特表 2024-525121 高レベルｒＡＡＶ生産のためのシステム

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-07-10

(54)【発明の名称】高レベルｒＡＡＶ生産のためのシステム

(51)【国際特許分類】

   C12N 7/01 20060101AFI20240703BHJP

   C12N 15/864 20060101ALI20240703BHJP

   C12N 15/35 20060101ALI20240703BHJP

   C12N 15/85 20060101ALI20240703BHJP

   C12N 15/861 20060101ALI20240703BHJP

   C12N 5/10 20060101ALN20240703BHJP

【ＦＩ】

C12N7/01 ZNA

C12N15/864 100Z

C12N15/35

C12N15/85 Z

C12N15/861 Z

C12N5/10

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023573566

(86)(22)【出願日】2022-06-30

(85)【翻訳文提出日】2024-01-26

(86)【国際出願番号】 EP2022068080

(87)【国際公開番号】W WO2023275260

(87)【国際公開日】2023-01-05

(31)【優先権主張番号】21183218.3

(32)【優先日】2021-07-01

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】508334199

【氏名又は名称】シャリテ－ウニヴェルジテーツメディツィン・ベルリン

【氏名又は名称原語表記】ＣＨＡＲＩＴＥ－ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＡＥＴＳＭＥＤＩＺＩＮ ＢＥＲＬＩＮ

(74)【代理人】

【識別番号】100145403

【弁理士】

【氏名又は名称】山尾 憲人

(74)【代理人】

【識別番号】100122301

【弁理士】

【氏名又は名称】冨田 憲史

(74)【代理人】

【識別番号】100170520

【弁理士】

【氏名又は名称】笹倉 真奈美

(74)【代理人】

【識別番号】100221545

【弁理士】

【氏名又は名称】白江 雄介

(72)【発明者】

【氏名】ウェガー，シュテファン

(72)【発明者】

【氏名】ハイルブロン，レギーネ

【テーマコード（参考）】

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B065AA93X

4B065AA95X

4B065AB01

4B065BA02

4B065CA44

(57)【要約】

本発明は、研究および治療用途において使用するための組換え型アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターまたはＡＡＶウイルス様粒子の新規生産方法を対象とする。特に、本発明は、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質をコードする第１の組換え型アデノウイルスベクターと、ＡＡＶ Ｃａｐタンパク質をコードする第２の組換え型アデノウイルスベクターとに細胞を感染させる、組換え型アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターまたはＡＡＶウイルス様粒子を生産するための有利な方法を開示する。この細胞には、さらに、導入遺伝子を含むＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）によってフランキングされた発現カセットを内包する導入遺伝子ベクターが提供される。本発明はさらに、導入遺伝子ベクター、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質をコードする第１の組換え型アデノウイルスベクター、およびＡＡＶ Ｃａｐタンパク質をコードする第２の組換え型アデノウイルスベクターを含む、本発明の方法に従ってｒＡＡＶベクターを生産するためのキットまたは組成物を開示する。本発明の方法、キット、および組成物は、安定なシステムにおけるＡＡＶベクター粒子の生産の増加を可能にする。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

組換え型アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターまたはＡＡＶウイルス様粒子を生産する方法であって、
ａ）プロモーターに作動可能に連結されたＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子を含む発現カセットを含む組換え型アデノウイルスｒｅｐベクター（ｒｅｐ－ｒＡｄＶ）であって、前記ｒｅｐ遺伝子がＲＩＳ－Ａｄを含まず、前記ｒｅｐベクターがＡＡＶ Ｃａｐタンパク質をコードしない、組換え型アデノウイルスｒｅｐベクターに、細胞を感染させることと、
ｂ）野生型ｐ４０プロモーターではないプロモーターに作動可能に連結されたＡＡＶ ｃａｐ遺伝子を含む発現カセットを含む組換え型アデノウイルスｃａｐベクター（ｃａｐ－ＡｄＶ）であって、前記ｃａｐベクターがＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質をコードしない、組換え型アデノウイルスｃａｐベクターに、細胞を感染させることと、
ｃ）プロモーターに作動可能に連結された導入遺伝子を含む発現カセットを含む導入遺伝子ベクターであって、前記発現カセットがＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）によってフランキングされている、導入遺伝子ベクターを提供することとを含み、
ａ）およびｃ）が、ＡＡＶウイルス様粒子の生産のために適宜行われる、方法。

【請求項2】

前記方法が、ｒＡＡＶベクターを生産するためのものであり、前記方法が、
ａ）プロモーターに作動可能に連結されたＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子を含む発現カセットを含む組換え型アデノウイルスｒｅｐベクター（ｒｅｐ－ｒＡｄＶ）であって、前記ｒｅｐ遺伝子がＲＩＳ－Ａｄを含まず、前記ｒｅｐベクターがＡＡＶ Ｃａｐタンパク質をコードしない、組換え型アデノウイルスｒｅｐベクターに、細胞を感染させることと、
ｂ）野生型ｐ４０プロモーターではないプロモーターに作動可能に連結されたＡＡＶ ｃａｐ遺伝子を含む発現カセットを含む組換え型アデノウイルスｃａｐベクター（ｃａｐ－ＡｄＶ）であって、前記ｃａｐベクターがＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質をコードしない、組換え型アデノウイルスｃａｐベクターに、細胞を感染させることと、
ｃ）プロモーターに作動可能に連結された導入遺伝子を含む発現カセットを含む導入遺伝子ベクターであって、前記発現カセットがＡＡＶ ＩＴＲによってフランキングされている、導入遺伝子ベクターをさらに提供することとを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記導入遺伝子ベクターが、スターターｒＡＡＶであり、
好ましくは、前記スターターｒＡＡＶが、１０～１５００ゲノム粒子（ＧＰ）／細胞のＭＯＩにおいて、好ましくは２０～５０ＧＰ／細胞のＭＯＩにおいて、前記細胞に投与される、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

前記導入遺伝子ベクターが、スタータートランスフェクションプラスミドである、請求項１または２に記載の方法。

【請求項5】

前記導入遺伝子ベクターが、スターター組換え型アデノウイルスベクターである、請求項１または２に記載の方法。

【請求項6】

前記ｒｅｐ－ＡｄＶの前記発現カセットの前記プロモーターが、弱いプロモーター、誘導性プロモーター、および構成的プロモーターを含む群から選択される異種プロモーターである、前記請求項のいずれかに記載の方法。

【請求項7】

前記異種プロモーターが、ＴＡＴＡボックスおよび少なくとも１つのＳＰ１結合部位を含み、前記プロモーターが、ＣＴＦ結合部位を含むＣＣＡＡＴボックスをさらに含んでいてもよい、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

前記ｃａｐ－ＡｄＶの前記発現カセット中の前記プロモーターが、ＴＡＴＡボックスおよび少なくとも１つのＳＰ１結合部位を含むプロモーターであり、前記プロモーターが、ＣＣＡＡＴボックスおよび少なくとも１つのＣＴＦ結合部位をさらに含んでいてもよい、前記請求項のいずれかに記載の方法。

【請求項9】

前記プロモーターが、ＨＳＶ－ＴＫプロモーターまたはＳＶ４０プロモーター、好ましくはＨＳＶ－ＴＫプロモーターである、請求項６から８のいずれかに記載の方法。Ｒｅｐオープンリーディングフレームが、配列番号１のヌクレオチド位置１９１１において停止コドンを導入することによってアミノ酸５３１において終止する、前記請求項のいずれかに記載の方法。

【請求項10】

第２の組換え型アデノウイルスベクター上の前記ｃａｐ遺伝子が、ＡＡＶ血清型１、２、３、４、５、６、７、８、および９を含む群から選択されるＡＡＶ血清型の構造タンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３をコードし、好ましくは、前記構造タンパク質が、ＡＡＶ血清型１、２、５、６、８または９のものである、前記請求項のいずれかに記載の方法。

【請求項11】

前記ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の３’領域における配列番号１のヌクレオチド１７０１から２１８６が、ＲｅｐオープンリーディングフレームのＣ末端部内のｐ４０プロモーターの転写活性を野生型ｐ４０プロモーターのものの３０％以下に低減させるように再コードされており、
好ましくは、前記ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の３’領域における配列番号１のヌクレオチド１７８２から１９１６が、適宜、配列番号４のｓＲｅｐ配列を得るために再コードされている、前記請求項のいずれかに記載の方法。

【請求項12】

ＧＧＴ結合部位を包含する前記ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の３’領域における配列番号１のヌクレオチド１７８１～１７９７と、ヌクレオチド１８５３におけるｐ４０転写開始部位（ＴＳＳ）を内包する前記ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の３’領域における配列番号１のヌクレオチド１８５１～１８５６とが、ＲｅｐオープンリーディングフレームのＣ末端部におけるｐ４０プロモーターの転写活性を野生型ｐ４０プロモーターのものの３０％以下に低減させるように再コードされている、前記請求項のいずれかに記載の方法。

【請求項13】

前記ｒｅｐ－ｒＡｄＶと前記ｃａｐ－ｒＡｄＶとの両方が、１００～２０００ＧＰ／細胞のＭＯＩにおいて、好ましくは１００～５００ＧＰ／細胞のＭＯＩにおいて、前記細胞に投与される、前記請求項のいずれかに記載の方法。

【請求項14】

前記ｒｅｐ－ｒＡｄＶおよび前記ｃａｐ－ｒＡｄＶが、第一世代の組換え型アデノウイルスベクターである、前記請求項のいずれかに記載の方法。

【請求項15】

前記細胞が、ヒト細胞、好ましくはＨＥＫ２９３細胞である、前記請求項のいずれかに記載の方法。

【請求項16】

前記方法が、組換え型ＡＡＶウイルス様粒子を生産するためのものであり、前記方法が、野生型ｐ４０プロモーターではないプロモーターに作動可能に連結されたＡＡＶ ｃａｐ遺伝子を含む発現カセットを含む組換え型アデノウイルスｃａｐベクターに細胞を感染させることを含み、前記ｃａｐベクターがＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質をコードしない、前記請求項のいずれかに記載の方法。

【請求項17】

請求項１～１７のいずれかに記載の方法に従って組換え型アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを生産するためのキットまたは組成物であって、
ａ）プロモーターに作動可能に連結された導入遺伝子を含む発現カセットを含む導入遺伝子ベクターであって、前記発現カセットがＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）によってフランキングされている、導入遺伝子ベクター、好ましくは、スターターｒＡＡＶベクター、
ｂ）プロモーターに作動可能に連結されたＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子を含む発現カセットを含む組換え型アデノウイルスｒｅｐベクター（ｒｅｐ－ｒＡｄＶ）であって、前記ｒｅｐ遺伝子がＲＩＳ－Ａｄを含まず、前記ｒｅｐベクターがＡＡＶ Ｃａｐタンパク質をコードしない、組換え型アデノウイルスｒｅｐベクター、および
ｃ）野生型ｐ４０プロモーターではないプロモーターに作動可能に連結されたＡＡＶ ｃａｐ遺伝子を含む発現カセットを含む組換え型アデノウイルスｃａｐベクター（ｃａｐ－ＡｄＶ）であって、前記ｃａｐベクターがＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質をコードしない、組換え型アデノウイルスｃａｐベクター
を含む、キットまたは組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、例えば研究および治療用途において使用するための組換え型アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターまたはＡＡＶウイルス様粒子の新規生産方法を対象とする。特に、本発明は、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質をコードする第１の組換え型アデノウイルスベクターと、ＡＡＶ Ｃａｐタンパク質をコードする第２の組換え型アデノウイルスベクターとに細胞を感染させる、組換え型アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターまたはＡＡＶウイルス様粒子を生産するための有利な方法を開示する。この細胞には、さらに、導入遺伝子を含むＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）によってフランキングされた発現カセットを内包する導入遺伝子ベクターが提供される。本発明はさらに、導入遺伝子ベクター、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質をコードする第１の組換え型アデノウイルスベクター、およびＡＡＶ Ｃａｐタンパク質をコードする第２の組換え型アデノウイルスベクターを含む、本発明の方法に従ってｒＡＡＶベクターを生産するためのキットまたは組成物を開示する。本発明の方法、キット、および組成物は、安定なシステムにおけるＡＡＶベクター粒子の生産の増加を可能にする。

【背景技術】

【0002】

遺伝子修飾されたウイルスは、遺伝子療法との関連においてヒト細胞に遺伝子を移入するためのベクターとして非常によく適している。アデノウイルスベクターおよびレトロウイルスベクターに加えて、アデノ随伴ウイルスに由来する組換え型ベクター（ｒＡＡＶ）の重要性がますます増加している。ｒＡＡＶベクターは、様々な単一遺伝子疾患の前臨床動物モデルおよび臨床試験において、長期にわたる発現と合わせて、卓越した有効性、非常に良好な安全性プロファイル、高い形質導入率、および安定なベクター持続性を示している。これらの特性は、前臨床研究および臨床研究の両方において、種々の遺伝子疾患の処置のための遺伝子移入プロトコールにおけるｒＡＡＶの使用を促進している。臨床研究では、アルファ１アンチトリプシン（Flotte et al., 2011, Hum Mol Gent 20）またはリポタンパク質リパーゼ欠損（Gaudet et al., 2013, Gene Ther 20）などの代謝欠陥、血友病Ａ（Rangarajan et al., 2017 N Engl J Med 377）およびＢ（Nathwani et al., 2014 N. Engl J Med 371）、ならびにレーバー先天黒内障（ＬＣＡ）（Bennett et al., 2016, Lancet 388）またはレーバー遺伝性視神経萎縮症（Feuer et al., 2016, Opthalmology 123）などの遺伝型の盲目の少なくとも部分的な是正を実現することができた。ＬＵＸＴＵＲＮＡという商品名のもとで、ＬＣＡ患者の網膜におけるＲＰＥ６５遺伝子のｒＡＡＶベクター媒介性発現が、米国では２０１７年１２月に、欧州では２０１８年１１月に臨床認可を受けた。脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）の処置のためのｒＡＡＶベクター（Mendell et al, 2017 N Engl J Med. 377）は、米国では２０１９年５月に、欧州では２０２０年７月に、ＺＯＬＧＥＮＳＭＡという商品名のもとで臨床認可を受けた。

【0003】

臨床設定における、特に全身への遺伝子移入を要するヒト疾患の処置におけるｒＡＡＶベクターの使用は、高度に精製された感染性のベクター粒子を大量に生成することが可能な生産および精製のシステムを必要とする（Clement and Grieger, 2016, Mol Ther Methods Clin Dev 3）。ｒＡＡＶ生産のための最初の手法である、ベクターおよびヘルパープラスミドの混合物を用いたＨＥＫ２９３細胞のコトランスフェクションは、臨床グレードのベクター調製物のために依然として広く使用されている（Clement and Grieger, 2016, Mol Ther Methods Clin Dev 3）。簡単に説明すると、このコトランスフェクション方法において使用されるプラスミドコンストラクトのうちの１つは、ベクターゲノムの複製およびパッケージングのためにシスで必要とされるＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）によってフランキングされた治療用導入遺伝子を含有する。第２のプラスミドは、ＡＡＶ Ｒｅｐ／Ｃａｐカセットをトランスで提供する。必要なアデノウイルス（ＡｄＶ）ヘルパー機能のＥ２ａ、Ｅ４ｏｒｆ６およびＶＡ ＲＮＡは、多くの研究所で使用されているｐＤＧプラスミドのような（Grimm et al., 1998, Gene Ther 26）、第２のプラスミドにおいてＲｅｐ／Ｃａｐ機能と共に提供されるか、または第３のプラスミドにおいて別々に提供される。しかし、後者は、その場合、計３つのプラスミドコンストラクトのコトランスフェクションを必要とする。ＨＥＫ２９３細胞を使用する場合、追加で必要とされるアデノウイルス機能のＥ１ａおよびＥ１ｂは、宿主ゲノム内に構成的に組み込まれたアデノウイルス配列から発現される。

【0004】

このようなトランスフェクションベースの生産システムを懸濁細胞に適合させることにおいては、近年かなりの進歩が遂げられているが（Grieger et al., 2016, Mol Ther 24）、トランスフェクション工程は依然として、ベクター収量および取り扱い易さに関する制限因子である。

【0005】

臨床試験における全身適用の場合は特に、ｒＡＡＶの使用には、患者当たり最大１０^１６個ほどのゲノム粒子という、特定の大量のベクター粒子が必要である（Clement et al, 2016, Mol Ther Methods Clin Dev 3）。しかし、上述のｒＡＡＶベクターのための従来のトランスフェクションベースの製造プロセスでは、精製前には、使用される細胞当たり最大で５．０×１０^４～１．０×１０^５以下のゲノムベクター粒子［ＧＰ／細胞、あるいは、ｖｇ／細胞（ウイルスゲノム／細胞）、いわゆる「バーストサイズ」］の収量が実現でき、精製後には２．０～３．０×１０^４ＧＰ／細胞の収量が実現できる（Clement et al, 2016）。懸濁細胞への適合における前述の進展（Grieger et al., 2016）にもかかわらず、これらの方法はさらに、依然として大半が接着細胞に限定されている。したがって、生産プロセスにおいて最大収量でゲノム粒子１０^１６個のベクター調製物を実現するには、およそ３．０～５．０×１０^１１個の細胞が必要であり、それ故、従来のトランスフェクションベースの製造方法は、多くの時間およびコストを要するものとなっている。

【0006】

哺乳動物細胞におけるｒＡＡＶのトランスフェクションベースの生産に代わる手段は、昆虫細胞における生産である。昆虫細胞は、パルボウイルスの中のデンソウイルス亜科（Ｄｅｎｓｏｖｉｒｉｎａｅ）のための宿主細胞として機能する。デンソウイルスは、ＡＡＶとよく似た機序により、それらのゲノムを複製する（Ding et al., 2002, J Virol 76）。Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａから単離されたＳｆ９細胞は、追加のヘルパー機能なしで、ＡＡＶ－ＩＴＲフランキングベクターゲノムのＲｅｐタンパク質媒介性複製を支持できることが示された（Urabe et al., 2002, Hum Gene Ther 13）。これは、ＡＡＶ－ＩＴＲによってフランキングされた導入遺伝子カセットならびにＡＡＶ ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質をデリバーするために複数の組換え型バキュロウイルスを使用する、Ｓｆ９懸濁培養物における初めての感染ベースのｒＡＡＶ生産手順の確立を可能にした（Urabe et al., 2002）。この最初の感染ベースの方法は、ＡＡＶ ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質の誘導性発現を行う安定な昆虫株など（Aslanidi et al., 2009, Proc Natl Acad Sci 106、Mietzsch et al., 2014, Hum Gene Ther 25）、いくつかのさらなる発展を経て、現在、臨床試験用のｒＡＡＶベクターの生産のために首尾よく使用されている（Clement et al, 2016）。しかし、昆虫細胞において生産されたｒＡＡＶは、ヒト細胞において生産されたｒＡＡＶと比較すると劣等な形質導入特徴を呈するように見受けられ（Rumachik et al., 2020 Molecular Therapy Methods & Clinical Development 18）、その原因はおそらくカプシドタンパク質の示差的翻訳後修飾である。

【0007】

バキュロウイルスによる昆虫細胞の感染に基づくｒＡＡＶ生産方法に加えて、哺乳動物細胞において、アデノウイルスまたは単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）に由来する組換え型ヘルパーウイルスを用いて、ＡＡＶ－ＩＴＲによってフランキングされた導入遺伝子カセットならびにＡＡＶ ＲｅｐおよびＣａｐ機能を提供するための試みが、以前から行われている。感染後、これらのウイルスは、ｒＡＡＶ生産に必要なヘルパー機能を同時に提供することができる。このような感染のみのｒＡＡＶ生産システムは既に、ＨＳＶでは実施に成功しており（Conway et al., 1999, Gene Ther 6）、臨床試験のために必要な懸濁細胞における大規模ｒＡＡＶ生産に適合されている（Clement et al., 2009, Hum Gene Ther 20、Thomas et al., 2009, Hum Gene Therapy 20）（図５）。しかし、ＨＳＶは、ＡＡＶヘルパーウイルスとしてアデノウイルス（Ａｄ）ほど十分に特性解析されていない。さらに、ＨＳＶベクターは、Ａｄベクターほど安定でなく、高い力価レベルまで増幅させるのがより困難である。

【0008】

一方、組換え型アデノウイルス（ｒＡｄ）のみに基づくｒＡＡＶ生産システム（図６）の確立は未だ成功していない。これは、アデノウイルスがＡＡＶに関して最もよく研究されているヘルパーウイルスであるという事実にかかわらない。

【0009】

必要な構成要素のうちの１つである、ＡＡＶ－ＩＴＲによってフランキングされた導入遺伝子カセットを有するｒＡｄベクターは、良好に増殖させることができ、かつ、ＡＡＶ－２ ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質の発現のための安定細胞株と組み合わせて、大規模ｒＡＡＶ生産のために首尾よく使用することもできる（Zhang et al., 2009, Hum Gene Ther 20）。しかし、第２の必要な構成要素である、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を含む組換え型アデノウイルスは、まったく増殖できなかったか、または遺伝子的に不安定であったため、大規模への適合には不適切と考えられている（Zhang et al., 2001, Gene Ther 8）。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

しかし、臨床設定における、特に全身への遺伝子移入を要するヒト疾患の処置におけるｒＡＡＶベクターの使用は、高度に精製された感染性のベクター粒子を大量に生成することが可能な生産および精製のシステムを必要とする。したがって、本発明者らは、現在の技術水準を考慮して、例えば前臨床および臨床の要件に合わせて、組換え型ＡＡＶベクターの生産をスケールアップするための新規かつ高度に効率的な方法を提供する課題に対処した。

【課題を解決するための手段】

【0011】

この課題は、本発明により、特に請求項の主題によって解決される。

【0012】

第１の態様において、本発明は、組換え型アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターまたはＡＡＶウイルス様粒子を生産する方法であって、
ａ）プロモーターに作動可能に連結されたＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子を含む発現カセットを含む組換え型アデノウイルスｒｅｐベクターであって、ｒｅｐ遺伝子がＲＩＳ－Ａｄを含まず、ｒｅｐベクターがＡＡＶ Ｃａｐタンパク質をコードしない、組換え型アデノウイルスｒｅｐベクターに、細胞を感染させることと、
ｂ）野生型ｐ４０プロモーターではないプロモーターに作動可能に連結されたＡＡＶ ｃａｐ遺伝子を含む発現カセットを含む組換え型アデノウイルスｃａｐベクターであって、前記ｃａｐベクターがＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質をコードしない、組換え型アデノウイルスｃａｐベクターに、細胞を感染させることと、
ｃ）プロモーターに作動可能に連結された導入遺伝子を含む発現カセットを含む導入遺伝子ベクターであって、発現カセットがＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）によってフランキングされている、導入遺伝子ベクターをさらに提供することとを含み、
ａ）およびｃ）が、ＡＡＶウイルス様粒子の生産のために適宜行われる、方法を対象とする。

【0013】

好ましい態様において、本発明は、組換え型アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを生産する方法であって、
ａ）プロモーターに作動可能に連結されたＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子を含む発現カセットを含む組換え型アデノウイルスｒｅｐベクターであって、ｒｅｐ遺伝子がＲＩＳ－Ａｄを含まず、ｒｅｐベクターがＡＡＶ Ｃａｐタンパク質をコードしない、組換え型アデノウイルスｒｅｐベクターに、細胞を感染させることと、
ｂ）野生型ｐ４０プロモーターではないプロモーターに作動可能に連結されたＡＡＶ ｃａｐ遺伝子を含む発現カセットを含む組換え型アデノウイルスｃａｐベクターであって、前記ｃａｐベクターがＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質をコードしない、組換え型アデノウイルスｃａｐベクターに、細胞を感染させることと、
ｃ）プロモーターに作動可能に連結された導入遺伝子を含む発現カセットを含む導入遺伝子ベクターであって、発現カセットがＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）によってフランキングされている、導入遺伝子ベクターをさらに提供することとを含む、方法を提供する。

【0014】

代替的に、本発明は、組換え型ＡＡＶウイルス様粒子を生産する方法であって、野生型ｐ４０プロモーターではないプロモーターに作動可能に連結されたＡＡＶ ｃａｐ遺伝子を含む発現カセットを含む組換え型アデノウイルスｃａｐベクターに細胞を感染させることを含み、前記ｃａｐベクターがＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質をコードしない、方法を提供する。

【0015】

ＡＡＶは、エンベロープを持たない正二十面体カプシドを有する一本鎖ＤＮＡウイルスのファミリーであるパルボウイルス科（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）の中のディペンドウイルス属を形成する。ＡＡＶのＤＮＡの複製および新しい感染性ウイルス粒子のアセンブリーを伴うその生産的感染サイクルは、好適なヘルパーウイルス、例えばアデノウイルスまたは単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）の存在に依存し、これがその名称および分類学的分類の理由である（図１）。ヘルパーウイルスの非存在下では、ＡＡＶは潜伏感染を確立することができる。インビトロ（Ｉｎ ｖｉｔｒｏ）では、多くの場合、その結果としてウイルスＤＮＡが培養細胞のゲノムに組み込まれ、一方、インビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）では、ＡＡＶ ＤＮＡは主に染色体外状態で安定なエピソームとして存在すると考えられている。今のところ、ＡＡＶはヒトにおける既知の疾患と因果的に関係付けられていない。

【0016】

本発明において、「組換え型ＡＡＶ」という用語は、人工的手段によって、例えば遺伝子エンジニアリングを介した組換えＤＮＡ技術によって、導入遺伝子を含み、かつ遺伝子療法などにおいてベクターとして使用され得るＡＡＶを取得するために、ゲノムが修飾されているＡＡＶを指す。

【0017】

これと比較して、「ＡＡＶウイルス様粒子」という用語は、実際のＡＡＶに類似するが、いかなるウイルス遺伝物質も含有せず、故に非感染性である分子を指す。ウイルス様粒子は、ウイルスカプシドを形成するタンパク質などのウイルス構造タンパク質からアセンブルされる。ＡＡＶウイルス様粒子は、遺伝子または他の治療剤のためのデリバリーシステムとして機能することもあれば、ワクチンとして使用されることもある。本発明の方法によって生産された空のＡＡＶウイルス様粒子は、患者の免疫系によって生産されたＡＡＶ特異的抗体に対するデコイとして機能することもでき、したがって遺伝子療法中のＡＡＶ媒介性遺伝子移入に有益な影響を与えることができる。

【0018】

本発明において、ｒＡＡＶベクターまたはＡＡＶウイルス様粒子を「生産すること」という用語は、プロデューサーまたはパッケージング細胞のタンパク質生合成機構を利用することによるそれらの生成を指す。生産することは、ｒＡＡＶを増幅させること、例えば、低量のスターターｒＡＡＶを、本明細書に記載されるように、例えば臨床レベルにおける適用のために十分に高い力価まで増幅させることも意味し得る。

【0019】

ＡＡＶゲノム
最もよく特性解析されているＡＶＶ血清型ＡＡＶ－２のゲノムは、約４．７ｋｂの長さを有し、各々１４５ｂｐの２つの逆方向末端反復（ＩＴＲ）によってフランキングされた、４つの調節性（Ｒｅｐ）タンパク質Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０ならびに３つのカプシド（Ｃａｐ）タンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３に対する、２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を必須のエレメントとして含有する（図２）。

【0020】

本発明において、本開示の方法によって生産されるＡＡＶベクターは、好ましくは、ＡＡＶ－２血清型に基づく。したがって、ＡＡＶ－２は、本発明の全体を通して参照血清型として使用される。別段明記されない限り、ＡＡＶゲノム、個々のＡＡＶタンパク質、およびＡＡＶの核酸配列またはアミノ酸配列への言及はすべて、ＡＡＶ－２に関して行われている。当業者であれば、ＡＡＶ－２ゲノムに関して与えられたすべての情報を他のＡＡＶ血清型へと容易に転用することができる。

【0021】

ＡＡＶ－２のｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子は、共通のイントロンを有するため、部分的に重なる。大型Ｒｅｐタンパク質であるＲｅｐ７８およびＲｅｐ６８は、内因性ｐ５プロモーターの制御下で発現され（Redemann et al., 1989, J Virol 63）、ＡＡＶ－ＩＴＲに対する配列特異的ＤＮＡ結合を介してＡＡＶ－２ ＤＮＡ複製において不可欠な役割を果たす（McCarty et al., 1994 J. Virol 68）。これらはさらに、ヘルパーウイルスの存在下で、ＡＡＶ－２ゲノムにおける他のエレメントおよび複数の細胞転写因子に結合することにより、小型Ｒｅｐタンパク質であるＲｅｐ５２／Ｒｅｐ４０およびカプシドタンパク質の発現を刺激する（Pereira and Muzyczka, 1997, J Virol 71）。小型Ｒｅｐタンパク質であるＲｅｐ５２およびＲｅｐ４０は、ｐ１９プロモーターによって発現され、ＤＮＡ複製中に予め形成されたカプシドへと新しく形成された一本鎖ＤＮＡを挿入するために必要である（King et al., 2001, Embo J 20）。Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ５２は、スプライシングされていない転写物によってコードされるが、より短い変異体であるＲｅｐ６８およびＲｅｐ４０の転写物は、ｒｅｐ遺伝子の３’部に局在するイントロンを切り取る。複数の複製研究により、小型Ｒｅｐタンパク質のＲｅｐ５２またはＲｅｐ４０のうちの１つと合わせた、大型Ｒｅｐタンパク質のＲｅｐ７８またはＲｅｐ６８のうちの１つが、ＡＡＶ－２ ＤＮＡの複製およびウイルス生産に十分であることが示されている（Ward et al., 1994, J Virol 68）。

【0022】

３つのカプシド（Ｃａｐ）タンパク質であるＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３は、ｐ４０プロモーターの制御下で、選択的にスプライスされた転写物および翻訳開始コドンを使用することにより（Becerra et al., 1988, J Virol 68、Muralidhar et al., 1994, J Virol 68）、最終的なカプシドにも存在する１：１：１０の化学量論比において生産される（Xie et al., 2002, Proc Natl Acad Sci 99）。ｒｅｐ遺伝子の３’部においてＲｅｐ６８およびＲｅｐ４０の発現におけるものと同じイントロンが切り取られている、主に形成されるスプライス変異体のうち、ＶＰ２の合成は、非標準のＡＣＧ開始コドンによって引き起こされ、主なカプシドタンパク質ＶＰ３の合成は、さらに下流で通常のＡＵＧ開始コドンによって引き起こされる。より存在度の低い選択的にスプライスされたｐ４０転写物は、同じスプライスドナー部位を使用するが、より上流のスプライスアクセプター部位を使用するため、この転写物は、ＶＰ１のＡＵＧ開始コドンを依然として含有する。カプシド構造は、ＡＡＶにコードされたアセンブリー活性化タンパク質（ＡＡＰ：ａｓｓｅｍｂｌｙ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）などのシャペロンの関与により、カプシドタンパク質の臨界濃度を超えるとアセンブルされる。ＡＡＰは、ＡＡＶ－２血清型では感染性ウイルス粒子の形成に必要であり、他の血清型ではこのプロセスを増進する（Earley et al., 2017, J Virol 91、Sonntag et al., 2011, J Virol 85、Sonntag et al., 2010, Proc Natl Acad Sci 107）。これは、ｃａｐ遺伝子の選択的リーディングフレームによってコードされる。ＡＡＶ ＤＮＡの複製、および完成したＤＮＡ含有ウイルス粒子のアセンブリーは、連動したプロセスを構成すると考えられている。

【0023】

ｒＡＶＶなどのウイルスベクターは、ターゲット生物に対して有害であってはならないため、その使用における重要な要素は安全性である。したがって、依然としてターゲット細胞に治療用遺伝子を導入することができるが、もはやその中で複製することはできない、複製欠損性ＡＶＶを開発する必要がある。これは、複製に不可欠なウイルス遺伝子を除去することによって実現される。

【0024】

ＡＡＶは非病原性であり、生産的複製のためにヘルパーウイルスに依存すると考えられているが、組換え型ゲノムにおけるコーディングウイルス配列（Ｒｅｐ／Ｃａｐ）は通常、完全に除去される。その目的は、ひとつには、ベクターゲノムの最大パッケージング能力が長さ４．７ｋｂの野生型ゲノムの大きさほどであることから、治療用導入遺伝子のための場所をあけるためである。もうひとつには、例えば細胞培養下のＲｅｐ７８について、とりわけ細胞増殖および細胞周期に対する複数の阻害効果が報告されていることから、高いＲｅｐ濃度による有毒作用の可能性を回避すべきである。ｒｅｐ遺伝子の欠失により、ｒＡＡＶベクターは、形質導入されたターゲット細胞のゲノムに組み込まれる能力も喪失する。しかし、エピソーマルベクターゲノムは、いわゆるコンカテマーの形成により、分化細胞において非常に高い安定性を示す。

【0025】

本発明者らは、本明細書においてそれぞれｒｅｐベクターおよびｃａｐベクターまたはｒｅｐ－ｒＡｄＶおよびｃａｐ－ｒＡｄＶと呼ばれる２つの別個の組換え型アデノウイルスベクターからＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子およびＡＡＶ ｃａｐ遺伝子を提供することにより、ＡＡＶベクター生産が首尾よく実現され得ることを見出した。本発明者らは、別個のｒｅｐ－ｒＡｄＶおよびｃａｐ－ｒＡｄＶによる細胞の重感染が、従来のプラスミドベースの生産方法のＲｅｐ／Ｃａｐカセットおよびアデノウイルスヘルパー機能を完全に機能的に置き換え得ることを実証することができた。この手法はまた、以前の標準的なトランスフェクションプロセスにおいて必要であった、高度に精製されたプラスミドＤＮＡを大量に生産する必要性をなくす。

【0026】

ベクターとしてのアデノウイルス性ウイルス
アデノウイルスは、２６～４５キロベースペア（ｋｂｐ）の長さの線状二本鎖ＤＮＡゲノムを有する、エンベロープを持たない正二十面体ウイルスのファミリーを指す。組換え型アデノウイルス（ｒＡｄ）は、ゲノムサイズが大きく、生成が複雑でなく、複雑な補完細胞株の必要性なしに高力価まで増幅することが可能であるため、研究用途および遺伝子移入のための魅力的なベクターと考えられている。

【0027】

長年にわたり、ｒＡｄベクター（ｒＡｄＶ）技術は、その安全性および治療可能性を向上させるために絶えず進歩してきた。今までに、三世代のｒＡｄＶが設計されている。第一世代の組換え型アデノウイルスベクターは、依然として、ウイルス複製に不可欠であるＥ１ａ／Ｅ１ｂおよびＥ３領域を除くすべてのアデノウイルス遺伝子を含有する。Ｅ３領域は、その機能が専ら免疫調節性であることから、細胞培養におけるｒＡｄＶ増殖そのものには不要であり、生産的ＡＡＶ感染のためのヘルパー作用に関与してもいないが、ｒＡｄＶ増幅に必要な欠損しているＥ１ａ／Ｅ１ｂ機能は、例えば、ＨＥＫ２９３細胞などの遺伝子修飾されたパッケージング細胞によって提供され得る。第一世代ｒＡｄＶは、約８．２ｋｂのクローニング能力を有する。第二世代ｒＡｄＶは、非構造的なＥ２遺伝子およびＥ４遺伝子をさらに欠いており、これは約１２ｋｂの増加したクローニング能力をもたらす。最後に、第三世代ｒＡｄＶは、そのすべてのウイルスタンパク質コード配列が除去されており、アデノウイルスＩＴＲおよびパッケージングシグナルのみをシスで保持する。したがって、第三世代ｒＡｄＶは、トランスでのウイルスタンパク質の提供のために、ヘルパーアデノウイルスを用いた重感染に依拠する。

【0028】

第一世代ｒＡｄＶは、十分に確立されており取り扱いが容易なＨＥＫ２９３などの補完細胞株の単純感染によって、非常に高い力価まで安価に増幅させることができる。さらに、第一世代ＡｄＶのクローニング能力は、ＡＡＶ ｒｅｐまたはｃａｐオープンリーディングフレームを内包するのに十分に大きい。したがって、好ましい実施形態において、組換え型アデノウイルスのｒｅｐベクターおよびｃａｐベクターは、第一世代の組換え型アデノウイルスベクター（ｒＡｄＶ）である。しかし、ｒｅｐ－ｒＡｄＶおよびｃａｐ－ｒＡｄＶは、別の実施形態では、第二世代ｒＡｄＶでもよい。ｒｅｐ－ｒＡｄＶおよびｃａｐ－ｒＡｄＶは、第三世代ｒＡｄＶでもよい。しかし、本発明の方法における第三世代ｒＡｄＶの使用は、上述のように好適なヘルパーアデノウイルスを用いた重感染を必要とするため、あまり好ましくない。

【0029】

ＡＡＶ ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質の発現のために使用される２つの異なるｒＡｄＶは、現在の技術水準から公知である任意の方法によって生産され得る。例えば、以下の実施例に記載するように、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社によるＡｄＥａｓｙ（商標）Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍを使用することで、ｒＡｄＶを生産することができる。しかし、当業者は、本明細書に記載されるｒｅｐ－ｒＡｄＶおよびｃａｐ－ｒＡｄＶを取得するために、当技術分野において公知の異なるｒＡｄＶ生産システムを参照してもよいし、商業的に提供される特注のＡｄＶサービスに依拠してもよい。

【0030】

ｒＡＡＶの大規模生産のためにＡＡＶ－２のｒｅｐおよびｃａｐの両遺伝子を発現するｒＡｄＶを安定に増殖させようとするこれまでの試みは失敗している。ＲｅｐおよびＣａｐを発現するｒＡｄＶは、複製不可能であったか、または本質的に遺伝子的に不安定であった。ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子のみを含有するｒＡｄＶでもアデノウイルス複製の阻害も観察され（Carlson et al., 2002, Mol Ther 6、Recchia et al., 1999, Proc Natl Acad Sci USA 96、Recchia et al., 2004, Mol Ther 10、Wang and Lieber, 2006, J Virol 80）、したがって、ｒＡｄ－ｒｅｐ／ｃａｐベクターの安定な増殖の失敗は、Ｒｅｐタンパク質発現に起因するとされた。しかし、Ｓｉｔａｒａｍａｎら（Sitaraman et al., 2011, Proc Natl Acad Sci USA 108）および本発明者らによる最近の研究により、これらのハイブリッドＡＡＶ／Ａｄベクターの複製の制限は、ＡＡＶ－２ ｒｅｐ遺伝子の３’部におけるシス阻害性配列が主な原因であることが示され、それ故、当該配列はＲＩＳ－Ａｄ（アデノウイルス複製のＲｅｐ阻害配列）と名付けられた。ＲＩＳ－Ａｄは、プロモーターと近位で一時停止したＲＮＡ ＩＩポリメラーゼとの複合体によって媒介されると思われる転写関連機序によって、アデノウイルスゲノム複製を阻害する（Weger et al, 2016, J Virol 90）。

【0031】

ＲＩＳ－Ａｄは、配列番号２のヌクレオチド配列に対応し、ＡＡＶ－２ゲノム（配列番号１）のヌクレオチド（ｎｔ）位置１７０１から２１８６にわたることが示された。ＲＩＳ－Ａｄは、機能的なＲｅｐタンパク質を発現することはできないが、Ｃａｐタンパク質およびＡＡＶイントロンの大部分の発現に関与するｐ４０プロモーターと、Ｃａｐタンパク質をコードする転写物のスプライシングに不可欠である、配列番号１のｎｔ位置１９０６におけるスプライスドナー部位とを依然として含む。理論に拘束されるものではないが、シスでのアデノウイルス複製の阻害は、ｃａｐ転写物の発現に必要なｐ４０プロモーターからの短い転写物の発現に基づくと考えられている（Weger et al., 2016, J Virol 90）。これらの短い転写物を生産するＲＮＡポリメラーゼＩＩは、ｐ４０プロモーターの直ぐ下流で一時停止し、この領域におけるｒｅｐ－Ａｄゲノムの複製の立体障害をもたらす可能性がある（図７）。

【0032】

ＲＩＳ－Ａｄ全体の再コードはｒｅｐ－Ａｄゲノム複製の阻害を逆転させ得ることが示された。核酸の再コードとは、翻訳されるアミノ酸配列が変化しないように、個々のアミノ酸をコードするトリプレットコドンを同義のトリプレットコドンで置換することを指す。したがって、一次核酸配列のみが再コードによって改変される。これを行うことができるのは、６４コドンの遺伝コードには冗長性があるが多義性はない、すなわち、複数の異なる核酸コドンが全く同一のアミノ酸をコードするからである。ｒｅｐ遺伝子の３’領域内のＲＩＳ－Ａｄを再コードすることにより、コードされたポリペプチド、すなわち、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質は影響を受けないが、それは、前記Ｒｅｐタンパク質を構成するアミノ酸配列が改変されないからである。しかし、再コードは、Ｒｅｐ ＯＲＦ内のｐ４０プロモーターを修飾するか、または好ましくは完全に破壊し、ひいてはｒｅｐ遺伝子の３’末端へのＲＮＡポリメラーゼ結合に干渉する。したがって、挿入されたＲｅｐ７８カセットによるｒＡｄＶ複製の阻害が無効になり得る。

【0033】

本発明の一実施形態において、ｒｅｐ遺伝子は、もはやＲＩＳ－Ａｄを含まず、すなわち、ＲＩＳ－Ａｄ全体が、例えば、Ｓｉｔａｒａｍａｎらにより既報のように、配列番号３に対する１００％の配列同一性を共有する核酸配列へと再コードされる。代替的に、再コードされた領域は、配列番号３に対する、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を持つ核酸配列を有してもよい。好ましくは、再コードされたＲＩＳ－Ａｄは、配列番号２、すなわち野生型ＲＩＳ－Ａｄの核酸配列に対する、９５％未満、９０％未満、８０％未満、または７０％未満の配列同一性を有する。

【0034】

本発明者らはまた、ＲＩＳ－Ａｄを、配列番号１のｎｔ１７８１～２０６０にわたり、配列番号１２に対応するヌクレオチド配列へとさらに絞り込めることを示した。このいわゆる最小ＲＩＳ－Ａｄは、上記のＲＩＳ－Ａｄについて記載したように再コードされ得る。したがって、再コードされた最小ＲＩＳ－Ａｄは、配列番号１３による核酸配列を有し得る。代替的に、再コードされた最小ＲＩＳ－Ａｄは、配列番号３に対する、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を持つ核酸配列を有してもよい。好ましくは、再コードされた最小ＲＩＳ－Ａｄは、配列番号１２、すなわち野生型最小ＲＩＳ－Ａｄの核酸配列に対する、９５％未満、９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、または５０％未満の配列同一性を有する。

【0035】

さらに、本発明者らは、ｒｅｐ－ＡｄＶゲノム複製の阻害を無効にするには、配列番号１のｎｔ１７８２から１９１６にわたるＲＩＳ－Ａｄのサブ領域を再コードするだけで十分であることを見出した。したがって、好ましい実施形態では、配列番号１のｎｔ１７８２～１９１６を包含する領域のみが再コードされ、例えば、配列番号４に対する１００％の核酸配列同一性を共有し、本明細書においてｓＲｅｐと呼ばれる核酸配列になる。ｓＲｅｐは、Ｒｅｐ７８タンパク質（配列番号５）のアミノ酸４８８から５３１に対応する。代替的に、ｒｅｐ遺伝子の再コードされたサブ領域は、ｓＲｅｐ（配列番号４）に対する、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を持つ核酸配列を有してもよい。好ましくは、配列番号１のｎｔ１７８２から１９１６にわたるＲＩＳ－Ａｄの再コードされたサブ領域は、配列番号１のｎｔ１７８２から１９１６の領域に対する、８０％未満、７０％未満、６０％未満、または５０％未満の配列同一性を有する。

【0036】

特筆すべきことに、ＲＩＳ－Ａｄまたは上述したそのサブ領域の再コードは、ｒｅｐ遺伝子の３’カルボキシ末端におけるスプライスドナー部位を破壊する。その結果、ｒｅｐ転写物の選択的スプライシングが無効になる。したがって、一実施形態において、本発明によれば、２つの代替的なＲｅｐタンパク質であるＲｅｐ６８およびＲｅｐ４０は、もはや発現されない。しかし、ＡＡＶ－２ ＤＮＡの複製およびウイルス生産には、Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ５２の発現だけで十分であることが見出されているため、Ｒｅｐ６８およびＲｅｐ４０は不要である。

【0037】

核酸領域の再コードは、前記核酸配列内のあらゆるトリプレットコドンが再コードされる必要があるということを意味するものではない。いくつかの実施形態において、核酸配列の再コードは、前記配列内の１つまたは複数の選択されたトリプレットコドンだけの再コードを指す。例えば、ＲＩＳ－Ａｄ内の選択されたトリプレットコドン、例えば、ｐ４０プロモーターにおいてＲＮＡポリメラーゼまたは特定の転写因子が結合する領域を再コードするだけで十分な場合がある。一実施形態では、ヌクレオチド１８５３においてｐ４０転写開始部位（ＴＳＳ）を内包するＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の３’領域における配列番号１のヌクレオチド１８５１～１８５６のみの再コードが、ｐ４０プロモーター機能を低減させ、ｒｅｐ－ＡｄＶ複製の阻害を少なくとも部分的に軽減するのに十分であり得る。代替的に、配列番号１のｎｔ１７８１～１７９７に対応するＧＧＴモチーフを包含する１７ヌクレオチドの領域が再コードされてもよい。好ましい実施形態では、配列番号１のｎｔ１８５１～１８５６に対応するｐ４０ ＴＳＳと、配列番号１のｎｔ１７８１～１７９７に対応するＧＧＴモチーフを包含するｐ４０領域との両方が再コードされ、ＲＩＳ－Ａｄの残部は未改変のままであり得る。

【0038】

いくつかの実施形態において、ｒｅｐ－ＡｄＶ複製の阻害を逆転させるには、配列番号１のｎｔ位置１８０２～１８１０に及ぶＳｐ１結合部位および／または配列番号１のｎｔ１８１３～１８２０にわたるＡＰ１結合部位を再コードすることで十分な場合もある。ｐ４０ ＴＳＳ、または配列番号１のｎｔ１７８１～１７９７にわたるＧＧＴモチーフを包含する領域に加えて、Ｓｐ１結合部位および／またはＡＰ１結合部位が再コードされてもよい。また、本明細書に記載されるように、ｐ４０ ＴＳＳ、配列番号１のｎｔ１７８１～１７９７のＧＧＴモチーフを包含する領域、Ｓｐ１結合部位、およびＡＰ１結合部位を同時に再コードし、ＲＩＳ－Ａｄの残部を未改変のままにすることが、特に有利であり得る。こうすれば、代替的なＲｅｐタンパク質であるＲｅｐ６８およびＲｅｐ４０の発現に必要なＲｅｐ ＯＲＦのカルボキシ末端部におけるスプライスドナー部位を保存することも可能であり得る。

【0039】

まとめると、「ＲＩＳ－Ａｄの再コード」または「ＲＩＳ－Ａｄを含まない」という用語は、本明細書では、例えば、配列番号１のｎｔ１７０１から２１８６に対応するＲＩＳ－Ａｄ全体、配列番号１のｎｔ１７８１～２０６０に対応する最小ＲＩＳ－Ａｄ、配列番号１のｎｔ１７８２～１９１６に対応するＲＩＳ－Ａｄのサブ領域、または、例えば、本明細書に記載されるｐ４０ ＴＳＳおよび／もしくは個々の転写因子結合部位を包含するＲＩＳ－Ａｄの選択されたコドンだけの再コードを意味すると理解され得る。

【0040】

ＲＩＳ－Ａｄの再コードは、ｐ４０プロモーターがｒｅｐ－ＡｄＶの複製に干渉しなくなる程度まで、Ｒｅｐ ＯＲＦの３’領域における生理学的なｐ４０プロモーターの活性を低減させるべきである。本発明において、これは、ＲＩＳ－Ａｄの再コードによってｐ４０プロモーターの活性が野生型ｐ４０プロモーターのものの３０％以下に低減すると実現される。好ましくは、ＲＩＳ－Ａｄの再コード後のｐ４０プロモーターの活性は、野生型ｐ４０プロモーターの活性の３０％未満ですらあり、例えば、ｐ４０プロモーターの活性は、好ましくは、野生型ｐ４０プロモーターのものの２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、９％以下、８％以下、７％以下、６％以下、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、または１％以下に低減する。特に好ましい実施形態において、ＲＩＳ－Ａｄの再コードは、ｐ４０プロモーター機能の完全な妨害をもたらし、すなわち、ｐ４０プロモーターは、測定可能な転写活性を全く呈さない。

【0041】

本発明の方法によれば、ｒｅｐ－ＡｄＶによって提供されるＡＡＶ－２ ｒｅｐ遺伝子の５’末端は、大型Ｒｅｐタンパク質の発現を駆動することが可能なプロモーターに作動可能に連結されている。プロモーターは、関連する遺伝子の転写のタイミング、速度、および位置を調節するＤＮＡエレメントである。プロモーター領域は、それぞれの関連する遺伝子の上流に見出され、ＲＮＡへの遺伝子の転写の方向を示すように非対称的に構成されている。ＲＮＡポリメラーゼは、遺伝子のプロモーター領域に結合することによって前記遺伝子の転写を開始する。プロモーターは、転写因子の結合部位として機能し得る種々の特定のサブ領域をさらに含む。プロモーターに結合した転写因子のタイプに応じて、それぞれの遺伝子の転写は活性化されるか、または抑制される。

【0042】

遺伝子などの核酸配列は、プロモーターが、前記核酸配列との関連で、当該配列の転写を制御するために正しい機能的位置および／または配向で位置付けられているとき、前記プロモーターに「作動可能に連結された」とみなされる。天然には、大型のＡＡＶ－２ Ｒｅｐタンパク質であるＲｅｐ７８およびＲｅｐ６８は、Ｒｅｐ ＯＲＦの５’末端に位置付けられたＡＡＶ－２ ｐ５プロモーターの制御下で転写されるが、より小型のＲｅｐタンパク質であるＲｅｐ５２およびＲｅｐ４０は、Ｒｅｐ ＯＲＦ内に存在する内部ｐ１９プロモーターから転写される。したがって、一実施形態において、ｒｅｐ－ＡｄＶにおけるＡＡＶ－２ ｒｅｐ遺伝子の５’末端に作動可能に連結されたプロモーターは、内因性ＡＡＶ－２ ｐ５プロモーターである。しかし、本発明者らは、生理学的なＡＡＶ－２ ｐ５プロモーターの制御下でのＲｅｐ７８の発現が、高いベクター不安定性に関連するｒｅｐ－ＡｄＶ複製の著しい阻害をもたらしたという驚くべき発見をした。おそらく、ｒｅｐ－ＡｄＶの遺伝子不安定性は、ｐ５プロモーターに存在する大型Ｒｅｐタンパク質に対する比較的強力な結合エレメント（ＲＢＥ）に起因し得る。したがって、好ましい実施形態において、ｒｅｐ－ＡｄＶ内部のＡＡＶ－２ ｒｅｐ遺伝子に作動可能に連結された生理学的なプロモーターは、ＡＡＶ－２ ｐ５プロモーターではなく、むしろ異種プロモーターである。

【0043】

異種プロモーターは、目的の遺伝子に人工的に連結されたプロモーターを指すが、前記プロモーターは通常、遺伝子の発現を制御しない。異種プロモーターを使用することにより、導入遺伝子の発現を増進または低減させることができる。代替的に、異種プロモーターは、化学的トリガー因子の存在下でのみ遺伝子発現を誘発することができる誘導性プロモーターであり得る。異種プロモーターは、それらの関連する遺伝子の細胞特異的または組織特異的な発現を確実にする細胞特異的または組織特異的なプロモーターでもよい。

【0044】

ｒｅｐ－ＡｄＶの異種プロモーターは、ウイルスベクターにおける導入遺伝子の発現に好適ないかなるプロモーターでもよい。

【0045】

しかし、高いＲｅｐタンパク質の発現はトランスでアデノウイルス複製を阻害することが以前に示されているため、好ましい実施形態において、ｒｅｐ遺伝子に連結された異種プロモーターは、ＭＭＴＶプロモーター、ＰＧＫ１遺伝子プロモーター、ＵＢＣ遺伝子プロモーターなどの弱いプロモーターか、またはテトラサイクリン誘導性プロモーター、Ｃｕｍａｔｅ誘導性プロモーター、電気感応性プロモーター（ｅｌｅｃｔｒｏｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、もしくはオプトジェネティクススイッチ（ｏｐｔｏｇｅｎｅｔｉｃ ｓｗｉｔｃｈ）などの誘導性プロモーターである。

【0046】

別の実施形態において、異種プロモーターは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ＴＫ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＣＡＧプロモーター（ＣＭＶ初期エンハンサーエレメント、ニワトリベータアクチンのプロモーター、第１のエキソンおよび第１のイントロン、ならびにウサギベータグロブリン遺伝子のスプライスアクセプターを含む）、ＣＭＶおよびニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）プロモーター、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター、第１のアデノウイルスサブタイプ５イントロンありまたはなしのアデノウイルスサブタイプ５主要後期プロモーター（ＭＬＰ）、ヒトβ－アクチンプロモーター、ヒト伸長因子１αプロモーター、ＥＦ１ａ遺伝子プロモーター、ならびにヒトベータアクチン遺伝子プロモーターなどの構成的活性プロモーターでもよい。

【0047】

特に好ましい実施形態において、ｒｅｐ－ｒＡｄＶの異種プロモーターは、少なくとも１つのＴＡＴＡボックスと、少なくとも１つのＳＰ１結合部位とを含み、ＣＴＦ結合部位を含む少なくとも１つのＣＣＡＡＴボックスを含んでいてもよいプロモーターである。好ましくは、プロモーターは、ＴＡＴＡボックスと、２つのＳＰ１結合部位（近位および遠位）と、ＣＴＦ結合部位を含むＣＣＡＡＴボックスとを含む。

【0048】

Ｇｏｌｄｂｅｒｇ－Ｈｏｇｎｅｓｓボックスとしても知られるＴＡＴＡボックスは、プロモーター領域において一般的に見出され、反復するチミン（Ｔ）およびアデニン（Ａ）塩基対によって特徴付けられるコンセンサス配列を含むＤＮＡの配列である。ＴＡＴＡボックスは、転写因子結合部位として機能し、転写開始に関与している。Ｓｐ１転写因子は、グアニン（Ｇ）およびシトシン（Ｃ）塩基対が豊富なプロモーターモチーフに結合する、いわゆるジンクフィンガー転写因子である。Ｓｐ１転写因子は、配列番号２２を有する核酸配列に特に良好に結合することが見出された。したがって、異種プロモーターは、配列番号２２の核酸配列を有する少なくとも１つのＳｐ１結合部位を含むことが好ましい。ＣＣＡＡＴボックスは、コンセンサス配列ＧＧＣＣＡＡＴＣＴを含む一続きのＤＮＡであり、通常、最初の転写部位に対して約６０～１００塩基の位置にある。ＣＣＡＡＴボックスは、ＣＣＡＡＴボックス結合転写因子（ＣＴＦ）などのための転写因子結合部位として機能する。好ましくは、異種プロモーターは、転写因子Ｅ２Ｆによってさらに誘導可能であり、転写因子Ｅ２Ｆは、アデノウイルス機能Ｅ１Ａによって誘導可能である。Ｅ２Ｆ媒介性誘導は、上述のプロモーターエレメントによって、特に、少なくとも１つ、好ましくは２つのＳｐ１結合部位によって媒介される。代替的に、ＣＣＡＡＴボックスと重なるコンセンサスＥ２Ｆ結合部位が、重要な程度までＥ２Ｆ活性化に関与することなく、プロモーター配列内に存在してもよい。

【0049】

プロモーターが２つのＳｐ１結合部位を内包する場合、好ましくは、ＴＡＴＡボックスと、ＴＳＳの近位に位置する上流の第１のＳｐ１結合部位（近位ＳＰ－１結合部位）との間の距離は、１３～４１塩基対（ｂｐ）、例えば、１５～２０ｂｐ、２０～２５ｂｐ、２５～３０ｂｐ、３０～３５ｂｐ、または３５～４１ｂｐの範囲内である。特に好ましい実施形態において、ＴＡＴＡボックスと近位Ｓｐ１結合部位との間の距離は、１７～２３ｂｐ、例えば、１９ｂｐである。異種プロモーターが、ＣＴＦ結合部位を含むＣＣＡＡＴボックスを含む場合、近位Ｓｐ１結合部位と、ＣＣＡＡＴボックス、およびＴＳＳから遠位に位置する第２のＳｐ１結合部位（遠位Ｓｐ１結合部位）を含む配列との間の距離は、好ましくは、１２～３２ｂｐ、例えば、１２～１５ｂｐ、１５～２０ｂｐ、２０～２５ｂｐ、または２５～３２ｂｐの範囲内である。最も好ましくは、近位Ｓｐ１結合部位と、ＣＣＡＡＴボックスおよび遠位ＳＰ１結合部位を含む領域との間の距離は、２０～２５ｂｐ、例えば、２２ｂｐである。ＣＣＡＡＴボックスおよび遠位Ｓｐ１結合部位は、互いの間の距離を１０ｂｐ以下として密接に並列しているべきである。言及されたエレメントを本明細書に記載される順序で含む例示的なプロモーターのスキームを図８に示す。ＴＡＴＡボックスの上流にある前述のプロモーター配列は、元々の遠位Ｓｐ１結合部位が反転した故に新しい近位Ｓｐ１結合部位になった後に上述のようにＴＡＴＡボックスから約１３～４１ｂｐ離れた距離にある限り、反転してもよい。

【0050】

特に好ましい実施形態において、プロモーターは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ＴＫ）プロモーターである。以下の実施例において示されるように、本発明者らは、ＨＳＶ－ＴＫプロモーターの制御下でのＲｅｐタンパク質の発現が、ｒＡＡＶベクター生産中にｒＡＡＶベクターゲノムの特に高い複製をもたらしたことを見出した。ＨＳＶ－ＴＫプロモーターは、上述のエレメント、例えば、それらのすべてによって特徴付けられ、配列番号６の核酸配列を有し得る。ＨＳＶ－ＴＫプロモーターは、配列番号６に対する少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を持つ核酸配列を有するＨＳＶ－ＴＫプロモーターの変異体でもよい。ＨＳＶ－ＴＫプロモーター変異体は、配列番号６に対する７０％未満の配列同一性、例えば、配列番号６に対する６５％未満、６０％未満、５５％未満、５０％未満、４５％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、または２５％未満の配列同一性を有する核酸配列を有してもよい。一実施形態において、ＨＳＶ－ＴＫ変異体は、配列番号６に対応するが、５’末端における最後の９０ｂｐを欠いている。このような切断型ＨＳＶ－ＴＫ変異体は、本明細書ではＨＳＶ－１０６と称され、配列番号１５の核酸配列を有する。別の実施形態において、ｒｅｐ遺伝子の５’末端に作動可能に連結された異種プロモーターは、配列番号６のＨＳＶ－ＴＫプロモーターと、ＴＡＴＡボックス、各々１０ｂｐの１つまたは２つのＳＰ１結合部位、および１２ｂｐのＣＣＡＡＴボックスのみを共有する。

【0051】

異種プロモーターがＨＳＶ－ＴＫプロモーターである場合、一実施形態では、ＣＣＡＡＴボックスおよび遠位Ｓｐ１結合部位を含有する配列をＴＡＴＡボックスの近位に寄せるために、第１の近位Ｓｐ１結合部位を欠失させてもよい。本発明において、近位Ｓｐ１結合部位を欠いているこのような切断型ＨＳＶ－ＴＫプロモーターは、ＨＳＶ－Ｍ１と称され、配列番号１６の核酸配列を有し得る。代替的に、切断型ＨＳＶ－ＴＫプロモーターは、反転した構成でＣＣＡＡＴボックスおよび残存する唯一のＳｐ１結合部位を含むエレメントを含んでもよく、これにより、例えば、本明細書においてＨＳＶ－Ｍ３と呼ばれ、配列番号１７の核酸配列を有し得るプロモーターコンストラクトが得られる。本発明者らは、驚くべきことに、ＴＡＴＡボックスおよび遠位Ｓｐ１結合部位のみを含み、近位Ｓｐ１結合部位およびＣＣＡＡＴボックスを欠いている切断型ＨＳＶ－ＴＫプロモーターが、依然としてＲｅｐタンパク質発現を駆動するのに十分であったことを見出した。したがって、さらに別の実施形態では、ＨＳＶ－ＴＫプロモーターの第１の近位Ｓｐ１結合部位に加えて、ＣＣＡＡＴボックスも欠失させることで、残存する遠位Ｓｐ１結合部位をＴＡＴＡボックスの近位に寄せてもよい。得られるプロモーターコンストラクトは、本明細書ではＨＳＶ－Ｍ２と称され、配列番号１８の核酸配列を有し得る。前述のように、残存する唯一のＳｐ－１結合部位を反転させて、例えば、本発明においてＨＳＶ－Ｍ４と称され、配列番号１９の核酸配列を有し得るプロモーターコンストラクトをもたらすこともできる。さほど好ましくない実施形態において、異種プロモーターは、遠位Ｓｐ１結合部位およびＣＣＡＡＴボックスを含む５’領域を欠いており、故に近位Ｓｐ１結合部位のみを含むＨＳＶ－ＴＫプロモーター変異体でもよい。このようなＨＳＶ－ＴＫ変異体は、本明細書ではＨＳＶ－５９と称され、配列番号２０の核酸配列を有し得る。

【0052】

言及された機能的エレメントを有し、配列番号１６、１７、１８、１９または２０のいずれかに対する少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する、切断型ＨＳＶ－ＴＫプロモーターのいずれかの変異体を使用してもよい。

【0053】

別の好ましい実施形態において、ｒｅｐ－ＡｄＶの異種プロモーターは、少なくとも１つのＴＡＴＡボックスと、少なくとも１つのＳＰ１結合部位とを含み、ＳＶ４０プロモーターである。以下の実施例において示されるように、本発明者らは、ＳＶ４０プロモーターの制御下における切断型の大小のＲｅｐタンパク質の発現が、ＨＳＶ－ＴＫプロモーターの制御下におけるＲｅｐタンパク質発現と比較して同様であるか、またはさらに高いことを予想外に見出した。ＳＶ４０プロモーターの活性は、ＨＳＶ－ＴＫプロモーターの活性と同様に、主に細胞転写因子Ｓｐ１の結合部位によって調節され、ＴＡＴＡボックス以外に他の転写因子は必要ないと思われる。ＳＶ４０プロモーターは、配列番号２１の核酸配列を有し得る。ＳＶ４０プロモーターは、配列番号２１に対する少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を持つ核酸配列を有するＳＶ４０プロモーターの変異体でもよい。ＳＶ４０プロモーター変異体は、配列番号２１に対する７０％未満の配列同一性、例えば、配列番号２１に対する６５％未満、６０％未満、５５％未満、５０％未満、４５％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、または２５％未満の配列同一性を有する核酸配列を有してもよい。

【0054】

上記のように、Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ５２の両タンパク質が、アデノウイルス複製をトランスで阻害することが以前に示されている。理論に拘束されるものではないが、この阻害は、ＡＡＶ－２イントロンによってコードされるＲｅｐ７８およびＲｅｐ５２のカルボキシ末端（Ｃ末端）部における特定のアミノ酸によって媒介されると考えられている。特に、ＡＡＶ－２イントロンは、Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ５２の両タンパク質の最もＣ末端側の９２アミノ酸をコードする。これらの、Ｃ末端側の、イントロンによってコードされる９２アミノ酸は、Ｒｅｐ７８のアミノ酸５３０から６２１に対応する。特筆すべきことに、Ｒｅｐ７８／Ｒｅｐ５２の両方の終止コドンも前記イントロン内に位置する。これに対し、Ｒｅｐ ｍＲＮＡの選択的スプライシングから生じるＲｅｐ６８およびＲｅｐ４０タンパク質は、イントロンによってコードされるこれらのアミノ酸を欠いているが、その代わり、スプライスアクセプター部位の直ぐ下流に位置する一続きのヌクレオチドによってコードされる７つの追加のアミノ酸をＣ末端に含む。これら７つのＲｅｐ６８／Ｒｅｐ４０特異的Ｃ末端アミノ酸は、したがって、Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ５２には存在しない。これは、他のＡＡＶ血清型、例えば、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、またはＡＡＶ－１２のうちのいくつかに関して、対応する様式で当てはまる。

【0055】

Ｒｅｐ７８／Ｒｅｐ５２のＣ末端側のイントロンによってコードされる９２個のアミノ酸のうちの少なくともいくつかは、アデノウイルス複製のために通常必要とされるキナーゼであるｃＡＭＰ依存性タンパク質キナーゼＡ（ＰＫＡ）との直接的な相互作用を媒介することが以前に見出されている。Ｒｅｐ７８／Ｒｅｐ５２のＣ末端とＰＫＡとの間の相互作用は、ＰＫＡ活性を阻害し、ひいてはアデノウイルス複製に干渉すると思われる。Ｒｅｐ７８／Ｒｅｐ５２とＰＫＡとの相互作用は、Ｒｅｐ７８のアミノ酸５２６から６２１にマッピングされた（Schmidt, JVirol 2002）。実際、特定のＲｅｐ７８アミノ酸５３３、５３６、５３９および５４０の交換は、Ｒｅｐ７８／Ｒｅｐ５２とＰＫＡとの相互作用を妨害することで、アデノウイルス複製の阻害を無効にするために十分であるように思われる（diPasquale, EMBO J 2003）。

【0056】

したがって、ＨＳＶ－ＴＫプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、または内因性ＡＡＶ－２ ｐ５プロモーターなどの構成的活性プロモーターからのＲｅｐタンパク質の発現は、好ましくは、Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ５２のＣ末端部をコードするＡＡＶイントロン配列の欠失を伴う。例えば、組換え型アデノウイルスｒｅｐベクターにおけるＲｅｐ ＯＲＦは、Ｒｅｐ７８および／またはＲｅｐ５２の９２個のＣ末端アミノ酸のすべてを欠失させるように終止し得る。欠失は、Ｒｅｐ７８／Ｒｅｐ５２の９２個未満のＣ末端アミノ酸を包含してもよい。例えば、Ｒｅｐ ＯＲＦは、以下の実施例に記載されるように、Ｒｅｐ７８／Ｒｅｐ５２のイントロンによってコードされるＣ末端アミノ酸のうちの９１個のみを欠失させるように終止し得る。他の実施形態では、イントロンによってコードされる、９０個未満、８５個未満、８０個未満、７５個未満、７０個未満、６５個未満、６０個未満、５５個未満、５０個未満、４０個未満、３０個未満、２０個未満、１０個未満、またはさらには５未満のアミノ酸が、切断型Ｒｅｐ７８／Ｒｅｐ５２タンパク質において欠失している。いくつかの実施形態では、Ｒｅｐ７８／Ｒｅｐ５２タンパク質とＰＫＡとの間の相互作用を媒介するのに必要であることが分かっている、例えばＲｅｐ７８のアミノ酸５３３、５３６、５３９および／または５４０などの、Ｃ末端内の選択されたアミノ酸のみを欠失させれば十分であり得る。これらの選択されたアミノ酸は、Ｒｅｐタンパク質とＰＫＡとの相互作用を無効にするために、置換されてもよい、すなわち他のアミノ酸と交換されてもよい。

【0057】

好ましい実施形態において、Ｒｅｐ７８／Ｒｅｐ５２タンパク質における、イントロンによってコードされるアミノ酸の欠失は、停止コドンを好ましくは配列番号１のヌクレオチド位置１９１１で導入することにより、スプライスドナー部位のほぼ直後で開始する。前記停止コドンの挿入は、アミノ酸５３１において終止するＲｅｐ ＯＲＦをもたらし、したがって、切断された大型Ｒｅｐタンパク質および切断された小型Ｒｅｐタンパク質の発現をもたらす。実際、以下の実施例に記載されるように、このように切断されたＲｅｐタンパク質をＨＳＶ－ＴＫプロモーターの制御下で発現させた場合、数ラウンドの増幅にわたり最高３×１０^１１ＧＰ／ｍＬの高力価におけるｒｅｐ－ＡｄＶの予想外に安定な複製が可能であった。しかし、本明細書に記載されるＲｅｐタンパク質のＣ末端部の欠失に関連する利点は、Ｒｅｐ ＯＲＦがＨＳＶ－ＴＫプロモーターまたはＳＶ４０プロモーターなどの構成的活性プロモーターに連結されている実施形態に必ずしも限定されない。むしろ、Ｒｅｐ発現を駆動するために使用されるプロモーターとは無関係の、本明細書に記載される切断型Ｒｅｐタンパク質を発現させることが有利である場合がある。したがって、好ましい実施形態において、組換え型アデノウイルスｒｅｐベクターにおけるＲｅｐ ＯＲＦは、配列番号１のヌクレオチド位置１９１１に停止コドンを導入することにより、アミノ酸５３１において終止する。Ｒｅｐ ＯＲＦを切断することは、ＲＩＳ－Ａｄの再コードを不必要にするわけではないことを理解されたい。そうではなく、ｒｅｐ－ＡｄＶ複製を特に高い程度まで安定化させると考えられるのは、ＲＩＳ－Ａｄの再コードおよびＲｅｐ ＯＲＦの切断の組み合わせである。したがって、ＲＩＳ－Ａｄの再コードは、依然として、ｓＲｅｐ（配列番号４）に対応する核酸配列を得るために、例えば切断型Ｒｅｐ ＯＲＦの配列番号１のヌクレオチド位置１７８２において開始し得る。切断型Ｒｅｐ ＯＲＦのＲＩＳ－Ａｄは、本明細書に記載されるように部分的に再コードされてもよい。いずれにせよ、配列番号１のｎｔ位置１９１１において停止コドンが挿入されるため、再コードは、配列番号１のヌクレオチド位置１９１０において終了するのが好ましい。

【0058】

ＲＩＳ－Ａｄの再コードおよび配列番号１のｎｔ位置１９１１におけるＲｅｐ ＯＲＦの切断により、本明細書においてＲｅｐ１／５３０と呼ばれ、好ましくは配列番号５によるＡＡＶ－２ Ｒｅｐ７８アミノ酸１～５３０からなるアミノ酸配列を有する大型Ｒｅｐタンパク質と、本明細書においてＲｅｐ２２５／５３０と呼ばれ、好ましくは配列番号５によるＡＡＶ－２ Ｒｅｐ７８アミノ酸２２５～５３０からなるアミノ酸配列を有する小型Ｒｅｐタンパク質とを発現することが可能である、ｒｅｐ－ＡｄＶがもたらされる。

【0059】

発現がＨＳＶ－ＴＫプロモーターまたはＳＶ４０プロモーターなどの異種プロモーターの制御下にあることが好ましいＲｅｐ１／５３０とは異なり、Ｒｅｐ２２５／５３０タンパク質の発現は、その生理学的なｐ１９プロモーターの制御下に留まることが好ましい。ｐ１９プロモーターはＲｅｐ７８／Ｒｅｐ６８ ＯＲＦ内に位置するため、それを異種プロモーターで置き換えると、Ｒｅｐ１／５３０発現の望まれない妨害をもたらすことになる。

【0060】

本発明の方法において使用され得る好適な第一世代ｒＡｄＶは、当業者によって調製され得る。例示的なｒｅｐ－ｒＡｄＶは、配列番号７の核酸配列を含む。ｒｅｐ－ｒＡｄＶは、配列番号７に対する少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含んでもよい。これは、配列番号７からなってもよい。代替的に、本発明に係る第１のＡｄＶは、配列番号７におけるものとは異なるプロモーター領域、例えば、本明細書において教示される別の好適なプロモーターを含んでもよい。

【0061】

細胞を感染させるために使用される、本明細書においてｃａｐベクターまたはｃａｐ－ｒＡｄＶと呼ばれる第２のアデノウイルスベクターは、野生型ｐ４０プロモーターではないプロモーターに作動可能に連結されたＡＡＶ ｃａｐ遺伝子を含む発現カセットを含む。

【0062】

ｃａｐ－ｒＡｄＶによって提供されるＡＡＶ ｃａｐ遺伝子は、正二十面体ＡＡＶカプシドへとアセンブルされる構造タンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３をコードする。本発明において、カプシドとは、ウイルスゲノムを取り囲むウイルスのタンパク質シェルを指す。カプシドは通常、プロトマーとして知られる反復構造サブユニットからなり、それらの幾何学的構造に従って分類され得る。

【0063】

ｃａｐ－ｒＡｄＶによって提供されるｃａｐ遺伝子によってコードされるカプシドタンパク質は、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ－２のカプシドタンパク質であり得、すなわち、パッケージング細胞においてｃａｐ遺伝子が発現すると形成されるカプシドは、ＡＡＶ－２カプシドであり得る。ウイルスの「血清型」は、表面抗原に基づいて、すなわち、ＡＡＶの場合にはそれらの血清型特異的ウイルスカプシドに基づいて、ひとつに分類される単一のウイルス種内のバリエーションである。

【0064】

現在、１２を超える異なるＡＡＶ血清型、および１００を超える天然に発生するカプシド変異体が知られている。血清型ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６およびＡＡＶ－９はヒトから初めて単離され、血清型ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１およびＡＡＶ－１２はサルから導出され、血清型ＡＡＶ－１はヒトおよびサルの両方から単離された。別個のＡＡＶ血清型は、それらの組織親和性において実質的に異なり得、すなわち、別個の細胞型および組織をターゲティングし、それらに感染し得る。例えば、血清型ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５およびＡＡＶ－８は、網膜の細胞に形質導入するのに特に好適であるが、血清型ＡＡＶ－６およびＡＡＶ－７は、骨格筋細胞に形質導入するために使用され得る。ＡＡＶ血清型９のカプシドは、ＡＡＶが血液脳関門（ＢＢＢ）を回避することを可能にし、したがって、全身投与による中枢神経系（ＣＮＶ）の形質導入のための主要なカプシドである（Wang et al., 2019, Nat Rev Drug Discov.）。

【0065】

したがって、ｃａｐ－ｒＡｄＶによって提供されるｃａｐ遺伝子は、任意の既知のＡＡＶ血清型または任意の既知のカプシド変異体の構造カプシドタンパク質をコードすることができる。特に、ＡＡＶ血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９およびｒｈ１０のいずれのカプシドタンパク質もコードすることができ、ここで、構造タンパク質は、好ましくは、ＡＡＶ血清型１、２、５、６、８および９のものである。これにより、特定の細胞型または目的の組織への形質導入のために特に好適である、いわゆる偽型ｒＡＡＶ－２ベクターの生産が可能になる。当業者には、最終的に偽型ＡＡＶ－２ベクターを得るためにＡＡＶ－２ゲノムを修飾する方法が分かるであろう。例えば、スプライスアクセプター部位の機能にとって重要なピリミジンリッチ領域内に位置するＡＡＶ－２イントロンの５’部を、それぞれの他のＡＡＶ血清型のイントロンの３’部および後続の血清型特異的カプシドリーディングフレームと融合してもよい。重要なことに、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の３’部に局在するカプシド発現の調節配列によるアデノウイルス複製の阻害は、血清型２特異的現象ではなく、他のＡＡＶ血清型の対応するゲノム領域についても当てはまる。したがって、代替的なＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質を、生理学的なもの以外のプロモーターの制御下に置くことも必要である。

【0066】

別の実施形態において、ｃａｐ遺伝子は、生産されるＡＡＶのターゲティング特異性を向上させるように特異的に修飾されているＡＡＶカプシドをコードし得る。例えば、ｃａｐ遺伝子は、例えば、特定の細胞受容体が結合できるカプシド表面上のペプチド配列を発現するように、遺伝子修飾され得る。そのような修飾の一例は、例えば、Girod et al.[1999, Nature Medicine 5(9)]に見出すことができる。代替的に、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）などのペプチド配列を、例えば、ＶＰ２タンパク質に融合して、細胞表面マーカーの抗体様認識をもたらすこともできる（Wang et al., 2019）。現在の技術水準を考慮すれば、当業者は、ＡＡＶの親和性を改変するためまたは細胞特異的ベクターターゲティングを向上させるためにＡＡＶカプシドを修飾するための多数の追加の手段を案出することができるであろう。ｃａｐ遺伝子は、ＡＡＶ血清型２、６、８および９からのフラグメントを含むＳＣＨ９変異体のように、コンピュータ支援事前選択の有無を問わず、指向性進化手法から導出することもできる（Ojala, Molecular Therapy 26, 304-319, 2018）。

【0067】

ｃａｐ－ＡｄＶによってコードされるｃａｐ遺伝子は、ＡＡＶカプシドの安定性を増加させ、かつ／またはｒＡＡＶベクターの親和性を変化させるのに有効な、少なくとも１つの点突然変異を含み得る。例えば、ＡＡＶ－２ ＶＰ３タンパク質の表面露出チロシン残基Ｙ２５２、Ｙ２７２、Ｙ４４４、Ｙ５００、Ｙ７００、Ｙ７０４、およびＹ７３０の部位特異的突然変異誘発は、ＡＡＶカプシドをプロテアソーム分解から保護し得る（Zhong et al., 2008, Proc. Natl. Acad. Sci 105）。Wu et al.[2006, J. Virol. 80(22)]による研究は、ＡＡＶ－６による実質細胞の優先的形質導入には、５３１位におけるリジン残基が必要であることを実証した。ＡＡＶ－２のＴ２５１、Ｔ５０３部位、またはＡＡＶ－８カプシドのＫ１３７部位における単一点突然変異は、ＡＡＶ－２およびＡＡＶ－８の形質導入効率を劇的に高め得る［Gabriel et al., 2013, Hum Gene Ther Methods 24(2)、Sen et al., 2013, Hum Gene Ther Methods 24(2)］。ヘパリン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）に対するＡＡＶ血清型２カプシドの天然の親和性は、ベクターを他の受容体に対してさらに特異的にターゲティングするように、アルギニン残基５８５および５８８の点突然変異によって除去され得る［Sullivan et al. Gene Therapy 25(3), 205.219, 2018］。したがって、点突然変異は、好ましくは、配列番号１４のＹ４４４Ｆ、Ｙ７３０Ｆ、Ｔ２５１Ａ、またはＲ５８５Ａ／Ｒ５８８Ａなどの突然変異であり得る。

【0068】

上述のように、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子は通常、Ｒｅｐ ＯＲＦの３’領域内に位置するその生理学的なｐ４０プロモーターから転写されるが、これは、アデノウイルスベクターゲノムの複製に干渉する。この問題を克服するためには、本明細書に記載されるように、ｒｅｐ遺伝子の３’領域内のＲＩＳ－Ａｄが再コードされる必要がある。しかし、再コードは、ｐ４０プロモーターの活性を低減させるか、または完全に消失させるため、ｒｅｐおよびｃａｐの両遺伝子が同じＡｄＶにおいてデリバーされる場合、Ｃａｐタンパク質の発現が妨げられる。したがって、本発明者らは、第１の方策として、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を分割し、それらを２つの別々のＡｄＶから提供することにした。

【0069】

野生型ｐ４０プロモーターはＲＩＳ－Ａｄの主要なエレメントを構成するため、ＡＡＶ Ｃａｐタンパク質を発現するｒＡｄＶの生成のためにこれを使用することはできない。したがって、第２の方策として、野生型ｐ４０プロモーターではないプロモーターの制御下でｃａｐ遺伝子を発現させる必要がある。

【0070】

一実施形態において、ｃａｐ遺伝子に作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｋｅｄ）プロモーターは、本明細書に記載されるような再コードされたｐ４０プロモーターであり得る。したがってこれは、その核酸配列において上述のｓＲｅｐ領域の各エリアに対応するｐ４０プロモーターであり得る。したがって、再コードされたｐ４０プロモーターは、配列番号８に対する、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を有し得る。いくつかの実施形態において、再コードされたｐ４０プロモーターは、配列番号８に対する１００％の配列同一性を有する核酸配列を有してもよい。いくつかの実施形態において、再コードされたｐ４０プロモーターは、上述のように、その核酸配列において、配列番号１のｎｔ１８５１～１８５６に対応するｐ４０転写開始部位と、適宜、配列番号１のヌクレオチド１７８１～１７９７に対応するＧＧＴモチーフを包含するｐ４０領域とを除いて、野生型ｐ４０プロモーターに対応し得、かつ、配列番号９の核酸配列を有し得る。

【0071】

別の実施形態において、ｃａｐ－ＡｄＶによって提供されるｃａｐ遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターは、異種プロモーターである。ｃａｐ－ｒＡｄＶの異種プロモーターは、ウイルスベクターにおける導入遺伝子の発現に好適ないかなる異種プロモーターでもよい。これは例えば、ＣＭＶプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＣＢＡプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＨＩＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＨＳＶ－ＴＫプロモーター、第１のアデノウイルスサブタイプ５イントロンありまたはなしのＭＬＰ、ヒトβ－アクチンプロモーター、ヒト伸長因子１αプロモーター、ＥＦ１ａ遺伝子プロモーター、ＰＧＫ１遺伝子プロモーター、ＵＢＣ遺伝子プロモーター、およびヒトベータアクチン遺伝子プロモーターなどの構成的活性プロモーターであり得る。これはまた、上述のような誘導性プロモーター、例えばテトラサイクリン誘導性プロモーター、Ｃｕｍａｔｅ誘導性プロモーター、電気感応性プロモーターおよびオプトジェネティクススイッチなどでもよい。しかし、好ましい実施形態において、ｃａｐ－ｒＡｄＶの異種プロモーターは、本明細書に記載されるように、少なくとも１つのＴＡＴＡボックスと、少なくとも１つのＳＰ１結合部位とを含み、少なくとも１つのＣＣＡＡＴボックスおよび少なくとも１つのＣＴＦ結合部位を含んでいてもよいプロモーターである。

【0072】

特に好ましい実施形態において、プロモーターは、ＨＳＶ－ＴＫプロモーター、または本明細書に記載されるその変異体のいずれかである。

【0073】

別の好ましい実施形態において、プロモーターは、ＳＶ４０プロモーター、または本明細書に記載されるその変異体のいずれかである。

【0074】

本発明の方法において使用できる例示的なｃａｐ－ｒＡｄＶは、配列番号１０の核酸配列を含む。ｃａｐ－ｒＡｄＶは、配列番号１０に対する少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含んでもよい。これは、配列番号１０からなってもよい。代替的に、本発明に係るｃａｐ－ｒＡｄＶは、配列番号１０におけるものとは異なるプロモーター領域、例えば、本明細書において教示される別の好適なプロモーターを含んでもよい。

【0075】

好ましくは、ｒｅｐ－ｒＡｄＶおよびｃａｐ－ｒＡｄＶの両方が、各々１００～２０００ゲノム粒子（ＧＰ）／細胞のＭＯＩ、例えば、各々１００～５００、５００～１０００、１０００～１５００、または１５００～２０００ＧＰ／細胞のＭＯＩにおいて、細胞に投与される。好ましくは、２つのＡｄＶは、各々、１５０～１０００ＧＰ／細胞のＭＯＩにおいて、より好ましくは１７５～７５０ＧＰ／細胞のＭＯＩにおいて、最も好ましくは２００～４００ＧＰ／細胞のＭＯＩにおいて投与される。ＭＯＩ（感染多重度）は、ウイルス粒子の、それらの感染ターゲット、すなわち感染させられるターゲット細胞に対する比率を表す。したがって、ｒＡｄＶを２００ＧＰ／細胞のＭＯＩで投与することは、単一のターゲット細胞に２００個のｒＡｄＶ粒子が接種されることを意味する。ＭＯＩは、所定の細胞に最終的に侵入するウイルスの数に関して間接的な結論を導き出すことを可能にする。ポアソン分布を使用することで、所定の細胞集団について、特定のＭＯＩで接種を行ったときに細胞が特定の量のウイルス粒子を吸収する確率を計算することができる。ＭＯＩが増加するにつれて、少なくとも１つのウイルス粒子に感染する細胞のパーセンテージも増加する（https://en.wikipedia.org/wiki/Multiplicity_of_infection）。

【0076】

さらに、ｒｅｐ－ｒＡｄＶおよびｃａｐ－ｒＡｄＶは、好ましくは、１：２から２：１の比、より好ましくは１：１の比で細胞に投与される。

【0077】

細胞には、プロモーターに作動可能に連結された導入遺伝子を含む発現カセットを含む導入遺伝子ベクターがさらに提供され、この発現カセットは、ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）によってフランキングされている。

【0078】

導入遺伝子ベクターは、好ましくは、ｒｅｐ－ｒＡｄＶおよびｃａｐ－ｒＡｄＶと併せて細胞に提供されるスターター組換え型ＡＡＶベクターである。しかし、他の実施形態において、導入遺伝子ベクターは、プラスミドまたは第３の組換え型アデノウイルスベクターでもよい。

【0079】

本発明において、導入遺伝子ベクターを「提供する」という用語は、カーゴ導入遺伝子を含む発現カセットが、ターゲットのパッケージング細胞によってウイルスベクター粒子中にパッケージングされ得るように、前記細胞中に導入遺伝子ベクターをデリバーする方法を指す。導入遺伝子ベクターの「提供」の具体的な方法は、ベクターの厳密な性質に依存する。導入遺伝子ベクターがスターターＡＡＶベクターまたはアデノウイルスベクターなどのウイルスベクターである場合、導入遺伝子ベクターは、細胞の感染によって前記細胞に提供される。感染の間、導入遺伝子を含む発現カセットは、形質導入として知られるプロセスによって細胞に導入される。したがって、本発明の方法が導入遺伝子デリバリーのためにウイルスベクターを使用する場合、本方法は完全に感染に基づくものである。

【0080】

導入遺伝子ベクターがプラスミドである場合、これは、好ましくは、現在の技術水準から公知である好適なトランスフェクション方法によって、例えば、電気穿孔、微量注射、遺伝子銃の使用、インペールフェクション（ｉｍｐａｌｅｆｅｃｔｉｏｎ）、静水圧、連続注入、超音波処理、リポフェクション、Ｆｕｇｅｎｅなどの非リポソーム試薬、または好ましくは、リン酸カルシウム沈降ベースのトランスフェクションによって、細胞に提供される。

【0081】

本発明において、「導入遺伝子」、「治療用遺伝子」または「カーゴ配列」という用語は同義に使用され、それ自体で有効な核酸配列（例えば、調節性ＲＮＡ）、または治療用ポリペプチドもしくはタンパク質をコードする核酸配列のいずれかを指し、これらは各々、プロモーターまたは転写後調節エレメント（例えばポリアデニル化配列）など、発現に必要なすべての制御エレメントを含む。導入遺伝子の選択は、生産されるｒＡＡＶの意図される用途に依存する。導入遺伝子がポリペプチドまたはタンパク質をコードする核酸配列である場合、導入遺伝子は、目的の遺伝子から転写されるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）からの逆転写によって生成され、かつ目的の遺伝子に通常存在するイントロンを欠いている、相補性ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）であることが好ましい。代替的に、導入遺伝子は、その長さが最終的なｒＡＡＶベクターのパッケージング限界を超えないことを条件として、イントロンを含み、調節性領域を含んでいてもよい、完全な目的の遺伝子であってもよい。導入遺伝子は、代替的に、合成的にエンジニアリングされてもよい。これは例えば、ターゲット細胞における目的の遺伝子の効率的な発現を確実にするためにコドン最適化されていてもよく、例えば、ヒト細胞における発現のためにコドン最適化されていてもよい。カーゴ配列は、適宜、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、すなわち、５’キャップ構造の非存在下でｍＲＮＡ翻訳を媒介し、単一のプロモーターの制御下で複数の遺伝子の共発現を可能にするＲＮＡエレメントをさらに含んでいてもよい。

【0082】

代替的な実施形態において、カーゴ配列は、マイクロＲＮＡ、低分子ヘアピンＲＮＡ、シングルガイドＲＮＡ、および長鎖ノンコーディングＲＮＡを含む群から選択される調節性ＲＮＡへと転写され得る。

【0083】

導入遺伝子発現カセットのプロモーターは、好ましくは、ＣＭＶプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＣＢＡプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＨＩＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＨＳＶ－ＴＫプロモーター、ヒトβ－アクチンプロモーター、ヒト伸長因子１αプロモーター、ＥＦ１ａ遺伝子プロモーター、ＰＧＫ１遺伝子プロモーター、およびＵＢＣ遺伝子プロモーターなどの構成的活性プロモーターか、第１のアデノウイルスサブタイプ５イントロンありもしくはなしのＭＬＰか、ＴＥＴ誘導性プロモーター、Ｃｕｍａｔｅ誘導性プロモーター、電気感応性プロモーター、およびオプトジェネティクススイッチを含む群から選択される誘導性プロモーターか、または組織特異的プロモーターである。

【0084】

導入遺伝子発現を制御するプロモーターは、代替的に、ＡＡＶ特異的プロモーターでもよい。これは例えば、ＡＡＶ－２ ｐ５、ｐ１９またはｐ４０プロモーターであり得る。

【0085】

いくつかの実施形態において、導入遺伝子ベクター中の発現カセットは、導入遺伝子発現を増進することが可能なプロモーター以外に追加の調節エレメントをさらに含み得る。例えば、遺伝子発現を強力に刺激する多くのＤＮＡエレメントが転写配列の最初の１キロベースにおけるイントロン内に位置することを示唆する証拠が増加している。したがって、導入遺伝子は、例えば、導入遺伝子発現を増進することが可能な追加のイントロンを含み得る。導入遺伝子ベクターは、適宜、ウッドチャック肝炎転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）をさらに含んでいてもよい。ＷＰＲＥ ＲＮＡ配列は、ＤＮＡから転写されると発現を増進する三次構造を作り出す。この配列は、ウイルスベクターによってデリバーされる遺伝子の発現を増加させるために、分子生物学において一般的に使用されている。導入遺伝子はさらに、コドン最適化されているのが好ましく、すなわち、導入遺伝子における特定のコドンが、遺伝子の発現を向上させるためにヒトなどの生物によって好ましく使用される同義コドンによって置換されていてもよい。コドン最適化は、好ましくないＧＣ含有量、クリプティックスプライス部位、転写終止シグナル、ＲＮＡ安定性に影響するモチーフ、および／または導入遺伝子に通常存在し得る核酸二次構造の影響を克服するのに役立ち得る。

【0086】

導入遺伝子ベクターの発現カセットをフランキングする末端のＡＡＶ ＩＴＲは、核酸レベルにおいて（シスで）、ゲノム複製、および複製されたＡＡＶゲノムのパッケージングのために必要である。好ましくは、ＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ－２血清型に由来する。代替的な実施形態において、ＡＡＶ ＩＴＲは、血清型２以外のＡＡＶ血清型に由来してもよい。

【0087】

上述のように、導入遺伝子ベクターは、好ましくは「スターターｒＡＡＶベクター」である。スターターｒＡＡＶは、ｒＡＡＶ生産を開始するために使用されるウイルスｒＡＡＶベクターである。これは、臨床研究または遺伝子療法において最終的に使用されるｒＡＡＶベクターと同一である。スターターｒＡＡＶベクターは、比較的少量で事前に生産され、その後、前臨床および臨床用途のために十分に高いベクター力価を得るために、数ラウンドにわたり本発明の方法によって増幅される。本発明者らは、本発明の方法を使用すると、スターターｒＡＡＶを最大で１０００倍～１５００倍に増幅できることを見出した。スターターｒＡＡＶベクターは、当業者に知られているいずれかのｒＡＡＶベクター生産方法によって元々取得されたものであり得る。例えば、スターターｒＡＡＶベクターは、例えば、上述のような、ベクタープラスミドおよび１つまたは複数のヘルパープラスミドの混合物を用いた、パッケージング細胞の従来のコトランスフェクションによって取得可能であり得る。代替的に、スターターｒＡＡＶベクターは、例えば、ＡＡＶ－ＩＴＲによってフランキングされた目的の導入遺伝子カセットならびにＡＡＶ ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質をコードするバキュロウイルスに昆虫細胞を感染させることなどによる、感染ベースの生産方法を介して取得可能であり得る。スターターｒＡＡＶベクターは、本発明の方法によって取得することもでき、すなわち、本明細書で開示される方法によって取得されたｒＡＡＶベクターは、後に行われるラウンドのｒＡＡＶベクター増幅のための新しいスターターｒＡＡＶベクターとして機能し得る。したがって、本発明の方法は、最終的なベクター収量が最大になるように、連続的なｒＡＡＶベクター増幅のために数ラウンドにわたって繰り返すことができる。スターターｒＡＡＶベクターは、１０～１５００ＧＰ／細胞の範囲内の比較的低いＭＯＩにおいて、例えば、１０～１００、１００～５００、５００～１２００ＧＰ／細胞のＭＯＩにおいて、または好ましくは、２０～５０ＧＰ／細胞もしくはそれ未満のＭＯＩにおいて、細胞に投与され得る。

【0088】

本発明の方法において導入遺伝子ベクターとして使用され得る導入遺伝子を欠いている例示的なスターターｒＡＡＶベクターは、配列番号１１の核酸配列を含む。スターターｒＡＡＶベクターは、配列番号１１に対する少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含んでもよい。代替的に、本発明に係るスターターｒＡＡＶベクターは、配列番号１１におけるものとは異なるプロモーター領域、例えば、本明細書において教示される別の好適なプロモーターを含んでもよい。

【0089】

別の実施形態において、導入遺伝子ベクターは、スターター組換え型アデノウイルスベクターであり得る。スターター組換え型アデノウイルスベクターとは、ｒＡＡＶ生産を開始するために使用される組換え型アデノウイルスベクターベクターである。したがって、スターター組換え型アデノウイルスベクターは、ｒｅｐ－ｒＡｄＶおよびｃａｐ－ｒＡｄＶと併せて感染細胞に投与される第３の組換え型アデノウイルスベクターである。導入遺伝子のサイズに応じて、導入遺伝子ＡｄＶは、第一世代、第二世代、または第三世代のＡｄＶであり得る。ｒｅｐ－ｒＡｄＶおよびｃａｐ－ＡｄＶのように、導入遺伝子ＡｄＶは、１００～５００、５００～１０００、１０００～１５００、または１５００～２０００ＧＰ／細胞のＭＯＩにおいて細胞に投与され得る。これは、好ましくは、１５０～１０００ＧＰ／細胞のＭＯＩにおいて、より好ましくは１７５～７５０ＧＰ／細胞のＭＯＩにおいて、最も好ましくは２００～４００ＧＰ／細胞のＭＯＩにおいて投与される。

【0090】

他の実施形態において、ＡＶＶ－ＩＴＲ導入遺伝子を含む発現カセットは、スターターＡＡＶでもＡｄＶでもないウイルスベクターによって提供されてもよい。例えば、ウイルス導入遺伝子ベクターは、レトロウイルスベクターに由来し得る。これは例えば、レンチウイルスベクターでもよい。

【0091】

導入遺伝子ベクターは、スタータートランスフェクションプラスミド、すなわち、ｒＡＡＶ生産を開始するために使用されるプラスミドでもよい。プラスミドは、分子クローニングにおいてベクターとして広く使用されている、比較的小さい環状ＤＮＡ分子である。導入遺伝子ベクターがプラスミドである場合、前記プラスミドは、細菌または酵母のいずれかに由来するプラスミドであり得る。当業者であれば、導入遺伝子デリバリーのために好適なプラスミドを特定するために、現在の技術水準から公知である様々なプラスミドのタイプから選択することができるであろう。ＡＡＶベクター生産のための好適な導入遺伝子プラスミドは、例えば、以下の実施例に記載されるような、ｐＴＲ－ＵＦ５プラスミドである。

【0092】

本発明の方法が空のウイルス様粒子ではなくＡＡＶベクターを生産するためのものである場合、導入遺伝子ベクターは、好ましくはスターターｒＡＡＶベクターである。本発明者らは、プラスミドベクターまたは第３のｒＡｄＶを介した導入遺伝子の提供が、より高レベルの空カプシドをもたらしたことを見出した。いくつかの報告は、空カプシドが、ＡＡＶベクターに対して免疫系によって生産された抗体のためのデコイとして機能する可能性があり、したがって、共投与された導入遺伝子搭載ｒＡＡＶ粒子が抗体によって捕捉されることを防ぐのに役立ち得ることを示唆している。しかし、高い割合の空ＡＡＶカプシドがＡＡＶベクター生産中に取得されるのは、通常はあまり望ましくない。空カプシドはさらに、ＡＡＶベクターに対する望まれない免疫応答を刺激する故に、所定の遺伝子療法の成功の確率を低減させる可能性がある。

【0093】

本明細書に記載されるように、ｒｅｐ－ｒＡｄＶおよびｃａｐ－ｒＡｄＶに感染させられ、導入遺伝子ベクターが提供される細胞は、ｒＡＡＶベクターアセンブリーのためのパッケージング細胞として機能する。この細胞は、好ましくは、例えば、ヒト胎児腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、またはＨｅＬａ細胞などのヒト細胞株の細胞である。好ましくは、この細胞は、ＨＥＫ２９３細胞またはＨＥＫ２９３Ｔ細胞であり、最も好ましくはＨＥＫ２９３細胞である。この細胞は、接着細胞でもよく、すなわち、成長のために表面または人工基質を必要とし得る。しかし、本発明に係る生産方法は、自由浮遊細胞、すなわち懸濁細胞におけるベクター生産に容易に適合することができ、それ故、より大規模なＡＡＶベクター生産が可能である。したがって、パッケージング細胞として使用される細胞は、好ましくは、好適な培地、例えばＧｉｂｃｏ（登録商標）ＣＤ ２９３ Ｍｅｄｉｕｍ、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ、またはＥｘｐｉ２９３（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（すべてＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃによる）などの無血清培地に存在する、懸濁下の細胞である。したがって、この細胞は、例えば、Ｇｉｂｃｏ（登録商標）２９３－Ｆ細胞、好ましくはＧｉｂｃｏ（登録商標）ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３－Ｆ細胞、またはＧｉｂｃｏ（登録商標）Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞であり得る。懸濁細胞は、ｒｅｐ－ＡｄＶと、ｃａｐ－ＡｄＶと、適宜、導入遺伝子ｒＡｄＶとに、それぞれ約１００～２０００ＧＰ／細胞のＭＯＩ、例えば、それぞれ１００～５００、５００～１０００、１０００～１５００、または１５００～２０００ＧＰ／細胞のＭＯＩで感染させてもよい。導入遺伝子ベクターがスターターｒＡＡＶである場合、これは、１０～１５００ＧＰ／細胞のＭＯＩにおいて、例えば、１０～１００、１００～５００、または５００～１２００ＧＰ／細胞のＭＯＩにおいて、懸濁細胞に投与され得る。懸濁細胞の感染は、２４～９６時間、例えば２４～３６時間、３６～４８時間、４８～６０時間、６０～７２時間、７２～８４時間、または８４～９６時間持続し得る。好ましくは、懸濁細胞の感染は、６４～９６時間持続する。

【0094】

ｒＡｄＶを介してｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子が提供されるため、アデノウイルスヘルパー機能を提供するために細胞をさらに遺伝子修飾する必要はない。

【0095】

導入遺伝子ベクターがウイルスベクターである場合、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を搭載した２つのｒＡｄＶならびに導入遺伝子ベクターは、重感染によって細胞に同時に投与され得る。代替的に、ウイルス導入遺伝子ベクターを最初に投与し、続いてｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を含む２つのｒＡｄＶの提供を行うなど、ベクターを順次投与してもよい。感染の順序は、特に重要ではないと考えられる。導入遺伝子ベクターがプラスミドである場合、細胞をまず２つのｒＡｄＶに感染させ、その後に導入遺伝子ベクタープラスミドをトランスフェクトしてもよく、またはその逆でもよい。

【0096】

パッケージング細胞を異なるＡｄＶに感染させ、導入遺伝子ベクターを提供した後、新しく生成されたウイルス粒子を回収する必要がある。ウイルス回収に適切な時点は、ウイルス侵入によって引き起こされるパッケージング細胞の構造変化によって特徴付けられる。これらの構造変化は、当業者によく知られている「細胞変性効果」という用語によってまとめられる。パッケージ細胞の感染／トランスフェクションと、生産されたＡＡＶベクター粒子またはＡＡＶウイルス様粒子の回収との間の時間は、数時間から数日、例えば、１２～９６時間、２４～７２時間、３６～６０時間、または４０～５０時間を要し得る。本発明者らは、ウイルス粒子が、通常、パッケージング細胞の感染／トランスフェクションから約６４～７２時間後に回収され得ることを見出した。

【0097】

本発明の方法の典型的に最終の工程として、新しく生産され回収されたｒＡＡＶベクターまたはＡＡＶウイルス様粒子は、当業者に知られている標準的な実験技術に従って精製される。ＡＡＶ粒子の精製は、例えば、以下の実施例に記載するようなＡＶＢセファロースを用いたＨＰＬＣアフィニティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー方法によって実現され得る。ｒＡＡＶベクターまたはウイルス様粒子はさらに、投与のために製剤および／またはパッケージングされてもよい。

【0098】

本発明によってさらに開示されるのは、本明細書に記載される組換え型アデノウイルスｃａｐベクターに細胞を感染させることを含む、空のＡＡＶウイルス様粒子（ＡＡＶ－ＶＬＰ）を生産することに特化した方法である。本発明者らは、ｃａｐ－ＡｄＶによるＨＥＫ２９３細胞単独の感染が、高レベルの空ＡＡＶカプシドを生産するのに十分であることを見出した。これらは、完全なｒＡＡＶベクターと同じように、アフィニティークロマトグラフィーによって高収量で精製され得る。ＡＡＶ－ＶＬＰは、既存の抗体のための結合ダミーとして働くため、例えば、ＡＡＶに対する既存のＢ細胞免疫応答を克服するのに使用され得る。ＡＡＶ－ＶＬＰの他の考えられる用途は、例えば、それらが様々なＡＡＶ血清型に対する抗体の特異的検出のための抗原として使用され得る、診断法におけるものである。

【0099】

最後に、本発明は、本発明の方法に従って組換え型アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを生産するためのキットまたは組成物であって、
ａ）プロモーターに作動可能に連結された導入遺伝子を含む発現カセットを含む導入遺伝子ベクターであって、発現カセットがＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）によってフランキングされている、導入遺伝子ベクター、
ｂ）プロモーターに作動可能に連結されたＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子を含む発現カセットを含む組換え型アデノウイルスｒｅｐベクター（ｒｅｐ－ｒＡｄＶ）であって、ｒｅｐ遺伝子がＲＩＳ－Ａｄを含まず、ｒｅｐベクターがＡＡＶ Ｃａｐタンパク質をコードしない、組換え型アデノウイルスｒｅｐベクター、および
ｃ）野生型ｐ４０プロモーターではないプロモーターに作動可能に連結されたＡＡＶ ｃａｐ遺伝子を含む発現カセットを含む組換え型アデノウイルスｃａｐベクター（ｃａｐ－ＡｄＶ）であって、前記ｃａｐベクターがＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質をコードしない、組換え型アデノウイルスｃａｐベクター
を含む、キットまたは組成物をさらに対象とする。

【0100】

導入遺伝子ベクターは、好ましくは、異種プロモーターに作動可能に連結された導入遺伝子を含む発現カセットを含むスターターｒＡＡＶベクターであり、この発現カセットは、ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）によってフランキングされている。

【0101】

キットは、３つの異なるウイルスベクターがひとつに混合される単一のコンパートメントを含み得る。代替的に、３つの異なるウイルスベクターは、キットの使用前または使用中にのみ混合される、最大３つの別個のコンパートメントに物理的に分離される。キットは２つのコンパートメントを含んでもよく、その場合、好ましくは、一方のコンパートメントがスターターｒＡＡＶベクターを含み、他方のコンパートメントが２つのＡｄＶを含む。キットの構成要素、すなわち３つの異なるウイルスベクターは、全く混合されなくてもよく、例えば、３つの別々の感染工程の間に好適なパッケージング細胞に別々に投与されてもよい。異なるベクターは、凍結中のウイルスベクターを安定化させるために、ＰＥＧ ６０００などの好適な貯蔵培地、またはグリセロールを含む溶液中に存在してもよい。キットまたは組成物は、２～６℃の温度で数日から数週間、例えば、１日から４週間、１日から３週間、１日から２週間、または１日から７日にわたって貯蔵され得る。好ましくは、キットまたは組成物は、２～６℃で２週間未満にわたって貯蔵され得る。長期貯蔵の場合、キットまたは組成物は、使用前に－８０℃で数週間から数か月の期間にわたって、例えば４週間から２４か月、２か月から２０か月、４か月から１６か月、８か月から１４か月、または約１２か月にわたって貯蔵され得る。いくつかの実施形態において、キットまたは組成物は、使用前に－８０℃でさらに長い期間にわたって、例えば３年間、４年間、５年間、６年間、７年間、８年間、９年間、またはさらには最長１０年間にわたって貯蔵され得る。

【0102】

本明細書で開示される、ＡＡＶベクター生産のための製造方法およびキットは、例えば、事前に生産された少量のｒＡＡＶを、単一の単純な重感染工程において最大で１０００倍～１５００倍に増幅させることを可能にする。最初に挿入された細胞当たりの収量は、新しく生産されたｒＡＡＶのアフィニティークロマティック（ｃｈｒｏｍａｔｉｃ）精製後に、２～４×１０^４ゲノムコピー／挿入細胞の範囲内である。さらに、他の感染ベースのｒＡＡＶパッケージング方法では絶対的に必要である、新しい導入遺伝子特異的なパッケージング細胞株またはヘルパーウイルスの長時間を要する生成は、必要とされない。単純な取り扱いおよび高いｒＡＡＶ収量のため、この新規生産システムは、例えば、研究室で既に特性解析されたｒＡＡＶベクターを動物モデルでの試験および臨床応用へと迅速に移すことを望むすべての使用者にとって、興味深いものとなるはずである。

【0103】

本発明の全体を通して、「約」という用語は、「±１０％」として理解されることを意図する。「約」が範囲に関連する場合、これは、その範囲の下限および上限の両方を指す。「ある（ａ）」は、別段明記されない限り、「１つまたは複数の」を意味することを意図する。

【0104】

本明細書で引用されるすべての文献は、これにより完全に援用される。本発明は、以下の実施例によってさらに説明されるが、それによって限定されるものではない。

【図面の簡単な説明】

【0105】

【図1】図１：アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の感染サイクル。アデノウイルスまたは単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）などのヘルパーウイルスの存在下での生産的感染と、ヘルパーウイルスの非存在下でのヒト１９番染色体上のＡＡＶ－Ｓ１部位への部分的に部位特異的な組み込みによる潜伏感染との二部からなる、細胞培養におけるＡＡＶ血清型２の感染サイクル。ＡＡＶ－２は、潜伏状態から、ヘルパーウイルスによる感染によってレスキューされ、生産的複製サイクルに再び入ることができる。

【図2】図２：ＡＡＶ血清型２のゲノム構成。囲み線によって示される、逆方向末端反復（ＩＴＲ）、４つのＲｅｐタンパク質Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、Ｒｅｐ４０、カプシドタンパク質ＶＰ１からＶＰ３、およびＡＡＰ（アセンブリー活性化タンパク質）を含むＡＡＶ－２のゲノム構成。対応する転写物は、矢印の付いた線によって示されている。右に向いた矢印は、マップユニット５、１９および４０における３つのＡＡＶ－２プロモーターの転写開始部位を表し、縦の矢印は、マップ位置９６におけるすべての転写物に共通するポリアデニル化（ポリＡ）部位を示す。

【図3】図３：組換え型ＡＡＶベクター（ｒＡＡＶ）の生産のための標準的な実験方法。ＡＡＶ－２ ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質ならびにアデノウイルス５型（Ａｄ５）Ｅ２ａ、Ｅ４ｏｒｆ６およびＶＡ－ＲＮＡ機能をコードするヘルパープラスミド（ｐＤＧプラスミドなど）と、ＡＡＶ－２ ＩＴＲによってフランキングされた導入遺伝子カセットを内包するベクタープラスミドとを用いる、ｒＡＡＶの生産のための標準的な２プラスミドコトランスフェクションシステム。追加で必要とされるＡｄ５ Ｅ１ａおよびＥ１ｂ機能は、ＨＥＫ２９３細胞によって提供される。

【図4】図４：偽型ＡＡＶベクターの生産のためのヘルパープラスミド。標準的なヘルパープラスミドにおけるＡＡＶ－２カプシド遺伝子の、ＡＡＶ－２血清型１、５、６、８および９のカプシド遺伝子への交換。これらの改変されたｃａｐ遺伝子、および対応するアセンブルされたカプシドは、異なるパターンの囲み線によって示されている。偽型ｒＡＡＶベクターの好ましいターゲット臓器が下に示されている。

【図5】図５：組換え型ＨＳＶ／ＡＡＶハイブリッドベクターを使用した組換え型ＡＡＶベクターの生産。ｒｅｐおよびｃａｐ機能を提供する組換え型ＨＳＶ（ｒＨＳＶ）ベクター（左側）ならびにＡＡＶ－ＩＴＲによってフランキングされた導入遺伝子を提供する第２のｒＨＳＶベクター（右側）を用いる、ｒＡＡＶベクターのパッケージング。

【図6】図６：組換え型アデノウイルス／ＡＡＶハイブリッドベクターを使用した組換え型ＡＡＶベクターの生産。ｒｅｐおよびｃａｐ機能を提供するｒＡｄベクター（ｒＡｄＶ）（左側）ならびにＡＡＶ－ＩＴＲによってフランキングされた導入遺伝子を提供する第２のｒＡｄＶを用いる、想定されるｒＡＡＶベクターのパッケージング。

【図7】図７：ＡＡＶ－２ヌクレオチド１７０１～２１８６（ＲＩＳ－Ａｄ）によるアデノウイルス複製の阻害の推定機序。（Ａ）：ＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩ一時停止に関与する可能性のあるＡＡＶ－２ ｐ４０プロモーター中のエレメント。Ｉｎｒエレメント、一時停止ボタン（ＰＢ）、およびＧＡＧＡエレメントの組み合わせは、ＴＳＳ付近の不釣り合いに高いレベルのＰｏｌ ＩＩを伴うプロモーターを高度に予測することが示されている。ヌクレオチド位置は、ＴＳＳに対して相対的に示されている。略語：ＴＢＰ、ＴＡＴＡボックス結合タンパク質；ＧＡＦ、ＧＡＧＡ因子。（Ｂ）：ｐ４０プロモーターにおける機能停止したＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩ複合体による立体障害を介したＡｄ５／ＡＡＶハイブリッドベクターゲノム複製の阻害の提唱されるモデル。略語：ＤＳＩＦ、ＤＲＢ感受性誘導因子；ＮＥＬＦ、負の伸長因子。

【図8】図８：大型Ｒｅｐ遺伝子の発現のための例示的なプロモーターのスキーム。（Ａ）：転写開始部位（ＴＳＳ）、ＴＡＴＡボックス、近位および遠位のＳｐ１結合部位、ならびにＣＣＡＡＴボックス（ＣＴＦ結合部位）を含むプロモーター。（Ｂ）および（Ｃ）：Ｓｐ１部位を１つだけ含む代替的なプロモーター。異なるエレメント間の好ましい距離は、塩基対（ｂｐ）で示されている。

【図9】図９：３’阻害性ＲＩＳ－Ａｄ配列の再コード後のアデノウイルスシャトルプラスミドによるＡＡＶ－２ Ｒｅｐタンパク質の発現。（Ａ）：ｒｅｐ遺伝子の３’部におけるＲＩＳ－Ａｄ（アデノウイルス複製のＲｅｐ阻害配列）の詳細を含むＡＡＶ－２のゲノム構成。ＡＡＶ－２の逆方向末端反復（ＩＴＲ）、４つのＲｅｐタンパク質Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、Ｒｅｐ４０、カプシドタンパク質ＶＰ１からＶＰ３、およびＡＡＰ（アセンブリー活性化タンパク質）が、異なる囲み線によって示されている。右に向いた矢印は、マップユニット５、１９および４０における３つのＡＡＶ－２プロモーターの転写開始部位を表し、縦の矢印は、マップ位置９６におけるすべての転写物に共通するポリアデニル化（ポリＡ）部位を示す。拡張されたＲＩＳ－Ａｄ領域の詳細と、ＲＩＳ－Ａｄの阻害機能を無効にするのに十分なＡＡＶ－２ヌクレオチド１７８２から１９１６の再コード（ｓＲｅｐ）とが、図の下部に示されている。特徴的なヌクレオチド位置は、囲み線の上に示されている。（Ｂ）：ｒＡｄ生成のために使用されるシャトルプラスミドの導入遺伝子カセットの概略表現（Ｅ．ｃｏｌｉにおける相同組換えのためのｐＳｈｕｔｔｌｅコンストラクト、およびその結果得られる、ＨＥＫ２９３細胞のトランスフェクションのためのｐＡｄＥａｓｙプラスミド）。囲み線は、Ｒｅｐ７８／Ｒｅｐ５２ ＯＲＦ、再コードされた（ｓＲｅｐ）配列、およびプロモーターカセットを表す。ＨＥＫ２９３細胞への対応するＰａｃＩ線形化ｐＡｄＥａｓｙプラスミドのトランスフェクション後のｒＡｄＶの形成が、「＋」および「－」の記号によって示されている。「（＋）」は不安定なｒＡｄＶを示す。

【図10】図１０：機能的Ｒｅｐタンパク質を発現するｒＡｄＶの特性解析。（Ａ）：ＨＥＫ２９３細胞を６４時間にわたり、示されているＭＯＩ（ゲノム粒子／細胞）でｒＡｄ－ＭＭＴＶ－ｓＲｅｐ（増幅ラウンド５）およびｒＡｄ－Ｍ２－Ｔｅｔ－ｓＲｅｐ（ラウンド６）に感染させた後の、抗Ｒｅｐウエスタンブロット分析。ｐＴＲ－ＵＦ５ ｒＡＡＶベクタープラスミドのトランスフェクションを陰性対照として使用し（「陰性」のレーン）、ｐＤＧプラスミドトランスフェクション（トランスフェクション効率約７０％）を陽性対照として使用した。上のパネルは、等しいＭＯＩにおけるｒＡｄ－ＭＭＴＶ－ｓＲｅｐおよびｒＡｄ－Ｍ２－Ｔｅｔ－ｓＲｅｐ（後者（ｔｈｅ ｌａｔｅｒ）はドキシサイクリンの存在下）の比較を示し、下のパネルは、異なるＭＯＩにおけるｒＡｄ－Ｍ２－Ｔｅｔ－ｓＲｅｐについてのドキシサイクリン（１μｇ／ｍｌ最終濃度、「ｄｏｘ」と表記）の効果を示す。（Ｂ）および（Ｃ）：ｒＡＡＶ複製ＤＮＡ中間体のサザンブロット分析。ウイルスＤＮＡをトランスフェクション／感染の６４時間後に抽出し、それぞれの導入遺伝子カセットに対するプローブとハイブリダイズした。矢印は、単量体および二量体の複製ｒＡＡＶ－ＤＮＡ中間体（ＲＦ－ＭおよびＲＦ－Ｄと表記）を示す。（Ｂ）：ＨＥＫ２９３細胞にｐＴＲ－ＵＦ５をトランスフェクトすることにより、ＡＡＶ－２ ＩＴＲによってフランキングされたＣＭＶ－ＧＦＰ導入遺伝子カセットを提供し、細胞をさらに、ドキシサイクリンの非存在下または存在下において、示されているＭＯＩで６４時間にわたってｒＡｄ－Ｍ２－Ｔｅｔ－ｓＲｅｐに感染させた。レーン２の陽性対照は、ｐＴＲ－ＵＦ５／ｐＤＧコトランスフェクト細胞を表す。（Ｃ）：ＡＡＶ－２ ＩＴＲによってフランキングされたＣＢＡ－ＧＦＰカセットを、プラスミドの形態で提供したか（ｐＳｈｕｔｔｌｅ－ＩＴＲ－ＧＦＰ）、または示されている２つの異なるＭＯＩでの対応するｒＡｄによる感染によって提供した（ｒＡｄ－ＩＴＲ－ＧＦＰ）。レーン２は、ｐＳｈｕｔｔｌｅ－ＩＴＲ－ＧＦＰ／ｐＤＧコトランスフェクションを表す。

【図11】図１１：単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ＴＫ）プロモーターの制御下でＡＡＶ－２カプシドタンパク質を発現するｒＡｄＶの生成。（Ａ）：ＡＡＶ－２ Ｃａｐタンパク質発現のためのアデノウイルスシャトルプラスミドの概略表現。異なる囲み線は、Ｃａｐ ＯＲＦ、主要ＡＡＶ－２イントロン、再コードされた（ｓＲｅｐ）配列、および異なるプロモーターカセットを表す。ＨＥＫ２９３細胞への対応するＰａｃＩ線形化ｐＡｄＥａｓｙプラスミドのトランスフェクション後のｒＡｄＶの形成が、「＋」および「－」の記号によって示されている。（Ｂ）：ｒＡｄ－ＨＳＶ－ＴＫ－Ｃａｐ増幅の増幅ラウンド３～８からの等量の凍結融解上清を用いた６４時間にわたるＨＥＫ２９３細胞の感染と、その後の全細胞抽出物の抗Ｃａｐウエスタン分析。矢印はカプシドタンパク質ＶＰ１からＶＰ３の位置を示す。ｐＤＧトランスフェクトＨＥＫ２９３細胞を陽性対照として使用した。（Ｃ）：示されているＭＯＩにおいて６４時間にわたる増幅ラウンド６（左側のレーン）および５（右側のレーン）からのｒＡｄ－ＨＳＶ－ＴＫ－Ｃａｐ凍結融解上清によるＨＥＫ２９３細胞の感染後の抗Ｃａｐウエスタンブロット分析。

【図12】図１２：ｒＡｄＶ媒介性ｒＡＡＶ２－ＧＦＰベクターパッケージングの最適化。Ａ：図の上部は、ＨＥＫ２９３細胞におけるｒＡＡＶ２－ＧＦＰベクターのｒＡｄＶ媒介性パッケージングのための異なる実験手法である、（Ｉ）ｒＡｄ－Ｍ２－Ｔｅｔ－ｓＲｅｐ（ｒｅｐ－ｒＡｄＶと表記）およびｒＡｄ－ＨＳＶ－ＴＫ－Ｃａｐ（ｃａｐ－ｒＡｄＶと表記）の混合物によるｐＴＲ－ＵＦ５トランスフェクト細胞の感染、（ＩＩ）ｒｅｐ－ｒＡｄＶおよびｃａｐ－ｒＡｄＶを用いた重感染による低投入量のスターターｒＡＡＶ２－ＧＦＰの増幅、ならびに（ＩＩＩ）ＩＴＲ－ＧＦＰ－ｒＡｄＶ、ｒｅｐ－ｒＡｄＶおよびｃａｐ－ｒＡｄＶによる三重ｒＡｄ感染の概要を示す。Ｂ：図の下部は、６ウェルプレートにて５×１０^５個のＨＥＫ２９３細胞を用いて行ったパッケージング実験からの凍結融解ライセートの少量のアリコート（１／１５）による３×１０^５個のＨｅＬａ細胞の形質導入の後に得られたＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージを示す。ＧＰ／細胞として表示されているＭＯＩは、ＨＥＫ２９３細胞におけるパッケージングのために使用されたものを指す。（ＩＩ）および（ＩＩＩ）では、ｒＡｄ－Ｃａｐを１０００ＧＰ／細胞のＭＯＩで使用した。陽性対照は、ｐＴＲ－ＵＦ５およびｐＤＧを用いる標準的なコトランスフェクションプロトコールによって行った。ｒＡｄＶ媒介性ｒＡＡＶ－ＧＦＰ増幅（ＩＩ）では、示されているとおり、６ウェル陽性対照の凍結融解ライセートからの１／３０または１／１５０の画分を、同じ６ウェル形式における次工程のｒＡｄＶ媒介性増幅のためのスターターｒＡＡＶ－ＧＦＰとして使用した。

【図13】図１３：組換え型アデノウイルスを利用して生成された、アフィニティー精製済みｒＡＡＶ２－ＧＦＰベクター調製物の特性解析。（Ａ）：示されているように異なるパッケージング手法を用いて生成された、アフィニティー精製済みの個々のｒＡＡＶ２－ＧＦＰベクター調製物に関する、細胞当たりのゲノム粒子（ＧＰ／細胞）としてのバーストサイズ。陽性対照は、標準的なコトランスフェクションプロトコールに対応し、ｒＡｄＶ媒介性パッケージングプロトコールは、図１２に詳細に示されている。２つの独立した代表的な調製物が各セットアップについて示されている。（Ｂ）：（Ａ）に示す異なるセットアップに対応するパターンコーディングが付された、アフィニティー精製済みｒＡＡＶ２－ＧＦＰ調製物を５つの異なるＭＯＩ（ＧＰ／細胞として表されている）で用いた、ＨｅＬａ細胞の形質導入後のＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージ。（Ｃ）：（Ａ）に示す精製されたｒＡＡＶ２－ＧＦＰベクター調製物からの４つの異なる量のゲノム粒子（１×１０^７、５×１０^７、２×１０^８および１×１０^９）を用いたカプシドタンパク質含有量のウエスタンブロット分析。より高いバーストサイズを有する各調製物を、４つの異なるパッケージング方法の各々の分析のために選択した。（Ｄ）：（Ｃ）と同じｒＡＡＶ２－ＧＦＰベクター調製物からの異なる量のゲノム粒子（１×１０^８、５×１０^８、２×１０^９および１×１０^１０）をロードしたＳＤＳ ＰＡＧＥゲルの銀染色。

【図14】図１４：一連の増幅ラウンドにわたるｒＡｄ－Ｍ２－Ｔｅｔ－ｓＲｅｐおよびｒＡｄ－ＨＳＶ－ＴＫ－Ｃａｐの収量、ゲノム安定性、およびタンパク質発現。ｒＡｄ－Ｍｅ－Ｔｅｔ－ｓＲｅｐ（ｒｅｐ－ｒＡｄＶ、ＡおよびＢの左パネル）およびｒＡｄ－ＨＳＶ－ＴＫ－Ｃａｐ（ｃａｐ－ｒＡｄＶ、ＡおよびＢの右パネル）を、ＨＥＫ２９３細胞において１５ラウンドにわたって増幅させた。基本的には、１×１０^７個の細胞（１７５ｃｍ^２フラスコ）を４４～５０時間にわたって先行ラウンドからの２．５×１０^１０個のゲノムｒＡｄ粒子に感染させ、３回の凍結融解サイクルによって５ｍｌの残留培地中に溶解させた。（Ａ）：方法のセクションに記載されるようにＰＣＲ分析によって決定された凍結融解上清におけるゲノムｒＡｄＶ力価。（Ｂ）：それぞれの導入遺伝子カセットの最末端に結合するオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ増幅によるゲノムの完全性の分析。ｒＡｄＶの生成のために使用したｐＡｄＥａｓｙプラスミドを陽性対照として使用した。（Ｃ）および（Ｄ）：２００のＭＯＩで６４時間にわたる、示されているｒｅｐ－ｒＡｄＶまたはｃａｐ－ｒＡｄＶの増幅ラウンドからの凍結融解上清によるＨＥＫ２９３細胞の感染後の、抗Ｒｅｐ（Ｃ）または抗Ｃａｐ（Ｄ）のウエスタンブロット分析。

【図15】図１５：構成的ＨＳＶ－ＴＫプロモーターを用いた、機能的な大型Ｒｅｐタンパク質のｒＡｄ媒介性発現の向上。（Ａ）：ｒｅｐ遺伝子の３’部におけるＲＩＳ－Ａｄ（アデノウイルス複製のＲｅｐ阻害配列）の詳細を含むＡＡＶ－２のゲノム構成（さらなる詳細については図９Ａを比較されたい）、ならびに、大型Ｒｅｐタンパク質Ｒｅｐ６８、およびスプライスドナー部位の直後で終止する切断型ｓＲｅｐ１／５３０タンパク質の描写。両方が、ＡＡＶ－２ヌクレオチド１７８２から１９０６の領域において再コードされている。異なる囲み線は、アデノウイルスシャトルプラスミドにおけるタンパク質の発現のために使用される、Ｒｅｐ－ＯＲＦ、再コードされた領域（ｓＲｅｐ）、およびＨＳＶ－ＴＫプロモーターを表す。（Ｂ）：精製されたスターターｒＡＡＶ－ＧＦＰ（ＭＯＩ １００）、およびｒＡｄ－Ｍ２－Ｔｅｔ－ｓＲｅｐ、ｒＡｄ－ＨＳＶ－ＴＫ－ｓＲｅｐ６８、またはｒＡｄ－ＨＳＶ－ＴＫ－ｓＲｅｐ１／５３０のいずれかを図示のように用いた、６４時間にわたるＨＥＫ２９３細胞の重感染後の抗Ｒｅｐウエスタンブロット分析。ゲノム粒子／細胞としてのＭＯＩも示されている。ｐＴＲ－ＵＦ５およびｐＤＧがコトランスフェクトされた細胞を陽性対照として使用した。（Ｃ）：実験手法は（Ｂ）と同一だが、ウイルスＤＮＡをトランスフェクション／感染の６４時間後に抽出し、ＣＭＶ－ＧＦＰ導入遺伝子カセットに対するプローブとハイブリダイズした。矢印は、単量体（ＲＦ－Ｍ）および二量体の複製（ＲＦ－Ｄ）ｒＡＡＶ－ＧＦＰ ＤＮＡ中間体を示す。

【図16】図１６：ＨＳＶ－ＴＫプロモーター制御下の切断型Ｒｅｐタンパク質のｒＡｄＶ媒介性発現後のｒＡＡＶ－ＧＦＰ増幅。（Ａ）および（Ｂ）：（Ａ）ｒＡｄ－ＨＳＶ－ＴＫ－ｓＲｅｐ６８および（Ｂ）ｒＡｄ－ＨＳＶ－ＴＫ－ｓＲｅｐ１／５３０の異なる増幅ラウンドからの上清におけるｒＡｄＶ導入遺伝子カセットの分析。ＰＣＲ増幅のために使用したオリゴヌクレオチドは、ｐＡｄＥａｓｙプラスミドにおいて導入遺伝子カセットをフランキングするアデノウイルス配列内で結合する。ｒＡｄＶの生成のために使用したこれらのｐＡｄＥａｓｙプラスミドを、ＰＣＲ増幅のための陽性対照としても使用した。ｒＡｄ－ＨＳＶ－ＴＫ－ｓＲｅｐ６８のより高い増幅ラウンドからのプローブにおいて観察された予想サイズのＰＣＲ産物およびオーバーサイズのバンドが、矢印によって示されている。（Ｃ）および（Ｄ）：５×１０^５個のＨＥＫ２９３細胞（６ウェル形式）を用いて行った、ｒＡＡＶ２－ＧＦＰのｒＡｄ媒介性増幅からの凍結融解ライセートの少量のアリコート（１／３０）による、３×１０^５個のＨｅＬａ細胞の形質導入の後に得られたＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージ。（Ｃ）：示されているように、一定量のｒＡＡＶ－ＧＦＰ投入ベクター（ＭＯＩ １００）、ならびに様々なＭＯＩのｒＡｄ－ＨＳＶ－ＴＫ－ｓＲｅｐ１／５３０（ｒｅｐ－ｒＡｄＶと表記）およびｒＡｄ－ＨＳＶ－ＴＫ－Ｃａｐ（ｃａｐ－ｒＡｄＶと表記）を使用した。（Ｄ）：一定量のｒＡｄ－ＨＳＶ－ＴＫ－ｓＲｅｐ１／５３０（ＭＯＩ ２００）およびｒＡｄ－ＨＳＶ－ＴＫ－Ｃａｐ（ＭＯＩ ４００）を漸増量のｒＡＡＶ－ＧＦＰ投入ベクターと共に使用した。（ＣおよびＤ）：ｒｅｐ－ｒＡｄＶは、図１２および１４のもの（ｒＡｄ－Ｍ２－Ｔｅｔ－ｓＲｅｐ７８）とは異なるｒＡｄＶベクター（ｒＡｄ－ＨＳＶ－ＴＫ－ｓＲｅｐ１／５３０）に対応することに留意されたい。スターターｒＡＡＶ－ＧＦＰのｒＡｄ－ＨＳＶ－ＴＫ－ｓＲｅｐ－Ｓｔｏｐ５３１およびｒＡｄ－ＨＳＶ－ＴＫ－Ｃａｐを介した増幅によって生成された、中規模アフィニティー精製済みｒＡＡＶ－ＧＦＰ調製物１および２（表１を比較されたい）の、（Ｅ）：抗Ｃａｐウエスタン分析および（Ｆ）：銀染色。ロードした精製済みｒＡＡＶ－ＧＦＰゲノム粒子の数が示されている。

【図17】図１７：異なるＡＡＶ血清型のｃａｐタンパク質の発現のためのアデノウイルスベクター（ｒＡｄＶ）の生成。（Ｂ）：様々な濃度におけるｒＡｄ－ＨＳＶ－ＴＫ－Ｃａｐ感染後のＣａｐ発現。（Ａ）：それぞれのＡＡＶ血清型のイントロンの３部および下流Ｃａｐ ＯＲＦを、ｐＳｈｕｔｔｌｅ－ＨＳＶ－ＴＫ－Ｃａｐ ＡＡＶ－２コンストラクトのＡＡＶ－２イントロンにおける対応する部位に融合させることによって生成された、アデノウイルスシャトルプラスミドの概略表現。異なる囲み線は、ＨＳＶ－ＴＫプロモーター、ＡＡＶ－２イントロンの５’部、ＡＡＶ血清型イントロンの３’部、およびそれぞれのＣａｐ ＯＲＦを表す。（Ｂ）：示されているように、ＭＯＩ １０００（左上）および４００～４０００（図の右上および下の部分）における、ＡＡＶ血清型１、２、３、５、６、８および９のｃａｐ－ｒＡｄＶベクターによる、ＨＥＫ２９３細胞の６４時間にわたる感染と、その後の抗Ｃａｐ ＭＡｂ Ｂ１を用いたＣａｐ発現のウエスタン分析。

【図18】図１８：対応する標準的なコトランスフェクションプロトコールと比較した、ＡＡＶ血清型１およびＡＡＶ血清型８ベクターについての、ｒＡｄＶ媒介性ｒＡＡＶ－ＧＦＰ増幅の収量。（Ａ）：示されているように、接着性ＨＥＫ２９３細胞において、標準的なコトランスフェクションプロトコールまたはｒＡｄＶ媒介性ベクター増幅のいずれかによって生成された、アフィニティー精製済みｒＡＡＶ１－ＧＦＰベクター調製物に関する、細胞当たりのゲノム粒子（ＧＰ／細胞）としてのバーストサイズ。各セットアップについて、２つの独立した代表的な調製物からの平均データが、標準偏差と共に示されている。（Ｂ）：示されているように、接着性ＨＥＫ２９３細胞において、標準的なコトランスフェクションプロトコールまたはｒＡｄＶ媒介性ベクター増幅のいずれかによって生成された、個々のアフィニティー精製済みｒＡＡＶ８－ＧＦＰベクター調製物に関する、細胞当たりのゲノム粒子（ＧＰ／細胞）としてのバーストサイズ。各セットアップについて、２つの独立した代表的な調製物からの平均データが、標準偏差と共に示されている。

【図19】図１９：異なるＨＥＫ懸濁細胞におけるＡＡＶ血清型２についてのｒＡｄＶ媒介性ｒＡＡＶ－ＧＦＰ増幅の収量。示されているように、８×１０^７個のＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３－ＦまたはＥｘｐｉ２９３Ｆ懸濁細胞のｒＡｄＶ媒介性ベクター増幅によって生成された、アフィニティー精製済みｒＡＡＶ２－ＧＦＰベクター調製物に関する、細胞当たりのゲノム粒子（ＧＰ／細胞）としてのバーストサイズ。各細胞株について、２つの独立した調製物の平均データが示され、標準偏差が示されている。

【図20】図２０：ＳＶ４０初期プロモーターまたは単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ＴＫ）プロモーターの様々な変異体の制御下でＡＡＶの非構造タンパク質および構造タンパク質を発現するｒＡｄＶの生成。（Ａ）：ｒＡｄＶにおいて、（Ｂ）３つのＡＡＶ－２ Ｃａｐタンパク質ＶＰ１からＶＰ３のすべて、または（Ｃ）Ｃ末端が欠失した部分的に再コードされたＡＡＶ－２の大小のＲｅｐタンパク質の発現のために使用される、様々なＨＳＶ－ＴＫプロモーター変異体および完全長ＳＶ４０初期プロモーターの概略表現。ＨＳＶ－ＴＫ変異体は、近位および遠位のＳｐ１結合部位ならびにＣＣＡＡＴボックス（ＣＴＦ結合部位）の存在および／または配向において異なる。すべてのプロモーター変異体が同一のＴＡＴＡボックスおよび転写開始部位（ＴＳＳ）を有する。（Ｂ）：対応するｒＡｄＶ－Ｃａｐベクターの増幅ラウンド１からの等量のゲノム粒子を用いた７０時間にわたるＨＥＫ２９３細胞の感染と、その後の全細胞抽出物の抗Ｃａｐウエスタン分析。矢印は、カプシドタンパク質ＶＰ１からＶＰ３の位置を示す。（Ｃ）：対応するｒＡｄＶ－Ｒｅｐベクターの増幅ラウンド１からの等量のゲノム粒子を用いた７０時間にわたるＨＥＫ２９３細胞の感染と、その後の全細胞抽出物の抗Ｒｅｐウエスタン分析。矢印は、大型および小型の、Ｃ末端が欠失し、部分的に再コードされたＲｅｐタンパク質の位置を示す。

【0106】

【表1】

【実施例】

【0107】

［実施例１］

【0108】

材料および方法
プラスミドおよびクローニング。
ＡＡＶ－２ ＩＴＲによってフランキングされたＣＭＶエンハンサー／プロモーター駆動型のＧＦＰカセットを搭載したプラスミドｐＴＲ－ＵＦ５（Zolotukhin et al., 1996）は、親切にもＮｉｃｋ Ｍｕｚｙｃｚｋａ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｆｌｏｒｉｄａ）から提供された。ＡＡＶ－２ ｐ５プロモーターおよび完全なＲｅｐ７８コード領域を含有するプラスミドのｐＳｈｕｔｔｌｅ－ｐ５－ＲｅｐおよびｐＳｈｕｔｔｌｅ－ｐ５－ｓＲｅｐについては既報である（Weger et al., 2014）。ｓＲｅｐという用語は、Ｓｉｔａｒａｍａｎら（Sitaraman et al., 2011）によるＡＡＶ－２のｎｔ１７８２から１９１６が再コードされたＲｅｐ７８配列を意味する。ｐＳｈｕｔｔｌｅ－ＭＭＴＶ－ＲｅｐおよびｐＳｈｕｔｔｌｅ－ＭＭＴＶ－ｓＲｅｐの生成では、対応するｐＳｈｕｔｔｌｅ－ｐ５－Ｒｅｐコンストラクトにおける、ｐ５プロモーターに先行するＢｇｌＩＩ部位と、Ｒｅｐ－ＯＲＦ内のユニークなＳａｌＩ部位（ＡＡＶ－２ ｎｔ１４２８）との間の配列を、ＭＭＴＶ－ＬＴＲおよびＲｅｐ ＯＲＦのアミノ末端部を含有するｐＤＧ（Grimm et al., 1998）からのＢａｍＨＩパーシャル／ＳａｌＩ制限フラグメントによって置き換えた。ｐＳｈｕｔｔｌｅ－Ｍ２－Ｔｅｔ－Ｒｅｐコンストラクトのクローニングでは、ＣＭＶプロモーター、ｒｔＴＡ（Ｍ２）トランスアクチベーター、およびＴｅｔプロモーター（７つのＴｅｔオペレーター配列とそれに続くＣＭＶコアプロモーターのアレイ）を含有するカセットをプラスミドｐＤ－Ｔｅｔ－Ｍ２－Ｋ１からＨｉｎｄＩＩＩ／ＡｇｅＩフラグメントとして切り取り、これを、３成分ライゲーションにより、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩ消化されたｐＳｈｕｔｔｌｅベクターにおいて、フランキングするＡｇｅＩ／ＸｂａＩ部位によってＰＣＲフラグメントとして生成された対応するＲｅｐ７８ ＯＲＦ（野生型またはｓＲｅｐヌクレオチド配列のいずれか）とアセンブルした。プラスミドｐＳｈｕｔｔｌｅ－ｐ４０－ＣａｐおよびｐＳｈｕｔｔｌｅ－ｓ－ｐ４０－Ｃａｐについては既報である（Weger et al., 2014）。異種プロモーターであるＣＭＶ（ヒトサイトメガロウイルス初期エンハンサー／プロモーター）、ＰＧＫ（マウスホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター）、ＨＳＶ－ＴＫ（単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼプロモーター）、およびアデノウイルスサブタイプ５ ＭＬＰ（主要後期プロモーター）の制御下でＡＡＶ－２ Ｃａｐタンパク質を発現させるために、ｐＳｈｕｔｔｌｅ－ｐ４０－Ｃａｐ内のＡＡＶ－２ ｎｔ１８８２におけるＨｉｎｄＩＩＩ部位までのｐ４０プロモーター配列を、クローニングのためのＸｂａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位を生成するプライマーを用いて好適な親プラスミドから増幅した対応する異種プロモーター配列によって置き換えた。Ａｄ－ＭＬＰ配列は、第１のリーダー配列を含む後期Ａｄ５転写物のための開始部位を基準としてｎｔ－５０６から＋１９２を含有するが、Ａｄ－ＭＬＰ－Ｉと称される配列は、完全な第１のイントロンおよび第２のリーダー配列（転写開始部位を基準としてｎｔ－５０６から１１３４）をさらに含有する。ＡＡＶ－２ ＩＴＲによってフランキングされたＣＢＡ（ニワトリβ－アクチンＣＭＶハイブリッドプロモーター）駆動型のＧＦＰ遺伝子を含有するｐＳｈｕｔｔｌｅ－ＩＴＲ－ＧＦＰの生成のために、完全なＩＴＲによってフランキングされた導入遺伝子カセットを、まずｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）へとサブクローニングされ、次いでｐＳｈｕｔｔｌｅベクターへのクローニングのためにＥｃｏＲＶ／ＸｂａＩで切り取られたＰｓｔＩを含むｐＴＲ－ＵＦ２６（Mietzsch et al., 2014）から切り取った。導入遺伝子カセットの非必須領域内に存在する追加のＰａｃＩ部位を、部分的消化、フィルイン反応、および再ライゲーションによって欠失させた。ｐＳｈｕｔｔｌｅ－Ｍ２－Ｔｅｔ－ｓＲｅｐ内のＣＭＶ－Ｍ２－Ｔｅｔカセットを、サブクローニングのためのＨｉｎｄＩＩＩおよびＡｇｅＩ部位を生成するプライマーを用いて増幅させたＨＳＶ－ＴＫプロモーターと交換することにより、ｐＳｈｕｔｔｌｅ－ＨＳＶ－ＴＫ－ｓＲｅｐ７８を生成した。ｐＳｈｕｔｔｌｅ－ＨＳＶ－ＴＫ－ｓＲｅｐ６８およびｐＳｈｕｔｔｌｅ－ＨＳＶ－ＴＫ－ｓＲｅｐ１／５３０については、ｐＳｈｕｔｔｌｅ－ＨＳＶ－ＴＫ－ｓＲｅｐ７８内のｓＲｅｐ７８カセットを、Ｒｅｐ ＯＲＦをフランキングするＡｇｅＩおよびＸｂａＩ部位を通して、部分的に再コードされた対応するＲｅｐ配列に交換した。５’末端においてＡｇｅＩ部位を生成し、３’末端においてＲｅｐ７８アミノ酸５３０から下流の終止コドンＴＡＡおよびＸｂａＩ部位を導入するプライマーをそれぞれ用いて、ｓＲｅｐ１／５３０配列をｐＳｈｕｔｔｌｅ－Ｍ２－Ｔｅｔ－ｓＲｅｐから増幅させた。ｓＲｅｐ６８配列は、５’末端においてＡｇｅＩ部位を生成するプライマーと、Ｒｅｐ７８アミノ酸５２９とインフレームのＢｓｓＨＩＩ制限を含む最初の３つのＲｅｐ６８特異的アミノ酸をコードするプライマーとを用いて、ｐＳｈｕｔｔｌｅ－Ｍ２－Ｔｅｔ－ｓＲｅｐから増幅させた。残り４つのＲｅｐ６８特異的アミノ酸を含有するＢｓｓＨＩＩ／ＸｂａＩリンカーおよび終止コドンを使用して、ＡｇｅＩ／ＢｓｓＨＩＩ切断増幅産物をＡｇｅＩ／ＸｂａＩ切断ベクターにライゲートした。すべてのｐＡｄＥａｓｙコンストラクトは、ｐＡｄＥａｓｙ－１プラスミド（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＹ３７０９０９）を含有するＥ．ｃｏｌｉ ＢＪ５１８３－ＡＤ－１細胞（Ａｇｉｌｅｎｔ）において、ＰｍｅＩ線形化ＤＮＡの相同組換えを介して、対応するｐＳｈｕｔｔｌｅプラスミドから生成した。

【0109】

細胞培養およびトランスフェクション。
５％ＣＯ_２で３７℃における、１０％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）ならびに１００μｇ／ｍｌのペニシリンおよびストレプトマイシンを補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で、ＨＥＫ２９３（ヒト胎児腎臓、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５７３）およびＨｅＬａ（ヒト子宮頸癌）細胞を増殖させた。ＨＥＫ－２９３細胞のトランスフェクションは、既報（Winter et al., 2012）のリン酸カルシウム沈降技法によって行った。トランスフェクションの前日に播種した細胞の数は、それぞれ、６ウェルプレートでは細胞３×１０^５個、２５ｃｍ^２フラスコでは細胞６×１０^５個、または１４．５ｃｍディッシュでは細胞４×１０^６個であった。

【0110】

組換え型アデノウイルスベクター（ｒＡｄＶ）の生成および増殖。
ｒＡｄＶの生成は、概ね既報のとおりにＡｄＥａｓｙシステム（He et al., 1998、Luo et al., 2007）を用いて行った。対応するｐＳｈｕｔｔｌｅコンストラクトをＰｍｅＩによって線形化し、安定に形質転換されたｐＡｄＥａｓｙプラスミドに含有されたＥ１／Ｅ３欠失Ａｄ５ゲノムとの相同組換えのために、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＪ５１８３－ＡＤ－１細胞に電気穿孔で挿入した。組換え型ｐＡｄＥａｓｙプラスミドＤＮＡをＥ．ｃｏｌｉ ＸＬ－１－Ｂｌｕｅ細胞中で増幅させ、ＰａｃＩによって線形化し、２５ｃｍ^２フラスコ内のＨＥＫ－２９３細胞にトランスフェクトした。一次ｒＡｄＶ調製物を、トランスフェクションの１２～１４日後に、２ｍｌの培地中で、液体窒素／３７℃の水浴における４回の凍結融解サイクルによって回収した。１．５ｍｌの上清を第１ラウンドの増幅のために使用し、２×１０^６個の細胞を感染の前日に７５ｃｍ^２フラスコ内に播種した。増幅のさらなるラウンドおよびＣｓＣｌ勾配遠心分離による精製を既報のとおりに行った（Luo et al., 2007）。

【0111】

ゲノムｒＡｄＶ粒子の数量化。
最近報告されたように（Weger et al., 2014）、Ａｄ５－Ｅ４領域からの２０２ｂｐ領域の増幅のためにプライマーＥ４－Ｑ１およびＥ４－Ｑ２を使用した、ＧｏＴａｑ ｑＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いるＬｉｇｈｔ－ＣｙｃｌｅｒベースのリアルタイムＰＣＲによって、ｒＡｄＶ凍結融解上清またはＣｓＣｌ精製済みｒＡｄＶ中のアデノウイルスゲノム粒子を決定した。

【0112】

組換え型アデノウイルス（ｒＡｄＶ）によるＨＥＫ－２９３細胞の感染。
ｒＡＡＶのウエスタンまたはサザンブロット分析および生産のために、ＨＥＫ－２９３細胞を、適切な細胞培養容器において、細胞培養培地を予め除去せずに、示された量（概して、細胞当たりのゲノム粒子として表されるＭＯＩ）のｒＡｄＶ凍結融解ライセートまたはＣｓＣｌ精製済みｒＡｄＶに感染させた。

【0113】

ウエスタン分析。
カプシド含有量についての精製済みｒＡＡＶ－２調製物のイムノブロット分析、または、ＡＡＶ－２ ＣａｐもしくはＲｅｐ発現についてのトランスフェクトＨＥＫ－２９３細胞もしくはｒＡｄＶ感染ＨＥＫ－２９３細胞からの全細胞抽出物のイムノブロット分析を、それぞれ、１：２０に希釈した抗Ｃａｐモノクローナル抗体Ｂ１または１：１０に希釈した抗Ｒｅｐモノクローナル抗体３０３．９（いずれもＰｒｏｇｅｎ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて行い、その後、西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート二次抗体とのインキュベーションおよび増強化学発光検出（ＥＣＬ）を既報（Winter et al., 2012）のとおりに行った。

【0114】

銀染色。
タンパク質サンプルバッファーに直接溶解させ、９５℃で５分間インキュベートし、８％ポリアクリルアミド／ＳＤＳゲル上で分離させた、１．０×１０^８から１．０×１０^１０のゲノム粒子に対応する様々な量のベクターを含む銀染色ゲルにおいて、精製済みｒＡＡＶ－２ベクター調製物のカプシドタンパク質含有量を分析した。染色反応は、既報（Mietzsch et al., 2014）のとおりに行った。

【0115】

ウイルスＤＮＡの抽出およびサザンハイブリダイゼーション。
改変されたＨｉｒｔ手順によるウイルスＤＮＡの抽出を、基本的に既報（Winter et al., 2012）のとおりに行った。２時間にわたって４０ユニットのＤｐｎＩによって消化された６μｇのＨｉｒｔ－ＤＮＡを用いてサザンブロット分析を行った。０．８％アガロースゲルでの電気泳動の後、ＤＮＡをキャピラリーブロッティングによってナイロン膜（Ｈｙｂｏｎｄ－Ｎ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に転写し、ＣＭＶプロモーター、ＧＦＰ－ＯＲＦおよびＳＶ４０ポリアデニル化部位を含むｐＴＲ－ＵＦ５からのビオチン－１１－ｄＵＴＰ標識された１．９ｋｂのＥｃｏＲＩプローブとハイブリダイズした。結合したビオチン化プローブを、ストレプトアビジン西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート（高感度ＨＲＰコンジュゲート、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と、その後の増強化学発光検出（ＥＣＬ）によって検出した。

【0116】

ＨＥＫ－２９３細胞におけるｒＡＡＶの生産および精製。
ＨＥＫ－２９３細胞を２５～３０％のコンフルエンシーで播種した。２４時間後、（Ｉ）細胞に、ｐＴＲ－ＵＦ５をトランスフェクトし、これをさらに、ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質発現のための２つのｒＡｄＶに感染させたか、（ＩＩ）細胞に、予めパッケージングされたスターターｒＡＡＶ－ＧＦＰを形質導入し、これをＲｅｐおよびＣａｐタンパク質発現のための２つのｒＡｄＶに重感染させたか、または（ＩＶ）細胞を、ＩＴＲによってフランキングされたＧＦＰベクターＤＮＡを提供するＩＴＲ－ＧＦＰ－ｒＡｄＶならびにＲｅｐおよびＣａｐタンパク質発現のための２つのｒＡｄＶに三重感染させた。１：１の分子比率のｐＤＧヘルパーおよびｐＴＲ－ＵＦ５ ＧＦＰ発現ベクタープラスミドをコトランスフェクトした細胞を、概して陽性対照（ｐｃ）として使用した。トランスフェクションを用いる手法では、細胞培地をトランスフェクションの１６時間後に新鮮培地に置き換えた。細胞は概してトランスフェクション／感染の６４時間後に回収した。６ウェルプレートにおけるｒＡＡＶパッケージングの最適化のために、掻爬した細胞を３回の凍結融解サイクルによって培地に直接溶解させ、遠心分離後、上清を以後の使用まで－８０℃で貯蔵した。中規模のｒＡＡＶ生産および精製では、回収した細胞をＰＢＳで洗浄し、１４．５ｃｍディッシュ当たり１ｍｌの溶解バッファー（１０ｍＭ Ｔｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、および１％ Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ－１００ ｖ／ｖ）に再懸濁し、３回の凍結融解サイクルによって溶解させた。粗製のライセートを、ライセート１ｍｌ当たり２５０Ｕのベンゾナーゼ（Ｍｅｒｃｋ）によって３７℃で１時間処理して、パッケージングされていないＡＡＶ ＤＮＡを分解し、８，０００ｇで３０分間遠心分離して、細胞残屑をペレット化した。上清を－８０℃で少なくとも１時間凍結させた。融解および８，０００ｇで１５分間の遠心分離の後、その上清を、ＡＥＫＴＡ精製システム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で１ｍｌの充填済みＨｉＴｒａｐカラムを使用する、既報（Mietzsch et al., 2014）のとおりの一工程のＡＶＢセファロースアフィニティークロマトグラフィーに供した。

【0117】

ｒＡＡＶベクター調製物の数量化。
アフィニティー精製済みｒＡＡＶ－ＧＦＰベクター調製物のアリコートを、４００μｇ／ｍｌの最終濃度のプロテイナーゼＫ（Ｒｏｔｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって、５６℃で２時間にわたり、溶解バッファー［１％（ｗ／ｖ）Ｎ－ラウロイルサルコシン、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．５、１０ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０］中で消化して、カプシドからベクターゲノムを放出させた。フェノール－クロロホルム抽出およびエタノール沈殿の後、サンプルを２０μｌのＴｒｉｓ－ＥＤＴＡバッファーｐＨ７．６に溶解し、ＧｏＴａｑ ｑＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いるＬｉｇｈｔ－ＣｙｃｌｅｒベースのリアルタイムＰＣＲによるゲノムコピー数の決定のために１：１００に予め希釈した。ベクターバックボーンのウシ成長ホルモン由来ポリＡ部位に特異的なプライマーを、既報（Mietzsch et al., 2014）のとおりに使用した。

【0118】

ＦＡＣＳ分析によるＨｅＬａ細胞中のｒＡＡＶ－ＧＦＰ形質導入効率の決定。
１２ウェルプレートにおける３×１０^５個のＨｅＬａ細胞に、ｒＡＡＶ－ＧＦＰパッケージングのために使用したＨＥＫ－２９３細胞からの小容量の凍結融解上清（通常、元のＨＥＫ－２９３ ６ウェルの１／１５に対応する容量を適用した）、または示されているＭＯＩ（ｇｐ／細胞）におけるアフィニティー精製済みｒＡＡＶ－ＧＦＰのいずれかを形質導入し、これを、１０のＭＯＩ（感染力価）におけるアデノウイルス２型に重複感染させた。形質導入の４４時間後に細胞を回収し、ＰＢＳによって１回洗浄し、５００μｌの２０％ＦＣＳ含有ＰＢＳに再懸濁した。ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒを製造元のプロトコール（Ｂｅｃｔｏｎ ＆ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に従って用いてＦＡＣＳ分析を行った。形質導入されていないＡｄ２感染ＨｅＬａ細胞を対照として用いて、ＧＦＰ陽性細胞についてのカットオフレベルを決定した。

【0119】

結果
機能的なＲｅｐタンパク質を発現する安定な組換え型アデノウイルス（ｒＡｄＶ）の生成。
シスでアデノウイルス複製を阻害するＡＡＶゲノム中の調節エレメントであるＲＩＳ－Ａｄ（図９Ａ）は、Ｒｅｐ ＯＲＦの一部を構成するだけでなく、ｐ４０プロモーター活性およびＡＡＶ－２スプライスの制御を介した効率的なＣａｐタンパク質発現にも必要である（Weger et al., 2016）。したがって、ＡＡＶ ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質のｒＡｄＶ媒介性発現のための我々の基本的なストラテジーは、これらのＡＡＶ遺伝子を２つの異なるベクターに分離させることに依拠した。Ｒｅｐタンパク質の発現に関し、我々は、Ｒｅｐ７８アミノ酸４８８から５３１の再コード（図９Ａ、ｓＲｅｐという）により、ＲＩＳ－Ａｄ機能を妨げた。Ｒｅｐ７８はトランスでアデノウイルス複製を阻害することが示されているため（Timpe et al., 2006、Weger et al., 2014）、我々は、生理学的なＡＡＶ－２ｐ５プロモーターだけでなく、より弱いＭＭＴＶ－ＬＴＲ（図９Ｂ、ＭＭＴＶ－ＲｅｐおよびＭＭＴＶ－ｓＲｅｐ）および誘導性システムも並行して使用して、その発現を駆動した。後者は、Ｒｅｐ ＯＲＦの上流の対応する応答エレメントに直接連結されたテトラサイクリン依存性トランスアクチベーター（ｒｔＴＡ／Ｍ２）のための構成的発現カセットからなるものであった（図９Ｂ、Ｍ２－Ｔｅｔコンストラクト）。小型Ｒｅｐタンパク質は、概して、内部ＡＡＶ－２ ｐ１９プロモーターの制御下で発現した。ｒＡｄＶの生成のためにｐＡｄＥａｓｙプラスミドを使用した場合、反復実験における野生型Ｒｅｐ配列を内包するコンストラクトはいずれも、ｒＡｄＶを生じさせなかった（図９Ｂ）。この所見は、以前の研究（Weger et al., 2016、Weger et al., 2014）において確立されたＲＩＳ－Ａｄのシス阻害性機能を裏付けた。ｐ５－ｓＲｅｐコンストラクトは、初期増幅ラウンドにおいて少量のＲｅｐタンパク質を発現する低力価のｒＡｄＶ上清調製物をもたらした。しかし、後続の増幅ラウンドにおいて観察されたウイルス力価およびＲｅｐタンパク質発現の低減（データは示さない）は、ウイルスが安定でないことを暗示した。これに対し、ＭＭＴＶ－ｓＲｅｐおよびＭ２－Ｔｅｔ－ｓＲｅｐコンストラクトから得られた初期のｒＡｄＶ調製物は、５～６回の増幅ラウンド後に得られた凍結融解培地上清において３×１０^１１から６×１０^１１ゲノム粒子（ｇｐ）／ｍｌの範囲内の力価で首尾よく継代することができた。これらの力価は、ｒＡｄＶ－ＣＭＶ－ＧＦＰ対照ウイルスのものと同等であった。ＣｓＣｌ勾配密度精製により、ｒＡｄＶベクターを２～４×１０^１２ｇｐ／ｍｌの力価まで濃縮することができた。これらの５～６回の増幅ラウンド後に、陽性対照として機能するｒＡＡＶ－２ベクター生産のための十分に確立された標準的なプラスミドｐＤＧ（Grimm et al., 1998）をトランスフェクトした（約７０％の効率において）細胞からのタンパク質抽出物を用いて、ｒＡｄＶ媒介性Ｒｅｐ発現レベルの並列比較を行った。４００～１０００ｇｐ／細胞のベクター用量において既に（図１０Ａ、上のパネル、レーン７および８）、ｒＡｄＶ－Ｍ２－Ｔｅｔ－ｓＲｅｐは、陽性対照（レーン２）と比べて同様のＲｅｐ５２レベル、およびわずかに高いＲｅｐ７８レベルを示し、２０００または４０００ｇｐ／細胞のベクター用量（レーン９および１０）では、さらなる大きな増加はなかった。同等の多重度において、ｒＡｄＶ－ＭＭＴＶ－ｓＲｅｐは、より低い量のＲｅｐ５２、そして特にＲｅｐ７８を発現し、Ｒｅｐ７８レベルは、４０００ｇｐ／細胞のベクター用量においてのみ陽性対照の範囲内であった（図１０Ａ、上のパネル、レーン３から６）。対応するｐＳｈｕｔｔｌｅおよびｐＡｄＥａｓｙプラスミドを用いた以前のトランスフェクション実験（データは示さない）とは異なり、Ｒｅｐ７８発現のドキシサイクリン媒介性誘導は、ｒＡｄＶ－Ｍ２－Ｔｅｔ－ｓＲｅｐについてはほとんど観察されなかった（図１０Ａ、下のパネル）。これは、テトラサイクリン応答エレメント（ＴＲＥ）の一部を構成する最小のＣＭＶプロモーターを刺激する初期アデノウイルス機能に起因する可能性がある。なぜなら、アデノウイルス感染の存在下では、ｐＳｈｕｔｔｌｅコンストラクトのトランスフェクション後にも調節が失われたからである（データは示さない）。ＡＡＶ－２ ＩＴＲによってフランキングされたＧＦＰカセットのＤＮＡ複製を促進するｒＡｄＶ－Ｍ２－Ｔｅｔ－ｓＲｅｐの能力を、ｐＴＲ－ＵＦ５トランスフェクト細胞の感染によってアッセイした。２０００～８０００ｇｐ／細胞の適用後、単量体（ＲＦ－Ｍ）および二量体（ＲＦ－Ｄ）の複製中間体の存在度は、ｐＤＧ／ｐＴＲ－ＵＦ５コトランスフェクション陽性対照についてスコアリングされたものと同様に高かった（図１０Ｂ）。驚くべきことに、高いＭＯＩでは、ドキシサイクリンの添加は、むしろＩＴＲ依存性複製を低減させた（図１０Ｂ、レーン９から１２）。より低いレベルのＡＡＶ－ＩＴＲ依存性ＤＮＡ複製がｒＡｄＶ－ＭＭＴＶ－ｓＲｅｐについて観察された（データは示さない）。トランスフェクションだけでなく感染工程にもよるｒＡＡＶパッケージングのための鋳型を提供するために、我々は、ＡＡＶ－２－ＩＴＲによってフランキングされたＧＦＰ導入遺伝子を内包するｒＡｄＶ（ｒＡｄＶ－ＩＴＲ－ＧＦＰ）を生成した。このＩＴＲによってフランキングされたＧＦＰ導入遺伝子も、ｒＡｄＶ－Ｍ２－Ｔｅｔ－ｓＲｅｐによって複製でき、典型的な単量体および二量体の複製形態が、トランスファーベクターのトランスフェクション後（図１０Ｃ、ｐＳｈｕｔｔｌｅ－ＩＴＲ－ＧＦＰ、レーン１から４）、およびｒＡｄＶ－ＩＴＲ－ＧＦＰ／ｒＡｄ－Ｍ２－Ｔｅｔ－ｓＲｅｐ重感染後（図１０Ｃ、レーン５から１２）の両方で検出された。

【0120】

組換え型アデノウイルスは、ＨＳＶ－ＴＫプロモーターの制御下でのＡＡＶ－２ Ｃａｐタンパク質の高レベルの発現を媒介することができる。
野生型ｐ４０プロモーターはＲＩＳ－Ａｄの主要なエレメントを構成するため（図９Ａ）、ＡＡＶ－２ Ｃａｐタンパク質を発現するｒＡｄＶの生成のためにこれを使用することはできなかった（Weger et al., 2014）。したがって、ＣＭＶ、ＰＧＫ、ＨＳＶ－ＴＫ、そしてさらにアデノウイルスサブタイプ５主要後期主要後期プロモーター（ＭＬＰ）を含む様々な異種プロモーター（図１１Ａ）を、Ｃａｐタンパク質発現を駆動するそれらの能力について、ＡＡＶ－２イントロンの上流で試験した。第１のＡｄ５由来イントロンの非存在／存在のみが異なる２つの異なるバージョンのＭＬＰ（図１１Ａ、ＭＬＰ－ＣａｐおよびＭＬＰ－Ｉ－Ｃａｐ）、そしてさらに、ｓＲｅｐ配列を含む突然変異型ＡＡＶ－２ ｐ４０プロモーター（図１１Ａ、ｓ－ｐ４０－Ｃａｐ）を分析に含めた。ＨＥＫ２９３細胞へのｐＡｄＥａｓｙプラスミドのトランスフェクションの後、特にＣａｐ発現がＨＳＶ－ＴＫまたは突然変異型ＡＡＶ－２ ｐ４０プロモーターによって制御されたものは、最終的にｒＡｄＶゲノム粒子を生じさせた（図１１Ａ）。一過性トランスフェクション後のｐＡｄＥ－ｐ４０－ＣａｐコンストラクトのＶＰ発現レベルがほとんど検出できないこと（データは示さない）、そして、ｒｅｐ－ｒＡｄＶに含有されたカルボキシ末端Ｒｅｐ配列とのｐ４０プロモーター配列の組換えの可能性を考慮して、ｒＡｄＶ－ＨＳＶ－ＴＫ－Ｃａｐのみを、ｒＡＡＶパッケージングのためのカプシドタンパク質を提供する手段としてさらに追求した。増幅ラウンド３～８からの培地上清を用いて感染させたＨＥＫ２９３細胞からのタンパク質抽出物のウエスタンブロット分析は、陽性対照として使用したｐＤＧトランスフェクションのものと同等の化学量論比で、３つのカプシドタンパク質ＶＰ１～ＶＰ３の高レベル発現を示した（図１１Ｂ）。１０００～４０００ｇｐ／細胞のｒＡｄベクター用量において、飽和したカプシドタンパク質レベルが観察された（図１１Ｃ）。

【0121】

ｒＡＡＶベクターのｒＡｄ媒介性パッケージングの最適化。
新しく生成されたｒＡｄＶによるＡＡＶ－２ ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質の発現をその後に使用して、ＡＡＶ－２ ＩＴＲによってフランキングされたＣＭＶ駆動型のＧＦＰ導入遺伝子を組換え型ＡＡＶ粒子中にパッケージングした。様々なＭＯＩのｒＡｄＶを使用した広範な最適化スキームにおいて、陽性対照として使用した、ヘルパープラスミドｐＤＧとベクタープラスミド（ＣＭＶ－ＧＦＰ導入遺伝子カセットを含むｐＴＲ－ＵＦ５）をコトランスフェクトする十分に確立された標準的なパッケージングシステム（Grimm et al., 1998）と、３つの異なるセットアップ（図１２、上部）、すなわち、（Ｉ）ＲｅｐおよびＣａｐ発現のための２つのｒＡｄＶによるｐＴＲ－ＵＦ５トランスフェクトＨＥＫ２９３細胞の過剰感染、（ＩＩ）低いＭＯＩで提供される精製されたスターターｒＡＡＶ－ＧＦＰ調製物のｒｅｐ－ｒＡｄＶ／ｃａｐ－ｒＡｄＶ媒介性増幅、そして最後に、（ＩＩＩ）ＲｅｐおよびＣａｐのための２つのｒＡｄＶによる、ＩＴＲによってフランキングされたＧＦＰ導入遺伝子を含有するｒＡｄＶ（ＩＴＲ－ＧＦＰ－ｒＡｄＶ）の三重感染を比較した。後者２つのシステム（ＩＩおよびＩＩＩ）は、ＤＮＡトランスフェクションとは無関係である。初期実験において（データは示さない）、ｒＡｄＶ－ＭＭＴＶ－ｓＲｅｐを含む形質導入ｒＡＡＶ粒子の収量は、概して、ｒＡｄＶ－Ｍ２－Ｔｅｔ－ｓＲｅｐを用いて実現されたものよりも明らかに低かった。したがって、さらなる最適化のために、ｒＡｄＶ－Ｍ２－Ｔｅｔ－ｓＲｅｐのみを使用した。以下および図１２では、簡略化を目的として、これをｒｅｐ－ｒＡｄＶと表記する（同様に、ｒＡｄＶ－ＨＳＶ－ＴＫ－Ｃａｐも単にｃａｐ－ｒＡｄＶと表記する）。ドキシサイクリンの存在下または非存在下において大きな差は観察されず、提示するすべての実験は、ドキシサイクリンの非存在下で行った。ｒＡＡＶベクター生産に関する測定値として、凍結融解上清中の形質導入ｒＡＡＶ－ＧＦＰ粒子をＨｅＬａ細胞の二次形質導入によって決定した。各実験に含まれた陽性対照（標準的なコトランスフェクション）を用いる３つのセットアップの各々についての代表的な実験を、図１２の下部に示す。概して、最適化されたＭＯＩ（ＧＰ／細胞として示される）のウイルス成分を用いた場合、陽性対照と同様の量の形質導入粒子が３つのセットアップすべてで得られた。ｒＡｄＶ媒介性スターターｒＡＡＶ－ＧＦＰ増幅プロトコールでは、スターターｒＡＡＶ－ＧＦＰの供給源として凍結融解上清を使用すると、形質導入単位の数を１００倍～２００倍に増幅させることができた（図１２、ＩＩ）。ＧＦＰベクター鋳型をｒＡｄＶとして提供した場合にも（セットアップＩＩＩ、ｒＡｄ三重感染）、高収量の形質導入ｒＡＡＶ－ＧＦＰ粒子がもたらされ、これは、ＩＴＲ－ＧＦＰ－ｒＡｄＶのＭＯＩが上昇するに連れて明らかに減少した（図１２、ＩＩＩにおいて、ＭＯＩ １００００について示されている）。これはおそらく、ウエスタン分析によって実証されたように（図示せず）、ＲｅｐおよびＣａｐ発現に関するｒＡｄＶへの干渉によるものである。まとめると、粗製の凍結融解ライセートでは、ＡＡＶ－２ ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質の発現のためにｒＡｄＶを用いる３つのシステムすべてが、標準的なコトランスフェクションプロトコールと同様か、またはさらに良好な収量の形質導入ｒＡＡＶ－ＧＦＰ単位をもたらした。

【0122】

組換え型アデノウイルスを用いて生成された精製済みｒＡＡＶベクター調製物の収量および特性解析。
新規のｒＡｄＶ依存性パッケージングシステムを用いて生成されたｒＡＡＶ－２ベクターをさらに詳細に分析するために、上述の実験セットアップの各々について（図１２、ＩからＩＩＩを比較されたい）、最適化された条件下で、２つの独立した中規模ｒＡＡＶ－ＧＦＰベクター調製（トランスフェクション／感染時で８×１０^７個のＨＥＫ２９３細胞）を行い、標準的なコトランスフェクションプロトコールの２つの調製を陽性対照として並行して実行した。すべてのｒＡＡＶ－ＧＦＰ調製物を一工程ＡＶＢアフィニティー精製に供した。最適化実験からのデータに一致して、精製されたｒＡＡＶ－ＧＦＰベクター画分の収量は、パッケージングのために使用したセットアップにかかわらず、約１×１０^４ＧＰ／細胞（バーストサイズ）の同様の範囲内であった（図１３Ａ）。ＡＡＶ－２野生型ゲノムは、すべての調製物において、ＰＣＲベースのアッセイの検出限界を下回った。また、すべての精製済みベクターが、ゲノム粒子に対して正規化した場合、広範囲のＭＯＩにわたり、ＨｅＬａ細胞における同様の形質導入率を示した（図１３Ｂ）。唯一の例外は、ｒＡｄＶ三重感染によって生産されたｒＡＡＶ－ＧＦＰベクターであり、これらは、より高い形質導入率をもたらす傾向があった。後者の所見は、ベクター鋳型を提供するｒＡｄＶの性質が原因で、これらのベクターにおけるプロモーターがわずかに異なること（ニワトリβ－アクチンＣＭＶハイブリッドかＣＭＶプロモーターか）に起因する可能性がある。ｒＡｄＶ媒介性スターターｒＡＡＶ増幅方法では（図１２、方法ＩＩ）、ゲノムｒＡＡＶ－ＧＦＰ粒子の投入数の約１００倍～２００倍の増加、および形質導入粒子の約２００倍～４００倍の増加が実現された。

【0123】

粒子カプシド含有量／組成および完全性の判断のために、４つのセットアップの各々について、より高いバーストサイズを有するそれぞれの調製物からの同数のゲノム粒子を、ＳＤＳ ＰＡＧＥと、それに続く銀染色に供した。すべての調製物について、個々のカプシドタンパク質の比率が見かけ上同様であるバックグラウンドのないＶＰ１～３のバンドが検出され（図１３Ｄ）、これら３つの主要な銀染色バンドの同一性は、抗Ｃａｐウエスタンブロット分析において確認された（図１３Ｃ）。しかし、プロトコールＩおよびＩＩＩ（それぞれ、ｐＴＲ－ＵＦ５トランスフェクション／ｒＡｄＶ過剰感染およびｒＡｄＶ三重感染）によって生成されたｒＡＡＶベクター調製物は、従来のコトランスフェクションプロトコールによって生成されたものよりも最大１０倍高いカプシドタンパク質含有量を示し、過剰の空粒子の可能性を示唆している。

【0124】

ｒＡＡＶパッケージングのために使用される組換え型アデノウイルスの安定な増幅。
ｒＡＡＶベクターの再現可能なパッケージングにおけるｒＡｄＶの使用に関する重要な要件は、段階的増幅の全体にわたるゲノムの完全性である。ＡＡＶ－２ ＲｅｐおよびＣａｐ発現のための新しく生成されたｒＡｄベクター（ｒＡｄＶ－Ｍ２－Ｔｅｔ－ｓＲｅｐおよびｒＡｄＶ－ＨＳＶ－ＴＫ－Ｃａｐ）のゲノム安定性を評価するために、これらを１５ラウンドにわたって継代したところ、各個の増幅ラウンドについて、ゲノム粒子量の分析により決定して５０～１５０の増幅係数が実現された。凍結融解ライセート（約３．０～４．０×１０^６個の細胞を１ｍｌの培地に溶解させた）において得られたゲノム力価は、２回の増幅ラウンド後のｒＡｄＶ－Ｍ２－Ｔｅｔ－ｓＲｅｐ（図１４Ａ、左パネル）と、５回の増幅ラウンド後のｒＡｄＶ－ＨＳＶ－ＴＫ－Ｃａｐ（図１４Ａ、右パネル）とについて、それぞれ、２～６×１０^１１ＧＰ／ｍｌの概ね一定の範囲内であった。両ベクターについて、完全な導入遺伝子カセットにわたるプライマーを用いたＰＣＲベースの分析によるベクターの完全性の評価により、上位シリーズの（ラウンド４を始点とする）増幅ラウンドの全体を通して、ただ１つの独特な主要増幅産物が明らかになった（図１４Ｂ、左のｒｅｐ－ｒＡｄＶおよび右パネルのｃａｐ－ｒＡｄＶ）。これらのバンドは、ｒＡｄベクターの生成のために使用されたそれぞれのｐＡｄＥａｓｙプラスミドから得られたＰＣＲ産物（図１４Ｂの陽性対照）との比較によっても判断されるように、サイズにおいてそれぞれの完全長配列に対応した。ｒＡｄＶベクターの分集団における導入遺伝子カセットの一部の欠失の可能性を示唆する、より低いサイズのバンドは観察されなかった。これらの所見は、２００のＭＯＩにおける順次増幅ラウンド（やはりラウンド４を始点とする）からのｒＡｄＶ上清によるＨＥＫ２９３細胞の感染後の、Ｒｅｐ（図１４Ｃ）およびＣａｐ（図１４Ｄ）のタンパク質発現のウエスタンブロット分析によって確認された。さらに、増幅ラウンド４および１５からのｒｅｐ－ｒＡｄＶ上清がｒＡＡＶ２－ＧＦＰベクターパッケージングを支持する能力を小規模および中規模のセットアップにおいて比較すると、この実験セットアップのバリエーションの範囲内では、わずかな差しか見出されなかった（データは示さない）。まとめると、これらの所見は、新しく生成されたｒＡｄＶが高度に安定であり、標準的な細胞株ＨＥＫ２９３において、一貫してＲｅｐ／Ｃａｐを発現し、連続的な増幅ラウンドにわたってｒＡＡＶパッケージングを支持することを示す。

【0125】

ＨＳＶ－ＴＫプロモーターの制御下で発現されたカルボキシ末端欠失型Ｒｅｐタンパク質を使用した、向上したｒＡｄＶ媒介性ｒＡＡＶパッケージング。
前述のように、組換え型アデノウイルスを利用してパッケージングされたｒＡＡＶ２－ＧＦＰ調製物のいくつかは、比較的高いカプシド含有量を示した（図１３ＣおよびＤを参照されたい）。したがって我々は、ｒＡｄＶ－ＨＳＶ－ＴＫ－Ｃａｐから発現されたＣａｐタンパク質の存在度はおそらく、パッケージングに関する制限因子を表すものではないと推論した。これに対し、ｒＡｄＶ－Ｍ２－Ｔｅｔ－ｓＲｅｐによる感染後の組換え型ＡＡＶベクターゲノムのＤＮＡ複製は、陽性対照である標準的なコトランスフェクションシステムのレベルに完全には達しなかった（図１０Ｂを比較されたい）。したがって我々は、ＡＡＶ ＤＮＡ複製に関与する大型Ｒｅｐタンパク質の発現率を増加させるために、Ｃａｐタンパク質のｒＡｄＶ媒介性発現によく適していることが既に証明されている構成的ＨＳＶ－ＴＫプロモーターでＣＭＶ－Ｍ２－Ｔｅｔ制御カセットを置き換えた。同時に、ＡＡＶ２イントロンによってコードされるアミノ酸モチーフについて報告されている（Di Pasquale and Chiorini, 2003）、アデノウイルス複製に対して生じ得る阻害効果を防止するために、Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ５２のカルボキシ末端部を含むＡＡＶ２イントロン配列を欠失させた。７つのＲｅｐ６８／Ｒｅｐ４０特異的カルボキシ末端アミノ酸を含むＲｅｐ６８ ＯＲＦ、またはスプライスドナー部位のほぼ直後で終止するＲｅｐ ＯＲＦのいずれかを含有する、２つの異なるコンストラクトを生成した（図１５Ａ、それぞれＲｅｐ６８およびＲｅｐ１／５３０という）。以前のベクターに関しては、アミノ酸４８８（ＡＡＶ－２ヌクレオチド１７８２）を始点としてＲｅｐ ＯＲＦを再コードした。対応するｒＡｄＶを首尾よく生成することができた。その後、それぞれの増幅ラウンド５から得られた上清によるＨＥＫ２９３細胞の感染は、その前のｒＡｄＶ－Ｍ２－Ｔｅｔ－ｓＲｅｐ７８ベクターと比較すると、ｒＡｄＶ－ＨＳＶ－ＴＫ－ｓＲｅｐ６８およびｒＡｄＶ－ＨＳＶ－ＴＫ－ｓＲｅｐ１／５３０の両方について、対応する大型Ｒｅｐタンパク質の割合を明らかに増加させた（図１５Ｂ）。それぞれの大型Ｒｅｐタンパク質の発現レベルの上昇と一致して、ｒＡｄＶ－ＨＳＶ－ＴＫ－ｓＲｅｐ６８およびｒＡｄＶ－ＨＳＶ－ＴＫ－ｓＲｅｐ１／５３０はまた、組換え型ＡＡＶゲノムの供給源として精製済みスターターｒＡＡＶ２－ＧＦＰベクターを用いた重感染後の複製中間体の強い存在度をもたらした（図１５Ｃ）。２００および１０００のＭＯＩでは、ｒＡＡＶ－ＧＦＰ複製中間体のこれらのレベルは、陽性対照であるｐＤＧ／ｐＴＲ－ＵＦ５コトランスフェクションよりも明らかに高かった（図１５Ｃ）。

【0126】

ｒＡＡＶパッケージングにおけるｒＡｄＶ－ＨＳＶ－ＴＫ－ｓＲｅｐ６８およびｒＡｄＶ－ＨＳＶ－ＴＫ－ｓＲｅｐ１／５３０の適用のために、ｒＡｄＶ媒介性スターターｒＡＡＶ増幅の手法（図１２、ＩＩを参照されたい）を選択した。初期の小規模実験では、ＣａｐおよびＲｅｐ発現のためのｒＡｄＶならびに予め精製されたスターターｒＡＡＶ－ＧＦＰベクターに関するＭＯＩを、パッケージング反応からの未処理の凍結融解ライセート中で得られた形質導入単位の数を測定値として用いて最適化した。これらの実験において、ｒＡＡＶパッケージングを促進するｒＡｄＶ－ＨＳＶ－ＴＫ－ｓＲｅｐ６８の能力は、このｒＡｄＶの増幅がラウンド５を超えると急激に低下することが観察されたが、ラウンド５からのベクター調製物は、ＡｄＶ－ＨＳＶ－ＴＫ－ｓＲｅｐ１／５３０のものと同等であった（データは示さない）。これには、ラウンド６を始点とするｒＡｄＶ－ＨＳＶ－ＴＫ－ｓＲｅｐ６８についてのＲｅｐ発現レベルにおける喪失が付随した（データは示さない）。フランキングアデノウイルス配列内に位置するプライマーを用いるｒＡｄＶ導入遺伝子カセットのＰＣＲ分析により、２．５ｋｂの予想サイズよりも大きい約１．０ｋｂの追加のバンドが明らかになり、これは、増幅ラウンド６からの物質において明らかに見られ、ラウンド７からの物質中でさらにより顕著になった（図１６Ａ）。これは、導入遺伝子カセットにおける挿入の可能性を示唆する。これに対し、ｒＡｄＶ－ＨＳＶ－ＴＫ－ｓＲｅｐ１／５３０については、調査された最高の増幅ラウンドであるラウンド１０まで、予想サイズのバンドしか見られなかった（図１６Ｂ）。したがって、後続のパッケージング実験はすべて、それ故に、ｒＡｄＶ－ＨＳＶ－ＴＫ－ｓＲｅｐ１／５３０を用いて行った。ｒＡｄＶ－ＨＳＶ－ＴＫ－ｓＲｅｐ１／５３０およびｒＡｄＶ－ＨＳＶ－ＴＫ－Ｃａｐの両方を２００～４００のＭＯＩで提供すると、効率的なスターターｒＡＡＶ－ＧＦＰ増幅がもたらされた［図１６Ｃ（ここでは、図１２および１４とは異なり、ｒｅｐ－ｒＡｄＶがｒＡｄＶ－ＨＳＶ－ＴＫ－ｓＲｅｐ１／５３０に対応することに留意されたい）］。２つのｒＡｄＶのうちの１つだけのＭＯＩをさらに上昇させると、形質導入効率がさらに低下したため、有益ではなかった。高いＭＯＩにおいて両ベクターを適用した場合（ＭＯＩ １０００におけるｒＡｄＶ－ＨＳＶ－ＴＫ－ｓＲｅｐ１／５３０およびＭＯＩ ２０００におけるｒＡｄＶ－ＨＳＶ－ＴＫ－Ｃａｐ）、形質導入単位の収量はわずかに向上したに留まり、また、これらの条件下では、空粒子の含有量が高いｒＡＡＶの生産に関する懸念が高まる。最適化されたＭＯＩ（２つのｒＡｄＶについては２００～４００、投入ｒＡＡＶ－ＧＦＰについては２０～５０）を適用して、３回の独立した中サイズのｒＡＡＶ－ＧＦＰ増幅を行い、後にｒＡＡＶ粒子のアフィニティー精製を行った。１．５１～２．８４×１０^４ＧＰ／細胞のバーストサイズが実現された（表１）。これらは、３０２から１４１９の間のゲノムスターターｒＡＡＶ－ＧＦＰ粒子の投入数の増幅係数に対応した。後者は、ほんの２０のＭＯＩのスターターｒＡＡＶ－ＧＦＰを使用した調製物について得られた。粒子カプシドの含有量および組成をアッセイするために、精製された調製物のうちの２つを、標準的なコトランスフェクションプロトコールから得られた調製物と並列して、Ｃａｐウエスタン分析および銀染色によって分析した。２つの調製物のうちの一方については、カプシド含有量がそれぞれの陽性対照と同等であった（図１６Ｅ、左パネル）。他方については、カプシド含有量がさらに低く（図１６Ｅ、右パネル）、空カプシドの割合がより小さいことを示唆している。銀染色により判断して、両方のｒＡＡＶ－ＧＦＰ調製物が夾雑タンパク質を含んでいなかった（図１６Ｆ）。まとめると、向上したｒＡｄＶ－ＨＳＶ－ＴＫ－ｓＲｅｐ１／５３０ベクターおよびｒＡｄＶ－ＨＳＶ－ＴＫ－Ｃａｐベクターをかなり低いＭＯＩで用いた重感染により、少量の予め精製されたスターターｒＡＡＶベクターを高い効率で増幅させることができ、好ましい特性を有するｒＡＡＶ調製物が得られた。ｒＡｄ－ＨＳＶ－ＴＫ－ｓＲｅｐ１／５３０は、少なくとも１０回の増幅ラウンドにわたり、ゲノムの完全性（図１６Ｂ）もＲｅｐタンパク質発現も喪失することなく（データは示さない）、安定に増殖することができた。

【0127】

表1: rAdV-HSV-TK-sRep1/530およびrAdV-HSV-TK-Cap(AAV-2)を用いて行った3回の独立したスターターrAAV-GFP血清型2増幅の特徴

【表2】

【0128】

他のＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質へのｒＡｄ媒介性ｒＡＡＶベクター生産の適合。
ＡＡＶ－２ Ｒｅｐタンパク質を他の血清型のカプシドタンパク質と共発現させることにより、ＡＡＶ２－ＩＴＲベースのベクターゲノムを対応する異種カプシドへとパッケージングすることもできる。そのようなベクターは、したがって、偽型ｒＡＡＶベクターといわれる（図４、「ｒＡＡＶ－２／Ｘ」も参照されたい。ここで「Ｘ」は、使用されるカプシドタンパク質の血清型を表す）。新しく開発されたｒＡｄＶベースのｒＡＡＶ－２パッケージング方法を偽型ｒＡＡＶ－２／Ｘベクターに適用するために、ＡＡＶ血清型１、３、５、６、８および９のカプシドタンパク質の発現のためのｒＡｄＶベクターを生成した。ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の３’部に局在するカプシド発現の調節配列によるアデノウイルス複製の阻害は、血清型２特異的現象を表すものではなく、他のＡＡＶ血清型の対応するゲノム領域にも適用される（Weger et al., 2016）。したがって、代替的なＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質もＨＳＶ－ＴＫプロモーターの制御下に置いた。

【0129】

ＨＳＶ－ＴＫプロモーターの下流で、ＡＡＶ－２イントロンの５’部を代替的な血清型のイントロンの３’部と融合させ、これに続いて、対応する下流に配置されたカプシドリーディングフレームを配し、融合部位は、それぞれのスプライスアクセプター部位のピリミジンリッチ領域の直ぐ上流に配置した（図１７Ａ）。言及したすべてのＡＡＶ血清型について、それぞれのＨＳＶ－ＴＫ駆動型カプシドリーディングフレームを有するｒＡｄＶを、少なくとも６回の増幅ラウンドにわたって安定に増殖させることができた。４００ＧＰ／細胞のＭＯＩにおいて既に、これらのｒＡｄＶは、それぞれのカプシドタンパク質の強力な発現をもたらした（図１７Ｂ）。これにより、３つのカプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３が、クローニングされた血清型のすべてについて適正なサイズおよび化学量論比で発現された。文献と一致して、ＡＡＶ血清型５および８のカプシドタンパク質は、他の血清型と比較して著しく異なる泳動挙動を示した。ＡＡＶ血清型３のカプシドタンパク質に対するｒＡｄＶを例外として、カプシド発現の明らかな飽和が１０００ＧＰ／細胞のＭＯＩから既に観察された。

【0130】

発現率は、ＡＡＶ－２ ｐ４０プロモーターの制御下でカプシドタンパク質を発現する（データは示さない）、対応する標準的なヘルパープラスミド（Grimm et al., 2003）のトランスフェクション後（トランスフェクション効率は陽性細胞５０～７０％の範囲内であった）よりも有意に高かった。

【0131】

ｒＡｄＶ－Ｔｅｔ－Ｍ２－ｓＲｅｐ７８またはｒＡｄＶ－ＨＳＶ－ＴＫ－ｓＲｅｐ１／５３０を用いた重感染により、ＡＡＶ血清型１、３、５、６、８および９のカプシドタンパク質の発現のためのこれらのｒＡｄＶは、ｒＡＡＶ血清型２パッケージングのための図１２に概説されるセットアップＩ（プラスミドトランスフェクションによる、ＡＡＶ－２ ＩＴＲによってフランキングされたＣＭＶ－ＧＦＰ導入遺伝子の提供）およびＩＩ（スターターｒＡＡＶ－２－ＣＭＶ－ＧＦＰベクターの増幅）を用いた、対応する偽型ｒＡＡＶベクターのパッケージングのために首尾よく利用された。

【0132】

最適化後、調査したすべての血清型について、ｒＡｄＶベースの方法により、それぞれの標準的なコトランスフェクション手法によるものと同様の収量の形質導入ｒＡＡＶベクター粒子を得ることができた（データは示さない）。ｒＡＡＶ２－５ベクターについては、ｒＡｄＶベースの方法および標準的なプラスミドコトランスフェクション手法の両方で得られた収量がかなり低かった。この結果は、既報である、ＡＡＶ５カプシド構造とのＡＡＶ２ Ｒｅｐタンパク質およびＡＡＶ－２ ＡＡＶ－２ ＩＴＲの適合性の欠如（Chiorini et al., 1999a、Chiorini et al., 1999b）によって説明され得る。また、ｒＡＡＶ－２ベクターについて上述したｒＡＡＶベクター粒子のクロマトグラフィー精製を用いた初期の中規模アッセイにおいて、ゲノム粒子における収量は、それぞれの陽性対照のものと同等であったか、またはそれよりも高かった。

【0133】

これらの所見は、ｒＡｄＶベースのｒＡＡＶパッケージングのセットアップが、一般的なＡＡＶ血清型およびカプシド変異体へと好都合に適用され得ることを暗示する。

【0134】

考察
種々のヒト遺伝子疾患の処置へのＡＡＶベースのベクターの適用の成功は、ｒＡＡＶ大規模生産システムの需要の増加をもたらした。毒性学、安全性、用量、および体内分布の評価のための前臨床研究だけでも、多くの場合、大型動物モデルにおける全身適用については特に、最大で１Ｅ１５から１Ｅ１６のベクターゲノムを必要とし得る（Clement and Grieger, 2016）。臨床試験において使用される多くのベクターが依然として懸濁細胞に適合した従来のプラスミドコトランスフェクションプロトコールによって生産されているが、専ら感染ベースのｒＡＡＶパッケージングシステムは、取り扱い易く、高度に精製されたプラスミドＤＮＡを大量に必要としないという点で有利であり得る（Clement and Grieger, 2016、Grieger et al., 2016）。哺乳動物細胞の場合、このようなシステムは、組換え型単純ヘルペスウイルス（ｒＨＳＶ）を用いて実施に成功しており（Conway et al., 1999）、臨床研究で使用するための大規模生産に適合されている（Clement et al., 2009）。アデノウイルス（Ａｄ）は、原型的な（Atchison et al., 1965）、かつ最もよく特性解析されているＡＡＶヘルパーウイルスを表すが、専ら第一世代の組換え型アデノウイルス（ｒＡｄＶ）に基づくｒＡＡＶパッケージングシステムには、これまで、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質を発現するｒＡｄＶの限られた複製および安定性という問題があった（Zhang et al., 2001）。

【0135】

我々のｒＡｄＶベースの新規システムへの鍵のうちの１つは、シスでアデノウイルス複製を阻害する（Sitaraman et al., 2011、Weger et al., 2016）、ｒｅｐ遺伝子の３’部におけるＡＡＶ－２配列であるＲＩＳ－Ａｄの機能的不活性化であった。ＲＩＳ－Ａｄは、一方ではＲｅｐコード領域の一部として、また一方ではｐ４０プロモーター駆動によるｃａｐ転写のための制御領域として、ＡＡＶ－２複製における二重機能を有するため、我々は、ＲｅｐおよびＣａｐのＯＲＦを別々のｒＡｄＶに割り当てた。この手法はまた、相対的なＲｅｐおよびＣａｐの発現レベルの調整に関する高い柔軟性を提供し、非ＡＡＶ－２血清型ベクターまたはカプシド変異体にシステムを適合させることを容易にする。ＲＩＳ－Ａｄ内の厳密に制限された領域（ｓＲｅｐという）におけるＲｅｐ ＯＲＦの再コードは、Ｒｅｐタンパク質の安定なｒＡｄＶ媒介性発現を可能にした。シス阻害性配列として作用するＲＩＳ－Ａｄに加えて、大型Ｒｅｐタンパク質であるＲｅｐ７８／Ｒｅｐ６８は、トランスでアデノウイルス複製を制限し得る（Timpe et al., 2006、Weger et al., 2014）。したがって、ＭＭＴＶ－ＬＴＲの制御下での低減したＲｅｐ７８／Ｒｅｐ６８発現が、従来のコトランスフェクションシステムを用いた組換え型ＡＡＶ粒子の生産のために有利であることも示されていることから（Grimm et al., 1998）、低い（ＭＭＴＶ－ＬＴＲ）または厳重に調節された（Ｍ２－Ｔｅｔ）発現に関して、Ｒｅｐ７８発現のためのプロモーターを最初に選択した。これらの考察の妥当性は、我々が、ｐ５プロモーター制御下で再コードされたＲｅｐ７８を発現するｒＡｄＶを安定に増殖させるのに失敗したことによって確認されたが、この限られた安定性には、ｐ５領域内の多機能性Ｒｅｐ結合エレメントとのＲｅｐ７８の相互作用が関与している可能性もある（Murphy et al., 2007）。ｐＳｈｕｔｔｌｅトランスファープラスミドについて見られた、ドキシサイクリンによるＣＭＶ－Ｍ２－Ｔｅｔ媒介性ｓＲｅｐ７８発現の強力な誘導は、対応するｒＡｄＶでは失われた。類似のシステムでは、再コードされたＲｅｐ７８タンパク質の誘導が保たれることが示されているため（Sitaraman et al., 2011）、その理由は完全に明らかではない。特筆すべきことに、後者のシステムにおいて、Ｍ２トランスアクチベーターの発現は、ＨＳＶ－ＴＫプロモーターによって駆動されており、我々のコンストラクトのようにＣＭＶプロモーターによって駆動されてはいなかった。低いＲｅｐ７８誘導にもかかわらず、ｒＡｄＶ－Ｍ２－Ｔｅｔ－ｓＲｅｐにおけるＲｅｐ７８のＲｅｐ５２に対する比は、我々の研究の全体を通して陽性対照として使用した、ｒＡＡＶ－２パッケージングコトランスフェクションプロトコール（Grimm et al., 1998）のために最適化されたｐＤＧプラスミドについて見られたものと同様であった。しかし、ｒＡｄＶ－Ｍ２－Ｔｅｔ－ｓＲｅｐによる組換え型ＡＡＶゲノムのＤＮＡ複製は、この陽性対照と比較するとわずかに低減したように見受けられた。ｐＤＧトランスフェクションと比較して、ＭＭＴＶプロモーターは、対応するｒＡｄＶによる感染後、明らかに低下したＲｅｐ７８／Ｒｅｐ５２比をもたらした。結果として、ｒＡｄＶ－ＭＭＴＶ－ｓＲｅｐは、ｒＡＡＶ－ＤＮＡ複製およびパッケージングの促進においてｒＡｄＶ－Ｍ２－Ｔｅｔ－ｓＲｅｐほど有効ではなく、したがって、さらなる追求は行わなかった。我々の研究の過程において、ＡＡＶ－２イントロンによってコードされる配列が欠如した大型Ｒｅｐタンパク質の発現のためのＨＳＶ－ＴＫプロモーターを使用することにより、ｒＡｄＶ媒介性ｒＡＡＶパッケージングのさらなる向上が実現された。これらは、ｒＡＡＶ－ＤＮＡ複製を支持するうえで完全に機能的であり、ｒＡｄＶにおいて高レベルで発現することができた。ＡＡＶ－２イントロンによってコードされるタンパク質ドメインは、直接的なタンパク質間相互作用を介してＰＫＡ活性を阻害することにより、アデノウイルス複製を抑制することが示されている（Di Pasquale and Chiorini, 2003）。これらの所見と一致して、我々は、ＨＳＶ－ＴＫプロモーターの制御下で発現される再コードされたＲｅｐ７８タンパク質を含むｒＡｄＶを安定に増殖させることができなかった（データは示さない）。ＨＳＶ－ＴＫプロモーターは、試験した一連の細胞プロモーターおよびウイルスプロモーターのうち、ＡＡＶ－２カプシドタンパク質の安定かつ高レベルの発現をもたらすことが見出された唯一のものでもあったため、ＡＡＶ－２機能のｒＡｄＶ媒介性発現のためにそれを使用することは、我々の新規システムのもう１つの重要な構成要素であった。この異種ウイルスプロモーターは、アデノウイルスまたはＡＡＶ機能による阻害に対する屈折性（ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅｎｅｓｓ）が高いため、ＡＡＶ－２機能のｒＡｄ媒介性発現のために特に好適であるという仮説が立てられる。

【0136】

カプシド含有量により判断された、ゲノム含有ｒＡＡＶ粒子に対する空粒子の大過剰が、我々の初期のｒＡｄＶ－Ｍ２－Ｔｅｔ－ｓＲｅｐベースのｒＡＡＶパッケージングシステムの主要な欠点のうちの１つであると思われた。空粒子は、ベクター適用後の自然免疫応答および適応免疫応答を増加させる可能性を有する（Mingozzi and High, 2013）。臨床グレードのベクター調製物の下流精製は、通常、例えばイオン交換クロマトグラフィーによる、このような空粒子の除去を要する（Qu et al., 2007）。重要なことに、ｒＡｄＶ－ＨＳＶ－ＴＫ－ｓＲｅｐ１／５３０を用いる進歩したシステムは、ｒＡＡＶゲノムのより高い複製につながり、標準的なコトランスフェクションプロトコールと比べて同様かまたはさらに低い割合の空粒子をもたらした。特筆すべきことに、特定の量の空粒子は、インビボのｒＡＡＶ形質導入のために有益ですらあり得る。デコイとして機能する最大で１００倍過剰量の空カプシドが、第ＩＸ因子遺伝子療法において、形質導入効率を喪失することなく、全身ｒＡＡＶデリバリーを行う際の主要な課題である既存のＢ細胞媒介性液性免疫を克服するために使用されている（Mingozzi et al., 2013）。これに関して、我々は、高力価のウイルス様粒子（ＶＬＰ）調製物が、ｒＡｄＶ－ＨＳＶ－ＴＫ－Ｃａｐ単独での感染によって効率的に生産され得ることを実証することができた（図示せず）。概して、２つの別々のｒＡｄＶからのＲｅｐおよびＣａｐの発現は、広範囲にわたり、カプシドレベルを調整し、それによってほぼ確実に空粒子の割合も調整する可能性を提供する。

【0137】

大規模なｒＡＡＶベクターパッケージングにおいてｒＡｄＶを定型的に使用するためには、これらが複数の増幅工程を通じて高いゲノム安定性を示す必要がある。特筆すべきことに、組み合わされた野生型ＲｅｐおよびＣａｐの発現カセットを含有するｒＡｄベクターについては、ほんの数回の増幅ラウンドにおいて、このカセットの部分的な喪失が報告された（Zhang et al., 2001）。これに対し、我々のｒＡｄＶは、ｒＡｄＶ－Ｍ２－Ｔｅｔ－ｓＲｅｐおよびｒＡｄＶ－ＨＳＶ－ＴＫ－Ｃａｐについては少なくとも１５回の増幅ラウンド、そしてｒＡｄＶ－ＨＳＶ－ＴＫ－ｓＲｅｐ１／５３０の場合には少なくとも１０回の増幅ラウンドにわたり、ゲノムの完全性および導入遺伝子発現に関して完全に安定であった。機能的な大型Ｒｅｐタンパク質の向上した発現のための後者のベクターについては、この１０回目の増幅ラウンド以降は試験していない。ｒＡｄＶ－ＨＳＶ－ＴＫ－ｓＲｅｐ１／５３０と比較して７つの追加のカルボキシ末端アミノ酸を含有するｒＡｄＶ－ＨＳＶ－ＴＫ－ｓＲｅｐ６８ベクターについては、増幅ラウンド６を始点として、Ｒｅｐ発現およびｒＡＡＶパッケージングの支持の低減が観察された。これは、先行ラウンド（日付は示さない（ｄａｔｅ ｎｏｔ ｓｈｏｗｎ））からの物質の再増幅後にも認められた。実に驚くべきことに、増幅中に導入遺伝子カセットの一部の欠失は起こらなかったが、より大きなバンドがＰＣＲ分析において現れ、導入遺伝子配列の重複の可能性が示唆された。ユニークな７つのカルボキシ末端アミノ酸のうちの１つである^５３５ＳにおけるＲｅｐ６８のリン酸化は、１４－３－３タンパク質ファミリーのメンバーとのその相互作用を媒介し、Ｒｅｐ６８－Ｓ５３５Ａ点突然変異体は、ＡＡＶ ＤＮＡ複製の促進において野生型タンパク質よりも効率的である（Han et al., 2004）。我々は、ｒＡｄ導入遺伝子カセットにおける推定上の重複がこのような相互作用に起因し得るかどうかについては、未だ解明していない。しかし、我々は、Ｒｅｐ６８固有の７つのアミノ酸を欠いている部分的に再コードされたｓＲｅｐ１／５３０タンパク質が、ｒＡＡＶ ＤＮＡ複製に関して完全に機能的であり、ｒＡｄＶ内で安定に増殖できることについては、しっかりと確立した。

【0138】

最初のｒＡｄＶ－Ｍ２－Ｔｅｔ－ｓＲｅｐに関し、ピーク画分のみを考慮した、精製後の異なるｒＡｄＶベースのｒＡＡＶ生産スキームでのバーストサイズは、７×１０^３～１．６×１０^４ｖｇ／ｃ（ベクターゲノム／細胞）の範囲内であり、したがって、高いトランスフェクション効率において標準的なプラスミドコトランスフェクションシステムとよく似ていた。これは、ｒＡＡＶ鋳型が、プラスミドのトランスフェクションによって提供されたか、少量のスターターｒＡＡＶベクターを用いた感染によって提供されたか、またはｒＡｄ／ｒＡＡＶハイブリッドベクターによって提供されたかに関係しなかった。カルボキシ末端欠失型ｓＲｅｐ１／５３０タンパク質を使用する向上したシステムは、スターターｒＡＡＶベクターの増幅を使用して少なくとも２倍高い収量につながり、アフィニティー精製後にほぼ３×１０^４ｖｇ／ｃのバーストサイズをもたらした。最適化されたｒＨＳＶベースのｒＡＡＶ生産システムは、現在、粗製の細胞ライセートまたは上清において８×１０^４～１×１０^５ｖｇ／ｃの最大バーストサイズを呈し（Chulay et al., 2011、Thomas et al., 2009）、大規模調製物の精製後に約２．０×１０^４ｖｇ／ｃの最終収量をもたらす（Chulay et al., 2011、Clement and Grieger, 2016）。Ｒｅｐ／Ｃａｐ発現および導入遺伝子のデリバリーのためにいくつかの組換え型バキュロウイルス（ｒＢａｃ）を用いる最初のＳｆ９昆虫細胞ベースのｒＡＡＶ生産システム（Urabe et al., 2002）は、バイオリアクタースケールの生産において２×１０^４ｖｇ／ｃのｒＡＡＶバーストサイズをもたらすのが普通である（Cecchini et al., 2011）。宿主ゲノムに安定に組み込まれたＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を含有するＳｆ９細胞株を用いた場合、イオジキサノール勾配遠心分離後に最大で１．４×１０^５ｖｇ／ｃ（Aslanidi et al., 2009）、粗製細胞ライセートでは９×１０^４ｖｇ／ｃ（Mietzsch et al., 2015）のｒＡＡＶ－２収量が報告されている。

【0139】

大規模ｒＡＡＶ生産のための十分に確立されたｒＨＳＶおよびバキュロウイルスに基づくシステムと比較して、ベクター収量における明らかな差はあまりないが、それでも、我々のｒＡｄＶベースの新規プロトコールは有利な代替手段を提示し得ると我々は考える。主な利点の１つとしては、標準的なＨＥＫ２９３細胞株における連続継代によって、ＲｅｐまたはＣａｐ発現を喪失することなく、対応するｒＡｄＶを高い力価まで容易に増幅させることができる。これに対し、ＨＳＶベースのシステムは、増殖のために対応する細胞株によって補完されなければならないＩＣＰ２７欠失型ｒＨＳＶベクターに依拠しており、必要なｒＨＳＶ成分の収量がかなり低くなる（Clement et al., 2009）。さらに、ｒＨＳＶは通常、第一世代アデノウイルスベクターほど安定しておらず、取り扱い易くもない。昆虫細胞における第一世代ｒＡＡＶパッケージングシステムにおいて使用された、ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質を発現する組換え型バキュロウイルスは、遺伝子的に不安定である（Kohlbrenner et al., 2005、Smith et al., 2009）。この問題は、前述のＳｆ９ ｒｅｐおよびｃａｐパッケージング細胞株によって対処されたが、昆虫細胞ベースのシステムについて残っている大きな課題は、ｒＨＳＶまたはプラスミドコトランスフェクション生成によるｒＡＡＶと比較して、報告されている粒子対感染力比が著しく高いこと（＞１０００）である。これは、適正な比率で３つのカプシドタンパク質を発現させるのが困難であり（Kohlbrenner et al., 2005、Urabe et al., 2002）、いくつかのＡＡＶ血清型では限定的なＶＰ１量が発現される（Mietzsch et al., 2015）ことに起因し得る。哺乳動物細胞および昆虫細胞におけるＡＡＶカプシドタンパク質の示差的翻訳後修飾も、昆虫細胞において生産されるベクターの形質導入効率の低下に寄与し得る（Rumachik et al., 2020）。

【0140】

我々は、ｒＡｄＶ媒介性パッケージング用のｒＡＡＶ鋳型を提供するための２つの異なる感染ベースの手法を研究した。一方は、ＡＡＶ－ＩＴＲによってフランキングされた導入遺伝子カセットを提供する第３のｒＡｄＶに依拠するものであり、他方の手法では、少量のスターターｒＡＡＶベクターを増幅させる。いくつかの理由で、我々は、簡略化された感染ベースの大規模ｒＡＡＶ生産システムのために、後者のシステムの方が好ましいと考える。予めパッケージングされたｒＡＡＶスターターベクターは、標準的なコトランスフェクションプロセスを使用して生産することができる。これは、新規の治療用遺伝子および／または制御エレメントを含む導入遺伝子カセットが、ＡＡＶ－ＩＴＲベースのベクタープラスミドへのクローニングおよび初期特性解析の直後に、大規模生産プロセスへと移され得ることを意味する。他の感染ベースのｒＡＡＶパッケージングシステムでは必要とされる、新しい導入遺伝子特異的なヘルパーウイルスまたはパッケージング株の長時間を要する生成が、省略され得る。ｒＡｄＶ三重感染システムは、パッケージングしようとする各導入遺伝子のために新規ｒＡｄＶを生成する必要性に加えて、再現可能な取り扱いに関するいくつかの問題も提起した。３つの個別のｒＡｄＶを用いた場合、２つだけを用いた場合よりも、異なるｒＡｄＶの間の競合効果が顕著であり、最適化がかなり困難になる。これは例えば、より高い量のＩＴＲ－ＧＦＰ－ｒＡｄＶがｒＡＡＶベクターの収量を強く低減させている図１２パネルＩＩＩにおいて見ることができ、その原因は、他の２つのｒＡｄＶからのＲｅｐおよびＣａｐタンパク質レベルの低下（図示せず）であるのがほぼ確実である。これに対し、ｒＡＡＶ増幅スキームにおける投入ｒＡＡＶベクターの量は、パッケージング効率を喪失することなく、広範囲にわたって変化させることができた（図１６Ｄ）。ｒＡｄ／ｒＡＡＶハイブリッドベクターは大規模ｒＡＡＶ調製において既に使用されているが（Zhang et al., 2009）、増幅ラウンドの増加に伴うｒＡＡＶパッケージング効率のいくらかの低下も認められた（データは示さない）。

【0141】

我々の研究によって実証されたように、２つの安定な第一世代組換え型アデノウイルスからＡＡＶ２ ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質を別々に発現させることには、大規模ｒＡＡＶ生産のための大きな見込みがある。このパッケージングシステムをＨＥＫ２９３懸濁細胞に適合させ、かつ／または、さらなるｒＡＡＶ血清型およびカプシド変異体に拡大適用することが可能である。
［実施例２］

【0142】

非ＡＡＶ２血清型のためのｒＡｄＶ媒介性ベクター増幅の使用
ＡＡＶ－２ ＩＴＲ（逆方向末端反復）によってフランキングされたＧＦＰ導入遺伝子を含む単量体ｒＡＡＶサブタイプ２ベクターを、接着性ＨＥＫ２９３細胞において、ｒＡｄＶ－ＨＳＶ－ＴＫ－ｓＲｅｐ１／５３０（ＡＡＶ血清型２）と、ＡＡＶ－１またはＡＡＶ－８血清型発現のためのそれぞれのｒＡｄ－ＨＳＶ－ＴＫ－Ｃａｐ（図１７）との重感染によって増幅させた。増幅プロセス中、ＡＡＶ－２フランキングベクターゲノムは、これにより、それぞれＡＡＶ－１またはＡＡＶ－８カプシドで偽型化される。増幅されたベクターをアフィニティー精製し、その収量を、同数の細胞に対して並行して行ったそれぞれの標準的なコトランスフェクションプロトコールと比較した（図１８ＡおよびＢ）。

【0143】

材料および方法
ｒＡＡＶ－２－ＧＦＰ（５０ＧＰ／細胞のＭＯＩ）、ｒＡｄＶ－ＨＳＶ－ＴＫ－ｓＲｅｐ１／５３０（ＡＡＶ血清型２、４００～５００ＧＰ／細胞のＭＯＩ）、およびｒＡｄ－ＨＳＶ－ＴＫ－Ｃａｐ－ＡＡＶ－１（４００～５００ＧＰ／細胞のＭＯＩ）を用いた８×１０^７個の接着性ＨＥＫ２９３細胞の重感染によって、偽型ｒＡＡＶ血清型１（ｒＡＡＶ２／１）－ＧＦＰベクターについてのｒＡｄＶ媒介性ベクター増幅を行った。コトランスフェクションプロトコールでは、２７０μｇのｐＤＰ１－ｒｓヘルパープラスミド（ＡＡＶ－２ Ｒｅｐ遺伝子、ＡＡＶ－１ Ｃａｐ遺伝子、ならびにアデノウイルスヘルパー機能Ｅ２ａ、Ｅ４ｏｒｆ６およびＶＡ－ＲＮＡを含有する）と、実施例１で既に上述したような９０μｇのベクタープラスミドｐＴＲ－ＵＦ５との混合物を用いたリン酸カルシウム沈降技法によって、８×１０^７個のＨＥＫ２９３細胞をコトランスフェクトした。

【0144】

偽型ｒＡＡＶ血清型８（ｒＡＡＶ２／８）－ＧＦＰベクターについては、ｒＡＡＶ－２－ＧＦＰ（ＭＯＩ ５０ＧＰ／細胞）、ｒＡｄＶ－ＨＳＶ－ＴＫ－ｓＲｅｐ１／５３０（ＡＡＶ血清型２、ＭＯＩ ２００～４００ＧＰ／細胞）、およびｒＡｄ－ＨＳＶ－ＴＫ－Ｃａｐ－ＡＡＶ－８（ＭＯＩ ２０００ＧＰ／細胞）を用いた重感染によってｒＡｄＶ増幅を行った。コトランスフェクションプロトコールでは、１８０μｇのｐＨｅｌｐｅｒプラスミド（アデノウイルスヘルパー機能Ｅ２ａ、Ｅ４ｏｒｆ６およびＶＡ－ＲＮＡを含有する）、９０μｇのｐＡＡＶ２－８（ＡＡＶ－２ ＲｅｐおよびＡＡＶ－８ Ｃａｐ）、および９０μｇのベクタープラスミドｐＴＲ－ＵＦ５の混合物を用いた。トランスフェクションを用いる手法では、細胞培地をトランスフェクションの１６時間後に新鮮培地に置き換えた。細胞は概してトランスフェクション／感染の６４時間後に回収した。

【0145】

実施例１に記載したようなＡＶＢセファロースマトリックス上でのＨＰＬＣアフィニティークロマトグラフィーによる凍結融解ライセートの一工程ベクター精製の後に、使用された細胞当たりのパッケージングされたベクターゲノム（ＧＰ／細胞）の数を示すバーストサイズを評価した。

【0146】

結果
ｒＡＡＶ２／１－ＧＦＰベクターのｒＡｄＶ媒介性増幅は、ＡＡＶ Ｒｅｐ血清型２およびＣａｐ血清型１機能ならびにアデノウイルスヘルパー機能の発現のためにベクタープラスミドおよびｐＤＰ１ｒｓプラスミドを用いる２プラスミドシステムに基づく標準的なコトランスフェクション方法によって得られた並行調製物と比較して、３～４倍良好なゲノム粒子収量をもたらした（図１８Ａ）。本発明に係る方法を用いて実現されたバーストサイズは、アフィニティー精製後に１×１０^４の範囲内であった。

【0147】

ｒＡＡＶ２／８－ＧＦＰベクターのｒＡｄＶ媒介性増幅は、ベクタープラスミド、アデノウイルスヘルパー機能のためのｐＨｅｌｐｅｒプラスミド、ならびにＡＡＶ Ｒｅｐ血清型２およびＣａｐ血清型８機能の発現のためのｐＡＡＶ２－８プラスミドを含む３プラスミドシステムに基づく標準的なコトランスフェクション方法を用いて行われた並行調製において得られたものと同等のゲノム粒子収量をもたらした。本発明に係る方法によって実現されたバーストサイズは、アフィニティー精製後に７．５×１０^３～１×１０^４の範囲内であった（図１８Ｂ）。特筆すべきことに、ｒＡｄＶ媒介性ベクター増幅によって得られたｒＡＡＶ２／８－ＧＦＰ粒子については、コトランスフェクション手順によって得られたものと比較して、インビトロで永久細胞（ＨｅＬａ）のおよそ２～３倍良好な形質導入が認められた。

【0148】

まとめると、ｒＡｄＶ媒介性ｒＡＡＶ増幅は、それぞれのコトランスフェクション方法と比較すると、ＡＡＶ血清型１および８について著しく高い収量（２～４倍）の形質導入単位（ＴＵ）を可能にした。
［実施例３］

【0149】

ＨＥＫ２９３懸濁細胞へのｒＡｄＶ媒介性ｒＡＡＶ血清型２増幅の適合
異なるＨＥＫ２９３懸濁細胞におけるＡＡＶ血清型２についてのｒＡｄＶ媒介性ｒＡＡＶ－ＧＦＰ増幅の収量を評価した（図１９）。

【0150】

材料および方法
ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３－Ｆ細胞［Ｇｉｂｃｏ（登録商標）］またはＥｘｐｉ２９３Ｆ（商標）［Ｇｉｂｃｏ（登録商標）］を、それぞれ、対応する無血清培地［Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ＭｅｄｉｕｍまたはＥｘｐｉ２９３（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ、すべてＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃによる］において培養し、感染の前日に５×１０^５／ｍＬの細胞密度で播種した。１×１０^６／ｍＬの密度で、５００ｍＬのＰＥＴＧ三角フラスコ内の１００ｍＬの細胞培養物（１×１０^８細胞）を、ｒＡＡＶ－２－ＧＦＰ（ＭＯＩ ８０ＧＰ／細胞）、ｒＡｄＶ－ＨＳＶ－ＴＫ－ｓＲｅｐ１／５３０（ＡＡＶ血清型２、ＭＯＩ ６００ＧＰ／細胞）、およびｒＡｄ－ＨＳＶ－ＴＫ－Ｃａｐ－ＡＡＶ－２（ＭＯＩ ４００ＧＰ／細胞）の混合物によって４４時間にわたり重感染させた。感染細胞を遠心分離によって回収した後、凍結融解ライセートを調製し、基本的に接着性ＨＥＫ２９３細胞について上述したとおりのＡＶＢセファロースマトリックス上でのＨＰＬＣアフィニティークロマトグラフィーによる一工程ベクター精製に供した。

【0151】

結果
ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３－ＦおよびＥｘｐｉ２９３Ｆ（商標）の両細胞について、ｒＡｄＶ媒介性ｒＡＡＶ－２－ＧＦＰベクター増幅は、使用された細胞当たりゲノム粒子０．７～１．０×１０^４個の範囲内の、アフィニティー精製済みｒＡＡＶ－２－ＧＦＰベクター調製物の高度に再現可能なバーストサイズをもたらした。
［実施例４］

【0152】

組換え型アデノウイルスベクター（ｒＡｄＶ）との関連におけるＡＡＶ ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質の発現に関する好適性についての様々なＨＳＶ－ＴＫプロモーター変異体および追加のウイルスプロモーターの詳細な分析。
以下では、アデノウイルスとの関連におけるＡＡＶ ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質の発現のためのＨＳＶ－ＴＫプロモーター内の個々の配列エレメントの重要性を試験した（図２０）。さらに、２つの追加のウイルスプロモーター、すなわちＲＳＶ（レトロウイルスであるラウス肉腫ウイルスのＵ３領域）プロモーターと、初期ＳＶ４０プロモーター（シミアンウイルス４０、ポリオーマウイルス）とを、ｒＡｄＶとの関連においてＲｅｐおよびＣａｐタンパク質を発現する好適性について同様に調査した。

【0153】

材料および方法
図２０Ａに示すＨＳＶ－ＴＫプロモーターエレメント、ＲＳＶ Ｕ３領域、またはＳＶ４０初期プロモーターのいずれかの制御下でｓＲｅｐ１／５３０またはＡＡＶ－２ Ｃａｐタンパク質を発現するｐＳｈｕｔｔｌｅコンストラクトを、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＪ５１８３－ＡＤ－１細胞における相同組換えのために使用し、その後、実施例１に記載したようなｒＡｄＶの生成のための対応するｐＡｄＥａｓｙコンストラクトを接着性ＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。次いで、ＨＥＫ２９３細胞における２回のさらなるｒＡｄＶ増幅ラウンドを行った。

【0154】

結果
文献によると、ＨＳＶ－ＴＫプロモーターの活性に重要なエレメントは、ＴＡＴＡボックス、近位Ｓｐ１結合部位、ＣＣＡＡＴボックス（ＣＴＦのための結合部位）、および遠位Ｓｐ１結合部位を含む。

【0155】

予想されたように、完全長ＨＳＶ－ＴＫプロモーター（ＨＳＶ－ＦＬ）は依然として、ＲｅｐまたはＣａｐ発現を大きく喪失することなく（それぞれ図２０ＢおよびＣ）、５’末端において（遠位Ｓｐ１部位に対して、コンストラクトＨＳＶ－１０６）、９０塩基対だけ短縮することができた。５’配列のさらなる欠失（遠位Ｓｐ１部位およびＣＣＡＡＴボックスの欠失、コンストラクトＨＳＶ－５９）に応じて、対応するｒＡｄＶ ｃａｐは、Ｃａｐ発現の著しい喪失を呈したが、ｒＡｄＶ－Ｒｅｐに対して活性は概ね保存された。

【0156】

ＴＡＴＡボックスに加えて遠位Ｓｐ１部位のみを含有するｒＡｄＶでは、ＣＣＡＡＴボックスの存在および配向にかかわらず、完全長ＨＳＶ－ＴＫプロモーターと比較して、ほんのわずかに低減したＲｅｐまたはＣａｐの発現が観察可能であった（コンストラクトＨＳＶ－Ｍ１からＨＳＶ－Ｍ４。Ｒｅｐについては、コンストラクトＨＳＶ－Ｍ３がいくらか遅れたｒＡｄＶ形成を示したため、これについては試験しなかった）。興味深いことに、大小のＲｅｐタンパク質の比率は、完全長ＨＳＶ－ＴＫプロモーターと比較して、小型Ｒｅｐタンパク質に有利なようにわずかにシフトしているように見受けられた。小型Ｒｅｐタンパク質はパッケージング工程に必須であるため、このことは、これらのコンストラクトを含むｒＡＡＶベクターのパッケージングのために潜在的に有利であり得る。

【0157】

ＲＳＶプロモーターについては、ＡＡＶ－２ Ｒｅｐタンパク質（Ｃ末端部分が再コードされた切断型Ｒｅｐタンパク質、ｒＡＡＶパッケージングのために首尾よく使用されるｒＡｄＶと同じＲｅｐカセット）の発現のためにも、ＡＡＶ－２ Ｃａｐタンパク質の発現のためにも、安定なｒＡｄＶを生成することができなかった（データは示さない）。実施例１において示した他のプロモーターと同様に、ＲＳＶプロモーターの使用は、アデノウイルス複製を阻害するようであった。

【0158】

これに対し、ＳＶ４０プロモーターは、対照コンストラクトと同様の効率および収量で、Ｒｅｐ発現およびＣａｐ発現の両方のための組換え型アデノウイルスを首尾よく生成した。後者は、ＣＭＶ－ＧＦＰカセットを含むｒＡｄＶの形成をもたらし、ｒＡｄＶの生成中、ＨＥＫ２９３細胞におけるトランスフェクションおよびｒＡｄＶ形成のための対照として常に含まれた。第１ラウンドから第２ラウンドの増幅後、ＳＶ４０プロモーターを含むｒＡｄＶは、ＨＳＶ－ＴＫプロモーターを搭載したｒＡｄＶと同等である、切断型の大小のＲｅｐタンパク質ならびに３つのｃａｐタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３のそれぞれの発現を示した（図２０ＢおよびＣ）。

【0159】

結論
初期ＳＶ４０プロモーターおよびＨＳＶ－ＴＫプロモーターの共通の特徴は、それらの活性が主に細胞転写因子Ｓｐ１の結合部位によって調節されること、そして、ＴＡＴＡボックス以外に他の配列エレメントは必要ないと思われることである。

【0160】

総括すると、これらの結果は、Ｓｐ１結合部位が、ＡＡＶ－２ ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質の発現のためのｒＡｄＶの生成を成功させるために特に重要なプロモーターエレメントを表すことを示唆している（Ｒｅｐタンパク質の場合において示されたように、部分的な再コードおよびＣ末端の切断は、必要とされる重要な追加の特徴を表す）。

【0161】

参考文献

【表3】

【表4】

【表5】

【表6】

【表7】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9A】

【図9B】

【図10A-B】

【図10C】

【図11A】

【図11B-C】

【図12A-B】

【図13A-B】

【図13C-D】

【図14A-B】

【図14C-D】

【図15】

【図16A-D】

【図16E-F】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【配列表】

2024525121000001.app

【国際調査報告】