▶ カウンスィル オブ サイエンティフィック アンド インダストリアル リサーチの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-07-09
(54)【発明の名称】操作されたＦｎＣａｓ９およびその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/09 20060101AFI20240702BHJP
C12N 15/11 20060101ALI20240702BHJP
C07K 14/195 20060101ALN20240702BHJP
【ＦＩ】
C12N15/09 110
C12N15/11 Z ZNA
C07K14/195
【審査請求】未請求
【予備審査請求】有
(21)【出願番号】P 2023580653
(86)(22)【出願日】2022-06-29
(85)【翻訳文提出日】2024-02-22
(86)【国際出願番号】 IN2022050595
(87)【国際公開番号】W WO2023275892
(87)【国際公開日】2023-01-05
(31)【優先権主張番号】202111029109
(32)【優先日】2021-06-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】IN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】596020691
【氏名又は名称】カウンスィル オブ サイエンティフィック アンド インダストリアル リサーチ
【氏名又は名称原語表記】ＣＯＵＮＣＩＬ ＯＦ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ ＆ ＩＮＤＵＳＴＲＩＡＬ ＲＥＳＥＡＲＣＨ
(74)【代理人】
【識別番号】110001737
【氏名又は名称】弁理士法人スズエ国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】チャクラボーティ、デボジョティ
(72)【発明者】
【氏名】マイティ、ソウヴィク
(72)【発明者】
【氏名】ヌレキ、オサム
(72)【発明者】
【氏名】ニシマス、ヒロシ
(72)【発明者】
【氏名】アチャーヤ、サンダラム
(72)【発明者】
【氏名】ヒラノ、セイチ
(72)【発明者】
【氏名】ヒラノ、ヒサト
【テーマコード（参考）】
4H045
【Ｆターム（参考）】
4H045AA10
4H045BA09
4H045CA11
4H045FA74
(57)【要約】
向上した動態活性およびより広範なＰＡＭ認識を有する、操作されたＦｎＣａｓ９変異体が提供される。Ｃａｓ９酵素と標的ＤＮＡとの間の相互作用を安定化させる特異的変異をタンパク質工学により導入した。向上した動態活性は、ＷＴ ＦｎＣａｓ９よりも効率的なＤＳＢ生成能によってＮＨＥＪ媒介性編集を増加させ、拡大されたＰＡＭ特異性は、ＦｎＣａｓ９変異体の標的範囲を増加させる。したがって、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システム標的の範囲およびアクセシビリティは、堅牢で高度に特異的に操作されたＦｎＣａｓ９変異体の生成と共に拡大される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
（ａ）配列番号２～１９７からなる群から選択される操作されたＦｎＣａｓ９タンパク質エフェクター；および（ｂ）配列番号１９８～２１５からなる群から選択されるＤＮＡ配列を使用してインビトロで転写されたｃｒｉｓｐｒ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）と、配列番号３０５を有するトランス活性化ｃｒｉｓｐｒ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）とを含む、キメラシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）；
を含む、遺伝子編集のためのリボ核タンパク質複合体。
【請求項2】
ＮＧＧ、ＮＧＡ、ＧＧＡおよびＧＧＧからなる群から選択されるＰＡＭ配列に結合した、請求項１に記載のリボ核タンパク質複合体。
【請求項3】
前記操作されたＦｎＣａｓ９タンパク質エフェクターが、配列番号２である、請求項１に記載のリボ核タンパク質複合体。
【請求項4】
前記操作されたＦｎＣａｓ９タンパク質エフェクターが、配列番号３である、請求項１に記載のリボ核タンパク質複合体。
【請求項5】
前記操作されたＦｎＣａｓ９タンパク質エフェクターが、配列番号４である、請求項１に記載のリボ核タンパク質複合体。
【請求項6】
前記操作されたＦｎＣａｓ９タンパク質エフェクターが、配列番号５である、請求項１に記載のリボ核タンパク質複合体。
【請求項7】
前記操作されたＦｎＣａｓ９タンパク質エフェクターが、配列番号１６である、請求項１に記載のリボ核タンパク質複合体。
【請求項8】
前記操作されたＦｎＣａｓ９タンパク質エフェクターが、配列番号３１である、請求項１に記載のリボ核タンパク質複合体。
【請求項9】
前記操作されたＦｎＣａｓ９タンパク質エフェクターが、配列番号４０である、請求項１に記載のリボ核タンパク質複合体。
【請求項10】
前記操作されたＦｎＣａｓ９タンパク質エフェクターが、配列番号４７である、請求項１に記載のリボ核タンパク質複合体。
【請求項11】
前記操作されたＦｎＣａｓ９タンパク質エフェクターが、配列番号５１～９９からなる群から選択される、請求項１に記載のリボ核タンパク質複合体。
【請求項12】
請求項１に記載のリボ核タンパク質複合体による遺伝子編集のための方法であって、前記方法は、
（ａ）配列番号２～９９からなる群から選択される前記操作されたＦｎＣａｓ９タンパク質エフェクターを、生細胞に送達すること；
（ｂ）前記ｃｒＲＮＡを配列番号１９８～２１１からなる群から選択されるＤＮＡ配列で転写し、前記ｓｇＲＮＡを使用して遺伝子標的においてＤＮＡを切断すること；および
（ｃ）場合により修復ＤＮＡ鋳型を含む前記細胞の修復機構によって、前記ＤＮＡ切断を封じること
を含む、方法。
【請求項13】
請求項１に記載のリボ核タンパク質複合体による塩基編集のための方法であって、前記方法は、
（ａ）配列番号１００～１９７からなる群から選択される前記操作されたＦｎＣａｓ９タンパク質エフェクターを、生細胞に送達すること；および
（ｂ）前記ｃｒＲＮＡを配列番号２１２～２１５からなる群から選択されるＤＮＡ配列で転写し、前記ｓｇＲＮＡを使用して前記ＤＮＡを切断することなく達成される、標的塩基を改変すること、
を含む、方法。
【請求項14】
（ａ）配列番号２～１９７からなる群から選択される操作されたＦｎＣａｓ９タンパク質エフェクター；および（ｂ）前記配列番号１９８～２１５からなる群から選択されるＤＮＡ配列を使用してインビトロで転写されたｃｒｉｓｐｒ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）；および配列番号３０５を有するトランス活性化ｃｒｉｓｐｒ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む、キメラシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）。
ｃ）相同組換え修復（ＨＤＲ）鋳型；
ｄ）適切な緩衝液、
からなる、遺伝子編集用のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、動態向上した操作されたｆｎｃａｓ９、およびフランシセラ・ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ）から得られた操作されたＣａｓ９タンパク質を使用する遺伝子編集のための方法を提供する。この操作されたバージョンのＦｎＣａｓ９（ｅｎＦｎＣａｓ９）は、遺伝子ターゲティングのためのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの使用を拡大する野生型ＦｎＣａｓ９と比較して、より速い動態、より強い結合およびより広いＰＡＭ結合特異性を有する。ｅｎＦｎＣａｓ９の用途は多様であり、これらの設定に限定されないが、以下の医療分野、医薬品、農業、バイオテクノロジーおよび食品分野における進歩に潜在的な影響を与える。
【背景技術】
【0002】
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、遺伝子編集技術に革命をもたらすことにより、分子経路の解明をより容易にし、発現を制御して機能を理解し、変異を修正することによって複数の遺伝性疾患を処置する可能性を伴う。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの主な制限には、オフターゲット効果、および特定のＰＡＭ配列が必要であることによって制約される標的化の制限が含まれる。
【発明の概要】
【0003】
したがって、本開示は、フランシセラ・ノビシダからの、向上した動態活性を有する操作されたＣａｓ９タンパク質（ＦｎＣａｓ９）に関する。操作されたＣａｓ９は、標的の結合および切断に関し、ポリヌクレオチドに対してより高い活性を有する。操作された変異体はまた、標的におけるミスマッチに対する非常に高い特異性を有し、治療的ゲノム編集、疾患診断およびゲノム調節などの分野に適しているが、これらに限定されない。操作されたタンパク質のより高い動態活性は、酵素が以前はアクセスできなかったヌクレオチド遺伝子座の編集を可能にする。
【0004】
本開示の主な目的は、動態向上した操作されたｆｎｃａｓ９を提供することである。
【0005】
本開示の別の目的は、フランシセラ・ノビシダから得られた操作されたＣａｓ９タンパク質を使用する遺伝子編集のための方法を提供し、非常に正確で、効率的で、かつＰＡＭに柔軟な遺伝子編集方法を開発することである。
【0006】
本開示の別の目的は、真核細胞内の病原性変異を修正するための遺伝子編集ツールの使用を提供することである。
【0007】
本開示の別の目的は、インビボ条件下で核酸を改変するための遺伝子編集方法を使用することである。
【0008】
本開示の別の目的は、病原性ヌクレオチド配列の存在を検出するための方法を使用することである。
【0009】
本開示の別の目的は、２つの類似するヌクレオチド配列を識別するための方法を使用することである。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【図1】２０～２４ｎｔ長のガイドＲＮＡ（ｓｇ２０～２４、配列番号１９８～２０２）を有するｓｇＲＮＡを用いた野生型（ＷＴ）ＦｎＣａｓ９（配列番号１）のインビトロ切断活性。切断活性は、時間（ｘ軸）の関数としての切断パーセント（ｙ軸）で示す。
【図2】ＷＥＤ－ＰＩドメインが強調されたＦｎＣａｓ９の結晶構造（ＰＤＢ：５Ｂ２Ｏ）。ＷＥＤ－ＰＩドメインを拡大して、操作目的のために変更されたアミノ酸残基を示す。
【図3】０．５分間および１分間の切断率として表されるＧＧＧ ＰＡＭ含有ＤＮＡ基質を使用したＦｎＣａｓ９変異体（ＷＴ）およびｅｎＦｎ変異体（配列番号１～５０）のインビトロ切断スクリーニングを示す、切断パーセント（ｙ軸）対時間（ｘ軸）の棒グラフ。
【図4】インビトロ切断スクリーニングアッセイから選定されたＦｎＣａｓ９変異体のアミノ酸位置を示すＦｎＣａｓ９の結晶構造（ＰＤＢ：５Ｂ２Ｏ）。ＷＥＤ－ＰＩドメインは、点線の円で強調されている。
【図5】研究に使用した、精製されたＦｎＣａｓ９タンパク質（配列番号１）およびｅｎＦｎＣａｓ９タンパク質変異体（配列番号２～５、１６、３１、４０、４７）を示すＣｏｏｍａｓｓｉｅゲル。
【図6】時間（ｘ軸）の関数としての切断率（ｙ軸）として表される、ＦｎＣａｓ９（配列番号１）およびＧＧＧ ＰＡＭ含有ＰＣＲ線状化ＤＮＡ基質上の９つのｅｎＦｎＣａｓ９変異体のサブセット（配列番号２～５、１６、３１、４０、４７）のインビトロ切断アッセイ。エラーバーは、ＳＤを表す（３回の独立した実験）。
【図7】ＷＴおよびｅｎＦｎ変異体（配列番号１、１６、３１、３４、４０）についてのＰＡＭ発見アッセイ後に得られた結果を示す配列ロゴ。ロゴに示されている塩基は、Ｃａｓ９によるＰＡＭ塩基認識の選好を表す。
【図8】ＧＧＡ ＰＡＭ含有ＤＮＡ基質を使用した、ＦｎＣａｓ９変異体（ＷＴ）およびｅｎＦｎ変異体（配列番号３０、３１、３３～４０、４２～４７）のインビトロ切断スクリーニングを示す、切断パーセント（ｙ軸）対時間（ｘ軸）の棒グラフ。
【図9】時間（ｘ軸）の関数としての切断率（ｙ軸）として表される、ＧＧＡ ＰＡＭ含有ＤＮＡ基質を使用したインビトロ切断アッセイを示す棒グラフである。エラーバーは、ＳＤを表す（３回の独立した実験）。
【図10】置換アミノ酸とＰＡＭ二重鎖との間の相互作用を示す構造モデル。ｅｎ１（Ｅ１３６９Ｒ、配列番号２）とｅｎ１５（Ｅ１６０３Ｈ、配列番号１６）との相互作用を示す。
【図11】置換アミノ酸とＰＡＭ二重鎖との間の相互作用を示す構造モデル。ｅｎ４（Ｇ１２４３Ｔ、配列番号５）の＋１リン酸基との相互作用。
【図12】置換アミノ酸とＰＡＭ二重鎖との間の相互作用を示す構造モデル。ｅｎ３１（Ｅ１３６９Ｒ／Ｅ１６０３Ｈ／Ｇ１２４３Ｔ、配列番号３１）のＰＡＭ二重鎖およびＰＬＬループとの相互作用。
【図13】ＨＢＢおよびその変異基質（配列番号２８３、２８４）に対するＦｎＣａｓ９（配列番号１）、ｅｎ１（配列番号２）、ｅｎ１５（配列番号１６）およびｅｎ３１（配列番号３１）のインビトロ切断結果を示す棒グラフ。各基質は、標的長にわたって単一の変異（位置はＰＡＭから遠ざかるようにカウントして示す）を保有している。２５ｎＭのＤＮＡ基質をそれぞれの１００ｎＭ ＲＮＰと共に３７℃で１５分間インキュベートした。
【図14】様々な濃度のＤＮＡ基質（ｘ軸）配列番号２８１、２８２の関数としての画分結合（ｙ軸）として表される、ＶＥＧＦＡ３ ＤＮＡ基質に対するＷＴ ｄＦｎＣａｓ９ＧＦＰおよび変異体の親和性を示すマイクロスケール熱泳動の結果。
【図15】ＥＭＸ１、ＨＢＢおよびＲＵＮＸ１遺伝子座上のそれぞれのＣａｓ９およびそれぞれのオフターゲット（ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔｓ，ＯＴｓ）による、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における編集パーセントとしてのインデル事象。配列番号２８５～３００。エラーバーは、ＳＥＭを表す（３回の独立した実験）。
【図16】ＶＥＧＦＡ３基質ＤＮＡ（配列番号２８１、２８２）上のＦｎＣａｓ９とｅｎ１５との間の比較結合親和性を示すマイクロスケール熱泳動の結果。データは、精製されたＤＮＡ基質（モル単位Ｍ、ｘ軸）に対する画分結合ＲＮＰ（ｙ軸）として表される。エラーバーは、ＳＤを表す（３回の独立した実験）。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（配列番号２９７～３００）におけるＦＡＮＣＦ遺伝子座を標的にしたアンプリコンシーケンシングから得られたインデル事象（パーセンテージで表す）。トランスフェクトされていない細胞は、対照の役割を果たす。エラーバーは、ＳＥＭを表す（３回の独立した実験）。
【図17】ＲＥＣ２トランケーション（配列番号２７５、２７６を使用）は、ｅｎＦｎＣａｓ９変異体の活性および特異性を保持する。（Ａ）部分的ＲＥＣ２欠失を有するＦｎＣａｓ９ドメイン構成の概略図。（Ｂ）ＤＮＡおよびＲＮＡとの複合体におけるＦｎＣａｓ９の結晶構造（ＰＤＢ：５２ＢＯ）を、空間充填オーバーレイとともにリボンモデルに示す。切断されたＲＥＣ２ドメイン（ΔＳ１１２－Ａ２９７）を赤色で強調し、点線の円でマークする。（Ｃ）ＧＧＧ ＰＡＭ含有ＤＮＡ基質に対するｅｎ１（配列番号２）、ＦｎＣａｓ９ΔＲＥＣ２およびｅｎ１ΔＲＥＣ２（配列番号５１）のインビトロ切断効率を示す棒グラフ。５ｎＭ ＤＮＡ基質を１００ｎＭ ＲＮＰと共に３７℃で１時間インキュベートした。エラーバーは、ＳＤを表す（３回の独立した実験）。スチューデントのアンペアｔ検定ｐ値を、＊＊＜０．０１、＊＊＊＜０．００１で表す。（Ｄ）ｅｎ１ΔＲＥＣ２を使用したＦＥＬＵＤＡによるＳＣＤ検出のためのラテラルフローアッセイ（ＬＦＡ）の結果。対応するＴＯＰＳＥ値を下部に示す。
【図18】（Ａ）Ｆｎ－ＡＢＥおよびｅｎ３１－ＡＢＥ（配列番号１２９）による、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＥＭＸ１（使用）を標的にしたアンプリコンシーケンシングから得られたＡ＞Ｇ塩基置換率を差し引いた対照。（Ｂ）ｅｎ３１－ＡＢＥによる、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における胎児ヘモグロビンの遺伝的持続性（ＨＰＦＨ）の再現に関与する－１１１ ＨＢＧ１／２プロモーター（配列番号２１２、２１３を使用）を標的にしたアンプリコンシーケンシング（配列番号３０１、３０２）から得られたＡ＞Ｇ塩基置換率を差し引いた対照。
【図19】それぞれのＣａｓ９－ＣＢＥについて、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において２つの異なるｇＲＮＡ（ｓｇ１およびｓｇ２、配列番号２１４、２１５）によってＢＣＬ１１Ａエンハンサーを標的にしたアンプリコンシーケンシング（配列番号３０３、３０４を使用）から得られたＣ＞Ｔ塩基置換率を差し引いた対照。
【図20】遺伝子編集のためのエクスビボ方法。患者由来のｉＰＳＣを培養する。インキュベーション後の増殖細胞をＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９操作に曝露する。複合体は、標的ゲノム領域において二本鎖ＤＮＡ切断を誘導する。改変は、天然のＤＮＡ修復機構を介して修正される。次いで、首尾よく処理された細胞を臨床基準に従って処理する。例えば、ヘモグロビン障害の場合、ＣＤ３４＋ＨＳＣを単離し、規定のインキュベーション条件下でＴｅＳＲ、ＤＭＥＭなどの適切な培地中で培養する。細胞の増殖に続いて、エレクトロポレーションを行い、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体を導入することができる細孔を細胞膜に作り出す。この複合体は、編集される遺伝子内の配列を標的とし、所望の切断を行う。ＨＤＲまたはＮＨＥＪなどの修復機構は、修正をサポートする。発現されると、首尾よく編集された細胞は、増殖を経て、臨床的に承認されたプラクティスに従ってレシピエントに再び導入される。
【図21】遺伝子編集のためのインビボ方法。患者に、ＡＡＶベクターを介して編集される遺伝子を標的とするように特別に設計されたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９構築物を導入する。標的細胞と会合した後の複合体は、所望の導入遺伝子発現をもたらし得る。患者における正しいタンパク質形成を介した症状逆転または所望の表現型の下流のフォローアップは、臨床的に承認されたプラクティスを遵守しながら観察することができる。
【発明を実施するための形態】
【0011】
本明細書における実施形態は、遺伝子編集のためのリボ核タンパク質複合体、リボ核タンパク質複合体を含む変異体、リボ核タンパク質複合体による遺伝子編集のための方法、リボ核タンパク質複合体による塩基編集のための方法、およびリボ核タンパク質複合体を含む遺伝子編集のためのキットを対象とする。
【0012】
リボ核タンパク質複合体は、（ａ）配列番号２～１９７からなる群から選択される操作されたＦｎＣａｓ９タンパク質エフェクターと、（ｂ）配列番号１９８～２１５からなる群から選択されるＤＮＡ配列を使用してインビトロで転写されるｃｒｉｓｐｒ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、および配列番号３０５を有するトランス活性化ｃｒｉｓｐｒ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）、を含むキメラシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）と、を含むか、またはそれらからなる。
【0013】
非限定的な例において、リボ核タンパク質複合体は、ＮＧＧ、ＮＧＡ、ＧＧＡおよびＧＧＧからなる群から選択されるＰＡＭ配列に結合され得る。
【0014】
非限定的な例において、リボ核タンパク質複合体の操作されたＦｎＣａｓ９タンパク質エフェクターは、配列番号２である。配列番号２を有する操作されたＦｎＣａｓ９タンパク質エフェクター配列は、野生型ＦｎＣａｓ９のアミノ酸位置１３６９のグルタミン酸（ｇｌｕ；Ｅ）がアルギニン（ａｒｇ；Ｒ）に置換されるなどの点変異を有する。
【0015】
非限定的な例において、リボ核タンパク質複合体の操作されたＦｎＣａｓ９タンパク質エフェクターは、配列番号３である。配列番号３を有する操作されたＦｎＣａｓ９タンパク質エフェクター配列は、野生型ＦｎＣａｓ９（配列番号１）のアミノ酸位置１４４９においてグルタミン酸（ｇｌｕ；Ｅ）がヒスチジン（ｈｉｓ；Ｈ）に置換されるなどの点変異を有する。
【0016】
非限定的な例において、リボ核タンパク質複合体の操作されたＦｎＣａｓ９タンパク質エフェクターは、配列番号４である。配列番号４を有する操作されたＦｎＣａｓ９タンパク質エフェクター配列は、野生型ＦｎＣａｓ９（配列番号１）のアミノ酸位置１３６９においてグルタミン酸（ｇｌｕ；Ｅ）がアルギニン（ａｒｇ；Ｒ）に置換され、野生型ＦｎＣａｓ９（配列番号１）のアミノ酸位置１４４９においてグルタミン酸がヒスチジンに置換されるなどの点変異を有する。
【0017】
非限定的な例において、リボ核タンパク質複合体の操作されたＦｎＣａｓ９タンパク質エフェクターは、配列番号５である。配列番号５を有する操作されたＦｎＣａｓ９タンパク質エフェクター配列は、野生型ＦｎＣａｓ９（配列番号１）のアミノ酸位置１２４３においてグリシン（ｇｌｙ；Ｇ）がトレオニン（ｔｈｒ；Ｔ）によって置き換えられるような点変異を有する。
【0018】
非限定的な例において、リボ核タンパク質複合体の操作されたＦｎＣａｓ９タンパク質エフェクターは、配列番号１６である。配列番号１６を有する操作されたＦｎＣａｓ９タンパク質エフェクター配列は、野生型ＦｎＣａｓ９（配列番号１）のアミノ酸位置１６０３においてグルタミン酸（ｇｌｕ；Ｅ）がヒスチジン（ｈｉｓ；Ｈ）に置換されるなどの点変異を有する。
【0019】
非限定的な例において、リボ核タンパク質複合体の操作されたＦｎＣａｓ９タンパク質エフェクターは、配列番号３１である。配列番号３１を有する操作されたＦｎＣａｓ９タンパク質エフェクター配列は、野生型ＦｎＣａｓ９（配列番号１）のアミノ酸位置１３６９においてグルタミン酸（グルー；Ｅ）がアルギニン（ａｒｇ；Ｒ）に置換され、野生型ＦｎＣａｓ９（配列番号１）のアミノ酸位置１４４９においてグルタミン酸（ｇｌｕ；Ｅ）がヒスチジン（ｈｉｓ；Ｈ）に置換され、野生型ＦｎＣａｓ９（配列番号１）のアミノ酸位置１２４３においてグリシン（ｇｌｙ；Ｇ）がトレオニン（ｔｈｒ；Ｔ）に置換されるなどの点変異を有する。
【0020】
非限定的な例において、リボ核タンパク質複合体の操作されたＦｎＣａｓ９タンパク質エフェクターは、配列番号４０である。配列番号４０を有する操作されたＦｎＣａｓ９タンパク質エフェクター配列は、野生型ＦｎＣａｓ９（配列番号１）のアミノ酸位置１３６９においてグルタミン酸（ｇｌｕ；Ｅ）がアルギニン（ａｒｇ；Ｒ）に置換され、野生型ＦｎＣａｓ９（配列番号１）の位置１２４３においてグリシン（ｇｌｙ；Ｇ）がトレオニン（ｔｈｒ；Ｔ）に置換されるなどの点変異を有する。
【0021】
非限定的な例において、リボ核タンパク質複合体の操作されたＦｎＣａｓ９タンパク質エフェクターは、配列番号４７である。配列番号４７を有する操作されたＦｎＣａｓ９タンパク質エフェクター配列は、野生型ＦｎＣａｓ９（配列番号１）のアミノ酸位置１６０３においてグルタミン酸（ｇｌｕ；Ｅ）がヒスチジン（ｈｉｓ；Ｈ）に置換され、野生型ＦｎＣａｓ９ａ（配列番号１）のアミノ酸位置１２４３においてグリシン（ｇｌｙ；Ｇ）がトレオニン（ｔｈｒ；Ｔ）に置換されるなどの点変異を有する。
【0022】
非限定的な例において、リボ核タンパク質複合体の操作されたＦｎＣａｓ９タンパク質エフェクターは、配列番号５１～９９からなる群から選択される。配列番号５１～９９を有する操作されたＦｎＣａｓ９タンパク質エフェクター配列は、ＲＥＣ２欠失を有する。
【0023】
例示的な変異体は、リボ核タンパク質複合体がＮＧＧ、ＮＧＡ、ＧＧＡおよびＧＧＧからなる群から選択されるＰＡＭ配列に結合している、本明細書に記載されるようなリボ核タンパク質複合体を含む。
【0024】
本明細書に記載されるリボ核タンパク質複合体による遺伝子編集のための方法は、操作されたＦｎＣａｓ９タンパク質エフェクターを生細胞に送達することを含む。操作されたＦｎＣａｓ９タンパク質エフェクターは、配列番号２～９９からなる群から選択され得る。遺伝子編集のための方法は、ｓｇＲＮＡを使用して遺伝子標的においてＤＮＡを切断することをさらに含み、ｃｒＲＮＡは、配列番号１９８～２１１からなる群から選択されるＤＮＡ配列で転写される。遺伝子編集のための方法は、場合により修復ＤＮＡ鋳型を含む細胞の修復機構によって、切断を封じることをさらに含む。
【0025】
本明細書に記載されるリボ核タンパク質複合体による塩基編集のための方法は、操作されたＦｎＣａｓ９タンパク質エフェクターを生細胞に送達することを含む。操作されたＦｎＣａｓ９タンパク質エフェクターは、配列番号１００～１９７からなる群から選択される。塩基編集のための方法は、ｓｇＲＮＡを使用して標的塩基を改変することをさらに含み、ｃｒＲＮＡは、配列番号２１２～２１５からなる群から選択されるＤＮＡ配列で転写され、標的塩基を改変することは、ＤＮＡを切断することなく達成される。
【0026】
本明細書中の実施形態による遺伝子編集のためのキットは、（ａ）配列番号２～１９７からなる群から選択される操作されたＦｎＣａｓ９タンパク質エフェクターと、（ｂ）キメラシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）と、を含むか、またはそれらからなり得る。ｓｇＲＮＡは、ｃｒｉｓｐｒ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及び配列番号３０５を有するトランス活性化ｃｒｉｓｐｒ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含むか、またはそれからなり、ｃｒＲＮＡは、配列番号１９８～２１５からなる群から選択されるＤＮＡ配列を使用してインビトロで転写される。
【0027】
［例］
以下の例は例示として与えられており、したがって、本開示または添付の特許請求の範囲を限定するように構成されるべきではない。
以下の例は例示として与えられており、したがって、本開示または添付の特許請求の範囲を限定するように構成されるべきではない。
【0028】
本開示で報告されるすべての材料は、実験室で合成したものであり、その天然形態の生物学的材料は使用していない。
【0029】
例１
ＦｎＣａｓ９を操作するためのプラスミド構築
点変異および欠失は、ｐＥ－Ｓｕｍｏベクター骨格（ＬｉｆｅＳｅｎｓｏｒｓ）（Ｈｉｒａｎｏ ｅｔ ａｌ．，２０１６）にクローニングしたＦｎＣａｓ９（配列番号１）に対する逆ＰＣＲ法によって行った。フォワードプライマーおよびプラスミド全体に変更を加え、増幅した（図２、図４、および図１０～図１２）。生成された変異体を以下の表１に示す。
ＦｎＣａｓ９を操作するためのプラスミド構築
点変異および欠失は、ｐＥ－Ｓｕｍｏベクター骨格（ＬｉｆｅＳｅｎｓｏｒｓ）（Ｈｉｒａｎｏ ｅｔ ａｌ．，２０１６）にクローニングしたＦｎＣａｓ９（配列番号１）に対する逆ＰＣＲ法によって行った。フォワードプライマーおよびプラスミド全体に変更を加え、増幅した（図２、図４、および図１０～図１２）。生成された変異体を以下の表１に示す。
【0030】
【表1】
【0031】
合成的に構築したｐＥＴ－Ｈｉｓ６－ｄＦｎＣａｓ９ＧＦＰ骨格およびＰＸ４５８－３ｘＨＡ－ＦｎＣａｓ９骨格（Ａｄｄｇｅｎｅ １３０９６９）上の点変異を、本質的に（Ａｃｈａｒｙａ ｅｔ ａｌ．，２０１９）に記載の方法に従って行った。哺乳動物特異的配列を、配列番号２６３～２７４を使用して生成した。図１７に示すＦｎＣａｓ９トランケーション、部分ＡおよびＢ（配列番号５１～９９）を、配列番号２７５および配列番号２７６を使用して生成した。Ｆｎ／ｅｎＦｎＣａｓ９塩基エディターも合成的に構築し、ＰＸ４５８－３ｘＨＡ－ＦｎＣａｓ９骨格にクローニングした（配列番号１００～１９７）。
【0032】
例２
Ｃａｓ９タンパク質およびｓｇＲＮＡ精製［ＰＫ１］
この研究で使用したタンパク質は、以前に報告されたように精製した（Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ ｅｔ ａｌ．，２０１８；Ａｃｈａｒｙａ ｅｔ ａｌ．，２０１９）簡潔には、フランシセラ・ノビシダからのＣａｓ９用のプラスミドを、大腸菌 Ｒｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ）中に発現させた。タンパク質を発現するＲｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）細胞は、ＯＤ６００が０．６に達するまでＬＢ培地（５０ｍｇ／Ｌカナマイシンを加えた）中３７℃で培養し、０．５ｍＭイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ β Ｄ－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ，ＩＰＴＧ）の添加によってタンパク質発現を誘導した。
Ｃａｓ９タンパク質およびｓｇＲＮＡ精製［ＰＫ１］
この研究で使用したタンパク質は、以前に報告されたように精製した（Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ ｅｔ ａｌ．，２０１８；Ａｃｈａｒｙａ ｅｔ ａｌ．，２０１９）簡潔には、フランシセラ・ノビシダからのＣａｓ９用のプラスミドを、大腸菌 Ｒｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ）中に発現させた。タンパク質を発現するＲｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）細胞は、ＯＤ６００が０．６に達するまでＬＢ培地（５０ｍｇ／Ｌカナマイシンを加えた）中３７℃で培養し、０．５ｍＭイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ β Ｄ－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ，ＩＰＴＧ）の添加によってタンパク質発現を誘導した。
【0033】
Ｒｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）細胞（ＤＳＳ Ｔａｋａｒａ）を１８℃で一晩さらに培養し、遠心分離によって回収した。大腸菌細胞を緩衝液Ａ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、２０ｍＭイミダゾール、および１Ｍ ＮａＣｌ）に再懸濁し、超音波処理によって溶解し、遠心分離した。溶解物をＮｉ－ＮＴＡビーズ（Ｒｏｃｈｅ）と混合し、混合物をＰｏｌｙ－Ｐｒｅｐカラム（ＢｉｏＲａｄ）にロードし、タンパク質を緩衝液Ｂ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、０．３Ｍイミダゾールおよび０．３Ｍ ＮａＣｌ）で溶出した。親和性溶出タンパク質を緩衝液Ｃ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、および０．１５Ｍ ＮａＣｌ）で平衡化したイオン交換ビーズ（ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）と混合し、タンパク質を緩衝液Ｄ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０および１Ｍ ＮａＣｌ）によって溶出した。精製タンパク質の濃度を、Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって測定した。精製したタンパク質は、さらなる使用までに－８０℃で保存した。精製されたＦｎＣａｓ９／ｅｎ ＦｎＣａｓ９変異体タンパク質のいくつか（配列番号１～５０）は、図５のポリアクリルアミドゲル上で見ることができる。
【0034】
鋳型を含有するＴ７プロモーターを基質として使用するＭｅｇａＳｃｒｉｐｔ Ｔ７転写キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、インビトロ転写ｓｇＲＮＡを合成した。ＩＶＴ反応物を３７℃で一晩インキュベートし、続いて従来のように（Ａｃｈａｒｙａ ｅｔ ａｌ．，２０１９）、ＮｕｃＡｗａｙスピンカラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）精製を行った。ＩＶＴ ｓｇＲＮＡは、さらなる使用までに－２０℃で保存した。プライマーは、配列番号１９８～２０２、２７７を使用した。
【0035】
例３
インビトロ切断（ＩＶＣ）アッセイ
動態研究のために、標的配列およびそれぞれのＰＡＭ配列（ＰＣＲベースのクローニングによって生成した）（それぞれの説明文に記載）を含有するｐＵＣ１１９プラスミド（Ｎｕｒｅｋｉ ｌａｂ、日本）をインビトロ切断実験のための基質として使用した。線状化ｐＵＣ１１９プラスミド（５０ｎｇまたは約５ｎＭ）を、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＤＴＴおよび５％グリセロールを含有する１０μＬの反応緩衝液中でＣａｓ９－ｓｇＲＮＡ複合体（５０ｎＭ）と共に３７℃で０．５～５分間インキュベートした。
インビトロ切断（ＩＶＣ）アッセイ
動態研究のために、標的配列およびそれぞれのＰＡＭ配列（ＰＣＲベースのクローニングによって生成した）（それぞれの説明文に記載）を含有するｐＵＣ１１９プラスミド（Ｎｕｒｅｋｉ ｌａｂ、日本）をインビトロ切断実験のための基質として使用した。線状化ｐＵＣ１１９プラスミド（５０ｎｇまたは約５ｎＭ）を、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＤＴＴおよび５％グリセロールを含有する１０μＬの反応緩衝液中でＣａｓ９－ｓｇＲＮＡ複合体（５０ｎＭ）と共に３７℃で０．５～５分間インキュベートした。
【0036】
ＥＤＴＡ（２０ｍＭのｎａｌ濃度）およびプロテイナーゼＫ（４０ｎｇ）を含有するクエンチングバッファーを添加することによって、反応を停止させた。反応生成物を、ＭｕｌｔｉＮＡマイクロチップ電気泳動デバイス（ＳＨＩＭＡＤＺＵ）を用いて分解し、可視化し、定量した（Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。図１、図３、図６～図９および図１３は、ガイドＲＮＡ、ｅｎＦｎＣａｓ９変異体およびＰＡＭ柔軟性のスクリーニングのために実施されたＩＶＣ実験をいくつか示す。
【0037】
残りのＩＶＣアッセイは、従来のように行った（Ａｃｈａｒｙａ ｅｔ ａｌ．，２０１９）。基質、濃度およびインキュベーション時間の詳細は、それぞれの図の凡例に記載されている。
【0038】
例４
ＰＡＭ発見アッセイ
ＰＡＭ発見アッセイ（図７）を、従来説明されているように実施した（Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。簡潔には、標的配列の下流にランダム化された８個のヌクレオチドを含有するｐＵＣ１１９プラスミドのライブラリーを、５０μＬの反応緩衝液中でＦｎＣａｓ９－ｓｇＲＮＡ複合体（５０ｎＭ）と共に３７℃で５分間インキュベートした。プロテイナーゼＫの添加によって反応を停止させ、次いで、Ｗｉｚａｒｄ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して精製した。共通のアダプター配列を含有するプライマーを使用して、精製されたＤＮＡサンプルを２５サイクル増幅した。カラム精製後、各ＰＣＲ産物（約５ｎｇ）を１５サイクルにわたる第２ラウンドのＰＣＲに供して、カスタムＩｌｌｕｍｉｎａ ＴｒｕＳｅｑアダプターおよびサンプルインデックスを追加した。
ＰＡＭ発見アッセイ
ＰＡＭ発見アッセイ（図７）を、従来説明されているように実施した（Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。簡潔には、標的配列の下流にランダム化された８個のヌクレオチドを含有するｐＵＣ１１９プラスミドのライブラリーを、５０μＬの反応緩衝液中でＦｎＣａｓ９－ｓｇＲＮＡ複合体（５０ｎＭ）と共に３７℃で５分間インキュベートした。プロテイナーゼＫの添加によって反応を停止させ、次いで、Ｗｉｚａｒｄ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して精製した。共通のアダプター配列を含有するプライマーを使用して、精製されたＤＮＡサンプルを２５サイクル増幅した。カラム精製後、各ＰＣＲ産物（約５ｎｇ）を１５サイクルにわたる第２ラウンドのＰＣＲに供して、カスタムＩｌｌｕｍｉｎａ ＴｒｕＳｅｑアダプターおよびサンプルインデックスを追加した。
【0039】
シーケンシングライブラリーをｑＰＣＲ（ＫＡＰＡ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって定量し、次いで、２０％ＰｈｉＸスパイクイン（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を含むＭｉＳｅｑシーケンサー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）でペアエンドシーケンシングに供した。シーケンシングリードを、ｂｌａｓｔｎ－ｓｈｏｒｔオプションを備えたＮＣＢＩ Ｂｌａｓｔ＋（バージョン２．８．１）を使用して、プライマー配列およびサンプルインデックスによって逆多重化した。各シーケンシングサンプルについて、可能な８－ｎｔＰＡＭ配列パターン（合計４８＝６５，５３６パターン）ごとのリードの数をカウントし、各サンプルのリードの総数によって正規化した。所与のＰＡＭ配列について、未処理サンプルと比較してｌｏｇ２倍濃縮として濃縮スコアを計算した。濃縮スコアが－２．０以下のＰＡＭ配列を使用して、ＷｅｂＬｏｇｏ（バージョン３．７．１）を使用して配列ロゴ表示を生成した。
【0040】
例５
結合アッセイ
マイクロスケール熱泳動（図１４Ａ、図１４Ｂ、図１４Ｃ、図１６）を前述のように実施した（Ａｃｈａｒｙａ ｅｔ ａｌ．，２０１９）。簡潔には、ｄＦｎＣａｓ９－ＧＦＰタンパク質を、ＰＡＧＥ精製されたそれぞれのＩＶＴ ｓｇＲＮＡ（１２％尿素－ＰＡＧＥによって精製された）と複合体化させた。Ｃａｓ９タンパク質およびｓｇＲＮＡ ＲＮＰ複合体の結合親和性を、Ｍｏｎｏｌｉｔｈ ＮＴ．１１５（ＮａｎｏＴｅｍｐｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧｍｂＨ、ミュンヘン、ドイツ）を使用して計算した。ＲＮＰ複合体（タンパク質：ｓｇＲＮＡモル比、１：１）を反応緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２）中で２５で１０分間再構成し、ＨＰＬＣ精製した異なるゲノム遺伝子座の３０ｂｐ ｄｓＤＮＡ（ＩＤＴ）を様々な濃度（０．０９ｎＭ～３０μＭの範囲）で、反応緩衝液中で３７℃の温度で３０分間ＲＮＰ複合体と共にインキュベートした。サンプルをＮａｎｏＴｅｍｐｅｒ標準処理キャピラリーに充填し、２０％ ＬＥＤ出力および４０％ ＭＳＴ出力を使用して２５℃で測定を実施した。データ分析は、ＮａｎｏＴｅｍｐｅｒ分析ソフトウェアを使用して行った。オリゴは、配列番号２８１および配列番号２８２である。
結合アッセイ
マイクロスケール熱泳動（図１４Ａ、図１４Ｂ、図１４Ｃ、図１６）を前述のように実施した（Ａｃｈａｒｙａ ｅｔ ａｌ．，２０１９）。簡潔には、ｄＦｎＣａｓ９－ＧＦＰタンパク質を、ＰＡＧＥ精製されたそれぞれのＩＶＴ ｓｇＲＮＡ（１２％尿素－ＰＡＧＥによって精製された）と複合体化させた。Ｃａｓ９タンパク質およびｓｇＲＮＡ ＲＮＰ複合体の結合親和性を、Ｍｏｎｏｌｉｔｈ ＮＴ．１１５（ＮａｎｏＴｅｍｐｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧｍｂＨ、ミュンヘン、ドイツ）を使用して計算した。ＲＮＰ複合体（タンパク質：ｓｇＲＮＡモル比、１：１）を反応緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２）中で２５で１０分間再構成し、ＨＰＬＣ精製した異なるゲノム遺伝子座の３０ｂｐ ｄｓＤＮＡ（ＩＤＴ）を様々な濃度（０．０９ｎＭ～３０μＭの範囲）で、反応緩衝液中で３７℃の温度で３０分間ＲＮＰ複合体と共にインキュベートした。サンプルをＮａｎｏＴｅｍｐｅｒ標準処理キャピラリーに充填し、２０％ ＬＥＤ出力および４０％ ＭＳＴ出力を使用して２５℃で測定を実施した。データ分析は、ＮａｎｏＴｅｍｐｅｒ分析ソフトウェアを使用して行った。オリゴは、配列番号２８１および配列番号２８２である。
【0041】
例６
インセルロゲノム編集分析
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ）を、ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２ｍＭ ＧｌｕｔａＭａｘ、１０％ＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１Ｘ ａｎｉｔｉｂｉｏｔｉｃ ａｎｄ ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えたＤＭＥＭ培地中、３７℃、５％ＣＯ２で増殖させた。哺乳動物細胞のトランスフェクションを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造者のプロトコルに従って使用して実施した。トランスフェクションの４８時間後、ＧＦＰ陽性細胞をＦＡＣＳ選別し（ＢＤ ＦＡＣＳ Ｍｅｌｏｄｙ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｅｒ）、ｇＤＮＡを単離した（Ｌｕｃｉｇｅｎ ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ溶液）。
インセルロゲノム編集分析
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ）を、ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２ｍＭ ＧｌｕｔａＭａｘ、１０％ＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１Ｘ ａｎｉｔｉｂｉｏｔｉｃ ａｎｄ ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えたＤＭＥＭ培地中、３７℃、５％ＣＯ２で増殖させた。哺乳動物細胞のトランスフェクションを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造者のプロトコルに従って使用して実施した。トランスフェクションの４８時間後、ＧＦＰ陽性細胞をＦＡＣＳ選別し（ＢＤ ＦＡＣＳ Ｍｅｌｏｄｙ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｅｒ）、ｇＤＮＡを単離した（Ｌｕｃｉｇｅｎ ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ溶液）。
【0042】
それぞれの遺伝子座を、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して、オーバーハングアダプター配列を含有するフォワードプライマーおよびリバースプライマーを使用してＰＣＲ増幅した。１６Ｓメタゲノミクスシーケンシングライブラリー調製プロトコルをライブラリー調製に適応した。簡潔には、ＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズ（Ａ６３８８１、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して、遊離プライマーおよびプライマー二量体からアンプリコンを分離した。
【0043】
デュアルインデックスを、Ｎｅｘｔｅｒａ ＸＴ Ｖ２インデックスキットを使用して行い、その後、別の一連のビーズベース精製を行った。ライブラリーを、Ｑｕｂｉｔ ｄｓＤＮＡ ＨＳアッセイキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｑ３２８５３）を使用して定量し、品質チェックのために１μＬをＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ）で実行した。ライブラリーは、正規化し、プールし、１５０ｂｐペアエンドシーケンシングラン（図１５、図１８、図１９）のためにｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉｎｉＳｅｑプラットフォームに取り込んだ。
【0044】
例７
遺伝子編集方法
例６で記載したように、遺伝子編集用のキットは、エクスビボ（図２０および図２１）を実施するために以下を使用して調製することができる：
１．Ｃａｓ９エフェクター。
２．シングルガイド（ｓｇ）ＲＮＡまたはデュアルｃｒＲＮＡ：ヌクレアーゼフリーの水（ＮＦＷ）に溶解したｔｒａｃｒＲＮＡ。
３．「１」のヌクレアーゼを使用する場合、ＮＦＷに溶解した相同組換え修復（ＨＤＲ）鋳型。
４．ＤＮＡが「１」で使用される場合、ＮＦＷが存在する。
５．ｍＲＮＡが「１」で使用される場合、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５が存在する。
６．タンパク質が「１」で使用される場合、タンパク質貯蔵緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＫＣｌ、１０％グリセロール、１ｍＭ ＤＴＴ）が存在する。
遺伝子編集方法
例６で記載したように、遺伝子編集用のキットは、エクスビボ（図２０および図２１）を実施するために以下を使用して調製することができる：
１．Ｃａｓ９エフェクター。
２．シングルガイド（ｓｇ）ＲＮＡまたはデュアルｃｒＲＮＡ：ヌクレアーゼフリーの水（ＮＦＷ）に溶解したｔｒａｃｒＲＮＡ。
３．「１」のヌクレアーゼを使用する場合、ＮＦＷに溶解した相同組換え修復（ＨＤＲ）鋳型。
４．ＤＮＡが「１」で使用される場合、ＮＦＷが存在する。
５．ｍＲＮＡが「１」で使用される場合、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５が存在する。
６．タンパク質が「１」で使用される場合、タンパク質貯蔵緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＫＣｌ、１０％グリセロール、１ｍＭ ＤＴＴ）が存在する。
【0045】
したがって、本開示は、他の特徴の中でも、以下を提供する：
１．ＤＮＡとの安定した結合および検出不能なオフターゲット編集のためにより高い特異性を有する操作されたＦｎＣａｓ９変異体、
２．野生型酵素が認識できない配列を標的にするためのＦｎＣａｓ９変異体の範囲を拡大するより広いＰＡＭ認識、ならびに
３．操作されたＦｎＣａｓ９変異体および誘導体は、二本鎖切断に基づく編集および切断のない編集の両方が細胞内で高い効率で機能することを確実にする。
１．ＤＮＡとの安定した結合および検出不能なオフターゲット編集のためにより高い特異性を有する操作されたＦｎＣａｓ９変異体、
２．野生型酵素が認識できない配列を標的にするためのＦｎＣａｓ９変異体の範囲を拡大するより広いＰＡＭ認識、ならびに
３．操作されたＦｎＣａｓ９変異体および誘導体は、二本鎖切断に基づく編集および切断のない編集の両方が細胞内で高い効率で機能することを確実にする。
【0046】
参考文献
１．Ｓａｎｄｅｒ，Ｊ．Ｄ．＆Ｊｏｕｎｇ，Ｊ．Ｋ．ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ ｅｄｉｔｉｎｇ，ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ａｎｄ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｇｅｎｏｍｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３２，３４７－３５５（２０１４）．
２．Ｄｏｕｄｎａ，Ｊ．Ａ．＆Ｃｈａｒｐｅｎｔｉｅｒ，Ｅ．Ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ．Ｔｈｅ ｎｅｗ ｆｒｏｎｔｉｅｒ ｏｆ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｗｉｔｈ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４６，１２５８０９６（２０１４）．
３．Ｍｏｊｉｃａ，Ｆ．Ｊ．，Ｄｉｅｚ－Ｖｉｌｌａｓｅｎｏｒ，Ｃ．，Ｇａｒｃｉａ－Ｍａｒｔｉｎｅｚ，Ｊ．＆Ａｌｍｅｎｄｒｏｓ，Ｃ．Ｓｈｏｒｔ ｍｏｔｉｆ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ＣＲＩＳＰＲ ｄｅｆｅｎｃｅ ｓｙｓｔｅｍ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １５５，７３３－７４０（２００９）．
４．Ｓｈａｈ，Ｓ．Ａ．，Ｅｒｄｍａｎｎ，Ｓ．，Ｍｏｊｉｃａ，Ｆ．Ｊ．＆Ｇａｒｒｅｔｔ，Ｒ．Ａ．Ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｍｏｔｉｆｓ：ｍｉｘｅｄ ｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ．ＲＮＡ Ｂｉｏｌ．１０，８９１－８９９（２０１３）．
５．Ｊｉｎｅｋ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ａ ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｄｕａｌ－ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ＤＮＡ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｉｎ ａｄａｐｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７，８１６－８２１（２０１２）．
６．Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ｈ．，Ｒｅｄｄｉｎｇ，Ｓ．，Ｊｉｎｅｋ，Ｍ．，Ｇｒｅｅｎｅ，Ｅ．Ｃ．＆Ｄｏｕｄｎａ，Ｊ．Ａ．ＤＮＡ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｃａｓ９．Ｎａｔｕｒｅ ５０７，６２－６７（２０１４）．
７．Ａｃｈａｒｙａ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．（２０１９）’Ｃａｓ９ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｅｓ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｗｉｔｈ ｖｅｒｙ ｈｉｇｈ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｃａｎ ｂｅ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ’，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，１１６（４２），ｐｐ．２０９５９－２０９６８．
８．Ｈｉｒａｎｏ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．（２０１６）’Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｃａｓ９’，Ｃｅｌｌ，１６４（５），ｐｐ．９５０－９６１．
９．Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．（２０１８）’Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｎｕｃｌｅａｓｅ ｗｉｔｈ ｅｘｐａｎｄｅｄ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｐａｃｅ’，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３６１（６４０８），ｐｐ．１２５９－１２６２．
１．Ｓａｎｄｅｒ，Ｊ．Ｄ．＆Ｊｏｕｎｇ，Ｊ．Ｋ．ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ ｅｄｉｔｉｎｇ，ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ａｎｄ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｇｅｎｏｍｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３２，３４７－３５５（２０１４）．
２．Ｄｏｕｄｎａ，Ｊ．Ａ．＆Ｃｈａｒｐｅｎｔｉｅｒ，Ｅ．Ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ．Ｔｈｅ ｎｅｗ ｆｒｏｎｔｉｅｒ ｏｆ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｗｉｔｈ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４６，１２５８０９６（２０１４）．
３．Ｍｏｊｉｃａ，Ｆ．Ｊ．，Ｄｉｅｚ－Ｖｉｌｌａｓｅｎｏｒ，Ｃ．，Ｇａｒｃｉａ－Ｍａｒｔｉｎｅｚ，Ｊ．＆Ａｌｍｅｎｄｒｏｓ，Ｃ．Ｓｈｏｒｔ ｍｏｔｉｆ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ＣＲＩＳＰＲ ｄｅｆｅｎｃｅ ｓｙｓｔｅｍ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １５５，７３３－７４０（２００９）．
４．Ｓｈａｈ，Ｓ．Ａ．，Ｅｒｄｍａｎｎ，Ｓ．，Ｍｏｊｉｃａ，Ｆ．Ｊ．＆Ｇａｒｒｅｔｔ，Ｒ．Ａ．Ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｍｏｔｉｆｓ：ｍｉｘｅｄ ｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ．ＲＮＡ Ｂｉｏｌ．１０，８９１－８９９（２０１３）．
５．Ｊｉｎｅｋ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ａ ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｄｕａｌ－ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ＤＮＡ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｉｎ ａｄａｐｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７，８１６－８２１（２０１２）．
６．Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ｈ．，Ｒｅｄｄｉｎｇ，Ｓ．，Ｊｉｎｅｋ，Ｍ．，Ｇｒｅｅｎｅ，Ｅ．Ｃ．＆Ｄｏｕｄｎａ，Ｊ．Ａ．ＤＮＡ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｃａｓ９．Ｎａｔｕｒｅ ５０７，６２－６７（２０１４）．
７．Ａｃｈａｒｙａ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．（２０１９）’Ｃａｓ９ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｅｓ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｗｉｔｈ ｖｅｒｙ ｈｉｇｈ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｃａｎ ｂｅ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ’，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，１１６（４２），ｐｐ．２０９５９－２０９６８．
８．Ｈｉｒａｎｏ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．（２０１６）’Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｃａｓ９’，Ｃｅｌｌ，１６４（５），ｐｐ．９５０－９６１．
９．Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．（２０１８）’Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｎｕｃｌｅａｓｅ ｗｉｔｈ ｅｘｐａｎｄｅｄ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｐａｃｅ’，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３６１（６４０８），ｐｐ．１２５９－１２６２．
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2024-03-04
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ａ）配列番号１６と配列番号３１からなる群から選択される操作されたＦｎＣａｓ９タンパク質エフェクター；およびｂ）ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）が、ＮＧＧ、ＮＧＡ、ＧＧＡおよびＧＧＧからなる群から選択されるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列から１～２０～２８塩基上流に位置する塩基配列に相補的なポリヌクレオチド配列に結合するキメラシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）；
ｃ）配列番号３０５を有するトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）
から構成されている遺伝子編集のためのリボ核タンパク質複合体。
【請求項2】
配列番号１６は、ＥがＨに置換されることによって１６０３位に点変異を有する、請求項１に記載のリボ核タンパク質複合体。
【請求項3】
配列番号３１は、ＥがＲに置換されることによって１３６９位に、ＥがＨに置換されることによって１４４９位に、およびＧがＴに置換されることによって１２４３位に点変異を有する、請求項１に記載のリボ核タンパク質複合体。
【請求項4】
前記配列番号８０は、配列番号３１によって表される前記操作されたＦｎＣａｓ９タンパク質においてＲＥＣ２欠失を有する、請求項１に記載のリボ核タンパク質複合体。
【請求項5】
請求項１に記載のリボ核タンパク質複合体による遺伝子編集のための方法であって、前記方法は、
（ａ）配列番号１６、３１を有する前記リボ核タンパク質複合体エフェクターを生細胞に送達するステップと、
（ｂ）配列番号１９８～２１１からなる群から選択される配列を有するシングルガイドＲＮＡを使用して、遺伝子標的においてその標的における前記リボ核タンパク質活性によりＤＮＡを切断するステップと、
（ｃ）修復ＤＮＡ鋳型の存在下または非存在下のいずれかにおいて、前記細胞の前記修復機構によって切断を封じるステップと、
を含む、方法。
【請求項6】
請求項１に記載のリボ核タンパク質複合体による塩基編集のための方法であって、前記方法は、
（ａ）Ｃａｓタンパク質が請求項１に記載の操作されたＦｎＣａｓ９タンパク質エフェクターに結合した核酸塩基編集ドメインからなる、リボ核タンパク質複合体を作成するステップと、
（ｂ）配列番号１２９、１７８を有する前記リボ核タンパク質複合体エフェクターを生細胞に送達するステップと、
（ｃ）配列番号２１２～２１５からなる群から選択される配列を有するシングルガイドＲＮＡを使用して、いかなるＤＮＡ切断もなく標的塩基を改変するステップと、
を含む、方法。
【請求項7】
（ａ）配列番号１６および配列番号３１を有する操作されたＦｎＣａｓ９リボ核タンパク質複合体エフェクター；および（ｂ）プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列から１～２０～２８塩基上流に位置する塩基配列に相補的なポリヌクレオチド配列に結合することができるＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）と、配列番号３０５を有するトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）とを含む、キメラシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）；
から構成されている、遺伝子編集用のキット。
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0046】
参考文献
１．Ｓａｎｄｅｒ，Ｊ．Ｄ．＆Ｊｏｕｎｇ，Ｊ．Ｋ．ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ ｅｄｉｔｉｎｇ，ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ａｎｄ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｇｅｎｏｍｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３２，３４７－３５５（２０１４）．
２．Ｄｏｕｄｎａ，Ｊ．Ａ．＆Ｃｈａｒｐｅｎｔｉｅｒ，Ｅ．Ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ．Ｔｈｅ ｎｅｗ ｆｒｏｎｔｉｅｒ ｏｆ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｗｉｔｈ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４６，１２５８０９６（２０１４）．
３．Ｍｏｊｉｃａ，Ｆ．Ｊ．，Ｄｉｅｚ－Ｖｉｌｌａｓｅｎｏｒ，Ｃ．，Ｇａｒｃｉａ－Ｍａｒｔｉｎｅｚ，Ｊ．＆Ａｌｍｅｎｄｒｏｓ，Ｃ．Ｓｈｏｒｔ ｍｏｔｉｆ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ＣＲＩＳＰＲ ｄｅｆｅｎｃｅ ｓｙｓｔｅｍ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １５５，７３３－７４０（２００９）．
４．Ｓｈａｈ，Ｓ．Ａ．，Ｅｒｄｍａｎｎ，Ｓ．，Ｍｏｊｉｃａ，Ｆ．Ｊ．＆Ｇａｒｒｅｔｔ，Ｒ．Ａ．Ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｍｏｔｉｆｓ：ｍｉｘｅｄ ｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ．ＲＮＡ Ｂｉｏｌ．１０，８９１－８９９（２０１３）．
５．Ｊｉｎｅｋ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ａ ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｄｕａｌ－ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ＤＮＡ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｉｎ ａｄａｐｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７，８１６－８２１（２０１２）．
６．Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ｈ．，Ｒｅｄｄｉｎｇ，Ｓ．，Ｊｉｎｅｋ，Ｍ．，Ｇｒｅｅｎｅ，Ｅ．Ｃ．＆Ｄｏｕｄｎａ，Ｊ．Ａ．ＤＮＡ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｃａｓ９．Ｎａｔｕｒｅ ５０７，６２－６７（２０１４）．
７．Ａｃｈａｒｙａ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．（２０１９）’Ｃａｓ９ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｅｓ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｗｉｔｈ ｖｅｒｙ ｈｉｇｈ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｃａｎ ｂｅ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ’，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，１１６（４２），ｐｐ．２０９５９－２０９６８．
８．Ｈｉｒａｎｏ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．（２０１６）’Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｃａｓ９’，Ｃｅｌｌ，１６４（５），ｐｐ．９５０－９６１．
９．Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．（２０１８）’Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｎｕｃｌｅａｓｅ ｗｉｔｈ ｅｘｐａｎｄｅｄ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｐａｃｅ’，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３６１（６４０８），ｐｐ．１２５９－１２６２．
以下に、本願出願の当初の特許請求の範囲に記載された発明を付記する。
［１］
（ａ）配列番号２～１９７からなる群から選択される操作されたＦｎＣａｓ９タンパク質エフェクター；および
（ｂ）配列番号１９８～２１５からなる群から選択されるＤＮＡ配列を使用してインビトロで転写されたｃｒｉｓｐｒ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）と、配列番号３０５を有するトランス活性化ｃｒｉｓｐｒ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）とを含む、キメラシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）；
を含む、遺伝子編集のためのリボ核タンパク質複合体。
［２］
ＮＧＧ、ＮＧＡ、ＧＧＡおよびＧＧＧからなる群から選択されるＰＡＭ配列に結合した、［１］に記載のリボ核タンパク質複合体。
［３］
前記操作されたＦｎＣａｓ９タンパク質エフェクターが、配列番号２である、［１］に記載のリボ核タンパク質複合体。
［４］
前記操作されたＦｎＣａｓ９タンパク質エフェクターが、配列番号３である、［１］に記載のリボ核タンパク質複合体。
［５］
前記操作されたＦｎＣａｓ９タンパク質エフェクターが、配列番号４である、［１］に記載のリボ核タンパク質複合体。
［６］
前記操作されたＦｎＣａｓ９タンパク質エフェクターが、配列番号５である、［１］に記載のリボ核タンパク質複合体。
［７］
前記操作されたＦｎＣａｓ９タンパク質エフェクターが、配列番号１６である、［１］に記載のリボ核タンパク質複合体。
［８］
前記操作されたＦｎＣａｓ９タンパク質エフェクターが、配列番号３１である、［１］に記載のリボ核タンパク質複合体。
［９］
前記操作されたＦｎＣａｓ９タンパク質エフェクターが、配列番号４０である、［１］に記載のリボ核タンパク質複合体。
［１０］
前記操作されたＦｎＣａｓ９タンパク質エフェクターが、配列番号４７である、［１］に記載のリボ核タンパク質複合体。
［１１］
前記操作されたＦｎＣａｓ９タンパク質エフェクターが、配列番号５１～９９からなる群から選択される、［１］に記載のリボ核タンパク質複合体。
［１２］
［１］に記載のリボ核タンパク質複合体による遺伝子編集のための方法であって、
前記方法は、
（ａ）配列番号２～９９からなる群から選択される前記操作されたＦｎＣａｓ９タンパク質エフェクターを、生細胞に送達すること；
（ｂ）前記ｃｒＲＮＡを配列番号１９８～２１１からなる群から選択されるＤＮＡ配列で転写し、前記ｓｇＲＮＡを使用して遺伝子標的においてＤＮＡを切断すること；および
（ｃ）場合により修復ＤＮＡ鋳型を含む前記細胞の修復機構によって、前記ＤＮＡ切断を封じること
を含む、方法。
［１３］
［１］に記載のリボ核タンパク質複合体による塩基編集のための方法であって、
前記方法は、
（ａ）配列番号１００～１９７からなる群から選択される前記操作されたＦｎＣａｓ９タンパク質エフェクターを、生細胞に送達すること；および
（ｂ）前記ｃｒＲＮＡを配列番号２１２～２１５からなる群から選択されるＤＮＡ配列で転写し、前記ｓｇＲＮＡを使用して前記ＤＮＡを切断することなく達成される、標的塩基を改変すること、
を含む、方法。
［１４］
（ａ）配列番号２～１９７からなる群から選択される操作されたＦｎＣａｓ９タンパク質エフェクター；および
（ｂ）前記配列番号１９８～２１５からなる群から選択されるＤＮＡ配列を使用してインビトロで転写されたｃｒｉｓｐｒ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）；および配列番号３０５を有するトランス活性化ｃｒｉｓｐｒ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む、キメラシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）。
ｃ）相同組換え修復（ＨＤＲ）鋳型；
ｄ）適切な緩衝液、
からなる、遺伝子編集用のキット。
１．Ｓａｎｄｅｒ，Ｊ．Ｄ．＆Ｊｏｕｎｇ，Ｊ．Ｋ．ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ ｅｄｉｔｉｎｇ，ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ａｎｄ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｇｅｎｏｍｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３２，３４７－３５５（２０１４）．
２．Ｄｏｕｄｎａ，Ｊ．Ａ．＆Ｃｈａｒｐｅｎｔｉｅｒ，Ｅ．Ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ．Ｔｈｅ ｎｅｗ ｆｒｏｎｔｉｅｒ ｏｆ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｗｉｔｈ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４６，１２５８０９６（２０１４）．
３．Ｍｏｊｉｃａ，Ｆ．Ｊ．，Ｄｉｅｚ－Ｖｉｌｌａｓｅｎｏｒ，Ｃ．，Ｇａｒｃｉａ－Ｍａｒｔｉｎｅｚ，Ｊ．＆Ａｌｍｅｎｄｒｏｓ，Ｃ．Ｓｈｏｒｔ ｍｏｔｉｆ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ＣＲＩＳＰＲ ｄｅｆｅｎｃｅ ｓｙｓｔｅｍ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １５５，７３３－７４０（２００９）．
４．Ｓｈａｈ，Ｓ．Ａ．，Ｅｒｄｍａｎｎ，Ｓ．，Ｍｏｊｉｃａ，Ｆ．Ｊ．＆Ｇａｒｒｅｔｔ，Ｒ．Ａ．Ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｍｏｔｉｆｓ：ｍｉｘｅｄ ｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ．ＲＮＡ Ｂｉｏｌ．１０，８９１－８９９（２０１３）．
５．Ｊｉｎｅｋ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ａ ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｄｕａｌ－ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ＤＮＡ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｉｎ ａｄａｐｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７，８１６－８２１（２０１２）．
６．Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ｈ．，Ｒｅｄｄｉｎｇ，Ｓ．，Ｊｉｎｅｋ，Ｍ．，Ｇｒｅｅｎｅ，Ｅ．Ｃ．＆Ｄｏｕｄｎａ，Ｊ．Ａ．ＤＮＡ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｃａｓ９．Ｎａｔｕｒｅ ５０７，６２－６７（２０１４）．
７．Ａｃｈａｒｙａ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．（２０１９）’Ｃａｓ９ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｅｓ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｗｉｔｈ ｖｅｒｙ ｈｉｇｈ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｃａｎ ｂｅ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ’，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，１１６（４２），ｐｐ．２０９５９－２０９６８．
８．Ｈｉｒａｎｏ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．（２０１６）’Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｃａｓ９’，Ｃｅｌｌ，１６４（５），ｐｐ．９５０－９６１．
９．Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．（２０１８）’Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｎｕｃｌｅａｓｅ ｗｉｔｈ ｅｘｐａｎｄｅｄ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｐａｃｅ’，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３６１（６４０８），ｐｐ．１２５９－１２６２．
以下に、本願出願の当初の特許請求の範囲に記載された発明を付記する。
［１］
（ａ）配列番号２～１９７からなる群から選択される操作されたＦｎＣａｓ９タンパク質エフェクター；および
（ｂ）配列番号１９８～２１５からなる群から選択されるＤＮＡ配列を使用してインビトロで転写されたｃｒｉｓｐｒ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）と、配列番号３０５を有するトランス活性化ｃｒｉｓｐｒ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）とを含む、キメラシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）；
を含む、遺伝子編集のためのリボ核タンパク質複合体。
［２］
ＮＧＧ、ＮＧＡ、ＧＧＡおよびＧＧＧからなる群から選択されるＰＡＭ配列に結合した、［１］に記載のリボ核タンパク質複合体。
［３］
前記操作されたＦｎＣａｓ９タンパク質エフェクターが、配列番号２である、［１］に記載のリボ核タンパク質複合体。
［４］
前記操作されたＦｎＣａｓ９タンパク質エフェクターが、配列番号３である、［１］に記載のリボ核タンパク質複合体。
［５］
前記操作されたＦｎＣａｓ９タンパク質エフェクターが、配列番号４である、［１］に記載のリボ核タンパク質複合体。
［６］
前記操作されたＦｎＣａｓ９タンパク質エフェクターが、配列番号５である、［１］に記載のリボ核タンパク質複合体。
［７］
前記操作されたＦｎＣａｓ９タンパク質エフェクターが、配列番号１６である、［１］に記載のリボ核タンパク質複合体。
［８］
前記操作されたＦｎＣａｓ９タンパク質エフェクターが、配列番号３１である、［１］に記載のリボ核タンパク質複合体。
［９］
前記操作されたＦｎＣａｓ９タンパク質エフェクターが、配列番号４０である、［１］に記載のリボ核タンパク質複合体。
［１０］
前記操作されたＦｎＣａｓ９タンパク質エフェクターが、配列番号４７である、［１］に記載のリボ核タンパク質複合体。
［１１］
前記操作されたＦｎＣａｓ９タンパク質エフェクターが、配列番号５１～９９からなる群から選択される、［１］に記載のリボ核タンパク質複合体。
［１２］
［１］に記載のリボ核タンパク質複合体による遺伝子編集のための方法であって、
前記方法は、
（ａ）配列番号２～９９からなる群から選択される前記操作されたＦｎＣａｓ９タンパク質エフェクターを、生細胞に送達すること；
（ｂ）前記ｃｒＲＮＡを配列番号１９８～２１１からなる群から選択されるＤＮＡ配列で転写し、前記ｓｇＲＮＡを使用して遺伝子標的においてＤＮＡを切断すること；および
（ｃ）場合により修復ＤＮＡ鋳型を含む前記細胞の修復機構によって、前記ＤＮＡ切断を封じること
を含む、方法。
［１３］
［１］に記載のリボ核タンパク質複合体による塩基編集のための方法であって、
前記方法は、
（ａ）配列番号１００～１９７からなる群から選択される前記操作されたＦｎＣａｓ９タンパク質エフェクターを、生細胞に送達すること；および
（ｂ）前記ｃｒＲＮＡを配列番号２１２～２１５からなる群から選択されるＤＮＡ配列で転写し、前記ｓｇＲＮＡを使用して前記ＤＮＡを切断することなく達成される、標的塩基を改変すること、
を含む、方法。
［１４］
（ａ）配列番号２～１９７からなる群から選択される操作されたＦｎＣａｓ９タンパク質エフェクター；および
（ｂ）前記配列番号１９８～２１５からなる群から選択されるＤＮＡ配列を使用してインビトロで転写されたｃｒｉｓｐｒ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）；および配列番号３０５を有するトランス活性化ｃｒｉｓｐｒ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む、キメラシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）。
ｃ）相同組換え修復（ＨＤＲ）鋳型；
ｄ）適切な緩衝液、
からなる、遺伝子編集用のキット。
【国際調査報告】