特表 2024-525184 Ｂ型肝炎ウイルスｐｒｅＳ１抗原の肝細胞受容体結合部位に特異的に結合するヒト抗体及びその用途

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-07-10

(54)【発明の名称】Ｂ型肝炎ウイルスｐｒｅＳ１抗原の肝細胞受容体結合部位に特異的に結合するヒト抗体及びその用途

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/08 20060101AFI20240703BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20240703BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240703BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20240703BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20240703BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240703BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240703BHJP

   A61P 31/20 20060101ALI20240703BHJP

   A61P 1/16 20060101ALI20240703BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240703BHJP

   G01N 33/576 20060101ALI20240703BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20240703BHJP

【ＦＩ】

C07K16/08 ZNA

C12N15/13

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

A61P31/20

A61P1/16

A61K39/395 S

G01N33/576 B

G01N33/53 D

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023577967

(86)(22)【出願日】2022-05-30

(85)【翻訳文提出日】2024-02-13

(86)【国際出願番号】 KR2022007679

(87)【国際公開番号】W WO2022265264

(87)【国際公開日】2022-12-22

(31)【優先権主張番号】10-2021-0077615

(32)【優先日】2021-06-15

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(31)【優先権主張番号】10-2021-0093625

(32)【優先日】2021-07-16

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．Ｗｉｔｅｐｓｏｌ

２．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】523473453

【氏名又は名称】アピットバイオ， インク．

(74)【代理人】

【識別番号】100097456

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 徹

(72)【発明者】

【氏名】ヒョ ジョン ホン

(72)【発明者】

【氏名】キョンヒ ジョウ

(72)【発明者】

【氏名】ジス ホン

(72)【発明者】

【氏名】ヨン ジン チェ

(72)【発明者】

【氏名】ジウ リー

【テーマコード（参考）】

4B065

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA01X

4B065AA57X

4B065AA72X

4B065AA87X

4B065AA92Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA25

4B065CA46

4C085AA13

4C085AA14

4C085BA89

4C085BB11

4C085EE01

4C085GG02

4C085GG03

4C085GG04

4C085GG05

4C085GG06

4C085GG08

4H045AA11

4H045AA30

4H045DA76

4H045EA53

4H045FA74

(57)【要約】

本発明は、Ｂ型肝炎ウイルスｐｒｅＳ１抗原の受容体結合モチーフに特異的に結合する抗体及びその用途に関する。
本発明の抗体は、ＨＢＶの多様な遺伝子型をターゲットとするため、ＨＢＶ中和またはＢ型肝炎ウイルスの感染抑制、治療が必要な分野に有用に使用することができる。
【選択図】図９

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＨＢＶ（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ）のｐｒｅＳ１抗原内の特定位置のアミノ酸に結合する抗体であって、
前記ｐｒｅＳ１抗原内の特定位置は、配列番号１９を基準として２２番、２３番及び２５番の位置に対応する、抗体。

【請求項2】

前記抗体は、配列番号５のＬＣＤＲ３配列の８番チロシン及び配列番号９のＨＣＤＲ３配列の６番ロイシンをパラトープとして有する、請求項１に記載の抗体。

【請求項3】

前記抗体は、配列番号８で示されるＨＣＤＲ２配列の１番のアミノ酸をパラトープとして有する、請求項１に記載の抗体。

【請求項4】

前記配列番号８で示されるＨＣＤＲ２配列の１番のアミノ酸は、アラニンまたはセリンである、請求項３に記載の抗体。

【請求項5】

前記抗体は、
（ａ）配列番号３の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号４の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；及び
（ｂ）配列番号７の重鎖ＣＤＲ１、配列番号８の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号９の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；
を含む、請求項１に記載の抗体。

【請求項6】

前記抗体は、
（ａ）配列番号３の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号４の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；及び
（ｂ）配列番号１０の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１１または１２の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１３の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；
を含む、請求項１に記載の抗体。

【請求項7】

前記抗体は、ＨＢＶの遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ及びＦから選択された一つ以上の遺伝子型に特異的に結合する、請求項１に記載の抗体。

【請求項8】

前記抗体の軽鎖可変領域は、配列番号１で構成される、請求項１に記載の抗体。

【請求項9】

前記抗体の重鎖可変領域は、配列番号２で構成される、請求項１に記載の抗体。

【請求項10】

前記抗体は、配列番号１４で記載された軽鎖可変領域；及び配列番号１５または１６で記載された重鎖可変領域を含む、請求項１に記載の抗体。

【請求項11】

請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗体をコードするポリヌクレオチド。

【請求項12】

請求項１１に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。

【請求項13】

請求項１２に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。

【請求項14】

請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗体を含む、ＨＢＶ感染に対する予防または治療用薬学的組成物。

【請求項15】

前記組成物は、Ｂ型肝炎の予防または治療のためのものである、請求項１４に記載の組成物。

【請求項16】

請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗体を用いて、ＨＢＶ感染の疑いのある個体から分離した生物学的試料に存在するｐｒｅＳ１を抗原抗体反応を通じて検出する段階を含む、ＨＢＶ感染の診断方法。

【請求項17】

前記方法は、Ｂ型肝炎の診断をするためのものである、請求項１２に記載の方法。

【請求項18】

請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗体を含む、ＨＢＶ検出用組成物。

【請求項19】

前記組成物は、Ｂ型肝炎診断用である、請求項１８に記載の組成物。

【請求項20】

請求項１８に記載の組成物を含む、ＨＢＶ検出用キット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、Ｂ型肝炎ウイルスｐｒｅＳ１抗原の肝細胞受容体結合部位に特異的に結合するヒト抗体及びその用途に関する。

【背景技術】

【0002】

Ｂ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ；ＨＢＶ）の感染は、公衆衛生において最も深刻で蔓延した問題である。２０１６年に地球上のＨＢＶ慢性感染者は約２億９０００万人である。

【0003】

現在までＨＢＶ遺伝子型は、合計１０種（Ａ－Ｊ）が存在することが確認された。遺伝子型Ａ及びＤはアフリカ及びヨーロッパに分布し、遺伝子型Ｂ及びＣはアジアに主に分布し、遺伝子型Ｅ－Ｊはヨーロッパ、アメリカ及びアジアにしばしば出現する。最も多く存在する遺伝子型はＡ－Ｄで、Ｂ型肝炎の約９０％を占める。

【0004】

ＨＢＶエンベロープは、構造的に関連したＳ（ｓｍａｌｌ）、Ｍ（ｍｉｄｄｌｅ）及びＬ（Ｌａｒｇｅ）の３つのタンパク質を含む。Ｓタンパク質はこれらの外被タンパク質の中に最も多く存在するタンパク質であり、Ｍタンパク質はｐｒｅＳ２及びＳで構成され、Ｌタンパク質はｐｒｅＳ１、ｐｒｅＳ２、及びＳで構成される。

【0005】

ＨＢＶに感染した肝細胞は、感染性ＨＢＶ粒子（ｖｉｒｉｏｎ）だけでなく、非感染性である球状及び繊維型サブウイルス（ｓｕｂｖｉｒａｌ）粒子を生成する。このサブウイルスの粒子は、大部分がＳタンパク質で構成され、一般には、ビリオンに比べて１０００倍～１００００倍多く生成される。このサブウイルスの粒子は、ウイルス特異的免疫反応を減少させると推定される。

【0006】

Ｓタンパク質とは異なり、Ｌタンパク質のｐｒｅＳ１は、主に感染性ビリオンに存在する。また、ｐｒｅＳ１の２０－２６番（Ａ－Ｃ、Ｆ遺伝子型；Ｄ遺伝子型である場合、９－１５番；Ｅ遺伝子型である場合、１９－２５番）のアミノ酸は、肝細胞受容体であるＮＴＣＰ（ｓｏｄｉｕｍ ｔａｕｒｏｃｈｏｌａｔｅ ｃｏｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）に結合してＨＢＶ感染を媒介する。この受容体結合部位は、ＨＢＶ遺伝子型の間に高度に保存されているため、ＨＢＶ感染の治療及び予防のターゲットになり得る。

【0007】

Ｂ型肝炎免疫タンパク質（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｉｍｍｕｎｅ ｇｌｏｂｕｌｉｎ；ＨＢＩＧ）は、偶発性（ａｃｃｉｄｅｎｔａｌ）または周産性（ｐｅｒｉｎａｔａｌ） のＨＢＶ曝露後の予防医学的な治療のために使用されている。ＨＢＩＧは、高い抗Ｓタンパク質抗体力価の血清を収集して製造される。しかし、ＨＢＶ感染にｐｒｅＳ１領域が重要である点を考慮すると、ＨＢＶ感染の予防及び治療においてＨＢＶの感染を抑制することができるｐｒｅＳ１特異的モノクローナル抗体（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ；ｍＡｂ）が有望な方法となり得る。臨床的に、抗ｐｒｅＳ１抗体の存在は、Ｂ型肝炎患者の回復に関連していることが明らかになった。最近、Ｌｉらは、ｐｒｅＳ１の肝細胞受容体結合部位（アミノ酸２０－２６番、Ａ－Ｃ、Ｆ遺伝子型）のｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ部分であるアミノ酸３１－３８番（Ａ－Ｃ、Ｆ遺伝子型）に特異的に結合するヒトモノクローナル抗体（２Ｈ５－Ａ１４）がヒト肝細胞を移植したマウスモデルでＨＢＶの感染を予防するだけでなく、Ｆｃ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎにより治療効果も示すことを証明した（Ｄａｎ Ｌｉ， Ｗｅｎｈｕｉ Ｈｅ， Ｘｉｍｉｎｇ Ｌｉｕ， Ｓａｎｄｕｏ Ｚｈｅｎｇ， Ｙｏｎｇｈｅ Ｑｉ， Ｈｕｉｙｕ Ｌｉ， Ｆｅｎｇｆｅｎｇ Ｍａｏ， Ｊｕａｎ Ｌｉｕ， Ｙｉｎｙａｎ Ｓｕｎ， Ｌｉｊｉｎｇ Ｐａｎ， Ｋａｉｘｉｎ Ｄｕ， Ｋｅｑｉｏｎｇ Ｙｅ， Ｗｅｎｈｕｉ Ｌｉ， Ｊｉａｎｈｕａ Ｓｕｉ．２０１７．Ａ ｐｏｔｅｎｔ ｈｕｍａｎ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆｃ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ ｒｅｄｕｃｅｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ＨＢＶ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ．ｅＬｉｆｅ ６：ｅ２６７３８．ＤＯＩ： ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．７５５４／ｅＬｉｆｅ．２６７３８）。

【0008】

ＨＢＶ粒子または組換えｐｒｅＳ１抗原で免疫化されたマウスから多数のＨＢＶ中和活性を有する抗ｐｒｅＳ１ ｍＡｂが製造された（Ｈｅｅｒｍａｎｎ Ｋ， Ｇｏｌｄｍａｎｎ Ｕ， Ｓｃｈｗａｒｔｚ Ｗ， Ｓｅｙｆｆａｒｔｈ Ｔ， Ｂａｕｍｇａｒｔｅｎ Ｈ， Ｇｅｒｌｉｃｈ Ｗ．１９８４．Ｌａｒｇｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｐｒｅ－ｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｖｉｒｏｌｏｇｙ．５２： ３９６－４０２； Ｐｉｚａｒｒｏ ＪＣ， Ｖｕｌｌｉｅｚ－ｌｅ Ｎｏｒｍａｎｄ Ｂ， Ｒｉｏｔｔｏｔ Ｍ－Ｍ， Ｂｕｄｋｏｗｓｋａ Ａ， Ｂｅｎｔｌｅｙ ＧＡ．２００１．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｅＳ１ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ．ＦＥＢＳ ｌｅｔｔｅｒｓ．５０９： ４６３－４６８； Ｋｉｍ ＪＨ， Ｇｒｉｐｏｎ Ｐ， Ｂｏｕｅｚｚｅｄｉｎｅ Ｆ， Ｊｅｏｎｇ ＭＳ， Ｃｈｉ ＳＷ， Ｒｙｕ ＳＥ， Ｈｏｎｇ ＨＪ．２０１５．Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉ－ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ ｐｒｅＳ１ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｂａｓｅｄ ｏｎ ａｎｔｉｇｅｎ－ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｏｍｐｌｅｘ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．ＦＥＢＳ ｌｅｔｔｅｒｓ．５８９： １９３－２００； Ｗｉ Ｊ， Ｊｅｏｎｇ ＭＳ， Ｈｏｎｇ ＨＪ．２０１７．Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ａｎｔｉ－ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ ｐｒｅＳ１ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｈａｔ ｂｉｎｄｓ ｔｏ ｔｈｅ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２７， １３３６－１３４４．など）。しかし、このように製造されたほとんどの抗体は、ＨＢＶ遺伝子型の全てを中和しないという問題が存在する。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0009】

【非特許文献1】Ｄａｎ Ｌｉ， Ｗｅｎｈｕｉ Ｈｅ， Ｘｉｍｉｎｇ Ｌｉｕ， Ｓａｎｄｕｏ Ｚｈｅｎｇ， Ｙｏｎｇｈｅ Ｑｉ， Ｈｕｉｙｕ Ｌｉ， Ｆｅｎｇｆｅｎｇ Ｍａｏ， Ｊｕａｎ Ｌｉｕ， Ｙｉｎｙａｎ Ｓｕｎ， Ｌｉｊｉｎｇ Ｐａｎ， Ｋａｉｘｉｎ Ｄｕ， Ｋｅｑｉｏｎｇ Ｙｅ， Ｗｅｎｈｕｉ Ｌｉ， Ｊｉａｎｈｕａ Ｓｕｉ．２０１７．Ａ ｐｏｔｅｎｔ ｈｕｍａｎ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆｃ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ ｒｅｄｕｃｅｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ＨＢＶ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ．ｅＬｉｆｅ ６：ｅ２６７３８．ＤＯＩ： ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．７５５４／ｅＬｉｆｅ．２６７３８

【非特許文献2】Ｈｅｅｒｍａｎｎ Ｋ， Ｇｏｌｄｍａｎｎ Ｕ， Ｓｃｈｗａｒｔｚ Ｗ， Ｓｅｙｆｆａｒｔｈ Ｔ， Ｂａｕｍｇａｒｔｅｎ Ｈ， Ｇｅｒｌｉｃｈ Ｗ．１９８４．Ｌａｒｇｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｐｒｅ－ｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｖｉｒｏｌｏｇｙ．５２： ３９６－４０２

【非特許文献3】Ｐｉｚａｒｒｏ ＪＣ， Ｖｕｌｌｉｅｚ－ｌｅ Ｎｏｒｍａｎｄ Ｂ， Ｒｉｏｔｔｏｔ Ｍ－Ｍ， Ｂｕｄｋｏｗｓｋａ Ａ， Ｂｅｎｔｌｅｙ ＧＡ．２００１．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｅＳ１ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ．ＦＥＢＳ ｌｅｔｔｅｒｓ．５０９： ４６３－４６８

【非特許文献4】Ｋｉｍ ＪＨ， Ｇｒｉｐｏｎ Ｐ， Ｂｏｕｅｚｚｅｄｉｎｅ Ｆ， Ｊｅｏｎｇ ＭＳ， Ｃｈｉ ＳＷ， Ｒｙｕ ＳＥ， Ｈｏｎｇ ＨＪ．２０１５．Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉ－ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ ｐｒｅＳ１ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｂａｓｅｄ ｏｎ ａｎｔｉｇｅｎ－ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｏｍｐｌｅｘ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．ＦＥＢＳ ｌｅｔｔｅｒｓ．５８９： １９３－２００

【非特許文献5】Ｗｉ Ｊ， Ｊｅｏｎｇ ＭＳ， Ｈｏｎｇ ＨＪ．２０１７．Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ａｎｔｉ－ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ ｐｒｅＳ１ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｈａｔ ｂｉｎｄｓ ｔｏ ｔｈｅ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２７， １３３６－１３４４．

【非特許文献6】Ｋｉｍ ＪＨ ｅｔ ａｌ．Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉ－ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ ｐｒｅＳ１ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｂａｓｅｄ ｏｎ ａｎｔｉｇｅｎ－ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｏｍｐｌｅｘ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．５８９：１９３－２００

【非特許文献7】Ｋｏｅｈｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、１９７６，Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５

【非特許文献8】ＭＥＴＨＯＤＳ：Ａ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２：１１９，１９９１

【非特許文献9】Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２００１ Ｊｕｌ；７５（１４）：６６９２－９

【非特許文献10】Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：４３３，１９９４

【非特許文献11】Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｌｅｔｔｅｒｓ．１７： ８７１－８７６（Ｋｉｍ ＨＳ， Ｈｏｎｇ ＨＪ．１９９５．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ， ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ ｐｒｅＳ１ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ

【非特許文献12】Ｍｉｎ，Ｊ．－Ｋ．ら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１６（１４）；３５７１－８０，２０１０

【非特許文献13】Ｃｈｏ Ｓ．ｅｔ ａｌ．，ＭＡＢＳ ８（２）、４１４－４２５，２０１６

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

このような背景の下に、本発明者らは、より効率的な予防や治療のために、ＨＢＶの多様な遺伝子型に結合することができ、ｐｒｅＳ１の肝細胞受容体結合部位に特異的なモノクローナル抗体を提供するために鋭意努力した結果、Ｂ型肝炎ウイルスの大部分を占める遺伝子型Ａ～Ｆに全て結合し、肝細胞受容体結合部位に結合してＨＢＶ感染抑制効能を示すヒトモノクローナル抗体を開発して本発明を完成した。

【課題を解決するための手段】

【0011】

本発明の目的は、Ｂ型肝炎ウイルスｐｒｅＳ１抗原の受容体結合部位に特異的に結合する新規な抗体を提供することにある。

【0012】

本発明の他の目的は、前記抗体の製造方法を提供することにある。

【0013】

本発明のもう一つの目的は、前記抗体をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドが含まれた発現ベクター及び前記ベクターが導入された宿主細胞を提供することにある。

【0014】

本発明のもう一つの目的は、前記抗体を含むＨＢＶ感染の予防または治療用薬学的組成物を提供することにある。

【0015】

本発明のもう一つの目的は、前記抗体を用いてＨＢＶ感染を予防または治療する方法を提供することにある。

【0016】

本発明のもう一つの目的は、前記抗体を用いてＨＢＶ感染の疑いのある個体から分離した生物学的試料に存在するｐｒｅＳ１を抗原抗体反応を通じて検出する段階を含む、ＨＢＶ感染の診断のための情報の提供方法を提供することにある。

【0017】

本発明のもう一つの目的は、前記抗体を含む、ＨＢＶ検出用組成物を提供することにある。

【0018】

本発明のもう一つの目的は、前記抗体を含むＨＢＶ検出用キットを提供することにある。

【発明の効果】

【0019】

本発明の抗体は、ＨＢＶの多様な遺伝子型が共有する配列をターゲットとし、ＨＢＶの多様な遺伝子型に結合することができ、ＨＢＶとの結合能に優れるため、ＨＢＶ感染の検出及び診断だけでなく、治療が必要な分野にも有用に使用することができる。

【図面の簡単な説明】

【0020】

【図1】ＨＢＶ ｐｒｅＳ１ Ｎ末端アミノ酸配列を整列したものである（遺伝子型Ａ－Ｆ、ＨＢＶ遺伝子型Ａに応じて番号付けする）。アミノ酸２０番－２６番は、ｐｒｅＳ１の必須の受容体結合モチーフであり、灰色の影で表示した。Ｂｉｏ－ｐｒｅＳ１－Ｌペプチドに含まれた配列は、アンダーラインで表示した。

【図2】ヒトＦａｂ合成ライブラリーから抗ｐｒｅＳ１モノクローナルＦａｂを分離する実験結果を示したものである。図２Ａは、各パンニングラウンドごとにファージのインプット及びアウトプット力価を示したものである。ｐｆｕは、ｐｌａｑｕｅ－ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔを示す。図２Ｂは、ｉｎｄｉｒｅｃｔ ＥＬＩＳＡにより決定された陽性ポリクローナルファージの増幅を示したものである。モノクローナルＦａｂの分離のために、ｐｒｅＳ１に対して最も多く増幅された４番目ラウンドのパンニングが選択された。図２Ｃは、４番目パンニングのアウトプットから選び出した陽性Ｆａｂクローン中、バイオ－ｐｒｅＳ１－Ｌペプチドに対する抗原結合活性が最も優れたＡｂＳ０ Ｆａｂファージのｉｎｄｉｒｅｃｔ ＥＬＩＳＡの結果を示したものである。

【図3】ＡｂＳ０ ＦａｂからＩｇＧ１に変換及び精製されたＡｂＳ０ ｍＡｂの抗原結合活性を分析したものである。図３Ａは、ｎｏｎ－ｒｅｄｕｃｉｎｇ（ＮＲ、６％）の条件及びｒｅｄｕｃｉｎｇ（Ｒ、１０％）の条件で精製されたＡｂＳ０のＳＤＳ－ＰＡＧＥを示す。Ｍはタンパク質マーカー、ＨＣは重鎖、ＬＣは軽鎖を示す。図３Ｂは、ＨＢＶ遺伝子型（Ａ－Ｄ）のｐｒｅＳ１に対する精製されたＡｂＳ０ ｍＡｂの抗原結合活性をＥＬＩＳＡで評価したものである。図３Ｃは、Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ３８４を利用したＢＬＩによるＡｂＳ０の親和度の分析結果を示したものである。ＨＢＶ遺伝子型Ａの組換えｐｒｅＳ１は、２倍数連続希釈で製造された（２５、１２．５、６．２５、３．１２５、１．５６２５ｎＭ）。全ての値は、複数のウェルから得て平均値±ＳＥＭで表現した。図３Ｄは、ＡｂＳ０抗体のｐｒｅＳ１に対する非特異的結合の可能性を排除するために、Ｌ１ＣＡＭを発現するが、ｐｒｅＳ１を発現しないヒト卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ３にＡｂＳ０抗体が結合しないことをＦＡＣＳで分析した結果である。

【図4】ＨＢＶ遺伝子型Ｄに対するＡｂＳ０のビリオン結合活性及びｉｎ－ｖｉｔｒｏ ＨＢＶ中和活性を評価した結果である。図４Ａは、ＡｂＳ０によるＨＢＶ遺伝子型Ｄ粒子の免疫沈降である。ＨｚＫＲ１２７－３．２（ｒｅｆ： Ｋｉｍ ＪＨ ｅｔ ａｌ．Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉ－ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ ｐｒｅＳ１ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｂａｓｅｄ ｏｎ ａｎｔｉｇｅｎ－ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｏｍｐｌｅｘ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．５８９：１９３－２００）が陽性対照群として使用され、マウスＩｇＧは、陰性対照群として使用された。ＲＣ ＤＮＡは、弛緩した環状ＤＮＡ、ＤＳＬ ＤＮＡは二本鎖線形ＤＮＡを示す。図４Ｂは、ＨＢＶ遺伝子型Ｄ粒子をＡｂＳ０（１０、１、０．１μｇ）またはマウスＩｇＧ（１０μｇ）とプレインキュベーション（ｐｒｅ－ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）した後、培養されたＨｅｐＧ２－ＮＴＣＰ細胞に添加した後、２日ごとに培地を交換し、感染７日後に細胞を得た。得られた細胞からＨＢＶ ＤＮＡを抽出してサザンブロットハイブリダイゼーションを行った結果である。

【図5】ＡｂＳ０抗体のエピトープマッピングをするために、ＧＳＴ－ｐｒｅＳ１（ａａ １－５６）－ｓｔｒｅｐの１９－３４番のアミノ酸のアラニン置換変異体の発現、精製及びＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った結果である。

【図6】ＧＳＴ－ｐｒｅＳ１（ａａ １－５６）－ｓｔｒｅｐの１９－３４番のアミノ酸のアラニン置換変異体に対するＡｂＳ０抗体の結合能をｉｎｄｉｒｅｃｔ ＥＬＩＳＡで分析した結果である。

【図7】ＡｂＳ０抗体のｐｒｅＳ１抗原に結合する部位（Ｐａｒａｔｏｐｅ）を分析するために、ＡｂＳ０抗体のＬＣＤＲ３（図７Ａ及び７Ｃ）、ＨＣＤＲ３（図７Ｂ及び７Ｄ）の各残基をアラニンで置換させた抗体変異体の抗原結合能をｉｎｄｉｒｅｃｔ ＥＬＩＳＡ（７Ａ、７Ｂ）及びｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＥＬＩＳＡ（７Ｃ、７Ｄ）で分析した結果である。

【図8】ＡｂＳ０抗体のｐｒｅＳ１抗原に結合する部位（Ｐａｒａｔｏｐｅ）を分析するために、ＡｂＳ０抗体のＨＣＤＲ１のＡｌａ３３（図８Ａ－Ｃ）、ＨＣＤＲ２のＳｅｒ５０（図８Ｄ）を他の残基で置換させた抗体変異体の抗原結合能をｉｎｄｉｒｅｃｔ ＥＬＩＳＡで分析した結果である。

【図9】ＡｂＳ１及びＡｂＳ０抗体の保存的（ＮＰＬＧＦＦＰ；ＷＴ）及び他の配列（ＮＰＬＧＦＬＰ；ｐｒｅＳ１－Ｌ２５）の受容体結合モチーフを有するＧｅｎｏｔｙｐｅ ＡのＧＳＴ－ｐｒｅＳ１（ａａ １－５６）－ｓｔｒｅｐタンパク質に対する抗原結合能をｉｎｄｉｒｅｃｔ ＥＬＩＳＡで分析した結果である。

【図10】ＡｂＳ１抗体のＧｅｎｏｔｙｐｅ Ｅ、ＦのＧＳＴ－ｐｒｅＳ１（ａａ １－５６）－ｓｔｒｅｐタンパク質に対する抗原結合能をｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＥＬＩＳＡ（図１０Ａ）及びｉｎｄｉｒｅｃｔ ＥＬＩＳＡ（図１０Ｂ）で分析した結果である。

【発明を実施するための形態】

【0021】

以下、本出願をより詳細に説明する。一方、本願で開示されたそれぞれの説明及び実施形態は、それぞれの異なる説明及び実施形態にも適用することができる。即ち、本出願で開示された多様な要素の全ての組み合わせが、本出願の範囲に属する。また、以下に記載される具体的な記述により本出願のカテゴリが制限されるとは見られない。また、本明細書の全体にわたって多数の論文及び特許文献が参照され、その引用が表示されている。引用された論文及び特許文献の開示内容は、その全体として本明細書に参照として組み込まれ、本出願が属する技術分野の水準及び本発明の内容がより明確に説明される。

【0022】

また、当該技術分野における通常の知識を有する者であれば、通常の実験のみを用いて本出願に記載された本発明の特定様態に対する多数の等価物を認知または確認することができる。また、このような等価物は、本発明に含まれることが意図される。

【0023】

本明細書の全体を通じて、天然的に存在するアミノ酸に対する通常の１文字及び３文字コードが使用される。また、本明細書で略語で言及したアミノ酸は、ＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ命名法に従って記載された。

【0024】

アラニンＡｌａ、Ａ アルギニンＡｒｇ、Ｒ
アスパラギンＡｓｎ、Ｎ アスパラギン酸Ａｓｐ、Ｄ
システインＣｙｓ、Ｃ グルタミン酸Ｇｌｕ、Ｅ
グルタミンＧｌｎ、Ｑ グリシンＧｌｙ、Ｇ
ヒスチジンＨｉｓ、Ｈ イソロイシンＩｌｅ、Ｉ
ロイシンＬｅｕ、Ｌ リシンＬｙｓ、Ｋ
メチオニンＭｅｔ、Ｍ フェニルアラニンＰｈｅ、Ｆ
プロリンＰｒｏ、Ｐ セリンＳｅｒ、Ｓ
スレオニンＴｈｒ、Ｔ トリプトファンＴｒｐ、Ｗ
チロシンＴｙｒ、Ｙ バリンＶａｌ、Ｖ

【0025】

本発明の目的を達成するための本発明の一態様は、Ｂ型肝炎ウイルスｐｒｅＳ１抗原に特異的に結合する新規な抗体を提供する。

【0026】

本出願において、用語「抗体」とは、免疫学的に特定抗原と反応性を有する免疫グロブリン分子を含む、抗原を特異的に認識する受容体の役割をするタンパク質分子を意味し、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、全体（ｗｈｏｌｅ）抗体及び抗体断片をすべて含む。

【0027】

また、前記用語は、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体及び２価（ｂｉｖａｌｅｎｔ）または二重特異性分子（例えば、二重特異性抗体）、ダイアボディ、トリアボディ及びテトラボディを含む。前記用語は、さらにＦｃＲｎに対する結合機能を保有した単鎖抗体、スキャップ、抗体定常領域の誘導体及びタンパク質スキャフォールドに基づいた人工抗体を含む。全抗体は２個の全長の軽鎖及び２個の全長の重鎖を有する構造であり、それぞれの軽鎖は、重鎖とジスルフィド結合で連結されている。前記全抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ及びＩｇＧを含み、ＩｇＧは亜型（ｓｕｂｔｙｐｅ）で、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４を含む。前記抗体断片は、抗原結合機能を保有している断片を意味し、Ｆｄ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２及びＦｖなどを含む。前記Ｆｄは、Ｆａｂ断片に含まれている重鎖の部分を意味する。前記Ｆａｂは、軽鎖及び重鎖の可変領域と軽鎖の定常領域及び重鎖の最初の定常領域（ＣＨ１ドメイン）を有する構造で１個の抗原結合部位を有する。Ｆａｂ’は、重鎖ＣＨ１ドメインのＣ末端に一つ以上のシステイン残基を含むヒンジ領域（ｈｉｎｇｅ ｒｅｇｉｏｎ）を有するという点でＦａｂと差がある。Ｆ（ａｂ’）_２抗体は、Ｆａｂ’のヒンジ領域のシステイン残基がジスルフィド結合を成しながら生成される。Ｆｖ（ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ）は、重鎖可変部位及び軽鎖可変部位のみを有している最小の抗体断片を意味する。二重ジスルフィドＦｖ（ｄｓＦｖ）は、ジスルフィド結合で重鎖可変部位と軽鎖可変部位が連結されており、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）は、一般に、ペプチドリンカーを通じて重鎖の可変領域と軽鎖の可変領域が共有結合で連結されている。このような抗体断片は、タンパク質加水分解酵素を用いて得ることができ（例えば、全抗体をパパインで制限切断し、Ｆａｂを得ることができ、ペブシンで切断すれば、Ｆ（ａｂ’）_２断片を得ることができる）、具体的には、遺伝子組換え技術を通じて製作することができる。

【0028】

本発明の抗体は、モノクローナル抗体であってもよい。

【0029】

本出願において、用語「モノクローナル抗体」は、実質的に同一の抗体集団で得られた単一分子組成の抗体分子を指し、このようなモノクローナル抗体は、特定のエピトープに対して単一結合特異性及び親和度を示す。

【0030】

典型的に、免疫グロブリンは、重鎖及び軽鎖を有し、それぞれの重鎖及び軽鎖は、定常領域及び可変領域（前記部位は、ドメインとしても知られている）を含む。軽鎖及び重鎖の可変領域は、相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ－ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇｒｅｇｉｏｎ、以下「ＣＤＲ」という）と呼ばれる３個の超可変領域及び４個のフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ）を含む。前記ＣＤＲは、主に抗原のエピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）に結合する役割をする。それぞれの鎖のＣＤＲは、典型的にＮ末端から始めて順にＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３と呼ばれ、さらに特定のＣＤＲが位置する鎖によって識別される。

【0031】

本発明の抗体は、ヒト抗体であってもよい。

【0032】

本出願において、用語「ヒト抗体」とは、ヒト免疫グロブリンに由来する分子であり、相補性決定領域、フレームワーク領域を含む抗体を構成するすべてのアミノ酸配列の全体がヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列で構成されていることを意味する。ヒト抗体は、通常、ヒトの疾病の治療に使用されるが、これは、三つ以上の潜在的な長所を有する。第一に、これは、ヒト免疫体系とより良好に相互作用し、例えば、補体依存性細胞傷害（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ，ＣＤＣ）または抗体依存性細胞性細胞傷害（ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ，ＡＤＣＣ）により目的細胞をより効率的に破壊させることができる。第二に、ヒト免疫体系が前記抗体を外来のものとして認識しない利点がある。第三に、さらに少量、より少ない頻度の薬物を投与した時にもヒトの循環系内半減期が天然の発生抗体と類似するという利点がある。

【0033】

また、前記のような本発明の抗体が定常領域を含む場合、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ由来またはそれらの組み合わせ（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）またはそれらのハイブリッド（ｈｙｂｒｉｄ）による定常領域を含むことができる。

【0034】

本出願において、用語「組み合わせ（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）」とは、二量体または多量体を形成する時、同一起源の単鎖免疫グロブリン定常領域をコードするポリペプチドが相異した起源の単鎖ポリペプチドと結合を形成することを意味する。その例として、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ及びＩｇＭの定常領域からなるグループから選択された２個以上の定常領域から二量体または多量体を形成することができる。

【0035】

本出願において、用語「ハイブリッド（ｈｙｂｒｉｄ）」とは、単鎖免疫グロブリン重鎖定常領域内に２個以上の相異した起源の免疫グロブリン重鎖定常領域に該当する配列が存在することを意味し、その例としてＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ及びＩｇＭのＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４からなるグループから選択される１個～４個のドメインからなるドメインのハイブリッドが可能である。

【0036】

本出願において、用語「Ｂ型肝炎ウイルス（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ）」は、ＨＢＶと互換的に使用される用語であり、感染する場合、これに対する免疫反応によりＢ型肝炎を起こすウイルスである。

【0037】

本出願において、用語「ｐｒｅＳ１抗原」とは、ＨＢＶ ＤＮＡのＳ、Ｃ、Ｘ、Ｐの４個の遺伝子の一つであるＳ遺伝子によりコードされるタンパク質を意味する。具体的には、Ｓ遺伝子は、表面抗原をコード（ｅｎｃｏｄｅ）する遺伝子であり、その前にＰｒｅ－Ｓ領域が存在し、Ｐｒｅ－ＳはＰｒｅＳ１領域とＰｒｅＳ２領域に分かれている。これらにより表面タンパク質であるＳ（ｓｍａｌｌ）タンパク質、Ｍ（ｍｉｄｄｌｅ）タンパク質、Ｌ（ｌａｒｇｅ）タンパク質がコードされる。Ｓタンパク質は、Ｓ遺伝子でコードされ、Ｍタンパク質はｐｒｅＳ２とＳタンパク質で構成されており、Ｌタンパク質はｐｒｅＳ１、ｐｒｅＳ２、Ｓタンパク質で構成されており、主に感染性ウイルス粒子（ビリオン）に存在する。したがって、ｐｒｅＳ１はウイルスの表面タンパク質を構成し、主に感染性ビリオンに存在する。

【0038】

本発明で提供する抗体は、多様な遺伝子型のＨＢＶに結合することができ、具体的には、遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ及びＦの全部に結合できるものであってもよい。一つの具現例として、本発明で提供する抗体は、ｐｒｅＳ１の遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ及びＦが共有する受容体結合モチーフ配列に結合することができるが、これに制限されない。

【0039】

本出願において、用語「Ｂ型肝炎ウイルスｐｒｅＳ１抗原に結合する抗体」は、ＨＢＶの表面抗原であるｐｒｅＳ１に結合してＨＢＶに対する中和活性及び／又はＨＢＶ感染抑制活性を示す抗体をいう。

【0040】

一つの具現例として、本発明で提供する抗体は、ｐｒｅＳ１抗原の特定位置のアミノ酸に結合するものであってもよく、前記位置は、配列番号１９を基準として２２番、２３番及び２５番に対応する位置であってもよい。

【0041】

前記配列番号１９は、任意のｐｒｅＳ１抗原で本発明の抗体が結合する位置を特定するための参照配列（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）に過ぎず、本発明のｐｒｅＳ１抗原は配列番号１９に制限されず、任意のｐｒｅＳ１抗原タンパク質において配列番号１９を基準として２２番、２３番及び２５番に対応する（ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ）位置は、配列アラインメント（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）を通じて確認することができる。このような配列アラインメントには、当業界に知られているＮｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム、ＥＭＢＯＳＳパッケージのＮｅｅｄｌｅプログラム、多重配列整列などが利用され得るが、これに制限されない。

【0042】

前記ｐｒｅＳ１抗原のアミノ酸配列は、公知となったデータベースからその情報を得ることができ、例えば、配列番号１７または１８の配列を含むものであってもよい。前記２２番、２３番及び２５番のアミノ酸は、配列番号１７または１８のアミノ酸配列においてそれぞれ３番、４番及び６番で示されるアミノ酸であってもよい。しかし、これに制限されない。

【0043】

前記配列番号１９を基準として２２番、２３番及び２５番のアミノ酸は、本発明の抗体が結合する部位であり、本発明の抗体が認識するｐｒｅＳ１抗原の「エピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）」は、配列番号１９を基準として２２番、２３番及び２５番に対応する位置で表現することができる。一方、前記配列番号１９を基準として２２番、２３番及び２５番に対応する位置は、ｐｒｅＳ１抗原が肝細胞受容体と結合する部位に含まれてもよい。したがって、本発明の抗体は、ｐｒｅＳ１抗原が肝細胞受容体と結合する作用を抑制することができる。

【0044】

前述した具現例のいずれか一つによる具現例として、前記抗体は、配列番号１９を基準として２２番の位置に対応するロイシン（Ｌｅｕ２２）、２３番の位置に対応するグリシン（Ｇｌｙ２３）及び２５番の位置に対応するフェニルアラニン（Ｐｈｅ２５）またはロイシン（Ｌｅｕ２５）に結合するものであってもよい。

【0045】

前述した具現例のいずれか一つによる具現例として、前記抗体は、配列番号５のＬＣＤＲ３配列の８番のチロシン及び配列番号９のＨＣＤＲ３配列の６番のロイシンをパラトープ（ｐａｒａｔｏｐｅ）として有する抗体であってもよい。

【0046】

前述した具現例のいずれか一つによる具現例として、前記抗体は、配列番号８で示されるＨＣＤＲ２配列の１番のアミノ酸をパラトープとして有する抗体であってもよい。前記配列番号８の１番のアミノ酸は、アラニンまたはロイシンであってもよい。

【0047】

本発明において、用語「パラトープ」は、抗体または抗体断片が抗原に特異的に結合する、即ち、抗体または抗体断片が抗原に物理的に接触する抗体または抗体断片上の領域または区域を意味する。

【0048】

前述した具現例のいずれか一つによる具現例として、前記抗体は、配列番号３の軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、配列番号４の軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）、及び配列番号５の軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域；及び配列番号７の重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、配列番号８の重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、及び配列番号９の重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域を含む、ｐｒｅＳ１に特異的に結合する抗体であってもよい。

【0049】

前述した具現例のいずれか一つによる具現例として、前記抗体は、配列番号３の軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、配列番号４の軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）、及び配列番号６の軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域；及び配列番号１０の重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、配列番号１１または１２の重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、及び配列番号１３の重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域を含む、ｐｒｅＳ１に特異的に結合する抗体であってもよい。

【0050】

前述した具現例のいずれか一つによる具現例として、前記抗体の軽鎖可変領域は、配列番号１で記載されたアミノ酸配列で構成されるものであってもよい。具体的には、配列番号１４で記載されたアミノ酸配列で構成されるものであってもよいが、これに制限されない。

【0051】

前述した具現例のいずれか一つによる具現例として、前記抗体の重鎖可変領域は、配列番号２で記載されたアミノ酸配列で構成されるものであってもよい。具体的には、配列番号１５または１６で記載されたアミノ酸配列で構成されるものであってもよいが、これに制限されない。

【0052】

前述した具現例のいずれか一つによる具現例として、前記抗体は、配列番号１で記載された軽鎖可変領域及び配列番号２で記載された重鎖可変領域を含むものであってもよいが、これに制限されない。具体的には、配列番号１４で記載された軽鎖可変領域；及び配列番号１５または１６で記載された重鎖可変領域を含むものであってもよいが、これに制限されない。

【0053】

本発明の一具現例では、配列番号１４の軽鎖可変領域及び配列番号１５の重鎖可変領域を含む、ｐｒｅＳ１領域に特異的に結合する抗体をＡｂＳ０と命名し、ＡｂＳ０がＨＢＶ遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤの全部に対して優れた結合能を示すことを確認した。

【0054】

また、前記配列番号６のＬＣＤＲ３配列の８番のチロシン、配列番号１３のＨＣＤＲ３配列の６番のロイシン及び配列番号１１で示されるＨＣＤＲ２配列の１番のセリンが前記ＡｂＳ０抗体のパラトープ（ｐａｒａｔｏｐｅ）であることを確認し、前記ＡｂＳ０抗体においてＨＣＤＲ２の１番のセリンを他のアミノ酸（アラニン）で置換した結果、配列番号１２で示されるＨＣＤＲ２配列を有する抗体がＡｂＳ０に比べても優れた結合能を示すことを確認し、配列番号１２のＨＣＤＲ２配列を有する抗体をＡｂＳ１抗体と命名した。

【0055】

このような本発明のｐｒｅＳ１に結合するヒト抗体は、既存の抗体に比べて高親和度及び低免疫原性を提供してＨＢＶに対する優れた中和及び感染抑制活性を示すため、本発明の抗体をｐｒｅＳ１に対する抗原認識乃至はＨＢＶの中和、感染抑制を有用に使用できる任意の適用に使用することができる。

【0056】

本発明のもう一つの様態は、前記抗体を製造する方法を提供する。

【0057】

本発明の抗体は、公知の抗体製造技術により容易に製造されることができる。例えば、モノクローナル抗体を製造する方法は、免疫動物から得たＢリンパ球を用いてハイブリドーマを製造することにより行われるか（Ｋｏｅｈｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、１９７６，Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５）、またはファージディスプレイ（ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ）技術などを用いることにより行われるが、これに制限されるものではなく、その他に公知の抗体製造技術を用いて容易に製造することができる。

【0058】

ファージディスプレイ技術を利用した抗体ライブラリーは、ハイブリドーマを製作せずに、すぐにＢリンパ球から抗体遺伝子を得てファージ（ｐｈａｇｅ）の表面に抗体を発現させる方法である。ファージディスプレイ技術を用いると、Ｂ細胞不滅化（ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚａｔｉｏｎ）によりモノクローナル抗体を生成するのに関連した既存の多くの困難を克服することができる。一般に、ファージディスプレイ技術は、１）ファージの外被タンパク質（ｃｏａｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）のｐまたはｐの Ｎ末端に該当する遺伝子部位にランダム配列のオリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）を挿入する段階；２）天然型の外被タンパク質の一部と前記ランダム配列のオリゴヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの融合タンパク質を発現させる段階；３）前記オリゴヌクレオチドによりコードされたポリペプチドと結合できる物質を処理する段階；４）前記物質に結合された抗体ファージ粒子を低いｐＨや結合競争力のある分子を用いて溶出させる段階；５）パンニング（ｐａｎｎｉｎｇ）により溶出されたファージを宿主細胞内で増幅させる段階；６）目的とする量を得るために前記方法を繰り返す段階；及び７）パンニングにより選別されたファージクローンのＤＮＡ配列から活性のある抗体の配列を決定する段階を含むことができる。

【0059】

本発明のモノクローナル抗体の製造方法は、ファージディスプレイ技術を用いて行われてもよい。当業者は、公知のファージディスプレイ技術、例えば、Ｂａｒｂａｓら（ＭＥＴＨＯＤＳ：Ａ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２：１１９，１９９１及びＪ．Ｖｉｒｏｌ．２００１ Ｊｕｌ；７５（１４）：６６９２－９）及びＷｉｎｔｅｒなど（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：４３３，１９９４）の論文などに公知となった方法を参考にして前記本発明の製造方法の各段階を容易に行うことができる。抗体ライブラリーを構築するために用いられるファージは、例えば、フィラメント性ファージ（ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｐｈａｇｅ）としてｆｄ、Ｍ１３、ｆ１、Ｉｆ１、Ｉｋｅ、Ｚｊ／Ｚ、Ｆｆ、Ｘｆ、Ｐｆ１またはＰｆ３ファージがあるが、これに制限されるものではない。また、前記フィラメント性ファージの表面上に異種遺伝子の発現のために用いられるベクターとしては、例えば、ｆＵＳＥ５、ｆＡＦＦ１、ｆｄ－ＣＡＴ１またはｆｄｔｅｔＤＯＧなどのファージベクターまたはｐＨＥＮ１、ｐＣｏｍｂ３、ｐＣｏｍｂ８またはｐＳＥＸなどのファージミドベクターがあるが、これに制限されるものではない。また、増幅のための組換えファージの成功した再感染のために求められる野生型外被タンパク質を提供するために用いられるヘルパーファージとしては、例えば、Ｍ１３Ｋ０７またはＶＳＣＭ１３などがあるが、これに制限されるものではない。

【0060】

本発明のモノクローナル抗体またはファージディスプレイクローンをコードするポリヌクレオチドは、通常の手続きを用いて容易に単離し、配列分析されることができる。その例として、ファージ鋳型ＤＮＡから当該重鎖及び軽鎖コード領域を特異的に増幅させるようにデザインされたオリゴヌクレオチドプライマーを使用することができる。一度前記ポリヌクレオチドが単離すると、これを発現ベクター内に入れることができ、その後、前記発現ベクターを適当な宿主細胞に導入し、形質転換された宿主細胞（即ち、形質転換体）から目的とするモノクローナル抗体を生産することができる。したがって、本発明の前記ヒトモノクローナル抗体の製造方法は、ヒトモノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターにおいて前記ヒトモノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチドを増幅させる段階を含む、ヒトモノクローナル抗体の製造方法であってもよいが、これに制限されない。

【0061】

本発明のもう一つの形態は、前記抗体をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドが含まれた発現ベクター及び前記ベクターが導入された宿主細胞を提供する。

【0062】

前記抗体については、前記で説明した通りである。

【0063】

本発明で提供する前記抗体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、特にこれに制限されないが、哺乳類細胞（例えば、ヒト、サル、ウサギ、ラット、ハムスター、マウス細胞など）、植物細胞、酵母細胞、昆虫細胞またはバクテリア細胞（例えば、大腸菌など）を含む真核または原核細胞で前記ポリヌクレオチドを複製及び／又は発現できるベクターであってもよく、具体的には、宿主細胞において前記ヌクレオチドが発現できるように適切なプロモーターに作動可能なように連結され、少なくとも一つの選別マーカーを含むベクターであってもよい。その例としてファージ、プラスミド、コスミド、ミニ染色体、ウイルスまたはレトロウイルスベクターなどに前記ポリヌクレオチドが導入された形態であってもよい。

【0064】

前記抗体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、前記抗体の重鎖または軽鎖をコードするポリヌクレオチドをそれぞれ含む発現ベクターまたは重鎖または軽鎖をコードするポリヌクレオチドをすべて含む発現ベクターであってもよい。

【0065】

本発明で提供する前記発現ベクターが導入された宿主細胞は、特にこれに制限されないが、前記発現ベクターが導入されて形質転換された大腸菌、ストレプトミセス、サルモネラ・ティフィムリウムなどのバクテリア細胞；酵母細胞；ピキア・パストリスなどの菌類細胞；ドロソフィラ、スポドプテラＳｆ９細胞などの昆虫細胞；ＣＨＯ（中国ハムスター卵巣細胞、ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ ｃｅｌｌｓ）、ＳＰ２／０（マウス骨髄種）、ヒトリンパ芽球（ｈｕｍａｎ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｏｉｄ）、ＣＯＳ、ＮＳＯ（マウス骨髄種）、ボウズメラノーマ（Ｂｏｗｅｓ ｍｅｌａｎｏｍａ）細胞、ＨＴ－１０８０、ＢＨＫ（ベビーハムスターの腎臓細胞、ｂａｂｙ ｈａｍｓｔｅｒ ｋｉｄｎｅｙ ｃｅｌｌｓ）、ＨＥＫ（ヒト胚性腎臓細胞、ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｋｉｄｎｅｙ ｃｅｌｌｓ）、ＰＥＲＣ．６（ヒト網膜細胞）などの動物細胞；または植物細胞であってもよい。

【0066】

本出願において、用語「導入」とは、前記抗体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主細胞に伝達する方法を意味する。このような導入は、カルシウムホスフェートＤＮＡ共沈殿法、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介トランスフェクション法、ポリブレン媒介形質感染法、電気衝撃法、微細注射法、リポソーム融合法、リポフェクタミン及び原形質体融合法などの当分野に公知となった種々の方法により行われ得る。また、形質導入は、感染（ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）を手段とし、ウイルス粒子を用いて目的物を細胞内に送達させることを意味する。併せて、遺伝子銃ボンバードメント（ｇｅｎｅ ｇｕｎ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）などによりベクターを宿主細胞内に導入することができる。本発明における導入は、形質転換と混用され得る。

【0067】

本発明のもう一つの形態は、前記抗体を含むＨＢＶ感染の予防または治療用薬学的組成物を提供する。具体的には、前記組成物は、Ｂ型肝炎の予防または治療のためのものであってもよい。

【0068】

本出願において、用語「Ｂ型肝炎」とは、ＨＢＶに感染した場合、これによる免疫反応により肝臓に炎症が起こる疾患をいう。本発明の抗体は、ＨＢＶに対する優れた中和能及び感染抑制能を示すため、これをＢ型肝炎の予防または治療に使用することができる。

【0069】

本出願において、用語「予防」とは、前記組成物の投与によりＨＢＶ感染の発病を抑制または遅延させるあらゆる行為を意味し、前記「治療」とは、前記組成物の投与によりＨＢＶ感染による症状が好転したり有益に変更されるあらゆる行為を意味する。

【0070】

前記薬学的組成物は、薬学的に許容可能な担体をさらに含むことができる。

【0071】

本出願において、用語「薬学的に許容可能な担体」とは、生物体を刺激することなく投与化合物の生物学的活性及び特性を阻害しない担体または希釈剤をいう。液状溶液に製剤化される組成物において許容される薬学的担体には、滅菌及び生体に適したものとして、食塩水、滅菌水、リンガー液、緩衝食塩水、アルブミン注射溶液、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール及びこれら成分中の１成分以上を混合して使用することができ、必要に応じて抗酸化剤、緩衝液、静菌剤など、他の通常の添加剤を添加することができる。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤及び潤滑剤を付加的に添加して水溶液、懸濁液、乳濁液などのような注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒または錠剤に製剤化することができる。

【0072】

前記薬学的組成物は、経口または非経口の種々の剤形であってもよい。製剤化する場合には、通常用いる充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を用いて調剤される。経口投与のための固形製剤には錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、このような固形製剤は、一つ以上の化合物に少なくとも一つ以上の賦形剤、例えば、澱粉、炭酸カルシウム、スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）またはラクトース（ｌａｃｔｏｓｅ）、ゼラチンなどを混ぜて調剤される。また、単純な賦形剤以外に、ステアリン酸マグネシウム、タルクなどのような潤滑剤も使用される。経口投与のための液状製剤には、懸濁剤、内溶液剤、乳剤、シロップ剤などが該当するが、一般に使用される単純希釈剤である水、リキッドパラフィン以外に、種々の賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれ得る。非経口投与のための製剤には、滅菌水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤が含まれる。非水性溶剤、懸濁溶剤としては、プロピレングリコール（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、エチルオレートのような注射可能なエステルなどが用いられる。坐剤の基剤としては、ウィテプゾール（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール、ツイン（ｔｗｅｅｎ）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどが用いられる。

【0073】

前記薬学的組成物は、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、懸濁剤、内溶液剤、乳剤、シロップ剤、滅菌水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、油剤、凍結乾燥製剤及び坐剤からなる群から選択されるいずれか一つの剤形を有することができる。

【0074】

前記本発明の組成物は、薬学的に有効な量で投与する。

【0075】

本出願において、用語「薬学的に有効な量」とは、医学的治療に適用可能な合理的な受恵／リスクの比率で疾患を治療するのに十分な量を意味し、有効用量の水準は、個体の種類及び重症度、年齢、性別、癌の種類、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与時間、投与経路及び排出比率、治療期間、同時に使用される薬物を含む要素及びその他の医学分野によく知られている要素により決定され得る。本発明の組成物は、個別治療剤として投与したり他の治療剤と併用して投与されてもよく、従来の治療剤とは順次または同時に投与することができる。そして単一または多重投与されてもよい。前記要素をすべて考慮して副作用なしに最小限の量で最大の効果が得られる量を投与することが重要であり、当業者により容易に決定することができる。

【0076】

本発明のもう一つの形態は、前記抗体を用いてＨＢＶ感染を予防または治療する方法を提供する。

【0077】

具体的には、前記方法は、前記抗体をＨＢＶ感染の疑いのある個体に投与する段階を含むものであってもよい。

【0078】

前記方法は、抗体及び薬学的に許容可能な担体をさらに含む薬学的組成物をＨＢＶが感染したり感染個体に投与する段階を含むＨＢＶ感染を予防または治療する方法であり、前記薬学的に許容可能な担体は、前記で説明した通りである。

【0079】

前記個体は、ウシ、ブタ、ヒツジ、ニワトリ、イヌ、ヒトなどを含む哺乳動物、鳥類などを含み、本発明の前記組成物の投与によりＨＢＶ感染が治療される個体を制限なく含む。この時、前記抗体は、薬学的に有効な量で単一または多重投与されてもよい。この時、抗体は、液剤、散剤、エアロゾル、カプセル剤、腸溶皮錠剤またはカプセル剤または坐剤の形態で投与することができる。投与の経路は、腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下内投与、内皮投与、経口投与、局所投与、鼻腔内投与、肺内投与、直腸内投与などを含むが、これに制限されない。

【0080】

前記方法は、また、Ｂ型肝炎の予防または治療に使用することができ、具体的には、ＨＢＶ遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ及びＦから選択されたいずれか一つ以上のＨＢＶ感染治療に用いられるが、これに制限されない。

【0081】

本発明のもう一つの形態は、前記抗体をＨＢＶ感染の予防または治療のための医薬品の製造に用いるための用途である。前記医薬品は、また、Ｂ型肝炎の予防または治療に使用することができ、ＨＢＶ遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ及びＦから選択されたいずれか一つ以上のＨＢＶ感染の治療に使用することができるが、これに制限されない。前記抗体及びＨＢＶ感染の予防または治療については前述の通りである。

【0082】

本発明のもう一つの形態は、前記抗体を用いてＨＢＶ感染の疑いのある個体から分離した生物学的試料に存在するｐｒｅＳ１を抗原抗体反応を通じて検出する段階を含む、ＨＢＶ感染の診断のための情報の提供方法を提供する。

【0083】

前記方法は、ＨＢＶ感染の診断方法であってもよい。また、前記方法は、Ｂ型肝炎の診断のために使用することができる。

【0084】

前記抗体、ＨＢＶについては、前述の通りである。

【0085】

前記ＨＢＶ診断のための情報の提供方法は、本発明のｐｒｅＳ１に特異的な抗体を、ＨＢＶ感染が疑われる個体から分離した生物学的試料と反応させ、抗原抗体複合体の形成を検出することによりｐｒｅＳ１を検出することができ、これを通じてＨＢＶ感染の診断のための情報を提供することができる。

【0086】

具体的には、（ａ）前記抗体をＨＢＶ感染が疑われる個体から分離した生物学的試料に処理し、ｐｒｅＳ１を抗原抗体反応を通じて検出する段階；（ｂ）前記（ａ）から検出されたｐｒｅＳ１の水準を対照群と比較し、対照群に比べてｐｒｅＳ１の水準が高ければ、ＨＢＶ感染患者として判定する段階を含む、方法であってもよい。

【0087】

本出願において、用語「生物学的試料」とは、組織、細胞、全血、血清、血漿、組織剖検試料（脳、皮膚、リンパ節、脊髄など）、細胞培養上澄液、破裂した真核細胞及び細菌発現系などが挙げられるが、これに制限されるものではない。これら生物学的試料を操作したり操作していない状態で本発明の抗体と反応させてｐｒｅＳ１の存在またはＨＢＶ感染有無を確認することができる。

【0088】

本出願において、用語「抗原抗体複合体」とは、試料中のｐｒｅＳ１抗原とそれを認知する本発明による抗体の結合物を意味し、このような抗原抗体複合体の形成は、比色法（ｃｏｌｏｒｍｅｔｒｉｃ ｍｅｔｈｏｄ）、電気化学法（ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄ）、蛍光法（ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ｍｅｔｈｏｄ）、発光法（ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｒｙ）、粒子計数法（ｐａｒｔｉｃｌｅ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ）、肉眼測定法（ｖｉｓｕａｌ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ）及びシンチレーション計数法（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ）からなる群から選択される任意の方法で検出することができる。しかし、必ずしもこれらのみに制限されず、多様な応用と適用が可能である。

【0089】

本発明では、抗原抗体複合体を検出するためのものとして種々の標識体を用いることができる。具体的な例としては、酵素、蛍光物、リガンド、発光物、微小粒子、放射性同位元素からなるグループから選択されることができ、必ずしもこれらのみに限定されるものではない。

【0090】

検出標識体として使用される酵素としてはアセチルコリンエステラーゼ、アルカリホスファターゼ、β－Ｄ－ガラクトシダーゼ、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ、β－ラクタマーゼなどを含み、蛍光物としてはフルオレセイン、Ｅｕ^３＋、Ｅｕ^３＋キレートまたはクリプテートなどを含み、リガンドとしてはビオチン誘導体などを含み、発光物としてはアクリジニウムエステル、イソルミノール誘導体などを含み、微小粒子としては金コロイド、着色ラテックスなどを含み、放射性同位元素としては^５７Ｃｏ、^３Ｈ、^１２５Ｉ、^１２５Ｉ－ボルトン（Ｂｏｌｔｏｎ）ハンター（Ｈｕｎｔｅｒ）試薬などを含むが、これに制限されない。

【0091】

具体的には、前記検出方法は、抗原抗体複合体を酵素免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）を用いたものであってもよい。酵素免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）には、固体支持体に付着した抗原を認知する標識された抗体を用いる直接的ＥＬＩＳＡ、固体支持体に付着した抗原を認知する抗体の複合体において捕獲抗体を認知する標識された二次抗体を用いる間接的ＥＬＩＳＡ、固体支持体に付着した抗体と抗原の複合体において抗原を認知する標識されたもう一つの抗体を用いる直接的サンドイッチＥＬＩＳＡ、固体支持体に付着した抗体と抗原の複合体において抗原を認知するもう一つの抗体と反応させた後、この抗体を認知する標識された２次抗体を用いる間接的サンドイッチＥＬＩＳＡなど、多様なＥＬＩＳＡ方法を含む。

【0092】

前記抗体は、検出標識を有することができ、検出標識を有さない場合は、これらモノクローナル抗体を捕獲することができ、検出標識を有するもう一つの抗体を処理して確認することができる。

【0093】

本発明のもう一つの様態は、本発明で提供する抗体を含む、ＨＢＶ検出用組成物を提供する。前記抗体については、前述の通りである。

【0094】

前記ＨＢＶ検出は、ＨＢＶのｐｒｅＳ１を検出することであってもよい。

【0095】

一つの具現例として、前記組成物は、検査対象の試料を採取または検出試薬を適用するための道具、抗原抗体結合を確認するための試薬または装置など、抗体を用いて生物学的試料から抗原タンパク質の存在有無を確認する通常の検出用組成物に含まれる道具、装置または試薬がさらに含まれてもよい。

【0096】

本発明のもう一つの形態は、前記抗体を含むＨＢＶ検出用キットを提供する。前記ＨＢＶ検出については、前述の通りである。

【0097】

一つの具現例として、前記キットは、また、肝炎診断キットの形態であってもよい。前記組成物及びＢ型肝炎、診断については、前述の通りである。

【0098】

本発明のもう一つの形態は、前記抗体をＨＢＶ検出のための組成物の製造に用いるための用途である。前記抗体及びＨＢＶについては、前述の通りである。

【0099】

以下、本発明を実施例及び実験例を通じてより詳細に説明する。しかし、これら実施例及び実験例は、本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれら実施例及び実験例に限定されるものではない。

【0100】

実施例１：ｐｒｅＳ１抗原の製造
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｌｅｔｔｅｒｓ．１７： ８７１－８７６（Ｋｉｍ ＨＳ， Ｈｏｎｇ ＨＪ．１９９５．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ， ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ ｐｒｅＳ１ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）などに開示された方法を使用してＨＢＶ遺伝子型ＣのＧＳＴ－ｐｒｅＳ１（１－１１９）、ＧＳＴ－ｐｒｅＳ１（１－５６）、及びｐｒｅＳ１（１－１１９）を製造した。そして、ＮＴＣＰ結合モチーフ（２０－ＮＰＬＧＦＦＰ－２６）を含む、ビオチン化合成ｐｒｅＳ１ペプチド（ｂｉｏｔｉｎ－ＳＧＳＧＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰ，Ｂｉｏ－ｐｒｅＳ１－Ｌ ｐｅｐｔｉｄｅ）は、ＡｎｙＧｅｎ、Ｉｎｃ（Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａ）に製作依頼して用いた。このように製作された組換えｐｒｅＳ１抗原及びＢｉｏ－ｐｒｅＳ１－Ｌペプチドを抗体ライブラリーのパンニングのための抗原として用いた。また、発掘された抗体の種々のＨＢＶ遺伝子型のｐｒｅＳ１抗原に対する結合有無を分析するために、ＨＢＶ遺伝子型Ａ－ＦのＧＳＴ－ｐｒｅＳ１（１－５６）－ｓｔｒｅｐ ｔａｇを大腸菌で発現及び精製した。遺伝子型Ａ－ＦのｐｒｅＳ１（１－５６）の配列は、図１に示されている。

【0101】

実施例２：ファージディスプレイされたヒト合成ＦａｂライブラリーからｐｒｅＳ１の肝細胞受容体結合部位に特異的なＦａｂの選別
ＨＢＶ ｐｒｅＳ１の肝細胞受容体結合部位に特異的なＦａｂを分離するために、ヒト合成Ｆａｂファージディスプレイライブラリーを４個のｐｒｅＳ１抗原に対しパンニングした。

【0102】

具体的には、実施例１のＧＳＴ－ｐｒｅＳ１（１－１１９）、ＧＳＴ－ｐｒｅＳ１（１－５６）、Ｂｉｏ－ｐｒｅＳ１－ＬペプチドとｐｒｅＳ１（１－１１９）の４個のｐｒｅＳ１抗原に対し、それぞれ１、２、３及び４ラウンドの標準パンニング手続きによりヒト合成Ｆａｂライブラリー（多様性１．３５ｘ１０^９）のパンニングを行った。それぞれのｐｒｅＳ１抗原をｉｍｍｕｎｏｔｕｂｅ（Ｂｉｏ－ｐｒｅＳ１－Ｌペプチドの場合は、ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ｃｏａｔｅｄ ｐｌａｔｅ）にコーティングして一晩中４℃で保管した。抗体ライブラリーファージは、抗原と共にインキュベーションし、結合されていないファージは、０．１％ ＰＢＳＴ（ＰＢＳ内に０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０）で洗浄した。３７℃で３０分間トリプシン溶液１０μｇ／ｍｌを用いて結合されたファージを溶出した。Ｅ．ｃｏｌｉ ＴＧ１細胞に溶出したファージを感染させて３７℃で１時間生長させて３７℃で一晩中インキュベーションした。増幅されたファージで次のラウンドのパンニングを行い、各ラウンドごとに次第に洗浄の程度を強化した。各ラウンドごとにファージ数のインプット及びアウトプットは、希釈とＣＦＵで計算した（図２Ａ）。

【0103】

パンニングが進行されながらｐｒｅＳ１抗原に対する抗体クローンが増幅されたかどうかを確認するために、各ラウンドのアウトプットファージに対してｉｎｄｉｒｅｃｔ ＥＬＩＳＡを行った結果、組換えｐｒｅＳ１抗原及びＢｉｏ－ｐｒｅＳ１－Ｌペプチドに結合するＦａｂクローンが３次パンニング後から増幅されることを確認した（図２Ｂ）。

【0104】

したがって、ｐｒｅＳ１抗原に最も高い活性を示すＦａｂクローンを選別するために、４番目のラウンドのパンニング後、１８８個のファージＦａｂクローンをランダムに選別してＨＢＶ遺伝子型（Ａ－Ｄ）のｐｒｅＳ１抗原に共通のＢｉｏ－ｐｒｅＳ１－Ｌペプチドを用いたｉｎｄｉｒｅｃｔ ＥＬＩＳＡを行った（図２Ｃ）。

【0105】

具体的には、パンニングの４ラウンドを行った後、合計１８８コロニーをランダムに選別し、それぞれ培養した後、モノクローナルＦａｂファージを得るために、ヘルパーファージに感染させた。その後、陽性クローンを確認するために、このファージにｉｎｄｉｒｅｃｔ ＥＬＩＳＡを行った。Ｉｎｄｉｒｅｃｔ ＥＬＩＳＡで１００ｎｇのＢＳＡ、Ｂｉｏ－ＰｒｅＳ１－Ｌペプチドを固定抗原として用い、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートされた抗Ｍ１３（１：５０００ｖ／ｖ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を２次抗体として用いた。Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＥＬＩＳＡで抗Ｍ１３抗体（１００ｎｇ／ｗｅｌｌ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）及び抗ヒトｋａｐｐａ ＨＲＰ（１：２０００ｖ／ｖ、Ｎｏｖｅｘ）をそれぞれ固定抗体及び２次抗体として用いた。

【0106】

分析の結果、ＡｂＳ０ ＦａｂファージがＢｉｏ－ＰｒｅＳ１－Ｌペプチドに最も高い抗原結合能を示すことを確認することができ、実施例１のｐｒｅＳ１（１－１１９）抗原に対する結合能も高く示すことを確認した（図２Ｃ）。

【0107】

実施例３：ＡｂＳ０ ＦａｂのヒトＩｇＧ１への変換及び抗原結合能の分析
ＡｂＳ０ ＦａｂをヒトＩｇＧ１に変換し、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞で発現させ、培養上清液に対してタンパク質の精製を行った。

【0108】

３－１ ＡｂＳ０ ＦａｂのヒトＩｇＧ１への変換
選別されたＦａｂをＩｇＧ１の形態に変換するために、重鎖可変領域（ＶＨ）及びカッパ軽鎖可変領域（ＶＫ）の配列をＰＣＲで増幅した後、組換えＰＣＲを用いてＩｇＧ重鎖及び軽鎖リーダー配列とそれぞれ結合させた。結果物であるＶＨ及びＶＫ配列をヒトＣγ１及びＣκ遺伝子が入っているｐｄＣＭＶ－ｄｈｆｒＣ発現プラスミドのＥｃｏＲＩ－ＡｐａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ－ＢｓｉＷＩ部位にサブクローニングし、ｐｄＣＭＶ－ｄｈｆｒＣ－ＡｂＳ０発現プラスミドを製作した。

【0109】

３－２抗体精製
３－１で製造した発現プラスミドをポリエチレンイミン（ＰＥＩ；ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ）を用いて１：４の比率（３０μｇ：１２０μｇ）でＨＥＫ２９３Ｆ細胞３０ｍＬに導入した。形質転換された細胞を７日間培養し、培養上清液としてＰｒｏｔｅｉｎ Ａを用いた親和度クロマトグラフィーを行った後、ＵＶ－Ｖｉｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒを用いて抗体の濃度を決定し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより精製された抗体の純度を検証した（図３Ａ）。

【0110】

３－３結合活性の分析
精製されたＡｂＳ０ ｍＡｂの種々のＨＢＶ遺伝子型のｐｒｅＳ１抗原に対する抗原結合活性を分析するために、各ウェルに遺伝子型Ａ－Ｄ（図１）のＧＳＴ－ｐｒｅＳ１（１－５６）－ｓｔｒｅｐ（３０ｎＭ／ｗｅｌｌ）をコーティングした後、連続して希釈されたＡｂＳ０抗体と反応させた。結合されたＡｂＳ０抗体は、抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ－ＨＲＰ（１：１０，０００ｖ／ｖ、Ｊａｃｋｓｏｎ）を２次抗体として用いて検出した。

【0111】

その結果、精製されたＡｂＳ０抗体が遺伝子型Ａ－Ｄの組換えｐｒｅＳ１に全て良好に結合することを確認した（図３Ｂ）。これにより、ＡｂＳ０抗体は、遺伝子型Ａ－ＤのｐｒｅＳ１抗原に対して結合活性を示すことを確認することができた。

【0112】

３－４ ＡｂＳ０の抗原結合親和度の分析
Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ３８４（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を用いてＢｉｏ－Ｌａｙｅｒ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙで抗体の親和度を決定した。具体的には、０．１％ ＰＢＡ（ＰＢＳ内に０．１％ ＢＳＡ）内で９６－ｗｅｌｌ ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ ｐｌａｔｅ（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ）を１０００ｒｐｍで２０分間撹拌してａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ Ｆｃ－ｃｏａｔｅｄ ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ｔｉｐｓ（ＡＨＣ，ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を活性化させた。ＡｂＳ０抗体（１μｇ／ｍｌ、２００μｌ）を加えて１０分間捕獲し、０．１％ ＰＢＡで２分間洗浄した。ＨＢＶ遺伝子型ＡのＧＳＴ－ｐｒｅＳ１（１－５６）－ｓｔｒｅｐ抗原を０．１％ ＰＢＡで２－ｆｏｌｄ ｓｅｒｉａｌ ｄｉｌｕｔｉｏｎ（２５、１２．５、６．２５、３．１２５、１．５６２５ｎＭ）を行い、チップに結合した抗体とそれぞれ５分間ａｓｓｏｔｉａｔｉｏｎ ｓｔｅｐ及び１０分間ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｓｔｅｐを行った。Ｂａｓｅｌｉｎｅ ｄｒｉｆｔに対して抗体がないランニングバッファーのみに露出したｃｏｎｔｒｏｌ ｓｅｎｓｏｒ（ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｃａｐｔｕｒｅｄ ＡＨＣ ｓｅｎｓｏｒ）値を除いて測定値を補正した。作動温度は３０℃に維持した。データは、１：１ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｍｏｄｅｌ（ｆｉｔｔｉｎｇ ｇｌｏｂａｌ，Ｒｍａｘ ｕｎｌｉｎｋｅｄ ｂｙ ｓｅｎｓｏｒ）を用いてＦｏｒｔｅＢｉｏ ｄａｔａ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖｅｒｓｉｏｎ ７．１を用いて分析した。

【0113】

その結果、ＡｂＳ０抗体の親和度は、０．５ｎＭであることを確認した。

【0114】

【表1】

【0115】

３－５ ＡｂＳ０抗体の抗原結合特異性（ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）の評価
ＡｂＳ０抗体のｐｒｅＳ１抗原に対する非特異的結合の可能性を排除するためにＬ１ＣＡＭを発現するが、ｐｒｅＳ１を発現しないヒト卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ３（Ｍｉｎ，Ｊ．－Ｋ．ら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１６（１４）；３５７１－８０，２０１０）を用いてｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙを行った。

【0116】

具体的には、培養されたＳＫＯＶ３細胞（２ｘ１０^５）にＡｂＳ０または陽性対照群としてＡｂ４１７（Ｌ１ＣＡＭ特異ヒト抗体：Ｃｈｏ Ｓ．ｅｔ ａｌ．，ＭＡＢＳ ８（２）、４１４－４２５，２０１６）を１μｇ（ｉｎ １００μｌ ｏｆ ０．１％ ＰＢＡ）を加え、４℃で１時間反応させた後、０．１％ ＰＢＡで二回洗浄した。この細胞にａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｆｃ－ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ（ＦＩＴＣ） ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（１：２０００ｖ／ｖ、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を加え、４℃で１時間反応させた後、ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ（１：２００ｖ／ｖ、Ｓｉｇｍａ）を加え、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて細胞を分析した。実験の結果、Ａｂ４１７はＳＫＯＶ３に結合したが、ＡｂＳ０抗体はＳＫＯＶ３細胞に結合しなかった（図３Ｄ）。

【0117】

これを通じて、ＡｂＳ０抗体がｐｒｅＳ１抗原に特異的に結合することを確認することができた。

【0118】

実施例４：ＡｂＳ０抗体のＨＢＶ中和活性の評価
４－１免疫沈降（Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｔａｔｉｏｎ）の分析
ＡｂＳ０抗体がＨＢＶビリオンに結合するかを確認するために、ＨＢＶ遺伝子型Ｄを用いて免疫沈降分析を行った。

【0119】

既存のＨＢＶ中和効能を示す抗ｐｒｅＳ１ヒト化抗体ＨｚＫＲ１２７－３．２をＨＢＶ遺伝子型Ｄの陽性対照群として用い、マウスＩｇＧを陰性対照群として用いた。免疫沈降後、ウイルスＤＮＡを抽出してサザンブロッティングで測定した。

【0120】

具体的には、ＨＢＶ遺伝子型ＤのＨＢＶ粒子の製造のために、ＨｅｐＧ２細胞を６ウェルプレートに６Х１０^５の密度で播種し、３７℃で培養した。翌日、ＨｅｐＧ２細胞をｐＨＢＶ１．２（ＨＢＶ遺伝子型Ｄ）で形質注入し、４日間インキュベーションした。培養上清液を回収し、ＡｂＳ０、ＨｚＫＲ１２７－３．２（陽性対照群）、またはｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（陰性対照群）１μｇ／ｍｌと４℃で一晩中インキュベーションした後、ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ｂｅａｄ ２０μｌと６時間４℃で免疫沈降を行った。免疫沈降させた複合体をＰＢＳで３回洗浄した後、次のようにウイルスＤＮＡを検出した。即ち、形質注入されたプラスミドＤＮＡを除去するために、免疫複合体にＤＮａｓｅ Ｉ（Ｓｉｇｍａ）及びｍｕｎｇ ｂｅａｎ ｎｕｃｌｅａｓｅ（Ｔａｋａｒａ，Ｋｕｓａｔｓｕ，Ｓｈｉｇａ，Ｊａｐａｎ）を３７℃で２０分間処理した。Ｃｏｒｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ＨＢＶ ＤＮＡを製造するために、沈降した免疫複合体にＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ（２０ ｍｇ／ｍｌ、Ｒｏｃｈｅ）を３７℃で２－３時間０．５％ ＳＤＳの存在下に加えて分解した後、ｐｈｅｎｏｌ／ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ／ｉｓｏａｍｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ（２５：２４：１）（Ｓｉｇｍａ）を用いてＨＢＶ ＤＮＡを抽出し、エタノールと３Ｍ酢酸ナトリウムを用いて精製した。精製されたＤＮＡを１％のアガロースゲルから分離し、ＨＢＶ ＤＮＡをサザンブロッティングで検出した。

【0121】

その結果、ＨＢＶ ＤＮＡのＲＣ（ｒｅｌａｘｅｄ ｃｉｒｃｕｌａｒ）及びＤＳＬ（ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ｌｉｎｅａｒ）の形態がＡｂＳ０またはＨｚＫＲ１２７－３．２抗体沈降物と共に検出され、ｍｏｕｓｅ ＩｇＧによってはＨＢＶ ＤＮＡが検出されなかった（図４Ａ）。

【0122】

これを通じてＡｂＳ０抗体がＨＢＶ遺伝子型Ｄのビリオンに結合されることを確認することができた。

【0123】

４－２ ＡｂＳ０のＨＢＶ中和活性の評価
ＡｂＳ０がＨＢＶ感染を中和できるかどうかをテストするために、遺伝子型ＤのＨＢＶ粒子を互いに異なる濃度の抗体とプレインキュベーション（ｐｒｅ－ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）し、細胞受容体ＮＴＣＰを過剰発現するＨｅｐＧ２－ＮＴＣＰ細胞に添加した。

【0124】

具体的には、ＮＴＣＰを過剰発現するＨｅｐＧ２（ＨｅｐＧ２－ＮＴＣＰと称する）細胞株を用いてＡｂＳ０のＨＢＶ中和活性を分析した。ＨｅｐＧ２－ＮＴＣＰ細胞を６ウェルプレートに６ｘ１０^５密度で播種し、３７℃で培養した。翌日、ＨｅｐＧ２－ＮＴＣＰ細胞を４％ ＰＥＧ（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）と２．５％ ＤＭＳＯを含むＰＭＭ（ｐｒｉｍａｒｙ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ ｍｅｄｉｕｍ）培地で遺伝子型ＤのＨＢＶ粒子に感染させた（細胞当たりウイルスゲノム等価物～２０００個）。

【0125】

中和の分析のために、ＨＢＶ粒子を希釈されたＡｂＳ０抗体（１０、１、０．１μｇ）またはｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（１０μｇ）とそれぞれ１時間常温でそれぞれプレインキュベーションした後、培養されたＨｅｐＧ２－ＮＴＣＰ細胞に添加し、２．５％ ＤＭＳＯを含むＰＭＭ培地で毎日２時間ごとに交換して７日間細胞を培養した。感染したＨｅｐＧ２－ＮＴＣＰ細胞から細胞内ＨＢＶ ＤＮＡを抽出し、サザンブロッティングを行った。

【0126】

その結果、ＡｂＳ０抗体は、用量に比例するようにＨＢＶ中和効果を示したが、ｍｏｕｓｅ ＩｇＧは中和効果を示していないことを確認した（図４Ｂ）。

【0127】

これを通じてＡｂＳ０は、ＨＢＶ感染を中和する能力があることを確認することができた。

【0128】

前記のような結果は、本発明の新規抗体であるＡｂＳ０がＨＢＶ遺伝子型Ａ－Ｄに全て結合することができ、前記遺伝子型のウイルスを効果的に中和させることを示唆し、前記遺伝子型のウイルス感染を予防したりウイルス感染による肝炎患者の治療に効果的であることを示唆する。併せて、前記ＨＢＶ遺伝子型Ａ－Ｄ感染有無も特異的に検出できることを示唆する。

【0129】

前記本発明の新規抗体ＡｂＳ０の軽鎖可変領域は配列番号１４で、重鎖可変領域は配列番号１５で示した。

【0130】

実施例５：ＡｂＳ０抗体のｆｉｎｅ ｅｐｉｔｏｐｅの決定
ＡｂＳ０抗体のＨＢＶ中和効能の機序を理解するために、ＡｂＳ０のｐｒｅＳ１内における結合部位（ｆｉｎｅ ｅｐｉｔｏｐｅ）を正確に決定し、このｆｉｎｅ ｅｐｉｔｏｐｅのアミノ酸配列がＨＢＶごとに保存されているかを分析した。

【0131】

５－１ ＰｒｅＳ１（１９－３４）のａｌａｎｉｎｅ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ
ＡｂＳ０抗体は、ｇｅｎｏｔｙｐｅ ＣのｐｒｅＳ１（２０－３２）ペプチドを用いたヒト抗体ライブラリーのパンニングを通じて発掘したものであるため、この抗体がｐｒｅＳ１（２０－３２）領域内に結合することと推定し、如何なる残基がＡｂＳ０抗体に結合するかを分析するために、ｇｅｎｏｔｙｐｅ ＣのｐｒｅＳ１（１９－３４）の各残基をアラニン（ａｌａｎｉｎｅ）で置換させた変異体を作り、ＡｂＳ０抗体の各変異体に対する抗原結合能を分析した。

【0132】

具体的には、突然変異配列が含まれたプライマーを用いて組換えＰＣＲ方法でｐｒｅＳ１（１９－３４）の各残基をアラニンで置換させたＤＮＡを合成し、ＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩ（ＮＥＢ）制限酵素で切断した後、ｗｉｌｄ ｔｙｐｅのｐｒｅＳ１配列が含まれている前記ｐＧＳＴ－ｐｒｅＳ１（１－５６）－ｓｔｒｅｐ発現プラスミドのＢａｍＨＩ－ＥｃｏＲＩ部位にそれぞれｓｕｂｃｌｏｎｉｎｇすることにより、ｗｉｌｄ ｔｙｐｅのｐｒｅＳ１（１－５６）の代わりにアラニン置換変異体を有する発現プラスミドを製作した。その後、各変異体を発現するために、組換えＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αを０．２ ｍＭのＩＰＴＧが含まれた培地で１８℃で１９時間培養した。その後、ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎにより細胞を破砕した後、グルタチオンビード（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）を用いた親和性クロマトグラフィーによりＧＳＴ－ｐｒｅＳ１（１－５６）－ｓｔｒｅｐタンパク質を精製し、精製されたタンパク質の純度を１２％ ＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認した（図５）。

【0133】

５－２．ｐｒｅＳ１のアラニン置換変異体に対する抗体の抗原結合能の分析
各アラニン置換変異体に対するＡｂＳ０抗体の抗原結合能をｉｎｄｉｒｅｃｔ ＥＬＩＳＡで分析した（図６）。

【0134】

具体的には、各ウェルに突然変異されたＧＳＴ－ｐｒｅＳ１（１－５６）－ｓｔｒｅｐ抗原（２００ｎｇ）をコーティングした後、連続して希釈されたＡｂＳ０抗体とインキュベーションした。結合されたＡｂＳ０抗体は、抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ－ＨＲＰ（１：１０，０００ｖ／ｖ、Ｔｈｅｒｍｏ）を２次抗体として用いて検出した。

【0135】

その結果、Ｌ２２Ａ、Ｇ２３ＡまたはＦ２５Ａ突然変異体は、ｗｉｌｄ ｔｙｐｅのｐｒｅＳ１抗原に比べて抗体結合活性を完全に喪失することを確認した。その結果は、ＡｂＳ０抗体がｐｒｅＳ１抗原のＬｅｕ２２、Ｇｌｙ２３及びＰｈｅ２５に直接的に結合することを意味する。

【0136】

実施例６：ＡｂＳ０抗体のｅｐｉｔｏｐｅ結合部位（ｐａｒａｔｏｐｅ）の決定及び親和度が増加した変異体の確認
ＡｂＳ０抗体のＣＤＲｓ中で抗原と直接的に結合するアミノ酸残基を探すために、ＣＤＲ残基をａｌａｎｉｎｅ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓと位置指定突然変異（ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）させた後、その変異体の抗原結合能を分析した。

【0137】

６－１．ＡｂＳ０抗体のＨＣＤＲ３及びＬＣＤＲ３のａｌａｎｉｎｅ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ
ＡｂＳ０抗体のＨＣＤＲ３（配列番号１５基準Ｖ９５、Ｉ９６、Ｙ９７、Ｓ９９、Ｌ１００）及びＬＣＤＲ３（配列番号１４基準Ｓ９１、Ｙ９２、Ｓ９３、Ｓ９４、Ｙ９６）の各残基をアラニンで置換させた変異体を製作するために、突然変異配列が含まれたプライマーを用いてＶＨまたはＶＬ遺伝子を組換えＰＣＲ方法を用いて合成した。ＨＣＤＲ３変異体の場合には、それぞれ合成されたＶＨ遺伝子をＥｃｏＲＩとＡｐａＩ制限酵素で切断した後にＡｂＳ０抗体の重鎖遺伝子が入っている発現ベクター（ｐＣＭＶ－ｄｈｆｒ－ＡｂＳ０Ｈ）のＥｃｏＲＩ－ＡｐａＩ位置にｓｕｂｃｌｏｎｉｎｇし、ＬＣＤＲ３変異体の場合には、それぞれ合成されたＶＬ遺伝子をＨｉｎｄＩＩＩとＢｓｉＷＩ制限酵素で切断した後にＡｂＳ０抗体の軽鎖遺伝子が入っている発現ベクター（ｐＣＭＶ－ｄｈｆｒ－ＡｂＳ０ｋ）のＨｉｎｄＩＩＩ－ＢｓｉＷＩ位置にｓｕｂｃｌｏｎｉｎｇし、次のように合計１０個のアラニン置換変異体の発現プラスミドを製作した。

【0138】

【表2】

【0139】

各変異体を生産するために、前記製作された発現プラスミドをポリエチレンイミン（ＰＥＩ；ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ）と１：４の比率（３０μｇ：１２０μｇ）で混合した後、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞に導入した。形質転換された細胞を７日間培養して変異体抗体を発現させた後、培養上清液を回収し、これらの抗原結合能をｉｎｄｉｒｅｃｔ ＥＬＩＳＡで分析した。具体的には、各ウェルにＨＢＶ遺伝子型Ｃの組換えＧＳＴ－ｐｒｅＳ１（１－５６）－ｓｔｒｅｐ抗原（１００ｎｇ）をコーティングした後、連続して希釈されたＡｂＳ０抗体またはＡｂＳ０変異体を結合させ、２次抗体として抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ－ＨＲＰ（１：１０，０００ｖ／ｖ、Ｔｈｅｒｍｏ）を加えて反応させた。

【0140】

Ｉｎｄｉｒｅｃｔ ＥＬＩＳＡに使用されたＡｂＳ０抗体またはＡｂＳ０変異体の濃度は、ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＥＬＩＳＡにより決定された。各ウェルに抗ヒトＩｇＧ ｋａｐｐａ抗体（１００ｎｇ，Ｔｈｅｒｍｏ）をコーティングした後、連続して希釈されたＡｂＳ０抗体または変異体を結合させ、２次抗体として抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ－ＨＲＰ（１：１０，０００ｖ／ｖ、Ｔｈｅｒｍｏ）を加えて反応させた。

【0141】

その結果、ＨＣＤＲ３変異体Ｌ１００Ａ及びＬＣＤＲ３変異体Ｙ９６Ａは、抗原結合活性がないか、または非常に低い一方、他の６個の変異体（ＨＣＤＲ３のＶ９５Ａ、Ｓ９９Ａ；ＬＣＤＲ３のＳ９１Ａ、Ｙ９２Ａ、Ｓ９３Ａ、Ｓ９４Ａ）は、ｗｉｌｄ ｔｙｐｅのＡｂＳ０と同一の抗原結合能を示した（図７）。ＣＤＲ３変異体Ｉ９６Ａ及びＹ９７Ａは発現しなかったため、分析できなかった。その結果からＡｂＳ０のＨＣＤＲ３のＬｅｕ１００、ＬＣＤＲ３のＴｙｒ９６が抗原結合に非常に大いに関与することを確認した。

【0142】

６－２ ＡｂＳ０抗体ＨＣＤＲ１及びＨＣＤＲ２の位置指定突然変異
一般に、抗体でＨＣＤＲ１の３３番のアミノ酸とＨＣＤＲ２の５０番のアミノ酸は、抗体ごとに異なって多様性が高く、抗原結合に関与することが知られているため、ＡｂＳ０抗体の場合、３３番、５０番の残基が抗原結合に関与するかを分析するために、位置指定突然変異を行った。（３３番及び５０番の位置は、配列番号１５を基準として記載した位置である）

【0143】

ＡｂＳ０抗体の場合、ＨＣＤＲ１の３３番のアミノ酸がアラニンとなっており、その残基が抗原結合に関与するかを調べるために、アラニンを８個の他の残基（Ｓ、Ｐ、Ｖ、Ｔ、Ｇ、Ｄ、Ｌ、Ｎ）で置換し、５０番のアミノ酸はセリンとなっており、６個の他の残基（Ａ、Ｙ、Ｅ、Ｆ、Ｖ、Ｐ）で置換した。変異体遺伝子の製作のために、ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ｐｒｉｍｅｒを利用した組換えＰＣＲを行い、合成されたＶＨ遺伝子をＥｃｏＲＩとＡｐａＩ制限酵素で切断した後にｐｄＣＭＶ－ｄｈｆｒ－ＡｂＳ０のＥｃｏＲＩ－ＡｐａＩ位置にｓｕｂｃｌｏｎｉｎｇして変異体の発現プラスミドを得、塩基配列の分析を通じて前記の合計１４種の変異体を確保したことを確認した。それぞれの発現プラスミドを前記６－１と同様な方法でＨＥＫ２９３Ｆ細胞に導入し、７日間培養後に得た培養上清液を前記６－１と同様にｉｎｄｉｒｅｃｔ ＥＬＩＳＡとｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＥＬＩＳＡで分析した。

【0144】

その結果、重鎖ＨＣＤＲ１ ３３番のアミノ酸の場合、アラニンをアスパラギン（Ａ３３Ｎ、図８Ａ）、ロイシン（Ａ３３Ｌ、図８Ｂ）、アスパラギン酸（Ａ３３Ｄ、図８Ｃ）で置換した場合には抗原結合能を示さず、グリシンで置換された変異体（Ａ３３Ｇ、図８Ｃ）もｗｉｌｄ ｔｙｐｅ ＡｂＳ０抗体に比べて抗原結合能が大きく減少したことが示された。その結果は、重鎖ＨＣＤＲ１の３３番のアミノ酸が抗原結合に関与することを意味する。一方、３個の変異体であるＡ３３Ｓ（図８Ａ）、Ａ３３Ｖ及びＡ３３Ｐ（図８Ｂ）は、ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ抗体と類似の抗原結合能を示した。

【0145】

ＨＣＤＲ２の５０番セリンの変異体の場合、Ｓ５０Ａ変異体は、ＡｂＳ０抗体に比べて若干増加した抗原結合能を示し、Ｓ５０Ｙ変異体の抗原結合活性は大きく減少した一方、Ｓ５０Ｆ及びＳ５０Ｅ変異体は抗原結合活性を示さないことを確認した（図８Ｄ）。Ｓ５０Ｖ及びＳ５０Ｐ変異体の場合、発現が検出されないため、抗原結合能を分析できなかった。その結果は、ＨＣＤＲ２の５０番の残基が抗原結合に重要に作用し、セリンよりはアラニンが抗原結合に、より最適であることを意味する。

【0146】

ＡｂＳ０抗体ＨＣＤＲ２の５２ａ番のグルタミン（配列番号１１を基準として４番のアミノ酸）も抗原結合に関与するかを分析するために、グルタミンを４個の他のアミノ酸（Ｙ、Ａ、Ｆ、Ｍ）で置換した変異体を製作してＨＥＫ２９３Ｆ細胞で一時的に発現させた結果、変異体（Ｑ５２ａＡ、Ａ５２ａＦ、Ａ５２ａＭ）は、ＡｂＳ０抗体と同一の抗原結合能を示し、Ｑ５２ａＹ変異体は、発現が検出されず、分析できなかった。この結果からＨＣＤＲ２アミノ酸５２ａ番がｐｒｅＳ１抗原との相互作用に関与しないことと推定した。

【0147】

前記実施例５及び６の結果に基づいて、ＡｂＳ０抗体でＨＣＤＲ１のＡｌａ３３、ＨＣＤＲ２のＳｅｒ５０、ＨＣＤＲ３のＬｅｕ１００、ＬＣＤＲ３のＴｙｒ９６がｐｒｅＳ１のＬｅｕ２２、Ｇｌｙ２３、Ｐｈｅ２５に直接的に結合することを推定することができた。また、実施例６の実験を通じてＡｂＳ０より抗原結合能がより向上した変異体Ｓ５０Ａを得ることができ、その変異体抗体を「ＡｂＳ１」と命名した。

【0148】

実施例７：ＡｂＳ１抗体の抗原結合特性の分析
７－１ ＡｂＳ１とＡｂＳ０抗体のｇｅｎｏｔｙｐｅ Ａ及びＣのｐｒｅＳ１抗原に対する結合能の比較
前記実施例６－２においてＡｂＳ０抗体及び変異体の抗原結合能を分析するために、ＨＢＶ遺伝子型Ｃの組換えＧＳＴ－ｐｒｅＳ１（１－５６）－ｓｔｒｅｐ抗原を使用したため、ＡｂＳ１抗体が他の遺伝子型のｐｒｅＳ１抗原に対してもＡｂＳ０より結合能がより高いかを分析するために、遺伝子型Ａの組換えＧＳＴ－ｐｒｅＳ１（１－５６）－ｓｔｒｅｐ抗原に対してｉｎｄｉｒｅｃｔ ＥＬＩＳＡを行った。その結果、ＡｂＳ１は、ＡｂＳ０より遺伝子型ＡのｐｒｅＳ１に対してより高い抗原結合能を示すことを確認した（図９）。

【0149】

７－２ ＡｂＳ１抗体の他のｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｔｉｆを有するｐｒｅＳ１抗原に対する結合能の分析
ＡｂＳ１抗体のｅｐｉｔｏｐｅ（ｐｒｅＳ１のＬｅｕ２２、Ｇｌｙ２３、Ｐｈｅ２５）がＨＢＶ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｔｉｆ内に入っているため、ＡｂＳ１抗体が地球上に存在するＨＢＶに広範囲に結合可能かどうかを推定するために、ＨＢＶ ｄａｔａｂａｓｅ（ｈｔｔｐｓ：／／ｈｂｖｄｂ．ｌｙｏｎ．ｉｎｓｅｒｍ．ｆｒ／ＨＢＶｄｂ／）に登録されている９６３９個（２０２１年４月３０日現在）のｐｒｅＳ１遺伝子の受容体結合部位（ａａ ２０－２６、ｇｅｎｏｔｙｐｅ Ａ）の配列を分析した結果、９６．６％ ｐｒｅＳ１配列がｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｔｉｆとしてＮＰＬＧＦＦＰ配列を有しており、２．６％は２５番の位置にフェニルアラニンの代わりにロイシンがあるＮＰＬＧＦＬＰを有していた（表３）。

【0150】

【表3】

【0151】

したがって、ＡｂＳ１抗体がＮＰＬＧＦＬＰにも結合するかを分析するために、ＮＰＬＧＦＬＰ配列を有するｇｅｎｏｔｙｐｅ ＡのＧＳＴ－ｐｒｅＳ１（１－５６）－ｓｔｒｅｐ抗原を発現及び精製してｉｎｄｉｒｅｃｔ ＥＬＩＳＡを行った結果、ＡｂＳ１抗体は、ＮＰＬＧＦＬＰに対してＮＰＬＧＦＦＰに対する結合能より若干低いが、良好に結合することを確認した（図９）。

【0152】

前記結果から、ＡｂＳ１抗体が遺伝子型Ａ、ＣのｐｒｅＳ１抗原に対してＡｂＳ０より高い抗原結合能を示すことを確認し、両抗体はいずれもＮＰＬＧＦＬＰ配列の肝細胞受容体結合モチーフを有するＨＢＶにも良好に結合することを予測することができた。

【0153】

７－３ ＡｂＳ１抗体のｇｅｎｏｔｙｐｅ Ｅ、ＦのｐｒｅＳ１抗原に対する結合能の分析
前記実施例を通じてＡｂＳ１抗体がＨＢＶ遺伝子型Ａ－Ｄ及び変異体のｐｒｅＳ１抗原に結合することを確認したため、ＡｂＳ１抗体が遺伝子型Ｅ、ＦのｐｒｅＳ１抗原に対しても結合できるかどうかを確認するために、遺伝子型Ｅ、Ｆの組換えＧＳＴ－ｐｒｅＳ１（１－５６）－ｓｔｒｅｐ抗原に対してｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＥＬＩＳＡ（図１０Ａ）及びｉｎｄｉｒｅｃｔ ＥＬＩＳＡ（図１０Ｂ）を行った。この時、実施例５のｇｅｎｏｔｙｐｅ ＣのＦ２５Ａ変異体ｐｒｅＳ１抗原をｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌとして使用した。その結果、ＡｂＳ１は遺伝子型Ｅ、ＦのｐｒｅＳ１に良好に結合することを確認した（図１０）。

【0154】

前記のような結果は、本発明の新規抗体であるＡｂＳ０、ＡｂＳ１がＨＢＶ遺伝子型Ａ－Ｆに全部結合することができ、ｐｒｅＳ１の肝細胞受容体結合モチーフに結合するため、ＨＢＶが肝細胞に入る過程を遮断することによりＨＢＶの中和だけでなく、ＨＢＶの感染を効果的に阻害するＨＢＶ ｅｎｔｒｙ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒの作用機序を有するところ、ＨＢＶ感染の予防及び治療にも有用に用いられることを示す。

【0155】

以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者であれば、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施されうることが理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本発明の範囲は前記詳細な説明よりは、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導かれるあらゆる変更または変形された形態が本発明の範囲に含まれるものと解釈すべきである。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【配列表】

2024525184000001.app

【手続補正書】

【提出日】2024-03-12

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＨＢＶ（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ）のｐｒｅＳ１抗原内の特定位置のアミノ酸に結合する抗体であって、
前記ｐｒｅＳ１抗原内の特定位置は、配列番号１９を基準として２２番、２３番及び２５番の位置に対応する、前記抗体。

【請求項2】

前記抗体は、配列番号５のＬＣＤＲ３配列の８番チロシン及び配列番号９のＨＣＤＲ３配列の６番ロイシンをパラトープとして有する、請求項１に記載の抗体。

【請求項3】

前記抗体は、配列番号８で示されるＨＣＤＲ２配列の１番のアミノ酸をパラトープとして有する、請求項１に記載の抗体。

【請求項4】

前記配列番号８で示されるＨＣＤＲ２配列の１番のアミノ酸残基は、アラニンまたはセリンである、請求項３に記載の抗体。

【請求項5】

前記抗体は、
（ａ）配列番号３の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号４の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；及び
（ｂ）配列番号７の重鎖ＣＤＲ１、配列番号８の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号９の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；
を含む、請求項１に記載の抗体。

【請求項6】

前記抗体は、
（ａ）配列番号３の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号４の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；及び
（ｂ）配列番号１０の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１１または１２の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１３の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；
を含む、請求項１に記載の抗体。

【請求項7】

前記抗体は、ＨＢＶの遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥまたはＦから選択された一つ以上の遺伝子型に特異的に結合する、請求項１に記載の抗体。

【請求項8】

前記抗体の軽鎖可変領域は、配列番号１で構成される、請求項１に記載の抗体。

【請求項9】

前記抗体の重鎖可変領域は、配列番号２で構成される、請求項１に記載の抗体。

【請求項10】

前記抗体は、配列番号１４で記載された軽鎖可変領域；及び配列番号１５または１６で記載された重鎖可変領域を含む、請求項１に記載の抗体。

【請求項11】

請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗体をコードするポリヌクレオチド。

【請求項12】

請求項１１に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。

【請求項13】

請求項１２に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。

【請求項14】

請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗体を含む、ＨＢＶ感染の予防または治療用薬学的組成物。

【請求項15】

前記組成物は、Ｂ型肝炎の予防または治療のためのものである、請求項１４に記載の組成物。

【請求項16】

請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗体を用いて、ＨＢＶ感染の疑いのある個体から分離した生物学的試料に存在するｐｒｅＳ１タンパク質を抗原抗体反応を通じて検出する段階を含む、ＨＢＶ感染の診断方法。

【請求項17】

前記方法は、Ｂ型肝炎の診断をするためのものである、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗体を含む、ＨＢＶ検出用組成物。

【請求項19】

前記組成物は、Ｂ型肝炎の診断をするためのものである、請求項１８に記載の組成物。

【請求項20】

請求項１８に記載の組成物を含む、ＨＢＶ検出用キット。

【手続補正2】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００４６

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0046】

前述した具現例のいずれか一つによる具現例として、前記抗体は、配列番号８で示されるＨＣＤＲ２配列の１番のアミノ酸をパラトープとして有する抗体であってもよい。前記配列番号８の１番のアミノ酸は、アラニンまたはセリンであってもよい。

【手続補正3】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００７９

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0079】

前記個体は、ヒトを含む哺乳動物などを含み、本発明の前記組成物の投与によりＨＢＶ感染が治療される個体を制限なく含む。この時、前記抗体は、薬学的に有効な量で単一または多重投与されてもよい。この時、抗体は、液剤、散剤、エアロゾル、カプセル剤、腸溶皮錠剤またはカプセル剤または坐剤の形態で投与することができる。投与の経路は、腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下内投与、内皮投与、経口投与、局所投与、鼻腔内投与、肺内投与、直腸内投与などを含むが、これに制限されない。

【手続補正4】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１０９

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0109】

３－２ＡｂＳ０の抗体精製
３－１で製造した発現プラスミドをポリエチレンイミン（ＰＥＩ；ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ）を用いて１：４の比率（３０μｇ：１２０μｇ）でＨＥＫ２９３Ｆ細胞３０ｍＬに導入した。形質転換された細胞を７日間培養し、培養上清液としてＰｒｏｔｅｉｎ Ａを用いた親和度クロマトグラフィーを行った後、ＵＶ－Ｖｉｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒを用いて抗体の濃度を決定し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより精製された抗体の純度を検証した（図３Ａ）。

【手続補正5】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１１０

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0110】

３－３ＡｂＳ０の結合活性の分析
精製されたＡｂＳ０ ｍＡｂの種々のＨＢＶ遺伝子型のｐｒｅＳ１抗原に対する抗原結合活性を分析するために、ｉｎｄｉｒｅｃｔ ＥＬＩＳＡを行った。具体的には、各ウェルに遺伝子型Ａ－Ｄ（図１）のＧＳＴ－ｐｒｅＳ１（１－５６）－ｓｔｒｅｐ（３０ｎＭ／ｗｅｌｌ）をコーティングした後、連続して希釈されたＡｂＳ０抗体と反応させた。結合されたＡｂＳ０抗体は、抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ－ＨＲＰ（１：１０，０００ｖ／ｖ、Ｊａｃｋｓｏｎ）を２次抗体として用いて検出した。

【手続補正6】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１２３

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0123】

４－２ ＡｂＳ０のＨＢＶ中和活性の評価
ＡｂＳ０がＨＢＶ感染を中和できるかどうかをテストするために、ヒト肝細胞受容体ＮＴＣＰを過剰発現するＨｅｐＧ２（ＨｅｐＧ２－ＮＴＣＰと称する）細胞株を用いてＡｂＳ０のＨＢＶ中和活性を分析した。遺伝子型ＤのＨＢＶ粒子を互いに異なる濃度の抗体とプレインキュベートし、続いて培養したＨｅｐＧ２－ＮＴＣＰ細胞に添加した。

【手続補正7】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１２４

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0124】

具体的には、ＨｅｐＧ２－ＮＴＣＰ細胞を６ウェルプレートに６ｘ１０^５密度で播種し、３７℃で培養した。翌日、ＨｅｐＧ２－ＮＴＣＰ細胞を４％ ＰＥＧ（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）と２．５％ ＤＭＳＯを含むＰＭＭ（ｐｒｉｍａｒｙ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ ｍｅｄｉｕｍ）培地で遺伝子型ＤのＨＢＶ粒子に感染させた（細胞当たりウイルスゲノム等価物～２０００個）。

【手続補正8】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１３０

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0130】

実施例５：ＡｂＳ０抗体のｆｉｎｅ ｅｐｉｔｏｐｅの決定
ＡｂＳ０抗体のＨＢＶ中和効能の機序を理解するために、ＡｂＳ０の結合部位（ｆｉｎｅ ｅｐｉｔｏｐｅ）を正確に決定し、このｆｉｎｅ ｅｐｉｔｏｐｅのアミノ酸配列がＨＢＶの遺伝子型ごとに保存されているかを分析した。

【手続補正9】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１３４

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0134】

具体的には、各ウェルに突然変異されたＧＳＴ－ｐｒｅＳ１（１－５６）－ｓｔｒｅｐ抗原（２００ｎｇ）または野生型ｐｒｅＳ１抗原をコーティングした後、連続して希釈されたＡｂＳ０抗体とインキュベーションした。結合されたＡｂＳ０抗体は、抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ－ＨＲＰ（１：１０，０００ｖ／ｖ、Ｔｈｅｒｍｏ）を２次抗体として用いて検出した。

【手続補正10】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１３８

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0138】

【表2】

【手続補正11】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１４８

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0148】

実施例７：ＡｂＳ１抗体の抗原結合特性の分析
７－１ ＡｂＳ１とＡｂＳ０抗体の抗原結合能の比較
前記実施例６－２においてＡｂＳ１はＡｂＳ０と比較してＨＢＶ遺伝子型ＣのｐｒｅＳ１抗原に対する増強された抗原結合能を示した。そのため、この実験においてはＡｂＳ１抗体が他の遺伝子型のｐｒｅＳ１抗原に対してもＡｂＳ０より結合能がより高いかを分析するために、遺伝子型ＡのｐｒｅＳ１抗原を使用してｉｎｄｉｒｅｃｔ ＥＬＩＳＡを行った。その結果、ＡｂＳ１は、ＡｂＳ０より遺伝子型ＡのｐｒｅＳ１に対してより高い抗原結合能を示すことを確認した（図９）。

【手続補正12】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１４９

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0149】

７－２ ＡｂＳ１抗体の他のｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｔｉｆ配列を有するｐｒｅＳ１抗原に対する結合能の分析
ＡｂＳ１抗体のｅｐｉｔｏｐｅ（ｐｒｅＳ１のＬｅｕ２２、Ｇｌｙ２３、Ｐｈｅ２５）がＨＢＶ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｔｉｆ内に入っているため、ＡｂＳ１抗体が地球上に存在するＨＢＶに広範囲に結合可能かどうかを推定するために、ＨＢＶ ｄａｔａｂａｓｅ（ｈｔｔｐｓ：／／ｈｂｖｄｂ．ｌｙｏｎ．ｉｎｓｅｒｍ．ｆｒ／ＨＢＶｄｂ／）に登録されている９６３９個（２０２１年４月３０日現在）のｐｒｅＳ１遺伝子の受容体結合部位（ａａ ２０－２６、ｇｅｎｏｔｙｐｅ Ａ）の配列を分析した結果、９６．６％ ｐｒｅＳ１配列がｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｔｉｆとして確証されたＮＰＬＧＦＦＰ配列を有しており、２．６％は２５番の位置にフェニルアラニン（Ｐｈｅ２５）の代わりにロイシン（Ｌｅｕ２５）があるＮＰＬＧＦＬＰを有していた（表３）。

【手続補正13】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１５０

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0150】

【表3】

【手続補正書】

【提出日】2024-03-12

【手続補正1】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】配列表

【補正方法】追加

【補正の内容】

【配列表】

2024525184000001.app

【国際調査報告】