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特表2024-525042組み換えボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖、組み換えボツリヌストキシン、並びにその組成物、その用途及びその方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-07-09
(54)【発明の名称】組み換えボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖、組み換えボツリヌストキシン、並びにその組成物、その用途及びその方法
(51)【国際特許分類】
C07K 14/33 20060101AFI20240702BHJP
C12P 21/00 20060101ALI20240702BHJP
C12N 15/31 20060101ALI20240702BHJP
A61K 38/48 20060101ALI20240702BHJP
A61K 47/18 20170101ALI20240702BHJP
A61K 47/26 20060101ALI20240702BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20240702BHJP
A61P 17/02 20060101ALI20240702BHJP
A61P 17/10 20060101ALI20240702BHJP
A61P 25/06 20060101ALI20240702BHJP
A61P 17/04 20060101ALI20240702BHJP
A61K 9/19 20060101ALI20240702BHJP
A61K 9/08 20060101ALI20240702BHJP
【ＦＩ】
C07K14/33 ZNA
C12P21/00 C
C12N15/31
A61K38/48
A61K47/18
A61K47/26
A61P17/00
A61P17/02
A61P17/10
A61P25/06
A61P17/04
A61K9/19
A61K9/08
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023580789
(86)(22)【出願日】2022-06-21
(85)【翻訳文提出日】2024-01-15
(86)【国際出願番号】 KR2022008793
(87)【国際公開番号】W WO2023277432
(87)【国際公開日】2023-01-05
(31)【優先権主張番号】10-2021-0083930
(32)【優先日】2021-06-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】513243723
【氏名又は名称】メディトックス インク．
(74)【代理人】
【識別番号】110002077
【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人
(72)【発明者】
【氏名】リー， チャン フン
(72)【発明者】
【氏名】キム， ククハン
(72)【発明者】
【氏名】イ， インテ
(72)【発明者】
【氏名】クァク， ソンソン
(72)【発明者】
【氏名】アン， ドンヒョン
(72)【発明者】
【氏名】イ， ヨンレ
(72)【発明者】
【氏名】チェ， ファジョン
【テーマコード（参考）】
4B064
4C076
4C084
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG30
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA01
4C076AA12
4C076AA29
4C076BB15
4C076BB16
4C076BB31
4C076CC01
4C076CC18
4C076CC19
4C076DD07
4C076DD38
4C076DD51
4C076DD67
4C076EE41
4C076GG06
4C076GG47
4C084AA01
4C084AA02
4C084BA01
4C084CA04
4C084DA33
4C084MA05
4C084MA17
4C084MA44
4C084MA63
4C084MA66
4C084NA14
4C084ZA08
4C084ZA29
4C084ZA30
4C084ZA89
4C084ZA91
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA11
4H045DA83
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】
効果及び半減期が増大され、患者の便宜性が高くなり、適応症にあつらえられた治療が可能な組み換えボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖、組み換えボツリヌストキシン、並びにそれと係わる組成物、用途及び方法を提供するためのものである。
【選択図】図１Ｃ
【選択図】図１Ｃ
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ボツリヌストキシンタイプＡ４ではない、ボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖の第１，第２，第３及び第４ドメインにおいて、第３ドメインの配列が、ボツリヌストキシンタイプＡ４の第３ドメイン、またはその変異体の配列で置換されたものである、組み換えボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖。
【請求項2】
組み換えボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖の第１，第２，第３及び第４ドメインにおいて、第４ドメインの配列が、ボツリヌストキシンタイプＡ４の第４ドメイン、またはその変異体の配列でさらに置換されたものである、請求項１に記載の組み換えボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖。
【請求項3】
ボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖は、ボツリヌストキシンタイプＡ１，Ａ２，Ａ３，Ａ５，Ａ６，Ａ７またはＡ８である、請求項１または２に記載の組み換えボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖。
【請求項4】
ボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖は、ボツリヌストキシンタイプＡ１である、請求項３に記載の組み換えボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖。
【請求項5】
請求項１ないし４のうちいずれか１項に記載の組み換えボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖、及びボツリヌストキシン重鎖を含む、組み換えボツリヌストキシン。
【請求項6】
ボツリヌストキシンタイプＡ重鎖は、ボツリヌストキシンタイプＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，ＦまたはＧである、請求項５に記載の組み換えボツリヌストキシン。
【請求項7】
ボツリヌストキシンタイプＡ重鎖は、ボツリヌストキシンタイプＡ１，Ａ２，Ａ３，Ａ４，Ａ５，Ａ６，Ａ７またはＡ８である、請求項６に記載の組み換えボツリヌストキシン。
【請求項8】
ボツリヌストキシンタイプＡ重鎖は、ボツリヌストキシンタイプＡ１である、請求項７に記載の組み換えボツリヌストキシン。
【請求項9】
請求項５ないし８のうちいずれか１項に記載の組み換えボツリヌストキシンタイプＡ、及び薬剤学的に許容される賦形剤または添加剤を含む、組成物。
【請求項10】
薬剤学的に許容される賦形剤または添加剤は、安定化剤、イオン化合物、界面活性剤、緩衝剤、凍結乾燥保護剤、またはそれらの組み合わせである、請求項９に記載の組成物。
【請求項11】
薬剤学的に許容される賦形剤または添加剤は、アミノ酸、塩、緩衝液、非イオン性界面活性剤、糖、糖アルコール、またはそれらの組み合わせである、請求項１０に記載の組成物。
【請求項12】
アルブミンまたは動物由来成分を含まない、請求項９ないし１１のうちいずれか１項に記載の組成物。
【請求項13】
凍結乾燥粉末、液状またはプレフィルドシリンジ製剤の形態である、請求項９ないし１２のうちいずれか１項に記載の組成物。
【請求項14】
シワ、角ばり顎、エラ張り顎、傷、皮膚軟化、傷痕、にきび、毛穴、弾力またはケロイド症状を改善させるためのものである、請求項９ないし１３のうちいずれか１項に記載の組成物。
【請求項15】
顔面痙攣、瞼痙攣、斜頸、眼瞼痙攣、頸部筋緊張異常症、咽頭中央部筋緊張異常症、痙攣性発声障害、偏頭痛、肛門掻痒症または多汗症を治療するためのものである、請求項９ないし１３のうちいずれか１項に記載の組成物。
【請求項16】
経皮、皮下または筋肉内の投与用である、請求項９ないし１５のうちいずれか１項に記載の組成物。
【請求項17】
シワ、角ばり顎、エラ張り顎、傷、皮膚軟化、傷痕、にきび、毛穴、弾力またはケロイド症状を改善させるためのものである、請求項９ないし１３のうちいずれか１項に記載の組成物の用途。
【請求項18】
顔面痙攣、瞼痙攣、斜頸、眼瞼痙攣、頸部筋緊張異常症、咽頭中央部筋緊張異常症、痙攣性発声障害、偏頭痛、肛門掻痒症または多汗症を治療するためのものである、請求項９ないし１３のうちいずれか１項に記載の組成物の用途。
【請求項19】
請求項９ないし１３のうちいずれか１項に記載の組成物を個体に投与する段階を含む、シワ、角ばり顎、エラ張り顎、傷、皮膚軟化、傷痕、にきび、毛穴、弾力またはケロイドを改善させるための方法。
【請求項20】
請求項９ないし１３のうちいずれか１項に記載の組成物を個体に投与する段階を含む、顔面痙攣、瞼痙攣、斜頸、眼瞼痙攣、頸部筋緊張異常症、咽頭中央部筋緊張異常症、痙攣性発声障害、偏頭痛、肛門掻痒症または多汗症を治療するための方法。
【請求項21】
ボツリヌストキシンタイプＡ４ではない、ボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖の第１，第２，第３及び第４ドメインにおいて、第３ドメインの配列が、ボツリヌストキシンタイプＡ４の第３ドメイン、またはその変異体の配列で置換される段階を含む、野生型ボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖対比で増大された効力または半減期を有する組み換えボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖を製造する方法。
【請求項22】
組み換えボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖の第１，第２，第３及び第４ドメインにおいて、第４ドメインの配列が、ボツリヌストキシンタイプＡ４の第４ドメイン、またはその変異体の配列でさらに置換される段階を含む、請求項２１に記載の野生型ボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖対比で増大された効力または半減期を有する組み換えボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖を製造する方法。
【請求項23】
ボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖は、ボツリヌストキシンタイプＡ１，Ａ２，Ａ３，Ａ５，Ａ６，Ａ７またはＡ８である、請求項２１または２２に記載の野生型ボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖対比で増大された効力または半減期を有する組み換えボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖を製造する方法。
【請求項24】
ボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖は、ボツリヌストキシンタイプＡ１である、請求項２３に記載の野生型ボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖対比で増大された効力または半減期を有する組み換えボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖を製造する方法。
【請求項25】
請求項１ないし４のうちいずれか１項に記載の組み換えボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖をコーディングするポリヌクレオシド、及びボツリヌストキシン重鎖をコーディングするポリヌクレオシドを含む核酸分子、またはそれを含むベクターを含む細胞を培養する段階を含む、野生型ボツリヌストキシン対比で増大された効力または半減期を有する組み換えボツリヌストキシンを製造する方法。
【請求項26】
ボツリヌストキシン重鎖は、ボツリヌストキシンタイプＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，ＦまたはＧである、請求項２５に記載の野生型ボツリヌストキシン対比で増大された効力または半減期を有する組み換えボツリヌストキシンを製造する方法。
【請求項27】
ボツリヌストキシン重鎖は、ボツリヌストキシンタイプＡ１，Ａ２，Ａ３，Ａ４，Ａ５，Ａ６，Ａ７またはＡ８である、請求項２６に記載の野生型ボツリヌストキシン対比で増大された効力または半減期を有する組み換えボツリヌストキシンを製造する方法。
【請求項28】
ボツリヌストキシン重鎖は、ボツリヌストキシンタイプＡ１である、請求項２７に記載の野生型ボツリヌストキシン対比で増大された効力または半減期を有する組み換えボツリヌストキシンを製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、組み換えボツリヌストキシンに係り、さらに詳細には、組み換えボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖、組み換えボツリヌストキシン、並びにそれと係わる組成物、用途及び方法に関する。
【背景技術】
【0002】
ボツリヌストキシン（ＢｏＮＴ：Botulinum toxin）は、クロストリジウム・ボツリナム（Clostridium botulinum）菌及び関連種によって生成される神経毒性タンパク質である。該ボツリヌストキシンは、神経筋接合部の軸索突起末端から分泌される神経伝達物質であるアセチルコリンの放出を阻む。
【0003】
ボツリヌストキシンは、ジスルフィド結合（disulfide bond）によって連結された１００ｋＤａ重鎖（heavy chain）及び５０ｋＤａ軽鎖（light chain）によって構成された１５０ｋＤａ二本鎖タンパク質によって合成される。該重鎖は、該軽鎖を、細胞のシトソル（cytosol）に転位（translocation）させることの一助となるＮ末端ドメイン（Ｈｎ）、及び神経細胞上の細胞表面受容体を認知して結合するＣ末端ドメイン（Ｈｃ）にさらに分けられる。細胞内に入れば、該軽鎖は、可溶性ＮＳＦ付着タンパク質受容体（ＳＮＡＲＥ：soluble NSF-attachment protein receptor）の一部を特異的に加水分解（Proteolytic cleavage）させ、神経伝達物質放出を非活性化する。
【0004】
ボツリヌストキシンは、７個の血清型（ボツリヌストキシンタイプＡ、ボツリヌストキシンタイプＢ、ボツリヌストキシンタイプＣ、ボツリヌストキシンタイプＤ、ボツリヌストキシンタイプＥ、ボツリヌストキシンタイプＦ及びボツリヌストキシンタイプＧ）に分けられ、それらは、アミノ酸配列の変異に基づき、亜型（subtype）にさらに細分化される。それらにおいて、ボツリヌストキシンタイプＡ１は、分子レベルの研究、及び前臨床段階、臨床段階の研究が幅広く進められ、現在、製薬産業で広く利用されている。なお、他のボツリヌストキシンタイプＡ亜型の場合、精製された毒素を分離させるのに困難さが伴い、薬理学的特徴について研究されたり報告されたりすることが少ない。現在、該ボツリヌストキシンタイプＡ亜型のうち一部だけが、生化学的、細胞的、そして生体内における特性が究明されている。報告された研究によれば、ボツリヌストキシンタイプＡ亜型に係わる多様な試験管内研究及び生体内研究により、効力、細胞内移動、持続力のようなメカニズム側面において、ボツリヌストキシンタイプＡ１と区別される特性が明らかにされている。最近、ボツリヌストキシンタイプＡ７及びボツリヌストキシンタイプＡ８につき、試験管内レベルにおける特性が報告されている。
【0005】
国際公開ＷＯ２０１８／１３２４２３は、改善された力価、細胞進入動力学、及び作用持続期間を有するための、ボツリヌス神経毒素タイプＡ第１亜型の軽鎖ペプチド、及びボツリヌス神経毒素タイプＡ第２亜型の重鎖ペプチドを含むボツリヌス神経毒素混合物、及びそれを含む製薬組成物を開示している。また、国際公開ＷＯ２０１７／２１４４４７は、さらに少ない容量でもって、同一レベルの毒素活性を維持するために、重鎖配列を組み替えたボツリヌストキシンＢ１を開示している。
【0006】
しかしながら、これまで、ボツリヌス神経毒素タイプＡ亜型軽鎖の下位ドメインを組み替えた、組み換えボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖、及びそれを含む組み換えボツリヌストキシンの効力を向上させようとする試みはなされていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0007】
【特許文献1】国際公開ＷＯ２０１８／１３２４２３
【特許文献2】国際公開ＷＯ２０１７／２１４４４７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
本開示の目的は、組み換えボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖、及びそれを含む組み換えボツリヌストキシンを提供するためのものである。
【0009】
本開示の他の目的は、前記組み換えボツリヌストキシンと係わる組成物を提供するためのものである。
【0010】
本開示のさらに他の目的は、前記組み換えボツリヌストキシンと係わる組成物の用途を提供するためのものである。
【0011】
本開示のさらに他の目的は、前記組み換えボツリヌストキシンと係わる組成物を個体に投与する段階を含む、疾患の改善方法または治療方法を提供するためのものである。
【0012】
本開示のさらに他の目的は、野生型ボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖、及びそれを含む野生型ボツリヌストキシン対比で増大された効力または半減期を有する組み換えボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖、並びにそれを含む組み換えボツリヌストキシンを製造する方法を提供するためのものである。
【課題を解決するための手段】
【0013】
本開示の一態様は、ボツリヌストキシンタイプＡ４ではない、ボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖の第１，第２，第３及び第４ドメインにおいて、第３ドメインの配列が、ボツリヌストキシンタイプＡ４の第３ドメイン、またはその変異体の配列で置換されたものである、組み換えボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖を提供する。
【0014】
本開示の他の態様は、前記組み換えボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖の第１，第２，第３及び第４ドメインにおいて、第４ドメインの配列が、ボツリヌストキシンタイプＡ４の第４ドメイン、またはその変異体の配列でさらに置換されたものである、組み換えボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖を提供する。
【0015】
本開示のさらに他の態様は、前記組み換えボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖、及びボツリヌストキシン重鎖を含む、組み換えボツリヌストキシンを提供する。
【0016】
本開示のさらに他の態様は、前記組み換えボツリヌストキシン、及び薬剤学的に許容される賦形剤または添加剤を含む組成物を提供する。
【0017】
本開示のさらに他の態様は、前記組み換えボツリヌストキシン、及び薬剤学的に許容される賦形剤または添加剤を含む組成物を個体に投与して疾患を改善させたり治療したりするための用途を提供する。
【0018】
本開示のさらに他の態様は、ボツリヌストキシンタイプＡ４ではない、ボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖の第１，第２，第３及び第４ドメインにおいて、第３ドメインの配列が、ボツリヌストキシンタイプＡ４の第３ドメイン、またはその変異体の配列で置換される段階を含む、野生型ボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖対比で増大された効果または半減期を有する組み換えボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖を製造する方法を提供する。
【0019】
本開示のさらに他の態様は、前記組み換えボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖の第１，第２，第３及び第４ドメインにおいて、第４ドメインの配列が、ボツリヌストキシンタイプＡ４の第４ドメイン、またはその変異体の配列でさらに置換される段階を含む、野生型ボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖対比で増大された効果または半減期を有する組み換えボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖を製造する方法を提供する。
【0020】
本開示のさらに他の態様は、前記組み換えボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖、及びボツリヌストキシン重鎖を含む、野生型ボツリヌストキシン対比で増大された効力または半減期を有する組み換えボツリヌストキシンを製造する方法を提供する。
【発明の効果】
【0021】
本開示によれば、効力及び半減期が増大され、患者の便宜性が高くなり、適応症にあつらえられた治療が可能な組み換えボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖、組み換えボツリヌストキシン、並びにそれと係わる組成物、用途及び方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【0022】
【図1A】ボツリヌストキシンタイプＡ１軽鎖（GenBank：ＣＡＬ８２３６０．１）及びボツリヌストキシンタイプＡ４軽鎖（GenBank：ＡＣＱ５１４１７．１）の配列比較（ESPript3.0（Robert and Gouet, 2014））を示す。ドメイン置換のための各ドメインの境界と開始点は、矢印及びボックスで表示し、下の表は、各ドメインの配列範囲と、２つの配列間のアミノ酸同一性分析結果と、である。
【図1B】ボツリヌストキシンタイプＡ１軽鎖及びボツリヌストキシンタイプＡ４軽鎖を分割したドメインに係わる構造的情報を示したものであり、各ドメインに係わるアミノ酸配列差と機能的特性とを示す。
【図1C】ボツリヌストキシンタイプＡ１軽鎖とボツリヌストキシンタイプＡ４軽鎖とのドメインが置換された組み換えボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖の組み合わせを示した模式図である。
【図2A】ドメインを置換して精製した組み換えボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析結果である。
【図2B】Clover-SNAP25-mRuby2（１３７－２０６）が、ドメインが置換された組み換えボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖によって加水分解された部位を確認した結果である。ドメインが置換された組み換えボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖が存在する条件と、存在しない条件とにより、蛍光タンパク質標識が付着されたSNAP25（１３７－２０６）の加水分解有無を確認した結果、ドメインが置換された組み換えボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖が存在する条件において加水分解された。サンプルは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びクマシブルー染色を介して分析した。
【図3】ドメインが置換された組み換えボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖の熱的安定性を示したグラフである。下の表は、それぞれのドメイン置換された組み換えボツリヌストキシン軽鎖の溶解温度を示す。
【図4】ドメインが置換された組み換えボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖のエンドペプチダーゼアッセイ（endopeptidase assay）結果である。ドメインが置換された組み換えボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖と野生型ボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖との力価結果を比較すれば、ｐＢＴ１０３は、野生型と類似した力価を示し、ｐＢＴ１１２は、１．７３倍、ｐＢＴ１１３は、１．４９倍、ｐＢＴ１１４は、１．３倍、ｐＢＴ１１５は、１．５５倍増大した。
【図5A】ボツリヌストキシンタイプＡの軽鎖が、他のボツリヌストキシンタイプＡ亜型の第３ドメインで置換された組み換えボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖の精製された産物をＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析した結果である。
【図5B】ボツリヌストキシンタイプＡの軽鎖が、他のボツリヌストキシンタイプＡ亜型の第３ドメインで置換された組み換えボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖の精製された産物熱的安定性を分析した結果である。それぞれの組み換えボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖の溶解点は、下の表に示した。ボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖に、ボツリヌストキシンタイプＡ４軽鎖の第３ドメインを導入する場合、熱的安定性が最も大きく向上された。
【図6A】ドメインが置換された組み換えボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖を含む組み換えボツリヌストキシン構成を図示した模式図である。
【図6B】ドメインが置換された組み換えボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖が導入された組み換えボツリヌストキシンの精製された産物につき、還元条件において、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析した結果である。組み換えボツリヌストキシンは、不純物がない１５０ｋｄ形態に精製された後、還元条件において、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析した。
【図7A】ラットにおいて、コアトックス（ボツリヌストキシンタイプＡ製品）及び組み換えボツリヌストキシン（ｐＢＴ１４２）を、それぞれ１．２，４，１２Ｕ／ｋｇ容量でもって、右側ふくらはぎ筋肉に投与した後、ＤＡＳ数値の経時的な変化を示したグラフである。各測定日のＤＡＳ値は、マン・ホイットニー（Mann－Whitney）検定を使用して分析した（＊ｐ＜０．０５）。
【図7B】ラットにおいて、コアトックス及び組み換えボツリヌストキシン（ｐＢＴ１４２）を、それぞれ１．２，４，１２Ｕ／ｋｇ容量でもって、右側ふくらはぎ筋肉に投与した後、各容量でもって、最高ＤＡＳ点数に係わるトレンドラインと、算出されたＤＡＳ ＥＤ５０と、を示したグラフである。
【図7C】ラットにおいて、コアトックス及び組み換えボツリヌストキシン（ｐＢＴ１４２）を、１２Ｕ／ｋｇ容量でもって、右側ふくらはぎ筋肉に投与した後、ＣＭＡＰ数値の経時的な変化を示したグラフである。各測定日において、コアトックスと組み換えボツリヌストキシン（ｐＢＴ１４２）とのＣＭＡＰ値につき、両側（two－tailed）ｔ検定を使用して分析した結果を示した（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図7D】ラットにおいて、コアトックス及び組み換えボツリヌストキシン（ｐＢＴ１４７）を、それぞれ１．２，４，１２Ｕ／ｋｇ容量でもって、右側ふくらはぎ筋肉に投与した後、ＤＡＳ数値の経時的な変化を示したグラフである。各測定日のＤＡＳ値は、マン・ホイットニー（Mann－Whitney）検定を使用して分析した（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１）。
【図7E】ラットにおいて、コアトックス及び組み換えボツリヌストキシン（ｐＢＴ１４７）を、それぞれ１．２，４，１２Ｕ／ｋｇ容量でもって、右側ふくらはぎ筋肉に投与した後、各容量でもって、最高ＤＡＳ点数に係わるトレンドラインと、算出されたＤＡＳ ＥＤ５０と、を示したグラフである。
【図7F】ラットにおいて、コアトックス及び組み換えボツリヌストキシン（ｐＢＴ１４７）を、それぞれ１２Ｕ／ｋｇ容量でもって、右側ふくらはぎ筋肉に投与した後、ＣＭＡＰ数値の経時的な変化を示したグラフである。各測定日において、コアトックスと組み換えボツリヌストキシン（ｐＢＴ１４７）とのＣＭＡＰ値につき、両側（two－tailed）ｔ検定を使用して分析した結果を示した（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図8A】マウスにおいて、コアトックス（ボツリヌストキシンタイプＡ製品）及び組み換えボツリヌストキシン（ｐＢＴ１４２及びｐＢＴ１４７）を、それぞれ１．２，４，１２、４０Ｕ／ｋｇ容量でもって、右側ふくらはぎ筋肉に投与した後、ＤＡＳ数値の経時的な変化を示したグラフである。各測定日のＤＡＳ値は、マン・ホイットニー（Mann－Whitney）検定を使用して分析した（＊ｐ＜０．０５）。
【図8B】マウスにおいて、コアトックス及び組み換えボツリヌストキシン（ｐＢＴ１４２及びｐＢＴ１４７）を、それぞれ１．２，４，１２、４０Ｕ／ｋｇ容量でもって、右側ふくらはぎ筋肉に投与した後、各容量でもって、最高ＤＡＳ点数に係わるトレンドラインと、算出されたＤＡＳ ＥＤ５０とを示したグラフである。
【図8C】マウスにおいて、コアトックス及び組み換えボツリヌストキシン（ｐＢＴ１４２及びｐＢＴ１４７）を、それぞれ１２Ｕ／ｋｇ容量でもって、右側ふくらはぎ筋肉に投与した後、ＣＭＡＰ数値の経時的な変化を示したグラフである。各測定日において、コアトックス及び組み換えボツリヌストキシン（ｐＢＴ１４２及びｐＢＴ１４７）のＣＭＡＰ値につき、両側（two－tailed）ｔ検定を使用して分析した（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【発明を実施するための形態】
【0023】
以下、本開示について、具体的な実施例を挙げてさらに詳細に説明するが、それらは、本開示の理解の一助とするためのものであるのみ、本開示の範囲は、いかようにも制限されるものではない。
【0024】
実施例１：ボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖のドメイン置換
ボツリヌストキシンタイプＡ１軽鎖とボツリヌストキシンタイプＡ４軽鎖とにおいて、どちらのドメインがタンパク質安定性に影響を及ぼすかということを確認するために、ボツリヌストキシンタイプＡ１軽鎖とボツリヌストキシンタイプＡ４軽鎖との遺伝子の４個ドメインが置換された。インフュージョンクローニング（In-Fusion cloning）方法を使用してドメインが置換された遺伝子、及び野生型を含む総１６個のドメイン置換軽鎖遺伝子を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現ベクターであるｐＥＴ２８ａにクローニングし、それぞれｐＢＴ１０２ないしｐＢＴ１０８、及びｐＢＴ１０９ないしｐＢＴ１１５と命名した（図１Ｃ）。その後、組み換えボツリヌストキシンＡ軽鎖遺伝子配列を分析し、ドメイン置換を確認した。
ボツリヌストキシンタイプＡ１軽鎖とボツリヌストキシンタイプＡ４軽鎖とにおいて、どちらのドメインがタンパク質安定性に影響を及ぼすかということを確認するために、ボツリヌストキシンタイプＡ１軽鎖とボツリヌストキシンタイプＡ４軽鎖との遺伝子の４個ドメインが置換された。インフュージョンクローニング（In-Fusion cloning）方法を使用してドメインが置換された遺伝子、及び野生型を含む総１６個のドメイン置換軽鎖遺伝子を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現ベクターであるｐＥＴ２８ａにクローニングし、それぞれｐＢＴ１０２ないしｐＢＴ１０８、及びｐＢＴ１０９ないしｐＢＴ１１５と命名した（図１Ｃ）。その後、組み換えボツリヌストキシンＡ軽鎖遺伝子配列を分析し、ドメイン置換を確認した。
【0025】
実施例２：ドメイン置換ボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖の発現及び精製
実施例１で製造された組み換えボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖遺伝子を利用し、１４種の組み換えボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖を製造した。製造された組み換え発現ベクターを、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の一種であるＢＬ２１（ＤＥ３）細胞に導入し、ドメインが置換された組み換えボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖の発現を誘導した。該発現は、ＩＰＴＧ（isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside）で誘導し、最終濃度は、０．５ｍＭになるように使用した。すなわち、１Ｍ ＩＰＴＧ ０．５ｍｌを液体培地１Ｌに入れた後、３７℃で約３時間、１８℃で約１８時間培養したＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を、４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、細胞を沈澱させた。上澄み液の培地を除去し、沈澱された細胞をＡバッファ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、２ｍＭ Ｂ－Ｍｅ（ｐＨ７．９））で再浮遊（resuspension）させた後、氷において、超音波分散器で、２パルス／１休止（pause）、パワー３５％で２０分間細胞を破砕した。前記破砕された細胞を、４℃ １４，０００ｒｐｍで１時間遠心分離した後、細胞カスが除去された上澄み液に対し、Ｎｉ－ＮＴＡカラムを使用し、ヒスタグ（His tag）とＮｉ－ＮＴＡレジン（resin）との結合を介し、上澄み液から、組み換えボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖を分離した。前記組み換えボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖のアミノ酸配列を、それぞれｐＢＴ１０２（配列番号１８）、ｐＢＴ１０３（配列番号１９）、ｐＢＴ１０４（配列番号２０）、ｐＢＴ１０５（配列番号２１）、ｐＢＴ１０６（配列番号２２）、ｐＢＴ１０７（配列番号２３）、ｐＢＴ１０８（配列番号２４）、ｐＢＴ１０９（配列番号２５）、ｐＢＴ１１０（配列番号２６）、ｐＢＴ１１１（配列番号２７）、ｐＢＴ１１２（配列番号２８）、ｐＢＴ１１３（配列番号２９）、ｐＢＴ１１４（配列番号３０）及びｐＢＴ１１５（配列番号３１）と示した。
実施例１で製造された組み換えボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖遺伝子を利用し、１４種の組み換えボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖を製造した。製造された組み換え発現ベクターを、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の一種であるＢＬ２１（ＤＥ３）細胞に導入し、ドメインが置換された組み換えボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖の発現を誘導した。該発現は、ＩＰＴＧ（isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside）で誘導し、最終濃度は、０．５ｍＭになるように使用した。すなわち、１Ｍ ＩＰＴＧ ０．５ｍｌを液体培地１Ｌに入れた後、３７℃で約３時間、１８℃で約１８時間培養したＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を、４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、細胞を沈澱させた。上澄み液の培地を除去し、沈澱された細胞をＡバッファ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、２ｍＭ Ｂ－Ｍｅ（ｐＨ７．９））で再浮遊（resuspension）させた後、氷において、超音波分散器で、２パルス／１休止（pause）、パワー３５％で２０分間細胞を破砕した。前記破砕された細胞を、４℃ １４，０００ｒｐｍで１時間遠心分離した後、細胞カスが除去された上澄み液に対し、Ｎｉ－ＮＴＡカラムを使用し、ヒスタグ（His tag）とＮｉ－ＮＴＡレジン（resin）との結合を介し、上澄み液から、組み換えボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖を分離した。前記組み換えボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖のアミノ酸配列を、それぞれｐＢＴ１０２（配列番号１８）、ｐＢＴ１０３（配列番号１９）、ｐＢＴ１０４（配列番号２０）、ｐＢＴ１０５（配列番号２１）、ｐＢＴ１０６（配列番号２２）、ｐＢＴ１０７（配列番号２３）、ｐＢＴ１０８（配列番号２４）、ｐＢＴ１０９（配列番号２５）、ｐＢＴ１１０（配列番号２６）、ｐＢＴ１１１（配列番号２７）、ｐＢＴ１１２（配列番号２８）、ｐＢＴ１１３（配列番号２９）、ｐＢＴ１１４（配列番号３０）及びｐＢＴ１１５（配列番号３１）と示した。
【0026】
前記組み換えボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖及び前記野生型ボツリヌストキシンタイプＡ１，Ａ４を含む、総１６種のタンパク質発現を試みたが５、種は、発現量が少ないか、あるいは封入体（inclusion body）として発現され、最終的に、１１種のタンパク質が可溶性として発現された（図２Ａ）。その後、精製された１１種のタンパク質を、Ｎ末端とＣ末端とに蛍光タンパク質が標識されたＳＮＡＰ２５（１３７－２０６）基質と反応させ、プロテアーゼ活性を確認した。蛍光タンパク質が標識されたＳＮＡＰ２５（１３７－２０６）３μＭを、ドメインが置換された組み換えボツリヌストキシン軽鎖０．２μＭと混合させ、３７℃で２時間インキュベーションし、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにローディングした。クマシブルー染色を介し、蛍光タンパク質・タグ付着されたＳＮＡＰ２５（１３７－２０６）が、ドメインが置換された組み換えボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖によって加水分解されることを確認した（図２Ｂ）。
【0027】
試験例１：ドメイン置換されたボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖の熱的安定性評価
ドメインが置換された組み換えボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖の熱的安定性を比較した。安定性評価方法として、熱変性中間温度（Ｔｍ）の評価を行い、一般的に、熱変性中間温度は、高いことが望ましい。各ドメイン置換組み換えボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖の熱安定性は、熱移動分析法（ＰＴＳ）を使用した。プロテインサーマルシフトダイキット（Protein Thermal Shift Dye Kit）（Catalog Ｎｏ．４４６１１４６（Applied Biosystems））を利用し、製造社の方法により、熱移動分析法アッセイを行った。具体的には、各組み換えボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖１０μｇを、プロテインサーマルシフトダイとバッファとで、２０μｌになるように混合した後、ＲＴ－ＰＣＲ（C1000 thermal cycler equipped with a CFX96 optical reaction module（Bio－Rad））でもって、２０℃において、６０秒当たり１℃ずつ温度を上昇させながら９５℃まで、ＲＯＸシグナルを確認した。溶融曲線を基に、各組み換えボツリヌストキシン軽鎖の溶解点（Ｔｍ：melting temperature）を決定した。前記ドメインが置換された各組み換えボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖の溶解点を図３に示した。
ドメインが置換された組み換えボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖の熱的安定性を比較した。安定性評価方法として、熱変性中間温度（Ｔｍ）の評価を行い、一般的に、熱変性中間温度は、高いことが望ましい。各ドメイン置換組み換えボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖の熱安定性は、熱移動分析法（ＰＴＳ）を使用した。プロテインサーマルシフトダイキット（Protein Thermal Shift Dye Kit）（Catalog Ｎｏ．４４６１１４６（Applied Biosystems））を利用し、製造社の方法により、熱移動分析法アッセイを行った。具体的には、各組み換えボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖１０μｇを、プロテインサーマルシフトダイとバッファとで、２０μｌになるように混合した後、ＲＴ－ＰＣＲ（C1000 thermal cycler equipped with a CFX96 optical reaction module（Bio－Rad））でもって、２０℃において、６０秒当たり１℃ずつ温度を上昇させながら９５℃まで、ＲＯＸシグナルを確認した。溶融曲線を基に、各組み換えボツリヌストキシン軽鎖の溶解点（Ｔｍ：melting temperature）を決定した。前記ドメインが置換された各組み換えボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖の溶解点を図３に示した。
【0028】
結果を見れば、ｐＢＴ１０３（配列番号１９）及びｐＢＴ１０４（配列番号２０）の熱的安定性が増大したことを確認した。野生型ボツリヌストキシンタイプＡ１軽鎖の溶解点が４３℃であることに比べ、ｐＢＴ１０３及びｐＢＴ１０４の溶解点は、それぞれ５２℃、及び５１℃に上昇し、ｐＢＴ１１４及びｐＢＴ１１５は、４９℃に上昇した。従って、対照群として使用された野生型ボツリヌストキシンタイプＡ１軽鎖の溶解点より、ｐＢＴ１０３及びｐＢＴ１０４は、８℃及び９℃の熱的安定性が増大し、ｐＢＴ１１４及びｐＢＴ１１５は、６℃の熱的安定性が増大した。従って、共通して、ボツリヌストキシンタイプＡ４軽鎖の第３ドメインを含むように、ドメイン置換された組み換えボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖の溶解点が上昇したことを確認した。
【0029】
試験例２：ドメイン置換されたボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖の力価評価
ドメイン置換された組み換えボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖に係わる試験管内活性を確認するために、酵素結合免疫吸着検査（ＥＬＩＳＡ：enzyme-linked immunosorbent assay）基盤エンドペブチダーゼアッセイ（endopeptidase assay）を遂行した。まず、ＧＳＴ－ＳＮＡＰ２５（１３７－２０６）基質を、最終２μｇ／ｍＬになるように希釈した後、９６ウェルプレートに、ウェル当たり１００μＬを添加し、４℃で１６時間反応させた。２％スキムミルク（skim milk）を、ＰＢＳＴ（phosphate buffered saline with Tween）に溶かして製造した後、基質コーティングが終わったウェルに２００μｌを添加し、２５℃で１時間反応させた。反応後、ＰＢＳＴ ３００μｌを使用し、３回ウェルを洗浄した後、ＴｏｘｉｎＡｓｓａｙＢｕｆｆｅｒ（ＨＥＰＥＳ、ＤＴＴ、硫酸亜鉛、Tween－２０が添加された反応バッファ（reaction buffer））を利用し、標準試料（ＳＴＤ（１，２，３，４，５，６Ｕ／ｍＬ）サンプル）、及びドメインが置換された組み換えボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖試料（ターゲット濃度：４Ｕ／ｍＬ）を製造し、ウェルに１００μＬずつローディングした後、２５℃で２時間反応させた。反応後、ＰＢＳＴ ３００μｌを使用し、３回ウェルを洗浄した後、一次抗体ウサギ抗ＳＮＡＰ２５（１９０－１９７）ｐＡｂを、１００μｌ／ウェル添加した後、３０分間反応させ、さらに前述のように３回洗浄した後、二次抗体である抗ウサギＩｇＧ ＨＲＰ conjugateを添加し、３０分間反応させた。ＴＭＢ（BioFx社）溶液を１００μｌ／ウェルでもって入れ、３０分間２５℃で発色させた。該発色が終われば、３Ｍ硫酸を５０μｌ／ウェルでもって添加し、発色を中断させ、４５０ｎｍで吸光度を測定した。
ドメイン置換された組み換えボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖に係わる試験管内活性を確認するために、酵素結合免疫吸着検査（ＥＬＩＳＡ：enzyme-linked immunosorbent assay）基盤エンドペブチダーゼアッセイ（endopeptidase assay）を遂行した。まず、ＧＳＴ－ＳＮＡＰ２５（１３７－２０６）基質を、最終２μｇ／ｍＬになるように希釈した後、９６ウェルプレートに、ウェル当たり１００μＬを添加し、４℃で１６時間反応させた。２％スキムミルク（skim milk）を、ＰＢＳＴ（phosphate buffered saline with Tween）に溶かして製造した後、基質コーティングが終わったウェルに２００μｌを添加し、２５℃で１時間反応させた。反応後、ＰＢＳＴ ３００μｌを使用し、３回ウェルを洗浄した後、ＴｏｘｉｎＡｓｓａｙＢｕｆｆｅｒ（ＨＥＰＥＳ、ＤＴＴ、硫酸亜鉛、Tween－２０が添加された反応バッファ（reaction buffer））を利用し、標準試料（ＳＴＤ（１，２，３，４，５，６Ｕ／ｍＬ）サンプル）、及びドメインが置換された組み換えボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖試料（ターゲット濃度：４Ｕ／ｍＬ）を製造し、ウェルに１００μＬずつローディングした後、２５℃で２時間反応させた。反応後、ＰＢＳＴ ３００μｌを使用し、３回ウェルを洗浄した後、一次抗体ウサギ抗ＳＮＡＰ２５（１９０－１９７）ｐＡｂを、１００μｌ／ウェル添加した後、３０分間反応させ、さらに前述のように３回洗浄した後、二次抗体である抗ウサギＩｇＧ ＨＲＰ conjugateを添加し、３０分間反応させた。ＴＭＢ（BioFx社）溶液を１００μｌ／ウェルでもって入れ、３０分間２５℃で発色させた。該発色が終われば、３Ｍ硫酸を５０μｌ／ウェルでもって添加し、発色を中断させ、４５０ｎｍで吸光度を測定した。
【0030】
標準試料の吸光値（ＯＤ：optical density）を利用し、標準試料の濃度と吸光値との検量線（calibration curve）を描いた後、生成された一次方程式を利用し、ドメインが置換された組み換えボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖試料の測定された力価を求めた。算出された力価とターゲット濃度とを利用し、ドメインが置換された組み換えボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖試料の回収率を算出し、ターゲット濃度対比の回収率を確認し、その結果を図４に示した。図４から知ることができるように、ｐＢＴ１０３（配列番号１９）は、野生型ボツリヌストキシンタイプＡ１軽鎖と類似した力価を見し、ｐＢＴ１１４（配列番号３０）は、１．３倍、ｐＢＴ１１５（配列番号３１）は、１．５５倍力価が増大した。
【0031】
比較例１：他のボツリヌストキシンタイプＡ亜型の軽鎖第３ドメインで置換された組み換えボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖の発現、精製及び熱的安定性の評価
組み換えボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖において、Ａ４の第３ドメインが、熱的安定性増大において、重要要因であるか否かということを確認するために、ボツリヌストキシンタイプＡ４軽鎖ではない他のボツリヌストキシンタイプＡであるボツリヌストキシンタイプＡ２，Ａ５，Ａ７及びＡ８軽鎖の第３ドメインを、ボツリヌストキシンタイプＡ１軽鎖の第３ドメインと置換した後、熱的安定性を比較した。
組み換えボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖において、Ａ４の第３ドメインが、熱的安定性増大において、重要要因であるか否かということを確認するために、ボツリヌストキシンタイプＡ４軽鎖ではない他のボツリヌストキシンタイプＡであるボツリヌストキシンタイプＡ２，Ａ５，Ａ７及びＡ８軽鎖の第３ドメインを、ボツリヌストキシンタイプＡ１軽鎖の第３ドメインと置換した後、熱的安定性を比較した。
【0032】
第３ドメインが置換された組み換えボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖を確保するために、４種の組み換えボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖を、実施例２の精製方法によって精製し、各ボツリヌストキシンタイプＡ亜型の軽鎖第３ドメインが置換された組み換えボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現ベクターであるｐＥＴ２８ａにクローニングした。
【0033】
ボツリヌストキシンタイプＡ２軽鎖の第３ドメインで置換されたベクターを、ｐＢＴ１５８（配列番号３２）、ボツリヌストキシンタイプＡ５軽鎖の第３ドメインで置換されたベクターを、ｐＢＴ１６０（配列番号３３）、ボツリヌストキシンタイプＡ７軽鎖の第３ドメインで置換されたベクターを、ｐＢＴ１６１（配列番号３４）、ボツリヌストキシンタイプＡ８軽鎖の第３ドメインで置換されたベクターを、ｐＢＴ１６２（配列番号３５）と命名した。各組み換えボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖は、実施例２と同一方法で精製した（図５Ａ）。ボツリヌストキシンタイプＡ３軽鎖の第３ドメイン置換された組み換えボツリヌストキシン軽鎖タンパク質は、発現されておらず、ボツリヌストキシンタイプＡ６軽鎖第３ドメインは、Ａ１の第３ドメインと配列が同じであるので、試験から除いた。
【0034】
前述のように、ボツリヌストキシンタイプＡ１軽鎖の第３ドメインを、ボツリヌストキシンタイプＡ２軽鎖の第３ドメイン、ボツリヌストキシンタイプＡ５軽鎖の第３ドメイン、ボツリヌストキシンタイプＡ７軽鎖の第３ドメイン、またはボツリヌストキシンタイプＡ８軽鎖の第３ドメインで置換した結果、ボツリヌストキシンタイプＡ４の第３ドメインで、ボツリヌストキシンタイプＡ１軽鎖の第３ドメインが置換された組み換えボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖の溶解点が最も高く、すなわち、熱的安定性に最もすぐれていた（図５Ｂ）。
【0035】
実施例３：ドメイン置換された組み換えボツリヌストキシンの製造及び精製
ドメイン置換された組み換えボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖に係わる組み換えボツリヌストキシンの機能分析のために、熱的安定性が増大され、活性が増大された組み換えボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖を含む組み換え全長ボツリヌストキシン遺伝子を、ｐＭ ＴＬ８００００ベクターシステムを利用し、インフュージョン方法で（infusion－ＨＤ（Takara））クローニングした。クローニングされた製造物は、ｐＢＴ１４２、ｐＢＴ１４３、ｐＢＴ１４４、ｐＢＴ１４５、ｐＢＴ１４６及びｐＢＴ１４７と命名し、図６Ａに、各ドメインの構成を模式図で示した。ドメインが置換された組み換えボツリヌストキシンは、Clos Tron方法（system）を使用し、毒素遺伝子を不活性化させた無毒化ホールＡハイパー（hall A-hyper）菌株を製造して使用した。
ドメイン置換された組み換えボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖に係わる組み換えボツリヌストキシンの機能分析のために、熱的安定性が増大され、活性が増大された組み換えボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖を含む組み換え全長ボツリヌストキシン遺伝子を、ｐＭ ＴＬ８００００ベクターシステムを利用し、インフュージョン方法で（infusion－ＨＤ（Takara））クローニングした。クローニングされた製造物は、ｐＢＴ１４２、ｐＢＴ１４３、ｐＢＴ１４４、ｐＢＴ１４５、ｐＢＴ１４６及びｐＢＴ１４７と命名し、図６Ａに、各ドメインの構成を模式図で示した。ドメインが置換された組み換えボツリヌストキシンは、Clos Tron方法（system）を使用し、毒素遺伝子を不活性化させた無毒化ホールＡハイパー（hall A-hyper）菌株を製造して使用した。
【0036】
毒素遺伝子が不活性化されるか、あるいはノックアウトされた菌株を含む無毒化クロストリジウム・ボツリナム菌株は、精製された組み換えボツリヌストキシン、または精製された組み換えボツリヌストキシン複合体の製造方法に使用することができる。毒素遺伝子が不活性化されるか、あるいはノックアウトされた菌株を製造する方法は、当分野に公知されており、例えば、Clos Tron方法を使用することが、文献［Bradshaw et al. 2010, Pellett et al. 2016］に説明されている。
【0037】
Clos Tron方法によって製造された組み換えボツリヌストキシンは、複合体成分を含んでいない１５０ｋＤａの形態に精製した（図６Ａ）。組み換えボツリヌストキシンは、それぞれｐＢＴ１４２（配列番号３６）、ｐＢＴ１４３（配列番号３７）、ｐＢＴ１４４（配列番号３８）、ｐＢＴ１４５（配列番号３９）、ｐＢＴ１４６（配列番号４０）、ｐＢＴ１４７（配列番号４１）であると確認した。前記組み換えボツリヌストキシンの全ての製造は、政府規制により、毒素生産が許可された施設で行った。
【0038】
試験例３：ラットにおける、ドメインが置換された組み換えボツリヌストキシンの効力
メス６週齢ＳＤ（Sprague－Dawley）ラットを、（株）オリエントバイオから購入し、１週間、順化させて検疫した後、７週齢ラットを実験に使用した。飼料は、滅菌された実験動物用固形飼料（Ｒ４０－１０（ＳＡＦＥ（フランス）））を自由給餌し、食水は、上水道水を高温高圧滅菌して自由給餌させた。順化期間、検疫期間及び実験期間の間、マウスは、温度２３±３℃、相対湿度５５±１５％、照明時間１２時間（午前８時～午後８時）、換気回数１５回／時間及び照度１５０～３００ルックスに設定された特定病原体不在条件下で飼育された。本研究は、（株）メディトックス動物実験倫理委員会の検討及び承認の後で遂行された。
メス６週齢ＳＤ（Sprague－Dawley）ラットを、（株）オリエントバイオから購入し、１週間、順化させて検疫した後、７週齢ラットを実験に使用した。飼料は、滅菌された実験動物用固形飼料（Ｒ４０－１０（ＳＡＦＥ（フランス）））を自由給餌し、食水は、上水道水を高温高圧滅菌して自由給餌させた。順化期間、検疫期間及び実験期間の間、マウスは、温度２３±３℃、相対湿度５５±１５％、照明時間１２時間（午前８時～午後８時）、換気回数１５回／時間及び照度１５０～３００ルックスに設定された特定病原体不在条件下で飼育された。本研究は、（株）メディトックス動物実験倫理委員会の検討及び承認の後で遂行された。
【0039】
対照群として、ボツリヌストキシン製品であるコアトックス（ボツリヌストキシンタイプＡ、Lot Ｎｏ．：ＮＳＡ１９０１６またはＮＳＡ２００１１（メディトックス））１００単位（unit）を使用した。組み換えボツリヌストキシンｐＢＴ１４２は、１，３１６Ｕ／ｍＬ、ｐＢＴ１４７は、３４８Ｕ／ｍＬに製造し、実験に使用した。各組み換えボツリヌストキシンの力価は、マウス力価試験法を介し、効力試験前に測定して導き出された力価値を基に試験を行った。プラセボ（偽薬投与群）としては、組み換えボツリヌストキシンにおいて、ボツリヌストキシン成分を除去し、賦形剤成分を同一に使用して、組み換えボツリヌストキシンｐＢＴ１４２及び組み換えボツリヌストキシンｐＢＴ１４７、及びコアトックスの効力試験を進めた。各試験物質の投与容量は、いずれも単位（unit）（Ｕ：ボツリヌストキシンの生物学的活性を示す値であり、１Ｕは、マウス腹腔投与によるマウス半数致死量）を基準に、同一容量でもって投与した。
【0040】
コアトックスは、滅菌生理食塩水（３５Ｖ３ＡＦ３、大韓薬品工業）を使用して希釈し、組み換えボツリヌストキシンｐＢＴ１４２及び組み換えボツリヌストキシンｐＢＴ１４７は、プラセボを利用し、１２，４０，１２０Ｕ／ｍＬ濃度にそれぞれ希釈した。試験物質が投与された日を０日にし、注射麻酔剤（６０ｍｇ／ｋｇ塩酸ケタミン＋１０ｍｇ／ｋｇキシラジン）を利用してラットに麻酔をかけた後、表１の各群の構成により、それぞれの試験物質をラットの右側ふくらはぎ筋肉に、ハミルトン注射器を利用し、０．１ｍＬ／ｋｇで投与した。
【0041】
効力評価においては、ラットの筋肉マヒ程度を肉眼で評価するＤＡＳ（digit abduction score）評価法と、外部的な電気刺激に反応する筋肉の活動電位を測定する複合筋肉活動電位（ＣＭＡＰ：compound muscle action potential）試験法とを使用した。
【0042】
【表1】
【0043】
【表2】
【0044】
Graphpad Prism ７．０５（GraphPad Software Inc., CA（米国））は、グラフ提示に使用され、SPSS software ２５．０（SPSS Inc., IL（米国））及びExcel（２０１３（ＭＳ（米国）））は、統計分析に使用された。実験の結果は、平均±標準偏差で表示した。ＤＡＳ ＥＤ５０は、Graphpad Prismを利用し、最低０点値及び最高４点値を固定させた後、３指標ロジステックモデルを利用して算出した。コルモゴロフ・スミルノフ検定（Kolmogorov－Smirnov test）を利用し、正規性検定を実施した。非母数データは、マン・ホイットニー（Mann－Whitney）検定を介して統計分析をし、母数データの場合、両側（two－tailed）ｔ検定を行い、ｐ値が０．０５より小さい場合、統計的に有意性があると判断した。
【0045】
ラット右側ふくらはぎ筋肉に、コアトックスと組み換えボツリヌストキシンｐＢＴ１４２とを、１．２，４，１２Ｕ／ｋｇ容量でもって、単回投与した後、ＤＡＳ評価結果、１２Ｕ／ｋｇの容量でもって投与した後、１４日目、ｐＢＴ１４２投与群において、コアトックス投与群対比で、有意的にＤＡＳ点数が増大した。コアトックス４Ｕ／ｋｇ投与群においては、４９日目、全ての個体が回復され、同じ容量のｐＢＴ１４２投与群においては、それより７日延長された５６日目、全ての個体が回復された。そして、コアトックス１２Ｕ／ｋｇ投与群は、投与後９１日目、全ての個体が回復されたが、同じ容量のｐＢＴ１４２投与群の場合、それより２１日延長された１１２日目、全ての個体が回復された（図７Ａ）。ＤＡＳ ＥＤ５０比較を介し、ｐＢＴ１４２がコアトックスより、約１．８倍強い効力を示すことを確認した（図７Ｂ）。ＤＡＳ結果と類似して、ＣＭＡＰ試験においても、１２Ｕ／ｋｇ ｐＢＴ１４２投与群が、コアトックス１２Ｕ／ｋｇ投与群対比で、有意的に低いＣＭＡＰ値を示し、強い効力を示し、コアトックス１２Ｕ／ｋｇ投与群は、投与後１１２日目、ＣＭＡＰ値を回復し、ｐＢＴ１４２ １２Ｕ／ｋｇ投与群は、それより１５日延長された１２７日目、ＣＭＡＰ値を回復させた（図７Ｃ）。以上の結果から、コアトックス対比で、組み換えボツリヌストキシンｐＢＴ１４２の効力と作用期間とが延長されることを確認した。
【0046】
ラット右側ふくらはぎ筋肉に、コアトックスと組み換えボツリヌストキシンｐＢＴ１４７とを、１．２，４，１２Ｕ／ｋｇ容量でもって、単回投与した後、ＤＡＳ評価結果、４Ｕ／ｋｇ容量でもって投与した後、５，７，１４，２１，２８，３５，４２日目、１２Ｕ／ｋｇ容量でもって投与した後、１４，２１，２８日目、ｐＢＴ１４７投与群において、コアトックス投与群対比で、有意的にＤＡＳ点数が増大した。コアトックス１．２Ｕ／ｋｇ投与群においては、２８日目、全ての個体が回復され、同じ容量のｐＢＴ１４７投与群においては、それより７日延長された３５日目、全ての個体が回復された。コアトックス４Ｕ／ｋｇ投与群においては、４２日目、全ての個体が回復され、同じ容量のｐＢＴ１４７投与群においては、それより２８日延長された７０日目、全ての個体が回復された。コアトックス１２Ｕ／ｋｇ投与群は、投与後８４日目、全ての個体が回復されたが、同じ容量のｐＢＴ１４７投与群の場合、それより２８日延長された１１２日目、全ての個体が回復された（図７Ｄ）。ＤＡＳ ＥＤ５０比較を介し、ｐＢＴ１４７が、コアトックスより、約１．５倍強い効力を示すことを確認した（図７Ｅ）。ＣＭＡＰ試験においては、全ての測定日において、ｐＢＴ１４７１２Ｕ／ｋｇ投与群が、コアトックス１２Ｕ／ｋｇ投与群対比で、有意的に低いＣＭＡＰ値を示すことを確認し、コアトックス１２Ｕ／ｋｇ投与群は、投与後１１２日目、ＣＭＡＰ回復が観察され、ｐＢＴ１４７１２Ｕ／ｋｇ投与群は、それより１４日延長された１２６日目、ＣＭＡＰ回復が観察された（図７Ｆ）。以上の結果から、コアトックス対比で、組み換えボツリヌストキシンｐＢＴ１４７の効力と作用期間とが延長されていることを確認した。
【0047】
試験例４：マウスにおいて、ドメインが置換された組み換えボツリヌストキシンの効力
メス５週齢ＣＤ１（ＩＣＲ）マウスを、（株）オリエントバイオから購入し、１週間の順化及び検疫の後、６週齢マウスを実験に使用した。飼料は、滅菌された実験動物用固形飼料（Ｒ４０－１０（SAFE（フランス）））を自由給餌し、食水は、上水道水を高温高圧滅菌して自由給餌した。順化期間、検疫期間及び実験期間の間、マウスは、温度２３±３℃、相対湿度５５±１５％、照明時間１２時間（午前８時～午後８時）、換気回数１５回／時間及び照度１５０～３００ルックスに設定された特定病原体不在条件下で飼育した。本研究は、（株）メディトックス動物実験倫理委員会の検討及び承認の後で行った。
メス５週齢ＣＤ１（ＩＣＲ）マウスを、（株）オリエントバイオから購入し、１週間の順化及び検疫の後、６週齢マウスを実験に使用した。飼料は、滅菌された実験動物用固形飼料（Ｒ４０－１０（SAFE（フランス）））を自由給餌し、食水は、上水道水を高温高圧滅菌して自由給餌した。順化期間、検疫期間及び実験期間の間、マウスは、温度２３±３℃、相対湿度５５±１５％、照明時間１２時間（午前８時～午後８時）、換気回数１５回／時間及び照度１５０～３００ルックスに設定された特定病原体不在条件下で飼育した。本研究は、（株）メディトックス動物実験倫理委員会の検討及び承認の後で行った。
【0048】
対照群として、コアトックス（ボツリヌストキシンタイプＡ、Lot Ｎｏ．：ＮＳＡ２００１５（メディトックス））１００単位（unit）を使用した。組み換えボツリヌストキシンとしてのｐＢＴ１４２は、２，８０３Ｕ／ｍＬ、組み換えボツリヌストキシンとしてのｐＢＴ１４７は、２，５３７Ｕ／ｍＬで製造して実験に使用した。各組み換えボツリヌストキシンの力価は、マウス力価試験法を介し、効力試験前に測定して導き出された力価値を基に試験を行った。プラセボ（偽薬投与群）は、組み換えボツリヌストキシンからボツリヌストキシンを除き、残り賦形剤成分は、等しく使用した。効力試験において、各試験物質の投与容量は、いずれも単位（unit）（Ｕ：ボツリヌストキシンの生物学的活性を示す値であり、１Ｕは、マウス腹腔投与によるマウス半数致死量）を基準に同一に投与した。
【0049】
コアトックスは、滅菌生理食塩水（３５Ｖ３ＡＦ３、大韓薬品工業）を使用して希釈し、組み換えボツリヌストキシンｐＢＴ１４２，ｐＢＴ１４７は、プラセボを利用し、６，２０，６０，２００Ｕ／ｍＬ濃度にそれぞれ希釈した。試験物質が投与された日を０日にし、注射麻酔剤（１００ｍｇ／ｋｇ塩酸ケタミン＋１０ｍｇ／ｋｇキシラジン）を利用してマウスに麻酔をかけた後、表３の群構成により、それぞれの試験物質をマウスの右側ふくらはぎ筋肉にハミルトン注射器を利用し、０．２ｍＬ／ｋｇで投与した。
【0050】
【表3】
【0051】
【表4】
【0052】
マウス右側ふくらはぎ筋肉に、コアトックスと、２種の組み換えボツリヌストキシンｐＢＴ１４２及び組み換えボツリヌストキシンｐＢＴ１４７とを、１．２，４，１２、４０Ｕ／ｋｇ容量でもって単回投与した後、ＤＡＳ評価した結果、ｐＢＴ１４７４Ｕ／ｋｇ投与群において、投与後、１４，２１，２８日目に、コアトックス対比で、有意的なＤＡＳ点数の増大を観察した。コアトックス１．２Ｕ／ｋｇ投与群においては、１４日目、全ての個体が回復され、同じ容量のｐＢＴ１４２投与群及びｐＢＴ１４７投与群においては、それより１４日延長された２８日目、全ての個体が回復された。そして、コアトックス４Ｕ／ｋｇ投与群は、投与後２８日目、全ての個体が回復されたが、同じ容量のｐＢＴ１４２投与群及びｐＢＴ１４７投与群の場合、それより１４日延長された４２日目、全ての個体が回復された。コアトックス１２Ｕ／ｋｇ投与群は、投与後４９日目、全ての個体が回復されたが、同じ容量のｐＢＴ１４２投与群及びｐＢＴ１４７投与群の場合、それより１４日延長された６３日目、全ての個体が回復された。そして、コアトックス４０Ｕ／ｋｇ投与群は、投与後７０日目、全ての個体が回復されたが、同じ容量のｐＢＴ１４２投与群及びｐＢＴ１４７投与群の場合、それぞれそれより１４日及び７日延長された８４日目及び７７日目、全ての個体が回復され（図８Ａ）、ＤＡＳ ＥＤ５０比較を介し、ｐＢＴ１４２が、コアトックスより約１．２倍、ｐＢＴ１４７が、コアトックスより約１．４倍強い効力を示した（図８Ｂ）。
【0053】
ＣＭＡＰ試験においては、ｐＢＴ１４２投与群及びｐＢＴ１４７１２Ｕ／ｋｇ投与群が、コアトックス１２Ｕ／ｋｇ投与群対比で、有意的に低いＣＭＡＰ値を示すことを確認し、コアトックス１２Ｕ／ｋｇ投与群は、投与後８４日目、ＣＭＡＰ回復が観察されたが、ｐＢＴ１４７１２Ｕ／ｋｇ投与群は、それより１４日延長された９８日目、ＣＭＡＰ回復が観察された（図８Ｃ）。以上のように、マウスにおいて遂行された以上の結果から、コアトックス対比で、組み換えボツリヌストキシンｐＢＴ１４２及び組み換えボツリヌストキシンｐＢＴ１４７の効力と作用期間とが延長された。
【0054】
異なって定義されない限り、本明細書に使用された技術的及び科学的な用語は、本開示が属する分野において、一般的に使用されるところと同一意味を有する。本開示の理解のために、下記定義が適用され、単数形で使用される用語は、複数形を含み、その逆も同様である。
【0055】
本願で使用される用語「タンパク質」，「ポリペプチド」は、アミノ酸残基の重合体、その変異体及び合成類似体を意味するために、本明細書において、相互交換自在に使用される。それら用語は、１以上のアミノ酸残基が合成された非天然発生アミノ酸、例えば、関連する天然発生アミノ酸の化学的な類似体を始めとし、天然発生アミノ酸重合体に適用される。それら用語は、またポリペプチドの翻訳後の変形、例えば、グリコシル化、リン酸化及びアセチル化を含む。
【0056】
用語「ボツリヌストキシン（ＢｏＮＴ：Botulinum toxin）」は、ボツリヌストキシンの任意のポリペプチドまたは断片を包括する。具体例において、該ボツリヌストキシンは、全長ボツリヌストキシン（full-length Botulinum toxin）またはボツリヌストキシン断片（Botulinum toxin derived fragments）を称する。具体例において、該ボツリヌストキシンは、ニューロンに進入し、神経伝達物質放出を抑制する全体的な細胞メカニズムを実行することができる。
【0057】
用語「ドメイン」は、与えられたタンパク質配列及び保存された部分であり、タンパク質鎖の残り部分と独立して進化して機能しながら存在しうる三次構造である。該ドメインは、独立して安定するために、該ドメインは、１つのタンパク質と、他のタンパク質との遺伝工学により、ドメインスワップ（domain swap）され、キメラタンパク質（chimera protein）を生成することができる。
【0058】
用語「パーセント同一性（percent identity）」は、ポリペプチド間のアミノ酸配列同一性程度を言う。例えば、第１アミノ酸配列が第２アミノ酸配列と同一である場合、該第１アミノ酸配列及び該第２アミノ酸配列は、１００％同一性を示す。２つのアミノ酸配列のパーセント同一性は、Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-68, 1990のアルゴリズムでもって、Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-77, 1993で変形されたアルゴリズムを使用しても決定される。そのようなアルゴリズムは、Altschul, et al. J. Mol. Biol. 215: 403-10, 1990のＮＢＬＡＳＴプログラム及びＸＢＬＡＳＴプログラム（version ２．０）に含まれて（incorporated）いる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＸＢＬＡＳＴプログラム（score＝５０、wordlength＝３）で行われ、関心タンパク質分子につき、相同性であるアミノ酸配列を得ることができる。２配列間にギャップがある場合、Gapped BLAST Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25(17): 3389-3402, 1997に記述されているように使用されうる。ＢＬＡＳＴプログラム及びGapped ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、各プログラム（例：ＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）のデフォルト変数が使用されうる。
【0059】
用語「組み換え」は、ＤＮＡ（deoxyribonucleic acid）やＲＮＡ（ribonucleic acid）のような遺伝子をなす要素が、解体過程と組み換え過程とにおいて、本来の配列とは異なって入れ替わる過程を示す用語である。分子生物学の実験を介し、ＤＮＡ切片を人為的に組み換えすることができる。そのように人為的に組み換えられたＤＮＡを、組み換えＤＮＡと言う。
【0060】
用語「変異体」は、すなわち、核酸配列またはアミノ酸配列における任意の変形、例えば、核酸またはアミノ酸の切断、付加、欠失、置換、及びそれらの任意の組み合わせを包括する。すなわち、「組み換えボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖ドメインの変異体」は、組み換えボツリヌス神経毒素タイプＡ軽鎖ドメインを構成する核酸またはアミノ酸の切断、付加、欠失、置換、及びそれらの任意の組み合わせを包括することができる。
【0061】
用語「置換」は、任意の配列位置において正常に見出される野生型残基以外の任意のアミノ酸を含むものでもある。そのような置換は、非極性（疎水性）アミノ酸、例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン及びプロリンによる代替でもある。該置換は、極性（親水性）アミノ酸、例えば、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン及びグルタミンによる代替でもある。該置換は、電気的に荷電されたアミノ酸、例えば、負電気的に荷電されたアミノ酸、例えば、アスパラギン酸及びグルタミン酸、並びに正電気的に荷電されたアミノ酸、例えば、リシン、アルギニン及びヒスチジンによる代替でもある。
【0062】
用語「野生型」は、自然に発生する一般的な種の表現型を言う。一般的に、該野生型は、非標準突然変異（mutant）対立遺伝子によって生成されたところとは反対に、遺伝子座（locus）における標準正常（normal）対立遺伝子の産物でもある。
【0063】
用語「個体」は、男性または女性でもある。該個体は、完全に発達された個体（例えば、成人）または発達過程を経ている個体（例えば、児童、乳児または胎児）でもある。該個体は、哺乳動物でもある。該哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、犬、猫、馬または牛でもあるが、それら例に制限するものではない。
【0064】
最近市販中であるボツリヌストキシン製剤は、ほとんど有効成分が、ボツリヌストキシンタイプＡ１である製剤であり、マイオブロック（Myobloc）の場合には、ボツリヌストキシンタイプＢ１を有効成分として使用している。ボツリヌストキシンタイプＡ１製剤の効力持続期間は、平均約３ヵ月ほどであり、ボツリヌストキシンタイプＢ１製剤の場合には、さらに短いと知られている。筋肉内注射で投与しなければならないボツリヌストキシン製剤の特性上、患者の便宜性側面において、市販中の製剤より長い持続性を有する製品の開発が必要である。
【0065】
【0066】
ボツリヌストキシンタイプＡ１軽鎖の第１ドメイン（配列番号１）、及びボツリヌストキシンタイプＡ４軽鎖の第１ドメイン（配列番号５）は、主に基質であるＳＮＡＰ２５と相互結合する部位として、α－exositeが含まれた部分である。ボツリヌストキシンタイプＡ１及びＡ４の軽鎖の第１ドメインは、１番位置のアミノ酸、ないし９０～１５０番位置のアミノ酸（例えば、９０番，９５番，１００番，１０５番，１１０番，１１５番，１２０番，１２５番，１３０番，１３５番，１４０番，１４５番及び１５０番位置のアミノ酸）でもある。
【0067】
ボツリヌストキシンタイプＡ１軽鎖の第２ドメイン（配列番号２）、及びボツリヌストキシンタイプＡ４軽鎖の第２ドメイン（配列番号６）は、軽鎖の酵素活性に主に関与する部分であり、１７０ループ（loop）を含み、補助因子である亜鉛と結合する部分である。ボツリヌストキシンタイプＡ１及びＡ４の軽鎖の第２ドメインは、９１～１５１番位置のアミノ酸（例えば、９１番，９６番，１０１番，１０６番，１１１番，１１６番，１２１番，１２６番，１３１番，１３６番，１４１番，１４６番及び１５１番位置のアミノ酸）、ないし２１０～２７０番位置のアミノ酸（例えば、２１０番，２１５番，２２０番，２２５番，２３０番，２３５番，２４０番，２４５番，２５０番，２５５番，２６０番，２６５番及び２７０番位置のアミノ酸）でもある。
【0068】
ボツリヌストキシンタイプＡ１軽鎖の第３ドメイン（配列番号３）、及びボツリヌストキシンタイプＡ４軽鎖の第３ドメイン（配列番号７）は、基質結合を安定化させる２５０ループ（loop）と３７０ループ（loop）とを含んでおり、基質結合部位であるα－exosite、β－exositeにいずれも関与する部位である。ボツリヌストキシンタイプＡ１及びＡ４の軽鎖の第３ドメインは、２１１～２７１番アミノ酸（例えば、２１１番，２１６番，２２１番，２２６番，２３１番，２３６番，２４１番，２４６番，２５１番，２５６番，２６１番，２６６回及び２７１番アミノ酸）、ないし３８６～４４６番アミノ酸（例えば、３８６番，３９１番，３９６番，４０１番，４０６番，４１１番，４１６番，４２１番，４２６番，４３１番，４３６番，４４１番及び４４６番アミノ酸）でもある。
【0069】
ボツリヌストキシンタイプＡ１軽鎖の第４ドメイン（配列番号４）、及びボツリヌストキシンタイプＡ４軽鎖の第４ドメイン（配列番号８）は、ボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖の構造的柔軟性に関与する部分である。ボツリヌストキシンタイプＡ１及びＡ４の軽鎖の第４ドメインは、３６２～４２５番アミノ酸（例えば、３６２番，３６７番，３７２番，３７７番，３８２番，３８７番，３９２番，３９７番，４０２番，４０７番，４１２番，４１７番，４２２番及び４２５番アミノ酸）、ないし４１０～４４８番アミノ酸（例えば、４１０番，４１４番，４１７番，４２０番，４２５番，４３０番，４３５番，４４０番，４４５番及び４４８番アミノ酸）でもある。
【0070】
本開示の一態様によれば、ボツリヌストキシンタイプＡ４ではない、ボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖の第１，第２，第３及び第４ドメインにおいて、第３ドメインの配列が、ボツリヌストキシンタイプＡ４軽鎖の第３ドメイン、またはその変異体の配列で置換されたものである組み換えボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖を提供する。
【0071】
一具体例において、前記ボツリヌストキシンタイプＡ４ではない、ボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖は、ボツリヌストキシンタイプＡ１軽鎖（配列番号９）、ボツリヌストキシンタイプＡ２軽鎖（配列番号１０）、ボツリヌストキシンタイプＡ３軽鎖（配列番号１１）、ボツリヌストキシンタイプＡ５軽鎖（配列番号１３）、ボツリヌストキシンタイプＡ６軽鎖（配列番号１４）、ボツリヌストキシンタイプＡ７軽鎖（配列番号１５）またはボツリヌストキシンタイプＡ８軽鎖（配列番号１６）でもある。例えば、ボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖は、ボツリヌストキシンタイプＡ１軽鎖でもある。
【0072】
一具体例において、前記ボツリヌストキシンタイプＡ４軽鎖の第３ドメインは、配列番号７の配列でもある。他の具体例において、ボツリヌストキシンタイプＡ４軽鎖の第３ドメインの変異体は、ボツリヌストキシンタイプＡ４軽鎖第３ドメインと同一基質結合部位であるα－exosite、β－exositeにいずれも関与し、配列番号３の配列と、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0073】
本開示の他の態様によれば、前記組み換えボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖の第１，第２，第３及び第４ドメインにおいて、第４ドメインの配列が、ボツリヌストキシンタイプＡ４軽鎖の第４ドメイン、またはその変異体の配列でさらに置換されたものである組み換えボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖を提供する。
【0074】
一具体例において、前記ボツリヌストキシンタイプＡ４軽鎖第４ドメインは、配列番号８の配列でもある。他の具体例において、ボツリヌストキシンタイプＡ４軽鎖の第４ドメインの変異体は、ボツリヌストキシンタイプＡ４軽鎖第４ドメインと同一くボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖の構造的柔軟性に関与し、配列番号４と、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0075】
本開示のさらに他の態様によれば、前記組み換えボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖、及びボツリヌストキシン重鎖を含む組み換えボツリヌストキシンを提供する。
【0076】
一具体例において、前記ボツリヌストキシン重鎖は、ボツリヌストキシンタイプＡ重鎖、ボツリヌストキシンタイプＢ重鎖、ボツリヌストキシンタイプＣ重鎖、ボツリヌストキシンタイプＤ重鎖、ボツリヌストキシンタイプＥ重鎖、ボツリヌストキシンタイプＦ重鎖、またはボツリヌストキシンタイプＧ重鎖でもある。
【0077】
一具体例において、前記ボツリヌストキシン重鎖は、ボツリヌストキシンタイプＡ重鎖でもある。例えば、ボツリヌストキシン重鎖は、ボツリヌストキシンタイプＡ１重鎖、ボツリヌストキシンタイプＡ２重鎖、ボツリヌストキシンタイプＡ３重鎖、ボツリヌストキシンタイプＡ４重鎖、ボツリヌストキシンタイプＡ５重鎖、ボツリヌストキシンタイプＡ６重鎖、ボツリヌストキシンタイプＡ７重鎖またはボツリヌストキシンタイプＡ８重鎖でもある。例えば、該ボツリヌストキシン重鎖は、ボツリヌストキシンタイプＡ１重鎖（配列番号１７）でもある。
【0078】
一具体例において、前記組み換えボツリヌストキシンは、組み換えボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖、及びボツリヌストキシン重鎖がジスルフィド結合によって連結されているものである組み換えボツリヌストキシンでもある。例えば、組み換えボツリヌストキシンは、ボツリヌストキシンタイプ間において、高程度のアミノ酸配列同一性を有する約１５０ｋＤａ重量の比較的不活性である単一ポリペプチド鎖であり、クロストリジウムバクテリアで生産される。該単一ポリペプチドは、次に、およそ１００ｋＤａ重鎖及び５０ｋＤａ軽鎖に分解され、該重鎖及び該軽鎖は、ジスルフィド結合を形成することができる。
【0079】
本開示のさらに他の態様によれば、前記組み換えボツリヌストキシン、及び薬剤学的に許容される賦形剤または添加剤を含む組成物を提供する。
【0080】
一具体例において、薬剤学的に許容される賦形剤または添加剤は、安定化剤、イオン化合物（ionic compound）、界面活性剤、緩衝剤、凍結乾燥保護剤、またはそれらの組み合わせ、例えば、アミノ酸（例えば、メチオニン）、塩（例えば、ＮａＣｌ）、緩衝液、非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート（例：ポリソルベート２０））、糖（例えば、白糖のようなジサッカライド）、糖アルコール（例えば、ソルビトール）、またはそれらの組み合わせでもある。
【0081】
一具体例において、前記組成物は、アルブミンまたは動物由来成分を含まないものでもある。例えば、前記アルブミンまたは動物由来成分を含まない組成物は、ＷＯ２００９－００８５９５Ａ１またはＷＯ２０１２－１３４２４０Ａ２に開示されているものを含み、前記特許の内容は、その全体として、本明細書に参照として引用される。
【0082】
一具体例において、前記組成物は、固体製剤または液体製剤、例えば、凍結乾燥粉末、液状またはプレフィルドシリンジ（pre-filled syringe）製剤のようないかなる形態にも製剤化されうる。
【0083】
本開示のさらに他の態様によれば、前記組み換えボツリヌストキシン、及び薬剤学的に許容される賦形剤または添加剤を含む組成物を個体に投与し、疾患を改善させたり治療したりするための用途を提供する。
【0084】
一具体例において、前記組み換えボツリヌストキシン、薬剤学的に許容される賦形剤または添加剤を含む組成物を個体に投与し、シワ、角ばり顎、エラ張り顎、傷、皮膚軟化、傷痕、にきび、毛穴、弾力またはケロイドを改善させるための用途でもある。
【0085】
一具体例において、前記組み換えボツリヌストキシン、薬剤学的に許容される賦形剤または添加剤を含む組成物を個体に投与し、顔面痙攣、瞼痙攣、斜頸、眼瞼痙攣、頸部筋緊張異常症、咽頭中央部筋緊張異常症、痙攣性発声障害、偏頭痛、肛門掻痒症または多汗症を治療するための用途でもある。
【0086】
一具体例において、前記組成物は、経皮、皮下、または筋肉内の投与によっても成り立つことができる。具体例において、前記組成物を、筋肉、または筋肉の群に局所的に投与することによっても成り立つ。具体例において、額しわ、皮膚しわの低減は、前記組成物を、当該しわの経皮または皮下に投与することによってもなる。
【0087】
本開示のさらに他の態様によれば、前記組み換えボツリヌストキシン、及び薬剤学的に許容される賦形剤または添加剤をさらに含む組成物を個体に投与し、疾患を改善させたり治療したりするための方法を提供する。一具体例において、前記組成物を個体に投与する段階を含む、シワ、角ばり顎、エラ張り顎、傷、皮膚軟化、傷痕、にきび、毛穴、弾力またはケロイドを改善させるための方法でもある。
【0088】
一具体例において、前記組成物を個体に投与する段階を含む、顔面痙攣、瞼痙攣、斜頸、眼瞼痙攣、頸部筋緊張異常症、咽頭中央部筋緊張異常症、痙攣性発声障害、偏頭痛、肛門掻痒症または多汗症を治療するための方法でもある。
【0089】
本開示のさらに他の態様によれば、ボツリヌストキシンタイプＡ４ではない、ボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖の第１，第２，第３及び第４ドメインにおいて、第３ドメインの配列が、ボツリヌストキシンタイプＡ４の第３ドメイン、またはその変異体の配列で置換される段階を含む、野生型ボツリヌストキシンタイプＡ１軽鎖対比で増大された効力または半減期を有する組み換えボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖を製造する方法を提供する。
【0090】
一具体例において、ボツリヌストキシンタイプＡ１軽鎖の第３ドメインの配列が、ボツリヌストキシンタイプＡ４の第３ドメイン、またはその変異体の配列で置換される段階を含む、野生型ボツリヌストキシンタイプＡ１軽鎖対比で増大された効力または半減期を有する組み換えボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖を製造する方法でもある。
【0091】
例えば、ボツリヌストキシンタイプＡ１軽鎖とボツリヌストキシンタイプＡ４軽鎖の遺伝子の４個ドメインを互いに置換する段階と、野生型ボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖、及びドメインが置換された組み換えボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖を含む遺伝子をそれぞれクローニングし、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に導入した後、ドメイン置換された組み換えボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖の発現を誘導する段階と、そうのうち、ボツリヌストキシンタイプＡ１軽鎖の第３ドメインの配列が、ボツリヌストキシンタイプＡ４の第３ドメイン、またはその変異体の配列で置換された組み換えボツリヌストキシンＡ軽鎖（ｐＢＴ１０３（配列番号１９））を製造する段階と、を含む、野生型ボツリヌストキシン対比で増大された効力または半減期を有する組み換えボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖を製造する方法でもある。
【0092】
本開示のさらに他の態様によれば、前記組み換えボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖の第１，第２，第３及び第４ドメインにおいて、第４ドメインの配列が、ボツリヌストキシンタイプＡ４の第４ドメイン、またはその変異体の配列でさらに置換される段階を含む、野生型ボツリヌストキシンタイプＡ１対比で増大された効力または半減期を有する組み換えボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖を製造する方法を提供する。
【0093】
一具体例において、前記組み換えボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖の第４ドメインの配列が、ボツリヌストキシンタイプＡ４の第４ドメイン、またはその変異体の配列でさらに置換される段階を含む、野生型ボツリヌストキシンタイプＡ１対比で増大された効力または半減期を有する組み換えボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖を製造する方法でもある。
【0094】
例えば、ボツリヌストキシンタイプＡ１軽鎖とボツリヌストキシンタイプＡ４軽鎖との遺伝子の４個ドメインを互いに置換する段階と、野生型ボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖、及びドメインが置換された組み換えボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖を含む遺伝子をそれぞれクローニングし、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に導入した後、ドメイン置換された組み換えボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖の発現を誘導する段階と、そのうち、ボツリヌストキシンタイプＡ１軽鎖の第３ドメイン、及びボツリヌストキシンタイプＡ１軽鎖の第４ドメインの配列が、ボツリヌストキシンタイプＡ４の第３ドメイン，第４ドメインまたはその変異体の配列で置換された組み換えボツリヌストキシンＡ軽鎖（ｐＢＴ１０４（配列番号２０））を製造する段階を含む、野生型ボツリヌストキシンタイプＡ１対比で増大された効力または半減期を有する組み換えボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖を製造する方法でもある。
【0095】
本開示のさらに他の態様は、前記組み換えボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖をコーディングするポリヌクレオシド、及びボツリヌストキシン重鎖をコーディングするポリヌクレオシドを含む核酸、またはそれを含むベクターを含む細胞を提供する。前記細胞は、前記組み換えボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖、及びボツリヌストキシン重鎖を含む組み換えボツリヌストキシンを発現するものでもある。
【0096】
本開示のさらに他の態様によれば、前記組み換えボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖をコーディングするポリヌクレオシド、及びボツリヌストキシン重鎖をコーディングするポリヌクレオシドを含む核酸、またはそれを含むベクターを含む細胞を培養する段階を含む、野生型ボツリヌストキシン対比で増大された効力または半減期を有する組み換えボツリヌストキシンを製造する方法を提供する。前記方法は、培養物から組み換えボツリヌストキシンを分離する段階をさらに含むものでもある。
【0097】
一具体例において、ボツリヌストキシン重鎖は、ボツリヌストキシンタイプＡ１重鎖、ボツリヌストキシンタイプＡ２重鎖、ボツリヌストキシンタイプＡ３重鎖、ボツリヌストキシンタイプＡ４重鎖、ボツリヌストキシンタイプＡ５重鎖、ボツリヌストキシンタイプＡ６重鎖、ボツリヌストキシンタイプＡ７重鎖またはボツリヌストキシンタイプＡ８重鎖でもある。具体例において、該ボツリヌストキシン重鎖は、ボツリヌストキシンタイプＡ１重鎖（配列番号１７）でもある。
【0098】
例えば、ドメイン置換された組み換えボツリヌストキシンタイプＡ軽鎖（ｐＢＴ１０３、ｐＢＴ１０４）及びボツリヌストキシンタイプＡ１重鎖を含む全長組み換えボツリヌストキシン遺伝子（ｐＢＴ１４２、ｐＢＴ１４７）をクローニングする段階と、クローニングされた毒素遺伝子を不活性化させた無毒化菌株に導入し、毒素遺伝子が導入された不活性化された無毒化菌株を培養し、ドメインが置換されたボツリヌストキシンを製造する［Bradshaw et al. 2010, Pellett et al. 2016］段階と、培養物から複合体成分を有していない１５０ｋＤａ形態の組み換え毒素を精製して分離する段階と、を含む、野生型ボツリヌストキシン対比で増大された効力または半減期を有する組み換えボツリヌストキシンを製造する方法でもある。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図2A】
【図2B】
【図3】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図6A】
【図6B】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図7D】
【図7E】
【図7F】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【配列表】
【国際調査報告】