特表 2024-525142 ＡＡＶベクターカラム精製方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-07-10

(54)【発明の名称】ＡＡＶベクターカラム精製方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 7/02 20060101AFI20240703BHJP

【ＦＩ】

C12N7/02

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023576326

(86)(22)【出願日】2022-06-10

(85)【翻訳文提出日】2024-02-07

(86)【国際出願番号】 US2022072859

(87)【国際公開番号】W WO2022261663

(87)【国際公開日】2022-12-15

(31)【優先権主張番号】63/209,680

(32)【優先日】2021-06-11

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/366,094

(32)【優先日】2022-06-09

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】518138077

【氏名又は名称】スパーク セラピューティクス インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】ＳＰＡＲＫ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ， ＩＮＣ．

(74)【代理人】

【識別番号】100094569

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 伸一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100103610

【弁理士】

【氏名又は名称】▲吉▼田 和彦

(74)【代理人】

【識別番号】100109070

【弁理士】

【氏名又は名称】須田 洋之

(74)【代理人】

【識別番号】100119013

【弁理士】

【氏名又は名称】山崎 一夫

(74)【代理人】

【識別番号】100123777

【弁理士】

【氏名又は名称】市川 さつき

(74)【代理人】

【識別番号】100111796

【弁理士】

【氏名又は名称】服部 博信

(74)【代理人】

【識別番号】100123766

【弁理士】

【氏名又は名称】松田 七重

(72)【発明者】

【氏名】カナル オンマル

(72)【発明者】

【氏名】クマール ヴィジェシュ

(72)【発明者】

【氏名】ジン ミ

【テーマコード（参考）】

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B065AA95X

4B065AB01

4B065BA02

4B065BD14

4B065CA44

(57)【要約】

本明細書には、ｒＡＡＶ粒子を精製するための、特に完全ｒＡＡＶ粒子及び不完全粒子を両方とも含むｒＡＡＶ調製物から完全ｒＡＡＶ粒子を精製するための方法が記載されている。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

完全組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を精製するための方法であって、
（ａ）完全ｒＡＡＶ粒子及び不完全ｒＡＡＶ粒子を含むｒＡＡＶ調製物を準備するステップ、
（ｂ）負荷緩衝液中の前記ｒＡＡＶ調製物を、クロマトグラフィー媒体を含むカラムに負荷するステップであり、前記完全ｒＡＡＶ粒子は、前記クロマトグラフィー媒体に対して前記不完全粒子よりも高い結合親和性を有し、前記カラムにアプライされる前記完全ｒＡＡＶ粒子及び前記不完全粒子の量は、前記クロマトグラフィー媒体の結合容量を超えており、前記クロマトグラフィー媒体に結合した前記不完全粒子は、前記完全ｒＡＡＶ粒子により置換され、前記カラムからフロースルーへ入る、ステップ、並びに
（ｃ）前記クロマトグラフィー媒体に結合した前記完全ｒＡＡＶ粒子を溶出緩衝液で溶出して、精製調製物を得るステップ
を含む方法。

【請求項2】

前記クロマトグラフィー媒体は、イオン交換カラムクロマトグラフィー媒体、好ましくは、陰イオン交換クロマトグラフィー媒体である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記カラムクロマトグラフィー媒体は、Ｐｏｒｏｓ５０ＨＱ、Ｐｏｒｏｓ５０Ｄ、Ｐｏｒｏｓ５０ＰＩ、Ｃａｐｔｏ ＩｍｐＲｅｓ Ｑ、ＣＩＭｍｕｌｔｕｓ^TMＱＡモノリシックカラム、及びＰｏｒｏｓ ＸＱからなる群から選択され、好ましくは、Ｐｏｒｏｓ ＸＱである、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

完全組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を精製するための方法であって、
（ａ）前記完全ｒＡＡＶ粒子及び不完全粒子を含むｒＡＡＶ調製物を準備するステップ、
（ｂ）負荷緩衝液中の前記ｒＡＡＶ調製物の第１のバッチを、第１のクロマトグラフィー媒体を含む第１のカラムに負荷するステップであり、前記完全ｒＡＡＶ粒子は、前記第１のクロマトグラフィー媒体に対して前記不完全粒子よりも高い結合親和性を有し、前記第１のカラムにアプライされる前記完全ｒＡＡＶ粒子及び前記不完全粒子の量は、前記第１のクロマトグラフィー媒体の結合容量を超えており、前記第１のクロマトグラフィー媒体に結合した前記不完全粒子は、前記完全ｒＡＡＶ粒子により置換され、前記第１のカラムから第１の負荷フロースルーへ入る、ステップ、
（ｃ）前記第１の負荷フロースルーを、第２のクロマトグラフィー媒体を含む第２のカラムに負荷して、負荷された又は部分的に負荷された第２のカラムを得るステップであり、前記第２のクロマトグラフィー媒体は、前記第１のクロマトグラフィー媒体と同じタイプである、ステップ、
（ｄ）任意選択で、前記第１のカラムを洗浄緩衝液で洗浄して、洗浄された第１のカラムを得るステップ、
（ｅ）前記第１のクロマトグラフィー媒体に結合した前記完全ｒＡＡＶ粒子を溶出緩衝液で溶出して、前記第１のカラムからの第１の溶出物及び溶出された第１のカラムを得るステップであり、前記第１の溶出物は、前記完全ｒＡＡＶ粒子対前記不完全ｒＡＡＶ粒子の増加した比を含む、ステップ、
（ｆ）任意選択で、負荷緩衝液中の前記ｒＡＡＶ調製物の第２のバッチを、前記少なくとも部分的に負荷された第２のカラムにアプライするステップであり、前記第２のカラムにアプライされる前記完全ｒＡＡＶ粒子及び前記不完全粒子の量は、前記第２のクロマトグラフィー媒体の結合容量を超えており、前記第２のクロマトグラフィー媒体に結合した前記不完全粒子は、前記完全ｒＡＡＶ粒子により置換され、前記第２のカラムから第２の負荷フロースルーへ入る、ステップ、
（ｇ）任意選択で、ステップ（ｅ）の後で、前記第２のカラムからの前記負荷フロースルーを前記溶出された第１のカラムに負荷して、第２の負荷された第１のカラムを得、任意選択で、ステップ（ｅ）で溶出を行う前に、第２の負荷された第１のカラムを洗浄するステップ、
（ｈ）任意選択で、前記第２のカラムを洗浄緩衝液で洗浄して、洗浄された第２のカラムを得るステップ、
（ｉ）前記第２のクロマトグラフィー媒体に結合した前記完全ｒＡＡＶ粒子を溶出緩衝液で溶出して、第２の溶出物及び溶出された第２のカラムを得るステップであり、前記第２の溶出物は、前記完全ｒＡＡＶ粒子対前記不完全ｒＡＡＶ粒子の増加した比を含む、ステップ、並びに
（ｊ）前記第１の溶出物及び前記第２の溶出物を一緒にして、完全ｒＡＡＶ粒子の精製調製物を生成するステップ
を含む方法。

【請求項5】

前記第１のクロマトグラフィー媒体及び／又は前記第２のクロマトグラフィー媒体は、イオン交換カラムクロマトグラフィー媒体、好ましくは、陰イオン交換クロマトグラフィー媒体である、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

前記ステップ（ｂ）～（ｉ）は、１回又は複数回のサイクルで実施される、請求項４又は５に記載の方法。

【請求項7】

前記第２のカラムは、ステップ（ｃ）の後で部分的に負荷される、請求項４～６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記第１のカラムクロマトグラフィー媒体は、Ｐｏｒｏｓ５０ＨＱ、Ｐｏｒｏｓ５０Ｄ、Ｐｏｒｏｓ５０ＰＩ、Ｃａｐｔｏ ＩｍｐＲｅｓ Ｑ、ＣＩＭｍｕｌｔｕｓ^TMＱＡモノリシックカラム、及びＰｏｒｏｓ ＸＱからなる群から選択され、好ましくは、Ｐｏｒｏｓ ＸＱである、請求項４～７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

完全組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を精製するための方法であって、
（ａ）前記完全ｒＡＡＶ粒子及び不完全粒子を含むｒＡＡＶ調製物を準備するステップ、
（ｂ）負荷緩衝液中の前記ｒＡＡＶ調製物の第１のバッチを、第１のクロマトグラフィー媒体を含む第１のカラムに負荷するステップであり、前記完全ｒＡＡＶ粒子は、前記第１のクロマトグラフィー媒体に対して前記不完全粒子よりも高い結合親和性を有し、前記第１のカラムにアプライされる前記完全ｒＡＡＶ粒子及び前記不完全粒子の量は、前記第１のクロマトグラフィー媒体の結合容量を超えており、前記第１のクロマトグラフィー媒体に結合した前記不完全粒子は、前記完全ｒＡＡＶ粒子により、前記第１のカラムからの第１の負荷フロースルーへと置換される、ステップ、
（ｃ）前記第１の負荷フロースルーを、第２のクロマトグラフィー媒体を含む第２のカラムに負荷して、負荷された又は部分的に負荷された第２のカラムを得るステップであり、前記第２のクロマトグラフィー媒体は、前記第１のクロマトグラフィー媒体と同じタイプである、ステップ、
（ｄ）任意選択で、前記第１のカラムを洗浄緩衝液で洗浄して、洗浄された第１のカラムを得るステップ、
（ｅ）前記第１のクロマトグラフィー媒体に結合した前記完全ｒＡＡＶ粒子を溶出緩衝液で溶出して、前記第１のカラムからの第１の溶出物及び溶出された第１のカラムを得るステップであり、前記第１の溶出物は、前記完全ｒＡＡＶ粒子対前記不完全ｒＡＡＶ粒子の増加した比を含む、ステップ、
（ｆ）任意選択で、負荷緩衝液中の前記ｒＡＡＶ調製物の第２のバッチを、前記少なくとも部分的に負荷された第２のカラムにアプライするステップであり、前記第２のカラムにアプライされる前記完全ｒＡＡＶ粒子及び前記不完全粒子の量は、前記第２のクロマトグラフィー媒体の結合容量を超えており、前記第２のクロマトグラフィー媒体に結合した前記不完全粒子は、前記完全ｒＡＡＶ粒子により置換され、前記第２のカラムから第２の負荷フロースルーへ入る、ステップ、
（ｇ）前記第２のカラムからの前記第２の負荷フロースルーを、第３のクロマトグラフィー媒体を含む第３のカラムに負荷して、負荷された又は部分的に負荷された第３のカラムを得るステップであり、好ましくは、前記第３のクロマトグラフィー媒体は、前記第１のクロマトグラフィー媒体と同じタイプである、ステップ、
（ｈ）任意選択で、前記第２のカラムを洗浄緩衝液で洗浄して、洗浄された第２のカラムを得るステップ、
（ｉ）ステップ（ｋ）の後で、又は洗浄ステップ（ｌ）が実施される場合には前記洗浄ステップ（ｌ）の後で、前記第１のカラムをバイパスし、前記第２のクロマトグラフィー媒体に結合した前記完全ｒＡＡＶ粒子を溶出緩衝液で溶出して、第２の溶出物及び溶出された第２のカラムを得るステップであり、前記第２の溶出物は、前記完全ｒＡＡＶ粒子対前記不完全ｒＡＡＶ粒子の増加した比を含む、ステップ、
（ｊ）任意選択で、前記第２カラムフロースルー後に前記第３のカラムが飽和（つまり、負荷）されていない場合、負荷緩衝液中の前記ｒＡＡＶ調製物の第３バッチを、前記部分的に負荷された第３のカラムにアプライしてもよく、前記第３のカラムにアプライされる前記完全ｒＡＡＶ粒子及び前記不完全粒子の量は、前記第３のクロマトグラフィー媒体の結合容量を超えており、前記第３のクロマトグラフィー媒体に結合した前記不完全粒子は、前記完全ｒＡＡＶ粒子により置換され、前記第３のカラムから第３の負荷フロースルーへ入る、ステップ、
（ｋ）ステップ（ｎ）が実施される場合、ステップ（ｄ）と（ｅ）との間で、前記第３のカラムからの前記第３の負荷フロースルーを、前記洗浄された第１のカラムに負荷して、第２の負荷された第１のカラムを得、任意選択で、ステップ（ｅ）で溶出を行う前に、第２の負荷された第１のカラムを洗浄する、ステップ、
（ｌ）任意選択で、前記第３のカラムを洗浄緩衝液で洗浄して、洗浄された第３のカラムを得るステップ、
（ｍ）前記第１のカラム及び前記第２のカラムをバイパスし、前記第３のクロマトグラフィー媒体に結合した前記完全ｒＡＡＶ粒子を溶出緩衝液で溶出して、第３の溶出物及び溶出された第３のカラムを得るステップであり、前記第３の溶出物は、前記完全ｒＡＡＶ粒子対前記不完全ｒＡＡＶ粒子の増加した比を含む、ステップ、並びに
（ｎ）前記第１の溶出物、前記第２の溶出物、及び前記第３の溶出物を一緒にして、完全ｒＡＡＶ粒子の精製調製物を生成するステップ
を含む方法。

【請求項10】

前記第１のクロマトグラフィー媒体及び／又は前記第２のクロマトグラフィー媒体及び／又は前記第３のクロマトグラフィー媒体は、イオン交換カラムクロマトグラフィー媒体、好ましくは、陰イオン交換クロマトグラフィー媒体である、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

前記ステップ（ｂ）～（ｍ）は、１回又は複数回のサイクルで実施される、請求項９又は１０に記載の方法。

【請求項12】

前記第２のカラムは、ステップ（ｃ）の後で部分的に負荷される、請求項９～１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

前記第３のカラムは、ステップ（ｇ）の後で部分的に負荷される、請求項９～１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

前記第１のカラムクロマトグラフィー媒体は、Ｐｏｒｏｓ５０ＨＱ、Ｐｏｒｏｓ５０Ｄ、Ｐｏｒｏｓ５０ＰＩ、Ｃａｐｔｏ ＩｍｐＲｅｓ Ｑ、ＣＩＭｍｕｌｔｕｓ^TMＱＡモノリシックカラム、及びＰｏｒｏｓ ＸＱからなる群から選択され、好ましくは、Ｐｏｒｏｓ ＸＱである、請求項９～１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

前記不完全粒子は、空粒子及び／又は部分粒子を含み、好ましくは空粒子及び部分粒子を両方とも含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項16】

前記負荷緩衝液は、Ｔｒｉｓ、Ｂｉｓ－ｔｒｉｓ、Ｂｉｓ－ｔｒｉｓプロパン、Ｔｒｉｓ酢酸、エタノールアミン、及びホスフェートからなる群から選択される少なくとも１つの緩衝剤を含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項17】

前記負荷緩衝液は、Ｋ（Ｉ）、Ｌｉ（Ｉ）、Ｃａ（ＩＩ）、Ｍｇ（ＩＩ）、Ｃｕ（ＩＩ）、Ｂａ（ＩＩ）、Ｃｏ（ＩＩ）、Ｎｉ（ＩＩ）、Ｍｎ（ＩＩ）、Ｚｎ（ＩＩ）、Ｃｄ（ＩＩ）、Ｐｂ（ＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩ）、Ｎａ（Ｉ）、及びＮＨ₄ ⁺からなる群から選択される陽イオンの少なくとも１つの塩を含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項18】

前記負荷緩衝液は、約１０～１００ｍＭのナトリウム塩、好ましくは２０～６０ｍＭ ＮａＣｌを含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

前記負荷緩衝液は、約０～２０ｍＭのマグネシウム塩、好ましくは１～１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂を含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項20】

前記負荷緩衝液は、約０～１０ｍＭのカルシウム塩、好ましくは０．１～２．５ｍＭ ＣａＣｌ₂を含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項21】

前記負荷緩衝液は、約０～１００ｍＭのリチウム塩、好ましくは０～７５ｍＭ ＬｉＣｌを含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項22】

前記負荷緩衝液は、約０～５ｍＭの銅塩、好ましくは０．１～２．５ｍＭ ＣｕＣｌ₂を含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項23】

前記負荷緩衝液は、約５～１００ｍＭのアンモニウム塩、好ましくは１０～５０ｍＭ （ＮＨ₄）₂ＳＯ₄を含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項24】

前記負荷緩衝液は、約２０～６０ｍＭ ＮａＣｌ、２０～５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１～５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、０～７５ｍＭ ＬｉＣｌ、０～１０ｍＭ ＣｕＣｌ₂、及び／又は０．１～２．５ｍＭ ＣａＣｌ₂を含む、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項25】

前記負荷緩衝液は、約２０～６０ｍＭ ＮａＣｌ、１０～３０ｍＭ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、１～５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、０．１～２．５ｍＭ ＣｕＣｌ₂を、好ましくはＴｒｉｓ中に、より好ましくは２０～１００ｍＭ Ｔｒｉｓ中に、含む、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項26】

前記負荷緩衝液は、約６～１０のｐＨを有する、請求項１～２５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項27】

前記負荷緩衝液は、ポロクサマー１８８、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０、ＮＰ－４０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、及びＴｒｉｔｏｎ ＣＧ－１１０からなる群から選択される少なくとも１つの界面活性剤を含む、請求項１～２６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項28】

前記負荷緩衝液中の前記界面活性剤の濃度は、０．０００１％～０．１％である、請求項２７に記載の方法。

【請求項29】

前記溶出緩衝液は、Ｋ（Ｉ）、Ｌｉ（Ｉ）、Ｃａ（ＩＩ）、Ｍｇ（ＩＩ）、Ｃｕ（ＩＩ）、Ｂａ（ＩＩ）、Ｃｏ（ＩＩ）、Ｎｉ（ＩＩ）、Ｍｎ（ＩＩ）、Ｚｎ（ＩＩ）、Ｃｄ（ＩＩ）、Ｐｂ（ＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩ）、Ｎａ（Ｉ）、及びＮＨ₄ ⁺からなる群から選択される陽イオンの少なくとも１つの塩を含む、請求項１～２８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項30】

前記溶出緩衝液は、約０～１０００ｍＭ ＮａＣｌ、好ましくは、２０～３００ｍＭ ＮａＣｌを含む、請求項１～２９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項31】

前記溶出緩衝液は、約０～３０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、好ましくは、２～１５ｍＭ ＭｇＣｌ₂を含む、請求項１～２９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項32】

前記溶出緩衝液は、約０～２００ｍＭ ＬｉＣｌ、好ましくは、０～１５０ｍＭ ＬｉＣｌを含む、請求項１～２９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項33】

前記溶出緩衝液は、約０．１～２０ｍＭ ＣａＣｌ₂、好ましくは、５～１０ｍＭ ＣａＣｌ₂を含む、請求項１～２９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項34】

前記溶出緩衝液は、約０～１０ｍＭ ＣｕＣｌ₂、好ましくは、０～３ｍＭ ＣｕＣｌ₂を含む、請求項１～２９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項35】

前記溶出緩衝液は、約５～１００ｍＭのアンモニウム塩、好ましくは１０～５０ｍＭ （ＮＨ₄）₂ＳＯ₄を含む、請求項１～２９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項36】

前記溶出緩衝液は、Ｔｒｉｓ、Ｂｉｓ－ｔｒｉｓ、Ｂｉｓ－ｔｒｉｓプロパン、Ｔｒｉｓ酢酸、エタノールアミン、及びホスフェートからなる群から選択される少なくとも１つの緩衝剤を含む、請求項１～３５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項37】

前記溶出緩衝液は、約２０～２００ｍＭ ＮａＣｌを、好ましくはＴｒｉｓ緩衝液中に、含む、請求項１～３６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項38】

前記溶出緩衝液は、ポロクサマー１８８、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０、ＮＰ－４０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、及びＴｒｉｔｏｎ ＣＧ－１１０からなる群から選択される少なくとも１つの界面活性剤を含む、請求項１～３７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項39】

前記溶出緩衝液中の前記界面活性剤の濃度は、０．０００１％～０．１％である、請求項３８に記載の方法。

【請求項40】

前記溶出緩衝液は、約６～１０、好ましくは８～９のｐＨを有する、請求項１～３９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項41】

前記ｒＡＡＶ調製物中の不純物は、前記完全ｒＡＡＶ粒子よりも高い親和性で前記第１のカラムに結合する、請求項９又は１０に記載の方法。

【請求項42】

完全組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を精製するための方法であって、
（ａ）前記完全ｒＡＡＶ粒子及び不完全粒子を含むｒＡＡＶ調製物を準備するステップ、
（ｂ）負荷緩衝液中の前記ｒＡＡＶ調製物を、クロマトグラフィー媒体を含むカラムに負荷するステップであり、前記負荷緩衝液はＣａＣｌ₂を含み、前記完全ｒＡＡＶ粒子は前記クロマトグラフィー媒体に結合する、ステップ、及び
（ｃ）前記クロマトグラフィー媒体に結合した前記完全ｒＡＡＶ粒子を溶出緩衝液で溶出して、精製調製物を得るステップであり、前記溶出緩衝液はＣａＣｌ₂を含む、ステップ
を含む方法。

【請求項43】

前記クロマトグラフィー媒体は、イオン交換カラムクロマトグラフィー媒体、好ましくは、陰イオン交換クロマトグラフィー媒体である、請求項４２に記載の方法。

【請求項44】

前記カラムクロマトグラフィー媒体は、Ｐｏｒｏｓ５０ＨＱ、Ｐｏｒｏｓ５０Ｄ、Ｐｏｒｏｓ５０ＰＩ、Ｃａｐｔｏ ＩｍｐＲｅｓ Ｑ、ＣＩＭｍｕｌｔｕｓ^TMＱＡモノリシックカラム、及びＰｏｒｏｓ ＸＱからなる群から選択され、好ましくは、Ｐｏｒｏｓ ＸＱである、請求項４３に記載の方法。

【請求項45】

前記負荷緩衝液は、Ｋ（Ｉ）、Ｌｉ（Ｉ）、Ｃａ（ＩＩ）、Ｍｇ（ＩＩ）、Ｃｕ（ＩＩ）、Ｂａ（ＩＩ）、Ｃｏ（ＩＩ）、Ｎｉ（ＩＩ）、Ｍｎ（ＩＩ）、Ｚｎ（ＩＩ）、Ｃｄ（ＩＩ）、Ｐｂ（ＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩ）、Ｎａ（Ｉ）、及びＮＨ₄ ⁺からなる群から選択される陽イオンの少なくとも１つの塩を含む、請求項４２～４４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項46】

前記負荷緩衝液は、約０～１０ｍＭ ＣａＣｌ₂、好ましくは、０．１～２．５ｍＭ ＣａＣｌ₂を含む、請求項４２～４５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項47】

前記負荷緩衝液は、約１０～１００ｍＭ ＮａＣｌ、好ましくは２０～６０ｍＭ ＮａＣｌを含む、請求項４２～４５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項48】

前記負荷緩衝液は、約０～２０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、好ましくは、１～１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂を含む、請求項４２～４５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項49】

前記負荷緩衝液は、約０～１００ｍＭ ＬｉＣｌ、好ましくは、０～７５ｍＭ ＬｉＣｌを含む、請求項４２～４５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項50】

前記負荷緩衝液は、約０～５ｍＭの銅塩、好ましくは０．１～２．５ｍＭ ＣｕＣｌ₂を含む、請求項４２～４５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項51】

前記負荷緩衝液は、約５～１００ｍＭのアンモニウム塩、好ましくは１０～５０ｍＭ （ＮＨ₄）₂ＳＯ₄を含む、請求項４２～４５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項52】

前記負荷緩衝液は、Ｔｒｉｓ、Ｂｉｓ－ｔｒｉｓ、Ｂｉｓ－ｔｒｉｓプロパン、Ｔｒｉｓ酢酸、エタノールアミン、及びホスフェートからなる群から選択される少なくとも１つの緩衝剤を含む、請求項４２～５１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項53】

前記負荷緩衝液は、約２０～６０ｍＭ ＮａＣｌ、１～５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、０～７５ｍＭ ＬｉＣｌ、０．１～２．５ｍＭ ＣａＣｌ₂を、好ましくは２０～５０ｍＭ Ｔｒｉｓ中に、含む、請求項４２～５２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項54】

前記負荷緩衝液は、約２０～６０ｍＭ ＮａＣｌ、１０～３０ｍＭ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、１～５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、０．１～２．５ｍＭ ＣｕＣｌ₂を、好ましくはＴｒｉｓ中に、より好ましくは２０～１００ｍＭ Ｔｒｉｓ中に、含む、請求項４２～５２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項55】

前記負荷緩衝液は、ポロクサマー１８８、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０、ＮＰ－４０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、及びＴｒｉｔｏｎ ＣＧ－１１０からなる群から選択される少なくとも１つの界面活性剤を含む、請求項４２～５４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項56】

前記負荷緩衝液中の前記界面活性剤の濃度は、０．０００１％～０．１％である、請求項５５に記載の方法。

【請求項57】

前記負荷緩衝液は、約６～１０、好ましくは８～９のｐＨを有する、請求項４２～５６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項58】

前記溶出緩衝液は、Ｋ（Ｉ）、Ｌｉ（Ｉ）、Ｃａ（ＩＩ）、Ｍｇ（ＩＩ）、Ｃｕ（ＩＩ）、Ｂａ（ＩＩ）、Ｃｏ（ＩＩ）、Ｎｉ（ＩＩ）、Ｍｎ（ＩＩ）、Ｚｎ（ＩＩ）、Ｃｄ（ＩＩ）、Ｐｂ（ＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩ）、Ｎａ（Ｉ）、及びＮＨ₄ ⁺からなる群から選択される陽イオンの少なくとも１つの塩を含む、請求項４２～５７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項59】

前記溶出緩衝液は、約０．１～２０ｍＭ ＣａＣｌ₂、好ましくは、５～１０ｍＭ ＣａＣｌ₂を含む、請求項４２～５８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項60】

前記溶出緩衝液は、約０～１０００ｍＭ ＮａＣｌ、好ましくは、２０～３００ｍＭ ＮａＣｌを含む、請求項４２～５８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項61】

前記溶出緩衝液は、約０～３０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、好ましくは、２～１５ｍＭ ＭｇＣｌ₂を含む、請求項４２～５８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項62】

前記溶出緩衝液は、約０～２００ｍＭ ＬｉＣｌ、好ましくは、０～１５０ｍＭ ＬｉＣｌを含む、請求項４２～５８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項63】

前記溶出緩衝液は、Ｔｒｉｓ、Ｂｉｓ－ｔｒｉｓ、Ｂｉｓ－ｔｒｉｓプロパン、Ｔｒｉｓ酢酸、エタノールアミン、及びホスフェートからなる群から選択される少なくとも１つの緩衝剤を含む、請求項４２～６２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項64】

前記溶出緩衝液は、約２０～２００ｍＭ ＮａＣｌを、好ましくは４０～６０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液中に、含む、請求項４２～６３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項65】

前記溶出緩衝液は、ポロクサマー１８８、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０、ＮＰ－４０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、及びＴｒｉｔｏｎ ＣＧ－１１０からなる群から選択される少なくとも１つの界面活性剤を含む、請求項４２～６４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項66】

前記溶出緩衝液中の前記界面活性剤の濃度は、０．０００１％～０．１％である、請求項６５に記載の方法。

【請求項67】

前記溶出緩衝液は、約６～１０、好ましくは８～９のｐＨを有する、請求項４２～６６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項68】

精製された完全ｒＡＡＶ粒子の収率は、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上である、請求項１～６７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項69】

前記精製調製物中の前記完全ｒＡＡＶ粒子対前期不完全粒子の比は、９：１以上、好ましくは４９：１以上である、請求項１～６８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項70】

前記不完全粒子は、空粒子及び／又は部分粒子を含み、好ましくは空粒子及び部分粒子を両方とも含む、請求項１～６９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項71】

部分ｒＡＡＶ粒子を精製するための方法であって、
（ｄ）空粒子及び部分粒子を含む不完全ｒＡＡＶ調製物を準備するステップ、
（ｅ）負荷緩衝液中の前記不完全ｒＡＡＶ調製物を、クロマトグラフィー媒体を含むカラムに負荷するステップであり、前記部分ｒＡＡＶ粒子は、前記クロマトグラフィー媒体に対して前記空粒子よりも高い結合親和性を有する、ステップ、並びに
（ｆ）前記クロマトグラフィー媒体に結合した前記部分ｒＡＡＶ粒子を溶出緩衝液で溶出して、精製調製物を得るステップ
を含む方法。

【請求項72】

前記完全ｒＡＡＶ粒子は、ポリペプチドをコードする導入遺伝子、又はｓｉＲＮＡ、アンチセンス分子、ｍｉＲＮＡ、リボザイム、及びｓｈＲＮＡからなる群から選択される核酸を含む、請求項１～７１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項73】

空組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を精製するための方法であって、
（ａ）前記空ｒＡＡＶ粒子、並びに完全ｒＡＡＶ粒子及び部分ｒＡＡＶ粒子の少なくとも１つを含むｒＡＡＶ調製物を準備するステップ、
（ｂ）負荷緩衝液中の前記ｒＡＡＶ調製物を、クロマトグラフィー媒体を含むカラムに負荷するステップであり、前記空ｒＡＡＶ粒子は、前記クロマトグラフィー媒体に対して前記完全粒子又は前記部分粒子よりも高い結合親和性を有し、前記カラムにアプライされる前記空ｒＡＡＶ粒子、並びに完全粒子及び部分粒子の前記少なくとも１つの量は、前記クロマトグラフィー媒体の結合容量を超えており、前記クロマトグラフィー媒体に結合した完全粒子及び部分粒子の前記少なくとも１つは、前記空ｒＡＡＶ粒子により置換され、前記カラムからフロースルーへ入る、ステップ、並びに
（ｃ）前記クロマトグラフィー媒体に結合した前記空ｒＡＡＶ粒子を溶出緩衝液で溶出して、精製調製物を得るステップ
を含む方法。

【請求項74】

前記ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ９．４７、ＡＡＶ９（ｈｕ１４）、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、Ｒｈ８、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ－２ｉ８、ＬＫ０３、ＲＨＭ４－１、ＤＪ、ＤＪ８、ＮＰ５９、Ａｎｃ－８０、及びそれらのバリアントからなる群から選択される１つ又は複数のＡＡＶに由来するカプシドを含む、請求項１～７３のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年６月１１日に出願された米国特許仮出願第６３／２０９，６８０号及び２０２２年６月９日に出願された米国特許仮出願第６３／３６６，０９４号に対する優先権を主張するものであり、こうした文献の開示は参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

本出願は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を精製するための方法に関する。より詳細には、本出願は、完全ｒＡＡＶ粒子及び非完全ｒＡＡＶ粒子を両方とも含む調製物から完全ｒＡＡＶ粒子を精製するための方法に関する。

【背景技術】

【0003】

遺伝子送達は、後天性疾患及び遺伝性疾患を治療するための有望な方法である。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に基づく系を含む、遺伝子移入を目的とした少なからぬウイルスに基づく系が報告されている。
ＡＡＶは、ディペンドウイルス属に属するヘルパー依存性ＤＮＡパルボウイルスである。ＡＡＶは、増殖性感染を生じさせるために、ヘルパーウイルス機能、例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、又はワクシニアを必要とする。
ＡＡＶは、幅広い宿主範囲を有し、好適なヘルパーウイルスの存在下にて、あらゆる種の細胞内で複製することができる。ＡＡＶは、いかなるヒト疾患又は動物疾患にも関連付けられておらず、組み込まれても宿主細胞の生物学的特性に有害効果を及ぼすことはないと考えられている。
ＡＡＶベクターは、目的の異種性核酸配列（例えば、治療用タンパク質をコードする選択された遺伝子、アンチセンス分子、リボザイム、ｍｉＲＮＡなどの核酸）を運搬するように、ＡＡＶゲノムの内部部分を全体的に又は部分的に欠失させ、逆位末端配列（ＩＴＲ）間に目的の異種性核酸配列を挿入することにより遺伝子操作することができる。ＩＴＲは、そのようなベクターにおいて機能を維持し、目的の異種性核酸配列を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の複製及びパッケージングを可能にする。また、異種性核酸配列は、典型的には、患者の標的細胞での核酸発現を駆動することが可能なプロモーター配列に連結されている。また、ポリアデニル化部位などの終結シグナルがベクターに含まれていてもよい。ｒＡＡＶゲノムＤＮＡは、正二十面体対称に配置された３つのカプシドタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３）の混合物を含むタンパク質殻であるウイルスカプシドにパッケージングされている。
組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）は、複数のグループによる幾つかの初期段階臨床治験において優れた治療的有望性を示している。承認に向けたこの新しいクラスの生物学的製剤の開発は、ベクター設計及び製造工程パラメーターが臨床等級ベクターの不純物プロファイルにどのような影響を及ぼすかについてのより良好な理解を含む、ベクター特徴付け及び品質管理方法を向上させることを含むことになる。

【0004】

ｒＡＡＶの生産に伴う課題の１つは、完全な遺伝物質を含まない「不完全」ｒＡＡＶ粒子の形成である。不完全ｒＡＡＶ粒子は、本明細書で使用される場合、「空」粒子及び「部分」粒子を含む、一連の粒子又はバリアントを指す。「部分」粒子は、本明細書では、一部の遺伝物質を有するが、完全粒子のように完全な遺伝物質を有していないｒＡＡＶ粒子を指す。ｒＡＡＶ媒介性遺伝子発現の臨床安全性及び有効性に対する不完全粒子（空粒子及び部分粒子を含む）の影響に疑念が生じたため、こうした種を完全粒子から除去又は分離するための精製方法の開発が必要となった。こうしたタイプのｒＡＡＶ粒子間の構造的類似性を考慮すると、不完全ＡＡＶ粒子と完全ＡＡＶ粒子とを効率的に分離するためのロバストで大規模化可能な精製方法の開発は依然として困難である。ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶにおける一本鎖ＤＮＡゲノムの存在及び長さが異なる。完全ｒＡＡＶ粒子を不完全粒子から分離するための様々な技法が開発されている。しかしながら、こうした技法では、設計された完全ｒＡＡＶ粒子は、低純度及び／又は低収率で得られることが多い。

【0005】

従って、空粒子又は部分粒子からの精製を含む、完全ｒＡＡＶ粒子を不完全粒子から高純度及び／又は高収率で精製するための新しい系及び方法の開発の必要性が依然として存在する。

【発明の概要】

【0006】

本出願は、カラムクロマトグラフィー技法を使用して、完全ｒＡＡＶ粒子並びに空粒子及び／又は部分粒子を含んでいてもよい不完全粒子を含むｒＡＡＶ調製物から、完全組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を精製するための方法及び系に関する。
１つの基本態様では、本出願は、完全組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を精製するための方法であって、
（ａ）完全ｒＡＡＶ粒子及び不完全粒子を含むｒＡＡＶ調製物を準備するステップ、
（ｂ）負荷緩衝液中のｒＡＡＶ調製物を、クロマトグラフィー媒体を含むカラムに負荷するステップであり、完全ｒＡＡＶ粒子は、クロマトグラフィー媒体に対して不完全粒子よりも高い結合親和性を有する、ステップ、及び
（ｃ）クロマトグラフィー媒体に結合した完全ｒＡＡＶ粒子を溶出緩衝液で溶出して、精製調製物を得るステップ
を含む方法に関する。

【0007】

一部の実施形態では、不完全粒子は空粒子を含む。
一部の実施形態では、不完全粒子は部分粒子を含む。
一部の実施形態では、不完全粒子は、空粒子及び部分粒子を含む。
一部の実施形態では、不完全粒子は、クロマトグラフィー媒体に結合せず、カラムを通過して流出する。
一部の実施形態では、部分粒子は、クロマトグラフィー媒体に結合せず、カラムを通過して流出する。
一部の実施形態では、カラムにアプライされる完全ｒＡＡＶ粒子及び空ｒＡＡＶ粒子の量は、クロマトグラフィー媒体の結合容量を超えており、クロマトグラフィー媒体に結合した空粒子は、完全ｒＡＡＶ粒子により、カラムからの負荷フロースルーへと置換される。
一部の実施形態では、カラムにアプライされる完全ｒＡＡＶ粒子及び不完全ｒＡＡＶ粒子の量は、クロマトグラフィー媒体の結合容量を超えており、クロマトグラフィー媒体に結合した空粒子は、部分ｒＡＡＶ粒子及び完全ｒＡＡＶ粒子により、カラムからの負荷フロースルーへと置換される。

【0008】

一部の実施形態では、カラムにアプライされる完全ｒＡＡＶ粒子及び不完全ｒＡＡＶ粒子の量は、クロマトグラフィー媒体の結合容量を超えており、クロマトグラフィー媒体に結合した空粒子及び部分粒子は、完全ｒＡＡＶ粒子により、カラムからの負荷フロースルーへと置換される。
一部の実施形態では、クロマトグラフィー媒体は、イオン交換カラムクロマトグラフィー媒体、好ましくは陰イオン交換クロマトグラフィー媒体である。
一部の実施形態では、カラムクロマトグラフィー媒体は、Ｐｏｒｏｓ５０ＨＱ、Ｐｏｒｏｓ５０Ｄ、Ｐｏｒｏｓ５０ＰＩ、Ｃａｐｔｏ ＩｍｐＲｅｓ Ｑ、及びＰｏｒｏｓ ＸＱからなる群から選択され、好ましくはＰｏｒｏｓ ＸＱである。
一部の実施形態では、カラムクロマトグラフィー媒体は、ＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（商標）ＱＡモノリシックカラムなどのモノリスである。
一部の実施形態では、負荷緩衝液は、Ｔｒｉｓ、Ｂｉｓ－ｔｒｉｓ、Ｂｉｓ－ｔｒｉｓプロパン、Ｔｒｉｓ酢酸、エタノールアミン、及びホスフェートからなる群から選択される少なくとも１つの緩衝剤を含む。
一部の実施形態では、負荷緩衝液は、Ｋ（Ｉ）、Ｌｉ（Ｉ）、Ｃａ（ＩＩ）、Ｍｇ（ＩＩ）、Ｃｕ（ＩＩ）、Ｂａ（ＩＩ）、Ｃｏ（ＩＩ）、Ｎｉ（ＩＩ）、Ｍｎ（ＩＩ）、Ｚｎ（ＩＩ）、Ｃｄ（ＩＩ）、Ｐｂ（ＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩ）、Ｎａ（Ｉ）、及びＮＨ₄ ⁺からなる群から選択される陽イオンの少なくとも１つの塩を含む。塩の陰イオン成分は、決定的なものではない。
一部の実施形態では、負荷緩衝液は、約６～１０、好ましくは８～９のｐＨを有する。

【0009】

一部の実施形態では、溶出緩衝液は、Ｔｒｉｓ、Ｂｉｓ－ｔｒｉｓ、Ｂｉｓ－ｔｒｉｓプロパン、Ｔｒｉｓ酢酸、エタノールアミン、及びホスフェートからなる群から選択される少なくとも１つの緩衝剤を含む。
一部の実施形態では、溶出緩衝液は、Ｋ（Ｉ）、Ｌｉ（Ｉ）、Ｃａ（ＩＩ）、Ｍｇ（ＩＩ）、Ｃｕ（ＩＩ）、Ｂａ（ＩＩ）、Ｃｏ（ＩＩ）、Ｎｉ（ＩＩ）、Ｍｎ（ＩＩ）、Ｚｎ（ＩＩ）、Ｃｄ（ＩＩ）、Ｐｂ（ＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩ）、Ｎａ（Ｉ）、及びＮＨ₄ ⁺からなる群から選択される陽イオンの少なくとも１つの塩を含む。塩の陰イオン成分は、決定的なものではない。
一部の実施形態では、溶出緩衝液は、約６～１０、好ましくは８～９のｐＨを有する。

【0010】

一部の実施形態では、精製された完全ｒＡＡＶ粒子の収率は７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上である。
一部の実施形態では、精製調製物は不完全粒子を実質的に含まない。他の実施形態では、精製調製物は、ｒＡＡＶ調製物よりも、完全ｒＡＡＶ粒子対不完全粒子の増加した比を含む。好ましくは、精製調製物中の完全ｒＡＡＶ粒子対不完全粒子の比は、９：１以上、例えば、１０：１、１５：１、２０：１、２５：１、３０：１、３５：１、４０：１、４５：１、若しくは５０：１以上、又はそれらの間の任意の比、より好ましくは４９：１以上である。
一部の実施形態では、完全ｒＡＡＶ粒子は、ポリペプチドをコードする導入遺伝子、又はｓｉＲＮＡ、アンチセンス分子、ｍｉＲＮＡ、リボザイム、及びｓｈＲＮＡからなる群から選択される核酸を含む。
一部の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ血清型に由来するカプシドを含む。
別の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、イオン交換クロマトグラフィー媒体に結合することが可能な遺伝子操作カプシドに由来するカプシドを含む。

【0011】

別の基本態様では、本出願は、完全組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を精製するための方法であって、
（ａ）完全ｒＡＡＶ粒子及び不完全粒子を含むｒＡＡＶ調製物を準備するステップ、
（ｂ）負荷緩衝液中のｒＡＡＶ調製物の第１のバッチを、第１のクロマトグラフィー媒体を含む第１のカラムに負荷するステップであり、完全ｒＡＡＶ粒子は、第１のクロマトグラフィー媒体に対して不完全粒子よりも高い結合親和性を有し、第１のカラムにアプライされる完全ｒＡＡＶ粒子及び不完全粒子の量は、第１のクロマトグラフィー媒体の結合容量を超えており、第１のクロマトグラフィー媒体に結合した不完全粒子は、完全ｒＡＡＶ粒子により、第１のカラムからの第１の負荷フロースルーへと置換される、ステップ、
（ｃ）第１の負荷フロースルーを、第２のクロマトグラフィー媒体を含む第２のカラムに負荷して、部分的に負荷された（つまり、完全には飽和していない）第２のカラムを得るステップであり、好ましくは、第２のクロマトグラフィー媒体は、第１のクロマトグラフィー媒体と同じタイプである、ステップ、
（ｄ）任意選択で、第１のカラムを洗浄緩衝液で洗浄して、洗浄された第１のカラムを得るステップ、
（ｅ）ステップ（ｃ）の後で、又は洗浄ステップ（ｄ）が実施される場合には洗浄ステップ（ｄ）の後で、第２のカラムをバイパスし、第１のクロマトグラフィー媒体に結合した完全ｒＡＡＶ粒子を溶出緩衝液で溶出して、第１のカラムからの第１の溶出物及び溶出された第１のカラムを得るステップであり、第１の溶出物は、完全ｒＡＡＶ粒子対不完全ｒＡＡＶ粒子の増加した比を含む、ステップ、
（ｆ）負荷緩衝液中のｒＡＡＶ調製物の第２のバッチを、部分的に負荷された第２のカラムに負荷するステップであり、第２のカラムにアプライされる完全ｒＡＡＶ粒子及び不完全な粒子の量は、第２のクロマトグラフィー媒体の結合容量を超えており、第２のクロマトグラフィー媒体に結合した不完全粒子は、完全ｒＡＡＶ粒子により、第２のカラムからの第２の負荷フロースルーへと置換される、ステップ、
（ｇ）第２の負荷フロースルーを、溶出された第１のカラムに負荷して、部分的に負荷された第１のカラムを得るステップ、
（ｈ）任意選択で、第２のカラムを洗浄緩衝液で洗浄して、洗浄された第２のカラムを得るステップ、
（ｉ）ステップ（ｇ）の後で、又は洗浄ステップ（ｈ）が実施される場合には洗浄ステップ（ｈ）の後で、第１のカラムをバイパスし、第２のクロマトグラフィー媒体に結合した完全ｒＡＡＶ粒子を溶出緩衝液で溶出して、第２の溶出物及び溶出された第２のカラムを得るステップであり、第２の溶出物は、完全ｒＡＡＶ粒子対不完全ｒＡＡＶ粒子の増加した比を含む、ステップ、並びに
（ｊ）第１の溶出物及び第２の溶出物を一緒にして、精製調製物を生成するステップ
を含む方法に関する。

【0012】

一部の実施形態では、不完全粒子は空粒子を含む。
一部の実施形態では、不完全粒子は部分粒子を含む。
一部の実施形態では、不完全粒子は、空粒子及び部分粒子を両方とも含む。
一部の実施形態では、不完全粒子が空粒子及び部分粒子を両方とも含む場合、ステップ（ｉ）の第２の溶出物は、完全ｒＡＡＶ粒子及び部分ｒＡＡＶ粒子対空ｒＡＡＶ粒子の増加した比を含む。
一部の実施形態では、２つよりも多くのカラムを使用することができ、２つが最低である。３カラム設定では、完全粒子は第１のカラムで富化され、部分粒子は、存在する場合、第２のカラムで富化され、空粒子は第３のカラムで富化される。一部の実施形態では、調製物中に不純物又は凝集体が存在する場合、不純物又は凝集体は、完全粒子よりも高い親和性で第１のカラムに結合する可能性がある。こうした実施形態では、完全粒子は、その後のカラムで富化されることになる。
一部の実施形態では、第１のクロマトグラフィー媒体及び／又は第２のクロマトグラフィー媒体は、イオン交換カラムクロマトグラフィー媒体、好ましくは陰イオン交換クロマトグラフィー媒体である。

【0013】

一部の実施形態では、第２のカラムは、第１のフロースルーを負荷した後で、部分的に負荷される。
一部の実施形態では、ステップ（ｂ）～（ｉ）は、１回のサイクル又は複数回のサイクルで実施される。
一部の実施形態では、次の負荷サイクルの前に、溶出されたカラムを、サイクル全体にわたって一貫したカラム結合容量を維持するために有益であるか又は必要であるその後のステップに供してもよい。例えば、そのようなステップとしては、これらに限定されないが、カラムのストリッピング、カラムの清浄化及び／若しくは消毒、並びに／又はカラムの再平衡化が挙げられる。
一部の実施形態では、第１又は第２のカラムクロマトグラフィー媒体は、Ｐｏｒｏｓ５０ＨＱ、Ｐｏｒｏｓ５０Ｄ、Ｐｏｒｏｓ５０ＰＩ、Ｃａｐｔｏ ＩｍｐＲｅｓ Ｑ、及びＰｏｒｏｓ ＸＱからなる群から選択され、好ましくはＰｏｒｏｓ ＸＱである。
一部の実施形態では、カラムクロマトグラフィー媒体は、ＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（商標）ＱＡモノリシックカラムなどのモノリスである。

【0014】

一部の実施形態では、負荷緩衝液は、Ｔｒｉｓ、Ｂｉｓ－ｔｒｉｓ、Ｂｉｓ－ｔｒｉｓプロパン、Ｔｒｉｓ酢酸、エタノールアミン、及びホスフェートからなる群から選択される少なくとも１つの緩衝剤を含む。
一部の実施形態では、負荷緩衝液は、Ｋ（Ｉ）、Ｌｉ（Ｉ）、Ｃａ（ＩＩ）、Ｍｇ（ＩＩ）、Ｃｕ（ＩＩ）、Ｂａ（ＩＩ）、Ｃｏ（ＩＩ）、Ｎｉ（ＩＩ）、Ｍｎ（ＩＩ）、Ｚｎ（ＩＩ）、Ｃｄ（ＩＩ）、Ｐｂ（ＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩ）、Ｎａ（Ｉ）、及びＮＨ₄ ⁺からなる群から選択される陽イオンの少なくとも１つの塩を含む。塩の陰イオン成分は、決定的なものではない。
一部の実施形態では、負荷緩衝液は、約６～１０、好ましくは８～９のｐＨを有する。
一部の実施形態では、負荷緩衝液は、少なくとも１つの界面活性剤を含む。
一部の実施形態では、負荷緩衝液中の界面活性剤は、ポロクサマー１８８、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０、ＮＰ－４０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、及びＴｒｉｔｏｎ ＣＧ－１１０からなる群から選択される。
一部の実施形態では、負荷緩衝液中の界面活性剤の濃度は、０．０００１％～０．１％である。

【0015】

一部の実施形態では、溶出緩衝液は、Ｔｒｉｓ、Ｂｉｓ－ｔｒｉｓ、Ｂｉｓ－ｔｒｉｓプロパン、Ｔｒｉｓ酢酸、エタノールアミン、及びホスフェートからなる群から選択される少なくとも１つの緩衝剤を含む。
一部の実施形態では、溶出緩衝液は、Ｋ（Ｉ）、Ｌｉ（Ｉ）、Ｃａ（ＩＩ）、Ｍｇ（ＩＩ）、Ｃｕ（ＩＩ）、Ｂａ（ＩＩ）、Ｃｏ（ＩＩ）、Ｎｉ（ＩＩ）、Ｍｎ（ＩＩ）、Ｚｎ（ＩＩ）、Ｃｄ（ＩＩ）、Ｐｂ（ＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩ）、Ｎａ（Ｉ）、及びＮＨ₄ ⁺からなる群から選択される陽イオンの少なくとも１つの塩を含む。塩の陰イオン成分は、決定的なものではない。
一部の実施形態では、溶出緩衝液は、約６～１０、好ましくは８～９のｐＨを有する。
一部の実施形態では、溶出緩衝液は、少なくとも１つの界面活性剤を含む。
一部の実施形態では、溶出緩衝液中の界面活性剤は、ポロクサマー１８８、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０、ＮＰ－４０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、及びＴｒｉｔｏｎ ＣＧ－１１０からなる群から選択される。

【0016】

一部の実施形態では、溶出緩衝液中の界面活性剤の濃度は、０．０００１％～０．１％である。
一部の実施形態では、精製された完全ｒＡＡＶ粒子の収率は、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上である。
一部の実施形態では、精製調製物は、不完全粒子を実質的に含まない。他の実施形態では、精製調製物は、ｒＡＡＶ調製物よりも、完全ｒＡＡＶ粒子対不完全粒子の増加した比を含む。好ましくは、精製調製物中の完全粒子対不完全粒子の比は、９：１以上、例えば、１０：１、１５：１、２０：１、２５：１、３０：１、３５：１、４０：１、４５：１、若しくは５０：１以上、又はそれらの間の任意の比、より好ましくは４９：１以上である。
一部の実施形態では、完全ｒＡＡＶ粒子は、ポリペプチドをコードする導入遺伝子、タンパク質をコードするか若しくは目的の転写物へと転写される核酸、又はｓｉＲＮＡ、アンチセンス分子、ｍｉＲＮＡ、リボザイム、及びｓｈＲＮＡからなる群から選択される核酸を含む。

【0017】

一部の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、Ｐｕｌｉｃｈｅｒｌａら、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．、１９巻（６号）１０７０～１０７８頁（２０１１年）（なかでも、ＡＡＶ９．４７を含むＡＡＶ９バリアントが記載されている）、米国特許第７，９０６，１１１号明細書（なかでもＡＡＶ９（ｈｕ１４）が記載されている）、第１０，５３２，１１１号明細書（なかでもＮＰ５９が記載されている）、第１０，７３８，０８７号明細書（なかでもＡｎｃ－８０が記載されている）、第９，１６９，２９９号明細書（「ＬＫ０３」が記載されている）、第９，８４０，７１９号明細書（「ＲＨＭ４－１」が記載されている）、第７，７４９，４９２号明細書、第７，５８８，７７２号明細書（「ＤＪ」及び「ＤＪ８」が記載されている）、第９，５８７，２８２号明細書、及び国際公開第２０１２／１４５６０１号パンフレット、国際公開第２０１３／１５８８７９号パンフレット、国際公開第２０１５／０１３３１３号パンフレット、国際公開第２０１８／１５６６５４号パンフレット、米国特許出願公開第２０１３／００５９７３２号明細書に示されているＡＡＶカプシドのバリアントを含む、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ９．４７、ＡＡＶ９（ｈｕ１４）、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、Ｒｈ８、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ－２ｉ８、ＬＫ０３、ＲＨＭ４－１、ＤＪ、ＤＪ８、ＮＰ５９、Ａｎｃ－８０、及びそれらのバリアントからなる群から選択される１つ又は複数のＡＡＶに由来するカプシドを含む。これら文献は全て、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0018】

別の基本態様では、本出願は、完全組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を精製するための方法であって、
（ａ）完全ｒＡＡＶ粒子及び不完全粒子を含むｒＡＡＶ調製物を準備するステップ、
（ｂ）負荷緩衝液中のｒＡＡＶ調製物を、クロマトグラフィー媒体を含むカラムに負荷するステップであり、負荷緩衝液はＣａＣｌ₂を含み、完全ｒＡＡＶ粒子はクロマトグラフィー媒体に結合する、ステップ、並びに
（ｃ）クロマトグラフィー媒体に結合した完全ｒＡＡＶ粒子を溶出緩衝液で溶出して、精製調製物を得るステップであり、溶出緩衝液は任意選択でＣａＣｌ₂を含む、ステップ
を含む方法に関する。

【0019】

一部の実施形態では、クロマトグラフィー媒体は、イオン交換カラムクロマトグラフィー媒体、好ましくは陰イオン交換クロマトグラフィー媒体である。
一部の実施形態では、カラムクロマトグラフィー媒体は、Ｐｏｒｏｓ５０ＨＱ、Ｐｏｒｏｓ５０Ｄ、Ｐｏｒｏｓ５０ＰＩ、Ｃａｐｔｏ ＩｍｐＲｅｓ Ｑ、及びＰｏｒｏｓ ＸＱからなる群から選択され、好ましくはＰｏｒｏｓ ＸＱである。
一部の実施形態では、負荷緩衝液は、少なくとも１つの界面活性剤を含む。
一部の実施形態では、負荷緩衝液中の界面活性剤は、ポロクサマー１８８、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０、ＮＰ－４０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、及びＴｒｉｔｏｎ ＣＧ－１１０からなる群から選択される。
一部の実施形態では、負荷緩衝液中の界面活性剤の濃度は、０．０００１％～０．１％である。

【0020】

一部の実施形態では、負荷緩衝液は、Ｔｒｉｓ、Ｂｉｓ－ｔｒｉｓ、Ｂｉｓ－ｔｒｉｓプロパン、Ｔｒｉｓ酢酸、エタノールアミン、及びホスフェートからなる群から選択される少なくとも１つの緩衝剤を含む。
一部の実施形態では、溶出緩衝液は、Ｔｒｉｓ、Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ、Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓプロパン、Ｔｒｉｓ酢酸、エタノールアミン、及びホスフェートからなる群から選択される少なくとも１つの緩衝剤を含む。
一部の実施形態では、負荷緩衝液は、Ｋ（Ｉ）、Ｌｉ（Ｉ）、Ｃａ（ＩＩ）、Ｍｇ（ＩＩ）、Ｃｕ（ＩＩ）、Ｂａ（ＩＩ）、Ｃｏ（ＩＩ）、Ｎｉ（ＩＩ）、Ｍｎ（ＩＩ）、Ｚｎ（ＩＩ）、Ｃｄ（ＩＩ）、Ｐｂ（ＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩ）、Ｎａ（Ｉ）、及びＮＨ₄ ⁺からなる群から選択される陽イオンの少なくとも１つの塩を含む。
一部の実施形態では、溶出緩衝液は、Ｋ（Ｉ）、Ｌｉ（Ｉ）、Ｃａ（ＩＩ）、Ｍｇ（ＩＩ）、Ｃｕ（ＩＩ）、Ｂａ（ＩＩ）、Ｃｏ（ＩＩ）、Ｎｉ（ＩＩ）、Ｍｎ（ＩＩ）、Ｚｎ（ＩＩ）、Ｃｄ（ＩＩ）、Ｐｂ（ＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩ）、Ｎａ（Ｉ）、及びＮＨ₄ ⁺からなる群から選択される陽イオンの少なくとも１つの塩を含む。

【0021】

一部の実施形態では、負荷緩衝液は、約０～１０ｍＭ ＣａＣｌ₂、好ましくは０．１～２．５ｍＭ ＣａＣｌ₂を含む。
一部の実施形態では、溶出緩衝液は、約０．１～２０ｍＭ ＣａＣｌ２、好ましくは５～１０ｍＭ ＣａＣｌ₂を含む。
一部の実施形態では、負荷緩衝液は、約０～１００ｍＭ ＬｉＣｌ、好ましくは０～７５ｍＭ ＬｉＣｌを含む。
一部の実施形態では、溶出緩衝液は、約０～２００ｍＭ ＬｉＣｌ、好ましくは０～１５０ｍＭ ＬｉＣｌを含む。
一部の実施形態では、負荷緩衝液は、約０～１０ｍＭ ＣｕＣｌ₂、好ましくは０．１～３ｍＭ ＣｕＣｌ₂を含む。
一部の実施形態では、溶出緩衝液は、約０～１０ｍＭ ＣｕＣｌ₂、好ましくは０～３ｍＭ ＣｕＣｌ₂を含む。
一部の実施形態では、負荷緩衝液は、ＮａＣｌ及び／又はＭｇＣｌ₂を更に含む。

【0022】

一部の実施形態では、負荷緩衝液は、約６～１０、好ましくは８～９のｐＨを有する。
一部の実施形態では、溶出緩衝液は、ＮａＣｌ及び／又はＭｇＣｌ₂を更に含む。
一部の実施形態では、溶出緩衝液は、少なくとも１つの界面活性剤を含む。
一部の実施形態では、溶出緩衝液中の界面活性剤は、ポロクサマー１８８、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０、ＮＰ－４０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、及びＴｒｉｔｏｎ ＣＧ－１１０からなる群から選択される。
一部の実施形態では、溶出緩衝液中の界面活性剤の濃度は、０．０００１％～０．１％である。
一部の実施形態では、溶出緩衝液は、約６～１０、好ましくは８～９のｐＨを有する。

【0023】

一部の実施形態では、精製された完全ｒＡＡＶ粒子の収率は、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上である。
一部の実施形態では、精製調製物は、不完全粒子を実質的に含まない。他の実施形態では、精製調製物は、ｒＡＡＶ調製物よりも、完全ｒＡＡＶ粒子対不完全粒子の増加した比を含む。好ましくは、精製調製物中の完全粒子対不完全粒子の比は、９：１以上、例えば、１０：１、１５：１、２０：１、２５：１、３０：１、３５：１、４０：１、４５：１、若しくは５０：１以上、又はそれらの間の任意の比、より好ましくは４９：１以上である。
一部の実施形態では、完全ｒＡＡＶ粒子は、ポリペプチドをコードする導入遺伝子、又はｓｉＲＮＡ、アンチセンス分子、ｍｉＲＮＡ、リボザイム、及びｓｈＲＮＡからなる群から選択される核酸を含む。

【0024】

一部の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、Ｐｕｌｉｃｈｅｒｌａら、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．、１９巻（６号）１０７０～１０７８頁（２０１１年）（なかでも、ＡＡＶ９．４７を含むＡＡＶ９バリアントが記載されている）、米国特許第７，９０６，１１１号明細書（なかでもＡＡＶ９（ｈｕ１４）が記載されている）、第１０，５３２，１１１号明細書（なかでもＮＰ５９が記載されている）、第１０，７３８，０８７号明細書（なかでもＡｎｃ－８０が記載されている）、第９，１６９，２９９号明細書（「ＬＫ０３」が記載されている）、第９，８４０，７１９号明細書（「ＲＨＭ４－１」が記載されている）、第７，７４９，４９２号明細書、第７，５８８，７７２号明細書（「ＤＪ」及び「ＤＪ８」が記載されている）、第９，５８７，２８２号明細書、及び国際公開第２０１２／１４５６０１号パンフレット、国際公開第２０１３／１５８８７９号パンフレット、国際公開第２０１５／０１３３１３号パンフレット、国際公開第２０１８／１５６６５４号パンフレット、米国特許出願公開第２０１３／００５９７３２号明細書に示されているＡＡＶカプシドのバリアントを含む、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ９．４７、ＡＡＶ９（ｈｕ１４）、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、Ｒｈ８、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ－２ｉ８、ＬＫ０３、ＲＨＭ４－１、ＤＪ、ＤＪ８、ＮＰ５９、Ａｎｃ－８０、及びそれらのバリアントからなる群から選択されるＡＡＶに由来する。これら文献は全て、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0025】

１つの基本態様では、本出願は、部分ｒＡＡＶ粒子を精製するための方法であって、
（ａ）空粒子及び部分粒子を含む不完全ｒＡＡＶ調製物を準備するステップ、
（ｂ）負荷緩衝液中の不完全ｒＡＡＶ調製物を、クロマトグラフィー媒体を含むカラムに負荷するステップであり、部分ｒＡＡＶ粒子は、クロマトグラフィー媒体に対して空粒子よりも高い結合親和性を有する、ステップ、並びに
（ｃ）クロマトグラフィー媒体に結合した部分ｒＡＡＶ粒子を溶出緩衝液で溶出して、精製調製物を得るステップ
を含む方法に関する。

【0026】

一部の実施形態では、カラムにアプライされる部分ｒＡＡＶ粒子及び空ｒＡＡＶ粒子の量は、クロマトグラフィー媒体の結合容量を超えており、クロマトグラフィー媒体に結合した空粒子は、部分ｒＡＡＶ粒子により、カラムからの負荷フロースルーへと置換される。
一部の実施形態では、クロマトグラフィー媒体は、イオン交換カラムクロマトグラフィー媒体、好ましくは陰イオン交換クロマトグラフィー媒体である。
一部の実施形態では、カラムクロマトグラフィー媒体は、Ｐｏｒｏｓ５０ＨＱ、Ｐｏｒｏｓ５０Ｄ、Ｐｏｒｏｓ５０ＰＩ、Ｃａｐｔｏ ＩｍｐＲｅｓ Ｑ、及びＰｏｒｏｓ ＸＱからなる群から選択され、好ましくはＰｏｒｏｓ ＸＱである。
一部の実施形態では、カラムクロマトグラフィー媒体は、ＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（商標）ＱＡモノリシックカラムなどのモノリスである。

【0027】

一部の実施形態では、負荷緩衝液は、Ｔｒｉｓ、Ｂｉｓ－ｔｒｉｓ、Ｂｉｓ－ｔｒｉｓプロパン、Ｔｒｉｓ酢酸、エタノールアミン、及びホスフェートからなる群から選択される少なくとも１つの緩衝剤を含む。
一部の実施形態では、負荷緩衝液は、Ｋ（Ｉ）、Ｌｉ（Ｉ）、Ｃａ（ＩＩ）、Ｍｇ（ＩＩ）、Ｃｕ（ＩＩ）、Ｂａ（ＩＩ）、Ｃｏ（ＩＩ）、Ｎｉ（ＩＩ）、Ｍｎ（ＩＩ）、Ｚｎ（ＩＩ）、Ｃｄ（ＩＩ）、Ｐｂ（ＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩ）、Ｎａ（Ｉ）、及びＮＨ₄ ⁺からなる群から選択される陽イオンの少なくとも１つの塩を含む。塩の陰イオン成分は、決定的なものではない。
一部の実施形態では、負荷緩衝液は、約６～１０、好ましくは８～９のｐＨを有する。
一部の実施形態では、負荷緩衝液は、少なくとも１つの界面活性剤を含む。
一部の実施形態では、負荷緩衝液中の界面活性剤は、ポロクサマー１８８、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０、ＮＰ－４０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、及びＴｒｉｔｏｎ ＣＧ－１１０からなる群から選択される。
一部の実施形態では、負荷緩衝液中の界面活性剤の濃度は、０．０００１％～０．１％である。

【0028】

一部の実施形態では、溶出緩衝液は、Ｔｒｉｓ、Ｂｉｓ－ｔｒｉｓ、Ｂｉｓ－ｔｒｉｓプロパン、Ｔｒｉｓ酢酸、エタノールアミン、及びホスフェートからなる群から選択される少なくとも１つの緩衝剤を含む。
一部の実施形態では、溶出緩衝液は、Ｋ（Ｉ）、Ｌｉ（Ｉ）、Ｃａ（ＩＩ）、Ｍｇ（ＩＩ）、Ｃｕ（ＩＩ）、Ｂａ（ＩＩ）、Ｃｏ（ＩＩ）、Ｎｉ（ＩＩ）、Ｍｎ（ＩＩ）、Ｚｎ（ＩＩ）、Ｃｄ（ＩＩ）、Ｐｂ（ＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩ）、Ｎａ（Ｉ）、及びＮＨ₄ ⁺からなる群から選択される陽イオンの少なくとも１つの塩を含む。塩の陰イオン成分は、決定的なものではない。
一部の実施形態では、溶出緩衝液は、約６～１０、好ましくは８～９のｐＨを有する。
一部の実施形態では、溶出緩衝液は、少なくとも１つの界面活性剤を含む。
一部の実施形態では、溶出緩衝液中の界面活性剤は、ポロクサマー１８８、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０、ＮＰ－４０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、及びＴｒｉｔｏｎ ＣＧ－１１０からなる群から選択される。

【0029】

一部の実施形態では、溶出緩衝液中の界面活性剤の濃度は、０．０００１％～０．１％である。
一部の実施形態では、精製調製物は、空粒子を実質的に含まない。他の実施形態では、精製調製物は、ｒＡＡＶ調製物よりも、部分ｒＡＡＶ粒子対空粒子の増加した比を含む。好ましくは、精製調製物中の部分ｒＡＡＶ粒子対空粒子の比は、９：１以上、例えば、１０：１、１５：１、２０：１、２５：１、３０：１、３５：１、４０：１、４５：１、若しくは５０：１以上、又はそれらの間の任意の比、より好ましくは４９：１以上である。
一部の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ血清型に由来するカプシドを含む。
別の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、イオン交換クロマトグラフィー媒体に結合することが可能な遺伝子操作カプシドに由来するカプシドを含む。

【0030】

一部の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、Ｐｕｌｉｃｈｅｒｌａら、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．、１９巻（６号）１０７０～１０７８頁（２０１１年）（なかでも、ＡＡＶ９．４７を含むＡＡＶ９バリアントが記載されている）、米国特許第７，９０６，１１１号明細書（なかでもＡＡＶ９（ｈｕ１４）が記載されている）、第１０，５３２，１１１号明細書（なかでもＮＰ５９が記載されている）、第１０，７３８，０８７号明細書（なかでもＡｎｃ－８０が記載されている）、第９，１６９，２９９号明細書（「ＬＫ０３」が記載されている）、第９，８４０，７１９号明細書（「ＲＨＭ４－１」が記載されている）、第７，７４９，４９２号明細書、第７，５８８，７７２号明細書（「ＤＪ」及び「ＤＪ８」が記載されている）、第９，５８７，２８２号明細書、及び国際公開第２０１２／１４５６０１号パンフレット、国際公開第２０１３／１５８８７９号パンフレット、国際公開第２０１５／０１３３１３号パンフレット、国際公開第２０１８／１５６６５４号パンフレット、米国特許出願公開第２０１３／００５９７３２号明細書に示されているＡＡＶカプシドのバリアントを含む、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ９．４７、ＡＡＶ９（ｈｕ１４）、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、Ｒｈ８、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ－２ｉ８、ＬＫ０３、ＲＨＭ４－１、ＤＪ、ＤＪ８、ＮＰ５９、Ａｎｃ－８０、及びそれらのバリアントからなる群から選択されるＡＡＶに由来する。これら文献は全て、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0031】

１つの基本態様では、本出願は、空ｒＡＡＶ粒子を精製するための方法であって、
（ａ）空ｒＡＡＶ粒子並びに完全ｒＡＡＶ粒子及び部分ｒＡＡＶ粒子の少なくとも１つを含むｒＡＡＶ調製物を準備するステップ、
（ｂ）負荷緩衝液中のｒＡＡＶ調製物を、クロマトグラフィー媒体を含むカラムに負荷するステップであり、空ｒＡＡＶ粒子は、クロマトグラフィー媒体に対して完全粒子又は部分粒子よりも高い結合親和性を有し、カラムにアプライされる空ｒＡＡＶ粒子並びに完全粒子及び部分粒子の少なくとも１つの量は、クロマトグラフィー媒体の結合容量を超えており、クロマトグラフィー媒体に結合した完全粒子及び部分粒子の少なくとも１つは、空ｒＡＡＶ粒子により、カラムからのフロースルーへと置換される、ステップ、並びに
（ｃ）クロマトグラフィー媒体に結合した空ｒＡＡＶ粒子を溶出緩衝液で溶出して、精製調製物を得るステップ
を含む方法に関する。

【0032】

一部の実施形態では、カラムにアプライされる空ｒＡＡＶ粒子並びに完全粒子及び部分粒子の量は、クロマトグラフィー媒体の結合容量を超えており、クロマトグラフィー媒体に結合した完全粒子及び部分粒子の少なくとも１つは、空ｒＡＡＶ粒子により、カラムからの負荷フロースルーへと置換される。
一部の実施形態では、ｒＡＡＶ調製物は完全粒子を含む。
一部の実施形態では、ｒＡＡＶ調製物は部分粒子を含む。
一部の実施形態では、ｒＡＡＶ調製物は完全粒子及び部分粒子を両方とも含む。
一部の実施形態では、クロマトグラフィー媒体は、イオン交換カラムクロマトグラフィー媒体、好ましくは陰イオン交換クロマトグラフィー媒体である。
一部の実施形態では、カラムクロマトグラフィー媒体は、Ｐｏｒｏｓ５０ＨＱ、Ｐｏｒｏｓ５０Ｄ、Ｐｏｒｏｓ５０ＰＩ、Ｃａｐｔｏ ＩｍｐＲｅｓ Ｑ、及びＰｏｒｏｓ ＸＱからなる群から選択され、好ましくはＰｏｒｏｓ ＸＱである。

【0033】

一部の実施形態では、カラムクロマトグラフィー媒体は、ＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（商標）ＱＡモノリシックカラムなどのモノリスである。
一部の実施形態では、負荷緩衝液は、Ｔｒｉｓ、Ｂｉｓ－ｔｒｉｓ、Ｂｉｓ－ｔｒｉｓプロパン、Ｔｒｉｓ酢酸、エタノールアミン、及びホスフェートからなる群から選択される少なくとも１つの緩衝剤を含む。
一部の実施形態では、負荷緩衝液は、Ｋ（Ｉ）、Ｌｉ（Ｉ）、Ｃａ（ＩＩ）、Ｍｇ（ＩＩ）、Ｃｕ（ＩＩ）、Ｂａ（ＩＩ）、Ｃｏ（ＩＩ）、Ｎｉ（ＩＩ）、Ｍｎ（ＩＩ）、Ｚｎ（ＩＩ）、Ｃｄ（ＩＩ）、Ｐｂ（ＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩ）、Ｎａ（Ｉ）、及びＮＨ₄ ⁺からなる群から選択される陽イオンの少なくとも１つの塩を含む。塩の陰イオン成分は、決定的なものではない。
一部の実施形態では、負荷緩衝液は、約６～１０、好ましくは８～９のｐＨを有する。

【0034】

一部の実施形態では、負荷緩衝液は少なくとも１つの界面活性剤を含む。
一部の実施形態では、負荷緩衝液中の界面活性剤は、ポロクサマー１８８、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０、ＮＰ－４０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、及びＴｒｉｔｏｎ ＣＧ－１１０からなる群から選択される。
一部の実施形態では、負荷緩衝液中の界面活性剤の濃度は、０．０００１％～０．１％である。
一部の実施形態では、溶出緩衝液は、Ｔｒｉｓ、Ｂｉｓ－ｔｒｉｓ、Ｂｉｓ－ｔｒｉｓプロパン、Ｔｒｉｓ酢酸、エタノールアミン、及びホスフェートからなる群から選択される少なくとも１つの緩衝剤を含む。
一部の実施形態では、溶出緩衝液は、Ｋ（Ｉ）、Ｌｉ（Ｉ）、Ｃａ（ＩＩ）、Ｍｇ（ＩＩ）、Ｃｕ（ＩＩ）、Ｂａ（ＩＩ）、Ｃｏ（ＩＩ）、Ｎｉ（ＩＩ）、Ｍｎ（ＩＩ）、Ｚｎ（ＩＩ）、Ｃｄ（ＩＩ）、Ｐｂ（ＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩ）、Ｎａ（Ｉ）、及びＮＨ₄ ⁺からなる群から選択される陽イオンの少なくとも１つの塩を含む。塩の陰イオン成分は、決定的なものではない。

【0035】

一部の実施形態では、溶出緩衝液は、約６～１０、好ましくは８～９のｐＨを有する。
一部の実施形態では、溶出緩衝液は、少なくとも１つの界面活性剤を含む。
一部の実施形態では、溶出緩衝液中の界面活性剤は、ポロクサマー１８８、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０、ＮＰ－４０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、及びＴｒｉｔｏｎ ＣＧ－１１０からなる群から選択される。
一部の実施形態では、溶出緩衝液中の界面活性剤の濃度は、０．０００１％～０．１％である。

【0036】

一部の実施形態では、精製調製物は、空粒子を実質的に含まない。他の実施形態では、精製調製物は、ｒＡＡＶ調製物よりも、部分ｒＡＡＶ粒子対空粒子の増加した比を含む。好ましくは、精製調製物中の部分ｒＡＡＶ粒子対空粒子の比は、３：１以上、例えば、３．５：１、４：１、４．５：１、５：１、５．５：１、６：１、６．５：１、７：１、若しくは７．５：１以上、又はそれらの間の任意の比、より好ましくは４：１以上である。
一部の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ血清型に由来するカプシドを含む。
別の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、イオン交換クロマトグラフィー媒体に結合することが可能な遺伝子操作カプシドに由来するカプシドを含む。

【0037】

一部の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、Ｐｕｌｉｃｈｅｒｌａら、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．、１９巻（６号）１０７０～１０７８頁（２０１１年）（なかでも、ＡＡＶ９．４７を含むＡＡＶ９バリアントが記載されている）、米国特許第７，９０６，１１１号明細書（なかでもＡＡＶ９（ｈｕ１４）が記載されている）、第１０，５３２，１１１号明細書（なかでもＮＰ５９が記載されている）、第１０，７３８，０８７号明細書（なかでもＡｎｃ－８０が記載されている）、第９，１６９，２９９号明細書（「ＬＫ０３」が記載されている）、第９，８４０，７１９号明細書（「ＲＨＭ４－１」が記載されている）、第７，７４９，４９２号明細書、第７，５８８，７７２号明細書（「ＤＪ」及び「ＤＪ８」が記載されている）、第９，５８７，２８２号明細書、及び国際公開第２０１２／１４５６０１号パンフレット、国際公開第２０１３／１５８８７９号パンフレット、国際公開第２０１５／０１３３１３号パンフレット、国際公開第２０１８／１５６６５４号パンフレット、米国特許出願公開第２０１３／００５９７３２号明細書に示されているＡＡＶカプシドのバリアントを含む、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ９．４７、ＡＡＶ９（ｈｕ１４）、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、Ｒｈ８、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ－２ｉ８、ＬＫ０３、ＲＨＭ４－１、ＤＪ、ＤＪ８、ＮＰ５９、Ａｎｃ－８０、及びそれらのバリアントからなる群から選択されるＡＡＶに由来する。これら文献は全て、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0038】

本発明の１つ又は複数の実施形態の詳細は、下記の記載に示されている。他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明及び添付の特許請求の範囲から明らかになるだろう。
本発明の上述の概要及び以下の詳細な説明は、添付の図面と併せて読むとより良好に理解されるだろう。本発明は、図面に示されている実施形態そのものに限定されないことが理解されるべきである。

【図面の簡単な説明】

【0039】

【図1A-1C】３つの異なるｐＨ値：ｐＨ８．０（図１Ａ）、ｐＨ８．６（図１Ｂ）、及びｐＨ９．２５（図１Ｃ）における、Ｐｏｒｏｓ５０ＨＱ樹脂での完全ｒＡＡＶ粒子と不完全粒子との分離を示す。

【図2A-2D】異なるｐＨの異なる緩衝液：ｐＨ８．６及び５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（図２Ａ）、ｐＨ８．６及び２５ｍＭ Ｔｒｉｓ（図２Ｂ）、ｐＨ８．０及び２５ｍＭ Ｔｒｉｓ（図２Ｃ）、並びにｐＨ９．２５及び２５ｍＭ Ｔｒｉｓ（図１Ｄ）を用いた、Ｐｏｒｏｓ５０Ｄ樹脂での完全ｒＡＡＶ粒子と不完全粒子との分離を示す。

【図3A-3E】異なるｐＨ値の異なる結合強度：ｐＨ８．０、ＮａＣｌ無し（図３Ａ）、ｐＨ８．６、ＮａＣｌ無し（図３Ｂ）、ｐＨ８．６及び３０ｍＭ ＮａＣｌ（図３Ｃ）、ｐＨ９．２、ＮａＣｌ無し（図４Ｃ）、並びにｐＨ９．２及び３０ｍＭ ＮａＣｌ（図３Ｅ）を用いた、Ｐｏｒｏｓ５０ＰＩ樹脂での完全ｒＡＡＶ粒子と不完全粒子との分離を示す。

【図4A-4C】異なるｐＨ値の異なる緩衝液：ｐＨ８．０及び５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ＮａＣｌ無し（図４Ａ）、ｐＨ８．６及び２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ＮａＣｌ無し（図４Ｂ）、並びにｐＨ９．０及び２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ＮａＣｌ無し（図４Ｃ）を用いた、Ｃａｐｔｏ ＩｍｐＲｅｓ Ｑ樹脂での完全ｒＡＡＶ粒子と不完全粒子との分離を示す。

【図5】Ｐｏｒｏｓ ＸＱ樹脂での完全ｒＡＡＶ粒子と不完全粒子との分離が、ｐＨ８及びｐＨ９．２５と比較してｐＨ８．７５にて最も良好だったことを示す。

【図6】Ｐｏｒｏｓ ＸＱ樹脂での完全ｒＡＡＶ粒子と不完全粒子との分離に対する、結合塩（１．６、５、及び６．８ｍＳ／ｃｍ）の効果を示す。

【図7】Ｐｏｒｏｓ ＸＱ樹脂での完全ｒＡＡＶ粒子と不完全粒子との分離に対する、流速の効果を示す。

【図8A-8B】図８Ａは、低負荷での試料のＨＰＬＣ分析を示し、図８Ｂは、ブレイクスルー負荷での試料のＨＰＬＣ分析を示す。

【図9A-9D】ブレイクスルー条件下における、塩：４５ｍＭ ＮａＣｌ（図９Ａ）、６０ｍＭ ＮａＣｌ（図９Ｂ）、７５ｍＭ ＮａＣｌ（図９Ｃ）、及び９０ｍＭ ＮａＣｌ（図９Ｄ）による結合強度の効果を示す。

【図10A-10D】塩：６０ｍＭ ＮａＣｌ（図１０Ａ）、７５ｍＭ ＮａＣｌ（図１０Ｂ）、９０ｍＭ ＮａＣｌ（図１０Ｃ）、及び１２０ｍＭ ＮａＣｌ（図１０Ｄ）による異なる結合強度での段階溶出を示す。

【図11A-11B】６０ｍＭ ＮａＣｌを有する５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．５緩衝液で試料をＰＸＱ樹脂に負荷したことを示す。溶出は、線形勾配を使用して、３００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．５緩衝液を用いて行った。図１１Ｂでは、図１１Ａよりも多くの試料をカラムに負荷した。こうした図は、置換クロマトグラフィーが、完全ｒＡＡＶ粒子を不完全粒子から分離することを示す。図１１Ｂは、より多くの試料を負荷すると置換がより顕著になり、＞９０％の収率で産物純度がほぼ１００％に増加したことを更に示す。

【図12】１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂を有する５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．５緩衝液で試料をＰＸＱ樹脂に負荷したことを示す。溶出は、３００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．５緩衝液を用いて行った。図１２は、１０ｍＭの高濃度のＭｇＣｌ₂を負荷試料に使用すると、負荷中に不完全粒子が除去されることを示す。

【図13】２．５ｍＭ ＣａＣｌ₂を有する５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．５緩衝液で試料をＰＸＱ樹脂に負荷したことを示す。溶出は、３００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．５緩衝液を用いて行った。図１３は、ＣａＣｌ₂を負荷物に添加することにより、負荷中に不完全粒子が除去されることを示す。この方法は、図１２の方法と比較して、完全粒子と不完全粒子との導電率差異がより大きい（＞４ｍＳ／ｃｍ）ため、よりロバストである。

【図14A-14B】１～１．５ｍＭ ＣａＣｌ₂＋２．５ｍＭ ＭｇＣｌ₂＋２０ｍＭ ＮａＣｌを有する５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．５緩衝液で試料をＰＸＱ樹脂に負荷したことを示す。溶出は、１０ｍＭ ＣａＣｌ₂、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、２０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．５緩衝液を用いて行った。こうした図は、ＣａＣｌ₂濃度のロバスト性を示す。図１４Ａは、１．５ｍＭ ＣａＣｌ₂を用いて負荷した場合であり、図１４Ｂは、１ｍＭ ＣａＣｌ₂を用いて負荷した場合である。この方法では、ＣａＣｌ₂濃度が５０％変化した場合でさえ、他の添加剤が存在した場合でさえ、完全粒子を一切喪失することなく、不完全粒子の１００％除去がもたらされた。更に、ＣａＣｌ₂勾配による溶出では、５ｍＭ ＣａＣｌ₂がアプライされるまで完全粒子は溶出しない。これは、不完全収集と完全収集との間に４ｍＭ ＣａＣｌ₂というロバストな差異があることを示している。

【図14C-14D】図１４Ｂと同じ条件であるが、図１４Ｄに示されている薬物物質の分析的超遠心分離（ＡＵＣ）分析が共に示されている。

【図15】５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．５で試料をＰＸＱ樹脂に負荷したクロマトグラムを示す。カラムを、１ｍＭ ＣａＣｌ₂＋２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２を有する５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．５緩衝液で洗浄した。この図は、ＣａＣｌ₂を試料負荷物に添加しなかった場合、不完全粒子から完全粒子を精製する際に収率及び純度が両方とも損なわれたことを示している。加えて、カラムに結合した不完全粒子を、洗浄により全て除去することは困難だった。更に、ＣａＣｌ₂濃度を増加させたその後の溶出では、結合した不完全粒子は樹脂上で安定ではなく、新たな不純物が生成され、それによりひいては最終純度が損なわれた。

【図16】完全ｒＡＡＶ粒子を不完全粒子から分離するためのサイクル置換クロマトグラフィーの実施スキームを示す。

【図17】５８ｍＭ ＬｉＣｌを有する５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．５緩衝液で試料をＰＸＱ樹脂に負荷したクロマトグラムを示す。カラムを、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．５＋１２０ｍＭ ＬｉＣｌ緩衝液で溶出した。この条件では、不完全溶出と完全溶出との導電率差異は０．２ｍＳ／ｃｍである。

【図18】少なくとも負荷緩衝液中、好ましくは洗浄緩衝液及び溶出緩衝液中の添加剤を用いて完全ｒＡＡＶ粒子を不完全粒子から分離するためのサイクル置換クロマトグラフィーの実施スキームを示す。

【図19A-19B】試料負荷中の不完全粒子の除去、及び勾配溶出又は段階溶出を用いたｐＨ減少による完全粒子の回収を示す。負荷試料緩衝液は、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２ｍＭ ＭｇＣｌ₂、２ｍＭ ＣａＣｌ₂、２０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．５である。２０ｍＭ ＢｉｓＴｒｉｓ－３０ｍＭ酢酸塩、２ｍＭ ＭｇＣｌ₂、２ｍＭ ＣａＣｌ₂、ｐＨ６．０を用いた漸減ｐＨ勾配での溶出が図１９Ａに示されている。２０ｍＭ ＢｉｓＴｒｉｓ－３０ｍＭ酢酸塩、２ｍＭ ＭｇＣｌ₂、２ｍＭ ＣａＣｌ₂、ｐＨ７．０及びｐＨ６．０を用いたｐＨ段階法による溶出が図１９Ｂに示されている。

【図20A-20B】（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄を試料負荷物に添加すると、負荷中に、不完全粒子のフロースルーがもたらされることを示す（図２０Ｂ）。試料を、０．０００２％ポロクサマー１８８、２０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ （ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、及び２．０ｍＭ ＭｇＣｌ₂を有する１００ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．５緩衝液でＰＸＱ樹脂に負荷した。。溶出緩衝液は、０．０００２％ポロクサマー１８８及び３００ｍＭ ＮａＣｌを有する５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．５である。（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄が存在しない場合（挿入図に示されている）、不完全粒子は、同じ緩衝液伝導率７ｍＳ／ｃｍでの試料負荷中に除去されなかった（図２０Ａ）。

【図21】（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄を試料負荷物に添加すると、モノリスカラムへの試料負荷中に、不完全粒子のフロースルーがもたらされることを示す。試料を、０．０００２％ポロクサマー１８８、２０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ （ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、及び２．０ｍＭ ＭｇＣｌ₂を有する５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．５緩衝液でＢＩＡ １．３μｍモノリスカラムに負荷した。溶出緩衝液は、０．０００２％ポロクサマー１８８及び２００ｍＭ ＮａＣｌを有する５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．５緩衝液である。

【図22A-22B】ＣｕＣｌ₂を試料負荷物に添加すると、試料負荷中に、不完全粒子のフロースルーがもたらされることを示す。試料を、０．０００２％ポロクサマー１８８、２０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、２．０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、及び１．５ｍＭ ＣｕＣｌ₂を有する５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．５緩衝液でＰＸＱ樹脂に負荷した。溶出緩衝液は、０．０００２％ポロクサマー１８８及び２ｍＭ ＭｇＣｌ₂を有する１８０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．２緩衝液である。

【図22C-22E】ＣｕＣｌ₂を試料負荷物に添加すると、分析スケールにおいて、不完全粒子（最も左側のピーク）と完全粒子（左から２番目のピーク）との間の分解能の増加がもたらされることを示す。加えて、ＣｕＣｌ₂の添加は、一部の産物バリアント（２番目のピーク以降のピーク）の著しい低減に結び付く。これは、ＣａＣｌ₂を負荷物に添加することにより、負荷中に不完全粒子が除去されることを示す。

【図22F】Ｃｕ（ＩＩ）が、他のイオンの中でも、不完全ピークと完全ピークとの分解能の最も高い増加に結び付くことを示す。試料は、０．５～２ｍＭの指定イオンを有する５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．５中に存在する。

【図23A-23E】ＣｕＣｌ₂を添加すると、負荷中に不完全粒子を除去することができ、部分粒子と完全粒子との間にある程度の分解能を達成できることを示す。ｒＡＡＶ調製物を、０．０００２％ポロクサマー１８８、２０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭ ＮＨ₄ＳＯ₄、２．０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、及び１．５ｍＭ ＣｕＣｌ₂を有する５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．５緩衝液でＰＸＱ樹脂に負荷した。結合した粒子を、０．０００２％ポロクサマー１８８及び２つの異なる量のＮａＣｌを有する５０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ６．０緩衝液を用いて段階的に溶出した。溶出ピーク１は５０ｍＭ ＮａＣｌで得られ、溶出ピーク２は２００ｍＭ ＮａＣｌで得られる（図２３Ａ～２３Ｂ）。図２３Ｃ～２３Ｅは、分析用超遠心分離を使用した溶出液ピークの沈降係数分布を示す。下記の表１に示されているように、ピーク１は、部分粒子（４０．１％）及び完全粒子（４９．３％）を両方とも含むが、ピーク２には、主として完全粒子（６９．８％）が富化されており、部分粒子（１５．５％）のパーセンテージはより低く、不完全粒子（１５．５％）は除去されている。

【表1】

【図24A-24G】ｒＡＡＶ粒子バリアントを富化するための３カラム置換クロマトグラフィー法の使用を示す。ｒＡＡＶ調製物を、直列に接続された３つのＰＸＱカラムに負荷した。負荷緩衝液は、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．５、７５ｍＭ ＮａＣｌ、及び２ｍＭ ＭｇＣｌ₂である。３つのカラムを、０．０００２％ポロクサマー１８８及び２ｍＭ ＭｇＣｌ₂を有する２００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ８．５を使用して連続的に溶出した（分取クロマトグラムは図２４Ａ～２４Ｂを参照）。収集した画分を、ＵＰＬＣを使用してＩＥＸカラムで分析した。図２４Ｃ～２４Ｄに示されているように、空粒子はカラムを通過して流出し、空粒子の大部分は負荷中に除去された。加えて、分析用ＩＥＸクロマトグラムは、最初のカラムには最も強力な結合粒子が富化されており（最も長い保持時間、図２４Ｅ）、２番目及び３番目のカラムには、それぞれ２番目に強力な結合粒子及び最も弱い結合粒子が富化されていることを示す（図２４Ｆ～図２４Ｇ）。最初のカラム溶出物及び２番目のカラム溶出物には、完全粒子が富化されている。これは、３カラム設定で異なる粒子バリアントを富化するための置換クロマトグラフィーの使用を示す。

【図25A-25D】完全粒子を富化するための２カラム置換クロマトグラフィー法の使用を示す。ｒＡＡＶ調製物を、直列に接続された２つのＰＸＱカラムに負荷した。負荷緩衝液は、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．５、１０ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、及び１ｍＭ ＣａＣｌ₂である。溶出は、カラム１及びカラム２から、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．５、２００ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、及び０．０００２％ポロクサマー１８８を用いて連続的に実施した（分取クロマトグラムは図２５Ａ～２５Ｂを参照）。収集した画分を、ＵＰＬＣを使用して分析した。図２５Ｃに示されているように、空粒子は負荷中に流出した。ｒＡＡＶ調製物中の不純物は、完全粒子よりも高い親和性でＰＸＱ樹脂に結合した。その結果、こうした不純物は、カラム２に負荷される調製物中では低減され、カラム２との結合に対して最も高い親和性を有する種は完全粒子だった。溶出すると、カラム２溶出物には完全粒子がより多く富化されている。従って、図２５Ｄ（ＵＰＬＣ分析）に示されているように、カラム２溶出ピークは、カラム１よりも完全粒子の富化が良好だったことを示している。

【図26A-26D】部分粒子及び完全粒子を富化するための３カラム置換クロマトグラフィー法の使用を示す。ｒＡＡＶ調製物を、直列に接続された３つのＰＸＱカラムに負荷した。負荷緩衝液は、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．５、２０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭ硫酸アンモニウム、２ｍＭ ＭｇＣｌ₂、及び１．５ｍＭ ＣａＣｌ₂である。溶出は、カラム１、２、及び３から、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．５、２００ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、及び０．０００２％ポロクサマー１８８を用いて連続的に実施した（分取クロマトグラムは図２６Ａ～２６Ｂを参照）。図２６Ｃ～２６Ｄは、分析用イオン交換クロマトグラフィー及び分析用超遠心分離（ＡＵＣ）によるフロースルー及び溶出物の特徴付けを示す。空粒子は負荷中に流出した（図２６Ｃ）。カラム１からの主要溶出物ピークには完全粒子が富化されており、カラム３からの主要溶出物ピークには部分粒子が富化されているが、カラム２には部分粒子及び完全粒子が両方とも含まれている（図２６Ｄ）。

【発明を実施するための形態】

【0040】

背景技術及び明細書全体にわたって、種々の出版物、論文、及び特許が引用又は記載されており、そうした参考文献の各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に含まれている文書、行為、物質、装置、又は物品などの考察は、本発明の状況を提供するためのものである。そのような考察は、こうしたもののいずれか又は全てが、開示又は特許請求されているあらゆる発明に関して、先行技術の一部を形成することを認めるものではない。
本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、別様に定義されていない限り、本発明が関する当業者が一般的に理解するものと同じ意味を有する。それ以外の場合、本明細書で使用されるある特定の用語は、本明細書に示されている意味を有する。本明細書で引用されている全ての特許、公開特許出願、及び広報は、あたかも本明細書に完全に示されているかのごとく、参照により組み込まれる。本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、状況が明らかに別様に指示しない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は複数の参照物を含むことが留意されなければならない。

【0041】

本明細書及びそれに続く特許請求の範囲全体を通じて、状況が別様に要求しない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という単語、及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変化形は、記載の整数若しくはステップ又は整数若しくはステップの群を包含するが、任意の他の整数若しくはステップ又は整数若しくはステップの群を除外しないことを示唆すると理解されることになる。本明細書で使用される場合、「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、「含むこと（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」又は「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語で置き換えることができ、本明細書で使用される場合、場合によっては「有すること（ｈａｖｉｎｇ）」という用語で置き換えることができる。

【0042】

本明細書で使用される場合、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」は、請求項要素で指定されていないあらゆる要素、ステップ、又は成分を除外する。本明細書で使用される場合、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」は、請求項の基本的及び新規特徴に実質的に影響を及ぼさない物質又はステップを排除しない。本明細書において本発明の態様又は実施形態の状況で使用される場合は常に、「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含むこと（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、及び「有すること（ｈａｖｉｎｇ）」という前述の用語はいずれも、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」又は「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という用語に置き換えて、本開示の範囲を変更することができる。

【0043】

本明細書で使用される場合、「約」という用語は、数値と併せて使用される場合、参照数値の±１０％以内、例えば±５％又は±１％以内の任意の数値を指す。例えば、約５．０のｐＨは、端値を含む４．５～５．５の任意のｐＨを意味する。
本明細書で使用される場合、複数の記載要素間の接続用語「及び／又は」は、個々の選択肢及び選択肢の組合せを両方とも包含すると理解される。例えば、２つの要素が「及び／又は」で結合されている場合、第１の選択肢は、第２の要素を除いた第１の要素の適用可能性を指す。第２の選択肢は、第１の要素を除いた第２の要素の適用可能性を指す。第３の選択肢は、第１の要素及び第２の要素の適用可能性を指す。こうした選択肢のいずれか１つがその意味の範囲内に入ると理解され、従って、本明細書で使用される「及び／又は」という用語の要件を満たす。選択肢の１つよりも多くの同時適用も、その意味に入ると理解され、従って「及び／又は」という用語の要件を満たす。

【0044】

「ベクター」という用語は、核酸分子のあらゆる小型キャリア、例えば、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、ウイルス、ビリオン、又は核酸の挿入若しくは組込みにより操作することができる他のビヒクルを指す。ベクターは、遺伝的操作（つまり、「クローニングベクター」）、細胞へのポリヌクレオチドの導入／移入、及び挿入ポリヌクレオチドの細胞での転写又は翻訳に使用することができる。「発現ベクター」は、宿主細胞での発現に必要な必須調節領域を有する遺伝子又は核酸配列を含むベクターである。ベクター核酸配列は、一般に、細胞において増殖するための少なくとも複製起点を含み、任意選択で、異種性核酸配列、発現制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー）、イントロン、逆位末端配列（ＩＴＲ）、任意選択の選択可能マーカー、ポリアデニル化シグナルなどの追加エレメントを含む。

【0045】

「アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター」又は「ＡＡＶベクター」という用語は、Ｐｕｌｉｃｈｅｒｌａら、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．、１９巻（６号）１０７０～１０７８頁（２０１１年）（なかでも、ＡＡＶ９．４７を含むＡＡＶ９バリアントが記載されている）、米国特許第７，９０６，１１１号明細書（なかでもＡＡＶ９（ｈｕ１４）が記載されている）、第１０，５３２，１１１号明細書（なかでもＮＰ５９が記載されている）、第１０，７３８，０８７号明細書（なかでもＡｎｃ－８０が記載されている）、第９，１６９，２９９号明細書（「ＬＫ０３」が記載されている）、第９，８４０，７１９号明細書（「ＲＨＭ４－１」が記載されている）、第７，７４９，４９２号明細書、第７，５８８，７７２号明細書（「ＤＪ」及び「ＤＪ８」が記載されている）、第９，５８７，２８２号明細書、及び国際公開第２０１２／１４５６０１号パンフレット、国際公開第２０１３／１５８８７９号パンフレット、国際公開第２０１５／０１３３１３号パンフレット、国際公開第２０１８／１５６６５４号パンフレット、米国特許出願公開第２０１３／００５９７３２号明細書に示されているＡＡＶカプシドのバリアントを含む、限定ではないが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ９．４７、ＡＡＶ９（ｈｕ１４）、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、Ｒｈ８、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ－２ｉ８、ＬＫ０３、ＲＨＭ４－１、ＤＪ、ＤＪ８、ＮＰ５９、Ａｎｃ－８０、及びそれらのバリアントなどのＡＡＶ血清型を含む、アデノ随伴ウイルス血清型に由来するベクターを指す。これら文献は全て、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。加えて、ＡＡＶベクターとしては、組織向性、安定性、及び形質導入効率を考慮して遺伝子操作されているＡＡＶが挙げられる。ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ野生型遺伝子の１つ又は複数、好ましくは複製（ｒｅｐ）遺伝子及びカプシド（ｃａｐ）遺伝子の全体又は一部が欠失していてよいが、機能的フランキングＩＴＲ配列を保持している。機能的ＩＴＲ配列は、ＡＡＶビリオンのレスキュー、複製、及びパッケージングに必要である。従って、ＡＡＶベクターは、本明細書では、ウイルスの複製及びパッケージングのためにシス位に必要とされる少なくともそうした配列（例えば、機能的ＩＴＲ）を含むと規定される。ＩＴＲは、野生型ヌクレオチド配列である必要はなく、配列が機能的レスキュー、複製、及びパッケージングを提供する限り、例えば、ヌクレオチドの挿入、欠失、又は置換により変更されていてもよい。

【0046】

「ＡＡＶビリオン」という用語は、ＡＡＶカプシドタンパク質コートに付随する直鎖状一本鎖核酸ゲノムを含む野生型（ｗｔ）ＡＡＶウイルス粒子などのウイルス粒子を指す。
組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶベクター）は、アデノ随伴ウイルスに由来する。ＡＡＶベクターは、核酸／遺伝物質が細胞で維持され得るように核酸／遺伝物質を細胞へと導入することができるため、遺伝子療法ベクターとして有用である。ＡＡＶはヒトの病原性疾患に関連付けられていないため、ｒＡＡＶベクターは、実質的なＡＡＶ病原性又は疾患を引き起こすことなく、異種性核酸配列（例えば、治療用タンパク質及び作用剤）をヒト患者に送達することができる。

【0047】

組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターなどのベクターの修飾語としての、並びに組換えポリヌクレオチド及びポリペプチドなどの配列の修飾語としての「組換え」という用語は、組成が、一般に自然界では生じない様式で操作されている（つまり、遺伝子操作されている）ことを意味する。ｒＡＡＶベクターの一例は、野生型ＡＡＶゲノムに通常は存在しない核酸がウイルスゲノム内に挿入されているものであってもよい。例えば、治療用タンパク質又はポリヌクレオチド配列をコードする核酸（例えば、遺伝子）は、遺伝子がＡＡＶゲノム内で通常は付随している５’領域、３’領域、及び／又はイントロン領域の有無に関わらず、ベクターにクローニングされている。「組換え」という用語は、本明細書では、ＡＡＶベクター並びにポリヌクレオチドなどの配列に対して常に使用されているわけではないが、あらゆるそのような省略にも関わらず、ＡＡＶベクター、ポリヌクレオチドなどを含む組換え形態は、明示的に含まれる。

【0048】

ｒＡＡＶベクターは、分子的方法を使用してＡＡＶゲノムから野生型ゲノムを除去し、目的の治療用タンパク質又は核酸分子をコードする核酸などの非天然（異種性）核酸で置き換えることにより、ＡＶＶなどのウイルスの野生型ゲノムから導出される。典型的には、ＡＡＶの場合、ＡＡＶゲノムの一方又は両方の逆位末端配列（ＩＴＲ）配列が、ｒＡＡＶベクターに保持されている。ｒＡＡＶゲノムは、ＡＡＶゲノムの全部又は一部が、治療用タンパク質又はポリヌクレオチド配列をコードする異種性核酸など、ＡＡＶゲノム核酸に関して非天然である配列で置き換えられているため、ＡＡＶゲノムとは区別される。従って、非天然配列の組込みは、ＡＡＶを「組換え」ＡＡＶベクターであると規定し、それを「ｒＡＡＶベクター」と呼ぶことができる。組換えＡＡＶベクター配列をパッケージングすることができ、これを本明細書ではｅｘ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、又はｉｎ ｖｉｖｏでの細胞のその後の感染（形質導入）のための「粒子」と呼ぶ。

【0049】

「組換えＡＡＶビリオン」、「ｒＡＡＶビリオン」、「ＡＡＶベクター粒子」、「完全ｒＡＡＶカプシド」、「完全ｒＡＡＶ粒子」、「完全カプシド」、及び「完全粒子」という用語は各々、本明細書で使用される場合、片側又は両側がＡＡＶ ＩＴＲによりフランキングされている目的の異種性ヌクレオチド配列を含む核酸分子が被包されている、ＡＡＶタンパク質殻を含む感染性複製欠損ウイルスを指す。完全ｒＡＡＶ粒子は、その中に導入されたＡＡＶベクター、ＡＡＶヘルパー機能、及びアクセサリー機能を指定する配列を有する好適な宿主細胞において産生される。このようにして、宿主細胞は、その後の遺伝子送達のためのＡＡＶベクター（目的の組換えヌクレオチド配列を含む）を感染性組換えビリオン粒子へとパッケージングするために必要なＡＡＶポリペプチドをコードすることが可能になる。

【0050】

「不完全カプシド」及び「不完全粒子」という用語は各々、本明細書で使用される場合、片側又は両側がＡＡＶ ＩＴＲによりフランキングされている異種性核酸配列を含む、ＡＡＶ粒子殻を含むが完全な核酸分子を欠如するＡＡＶ粒子又はビリオンを指す。そのような不完全粒子は、完全な異種性核酸配列を宿主細胞へと又は生物内の細胞へと移入しない。こうした不完全粒子としては、異なる長さ又は量の不完全遺伝物質を有するバリアントが挙げられる。分析方法（例えば、ＵＰＬＣ及びＡＵＣ）により任意の遺伝物質を有すると検出されるのに十分な遺伝物質を欠如するか又は全く有していない不完全粒子は、「空」粒子と呼ばれる。ある程度の遺伝物質を有するが完全粒子未満であると分析方法により検出されるのに十分な遺伝物質を有する不完全粒子は、「部分」粒子と呼ばれる。不完全遺伝物質は、インタクトであってもよく又は断片化されていてもよい。

【0051】

当技術分野で公知である任意の分析方法を使用して、完全粒子対不完全粒子又は不完全粒子対完全粒子の比を決定することを含む、完全粒子及び不完全粒子を定量化することができる。例えば、そのような方法は、これらに限定されないが、物理的力価計算；Ａ２６０＆Ａ２８０吸光度；分析用陰イオン交換クロマトグラフィー法（例えば、ＵＰＬＣ）；マルチアングル光散乱法；分析用超遠心分離法（ＡＵＣ）；極低温電子顕微鏡法（Ｃｒｙｏ－ＥＭ）；又は電荷検出質量分析法（ＣＤＭＳ）であってもよい。定量的評価を例示するために、幾つかの異なる方法、ＵＰＬＣ、Ａ２６０＆Ａ２８０吸光度、及びＡＵＣが、本開示に示されている。

【0052】

ベクター「ゲノム」は、最終的にパッケージング又は被包されてｒＡＡＶ粒子を形成する組換え配列の部分を指す。組換えプラスミドを使用して組換えＡＡＶベクターを構築又は製造する場合、ＡＡＶベクターゲノムは、組換えプラスミドのベクターゲノム配列に対応しない「プラスミド」の部分を含まない。組換えプラスミドのこの非ベクターゲノム部分は、「プラスミド骨格」と呼ばれ、プラスミドのクローニング及び増幅、つまり増殖及び組換えウイルス産生に必要な工程にとって重要であるが、それ自体はｒＡＡＶ粒子にパッケージング又は被包されない。従って、ベクター「ゲノム」は、ｒＡＡＶによりパッケージング又は被包されている核酸を指す。

【0053】

「ＡＡＶヘルパー機能」という用語は、発現されると、ＡＡＶ遺伝子産物及びＡＡＶベクターを提供することができ、次いで生産的なＡＡＶ複製及びパッケージングのためにトランスで機能するＡＡＶ由来コード配列（タンパク質）を指す。従って、ＡＡＶヘルパー機能は、ｒｅｐ及びｃａｐ並びにある特定のＡＡＶ血清型のアセンブリ活性化タンパク質（ＡＡＰ）などの他のものを含むＡＡＶオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む。Ｒｅｐ発現産物は、なかでも、ＤＮＡ複製のＡＡＶ起点の認識、結合、及びニッキング；ＤＮＡヘリカーゼ活性；及びＡＡＶ（又は他の異種性）プロモーターからの転写のモジュレーションを含む、多数の機能を有することが示されている。Ｃａｐ発現産物（カプシド）は、必要なパッケージング機能を供給する。ＡＡＶヘルパー機能は、ＡＡＶベクターゲノムに欠けているトランス位のＡＡＶ機能を補完するために使用される。

【0054】

「ＡＡＶヘルパー構築物」という用語は、一般に、例えば対象に対する遺伝子療法により目的の核酸配列を送達するための形質導入ＡＶＶベクターを産生するために使用されることになるＡＡＶベクターから欠失されたＡＡＶ機能を提供するヌクレオチド配列を含む核酸配列を指す。ＡＡＶヘルパー構築物は、一般に、ＡＡＶ ｒｅｐ及び／又はｃａｐ遺伝子の一過性発現を提供して、ＡＡＶベクター複製に必要な欠落ＡＡＶ機能を補完するために使用される。ヘルパー構築物は、一般に、ＡＡＶ ＩＴＲを欠如し、それら自体を複製もパッケージングもすることができない。ＡＡＶヘルパー構築物は、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、ウイルス、又はビリオンの形態であってもよい。Ｒｅｐ発現産物及びＣａｐ発現産物を両方ともコードするプラスミドｐＡＡＶ／Ａｄ及びｐＩＭ２９＋４５などの、少なからぬＡＡＶヘルパー構築物が報告されている（例えば、Ｓａｍｕｌｓｋｉら（１９８９年）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３巻：３８２２～３８２８頁；及びＭｃＣａｒｔｙら（１９９１年）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５巻：２９３６～２９４５頁を参照）。Ｒｅｐ発現産物及び／又はＣａｐ発現産物をコードする少なからぬ他のベクターが報告されている（例えば、米国特許第５，１３９，９４１号明細書及び第６，３７６，２３７号明細書を参照）。

【0055】

「アクセサリー機能」という用語は、ＡＡＶが複製に関して依存する非ＡＡＶ由来のウイルス及び／又は細胞機能を指す。この用語は、ＡＡＶ遺伝子転写の活性化、段階特異的ＡＡＶ ｍＲＮＡスプライシング、ＡＡＶ ＤＮＡ複製、Ｃａｐ発現産物の合成、及びＡＡＶカプシドパッケージングに関与する部分を含む、ＡＡＶ複製に必要なタンパク質及びＲＮＡを含む。ウイルスに基づくアクセサリー機能は、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルス１型以外）及びワクシニアウイルスなど、公知のヘルパーウイルスのいずれに由来してもよい。

【0056】

「アクセサリー機能ベクター」は、一般に、アクセサリー機能を提供するポリヌクレオチド配列を含む核酸分子を指す。そのような配列は、アクセサリー機能ベクターに存在してもよく、好適な宿主細胞にトランスフェクトすることができる。アクセサリー機能ベクターは、宿主細胞でのｒＡＡＶビリオン産生を支援することが可能である。アクセサリー機能ベクターは、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、又はコスミドの形態であってもよい。加えて、アクセサリー機能には、アデノウイルス遺伝子の完全な補完は必要ではない。例えば、ＤＮＡ複製及び後期遺伝子合成が可能ではないアデノウイルス突然変異体は、ＡＡＶ複製を許容することが報告されている（Ｉｔｏら、（１９７０年）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．９巻：２４３頁；Ｉｓｈｉｂａｓｈｉら、（１９７１年）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４５巻：３１７頁）。同様に、Ｅ２Ｂ及びＥ３領域内の突然変異体は、ＡＡＶ複製を支援することが示されており、これは、Ｅ２Ｂ及びＥ３領域が、おそらくはアクセサリー機能の提供に関与していないことを示す（Ｃａｒｔｅｒら、（１９８３年）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １２６巻：５０５頁）。Ｅ１領域を欠損しているか又はＥ４領域が欠失しているアデノウイルスは、ＡＡＶ複製を支援することができない。従って、Ｅ１Ａ及びＥ４領域は、直接的に又は間接的にのいずれかでＡＡＶ複製に必要であると考えられる（Ｌａｕｇｈｌｉｎら、（１９８２年）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４１巻：８６８頁；Ｊａｎｉｋら、（１９８１年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８巻：１９２５頁；Ｃａｒｔｅｒら、（１９８３年）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １２６巻：５０５頁）。他の特徴付けられているアデノウイルス突然変異体としては、以下のものが挙げられる：ＥＩＢ（Ｌａｕｇｈｌｉｎら（１９８２年）、上記；Ｊａｎｉｋら（１９８１年）、上記；Ｏｓｔｒｏｖｅら、（１９８０年）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １０４巻：５０２頁）；Ｅ２Ａ（Ｈａｎｄａら、（１９７５年）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．２９巻：２３９ｐ頁；Ｓｔｒａｕｓｓら、（１９７６年）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１７巻：１４０頁；Ｍｙｅｒｓら、（１９８０年）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．３５巻：６６５頁；Ｊａｙら、（１９８１年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８巻：２９２７頁；Ｍｙｅｒｓら、（１９８１年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６巻：５６７頁）；Ｅ２Ｂ（Ｃａｒｔｅｒ、Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｈｅｌｐｅｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ、Ｉ ＣＲＣ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ（Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ編、１９９０年））；Ｅ３（Ｃａｒｔｅｒら（１９８３年）、上記）；及びＥ４（Ｃａｒｔｅｒら（１９８３年）、上記；Ｃａｒｔｅｒ（１９９５年））。ＥＩＢコード領域に突然変異を有するアデノウイルスにより提供されるアクセサリー機能の研究では、矛盾する結果が得られているが、ＥｌＢ５５ｋは、ＡＡＶビリオン産生に必要である可能性があるが、ＥＩＢ１９ｋはそうではない（Ｓａｍｕｌｓｋｉら、（１９８８年）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２巻：２０６～２１０頁）。加えて、国際公開第９７／１７４５８号パンフレット及びＭａｔｓｈｕｓｈｉｔａら、（１９９８年）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５巻：９３８～９４５頁には、種々のアデノウイルス遺伝子をコードするアクセサリー機能ベクターが記載されている。例示的なアクセサリー機能ベクターは、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡコード領域、アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６コード領域、アデノウイルスＥ２Ａ ７２ｋＤコード領域、アデノウイルスＥ１Ａコード領域、及びインタクトＥ１Ｂ５５ｋコード領域を欠如するアデノウイルスＥＩＢ領域を含む。そのようなアクセサリー機能ベクターは、例えば、国際公開第０１／８３７９７号パンフレットに記載されている。

【0057】

本明細書で使用される場合、「血清型」という用語は、他のＡＡＶ血清型とは血清学的に異なるカプシドを有するＡＡＶを指すために使用される区別である。血清学的区別性は、別のＡＡＶと比較して１つのＡＡＶに対する抗体間の交差反応性が欠如していることに基づいて決定される。交差反応性の違いは、通常、カプシドタンパク質配列／抗原決定基の違いによるものである（例えば、ＡＡＶ血清型のＶＰ１、ＶＰ２、及び／又はＶＰ３配列の違いによる）。

【0058】

伝統的な定義下では、血清型は、目的のウイルスを、中和活性に関して全ての既存の特徴付けられている血清型に特異的な血清に対して試験し、目的のウイルスを中和する抗体が見出されないことを意味する。より多くの天然に存在するウイルス分離株が発見されるため、及び／又はカプシド突然変異体が発生するため、現在存在する血清型のいずれかとの血清学的差異が存在する場合もあれば、又は存在しない場合もある。従って、新しいウイルス（例えば、ＡＡＶ）が血清学的差異を示さない場合、この新しいウイルス（例えば、ＡＡＶ）は、対応する血清型のサブグループ又はバリアントであるだろう。多くの場合、カプシド配列修飾を有する突然変異ウイルスに対しては、血清型の従来の定義に従って別の血清型であるか否かを決定するための、中和活性に関する血清学的試験はまだ実施されていない。従って、便宜上また繰返しを避けるために、「血清型」という用語は、血清学的に異なるウイルス（例えば、ＡＡＶ）並びに血清学的に異なっておらず、所与の血清型のサブグループ又はバリアント内に存在する可能性のあるウイルス（例えば、ＡＡＶ）の両方を幅広く指す。

【0059】

ｒＡＡＶベクターとしては、任意のウイルス株又は血清型が挙げられる。非限定的な例として、ｒＡＡＶプラスミド又はベクターゲノム又は粒子（カプシド）は、Ｐｕｌｉｃｈｅｒｌａら、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．、１９巻（６号）１０７０～１０７８頁（２０１１年）（なかでも、ＡＡＶ９．４７を含むＡＡＶ９バリアントが記載されている）、米国特許第７，９０６，１１１号明細書（なかでもＡＡＶ９（ｈｕ１４）が記載されている）、第１０，５３２，１１１号明細書（なかでもＮＰ５９が記載されている）、第１０，７３８，０８７号明細書（なかでもＡｎｃ－８０が記載されている）、第９，１６９，２９９号明細書（「ＬＫ０３」が記載されている）、第９，８４０，７１９号明細書（「ＲＨＭ４－１」が記載されている）、第７，７４９，４９２号明細書、第７，５８８，７７２号明細書（「ＤＪ」及び「ＤＪ８」が記載されている）、第９，５８７，２８２号明細書、及び国際公開第２０１２／１４５６０１号パンフレット、国際公開第２０１３／１５８８７９号パンフレット、国際公開第２０１５／０１３３１３号パンフレット、国際公開第２０１８／１５６６５４号パンフレット、米国特許出願公開第２０１３／００５９７３２号明細書に示されているＡＡＶカプシドのバリアントを含む、例えば、限定はされないが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ９．４７、ＡＡＶ９（ｈｕ１４）、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、Ｒｈ８、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ－２ｉ８、ＬＫ０３、ＲＨＭ４－１、ＤＪ、ＤＪ８、ＮＰ５９、Ａｎｃ－８０、及びそれらのバリアントを含む任意のＡＡＶ血清型に基づいていてもよい。これら文献は全て、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。配列情報を含む全ての上述のＡＡＶの説明は、それらの全体が参照により組み込まれる。そのようなベクターは、同じ株又は血清型（又はサブグループ又はバリアント）に基づいていてもよく、又は互いに異なっていてもよい。非限定的な例として、１つの血清型ゲノムに基づくｒＡＡＶプラスミド又はベクターゲノム又は粒子（カプシド）は、ベクターをパッケージングするカプシドタンパク質の１つ又は複数と同一であってもよい。加えて、ｒＡＡＶプラスミド又はベクターゲノムは、ベクターゲノムをパッケージングするカプシドタンパク質の１つ又は複数とは異なるＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ２）血清型ゲノムに基づいていてもよく、その場合、３つのカプシドタンパク質の少なくとも１つは、これらに限定されないが、Ｐｕｌｉｃｈｅｒｌａら、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．、１９巻（６号）１０７０～１０７８頁（２０１１年）（なかでも、ＡＡＶ９．４７を含むＡＡＶ９バリアントが記載されている）、米国特許第７，９０６，１１１号明細書（なかでもＡＡＶ９（ｈｕ１４）が記載されている）、第１０，５３２，１１１号明細書（なかでもＮＰ５９が記載されている）、第１０，７３８，０８７号明細書（なかでもＡｎｃ－８０が記載されている）、第９，１６９，２９９号明細書（「ＬＫ０３」が記載されている）、第９，８４０，７１９号明細書（「ＲＨＭ４－１」が記載されている）、第７，７４９，４９２号明細書、第７，５８８，７７２号明細書（「ＤＪ」及び「ＤＪ８」が記載されている）、第９，５８７，２８２号明細書、及び国際公開第２０１２／１４５６０１号パンフレット、国際公開第２０１３／１５８８７９号パンフレット、国際公開第２０１５／０１３３１３号パンフレット、国際公開第２０１８／１５６６５４号パンフレット、米国特許出願公開第２０１３／００５９７３２号明細書に示されているＡＡＶカプシドのバリアントを含む、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ９．４７、ＡＡＶ９（ｈｕ１４）、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、Ｒｈ８、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ－２ｉ８、ＬＫ０３、ＲＨＭ４－１、ＤＪ、ＤＪ８、ＮＰ５９、Ａｎｃ－８０、及びそれらのバリアントであってもよい。これら文献は全て、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。従って、ｒＡＡＶベクターは、特定の血清型並びに混合血清型に特徴的な遺伝子／タンパク質配列と同一の遺伝子／タンパク質配列を含む。種々の実施形態は、カプシドがイオン交換クロマトグラフィーカラムに結合することが可能である限り、あらゆる供給源に由来するあらゆるｒＡＡＶ又はＡＡＶカプシドに適用可能である。

【0060】

種々の例示的な実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、Ｐｕｌｉｃｈｅｒｌａら、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．、１９巻（６号）１０７０～１０７８頁（２０１１年）（なかでも、ＡＡＶ９．４７を含むＡＡＶ９バリアントが記載されている）、米国特許第７，９０６，１１１号明細書（なかでもＡＡＶ９（ｈｕ１４）が記載されている）、第１０，５３２，１１１号明細書（なかでもＮＰ５９が記載されている）、第１０，７３８，０８７号明細書（なかでもＡｎｃ－８０が記載されている）、第９，１６９，２９９号明細書（「ＬＫ０３」が記載されている）、第９，８４０，７１９号明細書（「ＲＨＭ４－１」が記載されている）、第７，７４９，４９２号明細書、第７，５８８，７７２号明細書（「ＤＪ」及び「ＤＪ８」が記載されている）、第９，５８７，２８２号明細書、及び国際公開第２０１２／１４５６０１号パンフレット、国際公開第２０１３／１５８８７９号パンフレット、国際公開第２０１５／０１３３１３号パンフレット、国際公開第２０１８／１５６６５４号パンフレット、米国特許出願公開第２０１３／００５９７３２号明細書に示されているＡＡＶカプシドのバリアントを含む、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ９．４７、ＡＡＶ９（ｈｕ１４）、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、Ｒｈ８、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ－２ｉ８、ＬＫ０３、ＲＨＭ４－１、ＤＪ、ＤＪ８、ＮＰ５９、Ａｎｃ－８０、及びそれらのバリアントの１つ又は複数のカプシドタンパク質と少なくとも７０％以上（例えば、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％など）同一であるカプシド配列を含むか又はからなる。これら文献は全て、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。種々の例示的な実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、Ｐｕｌｉｃｈｅｒｌａら、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．、１９巻（６号）１０７０～１０７８頁（２０１１年）（なかでも、ＡＡＶ９．４７を含むＡＡＶ９バリアントが記載されている）、米国特許第７，９０６，１１１号明細書（なかでもＡＡＶ９（ｈｕ１４）が記載されている）、第１０，５３２，１１１号明細書（なかでもＮＰ５９が記載されている）、第１０，７３８，０８７号明細書（なかでもＡｎｃ－８０が記載されている）、第９，１６９，２９９号明細書（「ＬＫ０３」が記載されている）、第９，８４０，７１９号明細書（「ＲＨＭ４－１」が記載されている）、第７，７４９，４９２号明細書、第７，５８８，７７２号明細書（「ＤＪ」及び「ＤＪ８」が記載されている）、第９，５８７，２８２号明細書、及び国際公開第２０１２／１４５６０１号パンフレット、国際公開第２０１３／１５８８７９号パンフレット、国際公開第２０１５／０１３３１３号パンフレット、国際公開第２０１８／１５６６５４号パンフレット、米国特許出願公開第２０１３／００５９７３２号明細書に示されているＡＡＶカプシドのバリアントを含む、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ９．４７、ＡＡＶ９（ｈｕ１４）、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、 Ｒｈ８、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ－２ｉ８、ＬＫ０３、ＲＨＭ４－１、ＤＪ、ＤＪ８、ＮＰ５９、Ａｎｃ－８０、及びそれらのバリアントの１つ又は複数のＩＴＲと少なくとも７０％以上（例えば、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％など）同一である配列を含むか又はからなる。これら文献は全て、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0061】

これらに限定されないが、Ｐｕｌｉｃｈｅｒｌａら、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．、１９巻（６号）１０７０～１０７８頁（２０１１年）（なかでも、ＡＡＶ９．４７を含むＡＡＶ９バリアントが記載されている）、米国特許第７，９０６，１１１号明細書（なかでもＡＡＶ９（ｈｕ１４）が記載されている）、第１０，５３２，１１１号明細書（なかでもＮＰ５９が記載されている）、第１０，７３８，０８７号明細書（なかでもＡｎｃ－８０が記載されている）、第９，１６９，２９９号明細書（「ＬＫ０３」が記載されている）、第９，８４０，７１９号明細書（「ＲＨＭ４－１」が記載されている）、第７，７４９，４９２号明細書、第７，５８８，７７２号明細書（「ＤＪ」及び「ＤＪ８」が記載されている）、第９，５８７，２８２号明細書、及び国際公開第２０１２／１４５６０１号パンフレット、国際公開第２０１３／１５８８７９号パンフレット、国際公開第２０１５／０１３３１３号パンフレット、国際公開第２０１８／１５６６５４号パンフレット、米国特許出願公開第２０１３／００５９７３２号明細書（これら文献は全て、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）に示されているＡＡＶカプシドのバリアントを含む、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ９．４７、ＡＡＶ９（ｈｕ１４）、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、Ｒｈ８、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ－２ｉ８、ＬＫ０３、ＲＨＭ４－１、ＤＪ、ＤＪ８、ＮＰ５９、Ａｎｃ－８０、及びそれらのバリアントを含むｒＡＡＶ、並びにバリアント、ハイブリッド、及びキメラ配列は、当業者に公知である組換え技法を使用して、１つ又は複数の機能的ＡＡＶ ＩＴＲ配列でフランキングされている１つ又は複数の異種性ポリヌクレオチド配列（導入遺伝子）を含むように構築することができる。そのようなベクターは、野生型ＡＡＶ遺伝子の１つ又は複数が全体的に又は部分的に欠失されているが、組換えベクターのレスキュー、複製、及びｒＡＡＶベクター粒子へのパッケージングに必要な、少なくとも１つの機能的フランキングＩＴＲ配列を保持する。従って、ｒＡＡＶベクターゲノムは、複製及びパッケージングのためにシス位に必要な配列（例えば、機能的ＩＴＲ配列）を含むだろう。

【0062】

「核酸」及び「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書では同義的に使用され、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及びリボ核酸（ＲＮＡ）を含む、全ての形態の核酸、オリゴヌクレオチドを指す。核酸としては、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、及びアンチセンスＤＮＡ、並びにスプライス又は未スプライスｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ ｔＲＮＡ、並びに阻害性ＤＮＡ又はＲＮＡ（ＲＮＡｉ、例えば、低分子又は短鎖ヘアピン（ｓｈ）ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子又は短鎖干渉（ｓｉ）ＲＮＡ、トランススプライシングＲＮＡ、又はアンチセンスＲＮＡ）が挙げられる。核酸としては、天然に存在するポリヌクレオチド、合成ポリヌクレオチド、及び意図的に修飾又は変更されたポリヌクレオチドが挙げられる。核酸は、一本鎖、二本鎖、又は三本鎖であってもよく、直鎖状又は環状であってもよく、任意の長さであってもよい。核酸が考察されている場合、特定のポリヌクレオチドの配列又は構造は、本明細書では、５’から３’方向で配列を提供する慣例に従って記載されていてもよい。

【0063】

「異種性」核酸配列は、ポリヌクレオチドを細胞にベクター媒介性移入／送達するための、ＡＡＶプラスミド又はベクターに挿入されたポリヌクレオチドを指す。異種性核酸配列は、ＡＡＶ核酸とは異なり、つまりＡＡＶ核酸に対して非天然である。細胞へと移入／送達したら、ベクター内に含まれている異種性核酸配列を発現させることができる（例えば、適切な場合には転写及び翻訳させることができる）。代替的に、細胞へと移入／送達された、ベクター内に含まれている異種性ポリヌクレオチドは、発現させる必要はない。

【0064】

「核酸配列」によりコードされる「ポリペプチド」、「タンパク質」、及び「ペプチド」は、天然に存在するタンパク質と同様の完全長天然配列、並びに部分配列、修飾型、又はバリアントが天然完全長タンパク質のある程度の機能を保持する限り、機能的部分配列、修飾型、又は配列バリアントを含む。核酸配列によりコードされるそのようなポリペプチド、タンパク質、及びペプチドは、治療される哺乳動物において欠損しているか、又はその発現が不十分であるか、又は欠乏している内因性タンパク質と同一であってもよいが、同一である必要はない。
「導入遺伝子」は、本明細書では、細胞又は生物へと導入することが意図されているか又は導入されている核酸（例えば、異種性）を便宜的に指すために使用される。導入遺伝子としては、治療用タンパク質又はポリヌクレオチド配列をコードする異種性核酸などの任意の核酸が挙げられる。

【0065】

導入遺伝子を有する細胞では、導入遺伝子は、プラスミド又はＡＡＶベクターによる細胞の「形質導入」又は「トランスフェクション」により導入／移入されている。「形質導入する」及び「トランスフェクトする」という用語は、宿主細胞（例えば、ＨＥＫ２９３）又は生物の細胞への、核酸などの分子の導入を指す。導入遺伝子は、レシピエント細胞のゲノム核酸に組み込まれてもよく又は組み込まれなくてもよい。導入核酸は、レシピエント細胞又は生物の核酸（ゲノムＤＮＡ）に組み込まれると、その細胞又は生物に安定的に維持され、レシピエント細胞又は生物の細胞の子孫細胞又は子孫生物に更に受け継がれるか又は遺伝され得る。
「宿主細胞」は、例えば、ＡＡＶベクタープラスミド、ＡＡＶヘルパー構築物、アクセサリー機能ベクター、又は他のトランスファーＤＮＡのレシピエントとして使用することができるか又は使用されている微生物、酵母細胞、昆虫細胞、及び哺乳動物細胞を意味する。この用語は、トランスフェクトされた元の細胞の子孫を含む。従って、「宿主細胞」は、一般に、外因性ＤＮＡ配列でトランスフェクトされた細胞を指す。単一の親細胞の子孫は、天然の、偶発的な、又は意図的な突然変異により、元の親とは形態学に又はゲノムＤＮＡ若しくは全ＤＮＡ相補性が必ずしも完全に同一であるとは限らない可能性があることが理解される。例示的な宿主細胞としては、ＨＥＫ２９３などのヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞が挙げられる。

【0066】

「治療用タンパク質」は、本明細書で使用される場合、細胞又は対象におけるタンパク質の不十分な量、非存在、又は欠陥に起因する症状を緩和又は低減することができるペプチド又はタンパク質である。導入遺伝子によりコードされる「治療用」タンパク質は、例えば遺伝的欠陥の修正、遺伝子（発現又は機能）欠損の修正などの利益を対象に付与することができる。
本発明に従って有用な遺伝子産物（例えば、治療用タンパク質）をコードする異種核酸の非限定的な例としては、これらに限定されないが、以下のものを含む疾患又は障害の治療に使用することができるものが挙げられる：
「止血」又は血液凝固障害、例えば、血友病Ａ、阻害性抗体を有する血友病Ａ患者、血友病Ｂ、凝固第ＶＩＩ、第ＶＩＩＩ、第ＩＸ及び第Ｘ、第ＸＩ、第Ｖ、第ＸＩＩ、第ＩＩ因子、フォンビルブランド因子の欠乏症、複合ＦＶ／ＦＶＩＩＩ欠乏症、サラセミア、ビタミンＫエポキシドレダクターゼＣＩ欠乏症、ガンマ－カルボキシラーゼ欠乏症；貧血、外傷に伴う出血、傷害、血栓症、血小板減少症、脳卒中、凝固障害、播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）；ヘパリン、低分子量ヘパリン、五糖、ワルファリン、小分子抗血栓薬（つまり、ＦＸａ阻害剤）に関連付けられる過剰抗凝固作用；並びにベルナールスーリエ症候群、グランツマン血小板無力症（Ｇｌａｎｚｍａｎ ｔｈｒｏｍｂｌａｓｔｅｍｉａ）、及び貯蔵プール欠乏症などの血小板障害。

【0067】

ある特定の実施形態では、疾患又は障害は、中枢神経系（ＣＮＳ）に影響を及ぼすか又はそれを起源とする。ある特定の実施形態では、疾患は神経変性疾患である。ある特定の実施形態では、ＣＮＳ又は神経変性疾患は、アルツハイマー病、ハンチントン病、ＡＬＳ、遺伝性痙性片麻痺、原発性側索硬化症、脊髄性筋萎縮症、ケネディ病、ポリグルタミンリピート病、又はパーキンソン病である。ある特定の実施形態では、ＣＮＳ又は神経変性疾患は、ポリグルタミンリピート病である。ある特定の実施形態では、ポリグルタミンリピート病は、脊髄小脳失調症（ＳＣＡ１、ＳＣＡ２、ＳＣＡ３、ＳＣＡ６、ＳＣＡ７、又はＳＣＡ１７）である。

【0068】

ある特定の実施形態では、異種性核酸は、以下のものからなる群から選択されるタンパク質をコードする：ポンペ病の治療のためのＧＡＡ（酸性アルファ－グルコシダーゼ）；ウィルソン病の治療のためのＡＴＰ７Ｂ（銅輸送ＡＴＰａｓｅ２）；ファブリー病の治療のためのアルファガラクトシダーゼ；シトルリン血症１型の治療のためのＡＳＳ１（アルギノコハク酸シンターゼ）；ゴーシェ病１型の治療のためのベータ－グルコセレブロシダーゼ；ティサックス病の治療のためのベータ－ヘキソサミニダーゼＡ；Ｃ１阻害剤欠乏症Ｉ型及びＩＩ型としても知られている遺伝性血管浮腫（ＨＡＥ）の治療のためのＳＥＲＰＩＮＧ１（Ｃ１プロテアーゼ阻害剤又はＣ１エステラーゼ阻害剤）；並びに糖原病Ｉ型（ＧＳＤＩ）の治療のためのグルコース－６－ホスファターゼ。

【0069】

ある特定の実施形態では、異種性核酸は、以下のものをコードする：ＣＦＴＲ（嚢胞性線維症膜貫通調節タンパク質）、血液凝固（凝血）因子（第ＸＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第ＶＩＩＩ因子、第Ｘ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩａ因子、プロテインＣなど）、機能獲得型血液凝固因子、抗体、網膜色素上皮特異的６５ｋＤａタンパク質（ＲＰＥ６５）、エリスロポエチン、ＬＤＬ受容体、リポタンパク質リパーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、β－グロビン、α－グロビン、スペクトリン、α－アンチトリプシン、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、金属輸送体（ＡＴＰ７Ａ若しくはＡＴＰ７）、スルファミダーゼ、リソソーム蓄積症に関与する酵素（ＡＲＳＡ）、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、β－２５グルコセレブロシダーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、リソソームヘキソサミニダーゼ、分岐鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ、ホルモン、成長因子、インスリン様成長因子１若しくは２、血小板由来成長因子、上皮成長因子、神経成長因子、神経栄養因子－３及び－４、脳由来神経栄養因子、グリア由来成長因子、トランスフォーミング成長因子α及びβ、サイトカイン、α－インターフェロン、β－インターフェロン、インターフェロン－γ、インターロイキン－２、インターロイキン－４、インターロイキン１２、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、リンホトキシン、自殺遺伝子産物、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、ジフテリア毒素、シトクロムＰ４５０、デオキシシチジンキナーゼ、腫瘍壊死因子、薬剤耐性タンパク質、腫瘍抑制タンパク質（例えば、ｐ５３、Ｒｂ、Ｗｔ－１、ＮＦ１、フォンヒッペル－リンダウ（ＶＨＬ）、腺腫性大腸ポリポーシス（ＡＰＣ））、免疫調節特性を有するペプチド、寛容原性又は免疫原性ペプチド又はタンパク質Ｔレジトープ（Ｔｒｅｇｉｔｏｐｅ）又はｈＣＤＲ１、インスリン、グルコキナーゼ、グアニル酸シクラーゼ２Ｄ（ＬＣＡ－ＧＵＣＹ２Ｄ）、Ｒａｂエスコートタンパク質１（コロイデレミア）、ＬＣＡ５（ＬＣＡ－レベルシリン（Ｌｅｂｅｒｃｉｌｉｎ））、オルニチンケト酸アミノトランスフェラーゼ（脳回転状萎縮症）、レチノスキシン１（Ｘ連鎖網膜剥離症）、ＵＳＨ１Ｃ（Ｕｓｈｅｒ症候群１Ｃ）、Ｘ連鎖網膜色素変性ＧＴＰａｓｅ（ＸＬＲＰ）、ＭＥＲＴＫ（ＡＲ型のＲＰ：網膜色素変性症）、ＤＦＮＢ１（コネキシン２６難聴）、ＡＣＨＭ２、３、及び４（色覚異常）、ＰＫＤ－１若しくはＰＫＤ－２（多発性嚢胞腎）、ＴＰＰ１、ＣＬＮ２、スルファターゼ、N-アセチルグルコサミン－１－リン酸トランスフェラーゼ、カテプシンＡ、ＧＭ２－ＡＰ、ＮＰＣ１、ＶＰＣ２、スフィンゴ脂質活性化タンパク質、ゲノム編集のための１つ若しくは複数のジンクフィンガーヌクレアーゼ、又はゲノム編集のための修復鋳型として使用される１つ若しくは複数のドナー配列。

【0070】

核酸分子、クローニングベクター、発現ベクターなどのベクター（例えば、ベクターゲノム）、及びプラスミドは、組換えＤＮＡ技術法を使用して調製することができる。ヌクレオチド配列情報が利用可能であると、様々な手段による核酸分子の調製が可能になる。例えば、ベクター又はプラスミドを含む第ＩＸ因子（ＦＩＸ）をコードする異種性核酸は、種々の標準的なクローニング、組換えＤＮＡ技術を使用して、細胞発現又はｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳及び化学合成技法により製作することができる。ポリヌクレオチドの純度は、配列決定及びゲル電気泳動などにより決定することができる。例えば、核酸は、ハイブリダイゼーション又はコンピュータに基づくデータベーススクリーニング技法を使用して単離することができる。そのような技術としては、これらに限定されないが、（１）ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーと相同性ヌクレオチド配列を検出するためのプローブとのハイブリダイゼーション；（２）例えば、発現ライブラリーを使用して、共通の構造的特徴を有するポリペプチドを検出するための抗体スクリーニング；（３）目的の核酸配列にアニーリングすることが可能なプライマーを使用した、ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡに対するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）；（４）関連配列の配列データベースのコンピュータ検索；及び（５）サブトラクション核酸ライブラリーのディファレンシャルスクリーニングが挙げられる。

【0071】

ｒＡＡＶビリオンを生成するための当技術分野で公知の方法：例えば、１つのＡＡＶヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、又はワクシニアウイルス）による共感染と併せてＡＡＶベクター及びＡＡＶヘルパー配列を使用するトランスフェクション、又は組換えＡＡＶベクター、ＡＡＶヘルパーベクター、及びアクセサリー機能ベクターによるトランスフェクション。ｒＡＡＶビリオンを生成するための非限定的な方法は、例えば、米国特許第６，００１，６５０号明細書及び第６，００４，７９７号明細書、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１６／６４４１４号パンフレット（国際公開第２０１７／０９６０３９号パンフレットとして公開）並びに米国特許仮出願第６２／５１６，４３２号明細書及び第６２／５３１，６２６号明細書に記載されている。組換えｒＡＡＶベクター産生（つまり、細胞培養系でのベクター生成）後、宿主細胞及び細胞培養上清からｒＡＡＶビリオンを得、次いで本明細書に記載のように精製することができる。

【0072】

完全ｒＡＡＶ粒子の精製方法
一基本態様では、本出願は、完全組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を精製するための方法であって、
（ａ）完全ｒＡＡＶ粒子及び不完全粒子を含むｒＡＡＶ調製物を準備するステップ、
（ｂ）負荷緩衝液中のｒＡＡＶ調製物を、クロマトグラフィー媒体を含むカラムに負荷するステップであり、完全ｒＡＡＶ粒子は、クロマトグラフィー媒体に対して不完全粒子よりも高い結合親和性を有する、ステップ、並びに
（ｃ）クロマトグラフィー媒体に結合した完全ｒＡＡＶ粒子を溶出緩衝液で溶出して、完全ｒＡＡＶ粒子対不完全粒子の増加した比を含む精製調製物を得るステップ
を含む方法に関する。

【0073】

本出願の実施形態によると、ｒＡＡＶ調製物は、完全ｒＡＡＶ粒子、並びに空粒子及び部分粒子を含む不完全粒子、並びにそれらのバリアントを含む任意の混合物であってもよい。また、ｒＡＡＶ調製物は、更に分離するための種々の不完全粒子（例えば、空粒子及び部分粒子）の混合物を含んでいてもよい。例えば、ｒＡＡＶ調製物は、細胞ライセート、処理された細胞ライセート、上清、又は以前に精製された調製物であってもよい。本出願の方法に有用なｒＡＡＶ調製物は、本開示に照らして、当技術分野で公知のｒＡＡＶを収集するための任意の方法を使用して得ることができる。例えば、細胞ライセートは、細胞を破壊又は溶解し、遠心分離、顕微溶液化、及び／又は深層濾過により細胞デブリを除去することにより得ることができる。細胞ライセートは直接使用してもよく、又は本出願の方法に使用する前に更に処理若しくは保管してもよい。

【0074】

典型的には、細胞ライセートを、濾過及び遠心分離などにより清澄化して細胞デブリを除去し、清澄化細胞ライセートにする。ライセート（任意選択で清澄化されている）は、完全ｒＡＡＶ粒子、不完全粒子、及び他のｒＡＡＶベクター産生／工程関連不純物、例えば、とりわけ細胞性タンパク質、脂質、及び／又は核酸、並びに細胞培養培地成分が含まれている可能性のある、宿主細胞の可溶性細胞成分を含む。次いで、任意選択で清澄化されたライセートを追加の精製ステップに供して、当技術分野で公知の任意の方法により他の工程関連不純物を除去することができる。得られた処理されたライセートを、本出願の方法に使用する前に、適切な緩衝液で希釈又は濃縮してもよい。

【0075】

一部の実施形態では、不完全粒子は空粒子を含む。
一部の実施形態では、不完全粒子は部分粒子を含む。
一部の実施形態では、不完全粒子は、空粒子及び部分粒子を両方とも含む。
一部の実施形態では、クロマトグラフィー媒体は、イオン交換カラムクロマトグラフィー媒体、好ましくは陰イオン交換クロマトグラフィー媒体である。この方法で使用される陰イオン交換クロマトグラフィー媒体は、強陰イオン交換樹脂であってもよく又は弱陰イオン交換樹脂であってもよい。好ましくは、陰イオン交換クロマトグラフィー媒体は、独自の第四級アミン、四級化ポリエチレンイミン、ポリエチレンイミン、又はジメチルアミノプロピルなどの陰イオン交換リガンドを含む。より好ましくは、陰イオン交換クロマトグラフィー媒体は、弱陰イオン交換樹脂（例えば、Ｐｏｒｏｓ５０Ｄ、Ｐｏｒｏｓ５０ＰＩ）又は強陰イオン交換樹脂（例えば、Ｐｏｒｏｓ ＸＱ、Ｐｏｒｏｓ５０ＨＱ）から選択される。陰イオン交換クロマトグラフィー媒体の他の例としては、これらに限定されないが、ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ、Ｑ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＨＰ及びＦＦ）、ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（低置換及び高置換）、Ｃａｐｔｏ Ｑ、Ｑ ＸＰ、Ｓｏｕｒｃｅ３０Ｑ 及び１５Ｑ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＤＥＡＥ、及びＭＰＨＱが挙げられる。陰イオン交換クロマトグラフィー媒体の他の例としては、ＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（商標）ＱＡモノリシックカラムなどのモノリスが挙げられる。

【0076】

一部の実施形態では、クロマトグラフィー媒体は、イオン交換カラムクロマトグラフィー媒体、好ましくは陰イオン交換クロマトグラフィー媒体である。
一部の実施形態では、カラムクロマトグラフィー媒体は、Ｐｏｒｏｓ５０ＨＱ、Ｐｏｒｏｓ５０Ｄ、Ｐｏｒｏｓ５０ＰＩ、Ｃａｐｔｏ ＩｍｐＲｅｓ Ｑ、及びＰｏｒｏｓ ＸＱからなる群から選択され、好ましくはＰｏｒｏｓ ＸＱである。
一部の実施形態では、カラムクロマトグラフィー媒体は、ＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（商標）ＱＡモノリシックカラムなどのモノリスである。
一部の実施形態では、複数のクロマトグラフィー媒体が使用される。
一部の実施形態では、複数のクロマトグラフィー媒体が使用される場合、媒体は同じである。
一部の実施形態では、イオン交換クロマトグラフィー媒体は、ＡＶＢ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、マサチューセッツ州マールボロ）などの親和性クロマトグラフィー媒体、又はＳｕｐｅｒｄｅｘ２００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）などのサイズ排除クロマトグラフィーと併せて（前又は後を意味する）使用される。

【0077】

一部の実施形態では、ｒＡＡＶ調製物が、ステップ（ｂ）において、クロマトグラフィー媒体を含むカラムに負荷緩衝液で負荷される場合、完全ｒＡＡＶ粒子のみがクロマトグラフィー媒体に結合し、不完全粒子はクロマトグラフィー媒体に結合せず、カラムを通過して流出する。一部の実施形態では、カラムからのフロースルーは空粒子を含む。一部の実施形態では、カラムからのフロースルーは部分粒子を含む。一部の実施形態では、カラムからのフロースルーは完全ｒＡＡＶ粒子及び空粒子を両方とも含む。一部の実施形態では、カラムからのフロースルーは完全ｒＡＡＶ粒子及び部分粒子を両方とも含む。一部の実施形態では、カラムからのフロースルーは、完全ｒＡＡＶ粒子、並びに空粒子及び部分粒子を含む不完全粒子を両方とも含む。

【0078】

一部の実施形態では、負荷緩衝液中のｒＡＡＶ調製物が、ステップ（ｂ）においてクロマトグラフィー媒体を含むカラムにアプライされる場合、完全ｒＡＡＶ粒子、及びバリアント様粒子を含む不完全粒子は両方ともクロマトグラフィー媒体に結合するが、完全ｒＡＡＶ粒子は、クロマトグラフィー媒体に対して不完全粒子よりも高い結合親和性を有し、カラムにアプライされる完全粒子及び不完全粒子の量は、クロマトグラフィー媒体の結合容量を超えており、クロマトグラフィー媒体に結合した不完全粒子は、完全ｒＡＡＶ粒子により、カラムからの負荷フロースルーへと置換される。カラムからの負荷フロースルーは、完全ｒＡＡＶ粒子及び不完全粒子を両方とも含む。ある特定の実施形態では、一部の不完全粒子（例えば、空粒子及び／又は部分粒子）は、クロマトグラフィー媒体に結合するが、溶出緩衝液による完全ｒＡＡＶ粒子の溶出前に洗浄緩衝液により溶出することができる。

【0079】

理論に束縛されることは望まないが、完全ＡＡＶ粒子と不完全ＡＡＶ粒子との分離は、置換現象により負荷中に生じると考えられる。粒子の混合物を含むｒＡＡＶ調製物をまずカラムにアプライすると、全ての粒子がカラムの利用可能な部位に結合する。利用可能な部位がカラムの入口に向かって占有されると共に、クロマトグラフィー媒体に対してより高い親和性を有する完全ｒＡＡＶ粒子は、クロマトグラフィー媒体に対してより低い親和性を有する結合した不完全粒子を置換し、カラムの上部部分では完全粒子が富化される。この過程で、不完全粒子は、下流のクロマトグラフィー媒体に結合する。より多くの混合物がカラムにアプライされると、より多くの完全ｒＡＡＶ粒子が、上流のクロマトグラフィー媒体に結合し、結合した不完全粒子を置換し、不完全粒子を更に下流へと押し流すことになる。ある特定の実施形態では、試料負荷が完了した後、クロマトグラフィー媒体には不完全粒子が結合していないか、又はクロマトグラフィー媒体に結合している不完全粒子の量は、完全ｒＡＡＶの量と比較して低減されている。完全粒子による不完全粒子の置換は、クロマトグラフィー媒体に対するそれらの親和性が異なる結果であるため、それらの親和性の対比を強化することにより分離を向上させることができる。クロマトグラフィー媒体に結合する粒子の親和性は、ｒＡＡＶ粒子、樹脂、及び環境（緩衝液条件（塩及びｐＨ）を含む）などの要因により決まる。同様に、この推論は、不完全ｒＡＡＶ粒子が部分粒子を含む場合、部分粒子にも当てはまる。不完全粒子集団のバリアントとして、部分粒子は、他の不完全粒子、特に空粒子よりも高い親和性だが、完全粒子よりも低い親和性でクロマトグラフィー媒体に結合することができ、従って完全粒子及び部分粒子は両方とも、他の不完全粒子を置換することができる。他の不完全粒子に加えて、クロマトグラフィー媒体に対する完全粒子及び部分粒子の親和性の対比を強化することにより、完全粒子からの部分粒子の分離を更に向上させることができる。また同様に、不完全ｒＡＡＶ粒子が空粒子を含む場合、本開示の方法を使用して、完全粒子及び他の不完全粒子からの空粒子の分離を向上させることができる。

【0080】

置換の利益は、カラムにおいてブレイクスルーが生じ、カラムクロマトグラフィー媒体の結合容量点を超えると実現される。クロマトグラフィー媒体樹脂が局所的にその飽和を超え続けると、完全粒子と不完全粒子との間で競合が起こり、結合した不完全粒子が、進入してくる完全粒子により置換されることに結び付く。
置換の利益は、クロマトグラフィー媒体に対する親和性が異なることに基づいて、他のｒＡＡＶ不純物及び産物バリアント、例えば、切断導入遺伝子を有する部分的に充填されたカプシド、翻訳後修飾を有する空の若しくは部分的な若しくは完全なカプシドバリアント、又は断片若しくは凝集体の分離にも同様に適用することができる。

【0081】

一部の実施形態では、不完全粒子が空粒子及び部分粒子を両方とも含む場合、全ての不完全粒子は、カラムの利用可能な部位に結合する。利用可能な部位が占有されると、クロマトグラフィー媒体に対して空粒子よりも比較的より高い親和性を有する部分粒子は、結合した空粒子を置換する。
陰イオン交換樹脂などのクロマトグラフィー媒体は、ｐＨ及び緩衝液容積などの種々の条件下で種々の緩衝液を用いて、平衡化、洗浄、及び溶出することができる。以下は、特定の非限定的な例を説明することを目的とするが、本発明を限定することを意図するものではない。
陰イオン交換クロマトグラフィーは、標準的緩衝液を使用し、製造業者の仕様書に従って平衡化することができる。次いで、平衡化後、試料を負荷する。その後、クロマトグラフィー媒体を、少なくとも１回又はそれよりも多くの回数で、例えばカラム容積の２～１０倍で洗浄する。クロマトグラフィー媒体からの溶出は、２～２０カラム容量の高塩緩衝液による。

【0082】

本出願の実施形態によると、陰イオン交換クロマトグラフィーの洗浄及び溶出のための平衡緩衝液及び溶液は、約ｐＨ６．０～ｐＨ１２のｐＨが適切である。加えて、陰イオン交換カラムの洗浄及び溶出のための適切な平衡緩衝液及び溶液は、一般に、性質が陽イオン性又は双性イオン性である。そのような緩衝液としては、限定ではないが、以下の緩衝剤を有する緩衝液が挙げられる：Ｎ－メチルピペラジン；ピペラジン；Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ；Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓプロパン；トリエタノールアミン；Ｔｒｉｓ；Ｔｒｉｓ酢酸；Ｎ－メチルジエタノールアミン；１，３－ジアミノプロパン；エタノールアミン；及び酢酸などが挙げられる。試料を溶出するには、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ₂、ＣａＣｌ₂、硫酸塩、ギ酸塩、又は酢酸塩などの塩を使用して、開始緩衝液のイオン強度を増加させる。
一部の実施形態では、負荷緩衝液は、Ｔｒｉｓ、Ｂｉｓ－ｔｒｉｓ、Ｂｉｓ－ｔｒｉｓプロパン、Ｔｒｉｓ酢酸、エタノールアミン、及びホスフェートからなる群から選択される少なくとも１つの緩衝剤を含む。ある特定の実施形態では、負荷緩衝液は、約２０～５０ｍＭの濃度、例えば、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭ、又はそれらの間の任意の濃度の選択された緩衝剤を含んでいた。好ましい実施形態では、負荷緩衝液は、２０～５０ｍＭ Ｔｒｉｓを含む。

【0083】

一部の実施形態では、負荷緩衝液は、Ｋ（Ｉ）、Ｌｉ（Ｉ）、Ｃａ（ＩＩ）、Ｍｇ（ＩＩ）、Ｃｕ（ＩＩ）、Ｂａ（ＩＩ）、Ｃｏ（ＩＩ）、Ｎｉ（ＩＩ）、Ｍｎ（ＩＩ）、Ｚｎ（ＩＩ）、Ｃｄ（ＩＩ）、Ｐｂ（ＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩ）、Ｎａ（Ｉ）、及びＮＨ₄ ⁺からなる群から選択される陽イオンの少なくとも１つの塩を含む。例えば、負荷緩衝液は、ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ₂、及びＣａＣｌ₂からなる群から選択される複数の塩を含んでいてもよい。好ましい実施形態では、負荷緩衝液は、ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ₂、ＣｕＣｌ₂、ＬｉＣｌ、及びＣａＣｌ₂を含む。塩に対する陰イオン成分は決定的なものではなく、特定の陰イオンが好ましいということはない。

【0084】

一部の実施形態では、負荷緩衝液は、Ｋ（Ｉ）、Ｌｉ（Ｉ）、Ｃａ（ＩＩ）、Ｍｇ（ＩＩ）、Ｃｕ（ＩＩ）、Ｂａ（ＩＩ）、Ｃｏ（ＩＩ）、Ｎｉ（ＩＩ）、Ｍｎ（ＩＩ）、Ｚｎ（ＩＩ）、Ｃｄ（ＩＩ）、Ｐｂ（ＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩ）、Ｎａ（Ｉ）、及びＮＨ₄ ⁺からなる群から選択される陽イオンの少なくとも１つの塩を含む。
一部の実施形態では、負荷緩衝液は、Ｋ（Ｉ）、Ｌｉ（Ｉ）、Ｃａ（ＩＩ）、Ｍｇ（ＩＩ）、Ｃｕ（ＩＩ）、Ｂａ（ＩＩ）、Ｃｏ（ＩＩ）、Ｎｉ（ＩＩ）、Ｍｎ（ＩＩ）、Ｚｎ（ＩＩ）、Ｃｄ（ＩＩ）、Ｐｂ（ＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩ）、Ｎａ（Ｉ）、及びＮＨ₄ ⁺からなる群から選択される陽イオンの少なくとも１つの塩を含み、完全ｒＡＡＶ粒子のみがクロマトグラフィー媒体に結合し、不完全粒子はクロマトグラフィー媒体に結合せず、カラムを通過して流出する。好ましい実施形態では、負荷緩衝液は、少なくともＣａＣｌ₂を含む。

【0085】

一部の実施形態では、負荷緩衝液は、約１０～１００ｍＭ、例えば、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００ｍＭ、又はそれらの間の任意の濃度のナトリウム塩を含む。好ましい実施形態では、ナトリウム塩の濃度は、約２０～６０ｍＭ、例えば、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０ｍＭ、又はそれらの間の任意の濃度である。
一部の実施形態では、負荷緩衝液は、約０～２０ｍＭ、例えば、０、５、１０、１５、２０ｍＭ、又はそれらの間の任意の濃度のマグネシウム塩を含む。好ましい実施形態では、マグネシウム塩の濃度は、約１～１０ｍＭ、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０ｍＭ、又はそれらの間の任意の濃度である。

【0086】

一部の実施形態では、負荷緩衝液は、約０～１００ｍＭ、例えば、０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００ｍＭ、又はそれらの間の任意の濃度のリチウム塩を含む。好ましい実施形態では、リチウム塩の濃度は、約０～７５ｍＭ、例えば、０、１５、２５、３５、４５、５５、６５、７５ｍＭ、又はそれらの間の任意の濃度である。
一部の実施形態では、負荷緩衝液は、約０～１０ｍＭ、例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０ｍＭ、又はそれらの間の任意の濃度のカルシウム塩を含む。好ましい実施形態では、カルシウム塩の濃度は、約０．１～２．５ｍＭ、例えば、０．１、０．５、１．０、１．５、２．０、２．５ｍＭ、又はそれらの間の任意の濃度である。
一部の実施形態では、負荷緩衝液は、約０～５ｍＭ、例えば、０、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５ｍＭ、又はそれらの間の任意の濃度の銅塩を含む。好ましい実施形態では、銅塩の濃度は、約０．１～２．５ｍＭ、例えば、０．１、０．５、１．０、１．５、２．０、２．５ｍＭ、又はそれらの間の任意の濃度である。
一部の実施形態では、負荷緩衝液は、約５～１００ｍＭ、例えば、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００ｍＭ、又はそれらの間の任意の濃度のアンモニウム塩を含む。好ましい実施形態では、アンモニウムの濃度は、約１０～５０ｍＭ、例えば、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０ｍＭ、又はそれらの間の任意の濃度である。

【0087】

一部の実施形態では、負荷緩衝液は、Ｋ（Ｉ）、Ｌｉ（Ｉ）、Ｃａ（ＩＩ）、Ｍｇ（ＩＩ）、Ｃｕ（ＩＩ）、Ｂａ（ＩＩ）、Ｃｏ（ＩＩ）、Ｎｉ（ＩＩ）、Ｍｎ（ＩＩ）、Ｚｎ（ＩＩ）、Ｃｄ（ＩＩ）、Ｐｂ（ＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩ）、Ｎａ（Ｉ）、及びＮＨ₄ ⁺からなる群から選択される陽イオンの少なくとも１つの塩を含む。
一部の実施形態では、負荷緩衝液は、約７～１０のｐＨ、例えば、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、又はそれらの間の任意のｐＨ、好ましくは約８～９のｐＨを有する。
ある特定の実施形態では、負荷緩衝液は、好ましくは、Ｔｒｉｓ中に、より好ましくは２０～５０ｍＭ Ｔｒｉｓ中に、約２０～６０ｍＭ ＮａＣｌ、１～５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、０．１～２．５ｍＭ ＣａＣｌ₂を含む。

【0088】

ある特定の実施形態では、負荷緩衝液は、好ましくはＴｒｉｓ中に、より好ましくは２０～１００ｍＭ Ｔｒｉｓ中に、約２０～６０ｍＭ ＮａＣｌ、１０～３０ｍＭ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、１～５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、０．１～２．５ｍＭ ＣｕＣｌ₂を含む。
一部の実施形態では、負荷緩衝液は、少なくとも１つの界面活性剤を含む。
一部の実施形態では、負荷緩衝液中の界面活性剤は、ポロクサマー１８８、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０、ＮＰ－４０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、及びＴｒｉｔｏｎ ＣＧ－１１０からなる群から選択される。
一部の実施形態では、負荷緩衝液中の界面活性剤の濃度は、０．０００１％～０．１％である。

【0089】

負荷ステップ（ｂ）の後、負荷緩衝液中のｒＡＡＶ調製物を、クロマトグラフィー媒体を含むカラムに負荷し、完全ｒＡＡＶ粒子は、クロマトグラフィー媒体に対して不完全粒子よりも高い結合親和性を有し、完全ｒＡＡＶ粒子は、クロマトグラフィー媒体に結合する。任意選択で、カラムを、溶出前に洗浄緩衝液で洗浄してもよい。例えば、クロマトグラフィー媒体に結合した不完全粒子を除去するために、洗浄緩衝液は、負荷条件と比較して増加した塩濃度及び／又は増加した溶出ｐＨを有してもよい。
次いで、クロマトグラフィー媒体に結合した完全粒子を、例えば、負荷条件と比較して増加した塩濃度及び／又は溶出用に調整されたｐＨを使用して、より純粋な形態で溶出させる。ｐＨを調整すると、完全粒子と不完全粒子との分離を強化することができる。好ましくは、完全粒子の溶出は、ｐＨを変化させずに塩勾配のみを使用して達成される。
一部の実施形態では、溶出緩衝液は、Ｔｒｉｓ、Ｂｉｓ－ｔｒｉｓ、Ｂｉｓ－ｔｒｉｓプロパン、Ｔｒｉｓ酢酸、エタノールアミン、及びホスフェートからなる群から選択される少なくとも１つの緩衝剤を含む。ある特定の実施形態では、溶出緩衝液は、約２０～７０ｍＭの濃度、例えば、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭ、６０ｍＭ、７０ｍＭ、又はそれらの間の任意の濃度の選択された緩衝剤を含んでいた。好ましい実施形態では、溶出緩衝液は、４０～６０ｍＭ Ｔｒｉｓを含む。

【0090】

一部の実施形態では、溶出緩衝液は、Ｋ（Ｉ）、Ｌｉ（Ｉ）、Ｃａ（ＩＩ）、Ｍｇ（ＩＩ）、Ｃｕ（ＩＩ）、Ｂａ（ＩＩ）、Ｃｏ（ＩＩ）、Ｎｉ（ＩＩ）、Ｍｎ（ＩＩ）、Ｚｎ（ＩＩ）、Ｃｄ（ＩＩ）、Ｐｂ（ＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩ）、Ｎａ（Ｉ）、及びＮＨ₄ ⁺からなる群から選択される陽イオンの少なくとも１つの塩を含む。例えば、溶出緩衝液は、好ましくは、ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ₂、ＬｉＣｌ、ＣｕＣｌ₂、及びＣａＣｌ₂からなる群から選択される１つ又は複数の塩を含んでいてもよい。塩の陰イオン成分は決定的なものではない。
一部の実施形態では、溶出緩衝液は、Ｋ（Ｉ）、Ｌｉ（Ｉ）、Ｃａ（ＩＩ）、Ｍｇ（ＩＩ）、Ｃｕ（ＩＩ）、Ｂａ（ＩＩ）、Ｃｏ（ＩＩ）、Ｎｉ（ＩＩ）、Ｍｎ（ＩＩ）、Ｚｎ（ＩＩ）、Ｃｄ（ＩＩ）、Ｐｂ（ＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩ）、Ｎａ（Ｉ）、及びＮＨ₄ ⁺からなる群から選択される陽イオンの少なくとも１つの塩を含む。

【0091】

一部の実施形態では、溶出緩衝液は、約０～１０００ｍＭ、例えば,０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００ｍＭ、又はそれらの間の任意の濃度のＮａＣｌを含む。好ましい実施形態では、ＮａＣｌの濃度は、約２０～３００ｍＭ、例えば、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、２００、２５０、３００ｍＭ、又はそれらの間の任意の濃度である。
一部の実施形態では、溶出緩衝液は、約０～３０ｍＭ、例えば、０、５、１０、１５、２０、２５、３０ｍＭ、又はそれらの間の任意の濃度のＭｇＣｌ₂を含む。好ましい実施形態では、ＭｇＣｌ₂の濃度は、約２～１５ｍＭ、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５ｍＭ、又はそれらの間の任意の濃度である。

【0092】

一部の実施形態では、溶出緩衝液は、約０～２００ｍＭ、例えば、０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００ｍＭ、又はそれらの間の任意の濃度のＬｉＣｌである。好ましい実施形態では、ＬｉＣｌの濃度は、約０～１５０ｍＭ、例えば、０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０ｍＭ、又はそれらの間の任意の濃度である。
一部の実施形態では、溶出緩衝液は、約０．１～２０ｍＭ、例えば、０．１、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０ｍＭ、又はそれらの間の任意の濃度のＣａＣｌ₂を含む。好ましい実施形態では、ＣａＣｌ₂の濃度は、約５～１０ｍＭ、例えば、５、６、７、８、９、１０ｍＭ、又はそれらの間の任意の濃度である。
一部の実施形態では、溶出緩衝液は、約０～１０ｍＭ、例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０ｍＭ、又はそれらの間の任意の濃度のＣｕＣｌ₂を含む。好ましい実施形態では、ＣｕＣｌ₂の濃度は、約０～３ｍＭ、例えば、０、１、２、３ｍＭ、又はそれらの間の任意の濃度である。

【0093】

一部の実施形態では、溶出緩衝液は、約５～１００ｍＭ、例えば、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００ｍＭ、又はそれらの間の任意の濃度の（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄を含む。好ましい実施形態では、（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄の濃度は、約１０～５０ｍＭ、例えば、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０ｍＭ、又はそれらの間の任意の濃度である。
一部の実施形態では、溶出緩衝液は、約６～１０、例えば、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０のｐＨ、又はそれらの間の任意のｐＨ、好ましくは約７～９のｐＨを有する。
ある特定の実施形態では、溶出緩衝液は、好ましくはＴｒｉｓ中に、より好ましくは４０～６０ｍＭ Ｔｒｉｓ中に、約２０～１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む。
一部の実施形態では、溶出緩衝液は、少なくとも１つの界面活性剤を含む。
一部の実施形態では、溶出緩衝液中の界面活性剤は、ポロクサマー１８８、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０、ＮＰ－４０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、及びＴｒｉｔｏｎ ＣＧ－１１０からなる群から選択される。
一部の実施形態では、溶出緩衝液中の界面活性剤の濃度は、０．０００１％～０．１％である。

【0094】

別の基本態様では、本出願は、完全組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を精製するための方法であって、
（ａ）完全ｒＡＡＶ粒子及び不完全粒子を含むｒＡＡＶ調製物を準備するステップ、
（ｂ）負荷緩衝液中のｒＡＡＶ調製物の第１のバッチを、第１のクロマトグラフィー媒体を含む第１のカラムに負荷するステップであり、完全ｒＡＡＶ粒子は、第１のクロマトグラフィー媒体に対して不完全粒子よりも高い結合親和性を有し、第１のカラムにアプライされる完全ｒＡＡＶ粒子及び不完全粒子の量は、第１のクロマトグラフィー媒体の結合容量を超えており、第１のクロマトグラフィー媒体に結合した不完全粒子は、完全ｒＡＡＶ粒子により、第１のカラムからの第１の負荷フロースルーへと置換される、ステップ、
（ｃ）第１の負荷フロースルーを、第２のクロマトグラフィー媒体を含む第２のカラムに負荷して、負荷された又は部分的に負荷された第２のカラム及び第２のカラムからの第１のフロースルーを得るステップであり、第２のクロマトグラフィー媒体は、第１のクロマトグラフィー媒体と同じタイプである、ステップ、
（ｄ）任意選択で、第１のカラムを洗浄緩衝液で洗浄して、洗浄された第１のカラムを得るステップ、
（ｅ）ステップ（ｃ）の後に、又は洗浄ステップ（ｄ）が実施される場合には洗浄ステップ（ｄ）の後に、第２のカラムをバイパスし、第１のクロマトグラフィー媒体に結合した完全ｒＡＡＶ粒子を溶出緩衝液で溶出して、第１のカラムからの第１の溶出物及び溶出された第１のカラムを得るステップであり、第１の溶出物は、完全ｒＡＡＶ粒子対不完全ｒＡＡＶ粒子の増加した比を含む、ステップ、
（ｆ）任意選択で、第１のカラムフロースルー後に第２のカラムが飽和（つまり、負荷）されていない場合、負荷緩衝液中のｒＡＡＶ調製物の第２のバッチを、部分的に負荷された第２のカラムにアプライしてもよく、第２のカラムにアプライされる完全ｒＡＡＶ粒子及び不完全粒子の量は、第２のクロマトグラフィー媒体の結合容量を超えており、第２のクロマトグラフィー媒体に結合した不完全粒子は、完全ｒＡＡＶ粒子により、第２のカラムからの第２の負荷フロースルーへと置換される、ステップ、
（ｇ）ステップ（ｆ）が実施される場合、ステップ（ｄ）と（ｅ）との間で、第２のカラムからの第２の負荷フロースルーを、洗浄された第１のカラムに負荷して第２の負荷された第１のカラムを得、任意選択で、ステップ（ｅ）での溶出へと進む前に第２の負荷された第１のカラムを洗浄するステップ、
（ｈ）任意選択で、第２のカラムを洗浄緩衝液で洗浄して、洗浄された第２のカラムを得るステップ、
（ｉ）ステップ（ｇ）の後で、又は洗浄ステップ（ｈ）が実施される場合には洗浄ステップ（ｈ）の後で、第１のカラムをバイパスし、第２のクロマトグラフィー媒体に結合した完全ｒＡＡＶ粒子を溶出緩衝液で溶出して、第２の溶出物及び溶出された第２のカラムを得るステップであり、第２の溶出物は、完全ｒＡＡＶ粒子対不完全ｒＡＡＶ粒子の増加した比を含む、ステップ、並びに
（ｊ）第１の溶出物及び第２の溶出物を一緒にして、完全ｒＡＡＶ粒子の精製調製物を生成するステップ
を含む方法に関する。

【0095】

一部の実施形態では、不完全粒子は、空粒子を含む。
一部の実施形態では、不完全粒子は、部分粒子を含む。
一部の実施形態では、不完全粒子は、空粒子及び部分粒子を両方とも含む。
一部の実施形態では、第１のクロマトグラフィー媒体及び／又は第２のクロマトグラフィー媒体は、イオン交換カラムクロマトグラフィー媒体、好ましくは陰イオン交換クロマトグラフィー媒体である。
一部の実施形態では、２カラム精製法は、図１２に示されている実施スキームに従って設定及び操作される。２カラム法のステップ（ａ）及び（ｂ）は、１カラム置換クロマトグラフィー法の最初の２つのステップと同様である。こうした２つのステップの後、完全ｒＡＡＶ粒子は、第１のクロマトグラフィー媒体に結合し、第１のカラムからの第１の負荷フロースルーは、完全ｒＡＡＶ粒子及び不完全粒子を両方とも含む。
ステップ（ｆ）では、負荷緩衝液中のｒＡＡＶ調製物の第２バッチを、ステップ（ｃ）で部分的に負荷された第２カラムにアプライする。ｒＡＡＶ調製物の第２バッチの量は、第１のバッチと同じであってもよく、又は第１のバッチと異なっていてもよい。好ましくは、第２のバッチの量は第１のバッチと同じである。

【0096】

本出願の実施形態によると、ステップ（ｆ）において第２カラムにアプライされる完全ｒＡＡＶ粒子及び不完全粒子の量は、第１負荷フロースルーからの量及びｒＡＡＶ調製物の第２バッチからの量を含み、第２のクロマトグラフィー媒体の結合容量を超えている。部分的に負荷された第２のカラムへの第２のバッチの負荷中に、第２のクロマトグラフィー媒体に結合した不完全粒子は、完全ｒＡＡＶ粒子により、第２のカラムからの第２の負荷フロースルーへと置換される。
その後のステップ（ｇ）では、第２のカラムからの第２の負荷フロースルーを、以前に洗浄又は溶出された第１のカラムに負荷する。次いで、ステップ（ｇ）の後、第１のカラムを部分的に負荷し、第２のカラムからの第２の負荷フロースルー中の完全ｒＡＡＶ粒子及び不完全粒子の量は、この時点では、第１のクロマトグラフィー媒体の結合容量を超えていない。

【0097】

ステップ（ｂ）～（ｉ）は、ｒＡＡＶ調製物の量に応じて、１サイクル又は複数サイクルで実施することができる。「１サイクル」という用語は、本明細書で使用される場合、ステップ（ｂ）～ステップ（ｉ）を連続して１回実施すること指す。「複数サイクル」という用語は、本明細書で使用される場合、ステップ（ｂ）～ステップ（ｉ）を連続して１回よりも多く実施すること指す。
ステップ（ｂ）～（ｉ）が複数サイクルで実施される場合、繰返しステップ（ｂ）における「第１のバッチ」は、そのサイクル番号のｒＡＡＶ調製物の新たな「第１のバッチ」を指し、繰返しステップ（ｆ）における「第２のバッチ」は、その同じサイクルでのｒＡＡＶ調製物の新たな「第２のバッチ」を指す。

【0098】

一部の実施形態では、不完全粒子が空粒子及び部分粒子を両方とも含む場合、ステップ（ｉ）の第２の溶出物は、完全ｒＡＡＶ粒子及び部分ｒＡＡＶ粒子対空ｒＡＡＶ粒子の増加した比を含む。
一部の実施形態では、複数のサイクルが実施される場合、溶出されたカラムを、次の負荷サイクルの前に、サイクル全体にわたって一貫したカラム結合容量を維持するために有益であるか又は必要であるその後のステップに供してもよい。例えば、そのようなステップとしては、これらに限定されないが、カラムのストリッピング、カラムの清浄化、及び／若しくは消毒、並びに／又はカラムの再平衡化が挙げられる。
一部の実施形態では、負荷緩衝液は、Ｔｒｉｓ、Ｂｉｓ－ｔｒｉｓ、Ｂｉｓ－ｔｒｉｓプロパン、Ｔｒｉｓ酢酸、エタノールアミン、及びホスフェートからなる群から選択される少なくとも１つの緩衝剤を含む。ある特定の実施形態では、負荷緩衝液は、約２０～５０ｍＭの濃度、例えば、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭ、又はそれらの間の任意の濃度の選択された緩衝剤を含んでいた。好ましい実施形態では、負荷緩衝液は、２０～５０ｍＭ Ｔｒｉｓを含む。

【0099】

一部の実施形態では、負荷緩衝液は、０～２００ｍＭの範囲の、Ｋ（Ｉ）、Ｌｉ（Ｉ）、Ｃａ（ＩＩ）、Ｍｇ（ＩＩ）、Ｃｕ（ＩＩ）、Ｂａ（ＩＩ）、Ｃｏ（ＩＩ）、Ｎｉ（ＩＩ）、Ｍｎ（ＩＩ）、Ｚｎ（ＩＩ）、Ｃｄ（ＩＩ）、Ｐｂ（ＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩ）、Ｎａ（Ｉ）、及びＮＨ₄ ⁺からなる群から選択される陽イオンの少なくとも１つの塩を含む。塩に対する陰イオン成分は決定要因ではなく、特定の陰イオンが好ましいということはない。例えば、負荷緩衝液は、好ましくは、ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ₂、ＬｉＣｌ、ＣｕＣｌ₂、及びＣａＣｌ₂からなる群から選択される１つ又は複数の塩を含んでいてもよい。
一部の実施形態では、負荷緩衝液は、約１０～１００ｍＭ、例えば、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００ｍＭ、又はそれらの間の任意の濃度のナトリウム塩を含む。好ましい実施形態では、ナトリウム塩の濃度は、約２０～６０ｍＭ、例えば、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０ｍＭ、又はそれらの間の任意の濃度である。

【0100】

一部の実施形態では、負荷緩衝液は、約０～２０ｍＭ、例えば、０、５、１０、１５、２０ｍＭ、又はそれらの間の任意の濃度のマグネシウム塩を含む。好ましい実施形態では、マグネシウム塩の濃度は、約１～１０ｍＭ、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０ｍＭ、又はそれらの間の任意の濃度である。
一部の実施形態では、負荷緩衝液は、約０～１００ｍＭ、例えば、０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００ｍＭ、又はそれらの間の任意の濃度のリチウム塩を含む。好ましい実施形態では、リチウム塩の濃度は、約０～７５ｍＭ、例えば、０、１５、２５、３５、４５、５５、６５、７５ｍＭ、又はそれらの間の任意の濃度である。

【0101】

一部の実施形態では、負荷緩衝液は、約０～１０ｍＭ、例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０ｍＭ、又はそれらの間の任意の濃度のカルシウム塩を含む。好ましい実施形態では、カルシウム塩の濃度は、約０．１～２．５ｍＭ、例えば、０．１、０．５、１．０、１．５、２．０、２．５ｍＭ、又はそれらの間の任意の濃度である。
一部の実施形態では、負荷緩衝液は、約０～５ｍＭ、例えば、０、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５ｍＭ、又はそれらの間の任意の濃度の銅塩を含む。好ましい実施形態では、銅塩の濃度は、約０．１～２．５ｍＭ、例えば、０．１、０．５、１．０、１．５、２．０、２．５ｍＭ、又はそれらの間の任意の濃度である。
一部の実施形態では、負荷緩衝液は、約５～１００ｍＭ、例えば、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００ｍＭ、又はそれらの間の任意の濃度のアンモニウム塩を含む。好ましい実施形態では、アンモニウムの濃度は、約１０～５０ｍＭ、例えば、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０ｍＭ、又はそれらの間の任意の濃度である。

【0102】

一部の実施形態では、負荷緩衝液は、少なくとも１つの界面活性剤を含む。
一部の実施形態では、負荷緩衝液中の界面活性剤は、ポロクサマー１８８、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０、ＮＰ－４０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、及びＴｒｉｔｏｎ ＣＧ－１１０からなる群から選択される。
一部の実施形態では、負荷緩衝液中の界面活性剤の濃度は、０．０００１％～０．１％である。
一部の実施形態では、負荷緩衝液は、約６～１０、例えば、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０のｐＨ、又はそれらの間の任意のｐＨ、好ましくは約８～９のｐＨを有する。
ある特定の実施形態では、負荷緩衝液は、好ましくはＴｒｉｓ中に、より好ましくは２０～５０ｍＭ Ｔｒｉｓ中に、約２０～６０ｍＭ ＮａＣｌ、１～５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、０．１～２．５ｍＭ ＣｕＣｌ₂を含む。

【0103】

ある特定の実施形態では、負荷緩衝液は、０．００００５～０．０１％ポロクサマー１８８、より好ましくは０．０００２～０．００１％ポロクサマー１８８を有する、好ましくはＴｒｉｓ中に、より好ましくは２０～５０ｍＭ Ｔｒｉｓ中に、約２０～６０ｍＭ ＮａＣｌ、５０～３０ｍＭ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、１～５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、０．１～３ｍＭ ＣｕＣｌ₂を含む。
負荷ステップの後、完全粒子はクロマトグラフィー媒体に結合し、不完全粒子はカラムから出てフロースルーに入る。任意選択で、カラムを、溶出前に好適な洗浄緩衝液で洗浄してもよい。例えば、クロマトグラフィー媒体に結合した不完全粒子を除去するために、洗浄緩衝液は、負荷条件と比較して増加した塩濃度及び／又は増加した溶出ｐＨを有してもよい。

【0104】

次いで、クロマトグラフィー媒体に結合した完全粒子を、例えば、負荷条件と比較して増加した塩濃度及び／又は溶出用に調整されたｐＨを使用して、より純粋な形態で続いて溶出させる。ｐＨを調整すると、分離の強化を可能にすることができる。好ましくは、完全粒子の溶出は、ｐＨを増加させずに塩勾配のみを使用して達成される。
一部の実施形態では、溶出緩衝液は、Ｔｒｉｓ、Ｂｉｓ－ｔｒｉｓ、Ｂｉｓ－ｔｒｉｓプロパン、Ｔｒｉｓ酢酸、エタノールアミン、及びホスフェートからなる群から選択される少なくとも１つの緩衝剤を含む。ある特定の実施形態では、負荷緩衝液は、約２０～７０ｍＭの濃度、例えば、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭ、６０ｍＭ、７０ｍＭ、又はそれらの間の任意の濃度の選択された緩衝剤を含んでいた。好ましい実施形態では、負荷緩衝液は、４０～６０ｍＭ Ｔｒｉｓを含む。

【0105】

一部の実施形態では、溶出緩衝液は、Ｋ（Ｉ）、Ｌｉ（Ｉ）、Ｃａ（ＩＩ）、Ｍｇ（ＩＩ）、Ｃｕ（ＩＩ）、Ｂａ（ＩＩ）、Ｃｏ（ＩＩ）、Ｎｉ（ＩＩ）、Ｍｎ（ＩＩ）、Ｚｎ（ＩＩ）、Ｃｄ（ＩＩ）、Ｐｂ（ＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩ）、Ｎａ（Ｉ）、及びＮＨ₄ ⁺からなる群から選択される陽イオンの少なくとも１つの塩を含む。例えば、溶出緩衝液は、好ましくは、ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ₂、ＬｉＣｌ、ＣｕＣｌ₂、及びＣａＣｌ₂からなる群から選択される１つ又は複数の塩を含んでいてもよい。塩の陰イオン成分は決定的なものではない。
一部の実施形態では、溶出緩衝液は、Ｋ（Ｉ）、Ｌｉ（Ｉ）、Ｃａ（ＩＩ）、Ｍｇ（ＩＩ）、Ｃｕ（ＩＩ）、Ｂａ（ＩＩ）、Ｃｏ（ＩＩ）、Ｎｉ（ＩＩ）、Ｍｎ（ＩＩ）、Ｚｎ（ＩＩ）、Ｃｄ（ＩＩ）、Ｐｂ（ＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩ）、Ｎａ（Ｉ）、及びＮＨ₄ ⁺からなる群から選択される陽イオンの少なくとも１つの塩を含む。例えば、負荷緩衝液は、好ましくは、ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ₂、ＬｉＣｌ、ＣｕＣｌ₂、及びＣａＣｌ₂からなる群から選択される１つ又は複数の塩を含んでいてもよい。

【0106】

一部の実施形態では、溶出緩衝液は、約０～１０００ｍＭ、例えば０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００ｍＭ、又はそれらの間の任意の濃度のナトリウム塩を含む。好ましい実施形態では、ナトリウム塩の濃度は、約２０～３００ｍＭ、例えば、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、２００、２５０、３００ｍＭ、又はそれらの間の任意の濃度である。
一部の実施形態では、溶出緩衝液は、約０～３０ｍＭ、例えば、０、５、１０、１５、２０、２５、３０ｍＭ、又はそれらの間の任意の濃度のマグネシウム塩を含む。好ましい実施形態では、マグネシウム塩の濃度は、約２～１５ｍＭ、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５ｍＭ、又はそれらの間の任意の濃度である。

【0107】

一部の実施形態では、溶出緩衝液は、約０～２００ｍＭ、例えば、０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００ｍＭ、又はそれらの間の任意の濃度のリチウム塩を含む。好ましい実施形態では、リチウム塩の濃度は、約０～１５０ｍＭ、例えば、０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０ｍＭ、又はそれらの間の任意の濃度である。
一部の実施形態では、溶出緩衝液は、約０．１～２０ｍＭ、例えば、０．１、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０ｍＭ、又はそれらの間の任意の濃度のカルシウム塩を含む。好ましい実施形態では、カルシウム塩の濃度は、約５～１０ｍＭ、例えば、５、６、７、８、９、１０ｍＭ、又はそれらの間の任意の濃度である。

【0108】

一部の実施形態では、溶出緩衝液は、約０～５ｍＭ、例えば、０、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５ｍＭ、又はそれらの間の任意の濃度の銅塩を含む。好ましい実施形態では、銅塩の濃度は、約０．１～２．５ｍＭ、例えば、０．１、０．５、１．０、１．５、２．０、２．５ｍＭ、又はそれらの間の任意の濃度である。
一部の実施形態では、溶出緩衝液は、約５～１００ｍＭ、例えば、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００ｍＭ、又はそれらの間の任意の濃度のアンモニウム塩を含む。好ましい実施形態では、アンモニウムの濃度は、約１０～５０ｍＭ、例えば、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０ｍＭ、又はそれらの間の任意の濃度である。
一部の実施形態では、溶出緩衝液は、約６～１０、例えば、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０のｐＨ、又はそれらの間の任意のｐＨ、好ましくは約８～９のｐＨを有する。

【0109】

ある特定の実施形態では、溶出緩衝液は、好ましくはＴｒｉｓ中に、より好ましくは４０～６０ｍＭ Ｔｒｉｓ中に、約２０～１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む。
一部の実施形態では、溶出緩衝液は、少なくとも１つの界面活性剤を含む。
一部の実施形態では、溶出緩衝液中の界面活性剤は、ポロクサマー１８８、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０、ＮＰ－４０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、及びＴｒｉｔｏｎ ＣＧ－１１０からなる群から選択される。
一部の実施形態では、溶出緩衝液中の界面活性剤の濃度は、０．０００１％～０．１％である。

【0110】

一部の実施形態では、この方法では、完全ｒＡＡＶ粒子の精製のために、少なくとも２つのカラム、例えば３つのカラムが使用される。特に、この方法は、ステップ（ｇ）～（ｊ）を含まないが、
（ｋ）ステップ（ｆ）の後、第２のカラムからの第２の負荷フロースルーを、第３のクロマトグラフィー媒体を含む第３のカラムに負荷して、負荷された又は部分的に負荷された第３のカラムを得るステップであり、好ましくは、第３のクロマトグラフィー媒体は、第１のクロマトグラフィー媒体と同じタイプである、ステップ、
（ｌ）任意選択で、第２のカラムを洗浄緩衝液で洗浄して、洗浄された第２のカラムを得るステップ、
（ｍ）ステップ（ｋ）の後で、又は洗浄ステップ（ｌ）が実施される場合には洗浄ステップ（ｌ）の後で、第１のカラムをバイパスし、第２のクロマトグラフィー媒体に結合した完全ｒＡＡＶ粒子を溶出緩衝液で溶出して、第２の溶出物及び溶出された第２のカラムを得るステップであり、第２の溶出物は、完全ｒＡＡＶ粒子対不完全ｒＡＡＶ粒子の増加した比を含む、ステップ、
（ｎ）任意選択で、第２のカラムフロースルー後に第３カラムが飽和（つまり、負荷）されていない場合、負荷緩衝液中のｒＡＡＶ調製物の第３バッチを、部分的に負荷された第３のカラムにアプライしてもよく、第３のカラムにアプライされる完全ｒＡＡＶ粒子及び不完全粒子の量は、第３のクロマトグラフィー媒体の結合容量を超えており、第３のクロマトグラフィー媒体に結合した不完全粒子は、完全ｒＡＡＶ粒子により、第３のカラムからの第３の負荷フロースルーへと置換される、ステップ、
（ｏ）ステップ（ｎ）が実施される場合、ステップ（ｄ）と（ｅ）との間で、第３のカラムからの第３の負荷フロースルーを、洗浄された第１のカラムに負荷して、第２の負荷された第１のカラムを得、任意選択で、ステップ（ｅ）での溶出に進む前に、第２の負荷された第１のカラムを洗浄する、ステップ、
（ｐ）任意選択で、第３のカラムを洗浄緩衝液で洗浄して、洗浄された第３のカラムを得るステップ、
（ｑ）第１のカラム及び第２のカラムをバイパスし、第３のクロマトグラフィー媒体に結合した完全ｒＡＡＶ粒子を溶出緩衝液で溶出して、第３の溶出物及び溶出された第３のカラムを得るステップであり、第３の溶出物は、完全ｒＡＡＶ粒子対不完全ｒＡＡＶ粒子の増加した比を含む、ステップ、並びに
（ｒ）第１の溶出物、第２の溶出物、及び第３の溶出物を一緒にして、完全ｒＡＡＶ粒子の精製調製物を生成するステップ
を更に含む。

【0111】

一部の実施形態では、不完全粒子が空粒子及び部分粒子を両方とも含む場合、完全粒子は第１のカラムで富化され、部分粒子は第２のカラムで富化され、空粒子は第３のカラムで富化される。

【0112】

本発明者らの知る限り、不完全ｒＡＡＶ粒子から完全ｒＡＡＶ粒子を精製するための置換クロマトグラフィー法は存在しない。通常の陰イオン交換クロマトグラフィーなどの、完全粒子を精製するための既存の精製方法と比較して、本出願の方法後の完全粒子の純度は著しく増加する。一部の実施形態では、精製調製物は、不完全粒子を実質的に含まず、より詳細には、空粒子及び／又は部分粒子を実質的に含まない。他の実施形態では、精製調製物は、ｒＡＡＶ調製物よりも、完全ｒＡＡＶ粒子対不完全粒子の増加した比を含む。好ましくは、精製調製物中の完全ｒＡＡＶ粒子対不完全粒子の比は、９：１以上、例えば、１０：１、１５：１、２０：１、２５：１、３０：１、３５：１、４０：１、４５：１、若しくは５０：１以上、又はそれらの間の任意の比、より好ましくは４９：１以上である。

【0113】

本出願の実施形態によると、精製調製物中の完全ｒＡＡＶ粒子対不完全粒子の比は、完全ｒＡＡＶ粒子及び不完全粒子の数により計算することができる。一部の実施形態では、比は、完全ｒＡＡＶ粒子及び不完全粒子のモル濃度に基づく検量線から導出される。一部の実施形態では、比は、完全ｒＡＡＶ粒子及び不完全粒子の数に基づいて計算される。

【0114】

一部の実施形態では、精製された完全ｒＡＡＶ粒子中の完全粒子対不完全粒子の比は、９：１以上、好ましくは４９：１以上である。
本出願の置換クロマトグラフィー法は、精製された完全粒子の高い収率／回収率も達成することができる。一部の実施形態では、精製された完全ｒＡＡＶ粒子の収率は、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上である。「収率」という用語は、本明細書で使用される場合、初期ｒＡＡＶ調製物中の完全ｒＡＡＶ粒子に対する、精製調製物中の完全ｒＡＡＶ粒子のパーセンテージ又は割合を指す。収率を計算する方法は複数存在する。収率を計算する１つの方法は、パーセント（％）＝（精製調製物中の完全ｒＡＡＶ粒子の量）／（初期ｒＡＡＶ調製物中の完全ｒＡＡＶ粒子の量）×１００である。収率パーセントを計算するための別の方法は、精製調製物中の導入遺伝子のコピー数を、初期調製物中の導入遺伝子のコピー数で割り、１００を掛けることである。

【0115】

別の基本態様では、本出願は、完全組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を精製するための方法であって、
（ａ）完全ｒＡＡＶ粒子及び不完全粒子を含むｒＡＡＶ調製物を準備するステップ、
（ｂ）負荷緩衝液中のｒＡＡＶ調製物を、クロマトグラフィー媒体を含むカラムに負荷するステップであり、負荷緩衝液はＣａＣｌ₂を含み、完全ｒＡＡＶ粒子は、クロマトグラフィー媒体に結合する、ステップ、
（ｃ）クロマトグラフィー媒体に結合した完全ｒＡＡＶ粒子を溶出緩衝液で溶出して、精製調製物を得るステップであり、溶出緩衝液は任意選択でＣａＣｌ₂を含む、ステップ
を含む方法に関する。

【0116】

一部の実施形態では、クロマトグラフィー媒体は、イオン交換カラムクロマトグラフィー媒体、好ましくは、陰イオン交換クロマトグラフィー媒体である。
一部の実施形態では、カラムクロマトグラフィー媒体は、Ｐｏｒｏｓ ＨＱ、Ｐｏｒｏｓ ＰＤ、ポリエチレンイミン（ＰＩ）、Ｃａｐｔｏ ＩｍｐＲｅｓ Ｑ、及びＰｏｒｏｓ ＸＱからなる群から選択され、好ましくはＰｏｒｏｓ ＸＱである。
一部の実施形態では、カラムにアプライされる完全ｒＡＡＶ粒子及び不完全粒子の量は、クロマトグラフィー媒体の結合容量を超えない。

【0117】

一部の実施形態では、カラムにアプライされる完全ｒＡＡＶ粒子及び不完全粒子の量は、クロマトグラフィー媒体の結合容量を超えており、第１のクロマトグラフィー媒体に結合した不完全粒子は、完全ｒＡＡＶ粒子により、第１のカラムからの第１の負荷フロースルーへと置換される。
一部の実施形態では、不完全粒子は、空粒子を含む。
一部の実施形態では、不完全粒子は、部分粒子を含む。
一部の実施形態では、不完全粒子は、空粒子及び部分粒子を両方とも含む。

【0118】

本出願の実施形態によると、Ｋ（Ｉ）、Ｌｉ（Ｉ）、Ｃａ（ＩＩ）、Ｍｇ（ＩＩ）、Ｃｕ（ＩＩ）、Ｂａ（ＩＩ）、Ｃｏ（ＩＩ）、Ｎｉ（ＩＩ）、Ｍｎ（ＩＩ）、Ｚｎ（ＩＩ）、Ｃｄ（ＩＩ）、Ｐｂ（ＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩ）、Ｎａ（Ｉ）、及びＮＨ₄ ⁺からなる群から選択される陽イオンの塩を負荷緩衝液に添加することにより、より多くの完全ｒＡＡＶ粒子がクロマトグラフィー媒体に結合し、より少ない不完全粒子がクロマトグラフィー媒体に結合するように、クロマトグラフィー媒体に対する親和性の差異を増加させることができる。従って、カラムからの負荷フロースルーは、より少ない完全粒子を含み、従って完全粒子の回収率が増加する。所与の塩の陰イオン成分は、決定的なものではない。

【0119】

一部の実施形態では、負荷緩衝液は、約０～１０ｍＭ、例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０ｍＭ、又はそれらの間の任意の濃度のカルシウム塩を含む。好ましい実施形態では、カルシウム塩の濃度は、約０．１～２．５ｍＭ、例えば、０．１、０．５、１．０、１．５、２．０、２．５ｍＭ、又はそれらの間の任意の濃度である。
一部の実施形態では、負荷緩衝液は、約０～１００ｍＭ、例えば、０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００ｍＭ、又はそれらの間の任意の濃度のリチウム塩を含む。好ましい実施形態では、リチウム塩の濃度は、約０～７５ｍＭ、例えば、０、１５、２５、３５、４５、５５、６５、７５ｍＭ、又はそれらの間の任意の濃度である。
一部の実施形態では、負荷緩衝液は、Ｔｒｉｓ、Ｂｉｓ－ｔｒｉｓ、Ｂｉｓ－ｔｒｉｓプロパン、Ｔｒｉｓ酢酸、エタノールアミン、及びホスフェートからなる群から選択される少なくとも１つの緩衝剤を含む。ある特定の実施形態では、負荷緩衝液は、約２０～５０ｍＭの濃度、例えば、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭ、又はそれらの間の任意の濃度の選択された緩衝液を含んでいた。好ましい実施形態では、負荷緩衝液は、２０～５０ｍＭ Ｔｒｉｓを含む。

【0120】

一部の実施形態では、負荷緩衝液は、ナトリウム塩及び／又はマグネシウム塩を更に含む。好ましい実施形態では、負荷緩衝液は、ナトリウム塩及びマグネシウム塩を両方とも更に含む。
一部の実施形態では、負荷緩衝液は、約１０～１００ｍＭ、例えば、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００ｍＭ、又はそれらの間の任意の濃度のナトリウム塩を含む。好ましい実施形態では、ナトリウム塩の濃度は、約２０～６０ｍＭ、例えば、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０ｍＭ、又はそれらの間の任意の濃度である。
一部の実施形態では、負荷緩衝液は、約０～２０ｍＭ、例えば、０、５、１０、１５、２０ｍＭ、又はそれらの間の任意の濃度のマグネシウム塩を含む。好ましい実施形態では、マグネシウム塩の濃度は、約１～１０ｍＭ、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０ｍＭ、又はそれらの間の任意の濃度である。

【0121】

一部の実施形態では、負荷緩衝液は、約６～１０、例えば、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０のｐＨ、又はそれらの間の任意のｐＨ、好ましくは約８～９のｐＨを有する。
ある特定の実施形態では、負荷緩衝液は、好ましくは、Ｔｒｉｓ中に、より好ましくは２０～５０ｍＭ Ｔｒｉｓ中に、約２０～６０ｍＭ ＮａＣｌ、１～５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、０．１～２．５ｍＭ ＣａＣｌ₂を含む。
一部の実施形態では、負荷緩衝液は、少なくとも１つの界面活性剤を含む。
一部の実施形態では、負荷緩衝液中の界面活性剤は、ポロクサマー１８８、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０、ＮＰ－４０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、及びＴｒｉｔｏｎ ＣＧ－１１０からなる群から選択される。
一部の実施形態では、負荷緩衝液中の界面活性剤の濃度は、０．０００１％～０．１％である。

【0122】

負荷ステップの後、完全粒子はクロマトグラフィー媒体に結合し、不完全粒子はカラムから出てフロースルーに入る。任意選択で、カラムを、好適な洗浄緩衝液で洗浄してもよい。例えば、クロマトグラフィー媒体に結合した不完全粒子を除去するために、洗浄緩衝液は、負荷条件と比較して増加した塩濃度及び／又は溶出用に調整されたｐＨを有してもよい。
次いで、クロマトグラフィー媒体に結合した完全粒子は、例えば、負荷条件と比較して増加した塩濃度及び／又は溶出用に調整されたｐＨを使用して、より純粋な形態で続いて溶出される。ｐＨを調整すると、完全ｒＡＡＶ粒子と不完全ｒＡＡＶ粒子との分離を増加させることができる。好ましくは、完全粒子の溶出は、ｐＨを増加させずに塩勾配のみを使用して達成される。
一部の実施形態では、溶出緩衝液は、Ｔｒｉｓ、Ｂｉｓ－ｔｒｉｓ、Ｂｉｓ－ｔｒｉｓプロパン、Ｔｒｉｓ酢酸、エタノールアミン、及びホスフェートからなる群から選択される少なくとも１つの緩衝剤を含む。

【0123】

一部の実施形態では、溶出緩衝液は、Ｋ（Ｉ）、Ｌｉ（Ｉ）、Ｃａ（ＩＩ）、Ｍｇ（ＩＩ）、Ｃｕ（ＩＩ）、Ｂａ（ＩＩ）、Ｃｏ（ＩＩ）、Ｎｉ（ＩＩ）、Ｍｎ（ＩＩ）、Ｚｎ（ＩＩ）、Ｃｄ（ＩＩ）、Ｐｂ（ＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩ）、Ｎａ（Ｉ）、及びＮＨ₄ ⁺からなる群から選択される陽イオンの少なくとも１つの塩を含む。例えば、溶出緩衝液は、好ましくは、ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ₂、ＬｉＣｌ、ＣｕＣｌ₂、及びＣａＣｌ₂からなる群から選択される１つ又は複数の塩を含んでいてもよい。塩の陰イオン成分は決定的なものではない。
一部の実施形態では、溶出緩衝液は、Ｋ（Ｉ）、Ｌｉ（Ｉ）、Ｃａ（ＩＩ）、Ｍｇ（ＩＩ）、Ｃｕ（ＩＩ）、Ｂａ（ＩＩ）、Ｃｏ（ＩＩ）、Ｎｉ（ＩＩ）、Ｍｎ（ＩＩ）、Ｚｎ（ＩＩ）、Ｃｄ（ＩＩ）、Ｐｂ（ＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩ）、Ｎａ（Ｉ）、及びＮＨ₄ ⁺からなる群から選択される陽イオンの少なくとも１つの塩を含む。例えば、負荷緩衝液は、好ましくは、ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ₂、ＬｉＣｌ、ＣｕＣｌ₂、及びＣａＣｌ₂からなる群から選択される１つ又は複数の塩を含んでいてもよい。

【0124】

一部の実施形態では、溶出緩衝液は、約０．１～２０ｍＭ、例えば、０．１、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０ｍＭ、又はそれらの間の任意の濃度のカルシウム塩を含む。好ましい実施形態では、カルシウム塩の濃度は、約５～１０ｍＭ、例えば、５、６、７、８、９、１０ｍＭ、又はそれらの間の任意の濃度である。
一部の実施形態では、溶出緩衝液は、約０～２００ｍＭ、例えば、０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００ｍＭ、又はそれらの間の任意の濃度のリチウム塩を含む。好ましい実施形態では、リチウム塩の濃度は、約０～１５０ｍＭ、例えば、０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０ｍＭ、又はそれらの間の任意の濃度である。

【0125】

一部の実施形態では、溶出緩衝液は、Ｔｒｉｓ、Ｂｉｓ－ｔｒｉｓ、Ｂｉｓ－ｔｒｉｓプロパン、Ｔｒｉｓ酢酸、及びホスフェートからなる群から選択される少なくとも１つの緩衝剤を含む。ある特定の実施形態では、負荷緩衝液は、約２０～７０ｍＭの濃度、例えば、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭ、６０ｍＭ、７０ｍＭ、又はそれらの間の任意の濃度の選択された緩衝剤を含んでいた。好ましい実施形態では、負荷緩衝液は４０～６０ｍＭ Ｔｒｉｓを含む。
一部の実施形態では、溶出緩衝液は、少なくとも１つの界面活性剤を含む。
一部の実施形態では、溶出緩衝液中の界面活性剤は、ポロクサマー１８８、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０、ＮＰ－４０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、及びＴｒｉｔｏｎ ＣＧ－１１０からなる群から選択される。
一部の実施形態では、溶出緩衝液中の界面活性剤の濃度は、０．０００１％～０．１％である。
一部の実施形態では、溶出緩衝液は、ナトリウム塩及び／又はマグネシウム塩を更に含む。好ましい実施形態では、負荷緩衝液は、ナトリウム塩及びマグネシウム塩を両方とも更に含む。塩の陰イオン成分は、決定的なものではない。

【0126】

一部の実施形態では、溶出緩衝液は、約０～１０００ｍＭ、例えば０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００ｍＭ、又はそれらの間の任意の濃度のナトリウム塩を含む。好ましい実施形態では、ナトリウム塩の濃度は、約２０～１５０ｍＭ、例えば、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０ｍＭ、又はそれらの間の任意の濃度である。
一部の実施形態では、溶出緩衝液は、約０～３０ｍＭ、例えば、０、５、１０、１５、２０、２５、３０ｍＭ、又はそれらの間の任意の濃度のマグネシウム塩を含む。好ましい実施形態では、マグネシウム塩の濃度は、約２～１５ｍＭ、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５ｍＭ、又はそれらの間の任意の濃度である。
一部の実施形態では、溶出緩衝液は、約６～１０、例えば、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０のｐＨ、又はそれらの間の任意のｐＨ、好ましくは約８～９のｐＨを有する。

【0127】

ある特定の実施形態では、溶出緩衝液は、好ましくはＴｒｉｓ中に、より好ましくは４０～６０ｍＭ Ｔｒｉｓ中に、約２０～１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む。
一部の実施形態では、精製調製物は、不完全粒子を実質的に含まない。他の実施形態では、精製調製物は、ｒＡＡＶ調製物よりも、完全ｒＡＡＶ粒子対不完全粒子の増加した比を含む。好ましくは、精製調製物中の完全ｒＡＡＶ粒子対不完全粒子の比は、９：１以上、例えば、１０：１、１５：１、２０：１、２５：１、３０：１、３５：１、４０：１、４５：１、若しくは５０：１以上、又はそれらの間の任意の比、より好ましくは４９：１以上である。
本出願の実施形態によると、精製調製物中の完全ｒＡＡＶ粒子対不完全粒子の比は、完全ｒＡＡＶ粒子及び不完全粒子の数により計算することができる。一部の実施形態では、比は、完全ｒＡＡＶ粒子及び不完全粒子のモル濃度に基づく検量線から導出される。一部の実施形態では、比は、完全ｒＡＡＶ粒子及び不完全粒子の数に基づいて計算される。

【0128】

一部の実施形態では、精製された完全ｒＡＡＶ粒子中の完全粒子対不完全粒子の比は、９：１以上、好ましくは４９：１以上である。
一部の実施形態では、精製された完全ｒＡＡＶ粒子の収率は、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上である。「収率」という用語は、本明細書で使用される場合、初期ｒＡＡＶ調製物中の完全ｒＡＡＶ粒子に対する、精製調製物中の完全ｒＡＡＶ粒子のパーセンテージを指す。例えば、収率（％）＝（精製調製物中の完全ｒＡＡＶ粒子の量）／（初期ｒＡＡＶ調製物中の完全ｒＡＡＶ粒子の量）、パーセントとして。
以下の実施形態は、上記に記載の基本態様を含む、本明細書で開示される基本態様の各々に当てはまる。
一部の実施形態では、完全ｒＡＡＶ粒子は、ポリペプチドをコードする導入遺伝子、タンパク質をコードするか又は目的の転写物へと転写される核酸、又はｓｉＲＮＡ、アンチセンス分子、ｍｉＲＮＡ、リボザイム、及びｓｈＲＮＡからなる群から選択される核酸を含む。

【0129】

本明細書で開示される種々の実施形態は、カプシドの供給源又は血清型に関わりなく、イオン交換クロマトグラフィーカラムに結合することが可能な任意のｒＡＡＶ若しくはＡＡＶカプシド、粒子、不純物、又は凝集体に適用可能である。本開示の方法は、イオン交換クロマトグラフィーカラムに結合可能な任意のＡＡＶ又はｒＡＡＶカプシドに適用可能であるため、カプシドは、任意の供給源、例えば、ヒト、トリ、ウシ、イヌ、ウマ、霊長類、非霊長類、ヒツジ、又はそれらの派生物に由来してもよい。

【0130】

一部の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、細胞標的指向性ペプチドなどのペプチド修飾を有するＡＡＶカプシドを含み、Ｐｕｌｉｃｈｅｒｌａら、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．、１９巻（６号）１０７０～１０７８頁（２０１１年）（なかでも、ＡＡＶ９．４７を含むＡＡＶ９バリアントが記載されている）、米国特許第７，９０６，１１１号明細書（なかでもＡＡＶ９（ｈｕ１４）が記載されている）、第１０，５３２，１１１号明細書（なかでもＮＰ５９が記載されている）、第１０，７３８，０８７号明細書（なかでもＡｎｃ－８０が記載されている）、第９，１６９，２９９号明細書（「ＬＫ０３」が記載されている）、第９，８４０，７１９号明細書（「ＲＨＭ４－１」が記載されている）、第７，７４９，４９２号明細書、第７，５８８，７７２号明細書（「ＤＪ」及び「ＤＪ８」が記載されている）、第９，５８７，２８２号明細書、及び国際公開第２０１２／１４５６０１号パンフレット、国際公開第２０１３／１５８８７９号パンフレット、国際公開第２０１５／０１３３１３号パンフレット、国際公開第２０１８／１５６６５４号パンフレット、米国特許出願公開第２０１３／００５９７３２号明細書（これら文献は全て、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）に示されているＡＡＶカプシドのバリアントを含む、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ９．４７、ＡＡＶ９（ｈｕ１４）、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、Ｒｈ８、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ－２ｉ８、ＬＫ０３、ＲＨＭ４－１、ＤＪ、ＤＪ８、ＮＰ５９、Ａｎｃ－８０、及びそれらのバリアントからなる群から選択される１つ又は複数のＡＡＶに由来する。

【0131】

一部の実施形態では、完全ｒＡＡＶ粒子は、以下のものからなる群から選択される遺伝子産物をコードする導入遺伝子を含む：インスリン、グルカゴン、成長ホルモン（ＧＨ）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）、濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、アンジオポエチン、アンジオスタチン、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、表皮成長因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング成長因子α（ＴＧＦａ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、インスリン成長因子Ｉ及びＩＩ（ＩＧＦ－Ｉ及びＩＧＦ－ＩＩ）、ＴＧＦｐ、アクチビン、インヒビン、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィンＮＴ－３及びＮＴ４／５、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、アグリン、ネトリン－１及びネトリン－２、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、エフリン、ノギン、ソニックヘッジホッグ、及びチロシンヒドロキシラーゼ。

【0132】

一部の実施形態では、完全ｒＡＡＶ粒子は、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン（ＩＬ１～ＩＬ－１７）、単球走化性タンパク質、白血病阻害因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、Ｆａｓリガンド、腫瘍壊死因子α及びβ、インターフェロンα、β、及びγ、幹細胞因子、ｆｌｋ－２／ｆｌｔ３リガンド、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥ、キメラ免疫グロブリン、ヒト化抗体、単鎖抗体、Ｔ細胞受容体、キメラＴ細胞受容体、単鎖Ｔ細胞受容体、クラスＩ及びクラスＩＩ ＭＨＣ分子からなる群から選択される遺伝子産物をコードする導入遺伝子を含む。

【0133】

一部の実施形態では、完全ｒＡＡＶ粒子は、カルバモイルシンテターゼＩ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギノコハク酸シンテターゼ、アルギノコハク酸リアーゼ、アルギナーゼ、フマリルアセト酢酸ヒドロラーゼ（ｆｕｍａｒｙｌａｃｅｔａｃｅｔａｔｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ）、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、アルファ－１アンチトリプシン、グルコース－６－ホスファターゼ、ポルホビリノーゲンデアミナーゼ、第Ｖ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、シスタチオンベータシンターゼ、分岐鎖ケト酸デカルボキシラーゼ、アルブミン、イソバレリル－ｃｏＡデヒドロゲナーゼ、プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼ、メチルマロニルＣｏＡムターゼ、グルタリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、インスリン、ベータ－グルコシダーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｙｒｕｖａｔｅ ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ）、肝ホスホリラーゼ、ホスホリラーゼキナーゼ、グリシンデカルボキシラーゼ、ＲＰＥ６５、Ｈ－タンパク質、Ｔ－タンパク質、嚢胞性線維症膜貫通調節因子（ＣＦＴＲ）配列、及びジストロフィンｃＤＮＡ配列からなる群から選択される、先天性代謝異常の修正に有用なタンパク質をコードする導入遺伝子を含む。

【0134】

一部の実施形態では、完全ｒＡＡＶ粒子は、第ＶＩＩＩ因子及び第ＩＸ因子をコードする導入遺伝子を含む。
本出願の実施形態による方法により精製される目的の完全ｒＡＡＶ粒子は、宿主細胞で産生することができる。初期ステップとして、典型的には、ｒＡＡＶビリオンを産生する宿主細胞を、任意選択で、ｒＡＡＶビリオンを産生する宿主細胞（懸濁又は接着）が培養された細胞培養上清（培地）の回収と組み合わせて、回収することができる。本明細書の方法では、回収された細胞及び任意選択で細胞培養上清を、必要に応じてそのまま使用してもよく又は濃縮して使用してもよい。更に、アクセサリー機能を発現させるために感染を使用する場合、残留ヘルパーウイルスを不活化してもよい。例えば、アデノウイルスは、例えば２０分間以上およそ６０℃の温度に加熱することにより不活化することができ、それによりヘルパーウイルスのみが不活化される。なぜならば、ＡＡＶは熱安定性であるが、ヘルパーアデノウイルスは熱不安定性であるからである。

【0135】

回収物の細胞及び／又は上清を、例えば、界面活性剤、顕微溶液化、及び／又はホモジナイゼーションなどの化学的又は物理的手段により細胞を破壊することにより溶解し、ｒＡＡＶ粒子を放出させる。細胞溶解と同時に又は細胞溶解後に続いて、ベンゾナーゼなどのヌクレアーゼを添加して、夾雑ＤＮＡを分解してもよい。典型的には、得られたライセートを、濾過、遠心分離などにより清澄化して、細胞デブリを除去し、清澄化細胞ライセートにする。特定の例では、ライセートを、ミクロン径細孔サイズフィルター（例えば、０．１～１０．０μｍの細孔サイズフィルター、例えば０．４５μｍ及び／又は細孔サイズ０．２μｍフィルター）で濾過して、清澄化ライセートを生成する。

【0136】

ライセート（任意選択で清澄化されている）は、ｒＡＡＶ粒子（完全ｒＡＡＶ粒子及びＡＡＶ不完全粒子）及びＡＡＶベクター産生／工程関連不純物、例えば、とりわけ細胞性タンパク質、脂質、及び／又は核酸、並びに細胞培養培地成分を含んでいてもよい、宿主細胞に由来する可溶性細胞成分を含む。次いで、必要に応じて清澄化されたライセートを、クロマトグラフィーを使用して完全ＡＡＶ粒子を不純物から精製するための追加の精製ステップに供する。清澄化されたライセートを、本出願のクロマトグラフィー法の前に、適切な緩衝液で希釈又は濃縮してもよい。

【実施例】

【0137】

実施例１
完全ｒＡＡＶ粒子と不完全粒子とを分離するための樹脂スクリーニング
この実施例では、完全ｒＡＡＶ粒子と不完全粒子との分離に最も良好な樹脂を特定するために、様々な樹脂をスクリーニングした。
方法及び材料
試料は、不完全粒子及び完全ＲＨＭ４－１ ｒＡＡＶ粒子を、２．４：１の比で含んでいた（つまり、７０％不純物／３０％産物）。カラムサイズは、０．３５３ｍＬ ３ｍｍ×５０ｍｍである。樹脂スクリーニングは、パルス負荷（結合容量の１０％）及び１分間の滞留時間を使用して実施した。スクリーニング中、３つのｐＨ値（８．０、８．６、及び９．２５）及び塩（６．８、５、及び１．６ｍＳ／ｃｍ）による３つの結合強度を試験した。負荷緩衝液は、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ又は２５ｍＭ Ｔｒｉｓだった。カラムからのフロースルー流出物を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析して、完全粒子と不完全粒子との分離を決定した。

【0138】

結果
Ｐｏｒｏｓ５０ＨＱ樹脂（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；ＰＯＲＯＳ（商標）－（マサチューセッツ州ウォルサム））：この樹脂は、ある程度の弱陰イオン交換（ＡＥＸ）官能性を有する四級化ポリエチレンイミン官能基に基づく。図１Ａ～１Ｃに示されているように、Ｐｏｒｏｓ５０ＨＱ樹脂での完全粒子と不完全粒子との分離は、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ及び３０ｍＭ ＮａＣｌ下の３つのｐＨ値の全てで有意差はなく、ｐＨ８．６での分離が、他の２つのｐＨ値と比較してわずかにより良好であるに過ぎなかった。
Ｐｏｒｏｓ５０Ｄ樹脂：この樹脂は、ジメチルアミノプロピル官能基に基づく。図２Ａ～２Ｄに示されているように、ｒＡＡＶ粒子とＰｏｒｏｓ５０Ｄ樹脂との結合は、スクリーニング条件下では不良であり、ｐＨの増加と共に減少した。図では種々の負荷緩衝液を使用した：ｐＨ８．６及び５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（図２Ａ）、ｐＨ８．６及び２５ｍＭ Ｔｒｉｓ（図２Ｂ）、ｐＨ８．０及び２５ｍＭ Ｔｒｉｓ（図２Ｃ）、及びｐＨ９．２５及び２５ｍＭ Ｔｒｉｓ（図２Ｄ）。

【0139】

Ｐｏｒｏｓ５０ＰＩ樹脂：この樹脂は、ポリエチレンイミン官能基に基づく。図３Ａ～３Ｅに示されているように、ｒＡＡＶ粒子とＰｏｒｏｓ５０ＰＩ樹脂との結合は、ｐＨの増加と共に減少した。ＮａＣｌの添加も、分解能をわずかに向上させたことに留意されたい。こうした図では、異なるｐＨ及び塩濃度でのＰｏｒｏｓ５０ＰＩ樹脂が評価されている：ｐＨ８．０、ＮａＣｌ無し（図３Ａ）、ｐＨ８．６、ＮａＣｌ無し（図３Ｂ）、ｐＨ８．６及び３０ｍＭ ＮａＣｌ（図３Ｃ）、ｐＨ９．２、ＮａＣｌ無し（図４Ｃ）、ｐＨ９．２及び３０ｍＭ ＮａＣｌ（図３Ｅ）。
Ｃａｐｔｏ ＩｍｐＲｅｓ Ｑ樹脂：この樹脂には、イオン基リガンドを有するＣａｐｔｏ（商標）（Ｃｙｔｉｖａ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ－マサチューセッツ州マールボロ）に基づくアガロースマトリックスが使用されている。図４Ａ～４Ｃに示されているように、ｒＡＡＶ粒子とＣａｐｔｏ ＩｍｐＲｅｓ Ｑ樹脂との結合は、ｐＨの増加と共に増加した。しかしながら、スクリーニング条件下では、完全粒子と不完全粒子との分離は、Ｃａｐｔｏ ＩｍｐＲｅｓ Ｑ樹脂では不良だった。こうした図では、異なるｐＨ値の異なる緩衝液を用いてＣａｐｔｏ ＩｍｐＲｅｓ Ｑ樹脂が評価されている：ｐＨ８．０及び５０ｎｍ Ｔｒｉｓ、ＮａＣｌ無し（図４Ａ）、ｐＨ８．６及び２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ＮａＣｌ無し（図４Ｂ）、及びｐＨ９．０及び３０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ＮａＣｌ無し（図４Ｃ）。

【0140】

Ｐｏｒｏｓ ＸＱ樹脂：この樹脂は、独自の第四級アミン官能基に基づく。スクリーニングにより、Ｐｏｒｏｓ ＸＱ樹脂は、完全粒子と不完全粒子との分離に最も良好であることが示された。図５に示されているように、分離は、他のｐＨ値（ｐＨ８及び９．２５）と比較してｐＨ８．７５において最も良好でだった。図６に示されているように、結合塩も分離に影響を及ぼした。加えて、図７に示されているように、分離は、ｐＨ８．７５で実施した場合、異なる流速（８４ｃｍ／ｈ、１５０ｃｍ／ｈ、及び３００ｃｍ／ｈ）下で同様だった。

【0141】

実施例２
Ｐｏｒｏｓ ＸＱ樹脂を用いた置換クロマトグラフィーの最適化
この実施例では、Ｐｏｒｏｓ ＸＱ樹脂にて完全ＲＨＭ４－１ ｒＡＡＶ粒子と不完全粒子とを置換クロマトグラフィーで分離するための最適な条件を特定するために、異なる条件をスクリーニングした。
図８Ａは、試料をｐＨ８．６の３０ｍＭ Ｔｒｉｓで負荷し、負荷量が少なかった場合、流出物のＨＰＬＣ分析では２つの産物ピークが存在したことを示す。２つのピークのうち、不完全粒子対完全粒子の比（Ｅ／Ｆ）は、ピークＰ１では９．９だったが、ピークＰ２のＥ／Ｆの比は０．８だった。これは、Ｐｏｒｏｓ ＸＱ樹脂に結合する不完全粒子の親和性が、樹脂に結合する完全粒子の親和性よりも弱く、従って不完全粒子が完全粒子よりも早く溶出したことを示している。
対照的に、結合容量を超える量の試料を負荷した場合、図８Ｂに示されているように、フロースルー（ＦＴ）中のＥ／Ｆ比は、ブレイクスルーでは２．４であった。図８Ｂは、負荷物への３０ｍＭ ＮａＣｌの添加が、置換の促進には十分ではなかったことを示している。従って、フロースルーのＥ／Ｆ比は、負荷物の比と同じである。
次に、置換カラムクロマトグラフィー下で不完全粒子と完全粒子をより良好に分離するための最適な塩濃度を特定するために、異なる塩濃度における異なる結合強度をスクリーニングした。図９Ａ及び９Ｂに示されているように、負荷緩衝液中のＮａＣｌ濃度をそれぞれ４５ｍＭから６０ｍＭへと増加させると、フロースルー中のＥ／Ｆ比が３．４から２２９に増加し、より高い塩濃度では完全粒子による不完全粒子のより大きな置換が示された。同時に、産物ピークＰ２の純度は、Ｅ／Ｆ＝１からＥ／Ｆ＝０．７へと向上した。

【0142】

しかしながら、塩濃度を更に７５ｍＭ及び９０ｍＭへと増加させても、それぞれ図９Ｃ及び９Ｄに示すように、樹脂に対する試料の全体的親和性が低減されたため、置換は更には強化されなかった。従って、図９Ａ～９Ｄは、不完全粒子と完全粒子との間の結合親和性の差異が最も顕著であった中間の結合強度で最適な置換が生じたことを示している。より一般には、こうした結果は、塩濃度で調整可能な結合強度を手がかりとして使用して、不完全粒子の置換を促進することができ、その結果、分解能を向上させることができることを示している。
加えて、段階溶出条件も試験して、溶出緩衝液中の塩範囲を決定した。試験に使用した負荷緩衝液は、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．５及び３０ｍＭ ＮａＣｌを含んでいた。図１０Ａ～１０Ｄに示されているように、段階溶出は、それぞれ６０ｍＭ、７５ｍＭ、９０ｍＭ、及び１２０ｍＭの濃度のＮａＣｌを有する全ての試験した溶出緩衝液で機能した。

【0143】

この実施例では、更なる置換も研究した。図１１Ａ～１１Ｂに示されていように、ブレイクスルー負荷を超えてより多くの試料を負荷すると、更なる置換が生じ、カラムの底部部分に結合した不完全粒子も完全粒子により置換され、フロースルーに存在した。図１１Ｂは、更なる置換により、精製調製物中のｒＡＡＶの純度がほぼ１００％に向上されたことを示した。加えて、更なる置換クロマトグラフィーでも、精製された完全粒子が９０％よりも高い高収率で得られた。

【0144】

実施例３
試料負荷物及び洗浄緩衝液における添加剤としてのＣａＣｌ₂の使用
Ｐｏｒｏｓ ＸＱ樹脂を用いた完全ＲＨＭ４－１ ｒＡＡＶ粒子と不完全粒子との分離の研究では、置換クロマトグラフィー精製での産物喪失が認められた。例えば、ブレイクスルー実行では、負荷緩衝液が５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／６０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．５の場合、回収収率は、単一カラム法では８９．８１％、提案されている２カラム法では７４．９２％だった。喪失は、主にフロースルー中に完全粒子が存在することに起因すると考えられる。分解能を向上させ、フロースルー中の完全ｒＡＡＶ粒子の量を減少させ、従って回収収率を増加させるために、試料負荷物又は洗浄緩衝液への添加剤の添加を研究した。
図１２に示されているように、試料負荷物へのＭｇＣｌ₂の添加をまず試験した。ＭｇＣｌ₂を添加剤として使用して、分解能を向上させることができた。しかしながら、その後の洗浄ステップでは、カラムに結合している不完全粒子を洗い流すためにＭｇＣｌ₂の濃度を増加させる必要があった。負荷緩衝液と溶出緩衝液との間の伝導率の差異がわずか約１ｍＳ／ｃｍであったため、試料負荷物へのＭｇＣｌ₂の添加は、非結合条件下でさえもロバストではないことが見出された。

【0145】

他の添加剤も試験した。ＣａＣｌ₂は、Ｐｏｒｏｓ ＸＱ樹脂での精製に最も良好なフロースルーをもたらした添加剤であることが特定された。図１３に示されているように、ＣａＣｌ₂の添加は、不完全ｒＡＡＶ粒子と完全ｒＡＡＶ粒子との分離を向上させた。加えて、ＣａＣｌ₂を使用すると、負荷緩衝液と溶出緩衝液との間の伝導率の差異はロバストであり、例えば、約４ｍＳ／ｃｍだった。
ＣａＣｌ₂を試料負荷物に添加しなかった場合、不完全粒子からの完全ｒＡＡＶ粒子の精製において、収率及び産物純度が両方とも損なわれることも見出された。図１５に示されているように、ＮａＣｌ以外の添加剤が試料負荷物に使用されておらず、洗浄緩衝液が１ｍＭ ＣａＣｌ₂及び２．５ｍＭ ＭｇＣｌ₂を含んでいた場合、カラムに結合した不完全粒子を洗浄により全て除去することは困難だった。更に、ＣａＣｌ₂濃度増加によるその後の溶出中（図１５）、結合した不完全粒子は樹脂上で不安定であり、新たな不純物が生成されると考えられ、それがひいては産物純度に影響を及ぼした。
従って、本発明者らは、驚くべきことに、試料負荷物に、好ましくは洗浄緩衝液及び溶出緩衝液にＣａＣｌ₂を添加すると、最適な分離が得られ、収率が向上することを見出した。

【0146】

実施例４
試料負荷物及び洗浄緩衝液における添加剤としてのＬｉＣｌの使用
Ｐｏｒｏｓ ＸＱ樹脂での精製について試験した別の添加剤は塩化リチウムだった。図１７に示されているように、ＬｉＣｌの添加は、不完全ＲＨＭ４－１ ｒＡＡＶ粒子と完全ＲＨＭ４－１ ｒＡＡＶ粒子との分離を向上させた。加えて、ＬｉＣｌを使用すると、負荷緩衝液と溶出緩衝液との間の伝導率の差異は、約０．２ｍＳ／ｃｍだった。

【0147】

実施例５
試料負荷物及び洗浄緩衝液にＣａＣｌ₂を添加することによる、置換クロマトグラフィーでの分離及び収率の向上強化
実施例３及び４に示されているような、負荷緩衝液並びに任意選択で洗浄緩衝液及び溶出緩衝液にＣａＣｌ₂のような添加剤を使用することによる不完全ＲＨＭ４－１ ｒＡＡＶ粒子と完全ＲＨＭ４－１ ｒＡＡＶ粒子との分離の向上も、実施例２に示されている置換クロマトグラフィー法と併せて使用することができる。こうした方法は、図１８に示されているように組み合わせると、不完全粒子に対する完全ｒＡＡＶ粒子の最適な分離及び収率をもたらすことになる。

【0148】

実施例６
添加剤及びｐＨ減少による分離の向上強化
実施例３及び４に示されているような、負荷緩衝液及び任意選択で洗浄緩衝液及び溶出緩衝液にＣａＣｌ₂のような添加剤を使用することによる不完全ＲＨＭ４－１ ｒＡＡＶ粒子と完全ＲＨＭ４－１ ｒＡＡＶ粒子との分離向上は、図１９に示されているように、勾配溶出又は段階溶出を使用してｐＨを減少させることにより強化することができる。

【0149】

実施例７
添加剤（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄による分離の向上強化
ＰＸＱ樹脂での空ＲＨＭ４－１ ｒＡＡＶ粒子と完全ＲＨＭ４－１ ｒＡＡＶ粒子との分離向上は、図２０Ａ～２０Ｂに示されているように、（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄を負荷緩衝液中の添加剤として使用することにより達成することができる。

【0150】

実施例８
添加剤（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄による分離の向上強化
ＢＩＡモノリス樹脂での空ＲＨＭ４－１ ｒＡＡＶ粒子と完全ＲＨＭ４－１ ｒＡＡＶ粒子との分離向上は、図２１に示されているように、（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄を負荷緩衝液中の添加剤として使用することにより達成することができる。

【0151】

実施例９
添加剤ＣｕＣｌ₂による分離の向上強化
ＰＸＱ樹脂での空ＲＨＭ４－１ ｒＡＡＶ粒子と完全ＲＨＭ４－１ ｒＡＡＶ粒子との分離向上は、図２２Ａ～２２Ｅに示されているように、ＣｕＣｌ₂を負荷緩衝液中の添加剤として使用することにより達成することができる。

【0152】

実施例１０
ＣｕＣｌ₂による部分粒子の分離並びにより低いｐＨ及び漸増塩による溶出の向上強化負荷緩衝液にＣｕＣｌ₂のような添加剤を使用することによる空ＬＫ０３ ｒＡＡＶ粒子、部分ＬＫ０３ ｒＡＡＶ粒子、及び完全ＬＫ０３ ｒＡＡＶ粒子の分離向上は、図２３Ａ～２３Ｅに示されているように、より低いｐＨでの塩を増加させた勾配溶出又は段階溶出により強化することができる。
実施例１１
複数のカラムによる部分粒子の分離の向上強化
２つのカラムを使用して観察された空ＬＫ０３ ｒＡＡＶ粒子、部分ＬＫ０３ ｒＡＡＶ粒子、及び完全ＬＫ０３ ｒＡＡＶ粒子の分離向上は、図２４～２６に示されているように、少なくとも３つのカラムを使用することにより強化することができる。この方法は、図２５に示されているように、カラムに対して完全粒子よりも強力な親和性を有する不純物及び凝集体を除去するために使用することができる。この２カラム設定では、カラムに対して完全粒子よりも強力な親和性を有する凝集体及び不純物が、最初のカラムに結合しているため、２番目のカラムには完全粒子が富化される。複数カラム設定では、最初のカラムでは最も強力な結合粒子（最も高い保持時間）が富化され、その後のカラムでは次に最も強力な結合粒子が富化される。標的ｒＡＡＶ粒子又は不純物が最も大きな親和性を有するカラムを決定したら、本開示の方法を使用して、所望のｒＡＡＶ粒子又は不純物を精製することができる。この実施例は、複数カラム設定で異なる粒子バリアントを富化するための本開示の方法の使用を更に示す。

【0153】

本明細書に記載の例及び実施形態は例示を目的としているに過ぎず、その幅広い発明概念から逸脱することなく上記に記載の実施形態に変更をなすことができることが理解される。例えば、本発明の概念は、空粒子から部分粒子を分離して、又は図２５に示されているように、樹脂に対して完全粒子よりも強力な親和性を有する不純物を分離して、第１のカラムとは対照的に完全粒子を第２のカラムにて富化することを含む。従って、本発明は、開示されている特定の実施形態に限定されず、添付の特許請求の範囲により規定される本発明の趣旨及び範囲内の改変を網羅することが意図されていることが理解される。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図3E】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8A】

【図8B】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図9D】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図10D】

【図11A】

【図11B】

【図12】

【図13】

【図14A】

【図14B】

【図14C】

【図14D】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19A】

【図19B】

【図20A】

【図20B】

【図21】

【図22A】

【図22B】

【図22C】

【図22D】

【図22E】

【図22F】

【図23A】

【図23B】

【図23C】

【図23D】

【図23E】

【図24A】

【図24B】

【図24C】

【図24D】

【図24E】

【図24F】

【図24G】

【図25A】

【図25B】

【図25C】

【図25D】

【図26A】

【図26B】

【図26C】

【図26D】

【国際調査報告】