７０％同一、好ましくは少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９７％同一であるヌクレオチド配列を、有するヌクレオチドを含み、
任意選択的に、前記ＬＰＡＡＴが配列番号９１に記載の配列を、又は配列番号９１に記載の配列と少なくとも７０％同一、好ましくは少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９７％同一である有するヌクレオチド配列を有するヌクレオチドを含む、前記微生物細胞。

【請求項48】

真核細胞、真菌細胞、細菌細胞、若しくは藻類細胞、生きた微生物細胞、死んだ微生物細胞、又はこれらの任意の混合物を含む、又はこれらからなる、請求項３０～４７のいずれか１項に記載の微生物細胞。

【請求項49】

（ｉ）発酵に適したもの、（ｉｉ）油性細胞、（ｉｉｉ）非油性細胞、好ましくは遺伝子改変による油性細胞に由来する非油性細胞、及び（ｉｖ）従属栄養細胞の、１つ若しくはそれ以上又はすべてである、請求項３０～４８のいずれか１項に記載の微生物細胞。

【請求項50】

酵母細胞である、請求項３０～４９のいずれか１項に記載の微生物細胞。

【請求項51】

前記酵母細胞が、サッカロミセス・セレビッシェ、ヤローウィア・リポリティカ、ピキア・パストリス、及びこれらの任意の混合物からなる群から選択される、請求項５０に記載の微生物細胞。

【請求項52】

酵母細胞がヤローウィア・リポリティカである、請求項５１に記載の微生物細胞。

【請求項53】

約５ｇ／ｌ未満、約２ｇ／ｌ未満、約１ｇ／ｌ未満のステアリン酸塩を有するか、又はステアリン酸塩が添加されていない培地中の、又は前記培地で培養された、請求項３０～５２のいずれか１項に記載の微生物細胞。

【請求項54】

請求項１～２９のいずれか１項に記載の脂質を含むか、又は請求項３０～５３のいずれか１項に記載の微生物細胞から生成される、微生物細胞抽出物。

【請求項55】

好ましくは微生物細胞のゲノムに組み込まれた、請求項３４～４０のいずれか１項に記載の酵素の１つ又はそれ以上をコードする、ＤＮＡ構築体又はＤＮＡ構築体の組み合わせ。

【請求項56】

（ａ）請求項３０～５３のいずれか１項に記載の微生物細胞を得る工程、及び
（ｂ）前記微生物細胞から脂質を抽出する工程を含み、
それにより抽出された脂質を生成する、抽出された脂質の生成プロセス。

【請求項57】

前記微生物細胞を培養する工程、又は工程（ｂ）の前に前記細胞を酸で処理する工程をさらに含む、請求項５６に記載のプロセス。

【請求項58】

細胞が、５ｇ／ｌ未満、２ｇ／ｌ未満、１ｇ／ｌ未満のステアリン酸塩を有するか、又はステアリン酸が存在しない培地中で培養されている、請求項５７に記載のプロセス。

【請求項59】

脂質を抽出する工程が、前記細胞を有機溶媒に曝露する工程、細胞をプレスする工程、又は細胞をマイクロ波照射、超音波処理、高速ホモジナイゼーション、高圧ホモジナイゼーション、ビーズ叩解、オートクレーブ滅菌、熱分解、又はこれらの任意の組み合わせによって処理する工程を含む、請求項５６～５８のいずれか１項に記載のプロセス。

【請求項60】

前記方法が、抽出後の前記脂質を改変又は精製することをさらに含む、請求項５６～５９のいずれか１項に記載のプロセス。

【請求項61】

以下の工程を含む、微生物細胞を培養するプロセス：
（ａ）請求項３０～５３のいずれか１項に記載の微生物細胞を取得する工程、及び
（ｂ）適切な培地中で前記細胞を培養することにより、細胞の数を増やす工程。

【請求項62】

請求項３４～４７のいずれか１項に記載の１つ又はそれ以上の遺伝子改変及び／又は外因性ポリヌクレオチドを前駆微生物細胞に導入する工程を含む、請求項１～２９のいずれか１項に記載の脂質を産生する微生物細胞を製造するプロセス。

【請求項63】

以下の１つ又はそれ以上の工程を含む、請求項６２に記載のプロセス：
（ｉ）導入された前記遺伝子改変及び／又は前記外因性ポリヌクレオチドを含む細胞から子孫細胞を生成する工程、
（ｉｉ）前駆細胞集団の突然変異誘発、
（ｉｉｉ）１つ又はそれ以上の外因性ポリヌクレオチドを導入して、それにより外因性ポリヌクレオチドが前記微生物細胞のゲノムに、好ましくは所定の位置に組み込まれる工程、
（ｉｖ）前記細胞又はその子孫細胞の脂肪酸組成を決定する工程、及び
（ｖ）請求項１～２９のいずれか１項に記載の脂質を含む子孫細胞を選択する工程。

【請求項64】

請求項１～２９のいずれか１項に記載の脂質の１つ又はそれ以上又はすべてを含む組成物、請求項３０～５３のいずれか１項に記載の微生物細胞、又は請求項５４に記載の微生物細胞抽出物。

【請求項65】

別の食物、飼料、又は飲料成分を含む含む、請求項６４に記載の組成物。

【請求項66】

抽出された微生物脂質、細胞、又は抽出物以外の供給源に由来する、エステル化された又はエステル化されていない１つ又はそれ以上の脂肪酸をさらに含む、請求項６４又は請求項６５に記載の組成物。

【請求項67】

請求項１～２９のいずれか１項に記載の脂質、請求項３０～５３のいずれか１項に記載の微生物細胞、請求項５４に記載の微生物細胞抽出物、又は請求項６４～６６のいずれか１項に記載の組成物、及び少なくとも１つの他の食物、飼料、又は飲料成分の１つ又はそれ以上又はすべてである成分を含む食物、飼料、又は飲料。

【請求項68】

動物から得られる成分が欠如している、請求項６７に記載の食物、飼料、又は飲料。

【請求項69】

前記食物、飼料、又は飲料が肉代替品である、請求項６７又は請求項６８に記載の食物、飼料、又は飲料。

【請求項70】

請求項１～２９のいずれか１項に記載の脂質、請求項３０～５３のいずれか１項に記載の微生物細胞、請求項５４に記載の細胞抽出物、又は請求項６４～６６のいずれか１項に記載の組成物の１つ又はそれ以上又はすべてを、少なくとも１つの他の食物、飼料、又は飲料成分と組み合わせる工程を含む、食物、飼料、又は飲料を製造する方法。

【請求項71】

食物、飼料、若しくは飲料成分、又は食物、飼料、若しくは飲料を製造するための、請求項１～２９のいずれか１項に記載の脂質、請求項３０～５３のいずれか１項に記載の微生物細胞、請求項５４に記載の微生物細胞抽出物、又は請求項６４～６６の組成物の１つ又はそれ以上又はすべての使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

発明の分野
本発明は、抽出された微生物の脂質、前記脂質を含む微生物細胞、及びこれらの抽出物に関する。本発明はまた、食物、飼料、及び飲料におけるこれらの脂質、細胞、及び抽出物の使用にも関する。

【背景技術】

【0002】

飽和脂肪酸は、末端のメチル基とカルボン酸基の間にあるメチレン（ＣＨ_２）基からなる炭素原子の直鎖である。食物中の最も一般的な飽和脂肪酸は、ラウリン酸（Ｃ１２）、パルミチン酸（Ｃ１６）、ステアリン酸（Ｃ１８）である。
特定の飽和脂肪酸を高レベルで摂取すると健康上の懸念があるにもかかわらず、これらは一部の食物、及びその製造プロセスの重要な部分を形成している。
ココナツオイルは、最も飽和度の高い天然脂肪である（典型的には、約９４％飽和）。他の「飽和」脂肪には、パーム核油（典型的には、８２％飽和）、カカオ脂（典型的には、６０～６４％飽和）、及びパーム油（典型的には、５１％飽和）がある。ラードと牛脂も、典型的にはそれぞれ４０％と３７％の飽和脂肪しか含まないにもかかわらず、しばしばこの飽和脂肪のカテゴリーに属すると考えられている（Talbot, 2011）。
食物、及び食物製造プロセスで使用できる、特に非動物源からの飽和脂肪酸の代替供給源の必要性が高まっている。

【発明の概要】

【0003】

本発明者らは、高レベルの飽和脂肪酸と低レベルの多価不飽和脂肪酸を含む新たな抽出された微生物脂質を生成した。

【0004】

すなわち、第１の態様において、本発明は、飽和脂肪酸（ＳＦＡ）の総飽和脂肪酸含有量と、一価不飽和脂肪酸（ＭＵＦＡ）の総一価不飽和脂肪酸含有量とを含む総脂肪酸含有量を含む抽出された微生物脂質を提供し、ここで、ＳＦＡの少なくとも一部とＭＵＦＡの少なくとも一部とを含む総脂肪酸含有量の少なくとも一部がトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）の形態でエステル化されており、従って前記抽出された微生物脂質は総ＴＡＧ含有量を有し、そして、ここで、
（ｉ）抽出された微生物脂質の総ＳＦＡ含有量は、ステアリン酸（Ｃ１８：０）、パルミチン酸（Ｃ１６：０）、ミリスチン酸（Ｃ１４：０）、アラキジン酸（Ｃ２０：０）、ベヘン酸（Ｃ２２：０）、及びリグノセリン酸（Ｃ２４：０）を含み、従って、前記抽出された微生物脂質の総脂肪酸含有量の脂肪酸の少なくとも５０重量％はＳＦＡであり、
（ｉｉ）前記総脂肪酸含有量の２０重量％～８５重量％はステアリン酸であり、
（ｉｉｉ）前記抽出された微生物脂質の総ＭＵＦＡ含有量は、オレイン酸（Ｃ１８：１Δ９）及びパルミトレイン酸（Ｃ１６：１Δ９）、並びに任意選択的にＣ１６：１Δ７及び／又はＣ１７：１を含み、
（ｉｖ）前記抽出された微生物脂質の前記総脂肪酸（ＴＦＡ）含有量は、多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）が欠如しているか、又はリノール酸（Ｃ１８：２Δ９，１２）を含むＰＵＦＡ含有量を含み、ここで、前記ＰＵＦＡ含有量は前記総脂肪酸含有量の５重量未満であり、
（ｖ）前記抽出された微生物脂質は、リン脂質を含む極性脂質を含むか、又は極性脂質が欠如しているかのいずれかであり、そして
（ｖｉ）前記抽出された微生物脂質は２５℃で固体である。

【0005】

１つの実施態様において、脂質は、３０℃、３５℃、４０℃、４５℃、又は５０℃のうちの１つ又はそれ以上又はすべてで固体である。

【0006】

１つの実施態様において、脂質のＴＦＡ含有量、又はＴＡＧ含有量のＴＦＡ含有量、又は両方の２０重量％～８０重量％、２０重量％～７５重量％、２０重量％～７０重量％、２０重量％～６５重量％、２０重量％～６０重量％、２０重量％～５５重量％、２０重量％～５０重量％、２０重量％～４５重量％、２５重量％～８０重量％、２５重量％～７５重量％、２５重量％～７０重量％、２５重量％～６５重量％、２５重量％～６０重量％、２５重量％～５５重量％、２５重量％～５０重量％、又は２５重量％～４５重量％はステアリン酸である。この実施態様において、抽出された微生物脂質は、好ましくは抽出された酵母脂質であり、より好ましくは抽出された ヤロウィア（Yarrowia）
脂質、例えばワイ・リポリティカ（Y. liplytica）脂質である。

【0007】

１つの実施態様において、脂質のＴＦＡ含有量、又はＴＡＧ含有量のＴＦＡ含有量、又は両方は、４重量％未満、３重量％未満、２重量％未満、１重量％未満、０．５重量％未満、若しくは０．２重量％未満、又は０．２重量％～５重量％、０．２重量％～４重量％、０．２重量％～３重量％、０．２重量％～２重量％、０．５重量％～５重量％、０．５重量％～４重量％、０．５重量％～３重量％、０．５重量％～２重量％のリノール酸（ＬＡ）を含むか、又はＬＡは、脂質のＴＦＡ含有量及び／又はＴＡＧ含有量のＴＦＡ含有量には本質的に存在しない。この実施態様において、抽出された微生物脂質は、好ましくは抽出された酵母脂質であり、より好ましくは抽出されたヤロウィア脂質、例えばワイ・リポリティカ脂質である。

【0008】

１つの実施態様において、脂質の又はＴＡＧ含有量のＴＦＡ含有量、又は両方は、４重量％未満、３重量％未満、２重量％未満、１重量％未満、０．５重量％未満、若しくは０．２重量％未満、又は０．２重量％～５重量％、０．２重量％～４重量％、０．２重量％～３重量％、０．２重量％～２重量％、０．５重量％～５重量％、０．５重量％～４重量％、０．５重量％～３重量％、０．５重量％～２重量％のＰＵＦＡを含むか、又はＰＵＦＡは、脂質の及び／又はＴＡＧ含有量のＴＦＡ含有量には本質的に存在しない。この実施態様において、抽出された微生物脂質は、好ましくは抽出された酵母脂質であり、より好ましくは抽出されたヤロウィア脂質、例えばワイ・リポリティカ脂質である。

【0009】

１つの実施態様において、脂質の及び／又はＴＡＧのＴＦＡ含有量は、少なくとも１０重量％、少なくとも１２重量％、少なくとも１５重量％、少なくとも２０重量％、少なくとも２５重量％、少なくとも３０重量％、１０重量％～５０重量％、１０重量％～４５重量％、１０重量％～４０重量％、１０重量％～３５重量％、１０重量％～３０重量％、１５重量％～５０重量％、１５重量％～４５重量％、１５重量％～４０重量％、１５重量％～３５重量％、１５重量％～３０重量％、２０重量％～５０重量％、２０重量％～４５重量％、２０重量％～４０重量％、２０重量％～３５重量％、又は２０重量％～３０重量％のオレイン酸を含む。この実施態様において、抽出された微生物脂質は、好ましくは抽出された酵母脂質であり、より好ましくは抽出されたヤロウィア脂質、例えばワイ・リポリティカ脂質である。

【0010】

１つの実施態様において、脂質のＴＦＡ含有量及び／又はＴＡＧのＴＦＡ含有量は、少なくとも５％、少なくとも８％、少なくとも１０％、又は少なくとも１２％のパルミチン酸を含む。実施態様において、パルミチン酸含有量は、５％～２５％、８％～２５％、１０％～２５％、又は１２％～２５％である。

【0011】

１つの実施態様において、脂質は、少なくとも１つの遺伝子改変を含み、及び少なくとも１つの遺伝子改変が欠如した対応する微生物から得られた対応する抽出された微生物脂質と比較して、脂質のＴＦＡ含有量及び／又はＴＡＧ含有量中に、より多量の、総ＳＦＡ含有量、Ｃ１８：０含有量、Ｃ２０：０含有量、及びＣ２２：０含有量の１つ又はそれ以上又はすべてを有する微生物から抽出された。例示的な遺伝子改変は本明細書で論じられる。この実施態様において、抽出された微生物脂質は、好ましくは抽出された酵母脂質であり、より好ましくは抽出されたヤロウィア脂質、例えばワイ・リポリティカ脂質である。

【0012】

１つの実施態様において、脂質のＴＦＡ含有量及び／又はＴＡＧ含有量は、３０重量％～９０重量％、３０重量％～８５重量％、３０重量％～８０重量％、３０重量％～７５重量％、３０重量％～７０重量％、３０重量％～６５重量％、３０重量％～６０重量％、３０重量％～５５重量％、３０重量％～５０重量％、３０重量％～４５重量％、３０重量％～４０重量％、３５重量％～９０重量％、３５重量％～８５重量％、３５重量％～８０重量％、３５重量％～７５重量％、３５重量％～７０重量％、３５重量％～６５重量％、３５重量％～６０重量％、３５重量％～５５重量％、３５重量％～５０重量％、３５重量％～４５重量％、３５重量％～４０重量％、４０重量％～９０重量％、４０重量％～８５重量％、４０重量％～８０重量％、４０重量％～７５重量％、４０重量％～７０重量％、４０重量％～６５重量％、４０重量％～６０重量％、４０重量％～５５重量％、４０重量％～５０重量％、４０重量％～４５重量％、４５重量％～９０重量％、４５重量％～８５重量％、４５重量％～８０重量％、４５重量％～７５重量％、４５重量％～７０重量％、４５重量％～６５重量％、４５重量％～６０重量％、４５重量％～５５重量％、４５重量％～５０重量％、５０重量％～９０重量％、５０重量％～８５重量％、５０重量％～８０重量％、５０重量％～７５重量％、５０重量％～７０重量％、５０重量％～６５重量％、５０重量％～６０重量％、５５重量％～９０重量％、５５重量％～８５重量％、５５重量％～８０重量％、５５重量％～７５重量％、５５重量％～７０重量％、５５重量％～６５重量％、５５重量％～６０重量％、６０重量％～９０重量％、６０重量％～８５重量％、６０重量％～８０重量％、６０重量％～７５重量％、又は６０重量％～７０重量％のＳＦＡを含む。この実施態様において、抽出された微生物脂質は、好ましくは抽出された酵母脂質であり、より好ましくは抽出されたヤロウィア脂質、例えばワイ・リポリティカ脂質である。

【0013】

１つの実施態様において、総ＳＦＡ含有量が、脂質のＴＦＡ含有量及び／又はＴＡＧのＴＦＡ含有量の少なくとも６０重量％である場合、ステアリン酸含有量は少なくとも４０重量％である。

【0014】

１つの実施態様において、脂質のＴＦＡ含有量又は脂質のＴＡＧ含有量又は両方の、１８個以上の炭素を含む総飽和脂肪酸と１６個以下の炭素を含む総飽和脂肪酸との比（Ｌ／Ｓ－ＳＦＡ比）は、少なくとも約１．５であり、少なくとも約２であり、少なくとも約２．５であり、少なくとも約３であり、少なくとも約４であり、少なくとも約５であり、少なくとも約６であり、少なくとも約７であり、少なくとも約８であり、少なくとも約９であり、少なくとも約１０であり、又は約３～約１０である。１つの実施態様において、脂質のＴＦＡ含有量又は脂質のＴＡＧ含有量又は両方のＬ／Ｓ－ＳＦＡ比は、１．５～１０、１．５～９、１．５～８、１．５～７、１．５～６、１．５～５、１．５～４、１．７５～１０、１．７５～９、１．７５～８、１．７５～７、１．７５～６、１．７５～５、１．７５～４、２～１０、２～９、２～８、２～７、２～６、２～５、２～４、２．５～１０、２．５～９、２．５～８、２．５～７、２．５～６、２．５～５、２．５～４である。これらの実施態様において、抽出された微生物脂質は、好ましくは抽出された酵母脂質であり、より好ましくは抽出されたヤロウィア脂質、例えばワイ・リポリティカ脂質である。

【0015】

１つの実施態様において、脂質は、少なくとも１つの遺伝子改変を含む微生物から抽出され、脂質のＴＦＡ含有量又はＴＡＧ含有量又は両方のＬ／Ｓ－ＳＦＡ比は、少なくとも１つの遺伝子改変が欠如した対応する微生物から得られた対応する抽出された微生物脂質と比較して、少なくとも約１．５、少なくとも約２、少なくとも約２．５、少なくとも約３、少なくとも約４、少なくとも約５、少なくとも約６、少なくとも約７、少なくとも約８、少なくとも約９、少なくとも約１０倍、又は３～１０倍大きい。１つの実施態様において、脂質は、少なくとも１つの遺伝子改変を含む微生物から抽出され、そして脂質のＴＦＡ含有量又はＴＡＧ含有量又は両方のＬ／Ｓ－ＳＦＡ比は、少なくとも１つの遺伝子改変が欠如した対応する微生物から得られた対応する抽出された微生物脂質と比較して、１．５～１０、１．５～９、１．５～８、１．５～７、１．５～６、１．５～５、１．５～４、１．７５～１０、１．７５～９、１．７５～８、１．７５～７、１．７５～６、１．７５～５、１．７５～４、２～１０、２～９、２～８、２～７、２～６、２～５、２～４、２．５～１０、２．５～９、２．５～８、２．５～７、２．５～６、２．５～５、又は２．５～４倍上昇している。これらの実施態様において、抽出された微生物脂質は、好ましくは抽出された酵母脂質であり、より好ましくは抽出されたヤロウィア脂質、例えばワイ・リポリティカ脂質である。例示的な遺伝子改変は本明細書で論じられる。

【0016】

１つの実施態様において、Ｃ２０：０、Ｃ２２：０、及びＣ２４：０脂肪酸の含有量の合計は、抽出された脂質のＴＦＡ含有量又は抽出された脂質のＴＡＧ含有量又は両方の、５重量％～２５重量％、５重量％～２０重量％、５重量％～１８重量％、５重量％～１６重量％、５重量％～１５重量％、５重量％～１４重量％、５重量％～１３重量％、５重量％～１２重量％、５重量％～１０重量％、６重量％～２５重量％、６重量％～２０重量％、６重量％～１８重量％、６重量％～１６重量％、６重量％～１５重量％、６重量％～１４重量％、６重量％～１３重量％、６重量％～１２重量％、６重量％～１０重量％、７重量％～２５重量％、７重量％～２０重量％、７重量％～１８重量％、７重量％～１６重量％、７重量％～１５重量％、７重量％～１４重量％、７重量％～１３重量％、７重量％～１２重量％、又は７重量％～１０重量％である。この実施態様において、抽出された微生物脂質は、好ましくは抽出された酵母脂質であり、より好ましくは抽出されたヤロウィア脂質、例えばワイ・リポリティカ脂質である。

【0017】

１つの実施態様において、Ｃ２０：０脂肪酸の含有量は、抽出された脂質のＴＦＡ含有量又は抽出された脂質のＴＡＧ含有量又は両方の、約１重量％～約５重量％、約１重量％～約４重量％、約１重量％～約３重量％、約２重量％～約５重量％、約２重量％～約４重量％、約２重量％～約３重量％である。

【0018】

１つの実施態様において、Ｃ２２：０脂肪酸の含有量は、抽出された脂質のＴＦＡ含有量又は抽出された脂質のＴＡＧ含有量又は両方の、約１重量％～約５重量％、約１重量％～約４重量％、約２重量％～約５重量％、又は約２重量％～約４重量％である。

【0019】

１つの実施態様において、Ｃ２４：０脂肪酸の含有量は、抽出された脂質のＴＦＡ含有量又は抽出された脂質のＴＡＧ含有量又は両方の、約１重量％～約６重量％、約１重量％～約５重量％、約１重量％～約４重量％、約２重量％～約６重量％、約２重量％～約５重量％、又は約２重量％～約４重量％である。

【0020】

別の実施態様において、Ｃ２０：０脂肪酸の含有量は、抽出された脂質のＴＦＡ含有量又は抽出された脂質のＴＡＧ含有量又は両方の、少なくとも約１重量％、少なくとも約１．５重量％、少なくとも約２重量％、少なくとも約２．５重量％、又は少なくとも約３重量％であり、Ｃ２２：０脂肪酸の含有量は、少なくとも約１重量％、少なくとも約１．５重量％、少なくとも約２重量％、少なくとも約２．５重量％、少なくとも約３重量％、又は少なくとも約３．５重量％であり、及び／又はＣ２４：０脂肪酸の含有量は、少なくとも約１重量％、少なくとも約１．５重量％、少なくとも約２重量％、少なくとも約２．５重量％、少なくとも約３重量％、少なくとも約３．５重量％、又は少なくとも４重量％である。

【0021】

１つの実施態様において、（ｉ）脂質の若しくはＴＡＧ含有量のＴＦＡ含有量又は両方の２０重量％～５５重量％はステアリン酸であり、そして（ｉｉ）４重量％未満、３重量％未満、２重量％未満、１重量％未満、０．５重量％未満、若しくは０．２重量％未満、又は０．２重量％～５重量％、０．２重量％～４重量％、０．２重量％～３重量％、０．２重量％～２重量％、０．５重量％～５重量％、０．５重量％～４重量％、０．５重量％～３重量％、０．５重量％～２重量％は、リノール酸（ＬＡ）若しくは総ＰＵＦＡ若しくは両方であるか、又はＬＡ若しくはＰＵＦＡ若しくは両方は、脂質の及び／又はＴＡＧ含有量のＴＦＡから本質的に欠如している。１つの実施態様において、（ｉ）脂質の若しくはＴＡＧ含有量のＴＦＡ含有量又は両方の２０重量％～５０重量％はステアリン酸であり、そして（ｉｉ）４重量％未満、３重量％未満、２重量％未満、１重量％未満、０．５重量％未満、若しくは０．２重量％未満、又は０．２重量％～５重量％、０．２重量％～４重量％、０．２重量％～３重量％、０．２重量％～２重量％、０．５重量％～５重量％、０．５重量％～４重量％、０．５重量％～３重量％、０．５重量％～２重量％は、リノール酸（ＬＡ）若しくは総ＰＵＦＡ若しくは両方であり、又はＬＡ若しくはＰＵＦＡ若しくは両方は、脂質の及び／又はＴＡＧ含有量のＴＦＡから本質的に欠如している。１つの実施態様において、（ｉ）脂質のＴＦＡ含有量、又はＴＡＧ含有量のＴＦＡ含有量、又は両方の２０重量％～４５重量％はステアリン酸であり、そして（ｉｉ）４重量％未満、３重量％未満、２重量％未満、１重量％未満、０．５重量％未満、若しくは０．２重量％未満、又は０．２重量％～５重量％、０．２重量％～４重量％、０．２重量％～３重量％、０．２重量％～２重量％、０．５重量％～５重量％、０．５重量％～４重量％、０．５重量％～３重量％、０．５重量％～２重量％は、リノール酸（ＬＡ）若しくは総ＰＵＦＡ若しくは両方であり、又はＬＡ若しくはＰＵＦＡ若しくは両方は、脂質の及び／又はＴＡＧ含有量のＴＦＡから本質的に欠如している。これらの実施態様において、抽出された微生物脂質は、好ましくは抽出された酵母脂質であり、より好ましくは抽出されたヤロウィア脂質、例えばワイ・リポリティカ脂質である。

【0022】

１つの実施態様において、（ｉ）脂質の若しくはＴＡＧ含有量のＴＦＡ含有量又は両方の２０重量％～５５重量％はステアリン酸であり、そして（ｉｉ）少なくとも１０重量％、少なくとも１２重量％、少なくとも１５重量％、少なくとも２０重量％、少なくとも２５重量％、少なくとも３０重量％、１０重量％～５０重量％、１０重量％～４５重量％、１０重量％～４０重量％、１０重量％～３５重量％、１０重量％～３０重量％、１５重量％～５０重量％、１５重量％～４５重量％、１５重量％～４０重量％、１５重量％～３５重量％、１５重量％～３０重量％、２０重量％～５０重量％、２０重量％～４５重量％、２０重量％～４０重量％、２０重量％～３５重量％、又は２０重量％～３０重量％はオレイン酸である。１つの実施態様において、（ｉ）脂質の若しくはＴＡＧ含有量のＴＦＡ含有量又は両方の２０重量％～５０重量％はステアリン酸であり、そして（ｉｉ）少なくとも１０重量％、少なくとも１２重量％、少なくとも１５重量％、少なくとも２０重量％、少なくとも２５重量％、少なくとも３０重量％、１０重量％～５０重量％、１０重量％～４５重量％、１０重量％～４０重量％、１０重量％～３５重量％、１０重量％～３０重量％、１５重量％～５０重量％、１５重量％～４５重量％、１５重量％～４０重量％、１５重量％～３５重量％、１５重量％～３０重量％、２０重量％～５０重量％、２０重量％～４５重量％、２０重量％～４０重量％、２０重量％～３５重量％、又は２０重量％～３０重量％はオレイン酸である。１つの実施態様において、（ｉ）脂質の若しくはＴＡＧ含有量のＴＦＡ含有量又は両方の２０重量％～４５重量％はステアリン酸であり、そして（ｉｉ）少なくとも１０重量％、少なくとも１２重量％、少なくとも１５重量％、少なくとも２０重量％、少なくとも２５重量％、少なくとも３０重量％、１０重量％～５０重量％、１０重量％～４５重量％、１０重量％～４０重量％、１０重量％～３５重量％、１０重量％～３０重量％、１５重量％～５０重量％、１５重量％～４５重量％、１５重量％～４０重量％、１５重量％～３５重量％、１５重量％～３０重量％、２０重量％～５０重量％、２０重量％～４５重量％、２０重量％～４０重量％、２０重量％～３５重量％、又は２０重量％～３０重量％はオレイン酸である。これらの実施態様において、抽出された微生物脂質は、好ましくは抽出された酵母脂質であり、より好ましくは抽出されたヤロウィア脂質、例えばワイ・リポリティカ脂質である。

【0023】

１つの実施態様において、（ｉ）脂質の若しくはＴＡＧ含有量のＴＦＡ含有量又は両方の２０％～５５重量％はステアリン酸であり、そして（ｉｉ）脂質のＴＦＡ含有量又は脂質のＴＡＧ含有量又は両方のＬ／Ｓ－ＳＦＡ比は、１．５～１０、１．５～９、１．５～８、１．５～７、１．５～６、１．５～５、１．５～４、１．７５～１０、１．７５～９、１．７５～８、１．７５～７、１．７５～６、１．７５～５、１．７５～４、２～１０、２～９、２～８、２～７、２～６、２～５、２～４、２．５～１０、２．５～９、２．５～８、２．５～７、２．５～６、２．５～５、２．５～４である。１つの実施態様において、（ｉ）脂質の若しくはＴＡＧ含有量のＴＦＡ含有量又は両方の２０％～５０重量％はステアリン酸であり、そして（ｉｉ）脂質のＴＦＡ含有量又は脂質のＴＡＧ含有量又は両方のＬ／Ｓ－ＳＦＡ比は、１．５～１０、１．５～９、１．５～８、１．５～７、１．５～６、１．５～５、１．５～４、１．７５～１０、１．７５～９、１．７５～８、１．７５～７、１．７５～６、１．７５～５、１．７５～４、２～１０、２～９、２～８、２～７、２～６、２～５、２～４、２．５～１０、２．５～９、２．５～８、２．５～７、２．５～６、２．５～５、２．５～４である。１つの実施態様において、（ｉ）脂質の又は脂質のＴＡＧ含有量又は両方の２０％～４５重量％はステアリン酸であり、そして（ｉｉ）脂質のＴＦＡ含有量又は脂質のＴＡＧ含有量又は両方のＬ／Ｓ－ＳＦＡ比は、１．５～１０、１．５～９、１．５～８、１．５～７、１．５～６、１．５～５、１．５～４、１．７５～１０、１．７５～９、１．７５～８、１．７５～７、１．７５～６、１．７５～５、１．７５～４、２～１０、２～９、２～８、２～７、２～６、２～５、２～４、２．５～１０、２．５～９、２．５～８、２．５～７、２．５～６、２．５～５、２．５～４である。これらの実施態様において、抽出された微生物脂質は、好ましくは抽出された酵母脂質であり、より好ましくは抽出されたヤロウィア脂質、例えばワイ・リポリティカ脂質である。

【0024】

１つの実施態様において、脂質は、少なくとも１つの遺伝子改変を含む微生物から抽出され、そして（ｉ）脂質の若しくはＴＡＧ含有量のＴＦＡ含有量又は両方の２０重量％～５５重量％はステアリン酸であり、及び（ｉｉ）脂質は、前記少なくとも１つの遺伝子改変が欠如した対応する微生物から得られた対応する抽出された微生物脂質と比較して、ＴＦＡ含有量及び／又はＴＡＧ含有量において、総ＳＦＡ含有量、Ｃ１８：０含有量、Ｃ２０：０含有量、及びＣ２２：０含有量のうちの１つ又はそれ以上又はすべてを、より多量に有する。１つの実施態様において、脂質は、少なくとも１つの遺伝子改変を含む微生物から抽出され、そして（ｉ）脂質の若しくはＴＡＧ含有量のＴＦＡ含有量又は両方の２０重量％～５０量％はステアリン酸であり、及び（ｉｉ）脂質は、前記少なくとも１つの遺伝子改変が欠如した対応する微生物から得られた対応する抽出された微生物脂質と比較して、ＴＦＡ含有量及び／又はＴＡＧ含有量において、総ＳＦＡ含有量、Ｃ１８：０含有量、Ｃ２０：０含有量、及びＣ２２：０含有量のうちの１つ又はそれ以上又はすべてを、より多量に有する。１つの実施態様において、脂質は、少なくとも１つの遺伝子改変を含む微生物から抽出され、そして（ｉ）脂質の若しくはＴＡＧ含有量のＴＦＡ含有量又は両方の２０重量％～４５重量％はステアリン酸であり、及び（ｉｉ）脂質は、前記少なくとも１つの遺伝子改変が欠如した対応する微生物から得られた対応する抽出された微生物脂質と比較して、ＴＦＡ含有量及び／又はＴＡＧ含有量において、総ＳＦＡ含有量、Ｃ１８：０含有量、Ｃ２０：０含有量、及びＣ２２：０含有量のうちの１つ又はそれ以上又はすべてを、より多量に有する。これらの実施態様において、前記抽出された微生物脂質は、好ましくは抽出された酵母脂質であり、より好ましくは抽出されたヤロウィア脂質、例えばワイ・リポリティカ脂質である。

【0025】

１つの実施態様において、
（ｉ）脂質の若しくはＴＡＧ含有量のＴＦＡ含有量又は両方の２０重量％～５５重量％はステアリン酸であり、及び（ｉｉ）脂質の若しくはＴＡＧ含有量のＴＦＡ含有量又は両方のＣ２４：０脂肪酸の含有量は、約１重量％～約６重量％、約１重量％～約５重量％、約１重量％～約４重量％、約２重量％～約６重量％、約２重量％～約５重量％、又は約２重量％～約４重量％である。１つの実施態様において、（ｉ）脂質の若しくはＴＡＧ含有量のＴＦＡ含有量又は両方の２０重量％～５０重量％はステアリン酸であり、及び（ｉｉ）脂質の若しくはＴＡＧ含有量のＴＦＡ含有量又は両方のＣ２４：０脂肪酸の含有量は、約１重量％～約６重量％、約１重量％～約５重量％、約１重量％～約４重量％、約２重量％～約６重量％、約２重量％～約５重量％、又は約２重量％～約４重量％である。１つの実施態様において、（ｉ）脂質の若しくはＴＡＧ含有量のＴＦＡ含有量又は両方の２０重量％～４５重量％はステアリン酸であり、及び（ｉｉ）脂質の若しくはＴＡＧ含有量のＴＦＡ含有量又は両方のＣ２４：０脂肪酸の含有量は、約１重量％～約６重量％、約１重量％～約５重量％、約１重量％～約４重量％、約２重量％～約６重量％、約２重量％～約５重量％、又は約２重量％～約４重量％である。これらの実施態様において、前記抽出された微生物脂質は、好ましくは抽出された酵母脂質であり、より好ましくは抽出されたヤロウィア脂質、例えばワイ・リポリティカ脂質である。

【0026】

１つの実施態様において、
（ｉ）脂質の若しくはＴＡＧ含有量のＴＦＡ含有量又は両方の４重量％未満はリノール酸（ＬＡ）であり、及び（ｉｉ）少なくとも１０重量％、少なくとも１２重量％、少なくとも１５重量％、少なくとも２０重量％、少なくとも２５重量％、少なくとも３０重量％、１０重量％～５０重量％、１０重量％～４５重量％、１０重量％～４０重量％、１０重量％～３５重量％、１０重量％重量％～３０重量％、１５重量％～５０重量％、１５重量％～４５重量％、１５重量％～４０重量％、１５重量％～３５重量％、１５重量％～３０重量％、２０重量％～５０重量％、２０重量％～４５重量％、２０重量％～４０重量％、２０重量％～３５重量％、又は２０重量％～３０重量％はオレイン酸である。１つの実施態様において、（ｉ）脂質の若しくはＴＡＧ含有量のＴＦＡ含有量又は両方の３重量％未満はリノール酸（ＬＡ）であり、及び（ｉｉ）少なくとも１０重量％、少なくとも１２重量％、少なくとも１５重量％、少なくとも２０重量％、少なくとも２５重量％、少なくとも３０重量％、１０重量％～５０重量％、１０重量％～４５重量％、１０重量％～４０重量％、１０重量％～３５重量％、１０重量％重量％～３０重量％、１５重量％～５０重量％、１５重量％～４５重量％、１５重量％～４０重量％、１５重量％～３５重量％、１５重量％～３０重量％、２０重量％～５０重量％、２０重量％～４５重量％、２０重量％～４０重量％、２０重量％～３５重量％、又は２０重量％～３０重量％はオレイン酸である。１つの実施態様において、（ｉ）脂質の若しくはＴＡＧ含有量のＴＦＡ含有量又は両方の２重量％未満はリノール酸（ＬＡ）であり、及び（ｉｉ）少なくとも１０重量％、少なくとも１２重量％、少なくとも１５重量％、少なくとも２０重量％、少なくとも２５重量％、少なくとも３０重量％、１０重量％～５０重量％、１０重量％～４５重量％、１０重量％～４０重量％、１０重量％～３５重量％、１０重量％重量％～３０重量％、１５重量％～５０重量％、１５重量％～４５重量％、１５重量％～４０重量％、１５重量％～３５重量％、１５重量％～３０重量％、２０重量％～５０重量％、２０重量％～４５重量％、２０重量％～４０重量％、２０重量％～３５重量％、又は２０重量％～３０重量％はオレイン酸である。１つの実施態様において、（ｉ）脂質の若しくはＴＡＧ含有量のＴＦＡ含有量又は両方の０．２重量％未満はリノール酸（ＬＡ）であるか、又はＬＡは、脂質の若しくはＴＡＧ含有量のＴＦＡ含有量又は両方から欠如しており、及び（ｉｉ）少なくとも１０重量％、少なくとも１２重量％、少なくとも１５重量％、少なくとも２０重量％、少なくとも２５重量％、少なくとも３０重量％、１０重量％～５０重量％、１０重量％～４５重量％、１０重量％～４０重量％、１０重量％～３５重量％、１０重量％重量％～３０重量％、１５重量％～５０重量％、１５重量％～４５重量％、１５重量％～４０重量％、１５重量％～３５重量％、１５重量％～３０重量％、２０重量％～５０重量％、２０重量％～４５重量％、２０重量％～４０重量％、２０重量％～３５重量％、又は２０重量％～３０重量％はオレイン酸である。これらの実施態様において、前記抽出された微生物脂質は、好ましくは抽出された酵母脂質であり、より好ましくは抽出されたヤロウィア脂質、例えばワイ・リポリティカ脂質である。

【0027】

１つの実施態様において、
（ｉ）脂質の若しくはＴＡＧ含有量のＴＦＡ含有量又は両方の４重量％未満はリノール酸（ＬＡ）であり、及び（ｉｉ）脂質のＴＦＡ含有量又は脂質のＴＡＧ含有量又は両方のＬ／Ｓ－ＳＦＡ比は、１．５～１０、１．５～９、１．５～８、１．５～７、１．５～６、１．５～５、１．５～４、１．７５～１０、１．７５～９、１．７５～８、１．７５～７、１．７５～６、１．７５～５、１．７５～４、２～１０、２～９、２～８、２～７、２～６、２～５、２～４、２．５～１０、２．５～９、２．５～８、２．５～７、２．５～６、２．５～５、及び２．５～４である。１つの実施態様において、（ｉ）脂質の若しくはＴＡＧ含有量のＴＦＡ含有量又は両方の３重量％未満はリノール酸（ＬＡ）であり、及び（ｉｉ）脂質のＴＦＡ含有量又は脂質のＴＡＧ含有量又は両方のＬ／Ｓ－ＳＦＡ比は、１．５～１０、１．５～９、１．５～８、１．５～７、１．５～６、１．５～５、１．５～４、１．７５～１０、１．７５～９、１．７５～８、１．７５～７、１．７５～６、１．７５～５、１．７５～４、２～１０、２～９、２～８、２～７、２～６、２～５、２～４、２．５～１０、２．５～９、２．５～８、２．５～７、２．５～６、２．５～５、及び２．５～４である。１つの実施態様において、（ｉ）脂質の若しくはＴＡＧ含有量のＴＦＡ含有量又は両方の２重量％未満はリノール酸（ＬＡ）であり、及び（ｉｉ）脂質のＴＦＡ含有量又は脂質のＴＡＧ含有量又は両方のＬ／Ｓ－ＳＦＡ比は、１．５～１０、１．５～９、１．５～８、１．５～７、１．５～６、１．５～５、１．５～４、１．７５～１０、１．７５～９、１．７５～８、１．７５～７、１．７５～６、１．７５～５、１．７５～４、２～１０、２～９、２～８、２～７、２～６、２～５、２～４、２．５～１０、２．５～９、２．５～８、２．５～７、２．５～６、２．５～５、及び２．５～４である。１つの実施態様において、（ｉ）脂質の若しくはＴＡＧ含有量のＴＦＡ含有量又は両方の０．２重量％未満はリノール酸（ＬＡ）であり、及び（ｉｉ）脂質のＴＦＡ含有量又は脂質のＴＡＧ含有量又は両方のＬ／Ｓ－ＳＦＡ比は、１．５～１０、１．５～９、１．５～８、１．５～７、１．５～６、１．５～５、１．５～４、１．７５～１０、１．７５～９、１．７５～８、１．７５～７、１．７５～６、１．７５～５、１．７５～４、２～１０、２～９、２～８、２～７、２～６、２～５、２～４、２．５～１０、２．５～９、２．５～８、２．５～７、２．５～６、２．５～５、及び２．５～４である。これらの実施態様において、抽出された微生物脂質は、好ましくは抽出された酵母脂質、より好ましくは抽出されたヤロウィア脂質、例えばワイ・リポリティカ脂質である。

【0028】

１つの実施態様において、
（ｉ）脂質の若しくはＴＡＧ含有量のＴＦＡ含有量又は両方の４重量％未満はＰＵＦＡであり、及び（ｉｉ）少なくとも１０重量％、少なくとも１２重量％、少なくとも１５重量％、少なくとも２０重量％、少なくとも２５重量％、少なくとも３０重量％、１０重量％～５０重量％、１０重量％～４５重量％、１０重量％～４０重量％、１０重量％～３５重量％、１０重量％～３０重量％、１５重量％～５０重量％、１５重量％～４５重量％、１５重量％～４０重量％、１５重量％～３５重量％、１５重量％～３０重量％、２０重量％～５０重量％、２０重量％～４５重量％、２０重量％～４０重量％、２０重量％～３５重量％、又は２０重量％～３０重量％は、オレイン酸である。１つの実施態様において、（ｉ）脂質の若しくはＴＡＧ含有量のＴＦＡ含有量又は両方の３重量％未満はＰＵＦＡであり、及び（ｉｉ）少なくとも１０重量％、少なくとも１２重量％、少なくとも１５重量％、少なくとも２０重量％、少なくとも２５重量％、少なくとも３０重量％、１０重量％～５０重量％、１０重量％～４５重量％、１０重量％～４０重量％、１０重量％～３５重量％、１０重量％～３０重量％、１５重量％～５０重量％、１５重量％～４５重量％、１５重量％～４０重量％、１５重量％～３５重量％、１５重量％～３０重量％、２０重量％～５０重量％、２０重量％～４５重量％、２０重量％～４０重量％、２０重量％～３５重量％、又は２０重量％～３０重量％は、オレイン酸である。１つの実施態様において、（ｉ）脂質の若しくはＴＡＧ含有量のＴＦＡ含有量又は両方の２重量％未満はＰＵＦＡであり、及び（ｉｉ）少なくとも１０重量％、少なくとも１２重量％、少なくとも１５重量％、少なくとも２０重量％、少なくとも２５重量％、少なくとも３０重量％、１０重量％～５０重量％、１０重量％～４５重量％、１０重量％～４０重量％、１０重量％～３５重量％、１０重量％～３０重量％、１５重量％～５０重量％、１５重量％～４５重量％、１５重量％～４０重量％、１５重量％～３５重量％、１５重量％～３０重量％、２０重量％～５０重量％、２０重量％～４５重量％、２０重量％～４０重量％、２０重量％～３５重量％、又は２０重量％～３０重量％は、オレイン酸である。１つの実施態様において、（ｉ）脂質の若しくはＴＡＧ含有量のＴＦＡ含有量又は両方の０．２重量％未満はＰＵＦＡであるか、又はＰＵＦＡは、脂質の若しくはＴＡＧ含有量のＴＦＡ含有量又は両方から欠如しており、及び（ｉｉ）少なくとも１０重量％、少なくとも１２重量％、少なくとも１５重量％、少なくとも２０重量％、少なくとも２５重量％、少なくとも３０重量％、１０重量％～５０重量％、１０重量％～４５重量％、１０重量％～４０重量％、１０重量％～３５重量％、１０重量％～３０重量％、１５重量％～５０重量％、１５重量％～４５重量％、１５重量％～４０重量％、１５重量％～３５重量％、１５重量％～３０重量％、２０重量％～５０重量％、２０重量％～４５重量％、２０重量％～４０重量％、２０重量％～３５重量％、又は２０重量％～３０重量％は、オレイン酸である。これらの実施態様において、抽出された微生物脂質は、好ましくは抽出された酵母脂質、より好ましくは抽出されたヤロウィア脂質、例えばワイ・リポリティカ脂質である。

【0029】

１つの実施態様において、（ｉ）脂質の若しくはＴＡＧ含有量のＴＦＡ含有量又は両方の４重量％未満はＰＵＦＡであり、及び（ｉｉ）脂質のＴＦＡ含有量又は脂質のＴＡＧ含有量又は両方のＬ／Ｓ－ＳＦＡ比は、１．５～１０、１．５～９、１．５～８、１．５～７、１．５～６、１．５～５、１．５～４、１．７５～１０、１．７５～９、１．７５～８、１．７５～７、１．７５～６、１．７５～５、１．７５～４、２～１０、２～９、２～８、２～７、２～６、２～５、２～４、２．５～１０、２．５～９、２．５～８、２．５～７、２．５～６、２．５～５、及び２．５～４である。１つの実施態様において、（ｉ）脂質の若しくはＴＡＧ含有量のＴＦＡ含有量又は両方の３重量％未満はＰＵＦＡであり、及び（ｉｉ）脂質のＴＦＡ含有量又は脂質のＴＡＧ含有量又は両方のＬ／Ｓ－ＳＦＡ比は、１．５～１０、１．５～９、１．５～８、１．５～７、１．５～６、１．５～５、１．５～４、１．７５～１０、１．７５～９、１．７５～８、１．７５～７、１．７５～６、１．７５～５、１．７５～４、２～１０、２～９、２～８、２～７、２～６、２～５、２～４、２．５～１０、２．５～９、２．５～８、２．５～７、２．５～６、２．５～５、及び２．５～４である。１つの実施態様において、（ｉ）脂質の若しくはＴＡＧ含有量のＴＦＡ含有量又は両方の２重量％未満はＰＵＦＡであり、及び（ｉｉ）脂質のＴＦＡ含有量又は脂質のＴＡＧ含有量又は両方のＬ／Ｓ－ＳＦＡ比は、１．５～１０、１．５～９、１．５～８、１．５～７、１．５～６、１．５～５、１．５～４、１．７５～１０、１．７５～９、１．７５～８、１．７５～７、１．７５～６、１．７５～５、１．７５～４、２～１０、２～９、２～８、２～７、２～６、２～５、２～４、２．５～１０、２．５～９、２．５～８、２．５～７、２．５～６、２．５～５、及び２．５～４である。１つの実施態様において、（ｉ）脂質の若しくはＴＡＧ含有量のＴＦＡ含有量又は両方の０．２重量％未満はＰＵＦＡであるか、又はＰＵＦＡは、脂質の若しくはＴＡＧ含有量のＴＦＡ含有量又は両方から欠如しており、及び（ｉｉ）脂質のＴＦＡ含有量又は脂質のＴＡＧ含有量又は両方のＬ／Ｓ－ＳＦＡ比は、１．５～１０、１．５～９、１．５～８、１．５～７、１．５～６、１．５～５、１．５～４、１．７５～１０、１．７５～９、１．７５～８、１．７５～７、１．７５～６、１．７５～５、１．７５～４、２～１０、２～９、２～８、２～７、２～６、２～５、２～４、２．５～１０、２．５～９、２．５～８、２．５～７、２．５～６、２．５～５、及び２．５～４である。これらの実施態様において、抽出された微生物脂質は、好ましくは抽出された酵母脂質、より好ましくは抽出されたヤロウィア脂質、例えばワイ・リポリティカ脂質である。

【0030】

１つの実施態様において、Ｃ２０：０、Ｃ２２：０、及びＣ２４：０脂肪酸は、抽出された脂質のＴＦＡ含有量又は脂質のＴＡＧのＴＦＡ含有量又は両方の脂肪酸の少なくとも９５重量％、少なくとも９７重量％、又は少なくとも９９重量％を含み、これらは少なくとも炭素数２０又はそれ以上である。

【0031】

好ましい実施態様において、上記実施態様の抽出された微生物脂質の総ＭＵＦＡ含有量又は抽出された微生物脂質中のＴＡＧ含有量は、（ｉ）オレイン酸（Ｃ１８：１Δ９）、パルミトレイン酸（Ｃ１６：１Δ９）、及びＣ１６：１Δ７、又は（ｉｉ）オレイン酸（Ｃ１８：１Δ９）、パルミトレイン酸（Ｃ１６：１Δ９）、Ｃ１６：１Δ７、及びＣ１７：１を含む。

【0032】

好ましい実施態様において、抽出された微生物脂質又は抽出された微生物脂質中のＴＡＧ含有量はシクロプロパン脂肪酸が欠如している。
１つの実施態様において、脂質は極性脂質を含み、ここで、極性脂質のＴＦＡ含有量は、抽出された脂質のＴＦＡ含有量又はＴＡＧ含有量について本明細書で定義される１つ又はそれ以上の特徴を有する。

【0033】

１つの実施態様において、ＴＡＧは、抽出された脂質の総脂質含有量の少なくとも５０重量％、少なくとも６０重量％、少なくとも７０重量％、少なくとも８０重量％、少なくとも９０重量％、少なくとも９５重量％、少なくとも９６重量％、少なくとも９７重量％、少なくとも９８重量％、少なくとも９９重量％、又は１００重量％を含む。

【0034】

１つの実施態様において、脂質は、ステロール及び／又はステロールエステル、好ましくはエルゴステロール及び／又はエルゴステロールエステルを含む。１つの実施態様において、抽出された微生物脂質は、少なくとも１重量％、少なくとも２重量％、又は少なくとも３重量％のエルゴステロール及び／又はエルゴステロールエステルを含む。１つの実施態様において、抽出された微生物脂質は、１重量％～１０重量％、２重量％～１０重量％、又は３重量％～１０重量％のエルゴステロール及び／又はエルゴステロールエステルを含む。

【0035】

１つの実施態様において、脂質は２０重量％未満の水分含有量を有する。
１つの実施態様において、脂質は、１０重量％未満、７．５重量％未満、又は５重量％未満の揮発性溶媒含有量を有する。

【0036】

１つの実施態様において、脂質は、それらのｓｎ－２位でエステル化されたＭＵＦＡ、好ましくはオレイン酸を含むＴＡＧ分子を含み、ここで、ｓｎ－２位でエステル化されたＭＵＦＡを含むＴＡＧ分子の数と、抽出された脂質中のそれらのｓｎ－２位でエステル化されたＭＵＦＡ以外の脂肪酸を含むＴＡＧ分子との比（ｓｎ－２における、ＭＵＦＡ：他のＦＡの比）は、約０．５０未満、約０．３０未満、約０．２０未満、約０．１０未満、約０．０５未満、約０．０４未満、約０．０３未満、又は約０．０２未満である。

【0037】

１つの実施態様において、脂質は、少なくとも１つの遺伝子改変を含み、リン脂質を含む極性脂質を含む微生物から抽出され、ここで、抽出された脂質中のホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、及びホスファチジルセリン（ＰＳ）の少なくとも２つ、好ましくは３つ、又は４つすべてが、少なくとも１つの遺伝子改変が欠如した対応する微生物から得られた対応する抽出された脂質よりも多量のＳＦＡを有する。例示的な遺伝子改変が本明細書で論じられる。

【0038】

１つの実施態様において、脂質は、
（ａ）ＦＡＴＡ脂肪アシルチオエステラーゼをコードする外因性ポリヌクレオチド、
（ｂ）少なくとも１つの脂肪酸アシルトランスフェラーゼ、好ましくは少なくともジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）をコードする、少なくとも１つの外因性ポリヌクレオチド、及び
（ｃ）内因性Δ１２デサチュラーゼの発現及び／又は活性の低下をもたらす遺伝子改変、好ましくはΔ１２デサチュラーゼをコードする内因性遺伝子の遺伝子改変、より好ましくはΔ１２デサチュラーゼをコードする内因性遺伝子のヌル変異、最も好ましくはＦＡＤ２遺伝子のヌル変異、
を含む遺伝子改変を含む微生物から抽出されたものであり、
ここで、各ポリヌクレオチドは、微生物細胞内で前記ポリヌクレオチドの発現を指令することができる１つ又はそれ以上のプロモーターに作動可能に連結されている。

【0039】

１つの実施態様において、少なくとも１つのＤＧＡＴは、配列番号１４４～１５４のいずれか１つに記載の配列を、又は配列番号１４４～１５４のいずれか１つ又はそれ以上と少なくとも７０％同一、好ましくは少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９７％同一であるヌクレオチド配列を、有するヌクレオチドを含む。

【0040】

１つの実施態様において、ＦＡＴＡ脂肪アシルチオエステラーゼは、配列番号８４又は８６のいずれか１つに記載の配列を、又は配列番号８４又は８６のいずれか１つ又はそれ以上と少なくとも７０％同一、好ましくは少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９７％同一であるヌクレオチド配列を、有するヌクレオチドを含む。

【0041】

１つの実施態様において、微生物は、少なくとも１つの遺伝子改変が欠如した対応する微生物から得られる対応する抽出された微生物脂質と比較して、脂質のＴＦＡ含有量及び／又はＴＡＧ含有量において、総ＳＦＡ含有量、Ｃ２０：０含有量、Ｃ２２：０含有量、及びＣ２４：０含有量のうちの１つ又はそれ以上又はすべてをより多く有する。１つの実施態様において、Ｃ２０：０含有量は少なくとも１％、１．５％、又は２％であり、Ｃ２２：０含有量は少なくとも１％、１．５％、又は２％であり、及びＣ２４：０含有量は少なくとも１．５％、２％又は２．５％である。１つの実施態様において、Ｃ２０：０含有量は約１．０％～４％であり、Ｃ２２：０含有量は約１．０％～４％であり、及びＣ２４：０含有量は約２％～５％である。別の実施態様において、Ｃ２０：０含有量、Ｃ２２：０含有量、及びＣ２４：０含有量には、上記の量が含まれる。

【0042】

１つの実施態様において、微生物は、アシル－ＣｏＡシンセターゼ（ＡＣＳ）をコードする外因性ポリヌクレオチドをさらに含み、任意選択的に、ＡＣＳは、配列番号８８～８９のいずれか１つとして示される配列を、又は配列番号８８～８９のいずれか１つ又はそれ以上と少なくとも７０％同一、好ましくは少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９７％同一であるヌクレオチド配列を、有するヌクレオチドを含む。

【0043】

別の実施態様において、微生物は、リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）をコードする外因性ポリヌクレオチドをさらに含み、任意選択的に、ＬＰＡＡＴは、配列番号９１に記載の配列を、又は配列番号９１と少なくとも７０％同一、好ましくは少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９７％同一であるヌクレオチド配列を、有するヌクレオチドを含む。

【0044】

１つの実施態様において、抽出された微生物脂質は、真核細胞、真菌細胞、細菌細胞、又は藻類細胞、生きた微生物細胞、死んだ微生物細胞、又はこれらの任意の混合物を含むか又はからなる微生物細胞から得られる。

【0045】

１つの実施態様において、微生物細胞は、（ｉ）発酵に適したもの、（ｉｉ）油性細胞、（ｉｉｉ）非油性細胞、好ましくは遺伝子改変による油性細胞に由来する非油性細胞、及び（ｉｖ）従属栄養細胞の１つ若しくはそれ以上又はすべてである。

【0046】

１つの実施態様において、微生物細胞は酵母細胞である。適切な酵母細胞の例には、限定されるものではないが、サッカロミセス・セレビッシェ（Saccharomyces cerevisiae）、ヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、及びこれらの任意の混合物が挙げられる。
１つの実施態様において、酵母細胞はヤロウィア・リポリティカである。

【0047】

１つの実施態様において、脂質は少なくとも５ｇ、少なくとも１０ｇ、少なくとも５０ｇ、又は少なくとも１００ｇの重量を有する。
１つの実施態様において、脂質は５ｇ／ｌ未満、２ｇ／ｌ未満、１ｇ／ｌ未満のステアリン酸塩の存在下で培養されたか、又は培地に添加されたステアリン酸塩の非存在下で培養された微生物細胞から得られた。
また、本明細書に定義される脂質を含む微生物細胞も提供される。

【0048】

さらなる態様において、本発明は、少なくとも１つの遺伝子改変を有する微生物細胞、好ましくは酵母細胞を提供し、ここで、前記微生物細胞は、少なくとも１つの遺伝子改変が欠如しており、同じ条件下で培養された対応する微生物細胞と比較した各場合に、（ｉ）前記微生物細胞の総脂肪酸（ＴＦＡ）含有量、又は前記微生物細胞中のＴＡＧのＴＦＡ含有量、又は両方において、飽和脂肪酸（ＳＦＡ）含有量の増加、少なくとも１８個の炭素を有するＳＦＡ含有量の増加、ステアリン酸含有量の増加、Ｃ２０：０及びＣ２２：０脂肪酸含有量の増加、Ｃ２４：０脂肪酸含有量の増加、Ｌ／Ｓ－ＳＦＡ比の増加、又はこれらの任意の組み合わせ、及び（ｉｉ）トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）産生若しくは蓄積、又は両方の増加を有する。好ましい実施態様において、細胞は、（ａ）飽和脂肪酸（ＳＦＡ）含有量の増加、及び（ｂ）トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）産生若しくは蓄積の増加、又は両方、又は（ａ）少なくとも１８個の炭素を有するＳＦＡ含有量の増加、及び（ｂ）トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）産生若しくは蓄積の増加、又は両方、又は
（ａ）ステアリン酸塩含有量の増加、及び（ｂ）トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）産生若しくは蓄積の増加、又は両方、又は（ａ）Ｃ２０：０及びＣ２２：０脂肪酸の含有量の増加、及び（ｂ）トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）産生若しくは蓄積の増加、又は両方、又は（ａ）Ｃ２４：０脂肪酸の含有量の増加、及び（ｂ）トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）産生若しくは蓄積の増加、又は両方、又は（ａ）Ｌ／Ｓ－ＳＦＡ比の増加、及び（ｂ）トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）産生若しくは蓄積の増加、又は両方を有する。より好ましい実施態様において、細胞は、（ａ）飽和脂肪酸（ＳＦＡ）含有量の増加、（ｂ）ステアリン酸塩含有量の増加、及び（ｃ）トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）産生若しくは蓄積の増加、又は両方、又は（ａ）飽和脂肪酸（ＳＦＡ）含有量の増加、（ｂ）Ｃ２０：０及びＣ２２：０含有量の増加、及び（ｃ）トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）産生若しくは蓄積の増加、又は両方、又は（ａ）飽和脂肪酸（ＳＦＡ）含有量の増加、（ｂ）ステアリン酸塩、Ｃ２０：０、及びＣ２２：０含有量の増加、及び（ｃ）トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）産生若しくは蓄積の増加、又は両方を有する。それぞれのより好ましい実施態様において、細胞の脂質含有量はまた、Ｌ／Ｓ－ＳＦＡ比の増加も含み得る。１つの実施態様において、Ｃ２０：０含有量は少なくとも１％、１．５％、又は２％であり、Ｃ２２：０含有量は少なくとも１％、１．５％、又は２％であり、及びＣ２４：０含有量は少なくとも１．５％、２％、又は２．５％である。１つの実施態様において、Ｃ２０：０含有量は１．０％～４％であり、Ｃ２２：０含有量は１．０％～４％であり、及びＣ２４：０含有量は２％～５％である。別の実施態様において、Ｃ２０：０含有量、Ｃ２２：０含有量、及びＣ２４：０含有量には、上記の量が含まれる。

【0049】

１つの実施態様において、細胞のＴＦＡ含有量若しくは細胞のＴＡＧ含有量、又は両方は、抽出された脂質のＴＦＡ含有量又はＴＡＧ含有量について、本発明の脂質について本明細書で定義される１つ又はそれ以上の特徴を有する。

【0050】

１つの実施態様において、細胞の脂質の又はＴＡＧ含有量のＴＦＡ含有量又は両方の
２０重量％～８０重量％、２０重量％～７５重量％、２０重量％～７０重量％、２０重量％～６５重量％、２０重量％～６０重量％、２０重量％～５５重量％、２０重量％～５０重量％、２０重量％～４５重量％、２５重量％～８０重量％、２５重量％～７５重量％、２５重量％～７０重量％、２５重量％～６５重量％、２５重量％～６０重量％、２５重量％～５５重量％、２５重量％～５０重量％、又は２５重量％～４５重量％は、ステアリン酸である。この実施態様において、細胞は好ましくは酵母細胞であり、より好ましくはワイ・リポリティカ細胞などのヤロウィア細胞である。

【0051】

１つの実施態様において、細胞の脂質の又はＴＡＧ含有量のＴＦＡ含有量又は両方は、４重量％未満、３重量％未満、２重量％未満、１重量％未満、０．５重量％未満、若しくは０．２重量％、又は０．２重量％～５重量％、０．２重量％～４重量％、０．２重量％～３重量％、０．２重量％～２重量％、０．５重量％～５重量％、０．５重量％～４重量％、０．５重量％～３重量％、０．５重量％～２重量％のリノール酸（ＬＡ）を含むか、又はＬＡは、本質的に細胞の脂質の及び／又はＴＡＧ含有量のＴＦＡから欠如している。１つの実施態様において、細胞の脂質の及び／又はＴＡＧ含有量のＴＦＡ含有量は、
４重量％未満、３重量％未満、２重量％未満、１重量％未満、０．５重量％未満、若しくは０．２重量％、又は０．２重量％～５重量％、０．２重量％～４重量％、０．２重量％～３重量％、０．２重量％～２重量％、０．５重量％～５重量％、０．５重量％～４重量％、０．５重量％～３重量％、０．５重量％～２重量％のＰＵＦＡを含むか、又はＰＵＦＡは、本質的に細胞の脂質の及び／又はＴＡＧ含有量のＴＦＡから欠如している。これらの実施態様において、細胞は好ましくは酵母細胞であり、より好ましくはワイ・リポリティカ細胞などのヤロウィア細胞である。

【0052】

１つの実施態様において、細胞の脂質のＴＦＡ含有量、及び／又は細胞のＴＡＧのＴＦＡ含有量は、少なくとも１０％、少なくとも１２重量％、少なくとも１５重量％、少なくとも２０重量％、少なくとも２５重量％、少なくとも３０重量％、１０重量％～５０重量％、１０重量％～４５重量％、１０重量％～４０重量％、１０重量％～３５重量％、１０重量％～３０重量％、１５重量％～５０重量％、１５重量％～４５重量％、１５重量％～４０重量％、１５重量％～３５重量％、１５重量％～３０重量％、２０重量％～５０重量％、２０重量％～４５重量％、２０重量％～４０重量％、２０重量％～３５重量％、又は２０重量％～３０重量％のオレイン酸を含む。この実施態様において、細胞は好ましくは酵母細胞であり、より好ましくはヤロウィア細胞、例えばワイ・リポリティカ細胞である。

【0053】

１つの実施態様において、細胞のＴＦＡ含有量、細胞のＴＡＧ含有量、若しくは細胞の極性脂質、又はこれらの任意の組み合わせは、少なくとも遺伝子組み換えが欠如しており、同じ条件下で培養された対応する微生物細胞と比較して、Ｌ／Ｓ－ＳＦＡ比が増加している。１つの実施態様において、細胞の脂質の若しくはＴＦＡ含有量又はＴＡＧ含有量又は両方のＬ／Ｓ－ＳＦＡ比は、１．５～１０、１．５～９、１．５～８、１．５～７、１．５～６、１．５～５、１．５～４、１．７５～１０、１．７５～９、１．７５～８、１．７５～７、１．７５～６、１．７５～５、１．７５～４、２～１０、２～９、２～８、２～７、２～６、２～５、２～４、２．５～１０、２．５～９、２．５～８、２．５～７、２．５～６、２．５～５、２．５～４である。これらの実施態様において、細胞は、好ましくは酵母細胞、より好ましくはヤロウィア細胞、例えばワイ・リポリティカ細胞である。

【0054】

１つの実施態様において、Ｌ／Ｓ－ＳＦＡ比は、少なくとも１つの遺伝子改変が欠如しており、同じ条件下で培養された対応する微生物細胞のＴＦＡ含有量、ＴＡＧ含有量、又は極性脂質中よりも、少なくとも約１．５、少なくとも約２、少なくとも約２．５、少なくとも約３、少なくとも約４、少なくとも約５、少なくとも約６、少なくとも約７、少なくとも約８、少なくとも約９、少なくとも約１０、又は約３～約１０倍高い。

【0055】

１つの実施態様において、微生物細胞、好ましくは酵母細胞は、
（ａ）ＦＡＴＡ脂肪アシルチオエステラーゼ、
（ｂ）少なくとも１つの脂肪酸アシルトランスフェラーゼ、好ましくは少なくともジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）、又は
（ｃ）ＦＡＴＡ、及び少なくとも１つの脂肪酸アシルトランスフェラーゼ、好ましくは少なくともＤＧＡＴをコードする外因性ポリヌクレオチドである少なくとも１つの遺伝子改変を含み、
ここで、各ポリヌクレオチドは、微生物細胞内で前記ポリヌクレオチドの発現を指令することができる１つ又はそれ以上のプロモーターに作動可能に連結されている。

【0056】

さらなる態様において、本発明は、
（ａ）ＦＡＴＡ脂肪アシルチオエステラーゼ、
（ｂ）少なくとも１つの脂肪酸アシルトランスフェラーゼ、好ましくは少なくともジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）、又は
（ｃ）ＦＡＴＡ、及び少なくとも１つの脂肪酸アシルトランスフェラーゼ、好ましくは少なくともＤＧＡＴ、及び
（ｄ）任意選択的に、内因性Δ１２デサチュラーゼの発現及び／又は活性の低下をもたらす遺伝子改変、好ましくはΔ１２デサチュラーゼをコードする内因性遺伝子の遺伝子改変、より好ましくはΔ１２デサチュラーゼをコードする内因性遺伝子のヌル変異を、コードする少なくとも１つの外因性ポリヌクレオチドである少なくとも１つの遺伝子改変を含む微生物細胞、好ましくは酵母細胞を提供し、
ここで、各ポリヌクレオチドは、微生物細胞内で前記ポリヌクレオチドの発現を指令することができる１つ又はそれ以上のプロモーターに作動可能に連結されている。

【0057】

１つの実施態様において、遺伝子改変は、１つ又はそれ以上のジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）、グリセロール－３－リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＧＰＡＴ）、若しくはリン脂質：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＰＤＡＴ）ポリペプチド、又はこれらの任意の組み合わせをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む。１つ又はそれ以上のＤＧＡＴを含む実施態様において、ＤＧＡＴをコードする細胞中の少なくとも１つのポリヌクレオチド又はすべてのポリヌクレオチドは、配列番号１４４～１５４のいずれか１つに記載の配列を有するヌクレオチド、又は配列番号１４４～１５４のいずれか１つ又はそれ以上と少なくとも７０％同一、好ましくは少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９７％同一であるヌクレオチド配列を、有するヌクレオチドを含む。１つの実施態様において、細胞内のＤＧＡＴをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド又はすべてのポリヌクレオチドは、配列番号１１５～１２５の１つ又はそれ以上に記載の配列をコードし、コドン縮重のみによって配列番号１４４～１５４の１つと異なる。

【0058】

１つの実施態様において、本発明の微生物細胞、好ましくは酵母細胞は、それぞれがＧＰＡＴをコードする１つ又はそれ以上の外因性ポリヌクレオチドを含む。１つの実施態様において、ＧＰＡＴの少なくとも１つ又はＧＰＡＴのすべては、配列番号１２６～１３８のいずれか１つに記載の配列を、又は配列番号１２６～１３８のいずれか１つ又はそれ以上と少なくとも７０％同一、好ましくは少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を有するアミノ酸を含む。

【0059】

１つの実施態様において、ＧＰＡＴをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド又はすべてのポリヌクレオチドは、配列番号１５５～１６７のいずれか１つに記載の配列を、又は配列番号１５５～１６７のいずれか１つ又はそれ以上と少なくとも７０％同一、好ましくは少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９７％同一であるヌクレオチド配列を、有するヌクレオチドを含む。１つの実施態様において、ＧＰＡＴをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド又はすべてのポリヌクレオチドは、配列番号１２６～１３８の１つ又はそれ以上に記載の配列をコードし、コドン縮重のみによって配列番号１５５～１６７の１つと異なる。

【0060】

１つの実施態様において、本発明の微生物細胞、好ましくは酵母細胞は、それぞれがリン脂質：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＰＤＡＴ）をコードする１つ又はそれ以上の外因性ポリヌクレオチドを含む。１つの実施態様において、ＰＤＡＴの少なくとも１つ又はＰＤＡＴのすべては、配列番号１３９～１４３のいずれか１つに記載の配列を、又は配列番号１３９～１４３のいずれか１つ又はそれ以上と少なくとも７０％同一、好ましくは少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を有するアミノ酸を含む。

【0061】

１つの実施態様において、ＰＤＡＴをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド又はすべてのポリヌクレオチドは、配列番号１６８～１７２のいずれか１つに記載の配列を、又は配列番号１６８～１７２のいずれか１つ又はそれ以上と少なくとも７０％同一、好ましくは少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９７％同一であるであるヌクレオチド配列を、有するヌクレオチドを含む。１つの実施態様において、ＰＤＡＴをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド又はすべてのポリヌクレオチドは、配列番号１３９～１４３の１つ又はそれ以上に記載の配列をコードし、コドン縮重のみによって配列番号１６８～１７２の１つと異なる。

【0062】

１つの実施態様において、微生物細胞、好ましくは酵母細胞は、ＤＧＡＴをコードする外因性ポリヌクレオチドと、ＧＰＡＴ、２つ以上のＤＧＡＴと１つのＧＰＡＴ、２つ以上のＧＰＡＴと１つのＤＧＡＴ、又は２つ以上のＤＧＡＴと２つ以上のＧＰＡＴをコードする外因性ポリヌクレオチドとを含み、ここで、ＤＧＡＴの少なくとも１つ及び／又はＧＰＡＴの少なくとも１つは、上記で定義したとおりである。

【0063】

１つの実施態様において、細胞は、ＤＧＡＴをコードする外因性ポリヌクレオチドと、ＰＤＡＴ、２つ以上のＤＧＡＴと１つのＰＤＡＴ、２つ以上のＰＤＡＴと１つのＤＧＡＴ、又は２つ以上のＤＧＡＴと２つ以上のＰＤＡＴをコードする外因性ポリヌクレオチドとを含み、ここで、ＤＧＡＴの少なくとも１つ及び／又はＰＤＡＴの少なくとも１つは上記で定義したとおりである。

【0064】

１つの実施態様において、細胞は、ＧＰＡＴをコードする外因性ポリヌクレオチドと、ＰＤＡＴ、２つ以上のＧＰＡＴと１つのＰＤＡＴ、２つ以上のＰＤＡＴと１つのＧＰＡＴ、又は２つ以上のＧＰＡＴと２つ以上のＰＤＡＴをコードする外因性ポリヌクレオチドとを含み、ここで、ＧＰＡＴの少なくとも１つ及び／又はＰＤＡＴの少なくとも１つは上記で定義したとおりである。

【0065】

１つの実施態様において、細胞は、ＤＧＡＴをコードする外因性ポリヌクレオチド、ＧＰＡＴをコードする外因性ポリヌクレオチド、及びＰＤＡＴをコードする外因性ポリヌクレオチド、又はこれらの１つ又はそれ以上の複数のメンバーを含む。

【0066】

１つの実施態様において、細胞は、２つ又はそれ以上のＤＧＡＴをコードする外因性ポリヌクレオチドを含み、ここで、ＤＧＡＴの少なくとも１つは上記で定義したとおりである。
１つの実施態様において、細胞は、２つ又はそれ以上のＧＰＡＴをコードする外因性ポリヌクレオチドを含み、ここで、ＧＰＡＴの少なくとも１つは上記で定義したとおりである。
１つの実施態様において、細胞は、２つ又はそれ以上のＰＤＡＴをコードする外因性ポリヌクレオチドを含み、ここで、ＰＤＡＴの少なくとも１つは上記で定義したとおりである。

【0067】

さらなる態様において、本発明は、脂質と、以下をコードする少なくとも１つの外因性ポリヌクレオチドである少なくとも１つの遺伝子改変とを含む、微生物細胞、好ましくは酵母細胞を提供する：
（ａ）ＦＡＴＡ脂肪アシルチオエステラーゼ、
（ｂ）少なくとも１つの脂肪酸アシルトランスフェラーゼ、好ましくは少なくともジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）、又は
（ｃ）ＦＡＴＡ及び少なくとも１つの脂肪酸アシルトランスフェラーゼ、好ましくは少なくともＤＧＡＴ、
ここで、各ポリヌクレオチドは、微生物細胞内で前記ポリヌクレオチドの発現を指令することができる１つ又はそれ以上のプロモーターに作動可能に連結されており、及びここで、
（ｄ）任意選択的に、内因性Δ１２デサチュラーゼの発現及び／又は活性の低下をもたらす遺伝子改変、好ましくはΔ１２デサチュラーゼをコードする内因性遺伝子の遺伝子改変、より好ましくはΔ１２デサチュラーゼをコードする内因性遺伝子のヌル変異、最も好ましくはＦＡＤ２遺伝子のヌル変異、及び
（ｅ）細胞の脂質の若しくはＴＡＧ含有量のＴＦＡ含有量又は両方の２０％～８０重量％、２０重量％～７５重量％、２０重量％～７０重量％、２０重量％～６５重量％、２０重量％～６０重量％、２０重量％～５５重量％、２０重量％～５０重量％、２０重量％～４５重量％、２５重量％～８０重量％、２５重量％～７５重量％、２５重量％～７０重量％、２５重量％～６５重量％、２５重量％～６０重量％、２５重量％～５５重量％、２５重量％～５０重量％、又は２５重量％～４５重量％はステアリン酸である。

【0068】

この態様の１つの実施態様において、細胞の脂質の若しくはＴＡＧ含有量のＴＦＡ含有量又は両方は、４重量％未満、３重量％未満、２重量％未満、１重量％未満、０．５重量％未満、若しくは０．２重量％未満、又は０．２重量％～５重量％、０．２重量％～４重量％、０．２重量％～３重量％、０．２重量％～２重量％、０．５重量％～５重量％、０．５重量％～４重量％、０．５重量％～３重量％、０．５重量％～２重量％のリノール酸（ＬＡ）を含むか、又はＬＡは、細胞の脂質の及び／又はＴＡＧ含有量のＴＦＡが本質的に欠如している。この態様の別の実施態様において、細胞の脂質の若しくはＴＡＧ含有量のＴＦＡ含有量含有量又は両方は、４重量％未満、３重量％未満、２重量％未満、１重量％未満、０．５重量％未満、若しくは０．２重量％未満、又は０．２重量％～５重量％、０．２重量％～４重量％、０．２重量％～３重量％、０．２重量％～２重量％、０．５重量％～５重量％、０．５重量％～４重量％、０．５重量％～３重量％、０．５重量％～２重量％のＰＵＦＡを含むか、又はＰＵＦＡは、細胞の脂質の及び／又はＴＡＧ含有量のＴＦＡが本質的に欠如している。この態様の１つの実施態様において、細胞の脂質の若しくはＴＡＧ含有量のＴＦＡ含有量又は両方の２０重量％～５５重量％はステアリン酸である。この態様の１つの実施態様において、細胞の脂質の若しくはＴＡＧ含有量のＴＦＡ含有量又は両方の２０重量％～５０重量％はステアリン酸である。この態様の１つの実施態様において、細胞の脂質の若しくは細胞のＴＡＧ含有量のＴＦＡ含有量又は両方の２０重量％～４５重量％はステアリン酸である。

【0069】

さらなる態様において、本発明は、脂質と、以下をコードする少なくとも１つの外因性ポリヌクレオチドである少なくとも１つの遺伝子改変とを含む微生物細胞、好ましくは酵母細胞を提供する：
（ａ）ＦＡＴＡ脂肪アシルチオエステラーゼ、
（ｂ）少なくとも１つの脂肪酸アシルトランスフェラーゼ、好ましくは少なくともジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）、又は
（ｃ）ＦＡＴＡ、及び少なくとも１つの脂肪酸アシルトランスフェラーゼ、好ましくは少なくともＤＧＡＴ、
ここで、各ポリヌクレオチドは、微生物細胞内で前記ポリヌクレオチドの発現を指令することができる１つ又はそれ以上のプロモーターに作動可能に連結されており、及びここで、
（ｄ）任意選択的に、内因性Δ１２デサチュラーゼの発現及び／又は活性の低下をもたらす遺伝子改変、好ましくはΔ１２デサチュラーゼをコードする内因性遺伝子の遺伝子改変、より好ましくはΔ１２デサチュラーゼをコードする内因性遺伝子のヌル変異、好ましくはＦＡＤ２遺伝子のヌル変異、及び
（ｅ）細胞の脂質の若しくはＴＡＧ含有量のＴＦＡ含有量又は両方のＬ／Ｓ－ＳＦＡ比は、１．５～１０、１．５～９、１．５～８、１．５～７、１．５～６、１．５～５、１．５～４、１．７５～１０、１．７５～９、１．７５～８、１．７５～７、１．７５～６、１．７５～５、１．７５～４、２～１０、２～９、２～８、２～７、２～６、２～５、２～４、２．５～１０、２．５～９、２．５～８、２．５～７、２．５～６、２．５～５、２．５～４である。この態様の１つの実施態様において、細胞の脂質の若しくはＴＡＧ含有量のＴＦＡ含有量又は両方の２０重量％～５５重量％はステアリン酸である。この態様の１つの実施態様において、細胞の脂質の若しくはＴＡＧ含有量のＴＦＡ含有量又は両方の２０重量％～５０重量％はステアリン酸である。この態様の１つの実施態様において、細胞の脂質の若しくはＴＡＧ含有量のＴＦＡ含有量又は両方の２０重量％～４５重量％はステアリン酸である。

【0070】

さらなる態様において、本発明は、脂質と、以下をコードする少なくとも１つの外因性ポリヌクレオチドである少なくとも１つの遺伝子改変とを含む微生物細胞、好ましくは酵母細胞を提供する：
（ａ）ＦＡＴＡ脂肪アシルチオエステラーゼ、
（ｂ）少なくとも１つの脂肪酸アシルトランスフェラーゼ、好ましくは少なくともジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）、又は
（ｃ）ＦＡＴＡ、及び少なくとも１つの脂肪酸アシルトランスフェラーゼ、好ましくは少なくともＤＧＡＴ、
ここで、各ポリヌクレオチドは、微生物細胞内で前記ポリヌクレオチドの発現を指令することができる１つ又はそれ以上のプロモーターに作動可能に連結されており、及びここで
（ｄ）任意選択的に、内因性Δ１２デサチュラーゼの発現及び／又は活性の低下をもたらす遺伝子改変、好ましくはΔ１２デサチュラーゼをコードする内因性遺伝子の遺伝子改変、より好ましくはΔ１２デサチュラーゼをコードする内因性遺伝子のヌル変異、最も好ましくはＦＡＤ２遺伝子のヌル変異、及び
（ｅ）細胞の脂質のＴＦＡ含有量若しくはＴＡＧ含有量又は両方におけるＣ２０：０、Ｃ２２：０、及びＣ２４：０脂肪酸の含有量の合計は、５重量％～２５重量％、５重量％～２０重量％、５重量％～１８重量％、５重量％～１６重量％、５重量％～１５重量％、５重量％～１４重量％、５重量％～１３重量％、５重量％～１２重量％、５重量％～１０重量％、６重量％～２５重量％、６重量％～２０重量％、６重量％～１８重量％、６重量％～１６重量％、６重量％～１５重量％、６重量％～１４重量％、６重量％～１３重量％、６重量％～１２重量％、６重量％～１０重量％、７重量％～２５重量％、７重量％～２０重量％、７重量％～１８重量％、７重量％～１６重量％、７重量％～１５重量％、７重量％～１４重量％、７重量％～１３重量％、７重量％～１２重量％、又は７重量％～１０重量％である、又は
（ｆ）Ｃ２０：０脂肪酸の含有量は、抽出された脂質のＴＦＡ含有量又は抽出された脂質のＴＡＧ含有量又は両方の、約１重量％～約５重量％、約１重量％～約４重量％、約１重量％～約３重量％、約２重量％～約５重量％、約２重量％～約４重量％、約２重量％～約３重量％である、
（ｇ）Ｃ２２：０脂肪酸の含有量は、抽出された脂質のＴＦＡ含有量又は抽出された脂質のＴＡＧ含有量又は両方の、約１重量％～約５重量％、約１重量％～約４重量％、約２重量％～約５重量％、約２重量％～約４重量％である、及び
（ｈ）Ｃ２４：０脂肪酸の含有量は、抽出された脂質のＴＦＡ含有量又は抽出された脂質のＴＡＧ含有量又は両方の、約１重量％～約６重量％、約１重量％～約５重量％、約１重量％～約４重量％、約２重量％～約６重量％、約２重量％～約５重量％、又は約２重量％～約４重量％であるか、又は
（ｉ）Ｃ２０：０脂肪酸の含有量は、抽出された脂質のＴＦＡ含有量又は抽出された脂質のＴＡＧ含有量又は両方の、少なくとも約１重量％、少なくとも約１．５重量％、少なくとも約２重量％、少なくとも約２．５重量％、又は少なくとも約３重量％であり、Ｃ２２：０脂肪酸の含有量は、少なくとも約１重量％、少なくとも約１．５重量％、少なくとも約２重量％、少なくとも約２．５重量％、少なくとも約３重量％、又は少なくとも約３．５重量％であり、そしてＣ２４：０脂肪酸の含有量は、少なくとも約１重量％、少なくとも約１．５重量％、少なくとも約２重量％、少なくとも約２．５重量％、少なくとも約３重量％、少なくとも約３．５重量％、又は少なくとも４重量％である。

【0071】

この態様の１つの実施態様において、細胞の脂質の若しくはＴＡＧ含有量のＴＦＡ含有量又は両方の２０重量％～５５重量％はステアリン酸である。この態様の１つの実施態様において、細胞の脂質の若しくはＴＡＧ含有量のＴＦＡ含有量又は両方の２０重量％～５０重量％はステアリン酸である。この態様の１つの実施態様において、細胞の脂質の若しくはＴＡＧ含有量のＴＦＡ含有量又は両方の２０重量％～４５重量％はステアリン酸である。

【0072】

上記態様の実施態様において、細胞の脂質のＴＦＡ含有量、及び／又は細胞のＴＡＧのＴＦＡ含有量はさらに、少なくとも１０重量％、少なくとも１２重量％、少なくとも１５重量％、少なくとも２０重量％、少なくとも２５重量％、少なくとも３０重量％、１０重量％～５０重量％、１０重量％～４５重量％、１０重量％～４０重量％、１０重量％～３５重量％、１０重量％～３０重量％、１５重量％～５０重量％、１５重量％～４５重量％、１５重量％～４０重量％、１５重量％～３５重量％、１５重量％～３０重量％、２０重量％～５０重量％、２０重量％～４５重量％、２０重量％～４０重量％、２０重量％～３５重量％、又は２０重量％～３０重量％のオレイン酸を含む。

【0073】

上記態様の実施態様において、前記少なくとも１つのアシルトランスフェラーゼ、好ましくは少なくともＤＧＡＴは、パルミトイル－ＣｏＡと比較して、基質としてのステロイル－ＣｏＡ分子に対して少なくとも同等以上の活性を有する。細胞は、この特性を２つ以上のＤＧＡＴを含み得る。

【0074】

上記態様の実施態様において、外因性ＤＧＡＴの１つ又はそれ以上又はすべては、配列番号８１、又は配列番号１１５～１２５のいずれか１つに記載の配列を、あるいは配列番号８１又は配列番号１１５～１２５のいずれか１つ又はそれ以上と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を、有するアミノ酸を含む。

【0075】

上記態様の実施態様において、ＤＧＡＴの少なくとも１つは酵母ＤＧＡ１である。１つの実施態様において、少なくとも１つのＤＧＡ１は、配列番号５３に記載の配列を、又は配列番号５３と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、若しくは少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を、有するアミノ酸を含む。

【0076】

上記態様の実施態様において、ＦＡＴＡは、配列番号８３若しくは配列番号８５に記載の配列を、又は配列番号８３及び配列番号８５の一方又は両方と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を、有するアミノ酸を含む。

【0077】

ＤＧＡＴを列挙する上記実施態様において、ＤＧＡＴをコードする細胞内の少なくとも１つのポリヌクレオチド又はすべてのポリヌクレオチドは、配列番号１４４～１５４のいずれか１つに記載の配列を、又は配列番号１４４～１５４のいずれか１つ又はそれ以上と少なくとも７０％同一、好ましくは少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９７％同一であるヌクレオチド配列を、有するヌクレオチドを含むことができる。１つの実施態様において、細胞内のＤＧＡＴをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド又はすべてのポリヌクレオチドは、配列番号１１５～１２５の１つ又はそれ以上に記載の配列をコードし、コドン縮重のみによって配列番号１４４～１５４の１つと異なる。

【0078】

１つの実施態様において、本発明の微生物細胞、好ましくは酵母細胞は、それぞれがＧＰＡＴをコードする１つ又はそれ以上の外因性ポリヌクレオチドを含む。１つの実施態様において、ＧＰＡＴの少なくとも１つ又はＧＰＡＴのすべては、配列番号１２６～１３８のいずれか１つに記載の配列を、又は配列番号１２６～１３８のいずれか１つ又はそれ以上と少なくとも７０％同一、好ましくは少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を、有するアミノ酸を含む。

【0079】

１つの実施態様において、ＧＰＡＴをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド又はすべてのポリヌクレオチドは、配列番号１５５～１６７のいずれか１つに記載の配列を、又は配列番号１５５～１６７のいずれか１つ又はそれ以上と少なくとも７０％同一、好ましくは少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を、有するヌクレオチドを含む。１つの実施態様において、ＧＰＡＴをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド又はすべてのポリヌクレオチドは、配列番号１２６～１３８の１つ又はそれ以上に記載の配列をコードし、及びコドン縮重のみによって配列番号１５５～１６７の１つと異なる。

【0080】

１つの実施態様において、本発明の微生物細胞、好ましくは酵母細胞は、それぞれがＰＤＡＴをコードする１つ又はそれ以上の外因性ポリヌクレオチドを含む。１つの実施態様において、ＰＤＡＴの少なくとも１つ又はＰＤＡＴのすべては、配列番号１３９～１４３のいずれか１つに記載の配列を、又は配列番号１３９～１４３のいずれか１つ又はそれ以上と少なくとも７０％同一、好ましくは少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するアミノ酸を含む。

【0081】

１つの実施態様において、ＰＤＡＴをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド又はすべてのポリヌクレオチドは、配列番号１６８～１７２のいずれか１つに記載の配列を、又は配列番号１６８～１７２のいずれか１つ又はそれ以上と少なくとも７０％同一、好ましくは少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を、有するヌクレオチドを含む。１つの実施態様において、ＰＤＡＴをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド又はすべてのポリヌクレオチドは、配列番号１３９～１４３の１つ又はそれ以上に記載の配列をコードし、及びコドン縮重のみによって配列番号１６８～１７２の１つと異なる。

【0082】

１つの実施態様において、微生物細胞、好ましくは酵母細胞は、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）をコードする外因性ポリヌクレオチドと、グリセロール－３－リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＧＰＡＴ）、２つ以上のＤＧＡＴと１つのｇＰＡＴ、２つ以上のＧＰＡＴと１つのＤＧＡＴ、又は２つ以上のＤＧＡＴと２つ以上のＧＰＡＴをコードする外因性ポリヌクレオチドとを含み、ここで、ＤＧＡＴの少なくとも１つ及び／又はＧＰＡＴの少なくとも１つは上記で定義したとおりである。

【0083】

１つの実施態様において、細胞は、ＤＧＡＴをコードする外因性ポリヌクレオチドと、ＰＤＡＴ、２つ以上のＤＧＡＴと１つのＰＤＡＴ、２つ以上のＰＤＡＴと１つのＤＧＡＴ、又は２つ以上のＤＧＡＴと２つ以上のＰＤＡＴをコードする外因性ポリヌクレオチドとを含み、ここで、ＤＧＡＴの少なくとも１つ及び／又はＰＤＡＴの少なくとも１つは上記で定義したとおりである。

【0084】

１つの実施態様において、細胞は、ＧＰＡＴをコードする外因性ポリヌクレオチドと、ＰＤＡＴ、２つ以上のＧＰＡＴと１つのＰＤＡＴ、２つ以上のＰＤＡＴと１つのＧＰＡＴ、又は２つ以上のＧＰＡＴと２つ以上のＰＤＡＴをコードする外因性ポリヌクレオチドとを含み、ここで、ＧＰＡＴの少なくとも１つ及び／又はＰＤＡＴの少なくとも１つは上記で定義したとおりである。

【0085】

１つの実施態様において、細胞は、ＤＧＡＴをコードする外因性ポリヌクレオチド、ＧＰＡＴをコードする外因性ポリヌクレオチド、及びＰＤＡＴをコードする外因性ポリヌクレオチド、又はこれらの１つ又はそれ以上の複数のメンバーを含む。

【0086】

１つの実施態様において、細胞は、２つ又はそれ以上のＤＧＡＴをコードする外因性ポリヌクレオチドを含み、ここで、ＤＧＡＴの少なくとも１つは上記で定義したとおりである。

【0087】

１つの実施態様において、細胞は、２つ又はそれ以上のＧＰＡＴをコードする外因性ポリヌクレオチドを含み、ここで、ＧＰＡＴの少なくとも１つは上記で定義したとおりである。

【0088】

１つの実施態様において、細胞は、２つ又はそれ以上のＰＤＡＴをコードする外因性ポリヌクレオチドを含み、ここで、ＰＤＡＴの少なくとも１つは上記で定義したとおりである。

【0089】

上記態様の実施態様において、微生物細胞、好ましくは酵母細胞は、リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）をコードする外因性ポリヌクレオチドをさらに含み、ここで、ポリヌクレオチドは、微生物細胞内でポリヌクレオチドの発現を指令することができる１つ又はそれ以上のプロモーターに作動可能に連結されている。１つの実施態様において、ＬＰＡＡＴは、配列番号９０に記載の配列を、又は配列番号９０と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するアミノ酸を含む。

【0090】

上記態様の実施態様において、微生物細胞、好ましくは酵母細胞は、リゾホスファチジルコリンアシルトランスフェラーゼ（ＬＰＣＡＴ）、モノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＭＧＡＴ）、ホスホリパーゼＡ_２（ＰＬＡ_２）、ホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）、ホスホリパーゼＤ（ＰＬＤ）、ＣＤＰ－コリンジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）、ホスファチジルコリン：ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＰＤＣＴ）、アシル－ＣｏＡシンターゼ（ＡＣＳ）、脂肪酸デサチュラーゼ、又はこれらの２つ又はそれ以上の任意の組み合わせをコードする外因性ポリヌクレオチドをさらに含む。

【0091】

上記態様の実施態様において、微生物細胞、好ましくは酵母細胞、より好ましくはワイ・リポリティカ細胞は、内因性Δ１２デサチュラーゼ若しくはΔ９デサチュラーゼの発現及び／又は活性、又はΔ１２デサチュラーゼとΔ９デサチュラーゼの両方の発現及び／又は活性の低下をもたらす遺伝子改変、好ましくはΔ１２デサチュラーゼ若しくはΔ９デサチュラーゼをコードする内因性遺伝子の遺伝子改変、より好ましくはΔ１２デサチュラーゼをコードする内因性遺伝子のヌル変異、又はΔ１２デサチュラーゼをコードする内因性遺伝子のヌル変異とヌル変異ではないΔ９デサチュラーゼをコードする内因性遺伝子の遺伝子の変異を含む。上記態様の実施態様において、微生物細胞、好ましくは酵母細胞は、脂肪酸デサチュラーゼ遺伝子の発現及び／又は活性を低下させるサイレンシングＲＮＡ分子をコードする外因性ポリヌクレオチドを、及び／又はデサチュラーゼ遺伝子、好ましくはΔ９デサチュラーゼ遺伝子又はΔ１２デサチュラーゼ遺伝子の発現及び／又は活性を低下させる脂肪酸デサチュラーゼ遺伝子の変異を、さらに含む。好ましい実施態様において、Δ９デサチュラーゼ遺伝子の変異はヌル変異ではない。好ましい実施態様において、Δ１２デサチュラーゼ遺伝子の変異はヌル変異である。１つの実施態様において、細胞は、内因性ＤＧＡＴ、ＧＰＡＴ、又はＰＤＡＴ遺伝子の発現及び／又は活性を低下させるサイレンシングＲＮＡ分子コードする外因性ポリヌクレオチドを、及び／又はデサチュラーゼ遺伝子の発現及び／又は活性を低下させる内因性ＤＧＡＴ、ＧＰＡＴ、又はＰＤＡＴ遺伝子の変異を、さらに含む。

【0092】

上記態様の好ましい実施態様において、遺伝子改変は、内因性Δ１２デサチュラーゼをコードする遺伝子における変異、好ましくはＦＡＤ２遺伝子のヌル変異である。

【0093】

上記態様の実施態様において、内因性Δ１２デサチュラーゼは、配列番号１に記載の配列を、又は配列番号１と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を、有するアミノ酸を含む。

【0094】

従って、１つの実施態様において、微生物細胞、好ましくは酵母細胞は、
（ａ）ＦＡＴＡ脂肪アシルチオエステラーゼをコードする外因性ポリヌクレオチド、
（ｂ）少なくとも１つの脂肪酸アシルトランスフェラーゼ、好ましくは少なくともジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）をコードする少なくとも１つの外因性ポリヌクレオチド、及び
（ｃ）内因性Δ１２デサチュラーゼの発現及び／又は活性の低下をもたらす遺伝子改変、好ましくはΔ１２デサチュラーゼをコードする内因性遺伝子の遺伝子改変、より好ましくはΔ１２デサチュラーゼをコードする内因性遺伝子のヌル変異、最も好ましくはＦＡＤ２遺伝子のヌル変異を含む遺伝子改変を含み、
ここで、各ポリヌクレオチドは、微生物細胞内で前記ポリヌクレオチドの発現を指令することができる１つ又はそれ以上のプロモーターに作動可能に連結されている。

【0095】

１つの実施態様において、少なくとも１つのＤＧＡＴは、配列番号１４４～１５４のいずれか１つに記載の配列を、又は配列番号１４４～１５４のいずれか１つ又はそれ以上と少なくとも７０％同一、好ましくは少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９７％同一であるヌクレオチド配列を、有するヌクレオチドを含む。

【0096】

１つの実施態様において、ＦＡＴＡ脂肪アシルチオエステラーゼは、配列番号８４又は８６のいずれか１つに記載の配列を、又は配列番号８４又は８６のいずれか１つ又はそれ以上と少なくとも７０％同一、好ましくは少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９７％同一であるヌクレオチド配列を、有するヌクレオチドを含む。

【0097】

１つの実施態様において、微生物細胞は、少なくとも１つの遺伝子改変が欠如した対応する微生物から得られた対応する抽出された微生物脂質と比較して、脂質のＴＦＡ含有量及び／又はＴＡＧ含有量中に、総ＳＦＡ含有量、Ｃ２０：０含有量、Ｃ２２：０含有量、及びＣ２４：０含有量の１つ又はそれ以上又はすべてをより多量に有する。

【0098】

１つの実施態様において、Ｃ２０：０脂肪酸の含有量は、抽出された脂質のＴＦＡ含有量又は抽出された脂質のＴＡＧ含有量又は両方の、約１重量％～約５重量％、約１重量％～約４重量％、約１重量％～約３重量％、約２重量％～約５重量％、約２重量％～約４重量％、約２重量％～約３重量％である、

【0099】

１つの実施態様において、Ｃ２２：０脂肪酸の含有量は、抽出された脂質のＴＦＡ含有量又は抽出された脂質のＴＡＧ含有量又は両方の、約１％～約５％、約１％～約４％、約２％～約５％、又は約２％～約４重量％である。

【0100】

１つの実施態様において、Ｃ２４：０脂肪酸の含有量は、抽出された脂質のＴＦＡ含有量又は抽出された脂質のＴＡＧ含有量又は両方の、約１％～約６％、約１％～約５％、約１％～約４％、約２％～約６％、約２％～約５％、又は約２％～約４重量％である。

【0101】

別の実施態様において、Ｃ２０：０脂肪酸の含有量は、抽出された脂質のＴＦＡ含有量又は抽出された脂質のＴＡＧ含有量又は両方の、少なくとも約１％、少なくとも約１．５％、少なくとも約２％、少なくとも約２．５％、又は少なくとも約３％であり、Ｃ２２：０脂肪酸の含有量は、少なくとも約１％、少なくとも約１．５％、少なくとも約２％、少なくとも約２．５％、少なくとも約３％、又は少なくとも約３．５％であり、及びＣ２４：０脂肪酸の含有量は、少なくとも約１％、少なくとも約１．５％、少なくとも約２％、少なくとも約２．５％、少なくとも約３％、少なくとも約３．５％、又は少なくとも４重量％である。

【0102】

別の実施態様において、Ｃ２０：０含有量は１．０％～４％であり、Ｃ２２：０含有量は１．０％～４％であり、及びＣ２４：０含有量は２％～５％である。

【0103】

１つの実施態様において、微生物は、アシル－ＣｏＡシンセターゼ（ＡＣＳ）をコードする外因性ポリヌクレオチドをさらに含み、任意選択的に、ＡＣＳは、配列番号８８～８９のいずれか１つとして示される配列を、又は配列番号８８～８９のいずれか１つ又はそれ以上と少なくとも７０％同一、好ましくは少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９７％同一であるヌクレオチド配列を、有するヌクレオチドを含む。

【0104】

別の実施態様において、微生物は、リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）をコードする外因性ポリヌクレオチドをさらに含み、任意選択的に、ＬＰＡＡＴは、配列番号９１に記載の配列を、又は配列番号９１と少なくとも７０％同一、好ましくは少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９７％同一であるヌクレオチド配列を、有するヌクレオチドを含む。

【0105】

上記態様の実施態様において、微生物細胞、好ましくは酵母細胞は、ステアロイル－ＣｏＡと比較して、基質としてＰＵＦＡ－ＣｏＡに対する優先性を、又はステアロイル－ＣｏＡと比較して、パルミトイル－ＣｏＡに対する優先性を、又は両方を有するＤＧＡＴをコードする内因性遺伝子、好ましくはＤＧＡ２遺伝子の、遺伝子発現若しくは活性又は両方の低下をもたらす遺伝子改変を含む。

【0106】

上記態様の実施態様において、内因性ＤＧＡ２は、配列番号５５に記載の配列を、又は配列番号５５と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を、有するアミノ酸を含む。

【0107】

上記態様の実施態様において、微生物細胞、好ましくは酵母細胞は、以下を有する：
１）ＦＡＴＡ脂肪アシルチオエステラーゼをコードする外因性ポリヌクレオチド、及び内因性Δ１２デサチュラーゼ遺伝子の発現及び／又は活性の低下をもたらす遺伝子改変、
２）脂肪酸アシルトランスフェラーゼ、好ましくはジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）をコードする外因性ポリヌクレオチド、及び内因性Δ１２デサチュラーゼ遺伝子の発現及び／又は活性の低下をもたらす遺伝子改変、
３）ＦＡＴＡ脂肪アシルチオエステラーゼ及び脂肪酸アシルトランスフェラーゼ、好ましくはジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）をコードする外因性ポリヌクレオチド、及び内因性Δ１２デサチュラーゼ遺伝子の発現及び／又は活性の低下をもたらす遺伝子改変、
４）ＦＡＴＡ脂肪アシルチオエステラーゼをコードする外因性ポリヌクレオチド、及び内因性ＤＧＡ２遺伝子の発現及び／又は活性の低下をもたらす遺伝子改変、
５）脂肪酸アシルトランスフェラーゼ、好ましくはジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）をコードする外因性ポリヌクレオチド、及び内因性ＤＧＡ２遺伝子の発現及び／又は活性の低下をもたらす遺伝子改変、
６）ＦＡＴＡ脂肪アシルチオエステラーゼ及び脂肪酸アシルトランスフェラーゼ、好ましくはジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）をコードする外因性ポリヌクレオチド、及び内因性ＤＧＡ２遺伝子の発現及び／又は活性の低下をもたらす遺伝子改変、
７）ＦＡＴＡ脂肪アシルチオエステラーゼをコードする外因性ポリヌクレオチド、内因性Δ１２デサチュラーゼ遺伝子の発現及び／又は活性の低下をもたらす遺伝子改変、及び内因性ＤＧＡ２遺伝子の発現及び／又は活性の低下をもたらす遺伝子改変、
８）脂肪酸アシルトランスフェラーゼ、好ましくはジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）をコードする外因性ポリヌクレオチド、内因性Δ１２デサチュラーゼ遺伝子の発現及び／又は活性の低下をもたらす遺伝子改変、及び内因性ＤＧＡ２遺伝子の発現及び／又は活性の低下をもたらす遺伝子改変、又は
９）ＦＡＴＡ脂肪アシルチオエステラーゼ及び脂肪酸アシルトランスフェラーゼ、好ましくはジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）をコードする外因性ポリヌクレオチド、内因性Δ１２デサチュラーゼ遺伝子の発現及び／又は活性の低下をもたらす遺伝子改変、及び内因性ＤＧＡ２遺伝子の発現及び／又は活性の低下をもたらす遺伝子改変、
ここで、各ポリヌクレオチドは、前記微生物細胞内で前記ポリヌクレオチドの発現を指令することができる１つ又はそれ以上のプロモーターに作動可能に連結されている。

【0108】

上記態様の実施態様において、微生物細胞、好ましくは酵母細胞は、真核細胞、真菌細胞、細菌細胞、若しくは藻類細胞、生きた微生物細胞、死んだ微生物細胞、又はこれらの任意の混合物を含むか若しくはこれらからなる。
上記態様の実施態様において、微生物細胞、好ましくは酵母細胞は、（ｉ）発酵に適した細胞、（ｉｉ）油性細胞、（ｉｉｉ）非油性細胞、好ましくは遺伝子組み換えによる油性細胞由来の非油性細胞、及び（ｉｖ）従属栄養細胞のうちの１つ又はそれ以上又はすべてである。

【0109】

上記態様の実施態様において、微生物細胞は酵母細胞である。適切な酵母細胞の例には、限定されるものではないが、サッカロミセス・セレビッシェ、ヤローウィア・リポリティカ、ピキア・パストリス、及びこれらの任意の混合物が含まれる。
上記態様の実施態様において、酵母細胞は ヤローウィア・リポリティカである。

【0110】

上記態様の実施態様において、微生物細胞は、約５ｇ／ｌ未満、約２ｇ／ｌ未満、約１ｇ／ｌ未満のステアリン酸塩を有するか、又はステアリン酸塩が添加されていない培地中に存在するか、又は前記培地で培養されたものである。

【0111】

別の態様において、本発明は、本明細書に定義される脂質を含むか、又は本発明の微生物細胞から産生される微生物細胞抽出物、好ましくは酵母細胞抽出物を提供する。

【0112】

別の態様において、本発明は、本明細書で定義される酵素の１つ又はそれ以上をコードし、好ましくは微生物細胞、例えば酵母細胞のゲノムに組み込まれた、ＤＮＡ構築体又はＤＮＡ構築体の組み合わせを提供する。

【0113】

１つの実施態様において、ＤＧＡＴをコードする細胞内の少なくとも１つのＤＮＡ構築体又はすべてのＤＮＡ構築体は、配列番号１４４～１５４のいずれか１つに記載の配列を、又は、配列番号１４４～１５４のいずれか１つ又はそれ以上と、少なくとも７０％同一、好ましくは少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９７％同一であるヌクレオチド配列を、有するヌクレオチドを含む。１つの実施態様において、細胞内のＤＧＡＴをコードする少なくとも１つのＤＮＡ構築体又はすべてのＤＮＡ構築体は、配列番号１１５～１２５の１つ又はそれ以上に記載の配列をコードし、及びコドン縮重のみによって配列番号１４４～１５４の１つと異なる。

【0114】

別の実施態様において、ＦＡＴＡ脂肪アシルチオエステラーゼをコードする細胞内の少なくとも１つのＤＮＡ構築体又はすべてのＤＮＡ構築体は、配列番号８４又は８６のいずれか１つに記載の配列を、配列番号８４又は８６のいずれか１つ又はそれ以上と少なくとも７０％同一、好ましくは少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９７％同一であるヌクレオチド配列を、有するヌクレオチドを含む。

【0115】

別の実施態様において、アシル－ＣｏＡシンセターゼ（ＡＣＳ）をコードする細胞内の少なくとも１つのＤＮＡ構築体又はすべてのＤＮＡ構築体は、配列番号８８～８９のいずれか１つに記載の配列を、配列番号８８～８９のいずれか１つ又はそれ以上と少なくとも７０％同一、好ましくは少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９７％同一であるヌクレオチド配列を、有するヌクレオチドを含む。

【0116】

別の実施態様において、リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）をコードする細胞内の少なくとも１つのＤＮＡ構築体又はすべてのＤＮＡ構築体は、配列番号９１に記載の配列を、又は配列番号９１と少なくとも７０％同一、好ましくは少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９７％同一であるヌクレオチド配列を、有するヌクレオチドを含む。

【0117】

別の態様において、本発明は、
（ａ）本発明の微生物細胞を取得すること、及び
（ｂ）微生物細胞から脂質を抽出すること、を含む、抽出された脂質を産生するプロセスを提供し、それにより抽出された脂質を産生する。従って、本明細書に記載される微生物細胞の実施態様のそれぞれは、抽出された脂質を産生するためのプロセスにおいて使用され得る。

【0118】

１つの実施態様において、このプロセスは、微生物細胞を培養する工程、又は工程（ｂ）の前に細胞を酸で処理する工程をさらに含む。
１つの実施態様において、このプロセスは、微生物細胞を培養する工程、又は抽出工程を改善するために、培養後であるが抽出工程の前に細胞を処理する工程、例えば工程（ｂ）の前に細胞を酸で処理する工程をさらに含む。

【0119】

１つの実施態様において、細胞は、５ｇ／ｌ未満、２ｇ／ｌ未満、１ｇ／ｌ未満のステアリン酸塩を有する培地中で、又はステアリン酸塩を含まない培地中で培養される。あるいは、細胞は、少なくとも１ｇ／ｌ、少なくとも２ｇ／ｌ、又は少なくとも５ｇ／ｌのステアリン酸塩を含む培地中で培養される。

【0120】

１つの実施態様において、脂質を抽出する工程は、細胞を有機溶媒に曝露すること、細胞をプレスすること、又はマイクロ波照射、超音波処理、高速ホモジナイズ、高圧ホモジナイズ、ビーズ叩解、オートクレーブ滅菌、熱分解、又はこれらの任意の組み合わせによって細胞を処理することを含む。
１つの実施態様において、この方法は、抽出後に脂質を改変又は精製することをさらに含む。

【0121】

別の態様において、本発明は微生物細胞を培養する方法を提供し、この方法は、
（ａ）本発明の微生物細胞を取得すること、及び
（ｂ）適切な培地中で細胞を培養することにより細胞の数を増加させることを含む。
従って、本明細書に記載される微生物細胞の実施態様のそれぞれは、微生物細胞を培養するプロセスにおいて使用され得る。

【0122】

別の態様において、本発明は、本発明の脂質を産生する微生物細胞を産生するプロセスを提供し、このプロセスは、本明細書に定義される１つ又はそれ以上の遺伝子改変及び／又は外因性ポリヌクレオチドを前駆微生物細胞に導入する工程を含む。このプロセスは、本明細書に記載される本発明の微生物細胞の実施態様のそれぞれを生成するために使用され得る。

【0123】

１つの実施態様において、プロセスは、
（ｉ）導入された遺伝子改変及び／又は外因性ポリヌクレオチドを含む細胞から子孫細胞を生成する工程、
（ｉｉ）前駆細胞集団の突然変異誘発、
（ｉｉｉ）１つ又はそれ以上の外因性ポリヌクレオチドの導入、それにより外因性ポリヌクレオチドが微生物細胞のゲノム、好ましくは所定の位置に組み込まれる工程、
（ｉｖ）細胞又はその子孫細胞の脂肪酸組成を決定する工程、及び
（ｖ）本発明の脂質を含む子孫細胞を選択する工程、の１つ又はそれ以上の工程を含む。

【0124】

別の態様において、本発明は、本発明の脂質、本発明の微生物細胞、又は本発明の微生物細胞抽出物の１つ又はそれ以上又はすべてを含む組成物を提供する。従って、本明細書に記載される微生物細胞及び抽出された脂質の各実施態様は、組成物を製造するために使用することができる。組成物は、食物又は飲料を製造するための成分として使用することができる。

【0125】

１つの実施態様において、組成物は、本発明の脂質に加えて、食物、飼料、又は飲料成分を含む。本発明の脂質又は組成物は、医薬品、化粧品、及びトイレタリーなどのパーソナルケア製品に使用することができる。

【0126】

１つの実施態様において、組成物は、抽出された微生物の脂質、細胞、又は抽出物以外の供給源からの、エステル化された又はエステル化されていない１つ又はそれ以上の脂肪酸を含む。

【0127】

別の態様において、本発明は、本発明の脂質、本発明の微生物細胞、本発明の微生物細胞抽出物、又は本発明の組成物の１つ又はそれ以上又はすべてである成分、及び少なくとも1つの他の食物、飼料、又は飲料成分を含む食物、飼料、又は飲料を提供する。従って、本明細書に記載される微生物細胞及び抽出された脂質の実施態様のそれぞれは、食物、飼料、又は飲料の食物、飼料、又は飲料成分を製造するために使用することができる。

【0128】

１つの実施態様において、食物、飼料、又は飲料には、動物から得られる成分が欠如している。

【0129】

１つの実施態様において、本発明の食物、飼料、若しくは飲料成分、又は食物、飼料、若しくは飲料は、肉代替品、脂肪、油、若しくはドレッシング、スープ、麺製品、シチュー、ストック、ブロス、ソース、グレービーソース、パスタソース、トマト製品、乾燥調味料ミックス、パン、パン代替品、ペストリー、クロワッサン、ビスケット、クラッカー、ケーキ、ピザ生地、パイ生地、乾燥ベーカリーミックス、ベーカリー生地、ドーナツ、混合材料料理、スナック、例えば甘いスナック、風味豊かな食物若しくは塩辛いスナック、肉代替品又は類似品、乳製品代替品又は類似品、又は別の食物である。

【0130】

別の態様において、本発明は、食物、飼料、又は飲料を製造する方法を提供し、この方法は、本発明の脂質、本発明の微生物細胞、本発明の微生物細胞抽出物、又は本発明の組成物を、少なくとも１つの他の食物、飼料、又は飲料成分と一緒にすることを含む。従って、本明細書に記載される微生物細胞及び抽出された脂質の実施態様のそれぞれは、本方法において使用することができる。

【0131】

また、食物、飼料、若しくは飲料成分、又は食物、飼料、若しくは飲料を製造するための、本発明の脂質、本発明の微生物細胞、本発明の微生物細胞抽出物、又は本発明の組成物の１つ若しくはそれ以上又はすべての使用も提供される。

【0132】

本明細書のいずれの実施態様も、特に明記しない限り、他の実施態様に準用して適用されるものとする。
本発明は、本明細書に記載される特定の実施態様によって範囲が限定されるものではなく、例示のみを目的としている。機能的に同等の製品、組成物、及び方法は、本明細書に記載されるように、明らかに本発明の範囲内である。
本明細書全体を介して、特に別段の記載がない限り、又は文脈上別段の必要がない限り、単一の工程、組成物、工程の群又は組成物の群への言及は、これらの工程、組成物、工程の群、又は組成物の群のうちの１つ及び複数（すなわち、１つ又はそれ以上）を包含するものと理解すべきである。

【0133】

以下、本発明を、以下の非限定的な実施例により、及び添付の図面を参照して説明する。

【図面の簡単な説明】

【0134】

【図1】図１：ＹＰＤ培地で最長７日間培養したエス・セレビッシェ（S. cerevisiae）の増殖曲線。

【図2】図２：微生物ＦＡＤ２やＵＲＡ３などの目的の遺伝子に不活性化欠失を導入する遺伝子構築体を作成するための概略図。パネルＡ．これらの２つの領域間のＳａｃＩＩ部位と結合された目的の遺伝子の１，０００ｂｐの５'上流領域と１，０００ｂｐの３'下流領域を有する２ｋｂ断片のＤＮＡ合成。制限部位とｌｏｘ部位の位置は縦線で示されている。ＣＤＳ：目的の遺伝子のタンパク質コード領域。Ｂ．ＳａｃＩＩ部位に適合したプライマーを使用するヒグロマイシン（Ｈｐｈ）又はヌルセオスリシン（Ｎａｔ１）抗生物質耐性遺伝子の増幅。Ｃ．ＡのＤＮＡ断片にＳａｃＩＩ末端抗生物質耐性遺伝子カセットを挿入することによる遺伝子構築体の構築。縮尺通りではない。

【図3】図３：微生物に遺伝子欠失を導入するための遺伝子構築体の構築の概略図。パネルＡ．目的の遺伝子の５'上流領域及び３'下流領域のＰＣＲ増幅と連結による２ｋｂ断片の作成。オリゴヌクレオチドプライマーは小さな横矢印で示され、制限酵素部位とｌｏｘ部位は縦線で示されている。ＣＤＳ：目的の遺伝子のタンパク質コード領域。Ｂ．フランキングＡｓｉＳＩ部位に適合したプライマーを使用するヒグロマイシン（Ｈｐｈ）又はヌルセオスリシン（Ｎａｔ１）耐性遺伝子の増幅。Ｃ．ワイ・リポリティカなどの微生物に導入するための遺伝子構築体の組み立て。

【図4】図４：リン脂質の概略構造。ヒドロキシルの１つは、コリン、セリン、イノシトールなどのさまざまな頭部基で置き換えることができる。

【図5】図５：ワイ・リポリティカにおける候補ＰＤＡＴの組み合わせの発現のための遺伝子構築体の概略図。各ＰＤＡＴは、ｐＴＥＦプロモーターとＬＩＰ２遺伝子転写ターミネーターの制御下にある。

【図6】図６：候補アシルトランスフェラーゼ遺伝子をワイ・リポリティカに導入するためのクローニングベクターの概略図。ｐＮＩｚ０ｈｙｇ［ｄｇａ２］の配列は配列番号１７３として提供される。ｐＮＩｚ０ｕｒａ［ｆａｄ２］の配列は配列番号１７４として提供される。ｐＮＩｚ０ｎａｔ［ｌｒｏ１］の配列は配列番号１７５として提供される。ｐＮＩｚ０ｈｙｇ［ｐｏｘ２］の配列は配列番号１７６として提供される。

【図7】図７：（Ａ）ワイ・リポリティカＷ２９株細胞の光学顕微鏡写真、（Ｂ）規定培地（Ｍ１）で培養して脂質を蓄積した後の形質転換されたワイ・リポリティカｙＮＩ００５６株細胞。

【0135】

配列表のキー
配列番号１。ワイ・リポリティカＷ２９株ＦＡＤ２ポリペプチドのアミノ酸配列、登録番号ＸＰ＿５００７０７．１。

【0136】

配列番号２。上流領域と下流領域を含むワイ・リポリティカＷ２９株のＦＡＤ２遺伝子のヌクレオチド配列。ヌクレオチド１～１０００は５'上流配列に対応し、ヌクレオチド１００１～２２６０はΔ１２デサチュラーゼのタンパク質コード領域に対応し、そしてヌクレオチド２２６１～３２６０は３'下流領域に対応する。

【0137】

配列番号３。ヒグロマイシン耐性選択マーカー遺伝子（ｐＴＥＦ－Ｈｙｇ－ｔＬｉｐ２）の塩基配列。ヌクレオチド１～４１７は、ＴＥＦプロモーター（Mulleretal., 1998；登録番号ＡＦ０５４５０８）に対応し、ヌクレオチド４１８～１４４３は、ヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（Ｈｐｈ）酵素のタンパク質コード領域に対応し、そしてヌクレオチド１４４４～１６２０は、登録番号ＨＭ４８６９００（Darvishi et al., 2011）由来のワイ・リポリティカ Ｕ６株リパーゼ２遺伝子由来のポリアデニル化領域／転写ターミネーターに対応する。ヌクレオチド２０～５３はｌｏｘＰ部位に対応し、ヌクレオチド１５６９～１５９８はｌｏｘＲ部位に対応する。

【0138】

配列番号４。ｐＴＥＦ－Ｈｙｇ－ｔＬｉｐ２によってコードされるヒグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（Ｈｐｈ）のアミノ酸配列。

【0139】

配列番号５。ＧＧＥ３６８（登録番号ＡＩＣ０６９９２、Calvey et al.(2014)）由来のヌルセオスリシン耐性選択マーカー遺伝子（ｐＴＥＦ－Ｎａｔ１－ｔＬｉｐ２）のヌクレオチド配列。ヌクレオチド１～４１８はＴＥＦプロモーターに対応し、ヌクレオチド４１９～９８８は、ヌルセオスリシンアセチルトランスフェラーゼ（Ｎａｔ１）酵素のタンパク質コード領域に対応し、そしてヌクレオチド９８９～１１６５は、Ｌｉｐ２遺伝子のポリアデニル化領域／転写ターミネーターに対応する。ヌクレオチド２０～５３はｌｏｘＰ部位に対応し、及びヌクレオチド１１１４～１１４３はｌｏｘＲ部位に対応する。１１６５ｎｔ。

【0140】

配列番号６。ｐＴＥＦ－Ｎａｔ１－ｔＬｉｐ２遺伝子によってコードされるヌルセオスリシンアセチルトランスフェラーゼ（Ｎａｔ１）のアミノ酸配列。
配列番号７。ワイ・リポリティカＴＥＦプロモーターのヌクレオチド配列（Muller et al., 1998；登録番号ＡＦ０５４５０８）。
配列番号８～４９。オリゴヌクレオチドプライマー（表１３を参照）
配列番号５０。ワイ・リポリティカＵＲＡ３株ポリペプチドのアミノ酸配列、GenBank登録番号Ｑ１２７２４；２８６ａａ。

【0141】

配列番号５１。上流領域と下流領域とを含むワイ・リポリティカのＵＲＡ３遺伝子のヌクレオチド配列。ヌクレオチド１～１，０００は５'上流配列に対応し、ヌクレオチド１，００１～１，８６１はオロチジン－５'－リン酸デカルボキシラーゼのタンパク質コード領域に対応し、そしてヌクレオチド１，８６２～２，８６１は３'下流領域に対応する。

【0142】

配列番号５２。ワイ・リポリティカＷ２９株の染色体ＥのＤＧＡ１遺伝子（ＹＡＬＩ０Ｅ３２７６９ｐ）のヌクレオチド配列、登録番号ＣＲ３８２１３１．１のヌクレオチド３８８５８５７～３８８９４０１（ＤＧＡ１遺伝子の上流領域と下流領域を含む）。ヌクレオチド１～１，０００は５'上流配列に対応し、ヌクレオチド１，００１～２，５４５はＤＧＡ１ポリペプチドのタンパク質コード領域に対応し、そしてヌクレオチド２，５４６～３，５４５は３'下流領域に対応する；３，５４５ｎｔ。

【0143】

配列番号５３。ＹＡＬＩ０Ｅ３２７６９ｐ遺伝子によってコードされるワイ・リポリティカＷ２９株由来のＤＧＡ１ポリペプチドのアミノ酸配列（GenBank登録番号．ＸＰ＿５０４７００．１；５１４ａａ）。

【0144】

配列番号５４。ワイ・リポリティカＷ２９株の染色体ＤのＤＧＡ２遺伝子（ＹＡＬＩ０Ｄ０７９８６ｐ）のヌクレオチド配列、登録番号ＣＰ０１７５５６．１のヌクレオチド１０２５４１３～１０２８９９３（ＤＧＡ２遺伝子の上流領域と下流領域を含む）。ヌクレオチド１～１，０００は５'上流配列に対応し、ヌクレオチド１，００１～２，５８１はＤＧＡ２ポリペプチドのタンパク質コード領域に対応し、そしてヌクレオチド２，５８２～３，５８１は３'下流領域に対応する；３，５８１ｎｔ。

【0145】

配列番号５５。ワイ・リポリティカＷ２９株ＤＧＡ２ポリペプチドのアミノ酸配列、GenBank登録番号ＸＰ＿５０２５５７；５２６ａａ。

【0146】

配列番号５６。ワイ・リポリティカＣＬＩＢ１２２株の染色体ＥのＬＲＯ１遺伝子（ＹＡＬＩ０Ｅ１６７９７ｐ）のヌクレオチド配列、登録番号ＣＲ３８２１３１．１のヌクレオチド１９８９９５０～１９９３８９６（ＬＲＯ１遺伝子の上流領域と下流領域を含む）。ヌクレオチド１～１０００は５'上流配列に対応し、ヌクレオチド１，００１～２，９４７はＰＤＡＴのタンパク質コード領域に対応し、そしてヌクレオチド２，９４８～３，９４７は３'下流領域に対応する；３，９４７ｎｔ。

【0147】

配列番号５７。ＬＲＯ１遺伝子（ＹＡＬＩ０Ｅ１６７９７ｐ）によってコードされるワイ・リポリティカＣＬＩＢ１２２株由来のＰＤＡＴのアミノ酸配列、GenBank登録番号ＸＰ＿５０４０３８；６４８ａａ。

【0148】

配列番号５８。ワイ・リポリティカＷ２９株の染色体ＦのＡＲＥ１遺伝子（ＹＡＬＩ０Ｆ０６５７８ｐ）のヌクレオチド配列、登録番号ＣＰ０２８４５３．１のヌクレオチド９５７７５１～９６１３８２（ＡＲＥ１遺伝子の上流領域と下流領域を含む）。ヌクレオチド１～１，０００は５'上流配列に対応し、ヌクレオチド１，００１～２，６３２はＡＳＡＴのタンパク質コード領域に対応し、そしてヌクレオチド２，６３３～３，６３２は３'下流領域に対応する；３，６３２ｎｔ。

【0149】

配列番号５９。ＡＲＥ１遺伝子（ＹＡＬＩ０Ｆ０６５７８ｐ）によってコードされるワイ・リポリティカＷ２９株由来のＡＳＡＴのアミノ酸配列、GenBank登録番号ＸＰ＿５０５０８６；５４３ａａ。

【0150】

配列番号６０。ワイ・リポリティカＣＬＩＢ１２２株の染色体ＥのＰＯＸ１遺伝子（ＹＡＬＩ０Ｅ３２８３５ｇ）のヌクレオチド配列、登録番号ＣＲ３８２１３１．１のヌクレオチド３８９７１０２～３８９９１３５（ＰＯＸ１遺伝子の上流領域と下流領域を含む）。ヌクレオチド１～１，０００は５'上流配列に対応し、ヌクレオチド１，００１～３，１０３はＰＯＸ１のタンパク質コード領域に対応し、そしてヌクレオチド３，１０４～４，１０３は３'下流領域に対応する；４，１０３ｎｔ。

【0151】

配列番号６１。ＹＡＬＩ０Ｅ３２８３５ｐによってコードされるワイ・リポリティカＣＬＩＢ１２２株由来のＰＯＸ１のアミノ酸配列、GenBank登録番号ＸＰ＿５０４７０３．１；６７７ａａ。

【0152】

配列番号６２。ワイ・リポリティカＣＬＩＢ１２２株の染色体ＦのＰＯＸ２遺伝子（ＹＡＬＩ０Ｆ１０８５７ｇ）のヌクレオチド配列、登録番号ＣＲ３８２１３２．１のヌクレオチド１４４９２８９～１４５１３９１（ＰＯＸ２遺伝子の上流領域と下流領域を含む）。ヌクレオチド１～１，０００は５'上流配列に対応し、ヌクレオチド１，００１～３，１０３はＰＯＸ２のタンパク質コード領域に対応し、そしてヌクレオチド３，１０４～４，１０３は３'下流領域に対応する；４，１０３ｎｔ。

【0153】

配列番号６３。ＹＡＬＩ０Ｆ１０８５７ｐによってコードされるワイ・リポリティカＣＬＩＢ１２２株由来のＰＯＸ２遺伝子のアミノ酸配列、GenBank登録番号＿ＸＰ＿５０５２６４．１；７００ａａ。

【0154】

配列番号６４。ワイ・リポリティカＣＬＩＢ１２２株の染色体ＤのＰＯＸ３遺伝子（ＹＡＬＩ０Ｄ２４７５０ｇ）のヌクレオチド配列、登録番号ＣＲ３８２１３０．１のヌクレオチド３２９１５７９～３２９３６８１（ＰＯＸ３遺伝子の上流領域と下流領域を含む）。ヌクレオチド１～１，０００は５'上流配列に対応し、ヌクレオチド１，００１～３，１０３はＰＯＸ３のタンパク質コード領域に対応し、そしてヌクレオチド３，１０４～４，１０３は３'下流領域に対応する；４，１０３ｎｔ。

【0155】

配列番号６５。ＹＡＬＩ０Ｄ２４７５０ｐによってコードされるワイ・リポリティカＣＬＩＢ１２２株のＰＯＸ３のアミノ酸配列、GenBank登録番号ＸＰ＿５０３２４４；７００ａａ。

【0156】

配列番号６６。ワイ・リポリティカＣＬＩＢ１２２株の染色体ＥのＭＦＥ１遺伝子（ＹＡＬＩ０Ｅ１５３７８ｇ）のヌクレオチド配列、登録番号ＣＲ３８２１３１．１のヌクレオチド１８２９４６０～１８３２２３９（ＭＦＥ１遺伝子の上流領域と下流領域を含む）。ヌクレオチド１～１，０００は５'上流配列に対応し、ヌクレオチド１，００１～３，７０６はＰＤＡＴのタンパク質コード領域に対応し、そしてヌクレオチド３，７０６～４，７０６は３'下流領域に対応する；４，７０６ｎｔ。

【0157】

配列番号６７。ＹＡＬＩ０Ｅ１５３７８ｐによってコードされるワイ・リポリティカＣＬＩＢ１２２株のＭＦＥ１のアミノ酸配列、GenBank登録番号ＸＰ＿５０３９８０。９０１ａａ。

【0158】

配列番号６８。ワイ・リポリティカＣＬＩＢ１２２株の染色体ＣのＰＥＸ１０遺伝子（ＹＡＬＩ０Ｃ０１０２３ｇ）のヌクレオチド配列、登録番号ＣＲ３８２１２９．１のヌクレオチド１３９７１８～１４０８５１（ＰＥＸ１０遺伝子の上流領域と下流領域を含む）。ヌクレオチド１～１，０００は５'上流配列に対応し、ヌクレオチド１，００１～２，１３４はＰＥＸ１０のタンパク質コード領域に対応し、そしてヌクレオチド２，１３５～３，１３４は３'下流領域に対応する；３，１３４ｎｔ。

【0159】

配列番号６９。ＹＡＬＩ０Ｃ０１０２３ｐにコードされるワイ・リポリティカＣＬＩＢ１２２株由来のＰＥＸ１０アミノ酸配列、GenBank登録番号ＸＰ＿５０１３１１；３７７ａａ。

【0160】

配列番号７０。ワイ・リポリティカＣＬＩＢ１２２株由来の染色体ＤのＳＮＦ１遺伝子（ＹＡＬＩ０Ｄ０２１０１ｇ）のヌクレオチド配列、登録番号ＣＲ３８２１３０．１のヌクレオチド２３６１３３～２３７８７２（ＳＮＦ１遺伝子の上流領域と下流領域を含む）。ヌクレオチド１～１，０００は５'上流配列に対応し、ヌクレオチド１，００１～２，７４０はＳＮＦ１のタンパク質コード領域に対応し、そしてヌクレオチド２，７４１～３，７４０は３'下流領域に対応する；３，７４０ｎｔ。

【0161】

配列番号７１。ＹＡＬＩ０Ｄ０２１０１ｐにコードされるワイ・リポリティカＣＬＩＢ１２２株由来のＳＮＦ１のアミノ酸配列、GenBank登録番号ＸＰ＿５０２３１２；５７９ａａ。

【0162】

配列番号７２。ワイ・リポリティカＣＬＩＢ１２２株の染色体ＥのＳＰＯ１４遺伝子（ＹＡＬＩ０Ｅ１８８９８ｇ）のヌクレオチド配列、登録番号ＣＲ３８２１３１．１のヌクレオチド２２５１８８４～２２５７３７３（ＳＰＯ１４遺伝子の上流領域と下流領域を含む）。ヌクレオチド１～１，０００は５'上流配列に対応し、ヌクレオチド１，００１～６，４９０はＳＰＯ１４のタンパク質コード領域に対応し、そしてヌクレオチド６，４９１～７，４９０は３'下流領域に対応する；７，４９０ｎｔ。

【0163】

配列番号７３。ＹＡＬＩ０Ｅ１８８９８ｐにコードされるワイ・リポリティカＣＬＩＢ１２２株由来のＳＰＯ１４のアミノ酸配列、GenBank登録番号ＸＰ＿５０４１２４；１８２９ａａ。

【0164】

配列番号７４。ワイ・リポリティカＣＬＩＢ１２２株の染色体ＥのＯＰＩ１遺伝子（ＹＡＬＩ０Ｃ１４７８４ｇ）のヌクレオチド配列、登録番号ＣＲ３８２１２９．１のヌクレオチド２２５１８８４～２３７８７２（ＯＰＩ１遺伝子の上流領域と下流領域を含む）。ヌクレオチド１～１，０００は５'上流配列に対応し、ヌクレオチド１，００１～２，８６３はＯＰＩ１のタンパク質コード領域に対応し、そしてヌクレオチド２，８６４～３，８６３は３'下流領域に対応する；３，８６３ｎｔ。

【0165】

配列番号７５。ＹＡＬＩ０Ｃ１４７８４ｐにコードされるワイ・リポリティカＣＬＩＢ１２２株由来のＯＰＩ１のアミノ酸配列、GenBank登録番号ＸＰ＿５０１８４３；６２０ａａ。

【0166】

配列番号７６。エス・セレビッシェのＰＯＸ１遺伝子（ＹＧＬ２０５Ｗ；ｃｈｒＶＩＩ：１０８１５８～１１０４０４）のヌクレオチド配列（上流領域と下流領域を含む）。ヌクレオチド１～１，０００は５'上流配列に対応し、ヌクレオチド１，００１～３，２４７はアシルＣｏＡオキシダーゼのタンパク質コード領域に対応し、そしてヌクレオチド３，２４８～４，２４７は３'下流領域に対応する。

【0167】

配列番号７７。エス・セレビッシェＳ２８８Ｃ株のＰＯＸ１遺伝子産物のアミノ酸配列（登録番号ＮＰ＿０１１３１０．１）；７４８ａａ。

【0168】

配列番号７８。ワイ・リポリティカ由来のＦＢＡＩＮプロモーターのヌクレオチド配列（米国特許第８，８１５，５６６号）；９７３ｎｔ。翻訳開始ＡＴＧはヌクレオチド８０３～８０５にあり、イントロンはヌクレオチド８６６～９６７である。

【0169】

配列番号７９。改変されたワイ・リポリティカＦＢＡＩＮ遺伝子プロモーターのヌクレオチド配列（ＦＢＡＩＮｍ）；９２７ｎｔ。ＦＢＡＩＮプロモーター（配列番号７８）のヌクレオチド８０５～８５７に対応する領域を欠失させてＦＢＡＩＮｍを作製した。プロモーターもまた改変して、ＦＢＡＩＮから野生型ＡＴＧを除去して、ＡＴＧ開始コドンのすぐ上流に、任意選択的な翻訳コンセンサス配列（ＣＡＣＡ；Gasmi et al, 2011）を提供した、ヌクレオチド９２５～９２７。

【0170】

配列番号８０。ワイ・リポリティカのＧＰＤ遺伝子プロモーターのヌクレオチド配列（米国特許第８，８１５，５６６号）；９７１ｎｔ。翻訳開始コドンＡＴＧはヌクレオチド９６９～９７１にある。

【0171】

配列番号８１。エム・テトラフィラ（M. tetraphylla）（マカダミア）由来のＤＧＡＴ１のアミノ酸配列、ＮＣＢＩ登録番号ＫＴ７３６３０２．１；５３５ａａ。

【0172】

配列番号８２。ＢｓａＩ部位に隣接した、エム・テトラフィラ由来のＭｔＤＧＡＴ１をコードするｐＡＴ１１７にクローニングされたタンパク質コード領域のヌクレオチド配列；１６３４ｎｔ。

【0173】

配列番号８３。ジー・マンゴスタナ（G. mangostana）（マンゴスチン）由来のＧｍＦＡＴＡ１のアミノ酸配列、ＮＣＢＩ登録番号Ｕ９２８７６．１；３５２ａａ。

【0174】

配列番号８４。ＢｓａＩサイトに隣接した、ジー・マンゴスタナ由来のＦＡＴＡ１タンパク質をコードするｐＡＴ０６６にクローニングされたタンパク質コード領域のヌクレオチド配列。開始コドンＡＴＧはヌクレオチド９～１１にあり、終止コドンはヌクレオチド１０６８～１０７にある；１０８１ｎｔ。

【0175】

配列番号８５。ジー・マンゴスタナ（マンゴスチン）由来のＧｍＦＡＴＡ２のアミノ酸配列、ＮＣＢＩ登録番号Ｕ９２８７７．１；３５５ａａ。

【0176】

配列番号８６。ジー・マンゴスタナ由来のＦＡＴＡ２をコードするｐＡＴ０６７にクローニングされたタンパク質コード領域のヌクレオチド配列。開始コドンＡＴＧはヌクレオチド９～１１にあり、終止コドンはヌクレオチド１０７７～１０７９にある；１０９０ｎｔ。

【0177】

配列番号８７。ピー・クロロラフィス（P. chlororaphis）由来のＰｃＡＣＳ－Ｘ１のアミノ酸配列、ＮＣＢＩ登録番号ＢＡＤ９０９３３；５４５ａａ。

【0178】

配列番号８８。ＢｓａＩ部位に隣接している、ピー・クロロラフィス由来のｐＡＴ１３６（ＰｃＡＣＳ－Ｘ１）にクローニングされたタンパク質コード領域のヌクレオチド配列。開始コドンＡＴＧはヌクレオチド１２～１４にあり、終止コドンはヌクレオチド１６４７～１６４９にある；１６６０ｎｔ。

【0179】

配列番号８９。ＢｓａＩ部位に隣接している、ピー・クロロラフィス由来のｐＡＴ１３８（ＰｃＡＣＳ－Ｘ２）にクローニングされたタンパク質コード領域のヌクレオチド配列；１６６０ｎｔ。

【0180】

配列番号９０。モルティエラ・アルピナ（クサレケカビ）由来のＭａＬＰＡＡＴのアミノ酸配列、ＮＣＢＩ登録番号；３１４ａａ。

【0181】

配列番号９１。クサレケカビ（M. alpina）由来のＭｔＬＰＡＡＴのタンパク質コード領域のヌクレオチド配列；９４５ｎｔ。

【0182】

配列番号９２。ワイ・リポリティカ細胞を形質転換するために使用されたｐＡＴ２０７のＮｏｔＩ ＤＮＡ断片のヌクレオチド配列。ヌクレオチド１～８及び９０９６～９１０３、ＮｏｔＩ制限酵素部位；ヌクレオチド９～３０８、ワイ・リポリティカゼータ配列の５'部分；ヌクレオチド３６５～１６４３、ヌクレオチド１３９８～１６２１にＵＲＡ３遺伝子のプロモーターを含む逆配向のワイ・リポリティカＵＲＡ３遺伝子；ヌクレオチド１９０３～２２６１、３９６０～４３１８、及び６５９５～６９６７、ｐＴＥＦプロモーター；ヌクレオチド１６４４～１９０２、３４８３～３９５９、及び６１１８～６５９４、エンハンサー配列；ヌクレオチド２２６９～３３３０、ＧｍＦＡＴＡ１のタンパク質コード領域；ヌクレオチド４３２９～５９６６、ＰｃＡＣＳ－Ｘ１のタンパク質コード領域；ヌクレオチド６９６８～８５７５、ＭｔＤＧＡＴ１のタンパク質コード領域；３３３１～３４８２、５９７１～６１１７、及び８５８０～８６９６、ｌｉｐ２転写ターミネーター；及び、ヌクレオチド８７０１～９０９５、ワイ・リポリティカゼータ配列の３'部分。

【0183】

配列番号９３。ワイ・リポリティカ細胞を形質転換するために使用されたｐＡＴ２０８のＮｏｔＩ ＤＮＡ断片のヌクレオチド配列。ヌクレオチド１～８及び９０９６～９１０３、ＮｏｔＩ制限酵素部位；ヌクレオチド９～３０８、ワイ・リポリティカゼータ配列の５'部分；ヌクレオチド３６５～１６４３、ヌクレオチド１３９８～１６２１にＵＲＡ３遺伝子のプロモーターを含む逆配向のワイ・リポリティカＵＲＡ３遺伝子；ヌクレオチド１９０３～２２６１、３９６０～４３１８、及び６５９５～６９６７、ｐＴＥＦプロモーター。ヌクレオチド１６４４～１９０２、３４８３～３９５９、及び６１１８～６５９４、エンハンサー配列；ヌクレオチド２２６９～３３３０、ＧｍＦＡＴＡ１のタンパク質コード領域；ヌクレオチド４３２９～５９６６、ＰｃＡＣＳ－Ｘ２のタンパク質コード領域；ヌクレオチド６９６８～８５７５、ＭｔＤＧＡＴ１のタンパク質コード領域；３３３１～３４８２、５９７１～６１１７、及び８５８０～８６９６、ｌｉｐ２転写ターミネーター；及び、ヌクレオチド８７０１～９０９５、ワイ・リポリティカゼータ配列の３'部分。

【0184】

配列番号９４。ワイ・リポリティカ細胞を形質転換するために使用されたｐＡＴ２０９のＮｏｔＩ ＤＮＡ断片のヌクレオチド配列。ヌクレオチド１～８及び９１０５～９１１２、ＮｏｔＩ制限酵素部位；ヌクレオチド９～３０８、ワイ・リポリティカゼータ配列の５'部分；ヌクレオチド３６５～１６４３、ヌクレオチド１３９８～１６２１にＵＲＡ３遺伝子のプロモーターを含む逆配向のワイ・リポリティカＵＲＡ３遺伝子；ヌクレオチド１９０３～２２６１、３９６９～４３２７、及び６６０４～６９７６、ｐＴＥＦプロモーター。ヌクレオチド１６４４～１９０２、３４９２～３９６８、及び６１２７～６６０３、エンハンサー配列；ヌクレオチド２２６９～３３３０、ＧｍＦＡＴＡ２のタンパク質コード領域；ヌクレオチド４３３８～５９７５、ＰｃＡＣＳ－Ｘ１のタンパク質コード領域；ヌクレオチド６９７７～８５８４、ＭｔＤＧＡＴ１のタンパク質コード領域；３３４０～３４９１、５９８０～６１２６、及び８５８９～８７０５、ｌｉｐ２転写ターミネーター；及び、ヌクレオチド８７１０～９１０４、ワイ・リポリティカゼータ配列の３'部分。

【0185】

配列番号９５。ワイ・リポリティカ細胞を形質転換するために使用されたｐＡＴ２１０のＮｏｔＩ ＤＮＡ断片のヌクレオチド配列。ヌクレオチド１～８及び９１０５～９１１２、ＮｏｔＩ制限酵素部位；ヌクレオチド９～３０８、ワイ・リポリティカゼータ配列の５'部分；ヌクレオチド３６５～１６４３、ヌクレオチド１３９８～１６２１にＵＲＡ３遺伝子のプロモーターを含む逆配向のワイ・リポリティカＵＲＡ３遺伝子；ヌクレオチド１９０３～２２６１、３９６９～４３２７、及び６６０４～６９７６、ｐＴＥＦプロモーター。ヌクレオチド１６４４～１９０２、３４９２～３９６８、及び６１２７～６６０３、エンハンサー配列；ヌクレオチド２２６９～３３３０、ＧｍＦＡＴＡ２のタンパク質コード領域；ヌクレオチド４３３８～５９７５、ＰｃＡＣＳ－Ｘ２のタンパク質コード領域；ヌクレオチド６９７７～８５８４、ＭｔＤＧＡＴ１のタンパク質コード領域；３３４０～３４９１、５９８０～６１２６、及び８５８９～８７０５、ｌｉｐ２転写ターミネーター；及び、ヌクレオチド８７１０～９１０４、ワイ・リポリティカゼータ配列の３'部分。

【0186】

配列番号９６。ワイ・リポリティカ細胞を形質転換するために使用されたｐＡＴ２１１のＮｏｔＩ ＤＮＡ断片のヌクレオチド配列。ヌクレオチド１～８及び８４１０～８４１７、ＮｏｔＩ制限酵素部位；ヌクレオチド９～３０８、ワイ・リポリティカゼータ配列の５'部分；ヌクレオチド３６５～１６４３、ヌクレオチド１３９８～１６２１にＵＲＡ３遺伝子のプロモーターを含む逆配向のワイ・リポリティカＵＲＡ３遺伝子；ヌクレオチド１９０３～２２６１、３９６０～４３１８、及び５９０９～６２６７、ｐＴＥＦプロモーター。ヌクレオチド１６４４～１９０２、３４８３～３９５９、及び５４３２～５９０８、エンハンサー配列；ヌクレオチド２２６９～３３３０、ＧｍＦＡＴＡ１のタンパク質コード領域；ヌクレオチド４３３３～５２８０、ＭａＬＰＡＡＴのタンパク質コード領域；ヌクレオチド６２８２～７８８９、ＭｔＤＧＡＴ１のタンパク質コード領域；３３３１～３４８２、５２８１～５４３１、及び７８９０～８０１０、ｌｉｐ２転写ターミネーター；及び、ヌクレオチド８０１５～８４０９、ワイ・リポリティカゼータ配列の３'部分。

【0187】

配列番号９７。ワイ・リポリティカ細胞を形質転換するために使用されたｐＡＴ２１２のＮｏｔＩ ＤＮＡ断片のヌクレオチド配列。ヌクレオチド１～８及び８４１９～８４２６、ＮｏｔＩ制限酵素部位；ヌクレオチド９～３０８、ワイ・リポリティカゼータ配列の５'部分；ヌクレオチド３６５～１６４３、ヌクレオチド１３９８～１６２１にＵＲＡ３遺伝子のプロモーターを含む逆配向のワイ・リポリティカＵＲＡ３遺伝子；ヌクレオチド１９０３～２２６１、３９６０～４３１８、及び５９０９～６２６７、ｐＴＥＦプロモーター；ヌクレオチド１６４４～１９０２、３４８３～３９５９、及び５４３２～５９０８、エンハンサー配列；ヌクレオチド２２７２～３３３９、ＧｍＦＡＴＡ２のタンパク質コード領域；ヌクレオチド４３４２～５２８９、ＭａＬＰＡＡＴのタンパク質コード領域；ヌクレオチド６２９１～７８９８、ＭｔＤＧＡＴ１のタンパク質コード領域；３３４０～３４９１、５２９０～５４９０、及び７８９９～８０１９、ｌｉｐ２転写ターミネーター；及び、ヌクレオチド８０２４～８４１８、ワイ・リポリティカゼータ配列の３'部分。

【0188】

配列番号９８。オリゴヌクレオチドプライマーａｔ００１
配列番号９９。オリゴヌクレオチドプライマーａｔ００２。
配列番号１００。オリゴヌクレオチドプライマーａｔ０８５。
配列番号１０１。オリゴヌクレオチドプライマーａｔ０８６。
配列番号１０２。オリゴヌクレオチドプライマーａｔ２７４。
配列番号１０３。オリゴヌクレオチドプライマーａｔ２７５。
配列番号１０４。オリゴヌクレオチドプライマーａｔ２９７。
配列番号１０５。オリゴヌクレオチドプライマーａｔ２９８。
配列番号１０６。オリゴヌクレオチドプライマーａｔ２９９。
配列番号１０７。オリゴヌクレオチドプライマーａｔ３００。

【0189】

配列番号１０８。ワイ・リポリティカ細胞を形質転換するために使用されたｐＡＴ０９１のＮｏｔＩ ＤＮＡ断片のヌクレオチド配列。ヌクレオチド１～８及び４６４８～４６５５、ＮｏｔＩ制限酵素部位；ヌクレオチド９～３１１、ワイ・リポリティカゼータ配列の５'部分；ヌクレオチド３６５～１６４３、ヌクレオチド１３９８～１６２１にＵＲＡ３遺伝子のプロモーターを含む逆配向のワイ・リポリティカＵＲＡ３遺伝子；ヌクレオチド２０８０～２４７９、ｐＴＥＦプロモーター；ヌクレオチド１６４４～２０７９、エンハンサー配列；ヌクレオチド２４８７～４１２７、ＰｃＡＣＳ－Ｘ１のタンパク質コード領域；４１２８～４２４８、ｌｉｐ２転写ターミネーター；及び、ヌクレオチド４２５４～４６４７、ワイ・リポリティカゼータ配列の３'部分。

【0190】

配列番号１０９。ワイ・リポリティカ細胞を形質転換するために使用されたｐＡＴ１０８のＮｏｔＩ ＤＮＡ断片のヌクレオチド配列。ヌクレオチド１～８及び４０７８～４０８５、ＮｏｔＩ制限酵素部位；ヌクレオチド９～３１１、ワイ・リポリティカゼータ配列の５'部分；ヌクレオチド３６５～１６４３、ヌクレオチド１３９８～１６２１にＵＲＡ３遺伝子のプロモーターを含む逆配向のワイ・リポリティカＵＲＡ３遺伝子；ヌクレオチド２０８０～２４７９、ｐＴＥＦプロモーター；ヌクレオチド１６４４～２０７９、エンハンサー配列；ヌクレオチド２４８７～３５５７、ＧｍＦＡＴＡ２のタンパク質コード領域；３５５８～３６８２、ｌｉｐ２転写ターミネーター；及び、ヌクレオチド３６８３～４０７７、ワイ・リポリティカゼータ配列の３'部分。

【0191】

配列番号１１０。ワイ・リポリティカ細胞を形質転換するために使用されたｐＡＴ１３５のＮｏｔＩ ＤＮＡ断片のヌクレオチド配列。ヌクレオチド１～８及び４６２２～４６２９、ＮｏｔＩ制限酵素部位；ヌクレオチド９～３１１、ワイ・リポリティカゼータ配列の５'部分；ヌクレオチド３６５～１６４３、ヌクレオチド１３９８～１６２１にＵＲＡ３遺伝子のプロモーターを含む逆配向のワイ・リポリティカＵＲＡ３遺伝子；ヌクレオチド２０８０～２４７９、ｐＴＥＦプロモーター；ヌクレオチド１６４４～２０７９、エンハンサー配列；ヌクレオチド２４９４～４１０１、ＭｔＤＧＡＴ１のタンパク質コード領域；４１０２～４２２６、ｌｉｐ２転写ターミネーター；及び、ヌクレオチド４２２７～４６２１、ワイ・リポリティカゼータ配列の３'部分。

【0192】

配列番号１１１。ワイ・リポリティカ細胞を形質転換するために使用されたｐＡＴ２１３のＮｏｔＩ ＤＮＡ断片のヌクレオチド配列。ヌクレオチド１～８及び６７１４～６７２１、ＮｏｔＩ制限酵素部位；ヌクレオチド９～３１１、ワイ・リポリティカゼータ配列の５'部分；ヌクレオチド３６５～１６４３、ヌクレオチド１３９８～１６２１にＵＲＡ３遺伝子のプロモーターを含む逆配向のワイ・リポリティカＵＲＡ３遺伝子；ヌクレオチド２０８０～２４７９及び４１４６～４５４６、ｐＴＥＦプロモーター；ヌクレオチド１６４４～２０７９及び３７１０～４１４５、エンハンサー配列；ヌクレオチド２４８７～３５５７、ＧｍＦＡＴＡ２のタンパク質コード領域；ヌクレオチド４５５６～６１９３、ＰｃＡＣＳ－Ｘ１のタンパク質コード領域；３５５８～３７０９及び６１９４～６３１８、ｌｉｐ２転写ターミネーター；及び、ヌクレオチド６３１９～６７１３、ワイ・リポリティカゼータ配列の３'部分。

【0193】

配列番号１１２。ワイ・リポリティカ細胞を形質転換するために使用されたｐＡＴ２１４のＮｏｔＩ ＤＮＡ断片のヌクレオチド配列。ヌクレオチド１～８及び６６８８～６６９５、ＮｏｔＩ制限酵素部位；ヌクレオチド９～３１１、ワイ・リポリティカゼータ配列の５'部分；ヌクレオチド３６５～１６４３、ヌクレオチド１３９８～１６２１にＵＲＡ３遺伝子のプロモーターを含む逆配向のワイ・リポリティカＵＲＡ３遺伝子；ヌクレオチド２０８０～２４７９及び４１４６～４５４６、ｐＴＥＦプロモーター；ヌクレオチド１６４４～２０７９及び３７１０～４１４５、エンハンサー配列；ヌクレオチド２４８７～３５５７、ＧｍＦＡＴＡ２のタンパク質コード領域；ヌクレオチド４５６０～６１６７、ＭｔＤＧＡＴ１のタンパク質コード領域；３５５８～３７０９及び６１６８～６２９２、ｌｉｐ２転写ターミネーター；及び、ヌクレオチド６２９３～６６８７、ワイ・リポリティカゼータ配列の３'部分。

【0194】

配列番号１１３。ワイ・リポリティカ細胞を形質転換するために使用されたｐＡＴ２１５のＮｏｔＩ ＤＮＡ断片のヌクレオチド配列。ヌクレオチド１～８及び７２５８～７２６５、ＮｏｔＩ制限酵素部位；ヌクレオチド９～３１１、ワイ・リポリティカゼータ配列の５'部分；ヌクレオチド３６５～１６４３、ヌクレオチド１３９８～１６２１にＵＲＡ３遺伝子のプロモーターを含む逆配向のワイ・リポリティカＵＲＡ３遺伝子；ヌクレオチド２０８０～２４７９及び４７１６～５１１６、ｐＴＥＦプロモーター；ヌクレオチド１６４４～２０７９及び４２８０～４７１５、エンハンサー配列；ヌクレオチド２４８７～４１２７、ＰｃＡＣＳ－Ｘ１のタンパク質コード領域；ヌクレオチド５１３０～６７３７、ＭｔＤＧＡＴ１のタンパク質コード領域；４１２８～４２７９及び６７３８～６８６２、ｌｉｐ２転写ターミネーター；及び、ヌクレオチド６８６３～７２５７、ワイ・リポリティカゼータ配列の３'部分。

【0195】

配列番号１１４。ワイ・リポリティカ細胞を形質転換するために使用されたｐＡＴ２１６のＮｏｔＩ ＤＮＡ断片のヌクレオチド配列。ヌクレオチド１～８及び９２６０～９２６７、ＮｏｔＩ制限酵素部位；ヌクレオチド９～３１１、ワイ・リポリティカゼータ配列の５'部分；ヌクレオチド３６５～１６４３、ヌクレオチド１３９８～１６２１にＵＲＡ３遺伝子のプロモーターを含む逆配向のワイ・リポリティカＵＲＡ３遺伝子；ヌクレオチド２０８０～２４７９、４１４６～４５４５、及び６７８１～７１８１、ｐＴＥＦプロモーター；ヌクレオチド１６４４～２０７９、３７１０～４１４５、及び６３４５～６７８０、エンハンサー配列；ヌクレオチド２４８７～３５５７、ＧｍＦＡＴＡ２のタンパク質コード領域；ヌクレオチド４５５６～６１９３、ＰｃＡＣＳ－Ｘ１のタンパク質コード領域；ヌクレオチド７１９５～８７３９、ＹＩＤＧＡ１のタンパク質コード領域；３５５８～３７０９、６１９４～６３４４、及び８７４０～８８６４、ｌｉｐ２転写ターミネーター；及び、ヌクレオチド８８６５～９２５９、ワイ・リポリティカゼータ配列の３'部分。

【0196】

配列番号１１５－ティー・カカオ（T. cacao）由来のＴｃＤＧＡＴ１のアミノ酸配列。
配列番号１１６－ティー・カカオ由来のＴｃＤＧＡＴ２のアミノ酸配列。
配列番号１１７－ティー・カカオ由来のＴｃＤＧＡＴ３のアミノ酸配列。
配列番号１１８－ティー・カカオ由来のＴｃＤＧＡＴ４のアミノ酸配列。
配列番号１１９－ティー・カカオ由来のＴｃＤＧＡＴ５のアミノ酸配列。
配列番号１２０－ティー・カカオ由来のＴｃＤＧＡＴ６のアミノ酸配列。
配列番号１２１－ティー・カカオ由来のＴｃＤＧＡＴ７のアミノ酸配列。
配列番号１２２－ティー・カカオ由来のＴｃＤＧＡＴ８のアミノ酸配列。
配列番号１２３－ティー・カカオ由来のＴｃＤＧＡＴ９のアミノ酸配列。
配列番号１２４－ティー・カカオ由来のＴｃＤＧＡＴ１０のアミノ酸配列。
配列番号１２５－ティー・カカオ由来のＴｃＤＧＡＴ１１のアミノ酸配列。
配列番号１２６－ティー・カカオ由来のＴｃＧＰＡＴ１のアミノ酸配列。
配列番号１２７－ティー・カカオ由来のＴｃＧＰＡＴ２のアミノ酸配列。
配列番号１２８－ティー・カカオ由来のＴｃＧＰＡＴ３のアミノ酸配列。
配列番号１２９－ティー・カカオ由来のＴｃＧＰＡＴ４のアミノ酸配列。
配列番号１３０－ティー・カカオ由来のＴｃＧＰＡＴ５のアミノ酸配列。
配列番号１３１－ティー・カカオ由来のＴｃＧＰＡＴ６のアミノ酸配列。
配列番号１３２－ティー・カカオ由来のＴｃＧＰＡＴ７のアミノ酸配列。
配列番号１３３－ティー・カカオ由来のＴｃＧＰＡＴ８のアミノ酸配列。
配列番号１３４－ティー・カカオ由来のＴｃＧＰＡＴ９のアミノ酸配列。
配列番号１３５－ティー・カカオ由来のＴｃＧＰＡＴ１０のアミノ酸配列。
配列番号１３６－ティー・カカオ由来のＴｃＧＰＡＴ１１のアミノ酸配列。
配列番号１３７－ティー・カカオ由来のＴｃＧＰＡＴ１２のアミノ酸配列。
配列番号１３８－ティー・カカオ由来のＴｃＧＰＡＴ１３のアミノ酸配列。
配列番号１３９－ティー・カカオ由来のＴｃＰＤＡＴ１のアミノ酸配列。
配列番号１４０－ティー・カカオ由来のＴｃＰＤＡＴ２のアミノ酸配列。
配列番号１４１－ティー・カカオ由来のＴｃＰＤＡＴ４のアミノ酸配列。
配列番号１４２－ティー・カカオ由来のＴｃＰＤＡＴ５のアミノ酸配列。
配列番号１４３－ティー・カカオ由来のＴｃＰＤＡＴ６のアミノ酸配列。

【0197】

配列番号１４４－ティー・カカオ由来のＴｃＤＧＡＴ１をコードするコドン最適化されたオープンリーディングフレーム。
配列番号１４５－ティー・カカオ由来のＴｃＤＧＡＴ２をコードするコドン最適化されたオープンリーディングフレーム。
配列番号１４６－ティー・カカオ由来のＴｃＤＧＡＴ３をコードするコドン最適化されたオープンリーディングフレーム。
配列番号１４７－ティー・カカオのＴｃＤＧＡＴ４をコードするコドン最適化されたオープンリーディングフレーム。
配列番号１４８－ティー・カカオのＴｃＤＧＡＴ５をコードするコドン最適化されたオープンリーディングフレーム。
配列番号１４９－ティー・カカオのＴｃＤＧＡＴ６をコードするコドン最適化されたオープンリーディングフレーム。
配列番号１５０－ティー・カカオのＴｃＤＧＡＴ７をコードするコドン最適化されたオープンリーディングフレーム。
配列番号１５１－ティー・カカオのＴｃＤＧＡＴ８をコードするコドン最適化されたオープンリーディングフレーム。
配列番号１５２－ティー・カカオ由来のＴｃＤＧＡＴ９をコードするコドン最適化されたオープンリーディングフレーム。
配列番号１５３－ティー・カカオ由来のＴｃＤＧＡＴ１０をコードするコドン最適化されたオープンリーディングフレーム。
配列番号１５４－ティー・カカオ由来のＴｃＤＧＡＴ１１をコードするコドン最適化されたオープンリーディングフレーム。
配列番号１５５－ティー・カカオ由来のＴｃＧＰＡＴ１をコードするコドン最適化されたオープンリーディングフレーム。
配列番号１５６－ティー・カカオ由来のＴｃＧＰＡＴ２をコードするコドン最適化されたオープンリーディングフレーム。
配列番号１５７－ティー・カカオ由来のＴｃＧＰＡＴ３をコードするコドン最適化されたオープンリーディングフレーム。
配列番号１５８－ティー・カカオ由来のＴｃＧＰＡＴ４をコードするコドン最適化されたオープンリーディングフレーム。
配列番号１５９－ティー・カカオ由来のＴｃＧＰＡＴ５をコードするコドン最適化されたオープンリーディングフレーム。
配列番号１６０－ティー・カカオ由来のＴｃＧＰＡＴ６をコードするコドン最適化されたオープンリーディングフレーム。
配列番号１６１－ティー・カカオ由来のＴｃＧＰＡＴ７をコードするコドン最適化されたオープンリーディングフレーム。
配列番号１６２－ティー・カカオ由来のＴｃＧＰＡＴ８をコードするコドン最適化されたオープンリーディングフレーム。
配列番号１６３－ティー・カカオ由来のＴｃＧＰＡＴ９をコードするコドン最適化されたオープンリーディングフレーム。
配列番号１６４－ティー・カカオ由来のＴｃＧＰＡＴ１０をコードするコドン最適化されたオープンリーディングフレーム。
配列番号１６５－ティー・カカオ由来のＴｃＧＰＡＴ１１をコードするコドン最適化されたオープンリーディングフレーム。
配列番号１６６－ティー・カカオ由来のＴｃＧＰＡＴ１２をコードするコドン最適化されたオープンリーディングフレーム。
配列番号１６７－ティー・カカオ由来のＴｃＧＰＡＴ１３をコードするコドン最適化されたオープンリーディングフレーム。
配列番号１６８－ティー・カカオ由来のＴｃＰＤＡＴ１をコードするコドン最適化されたオープンリーディングフレーム。
配列番号１６９－ティー・カカオ由来のＴｃＰＤＡＴ２をコードするコドン最適化されたオープンリーディングフレーム。
配列番号１７０－ティー・カカオ由来のＴｃＰＤＡＴ４をコードするコドン最適化されたオープンリーディングフレーム。
配列番号１７１－ティー・カカオ由来のＴｃＰＤＡＴ５をコードするコドン最適化されたオープンリーディングフレーム。
配列番号１７２－ティー・カカオ由来のＴｃＰＤＡＴ６をコードするコドン最適化されたオープンリーディングフレーム。

【0198】

配列番号１７３－ワイ・リポリティカ細胞の形質転換のための遺伝子の挿入に使用されたクローニングベクターｐＮＩｚ０ｈｙｇ［ｄｇａ２］のヌクレオチド配列。ヌクレオチド４１６～４２３及び６１３４～６１４１、ＮｏｔＩ制限酵素部位；ヌクレオチド４２４～７３６、ワイ・リポリティカゼータ配列の５'部分；ヌクレオチド７３７～７４２及び５７３３～５７３８、ＢｓａＩ制限酵素部位；ヌクレオチド７４３～１７４２、ワイ・リポリティカＤＧＡ２遺伝子由来の５'上流配列；ヌクレオチド１７４３～１７５５、ＳｆｉＩ制限酵素部位；ヌクレオチド１７８４～１８１１及び４６９９～４７３２、ｌｏｘＰｓｙｍ組換え部位；ヌクレオチド１８２９～２２４５及び３４６０～３８５８、ｐＴＥＦプロモーター；ヌクレオチド２２４６～３２７１、ヒグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ＨｙｇＲ）のタンパク質コード領域；ヌクレオチド３８５９～４５８１、ｆｕＧＦＰポリペプチドのタンパク質コード領域；ヌクレオチド３２７２～３４５３及び４５８２～４６９８、ｌｉｐ２ポリアデニル化／転写ターミネーター；ヌクレオチド４７３３～５７３２、ワイ・リポリティカＤＧＡ２遺伝子由来の３'下流配列；ヌクレオチド５７３９～６１４１、ワイ・リポリティカゼータ配列の３'部分；８３９７ｎｔ。

【0199】

配列番号１７４－ワイ・リポリティカ細胞の形質転換のための遺伝子の挿入に使用されたクローニングベクターｐＮＩｚ０ｕｒａ［ｆａｄ２］のヌクレオチド配列。ヌクレオチド４１６～４２３及び５７３７～５７４４、ＮｏｔＩ制限酵素部位；ヌクレオチド４２４～７３６、ワイ・リポリティカゼータ配列の５'部分；ヌクレオチド７３７～７４２及び５３２０～５３２５、ＢｓａＩ制限酵素部位；ヌクレオチド７４３～１７４２、ワイ・リポリティカＦＡＤ２遺伝子由来の５'上流配列；ヌクレオチド１７４３～１７５５、ＳｆｉＩ制限酵素部位；ヌクレオチド１７８４～１８１７及び４２８６～４３１９、ｌｏｘＰｓｙｍ組換え部位；ヌクレオチド１８１８～３０３７、ＵＲＡ３選択マーカー遺伝子（逆配向）、ＵＲＡ３のタンパク質コード領域の相補体であるヌクレオチド１９９９～２８５９を含む；ヌクレオチド３０３８～３４４５、ｐＴＥＦプロモーター；ヌクレオチド３４４６～４１６８、ｆｕＧＦＰポリペプチドのタンパク質コード領域；ヌクレオチド４１６９～４２８５、ｌｉｐ２ポリアデニル化／転写ターミネーター；ヌクレオチド４３２０～５３１９、ワイ・リポリティカＦＡＤ２遺伝子由来の３'下流配列；ヌクレオチド５３２６～５７２８、ワイ・リポリティカゼータ配列の３'部分；７９８４ｎｔ。

【0200】

配列番号１７５－ワイ・リポリティカ細胞の形質転換のための遺伝子の挿入に使用されたクローニングベクターｐＮＩｚ０ｎａｔ［Ｉｒｏ１］のヌクレオチド配列。ヌクレオチド４１６～４２３及び５６７９～５６８６、ＮｏｔＩ制限酵素部位；ヌクレオチド４２４～７３６、ワイ・リポリティカゼータ配列の５'部分；ヌクレオチド７３７～７４２及び５３２０～５３２５、ＢｓａＩ制限酵素部位。ヌクレオチド７４３～１７４２、ワイ・リポリティカＦＡＤ２遺伝子由来の５'上流配列；ヌクレオチド１７４３～１７５５、ＳｆｉＩ制限酵素部位；ヌクレオチド１７８４～１８１７及び４２４４～４２７７、ｌｏｘＰｓｙｍ組換え部位；ヌクレオチド１８１８～３０３７、ＵＲＡ３選択マーカー遺伝子（逆配向）、ＵＲＡ３のタンパク質コード領域の相補体であるヌクレオチド１９９９～２８５９を含む；ヌクレオチド１８８３～２２４６及び３００５～３４０３、ｐＴＥＦプロモーター；ヌクレオチド３４０４～４１２６、ｆｕＧＦＰポリペプチドのタンパク質コード領域；ヌクレオチド２８１７～２９９８及び４１２７～４２４３、ｌｉｐ２ポリアデニル化／転写ターミネーター；ヌクレオチド４２７８～５２７７、ワイ・リポリティカのＦＡＤ２遺伝子由来の３'下流配列；ヌクレオチド５２８４～５６７８、ワイ・リポリティカゼータ配列の３'部分。７９４２ｎｔ。

【0201】

配列番号１７６～ワイ・リポリティカ細胞の形質転換のための遺伝子の挿入に使用されたクローニングベクターｐＮＩｚ０ｈｙｇ［ｐｏｘ２］のヌクレオチド配列。ヌクレオチド４１６～４２３及び６１３４～６１４１、ＮｏｔＩ制限酵素部位；ヌクレオチド４２４～７３６、ワイ・リポリティカゼータ配列の５'部分；ヌクレオチド７３７～７４２及び５７３３～５７３８、ＢｓａＩ制限酵素部位；ヌクレオチド７４３～１７４２、ワイ・リポリティカＰＯＸ２遺伝子由来の５'上流配列；ヌクレオチド１７４３～１７５５、ＳｆｉＩ制限酵素部位；ヌクレオチド１７８４～１８１１及び４６９９～４７３２、ｌｏｘＰｓｙｍ組換え部位；ヌクレオチド１８８２～２２４５及び３４６０～３８５８、ｐＴＥＦプロモーター；ヌクレオチド２２４６～３２７１、ヒグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼのタンパク質コード領域（ＨｙｇＲ；配列番号４）；ヌクレオチド３８５９～４５８１、ｆｕＧＦＰポリペプチドのタンパク質コード領域；ヌクレオチド３２７２～３４５３及び４５８２～４６９８、ｌｉｐ２ポリアデニル化／転写ターミネーター；ヌクレオチド４７３３～５７３２、ワイ・リポリティカＰＯＸ２遺伝子由来の３'下流配列；ヌクレオチド５７３９～６１４１、ワイ・リポリティカゼータ配列の３'部分；８３９７ｎｔ。

【発明を実施するための形態】

【0202】

発明の詳細な説明
略語
アセチル－ＣｏＡ及びマロニル－ＣｏＡ：アセチル－補酵素Ａ及びマロニル－補酵素Ａ、
ＡＣＣａｓｅ：アセチル－ＣｏＡカルボキシラーゼ、
ＦＡＳ：脂肪酸シンターゼ複合体、
ＫＡＳＩＩ：ケトアシル－ＡＣＰシンターゼＩＩ（ＥＣ２．３．１．４１）、
ＰＡＰ：ＰＡホスホリラーゼ（ＥＣ３．１．３．４）、
Ｇ３Ｐ：グリセロール－３－リン酸、
ＬＰＡ：リゾホスファチジン酸、
ＰＡ：ホスファチジン酸、
ＭＡＧ：モノアシルグリセロール
ＤＡＧ：ジアシルグリセロール、
ＴＡＧ：トリアシルグリセロール、
アシル－ＣｏＡ：アシル－補酵素Ａ、
ＰＣ：ホスファチジルコリン、
ＧＰＡＴ：グリセロール－３－リン酸アシルトランスフェラーゼ、
ＬＰＡＡＴ：リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．５１）、
ＬＰＣＡＴ：アシル－ＣｏＡ：リゾホスファチジルコリンアシルトランスフェラーゼ、又は同義語である１－アシルグリセロホスホコリンＯ－アシルトランスフェラーゼ、アシル－ＣｏＡ：１－アシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリンＯ－アシルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．２３）、
ＣＰＴ：ＣＤＰ－コリン：ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ、又は同義語である１－アルキル－２－アセチルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ、アルキルアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ、コリンホスホトランスフェラーゼ、ホスホリルコリン－グリセリドトランスフェラーゼ（ＥＣ２．７．８．２）、
ＰＤＣＴ：ホスファチジルコリン：ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ、
ＰＬＣ：ホスホリパーゼＣ（ＥＣ３．１．４．３）、
ＰＬＤ：ホスホリパーゼＤ、コリンホスファターゼ、レシチナーゼＤ、リポホスホジエステラーゼＩＩ（ＥＣ３．１．４．４）、
ＰＤＡＴ：リン脂質：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ、又は同義語であるリン脂質：１，２－ジアシル－ｓｎ－グリセロールＯ－アシルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．１５８）、
ＦＡＤ２：脂肪酸Δ１２－デサチュラーゼ、
ＦＡＤ３、脂肪酸Δ１５－デサチュラーゼ、
ＵＤＰ－Ｇａｌ：ウリジン二リン酸ガラクトース。

【0203】

一般的技術と定義
特に別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、当該分野（例えば、細胞培養、発酵、分子遺伝学、タンパク質化学、肉以外の食物、及び生化学において）の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有するものと解釈されるものとする。

【0204】

他に指示がない限り、本発明で利用される組換えタンパク質、細胞培養、及び免疫学的技術は、当業者に公知の標準的な操作である。このような技術は、以下のような文献に記載及び説明されている：J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984), J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989), T.A. Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volumes 1 and 2, IRL Press (1991), D.M. Glover and B.D. Hames (editor), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995 and 1996), 及び F.M. Ausubel et al. (editor), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988, 現在までのすべての更新を含む), Ed Harlow and David Lane (editor) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988), 及び J.E. Coligan et al. (editor) Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons（現在までのすべての更新を含む）。

【0205】

用語「及び／又は」、例えば「Ｘ及び／又はＹ」は、「Ｘ及びＹ」又は「Ｘ又はＹ」のいずれかを意味すると理解され、両方の意味又はいずれかの意味を明示的に支持すると解釈されるものとする。
本明細書で使用される用語「約」は、別段の記載がない限り、指定された値の±１０％、より好ましくは±５％、より好ましくは±１％を指す。
本明細書全体を通して、「含む（comprise）」という単語、又は「含む（comprises）」又は「含む（comprising）」などの変形は、記載された要素、整数、若しくは工程、又は要素、整数、若しくは工程のグループの包含を意味するものと理解されるが、他の要素、整数、工程、あるいは要素、整数、工程のグループを除外するものではない。

【0206】

選択された定義
本明細書で使用される場合、「脂質」は、エステル化されていてもエステル化されていなくてもよい脂肪酸、又はそれらの誘導体であり、水には不溶であるが、有機溶媒、例えばクロロホルムには可溶である、脂肪酸であるか又はそれらを含む有機化合物のクラスのいずれかである。本明細書で使用される脂質には、非極性脂質、例えばトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、及びモノアシルグリセロール（ＭＡＧ）、並びにワックス、ワックスエステル、ステロールエステルが含まれ、及び極性脂質、例えば遊離脂肪酸（ＦＦＡ）、リン脂質、ガラクト脂質、セラミド、及び他のスフィンゴ脂質が含まれる。脂質は、主に炭素（Ｃ）と水素（Ｈ）及び若干の酸素（Ｏ）で構成され、リン（Ｐ）、窒素（Ｎ）、硫黄（Ｓ）も含まれる場合がある。本明細書で使用される用語「抽出された脂質」は、微生物細胞から抽出された脂質組成物を指す。抽出された脂質は、例えば、細胞を溶解することによって得られる比較的粗製の組成物でも、細胞由来の水、核酸、タンパク質、及び炭水化物の１つ又はそれ以上の又はそれぞれの、すべてではなくても、ほとんどが取り除かれているより精製された組成物であってもよい。精製方法の例を以下に記載する。１つの実施態様において、抽出された脂質は、組成物の重量の少なくとも約１０％（ｗ／ｗ）、少なくとも約２０％（ｗ／ｗ）、少なくとも約３０％（ｗ／ｗ）、少なくとも約４０％（ｗ／ｗ）、少なくとも約５０％（ｗ／ｗ）、少なくとも約６０％（ｗ／ｗ）、少なくとも約７０％（ｗ／ｗ）、少なくとも約８０％（ｗ／ｗ）、少なくとも約９０％（ｗ／ｗ）、又は少なくとも約９５％（ｗ／ｗ）の脂質を含む。実施態様において、抽出された脂質は、約１０重量％～９５重量％の脂質、例えば約１０重量％～約５０重量％、又は約５０重量％～９５重量％の脂質を含む。脂質は室温（２５℃）で固体又は液体、又はその２つの混合物でもよく、液体の場合は油と見なされ、固体の場合は脂肪と見なされる。１つの実施態様において、本発明の抽出された脂質は、別の供給源から生成された別の脂質、例えば動物脂質と混合されていない。あるいは、抽出された脂質を別の脂質とブレンドされていてもよい。

【0207】

本明細書で使用される用語「極性脂質」は、親水性の頭部基と１つ又はそれ以上の炭化水素鎖の疎水性尾部、例えば１つ又はそれ以上の脂肪アシル基、とを有する両新媒性脂質分子を指し、リン脂質（例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ジホスファチジルグリセロール）、ガラクト脂質、セファリン、スフィンゴ脂質（スフィンゴミエリン及びスフィンゴ糖脂質）、ホスファチジン酸、カルジオリピン、及びグリコグリセロ脂質を含む。親水性頭部基は、生理的ｐＨでは荷電又は非荷電の極性基であり、これらの脂質に両親媒性の性質を与える。極性脂質は、イオン化する能力及び／又は親水性頭部基を介して水分子と水素結合を形成する能力を有しており、これにより非極性脂質と比較して水溶解度が増加する。リン脂質は、脂肪酸、グリセロール、リン酸の主要な構造単位で構成されており、アミノアルコールを含む場合がある。これらは主に細胞内で構造脂質として機能し、植物、微生物、動物の膜の構造において重要な役割を果たしていると考えられている。極性脂質はその化学構造により双極性を示し、極性溶媒と非極性溶媒の両方に溶解性又は部分溶解性を示す。

【0208】

本明細書で使用される用語「リン脂質」は、炭化水素鎖の親水性の頭部基と、１つ（リゾホスファチジン酸の場合）又は２つの疎水性尾部とを有る脂肪酸を含む両親媒性分子であって、リン酸塩含有「頭部」基にエステル化されたグリセロール骨格と、疎水性尾部を提供する脂肪酸とを有する両親媒性分子を指す。リン酸基は、コリン、エタノールアミン、又はセリンなどの単純な有機分子と共有結合することができる。中性ｐＨでは頭部基が帯電しているため、リン脂質は極性脂質であり、クロロホルムなどの溶媒に加えてエタノールなどの溶媒にもある程度の溶解性を有する。リン脂質はすべての細胞膜の重要な構成要素である。これらは両親媒性の特徴により、脂質二重層を形成することができる。よく知られているリン脂質には、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジン酸（ＰＡ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、及びカルジオリピンが含まれる。

【0209】

本明細書で使用される用語「非極性脂質」は、１つ又はそれ以上の炭化水素基、例えば１つ又はそれ以上のアシル鎖の疎水性「尾部」を有するが、両親媒性分子ではなく、極性脂質が有する親水性の頭部基が欠如している脂質を指す。非極性脂質の脂肪酸はエステル化された形になっており、遊離（非エステル化）脂肪酸はここでは極性脂質と見なされる。エステル化された形態の例には、限定されるものではないが、トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、及びモノアシルグリセロール（ＭＡＧ）が含まれる。非極性脂質にはまた、ステロールエステルやワックスエステルも含まれる。非極性脂質は、生理学的ｐＨでは本質的に帯電していないため、「中性脂質」としても知られている。ＴＡＧやステロールエステルなどの非極性脂質は、空気－水、油－水界面で単分子層（単層）を形成しないため、水溶液には本質的に不溶である。対照的に、極性脂質は空気－水又は油－水界面で単層を形成することができ、水相ではミセル又は二重層を形成することができる。非極性脂質は、室温で液体であるか、又は非極性脂質中の脂肪酸の不飽和度に応じて固体の場合もある。典型的には、脂肪酸含有量の飽和度が高くなるほど、脂質の融解温度は高くなる。室温で液体である抽出された脂質を本明細書では「油」と呼ぶのに対し、室温で固体である抽出された脂質を本明細書では「脂肪」と呼ぶ。

【0210】

本明細書で使用される用語「脂肪酸」は、脂肪族炭化水素鎖と末端カルボキシル基とからなるカルボン酸を指す。炭化水素鎖は飽和でも不飽和でもよい。不飽和脂肪酸には、炭素－炭素二重結合を１つだけ有する一価不飽和脂肪酸と、少なくとも２つの炭素－炭素二重結合、典型的にはは２～６個の炭素－炭素二重結合を有する多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）が含まれる。脂肪酸は、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）であってもよく、又はグリセロール若しくはグリセロールリン酸分子、ＣｏＡ分子、若しくは当技術分野で知られている他の頭部基にエステル化されていてもよく、好ましくはリン脂質などの極性脂質の一部としてエステル化されている。

【0211】

本明細書で使用される用語「総脂肪酸（ＴＦＡ）含有量」又はその変形は、例えば抽出された脂質又は細胞中の重量ベースの脂肪酸の総量を指す。一例において、総脂肪酸含有量には、飽和脂肪酸（ＳＦＡ）の総飽和脂肪酸含有量、及び一価不飽和脂肪酸（ＭＵＦＡ）の総一価不飽和脂肪酸含有量が含まれる。ＴＦＡは、細胞又は他の画分の重量の百分率として、例えば、極性脂質の百分率として表すことができる。他に明記されない限り、細胞重量に関する重量は乾燥電池重量（ＤＣＷ）である。１つの実施態様において、ＴＦＡ含有量は、脂肪酸を脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）若しくは脂肪酸ブチルエステル（ＦＡＢＥ）に変換し、ＦＡＭＥ若しくはＦＡＢＥの量をＧＣによって測定することにより測定され、ＧＣでは、定量標準物質として既知量の独特の脂肪酸標準物質の添加が使用される。典型的には、Ｃ１０～Ｃ２４の範囲の脂肪酸のみを含む脂質の量及び脂肪酸組成がＦＡＭＥへの変換によって決定され、一方、Ｃ４～Ｃ１０の範囲の脂肪酸を含む脂質はＦＡＢＥへの変換によって決定される。従って、ＴＦＡは脂肪酸だけの重量を表し、脂質内の脂肪酸とそれに結合した部分の重量を表すのではない。

【0212】

「飽和脂肪酸」は、アシル鎖に沿った二重結合や他の官能基を含まない。用語「飽和された」は、すべての炭素（カルボン酸［－ＣＯＯＨ］基を除く）に可能な限り多くの水素が含まれている水素を指す。本発明の脂質における飽和脂肪酸の例には、ステアリン酸（Ｃ１８：０）、パルミチン酸（Ｃ１６：０）、ミリスチン酸（Ｃ１４：０）、アラキジン酸（Ｃ２０：０）、ベヘン酸（Ｃ２２：０）、及びリグノセリン酸（Ｃ２４：０）が含まれる。

【0213】

「不飽和脂肪酸」は、飽和脂肪酸と同様の形態をしているが、鎖に沿って１つ又はそれ以上のアルケン官能基が存在し、各アルケンが鎖の単結合「－ＣＨ２－ＣＨ２－」部分を二重結合した「－ＣＨ＝ＣＨ－」部分（すなわち、別の炭素に二重結合した炭素）で置換されている点を除く。二重結合のどちらかの側に結合している鎖内の隣の２つの炭素原子は、シス又はトランス配置で存在することができるが、シス配置が好ましい。

【0214】

本明細書で使用される用語「一価不飽和脂肪酸」は、その炭素鎖中に少なくとも１２個の炭素原子と、鎖中に１つだけのアルケン基（炭素－炭素二重結合）を含む脂肪酸を指す。一価不飽和脂肪酸には、Ｃ１２：１Δ９、Ｃ１４：１Δ９、Ｃ１６：１Δ９（パルミトレイン酸）、Ｃ１８：１Δ９（オレイン酸）、及びＣ１８：１Δ１１（バクセン酸）が含まれる。

【0215】

本明細書で使用される用語「多価不飽和脂肪酸」又は「ＰＵＦＡ」は、その炭素鎖に少なくとも１２個の炭素原子と、少なくとも２つのアルケン基（炭素－炭素二重結合）とを含む脂肪酸を指す。通常、脂肪酸の炭素鎖中の炭素原子の数は、分岐していない炭素鎖を指す。特に他に言及しない限りは、炭素鎖が分岐している場合、炭素原子数には側基の炭素原子は含まれない。本発明の極性脂質、例えば本発明の抽出物又は細胞は、脂肪酸のメチル末端から６番目の炭素－炭素結合に不飽和（炭素－炭素二重結合）を有する少なくとも１つのω６脂肪酸を含む。ω６脂肪酸の例には、限定されるものではないが、アラキドン酸（ＡＲＡ、Ｃ２０：４Δ５，８，１１，１４；ω６）、ジホモガンマリノレン酸（ＤＧＬＡ、Ｃ２０：３Δ８，１１，１４；ω６）、エイコサジエン酸（ＥＤＡ、Ｃ２０：２Δ１１，１４；ω６）、ドコサテトラエン酸（ＤＴＡ、Ｃ２２：４Δ７，１０，１３，１６；ω６）、ドコサペンタエン酸－ω６（ＤＰＡ－ω６、Ｃ２２：５Δ４，７，１０，１３，１６；ω６）、γ－リノレン酸（ＧＬＡ、Ｃ１８：３Δ６，９，１２；ω６）、及びリノール酸（ＬＡ、Ｃ１８：２Δ９，１２；ω６）が含まれる。いくつかの実施態様において、本発明の極性脂質、例えば本発明の抽出物又は細胞は、脂肪酸のメチル末端から３番目の炭素－炭素結合に不飽和（炭素－炭素二重結合）を有する少なくとも１つのω３脂肪酸を含む。いくつかの実施態様において、本発明の極性脂質、例えば本発明の抽出物又は細胞は、Ｃ１６：３ω３、ＡＬＡ、ＥＰＡ、及びＤＨＡのうちの１つ又はそれ以上などの特定のω３脂肪酸を含まないか、又はいずれのω３脂肪酸も含まない。ω３脂肪酸の例には、限定されるものではないが、α－リノレン酸（ＡＬＡ、Ｃ１８：３Δ９，１２，１５；ω３）、ヘキサデカトリエン酸（Ｃ１６：３ω３）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ、Ｃ２０：５Δ５，８，１１，１４，１７；ω３）、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ、Ｃ２２：５Δ７，１０，１３，１６，１９，ω３）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ、２２：６Δ４，７，１０，１３，１６，１９、ω３）、エイコサテトラエン酸（ＥＴＡ、Ｃ２０：４Δ８，１１，１４，１７；ω３）、及びエイコサトリエン酸（ＥＴｒＡ、Ｃ２０：３Δ１１，１４，１７；ω３）が含まれる。いくつかの実施態様において、本発明の極性脂質、例えば本発明の抽出物又は細胞は、以下のω３脂肪酸のうちの１つ又はそれ以上又はすべてを含まない：Ｃ１６：３ω３、ＥＰＡ、及びＤＨＡ。

【0216】

本明細書において使用される用語「Ｌ／Ｓ－ＳＦＡ比」は、１８個以上の炭素を有する飽和脂肪酸（例えば、ステアリン酸（Ｃ１８：０）、アラキジン酸（Ｃ２０：０）、ベヘン酸（Ｃ２２：０）、及びリグノセリン酸（Ｃ２４：０））の総量を、１６個以下の炭素を有する飽和脂肪酸（例えば、パルミチン酸（Ｃ１６：０）、ミリスチン酸（Ｃ１４：０）、ラリン酸（Ｃ：１２：０））の総量で割った値を指す。

【0217】

本明細書で使用される「Ｃ１２：０」はラウリン酸を指す。
本明細書で使用される「Ｃ１４：０」はミリスチン酸を指す。
本明細書で使用される「Ｃ１５：０」はｎ－ペンタデカン酸を指す。
本明細書で使用される「Ｃ１６：０」はパルミチン酸を指す。
本明細書で使用される「Ｃ１７：Δ１」はヘプタデセン酸を指す。
本明細書で使用される「Ｃ１６：１Δ９」とは、パルミトレイン酸又は－ヘキサデカ－９－エン酸を指す。
本明細書で使用される「Ｃ１８：０」はステアリン酸を指す。
本明細書で使用される「Ｃ１８：１Δ９」（時に「Ｃ１８：１」と略して呼ばれる）はオレイン酸を指す。
本明細書で使用される「Ｃ１８：１Δ１１」はバクセン酸を指す。
本明細書で使用される「Ｃ２０：０」はアラキジン酸としても知られているエイコサン酸を指す。
本明細書で使用される「Ｃ２０：１」はエイソコセン酸を指す。
本明細書で使用される「Ｃ２２：０」はベヘン酸としても知られているドコサン酸を指す。
本明細書で使用される「Ｃ２２：１」はエルカ酸を指す。
本明細書で使用される「Ｃ２４：０」はリグノセリン酸としても知られているテトラコサン酸を指す。

【0218】

「トリアシルグリセリド」又は「ＴＡＧ」は、グリセロールが、同じ（例えばトリオレインの場合のように）か又はより一般的には異なる３つの脂肪酸でエステル化されたグリセリドである。３つの脂肪酸がすべて異なる場合もあれば、２つの脂肪酸が同じで３番目が異なる場合もある。ＴＡＧ合成のケネディ経路では、以下に説明するようにＤＡＧが生成され、次に、ジグリセリドアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）の活性によって３番目のアシル基がグリセロール骨格にエステル化される。ＴＡＧは非極性脂質の一種である。ＴＡＧ分子内でエステル化された３つのアシル基は、ＴＡＧ分子のグリセロール主鎖内の位置を指し、ｓｎ－１、ｓｎ－２、及びｓｎ－３の位置でエステル化されていると呼ばれる。ｓｎ－１とｓｎ－３の位置は化学的には同一であるが、生化学的にはｓｎ－１とｓｎ－３の位置でエステル化されたアシル基は、別個の異なるアシルトランスフェラーゼ酵素がエステル化を触媒するという点で異なる。

【0219】

「ジアシルグリセリド」又は「ＤＡＧ」は、グリセロールが、同じか又は好ましくは異なる２つの脂肪酸でエステル化されたグリセリドである。本明細書で使用される場合、ＤＡＧは、ｓｎ－１、３又はｓｎ－２位にヒドロキシル基を含むため、ＤＡＧには、ＰＡ又はＰＣなどのリン酸化グリセロ脂質分子は含まれない。ＤＡＧ合成のケネディ経路では、ｓｎ－１位でグリセロール－３－リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＧＰＡＴ）によって触媒される最初の反応で、前駆体ｓｎ－グリセロール－３－リン酸（Ｇ３Ｐ）が２つのアシル基（それぞれ脂肪酸補酵素Ａエステルに由来する）にエステル化されてＬｙｓｏＰＡを生成され、続いてリゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）によって触媒されるｓｎ－２位の２回目のアシル化によってホスファチジン酸（ＰＡ）を生成される。次に、この中間体はＰＡＰによって脱リン酸化されてＤＡＧが生成される。

【0220】

本明細書で使用される「油」は、主に脂質を含み、室温で液体である組成物である。

【0221】

本明細書で使用される「油性」細胞又は微生物は、乾燥重量ベースでその細胞質量の少なくとも２０％、例えば２０％～７０％の脂質を貯蔵できるものである。当技術分野で知られているように、脂質含有量は培養条件に依存することがある。微生物が少なくとも１つの設定の培養条件下で、乾燥細胞重量基準で少なくとも２０％の脂質を合成し蓄積することができる限り、たとえ異なる条件下で脂質の蓄積が２０％未満でも、その微生物は油性細胞と見なされると理解される。本明細書で使用される「油性微生物に由来する微生物」は、１つ又はそれ以上の遺伝子改変によって前駆体油性微生物に由来する微生物である。油性微生物に由来する微生物は、それ自体が油性微生物であるか、又は２０％未満の脂質を産生し、油性微生物ではない可能性がある。遺伝子改変の少なくとも１つがヒトの介入によって導入されたものである限り、遺伝子改変はヒトの介入によって導入されたものであっても、自然に発生したものであってもよい。１つの実施態様において、誘導微生物を産生するための遺伝子改変は、ＴＡＧの合成及び／又は蓄積の減少をもたらす１つ又はそれ以上の遺伝子改変を含む。

【0222】

本明細書で使用される「従属栄養性」細胞は、代謝及び増殖のための炭素源として有機材料を利用できる細胞である。従属栄養生物もまた、適切な条件下で独立栄養的に増殖できる可能性がある。

【0223】

本明細書で使用される「発酵」とは、酸素が欠乏しているか、又は空気と比較して酸素レベルが低下している条件下で、細胞内の酵素の作用を介して有機分子に化学変化を引き起こす代謝プロセスを指す。

【0224】

本明細書で使用される用語「揮発性溶媒」は、容易に蒸発して、微生物細胞を破壊し分散させるために使用できる気体なる液体を指し、従って本発明の抽出された脂質中に存在する可能性がある。本発明の抽出された脂質中に存在し得る揮発性溶媒の例とには、限定されるものではないが、ヘキサン及び他のアルカン類、クロロホルム、エーテル、メタノール、エタノール、プロパノール、及びこれらのいずれか１つ又はそれ以上の混合物が挙げられる。

【0225】

本明細書で使用される用語「少なくとも１つの遺伝子改変が欠如した対応する微生物に由来する対応する抽出された微生物脂質」は、少なくとも１つの遺伝子改変を有する細胞から産生される脂質と同じ培養条件下で産生された脂質を指す。

【0226】

脂肪酸生合成
本発明は、飽和脂肪酸の産生を増加させるため、特に炭素数１８以上の長さの飽和脂肪酸の産生を増加させるための微生物細胞の遺伝子改変に関する。外因性ポリヌクレオチドの発現又は内因性遺伝子の改変のいずれかによって改変され得る遺伝子の詳細については、以下で論じられる。

【0227】

本明細書で使用される用語「脂肪酸アシルアシルトランスフェラーゼ」は、アシル－ＣｏＡ、ＰＣ、又はアシル－ＡＣＰ、好ましくはアシル－ＣｏＡ又はＰＣ由来のアシル基を、アシル基が転移される基質分子上に転移して、共有結合によってアシル基を基質分子に連結して、エステル結合を形成することができるタンパク質を指す。好ましい基質分子は、３－ホスホグリセロール、リゾホスファチジン酸、又はジアシルグリセロールであり、それぞれＭＡＧ、ＤＡＧ、又はＴＡＧを生成する。これらのアシルトランスフェラーゼには、ＤＧＡＴ、ＰＤＡＴ、ＭＧＡＴ、ＧＰＡＴ、ＬＰＡＡＴ、及びＬＰＣＡＴが含まれる。

【0228】

ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）
アシル－ＣｏＡ：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．２０）としても知られている本明細書で使用される用語「ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ」（ＤＧＡＴ）は、脂肪アシル基をアシル－ＣｏＡからＤＡＧ基質に転移してＴＡＧを生成する。従って、用語「ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性」は、ＴＡＧを生成するためのアシル－ＣｏＡからＤＡＧへのアシル基の転移を指す。ＤＧＡＴはまた、モノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＭＧＡＴ）活性も有するすることができるが、主にＤＧＡＴとして機能し、すなわち、酵素活性を生成物のｎｍｏｌ／分／タンパク質ｍｇの単位で表すと、ＭＧＡＴよりもＤＧＡＴとしての触媒活性が高くなる（例えば、Yen et al., 2005参照）。ＤＧＡＴはアシルＣｏＡ基質をアシル供与体として使用し、それをＤＡＧのｓｎ－３位に転移してＴＡＧを生成する。この酵素は、細胞の小胞体（ＥＲ）内、又は可溶性ＤＧＡＴ３の場合は細胞質内で、天然の状態で機能する。

【0229】

ＤＧＡＴには、ＤＧＡＴ１、ＤＧＡＴ２、及びＤＧＡＴ３と呼ばれる３つの既知のタイプがある。ＤＧＡＴの種類の多様性と関係は、Lung and Weselake (2006)及びTurchetto-Zolet et al. (2011 and 2016)の総説がある。ＤＧＡＴ１ポリペプチドは、多くの場合１０個の膜貫通ドメインを有する膜タンパク質であるが、６～９個の膜貫通ドメインしか持たない場合もある。これらはステロール：アシル－ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ（ＡＣＡＴ；ＥＣ２．３．１．２６）と配列相同性を示す。どちらの酵素も、膜結合型Ｏ－アシルトランスフェラーゼ（ＭＢＯＡＴ）タンパク質の大きなファミリーに属する。モルティエレラ・ラマニアナ（Mortierella rammanniana）(Lardizabal et al., 2001)で最初に同定されたＤＧＡＴ２ポリペプチドも膜タンパク質であるが、１個又は２個の膜貫通ドメインを有し、一方、ＤＧＡＴ３ポリペプチドは典型的には膜貫通ドメインを持たず、細胞質に可溶性であると考えられている。植物、動物、及び微生物源由来のＤＧＡＴ１ポリペプチドは、典型的には５１０～５５０個のアミノ酸残基を有し、一方、植物及び動物由来のＤＧＡＴ２ポリペプチドは、典型的には約３１０～３３０残基を有する。ＤＧＡＴ２は、酵母サッカロミセス・セレビシエなどのほとんどの微生物細胞においてＤＡＧからＴＡＧの生成に関与する主要な酵素であると考えられている。ＤＧＡＴ２ポリペプチドは、アミノ酸配列において、アシル－ＣｏＡ：モノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＭＧＡＴ、ＥＣ２．３．１．２２）、及びアシル－ＣｏＡワックス－アルコールアシルトランスフェラーゼ（ＡＷＡＴ、ＥＣ２．３．１．７５）に関連している、Turchetto-Zolet et al. (2011)。

【0230】

植物のＤＧＡＴ１とＤＧＡＴ２は、トリアシルグリセロール生合成において重複しない機能を有するようである。ＤＧＡＴ１は、種子発育中のＴＡＧ合成を担う主要な酵素である。ＤＧＡＴ１ポリペプチドの例には、 ＹＡＬＩ０Ｄ０７９８６ｇ遺伝子（ＤＧＡ２遺伝子としても知られている、配列番号５５）によってコードされるヤローウィア・リポリティカ、モルティエレラ・アルピナ（クサレケカビ）（ＡＱＸ３４６２６．１）、アスペルギルス・フミガツス（Aspergillus fumigatus）（ＸＰ＿７５５１７２．１）、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）（ＣＡＢ４４７７４．１）、トウゴマ（Ricinus communis）（ＡＡＲ１１４７９．１）、シナアブラギリ（Vernicia fordii）（ＡＢＣ９４４７２．１）、ベロニア・ガラメンシス（Vernonia galamensis）（ＡＢＶ２１９４５．１、及びＡＢＶ２１９４６．１）、ニシキギ（Euonymus alatus）（ＡＡＶ３１０８３．１）、ナンノクロロプシス・オセアニカ（Nannochloropsis oceanica）（Zienkiewicz et al., 2017）、サッカロミセス・セレビッシェ（Zulu et al., 2017）、カエノラブディティス・エレガンス(Caenorhabditis elegans)（ＡＡＦ８２４１０．１）、ドブネズミ（Rattus norvegicus）（ＮＰ＿４４５８８９．１）、ホモ・サピエンス（Homo sapiens）（ＮＰ＿０３６２１１．２）由来のＤＧＡＴ１タンパク質、並びにこれらの変種及び／又は変異体が含まれる。ＤＧＡＴ２ポリペプチドの例には、シロイヌナズナ（ＮＰ＿５６６９５２．１）、トウゴマ（ＡＡＹ１６３２４．１）、シナアブラギリ（ＡＢＣ９４４７４．１）、モルティエレラ・ラマニアナ（Mortierella ramanniana）（ＡＡＫ８４１７９．１）、ホモ・サピエンス（Ｑ９６ＰＤ７．２；Ｑ５８ＨＴ５．１）、ボス・タウルス（Bos taurus）（Ｑ７０ＶＺ８．１）、ハツカネズミ（Mus musculus）（ＡＡＫ８４１７５．１）由来のＤＧＡＴ２遺伝子によってコードされるタンパク質、並びにこれらの変種及び／又は変異体が含まれる。ＤＧＡＴ１及びＤＧＡＴ２のアミノ酸配列は、これらのアミノ酸配列においてほとんど相同性を示さない（Turchetto-Zolet et al., 2011, Turchetto-Zolet et al., 2016）。例えば、シロイヌナズナ（A. thaliana）のＤＧＡＴ２は、シロイヌナズナのＤＧＡＴ１と比較して、一価不飽和オレオイル－ＣｏＡよりも、アシル供与体として多価不飽和リノレオイル－ＣｏＡ、及びリノレノイル－ＣｏＡに対する優先性を有する。

【0231】

ＤＧＡＴ３ポリペプチドの例には、ピーナツ（Arachis hypogaea, Saha, et al., 2006）由来のＤＧＡＴ３遺伝子、並びにその変種及び／又は変異体によってコードされるタンパク質が挙げられる。ＤＧＡＴは、検出可能なＭＧＡＴ活性をほとんど又は全く持たず、例えば３００ｐｍｏｌ／分／ｍｇタンパク質未満、好ましくは２００ｐｍｏｌ／分／ｍｇタンパク質未満、より好ましくは１００ｐｍｏｌ／分／ｍｇタンパク質未満である。

【0232】

１つの実施態様において、ＤＧＡＴをコードする外因性ポリヌクレオチドは、以下の１つ又はそれ以上を含む：
ｉ）その配列が配列番号５３、５５、又は１１５～１２５のいずれか１つに記載されているアミノ酸を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド、
ｉｉ）配列番号５３、５５、又は１１５～１２５のいずれか１つ又はそれ以上と少なくとも３０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド、
ｉｉｉ）配列番号５２、５４、又は１４４～１５４のいずれか１つに記載の配列を有するヌクレオチド、
ｉｖ）配列番号５２、５４、又は１４４～１５４の１つ又はそれ以上と少なくとも３０％同一である配列を有するヌクレオチド、又は
ｖ）厳密性条件下で、ｉ）～ｉｖ）のいずれか１つ又はそれ以上にハイブリダイズするポリヌクレオチド。

【0233】

１つの実施態様において、ＤＧＡＴ１をコードする本発明の外因性ポリヌクレオチドは、以下の１つ又はそれ以上を含む：
ｉ）その配列が配列番号５５に記載されているアミノ酸を含むポリペプチド、若しくはその生物学的に活性な断片を、又はそのアミノ酸配列が配列番号５５と少なくとも３０％同一であるポリペプチドを、コードするヌクレオチド、
ｉｉ）その配列が、ｉ）と少なくとも３０％同一、少なくとも４０％同一、又は少なくとも９５％同一であるヌクレオチド、及び
ｉｉｉ）厳密性条件下でｉ）又はｉｉ）の一方又は両方にハイブリダイズするポリヌクレオチド。

【0234】

１つの実施態様において、ＤＧＡＴ２をコードする本発明の外因性ポリヌクレオチドは、以下の１つ又はそれ以上を含む：
ｉ）その配列が配列番号５３に記載されているアミノ酸を含むポリペプチド、若しくはその生物学的に活性な断片を、又はそのアミノ酸配列が配列番号５３と少なくとも３０％同一、少なくとも４０％同一、又は少なくとも９５％同一であるポリペプチドを、コードするヌクレオチド、
ｉｉ）その配列がｉ）と少なくとも３０％同一であるヌクレオチド、及び
ｉｉｉ）厳密性条件下でｉ）又はｉｉ）の一方又は両方にハイブリダイズするポリヌクレオチド。

【0235】

１つの実施態様において、ＤＧＡＴは、配列番号１１５又は配列番号１１６に提供される配列を有するアミノ酸を含まない。

【0236】

ＴｃＤＧＡＴ１ポリペプチド（配列番号１１５）は、ＤＧＡＴ１クラス（ＰＬＮ０２４０１）であり、www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/ から入手可能なソフトウェアによって９個の膜貫通ドメインを有すると予測される。これは、アミノ酸２６６～４８９にＭＢＯＡＴドメイン（ｐｆａｍ０３０６２）を有する。ＴｃＤＧＡＴ２ポリペプチド（配列番号１１６）はＤＧＡＴ２クラス（ＰＬＮ０２７８３）であり、２個の膜貫通ドメインを有することがソフトウェアによって予測される。これは、アミノ酸７４～３１８にＤＡＧＡＴドメイン（ｐｆａｍ０３９８２）を有する。ＴｃＤＧＡＴ３～８はすべて、同様にアシルトランスフェラーゼでもあるワックスエステルシンターゼ（ＷＥＳ、ｐｆａｍ０３００７）と相同性を有する。ＴｃＤＧＡＴ３（配列番号１１７）は、膜貫通ドメインを持たないと予測されるが、アミノ酸６４～２６８にＷＥＳドメインを有する。ＴｃＤＧＡＴ４（配列番号１１８）は、１個の膜貫通ドメインを有すると予測され、アミノ酸１２８～２７６にＷＥＳドメインを有する。ＴｃＤＧＡＴ５（配列番号１１９）は、１個の膜貫通ドメインを有すると予測され、アミノ酸１４６～３０３にＷＥＳドメインを有する。ＴｃＤＧＡＴ６（配列番号１２０）は、１個の膜貫通ドメインを有すると予測され、アミノ酸１０２～２９１にＷＥＳドメインを有する。ＴｃＤＧＡＴ７（配列番号１２１）は、膜貫通ドメインを有さないと予測され、同定されたＷＥＳドメインを持たない。ＴｃＤＧＡＴ８（配列番号１２２）は、１個の膜貫通ドメインを有すると予測され、アミノ酸３６～１７７にＷＥＳ縮合ドメイン（ｃｄ１９５３３）を有すると予測される。ＴｃＤＧＡＴ９～１１はすべて、ＰＤＡＴファミリーの酵母ＬＲＯ１（ＰＬＮ０２５１７）と相同性を有する。ＴｃＤＧＡＴ９（配列番号１２３）は、１個の膜貫通ドメインを有すると予測され、アミノ酸１３４～６３０にＬＣＡＴドメイン（ｐｆａｍ０２４５０）を有する。ＴｃＤＧＡＴ１０（配列番号１２４）は、膜貫通ドメインを持たないと予測されるが、アミノ酸１４８～６５１にＬＣＡＴドメイン（ｐｆａｍ０２４５０）を有する。ＴｃＤＧＡＴ１１（配列番号１２５）は、１個の膜貫通ドメインを有すると予測され、アミノ酸１５０～６４５にＬＣＡＴドメイン（ｐｆａｍ０２４５０）を有する。

【0237】

本明細書で使用される「ＤＧＡ１ポリペプチド」は、ワイ・リポリティカＤＧＡ１ポリペプチドのアミノ酸配列である配列番号５３の全長に沿って少なくとも３０％の配列同一性を有するポリペプチドである。本明細書で使用される機能的ＤＧＡ１ポリペプチドは、ＤＡＧとアシル－ＣｏＡからＴＡＧを生成することができるＤＧＡ１ポリペプチドである。多数のＤＧＡ１ポリペプチドが報告されており、配列はデータベースで入手可能であり、例えば、登録番号ＮＣ＿００１１４７．６（７９４０７６．．７９５３３２、相補体）、サッカロミセス・セレビッシェ 染色体ＸＶ、遺伝子ＹＯＲ２４５Ｃ；登録番号ＫＡＢＡ２＿０２Ｓ１４９８２、カタクスタニア・バルネッティ（Kazachstania barnettii）；登録番号ＮＣ＿０３０９８３．１染色体ＶＩＩＩ（５５２５９６．．５５３８５２、相補体）、サッカロミセス・ユーバヤヌス（Saccharomyces eubayanus）；登録番号ＮＣ＿００５７８４．３染色体ＩＩＩ（５９４１１７．．５９５５０２、相補体）、エレモテシウム・ゴシッピ（Eremothecium gossypii）などがある。本明細書で使用される「Yarrowia ＤＧＡ１ポリペプチド」は、配列番号５３の全長に沿って少なくとも９５％の配列同一性を有し、ＤＧＡＴ活性を有するポリペプチドである。配列番号５３の他に、ヤロウィアＤＧＡ１ポリペプチド配列の例には、登録番号：ＱＮＱ００８８５．１（５１３／５１４同一）；ＫＡＧ５３６５６９６．１（４９６／５１４同一）、及びＫＡＧ５３５７６２１．１（４９４／５１４同一）が含まれる。

【0238】

本明細書で使用される「ＤＧＡ２ポリペプチド」は、ワイ・リポリティカＤＧＡ２ポリペプチドのアミノ酸配列である配列番号５５の全長に沿って少なくとも３０％の配列同一性を有するポリペプチドである。本明細書で使用される機能的ＤＧＡ２ポリペプチドは、ＤＡＧとアシル－ＣｏＡからＴＡＧを生成することができるＤＧＡ２ポリペプチドである。多数のＤＧＡ２ポリペプチドが報告されており、配列はデータベースで入手可能である。本明細書で使用される「ヤロウィアＤＧＡ２ポリペプチド」は、配列番号５５の全長に沿って少なくとも９５％の配列同一性を有し、ＤＧＡＴ活性を有するポリペプチドである。配列番号５５の他に、Yarrowia ＤＧＡ２ポリペプチド配列の例には、登録番号：ＲＤＷ４２０２０．１（５２５／５２６同一）；ＲＤＷ４２０２０．１（５２５／５２６同一）；ＫＡＧ５３６１３８７．１（４９５／５２６同一）、及びＫＡＧ５３５８０６３．１（４９４／５２６同一）が含まれる。

【0239】

リン脂質：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＰＤＡＴ）
本明細書で使用される用語「リン脂質：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ」（ＰＤＡＴ；ＥＣ２．３．１．１５８）又はその同義語「リン脂質：１，２－ジアシル－ｓｎ－グリセロールＯ－アシルトランスフェラーゼ」は、リン脂質から、典型的にはＰＣのｓｎ－２位からＤＡＧのｓｎ－３位までアシル基を転移して、ＴＡＧとリゾホスホコリン（ＬＰＣ）を生成する。この反応はＤＧＡＴとは異なり、アシル供与体としてリン脂質を使用する。本発明の細胞にとって外因性又は内因性であり得るＰＤＡＴ１などのＰＤＡＴの発現の増加は、ＰＣからのＴＡＧの産生を増加させる。酵素ＬＰＣＡＴはＬＰＣを再アシル化してより多くのＰＣを生成し、ＰＤＡＴによるＴＡＧの継続的な生成を可能にする。植物細胞には、ＰＤＡＴ１、ＰＤＡＴ２、又はＰＤＡＴ３などのいくつかの形態のＰＤＡＴが存在する（Ghosal et al., 2007）。

【0240】

１つの実施態様において、ＰＤＡＴをコードする外因性ポリヌクレオチドは、以下の１つ又はそれ以上を含む：
ｉ）その配列が配列番号５７又は１３９～１４３のいずれか１つに記載されているアミノ酸を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド、
ｉｉ）配列番号５７又は１３９～１４３のいずれか１つ又はそれ以上と少なくとも３０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド、
ｉｉｉ）配列番号５６又は１６８～１７２のいずれか１つに記載の配列を有するヌクレオチド、
ｉｖ）配列番号５６又は１６８～１７２の１つ又はそれ以上と少なくとも３０％同一である配列を有するヌクレオチド、又は
ｖ）厳密性条件下で、ｉ）～ｉｖ）のいずれか１つ又はそれ以上にハイブリダイズするポリヌクレオチド。

【0241】

ただし、任意のＰＤＡＴコード遺伝子を使用することができる。微生物又は植物、真菌又は藻類の種に由来するＰＤＡＴの相同体及び天然に存在する変種は、本発明において容易に同定することができ使用することができる。１つの実施態様において、相同体又は変種は、列挙された配列番号又は登録番号のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一、好ましくは少なくとも９９％同一である。ＰＤＡＴは、本発明の微生物にとって外因性であっても内因性であってもよい。

【0242】

モノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＭＧＡＴ）
本明細書で使用される用語「モノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ」又は「ＭＧＡＴ」は、脂肪アシル基をアシル－ＣｏＡからＭＡＧ基質、例えばｓｎ－２ＭＡＧに転移してＤＡＧを生成するタンパク質を指す。従って用語「モノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性」は、少なくとも、ＤＡＧを生成するためのアシル－ＣｏＡからＭＡＧへのアシル基の転移を指す。本明細書で使用される用語「ＭＧＡＴ」は、ｓｎ－１／３ＭＡＧ及び／又はｓｎ－２ＭＡＧ基質に作用して、それぞれｓｎ－１，３ＤＡＧ及び／又はｓｎ－１，２／２，３－ＤＡＧを生成する酵素を含む。好ましい実施態様において、ＭＧＡＴはｓｎ－１ＭＡＧと比較してｓｎ－２ＭＡＧ基質に対する優先性を有するか、又は実質的にｓｎ－２ＭＡＧのみを基質として使用する。本明細書で使用されるＭＧＡＴは、ＭＡＧと比較してアシル基を優先的にＬｙｓｏＰＡに転移する酵素は含まず、そのような酵素はＬＰＡＡＴとして知られる。すなわちＭＧＡＴは、ＬｙｓｏＰＡに対する触媒活性が低い場合でも、非リン酸化モノアシル基質を優先的に使用する。好ましいＭＧＡＴは、ＬｙｓｏＰＡのアシル化において検出可能な活性を有さない。ＭＧＡＴはまた、ＤＧＡＴ機能も有する可能性があるが、主にＭＧＡＴとして機能し、すなわち、これは、酵素活性が生成物モル数／分／ｍｇタンパク質の単位で表される場合、ＤＧＡＴよりもＭＧＡＴとしての触媒活性が高くなる（Yene et al. 2002も参照）。ＭＧＡＴには３つの既知のクラスがあり、それぞれＭＧＡＴ１、ＭＧＡＴ２、及びＭＧＡＴ３と呼ばれる。ＭＧＡＴ１、ＭＧＡＴ２、及びＭＧＡＴ３ポリペプチドの例は、ＷＯ２０１３／０９６９９３に記載されている。

【0243】

ｓｎ－グリセロール－３－リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＧＰＡＴ）
ＡＣＰ又はＣｏＡにエステル化された脂肪酸からのグリセロ脂質合成における重要な構成要素の１つは、酵素ｓｎ－グリセロール－３－リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＧＰＡＴ）であり、これは非極性脂質の生合成に関与するポリペプチドの１つである。この酵素は次の反応を触媒する：Ｇ３Ｐ＋脂肪アシルＡＣＰ又は－ＣｏＡ→ＬＰＡ＋遊離－ＡＣＰ又は－ＣｏＡ。ＧＰＡＴ酵素には少なくとも３つの異なるタイプがあり、１つは天然のアシル基質としてアシル－ＡＣＰを使用する色素体間質に局在する可溶型、及びアシル－ＣｏＡとアシル－ＡＣＰをそれぞれ天然のアシル供与体として使用する、ＥＲ及びミトコンドリアに局在する２つの膜結合型である（Chen et al., 2011）。

【0244】

本明細書で使用される用語「グリセロール－３－リン酸アシルトランスフェラーゼ」（ＧＰＡＴ；ＥＣ２．３．１．１５）、及びその同義語「グリセロール－３－リン酸Ｏ－アシルトランスフェラーゼ」は、グリセロール－３－リン酸（Ｇ－３）をアシル化してＬｙｓｏＰＡ及び／又はＭＡＧを生成するタンパク質を指し、後者の生成物は、ＧＰＡＴがＬｙｓｏＰＡに対するホスファターゼ活性も有する場合に生成される。ＧＰＡＴがＥＲ型ＧＰＡＴ（「アシルＣｏＡ：ｓｎ－グリセロール－３－リン酸１－Ｏ－アシルトランスフェラーゼ」、「ミクロソームＧＰＡＴ」とも呼ばれる）である場合、転移されるアシル基はアシルＣｏＡからのものでありるか。又は、ＧＰＡＴが色素体型ＧＰＡＴの場合はアシルＡＣＰからのものである。従って用語「グリセロール－３－リン酸アシルトランスフェラーゼ活性」は、ＬｙｓｏＰＡ及び／又はＭＡＧを生成するためのＧ－３－Ｐのアシル化を指す。用語「ＧＰＡＴ」は、Ｇ－３－Ｐをアシル化してｓｎ－１ＬＰＡ及び／又はｓｎ－２ＬＰＡを生成する酵素を包含する。好ましくは細胞内で過剰発現され得るＧＰＡＴは、細胞のＥＲ内で機能する膜結合ＧＰＡＴであり、より好ましくはＧＰＡＴ９である。

【0245】

ＧＰＡＴファミリーは大きく、既知のメンバーはすべて、２つの保存されたドメインであるｐｌｓＣアシルトランスフェラーゼドメイン（ＰＦ０１５５３）及びＨＡＤ様ヒドロラーゼ（ＰＦ１２７１０）スーパーファミリードメインとその変種を含む。これに加えて、少なくともシロイヌナズナでは、サブクラスＧＰＡＴ４～ＧＰＡＴ８のＧＰＡＴはいずれもホスホセリンホスファターゼドメイン（ＰＦ００７０２）と相同的なＮ末端領域を含み、生成物としてＭＡＧを産生するＧＰＡＴは、このような相同領域の存在により同定することができる。

【0246】

シロイヌナズナ属ＧＰＡＴ４（登録番号ＮＰ＿１７１６６７．１）及びＧＰＡＴ６（ＮＰ＿１８１３４６．１）のホモログには、ＡＡＦ０２７８４．１（シロイヌナズナ）、ＡＡＬ３２５４４．１（シロイヌナズナ）、ＡＡＰ０３４１３．１（イネ（Oryza sativa））、ＡＢＫ２５３８１．１（Picea sitchensis）、ＡＣＮ３４５４６．１（トウモロコシ（Zea mays））、ＢＡＦ００７６２．１（シロイヌナズナ）、ＢＡＨ００９３３．１（イネ）、ＥＡＹ８４１８９．１（イネ）、ＥＡＹ９８２４５．１（イネ）、ＥＡＺ２１４８４．１（イネ）、ＥＥＣ７１８２６．１（イネ）、ＥＥＣ７６１３７．１（イネ）、ＥＥＥ５９８８２．１（イネ）、ＥＦＪ０８９６３．１（Selaginella moellendorffii）、ＥＦＪ１１２００．１（Selaginella moellendorffii）、ＮＰ＿００１０４４８３９．１（イネ）、ＮＰ＿００１０４５６６８．１（イネ）、ＮＰ＿００１１４７４４２．１（トウモロコシ）、ＮＰ＿００１１４９３０７．１（トウモロコシ）、ＮＰ＿００１１６８３５１．１（トウモロコシ）、ＡＦＨ０２７２４．１（セイヨウアブラナ（Brassica napus））、ＮＰ１９１９５０．２（シロイヌナズナ）、ＸＰ＿００１７６５００１．１（ヒメツリガネゴケ（Physcomitrella patens））、ＸＰ＿００１７６９６７１．１（ヒメツリガネゴケ）、（ヨーロッパブドウ（Vitis vinifera））、ＸＰ＿００２２７５３４８．１（ヨーロッパブドウ）、ＸＰ＿００２２７６０３２．１（Vitis vinifera）、ＸＰ＿００２２７９０９１．１（ヨーロッパブドウ）、ＸＰ＿００２３０９１２４．１（コットンウッド）、ＸＰ＿００２３０９２７６．１（コットンウッド）、ＸＰ＿００２３２２７５２．１（コットンウッド）、ＸＰ＿００２３２３５６３．１（コットンウッド）、ＸＰ＿００２４３９８８７．１（モロコシ（Sorghum bicolor））、ＸＰ＿００２４５８７８６．１（モロコシ）、ＸＰ＿００２４６３９１６．１（モロコシ）、ＸＰ＿００２４６４６３０．１（モロコシ）、ＸＰ＿００２５１１８７３．１（トウゴマ）、ＸＰ＿００２５１７４３８．１（トウゴマ）、ＸＰ＿００２５２０１７１．１（トウゴマ）、ＡＣＴ３２０３２．１（シナアブラギリ（Vernicia fordii））、ＮＰ＿００１０５１１８９．１（イネ）、ＡＦＨ０２７２５．１（セイヨウアブラナ（Brassica napus））、ＸＰ＿００２３２０１３８．１（コットンウッド）、ＸＰ＿００２４５１３７７．１（モロコシ）、ＸＰ＿００２５３１３５０．１（トウゴマ）、及びＸＰ＿００２８８９３６１．１（ミヤマハタザオ（Arabidopsis lyrata））が含まれる。

【0247】

可溶性色素体ＧＰＡＴが精製され、これらをコードする遺伝子が、いくつかの植物種から、例えば大豆（Pisum sativum、登録番号：Ｐ３０７０６．１）、ホウレンソウ（Spinacia oleracea、登録番号：Ｑ４３８６９．１）、カボチャ（Cucurbita moschate、登録番号：Ｐ１０３４９．１）、キュウリ（Cucumis sativus、登録番号：Ｑ３９６３９．１）、シロイヌナズナ（登録番号：Ｑ４３３０７．２）からクローニングされている。

【0248】

１つの実施態様において、ＧＰＡＴをコードする外因性ポリヌクレオチドは、以下の１つ又はそれ以上を含む：
ｉ）配列番号１２６～１３８のいずれか１つに記載の配列を有するアミノ酸を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド、
ｉｉ）配列番号１２６～１３８のいずれか１つ又はそれ以上と少なくとも３０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド、
ｉｉｉ）配列番号１５５～１６７のいずれか１つに記載の配列を有するヌクレオチド、
ｉｖ）配列番号１５５～１６７の１つ又はそれ以上と少なくとも３０％同一である配列を有するヌクレオチド、又は
ｖ）厳密性条件下で、ｉ）～ｉｖ）のいずれか１つ又はそれ以上にハイブリダイズするポリヌクレオチド。

【0249】

１－アシル－ｓｎ－グリセロリン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）
本明細書で使用される用語「リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ」（ＬＰＡＡＴ；ＥＣ２．３．１．５１）及びその同義語「１－アシル－グリセロール－３－リン酸アシルトランスフェラーゼ」、「アシル－ＣｏＡ：１－アシル－ｓｎ－グリセロール－３－リン酸２－Ｏ－アシルトランスフェラーゼ」、及び「１－アシルグリセロール－３－リン酸Ｏ－アシルトランスフェラーゼ」は、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）をアシル化してホスファチジン酸（ＰＡ）を生成するタンパク質を指す。転移されるアシル基は、ＬＰＡＡＴがＥＲ型ＬＰＡＡＴである場合にはアシル－ＣｏＡから、又はＬＰＡＡＴが色素体型ＬＰＡＡＴである場合にはアシル－ＡＣＰからのものである。従って、用語「リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ活性」は、ＬＰＡをアシル化してＰＡを生成することを指す。

【0250】

アシル－ＡＣＰチオエステラーゼ
本明細書で使用される用語「アシル－ＡＣＰチオエステラーゼ」は、アシル－アシルキャリアータンパク質（ＡＣＰ）基質（ＥＣ３．１．２．１４）のチオエステル結合を加水分解する酵素を指す。これらは、植物や他の真核生物の核遺伝子によってコードされる色素体を標的とする可溶性酵素である。アシル－ＡＣＰチオエステラーゼはＡＣＰ由来のアシル基を切断し、それにより脂肪酸合成が起きる色素体中の脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳ）による脂肪酸合成におけるアシル鎖伸長活性が停止する。この最終工程では、色素体内の遊離脂肪酸が放出され、続いて色素体から細胞質及び小胞体へ輸送されるアシル－ＣｏＡチオエステルに変換され、ＴＡＧ、他の中性脂質、及びリン脂質が生成される。脂肪アシルＡＣＰチオエステラーゼは、アミノ酸の整列（Martins-Noguerol et al. 2020）と活性に基づいて、２つの異なるが密接に関連しているクラスに分類され、すなわち、主にＣ１６及びより短いＳＦＡに対して特異性を有するＦＡＴＢアシル－ＡＣＰチオエステラーゼと、Ｃ１６－ＡＣＰ基質よりもＣ１８－ＡＣＰ基質に対してより活性があり、特にオレオイル－ＡＣＰなどのＭＵＦＡ－ＡＣＰ基質に対してより活性であるが、ステアロイル－ＡＣＰに対しても活性を有する可能性があるＦＡＴＡアシル－ＡＣＰチオエステラーゼである（Jones et al., 1995; Salas and Ohlrogge, 2002）。Hawkins and Kridl (1998) は、ＦＡＴＡクラスとＦＡＴＢクラスの両方の酵素のステアロイルＡＣＰに対する活性は限定的であるが、いずれもオレオイルＡＣＰと比較してその基質を優先しないことを報告した。しかし、より最近の報告（Ghosh et al., 2007）では、オレオイル－及びパルミトイル－ＡＣＰよりもステアロイル－ＡＣＰに対して特異性を有する マフア（mahua）（マフア・ラティフォリア（Madhuca latifolia）、登録番号ＡＡＸ５１６３７）及び ナンヨウアブラギリ（Jatropha curcas）（Dani et al., 2011; 登録番号ＡＣＴ０９３６６）由来のＦＡＴＢチオエステラーゼが同定された。本明細書で使用される「ＦＡＴＡポリペプチド」又は「ＦＡＴＡチオエステラーゼ」は、ＦＡＴＡクラスのアシル－ＡＣＰチオエステラーゼを指し、「ＦＡＴＢポリペプチド」又は「ＦＡＴＢチオエステラーゼ」は、ＦＡＴＢクラスのアシル－ＡＣＰチオエステラーゼを指す。

【0251】

トランスジェニック植物におけるＦＡＴＡポリペプチドの過剰発現は、場合によっては種子油中のステアリン酸レベルを増加させるが、他の場合には増加させない（Hawkins and Kridl, 1998）。

【0252】

Bhattacharjee et al., (2011) は、マンゴー（Mangifera indica）からのＦＡＴＡチオエステラーゼを同定し、これは、オレオイル－ＡＣＰ、ステアロイル－ＡＣＰ、パルミトイル－ＡＣＰに対してそれぞれ１００：３５：１．８の相対基質特異性を有した。本明細書に記載されるように、本発明者らは、熱帯植物マンゴスチン（Garcinia mangostana）から、ＧａｒｍＦＡＴＡ１（登録番号Ｕ９２８７６）及びＧａｒｍＦＡＴＡ２（Hawkins and Kridl, 1998）と命名される２つの関連するＦＡＴＡアシル－ＡＣＰチオエステラーゼを選択した。どちらのタンパク質も、タンパク質を色素体に導くように機能するＮ末端輸送ペプチド配列（ＴＰＳ）を有する。前者のポリペプチドはＴＰＳを含めて３５２個のアミノ酸を有し、一方、後者のポリペプチドはＴＰＳを含めて３５５個のアミノ酸を有する。ＧａｒｍＦＡＴＡ１とＧａｒｍＦＡＴＡ２のアミノ酸配列は、ＧａｒｍＦＡＴＡ１の全長に沿って７３％同一である。ＧａｒｍＦＡＴＡ１はＣ１８：１－ＡＣＰに対して最大の活性を示し、Ｃ１８：０－ＡＣＰに対しては約７分の１の活性があり、Ｃ１６：０－ＡＣＰに対しては再び活性が低く、オレオイル、ステアロイル－ＡＣＰ及びパルミトイル－ＡＣＰに対してそれぞれ１００：１５：６の相対活性を示した。対照的に、ＧａｒｍＦＡＴＡ２は、Ｃ１８：１－ＡＣＰと比較してＣ１８：０－ＡＣＰに対して５０分の１の活性を有した。従って、両方の酵素は、ＭＵＦＡ、Ｃ１８：１－ＡＣＰに対して主要な活性を有した。ＧａｒｍＦＡＴＡ１及びＧａｒｍＦＡＴＡ２のアミノ酸配列は、本明細書において配列番号８３及び配列番号８５として提供される。

【0253】

デサチュラーゼ
本明細書で使用される用語「デサチュラーゼ」は、典型的には例えばアシル－ＣｏＡエステルなどのエステル化された形態である脂肪酸基質のアシル基に、炭素－炭素二重結合を導入することができる酵素を指す。アシル基は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）などのリン脂質、又はアシルキャリアータンパク質（ＡＣＰ）、又は好ましくはＣｏＡにエステル化されてもよい。従って、これに応じてデサチュラーゼは一般に３つのグループに分類できる。１つの実施態様において、デサチュラーゼはフロントエンドデサチュラーゼである。

【0254】

本明細書で使用される用語「フロントエンドデサチュラーゼ」は、カルボキシル基と脂質のアシル鎖の既存の不飽和部分との間に二重結合を導入する酵素のクラスのメンバーを指し、これらは、３つの高度に保存されたヒスチジンボックスを含む典型的な脂肪酸デサチュラーゼドメインとともに、Ｎ末端シトクロムｂ５ドメインの存在により、構造的に特徴付けられる（Napier et al., 1997）。

【0255】

本明細書で使用される「Δ１２－デサチュラーゼ」とは、脂肪酸基質のカルボキシル末端から１第２の炭素－炭素結合に炭素－炭素二重結合を導入するデサチュラーゼ反応を実行できるタンパク質を指す。Δ１２－デサチュラーゼは典型的には、オレオイル－ホスファチジルコリン又はオレオイル－ＣｏＡを、それぞれリノレオイル－ホスファチジルコリン（Ｃ１８：１－ＰＣ）又はリノレオイル－ＣｏＡ（Ｃ１８：１－ＣｏＡ）に変換する。ＰＣ結合基質を使用するサブクラスはリン脂質依存性Δ１２－デサチュラーゼと呼ばれ、後者のサブクラスはアシルＣｏＡ依存性Δ１２－デサチュラーゼと呼ばれる。植物及び真菌のΔ１２－デサチュラーゼは一般に前者のサブクラスに属するが、動物のΔ１２－デサチュラーゼは、シー・エレガンス（C. elegans）などの下等動物のΔ１２－デサチュラーゼを除いて、一般に後者のサブクラスに属し、例えば、Zhou et al. (2008) によって昆虫からクローニングされた遺伝子によってコードされるΔ１２－デサチュラーゼである。他の多くのΔ１２－デサチュラーゼ配列は、配列データベースを検索することで簡単に特定できる。多数のデサチュラーゼをコードする遺伝子が真菌源から単離されている。米国特許第７，２１１，６５６号には、サプロレグニア・ジクリナ（Saprolegnia diclina）由来の１２デサチュラーゼが記載されている。ＷＯ２００９０１６２０２は、ヘロブデラ・ロブスタ（Helobdella robusta）、ラッカリア・ビカラー（Laccaria bicolor）、ナスビカサガイ（Lottia gigantea）、ミクロコレウス・クトノプラステス（Microcoleus chthonoplastes）、モノシガ・ブレビコリス（Monosiga brevicollis）、黒シガトカ病病原菌（Mycosphaerella fijiensis）、コムギ葉枯病菌（Mycospaerella graminicola）、ナエブレリア・グルベン（Naegleria gruben）、ピーマン立枯病菌（Nectria haematococca）、ネマステラ・ベクテンシス（Nematostella vectensis）、ヒゲカビ（Phycomyces blakesleeanus）、トリコデルマ・リーセイ（Trichoderma resii）、ヒメツリガネゴケ（Physcomitrella patens）、ポスチア・プラセンタ（Postia placenta）、イヌカタヒバ（Selaginella moellendorffii） 及びミクロドキュウム・ニバレ（Microdochium nivale）由来の真菌デサチュラーゼを記載している。ＷＯ２００５／０１２３１６には、タラシオシラ・シュードナナ（Thalassiosira pseudonana）、及び他の真菌由来の１２－デサチュラーゼが記載されている。ＷＯ２００３／０９９２１６には、アカパンカビ（Neurospora crassa）、アスペルギルス・ニデュランス(（Aspergillus nidulans）、ボトリティス菌（Botrytis cinerea）及びモルティエラ・アルピナ（クサレケカビ）から単離された真菌の１２－デサチュラーゼをコードする遺伝子が記載されている。

【0256】

他の遺伝子
上記酵素の発現の操作に加えて、微生物細胞の脂質における飽和脂肪酸の産生は、微生物の脂肪酸生合成、異化、及び調節に関与する１つ又はそれ以上の内因性遺伝子の発現を調節する遺伝子改変によって増強することができる。このような例示的な微生物遺伝子は表１に示される。

【0257】

いくつかの実施態様において、脂質中の飽和脂肪酸の産生を増加させる遺伝子改変は、表１の１つ又はそれ以上の遺伝子の発現及び／又は活性の増加をもたらす。いくつかの実施態様において、遺伝子改変は、脂肪酸合成遺伝子の発現及び／又は活性の増加をもたらす（例については表１を参照）。いくつかの実施態様において、遺伝子改変は、リン脂質合成遺伝子の発現及び／又は活性の増加をもたらす（例については表１を参照）。いくつかの実施態様において、遺伝子改変は、脂質合成調節遺伝子の発現及び／又は活性の増加をもたらす（例については表１を参照）。

【表1-1】

【表1-2】

【表1-3】

【表1-4】

【表1-5】

【表1-6】

【0258】

いくつかの実施態様において、脂質中の飽和脂肪酸の産生を増加させる遺伝子改変は、表１の１つ又はそれ以上の遺伝子の発現及び／又は活性を低減又は妨害する。いくつかの実施態様において、前記遺伝子改変は、脂質異化遺伝子の発現及び／又は活性を低減又は妨害する。（例については表１を参照）。

【0259】

微生物におけるリン脂質の合成
リン脂質は生体膜の主要な構造成分として、細胞の形態及び細胞小器官の機能において重要な役割を果たしており、一部は二次メッセンジャーとしても機能する。リン脂質は、リン酸頭部基と２つの脂肪酸にエステル化されたグリセロール主鎖を有する両親媒性分子である（図４）。中性ｐＨでは頭部基が帯電しているため、これらは極性脂質であり、クロロホルムなどの溶媒に加えてエタノールなどの溶媒にもある程度の溶解性を示す。エス・セレビッシェなどの真核微生物のリン脂質のグリセロリン酸主鎖にエステル化されている最も一般的な脂肪酸には、パルミチン酸（Ｃ１６：０）、パルミトレイン酸（Ｃ１６：１）、ステアリン酸（Ｃ１８：０）、及びオレイン酸（Ｃ１８：０）がある（Carman and Gil-Soo, 2011）。エス・セレビッシェの全細胞抽出物に含まれる主要なリン脂質は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、及びホスファチジルセリン（ＰＳ）である。ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）とカルジオリピン（ＣＬ）は、エス・セレビッシェ細胞抽出物全体では少量のリン脂質であるが、ミトコンドリア脂質の主要なリン脂質である（Zhang et al., 2014）。ワイ・リポリティカやシゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）などの他の酵母も同様のリン脂質構成を有する（Fernandez et al., 1986, Fakas 2017）。対照的に、大腸菌（Escherichia coli）などの原核生物のリン脂質組成は主にＰＥ、ＰＧ、及びＣＬで構成されており、これらのリン脂質は主に脂肪酸１６：０、１６：１、１８：１Δ１１を含んでいる（De Siervo,1969）。大腸菌（E. coli）や他の多くの細菌はＰＣが欠如している。

【0260】

微生物のリン脂質の合成に関与する酵素と対応する遺伝子は表１に示される。酵母のリン脂質の合成に関与する酵素と遺伝子は、エス・セレビッシェで詳細に特性解析されている（Carman and Zeimetz, 1996）。リン脂質の特異的な合成は、リン脂質ホスファチジン酸（ＰＡ）の合成から始まり、ＰＡは、アシルトランスフェラーゼ及びリゾリン脂質アシルトランスフェラーゼによって触媒される脂肪アシル補酵素Ａ（ＣｏＡ）依存性反応の後、グリセロール－３－リン酸又はジヒドロキシアセトンリン酸から生成される（Athenstaedt and Daum, 1997; Athenstaedt et al., 1999; Zheng and Zou 2001）。エス・セレビッシェのすべての主要なリン脂質クラスは、共通の前駆体であるシチジン二リン酸ジアシルグリセロール（ＣＤＰ－ＤＡＧ）から合成される。ＣＤＰ－ＤＡＧはＣＤＰ－ＤＡＧシンターゼによって触媒される反応で合成され、これは、ＣＤＰ供与体としてシチジン三リン酸（ＣＴＰ）を使用してＰＡをＣＤＰ－ＤＡＧに変換する（Carter and Kennedy, 1966; Shen et al., 1996）。ＣＤＰ－ＤＡＧは、他のすべての酵母と同様に、エス・セレビッシェの主要な及び少量のリン脂質すべてを合成するための重要な中間体である。ある反応では、ＣＤＰ－ＤＡＧはそのホスファチジル部分をイノシトールに供与して、ＰＩシンターゼによって触媒される反応でＰＩを生成する（Nikawa and Yamashita, 1984）。この反応で使用されるイノシトールは、イノシトール－３－リン酸シンターゼ（Klig and Henry, 1984; Dean-Johnson and Henry, 1989）及びイノシトール－３－リン酸ホスファターゼ（Murray and Greenberg, 2000）によって触媒される反応を介して、グルコース－６－リン酸から誘導することができる。ＰＩの合成に使用されるイノシトールは、イノシトール透過酵素によって培地中に外部から供給されたイノシトールからも利用できる。ＣＤＰ－ＤＡＧはまた、そのホスファチジル部分をグリセロール－３－リン酸に供与して、ＰＧＰシンターゼによって触媒される反応においてホスファチジルグリセロリン酸（ＰＧＰ）を生成することもできる（Chang et al., 1998a）。次に、ＰＧＰはＰＧＰホスファターゼによってに脱リン酸化されてＰＧになる（Osman et al., 2010）。カルジオリピン（ＣＬ）シンターゼは、ＰＧとＣＤＰ－ＤＡＧの別の分子の反応を触媒してＣＬを生成する（Chang et al., 1998b）。ＣＤＰ－ＤＡＧを利用する最後の酵素はＰＳシンターゼ（Letts et al., 1983）であり、これは、ＣＤＰ－ＤＡＧからＣＭＰをセリンで置換することによってＰＳの生成を触媒する（Kanfer and Kennedy, 1964）。次にＰＳはＰＳデカルボキシラーゼ酵素（Trotter et al., 1993）によって脱炭酸されてＰＥになる。次にＰＥは３工程のＳ－アデノシルメチオニン（ＡｄｏＭｅｔ）依存性メチル化反応によってＰＣに変換され、ここで、最初のメチル化反応はＰＥメチルトランスフェラーゼによって触媒され、そして最後の２つのメチル化反応は、リン脂質メチルトランスフェラーゼによって触媒される（Kodaki and Yamashita 1987）。

【0261】

ＰＥ及びＰＣはまた、ケネディ経路のＣＤＰ－エタノールアミン及びＣＤＰ－コリン分岐によって、外部から供給されたエタノールアミン及びコリンから合成することもできる。外部から供給されたエタノールアミンとコリンは、エタノールアミンキナーゼとコリンキナーゼによりＡＴＰを用いてリン酸化され、それぞれホスホエタノールアミンとホスホコリンを生成する（Kim et al., 1999; Hosaka et al., 1989）。次に、これらの中間体はＣＴＰで活性化され、ホスホエタノールアミンシチジリルトランスフェラーゼ、及びホスホコリンシチジリルトランスフェラーゼによって、それぞれＣＤＰ－エタノールアミン及びＣＤＰ－コリンを生成する（Min-Seok et al., 1996; Tsukagoshi et al., 1987）。次に、エタノールアミンホスホトランスフェラーゼとコリンホスホトランスフェラーゼは、ＤＡＧとの反応でＣＤＰ－エタノールアミンとＣＤＰ－コリンを変換し、ＰＥとＰＣを生成する（Hjelmstad and Bell 1988; Hjelmstad and Bell, 1991）。ＣＤＰ－ＤＡＧ、ＣＤＰ－エタノールアミン、及びＣＤＰ－コリンの合成に必要なＣＴＰは、ＣＴＰシンセターゼ酵素の作用によってＵＴＰから誘導される。ケネディ経路を介するＰＥ及びＰＣの合成に使用されるＤＡＧは、ＰＡＨ１にコードされたＰＡホスファターゼによるＰＡに由来する（Han et al., 2006）。ＰＡホスファターゼ反応で生成されたＤＡＧは、ＤＡＧキナーゼによってＰＡに戻されるか（Han et al., 2008a; Han et al., 2008b）、又はＤＧＡ１及びＬＲＯ１によってコードされるアシルトランスフェラーゼ酵素による中性脂質ＴＡＧの合成に使用される可能性がある。さらに、エルゴステロールエステルの合成に関与する追加のアシルトランスフェラーゼ酵素も、ＤＡＧをアシル化してＴＡＧを生成する可能性がある。

【0262】

ケネディ経路は、ＣＤＰ－ＤＡＧ経路の酵素が機能しないか欠損している場合、ＰＥ及びＰＣの合成において極めて重要な役割を果たす（Carman and Henry, 1999; Greenberg and Lopes, 1996）。例えば、ＰＥの３工程のメチル化が欠損した変異体は、成長のためにコリンの補給を必要とし、ケネディ経路のＣＤＰコリン分岐を介してＰＣを合成する。ＰＳ又はＰＥの合成が欠損している変異体は、それぞれエタノールアミン又はコリンが補充されるとＰＣを合成することができる。エタノールアミンは、ケネディ経路のＣＤＰ－エタノールアミン分岐を介してＰＥに取り込まれ、続いてＰＥがメチル化されてＰＣが生成される。ＣＤＰ－ＤＡＧ経路に欠陥のある変異体でも、短いアシル鎖を有するｌｙｓｏＰＥ、ｌｙｓｏＰＣ、又はＰＣが補充されると、ＰＥ又はＰＣを合成することができる。細胞に輸送されたＬｙｓｏＰＥ及びｌｙｓｏＰＣは、同じくｌｙｓｏＰＡを基質としても利用するリゾリン脂質アシルトランスフェラーゼによって、それぞれＰＥ及びＰＣにアシル化される。さらに、ＣＤＰ－コリン及びＣＤＰ－エタノールアミン分岐の両方に欠陥のあるケネディ経路変異体は、ＣＤＰ－ＤＡＧ経路によってのみＰＣを合成することができる。しかし、ＣＤＰ－ＤＡＧ経路変異体とは異なり、ケネディ経路変異体は栄養要求性を示さず、本質的に正常なリン脂質の相補体を有する。

【0263】

エタノールアミンとコリンの非存在下で細胞を増殖させる場合、ＣＤＰ－ＤＡＧ経路が主にＰＥとＰＣの合成に関与することを、証拠が裏付けている（Carman and Henry 1989）。しかしケネディ経路は、ＰＥ及びＰＣの前駆体が培地中に補充されていない場合、これらの合成に寄与する可能性がある。例えば、ＣＤＰ－ＤＡＧ経路によって合成されたＰＣは、ホスホリパーゼＤによって常にコリンとＰＡに加水分解される。次に、コリンはケネディ経路のＣＤＰコリン分岐を介してＰＣに戻され、そしてＰＡは中間体ＣＤＰ－ＤＡＧ及びＤＡＧを介して他のリン脂質に変換される。

【0264】

エス・セレビッシェのリン脂質合成、及び関与する遺伝子と酵素について上に示した詳細は、油性酵母ヤローウィア・リポリティカにも当てはまることが判明した。別の一般的な酵母であるエス・ポンベ（S. pombe）は、エス・セレビッシェの経路と非常によく似たＰＬ生合成経路を使用する。しかしながら、エス・ポンベとエス・セレビッシェには１つの大きな違いがある。エス・ポンベは天然のイノシトール栄養要求性物質であり、これは前駆体グルコース６－リン酸からＬ－ミオイノシトール３－リン酸を生成できないため、イノシトールの非存在下では増殖できない。その結果、エス・ポンベ細胞のＰＩ含有量は、増殖培地中のイノシトールの濃度に強く依存する。エス・ポンベのイノシトール要求性は、エス・セレビッシェ中のＩＮＯ１遺伝子によってコードされるイノシトール－３－リン酸シンターゼの欠如によるものであり、これは、エス・ポンベ中のピキア・パストリスのイノシトール－３－リン酸シンターゼの発現が、この天然のイノシトール栄養要求性物質をイノシトール原栄養物質に変換するという観察によって証明される。

【0265】

大腸菌やその他のグラム陰性菌のリン脂質は、内膜と外膜の構築に使用される。大腸菌はその膜に主要なリン脂質種を３つだけ保有しており、それは、リン脂質の大部分（７５％）を占めるＰＥと、残りのそれぞれ１５～２０％及び５～１０％を占めるＰＧ及びＣＬである。細菌のリン脂質合成は、グリセロール３－リン酸（Ｇ３Ｐ）のアシル化から始まり、リゾホスファチジン酸（ｌｙｓｏＰＡ）が生成される。この界面活性剤のような中間体は２回目のアシル化を受け、細菌のリン脂質の重要な前駆体であるホスファチジン酸（ＰＡ）を生成する。大腸菌の主要なＰＬは、エス・セレビッシェについて記載したように、ＣＤＰ－ＤＡＧ経路の酵素によってＰＡから合成される。要約すると、アシル転移モジュールはＰＡを膜に沈着させ、そこでＣＤＰ－ＤＡＧシンターゼによって活性化されてＣＤＰ－ＤＡＧになる。この中間体は、ＰＳシンターゼとＰＳデカルボキシラーゼ（Ｐｓｄ）によるＰＥ合成の両方に使用される。ＰＧは、ＰＧＰシンターゼによって同じ中間体から生成され、リン酸化された中間体はＰＧＰホスファターゼによって脱リン酸化される。最後に、ＣＬシンターゼによる２つのＰＧ分子の縮合によってＣＬが生成される。

【0266】

微生物細胞
本発明では、多種多様な異なる微生物細胞を使用することができる。１つの実施態様において、微生物細胞は単細胞生物として存在するが、そのような細胞は凝集する可能性がある。本発明の微生物細胞の例には、細菌細胞、及び真核細胞や藻類細胞などの真菌細胞が含まれる。真核微生物は細菌（原核）微生物よりも好ましい。本明細書において使用される用語「微生物細胞」、「微生物（microbe）」、及び「微生物（microorganism）」は同じものを意味する。

【0267】

１つの実施態様において、微生物細胞は発酵に適しているが、これらは周囲酸素濃度下で培養することもできる。別の実施態様において、微生物細胞は油性細胞、好ましくは油性真核微生物、又は好ましくは前駆体真核油性微生物などの前駆体油性微生物に由来する。別の実施態様において、微生物細胞は従属栄養性細胞、好ましくは従属栄養性真核微生物である。微生物細胞は、これらの特徴のうち少なくとも２つを有することが好ましく、より好ましくは、これらの特徴のすべてによって特徴づけられる。

【0268】

１つの実施態様において、本発明の細胞は酵母細胞である。本発明に有用な酵母細胞の例には、限定されるものではないが、Saccharomyces属、例えばサッカロミセス・セレビッシェ、Yarrowia属、例えばヤロウィア・リポリティカ、ピキア属、例えばピキア・パストリス、カンジダ（Candida）属、例えばカンジダ・ルゴサ（Candida rugosa）、アスペルギルス（Aspergillus）属、例えばアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、クリプトコッカス（Cryptococcus）属、例えばクリプトコッカス・クルバトゥス（Cryptococcus curvatus）、ロドスポリジウム（Rhodosporidium）属、例えばロドスポリジウム・トルロイデス（Rhodosporidium toruloides）、ロドトルラ（Rhodotorula）属、例えばロドトルラ・グルティニス（Rhodotorula glutinis）、及びトリコスポロン（Trichosporon）属、例えばトリコスポロン・ファーメンタンス（Trichosporon fermentans）が含まれる。

【0269】

１つの実施態様において、真菌細胞はカビ細胞である。本発明に有用なカビ細胞の例には、限定されるものではないが、クニンガメラ（Cunninghamella）属、例えばクニンガメラ・エチヌレート（Cunninghamella echinulate）、モルチエレラ（Mortierella）属、例えばモルチエレラ・イサベリナ（Mortierella isabellina）又はモルチエレラ・アルピナ（クサレケカビ）、ムコラーレス（Mucorales）属、例えばムコラーレス・フンギ（Mucorales fungi）、及びトリコデルマ（Trichoderma）属、例えばトリコデルマ・ハルジアナム（Trichoderma harzianum）が含まれる。

【0270】

１つの実施態様において、細胞は細菌細胞である。本発明に有用な細菌細胞の例には、アシネトバクター（Acinetobacter）、例えばアシネトバクター・ベイリィ（Acinetobacter Baylyi）、アルカニボラクス（Alcanivorax）属、例えばアルカニボラクス・ボルクメンシス（Alcanivorax borkumensis）、タイワンツバキ（Gordonia）属、例えばＤＧ、マイコバクテリウム（Mycobacterium）属、例えば結核菌（Mycobacterium tuberculosis）、ノカルジア（Nocardia）属、例えばノカルジア・グロベルラ（Nocardia globerula）、ロドコッカス（Rhodococcus）属、例えばロドコッカス・オパクス（Rhodococcus opacus）、及びストレプトミセス（Streptomyces）属、例えばストレプトミセス・セリカラー（Streptomyces coelicolor）が含まれる。

【0271】

１つの実施態様において、細胞は、微細藻類又は珪藻類（Bacillariophyceae）細胞などの藻類細胞である。本発明に有用な藻類細胞の例には、限定されるものではないが、以下が含まれる：プロトテカ（Prototheca）属、例えばプロトテカ・モリフォルミス（Prototheca moriformis）、スラウストキトリウム（Thraustochytrium）属、クロレラ（Chlorella）属。クロレラ・プロトセコイデス（Chlorella protothecoides）、クロレラ・ブルガリス（Chlorella vulgaris）又はクロレラ・エリプソイデア（Chlorella ellipsoidea）、シゾキトリウム（Schizochytrium）属、例えばシゾキトリウム（Schizochytrium）ＦＣＣ－１３２４株、ドナリエラ（Dunaliella）属、ヘマトコッカス（Haematococcus）属、例えばヘマトコッカス・プルビアリス（Haematococcus pluvialis）、ネオクロリス（Neochloris）属、例えばネオクロリス・オレブンダンス（Neochloris oleabundans）、例えばＵＴＥＸ＃１１８５株、シュードクロロコッカム（Pseudochlorococcum）属、セネデスムス（Scenedesmus）属、例えばセネデスムス・オブリキュス（Scenedesmus obliquus）、テトラセルミス（Tetraselmis）属、テトラセルミス・シュイ（Tetraselmis chui）又はテトラセルミス・テトラテレ（Tetraselmis tetrathele）、チェトセロス（Chaetoceros）属、例えばチェトセロス・カルシトランス（Chaetoceros calcitrans）、チェトセロス・グラシリス（Chaetoceros gracilis）又はチェトセロス・ムエレリ（Chaetoceros muelleri）、ニチェア（Nitzschia）属、例えばニチェアｃｆ．プシラ（Nitzschia cf. pusilla）、ファエオダクチルム（Phaeodactylum）属、例えばファエオダクチルム・トリコルヌツム（Phaeodactylum tricornutum）、スケルトネマ（Skeletonema）属、例えばＣＳ２５２株、タラシオシラ（Thalassiosira）属、例えばタラシオシラ・シュードナナ（Thalassiosira pseudonana）、クリプテコディニウム（Crypthecodinium）属、例えばクリプテコディニウム・コーニー（Crypthecodinium cohnii）、イソクリシス（Isochrysis）属、例えばイソクリシス・ジャンジャンゲンシス（Isochrysis zhangjiangensis）、ナンノクロロプシス（Nannochloropsis）属、ナンノクロロプシス・オキュラタ（Nannochloropsis oculata）、例えばＮＣＴＵ－３株、パブロバ（Pavlova）属、例えばパブロバ・サリナ（Pavlova salina）、ロドモナス（Rhodomonas）属、及びタラシオシラ（Thalassiosira）属、例えばタラシオシラ・ヴァイスフロギ（Thalassiosira weissflogii）。

【0272】

ポリペプチド
用語「ポリペプチド」と「タンパク質」は、一般的に同じ意味で使用される。
ポリペプチド又はポリペプチドのクラスは、参照アミノ酸配列に対するそのアミノ酸配列の同一性の程度（同一性％）によって、又は別の参照アミノ酸配列よりも、ある参照アミノ酸配列に対して高い同一性％を有することによって定義され得る。参照アミノ酸配列に対するポリペプチドの同一性％は、典型的には、ＧＡＰ分析（Needleman and Wunsch, 1970；ＧＣＧプログラム）によって、ギャップ生成ペナルティ＝５、及びギャップエクステンションペナルティ＝０．３のパラメーターを用いて決定される。クエリ配列は少なくとも１００アミノ酸の長さであり、ＧＡＰ分析では少なくとも１００アミノ酸の領域にわたって２つの配列が整列される。さらにより好ましくはクエリ配列は少なくとも２５０アミノ酸の長さであり、ＧＡＰ分析は少なくとも２５０アミノ酸の領域にわたって２つの配列が整列される。さらにより好ましくはＧＡＰ分析は、参照アミノ酸配列の全長にわたって２つの配列が整列される。ポリペプチド又はポリペプチドのクラスは、参照ポリペプチドと同じ酵素活性を有していてもよく、又は参照ポリペプチドとは異なる活性を有していてもよく、又は参照ポリペプチドの活性が欠如していてもよい。好ましくはポリペプチドは、参照ポリペプチドの活性の少なくとも１０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、又は少なくとも９０％の酵素活性を有する。

【0273】

本明細書で定義されるポリヌクレオチドは、アシルトランスフェラーゼ又はチオエステラーゼなどの酵素の生物学的に活性な断片をコードし得る。本明細書で使用される「生物学的に活性な」断片は、全長参照ポリペプチドの規定の活性、例えばアシルトランスフェラーゼ又はチオエステラーゼ活性又は他の酵素活性を保持する、本明細書で規定されるポリペプチドの一部である。本明細書で使用される生物学的に活性な断片には、全長ポリペプチドは含まれない。生物学的に活性な断片は、定義された活性を維持する限り、任意の大きさの部分であり得る。好ましくは、生物学的に活性な断片は全長タンパク質の活性の少なくとも１０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、又は少なくとも９０％を維持する。

【0274】

定義されたポリペプチド又は酵素に関して、本明細書で提供されるものよりも高い同一性％の数値が好ましい実施態様を包含することが理解されるであろう。従って、該当する場合、最小の同一性％数値を考慮すると、ポリペプチド／酵素は、関連する指名された配列番号と、少なくとも３５％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも４５％、より好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも５５％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも７６％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上、より好ましくは９９．１％以上、より好ましくは９９．２％以上、より好ましくは９９．３％以上％、より好ましくは少なくとも９９．４％、より好ましくは少なくとも９９．５％、より好ましくは少なくとも９９．６％、より好ましくは少なくとも９９．７％、より好ましくは少なくとも９９．８％、さらにより好ましくは少なくとも９９．９％同一であることが好ましい。１つの実施態様において、上に列挙した範囲のそれぞれについて、同一性％は１００％を含まず、すなわち、アミノ酸配列は指定された配列番号と異なる。

【0275】

本明細書で定義されるポリペプチドのアミノ酸配列変種／変異体は、本明細書で定義される核酸に適切なヌクレオチド変化を導入することによって、又は所望のポリペプチドのインビトロ合成によって調製され得る。このような変種／変異体には、例えば、アミノ酸配列内の残基の欠失、挿入、又は置換が含まれる。最終的なペプチド生成物が所望の酵素活性を有することを条件として、欠失、挿入、及び置換を組み合わせて最終構築体を得ることができる。

【0276】

変異体（改変された）ペプチドは、当技術分野で知られている任意の技術を使用して調製することができる。例えば、本明細書で定義されるポリヌクレオチドは、Harayama (1998)によって広く記載されているように、インビトロ突然変異誘発又はＤＮＡシャフリング技術に供され得る。変異／改変されたＤＮＡに由来する生成物は、本明細書に記載の技術を使用して容易にスクリーニングして、これらが、例えばアシルトランスフェラーゼ又はチオエステラーゼ活性を有するかどうかを決定することができる。

【0277】

アミノ酸配列変異体の設計において、変異部位の位置及び変異の性質は、改変される特性に依存する。変異の部位は、個別に又は連続して改変することができる。例えば、（１）最初に保存的アミノ酸の選択により、次に達成された結果に応じてより根本的な選択により置換する、（２）標的残基を削除する、又は（３）特定された部位に隣接して他の残基を挿入する。

【0278】

アミノ酸配列の欠失は、一般に約１～１５残基、より好ましくは約１～１０残基、典型的には約１～５の連続残基の範囲である。

【0279】

置換変異体は、ポリペプチド分子内の少なくとも１つのアミノ酸残基が除去され、その位置に別の残基が挿入される。置換突然変異誘発にとって最も重要な部位には、アシルトランスフェラーゼやチオエステラーゼなどの天然タンパク質内に保存されていない部位が含まれる。これらの部位は、酵素活性を維持するために比較的保存的な方法で置換されることが好ましい。このような保存的置換は表２の「例示的な置換」の見出しの下に示される。

【0280】

好ましい実施態様において、変異体／変種ポリペプチドは、天然に存在するポリペプチドと比較した場合、１つ又は２つ又は３つ又は４つだけ、又はそれ以下の保存的アミノ酸変化を有する。保存的アミノ酸変化の詳細は表２に示される。当業者であれば理解されるように、このような小さな変化は、組換え細胞で発現させた場合にポリペプチドの活性を変化させないことは合理的に予測することができる。

【表2】

【0281】

ポリヌクレオチド
本発明はまた、例えば遺伝子、単離されたポリヌクレオチド又はキメラＤＮＡなどのキメラ遺伝子構築体であり得るポリヌクレオチドの使用を提供する。これは、ゲノム起源又は合成起源の、二本鎖又は一本鎖のＤＮＡ又はＲＮＡであってもよく、本明細書で定義される特定の活性を実行するために炭水化物、脂質、タンパク質、又は他の物質と組み合わされてもよい。用語「ポリヌクレオチド」は、本明細書では用語「核酸分子」と互換的に使用される。

【0282】

１つの実施態様において、ポリヌクレオチドは天然には存在しない。天然に存在しないポリヌクレオチドの例には、限定されるものではないが、微生物細胞での発現のためにコドンが最適化されたもの、例えば本明細書に記載の方法を使用することにより変異されたもの、及びタンパク質をコードするオープンリーディングフレームが天然には結合していないプロモーター、すなわちオープンリーディングフレームに関して異種であるプロモーターに作動可能に連結されているポリヌクレオチドが含まれる。

【0283】

本明細書で使用される「キメラＤＮＡ」又は「キメラ遺伝子構築体」又は同様のものは、その本来の位置において本来のＤＮＡ分子ではない任意のＤＮＡ分子を指し、本明細書では「ＤＮＡ構築体」とも呼ばれる。典型的には、キメラＤＮＡ又はキメラ遺伝子は、自然界では作動可能に結合して見出されない、すなわち互いに異種である調節配列及び転写配列又はタンパク質コード配列を含む。従って、キメラＤＮＡ又はキメラ遺伝子は、異なる供給源に由来する制御配列及びコード配列、又は同じ供給源に由来するが自然界に見られるものとは異なる様式で配置された制御配列及びコード配列を含み得る。

【0284】

「内因性遺伝子」とは、生物のゲノム内の自然な位置にある天然遺伝子を指す。本明細書で使用される「組換え核酸分子」、「組換えポリヌクレオチド」、又はこれらの変形は、組換えＤＮＡ技術によって構築又は改変された核酸分子を指す。用語「外来ポリヌクレオチド」又は「外因性ポリヌクレオチド」又は「異種ポリヌクレオチド」などは、実験操作によって細胞のゲノムに導入された任意の核酸を指す。外来遺伝子又は外因性遺伝子は、非天然生物に挿入される遺伝子、天然宿主内の新しい位置に導入される天然遺伝子、又はキメラ遺伝子であり得る。「トランス遺伝子」は、形質変換操作によってゲノムに導入された遺伝子である。用語「遺伝子改変」、「遺伝子変形」、「トランスジェニック」、及びこれらの変形には、形質転換又は形質導入による細胞への遺伝子の導入、細胞内の遺伝子の変異、遺伝子の欠失、及びこれらの行為が行われた細胞又は生物、又はその子孫のゲノム内の遺伝的変化による遺伝子の制御の改変又は調節が含まれる。本明細書で使用される「ゲノム領域」とは、トランス遺伝子又はトランス遺伝子のグループ（本明細書ではクラスターとも呼ばれる）が細胞又はその祖先に挿入されたゲノム内の位置を指す。このような領域は、本明細書に記載の方法などのヒトの介入によって組み込まれたヌクレオチドのみを含む。

【0285】

ポリヌクレオチドの文脈における用語「外因性」は、本来の状態と比較して変化した量で細胞内に存在するときのポリヌクレオチドを指す。１つの実施態様において、細胞は、天然にはポリヌクレオチドを含まない細胞である。しかしながら、細胞は、コードされたポリペプチドの産生量の変化をもたらす非内因性ポリヌクレオチドを含む細胞であってもよい。外因性ポリヌクレオチドには、それが存在するトランスジェニック（組換え）細胞又は無細胞発現系の他の成分から分離されていないポリヌクレオチド、及びそのような細胞又は無細胞系で生成され、次に、少なくとも他の成分から精製され除去されるポリヌクレオチドが含まれる。外因性ポリヌクレオチド（核酸）は、自然界に存在するヌクレオチドの連続したストレッチであってもよいし、異なる供給源（天然、及び／又は合成）からのヌクレオチドの２つ以上の連続したストレッチを結合して単一のポリヌクレオチドを生成してもよい。典型的には、そのようなキメラポリヌクレオチドは、目的の細胞においてオープンリーディングフレームの転写を駆動するのに適したプロモーターに作動可能に連結されたポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを少なくとも含む。

【0286】

定義されたポリヌクレオチドに関して、上記で提供されたものよりも高い同一性％の数値が好ましい実施態様を包含することが理解されるであろう。すなわち、該当する場合、最小の同一性％数値を考慮すると、ポリヌクレオチドは、指定された配列番号と少なくとも３５％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも４５％、より好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも５５％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％、より好ましくは少なくとも９９．１％、より好ましくは少なくとも９９．２％、より好ましくは少なくとも９９．３％、より好ましくは少なくとも９９．４％、より好ましくは少なくとも９９．５％、より好ましくは少なくとも９９．６％、より好ましくは少なくとも９９．７％、より好ましくは少なくとも９９．８％、さらにより好ましくは少なくとも９９．９％同一であるのポリヌクレオチド配列を含むことが好ましい。１つの実施態様において、上に列挙した範囲のそれぞれについて、同一性％は１００％を含まず、すなわち、ヌクレオチド配列は指定された配列番号と異なる。

【0287】

ポリヌクレオチドは、天然に存在する分子と比較した場合、ヌクレオチド残基の欠失、挿入、又は置換である１つ又はそれ以上の変異を有する場合がある。参照配列と比較して変異を有するポリヌクレオチドは、天然に存在するもの（すなわち、天然源から単離されたもの）、又は合成されたもの（例えば、上記のように核酸に対して部位特異的突然変異誘発又はＤＮＡシャフリングを行うことによって）のいずれかであり得る。すなわち、ポリヌクレオチドが天然源由来のものであっても、組換え由来のものであってもよいことは明らかである。好ましいポリヌクレオチドは、当技術分野で知られているように、微生物細胞における翻訳のためにコドンが最適化されたコード領域を有するものである。

【0288】

組換えベクター
組換え発現を使用して、本発明の遺伝子改変微生物を産生することができる。組換えベクターは、異種ポリヌクレオチド配列、すなわち、好ましくはポリヌクレオチド分子が由来する種以外の種に由来する、本明細書で定義されるポリヌクレオチド分子に隣接して天然では見出されないポリヌクレオチド配列を含む。ベクターはＲＮＡ又はＤＮＡのいずれでもよく、典型的にははプラスミドである。プラスミドベクターには、典型的には、原核細胞における発現カセットの容易な選択、増幅、及び形質転換を可能にする追加の核酸配列、例えば、ｐＹＥＳ由来ベクター、ｐＵＣ由来ベクター、ｐＳＫ由来ベクター、ｐＧＥＭ由来ベクター、ｐＳＰ由来ベクター、又はｐＢＳ由来ベクターが含まれる。適切な酵母発現ベクターには、ｐＰＩＣシリーズのベクター、酵母組み込みプラスミド（ＹＩｐ）、酵母複製プラスミド（ＹＲｐ）、酵母セントロメアプラスミド（ＹＣｐ）、及び酵母エピソーマルプラスミド（ＹＥｐ）が含まれる。追加の核酸配列には、ベクターの自律複製を提供する複製開始点、好ましくは抗生物質又は除草剤耐性をコードする選択マーカー遺伝子、核酸構築体にコードされる核酸配列又は遺伝子を挿入するための複数の部位を提供する固有のマルチクローニング部位、及び微生物細胞の形質転換を促進する配列が含まれる。組換えベクターは、本明細書で定義される２つ以上のポリヌクレオチド、例えば本明細書で定義される３、４、５、又は６個のポリヌクレオチドの組み合わせ、好ましくは本明細書に記載のキメラ遺伝子構築体を含んでもよく、各ポリヌクレオチドは細胞内で作動可能な発現制御配列に作動可能に連結されている。

【0289】

本明細書で使用される「作動可能に連結された」とは、２つ以上の核酸（例えば、ＤＮＡ）セグメント間の機能的関係を指す。典型的には、それは転写調節要素（プロモーター）と転写された配列との機能的関係を指す。例えば、プロモーターは、適切な細胞におけるコード配列の転写を刺激又は調節する場合、本明細書で定義されるポリヌクレオチドなどのコード配列に作動可能に連結されている。一般に、転写配列に作動可能に連結されたプロモーター転写調節要素は、転写配列に物理的に隣接しており、すなわち、これらはシス作用性である。しかし、エンハンサーなどの一部の転写調節要素は、転写を増強するコード配列に物理的に隣接していることも、近接して配置されていることも必要ではない。例えば、５'ＵＴＲ配列内のイントロン、又はタンパク質コード領域の５'末端付近のイントロンには、発現レベルの増加をもたらす転写エンハンサー、例えばＦＢＡＩＮプロモーター領域が含まれる場合がある。

【0290】

形質転換体の同定を容易にするために、核酸構築体は、外来又は外因性ポリヌクレオチドとして、又はそれに加えて、選択可能な又はスクリーニング可能なマーカー遺伝子を含むことが望ましい。「マーカー遺伝子」とは、マーカー遺伝子を発現する細胞に異なる表現型を与え、従ってそのような形質転換細胞をマーカーを持たない細胞から区別できるようにする遺伝子を意味する。選択可能なマーカー遺伝子は、選択薬剤（例えば、除草剤、抗生物質、放射線、熱、又は非形質転換細胞に損傷を与える他の処理）に対する耐性に基づいて「選択」できる形質を与える。スクリーニング可能なマーカー遺伝子（又はレポーター遺伝子）は、（例えば、非形質転換細胞には存在しないβ－グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、ＧＦＰ又は他の酵素活性を）観察又は試験、すなわち「スクリーニング」することによって同定できる形質を与える。マーカー遺伝子と目的の塩基配列は連結されている必要はない。選択した細胞と組み合わせてマーカーが機能する（すなわち選択的）限り、実際のマーカーの選択は重要ではない。

【0291】

選択可能なマーカーの例は、抗生物質耐性、例えばヒグロマイシン、ヌルセオスリシン、アンピシリン、エリスロマイシン、クロラムフェニコール、又はテトラサイクリン耐性を、好ましくはヒグロマイシン又はカナマイシン耐性を、与えるマーカーである。

【0292】

本発明の組換え酵母は、ガラクトシダーゼ又は選択可能な増殖マーカーのいずれかをコードするレポーター遺伝子を含み得る。

【0293】

「ガラクトシダーゼ」は、様々な基質から末端ガラクトース残基を切断し、また基質を切断して検出可能なシグナルを生成することができる任意の酵素であり得る。１つの実施態様において、ガラクトシダーゼは、細菌性（例えば大腸菌由来）ＬａｃＺなどのβ－ガラクトシダーゼである。別の実施態様において、ガラクトシダーゼは、酵母（例えばエス・セレビッシェ）Ｍｅｌ－１などのβ－ガラクトシダーゼである。β－ガラクトシダーゼ活性は、切断後に濃い青色の生成物を生成するＸ－ｇａｌ（５－ブロモ－４－クロロインドリル－β－Ｄ－ガラクトピラノシド）、切断後に約４２０ｎｍで最大吸光度を有する水溶性黄色色素を生成するＯＮＰＧ（ｏ－ニトロフェニルガラクトシド）、及び切断後に分光測光法で測定可能な水溶性赤色生成物を生成するＣＰＲＧ（クロロフェノールレッド－β－Ｄ－ガラクトピラノシド）などの酵素の基質を使用して検出することができる。α－ガラクトシダーゼ活性は、切断後にインジゴ色素を生成するｏ－ニトロフェニル－Ｄ－ガラクトピラノシドや、切断後に分光光度法で測定可能な赤色の水溶性生成物を生成するクロロフェノールレッド－α－Ｄ－ガラクトピラノシドなどの、酵素の基質を使用して検出することができる。酵母におけるガラクトシダーゼ発現を検出するためのキットは市販されており、例えば、Thermo Scientificのβ－ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）発現キットがある。

【0294】

好ましくは選択可能な増殖マーカーは、栄養マーカー又は抗生物質耐性マーカーである。

【0295】

典型的な酵母選択可能な栄養マーカーには、限定されるものではないが、ＬＥＵ２、ＴＲＰ１、ＨＩＳ３、ＨＩＳ４、ＵＲＡ３、ＵＲＡ５、ＳＦＡ１、ＡＤＥ２、ＭＥＴ１５、ＬＹＳ５、ＬＹＳ２、ＩＬＶ２、ＦＢＡ１、ＰＳＥ１、ＰＤＩ１、及びＰＧＫ１が含まれる。当業者であれば、染色体の欠失又は不活性化により宿主が生存できなくなる任意の遺伝子、いわゆる必須遺伝子は、ｐｇｋ１酵母株のＰＧＫ１について証明されているように、機能的遺伝子が例えばプラスミド上に提供されている場合、選択マーカーとして使用できることを理解するであろう。適切な必須遺伝子は、スタンフォードゲノムデータベース（Stanford Genome Database：SGD）（http:://db.yeastgenome.org）内で見つけることができる。欠失又は不活性化されている場合、栄養（生合成）要求性をもたらさない必須遺伝子産物（例えば、ＰＤＩ１、ＰＳＥ１、ＰＧＫ１、又はＦＢＡ１）は、プラスミドの非存在下では、遺伝子産物を産生して、特定の選択条件下で細胞を培養する必要があるという欠点を伴うことなくプラスミドの安定性を向上することができない酵母宿主細胞中のプラスミド上の選択マーカーとして使用することができる。「栄養要求性（生合成）要件」には、増殖培地への添加又は改変によって補うことができる欠乏が含まれる。

【0296】

発現
発現ベクターは、微生物細胞における遺伝子発現を指令することができる。本明細書で使用される発現ベクターは、宿主細胞を形質転換することができ、１つ又はそれ以上の特定のポリヌクレオチド分子の発現をもたらすことができるベクターである。本発明に有用な発現ベクターは、転写制御配列、翻訳制御配列、複製開始点などの制御配列、及び組換え細胞と適合し、本発明のポリヌクレオチド分子の発現を制御する他の制御配列を含む。特に、本発明に有用なポリヌクレオチド又はベクターには、転写制御配列が含まれる。転写制御配列とは、転写の開始、伸長、終止を制御する配列である。特に重要な転写制御配列は、プロモーター配列やエンハンサー配列などの転写開始を制御する配列である。適切な転写制御配列には、本発明の組換え細胞の少なくとも１つにおいて機能し得る任意の転写制御配列が含まれる。使用される調節配列の選択は、標的微生物細胞に応じて異なる。様々なそのような転写制御配列が当業者に知られている。

【0297】

酵母細胞は、典型的には化学的方法によって形質転換される（例えば、Rose et al., 1990, Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. , 及び Kawai et al., 2010 に記載されている）。典型的には、細胞は酢酸リチウムで処理されて、約１０^４ コロニー形成単位（形質転換細胞）／μｇ ＤＮＡの形質転換効率を達成する。酵母を形質転換するためのその他の標準操作には、ｉ）名前が示唆するように、酵母スフェロプラストの生成に依存するスフェロプラスト法、ｉｉ）ＤＮＡでコーティングされた金属微粒子を細胞内に打ち込む銃弾法、及びｉｉｉ）ガラスビーズと細胞に送達されるＤＮＡとによる酵母細胞の撹拌に依存しているガラスビーズ法が含まれる。もちろん、酵母細胞に核酸を導入する任意の適切な手段を使用することができる。

【0298】

酵母などの生物を外因性プラスミドで形質転換すると、コピー数やその他の要因の違いにより、形質転換された遺伝子の浸透度にクローンの違いが生じる可能性があることはよく知られている。従って、各形質転換受容体について２つ以上の独立したクローン分離株をスクリーニングして、スクリーニング中に適切な受容体＝リガンド対を同定する可能性を最大化することが推奨される。異なるクローン分離株を個別にスクリーニングすることも、スクリーニング用に単一のウェルに組み合わせてスクリーニングすることもできる。後者のオプションは、比色レポーターではなく栄養レポーターが使用される場合に特に便利である。

【0299】

「構成的プロモーター」とは、特定の増殖条件によって誘導される必要性なしで、細胞内で作動可能に連結された転写配列の発現を指令するプロモーターを指す。本発明の酵母細胞に有用な構成的プロモーターの例には、限定されるものではないが、酵母ＰＧＫ（ホスホグリセリン酸キナーゼ）プロモーター、酵母ＡＤＨ－１（アルコール脱水素酵素）プロモーター、酵母ＥＮＯ（エノラーゼ）プロモーター、酵母グリセルアルデヒド３－リン酸脱水素酵素プロモーター（ＧＰＤ）プロモーター、酵母ＰＹＫ－１（ピルビン酸キナーゼ）プロモーター、酵母翻訳－伸長因子１－アルファプロモーター（ＴＥＦ）プロモーター、及び酵母ＣＹＣ－１（サイトクロームｃ－オキシダーゼプロモーター）プロモーターが含まれる。好ましい実施態様において、酵母プロモーターはエス・セレビッシェプロモーターである。別の実施態様において、構成的プロモーターは酵母に由来していなくてもよい。本発明に有用なそのようなプロモーターの例には、限定されるものではないが、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター、糖質コルチコイド応答要素、及びアンドロゲン応答要素が含まれる。構成的プロモーターは、天然に存在する分子、又は例えばプロモーター機能を消失させない（好ましくは増強しない）１、２、又は３個のヌクレオチド置換を含むその変種であり得る。

【0300】

組換えＤＮＡ技術は、例えば、宿主細胞内のポリヌクレオチド分子のコピー数、これらのポリヌクレオチド分子が転写される効率、得られる転写物が翻訳される効率、及び翻訳後改変の効率を操作することによって、形質転換されたポリヌクレオチド分子の発現を改善するために使用することができる。本明細書で定義されるポリヌクレオチド分子の発現を増加させるために有用な組換え技術には、限定されるものではないが、１つ又はそれ以上の宿主細胞染色体へのポリヌクレオチド分子の組み込み、ｍＲＮＡへの安定性配列の付加、転写制御シグナル（例えば、プロモーター、オペレーター、エンハンサー）の置換又は改変、翻訳制御シグナル（例えば、リボソーム結合部位、シャインダルガルノ配列）の置換又は改変、宿主細胞のコドン使用に対応するポリヌクレオチド分子の改変、及び転写物を不安定化する配列の欠失が含まれる。

【0301】

その他の遺伝子改変技術
核酸分子を微生物細胞に導入するのに、任意の方法を使用することができ、多くのそのような方法がよく知られている。例えば、形質転換及び電気穿孔法は、酵母細胞に核酸を導入するための一般的な方法である（例えば、Gietz et al., 1992; Ito et al., 1983; Becker et al., 1991を参照）。

【0302】

１つの実施態様において、微生物細胞内の特定の染色体部位への目的の遺伝子の組み込みは、相同組換えを介して起きる。この実施態様によれば、少なくとも１つのマーカー遺伝子及び／又は組み込まれる遺伝子を含むモジュール（内部モジュール）を含む組み込みカセットは、標的組み込み部位（組換え誘導配列）の末端のＤＮＡ断片と相同的なＤＮＡ断片によって両側に隣接される。適切な方法によりカセットを用いて微生物細胞を形質転換した後、組換え誘導配列間の相同組換えにより、組込みカセットの組換え配列に対応するゲノムの２つの部位間の染色体領域が内部モジュールで置換される可能性がある（Orr-Weaver et al., 1981）。

【0303】

１つの実施態様において、微生物細胞への目的遺伝子の組込みのための組込みカセットは、微生物細胞染色体への異種遺伝子の組込みのための組換え誘導配列が隣接する選択マーカーとともに、適切なプロモーターの制御下にある異種遺伝子を含む。１つの実施態様において、異種遺伝子には、本明細書に記載の脂肪酸生合成遺伝子のいずれかが含まれる。

【0304】

内因性遺伝子の欠失が望ましい場合、組込みカセットは、欠失の標的とされる内因性遺伝子の末端（及び／又は隣接する配列）のＤＮＡ断片と相同的なＤＮＡ断片が隣接する選択マーカー（他の異種遺伝子配列を含まない）を含むことができる。内因性遺伝子の欠失又は変異に適した他の方法（例えば、部位特異的ヌクレアーゼ又はＲＮＡ誘導性ヌクレアーゼを使用して）を以下に記載する。
選択可能なマーカー遺伝子は、微生物細胞で使用される任意のマーカー遺伝子であり得、限定されるものではないが、ＨＩＳ３、ＴＲＰ１、ＬＥＵ２、ＵＲＡ３、ｂａｒ、ｂｌｅ、ｈｐｈ、及びｋａｎを含む。組換え配列は、所望の用途に適した所望の組み込み部位に応じて、自由に選択することができる。

【0305】

別の実施態様において、微生物細胞の染色体への遺伝子の組み込みは、ランダムな組み込みを介して起こり得る（Kooistra et al., 2004）。
さらに、１つの実施態様において、特定の導入されたマーカー遺伝子は、当業者に公知の技術を使用してゲノムから除去される。例えば、ＵＲＡ３マーカーの消失は、ＵＲＡ３含有細胞をＦＯＡ（５－フルオロオロチン酸）含有培地にプレーティングし、ＦＯＡ耐性コロニーを選択することによって得ることができる（Boeke et al., 1984）。

【0306】

本開示の微生物細胞内に含まれる外因性核酸分子は、その細胞内で任意の形態で維持され得る。例えば、外因性核酸分子は、細胞のゲノムに組み込まれることも、娘細胞に安定して受け継がれる（「遺伝」する）ことができるエピソーム状態に維持されることもできる。このような染色体外遺伝要素（例えば、プラスミド、ミトコンドリアゲノム）は、娘細胞におけるそのような遺伝要素の存在を保証する選択マーカーをさらに含む場合がある。さらに、微生物細胞は安定的に形質転換することも、一過性に形質転換することもできる。さらに、本明細書に記載の微生物細胞は、上記のような特定の外因性核酸分子の単一コピー又は複数コピーを含むことができる。

【0307】

部位特異的ヌクレアーゼを使用するゲノム編集
ゲノム編集は、非特異的ＤＮＡ切断モジュールに融合した配列特異的ＤＮＡ結合ドメインで構成される人工ヌクレアーゼを使用する。これらのキメラヌクレアーゼは、細胞の内因性細胞ＤＮＡ修復機構を刺激する標的ＤＮＡ二本鎖切断を誘導して、誘導された切断を修復することにより、効率的かつ正確な遺伝子改変（欠失、変異、挿入を含む）を可能にする。このような機構には、例えば、誤りが起こりやすい非相同末端結合（ＮＨＥＪ）及び相同性指向修復（ＨＤＲ）が含まれる。

【0308】

伸長された相同性アームを有するドナープラスミドの存在下で、ＨＤＲは、既存の遺伝子を修正又は置換する単一又は複数のトランス遺伝子の導入をもたらすことができる。ドナープラスミドが存在しない場合、ＮＨＥＪ媒介修復により、遺伝子破壊を引き起こす標的の小さな挿入又は欠失変異が生じる。

【0309】

本発明の方法において有用な人工ヌクレアーゼには、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）及び転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）が含まれる。

【0310】

典型的には、ヌクレアーゼにコードされた遺伝子は、プラスミドＤＮＡ、ウイルスベクター、又はインビトロで転写されたｍＲＮＡによって細胞に送達される。蛍光代替レポーターベクターの使用により、ＺＦＮ、及びＴＡＬＥＮ改変細胞の濃縮も可能になる。ＺＦＮ遺伝子送達システムの代替として、細胞膜を通過して内因性遺伝子破壊を誘導できる精製ＺＦＮタンパク質と細胞を接触させることができる。

【0311】

亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、ＤＮＡ結合ドメインとＤＮＡ切断ドメインを含み、ＤＮＡ結合ドメインは少なくとも１つの亜鉛フィンガーからなり、ＤＮＡ切断ドメインに作動可能に連結されている。亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインはタンパク質のＮ末端に位置し、ＤＮＡ切断ドメインは前記タンパク質のＣ末端に位置する。

【0312】

ＺＦＮには少なくとも１つの亜鉛フィンガーが必要である。好ましい実施態様において、ＺＦＮは、宿主細胞における標的遺伝子組換えに有用な十分な特異性を有するために、少なくとも３つの亜鉛フィンガーを有するであろう。一般に、３つを超える亜鉛フィンガーを有するＺＦＮは、１つの亜鉛フィンガーが追加されるたびに、特異性が徐々に大きくなるであろう。

【0313】

亜鉛フィンガードメインは、任意のクラス又はタイプの亜鉛フィンガーに由来することができる。特定の実施態様において、亜鉛フィンガードメインは、例えば亜鉛フィンガー転写因子ＴＦＩＩＩＡ又はＳｐ１によって非常に一般的に表される亜鉛フィンガーのＣｉｓ_２Ｈｉｓ_２タイプを含む。好ましい実施態様において、亜鉛フィンガードメインは、３つのＣｉｓ_２Ｈｉｓ_２型亜鉛フィンガーを含む。ＺＦＮのＤＮＡ認識及び／又は結合特異性は、細胞ＤＮＡの任意の選択された部位で標的遺伝子組換えを達成するために変更することができる。そのような改変は、既知の分子生物学及び／又は化学合成技術を使用して達成することができる。（例えば、Bibikova et al., 2002を参照）。

【0314】

ＺＦＮ ＤＮＡ切断ドメインは、非特異的ＤＮＡ切断ドメインのクラス、例えばＦｏｋＩなどのＩＩ型制限酵素のＤＮＡ切断ドメインに由来する（Kim et al., 1996）。他の有用なエンドヌクレアーゼとしては、例えば、ＨｈａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｎｏｄ、ＢｂｖＣＩ、ＥｃｏＲＩ、ＢｇｌＩ、及びＡｌｗＩが挙げられる。

【0315】

本発明の好ましい実施態様に従って遺伝子組換え又は変異を標的とするためには、宿主微生物細胞ＤＮＡ内で２つの９ｂｐ亜鉛フィンガーＤＮＡ認識配列を同定しなければならない。これらの認識部位は互いに逆向きであり、約６ｂｐのＤＮＡによって分離されている。次に、ＺＦＮは、標的遺伝子座でＤＮＡに特異的に結合する亜鉛フィンガーの組み合わせを設計及び作製し、亜鉛フィンガーをＤＮＡ切断ドメインに連結することによって生成される。

【0316】

ＺＦＮ活性は、ヌクレアーゼ発現レベルを増加させるための一時的な低体温培養条件の使用（Doyon et al., 2010）、及びＤＮＡ末端プロセシング酵素と部位特異的ヌクレアーゼの同時送達（Certo et al., 2012）を使用して改善することができる。ＺＦＮ媒介ゲノム編集の特異性は、エラーが起こりやすいＮＨＥ－Ｊ修復経路を活性化することなくＨＤＲを刺激する亜鉛フィンガーニッカーゼ（ＺＦＮｉｃｋａｓｅ）を使用することで改善することができる（Kim et al., 2012; Wang et al., 2012; Ramirez et al., 2012; McConnell Smith et al., 2009）。

【0317】

転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）は、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインとエンドヌクレアーゼドメインとを含む。

【0318】

ＴＡＬエフェクターは、病原体によって植物細胞に注入される植物病原性細菌のタンパク質であり、そこで、これらは核に移動し、転写因子として機能して、特定の植物遺伝子をオンにする。ＴＡＬエフェクターの一次アミノ酸配列は、それが結合するヌクレオチド配列を決定する。従って、ＴＡＬエフェクターの標的部位を予測することができ、特定のヌクレオチド配列に結合する目的で、ＴＡＬエフェクターを工学作成及び生成することができる。

【0319】

ヌクレアーゼ又はヌクレアーゼの一部、典型的にはＦｏｋＩなどのＩＩ型制限エンドヌクレアーゼ由来の非特異的切断ドメインをコードする配列が、ＴＡＬエフェクターをコードする核酸配列に融合される（Kim et al., 1996）。他の有用なエンドヌクレアーゼは、例えば、ＨｈａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｎｏｄ、ＢｂｖＣＩ、ＥｃｏＲＩ、ＢｇｌＩ、及びＡｌｗＩを含むことができる。一部のエンドヌクレアーゼ（例えば、ＦｏｋＩ）が二量体としてのみ機能するという事実を利用して、ＴＡＬエフェクターの標的特異性を高めることができる。例えば、場合によっては、各ＦｏｋＩモノマーを、異なるＤＮＡ標的配列を認識するＴＡＬエフェクター配列に融合させることができ、２つの認識部位が近接している場合にのみ、不活性なモノマーが結合して機能的な酵素が生成される。ヌクレアーゼを活性化するためにＤＮＡ結合を必要とすることにより、高度に部位特異的な制限酵素を作成することができる。

【0320】

配列特異的なＴＡＬＥＮは、細胞内に存在するあらかじめ選択された標的ヌクレオチド配列内の特定の配列を認識することができる。従って、いくつかの実施態様において、ヌクレアーゼ認識部位について標的ヌクレオチド配列をスキャンすることができ、標的配列に基づいて特定のヌクレアーゼを選択することができる。他の場合には、特定の細胞配列を標的とするようにＴＡＬＥＮを工学作成することができる。

【0321】

プログラム可能なＲＮＡ誘導ＤＮＡエンドヌクレアーゼを使用するゲノム編集
上述した部位特異的ヌクレアーゼとは異なり、クラスター化され規則的に間隔が空いた短い回文構造の反復配列（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）（ＣＲＩＳＰＲ）／Ｃａｓシステムは、標的遺伝子変化を誘導するためのＺＦＮ及びＴＡＬＥＮの代替手段を提供する。細菌では、ＣＲＩＳＰＲシステムは、ＲＮＡ誘導性のＤＮＡ切断を介して、侵入する外来ＤＮＡに対して獲得免疫を提供する。

【0322】

ＣＲＩＳＰＲシステムは、侵入する外来ＤＮＡを配列特異的にサイレンシングするために、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）とトランス活性化キメラＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）に依存している。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムには３つのタイプが存在する。タイプＩＩシステムでは、Ｃａｓ９は、ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ標的の認識時にＤＮＡを切断するＲＮＡ誘導性ＤＮＡエンドヌクレアーゼとして機能する。ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡはｔｒａｃｒＲＮＡと対合して、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを相補的なＤＮＡ部位に誘導して切断する２つのＲＮＡ構造を形成する。

【0323】

大腸菌で最初に認識された散在した短い配列反復配列（ＳＳＲ）の別個のクラスである（Ishino et al., 1987; Nakata et al., 1989）。同様の散在ＳＳＲが、ハロフェラックス・メディテラネイ（Haloferax mediterranei）、化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）、アナベナ（Anabaena）、及び結核菌（Mycobacterium tuberculosis）でも同定されている（Groenen et al., 1993; Hoe et al., 1999; Masepohl et al., 1996; Mojica et al., 1995)。

【0324】

ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、反復の構造によって他のＳＳＲとは異なり、これは短い規則的間隔反復配列（ＳＲＳＲ）と呼ばれている（Janssen et al., 2002; Mojica et al., 2000）。この反復配列はクラスター内に発生する短い要素であり、常に一定の長さの固有の介在配列によって規則的に配置されている（Mojica et al., 2000）。反復配列は株間で高度に保存されているが、散在する反復配列の数とスペーサー領域の配列は株ごとに異なる（van Embden et al., 2000）。

【0325】

ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の共通の構造的特徴は、Jansen et al. (2002) に、（ｉ）所定の遺伝子座内で配列変化がまったくないか又はほとんどない、複数の短い直接反復配列の存在、（ｉｉ）同様のサイズの反復配列間の非反復スペーサー配列の存在、（ｉｉｉ）複数のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座を有するほとんどの種における、数百塩基対の共通のリーダー配列の存在、（ｉｖ）遺伝子座内の長いオープンリーディングフレームの欠如、及び（ｖ）１つ又はそれ以上のｃａｓ遺伝子の存在、として記載されている。

【0326】

ＣＲＩＳＰＲは典型的には、最大１１ｂｐの内部及び末端の逆配向反復配列を含む２４～４０ｂｐの短い部分回文配列である。分離された要素が検出されているが、これらは一般に、独特の介在２０～５８ｂｐ配列によって間隔の空いた反復単位のクラスター（ゲノムあたり最大約２０以上）に配置されている。ＣＲＩＳＰＲは一般に、特定のゲノム内で均一であり、そのほとんどが同一である。しかし、例えば古細菌（Archaea）には異質性の例がある（Mojica et al., 2000）。

【0327】

本明細書で使用される用語「ｃａｓ遺伝子」は、一般に、隣接するＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に関連して、又は隣接して、又はその近傍に結合している１つ又はそれ以上のｃａｓ遺伝子を指す。Ｃａｓタンパク質ファミリーの包括的な総説は、Haft et al. (2005) に記載されている。特定のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座におけるｃａｓ遺伝子の数は、種によって異なる。

【0328】

細胞培養
効果的な培養条件は当業者に公知であり、限定されるものではないが、脂質生成を可能にする適切な培地、バイオリアクター、温度、ｐＨ、及び酸素条件が含まれる。適切な培地とは、本明細書で定義される脂質を産生するために細胞が培養される任意の培地を指す。このような培地は典型的には、同化可能な炭素、窒素、及びリン酸源、並びに適切な塩、ミネラル、金属、及びビタミンなどの他の栄養素を有する水性培地を含む。本明細書で定義される細胞は、従来の発酵バイオリアクター、振盪フラスコ、試験管、マイクロタイターディッシュ、及びシャーレで培養することができる。培養は、組換え細胞に適した温度、ｐＨ、及び酸素含有量で行うことができる。このような培養条件は、当業者の専門知識の範囲内である。

【0329】

脂質抽出
本発明の微生物細胞からの脂質の抽出は、例えば Patel et al. (2018) に記載されているように、油性微生物から脂質を抽出するための当該分野で公知の方法と同様の方法を使用する。１つの実施態様において、抽出は、有機溶媒（例えば、ヘキサン、又はヘキサンとエタノールの混合物）が少なくともバイオマスと混合される溶媒抽出によって、好ましくはバイオマスが乾燥され粉砕された後に行われるが、これはまた濡れた状態でも行われる。溶媒は細胞内の脂質を溶解し、次にこの溶液は物理的作用（例えば、超音波処理）によってバイオマスから分離される。超音波処理は、微生物細胞の細胞の完全性を破壊するために最も広く使用されている前処理方法の１つである。他の前処理方法には、硫酸などの酸による処理、マイクロ波照射、高速ホモジナイゼーション、高圧ホモジナイゼーション、ビーズ叩解、オートクレーブ、及び熱分解が含まれ得る。例えば、２％硫酸による処理は６０℃で５分間行われる。次に、有機溶媒を非極性脂質から分離することができる（例えば、蒸留によって）。この２回目の分離工程により細胞から非極性脂質が得られ、従来の蒸気回収を使用すれば再利用可能な溶媒を得ることができる。

【0330】

溶媒抽出では、有機溶媒（例えば、ヘキサン、又はヘキサンとエタノールの混合物）が、好ましくはバイオマスが乾燥、及び粉砕された後に、少なくとも微生物細胞のバイオマスと混合される。溶媒は、バイオマスなどの中の脂質を溶解し、次に、この溶液は、機械的作用（例えば、上記のプロセスによる）によってバイオマスから分離される。この分離工程はまた、濾過（例えば、フィルタープレス又は同様の装置を用いて）又は遠心分離などによって行うこともできる。次に、有機溶媒を非極性脂質から分離することができる（例えば、蒸留によって）。この２回目の分離工程では微生物細胞から非極性脂質が得られ、従来の蒸気回収を使用すれば再利用可能な溶媒を得ることができる。

【0331】

本発明の微生物細胞から抽出された脂質は、通常の油処理操作に供され得る。本明細書で使用される用語「精製された」は、本発明の脂質に関して使用される場合、典型的には、抽出された脂質が脂質成分の純度を高めるための１つ又はそれ以上の処理工程に曝されていることを意味する。例えば、精製工程は、抽出された油の脱ガム、脱臭、脱色、乾燥、及び／又は分画からなる群のうちの１つ又はそれ以上又はすべてを含んでもよい。しかしながら、本明細書で使用される用語「精製された」は、総脂肪酸含有量の脂肪酸組成を変えるために本発明の脂質又は油の脂肪酸組成を変えるエステル交換プロセス又は他のプロセスを含まない。換言すると、好ましい実施態様において、精製された脂質の脂肪酸組成は、本質的に未精製脂質の脂肪酸組成と同じである。

【0332】

脱ガム
脱ガムは液体形態の脂質（油）の精製の初期段階であり、その主な目的は、抽出された脂質全体の約１～２％として存在し得るリン脂質の大部分を油から分離することである。典型的にはリン酸を含む約２％の水を原油に７０～８０℃で添加すると、微量金属や色素を伴うリン脂質の大部分が分離される。除去される不溶性物質は主にリン脂質の混合物であり、レシチンとしても知られている。脱ガムは、粗抽出された脂質に濃リン酸を添加して、非水和性リン脂質を水和性形態に変換し、存在する微量金属をキレート化することによって実行することができる。ガムは遠心分離によって油から分離される。ＬＡ単独以外のω６脂肪酸を含む回収ガムも本発明に包含される。

【0333】

アルカリ精製
アルカリ精製は、油の形で脂質を処理する精製プロセスの１つであり、中和とも呼ばれる場合がある。これは通常、脱ガムの後で漂白の前に行われる。脱ガム後、油は充分量のアルカリ溶液の添加により処理して、すべての脂肪酸とリン酸を力価測定し、生成された石鹸を除去する。適切なアルカリ性物質としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、水酸化リチウム、水酸化カルシウム、炭酸カルシウム、及び水酸化アンモニウムが含まれる。このプロセスは典型的には室温で行われ、遊離脂肪酸画分が除去される。石鹸は遠心分離又は石鹸用の溶媒への抽出によって除去され、中和された油は水で洗浄される。必要に応じて、油中の過剰なアルカリは塩酸や硫酸などの適切な酸で中和することができる。

【0334】

漂白
漂白は、漂白土（０．２～２．０％）の存在下、酸素の非存在下で、窒素又は蒸気を使用するか真空中で操作することにより、油を９０～１２０℃で１０～３０分間加熱する精製プロセスである。油処理におけるこの工程は、不要な顔料を除去するように設計されており、このプロセスでは酸化生成物、微量金属、硫黄化合物、及び少量の石鹸も除去される。

【0335】

消臭
脱臭は、高温（２００～２６０℃）かつ低圧（０．１～１ｍｍＨｇ）で油脂を処理することである。これは典型的には、油１００ｍｌあたり約０．１ｍｌ／分の速度で油に蒸気を導入することによって達成される。約３０分間のスパージング後、油は真空下で冷却される。典型的には、油はガラス容器に移され、アルゴンでフラッシュされてから冷蔵保存される。この処理により、油の色が改善され、残留する遊離脂肪酸、モノアシルグリセロール、酸化生成物などの揮発性物質や臭気化合物の大部分が除去される。

【0336】

エステル化とエステル交換
本明細書で使用される「エステル化」は、脂肪酸とアルコールとのエステル化反応を介して少なくとも１つの脂肪酸エステルを生成する化学反応を指す。脂肪酸エステル（ＦＡＥ）は、脂肪酸とアルコールの組み合わせから生じるエステルの一種である。アルコール成分がグリセロールである場合、生成される脂肪酸エステルには、モノグリセリド、ジグリセリド、又はトリグリセリドが含まれ得る。

【0337】

本明細書で使用される「エステル交換」は、ＴＡＧ内及びＴＡＧ間で脂肪酸を交換する（エステル交換）か、又は脂肪酸を別のアルコールに転移してエステルを生成するプロセスを意味する。これには、最初に遊離脂肪酸としてＴＡＧから脂肪酸を放出することが含まれる場合もあれば、脂肪酸エステル、好ましくは脂肪酸メチルエステル又はエチルエステルを直接生成する場合もある。メタノールやエタノールなどのアルコールによるＴＡＧのエステル交換反応では、アルコールのアルキル基がＴＡＧのアシル基（ＳＣＦＡを含む）とエステル結合を形成する。

【0338】

食物、飼料、飲料、及び組成物
本発明は、ヒトが消費するための食物若しくは飲料、又は動物が消費するための飼料、好ましくは少なくともヒトが消費する食物、あるいは食物又は飲料を調製するために使用できる食物若しくは飲料の成分として使用することができる脂質及び組成物を含む。組成物を食物、飲料、又は飼料に添加して、食物、飲料、又は飼料の食感、外観、香り、及び／又は風味のうちの１つ又はそれ以上を改善することもできる。脂質は、生地の稠度若しくは加工能力を改善するために、又は室温以上に温めたときの食物の稠度、食感、若しくは味を高めるために使用され得る。本発明の目的上、食物、飲料、又は飼料は、体内に摂取されると、（ａ）組織に栄養を与え、組織を構築し、又はエネルギーを供給する働きをする、及び／又は（ｂ）適切な栄養状態又は代謝機能を維持、回復、又は支持する、ヒト又は動物の消費のための調製物である。

【0339】

適切な食物／飼料には、肉代替品、スープベース、シチューベース、スナック食物、ブイヨンパウダー、ブイヨンキューブ、フレーバーパック、又は冷凍食物が含まれる。肉代替品は、例えばホットドッグ、ハンバーガー、ひき肉、ソーセージ、ステーキ、フィレ、ロースト、胸肉、もも、手羽先、ミートボール、ミートローフ、ベーコン、ストリップ、フィンガー、ナゲット、カツレツ、又はキューブとして配合することができる。

【0340】

本発明の脂質は、脂肪として食物成分として、又は油、及びドレッシングにおいて、又はバター、粉末バター、マーガリン、マヨネーズ若しくはサラダドレッシングなどの製品において使用することができる。これは、例えば、缶入りスープ又はインスタントスープ、ヌードルボウル又はヌードルカップ製品、シチュー、ストック、スープ、缶詰野菜、乾燥野菜などのスープに使用することができる。それは、ソースやグレービーソース、パスタソース、トマト製品、乾燥調味料ミックス、調味料キューブなどに使用できる。これは、例えば、パン、パン代替品、ペストリー、クロワッサン、ビスケット、セイボリービスケット、クラッカー、ケーキ、ピザ生地、パイペストリー、ドライベーカリーミックス、ベーカリー生地などのベーカリー製品に使用することができる。具体例な例には、例えば、マフィン（例えば、イングリッシュマフィン）、クラッカー（例えば、塩クラッカー、焼きクラッカー、グラハムクラッカーなど）、ロール（例えば、ソフトロール、ディナーロール、クレセントロール）、ビスケット（例えば、バターミルクビスケット、コブラービスケット）、パイ生地、パン（例えば、フォカッチャ、ブルスケッタ、サワードウブレッド、ソーダブレッド、ブレッドスティック、コーンブレッド）、ピザ生地、ベーグルが含まれる。甘い生地は、ブラウニー、クッキー、マフィン、ターンオーバー、ドーナツ、ケーキ、ペストリー、パイ、スコーンなどを作るために使用することができる。これは冷凍食物や缶詰食物などの混合料理に使用できる。例えば、これは、甘いスナック、風味豊かな食物、又は塩味のスナックに、例えば、ポテトチップス、パリパリした菓子、ナッツ、トルティーヤトスターダ、プレッツェル、チーズスナック、コーンスナック、ポテトスナック、インスタントポップコーン、電子レンジ対応ポップコーン、豚の皮、ナッツ、クラッカー、クラッカースナック、朝食用シリアル、肉、塩漬け肉、昼食／朝食用の肉、ピーナッツバターに使用することができる。これは、乳製品の代替品や類似品、例えば、アイスクリーム、アイスクリームデザート、フローズンヨーグルト、牛乳、生／低温殺菌牛乳、全脂肪生／低温殺菌牛乳、半脱脂生／低温殺菌牛乳、ロングライフミルク／ＵＨＴ牛乳、全脂肪ロングライフ／ＵＨＴ牛乳、半脱脂ロングライフ／ＵＨＴ牛乳、無脂肪ロングライフ／ＵＨＴ牛乳、ヤギ乳、練乳／無糖乳、プレーン練乳／無糖練乳、フレーバー練乳、機能性練乳、その他の練乳、フレーバーミルクドリンク、乳製品のみのフレーバーミルクドリンク、豆乳、サワーミルクドリンク、発酵乳飲料、コーヒークリーマー／ホワイトナー、粉ミルク、フレーバーパウダーミルクドリンク、クリーム、ヨーグルト、プレーン／ナチュラルヨーグルト、フレーバーヨーグルト、フルーツヨーグルト、プロバイオティクスヨーグルト、ヨーグルトドリンク、その他の乳製品ベースのデザートに使用することができる。これは、他の食物、例えば朝食用シリアル、シリアルフレーク、ミューズリー、子供用朝食用シリアル及びホットシリアルにも使用することができる。

【0341】

本発明の食物、飲料、又は飼料は、例えば、本発明の抽出された脂質、本発明の微生物細胞、本発明の微生物細胞抽出物又は組成物を含む。食物は固体又は液体のいずれかの形態であってよい。さらに、組成物は、特定の用途に望ましい量の食用主要栄養素、タンパク質、炭水化物、ビタミン、及び／又はミネラルを含んでもよい。これらの成分の量は、組成物が正常な個人への使用を意図しているのか、それとも代謝障害などに苦しむ個人などの特殊なニーズを有する個人への使用を意図しているのかに応じて変化するであろう。

【0342】

栄養価のある適切な成分の例には、限定されるものではないが、食用脂肪、炭水化物、タンパク質などの主要栄養素が含まれる。本発明の脂質以外のこのような食用脂肪の例には、限定されるものではないが、ココナッツ油、ルリチシャ油、真菌油、ブラックカラントオイル、大豆油、モノグリセリド、及びジグリセリドが含まれる。このような炭水化物の例には（限定されるものではないが）、グルコース、食用乳糖、加水分解デンプンが含まれる。さらに、本発明の栄養組成物に利用できるタンパク質の例には（限定されるものではないが）、大豆タンパク質、電気透析ホエー、電気透析スキムミルク、ミルクホエー、又はこれらのタンパク質の加水分解物が含まれる。

【0343】

ビタミン、及びミネラルに関しては、以下のものを本発明の食物、飲料、又は飼料に添加してもよい：カルシウム、リン、カリウム、ナトリウム、塩化物、マグネシウム、マンガン、鉄、銅、亜鉛、セレン、ヨウ素、ビタミンＡ、Ｅ、Ｄ、Ｃ、及びＢ複合体。他のそのようなビタミンやミネラルも添加することができる。

【0344】

追加の成分には、食物グレードの油、例えばキャノーラ油、トウモロコシ油、ヒマワリ油、大豆油、オリーブ油、ココナッツ油、調味料、例えば食用塩（例えば、塩化ナトリウムや塩化カリウムなど）、又はハーブ（例えば、ローズマリー、タイム、バジル、セージ、又はミント）、香味剤、タンパク質（例えば、大豆タンパク質分離物、小麦グルチン、エンドウ豆ビシリン、及び／又はエンドウ豆レグミン）、タンパク質濃縮物（例えば、大豆タンパク質濃縮物）、乳化剤（例えば、レシチン）、ゲル化剤（例えば、Ｋ－カラギーナン又はゼラチン）、繊維（例えば、竹充填剤（bamboo filer）又はイヌリン）、又はミネラル（例えば、ヨウ素、亜鉛、及び／又はカルシウム）が含まれる。

【0345】

本明細書に記載される食物及び飼料は、天然着色料、例えばターメリック又はビートジュース、又は人工着色料、例えばアゾ染料、トリフェニルメタン、キサンテン、キニーネ、インジゴイド、二酸化チタン、赤色３号、赤色４０号、青色１号、又は黄色５号を含むことができる。

【0346】

本明細書に記載される食物及び飼料は、肉の保存期限延長剤、例えば一酸化炭素、亜硝酸塩、メタ重亜硫酸ナトリウム、ボムバル、ビタミンＥ、ローズマリー抽出物、緑茶抽出物、カテキン、及び他の抗酸化物質を含むことができる。

【0347】

本発明の食物、飲料、又は飼料で利用される成分は、半精製又は精製起源のものであり得る。半精製又は精製されたものとは、天然材料の精製又は新規合成によって調製された材料を意味する。

【0348】

１つの実施態様において、食物、飲料、又は飼料は動物由来の成分を含まない。すなわち、好ましい実施態様において、少なくとも一部の成分は植物材料又は植物由来の材料である。いくつかの実施態様において、食物、飲料、又は飼料は、大豆不使用、小麦不使用、酵母不使用、ＭＳＧ不使用、及び／又はタンパク質加水分解生成物不使用であり得、肉のような風味があり、非常に風味が良く、異臭や異様な風味がないもの、又はそれらのレベルの低下しているものでもよい。

【0349】

さらに、本発明の組成物は、他の食物（例えば、肉レプリカ、肉代替品、豆腐、モックダック、又は他のグルテンベースの野菜製品、テクスチャード植物性タンパク質、例えばテクスチャード大豆タンパク質、豚肉、魚、子羊肉、又は家禽製品、例えば鶏肉や七面鳥製品）の味、食感、外観、口当たり、及び／又は香りプロフィールを調節するために使用することができ、調理前又は調理中に他の食物に適用することができる。

【0350】

いくつかの実施態様において、本明細書に記載の組成物は、組成物を加熱する際にメイラード反応を引き起こすのに必要な成分を含む。例えば、組成物は、（ｉ）糖、糖アルコール、糖酸、又は糖誘導体、及び（ｉｉ）アミノ酸又はその誘導体の一方又は両方を含んでもよい。

【0351】

適切な糖、糖アルコール、糖酸、及び糖誘導体には、グルコース、フルクトース、リボース、スクロース、アラビノース、グルコース－６－リン酸、フルクトース－６－リン酸、フルクトース１，６－二リン酸、イノシトール、マルトース、糖蜜、マルトデキストリン、グリコーゲン、ガラクトース、ラクトース、リビトール、グルコン酸、及びグルクロン酸、アミロース、アミロペクチン、又はキシロースが含まれる。

【0352】

適切なアミノ酸及びその誘導体には、システイン、シスチン、システインスルホキシド、アリシン、セレノシステイン、メチオニン、イソロイシン、ロイシン、リジン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファン、５－ヒドロキシトリプトファン、バリン、アルギニン、ヒスチジン、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、プロリン、セリン、及びチロシンが含まれる。

【0353】

組成物はまた、別の１つ又はそれ以上の風味前駆体を含む油（例えば、植物油）、遊離脂肪酸、α－ヒドロキシ酸、ジカルボン酸、ヌクレオシド、ヌクレオチド、ビタミン、ペプチド、タンパク質加水分解物、抽出物、リン脂質、レシチン、及び有機分子も含むことができる。

【0354】

本明細書に記載される食物、飼料、飲料、及び組成物は、調理前又は調理中に組成物を食物の上に振りかけるか又は広げることができるように、個々のパケット又はシェーカー内に密封することを含む様々な方法で包装することができる。

【0355】

本明細書に記載される食物、飲料、及び飼料は、熟練のパネリストを使用して、食感、外観、口当たり、風味、及び香りについて評価することができる。評価には、食物、飲料、又は飼料の製品の外観、色、完全性、食感、風味、口当たりなどを判断するために、製品を目で見て、感じて、咀嚼し、匂いを嗅ぎ、味わうことが含まれ得る。パネリストには、赤色光又は白色光の下で試料を提供することができる。スケールを使用して、食物の全体的な許容性や品質、あるいは肉感、食感、風味などの特定の品質特性を評価することができる。

【0356】

いくつかの実施態様において、本明細書に記載の食物、飲料、又は飼料を、嗅覚計の測定値に基づいて別の製品（例えば、肉又は肉代替品）と比較することができる。様々な実施態様において、嗅覚計は、臭気濃度、及び臭気閾値、参照ガスと比較した臭気閾値超過値、鑑賞の程度を決定するための快楽スケールスコア、又は臭気の相対強度を評価するために使用され得る。

【0357】

いくつかの実施態様において、ＧＣＭＳを使用して特定された揮発性化学物質を評価することができる。例えば、ヒトは、特定のピークの原因となる化学物質の匂いを嗅いだ経験を評価することができる。この情報は、本発明の組成物によって生成されるフレーバー及び芳香化合物のプロフィールをさらに改良するために使用することができる。

【0358】

特徴的なフレーバーや香りの成分は、主に調理プロセス中に、植物や肉に含まれるアミノ酸、脂肪、糖などの化学反応分子によって生成される。従って、いくつかの実施態様において、食物、飲料、又は飼料は、調理中又は調理後に肉との類似性について試験される。いくつかの実施態様において、食物又は飼料の嗅覚マップを作成するために、ヒトによる格付け、ヒトによる評価、嗅覚計の測定値、若しくはＧＣ－ＭＳ測定値、又はこれらの組み合わせが使用される。同様に、食物、飲料、又は飼料、例えば肉の模造品の嗅覚マップを作成することができる。これらのマップを比較して、調理済みの食物又は飼料が肉にどの程度似ているかを評価することができる。

【0359】

パーソナルケア製品
本発明の脂質は、医薬品、化粧品、トイレタリーなどのパーソナルケア製品に使用することができる。例には、アフターシェーブローション、ベビーローション、オイル、パウダー及びクリーム、ベビーシャンプー、ベースコート及びアンダーコート、バスカプセル、バスオイル、タブレット及びソルト、バスソープ及び洗剤、ひげ柔軟剤、頬紅、ボディ及びハンドプレパレーション、泡風呂、クリーニング製品、コロン及びトイレ用水、キューティクル柔軟剤、歯磨き剤、デオドラント、脱毛剤、潅水剤、ドレッシング、アイローション、アイメイクアップ各種製剤、アイメイクアップリムーバー、アイシャドウ、アイブロウペンシル、アイライナー、フェイスアンドネックプレパレーション、フェイスパウダー、女性用衛生用品消臭剤、フットパウダー及びスプレー、ファンデーション、芳香剤、ヘアブリーチ剤、ヘアカラースプレー、ヘアカラー各種製剤、ヘアコンディショナー、ヘアダイ及びカラー、カラー付きヘアライトナー、ヘア剤、ヘアリンス、ヘアシャンプー、ヘアスプレー、ヘアティント、ヘアウェーブセット、ヘアグルーミング補助具、室内日焼け剤、レッグアンドボディペイント、口紅、トローチ、化粧下地、メイク固定剤、メイクアップ剤、マニキュア剤、マスカラ、保湿剤、うがい薬及び口臭清涼剤、ネイルクリーム及びローション、爪延長剤、マニキュア及びエナメル、ナイトスキンケア剤、オーラルケア製品、口腔衛生製品、ペーストマスク、香水、個人用清潔製品、プレシェーブローション、ルージュ、サシェ、シャンプー、シェービングクリーム、シェービング剤、シェービングソープ、スキンケア各種製剤、皮膚清涼剤、日焼けジェル、クリーム及びリキッド、日焼け剤、歯磨き粉、歯磨きジェル、歯のホワイトニング製品、及びトニックが含まれる。

【実施例】

【0360】

実施例１．材料と方法
培地
ＹＰＤ培地は、１０ｇ／Ｌ酵母エキス（Sigma Aldrich, カタログ番号Ｙ１６２５）、２０ｇ／Ｌペプトン（Sigma Aldrich, カタログ番号Ｐ０５５６）、及び２０ｇ／Ｌグルコース（Sigma Aldrich, カタログ番号Ｇ７０２１）を含むリッチ培地である。ＹＰＤプレートにはさらに２０ｇ／Ｌの寒天が含まれている。ＳＤ－Ｕｒａ培地には、酵母合成ドロップアウト培地（Sigma カタログ番号Ｙ１５０１）が含まれていた。この培地には、必要に応じてウラシルを添加した。

【0361】

大規模培養用の培地
特に明記しない限り、大規模培養（２Ｌ以上）用の種培養物を調製するために使用した培地は、１０．６４ｇ／Ｌのオルトリン酸二水素カリウム（ＫＨ_２ＰＯ_４）、４．０ｇ／Ｌのオルトリン酸水素二アンモニウム（（ＮＨ_４）_２ＨＰＯ_４）、及び１．７ｇ／Ｌのクエン酸（一水和物）を含む基本培地（ＢＭ）を有する規定培地（ＤＭ－Ｇｌｕｃ）であった。これらの成分を、逆浸透により精製した必要量の約７０％の水に溶解し、２Ｍ ＮａＯＨでｐＨ６．０に調整し、精製水を使用して必要量に調製した。ＢＭを１２１℃で２０分間滅菌し、室温まで冷却した。次に、以下の成分を別々に添加した：３０ｍｌ／Ｌの６６０ｇ／Ｌグルコース（オートクレーブ処理済み）を最終濃度２０ｇ／Ｌまで、１０ｍｌ／Ｌの１Ｍ硫酸マグネシウム七水和物（オートクレーブ処理済み）、１０ｍｌ／Ｌの微量金属溶液（下記参照、フィルター滅菌済み）、１０ｍｌ／Ｌの１５ｇ／Ｌチアミン塩酸塩（フィルター滅菌済み）、３ｍｌ／Ｌの１０％（ｖ／ｖ）Sigma 消泡剤２０４（オートクレーブ滅菌済み）。

【0362】

２Ｌ及び１０Ｌ培養用の発酵培地（ＦＭ）も基本培地としてＢＭを使用した。必要な量をバイオリアクターに加え、１２１℃で、オートクレーブ可能なバイオリアクターの場合は６０分間の流体サイクルで滅菌し、定置蒸気バイオリアクターの場合は３０分間滅菌し、そして３１℃まで冷却した。以下の成分を基本培地１リットル当たり添加した：１２１ｍｌ／Ｌの６６０ｇ／Ｌグルコース（オートクレーブ滅菌済み）を最終濃度８０ｇ／Ｌまで、５ｍｌ／Ｌの１Ｍ硫酸マグネシウム七水和物（オートクレーブ滅菌済み）、５ｍｌ／Ｌの微量金属溶液（下記参照、フィルター滅菌済み）、５ｍｌ／Ｌの１５ｇ／Ｌチアミン塩酸塩（フィルター滅菌済み）、及び５０ｍｌ／Ｌの２００ｇ／Ｌ塩化アンモニウム（フィルター滅菌済み）。グルコース、マグネシウム、微量金属溶液、及びチアミン溶液を混合し、一緒にバイオリアクターに加えた。培地を配合した後、ｐＨをチェックし、典型的には６．０よりわずかに低い値であった。ｐＨコントローラーを使用してアンモニア溶液を培地に添加し、ｐＨを６．０にした。

【0363】

小規模（５０ｍｌ）培養及び２Ｌ以上の大規模培養も、より多くのＴＡＧ合成を誘導するために、８％（ｗ／ｖ）のグリセロールを含み、より低い窒素含有量を有する規定培地（ＤＭ－Ｇｌｙｃ－ＬｏｗＮ）で増殖させた。この培地はＤＭ－Ｇｌｕｃと同じであったが、但し、炭素源としてグルコースが８０ｇ／Ｌグリセロール（最終濃度）に置換され、（ＮＨ_４）_２ＨＰＯ_４含有量が０．５ｇ／Ｌに減少された。より大きな培養物については、種培養物を、必要に応じてウラシル及び任意のアミノ酸を添加して、ＳＤ－Ｕｒａ培地中で２４～４８時間増殖させた。種培養物の試料を遠心分離し、細胞をより大きな培養物に接種するために使用した。これらの培養物を４８～９６時間インキュベートし、特に明記しない限りｐＨを６．０に維持した。

【0364】

代替培地は、ＤＭ－Ｇｌｙｃ－ＬｏｗＮと同じであったが、炭素源としてグルコース又はグリセロールを８％（ｗ／ｖ）で含み、低窒素レベルを得るために（ＮＨ_４）_２ＨＰＯ_４を最終濃度０．５ｇ／Ｌの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４で置換し、酵母抽出物を１ｇ／Ｌで添加し、ＭｇＳＯ_４及びクエン酸を省略した。これらの培地は、本明細書ではそれぞれＤＭ－Ｇｌｕｃ－ＬｏｗＮ－ＬｏｗＭｇ及びＤＭ－Ｇｌｙｃ－ＬｏｗＮ－ＬｏｗＭｇと呼ばれる。

【0365】

上記の培地で使用した微量金属溶液（ＴＭ）は、１リットルあたり以下を含有した：２．０ｇのＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ、０．０８ｇのＮａＩ、３．０ｇのＭｎＳＯ_４・Ｈ_２Ｏ、０．２ｇのＮａＭｏＯ_４・２Ｈ_２Ｏ、０．０２ｇのＨ_３ＢＯ_３、０．５ｇのＣｏＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ、７．０ｇのＺｎＣｌ_２、２２．０ｇのＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、０．５０ｇのＣａＳＯ_４・２Ｈ_２Ｏ、及び１ｍｌの硫酸。試薬は記載された順序で加えられた。硫酸を添加すると、硫酸カルシウムが溶解した。微量金属溶液を０．２μｍフィルターで濾過滅菌し、アルミホイルで包んだ瓶に入れて２～８℃で保存した。

【0366】

１つのｐＨ制御試薬は、１１８ｍＬの８５％Ｈ_３ＰＯ_４を８８２ｍＬの精製水に添加することによって調製されたリン酸溶液（１０％ｗ／ｖ）であった。この溶液はオートクレーブ滅菌された。

【0367】

もう１つは、３３０ｍｌの３０％アンモニア溶液を６７０ｍｌの精製水に添加することによって調製されたアンモニア溶液（１０％ｖ／ｖ）であった。この溶液は自己滅菌性であると考えられた。１００ｍｌのSigma 消泡剤２０４を９００ｍｌの精製水と混合することにより１０％の濃度を提供して、消泡剤溶液を調製した。混合物をオートクレーブ滅菌した。

【0368】

濾過滅菌した１３４ｍｌの２００ｇ／Ｌ塩化アンモニウムを１Ｌの６６０ｇ／Ｌグルコースに添加し、オートクレーブ滅菌して供給溶液を調製した。

【0369】

微生物株とクローニングベクター
エス・セレビッシェＩＮＶＳｃ１株（ThermoFisher, カタログ番号Ｃ８１０００）及びＤ５Ａ（ＡＴＣＣ２０００６２）を、リン脂質を含む脂質の生成に関する実験の宿主株として使用した。トランス遺伝子の添加によって酵母におけるさまざまな脂質改変遺伝子を試験する場合、遺伝子導入のためのベースベクターとしてｐＹＥＳ２プラスミドを使用した。ＩＮＶＳｃ１及びｐＹＥＳ２は、Invitrogen （カタログ番号Ｖ８２５－２０）から入手した。ＩＮＶＳｃ１の遺伝子型は、ＭＡＴａ ｈｉｓ３Δ１ ｌｅｕ２ ｔｒｐ１－２８９ ｕｒａ３－５２／ＭＡＴα ｈｉｓ３Δ１ ｌｅｕ２ ｔｒｐ１－２８９ ｕｒａ３－５２であり、その表現型はＨｉｓ－、Ｌｅｕ－、Ｔｒｐ－、及びＵｒａ－であった。ｐＹＥＳ２ベクターは、本明細書に記載されるような様々なタンパク質をコードするＤＮＡ断片の挿入に使用されるユニークなＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｈｏＩ制限酵素部位を有していた。ｐＹＥＳ２発現ベクターは、Ｕｒａ－である酵母株に導入するための選択マーカー遺伝子としてＵＲＡ３遺伝子を、高コピー維持のための２μ複製開始点を、及び酵母におけるタンパク質コード領域の発現のための誘導性Ｇａｌ１プロモーターを含んでいた。このプラスミドはまた、クローニング実験中に大腸菌で選択するためのアンピシリン耐性遺伝子も含有していた。

【0370】

ヤローウィア・リポリティカのいくつかの株はアメリカンタイプカルチャーコレクション（American Type Culture Collection）（Manassas VA, USA）から入手した：遺伝子型ｌｅｕ２－３５ ｌｙｓ５－１２ ｕｒａ３－１８ ｘｐｒ２：：ＬＹＳ５Ｂを有するＪＭ２３株（ＡＴＣＣ９０８１２）、ｌｅｕ２－３５ ｌｙｓ５－１２ ｕｒａ３－１８ ｘｐｒ２：：ＬＹＳ５Ｂを有するＩＦＰ２９株（ＡＴＣＣ２０４６０）、及び野生型Ｗ２９株（Casaregola et al., 2000）。
大腸菌ＤＨ５α株及びＢＬ２１株は、ThermoFisher Scientific から入手した（カタログ番号１８２６５０１７、ＥＣ０１１４）。

【0371】

脂質分析のためのエス・セレビッシェとワイ・リポリティカ培養物の増殖
脂肪酸の生成、抽出、及び分析のための培養物に接種菌を提供するために、ワイ・リポリティカ又はエス・セレビッシェの小規模培養物を、５ｍｌのＹＰＤ培地中で２９℃で２４時間増殖させた。実験のために、接種菌培養物を、例えば５０～２０００ｍｌの容量を有する増殖培地中に、６００ｎｍの光学密度（ＯＤ６００）が０．１になるまで希釈した。培養物は、１０ｍｌの培養物についてはポリプロピレンチューブ中で増殖させ、又はより大容量の場合にはガラスフラスコ中で増殖させ、この容器は培養物容量より少なくとも５倍大きい容量を有した。容器を３Ｍマイクロポア外科用テープ（カタログ番号１５３０－１）で密封し、特に指定のない限り２９℃の規定温度で通気のために２００ｒｐｍで、シェーカー内でインキュベートした。

【0372】

ＳＤ－Ｕｒａ培地を使用した場合、２％グリセロール又はラフィノース（ｗ／ｖ）（MP Chemicals, USA、カタログ番号４０１００２２）などの炭素源を使用した。培養物を、通気のために振盪しながら２８℃で一晩インキュベートした。接種菌培養物を、２％（ｗ／ｖ）グリセロール又はラフィノースを含有する１０ｍｌのＳＤ－Ｕｒａ培地、又は指定された他の容量で希釈して、０．１の初期ＯＤ６００を得た。５０ｍｌチューブ又は２５０ｍｌフラスコ内の培養物を、通気のために２８℃、２００ｒｐｍの振盪機内でインキュベートした。ＯＤ６００を１５分又は３０分の時間間隔でチェックした。ＯＤ６００が０．３に達したとき、必要に応じて、ＧＡＬ１プロモーターからトランス遺伝子を誘導するために、潜在的な基質（存在する場合）として外因性化合物を２％ガラクトースとともに添加した。

【0373】

ｐＹＥＳ２誘導体などの形質転換体のために、３Ｌ容量のエス・セレビッシェ細胞の大規模培養物を増殖させた。これらはグリセロールストックから接種された。種培養物を、２％（ｗ／ｖ）ラフィノースを含む１０ｍｌのＳＤ－Ｕｒａ培地で最大４８時間増殖させた。細胞を、２％（ｗ／ｖ）ラフィノースを含む３ＬのＳＤ－Ｕｒａ培地にＯＤ６００が０．１になるまで移し、２８℃、２００ｒｐｍで振盪しながら増殖させた。ＯＤ６００を１５分及び３０分の時間間隔でチェックした。ＯＤ６００が０．３に達したとき、トランス遺伝子を誘導するためにガラクトースを最終濃度２％（ｗ／ｖ）まで添加した。所望の場合、特に明記しない限り、酪酸ナトリウムを最終濃度２ｍｇ／ｍｌになるように培養物に添加するか、又はステアリン酸ナトリウムを０．５ｍｇ／Ｌになるように添加した。次に、フラスコを滅菌アルミニウム箔で緩く閉じた。培養物をインキュベーター内で４８時間増殖させた後、遠心分離によって細胞を採取した。

【0374】

大腸菌の培養物をグリセロールストックから５ｍｌのＬＢ培地中で２４時間増殖させて、接種菌を得た。培養物をポリプロピレンチューブ又はガラスフラスコ中のＬＢ培地でＯＤ６００が０．１になるまで希釈し、特に指定しない限り、通気のために３７℃、２００ｒｐｍで振盪機中でインキュベートした。

【0375】

細胞への脂質基質の供給
基質供給実験では、酵母と細菌接種菌培養物の両方を、１％テルギトール（Sigma-Aldrich カタログ番号ＮＰ４０Ｓ）を含むそれぞれの増殖培地に０．１のＯＤ６００で希釈し、一定期間（典型的にはは２時間）振盪しながらインキュベートした。次に、脂肪酸、油、又は油加水分解物などの脂質基質を培地に添加し、培養物をさらに異なる期間インキュベートした。脂肪酸基質をエタノールに溶解し、最終濃度０．５ｍｇ／ｍｌで培養物に加えるか、又は脂肪酸のナトリウム塩を水溶液として加えた。

【0376】

潜在的な炭素源又は基質として化合物を培地に添加する場合（供給アッセイ）、以下の化合物をSigma-Aldrich から入手した：エタノールアミン（カタログ番号１１０１６７）、塩化コリン（Ｃ７０１７）、ミオ－イノシトール（１３０１１）、酪酸（Ｂ１０３５００）、酪酸ナトリウム（Ｂ５８８７）、トリブチリン（Ｗ２２２３０５）、又はパルミチン酸（７６１１９）。

【0377】

２Ｌ発酵のパラメーター
以下のパラメーターは、最大作業容量が２Ｌ培養物である３Ｌ（総容量）のSartorius Biostat B オートクレーブ可能バイオリアクターに使用された。開始時の培地容量は１Ｌであった。初期温度設定値は３１℃で、プロセス中は変更されなかった。温度コントローラーの構成は、最小：－１００％；最大：１００％；ＸＰ：４％；ＴＩ：３００秒；ＴＤ：７５秒；デッド：０．０％；溶存酸素コントローラーを使用したカスケード制御；最小撹拌速度：５００ｒｐｍ；最大撹拌速度：１２００ｒｐｍ；ｐＨ制御設定値：６．０；ｐＨコントローラー構成：最小：－１００％、最大：１００％、ＸＰ：３０％、ＴＩ：３０秒、ＴＤ：０秒、デッド：０．２％（０．０２ｐＨ単位に相当）であった。自動ｐＨ制御に使用した酸と塩基は、１０％Ｈ_３ＰＯ_４と１０％アンモニア溶液であった。

【0378】

初期の溶存酸素設定値は３０％であった。溶存酸素（ＤＯ）電極は、滅菌後及び媒体温度が３１℃で安定した後に較正された。０％飽和は、純窒素、スターラー速度１００ｒｐｍ、及び窒素流量０．１Ｌ／分を使用して較正し、飽和は、スターラー速度は５００ｒｐｍ、空気流量は０．５Ｌ／分に設定して確立した。カスケード制御では、２工程のカスケードでスターラーを使用し、続いてガス混合を使用して空気流の酸素富化を得た。酵母細胞は泡の上に浮く傾向があるため、酸素富化を使用して空気流量を減らし、それにより、プロセスに悪影響を及ぼす可能性のある泡立ちを軽減した。空気流量は０．５Ｌ／分で一定であり、最小酸素富化率は０％、そして最大酸素富化率は５０％であった。溶存酸素コントローラーの構成は、デッド：０％、最小：０％（５１０ｒｐｍ）、最大：１００％（１４２５ｒｐｍ）、ＸＰ：９０％、ＴＩ：５０秒、ＴＤ：０秒に設定された。

【0379】

泡制御については、１０％ Sigma 消泡剤２０４を使用し、接種前に１０％（ｖ／ｖ）Sigma 消泡剤２０４を１０ｍｌ添加し、接種後７時間に２０ｍｌを添加し、接種後３１時間に３０ｍｌを添加して、自動化学泡制御を実現した。泡コントローラーの構成は、サイクル：１０秒、パルス：５秒、感度：０４であった。

【0380】

目標接種ＯＤ６００は０．２０であり、これは二次種培養物を使用して、基本培地の開始容量に基づいて計算された。流加バッチモードでは、供給溶液の供給を、供給流速２０ｍｌ／ｈで接種後１４時間に開始した。各プロセスの完了時に、容器から水を抜き、遠心分離によって細胞を採取した。

【0381】

１０Ｌ発酵のパラメーター
同じパラメーターが、最大作業容量１０Ｌ培養の１５Ｌの Sartorius Biostat C10 定置蒸気バイオリアクターに使用されたが、以下の違いがある。溶存酸素（ＤＯ）電極を較正するために、０％飽和は、スターラー速度１００ｒｐｍ、窒素流量１Ｌ／分で純窒素を使用して較正し、飽和は、スターラー速度５００ｒｐｍ及び空気流量を３Ｌ／分に設定して確立した。カスケード制御については、空気流量は３．０Ｌ／分で一定であった。溶存酸素コントローラーの構成は次のように設定された：HTimeスターラー：０分、デッド：０．５％、最小：５１０ｒｐｍで３４％、最大：１４２５ｒｐｍで９５％、ＸＰ：１５０％、ＴＩ：１００秒、ＴＤ：０秒、HTime GasMix：０分、デッド：０．５％、最小：０％（酸素補給なし）、最大：５０％、ＸＰ：５％、ＴＩ：２００秒、ＴＤ：０秒。

【0382】

２Ｌ発酵に関しては、二次種培養物を使用した場合の目標接種物ＯＤ６００は０．２０であった。流加バッチモードでは、供給溶液による供給は、接種後１４時間に供給流速１００ｍｌ／ｈで開始した。各プロセスの完了時に、特に明記しない限り、接種から２４時間後、培養物を１０５℃で５分間熱不活性化し、次に３１℃に冷却した後、遠心分離によって細胞を採取した。

【0383】

大規模培養物のための種培養
一次種培養では、酵母菌株の凍結グリセロールストックを使用して、通気キャップ付きのプラスチックバッフル付き１Ｌ三角フラスコ内の１００ｍＬのＤＭに接種した。これを、通気のために２００ｒｐｍで振盪しながら２８℃で２４±２時間インキュベートした。インキュベーションの終了時に、６００ｎｍの光学密度（ＯＤ６００）を測定した。二次種培養物は、一次種子培養物を使用して、通気キャップ付きのプラスチックバッフル付き２Ｌ三角フラスコ中の５００ｍＬのＤＭに、開始ＯＤ６００が０．０４になるまで接種することによって調製した。第２の種培養物を、２８℃、２００ｒｐｍで振盪しながら１６±２時間インキュベートした。ＯＤ６００はインキュベーションの終了時に測定された。この培養物を大規模発酵に接種するために使用した。

【0384】

細胞の採取、洗浄、及び凍結乾燥
小規模培養物から細胞を、例えば５０ｍｌチューブ中で４６００ｇで１５分間の遠心分離によって採取し、１０ｍｌの MilliQ 水で２回洗浄し、最後に１ｍｌの MilliQ 水で洗浄した。最終洗浄では、乾燥細胞重量を測定するため、細胞懸濁液をあらかじめ秤量した２ｍｌエッペンドルフチューブに移し、遠心分離し、細胞ペレットを凍結乾燥（VirTisベンチトップ凍結乾燥機、SP Scientific）した後、秤量し脂質抽出を行った。ＡＲＡ、ＤＧＬＡ、γ－リノレン酸（ＧＬＡ）、酪酸塩、又はパルミチン酸塩などの脂質基質を増殖培地に添加した場合、細胞ペレットは１ｍｌの１％テルギトール（ｖ／ｖ）、１ｍｌの０．５％テルギトールで連続的に洗浄され、１ｍｌの水で最終洗浄して、細胞の外側から残りの基質を除去し、上記のように凍結乾燥した。油を増殖培地に添加した場合、細胞は上記と同様に遠心分離によって採取したが、細胞ペレットは５ｍｌの１０％テルギトール（ｖ／ｖ）、５ｍｌの５％テルギトール、５ｍｌの１％テルギトール、５ｍｌの０．５％テルギトールで連続的に洗浄し、及び５ｍｌの水で最終洗浄して、細胞の外側から残っている油を除去した。場合によっては、Bodipyで染色した後の顕微鏡観察により、細胞壁に油汚れが付いていないことを確認した。最後の洗浄により、ペレットを予め秤量した２ｍｌエッペンドルフチューブに移し、凍結乾燥した後、秤量して脂質抽出を行った。

【0385】

酵母細胞からの脂質抽出
Bligh and Dyer (1959) を改変した方法を使用して、総細胞脂質をエス・セレビッシェ又はワイ・リポリティカなどの酵母細胞から抽出した。約５０ｍｇの凍結乾燥細胞を、２ｍｌエッペンドルフチューブ中の０．５ｇの酸化ジルコニウムビーズ（カタログ番号ＺＲＯＢ０５、Next Advance, Inc., USA）を含むクロロホルム／メタノール（２／１、ｖ／ｖ）の混合物０．６ｍｌを用いて、ブレットブレンダーブルー（Bullet Blender Blue）（Next Advance, Inc. USA）を速度６で５分間使用してホモジナイズした。次に、混合物を超音波処理水浴中で５分間超音波処理し、０．３ｍｌの０．１Ｍ ＫＣｌを加えた。混合物を１０分間振盪し、１０，０００ｇで５分間遠心分離した。脂質を含む下層の有機相をガラスバイアルに移し、細胞破片を含む上層を０．４ｍｌのクロロホルムと２０分間混合し遠心分離することによって残りの脂質を抽出した。下相を収集し、ガラスバイアル内の最初の抽出物と合わせた。窒素ガス流下で脂質試料から溶媒を蒸発させ、抽出した脂質を測定量のクロロホルムに再懸濁した。必要に応じて、脂質試料をさらなる分析まで－２０℃で保存した。

【0386】

より大きなバイオマスからの脂質抽出
より大きなバイオマスから総脂質を抽出するために、特に明記しない限り、より大量の溶媒を使用して、異なる細胞ホモジナイゼーション方法を使用した。６個の５０ｍｌ Cellstarポリプロピレンチューブ（６×チューブＡ）（カタログ番号２２７２６１、Greiner bio-one）に分配した約１．５ｇの凍結乾燥細胞を、チューブ当たり９ｍｌのクロロホルム／メタノール（２／１、ｖ／ｖ）で Ultra-Turrax T25ホモジナイザー（IKA Labortechnik Staufen, Germany）を使用して３分間ホモジナイズした。各チューブに３ｍｌの１Ｍ ＫＣｌを加えた後、さらに２分間ホモジナイゼーションを行った。各チューブを６，０００ｇで３分間遠心分離した。下相を新しいチューブ（チューブＢ）に移し、溶媒を室温で窒素流下で蒸発させた。上相を１ｇのガラスビーズと、Vibramax ミキサー中で１０分間、そして１分間激しくボルテックスしながら混合した。６ｍｌのクロロホルムを各チューブに加え、再度３分間混合した。遠心分離後、下相をチューブＢに移し、室温で窒素ガス流下で溶媒を蒸発させた。残りの脂質を抽出するために、チューブＡの上相をさらに６ｍｌのクロロホルムと混合し、３分間混合した。遠心分離後、下相を再びチューブＢに移した。３ｍｌのメタノール及び３ｍｌの０．１Ｍ ＫＣｌをチューブＢに加え、３分間混合した。下相をファルコンチューブに移し、窒素ガス流下、室温で溶媒を蒸発させた。抽出した脂質をクロロホルム／メタノール（２／１、ｖ／ｖ）に溶解し、－２０℃で保存した。

【0387】

薄層クロマトグラフィーによる脂質分画
ＴＡＧ、ＤＡＧ、遊離脂肪酸、及び極性脂質、例えばリン脂質（ＰＬ）などのさまざまなタイプの脂質を分離するために、総脂質を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）プレート（シリカゲル６０、カタログ番号１．０５６２６．０００１、MERCK, Darmstadt, Germany）により、溶媒系としてヘキサン：ジエチルエーテル：酢酸（７０／３０／１ｖ／ｖ／ｖ）を使用して分画した。ＴＡＧ、ＤＡＧ、ＦＦＡ、及びＭＡＧを含む１８－６Ａ（Nu-Chek Prep Inc, USA）などの脂質標準物質の試料を隣接するレーンで流して、さまざまな脂質スポットを同定した。短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）を含むさまざまなＴＡＧを区別する場合、トリヘプタデカノインを含む標準物質（Nu-Chek USA、カタログ番号Ｔ－１５５）、等量のトリアセチンを含むトリグリセリド混合物Ｃ２～Ｃ１０（ＴＡＧ６：０）、トリブチリン（ＴＡＧ１２：０）、トリカプリリン（ＴＡＧ１８：０）、及びトリデカノイン（ＴＡＧ３０：０）（Sigma-Aldrich 、カタログ番号１７８１０－１ＡＭＰ－Ｓ）を隣接するレーンで流して、ＴＡＧ脂質スポットを同定した。クロマトグラフィーの後、プレートにアセトン：水（８０／２０ｖ／ｖ）中５ｍｇ／１００ｍｌの濃度で調製したプリムリン（カタログ番号２０６８６５、Sigma, Taufkirchen, Germany）溶液をスプレーし、脂質バンドを紫外線の下で視覚化した。各スポットから脂質を含むシリカを削り取り、チューブに移した。脂質画分は、メチル化、プロピル化、又はブチル化のいずれかを使用して、誘導体化するためにシリカから抽出された。

【0388】

総脂質からのＰＬとＡＧの大規模分画
８枚のＴＬＣプレート（シリカゲル６０；カタログ番号１．０５６２６．０００１、MERCK, Darmstadt, Germany）のそれぞれの１８ｃｍライン上に脂質をロードすることによって、ＰＬ及びＴＡＧが総脂質約１００ｍｇから分画され、ヘキサン／ジエチルエーテル／酢酸（７０：３０：１、ｖ：ｖ：ｖ）からなる溶媒混合物を用いてクロマトグラフィーにかけられた。ＴＡＧ、ＤＡＧ、ＦＦＡ、及びＭＡＧを含む脂質標準物質（１８－６Ａ；NuChek Inc, USA）のアリコートを並行して分析して、脂質バンドの同定の助けとした。プレートをプリムリンで染色し、ＵＶ光下で可視化した後、起点に位置するＰＬバンド及びＴＡＧ標準物質と同じ移動度を有するＴＡＧバンドを収集し、ファルコンチューブに移した。脂質／シリカ試料をクロロホルム６ｍｌとメタノール３ｍｌの混合物で抽出し、５分間激しく混合し、次に３ｍｌの水を加えて、さらに５分間混合した。３，０００ｇで５分間遠心分離した後、下部の有機相を新しいチューブに移した。３０００ｒｃｆで５分間遠心分離した後、下相をファルコンチューブに移した。上相を５ｍｌのクロロホルムと５分間混合して、残っている脂質を抽出した。遠心分離後、下相を最初の抽出物と合わせた。窒素ガス流下で溶媒を蒸発させた。抽出した脂質（ＴＡＧ又はＰＬ）を少量のクロロホルムに溶解し、０．２μｍマイクロスピンフィルター（Chromservis, EU、カタログ番号ＣＩＮＹ－０２）で濾過して全ての微粒子を除去した。各ＰＬ及びＴＡＧ画分の脂肪酸組成及び量は、ＦＡＭＥの調製及びＧＣ分析によって決定された。このような調製物は、例えば、ＰＣ、ＰＥ、ＰＩ、及びＰＳなどの異なる極性脂質クラスの分離、又は芳香試験や反応生成物としての揮発性化合物の検出のためのメイラード反応に使用された。

【0389】

脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）への脂質の誘導体化
ＧＣによる分析のために、脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）を、ＰＴＴＥで裏打ちされたスクリューキャップを備えた２ｍｌのガラス中の０．７ｍｌの１Ｎメタノール性ＨＣｌ（Sigma-Aldrich 、カタログ番号９０９６４）で８０℃で２時間処理することにより、総抽出脂質又は精製ＴＡＧ若しくはＰＬ画分から調製した。トルエンに溶解された既知量のヘプタデカノイン（Nu-Chek Prep, Inc.、カタログ番号Ｎ－７－Ａ、Waterville, MN, USA）を各試料に添加した後、定量のための内部標準物質として処理した。バイアルを冷却後、０．３ｍｌの０．９％ＮａＣｌ（ｗ／ｖ）及び０．１ｍｌのヘキサンを加え、混合物を５分間ボルテックス混合した。混合物を１７００ｇで５分間遠心分離し、ＦＡＭＥを含む上層のヘキサン相をＧＣで分析した。

【0390】

ＧＣによるＦＡＭＥの分析と定量
個々のＦＡＭＥを、３０ｍのSGE-BPX70カラム（７０％シアノプロピルポリシルフェニレンシロキサン、内径０．２５ｍｍ、膜厚０．２５μｍ）、スプリット／スプリットレスインジェクター、及びAgilent Technologies 7693シリーズオートサンプラーとインジェクター、及び水素炎イオン化検出器（ＦＩＤ）を備えた Agilent 7890A GC（Palo Alto, California, USA）を用いて、ＧＣにより同定及び定量した。試料は、オーブン温度１５０℃でスプリットモード（比率５０：１）で注入された。カラム温度は、１５０℃で１分間、３℃／分で２１０℃まで上昇、２分間保持して、５０℃／分で２４０℃に到達し、次に２４０℃で０．４分間保持するようにプログラムされた。インジェクターの温度は２４０℃、検出器の温度は２８０℃に設定された。ヘリウムをキャリアガスとして１．０ｍｌ／分の一定流量で使用した。ＦＡＭＥピークは、ＦＡＭＥ標準物質（ＧＬＣ－４１１、ＧＬＣ－６７４、Nu-Chek Inc., USA）の保持時間に基づいて同定された。ピークは、既知量の外部標準物質ＧＬＣ－４１１（NuChek）とＣ１７：０－ＭＥ内部標準物質の応答に基づいて、Agilent Technologies ChemStation ソフトウェア (Rev B.04.03 (16), Palo Alto, California, USA) を用いて積分された。得られたデータは、脂肪酸組成を重量ベースで示し、総脂肪酸含有量１００％中の各脂肪酸の割合（重量％）を示す。これらの重量ベースの割合は、各脂肪酸の既知の分子量に基づいて、モルベースの割合（モル％）に容易に変換することができる。

【0391】

トリアシルグリセロールのけん化
遊離脂肪酸は、１ｍｇのＴＡＧを０．２ｍｌの３Ｍ ＫＯＨ中で８０℃で３分間インキュベートすることによってＴＡＧから放出された。試料を室温まで冷却した後、１００μｌのヘキサンを混合物に添加した。混合物を５分間ボルテックス混合し、１７００ｇで５分間遠心分離し、上部有機相をＧＣ分析のために収集した。

【0392】

エチルエステル又はプロピルエステルへの脂質の誘導体化
ＴＡＧ内の脂肪酸を脂肪酸エチルエステル（ＦＡＥＥ）に変換するために、２ｍｇのＴＡＧを１Ｎ ＨＣｌ／エタノール溶液中で８０℃で２時間インキュベートした。試料を室温まで冷却した後、１００μｌのヘキサンを混合物に加えた。混合物を５分間ボルテックス混合し、１７００ｇで５分間遠心分離し、上部有機相をＧＣ分析のために収集した。ＴＡＧ内の脂肪酸を脂肪酸プロピルエステルに変換するために、２ｍｇのＴＡＧを１Ｎ ＨＣｌ／エタノールではなく１Ｎ ＨＣｌ／プロパノール中でインキュベートし、その他は同様に処理した。

【0393】

ＧＣ－ＭＳによるピーク本体
ＧＣ－ＦＩＤクロマトグラム内の未知の又は不確実なピークの本体は、ガスクロマトグラフィー質量分析（ＧＣ－ＭＳ）によって確認された。試料を７０ｅＶの電子イオン化モードで動作するＧＣ－ＭＳで分析して、ピークの同一性を確認し、可能性のある汚染、分解生成物、又は試薬シグナルに対応する可能性のある余分なピークを特定した。HTX-Pal液体オートサンプラーに接続されたShimadzu GC-MS QP2010 Plus（Shimadzu Corporation, Japan）システムを次のパラメーターを用いて使用した：２５０℃の温度で１５：１分割のスプリット／スプリットレス注入口を使用する１又は２μｌの注入量。使用したオーブン温度プログラムはＧＣ－ＦＩＤの場合と同じであった。ＭＳイオン源とインターフェースの温度は、それぞれ２００℃と２５０℃であった。データは、スキャン速度１０００、スキャン範囲４０～５００ｍ／ｚで収集された。ピーク分離は、キャリアガスとしてＨｅを３０ｃｍ／秒で使用する Stabilwax 又は Stabilwax-DA（Restek/Shimadzu）キャピラリーカラム（３０ｍｘ×径０．２５ｍｍ、膜厚０．２５μｍ）によって行った。質量スペクトルの相関付けは、ＮＩＳＴライブラリ、保持指数、及び利用可能な標準物質の一致する保持時間を使用して実行された。特定されたＳＣＦＡは、Ｓ／Ｎ比が１０：１を超える場合に存在すると設定された。器具ブランク及び操作ブランクは、品質管理の目的で実行された。

【0394】

組換えＤＮＡ法
エス・セレビッシェで試験するために挿入された単一遺伝子を有するｐＹＥＳ２の誘導体を、必要に応じてプラスミド内の特有のＨｉｎｄＩＩＩとＸｈｏＩ部位又は他の制限酵素部位にタンパク質コード領域を、標準的なクローニング法により挿入することによって作製した。大腸菌ＤＨ５α株を、標準的な方法に従ってクローニング及びプラスミド増殖及びＤＮＡ調製で使用した。

【0395】

Golden Gate(ＧＧ)法（Larroude et al., 2018）は、単一ベクター内の複数の発現カセットの迅速かつ効率的なコンビナトリアルアセンブリを可能にするため、エス・セレビッシェ又はワイ・リポリティカで試験するための多重遺伝子構築体の作成に使用した。ＧＧ ＤＮＡ部分とドナーベクター（Ｌ０ベクターとも呼ばれる）を、Celinska et al. (2017) とLarroude et al. (2018)に従って、Addgene, USAから入手した。ＤＮＡ部分にはプロモーター（ＧＧＥ１４６、ＧＧＥ１５１、及びＧＧＥ２９４）、ターミネーター（ＧＧＥ０１４、ＧＧＥ０１５、ＧＧＥ０８０、ＧＧＥ０２０、及びＧＧＥ０２１）が含まれ、バックボーンアセンブリベクター（目的地ベクター）はＧＧＥ１１４であった。

【0396】

ＧＧアセンブリによるベクターへの挿入のためのタンパク質コード領域は、Twist Bioscience and GeneArt オンラインソフトウェア (Twist Bioscience: www.twistbioscience.com/products/genes; ThermoFisher/GeneArt: www.thermofisher.com/au/en/home/life-science/cloning/gene-synthesis/geneart-gene-synthesis.html) を使用して、エス・セレビッシェ又はワイ・リポリティカについてコドン最適化され、Twist Bioscience 又は GeneArt (ThermoFisher, USA)で、又は研究室で合成された。ＢｓａＩ部位はＧＧアセンブリ法で使用されたため、タンパク質コード領域のコドン最適化ヌクレオチド配列では、内部ＢｓａＩ制限酵素部位は回避された。ＮｏｔＩはワイ・リポリティカの形質転換のための遺伝子構築体を線形化するために使用されたため、ヌクレオチド配列内ではＮｏｔＩ制限酵素部位も回避された。１つ、２つ、又は３つの遺伝子を１つのベクターに挿入する場合、個々の成分は、各翻訳開始コドン（ＡＴＧ）の５'、及び翻訳終止コドンの３'のすぐ近くの４ヌクレオチドのオーバーハング、バックボーンベクターＧＧＥ１１４内の成分の位置に依存する各４ヌクレオチドのオーバーハングを用いて、表３に従って、個々の成分が設計された。適切な４ｎｔオーバーハングを有する外部ＢｓａＩ部位を、各ＤＮＡ鎖の５'末端に付加した。連続成分間で使用される４ｎｔオーバーハング配列は、当技術分野で知られているように、各部位で任意の４ヌクレオチド配列を使用して、連続成分間の結合を可能にするように変えることができる。

【0397】

アンピシリン選択マーカー遺伝子を有するＧＧバックボーンベクターＧＧＥ１１４を用いてＧＧ反応を行う際の偽陽性を避けるために、タンパク質コード領域をカナマイシン選択マーカー遺伝子を有するクローニングベクター内で合成した。標準的な方法に従って、大腸菌ＤＨ５α株株をクローニング及びプラスミド増殖に使用した。形質転換細胞を選択するために抗生物質を適宜使用し、例えば、アンピシリン選択マーカー遺伝子を有する構築体の選択のためにアンピシリンを１００μｇ／ｍＬで添加した。

【0398】

デスティネーションベクターＧＧＥ１１４には赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）発色団が含まれており、これは、Larroude et al. (2018)が記載しているように、大腸菌でのネガティブクローニングのカラーベースの視覚マーカーとして機能する。ベクターＧＧＥ１１４はいわゆるデスティネーションベクターであり、細菌レプリコンに加えて、ワイ・リポリティカゲノムへのより効率的な組み込みのためのＺＥＴＡ配列とＵＲＡ３選択マーカー遺伝子を含み、これは、この組み合わせを使用して、高コピー維持のための２μ起点を含むバックボーンベクターｐＹＥＳ２に組み立てるべき断片の数を減らすことを目的としている。この場合、ＲＦＰはＵＲＡ３マーカー遺伝子とＺＥＴＡｄｏｗｎの間にあった。ＢｓａＩ酵素の存在下では、ＲＦＰが放出され、１、２、又は３つの転写単位（ＴＵ；プロモーター－タンパク質コード領域－ターミネーター）が挿入された。

【表3】

【0399】

ＧＧアセンブリ反応ミックスは、０．７５μｌの１０×Ｔ４リガーゼ緩衝液、０．７５μｌの１０×ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、０．７５μｌのＢｓａＩ ＨＦ－Ｖ２（ＮＥＢ）、０．５μｌのＴ４リガーゼ（ＮＥＢ）を加えることにより、最終容量７．５μｌ中に等モル量（５０ｎｇ）のＧＧＥ１１４などのＧＧバックボーンベクター、及び他のＤＮＡ成分（ドナーベクター）を含有した。反応混合物を、３７℃で３分間、続いて１６℃で４分間を２５サイクル、次に５０℃で５分間及び８０℃で５分間を１サイクルでインキュベートした。２～３μｌの試料を、標準的な方法により大腸菌ＤＨ５α株のコンピテント細胞に導入した。ＲＦＰが欠如したコロニーは、適切なプライマーを用いるコロニーＰＣＲによって所望の遺伝子挿入体を含むことが確認され、制限消化物で証明された。グリセロールストックを作成し、－８０℃で保存した。

【0400】

エス・セレビッシェの形質転換
コンピテント細胞を使用しない、ｐＹＥＳ２に基づく遺伝子構築体のエス・セレビッシェへの導入には迅速な方法が使用された。白金耳一杯のエス・セレビッシェ細胞を新しいプレートからこすり取り、細胞を１００μｌの形質転換緩衝液（Sigma-Aldrich 、カタログ番号Ｔ０８０９）に再懸濁した。使用前に５分間煮沸した１０μｌの１０ｍｇ／ｍｌサケ精巣ＤＮＡを含む約１μｇのプラスミドＤＮＡを、６００μｌのプレート緩衝液（Sigma-Aldrich 、カタログ番号Ｐ８９６６）とともに細胞懸濁液に添加し、よく混合した。混合物を室温でローターホイール内で最低速度で１６時間インキュベートした。次に、混合物に４２℃で１５分間熱ショックを与え、３５００ｒｐｍで３分間遠心分離し、細胞のペレットを２００μｌの滅菌水に再懸濁した。形質転換体の選択のために、最大１００μｌのアリコートを、ウラシルが欠如した合成ドロップアウト選択培地（ＳＤ－ＵＲＡ、Sigma-Aldrich 、カタログ番号Ｙ１５０１）上にプレーティングした。プレートを２８℃で３日間又はコロニーが出現するまで、インキュベートした。各プレートから２つ以上のコロニーを取り上げ、コロニーＰＣＲによって遺伝子構築体の存在を検査して、形質転換体を同定した。

【0401】

発現カセットの組み込みのためのワイ・リポリティカの形質転換
相同組換えによるワイ・リポリティカへの挿入のための発現カセット（転写単位）を含む遺伝子構築体のＤＮＡを、ＮｏｔＩ又は他の適切な制限酵素で消化して発現カセットを放出させた。線状化ＤＮＡを、Frozen-EZ Yeast Transformation II キット（Zymo Research, California, USA）を使用して調製した、選択したＵｒａ－ワイ・リポリティカ株又は所望の他の受容体株のコンピテント細胞に導入した。簡単に説明すると、ＮｏｔＩで消化し直線化した発現ベクター５μｌ（２μｇ）を、５０μｌコンピテント細胞及びキットの５００μｌのＥＺ３溶液と混合し、完全に混合した。陰性対照の形質転換は、遺伝子構築体のいかなるＤＮＡも含まないコンピテント細胞を含有した。混合物を２８℃で２時間インキュベートし、次に１００μｌをＳＤ－Ｕｒａプレートに、又は必要に応じて他の選択プレート、例えば抗生物質含有培地上に広げた。プレートを２８℃で２日間インキュベートした。受容体株が機能的ＵＲＡ３遺伝子が欠如した栄養要求株である場合、ＵＲＡ遺伝子を有するベクターを受け取った形質転換体のみがこれらのプレート上で増殖した。ワイ・リポリティカ形質転換では多くのコロニーが得られた。Ｕｒａ^＋又は抗生物質耐性コロニーを選択プレートから取り上げ、導入された遺伝子構築体及び目的の遺伝子改変に対応する表現型について、コロニーＰＣＲによって形質転換されたことを確認した。

【0402】

遺伝子発現解析
トランス遺伝子の発現は、細胞からＲＮＡを精製するためのDNase RQ1 キット（Promega カタログ番号Ｍ６１０１）とQiagenカラム（Qiagen RNAse-free DNAse）、及び標準的な方法を使用する逆転写用のオリゴｄＴプライマー（２００～５００ｎｇ）、ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）、Superscript III 逆転写酵素、及び０．１Ｍ ＤＴＴを使用して分析した。

【0403】

実施例２．微生物からの脂質の抽出
エス・セレビッシェやワイ・リポリティカなどの酵母からの脂質抽出は、これらの微生物の細胞壁が硬いため、より困難になる。酵母からの細胞破壊及び脂質抽出については、機械的、酵素的、化学的、浸透圧ショック、及びマイクロ波による細胞破壊法を含む様々な方法が文献に記載されている（Hein and Hayen, 2012）。Chisti and Moo-Young (1986) は、微生物細胞の破壊の機械的、化学的、酵素的方法、並びに浸透圧ショックによる細胞溶解をレビューした。Hegel et al. (2011) は、超臨界二酸化炭素を使用する酵母からの脂質抽出について記載した。Peter et al. (2017) は、酸化ジルコニウムビーズ、ブレットブレンダー、及び水浴超音波処理器を使用して、水／メタノール溶媒混合物中でシゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）細胞の細胞破壊とホモジナイゼーションを報告した。

【0404】

以下の実施例に記載の試験を実施するには、簡単で高処理能力かつ小規模な脂質抽出法が所望された。従って本発明者らは、エス・セレビッシェ及びワイ・リポリティカから脂質を抽出するためのいくつかの方法及び変法を試験し、特に脂質を抽出し抽出効率を試験するための有機溶媒による細胞物質の細胞壁破壊及びホモジナイゼーションのためのいくつかの方法を試験した。

【0405】

実験１－エス・セレビッシェからの脂質の抽出
ＫＣｌ溶液又はメタノールの存在下で、細胞破壊のために超音波処理を使用して酵母細胞からの脂質抽出効率を試験することを目的とする最初の実験で、エス・セレビッシェＩＮＶＳｃ１株を５ｍｌのＹＰＤ培地で３日間増殖させた。細胞を遠心分離によって採取し、実施例１に記載のように水で洗浄し凍結乾燥した。２ｍｌチューブ中の約２５ｍｇの同一の乾燥細胞ペレットを４つの方法で処理した：

【0406】

１Ａ．ＫＣｌ溶液中でホモジナイゼーション、クロロホルム／メタノールを使用して脂質抽出。
１Ｂ．ＫＣｌ溶液中でホモジナイゼーション、５分間の超音波処理、クロロホルム／メタノールを使用して脂質抽出。
２Ａ．メタノール中でホモジナイゼーション、クロロホルム／メタノール／ＫＣｌを使用して脂質抽出。
２Ｂ．メタノール中でホモジナイゼーション、５分間の超音波処理、クロロホルム／メタノール／ＫＣｌを使用して脂質抽出。

【0407】

方法１Ａでは、０．３ｍｌの１Ｍ ＫＣｌをチューブに加え、ジルコニウムビーズ（カタログ番号ＺＲＯＢ０５、Next Advance, Inc., USA）とブレットブレンダーブルー（Next Advance, Inc., USA）を使用して速度８で３分間撹拌し、続いて０．４ｍｌのメタノールと０．８ｍｌのクロロホルムを添加して、細胞を破壊した。混合物を５分間振盪し、１０，０００ｇで５分間遠心分離した。脂質を含む下相をガラスバイアルに移した。方法１Ｂの唯一の違いは、メタノールの添加後でクロロホルムの添加前に、水浴超音波処理装置（Bransonic M2800H-E, Branson Ultrasonic Corporation, USA）を５分間使用して、混合物を超音波処理する追加の工程であった。方法２Ａでは、酵母細胞及びジルコニウムビーズを含むチューブに０．３ｍｌのメタノールを添加し、ブレットブレンダーでホモジナイズし、続いて０．３ｍｌの１Ｍ ＫＣｌ、０．１ｍｌのメタノール、及び０．８ｍｌのクロロホルムを添加した。混合物を振盪し、遠心分離し、前と同様に下相を収集した。方法２Ｂは、ブレットブレンダーで細胞を破壊した後に超音波処理を行ったことを除いて、２Ａと同じであった。

【0408】

各試料について、窒素ガス流下で脂質試料から溶媒を蒸発させ、抽出された脂質を測定量のクロロホルムに溶解させた。各試料中の抽出された脂質の量を測定するために、クロロホルム中の脂質の測定アリコートを、ＰＴＴＥで裏打ちされたスクリューキャップを備えたＧＣバイアルに移した。窒素ガス下でクロロホルムを蒸発させた後、既知量のトリヘプタデカノイン（Nu-Chek Prep, Inc.、カタログ番号Ｔ－１５５、Waterville, MN, USA）をバイアルに添加した。各脂質試料中の脂肪酸を、実施例１に記載したように、ＦＡＭＥに変換しＧＣによって測定した。ピーク面積を積分し、既知量のヘプタデカノインと比較して、抽出された脂質中の脂肪酸の重量を算出した。

【0409】

抽出前に細胞内に存在する脂質の総量を測定するための対照として、二重の同一の細胞ペレット中のすべての脂質を、メタノール性ＨＣｌとトリヘプタデカノインによる直接メチル化によってＦＡＭＥに変換し、ＧＣで分析した。２つの対照の平均は、細胞脂肪酸含有量の１００％と見なされる総脂肪酸含有量を与えた。抽出された脂質中の総脂肪酸含有量と細胞脂肪酸含有量の比較により、試験した４つの方法の抽出効率が得られた。

【0410】

表４はこの実験のデータを提供する。この実験で試験した４つの方法のうち、方法２Ｂが凍結乾燥エス・セレビッシェ細胞から最も効率的な脂質抽出を提供し、全細胞脂肪酸含有量の６２．４％の収率を示した。方法２Ｂには、ジルコニウムビーズとブレットブレンダーを使用するメタノール中での細胞の破壊と、次の超音波処理が含まれた。一方、方法１Ｂでは、ＫＣｌ溶液中でのホモジナイゼーションと超音波処理による細胞破壊により、２６．２％の脂質抽出効率が得られた。方法１Ａ及び２Ａでは超音波処理が使用されなかったため、脂質抽出効率が低かった。

【0411】

実験２
より大きな細胞試料を用いて脂質抽出効率を推定し、細胞をクロロホルム／メタノール（２／１、ｖ／ｖ）の混合液中で破壊する方法と比較するために、別の実験を実施した。約４７ｍｇの乾燥細胞ペレットと０．５ｇのジルコニウムビーズを２ｍｌのエッペンドルフチューブに移した。方法３Ａでは、超音波処理を使用して脂質抽出効率を試験した。このために、０．４ｍｌのメタノールをチューブに加え、混合物を水浴中で４０℃で１０分間超音波処理した。次に、０．３ｍｌの１Ｍ ＫＣｌと０．８ｍｌのクロロホルムをチューブに添加し、混合物を５分間ボルテックス混合し、続いて１０，０００ｇで５分間遠心分離した。下相をガラスバイアルに集めた。０．８ｍｌのクロロホルムを添加し、混合物を５分間ボルテックス混合し、続いて遠心分離して下相を収集することにより２回目の抽出を行って、これをガラスバイアル中の最初の抽出物と合わせた。方法３Ｂでは、ジルコニウムビーズとブレットブレンダーの両方を速度８で５分間使用し、０．４ｍｌのメタノール中で細胞を破壊するために１０分間超音波処理したが、それ以外は方法３Ｂと同じであった。方法４では、メタノールではなくクロロホルム／メタノール（２／１、ｖ／ｖ）の混合物中で細胞破壊を試験した。抽出された脂質は実験１と同様に処理され定量された。実験１と同様に、細胞試料中の脂肪酸の直接メチル化により、総脂肪酸含有量が得られ、１００％と見なした。

【0412】

データは表４に示される。細胞をメタノール中で超音波処理により破壊した場合（方法３Ａ）、総脂質含有量の２７％が細胞から抽出された。ブレットブレンダーを使用し、さらに超音波処理によりメタノール中で細胞を破壊すると、総脂質の４６．４％が得られた。一方、クロロホルム／メタノール（２／１、ｖ／ｖ）の混合物中で細胞を破壊し、続いて超音波処理すると、エス・セレビッシェから抽出された脂質が最低レベルとなった。

【0413】

実験３
３回目の実験では、メタノール中で細胞をホモジナイゼーションするために、ガラスビーズ、ジルコニウムビーズ、又は金属ボールを使用し、及びビーズビーター又はボルテックス混合を使用して、エス・セレビッシェ 細胞からの脂質抽出効率を比較した。前の実験と同様に１０ｍｌの培養物から細胞を取得し、同一の細胞ペレットを処理した。ガラスビーズ、ジルコニウムビーズ、又は金属ボールをチューブに加え、以下のようにボルテックス混合するか、ブレットブレンダーを使用して混合した。

【0414】

方法５：０．３ｍｌのメタノール、０．５ｇのガラスビーズ（カタログ番号Ｇ８７７２、Sigma）、及び２つの１ｍｍ金属ボールを、細胞ペレットを含むチューブに加え、Vibramaxを使用して１０分間ボルテックス混合した。

【0415】

方法６：０．３ｍｌのメタノール、０．５ｇのジルコニウムビーズ（カタログ番号ＺＲＯＢ０５、Next Advance, Inc., USA）、及び２つの１ｍｍ金属ボールを、細胞を含む第２のチューブに加え、１０分間ボルテックス混合した。

【0416】

方法７：０．３ｍｌのメタノール及び０．５ｇのジルコニウムビーズを、細胞ペレットを含む第３のチューブに加え、１０分間ボルテックス混合した。

【0417】

方法８：０．３ｍｌのメタノール及び０．５ｇのジルコニウムビーズを、細胞ペレットを含む第４のチューブに加え、TissueLyser II（Qiagen Inc., Germantown, MD, USA）中で２５ｒｐｍ／秒で３分間振盪した。

【0418】

ホモジナイゼーション後、０．４ｍｌの１Ｍ ＫＣｌ、０．１ｍｌのメタノール、及び０．８ｍｌのクロロホルムを各チューブに加え、混合物をさらに５分間ボルテックス混合した。混合物を１０，０００ｇで５分間遠心分離し、下層のクロロホルム相をガラスバイアルに移した。前の実験と同様に、抽出された脂質試料を乾燥させ、脂肪酸をＦＡＭＥに変換し、ＧＣで定量した。

【0419】

脂質抽出プロセス中、混合物の遠心分離後の界面に細胞破片が蓄積した。細胞破片に残っている脂質を測定して、総脂質含有量を決定するために、細胞破片を凍結乾燥機で乾燥させた。既知量のトリヘプタデカノインを加え、０．７ｍｌのメタノール性ＨＣｌを使用して８０℃で２時間インキュベートすることにより脂肪酸をＦＡＭＥに変換した。ＦＡＭＥは、以前と同様にＧＣにより定量された。

【0420】

データは表４に示される。最も効率的な抽出は、ジルコニウムビーズをビーズビーターと共に使用する方法８であり、総脂肪酸含有量の６６．５％が抽出された。方法５～７では、方法８より抽出された脂質の量が少なかった（表４）。ビーズビーターを使用する脂質抽出の効率（方法８）は、ブレットブレンダーと超音波処理とを使用する細胞破壊を含む方法２Ｂ及び３Ｂと同様であった。最初の抽出後に細胞破片中に残存する脂質の脂肪酸組成は、抽出された脂質の脂肪酸組成と同じであった。

【表4】

【0421】

実験４．ワイ・リポリティカからの脂質の抽出
主な目的が細胞の脂肪酸組成を決定することであり、最大の抽出効率は必要なかったワイ・リポリティカにおける多くの分析について、本発明者らは、試料の高処理能力に適しているが十分な抽出脂質を提供する、より簡単な方法を日常的に使用することにした。この結論は、抽出された脂質の脂肪酸組成が細胞破片中に残っている残留脂質の組成と同じであり（表４）、従って細胞の脂肪酸含有量を代表するという上記の実験で得られた観察を考慮したものであった。簡単に説明すると、実施例１に記載したこの方法では、乾燥細胞ペレットをホモジナイズし、ジルコニウムビーズを含むクロロホルム／メタノール（２／１、ｖ／ｖ）溶液中の細胞をブレットブレンダーを使用して破壊し、続いて水浴超音波処理器内で超音波処理し、２０分間混合した。ＫＣｌ溶液の添加後、混合物を１０分間ボルテックス混合し、遠心分離して相を分離した。下相を収集した。上相に残っている脂質を別量のクロロホルムを使用して抽出し、抽出物を合わせて乾燥させた。

【0422】

培養物を遠心分離により採取した直後、ワイ・リポリティカ細胞を１０５℃で５分間熱処理して、細胞を死滅させ、細胞内又は細胞から全てのリパーゼを不活性化できるかどうかを調べるために、別の実験を実施した。さらに、細胞のアリコートは、脂質抽出前に凍結乾燥されたか、又は凍結乾燥されなかった。野生型Ｗ２９細胞からの脂質抽出物をＴＬＣで分析したところ、乾燥させずに加熱処理した細胞は、乾燥させていた細胞よりも遊離脂肪酸（ＦＦＡ）の生成が少ないことが観察され、加熱処理が効果的であることが示唆された。熱処理自体は細胞の脂質含有量や脂肪酸含有量に影響を与えなかった。乾燥させていない細胞からの脂質の抽出は、凍結乾燥させた細胞からの抽出と少なくとも同程度の効率であった。

【0423】

実施例３．微生物由来の脂質の含有量と組成
本発明者らは、ベースラインとしてトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）と極性脂質を含む、様々な微生物からの総脂質含有物の含有量と組成を決定した後に、脂質含有量と組成を改変するための微生物の遺伝子改変を実施したいと考えた。

【0424】

微生物の増殖と脂質の抽出
増殖サイクル中の微生物細胞内の極性脂質とＴＡＧを含む総脂質の量及び脂肪酸組成を決定するために、３つの異なる種の５つの広く使用されている菌株が選択された。これらは、大腸菌ＤＨ５α株及びＢＬ２１株、油性野生型ワイ・リポリティカＷ２９株、及びエス・セレビッシェＩＮＶＳｃ１株とＤ５Ａ株であった。これらの種は、遺伝子工学のための遺伝的ツールとプロセスが利用可能であること、及びこれらの種における脂質合成と代謝に関する情報の深さにより選択された。Ｄ５Ａ株は、エス・セレビッシェの油性株として選択された（He et al., 2018）。これらの微生物は、さまざまな時点で試料を取り出して分析しながら、最大７日間培養された。接種菌培養物は、大腸菌の場合はＬＢ培地、又は酵母の場合はＹＰＤ若しくはＳＤ＋Ｕｒａ培地中で、細胞を一晩増殖させることによって調製した。これらの培養物の試料を、１Ｌのボトル中の同じ増殖培地２００ｍｌで希釈して、初期ＯＤ６００を０．１にした。各ボトルの口を微細孔テープで覆い、培養物を振盪して通気した。大腸菌細胞は、振盪機中で、３７℃、２５０ｒｐｍでインキュベートした。酵母細胞は、２％グルコースを炭素源として含むＹＰＤ培地中で増殖させ、２８℃で２００ｒｐｍで振盪しながらインキュベートした。各培養物から１０ｍｌの試料を、１８時間、２４時間、２日、３日、４日、５日、６日、及び７日の時点で採取した。３，４００ｇで１０分間遠心分離して培養物から細胞を回収し、各回３ｍｌの脱イオン水で２回洗浄し、１．５ｍｌの脱イオン水で１回洗浄した。細胞を予め秤量した２ｍｌチューブに移し、２４時間凍結乾燥した。次に、チューブの重量を再度測定し、乾燥細胞重量を計算した後、脂質を抽出した。

【0425】

実施例１に記載のように、０．６ｍｌのクロロホルム／メタノール（２／１、ｖ／ｖ）を抽出溶媒として、ジルコニウムビーズの存在下で、ブレットブレンダーを使用して総細胞脂質を抽出し、続いて４０℃の水浴中で超音波処理した。ホモジネートを０．３ｍｌの０．１Ｍ ＫＣｌと１０分間混合した後、混合物を１０，０００ｇで５分間遠心分離した。脂質を含む下相をガラスバイアルに移した。残りの脂質を、細胞破片を含む上相から０．６ｍｌのクロロホルムで２０分間抽出し、前と同様に、遠心分離し、下相を収集した。合わせた下相から溶媒を窒素ガス流下で蒸発させ、抽出した脂質を所定量のクロロホルムに再懸濁した。乾燥細胞重量２０ｍｇから抽出した脂質のアリコートを、ヘキサン／ジエチルエーテル／酢酸（７０／３０／１、ｖ／ｖ／ｖ）の混合溶媒を使用してＴＬＣプレート上で分画し、実施例１に記載したように、ＴＡＧ脂質と極性脂質を分離した。再度、実施例１に記載のように、ＴＡＧからの脂質及び極性脂質スポットの脂肪酸組成を、脂質から生成されたＦＡＭＥのＧＣによって決定した。

【0426】

エス・セレビッシェを用いた最初の実験
最初の実験では、ＹＰＤ、及びＳＤ＋Ｕｒａ培地で１、２、３、又は４日間増殖させた後、エス・セレビッシェＩＮＶＳｃ１株の培養細胞から脂質を抽出した。抽出された脂質収量を乾燥細胞重量（ｄｃｗ）の割合として含むデータは表５に示される。ＴＬＣ分画におけるＴＡＧ及び極性脂質の回収効率は測定されなかった。ＩＮＶＳｃ１細胞によって産生されたＴＡＧの量は、ＹＰＤ培地で培養した場合には少なく、ＳＤ＋Ｕｒａ培地では多かったことが注目された。極性脂質の収率は乾燥細胞重量ベースで０．６３％～１．１５％であったが、この方法は効率的な抽出のための最大化はされなかった。脂肪酸組成に関して、両方の画分に最も多く存在する脂肪酸としてＣ１６：１Δ９が４７～６７％含まれていた。オレイン酸（Ｃ１８：１Δ９）とパルミチン酸（Ｃ１６：０）は、低レベルのステアリン酸（Ｃ１８：０）と同様に、存在する他の主要な脂肪酸であり、リノール酸（ＬＡ、Ｃ１８：２Δ９，１２）は存在しなかった。これらのデータは、４０～５５％のＣ１６：１、３０～３５％のＣ１８：１Δ９、及び少量のＣ１６：０とＣ１８：０の存在を報告した公表された報告書（例えば、Itoh and Kaneko, 1974; Stukey et al., 1989; Kamisaka et al., 2015）と一致していた。これら４つの脂肪酸は、多くの野生型エス・セレビッシェ株の脂肪酸含有量のほぼすべてを構成する。ＩＮＶＳｃ１などの野生型株は、一価不飽和パルミトレイン酸とオレイン酸を生成するＯＬＥ１遺伝子によってコードされるΔ９－デサチュラーゼである、１つのみの脂肪酸デサチュラーゼを含む（Stukey et al., 1989）。

【0427】

エス・セレビッシェと同様に、野生型分裂酵母エス・ポンベは、ＬＡ及び他の多価不飽和脂肪酸を合成することができない（Ratledge and Evans 1989; Holic et al., 2012）。対照的に、エス・クルイベリ（S. kluyveri）やケー・ラクチス（K. lactis）などの他の野生型酵母は、Δ１２－及びΔ１５－デサチュラーゼを有し、ＬＡ及びＡＬＡを産生することができる。

【0428】

最長７日間増殖後の大腸菌、ワイ・リポリティカ、及びエス・セレビッシェにおける脂肪酸組成
大腸菌、エス・セレビッシェ、及びワイ・リポリティカを用いて実験を行い、最長７日間毎日、培養物をサンプリングした。２つのエス・セレビッシェ株の増殖曲線は図１に示され、これは、７日間の培養にわたるＯＤ６００と乾燥細胞重量を示している。脂質の量及び脂肪酸組成は、各時点における各菌株の極性脂質とＴＡＧ画分の両方について決定された。データは、２つの大腸菌株については表６に、ワイ・リポリティカＷ２９株については表７に、エス・セレビッシェＩＮＶＳｃ１株とＤ５Ａ株については表８に示されている。脂肪酸Ｃ１５：０（ペンタデカン酸）の本体はＧＣ－ＭＳによって確認された。

【0429】

大腸菌ＢＬ２１株の極性脂質の脂肪酸組成は、Kanemasa et al. (1967) 、及び他の野生型大腸菌株についてはMarr and Ingraham (1962)が報告したものと同様であった。他の多くの細菌と同様に、大腸菌の極性脂質は４種類の脂肪酸を含む：Ｃ１２：０、Ｃ１４：０、Ｃ１５：０、Ｃ１６：０を含む直鎖飽和脂肪酸、Ｃ１６：１Δ９（シス－パルミトレイン酸）及びＣ１８：１Δ１１（シス－バクセン酸）を含む直鎖一価不飽和脂肪酸、分枝鎖脂肪酸、及びＣ１７：０ｃ^＊（シス－９，１０－メチレンヘキサデセン酸）及びＣ１９：０ｃ^＊（シス－１１，１２－メチレンオクタデセン酸）を含むシクロプロパン脂肪酸（Hildebrand and Law, 1964）。Ｃ１６：０、Ｃ１６：１、Ｃ１８：０、及びＣ１８：１Δ１１の存在は、Oldham et al. (2001)によって大腸菌ＢＬ２１株で報告された。野生型大腸菌に見られる不飽和脂肪酸はすべてシスコンフォメーションのモノエンであるが、オレイン酸は含まない（Cronan and Vagelos, 1972）。４種類の脂肪酸はすべて、ＢＬ２１から抽出された脂質で観察され、これは、約３１～３６％のＣ１８：１Δ１１と約７～１０％のＣ１６：１Δ９、並びに３０～３５％の飽和脂肪酸Ｃ１６：０（パルミチン酸）、１０～２０％のシクロプロパン脂肪酸Ｃ１７：０ｃ^＊、及び１～５％のＣ１９：０ｃ^＊を有した。これら後者の２つの脂肪酸は細菌の脂質に特有のものであり、動物性脂肪や酵母の脂質でまれに見られる。これらは、対応するモノエンＣ１６：１Δ９及びＣ１８：１Δ１１から、シクロプロパン脂肪酸シンターゼ（ＣＰＦＡＳ）の活性によって生成される。動物性脂肪で観察されたもう１つの違いは、ＬＡなどの多価不飽和脂肪酸が野生型大腸菌脂質には存在せず、これはＢＬ２１及びＤＨ５αで観察された。さらに、オレイン酸（Ｃ１８：１Δ９）は大腸菌の極性脂質では観察されなかったが、動物及び植物の脂質にはかなりのレベルで存在する。

【0430】

ＤＨ５α株は、その極性脂質中のいくつかの脂肪酸の量の点で、ＢＬ２１とは著しく異なる脂肪酸組成を示し、Ｃ１８：１Δ１１が約３～８％でかなり少なく、Ｃ１６：１Δ９が少ないが、Ｃ１６：０が多く、Ｃ１５：０及びシクロプロパン脂肪酸はかなり多い。ＤＨ５αでは、総脂肪酸含有量のほぼ半分がパルミチン酸であり、これはほぼ独占的にリン脂質のｓｎ－１位に位置していることが報告された（Cronan and Vagelos, 1972）。Hildebrand and Law (1964) は、大腸菌におけるシクロプロパン脂肪酸の存在を報告しており、これらはここＤＨ５αでも観察された。表９に示すように、ペンタデカン酸、ノナデカン酸（Ｃ１９：０）、及びシクロプロパン脂肪酸が極性脂質画分中で観察された。Ｃ１６：１及びＣ１８：１Δ１１のレベルがＢＬ２１と比較してＤＨ５αで低下していることは、Ｃ１４：０、Ｃ１５：０、Ｃ１６：０、及びシクロプロパン脂肪酸の量の増加を伴っていた。両方の大腸菌株では、脂質中に含まれるステアリン酸（Ｃ１８：０）は２％未満であった。極性脂質の最大量は、培養２日目に約２．７％のＤＣＷで観察された。

【0431】

ワイ・リポリティカの脂肪酸組成（表７）は、大腸菌及びエス・セレビッシェの脂肪酸組成とはかなり異なっていた。ワイ・リポリティカの脂質では、例えば、ＬＡなどの多価不飽和脂肪酸や、より長鎖の炭素数２０、２２、又は２４の飽和脂肪酸、Ｃ２０：０、Ｃ２２：０、及びＣ２４：０（ＶＬＣ－ＳＦＡ）など、より広範囲の脂肪酸が観察され、これらはすべてＴＡＧ画分に存在していた。Ｃ２４：０は、ほとんどの時点で３％～９％のレベルでＴＡＧ画分に存在していた。ＧＣクロマトグラムにおけるこの脂肪酸のピークはＣ２４：０標準物質と同じ位置にあり、ＧＣ－ＭＳによってもピークの本体がＣ２４：０であることが確認された。Ｃ２４：０は一般的に存在し、Ｃ２０：０やＣ２２：０は、重量基準で存在しないか、極性脂質画分の低レベル（＜０．５％）の総脂肪酸含有量に存在していた。ワイ・リポリティカは油性微生物であるが、富裕なＹＰＤ培地を使用したこの実験の増殖条件は高レベルのＴＡＧ産生に有利ではなかったため、乾燥細胞重量ベースで約１％未満のＴＡＧ産生であった。ＴＡＧは７日間にわたってその低レベルで蓄積し続けた。極性脂質の最高レベルは培養２日目に観察された。パルミチン酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、及びリノール酸は、ワイ・リポリティカの主要な脂肪酸であった。極性脂質にはまた、ペンタデカン酸やヘプタデセン酸などの奇数鎖脂肪酸とともに、低レベルの短鎖、中鎖、長鎖の飽和脂肪酸と一価不飽和脂肪酸も含んでいた（表７）。ペンタデカン酸のピークの本体はＧＣ－ＭＳによっても確認された。脂肪酸組成は、Carsanba et al., (2020)によって報告されたものと同様であった。しかし、本発明者らは、ここで観察されたレベルでワイ・リポリティカのＴＡＧにＣ２４：０が存在するという以前の報告を知らなかった。

【0432】

ワイ・リポリティカの極性脂質とＴＡＧ画分は、一部の脂肪酸の量が大きく異なることを示した。一般に、極性脂質にはＴＡＧよりも高いレベルのＬＡ及びパルミトレイン酸（Ｃ１６：１）が含まれており、一方でＴＡＧはパルミチン酸、ステアリン酸、及びリグノセリン酸（Ｃ２４：０）が豊富であった。特に、ＴＡＧは、極性脂質の１％未満と比較して、飽和脂肪酸ステアリン酸のレベルが約４～１２％～はるかに多く、並びに飽和Ｃ２０、Ｃ２２、及びＣ２４脂肪酸も多量に含んでいた。ワイ・リポリティカ極性脂質は大腸菌脂質と容易に区別でき、例えば前者は主な一価不飽和脂肪酸としてＣ１８：１Δ１１（バクセン酸）ではなくＣ１８：１Δ９（オレイン酸）を有していた。上で述べたように、大腸菌脂質にはオレイン酸が欠如していた。

【0433】

エス・セレビッシェＩＮＶＳｃ１株及びＤ５Ａの極性脂質とＴＡＧ画分には、主に４つの脂肪酸、一価不飽和脂肪酸のパルミトレイン酸（Ｃ１６：１Δ９）とオレイン酸（Ｃ１８：１Δ９）、及び飽和脂肪酸のパルミチン酸（Ｃ１６：０）とステアリン酸（Ｃ１８：０）が含まれていた。これらのデータは、公開された報告と一致していた（He et al., 2018）。極性脂質画分は、ＴＡＧ画分と比較して、飽和脂肪酸がわずかに多く、一価不飽和脂肪酸が低かった。

【0434】

ワイ・リポリティカ株のスクリーニング
CSIRO微生物コレクションからの他の５つのワイ・リポリティカ株を、脂質産生と脂肪酸組成についてスクリーニングした。これらの株を種培養物としてＳＤ－Ｕｒａ培地で４８時間増殖させた。種培養物の試料を遠心分離し、細胞ペレットをＤＭ－Ｇｌｕｃ培地に再懸濁し、これを使用して、炭素源として８％（ｗ／ｖ）グルコースと主な窒素源として４ｇ／ｌオルトリン酸水素二アンモニウムを含有するＤＭ－Ｇｌｕｃ培地中の培養物に接種した（実施例１）。４８時間後に細胞を採取し、脂質を抽出し、ＴＬＣで分画した。ＴＡＧ及び極性脂質画分を、実施例１に記載したようにＦＡＭＥのＧＣによって分析した。４つの株のデータは表９に示される。これらの株はすべて、野生型Ｗ２９株と同様の脂肪酸プロフィールを有するＴＡＧを産生した。これらの培養条件下で生成されたＴＡＧ画分の主な脂肪酸は、重量ベースでオレイン酸（３０～４５％）、パルミチン酸（１０～１７％）、ステアリン酸（１２～２４％）、及びリノール酸（４～７％）であった。特に、蓄積されたＴＡＧは、２．６～５．５％のＣ２４：０を含み、そしてＣ２０：０とＣ２２：０もそれぞれ約１～２％で存在した。

【表5】

【表6】

【表7】

【表8】

【表9】

【0435】

実施例４．微生物における脂質の大規模産生
バイオ発酵槽での大規模な、具体的には少なくとも２５Ｌの容量でのワイ・リポリティカの培養を調べるために、一連の実験を行った。最初の実験では、野生型ワイ・リポリティカＷ２９株を使用し、脂質は有機溶剤を使用して採取した細胞塊から抽出した。

【0436】

実験１（Ｂ００１）
２５Ｌスケールの最初の実験では、野生型ワイ・リポリティカＷ２９株を２５Ｌ発酵槽で増殖させて、より大規模なバッチ培養からのバイオマス生産、回収と乾燥、及び脂質抽出プロセスを試験した。この培養のさまざまな時点で、脂質の蓄積もモニタリングされた。増殖培地は、Hahn-Hagerdal et al. (2005)による総説の表１のＤＭ欄、第５頁に記載されている通りであり、以下の調整が加えられた：チアミンを除くすべてのビタミンが除がれた。リン酸二水素カリウムを１０ｇ／Ｌで添加し、硫酸アンモニウムを１０ｇ／Ｌのリン酸二アンモニウムで置き換え、クエン酸を２ｇ／Ｌで添加した。微量元素のＣｕＳＯ_４、ＮａＭｏＯ_４、ＭｎＣｌ_２、ＣｏＣｌ_２、Ｈ_３ＢＯ_３、及びＺｎＳＯ_４は、量を３倍から３０倍で変化させて、公開されているレシピに対して低い濃度で存在し、ＣａＣｌ_２は８倍増加した。追加のＳ、Ｎ、及びＰは無機酸として供給された。培養培地を発酵槽内でオートクレーブ滅菌し、熱処理後にチアミンを無菌的に添加して、２００ｇ／Ｌの滅菌濾過チアミンストック溶液を使用して最終濃度０．１５ｇ／Ｌにした。増殖培地は、炭素源として４０ｇ／ｋｇのグリセロールを有し、培養の開始時にｐＨ６．０であった。この培地の利点の１つは、これはオートクレーブ滅菌後にチアミンのみを添加することで、全体としてオートクレーブ滅菌できることである。

【0437】

発酵槽培養用のＷ２９株接種菌を、フラスコ中で２９℃、１８０ｒｐｍで２４時間振盪しながら、ＹＰＤ培地中の４００ｍｌ培養物として増殖させた。接種菌を発酵槽に添加し、混合物をサンプリングして時間ゼロ試料を得た。接種後、培養物のＯＤ６００は０．１３２であった。培養条件は、温度２９℃、ｐＨ設定値６．０、空気流量約３３Ｌ／分、スターラー約２００ＲＰＭであった。次のパラメーターがモニターされた：溶存酸素（ＤＯ）濃度とｐＨ。温度とｐＨ値をそれぞれの設定値に制御した。４７時間の時点（接種後）で培養物のｐＨ値を６．０から８．０に変更して、脂質の蓄積を刺激した。酵母の増殖は、６００ｎｍでＯＤ（ＯＤ６００）を測定することによってモニターされた。野生型ワイ・リポリティカは炭素源としてグリセロールで増殖中にクエン酸を分泌するため、培地中のクエン酸レベルもモニターした。培養中にＤＯは１０ｐｐｍから４８時間で約２ｐｐｍに減少した。クエン酸と一致するＨＰＬＣ保持時間を有する代謝物が培養物中で生成され、徐々に蓄積され、６０時間で約４０ｇ／Ｌに達したが、９０時間で約３３ｇ／Ｌに減少した。グリセロールの濃度は、４０時間でほぼゼロまで徐々に減少し、その時点で、次の８時間にわたって４．５Ｌの４００ｇ／ｋｇグリセロールを使用してグリセロール供給物を培養物に供給した。これにより、培地中のグリセロール濃度が約２０ｇ／ｋｇに増加し、次に、グリセロール濃度は６０時間の時点でゼロまで低下した。９０時間の時点で、細胞密度は約３０ｇ／ｋｇ（ＤＣＷ）に達し、その時点で培養を停止し、細胞を遠心分離によって採取した。バイオマスを２倍量の冷水で洗浄し、固形分１７％を有する３．２ｋｇの酵母クリームを得た。バイオマスの半分を、入口温度１６０℃、出口温度７８℃で噴霧乾燥し、１５６ｇの乾燥粉末を得た。固形分２０％を有する残りの１．７ｋｇを冷凍した。この材料の少量を凍結乾燥し、２２ｇの乾燥細胞を回収した。

【0438】

試料は、培養中の４２、６２、及び６８時間の時点、及び細胞の採取の９０時間の時点で取り出された。試料を噴霧乾燥又は凍結乾燥し、溶媒としてエタノール／ヘキサン（６０／４０；ｖ／ｖ）を使用して、脂質を２０時間抽出することにより脂質含有量を分析した。抽出した脂質の溶媒を真空下５０℃で蒸発させ、脂質をＣＯ_２流下で乾燥させた。乾燥した脂質を秤量した。４０時間～９０時間までの各時点で、回収された脂質の量は、乾燥細胞重量ベースで１７～２５％であった。組成を分析するために、抽出した脂質の試料を２ｍｌのエタノール／ヘキサン（６／４ｖ／ｖ）又は１ｍｌのクロロホルムに溶解し、２×５μｌアリコートをヘキサン／ジエチルエーテル／酢酸（７０／３０／１；ｖ／ｖ／ｖ）を使用して、ＴＬＣプレート（シリカゲル６０ Ｆ２５４、２５ｃｍｘ２５ｃｍ）上でクロマトグラフィーにかけた。プレートをヨウ素蒸気で３０分間染色して、脂質の種類を観察した。ＴＬＣプレートの起点で極性脂質のバンドが観察され、移動度の上昇に伴ってＤＡＧ、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）、及びＴＡＧのバンドが観察され、ＴＡＧバンドが最も強かった。

【0439】

この実験では、接種後約４０時間でグリセロールの枯渇によって決定されるように、最初のバッチ段階が終了した後、２．８ｋｇのグリセロールを培養物に供給した。接種後９０時間の実験終了までに、ほぼ同量のクエン酸とバイオマスが産生された。興味深いことに、細胞乾燥物１グラムあたりの抽出された脂質の最高レベルは、接種後６１．５時間で栄養供給物からのグリセロールが使い果たされた時点で発生した。この時点から実験が終了する９０時間までに、さらなる脂質生成は観察されなかった。この発酵では、２Ｌスケールで経験したよりも低い細胞密度が生成されたが、乾燥細胞重量ベースで約３０％対５％で有意に高いＴＡＧ蓄積があった。９０時間にわたるこの実験は、窒素制限が達成された後の大量のＴＡＧ生成のために設計された。おそらくは、窒素濃度とグリセロール濃度のバランスを取ることにより、良好なＴＡＧ産生を維持しながら細胞密度を増加させる改善が検討された。クエン酸の濃度は発酵の後半で減少し、グリセロールが使い果たされたときにクエン酸が炭素源として使用できることを示唆している。

【0440】

遠心分離によって酵母細胞をうまく採取でき、細胞ペレットを冷水に再懸濁し、次に細胞を再遠心分離してペーストにすることで、培養ブロスを細胞から除去できることが実証された。また、バイオマスを冷凍ペーストから凍結乾燥したり、固形分２０％の酵母クリームから噴霧乾燥したりできることも実証された。ＴＬＣ分析から、細胞からの溶媒抽出物の少なくとも３０％がＴＡＧであり、残りの脂質質量はＤＡＧ＞ＦＦＡ及び極性脂質の順に多くなったと結論付けられた。

【0441】

実験２及び３（Ｂ００３、Ｂ００４）
２５Ｌスケールのさらなる実験で、炭素源として４０ｇ／Ｌ又は７０ｇ／Ｌグリセロールを使用する培地で、野生型ワイ・リポリティカＷ２９株を増殖させて、さまざまなＣ／Ｎ比率でバイオマス産生と脂質産生を評価した。実験Ｂ００３では、実験Ｂ００１と比較して、最初の培地は４０ｇ／Ｌのグリセロール、０．１５ｇ／Ｌのチアミン、ｐＨ６．０を有し、クエン酸は添加されなかった。窒素源として、バッチ段階でバイオマスの成長を促進するために、リン酸二アンモニウム（ＤＡＰ）が１０ｇ／Ｌで存在した。従って、初期のＣ：Ｎ比は６：１であった。Ｗ２９細胞の１Ｌ接種菌を添加した後の初期細胞密度（ＯＤ６００）は０．２２で、ｐＨは６．２２であった。バイオマスは、１７時間で１５．７ｇ／Ｌのｄｃｗに達した。接種の２０時間後、グリセロールとＤＡＰを含む供給物（５Ｌ）を１時間あたり０．５Ｌで開始して、Ｃ：Ｎ比２０：１を得た。バイオマスは指数期に増殖を続け、２４時間で供給量の半分に相当する３０．５１ｇ／Ｌに達し、これは、２０時間でバッチ培地中に窒素が残っていることを示している。次に、バイオマスは定常期に達し、重要な栄養素が制限されていることを示唆した。２４時間培養試料には過剰なグリセロールとクエン酸が含まれていたため、制限栄養素は窒素である可能性があった。２４時間の時点から、クエン酸濃度は最大１４ｇ／Ｌまで増加したが、グリセロールは着実に消費され、供給培地が消費された３０時間の時点までに、最小値０．４６ｇ／Ｌになった。４５時間の発酵実験の終了時点で、ＤＣＷは３４．３ｇ／Ｌ、クエン酸濃度は７．６９ｇ／Ｌであった。実験Ｂ００１とは対照的に、採取バイオマスＤＣＷは２９．６ｇ／Ｌから３４．３ｇ／Ｌに増加し、採取上清中のクエン酸濃度は３３．４５ｇ／Ｌから７．６９ｇ／Ｌに減少した。ただし、エタノール／ヘキサン抽出可能な脂質含有量は、Ｂ００１の２８％からＢ００３の８％に低下した。回収した細胞を２倍量の冷１％ＮａＣｌ（ｗ／ｖ）で洗浄し、噴霧乾燥した。結論として、３０Ｌの発酵培養ブロスから６７１ｇの洗浄酵母粉末が生成された。栄養物質は実験Ｂ００１よりも効率的にバイオマスに変換されたが、脂質の蓄積は少なくなった。発酵を延長すると、脂質収量が増加すると予測された。

【0442】

実験Ｂ００４では、初期培地を７０ｇ／Ｌグリセロールに変更して、グリセロール供給開始の２４～３０時間前に、より早い窒素制限を行った。供給物には、唯一の窒素源として、いくらかの窒素を含む無機塩混合物が含まれていた。Ｃ：Ｎ比を２０：１から約１００：１に高めるために、供給物からＤＡＰを省略した。酸素消費量又はグリセロール枯渇の変化をモニターして、供給物の開始を知らせた。３２時間の時点で５０．１ｇ／Ｌのバイオマスが達成された。供給１の終了時点で、残留グリセロール及びクエン酸はそれぞれ１８ｇ／Ｌ及び１５ｇ／Ｌであった。供給１後のバッチ発酵を４７時間継続した。７Ｌのブロスを採取し、濃縮し、洗浄して冷凍した。供給１の後にｐＨ６で長時間培養した後、細胞の５０％がメチレンブルーで染色されたことが注目された。溶存酸素レベルは劇的に上昇し、培養物が代謝的に不活性であることを示しており、これはおそらく窒素枯渇によるものである。

【0443】

かなりの数の生細胞が存在したため、２回目の供給は供給１と同じ組成で開始したが、残りの生細胞に脂質が貯蔵される可能性があるかどうかを調べるために、ｐＨを８に調整した。２回目の供給後、バイオマスは４３ｇ／Ｌから４７ｇ／Ｌにわずかに増加した。残留グリセロール及びクエン酸は、２回目の供給中にそれぞれ２３ｇ／Ｌ及び２５ｇ／Ｌまで継続的に増加した。供給２の終了後さらに１６時間、バッチ発酵を継続した。実験の終了までに、クエン酸は４０ｇ／Ｌに増加し、残留グリセロールは９ｇ／Ｌに減少していた。発酵を７７時間で停止した。熱処理前に培養液７Ｌを採取した。バイオマスは、乾燥重量４１ｇ／Ｌ、中性脂質含有量１８％ｗ／ｗを有し、グリセロール及びクエン酸はそれぞれ９ｇ／Ｌ及び４０ｇ／Ｌであった。残りの培養物を１０５℃で５分間加熱して細胞を死滅させた。

【0444】

これらの実験から、大規模発酵により適切なバイオマスと脂質産生を備えた酵母細胞を産生できることが結論付けられた。

【0445】

実施例５．脂質の抽出と分画－大規模
発酵槽中で少なくとも２Ｌ又は８Ｌの容量で増殖させたワイ・リポリティカ細胞から、大規模に、脂質の抽出、及びＴＡＧ及びリン脂質を含む脂質の精製／分画を試験するために、以下の実験を実行した。

【0446】

実験１
本発明者らは、エタノール：ヘキサンの溶媒混合物を使用することにより、ワイ・リポリティカなどの微生物細胞から脂質を抽出し、同時にＴＡＧと極性脂質を分離できると考えた。この方法は、Sun et al. (2019) に基づいている。湿重量約１００ｇのワイ・リポリティカ細胞を使用し、ＴＡＧと極性脂質を細胞から効果的に抽出し、それぞれヘキサン相とエタノール－水相に分配できるかどうかを試験した。この実験では、細胞の湿重量１０２．１２ｇ（細胞の乾燥重量２０．４２ｇ、すなわち水分約８０％と固形分２０％に相当）を５００ｍｌのエタノール／ヘキサン（４／６、ｖ／ｖ）と、１Ｌのビーカー中で一晩撹拌して混合した。これにより、細胞の湿重量に基づいて１／５（ｗ／ｖ）、又は細胞の乾燥重量に基づいて１／２５（ｗ／ｖ）の試料／溶媒比が得られた。一晩混合した後、混合物は２相に分離し、界面に細胞物質が凝集した。上部のヘキサン相は淡黄色であり、下部のエタノール相は淡緑色であった。混合物をデカントし、ガラス真空濾過装置を使用してガラス繊維フィルター（１．２μｍ、MicroAnalytix Pty Ltd、カタログ番号ＷＨ１８２２－０９０）で濾過して、凝集した細胞物質を除去し、残渣を１００ｍｌのエタノール／ヘキサン（４／６ｖ／ｖ）溶媒ですすぎ、濾液を合わせた。濾液を分液漏斗で２相に分離した：ＴＡＧの大部分が含まれることが期待された上部のヘキサン相と、ＰＬを含む極性脂質の大部分が含まれることが期待された下部のエタノール相。２つの相を１Ｌ丸底フラスコに別々に集め、ロータリーエバポレーターを使用して乾燥させた。乾燥抽出物を秤量し、ヘキサン相から抽出された脂質０．５１３ｇ（乾燥細胞重量２０．４２ｇの２．５１％）、及びエタノール相から抽出された脂質３．６９ｇ（１８．０６％ ｗ／ｄｃｗ）を得た。両方の画分をクロロホルムで洗浄して痕跡量の水を除去し、クロロホルムを加えた後、ロータリーエバポレーションロータリーエバポレーターで蒸発させ、クロロホルムの添加により透明な水を含まない抽出物が得られるまで、この工程を繰り返した。これにより、上相から０．５１ｇの脂質が回収され、エタノール相から３．４３ｇの脂質が回収された。

【0447】

抽出された脂質を輸送に適したチューブに移すために、極性脂質抽出物を２６ｍｌのクロロホルムに溶解し、５０ｍｌのプラスチック遠心分離チューブに移し、Savant SC250EXP SpeedVac濃縮器を使用して４５℃で一晩溶媒を蒸発させた。

【0448】

抽出された脂質画分の試料をＴＬＣプレートに適用し、クロマトグラフィーを行って、さまざまな脂質クラスを分離した。ＦＡＭＥの定量によって決定されるように、上層のヘキサン相からの抽出物は２４．９％の脂質を含有し、その６０％はＴＡＧであったが、脂質の４０％にかなりの極性脂質も含有していた。下部のエタノール相からの抽出物は９．５％の脂質が含有し、その９５％は極性脂質であり、その画分ではＴＡＧは検出されなかった。

【0449】

確立された方法を使用して、同じ条件下で増殖させたワイ・リポリティカ細胞から抽出可能な総脂質の量を決定し、エタノール／ヘキサン抽出が十分に効率的であるかどうかを試験するために、Bligh and Dyer (1959)に基づく標準的操作を使用して同様の量の細胞から脂質を抽出した。簡単に説明すると、約２０％の全固形分を有する１０３．０８ｇの凍結湿潤細胞ペレットを１Ｌガラスビーカーに入れた。１６６．７ｍｌのクロロホルム、２６６．３ｍｌのメタノール、及び５３．４ｍｌの水を含むクロロホルム／メタノール／水溶媒を添加した。凍結ペレットを溶媒中でスプーンを使用して細かく砕いた。ビーカーをアルミホイルで覆い、混合物をマグネティックスターラーを用いて室温で一晩撹拌した。次に、混合物をガラス繊維フィルターを通して真空濾過し、細胞物質の残留物を１３１ｍｌのクロロホルム及び１０３ｍｌの水ですすぎ、再度濾過した。全濾液を１Ｌの分液漏斗に移し、穏やかに振盪し、相分離が起きるまで数時間放置した。抽出された脂質を含む底部のクロロホルム層を２５０ｍｌの丸底フラスコに排出し、回転真空蒸発により溶媒を除去した。フラスコ内の総脂質抽出物を重量収量決定のために秤量した：湿った酵母細胞ペレットの水分含有量が８０％であると仮定すると、乾燥細胞重量ベースで２．０６ｇの脂質収量は９．９７％であった。総脂質抽出物を２６ｍｌのクロロホルムに溶解し、試料をＦＡＭＥに変換し、実施例１に記載したようにＧＣにより定量した。

【0450】

Bligh-Dyer法で抽出した脂質の試料もＴＬＣプレートに適用し、クロマトグラフ処理して、さまざまな脂質クラスを分離した。既知の脂質クラスの標準物質を隣接するレーンに適用して、脂質スポットを同定した。これにより、Bligh-Dyer 抽出物中の極性脂質とＴＡＧ画分が同定され、それらの定量が可能になった。Bligh-Dyer 抽出物には総脂質が２８．３％含まれており、そのうち７％がＴＡＧ、そしてそのうち９３％が極性脂質であった。エタノール／ヘキサン法を使用した抽出は、Bligh-Dyer 法とほぼ同じ効率であり、エタノール／ヘキサンが溶剤系が有用であることを示していた。

【0451】

上相（ヘキサン）及び下相（エタノール）からの抽出物について、実施例１に記載したように、ＦＡＭＥへの変換及びＧＣ分析により、各画分の試料を脂肪酸組成について分析した。ＴＬＣプレート上で分離された極性脂質とＴＡＧ画分について、脂肪酸組成も個別に測定された。データは表１０に示される。実験１では、下層（エタノール）相で抽出された脂質は、主に（９５％）極性脂質を含み、これは、上層（ヘキサン）相で抽出されたＴＡＧよりも、飽和脂肪酸Ｃ１８：０、Ｃ２２：０、及びＣ２４：０がはるかに低い脂肪酸組成を有した。対照的に、Ｃ１６：０のレベルは、同じ上相からの極性脂質とＴＡＧ画分の両方で１６～１８％で同様であった。

【0452】

この実験からの１つの結論は、下部のエタノール相から抽出された脂質はほぼ完全に極性脂質であり、本質的にＴＡＧが欠如しているということであった。ただし、この方法では利用可能な極性脂質のすべてが抽出されておらず、上部のヘキサン相にかなりの極性脂質が残っている。残った極性脂質は、脱ガム操作によって回収することができる。エタノール相から抽出された物質は重量でわずか９．５重量％の脂質であり、タンパク質と炭水化物はクロロホルムに溶けないため、残りの９０％の物質（おそらく一部のタンパク質や炭水化物などのエタノール可溶性物質）は脂質をクロロホルムに抽出することである程度除去することができる。

【表10】

【0453】

実験２
使用する溶媒を変更した以外は実験１と同じ第２の実験を行った。今回は、湿重量９９．８ｇの細胞の抽出に、最初に５００ｍｌの、エタノール：ヘキサン（４／６ｖ／ｖ）ではなく（６／４ｖ／ｖ）を使用し、次に（４：６ｖ／ｖ）に調整した。実験１では、おそらく細胞試料中の水分の量が原因で、抽出の開始時でも相が分離する傾向があったために、この変更を行った。この第２の実験では、室温で一晩撹拌することにより、細胞をエタノール／ヘキサン（６／４ｖ／ｖ）と混合した。次に、溶媒混合物がエタノール／ヘキサン（４／６ｖ／ｖ）となるように２５０ｍｌのヘキサンを加え、さらに５分間混合した。残りの操作は実験１と同じであった。生成物は、最初に上部のヘキサン相から１．２３ｇ（６．１６％ｗ／ｄｃｗ）、下部のエタノール相から４．０５ｇ（２０．２９％ｗ／ｄｃｗ）回収した。抽出物をクロロホルムで洗浄し乾燥した後、回収量はそれぞれ６．１６ｇと１９．８９ｇであった。

【0454】

これらの実験と以下の実験から、この溶媒抽出法は、一晩の抽出中に混合物が適切に撹拌されている限り、非常にうまく機能すると結論づけられた。最適化のために条件を変更し、例えば、溶媒の量、比率、抽出時間、温度などの条件を変更し、湿潤細胞と乾燥細胞から始めた。乾燥細胞から高温で抽出すると、総脂質、ＴＡＧ、及び極性脂質画分の収量が増加すると予測された。

【0455】

実験３
実験１と２のバッチ抽出では、細胞の湿重量１００ｇあたり約５００ｍｌの回収脂質量に対して大量の溶媒が使用されたため、ソックスレー装置を使用して抽出を試験することが決定された（De Castro et al., 2010）。この実験では実験２と同じ溶媒組成を使用し、エタノール／ヘキサン（６／４、ｖ／ｖ）から開始し、次にヘキサンを加えて比率を（４／６、ｖ／ｖ）に調整した。４ｇの細胞乾燥重量を有する２０ｇ（湿重量）の細胞試料をソックスレーカップに加えた。抽出にはフラスコ内で３００ｍｌのエタノール／ヘキサン（６／４、ｖ／ｖ）を使用し、マントルヒーターを使用して溶媒を３時間加熱し、水道水で冷却器を冷却した。３時間の抽出後、フラスコを１５０ｍｌのヘキサンですすぎ、それにより溶媒比をエタノール／ヘキサン（４／６、ｖ／ｖ）に調整した。残りの操作は実験１と同じで、上部のヘキサン相と下部のエタノール相から脂質を回収した。上相からの脂質回収率は５．４％（ｗ／ｄｃｗ）、そして下相からは１７％（ｗ／ｄｃｗ）であり、従って、実験１、２と比較して、より短時間でほぼ同等の極性脂質収率が得られた。この方法には、より大きな１ｋｇ又は５ｋｇのソックスレー装置又はさらに大規模なパイロットスケール抽出を使用することでスケールアップできる可能性があると考えられた。

【0456】

実験４
実験２と同様の溶媒系を使用し、エタノール／ヘキサンの初期比６／４（ｖ／ｖ）、次にエタノール／ヘキサン４／６（ｖ／ｖ）を使用して、９００ｇ（湿重量）の細胞のバッチ抽出を行った。抽出は３つの２Ｌフラスコで実施された。上相からの脂質の回収量は１０．８９ｇでほとんどがＴＡＧであり、下相からの回収量は３２．４５ｇでほとんどが極性脂質であった。これは、抽出された極性脂質の収率１８％（ｄｃｗベースのｗ／ｗ）は示した。極性脂質画分は非常に粘稠であったが、５０℃に温めることで蒸発フラスコから移すことができた。

【0457】

実験５
室温で行われた以前の実験と比較して、５０℃の暖かい温度で６／４（ｖ／ｖ）のエタノール／ヘキサンを使用して、湿ったワイ・リポリティカ細胞からの脂質抽出効率を粉末状の凍結乾燥細胞と比較する実験を実施した。抽出は３時間行うか、同じ溶媒を使用してソックスレー装置で３時間行った。抽出が完了した後、さらにヘキサンを加えてエタノール／ヘキサンの比を４／６（ｖ／ｖ）に調整した。ワイ・リポリティカＷ２９株細胞は、極性脂質にω６脂肪酸を組み込むためにＡＲＡの存在下で増殖させておいた。溶媒と乾燥細胞の混合物は単相となったが、湿潤細胞からの対応する混合物は水分含有量により２相になった。従って、前の混合物の半分に少量の水を加え、混合すると、２つの相が分離した。混合物を濾過して細胞破片を除去し、各相から脂質を回収した。結果は表１１に示される。乾燥細胞については、脂質を単相抽出物から回収し、少量の水を加えた後の２相から別々に回収した。

【0458】

実験６．有機溶媒による大規模な脂質の抽出
ｆａｄ２及びｕｒａ３変異を有し（以下の実施例７）、Ｕｒａ３遺伝子を含む３つの遺伝子を有する遺伝子構築体を含むワイ・リポリティカ株を、１０Ｌ発酵槽内で、８％グリセロール（ｗ／ｖ）を炭素源として含み、より低い窒素含有量を有する８Ｌの培養容量（ＤＭ－Ｇｌｙｃ－ＬｏｗＮ培地、実施例１）で増殖させて、ＴＡＧ生成を誘導した。その培地中で４８時間後の培養物のＯＤ６００は１３９であり、乾燥細胞収量は約５２ｇ／Ｌであった。４８時間の培養後、培養物全体を１０５℃で５分間熱処理して細胞を死滅させた。遠心分離により細胞を採取し、乾燥細胞重量含有量が約２６％である細胞ペースト約１．６ｋｇ（湿重量）を得た。採取した細胞を試料に分割し、以下のようにさまざまな抽出方法を比較した。

【表11】

【0459】

溶媒としてエタノール／ヘキサンを使用する最初の方法では、３８１ｇの細胞ペーストを、エタノール／ヘキサン（６０／４０ｖ／ｖ）を用いて、約５：１（ｖ／ｗ）の溶媒：湿細胞重量比（これは、乾燥重量ベースで約２０：１（ｖ／ｗ）に等しい）を使用して抽出した。これには、１１４４ｍｌのエタノールと７６２ｍｌのヘキサンを使用した。抽出を室温で一晩継続的に撹拌しながら実施し、次に、混合物を濾過して細胞破片を除去した。ヘキサン９５０ｍｌを加えて、液体のエタノール／ヘキサン比を４０／６０（ｖ／ｖ）に調整し、抽出したペレットを洗浄した。再度濾過して残留固体を除去した後、液相をプールして混合し、分液漏斗で相を分離させた。上（ヘキサン）層を収集し、４０℃、２５ｍｂａｒで３０分間ロータリーエバポレーターで蒸発させてヘキサンを除去し、２．１５ｇの抽出脂質試料を得た。これは、乾燥細胞重量に基づいて２．１６％の抽出収率を示した。実施例１に記載したように、抽出した物質のアリコートをＴＬＣで分析して脂質クラスを分離し、ＦＡＭＥのＧＣで定量した。この物質の脂肪酸含有量は３９．２重量％であり、これには２２．６重量％のＴＡＧと１０．８重量％の極性脂質が含まれていた。これは室温では固体であったため、油ではなく抽出された脂肪と見なされた。

【0460】

湿潤細胞ペーストの脱水後のヘキサン抽出を使用する第２の方法では、３８１ｇの湿潤細胞ペーストを７６０ｍｌのエタノールに再懸濁し、濾過して細胞を回収した。２回目の７６０ｍｌのエタノールの細胞への再懸濁を行い、再び濾過して回収した。この処理は、細胞ペーストからほとんどすべての水を除去することを目的とした。次に、細胞をヘキサン（１．９Ｌ）を用いて、ヘキサン：湿細胞比５：１（ｖ／ｗ）、乾燥細胞重量ベースで約２５：１を使用して抽出し、混合液を室温で一晩撹拌した。上層（全容量の約９５％）を収集し、ロータリーエバポレーターで蒸発させて、７．６０ｇの抽出脂質試料を得た。これは、乾燥細胞重量に基づいて７．６７％の抽出収率を示した。実施例１に記載したように、抽出した物質のアリコートをＴＬＣで分析して脂質クラスを分離し、ＦＡＭＥのＧＣで定量した。この試料の総脂肪酸含有量は３７．１重量％であり、これには２４重量％のＴＡＧと、１１．５重量％の極性脂質が含まれていた。これは室温では固体であったため、油ではなく抽出された脂肪と見なされた。

【0461】

エタノール／ヘキサンではなくＤＭＳＯ／ヘキサン溶媒を使用する第３の方法では、最初の方法と同様であるが、エタノール／ヘキサンの代わりにＤＭＳＯ／ヘキサンを使用し、６０．１ｇの湿潤細胞ペーストを２０ｍｌのＤＭＳＯ及び３００ｍｌのヘキサンと混合し、室温で一晩撹拌した。以下の工程は、最初の方法と本質的に同じであった。この方法では、乾燥細胞重量ベースで約０．５％という比較的低い脂質収率が得られた。実施例１に記載したように、抽出された物質のアリコートをＴＬＣで分析して脂質の種類を分離し、ＦＡＭＥのＧＣで定量した。この試料の脂肪酸含有量は４３．５重量％であり、これには１９．９重量％のＴＡＧと１７．１重量％の極性脂質が含まれていた。この方法は明らかに他の２つの方法よりも脂質、特にＴＡＧの抽出量が少ないため、好ましくなかった。

【0462】

試験した方法の中で 第２の方法はより効率的であり、ヘキサンを用いる抽出が、ワイ・リポリティカを含む酵母細胞などの１ｋｇ以上（湿重量又は乾燥重量）の微生物細胞の抽出に適しており、細胞塊の水分含有量は十分に低いと結論付けられた。

【0463】

第１及び第２の方法からの抽出脂質試料を、脂質をヘキサンに溶解し、混合物をチューブに移し、窒素流下でヘキサンを蒸発させることにより、１０ｍｌのガラスチューブに移した。抽出された脂質は窒素でフラッシュし、酸化を防ぐために密封した後、室温で保管した。水分又は残留溶媒の存在を試験するために、試料を一晩凍結乾燥した。前後の試料の重量を測定することにより、最初の抽出物には１４．５％の水又は溶媒が含まれているのに対し、第２の抽出物には２３．７％の水又は溶媒が含まれていることが判明した。これらを除去すると、最初の抽出物の脂肪酸含有量は重量ベースで４６％であり、第２の抽出物の脂肪酸含有量は４９％であった。

【0464】

少なくとも一部の非脂質化合物を除去することによって第１及び第２の抽出物中の脂質をさらに精製するために、抽出された脂質をある容量のクロロホルムに溶解し、次に半分の容量のメタノールを添加し、続いて０．８倍容量の０．１Ｍ ＫＣｌ水溶液を添加した。これは、Bligh and Dyer (1959)の溶媒混合物に従った。各溶液を完全に混合し、２つの相を分離させた。下層（クロロホルム）を回収した。２回目の抽出で、別量のクロロホルム／メタノールを上相に加え、クロロホルム相を合わせた。各クロロホルム溶液から溶媒を蒸発させた。得られた脂質生成物は、ＦＡＭＥのＧＣ分析により測定したところ、第１の試料では７８重量％、そして第２の試料では７０重量％の総脂肪酸含有量を有していた。これらの生成物は、有機溶媒であるクロロホルム及びヘキサンに可溶であったため、純粋な脂質であると考えられた。精製工程によって除去された物質は、クロロホルムよりもメタノール／水相に溶解しやすい物質であると考えられ、おそらくいくつかのタンパク質が含まれていたと考えられる。精製、抽出された脂質には、ＴＡＧ及び極性脂質以外の脂質、例えばステロール、ステロールエステル、一部の色素などが含まれていると考えられた。ＴＡＧはまた、ＴＬＣによる分画によってこれらの試料から精製された。

【0465】

アセトンからの沈殿による極性脂質と非極性脂質の分画
規定の温度で有機溶媒から沈殿させることにより、飽和及び不飽和脂肪酸を含む脂質が飽和脂肪酸含有量を濃縮できるかどうかを試験するための実験が実施された。これを実施するために、９７ｍｇのカカオ脂（Societe Africaine De Cacao）と、ＡＲＡの存在下で培養されたワイ・リポリティカ細胞から抽出された約２ｍｇの極性脂質（総脂肪酸含有量中約１６．４％のＡＲＡを有する）とを、１５ｍｌのチューブ中で５０℃で混合した。混合物を４０℃の水浴中で５分間超音波処理し、次に３７℃で１５分間混合することにより、脂質を５ｍｌのアセトンに溶解した。飽和脂肪酸が豊富に含まれるため、カカオ脂を使用した。アセトン中の脂質混合物を、混合しながら２０℃で２４時間インキュベートした。この温度では沈殿物は明確には観察されなかった。しかし、混合物を４，６００ｇで１５分間遠心分離し、上清を新しいチューブに移し、これを１５℃で２４時間インキュベートした。最初のチューブは、観察された小さなペレットの脂質分析のために－２０℃で保管された。前と同様に混合物を遠心分離した後、１５℃の上清を新しいチューブに移し、１２．５℃で２４時間インキュベートした後、かなりの沈殿が観察された。混合物を再度遠心分離し、上清を新しいチューブに移した。ペレットを２ｍｌの冷（１２．５℃）アセトンで穏やかに混合して洗浄し、上清を以前の上清と合わせ、これを１０℃で３日間インキュベートした。遠心分離後、上清を再び新しいチューブに移し、ペレットを２ｍｌの冷アセトンで洗浄し、上清を以前の上清と合わせ、これを４℃で２４時間インキュベートした。遠心分離後、上清を再度新しいチューブに回収し、ペレットを２ｍｌの冷アセトンで洗浄し、上清を４℃の上清と合わせた。すべてのペレット及び上清からアセトンを室温で窒素流下で蒸発させ、乾燥して、回収した脂質をクロロホルムに溶解した。沈殿物及び上清画分のＴＡＧ及び極性脂質クラスを、ヘキサン／ジエチルエーテル／酢酸（７０／３０／１）を使用するＴＬＣクロマトグラフィーによって分離し、ＦＡＭＥのＧＣによって脂肪酸組成を定量及び分析した。

【0466】

データは表１２に示される。ＴＡＧ及び極性脂質は、試験したすべての温度、すなわち２０℃、１５℃、１２．５℃、１０℃、及び４℃で沈殿した。最大量のＴＡＧは１２．５℃で沈殿し（４１％）、続いて４℃で２１．９％が沈殿し、一方、２０℃では極性脂質の３０．７％が沈殿した。極性脂質の大部分（６０．９％）は４℃で上清に残り、極性脂質の総脂肪酸含有量の１６．４％から２４．８％のＡＲＡレベルに濃縮された。４℃の上清にも、総ＴＡＧの２７．４％が含まれていた。２０℃と１５℃で沈殿した極性脂質は、Ｃ１８：１とＣ１８：２が豊富であったが、一方、１２．５℃、１０℃、及び４℃で沈殿した極性脂質はＣ１６：０とＣ１８：０が多く、ＡＲＡの含有率は低かった。一方、より高い温度で沈殿したＴＡＧには高レベルのＣ１８：０が含まれていたのに対し、より低い温度で沈殿したＴＡＧにはＣ１６：０、Ｃ１８：１、及びＣ１８：２が豊富に含まれていた。従って、アセトン又は同様の溶媒からの沈殿を使用して、ＳＦＡ脂肪酸含有量を増加させ、抽出された脂質中の極性脂質／非極性脂質（ＴＡＧ）比を減少させることができる。ＰＵＦＡと一部のＭＵＦＡを除去してＳＦＡを濃縮することにより、抽出された脂質のＳＦＡ含有量を増やすために使用することができる。混合物にＴＡＧ結晶の接種することにより、さらなる最適化作業を行って、ＴＡＧの沈殿と低温の適用を増強することができる。

【0467】

実施例６．多価不飽和脂肪酸を減らすための微生物の改変
多くの酵母は、リノール酸（ＬＡ、Ｃ１８：２Δ９，１２）やα－リノレン酸（ＡＬＡ、Ｃ１８：３Δ９，１２，１５）などの多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）を産生し、これらはＴＡＧを含む油に、及びリン脂質などのこれらの膜脂質に取り込まれる。ＬＡ及びＬＡ由来の他のＰＵＦＡの産生には、ＦＡＤ２遺伝子によってコードされるΔ１２デサチュラーゼの活性が必要であるが、ＬＡからＡＬＡを産生するための３番目の二重結合の取り込みには、さらにΔ１５デサチュラーゼが必要である。添加された脂肪酸が欠如した富裕培地で培養すると、野生型ワイ・リポリティカＷ２９株はω６脂肪酸ＬＡを産生した（実施例３、表７）。いくつかの試料では、Ｗ２９株はまた、微量のω６脂肪酸Ｃ２０：２Δ１１，１４も産生し、これは、ＬＡの２炭素伸長生成物であった。ＡＬＡはＴＡＧ及びリン脂質に存在しないため、Ｗ２９株はΔ１５デサチュラーゼが欠如しているように見えた。ＦＡＤ２遺伝子は、Yadav and Zhang （ＷＯ２００４／１０４１６７） 及び Tezaki et al. (2017)によって、ワイ・リポリティカからクローニングされ、Δ１２デサチュラーゼをコードすることが示された。彼らはまた、ＬＡを産生しない欠失変異体（ｆａｄ２）も作製した。この変異体は、増殖培地にＬＡが添加されていない場合、１２℃での増殖が損なわれた。

【表12】

【0468】

ワイ・リポリティカΔ１２デサチュラーゼ（配列番号１）は、４１９個のアミノ酸残基のタンパク質である。このタンパク質には、脂肪酸デサチュラーゼに典型的な３つのヒスチジンモチーフが、アミノ酸位置１２１～１２５、１５７～１６１、及び３４３～３４７に含まれている。これらのヒスチジンモチーフは、すべてのＦＡＤ２ホモログ間で高度に保存されている。ワイ・リポリティカΔ１２デサチュラーゼを他の微生物デサチュラーゼと比較した場合、このタンパク質は、子嚢菌酵母であるエス・クルイベリ（登録番号Ｑ７６５Ｎ３）、ケー・パストリス（Ｑ５ＢＵ９９）、ケー・ラクチス（Ｑ６ＣＫＹ７）、シー・アルビカンス（C. albicans）（Ｑ５９ＷＴ３）、シー・パラプシロシス（C. parapsilosis）（Ｃ３Ｗ９５６）、及びオー・ポリモルファ（O. Polymorpha）（Ｅ５ＤＣＪ６）(Tezakietal.,2017)に関連しているが、系統学的には異なっていた。ＦＡＤ２ホモログの多重配列アラインメントにより、真菌ホモログが、配列番号１の位置１０２～３７５のアミノ酸領域にわたる脂肪酸デサチュラーゼドメイン（ＰＦ００４８７）内で少なくとも４６％の配列相同性を示すことが明らかになった。

【0469】

ワイ・リポリティカにＦＡＤ２遺伝子欠失を導入するための遺伝子構築体
本発明者らは、内因性Δ１２デサチュラーゼがオレイン酸をＬＡに変換する能力を低下させ、それによりワイ・リポリティカ中のＰＵＦＡの量を低下させたいと考えた。ＦＡＤ２遺伝子のタンパク質コード配列をワイ・リポリティカのゲノムから欠失させ、それにより遺伝子を完全に不活性化し、ヌル変異を提供するために、Fickers et al. (2003)の一般的な戦略を、以下のように異なる制限酵素部位を使用するための改変を加えて使用した。この戦略の概略図は図２に示される。この戦略には、目的の遺伝子のタンパク質コード領域が選択マーカー遺伝子で置換され、５'上流及び３'下流の配列（これらは、内因性遺伝子への組換えによる遺伝子カセットの組み込みを提供し、それによりタンパク質コード領域を削除する）が隣接する遺伝子カセットの構築が含まれた。遺伝子構築体は、抗生物質であるヒグロマイシン又はヌルセオスリシンに対する耐性を提供する選択マーカー遺伝子を使用し、状況に適した選択肢を提供した。それぞれ１，０００塩基対の５'上流及び３'下流の配列は標的遺伝子と相同であり、各領域での組換えを可能にした。

【0470】

ワイ・リポリティカＷ２９株のＦＡＤ２遺伝子のヌクレオチド配列、及びその上流配列及び下流配列を、ＫＥＧＧヤロウィアデータベース（www.genome.jp/kegg-bin/show_organism?org=yli）から、既知のアミノ酸配列をクエリとして使用して、遺伝子ＹＡＬＩ０Ｂ１０１５３ｐ（登録番号ＸＰ＿５００７０７）として抽出した。本明細書の配列番号２は、おそらくＦＡＤ２プロモーターを含むタンパク質コード配列の上流の１，０００ヌクレオチドと、それに続くタンパク質コード配列とタンパク質コード配列の下流の１，０００ヌクレオチドとを含む、ＦＡＤ２遺伝子のヌクレオチド配列を提供する。

【0471】

ＳａｃＩＩ制限酵素部位を介して１，０００塩基対の３'下流配列に結合した１，０００塩基対の５'上流配列に対応するＤＮＡ断片を、GeneArt（Thermofisher, USA）により合成した。このＤＮＡ断片は、隣接するＡｓｃＩ及びＮｏｔＩ制限部位を有しており、これらを使用してこの断片をｐＭＫベクターに挿入し、構築体ｐＡＴ０４２が形成された。クローニングされた挿入体の塩基配列を確認した。ＦＡＤ２タンパク質コード配列を介さずに５'上流配列を３'下流配列に結合することにより、この配置は、１，２６０塩基対のＦＡＤ２タンパク質コード配列（Δｆａｄ２）を効果的に欠失させた。

【0472】

選択可能なマーカー遺伝子
Larroude et al. (2018)によって記載されている抗生物質ヒグロマイシン（Ｈｙｇ）又はヌルセオスリシン（Ｎａｔ１）に対する耐性を提供するための遺伝子カセットは、Addgene（Watertown, MA. USA）から入手し、それぞれＨｙｇ（配列番号：４）及びＮａｔ１（配列番号：６）ポリペプチドをコードしている。各遺伝子は、ワイ・リポリティカの強力な構成的プロモーターであるワイ・リポリティカ（配列番号７；Muller et al., 1998）由来の翻訳伸長因子－１α（ｐＴＥＦ）遺伝子からのプロモーターと、ワイ・リポリティカＵ６株リパーゼ２遺伝子ポリアデニル化領域／転写ターミネーター（ｔＬｉｐ２；Darvishi et al., 2011;；登録番号ＨＭ４８６９００）の制御下にあった。これらのヌクレオチド配列は、配列番号３及び配列番号５として提供される。ＧＧＥ３６７及びＧＧＥ３６８からのＨｙｇ及びＮａｔ１転写単位を含むＤＮＡ断片をＰＣＲによって改変し、オリゴヌクレオチドプライマーａｔ００３及びａｔ００４を使用して各末端にＳａｃＩＩ制限部位を付加した（表１３）。改変されたＤＮＡ断片をベクターｐＣＲ Ｚｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ ＴＯＰＯ（Thermofisher USA；カタログ番号４５０２４５）に連結し、クローニング断片のヌクレオチド配列を確認した。Ｈｙｇ配列及びＮａｔ１配列を含む得られた遺伝子構築体を、それぞれｐＡＴ１２１及びｐＡＴ１２２と名付けた（表１４）。一対の類似した改変において、Ｈｙｇ及びＮａｔ１転写単位を含むＤＮＡ断片を、プライマーａｔ２２９及びａｔ２３０（表１３）を使用して改変し、隣接するＡｓｉＳＩ部位を追加し、ｐＡＴ１２３及びｐＡＴ１２４を生成した。

【0473】

隣接するＳａｃＩＩ制限部位を追加するために使用されるプロセスでは、プライマーの設計は、ＴＥＦプロモーターの５'末端のｌｏｘＰ部位とＬｉｐ２ターミネーターの３'末端のｌｏｘＲ部位の保持を提供し（図２）、従ってＨｙｇ及びＮａｔ１耐性遺伝子カセットに隣接している。これらの組換え部位は保持されたため、耐性遺伝子は微生物ゲノムに組み込まれた後、Ｃｒｅ／ｌｏｘ組換えによって切除することができる。以下でさらに説明するように、この設計により、複数回の遺伝子欠失において同じ選択マーカー遺伝子を再利用することが可能となった。

【0474】

ｐＡＴ１２１のＤＮＡ試料をＳａｃＩＩで消化し、アガロースゲルで電気泳動し、ゲル抽出キット（Qiagen, USA、カタログ番号２８７０４）を使用して、ヒグロマイシン耐性遺伝子を含む断片をゲルから精製した。次に、このＤＮＡ断片を、ＳａｃＩＩで消化され、子ウシ腸アルカリホスファターゼ（New England Biolabs, USA）で処理されたｐＡＴ０４２に連結した。連結ミックスを、標準的な形質転換法により大腸菌ＤＨ５αコンピテント細胞に導入した。カナマイシン耐性コロニーを選択した。５個のコロニーからＤＮＡを調製し、制限酵素ＸｍａＩ、ＡｓｃＩ、ＮｏｔＩによる消化とアガロースゲル電気泳動によってスクリーニングし、Ｈｙｇ耐性カセットが、ＦＡＤ２配列の５'上流及び３'下流間のＳａｃＩＩ部位に正しく挿入されていることを同定し確認した。ＦＡＤ２からの５'上流配列及び３'下流配列が隣接するＨｙｇ抗生物質耐性遺伝子配列を有する得られた構築体は保持され、ｐＡＴ２５９と命名した。ヌルセオスリシン耐性遺伝子カセット（Ｎａｔ１）を使用する同様の構築により、ｐＡＴ２６０と命名された遺伝子構築体が生成された（表１４と図２）。

【0475】

ワイ・リポリティカへのＦＡＤ２欠失構築体の導入
ヒグロマイシン耐性遺伝子を含むｐＡＴ２５９内の遺伝子構築体をワイ・リポリティカに導入し、形質転換により遺伝子改変された細胞を同定するために、以下のプロトコールに従った。形質転換されるワイ・リポリティカＷ２９株の細胞をＹＰＤ寒天プレート上に画線塗布し、２８℃で１６時間インキュベートした。白金耳一杯分の新たに増殖させた細胞を寒天表面からこすり落とした。細胞を１ｍＬのＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス－ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）で洗浄し、１５，８００ｇで室温で１分間遠心分離することによってペレット化した。細胞を６００μＬの０．１Ｍ酢酸リチウム（ＬｉＡｃ）溶液に再懸濁し、２８℃で１時間インキュベートしてコンピテント細胞を生成した。次に、細胞懸濁液を室温で４００ｇで２分間遠心分離し、細胞を６０μＬの０．１Ｍ ＬｉＡｃ溶液中に穏やかに再懸濁した。４０μＬのコンピテント細胞を２ｍＬチューブに移し、３～１０μＬ（約５００～１，０００ｎｇ ＤＮＡ）のＡｓｃＩ／ＮｏｔＩ線状化ＤＮＡベクター及び３μＬのキャリアＤＮＡ（５ｍｇ／ｍＬ）と穏やかに混合した。混合物を２８℃で１５分間インキュベートした。３５０μＬのＰＥＧ４０００溶液を各形質転換に添加し、穏やかに混合した。混合物を２８℃で１時間インキュベートし、続いて３９℃で１０分間熱ショックを与えた。６００μＬのＬｉＡｃ ０．１Ｍ溶液を加え、穏やかに混合した。

【0476】

各形質転換ミックスを５ｍＬの非選択培地（ＹＰＤ）で２４時間培養して、形質転換体の回収を行った。次に細胞を希釈し、ヒグロマイシン（２５０μｇ／ｍＬ）を含む選択ＹＰＤ培地にプレーティングし、プレートを２８℃で２日間インキュベートして、プレートあたり５０～１００個のコロニーを得た。ヌルセオスリシンを選択剤として、同様の構成のＮａｔ１遺伝子の導入と組合わせて使用した場合、この抗生物質は４００μｇ／ｍＬの濃度で使用された。

【0477】

ワイ・リポリティカ形質転換由来のヒグロマイシン耐性コロニーを、オリゴヌクレオチドプライマーａｔ２３９及びａｔ２４０を使用してＦＡＤ２遺伝子挿入についてＰＣＲによってスクリーニングし、Ｈｙｇの遺伝子欠失／挿入について陽性であるコロニーを選択した。表現型を検査し、ＦＡＤ２欠失変異を確認するために、４つのヒグロマイシン耐性コロニーをＹＰＤ培地中で２８℃で増殖させ、細胞から抽出した総脂質の脂肪酸組成をＦＡＭＥのＧＣ定量によって決定した。結果（表１５）は、４つの形質転換体すべてからの脂質がＬＡが欠如していることを示し、各単離株においてＦＡＤ２遺伝子が不活性化され、同時にオレイン酸レベルが総脂肪酸含有量の約７６％まで増加したことが確認された。ＦＡＤ２に関して野生型であり、対照として含まれる株を、同じ条件下で増殖させた。これらは、約１８％のＬＡと５６％のオレイン酸を有する脂質を含んでいた。ｆａｄ２変異体において観察された脂質の脂肪酸組成は、ＷＯ２００４／１０４１６７で報告されたものと同様であり、オレイン酸が７４％であり、ＬＡは検出されなかった。

【0478】

株中にＬＡ以外のＰＵＦＡが欠如していることを確認するために、ワイ・リポリティカ形質転換体をＹＰＤ培地中で最大３日間増殖させた。一部の試料では、細胞由来の極性脂質又はＴＡＧのいずれかに微量のＬＡ（０．１％）が観察された以外、多価不飽和脂肪酸は観察されなかった（表１６）。

【表13】

【表14】

【表15】

【表16】

【0479】

実施例７．ウラシル栄養要求性を生成するためのワイ・リポリティカの改変
ワイ・リポリティカのＵＲＡ３遺伝子は、酵素オロチジン－５'－リン酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．２３；GenBank登録番号Ｑ１２７２４）をコードし、登録番号ＡＪ３０６４２１．１として変種配列を有する（Mauersberger et al., 2001）。この酵素は微生物におけるウラシルの合成に必要であるため、ＵＲＡ３遺伝子のヌル変異体は、増殖するために培地にウラシルを添加する必要がある。このような栄養要求性変異体は、ウラシルが欠如した規定培地上でのＵＲＡ３変異の相補性を選択する選択マーカー遺伝子として機能性ＵＲＡ３遺伝子を含む遺伝子構築体とともに使用されている（Mauersberger et al., 2001）。従って、野生型Ｗ２９株から出発して、ワイ・リポリティカにおいてＵＲＡ３遺伝子欠失変異体が作製された。使用した戦略は、ｆａｄ２ＫＯ１変異体に対する戦略と同様であった（実施例６、図２）。

【0480】

ＵＲＡ３遺伝子欠失をワイ・リポリティカに導入するための遺伝子構築体
ワイ・リポリティカＷ２９株のＵＲＡ３遺伝子の上流領域及び下流領域のヌクレオチド配列（それぞれ１，０００塩基対）は、クエリーとしてＵ４０５６４．１（www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/U40564.1/）の配列を使用して、ＮＣＢＩデータベースから抽出された。染色体Ｅの配列は、より広範囲の上流配列及び下流配列を提供するために、１００％の同一性パラメーターと位置３１５０６９２～３１５４４０１に設定された変更領域オプションを使用して選択された。ＵＲＡ３遺伝子のヌクレオチド配列は、本明細書においてタンパク質コード配列の上流の１，０００ヌクレオチドと下流の１，０００ヌクレオチドを含む配列番号５１として提供される。ワイ・リポリティカ由来のコードされたオロチジン－５'－リン酸デカルボキシラーゼポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号５０として提供される。

【0481】

ＳａｃＩＩ制限酵素部位を介して１，０００塩基対の３'下流配列に結合した１，０００塩基対の５'上流配列に対応するＤＮＡ断片を、GeneArt（Thermofisher, USA）によって、最初はベクターｐＭＫ－Ｔ内で合成して、ｐＡＴ０６９を生成した。このＤＮＡ断片は、隣接するＡｓｃＩ及びＮｏｔＩ制限部位を有しており、これらを使用して断片をｐＭＫ－ＲＱベクターに挿入し、構築体ｐＡＴ０７０を生成した（表１４、実施例６）。クローニングされた挿入体のヌクレオチド配列を確認した。ＵＲＡ３タンパク質コード配列を介さずに、５'上流配列を３'下流配列に結合すると、この配置により８６１塩基対のＵＲＡ３タンパク質コード配列（ΔＵＲＡ３）が効果的に欠失された。

【0482】

ヒグロマイシン耐性遺伝子を含むｐＡＴ１２１のＤＮＡとヌルセオスリシン耐性遺伝子を含むｐＡＴ１２２（実施例６）のＤＮＡをＳａｃＩＩで消化し、これらの遺伝子にかかる断片をゲル抽出キット（Qiagen, USA）を使用して精製した。このＤＮＡ断片を、ＳａｃＩＩで消化し、子ウシ腸アルカリホスファターゼで処理されたｐＡＴ０７０と別々に連結した。連結混合物を大腸菌ＤＨ５αコンピテント細胞に形質転換した。各連結について５個のコロニーからＤＮＡを調製し、コロニーからのＤＮＡ試料を数個の制限酵素による消化とアガロースゲル電気泳動によりスクリーニングして、５'上流配列及び３'下流配列の間に正しい挿入が起きていることを同定及び確認した。ＵＲＡ３由来の５'上流配列及び３'下流配列が隣接するＨｙｇ又はＮａｔ１抗生物質耐性遺伝子配列を有する得られた構築体を、それぞれｐＡＴ２５７及びｐＡＴ２５８と命名した（表１４）。

【0483】

ＵＲＡ３欠失構築体の導入
ヒグロマイシン耐性遺伝子を含む遺伝子構築体ｐＡＴ２５７をワイ・リポリティカに導入し、形質転換により遺伝子改変されたＵｒａ－栄養要求性細胞を同定するために、実施例６に記載の形質転換プロトコールに従った。形質転換された細胞は、２５０μｇ／ｍＬヒグロマイシンを含むＹＰＤプレート上で選択された。抗生物質耐性コロニーを、ＵＲＡ３遺伝子挿入及びウラシル栄養要求性について、ＰＣＲによってスクリーニングした。ウラシル栄養要求性については、ヒグロマイシン耐性コロニーを、それぞれヒグロマイシンを含むＹＰＤプレート及びＳＤ－Ｕｒａプレート上でスクリーニングした。ＹＰＤプレートとＳＤ－Ｕｒａプレートの両方で増殖したコロニーは、遺伝子欠失陰性として廃棄されたが、ＹＰＤプレートでは増殖したがＳＤ－Ｕｒａプレートでは増殖しなかったコロニーは、ｕｒａ遺伝子欠失を有するものとして選択された。陽性コロニーを、Phire ＤＮＡ ＰＣＲキット（ThermoFisher）を用いて、プライマーａｔ２７０及びａｔ２７２（表１３、実施例６）を使用するＰＣＲによってスクリーニングした。初期変性は９８℃で５分間であり、続いて、１ｋｂあたり、９８℃で５秒、６０℃で５秒、７２℃で２０秒を４０サイクル行い、最終伸長は７２℃で４分間であった。いくつかの陽性コロニーを、ＴａｑポリメラーゼをThermoPol緩衝液（NEB Biolabs, USA、カタログ番号Ｍ０２６７）と共に用いて再試験して、遺伝子欠失の妥当性を確認した。

【0484】

形質転換細胞株の１つはワイ・リポリティカ ｕｒａ３欠失変異体として保持され、ワイ・リポリティカｕｒａ３ＫＯ２７株と命名された。この株は、さまざまな単一遺伝子（Ｕｒａ３遺伝子に加えて）、及び複数遺伝子の遺伝子構築体の導入に使用され、Ｕｒａ^＋表現型の選択を可能にした。

【0485】

二重欠失変異体ｆａｄ２－ｕｒａ３の生成
実施例６に記載のワイ・リポリティカのｆａｄ２ＫＯ１変異体を第２ラウンドの形質転換で改変して、ＵＲＡ３遺伝子欠失を導入した。これは、上記の形質転換プロトコールを使用したが、抗生物質を含むＹＰＤ培地上でヌルセオスリシンに対する耐性を提供するＮａｔ１選択マーカー遺伝子を有するｐＡＴ２５８を使用した。濃度４００μｇ／ｍＬのヌルセオスリシンを含むプレート上で増殖したコロニーは、ｕｒａ３欠失変異を有することが確認された：ｕｒａ３ＫＯ２７株について上記したように、抗生物質耐性コロニーをＵＲＡ３遺伝子挿入及びウラシル栄養要求性についてＰＣＲによってスクリーニングした。１つの二重変異株が保持され、ｆａｄ２ＫＯ１－ｕｒａ３ＫＯ２７と命名された。この株は、さまざまな単一遺伝子及び複数遺伝子の遺伝子構築体の導入に使用され、ｆａｄ２変異体バックグラウンドでＵｒａ^＋表現型の選択を可能にした。

【0486】

実施例８．トリアシルグリセロール合成を低下させるための微生物の改変－単一遺伝子変異体
エス・セレビッシェやワイ・リポリティカなどの酵母におけるトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）合成は、一連の酵素の活性によって行われ、主にケネディ経路を介して行われる。ケネディ経路では、最初に遊離脂肪酸が補酵素Ａ（ＣｏＡ）に結合してアシルＣｏＡ分子が生成される。次に、３つのアシルＣｏＡからのアシル基が段階的にエステル化されてグリセロール骨格となり、ＴＡＧが合成される。最初の工程では、グリセロール－３－リン酸（Ｇ３Ｐ）が、エス・セレビッシェのＳＣＴ１及びＧＰＴ２遺伝子とワイ・リポリティカのＹＡＬＩ０Ｃ００２０９ｇ遺伝子によってコードされるグリセロール－３－リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＧＰＡＴ；ＥＣ２．３．１．１５）によってアシル化されて、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）を生成される。次に、ＬＰＡは、エス・セレビッシェのＳＬＣ１遺伝子及びワイ・リポリティカのＹＡＬＩ０Ｅ１８９６４ｇ遺伝子によってコードされるリゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ；ＥＣ２．３．１．５１；１－アシル－ｓｎ－Ｇ３Ｐアシルトランスフェラーゼとも呼ばれる）によってアシル化されて、ホスファチジン酸（ＰＡ）が生成される。続いて、酵素ホスファチジン酸ホスホヒドロラーゼ（ＰＡＰ）によるＰＡの脱リン酸化が行われて、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）が生成される。最終工程では、ＤＡＧは、２つのジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．２０）であるＤＧＡ１又はＤＧＡ２のいずれかによって、アシル供与体としてアシルＣｏＡを使用して、アシル化される。ＤＧＡ１は、エス・セレビッシェではＤＧＡ１遺伝子、ワイ・リポリティカではＹＡＬＩ０Ｅ３２７６９ｇ遺伝子によってコードされる。ＴＡＧもまた、ＤＡＧから、エス・セレビッシェのＬＲＯ１遺伝子及びワイ・リポリティカのＹＡＬＩ０Ｅ１６７９７ｇ遺伝子にコードされるリン脂質：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＰＤＡＴ、リン脂質：１，２－ジアシル－ｓｎ－グリセロールＯ－アシルトランスフェラーゼ；ＥＣ２．３．１．１５８としても知られている）によって合成され、これは、グリセロリン脂質をアシル供与体として使用してＴＡＧを生成する。２つの異なるアシル－ＣｏＡ：ステロールアシルトランスフェラーゼ（ＡＳＡＴ、ＥＣ２．３．１．２６）もまた、エス・セレビッシェ中でＡＲＥ１及びＡＲＥ２遺伝子によりコードされ、ワイ・リポリティカ中で単一のＡＲＥ遺伝子ＹＡＬＩ０Ｆ０６５７８ｇによってコードされる、ＴＡＧを合成することができる。

【0487】

ワイ・リポリティカは、窒素が制限された増殖条件下で２０重量％を超える脂質（乾燥細胞重量）を、いくつかの株では少なくとも３０％までのＴＡＧを産生できるため、油性酵母であると考えられている。特定の遺伝子改変を行うことで、ワイ・リポリティカ株は、重量で最大７７％あるいはそれ以上の脂質を産生するように工学操作することができる。他の酵母を含む他の多くの既知の油性真菌が存在する。対照的に、エス・セレビッシェのほとんどの株は、多量のＴＡＧを生成せず、Ｄ５Ａなどの少数の株を除いて、油性酵母とは見なされない（He et al., 2018）。

【0488】

本発明者らは、増加した量のＬＣ及びＶＬＣ飽和脂肪酸を含む脂質が、より多くのＴＡＧ及び／又は改変された脂肪酸組成を有するＴＡＧを産生するように遺伝子改変された酵母株において産生され得ると考えた。従って、まず第１に、ワイ・リポリティカにおけるＤＧＡ１、ＤＧＡ２、ＬＲＯ１、及びＡＲＥ１遺伝子を含むＴＡＧ合成遺伝子を不活性化し、これらの機能を試験する実験が計画された。

【0489】

ＤＧＡ１遺伝子欠失をワイ・リポリティカに導入するための遺伝子構築体
ワイ・リポリティカのゲノムからＤＧＡ１遺伝子及び他のＴＡＧ合成遺伝子のタンパク質コード配列を欠失させ、それによりヌル変異を提供するために、ＦＡＤ２について図２に記載した一般的な戦略をいくつかの態様で改変した。改変された戦略の概略は図３に示される。前と同様に、遺伝子欠失を導入するための遺伝子カセットは、内因性遺伝子への組換えにより遺伝子カセットの組み込みを提供する５'上流配列及び３'下流配列が隣接する選択マーカー遺伝子で置換された目的の遺伝子のタンパク質コード領域を有した。ただし今回は、１，０００塩基対の５'上流配列及び３'下流配列は社内でＰＣＲによって産生された。また、増幅に使用したプライマー、及び選択マーカー遺伝子は、ＳａｃＩＩ部位ではなくＡｓｉＳＩ制限酵素部位を有した。

【0490】

ワイ・リポリティカＷ２９株のＤＧＡ１遺伝子のヌクレオチド配列とその上流配列及び下流配列は、ＫＥＧＧヤロウィアデータベース（www.genome.jp/kegg-bin/show_organism?org=yli）から、公開されているＹＡＬＩ遺伝子識別子を使用して、遺伝子ＹＡＬＩ０Ｅ３２７６９ｐ、染色体Ｅのヌクレオチド３８８５８５７～３８８９４０１（登録番号ＣＲ３８２１３１．１）として抽出された。ＤＧＡ１遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号５２として本明細書に提供され、タンパク質コード配列の上流の１，０００ヌクレオチド、それに続くタンパク質コード配列、及びタンパク質コード配列の下流の１，０００ヌクレオチドを含む。

【0491】

コードされたＤＧＡ１ポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号５３として提供される。ワイ・リポリティカＤＧＡ１は、５１４個のアミノ酸残基のタンパク質であり、動物、及び植物のＤＧＡＴ２酵素のホモログであるため、ＤＧＡＴ２ポリペプチドであると考えられている。これらはすべてＭＢＯＡＴタンパク質ファミリーのメンバーである（Wang et al., 2013）。

【0492】

ＤＧＡ１タンパク質コード領域に隣接する５'上流領域及び３'下流領域は、ワイ・リポリティカＷ２９株のゲノムＤＮＡから増幅された。各増幅反応は、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼをThermoPol緩衝液及び一対のオリゴヌクレオチドプライマーとともに使用した（実施例６の表１３）。この手段により、５'上流断片は、５'末端にＡｓｃＩの制限酵素部位及び３'末端にＡｓｉＳＩの制限酵素部位を追加することによって適合された。同様に、３'下流断片は、製造業者の指示に従って、その５'末端にＡｓｉＳＩの制限酵素部位及びその３'末端にＮｏｔＩの制限酵素部位を追加することによって適合された。（Phusion高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ, Thermofisher, US）。増幅されたＤＮＡ断片を標準プロトコールを用いて、ＡｓｉＳＩで消化し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで連結し、そしてベクターｐＣＲ Ｚｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ ＴＯＰＯにベクターに挿入してｐＡＴ２５３を生成した（実施例６の表１４）。クローニングされた挿入体のヌクレオチド配列を確認した。

【0493】

ヒグロマイシン耐性遺伝子を含むｐＡＴ１２３、及びヌルセオスリシン耐性遺伝子を含むｐＡＴ１２４（実施例６）のＤＮＡをＡｓｉＳＩで消化し、これらの遺伝子にかかる断片をゲル抽出キット（Qiagen, USA）を使用して精製した。ＤＮＡ断片を、ＡｓｉＳＩで消化し、子ウシ腸アルカリホスファターゼで処理したｐＡＴ２５３ ＤＮＡと別々に連結した。連結混合物を大腸菌ＤＨ５αコンピテント細胞に形質転換した。各連結について少なくとも５個のコロニーからＤＮＡを調製し、コロニーのＤＮＡ試料を制限酵素による消化とアガロースゲル電気泳動によってスクリーニングして、５'上流配列及び３'下流配列に正しい挿入が起きていることを同定及び確認した。ＤＧＡ１からの５'上流配列及び３'下流配列が隣接するＨｙｇ又はＮａｔ１抗生物質耐性遺伝子配列を有する得られた構築体を、それぞれｐＡＴ２６５及びｐＡＴ２６６と命名した（実施例６の表１４）。

【0494】

ＤＧＡ１欠失構築体のワイ・リポリティカへの導入
Ｈｙｇ耐性遺伝子を含む遺伝子構築体ｐＡＴ２６５及びＮａｔ１耐性遺伝子を含む遺伝子構築体ｐＡＴ２６６を導入して、ワイ・リポリティカのＤＧＡ１タンパク質コード領域を置換し、形質転換により遺伝子改変されたΔｄｇａ１細胞を同定するために、実施例６に記載の形質転換プロトコールに従った。形質転換細胞は、選択マーカー遺伝子に従って、２５０μｇ／ｍｌヒグロマイシン又は４００μｇ／ｍｌヌルセオスリシンを含むＹＰＤプレート上で選択された。抗生物質耐性コロニーを、ＤＧＡ１遺伝子挿入についてＰＣＲによってスクリーニングした。５'上流領域に位置する１つのオリゴヌクレオチドプライマー（ａｔ２４５）とＤＧＡ１タンパク質コード領域内に位置する第２のプライマー（ａｔ２４７）をＰＣＲ反応で使用して、抗生物質耐性コロニーのゲノムＤＮＡに欠失変異が導入されていることを確認した。ＰＣＲ反応は、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼをThermoPol緩衝液（NEB, USA）と共に用いて標準条件下で実施した。増幅産物の欠如は、欠失変異の存在を示した。Ｗ２９からのゲノムＤＮＡをＰＣＲの陽性対照として並行して使用した。オリゴヌクレオチドプライマーａｔ２４５特にａｔ２４８（後者はＤＧＡ１の３'領域に位置する）を使用する２回目のＰＣＲ試験でも、欠失／挿入変異の存在が確認され、欠失の存在下では１．３ｋｂの増幅産物が生成され、野生型の変異していないＤＧＡ１では１．６ｋｂの産物が生成された。プライマー対ａｔ２４６とａｔ２４８も使用された。Ｎａｔ１遺伝子について試験したコロニー１０個のうち７個で、ＤＧＡ１タンパク質コード領域の欠如が確認された。

【0495】

各形質転換からの形質転換細胞株の１つが選択され、ワイ・リポリティカＤＧａ１欠失変異体として保持され、ｄｇａ１ＫＯ１（Ｈｙｇ）株及びｄｇａ１ＫＯ１（Ｎａｔ１）株と命名された。

【0496】

ｄｇａ１ＫＯ１株を、ＴＡＧ合成を誘導する高グルコース／低窒素培地中での増殖により、対応する野生型株と比較し、ＴＡＧ合成能力の低下を決定した。後者の培地中、２９℃で９６時間培養した後のｄｇａ１ＫＯ１変異体では、ＴＡＧレベルの５０％の低下が観察される。驚くべきことに、ＶＬＣ－ＳＦＡ、特にＣ２４：０の量が、ｄｇａ１変異体において大きく低下していることが観察された（実施例１１を参照）。実際、総脂肪酸含有量の割合としてのＴＡＧ中のＣ２４：０のレベルは８３％低下した。Ｃ１８：０のレベルも大きく低下し、総飽和脂肪酸の割合は、野生型Ｗ２９株の約５５％からｄｇａ１変異体の約３５％まで低下した。ＤＧＡ１タンパク質が、ワイ・リポリティカのＴＡＧへのＶＬＣ－ＳＦＡ、特にＣ２４：０及びＣ１８：０の取り込みの大部分に関与していると結論づけられた。ｄｇａ１ＫＯ１株もＹＰＤなどの富裕培地で増殖する。

【0497】

ＤＧＡ２遺伝子欠失をワイ・リポリティカに導入するための遺伝子構築体
ワイ・リポリティカのゲノムからＤＧＡ２遺伝子のタンパク質コード配列を欠失させるために、ＤＧＡ１欠失の場合と同じ戦略が使用された（図３）。ワイ・リポリティカＷ２９株のＤＧＡ２遺伝子のヌクレオチド配列とその上流配列及び下流配列は、ＫＥＧＧヤロウィアデータベース（www.genome.jp/kegg-bin/show_organism?org=yli）から、公開されているＹＡＬＩ遺伝子識別子を使用して、遺伝子ＹＡＬＩ０Ｂ１０１５３ｐ（登録番号ＸＰ＿５００７０７）として抽出された。ＤＧＡ２遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号５４として提供され、タンパク質コード配列の上流の１，０００ヌクレオチド、それに続くタンパク質コード配列、及びタンパク質コード配列の下流の１，０００ヌクレオチドを含む。

【0498】

コードされたＤＧＡ２ポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号５５として提供される。ワイ・リポリティカＤＧＡ２は、５２６個のアミノ酸残基のタンパク質である。このタンパク質は、膜結合型Ｏ－アシルトランスフェラーゼファミリードメイン含有（ＭＢＯＡＴ）タンパク質のメンバーであり、複数の膜貫通領域（典型的には８～１０個のそのような領域）を有し、これはアシル基を膜内の基質（この場合はＤＡＧ）に転移する。ワイ・リポリティカＤＧＡ２タンパク質は、植物や動物のＤＧＡＴ１タンパク質とより密接に関連しており、子嚢菌酵母であるエル・クルイベリ、ケー・パストリス、ケー・ラクチス、シー・アルビカンス、シー・パラプシロシス、及び オー・ポリモルファのＤＧＡＴ２とは系統学的に異なる。従って、これはＤＧＡＴ１であると見なされる。ＤＧＡ２ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号５５）は、ＢＬＡＳＴプログラムで比較した場合、ＤＧＡ１ポリペプチド（配列番号５３）のアミノ酸配列と有意な同一性を示さない。

【0499】

５'上流領域及び３'下流領域は、ワイ・リポリティカＷ２９株由来のゲノムＤＮＡから増幅された（図３）。各増幅反応には、Phusion高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ（NEB, USA）及び一対のオリゴヌクレオチドプライマーを使用した（表１３）。ＤＧＡ１の増幅に関しては、５'上流断片は、その５'末端にＡｓｃＩの制限酵素部位を有し、その３'末端にＡｓｉＳＩの制限酵素部位を有していた。同様に、３'下流断片は、その５'末端にＡｓｉＳＩの部位があり、その３'末端にＮｏｔＩの部位があった。増幅されたＤＮＡ断片をＡｓｉＳＩで消化し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで連結し、ベクターｐＣＲ Ｚｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ ＴＯＰＯに挿入して、ｐＡＴ２５４を生成した（実施例６の表１４）。クローニングされた挿入体のヌクレオチド配列を確認した。

【0500】

ヒグロマイシン耐性遺伝子を含むｐＡＴ１２３及びヌルセオスリシン耐性遺伝子を含むｐＡＴ１２４（実施例６）のＤＮＡをＡｓｉＳＩで消化し、これらの遺伝子にかかる断片をゲル抽出キットを使用して精製した。これらを、ＡｓｉＳＩで消化したｐＡＴ２５４に連結し、連結混合物を大腸菌ＤＨ５αコンピテント細胞に導入した。各連結について５個のコロニーからＤＮＡを調製し、制限酵素による消化によってスクリーニングした。アガロースゲル電気泳動により正しい構築体が同定され、意図した挿入が５'上流配列と３'下流配列の間に起きていることが確認された。ＤＧＡ２からの５'上流配列及び３'下流配列が隣接するＨｙｇ又はＮａｔ１抗生物質耐性遺伝子配列を有する得られた構築体を、それぞれｐＡＴ２６７及びｐＡＴ２６８と命名した（実施例６の表１４）。

【0501】

ワイ・リポリティカへのＤＧＡ２欠失構築体の導入
ヒグロマイシン耐性遺伝子を含む遺伝子構築体ｐＡＴ２６７をワイ・リポリティカに導入するために、実施例６に記載の形質転換プロトコールに従った。形質転換細胞は、２５０μｇ／ｍＬヒグロマイシンを含むＹＰＤプレート上で選択された。抗生物質耐性コロニーをＤＧＡ２遺伝子挿入についてＰＣＲによってスクリーニングし、形質転換により遺伝子改変されたΔｄｇａ２細胞を同定した。ＤＧＡ２タンパク質コード領域内部のオリゴヌクレオチドプライマー対ａｔ２４９とａｔ２５１をＰＣＲ反応に使用して、ヒグロマイシン耐性コロニーのゲノムＤＮＡに欠失変異が導入されたことを確認した。ＰＣＲ反応は、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼをThermoPol緩衝液（NEB, USA）と共に用いて標準条件下で実施した。増幅産物の欠如は、欠失変異の存在を示した。Ｗ２９からのゲノムＤＮＡをＰＣＲの陽性対照として並行して使用した。オリゴヌクレオチドプライマー対ａｔ２５０とａｔ２５２（後者はＤＧＡ２の３'領域に位置する）を使用する２回目のＰＣＲ試験でも、欠失／挿入変異の存在が確認された。Ｈｙｇ遺伝子で選択された６個のコロニーのうち５個で、ＤＧＡ２タンパク質コード領域の欠如が確認された。

【0502】

形質転換細胞株の１つはワイ・リポリティカＤＧａ２欠失変異体として保持され、ワイ・リポリティカＤＧａ２ＫＯ１（Ｈｙｇ）株と命名された。

【0503】

ＴＡＧ合成を誘導する高グルコース／低窒素培地（ＤＭ－Ｇｌｙｃ－ＬｏｗＮ）での増殖により、ｄｇａ２ＫＯ１（Ｈｙｇ）株を対応する野生型株と比較し、ＴＡＧ合成能力の低下を測定した。野生型ＤＧＡ２株と比較してｄｇａ２ＫＯ１変異体では、ＴＡＧレベルの約４６％の低下が観察された。驚くべきことに、Ｃ２４：０の量が野生型対照と比較してｄｇａ２変異体において増加していることが観察された（実施例１１を参照）。実際、総脂肪酸含有量の割合としてＴＡＧのＣ２４：０のレベルは約２０％増加した。この観察は、ＤＧＡ１タンパク質がワイ・リポリティカのＴＡＧ中のＣ２４：０の大部分の挿入に関与しているのに対し、ＤＧＡ２ポリペプチドはＳＦＡよりも不飽和脂肪酸に対してより活性であるという上記の結論を支持した。同時に、総飽和脂肪酸の割合は野生型Ｗ２９株の約５５％からｄｇａ２変異体では約４３％まで低下した。

【0504】

ＬＲＯ１遺伝子欠失をワイ・リポリティカに導入するための遺伝子構築体
ワイ・リポリティカのゲノムからＬＲＯ１遺伝子のタンパク質コード配列を欠失させるために、ＤＧＡ１欠失の場合と同じ戦略が使用された（図３）。ワイ・リポリティカＷ２９株のＬＲＯ１遺伝子のヌクレオチド配列とその上流配列及び下流配列は、ＫＥＧＧヤロウィアデータベース（www.genome.jp/kegg-bin/show_organism?org=yli）から、公開されているＹＡＬＩ遺伝子識別子を使用して、遺伝子ＹＡＬＩ０Ｅ１６７９７ｐ（登録番号ＣＲ３８２１３１．１）として抽出された。ＬＲＯ１遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号５６として提供され、タンパク質コード配列の上流の１，０００ヌクレオチド、それに続くタンパク質コード配列、及びタンパク質コード配列の下流の１，０００ヌクレオチドを含む。

【0505】

コードされたＰＤＡＴポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号５７として提供される。ＬＲＯ１遺伝子によりコードされるワイ・リポリティカタンパク質は、ＰＤＡＴ活性を有する６４８個のアミノ酸残基のタンパク質である。

【0506】

ＬＲＯ１タンパク質コード領域に隣接する５'上流領域及び３'下流領域は、Phusion高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ（NEB, USA）及び一対のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ワイ・リポリティカＷ２９株由来のゲノムＤＮＡから増幅された（実施例６の表１３）。ＤＧＡ１の増幅に関しては、５'上流断片は、その５'末端にＡｓｃＩの制限酵素部位を有し、その３'末端にＡｓｉＳＩの制限酵素部位を有していた。同様に、３'下流断片は、その５'末端にＡｓｉＳＩの部位があり、その３'末端にＮｏｔＩの部位があった。増幅されたＤＮＡ断片をＡｓｉＳＩで消化し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで連結し、ベクターｐＣＲＺｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ ＴＯＰＯに挿入して、ｐＡＴ２５６を生成した（実施例６の表１４）。クローニングされた挿入体のヌクレオチド配列を確認した。

【0507】

ヒグロマイシン耐性遺伝子を含むｐＡＴ１２３及びヌルセオスリシン耐性遺伝子を含むｐＡＴ１２４（実施例６）のＤＮＡをＡｓｉＳＩで消化し、これらの遺伝子にかかる断片をゲル抽出キットを使用して精製した。これらを、ＡｓｉＳＩで消化したｐＡＴ２５６に連結し、連結混合物を大腸菌ＤＨ５αコンピテント細胞に導入した。各連結について５個のコロニーからＤＮＡを調製し、制限酵素による消化によってスクリーニングした。アガロースゲル電気泳動により正しい構築体が同定され、意図した挿入が５'上流配列と３'下流配列の間に起きていることが確認された。ＬＲＯ１からの５'上流配列及び３'下流配列が隣接するＨｙｇ又はＮａｔ１抗生物質耐性遺伝子配列を有する得られた構築体を、それぞれｐＡＴ２７１及びｐＡＴ２７２と命名した（実施例６の表１４）。

【0508】

ワイ・リポリティカへのＬＲＯ１欠失構築体の導入
ヌルセオスリシン耐性遺伝子を含む遺伝子構築体ｐＡＴ２７２をワイ・リポリティカに導入するために、実施例６に記載の形質転換プロトコールに従った。形質転換細胞は、４００μｇ／ｍＬのヌルセオスリシンを含むＹＰＤプレート上で選択された。抗生物質耐性コロニーをＬＲＯ１遺伝子挿入についてＰＣＲによってスクリーニングし、形質転換により遺伝子改変されたΔｌｒｏ１細胞を同定した。ＬＲＯ１の５'上流領域に位置する１つのオリゴヌクレオチドプライマー（ａｔ２５７）と３'下流領域に位置する第２のプライマー（ａｔ２６０）をＰＣＲ反応に使用して、抗生物質耐性コロニーのゲノムＤＮＡに欠失変異が導入されていることを確認した。ＰＣＲ反応は、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼをThermoPol緩衝液（NEB, USA）と共に用いて標準条件下で実施した。Ｗ２９からのＤＮＡをＰＣＲの陽性対照として並行して使用した。２．２ｋｂ増幅産物の欠如及び１．４ｋｂ産物の存在は、欠失変異の存在を示した。プライマーａｔ２５８及びａｔ２６０を使用して、確認的なＰＣＲ反応を実行した。試験した１０個のコロニーのうち４個で、ＬＲＯ１タンパク質コード領域が存在しないことが確認された。

【0509】

５'上流領域に位置する１つのオリゴヌクレオチドプライマー（ａｔ２４５）とＬＲＯ１タンパク質コード領域内に位置する第２のプライマー（ａｔ２４７）をＰＣＲ反応に使用して、抗生物質耐性コロニーのゲノムＤＮＡに欠失変異が導入されていることを確認した。ＰＣＲ反応は、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼをThermoPol緩衝液（NEB, USA）と共に用いて標準条件下で実施した。増幅産物の欠如は、欠失変異の存在を示した。Ｗ２９からのゲノムＤＮＡをＰＣＲの陽性対照として並行して使用した。オリゴヌクレオチドプライマーａｔ２４５及びａｔ２４８（後者はＬＲＯ１の３'領域に位置する）を使用する２回目のＰＣＲ試験でも、欠失／挿入変異の存在が確認され、欠失の存在下では１．３ｋｂの増幅産物が、野生型の変異していないＤＧＡ１遺伝子では１．６ｋｂの産物が生成された。Ｎａｔ１遺伝子について試験した１０個のコロニーのうち４個で、ＬＲＯ１タンパク質コード領域が存在しないことが確認された。

【0510】

形質転換細胞株の１つはワイ・リポリティカｌｒｏ１欠失変異体として保持され、ワイ・リポリティカｌｒｏ１ＫＯ１株と命名された。

【0511】

ＴＡＧ合成を誘導する高グルコース／低窒素培地（ＤＭ－Ｇｌｙｃ－ＬｏｗＮ）での増殖により、ｌｒｏ１ＫＯ１株を対応する野生型株と比較し、ＴＡＧ合成能力の低下を測定した。ｌｒｏ１ＫＯ１変異体ではＴＡＧレベルの約３０％の低下が観察された。総飽和脂肪酸の割合は、野生型Ｗ２９株の約５５％からｌｒｏ１変異体では約５０％まで低下したため、ｄｇａ１及びｄｇａ２変異体よりも変化が小さらった。

【0512】

ＡＲＥ１遺伝子欠失をワイ・リポリティカに導入するための遺伝子構築体
エス・セレビッシェを含む真菌の遺伝子ＡＲＥ１とＡＲＥ２は、ＴＡＧを合成することもできる酵素アシル－ＣｏＡ：ステロールアシルトランスフェラーゼ（ＡＳＡＴ、ＥＣ２．３．１．２６）をコードする。ワイ・リポリティカは単一のＡＲＥ遺伝子、すなわちＡＲＥ１を有するようである。ワイ・リポリティカゲノムからＡＲＥ１遺伝子のタンパク質コード配列を欠失させるために、ＤＧＡ１欠失の場合と同じ戦略が使用された（図３）。ワイ・リポリティカＷ２９株のＡＲＥ１遺伝子のヌクレオチド配列とその上流配列及び下流配列は、ＫＥＧＧヤロウィアデータベース（www.genome.jp/kegg-bin/show_organism?org=yli）から、公開されているＹＡＬＩ遺伝子識別子を使用して、遺伝子ＹＡＬＩ０Ｆ０６５７８ｇ（登録番号ＣＲ３８２１３１．１）として抽出された。ＡＲＥ１遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号５８として提供され、タンパク質コード配列の上流の１，０００ヌクレオチド、それに続くタンパク質コード配列、及びタンパク質コード配列の下流の１，０００ヌクレオチドを含む。

【0513】

コードされたＡＳＡＴポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号５９として提供される。ワイ・リポリティカＡＳＡＴは、５４３個のアミノ酸残基からなるタンパク質である。

【0514】

ＡＳＡＴタンパク質コード領域に隣接する５'上流領域及び３'下流領域は、ワイ・リポリティカＷ２９株のゲノムＤＮＡから増幅された（図３）。各増幅反応は、Phusion高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ（NEB, USA）及び一対のオリゴヌクレオチドプライマーを使用した（実施例６の表１３）。ＤＧＡ１の増幅に関しては、５'上流断片は、その５'末端にＡｓｃＩの制限酵素部位を有し、その３'末端にＡｓｉＳＩの制限酵素部位を有していた。同様に、３'下流断片は、その５'末端にＡｓｉＳＩの部位があり、その３'末端にＮｏｔＩの部位があった。増幅されたＤＮＡ断片をＡｓｉＳＩで消化し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで連結し、ベクターｐＣＲ Ｚｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ ＴＯＰＯに挿入して、ｐＡＴ２５１を生成した（実施例６の表１４）。クローニングされた挿入体のヌクレオチド配列を確認した。

【0515】

ヒグロマイシン耐性遺伝子を含むｐＡＴ１２３及びヌルセオスリシン耐性遺伝子を含むｐＡＴ１２４（実施例６）のＤＮＡをＡｓｉＳＩで消化し、これらの遺伝子にかかる断片をゲル抽出キットを使用して精製した。これらを、ＡｓｉＳＩで消化したｐＡＴ２５１に連結し、連結混合物を大腸菌ＤＨ５αコンピテント細胞に導入した。各連結について５個のコロニーからＤＮＡを調製し、制限酵素による消化によってスクリーニングした。アガロースゲル電気泳動により正しい構築体が同定され、意図した挿入が５'上流配列と３'下流配列の間に起きていることが確認された。ＬＲＯ１からの５'上流配列及び３'下流配列が隣接するＨｙｇ又はＮａｔ１抗生物質耐性遺伝子配列を有する得られた構築体を、それぞれｐＡＴ２６１及びｐＡＴ２６２と命名した（実施例６の表１４）。

【0516】

ワイ・リポリティカへのＡＲＥ１欠失構築体の導入
遺伝子構築体ｐＡＴ２６１及びｐＡＴ２６２をワイ・リポリティカに導入するために、実施例６に記載の形質転換プロトコールに従った。形質転換細胞は、適切な抗生物質を含むＹＰＤプレート上で選択された。抗生物質耐性コロニーをＡＲＥ１遺伝子挿入についてＰＣＲによってスクリーニングし、形質転換により遺伝子改変されたΔａｒｅ１細胞を同定した。Ｗ２９からのＤＮＡをＰＣＲの陽性対照として並行して使用した。それぞれ５'上流領域及び３'下流領域に位置するプライマー対ａｔ２４１とａｔ２４４をＰＣＲ反応に使用して、抗生物質耐性コロニーのゲノムＤＮＡに欠失変異が導入されていることを確認した。タンパク質コード領域内部のプライマー対ａｔ２４２とａｔ２４３、及びａｔ２４２とａｔ２４４を用いる追加のＰＣＲ反応により、欠失／挿入変異の存在が確認された。ＡＲＥ１タンパク質コード領域の欠如は、ヒグロマイシンに耐性のある６個のコロニーのうち３個、及びヌルセオスリシンに耐性のある４個のコロニーのうち３個で確認された。形質転換細胞株のそれぞれ１つをワイ・リポリティカ ａｒｅ１欠失変異体として保持し、そしてワイ・リポリティカ株はａｒｅ１ＫＯ１（Ｈｙｇ）及びａｒｅ１ＫＯ１（Ｎａｔ１）と命名された。

【0517】

ＴＡＧ合成を誘導する高グルコース／低窒素培地（ＤＭ－Ｇｌｙｃ－ＬｏｗＮ）での増殖により、ａｒｅ１ＫＯ１株を対応する野生型株と比較し、ＴＡＧ合成能力の低下を測定する。ａｒｅ１ＫＯ１変異体のＴＡＧレベルは約２０％低下しており、これはｄｇａ１、ｄｇａ２、及びｌｒｏ１の低下よりも小さかった。Ａｒｅ１タンパク質は、この実施例で試験した４個の酵素のうちで、ワイ・リポリティカにおけるＴＡＧの合成において最も活性が低いと結論づけられた。

【0518】

実施例９．トリアシルグリセロール合成を低下させるための微生物の改変－複数遺伝子変異体
実施例８に記載したように、ＴＡＧ生合成のための４個の遺伝子、すなわちＤＧＡ１、ＤＧＡ２、ＬＲＯ１、及びＡＲＥ１のいずれか１つに欠失を有する単一遺伝子変異体をワイ・リポリティカで生成した。本発明者らは、複数の遺伝子欠失を有する変異体を作製し、内因性ＴＡＧ合成をさらに低下させ、そして異種ＤＧＡＴ及び／又は他の酵素を過剰発現する１つ又はそれ以上の遺伝子を追加して、例えば脂肪アシルチオエステラーゼ又はアシルＣｏＡシンセターゼなどの脂肪酸組成を改変することを目的とした。これには、まず抗生物質耐性マーカー遺伝子、例えばヌルセオスリシン耐性遺伝子を除去して、次の形質転換でマーカー遺伝子を再利用を可能にすることが含まれた。

【0519】

選択可能なマーカー遺伝子のＣｒｅ－Ｌｏｘ切除
ヒグロマイシン耐性遺伝子以外の選択マーカー遺伝子がｌｏｘ部位に隣接している場合、プラスミドｐＵＢ４－ＣＲＥが使用される。このベクターは、２つのｌｏｘ部位間のＤＮＡを切除できるＣｒｅリコンビナーゼタンパク質をコードしている。ＪＭＥ５４７株由来の複製ベクターであるｐＵＢ４－ＣＲＥは、フランスのINRAEから入手した（Fickers et al., 2003）。改変されるエス・セレビッシェ又はワイ・リポリティカ株は、以下に記載するようにプラスミドｐＵＢ４－ＣＲＥで形質転換され、ヒグロマイシン耐性について選択される。コロニーをヌルセオスリシンを含む培地と含まない培地にプレーティングして、選択マーカー遺伝子の損失をスクリーニングする。抗生物質に感受性のあるコロニーが選択され、フランキングプライマーと内部プライマーの組み合わせを用いたＰＣＲ及び欠失領域の配列決定によって、ヌルセオスリシン遺伝子の消失が確認される。選択されたコロニーを、ヒグロマイシンの非存在下、すなわち選択圧力なしでＹＰＤ培地中で増殖させ、プレーティングして、ｐＵＢ４－ＣＲＥを消失したコロニーを同定する（Fickers et al., 2003）。このようなコロニーは、ヌルセオスリシン選択マーカー遺伝子が切除された株として選択される。

【0520】

ヒグロマイシン耐性遺伝子以外の選択マーカー遺伝子を有するｐＵＢ４－ＣＲＥの誘導体を使用して、ヒグロマイシン耐性選択マーカー遺伝子を切除するために、同様の操作に従う。

【0521】

Frozen-EZ Yeast Transformation IIキット（Zymo Research, USA）を使用する、ｐＵＢ４－ＣＲＥを導入するための形質転換操作は、以下のとおりである。Zymo Researchからの指示に従って調製した５０μｌのＵｒａ－ＫＯ２１コンピテント細胞を、５～１０μｌ容量中の０．５～１ｇのＤＮＡで形質転換する。次に、５００μｌのＥＺ３溶液を添加し、細胞懸濁液と完全に混合する。混合物を、時折穏やかに混合しながら、３０℃で４５分～２時間インキュベートする。５０～１５０μｌの形質転換混合物を、ヒグロマイシンを含みヌルセオスリシンを含まないＹＰＤプレート上に広げる。プレートを３０℃で２～４日間インキュベートして、形質転換体を増殖させる。

【0522】

複数の不活性化変異を有する変異体の作製
ヒグロマイシン又はノルセオスリシン耐性マーカー遺伝子が変異遺伝子（例えばＤＧＡ１遺伝子）から切除され、ｐＵＢ４－ＣＲＥ切除プラスミドが細胞から失われると、ヒグロマイシン又はノルセオスリシン選択マーカー遺伝子は、第２の遺伝子を不活性化する突然変異誘発の２回目のラウンドで再び使用することができる。マーカー切除のプロセスを繰り返すことができ、３番目の遺伝子に対して３回目の突然変異誘発を実行し、続いて４回目の突然変異誘発を実行する。この戦略では、４つのＴＡＧ合成遺伝子のすべての組み合わせに対して、二重、三重、そして最終的には四重の変異体が生成される。

【0523】

ＤＧＡ１、ＬＲＯ１、ＡＲＥ１、及びＡＲＥ２から選択される複数の遺伝子を不活性化するために、エス・セレビッシェ Ｄ５Ａ株を用いて同様の戦略が実行される

【0524】

実施例１０．脂肪酸異化作用を低下させるための微生物の改変
ワイ・リポリティカは、乾燥細胞重量で２０％を超える脂質を産生できるため、油性酵母であると考えられている。ワイ・リポリティカなどの微生物のペルオキシソームで起きるβ酸化経路によって、脂質の分解と再動員が引き起こされる。この経路を介して、アシルＣｏＡはアシルＣｏＡオキシダーゼの活性によって異化され、アシル鎖は最終的にアセチルＣｏＡ分子に分解され、これらはペルオキシソームから放出される。ペルオキシソームの脂肪酸のβ酸化は、エス・セレビッシェ中の単一のＰＯＸ１遺伝子、及びワイ・リポリティカ中の６個の異なるＰＯＸ遺伝子（ＰＯＸ１～ＰＯＸ６）によってコードされるアシルＣｏＡオキシダーゼの活性によって開始される。本発明者らは、アシル－ＣｏＡの分解を制限することにより、飽和脂肪酸含有量が増加した脂質の産生と蓄積のために、アシル鎖を利用できると考えた。

【0525】

従って、ＰＯＸ１～３及び５、及びＭＦＥ１を含む最も活性なアシルＣｏＡオキシダーゼ遺伝子をコードする１つ又はそれ以上の遺伝子の不活性化を介して脂質異化作用を低下させ、また、ワイ・リポリティカ中のＰＥＸ１０遺伝子の不活性化を介してペルオキシソームの生合成を妨害するように、実験を計画した。

【0526】

ＰＯＸ１遺伝子欠失をワイ・リポリティカに導入するための遺伝子構築体
脂肪酸のβ酸化に関与するＰＯＸ１遺伝子及び他の遺伝子のタンパク質コード配列をワイ・リポリティカゲノムから欠失させ、それによりヌル変異を提供するために、実施例８（図３）に記載されているような一般的戦略に従う。以前と同様に、遺伝子欠失を導入するための遺伝子カセットには、目的の遺伝子のタンパク質コード領域が、１，０００塩基対の５'上流配列及び３'下流配列が隣接している選択マーカー遺伝子で置換されおり、これにより、内因性遺伝子への組換えにより遺伝子カセットの組み込みが可能になった。選択マーカー遺伝子の増幅に使用されたプライマーは、ＳａｃＩＩ部位ではなくＡｓｉＳＩ制限酵素部位を有した。

【0527】

ワイ・リポリティカのＰＯＸ１遺伝子のヌクレオチド配列、並びにその上流配列及び下流配列は、ＫＥＧＧヤロウィアデータベース（www.genome.jp/kegg-bin/show_organism?org=yli）から、公開されているＹＡＲＬＩ遺伝子識別子を使用して、遺伝子ＹＡＬＩ０Ｅ３２８３５ｇ、染色体Ｅのヌクレオチド３８９７１０２～３８９９１３５（登録番号ＣＲ３８２１３１．１）として抽出された。ＰＯＸ１遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号６０として本明細書に提供され、タンパク質コード配列の上流の１，０００ヌクレオチド、それに続くタンパク質コード配列、及びタンパク質コード配列の下流の１，０００ヌクレオチドを含む。

【0528】

コードされたＰＯＸ１ポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号６１として提供される。ワイ・リポリティカＰＯＸ１は、６７７個のアミノ酸残基からなるタンパク質である。

【0529】

ＰＯＸ１タンパク質コード領域に隣接する５'上流領域及び３'下流領域は、ワイ・リポリティカＷ２９株のゲノムＤＮＡから増幅された（図３）。各増幅反応では、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼをThermoPol緩衝液及び一対のオリゴヌクレオチドプライマーと共に使用した。この手段により、５'上流断片は、５'末端にＡｓｃＩ及び３'末端にＡｓｉＳＩの制限酵素部位を追加することによって適合された。同様に、３'下流断片は、その５'末端にＡｓｉＳＩの制限酵素部位及びその３'末端にＮｏｔＩの制限酵素部位を追加することによって適合された。増幅されたＤＮＡ断片をＡｓｉＳＩで消化し、標準プロトコールを使用してＴ４ＤＮＡリガーゼで連結し、そしてベクターｐＣＲ Ｚｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ ＴＯＰＯに挿入した。クローニングされた挿入体のヌクレオチド配列を確認した。

【0530】

ヒグロマイシン耐性遺伝子を含むｐＡＴ１２３及びヌルセオスリシン耐性遺伝子を含むｐＡＴ１２４（実施例６）のＤＮＡをＡｓｉＳＩで消化し、これらの遺伝子にかかる断片をゲル抽出キット（Qiagen, USA）を使用して精製した。ＤＮＡ断片は、ＡｓｉＳＩで消化され、子ウシ腸アルカリホスファターゼで処理される増幅された５'領域及び３'領域と別々に連結される。連結混合物は大腸菌ＤＨ５αコンピテント細胞に形質転換される。各連結について少なくとも５個のコロニーからＤＮＡを調製し、コロニーからのＤＮＡ試料を制限酵素による消化とアガロースゲル電気泳動によってスクリーニングして、５'上流配列と３'下流配列の間に正しい挿入が行われたことを同定及び確認する。ＰＯＸ１からの５'上流配列及び３'下流配列が隣接するＨｙｇ又はＮａｔ１抗生物質耐性遺伝子配列を有する得られた構築体が選択され保持される。

【0531】

ＰＯＸ１欠失構築体のワイ・リポリティカへの導入
ＰＯＸ１タンパク質コード領域を置換するヒグロマイシン耐性遺伝子を含む遺伝子構築体をワイ・リポリティカに導入し、形質転換により遺伝子改変Δｐｏｘ１細胞を同定するために、実施例６に記載の形質転換プロトコールに従う。形質転換細胞は、２５０μｇ／ｍＬヒグロマイシンを含むＹＰＤプレート上で選択される。抗生物質耐性コロニーは、ＰＯＸ１遺伝子挿入についてＰＣＲによってスクリーニングされる。形質転換細胞株の１つが選択され、ワイ・リポリティカＰＯＸ２欠失変異体として保持され、及びｐｏｘ１ＫＯ１株と命名される。

【0532】

ポックス１ＫＯ１株を、富裕培地であるＹＰＤでの増殖、及びＴＡＧ合成を誘導する高グルコース／低窒素培地での増殖により、対応する野生型株と比較し、ＴＡＧ蓄積の増加を決定する。脂質の量及び脂肪酸組成も評価される。ＳＦＡ含有量が増加したＴＡＧ蓄積が増加させるために、ＤＧＡＴをコードする遺伝子構築体が導入される。

【0533】

同じアプローチを使用して、配列番号７７をコードするエス・セレビッシェのＰＯＸ１遺伝子（配列番号７６）を欠失させる。

【0534】

ＰＯＸ２遺伝子欠失をワイ・リポリティカに導入するための遺伝子構築体
ワイ・リポリティカゲノムからＰＯＸ２遺伝子のタンパク質コード配列を欠失させるために、ＰＯＸ１欠失の場合と同じ戦略が使用される。ワイ・リポリティカのＰＯＸ２遺伝子のヌクレオチド配列とその上流配列及び下流配列は、ＫＥＧＧヤロウィアデータベース（www.genome.jp/kegg-bin/show_organism?org=yli）から、公開されているＹＡＲＬＩ遺伝子識別子を使用して、遺伝子ＹＡＬＩ０Ｆ１０８５７ｇ、染色体Ｆのヌクレオチド１４４９２８９～１４５１３９１（登録番号ＣＲ３８２１３２．１）として抽出された。ＰＯＸ２遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号６２として提供され、タンパク質コード配列の上流及び下流の１，０００ヌクレオチドを含む。コードされたＰＯＸ２ポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号６３として提供される。ワイ・リポリティカＰＯＸ２は、７００個のアミノ酸残基からなるタンパク質である。

【0535】

他の標的遺伝子欠失をワイ・リポリティカに導入するための遺伝子構築体
同様のプロセスに従って、脂質の異化に関与するアシル－ＣｏＡオキシダーゼでもあるＰＯＸ３タンパク質（配列番号６５）をコードするワイ・リポリティカのＰＯＸ３遺伝子（配列番号６４）のコード領域を欠失させる。

【0536】

両方ともペルオキシソーム機能に関与し、従って脂肪酸の異化を媒介するＭＦＥ１（配列番号６６）及びＰＥＸ１０（配列番号６８）のタンパク質コード配列を欠失させるために、同じアプローチが使用される。脂肪酸合成を調節する調節遺伝子であるＳＮＦ１（配列番号７０）、ＳＰＯ１４（配列番号７２）、及びＯＰＩ１（配列番号７４）のタンパク質コード配列、及びワイ・リポリティカゲノム由来の他の目的の遺伝子のタンパク質コード配列を欠失させるために、上記のＰＯＸ１の欠失と同じ戦略が使用される。タンパク質コード配列の上流及び下流の１，０００ヌクレオチドを含むヌクレオチド配列、及び標的遺伝子のコードされたポリペプチド配列が提供されており（本明細書では配列番号６７、６９、７１、７３、７５、及び７７）、これらは、公開されているＹＡＲＬＩ遺伝子識別子を使用して、ＫＥＧＧヤロウィアデータベース（www.genome.jp/kegg-bin/show_organism?org=yli）から抽出された。

【0537】

実施例１１．単一遺伝子ＴＡＧ変異体の脂肪酸組成
実施例８に記載したように生成されたワイ・リポリティカ単一遺伝子変異体のそれぞれを、８％（ｗ／ｖ）グリセロール含有量と低窒素含有量を有するＤＭ－Ｇｌｙｃ－ＬｏｗＮ培地中で増殖させて、ＴＡＧ産生を誘導した。培養物を２８℃で４日間増殖させた。細胞を遠心分離によって採取し、ｍｉｌｌｉＱ水で２回洗浄し、予め秤量したエッペンドルフチューブに移し、－８０℃で２０分間凍結し、そして一晩凍結乾燥した。脂質を抽出し、分画して、ＴＡＧを極性脂質及び他の脂質クラスから分離した。ＴＡＧ及び極性脂質画分の脂肪酸組成は、実施例１に記載したようにＦＡＭＥのＧＣによって決定した。

【0538】

各株の二重培養の平均に関するデータは表１７に示される。いくつかの重要な特徴が注目された。この実験では、野生型Ｗ２９株は６．３％のＴＦＡ含有量を蓄積した。単一遺伝子ｌｒｏ１変異体は、わずかに少ない総脂質を蓄積した。単一遺伝子ｄｇａ１及びｄｇａ２変異体は、より少ないＴＡＧ、従ってより少ない総脂質を蓄積した。これは、極性脂質含有量と組成の場合には当てはまらず、これらは、ｄｇａ１変異体の極性脂質におけるＳＦＡ含有量のわずかな増加を除いて、野生型株と比較して単一遺伝子変異体のそれぞれでほとんど同じであった。しかしながら、ＴＡＧ画分の脂肪酸含有量と組成には、さらに大きな違いが見られた。ＴＡＧ含有量はｄｇａ１及びｄｇａ２変異体で顕著に低下し、ｌｒｏ１変異体でも低下したが、それほどではなく、これが各株の総脂質の低下の原因であった。最も重要なことは、長鎖飽和脂肪酸の割合が、ｄｇａ１変異体、すなわちＣ１８：０、Ｃ２０：０、Ｃ２２：０、そして何よりもＣ２４：０で顕著に低下したことである。ＴＡＧのＣ１８：０含有量は、野生型の２３．１％からｄｇａ１変異体では１０．７％に低下し、Ｃ２４：０は７．５％から１．３％に低下し、相対的に８３％低下した。対照的に、Ｃ１６：０の割合はｄｇａ２変異体で低下した。同じパターンがＣ１８：０及びより長いＳＦＡとＣ１６：０及びより短いＳＦＡとの比（Ｌ／Ｓ－ＳＦＡ比）にも見られ、これは、野生型の１．５１からｄｇａ１変異体の０．６３まで低下したが、ｄｇａ２変異体では１．９７に上昇した。

【0539】

本発明者らは、ワイ・リポリティカの異なるＴＡＧ産生酵素はそれらの脂肪酸基質特異性が異なると結論づけた。すなわち、ＤＧＡ１タンパク質は、より長いＳＦＡの大部分をＴＡＧに挿入するのに活性であり、特にＣ２４：０のほとんどがＴＡＧに蓄積されたため、この酵素はより長いＳＦＡに対して著しく高い特異性を有していたのに対し、ＤＧＡ２タンパク質はＣ１６：０に対してより高い特異性を有していた。これはまた、ワイ・リポリティカのＴＡＧ分子においてエステル化されたＣ２４：０のほとんどが、ＴＡＧ分子のｓｎ－３位でエステル化されていることを意味した。ＧＣトレース上のピークのＣ２４：０の本体はＧＣ－ＭＳによって確認された。

【表17】

【0540】

実施例１２．ワイ・リポリティカＤＧＡ１の過剰発現
実施例１１に記載のデータを考慮し、データから導かれた結論に基づいて、本発明者らは、酵母細胞においてワイ・リポリティカＤＧＡ１酵素を過剰発現する遺伝子構築体を設計した。ワイ・リポリティカの場合、この構築体は、ＴＥＦプロモーター（配列番号７）、ＦＢＡＩｎプロモーター（配列番号７８又は配列番号７９）、又はＰＤＫプロモーター（配列番号８０）などの強力なプロモーターの制御下で、ＤＧＡ１タンパク質のコード領域を組み込むように特別に設計された。異種ＤＧＡ１遺伝子は、組み込みのためのＤＧＡ２遺伝子（実施例８）からの隣接配列を有しており、その結果ＤＧＡ２遺伝子の不活性化をもたらした。この構築体は、２つの遺伝子改変、すなわちワイ・リポリティカにおけるＤＧＡ１ポリペプチドの過剰発現とＤＧＡ２遺伝子の不活性化の両方を同時に提供し、いずれかの遺伝子改変単独よりもＳＦＡ含有量をさらに増加させるように、設計された。ＤＧＡ２遺伝子に構築体が組み込まれた形質転換株は、ＴＡＧ合成を誘導する培地中で増殖される。これらの培養物から抽出された脂質は、非形質転換親株と比較してＳＦＡ含有量が大幅に増加しており、抽出された脂質の総脂肪酸含有量中のＣ２０：０、Ｃ２２：０、及びＣ２４：０が大幅に増加している。

【0541】

実施例１３．飽和脂肪酸含有量を増加させるための微生物の改変
多くの酵母は、リノール酸（ＬＡ、Ｃ１８：２Δ９，１２）や、一部の種ではα－リノレン酸（ＡＬＡ、Ｃ１８：３Δ９，１２，１５）などの多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）を生成し、これらは、ＴＡＧを含む脂質に組み込まれる。例えば上記実施例３を参照。本発明者らは、抽出された脂質の融点を上昇させるために、ステアリン酸（Ｃ１８：０）を含む飽和脂肪酸のレベルを上昇させ、ω６脂肪酸ＬＡを含む多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）を減少させたいと考えた。炭素源としてグルコースを有し、脂肪酸の補充が欠如した富裕培地で培養した場合、野生型ワイ・リポリティカＷ２９株は、それぞれ細胞の総脂肪酸含有量の割合として、比較的少量の約４～７％のステアリン酸及び約６～１５％のＬＡを生成した（表７、実施例３）。より多くのＴＡＧ合成を誘導するために、低窒素レベル及び炭素源としてグリセロールを有する培地中でｆａｄ２変異株を培養すると、ステアリン酸レベルは１８％（表１６、実施例６）に増加し、他の実験では２０％以上に増加した。Ｗ２９株は、ＴＡＧにＡＬＡが存在せず、リン脂質が細胞から抽出されたため、活性Δ１５デサチュラーゼが欠如していた。実施例６に記載のように、変異によるワイ・リポリティカのＦＡＤ２遺伝子の不活性化は、ＰＵＦＡ、特にＬＡ及び他のω６脂肪酸の生成を消失させた。

【0542】

ＴＡＧの生成と蓄積を増加させるために、炭素：窒素比が高い規定培地（ＤＭ－Ｇｌｙｃ－ＬｏｗＮ、実施例１）中で、野生型Ｗ２９株、ｆａｄ２変異体、及びｆａｄ２－ｕｒａ３二重変異体を培養する実験を実施した。種培養物をＳＤ－Ｕｒａ培地で増殖させ、ＤＭ－Ｇｌｙｃ－ＬｏｗＮで培養物を接種するために使用した。これらの培養物を９６時間増殖させた。ｐＨを毎日測定し、２４時間と４８時間にＮａＯＨでｐＨ６．０に調整し、次にｐＨは安定し、それ以上の調整は必要なかった。細胞を９６時間に採取し、洗浄した。細胞試料中の総脂肪酸含有量は、実施例１に記載したように細胞を直接メチル化することによって測定し、脂質を残りの細胞から抽出し、ＴＬＣによって分画した。実施例１に記載したように、ＴＡＧ画分をＧＣで分析した。使用した培養条件下で、以前の実験との比較で、Ｗ２９株由来のＴＡＧは、ステアリン酸含有量が約３１～３３％まで増加し、ＬＡ含有量が約４～５％で低かった（表１８）。総飽和脂肪酸含有量は総脂肪酸含有量の５２～５５％であり、これまでに見られたよりも高かった。パルミチン酸は、ＴＦＡ含有量の１６～２０重量％で存在した。すべての試料はまた、Ｃ２０：０、Ｃ２２：０、及びＣ２４：０も含んでいた。ｆａｄ２及びｆａｄ２－ｕｒａ３変異体由来のＴＡＧは、ＬＡ及び他のＰＵＦＡが欠如し、ＦＡＤ２遺伝子によってコードされるΔ１２デサチュラーゼの主要基質であるオレイン酸の量が増加していた。これらの変異体はまた、ステアリン酸もＴＦＡ含有量の２７～３０％でわずかに少なかったが、パルミチン酸レベルはＴＦＡ含有量の１５～１９％でほぼ同じであった。これらの増殖条件下でのＴＦＡ含有量は、乾燥細胞重量の約６％に達した。本発明者らは、抽出された脂質の総脂肪酸含有量におけるステアリン酸及び他の長鎖ＳＦＡの割合が、使用される培地及び増殖条件によって大きく影響される可能性があると結論付けた。ｕｒａ３－ｐＡＴ２０７及びｕｒａ３－ｐＡＴ２０８変異体のＴＡＧ画分の予測融点は約４０℃である。ｆａｄ２－ｕｒａ３二重変異体（ｕｒａ３ｆａｄ２ ｐＡＴ２０７及びｕｒａ３ｆａｄ２ ｐＡＴ２０８）のＴＡＧ画分の予測融点は約４４℃である。

【表18】

【0543】

飽和脂肪酸含有量を増やすための遺伝子改変
本発明者らは、特にワイ・リポリティカなどの酵母における微生物脂質中の総ＳＦＡのレベルをさらに上昇させたいと考えた。実施例１１及び１２及び本実施例に記載されているように、本発明者らは、特にＤＧＡＴが、ステアロイル－ＣｏＡ、Ｃ２０：０－ＣｏＡ、Ｃ２２：０－ＣｏＡ、及び特にＣ２４：０－ＣｏＡなどのより長いＳＦＡ－ＣｏＡ基質に対して、Ｃ１６：０－ＣｏＡと比較して、少なくとも同じ活性、好ましくはより高い活性を有する場合、ＳＦＡをＴＡＧに移入する活性を有するＤＧＡＴの微生物細胞における発現を増加させる方法を着想した。すなわち、他のＤＧＡＴと比較して、少なくともＣ１８を有するＳＦＡに対してより高い特異性を有するＤＧＡＴである。実施例１１及び１２に記載されるように、そのようなＤＧＡＴの１つはワイ・リポリティカＤＧＡ１タンパク質であり、これは、アミノ酸配列がＤＧＡＴ１タンパク質よりも動物及び植物のＤＧＡＴ２により関連していたにもかかわらず、ＤＧＡ２タンパク質よりもステアリン酸及びより長いＳＦＡに対してより高い活性を有していた。この実施例に記載されているように、一価不飽和脂肪酸（ＭＵＦＡ）に対してより高い特異性を有することが知られており、従ってＳＦＡの割合を増加させることは期待されなかった他のＤＧＡＴ酵素は、驚くべきことに、ワイ・リポリティカなどの微生物の抽出された脂質におけるステアリン酸及び総ＳＦＡの割合を実質的に増加させること、並びにＴＡＧ産生に有利な条件下で増殖させた場合の細胞の総脂質含有量も増加することができた。これらの実験の一部では、微生物細胞に導入された遺伝子構築体は、ステアロイル－ＡＣＰに対して活性を有する脂肪アシルチオエステラーゼ、例えばマンゴスチンチオエステラーゼをコードする第２の遺伝子を有していた。

【0544】

本発明者らは、Arroyo-Caro et al. (2015) によって報告された、ＭｔＤＧＡＴ１と称されるマカダミアであるマカダミア・テトラフィラ（Macadamia tetraphylla）からのＤＧＡＴ１酵素が、ＰＵＦＡよりもＭＵＦＡに対して基質特異性を有することを特定した。マカダミアは種子油中に異常に高い割合のＭＵＦＡを蓄積することができ、総脂肪酸含有量の約６０％のオレイン酸と２０％のパルミトレイン酸を含む。本発明者らは、ワイ・リポリティカにおけるＭＵＦＡ産生の増加について試験する目的でＭｔＤＧＡＴ１を選択したが、それがＳＦＡを増加させ、ＭＵＦＡ含有量を低下させる可能性があるとは考えていなかった。ＭｔＤＧＡＴ１のアミノ酸配列（ＮＣＢＩ登録番号ＫＴ７３６３０２）は、配列番号８１として本明細書に提供される。これは５３５個のアミノ酸を有し、基質としてアシルＣｏＡ及びＤＡＧに結合するためのドメイン、９又は１０個の予測される膜貫通ドメイン、及びＣ末端近くのＥＲ保持モチーフを有する（Arroyo-Caroetal., 2015）。ＴＡＧ合成に欠陥のあるエス・セレビッシェ細胞でＭｔＤＧＡＴ１を過剰発現させると、ＭＵＦＡ、特にオレイン酸のレベルが増加した脂質が生成されたが、ＳＦＡ（Ｃ１６：０及びＣ１８：０）のレベルは、エス・セレビッシェの同じ株におけるエー・タリアーナ（A. thaliana）ＤＧＡＴ１及びエキウム・ピガルディイ（Echium pigardii）ＤＧＡＴ１の過剰発現によって生成されたものと同様であった（Arroyo-Caro et al., 2015）。著者らは、酵母細胞におけるＳＦＡの増強については報告しておらず、また予測もしていなかった。さらに、植物ＤＧＡＴ１酵素を用いた他の研究では、Ｃ１６：０及びＣ１８：０の増加無しで、一価不飽和オレオイルＣｏＡに対する基質特異性が示された（Zhou et al., 2013）。

【0545】

本発明者らはまた、マンゴスチン（Garcinia mangostana）から、ＧａｒｍＦＡＴＡ１及びＧａｒｍＦＡＴＡ２と呼ばれる２つの関連するアシル－アシル－キャリアー－タンパク質（ＡＣＰ）チオエステラーゼを選択した（Hawkins and Kridl, 1998）。どちらのタンパク質も、タンパク質を色素体に導くように機能するＮ末端輸送ペプチド配列（ＴＰＳ）を有する。そのＴＰＳを含む前者のポリペプチドは３５２個のアミノ酸を有し、一方、そのＴＰＳを含む後者のポリペプチドは３５５個のアミノ酸を有する。ＧａｒｍＦＡＴＡ１とＧａｒｍＦＡＴＡ２のアミノ酸配列は、ＧａｒｍＦＡＴＡ１の全長に沿って７３％同一である。アシル－ＡＣＰチオエステラーゼは、ＡＣＰからアシル基を切断し、それにより脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳ）による脂肪酸合成におけるアシル鎖伸長活性を停止させる。脂肪アシルＡＣＰチオエステラーゼは、配列相同性と活性に基づいて２つの異なるが関連するグループに分類され、すなわち、主にＣ１６以下のＳＦＡに対して特異性を有するＦＡＴＢチオエステラーゼと、Ｃ１６－ＡＣＰ基質よりもＣ１８－ＡＣＰ基質、特にＭＵＦＡ－ＡＣＰ基質に対してより活性が高いＦＡＴＡチオエステラーゼである。ＧａｒｍＦＡＴＡ１は、Ｃ１８：１－ＡＣＰに対して最大の活性を示し、Ｃ１８：０－ＡＣＰに対しては約８倍低い活性があり、Ｃ１６：０－ＡＣＰに対しても活性が低い。対照的に、ＧａｒｍＦＡＴＡ２は、Ｃ１８：１－ＡＣＰと比較してＣ１８：０－ＡＣＰに対して活性が約５０倍低かった。従って、両方の酵素は、ＭＵＦＡ、Ｃ１８：１－ＡＣＰに対して主要な活性を有した。アブラナ属種子におけるＧａｒｍＦＡＴＡ１の異種発現により、ある例では種子油中に２２％のステアリン酸が蓄積した（Hawkins and Kridl, 1998）。ＧａｒｍＦＡＴＡ１及びＧａｒｍＦＡＴＡ２のアミノ酸配列は、本明細書において配列番号８３及び配列番号８５として提供される。

【0546】

別のプロジェクトについて、本発明者らは、短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）に対して活性を有するシュードモナス・クロロラフィス（Pseudomonas chlororaphis）由来のアシルＣｏＡシンセターゼ（ＡＣＳ）を選択した（Hashimoto et al., 2005）。アシル－ＣｏＡシンセターゼは、補因子Ａ（ＣｏＡ）分子への脂肪酸の共有結合を触媒し、ＡＴＰ依存性反応でアシル－ＣｏＡチオールエステルを生成する。この酵素は長鎖脂肪酸に対して不活性であることが報告されており（Hashimoto et al., 2005）、長鎖ＳＦＡには影響を与えると予測されなかったにもかかわらず、以下に記載する構築体に含まれていた。ＰｃＡＣＳのアミノ酸配列は、本明細書において配列番号８７として提供される。

【0547】

本発明者らはまた、２つの構築体に含まれる、ＰＵＦＡに対する基質特異性を有すると考えられるクサレケカビＰＡＡＴ（ＭａＬＰＡＡＴ）を、やはり異なる目的のために選択した。ＭａＬＰＡＡＴのアミノ酸配列は、本明細書において配列番号９０として提供される。

【0548】

ｐＡＴ２０７～ｐＡＴ２１２の構築
GoldenGate戦略を使用して、実施例１に記載したように複数遺伝子構築体を生成した。最初の工程として、所望のポリペプチドのコード領域を含む中間遺伝子構築体を作製し、各構築体はクローニングベクターに単一の遺伝子挿入を有する。各タンパク質コード領域は、ワイ・リポリティカでの発現用にコドンが最適化され、GoldenGateアセンブリを可能にするために隣接するＢｓａＩ制限部位（ＧＧＴＣＴＣ）を使用して合成された。マカダミアＤＧＡＴ１のタンパク質コード領域を有する最初の遺伝子構築体ｐＡＴ１１７が合成された。１５８８個のヌクレオチドのタンパク質コード領域のコドン最適化ヌクレオチド配列（配列番号８２）は、ＮＣＢＩ登録番号ＫＴ７３６３０２．１の天然マカダミア配列と７５％同一であり、すなわち、ヌクレオチドの２５％がコドン最適化によって変更された。それぞれＧｍＦＡＴＡ１ポリペプチド及びＧｍＦＡＴＡ２ポリペプチドをコードするタンパク質コード領域を有する第２及び第３の遺伝子構築体ｐＡＴ０６６とｐＡＴ０６７が合成された。タンパク質コード領域のコドン最適化ヌクレオチド配列は、天然マンゴスチン配列と７４％同一であった。ｐＡＴ０６６及びｐＡＴ０６７におけるタンパク質コード領域のヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号８４及び配列番号８６として提供される。同じＰｃＡＣＳポリペプチド（配列番号８７）をコードするがヌクレオチド配列が異なるタンパク質コード領域を有する第４及び第５の遺伝子構築体（ｐＡＴ１３６及びｐＡＴ１３８）を合成した。タンパク質コード領域のコドン最適化ヌクレオチド配列は、天然シュードモナス（Pseudomonas）配列と６５％同一であった。ｐＡＴ１３６及びｐＡＴ１３８におけるタンパク質コード領域のヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号８８及び配列番号８９として提供される。

【0549】

これらの中間体ベクターを、ｐＴＥＦプロモーター配列及び各異種遺伝子のＬｉｐ２遺伝子転写ターミネーター／ポリアデニル化領域とともにGoldenGateアセンブリ反応に使用して、それぞれが選択マーカー遺伝子としてＵｒａ３遺伝子を含む４つの遺伝子を含む一連の遺伝子構築体を生成した。Ｕｒａ３遺伝子はデスティネーションベクターＧＧＥ１１４に存在していた。例えば、ｐＡＴ２０７のＤＮＡ部分は、ＧＧＥ１４６、ＧＧＥ１５１、及びＧＧＥ２９４（ｐＴＥＦプロモーター）、ＧＧＥ０１４、ＧＧＥ０１５、ＧＧＥ０８０、ＧＧＥ０２０、及びＧＧＥ０２１（ターミネーター）由来であり、バックボーンアセンブリベクター（デスティネーションベクター）は、ｐＡＴ０６６、ｐＡＴ１３６、及びｐＡＴ１１７からのコード領域に加えて、ＧＧＥ１１４であった。ＵＲＡ３遺伝子以外の各遺伝子を駆動するために使用されるｐＴＥＦプロモーターは、それぞれ長さ１０９ヌクレオチドの４つの連結された上流活性化配列（ＵＡＳ）を含み、これらは一緒になって遺伝子の転写を増加させるエンハンサー要素として機能した。他の構築体も同様の方法で組み立てられた。各構築体中の遺伝子は表１９に列挙される。各４遺伝子クラスターは、ＮｏｔＩを有するＤＮＡ断片の切除を可能にするために、ＮｏｔＩ制限酵素部位に隣接していた。また、４遺伝子クラスターには、５'ＮｏｔＩ部位のすぐ内側にあるワイ・リポリティカのゼータ配列の５'部分が隣接し、３'ＮｏｔＩ部位のすぐ内側にあるワイ・リポリティカのゼータ配列の３'部分が隣接しており、ワイ・リポリティカのゲノムへのより効率的な組み込みを提供した。６つの構築体のヌクレオチド配列は、配列番号９２～９７として提供される。

【表19】

【0550】

ワイ・リポリティカの形質転換と形質転換体により産生される脂質の分析
最初の実験では、ｐＡＴ２０７～２１０からのＮｏｔＩ ＤＮＡ断片を使用して、実施例７に記載されるように産生されたワイ・リポリティカのｕｒａ３ＫＯ２７変異株を形質転換した。形質転換体を、ＳＤ－Ｕｒａプレート上でウラシル原栄養性について選択した。コロニーをスクリーニングし、陽性の形質転換コロニーを同定した。各形質転換からの５つの形質転換体をＤＭ－Ｇｌｙｃ－ＬｏｗＮ培地で９６時間培養し、脂質を抽出し、ＴＬＣプレート上で分画した。脂肪酸組成とＴＡＧ及び極性脂質画分の含有量をＦＡＭＥのＧＣによって分析した。ｐＡＴ２０７からｐＡＴ２１０までの選択された形質転換体のデータを表２０及び２１に示し、各形質転換体の三重培養のデータを示す。他の形質転換体は、対照株と比較して同様の脂肪酸組成を有するか、表現型が中間であり、導入されたトランス遺伝子の発現レベルが低いか、発現しないと推定された。この観察は、ゲノム内の多くの可能な部位のいずれかに挿入できるゼータ配列を介して宿主ゲノムに挿入する構築体について予測されたものである。

【0551】

いくつかの観察は重要であった。第１に、構築体ｐＡＴ２０７、２０８、及び２０９のそれぞれは、細胞のＴＡＧ含有量及び極性脂質含有量の両方における総脂肪酸含有量の割合として、ステアリン酸含有量が著しく増加した形質転換体を提供した。形質転換体ｐＡＴ２０９－５におけるステアリン酸含有量は、対照株ｕｒａ３ＫＯ２７におけるＴＡＧ中の約２０％及び極性脂質中の約３％と比較して、ＴＡＧ中の総脂肪酸含有量の３７．９％及び極性脂質中の３５．５％であった。さらに、一部の形質転換体では、非形質転換対照株と比較して、ＴＡＧ含有量が２倍以上であった。これらの形質転換体がＴＡＧ合成に最適な条件下で増殖されなかったことを考慮すると（以下を参照）、ＴＡＧの増加の程度は最大ではなかった。これらのデータから、本発明者らは、形質転換体中で産生されたステアリン酸の量が実質的に増加し、及びＴＡＧと極性脂質の両方への取り込みも増加したと結論づけた。生成されたステアリン酸の量は、絶対量でも他の脂肪酸と比較しても、増加していると考えられる。これは、ｐＡＴ２０７、２０８、及び２０９の遺伝子から生成されたアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ及びＤＧＡＴ１酵素の両方が、ステアリン酸の生成及び細胞脂質への取り込みを増加させるように機能していることを示唆した。ＴＡＧへのステアリン酸の取り込みの増加は、ＭｔＤＧＡＴ１の活性を示していた。本発明者らは、これらの構築体中のＰｃＡＣＳが、ＳＣＦＡ以外の脂肪酸に対する活性の欠如が既知であることを考慮すると、ステアリン酸レベルの増加に何の役割も持たないであろうと考えた。

【0552】

本発明者らはまた、ステアリン酸の増加に加えて、形質転換体からのＴＡＧにおいて、ＶＬＣ－ＳＦＡ、Ｃ２０：０、及びＣ２２：０が最大約４倍まで増加していることも観察した。Ｃ２０：０はまた、形質転換体からの極性脂質においても増加していた。これは、ステアリン酸の増加に伴い、形質転換体におけるＶＬＣ－ＳＦＡの生成及び細胞脂質への取り込みが増加したことを示した。さらなる観察は、極性脂質含有量ではなくＴＡＧ含有量が、形質転換されていない対照株と比較して、形質転換体において実質的に増加していることであった。これは、非形質転換細胞と比較して増加した量のステアリン酸塩及びより長いＳＦＡをＴＡＧに取り込むことを含めて、ＴＡＧレベルを増加させると予測されないチオエステラーゼ酵素の活性がなくても、ＤＧＡＴ遺伝子が単独でも形質転換体中で活性であることを示した。さらに、形質転換体からのＴＡＧ中のＣ１８：１Δ９及びＣ１６：１Δ９などの一価不飽和脂肪酸の割合が大幅に減少した。これは、ＭｔＤＧＡＴ１がこれらのＭＵＦＡに対して主要な活性を有することが報告されているため（Arroyo-Caro et al., 2015）、ＭｔＤＧＡＴ１を発現する構築体にとって驚くべき結果であり、実際、これは本発明者らの予測とは逆の結果であった。形質転換体からの極性脂質でも、ＭＵＦＡ含有量の同様の減少が観察された。

【0553】

さらに、形質転換体由来のＴＡＧ中の総ＳＦＡ含有量は５０％未満から６０％超に増加し、Ｌ／Ｓ－ＳＦＡ比は１．５未満から３．０超に増加した。これもまた、報告されているＭｔＤＧＡＴ１酵素のＭＵＦＡに対する主要な活性を考慮すると、予想外の結果であった。

【0554】

ｆａｄ２変異体の形質転換と形質転換体に産生された脂質の分析
ｐＡＴ２０７～ｐＡＴ２１２のＮｏｔＩ ＤＮＡ断片もまた、実施例７に記載されたように産生されたワイ・リポリティカのｆａｄ２ＫＯ１－ｕｒａＫＯ２７二重変異株を形質転換するために使用された。 形質転換操作はChen et al. (1997) により記載されたように実施し、推定形質転換体のコロニーを、ＳＤ－ｕｒａプレート上で３０℃で３日間インキュベートして選択した。この操作を、ｐＡＴ２０７、ｐＡＴ２０８、ｐＡＴ２１０、ｐＡＴ２１１、及びｐＡＴ２１２については２回、そしてｐＡＴ２０９プラスミドについては３回行った。Looke et al. (2011)によって記載されたように、ゲノムＤＮＡを推定形質転換体から抽出し、そしてゲノムに組み込まれたｐＡＴ２０７～２１２プラスミドの存在は、オリゴヌクレオチドプライマー対ａｔ００１（配列番号９８）とａｔ００２（配列番号９９）を使用するＰＣＲ増幅によって確認された。最初の形質転換セットでは、確認された形質転換コロニーの数は次のとおりであった：ｐＡＴ２０７、４；ｐＡＴ２０８、１０；ｐＡＴ２０９、８；ｐＡＴ２１０、９；ｐＡＴ２１１，１０、及びｐＡＴ２１２，７。第２のセットでは、選択されたコロニーの数は次のとおりであった：ｐＡＴ２０７、８；ｐＡＴ２０８、３；ｐＡＴ２０９、３３；ｐＡＴ２１０、１０；ｐＡＴ２１１，５、及びｐＡＴ２１２，１０。これらをＳＤ－ｕｒａプレート上に再度画線塗布した。確認された各形質転換株から単一のコロニーを選択し、ＳＤ－ｕｒａ培地中で一晩培養して種培養物を生成した。種培養物を使用して、５０ｍｌファルコンチューブに１０ｍｌのＤＭ－Ｇｌｙｃ－ＬｏｗＮ培地をＯＤ６００が０．２になるまで接種し、滅菌AeraSeal（登録商標）フィルム（Sigma, A9224）で覆い、通気のために２００ｒｐｍで振盪しながら３０℃で９６時間培養した。

【0555】

脂質を細胞培養物から抽出し、実施例１に記載したように脂質を抽出し分析した。総脂肪酸（ＴＦＡ）、ＴＡＧ、及び極性脂質画分の脂肪酸含有量及び組成を、ＦＡＭＥのＧＣによって分析した。ｐＡＴ２０７からｐＡＴ２１２までの選択された形質転換体のデータは表２２～２４に示される。

【0556】

多くの形質転換体では非形質転換対照と比較して、総脂肪酸含有量が大幅に増加していることがすぐに明らかであった。重量ベースで１０～１３％のＴＦＡを生成する非形質転換細胞と比較して、一部の形質転換体は重量ベース（乾燥細胞重量）で最大約３３％の総脂肪酸含有量を有していた。これは、減少したＰＵＦＡ、特に減少したＬＡ（これは、検出されなかったか又は総脂肪酸含有量の０．２％以下、例えば０．１重量％の少量で存在した）と組み合わせられたものである。他の形質転換体では、ＴＦＡ含有量が増加していないか、この表現型では中間的であり、異なる形質転換体に対するトランス遺伝子活性の範囲が示されている。ＦＡＤ２野生型株を用いた以前の実験と同様に、ステアリン酸、Ｃ２０：０、及びＣ２２：０含有量の大幅な増加が、非形質転換対照株と比較して、脂肪酸の絶対量（増加した脂質含有量を考慮して）と他の脂肪酸と比較した量の両方で観察された。一部の形質転換体では、ステアリン酸含有量がほぼ４０％に達した。一部の形質転換体では、Ｃ２０：０の量が重量ベースでＣ２４：０の量を超え、ＴＦＡ含有量の少なくとも１．０％であり、一部の形質転換体では、重量ベースでＴＡＧのＴＦＡ含有量と脂肪酸含有量の両方が３．０％を超えた。別の形質転換体では、抽出された脂質及び脂質中のＴＡＧは１２％のＣ２４：０を有していたため、Ｃ２４：０の量はＣ２０：０及びＣ２２：０の量よりも実質的に多かった。総ＳＦＡ含有量は、ＴＦＡ含有量の最大約７０重量％まで増加した。Ｌ／Ｓ－ＳＦＡ比もまた、対照細胞における約１．２～１．４から、いくつかの例（例えばコロニーｐＡＴ２０８－５）では３．０を超えるまで有意に増加した。これらのデータは再度、いくつかのトランスジェニック株におけるＤＧＡＴ及びＦＡＴＡ酵素の両方の活性を示した。一部の形質転換体ではパルミチン酸含有量も増加し、総ＳＦＡの増加に寄与した。それぞれの場合において、ＬＡ含有量及び総ＰＵＦＡ含有量の両方とも０．２％以下であったため、ｆａｄ２変異及び他のΔ１２デサチュラーゼの欠如により、ＬＡは存在しないか、重量ベースで０．２％未満しか存在しなかった。オレイン酸の量は、ＴＦＡ含有量の百分率としての重量ベースで、非形質転換細胞の約５５～６０％から形質転換細胞の２５％～５５％まで低下した。興味深いことに、非形質転換細胞と比較して形質転換体細胞では、ＴＦＡ及びＴＡＧ中のＣ２４：０含有量は増加しなかったが、Ｃ２０：０及びＣ２２：０含有量が大幅に増加し、これは、Ｃ２２：０をＣ２４：０に伸長するエロンガーゼがこれらのワイ・リポリティカ細胞では活性が増加しなかったことを示している。Ｃ２４：０は、主に膜機能のためのスフィンゴ脂質含有量としてワイ・リポリティカ細胞によって使用されるが、一部のＣ２４：０はこれらの細胞内でＴＡＧの形でエステル化されていた。

【0557】

また、一部の形質転換体ではＴＡＧ含有量が増加したが、ステアリン酸含有量は実質的に増加せず、一方、他の形質転換体ではステアリン酸含有量が増加したが、ＴＡＧ含有量はそれほど増加していないことも観察された。これは、２つの外因性酵素ＤＧＡＴ及びＦＡＴＡの一方が他方よりも活性が高いためであると考えられ、すなわち、ＤＧＡＴはＴＡＧ含有量の増加に関与しており、ＦＡＴＡチオエステラーゼは他の脂肪族酵素と比較してステアリン酸の増加に関与している。また、一部の形質転換体は、野生型、例えばコロニーｐＡＴ２１２－１及び２１２－４と比較して、ステアリン酸含有量が減少していることも観察された（表２２）。これは、内因性チオエステラーゼ活性の低下に起因する可能性がある。これらの結論を確認するために、これらのトランス遺伝子及び内因性遺伝子について、さまざまな形質転換体中のｍＲＮＡレベルのＲＴ－ＰＣＲアッセイを実行される。

【0558】

ｐＡＴ２１１及びｐＡＴ２１２からの形質転換体は、得られた形質転換体の数の割合として、他の４つの構築体よりもステアリン酸含有量及びＳＦＡ含有量が実質的に増加した形質転換体をより多く提供するようであった。これは、これらの遺伝子構築体に対するＬＰＡＡＴをコードする遺伝子の何らかの活性を示している可能性がある。これら２つの構築体には、シュードモナスのアシルＣｏＡシンセターゼ（ＡＣＳ）をコードする遺伝子が含まれていないことが注目された－ＰｃＡＣＳは、少なくともＣ１８を有する脂肪酸に影響を与えることは予測されなかった。

【0559】

形質転換体由来の極性脂質の分析のデータ（表２２）は、上記の結論を裏付けるものであったが、いくつかの驚くべき観察結果も明らかにした。第１に、極性脂質含有量は、非形質転換細胞の２％～３％から、一部の形質転換体では少なくとも８％まで大幅に増加した。これは、ＬＰＡＡＴを発現する遺伝子を含む形質転換体ではＬＰＡＡＴを発現しなかった形質転換体よりも多く観察され、ここから、ＬＰＡＡＴが極性脂質含有量の増加に役割を果たしていると結論づけられた。第２に、一部の形質転換体ではステアリン酸含有量だけでなくパルミチン酸含有量も大幅に増加しており、極性脂質中のＳＦＡ含有量が６０重量％を超えていた。驚くべきことに、一部の形質転換体における極性脂質中の総脂肪酸の割合としてのＳＦＡ含有量は、ＴＡＧ含有量におけるＳＦＡ含有量を超えていた。これは、非形質転換細胞のＴＡＧにおける約４０％のＳＦＡ含有量と比較して、非形質転換細胞の極性脂質における約１１％というはるかに低いＳＦＡ含有量を考慮すると、最も驚くべきことであった。形質転換細胞の極性脂質におけるパルミチン酸の増加は、同じ細胞におけるＴＡＧのわずかな減少を考慮すると予測されなかった。極性脂質におけるＳＦＡの増加が、ＳＦＡの供給を増加させる外因性ＦＡＴＡチオエステラーゼ活性による可能性が高いと結論付けられた。

【表20】

【表21】

【表22-1】

【表22-2】

【表23-1】

【表23-2】

【表24-1】

【表24-2】

【0560】

ステアリン酸存在下での形質転換体の培養
形質転換体ｐＡＴ２０９－５を含むワイ・リポリティカｕｒａ３変異株、及び形質転換体ｐＡＴ２１１－０３及びｐＡＴ２１１－０９を含むｕｒａ３－ｆａｄ２二重変異体バックグラウンド中の選択された形質転換体を、１０ｇ／Ｌのステアリン酸ナトリウムを補充した低窒素含有量の規定培地で培養する。ある実験では、培地のｐＨは８．０に調整される。４日間の培養後、細胞を培養物から回収し、脂質を抽出する。脂質の分析により、ステアリン酸の量が、抽出された脂質の並びに脂質のＴＡＧ画分の総脂肪酸含有量の最大７５重量％又は８５重量％に達していることが示されている。ステアリン酸レベルがＴＦＡ含有量の７５重量％までである場合、オレイン酸の量はＴＦＡ含有量の少なくとも１０重量％である。Ｃ１６：１Δ７及びＣ１７：１のように、Ｃ２０：０、Ｃ２２：０、及びＣ２４：０も存在する。ｕｒａ３－ｆａｄ２株中の形質転換体からの脂質では、ＰＵＦＡは存在しないか、又は０．２％未満のレベルで存在する。抽出された脂質にはまた、トランス遺伝子が欠如した対応するワイ・リポリティカ株から産生された脂質と比較して、ＳＦＡ量が増加したリン脂質も含まれる。抽出された脂質は２５℃で固体である。これらの脂質は、高オレイン酸大豆油などの油とブレンドされる。

【0561】

実施例１４． 飽和脂肪酸含有量を増加させるための微生物のさらなる改変
遺伝子構築体ｐＡＴ２０７～２１２を用いた実施例１３に記載の実験を考慮して、本発明者らは、ＤＧＡＴ１及びＦＡＴＡ酵素の活性、並びこれらの構築体によってコード化されるピー・クロロラフィス（P. chlororaphis）ＡＣＳ酵素活性の推定される欠如を、単一及び二重の遺伝子構築体を作成することにより確認したいと考えた。これらの構築体は、ワイ・リポリティカにおけるＳＦＡ含有量とＴＦＡ含有量を増加させる能力について、三重遺伝子構築体ｐＡＴ２０９と比較される。

【0562】

GoldenGate戦略を使用して、それぞれが選択可能なマーカー遺伝子としてＵＲＡ３遺伝子も有する６つの構築体（表２６）を生成した。各構築体は、最初に、必要に応じて、隣接するＢｓａＩ制限部位を有する実施例１３からの３つの個々の遺伝子の５'上流配列又は３'下流配列を改変して作製することにより、ＵＲＡ^＋ベクターへのクローニングを可能にした。例えば、ＭｔＤＧＡＴ１コード領域を有するｐＡＴ１２０は、ｐＡＴ１１７からプライマーａｔ２７４及びａｔ２７５を使用するＰＣＲによって作製され、ｐＡＴ１６１は、ｐＡＴ１１７からプライマーａｔ２９７及びａｔ２９８を使用するＰＣＲによって作製された。デスティネーションベクターへの組み立ては、ｐＡＴ２０７～２１２の構築と同様の方法で行った。ＰｃＡＣＳ－Ｘ１タンパク質をコードする構築体ｐＡＴ０９１は、成分ＧＧ１１４、ＧＧ０２０、ＧＧ１４６、及びｐＡＴ０２１からのタンパク質コード配列から組み立てられた。ＧｍＦＡＴＡ２タンパク質をコードする構築体ｐＡＴ１０８は、成分ＧＧ１１４、ＧＧ０２０、ＧＧ１４６、及びｐＡＴ０６７からのタンパク質コード配列から組み立てられた。ＭｔＤＧＡＴ１タンパク質をコードする構築体ｐＡＴ１３５は、成分ＧＧ１１４、ＧＧ０２０、ＧＧ１４６、及びｐＡＴ１２０からのタンパク質コード配列から組み立てられた。ＧｍＦＡＴＡ２及びＰｃＡＣＳ－Ｘ１タンパク質をコードする構築体ｐＡＴ２１３は、成分ＧＧ１１４、ＧＧ１４６、ＧＧ１５１、ＧＧ０１４、ＧＧ０２１、及びｐＡＴ０６７とｐＡＴ１３６からのタンパク質コード配列から組み立てられた。ＧｍＦＡＴＡ２タンパク質及びＭｔＤＧＡＴ１タンパク質をコードする構築体ｐＡＴ２１４は、成分ＧＧ１１４、ＧＧ１４６、ＧＧ１５１、ＧＧ０１４、ＧＧ０２１、及びｐＡＴ０６７とｐＡＴ１６１からのタンパク質コード配列から組み立てられた。ＰｃＡＣＳ－Ｘ１及びＭｔＤＧＡＴ１タンパク質をコードする構築体ｐＡＴ２１５は、成分ＧＧ１１４、ＧＧ１４６、ＧＧ１５１、ＧＧ０１４、ＧＧ０２１、及びｐＡＴ０２１とｐＡＴ１６１からのタンパク質コード配列から組み立てられた。バックボーンベクターＧＧ１１４中の各遺伝子構築体には、ＮｏｔＩによるＤＮＡカセットの切除を可能にするＮｏｔＩ制限酵素部位が隣接していた。これら６つの構築体のＮｏｔＩ ＤＮＡ断片のヌクレオチド配列は配列番号１０８～１１３として提供され、オリゴヌクレオチドプライマーのヌクレオチド配列は配列番号１００～１０７として提供される（表２５）。

【0563】

ＧｍＦＡＴＡ２、ＰｃＡＣＳ－Ｘ１、及びワイ・リポリティカＤＧＡ１タンパク質をコードする３つの遺伝子と、ＵＲＡ３選択マーカー遺伝子である４番目の遺伝子を有する７番目の遺伝子構築体（ｐＡＴ２１６）を、GoldenGate戦略によって組み立てた。従って、この構築体は、マカダミアＭｔＤＧＡＴ１のコード領域がワイ・リポリティカＤＧＡ１コード領域で置換されたことを除いて、ｐＡＴ２０９と同一であった。これは、実施例１１に記載したように、ＹｌＤＧＡ１タンパク質がＳＦＡに対して特異的な活性を有すると推定され、従って、たとえＹｌＤＧＡ１がＤＧＡＴ２ファミリーに属していても、ＭｔＤＧＡＴ１を置換できると考えられたため、作製された。従って、この構築体ｐＡＴ２１６は、ＦＡＴＡチオエステラーゼタンパク質の共発現に関連して２つのＤＧＡＴ酵素の比較を可能にした。ｐＡＴ２１６を作製するために、Ｙ１ＤＧＡ１コード領域を有する第１の構築体ｐＡＴ１６２を、ＰＣＲによってプライマーａｔ２９９及びａｔ３００（表２５）、及びワイ・リポリティカ由来のタンパク質コード配列を使用して作製した。ｐＡＴ２１６は、ＧＧ１１４、ＧＧ１４６、ＧＧ１５１、ＧＧ２９４、ＧＧ０１４、ＧＧ０１５、ＧＧ０８０からの成分と、ｐＡＴ０６７、ｐＡＴ１３６、及びｐＡＴ１６２からのタンパク質コード領域を使用して組み立てられた。ｐＡＴ２１６からのＮｏｔＩ ＤＮＡ断片のヌクレオチド配列は、配列番号１１４として提供される。遺伝子構築体とこれらの関連成分の遺伝子を表２６に示す。

【表25】

【表26】

【0564】

ワイ・リポリティカの形質転換と形質転換体が産生する脂質の分析
これらの遺伝子構築体からのＮｏｔＩ ＤＮＡ断片を使用して、他の構築体について上述したように、ワイ・リポリティカのｆａｄ２ＫＯ１－ｕｒａ３ＫＯ２７二重変異株を形質転換し、３０℃で３日間インキュベートしてＳＤ－ｕｒａプレート上の形質転換体コロニーを選択する。推定上の形質転換体からゲノムＤＮＡを抽出し、ゲノムに組み込まれた遺伝子構築体の存在をＰＣＲ増幅によって確認する。各形質転換から少なくとも６つの確認された形質転換体コロニーを選択し、ＳＤ－ｕｒａ培地で一晩培養して種培養物を生成する。種培養物を使用して、５０ｍｌファルコンチューブ内の１０ｍｌのＤＭ－Ｇｌｙｃ－ＬｏｗＮ培地に、ＯＤ６００が０．２になるまで接種し、通気のために２００ｒｐｍで振盪しながら３０℃で９６時間培養する。採取した細胞から脂質を抽出し、実施例１に記載のように分析する。総脂肪酸（ＴＦＡ）の脂肪酸含有量と組成、ＴＡＧ、及び極性脂質画分をＦＡＭＥのＧＣにより分析する。

【0565】

実施例１５．他のアシルトランスフェラーゼ遺伝子
他の脂肪酸アシルアシルトランスフェラーゼは、微生物の飽和脂肪酸含有量を増加させる、特にステアリン酸及び少なくとも２０個の炭素を有する飽和脂肪酸であるアラキジン酸（Ｃ２０：０）、ベヘン酸（Ｃ２２：０）、及びリグノセリン酸（Ｃ２４：０）を増加させる可能性のある酵素として考えられていた。熱帯植物種テオブロマ・カカオ（Theobroma cacao）の種子は、カカオ脂として知られる脂質源であり、ステアリン酸が豊富なＴＡＧ分子を構造化しており、例えばチョコレートや化粧品などに使用されている。テオブロマ・カカオのゲノム中に、１１種類のＤＧＡＴ遺伝子が同定されている（Wei et al., 2017）。１１種類のＤＧＡＴ酵素のうち２種類、すなわちＴｃＤＧＡＴ１とＴｃＤＧＡＴ２が、エス・セレビッシェでカカオ脂様ＴＡＧを生成する能力について試験されたが、効果はほとんどなかった（Wei et al., 2017）。ＤＧＡＴのアミノ酸配列は、本明細書において配列番号１１５～１２５として提供される。ティー・カカオはまた、本明細書においてＴｃＧＰＡＴ１～１３と称される、ＧＰＡＴ酵素に対して相同性を有するポリペプチドをコードする複数の遺伝子、及び本明細書においてＴｃＰＤＡＴ１、２、及び４～６と称される、ＰＤＡＴに対して相同性を有するポリペプチドをコードする複数の遺伝子を有する。ＧＰＡＴのアミノ酸配列は、本明細書において配列番号１２６～１３８として提供され、ＰＤＡＴのアミノ酸配列は、本明細書において配列番号１３９～１４３として提供される。

【0566】

本発明者らは、ＴｃＤＧＡＴ９～ＴｃＤＧＡＴ１１アミノ酸配列が、ティー・カカオ由来の他のＤＧＡＴ配列よりも、ＰＤＡＴ酵素であるエス・セレビッシェＬＲＯ１遺伝子産物とより関連していることに注目した。従って、候補ＤＧＡＴ酵素のうち、ＴｃＤＧＡＴ９、１０、及び１１酵素が特に興味深いものであった。

【0567】

コドン最適化ヌクレオチド配列は、単独で、又はＦＡＴＡ酵素、例えばパルミトイル－ＡＣＰよりもステアロイル－ＡＣＰに対して活性が高いＧｍＦＡＴＡ酵素と組み合わせて、ワイ・リポリティカにおいて候補ＤＧＡＴ、ＧＰＡＴ、及びＰＤＡＴ酵素を発現するように設計された。ヌクレオチド配列は、ＤＧＡＴについては配列番号１４４～１５４、ＧＰＡＴについては配列番号１５５～１６７、及び候補ＰＤＡＴについては配列番号１６８～１７２として本明細書に提供される。ＴｃＤＧＡＴ、ＴｃＧＰＡＴ、及びＴｃＰＤＡＴタンパク質コード配列は、ワイ・リポリティカでの発現用にコドン最適化された。いずれの場合も、コドン最適化配列は、配列の全長に沿ってティー・カカオ由来の天然タンパク質コード配列と７３％～７７％同一であり、すなわちヌクレオチドの２３％～２７％がコドン最適化によって置換されていた。

【0568】

ＭｔＤＧＡＴ配列をティー・カカオ配列で置換することを除き、ｐＡＴ２１４について実施例１４に記載したアプローチを使用して、それぞれがＧｍＦＡＴＡ酵素とともにＴｃＤＧＡＴ酵素の１つを発現する１１の遺伝子構築体を設計した。１３個の構築体がＧＰＡＴ用に、そして５個の構築体がＰＤＡＴ用に、同様に設計されている。ＤＧＡＴとＧＰＡＴ、ＤＧＡＴとＰＤＡＴ、及びＧＰＡＴとＰＤＡＴの組み合わせも設計されている。構築体は、上記及び実施例１に記載の他の構築体と同様の方法でGoldenGate戦略によって合成される。各構築体は、ワイ・リポリティカのｕｒａ３ＫＯ２７－ｆａｄ２ＫＯ１変異株に導入される。確認された形質転換体は低窒素培地で培養され、細胞から脂質が抽出され、そしてＴＦＡ、ＴＡＧ、及び極性脂質画分が含有量と脂肪酸組成について分析される。脂肪酸アシルアシルトランスフェラーゼの少なくとも一部は、細胞内のＴＡＧ含有量と抽出された脂質内のＳＦＡ含有量の両方を増加させると予測される。所望の脂肪酸プロフィールを有する形質転換体が選択される。

【0569】

コドン最適化ヌクレオチド配列もまた、単独で、又はＦＡＴＡ酵素、ＤＧＡＴ酵素、又はＦＡＴＡ酵素とＤＧＡＴ酵素の両方と組み合わせて、ワイ・リポリティカにおいて候補のＧＰＡＴ及びＰＤＡＴ酵素を発現するように設計された。構築体はまた、ワイ・リポリティカにおいて２つ又は３つの候補ＰＤＡＴ酵素を発現するように設計された。

【0570】

複数遺伝子ベクターの設計
３つのティー・カカオＰＤＡＴ遺伝子、ガルシニア・マンゴスタナ（Garcinia mangostana）由来のアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ（ＧｍＦＡＴＡ１）、及びクサレケカビ由来のＬＰＡＡＴ（表２７）のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のＤＮＡ配列を、ワイ・リポリティカにおける発現用にコドン最適化され、そして遺伝子構築体は多重遺伝子発現カセットとして化学的に合成された（図５）。各発現カセットは、酵母組み込みベクターへの挿入を提供にするために、隣接するＳｆｉＩ制限酵素部位を使用して設計された。各遺伝子は、構成的ワイ・リポリティカＴＥＦ１プロモーターに作動可能に連結されており、ワイ・リポリティカＬＩＰ２遺伝子の３'転写終結／ポリアデニル化領域によって終結されている。受容体組込みベクターは図６に概略的に示される。これらの組込みベクターはそれぞれ、ワイ・リポリティカにおける形質転換体の選択のためのヒグロマイシン耐性遺伝子、ヌルセオスリシン耐性遺伝子、又はＵＲＡ３遺伝子である選択マーカー遺伝子を含んでいた。これらはまた、形質転換体を容易な検出のためのレポーター遺伝子としてＧＦＰ発現カセット、必要に応じてセミランダム挿入用の５'及び３'ゼータ配列、及びワイ・リポリティカのゲノムへの標的組み込みのためのそれぞれ約１，０００ヌクレオチドのＤＧＡ２、ＦＡＤ２、ＬＲＯ１、又はＰＯＸ２遺伝子からの５'上流配列及び３'下流配列も含んでいた。従って、カセットをこれらの遺伝子のいずれかに組み込むと、これらの遺伝子に組み込まれたときに、ＹｌＤＧＡ２、ＹｌＦＡＤ２、ＹｌＬＲＯ１、又はＹｌＰＯＸ２遺伝子のいずれかが同時に破壊される。ベクターと挿入体の組み合わせを表２８に示す。

【0571】

各構築体は、ワイ・リポリティカのｕｒａ３ＫＯ２７－ｆａｄ２ＫＯ１変異株及びＦＡＤ２野生型株に導入される。確認された形質転換体は低窒素培地で培養され、細胞から脂質が抽出され、ＴＦＡ、ＴＡＧ、及び極性脂質画分は、含有量と脂肪酸組成について分析される。脂肪アシルアシルトランスフェラーゼの少なくとも一部は、細胞内のＴＡＧ含有量と抽出された脂質内のＳＦＡ含有量の両方を増加させると予測される。所望の脂肪酸プロフィールを有する形質転換体が選択される。

【表27】

【表28】

【0572】

実施例１６．固体脂肪を生成するための大規模な脂質抽出
大規模なバッチ培養で増殖させたトランスジェニック酵母細胞からのバイオマス産生、回収、及び脂質抽出プロセスを試験するために、以下のように、２５Ｌ発酵槽で増殖させた後、形質転換ワイ・リポリティカ株ｙＮＩ００５６から脂質を抽出した。ｙＮＩ００５６と称する株は、ＧｍＦＡＴＡ１、ＰｃＡＣＳ－Ｘ１、及びＭｔＤＧＡＴ１ポリペプチドをコードする遺伝子を含むｐＡＴ２０７（実施例１３）のＤＮＡを使用して、ワイ・リポリティカｙＮＩ０１４２株（ｕｒａ３－ｆａｄ２）の形質転換体から選択し、ＵＲＡ＋形質転換体を選択した。ｙＮＩ００５６株は、ｐＡＴ２０７を有する形質転換体を５０ｍｌファルコンチューブ中の１０ｍｌのＹＰＤ培地中で４８時間増殖させた後に選択され、そこで２１．６％のステアリン酸、１１．８％のパルミチン酸、２．４％のＣ２０：０、４．７％のＣ２２：０、及び１１．６％のＣ２４：０、Ｌ／Ｓ－ＳＦＡ比３．３を含む５２．５％のＳＦＡを有する４．３％（ｗ／乾燥重量）のＴＡＧを生成した。

【0573】

２０Ｌ培養の接種菌を２工程のプロセスで調製した。最初の工程では、ｙＮＩ００５６の単一コロニーを１０ｍｌのＹＰＤ培地に接種し、培養物を２５０ｒｐｍで振盪しながら３０℃で１６時間培養した。次に、１０ｍｌの培養物を２．５Ｌフラスコ中の１ＬのＹＰＤ培地に接種し、２００ｒｐｍで振盪しながら３０℃で２４時間培養して、接種菌を生成した。この第２工程後の細胞密度を測定し、ＯＤは２５であった。試料を光学顕微鏡で調べて汚染をチェックした。Sartorius Stedim Biostat C Plus 自動発酵槽を４％のＮａＯＨ溶液で洗浄して容器とチューブを洗浄し、次に水道水で洗浄した。温度及びｐＨプローブを較正した。炭素源として８０ｇ／Ｌのグリセロールを含む２０リットルのＤＭ－Ｇｌｙｃ－ＬｏｗＮ培地（実施例１）を発酵槽に添加し、１２１℃で２０分間加熱することによってその場で滅菌し、次に接種のために３０℃に冷却した。１Ｌの接種菌を追加して、ＶＶＭ＝０．５で通気を制御し、４００ｒｐｍで２４時間撹拌することにより、高溶存酸素（ＤＯ）下でバイオマス増殖の第１段階の発酵を行った。本明細書で使用されるＶＶＭは、１分当たりの培地の単位容量当たりの容量流量である。２４時間培養した後、空気流量をＶＶＭ＝０．０５（１Ｌ／分）に下げ、１８０ｒｐｍで撹拌して脂質合成を増加させ、さらに２７時間培養した。発酵槽冷却システムを使用して温度を３０℃に維持した。シリコーンベースの消泡剤溶液を最終濃度０．０７５ｇ／Ｌまで添加することによって、発泡を制御した。

【0574】

培養物は、約２５時間の培養で最大ＯＤ及び細胞乾燥重量に達していた（表２９）。この時点で、培地のｐＨは４．５３に低下しており、その時点で２Ｍ ＮａＯＨを少量添加した。この添加後、ｐＨは５．７０に上昇した。望ましいｐＨは６．０であったが、発酵槽のｐＨメーターが適切に作動していなかった。４，０００ｒｐｍで５分間の遠心分離により、培養物から細胞を回収し、上清を除去した。細胞ペレットを水で２回洗浄し、毎回遠心分離により細胞を回収し、総湿重量４５３ｇを得て、これは乾燥重量１１４ｇに相当し、すなわち固形分２５％に相当した。この実験におけるグリセロールからバイオマスへの変換率は１３．１％であり、最適値よりも低かった。

【0575】

細胞から脂質を抽出するために、４５０ｇの細胞バイオマス（湿重量）を２Ｌの水に再懸濁し、懸濁液をEmulsiflex C5ホモジナイザーに通した。処理した懸濁液のアリコートを光学顕微鏡で観察すると、細胞全体と細胞破片の両方が見え、多くの細胞が少なくとも損傷を受けていることが示された。処理した懸濁液を、VX22G高速冷却遠心機で４，７３０ｒｃｆ、４℃で２０分間遠心分離した。細胞ペレットを１Ｌのビーカーに移し、１０分間撹拌しながら６００ｍＬのエタノールに再懸濁して、細胞物質を脱水した。混合物を４，７３０ｒｃｆ、４℃で２０分間遠心分離した。エタノール上清を収集した。細胞ペレットは、粘稠度がチョーキー／粘土状であった。これらを２Ｌのボトルに移し、１．５Ｌのヘキサンと１２０ｒｐｍで一晩振盪しながら混合して、ヘキサン可溶性脂質を抽出した。混合物をブフナー漏斗を使用して真空濾過した。ヘキサン上清を丸底フラスコに集め、ロータリーエバポレーターを使用して浴温３５℃、真空を３００ミリバールに設定して、蒸発させた。抽出された脂質は室温で粘稠な液体であり、黄色がかった半透明であった。抽出された物質の重量は合計６．３ｇであった。

【表29】

【0576】

この試料を－２０℃まで冷却し、これはその温度では凍結固体であるが、次に４℃に移してゆっくり解凍する。これにより、より大きく、より飽和したＴＡＧ分子が結晶化し、ＳＦＡ含有量、特にステアリン酸、並びにＣ２０：０、Ｃ２２：０、及びＣ２４：０が増加した固体脂肪画分が得られる。あるいは、抽出された脂質をシリカカラムで分画して、ＳＦＡ含有量が増加したＴＡＧ画分を得ることができる。

【0577】

大規模培養を用いるさらなる実験（Ｂ０１４）
２０Ｌスケールの以下の実験では、培養条件を変更した。同じワイ・リポリティカ ｙＮＩ００５６株及び培地を使用したが、培養物のｐＨは６．０に良好に制御され、温度は２８℃に維持された。接種菌は、５００ｍＬフラスコ中の４つの２００ｍＬ培養物として規定培地（ＤＭ－Ｇｌｙｃ－ＬｏｗＮ）で調製し、ＯＤ６００が１．５～２．５になるまで２４時間培養し、過圧によって発酵槽に導入した。接種時に測定された培養密度（ＯＤ６００）は０．０２６であった。培養は接種後９２時間まで継続した。ステージ１（０～４８時間）では、空気流量０．５～０．６ＶＶＭで撹拌（stirring）／撹拌（agitation）を３００～４００ｒｐｍに上昇させ、溶存酸素（ＤＯ）が１ｐｐｍを下回った場合は背圧によって、少なくとも１ｐｐｍ（２０％飽和）のＤＯを維持した。ステージ２（４８時間～９２時間）では、任意の時点での残留グリセロールが５ｇ／Ｌ未満であれば、さらにグリセロールを培地中に約６０ｇ／Ｌまで添加した。ステージ１の発酵中は、気圧は５～１０ＰＳＩに維持され、空気流量は１０～１３Ｌ／分に維持され、ＤＯは１８．８ｐｐｍから４．０ｐｐｍＯ_２に低下した。ステージ２の発酵（４８～９２時間）中は、圧力は約１０ＰＳＩに維持され、撹拌／撹拌は１００～１５０ｒｐｍ、空気流量は約５Ｌ／分、ＤＯは採取時に４．０から０．９に低下し、すなわち、ステージ２ではＴＡＧ生合成を増加させるためにＤＯを制限した。試料を１日２回取り出して、ＨＰＬＣ及び屈折率によるＯＤ６００、グルコース及びクエン酸レベル、乾燥重量細胞産生、及び顕微鏡観察、ケルダール無機窒素検査による窒素レベル、リン酸塩反射率検査ストリップ、及び比色試験ストリップにより硫酸塩を評価した。この後、培養物を熱処理して酵母細胞を不活性化し、冷却し、遠心分離により細胞を収集した。

【0578】

ＯＤは２４時間の５．１から７２時間の７．３に増加し、９６時間では６．９に低下した。７２時間後の増殖の減少は、培地中の窒素レベルが低いことに起因すると考えられる。リン酸塩及び硫酸塩は、９６時間でも培地中でまだ利用可能であった。クエン酸塩濃度は２４時間で著しく低下していて、増殖期中のクエン酸塩の同化を示唆しており、次に、接種時の１．７ｇ／Ｌから接種後９６時間の４．２２８ｇ／Ｌに増加し、より多くのＴＡＧ合成への切り替えと一致した。ＤＣＷ、ＯＤ６００、及びグリセロール消費量（４２．７％）が示すように、酵母の増殖の大部分は培養の最初の３０時間の細胞分裂によって起こり、次に、おそらく過剰の炭素から脂質への変換により、３０時間から９６時間にかけて緩やかな蓄積が起きた。ＤＣＷは、熱処理後、２４時間の５．５ｇ／Ｌから７２時間の７．０ｇ／Ｌに増加し、熱処理後９６時間の時点で６．５ｇ／Ｌに低下した。

【0579】

細胞を遠心分離によって採取し、２０．３ｇの乾燥バイオマスを得た。これは、培養容量からのバイオマスの最適収量よりもはるかに少ないと考えられた。Ultraturraxを最大速度で１０分間使用して細胞を破壊しながら、細胞から脂質を４０ｍｌのヘキサン中に抽出した。途中で撹拌しながら、破壊工程をさらに２回繰り返した。混合物を一晩撹拌し、次に遠心分離し、ヘキサン上清を回収した。ロータリーエバポレーターを使用して溶媒を除去し、１ｇの乾燥され抽出された脂質を得た。これをヘキサンに溶解してエバポレーターフラスコから取り出した。ヘキサンを一晩かけて部分的に蒸発させた。物質を遠心分離すると、液体上清と、クロロホルムに可溶性の固体物質が得られた。ＴＬＣで分析すると、両方の画分にかなりのＴＡＧが含まれていた。この抽出された脂質はアセトンで分画され、飽和脂肪酸含有量が増加している。

【0580】

大規模培養を用いるさらなる実験（Ｂ０１６）
実験Ｂ０１４の細胞収量は、Ｂ００１と比較して最適ではなかった。これは、培養中の増殖培地中の窒素の枯渇が早すぎたことが原因である可能性がある。従って、実験Ｂ０１６では、細胞増殖期中に窒素濃度を０．５ｇ／Ｌではなく２ｇ／Ｌのリン酸アンモニウムに増やすことで培地を調整し、窒素制限とさらなるＴＡＧ合成の誘導の前にバイオマスを増そうとした。窒素供給により増殖が制限され始めた時点（６５時間）で、６０ｇ／Ｌグリセロール、そして硫酸マグネシウム、塩酸チアミン、及び最初の２０Ｌ培養物と同レベルの微量元素を含む供給物を培養物に添加した。接種時に測定された培養密度（ＯＤ６００）は０．０９７であった。バイオマスの乾燥重量、ＯＤ、及びグリセロール消費量によって示されるように、酵母の増殖のほとんどは細胞分裂による培養の最初の４０．５時間以内に起こり、次に、おそらく過剰な炭素の脂肪への変換により、４０．５時間から８８．４時間にかけてゆっくりとした蓄積が起きたことが、脂肪酸含有量と窒素の枯渇を測定することで確認される。６５時間でグリセロールをさらに添加しても、バイオマスの乾燥重量及びＯＤ６００はさらに増加しなかったが、これは窒素が制限されている場合に炭素が脂質に変換されたためである可能性がある。最終的なＯＤ６００は２０．６、ＤＷは１６．５ｇ／Ｌであった。ＨＰＬＣ用の試料は０．２２μｍフィルターでろ過された。クエン酸濃度は、接種時の１．７ｇ／Ｌから接種後８８．４時間の８．７ｇ／Ｌに増加した。以前の実験では、クエン酸の蓄積は、脂質、特にＴＡＧの蓄積に対応していた。硫酸塩は実験全体を介してかなり過剰に存在した。窒素と同様に、リン酸塩は着実に消費され、発酵終了時には残っていたのは２０％であった。ＤＡＰ濃度を０．５ｇ／Ｌから２．０ｇ／Ｌに増加させることによる実験開始時の窒素とリン酸塩の増加により、最初の２４時間でバイオマスが、実験Ｂ０１４での５．５ｇ／Ｌと比較して、約１６ｇ／Ｌに増加した。培養物の初期ＯＤも、この実験ではＢ０１４（０．０５）よりも高かった（０．０９７）が、Ｂ００１（０．１３２）よりは低かった。初期ＯＤが増加すると、増殖期のバイオマスが増加し、第２ステージの発酵で脂質が増加すると考えられる。

【0581】

細胞培養物を４７．５時間、６５．２時間、及び８８．４時間の培養終了時点でサンプリングした。このとき、培養物を１０５℃で１５分間加熱処理して細胞を死滅させ、冷却し、遠心分離によって細胞を採取した。熱処理した培養物のアリコートをプレーティングすることによって得られた生細胞数は、すべての細胞が死滅したわけではなく、１ｍｌ当たり１０^５個の生細胞が残っており、すなわち９９．９％死滅していることを示した。培養により、凍結乾燥後の乾燥重量が２２０．９ｇである１０００ｇの細胞ペーストが得られた。

【0582】

以前と同様に、Ultraturrax を使用して細胞を破壊して、１８０ｇの細胞から４００ｍｌのヘキサン中に脂質を抽出した。ヘキサンを蒸発させた後、８．１ｇの固体脂質を回収した。脂質を少量のヘキサンに溶解して、これをエバポレーターフラスコから取り出し、５０℃に温めた後、チューブに回収した。遠心分離後、２つの層があるように見えた。両方の層を回収して別々に分析した。両方の試料からヘキサンを蒸発させ、室温で固体の２つの脂質試料を得た。これらを冷エタノールで３回洗浄し、乾燥させた。これにより、第１及び第２の試料においてそれぞれ７．３ｇ及び０．８ｇの抽出された脂質が得られた。ＴＬＣによって分析されたアリコートは、大部分がＴＡＧの存在を示し、少量の極性脂質も存在することを示した。

【0583】

最初のヘキサン抽出で残った細胞破片もさらに抽出して、残留脂質を得た。この脂質も分画し、この「細胞破片」脂質からの極性画分とＴＡＧ画分の両方の脂肪酸組成を決定した（表３０）。

【0584】

ＧＣによる脂肪酸分析は、抽出された脂質の飽和脂肪酸含有量が、総脂肪酸含有量の割合として重量ベースで３６％であり、主に約１８％がパルミチン酸塩で約１２％がステアリン酸塩で構成されていることが示されが、Ｃ２０：０、Ｃ２２：０、及びＣ２４：０の３つすべても含まれており、Ｃ２４：０は約４％であった。野生型Ｗ２９株の対応するデータと比較して、ＳＦＡ含有量とステアリン酸レベルは増加していた。抽出された脂質は、アセトンを用いた沈殿によって分画されて、飽和脂肪酸含有量が増加した。

【0585】

表３０では、抽出された脂質には検出可能な量のＣ８：０、Ｃ１０：０、Ｃ１２：０、Ｃ１４：１、Ｃ１５：１、Ｃ１８：１Δ１１、Ｃ１８：２ω６（ＬＡ）、Ｃ１８：３ω３（ＡＬＡ）、及び他のＰＵＦＡも含んでいなかった。

【表30】

【0586】

大規模培養を用いるさらなる実験（Ｂ０１９）
実験Ｂ０１６の細胞収量はＢ００１４と比較してはるかに優れていたが、熱処理は、培養終了時にすべての細胞を死滅させるのに完全には効果的ではなかった。従って、実験Ｂ００１９はＢ００１６と同様の条件を使用して実行されたが、１つの違いは、培養物を１０５℃ではなく１２０℃で３分間加熱処理したことである。窒素濃度をさらに５０％増加させて３．０ｇ／ＬのＤＡＰとし、グリセロールを含む供給物（窒素を除く）を２４時間からスタートして発酵槽に徐々に導入した。培養物を２４時間、４０時間、及び４８時間の時点でサンプリングし、６０時間の時点で１２０℃で熱処理した。培養物を発酵槽内でその場で１０℃に冷却した後、かなりの脂肪が培地の表面と撹拌機のバッフルの一部に堆積していることがわかった。この沈殿物を培地の表面及びバッフルからすくい取ることによって回収し、３．６ｇのクリーム状の脂肪を得た。熱処理により多くの酵母細胞が破壊され、培地への脂質の放出が引き起こされたと結論付けられた。

【0587】

細胞試料を光学顕微鏡で検査し、初期増殖期後及び熱処理前の培養終了時の両方で、その形態を観察した。大部分の細胞は酵母に典型的な楕円形というより、細長いように見えたが、他の細胞は楕円形又は中間の形であった。

【0588】

別の実験では、野生型ワイ・リポリティカＷ２９株及び形質転換したｙＮＩ００５６株を同様の条件下で培養し、細胞を光学顕微鏡で観察した。形質転換された細胞の多くは菌糸の形をしており、形状が非常に細長く、その他の細胞は楕円形かやや細長い形であった。対照的に、野生型Ｗ２９細胞はいずれも細長い形態も菌糸の形態も示さなかった（図７Ａ及び７Ｂ）。形質転換細胞のこのような細胞形態は、特に培養中の比較的低い溶存酸素レベルで引き起こされる、細胞のストレス状態の指標であると考えられた。

【0589】

実施例１７．脂質分画
粗脂質調製物を有機溶媒で分画して、より純粋な極性脂質、又はＴＡＧを含むほとんど中性（非極性）脂質を有する画分を得ることができる（例えば、米国特許第７，５５０，６１６号）。例えば、報告されているいくつかの方法は、エタノールやアセトンなどの有機溶媒における中性脂質と極性脂質の溶解度の違いを利用している。これらの方法のいくつかを試験するために、モデル系として、卵黄脂質及びオキアミ脂質を含む、実質的に中性及び極性脂質の混合物を有するいくつかの脂質の分画が試みた。

【0590】

鶏卵の脂質はほとんどが卵黄部分に存在し、重量で約３３％の脂質を構成する。卵黄中のタンパク質と密接に関連する脂質は、大部分がＴＡＧ（６６重量％）であり、リン脂質（ＰＬ、２８％）、及びコレステロール及びそのエステル（６％）が少量存在する（Belitz et al., 2009）。ＰＬは、少量のω３及びω６脂肪酸を含む（Gladkowski et al., 2011）。Palacios and Wang (2005) の方法に基づいて、Gladkowski et al., (2012) は、エタノールを用いて卵黄からＰＬを抽出し、ＰＬを冷アセトンで沈殿させることにより中性脂質を取り出し、次にＰＬを精製した。

【0591】

新鮮な卵黄（１７ｇ）、卵レシチン粉末（２０．４ｇ）、及び市販のオキアミ油カプセル（Bioglan Red Krill Oil; Natural Bio Pty Ltd, Warriewood, NSW, Australia）から得たナンキョクオキアミ（Euphausia superba）のオキアミ油（１７．７ｇ）を、それぞれ６０ｍｌのエタノールと混合し、室温で３０分間撹拌した。混合物を遠心分離し、エタノール上清を収集した。沈殿物をさらに２回、各回６０ｍｌのエタノールで抽出した。抽出混合物を再度遠心分離し、エタノール上清を合わせた。各沈殿物は中性脂質の抽出のために保持された。合わせた上清からのエタノールを、ＳＲ－１００ロータリーエバポレーター（Buchi, Switzerlandス）を使用し、４００ｒｐｍで１５ｍｂａｒの真空で操作して、冷却器を－１６℃で水浴を３７℃に設定して蒸発させた。これにより、１７ｇの新鮮な卵黄から３．２ｇのＰＬ濃縮脂質抽出物、２０．４ｇの卵レシチン粉末から５．８６ｇ、オキアミ油から回収した１７．８３ｇの濃縮ＰＬが得られた。オキアミ油から回収された脂質には、おそらくまだ少量の溶媒が含まれていた。それにもかかわらず、実質的に１００％の回収率は、カプセルからのオキアミ油がそもそもＰＬが高度に濃縮されていることを示した。

【0592】

回収した脂質のアリコートを、溶媒としてヘキサン：ジエチルエーテル：酢酸（７０：３０：１；ｖ／ｖ／ｖ）を使用して、実施例１に記載したようにＴＬＣにより分析した。新鮮な卵黄からのエタノール抽出物と卵黄レシチン粉末は、かなりの量の極性脂質並びに少量のＴＡＧを含むことが観察されたが、オキアミ油抽出物にはＴＡＧは検出されなかった。

【0593】

新鮮な卵黄から極性脂質をさらに精製するために、乾燥抽出物を３０ｍｌのヘキサンに溶解し、溶液を氷浴中で０℃に冷却した。次に６０ｍｌの冷アセトン（－２０℃）を溶液に添加して、少なくとも２０分間ＰＬを沈殿させた。他の実験では、混合物を０℃で一晩維持すると、より多くの沈殿が形成されることが示された。沈殿物を収集し、真空下で乾燥させた。脂質の試料をクロロホルムに溶解し、ＴＬＣで分析して極性脂質とＴＡＧ含有量を推定した。最初の沈殿物は、ほとんどが極性脂質であり、少量のＴＡＧを含むことが示された。極性脂質をさらに精製するために、沈殿物を２０ｍｌ分の冷アセトン（－２０℃）で５回洗浄して、より多くのＴＡＧ及び他の中性脂質を取り出した。室温で１０時間ロータリーエバポレーションして、残留溶媒を沈殿物から除去した。脂質収量を重量測定し、少量のアリコートを、ＦＡＭＥのＧＣ定量による脂肪酸組成の分析に使用した。１７ｇの新鮮な卵黄の最初の投入から、１．１グラムの精製極性脂質が回収された。この抽出された脂質のアリコートをＴＬＣで分析したところ、中性脂質が本質的に含まれておらず、ＴＡＧを含むことが観察された。これらの観察は、抽出物が９６％純粋なＰＬであることを発見したGladkowski et al., (2012) によって報告された観察結果と一致していた。

【0594】

卵黄及び卵黄粉末のエタノール抽出後の沈殿から、沈殿物をヘキサン５０ｍｌで２回抽出することにより、中性脂質を抽出した。中性脂質を含む合わせたヘキサン溶液を、各回５０ｍｌの９０％エタノールで４回洗浄した。次に、ヘキサンを減圧下で蒸発させて、卵黄から精製された中性脂質を得た。

【0595】

抽出された脂質の脂肪酸組成を決定するために、実施例１に記載のように、アリコート中の総脂肪酸をＧＣ分析用のＦＡＭＥに変換した。これには、エタノール抽出後であるがヘキサン／アセトン沈殿前の試料（第１ｐｐｔ）、並びに、ヘキサン／アセトン沈殿後の試料（第２ｐｐｔ）が含まれた。データを表３１に示す。新鮮な卵黄から単離したエタノール可溶性脂質及びそこから精製されたアセトン沈殿脂質には、主要な飽和脂肪酸としてＣ１６：０及びＣ１８：０が含まれていた。新鮮な卵黄からの第１の脂質沈殿物は、２４．７％（Ｃ１６：０）と１５．６％（Ｃ１８：０）を含み、一方、より精製された極性脂質は、２７％（Ｃ１６：０）と１６％（Ｃ１８：０）を含んだ。第２沈殿物中のＬＡの量は、第１の沈殿物よりもわずかに多かった。ＬＡは、ＴＡＧ中よりもＰＬ中に多量に存在する。新鮮な卵黄とより純粋な極性脂質調製物の両方には、ω６及びω３ ＬＣ－ＰＵＦＡも含まれていた。例えば、新鮮な卵黄の第１沈殿物には５．３％のＣ２０：４（ＡＲＡ）、２．３％のＣ２０：５（ＥＰＡ）、及び５％のＣ２２：６（ＤＨＡ）が含まれていたが、より精製された極性脂質調製物には５．３％のＡＲＡ及び４％のＤＨＡが含まれていた。オキアミ油からの第１沈殿物と、オキアミ油からのより精製された極性脂質は、主要な飽和脂肪酸としてＣ１６：０を有した。オキアミ油の第１沈殿物及びより精製された極性脂質にはまた、第１沈殿物中にかなりの量のω３ ＬＣ－ＰＵＦＡ、すなわち１．１％のＡＲＡ、３４．７％のＥＰＡ、及び１９．０％のＤＨＡが含まれていたが、より精製された極性脂質には１．１％のＡＲＡ、４８．１％のＥＰＡ、及び２５．７％のＤＨＡが含まれていた。卵黄レシチン粉末からの沈殿した脂質は、１７％のＣ１６：０及び４％のＣ１８：０を有していたが、ＬＣ－ＰＵＦＡ ＥＰＡ及びＤＨＡ中では少なかった。レシチン粉末のＬＣ－ＰＵＦＡ含有量が低いのは、おそらく製造又は保存中にこれらの多価不飽和脂肪酸が酸化分解されたためであると考えられた。

【0596】

全脂質調製物から分画により極性脂質を精製する別の方法は、例えばＳＰＥカラム（HyperSep aminopropyl, ThermoFisher, UK）などのシリカベースのカラムクロマトグラフィーを使用することである。

【表31】

【0597】

本出願は、２０２１年６月１１日に出願されたＡＵ２０２１９０１７６６及び２０２１年１０月１日に出願されたＡＵ２０２１９０３１６０に対する優先権を主張し、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。

【0598】

広く説明した本発明の精神又は範囲から逸脱することなく、具体的な実施態様に示される本発明に多くの変更態様及び／又は修正を加え得ることが当業者には理解されよう。従って、本実施態様はあらゆる点で例示的なものであり、限定的なものではないと考えられるべきである。

【0599】

本明細書で議論及び／又は参照されるすべての刊行物は、その全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書に含まれる文書、行為、材料、装置、物品などに関するいかなる議論も、単に本発明の文脈を提供することを目的とするものである。これらの事項のいずれか又はすべてが、先行技術上記基盤の一部を形成しているものとして、又は本出願の各請求項の優先日以前に存在していても本発明に関連する分野における一般常識であったことを認めるものとして解釈されるべきではない。

【0600】

［参考文献］
Adeyo et al. (2011) J Cell Biology 192:1043-1055.
Al-Feel et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:4534-4538.
Arroyo-Caro et al. (2015) J. Agric. Food Chem. 64:277-285.
Athenstaedt and Daum (1997) J. Bacteriol. 179:7611-7616.
Athenstaedt et al. (1999) J. Bacteriol. 181:1458-1463.
Bankaitis et al. (2007). Advances Enzyme Regulation 47:27.
Bhattacharjee et al. (2011) Phytochem 72:166-177.
Becker et al. (1991) Methods in Enzymology 194: 182-7.
Beopoulos et al. (2008) App Env Micro. 74:7779-7789.
Belitz et al., (2009). Food chemistry (4th revised edition). Springer-Verlag, Berlin, Germany.
Bibikova et al. (2002) Genetics 161:1169-1175.
Bligh and Dyer (1959) Can. J. Biochem. Physiol. 37:911-918.
Boeke et al. (1984) Mol. Gen. Genet 197: 345-47.
Calvey et al. (2014) Curr Genet 60:223-230.
Carman and Gil-Soo (2011) Ann Rev Biochem 80:859-883.
Carman and Henry (1989) Annu. Rev. Biochem. 58:635-669.
Carman and Henry (1999) Prog. Lipid Res. 38:361-399.
Carman and Zeimetz (1996) J. Biol. Chem. 271:13293-13296.
Carsanba et al. (2020) Microorganisms 8:1054.
Carter and Kennedy (1966). J. Lipid Res. 7:678-683.
Casaregola et al. (2000) FEBS Lett. 487:95-100.
Celinska et al. (2017) Microb Biotechnol 10: 450-455.
Certo et al. (2012) Nat Methods 8:941-943.
Chang et al. (1998a) J. Biol. Chem. 273:9829-9836.
Chang et al. (1998b) J. Biol. Chem. 273:14933-14941.
Chen et al. (1997) Appl Microbiol Biotechnol. 48:232-5.
Chen et al. (2011) Plant Physiol 155:851-865.
Chisti and Moo-Young (1986). Enzyme and Microbial Technology 8:194-204.
Clancey et al. (1993) J Biol Chem, 268:24580-24590.
Cronan and Vagelos (1972) Biochim Biophys Acta. 265:25-60.
Dabirian et al. (2019) ACS Synthetic Biology 8:1788-1800.
Dani et al. (2011) Plant Biology 13:453-461.
Darvishi et al. (2011) New Biotechnol. 28:756-760.
Dean-Johnson and Henry (1989) J. Biol. Chem. 264:1274-1283.
Delhaize et al. (1999) J Biol Chem 274:7082-7088.
De Castro and Priego-Capote (2010) J Chromatog A 1217:2383-2389.
De Siervo (1969) J Bacteriology 100:1342-1349.
De Virgilio et al. (1992) Yeast 8:1043-1051.
Doyon et al. (2010) Nat. Methods 7:459-460.
Dulermo et al. (2015) Biochim Biophys Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids 1851:1107-1117.
Dzugasova et al. (1998) Current Genetics 34:297-302.
Fakas et al. (2011). J Biol Chem, 286:1464-1474.
Fakas (2017) Eng Life Sci 17:292-302.
Feng et al. (2015) Metabolic Engineering 27:10-19.
Fernandez et al. (1986) J Bacteriol 166:779-786.
Ferreira et al. (2018) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 115:1262-1267.
Fickers et al. (2003) J Microbiol Methods 55:727-737.
Fischl et al. (1986) J Biol Chem, 261:3178-3183.
Fyrst et al. (1999) Biochemistry 38:5864-5871.
Gasmi et al. (2011) Appl Microbiol Biotechnol 89:109-119.
Ghosal et al. (2007) 1771:1457-1463.
Ghosh et al. (2007) Plant Physiol Biochem 45:887-897.
Gietz et al. (1992) Nuc Acids Res. 27: 69-74.
Gladkowski et al (2011). Food chemistry 126:1013-1018.
Gladkowski et al (2012). J Am Oil Chem Soc 89:179-182.
Greenberg and Lopes (1996) Microbiol. Rev. 60:1-20.
Groenen et al. (1993) Mol. Microbiol. 10:1057-1065.
Gsell et al. (2013) PloS One 8:e77380.
Haft et al. (2005) Computational Biology 1(6):e60.
Hahn-Hagerdal et al. (2005) Microbial Cell Factories 4:31 doi:10.1186/1475-2859-4-31.
Han et al. (2006) J. Biol. Chem. 281:9210-9218.
Han et al. (2008a) J. Biol. Chem. 283:20433-20442.
Han et al. (2008b) J. Biol. Chem. 283:20443-20453.
Han and Carman (2017) J Biol Chem 292:13230-13242.
Harayama (1998) Trends Biotechnol. 16: 76-82.
Hashimoto et al. (2005) J. Biol. Chem. 280:8660-8667.
Hawkins and Kridl (1998) Plant J. 13:743-752.
He et al. (2018) Biotechnol Biofuels 11:258.
Hegel et al (2011) J Supercrit Fluids. 58:68-78.
Hein and Hayen (2012) Metabolites 2:254-267.
Helliwell et al. (1998) Genetics 148:99-112.
Hiesinger et al. (1997) FEBS Letters 415:16-20.
Hildebrand and Law (1964) Biochem. 3:1304-1308.
Hjelmstad and Bell (1988). J. Biol. Chem. 263:19748-19757.
Hjelmstad and Bell (1991). J. Biol. Chem. 266:5094-5103.
Hoe et al. (1999) Emerg. Infect. Dis. 5:254-263.
Holic et al. (2012) Appl Microbiol Biotech. doi:10.1007/s00253-012-3959-6.
Hosaka et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:2053-2059.
Ishino et al. (1987) J. Bacteriol. 169:5429-5433.
Ito et al. (1983) J. Bacteriol. 153: 163-8.
Itoh and Kaneko (1974). Yukagaku 23:350-354.
Janssen and Steinbuchel (2014) Biotechnology Biofuels 7:1-26.
Jani and Lopes (2009) FEMS Yeast Research 9:552-564.
Janssen et al. (2002) OMICS J. Integ. Biol. 6:23-33.
Jansen et al. (2002) Mol Microbiol 43:1565-1575.
Jones et al. (1995). Plant Cell 7:359-371.
Kamisaka et al. (2015) Appl Microbiol Biotechnol 99:201-210.
Kanemasa et al. (1967) Biochim Biophys Acta 144:382-390.
Kanfer and Kennedy (1964) J. Biol. Chem. 239:1720-1726.
Kassab et al. (2019) Microbial Cell Factories 18:1-10.
Kooistra et al. (2004) Yeast 21: 781-792.
Kim et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:1156-1160.
Kim et al. (1999) J. Biol. Chem. 274:14857-14866.
Kim et al. (2012) Genome Res. 22:1327-1333.
Klein et al. (2016) Molecular Biology Cell 27:2014-2024.
Klig and Henry (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3816-3820.
Kodaki and Yamashita (1987) J. Biol. Chem. 262:15428-15435.
Lardizabal et al., (2001). J Biol Chem 276:38862-38869.
Larroude et al. (2018) Biotechnol Adv. 36:2150-2164.
Lee et al. (1994) J Biol Chem 269:19725-19730.
Letts et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:7279-7283.
Li et al., (2007) Biochim Biophys Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids 1771:1246-1253.
Looke et al. (2011) Biotechniques 50: 325-328.
Luke et al. (1996). Molecular Cellular Biology 16:2744-2755.
Lung and Weselake (2006). Lipids 41:1073-1088.
Mauersberger et al. (2001) J Bacteriol DOI: 10.1128/JB.183.17.5102-5109.2001.
Marr and Ingraham (1962). J. Bacteriol 84:1260-1267.
Martins-Noguerol et al. (2020) Heliyon doi.org/10.1016/j.heliyon.2020.e05237.
Masepohl et al. (1996) Biochim. Biophys. Acta 1307:26-30.
McConnell Smith et al. (2009) PNAS 106:5099-5104.
McGraw and Henry (1989). Genetics 122:317-330.
Michaelson et al. (1998) J Biol Chem 273:19055-19059.
Min-Seok et al. (1996) J. Biochem. 120:1040-1047.
Mojica et al. (1995) Mol. Microbiol.17:85-93.
Mojica et al. (2000) Mol. Microbiol. 36:244-246.
Muller et al. (1998). Yeast 14:1267-1283.
Murray and Greenberg (2000). Mol. Microbiol. 36:651-661.
Nakata et al. (1989) J. Bacteriol. 171:3553-3556.
Napier et al. (1997) Biochem J 328:717-718.
Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453.
Nikawa and Yamashita (1984) Eur. J. Biochem. 143:251-256.
Oh et al. (1997) J Biol Chem 272:17376-17384.
Oldham et al. (2001) Chem. Senses 26:529-531.
Orr-Weaver et al. (1981) PNAS USA 78: 6354-58.
Osman et al. (2010) EMBO J. 29:1976-1987.
Palacios and Wang (2005). J Am Oil Chem Soc 82:571-578.
Pascual et al. (2013) J Biol Chem, 288:35781-35792.
Patel et al. (2018) Molecules 23:1562.
Peter et al. (2017) PLOS ONE 12:e0173739.
Ramirez et al. (2012) Nucleic Acids Res. 40:5560-5568.
Ratledge and Evans (1989) Lipids and their metabolism. In: Rose and Harrison (eds), The yeasts, 2nd edn. Academic, London, pp 367-455.
Ren et al. (2014) Molecular Biology Cell 25:712-727.
Saha et al. (2006) Plant Physiol. 141:1533-1543.
Salas and Ohlrogge (2002). Arch Biochem Biophys 403:25-34.
Schuller et al. (1992) EMBO Journal 11:107-114.
Schneiter et al. (2000) J Bacteriol 182:3655-3660.
Shen et al. (1996) J Biol Chem, 271:789-795.
Shen and Dowhan (1997) J Biol Chem, 272:11215-11220.
Sreenivas et al. (1998) J Biol Chem, 273:16635-16638.
Sreenivas et al. (2001). J Biol Chem, 276:29915-29923.
Sreenivas and Carman (2003) J Biol Chem, 278:20673-20680.
Stukey et al. (1989). J Biol Chem 264:16537-16544.
Summers et al. (1988) Genetics 120:909-922.
Sun et al. (2019) Food Science Nutr. 7:700-710.
Talbot (2011) ‘Sources of saturated and other dietary fats’ in Reducing Saturated Fats in Foods ed Talbot G. Woodhead Publishing, Cambridge.
Tamura et al. (2013). Cell Metabolism 17:709-718.
Tani and Kuge (2014) Yeast 31:145-158.
Tezaki et al. (2017) Biochem Biophys Res Commun. 488:165-170.
Tsukagoshi et al. (1987) Eur. J. Biochem. 169:477-486.
Tripathi et al. (2019) J Biol Chem, 294:19081-19098.
Trotter et al. (1993). J. Biol. Chem. 268:21416-21424.
Trotter and Voelker (1995) J Biol Chem 270:6062-6070.
Turchetto-Zolet et al. (2011) BMC Evolutionary Biology 11:263.
Turchetto-Zolet et al. (2016) Genetics and Molecular Biology 39:524-538.
van Embden et al. (2000) J. Bacteriol. 182:2393-2401.
Wang et al. (2012) Genome Res. 22:1316-1326.
Wang et al. (2013) Planta 238:907-922.
Wei et al. (2017) AMB Expr 7:34.
Williams et al. (2008). Biochem. Biophys. Res. Commun. 374: 620-624.
Wongwathanarat et al. (1999). Microbiology 145:2939-2946.
Yen et al. (2002) PNAS USA 99:8512-8517.
Yen et al. (2005) J Lipid Res 46:1502-1511.
Zhang et al. (2014) Cell Mol Life Sci 71:3767-3778.
Zheng and Zou (2001). J. Biol. Chem. 276:41710-16.
Zhou et al. (2008) Insect Mol. Biol. 17:667-676.
Zhou et al. (2013) FEBS Letters 587:2371-2376.
Zienkiewicz et al. (2017) Biotechnology for Biofuels 10 doi:http://dx.doi.org/10.1186/ s13068-016-0686-8.
Zulu et al. (2017) Biotechnology for Biofuels, 10 doi:https://doi.org/10.1186/s13068-017-0874-1.

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【配列表】

2024524882000001.app

【国際調査報告】