特表 2024-524924 バナナ果実における褐変の遅延又は防止

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-07-09

(54)【発明の名称】バナナ果実における褐変の遅延又は防止

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20240702BHJP

   C12N 15/11 20060101ALI20240702BHJP

   A01H 6/00 20180101ALI20240702BHJP

   A01H 5/08 20180101ALI20240702BHJP

   C12N 9/02 20060101ALI20240702BHJP

   C12N 15/53 20060101ALI20240702BHJP

【ＦＩ】

C12N15/09 110

C12N15/11 Z ZNA

A01H6/00

A01H5/08

C12N9/02

C12N15/53

【審査請求】未請求

【予備審査請求】有

(21)【出願番号】P 2023577572

(86)(22)【出願日】2022-06-30

(85)【翻訳文提出日】2024-02-13

(86)【国際出願番号】 EP2022068072

(87)【国際公開番号】W WO2023275255

(87)【国際公開日】2023-01-05

(31)【優先権主張番号】2109585.6

(32)【優先日】2021-07-02

(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB

(31)【優先権主張番号】2116382.9

(32)【優先日】2021-11-12

(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】523470175

【氏名又は名称】トロピック バイオサイエンシーズ ユーケー リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100136629

【弁理士】

【氏名又は名称】鎌田 光宜

(74)【代理人】

【識別番号】100080791

【弁理士】

【氏名又は名称】高島 一

(74)【代理人】

【識別番号】100125070

【弁理士】

【氏名又は名称】土井 京子

(74)【代理人】

【識別番号】100121212

【弁理士】

【氏名又は名称】田村 弥栄子

(74)【代理人】

【識別番号】100174296

【弁理士】

【氏名又は名称】當麻 博文

(74)【代理人】

【識別番号】100137729

【弁理士】

【氏名又は名称】赤井 厚子

(74)【代理人】

【識別番号】100152308

【弁理士】

【氏名又は名称】中 正道

(74)【代理人】

【識別番号】100201558

【弁理士】

【氏名又は名称】亀井 恵二郎

(72)【発明者】

【氏名】ネヴィット、ダニエル

(72)【発明者】

【氏名】グリーン、ロバート トリスタン

(72)【発明者】

【氏名】パイス ディエゲス、シルヴィア マリーナ

(72)【発明者】

【氏名】ギヨーム－ショプファー、デイヴィッド

(72)【発明者】

【氏名】チャパロ ガルシア、アンジェラ ルシア

(57)【要約】

本発明は、ポリフェノールオキシダーゼ（ＰＰＯ）をコードしている１つ以上の遺伝子を遺伝的に編集することにより、バナナ果実の褐変を遅延又は防止するための組成物及び方法に関する。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

バナナ植物又はバナナ植物細胞において、ＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ８、ＰＰＯ９、又はＰＰＯ４のポリフェノールオキシダーゼ遺伝子によってコードされている少なくとも１つの内因性のＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ８、ＰＰＯ９、又はＰＰＯ４のポリフェノールオキシダーゼのレベル又は活性を低下させる方法。

【請求項2】

前記ＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ８、ＰＰＯ９、又はＰＰＯ４のポリフェノールオキシダーゼ遺伝子が、
（Ａ）
（ａ）配列番号５（ＰＰＯ１）若しくは配列番号５に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号６（ＰＰＯ２）若しくは配列番号６に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１２（ＰＰＯ８）若しくは配列番号１２に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号１３（ＰＰＯ９）若しくは配列番号１３に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；及び
（ｅ）配列番号８（ＰＰＯ４）若しくは配列番号８に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド
からなる群から選択されるコード配列を含む；
（Ｂ）
（ａ）配列番号４０（ＰＰＯ１）若しくは配列番号４０に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｂ）配列番号４１（ＰＰＯ２）若しくは配列番号４１に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｃ）配列番号４７（ＰＰＯ８）若しくは配列番号４７に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｄ）配列番号４８（ＰＰＯ９）若しくは配列番号４８に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；及び
（ｅ）配列番号４３（ＰＰＯ４）若しくは配列番号４３に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド
からなる群から選択されるポリフェノールオキシダーゼをコードしている；又は
（Ｃ）
（ａ）配列番号１５１（ＰＰＯ１）若しくは配列番号１５１に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１５２（ＰＰＯ２）若しくは配列番号１５２に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１５８（ＰＰＯ８）若しくは配列番号１５８に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号１５９（ＰＰＯ９）若しくは配列番号１５９に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；及び
（ｅ）配列番号１５４（ＰＰＯ４）若しくは配列番号１５４に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド
からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

（ａ）前記バナナ植物若しくはバナナ植物細胞における少なくとも１つの内因性のＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ８、ＰＰＯ９、若しくはＰＰＯ４のポリフェノールオキシダーゼのレベルを低下させる；
（ｂ）前記バナナ植物又はバナナ植物細胞における少なくとも１つの内因性のＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ８、ＰＰＯ９、若しくはＰＰＯ４のポリフェノールオキシダーゼの機能を低下させる；又は
（ｃ）前記バナナ植物又はバナナ植物細胞における少なくとも１つの内因性のＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ８、ＰＰＯ９、若しくはＰＰＯ４のポリフェノールオキシダーゼの機能を喪失させる、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

（ａ）前記少なくとも１つの内因性のＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ８、ＰＰＯ９、若しくはＰＰＯ４のポリフェノールオキシダーゼのレベル若しくは活性が低下していないバナナ植物の果肉及び／若しくは果皮と比較して、前記バナナ植物の果肉及び／若しくは果皮の褐変を遅延させる；並びに／又は
（ｂ）前記少なくとも１つの内因性のＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ８、ＰＰＯ９、若しくはＰＰＯ４のポリフェノールオキシダーゼのレベル若しくは活性が低下していないバナナ植物の果肉及び／若しくは果皮と比較して、前記バナナ植物の果肉及び／若しくは果皮の褐変を低減する、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

（ａ）前記バナナ植物細胞若しくは前記バナナ植物の一部に、前記少なくとも１つのＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ８、ＰＰＯ９、若しくはＰＰＯ４のポリフェノールオキシダーゼ遺伝子の転写物を標的とするサイレンシングＲＮＡを提供することであって、任意で、前記サイレンシングＲＮＡが、前記バナナ植物細胞若しくは前記バナナ植物の一部にエンドヌクレアーゼを導入することにより提供され、前記エンドヌクレアーゼが、前記少なくとも１つのＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ８、ＰＰＯ９、若しくはＰＰＯ４のポリフェノールオキシダーゼ遺伝子の転写物を標的とする前記サイレンシングＲＮＡをコードするように、内因性非コードＲＮＡをコードしている遺伝子を改変することができ、更に任意で、前記エンドヌクレアーゼが、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクタヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ホーミングエンドヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ、及び改変型ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼからなる群から選択されること；又は
（ｂ）前記少なくとも１つのＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ８、ＰＰＯ９、若しくはＰＰＯ４のポリフェノールオキシダーゼをコードしているＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ８、ＰＰＯ９、若しくはＰＰＯ４のポリフェノールオキシダーゼ遺伝子に改変を導入することであって；任意で、前記改変が、前記バナナ植物細胞に提供されかつ前記少なくとも１つのＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ８、ＰＰＯ９、若しくはＰＰＯ４のポリフェノールオキシダーゼ遺伝子を標的とすることが可能なエンドヌクレアーゼによって、前記ＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ８、ＰＰＯ９、若しくはＰＰＯ４のポリフェノールオキシダーゼ遺伝子に導入され；更に任意で、前記エンドヌクレアーゼが、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクタヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ホーミングエンドヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ、及び改変型ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼからなる群から選択され；更に任意で、前記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼがＣａｓ９エンドヌクレアーゼであること
を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ又は改変型ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼと、前記少なくとも１つのＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ８、ＰＰＯ９、若しくはＰＰＯ４のポリフェノールオキシダーゼ遺伝子に特異的な１つ以上のガイドＲＮＡとを前記バナナ植物細胞に提供することを含み、前記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ又は改変型ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ及び前記１つ以上のガイドＲＮＡが、前記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ又は改変型ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼが前記少なくとも１つの内因性のＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ８、ＰＰＯ９、若しくはＰＰＯ４のポリフェノールオキシダーゼ遺伝子に二本鎖切断又は一本鎖切断を導入することを可能にする複合体を形成し；任意で、前記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼがＣａｓ９エンドヌクレアーゼである、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

前記少なくとも１つの内因性のＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ８、ＰＰＯ９、又はＰＰＯ４のポリフェノールオキシダーゼ遺伝子の改変を含む少なくとも１つのバナナ植物細胞を同定することを更に含み、前記改変が、
（ａ）少なくとも１つのヌクレオチド挿入；
（ｂ）少なくとも１つのヌクレオチド欠失；
（ｃ）挿入－欠失（インデル）；
（ｄ）逆位；
（ｅ）少なくとも１つのヌクレオチド置換；及び
（ｆ）（ａ）～（ｅ）の任意の組み合わせ
からなる群から選択される、請求項５又は６に記載の方法。

【請求項8】

前記１つ以上のガイドＲＮＡが、１つ以上のプロモータに動作可能に連結された前記１つ以上のガイドＲＮＡをコードしている１つ以上の組換えＤＮＡコンストラクト内でバナナ植物細胞に提供される、請求項６又は７に記載の方法。

【請求項9】

前記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ若しくは改変型ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ及び／又は前記１つ以上のガイドＲＮＡが、ＲＮＡの形態でバナナ植物細胞に提供される、請求項６又は７に記載の方法。

【請求項10】

前記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ又は改変型ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼが、タンパク質の形態で前記バナナ植物細胞に提供され、前記１つ以上のガイドＲＮＡが、ＲＮＡの形態で前記バナナ植物細胞に提供され；任意で、前記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ又は改変型ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ及び前記１つ以上のガイドＲＮＡが、リボ核タンパク質複合体として前記バナナ植物細胞に提供される、請求項６又は７に記載の方法。

【請求項11】

前記エンドヌクレアーゼ、前記１つ以上のガイドＲＮＡ、及び／又は前記１つ以上の組換えＤＮＡコンストラクトが、
（ａ）微粒子銃；
（ｂ）アグロバクテリウム形質転換；
（ｃ）プロトプラストトランスフェクション；
（ｄ）エレクトロポレーション；及び
（ｅ）ナノ粒子によって媒介されるトランスフェクション。
からなる群から選択される方法を用いて前記バナナ植物細胞に提供される、請求項５～１０のいずれか一項に記載の方法

【請求項12】

前記エンドヌクレアーゼが、エンドヌクレアーゼポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドとしてバナナ植物細胞に提供され；任意で、前記エンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼであり、前記ポリヌクレオチドが、Ｃａｓ９ポリペプチドをコードしているＣａｓ９ポリヌクレオチドである、請求項５～１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

前記１つ以上のガイドＲＮＡ及び前記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ又は改変型ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼが、前記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ又は改変型ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ、少なくとも１つの選択マーカー遺伝子、及び前記１つ以上のガイドＲＮＡをコードしている１つ以上のプラスミドのアグロバクテリウム形質転換を介して前記バナナ植物細胞に提供される、請求項６又は７に記載の方法。

【請求項14】

前記１つ以上のガイドＲＮＡが、
（ａ）配列番号３２；
（ｂ）配列番号３３；
（ｃ）配列番号３４；
（ｄ）配列番号３５；
（ｅ）配列番号５７；
（ｆ）配列番号５８；
（ｇ）配列番号３８；
（ｈ）配列番号３９；
（ｉ）配列番号６２；
（ｊ）配列番号７６；
（ｋ）配列番号７７；及び
（ｌ）（ａ）～（ｋ）の任意の組み合わせ
からなる群から選択される配列を有する可変領域を含む、請求項６～１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

前記１つ以上のガイドＲＮＡが、
（ａ）配列番号３２及び３３；
（ｂ）配列番号３４及び３５；
（ｃ）配列番号３２及び３４；
（ｄ）配列番号３２及び３５；
（ｅ）配列番号３３及び３４；
（ｆ）配列番号３３及び３５；
（ｇ）配列番号５７及び５８；
（ｈ）配列番号３８及び３９；
（ｉ）配列番号６２及び３３；並びに
（ｊ）配列番号７６及び７７
からなる群から選択される可変領域を含む一対のガイドＲＮＡである、請求項６～１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項16】

前記バナナ植物細胞が胚形成細胞である及び／又は胚形成細胞懸濁液に含有される、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項17】

請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法によって得ることができる、バナナ植物細胞。

【請求項18】

前記バナナ植物細胞からバナナ植物を再生することを更に含み；
任意で、該バナナ植物から果実を収穫することを更に含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

請求項１８に記載の方法によって得ることができるバナナの植物又は植物部位であって；任意で、
（ａ）配列番号１７９に記載の；
（ｂ）配列番号１７７に記載の切断型ＰＰＯ１タンパク質を発現する；又は
（ｃ）配列番号１７８に記載のコード配列を有する変異ＰＰＯ１遺伝子を含み；
更に任意で、前記変異が、ＰＰＯ１遺伝子の１つのアレルにのみ存在する、バナナの植物又は植物部位。

【請求項20】

請求項１８に記載の方法によって得ることができるバナナ植物から収穫された果実であって、前記果実の果肉及び／又は果皮が、前記少なくとも１つの内因性のＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ８、ＰＰＯ９、又はＰＰＯ４のポリフェノールオキシダーゼのレベル又は活性が低下していないバナナ植物の果肉及び／又は果皮と比較して褐変が遅延及び／又は低減する表現型を特徴とする、果実。

【請求項21】

野生型バナナ植物と比較して果肉及び／又は果皮の褐変が遅延及び／又は低減する表現型を特徴とするバナナ植物を作出する方法であって、
（ａ）バナナ植物細胞に、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ又は改変型ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ及び１つ以上のガイドＲＮＡを提供することであって、前記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ又は改変型ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ及び前記１つ以上のガイドＲＮＡが、
（Ａ）
（ｉ）配列番号５若しくは配列番号５に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｉｉ）配列番号６若しくは配列番号６に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｉｉｉ）配列番号１２若しくは配列番号１２に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｉｖ）配列番号１３若しくは配列番号１３に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；及び
（ｖ）配列番号８若しくは配列番号８に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド
からなる群から選択されるコード配列を含む；
（Ｂ）
（ｉ）配列番号４０若しくは配列番号４０に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｉｉ）配列番号４１若しくは配列番号４１に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｉｉｉ）配列番号４７若しくは配列番号４７に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｉｖ）配列番号４８若しくは配列番号４８に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；及び
（ｖ）配列番号４３若しくは配列番号４３に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド
からなる群から選択されるポリフェノールオキシダーゼをコードしている；又は
（Ｃ）
（ｉ）配列番号１５１若しくは配列番号１５１に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｉｉ）配列番号１５２若しくは配列番号１５２に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｉｉｉ）配列番号１５８若しくは配列番号１５８に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｉｖ）配列番号１５９若しくは配列番号１５９に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；及び
（ｖ）配列番号１５４若しくは配列番号１５４に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド
からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む
少なくとも１つの内因性のＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ８、ＰＰＯ９、又はＰＰＯ４のポリフェノールオキシダーゼ遺伝子に、前記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ又は改変型ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼが、一本鎖切断又は二本鎖切断を導入することを可能にする複合体を形成することと；
（ｂ）前記少なくとも１つの内因性のＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ８、ＰＰＯ９、又はＰＰＯ４のポリフェノールオキシダーゼ遺伝子の改変を含む少なくとも１つのバナナ植物細胞を同定することであって、前記改変が、
（ｉ）少なくとも１つのヌクレオチド挿入；
（ｉｉ）少なくとも１つのヌクレオチド欠失；
（ｉｉｉ）少なくとも１つのヌクレオチド置換；又は
（ｉｖ）（ｂ）（ｉ）～（ｂ）（ｉｉｉ）の任意の組み合わせ
からなる群から選択されることと；及び
（ｃ）前記バナナ植物細胞からバナナ植物を再生することであって、前記バナナ植物が、野生型バナナ植物と比較して果肉及び／又は果皮の褐変が遅延及び／又は低減する表現型を特徴とすることと
を含む方法。

【請求項22】

前記バナナ植物から果実を収穫することを更に含み、前記果実が、前記少なくとも１つの内因性のＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ８、ＰＰＯ９、又はＰＰＯ４のポリフェノールオキシダーゼのレベル又は活性が低下も喪失もしていないバナナ植物の果実と比較して褐変が遅延及び／又は低減する表現型を特徴とする、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

少なくとも１つの改変された内因性のＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ８、ＰＰＯ９、又はＰＰＯ４のポリフェノールオキシダーゼ遺伝子をそのゲノム中に含むバナナの植物又は植物部位であって、前記改変の結果、前記改変された内因性のＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ８、ＰＰＯ９、又はＰＰＯ４のポリフェノールオキシダーゼ遺伝子によってコードされている少なくとも１つの内因性のＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ８、ＰＰＯ９、又はＰＰＯ４のポリフェノールオキシダーゼが低減又は機能が低下し、前記改変が、
（Ａ）
（ａ）配列番号５若しくは配列番号５に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号６若しくは配列番号６に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１２若しくは配列番号１２に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号１３若しくは配列番号１３に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；及び
（ｅ）配列番号８若しくは配列番号８に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド
からなる群から選択されるコード配列を含む；
（Ｂ）
（ａ）配列番号４０若しくは配列番号４０に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｂ）配列番号４１若しくは配列番号４１に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｃ）配列番号４７若しくは配列番号４７に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｄ）配列番号４８若しくは配列番号４８に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；及び
（ｅ）配列番号４３若しくは配列番号４３に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド
からなる群から選択されるポリフェノールオキシダーゼをコードしている；又は
（Ｃ）
（ａ）配列番号１５１若しくは配列番号１５１に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１５２若しくは配列番号１５２に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１５８若しくは配列番号１５８に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号１５９若しくは配列番号１５９に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；及び
（ｅ）配列番号１５４若しくは配列番号１５４に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド
からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む
少なくとも１つの内因性のＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ８、ＰＰＯ９、又はＰＰＯ４のポリフェノールオキシダーゼ遺伝子に位置する、バナナの植物又は植物部位。

【請求項24】

非トランスジェニックである、請求項１９又は２３に記載のバナナの植物又は植物部位。

【請求項25】

前記果実が、前記少なくとも１つの内因性のＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ８、ＰＰＯ９、又はＰＰＯ４のポリフェノールオキシダーゼのレベル又は活性が低下していないバナナ植物の果実と比較して褐変が遅延及び／又は低減する表現型を特徴とする、請求項２３又は２４に記載のバナナ植物から収穫されたバナナ果実。

【請求項26】

バナナ果実食品を得る方法であって、請求項２５に記載のバナナ果実を加工することを含む方法。

【請求項27】

（Ａ）
（ａ）配列番号５若しくは配列番号５に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号６若しくは配列番号６に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１２若しくは配列番号１２に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号１３若しくは配列番号１３に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；及び
（ｅ）配列番号８若しくは配列番号８に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド
からなる群から選択されるコード配列を含む；
（Ｂ）
（ａ）配列番号４０若しくは配列番号４０に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｂ）配列番号４１若しくは配列番号４１に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｃ）配列番号４７若しくは配列番号４７に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｄ）配列番号４８若しくは配列番号４８に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；及び
（ｅ）配列番号４３若しくは配列番号４３に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド
からなる群から選択されるポリフェノールオキシダーゼをコードしている；又は
（Ｃ）
（ａ）配列番号１５１若しくは配列番号１５１に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１５２若しくは配列番号１５２に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１５８若しくは配列番号１５８に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号１５９若しくは配列番号１５９に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；及び
（ｅ）配列番号１５４若しくは配列番号１５４に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド
からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む、
バナナのＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ８、ＰＰＯ９、又はＰＰＯ４のポリフェノールオキシダーゼポリヌクレオチドを含むＤＮＡ配列。

【請求項28】

（Ａ）
（ａ）配列番号５若しくは配列番号５に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号６若しくは配列番号６に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１２若しくは配列番号１２に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号１３若しくは配列番号１３に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；及び
（ｅ）配列番号８若しくは配列番号８に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド
からなる群から選択されるコード配列を含む；
（Ｂ）
（ａ）配列番号４０若しくは配列番号４０に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｂ）配列番号４１若しくは配列番号４１に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｃ）配列番号４７若しくは配列番号４７に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｄ）配列番号４８若しくは配列番号４８に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；及び
（ｅ）配列番号４３若しくは配列番号４３に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド
からなる群から選択されるポリフェノールオキシダーゼをコードしている；又は
（Ｃ）
（ａ）配列番号１５１若しくは配列番号１５１に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１５２若しくは配列番号１５２に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１５８若しくは配列番号１５８に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号１５９若しくは配列番号１５９に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；及び
（ｅ）配列番号１５４若しくは配列番号１５４に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド
からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む
バナナのＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ８、ＰＰＯ９、又はＰＰＯ４のポリフェノールオキシダーゼポリヌクレオチドを含むＤＮＡコンストラクト又はベクター。

【請求項29】

ベクター又は請求項２８で形質転換された植物細胞であって、任意でバナナ植物細胞である、植物細胞。

【請求項30】

（ａ）配列番号５、配列番号６、配列番号１２、配列番号１３、若しくは配列番号８によってコードされているか、又は配列番号５、配列番号６、配列番号１２、配列番号１３、若しくは配列番号８に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされている；
（ｂ）配列番号４０、配列番号４１、配列番号４７、配列番号４８、若しくは配列番号４３を含むか、又は配列番号４０、配列番号４１、配列番号４７、配列番号４８、若しくは配列番号４３に対して少なくとも７５％の配列同一性を有する配列を含む；或いは
（ｃ）配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１５８、配列番号１５９、若しくは配列番号１５４によってコードされているか、又は配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１５８、配列番号１５９、若しくは配列番号１５４に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされている、
ポリフェノールオキシダーゼタンパク質。

【請求項31】

植物細胞においてポリフェノールオキシダーゼを発現させる方法であって、前記植物細胞に、植物細胞内で活性のあるプロモータに動作可能に連結されている
（Ａ）
（ａ）配列番号５若しくは配列番号５に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号６若しくは配列番号６に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１２若しくは配列番号１２に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号１３若しくは配列番号１３に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；及び
（ｅ）配列番号８若しくは配列番号８に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド
からなる群から選択されるコード配列を含む；
（Ｂ）
（ａ）配列番号４０若しくは配列番号４０に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｂ）配列番号４１若しくは配列番号４１に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｃ）配列番号４７若しくは配列番号４７に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｄ）配列番号４８若しくは配列番号４８に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；及び
（ｅ）配列番号４３若しくは配列番号４３に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド
からなる群から選択されるポリフェノールオキシダーゼをコードしている；又は
（Ｃ）
（ａ）配列番号１５１若しくは配列番号１５１に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１５２若しくは配列番号１５２に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１５８若しくは配列番号１５８に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号１５９若しくは配列番号１５９に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；及び
（ｅ）配列番号１５４若しくは配列番号１５４に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド
からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む
バナナポリフェノールオキシダーゼポリヌクレオチドを導入することを含む方法。

【請求項32】

（ａ）配列番号３２；
（ｂ）配列番号３３；
（ｃ）配列番号３４；
（ｄ）配列番号３５；
（ｅ）配列番号５７；
（ｆ）配列番号５８；
（ｇ）配列番号３８；
（ｈ）配列番号３９；
（ｉ）配列番号６２；
（ｊ）配列番号７６；及び
（ｋ）配列番号７７
からなる群から選択される可変領域を含む、合成バナナポリフェノールオキシダーゼガイドＲＮＡ。

【請求項33】

少なくとも１つのバナナのＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ８、ＰＰＯ９、又はＰＰＯ４のポリフェノールオキシダーゼガイドＲＮＡを発現するヌクレオチド配列に動作可能に連結されたプロモータを含む組換えＤＮＡコンストラクトであって、前記ガイドＲＮＡが、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ又は改変型ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼと複合体を形成することができ、前記複合体が、バナナゲノム中の
（Ａ）
（ａ）配列番号５若しくは配列番号５に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号６若しくは配列番号６に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１２若しくは配列番号１２に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号１３若しくは配列番号１３に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；及び
（ｅ）配列番号８若しくは配列番号８に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド
からなる群から選択されるコード配列を含む；
（Ｂ）
（ａ）配列番号４０若しくは配列番号４０に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｂ）配列番号４１若しくは配列番号４１に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｃ）配列番号４７若しくは配列番号４７に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｄ）配列番号４８若しくは配列番号４８に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；及び
（ｅ）配列番号４３若しくは配列番号４３に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド
からなる群から選択されるポリフェノールオキシダーゼをコードしている；又は
（Ｃ）
（ａ）配列番号１５１若しくは配列番号１５１に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１５２若しくは配列番号１５２に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１５８若しくは配列番号１５８に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号１５９若しくは配列番号１５９に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；及び
（ｅ）配列番号１５４若しくは配列番号１５４に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド
からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む
少なくとも１つの内因性バナナのＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ８、ＰＰＯ９、又はＰＰＯ４のポリフェノールオキシダーゼ遺伝子に結合し、二本鎖切断又は一本鎖切断を生じさせることができる、組換えＤＮＡコンストラクト。

【請求項34】

前記１つ以上のバナナポリフェノールオキシダーゼガイドＲＮＡが、
（ａ）配列番号３２；
（ｂ）配列番号３３；
（ｃ）配列番号３４；
（ｄ）配列番号３５；
（ｅ）配列番号５７；
（ｆ）配列番号５８；
（ｇ）配列番号３８；
（ｈ）配列番号３９；
（ｉ）配列番号６２；
（ｊ）配列番号７６；
（ｋ）配列番号７７；及び
（ｌ）（ａ）～（ｋ）の任意の組み合わせ
からなる群から選択される配列を有する可変領域を含む、請求項３３に記載の組換えＤＮＡコンストラクト。

【請求項35】

前記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼがＣａｓ９エンドヌクレアーゼである、請求項３３又は３４に記載の組換えＤＮＡコンストラクト。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、幾つかの実施形態によれば、バナナ果実における褐変を遅延又は防止するための組成物及び方法に関する。本発明の幾つかの実施形態においては、バナナ果実における褐変の遅延又は防止は、ポリフェノールオキシダーゼ（ＰＰＯ）をコードしている１つ以上の遺伝子を遺伝的に編集することによって達成される。

【背景技術】

【0002】

栽培されているバナナ及びプランテンは、ムサ属の巨大な草本植物である。これらは不稔性かつ単為結実性であるため、種子なしに果実が発達する。栽培されている雑種及び種はほとんどが３倍体であるが、一部は２倍体又は４倍体である。そのほとんどは、野生で発見された変異体から繁殖したものである。

【0003】

バナナは、クライマクテリック型果実に属する。収穫後、緑色のバナナは、果肉が軟らかくなり、甘味が増し、香りが出て、よって食品としての価値が上がるまで、成熟過程（内部エチレンの生成、デンプン及びプロトペクチンの加水分解を含む）を経てクライマクテリック型変化を遂げなければならない。従来、バナナは熟す前に収穫されるため、輸送及び貯蔵の期間は成熟の進行の長さに影響を受ける。バナナの果実は、多くの場合、輸送過程中にエチレンが生成されることから成熟が進み得る。更に、果実が熟し過ぎて褐色になり始め、腐敗して市場価値が下がることもある。従って、バナナの果実の褐変を制御する必要がある。特に、果実の褐変を遅延又は防止する能力は、バナナ果実の輸送を容易にし、バナナ果実の貯蔵寿命を向上させる。果実の褐変に影響を与える可能性のある要素の１つは、ポリフェノールオキシダーゼ（ＰＰＯ）である。

【0004】

ポリフェノールオキシダーゼ（ＰＰＯ）は、バナナ等のほとんどの果物及び野菜を含む植物界及び動物界全体にみられる酵素である。ＰＰＯは食品産業において重要であるが、その理由は、傷み又は圧迫によって組織が損傷した場合に酵素的褐変を触媒し、農産物の市場性を低下させ、経済的損失をもたらすためである。ＰＰＯの作用による酵素的褐変は、農産物の栄養素含有量の損失にもつながり、その価値を更に低下させる場合がある。ＰＰＯ反応の基質は植物細胞の液胞内に位置するため、ＰＰＯが一連の褐変反応を開始させる。果実を薄切りにしたり裏ごししたりした際に酸素に曝されることも、ＰＰＯによる酵素的褐変を引き起こす。ＰＰＯはモノフェノール及び／又はｏ－ジフェノールを基質として受け入れることが知られており、ベンゼン環が１つのヒドロキシル置換基を含有するモノフェノール分子のｏ－ジフェノール（１，２位に２つのヒドロキシル置換基を含有し、間に炭素を有しないフェノール分子）へのｏ－ヒドロキシル化を触媒することによって作用する。この酵素は更に、ｏ－ジフェノールの酸化を触媒してｏ－キノンを生成することもできる。ＰＰＯはｏ－キノンの迅速な重合を触媒し、果実の褐変を引き起こす黒色、褐色、又は赤色の色素（ポリフェノール）を生成する。従って、例えばバナナにおいて果実の褐変を遅延又は防止するための取り組みにおいて、果実において活性のあるＰＰＯのレベル又は活性を低下させる方法を見出すことが望まれる。

【0005】

ＰＰＯ遺伝子の発現を低下させてＰＰＯのレベル又は活性を低下させることは、果実の褐変を防止する１つの方法である（リンゴ、いわゆる「北極リンゴ」について米国特許第９５８０７２３号に記載されている）。農業の生産性を向上させる典型的なアプローチ（収量の向上又は害虫抵抗性の操作等）は、これまで、突然変異育種又は形質転換によって作物種のゲノムに遺伝子を導入することに頼ってきた。しかし、これらのプロセスは本質的に非特異的であり、比較的非効率的である。例えば、植物の形質転換法では、外来性ＤＮＡを送達し、それをランダムな位置でゲノムに組み込む。更に、これら組み込みのランダムな性質から、意図しないゲノム破壊による多面的効果が生じたかどうかを予測することが困難になる。最近のゲノム編集技術の進歩により、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子編集の使用等によって、従来の育種又は標準的な遺伝子操作よりも正確に生細胞内のＤＮＡ配列を改変することが可能になった。

【0006】

しかし、他のほとんどの食用作物とは異なり、バナナは遺伝子改良が困難である。これは、一部には、バナナ種が単為生殖性である（生育可能な種子を作らない）ので、有性生殖によって遺伝的に挿入された配列を除去することが不可能であるためである（例えば、Ｃａｓ９配列を導入するアグロバクテリアを用いて挿入されたトランスファーＤＮＡ、Ｔ－ＤＮＡの除去）。更に、ほぼ全てのバナナの品種及び在来種は３倍体であり、雄性及び雌性の不稔率が高いため、バナナの戻し交配は不可能であり、従って、現在の品種に新たな形質を遺伝子移入する可能性は排除される。更に、バナナゲノムのアノテーションが不完全であり、発現データも限られているため、標的とすべき最適な遺伝子について十分に深い情報が得られない。

【0007】

本発明は、バナナにおける９つの異なるＰＰＯ遺伝子（ＰＰＯ１～ＰＰＯ９と命名）の同定、特に、ＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ８、ＰＰＯ９、及びＰＰＯ４等の特定のＰＰＯがバナナ果実では発現するが、他の組織では発現が低いか又は発現しないことを特徴とするという特徴付けに一部基づいている。本発明の幾つかの実施形態によれば、バナナ果実における褐変を遅延又は防止するために、同定されたＰＰＯ遺伝子、特にＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ８、ＰＰＯ９、及び／又はＰＰＯ４が本明細書において標的とされる。以前、Ｇｏｏｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ ｏｆ ｂａｎａｎａ ｆｒｕｉｔ ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ ｏｘｉｄａｓｅ”，Ｐｌａｎｔａ，Ｓｅｐ ２００１；１２３（５）：７４８－５７では、バナナのＰＰＯを同定するために縮重プライマーが使用され、該プライマーは本明細書のＰＰＯのいずれとも一致しないが、ＰＰＯ４及びＰＰＯ５のいずれかと最も密接に相関している。国際公開第９６３７６１７号、同第９７２９１９３号、及び同第９８５３０８０号では、Ｇｏｏｄｉｎｇら（２００１）上掲と同じ縮重プライマーが使用された。中国特許第１０４４０４００７号には、本明細書ではＰＰＯ８と称するバナナのＰＰＯ遺伝子の発見が開示されている。

【発明の概要】

【0008】

本発明は、バナナ植物又はバナナ植物細胞において、ＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ８、ＰＰＯ９、又はＰＰＯ４のポリフェノールオキシダーゼ遺伝子によってコードされている少なくとも１つの内因性のＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ８、ＰＰＯ９、又はＰＰＯ４のポリフェノールオキシダーゼのレベル又は活性を低下させる方法を提供する。任意で、本発明の方法は、該バナナ植物細胞からバナナ植物を再生することを更に含む。更に任意で、本発明の方法は、該バナナ植物から果実を収穫することを更に含む。幾つかの実施形態によれば、少なくとも１つの内因性のＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ８、ＰＰＯ９、又はＰＰＯ４のポリフェノールオキシダーゼのレベル又は活性を低下させることは、該少なくとも１つのＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ８、ＰＰＯ９、又はＰＰＯ４のポリフェノールオキシダーゼをコードしているＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ８、ＰＰＯ９、又はＰＰＯ４のポリフェノールオキシダーゼ遺伝子に改変を導入することを含む。

【0009】

本発明は更に、本発明の上記方法によって得ることができるバナナ植物細胞、本発明の上記方法によって得ることができるバナナの植物又は植物部位、及び本発明の上記方法によって得ることができるバナナ植物から収穫された果実であって、果肉及び／又は果皮が、該少なくとも１つの内因性のＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ８、ＰＰＯ９、又はＰＰＯ４のポリフェノールオキシダーゼのレベル又は活性が低下していないバナナ植物の果肉及び／又は果皮と比較して褐変が遅延及び／又は低減する表現型を特徴とする果実を提供する。

【0010】

野生型バナナ植物と比較して果肉及び／又は果皮の褐変が遅延及び／又は低減する表現型を特徴とするバナナ植物を作出する方法であって、（ａ）バナナ植物細胞に、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ又は改変型ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ及び１つ以上のガイドＲＮＡを提供することであって、該ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ又は改変型ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ及び該１つ以上のガイドＲＮＡが、該ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ又は改変型ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼが、（Ａ）配列番号５若しくは配列番号５に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；配列番号６若しくは配列番号６に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；配列番号１２若しくは配列番号１２に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；配列番号１３若しくは配列番号１３に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；及び配列番号８若しくは配列番号８に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドからなる群から選択されるコード配列を含む；（Ｂ）配列番号４０若しくは配列番号４０に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；配列番号４１若しくは配列番号４１に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；配列番号４７若しくは配列番号４７に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；配列番号４８若しくは配列番号４８に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；及び配列番号４３若しくは配列番号４３に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチドからなる群から選択されるポリフェノールオキシダーゼをコードしている；又は（Ｃ）配列番号１５１若しくは配列番号１５１に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；配列番号１５２若しくは配列番号１５２に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；配列番号１５８若しくは配列番号１５８に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；配列番号１５９若しくは配列番号１５９に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；及び配列番号１５４若しくは配列番号１５４に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む、少なくとも１つの内因性のＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ８、ＰＰＯ９、又はＰＰＯ４のポリフェノールオキシダーゼ遺伝子に一本鎖切断又は二本鎖切断を導入することを可能にする複合体を形成することと、（ｂ）該少なくとも１つの内因性のＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ８、ＰＰＯ９、又はＰＰＯ４のポリフェノールオキシダーゼ遺伝子の改変を含む少なくとも１つのバナナ植物細胞を同定することであって、該改変が、少なくとも１つのヌクレオチド挿入；少なくとも１つのヌクレオチド欠失；少なくとも１つのヌクレオチド置換；又は前述の任意の組み合わせからなる群から選択されることと；該バナナ植物細胞からバナナ植物を再生することであって、該バナナ植物が、野生型バナナ植物と比較して果肉及び／又は果皮の褐変が遅延及び／又は低減する表現型を特徴とすることと、を含む方法が、本発明によって更に提供される。

【0011】

本発明は更に、少なくとも１つの改変された内因性のＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ８、ＰＰＯ９、又はＰＰＯ４のポリフェノールオキシダーゼ遺伝子をそのゲノム中に含むバナナの植物又は植物部位であって、該改変の結果、該改変された内因性のＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ８、ＰＰＯ９、又はＰＰＯ４のポリフェノールオキシダーゼ遺伝子によってコードされている少なくとも１つの内因性のＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ８、ＰＰＯ９、又はＰＰＯ４のポリフェノールオキシダーゼが低減又は機能が低下し、該改変が、（Ａ）配列番号５若しくは配列番号５に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；配列番号６若しくは配列番号６に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；配列番号１２若しくは配列番号１２に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；配列番号１３若しくは配列番号１３に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；及び配列番号８若しくは配列番号８に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドからなる群から選択されるコード配列を含む；（Ｂ）配列番号４０若しくは配列番号４０に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；配列番号４１若しくは配列番号４１に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；配列番号４７若しくは配列番号４７に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；配列番号４８若しくは配列番号４８に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；及び配列番号４３若しくは配列番号４３に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチドからなる群から選択されるポリフェノールオキシダーゼをコードしている；又は（Ｃ）配列番号１５１若しくは配列番号１５１に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；配列番号１５２若しくは配列番号１５２に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；配列番号１５８若しくは配列番号１５８に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；配列番号１５９若しくは配列番号１５９に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；及び配列番号１５４若しくは配列番号１５４に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む、少なくとも１つの内因性のＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ８、ＰＰＯ９、又はＰＰＯ４のポリフェノールオキシダーゼ遺伝子に位置する、バナナの植物又は植物部位を提供する。

【0012】

本発明は更に、本発明のバナナ植物から収穫されたバナナ果実であって、該少なくとも１つの内因性のＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ８、ＰＰＯ９、又はＰＰＯ４のポリフェノールオキシダーゼのレベル又は活性が低下していないバナナ植物の果実と比較して褐変が遅延及び／又は低減する表現型を特徴とする果実を提供する。バナナ果実食品を得る方法であって、本発明のバナナ果実を加工することを含む方法が、本発明により更に提供される。

【0013】

バナナのＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ８、ＰＰＯ９、又はＰＰＯ４のポリフェノールオキシダーゼポリヌクレオチドを含むＤＮＡ配列であって、（Ａ）配列番号５若しくは配列番号５に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；配列番号６若しくは配列番号６に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；配列番号１２若しくは配列番号１２に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；配列番号１３若しくは配列番号１３に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；及び配列番号８若しくは配列番号８に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドからなる群から選択されるコード配列を含む；（Ｂ）配列番号４０若しくは配列番号４０に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；配列番号４１若しくは配列番号４１に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；配列番号４７若しくは配列番号４７に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；配列番号４８若しくは配列番号４８に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；及び配列番号４３若しくは配列番号４３に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチドからなる群から選択されるポリフェノールオキシダーゼをコードしている；又は（Ｃ）配列番号１５１若しくは配列番号１５１に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；配列番号１５２若しくは配列番号１５２に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；配列番号１５８若しくは配列番号１５８に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；配列番号１５９若しくは配列番号１５９に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；及び配列番号１５４若しくは配列番号１５４に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む、ＤＮＡ配列が本発明により更に提供される。

【0014】

本発明は更に、（Ａ）配列番号５若しくは配列番号５に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；配列番号６若しくは配列番号６に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；配列番号１２若しくは配列番号１２に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；配列番号１３若しくは配列番号１３に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；及び配列番号８若しくは配列番号８に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドからなる群から選択されるコード配列を含む；（Ｂ）配列番号４０若しくは配列番号４０に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；配列番号４１若しくは配列番号４１に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；配列番号４７若しくは配列番号４７に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；配列番号４８若しくは配列番号４８に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；及び配列番号４３若しくは配列番号４３に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチドからなる群から選択されるポリフェノールオキシダーゼをコードしている；又は（Ｃ）配列番号１５１若しくは配列番号１５１に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；配列番号１５２若しくは配列番号１５２に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；配列番号１５８若しくは配列番号１５８に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；配列番号１５９若しくは配列番号１５９に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；及び配列番号１５４若しくは配列番号１５４に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む、バナナのＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ８、ＰＰＯ９、又はＰＰＯ４のポリフェノールオキシダーゼポリヌクレオチドを含むＤＮＡコンストラクト又はベクターを提供する。本発明のベクターで形質転換された植物細胞であって、任意で、バナナ植物細胞である植物細胞が、本発明により更に提供される。

【0015】

本発明は更に、配列番号５、配列番号６、配列番号１２、配列番号１３、若しくは配列番号８によってコードされているか、又は配列番号５、配列番号６、配列番号１２、配列番号１３、若しくは配列番号８に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされている；配列番号４０、配列番号４１、配列番号４７、配列番号４８、若しくは配列番号４３を含むか、又は配列番号４０、配列番号４１、配列番号４７、配列番号４８、若しくは配列番号４３に対して少なくとも７５％の配列同一性を有する配列を含む；或いは配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１５８、配列番号１５９、若しくは配列番号１５４によってコードされているか、又は配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１５８、配列番号１５９、若しくは配列番号１５４に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされているポリフェノールオキシダーゼタンパク質を提供する。

【0016】

植物細胞においてポリフェノールオキシダーゼを発現させる方法であって、該植物細胞に、植物細胞内で活性のあるプロモータに動作可能に連結されている（Ａ）配列番号５若しくは配列番号５に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；配列番号６若しくは配列番号６に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；配列番号１２若しくは配列番号１２に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；配列番号１３若しくは配列番号１３に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；及び配列番号８若しくは配列番号８に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドからなる群から選択されるコード配列を含む；（Ｂ）配列番号４０若しくは配列番号４０に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；配列番号４１若しくは配列番号４１に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；配列番号４７若しくは配列番号４７に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；配列番号４８若しくは配列番号４８に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；及び配列番号４３若しくは配列番号４３に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチドからなる群から選択されるポリフェノールオキシダーゼをコードしている；又は（Ｃ）配列番号１５１若しくは配列番号１５１に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；配列番号１５２若しくは配列番号１５２に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；配列番号１５８若しくは配列番号１５８に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；配列番号１５９若しくは配列番号１５９に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；及び配列番号１５４若しくは配列番号１５４に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む、バナナポリフェノールオキシダーゼポリヌクレオチドを導入することを含む方法が、本発明により更に提供される。

【0017】

本発明は更に、配列番号３２；配列番号３３；配列番号３４；配列番号３５；配列番号５７；配列番号５８；配列番号３８；配列番号３９；配列番号６２；配列番号７６；及び配列番号７７からなる群から選択される可変領域を含む合成バナナポリフェノールオキシダーゼガイドＲＮＡを提供する。

【0018】

本発明は更に、少なくとも１つのバナナのＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ８、ＰＰＯ９、又はＰＰＯ４のポリフェノールオキシダーゼガイドＲＮＡを発現するヌクレオチド配列に動作可能に連結されたプロモータを含む組換えＤＮＡコンストラクトであって、該ガイドＲＮＡが、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ又は改変型ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼと複合体を形成することが可能であり、該複合体が、バナナゲノム中に、（Ａ）配列番号５若しくは配列番号５に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；配列番号６若しくは配列番号６に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；配列番号１２若しくは配列番号１２に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；配列番号１３若しくは配列番号１３に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；及び配列番号８若しくは配列番号８に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドからなる群から選択されるコード配列を含む；（Ｂ）配列番号４０若しくは配列番号４０に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；配列番号４１若しくは配列番号４１に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；配列番号４７若しくは配列番号４７に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；配列番号４８若しくは配列番号４８に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；及び配列番号４３若しくは配列番号４３に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチドからなる群から選択されるポリフェノールオキシダーゼをコードしている；又は（Ｃ）配列番号１５１又は配列番号１５１に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；配列番号１５２又は配列番号１５２に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；配列番号１５８又は配列番号１５８に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；配列番号１５９又は配列番号１５９に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；及び配列番号１５４又は配列番号１５４に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む、少なくとも１つの内因性バナナのＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ８、又はＰＰＯ９のポリフェノールオキシダーゼ遺伝子に結合し、二本鎖切断又は一本鎖切断を作製することが可能である組換えＤＮＡコンストラクトを提供する。

【図面の簡単な説明】

【0019】

本開示は、本出願の一部を構成する添付図面及び配列表の以下の説明からより深く理解することができる。

【図1】選択したマレーヤマバショウ（Ｍｕｓａ ａｃｕｍｉｎａｔａ）ＰＰＯタンパク質の同一性パーセントマトリックス。ＰＰＯは互いに３５％～９７％の相同性を有する。

【図2】選択したマレーヤマバショウ及びセイヨウリンゴ（Ｍａｌｕｓ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）のＰＰＯタンパク質の同一性パーセントマトリックス。ＰＰＯはクエリー配列に対して約３９％～９７％の相同性を有する。

【図3】遺伝子編集の標的となる選択されたＰＰＯのＤＷＬドメインのタンパク質アラインメント。セイヨウリンゴのクエリー配列を枠内に示す。

【図4】各被検組織における各ＰＰＯの平均発現レベルを示す発現プロファイル。単位は、視覚的に定量化し、定量化を数字として表し、その数字を－から＋、＋＋、＋＋＋までの尺度に直線的に変換することによって導き出される任意のものである。

【図5】種々の組織からの全ＲＮＡシーケンスデータの比較及びＴＭＭ正規化（Ｍ値のトリム平均）による発現の測定に基づく、バナナのＰＰＯ１、ＰＰＯ２、及びＰＰＯ４～ＰＰＯ９のＲＮＡ－ｓｅｑ発現を示す棒グラフ。ＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ８、及びＰＰＯ９では、バナナの果実及び／又は果肉における発現がみられた。ｅｄｇｅＲによってＴＭＭの正規化を実施して、サンプル間及びサンプル内の組成バイアスを排除した。ＴＭＭ正規化は、特にサンプル間の発現転写物の基本的な分布が著しく異なる状況において、ＲＮＡ－ｓｅｑデータから相対的なＲＮＡ産生レベルを推定する方法である。ＴＭＭ法はサンプル間のスケール係数を推定する。ＰＰＯ３は、ＲＮＡ－ｓｅｑによって検出されなかった。

【図6】図６Ａに示す遺伝子及び図６Ｂに示す欠失を有するＰＰＯ２における編集の生成。

【図7】（Ａ）バナナＰＰＯ１遺伝子の最初のエクソンの部分ゲノム配列。黒字はコード配列のヌクレオチド（開始コドンのアデノシンからヌクレオチド１～６９５を表示）を示し、灰色の字は上流の非翻訳領域のヌクレオチド（開始コドンのアデノシンからヌクレオチド－１６６～－１を表示）を示す。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に関連するＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）部位を点線で示す。ＰＰＯ１遺伝子を標的とする２つのｓｇＲＮＡ（８５７、８５８）を網掛けで示し、それらのプロトスペーサ隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列も網掛けで示す。太字及び下線は、褐変が低減したバナナ植物で欠失しているヌクレオチド（シトシン、ｂｐ３７１）を更に示す。網掛けは更に、シーケンシング及び編集の確認のためにＰＰＯ１標的部位領域を増幅するためのＰＣＲに使用したプライマーを示す。（Ｂ）編集されていないＰＰＯ１遺伝子及び編集されたＰＰＯ１遺伝子から産生されたＰＰＯ１タンパク質配列の部分的アラインメント。ボックスは、ｓｇＲＮＡ ８５８ガイドＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＤＳＢによって誘導されたＰＰＯ１遺伝子の一塩基対欠失によって引き起こされたタンパク質配列の変化を示す。編集されていないＰＰＯ１タンパク質の全長は５７８アミノ酸長であるが、編集されたＰＰＯ１タンパク質は、単一塩基対の欠失によって惹起されたフレームシフトに起因する未成熟終止コドン（アスタリスクで示す）の存在により切断されている（１２７アミノ酸長）。

【図8】外因性エチレンを適用していない自然成熟過程にわたってグランドナインバナナに対して行ったＲＮＡ－ｓｅｑ発現解析。５つの成熟段階から果皮及び果肉のサンプルを採取した：全緑色（未熟期）、緑－黄色（第１の転換点）、全黄色（成熟期）、黄－褐色（第２の転換点）、全褐色（過熟期）。全ての果肉サンプル及び全緑色期の果皮から高品質のＲＮＡが得られた。インビトログランドナイン植物の葉及び根、並びに胚及び胚形成細胞のインビトロ培養からも組織サンプルを採取した。ＴＭＭ正規化を用いて上記のように相対的ｍＲＮＡ存在量を定量化した。ＰＰＯ１、ＰＰＯ４、及びＰＰＯ９は、未熟な緑色期のグランドナインバナナの果皮におけるＰＰＯ発現の９０％超を占めるが、グランドナインバナナの果肉で発現する優勢ＰＰＯ遺伝子はＰＰＯ１であり、ＰＰＯ８がより高発現する過熟褐色期は例外である。

【発明を実施するための形態】

【0020】

配列
配列番号１は、北極リンゴ由来のＰＰＯペプチド配列である。
配列番号２は、北極リンゴ由来のＰＰＯペプチド配列である。
配列番号３は、北極リンゴ由来のＰＰＯペプチド配列である。
配列番号４は、北極リンゴ由来のＰＰＯペプチド配列である。
配列番号５は、バナナ由来のＰＰＯ１遺伝子コード配列である（アクセッション番号Ｍａ０６＿３１０８０）。
配列番号６は、バナナ由来のＰＰＯ２遺伝子コード配列である（アクセッション番号Ｍａ０７＿０３５４０）。
配列番号７は、バナナ由来のＰＰＯ３遺伝子コード配列である（アクセッション番号Ｍａ０７＿０３６５０）。
配列番号８は、バナナ由来のＰＰＯ４遺伝子コード配列である（アクセッション番号Ｍａ０８＿０９１５０）。
配列番号９は、バナナ由来のＰＰＯ５遺伝子コード配列である（アクセッション番号Ｍａ０８＿０９１６０）。
配列番号１０は、バナナ由来のＰＰＯ６遺伝子コード配列である（アクセッション番号Ｍａ０８＿０９１７０）。
配列番号１１は、バナナ由来のＰＰＯ７遺伝子コード配列である（アクセッション番号Ｍａ０８＿０９１８０）。
配列番号１２は、バナナ由来のＰＰＯ８遺伝子コード配列である（アクセッション番号Ｍａ０８＿３４７４０）。
配列番号１３は、バナナ由来のＰＰＯ９遺伝子コード配列である（アクセッション番号Ｍａ１０＿２０５１０）。
配列番号１４は、ＰＰＯ１をコードしているｍＲＮＡの発現を同定するために使用したフォワードオリゴヌクレオチドである。
配列番号１５は、ＰＰＯ１をコードしているｍＲＮＡの発現を同定するために使用したリバースオリゴヌクレオチドである。
配列番号１６は、ＰＰＯ２をコードしているｍＲＮＡの発現を同定するために使用したフォワードオリゴヌクレオチドである。
配列番号１７は、ＰＰＯ２をコードしているｍＲＮＡの発現を同定するために使用したリバースオリゴヌクレオチドである。
配列番号１８は、ＰＰＯ３をコードしているｍＲＮＡの発現を同定するために使用したフォワードオリゴヌクレオチドである。
配列番号１９は、ＰＰＯ３をコードしているｍＲＮＡの発現を同定するために使用したリバースオリゴヌクレオチドである。
配列番号２０は、ＰＰＯ４をコードしているｍＲＮＡの発現を同定するために使用したフォワードオリゴヌクレオチドである。
配列番号２１は、ＰＰＯ４をコードしているｍＲＮＡの発現を同定するために使用したリバースオリゴヌクレオチドである。
配列番号２２は、ＰＰＯ５をコードしているｍＲＮＡの発現を同定するために使用したフォワードオリゴヌクレオチドである。
配列番号２３は、ＰＰＯ５をコードしているｍＲＮＡの発現を同定するために使用したリバースオリゴヌクレオチドである。
配列番号２４は、ＰＰＯ６をコードしているｍＲＮＡの発現を同定するために使用したフォワードオリゴヌクレオチドである。
配列番号２５は、ＰＰＯ６をコードしているｍＲＮＡの発現を同定するために使用したリバースオリゴヌクレオチドである。
配列番号２６は、ＰＰＯ７をコードしているｍＲＮＡの発現を同定するために使用したフォワードオリゴヌクレオチドである。
配列番号２７は、ＰＰＯ７をコードしているｍＲＮＡの発現を同定するために使用したリバースオリゴヌクレオチドである。
配列番号２８は、ＰＰＯ８をコードしているｍＲＮＡの発現を同定するために使用したフォワードオリゴヌクレオチドである。
配列番号２９は、ＰＰＯ８をコードしているｍＲＮＡの発現を同定するために使用したリバースオリゴヌクレオチドである。
配列番号３０は、ＰＰＯ９をコードしているｍＲＮＡの発現を同定するために使用したフォワードオリゴヌクレオチドである。
配列番号３１は、ＰＰＯ９をコードしているｍＲＮＡの発現を同定するために使用したリバースオリゴヌクレオチドである。
配列番号３２は、ＰＰＯ１ ｓｇＲＮＡ１ ｓｇ２０１９の可変配列である。
配列番号３３は、ＰＰＯ１ ｓｇＲＮＡ２ ｓｇ８５８の可変配列である。
配列番号３４は、ＰＰＯ２ ｓｇＲＮＡ１ ｓｇ８５４の可変配列である。
配列番号３５は、ＰＰＯ２ ｓｇＲＮＡ２ ｓｇ８５５の可変配列である。
配列番号３６は、ＰＰＯ３ ｓｇＲＮＡ１ ｓｇ１４３５の可変配列である。
配列番号３７は、ＰＰＯ３ ｓｇＲＮＡ２ ｓｇ１４３６の可変配列である。
配列番号３８は、ＰＰＯ９ ｓｇＲＮＡ１ ｓｇ８５０の可変配列である。
配列番号３９は、ＰＰＯ９ ｓｇＲＮＡ２ ｓｇ８５１の可変配列である。
配列番号４０は、バナナ由来のＰＰＯ１ポリペプチド配列である（アクセッション番号Ｍａ０６＿３１０８０）。
配列番号４１は、バナナ由来のＰＰＯ２ポリペプチド配列である（アクセッション番号Ｍａ０７＿０３５４０）。
配列番号４２は、バナナ由来のＰＰＯ３ポリペプチド配列である（アクセッション番号Ｍａ０７＿０３６５０）。
配列番号４３は、バナナ由来のＰＰＯ４ポリペプチド配列である（アクセッション番号Ｍａ０８＿０９１５０）。
配列番号４４は、バナナ由来のＰＰＯ５ポリペプチド配列である（アクセッション番号Ｍａ０８＿０９１６０）。
配列番号４５は、バナナ由来のＰＰＯ６ポリペプチド配列である（アクセッション番号Ｍａ０８＿０９１７０）。
配列番号４６は、バナナ由来のＰＰＯ７ポリペプチド配列である（アクセッション番号Ｍａ０８＿０９１８０）。
配列番号４７は、バナナ由来のＰＰＯ８ポリペプチド配列である（アクセッション番号Ｍａ０８＿３４７４０）。
配列番号４８は、バナナ由来のＰＰＯ９ポリペプチド配列である（アクセッション番号Ｍａ１０＿２０５１０）。
配列番号４９は、ＰＡＭ部位を含むＰＰＯ１ ｓｇＲＮＡ ｓｇ２０１９の可変配列である。
配列番号５０は、ＰＡＭ部位を含むＰＰＯ１ ｓｇＲＮＡ ｓｇ８５８の可変配列である。
配列番号５１は、ＰＡＭ部位を含むＰＰＯ２ ｓｇＲＮＡ ｓｇ８５４の可変配列である。
配列番号５２は、ＰＡＭ部位を含むＰＰＯ２ ｓｇＲＮＡ ｓｇ８５５の可変配列である。
配列番号５３は、ＰＡＭ部位を含むＰＰＯ３ ｓｇＲＮＡ ｓｇ１４３５の可変配列である。
配列番号５４は、ＰＡＭ部位を含むＰＰＯ３ ｓｇＲＮＡ ｓｇ１４３６の可変配列である。
配列番号５５は、ＰＡＭ部位を含むＰＰＯ９ ｓｇＲＮＡ ｓｇ８５０の可変配列である。
配列番号５６は、ＰＡＭ部位を含むＰＰＯ９ ｓｇＲＮＡ ｓｇ８５１の可変配列である。
配列番号５７は、ＰＰＯ８ ｓｇＲＮＡ１ ｓｇ８５２の可変配列である。
配列番号５８は、ＰＰＯ８ ｓｇＲＮＡ２ ｓｇ８５３の可変配列である。
配列番号５９は、別のＰＰＯ１ ｓｇＲＮＡの可変配列である。
配列番号６０は、別のＰＰＯ１ ｓｇＲＮＡの可変配列である。
配列番号６１は、別のＰＰＯ１ ｓｇＲＮＡの可変配列である。
配列番号６２は、別のＰＰＯ１ ｓｇＲＮＡ（ｓｇ８５７）の可変配列である。
配列番号６３は、別のＰＰＯ１ ｓｇＲＮＡの可変配列である。
配列番号６４は、別のＰＰＯ２ ｓｇＲＮＡの可変配列である。
配列番号６５は、別のＰＰＯ２ ｓｇＲＮＡの可変配列である。
配列番号６６は、別のＰＰＯ２ ｓｇＲＮＡの可変配列である。
配列番号６７は、別のＰＰＯ２ ｓｇＲＮＡの可変配列である。
配列番号６８は、別のＰＰＯ２ ｓｇＲＮＡの可変配列である。
配列番号６９は、別のＰＰＯ２ ｓｇＲＮＡの可変配列である。
配列番号７０は、別のＰＰＯ２ ｓｇＲＮＡの可変配列である。
配列番号７１は、別のＰＰＯ３ ｓｇＲＮＡの可変配列である。
配列番号７２は、別のＰＰＯ３ ｓｇＲＮＡの可変配列である。
配列番号７３は、別のＰＰＯ３ ｓｇＲＮＡの可変配列である。
配列番号７４は、別のＰＰＯ３ ｓｇＲＮＡの可変配列である。
配列番号７５は、別のＰＰＯ３ ｓｇＲＮＡの可変配列である。
配列番号７６は、別のＰＰＯ４ ｓｇＲＮＡの可変配列である。
配列番号７７は、別のＰＰＯ４ ｓｇＲＮＡの可変配列である。
配列番号７８は、別のＰＰＯ５ ｓｇＲＮＡの可変配列である。
配列番号７９は、別のＰＰＯ５ ｓｇＲＮＡの可変配列である。
配列番号８０は、別のＰＰＯ６ ｓｇＲＮＡの可変配列である。
配列番号８１は、別のＰＰＯ６ ｓｇＲＮＡの可変配列である。
配列番号８２は、別のＰＰＯ７ ｓｇＲＮＡの可変配列である。
配列番号８３は、別のＰＰＯ７ ｓｇＲＮＡの可変配列である。
配列番号８４は、別のＰＰＯ７ ｓｇＲＮＡの可変配列である。
配列番号８５は、別のＰＰＯ７ ｓｇＲＮＡの可変配列である。
配列番号８６は、別のＰＰＯ７ ｓｇＲＮＡの可変配列である。
配列番号８７は、別のＰＰＯ７ ｓｇＲＮＡの可変配列である。
配列番号８８は、別のＰＰＯ７ ｓｇＲＮＡの可変配列である。
配列番号８９は、別のＰＰＯ７ ｓｇＲＮＡの可変配列である。
配列番号９０は、別のＰＰＯ８ ｓｇＲＮＡの可変配列である。
配列番号９１は、別のＰＰＯ８ ｓｇＲＮＡの可変配列である。
配列番号９２は、別のＰＰＯ８ ｓｇＲＮＡの可変配列である。
配列番号９３は、別のＰＰＯ８ ｓｇＲＮＡの可変配列である。
配列番号９４は、別のＰＰＯ９ ｓｇＲＮＡの可変配列である。
配列番号９５は、別のＰＰＯ９ ｓｇＲＮＡの可変配列である。
配列番号９６は、別のＰＰＯ９ ｓｇＲＮＡの可変配列である。
配列番号９７は、別のＰＰＯ９ ｓｇＲＮＡの可変配列である。
配列番号９８は、ｓｇＲＮＡの可変配列と共に使用したスカフォールドである。
配列番号９９は、ＰＡＭ部位を含むＰＰＯ８ ｓｇＲＮＡ ｓｇ８５２の可変配列である。
配列番号１００は、ＰＡＭ部位を含むＰＰＯ８ ｓｇＲＮＡ ｓｇ８５３の可変配列である。
配列番号１０１は、ＰＡＭ部位を含む別のＰＰＯ１ ｓｇＲＮＡの可変配列である。
配列番号１０２は、ＰＡＭ部位を含む別のＰＰＯ１ ｓｇＲＮＡの可変配列である。
配列番号１０３は、ＰＡＭ部位を含む別のＰＰＯ１ ｓｇＲＮＡの可変配列である。
配列番号１０４は、ＰＡＭ部位を含む別のＰＰＯ２ ｓｇＲＮＡの可変配列である。
配列番号１０５は、ＰＡＭ部位を含む別のＰＰＯ２ ｓｇＲＮＡの可変配列である。
配列番号１０６は、ＰＡＭ部位を含む別のＰＰＯ２ ｓｇＲＮＡの可変配列である。
配列番号１０７は、ＰＡＭ部位を含む別のＰＰＯ３ ｓｇＲＮＡの可変配列である。
配列番号１０８は、ＰＡＭ部位を含む別のＰＰＯ３ ｓｇＲＮＡの可変配列である。
配列番号１０９は、ＰＡＭ部位を含むＰＰＯ７ ｓｇＲＮＡの可変配列である。
配列番号１１０は、ＰＡＭ部位を含むＰＰＯ７ ｓｇＲＮＡの可変配列である。
配列番号１１１は、ＰＡＭ部位を含むＰＰＯ７ ｓｇＲＮＡの可変配列である。
配列番号１１２は、ＰＡＭ部位を含むＰＰＯ７ ｓｇＲＮＡの可変配列である。
配列番号１１３は、ＰＡＭ部位を含むＰＰＯ７ ｓｇＲＮＡの可変配列である。
配列番号１１４は、ＰＡＭ部位を含むＰＰＯ７ ｓｇＲＮＡの可変配列である。
配列番号１１５は、ＰＡＭ部位を含む別のＰＰＯ８ ｓｇＲＮＡの可変配列である。
配列番号１１６は、ＰＡＭ部位を含む別のＰＰＯ８ ｓｇＲＮＡの可変配列である。
配列番号１１７は、ＰＡＭ部位を含む別のＰＰＯ８ ｓｇＲＮＡの可変配列である。
配列番号１１８は、ＰＡＭ部位を含む別のＰＰＯ８ ｓｇＲＮＡの可変配列である。
配列番号１１９は、ＰＡＭ部位を含む別のＰＰＯ９ ｓｇＲＮＡの可変配列である。
配列番号１２０は、ＰＡＭ部位を含む別のＰＰＯ９ ｓｇＲＮＡの可変配列である。
配列番号１２１は、ＰＡＭ部位を含む別のＰＰＯ９ ｓｇＲＮＡの可変配列である。
配列番号１２２は、ＰＡＭ部位を含む別のＰＰＯ９ ｓｇＲＮＡの可変配列である。
配列番号１２３は、ＰＰＯ１における遺伝子編集イベントを検出するためのフォワードプライマーである。配列番号１２４は、ＰＰＯ１における遺伝子編集イベントを検出するためのリバースプライマーである。
配列番号１２５は、ＰＰＯ２における遺伝子編集イベントを検出するためのフォワードプライマーである。
配列番号１２６は、ＰＰＯ２における遺伝子編集イベントを検出するためのリバースプライマーである。
配列番号１２７は、ＰＰＯ３における遺伝子編集イベントを検出するためのフォワードプライマーである。
配列番号１２８は、ＰＰＯ３における遺伝子編集イベントを検出するためのリバースプライマーである。
配列番号１２９は、ＰＰＯ８における遺伝子編集イベントを検出するためのフォワードプライマーである。
配列番号１３０は、ＰＰＯ８における遺伝子編集イベントを検出するためのリバースプライマーである。
配列番号１３１は、ＰＰＯ９における遺伝子編集イベントを検出するためのフォワードプライマーである。
配列番号１３２は、ＰＰＯ９における遺伝子編集イベントを検出するためのリバースプライマーである。
配列番号１３３は、Ｃａｓ９が存在しないことを確認するために使用したプライマー１６８４である。
配列番号１３４は、Ｃａｓ９が存在しないことを確認するために使用したプライマー１６８５である。
配列番号１３５は、Ｃａｓ９が存在しないことを確認するために使用したプライマー１６８６である。
配列番号１３６は、Ｃａｓ９が存在しないことを確認するために使用したプライマー１６８７である。
配列番号１３７は、骨格が存在しないことを確認するために使用したプライマー１５６３である。
配列番号１３８は、骨格が存在しないことを確認するために使用したプライマー１５６４である。
配列番号１３９は、骨格が存在しないことを確認するために使用したプライマー１５６５である。
配列番号１４０は、骨格が存在しないことを確認するために使用したプライマー１５６６である。
配列番号１４１は、骨格が存在しないことを確認するために使用したプライマー１５６７である。
配列番号１４２は、骨格が存在しないことを確認するために使用したプライマー１５６８である。
配列番号１４３は、骨格が存在しないことを確認するために使用したプライマー１５６９である。
配列番号１４４は、骨格が存在しないことを確認するために使用したプライマー１５７０である。
配列番号１４５は、骨格が存在しないことを確認するために使用したプライマー１５７１である。
配列番号１４６は、骨格が存在しないことを確認するために使用したプライマー１５７２である。
配列番号１４７は、骨格が存在しないことを確認するために使用したプライマー１５７３である。
配列番号１４８は、骨格が存在しないことを確認するために使用したプライマー１５７４である。
配列番号１４９は、骨格が存在しないことを確認するために使用したプライマー１５７５である。
配列番号１５０は、骨格が存在しないことを確認するために使用したプライマー１５７６である。
配列番号１５１は、バナナ由来のＰＰＯ１遺伝子配列である（アクセッション番号Ｍａ０６＿３１０８０）。
配列番号１５２は、バナナ由来のＰＰＯ２遺伝子配列である（アクセッション番号Ｍａ０７＿０３５４０）。
配列番号１５３は、バナナ由来のＰＰＯ３遺伝子配列である（アクセッション番号Ｍａ０７＿０３６５０）。
配列番号１５４は、バナナ由来のＰＰＯ４遺伝子配列である（アクセッション番号Ｍａ０８＿０９１５０）。
配列番号１５５は、バナナ由来のＰＰＯ５遺伝子配列である（アクセッション番号Ｍａ０８＿０９１６０）。
配列番号１５６は、バナナ由来のＰＰＯ６遺伝子配列である（アクセッション番号Ｍａ０８＿０９１７０）。
配列番号１５７は、バナナ由来のＰＰＯ７遺伝子配列である（アクセッション番号Ｍａ０８＿０９１８０）。
配列番号１５８は、バナナ由来のＰＰＯ８遺伝子配列である（アクセッション番号Ｍａ０８＿３４７４０）。
配列番号１５９は、バナナ由来のＰＰＯ９遺伝子配列である（アクセッション番号Ｍａ１０＿２０５１０）。
配列番号１６０は、コムギＴａＵ６プロモータである。
配列番号１６１は、図３からのＭａ１０＿ｐ２０５１０－ＰＰＯ９である。
配列番号１６２は、図３からのＭａ０８＿ｐ０９１８０－ＰＰＯ７である。
配列番号１６３は、図３からのＭａ０８＿ｐ０９１７０－ＰＰＯ６である。
配列番号１６４は、図３からのＭａ０８＿ｐ０９１５０－ＰＰＯ４である。
配列番号１６５は、図３からのＭａ０８＿ｐ０９１６０－ＰＰＯ５である。
配列番号１６６は、図３からのＧＰＯ３＿２１＿ＵＳ９５８０７２３Ｂ２＿２１である。
配列番号１６７は、図３からのＰＰＯ３＿ＢＡＡ２１６７６である。
配列番号１６８は、図３からのＡＰＯ５＿ＡＡＡ６９９０２である。
配列番号１６９は、図３からのＰＰＯ７＿ＢＡＡ２１６７７である。
配列番号１７０は、図３からのＭａ０６＿ｐ３１０８０－ＰＰＯ１である。
配列番号１７１は、図３からのＭａ０７＿ｐ０３６５０－ＰＰＯ３である。
配列番号１７２は、図３からのＭａ０７＿ｐ０３５４０－ＰＰＯ２である。
配列番号１７３は、図３からのＭａ０８＿ｐ３４７４０－ＰＰＯ８である。
配列番号１７４は、図６からのＭａ０７＿ｇ０３５４０－ＰＰＯ２－ＷＴである。
配列番号１７５は、Ｍａ０７＿ｇ０３４５０－ＰＰＯ２－ＧＥ－プール－胚である。
配列番号１７６は、ＰＡＭ部位を含むＰＰＯ１ ｓｇＲＮＡ ｓｇ８５７の可変配列である。
配列番号１７７は、ＰＰＯ１変異体タンパク質配列である。
配列番号１７８は、ＰＰＯ１変異体コード配列である。
配列番号１７９は、ＰＰＯ１変異体遺伝子配列である。
配列番号１８０～配列番号２２５は、ＰＡＭ部位を含まない表８に提供されているｓｇＲＮＡである。

【0021】

発明を実施するための形態
本発明は、バナナに存在する９つのポリフェノールオキシダーゼ（ＰＰＯ）遺伝子（本発明者らがＰＰＯ１～ＰＰＯ９と命名）があり、そのうちのほとんどがこれまでＰＰＯ遺伝子として同定されていなかったという知見に一部基づいている。本発明は更に、同定されたＰＰＯのうちのいくつか、特にポリフェノールオキシダーゼ１（ＰＰＯ１）、ポリフェノールオキシダーゼ２（ＰＰＯ２）、ポリフェノールオキシダーゼ８（ＰＰＯ８）、ポリフェノールオキシダーゼ９（ＰＰＯ９）、及びポリフェノールオキシダーゼ４（ＰＰＯ４）が、バナナ果実の果肉及び／又は果皮で発現するが、他の組織、特に胚組織又は胚細胞懸濁液（ＥＣＳ）では発現が低いか又は発現しないことを特徴とするという知見に一部基づいている。理論にも機序にも束縛されることを望むものではないが、本発明の幾つかの実施形態によれば、バナナ植物におけるＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ８、ＰＰＯ９、及び／又はＰＰＯ４のレベル又は活性を低下させると、他の植物部位において望ましくない影響を引き起こすことなく、バナナ果実の果肉及び／又は果皮の褐変が遅延又は防止される。幾つかの実施形態によれば、本発明は、バナナ果実の褐変を遅延又は防止するために、バナナ植物又はバナナ植物細胞においてＰＰＯ、特にＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ８、ＰＰＯ９、及び／又はＰＰＯ４のレベル又は活性を低下させる種々の方法を目的とする。このような方法の生成物も本発明によって提供される。

【0022】

特に、本発明は、バナナ植物又はバナナ植物細胞において、ポリフェノールオキシダーゼ遺伝子又はポリヌクレオチドによってコードされている少なくとも１つの内因性ポリフェノールオキシダーゼのレベル又は活性を低下させる方法を提供する。本発明は更に、バナナ果実及びバナナ果皮の少なくとも一方の褐変を低減及び／又は遅延させる方法を提供する。幾つかの実施形態によれば、バナナ果実の果肉及び果皮の少なくとも一方の褐変を低減及び／又は遅延させる方法であって、（例えば、少なくとも１つの内因性ＰＰＯをコードしている遺伝子の発現を低減又は喪失を誘導することにより）バナナ果実が生じるバナナ植物細胞又はバナナ植物の少なくとも１つの内因性ＰＰＯを低減又は機能喪失を誘導することを含む方法が、本明細書において提供される。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。幾つかの実施形態によれば、内因性ＰＰＯは、ＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ８、ＰＰＯ９、及び、／又はＰＰＯ４である。幾つかの実施形態によれば、ＰＰＯは、ＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ３、ＰＰＯ４、ＰＰＯ５、ＰＰＯ６、ＰＰＯ７、ＰＰＯ８、及びＰＰＯ９からなる群から選択される。

【0023】

本明細書で使用するとき、１つ以上の内因性ポリフェノールオキシダーゼの「レベル又は活性が低下する」という用語は、（ａ）バナナ植物若しくはバナナ植物細胞における１つ以上の内因性ポリフェノールオキシダーゼによって付与される褐変が遅延若しくは低減する表現型又はバナナ植物若しくはバナナ植物細胞における１つ以上の内因性ポリフェノールオキシダーゼの機能が、「野生型」のバナナ植物若しくは植物細胞と比較して低下すること；及び／又は（ｂ）バナナ植物若しくはバナナ植物細胞における１つ以上の内因性ポリフェノールオキシダーゼをコードしている遺伝子の発現レベルが、「野生型」のバナナ植物若しくは植物細胞と比較して低下することを意味する。発現レベルは、ｍＲＮＡ又はタンパク質であり得る。このような低下は、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は好ましくは１００％であり得る。幾つかの実施形態によれば、低下は、機能が完全に喪失することである。この文脈において、「野生型」とは、遺伝的背景が同じでありかつ発生段階が同等であることを意味する。幾つかの実施形態においては、本発明の方法は、該バナナ植物又はバナナ植物細胞における少なくとも１つの内因性のＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ８、ＰＰＯ９、又はＰＰＯ４のポリフェノールオキシダーゼの機能を低下させる。他の実施形態においては、方法は、該バナナ植物又はバナナ植物細胞における少なくとも１つの内因性のＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ８、ＰＰＯ９、又はＰＰＯ４のポリフェノールオキシダーゼの機能を喪失させる。幾つかの実施形態においては、本発明の方法は、該バナナ植物又はバナナ植物細胞における少なくとも１つの内因性ポリフェノールオキシダーゼの機能を低下させ、該少なくとも１つのポリフェノールオキシダーゼは、ＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ３、ＰＰＯ４、ＰＰＯ５、ＰＰＯ６、ＰＰＯ７、ＰＰＯ８、ＰＰＯ９、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。他の実施形態においては、方法は、該バナナ植物又はバナナ植物細胞における少なくとも１つの内因性ポリフェノールオキシダーゼの機能を喪失させ、該少なくとも１つのポリフェノールオキシダーゼは、ＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ３、ＰＰＯ４、ＰＰＯ５、ＰＰＯ６、ＰＰＯ７、ＰＰＯ８、ＰＰＯ９、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。

【0024】

本明細書で使用するとき、「内因性」という用語は、バナナ植物又はバナナ植物細胞のゲノムにネイティブであり、ゲノム内のネイティブな位置にあることを意味する。

【0025】

本明細書で使用するとき、「ポリフェノールオキシダーゼ」又は「ＰＰＯ」という用語は、バナナ等のほとんどの果物及び野菜を含む、植物界及び動物界全体にみられる酵素群に属する酵素を指す。これに対応して、「ポリフェノールオキシダーゼ遺伝子」又は「ＰＰＯ遺伝子」という用語は、本明細書で使用するとき、ポリフェノールオキシダーゼ又はＰＰＯをコードしている遺伝子を指す。ＰＰＯは、傷み又は圧迫によって組織が損傷した場合を含む、酵素的褐変を触媒する。果実を薄切りにしたり裏ごししたりした際に酸素に曝されることも、ＰＰＯによる酵素的褐変を引き起こす。ＰＰＯはモノフェノール及び／又はｏ－ジフェノールを基質として受け入れることが知られており、ベンゼン環が１つのヒドロキシル置換基を含有するモノフェノール分子のｏ－ジフェノール（１，２位に２つのヒドロキシル置換基を含有し、間に炭素を有しないフェノール分子）へのｏ－ヒドロキシル化を触媒することによって作用する。酵素は更に、ｏ－ジフェノールの酸化を触媒してｏ－キノンを生成することもできる。ＰＰＯはｏ－キノンの迅速な重合を触媒し、果実の褐変を引き起こす黒色、褐色、又は赤色の色素（ポリフェノール）を生成する。

【0026】

多くの植物が幾つかのＰＰＯメンバーを含んでいるが、バナナＰＰＯファミリーは今日まで特徴付けられていない。本発明者らは、バナナ（Ｍｕｓａ ａｃｕｍｉｎａｔａ ＤＨ－Ｐａｈａｎｇ）における９つの内因性ＰＰＯを同定し、「ＰＰＯ１」、「ＰＰＯ２」、「ＰＰＯ３」、「ＰＰＯ４」、「ＰＰＯ５」、「ＰＰＯ６」、「ＰＰＯ７」、「ＰＰＯ８」、及び「ＰＰＯ９」と命名した。本明細書で記載する通り、これらＰＰＯは、以下を含む種々の種のゲノムに対して複雑な系統発生解析を何度か繰り返すことによって同定された：ロブスタコーヒーノキ（Ｃｏｆｆｅａ ｃａｎｅｐｈｏｒａ）、ナツメヤシ（Ｐｈｏｅｎｉｘ ｄａｃｔｙｌｉｆｅｒａ）、ムサ・アクミナタ バンクシア（Ｍｕｓａ ａｃｕｍｉｎａｔａ ｂａｎｋｓｉａ）、ムサ・アクミナタ カルカッタ（Ｍｕｓａ ａｃｕｍｉｎａｔａ Ｃａｌｃｕｔｔａ）、ムサ・アクミナタ ＤＨバハン（Ｍｕｓａ ａｃｕｍｉｎａｔａ ＤＨ－Ｐａｈａｎｇ）、リュウキュウバショウ（Ｍｕｓａ ｂａｌｂｉｓｉａｎａ）、ムサ・イチネランス（Ｍｕｓａ ｉｔｉｎｅｒａｎｓ）、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）、リンゴ（Ｍａｌｕｓ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）、ピーマン（Ｃａｐｓｉｃｕｍ ａｎｎｕｕｍ）、ベンサミアナタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）、トマト（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）、及びイネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）。

【0027】

幾つかの実施形態においては、内因性ＰＰＯ１のレベル又は活性が低下する。幾つかの実施形態においては、内因性ＰＰＯ２の活性が低下する。幾つかの実施形態においては、内因性ＰＰＯ３のレベル又は活性が低下する。幾つかの実施形態においては、内因性ＰＰＯ４のレベル又は活性が低下する。幾つかの実施形態においては、内因性ＰＰＯ５のレベル又は活性が低下する。幾つかの実施形態においては、内因性ＰＰＯ６のレベル又は活性が低下する。幾つかの実施形態においては、内因性ＰＰＯ７のレベル又は活性が低下する。幾つかの実施形態においては、内因性ＰＰＯ８のレベル又は活性が低下する。幾つかの実施形態においては、内因性ＰＰＯ９のレベル又は活性が低下する。幾つかの実施形態においては、ＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ３、ＰＰＯ４、ＰＰＯ５、ＰＰＯ６、ＰＰＯ７、ＰＰＯ８、及びＰＰＯ９からなる群から選択される内因性ＰＰＯのうちの２つ以上のレベル又は活性が低下する。特定の実施形態においては、内因性のＰＰＯ１及びＰＰＯ２のレベル又は活性が低下する。これら実施形態のいずれにおいても、ＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ３、ＰＰＯ４、ＰＰＯ５、ＰＰＯ６、ＰＰＯ７、ＰＰＯ８、及びＰＰＯ９からなる群から選択される１つ以上の内因性ポリフェノールオキシダーゼの「レベル又は活性が低下する」という用語は、バナナ植物若しくはバナナ植物細胞においてＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ３、ＰＰＯ４、ＰＰＯ５、ＰＰＯ６、ＰＰＯ７、ＰＰＯ８、及びＰＰＯ９からなる群から選択されるこれら１つ以上の内因性ポリフェノールオキシダーゼによって付与される表現型、又はバナナ植物若しくはバナナ植物細胞におけるＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ３、ＰＰＯ４、ＰＰＯ５、ＰＰＯ６、ＰＰＯ７、ＰＰＯ８、及びＰＰＯ９からなる群から選択される１つ以上の内因性ポリフェノールオキシダーゼの機能が、野生型のバナナ植物若しくは植物細胞と比較して低下するか又は完全に失われることを意味する。

【0028】

本明細書の実施形態のいずれかにおける内因性ＰＰＯ遺伝子は、ポリヌクレオチド配列に対して「配列同一性」又は相同性を有すると記載され得る。相同性又は配列同一性の量は変化し得、約１～２０ｂｐ、約２０～５０ｂｐ、約５０～１００ｂｐ、約７５～１５０ｂｐ、約１００～２５０ｂｐ、約１５０～３００ｂｐ、約２００～４００ｂｐ、約２５０～５００ｂｐ、約３００～６００ｂｐ、約３５０～７５０ｂｐ、約４００～８００ｂｐ、約４５０～９００ｂｐ、約５００～１０００ｂｐ、約６００～１２５０ｂｐ、約７００～１５００ｂｐ、約８００～１７５０ｂｐ、約９００～２０００ｂｐ、約１～２．５ｋｂ、約１．５～３ｋｂ、約２～４ｋｂ、約２．５～５ｋｂ、約３～６ｋｂ、約３．５～７ｋｂ、約４～８ｋｂ、約５～１０ｋｂ、又は内因性ＰＰＯの遺伝子配列若しくはポリヌクレオチド配列の全長以下の範囲の単位整数値を有する全長及び／又は領域を含む。これら範囲には、範囲内の全ての整数が含まれ、例えば、１～２０ｂｐの範囲には、１ｂｐ、２ｂｐ、３ｂｐ、４ｂｐ、５ｂｐ、６ｂｐ、７ｂｐ、８ｂｐ、９ｂｐ、１０ｂｐ、１１ｂｐ、１２ｂｐ、１３ｂｐ、１４ｂｐ、１５ｂｐ、１６ｂｐ、１７ｂｐ、１８ｂｐ、１９ｂｐ、及び２０ｂｐが含まれる。相同性又は配列同一性の量はまた、２つの遺伝子又は２つのポリヌクレオチドのアラインされた全長にわたる配列同一性パーセントによって記述することもでき、これには少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性パーセントが含まれる。十分な相同性には、ポリヌクレオチドの長さ、グローバルな配列同一性パーセント、及び任意で、連続するヌクレオチドの保存領域又はローカルな配列同一性パーセントの任意の組み合わせが含まれる。例えば、十分な相同性は、内因性ＰＰＯの遺伝子配列又はポリヌクレオチド配列の領域と少なくとも８０％の配列同一性を有する７５～１５０ｂｐの領域として記述することができる。十分な相同性はまた、２つの遺伝子又はポリヌクレオチドが高ストリンジェンシー条件下で特異的にハイブリダイズする予測能力によって記述することもできる。これに関しては、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ（１９９４）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，（Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）；及びＴｉｊｓｓｅｎ（１９９３）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ－Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ，（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照。

【0029】

本発明の特定の実施形態においては、ＰＰＯ１遺伝子は、配列番号５に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するコード配列を含むポリヌクレオチド配列を指す；ＰＰＯ２遺伝子は、配列番号６に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するコード配列を含むポリヌクレオチド配列を指す；ＰＰＯ３遺伝子は、配列番号７に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するコード配列を含むポリヌクレオチド配列を指す；ＰＰＯ４遺伝子は、配列番号８に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するコード配列を含むポリヌクレオチド配列を指す；ＰＰＯ５遺伝子は、配列番号９に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するコード配列を含むポリヌクレオチド配列を指す；ＰＰＯ６遺伝子は、配列番号１０に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するコード配列を含むポリヌクレオチド配列を指す；ＰＰＯ７遺伝子は、配列番号１１に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するコード配列を含むポリヌクレオチド配列を指す；ＰＰＯ８遺伝子は、配列番号１２に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するコード配列を含むポリヌクレオチド配列を指す；又はＰＰＯ９遺伝子は、配列番号１３に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するコード配列を含むポリヌクレオチド配列を指す。本発明の特定の実施形態においては、本発明のＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ８、又はＰＰＯ９のポリフェノールオキシダーゼ遺伝子は、配列番号５（ＰＰＯ１）又は配列番号５に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；配列番号６（ＰＰＯ２）又は配列番号６に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；配列番号１２（ＰＰＯ８）又は配列番号１２に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；及び配列番号１３（ＰＰＯ９）又は配列番号１３に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドからなる群から選択されるコード配列を含む。

【0030】

本発明の特定の実施形態においては、ＰＰＯ１遺伝子は、配列番号４０に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するポリフェノールオキシダーゼをコードしているポリヌクレオチド配列を指す；ＰＰＯ２遺伝子は、配列番号４１に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するポリフェノールオキシダーゼをコードしているポリヌクレオチド配列を指す；ＰＰＯ３遺伝子は、配列番号４２に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するポリフェノールオキシダーゼをコードしているポリヌクレオチド配列を指す；ＰＰＯ４遺伝子は、配列番号４３に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するポリフェノールオキシダーゼをコードしているポリヌクレオチド配列を指す；ＰＰＯ５遺伝子は、配列番号４４に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するポリフェノールオキシダーゼをコードしているポリヌクレオチド配列を指す；ＰＰＯ６遺伝子は、配列番号４５に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するポリフェノールオキシダーゼをコードしているポリヌクレオチド配列を指す；ＰＰＯ７遺伝子は、配列番号４６に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するポリフェノールオキシダーゼをコードしているポリヌクレオチド配列を指す；ＰＰＯ８遺伝子は、配列番号４７に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するポリフェノールオキシダーゼをコードしているポリヌクレオチド配列を指す；又はＰＰＯ９遺伝子は、配列番号４８に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するポリフェノールオキシダーゼをコードしているポリヌクレオチド配列を指す。本発明の特定の実施形態においては、本発明のＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ８、又はＰＰＯ９のポリフェノールオキシダーゼ遺伝子は、配列番号４０（ＰＰＯ１）又は配列番号４０に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；配列番号４１（ＰＰＯ２）又は配列番号４１に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；配列番号４７（ＰＰＯ８）又は配列番号４７に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；及び配列番号４８（ＰＰＯ９）又は配列番号４８に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチドからなる群から選択されるポリフェノールオキシダーゼをコードしている。

【0031】

本発明の特定の実施形態においては、ＰＰＯ１遺伝子は、配列番号１５１に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド配列を指す；ＰＰＯ２遺伝子は、配列番号１５２に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド配列を指す；ＰＰＯ３遺伝子は、配列番号１５３に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド配列を指す；ＰＰＯ４遺伝子は、配列番号１５４に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド配列を指す；ＰＰＯ５遺伝子は、配列番号１５５に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド配列を指す；ＰＰＯ６遺伝子は、配列番号１５６に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド配列を指す；ＰＰＯ７遺伝子は、配列番号１５７に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド配列を指す；ＰＰＯ８遺伝子は、配列番号１５８に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド配列を指す；又はＰＰＯ９遺伝子は、配列番号１５９に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド配列を指す。本発明の特定の実施形態においては、本発明のＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ８、又はＰＰＯ９のポリフェノールオキシダーゼ遺伝子は、配列番号１５１（ＰＰＯ１）又は配列番号１５１に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；配列番号１５２（ＰＰＯ２）又は配列番号１５２に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；配列番号１５８（ＰＰＯ８）又は配列番号１５８に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；及び配列番号１５９（ＰＰＯ９）又は配列番号１５９に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。

【0032】

本明細書において特定の配列に言及する場合、これらはまた、塩基置換、塩基欠失、若しくは塩基付加をもたらす、例えば、シーケンシングエラー、クローニングエラー、又は他の改変に起因する小さな配列多様性を含むものとして、その相補配列に実質的に対応する配列も包含し得るが、ただし、そのような多様性の頻度は、５０ヌクレオチドに１ヌクレオチド未満、或いは１００ヌクレオチドに１ヌクレオチド未満、或いは２００ヌクレオチドに１ヌクレオチド未満、或いは５００ヌクレオチドに１ヌクレオチド未満、或いは１０００ヌクレオチドに１ヌクレオチド未満、或いは５，０００ヌクレオチドに１ヌクレオチド未満、或いは１０，０００ヌクレオチドに１ヌクレオチド未満である。

【0033】

本明細書に開示される任意の配列識別番号（配列番号）は、その配列番号がＤＮＡ配列形式又はＲＮＡ配列形式でしか表現されていない場合であっても、その配列番号に言及する文脈に応じてＤＮＡ配列又はＲＮＡ配列のいずれを参照することもできる。例えば、所与の配列番号はＤＮＡ配列形式で表されるが（例えば、チミンのＴが記載されている）、所与の核酸配列に対応するＤＮＡ配列又はＲＮＡ分子の核酸配列のＲＮＡ配列のいずれを参照することもできる。同様に、一部の配列はＲＮＡ配列形式で表されるが（例えば、ウラシルのＵが記載されている）、記載されている分子の実際の種類に応じて、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を構成するＲＮＡ分子の配列又は示されているＲＮＡ配列に対応するＤＮＡ分子の配列のいずれを参照することもできる。いずれにしても、任意の置換を有する開示されている配列を有するＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子の両方が想定される。

【0034】

タンパク質に関して配列同一性パーセントを用いる場合、同一ではない残基の位置は、保存的アミノ酸置換によって異なることが多く、ここでアミノ酸残基は化学的特性（例えば、電荷又は疎水性）が類似している他のアミノ酸残基に置換されるので分子の機能的特性が変化しない。保守的置換で配列が異なる場合、置換の保存的な性質を補正するために、配列同一性パーセントを上方に調整してよい。このような保存的置換によって異なる配列は、「配列類似性」又は「類似性」を有するとみなされる。この調整を行うための手段は、当業者に周知である。典型的には、保守的置換を完全なミスマッチではなく部分的なミスマッチとしてスコアリングして、配列同一性パーセントを高めることを含む。従って、例えば、同一アミノ酸にスコア１が与えられ、非保存的置換にスコア０が与えられる場合、保存的置換には０と１との間のスコアが与えられる。保守的置換のスコアリングは、例えば、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ Ｓ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ＪＧ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９９２，８９（２２）：１０９１５－９のアルゴリズムに従って計算される。同一性は、デフォルトのパラメータを使用すること等によって、例えば、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）の「ＢｌａｓｔＮ」ソフトウェアを含む任意の相同性比較ソフトウェアを用いて求めることができる。幾つかの実施形態においては、同一性は、グローバルな同一性、すなわち、核酸配列全体にわたる同一性であり、その一部にわたる同一性ではない。

【0035】

本明細書で使用するとき、「植物」という用語は、植物全体、接ぎ木された植物、植物の祖先及び後代、植物器官、植物組織、及び「植物部位」を指す。本明細書で使用するとき、「植物部位」には、根（塊茎を含む）、台木、茎、若枝、シュート、果実、葉、花粉、種子、腫瘍組織、並びに種々の形態の細胞及び培養物（例えば、単細胞、プロトプラスト、胚、胚細胞、及びカルス組織）を含むがこれらに限定されない分化組織及び未分化組織が含まれる。植物組織は、植物体、又は植物の器官、組織、若しくは細胞培養物におけるものであってよい。

【0036】

特定の実施形態においては、植物部位は果実である。果実は、果肉及び果皮等の組織を含む。他の実施形態においては、植物部位は種子である。本明細書で使用するとき、「種子」という用語は、別のそのような植物に発育することができる顕花植物の生殖単位を指す。「植物器官」という用語は、植物の形態的及び機能的に異なる部分を構成する植物の組織又は組織群を指す。「ゲノム」という用語は、生物、若しくはウイルス、若しくはオルガネラの各細胞に存在する遺伝物質（遺伝子及び非コード配列）の相補体全体、及び／又は片親から（ハプロイド）単位として遺伝した完全な染色体セットを指す。「後代」とは、植物の任意の後続世代を含む。

【0037】

「トランスジェニック植物」には、例えば、形質転換工程によって導入された異種ポリヌクレオチドをそのゲノム内に含む植物が含まれる。異種ポリヌクレオチドは、そのポリヌクレオチドが後に続く世代に受け継がれるように、ゲノム内に安定的に組み込まれ得る。異種ポリヌクレオチドは、単独で又は組換えＤＮＡコンストラクトの一部としてゲノムに組み込まれ得る。トランスジェニック植物はまた、そのゲノム内に１種を超える異種ポリヌクレオチドを含んでいてもよい。各異種ポリヌクレオチドは、トランスジェニック植物に異なる形質を付与することができる。

【0038】

本明細書で使用するとき、「異種」ポリヌクレオチドは、外来種に由来する配列を含む。

【0039】

「トランスジェニック」には、異種核酸の存在によって遺伝子型が変化した任意の細胞、細胞株、カルス、組織、植物部位、又は植物が含まれ得、最初にそのように変化したトランスジェニックだけでなく、最初のトランスジェニックから有性交配又は無性繁殖によって作出されたものも含まれる。一部の植物では、植物ゲノムに導入された異種ポリヌクレオチドは、育種を通して除去することができる。このプロセスは、前述のようにバナナでは不可能である。

【0040】

幾つかの実施形態によれば、本明細書に記載のバナナ細胞、バナナ植物、又はバナナ植物部位は、非トランスジェニックである。幾つかの実施形態によれば、本明細書に開示される方法からは、非トランスジェニックであるバナナ細胞、バナナ植物、又はバナナ植物細胞が得られる。

【0041】

従来の植物育種法、本明細書に記載のゲノム編集手順（外来ポリヌクレオチドを挿入させない）、又はランダム交雑、非組換えウイルス感染、非組換え細菌形質転換、非組換え転位、若しくは偶発変異等の天然に発生する事象によるゲノム（染色体又は染色体外）の改変は、トランスジェニックとみなされるとは意図されない。

【0042】

特定の実施形態においては、稔性植物とは、生存可能な雄性及び雌性の配偶子を生産しかつ自家稔性である植物である。このような自家稔性植物は、任意の他の植物の配偶子及びその中に含まれる遺伝物質からの寄与なしに後代植物を生産することができる。他の実施形態は、自家稔性ではない植物の使用も含み得るが、その理由は、その植物が生存可能な又はそうでなければ受精可能な雄性配偶子若しくは雌性配偶子、又はその両方を生産しないためである。本明細書で使用するとき、「雄性不稔植物」とは、生存可能な又はそうでなければ受精可能な雄性配偶子を生産しない植物である。本明細書で使用するとき、「雌性不稔植物」とは、生存可能な又はそうでなければ受精可能な雌性配偶子を生産しない植物である。雄性不稔植物及び雌性不稔植物は、それぞれ雌性稔性及び雄性稔性であり得る。雄性稔性（であるが雌性不稔）植物は、雌性稔性植物と交配すると生存可能な後代を生産することができ、雌性稔性（であるが雄性不稔）植物は、雄性稔性植物と交配すると生存可能な後代を生産することができる。

【0043】

本明細書で使用するとき、「バナナ植物」という用語は、プランテンを含むムサ属の植物を指す。これらには、ムサ・アクミナタ（例えば、ムサ・アクミナタ バンクシア、ムサ・アクミナタ カルカッタ、及びムサ・アクミナタ ＤＨバハン）、リュウキュウバショウ、ムサ・イチネランス、及び同質三倍体ムサ・アクミナタ「キャベンディッシュ」及び「グロス・ミチェル」が含まれる。特定の実施形態によれば、バナナは、同質三倍体ムサ・アクミナタ「キャベンディッシュ」である。栽培されているバナナは、祖先種であるムサ・アクミナタ（ゲノムＡＡ）に由来する不燃性同質三倍体（ＡＡＡ）である。更に、プランテン（ＡＡＢ又はＡＢＢ）は、ムサ・アクミナタ（ＡＡ）及びリュウキュウバショウ（ゲノムＢＢ）の雑種形成に由来する不稔性の種間同質三倍体である。栽培されているバナナ及びプランテンは三倍体であるため生存可能な種子を生産することができないが、野生種は二倍体であるため生存可能な種子を生産することができる。特定の実施形態においては、バナナ植物は三倍体である。二倍体及び四倍体を含む他の倍数体も企図される。

【0044】

幾つかの実施形態においては、「バナナ植物」は、エリート系統若しくは純粋系統等のバナナ育種系統、又はバナナの品種若しくは育種遺伝資源である。本明細書で使用するとき、「育種系統」という用語は、野生品種又は在来種とは対照的に、商業的に価値のある又は農業的に望ましい特徴を有する栽培バナナの系統を指す。この用語は「エリート育種系統」又は「エリート系統」への言及を含むが、これは商業的なＦ_１雑種を作出するために使用される本質的にホモ接合体、通常は近交系の植物系統を表す。「エリート育種系統」は、多くの農学的に望ましい形質を含む優れた農学的性能についての育種及び選抜によって得られる。「エリート植物」は、エリート系統の任意の植物である。優れた農学的性能とは、本明細書で定義する農学的に望ましい形質の望ましい組み合わせを指し、エリート育種系統では、非エリート育種系統と比較して農学的に望ましい形質の大部分、好ましくは全てが改善されていることが望ましい。エリート育種血統は、本質的にホモ接合体であり、好ましくは近交系である。本明細書で使用するとき、「エリート系統」という用語は、優れた農学的性能について育種及び選抜された結果得られた任意の系統を指す。

【0045】

本明細書では、「栽培品種」及び「品種」という用語は互換的に使用され、商業化、例えば自家消費又は商業化のための農産物を生産するために農家及び生産者が使用する目的で、例えば交配及び選抜等の育種によって意図的に開発された植物を意味する。「育種遺伝資源」という用語は、「野生」状態以外の生物学的状態を有する植物を意味し、この「野生」状態は、植物又は遺伝系統の元の非栽培状態、すなわち自然状態を示す。

【0046】

「育種遺伝資源」という用語には、半自然、半野生、雑草、伝統的な栽培品種、在来種、育種材料、研究材料、育種家の系統、合成集団、雑種、創始者株／基本集団、近交系（雑種栽培品種の親）、分離集団、変異体／遺伝材料、市場クラス及び先進／改良された栽培品種が含まれるが、これらに限定されない。本明細書で使用するとき、「純粋種」、「純粋近交系」、又は「近交系」という用語は互換的であり、自殖及び／又は戻し交配を繰り返すことによって得られる実質的にホモ接合体の植物又は植物系統を指す。

【0047】

本明細書で使用するとき、「バナナ植物細胞」という用語は、バナナ植物の細胞である。バナナ植物細胞には、種子、懸濁培養物、胚、分裂組織領域、カルス組織、葉、根、シュート、配偶体、胞子体、花粉、小胞子、胚形成細胞、体細胞、及びプロトプラスト等からの細胞が含まれる。プロトプラストは、根、葉、胚細胞懸濁液、カルス、又は実生組織等であるがこれらに限定されない任意の植物組織に由来し得る。幾つかの実施形態によれば、バナナ植物細胞は、胚細胞懸濁液（ＥＣＳ）の細胞である。

【0048】

幾つかの実施形態においては、本発明の方法は、該少なくとも１つの内因性ポリフェノールオキシダーゼ（ＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ３、ＰＰＯ４、ＰＰＯ５、ＰＰＯ６、ＰＰＯ７、ＰＰＯ８、及びＰＰＯ９からなる群から選択される）のレベル若しくは活性が低下していないバナナ植物の果肉及び／若しくは果皮と比較して該バナナ植物の果肉及び／若しくは果皮の褐変を遅延させる；並びに／又は該少なくとも１つの内因性ポリフェノールオキシダーゼ（ＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ３、ＰＰＯ４、ＰＰＯ５、ＰＰＯ６、ＰＰＯ７、ＰＰＯ８、及びＰＰＯ９からなる群から選択される）のレベル又は活性が低下していないバナナ植物の果肉及び／若しくは果皮と比較して該バナナ植物の果肉及び／若しくは果皮の褐変を低減する。幾つかの実施形態においては、本発明の方法は、ＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ８、ＰＰＯ９、及びＰＰＯ４から選択される少なくとも１つの内因性ポリフェノールオキシダーゼのレベル又は活性が低下又は喪失しているバナナ植物由来のバナナ果実の果肉及び／又は果皮の褐変を遅延及び／又は低減する。幾つかの実施形態においては、本発明の方法は、ＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ８、ＰＰＯ９、及びＰＰＯ４から選択される少なくとも１つの内因性ポリフェノールオキシダーゼ遺伝子の発現が低下又は喪失しているバナナ植物由来のバナナ果実の果肉及び／又は果皮の褐変を遅延及び／又は低減する。

【0049】

この文脈において、バナナ果実の果肉及び／又はバナナ果実の果皮の「褐変」は、目視検査及び当技術分野で公知の他の方法によって測定することができる。

【0050】

幾つかの実施形態においては、「褐変」は、果皮の色に基づいて測定される。このような実施形態においては、野生型バナナ果実の果皮の特定の色（例えば、緑色、部分的に緑色、黄色、褐色等）が、花の出現から経過した日数と相関し得るように、褐変指数が構築される。このような指標を用いれば、特定の日の果皮の色を目視評価することで、褐変の遅延の指標を提供することができる（例えば、野生型バナナは花の出現から特定の日数で褐色になるが、ＰＰＯ遺伝子が遺伝的に編集されたバナナは花の出現から同じ日数後に黄色である場合）（“Ｄｏｌｅ Ｒｅｔａｉｌ Ｂａｎａｎａ Ｒｉｐｅｎｉｎｇ Ｇｕｉｄｅ”，ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｄｏｌｅｎｚ．ｃｏ．ｎｚ／ｕｐｌｏａｄｓ／ｍｅｄｉａ／５９２３６０８２０４８ａ９／ｂａｎａｎａ－ｔｒａｄｅ－ｓｅｃｔｉｏｎ－ｗｅｂ．ｐｄｆ及びＧｏｏｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ ｏｆ ｂａｎａｎａ ｆｒｕｉｔ ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ ｏｘｉｄａｓｅ”，Ｐｌａｎｔａ，Ｓｅｐ ２００１；１２３（５）：７４８－５７）。これは、花の出現後約６０～９０日で果実が成熟するという事実に基づいている。バナナの果実は、早ければ４０日ほどで、濃い褐色になる（ステージ１０）まで収穫される。花の出現後約９０日間でステージ１０に達すると予測される。果実の色は、例えば「Ｄｏｌｅ Ｒｅｔａｉｌ Ｂａｎａｎａ Ｒｉｐｅｎｉｎｇ Ｇｕｉｄｅ」に定義されている色の説明に基づいて、１０段階全てにおいて目視評価される。ステージ１とは、房の全ての果指が緑色の果皮を有するときであるが、ステージ７では、房の全ての果指が黄色の斑点を有し、果皮が褐色であり、ステージ１０では、房の全ての果指が濃褐色の果皮を有する。色の尺度を標準化するためにＤＰ－３０１データプロセッサーを備えるＭｉｎｏｌｔａ Ｃｈｒｏｍａ Ｍｅｔｅｒ ＣＲ ４００又はＭｉｎｏｌｔａ ＣＲ－３００ Ｃｈｒｏｍａ Ｍｅｔｅｒで比色座標を取る。ＣＲ－３００の測定ヘッドは、拡散照明／０°視野形状（鏡面反射性成分を含む）を使用して、Ｂｒｕｎｏ Ｂｏｎｎｅｔ，Ｃ．，Ｈｕｂｅｒｔ，Ｏ．，Ｍｂｅｇｕｉｅ－Ａ－Ｍｂｅｇｕｉｅ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｈａｒｖｅｓｔ ｓｔａｇｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｏａｃｔｉｖｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｉｎ Ｃａｖｅｎｄｉｓｈ ｂａｎａｎａｓ．Ｊ．Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ｕｎｉｖ．Ｓｃｉ．Ｂ１４，２７０－２７８（２０１３）に記載の通り、拡散照明条件下で見たときの色とよく相関する多種多様な表面の測定値を提供する。これにより、果実の各発育段階（１～１０）における反射色を測定することができ、これらデータは、果皮の色を果実の成熟及び褐変と相関させるためのものである。

【0051】

幾つかの実施形態においては、「褐変」は、薄切りにして裏ごししたバナナの果肉の経時的（０～１８０時間）目視評価を利用したバナナ褐変ガイドに基づいて測定される。このような実施形態においては、段階３から１０（上記参照）を表すバナナの房から３本の果指を採取し、果皮を０．２％次亜塩素酸ナトリウムで５分間（褐変を引き起こす可能性のある機械的損傷を避けるために）穏やかに洗浄する。次に、皮をむき、小片に切断し、電気ミキサー又はフードプロセッサーでホモジナイズした後、各個々のバナナの果指からバナナピューレを調製する。得られたピューレをペトリ皿に注ぎ、０分、１５分、３０分、６０分、及び１２０分後、そして２４時間、４８時間、及び７２時間後に画像を撮影する。更に、バナナをスライスし、ペトリ皿に置き、カラーステージ３及び４のバナナ房については、０時間、１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、及び７２時間後の画像を撮影する。ステージ５から１０のバナナの果指については、０時間から１８０時間まで８時間ごとにバナナスライスの画像を撮影する（約２２時点）（Ｃｈｉ，Ｍ．，Ｂｈａｇｗａｔ，Ｂ．，Ｌａｎｅ，Ｗ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．Ｒｅｄｕｃｅｄ ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ ｏｘｉｄａｓｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｂｒｏｗｎｉｎｇ ｉｎ ｐｏｔａｔｏ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ Ｌ．）ｗｉｔｈ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ．ＢＭＣ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌ １４，６２（２０１４）．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１８６／１４７１－２２２９－１４－６２及びＥｓｃａｌａｎｔｅ－Ｍｉｎａｋａｔａ，Ｐ．，Ｉｂａｒｒａ－Ｊｕｎｑｕｅｒａ，Ｖ．，Ｏｒｎｅｌａｓ－Ｐａｚ，Ｊ．ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｔｈｅ ｂａｎａｎａ ｐｕｌｐ ｂｒｏｗｎｉｎｇ ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ ‘Ｇｉａｎｔ Ｄｗａｒｆ’ ａｎｄ ＦＨＩＡ－２３ ｄｕｒｉｎｇ ｆｒｕｉｔ ｒｉｐｅｎｉｎｇ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｉｍａｇｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ ｏｘｉｄａｓｅ ａｎｄ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．３ Ｂｉｏｔｅｃｈ ８，３０（２０１８）を参照）。画像の色を褐変に相関させるために画像を処理する。色は、切断したばかりのバナナスライス又はバナナピューレの色（黄色／オフホワイト）から褐色バナナ（濃褐色）までのいずれかで変動すると予測される。

【0052】

幾つかの実施形態においては、「褐変」は、果肉の硬度及び果皮の硬度の評価に基づいて測定される。このような実施形態においては、果肉の硬度及び果皮の硬度は、Ｂｒｕｎｏ Ｂｏｎｎｅｔ，Ｃ．，Ｈｕｂｅｒｔ，Ｏ．，Ｍｂｅｇｕｉｅ－Ａ－Ｍｂｅｇｕｉｅ，Ｄ． ｅｔ ａｌ．，Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｈａｒｖｅｓｔ ｓｔａｇｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｏａｃｔｉｖｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｉｎ Ｃａｖｅｎｄｉｓｈ ｂａｎａｎａｓ．Ｊ．Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ｕｎｉｖ．Ｓｃｉ．Ｂ１４，２７０－２７８（２０１３）に記載の通り、ＴＡ－ＸＴ２ペネトロメータを用いて測定される。ステージ３から１０（果皮の色に基づいて証明；上記を参照）を表す房から３本の果指を採取する。４．９ｍｍの円筒形金属製穿孔器を用いて、清潔で新鮮な皮をむいていない果実に一定速度（２ｍｍ／ｓ）で１０ｍｍの深さまで貫入する。果皮を破るために印加された最大力が果皮の硬度を表し、力／時間曲線の傾きが果実の硬度を表す。

【0053】

幾つかの実施形態においては、「褐変」は、果皮の色（及び硬度）と果肉の色／質感との相関に基づいて測定される。このような実施形態においては、野生型植物における色（目視及び比色測定）、果皮の硬度、並びに果肉の硬度対バナナの成熟段階、並びに時間に対する果皮及び果肉の褐変のカタログを利用する。これにより、バナナの果皮及び果肉における褐変の低減を評価することができる基準ができる。

【0054】

幾つかの実施形態においては、「褐変」は、設定時間枠内に分析される、バナナ組織において形成されるメラニンの量に基づいて測定される。このような褐変の定量化は、簡単な生化学的アッセイで行うことができる（Ｍｉｃｈａｅｌ Ｌ．Ｓｕｌｌｉｖａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｄ Ｃｌｏｖｅｒ Ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ Ｏｘｉｄａｓｅ ｃＤＮＡｓ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ａｃｔｉｖｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ａｌｆａｌｆａ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ Ｏｃｔ ２００４，１３６（２）３２３４－３２４４；ＤＯＩ：１０．１１０４／ｐｐ．１０４．０４７４４９；Ｍａｔｔｈｅｗ Ａ．Ｅｓｃｏｂａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ Ｏｘｉｄａｓｅ ｆｒｏｍ Ｗａｌｎｕｔ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｎｏｖ ２００８，Ｖｏｌｕｍｅ １３３：Ｉｓｓｕｅ ６，ｐａｇｅｓ ８５２－８５８；ＤＯＩ：１０．２１２７３／ＪＡＳＨＳ．１３３．６．８５２）。これら酵素的褐変アッセイでは、バナナ組織の溶解物と混合した後に外因性ＰＰＯ基質の吸光度の変化を測定したところ、形成される生成物（メラニン）の量及び褐変反応の速度の両方がＰＰＯ活性に比例する。

【0055】

幾つかの実施形態においては、例えば成熟に伴う褐変を考慮する場合、褐変が「遅延する」とは、少なくとも１つの内因性ポリフェノールオキシダーゼ（ＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ３、ＰＰＯ４、ＰＰＯ５、ＰＰＯ６、ＰＰＯ７、ＰＰＯ８、及びＰＰＯ９からなる群から選択される）のレベル又は活性が低下していないバナナ植物の果肉及び／又は果皮と比較して、果肉及び／又は果皮の褐変の開始が少なくとも１日、少なくとも２日、少なくとも３日、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも６日、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、又は少なくとも１ヶ月遅くなることを意味する。特定の実施形態によれば、「遅延」は少なくとも３日間の遅延を指す。褐変は、上に概説した通り測定することができる。

【0056】

幾つかの実施形態においては、例えば傷みに関連する又は薄切りに関連する褐変を考慮する場合、褐変が「遅延する」とは、少なくとも１つの内因性ポリフェノールオキシダーゼ（ＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ３、ＰＰＯ４、ＰＰＯ５、ＰＰＯ６、ＰＰＯ７、ＰＰＯ８、及びＰＰＯ９からなる群から選択される）のレベル又は活性が低下していないバナナ植物の果肉及び／又は果皮と比較して、果肉及び／又は果皮の褐変の開始が、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも３時間、少なくとも４時間、少なくとも５時間、少なくとも６時間、少なくとも７時間、少なくとも８時間、少なくとも９時間、又は少なくとも１０時間遅くなることを意味する。褐変は、上に概説した通り測定することができる。

【0057】

幾つかの実施形態においては、褐変が「低減する」とは、少なくとも１つの内因性ポリフェノールオキシダーゼ（ＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ３、ＰＰＯ４、ＰＰＯ５、ＰＰＯ６、ＰＰＯ７、ＰＰＯ８、及びＰＰＯ９からなる群から選択される）のレベル又は活性が低下していないバナナ植物の果肉及び／又は果皮と比較して、果肉及び／又は果皮が褐変するのに２倍長く、３倍長く、４倍長く、５倍長く、６倍長く、７倍長く、８倍長く、９倍長く、又は１０倍長くかかることを意味する。褐変は、上に概説した通り測定することができる。

【0058】

幾つかの実施形態においては、褐変が「低減する」とは、規定の時点で形成されるメラニンが少ないことを意味する。例えば、少なくとも１つの内因性ポリフェノールオキシダーゼ（ＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ３、ＰＰＯ４、ＰＰＯ５、ＰＰＯ６、ＰＰＯ７、ＰＰＯ８、及びＰＰＯ９からなる群から選択される）のレベル又は活性が低下していない対照バナナ植物の果肉及び／又は果皮と比較して、果肉及び／又は果皮中で生じるメラニンが少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、３倍、５倍、１０倍又はそれ以上減少し得る。メラニン測定は、上に概説した通り、任意の時点で行ってよい。例えば、成熟に関連する褐変を考慮する場合、対照バナナが後述の実施例１で定義するステージ７、８、９、又は１０に達し、本発明のバナナが開花からの日数の観点で同齢である時点でメラニンを測定してよい。例えば、ステージ７、８、９、若しくは１０の本発明のバナナでは２倍以上少ないメラニンが存在し得る、ステージ７、８、９、若しくは１０の本発明のバナナでは３倍以上少ないメラニンが存在し得る、又はステージ７、８、９、若しくは１０の本発明のバナナでは５倍以上少ないメラニンが存在し得る。

【0059】

幾つかの実施形態においては、本発明の方法は、バナナ植物細胞又はバナナ植物の一部に、ＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ３、ＰＰＯ４、ＰＰＯ５、ＰＰＯ６、ＰＰＯ７、ＰＰＯ８、及びＰＰＯ９からなる群から選択される少なくとも１つの内因性ポリフェノールオキシダーゼ遺伝子の転写物を標的とするサイレンシングＲＮＡを提供することを含む。幾つかの実施形態においては、内因性ＰＰＯ１遺伝子の転写物が標的とされる。幾つかの実施形態においては、内因性ＰＰＯ２遺伝子の転写物が標的とされる。幾つかの実施形態においては、内因性ＰＰＯ３遺伝子の転写物が標的とされる。幾つかの実施形態においては、内因性ＰＰＯ４遺伝子の転写物が標的とされる。幾つかの実施形態においては、内因性ＰＰＯ５遺伝子の転写物が標的とされる。幾つかの実施形態においては、内因性ＰＰＯ６遺伝子の転写物が標的とされる。幾つかの実施形態においては、内因性ＰＰＯ７遺伝子の転写物が標的とされる。幾つかの実施形態においては、内因性ＰＰＯ８遺伝子の転写物が標的とされる。幾つかの実施形態においては、内因性ＰＰＯ９遺伝子の転写物が標的とされる。幾つかの実施形態においては、内因性のＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ３、ＰＰＯ４、ＰＰＯ５、ＰＰＯ６、ＰＰＯ７、ＰＰＯ８、及びＰＰＯ９のうちの２つ以上の転写物が標的とされる。特定の実施形態においては、内因性のＰＰＯ１及びＰＰＯ２の転写物が、標的とされる。

【0060】

サイレンシングＲＮＡは、外因性サイレンシングＲＮＡの導入；サイレンシングＲＮＡを発現する配列の細胞への導入（すなわち、導入遺伝子の作製）；又は既存の非コードＲＮＡ（サイレンシングＲＮＡ等）をコードしている内因性遺伝子を一過的に編集して、上記少なくとも１つのポリフェノールオキシダーゼ、任意でＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ８、ＰＰＯ９、及び／若しくはＰＰＯ４をコードしている標的遺伝子に向けてそのサイレンシング特異性をリダイレクトする（そして、場合によっては活性化する）（参照により本明細書に援用される国際公開第２０１９／０５８２５５号を参照）からなる群から選択される方法によって、バナナ植物細胞又はバナナ植物の一部に提供することができる。導入、発現、又はリダイレクトされ得る潜在的なサイレンシングＲＮＡとしては、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、Ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、段階的低分子干渉ＲＮＡ（ｐｈａｓｉＲＮＡ）、トランス作用型ｓｉＲＮＡ（ｔａｓｉＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、並びに自律的及び非自律的な転位ＲＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。

【0061】

他の実施形態においては、本発明の方法は、ＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ３、ＰＰＯ４、ＰＰＯ５、ＰＰＯ６、ＰＰＯ７、ＰＰＯ８、及びＰＰＯ９からなる群から選択される少なくとも１つの内因性ポリフェノールオキシダーゼ遺伝子に改変を導入することを含む。幾つかの実施形態においては、改変は、内因性ＰＰＯ１遺伝子に導入される。幾つかの実施形態においては、改変は、内因性ＰＰＯ２遺伝子に導入される。幾つかの実施形態においては、改変は、内因性ＰＰＯ３遺伝子に導入される。幾つかの実施形態においては、改変は、内因性ＰＰＯ４遺伝子に導入される。幾つかの実施形態においては、改変は、内因性ＰＰＯ５遺伝子に導入される。幾つかの実施形態においては、改変は、内因性ＰＰＯ６遺伝子に導入される。幾つかの実施形態においては、改変は、内因性ＰＰＯ７遺伝子に導入される。幾つかの実施形態においては、改変は、内因性ＰＰＯ８遺伝子に導入される。幾つかの実施形態においては、改変は、内因性ＰＰＯ９遺伝子に導入される。幾つかの実施形態においては、改変は、内因性のＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ３、ＰＰＯ４、ＰＰＯ５、ＰＰＯ６、ＰＰＯ７、ＰＰＯ８、及びＰＰＯ９のうちの２つ以上に導入される。特定の実施形態においては、改変は、内因性のＰＰＯ１及びＰＰＯ２に導入される。従って、幾つかの実施形態によれば、ＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ３、ＰＰＯ４、ＰＰＯ５、ＰＰＯ６、ＰＰＯ７、ＰＰＯ８、及びＰＰＯ９からなる群から選択されるポリフェノールオキシダーゼ遺伝子によってコードされている少なくとも１つの内因性ポリフェノールオキシダーゼのレベル又は活性を低下させる方法であって、ＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ３、ＰＰＯ４、ＰＰＯ５、ＰＰＯ６、ＰＰＯ７、ＰＰＯ８、及びＰＰＯ９からなる群から選択される少なくとも１つの内因性ポリフェノールオキシダーゼ遺伝子に改変を導入することを含む方法が、本明細書において提供される。

【0062】

これに関して、「改変を導入する」とは、１つ以上の内因性ポリフェノールオキシダーゼ遺伝子の少なくとも１つのアレルに少なくとも１つの変異を導入することを意味する。幾つかの実施形態によれば、１つ以上の内因性ポリフェノールオキシダーゼ遺伝子の１つのアレルに変異が導入されるが、他の２つのアレルは変異を含まない。幾つかの実施形態によれば、１つ以上の内因性ポリフェノールオキシダーゼ遺伝子の２つのアレルに変異が導入されるが、第３のアレルは変異を含まない。幾つかの実施形態によれば、１つ以上の内因性ポリフェノールオキシダーゼ遺伝子の各アレルに変異が導入される。いずれの実施形態においても、変異はホモ接合型であってもよくヘテロ接合型であってもよい。本明細書で使用するとき、「改変」は、少なくとも１つの内因性ＰＰＯのレベル又は活性を低下させる限り、少なくとも１つのヌクレオチドの挿入、少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、挿入－欠失（インデル）、逆位、少なくとも１つのヌクレオチドの置換、又は前述の任意の組み合わせを意味し得る。改変は、１つ以上の対応する内因性ポリフェノールオキシダーゼ遺伝子においてフレームシフト、ミスセンス変異、機能喪失変異、又はナンセンス変異をもたらし得、その結果、１つ以上の内因性ポリフェノールオキシダーゼ遺伝子が発現しなくなるか又は低下したレベルで発現するようになる。いずれの実施形態においても、改変のサイズは１ｋｂよりも小さくてよく、又は更には０．１ｋｂよりも小さくてもよい。幾つかの実施形態においては、機能喪失変異は、（例えば、エクソン１において）任意の発現産物の生成を阻害するように、それぞれのＰＰＯ遺伝子の５’領域にある。しかしながら、機能喪失変異は、例えば、遺伝子の調節エレメント（例えば、そのプロモータ）等であるがそれに限定されない、それぞれのＰＰＯ遺伝子のいずれの部分にあってもよい。

【0063】

幾つかの実施形態においては、改変は、該バナナ植物細胞に提供され、該少なくとも１つのポリフェノールオキシダーゼ遺伝子、例えば、ＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ８、ＰＰＯ９、又はＰＰＯ４のポリフェノールオキシダーゼ遺伝子のうちの少なくとも１つを標的とすることができるエンドヌクレアーゼによって、１つ以上のポリフェノールオキシダーゼ遺伝子に導入される。

【0064】

エンドヌクレアーゼは、ポリヌクレオチド鎖内のホスホジエステル結合を切断する酵素であり、塩基を損傷させることなく特定の部位でＤＮＡを切断する制限エンドヌクレアーゼを含む。制限酵素には、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、及びＩＶ型のエンドヌクレアーゼが含まれ、これらは更にサブタイプを含む。Ｉ型及びＩＩＩ型のシステムでは、メチラーゼ活性及び制限活性の両方が単一の複合体に含まれている。エンドヌクレアーゼには、ホーミングエンドヌクレアーゼ（ＨＥａｓｅ）としても知られているメガヌクレアーゼも含まれ、これは、制限エンドヌクレアーゼと同様に、特定の認識部位に結合し、切断する。エンドヌクレアーゼは、植物ゲノム等の真核生物ゲノムの精密な遺伝子操作を可能にする。

【0065】

幾つかの実施形態においては、エンドヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクタヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ホーミングエンドヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ、及び改変型ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼからなる群から選択される。幾つかの実施形態によれば、エンドヌクレアーゼはＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼであり、任意で、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼはＣａｓ９である。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。幾つかの実施形態においては、エンドヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクタヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、及びホーミングエンドヌクレアーゼからなる群から選択される。

【0066】

幾つかの実施形態によれば、バナナ植物又はバナナ植物細胞における少なくとも１つの内因性ポリフェノールオキシダーゼ（ＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ８、ＰＰＯ９、又はＰＰＯ４のポリフェノールオキシダーゼ遺伝子によってコードされているＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ８、ＰＰＯ９、又はＰＰＯ４のポリフェノールオキシダーゼ等）のレベル又は活性を低下させる方法であって、該少なくとも１つの内因性ポリフェノールオキシダーゼのレベル又は活性を低下させることが、該少なくとも１つのポリフェノールオキシダーゼをコードしているポリフェノールオキシダーゼ遺伝子に改変を導入することを含み；該改変が、該少なくとも１つのポリフェノールオキシダーゼ遺伝子が該バナナ植物又はバナナ植物細胞を標的とすることを可能にするエンドヌクレアーゼを提供することによって導入され；該エンドヌクレアーゼが、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ又は改変型ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼである方法が、本明細書において提供される。幾つかの実施形態によれば、エンドヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼが、選択されたポリフェノールオキシダーゼ遺伝子を特異的に標的とすることを可能にする少なくとも１つの「ターゲティング分子」と共にバナナ細胞に提供される。幾つかの実施形態によれば、ターゲティング分子は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ又は改変型ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼがポリフェノールオキシダーゼ遺伝子内の選択された配列を切断することを可能にするガイドＲＮＡである。

【0067】

本明細書で使用するとき、「メガヌクレアーゼ」は、一般的に、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリー、ＧＩＹ－ＹＩＧファミリー、Ｈｉｓ－Ｃｙｓボックスファミリー、及びＨＮＨファミリーの４つのファミリーに分類される。これらファミリーは、触媒活性及び認識配列に影響を与える構造モチーフによって特徴付けられる。例えば、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリーのメンバーは、保存されたＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフを１コピー又は２コピー有することを特徴とする。メガヌクレアーゼの４つのファミリーは、保存された構造エレメント、ひいては、ＤＮＡ認識配列の特異性及び触媒活性に関して互いに大きく異なっている。メガヌクレアーゼは、微生物種に一般的にみられ、非常に長い認識配列（＞１４ｂｐ）を有するという固有の特性を有しているため、所望の位置での切断についての特異性が天然で非常に高い。これを利用して、ゲノム編集において部位特異的な二本鎖切断を作製することができる。当業者であれば、これら天然に存在するメガヌクレアーゼを使用することができるが、このような天然に存在するメガヌクレアーゼの数は限られている。この課題を克服するために、突然変異誘発及びハイスループットスクリーニング法を用いて、固有の配列を認識するメガヌクレアーゼのバリアントが作製されている。例えば、様々なメガヌクレアーゼを融合させて新たな配列を認識するハイブリッド酵素が作製されている。或いは、メガヌクレアーゼのＤＮＡ相互作用アミノ酸を改変して配列特異的メガヌクレアーゼを設計することもできる（例えば、米国特許第８，０２１，８６７号を参照）。メガヌクレアーゼは、例えば、Ｃｅｒｔｏ，ＭＴ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ（２０１２）９：０７３－９７５、米国特許第８，３０４，２２２号、同第８，０２１，８６７号、同第８，１１９，３８１号、同第８，１２４，３６９号、同第８，１２９，１３４号、同第８，１３３，６９７号、同第８，１４３，０１５号、同第８，１４３，０１６号、同第８，１４８，０９８号、又は同第８，１６３，５１４号に記載の方法を用いて設計することができる。或いは、市販されている技術、例えば、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社のＤｉｒｅｃｔｅｄ Ｎｕｃｌｅａｓｅ Ｅｄｉｔｏｒ（商標）ゲノム編集技術を用いて部位特異的な切断特性を有するメガヌクレアーゼを得ることもできる。

【0068】

「ジンクフィンガーヌクレアーゼ」（又は「ＺＦＮ」）及び「転写活性化因子様エフェクタヌクレアーゼ」（又は「ＴＡＬＥＮ」）は、本明細書で使用するとき、標的となる二本鎖切断を生成するのに有効であることが証明されている（Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ Ｍ，Ｃｅｒｍａｋ Ｔ，Ｄｏｙｌｅ ＥＬ，ｅｔ ａｌ．Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＤＮＡ ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋｓ ｗｉｔｈ ＴＡＬ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．２０１０；１８６（２）：７５７－７６１．ｄｏｉ：１０．１５３４／ｇｅｎｅｔｉｃｓ．１１０．１２０７１７を参照）。本質的に、ＺＦＮ及びＴＡＬＥＮの制限エンドヌクレアーゼ技術は、特定のＤＮＡ結合ドメイン（それぞれ、一連のジンクフィンガードメイン又はＴＡＬＥリピートのいずれか）に連結された非特異的ＤＮＡ切断酵素を利用する。典型的には、そのＤＮＡ認識部位と切断部位とが互いに離れている制限酵素が選択される。切断部分が分離され、次いで、ＤＮＡ結合ドメインに連結され、それによって所望の配列に対して非常に高い特異性を有するエンドヌクレアーゼが得られる。このような特性を有する例示的な制限酵素は、ＦｏｋＩである。更に、ＦｏｋＩには、ヌクレアーゼ活性を有するようになるために二量体化を必要とするという利点があり、これは、各ヌクレアーゼパートナーが固有のＤＮＡ配列を認識するので特異性が高まることを意味する。この効果を高めるために、ＦｏｋＩヌクレアーゼは、ヘテロ二量体としてしか機能することができず、高い触媒活性を有するように操作されている。そのようなヌクレアーゼは、不要なホモ二量体活性の可能性を回避し、二本鎖切断の特異性を高める。従って、特定の部位を標的とするために、ＺＦＮ及びＴＡＬＥＮはヌクレアーゼ対として構築され、対の各メンバーが標的部位における隣接する配列に結合するように設計される。細胞内で一過的に発現すると、ヌクレアーゼはその標的部位に結合し、ＦｏｋＩドメインはヘテロ二量体化して二本鎖切断を作製する。「非相同末端結合」（又は「ＮＨＥＪ」）経路を通じてこれら二本鎖切断を修復すると、多くの場合、小さな欠失又は小さな配列挿入が生じる。ＮＨＥＪによって行われる各修復は固有のものであるので、単一のヌクレアーゼ対を使用して、標的部位に様々な欠失を有するアレル群を作り出すことができる。典型的には、欠失の長さは、数塩基対から数百塩基対のいずれかの範囲であるが、２対のヌクレアーゼを同時に使用することによって、細胞培養下でより大きな欠失を生じさせることが成功している（Ｃａｒｌｓｏｎ ＤＦ，Ｆａｈｒｅｎｋｒｕｇ ＳＣ，Ｈａｃｋｅｔｔ ＰＢ．Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＤＮＡ Ｗｉｔｈ Ｆｉｎｇｅｒｓ ａｎｄ ＴＡＬＥＮｓ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ．２０１２；１（１）：ｅ３．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ２０１２ Ｊａｎ ２４．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔｎａ．２０１１．５）。更に、標的領域に対して相同性を有するＤＮＡ断片をヌクレアーゼ対と一緒に導入すると、相同組換え（ＨＲ）を介して二本鎖切断を修復して、特定の改変を生じさせることができる（Ｕｒｎｏｖ，Ｆ．，Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．，Ｌｅｅ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｚｉｎｃ－ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ ４３５，６４６－６５１（２００５）．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０３５５６）。ＺＦＮ及びＴＡＬＥＮの両方のヌクレアーゼ部分は類似の特性を有するが、これら遺伝子操作されたヌクレアーゼ間の差異は、そのＤＮＡ認識ペプチドにある。ＺＦＮはＣｙｓ２－Ｈｉｓ２ジンクフィンガーに、ＴＡＬＥＮはＴＡＬＥに依拠する。これらＤＮＡ認識ペプチドドメインはいずれも、天然ではそのタンパク質中に組み合わせでみられるという特徴を有する。Ｃｙｓ２－Ｈｉｓ２ジンクフィンガーは、典型的には、３ｂｐ離れたリピートにみられ、様々な核酸相互作用タンパク質中に多様な組み合わせでみられる。一方、ＴＡＬＥは、アミノ酸と認識されるヌクレオチド対との間に１対１の認識比を有するリピートでみられる。ジンクフィンガー及びＴＡＬＥはいずれも反復パターンで生じるので、様々な組み合わせを試して多種多様な配列特異性を生み出すことができる。部位特異的ジンクフィンガーエンドヌクレアーゼを作製するためのアプローチとしては、中でも、例えばモジュラーアセンブリ（トリプレット配列に相関したジンクフィンガーを、必要な配列を網羅するように並べて結合させる）、ＯＰＥＮ（ペプチドドメイン対トリプレットヌクレオチドを低ストリンジェンシーで選択し、続いて、細菌系においてペプチドの組み合わせ対最終標的を高ストリンジェンシーで選択する）、及びジンクフィンガーライブラリの細菌ワンハイブリッドスクリーニングが挙げられる。ＺＦＮは、例えばＳａｎｇａｍｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（商標）（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）で設計され、市販されているものもある。ＴＡＬＥＮを設計及び入手する方法は、Ｒｅｙｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２０１２）３０（５）：４６０－４６５；Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２０１１）２９：１４３－１４８；Ｃｅｒｍａｋ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１１）３９（１２）：ｅ８２、及びＺｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２０１１）２９（２）：１４９－１５３に記載されている。ゲノム編集用途のＴＡＬ及びＴＡＬＥＮのコンストラクトを設計するために、「Ｍｏｊｏ Ｈａｎｄ」と命名された最近開発されたウェブベースのプログラムがＭａｙｏ Ｃｌｉｎｉｃによって導入された（ｗｗｗ．ｔａｌｅｎｄｅｓｉｇｎ．ｏｒｇを通してアクセスすることができる）。

【0069】

本明細書で使用するとき、「ホーミングエンドヌクレアーゼ」は、大きな非対称認識部位（１２～４０塩基対（ｂｐ））と、通常イントロン又はインテインのいずれかに埋め込まれたコード配列と、を有する二本鎖ＤＮａｓｅである（Ｂｅｌｆｏｒｔ，Ｍ．ａｎｄ Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｒ．Ｊ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２５，３３７９－３３８８）。イントロンは、前駆体ＲＮＡからスプライシングされて除去されるが、インテインは、前駆体タンパク質からスプライシングされて除去される（Ｄｕｊｏｎ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｇｅｎｅ，８２，１１５－１１８；Ｐｅｒｌｅｒ，Ｆ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２，１１２５－１１２７）。ホーミングエンドヌクレアーゼは、制限エンドヌクレアーゼと同様の慣例を用いて命名され、イントロンにコードされているエンドヌクレアーゼは接頭辞「Ｉ－」を、インテインエンドヌクレアーゼは接頭辞「ＰＩ－」を有する（Ｂｅｌｆｏｒｔ，Ｍ．ａｎｄ Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｒ．Ｊ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２５，３３７９－３３８８；Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｒ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３１，１８０５－１８１２）。ホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位は、稀である。例えば、１８塩基対（ｂｐ）の認識配列は、ランダム配列の７×１０^１０塩基対ごとに１つしか出現しない。しかしながら、制限エンドヌクレアーゼとは異なり、ホーミングエンドヌクレアーゼは、その認識配列内の若干の配列縮重を許容する（Ｇｉｍｂｌｅ，Ｆ．Ｓ．ａｎｄ Ｗａｎｇ，Ｊ．（１９９６）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２６３，１６３－１８０；Ａｒｇａｓｔ，Ｍ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２８０，３４５－３５３）。すなわち、一塩基の変化が切断を無効にするのではなく、その効率を様々な程度低下させる。その結果、観察される配列特異性は、典型的には、１０～１２塩基対の範囲である。

【0070】

幾つかの実施形態においては、本発明の方法は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ又は改変型ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼをバナナ植物細胞に提供することを含む。幾つかの実施形態においては、本発明の方法は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ又は改変型ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼと、少なくとも１つのポリフェノールオキシダーゼ遺伝子に特異的な１つ以上のガイドＲＮＡとをバナナ植物細胞に提供することを含み、該ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ又は改変型ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ及び該１つ以上のガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ又は改変型ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼが少なくとも１つの内因性ポリフェノールオキシダーゼ遺伝子に二本鎖切断又は一本鎖切断を導入することを可能にする複合体を形成する。これら実施形態の幾つかにおいては、該ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼである。これら実施形態の幾つかにおいては、少なくとも１つの内因性ポリフェノールオキシダーゼの遺伝子又はポリヌクレオチドは、ＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ３、ＰＰＯ４、ＰＰＯ５、ＰＰＯ６、ＰＰＯ７、ＰＰＯ８、及びＰＰＯ９からなる群から選択される。幾つかの実施形態においては、少なくとも１つの内因性ポリフェノールオキシダーゼ遺伝子は、ＰＰＯ１遺伝子である。幾つかの実施形態においては、少なくとも１つの内因性ポリフェノールオキシダーゼ遺伝子は、ＰＰＯ２遺伝子である。幾つかの実施形態においては、少なくとも１つの内因性ポリフェノールオキシダーゼ遺伝子は、ＰＰＯ３遺伝子である。幾つかの実施形態においては、少なくとも１つの内因性ポリフェノールオキシダーゼ遺伝子は、ＰＰＯ４遺伝子である。幾つかの実施形態においては、少なくとも１つの内因性ポリフェノールオキシダーゼ遺伝子は、ＰＰＯ５遺伝子である。幾つかの実施形態においては、少なくとも１つの内因性ポリフェノールオキシダーゼ遺伝子は、ＰＰＯ６遺伝子である。幾つかの実施形態においては、少なくとも１つの内因性ポリフェノールオキシダーゼ遺伝子は、ＰＰＯ７遺伝子である。幾つかの実施形態においては、少なくとも１つの内因性ポリフェノールオキシダーゼ遺伝子は、ＰＰＯ８遺伝子である。幾つかの実施形態においては、少なくとも１つの内因性ポリフェノールオキシダーゼ遺伝子は、ＰＰＯ９遺伝子である。幾つかの実施形態においては、内因性ポリフェノールオキシダーゼ遺伝子は、ＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ３、ＰＰＯ４、ＰＰＯ５、ＰＰＯ６、ＰＰＯ７、ＰＰＯ８、及びＰＰＯ９の遺伝子のうちの２つ以上である。幾つかの実施形態においては、内因性ポリフェノールオキシダーゼ遺伝子は、ＰＰＯ１及びＰＰＯ２の遺伝子である。

【0071】

方法の特定の実施形態においては、ＰＰＯ１遺伝子は、配列番号５に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するコード配列を含む；ＰＰＯ２遺伝子は、配列番号６に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するコード配列を含む；ＰＰＯ３遺伝子は、配列番号７に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するコード配列を含む；ＰＰＯ４遺伝子は、配列番号８に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するコード配列を含む；ＰＰＯ５遺伝子は、配列番号９に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するコード配列を含む；ＰＰＯ６遺伝子は、配列番号１０に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するコード配列を含む；ＰＰＯ７遺伝子は、配列番号１１に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するコード配列を含む；ＰＰＯ８遺伝子は、配列番号１２に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するコード配列を含む；又はＰＰＯ９遺伝子は、配列番号１３に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するコード配列を含む。方法の特定の実施形態においては、ＰＰＯ１、ＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ８、ＰＰＯ９、又はＰＰＯ４のポリフェノールオキシダーゼ遺伝子は、配列番号５（ＰＰＯ１）又は配列番号５に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；配列番号６（ＰＰＯ２）又は配列番号６に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；配列番号１２（ＰＰＯ８）又は配列番号１２に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；配列番号１３（ＰＰＯ９）又は配列番号１３に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；及び配列番号８（ＰＰＯ４）又は配列番号８に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドからなる群から選択されるコード配列を含む。

【0072】

方法の特定の実施形態においては、ＰＰＯ１遺伝子は、配列番号４０に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するポリフェノールオキシダーゼをコードしている；ＰＰＯ２遺伝子は、配列番号４１に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するポリフェノールオキシダーゼをコードしている；ＰＰＯ３遺伝子は、配列番号４２に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するポリフェノールオキシダーゼをコードしている；ＰＰＯ４遺伝子は、配列番号４３に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するポリフェノールオキシダーゼをコードしている；ＰＰＯ５遺伝子は、配列番号４４に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するポリフェノールオキシダーゼをコードしている；ＰＰＯ６遺伝子は、配列番号４５に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するポリフェノールオキシダーゼをコードしている；ＰＰＯ７遺伝子は、配列番号４６に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するポリフェノールオキシダーゼをコードしている；ＰＰＯ８遺伝子は、配列番号４７に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するポリフェノールオキシダーゼをコードしている；又はＰＰＯ９遺伝子は、配列番号４８に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するポリフェノールオキシダーゼをコードしている。方法の特定の実施形態においては、ＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ８、ＰＰＯ９、又はＰＰＯ４のポリフェノールオキシダーゼ遺伝子は、配列番号４０（ＰＰＯ１）又は配列番号４０に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；配列番号４１（ＰＰＯ２）又は配列番号４１に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；配列番号４７（ＰＰＯ８）又は配列番号４７に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；配列番号４８（ＰＰＯ９）又は配列番号４８に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；及び配列番号４３（ＰＰＯ４）又は配列番号４３に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチドからなる群から選択されるポリフェノールオキシダーゼをコードしている。

【0073】

方法の特定の実施形態においては、ＰＰＯ１遺伝子は、配列番号１５１に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む；ＰＰＯ２遺伝子は、配列番号１５２に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド配列を指す；ＰＰＯ３遺伝子は、配列番号１５３に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド配列を指す；ＰＰＯ４遺伝子は、配列番号１５４に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド配列を指す；ＰＰＯ５遺伝子は、配列番号１５５に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド配列を指す；ＰＰＯ６遺伝子は、配列番号１５６に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド配列を指す；ＰＰＯ７遺伝子は、配列番号１５７に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド配列を指す；ＰＰＯ８遺伝子は、配列番号１５８に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド配列を指す；又はＰＰＯ９遺伝子は、配列番号１５９に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド配列を指す。方法の特定の実施形態においては、ＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ８、ＰＰＯ９、又はＰＰＯ４のポリフェノールオキシダーゼ遺伝子は、配列番号１５１（ＰＰＯ１）又は配列番号１５１に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；配列番号１５２（ＰＰＯ２）又は配列番号１５２に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；配列番号１５８（ＰＰＯ８）又は配列番号１５８に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；配列番号１５９（ＰＰＯ９）又は配列番号１５９に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；及び配列番号１５４（ＰＰＯ４）又は配列番号１５４に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。

【0074】

本明細書で使用するとき、「ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ」（又は「Ｃａｓ」）は、ＲＮＡガイドポリヌクレオチド編集活性を有するエンドヌクレアーゼを指し、少なくとも１つの追加の構成要素である「ガイドＲＮＡ」（ｇＲＮＡ）を使用するゲノム編集のためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の構成要素の１つである。本発明の幾つかの実施形態においては、「ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ」は、「Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ」（又は「Ｃａｓ９」）である。幾つかの実施形態によれば、「ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ」は、ＳｐＣａｓ９、ＳａＣａｓ９、ＦｎＣａｓ９、ＮｍＣａｓ９、Ｓｔ１Ｃａｓ９、ＢｌａｔＣａｓ９（Ｓｈｏｔａ Ｎａｋａｄｅ，Ｔａｋａｓｈｉ Ｙａｍａｍｏｔｏ ＆ Ｔｅｔｓｕｓｈｉ Ｓａｋｕｍａ（２０１７），Ｃａｓ９，Ｃｐｆ１ ａｎｄ Ｃ２ｃ１／２／３―Ｗｈａｔ’ｓ ｎｅｘｔ？，Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ，８：３，２６５－２７３、及びその参照文献）等であるがこれらに限定されない、当技術分野で公知の任意のＣａｓ９であってよい。他の実施形態においては、「ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ」は、ＡｓＣｐｆ１又はＬｂＣｐｆ１等であるがこれらに限定されないＣｐｆ１であってよい（Ｓｈｏｔａ Ｎａｋａｄｅ，Ｔａｋａｓｈｉ Ｙａｍａｍｏｔｏ ＆ Ｔｅｔｓｕｓｈｉ Ｓａｋｕｍａ（２０１７）、Ｃａｓ９，Ｃｐｆ１ ａｎｄ Ｃ２ｃ１／２／３―Ｗｈａｔ’ｓ ｎｅｘｔ？，Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ，８：３，２６５－２７３、及びその参照文献）。

【0075】

本明細書で使用するとき、「ガイドＲＮＡ」又は「ｇＲＮＡ」という用語は、互換的に使用することができ、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ又は改変型ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼの、細胞内のゲノム配列又はエピソーム配列等の標的配列への特異的ターゲティングを容易にするポリヌクレオチドを指す。幾つかの実施形態によれば、ｇＲＮＡは、キメラ／単一分子（単一のＲＮＡ分子を含み、単一ガイドＲＮＡ又はｓｇＲＮＡとも呼ばれる）又はモジュラー（１つを超える別個のＲＮＡ分子を含み、典型的にはｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡであり、これらは例えば二重鎖形成によって連結され得る）であってよい。幾つかの実施形態によれば、ｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡである。

【0076】

ｓｇＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡ及びｃｒＲＮＡの両方（及び連結ループ）を含むＲＮＡ分子である。ｓｇＲＮＡは、単一のキメラ転写物において標的相同配列（ｃｒＲＮＡ）とｃｒＲＮＡをＣａｓ９ヌクレアーゼに連結させる内因性細菌ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）とをコードしているヌクレオチドの配列を含む。可変領域として知られているｃｒＲＮＡのこの領域は、関連するエンドヌクレアーゼの切断特異性を付与し、典型的には２０ヌクレオチド長であるが、約１７～２０ヌクレオチド長であってもよい。ｇＲＮＡ／Ｃａｓ複合体は、ｓｇＲＮＡ配列と相補的なゲノムＤＮＡとの間の塩基対合によって標的配列に動員される。Ｃａｓの結合を成功させるためには、ゲノム標的配列が、該標的配列の直後に正確なプロトスペーサ隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列も含有していなければならない。ｇＲＮＡ／Ｃａｓ複合体が結合すると、ＣａｓがＤＮＡの両鎖を切断して二重鎖切断を生じさせることができるように、Ｃａｓはゲノム標的配列に局在する。ＺＦＮ及びＴＡＬＥＮと同様に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓによって生じる二本鎖切断は、ＨＲ（相同組換え）又はＮＨＥＪ（非相同末端結合）によって修復することができ、ＤＮＡ修復中に特定の配列改変を受けやすい。Ｃａｓヌクレアーゼは、それぞれが異なるＤＮＡ鎖を切断する２つの機能性ドメイン：ＲｕｖＣ及びＨＮＨを有する。これらドメインの両方が活性である場合、ＣａｓはゲノムＤＮＡにおいて二本鎖切断を引き起こす。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓの大きな利点は、この系の高い効率性と合成ｇＲＮＡを容易に作製できる能力とを兼ね備えていることである。これにより、異なるゲノム部位を標的とする及び／又は同じ部位における異なる改変を標的とするように容易に改変することが可能な系ができる。更に、複数の遺伝子を同時に標的とすることができるプロトコルも確立されている。変異を保有する細胞の大部分は、標的となる遺伝子に両アレル変異が存在する。しかし、ｇＲＮＡ配列とゲノムＤＮＡ標的配列との間の塩基対合相互作用が明らかに柔軟であることから、標的配列との一致が不完全でもＣａｓによって切断することが可能になる。

【0077】

ＲｕｖＣ又はＨＮＨのいずれかの単一不活性触媒ドメインを含有するＣａｓ酵素の改変バージョンは、「ニッカーゼ」と呼ばれる。活性ヌクレアーゼドメインが１つだけの場合、Ｃａｓニッカーゼは標的ＤＮＡの片方の鎖だけを切断し、一本鎖切断又は「ニック」を作製する。一本鎖切断又はニックは、ほとんどの場合、ＰＡＲＰ（センサ）及びＸＲＣＣｌ／ＬＩＧ ＩＩＩ複合体（ライゲーション）等であるがこれらだけではないタンパク質が関与する一本鎖切断修復機構によって修復される。トポイソメラーゼＩの毒によって又は天然に存在するＳＳＢにおいてＰＡＲＰ１を捕捉する薬物によって一本鎖切断（ＳＳＢ）が生成された場合、これらは持続する可能性があり、細胞がＳ期に入り、複製フォークがこのようなＳＳＢに遭遇したときに、ＨＲによってのみ修復可能なシングルエンドＤＳＢとなる。しかし、Ｃａｓニッカーゼによって導入された２つの近接している対向する鎖のニックは二本鎖切断として処理され、「ダブルニック」ＣＲＩＳＰＲ系と称されることが多い。ダブルニックは基本的に非平行ＤＳＢであり、他のＤＳＢと同様に、遺伝子標的に対する所望の効果及びドナー配列の存在及び細胞周期のステージに応じてＨＲ又はＮＨＥＪによって修復され得る（ＨＲは、はるかに存在量が少なく、細胞周期のＳ期及びＧ２期でしか生じ得ない）。従って、特異性及びオフターゲット効果の減少が重要な場合、近接近しておりかつゲノムＤＮＡの対向する鎖に存在する標的配列を有する２つのｇＲＮＡを設計することによってダブルニックを作製するためのＣａｓニッカーゼを使用すると、いずれかのｇＲＮＡだけではゲノムＤＮＡを変化させることが不可能ではないとしても可能性の低いニックが生じるため、オフターゲット効果が減少するであろう。

【0078】

本明細書で使用するとき、「改変型ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ」（又は「改変型Ｃａｓ」とは、触媒ドメインが改変されている及び／又は追加ドメインに融合しているＣａｓを指す。幾つかの実施形態によれば、「改変型Ｃａｓ」とは、不活性触媒ドメイン（ｄｅａｄ Ｃａｓ、又はｄＣａｓ）を含有し、ヌクレアーゼ活性を有さないが、依然としてｇＲＮＡ特異性に基づいてＤＮＡには結合することはできるＣａｓを指す。幾つかの実施形態によれば、「改変型Ｃａｓ」とは、ニッカーゼ活性を有する（「ｎＣａｓ９」）ので、一本鎖切断を誘導するＣａｓを指す。幾つかの実施形態においては、改変型ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは「改変型Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ」であり、場合によっては、触媒的に不活性なＣａｓ９（又は「ｄＣａｓ９」）又はニッカーゼＣａｓ９（「ｎＣａｓ９」）である。ｄＣａｓは、不活性酵素を既知の調節ドメインに融合させることによって遺伝子発現を活性化又は抑制するためのＤＮＡ転写調節因子のプラットフォームとして利用することができる。例えば、ゲノムＤＮＡ中の標的配列にｄＣａｓが単独で結合すると、遺伝子の転写に干渉することができる。標的配列の選択及び／又は設計に役立てるために利用可能な公的に入手可能なツールに加えて、バイオインフォマティクスに基づいて決定された異なる種における異なる遺伝子に固有のｇＲＮＡのリストが多数公開されており、例えば、Ｆｅｎｇ Ｚｈａｎｇ研究室のＴａｒｇｅｔ Ｆｉｎｄｅｒ、 Ｍｉｃｈａｅｌ Ｂｏｕｔｒｏｓ研究室のＴａｒｇｅｔ Ｆｉｎｄｅｒ“Ｅ－ＣＲＩＳＰ”、ＲＧＥＮ Ｔｏｏｌｓ：“Ｃａｓ－ＯＦＦｉｎｄｅｒ”、ＣａｓＦｉｎｄｅｒ：Ｆｌｅｘｉｂｌｅ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ ｆｏｒ ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｃａｓ９ ｔａｒｇｅｔｓ ｉｎ ｇｅｎｏｍｅｓ ａｎｄ ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ Ｏｐｔｉｍａｌ Ｔａｒｇｅｔ Ｆｉｎｄｅｒがある。

【0079】

本発明の状況において、ｄＣａｓ又はｎＣａｓ９等の改変型Ｃａｓを、塩基編集のために他の酵素と共に（場合によっては融合タンパク質として）幾つかの実施形態に従って使用することもできる。塩基編集は、ＣＲＩＳＰＲ系の構成要素を他の酵素と共に使用して、二本鎖ＤＮＡ切断を作製することなく細胞のＤＮＡ又はＲＮＡに点変異を直接導入するゲノム編集アプローチである。ＤＮＡ塩基エディタは、核酸塩基デアミナーゼ酵素及び場合によってはＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤と融合した触媒活性のないヌクレアーゼを含む。ＲＮＡ塩基エディタは、ＲＮＡを標的とする構成要素を用いて同様の変化を実現する。塩基エディタは、ある塩基又は塩基対を別の塩基又は塩基対に直接変換することで、過剰な望ましくない編集副産物を生成することなく非分裂細胞に点変異を効率的に導入することを可能にする（Ｒｅｅｓ ａｎｄ Ｌｉｕ（２０１８），“Ｂａｓｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ：Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｎ ｔｈｅ Ｇｅｎｏｍｅ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ ｏｆ Ｌｉｖｉｎｇ Ｃｅｌｌｓ”，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９（１２）：７７０－７８８）。幾つかの実施形態によれば、改変型Ｃａｓ９は、アデノシン又はシチジンのデアミナーゼ等の塩基エディタ酵素に融合したｎＣａｓである。企図される具体的な塩基エディタとしては、ＡＰＯＢＥＣ、ＢＥ１、ＢＥ２、ＢＥ３、ＨＦ－ＢＥ３、ＢＥ４、ＢＥ４ｍａｘ、ＢＥ４－ＧＡＭ、ＹＥ１－ＢＥ３、ＥＥ－ＢＥ３、ＹＥ－ＢＥ３、ＹＥＥ－ＢＥ３、ＶＱＲ－ＢＥ３、ＶＲＥＲ－ＢＥ３、Ｓａ－ＢＥ３、Ｓａ－ＢＥ４、ＳａＢＥ４－Ｇａｍ、ＳａＫＫＨ－ＢＥ３、Ｃａｓ１２ａ－ＢＥ、Ｔａｒｇｅｔ－ＡＩＤ、Ｔａｒｇｅｔ－ＡＩＤ－ＮＧ、ｘＢＥ３、ｅＡ３Ａ－ＢＥ３、Ａ３Ａ－ＢＥ３、ＢＥ－ＰＬＵＳ、ＴＡＭ、ＣＲＩＳＰＲ－Ｘ、ＡＢＥ７．９、ＡＢＥ７．１０、ＡＢＥ７．１０＊、ｘＡＢＥ、ＡＢＥＳａ、ＶＱＲ－ＡＢＥ、ＶＲＥＲ－ＡＢＥ、ＳａＫＫＨ－ＡＢＥが挙げられる（Ｒｅｅｓ ａｎｄ Ｌｉｕ（２０１８），“Ｂａｓｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ：Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｎ ｔｈｅ Ｇｅｎｏｍｅ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ ｏｆ Ｌｉｖｉｎｇ Ｃｅｌｌｓ”，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９（１２）：７７０－７８８、及びその参照文献）。

【0080】

本明細書で使用するとき、「ガイドＲＮＡ」（又は「ｇＲＮＡ」）は、配列が少なくとも１つのポリフェノールオキシダーゼ遺伝子に特異的であるか、又はコードされているサイレンシングＲＮＡが本明細書に定義されるポリフェノールオキシダーゼ遺伝子をサイレンシングするように配列が改変されているサイレンシングＲＮＡをコードしているゲノム配列を標的とする限り、特定の配列に限定されない。本発明の幾つかの実施形態においては、１つ以上のガイドＲＮＡは、配列番号３２～３９及び５７～９７；並びに前述の任意の組み合わせからなる群から選択される配列を有する可変領域を含む。本発明の幾つかの実施形態においては、１つ以上のガイドＲＮＡは、配列番号１８０～１９６、１９９～２０２、及び２０７～２２５；並びに前述の任意の組み合わせからなる群から選択される配列を有する可変領域を含む。本発明の幾つかの実施形態においては、１つ以上のガイドＲＮＡは、配列番号３２；配列番号３３；配列番号３４；配列番号３５；配列番号３６；配列番号３７；配列番号５７；配列番号５８；配列番号３８；配列番号３９；配列番号６２；配列番号７６；配列番号７７；並びに前述の任意の組み合わせからなる群から選択される配列を有する可変領域を含む。

【0081】

本発明の幾つかの実施形態においては、該１つ以上のガイドＲＮＡは、配列番号３２及び３３；配列番号３４及び３５；配列番号３２及び３４；配列番号３２及び３５；配列番号３３及び３４；配列番号３３及び３５；配列番号５７及び５８；配列番号３８及び３９；配列番号６２及び３３；並びに配列番号７６及び７７からなる群から選択される可変領域を含む一対のガイドＲＮＡである。幾つかの実施形態によれば、上記ｇＲＮＡは、上記のような可変領域配列と、それに続く配列番号９８の一定のスカフォールド配列とを含む。

【0082】

好ましくは、本発明は、バナナ植物又はバナナ植物細胞において、ＰＰＯ１ポリフェノールオキシダーゼ遺伝子によってコードされている少なくとも１つの内因性ＰＰＯ１ポリフェノールオキシダーゼのレベル又は活性を低下させる方法であって、該ＰＰＯ１ポリフェノールオキシダーゼ遺伝子が、（Ａ）配列番号５（ＰＰＯ１）若しくは配列番号５に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドのコード配列を含むか；（Ｂ）配列番号４０（ＰＰＯ１）若しくは配列番号４０に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチドのポリフェノールオキシダーゼをコードしているか；又は（Ｃ）配列番号１５１（ＰＰＯ１）のポリヌクレオチド配列若しくは配列番号１５１に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含み；
該方法が、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ又は改変型ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼと、該少なくとも１つのＰＰＯ１ポリフェノールオキシダーゼ遺伝子に特異的な１つ以上のガイドＲＮＡとを該バナナ植物細胞に提供することを含み、該ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ又は改変型ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ及び該１つ以上のガイドＲＮＡが、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ又は改変型ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼが、該少なくとも１つの内因性ＰＰＯ１ポリフェノールオキシダーゼ遺伝子に二本鎖切断又は一本鎖切断を導入することを可能にする複合体を形成し；
任意で、該１つ以上のガイドＲＮＡが、配列番号３２、配列番号３３、又は配列番号６２の配列を有する可変領域を含む方法を提供する。

【0083】

好ましくは、本発明は、バナナ植物又はバナナ植物細胞において、ＰＰＯ２ポリフェノールオキシダーゼ遺伝子によってコードされている少なくとも１つの内因性ＰＰＯ２ポリフェノールオキシダーゼのレベル又は活性を低下させる方法であって、該ＰＰＯ２ポリフェノールオキシダーゼ遺伝子が、（Ａ）配列番号６（ＰＰＯ２）若しくは配列番号６に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドのコード配列を含むか；（Ｂ）配列番号４１（ＰＰＯ２）若しくは配列番号４１に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチドのポリフェノールオキシダーゼをコードしているか；又は（Ｃ）配列番号１５２（ＰＰＯ２）のポリヌクレオチド配列若しくは配列番号１５２に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含み；
該方法が、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ又は改変型ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼと、該少なくとも１つのＰＰＯ２ポリフェノールオキシダーゼ遺伝子に特異的な１つ以上のガイドＲＮＡとを該バナナ植物細胞に提供することを含み、該ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ又は改変型ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ及び該１つ以上のガイドＲＮＡが、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ又は改変型ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼが、該少なくとも１つの内因性ＰＰＯ２ポリフェノールオキシダーゼ遺伝子に二本鎖切断又は一本鎖切断を導入することを可能にする複合体を形成し；
任意で、該１つ以上のガイドＲＮＡが、配列番号３４又は配列番号３５の配列を有する可変領域を含む方法を提供する。

【0084】

好ましくは、本発明は、バナナ植物又はバナナ植物細胞において、ＰＰＯ５ポリフェノールオキシダーゼ遺伝子によってコードされている少なくとも１つの内因性ＰＰＯ５ポリフェノールオキシダーゼのレベル又は活性を低下させる方法であって、該ＰＰＯ５ポリフェノールオキシダーゼ遺伝子が、（Ａ）配列番号９（ＰＰＯ５）若しくは配列番号９に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドのコード配列を含むか；（Ｂ）配列番号４４（ＰＰＯ５）若しくは配列番号４４に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチドのポリフェノールオキシダーゼをコードしているか；又は（Ｃ）配列番号１５５（ＰＰＯ５）のポリヌクレオチド配列若しくは配列番号１５５に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含み；
該方法が、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ又は改変型ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼと、該少なくとも１つのＰＰＯ５ポリフェノールオキシダーゼ遺伝子に特異的な１つ以上のガイドＲＮＡとを該バナナ植物細胞に提供することを含み、該ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ又は改変型ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ及び該１つ以上のガイドＲＮＡが、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ又は改変型ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼが、該少なくとも１つの内因性ＰＰＯ５ポリフェノールオキシダーゼ遺伝子に二本鎖切断又は一本鎖切断を導入することを可能にする複合体を形成し；
任意で、該１つ以上のガイドＲＮＡが、配列番号７８又は配列番号７９の配列を有する可変領域を含む方法を提供する。

【0085】

好ましくは、本発明は、バナナ植物又はバナナ植物細胞において、ＰＰＯ８ポリフェノールオキシダーゼ遺伝子によってコードされている少なくとも１つの内因性ＰＰＯ８ポリフェノールオキシダーゼのレベル又は活性を低下させる方法であって、該ＰＰＯ８ポリフェノールオキシダーゼ遺伝子が、（Ａ）配列番号１２（ＰＰＯ８）若しくは配列番号１２に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドのコード配列を含むか；（Ｂ）配列番号４７（ＰＰＯ８）若しくは配列番号４７に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチドのポリフェノールオキシダーゼをコードしているか；又は（Ｃ）配列番号１５８（ＰＰＯ８）のポリヌクレオチド配列若しくは配列番号１５８に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含み；
該方法が、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ又は改変型ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼと、該少なくとも１つのＰＰＯ８ポリフェノールオキシダーゼ遺伝子に特異的な１つ以上のガイドＲＮＡとを該バナナ植物細胞に提供することを含み、該ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ又は改変型ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ及び該１つ以上のガイドＲＮＡが、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ又は改変型ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼが、該少なくとも１つの内因性ＰＰＯ８ポリフェノールオキシダーゼ遺伝子に二本鎖切断又は一本鎖切断を導入することを可能にする複合体を形成し；
任意で、該１つ以上のガイドＲＮＡが、配列番号５７又は配列番号５８の配列を有する可変領域を含む方法を提供する。

【0086】

好ましくは、本発明は、バナナ植物又はバナナ植物細胞において、ＰＰＯ９ポリフェノールオキシダーゼ遺伝子によってコードされている少なくとも１つの内因性ＰＰＯ９ポリフェノールオキシダーゼのレベル又は活性を低下させる方法であって、該ＰＰＯ９ポリフェノールオキシダーゼ遺伝子が、（Ａ）配列番号１３（ＰＰＯ９）若しくは配列番号１３に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドのコード配列を含むか；（Ｂ）配列番号４８（ＰＰＯ９）若しくは配列番号４８に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチドのポリフェノールオキシダーゼをコードしているか；又は（Ｃ）配列番号１５９（ＰＰＯ９）のポリヌクレオチド配列若しくは配列番号１５９に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含み；
該方法が、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ又は改変型ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼと、該少なくとも１つのＰＰＯ９ポリフェノールオキシダーゼ遺伝子に特異的な１つ以上のガイドＲＮＡとを該バナナ植物細胞に提供することを含み、該ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ又は改変型ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ及び該１つ以上のガイドＲＮＡが、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ又は改変型ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼが、該少なくとも１つの内因性ＰＰＯ９ポリフェノールオキシダーゼ遺伝子に二本鎖切断又は一本鎖切断を導入することを可能にする複合体を形成し；
任意で、該１つ以上のガイドＲＮＡが、配列番号３８又は配列番号３９の配列を有する可変領域を含む方法を提供する。

【0087】

好ましくは、本発明は、バナナ植物又はバナナ植物細胞において、ＰＰＯ４ポリフェノールオキシダーゼ遺伝子によってコードされている少なくとも１つの内因性ＰＰＯ４ポリフェノールオキシダーゼのレベル又は活性を低下させる方法であって、該ＰＰＯ４ポリフェノールオキシダーゼ遺伝子が、（Ａ）配列番号８（ＰＰＯ４）若しくは配列番号８に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドのコード配列を含むか；（Ｂ）配列番号４３（ＰＰＯ４）若しくは配列番号４３に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチドのポリフェノールオキシダーゼをコードしているか；又は（Ｃ）配列番号１５４（ＰＰＯ４）のポリヌクレオチド配列若しくは配列番号１５４に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含み；
該方法が、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ又は改変型ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼと、該少なくとも１つのＰＰＯ４ポリフェノールオキシダーゼ遺伝子に特異的な１つ以上のガイドＲＮＡとを該バナナ植物細胞に提供することを含み、該ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ又は改変型ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ及び該１つ以上のガイドＲＮＡが、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ又は改変型ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼが、該少なくとも１つの内因性ＰＰＯ４ポリフェノールオキシダーゼ遺伝子に二本鎖切断又は一本鎖切断を導入することを可能にする複合体を形成し；
任意で、該１つ以上のガイドＲＮＡが、配列番号７６又は配列番号７７の配列を有する可変領域を含む方法を提供する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用するためには、ｇＲＮＡ及びＣａｓの両方が標的細胞内になければならない又はリボ核タンパク質複合体として送達されなければならない。幾つかの実施形態によれば、Ｃａｓ／改変Ｃａｓ及び少なくとも１つのｇＲＮＡは、Ｃａｓ／改変Ｃａｓ及び／又は少なくとも１つのｇＲＮＡを発現する１つ以上のベクターを導入することによってバナナ細胞に提供される。挿入ベクターは１つのプラスミド上に両方のカセットを含有し得る、又はカセットは２つの別々のプラスミドから発現される。ＣＲＩＳＰＲプラスミドは市販されている（Ａｄｄｇｅｎｅ製のｐｘ３３０プラスミド等）。植物ゲノムを改変するためのクラスタ化された規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）ガイドＲＮＡ技術及びＣａｓエンドヌクレアーゼの使用は、少なくともＳｖｉｔａｓｈｅｖ ｅｔ ａｌ．（２０１５），Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，１６９（２）：９３１－９４５；Ｋｕｍａｒ ａｎｄ Ｊａｉｎ，２０１５，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｂｏｔａｎｙ，６６：４７－５７；及び米国特許出願公開第２０１５００８２４７８号に開示されており、これらは、全体が参照により本明細書に具体的に援用される。

【0088】

幾つかの実施形態においては、本発明の方法は、少なくとも１つの内因性ポリフェノールオキシダーゼ遺伝子の改変を含む少なくとも１つのバナナ植物細胞を同定することを更に含む。幾つかの実施形態においては、本発明の方法は、少なくとも１つの内因性ポリフェノールオキシダーゼ遺伝子の改変を含む少なくとも１つのバナナ植物細胞を同定することを更に含み、該改変は、少なくとも１つのヌクレオチド挿入；少なくとも１つのヌクレオチド欠失；少なくとも１つのヌクレオチド置換；及び前述の任意の組み合わせからなる群から選択される。これら実施形態の幾つかにおいては、少なくとも１つの内因性ポリフェノールオキシダーゼ遺伝子は、ＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ３、ＰＰＯ４、ＰＰＯ５、ＰＰＯ６、ＰＰＯ７、ＰＰＯ８、及びＰＰＯ９からなる群から選択される。幾つかの実施形態においては、少なくとも１つの内因性ポリフェノールオキシダーゼ遺伝子は、ＰＰＯ１遺伝子である。幾つかの実施形態においては、少なくとも１つの内因性ポリフェノールオキシダーゼ遺伝子は、ＰＰＯ２遺伝子である。幾つかの実施形態においては、少なくとも１つの内因性ポリフェノールオキシダーゼ遺伝子は、ＰＰＯ３遺伝子である。幾つかの実施形態においては、少なくとも１つの内因性ポリフェノールオキシダーゼ遺伝子は、ＰＰＯ４遺伝子である。幾つかの実施形態においては、少なくとも１つの内因性ポリフェノールオキシダーゼ遺伝子は、ＰＰＯ５遺伝子である。幾つかの実施形態においては、少なくとも１つの内因性ポリフェノールオキシダーゼ遺伝子は、ＰＰＯ６遺伝子である。幾つかの実施形態においては、少なくとも１つの内因性ポリフェノールオキシダーゼ遺伝子は、ＰＰＯ７遺伝子である。幾つかの実施形態においては、少なくとも１つの内因性ポリフェノールオキシダーゼ遺伝子は、ＰＰＯ８遺伝子である。幾つかの実施形態においては、少なくとも１つの内因性ポリフェノールオキシダーゼ遺伝子は、ＰＰＯ９遺伝子である。幾つかの実施形態においては、内因性ポリフェノールオキシダーゼ遺伝子は、ＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ３、ＰＰＯ４、ＰＰＯ５、ＰＰＯ６、ＰＰＯ７、ＰＰＯ８、及びＰＰＯ９の遺伝子のうちの２つ以上である。幾つかの実施形態においては、内因性ポリフェノールオキシダーゼ遺伝子は、ＰＰＯ１及びＰＰＯ２の遺伝子である。

【0089】

本明細書で使用するとき、「同定」は、ＤＮＡシーケンシング（例えば、次世代シーケンシング）、電気泳動、酵素ベースのミスマッチ検出アッセイ、並びにＰＣＲ、ＲＴ－ＰＣＲ、ＲＮａｓｅ保護、インサイチュハイブリダイゼーション、プライマー伸長、サザンブロット、ノーザンブロット、及びドットブロット分析等のハイブリダイゼーションアッセイ等であるがこれらに限定されない、少なくとも１つのヌクレオチド挿入；少なくとも１つのヌクレオチド検出；少なくとも１つのヌクレオチド置換；及び前述の任意の組み合わせからなる群から選択される改変又は編集イベントを検出することができる、当技術分野で公知の任意の技術を含み得る。また、一塩基多型（ＳＮＰ）を検出するために使用される様々な方法、例えば、ＰＣＲベースのＴ７エンドヌクレアーゼ、ヘテロ二重鎖、及びサンガーシーケンシングを用いてもよい。ＤＮＡ編集イベント（挿入－欠失イベント（すなわち、「インデル」）等）の存在を検証する別の方法は、ミスマッチＤＮＡを認識し、切断する構造選択的酵素（例えば、エンドヌクレアーゼ）を利用するミスマッチ切断アッセイを含む。ミスマッチ切断アッセイは、インデルを検出するための簡便で費用効率の高い方法であるので、ゲノム編集によって誘導された変異を検出するための典型的な手順である。このアッセイは、複数のヌクレオチドによって形成されるミスマッチ及びヘリックス外ループでヘテロ二重鎖ＤＮＡを切断し、２つ以上の小さな断片を生成する酵素を用いる。得られる断片のサイズが異なり、従来のゲル電気泳動又は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって容易に分離することができるように、予測されるヌクレアーゼ切断部位が中心から外れている約３００～１０００ｂｐのＰＣＲ産物が生成される。末端が標識された消化産物は、自動化されたゲル又はキャピラリー電気泳動によって分析することもできる。遺伝子座におけるインデルの頻度は、ＰＣＲアンプリコン及び切断されたＤＮＡバンドの積分強度を測定することによって推定することができる。消化工程は１５～６０分間かかり、ＤＮＡ調製及びＰＣＲ工程を加えると、アッセイ全体を３時間以内に完了することができる。このアッセイには通常２種の別の酵素が用いられる。Ｔ７エンドヌクレアーゼ１（Ｔ７Ｅ１）は、不完全にマッチしているＤＮＡをミスマッチの上流の１番目、２番目、又は３番目のホスホジエステル結合で認識し切断するリゾルバーゼである。Ｔ７Ｅ１ベースのアッセイの感度は０．５～５％である。対照的に、Ｓｕｒｖｅｙｏｒ（商標）ヌクレアーゼ（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ Ｉｎｃ．，Ｏｍａｈａ，ＮＥ，ＵＳＡ）は、セロリ由来のミスマッチ特異的ヌクレアーゼのＣＥＬファミリーのメンバーである。それは、一塩基多型（ＳＮＰ）又は小さなインデルの存在に起因するミスマッチを認識して切断し、ミスマッチの下流のＤＮＡ鎖を両方とも切断する。それは、最大１２ヌクレオチドのインデルを検出することができ、約３％、すなわち３２コピーに１コピーもの低頻度で存在する変異に対して感受性である。編集イベントの存在を検証する更に別の方法は、高分解能融解分析を含む。高分解能融解解析（ＨＲＭＡ）は、蛍光色素を組み込んだリアルタイムＰＣＲによってゲノム標的にまたがるＤＮＡ配列（９０～２００ｂｐ）を増幅し、その後アンプリコンの融解曲線を解析することを含む。ＨＲＭＡは、熱変性中に二本鎖ＤＮＡから挿入色素が放出される際の蛍光の消失に基づく。アンプリコンの温度依存性変性プロファイルを記録し、融解プロセスに１つ以上の分子種が関与しているかどうかを検出する。更に別の方法は、ヘテロ二重鎖移動度アッセイである。再ハイブリダイズしたＰＣＲ断片を直接ネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）で分析することによって変異を検出することもできる。この方法は、ポリアクリルアミドゲルにおけるヘテロ二重鎖ＤＮＡとホモ二重鎖ＤＮＡとの移動の違いを利用する。インデルによって生じるマッチＤＮＡ鎖とミスマッチＤＮＡ鎖との間の角度は、ヘテロ二重鎖ＤＮＡがネイティブ条件下でホモ二重鎖ＤＮＡよりも著しく遅い速度で移動することを意味し、両者は移動度に基づいて容易に区別することができる。１４０～１７０ｂｐの断片は１５％ポリアクリルアミドゲルで分離することができる。このようなアッセイの感度は、最適条件下では０．５％に近づくことができ、これはＴ７Ｅ１と同様である。ＰＣＲ産物を再アニーリングした後、アッセイの電気泳動工程に約２時間かかる。編集イベントの存在を検証する他の方法については、Ｚｉｓｃｈｅｗｓｋｉ（２０１７），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｄｖａｎｃｅｓ １（１）：９５－１０４に詳しく記載されている。

【0090】

本発明の幾つかの実施形態においては、１つ以上のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、１つ以上のプロモータに動作可能に連結された該１つ以上のガイドＲＮＡをコードしている１つ以上の組換えＤＮＡコンストラクト内でバナナ植物細胞に提供される。本発明の実施形態において有用なＤＮＡコンストラクトは、当業者に周知の組換えＤＮＡ技術を用いて構築することができる。そのようなＤＮＡコンストラクトは、市販されており、植物への形質転換に好適であり、かつ形質転換された細胞において関心対象の遺伝子を発現させるのに好適であり得る。

【0091】

本明細書で使用するとき、「プロモータ」は、植物で発現可能である、すなわち、植物の細胞、組織、又は器官において発現を誘導、付与、活性化、又は増強することができる。本発明の方法において有用なプロモータの例としては、アクチン、ＣＡＮＶ ３５Ｓ、ＣａＭＶ１９Ｓ、ＧＯＳ２が挙げられるが、これらに限定されない。様々な組織又は発生段階で活性のあるプロモータを使用することもできる。本明細書における実施形態のいずれかにおいては、ＰＰＯポリヌクレオチド配列は、植物発現のために最適化され得る。このような配列改変の例としては、バナナで通常みられるものにより近づけるためにＧ／Ｃ含量を変化させること及び一般的に植物種では通常みられないコドンを除去すること（コドンの最適化と呼ばれる）等が挙げられるが、これらに限定されない。バナナ植物細胞は、本発明の実施形態のＤＮＡコンストラクトで安定的又は一過的に形質転換され得る。安定的な形質転換では、ＰＰＯポリヌクレオチドが植物のゲノムに組み込まれるので、安定的かつ遺伝性の形質を表す。一過的な形質転換では、ＰＰＯポリヌクレオチドは、形質転換された細胞で発現するが、ゲノムには組み込まれない（従って、一過的な形質を表す）。幾つかの実施形態においては、ＤＮＡコンストラクト中のプロモータは、Ｐｏｌ３プロモータを含む。Ｐｏｌ３プロモータの例としては、ＡｔＵ６－２９、ＡｔＵ６２６、ＡｔＵ３Ｂ、ＡｔＵ３ｄ、及びＴａＵ６が挙げられるが、これらに限定されない。幾つかの実施形態においては、ＤＮＡコンストラクト中のプロモータは、Ｐｏｌ２プロモータを含む。Ｐｏｌ２プロモータの例としては、ＣａＭＶ ３５Ｓ、ＣａＭＶ １９Ｓ、ユビキチン、ＣＶＭＶが挙げられるが、これらに限定されない。幾つかの実施形態においては、ＤＮＡコンストラクト中のプロモータは、３５Ｓプロモータを含む。幾つかの実施形態においては、ＤＮＡコンストラクト中のプロモータは、Ｕ６プロモータを含む。幾つかの実施形態においては、ＤＮＡコンストラクト中のプロモータは、少なくとも１つのｇＲＮＡをコードしている核酸剤に動作可能に連結されたＰｏｌ３プロモータ（Ｕ６等）並びに／又はＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ及び／若しくは選択マーカー遺伝子をコードしている核酸配列に動作可能に連結されたＰｏｌ２プロモータ（ＣａｍＶ３５Ｓ等）を含む。このＤＮＡコンストラクトは、アグロバクテリウムによって媒介される形質転換による一過的な発現に有用であり得る（Ｈｅｌｅｎｓ ｅｔ ａｌ．（２００５），Ｐｌａｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ １：１３）。幾つかの実施形態においては、ＤＮＡコンストラクト中に含まれる核酸配列は、バナナゲノムへの組み込みを回避するために、バナナ植物細胞のゲノムに対して相同な配列（任意のガイド配列以外）を含まない。幾つかの実施形態においては、ＤＮＡコンストラクトは、選択マーカーをコードしている核酸配列も非組み込み性である場合等、非組み込み性コンストラクトである。本明細書で使用するとき、「非組み込み性」とは、関心対象の植物のゲノムへのコンストラクト又は配列の組み込みを促進するように積極的に設計されてはいないＤＮＡコンストラクト又は配列を指す。例えば、アグロバクテリウムによって媒介される遺伝子形質転換のための機能的Ｔ－ＤＮＡベクター系は、植物ゲノムに組み込まれるように積極的に設計されているので、非組み込み性ベクター系ではない。同様に、選択マーカー遺伝子配列のバナナゲノムへの相同組換えを促進するために関心対象の植物のゲノムに対して相同な隣接配列を有する選択マーカー遺伝子配列は、非組み込み性選択マーカー配列ではない。

【0092】

本発明の状況においては、様々なクローニングキットを使用することができる。本明細書で使用するとき、「ＤＮＡコンストラクト」はバイナリーベクターであってもよい。バイナリーベクターの例は、ｐＢＩＮ１９、ｐＢＩ１０１、ｐＢｉｎＡＲ、ｐＧＰＴＶ、ｐＣＡＭＢＩＡ、ｐＢＩＢ－ＨＹＧ、ｐＢｅｃｋｓ、ｐＧｒｅｅｎ、又はｐＰＺＰである（Ｈａｊｕｋｉｅｗｉｃｚ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２５，９８９（１９９４）及びＨｅｌｌｅｎｓ ｅｔ ａｌ．Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ ５，４４６（２０００））。ＤＮＡ送達の他の方法（例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション、微粒子銃、及びウイルス接種）において本発明の状況で使用することができる他のベクターの例は、ｐＧＥ－ｓｇＲＮＡ（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ２０１６ ７：１２６９７）、ｐＪＩＴ１６３－Ｕｂｉ－Ｃａｓ９（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２００４，３２，９４７－９５１）、ｐＩＣＨ４７７４２：：２ｘ３５Ｓ－５’ＵＴＲ－ｈＣａｓ９（ＳＴＯＰ）－ＮＯＳＴ（Ｂｅｌｈａｎ ｅｔ ａｌ．Ｐｌａｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０１３，１１；９（１）：３９）である。

【0093】

他の実施形態においては、該ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ若しくは改変型ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ及び／又は１つ以上のガイドＲＮＡは、ＲＮＡの形態でバナナ植物細胞に提供される。更に他の実施形態においては、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ又は改変型ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、タンパク質の形態でバナナ植物細胞に提供され、１つ以上のガイドＲＮＡは、ＲＮＡの形態で該バナナ植物細胞に提供される。幾つかの実施形態においては、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ又は改変型ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ及び１つ以上のガイドＲＮＡは、リボ核タンパク質複合体としてバナナ植物細胞に提供される。

【0094】

ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド、及び／若しくはタンパク質、又は核酸とペプチドとの組み合わせを植物細胞に導入する方法は多数存在する。これらとしては、例えば、プロトプラスト形質転換（米国特許第５，５０８，１８４号）；乾燥／阻害によって媒介されるＤＮＡの取り込み（Ｐｏｔｒｙｋｕｓ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１９９：１８３－８）；エレクトロポレーション（米国特許第５，３８４，２５３号）；炭化ケイ素繊維と共に撹拌する（米国特許第５，３０２，５２３号及び同第５，４６４，７６５号）；アグロバクテリウムによって媒介される形質転換（米国特許第５，５６３，０５５号、同第５，５９１，６１６号、第５，６９３，５１２号、同第５，８２４，８７７号、同第５，９８１，８４０号、及び同第６，３８４，３０１号）；ＤＮＡでコーティングされた粒子の加速（米国特許第５，０１５，５８０号、第５，５５０，３１８号、第５，５３８，８８０号、第６，１６０，２０８号、第６，３９９，８６１号、及び第６，４０３，８６５号）、並びにナノ粒子、ナノキャリア、及び細胞透過性ペプチド（国際公開第２０１１２６６４４Ａ２号；同第２００９０４６３８４Ａ１号；同第２００８１４８２２３Ａ１号）が挙げられる。トランスフェクションの他の方法としては、トランスフェクション試薬（例えば、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、デンドリマー（Ｋｕｋｏｗｓｋａ－Ｌａｔａｌｌｏ，Ｊ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．（１９９６），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３，４８９７－９０２）、細胞透過性ペプチド（Ｍａｅ ｅｔ ａｌ．（２００５），“Ｉｎｔｅｒｎａｌｉｓａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌ－ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｎｔｏ ｔｏｂａｃｃｏ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ”，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １６６９（２）：１０１－７）、又はポリアミン（Ｚｈａｎｇ ａｎｄ Ｖｉｎｏｇｒａｄｏｖ（２０１０），“Ｓｈｏｒｔ ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ ｐｏｌｙａｍｉｎｅｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｎｄ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｂｒａｉｎ ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ”，Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ，１４３（３）：３５９－３６６）の使用が挙げられる。

【0095】

本発明の幾つかの実施形態においては、エンドヌクレアーゼ、１つ以上のガイドＲＮＡ、及び／又は１つ以上の組換えＤＮＡコンストラクトは、微粒子銃又は遺伝子銃を用いてバナナ植物細胞に提供される。他の実施形態においては、エンドヌクレアーゼ、１つ以上のガイドＲＮＡ、及び／又は１つ以上の組換えＤＮＡコンストラクトは、アグロバクテリウム形質転換を用いてバナナ植物細胞に提供される。更に他の実施形態においては、エンドヌクレアーゼ、１つ以上のガイドＲＮＡ、及び／又は１つ以上の組換えＤＮＡコンストラクトは、プロトプラストトランスフェクションを用いてバナナ植物細胞に提供される。更に他の実施形態においては、エンドヌクレアーゼ、１つ以上のガイドＲＮＡ、及び／又は１つ以上の組換えＤＮＡコンストラクトは、エレクトロポレーションを用いてバナナ植物細胞に提供される。更に他の実施形態においては、エンドヌクレアーゼ、１つ以上のガイドＲＮＡ、及び／又は１つ以上の組換えＤＮＡコンストラクトは、ナノ粒子によって媒介されるトランスフェクションを用いてバナナ植物細胞に提供される。幾つかの実施形態においては、エンドヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドとしてバナナ植物細胞に提供される。これら実施形態の幾つかにおいては、エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼであり、ポリヌクレオチドは、Ｃａｓ９ポリペプチドをコードしているＣａｓ９ポリヌクレオチドである。幾つかの実施形態においては、１つ以上のガイドＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ又は改変型ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ又は改変型ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ、少なくとも１つの選択マーカー遺伝子、及び１つ以上のガイドＲＮＡをコードしている１つ以上のプラスミドのアグロバクテリウム形質転換を介してバナナ植物細胞に提供される。

【0096】

本発明の実施形態のいずれかにおいては、１つ以上のガイドＲＮＡは、配列番号３２～３９及び５７～９７；並びに前述の任意の組み合わせからなる群から選択される配列を有する可変領域を含む。本発明の幾つかの実施形態においては、１つ以上のガイドＲＮＡは、配列番号１８０～１９６、１９９～２０２、及び２０７～２２５；並びに前述の任意の組み合わせからなる群から選択される配列を有する可変領域を含む。本発明の実施形態のいずれかにおいては、１つ以上のガイドＲＮＡは、配列番号３２；配列番号３３；配列番号３４；配列番号３５；配列番号３６；配列番号３７；配列番号５７；配列番号５８；配列番号３８；配列番号３９；配列番号６２；配列番号７６；配列番号７７；並びに前述の任意の組み合わせからなる群から選択される配列を有する可変領域を含む。本発明の幾つかの実施形態においては、該１つ以上のガイドＲＮＡは、配列番号３２及び３３；配列番号３４及び３５；配列番号３２及び３４；配列番号３２及び３５；配列番号３３及び３４；配列番号３３及び３５；配列番号５７及び５８；配列番号３８及び３９；配列番号６２及び３３；並びに配列番号７６及び７７からなる群から選択される可変領域を含む一対のガイドＲＮＡである。

【0097】

本発明の幾つかの実施形態においては、バナナ植物細胞は、プロトプラストである、胚形成細胞である、及び／又は胚形成細胞懸濁液に含まれる。

【0098】

本発明は更に、前述の本発明の方法のいずれか１つによって得ることができるバナナ植物細胞を提供する。

【0099】

本発明の幾つかの実施形態においては、方法は、該バナナ植物細胞からバナナ植物を再生することを更に含む。

【0100】

本明細書で使用するとき、「再生」は、まずバナナ植物細胞（プロトプラストを含む）をカルスに発達する群に成長させ、続いて植物組織培養法を使用してカルスからシュートを再生する（カウロジェネシス（ｃａｕｌｏｇｅｎｅｓｉｓ））ことにより、バナナ植物細胞をバナナ植物全体に成長させることを含み得る。バナナプロトプラストをカルスに成長させ、その後シュートを再生させるには、カスタマイズしなければならない組織培養培地中の植物成長調節物質の適切なバランスを必要とする。また、プロトプラスト融合と呼ばれる技術を用いて、プロトプラストを植物の育種に使用することもできる。電界又はポリエチレングリコールの溶液を用いることによって、異なる種由来のプロトプラストの融合を誘導する。この技術は、組織培養で体細胞ハイブリッドを生成するために使用することができる。プロトプラストを再生させる方法は、当技術分野で周知である。幾つかの要因、すなわち、遺伝子型、ドナー組織及びその前処理、プロトプラストを単離するための酵素処理、プロトプラストの培養方法、培養、培養培地、並びに物理的環境が、プロトプラストの単離、培養、及び再生に影響を与える（Ｍａｈｅｓｈｗａｒｉ ｅｔ ａｌ．（１９８６），“Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ ａｎｄ ｏｆ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌｓ”：３－３６．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎを参照）。再生されたバナナを選抜に供してよい。バナナ植物又はその細胞は、導入遺伝子を有しない、すなわち「非トランスジェニック」であり得る。例えば、バナナ植物は、本発明の実施形態の幾つかで使用されるようなＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のいずれかをコードしているＤＮＡコンストラクトのいずれも有していなくてよい。幾つかの実施形態によれば、成体植物に成長及び再生させるバナナ細胞に対して遺伝子編集等の遺伝子操作を行う場合、これら細胞で発現し、胚形成及び／又は再生に悪影響を及ぼす可能性のある遺伝子を編集しないことが好ましい。理論にも機序にも房縛されることを望むものではないが、果肉及び／又は果皮で発現するが胚細胞では発現しないＰＰＯ遺伝子、例えばＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ８、ＰＰＯ９、又はＰＰＯ４の発見により、植物の再生に影響を与えることなく胚細胞を編集することが可能になる。

【0101】

実施形態の幾つかにおいては、本発明の方法は、該バナナ植物から果実を収穫することを更に含む。各成体バナナ植物は房を１つ生産し、該房は多くのバナナの果実、すなわち「果指」によって形成され、果指が房状の幾つかの「果段」になっている。これに関して、「収穫」は従来の意味を有する。例えば、鋭利な湾曲ナイフ又はナタを使用して、手作業（通常２～３人）でバナナの房をカットする。収穫は、通常、バナナの果実が成熟する７～１４日前の、まだ緑色で硬い時期に行われる。

【0102】

本発明は更に、前述の方法によって得ることができるバナナの植物又は植物部位を提供する。

【0103】

本発明の前述の方法によって得ることができるバナナ植物から収穫された果実であって、該果実の果肉及び／又は果皮が、該少なくとも１つの内因性ポリフェノールオキシダーゼ（ＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ３、ＰＰＯ４、ＰＰＯ５、ＰＰＯ６、ＰＰＯ７、ＰＰＯ８、及びＰＰＯ９からなる群から選択される）のレベル又は活性が低下していないバナナ植物の果肉及び／又は果皮と比較して褐変が遅延及び／又は低減する表現型を特徴とする果実が、本発明により更に提供される。

【0104】

幾つかの実施形態によれば、本発明の前述の方法によって得ることができるバナナ植物から収穫された果実であって、該果実の果肉及び／又は果皮が、該少なくとも１つの内因性ポリフェノールオキシダーゼ（ＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ８、ＰＰＯ９、及びＰＰＯ４からなる群から選択される）のレベル又は活性が低下していないバナナ植物の果肉及び／又は果皮と比較して褐変が遅延及び／又は低減する表現型を特徴とする果実が、本明細書において提供される。

【0105】

本発明は更に、野生型バナナ植物と比較して果肉及び／又は果皮の褐変が遅延及び／又は低減する表現型を特徴とするバナナ植物を作出する方法であって、バナナ植物細胞に、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ又は改変型ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ及び１つ以上のガイドＲＮＡを提供することであって、該ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ又は改変型ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ及び１つ以上のガイドＲＮＡが、ＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ３、ＰＰＯ４、ＰＰＯ５、ＰＰＯ６、ＰＰＯ７、ＰＰＯ８、及びＰＰＯ９からなる群から選択される少なくとも１つの内因性ポリフェノールオキシダーゼ遺伝子に該ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ又は改変型ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼが一本鎖切断又は二本鎖切断を導入することを可能にする複合体を形成することと；ＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ３、ＰＰＯ４、ＰＰＯ５、ＰＰＯ６、ＰＰＯ７、ＰＰＯ８、及びＰＰＯ９からなる群から選択される少なくとも１つの内因性ポリフェノールオキシダーゼ遺伝子の改変を含む少なくとも１つのバナナ植物細胞を同定することであって、該改変が、少なくとも１つのヌクレオチド挿入；少なくとも１つのヌクレオチド欠失；少なくとも１つのヌクレオチド置換；又は前述の任意の組み合わせからなる群から選択されることと；該バナナ植物細胞からバナナ植物を再生することであって、該バナナ植物が、野生型バナナ植物と比較して果肉及び／又は果皮の褐変が遅延及び／又は低減する表現型を特徴とすることと、を含む方法を提供する。幾つかの実施形態においては、方法は、該バナナ植物から果実を収穫することを更に含み、該果実は、少なくとも１つの内因性ポリフェノールオキシダーゼのレベル又は活性が低下も喪失もしていないバナナ植物の果実と比較して褐変が遅延及び／又は低減する表現型を特徴とする。

【0106】

本発明は更に、少なくとも１つの改変された内因性ポリフェノールオキシダーゼ遺伝子をそのゲノム中に含むバナナ植物又は植物部位であって、該改変の結果、該改変された内因性ポリフェノールオキシダーゼ遺伝子によってコードされている少なくとも１つの内因性ポリフェノールオキシダーゼの機能が低下又は喪失し、該改変が、少なくとも１つの内因性ポリフェノールオキシダーゼ遺伝子に位置するバナナ植物又は植物部位を提供する。

【0107】

前述の方法、バナナ植物、又はバナナ植物部位の幾つかの実施形態においては、少なくとも１つの内因性ポリフェノールオキシダーゼ遺伝子は、ＰＰＯ１遺伝子である。幾つかの実施形態においては、少なくとも１つの内因性ポリフェノールオキシダーゼ遺伝子は、ＰＰＯ２遺伝子である。幾つかの実施形態においては、少なくとも１つの内因性ポリフェノールオキシダーゼ遺伝子は、ＰＰＯ３遺伝子である。幾つかの実施形態においては、少なくとも１つの内因性ポリフェノールオキシダーゼ遺伝子は、ＰＰＯ４遺伝子である。幾つかの実施形態においては、少なくとも１つの内因性ポリフェノールオキシダーゼ遺伝子は、ＰＰＯ５遺伝子である。幾つかの実施形態においては、少なくとも１つの内因性ポリフェノールオキシダーゼ遺伝子は、ＰＰＯ６遺伝子である。幾つかの実施形態においては、少なくとも１つの内因性ポリフェノールオキシダーゼ遺伝子は、ＰＰＯ７遺伝子である。幾つかの実施形態においては、少なくとも１つの内因性ポリフェノールオキシダーゼ遺伝子は、ＰＰＯ８遺伝子である。幾つかの実施形態においては、少なくとも１つの内因性ポリフェノールオキシダーゼ遺伝子は、ＰＰＯ９遺伝子である。幾つかの実施形態においては、内因性ポリフェノールオキシダーゼ遺伝子は、ＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ３、ＰＰＯ４、ＰＰＯ５、ＰＰＯ６、ＰＰＯ７、ＰＰＯ８、及びＰＰＯ９の遺伝子のうちの２つ以上である。幾つかの実施形態においては、内因性ポリフェノールオキシダーゼ遺伝子は、ＰＰＯ１及びＰＰＯ２の遺伝子である。前述の方法、バナナ植物、又はバナナ植物部位の特定の実施形態においては、ＰＰＯ１遺伝子は、配列番号５に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するコード配列を含む；ＰＰＯ２遺伝子は、配列番号６に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するコード配列を含む；ＰＰＯ３遺伝子は、配列番号７に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するコード配列を含む；ＰＰＯ４遺伝子は、配列番号８に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するコード配列を含む；ＰＰＯ５遺伝子は、配列番号９に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するコード配列を含む；ＰＰＯ６遺伝子は、配列番号１０に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するコード配列を含む；ＰＰＯ７遺伝子は、配列番号１１に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するコード配列を含む；ＰＰＯ８遺伝子は、配列番号１２に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するコード配列を含む；又はＰＰＯ９遺伝子は、配列番号１３に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するコード配列を含む。前述の方法、バナナ植物、又はバナナ植物部位の特定の実施形態においては、ＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ８、ＰＰＯ９、又はＰＰＯ４のポリフェノールオキシダーゼ遺伝子ポリヌクレオチドは、配列番号５（ＰＰＯ１）又は配列番号５に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；配列番号６（ＰＰＯ２）又は配列番号６に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；配列番号１２（ＰＰＯ８）又は配列番号１２に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；配列番号１３（ＰＰＯ９）又は配列番号１３に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；及び配列番号８（ＰＰＯ４）又は配列番号８に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドからなる群から選択されるコード配列を含む。

【0108】

前述の方法、バナナ植物、又はバナナ植物部位の特定の実施形態においては、ＰＰＯ１遺伝子は、配列番号４０に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するポリフェノールオキシダーゼをコードしている；ＰＰＯ２遺伝子は、配列番号４１に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するポリフェノールオキシダーゼをコードしている；ＰＰＯ３遺伝子は、配列番号４２に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するポリフェノールオキシダーゼをコードしている；ＰＰＯ４遺伝子は、配列番号４３に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するポリフェノールオキシダーゼをコードしている；ＰＰＯ５遺伝子は、配列番号４４に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するポリフェノールオキシダーゼをコードしている；ＰＰＯ６遺伝子は、配列番号４５に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するポリフェノールオキシダーゼをコードしている；ＰＰＯ７遺伝子は、配列番号４６に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するポリフェノールオキシダーゼをコードしている；ＰＰＯ８遺伝子は、配列番号４７に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するポリフェノールオキシダーゼをコードしている；又はＰＰＯ９遺伝子は、配列番号４８に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するポリフェノールオキシダーゼをコードしている。前述の方法、バナナ植物、又はバナナ植物部位の特定の実施形態においては、ＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ８、又はＰＰＯ９のポリフェノールオキシダーゼ遺伝子は、配列番号４０（ＰＰＯ１）又は配列番号４０に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；配列番号４１（ＰＰＯ２）又は配列番号４１に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；配列番号４７（ＰＰＯ８）又は配列番号４７に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；配列番号４８（ＰＰＯ９）又は配列番号４８に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；及び配列番号４３（ＰＰＯ４）又は配列番号４３に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチドからなる群から選択されるポリフェノールオキシダーゼをコードしている。

【0109】

前述の方法、バナナ植物、又はバナナ植物部位の特定の実施形態においては、ＰＰＯ１遺伝子は、配列番号１５１に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む；ＰＰＯ２遺伝子は、配列番号１５２に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む；ＰＰＯ３遺伝子は、配列番号１５３に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む；ＰＰＯ４遺伝子は、配列番号１５４に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む；ＰＰＯ５遺伝子は、配列番号１５５に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む；ＰＰＯ６遺伝子は、配列番号１５６に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む；ＰＰＯ７遺伝子は、配列番号１５７に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む；ＰＰＯ８遺伝子は、配列番号１５８に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む；又はＰＰＯ９遺伝子は、配列番号１５９に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む。前述の方法、バナナ植物、又はバナナ植物部位の特定の実施形態においては、ＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ８、ＰＰＯ９、又はＰＰＯ４のポリフェノールオキシダーゼ遺伝子は、配列番号１５１（ＰＰＯ１）又は配列番号１５１に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；配列番号１５２（ＰＰＯ２）又は配列番号１５２に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；配列番号１５８（ＰＰＯ８）又は配列番号１５８に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；配列番号１５９（ＰＰＯ９）又は配列番号１５９に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；及び配列番号１５４（ＰＰＯ４）又は配列番号１５４に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。

【0110】

幾つかの実施形態においては、本発明のバナナの植物又は植物部位は非トランスジェニックである。例えば、本発明のバナナの植物又は植物部位は、本発明の実施形態の幾つかで使用されるようなＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のいずれかをコードしているＤＮＡコンストラクトのいずれも有していなくてよい。

【0111】

本発明の実施形態のいずれかのバナナ植物から収穫されたバナナ果実であって、該果実が、ＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ３、ＰＰＯ４、ＰＰＯ５、ＰＰＯ６、ＰＰＯ７、ＰＰＯ８、及びＰＰＯ９からなる群から選択される該少なくとも１つの内因性ポリフェノールオキシダーゼのレベル又は活性が低下していないバナナ植物の果実と比較して褐変が遅延及び／又は低減する表現型を特徴とする果実が、本発明により更に提供される。

【0112】

本発明は更に、バナナ果実食品を得る方法であって、本発明のバナナ果実を加工することを含む方法を提供する。幾つかの実施形態においては、バナナ果実食品は、増粘剤、着色料、又は香料である。また、家畜の飼料、天然繊維、並びに天然の生物活性化合物及び生物肥料の供給源も企図される。

【0113】

本発明は更に、バナナポリフェノールオキシダーゼポリヌクレオチドを含むＤＮＡ配列を提供する。

【0114】

バナナポリフェノールオキシダーゼポリヌクレオチドを含むＤＮＡコンストラクト又はベクターが、本発明により更に提供される。

【0115】

本発明は更に、バナナポリフェノールオキシダーゼポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換された植物細胞を提供する。これら実施形態の幾つかにおいては、植物細胞は、バナナ植物細胞である。

【0116】

ポリフェノールオキシダーゼタンパク質が、本発明により更に提供される。幾つかの実施形態においては、ポリフェノールオキシダーゼタンパク質は、ＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ３、ＰＰＯ４、ＰＰＯ５、ＰＰＯ６、ＰＰＯ７、ＰＰＯ８、及びＰＰＯ９からなる群から選択される。幾つかの実施形態においては、ポリフェノールオキシダーゼタンパク質は、配列番号５に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列によってコードされている。幾つかの実施形態においては、ポリフェノールオキシダーゼタンパク質は、配列番号６に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列によってコードされている。幾つかの実施形態においては、ポリフェノールオキシダーゼタンパク質は、配列番号７に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列によってコードされている。幾つかの実施形態においては、ポリフェノールオキシダーゼタンパク質は、配列番号８に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列によってコードされている。幾つかの実施形態においては、ポリフェノールオキシダーゼタンパク質は、配列番号９に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列によってコードされている。幾つかの実施形態においては、ポリフェノールオキシダーゼタンパク質は、配列番号１０に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列によってコードされている。幾つかの実施形態においては、ポリフェノールオキシダーゼタンパク質は、配列番号１１に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列によってコードされている。幾つかの実施形態においては、ポリフェノールオキシダーゼタンパク質は、配列番号１２に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列によってコードされている。幾つかの実施形態においては、ポリフェノールオキシダーゼタンパク質は、配列番号１３に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列によってコードされている。幾つかの実施形態においては、ポリフェノールオキシダーゼタンパク質は、配列番号４０に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する配列を含む。幾つかの実施形態においては、ポリフェノールオキシダーゼタンパク質は、配列番号４１に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する配列を含む。幾つかの実施形態においては、ポリフェノールオキシダーゼタンパク質は、配列番号４２に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する配列を含む。幾つかの実施形態においては、ポリフェノールオキシダーゼタンパク質は、配列番号４３に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する配列を含む。幾つかの実施形態においては、ポリフェノールオキシダーゼタンパク質は、配列番号４４に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する配列を含む。幾つかの実施形態においては、ポリフェノールオキシダーゼタンパク質は、配列番号４５に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する配列を含む。幾つかの実施形態においては、ポリフェノールオキシダーゼタンパク質は、配列番号４６に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する配列を含む。幾つかの実施形態においては、ポリフェノールオキシダーゼタンパク質は、配列番号４７に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する配列を含む。幾つかの実施形態においては、ポリフェノールオキシダーゼタンパク質は、配列番号４８に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する配列を含む。幾つかの実施形態においては、ポリフェノールオキシダーゼタンパク質は、配列番号１５１に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列によってコードされている。幾つかの実施形態においては、ポリフェノールオキシダーゼタンパク質は、配列番号１５２に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列によってコードされている。幾つかの実施形態においては、ポリフェノールオキシダーゼタンパク質は、配列番号１５３に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列によってコードされている。幾つかの実施形態においては、ポリフェノールオキシダーゼタンパク質は、配列番号１５４に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列によってコードされている。幾つかの実施形態においては、ポリフェノールオキシダーゼタンパク質は、配列番号１５５に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列によってコードされている。幾つかの実施形態においては、ポリフェノールオキシダーゼタンパク質は、配列番号１５６に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列によってコードされている。幾つかの実施形態においては、ポリフェノールオキシダーゼタンパク質は、配列番号１５７に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列によってコードされている。幾つかの実施形態においては、ポリフェノールオキシダーゼタンパク質は、配列番号１５８に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列によってコードされている。幾つかの実施形態においては、ポリフェノールオキシダーゼタンパク質は、配列番号１５９に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列によってコードされている。

【0117】

本発明は更に、植物細胞においてポリフェノールオキシダーゼを発現させる方法であって、植物細胞において活性のあるプロモータに動作可能に連結されたバナナポリフェノールオキシダーゼポリヌクレオチドを該植物細胞に導入することを含む方法を提供する。

【0118】

ＤＮＡ配列、ＤＮＡコンストラクト、ベクター、ベクターで形質転換された植物細胞、ベクターで形質転換されたバナナ植物細胞、及び植物細胞においてポリフェノールオキシダーゼを発現させる方法の実施形態の幾つかにおいては、ポリフェノールオキシダーゼポリヌクレオチドは、ＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ３、ＰＰＯ４、ＰＰＯ５、ＰＰＯ６、ＰＰＯ７、ＰＰＯ８、及びＰＰＯ９からなる群から選択される。ＤＮＡ配列、ＤＮＡコンストラクト、ベクター、ベクターで形質転換された植物細胞、ベクターで形質転換されたバナナ植物細胞、及び植物細胞においてポリフェノールオキシダーゼを発現させる方法の幾つかの実施形態においては、少なくとも１つの内因性ポリフェノールオキシダーゼポリヌクレオチドは、ＰＰＯ１ポリヌクレオチドである。幾つかの実施形態においては、ポリフェノールオキシダーゼポリヌクレオチドは、ＰＰＯ２ポリヌクレオチドである。幾つかの実施形態においては、ポリフェノールオキシダーゼポリヌクレオチドは、ＰＰＯ３ポリヌクレオチドである。幾つかの実施形態においては、ポリフェノールオキシダーゼポリヌクレオチドは、ＰＰＯ４ポリヌクレオチドである。幾つかの実施形態においては、ポリフェノールオキシダーゼポリヌクレオチドは、ＰＰＯ５ポリヌクレオチドである。幾つかの実施形態においては、ポリフェノールオキシダーゼポリヌクレオチドは、ＰＰＯ６ポリヌクレオチドである。幾つかの実施形態においては、ポリフェノールオキシダーゼポリヌクレオチドは、ＰＰＯ７ポリヌクレオチドである。幾つかの実施形態においては、ポリフェノールオキシダーゼポリヌクレオチドは、ＰＰＯ８ポリヌクレオチドである。幾つかの実施形態においては、ポリフェノールオキシダーゼポリヌクレオチドは、ＰＰＯ９ポリヌクレオチドである。幾つかの実施形態においては、ポリフェノールオキシダーゼポリヌクレオチドは、ＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ３、ＰＰＯ４、ＰＰＯ５、ＰＰＯ６、ＰＰＯ７、ＰＰＯ８、及びＰＰＯ９のポリヌクレオチドのうちの２つ以上を含む。ＤＮＡ配列、ＤＮＡコンストラクト、ベクター、ベクターで形質転換された植物細胞、ベクターで形質転換されたバナナ植物細胞、及び植物細胞においてポリフェノールオキシダーゼを発現させる方法の幾つかの実施形態においては、ポリフェノールオキシダーゼポリヌクレオチドは、ＰＰＯ１及びＰＰＯ２のポリヌクレオチドである。ＤＮＡ配列、ＤＮＡコンストラクト、ベクター、ベクターで形質転換された植物細胞、ベクターで形質転換されたバナナ植物細胞、及び植物細胞においてポリフェノールオキシダーゼを発現させる方法の特定の実施形態においては、ＰＰＯ１ポリヌクレオチドは、配列番号５に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するコード配列を含む；ＰＰＯ２ポリヌクレオチドは、配列番号６に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するコード配列を含む；ＰＰＯ３ポリヌクレオチドは、配列番号７に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するコード配列を含む；ＰＰＯ４ポリヌクレオチドは、配列番号８に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するコード配列を含む；ＰＰＯ５ポリヌクレオチドは、配列番号９に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するコード配列を含む；ＰＰＯ６ポリヌクレオチドは、配列番号１０に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するコード配列を含む；ＰＰＯ７ポリヌクレオチドは、配列番号１１に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するコード配列を含む；ＰＰＯ８ポリヌクレオチドは、配列番号１２に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するコード配列を含む；又はＰＰＯ９ポリヌクレオチドは、配列番号１３に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するコード配列を含む。ＤＮＡ配列、ＤＮＡコンストラクト、ベクター、ベクターで形質転換された植物細胞、ベクターで形質転換されたバナナ植物細胞、及び植物細胞においてポリフェノールオキシダーゼを発現させる方法の特定の実施形態においては、ＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ８、ＰＰＯ９、又はＰＰＯ４のポリフェノールオキシダーゼポリヌクレオチドは、配列番号５（ＰＰＯ１）又は配列番号５に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；配列番号６（ＰＰＯ２）又は配列番号６に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；配列番号１２（ＰＰＯ８）又は配列番号１２に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；配列番号１３（ＰＰＯ９）又は配列番号１３に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；及び配列番号８（ＰＰＯ４）又は配列番号８に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドからなる群から選択されるコード配列を含む。

【0119】

ＤＮＡ配列、ＤＮＡコンストラクト、ベクター、ベクターで形質転換された植物細胞、ベクターで形質転換されたバナナ植物細胞、及び植物細胞においてポリフェノールオキシダーゼを発現させる方法の特定の実施形態においては、ＰＰＯ１ポリヌクレオチドは、配列番号４０に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するポリフェノールオキシダーゼをコードしている；ＰＰＯ２ポリヌクレオチドは、配列番号４１に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するポリフェノールオキシダーゼをコードしている；ＰＰＯ３ポリヌクレオチドは、配列番号４２に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するポリフェノールオキシダーゼをコードしている；ＰＰＯ４ポリヌクレオチドは、配列番号４３に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するポリフェノールオキシダーゼをコードしている；ＰＰＯ５ポリヌクレオチドは、配列番号４４に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するポリフェノールオキシダーゼをコードしている；ＰＰＯ６ポリヌクレオチドは、配列番号４５に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するポリフェノールオキシダーゼをコードしている；ＰＰＯ７ポリヌクレオチドは、配列番号４６に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するポリフェノールオキシダーゼをコードしている；ＰＰＯ８ポリヌクレオチドは、配列番号４７に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するポリフェノールオキシダーゼをコードしている；又はＰＰＯ９ポリヌクレオチドは、配列番号４８に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するポリフェノールオキシダーゼをコードしている。ＤＮＡ配列、ＤＮＡコンストラクト、ベクター、ベクターで形質転換された植物細胞、ベクターで形質転換されたバナナ植物細胞、及び植物細胞においてポリフェノールオキシダーゼを発現させる方法の特定の実施形態においては、ＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ８、ＰＰＯ９、又はＰＰＯ４のポリフェノールオキシダーゼポリヌクレオチドは、配列番号４０（ＰＰＯ１）又は配列番号４０に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；配列番号４１（ＰＰＯ２）又は配列番号４１に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；配列番号４７（ＰＰＯ８）又は配列番号４７に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；配列番号４８（ＰＰＯ９）又は配列番号４８に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；及び配列番号４３（ＰＰＯ４）又は配列番号４３に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチドからなる群から選択されるポリフェノールオキシダーゼをコードしている。

【0120】

ＤＮＡ配列、ＤＮＡコンストラクト、ベクター、ベクターで形質転換された植物細胞、ベクターで形質転換されたバナナ植物細胞、及び植物細胞においてポリフェノールオキシダーゼを発現させる方法の特定の実施形態においては、ＰＰＯ１ポリヌクレオチドは、配列番号１５１に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む；ＰＰＯ２ポリヌクレオチドは、配列番号１５２に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む；ＰＰＯ３ポリヌクレオチドは、配列番号１５３に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む；ＰＰＯ４ポリヌクレオチドは、配列番号１５４に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む；ＰＰＯ５ポリヌクレオチドは、配列番号１５５に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む；ＰＰＯ６ポリヌクレオチドは、配列番号１５６に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む；ＰＰＯ７ポリヌクレオチドは、配列番号１５７に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む；ＰＰＯ８ポリヌクレオチドは、配列番号１５８に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む；又はＰＰＯ９ポリヌクレオチドは、配列番号１５９に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む。ＤＮＡ配列、ＤＮＡコンストラクト、ベクター、ベクターで形質転換された植物細胞、ベクターで形質転換されたバナナ植物細胞、及び植物細胞においてポリフェノールオキシダーゼを発現させる方法の特定の実施形態においては、ＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ８、ＰＰＯ９、又はＰＰＯ４のポリフェノールオキシダーゼポリヌクレオチドは、配列番号１５１（ＰＰＯ１）又は配列番号１５１に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；配列番号１５２（ＰＰＯ２）又は配列番号１５２に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；配列番号１５８（ＰＰＯ８）又は配列番号１５８に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；配列番号１５９（ＰＰＯ９）又は配列番号１５９に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；及び配列番号１５４（ＰＰＯ４）又は配列番号１５４に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。

【0121】

配列番号３２～３９及び５７～９７からなる群から選択される可変領域を含む合成バナナポリフェノールオキシダーゼガイドＲＮＡが、本発明により更に提供される。配列番号１８０～１９６、１９９～２０２、及び２０７～２２５からなる群から選択される可変領域を含む合成バナナポリフェノールオキシダーゼガイドＲＮＡが、本発明により更に提供される。幾つかの実施形態においては、合成バナナポリフェノールオキシダーゼガイドＲＮＡは、配列番号３２；配列番号３３；配列番号３４；配列番号３５；配列番号３６；配列番号３７；配列番号５７；配列番号５８；配列番号３８；配列番号３９；配列番号６２；配列番号７６；及び配列番号７７からなる群から選択される可変領域を含む。

【0122】

本発明は更に、少なくとも１つのバナナポリフェノールオキシダーゼガイドＲＮＡをコードしているヌクレオチド配列に動作可能に連結されたプロモータを含む組換えＤＮＡコンストラクトであって、該ガイドＲＮＡが、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ又は改変型ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼと複合体を形成することができ、該複合体が、少なくとも１つの内因性バナナポリフェノールオキシダーゼ遺伝子に結合し、二本鎖切断又は一本鎖切断を生じさせることができる、組換えＤＮＡコンストラクトを提供する。これら実施形態の幾つかにおいては、少なくとも１つの内因性ポリフェノールオキシダーゼ遺伝子は、ＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ３、ＰＰＯ４、ＰＰＯ５、ＰＰＯ６、ＰＰＯ７、ＰＰＯ８、及びＰＰＯ９からなる群から選択される。幾つかの実施形態においては、少なくとも１つの内因性ポリフェノールオキシダーゼ遺伝子は、ＰＰＯ１遺伝子である。幾つかの実施形態においては、少なくとも１つの内因性ポリフェノールオキシダーゼ遺伝子は、ＰＰＯ２遺伝子である。幾つかの実施形態においては、少なくとも１つの内因性ポリフェノールオキシダーゼ遺伝子は、ＰＰＯ３遺伝子である。幾つかの実施形態においては、少なくとも１つの内因性ポリフェノールオキシダーゼ遺伝子は、ＰＰＯ４遺伝子である。幾つかの実施形態においては、少なくとも１つの内因性ポリフェノールオキシダーゼ遺伝子は、ＰＰＯ５遺伝子である。幾つかの実施形態においては、少なくとも１つの内因性ポリフェノールオキシダーゼ遺伝子は、ＰＰＯ６遺伝子である。幾つかの実施形態においては、少なくとも１つの内因性ポリフェノールオキシダーゼ遺伝子は、ＰＰＯ７遺伝子である。幾つかの実施形態においては、少なくとも１つの内因性ポリフェノールオキシダーゼ遺伝子は、ＰＰＯ８遺伝子である。幾つかの実施形態においては、少なくとも１つの内因性ポリフェノールオキシダーゼ遺伝子は、ＰＰＯ９遺伝子である。幾つかの実施形態においては、内因性ポリフェノールオキシダーゼ遺伝子は、ＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ３、ＰＰＯ４、ＰＰＯ５、ＰＰＯ６、ＰＰＯ７、ＰＰＯ８、及びＰＰＯ９の遺伝子のうちの２つ以上である。幾つかの実施形態においては、内因性ポリフェノールオキシダーゼ遺伝子は、ＰＰＯ１及びＰＰＯ２の遺伝子である。特定の実施形態においては、ＰＰＯ１遺伝子は、配列番号５に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するコード配列を含む。特定の実施形態においては、ＰＰＯ２遺伝子は、配列番号６に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するコード配列を含む。特定の実施形態においては、ＰＰＯ３遺伝子は、配列番号７に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するコード配列を含む。特定の実施形態においては、ＰＰＯ４遺伝子は、配列番号８に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するコード配列を含む。特定の実施形態においては、ＰＰＯ５遺伝子は、配列番号９に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するコード配列を含む。特定の実施形態においては、ＰＰＯ６遺伝子は、配列番号１０に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するコード配列を含む。特定の実施形態においては、ＰＰＯ７遺伝子は、配列番号１１に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するコード配列を含む。特定の実施形態においては、ＰＰＯ８遺伝子は、配列番号１２に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するコード配列を含む。特定の実施形態においては、ＰＰＯ９遺伝子は、配列番号１３に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するコード配列を含む。特定の実施形態においては、ＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ８、ＰＰＯ９、又はＰＰＯ４のポリフェノールオキシダーゼ遺伝子は、配列番号５（ＰＰＯ１）又は配列番号５に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；配列番号６（ＰＰＯ２）又は配列番号６に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；配列番号１２（ＰＰＯ８）又は配列番号１２に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；配列番号１３（ＰＰＯ９）又は配列番号１３に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；及び配列番号８（ＰＰＯ４）又は配列番号８に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドからなる群から選択されるコード配列を含む。特定の実施形態においては、ＰＰＯ１遺伝子は、配列番号４０に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するポリフェノールオキシダーゼをコードしている；ＰＰＯ２遺伝子は、配列番号４１に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するポリフェノールオキシダーゼをコードしている；ＰＰＯ３遺伝子は、配列番号４２に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するポリフェノールオキシダーゼをコードしている；ＰＰＯ４遺伝子は、配列番号４３に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するポリフェノールオキシダーゼをコードしている；ＰＰＯ５遺伝子は、配列番号４４に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するポリフェノールオキシダーゼをコードしている；ＰＰＯ６遺伝子は、配列番号４５に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するポリフェノールオキシダーゼをコードしている；ＰＰＯ７遺伝子は、配列番号４６に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するポリフェノールオキシダーゼをコードしている；ＰＰＯ８遺伝子は、配列番号４７に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するポリフェノールオキシダーゼをコードしている；又はＰＰＯ９遺伝子は、配列番号４８に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するポリフェノールオキシダーゼをコードしている。特定の実施形態においては、ＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ８、ＰＰＯ９、又はＰＰＯ４のポリフェノールオキシダーゼ遺伝子は、配列番号４０（ＰＰＯ１）又は配列番号４０に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；配列番号４１（ＰＰＯ２）又は配列番号４１に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；配列番号４７（ＰＰＯ８）又は配列番号４７に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；配列番号４８（ＰＰＯ９）又は配列番号４８に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；及び配列番号４３（ＰＰＯ４）又は配列番号４３に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチドからなる群から選択されるポリフェノールオキシダーゼをコードしている。特定の実施形態においては、ＰＰＯ１遺伝子は、配列番号１５１に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態においては、ＰＰＯ２遺伝子は、配列番号１５２に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態においては、ＰＰＯ３遺伝子は、配列番号１５３に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態においては、ＰＰＯ４遺伝子は、配列番
号１５４に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態においては、ＰＰＯ５遺伝子は、配列番号１５５に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態においては、ＰＰＯ６遺伝子は、配列番号１５６に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態においては、ＰＰＯ７遺伝子は、配列番号１５７に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態においては、ＰＰＯ８遺伝子は、配列番号１５８に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態においては、ＰＰＯ９遺伝子は、配列番号１５９に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態においては、ＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ８、ＰＰＯ９、又はＰＰＯ４のポリフェノールオキシダーゼ遺伝子は、配列番号１５１（ＰＰＯ１）又は配列番号１５１に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；配列番号１５２（ＰＰＯ２）又は配列番号１５２に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；配列番号１５８（ＰＰＯ８）又は配列番号１５８に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；配列番号１５９（ＰＰＯ９）又は配列番号１５９に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；及び配列番号１５４（ＰＰＯ４）又は配列番号１５４に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。

【0123】

これら実施形態の幾つかにおいては、１つ以上のバナナポリフェノールオキシダーゼガイドＲＮＡは、配列番号３２～３９及び５７～９７；並びに前述の任意の組み合わせからなる群から選択される配列を有する可変領域を含む。幾つかの実施形態においては、１つ以上のバナナポリフェノールオキシダーゼガイドＲＮＡは、配列番号１８０～１９６、１９９～２０２、及び２０７～２２５；並びに前述の任意の組み合わせからなる群から選択される配列を有する可変領域を含む。幾つかの実施形態においては、合成バナナポリフェノールオキシダーゼガイドＲＮＡは、配列番号３２；配列番号３３；配列番号３４；配列番号３５；配列番号３６；配列番号３７；配列番号５７；配列番号５８；配列番号３８；配列番号３９；配列番号６２；配列番号７６；及び配列番号７７；並びに前述の任意の組み合わせからなる群から選択される可変領域を含む。本発明の幾つかの実施形態においては、該１つ以上のガイドＲＮＡは、配列番号３２及び３３；配列番号３４及び３５；配列番号３２及び３４；配列番号３２及び３５；配列番号３３及び３４；配列番号３３及び３５；配列番号５７及び５８；配列番号３８及び３９；配列番号６２及び３３；並びに配列番号７６及び７７からなる群から選択される可変領域を含む一対のガイドＲＮＡである。これら実施形態の幾つかにおいては、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼである。

【0124】

本発明の方法及び組成物の追加の実施形態を本明細書に示す。そのような実施形態には、以下が含まれる：

【0125】

１．バナナ植物又はバナナ植物細胞において、ＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ３、ＰＰＯ４、ＰＰＯ５、ＰＰＯ６、ＰＰＯ７、ＰＰＯ８、又はＰＰＯ９のポリフェノールオキシダーゼ遺伝子によってコードされている少なくとも１つの内因性のＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ３、ＰＰＯ４、ＰＰＯ５、ＰＰＯ６、ＰＰＯ７、ＰＰＯ８、又はＰＰＯ９のポリフェノールオキシダーゼのレベル又は活性を低下させる方法。

【0126】

２．ＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ３、ＰＰＯ４、ＰＰＯ５、ＰＰＯ６、ＰＰＯ７、ＰＰＯ８、又はＰＰＯ９のポリフェノールオキシダーゼ遺伝子が、
（Ａ）
（ａ）配列番号５（ＰＰＯ１）若しくは配列番号５に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号６（ＰＰＯ２）若しくは配列番号６に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号７（ＰＰＯ３）若しくは配列番号７に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号８（ＰＰＯ４）若しくは配列番号８に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号９（ＰＰＯ５）若しくは配列番号９に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｆ）配列番号１０（ＰＰＯ６）若しくは配列番号１０に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｇ）配列番号１１（ＰＰＯ７）若しくは配列番号１１に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｈ）配列番号１２（ＰＰＯ８）若しくは配列番号１２に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；及び
（ｉ）配列番号１３（ＰＰＯ９）若しくは配列番号１３に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド
からなる群から選択されるコード配列を含む；
（Ｂ）
（ａ）配列番号４０（ＰＰＯ１）若しくは配列番号４０に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｂ）配列番号４１（ＰＰＯ２）若しくは配列番号４１に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｃ）配列番号４２（ＰＰＯ３）若しくは配列番号４２に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｄ）配列番号４３（ＰＰＯ４）若しくは配列番号４３に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｅ）配列番号４４（ＰＰＯ５）若しくは配列番号４４に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｆ）配列番号４５（ＰＰＯ６）若しくは配列番号４５に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｇ）配列番号４６（ＰＰＯ７）若しくは配列番号４６に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｈ）配列番号４７（ＰＰＯ８）若しくは配列番号４７に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；及び
（ｉ）配列番号４８（ＰＰＯ９）若しくは配列番号４８に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド
からなる群から選択されるポリフェノールオキシダーゼをコードしている；又は
（Ｃ）
（ａ）配列番号１５１（ＰＰＯ１）若しくは配列番号１５１に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１５２（ＰＰＯ２）若しくは配列番号１５２に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１５３（ＰＰＯ３）若しくは配列番号１５３に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号１５４（ＰＰＯ４）若しくは配列番号１５４に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号１５５（ＰＰＯ５）若しくは配列番号１５５に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｆ）配列番号１５６（ＰＰＯ６）若しくは配列番号１５６に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｇ）配列番号１５７（ＰＰＯ７）若しくは配列番号１５７に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｈ）配列番号１５８（ＰＰＯ８）若しくは配列番号１５８に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；及び
（ｉ）配列番号１５９（ＰＰＯ９）若しくは配列番号１５９に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド
からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む、実施形態１に記載の方法。

【0127】

３．
（ａ）該バナナ植物若しくはバナナ植物細胞における少なくとも１つの内因性のＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ３、ＰＰＯ４、ＰＰＯ５、ＰＰＯ６、ＰＰＯ７、ＰＰＯ８、又はＰＰＯ９のポリフェノールオキシダーゼのレベルを低下させる；
（ｂ）該バナナ植物又はバナナ植物細胞における少なくとも１つの内因性のＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ３、ＰＰＯ４、ＰＰＯ５、ＰＰＯ６、ＰＰＯ７、ＰＰＯ８、又はＰＰＯ９のポリフェノールオキシダーゼの機能を低下させる；又は
（ｃ）該バナナ植物又はバナナ植物細胞における少なくとも１つの内因性のＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ３、ＰＰＯ４、ＰＰＯ５、ＰＰＯ６、ＰＰＯ７、ＰＰＯ８、又はＰＰＯ９のポリフェノールオキシダーゼの機能を喪失させる、実施形態１又は２に記載の方法。

【0128】

４．
（ａ）該少なくとも１つの内因性のＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ３、ＰＰＯ４、ＰＰＯ５、ＰＰＯ６、ＰＰＯ７、ＰＰＯ８、若しくはＰＰＯ９のポリフェノールオキシダーゼのレベル若しくは活性が低下していないバナナ植物の果肉及び／若しくは果皮と比較して該バナナ植物の果肉及び／若しくは果皮の褐変を遅延させる；並びに／又は
（ｂ）該少なくとも１つの内因性のＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ３、ＰＰＯ４、ＰＰＯ５、ＰＰＯ６、ＰＰＯ７、ＰＰＯ８、若しくはＰＰＯ９のポリフェノールオキシダーゼのレベル若しくは活性が低下していないバナナ植物の果肉及び／若しくは果皮と比較して該バナナ植物の果肉及び／若しくは果皮の褐変を低減する、実施形態１～３のいずれか１つに記載の方法。

【0129】

５．
（ａ）該バナナ植物細胞若しくは該バナナ植物の一部に、該少なくとも１つのＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ３、ＰＰＯ４、ＰＰＯ５、ＰＰＯ６、ＰＰＯ７、ＰＰＯ８、若しくはＰＰＯ９のポリフェノールオキシダーゼ遺伝子の転写物を標的とするサイレンシングＲＮＡを提供することであって、任意で、該サイレンシングＲＮＡが、該バナナ植物細胞若しくは該バナナ植物の一部にエンドヌクレアーゼを導入することにより提供され、該エンドヌクレアーゼが、該少なくとも１つのＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ３、ＰＰＯ４、ＰＰＯ５、ＰＰＯ６、ＰＰＯ７、ＰＰＯ８、若しくはＰＰＯ９のポリフェノールオキシダーゼ遺伝子の転写物を標的とする該サイレンシングＲＮＡをコードするように、内因性非コードＲＮＡをコードしている遺伝子を改変することができ、更に任意で、該エンドヌクレアーゼが、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクタヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ホーミングエンドヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ、及び改変型ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼからなる群から選択されること；又は
（ｂ）該少なくとも１つのＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ３、ＰＰＯ４、ＰＰＯ５、ＰＰＯ６、ＰＰＯ７、ＰＰＯ８、若しくはＰＰＯ９のポリフェノールオキシダーゼをコードしているＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ３、ＰＰＯ４、ＰＰＯ５、ＰＰＯ６、ＰＰＯ７、ＰＰＯ８、若しくはＰＰＯ９のポリフェノールオキシダーゼ遺伝子に改変を導入することであって；任意で、該改変が、該バナナ植物細胞に提供されかつ該少なくとも１つのＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ３、ＰＰＯ４、ＰＰＯ５、ＰＰＯ６、ＰＰＯ７、ＰＰＯ８、若しくはＰＰＯ９のポリフェノールオキシダーゼ遺伝子を標的とすることが可能なエンドヌクレアーゼによって、該ＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ３、ＰＰＯ４、ＰＰＯ５、ＰＰＯ６、ＰＰＯ７、ＰＰＯ８、若しくはＰＰＯ９のポリフェノールオキシダーゼ遺伝子に導入され；更に任意で、該エンドヌクレアーゼが、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクタヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ホーミングエンドヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ、及び改変型ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼからなる群から選択され；更に任意で、該ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼがＣａｓ９エンドヌクレアーゼであること
を含む、実施形態１～４のいずれか１つに記載の方法。

【0130】

６．ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ又は改変型ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼと、該少なくとも１つのＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ３、ＰＰＯ４、ＰＰＯ５、ＰＰＯ６、ＰＰＯ７、ＰＰＯ８、若しくはＰＰＯ９のポリフェノールオキシダーゼ遺伝子に特異的な１つ以上のガイドＲＮＡとを該バナナ植物細胞に提供することを含み、該ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ又は改変型ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ及び該１つ以上のガイドＲＮＡが、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ又は改変型ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼが該少なくとも１つの内因性のＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ３、ＰＰＯ４、ＰＰＯ５、ＰＰＯ６、ＰＰＯ７、ＰＰＯ８、若しくはＰＰＯ９のポリフェノールオキシダーゼ遺伝子に二本鎖切断又は一本鎖切断を導入することを可能にする複合体を形成し；任意で、該ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼがＣａｓ９エンドヌクレアーゼである、実施形態１～４のいずれか１つに記載の方法。

【0131】

７．少なくとも１つの内因性のＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ３、ＰＰＯ４、ＰＰＯ５、ＰＰＯ６、ＰＰＯ７、ＰＰＯ８、又はＰＰＯ９のポリフェノールオキシダーゼ遺伝子の改変を含む少なくとも１つのバナナ植物細胞を同定することを更に含み、該改変が、
（ａ）少なくとも１つのヌクレオチド挿入；
（ｂ）少なくとも１つのヌクレオチド欠失；
（ｃ）挿入－欠失（インデル）；
（ｄ）逆位；
（ｅ）少なくとも１つのヌクレオチド置換；及び
（ｆ）（ａ）～（ｅ）の任意の組み合わせ
からなる群から選択される、実施形態５又は６に記載の方法。

【0132】

８．該１つ以上のガイドＲＮＡが、１つ以上のプロモータに動作可能に連結された該１つ以上のガイドＲＮＡをコードしている１つ以上の組換えＤＮＡコンストラクト内でバナナ植物細胞に提供される、実施形態６又は７に記載の方法。

【0133】

９．該ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ若しくは改変型ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ及び／又は該１つ以上のガイドＲＮＡが、ＲＮＡの形態でバナナ植物細胞に提供される、実施形態６又は７に記載の方法。

【0134】

１０．該ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ又は改変型ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼが、タンパク質の形態で該バナナ植物細胞に提供され、該１つ以上のガイドＲＮＡが、ＲＮＡの形態で該バナナ植物細胞に提供され；任意で、該ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ又は改変型ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ及び該１つ以上のガイドＲＮＡが、リボ核タンパク質複合体として該バナナ植物細胞に提供される、実施形態６又は７に記載の方法。

【0135】

１１．該エンドヌクレアーゼ、該１つ以上のガイドＲＮＡ、及び／又は該１つ以上の組換えＤＮＡコンストラクトが、
（ａ）微粒子銃；
（ｂ）アグロバクテリウム形質転換；
（ｃ）プロトプラストトランスフェクション；
（ｄ）エレクトロポレーション；及び
（ｅ）ナノ粒子によって媒介されるトランスフェクション
からなる群から選択される方法を用いて該バナナ植物細胞に提供される、実施形態５～１０のいずれか１つに記載の方法。

【0136】

１２．該エンドヌクレアーゼが、エンドヌクレアーゼポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドとしてバナナ植物細胞に提供され；任意で、該エンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼであり、該ポリヌクレオチドが、Ｃａｓ９ポリペプチドをコードしているＣａｓ９ポリヌクレオチドである、実施形態５～１１のいずれか１つに記載の方法。

【0137】

１３．該１つ以上のガイドＲＮＡ及び該ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ又は改変型ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼが、該ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ又は改変型ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ、少なくとも１つの選択マーカー遺伝子、及び該１つ以上のガイドＲＮＡをコードしている１つ以上のプラスミドのアグロバクテリウム形質転換を介して該バナナ植物細胞に提供される、実施形態６又は７に記載の方法。

【0138】

１４．該１つ以上のガイドＲＮＡが、配列番号３２～３９及び５７～９７；並びに前述の任意の組み合わせからなる群から選択される配列を有する可変領域を含む、又は該１つ以上のガイドＲＮＡが、配列番号１８０～１９６、１９９～２０２、及び２０７～２２５；並びに前述の任意の組み合わせからなる群から選択される配列を有する可変領域を含む、実施形態６～１３のいずれか１つに記載の方法。

【0139】

１５．該１つ以上のガイドＲＮＡが、
（ａ）配列番号３２及び３３；
（ｂ）配列番号３４及び３５；
（ｃ）配列番号３２及び３４；
（ｄ）配列番号３２及び３５；
（ｅ）配列番号３３及び３４；
（ｆ）配列番号３３及び３５；
（ｇ）配列番号５７及び５８；
（ｈ）配列番号３８及び３９；
（ｉ）配列番号６２及び３３；並びに
（ｊ）配列番号７６及び７７
からなる群から選択される可変領域を含む一対のガイドＲＮＡである、実施形態６～１３のいずれか１つに記載の方法。

【0140】

１６．該バナナ植物細胞が胚形成細胞である及び／又は胚形成細胞懸濁液に含有される、実施形態１～１５のいずれか１つに記載の方法。

【0141】

１７．実施形態１～１６のいずれか１つに記載の方法によって得ることができる、バナナ植物細胞。

【0142】

１８．該バナナ植物細胞からバナナ植物を再生することを更に含み；
任意で、該バナナ植物から果実を収穫することを更に含む、実施形態１～１６のいずれか１つに記載の方法。

【0143】

１９．実施形態１８に記載の方法によって得ることができるバナナの植物又は植物部位であって；任意で、
（ａ）配列番号１７９に記載の；
（ｂ）配列番号１７７に記載の切断型ＰＰＯ１タンパク質を発現する；又は
（ｃ）配列番号１７８に記載のコード配列を有する
変異ＰＰＯ１遺伝子を含み；
更に任意で、該変異がＰＰＯ１遺伝子の１つのアレルにのみ存在する、バナナの植物又は植物部位。

【0144】

２０．実施形態１８に記載の方法によって得ることができるバナナ植物から収穫された果実であって、該果実の果肉及び／又は果皮が、該少なくとも１つの内因性のＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ３、ＰＰＯ４、ＰＰＯ５、ＰＰＯ６、ＰＰＯ７、ＰＰＯ８、又はＰＰＯ９のポリフェノールオキシダーゼのレベル又は活性が低下していないバナナ植物の果肉及び／又は果皮と比較して褐変が遅延及び／又は低減する表現型を特徴とする、果実。

【0145】

２１．野生型バナナ植物と比較して果肉及び／又は果皮の褐変が遅延及び／又は低減する表現型を特徴とするバナナ植物を作出する方法であって、
（ａ）バナナ植物細胞に、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ又は改変型ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ及び１つ以上のガイドＲＮＡを提供することであって、該ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ又は改変型ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ及び該１つ以上のガイドＲＮＡが、該ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ又は改変型ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼが、
（Ａ）
（ｉ）配列番号５若しくは配列番号５に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｉｉ）配列番号６若しくは配列番号６に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｉｉｉ）配列番号７若しくは配列番号７に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｉｖ）配列番号８若しくは配列番号８に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｖ）配列番号９若しくは配列番号９に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｖｉ）配列番号１０若しくは配列番号１０に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｖｉｉ）配列番号１１若しくは配列番号１１に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｖｉｉｉ）配列番号１２若しくは配列番号１２に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；及び
（ｉｘ）配列番号１３若しくは配列番号１３に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド
からなる群から選択されるコード配列を含む；
（Ｂ）
（ｉ）配列番号４０若しくは配列番号４０に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｉｉ）配列番号４１若しくは配列番号４１に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｉｉｉ）配列番号４２若しくは配列番号４２に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｉｖ）配列番号４３若しくは配列番号４３に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｖ）配列番号４４若しくは配列番号４４に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｖｉ）配列番号４５若しくは配列番号４５に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｖｉｉ）配列番号４６若しくは配列番号４６に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｖｉｉｉ）配列番号４７若しくは配列番号４７に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；及び
（ｉｘ）配列番号４８若しくは配列番号４８に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド
からなる群から選択されるポリフェノールオキシダーゼをコードしている；又は
（Ｃ）
（ｉ）配列番号１５１若しくは配列番号１５１に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｉｉ）配列番号１５２若しくは配列番号１５２に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｉｉｉ）配列番号１５３若しくは配列番号１５３に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｉｖ）配列番号１５４若しくは配列番号１５４に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｖ）配列番号１５５若しくは配列番号１５５に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｖｉ）配列番号１５６若しくは配列番号１５６に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｖｉｉ）配列番号１５７若しくは配列番号１５７に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｖｉｉｉ）配列番号１５８若しくは配列番号１５８に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；及び
（ｉｘ）配列番号１５９若しくは配列番号１５９に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド
からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む
少なくとも１つの内因性のＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ３、ＰＰＯ４、ＰＰＯ５、ＰＰＯ６、ＰＰＯ７、ＰＰＯ８、又はＰＰＯ９のポリフェノールオキシダーゼ遺伝子に一本鎖切断又は二本鎖切断を導入することを可能にする複合体を形成することと；
（ｂ）該少なくとも１つの内因性のＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ３、ＰＰＯ４、ＰＰＯ５、ＰＰＯ６、ＰＰＯ７、ＰＰＯ８、又はＰＰＯ９のポリフェノールオキシダーゼ遺伝子の改変を含む少なくとも１つのバナナ植物細胞を同定することであって、該改変が、
（ｉ）少なくとも１つのヌクレオチド挿入；
（ｉｉ）少なくとも１つのヌクレオチド欠失；
（ｉｉｉ）少なくとも１つのヌクレオチド置換；又は
（ｉｖ）（ｂ）（ｉ）～（ｂ）（ｉｉｉ）の任意の組み合わせ
からなる群から選択されることと；
（ｃ）該バナナ植物細胞からバナナ植物を再生することであって、該バナナ植物が、野生型バナナ植物と比較して果肉及び／又は果皮の褐変が遅延及び／又は低減する表現型を特徴とすることと
を含む方法。

【0146】

２２．該バナナ植物から果実を収穫することを更に含み、該果実が、該少なくとも１つの内因性のＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ３、ＰＰＯ４、ＰＰＯ５、ＰＰＯ６、ＰＰＯ７、ＰＰＯ８、又はＰＰＯ９のポリフェノールオキシダーゼのレベル又は活性が低下も喪失もしていないバナナ植物の果実と比較して褐変が遅延及び／又は低減する表現型を特徴とする、実施形態２１に記載の方法。

【0147】

２３．少なくとも１つの改変された内因性のＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ３、ＰＰＯ４、ＰＰＯ５、ＰＰＯ６、ＰＰＯ７、ＰＰＯ８、又はＰＰＯ９のポリフェノールオキシダーゼ遺伝子をそのゲノム中に含むバナナの植物又は植物部位であって、該改変の結果、該改変された内因性のＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ３、ＰＰＯ４、ＰＰＯ５、ＰＰＯ６、ＰＰＯ７、ＰＰＯ８、又はＰＰＯ９のポリフェノールオキシダーゼ遺伝子によってコードされている少なくとも１つの内因性のＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ３、ＰＰＯ４、ＰＰＯ５、ＰＰＯ６、ＰＰＯ７、ＰＰＯ８、又はＰＰＯ９のポリフェノールオキシダーゼが低減又は機能が低下し、該改変が、
（Ａ）
（ａ）配列番号５若しくは配列番号５に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号６若しくは配列番号６に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号７若しくは配列番号７に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号８若しくは配列番号８に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号９若しくは配列番号９に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｆ）配列番号１０若しくは配列番号１０に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｇ）配列番号１１若しくは配列番号１１に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｈ）配列番号１２若しくは配列番号１２に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；及び
（ｉ）配列番号１３若しくは配列番号１３に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド
からなる群から選択されるコード配列を含む；
（Ｂ）
（ａ）配列番号４０若しくは配列番号４０に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｂ）配列番号４１若しくは配列番号４１に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｃ）配列番号４２若しくは配列番号４２に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｄ）配列番号４３若しくは配列番号４３に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｅ）配列番号４４若しくは配列番号４４に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｆ）配列番号４５若しくは配列番号４５に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｇ）配列番号４６若しくは配列番号４６に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｈ）配列番号４７若しくは配列番号４７に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；及び
（ｉ）配列番号４８若しくは配列番号４８に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド
からなる群から選択されるポリフェノールオキシダーゼをコードしている；又は
（Ｃ）
（ａ）配列番号１５１若しくは配列番号１５１に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１５２若しくは配列番号１５２に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１５３若しくは配列番号１５３に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号１５４若しくは配列番号１５４に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号１５５若しくは配列番号１５５に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｆ）配列番号１５６若しくは配列番号１５６に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｇ）配列番号１５７若しくは配列番号１５７に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｈ）配列番号１５８若しくは配列番号１５８に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；及び
（ｉ）配列番号１５９若しくは配列番号１５９に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド
からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む
少なくとも１つの内因性のＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ３、ＰＰＯ４、ＰＰＯ５、ＰＰＯ６、ＰＰＯ７、ＰＰＯ８、又はＰＰＯ９のポリフェノールオキシダーゼ遺伝子に位置する、バナナの植物又は植物部位。

【0148】

２４．非トランスジェニックである、実施形態１９又は２３に記載のバナナの植物又は植物部位。

【0149】

２５．該果実が、該少なくとも１つの内因性のＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ３、ＰＰＯ４、ＰＰＯ５、ＰＰＯ６、ＰＰＯ７、ＰＰＯ８、又はＰＰＯ９のポリフェノールオキシダーゼのレベル又は活性が低下していないバナナ植物の果実と比較して褐変が遅延及び／又は低減する表現型を特徴とする、実施形態２３又は２４に記載のバナナ植物から収穫されたバナナ果実。

【0150】

２６．バナナ果実食品を得る方法であって、実施形態２５に記載のバナナ果実を加工することを含む方法。

【0151】

２７．
（Ａ）
（ａ）配列番号５若しくは配列番号５に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号６若しくは配列番号６に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号７若しくは配列番号７に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号８若しくは配列番号８に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号９若しくは配列番号９に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｆ）配列番号１０若しくは配列番号１０に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｇ）配列番号１１若しくは配列番号１１に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｈ）配列番号１２若しくは配列番号１２に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；及び
（ｉ）配列番号１３若しくは配列番号１３に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド
からなる群から選択されるコード配列を含む；
（Ｂ）
（ａ）配列番号４０若しくは配列番号４０に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｂ）配列番号４１若しくは配列番号４１に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｃ）配列番号４２若しくは配列番号４２に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｄ）配列番号４３若しくは配列番号４３に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｅ）配列番号４４若しくは配列番号４４に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｆ）配列番号４５若しくは配列番号４５に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｇ）配列番号４６若しくは配列番号４６に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｈ）配列番号４７若しくは配列番号４７に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；及び
（ｉ）配列番号４８若しくは配列番号４８に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド
からなる群から選択されるポリフェノールオキシダーゼをコードしている；又は
（Ｃ）
（ａ）配列番号１５１若しくは配列番号１５１に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１５２若しくは配列番号１５２に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１５３若しくは配列番号１５３に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号１５４若しくは配列番号１５４に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号１５５若しくは配列番号１５５に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｆ）配列番号１５６若しくは配列番号１５６に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｇ）配列番号１５７若しくは配列番号１５７に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｈ）配列番号１５８若しくは配列番号１５８に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；及び
（ｉ）配列番号１５９若しくは配列番号１５９に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド
からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む
バナナのＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ３、ＰＰＯ４、ＰＰＯ５、ＰＰＯ６、ＰＰＯ７、ＰＰＯ８、又はＰＰＯ９のポリフェノールオキシダーゼポリヌクレオチドを含むＤＮＡ配列。

【0152】

２８．
（Ａ）
（ａ）配列番号５若しくは配列番号５に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号６若しくは配列番号６に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号７若しくは配列番号７に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号８若しくは配列番号８に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号９若しくは配列番号９に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｆ）配列番号１０若しくは配列番号１０に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｇ）配列番号１１若しくは配列番号１１に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｈ）配列番号１２若しくは配列番号１２に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；及び
（ｉ）配列番号１３若しくは配列番号１３に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
からなる群から選択されるコード配列を含む；
（Ｂ）
（ａ）配列番号４０若しくは配列番号４０に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｂ）配列番号４１若しくは配列番号４１に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｃ）配列番号４２若しくは配列番号４２に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｄ）配列番号４３若しくは配列番号４３に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｅ）配列番号４４若しくは配列番号４４に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｆ）配列番号４５若しくは配列番号４５に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｇ）配列番号４６若しくは配列番号４６に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｈ）配列番号４７若しくは配列番号４７に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；及び
（ｉ）配列番号４８若しくは配列番号４８に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド
からなる群から選択されるポリフェノールオキシダーゼをコードしている；又は
（Ｃ）
（ａ）配列番号１５１若しくは配列番号１５１に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１５２若しくは配列番号１５２に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１５３若しくは配列番号１５３に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号１５４若しくは配列番号１５４に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号１５５若しくは配列番号１５５に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｆ）配列番号１５６若しくは配列番号１５６に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｇ）配列番号１５７若しくは配列番号１５７に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｈ）配列番号１５８若しくは配列番号１５８に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；及び
（ｉ）配列番号１５９若しくは配列番号１５９に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド
からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む
バナナのＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ３、ＰＰＯ４、ＰＰＯ５、ＰＰＯ６、ＰＰＯ７、ＰＰＯ８、又はＰＰＯ９のポリフェノールオキシダーゼポリヌクレオチドを含むＤＮＡコンストラクト又はベクター。

【0153】

２９．ベクター又は実施形態２８で形質転換された植物細胞であって、任意でバナナ植物細胞である、植物細胞。

【0154】

３０．
（ａ）配列番号５～１３のいずれか１つによってコードされているか、若しくは配列番号５～１３のいずれか１つに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされている；
（ｂ）配列番号４０～４８のいずれか１つを含むか、若しくは配列番号４０～４８のいずれか１つに対して少なくとも７５％の配列同一性を有する配列を含む；又は
（ｃ）配列番号１５１～１５９のいずれか１つによってコードされているか、又は配列番号１５１～１５９のいずれか１つに対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされている、ポリフェノールオキシダーゼタンパク質。

【0155】

３１．植物細胞においてポリフェノールオキシダーゼを発現させる方法であって、該植物細胞に、植物細胞内で活性のあるプロモータに動作可能に連結されている
（Ａ）
（ａ）配列番号５若しくは配列番号５に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号６若しくは配列番号６に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号７若しくは配列番号７に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号８若しくは配列番号８に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号９若しくは配列番号９に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｆ）配列番号１０若しくは配列番号１０に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｇ）配列番号１１若しくは配列番号１１に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｈ）配列番号１２若しくは配列番号１２に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；及び
（ｉ）配列番号１３若しくは配列番号１３に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド
からなる群から選択されるコード配列を含む；
（Ｂ）
（ａ）配列番号４０若しくは配列番号４０に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｂ）配列番号４１若しくは配列番号４１に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｃ）配列番号４２若しくは配列番号４２に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｄ）配列番号４３若しくは配列番号４３に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｅ）配列番号４４若しくは配列番号４４に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｆ）配列番号４５若しくは配列番号４５に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｇ）配列番号４６若しくは配列番号４６に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｈ）配列番号４７若しくは配列番号４７に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；及び
（ｉ）配列番号４８若しくは配列番号４８に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド
からなる群から選択されるポリフェノールオキシダーゼをコードしている；又は
（Ｃ）
（ａ）配列番号１５１若しくは配列番号１５１に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１５２若しくは配列番号１５２に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１５３若しくは配列番号１５３に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号１５４若しくは配列番号１５４に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号１５５若しくは配列番号１５５に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｆ）配列番号１５６若しくは配列番号１５６に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｇ）配列番号１５７若しくは配列番号１５７に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｈ）配列番号１５８若しくは配列番号１５８に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；及び
（ｉ）配列番号１５９若しくは配列番号１５９に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド
からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む
バナナポリフェノールオキシダーゼポリヌクレオチドを導入することを含む方法。

【0156】

３２．配列番号３２～３９及び５７～９７からなる群から選択される、又は配列番号１８０～１９６、１９９～２０２、及び２０７～２２５からなる群から選択される可変領域を含む、合成バナナポリフェノールオキシダーゼガイドＲＮＡ。

【0157】

３３．少なくとも１つのバナナのＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ３、ＰＰＯ４、ＰＰＯ５、ＰＰＯ６、ＰＰＯ７、ＰＰＯ８、又はＰＰＯ９のポリフェノールオキシダーゼガイドＲＮＡを発現するヌクレオチド配列に動作可能に連結されたプロモータを含む組換えＤＮＡコンストラクトであって、該ガイドＲＮＡが、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ又は改変型ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼと複合体を形成することができ、該複合体が、バナナゲノム中の、
（Ａ）
（ａ）配列番号５若しくは配列番号５に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号６若しくは配列番号６に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号７若しくは配列番号７に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号８若しくは配列番号８に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号９若しくは配列番号９に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｆ）配列番号１０若しくは配列番号１０に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｇ）配列番号１１若しくは配列番号１１に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｈ）配列番号１２若しくは配列番号１２に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；及び
（ｉ）配列番号１３若しくは配列番号１３に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド
からなる群から選択されるコード配列を含む；
（Ｂ）
（ａ）配列番号４０若しくは配列番号４０に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｂ）配列番号４１若しくは配列番号４１に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｃ）配列番号４２若しくは配列番号４２に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｄ）配列番号４３若しくは配列番号４３に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｅ）配列番号４４若しくは配列番号４４に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｆ）配列番号４５若しくは配列番号４５に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｇ）配列番号４６若しくは配列番号４６に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｈ）配列番号４７若しくは配列番号４７に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド；及び
（ｉ）配列番号４８若しくは配列番号４８に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチド
からなる群から選択されるポリフェノールオキシダーゼをコードしている；又は
（Ｃ）
（ａ）配列番号１５１若しくは配列番号１５１に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１５２若しくは配列番号１５２に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１５３若しくは配列番号１５３に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号１５４若しくは配列番号１５４に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号１５５若しくは配列番号１５５に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｆ）配列番号１５６若しくは配列番号１５６に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｇ）配列番号１５７若しくは配列番号１５７に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｈ）配列番号１５８若しくは配列番号１５８に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；及び
（ｉ）配列番号１５９若しくは配列番号１５９に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド
からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む
少なくとも１つの内因性バナナのＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ３、ＰＰＯ４、ＰＰＯ５、ＰＰＯ６、ＰＰＯ７、ＰＰＯ８、又はＰＰＯ９のポリフェノールオキシダーゼ遺伝子に結合し、二本鎖切断又は一本鎖切断を生じさせることができる組換えＤＮＡコンストラクト。

【0158】

３４．１つ以上のバナナポリフェノールオキシダーゼガイドＲＮＡが、配列番号３２～３９及び５７～９７；並びに前述の任意の組み合わせからなる群から選択される配列を有する可変領域を含む；又は１つ以上のバナナポリフェノールオキシダーゼガイドＲＮＡが、配列番号１８０～１９６、１９９～２０２、及び２０７～２２５；並びに前述の任意の組み合わせからなる群から選択される配列を有する可変領域を含む、実施形態３３に記載の組換えＤＮＡコンストラクト。

【0159】

３５．該ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼがＣａｓ９エンドヌクレアーゼである、実施形態３３又は３４に記載の組換えＤＮＡコンストラクト。

【0160】

特に定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び／又は科学用語は、本発明が関連する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載するものと類似又は等価な方法及び材料を用いることができるが、例示的な方法及び／又は材料について記載する。材料、方法、及び実施例は、単なる例示であり、限定を意図するものではない。

【0161】

用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、及びこれらの同根語は、「含むが、これらに限定されない」を意味する。用語「からなる」は、「含み、これらに限定される」を意味する。用語「から本質的になる」は、追加の成分、工程、及び／又は部品が、請求される組成物、方法、又は構造の基本的かつ新規な特徴を実質的に変化させない場合に限り、組成物、方法、又は構造が追加の成分、工程、及び／又は部品を含んでいてもよいことを意味する。

【0162】

本明細書で使用するとき、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈上特に指示しない限り、複数の指示対象を含む。例えば、用語「化合物」又は「少なくとも１つの化合物」は、その混合物を含む複数の化合物を含む場合がある。本明細書で使用するとき、用語「約」は、＋／－１０％を指す。

【実施例】

【0163】

以下の実施例は、例示目的のものであり、本発明の範囲を限定するとみなされるものではない。

【0164】

本明細書で使用される命名法及び実験手順には、分子的、生化学的、微生物学的、及び組換えのＤＮＡ技術が含まれる。このような技術は、文献において説明されている。例えば、以下を参照されたい：“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ” Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ” Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ－ＩＩＩ Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．，ｅｄ．（１９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ，“Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ”，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ”，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｂｉｒｒｅｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ）“Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｒｉｅｓ”，Ｖｏｌｓ．１－４，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９８）；米国特許第４，６６６，８２８号、同第４，６８３，２０２号、同第４，８０１，５３１号、同第５，１９２，６５９号、及び同第５，２７２，０５７号に記載の方法論；“Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ”，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ－ＩＩＩ Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．，ｅｄ．（１９９４）；“Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ－Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ” ｂｙ Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｗｉｌｅｙ－Ｌｉｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９４），Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ；“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ” Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ－ＩＩＩ Ｃｏｌｉｇａｎ Ｊ．Ｅ．，ｅｄ．（１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ），“Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ａｐｐｌｅｔｏｎ ＆ Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ（１９９４）；Ｍｉｓｈｅｌｌ ａｎｄ Ｓｈｉｉｇｉ（ｅｄｓ），“Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８０）；利用可能なイムノアッセイは、特許及び科学文献において広く説明されており、例えば、以下を参照されたい：米国特許第３，７９１，９３２号、同第３，８３９，１５３号、同第３，８５０，７５２号、同第３，８５０，５７８号、同第３，８５３，９８７号、同第３，８６７，５１７号、同第３，８７９，２６２号、同第３，９０１，６５４号、同第３，９３５，０７４号、同第３，９８４，５３３号、同第３，９９６，３４５号、同第４，０３４，０７４号、同第４，０９８，８７６号、同第４，８７９，２１９号、同第５，０１１，７７１号、及び同第５，２８１，５２１号；“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ” Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．，ｅｄ．（１９８４）；“Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ” Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．，ｅｄｓ．（１９８５）；“Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ” Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．，ｅｄｓ．（１９８４）；“Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ” Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．，ｅｄ．（１９８６）；“Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ” ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）；“Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ” Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．，（１９８４）ａｎｄ “Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ” Ｖｏｌ．１－３１７，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；“ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）；Ｍａｒｓｈａｋ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ－Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ” ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９６）；これらは全て、本明細書に完全に記載されているかのように、参照により援用される。他の一般的な参照文献は、全体を通して提供されている。その中の手順は、当技術分野で周知であり、読者の便宜のために提供される。そこに含まれる情報は全て、参照することにより本明細書に援用される。

【0165】

実施例１－バナナにおける褐変の測定
褐変は、果皮の色に基づいて測定することができ、その場合、果皮の色の目視評価と花の出現後にバナナ果実がそのような色に達するまでにかかる日数とが相関するように、褐変指数が構築される（“Ｄｏｌｅ Ｒｅｔａｉｌ Ｂａｎａｎａ Ｒｉｐｅｎｉｎｇ Ｇｕｉｄｅ” ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｄｏｌｅｎｚ．ｃｏ．ｎｚ／ｕｐｌｏａｄｓ／ｍｅｄｉａ／５９２３６０８２０４８ａ９／ｂａｎａｎａ－ｔｒａｄｅ－ｓｅｃｔｉｏｎ－ｗｅｂ．ｐｄｆ及びＧｏｏｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ ｏｆ ｂａｎａｎａ ｆｒｕｉｔ ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ ｏｘｉｄａｓｅ”，Ｐｌａｎｔａ，Ｓｅｐ ２００１；１２３（５）：７４８－５７を参照）。これは、花の出現後約６０～９０日で果実が成熟するという事実に基づいている。指数を構築するために、バナナの果実を早ければ４０日（ステージ１）から濃い褐色（ステージ１０）になるまで採取したところ、各色は花の出現後の日数と相関している。この指数では、花の出現後約９０日間でステージ１０に達すると予測される。果実の色は、例えば「Ｄｏｌｅ Ｒｅｔａｉｌ Ｂａｎａｎａ Ｒｉｐｅｎｉｎｇ Ｇｕｉｄｅ」に定義されている色の説明に基づいて、１０段階全てにおいて目視評価される。ステージ１は、房の全ての果指の果皮が緑色になったとき（花の出現から４０日後）であり、ステージ２は、通常ショルダーにみられる、最初に薄緑色に色が変化したとき（花の出現から４５日後）であり、ステージ３は、バナナの黄色の部分よりも緑色の部分が多いとき（花の出現から５０日後）であり、ステージ４は、バナナの緑色の部分よりも黄色の部分が多くなったとき（花の出現から６０日後）であり、ステージ５は、バナナの色が黄色で先端が緑色になったとき（花の出現から６５日後）であり、ステージ６は、バナナ全体が黄色になったとき（花の出現から７０日後）であるが、ステージ７では、房の全ての果指に黄色の斑点ができ、果皮が褐色になっており（花の出現から７５日後）、ステージ８では、褐変が進行しており（花の出現から８０日後）、ステージ９では、更に褐変が進行しており（花の出現から８５日後）、ステージ１０では、房の全ての果指の果皮が濃褐色になっている（花の出現から９０日後）。色の尺度を標準化するためにＤＰ－３０１データプロセッサーを備えるＭｉｎｏｌｔａ Ｃｈｒｏｍａ Ｍｅｔｅｒ ＣＲ ４００又はＭｉｎｏｌｔａ ＣＲ－３００ Ｃｈｒｏｍａ Ｍｅｔｅｒで比色座標を取る。ＣＲ－３００の測定ヘッドは、拡散照明／０°視野形状（鏡面反射性成分を含む）を使用して、Ｂｒｕｎｏ Ｂｏｎｎｅｔ，Ｃ．，Ｈｕｂｅｒｔ，Ｏ．，Ｍｂｅｇｕｉｅ－Ａ－Ｍｂｅｇｕｉｅ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｈａｒｖｅｓｔ ｓｔａｇｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｏａｃｔｉｖｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｉｎ Ｃａｖｅｎｄｉｓｈ ｂａｎａｎａｓ．Ｊ．Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ｕｎｉｖ．Ｓｃｉ．Ｂ１４，２７０－２７８（２０１３）に記載の通り、拡散照明条件下で見たときの色とよく相関する多種多様な表面の測定値を提供する。これにより、果実の各発育段階（１～１０）における反射色を測定することができ、これらデータは、果皮の色を果実の成熟及び褐変と相関させるためのものである。

【0166】

褐変は、薄切りにして裏ごししたバナナの果肉の経時的（０～１８０時間）目視評価を利用したバナナ褐変ガイドに基づいて測定することもできる。ステージ３から１０（上記参照）を表すバナナの房から３本の果指を採取し、果皮を０．２％次亜塩素酸ナトリウムで５分間（褐変を引き起こす可能性のある機械的損傷を避けるために）穏やかに洗浄する。次に、皮をむき、小片に切断し、電気ミキサー又はフードプロセッサーでホモジナイズした後、各個々のバナナの果指からバナナピューレを調製する。得られたピューレをペトリ皿に注ぎ、０分、１５分、３０分、６０分、及び１２０分後、そして２４時間、４８時間、及び７２時間後に画像を撮影する。更に、バナナをスライスし、ペトリ皿に置き、カラーステージ３及び４のバナナ房については、０時間、１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、及び７２時間後に画像を撮影する。ステージ５から１０のバナナの果指については、０時間から１８０時間まで８時間ごとにバナナスライスの画像を撮影する（約２２時点）。この測定方法は、Ｃｈｉ ｅｔ ａｌ．（２０１４）（Ｃｈｉ，Ｍ．，Ｂｈａｇｗａｔ，Ｂ．，Ｌａｎｅ，Ｗ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．Ｒｅｄｕｃｅｄ ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ ｏｘｉｄａｓｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｂｒｏｗｎｉｎｇ ｉｎ ｐｏｔａｔｏ （Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ Ｌ．）ｗｉｔｈ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ．ＢＭＣ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌ １４，６２（２０１４）．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１８６／１４７１－２２２９－１４－６２）及びＥｓｃａｌａｎｔｅ－Ｍｉｎａｋａｔａ，Ｐ．，Ｉｂａｒｒａ－Ｊｕｎｑｕｅｒａ，Ｖ．，Ｏｒｎｅｌａｓ－Ｐａｚ，Ｊ．ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｔｈｅ ｂａｎａｎａ ｐｕｌｐ ｂｒｏｗｎｉｎｇ ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ ‘Ｇｉａｎｔ Ｄｗａｒｆ’ ａｎｄ ＦＨＩＡ－２３ ｄｕｒｉｎｇ ｆｒｕｉｔ ｒｉｐｅｎｉｎｇ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｉｍａｇｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ ｏｘｉｄａｓｅ ａｎｄ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．３ Ｂｉｏｔｅｃｈ ８，３０（２０１８）の結果に基づいている。画像の色を褐変に相関させるために画像を処理する。色は、切断したばかりのバナナスライス又はバナナピューレの色（黄色／オフホワイト）から褐色バナナ（濃褐色）までのいずれかで変動すると予測される。

【0167】

褐変は、果肉の硬度及び果皮の硬度の評価に基づいて測定することもできる。果肉の硬度及び果皮の硬度は、Ｂｒｕｎｏ Ｂｏｎｎｅｔ，Ｃ．，Ｈｕｂｅｒｔ，Ｏ．，Ｍｂｅｇｕｉｅ－Ａ－Ｍｂｅｇｕｉｅ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｈａｒｖｅｓｔ ｓｔａｇｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｏａｃｔｉｖｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｉｎ Ｃａｖｅｎｄｉｓｈ ｂａｎａｎａｓ．Ｊ．Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ｕｎｉｖ．Ｓｃｉ．Ｂ１４，２７０－２７８（２０１３）に記載の通り、ＴＡ－ＸＴ２ペネトロメータを用いて測定される。ステージ３から１０（果皮の色に基づいて証明；上記を参照）を表す房から３本のバナナ果指を採取する。４．９ｍｍの円筒形金属製穿孔器を用いて、清潔で新鮮な皮をむいていない果実に一定速度（２ｍｍ／ｓ）で１０ｍｍの深さまで貫入する。果皮を破るために印加された最大力が果皮の硬度を表し、力／時間曲線の傾きが果実の硬度を表す。

【0168】

褐変は、果皮の色（及び硬度）と果肉の色／質感との相関に基づいて測定することもできる。これには、野生型植物における色（目視及び比色測定）、果皮の硬度、並びに果肉の硬度対バナナの成熟段階、並びに時間に対する果皮及び果肉の褐変のカタログを利用する。これにより、バナナの果皮及び果肉における褐変の低減を評価することができる基準ができる。

【0169】

実施例２－バナナにおけるＰＰＯの同定
バナナＰＰＯ遺伝子を同定するために、バイオインフォマティクス解析を行った。米国特許第９５８０７２３号（配列番号１～４）に提供されている北極リンゴ由来のＰＰＯペプチド配列をクエリー配列として用いて、バナナゲノム及びＰＰＯ遺伝子を有することが知られている他の植物種（アンズ、サツマイモ、ヨウシュヤマゴボウ、タバコ、トマト、ジャガイモ、及びブドウ）のゲノム中のホモログを検索した。「ＴＢｌａｓｔＮ」ツールを用いて、クエリータンパク質配列を翻訳された選択ゲノムのヌクレオチド配列とアラインした。その結果、バナナ（マレーヤマバショウ）由来の９配列を含む、クエリー配列に相同な７２配列が様々な生物種から見出された。

【0170】

得られた配列をマルチプルシーケンスアラインメント（ＭＳＡ）に供し、その後、系統樹を構築した。遺伝子をクラスタに編成した。Ｍａｘｉｍｕｍ Ｌｉｋｅｌｉｎｅｓｓアルゴリズム及びＮｅｉｇｈｂｏｕｒ Ｊｏｉｎｉｎｇアルゴリズムを組み合わせることによって、各クラスタに信頼性スコアを割り当てた。その背後にある根拠は、既知のＰＰＯ遺伝子と高い信頼度でクラスタを形成するバナナ遺伝子は、ＰＰＯ活性も保存されている可能性がより高いことである。解析は、「ＴＢｌａｓｔＮ」によって同定された９つのバナナ遺伝子が全て、他の種に由来するＰＰＯ遺伝子と高い信頼度でクラスタを形成することを示した。従って、９つの遺伝子は全て、機能が保存されたＰＰＯ遺伝子であると予測された。この解析及び検索されたＰＰＯは、更に系統発生解析を行うことによって確認された。これらＰＰＯは、図１に示すように互いに３５％～９７％の相同性を有し、図２に示すようにクエリー配列に対しては約３９％～９７％の相同性を有する。同定されたバナナＰＰＯは、図３から分かるように、ＤＷＬドメインをクエリー配列のＤＷＬドメインにアラインすることによって更に確認された。９つのＰＰＯバナナペプチド相同体を、Ｂａｎａｎａ Ｇｅｎｏｍｅ Ｈｕｂから得られた対応するアクセッション番号と共に表１に列挙し、配列番号４０～４８に記載する（対応する遺伝子配列は配列番号５～１３に列挙する）。

【0171】

【表1】

【0172】

実施例３－ターゲティングのためのＰＰＯ候補の選抜
表１のＰＰＯが発現しているバナナ組織を特定するために、種々のバナナ組織、具体的には胚細胞懸濁液（ＥＣＳ）、胚発生培地（ＥＤＭ）中でインキュベーションした後にＥＣＳから分化した胚、巻葉、天葉、旧葉、褐色の果皮、黄色の果皮、緑色の果皮、褐色の果実、黄色の果実、及び緑色の果実からｍＲＮＡを産生させた。バナナ組織を液体窒素中で瞬間凍結し、凍結乾燥し、ホモジナイズすることによって、ＲＮＡ抽出を行った。次いで、抽出バッファの入ったチューブにサンプルを入れ、混合しながら解凍した。サンプルを遠心分離し、上清を新たなチューブに移した。次いで、フェノール－クロロホルム抽出を使用し、続いて、遠心分離してＲＮＡペレットを得た。次いで、Ｐｌａｎｔ／Ｆｕｎｇｉ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｎｏｒｇｅｎ Ｂｉｏｔｅｋ Ｃｏｒｐ）を用いてｍＲＮＡの抽出を完了した。

【0173】

同定された９つのＰＰＯをコードしているｍＲＮＡの発現を、上記の全ての組織で、半定量的ＰＣＲを用いて、各組織／ＰＰＯの組み合わせごとに３～６回の生物学的反復試験を行って調べた。Ｔｕｒｂｏ ＤＮＡ－ｆｒｅｅ ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＲＮＡサンプルからＤＮＡを除去した。ＤＮＡｓｅ処理したＲＮＡを用い、転写物を確実に完全に網羅するためにｏｌｉｇｏ－ｄＴとランダムヘキサマーとの混合物と共にＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を使用してｃＤＮＡを合成した。各ＰＣＲにつき、１２ｎｇのｃＤＮＡをテンプレートとして用い、ＧｏＴａｑ Ｇ２マスターミックス（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて３０サイクルの標準的なＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応に使用したオリゴヌクレオチドを表２（及び配列番号１４～３１）に示す：

【0174】

【表2】

【0175】

発現プロファイルを図４に提示し、これは、各被検組織における各ＰＰＯの平均発現レベルを表す。単位は、視覚的に定量化し、定量化を数字として表し、その数字を－から＋、＋＋、＋＋＋までの尺度に直線的に変換することによって導き出される任意のものである。

【0176】

種々の組織からの全ＲＮＡシーケンシングデータを比較し、ＴＭＭ正規化（Ｍ値のトリム平均）によって発現を測定することにより、一部の組織において追加の発現解析を行った。簡潔に説明すると、根、天葉、巻葉、並びにバナナの果肉及び果皮（緑－黄色及び黄色の両成熟期）のサンプルを、それぞれ温室グランドナインバナナ植物及び市販のバナナ果実から採取した。根、天葉、及び巻葉は、温室条件下で９ヶ月～１年半生育した植物から採取した。サンプルを瞬間凍結し、サンプリング処理前に２日間凍結乾燥した。凍結乾燥したサンプルを乳鉢及び乳棒を用いて粉砕した。これらサンプルからのＲＮＡ－ｓｅｑサンプル調製は、全ＲＮＡ抽出、ポリアデニル化テール結合を用いたｍＲＮＡ濃縮、ｃＤＮＡを生成するための逆転写、及びアダプタライゲーションを用いたシーケンシングライブラリーの調製からなっていた。ライブラリーを、サンプルあたり少なくとも４４００万の生リード深度までシーケンシングし、生データのＱＣ解析（アダプタのトリミングを含む）の後、シーケンシングリードをバナナゲノムにアラインした。各遺伝子にアラインされたリード数を定量し、「Ｍ値のトリム平均」（ＴＭＭ）法を用いてサンプル間で正規化した（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｍ．Ｄ．，Ｏｓｈｌａｃｋ，Ａ．Ａ ｓｃａｌｉｎｇ ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＲＮＡ－ｓｅｑ ｄａｔａ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ １１，Ｒ２５（２０１０））。図５からわかるように、果肉及び／又は果皮の緑－黄色及び／又は黄色の成熟期でＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ８、及びＰＰＯ９の高発現がみられた。半定量的ＰＣＲデータからもＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ８、及びＰＰＯ９の同様の発現が示唆された。

【0177】

公開されているデータセットから発現パターンを示すために追加のアノテーショントラックをゲノムにロードすることによって、同定されたＰＰＯ遺伝子のアノテーションを、ｂａｎａｎａ ｇｅｎｏｍｅ ｈｕｂ（ｈｔｔｐｓ：／／ｂａｎａｎａ－ｇｅｎｏｍｅ－ｈｕｂ．ｓｏｕｔｈｇｒｅｅｎ．ｆｒ／）で更に検証した。ゲノム中のアノテーション付きエクソンｍＲＮＡ配列の発現を確認するためにこれらを評価した。この検証により、例えばＰＰＯ１及びＰＰＯ２のアノテーションが確認された。この検証により、ＲＮＡシーケンシングデータをアノテーションと比較したいずれの組織においてもＰＰＯ３が発現していないことが更に確認された。ＰＰＯ１及びＰＰＯ２は果肉及び果皮で発現していることが観察され、このことから、それらが果実の褐変に関係していることが示唆されたが、胚／ＥＣＳでは発現していない。

【0178】

外因性エチレンを適用しない自然成熟過程にわたって、商業的流通業者から直接入手したグランドナインバナナに対して追加のＲＮＡ－ｓｅｑ発現解析を行った。５つの成熟段階から果皮及び果肉のサンプルを採取した：全緑色（未熟期）、緑－黄色（第１の転換点）、全黄色（成熟期）、黄－褐色（第２の転換点）、全褐色（過熟期）。全ての果肉サンプル及び全緑色期の果皮から高品質のＲＮＡが得られた。インビトログランドナイン植物の葉及び根、並びに胚及び胚形成細胞のインビトロ培養からも組織サンプルを採取した。ＴＭＭ正規化を用いて上記のように相対的ｍＲＮＡ存在量を定量化した。図８から分かる通り、ＰＰＯ１、ＰＰＯ４、及びＰＰＯ９は、未熟な緑色期のグランドナインバナナの果皮におけるＰＰＯ発現の９０％超を占めるが、グランドナインバナナの果肉で発現する優勢ＰＰＯ遺伝子はＰＰＯ１であり、ＰＰＯ８がより高発現する過熟褐色期は例外である。

【0179】

実施例４－ＰＰＯ活性の確認
ＰＰＯ１及びＰＰＯ２等の同定されたＰＰＯが実際にＰＰＯ遺伝子であることを確認するために、タンパク質を合成し、比色アッセイを用いてＰＰＯ活性を試験する。簡潔に説明すると、各合成ＰＰＯについて、合成酵素溶液０．２ｍＬ及び１０ｍＭ ４－メチルカテコール（０．２Ｍリン酸バッファ、ｐＨ６．３）２．８ｍＬを混合し、経時的な４２０ｎｍにおける吸光度の変化の関数としてＰＰＯ活性を測定する（吸光度の増加がＰＰＯ活性を示す）。データプロットの直線部分を用いて相対的酵素活性を計算する。

【0180】

実施例５－ＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ８、又はＰＰＯ９において編集された遺伝的に改変された植物の作出
ＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ８、又はＰＰＯ９のレベル又は活性を低下させる効果を測定するために、ＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ８、又はＰＰＯ９のいずれかを編集した遺伝的に改変されたバナナ植物を作出する。ＰＰＯ３が編集された植物を対照として用いる。アグロバクテリウムを用いて、ＣＡＳ９をコードしているＤＮＡと、ＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ３、ＰＰＯ８、又はＰＰＯ９を標的とするｓｇＲＮＡとをバナナ植物のゲノムに導入する。Ｃａｓ９機構をコードしており、ＰＰＯを標的とするｓｇＲＮＡ及びカナマイシン耐性遺伝子（ｎｐｔＩＩ）を発現するプラスミドを保有するアグロバクテリウム株で、胚形成細胞懸濁液（ＥＣＳ）を形質転換する。Ｇａｎａｐａｔｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ（２００１）２０：１５７－１６２及びＫａｎｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｏｃｔｏｂｅｒ ２００４，Ｖｏｌｕｍｅ １４，Ｉｓｓｕｅ ３，ｐｐ ２３９－２５２に従って、アグロバクテリウム形質転換を行う。胚形成細胞をアグロバクテリウムと共に１～３日間共培養し、次いで、シュートが発生するまで選択剤としてＧ４１８を含有する再生培地に移す。

【0181】

それぞれ以下の表３及び３Ａに示すｓｇＲＮＡの対を含む、各ＰＰＯ遺伝子を別々に標的とするＣＲＩＳＰＲベクターコンストラクトを用いる。表３及び３Ａは、それぞれ配列番号９８として収載されるスカフォールドと共に使用されるｓｇＲＮＡの可変配列を示す。二重変異体植物が作出される確率を最大限に高めるために、表３に示すように、ｓｇＲＮＡ１とｓｇＲＮＡ２との組み合わせを含むコンストラクトを作製した。ＰＰＯ２を編集する例を図６に示す。対照として、ＰＰＯ３を標的とする遺伝的に改変された植物を作出する。以下のｓｇＲＮＡ可変領域の組み合わせを使用した：配列番号３２及び３３、配列番号６２及び３３、配列番号３４及び３５、配列番号３６及び３７、配列番号３８及び３９、配列番号３２及び３４、配列番号３２及び３５、配列番号３３及び３４、配列番号３３及び３５；配列番号３８及び３９；並びに配列番号５７及び５８。

【0182】

【表3】

【0183】

【表3A】

【0184】

遺伝的に改変された植物が再生したら、結実するまで圃場で成長させる。編集された植物と野生型植物との間でＰＰＯ発現及び果実の褐変を比較することにより、圃場試験中に成熟植物／果実におけるＰＰＯ編集表現型の評価を行う。各編集された系統及び対照系統から約２０株の植物を５株ずつ４群に分け、圃場で無作為に間隔をあけて配置する。植物が開花まで約１２週間かかり、開花の約１４～１７週間後に果実の発達を評価する。果実については、定植から２４週間後に３群を収穫し、エチレンで誘導された成熟の有り無し両方での褐変／ＰＰＯ発現を試験するために、各房を分割し、エチレンで成熟させずに保管するか（黄色期の代表）又はエチレンで成熟させる。

【0185】

上記実施例１に記載の通り、褐変を測定することができる。

【0186】

葉で発現するＰＰＯ遺伝子が編集された対照植物（例えばＰＰＯ９が編集されたもの）は、（葉で予め発現を試験することができるため）より早い発生段階でのＰＰＯの発現レベル及び／又は活性について野生型植物と比較する。どの遺伝的に改変された植物が果実において褐変の低減及び／又はＰＰＯの発現低下を示すのかが特定されたら、遺伝的に改変されておらず、選択されたＰＰＯ遺伝子が一過的に編集されたバナナ植物（ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９機構がゲノムに組み込まれていない）が作出される。

【0187】

実施例６－一過性ＣＡＳ９発現を用いたＰＰＯ遺伝子に変異を有するバナナ植物の作出
ＰＰＯ遺伝子が変異しているバナナ植物を作出するために、ＣＡＳ９機構をコードしており、更にＰＰＯ遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡを発現するベクターをバナナの胚形成細胞懸濁液（ＥＣＳ）に導入する。ＥＣＳを作製するために、まず、Ｍａ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｌ ｃｒｏｐｓ，Ｔａｉｐｅｉ，Ｔａｉｗａｎ，８－９ Ｍａｒｃｈ １９８８，ｐｐ．１８１－１８８及びＳｃｈｏｏｆｓ，Ｈ．（１９９７）－“Ｔｈｅ ｏｒｉｇｉｎ ｏｆ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｍｕｓａ”，ＰｈＤ ｔｈｅｓｉｓ，ＫＵＬｅｕｖｅｎ，Ｂｅｌｇｉｕｍに記載の通り、未熟な雄花又は茎頂等の初期外植片から胚形成カルスを発生させる。次いで、液体培地中で新たに発生した高度胚発生カルスから胚形成細胞懸濁液（ＥＣＳ）の培養を開始する。次に、培養を開始した細胞懸濁液が完全に定着するまで（６～９ヶ月）、１２～１４日ごとに培地の８０％を交換する。

【0188】

次いで、ＣＡＳ９機構をコードしており、更にＰＰＯを標的とするｓｇＲＮＡを発現するプラスミドを胚形成細胞懸濁液に打ち込む。細胞の打ち込みは、当技術分野で公知の任意の方法、例えばＨａｍａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐ．２０１８；８：１４４２２に記載の方法に従って実施することができる。打ち込みに用いられるプラスミドは全て４つの転写ユニットを含む。第１の転写ユニットには、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）Ｃａｓ９（ヒトコドン最適化）の発現を駆動するＣａＭＶ－３５Ｓプロモータ及びタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）ターミネータが含まれる。次の転写ユニットは、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光マーカーの発現を駆動する別のＣａＭＶ－３５Ｓプロモータ及びｔＮＯＳ（ノパリン合成酵素）ターミネータからなる。第３及び第４の転写ユニットにはそれぞれ、選択された標的遺伝子に対するｓｇＲＮＡを発現するコムギＵ６プロモータが含まれる（各ベクターは２つのｓｇＲＮＡを含む）。打ち込みに用いられるプラスミドに含まれるｓｇＲＮＡは、ＰＰＯ遺伝子を標的とするように設計される。ｓｇＲＮＡは、例えば、以下を標的とするように設計された：
－ ＰＰＯ遺伝子ＰＰＯ１ Ｍａ０６＿ｇ３１０８０（配列番号５）のエクソン１にみられる領域；
－ ＰＰＯ遺伝子ＰＰＯ２ Ｍａ０７＿ｇ０３５４０（配列番号６）のエクソン１にみられる領域；
－ ＰＰＯ遺伝子ＰＰＯ３ Ｍａ０７＿ｇ０３６５０（配列番号７）のエクソン２にみられる領域；
－ ＰＰＯ遺伝子ＰＰＯ８ Ｍａ０８＿３４７４０（配列番号１２）のエクソン１にみられる領域；及び
－ ＰＰＯ遺伝子ＰＰＯ９ Ｍａ１０＿ｇ２０５１０（配列番号１３）のエクソン２にみられる領域。

【0189】

使用したｓｇＲＮＡ及びその設計に使用した標的遺伝子を表４にまとめる（ｓｇＲＮＡ配列は全て５’から３’方向に列挙される。ｓｇＲＮＡは全て、ＰＡＭモチーフの配列（表４では太字体でマークされている）なしでクローニングされた。

【0190】

【表4】

【0191】

【表4A】

【0192】

上に示したｓｇＲＮＡを含有するベクターを打ち込んだ３日後、細胞を増殖培地に移し、続いて胚発生培地（ＥＤＭ）、次いで成熟培地に移す（関連する培地は、例えば、Ｓｔｒｏｓｓｅ Ｈ．，Ｒ．Ｄｏｍｅｒｇｕｅ，Ｂ．Ｐａｎｉｓ，Ｊ．Ｖ．Ｅｓｃａｌａｎｔ ａｎｄ Ｆ．Ｃｏｔｅ，２００３，Ｂａｎａｎａ ａｎｄ ｐｌａｎｔａｉｎ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ ｃｅｌｌ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｓ（Ａ．Ｖｅｚｉｎａ ａｎｄ Ｃ．Ｐｉｃｑ，ｅｄｓ）．ＩＮＩＢＡＰ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ８，Ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｎｅｔｗｏｒｋ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｂａｎａｎａ ａｎｄ Ｐｌａｎｔａｉｎ，Ｍｏｎｔｐｅｌｌｉｅｒ，Ｆｒａｎｃｅに見出すことができる）。発芽培地で成熟胚を発芽させ（Ｓｔｒｏｓｓｅ Ｈ．，Ｒ．Ｄｏｍｅｒｇｕｅ，Ｂ．Ｐａｎｉｓ，Ｊ．Ｖ．Ｅｓｃａｌａｎｔ ａｎｄ Ｆ．Ｃｏｔｅ．２００３．Ｂａｎａｎａ ａｎｄ ｐｌａｎｔａｉｎ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ ｃｅｌｌ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｓ（Ａ．Ｖｅｚｉｎａ ａｎｄ Ｃ．Ｐｉｃｑ，ｅｄｓ）．ＩＮＩＢＡＰ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ８．Ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｎｅｔｗｏｒｋ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｂａｎａｎａ ａｎｄ Ｐｌａｎｔａｉｎ，Ｍｏｎｔｐｅｌｌｉｅｒ，Ｆｒａｎｃｅ）、若いシュートを高さ約１ｃｍになるまでシュート成熟培地に移す。小植物体を発生させるためにシュートを発根培地に移す。

【0193】

次に、ゲノムＤＮＡを抽出するために各小植物体から葉のサンプルを採取し、次世代シーケンシングを用いてＤＮＡサンプルを遺伝子型解析に供する。遺伝子型解析の目的は、Ｃａｓ９が駆動する遺伝子編集イベントがＰＰＯ遺伝子のいずれかにおいて生じたかどうかを特定することである。植物体を個別にサンプリングする。葉の小片を切り、サンプルチューブに入れる（約２５ｍｇ）。これらサンプルから、ＯｋｔｏＰｕｒｅ ｓｙｓｔｅｍ（ＬＧＣ）においてＳｂｅａｄｅｘ ｋｉｔ（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてゲノムＤＮＡを抽出する。得られたゲノムＤＮＡを５ｎｇ／μＬに希釈し、次いで混合して、１２個の小植物体のプールを形成する。予測される編集部位に隣接するプライマーを用いて標的遺伝子のＰＣＲ増幅を行って、１０ｎｇのテンプレートＤＮＡを用いて１Ｋｂｐのアンプリコンを形成する。プールした各サンプルのＰＣＲアンプリコンを混合し、ＡｍｐＳｅｑシーケンシングに送る。ここでは、トランスポザーゼによって媒介される断片化を用いてライブラリーを構築し、次いで、各アンプリコンについてのシーケンシングのリードを生成するためにｍｉｓｅｑシーケンシングを行う。次いで、「Ｇｅｎｅｉｏｕｓ」、「ｐｉｎｄｅｌ」、「ｖａｒｓｃａｎ」、及び「ｆｒｅｅｂａｓｅ」ソフトウェアを用いてアンプリコン配列を解析して、潜在的なインデルを同定する。編集イベントが見つかった場合、表５に列挙するプライマーを用いたＰＣＲ反応によって更に検証する。編集が見つかった場合、小植物体の由来するＥＣＳ中で一過的に発現したＣａｓ９によって標的遺伝子が切断されたことを示す。Ｃａｓ９が実際に一過的に発現したことを確認するために、表６に列挙する標準的なプライマーセットを用いたＰＣＲ及びｑＲＴ－ＰＣＲによって、Ｃａｓ９及び保有ベクターの骨格が存在しないことを確認する。

【0194】

別の方法では、遺伝子型解析のためにサンガーシーケンシングを用い、ゲノムＤＮＡを用いて、予測される編集部位に隣接するプライマーを用いて標的領域を増幅し（表５）、サンガーシーケンシングによって１ｋｂｐのアンプリコンを解析して標的遺伝子の編集を同定する。

【0195】

【表5】

【0196】

【表6】

【0197】

編集された小植物体が同定されたら、その小植物体を微細繁殖させて、追加の同一の小植物体を作出する。微細繁殖法は当技術分野で公知であり、例えば、Ｍｕｎｉｒ Ｉｑｂａｌ ｅｔ ａｌ．（２０１３），Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｖｏｌｕｍｅ ２，Ｉｓｓｕｅ １，ＩＳＳＮ（Ｏｎｌｉｎｅ）２３１９－１４７３に記載されている。次いで、編集された植物のＰＰＯレベル及び褐変を、上記の通り圃場で確認する。

【0198】

上記実施例１に記載の通り、褐変を測定することができる。

【0199】

実施例７－アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）を用いて形質転換した胚形成細胞における一過性Ｃａｓ９発現を用いた、ＰＰＯ遺伝子に変異を有するバナナ植物の作出
ＰＰＯ遺伝子が変異しているバナナ植物を作出するための実施例６に記載した方法とは別の方法では、胚形成バナナ細胞のアグロバクテリウムによって媒介される形質転換を利用する。実施例６に記載の通り胚形成細胞懸濁液（ＥＣＳ）を作製し、Ｋｈａｎｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｒｅｅｄ．２００４；１４：２３９及びＴｒｉｐａｔｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．－Ｐｌａｎｔ ２０１２；４８：２１６に記載されているもの等の手順に従ってアグロバクテリウム・ツメファシエンスを使用して形質転換する。アグロバクテリウムによって媒介される形質転換に用いられるプラスミドは全て４つの転写ユニットを含む。第１の転写ユニットは、選択剤に対する耐性を付与する耐性遺伝子の発現を駆動する。次の転写ユニットは、ヒトコドン最適化された化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９の発現を駆動する。第３及び第４の転写ユニットにはそれぞれ、選択された標的遺伝子に対するｓｇＲＮＡの発現を駆動する（各ベクターは２つのｓｇＲＮＡを含む）。アグロバクテリウムによって媒介される形質転換に用いられるプラスミドに含まれるｓｇＲＮＡは、ＰＰＯ遺伝子を標的とするように設計される。使用したｓｇＲＮＡ及びその設計に使用した標的遺伝子を表４にまとめる（ｓｇＲＮＡ配列は全て５’から３’方向に列挙され、ＰＡＭモチーフの配列を有しないｓｇＲＮＡがクローニングされ、これを表４では太字体でマークする）。

【0200】

上記のプラスミドを保有するアグロバクテリウム・ツメファシエンス細胞と共にバナナ胚形成細胞を共培養した後、２５０ｍＬ三角フラスコ中の選択剤を含有する液体増殖培地にバナナ細胞を再懸濁させ、穏やかに振盪しながら５日間培養する。この選択処理により、形質転換に成功し、それによって耐性遺伝子を発現したバナナ細胞を濃縮することができるが、形質転換されていないバナナ細胞及びアグロバクテリウム・ツメファシエンス細胞は選択される。その後、バナナ細胞を液体増殖培地で４回洗浄して選択剤を除去し、次いで、増殖培地、続いて胚発生培地、成熟培地、及び発芽培地で培養する（関連する培地は、例えば、Ｓｔｒｏｓｓｅ Ｈ．，Ｒ．Ｄｏｍｅｒｇｕｅ，Ｂ．Ｐａｎｉｓ，Ｊ．Ｖ．Ｅｓｃａｌａｎｔ ａｎｄ Ｆ．Ｃｏｔｅ，２００３，Ｂａｎａｎａ ａｎｄ ｐｌａｎｔａｉｎ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ ｃｅｌｌ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｓ（Ａ．Ｖｅｚｉｎａ ａｎｄ Ｃ．Ｐｉｃｑ，ｅｄｓ）．ＩＮＩＢＡＰ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ８，Ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｎｅｔｗｏｒｋ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｂａｎａｎａ ａｎｄ Ｐｌａｎｔａｉｎ，Ｍｏｎｔｐｅｌｌｉｅｒ，Ｆｒａｎｃｅに見出すことができる）。若いシュートを高さ約１ｃｍになるまでシュート成熟培地に移し、その後、小植物体を発生させるために発根培地に移す。実施例６に記載した通り、葉のサンプルからゲノムＤＮＡを抽出し、表５に列挙した遺伝子特異的プライマーを用いてＰＣＲ及びシークエンシングすることによって標的部位を解析することにより、再生植物における標的遺伝子編集を同定する。表６に列挙するプライマーを用いたｑＲＴ－ＰＣＲで、編集された植物系統にプラスミド配列が存在しないことを確認する。最後に、実施例６で論じたように、編集された植物を微細繁殖させてクローンを作製し、実施例１に記載した方法を用いて植物における酵素的褐変のレベルを検証する。上記の手順を使用して、ＰＰＯ１遺伝子に標的とする編集を含み、ゲノムに組み込まれた外来プラスミド配列を有しないバナナ植物を得ることに成功した。バナナ胚形成細胞を、いずれもＰＰＯ１の第１のエクソンを標的とするｓｇＲＮＡ ｓｇ８５７（配列番号１７６）及びｓｇ８５８（配列番号５０）を含むプラスミドｐＭＯＬ＿００１９（表４参照）で形質転換した。ｐＭＯＬ＿００１９で形質転換した細胞を一過的に選択し、シュートへと再生し、これを上記の通りサンガーシーケンシング及びｑＲＴ－ＰＣＲによってスクリーニングした。

【0201】

ＰＰＯ１が編集された植物は、ＰＰＯ１の３つのアレルのうちの１つの第１のエクソンに一塩基対の欠失を有するので、編集されたアレルからは切断型ＰＰＯ１タンパク質が産生される。得られたタンパク質配列、コード配列、及び遺伝子配列を、それぞれ配列番号１７７、１７８、及び１７９に提供する。ＰＰＯ１遺伝子の標的領域を図７Ａに示し、欠失したヌクレオチド（シトシン－ｂｐ３７１）、ｓｇＲＮＡ、及び遺伝子型解析用プライマーをハイライトする。編集されたＰＰＯ１タンパク質及び編集されていないＰＰＯ１タンパク質の配列を図７Ｂに示す。表７に示すように、プラスミド特異的プライマーは、ＰＰＯ１が編集されたバナナ植物から抽出されたゲノムＤＮＡから標的配列を増幅することができなかった。これは陰性対照の野生型植物からのＤＮＡでも同様であったが、これらプライマーは、陽性対照のトランスジェニック植物から抽出されたゲノムＤＮＡからはプラスミド配列を増幅した。内部対照として、全サンプルで内因性バナナゲノム領域を増幅させた。従って、これら分析から、ＰＰＯ１が編集されたバナナ植物のゲノムにはプラスミド配列が存在しないことが確認された。

【0202】

【表7】

【0203】

実施例８－更なるｓｇＲＮＡの設計
ターゲティング特異性（潜在的オフターゲット編集の最小数）、編集効率（ターゲティングに影響を与える潜在的なＲＮＡ二次構造及びＳＮＰを考慮）、及び変異の予測可能性（ＤＳＢ周辺の配列マイクロホモロジーに基づくフレームシフト変異を誘発する可能性）を最大化するために、更なるＰＰＯ ｓｇＲＮＡを設計した。表８に列挙するように、Ｃａｓ９及び塩基エディタの両ターゲティング戦略について、それぞれ、標的遺伝子のコード配列に未成熟終止コドンを生じさせるインデル又はプログラム可能な塩基置換のいずれかが生じるように、全てのＰＰＯ遺伝子につき複数のｓｇＲＮＡを設計した。Ｃａｓ９編集用に設計されたｓｇＲＮＡは、Ｃａｓ９を用いた編集に最も有効であると予測されるが、塩基エディタによる編集にも有用であり得る。同様に、塩基編集用に設計されたｓｇＲＮＡは、塩基エディタを用いた編集に最も有効であると予測されるが、Ｃａｓ９による編集にも有用であり得る。主に対照として使用するために、ＰＰＯ３及びＰＰＯ７に対するｓｇＲＮＡも設計した。表８の配列はＰＡＭ部位を含まない。ＰＡＭ部位は、ガイド配列を標的配列にアラインすることによって同定することができる。

【0204】

【表8-1】

【0205】

【表8-2】

【0206】

本発明をその具体的な実施形態と併せて説明してきたが、当業者にとって多くの代替例、改変例、及び変形例が明らかになることは明白である。従って、添付の特許請求の範囲の趣旨及び広い範囲内のそのような代替例、改変例、及び変形例が全て包含されることが意図される。

【0207】

本明細書で言及される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、個々の刊行物、特許、又は特許出願が参照により本明細書中に援用されることが具体的かつ個別に示されているかのように、その全体が参照により本明細書に援用される。また、本出願における任意の参照文献を引用又は特定することは、そのような文献が本発明の先行技術として利用可能であることを認めると解釈されるものではない。章の見出しが使用されている限りにおいて、それが必ずしも限定的であると解釈されるべきではない。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5-1】

【図5-2】

【図6】

【図7-1】

【図7-2】

【図8-1】

【図8-2】

【配列表】

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【国際調査報告】