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特表2024-525078ＭＡＲＣ１遺伝子を標的にするＲＮＡｉ製剤及びその用途
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-07-09
(54)【発明の名称】ＭＡＲＣ１遺伝子を標的にするＲＮＡｉ製剤及びその用途
(51)【国際特許分類】
A61K 31/7105 20060101AFI20240702BHJP
A61K 31/7125 20060101ALI20240702BHJP
A61K 31/712 20060101ALI20240702BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20240702BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240702BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20240702BHJP
C12N 15/113 20100101ALN20240702BHJP
【ＦＩ】
A61K31/7105
A61K31/7125
A61K31/712
A61P1/16
A61P43/00 105
A61K48/00
C12N15/113 Z ZNA
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024500173
(86)(22)【出願日】2022-07-08
(85)【翻訳文提出日】2024-01-17
(86)【国際出願番号】 KR2022009984
(87)【国際公開番号】W WO2023282704
(87)【国際公開日】2023-01-12
(31)【優先権主張番号】10-2021-0089864
(32)【優先日】2021-07-08
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】518028055
【氏名又は名称】オリックス ファーマシューティカルズ，インコーポレーテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110002572
【氏名又は名称】弁理士法人平木国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ホン，ソン ウ
(72)【発明者】
【氏名】パク，ジュン ヒョン
(72)【発明者】
【氏名】チェ，チョン ヨン
【テーマコード（参考）】
4C084
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C084AA13
4C084NA14
4C084ZA75
4C084ZB21
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZA75
4C086ZB21
(57)【要約】
本発明は、ＭＡＲＣ１（mitochondrial amidoxime reducing component 1）遺伝子を標的にするＲＮＡｉ製剤及びその用途に係り、さらに詳細には、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡ配列に対して配列相補性を有するアンチセンスストランド、及び該アンチセンスストランドに対して配列相補性を有するセンスストランドを含むＲＮＡｉ製剤、及びＲＮＡｉ製剤を含む非アルコール性脂肪肝疾患のような肝疾患の予防用または治療用の薬学組成物に関する。
【選択図】図２９
【選択図】図２９
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＭＡＲＣ１（mitochondrial amidoxime reducing component 1）ｍＲＮＡ配列に対して配列相補性を有する、長さが１９ないし２１ｎｔであるヌクレオチド（ｎｔ）であるアンチセンスストランド、及び前記アンチセンスストランドに対して配列相補性を有する、長さが１５ないし１７ｎｔであるセンスストランドを含むＲＮＡｉ製剤であり、前記アンチセンスストランド５’末端及び前記センスストランド３’末端は、平滑末端（blunt end）を形成する、ＲＮＡｉ製剤。
【請求項2】
前記センスストランドは、表１、表１０、表１１、表１２、表１３及び表１４に列挙されたアンチセンスストランド配列のうちから選択された配列を有する、請求項１に記載のＲＮＡｉ製剤。
【請求項3】
前記センスストランドは、配列番号１４９、配列番号１５９、配列番号１７７、配列番号１７９、配列番号１８３、配列番号１９７、配列番号１９９、配列番号２２７、配列番号２４７、配列番号２５１、配列番号２５７、配列番号２５９、配列番号２６１、配列番号２７３、配列番号２８５、配列番号２８７、配列番号３３１、配列番号３５３、配列番号３８７、配列番号３９１、配列番号３９９、配列番号４２３、配列番号４２９、配列番号４３１、配列番号４３５、配列番号４３９、配列番号４４３、配列番号４４５、配列番号４４７及び配列番号５２７によってなる群のうちから選択されるいずれか一つのものである、請求項１に記載のＲＮＡｉ製剤。
【請求項4】
前記センスストランドは、配列番号６１、配列番号１４９、配列番号１８３、配列番号２２７、配列番号４２３、配列番号４３１、配列番号４３５、配列番号４３９、配列番号４４７、配列番号５２７及び配列番号５５１によってなる群のうちから選択されるいずれか一つのものである、請求項１に記載のＲＮＡｉ製剤。
【請求項5】
前記アンチセンスストランドは、表１、表１０、表１１、表１２、表１３及び表１４に列挙されたセンスストランド配列のうちから選択された配列を有する、請求項１に記載のＲＮＡｉ製剤。
【請求項6】
前記アンチセンスストランドは、配列番号１５０、配列番号１６０、配列番号１７８、配列番号１８０、配列番号１８４、配列番号１９８、配列番号２００、配列番号２２８、配列番号２４８、配列番号２５２、配列番号２５８、配列番号２６０、配列番号２６２、配列番号２７４、配列番号２８６、配列番号２８８、配列番号３３２、配列番号３５４、配列番号３８８、配列番号３９２、配列番号４００、配列番号４２４、配列番号４３０、配列番号４３２、配列番号４３６、配列番号４４０、配列番号４４４、配列番号４４６、配列番号４４８及び配列番号５２８によってなる群のうちから選択されるいずれか一つのものである、請求項１に記載のＲＮＡｉ製剤。
【請求項7】
前記アンチセンスストランドは、配列番号６２、配列番号１５０、配列番号１８４、配列番号２２８、配列番号４２４、配列番号４３２、配列番号４３６、配列番号４４０、配列番号４４８、配列番号５２８及び配列番号５５２によってなる群のうちから選択されるいずれか一つのものである、請求項１に記載のＲＮＡｉ製剤。
【請求項8】
前記ＲＮＡｉ製剤は、ＭＡＲＣ１の発現を抑制する、請求項１に記載のＲＮＡｉ製剤。
【請求項9】
前記センスストランドは、３’末端にＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ：Ｎ－acetylgalactosamine）誘導体と結合されている、請求項１に記載のＲＮＡｉ製剤。
【請求項10】
前記センスストランドまたは前記アンチセンスストランドは、１以上の化学的変形（chemical modification）を含む、請求項１に記載のＲＮＡｉ製剤。
【請求項11】
前記センスストランドは、下記のところから選択された１以上の化学的変形を含む、請求項１０に記載のＲＮＡｉ製剤：５’末端から隣接した２ないし４個のヌクレオチド結合を、ホスホロチオエート（phosphorothioate）、ボラノホスフェート（boranophosphate）、またはメチルホスホネート（methylphosphonate）で変形；
１個以上のヌクレオチド内の糖構造の２’炭素位置において、－ＯＨ基が、－ＣＨ３（methyl）、－ＯＣＨ３（methoxy）、－ＮＨ２、－Ｆ、－Ｏ－２－メトキシエチル－Ｏ－プロピル、－Ｏ－２－メチルチオエチル（methylthioethyl）、－Ｏ－３－アミノプロピルまたは－Ｏ－３－ジメチルアミノプロピルで置換；及び
３’末端における、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ：Ｎ－acetylgalactosamine）誘導体または細胞浸透ペプチドとの結合。
【請求項12】
前記アンチセンスストランドは、下記のところから選択された１以上の化学的変形を含む、請求項１０に記載のＲＮＡｉ製剤：３’末端または５’末端から隣接した２個ないし７個のヌクレオチド結合を、ホスホロチオエート（phosphorothioate）、ボラノホスフェート（boranophosphate）またはメチルホスホネート（methylphosphonate）で変形；
１個以上のヌクレオチド内の糖構造の２’炭素位置において、－ＯＨ基が、－ＣＨ３（methyl）、－ＯＣＨ３（methoxy）、－ＮＨ２、－Ｆ、－Ｏ－２－メトキシエチル－Ｏ－プロピル、－Ｏ－２－メチルチオエチル（methylthioethyl）、－Ｏ－３－アミノプロピルまたは－Ｏ－３－ジメチルアミノプロピルで置換されること；及び
５’末端における、リン酸基（phosphate group）、Ｅ－ビニルホスホネート（Ｅ－vinylphosphonate）または細胞浸透ペプチドとの結合。
【請求項13】
前記ＲＮＡｉ製剤は、センスストランドまたはアンチセンスストランドにおいて、３’末端または５’末端から隣接した２個ないし７個のヌクレオチド結合をし、
ホスホロチオエート（phosphorothioate）で変形されること；
センスストランドまたはアンチセンスストランドのうち１個以上のヌクレオチド内の糖構造の２’炭素位置において、－ＯＨ基が－ＯＣＨ３（methoxy）または－Ｆで置換される変形；
センスストランド３’末端における、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ：Ｎ－acetylgalactosamine）誘導体との結合；及び
アンチセンスストランド５’末端における、リン酸基（phosphate group）またはＥ－ビニルホスホネート（Ｅ－vinylphosphonate）との結合；によって構成された群のうちから選択された１以上の変形を含む、請求項１０に記載のＲＮＡｉ製剤。
【請求項14】
前記センスストランドは、表２、表１５、表１６及び表１７に列挙されたアンチセンスストランド配列のうちから選択された配列を有する、請求項１０に記載のＲＮＡｉ製剤。
【請求項15】
前記アンチセンスストランドは、表２、表１５、表１６及び表１７に列挙されたアンチセンスストランド配列のうちから選択された配列を有する、請求項１０に記載のＲＮＡｉ製剤。
【請求項16】
請求項１ないし１５のうちいずれか１項に記載のＲＮＡｉ製剤を有効成分として含む、肝疾患の予防用または治療用の薬学的組成物。
【請求項17】
前記肝疾患は、脂肪肝、肝線維症または肝硬変である、請求項１６に記載の肝疾患の予防用または治療用の薬学的組成物。
【請求項18】
前記脂肪肝は、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ：non-alcoholic fatty liver disease）である、請求項１７に記載の肝疾患の予防用または治療用の薬学的組成物。
【請求項19】
前記非アルコール性脂肪肝疾患は、単純脂肪肝症（simple steatosis）または非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ：non－alcoholic steatohepatitis）である、請求項１８に記載の肝疾患の予防用または治療用の薬学的組成物。
【請求項20】
請求項１ないし１５のうちいずれか１項に記載のＲＮＡｉ製剤を個体に投与する段階を含む、肝疾患を予防または治療する方法。
【請求項21】
肝疾患を予防または治療するための医薬の製造のための請求項１ないし１５のうちいずれか１項に記載のＲＮＡｉ製剤の用途。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ＭＡＲＣ１（mitochondrial amidoxime reducing component 1）遺伝子を標的にするＲＮＡｉ製剤及びその用途に係り、さらに詳細には、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡ配列に対して配列相補性を有するアンチセンスストランド、及び前記アンチセンスストランドに対して配列相補性を有するセンスストランドを含むＲＮＡｉ製剤、及び前記ＲＮＡｉ製剤を含む非アルコール性脂肪肝疾患のような肝疾患の予防用または治療用の薬学組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
最近になり、肥満人口増加による代謝症侯群の有病率上昇と共に、非アルコール性脂肪肝疾患の有病率も上昇勢にある。脂肪肝は、肝細胞内に中性脂肪が蓄積される疾患であり、肥満の合併症として誘発されるか、あるいはその他多様な原因、例えば、アルコール、糖尿、栄養不良症、薬物の濫用などによって誘発されると報告されているが、大きく見て、過多なアルコール摂取によるアルコール性脂肪肝疾患と、アルコール摂取とかかわらず、肝内に中性脂肪が蓄積される非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ：non-alcoholic fatty liver disease）とに区分され、該非アルコール性脂肪肝疾患には、単純脂肪肝症（simple steatosis）と非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ：non-alcoholic steatohepatitis）とが含まれる。
【0003】
単純脂肪肝症は、比較的予後が良好であるが、脂肪の蓄積がはなはだしくなれば、炎症、すなわち、脂肪肝炎（steatohepatitis）に進行し、広範囲な脂肪肝炎を伴う肝臓においては、肝細胞の壊死が示され、また星状細胞（stellate cell）が活性化されて繊維化が起こることになるが、特に肝静脈ではないという部位において、洞様欠陥周辺線維化（perisinusoidal fibrosis）がはなはだしく示される。従って、脂肪肝炎を放置すれば、肝繊維化または肝硬変に発展し、予後が不良になる。非アルコール性脂肪肝炎患者の１５～５０％において、肝臓の繊維化または硬変が示され、繊維化患者の３０％においては、１０年後に肝硬変が示される。
【0004】
非アルコール性脂肪肝疾患は、肥満、心臓疾患、糖尿病のような多様な代謝症侯群と密接に関連しており、そのような側面において、インスリン抵抗性改善剤、抗酸化剤、高脂血症治療剤、肝庇護薬、アンジオテンシンＩＩ受容体の拮抗剤のような、代謝症侯群に対する抑制効果がある薬剤が臨床的に試みされた。しかしながら、これまでのところ、非アルコール性脂肪肝疾患治療のための臨床的証拠を有する薬物の開発がなされていない実情であり、現在使用中の薬物は、いずれも次善策として選択されうる適応外（off-label）薬物だけが存在するのみであるが、そのような既存の適応外（off-label）薬物は、臨床的根拠が不足しており、安全性問題などにより、使用が制限的であるという限界がある。例えば、インスリン抵抗性改善薬であるピオグリタゾン（pioglitazone）は、非アルコール性脂肪肝炎治療剤として有望であったが、臨床において、肝線維化に対する実在的な改善効果が示されなかっただけではなく、骨折リスク、体重増加、心不全の悪化及び発症のような副作用問題点により、治療剤としての判定基準を明確に満足させることができなかった。そのように、非アルコール性脂肪肝疾患に対して承認された治療剤が全くない状況において、最近、米国食品医薬局（ＦＤＡ）は、非アルコール性脂肪肝炎の臨床指標として、炎症低減、肝繊維化低減、非アルコール性脂肪肝炎症状の緩和などを提示していた。
【0005】
なお、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ interference）現象を利用した疾病の治療は、ｍＲＮＡをターゲットにし、遺伝子発現を翻訳レベル（translational level）で調節する短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ：small interfering ＲＮＡ）を利用するために、さらに安全に疾病を治療する治療剤として注目されている。
【0006】
それにより、本発明者らは、非アルコール性脂肪肝炎の臨床指標に対する改善効果を示す新たな安全な薬物を開発するために、鋭意研究努力した結果、ＲＮＡ干渉技術を利用したＲＮＡ製剤を開発した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明の目的は、ＭＡＲＣ１の発現を特異的に抑制するＲＮＡｉ製剤を提供するところにある。
【0008】
本発明の他の目的は、前記ＲＮＡｉ製剤を含む、肝疾患の予防用または治療用の薬学組成物、または肝疾患の予防方法または治療方法を提供するところにある。
【課題を解決するための手段】
【0009】
前記目的を達成するために、一態様は、ＭＡＲＣ１（mitochondrial amidoxime reducing component 1）ｍＲＮＡ配列に対して配列相補性を有する、長さが１９ないし２１ｎｔであるヌクレオチド（ｎｔ）であるアンチセンスストランド、及び前記アンチセンスストランドに対して配列相補性を有する、長さが１５ないし１７ｎｔであるセンスストランドを含むＲＮＡｉ製剤であり、前記アンチセンスストランド５’末端及び前記センスストランド３’末端は、平滑末端（blunt end）を形成するＲＮＡｉ製剤を提供する。
【0010】
他の態様は、前記ＲＮＡｉ製剤を有効成分として含む、肝疾患の予防用または治療用の薬学組成物を提供する。
【0011】
さらに他の態様は、前記ＲＮＡｉ製剤を個体に投与する段階を含む、肝疾患の予防方法または治療方法を提供する。
【0012】
さらに他の態様は、肝疾患を予防または治療するための医薬の製造のための前記ＲＮＡｉ製剤の用途を提供する。
【発明の効果】
【0013】
一態様によるＲＮＡｉ製剤は、非特異的免疫反応、オフターゲット効果のような副作用を緩和させながら、ＭＡＲＣ１をエンコーディングするｍＲＮＡに結合し、それを分解することにより、前記タンパク質の発現を抑制することができる。
【0014】
また、一態様によるＲＮＡｉ製剤は、肝細胞表面受容体をターゲッティングし、肝組織内脂肪の蓄積緩和、炎症低減、肝繊維化低減、非アルコール性脂肪肝炎症状の緩和のような効果を示すので、非アルコール性脂肪肝疾患、肝線維症、肝硬変などを含む肝疾患の標的治療剤として有用に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【図1】一様相によるＭＡＲＣ１ ａｓｉＲＮＡ ５０種を、それぞれ１０ｎＭの濃度で、Ｈｕｈ７細胞に処理した後、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡの発現レベルを確認した結果である。
【図2】一様相によるＭＡＲＣ１ ＧａｌＮＡｃ－ａｓｉＲＮＡ ２３種を、それぞれ２００ｎＭの濃度で、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに由来する一次肝細胞に処理した後、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡの発現レベルを確認した結果である。
【図3】一様相による、ＯＬＸ－００３－１またはＯＬＸ－０３１－１を、高脂肪食餌が提供された動物モデルに投与した後（＃３－１、＃３１－１）、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡ及びＭＡＲＣ２ ｍＲＮＡの発現レベルを確認したものであり、Ａは、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡの発現レベルを確認した結果であり、Ｂは、ＭＡＲＣ２ ｍＲＮＡの発現レベルを確認した結果である。
【図4】一様相による、ＯＬＸ－００３－１またはＯＬＸ－０３１－１を、高脂肪食餌が提供された動物モデルに投与した後（＃３－１、＃３１－１）、肝臓の外観を肉眼で確認した結果である。
【図5】一様相による、ＯＬＸ－００３－１またはＯＬＸ－０３１－１を、高脂肪食餌が提供された動物モデルに投与した後（＃３－１、＃３１－１）、肝実質内の脂肪液胞のレベルを、Ｈ＆Ｅ染色法を介して確認した結果である。
【図6】一様相による、ＯＬＸ－００３－１またはＯＬＸ－０３１－１を、高脂肪食餌が提供された動物モデルに投与した後（＃３－１、＃３１－１）、肝実質内の脂肪液胞のレベルをオイルレッドＯ染色法を介して確認した結果である。
【図7】一様相によるＯＬＸ－０３１－１を、高脂肪食餌が提供された動物モデルに投与した後（＃０３１－１）、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡ及びＭＡＲＣ２ ｍＲＮＡの発現レベルを確認したものであり、Ａは、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡの発現レベルを確認した結果であり、Ｂは、ＭＡＲＣ２ ｍＲＮＡの発現レベルを確認した結果である。
【図8】一様相によるＯＬＸ－０３１－１を、高脂肪食餌が提供された動物モデルに投与した後（＃０３１－１）、肝臓の外観を肉眼で確認した結果である。
【図9】一様相によるＯＬＸ－０３１－１を、高脂肪食餌が提供された動物モデルに投与した後（＃０３１－１）、肝実質内の脂肪液胞のレベルを、Ｈ＆Ｅ染色法を介して確認した結果である。
【図10】一様相によるＯＬＸ－０３１－１を、高脂肪食餌が提供された動物モデルに投与した後（＃３１－１）、肝実質内の脂肪液胞及びコラーゲン沈着のレベルを、ピクロシリウスレッド染色法を介して確認した結果である。
【図11】一様相によるＯＬＸ－０３１－１を、高脂肪食餌が提供された動物モデルに投与した後（＃０３１－１）、肝繊維化関連因子の発現レベルを評価したものであり、Ａは、α－ＳＭＡ ｍＲＮＡの発現レベルを確認した結果であり、Ｂは、Ｃｏｌ１α１ ｍＲＮＡの発現レベルを確認した結果である。
【図12】一様相によるＯＬＸ－０３１－１を、高脂肪食餌が提供された動物モデルに投与した後（＃０３１－１）、肝組織内の中性脂肪のレベルを確認した結果である。
【図13】一様相によるＯＬＸ－０３１－１を、高脂肪食餌が提供された動物モデルに投与した後（＃０３１－１）、肝損傷指標因子の変化を確認したものであり、Ａは、血清内ＡＳＴレベルを確認した結果であり、Ｂは、血清内ＡＬＴレベルを確認した結果であり、Ｃは、血清内ＡＳＴ／ＡＬＴの比率を算出した結果である。
【図14】一様相によるＯＬＸ－０３１－１を、高脂肪食餌が提供された動物モデルに投与した後（＃３１－１）、血清内脂質指標物質の変化を確認したものであり、Ａは、コレステロールのレベルを確認した結果であり、Ｂは、中性脂肪のレベルを確認した結果であり、Ｃは、低密度脂質タンパク質のレベルを確認した結果であり、Ｄは、高密度脂質タンパク質のレベルを確認した結果である。
【図15】一様相によるＯＬＸ－０３１－２を、高脂肪食餌が提供された動物モデルに投与した後（ＣＤＨＦＤ ０３１－２、ＣＤＨＦＤ－ＮＣＤ ０３１－２）、肝実質内の脂肪液胞及び炎症巣のレベルを、Ｈ＆Ｅ染色法を介して確認した結果である。
【図16】一様相によるＯＬＸ－０３１－２を、高脂肪食餌が提供された動物モデルに投与した後（ＣＤＨＦＤ ０３１－２、ＣＤＨＦＤ－ＮＣＤ ０３１－２）、肝実質内の脂肪液胞及びコラーゲン沈着のレベルを、ピクロシリウスレッド染色法を介して確認した結果である。
【図17】一様相によるＯＬＸ－０３１－２を、高脂肪食餌が提供された動物モデルに投与した後（ＣＤＨＦＤ ０３１－２、ＣＤＨＦＤ－ＮＣＤ ０３１－２）、ＰＳＲ染色領域（％）を比較し、肝実質内のコラーゲン成分の含量を比較した結果である。
【図18】一様相によるＯＬＸ－０３１－２を、高脂肪食餌が提供された動物モデルに投与した後（ＣＤＨＦＤ ０３１－２、ＣＤＨＦＤ－ＮＣＤ ０３１－２）、肝繊維化関連因子の発現レベルを評価したものであり、Ａは、Ｃｏｌ１α１ ｍＲＮＡの発現レベルを確認した結果であり、Ｂは、α－ＳＭＡ ｍＲＮＡの発現レベルを確認した結果であり、Ｃは、ＴＩＭＰ１ ｍＲＮＡの発現レベルを確認した結果である。
【図19】一様相によるＯＬＸ－０３１－２を、高脂肪食餌が提供された動物モデルに投与した後（ＣＤＨＦＤ ０３１－２、ＣＤＨＦＤ－ＮＣＤ ０３１－２）、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡの発現レベルを確認した結果である。
【図20A】一様相によるＭＡＲＣ１ ａｓｉＲＮＡ １３４種のうち一部を、それぞれ１ｎＭの濃度で、Ｈｕｈ７細胞に処理した後、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡの発現レベルを確認した結果である。
【図20B】一様相によるＭＡＲＣ１ ａｓｉＲＮＡ １３４種のうち一部を、それぞれ１ｎＭの濃度で、Ｈｕｈ７細胞に処理した後、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡの発現レベルを確認した結果である。
【図20C】一様相によるＭＡＲＣ１ ａｓｉＲＮＡ １３４種のうち一部を、それぞれ１ｎＭの濃度で、Ｈｕｈ７細胞に処理した後、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡの発現レベルを確認した結果である。
【図21】一様相によるＭＡＲＣ１ ａｓｉＲＮＡ ４１種を、それぞれ０．１ｎＭの濃度で、Ｈｕｈ７細胞に処理した後、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡの発現レベルを確認した結果である。
【図22】一様相によるＭＡＲＣ１ ａｓｉＲＮＡ ３０種を、それぞれ１ｎＭの濃度で、Ｈｕｈ７細胞に処理した後、ＭＡＲＣ１タンパク質の発現レベルを確認した結果である。
【図23】一様相によるＭＡＲＣ１ ＧａｌＮＡｃ－ａｓｉＲＮＡ ４１種を、それぞれ１００ｎＭの濃度で、Ｈｕｈ７細胞に処理した後、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡの発現レベルを確認した結果である。
【図24】一様相によるＭＡＲＣ１ ＧａｌＮＡｃ－ａｓｉＲＮＡ ４１種を、それぞれ５００ｎＭの濃度で、ヒト由来の一次肝細胞に処理した後、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡの発現レベルを確認した結果である。
【図25】一様相によるＭＡＲＣ１ ＧａｌＮＡｃ－ａｓｉＲＮＡ ４１種を、それぞれ２０ｎＭまたは１００ｎＭの濃度で、ヒト由来の一次肝細胞に処理した後、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡの発現レベルを確認した結果である。
【図26】一様相によるＭＡＲＣ１ ＧａｌＮＡｃ－ａｓｉＲＮＡ １７種を、それぞれ１０ｎＭまたは１００ｎＭの濃度で、ヒト由来の一次肝細胞に処理した後、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡの発現レベルを確認した結果である。
【図27】一様相による、ＯＬＸ－０３１－２またはＯＬＸ－０７５－２を、それぞれ２．５ｍｐｋ、５ｍｐｋまたは１０ｍｐｋの濃度でサルに投与した後、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡの発現レベルを確認した結果である。
【図28】一様相によるＭＡＲＣ１ ＧａｌＮＡｃ－ａｓｉＲＮＡ ９種を、ｐＳＥＬＥＣＴ－ｍＳＥＡＰ－ｈＭＡＲＣ１によって形質感染された動物モデルに投与した後、ＳＥＡＰレポーター蛍光のレベルを介し、ヒトＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡの発現レベルを確認した結果である。
【図29】一様相によるＭＡＲＣ１ ＧａｌＮＡｃ－ａｓｉＲＮＡ １０種をｐｓｉＣＨＥＣＫ－２－ｈＭＡＲＣ１によって形質感染された動物モデルに投与した後、ルシフェラーゼレポーター蛍光のレベルを介し、ヒトＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡの発現レベルを確認した結果である。
【発明を実施するための形態】
【0016】
本出願で開示されたそれぞれの説明及び実施形態は、それぞれの他の説明及び実施形態にも適用されうる。すなわち、本出願で開示された多様な要素の全ての組み合わせが本出願の範疇に属する。また、下記のところで記述された具体的な敍述により、本出願の範疇が制限されるとすることはない。
【0017】
一様相は、ＭＡＲＣ１（mitochondrial amidoxime reducing component 1）ｍＲＮＡ配列に対して配列相補性を有する、長さが１９ないし２１ｎｔであるヌクレオチド（ｎｔ）であるアンチセンスストランド、及び前記アンチセンスストランドに対して配列相補性を有する、長さが１５ないし１７ｎｔであるセンスストランドを含むＲＮＡｉ製剤であり、前記アンチセンスストランド５’末端及び前記センスストランド３’末端は、平滑末端（blunt end）を形成するＲＮＡｉ製剤を提供する。
ＲＮＡｉ製剤
ＲＮＡｉ製剤
【0018】
本明細書において用語「ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ：ＲＮＡ interference）」は、目的遺伝子のｍＲＮＡと相同である配列を有するストランドと、それと相補的な配列を有するストランドとによって構成される二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を細胞などに導入し、目的遺伝子ｍＲＮＡの分解を誘導することにより、目的遺伝子の発現を抑制するメカニズムを意味する。
【0019】
本明細書において用語「ＲＮＡｉ製剤（ＲＮＡｉ agents）」または「ＲＮＡｉ誘導用核酸分子（nucleic acid molecules inducing ＲＮＡｉ）」は、配列特異的方式でもって、前記ＲＮＡ干渉を媒介することにより、遺伝子発現またはウイルス複製を抑制または下向き調節することができる任意の製剤または核酸分子を指称する。前述の用語は、個別核酸分子、複数の前記核酸分子、または前記核酸分子のプール（pool）のいずれをも称しうる。一具体例において、前記ＲＮＡｉ製剤は、ｓｉＲＮＡでもある。
【0020】
本明細書において用語「短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ：small interfering ＲＮＡ）」は、配列特異的に効率的な遺伝子発現抑制（gene silencing）を媒介する短い二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を意味する。
【0021】
本明細書において用語「遺伝子」とは、最広義の意味と見なされなければならならず、構造タンパク質または調節タンパク質を暗号化することができる。このとき、該調節タンパク質は転写因子、熱衝撃タンパク質、またはＤＮＡ／ＲＮＡ複製、転写及び／または翻訳に関与するタンパク質を含む。本発明において、発現抑制の対象になる目的遺伝子は、ウイルスゲノムに内在したものであり、動物遺伝子に統合されるか、あるいは染色体外構成要素として存在しうる。
【0022】
本明細書において用語「アンチセンスストランド（antisense strand）」は、関心ある目的核酸（target nucleic acid）に対し、実質的または１００％相補的なポリヌクレオチドであり、例えば、ｍＲＮＡ（messenger ＲＮＡ）、ｍＲＮＡではないＲＮＡ配列（例：ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ｐｉｗｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ及びｈｎＲＮＡ）、あるいはコーディングＤＮＡ配列または非コーディングＤＮＡ配列と全体として、または一部として相補的でもある。
【0023】
本明細書において用語「センスストランド（sense strand）」は、目的核酸と同一の核酸配列を有するポリヌクレオチドであり、ｍＲＮＡ（messenger ＲＮＡ）、ｍＲＮＡではないＲＮＡ配列（例：ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ｐｉｗｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ及びｈｎＲＮＡ）、あるいはコーディングＤＮＡ配列または非コーディングＤＮＡ配列と全体として、または一部として同一のポリヌクレオチドを言う。
【0024】
本明細書において用語「相補性（complementarity）」または「相補的な（complementary）」は、当業界で一般的に許容される意味を称する。前記用語は、一般的に、伝統的なワトソン・クリック（Watson-Crick）、または本明細書に記述された他の非伝統的類型の結合により、１つの核酸配列と、他の核酸配列との水素結合の形成または存在を称しうる。完璧な相補性は、核酸配列の全ての隣接残基が、第２核酸配列において、同一数の隣接残基と水素結合するということを意味しうる。部分相補性は、核酸分子内において、多様なミスマッチ（mismatch）または非塩基対ヌクレオチド（non－based paired nucleotides）（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個以上のミスマッチ、例えば、１個ないし３個のミスマッチ、非ヌクレオチドリンカ（non-nucleotide linker）、または非塩基対ヌクレオチド）を含むものでもある。前記部分相補性は、核酸分子のセンスストランドとアンチセンスストランドとの間において、または核酸分子のアンチセンスストランドと、それと相応する標的核酸分子との間において、バルジ（bulges）、ループ（loops）、突出（overhang）または平滑末端（blunt end）をもたらしうる。
【0025】
本明細書において用語―平滑末端（blunt end）」は、当業界において一般的に許容される意味を称する。本明細書のＲＮＡｉ製剤または核酸分子と係わり、前記用語は、突出ヌクレオチドがない、二本鎖ｓｉＲＮＡ分子の末端を称しうる。本明細書に記載されたｓｉＲＮＡ分子は、アンチセンスストランド５’末端及びセンスストランド３’末端は、平滑末端（blunt end）を形成するものでもある。
ＭＡＲＣ１の発現を抑制するためのＲＮＡｉ製剤
ＭＡＲＣ１の発現を抑制するためのＲＮＡｉ製剤
【0026】
「ＭＡＲＣ１（mitochondrial amidoxime reducing component 1）は、哺乳動物のモリブデン（molybdenum）含有酵素であり、ＭＴＡＲＣ１またはＭＯＳＣ１とも称され、ＭＡＲＣ１酵素の欠乏は、低い血中コレステロール数値・血中肝酵素数値、肝脂肪低減、及び肝硬変発病危険低減と関連があり、肝疾患に対する潜在的な治療標的にもなると知られている。前記ＭＡＲＣ１タンパク質は、天然に存在する野生型ＭＡＲＣ１、及びその機能的変異体を含むとも解釈され、前述のＭＡＲＣ１タンパク質、またはそれをコーディングする遺伝子の配列は、米国国立保健院のＧｅｎＢａｎｋのような公知のデータベースから得ることができる。
【0027】
本明細書において用語「発現（expression）」は、当業界において一般的に許容される意味を称する。前記用語は、一般的に、遺伝子が窮極的に、タンパク質を生成する過程を意味しうる。前記発現は、転写、スプライシング、転写後変形または翻訳を含むが、それらに制限されるものではない。本明細書で使用されているように、発現レベルは、ｍＲＮＡレベルまたはタンパク質レベルの検出によって決定されうるか、あるいはモニタリングされうる。
【0028】
個体におけるＭＡＲＣ１遺伝子発現と係わって使用された用語「抑制」または「低減」は、非処理群または正常対照群に対比し、統計的に有意な低減を称する。前記低減は、例えば、最小３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６０％、６５％、７０％、７０％、８０％、８５％、９０％または９５％以上でもあるが、それは、検出方法または測定方法により、検出レベル以下でもある。
【0029】
ｓｉＲＮＡは、短い干渉ＲＮＡ（small interfering ＲＮＡ）であり、ＲＮＡｉ（ＲＮＡ interference）作用に関与する。ＲＮＡｉは、１９９８年、カエノラブディティス・エレガンスで最初に発見された細胞内遺伝子調節メカニズムであり、その作用メカニズムは、細胞内に投入されたＲＮＡ二本鎖において、アンチセンスストランドが標的遺伝子のｍＲＮＡに相補的に結合することにより、標的遺伝子分解を誘導すると知られており、最近、最も注目されている新薬開発候補技術である。
【0030】
ただし、そのような可能性とは反対に、ｓｉＲＮＡの副作用及び短所が続けて報告されている。ＲＮＡｉ基盤治療剤の開発がなされるためには、１）効果的な伝達システムの不在、２）オフターゲット効果、３）免疫反応誘導、４）細胞内ＲＮＡｉ機構飽和のような障壁を克服しなければならない必要性がある。ｓｉＲＮＡが、標的遺伝子の発現を直接調節することができる効果的な方法にもかかわらず、そのような問題により、治療剤開発に困難を経験している。それにかかわり、非対称ｓｉＲＮＡ（ａｓｉＲＮＡ：asymmetric shorter duplex ｓｉＲＮＡ）は、従来のｓｉＲＮＡが有する（１９＋２）構造に比べ、短い二重螺旋長を有する非対称ＲＮＡｉ誘導構造である。既存のｓｉＲＮＡ構造技術において確認されるオフターゲット効果、ＲＮＡｉメカニズムの飽和、ＴＬＲ３による免疫反応のような問題点を克服した技術であり、それにより、副作用が低いＲＮＡｉ新薬開発が可能である。
【0031】
それを基に、本実施例において、センスストランド、及び前記センスストランドと相補的なアンチセンスストランドを含む非対称ｓｉＲＮＡを提示し、一実施例によるｓｉＲＮＡは、オフターゲット効果、ＲＮＡｉメカニズムの飽和のような問題を起こさ図、安定して高い伝達効率を維持しながら、目的とする程度に、有効にＭＡＲＣ１遺伝子に対する発現を抑制することができる。
【0032】
一実施例においては、ＭＡＲＣ１を標的にする非対称ｓｉＲＮＡ（ａｓｉＲＮＡ：asymmetric ｓｉＲＮＡ）をデザインして作製し、ＭＡＲＣ１を発現する細胞に、前記ａｓｉＲＮＡをトランスフェクション（transfection）させた後、ノックダウン効率（knockdown efficiency）にすぐれるＲＮＡｉ誘導用核酸分子、すなわち、ＭＡＲＣ１ ａｓｉＲＮＡを選別した。
【0033】
一具体例において、前記ＲＮＡｉ製剤は、前記センスストランドは、１５ないし１７ｎｔの長さを有し、前記アンチセンスストランドは、１９ないし２１ｎｔの長さを有することを特徴とするのである。さらに望ましくは、前記センスストランド長は、１６ｎｔであり、それと相補的なアンチセンスストランド長は、１９ｎｔ、２０ｎｔまたは２１ｎtであることを特徴とするのでもあるが、それに制限されるものではない。
【0034】
前記アンチセンスストランド５’末端及び前記センスストランド３’末端は、平滑末端（blunt end）を形成するものでもある。該アンチセンスストランド３’末端は、例えば、２ないし６ｎｔのオーバーハング（overhang）を含むものでもある。
【0035】
一具体例において、前記センスストランドは、表１、表１０、表１１、表１２、表１３及び表１４に列挙されたアンチセンスストランド配列のうちから選択された配列でもあり、前記アンチセンスストランドは、表１、表１０、表１１、表１２、表１３及び表１４に列挙されたセンスストランド配列のうちから選択された配列を含むものでもある。
【0036】
一具体例において、前記センスストランドは、例えば、配列番号１４９、配列番号１５９、配列番号１７７、配列番号１７９、配列番号１８３、配列番号１９７、配列番号１９９、配列番号２２７、配列番号２４７、配列番号２５１、配列番号２５７、配列番号２５９、配列番号２６１、配列番号２７３、配列番号２８５、配列番号２８７、配列番号３３１、配列番号３５３、配列番号３８７、配列番号３９１、配列番号３９９、配列番号４２３、配列番号４２９、配列番号４３１、配列番号４３５、配列番号４３９、配列番号４４３、配列番号４４５、配列番号４４７及び配列番号５２７によってなる群のうちから選択されるいずれか一つでもあり、例えば、配列番号６１、配列番号１４９、配列番号１８３、配列番号２２７、配列番号４２３、配列番号４３１、配列番号４３５、配列番号４３９、配列番号４４７、配列番号５２７及び配列番号５５１によってなる群のうちから選択されるいずれか一つでもある。
【0037】
一具体例において、前記アンチセンスストランドは、例えば、配列番号１５０、配列番号１６０、配列番号１７８、配列番号１８０、配列番号１８４、配列番号１９８、配列番号２００、配列番号２２８、配列番号２４８、配列番号２５２、配列番号２５８、配列番号２６０、配列番号２６２、配列番号２７４、配列番号２８６、配列番号２８８、配列番号３３２、配列番号３５４、配列番号３８８、配列番号３９２、配列番号４００、配列番号４２４、配列番号４３０、配列番号４３２、配列番号４３６、配列番号４４０、配列番号４４４、配列番号４４６、配列番号４４８及び配列番号５２８によってなる群のうちから選択されるいずれか一つでもあり、例えば、配列番号６２、配列番号１５０、配列番号１８４、配列番号２２８、配列番号４２４、配列番号４３２、配列番号４３６、配列番号４４０、配列番号４４８、配列番号５２８及び配列番号５５２によってなる群のうちから選択されるいずれか一つでもある。
【0038】
化学的な変形が導入されたＲＮＡｉ製剤
前記ＲＮＡｉ製剤において、前記センスストランドまたは前記アンチセンスストランドは、１以上の化学的変形（chemical modification）を含むものでもある。
前記ＲＮＡｉ製剤において、前記センスストランドまたは前記アンチセンスストランドは、１以上の化学的変形（chemical modification）を含むものでもある。
【0039】
一般的なｓｉＲＮＡは、ホスフェートバックボーン構造による高い負電荷、及び高い分子量などの理由により、細胞膜を通過することができ図、血液において、早く分解されて除去され、実際の標的部位に、ＲＮＡｉ誘導のための十分な量を伝達するのに困難が伴う。現在、インビトロ伝達の場合、陽イオン性脂質（cationic lipids）と陽イオンポリマー（cationic polymers）とを利用した高効率の伝達（delivery）方法が多く開発されているが、インビボの場合には、インビトロほどの高効率でｓｉＲＮＡを伝達し難く、生体内に存在する多様なタンパク質との相互作用により、ｓｉＲＮＡ伝達効率が低減する問題点がある。
【0040】
それにより、本実施例においては、非対称ｓｉＲＮＡ構造に化学的変形を導入し、向上された肝細胞標的伝達能（hepatocyte targeted delivery ability）を有するＲＮＡｉ製剤を提示し、さらに具体的には、別途の伝達体なしに、効果的に肝細胞内伝達がなされうる非対称ｓｉＲＮＡ構造体（ＧａｌＮＡｃ－ａｓｉＲＮＡ：ＧａｌＮＡｃ asymmetric ｓｉＲＮＡ）を提示する。
【0041】
本発明において、前記センスストランドまたは前記アンチセンスストランドにおいて、化学的変形は、以下に構成された群のうちから選択された１以上を含むものでもある：Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ：Ｎ－acetylgalactosamine）誘導体との結合；ヌクレオチド結合を、ホスホロチオエート（phosphorothioate）、ボラノホスフェート（boranophosphate）またはメチルホスホネート（methylphosphonate）で変形；ヌクレオチド内の糖構造の２’炭素位置における－ＯＨ基が、－ＣＨ３（methyl）、－ＯＣＨ３（methoxy）、－ＮＨ２、－Ｆ、－Ｏ－２－メトキシエチル－Ｏ－プロピル、－Ｏ－２－メチルチオエチル（methylthioethyl）、－Ｏ－３－アミノプロピルまたは－Ｏ－３－ジメチルアミノプロピルで置換されること；リン酸基（phosphate group）、Ｅ－ビニルホスホネート（Ｅ－vinylphosphonate）または細胞浸透ペプチドの結合。
【0042】
一具体例において、前記Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）誘導体は、下記化学式１の構造を有するものでもある。Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）誘導体は、肝細胞表面のＡＳＧＰＲ（asialoglycoprotien receptor）を認識し、ＲＮＡｉ製剤が肝細胞内に流入されるように一助となる役割を行うこと、すなわち、ＡＳＧＰＲターゲッティングモイエティとして作用するので、前記Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）誘導体が末端に結合されたＲＮＡｉ製剤は、肝細胞への伝達性が向上され、肝疾患に対して効果的な標的治療を提供するものでもある。
【化1】
【0043】
一具体例において、前記センスストランドは、下記のところから選択された１以上の化学的変形を含むものでもある：５’末端から隣接した２ないし４個のヌクレオチド結合を、ホスホロチオエート（phosphorothioate）、ボラノホスフェート（boranophosphate）またはメチルホスホネート（methylphosphonate）で変形；１個以上のヌクレオチド内の糖構造の２’炭素位置において、－ＯＨ基が、－ＣＨ３（methyl）、－ＯＣＨ３（methoxy）、－ＮＨ２、－Ｆ、－Ｏ－２－メトキシエチル－Ｏ－プロピル、－Ｏ－２－メチルチオエチル（methylthioethyl）、－Ｏ－３－アミノプロピルまたは－Ｏ－３－ジメチルアミノプロピルで置換されること；及び３’末端における、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ：Ｎ－acetylgalactosamine）誘導体または細胞浸透ペプチドとの結合。
【0044】
一具体例において、前記アンチセンスストランドは、下記のところから選択されるいずれか１以上の化学的変形を含むものでもある：３’末端または５’末端から隣接した２ないし７個のヌクレオチド結合を、ホスホロチオエート（phosphorothioate）、ボラノホスフェート（boranophosphate）またはメチルホスホネート（methylphosphonate）で変形；１個以上のヌクレオチド内の糖構造の２’炭素位置において、－ＯＨ基が、－ＣＨ３（methyl）、－ＯＣＨ３（methoxy）、－ＮＨ２、－Ｆ、－Ｏ－２－メトキシエチル－Ｏ－プロピル、－Ｏ－２－メチルチオエチル（methylthioethyl）、－Ｏ－３－アミノプロピルまたは－Ｏ－３－ジメチルアミノプロピルで置換；及び５’末端における、リン酸基（phosphate group）、Ｅ－ビニルホスホネート（Ｅ－vinylphosphonate）または細胞浸透ペプチドとの結合。
【0045】
他の具体例において、前記ＲＮＡｉ製剤は、センスストランドまたはアンチセンスストランドにおいて、３’末端または５’末端から隣接した２ないし７個のヌクレオチド結合を、ホスホロチオエート（phosphorothioate）で変形；センスストランドまたはアンチセンスストランドのうち１個以上のヌクレオチド内の糖構造の２’炭素位置において、－ＯＨ基が－ＯＣＨ３（methoxy）または－Ｆで置換される変形；及びセンスストランド３’末端における、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ：Ｎ－acetylgalactosamine）誘導体との結合；及びアンチセンスストランド５’末端における、リン酸基（phosphate group）またはＥ－ビニルホスホネート（Ｅ－vinylphosphonate）結合；によって構成された群のうちから選択された１以上の変形を含むものでもある。
【0046】
一具体例において、前記センスストランドは、表２、表１５、表１６及び表１７に列挙されたアンチセンスストランド配列のうちから選択された配列でもあり、前記アンチセンスストランドは、表２、表１５、表１６及び表１７に列挙されたセンスストランド配列のうちから選択された配列を含むものでもある。
【0047】
一具体例において、前記センスストランドは、下記表の（Ａ）ないし（Ｏ）によって構成された群のうちから選択されたいずれか一つであり、前記アンチセンスストランドは、下記表の（ａ）ないし（ｑ）で構成された群のうちから選択されたいずれか一つであることを特徴とする。
【0048】
【0049】
前記配列において、＊は、ホスホロチオエート結合（phosphorothioated bond）を意味し、ｍは、２’－Ｏ－メチル（methyl）を意味し、ｆは、２’－フルオロ（fluoro）を意味し、ＧａｌＮＡｃは、化学式１の三価（trivalent）ＧａｌＮＡｃ誘導体を意味し、Ｐは、５’－リン酸基（phosphate group）を意味し、ＥＶＰは、５’－Ｅ－ビニルホスホネート（Ｅ－vinylphosphonate）結合を意味する。
【0050】
【0051】
具体的には、前記ＲＮＡｉ製剤のセンスストランド及びアンチセンスストランドは、前記表で選択される下記のセンスストランド配列及びアンチセンスストランド配列でもある。
【0052】
他の態様は、前記ＲＮＡｉ製剤を有効成分として含む、肝疾患の予防用または治療用の薬学的組成物を提供する。
【0053】
さらに他の態様は、肝疾患を予防または治療するための医薬の製造のための前記ＲＮＡｉ製剤の用途を提供する。
【0054】
前記薬学的組成物は、前述のＲＮＡｉ製剤をそのまま含むか、あるいはそれを利用するために、その二者間に共通する内容は、本明細書の過度な複雑性を避けるために、その記載を省略する。
【0055】
肝疾患
前記薬剤学的組成物は、ＭＡＲＣ１遺伝子発現を抑制することにより、肝疾患の予防または治療のための薬剤学的組成物の有効成分にも活用される。
前記薬剤学的組成物は、ＭＡＲＣ１遺伝子発現を抑制することにより、肝疾患の予防または治療のための薬剤学的組成物の有効成分にも活用される。
【0056】
前述の肝疾患は、脂肪肝、肝線維症または肝硬変を含み、ここで、「脂肪肝」は、正常細胞内には存在しない中性脂肪が肝細胞内に異常に沈着されたように見える現象が示されたところを意味する。正常の肝臓は、約５％が脂肪組織で構成されており、中性脂肪、脂肪酸、リン脂質、コレステロール及びコレステロールエステルが脂肪の主要成分であるが、いったん脂肪肝が発生すれば、ほとんどの成分が中性脂肪に代替され、中性脂肪の量が肝重量の５％以上であるならば、脂肪肝と診断される。前記脂肪肝は「非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ：non-alcoholic fatty liver disease）」でもあり、「非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ：non-alcoholic fatty liver disease）」は、飲酒とかかわらず、肝臓内に中性脂肪が蓄積される疾患であり、脂肪酸が中性脂肪の形態でもって、肝臓の実質細胞内に５％以上蓄積された場合と定義されうる。前記非アルコール性脂肪肝疾患は、単純脂肪肝症（simple steatosis）または非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ：non－alcoholic steatohepatitis）でもある。該非アルコール性脂肪肝疾患は、病理学的に、単純脂肪肝症（simple steatosis）と炎症とを伴う非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ：non－alcoholic steatohepatitis）に分類されるが、ＮＡＳＨは、ＮＡＦＬＤ重度型の一形態であると言うことができる。脂肪蓄積がはなはだしい脂肪肝症は、炎症、すなわち、脂肪肝炎に進行し、長期間の放置時、肝炎、肝線維症、肝硬変のような深刻な肝疾患に移行されうる。単純脂肪肝症の発病率は、正常体重を有する人においては、１０～１５％であるが、過体重を有する人においては、８０％に大きく上昇するので、非アルコール性脂肪肝炎が効果的に治療されるためには、肝臓における中性脂肪蓄積を効果的に低減させ、非アルコール性脂肪肝症が脂肪肝炎に進行することを抑制しながら、脂肪肝炎の炎症を改善させることにより、次の段階への進行を抑制することが重要でもある。
【0057】
薬学的組成物
本明細書において用語「有効成分（effective ingredient）」は、有益であるか、あるいは望ましい臨床的または生化学的な結果に影響を与える適切な有効量の成分を意味する。具体的には、有効量の製剤、活性剤またはＲＮＡｉ製剤を意味しうる。
本明細書において用語「有効成分（effective ingredient）」は、有益であるか、あるいは望ましい臨床的または生化学的な結果に影響を与える適切な有効量の成分を意味する。具体的には、有効量の製剤、活性剤またはＲＮＡｉ製剤を意味しうる。
【0058】
前記有効量は、１回またはそれ以上投与され、疾病を予防するか、あるいは疾病状態を、非制限的に、症状の緩和、疾病範囲の低減、疾病状態の安定化（すなわち、悪化しないということ）、疾病進行の遅延または速度の低減、あるいは疾病状態の改善、または一時的緩和及び軽減（部分的であるか全体的に）のための適切な量でもある。
【0059】
本明細書において用語「予防（prevention）」は、疾患の発生を事前に遮断するか、疾患を抑制するか、あるいは進行を遅延させる全ての行為を意味する。例えば、前記肝疾患、またはその特徴的な特性の発生を防ぐか、発生を妨害するか、あるいは前記肝疾患、またはその特徴的な特性の発生から防御または保護することを称する。
【0060】
本明細書において用語「治療（treatment）」は、治療学的治療、及び予防的または予防措置的な方法いずれをも意味する。また、疾患の症状が好転、あるいは良好に変更される全ての行為を意味する。例えば、前記肝疾患、またはその特徴的な特性を、予防、低減または改善させるか、あるいは個体から前述の肝疾患、またはその特徴的な特性の進行を遅延（弱化）させるものである。
【0061】
本明細書において用語「有効量（effective amount）」は、当業界において一般的に許容される意味を称する。前記用語は、一般的に、研究者、獣医、医師、またはその他臨床医師らが追求する細胞、組織、システム、動物またはヒトの意図された生物学的反応（例：有益な反応）を導き出す分子、化合物または構成物の量を意味しうる。具体的には、「治療学的有効量（therapeutically effective amount）」は、例えば、疾病や障害と係わる測定可能なパラメータにおいて、治療的に関連する変化があり、特定臨床的治療が効果的であると見なされうるほどの望ましい医学的反応を導き出すことができる分子、化合物または構成物の量を意味しうる。前記疾病または前記障害の治療のための薬物の治療学的有効量は、前記パラメータで治療的に関連する変化をもたらすのに必要な量でもある。
【0062】
前記薬学組成物の投与方法は、通常の患者の症侯と、疾病の深刻度に基づき、本技術分野の通常の専門家が決定することができる。また、散剤、錠剤、カプセル剤、液剤、注射剤、軟膏剤、シロップ剤のような多様な形態に製剤化され、単位投与量容器または多投与量容器、例えば、密封されたアンプル及びビンなどによっても提供される。
【0063】
本発明の薬学組成物は、経口投与または非経口投与が可能である。本発明による組成物の投与経路は、以下のところに限定されるものではないが、例えば、口腔、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、硬膜内、心臓内、経皮、皮下、腹腔内、腸管、舌下または局所への投与が可能である。本発明による組成物の投与量は、患者の体重・年齢・性別・健康状態、食餌、投与時間、方法、排泄率、または疾病の重症度などにより、その範囲が多様であり、本技術分野の通常の専門家が容易に決定することができる。また、臨床投与のために、公知の技術を利用し、本発明の組成物を適する剤形に製剤化することができる。
【0064】
さらに他の態様は、前記ＲＮＡｉ製剤を個体に投与する段階を含む肝疾患を予防または治療する方法を提供する。
【0065】
前述の肝疾患を治療する方法は、前述のＲＮＡｉ製剤または薬学的組成物をそのまま含むか、あるいはそれらを利用するために、それら間に共通する内容は、本明細書の過度な複雑性を避けるために、その記載を省略する。
【0066】
本明細書において用語「個体」は、疾病、具体的には、肝疾患の治療を必要とする対象を意味し、さらに具体的には、ヒトまたは非ヒトである霊長類、マウス（mouse）、犬、猫、馬、牛、羊、豚、山羊、ラクダ、ヤギのような哺乳類をいずれも含むものでもある。
【0067】
以下、本発明について、実施例を介してさらに詳細に説明する。しかしながら、それら実施例は、本発明について例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲は、それら実施例に限定されるものではない。
【0068】
実施例１：ＲＮＡｉ誘導用核酸分子のスクリーニング及び治療効能の評価
１－１．５０種のａｓｉＲＮＡデザイン、及びＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡの発現抑制効果の評価
本実施例においては、ＭＡＲＣ１を標的にする高効率のＲＮＡｉ干渉を誘導する二本鎖核酸分子を確保するために、ＭＡＲＣ１遺伝子に対する標的配列選定後、それに係わるａｓｉＲＮＡ（ＭＡＲＣ１ asymmetric ｓｉＲＮＡ）をデザインした（センスストランド（１６－ｍｅｒ）、アンチセンスストランド（１９－ｍｅｒ））。具体的には、ＮＣＢＩデータベース検索を介し、ＭＡＲＣ１遺伝子情報を獲得した後、動物実験を考慮し、マウスと共通標的を有する塩基配列基準でもって、一定レベルの相同性を示す塩基配列を選抜し、総５０種のａｓｉＲＮＡをデザインし、それをＩＤＴ Korea, Inc.において、１０nmoleスケールに合成した。その後、合成されたａｓｉＲＮＡは、９５℃ ５分間、３７℃ ２５分間、インキュベーション過程を介してアニーリングし、１２％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）後、ＣｈｅｍｉＤｏｃ ＵＶ transilluminator（Biorad）を介し、ＱＣ（quality control）を行った。
１－１．５０種のａｓｉＲＮＡデザイン、及びＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡの発現抑制効果の評価
本実施例においては、ＭＡＲＣ１を標的にする高効率のＲＮＡｉ干渉を誘導する二本鎖核酸分子を確保するために、ＭＡＲＣ１遺伝子に対する標的配列選定後、それに係わるａｓｉＲＮＡ（ＭＡＲＣ１ asymmetric ｓｉＲＮＡ）をデザインした（センスストランド（１６－ｍｅｒ）、アンチセンスストランド（１９－ｍｅｒ））。具体的には、ＮＣＢＩデータベース検索を介し、ＭＡＲＣ１遺伝子情報を獲得した後、動物実験を考慮し、マウスと共通標的を有する塩基配列基準でもって、一定レベルの相同性を示す塩基配列を選抜し、総５０種のａｓｉＲＮＡをデザインし、それをＩＤＴ Korea, Inc.において、１０nmoleスケールに合成した。その後、合成されたａｓｉＲＮＡは、９５℃ ５分間、３７℃ ２５分間、インキュベーション過程を介してアニーリングし、１２％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）後、ＣｈｅｍｉＤｏｃ ＵＶ transilluminator（Biorad）を介し、ＱＣ（quality control）を行った。
【0069】
前述の方法によってデザインされたＭＡＲＣ１ ａｓｉＲＮＡの配列情報は、下記表１に示されている通りである。
【0070】
【表1】
【0071】
その後、ｍＲＮＡレベルにおける発現抑制効率を確認するために、前記ＭＡＲＣ１ ａｓｉＲＮＡをＨｕｈ７細胞に形質感染させた後、ｑＲＴ－ＰＣＲを遂行し、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡの発現レベルを測定した。具体的には、前記Ｈｕｈ７細胞は、９６ウェルプレートに、８×１０３細胞／ウェルにシーディングされ、そこに、ＭＡＲＣ１ ａｓｉＲＮＡ（１０ｎＭ（OliX Ｉｎｃ．））とＲＮＡｉＭａｘ（２μｌ／ｍｌ（Invitrogen Ｉｎｃ． １３７７８１５０））とを添加した後、Invitrogenから提供されたプロトコルによって形質感染を行った。その後、RNeasy Plus Mini Kit（Qiagen 74136）を使用して全てのＲＮＡを抽出し、そこに含まれたｍＲＮＡをテンプレートにする逆転写過程を介してｃＤＮＡを合成した。その後、ＴＢ Green（Takara RR820A）を使用してＰＣＲ混合物を準備し、製造社の指針により、StepOne Real-Time PCRシステムで定量的ＰＣＲを遂行した。なお、本実施例において対照群は、形質感染試薬のみを添加した群（ＮＴ）を使用した。
その結果、図１に示されているように、ＭＡＲＣ１ ａｓｉＲＮＡ ５０種の処理によるＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡの発現抑制効果を確認した。
１－２．２３種のＧａｌＮＡｃ－ａｓｉＲＮＡデザイン及びＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡの発現抑制効果の評価
その結果、図１に示されているように、ＭＡＲＣ１ ａｓｉＲＮＡ ５０種の処理によるＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡの発現抑制効果を確認した。
１－２．２３種のＧａｌＮＡｃ－ａｓｉＲＮＡデザイン及びＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡの発現抑制効果の評価
【0072】
本実施例においては、前記実施例１で製造されたＭＡＲＣ１ ａｓｉＲＮＡのうち、２３種のＭＡＲＣ１ ａｓｉＲＮＡを対象に、ＧａｌＮＡｃリガンド及び化学的変形が導入された非対称ｓｉＲＮＡをデザインした。具体的には、多様な化学的変形（２’ＯＭｅ、ＰＳ、Ｆｌｕｏｒｏなど）を導入し、前記センスストランド３’末端に、「三価（trivalent）ＧａｌＮＡｃ」と表記された誘導体を結合させ、ＭＡＲＣ１ ＧａｌＮＡｃ－ａｓｉＲＮＡを製造した。
【0073】
【表2】
【0074】
具体的には、前記表２において、「＊」、「ｍ」、「ｆ」、「Ｐ」、「ＧａｌＮＡｃ」と表記された化学的変形は、下記表３に示されている通りである。
【0075】
【表3】
【0076】
具体的には、前記表３において、「＊」は、既存のホスホジエステル結合が、ホスホロチオエート結合で置換された形態を意味するものであり、「ｍ」は、既存の２’－ＯＨが、２’－Ｏ－メチルで置換された形態を意味するものである。また、「ｆ」は、例えば、ｆＧの場合、既存のＧ（グアニン）の２’－ＯＨが、フルオロで置換された形態を意味するものであり、「Ｐ」は、５’末端に、リン酸基が結合された形態（５’末端塩基内の５番炭素に結合された酸素に、リン酸基が結合される）を意味するものである。また、「ＧａｌＮＡｃ」は、センスストランド３’末端に、下記化学式１の三価（trivalent）ＧａｌＮＡｃ誘導体が結合された形態を意味するものである。
なお、前記三価（trivalent）ＧａｌＮＡｃ誘導体構造は、下記化学式１に示されている通りである。
なお、前記三価（trivalent）ＧａｌＮＡｃ誘導体構造は、下記化学式１に示されている通りである。
【0077】
【化2】
【0078】
ｍＲＮＡレベルにおける発現抑制効率を確認するために、前記ＭＡＲＣ１ ＧａｌＮＡｃ－ａｓｉＲＮＡを、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに由来する一次肝細胞（mouse primary hepatocyte）に形質感染（transfection）させた後、ｑＲＴ－ＰＣＲを遂行し、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡの発現レベルを測定した。具体的には、前記一次肝細胞は、２４ウェルプレートに、７．５×１０４細胞／ウェルにシーディングされ、そこに、ＭＡＲＣ１ ＧａｌＮＡｃ－ａｓｉＲＮＡ（２００ｎＭ（OliX US，Ｉｎｃ．））を処理した。そこから、２４時間後、SuperPrep（商標）Cell lysis & RT kit for qPCR Kit II（TOYOBO ＳＣＱ－４０１）を使用して細胞ライセート（cell lysate）を準備し、そこに含まれたｍＲＮＡをテンプレートにする逆転写過程を介してｃＤＮＡを合成した。その後、前記合成されたｃＤＮＡをテンプレートにし、定量的ＰＣＲを、THUNDERBIRD（登録商標）Probe qPCR Mix（TOYOBO ＱＰＳ－１０１）及びProbe（Ｈｓ００２２４２２７＿ｍ１、Ｈｓ０３９２８９８５＿ｇ１（Applied Biosystems）を使用して遂行した。その後、CFX Connect Real-Time PCR System（Bio-Rad）を使用し、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡの発現レベルを確認した。なお、本実施例において対照群は、形質感染を行っていない群（ＮＴ）、陰性対照群として、ＯＬＸ７００Ａ－００１－８（１０ｎＭ）とＲＮＡｉＭＡＸ（２μｌ／ｍｌ（Invitrogen Ｉｎｃ． １３７７８１５０））とを添加した後、Invitrogenから提供されたプロトコルによって形質感染を行った群（ＮＣ）を使用し、陽性対照群（ＰＣ）として、ａｓｉＭＡＲＣ１－３０（１０ｎＭ）とＲＮＡｉＭＡＸ（２μｌ／ｍｌ（Invitrogen Ｉｎｃ． １３７７８１５０））とを添加した後、Invitrogenから提供されたプロトコルによって形質感染を行った群（ＰＣ）を使用した。前記ＯＬＸ７００Ａ－００１－８の配列情報は、表４に示されている通りであり、表４において、「＊」、「ｍ」、「ｆ」、「Ｐ」及び「ＧａｌＮＡｃ」と表記された化学的変形は、前記表３に示されている通りである。
【0079】
【表4】
【0080】
その結果、図２に示されているように、ＭＡＲＣ１ ＧａｌＮＡｃ－ａｓｉＲＮＡ ２３種の処理によるＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡの発現抑制効果を確認した。それらのうちでも、ＯＬＸ－００２－１、ＯＬＸ００３－１、ＯＬＸ－０３１－１の発現抑制効果は、さらにすぐれている。
【0081】
１－３．動物モデルを利用した治療効能評価
本実施例においては、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（雄、ｎ＝１５）を対象に、前記実施例１－２で発現抑制効果を確認したＭＡＲＣ１ ＧａｌＮＡｃ－ａｓｉＲＮＡを投与した後、それによる治療的効能を評価した。そのために、まず、動物モデルグループを、正常食餌が提供されたグループ（通常チャウ（normal chow））と、高脂肪食餌が提供されたグループ（ＨＦＤ（high fat diet）（Research Diet Ｄ１２４９２））とに分類し、前記グループを、投与される物質により、それぞれ１Ｘ ＰＢＳを投与した群（ＶＣ）、ＯＬＸ－００１－８を投与した群（ＮＣ）、ＯＬＸ－００３－１を皮下投与した群（＃３－１）、及びＯＬＸ－０３１－１を皮下投与した群（＃３１－１）に分類した。本実施例において、前記動物モデルグループに係わる具体的な分類は、下記表５に示されている通りである。
本実施例においては、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（雄、ｎ＝１５）を対象に、前記実施例１－２で発現抑制効果を確認したＭＡＲＣ１ ＧａｌＮＡｃ－ａｓｉＲＮＡを投与した後、それによる治療的効能を評価した。そのために、まず、動物モデルグループを、正常食餌が提供されたグループ（通常チャウ（normal chow））と、高脂肪食餌が提供されたグループ（ＨＦＤ（high fat diet）（Research Diet Ｄ１２４９２））とに分類し、前記グループを、投与される物質により、それぞれ１Ｘ ＰＢＳを投与した群（ＶＣ）、ＯＬＸ－００１－８を投与した群（ＮＣ）、ＯＬＸ－００３－１を皮下投与した群（＃３－１）、及びＯＬＸ－０３１－１を皮下投与した群（＃３１－１）に分類した。本実施例において、前記動物モデルグループに係わる具体的な分類は、下記表５に示されている通りである。
【0082】
【表5】
【0083】
なお、高脂肪食餌が提供された時点から１６週目に、ＭＡＲＣ１ ＧａｌＮＡｃ－ａｓｉＲＮＡを投与し、そこから２週経過後、ＭＡＲＣ１ ａｓｉＲＮＡを再び投与した。前記２次投与を実施した時点から２週経過後、対象マウスから肝臓を摘出し、そこから、肝組織試料及びその切片を得た。
【0084】
（１）ＭＡＲＣ１及びＭＡＲＣ２の発現態様確認
前記マウスから得られた肝組織試料を対象に、前記実施例１－２と同一方式でもって、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡ及びＭＡＲＣ２ ｍＲＮＡの発現レベルを評価した。
前記マウスから得られた肝組織試料を対象に、前記実施例１－２と同一方式でもって、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡ及びＭＡＲＣ２ ｍＲＮＡの発現レベルを評価した。
【0085】
その結果、図３に示されているように、一実施例によるＯＬＸ－００３－１またはＯＬＸ－０３１－１を投与したグループ（＃３－１、＃３１－１）は、高脂肪食餌が提供された他のグループ（ＶＣ、ＮＣ）と比較し、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡに対する発現抑制を示している一方、ＭＡＲＣ２ ｍＲＮＡの発現には、影響を及ぼさないということを確認した。
【0086】
（２）肝臓の外観評価
前記マウスから得られた肝臓を肉眼で観察し、肝臓の病変部位の変化を評価した。
前記マウスから得られた肝臓を肉眼で観察し、肝臓の病変部位の変化を評価した。
【0087】
その結果、図４に示されているように、高脂肪食餌が提供されたグループ（ＶＣ、ＮＣ）は、肝臓の縁部、すなわち、病変部位が鋭くなかった一方、一実施例によるＯＬＸ－００３－１またはＯＬＸ－０３１－１を投与したグループ（＃３－１、＃３１－１）は、正常グループと類似した形態的特性を示すことを確認した。
【0088】
（３）病理組織学的評価
前記マウスから得られた肝組織試料を、１０％ ＮＢＦ（neutral buffered formalin）溶液に固定化させ、パラフィン包埋ブロックを製造した後、そこから、４μｍ厚の組織切片を製造した。その後、前記組織切片を対象に、マイヤーヘマトキシリン（Mayer’s hematoxylin）試薬を使用してＨ＆Ｅ染色を実施した。また、ＯＣＴ包埋剤を使用して得られた４μｍ厚の凍結切片を対象に、オイルレッドＯ染色を実施した。
前記マウスから得られた肝組織試料を、１０％ ＮＢＦ（neutral buffered formalin）溶液に固定化させ、パラフィン包埋ブロックを製造した後、そこから、４μｍ厚の組織切片を製造した。その後、前記組織切片を対象に、マイヤーヘマトキシリン（Mayer’s hematoxylin）試薬を使用してＨ＆Ｅ染色を実施した。また、ＯＣＴ包埋剤を使用して得られた４μｍ厚の凍結切片を対象に、オイルレッドＯ染色を実施した。
【0089】
その結果、図５及び図６に示されているように、高脂肪食餌が提供されたグループ（ＶＣ、ＮＣ）において、肝実質に形成された多数の脂肪液胞（lipid vacuoles）が観察された一方、一実施例によるＯＬＸ－００３－１またはＯＬＸ－０３１－１を投与したグループ（＃３－１、＃３１－１）においては、脂肪液胞の形成が有意に低減されていることを確認した。
【0090】
実施例２．動物モデルを利用した治療効能評価
本実施例においては、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを対象に、前記実施例１で発現抑制効果を確認したａｓｉＭＡＲＣ１－０３１をテンプレートにし、下記表６のＭＡＲＣ１ ＧａｌＮＡｃ－ａｓｉＲＮＡを皮下投与した後、それによる治療的効能を評価した。
本実施例においては、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを対象に、前記実施例１で発現抑制効果を確認したａｓｉＭＡＲＣ１－０３１をテンプレートにし、下記表６のＭＡＲＣ１ ＧａｌＮＡｃ－ａｓｉＲＮＡを皮下投与した後、それによる治療的効能を評価した。
【0091】
【表6】
【0092】
具体的には、前記表６において、「＊」、「ｍ」、「ｆ」、「Ｐ」、「ＧａｌＮＡｃ」、「ＥＶＰ」と表記された化学的変形は、下記表７に示されている通りである。
【0093】
【表7】
【0094】
具体的には、前記表７において、「＊」、「ｍ」、「ｆ」、「Ｐ」、「ＧａｌＮＡｃ」は、前述のところと同じである。また、「ＥＶＰ」は、５’末端に、（Ｅ）ビニルホスホネートが結合された形態（５’末端塩基内の５番炭素を含む二重結合を形成）を意味するものであり、例えば、ＥＶＰ－ｍＵの場合、既存のＵ（グアニン）の２’－ＯＨが、２’－Ｏ－メチルで置換された形態において、５’末端に、（Ｅ）ビニルホスホネートが結合された形態を意味するものである。
【0095】
２－１．ＨＦＤ induced ＮＡＳＨマウスモデル（mouse model）におけるＯＬＸ－０３１－１の治療効能評価
動物モデルグループを、正常食餌が提供されたグループ（通常チャウ（normal chow））と、高脂肪食餌が提供されたグループ（ＨＦＤ）とに分類し、前記グループを、投与される物質により、それぞれ１Ｘ ＰＢＳを投与した群（ＶＣ）、ＯＬＸ７００Ａ－００１－８を投与した群（ＮＣ）、ＯＬＸ－０３１－１を投与した群（＃３１－１）に分類した。本実施例において、前記動物モデルグループに係わる具体的な分類は、下記表８に示されている通りである。
動物モデルグループを、正常食餌が提供されたグループ（通常チャウ（normal chow））と、高脂肪食餌が提供されたグループ（ＨＦＤ）とに分類し、前記グループを、投与される物質により、それぞれ１Ｘ ＰＢＳを投与した群（ＶＣ）、ＯＬＸ７００Ａ－００１－８を投与した群（ＮＣ）、ＯＬＸ－０３１－１を投与した群（＃３１－１）に分類した。本実施例において、前記動物モデルグループに係わる具体的な分類は、下記表８に示されている通りである。
【0096】
【表8】
【0097】
なお、高脂肪食餌が提供された時点から２８週目に、ＯＬＸ－０３１－１を投与し、そこから、１週間間隔で、総３回、ＯＬＸ－０３１－１を追加投与した。総４回の投与を終えた時点から１週経過後、対象マウスから肝臓を摘出し、そこから、肝組織試料及びその切片、血清試料を得た。
【0098】
（１）ＭＡＲＣ１及びＭＡＲＣ２の発現態様確認
前記マウスから得られた肝組織試料を対象に、前記実施例１－２と同一方式でもって、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡ及びＭＡＲＣ２ ｍＲＮＡの発現レベルを評価した。
前記マウスから得られた肝組織試料を対象に、前記実施例１－２と同一方式でもって、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡ及びＭＡＲＣ２ ｍＲＮＡの発現レベルを評価した。
【0099】
その結果、図７に示されているように、一実施例によるＯＬＸ－０３１－１を投与したグループ（＃３１－１）は、高脂肪食餌が提供された他のグループ（ＶＣ、ＮＣ）と比較し、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡに対する発現抑制を示している一方、ＭＡＲＣ２ ｍＲＮＡの発現には、影響を及ぼさないということを確認した。
【0100】
（２）肝臓の外観評価
前記マウスから得られた肝臓を肉眼で観察し、肝臓の病変部位の変化を評価した。
前記マウスから得られた肝臓を肉眼で観察し、肝臓の病変部位の変化を評価した。
【0101】
その結果、図８に示されているように、高脂肪食餌が提供されたグループ（ＨＦＤＶＣ、ＨＦＤＮＣ）は、肝臓の縁部、すなわち、病変部位が鋭くなかった一方、一実施例によるＯＬＸ－３１－１を投与したグループ（＃３１－１）は、正常グループと類似した形態的特性を示すことを確認した。
【0102】
（３）病理組織学的評価
前記マウスから得られた肝組織試料を、１０％ ＮＢＦ（neutral buffered formalin）溶液に固定化させ、パラフィン包埋ブロックを製造した後、そこから、４μｍ厚の組織切片を製造した。その後、前記組織切片を対象に、マイヤーヘマトキシリン（Mayer’s hematoxylin）試薬を使用したＨ＆Ｅ染色及びピクロシリウスレッドを実施した。
前記マウスから得られた肝組織試料を、１０％ ＮＢＦ（neutral buffered formalin）溶液に固定化させ、パラフィン包埋ブロックを製造した後、そこから、４μｍ厚の組織切片を製造した。その後、前記組織切片を対象に、マイヤーヘマトキシリン（Mayer’s hematoxylin）試薬を使用したＨ＆Ｅ染色及びピクロシリウスレッドを実施した。
【0103】
その結果、図９及び図１０に示されているように、高脂肪食餌が提供されたグループ（ＶＣ、ＮＣ）において、肝実質に形成された多数の脂肪液胞と、コラーゲン沈着とが観察された一方、一実施例によるＯＬＸ－０３１－１を投与したグループ（＃３１－１）は、そのような脂肪液胞の形成と、コラーゲン沈着とが有意に低減されていることを確認した。
【0104】
（４）の肝組織内の繊維化関連因子の発現及び中性脂肪レベル評価
前記マウスから得られた肝組織試料を対象に、肝繊維化関連因子の発現レベル、及び中性脂肪のレベルを評価した。具体的には、肝組織由来の細胞を対象に、Tri-RNA reagent（FAVORGEN ＦＡＴＲＲ ００１）を使用し、総（total）ＲＮＡを抽出し、それをテンプレートにする逆転写過程を介してｃＤＮＡを合成した（High-capacity cDNA Reverse Transcription Kit（Applied Biosystems ４３６８８１４））。その後、前記合成されたｃＤＮＡをテンプレートにし、定量的ＰＣＲを、TB Green（登録書評）Premix Ex Taq（商標）（Takara ＲＲ４２０Ａ）を使用して遂行した。その後、StepOne（商標）Real-Time PCR System（Applied Biosystems（商標）、及び恒存遺伝子であるＲＰＬ３２の発現レベルを適用し、α－ＳＭＡ及びｍＣｏｌ１α１ ｍＲＮＡの発現レベルを評価した。また、肝組織試料を、均質化器（homogenizer）（１００ｍｇ／ｍＬ、１：１０希釈）を使用し、５％ ＮＰ－４０／ＵＰＷ内で均質化させた。その後、前記均質化された試料を対象に、Triglyceride Assay Kit（Abcam ａｂ６５３３６）を使用し、中性脂肪レベルを測定した。
前記マウスから得られた肝組織試料を対象に、肝繊維化関連因子の発現レベル、及び中性脂肪のレベルを評価した。具体的には、肝組織由来の細胞を対象に、Tri-RNA reagent（FAVORGEN ＦＡＴＲＲ ００１）を使用し、総（total）ＲＮＡを抽出し、それをテンプレートにする逆転写過程を介してｃＤＮＡを合成した（High-capacity cDNA Reverse Transcription Kit（Applied Biosystems ４３６８８１４））。その後、前記合成されたｃＤＮＡをテンプレートにし、定量的ＰＣＲを、TB Green（登録書評）Premix Ex Taq（商標）（Takara ＲＲ４２０Ａ）を使用して遂行した。その後、StepOne（商標）Real-Time PCR System（Applied Biosystems（商標）、及び恒存遺伝子であるＲＰＬ３２の発現レベルを適用し、α－ＳＭＡ及びｍＣｏｌ１α１ ｍＲＮＡの発現レベルを評価した。また、肝組織試料を、均質化器（homogenizer）（１００ｍｇ／ｍＬ、１：１０希釈）を使用し、５％ ＮＰ－４０／ＵＰＷ内で均質化させた。その後、前記均質化された試料を対象に、Triglyceride Assay Kit（Abcam ａｂ６５３３６）を使用し、中性脂肪レベルを測定した。
【0105】
その結果、図１１に示されているように、高脂肪食餌が提供されたグループ（ＶＣ、ＮＣ）において、肝繊維化関連因子であるα－ＳＭＡ ｍＲＮＡの発現レベルが上昇した一方、一実施例によるＯＬＸ－０３１－１を投与したグループ（＃３１－１）においては、そのようなα－ＳＭＡ及びｍＣｏｌ１α１ ｍＲＮＡの発現増大が低減されていることを確認した。また、図１２に示されているように、肝組織内の中性脂肪のレベルも、一実施例によるＯＬＸ－０３１－１の投与によって低減されることを確認した。
【0106】
（５）血清学的評価
前記マウスから得られた血清試料を対象に、肝損傷の指標因子であるＡＳＴ（aspartate aminotransferase）及びＡＬＴ（alanine aminotransferase）、並びに脂質指標物質であるコレステロール（ＣＨＯＬ）、中性脂肪（ＴＧ）、低密度脂質タンパク質（ＬＤＬ）及び高密度脂質タンパク質（ＨＤＬ）のレベルを確認した。
前記マウスから得られた血清試料を対象に、肝損傷の指標因子であるＡＳＴ（aspartate aminotransferase）及びＡＬＴ（alanine aminotransferase）、並びに脂質指標物質であるコレステロール（ＣＨＯＬ）、中性脂肪（ＴＧ）、低密度脂質タンパク質（ＬＤＬ）及び高密度脂質タンパク質（ＨＤＬ）のレベルを確認した。
【0107】
その結果、図１３に示されているように、高脂肪食餌が提供されたグループ（ＶＣ、ＮＣ）において、ＡＳＴレベル及びＡＬＴレベルが格段に上昇した一方、一実施例によるＯＬＸ－０３１－１を投与したグループ（＃３１－１）においては、そのようなＡＳＴレベル及びＡＬＴレベルの上昇が低減されていることを確認した。また、図１４に示されているように、脂質指標物質のレベルも、一実施例によるＯＬＸ－０３１－１を投与したグループ（＃３１－１）において低減されていることを確認した。
【0108】
２－２．ＣＤＨＦＤ induced ＮＡＳＨマウスモデル（mouse model）でＯＬＸ－０３１－２の治療効能評価
動物モデルグループを、食餌の種類と提供期間とにより、１２週間、正常食餌が提供されたグループ（ＮＣＤ １２ｗ）、１６週間、正常食餌が提供されたグループ（ＮＣＤ １６ｗ）、１２週間、高脂肪食餌が提供されたグループ（ＣＤＨＦＤ １２ｗ）、１６週間、高脂肪食餌が提供されたグループ（ＣＤＨＦＤ １６ｗ）、１２週間、高脂肪食餌が提供され、４週間、正常食餌が提供されたグループ（ＣＤＨＦＤ－ＮＣＤ）に分類し、前記グループを、さらに投与される物質により、それぞれ１Ｘ ＰＢＳを投与した群（ＶＣ）、ＯＬＸ－０３１－２を投与した群（＃３１－２）に分類した。本実施例において、前記動物モデルグループに係わる具体的な分類は、下記表９に示されている通りである。
動物モデルグループを、食餌の種類と提供期間とにより、１２週間、正常食餌が提供されたグループ（ＮＣＤ １２ｗ）、１６週間、正常食餌が提供されたグループ（ＮＣＤ １６ｗ）、１２週間、高脂肪食餌が提供されたグループ（ＣＤＨＦＤ １２ｗ）、１６週間、高脂肪食餌が提供されたグループ（ＣＤＨＦＤ １６ｗ）、１２週間、高脂肪食餌が提供され、４週間、正常食餌が提供されたグループ（ＣＤＨＦＤ－ＮＣＤ）に分類し、前記グループを、さらに投与される物質により、それぞれ１Ｘ ＰＢＳを投与した群（ＶＣ）、ＯＬＸ－０３１－２を投与した群（＃３１－２）に分類した。本実施例において、前記動物モデルグループに係わる具体的な分類は、下記表９に示されている通りである。
【0109】
【表9】
【0110】
なお、高脂肪食餌が提供された時点から１２週目にＯＬＸ－０３１－２を投与し、そこから、２週経過後、ＯＬＸ－０３１－２を再び投与した。前記二次投与を実施した時点から２週経過後、対象マウスから肝臓を摘出し、そこから、肝組織試料及びその切片を得た。なお、前述の動物モデルグループ１及び３においては、高脂肪食餌が提供された時点から１２週目にマウスを犠牲にし、前述の試料を得た。
【0111】
（１）病理組織学的評価
前記実施例２－１の（３）と同一方式でもって、組織切片に対する、Ｈ＆Ｅ染色及びピクロシリウスレッドを実施し、肝実質に形成された多数の脂肪液胞やコラーゲン沈着などの変化を確認した。
前記実施例２－１の（３）と同一方式でもって、組織切片に対する、Ｈ＆Ｅ染色及びピクロシリウスレッドを実施し、肝実質に形成された多数の脂肪液胞やコラーゲン沈着などの変化を確認した。
【0112】
その結果、図１５に示されているように、高脂肪食餌が提供されたグループ（ＣＤＨＦＤ １２ｗ、ＣＤＨＦＤ １６ｗ）は、肝実質に、多数の脂肪液胞と炎症巣（inflammatory foci）とが観察された一方、一実施例によるＯＬＸ－０３１－２を投与したグループ（ＣＤＨＦＤ ０３１－２、ＣＤＨＦＤ－ＮＣＤ ０３１－２）においては、そのような脂肪液胞と炎症巣とが低減されていることを確認した。また、図１６及び図１７に示されているように、一実施例によるＯＬＸ－０３１－２を投与したグループ（ＣＤＨＦＤ ０３１－２、ＣＤＨＦＤ－ＮＣＤ ０３１－２）において、脂質成分及びコラーゲン沈着が有意に低減されていることを確認した。特に、ＯＬＸ－０３１－２を投与したグループ６（ＣＤＨＦＤ １６ｗ ０３１－２）は、高脂肪食餌が提供されたグループ３及び４（ＣＤＨＦＤ １２ｗ、ＣＤＨＦＤ １６ｗ）に比べ、脂肪液胞とコラーゲン沈着レベルとが低減されているが、それは、非アルコール性脂肪肝炎に対する有効な治療効能を示しているものである。
【0113】
（２）肝組織内の繊維化関連因子の発現評価
前記実施例２－１の（４）と同一の方式により、肝繊維化関連因子の発現レベルを評価した。
前記実施例２－１の（４）と同一の方式により、肝繊維化関連因子の発現レベルを評価した。
【0114】
その結果、図１８に示されているように、高脂肪食餌が提供されたグループ（ＣＤＨＦＤ、ＣＤＨＦＤ－ＮＣＤ）において、肝繊維化関連因子であるα－ＳＭＡ、ｍＣｏｌ１α１及びＴＩＭＰ１ ｍＲＮＡの発現レベルが上昇した一方、一実施例によるＯＬＸ－０３１－２を投与したグループ（＃ＣＤＨＦＤ ０３１－２、ＣＤＨＦＤ－ＮＣＤ ０３１－２）においては、そのようなα－ＳＭＡ、ｍＣｏｌ１α１及びＴＩＭＰ１ ｍＲＮＡの発現増大が低減されていることを確認した。それもまた、前記実験結果と同様に、ＯＬＸ－０３１－２を投与したグループ６（031-2 ＣＤＨＦＤ）は、高脂肪食餌が提供されたグループ３及び４（ＣＤＨＦＤ １２ｗ、ＣＤＨＦＤ１６ｗ）と格段な差を示している。
【0115】
（３）ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡの発現抑制効果の評価
前記マウスから得られた肝組織試料を対象に、前記実施例１－２と同一方式でもって、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡの発現レベルを評価した。
前記マウスから得られた肝組織試料を対象に、前記実施例１－２と同一方式でもって、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡの発現レベルを評価した。
【0116】
その結果、図１９に示されているように、一実施例によるＯＬＸ－０３１－２を投与したグループ（＃ＣＤＨＦＤ ０３１－２、ＣＤＨＦＤ－ＮＣＤ ０３１－２）においては、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡの発現レベルが、他のグループに比べ、有意に低いということを確認した。
【0117】
実施例３：ＲＮＡｉ誘導用二本鎖核酸分子の二次スクリーニング
３－１．２５０種のａｓｉＲＮＡのデザイン及び作製
本実施例においては、前記１－２と同一方式でもって、ＮＣＢＩデータベース検索を介し、ＭＡＲＣ１遺伝子情報を獲得した後、ヒト由来及びサル由来のＭＡＲＣ１それぞれにつき、共通標的を有する塩基配列基準において、一定レベルの相同性を示す塩基配列を選抜し、総２５０種のａｓｉＲＮＡをデザインし（センスストランド（１６－ｍｅｒ）、アンチセンスストランド（２１－ｍｅｒ））、それを、Bioneerにおいて、１０nmoleスケールに合成した。前述の方法によってデザインされたＭＡＲＣ１ ａｓｉＲＮＡの配列情報は、下記の表１０ないし表１４に示されている通りである。
３－１．２５０種のａｓｉＲＮＡのデザイン及び作製
本実施例においては、前記１－２と同一方式でもって、ＮＣＢＩデータベース検索を介し、ＭＡＲＣ１遺伝子情報を獲得した後、ヒト由来及びサル由来のＭＡＲＣ１それぞれにつき、共通標的を有する塩基配列基準において、一定レベルの相同性を示す塩基配列を選抜し、総２５０種のａｓｉＲＮＡをデザインし（センスストランド（１６－ｍｅｒ）、アンチセンスストランド（２１－ｍｅｒ））、それを、Bioneerにおいて、１０nmoleスケールに合成した。前述の方法によってデザインされたＭＡＲＣ１ ａｓｉＲＮＡの配列情報は、下記の表１０ないし表１４に示されている通りである。
【0118】
【表10】
【0119】
【表11】
【0120】
【表12】
【0121】
【表13】
【0122】
【表14】
【0123】
３－２．ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡの発現抑制効果の評価
ｍＲＮＡレベルにおいて、発現抑制効率を確認するために、前記ＭＡＲＣ１ ａｓｉＲＮＡをＨｕｈ７細胞に形質感染させた後、ｑＲＴ－ＰＣＲを遂行し、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡの発現レベルを測定した。具体的には、前記Ｈｕｈ７細胞は、９６ウェルプレートに、８×１０３細胞／ウェルにシーディングされ、そこに、ＭＡＲＣ１ ａｓｉＲＮＡ（１０ｎＭ（OliX Ｉｎｃ．））とＲＮＡｉＭａｘ（２μｌ／ｍｌ（Invitrogen Ｉｎｃ． １３７７８１５０））とを添加した後、Invitrogenから提供されたプロトコルによって形質感染を行った。そこから、２４時間後、SuperPrep（商標）Cell lysis & RT kit for qPCR Kit II（TOYOBO ＳＣＱ－４０１）を使用して細胞ライセート（cell lysate）を準備し、そこに含まれたｍＲＮＡをテンプレートにする逆転写過程を介してｃＤＮＡを合成した。その後、前記合成されたｃＤＮＡをテンプレートにし、定量的ＰＣＲを、THUNDERBIRD（登録商標）Probe qPCR Mix（TOYOBO ＱＰＳ－１０１）及びProbe（Ｈｓ００２２４２２７＿ｍ１、Ｈｓ０３９２８９８５＿ｇ１（Applied Biosystems））を使用して遂行し、ｍＲＮＡ発現抑制レベルを基準に、一次的に、総１３４種のＭＡＲＣ１ ａｓｉＲＮＡを選別した（図示せず）。なお、本実施例における対照群は、形質感染試薬のみを添加した群（Ｍｏｃｋ）、陽性対照群として、ａｓｉＭＡＲＣ１－３０を使用し、実施例１－２と同一方式でもって形質感染を行った群（ＰＣ１）を使用した。その後、前述のところのように選別された１３４種のＭＡＲＣ１ ａｓｉＲＮＡを対象に、前述のところと同一方式でもって、ＭＡＲＣ１ ａｓｉＲＮＡ処理濃度のみを、１ｎＭまたは０．１ｎＭに順次に変更しながら、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡ発現レベルを評価した。
ｍＲＮＡレベルにおいて、発現抑制効率を確認するために、前記ＭＡＲＣ１ ａｓｉＲＮＡをＨｕｈ７細胞に形質感染させた後、ｑＲＴ－ＰＣＲを遂行し、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡの発現レベルを測定した。具体的には、前記Ｈｕｈ７細胞は、９６ウェルプレートに、８×１０３細胞／ウェルにシーディングされ、そこに、ＭＡＲＣ１ ａｓｉＲＮＡ（１０ｎＭ（OliX Ｉｎｃ．））とＲＮＡｉＭａｘ（２μｌ／ｍｌ（Invitrogen Ｉｎｃ． １３７７８１５０））とを添加した後、Invitrogenから提供されたプロトコルによって形質感染を行った。そこから、２４時間後、SuperPrep（商標）Cell lysis & RT kit for qPCR Kit II（TOYOBO ＳＣＱ－４０１）を使用して細胞ライセート（cell lysate）を準備し、そこに含まれたｍＲＮＡをテンプレートにする逆転写過程を介してｃＤＮＡを合成した。その後、前記合成されたｃＤＮＡをテンプレートにし、定量的ＰＣＲを、THUNDERBIRD（登録商標）Probe qPCR Mix（TOYOBO ＱＰＳ－１０１）及びProbe（Ｈｓ００２２４２２７＿ｍ１、Ｈｓ０３９２８９８５＿ｇ１（Applied Biosystems））を使用して遂行し、ｍＲＮＡ発現抑制レベルを基準に、一次的に、総１３４種のＭＡＲＣ１ ａｓｉＲＮＡを選別した（図示せず）。なお、本実施例における対照群は、形質感染試薬のみを添加した群（Ｍｏｃｋ）、陽性対照群として、ａｓｉＭＡＲＣ１－３０を使用し、実施例１－２と同一方式でもって形質感染を行った群（ＰＣ１）を使用した。その後、前述のところのように選別された１３４種のＭＡＲＣ１ ａｓｉＲＮＡを対象に、前述のところと同一方式でもって、ＭＡＲＣ１ ａｓｉＲＮＡ処理濃度のみを、１ｎＭまたは０．１ｎＭに順次に変更しながら、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡ発現レベルを評価した。
【0124】
その結果、図２０Ａないし図２０Ｃに示されているように、ＭＡＲＣ１ ａｓｉＲＮＡ １３４種１ｎＭ処理によるＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡの発現抑制効果を確認し、それらのうち、ＭＡＲＣ１発現抑制効率にすぐれる上位４１種のＭＡＲＣ１ ａｓｉＲＮＡを選別した（＃５４、＃７５、＃８０、＃８９、＃９０、＃９２、＃９７、＃９９、＃１００、＃１１４、＃１２４、＃１２６、＃１２９、＃１３０、＃１３１、＃１３７、＃１４３、＃１４４、＃１６１、＃１６６、＃１７７、＃１９４、＃１９５、＃１９６、＃２００、＃２０１、＃２０２、＃２１０、＃２１１、＃２１２、＃２１５、＃２１６、＃２１７、＃２１８、＃２２０、＃２２２、＃２２３、＃２２４、＃２３３、＃２６４、＃２６８）。また、図２１に示されているように、前記発現抑制効果を確認したＭＡＲＣ１ ａｓｉＲＮＡ ４１種０．１ｎＭ処理によるＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡの発現抑制効果を確認し、それらのうち、さらにＭＡＲＣ１発現抑制効率にすぐれる上位３０種のＭＡＲＣ１ ａｓｉＲＮＡを選別した（＃７５、＃８０、＃８９、＃９０、＃９２、＃９９、＃１００、＃１１４、＃１２４、＃１２６、＃１２９、＃１３０、＃１３１、＃１３７、＃１４３、＃１４４、＃１６６、＃１７７、＃１９４、＃１９６、＃２００、＃２１２、＃２１５、＃２１６、＃２１８、＃２２０、＃２２２、＃２２３、＃２２４、＃２６４）。
【0125】
３－３．ＭＡＲＣ１タンパク質の発現抑制効果の評価
タンパク質レベルにおける発現抑制効率を確認するために、前記実施例３－２で選別された３０種のＭＡＲＣ１ ａｓｉＲＮＡをＨｕｈ７細胞に形質感染させた後、ウェスタンブロットを遂行し、ＭＡＲＣ１タンパク質の発現レベルを測定した。具体的には、前記Ｈｕｈ７細胞は、１２ウェルプレートに、５×１０４細胞／ウェルにシーディングされ、そこに、ＭＡＲＣ１ ａｓｉＲＮＡ（１ｎＭ（OliX Ｉｎｃ．）とＲＮＡｉＭａｘ（２μｌ／ｍｌ（Invitrogen Ｉｎｃ． １３７７８１５０））を添加した後、Invitrogenから提供されたプロトコルによって形質感染を行った。そこから、４８時間後、前記形質感染された細胞を破砕し、各サンプルごとに、１５μｇの細胞ライセート（cell lysate）を得た。前記得られた細胞ライセート（cell lysate）を対象に、１０％ ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル、ＭＡＲＣ１ウサギ（rabbit）ポリクローナル抗体（３％ ＢＳＡ内における１：１，０００希釈（Abcepta ＡＰ９７５４ｃ））及びビンキュリンマウス（vinculin mouse）モノクローナル抗体（３％ ＢＳＡ内における１：１，０００希釈（Santa Cruz Biotechnology ｓｃ－７３６１４）を使用してウェスタンブロットを遂行し、ChemiDoc XRS+ System（Bio-Rad）でＭＡＲＣ１タンパク質の発現レベルを確認した。なお、本実施例における対照群は、形質感染試薬のみを添加した群（Ｍ）、陽性対照群として、ａｓｉＭＡＲＣ１－３０またはａｓｉＭＡＲＣ１－３１を使用し、実施例１－２と同一方式でもって形質感染を行った群（ＰＣ１、ＰＣ２）を使用した。
タンパク質レベルにおける発現抑制効率を確認するために、前記実施例３－２で選別された３０種のＭＡＲＣ１ ａｓｉＲＮＡをＨｕｈ７細胞に形質感染させた後、ウェスタンブロットを遂行し、ＭＡＲＣ１タンパク質の発現レベルを測定した。具体的には、前記Ｈｕｈ７細胞は、１２ウェルプレートに、５×１０４細胞／ウェルにシーディングされ、そこに、ＭＡＲＣ１ ａｓｉＲＮＡ（１ｎＭ（OliX Ｉｎｃ．）とＲＮＡｉＭａｘ（２μｌ／ｍｌ（Invitrogen Ｉｎｃ． １３７７８１５０））を添加した後、Invitrogenから提供されたプロトコルによって形質感染を行った。そこから、４８時間後、前記形質感染された細胞を破砕し、各サンプルごとに、１５μｇの細胞ライセート（cell lysate）を得た。前記得られた細胞ライセート（cell lysate）を対象に、１０％ ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル、ＭＡＲＣ１ウサギ（rabbit）ポリクローナル抗体（３％ ＢＳＡ内における１：１，０００希釈（Abcepta ＡＰ９７５４ｃ））及びビンキュリンマウス（vinculin mouse）モノクローナル抗体（３％ ＢＳＡ内における１：１，０００希釈（Santa Cruz Biotechnology ｓｃ－７３６１４）を使用してウェスタンブロットを遂行し、ChemiDoc XRS+ System（Bio-Rad）でＭＡＲＣ１タンパク質の発現レベルを確認した。なお、本実施例における対照群は、形質感染試薬のみを添加した群（Ｍ）、陽性対照群として、ａｓｉＭＡＲＣ１－３０またはａｓｉＭＡＲＣ１－３１を使用し、実施例１－２と同一方式でもって形質感染を行った群（ＰＣ１、ＰＣ２）を使用した。
【0126】
その結果、図２２に示されているように、前記実施例３－２で選別された総３０種のＭＡＲＣ１ ａｓｉＲＮＡは、いずれもＭＡＲＣ１タンパク質の発現を抑制することを確認した。
実施例４：化学的変形が導入されたＲＮＡｉ誘導用核酸分子の製造
実施例４：化学的変形が導入されたＲＮＡｉ誘導用核酸分子の製造
【0127】
４－１．４１種のＭＡＲＣ１ ＧａｌＮＡｃ－ａｓｉＲＮＡのデザイン及び作製
本実施例においては、前記実施例１及び３で発現抑制効果を確認したＭＡＲＣ１ ａｓｉＲＮＡを対象に、ＧａｌＮＡｃリガンド及び化学的変形が導入された非対称ｓｉＲＮＡ（ＧａｌＮＡｃ－ａｓｉＲＮＡ）をデザインした。前記デザインされたＧａｌＮＡｃ－ａｓｉＲＮＡは、前記ａｓｉＲＮＡに比べ、多様な化学的変形（２’ＯＭｅ、ＰＳ、Ｆｌｕｏｒｏ、ＧａｌＮＡｃリガンドなど）が導入されたものであり、肝細胞内部への伝達が向上された非対称ｓｉＲＮＡである。
本実施例で作製された総４１種のＭＡＲＣ１ ＧａｌＮＡｃ－ａｓｉＲＮＡの配列情報は、下記表１５の通りである。
本実施例においては、前記実施例１及び３で発現抑制効果を確認したＭＡＲＣ１ ａｓｉＲＮＡを対象に、ＧａｌＮＡｃリガンド及び化学的変形が導入された非対称ｓｉＲＮＡ（ＧａｌＮＡｃ－ａｓｉＲＮＡ）をデザインした。前記デザインされたＧａｌＮＡｃ－ａｓｉＲＮＡは、前記ａｓｉＲＮＡに比べ、多様な化学的変形（２’ＯＭｅ、ＰＳ、Ｆｌｕｏｒｏ、ＧａｌＮＡｃリガンドなど）が導入されたものであり、肝細胞内部への伝達が向上された非対称ｓｉＲＮＡである。
本実施例で作製された総４１種のＭＡＲＣ１ ＧａｌＮＡｃ－ａｓｉＲＮＡの配列情報は、下記表１５の通りである。
【0128】
【表15】
【0129】
具体的には、前記表１５において、「＊」、「ｍ」、「ｆ」、「Ｐ」及び「ＧａｌＮＡｃ」と表記された化学的変形は、前記表７に示された通りである。
【0130】
４－２．ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡの発現抑制効果の評価
ｍＲＮＡレベルにおける発現抑制効率を確認するために、前記実施例４－１で作製された総４１種のＭＡＲＣ１ ＧａｌＮＡｃ－ａｓｉＲＮＡ（１００ｎＭ）それぞれを、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Koatech）に由来する一次培養されたマウスの肝細胞（ＰＭＨ：primary cultured mouse hepatocytes）に処理した後（ｎ＝３）、実施例１－２と同一方式でもってｑＲＴ－ＰＣＲを遂行し、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡの発現レベルを測定した。なお、本実施例における対照群は、物質を処理していない群（ＮＴ）、陰性対照群として、ＯＬＸ７００Ａ－００１－８（１００ｎＭ）を処理した群（ＮＣ）、陽性対照群として、ＯＬＸ－０３１－１（１０ｎＭ）を処理した群（ＰＣ）を使用した。
ｍＲＮＡレベルにおける発現抑制効率を確認するために、前記実施例４－１で作製された総４１種のＭＡＲＣ１ ＧａｌＮＡｃ－ａｓｉＲＮＡ（１００ｎＭ）それぞれを、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Koatech）に由来する一次培養されたマウスの肝細胞（ＰＭＨ：primary cultured mouse hepatocytes）に処理した後（ｎ＝３）、実施例１－２と同一方式でもってｑＲＴ－ＰＣＲを遂行し、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡの発現レベルを測定した。なお、本実施例における対照群は、物質を処理していない群（ＮＴ）、陰性対照群として、ＯＬＸ７００Ａ－００１－８（１００ｎＭ）を処理した群（ＮＣ）、陽性対照群として、ＯＬＸ－０３１－１（１０ｎＭ）を処理した群（ＰＣ）を使用した。
【0131】
その結果、図２３に示されているように、ＭＡＲＣ１ ＧａｌＮＡｃ－ａｓｉＲＮＡ ４１種の処理によるＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡの発現抑制効果を確認した。それらのうちでも、ＯＬＸ－０３１－１、ＯＬＸ－０３１－９、ＯＬＸ－２７４－１、ＯＬＸ－２３１－３、ＯＬＸ－２８１－１、ＯＬＸ－０３１－８、ＯＬＸ－０３１－６、ＯＬＸ－２３７－１、ＯＬＸ－０３１－４の発現抑制効果は、さらにすぐれている。
【0132】
４－３．ヒト由来の肝細胞に対するＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡの発現抑制効果の評価
ｍＲＮＡレベルにおける発現抑制効率を確認するために、前記実施例４－１で作製された総４１種のＭＡＲＣ１ ＧａｌＮＡｃ－ａｓｉＲＮＡそれぞれを、ヒトに由来する一次肝細胞（primary human hepatocyte）（Ｆ００９９５－Ｐ）に処理した後（ｎ＝３）、ｑＲＴ－ＰＣＲを遂行し、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡの発現レベルを測定した。具体的には、前記一次肝細胞は、９６ウェルプレートに、４×１０４細胞／ウェルにシーディングされ、そこに、ＭＡＲＣ１ ＧａｌＮＡｃ－ａｓｉＲＮＡ（５００ｎＭ（OliX Ｉｎｃ．）を処理した後、実施例１－２と同一方式でもってｑＲＴ－ＰＣＲを遂行し、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡの発現レベルを測定した。なお、本実施例における対照群は、物質を処理していない群（ＮＴ）、陰性対照群として、ＯＬＸ７００Ａ－００１－８（５００ｎＭ）を処理した群（ＮＣ）、陽性対照群として、ＯＬＸ－０３１－１（１０ｎＭ）を処理した群（ＰＣ）を使用した。
ｍＲＮＡレベルにおける発現抑制効率を確認するために、前記実施例４－１で作製された総４１種のＭＡＲＣ１ ＧａｌＮＡｃ－ａｓｉＲＮＡそれぞれを、ヒトに由来する一次肝細胞（primary human hepatocyte）（Ｆ００９９５－Ｐ）に処理した後（ｎ＝３）、ｑＲＴ－ＰＣＲを遂行し、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡの発現レベルを測定した。具体的には、前記一次肝細胞は、９６ウェルプレートに、４×１０４細胞／ウェルにシーディングされ、そこに、ＭＡＲＣ１ ＧａｌＮＡｃ－ａｓｉＲＮＡ（５００ｎＭ（OliX Ｉｎｃ．）を処理した後、実施例１－２と同一方式でもってｑＲＴ－ＰＣＲを遂行し、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡの発現レベルを測定した。なお、本実施例における対照群は、物質を処理していない群（ＮＴ）、陰性対照群として、ＯＬＸ７００Ａ－００１－８（５００ｎＭ）を処理した群（ＮＣ）、陽性対照群として、ＯＬＸ－０３１－１（１０ｎＭ）を処理した群（ＰＣ）を使用した。
【0133】
また、ＭＡＲＣ１ ＧａｌＮＡｃ－ａｓｉＲＮＡの処理濃度によるｍＲＮＡレベルにおける発現抑制効率を確認するために、前記ヒトに由来する一次肝細胞は、９６ウェルプレートに、３×１０４細胞／ウェルにシーディングされ、そこに、それぞれ２０ｎＭまたは１００ｎＭのＭＡＲＣ１ ＧａｌＮＡｃ－ａｓｉＲＮＡ（OliX Ｉｎｃ．）を処理した（ｎ＝２）。その後、実施例１－２と同一方式でもって、ｑＲＴ－ＰＣＲを遂行し、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡの発現レベルを測定した。なお、本実施例における対照群は、物質を処理していない群（ＮＴ）、陰性対照群として、ＯＬＸ７００Ａ－００１－８（１００ｎＭ）を処理した群（ＮＣ）、陽性対照群として、ＯＬＸ－０７５－１またはＯＬＸ－２１８－１（１０ｎＭ）を処理した群（ＰＣ１、及びＰＣ２）を使用した。
【0134】
その結果、図２４に示されているように、ＭＡＲＣ１ ＧａｌＮＡｃ－ａｓｉＲＮＡ ４１種の処理によるＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡの発現抑制効果を確認した。また、図２５に示されているように、前記４１種のＭＡＲＣ１ ＧａｌＮＡｃ－ａｓｉＲＮＡは、濃度依存的にＭＡＲＣ１の発現を抑制させ、特に、前記実施例１で確保されたＯＬＸ－０３１－１よりすぐれた効力を有する総１０種のＭＡＲＣ１ ＧａｌＮＡｃ－ａｓｉＲＮＡを選別した（ＯＬＸ－０７５－１、ＯＬＸ－１１４－１、ＯＬＸ－２１２－１、ＯＬＸ－２１６－１、ＯＬＸ－２２４－１、ＯＬＸ－２１８－１、ＯＬＸ－２６４－１、ＯＬＸ－２２０－１、ＯＬＸ－３１－７、ＯＬＸ－９２－１）。
【0135】
実施例５．ヒトＭＡＲＣ１を標的とするＧａｌＮＡｃ－ａｓｉＲＮＡの作製、及びＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡの発現抑制効果の評価
本実施例においては、前記実施例４の実験結果を基に、すぐれた効果を示したＯＬＸ－０７５－１を選択し、多様な化学的変形を有するＭＡＲＣ１ ＧａｌＮＡｃ－ａｓｉＲＮＡを作製した。本実施例で作製された総１７種のＭＡＲＣ１ ＧａｌＮＡｃ－ａｓｉＲＮＡの配列情報は、下記表１６の通りである。
本実施例においては、前記実施例４の実験結果を基に、すぐれた効果を示したＯＬＸ－０７５－１を選択し、多様な化学的変形を有するＭＡＲＣ１ ＧａｌＮＡｃ－ａｓｉＲＮＡを作製した。本実施例で作製された総１７種のＭＡＲＣ１ ＧａｌＮＡｃ－ａｓｉＲＮＡの配列情報は、下記表１６の通りである。
【0136】
【表16】
【0137】
具体的には、前記表１６において、「＊」、「ｍ」、「ｆ」、「Ｐ」、「ＧａｌＮＡｃ」及び「ＥＶＰ」と表記された化学的変形は、前記表７に示されている通りである。
【0138】
また、ｍＲＮＡレベルにおける発現抑制効率を確認するために、前述の作製された総１７種のＭＡＲＣ１ ＧａｌＮＡｃ－ａｓｉＲＮＡそれぞれを、ヒトに由来する一次肝細胞（primary human hepatocyte）（Ｆ００９９５－Ｐ）に処理した後（ｎ＝３）、ｑＲＴ－ＰＣＲを遂行し、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡの発現レベルを測定した。具体的には、前記一次肝細胞は、９６ウェルプレートに、４×１０４細胞／ウェルにシーディングされ、そこに、ＭＡＲＣ１ ＧａｌＮＡｃ－ａｓｉＲＮＡ（１０ｎＭまたは１００ｎＭ（OliX Ｉｎｃ．））を処理した後、実施例１－２と同一方式でもって、ｑＲＴ－ＰＣＲを遂行し、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡの発現レベルを測定した。
【0139】
その結果、図２６に示されているように、ＭＡＲＣ１ ＧａｌＮＡｃ－ａｓｉＲＮＡ １７種の処理によるＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡの発現抑制効果を確認した。
【0140】
実施例６．サルモデルを利用したＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡの発現抑制効果評価
サル動物モデルを対象に、多様な濃度（２．５ｍｐ、５ｍｐまたは１０ｍｐ）のＯＬＸ－０３１－２またはＯＬＸ－０７５－２を、１週間ごとに総２回皮下投与した後、前記二次投与を実施した時点から１週経過後、対象サルから肝臓を摘出し、そこから、肝組織試料及びその切片を得た。その後、実施例１－２と同一方式でもって、ｑＲＴ－ＰＣＲを遂行し、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡの発現レベルを測定した。本実施例において、前記ＯＬＸ－０３１－２及び前記ＯＬＸ－０７５－２の配列情報は、下記表１７のようであり、動物モデルグループに係わる具体的な分類は、下記表１８に示されている通りである。
サル動物モデルを対象に、多様な濃度（２．５ｍｐ、５ｍｐまたは１０ｍｐ）のＯＬＸ－０３１－２またはＯＬＸ－０７５－２を、１週間ごとに総２回皮下投与した後、前記二次投与を実施した時点から１週経過後、対象サルから肝臓を摘出し、そこから、肝組織試料及びその切片を得た。その後、実施例１－２と同一方式でもって、ｑＲＴ－ＰＣＲを遂行し、ＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡの発現レベルを測定した。本実施例において、前記ＯＬＸ－０３１－２及び前記ＯＬＸ－０７５－２の配列情報は、下記表１７のようであり、動物モデルグループに係わる具体的な分類は、下記表１８に示されている通りである。
【0141】
【表17】
【0142】
【表18】
【0143】
その結果、図２７に示されているように、ＯＬＸ－０７５－２投与群において、さらにすぐれたＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡ発現抑制効果を確認し、そのような効果は、濃度依存的な傾向性を示している。
【0144】
実施例７．動物モデルを利用したＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡの発現抑制効果評価
７－１．ＳＥＡＰレポーターを利用した発現抑制効果の評価
６週齢Ｂａｌｂ／ｃマウス（雌）を、ヒトＭＡＲＣ１遺伝子、及びそれと連結されたＳＥＡＰレポーターを含むプラスミド（ｐＳＥＬＥＣＴ－ｍＳＥＡＰ－ｈＭＡＲＣ１）で形質感染させた後、動物モデルグループを、投与される物質により、それぞれ１Ｘ ＰＢＳを投与した群（ＶＣ）、前記実施例５のＭＡＲＣ１ ＧａｌＮＡｃ－ａｓｉＲＮＡを投与した群（ＯＬＸ－０７５－２、ＯＬＸ－０７５－４、ＯＬＸ－０７５－５、ＯＬＸ－０７５－６、ＯＬＸ－０７５－８、ＯＬＸ－０７５－１２、ＯＬＸ－０７５－１６、ＯＬＸ－０７５－１８）、及び前記実施例６のＯＬＸ－０３１－２を投与した群に分類した。本実施例において、前記動物モデルグループに係わる具体的な分類は、下記表１９に示されている通りである。
７－１．ＳＥＡＰレポーターを利用した発現抑制効果の評価
６週齢Ｂａｌｂ／ｃマウス（雌）を、ヒトＭＡＲＣ１遺伝子、及びそれと連結されたＳＥＡＰレポーターを含むプラスミド（ｐＳＥＬＥＣＴ－ｍＳＥＡＰ－ｈＭＡＲＣ１）で形質感染させた後、動物モデルグループを、投与される物質により、それぞれ１Ｘ ＰＢＳを投与した群（ＶＣ）、前記実施例５のＭＡＲＣ１ ＧａｌＮＡｃ－ａｓｉＲＮＡを投与した群（ＯＬＸ－０７５－２、ＯＬＸ－０７５－４、ＯＬＸ－０７５－５、ＯＬＸ－０７５－６、ＯＬＸ－０７５－８、ＯＬＸ－０７５－１２、ＯＬＸ－０７５－１６、ＯＬＸ－０７５－１８）、及び前記実施例６のＯＬＸ－０３１－２を投与した群に分類した。本実施例において、前記動物モデルグループに係わる具体的な分類は、下記表１９に示されている通りである。
【0145】
【表19】
【0146】
なお、前記プラスミドで形質感染された時点から４週目に、ＭＡＲＣ１ ＧａｌＮＡｃ－ａｓｉＲＮＡを皮下投与し、そこから、１週経過後、血液サンプルを採取し、ＳＥＡＰレポーター蛍光のレベルを、Phospha-Light（商標）SEAP Reporter Gene Assay System（Invitrogen（商標）Ｔ１０１５）を介して確認し、ヒトＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡの発現抑制レベルを比較した。
【0147】
その結果、図２８に示されているように、ＭＡＲＣ１ ＧａｌＮＡｃ－ａｓｉＲＮＡ ９種の処理によるＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡの発現抑制効果が示され、それらのうちでも、ＯＬＸ－０７５－１２，ＯＬＸ－０７５－１６，ＯＬＸ－０７５－１７，ＯＬＸ－０７５－５，ＯＬＸ－０７５－８またはＯＬＸ－０７５－２投与群における発現抑制効果がさらにすぐれていた。
【0148】
７－２．二重ルシフェラーゼレポーターを利用した発現抑制効果の評価
６週齢Ｂａｌｂ／ｃマウスを、ヒトＭＡＲＣ１遺伝子を含むプラスミド（ｐｓｉＣＨＥＣＫ－２－ｈＭＡＲＣ１）で形質感染させた後、３ｍｐｋの前記実施例５のＭＡＲＣ１ ＧａｌＮＡｃ－ａｓｉＲＮＡを皮下投与した（ＯＬＸ－０７５－２、ＯＬＸ－０７５－４、ＯＬＸ－０７５－５、ＯＬＸ－０７５－６、ＯＬＸ－０７５－８、ＯＬＸ－０７５－１２、ＯＬＸ－０７５－１６、ＯＬＸ－０７５－１７、ＯＬＸ－０７５－１８）。そこから、３日経過後、血液サンプルを採取し、ルシフェラーゼレポーター蛍光のレベルを、Dual-Luciferase（登録商標）Reporter Assay System（Promega Ｅ１９８０）を介して確認し、ヒトＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡの発現抑制レベルを比較した。
６週齢Ｂａｌｂ／ｃマウスを、ヒトＭＡＲＣ１遺伝子を含むプラスミド（ｐｓｉＣＨＥＣＫ－２－ｈＭＡＲＣ１）で形質感染させた後、３ｍｐｋの前記実施例５のＭＡＲＣ１ ＧａｌＮＡｃ－ａｓｉＲＮＡを皮下投与した（ＯＬＸ－０７５－２、ＯＬＸ－０７５－４、ＯＬＸ－０７５－５、ＯＬＸ－０７５－６、ＯＬＸ－０７５－８、ＯＬＸ－０７５－１２、ＯＬＸ－０７５－１６、ＯＬＸ－０７５－１７、ＯＬＸ－０７５－１８）。そこから、３日経過後、血液サンプルを採取し、ルシフェラーゼレポーター蛍光のレベルを、Dual-Luciferase（登録商標）Reporter Assay System（Promega Ｅ１９８０）を介して確認し、ヒトＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡの発現抑制レベルを比較した。
【0149】
その結果、図２９に示されているように、多様な化学的変形を有する実施例５のＭＡＲＣ１ ＧａｌＮＡｃ－ａｓｉＲＮＡ投与群は、いずれもすぐれたＭＡＲＣ１ ｍＲＮＡ発現抑制効果を示し、それらのうちでも、ＯＬＸ－０７５－１６，ＯＬＸ－０７５－１７，ＯＬＸ－０７５－１２，ＯＬＸ－０７５－８，ＯＬＸ－０７５－８投与群における発現抑制効果がさらにすぐれていた。
【0150】
以上、本発明の内容の特定部分を詳細に記述したが、当業界の通常の知識を有する者において、そのような具体的技術は、単に望ましい実施例であるのみ、それにより、本発明の範囲が制限されるものではないという点は、明白であろう。従って、本発明の実質的な範囲は、特許請求の範囲と、それらの等価物とによって定義されるものである。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20A】
【図20B】
【図20C】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【配列表】
【国際調査報告】