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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-07-09
(54)【発明の名称】Ｃ２０テルペノイドアルコールの組換え製造
(51)【国際特許分類】
C12P 7/02 20060101AFI20240702BHJP
C12N 15/54 20060101ALI20240702BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20240702BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20240702BHJP
C12N 15/64 20060101ALI20240702BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240702BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20240702BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20240702BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240702BHJP
A01K 67/0275 20240101ALI20240702BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20240702BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20240702BHJP
C12N 9/12 20060101ALN20240702BHJP
【ＦＩ】
C12P7/02 ZNA
C12N15/54
C12N15/12
C12N15/62 Z
C12N15/64 Z
C12N5/10
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
A01K67/0275
C12P21/02 A
C07K19/00
C12N9/12
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024500159
(86)(22)【出願日】2022-06-30
(85)【翻訳文提出日】2024-02-20
(86)【国際出願番号】 EP2022068104
(87)【国際公開番号】W WO2023280677
(87)【国際公開日】2023-01-12
(31)【優先権主張番号】21184067.3
(32)【優先日】2021-07-06
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】520064986
【氏名又は名称】アイソバイオニクス ベー．フェー．
(74)【代理人】
【識別番号】110002572
【氏名又は名称】弁理士法人平木国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ビークワイルダー，マルティヌス ユリウス
(72)【発明者】
【氏名】スタイルズ，マシュー クイン
(72)【発明者】
【氏名】ボッシュ，ヘンドリック ヤン
(72)【発明者】
【氏名】フォス，アウリン ミンネルト
(72)【発明者】
【氏名】ファン ハウエリンゲン，アデル マルガレータ マリア リドゥイナ
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AC13
4B064AG27
4B064AG30
4B064CA19
4B064CC24
4B064CD15
4B064DA20
4B065AA01X
4B065AA57X
4B065AA72X
4B065AA83X
4B065AA88X
4B065AA90X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065BB40
4B065CA24
4B065CA27
4B065CA51
4B065CA60
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA41
4H045CA11
4H045CA40
4H045DA83
4H045DA89
4H045EA61
4H045FA74
(57)【要約】
ゲラニルゲラニルピロリン酸をコパリル二リン酸（ＣＰＰ）又はラブダ－１３－エン－８－オール二リン酸（ＬＰＰ）に変換する工程と、ＣＰＰ又はＬＰＰを少なくとも１つのＣ２０テルペノイドアルコールに変換する工程とを含む、少なくとも１つのＣ２０テルペノイドアルコールを製造する方法であって、前記変換は、ＣＰＰをマノオールに、ＬＰＰをスクラレオールに、且つ／又はＬＰＰをアビエノールに変換することができるジテルペンアルコールシンターゼ活性を示すポリペプチドによって行われ、前記ポリペプチドは、特許請求の範囲に規定されるようなアミノ酸配列を含む、方法が開示される。本発明は、ジテルペンアルコールシンターゼ活性を示す上述のポリペプチド及び前記ポリペプチドを含む融合タンパク質、それをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むベクター又は遺伝子構築物、前記ベクター又は遺伝子構築物を含む宿主細胞、ポリヌクレオチド、ベクター、遺伝子構築物又は宿主細胞を含む非ヒトトランスジェニック生物並びに少なくとも１つのＣ２０テルペノイドアルコールを製造するためのその使用に更に関する。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
少なくとも１つのＣ２０テルペノイドアルコールを製造する方法であって、ａ）ゲラニルゲラニルピロリン酸をコパリル二リン酸（ＣＰＰ）又はラブダ－１３－エン－８－オール二リン酸（ＬＰＰ）に変換する工程；及び
ｂ）ＣＰＰ又はＬＰＰを少なくとも１つのＣ２０テルペノイドアルコールに変換する工程であって、前記変換は、ジテルペンアルコールシンターゼ活性を示すポリペプチドによって行われ、前記ジテルペンアルコールシンターゼ活性は、コパリル二リン酸（ＣＰＰ）をマノオールに、ラブダ－１３－エン－８－オール二リン酸（ＬＰＰ）をスクラレオールに、且つ／又はＬＰＰをアビエノールに変換することができる、工程
を含み、前記ポリペプチドは、
ａ）配列番号３～１０又は配列番号３４のいずれか１つに示されるようなアミノ酸配列；
ｂ）配列番号３～１０又は配列番号３４のいずれか１つに示されるような前記アミノ酸配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列；
ｃ）配列番号１、２、１６、１７、１８又は３５に示されるような核酸配列によってコードされるアミノ酸配列；
ｄ）配列番号１、２、１６、１７、１８又は３５に示されるような前記核酸配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一である核酸配列によってコードされるアミノ酸配列；及び
ｅ）（ａ）～（ｄ）のいずれか１つのフラグメントであって、コパリル二リン酸（ＣＰＰ）をマノオールに、ラブダ－１３－エン－８－オール二リン酸（ＬＰＰ）をスクラレオールに、且つ／又はＬＰＰをアビエノールに変換することができるジテルペンアルコールシンターゼ活性を示すポリペプチドをコードするフラグメントのアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、方法。
【請求項2】
ジテルペンアルコールシンターゼ活性を示す前記ポリペプチドは、ＣＰＰをマノオールに、且つＬＰＰをスクラレオールに変換することができ、及び好ましくは、ａ）配列番号４、６、７、９、１０又は３４に示されるようなアミノ酸配列；
ｂ）配列番号４、６、７、９、１０又は３４に示されるような前記アミノ酸配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列；
ｃ）配列番号２、１６、１７又は３５に示されるような核酸配列によってコードされるアミノ酸配列；
ｄ）配列番号２、１６、１７又は３５に示されるような前記核酸配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一である核酸配列によってコードされるアミノ酸配列；及び
ｅ）（ａ）～（ｄ）のいずれか１つのフラグメントであって、ＣＰＰをマノオールに、且つＬＰＰをスクラレオールに変換することができるジテルペンアルコールシンターゼ活性を示すポリペプチドをコードするフラグメントのアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
ジテルペンアルコールシンターゼ活性を示す前記ポリペプチドは、ＬＰＰをアビエノールに変換することができ、及び好ましくは、ａ）配列番号３、５又は８に示されるようなアミノ酸配列；
ｂ）配列番号３、５又は８に示されるような前記アミノ酸配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列；
ｃ）配列番号１又は１８に示されるような核酸配列によってコードされるアミノ酸配列；
ｄ）配列番号１又は１８に示されるような前記核酸配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一である核酸配列によってコードされるアミノ酸配列；及び
ｅ）（ａ）～（ｄ）のいずれか１つのフラグメントであって、ＬＰＰをアビエノールに変換することができるジテルペンアルコールシンターゼ活性を示すポリペプチドをコードするフラグメントのアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
工程ａ）の前記変換は、ゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰ）をＬＰＰ及び／又はＣＰＰに変換するＩＩ型ジテルペンシンターゼの酵素活性を示す更なるポリペプチドによって行われる、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記工程ｂ）又は前記工程ａ）及びｂ）は、宿主細胞又は非ヒトトランスジェニック生物において行われる、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
宿主細胞又は非ヒトトランスジェニック生物並びに請求項１～５のいずれか一項に記載の方法によって得ることができる前記少なくとも１つのＣ２０テルペノイドアルコール、好ましくはマノオール、スクラレオール及び／又はアビエノールを含む組成物であって、前記宿主細胞又は非ヒトトランスジェニック生物は、組換えにより、ａ）配列番号３～１０又は配列番号３４のいずれか１つに示されるようなアミノ酸配列；
ｂ）配列番号３～１０又は配列番号３４のいずれか１つに示されるような前記アミノ酸配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列；
ｃ）配列番号１、２、１６、１７、１８又は３５に示されるような核酸配列によってコードされるアミノ酸配列；
ｄ）配列番号１、２、１６、１７、１８又は３５に示されるような前記核酸配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一である核酸配列によってコードされるアミノ酸配列；及び
ｅ）（ａ）～（ｄ）のいずれか１つのフラグメントであって、コパリル二リン酸（ＣＰＰ）をマノオールに、ラブダ－１３－エン－８－オール二リン酸（ＬＰＰ）をスクラレオールに、且つ／又はＬＰＰをアビエノールに変換することができるジテルペンアルコールシンターゼ活性を示すポリペプチドをコードするフラグメントのアミノ酸配列
を有する、ジテルペンアルコールシンターゼ活性を示す少なくとも１つのポリペプチドを含む、組成物。
【請求項7】
ジテルペンアルコールシンターゼ活性を示すポリペプチドであって、前記ジテルペンアルコールシンターゼ活性は、コパリル二リン酸（ＣＰＰ）をマノオールに、ラブダ－１３－エン－８－オール二リン酸（ＬＰＰ）をスクラレオールに、且つ／又はＬＰＰをアビエノールに変換することができ、前記ポリペプチドは、ａ）配列番号３～１０又は配列番号３４のいずれか１つに示されるようなアミノ酸配列；
ｂ）配列番号３～１０又は配列番号３４のいずれか１つに示されるような前記アミノ酸配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列；
ｃ）配列番号１、２、１６、１７、１８又は３５に示されるような核酸配列によってコードされるアミノ酸配列；
ｄ）配列番号１、２、１６、１７、１８又は３５に示されるような前記核酸配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一である核酸配列によってコードされるアミノ酸配列；及び
ｅ）（ａ）～（ｄ）のいずれか１つのフラグメントであって、コパリル二リン酸（ＣＰＰ）をマノオールに、ラブダ－１３－エン－８－オール二リン酸（ＬＰＰ）をスクラレオールに、且つ／又はＬＰＰをアビエノールに変換することができるジテルペンアルコールシンターゼ活性を示すポリペプチドをコードするフラグメントのアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、ポリペプチド。
【請求項8】
前記ジテルペンアルコールシンターゼ活性は、ＣＰＰをマノオールに、且つＬＰＰをスクラレオールに変換することができ、及び好ましくは、ａ）配列番号４、６、７、９、１０又は３４に示されるようなアミノ酸配列；
ｂ）配列番号４、６、７、９、１０又は３４に示されるような前記アミノ酸配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列；
ｃ）配列番号２、１６、１７又は３５に示されるような核酸配列によってコードされるアミノ酸配列；
ｄ）配列番号２、１６、１７又は３５に示されるような前記核酸配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一である核酸配列によってコードされるアミノ酸配列；及び
ｅ）（ａ）～（ｄ）のいずれか１つのフラグメントであって、ＣＰＰをマノオールに、且つＬＰＰをスクラレオールに変換することができるジテルペンアルコールシンターゼ活性を示すポリペプチドをコードするフラグメントのアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項７に記載のポリペプチド。
【請求項9】
前記ジテルペンアルコールシンターゼ活性は、ＬＰＰをアビエノールに変換することができ、及び好ましくは、ａ）配列番号３、５又は８に示されるようなアミノ酸配列；
ｂ）配列番号３、５又は８に示されるような前記アミノ酸配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列；
ｃ）配列番号１又は１８に示されるような核酸配列によってコードされるアミノ酸配列；
ｄ）配列番号１又は１８に示されるような前記核酸配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一である核酸配列によってコードされるアミノ酸配列；及び
ｅ）（ａ）～（ｄ）のいずれか１つのフラグメントであって、ＬＰＰをアビエノールに変換することができるジテルペンアルコールシンターゼ活性を示すポリペプチドをコードするフラグメントのアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項７に記載のポリペプチド。
【請求項10】
請求項７～９のいずれか一項に記載のポリペプチドと、（ｉ）好ましくはゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰ）をＬＰＰ及び／若しくはＣＰＰに変換するＩＩ型ジテルペンシンターゼの酵素活性を示すか、（ｉｉ）マルトース結合特性を有するか、又は（ｉｉｉ）チオレドキシン若しくはチオレドキシン融合タンパク質である少なくとも１つの更なるポリペプチドとを含む融合ポリペプチド。
【請求項11】
請求項７～９のいずれか一項に記載のポリペプチド若しくは請求項１０に記載の融合ポリペプチド又はその逆相補配列若しくは相補配列をコードするポリヌクレオチド。
【請求項12】
請求項１１に記載のポリヌクレオチドを含むベクター又は遺伝子構築物。
【請求項13】
請求項１２に記載のベクター又は遺伝子構築物を含む宿主細胞。
【請求項14】
請求項１１に記載のポリヌクレオチド、請求項１２に記載のベクター若しくは遺伝子構築物又は請求項１３に記載の宿主細胞を含むトランスジェニック非ヒト生物。
【請求項15】
少なくとも１つのＣ２０テルペノイドアルコール、好ましくはアビエノール、マノオール及び／又はスクラレオールを製造するための、請求項７～９のいずれか一項に記載のポリペプチド若しくは請求項１０に記載の融合ポリペプチド、請求項１１に記載のポリヌクレオチド、請求項１２に記載のベクター若しくは遺伝子構築物、請求項１３に記載の宿主細胞又は請求項１４に記載の非ヒトトランスジェニック生物の使用。
【請求項16】
ジテルペンアルコールシンターゼ活性を有するバリアントポリペプチドを調製する方法であって、ａ）請求項１１に記載の核酸を選択する工程；
ｂ）前記選択された核酸を改変して、少なくとも１つの変異核酸を得る工程；
ｃ）宿主細胞又は単細胞生物を前記変異核酸配列で形質転換して、前記変異核酸配列によってコードされるポリペプチドを発現させる工程；
ｄ）少なくとも１つの改変された特性及びジテルペンアルコールシンターゼ活性について前記ポリペプチドをスクリーニングする工程；及び
ｅ）任意選択により、前記ポリペプチドが所望のバリアントジテルペンアルコールシンターゼ活性を有しない場合、所望のバリアントジテルペンアルコールシンターゼ活性を有するポリペプチドが得られるまで前記プロセス工程（ａ）～（ｄ）を繰り返す工程；
ｆ）任意選択により、所望のバリアントジテルペンアルコールシンターゼ活性を有するポリペプチドが工程（ｄ）で同定された場合、工程（ｃ）で得られた前記対応する変異核酸を単離する工程
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、Ｃ２０テルペノイドアルコールの組換え製造の分野に関する。特に、本発明は、ゲラニルゲラニルピロリン酸をコパリル二リン酸（ＣＰＰ）又はラブダ－１３－エン－８－オール二リン酸（ＬＰＰ）に変換する工程と、ＣＰＰ又はＬＰＰを少なくとも１つのＣ２０テルペノイドアルコールに変換する工程とを含む、少なくとも１つのＣ２０テルペノイドアルコールを製造する方法であって、前記変換は、ジテルペンアルコールシンターゼ活性を示すポリペプチドによって行われ、前記ジテルペンアルコールシンターゼ活性は、コパリル二リン酸（ＣＰＰ）をマノオールに、ラブダ－１３－エン－８－オール二リン酸（ＬＰＰ）をスクラレオールに、且つ／又はＬＰＰをアビエノールに変換することができ、前記ポリペプチドは、ａ）配列番号３～７又は３４のいずれか１つに示されるようなアミノ酸配列；ｂ）配列番号３～７又は３４のいずれか１つに示されるようなアミノ酸配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列；ｃ）配列番号１、又は２、又は３５に示されるような核酸配列によってコードされるアミノ酸配列；ｄ）配列番号１、又は２、又は３５に示されるような核酸配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一である核酸配列によってコードされるアミノ酸配列；及びｅ）（ａ）～（ｄ）のいずれか１つのフラグメントであって、コパリル二リン酸（ＣＰＰ）をマノオールに、ラブダ－１３－エン－８－オール二リン酸（ＬＰＰ）をスクラレオールに、且つ／又はＬＰＰをアビエノールに変換することができるジテルペンアルコールシンターゼ活性を示すポリペプチドをコードするフラグメントのアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、方法に関する。本発明は、ジテルペンアルコールシンターゼ活性を示す上述のポリペプチド及び前記ポリペプチドを含む融合タンパク質、それをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むベクター又は遺伝子構築物、前記ベクター又は遺伝子構築物を含む宿主細胞、ポリヌクレオチド、ベクター、遺伝子構築物又は宿主細胞を含む非ヒトトランスジェニック生物に更に関する。更に、本発明は、少なくとも１つのＣ２０テルペノイドアルコール、好ましくはアビエノール、マノオール及び／又はスクラレオールを製造するための、前記ポリペプチド、融合ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター若しくは遺伝子構築物、宿主細胞又は非ヒトトランスジェニック生物の使用を企図する。更に、本発明は、少なくとも１つのＣ２０テルペノイドアルコール、好ましくはアビエノール、マノオール及び／又はスクラレオールを製造するためのキットを包含する。
【背景技術】
【0002】
スクラレオール（（＋）－スクラレオール）、アビエノール（Ｚ－アビエノール）及びマノオール（（＋）－マノオール）は、ラブダンジテルペンのメンバーである。ジテルペンは、Ｃ２０テルペンであり、植物及び微生物で天然に生じる。これらのラブダンジテルペン分子は、フレグランス産業に適用されるアンバーノートに変換することができるため、商品価値がある。アンバーノートの例としては、アンバーケタール、マノオールケトン、アンブロキシド及びスクラレオリドが挙げられる。ジテルペン分子をアンバーノートに変換するために、いくつかの化学経路又は生体触媒経路が開示されている。スクラレオールは、アンブロキシド、例えばＢａｒｒｅｒｏ ｅｔ ａｌ．１９９３，ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ４９，１０４０５－１０４１２；Ｆａｒｂｏｏｄの欧州特許第０ ２０４ ００９ Ｂ１号明細書）又はスクラレオリド（Ｆａｒｂｏｏｄの欧州特許出願公開第０ ４１９ ０２６ Ａ１号明細書）に変換することができる。マノオールは、アンバーケタール、例えば米国特許第７，２９４，４９２号明細書（クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ））又はマノオールケトン（欧州特許第１ ６８８ ５０１ Ｂ１号明細書）に変換することができ、アビエノールは、アンブロキシド（例えば、Ｂａｒｒｅｒｏ ｅｔ ａｌ．１９９３，ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ４９，１０４０５－１０４１２）又はスクラレオリド（米国特許第５，５２５，７２８号明細書）に変換することができる。
【0003】
これらの化合物の植物供給源としては、スクラレオールではサルビア・スクラレア（Ｓａｌｖｉａ ｓｃｌａｒｅａ）及びニコチアナ・グルチノサ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｇｌｕｔｉｎｏｓａ）、マノオールではハロカルプス・ビフォルミス（Ｈａｌｏｃａｒｐｕｓ ｂｉｆｏｒｍｉｓ）（ピンクパイン又はイエローパイン）並びにアビエノールではバルサム・ファー（Ｂａｌｓａｍ ｆｉｒ）（アビエス・バルサメア（Ａｂｉｅｓ ｂａｌｓａｍｅａ））が挙げられる。
【0004】
ジテルペンを生成するテルペンシクラーゼをコードする遺伝子は、広範に記載されており（Ｚｅｒｂｅ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２０１５ Ｊｕｌ；３３（７）：４１９－２８．）、これらの化合物の微生物生成が実証されている（例えば、Ｓｃｈａｌｋ Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１２，１３４，１８９００－１８９０３）。ジテルペンの生合成は、ゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ）から開始される。ＧＧＰＰは、カロテノイド、植物ホルモンなどの前駆体として自然界に広く存在する。ＧＧＰＰシンターゼは、広く知られており、例えばシネココッカス属種（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）ＰＣＣ ７００２、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、メンタ・ピペリタ（Ｍｅｎｔｈａ ｐｉｐｅｒｉｔａ）、アラビドプシス・サリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）由来のｃｒｔＥ（Ｆｅｎｇ Ｆｒｏｎｔ．Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．，２５ Ｍａｙ ２０２０及びその中の参考文献）が挙げられるが、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）由来のｉｄｓＡ遺伝子も挙げられる（Ｈｅｉｄｅｒ ＦＥＢＳ Ｊｏｕｒｎａｌ ２８１（２０１４）４９０６－４９２０）。
【0005】
ＧＧＰＰから出発して、ジテルペンの生合成は、通常、２つの工程：環化二リン酸（例えば、ラブダ－１３－エン－８－オール二リン酸、即ちＬＰＰ、コパリル－ＰＰ、即ちＣＰＰ）とするための工程１及びこの基質を最終生成物に変換する工程２によって媒介される。通常、工程１は、ＩＩ型ジテルペンシンターゼによって行われるが、工程２は、Ｉ型ジテルペンシンターゼによって行われる。両方の工程を行うことが知られているＩＩ型シンターゼ、例えばアビエス・バルサメア（Ａｂｉｅｓ ｂａｌｓａｍｅａ）由来のアビエノールシンターゼが存在する（Ｚｅｒｂｅ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＶＯＬ．２８７，ＮＯ．１５，ｐｐ．１２１２１－１２１３１，Ａｐｒｉｌ ６，２０１２）。通常、工程Ｉの酵素は、αβγドメインタンパク質であり、γドメインにＤＸＤＤモチーフが存在することを特徴とする。工程２の酵素は、αβγドメインタンパク質又はαβドメインタンパク質であり得、βドメインにＤＤＸＸＤモチーフが存在することを特徴とする。ジテルペンシンターゼに関する総説は、Ｚｅｒｂｅ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１５，３３（７），４１９－４２８内にある。
【0006】
関連するジテルペンの生合成について、以下の遺伝子が記載されている：スクラレオールについては、サルビア・スクラレア（Ｓａｌｖｉａ ｓｃｌａｒｅａ）由来のＬＰＰシンターゼ（ＬＰＰＳ）及びスクラレオールシンターゼ（ＳＳ）（Ｃａｎｉａｒｄ ｅｔ ａｌ．ＢＭＣ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１２，１２：１１９；Ｓｃｈａｌｋの国際公開第２００９／１０１１２６号パンフレット）であり、ＬＰＰＳは、αβγタンパク質（ＩＩ型）であり、ＳＳは、αβタンパク質（Ｉ型）であり、Ｉｇｎｅａ ｅｔ ａｌ（Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ２７（２０１５），６５－７５）では、ニコチアナ・グルチノサ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｇｌｕｔｉｎｏｓａ）由来のＬＰＰＳ及び同様の酵素のみによる酵母内でのスクラレオール合成が実証されている（Ｊｕｌｉｅｎ、国際公開第２０１４／０２２４３４Ａ１号明細書）。
【0007】
アビエノールについては、ニコチアナ・タバカム（ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）由来のＬＰＰＳ及びＡＢＳ（Ｓａｌａｕｄ，Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ（２０１２）７２，１－１７；国際公開第２００８／０７０３１Ａ１号明細書）であり、いずれの工程でも実行することができるアビエス・バルサメア（Ａｂｉｅｓ ｂａｌｓａｍｅａ）のＡＢＳ（Ｚｅｒｂｅ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＶＯＬ．２８７，ＮＯ．１５，ｐｐ．１２１２１－１２１３１，Ａｐｒｉｌ ６，２０１２）並びにアビエス属（Ａｂｉｅｓ）のＡＢＳ及びニコチアナ属（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）のＡＢＳ又はサルビア属（ｓａｌｖｉａ）のＳＳ（国際公開第２０１６／９４１７８Ａ１号明細書）である。
【0008】
マノオールについては、トリチカム・エスチバム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）、又はサルビア・ミルティオリザ（Ｓａｌｖｉａ Ｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａ）、又はタラロマイセス・ベルルキュロサス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｖｅｒｒｕｃｕｌｏｓｕｓ）、又はコレウス・フォルスコリ（Ｃｏｌｅｕｓ Ｆｏｒｓｋｏｈｌｉｉ）、マルビウム・バルガレ（Ｍａｒｒｕｂｉｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）、ロスマリナス・オフィシナーレ（Ｒｏｓｍａｒｉｎｕｓ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ）由来の工程１のＣＰＰＳ；工程２ではサルビア属（ｓａｌｖｉａ）のＳＳ（米国特許第２０１９／０３５２６７３号明細書）であり、コレウス・フォルスコリ（Ｃｏｌｅｕｓ ｆｏｒｓｋｏｈｌｉｉ）由来の工程１のＣＰＰＳ；工程２ではオリガナム・マジョラナ（Ｏｒｉｇａｎｕｍ ｍａｊｏｒａｎａ）由来のＯｍＴＰＳ４（Ｊｏｈｎｓｏｎ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２０１９）２９４（４）１３４９－１３６２；国際公開第２０２０／０２８７９５号明細書）である。
【0009】
スクラレオール、マノオール又はアビエノールを産生するための遺伝子操作微生物が記載されている。この遺伝子操作微生物には、以下の遺伝的エレメントの導入が含まれる。
【0010】
ＧＧＰＰシンターゼは、例えば、Ｆｅｎｇ Ｆｒｏｎｔ．Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．，２５ Ｍａｙ ２０２０に記載されているＧＧＰＰシンターゼの群から選択した。ＧＧＰＰを生成する目的のため、ＣｒｔＥ型の微生物酵素、例えばパントエア・アグロメランス（Ｐａｎｔｏｅａ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）由来のｃｒｔＥ（ＡＡＡ２４８１９）も採用されている（Ｓｃｈａｌｋ Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１２，１３４，１８９００－１８９０３）。コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）のＩｄｓＡは、極めて高い触媒効率を有することが示されている（Ｈｅｉｄｅｒ ＦＥＢＳ Ｊｏｕｒｎａｌ ２８１（２０１４）４９０６－４９２０）。
【0011】
ＬＰＰ又は（＋）－ＣＰＰをもたらす工程１の遺伝子は、先行技術では異なる供給源から選択されていた。サルビア・スクラレア（Ｓａｌｖｉａ ｓｃｌａｒｅａ）由来のＬＰＰＳ（Ｃａｎｉａｒｄ ｅｔ ａｌ．ＢＭＣ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１２，１２：１１９；Ｓｃｈａｌｋの国際公開第２００９／１０１１２６号パンフレット）、ニコチアナ・グルチノサ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｇｌｕｔｉｎｏｓａ）由来のＬＰＰＳ（国際公開第２０１４／０２２４３４号パンフレット Ａｌｌｙｌｉｘ）、コレウス・フォルスコリ（Ｃｏｌｅｕｓ ｆｏｒｓｋｏｈｌｉｉ）由来のＣｆＬＰＰＳ（Ｐａｔｅｒａｋｉ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１６４，１２２２－１２３６；国際公開第２０１５／０９１９４３号明細書）、ニコチアナ・タバカム（ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）由来のＮｔＬＰＰＳ（Ｓａｌａｕｄ，Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ（２０１２）７２，１－１７；国際公開第２００８／０７０３１Ａ１号明細書）、グリンデリア・ヒルスツラ（Ｇｒｉｎｄｅｌｉａ ｈｉｒｓｕｔｕｌａ）由来のＧｈＬＰＰＳ、トリプテリジウム・ウィルフォルディ（Ｔｒｉｐｔｅｒｙｇｉｕｍ ｗｉｌｆｏｒｄｉｉ）由来のＴｗＬＰＰＳ、シスタス・クレティカス（Ｃｉｓｔｕｓ ｃｒｅｔｉｃｕｓ）由来のＣｃＬＰＰＳ（Ｆａｌａｒａ，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２０１０，Ｖｏｌ．１５４，ｐｐ．３０１－３１０）。トリチカム・エスチバム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）、又はサルビア・ミルティオリザ（Ｓａｌｖｉａ Ｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａ）、又はタラロマイセス・ベルルキュロサス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｖｅｒｒｕｃｕｌｏｓｕｓ）又はコレウス・フォルスコリ（Ｃｏｌｅｕｓ Ｆｏｒｓｋｏｈｌｉｉ）、マルビウム・バルガレ（Ｍａｒｒｕｂｉｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）、ロスマリナス・オフィシナーレ（Ｒｏｓｍａｒｉｎｕｓ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ）由来のＣＰＰＳ（米国特許第２０１９／０３５２６７３号明細書）も同様に使用されている。
【0012】
Ｍａ及び共同研究者は、タイワニア・クリプトメリオイデス（Ｔａｉｗａｎｉａ ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉｏｉｄｅｓ）のジテルペンシンターゼの生化学的特徴について述べている（Ｍａ Ｌｉ－Ｔｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ，ｖｏｌ．１００，ｎｏ．６，１２５４－１２７２）。具体的には、ラブダ－１３－エン－８－オール二リン酸（ＬＰＰ、ＴｃＣＰＳ２）及び（＋）－コパリル二リン酸（ＣＰＰ、ＴｃＣＰＳ４）を形成する単官能のクラスＩＩ酵素と、それぞれビホルメン（ＴｃＫＳＬ１）、レボピマラジエン（ＴｃＫＳＬ３）及びフィロクラダノール（ＴｃＫＳＬ５）を生成する３つのクラスＩのｄｉＴＰＳとを含む、これまで裸子植物に観察されなかった５つの単官能ｄｉＴＰＳ機能の特性を明らかにした。更に、これらのジテルペンシンターゼのいずれも、スクラレオール、マノオール又はアビエノールの生成はおろか、ジテルペンアルコールシンターゼ活性を示さなかった。
【0013】
実際に、スクラレオール、マノオール又はアビエノールをもたらす工程２の遺伝子は、稀である。サルビア・スクラレア（Ｓａｌｖｉａ ｓｃｌａｒｅａ）のスクラレオールシンターゼは、ＣＰＰＳと組み合わせた場合にマノオールを生成することが知られている（米国特許出願公開第２０１９／０３５２６７３号明細書）。オリガナム・マジョラナ（Ｏｒｉｇａｎｕｍ ｍａｊｏｒａｎａ）由来のＯｍＴＰＳ４は、ＣＰＰＳを有するマノオールシンターゼであるが、ＬＰＰＳを有する場合、スクラレオールを生成せず、マノイルオキシドを生成する（Ｊｏｈｎｓｏｎ ２０１９）。Ｊｉａ（ＡＣＳ Ｃａｔａｌ．２０１８，８，３１３３－３１３７）では、残基Ｎ４３１をＩ、Ｄ又はＥに変異させることによってサルビア属（ｓａｌｖｉａ）スクラレオールシンターゼをイソアビエノールシンターゼに変換することができ、Ｎ４３１Ｑを変異することによって１３Ｒ－スクラレオールシンターゼから１３Ｓ－スクラレオールシンターゼに変更することができることが開示されている。Ｊｉａらは、スクラレオールシンターゼが、例外的に、ラブダノイル－ＰＰに水を添加してスクラレオールを形成するために重要となる、その残基の周囲の産物成果決定領域にアスパラギン（Ｎ４３１）を有していることを主張している。Ｎ．タバカム（Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ）のアビエノールシンターゼは、サルビア・フルティコサ（Ｓａｌｖｉａ ｆｒｕｔｉｃｏｓａ）由来のＣＰＰＳによってＺ－ビホルメンを生成する。Ｊｉａ ｅｔ ａｌは、サルビア・スクラレア（Ｓａｌｖｉａ ｓｃｌａｒｅａ）由来のスクラレオールシンターゼと、異なる種に由来する多数の工程２のジテルペンシンターゼシンターゼ、例えばコレウス・フォルスコリ（Ｃｏｌｅｕｓ ｆｏｒｓｋｏｈｌｉｉ）由来のマノイルオキシドシンターゼ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション：ＫＦ４４４５０８）；１ ＩｒＭＳ、イソドン・ルベッセンス（Ｉｓｏｄｏｎ ｒｕｂｅｓｃｅｎｓ）由来のミルチラジエンシンターゼ（ＫＸ８３１６５２）；ＣｆＭＳ、Ｃ．フォルスコリ（Ｃ．ｆｏｒｓｋｏｈｌｉｉ）由来のミルチラジエンシンターゼ（ＫＦ４４４５０９）；ＲｏＭＳ１、ローズマリウス・オフィシナリス（Ｒｏｓｅｍａｒｉｕｓ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）由来のミルチラジエンシンターゼ１（ＫＦ８０５８５８）；ＳｍＭＳ、サルビア・ミルティオリザ（Ｓａｌｖｉａ Ｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａ）由来のミルチラジエンシンターゼ（ＡＢＶ０８８１７）；ＲｏＭＳ１、ローズマリウス・オフィシナリス（Ｒｏｓｅｍａｒｉｕｓ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）由来のミルチラジエンシンターゼ（ＫＦ８０５８５９）；ＳｆＭＳ、サルビア・フルティコサ（Ｓａｌｖｉａ ｆｒｕｔｉｃｏｓａ）由来のミルチラジエンシンターゼ（ＫＰ０９１８４１）；ＭｖＥＬＳ、マルビウム・バルガレ（Ｍａｒｒｕｂｉｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）由来の９，１３－エポキシ－ラブダ－１４－エンシンターゼ（ＫＪ５８４４５４）とのアライメントを行った。そこでは、ＳｓＳＳの残基Ｎ４３８が、スクラレオール又はマノオールなどの１３－ヒドロキシル化ラブダンジテルペンを生成する能力を決定することが報告されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0014】
様々な工程２の酵素コード遺伝子が先行技術で報告されているが、それにもかかわらず、Ｃ２０テルペノイドアルコール、特にアビエノール、スクラレオール及び／又はマノオールの製造における工程２の反応を触媒するのに適用することができる高効率の酵素に対する必要性が存在する。更に、１つのみのＣ２０テルペノイドアルコールの生成に限定されない酵素を有することが望ましい。
【課題を解決するための手段】
【0015】
本発明の根底にある技術的問題は、上述の必要性に適合する手段及び方法の提供として理解されるものとする。この技術的問題は、特許請求の範囲及び下記の本明細書で特徴付けられる実施形態によって解決される。
【0016】
従って、本発明は、少なくとも１つのＣ２０テルペノイドアルコールを製造する方法であって、
ａ）ゲラニルゲラニルピロリン酸をコパリル二リン酸（ＣＰＰ）又はラブダ－１３－エン－８－オール二リン酸（ＬＰＰ）に変換する工程；及び
ｂ）ＣＰＰ又はＬＰＰを少なくとも１つのＣ２０テルペノイドアルコールに変換する工程であって、前記変換は、ジテルペンアルコールシンターゼ活性を示すポリペプチドによって行われ、前記ジテルペンアルコールシンターゼ活性は、コパリル二リン酸（ＣＰＰ）をマノオールに、ラブダ－１３－エン－８－オール二リン酸（ＬＰＰ）をスクラレオールに、且つ／又はＬＰＰをアビエノールに変換することができる、工程
を含み、前記ポリペプチドは、
ａ）配列番号３～１０又は配列番号３４のいずれか１つに示されるようなアミノ酸配列；
ｂ）配列番号３～１０又は配列番号３４のいずれか１つに示されるようなアミノ酸配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列；
ｃ）配列番号１、２、１６、１７、１８又は配列番号３５に示されるような核酸配列によってコードされるアミノ酸配列；
ｄ）配列番号１、２、１６、１７、１８又は配列番号３５に示されるような核酸配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一である核酸配列によってコードされるアミノ酸配列；及び
ｅ）（ａ）～（ｄ）のいずれか１つのフラグメントであって、コパリル二リン酸（ＣＰＰ）をマノオールに、ラブダ－１３－エン－８－オール二リン酸（ＬＰＰ）をスクラレオールに、且つ／又はＬＰＰをアビエノールに変換することができるジテルペンアルコールシンターゼ活性を示すポリペプチドをコードするフラグメントのアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、方法に関する。
ａ）ゲラニルゲラニルピロリン酸をコパリル二リン酸（ＣＰＰ）又はラブダ－１３－エン－８－オール二リン酸（ＬＰＰ）に変換する工程；及び
ｂ）ＣＰＰ又はＬＰＰを少なくとも１つのＣ２０テルペノイドアルコールに変換する工程であって、前記変換は、ジテルペンアルコールシンターゼ活性を示すポリペプチドによって行われ、前記ジテルペンアルコールシンターゼ活性は、コパリル二リン酸（ＣＰＰ）をマノオールに、ラブダ－１３－エン－８－オール二リン酸（ＬＰＰ）をスクラレオールに、且つ／又はＬＰＰをアビエノールに変換することができる、工程
を含み、前記ポリペプチドは、
ａ）配列番号３～１０又は配列番号３４のいずれか１つに示されるようなアミノ酸配列；
ｂ）配列番号３～１０又は配列番号３４のいずれか１つに示されるようなアミノ酸配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列；
ｃ）配列番号１、２、１６、１７、１８又は配列番号３５に示されるような核酸配列によってコードされるアミノ酸配列；
ｄ）配列番号１、２、１６、１７、１８又は配列番号３５に示されるような核酸配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一である核酸配列によってコードされるアミノ酸配列；及び
ｅ）（ａ）～（ｄ）のいずれか１つのフラグメントであって、コパリル二リン酸（ＣＰＰ）をマノオールに、ラブダ－１３－エン－８－オール二リン酸（ＬＰＰ）をスクラレオールに、且つ／又はＬＰＰをアビエノールに変換することができるジテルペンアルコールシンターゼ活性を示すポリペプチドをコードするフラグメントのアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、方法に関する。
【0017】
本明細書及び特許請求の範囲において、「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」は、それが使用される文脈に応じて、以下に言及される項目の１つ以上を意味し得ることを理解されたい。従って、例えば、「１つの」項目に対する言及は、少なくとも１つの項目を利用できることを意味し得る。
【0018】
以下に使用されるように、「有する」、「含む」又は「包含する」という用語は、非限定的な意味又は限定的な意味を有することが意図される。従って、限定的な意味のこれらの用語を有することは、記載された実施形態に、これらの用語によって導入された特徴以外の他の特徴が存在しない状況を指す可能性があり、即ち、この用語は、「からなる」又は「から本質的になる」という意味で限定的な意味を有する。非限定的な意味を有する場合、この用語は、記載される実施形態に、これらの用語によって導入される特徴以外に１つ以上の他の特徴が存在する状況を指す。
【0019】
更に、以下で使用されるように、「好ましくは」、「より好ましくは」、「最も好ましくは」、「詳細には」、「より詳細には」、「典型的には」及び「より典型的には」という用語は、これらの特徴が好ましい特徴であることを示すため、特徴と共に使用され、即ち、この用語により、本発明に従って代替的な特徴も想定され得ることが示されるものとする。
【0020】
更に、本明細書で使用される「少なくとも１つの」という用語は、その用語に続いて言及される項目の１つ以上が本発明に従って使用され得ることを意味することが理解されるであろう。例えば、この用語が少なくとも１つの項目を使用しなければならないことを示す場合、このことは、１つの項目又は２つ以上の項目、即ち２つ、３つ、４つ、５つ又は任意の他の数の項目であるものと理解され得る。その用語が言及する項目に応じて、当業者は、存在する場合にその用語がどの上限を指す可能性があるのかについて理解している。
【0021】
本発明による方法は、上記に言及される工程（ａ）及び（ｂ）からなり得るか、又は追加の工程を含み得る。このような追加の工程は、前処理の工程であり得るか、又は精製工程などのＣ２０テルペノイドアルコールの製造に必要とされる工程であり得る。
【0022】
本明細書で使用される「製造」という用語は、ＣＰＰ又はＬＰＰ（ＣＡＳ番号１０００８７６－３６－７）から少なくとも１つのＣ２０テルペノイドアルコール、特に環状Ｃ２０テルペノイドアルコール、より好ましくはマノオール、スクラレオール及び／又はアビエノールを生成することを指す。この製造により、任意の程度の純度の前記少なくとも１つのＣ２０テルペノイドアルコールを得ることができる。想定される純度の程度が高いほど、更に追加の精製が必要となる。本方法は、エキソビボで、例えば１つ以上の反応バイアル中で行われ得る。代替的に、本方法は、本明細書の他の箇所で言及される宿主細胞を含む微生物又は植物を含む非ヒトトランスジェニック生物などの生物内で全体的又は部分的に行われ得る。
【0023】
本発明に従って使用される「Ｃ２０テルペノイドアルコール」という用語は、アルコール部分を含むＣ２０テルペノイドに関する。テルペンは、高分子のイソプレンである。テルペノイドは、機能的な化学部位を更に有し得る。Ｃ２０テルペノイドは、ジテルペノイド又はジテルペンとも称される。好ましくは、本発明に従って言及される前記少なくとも１つのＣ２０テルペノイドアルコールは、環状Ｃ２０テルペノイドアルコールである。より好ましくは、マノオール（ＣＡＳ番号５９６－８５－０、分子式Ｃ２０Ｈ３４Ｏ）、スクラレオール（ＣＡＳ番号５１５－０３－７、分子式Ｃ２０Ｈ３６Ｏ２）又はアビエノール（ＣＡＳ番号１７９９０－１６－８、分子式Ｃ２０Ｈ３４Ｏ）である。
【0024】
本発明に従って使用される「ポリペプチド」という用語は、ペプチド結合によって互いに連結されたアミノ酸の連続配列を指す。本発明によるポリペプチドは、典型的には、アミノ酸鎖が本明細書の他の箇所で言及される酵素活性を発揮するのに必要とされる三次元構造を形成することができるように、少なくとも５０、少なくとも１００又は少なくとも２００アミノ酸長から構成される。「タンパク質」という用語は、本明細書において互換的に用いられ得る。
【0025】
本明細書に使用される「ジテルペンアルコールシンターゼ活性」という用語は、ＬＰＰ又はＣＰＰなどの出発物質をＣ２０テルペノイドアルコールに変換することができる酵素の活性を指す。ジテルペンシンターゼは、多様な主鎖構造をもたらす複雑な求電子的環形成及び／又は転位を受ける。ジテルペンシンターゼは、クラスＩＩの酵素からのゲラニルゲラニルリン酸から生成されるテルペン二リン酸を基質として使用するクラスＩの酵素に分類することができる。上記に言及されるジテルペンアルコールシンターゼ活性を有するポリペプチドは、典型的にはＩ型酵素である。好ましくは、前記ジテルペンアルコールシンターゼ活性により、コパリル二リン酸（ＣＰＰ）をマノオールに、ラブダ－１３－エン－８－オール二リン酸（ＬＰＰ）（ＣＡＳ番号１０００８７６－３６－７）をスクラレオールに、且つ／又はＬＰＰ（ＣＡＳ番号１０００８７６－３６－７）をアビエノールに変換することができる。好ましくは、本発明によるジテルペンアルコールシンターゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号２４に示されるような保存領域又は配列番号２４に１つ若しくはいくつかのアミノ酸変異を有する配列を含み、配列番号２４の４位のセリンはスレオニンに変換されるか又は置換され、この位置のセリンは変換されていることが好ましい。
【0026】
加えて、本発明によるジテルペンアルコールシンターゼ活性を有するポリペプチドは、ＰｆａｍドメインであるＰＦ０１３９７．２３（テルペンシンターゼ、Ｎ末端ドメイン）、ＰＦ０３９３６．１８（テルペンシンターゼファミリー、金属結合ドメイン）及びＰＦ１９０８６．２（テルペンシンターゼファミリー２、Ｃ末端金属結合）（ＰＦＡＭバージョン３５．０）；Ｐｆａｍ：Ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆａｍｉｌｉｅｓ ｄａｔａｂａｓｅ ｉｎ ２０２１；Ｊ．Ｍｉｓｔｒｙ，Ｓ．Ｃｈｕｇｕｒａｎｓｋｙ，Ｌ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｍ．Ｑｕｒｅｓｈｉ，Ｇ．Ａ．Ｓａｌａｚａｒ，Ｅ．Ｌ．Ｌ．Ｓｏｎｎｈａｍｍｅｒ，Ｓ．Ｃ．Ｅ．Ｔｏｓａｔｔｏ，Ｌ．Ｐａｌａｄｉｎ，Ｓ．Ｒａｊ，Ｌ．Ｊ．Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｒ．Ｄ．Ｆｉｎｎ，Ａ．Ｂａｔｅｍａｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０２０）ｄｏｉ；１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋａａ９１３を参照されたい。
【0027】
本発明によるジテルペンアルコールシンターゼ活性を示すポリペプチドであって、前記ジテルペンアルコールシンターゼ活性は、コパリル二リン酸（ＣＰＰ）をマノオールに、ラブダ－１３－エン－８－オール二リン酸（ＬＰＰ）をスクラレオールに、且つ／又はＬＰＰをアビエノールに変換することができる、ポリペプチドは、
ａ）配列番号３～１０又は配列番号３４のいずれか１つに示されるようなアミノ酸配列；
ｂ）配列番号３～１０又は配列番号３４のいずれか１つに示されるようなアミノ酸配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列；
ｃ）配列番号１、２、１６、１７、１８又は３５に示されるような核酸配列によってコードされるアミノ酸配列；
ｄ）配列番号１、２、１６、１７、１８又は３５に示されるような核酸配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一である核酸配列によってコードされるアミノ酸配列；及び
ｅ）（ａ）～（ｄ）のいずれか１つのフラグメントであって、コパリル二リン酸（ＣＰＰ）をマノオールに、ラブダ－１３－エン－８－オール二リン酸（ＬＰＰ）をスクラレオールに、且つ／又はＬＰＰをアビエノールに変換することができるジテルペンアルコールシンターゼ活性を示すポリペプチドをコードするフラグメントのアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
ａ）配列番号３～１０又は配列番号３４のいずれか１つに示されるようなアミノ酸配列；
ｂ）配列番号３～１０又は配列番号３４のいずれか１つに示されるようなアミノ酸配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列；
ｃ）配列番号１、２、１６、１７、１８又は３５に示されるような核酸配列によってコードされるアミノ酸配列；
ｄ）配列番号１、２、１６、１７、１８又は３５に示されるような核酸配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一である核酸配列によってコードされるアミノ酸配列；及び
ｅ）（ａ）～（ｄ）のいずれか１つのフラグメントであって、コパリル二リン酸（ＣＰＰ）をマノオールに、ラブダ－１３－エン－８－オール二リン酸（ＬＰＰ）をスクラレオールに、且つ／又はＬＰＰをアビエノールに変換することができるジテルペンアルコールシンターゼ活性を示すポリペプチドをコードするフラグメントのアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【0028】
好ましくは、ジテルペンアルコールシンターゼ活性を示す前記ポリペプチドは、ＣＰＰをマノオールに、且つＬＰＰをスクラレオールに変換することができる。より好ましくは、前記ポリペプチドは、
ａ）配列番号４、６、７、９、１０又は配列番号３４に示されるようなアミノ酸配列；
ｂ）配列番号４、６、７、９、１０又は配列番号３４に示されるようなアミノ酸配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列；
ｃ）配列番号２、１６、１７又は３５に示されるような核酸配列によってコードされるアミノ酸配列；
ｄ）配列番号２、１６、１７又は３５に示されるような核酸配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一である核酸配列によってコードされるアミノ酸配列；及び
ｅ）（ａ）～（ｄ）のいずれか１つのフラグメントであって、ＣＰＰをマノオールに、且つＬＰＰをスクラレオールに変換することができるジテルペンアルコールシンターゼ活性を示すポリペプチドをコードするフラグメントのアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
ａ）配列番号４、６、７、９、１０又は配列番号３４に示されるようなアミノ酸配列；
ｂ）配列番号４、６、７、９、１０又は配列番号３４に示されるようなアミノ酸配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列；
ｃ）配列番号２、１６、１７又は３５に示されるような核酸配列によってコードされるアミノ酸配列；
ｄ）配列番号２、１６、１７又は３５に示されるような核酸配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一である核酸配列によってコードされるアミノ酸配列；及び
ｅ）（ａ）～（ｄ）のいずれか１つのフラグメントであって、ＣＰＰをマノオールに、且つＬＰＰをスクラレオールに変換することができるジテルペンアルコールシンターゼ活性を示すポリペプチドをコードするフラグメントのアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【0029】
好ましくは、ジテルペンアルコールシンターゼ活性を示す前記ポリペプチドは、ＬＰＰをアビエノールにも変換され得る。より好ましくは、前記ポリペプチドは、
ａ）配列番号３、５又は８に示されるようなアミノ酸配列；
ｂ）配列番号３、５又は８に示されるようなアミノ酸配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列；
ｃ）配列番号１又は１８に示されるような核酸配列によってコードされるアミノ酸配列；
ｄ）配列番号１又は１８に示されるような核酸配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一である核酸配列によってコードされるアミノ酸配列；及び
ｅ）（ａ）～（ｄ）のいずれか１つのフラグメントであって、ＬＰＰをアビエノールに変換することができるジテルペンアルコールシンターゼ活性を示すポリペプチドをコードするフラグメントのアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
ａ）配列番号３、５又は８に示されるようなアミノ酸配列；
ｂ）配列番号３、５又は８に示されるようなアミノ酸配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列；
ｃ）配列番号１又は１８に示されるような核酸配列によってコードされるアミノ酸配列；
ｄ）配列番号１又は１８に示されるような核酸配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一である核酸配列によってコードされるアミノ酸配列；及び
ｅ）（ａ）～（ｄ）のいずれか１つのフラグメントであって、ＬＰＰをアビエノールに変換することができるジテルペンアルコールシンターゼ活性を示すポリペプチドをコードするフラグメントのアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【0030】
上記で本明細書に言及される配列同一性は、アミノ酸配列又は核酸配列間の関係を定義し、これらの配列を比較することによって決定することができるものである。通常、配列同一性は、２つの配列を配列の全長にわたって比較することにより決定されるが、互いにアライメントした配列の一部のみでも比較され得る。好ましくは、配列同一性は、本明細書では、配列の全長にわたって比較される。配列同一性は、ポリペプチド配列又は核酸配列間の関連性の程度を指す。配列同一性は、互いに比較された２つの配列内の同一のアミノ酸又はヌクレオチドの割合で表される。従って、２つの配列をアライメントした際、それらの配列間で一致するアミノ酸又はヌクレオチドの数を一般に決定し、アライメントした配列又は配列の一部におけるアミノ酸又はヌクレオチドの総数と関連付ける。例えば、バリアント配列は、親配列、即ち配列番号３～７若しくは配列番号３４のいずれか１つに示されるようなアミノ酸配列又は配列番号１若しくは２若しくは３５に示されるような核酸配列と比較したときのそれらの配列同一性によって定義され得る。２つの配列間のパーセント同一性を決定するために、最初の工程で、これらの２つの配列間でペアワイズ配列アライメントを生成し、この２つの配列をそれらの完全、全体又は全長にわたってアライメントする（即ちペアワイズグローバルアライメント）。アライメントは、本明細書に記載されるプログラム又はソフトウェアを用いて生成される。本発明の目的に好ましいアライメントは、最大配列同一性を決定することができるアライメントである。
【0031】
配列アライメントは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈアルゴリズム－Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓａｕｌ Ｂ．＆Ｗｕｎｓｃｈ，Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ Ｄ．（１９７０）．“Ａ ｇｅｎｅｒａｌ ｍｅｔｈｏｄ ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ ｔｏ ｔｈｅ ｓｅａｒｃｈ ｆｏｒ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｗｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ”．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ４８（３）；４４３－４５３などの多くのソフトウェアツールを用いて生成することができる。このアルゴリズムは、例えば、２つの配列のグローバルアライメントを行う「ＮＥＥＤＬＥ」プログラムに組み込まれている。ＮＥＥＤＬＥプログラムは、例えば、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ（ＥＭＢＯＳＳ）内に含まれる。ＥＭＢＯＳＳ － 様々なプログラムの一群：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ（ＥＭＢＯＳＳ），Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １６（６），２７６（２０００）。ＢＬＯＳＵＭ（ＢＬＯｃｋｓ ＳＵｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ Ｍａｔｒｉｘ） － 例えば、タンパク質ドメインの保存領域のアライメントに基づいて通常生成される（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ Ｓ，Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ＪＧ：Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｍａｔｒｉｃｅｓ ｆｒｏｍ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｌｏｃｋｓ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ＵＳＡ．１９９２ Ｎｏｖ １５；８９（２２）；１０９１５－９）。多くのＢＬＯＳＵＭの１つに「ＢＬＯＳＵＭ６２」があるが、これは、タンパク質配列をアライメントするときに多くのプログラムで多くの場合に「デフォルト」設定になっている。ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ） － 大規模な配列データベースにおいて類似配列を検索するために主に使用されているいくつかの個々のプログラム（ＢｌａｓｔＰ、ＢｌａｓｔＮ）からなる。ＢＬＡＳＴプログラムは、ローカルアライメントも生成する。典型的には、改良バージョン（「ＢＬＡＳＴ２」）である、ＮＣＢＩ（全米バイオテクノロジー情報センター）により提供される「ＢＬＡＳＴ」インターフェースが使用される。「元の」ＢＬＡＳＴ：Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，Ｇｉｓｈ，Ｗ．，Ｍｉｌｌｅｒ，Ｗ．，Ｍｙｅｒｓ，Ｅ．Ｗ．＆Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．（１９９０）“Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ．”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０；ＢＬＡＳＴ２：Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｆ．，Ｔｈｏｍａｓ Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ，Ａｌｅｊａｎｄｒｏ Ａ．Ｓｃｈａｆｆｅｒ，Ｊｉｎｇｈｕｉ Ｚｈａｎｇ，Ｚｈｅｎｇ Ｚｈａｎｇ，Ｗｅｂｂ Ｍｉｌｌｅｒ，ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ（１９９７），“Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ ａｎｄ ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ；ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒａｍｓ”，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２。
【0032】
本明細書で使用されるような配列同一性は、好ましくは、ＥＭＢＯＳＳペアワイズアライメントアルゴリズム「Ｎｅｅｄｌｅ」により決定されるような値である。特に、「最長同一性」を計算するＮＯＢＲＩＥＦオプション（‘Ｂｒｉｅｆ ｉｄｅｎｔｉｔｙ ａｎｄ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ’ｔｏ ＮＯ）を使用して、ＥＭＢＯＳＳパッケージからＮＥＥＤＬＥプログラムを使用することができる（バージョン２．８．０以降、ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ－Ｒｉｃｅ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（２０００）１６；２７６－２７７；ｈｔｔｐ：／／ｅｍｂｏｓｓ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｎｌ）。このような場合、アライメントされた２つの配列間の同一性は、以下のように計算される：両配列において同一のアミノ酸を示すアライメントにおける対応する位置の数を、アライメントにおけるギャップの総数の減算後のアライメントの全長により除する。アミノ酸配列のアライメントでは、デフォルトパラメータは、マトリクス＝Ｂｌｏｓｕｍ６２；オープンギャップペナルティ＝１０．０；ギャップ伸長ペナルティ＝０．５である。核酸配列のアライメントでは、デフォルトパラメータは、マトリクス＝ＤＮＡｆｕｌｌ；オープンギャップペナルティ＝１０．０；ギャップ伸長ペナルティ＝０．５である。
【0033】
本明細書で言及されるバリアントアミノ酸配列又は核酸配列は、対立遺伝子バリアント又はオーソログ、パラロガス若しくは相同バリアントなどの天然に存在するバリアントであり得る。代替的に、このような配列は、例えば、分子進化若しくは合理的設計のような当業者に公知の生物学的技術により、又は当技術分野で公知であり、本明細書の他の箇所に記載される変異誘発技術（ランダム変異誘発、部位特異的変異誘発、定向進化、遺伝子組換えなど）を使用することにより、酵素又は核酸の特性を改善（例えば、酵素の発現の改善又は酵素の酵素活性の増加）するために人為的に生成され得る。
【0034】
配列番号１、２、１６、１７、１８若しくは３５に示されるような核酸配列によってコードされるアミノ酸配列又は配列番号１、２、１６、１７、１８若しくは３５に示されるような核酸配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列によってコードされるバリアント核酸配列は、少なくとも１つのヌクレオチド置換、付加及び／又は欠失により、本明細書の他の箇所に記載される理由のために配列番号１、２、１６、１７、１８又は３５に示される核酸配列と異なり得る。本明細書で言及されるそのようなバリアント核酸配列を含むポリヌクレオチドは、好ましくは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で互いにハイブリダイズできることが理解されるであろう。本明細書で言及されるストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とは、好ましくは、約４５℃で６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、続いて５０～６５℃で０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で１回以上の洗浄工程を行うことである。当業者は、これらのハイブリダイゼーション条件が、緩衝液の温度及び濃度に関して、例えば有機溶媒が存在する場合、核酸の種類に応じて異なることを知っている。例えば、「標準的なハイブリダイゼーション条件」下では、温度は、核酸の種類に応じて異なり、０．１～５×ＳＳＣ（ｐＨ７．２）の濃度の水性緩衝液中で４２℃～５８℃である。上述した緩衝液中に有機溶媒が存在する、例えば５０％ホルムアミドである場合、標準条件下の温度は約４２℃である。ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッドのハイブリダイゼーション条件は、好ましくは、０．１×ＳＳＣで２０℃～４５℃、好ましくは３０℃～４５℃である。ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドのハイブリダイゼーション条件は、好ましくは、０．１×ＳＳＣで３０℃～５５℃、好ましくは４５℃～５５℃である。上述したハイブリダイゼーション温度は、例えば、ホルムアミドの非存在下の長さ約１００ｂｐ（＝塩基対）及びＧ＋Ｃ含有量５０％の核酸に対して決定されたものである。当業者であれば、上記の教本又は以下の教本：Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８９；Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ（Ｅｄ．）１９８５，”Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ”，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ；Ｂｒｏｗｎ（Ｅｄ．）１９９１，“Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ”，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄのような教本を参照することにより、必要とされるハイブリダイゼーション条件をどのように決定するかを知っている。従って、バリアント核酸配列は、配列番号１、２、１６、１７、１８若しくは３５に示されるような核酸配列によってコードされるアミノ酸配列又は配列番号１、２、１６、１７、１８若しくは３５に示されるような核酸配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％同一である核酸配列によってコードされるアミノ酸配列をコードする核酸配列と、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドから誘導することができる。
【0035】
更なる実施形態では、本発明のポリペプチドは、図５又は６に示される位置に保存アミノ酸を含み、好ましくは図６に示されるものである。保存アミノ酸位置は、図５及び６において黒い背景に白いフォントの文字で示されている。
【0036】
本発明のジテルペンアルコールシンターゼ活性を示すポリペプチドは、典型的には、１文字コードでＥＫＫＳＦＧＳＭＣＩ（配列番号５６）、又はＥＮＫＳＦＧＳＭＣＩ（配列番号５８）、又はＥＮＮＳＦＧＳＭＣＩ（配列番号５５）、又はＥＫＮＳＦＧＳＭＣＩ（配列番号５７）である一連のアミノ酸をＮ末端領域に含むことが判明した。好ましくは、本発明のポリペプチドは、配列番号５６又は５８に示されるような配列を含む。この配列のストレッチ内の最初のリシンをアスパラギンに置換するか、又はこの配列のストレッチ内のアスパラギンをリシンにそれぞれ置換しても、本明細書で言及される少なくとも１つのＣ２０テルペノイドアルコールの生成における酵素の性能に著しい影響を与えることはなかった。
【0037】
本発明のジテルペンアルコールシンターゼ活性を示すポリペプチドのフラグメントは、上記に明記されるジテルペンアルコールシンターゼ活性を示すのに十分な長さを有する、上述の配列及び配列バリアントの任意のアミノ酸配列からなるポリペプチドであり得る。これに関連して、上記で言及したポリペプチドの保存領域は、本発明に従って同定された。この領域は、配列番号２４又は配列番号２４に１つ若しくはいくつかのアミノ酸変異を有する配列に示され、配列番号２４の４位のセリンがスレオニンに変換又は置換され（前記セリンは変換されているのが好ましい）、配列番号３のアミノ酸４８６～アミノ酸４９７又は配列番号４のアミノ酸４８６～アミノ酸４９７に位置する。ジテルペンアルコールシンターゼ活性を示す本発明によるポリペプチドにおけるこの領域は、相同な他のシンターゼにおける産物決定領域、特に公知のサルビア属（Ｓａｌｖｉａ）スクラレオールシンターゼと異なる。従って、好ましくは、ポリペプチドの上述の生物活性を有するフラグメントは、上記に明記されるような保存された産物成果決定領域のアミノ酸配列を含むことが想定される。典型的には、フラグメントは、上述の配列又は本発明の配列バリアントに由来する少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１５０又は少なくとも２００の連続したアミノ酸長を含むか又はそれからなり、且つジテルペンアルコールシンターゼ活性を提供する。
【0038】
コパリル二リン酸（ＣＰＰ）をマノオールに、ラブダ－１３－エン－８－オール二リン酸（ＬＰＰ）をスクラレオールに、且つ／又はＬＰＰをアビエノールに変換することができるジテルペンアルコールシンターゼ活性を示す上述のポリペプチドは、融合ポリペプチドにも含まれ得る。このような融合ポリペプチドは、ジテルペンアルコールシンターゼ活性を示すポリペプチドのアミノ酸配列に加えて、１つ以上の追加のアミノ酸配列を含む。前記追加のアミノ酸配列は、例えば、工程１の触媒用のＩＩ型ジテルペンシンターゼ活性などの他の酵素活性を有するポリペプチド、ジテルペンシンターゼ活性を示すポリペプチドを機能させるためのサポート機能を有するポリペプチド又は例えば適切な発現をモニターするため若しくは精製目的のためのマーカー若しくは標識機能を有するポリペプチド若しくはペプチド、例えばタグ（例えば、ＭＹＣタグ、ＦＬＡＧタグ、Ｈｉｓタグなど）若しくは蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＢＦＰ、ＹＦＰ若しくはＣＦＰ）であり得る。
【0039】
更に、本開示は、Ｃ２０テルペノイドアルコール、好ましくはマノオール、スクラレオール及び／又はアビエノールを調製する方法に関し、本方法は、酵素の存在下でそれぞれコパリル二リン酸（ＣＰＰ）及び／又はラブダ－１３－エン－８－オール二リン酸（ＬＰＰ）をＣ２０テルペノイドアルコール、好ましくはマノオール、スクラレオール及び／又はアビエノールに変換することを含み、酵素は、タグペプチドを含む第１のセグメントと、本発明によるジテルペンアルコールシンターゼを含む第２のセグメントとを含む。前記第１のセグメントと前記第２のセグメントとを含む酵素を、本明細書では「タグ化酵素」と称し得る。
【0040】
タグペプチドは、好ましくは、窒素利用タンパク質（ＮｕｓＡ）、チオレドキシン（Ｔｒｘ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ユビキチン類似因子（ＳＵＭＯ）又はカルシウム結合タンパク質（Ｆｈ８）及びその機能的相同体の群から選択される。本明細書で使用されるように、タグペプチドの機能的相同体は、非タグ化酵素と比較して、タグ化酵素の溶解性に少なくともほぼ同じ効果を有するタグペプチドである。典型的には、相同体は、その相同体のペプチドに１つ以上のアミノ酸が挿入、置換、欠失又は延長されている点で異なる。相同体は、特に、親水性アミノ酸の別の親水性アミノ酸への１つ以上の置換又は疎水性アミノ酸の別の疎水性アミノ酸への１つ以上の置換を含み得る。相同体は、特に、ＮｕｓＡ、Ｔｒｘ、ＭＢＰ、ＧＳＴ、ＳＵＭＯ又はＦｈ８の配列と少なくとも４０％、より詳細には少なくとも５０％、好ましくは少なくとも５５％、より好ましくは少なくとも６０％の配列同一性、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有し得る。
【0041】
特に好適なものは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来のマルトース結合タンパク質又はその機能的相同体である。
【0042】
本発明によるタグ化酵素を使用することは、生成物の増加、具体的にはテルペノイド又はテルペン、例えばＣ２０テルペノイドアルコール、好ましくはマノオール、スクラレオール及び／又はアビエノールの細胞生成の増加に寄与し得る点で特に有利である。
【0043】
タグ化酵素の溶解性を改善（タグ化されていない酵素と比較して）するために、酵素の第１のセグメントがそのＣ末端で第２のセグメントのＮ末端と結合されていることが好ましい。代替的に、タグ化酵素の第１のセグメントは、そのＮ末端で第２のセグメントのＣ末端と結合されている。
【0044】
更に、本発明は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸に関し、ポリペプチドは、タグペプチド、好ましくはＭＢＰ、ＮｕｓＡ、Ｔｒｘ、ＧＳＴ、ＳＵＭＯ若しくはＦｈ８－タグ又はこれらのいずれかの機能的相同体を含む第１のセグメントと、ジテルペンアルコールシンターゼを含む第２のセグメントとを含む。第２のセグメントは、例えば、配列番号３～７、２８～３０、３４若しくは４０～５４のいずれか１つに示されるようなアミノ酸配列又はその機能的類似体を含み得る。
【0045】
更に、本発明は、前記タグ化ジテルペンアルコールシンターゼをコードする前記核酸を含む宿主細胞に関する。タグ化酵素をコードする本発明による特定の核酸を、配列番号８～配列番号１０及び配列番号２８～３０のいずれか１つに示す。宿主細胞は、特に、それらの配列のいずれかを含む遺伝子又はその機能的類似体を含み得る。
【0046】
更に、本発明は、タグペプチドを含む第１のセグメントと、ポリプレニル二リン酸をテルペンに変換するための酵素活性を有するポリペプチド、特にジテルペンアルコールシンターゼを含む第２のセグメントとを含む酵素に関し、タグペプチドは、ＭＢＰ、ＮｕｓＡ、Ｔｒｘ又はＳＥＴの群から選択されることが好ましい。本発明によるタグ化酵素を含む特定の酵素を配列番号８～配列番号１０及び配列番号２８～３０のいずれか１つに示す。
【0047】
好ましくは、融合タンパク質は、ＩＩ型ジテルペンシンターゼの酵素活性を示すポリペプチドを更に含むものとする。工程ａ）における変換は、ゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰ）をＬＰＰ及び／又はＣＰＰに変換するＩＩ型ジテルペンシンターゼの酵素活性を示す、更なるポリペプチドによって行われる。従って、ジテルペンシンターゼ活性を示すポリペプチドは、好ましくは、ゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰ）をＬＰＰ及び／若しくはＣＰＰに変換するＩＩ型ジテルペンシンターゼの酵素活性を示すか、マルトース結合特性を有するか、又はチオレドキシン若しくはチオレドキシン融合タンパク質である少なくとも１つの更なるポリペプチドを含む融合ポリペプチドに含まれることが好ましい。より好ましくは、前記更なるポリペプチドは、好ましくは、コレウス・フォルスコリ（Ｃｏｌｅｕｓ ｆｏｒｓｋｏｈｌｉｉ）由来のＬＰＰシンターゼ（ＣｆＬＰＰＳ）（Ｐａｔｅｒａｋｉ，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１６４，１２２２－１２３６（２０１４）；国際公開第２０１５／０９１９４３号明細書）又はニコチアナ・タバカム（ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）由来のＬＰＰシンターゼ（ＮｔＬＰＰＳ）（Ｓａｌａｕｄ，Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ（２０１２）７２，１－１７；国際公開第２００８０７０３１Ａ１号明細書）、好ましくはコレウス・フォルスコリ（Ｃｏｌｅｕｓ ｆｏｒｓｋｏｈｌｉｉ）由来のＣＰＰシンターゼ（ＣｆＣＰＰＳ）（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２０１９）２９４（４）１３４９－１３６２；国際公開第２０２００２８７９５号明細書）、チオレドキシン及びマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）からなる群から選択される。
【0048】
本発明の方法の工程ａ）では、ゲラニルゲラニルピロリン酸が、コパリル二リン酸（ＣＰＰ）又はラブダ－１３－エン－８－オール二リン酸（ＬＰＰ）に変換される。前記変換は、典型的には、酵素的に行われる。ゲラニルゲラニルリン酸をＣＰＰ又はＬＰＰに変換することができる酵素は、当技術分野でよく知られている。好ましくは、変換は、ゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰ）をＬＰＰ及び／又はＣＰＰに変換するＩＩ型ジテルペンシンターゼ、より好ましくはＬＰＰシンターゼであり、好ましくはコレウス・フォルスコリ（Ｃｏｌｅｕｓ ｆｏｒｓｋｏｈｌｉｉ）由来のＬＰＰシンターゼ（ＣｆＬＰＰＳ）又はニコチアナ・タバカム（ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）（ＮｔＬＰＰＳ）由来のＬＰＰシンターゼ、好ましくはコレウス・フォルスコリ（Ｃｏｌｅｕｓ ｆｏｒｓｋｏｈｌｉｉ）由来のＣＰＰシンターゼ（ＣｆＣＰＰＳ）の酵素活性を示すポリペプチドによって行われる。ＩＩ型ジテルペンシンターゼ活性を示すポリペプチドは、本明細書の他の箇所でより詳細に記載されるように、本発明のジテルペンアルコールシンターゼ活性を示すポリペプチドと共に融合ポリペプチドに含まれることが理解されるであろう。
【0049】
上述の工程ａ）は、インビトロで、即ち上記に記載されるような変換に必要とされる全ての成分を含有する好適な反応バイアル中で実施され得る。当業者は、反応が効率的に行われるように、反応条件をどのように調整するのかを十分に認識している。例えば、好適な緩衝液を使用して、好適なｐＨ及び好適な塩濃度を有する環境で成分を供給することができる。このような設定における好適な温度も同様にそのまま適用することができる。
【0050】
代替的に、工程ａ）は、本明細書の他の箇所で記載されているような宿主細胞中で行われ得る。宿主細胞は、上記に明記されるようなＩＩ型変換酵素と同様に、ＧＧＰを生成することができるものとすることを理解されたい。必要であれば、このようなＩＩ型酵素又はＧＧＰ合成に必要とされる他の酵素若しくはタンパク質を発現させるために、宿主細胞を遺伝子改変する必要がある。宿主細胞は、上述の酵素を発現させ、ＧＧＰをＣＰＰ及び／又はＬＰＰに変換することが可能となるのに十分な条件下及び時間で培養するものとする。特に好ましい条件は、下記に添付される実施例にも記載されている。
【0051】
更に、本発明の方法の工程ａ）は、生物、典型的には本明細書の他の箇所で言及されるトランスジェニック非ヒト生物などの多細胞生物でも実施することができる。典型的には、前記生物は、ＧＧＰからＣＰＰ及び／又はＬＰＰに変換するのに必要とされるＩＩ型酵素が発現されるように遺伝子改変される。
【0052】
本発明の方法の工程ｂ）では、ＣＰＰ又はＬＰＰは、少なくとも１つのＣ２０テルペノイドアルコールに変換され、前記変換は、ジテルペンアルコールシンターゼ活性を示すポリペプチドによって行われ、前記ジテルペンアルコールシンターゼ活性は、好ましくは、本発明のジテルペンアルコールシンターゼにより、コパリル二リン酸（ＣＰＰ）をマノオールに、ラブダ－１３－エン－８－オール二リン酸（ＬＰＰ）をスクラレオールに、且つ／又はＬＰＰをアビエノールに変換することができる。
【0053】
本発明の方法の工程ｂ）は、インビトロでも実施され得るか、又は上記の工程ａ）に明記されるような宿主細胞若しくは生物において行われ得る。特に好ましい条件は、下記に添付される実施例に記載されている。
【0054】
好ましくは、前記工程ｂ）又は前記工程ａ）及びｂ）は、宿主細胞又は非ヒトトランスジェニック生物において行われる。より好ましくは、前記宿主細胞又は非ヒトトランスジェニック生物は、本明細書の他の箇所でより詳細に記載されているような本発明の宿主細胞又は非ヒトトランスジェニック生物である。宿主細胞又は非ヒトトランスジェニック生物において工程ｂ）又は工程ａ）及びｂ）を実施するために適用される必要のある条件は、前記宿主細胞又は非ヒトトランスジェニック生物に応じたものであることが理解されるであろう。しかしながら、当業者は、所与の宿主細胞又は非ヒトトランスジェニック生物の選択に応じて、どのような条件を適用する必要があるのかを十分に認識している。
【0055】
好ましくは、本発明の方法は、前記製造された少なくとも１つのＣ２０テルペノイドアルコールを得る工程を含む。
【0056】
本明細書で使用される「得る」という用語は、工程ｂ）後に少なくとも１つのＣ２０テルペノイドアルコールを任意の程度の純度で提供することを指す。従って、少なくとも１つのＣ２０テルペノイドアルコールは、本質的に純粋な形態において又は追加の成分を含む組成物として提供され得る。従って、本発明の方法は、工程ｂ）が完了した後、１つ以上の精製工程を包含し得る。適用する必要のある精製技術は、本発明の方法の工程ａ）及び／又はｂ）をどのように実施するのかによる。例えば、これらの工程がインビトロで、即ち単離された成分、例えば単離された酵素、付加物及び補助成分、例えば反応緩衝液を使用して反応バイアル中で実施された場合、例えば本質的に純粋な少なくとも１つのＣ２０テルペノイドアルコールを得るためには、より少ない精製が必要となることが理解されるであろう。しかしながら、工程ａ）及びｂ）をインビボで、即ち本明細書の他の箇所で定義されるような宿主細胞において実施する場合、更なる精製工程と前処理工程とが必要となる可能性がある。典型的には、回収する必要のある宿主細胞と回収された細胞とを、前記細胞からＣ２０テルペノイドアルコールを放出させるために溶解しなければならない可能性がある。その後の精製工程では、残存成分からＣ２０テルペノイドアルコールを精製することを目的として、細胞片も同様に除去しなければならない。更に、工程を動物又は植物においてインビボで実施する場合、少なくとも１つのＣ２０テルペノイドアルコールを得るために、より更なる前処理及び／又は精製工程が必要となる可能性がある。当業者は、工程ａ）及びｂ）が実施される所与の状況に応じた好適な前処理及び／又は精製工程を十分に認識している。想定される精製技術は、抽出技術、ＬＣ、ＧＣ又はＨＰＬＣなどのクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、蒸留、遠心分離、濾過などであり得る。想定される前処理工程は、回収、熱処理、超音波処理、化学物質及び／又は酵素による処理などであり得る。特に好ましい処置は、下記に添付される実施例に記載されている。
【0057】
有利には、本発明の基礎をなす研究により、キュプレサ・ギガンテア（Ｃｕｐｒｅｓｓａ ｇｉｇａｎｔｅａ）由来の工程２の酵素のファミリー、即ちＣｕｐ２ｖ１及びＣｕｐ２ｖ２ｂは、ＣＰＰ及びＬＰＰをＣ２０テルペノイドアルコールであるマノオール、スクラレオール及び／又はアビエノールに効率的に変換できることが明らかになった。特に、Ｃｕｐ２ｖ１及びＣｕｐ２ｖ２ｂ酵素を例えばロドバクター属（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）において発現させた場合、下記に添付されている実施例に記載されているように、Ｃ２０テルペノイドアルコールを組換え製造するのに特に効率的であることが判明した。更に、Ｃｕｐ２ｖ２ａ及びＣｕｐ２ｖ２ｂ酵素、即ち本明細書の他の箇所に明記されるような配列番号４、６、７、９、１０若しくは３４のいずれか１つに示されるようなアミノ酸配列を有するポリペプチド又はそのバリアントは、２つのＣ２０テルペノイドアルコール、即ちマノオール及びスクラレオールを生成することができることが判明した。Ｃｕｐ２ｖ１、即ち本明細書の他の箇所に明記されるような配列番号３、５若しくは８に示されるようなアミノ酸配列を有するポリペプチド又はそのバリアントは、アビエノールを生成するのに効率的であった。
【0058】
本発明により、Ｃ２０テルペノイドアルコールを特に組換え製造手法においてより効率的に製造することが可能となる。
【0059】
一実施形態では、ある酵素がＣ２０テルペノイドアルコールを優先的に生成する場合、その酵素は本発明の方法において有用であると見なされる。更なる実施形態では、Ｃ２０テルペノイドアルコールを優先的に生成するとは、酵素によって生成される生成物間において酵素が活性化するのに好適な条件下で酵素に多種多様な基質が提供される場合、Ｃ２０テルペノイドアルコールが優勢となることを理解されたい。例えば、酵素によって生成される全ての分子から、分子の５０％超がＣ２０テルペノイドアルコールである。
【0060】
別の実施形態では、ジテルペンアルコールシンターゼ活性を示す本発明のポリペプチドは、ＣＰＰからマノオールを、且つ／又はＬＰＰからスクラレオールを、且つ／又はＬＰＰからアビエノールを優先的に生成するという事実を特徴とする。
【0061】
更なる実施形態では、マノオール、スクラレオール及び／又はアビエノールを優先的に生成するとは、酵素によって生成される生成物間において酵素が活性化するのに好適な条件下で酵素に好適な基質、例えばＬＰＰ又はＣＰＰが提供される場合、マノオール、スクラレオール及び／又はアビエノールが優勢となることを理解されたい。例えば、酵素によって生成される全ての分子から、分子の５０％超がこれらマノオール、スクラレオール又はアビエノールのいずれか１つである。
【0062】
本発明は、
ａ）本発明の方法、好ましくは請求項１～５のいずれか一項に記載の方法に従い、１つ以上のＣ２０テルペノイドアルコール、好ましくはアビエノール、マノオール及び／又はスクラレオールを生成する工程、
ｂ）任意選択により、前記１つ以上のＣ２０テルペノイドアルコールを精製する工程、及び
ｃ）前記１つ以上のＣ２０テルペノイドアルコールによって芳香組成物を調製及び配合する工程
を含む、芳香組成物を生成する方法に更に関する。
ａ）本発明の方法、好ましくは請求項１～５のいずれか一項に記載の方法に従い、１つ以上のＣ２０テルペノイドアルコール、好ましくはアビエノール、マノオール及び／又はスクラレオールを生成する工程、
ｂ）任意選択により、前記１つ以上のＣ２０テルペノイドアルコールを精製する工程、及び
ｃ）前記１つ以上のＣ２０テルペノイドアルコールによって芳香組成物を調製及び配合する工程
を含む、芳香組成物を生成する方法に更に関する。
【0063】
本明細書で使用される芳香組成物は、例えば、香味料、芳香剤又は香料であり得、例えばＣｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｆｌａｖｏｒｓ ａｎｄ Ｆｒａｇｒａｎｃｅｓ，Ｅｄｉｔｏｒ（ｓ）；Ｄａｖｉｄ Ｊ．Ｒｏｗｅ，Ｆｉｒｓｔ ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ；２６ Ｏｃｔｏｂｅｒ ２００４，Ｐｒｉｎｔ ＩＳＢＮ：９７８１４０５１１４５０９｜Ｏｎｌｉｎｅ ＩＳＢＮ：９７８１４４４３０５５１７｜ＤＯＩ：１０．１００２／９７８１４４４３０５５１７，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｌｔｄ．を参照されたい。
【0064】
以上の本明細書でなされた用語の定義及び説明は、別途指定される場合を除いて、本発明の以下の実施形態に変更すべき点を変更して適用される。
【0065】
本発明は、本発明の方法によって得ることができる前記少なくとも１つのＣ２０テルペノイドアルコール、好ましくはマノオール、スクラレオール及び／又はアビエノールを含む組成物又は芳香組成物も提供する。
【0066】
加えて、本発明は、宿主細胞又は非ヒトトランスジェニック生物並びに本発明の方法、好ましくは請求項１～５のいずれか一項に記載の方法によって得ることができる前記少なくとも１つのＣ２０テルペノイドアルコール、好ましくはマノオール、スクラレオール及び／又はアビエノールを含む組成物であって、宿主細胞又は非ヒトトランスジェニック生物は、組換えにより、
ａ）配列番号３～１０又は配列番号３４のいずれか１つに示されるようなアミノ酸配列；
ｂ）配列番号３～１０又は配列番号３４のいずれか１つに示されるようなアミノ酸配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列；
ｃ）配列番号１、２、１６、１７、１８又は３５に示されるような核酸配列によってコードされるアミノ酸配列；
ｄ）配列番号１、２、１６、１７、１８又は３５に示されるような核酸配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一である核酸配列によってコードされるアミノ酸配列；及び
ｅ）（ａ）～（ｄ）のいずれか１つのフラグメントであって、コパリル二リン酸（ＣＰＰ）をマノオールに、ラブダ－１３－エン－８－オール二リン酸（ＬＰＰ）をスクラレオールに、且つ／又はＬＰＰをアビエノールに変換することができるジテルペンアルコールシンターゼ活性を示すポリペプチドをコードするフラグメントのアミノ酸配列
を有する、ジテルペンアルコールシンターゼ活性を示す少なくとも１つのポリペプチドを含む、組成物に関する。
ａ）配列番号３～１０又は配列番号３４のいずれか１つに示されるようなアミノ酸配列；
ｂ）配列番号３～１０又は配列番号３４のいずれか１つに示されるようなアミノ酸配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列；
ｃ）配列番号１、２、１６、１７、１８又は３５に示されるような核酸配列によってコードされるアミノ酸配列；
ｄ）配列番号１、２、１６、１７、１８又は３５に示されるような核酸配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一である核酸配列によってコードされるアミノ酸配列；及び
ｅ）（ａ）～（ｄ）のいずれか１つのフラグメントであって、コパリル二リン酸（ＣＰＰ）をマノオールに、ラブダ－１３－エン－８－オール二リン酸（ＬＰＰ）をスクラレオールに、且つ／又はＬＰＰをアビエノールに変換することができるジテルペンアルコールシンターゼ活性を示すポリペプチドをコードするフラグメントのアミノ酸配列
を有する、ジテルペンアルコールシンターゼ活性を示す少なくとも１つのポリペプチドを含む、組成物に関する。
【0067】
更に、本発明は、ジテルペンアルコールシンターゼ活性を示すポリペプチドであって、前記ジテルペンアルコールシンターゼ活性は、コパリル二リン酸（ＣＰＰ）をマノオールに、ラブダ－１３－エン－８－オール二リン酸（ＬＰＰ）をスクラレオールに、且つ／又はＬＰＰをアビエノールに変換することができ、前記ポリペプチドは、
ａ）配列番号３～１０又は配列番号３４のいずれか１つに示されるようなアミノ酸配列；
ｂ）配列番号３～１０又は配列番号３４のいずれか１つに示されるようなアミノ酸配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列；
ｃ）配列番号１、２、１６、１７、１８又は３５に示されるような核酸配列によってコードされるアミノ酸配列；
ｄ）配列番号１、２、１６、１７、１８又は３５に示されるような核酸配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一である核酸配列によってコードされるアミノ酸配列；及び
ｅ）（ａ）～（ｄ）のいずれか１つのフラグメントであって、コパリル二リン酸（ＣＰＰ）をマノオールに、ラブダ－１３－エン－８－オール二リン酸（ＬＰＰ）をスクラレオールに、且つ／又はＬＰＰをアビエノールに変換することができるジテルペンアルコールシンターゼ活性を示すポリペプチドをコードするフラグメントのアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、ポリペプチドにも関する。
ａ）配列番号３～１０又は配列番号３４のいずれか１つに示されるようなアミノ酸配列；
ｂ）配列番号３～１０又は配列番号３４のいずれか１つに示されるようなアミノ酸配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列；
ｃ）配列番号１、２、１６、１７、１８又は３５に示されるような核酸配列によってコードされるアミノ酸配列；
ｄ）配列番号１、２、１６、１７、１８又は３５に示されるような核酸配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一である核酸配列によってコードされるアミノ酸配列；及び
ｅ）（ａ）～（ｄ）のいずれか１つのフラグメントであって、コパリル二リン酸（ＣＰＰ）をマノオールに、ラブダ－１３－エン－８－オール二リン酸（ＬＰＰ）をスクラレオールに、且つ／又はＬＰＰをアビエノールに変換することができるジテルペンアルコールシンターゼ活性を示すポリペプチドをコードするフラグメントのアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、ポリペプチドにも関する。
【0068】
好ましくは、前記ジテルペンアルコールシンターゼ活性は、ＣＰＰをマノオールに、且つＬＰＰをスクラレオールに変換することができる。より好ましくは、前記ポリペプチドは、
ａ）配列番号４、６、７、９、１０又は３４に示されるようなアミノ酸配列；
ｂ）配列番号４、６、７、９、１０又は３４に示されるようなアミノ酸配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列；
ｃ）配列番号２、１６、１７又は３５に示されるような核酸配列によってコードされるアミノ酸配列；
ｄ）配列番号２、１６、１７又は３５に示されるような核酸配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一である核酸配列によってコードされるアミノ酸配列；及び
ｅ）（ａ）～（ｄ）のいずれか１つのフラグメントであって、ＣＰＰをマノオールに、且つＬＰＰをスクラレオールに変換することができるジテルペンアルコールシンターゼ活性を示すポリペプチドをコードするフラグメントのアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
ａ）配列番号４、６、７、９、１０又は３４に示されるようなアミノ酸配列；
ｂ）配列番号４、６、７、９、１０又は３４に示されるようなアミノ酸配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列；
ｃ）配列番号２、１６、１７又は３５に示されるような核酸配列によってコードされるアミノ酸配列；
ｄ）配列番号２、１６、１７又は３５に示されるような核酸配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一である核酸配列によってコードされるアミノ酸配列；及び
ｅ）（ａ）～（ｄ）のいずれか１つのフラグメントであって、ＣＰＰをマノオールに、且つＬＰＰをスクラレオールに変換することができるジテルペンアルコールシンターゼ活性を示すポリペプチドをコードするフラグメントのアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【0069】
好ましくは、前記ジテルペンアルコールシンターゼ活性は、ＬＰＰをアビエノールに変換することもできる。より好ましくは、前記ポリペプチドは、
ａ）配列番号３、５又は８に示されるようなアミノ酸配列；
ｂ）配列番号３、５又は８に示されるようなアミノ酸配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列；
ｃ）配列番号１又は１８に示されるような核酸配列によってコードされるアミノ酸配列；
ｄ）配列番号１又は１８に示されるような核酸配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一である核酸配列によってコードされるアミノ酸配列；及び
ｅ）（ａ）～（ｄ）のいずれか１つのフラグメントであって、ＬＰＰをアビエノールに変換することができるジテルペンアルコールシンターゼ活性を示すポリペプチドをコードするフラグメントのアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
ａ）配列番号３、５又は８に示されるようなアミノ酸配列；
ｂ）配列番号３、５又は８に示されるようなアミノ酸配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列；
ｃ）配列番号１又は１８に示されるような核酸配列によってコードされるアミノ酸配列；
ｄ）配列番号１又は１８に示されるような核酸配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一である核酸配列によってコードされるアミノ酸配列；及び
ｅ）（ａ）～（ｄ）のいずれか１つのフラグメントであって、ＬＰＰをアビエノールに変換することができるジテルペンアルコールシンターゼ活性を示すポリペプチドをコードするフラグメントのアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【0070】
本発明は、本発明のポリペプチドと、（ｉ）好ましくはゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰ）をＬＰＰ及び／若しくはＣＰＰに変換するＩＩ型ジテルペンシンターゼの酵素活性を示すか、（ｉｉ）マルトース結合特性を有するか、又は（ｉｉｉ）チオレドキシン若しくはチオレドキシン融合タンパク質である少なくとも１つの更なるポリペプチドとを含む融合ポリペプチドも意図する。より好ましくは、前記更なるポリペプチドは、好ましくは、コレウス・フォルスコリ（Ｃｏｌｅｕｓ ｆｏｒｓｋｏｈｌｉｉ）由来のＬＰＰシンターゼ（ＣｆＬＰＰＳ）又はニコチアナ・タバカム（ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）由来のＬＰＰシンターゼ（ＮｔＬＰＰＳ）、好ましくはコレウス・フォルスコリ（Ｃｏｌｅｕｓ ｆｏｒｓｋｏｈｌｉｉ）由来のＣＰＰシンターゼ（ＣｆＣＰＰＳ）、チオレドキシン及びマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）からなる群から選択される。
【0071】
本発明は、本発明のジテルペンアルコールシンターゼ活性を有するポリペプチドを生成する方法であって、
（ａ）ジテルペンアルコールシンターゼ活性を有するポリペプチドを発現させるために、本発明の核酸配列で宿主細胞又は単細胞生物を形質転換すること；
（ｂ）工程（ａ）の宿主細胞から、ジテルペンアルコールシンターゼ活性を有する前記ポリペプチドを得るか又は単離すること；及び
（ｃ）任意選択により、ジテルペンアルコールシンターゼ活性を有する前記ポリペプチドを精製すること
を含む方法にも関する。
（ａ）ジテルペンアルコールシンターゼ活性を有するポリペプチドを発現させるために、本発明の核酸配列で宿主細胞又は単細胞生物を形質転換すること；
（ｂ）工程（ａ）の宿主細胞から、ジテルペンアルコールシンターゼ活性を有する前記ポリペプチドを得るか又は単離すること；及び
（ｃ）任意選択により、ジテルペンアルコールシンターゼ活性を有する前記ポリペプチドを精製すること
を含む方法にも関する。
【0072】
本発明は、
ａ）本発明の核酸又は本発明のポリペプチドをコードする核酸を選択する工程；
ｂ）選択された核酸を改変して、少なくとも１つの変異核酸を得る工程；
ｃ）宿主細胞又は単細胞生物を変異核酸配列で形質転換して、変異核酸配列によってコードされるポリペプチドを発現させる工程；
ｄ）少なくとも１つの改変された特性及びジテルペンアルコールシンターゼ活性についてポリペプチドをスクリーニングする工程；及び
ｅ）任意選択により、ポリペプチドが所望のバリアントジテルペンアルコールシンターゼ活性を有しない場合、所望のバリアントジテルペンアルコールシンターゼ活性を有するポリペプチドが得られるまでプロセス工程（ａ）～（ｄ）を繰り返す工程；
ｆ）任意選択により、所望のバリアントジテルペンアルコールシンターゼ活性を有するポリペプチドが工程（ｄ）で同定された場合、工程（ｃ）で得られた対応する変異核酸を単離する工程
を含む、ジテルペンアルコールシンターゼ活性を有するバリアントポリペプチドを調製する方法に更に関する。
ａ）本発明の核酸又は本発明のポリペプチドをコードする核酸を選択する工程；
ｂ）選択された核酸を改変して、少なくとも１つの変異核酸を得る工程；
ｃ）宿主細胞又は単細胞生物を変異核酸配列で形質転換して、変異核酸配列によってコードされるポリペプチドを発現させる工程；
ｄ）少なくとも１つの改変された特性及びジテルペンアルコールシンターゼ活性についてポリペプチドをスクリーニングする工程；及び
ｅ）任意選択により、ポリペプチドが所望のバリアントジテルペンアルコールシンターゼ活性を有しない場合、所望のバリアントジテルペンアルコールシンターゼ活性を有するポリペプチドが得られるまでプロセス工程（ａ）～（ｄ）を繰り返す工程；
ｆ）任意選択により、所望のバリアントジテルペンアルコールシンターゼ活性を有するポリペプチドが工程（ｄ）で同定された場合、工程（ｃ）で得られた対応する変異核酸を単離する工程
を含む、ジテルペンアルコールシンターゼ活性を有するバリアントポリペプチドを調製する方法に更に関する。
【0073】
本発明は、本発明のポリペプチド若しくは本発明の融合ポリペプチド又はその逆相補配列若しくは相補配列をコードするポリヌクレオチドに関する。
【0074】
本明細書に従って使用される「ポリヌクレオチド」という用語は、一本鎖又は二本鎖形態のいずれかのデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドポリマーを指し、別途限定されない限り、それらが天然に存在するヌクレオチド（例えば、ペプチド核酸）と同様に一本鎖核酸とハイブリダイズする点において天然ヌクレオチドの基本的性質を有する既知の類似体を包含する。本明細書で使用される用語は、本明細書で明記された配列と同様に、その相補配列又は逆相補配列を包含する。従って、用語は、安定性又は他の理由のために修飾された主鎖を有するＤＮＡ又はＲＮＡを包含する。更に、２つ例を挙げると、イノシンなどの通常のものではない塩基又はトリチル化塩基などの修飾塩基を含むＤＮＡ又はＲＮＡも、ポリヌクレオチドとして包含される。当業者に公知の多くの有用な目的を果たすＤＮＡ及びＲＮＡに対して、多岐にわたる修飾がなされてきたことが理解されるであろう。本発明の特定のポリペプチドをコードする本明細書の全ての核酸配列は、遺伝コードの縮重によるサイレント変異を有し得る。遺伝コードの縮重により、同一のポリペプチドをコードする非常に多くの機能的に同一なポリヌクレオチドが生じる。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ及びＧＣＵは、全てアミノ酸のアラニンをコードする。従って、コドンによってアラニンが指定される全ての位置において、コードされるポリペプチドを変更することなく、記載される対応するコドンのいずれかにコドンを変更することができる。このような核酸変異は、サイレント変異である。
【0075】
本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドをコードするものとし、即ち本発明の前記ポリペプチドをコードする核酸配列を含むものとする。加えて、本発明のポリヌクレオチドは、追加の核酸配列を含み得る。好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、オープンリーディングフレームに加えて、コード遺伝子領域の３’末端及び５’末端、即ちコード領域の５’末端の上流の配列の少なくとも５００、好ましくは２００、より好ましくは１００ヌクレオチドと、コード遺伝子領域の３’末端の下流の配列の少なくとも１００、好ましくは５０、より好ましくは２０ヌクレオチドとに更なる非翻訳配列を含み得る。
【0076】
本発明のポリヌクレオチドは、好ましくは、単離されたポリヌクレオチド（即ち精製された若しくはその天然の遺伝子座などの自然な状況から少なくとも単離された）として又は遺伝子改変された若しくは外因的に（即ち人為的に）操作された形態で提供されるものとする。単離されたポリヌクレオチドは、例えば、核酸が由来する細胞のゲノムＤＮＡ内で核酸分子に天然に隣接する約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂ又は０．１ｋｂ未満のヌクレオチド配列を含み得る。ポリヌクレオチドは、好ましくは、二本鎖又は一本鎖分子の形態で提供される。本発明は、本発明の前述のポリヌクレオチドのいずれかに言及することにより、前に言及された特定の配列又はそのバリアントの相補鎖又は逆相補鎖にも言及することが理解されるであろう。ポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡを含むＤＮＡポリヌクレオチド又はＲＮＡポリヌクレオチドを包含する。
【0077】
しかしながら、本発明は、本発明のポリヌクレオチドに由来し、本発明のポリヌクレオチドの転写又は翻訳を妨害することができるポリヌクレオチドバリアントにも関する。このようなバリアントポリヌクレオチドとしては、アンチセンス核酸、リボザイム、ｓｉＲＮＡ分子、モルホリノ核酸（ホスホロジアミデートモルホリノオリゴ）、三重らせん形成オリゴヌクレオチド、阻害オリゴヌクレオチド又はマイクロＲＮＡ分子が挙げられるが、これらの全ては、相補配列又は実質的な相補配列の存在により本発明のポリヌクレオチドを特異的に認識するものとする。これらの技術は、当業者によく知られている。上述の種類の適切なバリアントポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドの構造に基づいて容易に設計することができる。
【0078】
更に、グリコシル化若しくはメチル化ポリヌクレオチドなどの天然に存在する修飾されたポリヌクレオチド又はビオチン化ポリヌクレオチドなどの人為的に修飾されたポリヌクレオチドを含む、化学的に修飾されたポリヌクレオチドも含まれる。
【0079】
本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター又は遺伝子構築物にも関する。
【0080】
「ベクター」という用語は、好ましくは、ファージ、プラスミド、コスミド、ウイルスベクター及び細菌又は酵母人工染色体（ＹＡＣ）などの人工染色体を包含する。本発明のポリヌクレオチドを包含するベクターは、好ましくは、宿主における増殖及び／又は選択のための選択マーカーを更に含む。ベクターは、当技術分野でよく知られた様々な技術によって宿主細胞に組み込まれ得る。宿主細胞に導入する場合、ベクターは、細胞質に存在し得るか、又はゲノムに組み込まれ得る。後者の場合、ベクターは、相同組換え又は異種挿入を可能にする核酸配列を更に含み得ることを理解されたい。ベクターは、従来の形質転換技術又はトランスフェクション技術によって原核細胞又は真核細胞に導入することができる。これに関連して使用される場合、「形質転換」及び「トランスフェクション」、コンジュゲーション及び形質導入という用語は、リン酸カルシウム、塩化ルビジウム又は塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、ｆ因子による接合、天然コンピテンス、炭素系クラスター、化学的媒介導入、エレクトロポレーション又は微粒子銃を含む、外来核酸（例えば、ＤＮＡ）を宿主細胞に導入するための複数の先行技術のプロセスを含むことが意図される。植物細胞を含む宿主細胞の形質転換又はトランスフェクションに好適な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）及び他の実験手引書、例えばＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９５，Ｖｏｌ．４４，Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｅｄ．；Ｇａｒｔｌａｎｄ ａｎｄ Ｄａｖｅｙ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙに見出すことができる。代替的に、熱ショック又はエレクトロポレーション技術によってプラスミドベクターを導入し得る。ベクターがウイルスである場合、宿主細胞に適用する前に適切なパッケージング細胞株を使用してインビトロでパッケージングし得る。
【0081】
好ましくは、本明細書で言及されるベクターは、クローニングベクター、即ち微生物系で複製可能なクローニングベクターとして好適である。このようなベクターにより、細菌、好ましくは酵母又は真菌における効率的なクローニングが確実となり、植物の安定的な形質転換が可能となる。挙げるべきベクターは、特に、Ｔ ＤＮＡに媒介される形質転換に好適な様々なバイナリーベクター系及び同時組み込みベクター系である。このようなベクター系は、通例、少なくともｖｉｒ遺伝子（アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）に媒介される形質転換に必要とされる）と、Ｔ－ＤＮＡの境界を定める配列（Ｔ－ＤＮＡボーダー）とを含むことを特徴とする。これらのベクター系には、好ましくは、プロモーター及びターミネーターなどの更なるシス調節領域並びに／又は好適な形質転換宿主細胞若しくは生物を同定することができる選択マーカーも含まれる。同時組み込みベクター系は、ｖｉｒ遺伝子とＴ ＤＮＡ配列とが同じベクター上に配置されている一方、バイナリー系は、少なくとも２つのベクターをベースとしたものであり、その一方は、ｖｉｒ遺伝子を有するが、Ｔ－ＤＮＡがなく、第２のものは、Ｔ ＤＮＡを有するが、ｖｉｒ遺伝子がない。結果として、後者で述べたベクターは比較的小さく、操作が容易であり、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）及びアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の両方で複製可能である。これらのバイナリーベクターとしては、ｐＢＩＢ－ＨＹＧ、ｐＰＺＰ、ｐＢｅｃｋｓ、ｐＧｒｅｅｎシリーズのベクターが挙げられる。好ましくは、本発明に従って使用されるのは、Ｂｉｎ１９、ｐＢＩ１０１、ｐＢｉｎＡＲ、ｐＧＰＴＶ及びｐＣＡＭＢＩＡである。バイナリーベクター及びそれらの使用についての概要は、Ｈｅｌｌｅｎｓ ｅｔ ａｌ，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０００）５，４４６－４５１に見出すことができる。更に、適切なクローニングベクターを使用することにより、ポリヌクレオチドを宿主細胞又は植物若しくは動物などの生物に導入することが可能となり、これにより、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ），ｃｈａｐｔｅｒ ６／７，ｐｐ．７１－１１９（１９９３）；Ｆ．Ｆ．Ｗｈｉｔｅ，Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎ Ｈｉｇｈｅｒ Ｐｌａｎｔｓ；ｉｎ；Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｐｌａｎｔｓ，ｖｏｌ．１，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ，Ｅｄ．；Ｋｕｎｇ ａｎｄ Ｒ．Ｗｕ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９３，１５－３８；Ｂ．Ｊｅｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ，ｉｎ；Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｐｌａｎｔｓ，ｖｏｌ．１，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ，Ｅｄ．；Ｋｕｎｇ ａｎｄ Ｒ．Ｗｕ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９３），１２８－１４３；Ｐｏｔｒｙｋｕｓ １９９１，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．４２，２０５ ２２５に公開及び引用されているものなどのような植物の形質転換に使用することができる。
【0082】
より好ましくは、本発明のベクターは発現ベクターである。このような発現ベクターでは、即ち、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターは、原核細胞若しくは真核細胞又はその単離分画に発現させることができる、発現制御配列（「発現カセット」とも呼ばれる）に作動可能に連結された核酸配列を有する。好適な発現ベクターは当技術分野で公知であり、例えばＯｋａｙａｍａ－Ｂｅｒｇ ｃＤＮＡ発現ベクターであるｐｃＤＶ１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＣＤＭ８、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ１、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅ）又はｐＳＰＯＲＴ１（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）である。更なる典型的な融合発現ベクターの例は、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ；Ｓｍｉｔｈ １９８８，Ｇｅｎｅ ６７：３１－４０）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）及びｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）であり、それぞれ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質及びプロテインＡが組換え標的タンパク質と融合されている。好適な誘導可能な非融合性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現ベクターの例は、特に、ｐＴｒｃ（Ａｍａｎｎ １９８８，Ｇｅｎｅ ６９：３０１－３１５）及びｐＥＴ １１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒ １９９０，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５，６０－８９）である。ｐＴｒｃベクターの標的遺伝子の発現は、宿主のＲＮＡポリメラーゼによるハイブリッドｔｒｐ－ｌａｃ融合プロモーターからの転写に基づいて行われる。ｐＥＴ １１ｄベクターによる標的遺伝子の発現は、Ｔ７－ｇｎ１０－ｌａｃ融合プロモーターの転写に基づいて行われ、この転写は、同時発現させたウイルスＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７ ｇｎ１）によって媒介される。このウイルスポリメラーゼは、ｌａｃＵＶ ５プロモーターの転写制御下にあるＴ７ ｇｎ１遺伝子を保有する常在性ラブダ－プロファージに由来する宿主株ＢＬ２１（ＤＥ３）又はＨＭＳ１７４（ＤＥ３）により提供される。当業者は、原核生物に好適な他のベクターに精通しており、これらのベクターは、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ではｐＬＧ３３８、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＢＲ３２２などのｐＢＲシリーズ、ｐＵＣ１８又はｐＵＣ１９などのｐＵＣシリーズ、Ｍ１１３ｍｐシリーズ、ｐＫＣ３０、ｐＲｅｐ４、ｐＨＳ１、ｐＨＳ２、ｐＰＬｃ２３６、ｐＭＢＬ２４、ｐＬＧ２００、ｐＵＲ２９０、ｐＩＮ－ＩＩＩ１１３－Ｂ１、ｌａｍｂｄａｇｔ１１又はｐＢｄＣｌ、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）ではｐｌＪ１０１、ｐｌＪ３６４、ｐｌＪ７０２又はｐｌＪ３６１、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ではｐＵＢ１１０、ｐＣ１９４又はｐＢＤ２１４、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ではｐＳＡ７７又はｐＡＪ６６７である。酵母であるＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における発現用のベクターの例は、ｐＹｅｐ Ｓｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉ １９８７，Ｅｍｂｏ Ｊ．６：２２９－２３４）、ｐＭＦａ（Ｋｕｒｊａｎ １９８２，Ｃｅｌｌ ３０：９３３－９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚ １９８７，Ｇｅｎｅ ５４：１１３－１２３）及びｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を含む。ベクター及び糸状菌などの他の真菌に使用するのに好適なベクターを構築するためのプロセスは、ｖａｎ ｄｅｎ Ｈｏｎｄｅｌ，Ｃ．Ａ．Ｍ．Ｊ．Ｊ．，＆Ｐｕｎｔ，Ｐ．Ｊ．（１９９１）“Ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ ｖｅｃｔｏｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｆｏｒ ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｆｕｎｇｉ，ｉｎ；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｆｕｎｇｉ，Ｊ．Ｆ．Ｐｅｂｅｒｄｙ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄ．，ｐｐ．１－２８，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ又はＭｏｒｅ Ｇｅｎｅ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｆｕｎｇｉ（Ｊ．Ｗ．Ｂｅｎｎｅｔｔ＆Ｌ．Ｌ．Ｌａｓｕｒｅ，Ｅｄ．，ｐｐ．３９６－４２８；Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）に詳細に記載されているプロセスが含まれる。更に適切な酵母ベクターは、例えば、ｐＡＧ－１、ＹＥｐ６、ＹＥｐ１３又はｐＥＭＢＬＹｅ２３である。別の方法として、本発明のポリヌクレオチドは、バキュロウイルス発現ベクターを使用して昆虫細胞に発現させることもできる。培養した昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）にタンパク質を発現させるために利用可能なバキュロウイルスベクターは、ｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉｔｈ １９８３，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．３：２１５６－２１６５）及びｐＶＬシリーズ（Ｌｕｃｋｌｏｗ １９８９，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７０：３１－３９）を含む。
【0083】
更に、ベクターは、組み込みベクターであり得る。組み込みベクターは、例えば、細菌のゲノムなどの微生物のゲノムに組み込むことができる直鎖状又は環状ＤＮＡ分子を指し、本発明のアルコールアシルトランスフェラーゼなどの目的のポリペプチドをコードする遺伝子の安定な遺伝的形質をもたらす。組み込みベクターは、一般に、その転写をもたらす更なる核酸セグメントの制御下で（即ち作動可能に連結された）目的のポリペプチドをコードする遺伝子配列を含む１つ以上のセグメントを含む。
【0084】
このような更なるセグメントは、プロモーター及び終結配列並びに通常、相同組換えのプロセスによって標的細胞のゲノムに目的遺伝子の組み込みを誘発する１つ以上のセグメントを含み得る。典型的には、組み込みベクターは、標的細胞に導入することができるベクターであるが、その生物で機能しないレプリコンを有する。目的遺伝子を含むセグメントの組み込みは、そのセグメント内に適切なマーカーが含まれる場合に選択され得る。本発明の宿主細胞で発現させるポリペプチドに天然には関係しない、適切なシグナルペプチドをコードする１つ以上の核酸配列が、（発現）ベクターに組み込まれ得る。例えば、シグナルペプチドリーダーのＤＮＡ配列は、本発明のアルコールアシルトランスフェラーゼがシグナルペプチドを含む融合タンパク質として最初に翻訳されるように、本発明の核酸にインフレームで融合され得る。シグナルペプチドの性質に応じて、発現されるポリペプチドは、異なる標的化を受ける。意図される宿主細胞において機能的な分泌シグナルペプチドにより、例えば発現されたポリペプチドの細胞外分泌が促進される。他のシグナルペプチドにより、発現されたポリペプチドが、葉緑体、ミトコンドリア及びペルオキシソームのような特定のオルガネラに誘導される。シグナルペプチドは、意図されるオルガネラへの輸送時又は細胞からの輸送時にポリペプチドから切断され得る。ポリペプチドのアミノ末端又はカルボキシル末端では、更なるペプチド配列の融合を生じさせることが可能である。
【0085】
本明細書で使用される「遺伝子構築物」という用語は、本発明のポリヌクレオチド及び追加の機能的な核酸配列を含むポリヌクレオチドを指す。本発明による遺伝子構築物は、好ましくは、線状ＤＮＡ分子である。典型的には、本発明による遺伝子構築物は、標的構築物のゲノムＤＮＡへのランダム又は部位特異的組込みが可能な標的構築物であり得る。このような標的構築物は、好ましくは、下記に詳細に記載されるように、相同組換え又は異種組換えのいずれかを行うのに十分な長さのＤＮＡを含む。いずれの場合も、構築物は、好ましくは、プロモーター、転写開始部位、ポリアデニル化部位及び転写終結部位などの遺伝子発現を制御するための構造を有する、完璧なものでなければならない。
【0086】
更に、本発明は、本発明のベクター又は遺伝子構築物を含む宿主細胞に関する。
【0087】
本発明の宿主細胞は、本発明のベクター又は遺伝子構築物に含まれる本発明のポリペプチドを発現することができる。宿主細胞は、典型的には、本発明のポリペプチドをベクター又は遺伝子構築物から発現することができるように前記ベクター又は遺伝子構築物で形質転換される。形質転換されたベクター又は遺伝子構築物は、非組み込み型ベクター、例えばプラスミドとして維持され得るか、又は代替的に、本明細書の他の箇所でより詳細に明記されているように宿主細胞ゲノムに組み込まれ得る。
【0088】
本発明による宿主細胞は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｄ．Ｗ．“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”３ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，（２００１）；及びＦ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ，ｅｄｓ．，“Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８７）並びにそれに対する後日の追補に記載されているような、一般に当技術分野で公知の標準的な遺伝学的及び分子生物学技術に基づいて作製され得る。
【0089】
好ましくは、前記宿主細胞は、細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、藻細胞又はシアノバクテリア細胞、非ヒト動物細胞又は非ヒト哺乳動物細胞及び植物細胞からなる群から選択される。より好ましくは、宿主細胞は、以下の生物のいずれか１つから選択することができる。
【0090】
細菌：
細菌宿主細胞は、例えば、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、アミコラトプシス属（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）、ロドバクター属（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、パラコッカス属（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）又はパントエア属（Ｐａｎｔｏｅａ）からなる群から選択され得る。
細菌宿主細胞は、例えば、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、アミコラトプシス属（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）、ロドバクター属（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、パラコッカス属（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）又はパントエア属（Ｐａｎｔｏｅａ）からなる群から選択され得る。
【0091】
グラム陽性：バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）：有用なグラム陽性細菌宿主細胞としては、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞、例えばバチルス・アルカロフィウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｋａｌｏｐｈｉｕｓ）、バチルス・アミロリクエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、バチルス・シルキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・クラウシイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｌａｕｓｉｉ）、バチルス・コアギュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・フィルムス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｉｒｍｕｓ）、バチルス・ジャウツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｊａｕｔｕｓ）、バチルス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・リシェニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及びバチルス・ツリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）が挙げられるが、限定されない。最も好ましい原核生物は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞、好ましくはバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・リシェニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）又はバチルス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ）のバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞である。
【0092】
いくつかの他の好ましい細菌としては、放線菌目（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）、好ましくはストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、好ましくはストレプトマイセス・スフェロイデス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐｈｅｒｏｉｄｅｓ）（ＡＴＴＣ２３９６５）、ストレプトマイセス・サーモビオラセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｔｈｅｒｍｏｖｉｏｌａｃｅｕｓ）（ＩＦＯ１２３８２）、ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）又はストレプトマイセス・ムリヌス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍｕｒｉｎｕｓ）又はストレプトベルティシラム・ベルティシリウム種ベルティシリウム（Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｕｍ ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｓｐ．ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ）の株が挙げられる。他の好ましい細菌としては、ロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）、ロドモナス・パルストリ（Ｒｈｏｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｕｓｔｒｉ）、ストレプトコッカス・ラクティス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）が挙げられる。更なる好ましい細菌としては、ミクソコッカス属（Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ）に属する株、例えばＭ．ビレスセンス（Ｍ．ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）が挙げられる。
【0093】
グラム陰性：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ロドバクター属（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、パラコッカス属（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）：好ましいグラム陰性細菌は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、シュードモナス属種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）、好ましくはシュードモナス・プロシニア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｒｒｏｃｉｎｉａ）（ＡＴＣＣ１５９５８）又はシュードモナス・フルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）（ＮＲＲＬ Ｂ－１１）、ロドバクター・カプスラツス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）又はロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）、パラコッカス・カロチニファシエンス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｃａｒｏｔｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ）、パラコッカス・ゼアキサンチニファシエンス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ）又はパントエア・アナナチス（Ｐａｎｔｏｅａ ａｎａｎａｔｉｓ）である。
【0094】
真菌：
アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）：宿主細胞は、真菌細胞であり得る。本明細書で使用される「真菌」としては、子嚢菌門（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）、担子菌門（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）、ツボカビ門（Ｃｈｙｔｒｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）及び接合菌門（Ｚｙｇｏｍｙｃｏｔａ）並びに卵菌門（Ｏｏｍｙｃｏｔａ）及び不完全菌亜門（Ｄｅｕｔｅｒｏｍｙｃｏｔｉｎａ）及び全ての栄養胞子形成真菌が挙げられる。子嚢菌門（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）の代表的な群としては、例えば、ニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ユーペニシリウム属（Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）（＝ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ））、エメリセラ属（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ）（＝アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ））、ユーロチウム属（Ｅｕｒｏｔｉｕｍ）（＝アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ））及び下記に列挙される真正酵母が挙げられる。担子菌門（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）の例としては、キノコ、さび病及び黒穂病が挙げられる。ツボカビ門（Ｃｈｙｔｒｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）の代表的な群としては、例えば、カワリミズカビ属（Ａｌｌｏｍｙｃｅｓ）、ブラストクラジエラ属（Ｂｌａｓｔｏｃｌａｄｉｅｌｌａ）、ボウフラキン属（Ｃｏｅｌｏｍｏｍｙｃｅｓ）及び水生真菌が挙げられる。卵菌門（Ｏｏｍｙｃｏｔａ）の代表的な群としては、例えば、アクリャ属（Ａｃｈｌｙａ）などのサプロレグニオミセトス（Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉｏｍｙｃｅｔｏｕｓ）水生真菌（ミズカビ）が挙げられる。栄養胞子形成真菌の例としては、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）及びアルテルナリア属（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ）が挙げられる。接合菌門（Ｚｙｇｏｍｙｃｏｔａ）の代表的な群としては、例えば、リゾプス属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）及びムコール属（Ｍｕｃｏｒ）が挙げられる。
アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）：宿主細胞は、真菌細胞であり得る。本明細書で使用される「真菌」としては、子嚢菌門（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）、担子菌門（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）、ツボカビ門（Ｃｈｙｔｒｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）及び接合菌門（Ｚｙｇｏｍｙｃｏｔａ）並びに卵菌門（Ｏｏｍｙｃｏｔａ）及び不完全菌亜門（Ｄｅｕｔｅｒｏｍｙｃｏｔｉｎａ）及び全ての栄養胞子形成真菌が挙げられる。子嚢菌門（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）の代表的な群としては、例えば、ニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ユーペニシリウム属（Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）（＝ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ））、エメリセラ属（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ）（＝アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ））、ユーロチウム属（Ｅｕｒｏｔｉｕｍ）（＝アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ））及び下記に列挙される真正酵母が挙げられる。担子菌門（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）の例としては、キノコ、さび病及び黒穂病が挙げられる。ツボカビ門（Ｃｈｙｔｒｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）の代表的な群としては、例えば、カワリミズカビ属（Ａｌｌｏｍｙｃｅｓ）、ブラストクラジエラ属（Ｂｌａｓｔｏｃｌａｄｉｅｌｌａ）、ボウフラキン属（Ｃｏｅｌｏｍｏｍｙｃｅｓ）及び水生真菌が挙げられる。卵菌門（Ｏｏｍｙｃｏｔａ）の代表的な群としては、例えば、アクリャ属（Ａｃｈｌｙａ）などのサプロレグニオミセトス（Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉｏｍｙｃｅｔｏｕｓ）水生真菌（ミズカビ）が挙げられる。栄養胞子形成真菌の例としては、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）及びアルテルナリア属（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ）が挙げられる。接合菌門（Ｚｙｇｏｍｙｃｏｔａ）の代表的な群としては、例えば、リゾプス属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）及びムコール属（Ｍｕｃｏｒ）が挙げられる。
【0095】
いくつかの好ましい真菌としては、不完全菌亜門（Ｄｅｕｔｅｒｏｍｙｃｏｔｉｎａ）に属する株、不完全糸状菌綱（Ｈｙｐｈｏｍｙｃｅｔｅｓ）、例えばフザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、フミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｏｄｅｒｍａ）、ミロセシウム属（Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ）、ベルティシリウム属（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｕｍ）、アルスロマイセス属（Ａｒｔｈｒｏｍｙｃｅｓ）、カルダリオマイセス属（Ｃａｌｄａｒｉｏｍｙｃｅｓ）、ウロクラジウム属（Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍ）、エムベリシア属（Ｅｍｂｅｌｌｉｓｉａ）、クラドスポリウム属（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）又はドレスクレラ属（Ｄｒｅｓｃｈｌｅｒａ）、特にフザリウム・オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）（ＤＳＭ２６７２）、フミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、トリコデルマ・レシイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｓｉｉ）、ミロセシウム・ベルカナ（Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ ｖｅｒｒｕｃａｎａ）（ＩＦＯ６１１３）、ベルティシリウム・アルボアツルム（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｕｍ ａｌｂｏａｔｒｕｍ）、ベルティシリウム・ダーリイ（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｕｍ ｄａｈｌｉｅ）、アルスロマイセス・ラモサス（Ａｒｔｈｒｏｍｙｃｅｓ ｒａｍｏｓｕｓ）（ＦＥＲＭ Ｐ－７７５４）、カルダリオマイセス・フマゴ（Ｃａｌｄａｒｉｏｍｙｃｅｓ ｆｕｍａｇｏ）、ウロクラジウム・チャルタルム（Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍ ｃｈａｒｔａｒｕｍ）、エムベリシア・アリ（Ｅｍｂｅｌｌｉｓｉａ ａｌｌｉ）又はドレスクレラ・ハロデス（Ｄｒｅｓｃｈｌｅｒａ ｈａｌｏｄｅｓ）が挙げられる。他の好ましい真菌としては、担子菌類亜門（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔｉｎａ）、担子菌類綱（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ）、例えばコプリナス属（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）、ファネロカエテ属（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）、コリオルス属（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ）又はトラメテス属（Ｔｒａｍｅｔｅｓ）、特にコプリナス・シネレウスｆ．ミクロスポルス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ ｃｉｎｅｒｅｕｓ ｆ．ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｓ）（ＩＦＯ８３７１）、コプリナス・マクロリズス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ ｍａｃｒｏｒｈｉｚｕｓ）、ファネロカエテ・クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）（例えば、ＮＡ－１２）又はトラメテス属（Ｔｒａｍｅｔｅｓ）（以前はポリポルス属（Ｐｏｌｙｐｏｒｕｓ）と呼ばれている）、例えばＴ．ベルシカラー（Ｔ．ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）（例えば、ＰＲ４ ２８－Ａ）に属する株が挙げられる。
【0096】
更に好ましい真菌としては、接合菌亜門（Ｚｙｇｏｍｙｃｏｔｉｎａ）、ミコラセアエ網（Ｍｙｃｏｒａｃｅａｅ）、例えばリゾプス属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）及びムコール属（Ｍｕｃｏｒ）、特にムコール・ヒエマリス（Ｍｕｃｏｒ ｈｉｅｍａｌｉｓ）に属する株が挙げられる。
【0097】
酵母、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属：真菌宿主細胞は、酵母細胞であり得る。本明細書で使用される酵母としては、有子嚢胞子酵母（ａｓｃｏｓｐｏｒｏｇｅｎｏｕｓ ｙｅａｓｔ）（エンドマイセス目（Ｅｎｄｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）、担子胞子酵母（ｂａｓｉｄｉｏｓｐｏｒｏｇｅｎｏｕｓ ｙｅａｓｔ）及び不完全真菌（Ｆｕｎｇｉ ｌｍｐｅｒｆｅｃｔｉ）（ブラストミセテス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）に属する酵母が挙げられる。有子嚢胞子酵母（ａｓｃｏｓｐｏｒｏｇｅｎｏｕｓ ｙｅａｓｔ）は、スペルモフソラセア科（Ｓｐｅｒｍｏｐｈｔｈｏｒａｃｅａｅ）及びサッカロミセタセア科（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ）に分けられる。後者は、４つの亜科、シゾサッカロミコイデア（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｉｄｅａｅ）（例えば、シゾサッカロマイセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ））、ナドソニオイデア（Ｎａｄｓｏｎｉｏｉｄｅａｅ）、リポミコイデア（Ｌｉｐｏｍｙｃｏｉｄｅａｅ）及びサッカロミコイデア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｉｄｅａｅ）（例えば、クリベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）及びサッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ））から構成される。担子胞子酵母（ｂａｓｉｄｉｏｓｐｏｒｏｇｅｎｏｕｓ ｙｅａｓｔ）としては、ロイコスポリジム属（ｇｅｎｅｒａ Ｌｅｕｃｏｓｐｏｒｉｄｉｍ）、ロドスポリジウム属（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、スポリジオボルス属（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ）、フィロバシジウム属（Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ）及びフィロバシジエラ属（Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｅｌｌａ）が挙げられる。不完全真菌（Ｆｕｎｇｉ ｌｍｐｅｒｆｅｃｔｉ）に属する酵母は、２つの科、スポロボロミセタセア（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ）（例えば、スポロボロマイセス属（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）及びブレラ属（Ｂｕｌｌｅｒａ））並びにクリプトコッカセア（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）（例えば、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ））に分けられる。
【0098】
真核生物：
真核宿主細胞としては、非ヒト動物細胞、非ヒト哺乳動物細胞、鳥類細胞、爬虫類細胞、昆虫細胞又は植物細胞が更に挙げられるが、限定されない。
真核宿主細胞としては、非ヒト動物細胞、非ヒト哺乳動物細胞、鳥類細胞、爬虫類細胞、昆虫細胞又は植物細胞が更に挙げられるが、限定されない。
【0099】
最も好ましくは、宿主細胞は、細菌宿主細胞、特にロドバクター属（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）宿主細胞である。
【0100】
本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むトランスジェニック非ヒト生物、本発明のベクター若しくは遺伝子構築物又は本発明の宿主細胞に関する。
【0101】
本明細書で使用される「トランスジェニック非ヒト生物」という用語は、本発明のポリヌクレオチド、ベクター又は遺伝子構築物を含むように遺伝子改変された生物を指す。前記遺伝子改変は、相同組換え事象若しくは異種組換え事象、変異誘発又は遺伝子編集プロセスのいかなる種類の結果であり得る。従って、トランスジェニック非ヒト生物は、そのゲノムに天然に存在しない（即ち異種）ポリヌクレオチド、ベクター又は遺伝子構築物を含む点でその非トランスジェニック対応物と異なるものとする。本発明によるトランスジェニック非ヒト生物として想定される非ヒト生物は、多細胞生物であることが好ましい。更に、非ヒト生物は、動物又は植物であることが好ましい。好ましい動物は、哺乳動物、特にげっ歯類、例えばマウス、ラット、ウサギなどのような実験動物又はヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマなどのような畜産動物である。好ましい植物は、特に、アラビドプシス属種（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｓｐｐ．）、ニコチアナ属種（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｓｐｐ）、シコルム・インチブス（Ｃｉｃｈｏｒｕｍ ｉｎｔｙｂｕｓ）、ラクツカ・サティバ（Ｌａｃｔｕｃａ ｓａｔｉｖａ）、メンタ属種（Ｍｅｎｔｈａ ｓｐｐ）、アルテミシア・アニュア（Ａｒｔｅｍｉｓｉａ ａｎｎｕａ）、塊茎形成植物、油料作物、例えばブラシカ属種（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｓｐｐ．）又はブラシカ・ナピュス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）、果実のなる顕花植物（被子植物）及び樹木からなる群から選択される作物又は野菜である。
【0102】
一実施形態では、非ヒトトランスジェニック生物は、本発明のポリペプチド、前記ポリペプチドを含む融合タンパク質、それをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むベクター又は遺伝子構築物に対してトランスジェニックな非ヒトトランスジェニック生物である。
【0103】
一実施形態では、宿主細胞は、インビトロでの、例えば細胞培養における非ヒト細胞である。
【0104】
別の実施形態では、「非ヒト」という用語は、動物でないヒト以外の生物（例えば、植物、真菌若しくは微生物）又は哺乳動物以外の動物であり、好ましくは脊椎動物でない動物を指すことが理解されるであろう。
【0105】
トランスジェニック非ヒト生物を作製する方法は、当技術分野でよく知られており、例えばＬｅｅ－Ｙｏｏｎ Ｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｐｌａｎｔｓ；Ｇｅｎｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ，ｖｅｃｔｏｒ ａｎｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ．２０１８．ＤＯＩ．１０．５７７２／ｉｎｔｅｃｈｏｐｅｎ．７９３６９；Ｐｉｎｋｅｒｔ，Ｃ．Ａ．（ｅｄ．）１９９４．Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ａｎｉｍａｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｈａｎｄｂｏｏｋ．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｄｏ，Ｃａｌｉｆ．；Ｍｏｎａｓｔｅｒｓｋｙ Ｇ．Ｍ．ａｎｄ Ｒｏｂｌ，Ｊ．Ｍ．（ｅｄ．）（１９９５）Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｉｎ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ．ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ．Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｌｏｃ．ｃｉｔ，Ａｕｓｕｂｅｌ，ｌｏｃ．ｃｉｔ）を参照されたい。
【0106】
本発明は、一般に、少なくとも１つのＣ２０テルペノイドアルコール、好ましくはアビエノール、マノオール及び／又はスクラレオールを製造するための、本発明のポリペプチド若しくは本発明の融合ポリペプチド、本発明のポリヌクレオチド、本発明のベクター若しくは遺伝子構築物、本発明の宿主細胞又は本発明の非ヒトトランスジェニック生物の使用を企図する。
【0107】
本発明に従って製造されるＣ２０テルペノイドアルコールは、異なる産業分野において様々な有用性を有し得る。特に、前記Ｃ２０テルペノイドアルコールは、香味料、農薬、香料、医薬組成物、化粧品又は化学的構成要素を生産するために使用される。
【0108】
更に、本発明は、本発明のポリペプチド若しくは本発明の融合ポリペプチド、本発明のポリヌクレオチド、本発明のベクター若しくは遺伝子構築物、本発明の宿主細胞又は本発明の非ヒトトランスジェニック生物を含む、少なくとも１つのＣ２０テルペノイドアルコール、好ましくはアビエノール、マノオール及び／又はスクラレオールを製造するためのキットにも関する。
【0109】
本明細書で使用される「キット」という用語は、少なくとも１つのＣ２０テルペノイドアルコールを製造するための本発明の方法を実施するのに必要とされる構成要素の集合を指す。キットは、上述の構成要素のいずれかを、単一構成要素又はその任意の組み合わせのいずれかとして含むものとする。典型的には、キットの構成要素は、別々の容器において又は単一の容器内に提供される。容器は、典型的には、少なくとも１つのＣ２０テルペノイドアルコールを製造するための本発明の方法を実施するための指示書も含む。更に、キットは、好ましくは、インキュベーション試薬、培養培地、洗浄溶液、溶媒及び／又は少なくとも１つのＣ２０テルペノイドアルコールの精製に必要となる試薬若しくは手段など、本発明の方法を実施するために必要な更なる構成要素を含み得る。
【0110】
以下の実施形態は、本発明に従って想定される特に好ましい実施形態である。上記でなされた用語の定義及び説明の全ては、変更すべき点を変更して適用される。
【0111】
実施形態１：少なくとも１つのＣ２０テルペノイドアルコールを製造する方法であって、
ａ）ゲラニルゲラニルピロリン酸をコパリル二リン酸（ＣＰＰ）又はラブダ－１３－エン－８－オール二リン酸（ＬＰＰ）に変換する工程；及び
ｂ）ＣＰＰ又はＬＰＰを少なくとも１つのＣ２０テルペノイドアルコールに変換する工程であって、前記変換は、ジテルペンアルコールシンターゼ活性を示すポリペプチドによって行われ、前記ジテルペンアルコールシンターゼ活性は、コパリル二リン酸（ＣＰＰ）をマノオールに、ラブダ－１３－エン－８－オール二リン酸（ＬＰＰ）をスクラレオールに、且つ／又はＬＰＰをアビエノールに変換することができる、工程
を含み、前記ポリペプチドは、
ａ）配列番号３～１０又は配列番号３４のいずれか１つに示されるようなアミノ酸配列；
ｂ）配列番号３～１０又は配列番号３４のいずれか１つに示されるようなアミノ酸配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列；
ｃ）配列番号１、２、１６、１７、１８又は３５に示されるような核酸配列によってコードされるアミノ酸配列；
ｄ）配列番号１、２、１６、１７、１８又は３５に示されるような核酸配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一である核酸配列によってコードされるアミノ酸配列；及び
ｅ）（ａ）～（ｄ）のいずれか１つのフラグメントであって、コパリル二リン酸（ＣＰＰ）をマノオールに、ラブダ－１３－エン－８－オール二リン酸（ＬＰＰ）をスクラレオールに、且つ／又はＬＰＰをアビエノールに変換することができるジテルペンアルコールシンターゼ活性を示すポリペプチドをコードするフラグメントのアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、方法。
ａ）ゲラニルゲラニルピロリン酸をコパリル二リン酸（ＣＰＰ）又はラブダ－１３－エン－８－オール二リン酸（ＬＰＰ）に変換する工程；及び
ｂ）ＣＰＰ又はＬＰＰを少なくとも１つのＣ２０テルペノイドアルコールに変換する工程であって、前記変換は、ジテルペンアルコールシンターゼ活性を示すポリペプチドによって行われ、前記ジテルペンアルコールシンターゼ活性は、コパリル二リン酸（ＣＰＰ）をマノオールに、ラブダ－１３－エン－８－オール二リン酸（ＬＰＰ）をスクラレオールに、且つ／又はＬＰＰをアビエノールに変換することができる、工程
を含み、前記ポリペプチドは、
ａ）配列番号３～１０又は配列番号３４のいずれか１つに示されるようなアミノ酸配列；
ｂ）配列番号３～１０又は配列番号３４のいずれか１つに示されるようなアミノ酸配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列；
ｃ）配列番号１、２、１６、１７、１８又は３５に示されるような核酸配列によってコードされるアミノ酸配列；
ｄ）配列番号１、２、１６、１７、１８又は３５に示されるような核酸配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一である核酸配列によってコードされるアミノ酸配列；及び
ｅ）（ａ）～（ｄ）のいずれか１つのフラグメントであって、コパリル二リン酸（ＣＰＰ）をマノオールに、ラブダ－１３－エン－８－オール二リン酸（ＬＰＰ）をスクラレオールに、且つ／又はＬＰＰをアビエノールに変換することができるジテルペンアルコールシンターゼ活性を示すポリペプチドをコードするフラグメントのアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、方法。
【0112】
実施形態２：前記ポリペプチドは、配列番号２４に示されるような保存領域のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【0113】
実施形態３：前記少なくとも１つのＣ２０テルペノイドアルコールは、環状Ｃ２０テルペノイドアルコールである、実施形態１又は２に記載の方法。
【0114】
実施形態４：前記少なくとも１つのＣ２０テルペノイドアルコールは、マノオール、スクラレオール又はアビエノールである、実施形態１～３のいずれか１つに記載の方法。
【0115】
実施形態５：ジテルペンアルコールシンターゼ活性を示す前記ポリペプチドは、ＣＰＰをマノオールに、且つＬＰＰをスクラレオールに変換することができる、実施形態１～４のいずれか１つに記載の方法。
【0116】
実施形態６：前記ポリペプチドは、
ａ）配列番号４、６、７、９、１０又は３４に示されるようなアミノ酸配列；
ｂ）配列番号４、６、７、９、１０又は３４に示されるようなアミノ酸配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列；
ｃ）配列番号２、１６、１７又は３５に示されるような核酸配列によってコードされるアミノ酸配列；
ｄ）配列番号２、１６、１７又は３５に示されるような核酸配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一である核酸配列によってコードされるアミノ酸配列；及び
ｅ）（ａ）～（ｄ）のいずれか１つのフラグメントであって、ＣＰＰをマノオールに、且つＬＰＰをスクラレオールに変換することができるジテルペンアルコールシンターゼ活性を示すポリペプチドをコードするフラグメントのアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態５に記載の方法。
ａ）配列番号４、６、７、９、１０又は３４に示されるようなアミノ酸配列；
ｂ）配列番号４、６、７、９、１０又は３４に示されるようなアミノ酸配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列；
ｃ）配列番号２、１６、１７又は３５に示されるような核酸配列によってコードされるアミノ酸配列；
ｄ）配列番号２、１６、１７又は３５に示されるような核酸配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一である核酸配列によってコードされるアミノ酸配列；及び
ｅ）（ａ）～（ｄ）のいずれか１つのフラグメントであって、ＣＰＰをマノオールに、且つＬＰＰをスクラレオールに変換することができるジテルペンアルコールシンターゼ活性を示すポリペプチドをコードするフラグメントのアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態５に記載の方法。
【0117】
実施形態７：ジテルペンアルコールシンターゼ活性を示す前記ポリペプチドは、ＬＰＰをアビエノールに変換することができる、実施形態１～４のいずれか１つに記載の方法。
【0118】
実施形態８：前記ポリペプチドは、
ａ）配列番号３、５又は８に示されるようなアミノ酸配列；
ｂ）配列番号３、５又は８に示されるようなアミノ酸配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列；
ｃ）配列番号１又は１８に示されるような核酸配列によってコードされるアミノ酸配列；
ｄ）配列番号１又は１８に示されるような核酸配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一である核酸配列によってコードされるアミノ酸配列；及び
ｅ）（ａ）～（ｄ）のいずれか１つのフラグメントであって、ＬＰＰをアビエノールに変換することができるジテルペンアルコールシンターゼ活性を示すポリペプチドをコードするフラグメントのアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態７に記載の方法。
ａ）配列番号３、５又は８に示されるようなアミノ酸配列；
ｂ）配列番号３、５又は８に示されるようなアミノ酸配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列；
ｃ）配列番号１又は１８に示されるような核酸配列によってコードされるアミノ酸配列；
ｄ）配列番号１又は１８に示されるような核酸配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一である核酸配列によってコードされるアミノ酸配列；及び
ｅ）（ａ）～（ｄ）のいずれか１つのフラグメントであって、ＬＰＰをアビエノールに変換することができるジテルペンアルコールシンターゼ活性を示すポリペプチドをコードするフラグメントのアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態７に記載の方法。
【0119】
実施形態９：工程ａ）の前記変換は、ゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰ）をＬＰＰ及び／又はＣＰＰに変換するＩＩ型ジテルペンシンターゼの酵素活性を示す更なるポリペプチドによって行われる、実施形態１～８のいずれか１つに記載の方法。
【0120】
実施形態１０：ジテルペンシンターゼ活性を示す前記ポリペプチドは、好ましくは、ゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰ）をＬＰＰ及び／若しくはＣＰＰに変換するＩＩ型ジテルペンシンターゼの酵素活性を示すか、マルトース結合特性を有するか、又はチオレドキシン若しくはチオレドキシン融合タンパク質である少なくとも１つの更なるポリペプチドを含む融合ポリペプチドに含まれる、実施形態１～９のいずれか１つに記載の方法。
【0121】
実施形態１１：前記更なるポリペプチドは、好ましくは、コレウス・フォルスコリ（Ｃｏｌｅｕｓ ｆｏｒｓｋｏｈｌｉｉ）由来のＬＰＰシンターゼ（ＣｆＬＰＰＳ）又はニコチアナ・タバカム（ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）由来のＬＰＰシンターゼ（ＮｔＬＰＰＳ）、好ましくはコレウス・フォルスコリ（Ｃｏｌｅｕｓ ｆｏｒｓｋｏｈｌｉｉ）由来のＣＰＰシンターゼ（ＣｆＣＰＰＳ）、チオレドキシン及びマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）からなる群から選択される、実施形態１０に記載の方法。
【0122】
実施形態１２：前記工程ｂ）又は前記工程ａ）及びｂ）は、宿主細胞又は非ヒトトランスジェニック生物において行われる、実施形態１～１２のいずれか１つに記載の方法。
【0123】
実施形態１３：前記製造された少なくとも１つのＣ２０テルペノイドアルコールを得る工程を更に含む、実施形態１～１２のいずれか１つに記載の方法。
【0124】
実施形態１４：実施形態１～１４のいずれか１つに記載の方法によって得ることができる前記少なくとも１つのＣ２０テルペノイドアルコール、好ましくはマノオール、スクラレオール及び／又はアビエノールを含む組成物。
【0125】
実施形態１５：ジテルペンアルコールシンターゼ活性を示すポリペプチドであって、前記ジテルペンアルコールシンターゼ活性は、コパリル二リン酸（ＣＰＰ）をマノオールに、ラブダ－１３－エン－８－オール二リン酸（ＬＰＰ）をスクラレオールに、且つ／又はＬＰＰをアビエノールに変換することができ、前記ポリペプチドは、
ａ）配列番号３～１０又は配列番号３４のいずれか１つに示されるようなアミノ酸配列；
ｂ）配列番号３～１０又は配列番号３４のいずれか１つに示されるようなアミノ酸配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列；
ｃ）配列番号１、２、１６、１７、１８又は３５に示されるような核酸配列によってコードされるアミノ酸配列；
ｄ）配列番号１、２、１６、１７、１８又は３５に示されるような核酸配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一である核酸配列によってコードされるアミノ酸配列；及び
ｅ）（ａ）～（ｄ）のいずれか１つのフラグメントであって、コパリル二リン酸（ＣＰＰ）をマノオールに、ラブダ－１３－エン－８－オール二リン酸（ＬＰＰ）をスクラレオールに、且つ／又はＬＰＰをアビエノールに変換することができるジテルペンアルコールシンターゼ活性を示すポリペプチドをコードするフラグメントのアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、ポリペプチド。
ａ）配列番号３～１０又は配列番号３４のいずれか１つに示されるようなアミノ酸配列；
ｂ）配列番号３～１０又は配列番号３４のいずれか１つに示されるようなアミノ酸配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列；
ｃ）配列番号１、２、１６、１７、１８又は３５に示されるような核酸配列によってコードされるアミノ酸配列；
ｄ）配列番号１、２、１６、１７、１８又は３５に示されるような核酸配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一である核酸配列によってコードされるアミノ酸配列；及び
ｅ）（ａ）～（ｄ）のいずれか１つのフラグメントであって、コパリル二リン酸（ＣＰＰ）をマノオールに、ラブダ－１３－エン－８－オール二リン酸（ＬＰＰ）をスクラレオールに、且つ／又はＬＰＰをアビエノールに変換することができるジテルペンアルコールシンターゼ活性を示すポリペプチドをコードするフラグメントのアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、ポリペプチド。
【0126】
実施形態１６：配列番号２４に示されるような保存領域のアミノ酸配列を含む、実施形態１５に記載のポリペプチド。
【0127】
実施形態１７：前記ジテルペンアルコールシンターゼ活性は、ＣＰＰをマノオールに、且つＬＰＰをスクラレオールに変換することができる、実施形態１５又は１６に記載のポリペプチド。
【0128】
実施形態１８：
ａ）配列番号４、６、７、９、１０又は３４に示されるようなアミノ酸配列；
ｂ）配列番号４、６、７、９、１０又は３４に示されるようなアミノ酸配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列；
ｃ）配列番号２、１６、１７又は３５に示されるような核酸配列によってコードされるアミノ酸配列；
ｄ）配列番号２、１６、１７又は３５に示されるような核酸配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一である核酸配列によってコードされるアミノ酸配列；及び
ｅ）（ａ）～（ｄ）のいずれか１つのフラグメントであって、ＣＰＰをマノオールに、且つＬＰＰをスクラレオールに変換することができるジテルペンアルコールシンターゼ活性を示すポリペプチドをコードするフラグメントのアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態１７に記載のポリペプチド。
ａ）配列番号４、６、７、９、１０又は３４に示されるようなアミノ酸配列；
ｂ）配列番号４、６、７、９、１０又は３４に示されるようなアミノ酸配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列；
ｃ）配列番号２、１６、１７又は３５に示されるような核酸配列によってコードされるアミノ酸配列；
ｄ）配列番号２、１６、１７又は３５に示されるような核酸配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一である核酸配列によってコードされるアミノ酸配列；及び
ｅ）（ａ）～（ｄ）のいずれか１つのフラグメントであって、ＣＰＰをマノオールに、且つＬＰＰをスクラレオールに変換することができるジテルペンアルコールシンターゼ活性を示すポリペプチドをコードするフラグメントのアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態１７に記載のポリペプチド。
【0129】
実施形態１９：前記ジテルペンアルコールシンターゼ活性は、ＬＰＰをアビエノールに変換することができる、実施形態１５又は１６に記載のポリペプチド。
【0130】
実施形態２０：
ａ）配列番号３、５又は８に示されるようなアミノ酸配列；
ｂ）配列番号３、５又は８に示されるようなアミノ酸配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列；
ｃ）配列番号１又は１８に示されるような核酸配列によってコードされるアミノ酸配列；
ｄ）配列番号１又は１８に示されるような核酸配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一である核酸配列によってコードされるアミノ酸配列；及び
ｅ）（ａ）～（ｄ）のいずれか１つのフラグメントであって、ＬＰＰをアビエノールに変換することができるジテルペンアルコールシンターゼ活性を示すポリペプチドをコードするフラグメントのアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態１９に記載のポリペプチド。
ａ）配列番号３、５又は８に示されるようなアミノ酸配列；
ｂ）配列番号３、５又は８に示されるようなアミノ酸配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列；
ｃ）配列番号１又は１８に示されるような核酸配列によってコードされるアミノ酸配列；
ｄ）配列番号１又は１８に示されるような核酸配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一である核酸配列によってコードされるアミノ酸配列；及び
ｅ）（ａ）～（ｄ）のいずれか１つのフラグメントであって、ＬＰＰをアビエノールに変換することができるジテルペンアルコールシンターゼ活性を示すポリペプチドをコードするフラグメントのアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態１９に記載のポリペプチド。
【0131】
実施形態２１：実施形態１５～２０のいずれか１つに記載のポリペプチドと、（ｉ）好ましくはゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰ）をＬＰＰ及び／若しくはＣＰＰに変換するＩＩ型ジテルペンシンターゼの酵素活性を示すか、（ｉｉ）マルトース結合特性を有するか、又は（ｉｉｉ）チオレドキシン若しくはチオレドキシン融合タンパク質である少なくとも１つの更なるポリペプチドとを含む融合ポリペプチド。
【0132】
実施形態２２：前記更なるポリペプチドは、好ましくは、コレウス・フォルスコリ（Ｃｏｌｅｕｓ ｆｏｒｓｋｏｈｌｉｉ）由来のＬＰＰシンターゼ（ＣｆＬＰＰＳ）又はニコチアナ・タバカム（ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）由来のＬＰＰシンターゼ（ＮｔＬＰＰＳ）、好ましくはコレウス・フォルスコリ（Ｃｏｌｅｕｓ ｆｏｒｓｋｏｈｌｉｉ）由来のＣＰＰシンターゼ（ＣｆＣＰＰＳ）、チオレドキシン及びマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）からなる群から選択される、実施形態２１に記載の融合ポリペプチド。
【0133】
実施形態２３：実施形態１５～２０のいずれか１つに記載のポリペプチド又は実施形態２１若しくは２２の融合ポリペプチド或いはその逆相補配列又は相補配列をコードするポリヌクレオチド。
【0134】
実施形態２４：実施形態２３に記載のポリヌクレオチドを含むベクター又は遺伝子構築物。
【0135】
実施形態２５：実施形態２４に記載のベクター又は遺伝子構築物を含む宿主細胞。
【0136】
実施形態２６：細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、藻細胞又はシアノバクテリア細胞、非ヒト動物細胞又は非ヒト哺乳動物細胞及び植物細胞からなる群から選択される、実施形態２５に記載の宿主細胞。
【0137】
実施形態２７：実施形態２３に記載のポリヌクレオチド、実施形態２４に記載のベクター若しくは遺伝子構築物又は実施形態２５若しくは２６に記載の宿主細胞を含むトランスジェニック非ヒト生物。
【0138】
実施形態２８：少なくとも１つのＣ２０テルペノイドアルコール、好ましくはアビエノール、マノオール及び／又はスクラレオールを製造するための、実施形態１５～２０のいずれか１つに記載のポリペプチド又は実施形態２１若しくは２２に記載の融合ポリペプチド、実施形態２３に記載のポリヌクレオチド、実施形態２４に記載のベクター又は遺伝子構築物、実施形態２５又は２６に記載の宿主細胞或いは実施形態２７に記載の非ヒトトランスジェニック生物の使用。
【0139】
実施形態２９：前記Ｃ２０テルペノイドアルコールは、香味料、農薬、香料、薬剤、化粧品又は化学的構成要素を生産するために使用される、実施形態２８に記載の使用。
【0140】
実施形態３０：実施形態１５～２０のいずれか１つに記載のポリペプチド又は実施形態２１若しくは２２に記載の融合ポリペプチド、実施形態２３に記載のポリヌクレオチド、実施形態２４に記載のベクター又は遺伝子構築物、実施形態２５又は２６に記載の宿主細胞或いは実施形態２７に記載の非ヒトトランスジェニック生物を含む、少なくとも１つのＣ２０テルペノイドアルコール、好ましくはアビエノール、マノオール及び／又はスクラレオールを製造するためのキット。
【0141】
本明細書全体を通して引用される全ての参考文献は、その全体又は具体的に言及される開示内容に関して参照により本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【0142】
【図1】キュプレサス・ギガンテア（Ｃｕｐｒｅｓｓｕｓ ｇｉｇａｎｔｅａ）からのジクロロメタン抽出物のＧＣ ＭＳ分析。マノオール標準物質のＲｔに対応する１９．７分にマノオールの明確なピークが観察された。
【図2a】株ｐＢＢＲ－ＭＥＶ－ＰｃｒｔＥ－ＴｒｘＣｆＬＰＰＳ－ｍｂｐＣｕｐ２ｖ１－Ｐｒｐｌｍ－ＣｇＩｓｄＡ及びｐＢＢＲ－ＭＥＶ－ＰｃｒｔＥ－ＴｒｘＮｔＬＰＰＳ－ｍｂｐＣｕｐ２ｖ１－Ｐｒｐｌｍ－ＣｇＩｓｄＡのＧＣ分析。ａ）及びｂ）；分析から、１３．６１分に溶出する化合物が明らかとなった（その後、アビエノールと同定された）；ｃ、ｄ、ｅは、Ｃｕｐ２ｖ２ａ及びＣｕｐ２ｖ２ｂをＬＰＰシンターゼと組み合わせて発現させた構築物からの結果である。分析から、１４．０３分に溶出する新たな化合物が明らかとなった（その後、スクラレオールと同定された）；ｆ）株ｐＢＢＲ－ＭＥＶ－ＰｃｒｔＥ－ＴｒｘＣｆＣＰＰＳ－ｍｂｐＣｕｐ２ｖ２ａ－Ｐｒｐｌｍ－ＣｇＩｓｄＡのＧＣ分析から、１３．２９分に溶出する化合物が生成された（その後、マノオールと同定された）。
【図3a】株のＧＣ ＭＳ分析。ａ）ｐＢＢＲ－ＭＥＶ－ＰｃｒｔＥ－ＴｒｘＣｆＬＰＰＳ－ｍｂｐＣｕｐｒ２ｖ１－Ｐｒｐｌｍ－ＣｇＩｓｄＡのＧＣ ＭＳ分析により、この化合物がアビエノールに対応することが確認された；ｂ）ｐＢＢＲ－ＭＥＶ－ＰｃｒｔＥ－ＴｒｘＣｆＬＰＰＳ－ｍｂｐＣｕｐｒ２ｖ２ｂ－Ｐｒｐｌｍ－ＣｇＩｓｄＡのＧＣ ＭＳ分析により、この化合物がスクラレオールに対応することが確認された；ｃ）ｐＢＢＲ－ＭＥＶ－ＰｃｒｔＥ－ＴｒｘＣｆＣＰＰＳ－ｍｂｐＣｕｐ２ｖ２ａ－Ｐｒｐｌｍ－ＣｇＩｓｄＡのＧＣ ＭＳ分析により、この化合物がマノオールに対応することが明らかとなった。
【図4】産物決定領域のアライメント。ＣｆＭＯＳ、コレウス・フォルスコリ（Ｃｏｌｅｕｓ ｆｏｒｓｋｏｈｌｉｉ）由来のマノイルオキシドシンターゼ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション：ＫＦ４４４５０８）；ＩｒＭＳ、イソドン・ルベッセンス（Ｉｓｏｄｏｎ ｒｕｂｅｓｃｅｎｓ）由来のミルチラジエンシンターゼ（ＫＸ８３１６５２）；ＣｆＭＳ、Ｃ．フォルスコリ（Ｃ．ｆｏｒｓｋｏｈｌｉｉ）由来のミルチラジエンシンターゼ（ＫＦ４４４５０９）；ＲｏＭＳ１、ローズマリウス・オフィシナリス（Ｒｏｓｅｍａｒｉｕｓ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）由来のミルチラジエンシンターゼ１（ＫＦ８０５８５８）；ＳｍＭＳ、サルビア・ミルティオリザ（Ｓａｌｖｉａ Ｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａ）由来のミルチラジエンシンターゼ（ＡＢＶ０８８１７）；ＲｏＭＳ１、ローズマリウス・オフィシナリス（Ｒｏｓｅｍａｒｉｕｓ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）由来のミルチラジエンシンターゼ（ＫＦ８０５８５９）；ＳｆＭＳ、サルビア・フルティコサ（Ｓａｌｖｉａ ｆｒｕｔｉｃｏｓａ）由来のミルチラジエンシンターゼ（ＫＰ０９１８４１）；ＭｖＥＬＳ、マルビウム・バルガレ（Ｍａｒｒｕｂｉｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）由来の９，１３－エポキシ－ラブダ－１４－エンシンターゼ（ＫＪ５８４４５４）；ＳｓＳＳ サルビア・スクラレア（Ｓａｌｖｉａ ｓｃｌａｒｅａ）スクラレオールシンターゼ（ＪＮ１３３９２２）；イソアビエノールシンターゼであるＳｓＳＳのＳｓＳＳ－ｉＡＳバリアント（Ｊｉａ ｅｔ ａｌ ＡＣＳ Ｃａｔａｌ．２０１８，８，３１３３－３１３７）。
【図5-1】Ｃｕｐ２ｖ２ｂ（配列番号４）、Ｃｕｐ２ｖ２ａ（配列番号３４）、Ｃｕｐ２ｖ１（配列番号３）並びにそれぞれアクセッション番号ＫＴ５８８４８４、ＫＴ５８８４８５及びＫＴ５８８４８９の下で全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）データベースに見出されるＴｃＫＳＬ１、ＴｃＫＳＬ２及びＴｃＫＳＬ８；更に国際公開第２００９１０１１２６号パンフレットの配列番号３に見出されるようなＳｃＳＳの配列のタンパク質のアライメント。
【図6-1】Ｃｕｐ２ｖ２ｂ（配列番号４）、Ｃｕｐ２ｖ２ａ（配列番号３４）、Ｃｕｐ２ｖ１（配列番号３）並びにそれぞれアクセッション番号ＫＴ５８８４８４、ＫＴ５８８４８５及びＫＴ５８８４８９の下で全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）データベースに見出されるＴｃＫＳＬ１、ＴｃＫＳＬ２及びＴｃＫＳＬ８のタンパク質のアライメント。
【発明を実施するための形態】
【0143】
以下の配列は、本明細書全体及び添付の配列プロトコルにおいて参照される。
配列番号１：Ｃｕｐ２ｖ１ ｃＤＮＡ配列
配列番号２：Ｃｕｐ２ｖ２ｂ ｃＤＮＡ配列
配列番号３：Ｃｕｐ２ｖ１タンパク質
配列番号４：Ｃｕｐ２ｖ２ｂタンパク質
配列番号５：切断Ｃｕｐ２ｖ１タンパク質
配列番号６：切断Ｃｕｐ２ｖ２ａタンパク質
配列番号７：切断Ｃｕｐ２ｖ２ｂタンパク質
配列番号８：ＭＢＰ切断Ｃｕｐ２ｖ１タンパク質
配列番号９：ＭＢＰ切断Ｃｕｐ２ｖ２ａタンパク質
配列番号１０：ＭＢＰ切断ｃｕｐ２ｖ２ｂタンパク質
配列番号１１：ＳｓＳＳ切断タンパク質
配列番号１２：Ｔｒｘ－ＣｆＣＰＳタンパク質
配列番号１３：Ｔｒｘ－ＣｆＬＰＰＳタンパク質
配列番号１４：Ｔｒｘ－ＮｔＬＰＰＳタンパク質
配列番号１５：ＣｇＩｄｓＡタンパク質
配列番号１６：ＭＢＰ－Ｃｕｐ２ｖ２ｂ ＤＮＡ
配列番号１７：ＭＢＰ－Ｃｕｐ２ｖ２ａ ＤＮＡ
配列番号１８：ＭＢＰ－Ｃｕｐ２ｖ１ ＤＮＡ
配列番号１９：ＳｓＳＳ ｃＤＮＡ
配列番号２０：Ｔｒｘ－ＣｆＬＰＰＳ ＤＮＡ
配列番号２１：Ｔｒｘ－ＣｆＣＰＳ ＤＮＡ
配列番号２２：ＣｇｉｄｓＡ ｃＤＮＡ
配列番号２３：Ｔｒｘ－ＮｔＬＰＰＳ ＤＮＡ
配列番号２４：Ｃｕｐ２ｖ１、Ｃｕｐ２ｖ２ａ及びＣｕｐ２ｖ２ｂタンパク質の保存領域
配列番号２５：ＣｆＭＯＳタンパク質の産物決定領域；ＩｒＭＳタンパク質の産物決定領域；ＣｆＭＳタンパク質の産物決定領域；ＣＲｏＭＳ１タンパク質の産物決定領域；ＳｍＭＳタンパク質の産物決定領域；ＲｏＭＳ２タンパク質の産物決定領域；ＳｆＭＳタンパク質の産物決定領域；ＭｖＥＬＳタンパク質の産物決定領域
配列番号２６：ＳｓＳＳタンパク質の産物決定領域
配列番号２７：ＳｓＳＳ－ｉＡＳタンパク質の産物決定領域
配列番号２８：ＭＢＰ－Ｃｕｐｒ２ｖ２ｂ－２ポリペプチド
配列番号２９ ＭＢＰ－Ｃｕｐｒ２ｖ２ｂ－３ポリペプチド
配列番号３０ ＭＢＰ－Ｃｕｐｒ２ｖ２ｂ－４ポリペプチド
配列番号３１ ＭＢＰ－Ｃｕｐｒ２ｖ２ｂ－２ ＤＮＡ
配列番号３２ ＭＢＰ－Ｃｕｐｒ２ｖ２ｂ－３ ＤＮＡ
配列番号３３ ＭＢＰ－Ｃｕｐｒ２ｖ２ｂ－４ ＤＮＡ
配列番号３４ Ｃｕｐ２ｖ２ａタンパク質
配列番号３５ Ｃｕｐ２ｖ２ａ ＤＮＡ
配列番号３６ 切断Ｃｕｐ２ｖ１ ＤＮＡ
配列番号３７ 切断Ｃｕｐ２ｖ２ｂ ＤＮＡ
配列番号３８ 切断Ｃｕｐ２ｖ２ａ ＤＮＡ
配列番号３９ ＤＮＡ Ｃ末端及びＮ末端二重切断Ｃｕｐ２ｖ１
配列番号４０ タンパク質Ｃ末端及びＮ末端二重切断Ｃｕｐ２ｖ１
配列番号４１ バリアント１タンパク質
配列番号４２ バリアント２タンパク質
配列番号４３ バリアント３タンパク質
配列番号４４ バリアント４タンパク質
配列番号４５ バリアント５タンパク質
配列番号４６ バリアント６タンパク質
配列番号４７ バリアント７タンパク質
配列番号４８ バリアント８タンパク質
配列番号４９ バリアント９タンパク質
配列番号５０ バリアント１０タンパク質
配列番号５１ バリアント１１タンパク質
配列番号５２ バリアント１２タンパク質
配列番号５３ バリアント１３タンパク質
配列番号５４ バリアント１４タンパク質
配列番号５５ ＣｕｐモチーフＥＮＮＳＦＧＳＭＣＩ
配列番号５６ ＣｕｐモチーフＥＫＫＳＦＧＳＭＣＩ
配列番号５７ ＣｕｐモチーフＥＫＮＳＦＧＳＭＣＩ
配列番号５８ ＣｕｐモチーフＥＮＫＳＦＧＳＭＣＩ
配列番号１：Ｃｕｐ２ｖ１ ｃＤＮＡ配列
配列番号２：Ｃｕｐ２ｖ２ｂ ｃＤＮＡ配列
配列番号３：Ｃｕｐ２ｖ１タンパク質
配列番号４：Ｃｕｐ２ｖ２ｂタンパク質
配列番号５：切断Ｃｕｐ２ｖ１タンパク質
配列番号６：切断Ｃｕｐ２ｖ２ａタンパク質
配列番号７：切断Ｃｕｐ２ｖ２ｂタンパク質
配列番号８：ＭＢＰ切断Ｃｕｐ２ｖ１タンパク質
配列番号９：ＭＢＰ切断Ｃｕｐ２ｖ２ａタンパク質
配列番号１０：ＭＢＰ切断ｃｕｐ２ｖ２ｂタンパク質
配列番号１１：ＳｓＳＳ切断タンパク質
配列番号１２：Ｔｒｘ－ＣｆＣＰＳタンパク質
配列番号１３：Ｔｒｘ－ＣｆＬＰＰＳタンパク質
配列番号１４：Ｔｒｘ－ＮｔＬＰＰＳタンパク質
配列番号１５：ＣｇＩｄｓＡタンパク質
配列番号１６：ＭＢＰ－Ｃｕｐ２ｖ２ｂ ＤＮＡ
配列番号１７：ＭＢＰ－Ｃｕｐ２ｖ２ａ ＤＮＡ
配列番号１８：ＭＢＰ－Ｃｕｐ２ｖ１ ＤＮＡ
配列番号１９：ＳｓＳＳ ｃＤＮＡ
配列番号２０：Ｔｒｘ－ＣｆＬＰＰＳ ＤＮＡ
配列番号２１：Ｔｒｘ－ＣｆＣＰＳ ＤＮＡ
配列番号２２：ＣｇｉｄｓＡ ｃＤＮＡ
配列番号２３：Ｔｒｘ－ＮｔＬＰＰＳ ＤＮＡ
配列番号２４：Ｃｕｐ２ｖ１、Ｃｕｐ２ｖ２ａ及びＣｕｐ２ｖ２ｂタンパク質の保存領域
配列番号２５：ＣｆＭＯＳタンパク質の産物決定領域；ＩｒＭＳタンパク質の産物決定領域；ＣｆＭＳタンパク質の産物決定領域；ＣＲｏＭＳ１タンパク質の産物決定領域；ＳｍＭＳタンパク質の産物決定領域；ＲｏＭＳ２タンパク質の産物決定領域；ＳｆＭＳタンパク質の産物決定領域；ＭｖＥＬＳタンパク質の産物決定領域
配列番号２６：ＳｓＳＳタンパク質の産物決定領域
配列番号２７：ＳｓＳＳ－ｉＡＳタンパク質の産物決定領域
配列番号２８：ＭＢＰ－Ｃｕｐｒ２ｖ２ｂ－２ポリペプチド
配列番号２９ ＭＢＰ－Ｃｕｐｒ２ｖ２ｂ－３ポリペプチド
配列番号３０ ＭＢＰ－Ｃｕｐｒ２ｖ２ｂ－４ポリペプチド
配列番号３１ ＭＢＰ－Ｃｕｐｒ２ｖ２ｂ－２ ＤＮＡ
配列番号３２ ＭＢＰ－Ｃｕｐｒ２ｖ２ｂ－３ ＤＮＡ
配列番号３３ ＭＢＰ－Ｃｕｐｒ２ｖ２ｂ－４ ＤＮＡ
配列番号３４ Ｃｕｐ２ｖ２ａタンパク質
配列番号３５ Ｃｕｐ２ｖ２ａ ＤＮＡ
配列番号３６ 切断Ｃｕｐ２ｖ１ ＤＮＡ
配列番号３７ 切断Ｃｕｐ２ｖ２ｂ ＤＮＡ
配列番号３８ 切断Ｃｕｐ２ｖ２ａ ＤＮＡ
配列番号３９ ＤＮＡ Ｃ末端及びＮ末端二重切断Ｃｕｐ２ｖ１
配列番号４０ タンパク質Ｃ末端及びＮ末端二重切断Ｃｕｐ２ｖ１
配列番号４１ バリアント１タンパク質
配列番号４２ バリアント２タンパク質
配列番号４３ バリアント３タンパク質
配列番号４４ バリアント４タンパク質
配列番号４５ バリアント５タンパク質
配列番号４６ バリアント６タンパク質
配列番号４７ バリアント７タンパク質
配列番号４８ バリアント８タンパク質
配列番号４９ バリアント９タンパク質
配列番号５０ バリアント１０タンパク質
配列番号５１ バリアント１１タンパク質
配列番号５２ バリアント１２タンパク質
配列番号５３ バリアント１３タンパク質
配列番号５４ バリアント１４タンパク質
配列番号５５ ＣｕｐモチーフＥＮＮＳＦＧＳＭＣＩ
配列番号５６ ＣｕｐモチーフＥＫＫＳＦＧＳＭＣＩ
配列番号５７ ＣｕｐモチーフＥＫＮＳＦＧＳＭＣＩ
配列番号５８ ＣｕｐモチーフＥＮＫＳＦＧＳＭＣＩ
【0144】
更に、所与の単一アミノ酸置換を有する以下のポリペプチドも本発明によるポリペプチドである。配列番号４において、８４位のＬｙｓがＡｓｎによって置換され得る。配列番号６において、３位のＡｓｎがＬｙｓによって置換され得る。配列番号７において、３位のＬｙｓがＡｓｎによって置換され得る。配列番号９において、３７５位のＡｓｎがＬｙｓによって置換され得る。配列番号１０において、３７５位のＡｓｎがＬｙｓによって置換され得る。配列番号３において、３９８位がＩｌｅ又はＴｈｒで埋められている。配列番号５において、３１７位がＩｌｅ又はＴｈｒで埋められている。
【実施例】
【0145】
実施例は、本発明を単に説明するものとする。これらは、決して範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【0146】
実施例１：Ｃｕｐ２ｖ１、Ｃｕｐ２ｖ２ａ及びＣｕｐ２ｖ２ｂのクローニング
キュプレサス・ギガンテア（Ｃｕｐｒｅｓｓｕｓ ｇｉｇａｎｔｅａ）テルペンの分析。
キュプレサス・ギガンテア（Ｃｕｐｒｅｓｓｕｓ ｇｉｇａｎｔｅａ）の木をＥｓｖｅｌｄ（Ｂｏｓｋｏｏｐ）から入手した。皮層物質を液体窒素下で微粉となるまで粉砕し、この粉末１００ｍｇをジクロロメタン１ｍｌで抽出することにより、茎の皮層から抽出物を調製した。このジクロロメタン相をＧＣ ＭＳで分析した。マノオール標準物質のＲｔに対応する１９．７分に、マノオールの明確なピークが観察された。
キュプレサス・ギガンテア（Ｃｕｐｒｅｓｓｕｓ ｇｉｇａｎｔｅａ）テルペンの分析。
キュプレサス・ギガンテア（Ｃｕｐｒｅｓｓｕｓ ｇｉｇａｎｔｅａ）の木をＥｓｖｅｌｄ（Ｂｏｓｋｏｏｐ）から入手した。皮層物質を液体窒素下で微粉となるまで粉砕し、この粉末１００ｍｇをジクロロメタン１ｍｌで抽出することにより、茎の皮層から抽出物を調製した。このジクロロメタン相をＧＣ ＭＳで分析した。マノオール標準物質のＲｔに対応する１９．７分に、マノオールの明確なピークが観察された。
【0147】
ＲＮＡ抽出を行い、キュプレサス（Ｃｕｐｒｅｓｓｕｓ）の組織のｃＤＮＡから配列決定を行った
約１５ｍＬの抽出緩衝液（２％のヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド、２％のポリビニルピロリジノンＫ３０、１００ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２５ｍＭのＥＤＴＡ、２．０ＭのＮａＣｌ、０．５ｇ／Ｌのスペルミジン及び２％のβ－メルカプトエタノール）を６５℃に温めた後、３ｇの粉砕した皮層組織を加えて混合した。等体積のクロロホルム：イソアミルアルコール（１：２４）で混合物を２回抽出し、１０ＭのＬｉＣｌの四分の一の体積を上清に加えて混合した。ＲＮＡを４℃で一晩沈殿させ、１００００ｇで２０分間の遠心分離によって回収した。５００μＬのＳＳＴＥ［１．０ＭのＮａＣｌ、０．５％のＳＤＳ、１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣ１（ｐＨ８．０）、１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）］中でペレットを溶解し、等体積のクロロホルム：イソアミルアルコールで１回抽出した。２体積のエタノールを上清に加え、－２０℃で少なくとも２時間インキュベートし、１３０００ｇで遠心分離して上清を除去した。ペレットを風乾し、水中で再懸濁した。全ＲＮＡ（６０μｇ）をＶｅｒｔｉｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＡＧ（Ｆｒｅｉｓｉｎｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に送った。ＰｏｌｙＡ＋ＲＮＡを単離し、ランダム化Ｎ６アダプタープライマー及びＭ－ＭＬＶ Ｈ－逆転写酵素を使用してランダムプライムドｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡをせん断して断片化し、更なる分析のために５００ｂｐのサイズのフラグメントを使用した。このｃＤＮＡは、Ｉｌｌｕｍｉｎａにより定められるように、それらの５’末端及び３’末端に連結されたアダプター配列Ａ及びＢを有する。続いて、この物質をＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑシーケンシング装置上で分析した。このＭｉＳｅｑにより、全部で１９，６０８，８５９個の配列を読み取った。Ｔｒｉｍｍｏｍａｔｉｃ－０．３２を使用してＩｌｌｕｍｉｎａシーケンシングアダプターからの配列をトリミングし、Ｓｅｑｐｒｅｐを使用してペアエンド配列をオーバーラップさせ、ｂｏｗｔｉｅ２（バージョン２．２．１）を使用してｐｈｉＸ混入を除去した（ｐｈｉＸ ＤＮＡは、スパイクインコントロールとして使用され、通常、＜１％で存在する）。ペアエンドリードとシングルリードをＴｒｉｎｉｔｙアセンブリ（ｔｒｉｎｉｔｙｒｎａｓｅｑ－２．０．２）で使用した。Ｔｒｉｎｉｔｙにより、合計で８８６６７個のコンティグを組み立てた。
約１５ｍＬの抽出緩衝液（２％のヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド、２％のポリビニルピロリジノンＫ３０、１００ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２５ｍＭのＥＤＴＡ、２．０ＭのＮａＣｌ、０．５ｇ／Ｌのスペルミジン及び２％のβ－メルカプトエタノール）を６５℃に温めた後、３ｇの粉砕した皮層組織を加えて混合した。等体積のクロロホルム：イソアミルアルコール（１：２４）で混合物を２回抽出し、１０ＭのＬｉＣｌの四分の一の体積を上清に加えて混合した。ＲＮＡを４℃で一晩沈殿させ、１００００ｇで２０分間の遠心分離によって回収した。５００μＬのＳＳＴＥ［１．０ＭのＮａＣｌ、０．５％のＳＤＳ、１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣ１（ｐＨ８．０）、１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）］中でペレットを溶解し、等体積のクロロホルム：イソアミルアルコールで１回抽出した。２体積のエタノールを上清に加え、－２０℃で少なくとも２時間インキュベートし、１３０００ｇで遠心分離して上清を除去した。ペレットを風乾し、水中で再懸濁した。全ＲＮＡ（６０μｇ）をＶｅｒｔｉｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＡＧ（Ｆｒｅｉｓｉｎｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に送った。ＰｏｌｙＡ＋ＲＮＡを単離し、ランダム化Ｎ６アダプタープライマー及びＭ－ＭＬＶ Ｈ－逆転写酵素を使用してランダムプライムドｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡをせん断して断片化し、更なる分析のために５００ｂｐのサイズのフラグメントを使用した。このｃＤＮＡは、Ｉｌｌｕｍｉｎａにより定められるように、それらの５’末端及び３’末端に連結されたアダプター配列Ａ及びＢを有する。続いて、この物質をＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑシーケンシング装置上で分析した。このＭｉＳｅｑにより、全部で１９，６０８，８５９個の配列を読み取った。Ｔｒｉｍｍｏｍａｔｉｃ－０．３２を使用してＩｌｌｕｍｉｎａシーケンシングアダプターからの配列をトリミングし、Ｓｅｑｐｒｅｐを使用してペアエンド配列をオーバーラップさせ、ｂｏｗｔｉｅ２（バージョン２．２．１）を使用してｐｈｉＸ混入を除去した（ｐｈｉＸ ＤＮＡは、スパイクインコントロールとして使用され、通常、＜１％で存在する）。ペアエンドリードとシングルリードをＴｒｉｎｉｔｙアセンブリ（ｔｒｉｎｉｔｙｒｎａｓｅｑ－２．０．２）で使用した。Ｔｒｉｎｉｔｙにより、合計で８８６６７個のコンティグを組み立てた。
【0148】
セスキテルペンシンターゼを同定するために、Ｃ．ギガンテア（Ｃ．ｇｉｇａｎｔｅａ）のコンティグを使用して、ｃＤＮＡ配列のデータベースを作成した。このデータベースにおいて、ＴＢＬＡＳＴＮプログラムを利用して、アラビドプシス・サリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）由来のカウレンシンターゼ（Ｑ９ＳＡＫ２）、サルビア・スクラレア（Ｓａｌｖｉａ ｓｃｌａｒｅａ）由来のスクラレオールシンターゼ（ＡＥＴ２１２４６．１）、アビエス・バスサミフェラ（Ａｂｉｅｓ ｂａｌｓａｍｉｆｅｒａ）由来のアビエノールシンターゼ（Ｈ８ＺＭ７３．１）、サルビア・スクラレア（Ｓａｌｖｉａ ｓｃｌａｒｅａ）由来の１３－ラブデン－８，１５－ジオールピロリン酸シンターゼ（ＡＥＴ２１２４８．１）を含む、セスキテルペンシンターゼのタンパク質配列と同一性を示すタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列を同定した。Ｃ．ギガンテアア（Ｃ．ｇｉｇａｎｔｅａａ）のｃＤＮＡデータベース内の合計１８４のコンティグを、セスキテルペンシンターゼとかなりの相同性を有するものとして同定した。このコンティグを、配列中のオーバーラップに従って６８のグループに分類した。これらの６８のコンティグを、ＵｎｉＰｒｏｔデータベース（２０１５年８月２８日にダウンロードされた）に存在するタンパク質配列にそれらをアライメントするＢＬＡＳＴＸプログラムを使用して分析することによって更に特性を明らかにした。本発明者らは、それらのＵｎｉＰｒｏｔに存在するテルペンシンターゼ配列との相同性及びそれらの特徴に従い、手作業でそれらの１２個を推定上のジテルペンシンターゼ配列として同定した。
【0149】
Ｃｕｐ２ｖ１、Ｃｕｐ２ｖ２ａ及びＣｕｐ２ｖ２ｂの同定
ｃＤＮＡ配列の特徴の熟達した分析に基づいて、それらの３つが最も有望な候補遺伝子として本発明者らにより選択された。配列番号１及び２に示されるｃＤＮＡ配列は、それぞれＣｕｐ２ｖ１及びＣｕｐ２ｖ２ｂとして同定された。Ｃｕｐ２ｖ１タンパク質は配列番号３として示され、Ｃｕｐ２ｖ２ｂタンパク質は配列番号４として示される。Ｃｕｐ２ｖ１とＣｕｐ２ｖ２ｂタンパク質は、アミノ酸レベルで互いに９３．８％同一である。
ｃＤＮＡ配列の特徴の熟達した分析に基づいて、それらの３つが最も有望な候補遺伝子として本発明者らにより選択された。配列番号１及び２に示されるｃＤＮＡ配列は、それぞれＣｕｐ２ｖ１及びＣｕｐ２ｖ２ｂとして同定された。Ｃｕｐ２ｖ１タンパク質は配列番号３として示され、Ｃｕｐ２ｖ２ｂタンパク質は配列番号４として示される。Ｃｕｐ２ｖ１とＣｕｐ２ｖ２ｂタンパク質は、アミノ酸レベルで互いに９３．８％同一である。
【0150】
３番目のｃＤＮＡ配列はＣｕｐ２ｖ２ｂに類似しており、Ｃｕｐ２ｖ２ａと命名した。
【0151】
本発明者らは、人為的に短縮した配列のバージョンを生成し、それによって色素体標的化シグナルを除去し、Ｎ末端を変更した。これらの切断アミノ酸配列（ｔｒｃｕｐ２ｖ１、ｔｒｃｕｐ２ｖ２ａ及びｔｒｃｕｐ２ｖ２ｂと命名した）を、それぞれ配列番号５～７に示す。完全長のＣｕｐ２ｖ２ａタンパク質は、配列番号３４に示され、そのｃＤＮＡ配列を配列番号３５に示す。
【0152】
既知のサルビア（Ｓａｌｖｉａ）属スクラレオールシンターゼ（ＳｓＳＳ）のうち、切断バージョンをコントロールとして作成した（ｔｒＳｓＳＳ）。
【0153】
ＮＣＢＩのｎｒタンパク質データベースのＢＬＡＳＴにより、これらのタンパク質の最も近縁の相同体は、タイワニア・クリプトメリオイデス（Ｔａｉｗａｎｉａ ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉｏｉｄｅｓ）由来の未知の生成物特異性を有するジテルペンシンターゼ（ＡＯＧ１８２３１．１）であり、６７．６％のアミノ酸同一性を有することが明らかになった。特性が明らかとなったタンパク質のｕｎｉｐｒｏｔデータベースのＢＬＡＳＴにより、３９．１％のアミノ酸同一性を有するバイテックス・アグナスカスタス（Ｖｉｔｅｘ ａｇｎｕｓｃａｓｔｕｓ）由来のｅｎｔ－カウレンシンターゼが明らかになった。
【0154】
【表1】
【0155】
Ｃｕｐ２ｖ１、Ｃｕｐ２ｖ２ａ及びＣｕｐ２ｖ２ｂタンパク質は、本発明者らにより、アビエノール、マノオール及び／又はスクラレオールを生成するための工程２のジテルペンアルコールシンターゼの候補となることが同定された。本発明者らにより、Ｃｕｐ２ｖ１、Ｃｕｐ２ｖ２ａ及びＣｕｐ２ｖ２ｂの間で本質的に保存された領域が同定された（アライメントである図４を参照されたい）。シンターゼにおけるこの領域は、他のシンターゼの産物決定領域に対応する位置にあるが、前記他のシンターゼの産物決定領域、例えば既知のサルビア属（Ｓａｌｖｉａ）スクラレオールシンターゼにおける産物決定領域と異なる。Ｃｕｐ２ｖ１、Ｃｕｐ２ｖ２ａ及びＣｕｐ２ｖ２ｂは、異なる生成物特異性を有するが（下記を参照されたい）、既知の他のジテルペンシンターゼにおいて生成物特異性を決定するのに典型的に関与する領域は、前記Ｃｕｐタンパク質の間では極めて異なりながらも保存されている。
【0156】
実施例２：ロドバクター属（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）における工程１及び工程２の遺伝子を発現するためのプラスミドの構築
ロドバクター属（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）における発現のため、融合タンパク質を、マルトース結合タンパク質を含むＣｕｐ２ｖ１、Ｃｕｐ２ｖ２ａ、Ｃｕｐ２ｖ２ｂの切断バージョン（ｍｂｐＣｕｐ２ｖ１、ｍｂｐＣｕｐ２ｖ２ａ及びｍｂｐＣｕｐ２ｖ２ｂと命名し、それぞれ配列番号８～１０を参照されたい）と、多くの工程１の遺伝子である、ＣｆＬＰＰＳ、ＣｆＣＰＰＳ及びＮｔＬＰＰＳのチオレドキシンＴｒｘとの融合タンパク質（配列番号１２～１４を参照されたい）とを設計した。比較のため、ＣｆＬＰＰＳをサルビア・スクラレア（Ｓａｌｖｉａ ｓｃｌａｒｅａ）のスクラレオールシンターゼ（ＳｓＳＳ）の切断バージョンと組み合わせて発現させた構築物も調製した。この切断バージョンは、Ｓｃｈａｌｋ Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１２，１３４，１８９００－１８９０３に公開されたようなＳｓＳＳに対応する。
ロドバクター属（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）における発現のため、融合タンパク質を、マルトース結合タンパク質を含むＣｕｐ２ｖ１、Ｃｕｐ２ｖ２ａ、Ｃｕｐ２ｖ２ｂの切断バージョン（ｍｂｐＣｕｐ２ｖ１、ｍｂｐＣｕｐ２ｖ２ａ及びｍｂｐＣｕｐ２ｖ２ｂと命名し、それぞれ配列番号８～１０を参照されたい）と、多くの工程１の遺伝子である、ＣｆＬＰＰＳ、ＣｆＣＰＰＳ及びＮｔＬＰＰＳのチオレドキシンＴｒｘとの融合タンパク質（配列番号１２～１４を参照されたい）とを設計した。比較のため、ＣｆＬＰＰＳをサルビア・スクラレア（Ｓａｌｖｉａ ｓｃｌａｒｅａ）のスクラレオールシンターゼ（ＳｓＳＳ）の切断バージョンと組み合わせて発現させた構築物も調製した。この切断バージョンは、Ｓｃｈａｌｋ Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１２，１３４，１８９００－１８９０３に公開されたようなＳｓＳＳに対応する。
【0157】
パラコッカス・ゼアキサンチニファシエンス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ）由来のメバロン酸オペロンを、国際公開第２０１８／１６００６６ Ａ１号明細書に記載されているようなＬｐｐａプロモーターから発現させたＣｇＩｄｓＡ並びにｃｒｔＥプロモーター、次いでｔｒｘ－工程１の遺伝子、リボソーム結合部位及びｍｂｐ－工程２の遺伝子から構成されるオペロンと共に、欧州特許出願公開第２ ３３６ ３１０ Ａ１号明細書に記載されているようなその天然プロモーターにより発現させた構築物を作製した。
【0158】
以下の一連の構築物を調製した。
ａ．ｐＢＢＲ－ＭＥＶ－ＰｃｒｔＥ－ＴｒｘＮｔＬＰＰＳ－ｍｂｐＣｕｐ２ｖ１－Ｐｒｐｌｍ－ＣｇＩｓｄＡ
ｂ．ｐＢＢＲ－ＭＥＶ－ＰｃｒｔＥ－ＴｒｘＣｆＬＰＰＳ－ｍｂｐＣｕｐ２ｖ１－Ｐｒｐｌｍ－ＣｇＩｓｄＡ
ｃ．ｐＢＢＲ－ＭＥＶ－ＰｃｒｔＥ－ＴｒｘＮｔＬＰＰＳ－ｍｂｐＣｕｐ２ｖ２ａ－Ｐｒｐｌｍ－ＣｇＩｓｄＡ
ｄ．ｐＢＢＲ－ＭＥＶ－ＰｃｒｔＥ－ＴｒｘＣｆＬＰＰＳ－ｍｂｐＣｕｐ２ｖ２ａ－Ｐｒｐｌｍ－ＣｇＩｓｄＡ
ｅ．ｐＢＢＲ－ＭＥＶ－ＰｃｒｔＥ－ＴｒｘＣｆＬＰＰＳ－ｍｂｐＣｕｐ２ｖ２ｂ－Ｐｒｐｌｍ－ＣｇＩｓｄＡ
ｆ．ｐＢＢＲ－ＭＥＶ－ＰｃｒｔＥ－ＴｒｘＣｆＣＰＰＳ－ｍｂｐＣｕｐ２ｖ２ａ－Ｐｒｐｌｍ－ＣｇＩｓｄＡ
ｇ．ｐＢＢＲ－ＭＥＶ－ＰｃｒｔＥ－ＴｒｘＣｆＬＰＰＳ－ＳｓＳＳ－Ｐｒｐｌｍ－ＣｇＩｓｄＡ
ａ．ｐＢＢＲ－ＭＥＶ－ＰｃｒｔＥ－ＴｒｘＮｔＬＰＰＳ－ｍｂｐＣｕｐ２ｖ１－Ｐｒｐｌｍ－ＣｇＩｓｄＡ
ｂ．ｐＢＢＲ－ＭＥＶ－ＰｃｒｔＥ－ＴｒｘＣｆＬＰＰＳ－ｍｂｐＣｕｐ２ｖ１－Ｐｒｐｌｍ－ＣｇＩｓｄＡ
ｃ．ｐＢＢＲ－ＭＥＶ－ＰｃｒｔＥ－ＴｒｘＮｔＬＰＰＳ－ｍｂｐＣｕｐ２ｖ２ａ－Ｐｒｐｌｍ－ＣｇＩｓｄＡ
ｄ．ｐＢＢＲ－ＭＥＶ－ＰｃｒｔＥ－ＴｒｘＣｆＬＰＰＳ－ｍｂｐＣｕｐ２ｖ２ａ－Ｐｒｐｌｍ－ＣｇＩｓｄＡ
ｅ．ｐＢＢＲ－ＭＥＶ－ＰｃｒｔＥ－ＴｒｘＣｆＬＰＰＳ－ｍｂｐＣｕｐ２ｖ２ｂ－Ｐｒｐｌｍ－ＣｇＩｓｄＡ
ｆ．ｐＢＢＲ－ＭＥＶ－ＰｃｒｔＥ－ＴｒｘＣｆＣＰＰＳ－ｍｂｐＣｕｐ２ｖ２ａ－Ｐｒｐｌｍ－ＣｇＩｓｄＡ
ｇ．ｐＢＢＲ－ＭＥＶ－ＰｃｒｔＥ－ＴｒｘＣｆＬＰＰＳ－ＳｓＳＳ－Ｐｒｐｌｍ－ＣｇＩｓｄＡ
【0159】
これらの構築物を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｓ１７－１に導入し、得られた株は、標準的な手順を用いてロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）Ｒｓ２６５－９ｃにコンジュゲートするために使用した。得られた株を、それらのプラスミドにちなんで命名した。
【0160】
実施例３：Ｃ２０テルペノイドアルコールの小規模組換え製造
米国特許出願公開第２０２０／００１０８２２Ａ１号明細書に基本的に記載されているように、各株を小規模生産試験に使用した。この目的のために、１００ｍｇ／Ｌのネオマイシンを含むＲＳ１０２培地２０ｍｌと１白金耳のグリセロールストックを含む、バッフルのない１００ｍｌの振盪フラスコ中で種培養を行った。種培養フラスコを、１１０ｒｐｍで軌道５０ｍｍの振盪インキュベーター内において３０℃で７２時間培養した。
米国特許出願公開第２０２０／００１０８２２Ａ１号明細書に基本的に記載されているように、各株を小規模生産試験に使用した。この目的のために、１００ｍｇ／Ｌのネオマイシンを含むＲＳ１０２培地２０ｍｌと１白金耳のグリセロールストックを含む、バッフルのない１００ｍｌの振盪フラスコ中で種培養を行った。種培養フラスコを、１１０ｒｐｍで軌道５０ｍｍの振盪インキュベーター内において３０℃で７２時間培養した。
【0161】
７２時間が終了した時点で、培養液の正確な量を計算するために培養液のＯＤ６００を評価し、より大型のフラスコに移した。
【0162】
２つの底面バッフルを備える３００ｍｌの振盪フラスコで振盪フラスコ実験を行った。２０ｍｌのＲＳ１０２培地と最終濃度を１００ｍｇ／Ｌとしたネオマイシンを、２ｍｌの滅菌ｎ－ドデカンと共にフラスコに加えた。２０ｍｌの培地中で最終的なＯＤ６００値が０．０５となるように、接種物の量を調整した。
【0163】
このフラスコを、１１０ｒｐｍで軌道５０ｍｍの振盪インキュベーター内において３０℃で７２時間保持した。その後、培養液をあらかじめ計量された５０ｍｌのＰＰチューブに回収し、次いで４５００×ｇで２０分間遠心分離した。その後のＧＣ分析のため、ｎ－ドデカン層をマイクロ遠心チューブに移した。
【0164】
１０ｍｌのガラス製バイアルに１０マイクロリットルのラウリン酸エチルを秤量し、これに８００μｌの単離したドデカン溶液を加えて秤量した。その後、より正確にＧＣ分析を行うために、８ｍｌのアセトンをバイアルに加え、ドデカンの濃度を希釈した。約１．５ｍｌのテルペン含有ドデカンのアセトン溶液を、クロマトグラフィーバイアルに移した。米国特許出願公開第２０２０／００１０８２２Ａ１号明細書に記載されているように、各試料をガスクロマトグラフィーで分析した。化合物を同定するため、約２μＬを、Ｃａｎｋａｒ ｅｔ ａｌ．（２０１５）に詳細に記載されているようなガスクロマトグラフを用いるＧＣ／ＭＳによって分析した。スクラレオール、マノオール及びアビエノールの標準物質（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）と保持時間及び質量スペクトルを比較することによって生成物を同定した。
【0165】
株ｐＢＢＲ－ＭＥＶ－ＰｃｒｔＥ－ＴｒｘＮｔＬＰＰＳ－ｍｂｐＣｕｐ２ｖ１－Ｐｒｐｌｍ－ＣｇＩｓｄＡ及びｐＢＢＲ－ＭＥＶ－ＰｃｒｔＥ－ＴｒｘＣｆＬＰＰＳ－ｍｂｐＣｕｐ２ｖ１－Ｐｒｐｌｍ－ＣｇＩｓｄＡのＧＣ分析から、１３．６１分に溶出する化合物が明らかとなった（図２ａ、ｂ）。ＧＣ ＭＳ分析により、この化合物がアビエノールに対応することが確認された（図３ａ）。アビエノールに関し、構築物により以下の力価（ｇ／ｋｇ ｎ－ドデカン）であることが判明した：ｐＢＢＲ－ＭＥＶ－ＰｃｒｔＥ－ＴｒｘＮｔＬＰＰＳ－ｍｂｐＣｕｐ２ｖ１－Ｐｒｐｌｍ－ＣｇＩｓｄＡでは１．９及びｐＢＢＲ－ＭＥＶ－ＰｃｒｔＥ－ＴｒｘＣｆＬＰＰＳ－ｍｂｐＣｕｐ２ｖ１－Ｐｒｐｌｍ－ＣｇＩｓｄＡでは３．５。
【0166】
株ｐＢＢＲ－ＭＥＶ－ＰｃｒｔＥ－ＴｒｘＣｆＣＰＰＳ－ｍｂｐＣｕｐ２ｖ２ａ－Ｐｒｐｌｍ－ＣｇＩｓｄＡのＧＣ分析（図２ｆ）から、１３．２９分に溶出する化合物が生成された。ＧＣ ＭＳ分析により、この化合物がマノオールに対応することが明らかとなった（図３ｃ）。マノオールに関し、構築物により以下の力価（ｇ／ｋｇ ｎ－ドデカン）であることが判明した：ｐＢＢＲ－ＭＥＶ－ＰｃｒｔＥ－ＴｒｘＣｆＣＰＰＳ－ｍｂｐＣｕｐ２ｖ２ａ－Ｐｒｐｌｍ－ＣｇＩｓｄＡで１．５。
【0167】
株ｐＢＢＲ－ＭＥＶ－ＰｃｒｔＥ－ＴｒｘＮｔＬＰＰＳ－ｍｂｐＣｕｐ２ｖ２ａ－Ｐｒｐｌｍ－ＣｇＩｓｄＡ、ｐＢＢＲ－ＭＥＶ－ＰｃｒｔＥ－ＴｒｘＣｆＬＰＰＳ－ｍｂｐＣｕｐ２ｖ２ａ－Ｐｒｐｌｍ－ＣｇＩｓｄＡ、ｐＢＢＲ－ＭＥＶ－ＰｃｒｔＥ－ＴｒｘＣｆＬＰＰＳ－ＳｓＳＳ－Ｐｒｐｌｍ－ＣｇＩｓｄＡ及びｐＢＢＲ－ＭＥＶ－ＰｃｒｔＥ－ＴｒｘＣｆＬＰＰＳ－ｍｂｐＣｕｐ２ｖ２ｂ－Ｐｒｐｌｍ－ＣｇＩｓｄＡのＧＣ分析から、１４．０３分に溶出する新たな化合物が明らかとなった（図２ｃ、ｄ、ｅ）。ＧＣ ＭＳ分析により、この化合物がスクラレオールに対応することが確認された（図３ｂ）。異なる構築物によるスクラレオールの定量分析を下記の表に示す。
【0168】
【表2】
【0169】
配列番号７と比較してＮ末端に追加の配列を有するＣｕｐ２ｖ２ｂの更なる配列バリアントも、Ｎ末端にＭＢＰを有する融合タンパク質（配列番号２８～３０）として同様の設定で試験した。上記表１の４行目のｐＢＢＲ－ＭＥＶ－ＰｃｒｔＥ－ＴｒｘＣｆＬＰＰＳ－ｍｂｐＣｕｐ２ｖ２ｂ－Ｐｒｐｌｍ－ＣｇＩｓｄＡで示されるように、３つ全てが同様のレベルのスクラレオール生成物であることが示された。
【図1】
【図2a】
【図2b】
【図2c】
【図2d】
【図2e】
【図2f】
【図3a】
【図3b】
【図3c】
【図4】
【図5-1】
【図5-2】
【図6-1】
【図6-2】
【配列表】
【国際調査報告】