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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-07-10
(54)【発明の名称】方法及び組成物
(51)【国際特許分類】
C12N 5/10 20060101AFI20240703BHJP
C12N 5/078 20100101ALI20240703BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20240703BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20240703BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20240703BHJP
A61K 35/19 20150101ALI20240703BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240703BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240703BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20240703BHJP
A61P 9/00 20060101ALI20240703BHJP
A61P 31/00 20060101ALI20240703BHJP
C07K 19/00 20060101ALN20240703BHJP
C07K 16/00 20060101ALN20240703BHJP
C07K 14/705 20060101ALN20240703BHJP
【ＦＩ】
C12N5/10 ZNA
C12N5/078
C12N15/62 Z
C12N15/12
C12N15/13
A61K35/19
A61P35/00
A61P43/00 105
A61P37/06
A61P9/00
A61P31/00
C07K19/00
C07K16/00
C07K14/705
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023577984
(86)(22)【出願日】2022-06-15
(85)【翻訳文提出日】2024-02-15
(86)【国際出願番号】 GB2022051512
(87)【国際公開番号】W WO2022263824
(87)【国際公開日】2022-12-22
(31)【優先権主張番号】2108585.7
(32)【優先日】2021-06-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
２．Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ
(71)【出願人】
【識別番号】523473659
【氏名又は名称】ザップ・セラピューティクス・リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100108453
【弁理士】
【氏名又は名称】村山 靖彦
(74)【代理人】
【識別番号】100110364
【弁理士】
【氏名又は名称】実広 信哉
(74)【代理人】
【識別番号】100133400
【弁理士】
【氏名又は名称】阿部 達彦
(72)【発明者】
【氏名】ジェームズ・パターソン
(72)【発明者】
【氏名】ローレント・ジェスパーズ
【テーマコード（参考）】
4B065
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA93X
4B065AB01
4B065AC14
4B065AC20
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA25
4B065CA44
4B065CA46
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB38
4C087CA04
4C087CA12
4C087NA13
4C087NA14
4C087ZA36
4C087ZB08
4C087ZB21
4C087ZB26
4C087ZB31
4H045AA10
4H045AA11
4H045AA20
4H045BA10
4H045BA41
4H045CA40
4H045DA50
4H045DA76
4H045EA28
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、所望の標的特異性を有するキメラ血小板受容体（ＣＰＲ）を有する操作された血小板を提供する。追加的に、操作された血小板は、血小板の活性化時に放出され得るカーゴを含み得る。追加的に、血小板は、非血栓性血小板を生成するように操作された巨核球からインビトロで生成され得る。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
操作されたシャーシであって、前記シャーシが、Ａ）
ｉ）血小板炎症シグナル伝達経路を破壊すること、
ｉｉ）前記操作されたシャーシの免疫原性を低下させること、並びに／又は
ｉｉｉ）前記シャーシの１つ以上の基本機能を増強若しくは破壊することを行うように操作されており、１つ以上又は基本機能が、自然免疫応答及び／若しくは適応免疫応答、炎症、血管新生、アテローム性動脈硬化症、リンパ発達及び／若しくは腫瘍成長に関与し、任意選択で、
ｉｖ）血小板血栓形成経路を破壊するように操作されており、
かつ
Ｂ）前記シャーシが、
ｉ）１つ以上のキメラ血小板受容体（ＣＰＲ）、ユニバーサルキメラ血小板受容体（ユニバーサルＣＰＲ）、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、合成抗原提示受容体（ＳＡＰＲ）、若しくは操作されたプロテアーゼ活性化受容体（ｅＰＡＲＳ）、
ｉｉ）１つ以上のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ＳＡＰＲ、若しくはｅＰＡＲをコードする１つ以上の核酸、及び／又は
ｉｉｉ）１つ若しくはＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ＳＡＰＲ、若しくはｅＰＡＲをコードする１つ以上の核酸を含む１つ以上のベクターのうちのいずれか１つ以上を含むように更に操作されており、
前記操作されたシャーシが、
ａ）操作されたエフェクターシャーシであり、
ＴＵＢＢ１を含む血小板、
ＴＵＢＢ１を含む血小板様膜結合細胞フラグメント、又は
ＴＵＢＢ１を含む無核細胞フラグメントであるか、
ｂ）操作されたプロデューサーシャーシであり、
ＴＵＢＢ１を含む巨核芽球、
ＴＵＢＢ１を含む巨核球、
ＴＵＢＢ１を含む巨核球様細胞、
がん細胞株であって、
ＴＵＢＢ１を含む血小板、
ＴＵＢＢ１を含む血小板様膜結合細胞フラグメント、及び／若しくは
ＴＵＢＢ１を含む無核細胞フラグメントを形成することができ、
任意選択で、ＭＥＧ０１若しくはＤＡＭＩがん細胞株である、がん細胞株、又は
他の不死細胞であって、
ＴＵＢＢ１を含む血小板、
ＴＵＢＢ１を含む血小板様膜結合細胞フラグメント、及び／若しくは
ＴＵＢＢ１を含む無核細胞フラグメントを形成することができる、他の不死細胞であるか、
あるいは
ｃ）操作された前駆体シャーシであり、骨髄幹細胞、ｉＰＳＣ、プロデューサーシャーシを産生することができるがん細胞株、脂肪細胞、脂肪由来間葉系間質／幹細胞株（ＡＳＣＬ）、又はプロデューサーシャーシを産生することができる他の不死細胞である、操作されたシャーシ。
【請求項2】
前記操作されたシャーシが、ａ）１つ以上のカーゴをロードされており、かつ／又は
ｂ）１つ以上のカーゴを提供するように操作されている、請求項１に記載の操作されたシャーシ。
【請求項3】
前記操作されたシャーシが、プロデューサーシャーシに分化するように駆動されており、任意選択で巨核球、巨核球様細胞に分化するように駆動されている、操作された前駆体シャーシであり、任意選択で前記操作された前駆体シャーシが、操作された骨髄系幹細胞、ｉＰＳＣ、プロデューサーシャーシを産生することができるがん細胞株、脂肪細胞、脂肪由来間葉系間質／幹細胞株（ＡＳＣＬ）、又はプロデューサーシャーシを産生することができる他の不死細胞である、請求項１又は２に記載の操作されたシャーシ。
【請求項4】
前記操作されたシャーシが、プロデューサーシャーシであり、前記プロデューサーシャーシが、巨核芽球、巨核球、巨核球様細胞、血小板、血小板様膜結合細胞フラグメント若しくは無核細胞フラグメントを形成することができるがん細胞株、任意選択でＭＥＧ０１若しくはＤＡＭＩがん細胞株、又は血小板、血小板様膜結合細胞フラグメント若しくは無核細胞フラグメントを形成することができる他の不死細胞であり、前記巨核芽球、巨核球、巨核球様細胞、血小板、血小板様膜結合細胞フラグメント若しくは無核細胞フラグメントを形成することができるがん細胞株、任意選択でＭＥＧ０１若しくはＤＡＭＩ、又は血小板、血小板様膜結合細胞フラグメント若しくは無核細胞フラグメントを形成することができる他の不死細胞が、偽足伸長をもたらすことができる、請求項１～３のいずれか一項に記載の操作されたシャーシ。
【請求項5】
前記操作されたシャーシが、操作されたエフェクターシャーシであり、前記エフェクターシャーシが、血小板、血小板様膜結合細胞フラグメント、又は無核細胞フラグメントであり、前記血小板、血小板様膜結合細胞フラグメント、又は無核細胞フラグメントが、操作されたプロデューサーシャーシのフラグメント化によって産生されており、前記プロデューサーシャーシが、巨核芽球、巨核球、巨核球様細胞、血小板、血小板様膜結合細胞フラグメント若しくは無核細胞フラグメントを形成することができるがん細胞株、任意選択でＭＥＧ０１若しくはＤＡＭＩがん細胞株、又は血小板、血小板様膜結合細胞フラグメント若しくは無核細胞フラグメントを形成することができる他の不死細胞である、請求項１～４のいずれか一項に記載の操作されたシャーシ。
【請求項6】
前記操作されたシャーシが、操作されたエフェクターシャーシであり、操作されたエフェクターシャーシが、血小板、血小板様膜結合細胞フラグメント、又は無核細胞フラグメントであり、前記血小板、血小板様膜結合細胞フラグメント、又は無核細胞フラグメントが、血小板凝集アッセイにおいて凝集しない、請求項１～５のいずれか一項に記載の操作されたシャーシ。
【請求項7】
前記操作されたシャーシが、操作された前駆体シャーシ又はプロデューサーシャーシであり、前記１つ以上の核酸が、前記操作された前駆体シャーシ又はプロデューサーシャーシのゲノム核酸内の位置から発現され、任意選択で、１）第１のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ、若しくはｅＰＡＲをコードする核酸が、第１の遺伝子座の第１の対立遺伝子に導入されており、かつ／又は第１のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ、若しくはｅＰＡＲをコードする核酸が、第１の遺伝子座の第２の対立遺伝子に導入されており、かつ／あるいは
２）第１のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ、又はｅＰＡＲをコードする核酸が、第１の遺伝子座の第１の対立遺伝子に導入されており、第２のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ、又はｅＰＡＲをコードする第２の核酸が、第２の遺伝子座の第１の対立遺伝子に導入されており、かつ／あるいは
３）第１のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ、又はｅＰＡＲをコードする核酸が、第１の遺伝子座の第１の対立遺伝子に導入されており、第２のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ、又はｅＰＡＲをコードする第２の核酸が、第１の遺伝子座の第２の対立遺伝子に導入されている、請求項１～６のいずれか一項に記載の操作されたシャーシ。
【請求項8】
前記１つ以上の核酸が、エピソーム的に発現される、請求項１～６のいずれか一項に記載の操作されたシャーシ。
【請求項9】
前記操作されたシャーシが、ベータ２ミクログロブリン遺伝子からの発現が阻害されるように操作されており、任意選択で、前記ベータ２ミクログロブリン遺伝子がノックアウト又は欠失されている、請求項１～８のいずれか一項に記載の操作されたシャーシ。
【請求項10】
前記シャーシが、１つ以上のＨＬＡ遺伝子からの破壊された発現を有するように操作されている、請求項１～９のいずれか一項に記載の操作されたシャーシ。
【請求項11】
前記シャーシが、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ及び／又はＨＬＡ－Ｃのうちのいずれか１つ以上からの発現が破壊されるように操作されており、任意選択で、ＨＬＡ－Ａ及びＨＬＡ－Ｂの発現は完全に破壊されているが、ＨＬＡ－Ｃの発現は部分的に破壊されており、任意選択で、ＨＬＡ－Ａ及びＨＬＡ－Ｂの両方の対立遺伝子からの発現は破壊されているが、ＨＬＡ－Ｃの一方の対立遺伝子のみからの発現は破壊されている、請求項１０に記載の操作されたシャーシ。
【請求項12】
前記シャーシが、ＨＬＡクラスＩｂ遺伝子のうちのいずれか１つ以上、任意選択でＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ４７及びＰＤ－Ｌ１のうちのいずれか１つ以上を過剰発現するように操作されている、請求項１～１１のいずれか一項に記載の操作されたシャーシ。
【請求項13】
前記シャーシが、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ４７及びＰＤ－Ｌ１のうちのいずれか１つ以上を過剰発現するように操作されており、任意選択で、ベータ２ミクログロブリン遺伝子からの発現を破壊するように操作されている、請求項１～１２のいずれか一項に記載の操作されたシャーシ。
【請求項14】
前記シャーシが、ＴＧＦｂ及び／又はＧＡＲＰ及び／又はＣＤ４０Ｌの発現を下方制御又は阻害するように操作されている、請求項１～１３のいずれか一項に記載の操作されたシャーシ。
【請求項15】
前記カーゴが、ａ）タンパク質又はペプチドであって、任意選択で、
ｉ）抗体若しくはその抗原結合フラグメントであって、任意選択で、腫瘍抗原若しくは新抗原に結合する、抗体若しくはその抗原結合フラグメント、
ｉｉ）ヌクレアーゼなどの酵素、例えばＴＡＬＥＮ、
ｉｉｉ）サイトカイン、例えばＩＬ－１０、又は
ｉｖ）ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質、例えばＣａｓ９、
ｖ）二重特異性タンパク質、例えば二重特異性抗体若しくは任意選択でＴ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）である、タンパク又はペプチド、
ｂ）核酸であって、いくつかの実施形態では、
ｉ）例えばｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、及びクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）配列から選択される、ＲＮＡ、又は
ｉｉ）ＤＮＡベクターである、核酸、
ｃ）毒素、
ｄ）小分子薬物、造影剤、放射性ヌクレオチド薬物、放射性ヌクレオチドタグ付抗体、又はそれらの任意のコンジュゲート、
ｅ）ＡＡＶなどのウイルスベクター、
ｆ）腫瘍溶解性ウイルスなどのウイルス、
ｇ）ＣＲＩＳＰＲ媒介遺伝子編集を実行するための薬剤、
ｈ）エキソソーム、例えば第２のカーゴをプレロードされたエキソソーム、及び／あるいは
ｉ）１つ又は複数のナノ粒子、
あるいはそれらの任意の組み合わせのうちのいずれか１つ以上から選択される、請求項２～１４のいずれか一項に記載の操作されたシャーシ。
【請求項16】
前記カーゴが、内因的に発現されたカーゴであり、任意選択で、前記内因的に発現されたカーゴが、
ａ）タンパク質又はペプチドであって、いくつかの実施形態では、
ｉ）抗体若しくはその抗原結合フラグメント、例えば腫瘍抗原若しくは新抗原に結合する抗体若しくはその抗原結合フラグメント、
ｉｉ）ヌクレアーゼなどの酵素、例えばＴＡＬＥＮ、
ｉｉｉ）サイトカイン、例えばＩＬ－１０、又は
ｉｖ）ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質、例えばＣａｓ９、
ｖ）二重特異性タンパク質、例えば二重特異性抗体若しくは任意選択でＴ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）である、タンパク又はペプチド、
ｂ）核酸であって、いくつかの実施形態では、
ｉ）例えばｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、及びクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）配列から選択される、ＲＮＡである、核酸のうちのいずれか１つ以上である、請求項２～１５のいずれか一項に記載の操作されたシャーシ。
【請求項17】
前記カーゴが、前記シャーシに外因的にロードされ、任意選択で、外因的にロードされたカーゴが、ａ）タンパク質又はペプチドであって、いくつかの実施形態では、
ｉ）抗体若しくはその抗原結合フラグメント、例えば腫瘍抗原若しくは新抗原に結合する抗体若しくはその抗原結合フラグメント、
ｉｉ）ヌクレアーゼなどの酵素、例えばＴＡＬＥＮ、
ｉｉｉ）サイトカイン、例えばＩＬ－１０、又は
ｉｖ）ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質、例えばＣａｓ９、
ｖ）二重特異性タンパク質、例えば二重特異性抗体若しくは任意選択でＴ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）である、タンパク又はペプチド、
ｂ）核酸であって、いくつかの実施形態では、
ｉ）例えばｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、及びクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）配列から選択される、ＲＮＡである、核酸、
ｃ）毒素、
ｄ）小分子薬物、造影剤、放射性ヌクレオチド薬物、放射性ヌクレオチドタグ付抗体、又はそれらの任意のコンジュゲート、
ｅ）ＡＡＶなどのウイルスベクター、
ｆ）腫瘍溶解性ウイルスなどのウイルス、
ｇ）ＣＲＩＳＰＲ媒介遺伝子編集を実行するための薬剤、
ｈ）エキソソーム、例えば第２のカーゴをプレロードされたエキソソーム、及び／あるいは
ｉ）１つ又は複数のナノ粒子、
あるいはそれらの任意の組み合わせのうちのいずれか１つ以上である、請求項２～１６のいずれか一項に記載の操作されたシャーシ。
【請求項18】
前記シャーシがカーゴを含む場合、前記カーゴが、エキソソーム標的化ドメインを含み、任意選択で、前記カーゴが、融合タンパク質であるタンパク質又はペプチドであり、
ａ）カーゴタンパク質又はペプチドと、
ｂ）エキソソーム標的化ドメインと、を含み、任意選択で、前記エキソソーム標的化ドメインが、
ｉ）エキソソーム特異的膜タンパク質又はそのエキソソーム膜標的化部分、例えば、
テトラスパニン、例えばＣＤ６３、又は
非テトラスパニン、例えばＰＴＧＦＲＮ若しくはＢＡＳＰ１
ｉｉ）可溶性タンパク質由来のエキソソーム標的化配列、任意選択でＮｅｄｄ４ユビキチンリガーゼのＷＷドメイン、
ｉｉｉ）ユビキチンタグ、及び／又は
ｉｖ）タグ結合ドメイン、任意選択でタグに対して指向されたナノボディ、任意選択でＧＦＰに対して指向されたナノボディ、及び／又は
ｖ）表Ａに列挙されたタンパク質から選択されるタンパク質を含むか又はそれらからなる群から選択されるか、
あるいは前記カーゴがＲＮＡであり、前記エキソソーム標的化ドメインが、
ａ）エキソソーム標的化ヘアピン、
ｂ）ウイルスエキソソーム標的化ＲＮＡ又はそのエキソソーム標的化フラグメント、
ｃ）アプタマー、任意選択で、
ｉ）ＭＳ２結合ステムループ、
ｉｉ）Ｃ／Ｄボックス、及び／若しくは
ｉｉｉ）ＡＵリッチエレメントであり、任意選択で、前記ＲＮＡが、Ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡである、請求項２～１７のいずれか一項に記載の操作されたシャーシ。
【請求項19】
前記シャーシが、ａ）ＭＨＣクラス１遺伝子又はタンパク質の機能が破壊されている、
ｂ）前記β２ミクログロブリン遺伝子からの発現が破壊されており、任意選択で、前記β２ミクログロブリン遺伝子がノックアウトされている、
ｃ）１つ以上のＨＬＡ遺伝子からの発現が破壊されている、
ｄ）ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ及び／又はＨＬＡ－Ｃのうちのいずれか１つ以上からの発現が破壊されており、任意選択で、ＨＬＡ－Ａ及びＨＬＡ－Ｂの発現は完全に破壊されているが、ＨＬＡ－Ｃの発現は部分的に破壊されており、任意選択で、ＨＬＡ－Ａ及びＨＬＡ－Ｂの両方の対立遺伝子からの発現は破壊されているが、ＨＬＡ－Ｃの一方の対立遺伝子のみからの発現は破壊されている、
ｅ）ＨＬＡクラスＩｂ遺伝子のうちのいずれか１つ以上、任意選択でＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ４７及びＰＤ－Ｌ１のうちのいずれか１つ以上を過剰発現する、
ｆ）ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ４７及びＰＤ－Ｌ１のうちのいずれか１つ以上を過剰発現する（任意選択で、ベータ２ミクログロブリン遺伝子からの発現が破壊されるように操作されている）、並びに／又は
ｇ）１つ以上の免疫調節遺伝子を過剰発現しする（任意選択で、前記１つ以上の免疫調節遺伝子が、ＣＤ４７及びＰＤ－Ｌ１を含む群から選択される）、
ｈ）産物がカーゴの効力に悪影響を及ぼし得る１つ以上の遺伝子又は遺伝子産物を排除する、
ｉ）自然応答／適応応答を上方又は下方に調整する、
ｊ）炎症、血管新生、アテローム性動脈硬化症、リンパ発達及び腫瘍増殖を低減する、
ｋ）前記操作されたカーゴの生物学的作用に間接的に対抗する可能性が高い接着タンパク質及び／又はカーゴ実体をコードする１つ以上の遺伝子の発現が破壊されており、より大きな正味の治療効果をもたらす可能性がある、
ｌ）ＴＧＦｂ及び／又はＧＡＲＰ及び／又はＣＤ４０Ｌの発現を下方制御又は阻害する、
ｎ）ＣＤ３６、ＮＯＤ２、ＳＲＢ１、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ６、ＴＬＲ９、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ９３（Ｃ１ｑＲｐ）、Ｃ３ａＲ、ＣＤ８８（Ｃ５ａＲ）、ＣＤ８９（ＦｃａＲ１）、ＣＤ２３（ＦｃｅＲ１）、ＣＤ３２（ＦｃｇＲＩＩａ）、ＭＨＣクラス１、ＣＤ１９１（ＣＣＲ１）、ＣＤ１９３（ＣＣＲ３）、ＣＤ１９４（ＣＣＲ４）、ＣＤ１８４（ＣＸＣＲ４）、ＣＸ３ＣＲ１、ＣＤ１０２（ＩＣＡＭ－２）、ＪＡＭ－Ｃ／ＪＡＭ－３、ＣＤ６２Ｐ（Ｐ－セレクチン）、ＣＤ３１（ＰＥＣＡＭ－１）、ＣＤ１５０（ＳＬＡＭＦ１）、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ５、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ４／ＰＦ４、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ８、ＮＡＰ２（ＣＸＣＬ７）、ＩＬ－１ｂのうちのいずれか１つ以上の発現を下方制御若しくは阻害する、
ｏ）ＴＧＦｂ及び／又はＧＡＲＰの発現を破壊又は阻害する、
ｑ）Ｓｉｇｌｅｃ－７、Ｓｉｇｌｅｃ－９、Ｓｉｇｌｅｃ－１１又はＴＧＦｂのうちのいずれか１つ以上の発現を破壊又は阻害する、
ｓ）ＧＰＩｂ／Ｖ／ＩＸ及びＧＰＶＩ（ＧＰ６）、ＩＴＧＡ２Ｂ、ＣＬＥＣ２、インテグリンαＩＩｂｂ３、ａ２ｂ１、ａ５ｂ１及びａ６ｂ１、ＧＰＶＩ及びＩＴＧＡ２Ｂのうちのいずれか１つ以上の発現を破壊又は阻害する、
ｔ）Ｐａｒ１、Ｐａｒ４、Ｐ２Ｙ１２、ＧＰＩｂ／Ｖ／ＩＸ、トロンボキサン受容体（ＴＢＸＡ２Ｒ）、Ｐ２Ｙ１、Ｐ２Ｘ１及びインテグリンαＩＩｂｂ３のうちのいずれか１つ以上、又はＰａｒ１、Ｐａｒ４及びＰ２Ｙ１２からなる群からのいずれか１つ以上の発現を破壊又は阻害する、
ｕ）Ｃｏｘ１、Ｃｏｘ２、ＨＰＳ、プロトロンビン、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、フォン・ヴィレブランド因子及びトロンボキサン－Ａシンターゼ（ＴＢＸＡＳ１）のうちのいずれか１つ以上の発現を破壊又は阻害する、
ｖ）血小板又は血小板様膜結合細胞フラグメントの活性化に応答して目的のタンパク質又はＲＮＡを合成し、任意選択で、目的のタンパク質又はＲＮＡが、ＢＣＬ－３ ｍＲＮＡ非翻訳領域、任意選択で５′ＵＴＲから発現される、
ｚ）１つ以上のカーゴタンパク質又はカーゴＲＮＡを発現し、任意選択で、前記カーゴタンパク質又はカーゴＲＮＡが、アルファ顆粒標的化シグナルを含み、任意選択で、血小板因子４（ＰＦ４）又はフォン・ヴィレブランド因子（ｖＷｆ）を含む、
ａａ）少なくとも２つのＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲを発現し、任意選択で、少なくとも３、４、５、６、７、８、９又は少なくとも１０の異なるＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲを発現する、
ｂｂ）少なくとも２つのＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲを発現し、前記少なくとも２つのＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲの前記標的結合ドメインが、異なる標的に対して指向されている、
ｃｃ）少なくとも２つのＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲを発現し、前記少なくとも２つのＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲの前記標的結合ドメインが、異なる標的に対して指向されており、
ｉ）第１のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲの血小板調節ドメインが、血小板活性化ドメイン、任意選択で脱顆粒誘発ドメイン、任意選択でＩＴＡＭ含有ドメインであり、第２のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲの血小板調節ドメインが、血小板阻害ドメインであり、任意選択で血小板脱顆粒の誘発を防止するドメインであり、任意選択でＩＴＡＭ含有ドメインである、
ｉｉ）第１のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲの血小板調節ドメインが、血小板活性化ドメイン、任意選択で脱顆粒誘発ドメイン、任意選択でＩＴＡＭ含有ドメインであり、第２のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲの血小板調節ドメインが、血小板活性化ドメイン、任意選択で脱顆粒誘発ドメイン、任意選択でＩＴＡＭ含有ドメインである、
ｄｄ）ともに作動して論理回路を形成する、少なくとも２つのＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付け標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲを発現する、
ｅｅ）１つ以上のカーゴを発現し、任意選択で、前記カーゴが、
ａ）タンパク質又はペプチドであって、任意選択で、
ｉ）抗体若しくはその抗原結合フラグメント、例えば腫瘍抗原若しくは新抗原に結合する抗体若しくはその抗原結合フラグメント、
ｉｉ）ヌクレアーゼなどの酵素、例えばＴＡＬＥＮ、
ｉｉｉ）サイトカイン、例えばＩＬ－１０、又は
ｉｖ）ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質、例えばＣａｓ９、
ｖ）二重特異性タンパク質、例えば二重特異性抗体若しくは任意選択でＴ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）、
ｖｉ）エキソソーム標的化ドメインを含む融合タンパク質であり、前記融合タンパク質が、
ａ）カーゴタンパク質又はペプチドと、
ｂ）エキソソーム標的化ドメインと、を含み、任意選択で、前記エキソソーム標的化ドメインが、
ｉ）エキソソーム特異的膜タンパク質又はそのエキソソーム膜標的化部分、例えば、
テトラスパニン、例えばＣＤ６３、又は
非テトラスパニン、例えばＰＴＧＦＲＮ若しくはＢＡＳＰ１
ｉｉ）可溶性タンパク質由来のエキソソーム標的化配列、任意選択でＮｅｄｄ４ユビキチンリガーゼのＷＷドメイン、
ｉｉｉ）ユビキチンタグ、及び／又は
ｉｖ）タグ結合ドメイン、任意選択でタグに対して指向されたナノボディ、任意選択でＧＦＰに対して指向されたナノボディを含むか若しくはそれらからなる群から選択される、タンパク質又はペプチド。
ｂ）核酸であって、任意選択で、
ｉ）例えばｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、及びクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）配列から選択される、ＲＮＡ、及び／又は
ｉｉ）エキソソーム標的化ドメインを含むＲＮＡであって、任意選択で、前記エキソソーム標的化ドメインが、
ａ）エキソソーム標的化ヘアピン若しくは直鎖状モチーフ、
ｂ）ウイルスエキソソーム標的化ＲＮＡ若しくはそのエキソソーム標的化フラグメントを含むか若しくはそれらからなる群から選択される、ＲＮＡ、
ｉｉｉ）アプタマードメインを含むＲＮＡであって、任意選択で、前記アプタマードメインが、
ａ）ＭＳ２結合ステムループ、
ｂ）Ｃ／Ｄボックス、及び／若しくは
ｃ）ＡＵリッチエレメントから選択され、任意選択で、前記ＲＮＡが、Ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡである、ＲＮＡである、核酸を含む群から選択される、
ｆｆ）融合タンパク質を発現し、前記融合タンパク質が、
ｉ）エキソソーム膜タンパク質に融合された前記バクテリオファージコートタンパク質ＭＳ２（任意選択で、前記エキソソーム膜タンパク質は、Ｌａｍｐ２ｂ、ＶＳＶＧ、ＣＤ６３を含むか若しくはそれらからなる群から選択される）、及び／又は
ｉｉ）エキソソーム膜タンパク質に融合された前記古細菌リボソームタンパク質Ｌ７Ａｅ（任意選択で、前記エキソソーム膜タンパク質は、Ｌａｍｐ２ｂ、ＶＳＶＧ、ＣＤ６３を含むか若しくはそれらからなる群から選択される）、及び／又は
ｉｉｉ）ＣＤ９－ＨｕＲ融合タンパク質を含み、
任意選択で、前記融合タンパク質が、光活性化された二量体化タンパク質を更に含む、
ｇｇ）ｍＲＮＡから１つ以上のカーゴを、１つ以上の
ＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲを標的に結合するときにのみ翻訳し、任意選択で、前記カーゴが、
ａ）タンパク質又はペプチド、任意選択で、
ｉ）抗体若しくはその抗原結合フラグメント、例えば腫瘍抗原若しくは新抗原に結合する抗体若しくはその抗原結合フラグメント、
ｉｉ）ヌクレアーゼなどの酵素、例えばＴＡＬＥＮ、
ｉｉｉ）サイトカイン、例えばＩＬ－１０、又は
ｉｖ）ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質、例えばＣａｓ９、
ｖ）二重特異性タンパク質、例えば二重特異性抗体若しくは任意選択でＴ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）である、タンパク又はペプチド、
ｂ）核酸であって、いくつかの実施形態では、
ｉ）例えばｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、及びクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）配列から選択される、ＲＮＡである、核酸を含む群から選択され、
任意選択で、前記カーゴが、Ｂｃｌ－３ ｍＲＮＡ非翻訳領域、任意選択で５′ＵＴＲから発現されるように操作されている、請求項１～１８のいずれか一項に記載の操作されたシャーシ。
【請求項20】
前記ＣＰＲが、ａ）血小板調節ドメインである細胞内ドメインと、
ｂ）標的を認識して結合する異種標的結合ドメインと、を含み、
任意選択で、前記ＣＰＲが血小板膜に存在する場合、前記標的が前記標的結合ドメインに結合した後、前記血小板調節ドメインが活性化される、請求項１～１９のいずれか一項に記載の操作されたシャーシ。
【請求項21】
ＣＰＲ血小板調節ドメインが、血小板活性化ドメイン、任意選択でＩＴＡＭを含むドメイン、任意選択で血小板ＩＴＡＭを含むドメインであり、任意選択でＩＴＡＭを含むドメイン、又は任意選択で血小板ＩＴＡＭを含むドメインに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％又は１００％の配列同一性を有するドメインである、請求項１～２０のいずれか一項に記載の操作されたシャーシ。
【請求項22】
前記ＣＰＲが血小板の前記膜に存在する場合、活性化されると、前記血小板活性化ドメインが、ａ）前記血小板の脱顆粒をもたらす、
ｂ）前記血小板からの内容物の放出をもたらす、
ｃ）前記血小板の原形質膜上に血小板内内容物の存在をもたらす、
ｄ）前記原形質膜からのブレブ形成を介した細胞外小胞、及び／又は小分子薬物、造影剤、放射性ヌクレオチド薬物、放射性ヌクレオチドタグ付抗体、若しくはそれらの任意のコンジュゲートの放出をもたらす、
ｅ）両凹ディスクから完全に広がった細胞フラグメントへの血小板の形状の変化をもたらす、並びに／あるいは
ｆ）前記血小板へのカルシウムの流入をもたらす、請求項１～２１のいずれか一項に記載の操作されたシャーシ。
【請求項23】
前記ユニバーサルＣＰＲが、ａ）血小板調節ドメインである細胞内ドメインと、
ｂ）異種タグ結合ドメインと、を含み、任意選択で、前記異種タグ結合ドメインが、タグ付き標的化ペプチド上に存在するタグに結合し、前記タグ付き標的化ペプチドが、前記タグ及び標的結合ドメインを含み、
前記ユニバーサルＣＰＲが血小板原形質膜に位置する場合、前記標的への前記標的結合ドメインの同時結合の非存在下での前記ユニバーサルＣＰＲへの前記標的化ペプチドの結合は、前記血小板調節ドメインを活性化するのに十分ではない、請求項１～２２のいずれか一項に記載の操作されたシャーシ。
【請求項24】
前記ＳＡＰＲが、異種標的結合ドメインを含み、前記標的結合ドメインが、ａ）細胞外ドメインであって、
ｉ）ＭＨＣ－１タンパク質若しくはそのフラグメント、又はヒトＭＨＣ－１タンパク質若しくはそのフラグメントに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％若しくは１００％の配列同一性を有するタンパク質若しくはそのフラグメント、あるいは
ｉｉ）ＭＨＣ－２タンパク質若しくはそのフラグメント、又はヒトＭＨＣ－２タンパク質若しくはそのフラグメントに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％若しくは１００％の配列同一性を有するタンパク質若しくはそのフラグメントを含む、細胞外ドメインと、
ｂ）細胞内血小板調節ドメインであって、
前記
ＭＨＣ－１タンパク質若しくはそのフラグメント、又はヒトＭＨＣ－１タンパク質若しくはそのフラグメントに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％若しくは１００％の配列同一性を有するタンパク質若しくはそのフラグメント、あるいは
ＭＨＣ－２タンパク質若しくはそのフラグメント、又はヒトＭＨＣ－２タンパク質若しくはそのフラグメントに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％若しくは１００％の配列同一性を有するタンパク質若しくはそのフラグメントが、
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）に結合することができる、細胞内血小板調節ドメインと、を含む、請求項１～２３のいずれか一項に記載の操作されたシャーシ。
【請求項25】
前記ｅＰＡＲのプロテアーゼ認識部位が、前記天然の認識部位を切断する前記プロテアーゼではないプロテアーゼによって切断されるように操作されており、任意選択で、血小板の前記原形質膜に存在する場合、前記プロテアーゼ認識部位の切断が、ａ）前記血小板の脱顆粒、
ｂ）前記血小板からの内容物の前記放出、
ｃ）前記血小板の前記原形質膜上の細胞内内容物の前記存在、
ｄ）前記原形質膜からのブレブ形成を介した細胞外小胞の前記放出、及び／又は
ｅ）両凹ディスクから完全に広がった細胞フラグメントへの前記血小板の形状の変化をもたらす、請求項１～２４のいずれか一項に記載の操作されたシャーシ。
【請求項26】
前記操作されたシャーシが、操作されたエフェクターシャーシであり、任意選択で、前記標的化送達システムが、治療的標的化送達システム又は非治療的送達システムであり、任意選択で、前記系が、１つ以上のカーゴを更に含み、任意選択で、前記カーゴが、１つ以上の標的化ドメインを含み、任意選択で、エキソソーム標的化ドメインを含む、請求項１～２５のいずれか一項に記載の操作されたシャーシを含む、標的化送達システム。
【請求項27】
医薬における使用するための、請求項１～２６のいずれか一項に記載の操作されたシャーシ。
【請求項28】
治療的若しくは造影カーゴを送達するか、又はがん、自己免疫疾患、遺伝性疾患、心血管疾患及び／若しくは感染症を治療若しくは予防する際に使用するための操作されたシャーシであって、前記操作されたシャーシが、操作されたエフェクターシャーシである、請求項１～２７のいずれか一項に記載の操作されたシャーシ。
【請求項29】
カーゴを送達する方法であって、有効量の、請求項１～２８のいずれか一項に記載の操作されたシャーシ又は標的化送達システムを投与することを含み、前記操作されたシャーシが、操作されたエフェクターシャーシである、方法。
【請求項30】
体内の標的細胞、組織又は部位への標的化カーゴ送達の方法であって、前記方法が、有効量の、請求項１～２９のいずれか一項に記載の操作されたシャーシのうちのいずれか１つ以上を投与することを含み、前記ＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲの前記標的化ドメインが、体内の前記標的細胞、組織又は部位に結合し、前記操作されたシャーシが、操作されたエフェクターシャーシである、方法。
【請求項31】
カーゴの送達を必要とする対象にカーゴを送達する非治療的方法であって、前記方法が、有効量の、請求項１～３０のいずれか一項に記載の操作されたシャーシのうちのいずれか１つ以上を投与することを含み、前記ＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲの前記標的化ドメインが、前記体内の前記標的細胞、組織又は部位に結合し、前記操作されたシャーシが、操作されたエフェクターシャーシである、非治療的方法。
【請求項32】
有効量の、請求項１～３１のいずれか一項に記載の操作されたシャーシを投与することを含む、治療の方法であって、任意選択で、前記方法が、がん、自己免疫疾患、遺伝子疾患、心血管疾患及び／又は感染症のうちのいずれか１つ以上の治療又は予防のためのものであり、前記操作されたシャーシが、操作されたエフェクターシャーシである、方法。
【請求項33】
疾患又は感染症の前記治療又は予防のための、任意選択で、がん、遺伝子疾患、心血管疾患、自己免疫疾患、及び／又は感染症のうちのいずれか１つ以上の前記治療又は予防のための医薬品の製造における、請求項１～３２のいずれか一項に記載の操作されたシャーシの、使用。
【請求項34】
前記操作されたシャーシを、それを必要とする患者に投与することによって、カーゴ、任意選択で治療剤を送達するための、請求項１～３３のいずれか一項に記載のシャーシ又は操作されたシャーシを使用する、方法。
【請求項35】
キットであって、ａ）請求項１～３４のいずれか一項以上に記載の操作されたプロデューサーシャーシ、
ｂ）請求項１～３４のいずれか一項以上に記載の操作されたエフェクターシャーシ、
ｃ）請求項１～３４のいずれか一項以上に記載の操作された前駆体シャーシ、
ｄ）治療剤及び／若しくは造影剤及び／若しくはエキソソーム、任意選択で、第２のカーゴをプレロードされたエキソソーム、
並びに／又は
ｅ）請求項１～３４のいずれか一項以上において定義される１つ以上のカーゴをコードする核酸、並びに／又は
ｆ）請求項１～３４のいずれか一項以上において定義される１つ以上のカーゴを含む、キット。
【請求項36】
治療的カーゴを含むエキソソームの、それを必要とする対象への標的化送達における使用のための、医薬における使用のための、任意選択でがん、自己免疫疾患、遺伝性疾患、心血管疾患及び／又は感染症の治療又は予防における使用のためのものであり、前記操作されたシャーシが、前記カーゴ及び／又はシャーシ若しくは操作されたシャーシの操作によって前記エキソソームに標的化されている前記カーゴを含む操作されたエフェクターシャーシである、請求項１～３５のいずれか一項に記載の操作されたシャーシ。
【請求項37】
前記カーゴが、ａ）タンパク質又はペプチドであって、いくつかの実施形態では、
ｉ）抗体若しくはその抗原結合フラグメント、例えば腫瘍抗原若しくは新抗原に結合する抗体若しくはその抗原結合フラグメント、
ｉｉ）ヌクレアーゼなどの酵素、例えばＴＡＬＥＮ、
ｉｉｉ）サイトカイン、例えばＩＬ－１０、又は
ｉｖ）ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質、例えばＣａｓ９、
ｖ）二重特異性タンパク質、例えば二重特異性抗体若しくは任意選択でＴ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）である、タンパク又はペプチド、
ｂ）核酸であって、いくつかの実施形態では、
ｉ）例えばｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、及びクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）配列から選択される、ＲＮＡ、又は
ｉｉ）ＤＮＡベクターである、核酸、
ｃ）毒素、
ｄ）小分子薬物、造影剤、放射性ヌクレオチド薬物、放射性ヌクレオチドタグ付抗体、又はそれらの任意のコンジュゲート、
ｅ）ＡＡＶなどのウイルスベクター、
ｆ）腫瘍溶解性ウイルスなどのウイルス、
ｇ）ＣＲＩＳＰＲ媒介遺伝子編集を実行するための薬剤、
ｈ）エキソソーム、任意選択で、第２のカーゴをプレロードされたエキソソーム、及び／あるいは
ｉ）１つ又は複数のナノ粒子、
あるいはそれらの任意の組み合わせのうちのいずれか１つ以上から選択される、請求項３６に記載の使用のための操作されたシャーシ。
【請求項38】
前記シャーシ又は操作されたシャーシが、エキソソーム標的化ドメインを含むカーゴを内因的に発現するように操作されており、Ａ）前記カーゴがタンパク質又はペプチドである場合、前記タンパク質又はペプチドが、
ｉ）前記カーゴタンパク質又はペプチドと、
ｉｉ）エキソソーム標的化ドメインと、を含む、融合タンパク質であり、任意選択で、前記エキソソーム標的化ドメインが、
ａ）エキソソーム特異的膜タンパク質又はそのエキソソーム膜標的化部分、任意選択で、
テトラスパニン、例えばＣＤ６３、又は
非テトラスパニン、例えばＰＴＧＦＲＮ若しくはＢＡＳＰ１
ｂ）可溶性タンパク質由来のエキソソーム標的化配列、任意選択でＮｅｄｄ４ユビキチンリガーゼのＷＷドメイン、
ｃ）ユビキチンタグ、及び／又は
ｄ）タグ結合ドメイン、任意選択でタグに対して指向されたナノボディ、任意選択でＧＦＰに対して指向されたナノボディ、及び／又は
ｅ）表Ａに列挙されたタンパク質から選択されるタンパク質を含むか、又はそれらからなる群から選択され、
Ｂ）前記カーゴがＲＮＡであり、前記エキソソーム標的化ドメインが、
ａ）エキソソーム標的化ヘアピン若しくは直鎖状モチーフ、
ｂ）ウイルスエキソソーム標的化ＲＮＡ若しくはそのエキソソーム標的化フラグメント、
ｃ）アプタマー、任意選択で、
ｉ）ＭＳ２結合ステムループ、
ｉｉ）Ｃ／Ｄボックス、及び／若しくは
ｉｉｉ）ＡＵリッチエレメントであり、任意選択で、前記ＲＮＡが、Ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡであり、
任意選択で、
前記カーゴが、ＭＳ２結合ステムループを含むＲＮＡであり、前記シャーシ又は操作されたシャーシがまた、エキソソーム膜タンパク質に融合されたバクテリオファージコートタンパク質ＭＳ２を含む融合タンパク質を発現するように操作され、任意選択で、前記エキソソーム膜タンパク質が、Ｌａｍｐ２ｂ、ＶＳＶＧ、ＣＤ６３又は表Ａのタンパク質のうちのいずれかを含むか又はそれらからなる群から選択され、任意選択で、前記融合タンパク質が、光活性化二量体化タンパク質を更に含み、
前記カーゴが、Ｃ／Ｄボックスを含むＲＮＡであり、前記シャーシ又は操作されたシャーシがまた、エキソソーム膜タンパク質に融合された古細菌Ｌ７リボソームＬ７Ａｅタンパク質を含む融合タンパク質を発現するように操作され、任意選択で、前記エキソソーム膜タンパク質が、Ｌａｍｐ２ｂ、ＶＳＶＧ、ＣＤ６３又は表Ａのタンパク質のうちのいずれかを含むか又はそれらからなる群から選択され、任意選択で、前記融合タンパク質が、光活性化二量体化タンパク質を更に含み、
前記カーゴが、ＡＵリッチエレメントを含むＲＮＡであり、前記シャーシ又は操作されたシャーシが、ＣＤ９－ＨｕＲ融合タンパク質である融合タンパク質を発現するように操作されており、任意選択で、前記融合タンパク質が、光活性化二量体化タンパク質を更に含み、
前記カーゴが、アプタマーを含むＲＮＡであり、前記シャーシ又は操作されたシャーシが、エキソソーム膜タンパク質に融合されたアプタマー結合タンパク質（前記ＲＮＡ中に存在する前記アプタマーに結合する）を含む融合タンパク質を発現するように操作されており、任意選択で、前記エキソソーム膜タンパク質が、Ｌａｍｐ２ｂ、ＶＳＶＧ、ＣＤ６３又は表Ａのタンパク質のうちのいずれかを含むか又はそれらからなる群から選択され、任意選択で、前記融合タンパク質が、光活性化二量体化タンパク質を更に含む、請求項３６又は３７に記載の使用のための操作されたシャーシ。
【請求項39】
シャーシ又は操作されたシャーシに、エキソソーム標的化ドメインを含むカーゴを外因的にロードされており、任意選択で、Ａ）前記カーゴがタンパク質又はペプチドである場合、前記タンパク質又はペプチドが、
ｉ）前記カーゴタンパク質又はペプチドと、
ｉｉ）エキソソーム標的化ドメインと、を含む、融合タンパク質であり、任意選択で、前記エキソソーム標的化ドメインが、
ａ）エキソソーム特異的膜タンパク質又はそのエキソソーム膜標的化部分、任意選択で、
テトラスパニン、例えばＣＤ６３、又は
非テトラスパニン、例えばＰＴＧＦＲＮ若しくはＢＡＳＰ１
ｂ）可溶性タンパク質由来のエキソソーム標的化配列、任意選択でＮｅｄｄ４ユビキチンリガーゼのＷＷドメイン、
ｃ）ユビキチンタグ、及び／又は
ｄ）タグ結合ドメイン、任意選択でタグに対して指向されたナノボディ、任意選択でＧＦＰに対して指向されたナノボディ、及び／又は
ｅ）表Ａに列挙されたタンパク質から選択されるタンパク質を含むか若しくはそれらからなる群から選択され、
Ｂ）前記カーゴがＲＮＡであり、前記エキソソーム標的化ドメインが、
ａ）エキソソーム標的化ヘアピン若しくは直鎖状モチーフ、
ｂ）ウイルスエキソソーム標的化ＲＮＡ若しくはそのエキソソーム標的化フラグメント、
ｃ）アプタマー、任意選択で、
ｉ）ＭＳ２結合ステムループ、
ｉｉ）Ｃ／Ｄボックス、及び／若しくは
ｉｉｉ）ＡＵリッチエレメントであり、任意選択で、前記ＲＮＡが、Ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡであり、
任意選択で、
前記カーゴが、ＭＳ２結合ステムループを含むＲＮＡであり、前記シャーシ又は操作されたシャーシがまた、エキソソーム膜タンパク質に融合されたバクテリオファージコートタンパク質ＭＳ２を含む融合タンパク質を発現するように操作され、任意選択で、前記エキソソーム膜タンパク質が、Ｌａｍｐ２ｂ、ＶＳＶＧ、ＣＤ６３又は表Ａのタンパク質のうちのいずれかを含むか又はそれらからなる群から選択され、任意選択で、前記融合タンパク質が、光活性化二量体化タンパク質を更に含み、
前記カーゴが、Ｃ／Ｄボックスを含むＲＮＡであり、前記シャーシ又は操作されたシャーシがまた、エキソソーム膜タンパク質に融合された古細菌Ｌ７リボソームＬ７Ａｅタンパク質を含む融合タンパク質を発現するように操作され、任意選択で、前記エキソソーム膜タンパク質が、Ｌａｍｐ２ｂ、ＶＳＶＧ、ＣＤ６３又は表Ａのタンパク質のうちのいずれかを含むか又はそれらからなる群から選択され、任意選択で、前記融合タンパク質が、光活性化二量体化タンパク質を更に含み、
前記カーゴが、ＡＵリッチエレメントを含むＲＮＡであり、前記シャーシ又は操作されたシャーシが、ＣＤ９－ＨｕＲ融合タンパク質である融合タンパク質を発現するように操作されており、任意選択で、前記融合タンパク質が、光活性化二量体化タンパク質を更に含み、
前記カーゴが、アプタマーを含むＲＮＡであり、前記シャーシ又は操作されたシャーシが、エキソソーム膜タンパク質に融合されたアプタマー結合タンパク質（前記ＲＮＡ中に存在する前記アプタマーに結合する）を含む融合タンパク質を発現するように操作されており、任意選択で、前記エキソソーム膜タンパク質が、Ｌａｍｐ２ｂ、ＶＳＶＧ、ＣＤ６３又は表Ａのタンパク質のうちのいずれかを含むか又はそれらからなる群から選択され、任意選択で、前記融合タンパク質が、光活性化二量体化タンパク質を更に含む、請求項３６又は３７に記載の使用のための操作されたシャーシ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、標的化送達システムに関する。
【背景技術】
【0002】
血小板は、小さくかつ除核されており、分裂又は複製できない。人体では、血小板は損傷した組織を認識し、その内容物を放出して出血を軽減又は防止する重要な機能を果たす。腎臓及び肝臓からのトロンボポエチンは、骨髄幹細胞に接触し、巨核芽球（megakaryoblasorphant）への分化を引き起こし、追加のシグナルが巨核芽球の前駆巨核球への分化をもたらす。前駆巨核球は、血小板前駆体の伸長を伴う大きな細胞であり、分裂して増殖するときにフラグメントを発芽させ、血小板を生成する。
【0003】
ミトコンドリア、微小管、小胞は、血小板内に含まれており、血小板は、約１０日の寿命を有し、マクロファージによってクリアランスされる。血小板は、約７μｍ３の体積、３００ｎｍの直径を有する。血小板は、代謝的に活性であり、予めロードされたｍＲＮＡ発現（例えば、ｍｉＲＮＡによる）の転写後制御により遺伝子発現を変化させることができる。血小板は、顆粒と呼ばれる細胞内小胞を含む。活性化すると、顆粒化が刺激されて形状が変化し、顆粒の内容物が放出される。
【0004】
血小板は、小胞の３つの主要なサブタイプ：α顆粒（血小板当たり５０～８０）、密顆粒（血小板当たり３～８）、及び大型有芯小胞（large dense core vesicles、ＬＤＣＶ）（血小板当たり約１０，０００）を含有する。異なる変異は、各小胞サブタイプの生合成を選択的に破壊することができる。顆粒の内容物（主にアルファ顆粒に貯蔵される血小板細胞外小胞（platelet extracellular vesicle、ＰＥＶ）のサブセットである、エキソソームを含む）は、エキソサイトーシスによって放出される。血小板の脱顆粒に関しては、多種多様な生成物が放出される。
【0005】
ＰＥＶは、活性化シグナルに応答して血小板によって産生され、血小板から放出される膜結合実体である。これらのＰＥＶは、循環系における細胞外小胞の大部分を表す。血小板は、主に２つの小胞ファミリー、すなわちａ）微小胞、及びｂ）エキソソームを放出する（Ｈｅｉｊｎｅｎ，Ｈ．Ｆ．Ｇ．，Ｓｃｈｉｅｌ，Ａ．Ｅ．，Ｆｉｊｎｈｅｅｒ，Ｒ．，Ｇｅｕｚｅ，Ｈ．Ｊ．，＆Ｓｉｘｍａ，Ｊ．Ｊ．（１９９９）。Ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｌａｔｅｌｅｔｓ ｒｅｌｅａｓｅ ｔｗｏ ｔｙｐｅｓ ｏｆ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｖｅｓｉｃｌｅｓ：Ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｌｅｓ ｂｙ ｓｕｒｆａｃｅ ｓｈｅｄｄｉｎｇ ａｎｄ ｅｘｏｓｏｍｅｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｅｘｏｃｙｔｏｓｉｓ ｏｆ ｍｕｌｔｉｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ α－ｇｒａｎｕｌｅｓ．Ｂｌｏｏｄ，９４（１１），３７９１－３７９９．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１８２／ｂｌｏｏｄ．ｖ９４．１１．３７９１）。
【0006】
微小胞は、膜脱落によって産生され、血小板の細胞質内容物の試料を捕捉する。対照的に、エキソソームは、血小板ａ顆粒内に貯蔵され、血小板刺激媒介脱顆粒の際に放出される。それらの異なる生合成経路のために、エキソソーム及び微小胞は、カーゴの異なるサブセットを送達し、異なる表面タンパク質組成及び物理的サイズを特徴とする。
【0007】
【表1】
【0008】
エキソソームは、タンパク質、ＲＮＡ、ＲＮＰ及び化学メッセンジャーを含む、多様な範囲のカーゴを細胞間で自然に輸送する。エキソソームカーゴは、特定の濃縮されたカーゴを特徴付けることに加えて、細胞の細胞質内容物の確率的サンプリングの両方を表す。エキソソーム生合成の特異的機構は、それらへの外因性カーゴの標的化、したがって、デザイナー治療的エキソソームの産生を可能にする。これらは、ある範囲の細胞型において産生されているが、重要なことに、送達が試みられる前に、これらの細胞から引き続いて精製されている。エキソソームの全身送達には、潜在的な問題がある。それらのサイズが小さいため、それらは循環系から受動的に逃れることができ、したがって、標的細胞又は組織におけるそれらの取り込みを制限する。エキソソームを特定の細胞又は組織に標的化することはまた、操作された表面マーカー（Ｄｕａｎ，Ｌ．，Ｘｕ，Ｌ．，Ｘｕ，Ｘ．，Ｑｉｎ，Ｚ．，Ｚｈｏｕ，Ｘ．，Ｘｉａｏ，Ｙ．，Ｌｉａｎｇ，Ｙ．，＆Ｘｉａ，Ｊ．（２０２１）．Ｅｘｏｓｏｍｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｇｅｎｅ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｎａｎｏｓｃａｌｅ，１３（３），１３８７－１３９７．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３９／ｄ０ｎｒ０７６２２ｈ）又は特定のプロデューサー細胞由来のエキソソームの天然の標的細胞指向性のいずれかに依存する。したがって、全身送達を可能にする高効率エキソソーム標的化技術が依然として必要とされている。
【0009】
血小板は、シグナル伝達経路受容体の多様なセットを介して、様々な細胞外シグナルに応答する。受容体は、血小板の脱顆粒及びエフェクターの放出をもたらす細胞内シグナル伝達カスケードを誘発することと、血小板の凝集及び接着を引き起こすことと、の両方に作用する。糖タンパク質ＶＩ血小板（ＧＰＶＩ）シグナル伝達は、ＴＣＲなどの多くの免疫細胞受容体と同様に機能する。興味深いことに、血小板はトール様受容体（ＴＬＲ）も発現し、ペプチド分泌及び免疫系活性化を介して細菌の標的死滅を媒介することができる。
【0010】
α顆粒は、直径約２００～５００ｎｍを有し、血小板の体積の約１０％を占めている。エキソソームは、α顆粒中に貯蔵される。ほとんどのエフェクタータンパク質は、α顆粒に存在する。例えば、α顆粒から放出されるエフェクタータンパク質としては、Ｐ－セレクチン、αＩＩｂβ、及びＧＰＩｂαなどの内在性膜タンパク質；第Ｖ因子、第ＩＸ因子、及びプラスミノーゲンなどの凝固剤／抗凝固剤及び線維素溶解タンパク質；フィブリノーゲン及びフォン・ヴィレブランド因子（von Willebrand Factor、ｖＷＦ）などの接着タンパク質；ＣＸＣＬ４（サイトカイン（Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフ）リガンド４）（血小板因子４又はＰＦ４としても知られる）及びＣＸＣＬ１２（サイトカイン（Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフ）リガンド１２）（間質細胞由来因子１アルファ又はＳＤＦ－１アルファとしても知られる）などのケモカイン；伸長成長因子（elongation growth factor、ＥＧＦ）及びインスリン様成長因子１（insulin-like growth factor、ＩＧＦ）などの成長因子；血管内皮増殖因子（vascular endothelial growth factor、ＶＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（platelet-derived growth factor、ＰＤＧＦ）、及びアンギオスタチンなどの血管新生因子／阻害剤；並びに免疫グロブリンＧ（immunoglobulin G、ＩｇＧ）及び補体前駆体などの免疫メディエーターが挙げられる。
【0011】
密顆粒は、直径約１５０ｎｍを有し、血小板の体積の約１％を占めている。高密度顆粒から放出されるエフェクタータンパク質としては、Ｃａ２＋及びＭｇ２＋などのカチオン；ポリホスフェート；セロトニン及びヒスタミンなどの生理活性アミン；並びにアデノシン二リン酸（adenosine diphosphate、ＡＤＰ）及びアデノシン三リン酸（adenosine triphosphate、ＡＴＰ）などのヌクレオチドが挙げられる。
【0012】
ＬＤＣＶは、直径約１５０ｎｍ～約３００ｎｍの範囲を有し、血小板の体積の約１３．５％を占めている。ＬＤＣＶから放出されるエフェクタータンパク質としては、構造タンパク質（例えば、グラニン及び糖タンパク質）；バスコレギュレーター（vascoregulator）（例えば、カテコールアミン、バソスタチン、レニン－アンジオテンシン）；パラクリンシグナル伝達因子（例えば、グアニリン、ニューロテンシン、クロモグラニンＢ）；免疫メディエーター（例えば、エンケリチン及びユビキチン）；オピオド（opiod）（例えば、エンケファリン及びエンドルフィン）；イオン（例えば、Ｃａ２＋、Ｎａ＋、Ｃｌ－）、並びにヌクレオチド及びポリホスフェート（例えば、アデノシン一リン酸（adenosine monophosphate、ＡＭＰ）、グアノシン二リン酸（guanosine diphosphate、ＧＤＰ）、ウリジン－５’－三リン酸（uridine-5'-triphosphate、ＵＴＰ））が挙げられる。
【0013】
操作されたキメラ抗原受容体Ｔ細胞（chimeric antigen receptor T、ＣＡＲ－Ｔ細胞）に基づく現在の細胞療法は、がんの治療において有望であることが示されているが、それらの安全性、特に患者の発がん性形質転換に関する懸念、及びジェネリック又はユニバーサル治療製品を生成する能力の制限により、それらの使用は少数の患者に限定されている。現在の細胞治療製品を悩ませている安全性、コスト、及び患者のマッチングの問題から解放された、がん、自己免疫状態、及び感染症を治療する可能性を有する新しいタイプの治療に対する当該技術分野での長い間感じられてきた必要性が存在する。
【発明の概要】
【0014】
本発明は、対象へのカーゴの安全な送達において使用することができる様々な成分、組成物及び方法を提供し、好ましい実施形態では、安全な送達は、標的化された安全な送達である。本明細書に記載の様々な成分、組成物及び方法はまた、カーゴを対象に送達することに加えて、又はその代わりに、Ｔ細胞を刺激するために使用され得る。送達実体を生成するために使用される細胞又は細胞様実体、及び送達実体自体は、本明細書では集合的に「シャーシ」と呼ばれる。例えば、シャーシは、特定のカーゴを送達すること、例えば、標的化された様式で特定のカーゴを送達することのいずれかを目的として、又は、エフェクターシャーシの膜に存在する本発明の特異的受容体を対象における対応する標的と係合させることを目的として、それを必要とする対象に実際に投与されるシャーシである「エフェクターシャーシ」であってもよく、すなわち、エフェクターシャーシは、有用であるためにカーゴを含む必要がない。
【0015】
本明細書に記載のシャーシはまた、「プロデューサーシャーシ」であってもよい。プロデューサーシャーシは、血小板、又は血小板様膜結合細胞フラグメント、又は無核細胞フラグメントを直接産生することができるシャーシである。例えば、いくつかの実施形態では、プロデューサーシャーシは、原形質膜の伸長を介して、血小板、又は血小板様膜結合細胞フラグメント、又は無核細胞フラグメントを産生して血小板前駆細胞（protoplatelet）を形成し、これは次いで、血小板、又は血小板様膜結合細胞フラグメント、又は無核細胞フラグメントにフラグメント化される。
【0016】
いくつかの実施形態では、「無核細胞フラグメント」とは、赤血球（erythrocyte）又は赤血球のフラグメントという意味を含まない。いくつかの好ましい実施形態では、「無核細胞フラグメント」は、細胞外小胞又は他の脂質結合小胞を意味する範囲内に含むことを意図しないことも明らかである。当業者は、「無核細胞フラグメント」によって何が意図されるかを容易に理解することができる。
【0017】
したがって、いくつかの実施形態では、無核細胞フラグメントは、赤血球ではない。いくつかの実施形態では、無核細胞フラグメントは、赤血球のフラグメントではない。いくつかの実施形態では、無核細胞フラグメントは、細胞外小胞ではない。いくつかの実施形態では、無核細胞フラグメントは、エキソソームではない。
【0018】
好ましい実施形態では、無核細胞フラグメントは、本明細書中に記載されるようなプロデューサーシャーシから産生される。
【0019】
本明細書に記載の「エフェクターシャーシ」の産生をもたらす修飾の多くは、その後にエフェクターシャーシを産生するプロデューサーシャーシの成熟のはるか上流で行うことができることは、本明細書の開示から当業者には明らかである。したがって、場合によっては、本明細書に記載のシャーシが「前駆体シャーシ」であり得ることが適切であることは明らかである。前駆体シャーシは、好ましい実施形態では、プロデューサーシャーシを生成するために確実に使用され得る不死細胞である。明らかなように、いくつかの好ましい実施形態では、前駆体シャーシは、巨核球などの特定のプロデューサーシャーシに分化するように操作されたｉＰＳＣなどの不死細胞である。前駆体シャーシはまた、脂肪細胞などの不死化細胞、及び脂肪由来間葉系間質／幹細胞株（ＡＳＣＬ）などの他の成熟細胞の分化転換の結果である細胞を含む（Ｔｏｚａｗａ ｅｔ ａｌ ２０１９ Ｂｌｏｏｄ １３３：６３３－６４３を参照されたい）。
【0020】
骨髄幹細胞から巨核芽球、巨核球へのインビボ分化経路、又はｉＰＳＣから巨核球へのインビトロ分化は、十分に定義されており、当業者は、血小板又は血小板様膜結合細胞フラグメントを産生する方法を知っており、どの細胞が血小板又は血小板様膜結合細胞フラグメントの前駆体であるかを知っている。例えば、ｉＰＳＣなどの本明細書に記載の前駆体細胞を、本明細書に記載のプロデューサーシャーシに分化させる様々な方法がある。１つのそのような方法は、「フォワードプログラミング」として知られており、ｉＰＳＣの巨核球への直接分化を駆動し（例えば、Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ Ｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｅｓ ｆｒｏｍ Ｈｕｍａｎ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，Ｔｈｏｍａｓ Ｍｏｒｅａｕ，ＢＢＴＳ Ａｎｎｕａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ，Ｇｌａｓｇｏｗ ２０１７ １０４５＿ｔｈｕ＿ｌｏｍｏｎｄ＿ｍｏｒｅａｕ（１）．ｐｄｆを参照されたい）、典型的には、巨核球への分化を駆動する１つ以上の転写因子（Ｇａｔａ１、Ｔａｌ１及びＦｌｉ１）の発現を伴う。
【0021】
本明細書に記載の例示的なシャーシとしては、骨髄幹細胞、ｉＰＳＣ、巨核芽球、巨核球、巨核球様細胞、脂肪細胞、脂肪由来間葉系間質／幹細胞株（adipose-derived mesenchymal stromal/stem cell line、ＡＳＣＬ）、血小板、血小板様膜結合細胞フラグメント又は無核細胞フラグメントが挙げられる。
【0022】
例示的な前駆体シャーシとしては、骨髄系幹細胞、ｉＰＳＣ、脂肪細胞、脂肪由来間葉系間質／幹細胞株（ＡＳＣＬ）、及び本明細書に記載されるようなプロデューサーシャーシを産生することができるがん細胞株又は他の不死細胞が挙げられる。
【0023】
例示的なプロデューサーシャーシとしては、巨核芽球、巨核球、巨核球様細胞、若しくはがん細胞株、又は血小板、血小板様膜結合細胞フラグメント若しくは無核細胞フラグメントを形成することができる他の不死細胞、例えばＭＥＧ０１又はＤＡＭＩがん細胞株が挙げられる。
【0024】
例示的なエフェクターシャーシとしては、血小板、血小板様膜結合細胞フラグメント又は無核細胞フラグメントが挙げられる。
【0025】
本明細書に記載のシャーシはまた、本明細書に記載の任意の１つ以上のプロデューサー細胞に分化するように駆動された、これらの細胞／細胞様実体の任意の不死バージョンを含み、例えば、いくつかの実施形態では、シャーシは、巨核球への分化を指示するために、「フォワードプログラム」されている、すなわち、特定の遺伝子をノックイン若しくはノックアウトする（又はＲＮＡｉの使用などを介して遺伝子発現を修飾する）ように操作されている。
【0026】
本明細書に記載のシャーシのうちのいずれかは、本発明の１つ以上の受容体を発現するように修飾されてもよく、例えば、任意の前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシは、本明細書に記載の任意の１つ以上のキメラ血小板受容体（chimeric platelet receptor、ＣＰＲ）、ユニバーサルキメラ血小板受容体（ユニバーサルＣＰＲ）、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、合成抗原提示受容体（synthetic antigen presenting receptor、ＳＡＰＲ）、又は操作されたプロテアーゼ活性化受容体（engineered protease activated receptor、ｅＰＡＲ）を発現するように修飾されてもよい。「発現する」とは、転写及び翻訳、又は翻訳単独の意味を含む。例えば、本明細書に記載の受容体は、シャーシの表面上（すなわち、原形質膜内）に提示されなければならない。いくつかの実施形態では、シャーシは、受容体をコードする核酸を導入するように核酸レベルで修飾されている。この場合、シャーシは、核酸を転写及び翻訳して、機能的タンパク質を産生しなければならない。他の例では、シャーシを修飾して、本発明の機能的受容体に翻訳されるｍＲＮＡを導入することができる。したがって、本発明の受容体を発現する状況において、その意図は、機能的受容体タンパク質が産生されることを確実にすることである。
【0027】
いくつかの実施形態では、シャーシは、本発明の１つ以上の受容体を発現するように操作されているだけであり、例えば、任意の前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシは、本明細書に記載のいずれか１つ以上のキメラ血小板受容体（ＣＰＲ）、ユニバーサルキメラ血小板受容体（ユニバーサルＣＰＲ）、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、合成抗原提示受容体（ＳＡＰＲ）、又は操作されたプロテアーゼ活性化受容体（ｅＰＡＲ）を発現するようにされていてもよく、すなわち、いくつかの実施形態では、シャーシに対して更なる操作工程は行われていない。
【0028】
本明細書に記載のシャーシのうちのいずれかは、任意の１つ以上の異なる経路を調節するように操作されてもよく、例えば、任意の前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシは、
ｉ）血小板炎症シグナル伝達経路を破壊すること、
ｉｉ）操作されたシャーシの免疫原性を低下させること、
ｉｉｉ）シャーシの１つ以上の基本機能を増強若しくは破壊することを行うように操作されており、１つ以上又は基本機能が、自然免疫応答及び／若しくは適応免疫応答、炎症、血管新生、アテローム性動脈硬化症、リンパ発達及び／若しくは腫瘍成長に関与するように操作されてもよく、かつ／又は
ｉｖ）血小板血栓形成経路を破壊するように操作されてもよい。
ｉ）血小板炎症シグナル伝達経路を破壊すること、
ｉｉ）操作されたシャーシの免疫原性を低下させること、
ｉｉｉ）シャーシの１つ以上の基本機能を増強若しくは破壊することを行うように操作されており、１つ以上又は基本機能が、自然免疫応答及び／若しくは適応免疫応答、炎症、血管新生、アテローム性動脈硬化症、リンパ発達及び／若しくは腫瘍成長に関与するように操作されてもよく、かつ／又は
ｉｖ）血小板血栓形成経路を破壊するように操作されてもよい。
【0029】
いくつかの実施形態では、
ｉ）血小板炎症シグナル伝達経路、
ｉｉ）調節された場合に、操作されたシャーシの免疫原性を低下させる経路、
ｉｉｉ）自然免疫応答及び／若しくは適応免疫応答、炎症、血管新生、アテローム性動脈硬化症、リンパ発達及び腫瘍増殖に関与する基底機能、並びに／又は
ｉｖ）血小板血栓形成経路
が、
ａ）操作された前駆体シャーシであり、例えば、骨髄幹細胞、ｉＰＳＣ、プロデューサーシャーシを産生することができるがん細胞株、脂肪細胞、脂肪由来間葉系間質／幹細胞株（ＡＳＣＬ）、若しくはプロデューサーシャーシを産生することができる他の不死細胞である、操作された前駆体シャーシ、
ｂ）操作されたプロデューサーシャーシであり、例えば、巨核芽球、巨核球、巨核球様細胞、血小板を形成することができるがん細胞株、例えば、ＭＥＧ０１若しくはＤＡＭＩがん細胞株、血小板様膜結合細胞フラグメント若しくは無核細胞フラグメント、又は血小板、血小板様膜結合細胞フラグメント若しくは無核細胞フラグメントを形成することができる他の不死細胞である、操作されたプロデューサーシャーシ、あるいは
ｃ）操作されたエフェクターシャーシであり、例えば、血小板、血小板様膜結合細胞フラグメント若しくは無核細胞フラグメントである、操作されたエフェクターシャーシのうちのいずれか１つ以上において見出される経路である。
ｉ）血小板炎症シグナル伝達経路、
ｉｉ）調節された場合に、操作されたシャーシの免疫原性を低下させる経路、
ｉｉｉ）自然免疫応答及び／若しくは適応免疫応答、炎症、血管新生、アテローム性動脈硬化症、リンパ発達及び腫瘍増殖に関与する基底機能、並びに／又は
ｉｖ）血小板血栓形成経路
が、
ａ）操作された前駆体シャーシであり、例えば、骨髄幹細胞、ｉＰＳＣ、プロデューサーシャーシを産生することができるがん細胞株、脂肪細胞、脂肪由来間葉系間質／幹細胞株（ＡＳＣＬ）、若しくはプロデューサーシャーシを産生することができる他の不死細胞である、操作された前駆体シャーシ、
ｂ）操作されたプロデューサーシャーシであり、例えば、巨核芽球、巨核球、巨核球様細胞、血小板を形成することができるがん細胞株、例えば、ＭＥＧ０１若しくはＤＡＭＩがん細胞株、血小板様膜結合細胞フラグメント若しくは無核細胞フラグメント、又は血小板、血小板様膜結合細胞フラグメント若しくは無核細胞フラグメントを形成することができる他の不死細胞である、操作されたプロデューサーシャーシ、あるいは
ｃ）操作されたエフェクターシャーシであり、例えば、血小板、血小板様膜結合細胞フラグメント若しくは無核細胞フラグメントである、操作されたエフェクターシャーシのうちのいずれか１つ以上において見出される経路である。
【0030】
いくつかの実施形態では、シャーシは、
任意の１つ以上の異なる経路を調節するように操作されてもよく、例えば、任意の前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシは、
ｉ）血小板炎症シグナル伝達経路を破壊すること、
ｉｉ）操作されたシャーシの免疫原性を低下させること、
ｉｉｉ）シャーシの１つ以上の基本機能を増強若しくは破壊することを行うように操作されており、１つ以上又は基本機能が、自然免疫応答及び／若しくは適応免疫応答、炎症、血管新生、アテローム性動脈硬化症、リンパ発達及び／若しくは腫瘍成長に関与するように操作されてもよく、かつ／又は
ｉｖ）血小板血栓形成経路を破壊するように操作されてもよい。
すなわち、いくつかの実施形態では、シャーシに対して更なる操作工程が実行されていない。
任意の１つ以上の異なる経路を調節するように操作されてもよく、例えば、任意の前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシは、
ｉ）血小板炎症シグナル伝達経路を破壊すること、
ｉｉ）操作されたシャーシの免疫原性を低下させること、
ｉｉｉ）シャーシの１つ以上の基本機能を増強若しくは破壊することを行うように操作されており、１つ以上又は基本機能が、自然免疫応答及び／若しくは適応免疫応答、炎症、血管新生、アテローム性動脈硬化症、リンパ発達及び／若しくは腫瘍成長に関与するように操作されてもよく、かつ／又は
ｉｖ）血小板血栓形成経路を破壊するように操作されてもよい。
すなわち、いくつかの実施形態では、シャーシに対して更なる操作工程が実行されていない。
【0031】
本明細書に記載のシャーシのうちのいずれかは、本発明の１つ以上の受容体を発現するように操作されてもよく、いずれか１つ以上の異なる経路を調節するように操作されており、すなわち、いくつかの実施形態では、本発明は、
Ａ）任意の１つ以上の異なる経路を調節するように操作されている本明細書に記載されるようなシャーシのうちのいずれかを提供し、例えば、任意の前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシは、
ｉ）血小板炎症シグナル伝達経路を破壊すること、
ｉｉ）操作されたシャーシの免疫原性を低下させること、
ｉｉｉ）シャーシの１つ以上の基本機能を増強若しくは破壊することを行うように操作されており、１つ以上又は基本機能が、自然免疫応答及び／若しくは適応免疫応答、炎症、血管新生、アテローム性動脈硬化症、リンパ発達及び／若しくは腫瘍成長に関与するように操作されてもよく、かつ／又は
ｉｖ）血小板血栓形成経路を破壊するように操作されてもよく、
かつ
Ｂ）いずれか１つ以上のキメラ血小板受容体（ＣＰＲ）、ユニバーサルキメラ血小板受容体（ユニバーサルＣＰＲ）、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的ペプチドとの複合体、合成抗原提示受容体（ＳＡＰＲ）、若しくは本明細書に記載の操作されたプロテアーゼ活性化受容体（ｅＰＡＲ）を発現するように操作されてもよい。
Ａ）任意の１つ以上の異なる経路を調節するように操作されている本明細書に記載されるようなシャーシのうちのいずれかを提供し、例えば、任意の前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシは、
ｉ）血小板炎症シグナル伝達経路を破壊すること、
ｉｉ）操作されたシャーシの免疫原性を低下させること、
ｉｉｉ）シャーシの１つ以上の基本機能を増強若しくは破壊することを行うように操作されており、１つ以上又は基本機能が、自然免疫応答及び／若しくは適応免疫応答、炎症、血管新生、アテローム性動脈硬化症、リンパ発達及び／若しくは腫瘍成長に関与するように操作されてもよく、かつ／又は
ｉｖ）血小板血栓形成経路を破壊するように操作されてもよく、
かつ
Ｂ）いずれか１つ以上のキメラ血小板受容体（ＣＰＲ）、ユニバーサルキメラ血小板受容体（ユニバーサルＣＰＲ）、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的ペプチドとの複合体、合成抗原提示受容体（ＳＡＰＲ）、若しくは本明細書に記載の操作されたプロテアーゼ活性化受容体（ｅＰＡＲ）を発現するように操作されてもよい。
【0032】
本明細書に記載されるようなエフェクターシャーシには、血小板、血小板様膜結合細胞フラグメント、及び無核細胞フラグメントが含まれ、これらは、場合によっては、プロデューサーシャーシから産生されている。
【0033】
対象に投与され、対象において効果を生じることが意図される実際の送達剤（又はＴ細胞刺激剤）は、本明細書においてエフェクターシャーシと呼ばれ、その意味には、本明細書に記載されるようなプロデューサーシャーシのうちのいずれかに由来する、血小板、又は血小板様膜結合細胞フラグメント、他の細胞フラグメント又はＳｙｎｌｅｔ（本明細書に記載されるような）が含まれる。本明細書に記載のプロデューサーシャーシは、その意味に、エフェクターシャーシ、すなわち、血小板若しくは血小板様膜結合細胞フラグメント、又はＳｙｎｌｅｔを直接産生する典型的な分化プロセスにおいて上流にある、任意の細胞（操作された細胞を含む）を含む。
【0034】
「シャーシ」という一般的用語は、前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ、及びプロデューサーシャーシに由来し得るエフェクターシャーシの全てを包含することが意図される。
【0035】
いくつかの実施形態では、エフェクターシャーシは、カーゴを送達するために使用されず、例えば、いくつかの実施形態では、本明細書の考察から当業者に明らかであるように、本発明のＳＡＰＲを含むがカーゴを含まないエフェクターシャーシが有用であると考えられる。
【0036】
好ましい実施形態では、エフェクターシャーシ及び／又はプロデューサーシャーシ及び／又は前駆体シャーシは、本明細書に記載されるようなキメラ血小板受容体（ＣＰＲ）、ユニバーサルＣＰＲ、ＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとを含む複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲを含む。
【0037】
本明細書に記載されるような受容体は、血小板表面受容体の正常な細胞内機能を本質的に再指向し、その結果、特定の受容体に対する天然の内因性同族標的の認識に応答して細胞内シグナル伝達が起こるのではなく、細胞内シグナル伝達が異なる標的に応答して起こる、すなわち、受容体の「標的結合ドメイン」が、目的の標的、例えば、がん新抗原に結合するように修飾される。
【0038】
第１の態様では、本発明は、
キメラ血小板受容体であって、受容体が、
ａ）血小板調節ドメインである細胞内ドメインと、
ｂ）標的を認識して結合する異種標的結合ドメインと、を含む、キメラ血小板受容体を提供する。
キメラ血小板受容体であって、受容体が、
ａ）血小板調節ドメインである細胞内ドメインと、
ｂ）標的を認識して結合する異種標的結合ドメインと、を含む、キメラ血小板受容体を提供する。
【0039】
明確にするために、ＣＰＲに関連して本明細書に記載の標的結合ドメインに対する優先性は、本発明の他の態様の血小板調節ドメイン、例えば、本明細書に記載のユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、及びＳＡＰＲに対する優先性でもある。
【0040】
血小板は、外部シグナルを伝達して血小板の様々な機能をもたらす受容体を天然に含む。例えば、ＩＴＡＭドメインを含む血小板受容体は、適切な標的に結合することによって活性化されると、血小板の血栓形成経路及び脱顆粒経路を活性化すると考えられる。ＩＴＩＭドメインを含む血小板受容体は、適切な標的に結合することによって活性化されると、血小板血栓形成経路の活性化を阻害し、それによって脱顆粒の活性化を阻害すると考えられる。受容体を含む本明細書に記載されるような受容体及びシャーシは、この天然のプロセスを特定の標的に再指向すると考えられ、その結果、いくつかの実施例における血小板は、通常は脱顆粒する異なる標的に応答して脱顆粒する。血小板活性化（例えば、脱顆粒）又は活性化の阻害（例えば、脱顆粒の活性化の阻害）を達成するために必要なのは、標的に結合する外部ドメインと、血小板（又は本明細書に記載されるようなエフェクターシャーシ）の挙動を調節することができる内部ドメインと、を含む、本明細書に記載されるような受容体だけであると考えられる。エフェクターシャーシが受容体への標的結合に適切に応答するためには、関連する内部経路が機能的でなければならない。例えば、本明細書に記載されるようないくつかの実施形態では、血栓形成経路が破壊され、いくつかの実施形態では、エフェクターシャーシが標的への結合に応答して通常の血栓形成経路を誘発しない場合が好ましいが、脱顆粒が起こるためには、エフェクターシャーシは、機能的な脱顆粒経路を有していなければならない。
【0041】
脱顆粒は、ＩＰ３の生成を通じて起こる。ＩＴＡＭを含む受容体は、標的結合の際にリン酸化され、Ｓｒｃファミリーキナーゼ（Ｓｙｋなど）の動員をもたらす。Ｓｒｃファミリーキナーゼの動員は、ＰＬＣ－γ－２活性化及びＩＰ３生成をもたらす。本明細書に記載されるようなｅＰＡＲの活性化は、ＰＬＣ－ベータ活性化及びＩＰ３生成を誘発する。
【0042】
ＩＰ３は、ＩＰ３受容体に結合して活性化し、細胞内貯蔵及び細胞外環境から血小板細胞質へのＣａ２＋流入を誘発する。Ｃａ２＋は、アルファ顆粒のエキソサイトーシス（脱顆粒）及び一連の他の事象を誘発し、脱顆粒を含む血小板活性化に至る。
【0043】
したがって、いくつかの好ましい実施形態では、本明細書に記載のシャーシのうちのいずれか、例えば、前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ及びエフェクターシャーシは、血小板活性化及び／又は脱顆粒をもたらすために必要な細胞成分を含むことが明らかである。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるようなシャーシは、Ｓｒｃファミリーキナーゼ及びＩＰ３を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるようなシャーシは、ＰＬＣ－ベータ及びＩＰ３を含む。いくつかの実施形態では、シャーシは、ＩＰ３受容体を含む。
【0044】
異種標的結合ドメインは、細胞内シグナル伝達ドメインも含む膜貫通タンパク質の外側部分である。細胞内シグナル伝達ドメインは、血小板の調節、例えば血小板の活性化をもたらすように、標的結合ドメインへの標的の結合を変換する。当業者は、ＩＴＡＭ及びＩＴＩＭ受容体などのいくつかの受容体が、細胞内シグナル伝達及び血小板活性化をもたらすために膜表面上でのある程度の受容体クラスター化を必要とすることを理解する。したがって、血小板の調節、例えば、血小板の活性化をもたらすような標的結合ドメインへの標的の結合によって、本発明者らは、標的結合ドメインへの標的の結合が受容体クラスター化をもたらすという意味を含む。血小板の活性化に必要な受容体クラスター化の程度は、受容体及び標的に依存する。当業者は、当該技術分野で知られているアッセイ（例えば、本明細書に記載されるようなＰ－セレクチンを含むアッセイ）を使用して、本発明の所定のＣＰＲが血小板調節を達成し得るか否かを決定することができる。
【0045】
いくつかの実施形態では、受容体クラスター化が必要であると考えられるため、ＣＰＲがエフェクターシャーシの膜に存在する場合、いくつかの実施形態では、受容体が結合する標的は、エフェクターシャーシの膜に存在するＣＰＲによって結合された場合にＣＰＲ受容体クラスター化及び血小板調節ドメインの活性化をもたらす標的である。
【0046】
例えば、いくつかの実施形態では、標的は、細胞表面又は組織表面に存在する。
【0047】
異種標的結合ドメインとは、標的結合ドメインが細胞内血小板調節ドメインに対して異種である、すなわち、標的結合ドメインが細胞内ドメインに関連する通常の細胞外ドメインではないことを意味する。異種標的結合ドメイン又は異種タグ結合ドメインは、内因性標的に結合し得、例えば、対象に内因性である腫瘍抗原に結合し得るが、ＣＰＲがキメラであるため、標的結合ドメインは、内部血小板調節ドメインに対して異種である。
【0048】
いくつかの実施形態では、標的結合ドメインは、前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ及び／又はエフェクターシャーシに対して内因性であり得るが、血小板調節ドメインに対して異種であり、例えば、ＣＰＲは、任意の細胞若しくは前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ及び／又はエフェクターシャーシにおいて天然に見出されず、生物学的操作の結果として産生されている。したがって、いくつかの好ましい実施形態では、ＣＰＲは、天然に存在するタンパク質又は複合体ではない。
【0049】
いくつかの実施形態では、血小板調節ドメインは、ベース血小板において見出されるドメインであり、すなわち、血小板調節ドメインが血小板において天然に見出される場合である。
【0050】
例えば、細胞内調節ドメインが糖タンパク質ＶＩ（Glycoprotein VI、ＧＰＶＩ）の細胞内ドメインを含む実施形態では、標的化ドメインは、糖タンパク質ＶＩ（ＧＰＶＩ）の細胞外ドメインではなく、すなわち、ドメインは互いに対して異種である。いくつかの実施形態では、Ｃ型レクチン様受容体２（C-type lectinlike receptor 2、ＣＬＥＣ－２）又はＩｇＧ受容体ＩＩａのＦｃフラグメント（ＦＣｇＲ２Ａ）も同様の方法で改変することができる。他の実施形態では、細胞内ドメインがＣ型レクチン様受容体２（ＣＬＥＣ－２）の細胞内ドメインを含む場合、細胞外標的化ドメインは、ＣＬＥＣ－２の細胞外ドメインではなく、細胞内ドメインがＩｇＧ受容体ＩＩａのＦｃフラグメント（ＦＣｇＲ２Ａ）を含むいくつかの実施形態では、細胞外標的化ドメインは、ＦＣｇＲ２Ａの細胞外ドメインを含まない。
【0051】
標的結合ドメインは、対象に固有であるが、細胞内ドメインに固有ではないドメインである可能性があることは明らかである。
【0052】
異種標的結合ドメインは、特定の標的にいくらかの特異性で結合することができる任意の標的結合ドメインであり得る。好ましくは、標的結合ドメインは、標的又はタグに特異的に結合する。「特異的に結合する」とは、標的結合ドメインが、非標的（すなわち、オフターゲット）への結合と区別することができる様式でその標的に結合するという意味を含む。例えば、標的に特異的な標的結合ドメインは、意図されていない標的のものと比較して、意図された標的に対してより高い特異性で結合する標的結合ドメインを指し得る。特異性は、日常的な実験を通じて解離定数に基づいて決定することができる。標的「に特異的」である標的結合ドメインは、当該標的「に対して指向された」標的結合ドメインと同義であることが意図される。
【0053】
好ましくは、標的結合ドメインは、そのそれぞれの標的、例えば、免疫細胞標的にのみ結合し、環境中、例えば、ヒト身体内の任意の他の分子に結合しない。しかしながら、ある程度のオフターゲット結合が許容され得ることが理解され、当業者は、特定の結合活性が必要とされる特異性のものであるか否かを決定する方法を理解する。したがって、結合ドメインは、意図された標的に特異的に結合し得る一方で、非標的又は非タグ分子にもいくらか低いレベルで結合する。
【0054】
一実施形態では、標的結合ドメインは、コラーゲンに結合しない。
【0055】
本明細書に記載の発明はまた、いくつかの実施形態では、参照により本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０２０／０５３２４７号の３頁の段落［００１２］に「第２の領域」として記載されている配列又はタンパク質若しくはタンパク質の部分のうちのいずれかを含むか又はそれからなる異種標的結合ドメインを含む、ＣＰＲを提供する。
【0056】
本発明のＣＰＲは、タンパク質であり、単一の転写物として発現される。
【0057】
標的は、タンパク質性配列又はフラグメント又はドメインに特異的に結合することができる任意の標的であり得る。
【0058】
いくつかの実施形態では、標的結合ドメインは、対象の体内の組織上若しくは細胞上、又は対象の特定の位置において見出される内因性標的に結合し、例えば、内因性標的は、組織上、又は組織の特定のサブセット上、又は対象、例えばヒト対象の血漿若しくは血液中、例えば血液中に存在する標的であり得る。いくつかの実施形態では、標的は、１つ以上の疾患状態の間にのみ提示される標的であり、例えば、いくつかの実施形態では、標的は、腫瘍細胞において生じる新抗原である。いくつかの実施形態では、標的は、通常は標的を発現しない組織若しくは細胞上に有意な量、例えば異常なレベルでしか存在せず、かつ／又は１つ以上の疾患状態の間に局所的にしか存在しない標的である。本発明の１つ以上のＣＰＲを含む本発明のエフェクターシャーシ（本明細書に記載されるような）は、疾患の状態の開始又は疾患の進行の際に生じ得る異常について「調査」するために使用され得、そしてカーゴが放出され得る。標的結合ドメインは、疾患のマーカーに結合することができる任意のドメインであり得る。
【0059】
標的結合ドメインは、好ましくは、本明細書に記載されるような内因性標的に結合する。いくつかの実施形態では、標的結合ドメインは、人工又は外因性標的に結合し、すなわち、いくつかの実施形態では、標的結合ドメインは、血小板の活性化及び脱顆粒を達成するために、対象に提供される外因性薬剤に結合する必要がある。標的結合ドメインは、いくつかの実施形態では、「デザイナー薬物」に結合し、かつ／又は標的結合ドメインは、国際公開第２０２００７２４７１号に記載されるように、デザイナー薬物によって排他的に活性化されるデザイナー受容体（Designer Receptor Exclusively Activated by Designer Drug、ＤＲＥＡＤＤ）を使用して設計されている。
【0060】
いくつかの実施形態では、内因性標的への標的結合ドメインの結合は、血小板調節ドメインを介して血小板を調節するのに十分である。
【0061】
いくつかの実施形態では、標的は、細胞表面又は組織表面に存在する。
【0062】
いくつかの実施形態では、標的は、ＣＰＲ又はユニバーサルＣＰＲが血小板膜に存在する場合、標的が標的結合ドメインに結合した後、ＣＰＲ又はユニバーサルＣＰＲが原形質膜上にクラスター化するような標的である。この場合の血小板とは、例えば、任意のシグナル伝達経路を破壊するように操作されておらず、ＣＰＲ又はユニバーサルＣＰＲを発現するように操作されているだけの標準的なベース血小板を意味する。
【0063】
いくつかの実施形態では、ＣＰＲ又はユニバーサルＣＰＲが血小板膜に存在する場合、標的が標的結合ドメインに結合した後、血小板調節ドメインが活性化される。この場合の血小板とは、例えば、任意のシグナル伝達経路を破壊するように操作されておらず、ＣＰＲ又はユニバーサルＣＰＲを発現するように操作されているだけの標準的なベース血小板を意味する。これは、所与のＣＰＲ又はユニバーサルＣＰＲが本発明のＣＰＲであるか否かを決定するために当業者が容易に行うことができる試験であり、いくつかの実施形態では、ベース血小板が１つ若しくはＣＰＲ又はユニバーサルＣＰＲを発現するように操作されている場合、標的への標的結合ドメインの結合は、
ａ）血小板の脱顆粒をもたらす、
ｂ）血小板からの内容物の放出をもたらす、
ｃ）血小板の原形質膜上に血小板内内容物の存在をもたらす、
ｄ）原形質膜からのブレブ形成を介した細胞外小胞、及び／又は小分子薬物、造影剤、放射性ヌクレオチド薬物、放射性ヌクレオチドタグ付抗体、若しくはそれらの任意のコンジュゲートの放出をもたらす、
ｅ）両凹ディスク（biconcave disk）から完全に広がった細胞フラグメントへの血小板の形状の変化をもたらす、並びに／あるいは
ｆ）血小板へのカルシウムの流入をもたらす。
ａ）血小板の脱顆粒をもたらす、
ｂ）血小板からの内容物の放出をもたらす、
ｃ）血小板の原形質膜上に血小板内内容物の存在をもたらす、
ｄ）原形質膜からのブレブ形成を介した細胞外小胞、及び／又は小分子薬物、造影剤、放射性ヌクレオチド薬物、放射性ヌクレオチドタグ付抗体、若しくはそれらの任意のコンジュゲートの放出をもたらす、
ｅ）両凹ディスク（biconcave disk）から完全に広がった細胞フラグメントへの血小板の形状の変化をもたらす、並びに／あるいは
ｆ）血小板へのカルシウムの流入をもたらす。
【0064】
いくつかの実施形態では、ＣＰＲ又はユニバーサルＣＰＲが血小板原形質膜に存在する場合、標的への標的結合ドメインの結合後、ＣＰＲ又はユニバーサルＣＰＲが血小板原形質膜の表面にクラスター化し、当該クラスター化が、血小板調節ドメインを活性化するのに十分である。この場合の血小板とは、例えば、任意のシグナル伝達経路を破壊するように操作されておらず、ＣＰＲ又はユニバーサルＣＰＲを発現するように操作されているだけの標準的なベース血小板を意味する。
【0065】
受容体クラスター化、血小板活性化、又は血小板調節ドメインの活性化を引き起こすベース血小板に存在するＣＰＲ又はユニバーサルＣＰＲの標的結合ドメインへの標的結合に加えて、本明細書に記載されるようなエフェクターシャーシ（例えば、血小板、血小板様膜結合細胞フラグメント又は無核細胞フラグメント）における標的結合ドメインＣＰＲ又はユニバーサルＣＰＲへの標的結合の場合が好ましく、例えば、
ｉ）血小板炎症シグナル伝達経路を破壊すること、
ｉｉ）操作されたシャーシの免疫原性を低下させること、並びに／又は
ｉｉｉ）シャーシの１つ以上の基本機能を増強若しくは破壊することなどの１つ以上の経路を調節する（１つ以上又は基本機能は、自然免疫応答及び／若しくは適応免疫応答、炎症、血管新生、アテローム性動脈硬化症、リンパ発達及び／若しくは腫瘍成長に関与する）、かつ／又は
ｉｖ）血小板血栓形成経路を破壊するように操作されていても操作されていなくてもよく、
またエフェクターシャーシの活性化、ＣＰＲ若しくはユニバーサルＣＰＲ血小板調節ドメインの活性化、及び／又はエフェクターシャーシの表面上のＣＰＲクラスター化も引き起こす。
ｉ）血小板炎症シグナル伝達経路を破壊すること、
ｉｉ）操作されたシャーシの免疫原性を低下させること、並びに／又は
ｉｉｉ）シャーシの１つ以上の基本機能を増強若しくは破壊することなどの１つ以上の経路を調節する（１つ以上又は基本機能は、自然免疫応答及び／若しくは適応免疫応答、炎症、血管新生、アテローム性動脈硬化症、リンパ発達及び／若しくは腫瘍成長に関与する）、かつ／又は
ｉｖ）血小板血栓形成経路を破壊するように操作されていても操作されていなくてもよく、
またエフェクターシャーシの活性化、ＣＰＲ若しくはユニバーサルＣＰＲ血小板調節ドメインの活性化、及び／又はエフェクターシャーシの表面上のＣＰＲクラスター化も引き起こす。
【0066】
したがって、いくつかの実施形態では、標的は、ＣＰＲ又はユニバーサルＣＰＲが本明細書に記載されるようなエフェクターシャーシに存在する場合、標的がＣＰＲ又はユニバーサルＣＰＲの標的結合ドメインに結合した後、ＣＰＲ又はユニバーサルＣＰＲが原形質膜上にクラスター化するような標的である。エフェクターシャーシはまた、本明細書に記載されるような１つ以上の経路を破壊するように操作されていても操作されていなくてもよい。
【0067】
いくつかの実施形態では、ＣＰＲ又はユニバーサルＣＰＲがエフェクターシャーシ膜に存在する場合、標的が標的結合ドメインに結合した後、ＣＰＲ又はユニバーサルＣＰＲの血小板調節ドメインが活性化される。エフェクターシャーシはまた、本明細書に記載されるような１つ以上の経路を破壊するように操作されていても操作されていなくてもよい。いくつかの実施形態では、ＣＰＲ又はユニバーサルＣＰＲの標的結合ドメインへの標的の結合が、
ａ）エフェクターシャーシの脱顆粒をもたらす、
ｂ）エフェクターシャーシからの内容物の放出をもたらす、
ｃ）エフェクターシャーシの原形質膜上に血小板内内容物の存在をもたらす、
ｄ）原形質膜からのブレブ形成を介した細胞外小胞、及び／又は小分子薬物、造影剤、放射性ヌクレオチド薬物、放射性ヌクレオチドタグ付抗体、若しくはそれらの任意のコンジュゲートの放出をもたらす、
ｅ）両凹ディスクから完全に広がった細胞フラグメントへのエフェクターシャーシの形状の変化をもたらす、並びに／あるいは
ｆ）エフェクターシャーシへのカルシウムの流入をもたらす。
ａ）エフェクターシャーシの脱顆粒をもたらす、
ｂ）エフェクターシャーシからの内容物の放出をもたらす、
ｃ）エフェクターシャーシの原形質膜上に血小板内内容物の存在をもたらす、
ｄ）原形質膜からのブレブ形成を介した細胞外小胞、及び／又は小分子薬物、造影剤、放射性ヌクレオチド薬物、放射性ヌクレオチドタグ付抗体、若しくはそれらの任意のコンジュゲートの放出をもたらす、
ｅ）両凹ディスクから完全に広がった細胞フラグメントへのエフェクターシャーシの形状の変化をもたらす、並びに／あるいは
ｆ）エフェクターシャーシへのカルシウムの流入をもたらす。
【0068】
いくつかの実施形態では、ＣＰＲ又はユニバーサルＣＰＲがエフェクターシャーシ原形質膜に存在する場合、標的への標的結合ドメインの結合後、ＣＰＲ又はユニバーサルＣＰＲは、エフェクターシャーシ原形質膜の表面にクラスター化し、当該クラスター化は、ＣＰＲ又はユニバーサルＣＰＲの血小板調節ドメインを活性化するのに十分である。エフェクターシャーシはまた、本明細書に記載されるような１つ以上の経路を破壊するように操作されていても操作されていなくてもよい。
【0069】
いくつかの実施形態では、標的結合ドメインは、ヒト標的結合ドメイン配列、又はヒト標的結合ドメイン配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％若しくは１００％の配列同一性を有する配列を含む。
【0070】
いくつかの実施形態では、標的結合ドメインは、非ヒト標的結合ドメイン配列、任意選択で、
ヒト化配列、又は
マウス由来の配列を含む。
ヒト化配列、又は
マウス由来の配列を含む。
【0071】
いくつかの実施形態では、標的結合ドメインは、当該標的に特異的に結合する標的結合リガンド又はそのフラグメントを含む。
【0072】
いくつかの実施形態では、標的は抗原であり、標的化ドメインは、抗原、例えば腫瘍細胞上の新抗原又は腫瘍特異的抗原（tumour specific antigen、ＴＳＡ）に結合することができる。
【0073】
いくつかの実施形態では、標的結合ドメインは、ＣＤ１９を認識して、カーゴ、例えば化学療法剤であるカーゴを局所的に送達し得る。ＣＤ１９はよく知られているＢ細胞表面分子であり、Ｂ細胞受容体が活性化されると、Ｂ細胞抗原受容体が誘導するシグナル伝達及びＢ細胞集団の拡大を促進する。ＣＤ１９は、正常Ｂ細胞及び腫瘍性Ｂ細胞の両方で広く発現している。慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病、及び多くの非ホジキンリンパ腫などのＢ細胞に由来する悪性腫瘍は、ＣＤ１９の発現を頻繁に保持する。単一細胞系統に対するこのほぼ普遍的な発現及び特異性により、ＣＤ１９は免疫療法の魅力的な標的となっている。
【0074】
いくつかの実施形態では、標的結合ドメインは、標的細胞上に存在するサイトカイン受容体に結合する連結サイトカインを含む。
【0075】
いくつかの実施形態では、標的結合ドメインは、標的の天然リガンド（又はそのフラグメント）である。
【0076】
いくつかの実施形態では、標的結合ドメインは、コラーゲンに結合しない。
【0077】
いくつかの態様において、標的結合ドメインは、目的の標的に結合することができる抗体又はその抗原結合フラグメントである。例えば、標的結合ドメインは、例えばＣＤ１９を標的とするために、抗体の可変重鎖ドメインを含んでもよく、かつ／又は抗体の可変軽鎖ドメインを含んでもよく、かつ／又はカッパ軽鎖若しくはそのフラグメントを含んでもよい。
【0078】
いくつかの実施形態では、標的結合ドメインは、参照により本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０２０／０５３２４７号の６４～７７頁に提示される表１１から選択される抗体又はその抗体フラグメントである。抗体は、ＤｒｕｇＢａｎｋ識別子（ＤＢ ＩＤ）とともに列挙されている。これらの抗体の各々の標的は、抗体の各々で治療され得る例示的な疾患とともに、参照により本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０２０／０５３２４７号の７７～９２頁に記載されている。
【0079】
いくつかの実施形態では、標的結合ドメインは、ヒト標的結合ドメイン配列、又は例えば、ヒトタンパク質に由来する、例えば、ヒト抗体若しくはその抗体フラグメントに由来するヒト標的結合ドメイン配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％若しくは１００％の配列同一性を有する配列である。代替的に、標的結合ドメインは、非ヒト動物に由来し得るか、又は完全に合成のドメインであり得、例えば、抗体であり得るか、又はその抗体フラグメントは、マウスなどの非ヒト動物に由来し得る。いくつかの実施形態では、標的結合ドメインは、ヒト化配列であってもよく、例えば、標的結合ドメインは、ヒト化された抗体又はその抗原結合フラグメントであってもよい。
【0080】
標的結合ドメインは、抗体、そのバリアント又はフラグメントであり得る。抗体、バリアント、又はそのフラグメントは、当該技術分野で知られている通常の組換えＤＮＡ技術を使用して生成することができる。
【0081】
いくつかの実施形態では、標的結合ドメインは、参照により本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０２０／０５３２４７号の２３～３１頁の表２から選択されるタンパク質に結合することができる抗体又はその抗体フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗体又は抗体フラグメントは、ＩＬ２によってコードされるタンパク質（インターロイキン２、ＥＮＳＧ０００００１０９４７１）に結合し得る。いくつかの実施形態では、抗体又は抗体フラグメントは、ヒストン複合体に結合し得る。いくつかの実施形態では、抗体又は抗体フラグメントは、カリクレイン（ＫＬＫ、ＥＮＳＧ０００００１６７７５９）によってコードされるタンパク質に結合し得る。いくつかの実施形態では、抗体又は抗体フラグメントは、アミロイドに結合し得る。いくつかの実施形態では、抗体又は抗体フラグメントは、Ｎｏｔｃｈ受容体に結合し得る。いくつかの実施形態では、抗体又は抗体フラグメントは、酸化された低密度受容体１（ＯＬＲ１、ＥＮＳＧ０００００１７３３９１）によってコードされるタンパク質に結合し得る。
【0082】
例示的な標的結合ドメインは、参照により本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０２０／０５３２４７号の４６頁の表７に細胞外ドメインとして記載されている。
【0083】
いくつかの実施形態では、標的結合ドメインは、ＣＤ２７６に結合してもよく、例えば、標的結合ドメインは、ＣＤ２７６に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントであってもよい。
【0084】
本明細書で使用される場合、「抗体」又は「抗体（複数）」という用語は、抗原結合部位を含有する分子、例えば、免疫グロブリン分子、及び抗原結合部位を含有する免疫グロブリン分子の免疫学的に活性なフラグメントを指す。免疫グロブリン分子は、任意の種類（例えばＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、及びＩｇＹ）、クラス（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２）、又はサブクラスの免疫グロブリン分子であり得る。抗体としては、合成抗体、モノクローナル抗体、単一ドメイン抗体、一本鎖抗体、組換え産生された抗体、多重特異性抗体（二重特異性抗体を含む）、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、細胞内抗体、ｓｃＦｖ（例えば、単一特異的及び二重特異性などを含む）、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、及び上記のもののうちのいずれかのエピトープ結合フラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。
【0085】
本明細書で使用される場合、「抗体フラグメント」という用語は、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖなどの抗体の部分である。構造にかかわらず、抗体フラグメントは、インタクトな抗体によって認識されるのと同じ抗原に結合する。例えば、抗ＯＸ４０抗体フラグメントはＯＸ４０に結合する。「抗体フラグメント」という用語はまた、重鎖及び軽鎖の可変領域からなる「Ｆｖ」フラグメントなどの可変領域からなる単離されたフラグメント、並びに軽鎖及び重鎖可変領域がペプチドリンカーによって連結している組換え一本鎖ポリペプチド分子（「ｓｃＦｖタンパク質」）を含む。本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、Ｆｃフラグメント又は単一アミノ酸残基などの、抗原結合活性を有さない抗体の部分を含まない。
【0086】
「Ｆａｂフラグメント」によって、本発明者らは、インタクトな抗体によって認識される同じ抗原に結合することができるＦａｂフラグメント（完全な軽鎖並びに重鎖の可変領域及びＣＨ１領域を含む）を含む。Ｆａｂフラグメントは当該技術分野で知られている用語であり、Ｆａｂフラグメントは、重鎖及び軽鎖の各々の１つの定常ドメイン及び１つの可変ドメインを含む。
【0087】
一実施形態では、標的結合ドメインは、
ａ）ＦＣＥＲＧ ＥＣドメイン、ＣＬＥＣ１ ＥＣドメイン、ＦＣＧＲ２ ＥＣドメイン、ＧＰＶＩＡ ＥＣドメイン、ＣＥＡＣＡＭ１ ＥＣドメイン、Ｇ６ｂ－Ｂ ＥＣドメイン、ＬＩＬＲＢ２ ＥＣドメイン、ＰＥＣＡＭ１ ＥＣドメイン、ＴＬＴ１ ＥＣドメイン及び／又はＦＣＥＲＧ ＥＣドメイン、ＣＬＥＣ１ ＥＣドメイン、ＦＣＧＲ２ ＥＣドメイン、ＧＰＶＩＡ ＥＣドメイン、ＣＥＡＣＡＭ１ ＥＣドメイン、Ｇ６ｂ－Ｂ ＥＣドメイン、ＬＩＬＲＢ２ ＥＣドメイン、ＰＥＣＡＭ１ ＥＣドメイン及び／若しくはＴＬＴ１ ＥＣドメインに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％若しくは１００％の配列同一性を有する配列、並びに／あるいは
ｂ）標的結合ドメインが、参照により本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０２０／０５３２４７号の４６～４９頁に記載のドメイン若しくはその部分のうちのいずれか１つ以上、又は参照により本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０２０／０５３２４７号の４６～４９頁に記載のドメイン若しくはその部分のうちのいずれか１つ以上に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％若しくは１００％の配列同一性を有する配列のうちの少なくとも１つを含む。
ａ）ＦＣＥＲＧ ＥＣドメイン、ＣＬＥＣ１ ＥＣドメイン、ＦＣＧＲ２ ＥＣドメイン、ＧＰＶＩＡ ＥＣドメイン、ＣＥＡＣＡＭ１ ＥＣドメイン、Ｇ６ｂ－Ｂ ＥＣドメイン、ＬＩＬＲＢ２ ＥＣドメイン、ＰＥＣＡＭ１ ＥＣドメイン、ＴＬＴ１ ＥＣドメイン及び／又はＦＣＥＲＧ ＥＣドメイン、ＣＬＥＣ１ ＥＣドメイン、ＦＣＧＲ２ ＥＣドメイン、ＧＰＶＩＡ ＥＣドメイン、ＣＥＡＣＡＭ１ ＥＣドメイン、Ｇ６ｂ－Ｂ ＥＣドメイン、ＬＩＬＲＢ２ ＥＣドメイン、ＰＥＣＡＭ１ ＥＣドメイン及び／若しくはＴＬＴ１ ＥＣドメインに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％若しくは１００％の配列同一性を有する配列、並びに／あるいは
ｂ）標的結合ドメインが、参照により本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０２０／０５３２４７号の４６～４９頁に記載のドメイン若しくはその部分のうちのいずれか１つ以上、又は参照により本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０２０／０５３２４７号の４６～４９頁に記載のドメイン若しくはその部分のうちのいずれか１つ以上に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％若しくは１００％の配列同一性を有する配列のうちの少なくとも１つを含む。
【0088】
いくつかの実施形態では、標的結合ドメインは、自己免疫に関連するペプチド、任意選択で、
以下のタンパク質：ＭＯＧ、ＧＡＤ６５、ＭＡＧ、ＰＭＰ２２、ＴＰＯ、ＶＧＫＣ、ＰＬＰ、ＡＣｈＲ、ＴＲＩＢ２、ＮＭＤＡ、ＧｌｕＲ、ＧＡＤ２、ＡＲＭＣ９、ＣＹＰ２１Ａ２、ＣＡＳＲ、ＮＡＳＰ、インスリン、ＴＳＨＲ、甲状腺ペルオキシダーゼ、アシオグリコタンパク質受容体、ＣＹＰ２Ｄ６、ＬＦ、ＴＴＧ、Ｈ／Ｋ ＡＴＰ－ａｓｅ、第ＸＩＩＩ因子、ベータ２－ＧＰＩ、ＩＴＧＢ２、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＰ ＩＩｂ／ＩＩａ、ＣＯＬＩＩ、ＦＢＧベータアルファ、ＭＰＯ、ＣＹＯ、ＰＲＴＮ３、ＴＧＭ、ＣＯＬＶＩＩ、ＣＯＩＬ、ＤＳＧ１、ＤＳＧ３、ＳＯＸ１０、７０ＳＮＲＮＰ７０、ＳＡＧ及びａ３（ＩＶ）ＮＣ１コラーゲンのうちのいずれか１つ以上のペプチド若しくは部分、又は
以下のタンパク質：ＭＯＧ、ＧＡＤ６５、ＭＡＧ、ＰＭＰ２２、ＴＰＯ、ＶＧＫＣ、ＰＬＰ、ＡＣｈＲ、ＴＲＩＢ２、ＮＭＤＡ、ＧｌｕＲ、ＧＡＤ２、ＡＲＭＣ９、ＣＹＰ２１Ａ２、ＣＡＳＲ、ＮＡＳＰ、インスリン、ＴＳＨＲ、甲状腺ペルオキシダーゼ、アシオグリコタンパク質受容体、ＣＹＰ２Ｄ６、ＬＦ、ＴＴＧ、Ｈ／Ｋ ＡＴＰ－ａｓｅ、第ＸＩＩＩ因子、ベータ２－ＧＰＩ、ＩＴＧＢ２、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＰ ＩＩｂ／ＩＩａ、ＣＯＬＩＩ、ＦＢＧベータアルファ、ＭＰＯ、ＣＹＯ、ＰＲＴＮ３、ＴＧＭ、ＣＯＬＶＩＩ、ＣＯＩＬ、ＤＳＧ１、ＤＳＧ３、ＳＯＸ１０、７０ＳＮＲＮＰ７０、ＳＡＧ及びａ３（ＩＶ）ＮＣ１コラーゲンのうちのいずれか１つ以上に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％若しくは１００％の配列同一性を有するペプチド若しくは部分を含む。
以下のタンパク質：ＭＯＧ、ＧＡＤ６５、ＭＡＧ、ＰＭＰ２２、ＴＰＯ、ＶＧＫＣ、ＰＬＰ、ＡＣｈＲ、ＴＲＩＢ２、ＮＭＤＡ、ＧｌｕＲ、ＧＡＤ２、ＡＲＭＣ９、ＣＹＰ２１Ａ２、ＣＡＳＲ、ＮＡＳＰ、インスリン、ＴＳＨＲ、甲状腺ペルオキシダーゼ、アシオグリコタンパク質受容体、ＣＹＰ２Ｄ６、ＬＦ、ＴＴＧ、Ｈ／Ｋ ＡＴＰ－ａｓｅ、第ＸＩＩＩ因子、ベータ２－ＧＰＩ、ＩＴＧＢ２、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＰ ＩＩｂ／ＩＩａ、ＣＯＬＩＩ、ＦＢＧベータアルファ、ＭＰＯ、ＣＹＯ、ＰＲＴＮ３、ＴＧＭ、ＣＯＬＶＩＩ、ＣＯＩＬ、ＤＳＧ１、ＤＳＧ３、ＳＯＸ１０、７０ＳＮＲＮＰ７０、ＳＡＧ及びａ３（ＩＶ）ＮＣ１コラーゲンのうちのいずれか１つ以上のペプチド若しくは部分、又は
以下のタンパク質：ＭＯＧ、ＧＡＤ６５、ＭＡＧ、ＰＭＰ２２、ＴＰＯ、ＶＧＫＣ、ＰＬＰ、ＡＣｈＲ、ＴＲＩＢ２、ＮＭＤＡ、ＧｌｕＲ、ＧＡＤ２、ＡＲＭＣ９、ＣＹＰ２１Ａ２、ＣＡＳＲ、ＮＡＳＰ、インスリン、ＴＳＨＲ、甲状腺ペルオキシダーゼ、アシオグリコタンパク質受容体、ＣＹＰ２Ｄ６、ＬＦ、ＴＴＧ、Ｈ／Ｋ ＡＴＰ－ａｓｅ、第ＸＩＩＩ因子、ベータ２－ＧＰＩ、ＩＴＧＢ２、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＰ ＩＩｂ／ＩＩａ、ＣＯＬＩＩ、ＦＢＧベータアルファ、ＭＰＯ、ＣＹＯ、ＰＲＴＮ３、ＴＧＭ、ＣＯＬＶＩＩ、ＣＯＩＬ、ＤＳＧ１、ＤＳＧ３、ＳＯＸ１０、７０ＳＮＲＮＰ７０、ＳＡＧ及びａ３（ＩＶ）ＮＣ１コラーゲンのうちのいずれか１つ以上に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％若しくは１００％の配列同一性を有するペプチド若しくは部分を含む。
【0089】
この実施形態では、受容体を含むエフェクターシャーシは、抗原特異性Ｂ細胞に標的化される（Ｃａｂａｌｅｔｔａ ｅｔ ａｌ ２０１６ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＤＯＩ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｆ６７５６を参照されたい）。
【0090】
例えば、デスモグレイン３－ＩＴＡＭを含む標的結合ドメインは、ｐｅｍｐｈｉｇｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ Ｂ細胞を標的とするために使用され得る。代替的に、本発明のＳＡＰＲは、ＭＨＣクラス１又はＭＨＣクラス２が、ＴＧＦ－βなどの抗炎症性サイトカインの放出による破壊又は抑制のために自己免疫介在性Ｔ細胞を標的とする血小板の表面に、上記のリストからのペプチドをロードし得るように、ＭＨＣクラス１－ＩＴＡＭキメラ血小板受容体又はＭＨＣクラス２－ＩＴＡＭキメラ血小板受容体を発現する。追加的に、結合したＴ細胞をＴｒｅｇに分化転換させるために、ＦＯＸＰ３などの転写因子をコードするＲＮＡが放出され得る。
【0091】
いくつかの実施形態では、上記のように、標的結合ドメインは、受容体を自己抗原に関連する特定の組織に標的化し得る。例えば、標的結合ドメインは、脂肪組織、副腎、腹水、膀胱、血液、骨、骨髄、脳、子宮頸部、結合組織、耳、胚組織、食道、目、心臓、腸、腎臓、喉頭、肝臓、肺、リンパ、リンパ節、乳腺、口、筋肉、神経、卵巣、膵臓、副甲状腺、咽頭、下垂体、胎盤、前立腺、唾液腺、皮膚、胃、精巣、胸腺、甲状腺、トンシル、気管、臍帯、子宮、血管、及び脾臓に存在する抗原に結合し得る。
【0092】
本明細書に記載のＣＰＲは、血小板調節ドメインを含む。明確にするために、ＣＰＲに関連して本明細書に記載の血小板調節ドメインに対する優先性は、本発明の他の態様の血小板調節ドメイン、例えば、本明細書に記載のユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、及びＳＡＰＲに対する優先性でもある。
【0093】
いくつかの実施形態では、血小板調節ドメインは、受容体が使用される前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ及び／又はエフェクターシャーシに対して内因性であり、例えば、ｉＰＳＣ、巨核球、脂肪細胞、脂肪由来間葉系間質／幹細胞株（ＡＳＣＬ）又は血小板に対して内因性である。
【0094】
「調節ドメイン」とは、血小板活性化を誘発するドメインの意味を含み、血小板活性化の誘発を阻害又は防止するドメインの意味を含む。血小板の活性化を防止する阻害性血小板活性化ドメインの活性化によって活性化が阻害される場合に活性化されるか又は活性化されない血小板活性としては、
ａ）例えばアルファ顆粒の放出を伴う血小板の脱顆粒、
ｂ）血小板からの内容物の放出、
ｃ）血小板の原形質膜上の細胞内内容物の存在、
ｄ）原形質膜からのブレブ形成を介した細胞外小胞の放出、及び／又は
ｅ）両凹ディスクから完全に広がった細胞フラグメントへの血小板の形状の変化が挙げられる。
ａ）例えばアルファ顆粒の放出を伴う血小板の脱顆粒、
ｂ）血小板からの内容物の放出、
ｃ）血小板の原形質膜上の細胞内内容物の存在、
ｄ）原形質膜からのブレブ形成を介した細胞外小胞の放出、及び／又は
ｅ）両凹ディスクから完全に広がった細胞フラグメントへの血小板の形状の変化が挙げられる。
【0095】
「血小板調節ドメインの活性化」とは、血小板調節ドメインが、血小板調節ドメインを含む血小板を調節することができることを意味する。
【0096】
当業者は、受容体（例えば、本発明によるＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ及び／又はｅＰＡＲ）が、脱顆粒の活性化、又は脱顆粒の阻害若しくは脱顆粒の活性化の阻害をもたらすことができるかどうかを容易に決定することができる。例えば、当業者は、受容体を発現する血小板を、対応する標的を発現する細胞と接触させ、Ｐ－セレクチンの形状変化又は曝露を測定することができる。血小板の形状の変化又はＰ－セレクチンの曝露は、特定の受容体が標的への結合の際に血小板を活性化できることを示す。本発明の受容体が血小板の活性化を阻害する能力を決定するために、類似のアッセイが実行され得る。当業者は、受容体を発現する血小板を、対応する標的を発現し、典型的には血小板の活性化をもたらす内因性標的（例えばコラーゲン）も発現する細胞と接触させてもよい。Ｐ－セレクチンの形状又は曝露の変化は、調査中の受容体が通常の経路を介して血小板の活性化を阻害できないことを示す。形状を変化させないこと、又はＰ－セレクチンを曝露させないことは、受容体が血小板の活性化を首尾よく防止できることを示す。用量応答が測定されるべきであり、例えば、天然の血小板アゴニスト対例えばＰ－セレクチン曝露の用量応答のＥＣ５０が、操作された阻害性受容体標的の存在下でより高い場合、これは、機能的阻害性受容体の構築を示す。逆に、受容体上の阻害標的のＩＣ５０は、同族アゴニスト濃度を一定に保ち、潜在的な阻害刺激の量を変化させることによって、同様の様式で計算することができる。
【0097】
好ましい実施形態では、血小板活性化とは、血小板脱顆粒を引き起こすことを意味する。したがって、いくつかの態様において、血小板調節ドメインは、脱顆粒誘発ドメインであり、いくつかの実施形態では、調節ドメインは、血小板脱顆粒の誘発を防止するドメインである。いくつかの実施形態では、血小板調節ドメインは、アルファ顆粒の放出を誘発する活性化ドメインである。いくつかの実施形態では、血小板調節ドメインは、アルファ顆粒の放出の誘発を防止するドメインである。
【0098】
同一又は異なる実施形態では、血小板活性化とは、血小板から内容物を放出させることを意味する。したがって、いくつかの実施形態では、血小板調節ドメインは、血小板内容物放出ドメインであり、いくつかの実施形態では、調節ドメインは、血小板内容物の放出を防止するドメインである。
【0099】
同じ又は異なる実施形態では、「活性化」とは、血小板が原形質膜からのブレブ形成を介して細胞外小胞を放出することを意味する。
【0100】
同じ又は異なる実施形態では、血小板活性化とは、原形質膜上に血小板内内容物を提示させることを意味する。したがって、いくつかの実施形態では、血小板調節ドメインは、原形質膜上の血小板内内容物の提示を引き起こすドメインであり、いくつかの実施形態では、調節ドメインは、原形質膜上の血小板内内容物の提示を防止するドメインである。
【0101】
同じ又は異なる実施形態では、血小板活性化とは、原形質膜からのブレブ形成を介して細胞外小胞の放出を引き起こすことを意味する。いくつかの実施形態では、カルシウム流入は、血小板活性化を示す別の測定可能なパラメータである。したがって、いくつかの実施形態では、血小板調節ドメインは、原形質膜からのブレブ形成を介して細胞外小胞の放出を引き起こすドメインであり、いくつかの実施形態では、調節ドメインは、原形質膜からのブレブ形成を介して細胞外小胞の放出を防止するドメインである。したがって、いくつかの実施形態では、血小板調節ドメインは、血小板へのカルシウムの流入を引き起こすドメインであり、いくつかの実施形態では、調節ドメインは、血小板へのカルシウムの流入を防止するドメインである。
【0102】
同一又は異なる実施形態では、血小板活性化とは、両凹ディスクから完全に広がった細胞フラグメントへの血小板の形状の変化を引き起こすことを意味する。したがって、いくつかの実施形態では、血小板調節ドメインは、両凹ディスクから完全に広がった細胞フラグメントへの血小板の形状の変化を引き起こすドメインであり、いくつかの実施形態では、調節ドメインは、両凹ディスクから完全に広がった細胞フラグメントへの血小板の形状の変化を防止するドメインである。
【0103】
同じ又は異なる実施形態では、「活性化」とは、血小板が両凹ディスクから完全に広がった細胞フラグメントへと形状を変化させるという意味を含む。このプロセスの間、血小板は糸状仮足を伸長し、葉状仮足を生成し、その結果、血小板表面積が劇的に増加する。当業者は、血小板活性化に典型的な形状変化を特定することができ、例えば、Ａｓｌａｎ ｅｔ ａｌ ２０１２ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ７８８：９１－１００を参照されたい。
【0104】
好ましい実施形態では、「活性化」とは、血小板が、血小板に導入された（血小板前駆体、例えば巨核球若しくはｉＰＳＣの遺伝子操作を介して内因的に導入された、又は外因的に導入された）カーゴを放出する、又は血小板細胞表面に曝露するという意味を含む。カーゴ、並びにカーゴを前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ及び／又はエフェクターシャーシ、例えば血小板に導入する方法についての選好は、本明細書に記載されているとおりである。
【0105】
血小板活性化ドメインの例としては、ＩＴＡＭモチーフを含むドメイン、又はＩＴＡＭを含むドメイン、例えば血小板ＩＴＡＭを含むドメインに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％若しくは１００％の配列同一性を有するドメインを含むドメインが挙げられる。
【0106】
脱顆粒阻害ドメインの例としては、ＩＴＩＭモチーフを含むドメイン、又はＩＴＩＭを含むドメインに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％若しくは１００％の配列同一性を有するドメインを含むドメインが挙げられる。
【0107】
「脱顆粒を誘発する」又は「脱顆粒の誘発を防止する」とは、本発明者らは、標的結合ドメインがその対応する標的に結合する場合、脱顆粒が誘発されるか、又は誘発されることが防止されるという意味を含む。上記のように、いくつかの実施形態では、ある程度の受容体クラスター化が血小板調節ドメインの活性化に必要である。
【0108】
エフェクターシャーシ、例えば本明細書に記載の血小板が、標的へのＣＰＲ（又は本明細書に記載されるようなユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ）の標的結合ドメインの結合に応答して脱顆粒するかどうかは、血小板調節ドメインが血小板活性化ドメイン、例えば脱顆粒誘発ドメイン若しくは血小板活性化ドメインの阻害、又は異なる種類のドメインの組み合わせであるかどうかに依存する。
【0109】
本明細書に更に記載されるように、血小板活性化ドメイン（例えば、脱顆粒誘発ドメイン）及び血小板活性化ドメイン（例えば、脱顆粒阻害ドメイン）の阻害を含む、異なる受容体と異なる血小板調節ドメイン（例えば、本明細書に記載の異なるＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、又はＳＡＰＲ又はｅＰＡＲ）の組み合わせを、単一のエフェクターシャーシ、例えば、本明細書に記載されるような血小板において使用することによって、ＡＮＤ／ＯＲ／ＮＯＲなどの複雑な論理回路を構築することが可能であり、したがって、活性化（脱顆粒）する決定を行う前に様々な刺激を統合し、計算することができる。
【0110】
いくつかの実施形態では、血小板調節ドメインである細胞内ドメインは、血小板阻害ドメインである。いくつかの態様において、血小板阻害ドメインは、免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ（immunoreceptor tyrosine－based inhibition motif、ＩＴＩＭ）含有受容体ドメインを含む。ＩＴＩＭ受容体の非限定的な例としては、血小板及び内皮細胞接着分子１（platelet and endothelial cell adhesion molecule 1、ＰＥＣＡＭ１）、骨髄細胞様１で発現するトリガー受容体（ＴＬＴ１）、白血球免疫グロブリン様受容体Ｂ２（leukocyte immunoglobulin like receptor B2、ＬＩＬＲＢ２）、がん胎児性抗原関連細胞接着分子１（carcinoembryonic antigen related cell adhesion molecule 1、ＣＥＡＣＡＭ１）、巨核球及び血小板阻害性受容体Ｇ６ｂ（Ｇ６ｂ－Ｂ）が挙げられる。
【0111】
血小板活性化の阻害は、オフターゲット細胞の活性化を防止するなどの場合に有用であり得、オンターゲット抗原、又凝固において見出される正常な薬剤に応答する阻害血小板活性化、例えば、ＧＰＶＩ中のＩＴＡＭドメインをＩＴＩＭドメインと交換し、凝固部位で血小板活性化のスイッチを切ることができる。
【0112】
抗体によるＧ６ｂ－Ｂクラスター化は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｍｏｒｉ ｅｔ ａｌ．「Ｇ６ｂ－Ｂ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ ａｎｄ ａｇｏｎｉｓｔ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｂｙ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ＶＩ ａｎｄ ＣＬＥＣ－２」．ＪＢＣ，２００８に示されているように、ＧＰＶＩ及びＣＬＥＣ－２を介した血小板活性化を阻害する。キメラ「オフ」受容体を加えることは、本明細書に記載の標的化エフェクターシャーシ、例えば、本明細書に記載の合成血小板の特異性を改善するために使用され得る。免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）受容体を含む、ＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ及び／又はｅＰＡＲは、他のＣＰＲと組み合わせて使用される場合、論理ゲート構築を可能にする。
【0113】
一実施形態では、ＩＴＩＭ受容体ＬＩＬＲＢ２（配列番号３４）、ＰＥＣＡＭ１（配列番号３８）、ＴＬＴ１（配列番号４３）、及びＣＥＡＣＡＭ１（配列番号２４）のドメインは、参照により本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０２０／０５３２４７号の４４頁の表５、及び同様に参照により本明細書に組み込まれる対応する説明段落［００６３］に示されており、又は受容体ＬＩＬＲＢ２（配列番号３４）、ＰＥＣＡＭ１（配列番号３８）、ＴＬＴ１（配列番号４３）、及びＣＥＡＣＡＭ１（配列番号２４）のＩＴＩＭドメインに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％若しくは１００％の配列同一性を有するドメインは、参照により本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０２０／０５３２４７号の４４頁の表５及び同様に参照により本明細書に組み込まれる対応する説明段落［００６３］に示されている。
【0114】
一実施形態では、ＩＴＩＭ受容体のドメインをＴ細胞受容体ドメインと組み合わせて、キメラ血小板受容体とも呼ばれるキメラＩＴＩＭ受容体を形成することができる。
【0115】
任意の血小板阻害ドメイン、すなわち、標的結合を変換して血小板脱顆粒の活性化を阻害する任意のドメインが、本明細書に記載の受容体、例えば、本明細書に記載のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、及びＳＡＰＲにおける使用に好適であることは明らかである。
【0116】
いくつかの実施形態では、血小板調節ドメインは、血小板活性化ドメインである。好ましい実施形態では、血小板活性化ドメインは、脱顆粒誘発ドメインである。いくつかの実施形態では、血小板活性化ドメインは、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（immunoreceptor tyrosine-based activation motif、ＩＴＡＭ）含有受容体ドメインである。ＩＴＡＭ受容体は、血小板活性化を仲介し、免疫応答を刺激する。糖タンパク質ＶＩ（ＧＰＶＩ）はコラーゲンに結合し、血小板活性化の中心的なメディエーターである。細胞外ＩｇＧ様ドメインを特徴とし、内部チロシンキナーゼシグナル伝達経路は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）ガンマ鎖を介した受容体クラスター化によって引き起こされる。ＩＴＡＭ受容体の非限定的な例としては、糖タンパク質ＶＩ血小板（ＧＰＶＩＡ）、高親和性免疫グロブリンイプシロン受容体サブユニットガンマ（ＦＣＥＲＧ）、Ｃ型レクチンドメインファミリー１（ＣＬＥＣ１）、及びＩｇＧ受容体ＩＩのＦｃフラグメント（Fc fragment of IgG receptor II、ＦＣＧＲ２）が挙げられる
【0117】
いくつかの実施形態では、次いで、血小板調節ドメインは、血小板脱顆粒誘発ドメインであり、
免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）受容体からの１つ以上のドメインを含み、任意選択で、糖タンパク質ＶＩ（ＧＰＶＩ）、Ｃ型レクチン様受容体２（ＣＬＥＣ－２）、ＩｇＧ受容体ＩＩａのＦｃフラグメント（ＦＣｇＲ２Ａ）、高親和性免疫グロブリンイプシロン受容体サブユニットガンマ（ＦＣＥＲＧ）、Ｃ型レクチンドメインファミリー１（ＣＬＥＣ１）、若しくはＩｇＧ受容体ＩＩのＦｃフラグメント（ＦＣＧＲ２）からの１つ以上のドメイン、それらの部分若しくはフラグメントを含むか、又は
ＩＴＡＭを含むドメイン、例えば、血小板ＩＴＡＭを含むドメインに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％若しくは１００％の配列同一性を有する、任意選択で、糖タンパク質ＶＩ（ＧＰＶＩ）、Ｃ型レクチン様受容体２（ＣＬＥＣ－２）、ＩｇＧ受容体ＩＩａのＦｃフラグメント（ＦＣｇＲ２Ａ）、高親和性免疫グロブリンイプシロン受容体サブユニットガンマ（ＦＣＥＲＧ）、Ｃ型レクチンドメインファミリー１（ＣＬＥＣ１）、若しくはＩｇＧ受容体ＩＩのＦｃフラグメント（ＦＣＧＲ２）からの１つ以上のドメイン、それらの部分若しくはフラグメントに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％若しくは１００％の配列同一性を有するドメインを含む。
免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）受容体からの１つ以上のドメインを含み、任意選択で、糖タンパク質ＶＩ（ＧＰＶＩ）、Ｃ型レクチン様受容体２（ＣＬＥＣ－２）、ＩｇＧ受容体ＩＩａのＦｃフラグメント（ＦＣｇＲ２Ａ）、高親和性免疫グロブリンイプシロン受容体サブユニットガンマ（ＦＣＥＲＧ）、Ｃ型レクチンドメインファミリー１（ＣＬＥＣ１）、若しくはＩｇＧ受容体ＩＩのＦｃフラグメント（ＦＣＧＲ２）からの１つ以上のドメイン、それらの部分若しくはフラグメントを含むか、又は
ＩＴＡＭを含むドメイン、例えば、血小板ＩＴＡＭを含むドメインに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％若しくは１００％の配列同一性を有する、任意選択で、糖タンパク質ＶＩ（ＧＰＶＩ）、Ｃ型レクチン様受容体２（ＣＬＥＣ－２）、ＩｇＧ受容体ＩＩａのＦｃフラグメント（ＦＣｇＲ２Ａ）、高親和性免疫グロブリンイプシロン受容体サブユニットガンマ（ＦＣＥＲＧ）、Ｃ型レクチンドメインファミリー１（ＣＬＥＣ１）、若しくはＩｇＧ受容体ＩＩのＦｃフラグメント（ＦＣＧＲ２）からの１つ以上のドメイン、それらの部分若しくはフラグメントに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％若しくは１００％の配列同一性を有するドメインを含む。
【0118】
一実施形態では、細胞内ドメインは、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）受容体由来のドメインを含まない。一実施形態では、細胞内ドメインは、糖タンパク質ＶＩ（ＧＰＶＩ）、Ｃ型レクチン様受容体２（ＣＬＥＣ－２）、ＩｇＧ受容体ＩＩａのＦｃフラグメント（ＦＣｇＲ２Ａ）、高親和性免疫グロブリンイプシロン受容体サブユニットガンマ（ＦＣＥＲＧ）、Ｃ型レクチンドメインファミリー１（ＣＬＥＣ１）、又はＩｇＧ受容体ＩＩのＦｃフラグメント（ＦＣＧＲ２）からの１つ以上のドメイン、それらの部分又はフラグメントを含まない。一実施形態では、細胞内ドメインは、参照により本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０２０／０５３２４７号の配列番号５、７、１４及び／又は１９を含むか又はそれらからなるＩＴＡＭドメインを含まない。
【0119】
一実施形態では、細胞内ドメインは、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）受容体由来のドメインを含む。一実施形態では、細胞内ドメインは、糖タンパク質ＶＩ（ＧＰＶＩ）、Ｃ型レクチン様受容体２（ＣＬＥＣ－２）、ＩｇＧ受容体ＩＩａのＦｃフラグメント（ＦＣｇＲ２Ａ）、高親和性免疫グロブリンイプシロン受容体サブユニットガンマ（ＦＣＥＲＧ）、Ｃ型レクチンドメインファミリー１（ＣＬＥＣ１）、若しくはＩｇＧ受容体ＩＩのＦｃフラグメント（ＦＣＧＲ２）からの１つ以上のドメイン、それらの部分若しくはフラグメント、又は
１つ以上のドメインに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％若しくは１００％の配列同一性を有するドメイン、糖タンパク質ＶＩ（ＧＰＶＩ）、Ｃ型レクチン様受容体２（ＣＬＥＣ－２）、ＩｇＧ受容体ＩＩａのＦｃフラグメント（ＦＣｇＲ２Ａ）、高親和性免疫グロブリンイプシロン受容体サブユニットガンマ（ＦＣＥＲＧ）、Ｃ型レクチンドメインファミリー１（ＣＬＥＣ１）、又はＩｇＧ受容体ＩＩのＦｃフラグメント（ＦＣＧＲ２）からの１つ以上のドメイン、それらの部分又はフラグメントを含む。
１つ以上のドメインに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％若しくは１００％の配列同一性を有するドメイン、糖タンパク質ＶＩ（ＧＰＶＩ）、Ｃ型レクチン様受容体２（ＣＬＥＣ－２）、ＩｇＧ受容体ＩＩａのＦｃフラグメント（ＦＣｇＲ２Ａ）、高親和性免疫グロブリンイプシロン受容体サブユニットガンマ（ＦＣＥＲＧ）、Ｃ型レクチンドメインファミリー１（ＣＬＥＣ１）、又はＩｇＧ受容体ＩＩのＦｃフラグメント（ＦＣＧＲ２）からの１つ以上のドメイン、それらの部分又はフラグメントを含む。
【0120】
一実施形態では、細胞内ドメインは、参照により本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０２０／０５３２４７号の配列番号５、７、１４及び／若しくは１９を含むか若しくはそれからなるか、又は参照により本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０２０／０５３２４７号の配列番号５、７、１４及び／若しくは１９に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％若しくは１００％の配列同一性を有する配列を含むか若しくはそれからなるＩＴＡＭドメインを含む。
【0121】
ＩＴＡＭドメインは、ＩＴＡＭ受容体が血小板に内因的に見出されるのと同じ下流のシグナル伝達成分を依然として活性化することができるため、通常は血小板で発現されないＩＴＡＭ受容体由来のドメインが依然として本発明において機能すると予想されることは当業者には明らかである。例えば、Ｔ細胞ＣＡＲは、マクロファージ及びＮＫ細胞において使用され得ることが知られている。
【0122】
任意の血小板調節ドメイン、すなわち、標的結合を血小板調節、例えば血小板脱顆粒に変換する任意のドメインが、血小板調節ドメインとしての使用に好適であることは明らかである。
【0123】
いくつかの実施形態では、血小板調節ドメインは、天然に存在するドメインではない。例えば、いくつかの実施形態では、調節ドメイン、例えばＩＴＡＭ、ＩＴＩＭドメインは、標的結合に対する応答を増強又は減衰させる１つ以上の変異、挿入又は欠失を含む。場合によっては、血小板調節ドメインは、天然に存在する調節ドメインに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％又は１００％の配列同一性を含み、例えば、本明細書に記載の調節ドメイン配列のうちのいずれかに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％又は１００％の配列同一性を含む。
【0124】
例えば、いくつかの実施形態では、血小板調節ドメインは、修飾されていない血小板調節ドメインと比較して増加した感受性を有するように修飾されている修飾された血小板調節ドメインである。例えば、そのような修飾された血小板調節ドメインを含む本発明の受容体（例えば、本明細書に記載のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体又はＳＡＰＲ）は、より少ない量の標的に反応することが予想され、例えば、血小板調節ドメインが修飾された血小板活性化ドメインである場合、受容体を含むエフェクターシャーシは、修飾されていない調節ドメインを含む受容体を含むエフェクターシャーシ（例えば、修飾されていない血小板調節ドメインを含む本発明のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体又はＳＡＰＲ）を脱顆粒させるのに必要な量よりも少ない量の標的に応答して脱顆粒することが予想される。いくつかの実施形態では、修飾された血小板調節ドメインは、修飾されていない血小板調節ドメインと比較して減少した感受性を有するように修飾されている。例えば、そのような修飾された血小板調節ドメイン（例えば、本明細書に記載のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチド又はＳＡＰＲとの複合体又はＳＡＰＲ）を含む本発明の受容体は、修飾されていない血小板調節ドメインを有する受容体を含むエフェクターシャーシを反応（例えば、脱顆粒）させる量の標的に応答して反応（例えば、脱顆粒）しないと予想される。いくつかの実施形態では、次いで、血小板調節ドメインは、修飾血小板調節ドメインである。修飾とは、ドメインをコードする配列に対する任意の変化、例えば、挿入、欠失及び／又は置換の意味を含む。いくつかの実施形態では、血小板調節ドメインは、１つ以上のＩＴＡＭドメインを含み、ここで、ＩＴＡＭドメインは、１つ以上の修飾、例えば１つ以上の挿入、欠失又は置換を含む。いくつかの実施形態では、血小板調節ドメインは、１つ以上のＩＴＩＭドメインを含み、ここで、ＩＴＡＭドメインは、１つ以上の修飾、例えば１つ以上の挿入、欠失又は置換を含む。
【0125】
血小板調節ドメインがヒト血小板調節ドメインである必要はないことは、当業者には明らかである。例えば、ヒトではない種由来のＩＴＡＭ又はＩＴＩＭ含有ドメインは、本発明において有用であると考えられる。例えば、ヒト由来のＩＴＡＭ含有ドメインは、マウス種において活性であることが示されており、ＣＡＲ－Ｔ状況において機能することが示されている（Ｒｏｂｌｅｓ－Ｃａｒｒｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ ２０１０ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １８５：１５７７－１５８３）。
【0126】
いくつかの実施形態では、標的結合ドメインは、血小板調節ドメインを有する受容体の天然の標的結合ドメインであるが、血小板調節は、反対の機能を有するように改変されている。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の受容体（例えば、ＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、又はユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体）は、ＩＴＡＭ血小板調節ドメインを含む受容体の標的結合ドメインを含むが、ＩＴＡＭドメインはＩＴＩＭドメインに交換されている。例えば、いくつかの実施形態では、ＣＰＲ又はユニバーサルＣＰＲ又はユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体は、糖タンパク質ＶＩ（ＧＰＶＩ）、Ｃ型レクチン様受容体２（ＣＬＥＣ－２）、ＩｇＧ受容体ＩＩａのＦｃフラグメント（ＦＣｇＲ２Ａ）、高親和性免疫グロブリンイプシロン受容体サブユニットガンマ（ＦＣＥＲＧ）、Ｃ型レクチンドメインファミリー１（ＣＬＥＣ１）、又はＩｇＧ容体ＩＩのＦｃフラグメント（ＦＣＧＲ２）のうちのいずれかの外部標的結合ドメインを含むが、タンパク質のＩＴＡＭを含むドメインが、ＩＴＩＭを含むドメインに変化している。これは、本明細書に記載の任意の実施形態に適用される。
【0127】
いくつかの実施形態では、ＣＰＲは、ユニバーサルＣＰＲであると考えることができる。ユニバーサルＣＰＲとは、本発明者らは、標的化結合ドメインがタグ結合ドメインであるために、単一のＣＰＲを使用して、本発明の前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ及び／又はエフェクターシャーシを任意の標的に指向することが可能であるＣＰＲの意味を含む。
【0128】
したがって、更なる態様では、本発明はまた、
ユニバーサルキメラ血小板受容体であって、受容体が、
ａ）血小板調節ドメインである細胞内ドメインと、
ｂ）異種タグ結合ドメインと、を含む、ユニバーサルキメラ血小板受容体を提供する。
ユニバーサルキメラ血小板受容体であって、受容体が、
ａ）血小板調節ドメインである細胞内ドメインと、
ｂ）異種タグ結合ドメインと、を含む、ユニバーサルキメラ血小板受容体を提供する。
【0129】
好ましくは、ユニバーサルＣＰＲへの標的化ペプチド上のタグの結合は、血小板調節ドメインを活性化するのに十分ではない。血小板調節ドメインは、標的へのＣＰＲ／標的化ペプチド複合体のその後の結合の際にのみ活性化されるべきである。
【0130】
ユニバーサルＣＰＲの特徴についての選好は、本明細書の他の場所で説明されているとおりである。例えば、血小板調節ドメインについての選好は、第１の態様、すなわちＣＰＲに関連して記載されているとおりである。
【0131】
ユニバーサルＣＰＲは、タンパク質性配列又はフラグメント又はドメインに特異的に結合することができるタグ結合ドメインを有する。
【0132】
タグ「に特異的」であるタグ結合ドメインは、当該タグ「に対して指向された」タグ結合ドメインと同義であることが意図される。
【0133】
好ましくは、タグ結合ドメインは、そのそれぞれの標的、例えば、タグ付標的化ペプチド上のタグにのみ結合し、環境中、例えば、ヒト身体内の任意の他の分子に結合しない。しかしながら、ある程度のオフターゲット結合が許容され得ることが理解され、当業者は、特定の結合活性が必要とされる特異性のものであるか否かを決定する方法を理解する。したがって、結合ドメインは、意図された標的に特異的に結合し得る一方で、非タグ分子にもいくらか低いレベルで結合する。
【0134】
好ましい実施形態では、タグはペプチドタグであり、より大きな標的化ペプチドの一部として発現され、より大きな標的化ペプチドの一体部分であり、すなわち、そのような実施形態では、タグ付標的化ペプチドは、タグ及び標的結合ドメインの両方を含む単一のペプチドである。
【0135】
「タグ」の概念は、分子生物学の分野において周知であり、ここで、目的のペプチド又はポリペプチド配列を発現することは日常的であり、この配列は、タグをコードする比較的短い更なる配列を含むように伸長されている。好適なペプチドタグの例としては、ＦＬＡＧタグ、Ｖ５タグ、Ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、スポットタグ、Ｔ７タグ、ＮＥタグ及びロイシンジッパーが挙げられる（Ｈｗａｎ ｅｔ ａｌ ２０１８ Ｃｅｌｌ １７３：１４２６－１４３８）。
【0136】
いくつかの実施形態では、タグ付標的化ペプチドは、非ペプチドタグ、例えば、ユニバーサルＣＰＲのタグ結合ドメインのための結合パートナーとして作用し得る任意の部分でタグ付けされ得る。したがって、非ペプチドタグは、タグ結合ドメインが親和性を有する任意の化学物質であり得る。タグは、例えば、任意の有機分子、小分子、又はハプテンから選択することができる。タグは、例えば核酸、例えばアプタマーの形態をとることができる。
【0137】
本明細書に記載されるようなペプチドタグは、典型的には短いペプチド配列（すなわち、アミノ酸の配列）である。好ましい実施形態では、本明細書中に記載のタグは、ペプチドタグ又はタンパク質タグ、例えば、アミノ酸の短い配列である。タグは、本発明のユニバーサルＣＰＲのタグ結合ドメインによって結合され得、好ましくは特異的に結合され得る限り、任意の配列であり得る。
【0138】
ユニバーサルＣＰＲは、標的への標的結合ドメインの同時結合の非存在下で、タグ付標的化ペプチドへの結合の際に活性化されないことが好ましい。上記のように、当業者は、ＩＴＡＭ及びＩＴＩＭ受容体などのいくつかの受容体が、細胞内シグナル伝達及び血小板活性化をもたらすために膜表面上でのある程度の受容体クラスター化を必要とすることを理解する。本発明のユニバーサルＣＰＲが可溶性タグ付標的化ペプチドに結合する場合、受容体のクラスター化はなく、したがってユニバーサルＣＰＲへのタグ付標的化ペプチドの結合は、血小板調節ドメインの活性化を誘発しない。ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体が標的に結合するときのみ、受容体クラスター化が起こり、したがって血小板調節ドメインの活性化が起こる。
【0139】
可溶性ペプチドの結合は、標的への同時結合の非存在下では、血小板調節ドメインの活性化を誘発しないと考えられるため、タグ付標的化ペプチドは、可溶性ペプチドであることが好ましい。
【0140】
上記のように、いくつかの実施形態では、血小板調節ドメインを活性化するために、ある程度の受容体クラスター化が必要とされる。いくつかの実施形態では、ユニバーサルＣＰＲは、タグ付標的化ペプチド上に存在するタグに結合するタグ結合ドメインを含み、ユニバーサルＣＰＲが血小板原形質膜に位置する場合、標的へのタグ付標的結合ドメインの同時結合の非存在下でのユニバーサルＣＰＲへのタグ付標的化ペプチドの結合は、血小板調節ドメインの活性化をもたらすのに十分な受容体クラスター化を引き起こさない。
【0141】
他の実施形態では、タグ（例えば、ペプチドタグ）は、タグ付標的化ペプチドを産生するために、より大きな標的化ペプチドの発現に続いて、より大きな標的化ペプチドにコンジュゲートされ得る。
【0142】
ユニバーサルＣＰＲに加えて、本発明はまた、対応するタグ付標的化ペプチドを提供する。タグ付標的化ペプチドは、タグ及び標的結合ドメインを含み、任意選択で、タグ付標的化ペプチドは、可溶性ペプチドである。標的結合ドメインに対する選好は、例えば、第１の態様（すなわち、ＣＰＲ）ではなく、本明細書の他の箇所に記載されているとおりである。
【0143】
本発明はまた、以下を含む複合体を提供する：
ａ）ユニバーサルＣＰＲであって、
ｉ）異種タグ結合ドメインと、
ｉｉ）血小板調節ドメインと、を含む、ユニバーサルＣＰＲ、及び
ｂ）ＣＰＲのタグ結合ドメインに結合することができるタグと、標的化ドメインと、を含む、タグ付標的化ペプチド。
ａ）ユニバーサルＣＰＲであって、
ｉ）異種タグ結合ドメインと、
ｉｉ）血小板調節ドメインと、を含む、ユニバーサルＣＰＲ、及び
ｂ）ＣＰＲのタグ結合ドメインに結合することができるタグと、標的化ドメインと、を含む、タグ付標的化ペプチド。
【0144】
本発明はまた以下を提供する：
異種標的結合ドメインを含む合成抗原提示受容体（ＳＡＰＲ）であって、標的結合ドメインが、
ａ）細胞外ドメインであって、
ｉ）ＭＨＣ－１タンパク質若しくはそのフラグメント、又はヒトＭＨＣ－１タンパク質若しくはそのフラグメントに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％若しくは１００％の配列同一性を有するタンパク質若しくはそのフラグメント、又は
ｉｉ）ＭＨＣ－２タンパク質若しくはそのフラグメント、又はヒトＭＨＣ－２タンパク質若しくはそのフラグメントに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％若しくは１００％の配列同一性を有するタンパク質若しくはそのフラグメントを含む、細胞外ドメインと、
ｂ）細胞内血小板調節ドメインであって、
当該
ＭＨＣ－１タンパク質若しくはそのフラグメント、又はヒトＭＨＣ－１タンパク質若しくはそのフラグメントに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％若しくは１００％の配列同一性を有するタンパク質若しくはそのフラグメント、又は
ＭＨＣ－２タンパク質若しくはそのフラグメント、又はヒトＭＨＣ－２タンパク質若しくはそのフラグメントに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％若しくは１００％の配列同一性を有するタンパク質若しくはそのフラグメントが、
Ｔ細胞受容体（T Cell Receptor、ＴＣＲ）に結合することができる、細胞内血小板調節ドメインと、を含む。
異種標的結合ドメインを含む合成抗原提示受容体（ＳＡＰＲ）であって、標的結合ドメインが、
ａ）細胞外ドメインであって、
ｉ）ＭＨＣ－１タンパク質若しくはそのフラグメント、又はヒトＭＨＣ－１タンパク質若しくはそのフラグメントに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％若しくは１００％の配列同一性を有するタンパク質若しくはそのフラグメント、又は
ｉｉ）ＭＨＣ－２タンパク質若しくはそのフラグメント、又はヒトＭＨＣ－２タンパク質若しくはそのフラグメントに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％若しくは１００％の配列同一性を有するタンパク質若しくはそのフラグメントを含む、細胞外ドメインと、
ｂ）細胞内血小板調節ドメインであって、
当該
ＭＨＣ－１タンパク質若しくはそのフラグメント、又はヒトＭＨＣ－１タンパク質若しくはそのフラグメントに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％若しくは１００％の配列同一性を有するタンパク質若しくはそのフラグメント、又は
ＭＨＣ－２タンパク質若しくはそのフラグメント、又はヒトＭＨＣ－２タンパク質若しくはそのフラグメントに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％若しくは１００％の配列同一性を有するタンパク質若しくはそのフラグメントが、
Ｔ細胞受容体（T Cell Receptor、ＴＣＲ）に結合することができる、細胞内血小板調節ドメインと、を含む。
【0145】
この態様の特徴についての選好は、他の箇所に記載されているとおりであり、例えば、血小板調節ドメインは、血小板活性化ドメイン、任意選択でＩＴＡＭを含むドメイン、任意選択で血小板ＩＴＡＭを含むドメイン（任意選択でＩＴＡＭを含むドメイン、任意選択で血小板ＩＴＡＭを含むドメインに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％又は１００％の配列同一性を有するドメインである）、又は血小板活性化ドメイン（任意選択で、血小板活性化ドメインは、脱顆粒誘発ドメインである）であり得るか、又は血小板の活性化を防止する血小板活性化阻害ドメインであり、任意選択で、血小板活性化阻害ドメインが、ＩＴＩＭを含むドメインであり、任意選択で、ＩＴＩＭを含むドメインに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％又は１００％の配列同一性を有するドメインである。いくつかの実施形態では、血小板調節ドメインは、ｉＰＳＣ、巨核球又は血小板に対して内因性である。
【0146】
いくつかの実施形態では、本発明のＳＡＰＲを使用して、Ｔ細胞の活性化及び特定の抗原に対する応答の誘導を誘発することができる。これらの例において、ＳＡＰＲの細胞外ドメインは、Ｔ細胞応答を誘発することが望まれる抗原、例えば病原体由来の抗原であるアミノ酸配列、及びＭＨＣ－１タンパク質若しくはＭＨＣ－ＩＩタンパク質又はそれらのフラグメントをコードするアミノ酸配列を含むか又はそれらからなる。ＭＨＣ－１は、ＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化し、ＭＨＣ－２は、ＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化する。Ｔ細胞は、抗原提示細胞の表面に通常発現されるＭＨＣ－１／抗原の複合体に結合するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む。このように、本明細書に記載の本発明のＳＡＰＲは、合成抗原提示受容体であると考えることができる。加えて、本明細書に記載され、エフェクターシャーシの表面に提示されるものなどの抗原ペプチドをロードされた本発明のＳＡＰＲを発現する前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ及び／又はエフェクターシャーシを使用して、ＴＧＦ－βなどの抗炎症性サイトカインの放出による破壊又は抑制のために自己免疫媒介Ｔ細胞を標的化することができる。追加的に、結合したＴ細胞をＴｒｅｇに分化転換させるために、ＦＯＸＰ３などの転写因子をコードするＲＮＡが放出され得る。
【0147】
ＭＨＣが操作された一本鎖バリアントであることは、当業者には明らかである。
【0148】
したがって、本発明は以下を提供する：
上記のようなＳＡＰＲであって、当該細胞外ドメインが、
ａ）ＭＨＣ－１タンパク質若しくはそのフラグメント、又はヒトＭＨＣ－１タンパク質若しくはそのフラグメントに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％若しくは１００％の配列同一性を有するタンパク質若しくはそのフラグメント、及び抗原ペプチド（当該ＭＨＣ－１タンパク質若しくはそのフラグメント、又はヒトＭＨＣ－１タンパク質若しくはそのフラグメントに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％若しくは１００％の配列同一性を有するタンパク質若しくはそのフラグメント、及び抗原ペプチドが、ＴＣＲに結合することができる）、並びに／又は
ｂ）ＭＨＣ－２タンパク質若しくはそのフラグメント、又はヒトＭＨＣ－１タンパク質若しくはそのフラグメントに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％若しくは１００％の配列同一性を有するタンパク質若しくはそのフラグメント、及び抗原ペプチド（当該ＭＨＣ－２タンパク質若しくはそのフラグメント、又はヒトＭＨＣ－１タンパク質若しくはそのフラグメントに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％若しくは１００％の配列同一性を有するタンパク質若しくはそのフラグメント、及び抗原ペプチドが、ＴＣＲに結合することができる）を含む、ＳＡＰＲ。
上記のようなＳＡＰＲであって、当該細胞外ドメインが、
ａ）ＭＨＣ－１タンパク質若しくはそのフラグメント、又はヒトＭＨＣ－１タンパク質若しくはそのフラグメントに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％若しくは１００％の配列同一性を有するタンパク質若しくはそのフラグメント、及び抗原ペプチド（当該ＭＨＣ－１タンパク質若しくはそのフラグメント、又はヒトＭＨＣ－１タンパク質若しくはそのフラグメントに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％若しくは１００％の配列同一性を有するタンパク質若しくはそのフラグメント、及び抗原ペプチドが、ＴＣＲに結合することができる）、並びに／又は
ｂ）ＭＨＣ－２タンパク質若しくはそのフラグメント、又はヒトＭＨＣ－１タンパク質若しくはそのフラグメントに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％若しくは１００％の配列同一性を有するタンパク質若しくはそのフラグメント、及び抗原ペプチド（当該ＭＨＣ－２タンパク質若しくはそのフラグメント、又はヒトＭＨＣ－１タンパク質若しくはそのフラグメントに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％若しくは１００％の配列同一性を有するタンパク質若しくはそのフラグメント、及び抗原ペプチドが、ＴＣＲに結合することができる）を含む、ＳＡＰＲ。
【0149】
これらの実施形態では、有用な効果は、ＭＨＣ－１／抗原複合体又はＭＨＣ－２／抗原複合体を含むか又はそれからなる細胞外ドメインを含むＳＡＰＲが、ＴＣＲ（この場合、ＴＣＲが標的である）に結合する場合に得られ、結果は、特定の抗原に対するＴ細胞応答の活性化である。
【0150】
いくつかの実施形態では、抗原ペプチドは、
ａ）がん、自己免疫状態、遺伝子疾患、心血管疾患及び／若しくは感染症に関連する、並びに／又は
ｂ）
ｉ）参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１５１５３１０２号の２０６～２０７頁の表Ｆ、２０８頁の表Ｇ、２０８～２０９頁の表Ｈ、２０９～２１１頁の表Ｉ、２１２頁の表Ｊ、２１９～２２１頁の表４、２２１～２３０頁の表５、２３１～２３４頁の表６、２３５～２４２頁の表７及び２４３頁の表８９（これらのセクションは参照により本明細書に組み込まれる）に列挙されている抗原ペプチド、又は
ｉｉ）国際公開第２０１５１５３１０２第の２０６～２０７頁の表Ｆ、２０８頁の表Ｇ、２０８～２０９頁の表Ｈ、２０９～２１１頁の表Ｉ、２１２頁の表Ｊ、２１９～２２１頁の表４、２２１～２３０頁の表５、２３１～２３４頁の表６、２３５～２４２頁の表７、及び２４３頁の表８９（これらのセクションは参照により本明細書に組み込まれる）に列挙される抗原ペプチドに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％若しくは１００％の配列同一性を有する配列から選択される、並びに／又は
ｃ）
ｉ）国際公開第２０１９／１２６８１８号の４７～８６頁の表１、３２１頁の表１４、３２１頁の表１５、３２７頁の表１６、３２８頁の表１７、３２８～３２９頁の表１８、２２１～２２３頁の表１９、３３３～３３４頁の表２０、３４０～３４２頁の表２１、３４４～３４７頁の表２２、３４７～３４８頁の表２３、及び３４９～３５２頁の表２４（これらのセクションは参照により本明細書に組み込まれる）に列挙されている抗原ペプチドに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％又は１００％の配列同一性を有する配列から選択される、又は
ｉｉ）国際公開第２０１９／１２６８１８号の４７～８６頁の表１、３２１頁の表１４、３２１頁の表１５、３２７頁の表１６、３２８頁の表１７、３２８～３２９頁の表１８、２２１～２２３頁の表１９、３３３～３３４頁の表２０、３４０～３４２頁の表２１、３４４～３４７頁の表２２、３４７～３４８頁の表２３、及び３４９～３５２頁の表２４（これらのセクションは参照により本明細書に組み込まれる）に列挙されている抗原ペプチドに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％又は１００％の配列同一性を有する配列から選択される、
ｄ）
ｉ）以下のタンパク質：ＭＯＧ、ＧＡＤ６５、ＭＡＧ、ＰＭＰ２２、ＴＰＯ、ＶＧＫＣ、ＰＬＰ、ＡＣｈＲ、ＴＲＩＢ２、ＮＭＤＡ、ＧｌｕＲ、ＧＡＤ２、ＡＲＭＣ９、ＣＹＰ２１Ａ２、ＣＡＳＲ、ＮＡＳＰ、インスリン、ＴＳＨＲ、甲状腺ペルオキシダーゼ、アシオグリコタンパク質受容体、ＣＹＰ２Ｄ６、ＬＦ、ＴＴＧ、Ｈ／Ｋ ＡＴＰ－ａｓｅ、第ＸＩＩＩ因子、ベータ２－ＧＰＩ、ＩＴＧＢ２、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＰ ＩＩｂ／ＩＩａ、ＣＯＬＩＩ、ＦＢＧベータアルファ、ＭＰＯ、ＣＹＯ、ＰＲＴＮ３、ＴＧＭ、ＣＯＬＶＩＩ、ＣＯＩＬ、ＤＳＧ１、ＤＳＧ３、ＳＯＸ１０、７０ＳＮＲＮＰ７０、ＳＡＧ及びａ３（ＩＶ）ＮＣ１コラーゲンのうちのいずれか１つ以上、又は
ｉｉ）以下のタンパク質：ＭＯＧ、ＧＡＤ６５、ＭＡＧ、ＰＭＰ２２、ＴＰＯ、ＶＧＫＣ、ＰＬＰ、ＡＣｈＲ、ＴＲＩＢ２、ＮＭＤＡ、ＧｌｕＲ、ＧＡＤ２、ＡＲＭＣ９、ＣＹＰ２１Ａ２、ＣＡＳＲ、ＮＡＳＰ、インスリン、ＴＳＨＲ、甲状腺ペルオキシダーゼ、アシオグリコタンパク質受容体、ＣＹＰ２Ｄ６、ＬＦ、ＴＴＧ、Ｈ／Ｋ ＡＴＰ－ａｓｅ、第ＸＩＩＩ因子、ベータ２－ＧＰＩ、ＩＴＧＢ２、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＰ ＩＩｂ／ＩＩａ、ＣＯＬＩＩ、ＦＢＧベータアルファ、ＭＰＯ、ＣＹＯ、ＰＲＴＮ３、ＴＧＭ、ＣＯＬＶＩＩ、ＣＯＩＬ、ＤＳＧ１、ＤＳＧ３、ＳＯＸ１０、７０ＳＮＲＮＰ７０、ＳＡＧ及びａ３（ＩＶ）ＮＣ１コラーゲンのうちのいずれか１つ以上に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％若しくは１００％の配列同一性を有する配列から選択される、ペプチド又はその抗原部分を含む。
ａ）がん、自己免疫状態、遺伝子疾患、心血管疾患及び／若しくは感染症に関連する、並びに／又は
ｂ）
ｉ）参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１５１５３１０２号の２０６～２０７頁の表Ｆ、２０８頁の表Ｇ、２０８～２０９頁の表Ｈ、２０９～２１１頁の表Ｉ、２１２頁の表Ｊ、２１９～２２１頁の表４、２２１～２３０頁の表５、２３１～２３４頁の表６、２３５～２４２頁の表７及び２４３頁の表８９（これらのセクションは参照により本明細書に組み込まれる）に列挙されている抗原ペプチド、又は
ｉｉ）国際公開第２０１５１５３１０２第の２０６～２０７頁の表Ｆ、２０８頁の表Ｇ、２０８～２０９頁の表Ｈ、２０９～２１１頁の表Ｉ、２１２頁の表Ｊ、２１９～２２１頁の表４、２２１～２３０頁の表５、２３１～２３４頁の表６、２３５～２４２頁の表７、及び２４３頁の表８９（これらのセクションは参照により本明細書に組み込まれる）に列挙される抗原ペプチドに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％若しくは１００％の配列同一性を有する配列から選択される、並びに／又は
ｃ）
ｉ）国際公開第２０１９／１２６８１８号の４７～８６頁の表１、３２１頁の表１４、３２１頁の表１５、３２７頁の表１６、３２８頁の表１７、３２８～３２９頁の表１８、２２１～２２３頁の表１９、３３３～３３４頁の表２０、３４０～３４２頁の表２１、３４４～３４７頁の表２２、３４７～３４８頁の表２３、及び３４９～３５２頁の表２４（これらのセクションは参照により本明細書に組み込まれる）に列挙されている抗原ペプチドに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％又は１００％の配列同一性を有する配列から選択される、又は
ｉｉ）国際公開第２０１９／１２６８１８号の４７～８６頁の表１、３２１頁の表１４、３２１頁の表１５、３２７頁の表１６、３２８頁の表１７、３２８～３２９頁の表１８、２２１～２２３頁の表１９、３３３～３３４頁の表２０、３４０～３４２頁の表２１、３４４～３４７頁の表２２、３４７～３４８頁の表２３、及び３４９～３５２頁の表２４（これらのセクションは参照により本明細書に組み込まれる）に列挙されている抗原ペプチドに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％又は１００％の配列同一性を有する配列から選択される、
ｄ）
ｉ）以下のタンパク質：ＭＯＧ、ＧＡＤ６５、ＭＡＧ、ＰＭＰ２２、ＴＰＯ、ＶＧＫＣ、ＰＬＰ、ＡＣｈＲ、ＴＲＩＢ２、ＮＭＤＡ、ＧｌｕＲ、ＧＡＤ２、ＡＲＭＣ９、ＣＹＰ２１Ａ２、ＣＡＳＲ、ＮＡＳＰ、インスリン、ＴＳＨＲ、甲状腺ペルオキシダーゼ、アシオグリコタンパク質受容体、ＣＹＰ２Ｄ６、ＬＦ、ＴＴＧ、Ｈ／Ｋ ＡＴＰ－ａｓｅ、第ＸＩＩＩ因子、ベータ２－ＧＰＩ、ＩＴＧＢ２、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＰ ＩＩｂ／ＩＩａ、ＣＯＬＩＩ、ＦＢＧベータアルファ、ＭＰＯ、ＣＹＯ、ＰＲＴＮ３、ＴＧＭ、ＣＯＬＶＩＩ、ＣＯＩＬ、ＤＳＧ１、ＤＳＧ３、ＳＯＸ１０、７０ＳＮＲＮＰ７０、ＳＡＧ及びａ３（ＩＶ）ＮＣ１コラーゲンのうちのいずれか１つ以上、又は
ｉｉ）以下のタンパク質：ＭＯＧ、ＧＡＤ６５、ＭＡＧ、ＰＭＰ２２、ＴＰＯ、ＶＧＫＣ、ＰＬＰ、ＡＣｈＲ、ＴＲＩＢ２、ＮＭＤＡ、ＧｌｕＲ、ＧＡＤ２、ＡＲＭＣ９、ＣＹＰ２１Ａ２、ＣＡＳＲ、ＮＡＳＰ、インスリン、ＴＳＨＲ、甲状腺ペルオキシダーゼ、アシオグリコタンパク質受容体、ＣＹＰ２Ｄ６、ＬＦ、ＴＴＧ、Ｈ／Ｋ ＡＴＰ－ａｓｅ、第ＸＩＩＩ因子、ベータ２－ＧＰＩ、ＩＴＧＢ２、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＰ ＩＩｂ／ＩＩａ、ＣＯＬＩＩ、ＦＢＧベータアルファ、ＭＰＯ、ＣＹＯ、ＰＲＴＮ３、ＴＧＭ、ＣＯＬＶＩＩ、ＣＯＩＬ、ＤＳＧ１、ＤＳＧ３、ＳＯＸ１０、７０ＳＮＲＮＰ７０、ＳＡＧ及びａ３（ＩＶ）ＮＣ１コラーゲンのうちのいずれか１つ以上に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％若しくは１００％の配列同一性を有する配列から選択される、ペプチド又はその抗原部分を含む。
【0151】
細胞外ドメインは、ヒト標的結合ドメイン配列、非ヒト標的結合ドメイン配列、任意選択で、ヒト化配列又はマウス由来の配列を含んでもよい。
【0152】
ＴＣＲへの結合時に、ＳＡＰＲが血小板調節ドメインの活性化を誘発する場合、有用であると考えられる。例えば、血小板調節ドメインが血小板活性化ドメインである場合、血小板はカーゴを放出するか、又は調節ドメインが活性化阻害ドメインである場合、血小板の活性化が阻害されてカーゴの放出が防止される。ＳＡＰＲがＴ細胞に結合した場合に脱顆粒を誘発することは、特定の標的化Ｔ細胞が自己免疫応答に関与する場合に有利であり得、例えば、これらの状況では、血小板が、Ｔ細胞結合時に局所的に放出されて最終的にＴ細胞を破壊する毒性物質を含むことが有益であり得る。
【0153】
他の実施形態では、脱顆粒時に放出されるカーゴは、Ｔ細胞を刺激して特定の方法で分化させることができる。
【0154】
好ましい実施形態では、血小板調節ドメインが血小板活性化ドメインであり、ＳＡＰＲが血小板の膜に存在する場合、活性化されると、血小板活性化ドメインは、
ａ）血小板の脱顆粒をもたらす、
ｂ）血小板からの内容物の放出をもたらす、
ｃ）血小板の原形質膜上に細胞内内容物の存在をもたらす、
ｄ）原形質膜からのブレブ形成を介した細胞外小胞の放出をもたらす、及び／又は
ｅ）両凹ディスクから完全に広がった細胞フラグメントへの血小板の形状の変化をもたらす。
ａ）血小板の脱顆粒をもたらす、
ｂ）血小板からの内容物の放出をもたらす、
ｃ）血小板の原形質膜上に細胞内内容物の存在をもたらす、
ｄ）原形質膜からのブレブ形成を介した細胞外小胞の放出をもたらす、及び／又は
ｅ）両凹ディスクから完全に広がった細胞フラグメントへの血小板の形状の変化をもたらす。
【0155】
いくつかの実施形態では、血小板調節ドメインが血小板活性化ドメインの阻害であり、ＳＡＰＲが血小板の膜に存在する場合、活性化されると、血小板活性化阻害ドメインは、
ａ）血小板の脱顆粒を防止する、
ｂ）血小板からの内容物の放出を防止する、
ｃ）血小板の原形質膜上の細胞内内容物の存在を防止する、
ｄ）原形質膜からのブレブ形成を介した細胞外小胞の放出を防止する、及び／又は
ｅ）両凹ディスクから完全に広がった細胞フラグメントへの血小板の形状の変化を防止する。
ａ）血小板の脱顆粒を防止する、
ｂ）血小板からの内容物の放出を防止する、
ｃ）血小板の原形質膜上の細胞内内容物の存在を防止する、
ｄ）原形質膜からのブレブ形成を介した細胞外小胞の放出を防止する、及び／又は
ｅ）両凹ディスクから完全に広がった細胞フラグメントへの血小板の形状の変化を防止する。
【0156】
上記のように、本発明は、異種標的結合ドメインを含むＳＡＰＲを提供し、標的結合ドメインは、ＭＨＣ－１若しくはＭＨＣ－２タンパク質又はそのフラグメントを含み、当該ＭＨＣ－１若しくはＭＨＣ－２タンパク質又はそのフラグメントは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）に結合することができる。
【0157】
いくつかの例では、ＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、又はユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、又はＳＡＰＲは、シグナルペプチド及び／又はリンカーも含み得る。シグナルペプチドの非限定的な例としては、以下が挙げられる。
【0158】
【表2】
【0159】
ＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ及び／又はｅＰＡＲは、表６中のシグナルペプチド又は当該技術分野において知られているシグナルペプチドの部分を含み得る。この部分は、配列番号２、１１、１６、２５、３０、３５、３９、及び４４などであるが、これらに限定されない、表６の配列のうちのいずれかの１０～３０、１０～１５、１０～２０、１０～２５、１５～２０、１５～２５、１５～３０、２０～２５、又は２０～３０ヌクレオチドであり得る。この部分は、参照により本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０２０／０５３２４７号の４６頁の表７に記載の配列番号２、１１、１６、２５、３０、３５、３９、及び４４などであるが、これらに限定されない、参照により本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０２０／０５３２４７号の４６頁の表７の配列のうちのいずれかの１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドであり得る。
【0160】
いくつかの実施形態では、ＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、及び／又はＳＡＰＲは、膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、参照により本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０２０／０５３２４７号の４９～５０頁に記載されている膜貫通ドメイン又はその部分のうちのいずれか１つ以上を含むか又はそれからなる。
【0161】
いくつかの実施形態では、ＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体及び／又はＳＡＰＲは、参照により本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０２０／０５３２４７号の５０頁及び５１頁に記載されている細胞内ドメイン又はその部分を含むか又はそれからなる細胞内ドメインを含む。
【0162】
いくつかの実施形態では、ＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、及び／又はＳＡＰＲは、リンカーを含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、参照により本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０２０／０５３２４７号の５１頁に記載されているリンカー又はその部分を含むか又はそれからなる。
【0163】
いくつかの実施形態では、本発明のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、及び／又はＳＡＰＲは、参照により本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０２０／０５３２４７号の４１～６３頁に記載されているドメインの組み合わせを含むか又はそれからなる。
【0164】
本発明は、特定の部位／標的に対する血小板の活性化を指示する更なる受容体を提供する。これらの受容体は、プロテアーゼ活性化受容体（protease activated receptor、ＰＡＲ）に基づく。
【0165】
本発明は、プロテアーゼ認識部位が、天然の認識部位を切断するプロテアーゼではないプロテアーゼによって切断されるように操作されている、操作されたプロテアーゼ活性化受容体（ｅＰＡＲ）を提供する。例えば、ｅＰＡＲが操作されたＰＡＲ１である場合、ｅＰＡＲはトロンビンによって切断されない。
【0166】
いくつかの実施形態では、ｅＰＡＲが血小板の原形質膜に存在する場合、プロテアーゼ認識部位の切断は、
ａ）血小板の脱顆粒、
ｂ）血小板からの内容物の放出、
ｃ）血小板の原形質膜上の細胞内内容物の存在、
ｄ）原形質膜からのブレブ形成を介した細胞外小胞の放出、及び／又は
ｅ）両凹ディスクから完全に広がった細胞フラグメントへの血小板の形状の変化をもたらす。
ａ）血小板の脱顆粒、
ｂ）血小板からの内容物の放出、
ｃ）血小板の原形質膜上の細胞内内容物の存在、
ｄ）原形質膜からのブレブ形成を介した細胞外小胞の放出、及び／又は
ｅ）両凹ディスクから完全に広がった細胞フラグメントへの血小板の形状の変化をもたらす。
【0167】
この場合の血小板とは、ｅＰＡＲを発現する以外に操作されていないベース血小板を意味し、すなわち、正常に機能する血小板において、ｅＰＡＲの切断は、上記（ａ）～（ｅ）のいずれか１つ以上をもたらす。これは、ｅＰＡＲが本発明のｅＰＡＲであり、適切な機能特性を有するかどうかを当業者が決定することができる１つの簡単な手段である。当然ながら、好ましい実施形態では、本発明のｅＰＡＲは、本発明のシャーシ、例えば、本明細書に記載されるようなエフェクターシャーシ中に存在する場合、例えば、１つ以上の経路を調節する、例えば、
ｉ）血小板炎症シグナル伝達経路を破壊すること、
ｉｉ）操作されたシャーシの免疫原性を低下させること、並びに／又は
ｉｉｉ）シャーシの１つ以上の基本機能を増強若しくは破壊することなどの１つ以上の経路を調節する（１つ以上又は基本機能は、自然免疫応答及び／若しくは適応免疫応答、炎症、血管新生、アテローム性動脈硬化症、リンパ発達及び／若しくは腫瘍成長に関与する）、並びに／又は
ｉｖ）血小板血栓形成経路を破壊するように操作されている、上記の（ａ）～（ｅ）のいずれか１つをもたらすことが当業者に明らかである。
ｉ）血小板炎症シグナル伝達経路を破壊すること、
ｉｉ）操作されたシャーシの免疫原性を低下させること、並びに／又は
ｉｉｉ）シャーシの１つ以上の基本機能を増強若しくは破壊することなどの１つ以上の経路を調節する（１つ以上又は基本機能は、自然免疫応答及び／若しくは適応免疫応答、炎症、血管新生、アテローム性動脈硬化症、リンパ発達及び／若しくは腫瘍成長に関与する）、並びに／又は
ｉｖ）血小板血栓形成経路を破壊するように操作されている、上記の（ａ）～（ｅ）のいずれか１つをもたらすことが当業者に明らかである。
【0168】
したがって、いくつかの実施形態では、本発明のｅＰＡＲが本発明のエフェクターシャーシの膜に存在する場合、プロテアーゼ部位の切断は、
ａ）血小板の脱顆粒、
ｂ）血小板からの内容物の放出、
ｃ）血小板の原形質膜上の細胞内内容物の存在、
ｄ）原形質膜からのブレブ形成を介した細胞外小胞の放出、及び／又は
ｅ）両凹ディスクから完全に広がった細胞フラグメントへの血小板の形状の変化をもたらす。
ａ）血小板の脱顆粒、
ｂ）血小板からの内容物の放出、
ｃ）血小板の原形質膜上の細胞内内容物の存在、
ｄ）原形質膜からのブレブ形成を介した細胞外小胞の放出、及び／又は
ｅ）両凹ディスクから完全に広がった細胞フラグメントへの血小板の形状の変化をもたらす。
【0169】
いくつかの実施形態では、プロテアーゼの切断は、ｅＰＡＲのフラグメントの放出をもたらし、ｅＰＡＲのフラグメントは、シグナル伝達分子であり、細胞内シグナル伝達をもたらす。
【0170】
いくつかの実施形態では、ｅＰＡＲは、腫瘍微小環境において典型的に見出されるプロテアーゼによって切断されるように操作される。例えば、場合によっては、ｅＰＡＲは、マトリックスメタロプロテアーゼ、メタロペプチダーゼ、カテプシンＢ、ウロキナーゼ又はカスパーゼによって切断されるように操作される。
【0171】
いくつかの実施形態では、ｅＰＡＲは、直交性プロテアーゼによって切断されるように操作される。ヒト対象に対して非直交性であると考えられるプロテアーゼとしては、タバコエッチウイルス核封入－ａエンドペプチダーゼ（ＴＥＶプロテアーゼ）、Ｃ型肝炎ウイルスのＮＳ２－３プロテアーゼ（ＨＣＶプロテアーゼ）、又はタバコ葉脈斑紋ウイルス（ＴＶＭＶプロテアーゼ）などのウイルスプロテアーゼが挙げられる。操作されたプロテアーゼ受容体に導入されるプロテアーゼ認識部位は、ＴＥＶプロテアーゼ、ＨＣＶプロテアーゼ、及び／又はＴＶＭＶプロテアーゼのウイルスプロテアーゼ認識部位を含む。
【0172】
例えば、ｅＰＡＲがヒト身体の状況において使用される場合、ｅＰＡＲは、ヒトプロテアーゼではないプロテアーゼによって切断されるように操作され、すなわち、これらの実施形態では、ｅＰＡＲは、対象が対応する「外因性」プロテアーゼにも投与されるか、又は他の方法で曝露されない限り、対象において切断され得ない。本明細書における開示から明らかであるように、そのような外因性プロテアーゼは、第２のシャーシ（例えば、本明細書に記載されるような第２の前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシ）に存在するカーゴであり得る。この場合、第１のシャーシ（例えば、前駆体シャーシ、本明細書に記載されるような前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシ）は、第１のカーゴ及び本発明のｅＰＡＲを含み、第２のシャーシ（例えば、前駆体シャーシ、本明細書に記載されるような前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシ）は、本発明によるＣＰＲ及びｅＰＡＲを切断することができるプロテアーゼであるカーゴを含む。ＣＰＲ結合及び血小板活性化の際に、プロテアーゼが放出され、近傍にあるｅＰＡＲを切断し、例えば毒性カーゴであり得る第１のカーゴの放出をもたらす。このようにして、第１のカーゴは、意図された標的部位のみに放出される。このダブルフェイルセーフアプローチは、オフターゲット効果を低減する重要な安全性特徴であると考えることができる。カーゴは、第２のエフェクターシャーシが、それ自体が標的の近傍にのみ存在するプロテアーゼの近傍にある場合にのみ放出される。
【0173】
これは、本明細書に記載されるような前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシ及び本発明の受容体を使用して組み立てられ得るネットワーク及びシステムの多くの例のうちの１つにすぎない。
【0174】
この機構を利用して、ｅＰＡＲ、ＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ及び／又はｅＰＡＲの異なる組み合わせを発現する本明細書に記載されるような前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシ間のシグナル伝達ネットワークを構築することができる。いくつかの実施形態では、切断されたｅＰＡＲは、膜貫通ドメイン及び／又は細胞内ドメインを介してシグナルを伝播する。したがって、この様式でのｅＰＡＲの活性化は、操作された血小板又は操作された血小板様膜結合エフェクターシャーシの場合、血小板動員、血小板活性化、又は腫瘍微小環境への治療的分子などのカーゴの放出を含む下流シグナル伝達事象を誘導する。
【0175】
いくつかの実施形態では、ｅＰＡＲは、操作されたＧＰＣＲである。いくつかの実施形態では、ｅＰＡＲは、ＰＡＲ１、ＰＡＲ２、ＰＡＲ３、又はＰＡＲ４であり、プロテアーゼ部位は、トロンビン以外のプロテアーゼによって切断されるように操作されており、任意選択で、ＭＭＰ、カテプシンＢ、ウロキナーゼ又はカスパーゼによって切断される。
【0176】
プロテアーゼによる切断の際に、いくつかの実施形態では、ｅＰＡＲの部分が放出される。いくつかの実施形態では、切断の際に放出されるｅＰＡＲの部分は、シグナル伝達分子である。
【0177】
いくつかの実施形態では、ｅＰＡＲは、ＧＰＣＲであり、任意選択で、操作されたＰＡＲ１、ＰＡＲ２、ＰＡＲ３又はＰＡＲ４であり、任意選択で、ＰＡＲ１、ＰＡＲ２、ＰＡＲ３又はＰＡＲ４の配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％又は１００％の配列同一性を有する。
【0178】
本明細書における開示から、本発明のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲは、１つ以上の疾患の治療又は予防において役割を有することが明らかである。例えば、本発明の１つ以上のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲ、並びに本明細書に記載されるような前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシの組み合わせを使用して、ＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲ上の標的結合ドメインによって、体内の特定の部位、又は特定の組織若しくは細胞種、例えばがん細胞にカーゴを送達することができる。好ましい実施形態では、エフェクターシャーシは、１つ以上のカーゴを含み、本発明の１つ以上のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲを発現する、血小板又は血小板様膜結合細胞フラグメントであり、ＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲは、標的結合ドメインが標的に結合すると、血小板が脱顆粒し、カーゴを標的部位に送達するようなものである。カーゴは、本明細書に記載されるような治療的カーゴであってもよい。
【0179】
いくつかの実施形態では、本発明のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲは、疾患を媒介する自己反応性Ｔ細胞によって認識される領域を含む。例えば、ＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲは、自己反応性Ｔ細胞を直接標的化するためにＭＨＣ－ＩＴＡＭ融合物にロードされた、参照により本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０２０／０５３２４７号の１２９～１３４頁に提示されている表１２～２０中の分子標的由来のエピトープを含む。操作された血小板は、血小板の活性化時に放出される細胞傷害性又は免疫抑制タンパク質又は抗体をロードすることができる。
【0180】
例えば、１型糖尿病（Ｔ１ＤＭ）の一部の症例は、特定のインスリンペプチドに特異的なＴ細胞を特徴とする。したがって、免疫抑制因子を放出するように設計された血小板において、自己免疫駆動ペプチドとともにＭＨＣ１－ＩＴＡＭ受容体融合タンパク質を使用すると、Ｔ細胞特異的免疫抑制がもたらされる。ＩＬ－２を競合するＩＬ－２受容体（ＩＬ－２Ｒ）の曝露、ＴＧＦ－β１又はＩＬ－１０の放出、及びＭＨＣ１－ＩＴＡＭ活性化に関する他の多くの潜在的なオプションは、制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞と同様に免疫抑制を仲介する。
【0181】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるような前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ若しくはエフェクターシャーシ、又は本明細書に記載されるような操作された前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ若しくはエフェクターシャーシは、ＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲと、主要組織適合性複合体（major histocompatibility complex、ＭＨＣ）クラスＩ又はクラスＩＩとを含み、自己免疫疾患の治療において使用することができる。病原性Ｔ細胞受容体のＭＨＣリガンドをＣＡＲの抗原結合ドメインとして含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するＴ細胞は、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）の治療に有効であることが以前に示されている（Ｐｅｒｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１４３，６０９－６１７を参照し、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。Ｔ１Ｄでは、自己反応性ＣＤ８及びＣＤ４Ｔ細胞は、膵臓のインスリン産生Ｂ細胞を選択的に破壊する（同上）。自己反応性細胞によって認識されるＭＨＣ－ＩＩ制限ペプチドのいくつかは、インスリン／プレプロインスリン、膵島特異的グルコース－６－ホスファターゼ触媒サブユニット関連タンパク質、グルタミン酸デカルボキシラーゼ６５及び６７、熱ショックタンパク質６０及び７０、インスリノーマ関連タンパク質２、亜鉛トランスポーターＺｎＴ８、膵島アミロイドポリペプチド、クロモグラニンＡ、及びその他の自己抗原に由来することが観察されている（同上）。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の操作された血小板は、自己反応性細胞と相互作用して細胞を破壊するリガンド又はそのフラグメントを有するＣＰＲを含む。
【0182】
本発明はまた、本発明のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、タグ付標的化ペプチド、ＳＡＰＲ及び／又はｅＰＡＲをコードする核酸を提供する。本発明は、単一核酸分子中にユニバーサルＣＰＲ及びタグ付標的結合ペプチドの両方をコードする核酸を提供する。好ましい例では、ＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ及び／又はｅＰＡＲは、天然に存在する受容体ではなく、したがって、当該受容体をコードする核酸も天然に存在する核酸ではない。いくつかの実施形態では、核酸は、本発明のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ及び／又はｅＰＡＲをコードし、異種核酸配列も含む。場合によっては、核酸は、発現制御配列に作動可能に連結されている。発現制御配列は、エンハンサー及びプロモーターなどの成分を含むと考えられている。一実施形態では、本発明の核酸は、異種プロモーターを含む。同じ又は異なる実施形態では、本発明の核酸は、異種エンハンサー配列を含む。
【0183】
いくつかの実施形態では、核酸は、ＤＮＡである。いくつかの実施形態では、核酸は、ＲＮＡであり、例えば、ｍＲＮＡである。いくつかの実施形態では、核酸は、プロモーター、すなわち核酸からの発現を駆動するプロモーターによって作動可能に制御されるように配置される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、巨核球特異的プロモーター又は血小板特異的プロモーターではない。いくつかの実施形態では、プロモーターは、巨核球特異的プロモーター又は血小板特異的プロモーターを含む。巨核球特異的プロモーター及び血小板特異的プロモーターという用語は、同義に使用される。当業者は、巨核球特異的プロモーター及び血小板特異的プロモーターという用語が何を意味するかを理解する。いくつかの実施形態では、核酸は、異種発現配列、任意選択で異種プロモーターに作動可能に連結される。
【0184】
いくつかの実施形態では、プロモーターは、誘導性プロモーター、例えば、意図される対象において誘導性であるプロモーターである。例えば、ＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、タグ付標的化ペプチド、ＳＡＰＲ及び／又はｅＰＡＲがヒト対象における使用のためのものである場合、ＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、タグ付標的化ペプチド、ＳＡＰＲ及び／又はｅＰＡＲの発現を駆動するプロモーターは、いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターである。
【0185】
いくつかの実施形態では、プロモーターは、構成的プロモーター、例えば、意図される対象において構成的であるプロモーターである。例えば、ＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、タグ付標的化ペプチド、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲがヒト対象における使用のためのものである場合、ＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、タグ付標的化ペプチド、ＳＡＰＲ及び／又はｅＰＡＲの発現を駆動するプロモーターは、いくつかの実施形態では、構成的プロモーターである。
【0186】
本発明はまた、本発明のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、タグ付標的化ペプチド、ＳＡＰＲ及び／又はｅＰＡＲをコードする核酸を含むベクターを提供する。ベクトルには、プラスミドの意味が含まれる。いくつかの実施形態では、ベクターはまた、異種核酸を含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、プロモーター、例えば巨核球特異的プロモーターを含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、血小板特異的プロモーターを含む。
【0187】
本発明はまた、本発明の核酸のうちの任意の１つ以上を含むウイルス粒子又はウイルスベクターを提供する。
【0188】
「操作する」とは、本発明者らは、遺伝子配列及び／又はタンパク質配列に影響を及ぼすことができる任意の操作の意味を含み、例えば、本発明者らは、例えば、ＣＲＩＳＰＲベースの核酸編集及び相同組換えを使用して、核酸レベルで行われる操作を含み、本発明者らはまた、翻訳レベルで行われる操作、例えば、ＲＮＡｉを介した翻訳の抑制も含む。
【0189】
上記のように、本発明は、ＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ及びｅＰＡＲを提供する。これらは全て、細胞又は血小板の表面膜内に存在し、特定の標的（例えば、がん新抗原若しくはＴＣＲ）に結合し、かつ／又は特異的プロテアーゼによって切断される受容体であり、これは、カーゴアンロード、Ｔ細胞の活性化、又は他の細胞内シグナル伝達事象をもたらし得る、その後の血小板調節事象を誘発する。したがって、例えば、体内の特定の細胞若しくは組織へのカーゴの送達を指示するために、又はＴ細胞を活性化するために実際に使用される場合、ＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲは、エフェクターシャーシの分脈で配置され、ＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲは、エフェクターシャーシの原形質膜に局在化される。
【0190】
上記のように、血小板は、それらを標的化送達ビヒクルとしての使用に有利にする固有の特性を有する。
【0191】
プロデューサーシャーシへの前駆体シャーシの分化を駆動することが意図される修飾（例えば、フォワードプログラミング）は、任意の方法によって実行され得、遺伝子（例えば、転写因子）のノックインを伴い得る。各特定の遺伝子ノックインは、いくつかの方法で導入することができ、例えば、第１の遺伝子を第１の遺伝子座の第１の対立遺伝子に導入することができ、かつ／又は第１の遺伝子を第１の遺伝子座の第２の対立遺伝子に導入することができる。追加的に又は代替的に、第１の遺伝子を第１の遺伝子座の第１の対立遺伝子に導入することができ、第２の遺伝子を第２の遺伝子座の第１の対立遺伝子に導入することができる。追加的に又は代替的に、第１の遺伝子を第１の遺伝子座の第１の対立遺伝子に導入することができ、第２の遺伝子を第１の遺伝子座の第２の対立遺伝子に導入することができる。これらの様々な組み合わせは、タンパク質コード遺伝子の導入に適用され、また、機能的ＲＮＡコード配列（例えば、ＲＮＡｉに関与するＲＮＡ配列をコードする配列）の導入にも適用される。各遺伝子は、構成的プロモーター及び誘導性プロモーターの組み合わせの下で導入され得る。
【0192】
本明細書で言及される操作工程は、前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ及び／又はエフェクターシャーシのうちのいずれかにおいて実行することができるが、当業者であれば、血小板及び血小板様膜結合細胞フラグメントは核を含まず、したがって血小板又は血小板様膜結合細胞フラグメントの核酸を操作することは不可能であり、代わりに、操作は、典型的には、血小板又は血小板様膜結合細胞フラグメントを産生するプロデューサーシャーシ（例えば、巨核球）に分化する上流シャーシのうちの１つ以上において行われる、すなわち、操作工程は、典型的には、前駆体シャーシ又はプロデューサーシャーシにおいて行われることを理解する。血栓形成経路などの経路を破壊するいくつかの手段は、血小板と適合性であり、例えば、ｓｉＲＮＡを血小板において使用して、特定のｍＲＮＡからの発現を防止することができ、したがって、場合によっては、エフェクターシャーシを直接操作することが適切である。
【0193】
本明細書に記載の前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシを操作することに関する本明細書における「操作すること」への言及は、シャーシ中の１つ以上の遺伝子又はタンパク質の機能を望ましい方法で調節する任意の適切な手段を指すと解釈されるべきである。例えば、いくつかの実施形態は、操作することは、タンパク質の発現を低減又は阻害することであり、いくつかの実施形態では、操作することは、特定のタンパク質の発現を増加させることである。前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシは、任意の数の修飾を有するように操作されてもよく、例えば、任意の数のタンパク質の発現を破壊若しくは阻害するように、かつ／又は任意の数のタンパク質の発現を増加させるように操作されてもよい。遺伝子発現を破壊する例示的な手段としては、ＤＮＡレベル、転写レベル、翻訳レベル及び翻訳後レベルで作用するものが挙げられ、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（transcription activator-like effector nuclease、ＴＡＬＥＮ）、ＲＮＡ干渉構築物（ＲＮＡｉ）（例えば、低分子干渉ＲＮＡ（small interfering RNA、ｓｉＲＮＡ）若しくはマイクロＲＮＡ（short hairpin RNA、ｍｉＲＮＡ））、又は短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）が挙げられる。最終的な遺伝子産物（例えば、遺伝子がタンパク質コード遺伝子であるタンパク質、又は遺伝子若しくは核酸が活性ＲＮＡをコードするＲＮＡ）の発現を防止する任意の手段が、適切であると考えられる（ただし、方法がシャーシを死滅させないことを条件とする）。イントラボディ技術を使用して、遺伝子発現を調節することもできる。
【0194】
本発明者らは、遺伝子配列及び／又はタンパク質配列に影響を及ぼすことができる任意の操作の意味を含み、例えば、本発明者らは、ゲノムレベルで行われる操作、例えば、ＣＲＩＳＰＲベースの核酸編集及び相同組換えを使用して、例えば、前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシのゲノム核酸において修飾、欠失、置換などを行うことを含み、本発明者らはまた、翻訳レベルで行われる操作、例えば、ＲＮＡｉ又はｓｉＲＮＡを介した翻訳の抑制を含む。例えば、本明細書に記載されるような操作された前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシは、１つ以上の遺伝子欠失、単一の変異若しくは挿入、遺伝子ノックイン、プロモーター置換などを有し得るか、又はＲＮＡｉなどの１つ以上の調節分子を発現してもよい。本発明者らはまた、例えば、特定のタンパク質のリン酸化などの修飾を行うことによって、タンパク質レベルで修飾を行うことを含む。修飾の全ての方法がここに包含される。好ましくは、修飾は、ゲノムレベルで行われる。少なくとも本開示を考慮して、当業者は、本明細書に記載されるような操作された前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシの文脈において「操作すること」によって意味されるものを理解する。
【0195】
対象に投与される最終的な実体は、エフェクターシャーシ、例えば、血小板、又は血小板様膜結合細胞フラグメント（例えば、好ましい実施形態では、血小板の天然のシグナル伝達経路のうちの１つ以上を破壊するように、例えば、血栓形成経路を破壊するように操作されたカーゴを送達するために使用される血小板）であり、骨髄幹細胞、巨核芽球、巨核球又はｉＰＳＣを含む一連のますます分化する細胞に由来するか、又は核自体を含まない。血小板又は血小板様膜結合細胞フラグメントにおいてどのタンパク質が発現されるかを最終的に決定するのは骨髄幹細胞、巨核芽球、巨核球又はｉＰＳＣにおける修飾であるため、血小板の核酸の修飾への言及は、前駆体シャーシ及びプロデューサーシャーシ、例えば骨髄幹細胞、巨核芽球、巨核球又はｉＰＳＣへの修飾を包含することが意図されることは、当業者には明らかである。
【0196】
場合によっては、特定の経路において遺伝子全体をノックアウト又は削除する必要がないことは明らかである。例えば、ＧＰ１ｂノックアウトは、異常な血小板をもたらすが、受容体の細胞外ドメインのみを削除（機能する能力を削除）し、細胞内ドメインを保持することができ、その結果、ＧＰ１ｂ標的のフォンウィルブランド因子に結合する能力を欠く典型的な血小板をもたらす。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の破壊、欠失、又はノックアウトは、遺伝子全体の完全な破壊、欠失、又はノックアウトである。他の実施形態では、破壊、欠失及びノックアウトは、破壊欠失及び機能的ノックアウト、すなわちタンパク質の機能の破壊であり、いくつかの実施形態では、欠失は、タンパク質の細胞外ドメインの欠失である。
【0197】
「血小板様膜結合細胞フラグメント」という用語は、場合によっては、構造を血小板として分類するために日常的に使用される生物学的マーカー及び機能の多くが意図的に破壊されており、したがって、操作された血小板を標準的な定義に従って「血小板」として分類することができない可能性があるという事実を包含することが意図される。例えば、血小板凝集は、臨床試料中の血小板機能を決定するために使用される。場合によっては、本明細書に記載されるように、血小板の血栓形成系が破壊されているため、操作された血小板は凝集することができない。そのような場合、そのような実体を「血小板」と呼ぶことは、標準的な定義とは反対であり得る。本明細書において、血小板又は血小板様膜結合細胞フラグメントは、血小板が作製される典型的な方法でのフラグメント化によって巨核球又は巨核球様細胞から産生される実体として本明細書において定義される。したがって、一実施形態では、血小板様膜結合細胞フラグメントは、１つ以上のシグナル伝達経路を破壊するように、例えば血栓形成経路を破壊するように操作された巨核球から産生される細胞フラグメントとして定義される。同様に、破壊され得る経路に起因して、操作された巨核球は、巨核球の標準的な定義に適合しない場合があり、なぜなら、いくつかの実施形態では、定義マーカー又は機能のうちの１つ以上が、操作された巨核球において破壊され得るからである。したがって、場合によっては、巨核球様細胞という用語が好ましい場合がある。当業者は、巨核球又は巨核球様細胞が必要な機能、すなわち血小板又は血小板様膜細胞フラグメントを産生する能力を保持しているかどうかを決定することができる。操作された巨核球又は巨核球様細胞は、偽足伸長（pseudopodal extension）をもたらす能力を保持するはずである。
【0198】
巨核球などのプロデューサーシャーシ及び血小板などのエフェクターシャーシはまた、チューブリン－ＴＵＢＢ１（ベータ１－チューブリン）の特異的アイソフォームを発現する（又はそうでなければ含む）。ＴＵＢＢ１は、血小板細胞骨格を形成する微小管の成分である。例えば、血小板は核を含まないが、例えば、ＴＵＢＢ１ ｍＲＮＡの翻訳を介して、又は血小板がＴＵＢＢ１を発現する巨核球などのプロデューサーシャーシのフラグメントであることによって、血小板は依然としてＴＵＢＢ１タンパク質を含む。ＴＵＢＢ１は、血小板の機能に必要であり、したがって、前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシ、例えば、巨核球又は血小板を同定するために典型的に使用されるマーカーのうちのいくつかを除去するように操作された、操作された前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシが、依然として実際に本明細書に記載されるような前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシであるかどうかを決定するために使用するための、当業者にとって有用なマーカーであると考えられる。したがって、いくつかの実施形態では、前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシ、例えば、血小板若しくは血小板様膜結合細胞フラグメント、又は巨核球様細胞は、ＴＵＢＢ１を発現する。例えば、Ｓｃｈｗｅｒ ｅｔ ａｌ ２００１ Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ １１：５７９－５８６ ａｎｄ Ｋｕｎｉｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ ２００９ Ｂｌｏｏｄ １１３：４５８－４６１を参照されたい。
【0199】
当業者は、「ＴＵＢＢ１を発現する」とは、血小板産生に必要とされるＴＵＢＢ１の必要な機能を保持するＴＵＢＢ１バリアントの意味を含み、すなわち、ＴＵＢＢ１は、天然に存在するＴＵＢＢ１配列と比較して多くの変異又は置換を含み得るが、ＴＵＢＢ１機能を保持することを理解する。したがって、いくつかの実施形態では、シャーシがＴＵＢＢ１を含むと述べることがより適切である。
【0200】
本明細書に記載の前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシは、１つ以上のシグナル伝達経路を破壊するように操作されてもよく（巨核球への分化を指示するために必要な任意の操作、例えば、シャーシの分化を駆動するための操作、例えば、細胞をフォワードプログラムするための操作に加えて）、又は１つ以上のシグナル伝達経路を破壊するように操作されなくてもよい。１つ以上のシグナル伝達経路を破壊するように操作されていない前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシは、１つ以上のタンパク質を発現するように、又は１つ以上の変異若しくは他の修飾を含むように更に操作され得る。例えば、１つ以上のシグナル伝達経路を破壊するように操作されていない前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシは、本明細書に記載のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲのうちの１つ以上を発現するように更に操作され得る。１つ以上のシグナル伝達経路を破壊するように操作されていない前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシは、追加的に又は代替的に、分化のための関連遺伝子、例えばフォワードプログラミングに必要な遺伝子をノックインするように操作されていてもよい。
【0201】
したがって、一実施形態では、本発明は、本明細書に記載されるような前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシ、例えば、骨髄幹細胞、巨核芽球、巨核球、巨核球様細胞、ｉＰＳＣ、脂肪細胞、脂肪由来間葉系間質／幹細胞株（ＡＳＣＬ）、血小板又は血小板様膜結合細胞フラグメントを提供し、
以下を含む：
本発明による１つ以上のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ、若しくはｅＰＡＲＳ；
本発明によるＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ＳＡＰＲ、若しくはｅＰＡＲをコードする前述の請求項のいずれか一項に記載の１つ以上の核酸；
本発明によるＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ＳＡＰＲ若しくはｅＰＡＲをコードする前述の請求項のいずれか一項に記載の１つ以上の核酸を含む、前述の請求項のいずれか一項に記載の１つ以上のベクター；及び／又は
本発明によるＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ＳＡＰＲ、若しくはｅＰＡＲをコードする本発明による１つ以上の核酸を含む、本発明による１つ以上のウイルスベクター。
以下を含む：
本発明による１つ以上のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ、若しくはｅＰＡＲＳ；
本発明によるＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ＳＡＰＲ、若しくはｅＰＡＲをコードする前述の請求項のいずれか一項に記載の１つ以上の核酸；
本発明によるＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ＳＡＰＲ若しくはｅＰＡＲをコードする前述の請求項のいずれか一項に記載の１つ以上の核酸を含む、前述の請求項のいずれか一項に記載の１つ以上のベクター；及び／又は
本発明によるＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ＳＡＰＲ、若しくはｅＰＡＲをコードする本発明による１つ以上の核酸を含む、本発明による１つ以上のウイルスベクター。
【0202】
これらの実施形態では、前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシ、例えば、骨髄性幹、巨核芽球、巨核球、巨核球様細胞、ｉＰＳＣ、脂肪細胞、脂肪由来間葉系間質／幹細胞株（ＡＳＣＬ）、血小板又は血小板様膜結合細胞片は、「ベース」シャーシに非常に類似しており、例えば、ヒト体内で天然に見出される血小板に非常に類似しており、違いは、前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシが、本明細書に記載の１つ以上のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲを発現するように操作されていることである。前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシはまた、分化を駆動するように操作されていてもよく、例えば、フォワードプログラムされていてもよい。
【0203】
いくつかの実施形態では、前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシ、例えば、骨髄幹細胞、巨核芽球、巨核球、巨核球様細胞、ｉＰＳＣ、脂肪細胞、脂肪由来間葉系間質／幹細胞株（ＡＳＣＬ）、血小板又は血小板様膜結合細胞フラグメントは、
１つ以上のシグナル伝達経路を調節するように操作されておらず、任意選択で、血栓形成経路を破壊するように操作されておらず、かつ／又は血小板炎症シグナル伝達経路を破壊するように操作されておらず、かつ／又は操作された前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ若しくはエフェクターシャーシの免疫原性を低下させるように操作されていない、並びに／あるいは
前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシの１つ以上の基本機能を増強又は破壊するように操作されておらず、任意選択で、１つ以上又は
基本機能は、基礎免疫応答及び／又は適応免疫応答、炎症、血管新生、アテローム性動脈硬化症、リンパ発達及び腫瘍増殖に関与する。
１つ以上のシグナル伝達経路を調節するように操作されておらず、任意選択で、血栓形成経路を破壊するように操作されておらず、かつ／又は血小板炎症シグナル伝達経路を破壊するように操作されておらず、かつ／又は操作された前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ若しくはエフェクターシャーシの免疫原性を低下させるように操作されていない、並びに／あるいは
前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシの１つ以上の基本機能を増強又は破壊するように操作されておらず、任意選択で、１つ以上又は
基本機能は、基礎免疫応答及び／又は適応免疫応答、炎症、血管新生、アテローム性動脈硬化症、リンパ発達及び腫瘍増殖に関与する。
【0204】
これらの実施形態の前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシであって、１つ以上のシグナル伝達経路を調節するように、又は前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシの１つ以上の基本機能を増強若しくは破壊するように操作されていないが、１つ以上のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲを発現する前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシを使用して、身体、組織又は細胞内の特定部位へのカーゴの送達を標的化することができる。しかしながら、これらの前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシは、血小板に固有の特性、すなわち血栓形成能を保持しているため、ＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲが標的に結合すると、血小板は、血栓形成を誘発する。これは、例えば、腫瘍の周囲に血餅が形成されると腫瘍の酸素が欠乏し得るため、がんの治療において、又は外傷を受けた血管又は器官への酸素を制限することが有用である状況において有用であり得る。
【0205】
前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシを操作する全ての場合において、巨核球又は巨核球様細胞が血小板又は血小板様膜結合細胞フラグメントを産生する能力が維持されることが重要である。当業者は、そのような操作された巨核球が血小板又は血小板様膜結合細胞フラグメントを産生することができるかどうかを決定することができる。
【0206】
しかしながら、血栓形成能を有する血小板は、安全性の懸念のために体内での使用が制限されている。
【0207】
したがって、いくつかの好ましい実施形態では、前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシは、調節するように、例えば、１つ以上のシグナル伝達経路を破壊するように、例えば、血栓形成性シグナル伝達経路、血小板炎症シグナル伝達経路を破壊するように、及び／又は操作された前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシの免疫原性を低下させるように操作されている。血小板の任意のシグナル伝達経路を調節することができる。例えば、いくつかのシグナル伝達経路の調節は、例えば、炎症、血管新生、アテローム性動脈硬化症、リンパ発達及び腫瘍増殖における自然免疫応答及び／又は適応免疫応答に関与する経路を調節するために、前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシ、例えば、前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシの基本シグナル伝達経路である、血小板又は血小板様膜結合細胞フラグメントのいくつかの望ましい特徴を増強することができる。したがって、一実施形態では、本発明は、１つ以上のシグナル伝達経路を調節するように操作された、例えば、血栓形成経路を破壊するように操作された、及び／又は血小板炎症シグナル伝達経路を破壊するように操作された、及び／又は操作された前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ若しくはエフェクターシャーシの免疫原性を低下させるように操作された、及び／又は前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ若しくはエフェクターシャーシの１つ以上の基本機能を増強若しくは破壊するように操作された、操作された前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシを提供する。
【0208】
１つ以上のシグナル伝達経路を調節するように操作された、例えば、血栓形成経路を破壊するように操作された、及び／又は血小板炎症シグナル伝達経路を破壊するように操作された、及び／又は操作された前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ若しくはエフェクターシャーシの免疫原性を低下させるように操作された、及び／又は前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ若しくはエフェクターシャーシの１つ以上の基本機能を増強若しくは破壊するように操作された、本明細書に記載の操作された前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシは、本発明のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ化標的ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲに関連する任意の効果を超える用途を有するため、本発明が、本明細書に記載の操作された前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシのうちのいずれか、例えば、骨髄系幹細胞、巨核芽球、巨核球、巨核球様細胞、ｉＰＳＣ、血小板又は血小板様膜結合細胞フラグメントである操作された前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシを提供することが明らかであり、前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシは、
本発明の１つ以上のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ、若しくはｅＰＡＲＳ；
本発明の１つ以上のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲｓ若しくはｅＰＡＲｓをコードする１つ以上の核酸；
本発明の１つ以上のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ若しくはｅＰＡＲをコードする１つ以上の核酸を含む１つ以上のベクター；及び／又は
本発明の１つ以上のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ若しくはｅＰＡＲをコードする１つ以上の核酸を含む１つ以上のウイルスベクターを含まない。
本発明の１つ以上のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ、若しくはｅＰＡＲＳ；
本発明の１つ以上のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲｓ若しくはｅＰＡＲｓをコードする１つ以上の核酸；
本発明の１つ以上のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ若しくはｅＰＡＲをコードする１つ以上の核酸を含む１つ以上のベクター；及び／又は
本発明の１つ以上のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ若しくはｅＰＡＲをコードする１つ以上の核酸を含む１つ以上のウイルスベクターを含まない。
【0209】
例えば、本発明は、操作された前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシ（例えば、操作された骨髄幹細胞、巨核芽球、巨核球、巨核球様細胞、ｉＰＳＣ、血小板若しくは血小板様膜結合細胞フラグメント）を提供し、前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシは、１つ以上のシグナル伝達経路を調節するように操作されており（例えば、血栓形成経路を破壊するように操作されている、及び／又は血小板炎症シグナル伝達経路を破壊するように操作されている、及び／又は操作された前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ若しくはエフェクターシャーシの免疫原性を低下させるように操作されている）、かつ／あるいは前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシの１つ以上の基本機能を増強又は破壊するように操作されており、前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシは、
本発明のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ若しくはｅＰＡＲ；
本発明の１つ以上のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲｓ若しくはｅＰＡＲｓをコードする１つ以上の核酸；
本発明の１つ以上のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ若しくはｅＰＡＲをコードする１つ以上の核酸を含む１つ以上のベクター；及び／又は
本発明の１つ以上のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ若しくはｅＰＡＲをコードする１つ以上の核酸を含む１つ以上のウイルスベクターを含まない。
本発明のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ若しくはｅＰＡＲ；
本発明の１つ以上のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲｓ若しくはｅＰＡＲｓをコードする１つ以上の核酸；
本発明の１つ以上のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ若しくはｅＰＡＲをコードする１つ以上の核酸を含む１つ以上のベクター；及び／又は
本発明の１つ以上のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ若しくはｅＰＡＲをコードする１つ以上の核酸を含む１つ以上のウイルスベクターを含まない。
【0210】
例えば、本明細書に記載の操作された前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシのうちのいくつかは、本発明のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲが関与しない状況において有用であり得る低減された血栓形成能及び／又は免疫原性を有するように操作されていない前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシと比較して、低減された血栓形成能及び／又は免疫原性を有する。例えば、本発明の受容体を含まない操作された前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシは、凝固が望まれない状況、例えば脳卒中又はＭＩにおいて有用であると考えられ、例えば、血栓形成能力を欠くが外部受容体を含む血小板は、血栓形成部位に動員されるが、血栓形成プロセスを妨げる。ＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲの特徴についての選好は、本明細書に記載されているとおりである。
【0211】
しかしながら、いくつかの有利な実施形態では、本明細書に記載の操作された前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシは、１つ以上のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲを含む。したがって、本発明は、操作された前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシ（例えば、操作された骨髄幹細胞、巨核芽球、巨核球、巨核球様細胞、ｉＰＳＣ、血小板若しくは血小板様膜結合細胞フラグメント）のうちのいずれかを提供し、前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシは、１つ以上のシグナル伝達経路を調節するように操作されており（例えば、血栓形成経路を破壊するように操作されている、及び／又は血小板炎症シグナル伝達経路を破壊するように操作されている、及び／又は操作された前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ若しくはエフェクターシャーシの免疫原性を低下させるように操作されている）、かつ／あるいは前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシの１つ以上の基本機能を増強又は破壊するように操作されており、操作された前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシは、
本発明のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ若しくはｅＰＡＲ；
本発明の１つ以上のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲｓ若しくはｅＰＡＲｓをコードする１つ以上の核酸；
本発明の１つ以上のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ若しくはｅＰＡＲをコードする１つ以上の核酸を含む１つ以上のベクター；及び／又は
本発明の１つ以上のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ若しくはｅＰＡＲをコードする１つ以上の核酸を含む１つ以上のウイルスベクターのうちのいずれか１つ以上を含む。
本発明のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ若しくはｅＰＡＲ；
本発明の１つ以上のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲｓ若しくはｅＰＡＲｓをコードする１つ以上の核酸；
本発明の１つ以上のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ若しくはｅＰＡＲをコードする１つ以上の核酸を含む１つ以上のベクター；及び／又は
本発明の１つ以上のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ若しくはｅＰＡＲをコードする１つ以上の核酸を含む１つ以上のウイルスベクターのうちのいずれか１つ以上を含む。
【0212】
ＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲの特徴についての選好は、本明細書に記載されているとおりである。
【0213】
本発明のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲのうちのいずれかをコードする核酸は、種々の方法で前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシに導入され得ることは明らかである。例えば、いくつかの実施形態では、本発明のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲのうちのいずれかをコードする核酸が、ゲノム核酸に導入される。例えば、ＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ、又はｅＰＡＲをコードする核酸は、第１の遺伝子座の第１の対立遺伝子に導入することができ、かつ／又は核酸は、第１の遺伝子座の第２の対立遺伝子に導入することができる。追加的に又は代替的に、核酸を第１の遺伝子座の第１の対立遺伝子に導入することができ、第２の核酸（例えば、第２のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ、又はｅＰＡＲをコードする）を第２の遺伝子座の第１の対立遺伝子に導入することができる。追加的に又は代替的に、第１の核酸を第１の遺伝子座の第１の対立遺伝子に導入することができ、第２の核酸を第１の遺伝子座の第２の対立遺伝子に導入することができる。
【0214】
いくつかの実施形態では、本発明のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲのうちのいずれかをコードする核酸は、前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシに導入され、前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシにおいてエピソーム的に維持される。
【0215】
いくつかの実施形態では、本発明のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲのうちのいずれかをコードする核酸は、ヌクレオフェクションを介して前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシに導入される。
【0216】
これらの様々な組み合わせは、タンパク質コード遺伝子の導入に適用され、また、機能的ＲＮＡコード配列（例えば、ＲＮＡｉに関与するＲＮＡ配列をコードする配列）の導入にも適用される。
【0217】
上記のように、送達又は標的化送達ビヒクルとしての血小板及び操作された血小板の使用は、現在の治療法を超えるいくつかの利点を有する。
【0218】
本明細書に記載の血小板又は操作された血小板、例えば、本発明の１つ以上のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ、又はｅＰＡＲを発現する血小板は、巨核球から体外で生成され得る。巨核球は体外の培養で維持されるため、他の競合する細胞治療製品では不可能である、患者の発がん性形質転換を恐れることなく、ゲノムレベルで（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によって）広範囲に編集できる。
【0219】
本明細書に記載の血小板、例えば、本発明の１つ以上のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ、又はｅＰＡＲを発現する血小板は、体内で７～１０日の寿命を有し、継続して繁殖する可能性がほとんどないため、腫瘍自体を形成する可能性がほとんどない。
【0220】
血小板は、凍結して長期間保存することができ、その結果、貯蔵寿命が長くなり、現在利用可能な技術を使用すると、免疫原性がないため、操作された血小板を問題なく製造、保存、輸送、及び患者に投与することができる。
【0221】
特定の実施形態では、血小板様膜結合細胞フラグメントが送達ツールの血栓形成能を破壊するように操作されている場合、それはＳｙｎｌｅｔと呼ぶことができる。Ｓｙｎｌｅｔは、１つ以上の更なる修飾、及び／又はシグナル伝達経路の破壊若しくはノックインを含み得る。
【0222】
前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシ、例えば、骨髄幹細胞、巨核芽球、巨核球、脂肪細胞、脂肪由来間葉系間質／幹細胞株（ＡＳＣＬ）又はｉＰＳＣ、血小板、血小板様膜結合送達ツール、又はＳｙｎｌｅｔは、好ましくはエクスビボ又はインビトロで産生される。場合によっては、前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシは、例えば、ＨＳＣ移植を介してインビボで産生され得る。
【0223】
いくつかの実施形態では、前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ若しくはエフェクターシャーシ又は操作された前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシが、本発明の１つ以上のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲを発現し、１つ以上のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲが、血小板活性化ドメイン、例えば、血小板脱顆粒誘発ドメインを含む場合、いくつかの実施形態では、前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシ、すなわち、血小板又は血小板様膜結合細胞片又はＳｙｎｌｅｔは、１つ以上のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲの標的結合ドメインが標的に結合すると脱顆粒することが必要であると考えられる。
【0224】
いくつかの実施形態では、本発明の前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシが、１つ以上のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲを発現し、１つ以上のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲが、血小板阻害ドメイン、例えば血小板脱顆粒の誘発を防止するドメインを含む場合、いくつかの実施形態では、前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ若しくはエフェクターシャーシ又は操作された前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ若しくはエフェクターシャーシ、すなわち、血小板若しくは血小板様膜結合細胞片、又はＳｙｎｌｅｔは、１つ以上のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲの標的結合ドメインが標的に結合する際に、脱顆粒の活性化を阻害することができることが必要であると考えられる。
【0225】
特定のエフェクターシャーシが、脱顆粒を活性化する、すなわち誘発する、又は脱顆粒の活性化を阻害する能力を保持する必要があるかどうかは、エフェクターシャーシ中に存在する本発明の１つ以上のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲの性質に依存する。本発明のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲについての選好は、本明細書に記載されているとおりである。
【0226】
いくつかの特定の実施形態では、血小板が脱顆粒するか又は脱顆粒しないことは必要であるとは考えられず、標的へのＳＡＰＲの単純な結合が有用な効果を生じるのに十分である。例えば、いくつかの実施形態では、標的結合ドメインは、ＭＨＣ／抗原複合体を含む。これらの実施形態では、ＳＡＰＲは、抗原提示細胞による抗原／ＭＨＣ複合体の一部としての抗原の提示を模倣する。Ｔ細胞は、ＭＨＣ／抗原複合体の一部として提示されると、Ｔ細胞受容体（T cell receptor、ＴＣＲ）を介して抗原に結合することができ、その結果、Ｔ細胞の活性化及び分化がもたらされる。これはそれ自体、本発明の前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシの有利な使用であると考えられる。
【0227】
いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号１０４～１１１のうちのいずれかによって定義されるＣＰＲを提供する。
【0228】
キメラ抗原受容体Ｔ（ＣＡＲ－Ｔ）細胞とは対照的に、いくつかの実施形態では、本発明は、前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシ、例えば、操作された骨髄幹細胞、巨核芽球、巨核球、巨核球様細胞、ｉＰＳＣ、脂肪細胞、脂肪由来間葉系間質／幹細胞株（ＡＳＣＬ）、血小板、又は投与前に患者との適合を必要としないユニバーサル産物である血小板様膜結合細胞フラグメントを提供する。例えば、これらの実施形態では、前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシは、例えば、ベータ２ミクログロブリン遺伝子のノックアウトを介して、ベータ２ミクログロブリン遺伝子からの発現が阻害されるように操作されている。
【0229】
更に、本明細書に記載の前駆体からのインビトロでの血小板又は血小板様膜結合細胞フラグメントの産生は、ウイルスを継続的に産生し、細胞を編集する必要性を排除する。本明細書に記載の操作された血小板又は操作された血小板様膜結合細胞フラグメントの寿命が短いため、安全性の懸念は、現在の遺伝子編集治療と比較して制限されている。例えば、血小板は除核されているため、遺伝子編集及びゲノム安定性はＣＡＲ－Ｔ細胞よりも本発明において懸念は少なく、したがって、血小板治療の複雑さは、編集の効率又は培養時間の制限によって制限されない。追加的に、サイズが小さいため、操作された血小板は、ＣＡＲ－Ｔ細胞よりも固形腫瘍へのアクセスが良好である可能性がある。
【0230】
Ｒｕｂｉｕｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．から市販されているような除核赤血球もまた、治療剤を送達するために当該技術分野で企図されてきた。赤血球とは対照的に、本明細書に記載の操作された前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシ、例えば、操作された血小板又は操作された血小板様膜結合細胞フラグメントは、高度に代謝的に活性であり、再操作することができるシグナル伝達系を含む。実際、赤血球と比較して、本明細書に記載の操作された血小板又は操作された血小板様膜結合細胞フラグメントを用いて、より標的化された使用が可能である。
【0231】
本明細書に記載の操作された血小板又は操作された血小板様膜結合細胞フラグメントの小胞脱顆粒はまた、所望の標的が関与するまでカーゴ、例えば、カーゴタンパク質を「隠すこと」を可能にし、これは、生物療法タンパク質が一般に細胞の表面に発現するため、除核された赤血球では不可能である。
【0232】
本明細書に記載の操作された血小板又は操作された血小板様膜結合細胞フラグメントはまた、赤血球よりも小さく、より良好な生体内分布をもたらす可能性が高い。
【0233】
したがって、一実施形態では、標的又は抗原への血小板又は血小板様膜結合細胞フラグメント中に存在するＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲの標的結合ドメインの結合は、脱顆粒をもたらす。
【0234】
本明細書に記載の前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ若しくはエフェクターシャーシ、又は操作された前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ若しくはエフェクターシャーシのうちのいずれかに到達するために、遺伝子発現の何らかの調節を使用して、前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシ、例えば、操作された骨髄幹細胞、巨核芽球、巨核球、巨核球様細胞、ｉＰＳＣ、脂肪細胞、脂肪由来間葉系間質／幹細胞株（ＡＳＣＬ）、血小板、若しくは血小板様膜結合細胞片において天然に見出される遺伝子を調節し、かつ／又は非天然遺伝子若しくは他のコード配列、例えば、本発明の１つ以上のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ若しくはｅＰＡＲをコードする１つ以上の遺伝子を前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ若しくはエフェクターシャーシに導入する。
【0235】
発現を「調節する」とは、発現レベルを低下させること、発現を完全に防止すること（例えば、遺伝子ノックアウトの場合）、又は発現レベルを増加させることの意味を含む。
【0236】
上記のように、血栓形成能を有する本明細書に記載されるような前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシは、前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシを人体に投与することを伴うシナリオにおける使用が限定されている。他の天然シグナル伝達経路は、好ましくは調節されてもよく、例えば、破壊又は阻害又は増強されてもよい。
【0237】
前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシの基本経路である様々な経路の調節、破壊、阻害又は増強は、前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシが、１つ以上のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲを含まない状況において望ましく、また、前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシが、１つ以上のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲを含む状況においても望ましい。したがって、シグナル伝達経路の調節に関する本明細書における考察は、両方の実施形態、すなわち、本発明の１つ以上のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体を含む、及び含まない本発明の前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシに関連すると解釈されるべきである。
【0238】
本発明の前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシの基本シグナル伝達経路である任意のシグナル伝達経路は、調節、破壊、阻害又は増強され得る。有益に破壊され得る例示的な経路としては、血栓形成経路及び／又は炎症シグナル伝達経路及び／又は血小板免疫原性に関連する経路が挙げられる。調節され得る他の例示的な経路は、自然免疫応答及び／又は適応免疫応答、炎症、血管新生、アテローム性動脈硬化症、リンパ発達、腫瘍増殖、血小板接着、血小板遊走及び溢出に関与する経路である。
【0239】
破壊する特に有利な経路は、血栓形成経路である。血栓形成能を保持する本発明の前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシのいくつかの使用が本明細書に記載されているが、好ましい実施形態では、血栓形成経路が破壊される。より好ましい実施形態では、血栓形成経路全体が破壊される。例えば、カーゴを体内の特定の部位に標的化する場合、ほとんどの場合、カーゴの脱粒及び放出の際に、天然の血栓形成経路が誘発されず、標的部位での望ましくない血餅形成を防止することが好ましい。したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、操作された前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシ、例えば、操作された骨髄幹細胞、巨核芽球、巨核球、巨核球様細胞、ｉＰＳＣ、脂肪細胞、脂肪由来間葉系間質／幹細胞株（ＡＳＣＬ）、血小板、又は血小板様膜結合細胞フラグメントを提供し、操作された前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシは、血栓形成能が低下するように操作されていない前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシと比較して血栓形成能が低下している。いくつかの実施形態では、前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシは、血栓形成能を有しない、すなわち、全く血栓形成性ではない。
【0240】
いくつかの実施形態では、本発明の操作された前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシ、例えば、操作された骨髄幹細胞、巨核芽球、巨核球、巨核球様細胞、ｉＰＳＣ、脂肪細胞、脂肪由来間葉系間質／幹細胞株（ＡＳＣＬ）、血小板又は血小板様膜結合細胞フラグメントは、「天然の」操作された骨髄幹細胞、巨核芽球、巨核球、巨核球様細胞、ｉＰＳＣ、脂肪細胞、脂肪由来間葉系間質／幹細胞株（ＡＳＣＬ）、血小板又は血小板様膜結合細胞フラグメントから産生された血小板よりも血栓形成性が低い、すなわち、前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシ、例えば、血栓形成性が低下するように意図的に操作されていない骨髄幹細胞、巨核芽球、巨核球、巨核球様細胞又はｉＰＳＣから産生された血小板又は血小板様膜結合細胞フラグメントよりも血栓形成性が低い、例えば、本実施形態の操作された前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシは、インビボで見出される対応するｉＰＳＣ、巨核球又は血小板（例えば、ヒトドナー由来の血小板）よりも血栓形成性が低い。
【0241】
加えて又は代替的に、操作された前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシ、例えば、操作されたｉＰＳＣ前駆体、脂肪細胞、脂肪由来間葉系間質／幹細胞株（ＡＳＣＬ）、巨核球又は血小板は、血小板接着、遊走及び溢出のための経路の遺伝子成分内に遺伝子修飾を含有し得る。
【0242】
一実施形態では、本明細書に記載されるように、１つ以上のシグナル伝達経路を調節するように操作された前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシ、例えば、操作された骨髄幹細胞、巨核芽球、巨核球、巨核球様細胞、ｉＰＳＣ、脂肪細胞、脂肪由来間葉系間質／幹細胞株（ＡＳＣＬ）、血小板又は血小板様膜結合細胞フラグメントである操作された前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシは、血栓形成経路の１つ以上の機能を破壊するように操作されている。
【0243】
血栓形成能が取り除かれた操作された血小板又は操作された血小板様膜結合細胞フラグメントは、場合によっては、ＳＹＮＬＥＴ（商標）とも呼ばれ、血栓形成性に関してブランクテンプレートとして作用することができ、スキャフォールドとして効果的に機能し、カーゴを小胞内に内部的に、細胞質内に内部的に、又は原形質膜の外表面に貯蔵する能力を有する。本明細書に記載されるように、ＳＹＮＬＥＴ（血栓形成能を欠く操作された血小板又は操作された血小板様膜結合細胞フラグメント）における１つ以上のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲの発現は、ＳＹＮＬＥＴが特定の抗原又はシグナルに応答することを可能にする。これらの有利な操作された血小板及び操作された血小板様膜結合細胞フラグメントは、好ましくは、通常は血餅形成をもたらす内因性刺激に応答せず、好ましくは他の活性化血小板によって動員されず、活性化時に、好ましくは患者において内因性血小板を動員及び活性化することができない。そのような有利な操作された血小板又は操作された血小板様膜結合細胞フラグメントを産生するために、血小板前駆体、すなわち骨髄幹細胞、巨核芽球、巨核球、巨核球様細胞、脂肪細胞、脂肪由来間葉系間質／幹細胞株（ＡＳＣＬ）又はｉＰＳＣを適切に操作する必要があることは、当業者には明らかである。そのような操作方法の例は、本明細書に記載されている。
【0244】
いくつかの実施形態では、有利な血小板又は血小板様膜結合細胞フラグメント、例えば、患者において内因性血小板を動員及び活性化する能力を欠く血小板であって、血餅形成を通常もたらす内因性刺激に応答することができず、他の活性化血小板によって動員されない血小板を、血小板又は血小板様膜結合細胞フラグメントを外因的に処理することによって、例えば、血小板又は血小板様膜結合細胞フラグメントを、必要とされる遺伝子の転写又は翻訳を阻害する薬剤に曝露することによって、例えば、ｓｉＲＮＡフラグメント又は特定の転写物を標的とするＣＲＩＳＰＲ成分に曝露することによって、前駆体が操作されていることを必要とせずに（ＣＰＲを含む前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシの実施形態においてＣＰＲを発現すること以外）、産生することが可能であり得る。
【0245】
血栓形成経路は、例えば、傷害に応答して強固な血栓形成応答を提供するように一緒に作用するいくつかの経路を含む。血栓形成の一次刺激が認識される必要があり、血栓形成の二次刺激が認識され、血栓形成の二次メディエーターが放出される。
【0246】
血栓の一次刺激の認識には、例えば、内皮下層を認識するなど、創傷時に露出するようになる露出組織に関連する因子を認識する血小板が含まれる。通常の状況では、血小板は、内皮下層に曝露されない。内皮下層の曝露により、血小板は、ＧＰＩｂ／Ｖ／ＩＸ及びＧＰＶＩ（ＧＰ６）、ＩＴＧＡ２Ｂ、インテグリンｓ ａＩＩｂｂ３、ａ２ｂ１、ａ５ｂ１及びａ６ｂ１などの血小板表面の受容体を介して、コラーゲン、フォン・ヴィレブランド因子、フィブロネクチン、トロンボスポンジンなどのリガンドを認識できる。したがって、いくつかの実施形態では、血栓形成の一次刺激の認識に関与するタンパク質をコードする遺伝子には、ＧＰＩｂ／Ｖ／ＩＸ及びＧＰＶＩ（ＧＰ６）、ＩＴＧＡ２Ｂ、ＣＬＥＣ２、インテグリンｓ ａＩＩｂｂ３、ａ２ｂ１、ａ５ｂ１及びａ６ｂ１が含まれる。
【0247】
血小板が、例えば上記の相互作用を介して露出した内皮と接触すると、血小板は、他の血小板によって検出され、創傷部位で血小板凝集を引き起こす、ＡＤＰ、トロンビン、及びＴｘＡ２などの二次メッセンジャーを放出する。いくつかの実施形態では、二次メッセンジャーを認識する血小板の能力が破壊されている場合が好ましい。本発明の血小板が、意図された標的ではなく、例えば、創傷部位を標的とする場合は望ましくない。したがって、好ましい実施形態では、二次メッセンジャーを認識する血小板の能力が破壊される。この機能に関与する受容体には、Ｐａｒ１、Ｐａｒ４、Ｐ２Ｙ１２、ＧＰＩｂ／Ｖ／ＩＸ、トロンボキサン受容体（ＴＢＸＡ２Ｒ）、Ｐ２Ｙ１、Ｐ２Ｘ１及びインテグリンａＩＩｂｂ３が含まれる。
【0248】
上記のように、血小板が露出した組織を認識すると、それらは二次メッセンジャーを放出して他の血小板をその部位に動員する。本発明の血小板が標的、例えば腫瘍抗原に結合すると、本発明の血小板が次に他の血小板を標的部位に動員して血栓、例えば腫瘍部位での血栓を形成することは望ましくない。したがって、好ましい実施形態では、活性化された血小板が二次メッセンジャーを放出する経路が破壊される。経路は、二次メディエーターの産生及び／又は貯蔵及び／又は放出に関与するタンパク質を含むことができる。この経路に関与する遺伝子には、Ｃｏｘ１、Ｃｏｘ２、ＨＰＳ、ＴＭＥＭ１６Ｆ、プロトロンビン、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、フォン・ヴィレブランド因子及びトロンボキサン－Ａシンターゼ（ＴＢＸＡＳ１）が含まれる。
【0249】
代替的に、欠失又は修飾は、密顆粒からのＡＤＰ、セロトニン、及びＡＴＰ放出に不可欠なＨＰＳ（リソソームオルガネラ複合体３サブユニットの生合成）遺伝子、並びに炎症性及び血栓形成促進性メディエーターを生成し、アスピリンの標的である、ミトコンドリアにコードされたチトクロームＣオキシダーゼＩＩ（C oxidase II、ＣＯＸ２）などの血小板シグナル伝達を仲介する遺伝子に導入される。代替的に、欠失又は修飾は、プロトロンビン（主要タンパク質血栓性誘導物質）、血管新生促進因子であるＰＤＧＦ、ＥＧＦ（伸長成長因子）、及びフォン・ヴィレブランド因子（コラーゲンアダプタータンパク質）などの血栓性メディエーターを発現する遺伝子に導入される。
【0250】
トロンビン及びＡＤＰシグナル伝達の組み合わせによる喪失は、血管閉塞を無効にすることが観察されているが、ＩＴＡＭ受容体は、依然として活性化され得る（Ｂｏｕｌａｆｔａｌｉ ｅｔ ａｌ．「Ｐｌａｔｅｌｅｔ ＩＴＡＭ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｓ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｆｏｒ ｖａｓｃｕｌａｒ ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ ｉｎ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ」．ＪＣＩ，２０１３ ａｎｄ Ｃｏｒｎｅｌｉｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．「Ｒｏｌｅｓ ａｎｄ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ａｍｏｎｇ ｐｒｏｔｅａｓｅ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ａｎｄ Ｐ２ｒｙ１２ ｉｎ ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ ａｎｄ ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ」，ＰＮＡＳ．２０１０を参照され、これらの各々が、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。この研究は、重要な内因性血小板シグナル伝達経路の破壊が、ＩＴＡＭ受容体を介してシグナル伝達する血小板の能力を無効にしないことを示しており、本明細書に記載の操作されたＣＰＲが、非血栓形成性血小板バックグラウンドで機能する可能性が高いことを示している。
【0251】
例えば、トロンビンは、ＰＡＲ（プロテアーゼ活性化受容体）の切断を通じて血小板を活性化する。血小板シグナル伝達は、プロテアーゼ活性化ＧＰＣＲ、すなわちトロンビンによって切断されるＰＡＲ１及びＰＡＲ４によっても駆動される。シグナル伝達は強力であり、血小板を動員し、血小板活性化後の血小板間の正のフィードバックを促進するように作用する。ＰＡＲ１及びＰＡＲ４のトロンビン切断配列は明確に定義されている。
【0252】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の操作された血小板は、一次トロンビン受容体であるＰＡＲ４（プロテアーゼ活性化受容体４）、一次アンカー受容体であるＧＰ１ｂ－１Ｘ－Ｖ（糖タンパク質ＩＸと複合体化された糖タンパク質Ｉｂ）、ＡＤＰ（アデノシン二リン酸）受容体であり、クロピドグレル阻害の標的であるＰ２Ｙ１２（プリン作動性受容体Ｐ２Ｙ１２）、コラーゲン受容体であるＧＰＶＩ（糖タンパク質ｄｅｌｅｔｉｏｎｔｅｉｎ ＶＩ血小板）、又は操作された血小板の活性化を防止するためのトロンボキサン受容体などであるがこれらに限定されない内因性血小板受容体のドメインに導入された、又はそれを置換する少なくとも１つの欠失又は修飾を含んでもよい。
【0253】
血栓の一次刺激の認識に関与するタンパク質によって、このプロセスに関与する任意のタンパク質の意味が含まれること、例えば、血栓の一次刺激との接触又は認識に直接関与するタンパク質、更に例えば、血栓の一次刺激との接触又は認識に直接関与するそれらのタンパク質の発現につながる遺伝子も含まれることは、当業者には明らかである。当業者は、どのタンパク質が一次刺激の認識に関与しているとみなされるかを理解する。重要な特徴は、タンパク質の破壊が、それらの破壊が血栓の一次刺激の認識の欠陥につながることである。しかしながら、いくつかの実施形態では、血栓の一次刺激の認識に関与するタンパク質は、血栓の一次刺激と直接接触するタンパク質のみを含む。
【0254】
血栓形成の二次メディエーターの認識に関与するタンパク質によって、血栓形成の二次メディエーターとの接触又は認識に直接関与するタンパク質、並びにそれらのプロセスに間接的に関与するタンパク質、例えば、血栓形成の二次メディエーターとの接触又は認識に直接関与するタンパク質の産生に関与するタンパク質を含む。当業者は、血栓形成の二次メディエーターの認識に関与するタンパク質が何を意味するかを理解する。タンパク質の重要な特徴は、それらの破壊が血栓形成の二次メディエーターの認識に欠陥をもたらすことである。しかしながら、いくつかの実施形態では、血栓形成の二次メディエーターの認識に関与するタンパク質は、血栓形成の二次メディエーターと直接接触するタンパク質のみを含む。
【0255】
血栓形成の二次メディエーターの放出に関与するタンパク質によって、二次メディエーターの産生及び／又は貯蔵及び／又は放出に関与するタンパク質を含む。タンパク質の重要な特徴は、それらの破壊が二次メディエーターの最終的な放出に欠陥をもたらすことである。欠陥は、二次メディエーターの産生、二次メディエーターの貯蔵、及び／又は実際の放出プロセスにある可能性がある。
【0256】
いくつかの実施形態では、以下の３つの経路のうちのいずれか１つ以上が、前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシにおいて破壊される：血栓形成の一次刺激の認識、血栓形成の二次刺激の認識、及び血栓形成の二次メディエーターの放出。好ましい実施形態では、３つ全ての経路が破壊される。前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシにおいて本明細書に記載の血栓形成経路を破壊することによって全ての血栓形成能が取り除かれた操作された血小板、例えば、操作されたｉＰＳＣ、操作された脂肪細胞、操作された脂肪由来間葉系間質／幹細胞株（ＡＳＣＬ）、操作された巨核球又は操作された血小板は、潜在的な血栓症の安全性の懸念を軽減する。
【0257】
当業者は、単一の遺伝子が上記の機能のうちの１つ、２つ又は３つに関与し得ることを理解する。
【0258】
血栓形成応答を破壊すると考えられる操作された前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシ、例えば、操作されたｉＰＳＣ又は操作された巨核球ゲノム又は操作された血小板から欠失又は破壊され得る（すなわち、最終的な遺伝子産物の発現が防止される）遺伝子の例は、参照により本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０２０／０５３２４７号の３３頁の表３に示されている。
【0259】
いくつかの実施形態では、操作された前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシ、例えば、操作された骨髄系幹細胞、巨核芽球、巨核球、巨核球様細胞、ｉＰＳＣ、血小板又は血小板様膜結合細胞フラグメントは、内因性受容体、メディエータータンパク質及び／又はシグナル伝達タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は少なくとも１０個の遺伝子の破壊を含む。
【0260】
いくつかの実施形態では、操作された前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシは、少なくとも
血栓形成の一次刺激の認識に関与するタンパク質をコードする１つの遺伝子、
血栓形成の二次メディエーターの認識に関与するタンパク質をコードする１つの遺伝子、及び
血栓形成の二次メディエーターの放出に関与するタンパク質をコードする１つの遺伝子、の破壊又は欠失を含み、
いくつかの実施形態では、操作された前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシは、少なくとも；
血栓形成の一次刺激の認識に関与するタンパク質をコードする２つの遺伝子、
血栓形成の二次メディエーターの認識に関与するタンパク質をコードする２つの遺伝子、及び
血栓形成の二次メディエーターの放出に関与するタンパク質をコードする２つの遺伝子、の破壊又は欠失を含み、
いくつかの実施形態では、操作された前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシは、少なくとも：
血栓形成の一次刺激の認識に関与するタンパク質をコードする３つの遺伝子、
血栓形成の二次メディエーターの認識に関与するタンパク質をコードする３つの遺伝子、及び
血栓形成の二次メディエーターの放出に関与するタンパク質をコードする３つの遺伝子、の破壊又は欠失を含む。
血栓形成の一次刺激の認識に関与するタンパク質をコードする１つの遺伝子、
血栓形成の二次メディエーターの認識に関与するタンパク質をコードする１つの遺伝子、及び
血栓形成の二次メディエーターの放出に関与するタンパク質をコードする１つの遺伝子、の破壊又は欠失を含み、
いくつかの実施形態では、操作された前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシは、少なくとも；
血栓形成の一次刺激の認識に関与するタンパク質をコードする２つの遺伝子、
血栓形成の二次メディエーターの認識に関与するタンパク質をコードする２つの遺伝子、及び
血栓形成の二次メディエーターの放出に関与するタンパク質をコードする２つの遺伝子、の破壊又は欠失を含み、
いくつかの実施形態では、操作された前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシは、少なくとも：
血栓形成の一次刺激の認識に関与するタンパク質をコードする３つの遺伝子、
血栓形成の二次メディエーターの認識に関与するタンパク質をコードする３つの遺伝子、及び
血栓形成の二次メディエーターの放出に関与するタンパク質をコードする３つの遺伝子、の破壊又は欠失を含む。
【0261】
血栓形成の一次刺激の認識に関与するタンパク質をコードすると考えられる遺伝子としては、ＧＰＩｂ／Ｖ／ＩＸ及びＧＰＶＩ（ＧＰ６）、ＩＴＧＡ２Ｂ、ＣＬＥＣ２、インテグリンｓ ａＩＩｂｂ３、ａ２ｂ１、ａ５ｂ１及びａ６ｂ１が挙げられるか、又は任意選択でＧＰＶＩ及びＩＴＧＡ２Ｂが挙げられる。
【0262】
血栓形成の二次刺激の認識に関与するタンパク質をコードすると考えられる遺伝子としては、Ｐａｒ１、Ｐａｒ４、Ｐ２Ｙ１２、ＧＰＩｂ／Ｖ／ＩＸ、トロンボキサン受容体（ＴＢＸＡ２Ｒ）、Ｐ２Ｙ１、Ｐ２Ｘ１及びインテグリンａＩＩｂｂ３が挙げられるか、任意選択でＰａｒ１、Ｐａｒ４及びＰ２Ｙ１２が挙げられる。
【0263】
血栓形成の二次メディエーターの放出に関与するタンパク質と考えられる遺伝子としては、Ｃｏｘ１、ＨＰＳ及びトロンボキサンＡシンターゼ（ＴＢＸＡＳ１）が挙げられるか、任意選択でＣｏｘ１及びＨＰＳが挙げられる。
【0264】
いくつかの実施形態では
血栓形成の一次刺激の認識に関与するタンパク質をコードする少なくとも１つ、２つ、若しくは３つの遺伝子が、ＧＰＩｂ／Ｖ／ＩＸ及びＧＰＶＩ（ＧＰ６）、ＩＴＧＡ２Ｂ、ＣＬＥＣ２、インテグリンｓ ａＩＩｂｂ３、ａ２ｂ１、ａ５ｂ１及びａ６ｂ１からなる群から選択されるか、若しくはＧＰＶＩ及びＩＴＧＡ２Ｂからなる群から選択され、
血栓形成の二次メディエーターの認識に関与するタンパク質をコードする少なくとも１つ、２つ、若しくは３つが、Ｐａｒ１、Ｐａｒ４、Ｐ２Ｙ１２、ＧＰＩｂ／Ｖ／ＩＸ、トロンボキサン受容体（ＴＢＸＡ２Ｒ）、Ｐ２Ｙ１、Ｐ２Ｘ１及びインテグリンａＩＩｂｂ３からなる群から選択されるか、又はＰａｒ１、Ｐａｒ４及びＰ２Ｙ１２からなる群から選択され、かつ／あるいは
血栓形成の二次メディエーターの放出に関与するタンパク質をコードする少なくとも１つ、２つ、又は３つの遺伝子が、Ｃｏｘ１、Ｃｏｘ２、ＨＰＳ、プロトロンビン、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、フォン・ヴィレブランド因子及びトロンボキサンＡシンターゼ（ＴＢＸＡＳ１）からなる群から選択される。
血栓形成の一次刺激の認識に関与するタンパク質をコードする少なくとも１つ、２つ、若しくは３つの遺伝子が、ＧＰＩｂ／Ｖ／ＩＸ及びＧＰＶＩ（ＧＰ６）、ＩＴＧＡ２Ｂ、ＣＬＥＣ２、インテグリンｓ ａＩＩｂｂ３、ａ２ｂ１、ａ５ｂ１及びａ６ｂ１からなる群から選択されるか、若しくはＧＰＶＩ及びＩＴＧＡ２Ｂからなる群から選択され、
血栓形成の二次メディエーターの認識に関与するタンパク質をコードする少なくとも１つ、２つ、若しくは３つが、Ｐａｒ１、Ｐａｒ４、Ｐ２Ｙ１２、ＧＰＩｂ／Ｖ／ＩＸ、トロンボキサン受容体（ＴＢＸＡ２Ｒ）、Ｐ２Ｙ１、Ｐ２Ｘ１及びインテグリンａＩＩｂｂ３からなる群から選択されるか、又はＰａｒ１、Ｐａｒ４及びＰ２Ｙ１２からなる群から選択され、かつ／あるいは
血栓形成の二次メディエーターの放出に関与するタンパク質をコードする少なくとも１つ、２つ、又は３つの遺伝子が、Ｃｏｘ１、Ｃｏｘ２、ＨＰＳ、プロトロンビン、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、フォン・ヴィレブランド因子及びトロンボキサンＡシンターゼ（ＴＢＸＡＳ１）からなる群から選択される。
【0265】
いくつかの実施形態では、操作された前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシは、以下の遺伝子：
ＩＴＧＡ２Ｂ、ＨＰＳ及びＰＳＹ１２の少なくとも各々に破壊又は欠失を有する。
ＩＴＧＡ２Ｂ、ＨＰＳ及びＰＳＹ１２の少なくとも各々に破壊又は欠失を有する。
【0266】
いくつかの実施形態では、操作された前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシは、以下の遺伝子：
ＩＴＧＡ２Ｂ、ＨＰＳ１及びＰＡＲ１の少なくとも各々に破壊又は欠失を有する。
ＩＴＧＡ２Ｂ、ＨＰＳ１及びＰＡＲ１の少なくとも各々に破壊又は欠失を有する。
【0267】
好ましい実施形態では、操作された前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシは、以下の遺伝子：
ＧＰＶＩ、ＩＴＧＡ２Ｂ、Ｐａｒ１、Ｐａｒ４、Ｐ２Ｙ１２、Ｃｏｘ１及びＨＰＳの各々に破壊又は欠失を有する。
ＧＰＶＩ、ＩＴＧＡ２Ｂ、Ｐａｒ１、Ｐａｒ４、Ｐ２Ｙ１２、Ｃｏｘ１及びＨＰＳの各々に破壊又は欠失を有する。
【0268】
例えば、操作された前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシは、ＧＰＶＩ、ＩＴＧＡ２Ｂ、Ｐａｒ１、Ｐａｒ４、Ｐ２Ｙ１２、Ｃｏｘ１及びＨＰＳの各々のノックアウトを含み得る。
【0269】
得られた操作された血小板に対する巨核球の遺伝子のノックアウトの影響は、変化する可能性がある。例えば、ＲＡＢ２７ａ（ＲＡＳがん遺伝子）及びＨＰＳ（ハプトグロビン）遺伝子は、それぞれ、密顆粒のローディング及び形成において機能する。Ｒａｂ２７ａのノックアウト又は欠失は、密顆粒メディエーターを持たないが、そうでなければ正常な血小板生物学を伴う、操作された血小板がもたらされる可能性がある。ＨＰＳ遺伝子のノックアウト又は欠失により、密顆粒を含まない操作された血小板がもたらされる可能性がある。ＡＩＩｂＢ３又はＧＰ１ｂ－ＩＸ－Ｖのノックアウト又は欠失により、活性化後の血小板及びフォンウィルブランド因子（ｖＷＦ）間の相互作用が減少するため、血小板が互いに凝集しなくなる可能性がある。更に、ＡＩＩｂＢ３は、フィブリノーゲンに対するインテグリンの親和性を高めるための裏返しのシグナル伝達にも関与している（Ｄｕｒｒａｎｔ，Ｂｌｏｏｄ．２０１７ Ｏｃｔ ５；１３０（１４）：１６０７－１６１９）。ＩＰのノックアウト又は欠失（ＰＧＩ２Ｒ又はプロスタグランジンＩ２受容体）は、プロスタグランジンの負の調節がもたらされる可能性がある。ＴＰのノックアウト又は削除（ＴｘＡ２Ｒ又はトロンボキサンＡ２受容体）は、凝固を刺激するための活性化時に追加の血小板の動員の低減がもたらされる可能性がある。
【0270】
ＧＰＶＩ（ＩＴＡＭ受容体）は、Ｇタンパク質α－ｑ（Ｇａｌｐｈａｑ）ノックアウトマウスでも刺激されることが観察されている。逆に、コラーゲンなどのＩＴＡＭアゴニストは、ＡＤＰ及びトロンボキサンＡ２受容体（ＴＸＡ２）などのＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲアゴニスト）の放出を誘導し、Ｇｑ経路を介してホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）を間接的に活性化する。更に、Ｇａｌｐｈａｑは、トロンビン、ＡＤＰ、５－ヒドロキシトリプタミン（５ＨＴ）、ＰＡＦ、及びトロンボキサンＡ（ＴＸＡ）の適切な機能のために活性である。
【0271】
Ｐ－セレクチン、トロンボキサンシンターゼ、及び血小板活性化因子（platelet activating factor、ＰＡＦ）をノックアウト又は欠失すると、一度活性化されると血小板凝集の不全がもたらされる。ＬＩＭドメインキナーゼ１（LIM Domain Kinase 1、ＬＩＭＫ１）のノックアウト又は欠失は、ＴｘＡ２合成を低減する。ＣＸＣＬ４（Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフケモカインリガンド４）及びＣＸＣＬ７（Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフケモカインリガンド７）はケモカインであり、したがって、遺伝子のノックアウト又は欠失は、少なくとも１つのシグナル伝達経路を妨害する。タリン１及びキンドリンは、シグナル伝達で機能し、インテグリンが敏感な状態に入るのを可能にする。
【0272】
ＡＮＯ６／ＴＭＥＭ１６Ｆのノックアウト又は欠失は、血小板の活性化時にホスファチジルセリンを曝露する血小板の能力を破壊する。ホスファチドリセリンは、通常、血小板の細胞質面に保持される膜脂質である。血小板の活性化時に、カルシウムの流入は、ＡＮＯ６／ＴＭＥＭ１６Ｆを介して血小板の外側でホスファチジルセリン曝露を引き起こし、凝固因子と組み合わせて活性トロンビンの生成を触媒するように作用する。したがって、ＴＭＥＭ１６Ｆのノックアウトは、ホスファチジルセリンへの曝露を防ぎ、血小板の血栓形成性を低下させる。これは、ＡＮＯ６変異を特徴とし、臨床的に出血のリスクが高いスコット症候群患者によって例証される。
【0273】
血栓形成経路を破壊することに加えて、又はその代わりに、操作された前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシ、例えば操作されたｉＰＳＣ前駆体、巨核球又は血小板の免疫原性及び／又は炎症特性を調節することも有利であると考えられることは、当業者には明らかである。
【0274】
いくつかの実施形態では、本発明の操作された前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシ、例えば、操作された骨髄幹細胞、巨核芽球、巨核球、巨核球様細胞、ｉＰＳＣ、血小板又は血小板様膜結合細胞フラグメントは、「天然の」操作された骨髄幹細胞、巨核芽球、巨核球、巨核球様細胞、ｉＰＳＣ、血小板又は血小板様膜結合細胞フラグメントから産生された血小板よりも免疫原性が低い、すなわち、前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシ、例えば、免疫原性が低下するように意図的に操作されていない骨髄幹細胞、巨核芽球、巨核球、巨核球様細胞又はｉＰＳＣから産生された血小板又は血小板様膜結合細胞フラグメントよりも免疫原性が低い、例えば、本実施形態の操作された前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシは、インビボで見出される対応するｉＰＳＣ、巨核球又は血小板（例えば、ヒトドナー由来の血小板）よりも免疫原性が低い。操作されていない前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシよりも免疫原性が低い操作された前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシによって、本発明者らは、前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシが低免疫原性プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシであるという意味を含む。
【0275】
本発明の操作された前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシ、例えば、操作されたｉＰＳＣ、操作された巨核球又は操作された血小板は、β２ミクログロブリン遺伝子の欠失を介してユニバーサルにされ得る（Ｆｅｎｇ ｅｔ ａｌ．「Ｓｃａｌａｂｌｅ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｌａｔｅｌｅｔｓ ｆｒｏｍ Ｈｕｍａｎ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ」．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ，２０１４を参照され、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。この欠失がなくても、ＡＢＯが一致する血小板は、一般的に、副作用なしに臨床診療で使用される。ヒト由来のＯ型血小板は、抗Ａ／Ｂ抗体で汚染されているため、普遍的なドナーではないが、インビトロでの血小板では汚染は問題ではない。したがって、ある特定の実施形態では、本明細書に記載の発明は、これらの技術を使用して、遺伝子編集された血小板を大量生産することができ、これもまた容易に保存、輸送され、患者のマッチングを必要としない。
【0276】
低免疫前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシ、すなわち、操作された骨髄幹細胞、巨核芽球、巨核球、巨核球様細胞、ｉＰＳＣ、血小板、又は免疫原性が低下した血小板様膜結合細胞フラグメントなどの前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシの生成に好適であると考えられる更なる戦略。例えば、Ｓｕｇｉｍｏｔｏ，Ｎ＆Ｅｔｏ，Ｋ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（２０２１）ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００７／ｓ０００１８－０２０－０３７４９－８）を参照されたい。
【0277】
いくつかの実施形態では、前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシ、例えば、操作されていない操作された骨髄幹細胞、巨核芽球、巨核球、巨核球様細胞、ｉＰＳＣ、血小板、又は血小板様膜結合細胞フラグメントよりも免疫原性が低い操作された骨髄幹細胞、巨核芽球、巨核球、巨核球様細胞、ｉＰＳＣ、血小板、又は血小板様膜結合細胞フラグメントを作製するために使用することができる３つの戦略がある。
１． 細胞表面上のＨＬＡクラスＩａ発現の破壊によるユニバーサル前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシの生成
２． ＨＬＡクラスＩｂ遺伝子のユニバーサル前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシ過剰発現の生成
３． 免疫調節遺伝子の過剰発現によるユニバーサル前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシの生成。
１． 細胞表面上のＨＬＡクラスＩａ発現の破壊によるユニバーサル前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシの生成
２． ＨＬＡクラスＩｂ遺伝子のユニバーサル前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシ過剰発現の生成
３． 免疫調節遺伝子の過剰発現によるユニバーサル前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシの生成。
【0278】
低免疫効果の増強のためにこれらの戦略を組み合わせることができることは、当業者には明らかである。各戦略を以下に説明し例示する。
【0279】
戦略＃１：細胞表面上のＨＬＡクラスＩａの破壊による普遍的な操作された前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシの生成
１．１発現の破壊 ベータ２ミクログロブリン（Beta 2 microglobulin、ｂ２Ｍ）
何人かの研究者が、Ｂ２ＭがノックアウトされたｈＰＳＣを設計した。これは、Ｂ２Ｍタンパク質がＨＬＡクラスＩタンパク質とヘテロ二量体を形成し、細胞表面上でのＨＬＡクラスＩ発現に必要であるためである。Ｂ２Ｍ遺伝子のノックアウトは、全てのＨＬＡクラスＩ分子（ＨＬＡ－Ａ、－Ｂ、－Ｃ、－Ｅ、－Ｆ及び－Ｇ）を枯渇させることによって、細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞からの免疫応答を制限することができる。Ｂ２Ｍ遺伝子の破壊は、ＣＲＩＳＰＲ、ＴＡＬＥＮ若しくはＲＮＡ干渉又は本明細書に記載の他の操作方法を使用して達成することができる。これは、ＣＤ３４＋ＨＳＣ前駆体細胞及びｈｉＰＳＣにおいて実証されている（Ｂｏｒｇｅｒ ＡＫ，Ｅｉｃｋｅ Ｄ，Ｗｏｌｆ Ｃ，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＨＬＡ－ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｉＰ－ ＳＣ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｅｓ ａｎｄ ｐｌａｔｅｌｅｔｓ ｆｏｒ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｕｎｄｅｒ ｒｅｆｒａｃｔｏｒｉｎｅｓｓ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．Ｍｏｌ Ｍｅｄ．２０１６；２２：２７４２－２７８５、Ｎｏｒｂｎｏｐ Ｐ，Ｉｎｇｒｕｎｇｒｕａｎｇｌｅｒｔ Ｐ，Ｉｓｒａｓｅｎａ Ｎ，Ｓｕｐｈａｐｅｅｔｉｐｏｒｎ Ｋ，Ｓｈｏｔｅｌｅｒｓｕｋ Ｖ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＨＬＡ－ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｐｌａｔｅｌｅｔｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ．２０２０；１０（１）：８４７２、Ｆｉｇｕｅｉｒｅｄｏ Ｃ，Ｇｏｕｄｅｖａ Ｌ，Ｈｏｒｎ ＰＡ，Ｅｉｚ－Ｖｅｓｐｅｒ Ｂ，Ｂｌａｓｃｚｙｋ Ｒ，Ｓｅｌｔｓａｍ Ａ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＨＬＡ－ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｐｌａｔｅｌｅｔｓ ｆｒｏｍ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ．Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ．２０１０；５０（８）：１６９０－１７０１、Ｇｒａｓ Ｃ，Ｓｃｈｕｌｚｅ Ｋ，Ｇｏｕｄｅｖａ Ｌ，Ｇｕｚｍａｎ ＣＡ，Ｂｌａｓｃｚｙｋ Ｒ，Ｆｉｇｕｅｉｒｅｄｏ Ｃ．ＨＬＡ－ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎｓ ｐｒｅｖｅｎｔ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｒｅｆｒａｃｔｏｒｉｎｅｓｓ ｉｎ ａ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１３；２４（１２）：１０１８－１０２８．）。
１．１発現の破壊 ベータ２ミクログロブリン（Beta 2 microglobulin、ｂ２Ｍ）
何人かの研究者が、Ｂ２ＭがノックアウトされたｈＰＳＣを設計した。これは、Ｂ２Ｍタンパク質がＨＬＡクラスＩタンパク質とヘテロ二量体を形成し、細胞表面上でのＨＬＡクラスＩ発現に必要であるためである。Ｂ２Ｍ遺伝子のノックアウトは、全てのＨＬＡクラスＩ分子（ＨＬＡ－Ａ、－Ｂ、－Ｃ、－Ｅ、－Ｆ及び－Ｇ）を枯渇させることによって、細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞からの免疫応答を制限することができる。Ｂ２Ｍ遺伝子の破壊は、ＣＲＩＳＰＲ、ＴＡＬＥＮ若しくはＲＮＡ干渉又は本明細書に記載の他の操作方法を使用して達成することができる。これは、ＣＤ３４＋ＨＳＣ前駆体細胞及びｈｉＰＳＣにおいて実証されている（Ｂｏｒｇｅｒ ＡＫ，Ｅｉｃｋｅ Ｄ，Ｗｏｌｆ Ｃ，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＨＬＡ－ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｉＰ－ ＳＣ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｅｓ ａｎｄ ｐｌａｔｅｌｅｔｓ ｆｏｒ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｕｎｄｅｒ ｒｅｆｒａｃｔｏｒｉｎｅｓｓ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．Ｍｏｌ Ｍｅｄ．２０１６；２２：２７４２－２７８５、Ｎｏｒｂｎｏｐ Ｐ，Ｉｎｇｒｕｎｇｒｕａｎｇｌｅｒｔ Ｐ，Ｉｓｒａｓｅｎａ Ｎ，Ｓｕｐｈａｐｅｅｔｉｐｏｒｎ Ｋ，Ｓｈｏｔｅｌｅｒｓｕｋ Ｖ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＨＬＡ－ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｐｌａｔｅｌｅｔｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ．２０２０；１０（１）：８４７２、Ｆｉｇｕｅｉｒｅｄｏ Ｃ，Ｇｏｕｄｅｖａ Ｌ，Ｈｏｒｎ ＰＡ，Ｅｉｚ－Ｖｅｓｐｅｒ Ｂ，Ｂｌａｓｃｚｙｋ Ｒ，Ｓｅｌｔｓａｍ Ａ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＨＬＡ－ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｐｌａｔｅｌｅｔｓ ｆｒｏｍ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ．Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ．２０１０；５０（８）：１６９０－１７０１、Ｇｒａｓ Ｃ，Ｓｃｈｕｌｚｅ Ｋ，Ｇｏｕｄｅｖａ Ｌ，Ｇｕｚｍａｎ ＣＡ，Ｂｌａｓｃｚｙｋ Ｒ，Ｆｉｇｕｅｉｒｅｄｏ Ｃ．ＨＬＡ－ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎｓ ｐｒｅｖｅｎｔ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｒｅｆｒａｃｔｏｒｉｎｅｓｓ ｉｎ ａ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１３；２４（１２）：１０１８－１０２８．）。
【0280】
Ｎｏｒｂｎｏｐらは、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集を使用して、Ｂ２ＭノックアウトｈｉＰＳＣから分化したＨＳＣ、ＭＫ及び血小板を生成した。ＨＬＡユニバーサルｈｉＰＳＣ由来血小板は、機能的であることが見出され、増強されたＣＤ６２Ｐ（活性化血小板）発現によって活性化され、トロンビン及びアラキドン酸（古典的血小板アゴニスト）による刺激によって凝集が増強された。興味深いことに、鈴木ら（Ｓｕｚｕｋｉ Ｄ，Ｆｌａｈｏｕ Ｃ，Ｙｏｓｈｉｋａｗａ Ｎ，Ｓｔｉｒｂｌｙｔｅ Ｉ，Ｈａｙａｓｈｉ Ｙ，Ｓａｗａｇｕｃｈｉ Ａ，Ａｋａｓａｋａ Ｍ，Ｎａｋａｍｕｒａ Ｓ，Ｈｉｇａｓｈｉ Ｎ，Ｘｕ Ｈ，Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ Ｔ，Ｆｕｊｉｏ Ｋ，Ｍａｎｚ ＭＧ，Ｈｏｔｔａ Ａ，Ｔａｋｉａｚａｗａ Ｈ，Ｅｔｏ Ｋ，Ｓｕｇｉｍｏｔｏ Ｎ（２０２０）ｉＰＳＣ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｐｌａｔｅｌｅｔｓ ｄｅｐｌｅｔｅｄ ｏｆ ＨＬＡ ｃｌａｓｓ Ｉ ａｒｅ ｉｎｅｒｔ ｔｏ ａｎｔｉ－ＨＬＡ ｃｌａｓｓ Ｉ ａｎｄ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ １４（１）：４９－５９）は、Ｂ２Ｍ－ＫＯ ｉＰＳＣ－ＰＬＴが、ＨＬＡ－Ｉ発現を完全に欠いているが、インビトロでＮＫ細胞応答を誘発しないことを見出した。この観察は、ＨＬＡ－ＫＯ血小板を拒絶するＮＫ細胞の懸念を除去するが（戦略＃２及び＃３を参照されたい）、血小板の低い免疫原性の理由は未知のままである。
【0281】
いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍの発現は、以下のｇＲＮＡのうちのいずれか１つ以上を使用してノックアウトされる（実施例５を参照されたい）。
Ｂ２Ｍ＿１：ＡＡＧＵＣＡＡＣＵＵＣＡＡＵＧＵＣＧＧＡ［配列番号１１２］
Ｂ２Ｍ＿２：ＡＧＵＣＡＣＡＵＧＧＵＵＣＡＣＡＣＧＧＣ［配列番号１１３］
Ｂ２Ｍ＿３：ＡＣＵＵＧＵＣＵＵＵＣＡＧＣＡＡＧＧＡＣ［配列番号１１４］
Ｂ２Ｍ＿４：ＵＣＡＣＧＵＣＡＵＣＣＡＧＣＡＧＡＧＡＡ［配列番号１１５］
Ｂ２Ｍ＿１：ＡＡＧＵＣＡＡＣＵＵＣＡＡＵＧＵＣＧＧＡ［配列番号１１２］
Ｂ２Ｍ＿２：ＡＧＵＣＡＣＡＵＧＧＵＵＣＡＣＡＣＧＧＣ［配列番号１１３］
Ｂ２Ｍ＿３：ＡＣＵＵＧＵＣＵＵＵＣＡＧＣＡＡＧＧＡＣ［配列番号１１４］
Ｂ２Ｍ＿４：ＵＣＡＣＧＵＣＡＵＣＣＡＧＣＡＧＡＧＡＡ［配列番号１１５］
【0282】
以下のうちのいずれかが好ましい。
Ｂ２Ｍ＿２：ＡＧＵＣＡＣＡＵＧＧＵＵＣＡＣＡＣＧＧＣ［配列番号１１３］
Ｂ２Ｍ＿４：ＵＣＡＣＧＵＣＡＵＣＣＡＧＣＡＧＡＧＡＡ［配列番号１１５］
Ｂ２Ｍ＿２：ＡＧＵＣＡＣＡＵＧＧＵＵＣＡＣＡＣＧＧＣ［配列番号１１３］
Ｂ２Ｍ＿４：ＵＣＡＣＧＵＣＡＵＣＣＡＧＣＡＧＡＧＡＡ［配列番号１１５］
【0283】
好ましくは、
Ｂ２Ｍ＿４：ＵＣＡＣＧＵＣＡＵＣＣＡＧＣＡＧＡＧＡＡ。［配列番号１１５］
Ｂ２Ｍ＿４：ＵＣＡＣＧＵＣＡＵＣＣＡＧＣＡＧＡＧＡＡ。［配列番号１１５］
【0284】
Ｂ２Ｍ発現の完全ではないが著しい消滅でさえも、所望の低免疫表現型を提供し得る。レンチウイルス送達Ｂ２Ｍ短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を使用して、Ｋａｒａｂｅｋｉａｎら（Ｋａｒａｂｅｋｉａｎ Ｚ，Ｄｉｎｇ Ｈ，Ｓｔｙｂａｙｅｖａ Ｇ，ｅｔ ａｌ．ＨＬＡ ｃｌａｓｓ Ｉ ｄｅｐｌｅｔｅｄ ｈＥＳＣ ａｓ ａ ｓｏｕｒｃｅ ｏｆ ｈｙｐｏｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ｔｉｓｓｕｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇ Ｐｔ Ａ．２０１５；２１（１９－２０）：２５５９－２５７１）は、Ｂ２ＭのｍＲＮＡレベルが９０％減少したことを報告した。ｓｈＲＮＡによるＢ２Ｍ発現の持続的な抑制は、Ｔ細胞活性化による免疫反応だけでなく、ＮＫ細胞応答の抑制にも有効であった。後者の効果は、細胞におけるｓｈＲＮＡ発現がｈＥＳＣにおけるＢ２Ｍ発現の完全な排除をもたらさず、これがＮＫ細胞媒介細胞死滅を回避する利点を与えたという事実に起因する可能性がある。
【0285】
したがって、いくつかの実施形態では、本発明の操作された前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシは、操作されていない前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシに対して低減された免疫原性を有するように操作されている。いくつかの実施形態では、操作されていないシャーシに対して低減された免疫原性を有するように操作されている操作された前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシは、内因性ＭＨＣクラス１の機能を破壊するように、かつ／又はβ２ミクログロブリン遺伝子からの発現を破壊するように操作されている。いくつかの実施形態では、β２ミクログロブリン遺伝子はノックアウトされている。いくつかの実施形態では、β２ミクログロブリン遺伝子は、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集、又はｓｈＲＮＡ、任意選択で、ｓｈＲＮＡのレンチウイルス送達の使用によってノックアウトされている。
【0286】
１．２ ＨＬＡ遺伝子からの発現を破壊する
Ｂ２Ｍ破壊に加えて、又はその代わりに、ＨＬＡ－Ａ、Ｂ及びＣ分子のノックアウトがある。Ｄｅｕｓｅ ｅｔ ａｌ（Ｄｅｕｓｅ Ｔ，Ｓｅｉｆｅｒｔ Ｍ，Ｔｙａｎ Ｄ，ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｎａｉｖｅ ａｎｄ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＨＬＡ－ｃｌａｓｓ－Ｉ－ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．２０１１；１２４（Ｐｔ １７）：３０２９－３０３７）は、低免疫原性ｈＥＳＣを生成するために、イントラボディ技術を使用してＨＬＡクラスＩ分子がノックダウンされたｈＥＳＣを調製した。操作されたｈＥＳＣは、Ｔ細胞、ＮＫ細胞及びマクロファージからの免疫応答の大幅な低減を誘導し、したがって操作されたｈＥＳＣの生存を延長した。
Ｂ２Ｍ破壊に加えて、又はその代わりに、ＨＬＡ－Ａ、Ｂ及びＣ分子のノックアウトがある。Ｄｅｕｓｅ ｅｔ ａｌ（Ｄｅｕｓｅ Ｔ，Ｓｅｉｆｅｒｔ Ｍ，Ｔｙａｎ Ｄ，ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｎａｉｖｅ ａｎｄ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＨＬＡ－ｃｌａｓｓ－Ｉ－ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．２０１１；１２４（Ｐｔ １７）：３０２９－３０３７）は、低免疫原性ｈＥＳＣを生成するために、イントラボディ技術を使用してＨＬＡクラスＩ分子がノックダウンされたｈＥＳＣを調製した。操作されたｈＥＳＣは、Ｔ細胞、ＮＫ細胞及びマクロファージからの免疫応答の大幅な低減を誘導し、したがって操作されたｈＥＳＣの生存を延長した。
【0287】
Ｘｕら（Ｘｕ Ｈ，Ｗａｎｇ Ｂ，Ｏｎｏ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｏｆ ＨＬＡ ｇｅｎｅｓ ｖｉａ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｇｅｎｅｒａｔｅｓ ｉＰＳＣｓ ｗｉｔｈ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｉｍｍｕｎｅ ｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ．２０１９；２４（４）：（５６６－５７８）はまた、ＨＬＡ－Ａ及びＨＬＡ－Ｂがノックアウトされているが、ＨＬＡ－Ｃの単一対立遺伝子のみがＣＲＩＳＰＲによってノックアウトされている、ｈｉＰＳＣも調製した。ＨＬＡ－Ｃ発現を有するが、ＨＬＡ－Ａ及びＨＬＡ－Ｂ発現を有しないｈｉＰＳＣ－Ｃ細胞は、ＮＫ細胞活性を抑制した。１１本発明者らはまた、ヒト化マウスを使用して、インビボでのｈｉＰＳＣ－Ｃの移植片生存を評価した。Ｂ２ＭノックアウトｈｉＰＳＣの数は、ＮＫ細胞移植後に急速に減少したが、ｈｉＰＳＣ－Ｃ細胞は、インビボで広範囲に生存した。
【0288】
したがって、いくつかの実施形態では、前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシが、１つ以上のＨＬＡ遺伝子からの発現が破壊されるように操作されている、前述の請求項のいずれか一項に記載の操作された前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシ。いくつかの実施形態では、操作された前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシは、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ及び／又はＨＬＡ－Ｃのいずれか１つ以上からの発現が破壊されるように操作されている。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃの両方の対立遺伝子からの発現が破壊されている。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ａ及びＨＬＡ－Ｂの発現は、完全に破壊されているが、ＨＬＡ－Ｃの発現は、部分的に破壊されている。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ａ及びＨＬＡ－Ｂの両方の対立遺伝子からの発現が破壊されているが、ＨＬＡ－Ｃの一方の対立遺伝子のみからの発現が破壊されている。
【0289】
戦略＃２：ＨＬＡクラスＩｂ遺伝子の過剰発現によって免疫原性が低下した前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシの生成。
ｈＰＳＣにおいてＢ２Ｍをノックアウトすることは、それらが自己消失応答を欠くため、それらをナチュラルキラー（natural killer、ＮＫ）細胞媒介死滅に対して感受性にすることが一般に予想される。ＨＬＡ－Ｉ分子は、ＮＫ細胞上のキラー免疫グロブリン様受容体（killer immunoglobulin-like receptor、ＫＩＲ）及びＣＤ９４／ＮＫＧ２の阻害性リガンドである。
ｈＰＳＣにおいてＢ２Ｍをノックアウトすることは、それらが自己消失応答を欠くため、それらをナチュラルキラー（natural killer、ＮＫ）細胞媒介死滅に対して感受性にすることが一般に予想される。ＨＬＡ－Ｉ分子は、ＮＫ細胞上のキラー免疫グロブリン様受容体（killer immunoglobulin-like receptor、ＫＩＲ）及びＣＤ９４／ＮＫＧ２の阻害性リガンドである。
【0290】
多くの生理学的及び病理学的状態において、免疫調節分子は、天然に存在する。そのような分子には、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ４７及びＰＤ－Ｌ１が含まれる。ここ数年にわたって、これらの４つの分子は、普遍的な細胞の操作における上位の競合者として出現した。それらは、２つの群：「非古典的ＨＬＡクラスＩｂ（ＨＬＡ－Ｇ及びＥ）」及び「免疫チェックポイント」戦略（ＰＤＬ－１及びＣＤ４７）に分類される。
【0291】
したがって、いくつかの実施形態では、操作された前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシは、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ４７及びＰＤ－Ｌ１のうちのいずれか１つ以上を過剰発現するように操作されている。いくつかの実施形態では、操作された前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシは、ベータ２ミクログロブリンからの発現を阻害するように操作されており、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ４７及びＰＤ－Ｌ１のうちのいずれか１つ以上を過剰発現するようにも操作されている。
【0292】
２．１．ＨＬＡ－Ｇの過剰発現
ＨＬＡ－Ｇは、その１つ以上が細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞、Ｔｒｅｇ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、樹状細胞及び単球上で発現される、ＩＬＴ２、ＩＬＴ４及びＫＩＲ２ＤＬ４などの阻害性受容体を介して、自然免疫系及び適応免疫系の実質的に全てのアームに対して強力な免疫抑制作用を有するという点で、免疫調節分子の中でも独特である。ＨＬＡクラスＩａ陰性、ＨＬＡ－Ｇ陽性のｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞は、免疫原性が低減しており、インビトロでの生存の増加をもたらす（Ｂｊｏｒｄａｈｌ Ｒ，Ｃｌａｒｋｅ Ｒ，Ｇａｉｄａｒｏｖａ Ｓ ｅｔ ａｌ．Ｍｕｌｔｉ－ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｏｆｆ－ｔｈｅ－ｓｈｅｌｆ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｂｌｏｏｄ １３０（Ｓｕｐｐｌ．１），３１８７（２０１７）。
ＨＬＡ－Ｇは、その１つ以上が細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞、Ｔｒｅｇ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、樹状細胞及び単球上で発現される、ＩＬＴ２、ＩＬＴ４及びＫＩＲ２ＤＬ４などの阻害性受容体を介して、自然免疫系及び適応免疫系の実質的に全てのアームに対して強力な免疫抑制作用を有するという点で、免疫調節分子の中でも独特である。ＨＬＡクラスＩａ陰性、ＨＬＡ－Ｇ陽性のｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞は、免疫原性が低減しており、インビトロでの生存の増加をもたらす（Ｂｊｏｒｄａｈｌ Ｒ，Ｃｌａｒｋｅ Ｒ，Ｇａｉｄａｒｏｖａ Ｓ ｅｔ ａｌ．Ｍｕｌｔｉ－ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｏｆｆ－ｔｈｅ－ｓｈｅｌｆ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｂｌｏｏｄ １３０（Ｓｕｐｐｌ．１），３１８７（２０１７）。
【0293】
しかしながら、おそらく最も重要なことには、例えば、以下の３つの報告において、ＨＬＡ－Ｇは、ＨＬＡクラスＩａ（ＨＬＡ－Ａ、Ｂ及びＣ）が無傷のままである、同種異系細胞に対する耐性を促進することができるようである（Ｚｈａｏ Ｌ，Ｔｅｋｌｅｍａｒｉａｍ Ｔ，Ｈａｎｔａｓｈ ＢＭ．Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｍｕｔａｔｅｄ ＨＬＡ－Ｇ ｄｅｃｒｅａｓｅｓ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．１３（２），３４２－３５４（２０１４）、Ｔｅｋｌｅｍａｒｉａｍ Ｔ，Ｚｈａｏ Ｌ，Ｈａｎｔａｓｈ ＢＭ．Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｍｕｔａｔｅｄ ＨＬＡ－Ｇ１ ｒｅｄｕｃｅｓ ａｌｌｏｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｄｅｒｍａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ．Ｒｅｇｅｎ．Ｍｅｄ．９（６），７７５－７８４（２０１４）、Ｚｈａｏ ＨＸ，Ｊｉａｎｇ Ｆ，Ｚｈｕ ＹＪ ｅｔ ａｌ．Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｂｙ ＨＬＡ－Ｇ１ ｆｒｏｍ ｎｅｕｒａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ（ＮＰＣｓ）ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ（ｈＥＳＣｓ）．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４４（４），１４３５－１４４４（２０１７））。したがって、今日まで、ＨＬＡ－Ｇ１は、ＨＬＡクラスＩａ分子の遺伝子操作が行われていない同種異系細胞に対する耐性を単独で誘導することが示されている唯一の免疫調節分子である。
【0294】
２．２．ＨＬＡ－Ｅの過剰発現
ＨＬＡ－Ｅは、ＨＬＡ－Ｇと同様に、非古典的ＨＬＡクラスＩｂ分子であり、これは最小限に多型性である。単純化されたレベルでは、ＨＬＡ－Ｅは、ＮＫ及びＣＤ８＋Ｔ細胞上の受容体ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａを介して免疫阻害剤であるか、又はＮＫ及びＣＤ８＋Ｔ細胞上の受容体ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃを介して、並びにＴ細胞上のＴ細胞受容体を介して免疫活性化因子であるという二重の役割を有する。
ＨＬＡ－Ｅは、ＨＬＡ－Ｇと同様に、非古典的ＨＬＡクラスＩｂ分子であり、これは最小限に多型性である。単純化されたレベルでは、ＨＬＡ－Ｅは、ＮＫ及びＣＤ８＋Ｔ細胞上の受容体ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａを介して免疫阻害剤であるか、又はＮＫ及びＣＤ８＋Ｔ細胞上の受容体ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃを介して、並びにＴ細胞上のＴ細胞受容体を介して免疫活性化因子であるという二重の役割を有する。
【0295】
Ｇｏｒｎａｌｕｓｓｅら（Ｇｏｒｎａｌｕｓｓｅ ＧＧ，Ｈｉｒａｔａ ＲＫ，Ｆｕｎｋ ＳＥ，ｅｔ ａｌ．ＨＬＡ－Ｅ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｅｓｃａｐｅ ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ａｎｄ ｌｙｓｉｓ ｂｙ ＮＫ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１７；３５（８）：７６５－７７２）もまた、ＣＤ４７過剰発現（下記参照）だけでなく、ＨＬＡ－Ｅの強制発現によっても、自己消失応答の欠損を予防することができることを報告した。ＨＬＡ－ＥをＢ２Ｍ遺伝子座におけるｈＥＳＣにノックインしたところ、ＨＬＡ編集されたｈＥＳＣは、ＨＬＡ－Ａ、－Ｂ又は－Ｃの表面発現を示さなかった。ＨＬＡ編集されたｈＥＳＣ及びそれらの分化細胞（ＲＰＥ細胞及びＨＳＣ）は、ＣＤ８＋Ｔ細胞による同種異系応答を示さず、ＮＫ細胞による溶解に抵抗した。この研究は、ＨＬＡ－Ｅを除いて多型ＨＬＡクラスＩ分子を発現しないｈＥＳＣ及びそれらの分化細胞におけるＨＬＡ－Ｅ発現が、ＮＫ細胞による自己消失応答の阻害を防止し得ることを実証した。
【0296】
戦略＃３：免疫調節遺伝子の過剰発現による免疫原性の低下を伴う前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシの生成。
３．１．ＣＤ４７の過剰発現
ＣＤ４７は、マクロファージに対する「ｄｏｎ’ｔ ｅａｔ ｍｅ」シグナルとして作用して、細胞を食作用から保護することによって、自己認識において重要な役割を果たす。これは、ＣＤ４７と、マクロファージ上に見られる阻害性受容体であるＳＩＲＰα／ＣＤ１７２ａとの相互作用を介して達成される。ＣＤ４７は、免疫逃避のために固形悪性腫瘍及び血液悪性腫瘍において広範囲に上方制御される。また、胎児－母体血液と胎児組織との間の界面は、細胞性栄養膜細胞から構成され、低レベルのＨＬＡクラスＩ及びＩＩ分子並びに高レベルのＣＤ４７を発現する。したがって、Ｄｅｕｓｅら（Ｄｅｕｓｅ Ｔ，Ｈｕ Ｘ，Ｇｒａｖｉｎａ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ｈｙｐｏｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｏｆ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｅｖａｄｅ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｆｕｌｌｙ ｉｍｍｕｎｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ ｒｅｃｉｐｉｅｎｔｓ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１９；３７（３）：２５２－２５８）は、ＣＲＩＳＰＲを使用してＢ２Ｍ及びＣＩＩＴＡの両方をノックアウトし、その後、ＣＤ４７遺伝子をｈｉＰＳＣにノックインした、ｈｉＰＳＣ（ＢＣＣ－ｈｉＰＳＣ）を設計した。ＢＣＣ－ｈｉＰＳＣに由来する心筋細胞及び内皮細胞は、同種異系レシピエントにおいて免疫応答を回避した。具体的には、ＢＣＣ－ｈｉＰＳＣ上のＣＤ４７の過剰発現は、インビトロ及びインビボでＮＫ細胞活性及び殺傷能を阻害した。
３．１．ＣＤ４７の過剰発現
ＣＤ４７は、マクロファージに対する「ｄｏｎ’ｔ ｅａｔ ｍｅ」シグナルとして作用して、細胞を食作用から保護することによって、自己認識において重要な役割を果たす。これは、ＣＤ４７と、マクロファージ上に見られる阻害性受容体であるＳＩＲＰα／ＣＤ１７２ａとの相互作用を介して達成される。ＣＤ４７は、免疫逃避のために固形悪性腫瘍及び血液悪性腫瘍において広範囲に上方制御される。また、胎児－母体血液と胎児組織との間の界面は、細胞性栄養膜細胞から構成され、低レベルのＨＬＡクラスＩ及びＩＩ分子並びに高レベルのＣＤ４７を発現する。したがって、Ｄｅｕｓｅら（Ｄｅｕｓｅ Ｔ，Ｈｕ Ｘ，Ｇｒａｖｉｎａ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ｈｙｐｏｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｏｆ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｅｖａｄｅ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｆｕｌｌｙ ｉｍｍｕｎｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ ｒｅｃｉｐｉｅｎｔｓ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１９；３７（３）：２５２－２５８）は、ＣＲＩＳＰＲを使用してＢ２Ｍ及びＣＩＩＴＡの両方をノックアウトし、その後、ＣＤ４７遺伝子をｈｉＰＳＣにノックインした、ｈｉＰＳＣ（ＢＣＣ－ｈｉＰＳＣ）を設計した。ＢＣＣ－ｈｉＰＳＣに由来する心筋細胞及び内皮細胞は、同種異系レシピエントにおいて免疫応答を回避した。具体的には、ＢＣＣ－ｈｉＰＳＣ上のＣＤ４７の過剰発現は、インビトロ及びインビボでＮＫ細胞活性及び殺傷能を阻害した。
【0297】
３．２．ＰＤ－Ｌの過剰発現
ＣＤ２７４又はＢ７－Ｈ１としても知られるＰＤ－Ｌ１は、「ｄｏｎ’ｔ ｆｉｎｄ ｍｅ」シグナルをＴ細胞に送達し、それによって、Ｔ細胞上に位置するＰＤ－１受容体に結合してＴ細胞を阻害する。ＰＤ－Ｌ１は、Ｔ細胞表面に提示されるプログラム細胞死１（ＰＤ－１）に対して高い結合親和性を有し、ＰＤ－Ｌ１とＰＤ－１との間の相互作用が、Ｔ細胞活性の阻害をもたらす。Ｒｏｎｇら（Ｒｏｎｇ Ｚ，Ｗａｎｇ Ｍ，Ｈｕ Ｚ，ｅｔ ａｌ．Ａｎ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｐｒｅｖｅｎｔ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＥＳＣ－ｄｅｒｉｖｅｄ ａｌｌｏｇｒａｆｔｓ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ．２０１４；１４（１）：１２１－１３０）は、ＰＤ－Ｌ１及び細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（cytotoxic T lymphocyte antigen 4、ＣＴＬＡ４）－免疫グロブリン（immunoglobulin、Ｉｇ）を建設的に発現する遺伝子編集ｈＥＳＣ（ＰＣ－ｈＥＳＣ）を生成した。ＣＴＬＡ４は、Ｔ細胞の活性化に関与する主要なシグナル伝達経路である、ＣＤ８６及びＣＤ８０に対して高い結合親和性を有する。次いで、ＣＴＬＡ４及びＩｇの融合タンパク質を、Ｔ細胞媒介免疫応答を阻害するように設計した。ＰＣ－ｈＥＳＣから分化した細胞は、ヒト化マウスに移植された場合に免疫応答を生じなかったが、遺伝的に編集されていない元のｈＥＳＣは、ヒト化マウスにおいて広範に拒絶された。
ＣＤ２７４又はＢ７－Ｈ１としても知られるＰＤ－Ｌ１は、「ｄｏｎ’ｔ ｆｉｎｄ ｍｅ」シグナルをＴ細胞に送達し、それによって、Ｔ細胞上に位置するＰＤ－１受容体に結合してＴ細胞を阻害する。ＰＤ－Ｌ１は、Ｔ細胞表面に提示されるプログラム細胞死１（ＰＤ－１）に対して高い結合親和性を有し、ＰＤ－Ｌ１とＰＤ－１との間の相互作用が、Ｔ細胞活性の阻害をもたらす。Ｒｏｎｇら（Ｒｏｎｇ Ｚ，Ｗａｎｇ Ｍ，Ｈｕ Ｚ，ｅｔ ａｌ．Ａｎ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｐｒｅｖｅｎｔ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＥＳＣ－ｄｅｒｉｖｅｄ ａｌｌｏｇｒａｆｔｓ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ．２０１４；１４（１）：１２１－１３０）は、ＰＤ－Ｌ１及び細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（cytotoxic T lymphocyte antigen 4、ＣＴＬＡ４）－免疫グロブリン（immunoglobulin、Ｉｇ）を建設的に発現する遺伝子編集ｈＥＳＣ（ＰＣ－ｈＥＳＣ）を生成した。ＣＴＬＡ４は、Ｔ細胞の活性化に関与する主要なシグナル伝達経路である、ＣＤ８６及びＣＤ８０に対して高い結合親和性を有する。次いで、ＣＴＬＡ４及びＩｇの融合タンパク質を、Ｔ細胞媒介免疫応答を阻害するように設計した。ＰＣ－ｈＥＳＣから分化した細胞は、ヒト化マウスに移植された場合に免疫応答を生じなかったが、遺伝的に編集されていない元のｈＥＳＣは、ヒト化マウスにおいて広範に拒絶された。
【0298】
本明細書に記載の遺伝子の破壊及び過剰発現の様々な組み合わせを行うことができることは、当業者には明らかである。例えば、Ｈａｎら（Ｈａｎ Ｘ，Ｗａｎｇ Ｍ，Ｄｕａｎ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｙｐｏｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ ｈｕｍａｎ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０１９；１１６（２１）：１０４４１－１０４４６）は、ＨＬＡ－Ａ、－Ｂ及び－Ｃがノックアウトされた、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集を使用して低免疫原性ｈＥＳＣを生成した。その後、ＰＤ－Ｌ１、ＨＬＡ－Ｇ及びＣＤ４７を、これらのＨＬＡ欠損ＫＯ細胞中のＡＡＶＳ１のセーフハーバー遺伝子座にノックインした。
【0299】
したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、操作された前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシを提供し、前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシは、操作されていないシャーシに対して低減された免疫原性を有するように操作されており、前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシは、
ａ）ＭＨＣクラス１遺伝子又はタンパク質の機能が破壊されている、
ｂ）β２ミクログロブリン遺伝子からの発現が破壊されており、任意選択でβ２ミクログロブリン遺伝子がノックアウトされている、
ｃ）１つ以上のＨＬＡ遺伝子からの発現が破壊されている、
ｄ）ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ及び／又はＨＬＡ－Ｃのうちのいずれか１つ以上からの発現が破壊されており、任意選択で、ＨＬＡ－Ａ及びＨＬＡ－Ｂの発現は完全に破壊されているが、ＨＬＡ－Ｃの発現は部分的に破壊されており、任意選択で、ＨＬＡ－Ａ及びＨＬＡ－Ｂの両方の対立遺伝子からの発現は破壊されているが、ＨＬＡ－Ｃの一方の対立遺伝子のみからの発現は破壊されている、
ｅ）ＨＬＡクラスＩｂ遺伝子のうちのいずれか１つ以上、任意選択でＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ４７及びＰＤ－Ｌ１のうちのいずれか１つ以上を過剰発現する、
ｆ）ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ４７及びＰＤ－Ｌ１のうちのいずれか１つ以上を過剰発現する（任意選択で、ベータ２ミクログロブリン遺伝子からの発現が破壊されるように操作されている）、並びに／又は
ｇ）１つ以上の免疫調節遺伝子を過剰発現する（任意選択で、１つ以上の免疫調節遺伝子が、ＣＤ４７及びＰＤ－Ｌ１を含む群から選択される）ように操作されている。
ａ）ＭＨＣクラス１遺伝子又はタンパク質の機能が破壊されている、
ｂ）β２ミクログロブリン遺伝子からの発現が破壊されており、任意選択でβ２ミクログロブリン遺伝子がノックアウトされている、
ｃ）１つ以上のＨＬＡ遺伝子からの発現が破壊されている、
ｄ）ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ及び／又はＨＬＡ－Ｃのうちのいずれか１つ以上からの発現が破壊されており、任意選択で、ＨＬＡ－Ａ及びＨＬＡ－Ｂの発現は完全に破壊されているが、ＨＬＡ－Ｃの発現は部分的に破壊されており、任意選択で、ＨＬＡ－Ａ及びＨＬＡ－Ｂの両方の対立遺伝子からの発現は破壊されているが、ＨＬＡ－Ｃの一方の対立遺伝子のみからの発現は破壊されている、
ｅ）ＨＬＡクラスＩｂ遺伝子のうちのいずれか１つ以上、任意選択でＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ４７及びＰＤ－Ｌ１のうちのいずれか１つ以上を過剰発現する、
ｆ）ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ４７及びＰＤ－Ｌ１のうちのいずれか１つ以上を過剰発現する（任意選択で、ベータ２ミクログロブリン遺伝子からの発現が破壊されるように操作されている）、並びに／又は
ｇ）１つ以上の免疫調節遺伝子を過剰発現する（任意選択で、１つ以上の免疫調節遺伝子が、ＣＤ４７及びＰＤ－Ｌ１を含む群から選択される）ように操作されている。
【0300】
上記の遺伝子調節及び／又は過剰発現のうちのいずれかに加えて、本明細書に記載の操作された前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシは、より有利な前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシ、例えば、第２世代の前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシに更に操作され得る。これらの更なる操作工程は、いくつかの実施形態では、前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシ内に含有される、例えば、操作された血小板又は操作された血小板様膜結合細胞フラグメントとともに含有されるカーゴの効力に産物が負に影響し得る１つ以上の遺伝子を排除することを目的とする。前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシの天然の特性は、自然応答／適応応答に関して調整することができる。以下に記載されるのは、操作され得る２つの例示的な遺伝子であるが、この概念は、他の遺伝子（付録に列挙される）に適用され得る。このアプローチは、望ましい血管形成における血小板のベースライン特性を修飾するために拡張され得る。
【0301】
止血の一次細胞メディエーターとしてのそれらの十分に特徴付けられた役割を超えて、血小板が自然免疫応答及び適応免疫応答の調節において重要な役割を有することが徐々に認識されてきた。例えば、血小板は、炎症、血管新生、アテローム性動脈硬化症、リンパ発達及び腫瘍増殖の開始において役割を有することが示されている。
【0302】
プロテオミクス分析は、血小板が、トロンビンによる活性化後に３００を超える異なるタンパク質を分泌する能力を有し、そのうちのいくつか（例えば、ＩＬ－１、ＴＬＲ及びＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌとしても知られる））が、血液凝固以外のプロセスに明らかに関与することを実証した。
【0303】
それらが休止しているか又は活性化されているかにかかわらず、血小板は、それらの表面上（又はエキソソーム及び微小胞の表面上）に、血小板間の同型相互作用及び血小板と異なる免疫細胞集団との間の異型相互作用の両方を促進する一連の接着タンパク質を提示する。活性化されると、それらはまた、様々な炎症促進性及び抗炎症性サイトカイン及びケモカインを含有する、それらの顆粒の内容物を放出する。
【0304】
多数の報告が、自然系及び適応系由来の細胞並びに病原体又は病原体に感染した細胞と接触している休止血小板及び活性化血小板の相互作用を研究している。明らかになった像は、血小板が、状況（微小環境、細胞状態、組織完全性など）に完全に依存する炎症促進性及び免疫抑制性を併せ持つということである。
【0305】
前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシの遺伝子破壊は、血栓形成プログラムを除去するために排他的に標的化されるため、本明細書に記載の前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシ、例えば操作された前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシ、例えば血栓形成能が低下した操作された前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシ、例えば血栓形成能が低下した操作された血小板又は血小板様膜結合細胞フラグメントは、自然応答及び適応応答の調節においてヒト血小板と広く類似した特性を有すると考えられる。
【0306】
本明細書に記載されるように、いくつかの実施形態では、前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシは、脱顆粒時に放出されるカーゴを含み、好ましい実施形態では、前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシはまた、標的部位での脱顆粒及びカーゴの放出の局所的な誘発をもたらすように、本発明の１つ以上のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲを含む。脱顆粒の際に、顆粒の標準内容物もカーゴと一緒に放出されることが予想される。
【0307】
これは、大量の循環野生型血小板を考慮すると、操作された血小板の生物学的可能性、したがって治療可能性に悪影響を及ぼさない可能性があるが、いくつかの治療設定では、操作された血小板によって天然に産生されたいくつかの接着タンパク質及び／又はカーゴ実体が、操作された血小板の局所的な生物学的作用に間接的に対抗し、それによって治療有効性を低減する可能性があると考えられる。
【0308】
これに対処するために、操作されたカーゴの生物学的作用に間接的に対抗する可能性が高い接着タンパク質及び／又はカーゴ実体をコードする１つ以上の遺伝子を破壊して、より大きな正味の治療効果をもたらす可能性があることが有利であると考えられる。
【0309】
ここで概説される概念は、ＣＡＲ Ｔ細胞などの他の細胞療法とともに適用されており、例えば、ＭｃＧｏｗａｎ ｅｔ ａｌ ２０２０ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ ＰＤ－１ ｄｉｓｒｕｐｔｅｄ ＣＡＲ－Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｓｏｌｉｄ ｔｕｍｏｒｓ：Ｐｒｏｍｉｓｅｓ ａｎｄ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｂｉｏｐｈａ．２０１９．１０９６２５）を参照されたい。
【0310】
したがって、一実施形態では、操作された前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシ、例えば操作された骨髄幹細胞、巨核芽球、巨核球、巨核球様細胞、ｉＰＳＣ、血小板、又は血小板様膜結合細胞フラグメントは、操作されたカーゴの生物学的作用に間接的に対抗する可能性が高い接着タンパク質及び／又はカーゴ実体をコードする１つ以上の遺伝子の発現を破壊又はノックアウトするように操作されており、潜在的により大きな正味の治療効果をもたらす。
【0311】
ＣＤ４０Ｌの下方制御
活性化されると、血小板は、ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４として知られる）を放出する。ＣＤ４０Ｌは、Ｔ細胞上で最初に記載され、免疫系の重要な同時刺激シグナル発生及び機能であるが、血液血小板の真の数は、血液血小板を循環におけるＣＤ４０Ｌの主な供給源にする。
活性化されると、血小板は、ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４として知られる）を放出する。ＣＤ４０Ｌは、Ｔ細胞上で最初に記載され、免疫系の重要な同時刺激シグナル発生及び機能であるが、血液血小板の真の数は、血液血小板を循環におけるＣＤ４０Ｌの主な供給源にする。
【0312】
ＣＤ４０Ｌは、抗原提示細胞（Ｂ細胞、マクロファージ、樹状細胞、単球）上に主に見出される受容体であるＣＤ４０に結合する。ＣＤ４０はまた、上皮細胞及び内皮細胞、線維芽細胞、筋線維芽細胞、星細胞、並びに休止血小板などの非免疫細胞上にも存在する。ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ系は、免疫細胞間、及び免疫細胞と非免疫細胞との間の相互作用を可能にする。
【0313】
ＣＤ４０は、細胞表面受容体（Ｔヘルパー細胞及び活性化血小板上など）として、播種及び免疫の遠位制御のために循環中に放出される血小板微小胞（platelet micro-vesicle、ＰＭＶ）の表面に、又は可溶性三量体ｓＣＤ４０Ｌとして提示されるＣＤ４０Ｌと結合することができる。
【0314】
ＣＤ４０ＬとＣＤ４０との係合は、ＣＤ４０＋細胞の免疫応答プログラムの活性化をもたらす。例えば、（１）内皮細胞（endothelial cell、ＥＣ）は、ケモカイン（ＩＬ－８、ＴＮＦアルファ及びＭＣＰ－１）を分泌し、接着分子（Ｅ－セレクチン、ＶＣＡＭ及びＩＣＡＭ－１）を発現する。（２）ＤＣは、Ｉｌ－６及びＩＬ－１２を産生するとともに、それらのＣＤ８０及びＣＤ８６の発現を増加させる。（３）Ｂ細胞は、アイソタイプスイッチ、記憶表現型への成熟、及び増殖を受ける。
【0315】
ＣＤ４０は、炎症応答、体液性免疫及び細胞性免疫のための重要な活性化受容体である。ＣＤ４０は広範囲の細胞型に存在し、活性化血小板はＴヘルパー細胞とともにＣＤ４０Ｌ（膜結合及び可溶性）の主な寄与因子であるため、免疫系活性化が治療応答を促進することが求められる治療適応症において、血小板中のＣＤ４０Ｌレベルを維持することが有益であると推論することができる。
【0316】
しかしながら、他の治療設定において、操作された血小板におけるＣＤ４０Ｌの存在は、直交性の内因性／外因性カーゴが免疫、炎症及び／又は増殖事象を遮断するように選択される場合、直交性の内因性／外因性カーゴの治療効力を打ち消す／圧倒し得る。そのような治療設定は、例えば、抗原提示ＣＤ４０＋細胞によって駆動又は支持されるいくつかの形態の血液媒介がん又は自己免疫疾患（例えば、ＲＡ、クローン病、シェーグレン症候群）である。例えば、ＣＤ４０＋単核細胞（ＳＦＭＣ）は、関節リウマチ（rheumatoid arthritis、ＲＡ）を有する患者からの生検の滑液中に豊富である。ＲＡ ＳＦＭＣからのＴＮＦ－アルファ分泌は、ＣＤ４０刺激によって増強されるが、ＲＡ ＳＦＭＣからのＴＮＦ－アルファの自然分泌は、抗ＣＤ４０抗体によって阻害される。したがって、ＲＡを治療するためにＳＦＭＣにペイロードを送達することを対象とする操作された血小板は、血小板がＣＤ４０Ｌを欠いている場合、より大きな疾患修飾効果を示し得る。（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ＣＤ４０ ｉｎ ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ｓｙｎｏｖｉｕｍ Ｊ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．１９９８ Ｊｕｎ；２５（６）：１０４８－５３．）別の例では、ＣＤ４０は、多くのＢ細胞悪性腫瘍（すなわち、慢性リンパ性白血病（chronic lymphocytic leukemia、ＣＬＬ）及び多発性骨髄腫（multiple myeloma、ＭＭ）、非ホジキンリンパ腫、ホジキン病、及び急性リンパ芽球性白血病）及びある種の固形悪性腫瘍（例えば、腎細胞がん、乳がん、黒色腫、膵臓がん）の表面に発現される。濾胞性Ｔヘルパー細胞によるＣＤ４０Ｌ係合は、これらの悪性細胞において強力な生存促進性シグナル伝達を誘導する。それはまた、フルダラビン及びＢｃｌ－２アンタゴニストベネトクラクスなどのアポトーシス誘導低分子剤に対する耐性を誘導する。非アゴニスト抗体を用いてＣＤ４０を遮断するアプローチは、臨床において進歩している（Ｌｅｕｋ Ｌｙｍｐｈｏｍａ．２０１２ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ；５３（１１）Ｐｈａｓｅ Ｉ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｔｉ－ＣＤ４０ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｌｕｃａｔｕｍｕｍａｂ（ＨＣＤ１２２）ｉｎ ｒｅｌａｐｓｅｄ ｃｈｒｏｎｉｃ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ．）。したがって、悪性Ｂ細胞へのペイロードの送達を対象とする操作された血小板は、血小板がＣＤ４０Ｌを欠いている場合、より大きな疾患修飾効果を示し得ることが予想される。
【0317】
結論として、ＣＤ４０Ｌを欠く本発明の前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシは、ＣＤ４０Ｌの局所放出が炎症、
免疫応答又は細胞増殖を遮断することを目的とした直交治療効果に対抗する状況において、操作された血小板のより大きな治療有効性の可能性を開くであろう。
免疫応答又は細胞増殖を遮断することを目的とした直交治療効果に対抗する状況において、操作された血小板のより大きな治療有効性の可能性を開くであろう。
【0318】
したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、ＣＤ４０Ｌ遺伝子の発現を破壊又はノックアウトするように操作された、操作された前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシ、例えば、操作された骨髄幹細胞、巨核芽球、巨核球、巨核球様細胞、ｉＰＳＣ、血小板、又は血小板様膜結合細胞フラグメントを提供する。
【0319】
拡大解釈すると、活性化血小板の表面に提示されるか又は活性化血小板から放出される他の免疫活性化因子／エフェクター（可溶性タンパク質、エキソソーム上に固定された受容体又はＰＭＶのいずれかとして）を、遺伝子破壊／サイレンシングの標的とすることができる。ゲノム操作の効率及び多重能力は、１つの前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシにおいて複数の免疫活性化剤を標的化することを可能にする。いくつかの実施形態では、ＣＤ３６、ＮＯＤ２、ＳＲＢ１、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ６、ＴＬＲ９、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ９３（Ｃ１ｑＲｐ）、Ｃ３ａＲ、ＣＤ８８（Ｃ５ａＲ）、ＣＤ８９（ＦｃａＲ１）、ＣＤ２３（ＦｃｅＲ１）、ＣＤ３２（ＦｃｇＲＩＩａ）、ＭＨＣｃｌａｓｓ１、ＣＤ１９１（ＣＣＲ１）、ＣＤ１９３（ＣＣＲ３）、ＣＤ１９４（ＣＣＲ４）、ＣＤ１８４（ＣＸＣＲ４）、ＣＸ３ＣＲ１、ＣＤ１０２（ＩＣＡＭ－２）、ＪＡＭ－Ｃ／ＪＡＭ－３、ＣＤ６２Ｐ（Ｐ－セレクチン）、ＣＤ３１（ＰＥＣＡＭ－１）、ＣＤ１５０（ＳＬＡＭＦ１）、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ５、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ４／ＰＦ４、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ８、ＮＡＰ２（ＣＸＣＬ７）、ＩＬ－１ｂの発現を破壊又は阻害することが有益であると考えられる抗炎症性免疫エフェクターの非排他的なリスト。図１２を参照されたい。
【0320】
したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、以下の遺伝子：ＣＤ３６、ＮＯＤ２、ＳＲＢ１、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ６、ＴＬＲ９、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ９３（Ｃ１ｑＲｐ）、Ｃ３ａＲ、ＣＤ８８（Ｃ５ａＲ）、ＣＤ８９（ＦｃａＲ１）、ＣＤ２３（ＦｃｅＲ１）、ＣＤ３２（ＦｃｇＲＩＩａ）、ＭＨＣｃｌａｓｓ１、ＣＤ１９１（ＣＣＲ１）、ＣＤ１９３（ＣＣＲ３）、ＣＤ１９４（ＣＣＲ４）、ＣＤ１８４（ＣＸＣＲ４）、ＣＸ３ＣＲ１、ＣＤ１０２（ＩＣＡＭ－２）、ＪＡＭ－Ｃ／ＪＡＭ－３、ＣＤ６２Ｐ（Ｐ－セレクチン）、ＣＤ３１（ＰＥＣＡＭ－１）、ＣＤ１５０（ＳＬＡＭＦ１）、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ５、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ４／ＰＦ４、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ８、ＮＡＰ２（ＣＸＣＬ７）、ＩＬ－１ｂのうちのいずれか１つ以上の発現を破壊又はノックアウトするように操作された、操作された前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシ、例えば、操作された骨髄幹細胞、巨核芽球、巨核球、巨核球様細胞、ｉＰＳＣ、血小板、又は血小板様膜結合細胞フラグメントを提供する。
【0321】
ＧＡＲＰ－ＴＧＦβ軸の下方制御
トランスフォーミング増殖因子－β（ＴＧＦ－β）は、大部分の細胞によって発現され、全ての組織において見出される多面的サイトカインである。それは、生物学的プロセス（例えば、細胞増殖、発生、アポトーシス、線維症、血管新生、創傷治癒、及びがん）の多くの局面において重要な役割を果たす。
トランスフォーミング増殖因子－β（ＴＧＦ－β）は、大部分の細胞によって発現され、全ての組織において見出される多面的サイトカインである。それは、生物学的プロセス（例えば、細胞増殖、発生、アポトーシス、線維症、血管新生、創傷治癒、及びがん）の多くの局面において重要な役割を果たす。
【0322】
獲得免疫において、ＴＧＦ－β１は、従来のＣＤ４＋Ｔ（Ｔｃｏｎｖ）細胞を、転写因子Ｆｏｘｐ３を発現する誘導制御性Ｔ（ｉＴｒｅｇ）細胞に変換し、Ｔｒｅｇ増殖を促進するために必要とされる。自然免疫及びがんに関して、ＴＧＦ－βは、ＮＫＧ２Ｄリガンドの下方制御を介して、樹状細胞（dendritic cell、ＤＣ）成熟並びにナチュラルキラー（natural killer、ＮＫ）細胞を阻害する。ＴＧＦ－βの役割は、がんの開始を促進する非消散性炎症においても十分に研究されている。腫瘍由来ＴＧＦ－βは、マクロファージを腫瘍関連マクロファージ（tumour-associated macrophage、ＴＡＭ）に分極させる。ＴＡＭに由来するＴＧＦ－βは、転移をもたらす上皮間葉転換（epithelial to mesenchymal transition、ＥＭＴ）の主要な駆動因子のうちの１つである。更に、ＴＧＦ－βは、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞（cytotoxic T cell、ＣＴＬ）のクローン増殖及び細胞傷害性を直接阻害することによって、適応抗腫瘍免疫を損なう。最後に、ＴＧＦ－βは、ＣＤ４＋Ｔ細胞に調節性及び免疫抑制性の表現型を付与するＦｏｘｐ３の発現を誘導することによってＣＴＬを間接的に減弱させる。
【0323】
血小板は、ＴＧＦβ自体の分泌よりもむしろＴＧＦβドッキングＧＡＲＰの構成的発現を介して、全身的に、並びに腫瘍微小環境において、機能的ＴＧＦβの主要な供給源である。ＧＡＲＰ（糖タンパク質－Ａ反復優勢タンパク質）は、免疫細胞上、特に活性化Ｔｒｅｇ上、及び構成的に血小板上で発現される潜在型ＴＧＦ－β１受容体として同定されている。血小板内因性ＧＡＲＰは、ＴＧＦβの捕捉及び活性化において最も主要な役割を果たし、したがって、Ｔｒｅｇ細胞恒常性に著しく寄与する。
【0324】
これと一致して、いくつかの報告は、免疫性血小板減少症を有する患者がＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋調節性Ｔ（ＴＲｅｇ）細胞の欠損を有することを示している。血小板数を増加させる療法（静脈内免疫グロブリン、デキサメタゾン、リツキシマブ又はＴＰＯなど）は、ＩＴＰ患者においてＴｒｅｇ細胞数及び機能を回復させることが示されている。
【0325】
ＴＧＦβシグナル伝達は、がん進行において重要な役割を有し、ほとんどのがん細胞は、それらの上皮抗増殖応答を不活性化しており、遺伝子発現、免疫抑制性サイトカインの放出及び上皮可塑性に対する効果を介して、ＴＧＦβ発現及び自己分泌ＴＧＦβシグナル伝達の増加から利益を得る。結果として、ＴＧＦβは、がん細胞の浸潤及び播種、幹細胞特性並びに治療抵抗性を可能にする。がん細胞、間質線維芽細胞及び腫瘍微小環境中の他の細胞によって放出されるＴＧＦβは、腫瘍の構造を形作ることによって、及び免疫細胞の抗腫瘍活性を抑制することによってがんの進行を更に促進し、したがって、抗がん免疫療法の有効性を防止又は減衰する免疫抑制環境を生成する。
【0326】
したがって、ＧＡＲＰ－ＴＧＦβ軸は、がん微小環境における重要な免疫抑制性分子ホールマークである（Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ Ｏｎｃｏｌ．２０１８ Ｆｅｂ ２０；１１（１）Ｉｍｍｕｎｏｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ＧＡＲＰ－ＴＧＦ－ｂｅｔａ ｉｎ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃａｎｃｅｒ）。血小板は、バイスタンダーではない。実際、血小板がＧＡＲＰ－ＴＧＦβ軸を介してＴ細胞免疫を拘束するという証拠は、ＧＡＲＰコード遺伝子Ｌｒｒｃ３２の血小板特異的欠失によって得られており、これは腫瘍部位でのＴＧＦβ活性の鈍化をもたらし、動物モデルにおいて黒色腫及び結腸がんの両方に対する防御免疫を増強した（Ｐｌａｔｅｌｅｔｓ ｓｕｂｖｅｒｔ Ｔ ｃｅｌｌ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｖｉａ ＧＡＲＰ－ＴＧＦｂｅｔａ ａｘｉｓ．Ｓｃｉ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１７ Ｍａｙ ５；２（１１）。
【0327】
ＧＡＲＰ－ＴＧＦβ軸は、転移性細胞を「覆う」血小板にも関与しており、それらは、腫瘍細胞からの可溶性ＮＫＧ２Ｄリガンドの放出を誘導して検出をマスクすること（「免疫デコイ」）によって、並びにＮＫ細胞脱顆粒及び炎症性サイトカイン（ＩＦＮγ）産生を同時に能動的に抑制することによって、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を阻害する。
【0328】
したがって、（ｉＰＳＣレベルでのＧＡＲＰ若しくはＴＧＦβ遺伝子の破壊によるか、又はサイレンシングＲＮＡの発現によるかのいずれかで）ＧＡＲＰ－ＴＧＦβ軸を欠く本発明の前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシは、ＴＧＦβの活性化及び局所濃度が、がん細胞増殖及びＥＭＴを遮断することを目的とした直交治療効果に対抗する多くの状況において、操作された血小板のより大きな治療有効性の可能性を開く。
【0329】
いくつかの実施形態では、ＧＡＲＰ ＬＲＲＣ３２遺伝子は、以下のｇＲＮＡのうちのいずれかを使用してノックアウトされる。
ｇＲＮＡ９９：ＣＣＵＧＡＧＣＵＧＣＡＡＣＡＧＣＡＵＣＧ［配列番号１１６］
ｇＲＮＡ１００：ＧＣＣＡＣＣＡＧＣＡＣＵＣＡＧＣＧＣＡＧ［配列番号１１７］
ｇＲＮＡ９９：ＣＣＵＧＡＧＣＵＧＣＡＡＣＡＧＣＡＵＣＧ［配列番号１１６］
ｇＲＮＡ１００：ＧＣＣＡＣＣＡＧＣＡＣＵＣＡＧＣＧＣＡＧ［配列番号１１７］
【0330】
拡大解釈すると、活性化血小板の表面に提示されるか又は活性化血小板から放出される他の免疫調節因子（可溶性タンパク質、エキソソーム上に固定された受容体又はＰＭＶのいずれかとして）を、遺伝子破壊／サイレンシングの標的とすることができる。ゲノム操作の効率及び多重能力は、１つの前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシにおいて複数の免疫下方調節因子を標的化することを可能にする。いくつかの実施形態では、その発現を破壊又は阻害することが有益であると考えられる抗炎症性免疫エフェクターの非排他的なリストは、以下のとおりである：Ｓｉｇｌｅｃ－７、Ｓｉｇｌｅｃ－９、Ｓｉｇｌｅｃ－１１、ＴＧＦｂ。図１４及び図１５を参照されたい。
【0331】
したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、以下の遺伝子：Ｓｉｇｌｅｃ－７、Ｓｉｇｌｅｃ－９、Ｓｉｇｌｅｃ－１１、ＴＧＦｂのうちのいずれか１つ以上の発現を破壊又はノックアウトするように操作された、操作された前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシ、例えば、操作された骨髄幹細胞、巨核芽球、巨核球、巨核球様細胞、ｉＰＳＣ、血小板、又は血小板様膜結合細胞フラグメントを提供する。
【0332】
本明細書に記載されるように、遺伝子破壊又は過剰発現のうちのいずれか１つ以上を含む前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシは、本発明のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲのうちのいずれか１つ以上を含んでも含まなくてもよく、すなわち、本発明は、ＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲのうちのいずれか１つ以上を含まない本明細書に記載されるような前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシを提供し、また本発明の１つ以上のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲを含む本明細書に記載されるような前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシも提供することに留意されたい。
【0333】
いくつかの実施形態では、前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシは、Ｔ細胞シグナル伝達を増強し、免疫応答を刺激するために、１つ以上の追加のＩＴＡＭ受容体を発現するように操作され得る。Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）に結合した抗原を認識する（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｊａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉ．Ｓｉｇｎａｌ．１１，ｅａａｎ１０８８（２０１８）を参照されたい）。ＴＣＲ上のＩＴＡＭは、結合及び認識の作用を細胞内シグナルに変換する（同上）。追加のＩＴＡＭをキメラＴＣＲに挿入すると、ＩＴＡＭ受容体の数に比例してスケーリングすることが観察され、ＩＴＡＭ受容体の数を減らすかノックアウトすると、胸腺細胞系統の関与を損なうことによってＴ細胞の発達が阻害されることが観察された（同上）。したがって、一実施形態では、本発明は、Ｔ細胞シグナル伝達を増強し、免疫応答を刺激するために１つ以上の追加のＩＴＡＭ受容体を発現するように操作された、本明細書に記載されるような前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ若しくはエフェクターシャーシ、又は操作された前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ若しくはエフェクターシャーシを提供する。
【0334】
操作された前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシが、任意の数の異なる遺伝子破壊、遺伝子欠失、若しくは遺伝子過剰発現、又は他の修飾を含み得ることは、上記から明らかである。
【0335】
いくつかの実施形態では、操作された前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシ、例えば、操作された骨髄幹細胞、巨核芽球、巨核球、巨核球様細胞、ｉＰＳＣ、血小板又は血小板様膜結合細胞フラグメントは、少なくとも１つの遺伝子、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９又は少なくとも１０個の遺伝子の破壊、例えば、少なくとも１つの遺伝子、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９又は少なくとも１０個の遺伝子の破壊を含み、ここで、遺伝子は、血栓形成経路に関与し、免疫原性に関与し、かつ／又は炎症に関与する。
【0336】
いくつかの実施形態では、操作された前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシは、特定のシグナルに応答してタンパク質を合成するように操作されている。例えば、Ｗｅｙｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ．では、ＢＣＬ－３は、ラパマイシン（mechanistic target of rapamycin、ｍＴＯＲ）依存性シグナル伝達機構の機械的標的を介して、活性化血小板で特異的に上方制御された（Ｗｅｙｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ．「Ｓｉｇｎａｌ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｂｃｌ－３，ｉｎ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｈｕｍａｎ ｐｌａｔｅｌｅｔｓ」．ＰＮＡＳ，１９９８を参照され、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。したがって、ＢＣＬ－３遺伝子座への遺伝子のノックイン又は活性化依存性翻訳を媒介する最小の５’ＵＴＲ領域の同定により、血小板における合成遺伝子発現調節が可能になる。したがって、本明細書に記載の操作された前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシは、いくつかの実施形態では、シグナル伝達誘導性タンパク質翻訳をもたらす改変されたシグナル伝達経路を有し得る。例えば、前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシは、血小板活性化の際にカーゴタンパク質を発現するように操作されてもよく、かつ／又は血小板を破壊する目的で、若しくは毒性ペイロードを標的細胞／組織に送達する目的で、活性化の際に毒性タンパク質を発現するように操作されてもよい。
【0337】
いくつかの実施形態では、操作された前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシ、例えば操作された血小板又は操作された血小板様膜結合細胞フラグメントは、活性化シグナルに応答してタンパク質を合成することができる。例えば、Ｗｅｙｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ．では、ＢＣＬ－３は、ラパマイシン（ｍＴＯＲ）依存性シグナル伝達機構の機械的標的を介して、活性化血小板で特異的に上方制御された（Ｗｅｙｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ．「Ｓｉｇｎａｌ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｂｃｌ－３，ｉｎ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｈｕｍａｎ ｐｌａｔｅｌｅｔｓ」．ＰＮＡＳ，１９９８を参照され、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。したがって、ＢＣＬ－３遺伝子座への遺伝子のノックイン又は活性化依存性翻訳を媒介する最小の５’ＵＴＲ領域の同定により、血小板における合成遺伝子発現調節が可能になる。したがって、本明細書に記載の血小板は、シグナル伝達誘導タンパク質翻訳をもたらすシグナル伝達経路が改変している可能性がある。例えば、一度活性化された毒性タンパク質を発現するか、又は標的細胞の認識に続いて下流のイベントを引き起こす。したがって、いくつかの実施形態では、前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシは、血小板又は血小板様膜結合細胞フラグメントの活性化に応答して目的のタンパク質又はＲＮＡを合成するように操作されており、任意選択で、目的のタンパク質又はＲＮＡは、ＢＣＬ－３遺伝子座から発現される。
【0338】
本明細書に記載されるような前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシ、例えば、血栓形成能を欠き、かつ／又は免疫原性が低減しており、かつ／又は炎症能が低減しており、本発明の１つ以上のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲを発現する操作された前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシは、標的化送達システムであるとみなすことができる。したがって、本発明は、本発明の任意の１つ以上のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲを発現する、本明細書に記載されるような前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ若しくはエフェクターシャーシ又は操作された前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ若しくはエフェクターシャーシを含む標的化送達システムを提供する。
【0339】
カーゴの標的化送達を実際に行うエフェクターシャーシが、血小板若しくは血小板様膜結合細胞フラグメント、又はＳｙｎｌｅｔであることは当業者には明らかであるが、血小板若しくは血小板様膜結合細胞フラグメント、又はＳｙｎｌｅｔは、前駆体（precursor）前駆体（progenitor）シャーシ又はプロデューサーシャーシ、例えばｉＰＳＣ又は巨核球に由来する。
【0340】
場合によっては、前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシ、例えば、標的化送達システムの前駆体シャーシ、又はプロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシは、本発明の１つより多くのＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲを含む。例えば、前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシは、場合によっては、本発明の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、又は少なくとも１０種の異なるＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲを含む。
【0341】
場合によっては、例えば、前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシが、本発明の少なくとも２つのＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲを発現する場合、本発明の少なくとも２つのＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲの標的結合ドメインが異なる標的に向けられている場合、これは前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシを少なくとも２つの異なる標的に標的化することを可能にする。
【0342】
場合によっては、異なる標的結合ドメインを有する少なくとも２つのＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲの血小板調節ドメインは、両方とも血小板活性化ドメインであり、ＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲのうちの一方又は両方がそれぞれの標的に結合すると、血小板が脱顆粒する。これは、ＯＲシステムであると考えることができ、すなわち、血小板は、第１の標的又は第２の標的に結合すると活性化する。これが有用であり得る状況は、例えば、特定のがんが２つの異なる細胞表面腫瘍特異的抗原を発現することが知られている場合である。
【0343】
場合によっては、異なる標的結合ドメインを有する、少なくとも２つのＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲの血小板調節ドメインは、反対の機能を有し、すなわち、１つの血小板調節ドメインは、血小板活性化ドメインであり、第２の血小板調節ドメインは、血小板の活性化を阻害するドメインである。この状況において、例えば、第１の標的結合ドメインを有する第１のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲの血小板調節ドメインは、血小板活性化ドメインであってもよく、例えば、ＩＴＡＭ含有ドメインであってもよく、第２の標的結合ドメインを有する第２のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲの血小板調節ドメインは、血小板脱顆粒の活性化を阻害するドメインであってもよく、例えば、ＩＴＩＭ含有ドメインであってもよい。この実施形態の前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシが第１の標的にのみ結合する場合、ＩＴＡＭドメインは、血小板活性化及び脱顆粒をもたらす。しかしながら、第１及び第２の標的の両方が存在し、第１及び第２のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲが第１及び第２の標的に結合する場合、第２のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲのＩＴＩＭドメインは、そうでなければ第１の標的が第１のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲに結合することによって引き起こされる血小板の活性化を抑制する。このようにして、ＡＮＤ／ＯＲ／ＮＯＲのような複雑な論理ネットワークを構築することが可能である。上記の例では、活性化は、第１の標的の存在及び第２の標的の非存在下でのみ起こる。第２の標的が存在し、第２のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲによっても結合される場合、第１のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲを介した血小板活性化が阻害される。
【0344】
これらのタイプの論理ネットワークは、例えば、ＩＴＡＭドメインに基づくもの、ＩＴＩＭドメインに基づくもの、及びＧＰＣＲに基づくものを含む、本明細書に記載のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲのうちのいずれかを組み込むことができる。
【0345】
いくつかの実施形態では、前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシが、それを非血栓形成性にするように操作された、操作された前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシ、例えば、非血栓形成性になるように操作された、操作されたｉＰＳＣ、操作された巨核球又は操作された血小板であり、前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシが本発明の１つ以上のＣＰＲを発現する場合、操作された前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシと、１つ以上のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲとの組み合わせは、非血栓形成性送達システムであるとみなすことができる。したがって、本発明は、本発明による操作された前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシを含む非血栓形成性送達システムを提供し、操作された前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシは、非血栓形成性であり、本発明の１つ以上のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲを発現する。そのようなシステムは、Ｓｙｎｌｅｔ送達システムと称され得る。
【0346】
非血栓形成性送達システム又はＳｙｎｌｅｔ送達システムは、治療カーゴの送達のためのものであってもよく、この場合、システムは、非血栓形成性治療送達システムであるとみなすことができるか、又はカーゴは、非治療カーゴであってもよく、例えば、化粧品カーゴ又は造影剤であってもよく、この場合、システムは、非血栓形成性非治療送達システムであるとみなすことができる。
【0347】
したがって、本発明は、前述の請求項のいずれか一項に記載の１つ以上のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲを発現する、前述の請求項のいずれか一項定義されるような前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシ、好ましくはエフェクターシャーシを含む標的化送達システムを提供し、任意選択で、標的化送達システムは、治療的標的化送達システム又は非治療的送達システムである。
【0348】
本発明はまた、前述の請求項のいずれか一項に記載の１つ以上のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲを発現する、前述の請求項のいずれか一項定義されるような前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシ、好ましくはエフェクターシャーシを含む非血栓形成性標的化送達システムを提供し、前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシは、血栓形成経路を破壊するように操作されており、標的化送達システムは、非血栓形成性治療的標的化送達システム又は非血栓形成性非治療的送達システムである。
【0349】
言及したように、本発明の前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ若しくはエフェクターシャーシ、又は本発明の操作された前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ若しくはエフェクターシャーシは、カーゴを含んでもよい。本発明の前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ若しくはエフェクターシャーシ、又はカーゴを含む本発明の操作された前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ若しくはエフェクターシャーシは、本発明の１つ以上のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ若しくはｅＰＡＲを含んでもよく、又は本発明の１つ以上のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ若しくはｅＰＡＲを含まなくてもよい。
【0350】
本明細書におけるカーゴへの言及は、血小板若しくは血小板様膜結合細胞フラグメント、又は操作された血小板若しくは操作された血小板様膜結合細胞フラグメントを使用して送達され得る任意のカーゴを指すことが意図される。送達され得るために、カーゴは、細胞質中、アルファ顆粒などの顆粒中、又は原形質膜中若しくは原形質膜表面に位置し得る。
【0351】
カーゴは、治療的カーゴであってもよく、又は非治療的カーゴであってもよく、例えば、造影剤又は美容剤であってもよい。
【0352】
どの薬剤がカーゴとして使用するのに好適であるかは、当業者には明らかである。カーゴは、シャーシによって内因的に発現され得るか、又はシャーシに外因的にロードされ得る任意の実体であり得る。例えば、いくつかの実施形態では、カーゴは、
ａ）タンパク質又はペプチドであって、いくつかの実施形態では、
ｉ）抗体若しくはその抗原結合フラグメント、例えば腫瘍抗原若しくは新抗原に結合する抗体若しくはその抗原結合フラグメント、
ｉｉ）ヌクレアーゼなどの酵素、例えばＴＡＬＥＮ、
ｉｉｉ）サイトカイン、例えばＩＬ－１０、又は
ｉｖ）ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質、例えばＣａｓ９、
ｖ）二重特異性タンパク質、例えば二重特異性抗体若しくはＴ細胞エンゲージャー（bispecific T-cell engager、ＢｉＴＥ）、
ｂ）核酸であって、いくつかの実施形態では、
ｉ）例えばｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、及びクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（clustered regularly interspaced short palindromic repeat、ＣＲＩＳＰＲ）配列から選択される、ＲＮＡ、又は
ｉｉ）ＤＮＡベクターである、核酸、
ｃ）毒素、
ｄ）小分子薬物又は造影剤、
ｅ）ＡＡＶなどのウイルスベクター、
ｆ）腫瘍溶解性ウイルスなどのウイルス、
ｇ）ＣＲＩＳＰＲ媒介遺伝子編集を実行するための薬剤、
あるいはそれらの任意の組み合わせ、
ｈ）放射性ヌクレオチド薬物、
ｉ）放射性ヌクレオチドタグ付抗体、又はそれらの任意のコンジュゲートを含むか、あるいはそれらからなる群から選択される。
ａ）タンパク質又はペプチドであって、いくつかの実施形態では、
ｉ）抗体若しくはその抗原結合フラグメント、例えば腫瘍抗原若しくは新抗原に結合する抗体若しくはその抗原結合フラグメント、
ｉｉ）ヌクレアーゼなどの酵素、例えばＴＡＬＥＮ、
ｉｉｉ）サイトカイン、例えばＩＬ－１０、又は
ｉｖ）ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質、例えばＣａｓ９、
ｖ）二重特異性タンパク質、例えば二重特異性抗体若しくはＴ細胞エンゲージャー（bispecific T-cell engager、ＢｉＴＥ）、
ｂ）核酸であって、いくつかの実施形態では、
ｉ）例えばｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、及びクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（clustered regularly interspaced short palindromic repeat、ＣＲＩＳＰＲ）配列から選択される、ＲＮＡ、又は
ｉｉ）ＤＮＡベクターである、核酸、
ｃ）毒素、
ｄ）小分子薬物又は造影剤、
ｅ）ＡＡＶなどのウイルスベクター、
ｆ）腫瘍溶解性ウイルスなどのウイルス、
ｇ）ＣＲＩＳＰＲ媒介遺伝子編集を実行するための薬剤、
あるいはそれらの任意の組み合わせ、
ｈ）放射性ヌクレオチド薬物、
ｉ）放射性ヌクレオチドタグ付抗体、又はそれらの任意のコンジュゲートを含むか、あるいはそれらからなる群から選択される。
【0353】
いくつかの実施形態では、カーゴは、抗体又はその抗原結合フラグメントである。本明細書で使用される場合、「抗体」又は「抗体（複数）」という用語は、抗原結合部位を含有する分子、例えば、免疫グロブリン分子、及び抗原結合部位を含有する免疫グロブリン分子の免疫学的に活性なフラグメントを指す。免疫グロブリン分子は、任意の種類（例えばＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、及びＩｇＹ）、クラス（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２）、又はサブクラスの免疫グロブリン分子であり得る。抗体としては、合成抗体、モノクローナル抗体、単一ドメイン抗体、一本鎖抗体、組換え産生された抗体、多重特異性抗体（二重特異性抗体を含む）、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、細胞内抗体、ｓｃＦｖ（例えば、単一特異的及び二重特異性などを含む）、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、及び上記のもののうちのいずれかのエピトープ結合フラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。
【0354】
本明細書で使用される場合、「抗体フラグメント」という用語は、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖなどの抗体の部分である。構造にかかわらず、抗体フラグメントは、インタクトな抗体によって認識されるのと同じ抗原に結合する。例えば、抗ＯＸ４０抗体フラグメントはＯＸ４０に結合する。「抗体フラグメント」という用語はまた、重鎖及び軽鎖の可変領域からなる「Ｆｖ」フラグメントなどの可変領域からなる単離されたフラグメント、並びに軽鎖及び重鎖可変領域がペプチドリンカーによって連結している組換え一本鎖ポリペプチド分子（「ｓｃＦｖタンパク質」）を含む。本明細書で使用される場合、「抗体フラグメント」という用語は、Ｆｃフラグメント又は単一アミノ酸残基などの、抗原結合活性を有さない抗体の部分を含まない。
【0355】
「Ｆａｂフラグメント」によって、本発明者らは、インタクトな抗体によって認識される同じ抗原に結合することができるＦａｂフラグメント（完全な軽鎖並びに重鎖の可変領域及びＣＨ１領域を含む）を含む。Ｆａｂフラグメントは当該技術分野で知られている用語であり、Ｆａｂフラグメントは、重鎖及び軽鎖の各々の１つの定常ドメイン及び１つの可変ドメインを含む。
【0356】
いくつかの実施形態では、前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシ、例えば操作された血小板に、免疫系から覆い隠されるであろう毒素をロードしてもよい。前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシ、例えば、操作された血小板には、血液脳関門（blood brain barrier、ＢＢＢ）を通過する薬剤の移入を仲介するために、ケモカイン及び／又はセレクチンをロードされ得る。前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシの他の実施形態は、膜及び／又は可溶性タンパク質をロードされた血小板分泌顆粒を有し得る。ある特定の実施形態では、毒素は、血小板受容体の活性化時に放出されるであろう分泌顆粒へのその取り込みを指示するために付着したα顆粒局在化シグナルでコードされ得る。
【0357】
プログラム細胞死タンパク質（ＰＤ－１）の血小板発現、及びシクロホスファミドによる操作された血小板のロードは、強力な抗黒色腫剤として機能することが観察されている（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．「Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ＰＤ－１－Ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ Ｐｌａｔｅｌｅｔｓ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．」Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２０１８を参照され、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。具体的には、巨核球はＰＤ－１を発現するように操作され、次いで、得られた操作された血小板にシクロホスファミドが受動的にロードされた。黒色腫を標的とする血小板は、合成受容体ではなく、インビボでの腫瘍の外科的創傷によって（すなわち、血小板の天然の血栓形成性を使用して）引き起こされ、腫瘍のＴｒｅｇ枯渇及びＣＤ８＋Ｔ細胞を介した死滅の増加をもたらした。腫瘍体積は、ＰＤ－１を発現する血小板又はシクロホスファミドをロードした血小板で治療した動物と比較して、ＰＤ－１及びシクロホスファミドの両方を投与した群の動物の治療開始から２０日後に有意に少ないことが観察された。
【0358】
いくつかの実施形態では、本発明の操作された血小板のカーゴは、メッセンジャーＲＮＡ（messenger RNA、ｍＲＮＡ）であり得る。本明細書で使用される場合、「メッセンジャーＲＮＡ」（ｍＲＮＡ）という用語は、目的のポリペプチドをコードし、翻訳されて、インビトロ、インビボ、インサイチュ又はエクスビボでコードされた目的のポリペプチドを産生することができる、任意のポリヌクレオチドを指す。そのようなｍＲＮＡ分子は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際公開第２０１３／１５１６６６号に教示されているもののうちのいずれかの構造的成分又は特徴を有し得る。
【0359】
いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集システムを使用して、巨核球のゲノムを改変して、本明細書に記載の操作された血小板を生成することができる。代替的に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを小胞にパッケージ化して、ＣＰＲによって認識される抗原による血小板の活性化時に放出することもできる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、ＲＮＡ誘導エンドヌクレアーゼを利用して特定の配列を標的とし、標的核酸を分解する細菌適応免疫系である。それらは、ゲノム編集及び／又は転写調節の分野での様々な用途での使用に適合されている。当該技術分野で知られている、又は本明細書に開示されている酵素又はオルソログのいずれかを、ゲノム編集のための本明細書の方法で利用することができる。
【0360】
ある特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムであり得る。Ｃａｓ９は、トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）及びＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）と一緒に機能して、二本鎖ＤＮＡを切断するエンドヌクレアーゼである。リンカーループでｃｒＲＮＡの３’末端をｔｒａｃｒＲＮＡの５’末端に接続することにより、２つのＲＮＡを操作して単一分子ガイドＲＮＡを形成することができる。Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３７（６０９６）：８１６－８２１（２０１２）（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムがＲＮＡプログラム可能なゲノム編集に有用であることを示し、国際公開第２０１３／１７６７７２号は、部位特異的遺伝子編集のためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステムの多数の例及び適用を提供し、これら全体は、参照により本明細書に組み込まれる。例示的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムには、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅａｓ、及びＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓに由来するシステムが含まれる。
【0361】
ある特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムであり得る。Ｃｐｆ１は、ＩＩ型システムとは対照的に、ｔｒａｃｒＲＮＡを欠く単一のＲＮＡ誘導エンドヌクレアーゼである。Ｃｐｆ１は、４又は５個のヌクレオチドの５’オーバーハングを伴う千鳥状のＤＮＡ二本鎖切断を生成する。Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ．２０１５ Ｏｃｔ ２２；１６３（３）：７５９－７１（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）は、ゲノム編集適用で使用できるＣｐｆ１エンドヌクレアーゼの例を提供し、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。例示的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムとしては、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ属種、及びＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍに由来するものが挙げられる。
【0362】
ある特定の実施形態では、一方又は他方のヌクレアーゼドメインが不活性化されているＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼのニッカーゼバリアントを使用して、ＣＲＩＳＰＲ媒介ゲノム編集の特異性を高めることができる。ニッカーゼは、ＨＤＲ対ＮＨＥＪを促進することが示されている。ＨＤＲは、個々のＣａｓニッカーゼから、又は標的領域に隣接するニッカーゼのペアを使用して向けられる。
【0363】
ある特定の実施形態では、触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、標的領域（例えば、受容体などの抗原をコードする遺伝子）に結合し、それらの機能を妨害するために使用され得る。Ｃａｓ９及びＣｐｆ１などのＣａｓヌクレアーゼは、２つのヌクレアーゼドメインを包含する。触媒部位で重要な残基を変異させると、標的部位にのみ結合するが切断をもたらさないバリアントが作成される。
【0364】
ある特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ又は酵素に融合された追加の機能的ドメインを含み得る。機能ドメインは、転写活性化、転写抑制、ＤＮＡメチル化、ヒストン改変、及び／又はクロマチンリモデリングを含むがこれらに限定されないプロセスに関与し得る。そのような機能的ドメインには、転写活性化ドメイン（例えば、ＶＰ６４又はＫＲＡＢ、ＳＩＤ又はＳＩＤ４Ｘ）、転写リプレッサー、リコンビナーゼ、トランスポザーゼ、ヒストンリモデラー、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、クリプトクロム、光誘導性／制御可能なドメイン又は化学的に誘導可能／制御可能なドメインが含まれるが、これらに限定されない。
【0365】
ある特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ又は酵素は、以下の１つ又は組み合わせ：１つ以上のポリペプチド、ポリペプチドをコードする１つ以上のｍＲＮＡ、又はポリペプチドをコードする１つ以上のＤＮＡ、として細胞又は患者に投与され得る。
【0366】
ある特定の実施形態では、ガイド核酸は、関連するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素の活性を、標的核酸内の特定の標的配列に向けるために使用され得る。ガイド核酸は、それらがＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素と結合することによって、ガイド核酸及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体に標的特異性を提供し、したがって、ガイド核酸は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素の活性を指示することができる。
【0367】
一態様では、ガイド核酸は、ＲＮＡ分子であり得る。一態様では、ガイドＲＮＡは、単一分子のガイドＲＮＡであり得る。一態様では、ガイドＲＮＡは、化学的に改変され得る。ある特定の実施形態では、ゲノム内の異なる部位での複数のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介活性を媒介するために、２つ以上のガイドＲＮＡが提供され得る。
【0368】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の操作された血小板の小胞内のカーゴは、限定されないが、参照により本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０２０／０５３２４７号の９８～１２３頁に提示されている段落［０１９０］に記載されているものなどの小分子薬物である。
【0369】
前述のように、実際の送達ツールは血小板又は血小板様膜結合細胞フラグメントであるが、これらは前駆体細胞のフラグメントであり、したがって、前駆体細胞は、いくつかの実施形態ではカーゴを運ぶこともできることが適切であり、例えば、カーゴが内因的に産生される場合、いくつかの実施形態では、カーゴは、本明細書で定義されるような前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシのうちのいずれか１つ以上、例えば、骨髄幹細胞、巨核芽球、巨核球、巨核球様細胞、ｉＰＳＣ、血小板、又は血小板様膜結合細胞フラグメントのうちのいずれかによって産生され得る。このようにして、例えば巨核球によって発現されるカーゴは、血小板又は血小板様膜結合細胞フラグメントにおいても見出されると考えられる。
【0370】
したがって、いくつかの実施形態では、カーゴは、本発明の前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシ、例えば、操作された骨髄幹細胞、巨核芽球、巨核球、巨核球様細胞、ｉＰＳＣ、血小板又は血小板様膜結合細胞フラグメント、
血小板（若しくはＳｙｎｌｅｔ）又は巨核球などの前駆体細胞によって内因的に産生される。
血小板（若しくはＳｙｎｌｅｔ）又は巨核球などの前駆体細胞によって内因的に産生される。
【0371】
当業者は、カーゴ、例えば
ａ）タンパク質又はペプチドであって、いくつかの実施形態では、
ｉ）抗体若しくはその抗原結合フラグメント、例えば腫瘍抗原若しくは新抗原に結合する抗体若しくはその抗原結合フラグメント、
ｉｉ）ヌクレアーゼなどの酵素、例えばＴＡＬＥＮ、
ｉｉｉ）サイトカイン、例えばＩＬ－１０、又は
ｉｖ）ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質、例えばＣａｓ９、
ｖ）二重特異性タンパク質、例えば二重特異性抗体若しくは任意選択でＴ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）である、タンパク又はペプチド、
ｂ）核酸であって、いくつかの実施形態では、
ｉ）例えばｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、及びクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）配列から選択される、ＲＮＡである、核酸を発現するように、必要な構築物、プロモーター及びコード配列を含むように本明細書に記載されるような前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシのうちのいずれかを更に操作することができる。
ａ）タンパク質又はペプチドであって、いくつかの実施形態では、
ｉ）抗体若しくはその抗原結合フラグメント、例えば腫瘍抗原若しくは新抗原に結合する抗体若しくはその抗原結合フラグメント、
ｉｉ）ヌクレアーゼなどの酵素、例えばＴＡＬＥＮ、
ｉｉｉ）サイトカイン、例えばＩＬ－１０、又は
ｉｖ）ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質、例えばＣａｓ９、
ｖ）二重特異性タンパク質、例えば二重特異性抗体若しくは任意選択でＴ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）である、タンパク又はペプチド、
ｂ）核酸であって、いくつかの実施形態では、
ｉ）例えばｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、及びクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）配列から選択される、ＲＮＡである、核酸を発現するように、必要な構築物、プロモーター及びコード配列を含むように本明細書に記載されるような前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシのうちのいずれかを更に操作することができる。
【0372】
上記のように、血小板活性化の際にのみ誘導されるプロモーターの調節下にカーゴの発現を置くように、前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシを操作することが可能である。そのような戦略は、カーゴが前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ若しくはエフェクターシャーシに対して、又は対象に対して毒性であり得る状況において特に有用である。
【0373】
本明細書に記載の前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシのうちのいずれかは、ゲノム位置からカーゴを発現するように、すなわち、カーゴをコードする核酸及び関連する調節配列がゲノム内の遺伝子座に標的化されるように操作され得る。核酸は、本明細書の他の箇所に記載されるように、エキソソーム標的化配列に融合されたカーゴタンパク質又はペプチドの融合タンパク質をコードし得る。
【0374】
本明細書に記載されるようなカーゴをコードする核酸は、様々な方法で前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシに導入することができることは明らかである。例えば、いくつかの実施形態では、カーゴをコードする核酸は、ゲノム核酸に導入される。例えば、カーゴをコードする核酸は、第１の遺伝子座の第１の対立遺伝子に導入することができ、かつ／又は核酸は、第１の遺伝子座の第２の対立遺伝子に導入することができる。追加的に又は代替的に、核酸を第１の遺伝子座の第１の対立遺伝子に導入することができ、第２の核酸（例えば、第２のカーゴをコードする）を第２の遺伝子座の第１の対立遺伝子に導入することができる。追加的に又は代替的に、第１の核酸を第１の遺伝子座の第１の対立遺伝子に導入することができ、第２の核酸を第１の遺伝子座の第２の対立遺伝子に導入することができる。
【0375】
いくつかの実施形態では、カーゴをコードする核酸は、前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシに導入され、例えば環状核酸、例えばベクターとして、前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシ中にエピソーム的に維持される。
【0376】
いくつかの実施形態では、本発明のカーゴをコードする核酸は、ヌクレオフェクションを介して前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシに導入される。
【0377】
本発明はまた、本明細書に記載されるようなカーゴをコードする核酸を提供する。
【0378】
また、本明細書に記載されるように、カーゴは、カーゴ内に外因的にロードされ得る。
【0379】
いくつかの実施形態では、カーゴがアルファ顆粒を標的とする場合が好ましい。例示的なアルファ顆粒標的化シグナルとしては、ＰＦ４及びｖＷｆが挙げられる。したがって、一実施形態では、
前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシは、アルファ顆粒局在化シグナル、任意選択でＰＦ４又はｖＷｆペプチド配列を含む本明細書に記載されるようなカーゴを含む。いくつかの実施形態では、前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシは、アルファ顆粒局在化シグナルとインフレームでカーゴをコードする核酸を含み、任意選択で、アルファ顆粒局在化シグナルは、ｖＷｆのＰＦ４から選択される。アルファ顆粒局在化シグナルを含むカーゴは、内因的に発現され得るか、又は外因的にロードされ得る。
前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシは、アルファ顆粒局在化シグナル、任意選択でＰＦ４又はｖＷｆペプチド配列を含む本明細書に記載されるようなカーゴを含む。いくつかの実施形態では、前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシは、アルファ顆粒局在化シグナルとインフレームでカーゴをコードする核酸を含み、任意選択で、アルファ顆粒局在化シグナルは、ｖＷｆのＰＦ４から選択される。アルファ顆粒局在化シグナルを含むカーゴは、内因的に発現され得るか、又は外因的にロードされ得る。
【0380】
上記のように、カーゴをロードしたエキソソームの送達を体内の特定の細胞、組織、器官又はマーカーに標的化する手段が有利であると考えられる。したがって、いくつかの実施形態では、カーゴ（内因的に生成された、又は外因的にロードされた）がエキソソームに向けられる場合が好ましい。エキソソームは、典型的にはアルファ顆粒中に貯蔵され、脱顆粒を介して細胞から排出される最も重要な薬剤のうちの１つである。
【0381】
本明細書に記載されるような前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシ（操作されておらず、本発明の受容体のうちの１つ以上を発現する、又は本発明の１つ以上の受容体を発現する操作された前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ若しくはエフェクターシャーシ）は、血小板又は血小板様膜結合細胞フラグメントの標的係合依存性活性化を可能にし、標的特異的な、局在化されたα顆粒からのエキソソーム放出を可能にし、全身性エキソソーム送達戦略が現在直面している問題を回避する。血小板エキソソームの構成タンパク質は古典的エキソソームに類似しているため、様々なカーゴのために他の細胞型において開発されたエキソソームローディング戦略を、本発明の前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシにおけるエキソソームへのカーゴの標的化に適用することができると予想される。
【0382】
様々なカーゴタイプをエキソソームに標的化するための、例えば、タンパク質又はペプチドカーゴ、ＲＮＡカーゴ、及び／又はＣａｓ９遺伝子編集ツールをエキソソームに標的化するための例示的な手段を以下に記載する。他の手段及び組み合わせもまた、これら及び他のカーゴタイプを標的化するために利用可能である。したがって、当業者は、カーゴをエキソソームに標的化する立場にある。
【0383】
エキソソームローディング戦略には２つの主要なクラスがある。第１は、標的化成分がカーゴ自体の一部であるため、前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシ、例えば巨核球又は巨核球様細胞に対する更なる修飾を必要としない（すなわち、前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシがカーゴを内因的に発現するように操作される場合、エキソソーム標的化モチーフはカーゴ内に組み込まれ、カーゴをエキソソームに標的化するために別個の操作工程は必要とされない）。第２のストラテジーは、カーゴが標的化され得る何か（例えば、操作されたもの（例えば、以下に記載のＴＡＭＥＬシステム））を適所に配置するために、前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシ（例えば、巨核球又は巨核球様細胞又はその前駆体）のいくらかの更なる操作を必要とする。
【0384】
戦略１－カーゴに固有のエキソソーム標的化
タンパク質カーゴ－エキソソームタンパク質ローディング
エキソソームは、カーゴをロードするためにそれらのＮ末端又はＣ末端で修飾され得る別個の特異的な膜タンパク質を特徴とする。例えば、カーゴタンパク質又はペプチドをテトラスパニン（例えば、ＣＤ６３）又は非テトラスパニン（例えば、ＰＴＧＦＲＮ若しくはＢＡＳＰ１）のＣ末端に融合させることにより、そのカーゴタンパク質又はペプチドはエキソソームの内腔内に局在することが期待される。なぜなら、ホーミングタンパク質は依然としてエキソソームコンパートメントに特異的に標的化されるからである（Ｄｏｏｌｅｙ，Ｋ ｅｔ ａｌ．（２０２１）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，２９（５），１７２９－１７４３、Ｆｕ，Ｓ．ｅｔ ａｌ（２０２０）２０（Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ），１００２６１）。
タンパク質カーゴ－エキソソームタンパク質ローディング
エキソソームは、カーゴをロードするためにそれらのＮ末端又はＣ末端で修飾され得る別個の特異的な膜タンパク質を特徴とする。例えば、カーゴタンパク質又はペプチドをテトラスパニン（例えば、ＣＤ６３）又は非テトラスパニン（例えば、ＰＴＧＦＲＮ若しくはＢＡＳＰ１）のＣ末端に融合させることにより、そのカーゴタンパク質又はペプチドはエキソソームの内腔内に局在することが期待される。なぜなら、ホーミングタンパク質は依然としてエキソソームコンパートメントに特異的に標的化されるからである（Ｄｏｏｌｅｙ，Ｋ ｅｔ ａｌ．（２０２１）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，２９（５），１７２９－１７４３、Ｆｕ，Ｓ．ｅｔ ａｌ（２０２０）２０（Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ），１００２６１）。
【0385】
血小板エキソソーム中に位置すると考えられる他の遺伝子は、血小板に局在するタンパク質についてのＥｘｏＣａｒｔａ検索に由来する表Ａ中の遺伝子のリストを含む。
【0386】
【表3-1】
【0387】
【表3-2】
【0388】
【表3-3】
【0389】
【表3-4】
【0390】
【表3-5】
【0391】
巨核球発現におけるカーゴタンパク質又はペプチド及び膜常在性エキソソームタンパク質を含む融合タンパク質の発現は、そのカーゴタンパク質又はペプチドによる血小板エキソソームローディングをもたらすと予想される。
【0392】
可溶性タンパク質は、カーゴタンパク質又はペプチドへの標的化配列の融合によってエキソソームに標的化され得る。そのようなアプローチの１つは、治療的タンパクへのＮｅｄｄ４ユビキチンリガーゼのＷＷドメインの融合である（Ｓｔｅｒｚｅｎｂａｃｈ，Ｕ．ｅｔ ａｌ（２０１７）２５（６），１２６９－１２７８）。この戦略は、Ｎｄｆｉｐ１依存性機構によるエキソソームの内腔へのキメラＷＷドメイン－カーゴタンパク質／ペプチド融合物の取り込みをもたらす。
【0393】
ユビキチン化タンパク質もまた、エキソソームに輸送されることが多い。カーゴタンパク質又はペプチドをユビキチンタグでタグ付けすることを使用して、カーゴタンパク質又はペプチドを可溶性タンパク質としてエキソソーム内腔に輸送するよう指示することもできる（（Ｃｈｅｎｇ，Ｙ．，＆Ｓｃｈｏｒｅｙ，Ｊ．Ｓ．（２０１６）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１１３（６），１３１５－１３２４；Ｇｉｏｖａｎｎｏｎｅ，Ａ．ｅｔ ａｌ（２０１７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ，２８（２１），２８４３－２８５３）。
【0394】
巨核球発現におけるカーゴタンパク質又はペプチド及びエキソソームローディングタグを含む融合タンパク質の発現は、そのカーゴタンパク質又はペプチドによる血小板エキソソームローディングをもたらすと予想される。
【0395】
したがって、カーゴがタンパク質又はペプチドであるいくつかの実施形態では、カーゴタンパク質又はペプチドは、
ａ）カーゴタンパク質又はペプチドと、
ｂ）エキソソーム標的化ドメインと、を含む融合タンパク質として発現され、例えば、エキソソーム標的化ドメインが、
ｉ）エキソソーム特異的膜タンパク質又はそのエキソソーム膜標的化部分、例えば、
テトラスパニン、例えばＣＤ６３、又は
非テトラスパニン、例えばＰＴＧＦＲＮ若しくはＢＡＳＰ１
ｉｉ）可溶性タンパク質由来のエキソソーム標的化配列、例えば、Ｎｅｄｄ４ユビキチンリガーゼのＷＷドメイン、及び／又は
ｉｉｉ）ユビキチンタグ、及び／又は
ｉｖ）表Ａに列挙されるタンパク質から選択されるタンパク質を含むか又はそれらからなる群から選択される。
ａ）カーゴタンパク質又はペプチドと、
ｂ）エキソソーム標的化ドメインと、を含む融合タンパク質として発現され、例えば、エキソソーム標的化ドメインが、
ｉ）エキソソーム特異的膜タンパク質又はそのエキソソーム膜標的化部分、例えば、
テトラスパニン、例えばＣＤ６３、又は
非テトラスパニン、例えばＰＴＧＦＲＮ若しくはＢＡＳＰ１
ｉｉ）可溶性タンパク質由来のエキソソーム標的化配列、例えば、Ｎｅｄｄ４ユビキチンリガーゼのＷＷドメイン、及び／又は
ｉｉｉ）ユビキチンタグ、及び／又は
ｉｖ）表Ａに列挙されるタンパク質から選択されるタンパク質を含むか又はそれらからなる群から選択される。
【0396】
他の箇所に記載されるように、好ましいエフェクターシャーシは、血小板又は血小板様膜結合細胞フラグメント（又はその操作されたバージョン）であるが、当業者は、カーゴを内因的に発現させる場合、その発現は、典型的には、上流の前駆体細胞のうちの１つ以上において、例えば、前駆体シャーシ又はプロデューサーシャーシ、例えば、巨核球様細胞の巨核球において生じることを理解する。
【0397】
したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、任意の１つ以上のカーゴタンパク質又はペプチドを発現する、本明細書に記載されるような前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシを提供し、カーゴタンパク質又はペプチドは、
ａ）カーゴタンパク質又はペプチドと、
ｂ）エキソソーム標的化ドメインと、を含む融合タンパク質として発現され、例えば、エキソソーム標的化ドメインが、
ｉ）エキソソーム特異的膜タンパク質又はそのエキソソーム膜標的化部分、例えば、
テトラスパニン、例えばＣＤ６３、又は
非テトラスパニン、例えばＰＴＧＦＲＮ若しくはＢＡＳＰ１
ｉｉ）可溶性タンパク質由来のエキソソーム標的化配列、例えば、Ｎｅｄｄ４ユビキチンリガーゼのＷＷドメイン、及び／又は
ｉｉｉ）ユビキチンタグ、及び／又は
ｉｖ）表Ａに列挙されるタンパク質から選択されるタンパク質を含むか又はそれらからなる群から選択される。
ａ）カーゴタンパク質又はペプチドと、
ｂ）エキソソーム標的化ドメインと、を含む融合タンパク質として発現され、例えば、エキソソーム標的化ドメインが、
ｉ）エキソソーム特異的膜タンパク質又はそのエキソソーム膜標的化部分、例えば、
テトラスパニン、例えばＣＤ６３、又は
非テトラスパニン、例えばＰＴＧＦＲＮ若しくはＢＡＳＰ１
ｉｉ）可溶性タンパク質由来のエキソソーム標的化配列、例えば、Ｎｅｄｄ４ユビキチンリガーゼのＷＷドメイン、及び／又は
ｉｉｉ）ユビキチンタグ、及び／又は
ｉｖ）表Ａに列挙されるタンパク質から選択されるタンパク質を含むか又はそれらからなる群から選択される。
【0398】
上記のように、前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシは、ゲノム位置からカーゴ融合タンパク質若しくはペプチドを発現するように、及び／又はカーゴ融合タンパク質若しくはペプチドをエピソーム的に発現するように操作され得る。
【0399】
また、本明細書の他の箇所に記載されるように、カーゴは、前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシに外因的にロードされ得る。したがって、本発明はまた、１つ以上のカーゴタンパク質又はペプチドを含む、本明細書に記載されるような前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシを提供し、カーゴタンパク質又はペプチドは、
ａ）カーゴタンパク質又はペプチドと、
ｂ）エキソソーム標的化ドメインと、を含む融合タンパク質であり、例えば、エキソソーム標的化ドメインが、
ｉ）エキソソーム特異的膜タンパク質又はそのエキソソーム膜標的化部分、例えば、
テトラスパニン、例えばＣＤ６３、又は
非テトラスパニン、例えばＰＴＧＦＲＮ若しくはＢＡＳＰ１
ｉｉ）可溶性タンパク質由来のエキソソーム標的化配列、例えば、Ｎｅｄｄ４ユビキチンリガーゼのＷＷドメイン、及び／又は
ｉｉｉ）ユビキチンタグ、及び／又は
ｉｖ）表Ａに列挙されるタンパク質から選択されるタンパク質を含むか又はそれらからなる群から選択され、
カーゴタンパク質又はペプチドは、前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシに外因的にロードされている。
ａ）カーゴタンパク質又はペプチドと、
ｂ）エキソソーム標的化ドメインと、を含む融合タンパク質であり、例えば、エキソソーム標的化ドメインが、
ｉ）エキソソーム特異的膜タンパク質又はそのエキソソーム膜標的化部分、例えば、
テトラスパニン、例えばＣＤ６３、又は
非テトラスパニン、例えばＰＴＧＦＲＮ若しくはＢＡＳＰ１
ｉｉ）可溶性タンパク質由来のエキソソーム標的化配列、例えば、Ｎｅｄｄ４ユビキチンリガーゼのＷＷドメイン、及び／又は
ｉｉｉ）ユビキチンタグ、及び／又は
ｉｖ）表Ａに列挙されるタンパク質から選択されるタンパク質を含むか又はそれらからなる群から選択され、
カーゴタンパク質又はペプチドは、前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシに外因的にロードされている。
【0400】
ＲＮＡカーゴ－エキソソームＲＮＡローディング
他の箇所に記載されるように、標的化（例えば、本発明の受容体のうちの１つ以上を含む、本明細書に記載されるような前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ若しくはエフェクターシャーシ、又は操作された前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ若しくはエフェクターシャーシを使用する標的化手段を介して）又は非標的化（例えば、本発明の受容体のうちの１つ以上を含まない、本明細書に記載されるような操作された前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ若しくはエフェクターシャーシを介して）様式で送達されるカーゴは、ＲＮＡであり得る。送達のためにＲＮＡカーゴをエキソソームに標的化することも有利であると考えられる。
他の箇所に記載されるように、標的化（例えば、本発明の受容体のうちの１つ以上を含む、本明細書に記載されるような前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ若しくはエフェクターシャーシ、又は操作された前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ若しくはエフェクターシャーシを使用する標的化手段を介して）又は非標的化（例えば、本発明の受容体のうちの１つ以上を含まない、本明細書に記載されるような操作された前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ若しくはエフェクターシャーシを介して）様式で送達されるカーゴは、ＲＮＡであり得る。送達のためにＲＮＡカーゴをエキソソームに標的化することも有利であると考えられる。
【0401】
エキソソームは、ｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡを含む様々なＲＮＡカーゴを天然に含有する。血小板は、活性化時にＲＮＡカーゴを細胞に送達することが以前に示されている（ｍｉＲＮＡ転移（Ｌａｆｆｏｎｔ ｅｔ ａｌ．，２０１３ Ｂｌｏｏｄ，１２２（２），２５３－２６１；Ｍｉｃｈａｅｌ ｅｔ ａｌ．，（２０１７）Ｂｌｏｏｄ，１３０（５），５６７－５８０）、ｍＲＮＡ転移（Ｋｉｒｓｃｈｂａｕｍ，Ｍ．，（２０１５）．Ｂｌｏｏｄ，１２６（６），７９８－８０６；Ｒｉｓｉｔａｎｏ，Ａ ｅｔ ａｌ（２０１２）Ｂｌｏｏｄ，１１９（２６），６２８８－６２９５）。
【0402】
ＲＮＡ標的化モチーフ
エキソソーム常在性ＲＮＡの研究により、外因性ＲＮＡにおけるエキソソームＲＮＡ局在化を増加させることができる様々な配列が解明されている（Ｂａｔａｇｏｖ，Ａ．Ｏ．ｅｔ ａｌ（２０１１）１０ｔｈ Ｉｎｔ．Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ－１ｓｔ ＩＳＣＢ Ａｓｉａ Ｊｏｉｎｔ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ２０１１，ＩｎＣｏＢ ２０１１／ＩＳＣＢ－Ａｓｉａ ２０１１：Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ－Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｆｒｏｍ Ａｓｉａ Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｎｅｔｗｏｒｋ（ＡＰＢｉｏＮｅｔ），１２（ＳＵＰＰＬ．３）ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１８６／１４７１－２１６４－１２－Ｓ３－Ｓ１８）。エキソソームＲＮＡ局在化を増加させるために、異なる操作戦略が提案されている。これらの配列のうちのいくつかは、ＲＮＡ結合タンパク質との相互作用を媒介し、ｈｎＲＮＰａｇｉｈＡ２Ｂ１（Ｖｉｌｌａｒｒｏｙａ－Ｂｅｌｔｒｉ ｅｔ ａｌ（２０１３）Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，４，１－１０）、ＳＹＮＣＲＩＰ（Ｓａｎｔａｎｇｅｌｏ，Ｌ．ｅｔ ａｌ（２０１６）Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ，１７（３））又はＡｎｎｅｘｉｎ Ａ２（Ｈａｇｉｗａｒａ，Ｋ．ｅｔ ａｌ（２０１５）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，５８９（２４），４０７１－４０７８）を介して、エキソソームＲＮＡソーティングをもたらす。いくつかのｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ骨格は、それらをエキソソームに標的化する特異的ヘアピン構造（ｐｒｅ－ｍｉＲ－４５１など）を特徴とし、これは、パッケージング足場として使用される場合に代替ｍＲＮＡの標的化を容易にするために再利用され得る（Ｒｅｓｈｋｅ，Ｒ．ｅｔ ａｌ（２０２０）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，４（１），５２－６８）。最後に、いくつかのウイルスＲＮＡは、治療的ＲＮＡ再標的化のために再目的化され得るエキソソーム標的化モチーフを含有する（Ｌｅｖｅｓｑｕｅ ｅｔ ａｌ．，２００６ Ｔｒａｆｆｉｃ，７（９），１１７７－１１９３）。
エキソソーム常在性ＲＮＡの研究により、外因性ＲＮＡにおけるエキソソームＲＮＡ局在化を増加させることができる様々な配列が解明されている（Ｂａｔａｇｏｖ，Ａ．Ｏ．ｅｔ ａｌ（２０１１）１０ｔｈ Ｉｎｔ．Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ－１ｓｔ ＩＳＣＢ Ａｓｉａ Ｊｏｉｎｔ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ２０１１，ＩｎＣｏＢ ２０１１／ＩＳＣＢ－Ａｓｉａ ２０１１：Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ－Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｆｒｏｍ Ａｓｉａ Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｎｅｔｗｏｒｋ（ＡＰＢｉｏＮｅｔ），１２（ＳＵＰＰＬ．３）ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１８６／１４７１－２１６４－１２－Ｓ３－Ｓ１８）。エキソソームＲＮＡ局在化を増加させるために、異なる操作戦略が提案されている。これらの配列のうちのいくつかは、ＲＮＡ結合タンパク質との相互作用を媒介し、ｈｎＲＮＰａｇｉｈＡ２Ｂ１（Ｖｉｌｌａｒｒｏｙａ－Ｂｅｌｔｒｉ ｅｔ ａｌ（２０１３）Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，４，１－１０）、ＳＹＮＣＲＩＰ（Ｓａｎｔａｎｇｅｌｏ，Ｌ．ｅｔ ａｌ（２０１６）Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ，１７（３））又はＡｎｎｅｘｉｎ Ａ２（Ｈａｇｉｗａｒａ，Ｋ．ｅｔ ａｌ（２０１５）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，５８９（２４），４０７１－４０７８）を介して、エキソソームＲＮＡソーティングをもたらす。いくつかのｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ骨格は、それらをエキソソームに標的化する特異的ヘアピン構造（ｐｒｅ－ｍｉＲ－４５１など）を特徴とし、これは、パッケージング足場として使用される場合に代替ｍＲＮＡの標的化を容易にするために再利用され得る（Ｒｅｓｈｋｅ，Ｒ．ｅｔ ａｌ（２０２０）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，４（１），５２－６８）。最後に、いくつかのウイルスＲＮＡは、治療的ＲＮＡ再標的化のために再目的化され得るエキソソーム標的化モチーフを含有する（Ｌｅｖｅｓｑｕｅ ｅｔ ａｌ．，２００６ Ｔｒａｆｆｉｃ，７（９），１１７７－１１９３）。
【0403】
戦略２－エキソソーム標的化を促進するために、前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシを共操作する
内因性ＲＮＡエキソソームトラフィッキングシステムを利用することに加えて、ＲＮＡのエキソソーム特異的蓄積を駆動するために、新たな直交標的化システムが開発されている。ＴＡＭＥＬシステムは、バクテリオファージコートタンパク質ＭＳ２をＬａｍｐ２ｂ、ＶＳＶＧ及びＣＤ６３（エキソソーム膜タンパク質）に融合させた融合物を含む。標的治療的ＲＮＡを、ＭＳ２結合ステムループを発現するように操作した。カーゴｍＲＮＡ中に存在する操作されたステムループは、操作されたＭＳ２－エキソソーム膜タンパク質融合物との会合を駆動し、エキソソーム内のカーゴＲＮＡ蓄積を駆動する（Ｈｕｎｇ＆Ｌｅｏｎａｒｄ，２０１６ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ，５（１），１－１３）。ＭＳ２ローディングシステムは、青色光依存的様式でエキソソーム膜とのＲＮＡ会合を駆動するように更に修飾されている。ＭＳ２コートタンパク質及びエキソソーム膜タンパク質を光依存性二量体化タンパク質に融合させることによって、ＭＳ２ステムループ含有ＲＮＡは、青色光のみの存在下でエキソソームに特異的にロードされ得る。青色光を遮断すると、ＭＳ２コートタンパク質／ＲＮＡは、エキソソーム膜タンパク質から解離する。これは、標的細胞による取り込み時にｍＲＮＡの細胞質翻訳を促進する（Ｈｕａｎｇ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ（２０１９）Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，２９（９），１－８；Ｙｉｍ，Ｎ．ｅｔ ａｌ（２０１６）Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，７，１－９）。最後に、古細菌リボソームタンパク質Ｌ７ＡｅをＣＤ６３に融合させ、エキソソームへのＬ７Ａｅ標的化を促進することによって、同様の戦略が用いられている。Ｌ７Ａｅは、Ｃ／Ｄボックスとして知られるＲＮＡ構造に結合する。Ｌ７Ａｅ－ＣＤ６３融合物を同時発現する細胞における、ｍＲＮＡの３’ＵＴＲへのＣ／Ｄボックスの操作は、エキソソームコンパートメント内でのＣ／Ｄボックス含有ｍＲＮＡ濃縮をもたらした。これらの戦略は、ｍＲＮＡを血小板内エキソソームコンパートメントに標的化するために用いることができた（Ｋｏｊｉｍａ ｅｔ ａｌ．，２０１８ Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，９（１））。
内因性ＲＮＡエキソソームトラフィッキングシステムを利用することに加えて、ＲＮＡのエキソソーム特異的蓄積を駆動するために、新たな直交標的化システムが開発されている。ＴＡＭＥＬシステムは、バクテリオファージコートタンパク質ＭＳ２をＬａｍｐ２ｂ、ＶＳＶＧ及びＣＤ６３（エキソソーム膜タンパク質）に融合させた融合物を含む。標的治療的ＲＮＡを、ＭＳ２結合ステムループを発現するように操作した。カーゴｍＲＮＡ中に存在する操作されたステムループは、操作されたＭＳ２－エキソソーム膜タンパク質融合物との会合を駆動し、エキソソーム内のカーゴＲＮＡ蓄積を駆動する（Ｈｕｎｇ＆Ｌｅｏｎａｒｄ，２０１６ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ，５（１），１－１３）。ＭＳ２ローディングシステムは、青色光依存的様式でエキソソーム膜とのＲＮＡ会合を駆動するように更に修飾されている。ＭＳ２コートタンパク質及びエキソソーム膜タンパク質を光依存性二量体化タンパク質に融合させることによって、ＭＳ２ステムループ含有ＲＮＡは、青色光のみの存在下でエキソソームに特異的にロードされ得る。青色光を遮断すると、ＭＳ２コートタンパク質／ＲＮＡは、エキソソーム膜タンパク質から解離する。これは、標的細胞による取り込み時にｍＲＮＡの細胞質翻訳を促進する（Ｈｕａｎｇ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ（２０１９）Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，２９（９），１－８；Ｙｉｍ，Ｎ．ｅｔ ａｌ（２０１６）Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，７，１－９）。最後に、古細菌リボソームタンパク質Ｌ７ＡｅをＣＤ６３に融合させ、エキソソームへのＬ７Ａｅ標的化を促進することによって、同様の戦略が用いられている。Ｌ７Ａｅは、Ｃ／Ｄボックスとして知られるＲＮＡ構造に結合する。Ｌ７Ａｅ－ＣＤ６３融合物を同時発現する細胞における、ｍＲＮＡの３’ＵＴＲへのＣ／Ｄボックスの操作は、エキソソームコンパートメント内でのＣ／Ｄボックス含有ｍＲＮＡ濃縮をもたらした。これらの戦略は、ｍＲＮＡを血小板内エキソソームコンパートメントに標的化するために用いることができた（Ｋｏｊｉｍａ ｅｔ ａｌ．，２０１８ Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，９（１））。
【0404】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の本発明の前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシのうちのいずれかは、バクテリオファージコートタンパク質ＭＳ２をエキソソーム膜タンパク質、任意選択でＬａｍｐ２ｂ、ＶＳＶＧ及び／又はＣＤ６３に融合させるように操作されている。前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシ内の対応するＭＳ２結合ステムループを含むカーゴＲＮＡの存在（内因的に発現されるか、又は外因的にロードされる）は、エキソソームへのカーゴＲＮＡの標的化をもたらす。
【0405】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の本発明の前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシのうちのいずれかは、バクテリオファージコートタンパク質ＭＳ２を、
エキソソーム膜タンパク質、任意選択でＬａｍｐ２ｂ、ＶＳＶＧ及び／又はＣＤ６３、並びに
光依存性二量体化タンパク質に融合させるように操作されている。
エキソソーム膜タンパク質、任意選択でＬａｍｐ２ｂ、ＶＳＶＧ及び／又はＣＤ６３、並びに
光依存性二量体化タンパク質に融合させるように操作されている。
【0406】
前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシ内に存在する対応するＭＳ２結合ステムループを含むカーゴＲＮＡ（内因的に発現されるか、又は外因的にロードされる）は、青色光の存在下でのみエキソソームにロードされる。
【0407】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の本発明の前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシのうちのいずれかは、古細菌リボソームタンパク質Ｌ７Ａｅをエキソソーム膜タンパク質、任意選択でＬａｍｐ２ｂ、ＶＳＶＧ及び／又はＣＤ６３に融合させるように操作されており、いくつかの実施形態では、ＣＤ６３に融合される。前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシ内の対応するＣ／Ｄボックス結合パートナーを含むカーゴＲＮＡの存在（内因的に発現されるか、又は外因的にロードされる）は、エキソソームへのカーゴＲＮＡの標的化をもたらす。
【0408】
上記のように、前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシ（すなわち、本明細書に記載の任意の前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシ）は、ゲノム位置からカーゴＲＮＡを発現するように、及び／又はカーゴ融合ＲＮＡをエピソームにより発現するように操作され得る。
【0409】
また、本明細書の他の箇所に記載されるように、カーゴＲＮＡは、前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシに外因的にロードされ得る。
【0410】
したがって、本発明はまた、
ａ）エキソソーム標的化モチーフ、任意選択でヘアピン若しくはウイルスエキソソーム標的化ＲＮＡ又はそのエキソソーム標的化フラグメントを含むカーゴＲＮＡ、
ｂ）アプタマードメインを含むカーゴＲＮＡのうちのいずれか１つ以上を発現するように操作された、本明細書に記載の前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシを提供し、任意選択で、アプタマードメインが、
ｉ）ＭＳ２結合ステムループ、及び／若しくは
ｉｉ）Ｃ／Ｄボックス、及び／若しくは
ｉｉｉ）ＡＵリッチエレメントから選択され、任意選択で、ＲＮＡが、Ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡである。
ａ）エキソソーム標的化モチーフ、任意選択でヘアピン若しくはウイルスエキソソーム標的化ＲＮＡ又はそのエキソソーム標的化フラグメントを含むカーゴＲＮＡ、
ｂ）アプタマードメインを含むカーゴＲＮＡのうちのいずれか１つ以上を発現するように操作された、本明細書に記載の前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシを提供し、任意選択で、アプタマードメインが、
ｉ）ＭＳ２結合ステムループ、及び／若しくは
ｉｉ）Ｃ／Ｄボックス、及び／若しくは
ｉｉｉ）ＡＵリッチエレメントから選択され、任意選択で、ＲＮＡが、Ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡである。
【0411】
本発明はまた、
ａ）エキソソーム標的化モチーフ、任意選択でヘアピン若しくはウイルスエキソソーム標的化ＲＮＡ又はそのエキソソーム標的化フラグメントを含むカーゴＲＮＡ、
ｂ）アプタマードメインを含むカーゴＲＮＡのうちのいずれか１つ以上を発現するように操作された、本明細書に記載の前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシを提供し、任意選択で、アプタマードメインが、
ｉ）ＭＳ２結合ステムループ、及び／若しくは
ｉｉ）Ｃ／Ｄボックス、及び／若しくは
ｉｉｉ）ＡＵリッチエレメントから選択され、任意選択で、ＲＮＡが、Ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡであり、
カーゴＲＮＡが、外因的にロードされている。
ａ）エキソソーム標的化モチーフ、任意選択でヘアピン若しくはウイルスエキソソーム標的化ＲＮＡ又はそのエキソソーム標的化フラグメントを含むカーゴＲＮＡ、
ｂ）アプタマードメインを含むカーゴＲＮＡのうちのいずれか１つ以上を発現するように操作された、本明細書に記載の前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシを提供し、任意選択で、アプタマードメインが、
ｉ）ＭＳ２結合ステムループ、及び／若しくは
ｉｉ）Ｃ／Ｄボックス、及び／若しくは
ｉｉｉ）ＡＵリッチエレメントから選択され、任意選択で、ＲＮＡが、Ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡであり、
カーゴＲＮＡが、外因的にロードされている。
【0412】
当業者であれば、カーゴＲＮＡがＭＳ２結合ステムループを含む場合、典型的には、バクテリオファージコートタンパク質ＭＳ２とエキソソーム膜タンパク質、任意選択でＬａｍｐ２ｂ、ＶＳＶＧ及び／又はＣＤ６３との融合物を発現するように、前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシを操作すべきであることを理解する。場合によっては、前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシは、
ａ）バクテリオファージコートタンパク質ＭＳ２
ｂ）エキソソーム膜タンパク質、任意選択で、Ｌａｍｐ２ｂ、ＶＳＶＧ及び／又はＣＤ６３、並びに
ｃ）光依存性二量体化タンパク質を含む融合タンパク質を発現するように操作されてもよい。
ａ）バクテリオファージコートタンパク質ＭＳ２
ｂ）エキソソーム膜タンパク質、任意選択で、Ｌａｍｐ２ｂ、ＶＳＶＧ及び／又はＣＤ６３、並びに
ｃ）光依存性二量体化タンパク質を含む融合タンパク質を発現するように操作されてもよい。
【0413】
当業者はまた、カーゴＲＮＡがＣ／Ｄボックスを含む場合、典型的には、古細菌リボソームタンパク質Ｌ７Ａｅとエキソソーム膜タンパク質、任意選択でＬａｍｐ２ｂ、ＶＳＶＧ及び／又はＣＤ６３との融合物を発現するように、前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシを操作すべきであることを理解する。いくつかの実施形態では、ＣＤ６３に融合される。場合によっては、前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシは、
ａ）古細菌リボソームタンパク質Ｌ７Ａｅ
ｂ）エキソソーム膜タンパク質、任意選択で、Ｌａｍｐ２ｂ、ＶＳＶＧ及び／又はＣＤ６３、並びに
ｃ）光依存性二量体化タンパク質を含む融合タンパク質を発現するように操作されてもよい。
ａ）古細菌リボソームタンパク質Ｌ７Ａｅ
ｂ）エキソソーム膜タンパク質、任意選択で、Ｌａｍｐ２ｂ、ＶＳＶＧ及び／又はＣＤ６３、並びに
ｃ）光依存性二量体化タンパク質を含む融合タンパク質を発現するように操作されてもよい。
【0414】
当業者は、Ｃ／Ｄボックス、Ｌ７Ａｅ及びステムループ、上記のＭＳ２組み合わせに加えて、又はその代わりに使用することができるＲＮＡ配列（すなわち、アプタマー）及びＲＮＡ結合タンパク質の他の組み合わせがあることを理解する。
【0415】
したがって、いくつかの実施形態では、前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシは、
ａ）エキソソーム特異的タンパク質
例えば、テトラスパニン、例えばＣＤ６３；又は
非テトラスパニン、例えばＰＴＧＦＲＮ又はＢＡＳＰ１；又は
Ｌａｍｐ２ｂ又はＶＳＶＧ；
又は表Ａに列挙されるものから選択されるタンパク質と、
ｂ）特異的ＲＮＡアプタマーに結合することができるタンパク質又はそのフラグメントと、を含む融合タンパク質を発現するように操作されてもよい。
ａ）エキソソーム特異的タンパク質
例えば、テトラスパニン、例えばＣＤ６３；又は
非テトラスパニン、例えばＰＴＧＦＲＮ又はＢＡＳＰ１；又は
Ｌａｍｐ２ｂ又はＶＳＶＧ；
又は表Ａに列挙されるものから選択されるタンパク質と、
ｂ）特異的ＲＮＡアプタマーに結合することができるタンパク質又はそのフラグメントと、を含む融合タンパク質を発現するように操作されてもよい。
【0416】
そのような実施形態では、対応するカーゴＲＮＡが、上記（ｂ）のタンパク質が結合する特異的アプタマーを含むはずであることは、当業者には明らかである。
【0417】
Ｃａｓ９ ＲＮＰ送達
上述の戦略は、単離におけるＲＮＡ及びタンパク質エキソソームローディングに焦点を当てている。Ｃａｓ９／ガイドＲＮＡ送達によるゲノム操作を容易にするために、ガイド及びタンパク質の両方が送達されなければならない。エキソソームへのＣａｓ９ ＲＮＰ取り込みを駆動し、したがって、放出時にエキソソームに曝露される標的細胞における遺伝子編集を容易にするために、いくつかの操作戦略が提案されている。そのようなアプローチの１つは、ＣＤ９－ＨｕＲの操作によるものである。ＣＤ９はエキソソーム膜タンパク質であり、ＨｕＲは、ＡＵリッチエレメント（AU rich element、ＡＲＥ）を特異的に標的とするＲＮＡ結合タンパク質である。Ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡの３’ＵＴＲへのＡＲＥの操作、及びガイドＲＮＡへのその付加は、ＨｕＲ、及びしたがってＣＤ９とのそれらの会合を介して、エキソソーム内でのそれらの蓄積を駆動する（Ｌｉ，Ｚ．（２０１９）Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９（１），１９－２８）。Ｃａｓ９をエキソソームにロードするための別のアプローチは、エキソソーム膜タンパク質（ＣＤ９又はＣＤ６３など）へのＧＦＰの融合を含む。次いで、Ｃａｓ９をＧＦＰ結合ナノボディに融合させることができる。これは、エキソソーム膜タンパク質に結合したＧＦＰへのＣａｓ９タンパク質自体の結合をもたらし、エキソソームコンパートメントでのその蓄積を駆動する。この戦略は、Ｃａｓ９タンパク質の標的化によって駆動されるため、プロデューサー細胞において発現されるｓｇＲＮＡは、エキソソーム内に取り込まれた可溶性Ｃａｓ９に結合し、完全なＲＮＰ移入を容易にする）。最後に、機能的Ｃａｓ９システムもまた、プラスミドの形態でエキソソームに送達されている。エキソソームプロデューサー細胞（この場合、巨核球）にプラスミドをヌクレオフェクトすると、このプラスミドの一部がエキソソーム内に確率的にパッケージングされる。次いで、このプラスミドは、エキソソーム放出の際に標的細胞に移入され得る（Ｋｉｍ，Ｓ．Ｍ．ｅｔ ａｌ（２０１７）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，２６６（Ｊｕｌｙ），８－１６）。
上述の戦略は、単離におけるＲＮＡ及びタンパク質エキソソームローディングに焦点を当てている。Ｃａｓ９／ガイドＲＮＡ送達によるゲノム操作を容易にするために、ガイド及びタンパク質の両方が送達されなければならない。エキソソームへのＣａｓ９ ＲＮＰ取り込みを駆動し、したがって、放出時にエキソソームに曝露される標的細胞における遺伝子編集を容易にするために、いくつかの操作戦略が提案されている。そのようなアプローチの１つは、ＣＤ９－ＨｕＲの操作によるものである。ＣＤ９はエキソソーム膜タンパク質であり、ＨｕＲは、ＡＵリッチエレメント（AU rich element、ＡＲＥ）を特異的に標的とするＲＮＡ結合タンパク質である。Ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡの３’ＵＴＲへのＡＲＥの操作、及びガイドＲＮＡへのその付加は、ＨｕＲ、及びしたがってＣＤ９とのそれらの会合を介して、エキソソーム内でのそれらの蓄積を駆動する（Ｌｉ，Ｚ．（２０１９）Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９（１），１９－２８）。Ｃａｓ９をエキソソームにロードするための別のアプローチは、エキソソーム膜タンパク質（ＣＤ９又はＣＤ６３など）へのＧＦＰの融合を含む。次いで、Ｃａｓ９をＧＦＰ結合ナノボディに融合させることができる。これは、エキソソーム膜タンパク質に結合したＧＦＰへのＣａｓ９タンパク質自体の結合をもたらし、エキソソームコンパートメントでのその蓄積を駆動する。この戦略は、Ｃａｓ９タンパク質の標的化によって駆動されるため、プロデューサー細胞において発現されるｓｇＲＮＡは、エキソソーム内に取り込まれた可溶性Ｃａｓ９に結合し、完全なＲＮＰ移入を容易にする）。最後に、機能的Ｃａｓ９システムもまた、プラスミドの形態でエキソソームに送達されている。エキソソームプロデューサー細胞（この場合、巨核球）にプラスミドをヌクレオフェクトすると、このプラスミドの一部がエキソソーム内に確率的にパッケージングされる。次いで、このプラスミドは、エキソソーム放出の際に標的細胞に移入され得る（Ｋｉｍ，Ｓ．Ｍ．ｅｔ ａｌ（２０１７）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，２６６（Ｊｕｌｙ），８－１６）。
【0418】
したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の本発明の前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシのうちのいずれかは、ＣＤ９－ＨｕＲ融合タンパク質を発現するように操作されている。ＡＵリッチエレメントを含むカーゴＲＮＡは、エキソソームに標的化される。ＡＵリッチエレメントを含むカーゴＲＮＡは、内因的に発現されてもよく（すなわち、カーゴＲＮＡを発現するように、前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシが操作されてもよい）、又は外因的にロードされてもよい。この方法は、任意のカーゴＲＮＡをエキソソームに標的化するために使用され得る。
【0419】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の本発明の前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシのうちのいずれかは、ＣＤ９又はＣＤ６３などのエキソソーム膜タンパク質に融合されたＧＦＰを含む融合タンパク質を発現するように操作されていてもよい。ＧＦＰ結合ナノボディに融合されたカーゴタンパク質は、エキソソーム内でのその蓄積を駆動するエキソソーム膜に標的化される。本方法は、エキソソームへの任意のカーゴタンパク質又はペプチドの標的化に好適であると考えられる。いくつかの実施形態では、前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシは、対応するｓｇＲＮＡも発現するように操作されており、ｓｇＲＮＡは可溶性Ｃａｓ９に結合し、したがって両方ともエキソソームに標的化される。カーゴタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）及び／又はｓｇＲＮＡは内因的に発現されてもよく、すなわち、前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシは、カーゴタンパク質（例えば、Ｃａｓ９０）及び／又はｓｇＲＮＡを発現するように操作されていてもよく、又はカーゴタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）及び／若しくはｓｇＲＮＡは、外因的にロードされていてもよい。
【0420】
カーゴ（例えば、タンパク質、ペプチド、ＲＮＡなど）をエキソソームに標的化することができる多くの適切な手段が存在することは、上記から明らかである。上記のようなエキソソーム標的化に必要な任意の１つ以上のカーゴ及び／又は対応する成分を発現するように操作された巨核球様細胞の操作された巨核球である操作された前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシは、エキソソーム中にカーゴを含む血小板又は血小板様細胞フラグメントを産生するように発現される。
【0421】
カーゴがエキソソームに標的化される実施形態は、前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシが本発明の受容体のうちの１つ以上（すなわち、１つ以上のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲ）を含む場合に特に有利であると考えられ、本発明の受容体の存在は、前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシが特定の部位に標的化されるか、又は特定のシグナルに応答して活性化することを意味する。エキソソームの限られた半減期及び溢出の可能性に起因して、特定の標的部位でのエキソソームの局所放出は、エキソソームベースの療法の治療可能性に大きな影響を及ぼすと予想される。
【0422】
本発明は、ゲノム遺伝子座からの、又はエピソームによるカーゴの発現に好適な、カーゴ（任意のエキソソーム標的結合ドメインを含む）のうちの任意の１つ以上をコードする核酸を提供する。
【0423】
カーゴの送達を必要とする対象にカーゴを送達するための様々な方法が提供される。本明細書に記載されるように、カーゴは、治療薬又は毒素であり得る。カーゴの選好は、本明細書の他の箇所に記載されているとおりであり、例えば、カーゴは、エキソソーム内に位置し、エキソソーム中の血小板／Ｓｙｎｌｅｔから、例えばアルファ顆粒から輸送され得る。
【0424】
他の標的化シグナルを同様に使用して、例えば、カーゴをエキソソーム又は他の顆粒に標的化することができる。したがって、いくつかの実施形態では、カーゴ（それが内因的にロードされるか、又は外因的にロードされるかにかかわらず）は、標的化シグナル、例えば、α顆粒局在化シグナル及び／又はエキソソーム標的化シグナルに結合される。
【0425】
他の実施形態では、カーゴは、前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシの中又は上に、例えば、本発明の操作された骨髄系幹細胞、巨核芽球、巨核球、巨核球様細胞、ｉＰＳＣ、血小板、又は血小板様膜結合細胞フラグメント又はＳｙｎｌｅｔの中又は上に外因的にロードされる。血小板は、エンドサイトーシス及び開放小管システムを介してそれらの環境において薬物及び抗体を自然に吸収し、当業者は、血小板にカーゴを外因的にロードするための技術を知っており、例えば、ドキソルビシンでのインキュベーションによる血小板へのドキソルビシンのローディングについて論じているＷｕ ｅｔ ａｌ ２０２０ Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｓｃｉ ２７を参照されたい。血小板活性化後、通常は血小板活性化時に放出される血小板細胞外小胞中にドキソルビシンが見出された。Ｖｅｒｈｅｕｌ ｅｔ ａｌ ２００７ Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １５：５３４１－５３４７は、血小板へのベバシズマブのローディング及び血小板活性化時の抗体の放出を実証している。Ｘｕ ｅｔ ａｌ ２０１９ Ｂｉｏｍｅｔｅｒ Ｓｃｉ ７：４５６８－４５７７は、化学療法薬であるビンクリスチンによる血小板のローディングを示している。したがって、血小板には、広範なカーゴを外因的にロードすることができ、これは、血小板活性化の際に血小板から放出される。
【0426】
次いで、いくつかの実施形態では、本発明は、カーゴが外因的にロードされた本発明のシャーシのうちのいずれかを提供し、例えば、カーゴは、
ａ）タンパク質又はペプチドであって、いくつかの実施形態では、
ｉ）抗体若しくはその抗原結合フラグメント、例えば腫瘍抗原若しくは新抗原に結合する抗体若しくはその抗原結合フラグメント、
ｉｉ）ヌクレアーゼなどの酵素、例えばＴＡＬＥＮ、
ｉｉｉ）サイトカイン、例えばＩＬ－１０、又は
ｉｖ）ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質、例えばＣａｓ９、
ｖ）二重特異性タンパク質、例えば二重特異性抗体若しくは任意選択でＴ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）である、タンパク又はペプチド、
ｂ）核酸であって、いくつかの実施形態では、
ｉ）例えばｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、及びクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）配列から選択される、ＲＮＡ、又は
ｉｉ）ＤＮＡベクターである、核酸、
ｃ）毒素、
ｄ）小分子薬物、造影剤、放射性ヌクレオチド薬物、放射性ヌクレオチドタグ付抗体、又はそれらの任意のコンジュゲート、
ｅ）ＡＡＶなどのウイルスベクター、
ｆ）腫瘍溶解性ウイルスなどのウイルス、
ｇ）ＣＲＩＳＰＲ媒介遺伝子編集を実行するための薬剤、
ｈ）エキソソーム、例えば第２のカーゴをプレロードされたエキソソーム、及び／あるいは
ｉ）１つ又は複数のナノ粒子。
あるいはそれらの任意の組み合わせから選択される。
ａ）タンパク質又はペプチドであって、いくつかの実施形態では、
ｉ）抗体若しくはその抗原結合フラグメント、例えば腫瘍抗原若しくは新抗原に結合する抗体若しくはその抗原結合フラグメント、
ｉｉ）ヌクレアーゼなどの酵素、例えばＴＡＬＥＮ、
ｉｉｉ）サイトカイン、例えばＩＬ－１０、又は
ｉｖ）ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質、例えばＣａｓ９、
ｖ）二重特異性タンパク質、例えば二重特異性抗体若しくは任意選択でＴ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）である、タンパク又はペプチド、
ｂ）核酸であって、いくつかの実施形態では、
ｉ）例えばｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、及びクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）配列から選択される、ＲＮＡ、又は
ｉｉ）ＤＮＡベクターである、核酸、
ｃ）毒素、
ｄ）小分子薬物、造影剤、放射性ヌクレオチド薬物、放射性ヌクレオチドタグ付抗体、又はそれらの任意のコンジュゲート、
ｅ）ＡＡＶなどのウイルスベクター、
ｆ）腫瘍溶解性ウイルスなどのウイルス、
ｇ）ＣＲＩＳＰＲ媒介遺伝子編集を実行するための薬剤、
ｈ）エキソソーム、例えば第２のカーゴをプレロードされたエキソソーム、及び／あるいは
ｉ）１つ又は複数のナノ粒子。
あるいはそれらの任意の組み合わせから選択される。
【0427】
カーゴの選好は、本明細書の他の場所で説明されているとおりである。例えば、いくつかの実施形態では、カーゴは、上記のようなエキソソーム標的化ドメインを含むタンパク質である。
【0428】
いくつかの実施形態では、カーゴは、可溶性である。いくつかの実施形態では、カーゴは、膜結合型である。
【0429】
カーゴはまた、造影剤であり得る。
【0430】
本発明のシャーシを、エキソソーム又は合成エキソソームなどの他の脂質結合小胞を含む組成物とともにインキュベートすることは、本明細書に記載のシャーシを使用して送達の標的とすることができる、シャーシへのエキソソームの外因性ローディングを可能にするとも考えられる。いくつかの実施形態では、組成物は、本明細書に記載のカーゴのうちのいずれかなどの１つ以上の二次カーゴを含むエキソソームを含む。
【0431】
いくつかの好ましい実施形態では、カーゴは、血小板内に自然に見出される薬剤ではない、すなわち、カーゴは、血小板に関して内因性のカーゴではなく、外因性のカーゴである。当業者は、カーゴが血小板に対して外因性であるが、対象に対して内因性であり得ることを理解する。
【0432】
いくつかの好ましい実施形態では、カーゴは、血小板α顆粒内に自然に見出される薬剤ではない。例えば、カーゴは、血小板内に自然に見られるが、α顆粒内には自然には見られない薬剤であり得る。
【0433】
いくつかの実施形態では、カーゴは、血小板内に内因的に見出されるが、血小板内、又は血小板のα顆粒内に、本発明ではない血小板よりも高い濃度又は量で見出される薬剤であり得る。
【0434】
いくつかの実施形態では、カーゴは、α顆粒局在化シグナルを含み、α顆粒局在化シグナルは、カーゴを操作された血小板のα顆粒小胞に取り込むように指示する。例えば、いくつかの実施形態では、治療剤又は造影剤は、α顆粒局在化シグナルを含むか、又はそれに複合体化される。
【0435】
内因的に発現されるか又は外因的にロードされるカーゴは、前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシとともに様々な場所に貯蔵され得る。例えば、いくつかの実施形態では、カーゴは細胞質に貯蔵され、かつ／又はカーゴは原形質膜に貯蔵され、かつ／又はカーゴは原形質膜の外表面に貯蔵され、かつ／又はカーゴは１つ以上の顆粒に貯蔵され、好ましくはアルファ顆粒に貯蔵される。
【0436】
いくつかの実施形態では、カーゴ剤、例えば、治療剤は、前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシ内、例えば、血小板又は血小板様膜結合細胞フラグメント内のエキソソーム内に貯蔵される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのカーゴ剤、例えば、治療剤は、顆粒内、例えば、前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシ内、例えば、血小板又は血小板様膜結合細胞フラグメント内のアルファ顆粒内にある。いくつかの更なる実施形態では、少なくとも１つのカーゴ剤、例えば治療剤は、それ自体が顆粒、例えばアルファ顆粒内にあるエキソソーム内にある。
【0437】
血小板α顆粒にはタンパク質エフェクターが含まれており、可溶性タンパク質のローディングは、単純なシグナルペプチドを介して実行される。タンパク質を血小板分泌α顆粒に指向するための最小標的化配列は、以前に定義されており（Ｇｏｌｌｉ ｅｔ ａｌ．「Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ａ Ｇｒａｎｕｌｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｗｉｔｈｉｎ Ｐｌａｔｅｌｅｔ Ｆａｃｔｏｒ ４．」，ＪＢＣ，２００４を参照され、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、これらの実施形態のうちのいずれかにおいて、カーゴは、α顆粒局在化シグナルに結合され得る。例えば、カーゴが内因的に産生される場合、カーゴは、血小板（若しくはＳｙｎｌｅｔ）又は前駆体細胞、例えば巨核球によって、α顆粒局在化シグナルとインフレームで発現され得る。実際、
外因的にロードされたカーゴはまた、カーゴが血小板又は前駆体細胞に入ると、その後α顆粒に標的化されるように、α顆粒局在化シグナルに結合され得る。
外因的にロードされたカーゴはまた、カーゴが血小板又は前駆体細胞に入ると、その後α顆粒に標的化されるように、α顆粒局在化シグナルに結合され得る。
【0438】
カーゴが、前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ若しくはエフェクターシャーシ又は操作された前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ若しくはエフェクターシャーシによって内因的に産生される場合、カーゴは、特定の標的部位、組織若しくは細胞に標的化されるカーゴタンパク質若しくはペプチド、又はＲＮＡを産生するように、あるいは血小板（若しくはＳｙｎｌｅｔ）又は巨核球などの前駆体細胞内でカーゴを産生する酵素又は他の活性実体を産生するために発現される核酸によってコードされ得る。
【0439】
前述の請求項のいずれか一項に記載の操作された前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシであり、前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシは、
ａ）ＭＨＣクラス１遺伝子又はタンパク質の機能が破壊されている、
ｂ）β２ミクログロブリン遺伝子からの発現が破壊されており、任意選択でβ２ミクログロブリン遺伝子がノックアウトされている、
ｃ）１つ以上のＨＬＡ遺伝子からの発現が破壊されている、
ｄ）ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ及び／又はＨＬＡ－Ｃのうちのいずれか１つ以上からの発現が破壊されており、任意選択で、ＨＬＡ－Ａ及びＨＬＡ－Ｂの発現は完全に破壊されているが、ＨＬＡ－Ｃの発現は部分的に破壊されており、任意選択で、ＨＬＡ－Ａ及びＨＬＡ－Ｂの両方の対立遺伝子からの発現は破壊されているが、ＨＬＡ－Ｃの一方の対立遺伝子のみからの発現は破壊されている、
ｅ）ＨＬＡクラスＩｂ遺伝子のうちのいずれか１つ以上、任意選択でＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ４７及びＰＤ－Ｌ１のうちのいずれか１つ以上を過剰発現する、
ｆ）ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ４７及びＰＤ－Ｌ１のうちのいずれか１つ以上を過剰発現する（任意選択で、ベータ２ミクログロブリン遺伝子からの発現が破壊されるように操作されている）、並びに／又は
ｇ）１つ以上の免疫調節遺伝子を過剰発現する（任意選択で、１つ以上の免疫調節遺伝子が、ＣＤ４７及びＰＤ－Ｌ１を含む群から選択される）、
ｈ）産物がカーゴの効力に悪影響を及ぼし得る１つ以上の遺伝子又は遺伝子産物を排除する、
ｉ）自然応答／適応応答を上方又は下方に調整する、
ｊ）炎症、血管新生、アテローム性動脈硬化症、リンパ発達及び腫瘍増殖を低減する、
ｋ）操作されたカーゴの生物学的作用に間接的に対抗する可能性が高い接着タンパク質及び／又はカーゴ実体をコードする１つ以上の遺伝子の発現が破壊されており、より大きな正味の治療効果をもたらす可能性がある、
ｌ）ＣＤ４０Ｌの発現を下方制御又は阻害する、
ｎ）ＣＤ３６、ＮＯＤ２、ＳＲＢ１、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ６、ＴＬＲ９、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ９３（Ｃ１ｑＲｐ）、Ｃ３ａＲ、ＣＤ８８（Ｃ５ａＲ）、ＣＤ８９（ＦｃａＲ１）、ＣＤ２３（ＦｃｅＲ１）、ＣＤ３２（ＦｃｇＲＩＩａ）、ＭＨＣクラス１、ＣＤ１９１（ＣＣＲ１）、ＣＤ１９３（ＣＣＲ３）、ＣＤ１９４（ＣＣＲ４）、ＣＤ１８４（ＣＸＣＲ４）、ＣＸ３ＣＲ１、ＣＤ１０２（ＩＣＡＭ－２）、ＪＡＭ－Ｃ／ＪＡＭ－３、ＣＤ６２Ｐ（Ｐ－セレクチン）、ＣＤ３１（ＰＥＣＡＭ－１）、ＣＤ１５０（ＳＬＡＭＦ１）、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ５、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ４／ＰＦ４、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ８、ＮＡＰ２（ＣＸＣＬ７）、ＩＬ－１ｂのうちのいずれか１つ以上の発現を下方制御若しくは阻害する、
ｏ）ＧＡＲＰ及び／又はＴＧＦｂの発現を破壊又は阻害する、
ｑ）Ｓｉｇｌｅｃ－７、Ｓｉｇｌｅｃ－９、Ｓｉｇｌｅｃ－１１又はＴＧＦｂのうちのいずれか１つ以上の発現を破壊又は阻害する、
ｓ）ＧＰＩｂ／Ｖ／ＩＸ及びＧＰＶＩ（ＧＰ６）、ＩＴＧＡ２Ｂ、ＣＬＥＣ２、インテグリンαＩＩｂｂ３、ａ２ｂ１、ａ５ｂ１及びａ６ｂ１、ＧＰＶＩ及びＩＴＧＡ２Ｂのうちのいずれか１つ以上の発現を破壊又は阻害する、
ｔ）Ｐａｒ１、Ｐａｒ４、Ｐ２Ｙ１２、ＧＰＩｂ／Ｖ／ＩＸ、トロンボキサン受容体（ＴＢＸＡ２Ｒ）、Ｐ２Ｙ１、Ｐ２Ｘ１及びインテグリンαＩＩｂｂ３のうちのいずれか１つ以上、又はＰａｒ１、Ｐａｒ４及びＰ２Ｙ１２からなる群からのいずれか１つ以上の発現を破壊又は阻害する、
ｕ）Ｃｏｘ１、Ｃｏｘ２、ＨＰＳ、プロトロンビン、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、フォン・ヴィレブランド因子及びトロンボキサン－Ａシンターゼ（ＴＢＸＡＳ１）のうちのいずれか１つ以上の発現を破壊又は阻害する、
ｖ）血小板又は血小板様膜結合細胞フラグメントの活性化に応答して目的のタンパク質又はＲＮＡを合成し、任意選択で、目的のタンパク質又はＲＮＡが、ＢＣＬ－３ ｍＲＮＡ非翻訳領域、任意選択で５′ＵＴＲから発現される、
ｚ）１つ以上のカーゴタンパク質又はカーゴＲＮＡを発現し、任意選択で、カーゴタンパク質又はカーゴＲＮＡが、アルファ顆粒標的化シグナルを含み、任意選択で、血小板因子４（platelet factor 4、ＰＦ４）又はフォン・ヴィレブランド因子（ｖＷｆ）を含む、
ａａ）少なくとも２つのＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲを発現し、任意選択で、少なくとも３、４、５、６、７、８、９又は少なくとも１０の異なるＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲを発現する、
ｂｂ）少なくとも２つのＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲを発現し、少なくとも２つのＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲの標的結合ドメインが、異なる標的に対して指向されている、
ｃｃ）少なくとも２つのＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲを発現し、少なくとも２つのＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲの標的結合ドメインが、異なる標的に対して指向されており、
ｉ）第１のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲの血小板調節ドメインが、血小板活性化ドメイン、任意選択で脱顆粒誘発ドメイン、任意選択でＩＴＡＭ含有ドメインであり、第２のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲの血小板調節ドメインが、血小板阻害ドメインであり、任意選択で血小板脱顆粒の誘発を防止するドメインであり、任意選択でＩＴＡＭ含有ドメインである、
ｉｉ）第１のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲの血小板調節ドメインが、血小板活性化ドメイン、任意選択で脱顆粒誘発ドメイン、任意選択でＩＴＡＭ含有ドメインであり、第２のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲの血小板調節ドメインが、血小板活性化ドメイン、任意選択で脱顆粒誘発ドメイン、任意選択でＩＴＡＭ含有ドメインである、
ｄｄ）ともに作動して論理回路を形成する、少なくとも２つのＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付け標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲを発現する、
ｅｅ）１つ以上のカーゴを発現し、任意選択で、カーゴが、
ａ）タンパク質又はペプチドであって、任意選択で、
ｉ）抗体若しくはその抗原結合フラグメント、例えば腫瘍抗原若しくは新抗原に結合する抗体若しくはその抗原結合フラグメント、
ｉｉ）ヌクレアーゼなどの酵素、例えばＴＡＬＥＮ、
ｉｉｉ）サイトカイン、例えばＩＬ－１０、又は
ｉｖ）ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質、例えばＣａｓ９、
ｖ）二重特異性タンパク質、例えば二重特異性抗体若しくは任意選択でＴ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）、
ｖｉ）エキソソーム標的化ドメインを含む融合タンパク質であり、融合タンパク質が、
ａ）カーゴタンパク質又はペプチドと、
ｂ）エキソソーム標的化ドメインと、を含み、任意選択で、エキソソーム標的化ドメインが、
ｉ）エキソソーム特異的膜タンパク質又はそのエキソソーム膜標的化部分、例えば、
テトラスパニン、例えばＣＤ６３、又は
非テトラスパニン、例えばＰＴＧＦＲＮ若しくはＢＡＳＰ１
ｉｉ）可溶性タンパク質由来のエキソソーム標的化配列、任意選択でＮｅｄｄ４ユビキチンリガーゼのＷＷドメイン、
ｉｉｉ）ユビキチンタグ、及び／又は
ｉｖ）タグ結合ドメイン、任意選択でタグに対して指向されたナノボディ、任意選択でＧＦＰに対して指向されたナノボディを含むか若しくはそれらからなる群から選択される、タンパク質又はペプチド。
ｂ）核酸であって、任意選択で、
ｉ）例えばｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、及びクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）配列から選択される、ＲＮＡ、及び／又は
ｉｉ）エキソソーム標的化ドメインを含むＲＮＡであって、任意選択で、エキソソーム標的化ドメインが、
ａ）エキソソーム標的化ヘアピン若しくは直鎖状モチーフ、
ｂ）ウイルスエキソソーム標的化ＲＮＡ若しくはそのエキソソーム標的化フラグメントを含むか若しくはそれらからなる群から選択される、ＲＮＡ、
ｉｉｉ）アプタマードメインを含むＲＮＡであって、任意選択で、アプタマードメインが、
ａ）ＭＳ２結合ステムループ、
ｂ）Ｃ／Ｄボックス、及び／若しくは
ｃ）ＡＵリッチエレメントから選択され、任意選択で、ＲＮＡが、Ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡである、ＲＮＡである、核酸を含む群から選択される、
ｆｆ）融合タンパク質を発現し、融合タンパク質が、
ｉ）エキソソーム膜タンパク質に融合されたバクテリオファージコートタンパク質ＭＳ２（任意選択で、エキソソーム膜タンパク質は、Ｌａｍｐ２ｂ、ＶＳＶＧ、ＣＤ６３を含むか若しくはそれらからなる群から選択される）、及び／又は
ｉｉ）エキソソーム膜タンパク質に融合された古細菌リボソームタンパク質Ｌ７Ａｅ（任意選択で、エキソソーム膜タンパク質は、Ｌａｍｐ２ｂ、ＶＳＶＧ、ＣＤ６３を含むか若しくはそれらからなる群から選択される）、及び／又は
ｉｉｉ）ＣＤ９－ＨｕＲ融合タンパク質を含み、
任意選択で、融合タンパク質が、光活性化された二量体化タンパク質を更に含む、
ｇｇ）ｍＲＮＡから１つ以上のカーゴを、１つ以上の
ＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲを標的に結合するときにのみ翻訳し、任意選択で、カーゴが、
ａ）タンパク質又はペプチド、任意選択で、
ｉ）抗体若しくはその抗原結合フラグメント、例えば腫瘍抗原若しくは新抗原に結合する抗体若しくはその抗原結合フラグメント、
ｉｉ）ヌクレアーゼなどの酵素、例えばＴＡＬＥＮ、
ｉｉｉ）サイトカイン、例えばＩＬ－１０、又は
ｉｖ）ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質、例えばＣａｓ９、
ｖ）二重特異性タンパク質、例えば二重特異性抗体若しくは任意選択でＴ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）である、タンパク又はペプチド、
ｂ）核酸であって、いくつかの実施形態では、
ｉ）例えばｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、及びクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）配列から選択される、ＲＮＡである、核酸を含む群から選択され、
任意選択で、カーゴが、Ｂｃｌ－３ ｍＲＮＡ非翻訳領域、任意選択で５′ＵＴＲから発現されるように操作されている。
ａ）ＭＨＣクラス１遺伝子又はタンパク質の機能が破壊されている、
ｂ）β２ミクログロブリン遺伝子からの発現が破壊されており、任意選択でβ２ミクログロブリン遺伝子がノックアウトされている、
ｃ）１つ以上のＨＬＡ遺伝子からの発現が破壊されている、
ｄ）ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ及び／又はＨＬＡ－Ｃのうちのいずれか１つ以上からの発現が破壊されており、任意選択で、ＨＬＡ－Ａ及びＨＬＡ－Ｂの発現は完全に破壊されているが、ＨＬＡ－Ｃの発現は部分的に破壊されており、任意選択で、ＨＬＡ－Ａ及びＨＬＡ－Ｂの両方の対立遺伝子からの発現は破壊されているが、ＨＬＡ－Ｃの一方の対立遺伝子のみからの発現は破壊されている、
ｅ）ＨＬＡクラスＩｂ遺伝子のうちのいずれか１つ以上、任意選択でＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ４７及びＰＤ－Ｌ１のうちのいずれか１つ以上を過剰発現する、
ｆ）ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ４７及びＰＤ－Ｌ１のうちのいずれか１つ以上を過剰発現する（任意選択で、ベータ２ミクログロブリン遺伝子からの発現が破壊されるように操作されている）、並びに／又は
ｇ）１つ以上の免疫調節遺伝子を過剰発現する（任意選択で、１つ以上の免疫調節遺伝子が、ＣＤ４７及びＰＤ－Ｌ１を含む群から選択される）、
ｈ）産物がカーゴの効力に悪影響を及ぼし得る１つ以上の遺伝子又は遺伝子産物を排除する、
ｉ）自然応答／適応応答を上方又は下方に調整する、
ｊ）炎症、血管新生、アテローム性動脈硬化症、リンパ発達及び腫瘍増殖を低減する、
ｋ）操作されたカーゴの生物学的作用に間接的に対抗する可能性が高い接着タンパク質及び／又はカーゴ実体をコードする１つ以上の遺伝子の発現が破壊されており、より大きな正味の治療効果をもたらす可能性がある、
ｌ）ＣＤ４０Ｌの発現を下方制御又は阻害する、
ｎ）ＣＤ３６、ＮＯＤ２、ＳＲＢ１、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ６、ＴＬＲ９、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ９３（Ｃ１ｑＲｐ）、Ｃ３ａＲ、ＣＤ８８（Ｃ５ａＲ）、ＣＤ８９（ＦｃａＲ１）、ＣＤ２３（ＦｃｅＲ１）、ＣＤ３２（ＦｃｇＲＩＩａ）、ＭＨＣクラス１、ＣＤ１９１（ＣＣＲ１）、ＣＤ１９３（ＣＣＲ３）、ＣＤ１９４（ＣＣＲ４）、ＣＤ１８４（ＣＸＣＲ４）、ＣＸ３ＣＲ１、ＣＤ１０２（ＩＣＡＭ－２）、ＪＡＭ－Ｃ／ＪＡＭ－３、ＣＤ６２Ｐ（Ｐ－セレクチン）、ＣＤ３１（ＰＥＣＡＭ－１）、ＣＤ１５０（ＳＬＡＭＦ１）、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ５、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ４／ＰＦ４、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ８、ＮＡＰ２（ＣＸＣＬ７）、ＩＬ－１ｂのうちのいずれか１つ以上の発現を下方制御若しくは阻害する、
ｏ）ＧＡＲＰ及び／又はＴＧＦｂの発現を破壊又は阻害する、
ｑ）Ｓｉｇｌｅｃ－７、Ｓｉｇｌｅｃ－９、Ｓｉｇｌｅｃ－１１又はＴＧＦｂのうちのいずれか１つ以上の発現を破壊又は阻害する、
ｓ）ＧＰＩｂ／Ｖ／ＩＸ及びＧＰＶＩ（ＧＰ６）、ＩＴＧＡ２Ｂ、ＣＬＥＣ２、インテグリンαＩＩｂｂ３、ａ２ｂ１、ａ５ｂ１及びａ６ｂ１、ＧＰＶＩ及びＩＴＧＡ２Ｂのうちのいずれか１つ以上の発現を破壊又は阻害する、
ｔ）Ｐａｒ１、Ｐａｒ４、Ｐ２Ｙ１２、ＧＰＩｂ／Ｖ／ＩＸ、トロンボキサン受容体（ＴＢＸＡ２Ｒ）、Ｐ２Ｙ１、Ｐ２Ｘ１及びインテグリンαＩＩｂｂ３のうちのいずれか１つ以上、又はＰａｒ１、Ｐａｒ４及びＰ２Ｙ１２からなる群からのいずれか１つ以上の発現を破壊又は阻害する、
ｕ）Ｃｏｘ１、Ｃｏｘ２、ＨＰＳ、プロトロンビン、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、フォン・ヴィレブランド因子及びトロンボキサン－Ａシンターゼ（ＴＢＸＡＳ１）のうちのいずれか１つ以上の発現を破壊又は阻害する、
ｖ）血小板又は血小板様膜結合細胞フラグメントの活性化に応答して目的のタンパク質又はＲＮＡを合成し、任意選択で、目的のタンパク質又はＲＮＡが、ＢＣＬ－３ ｍＲＮＡ非翻訳領域、任意選択で５′ＵＴＲから発現される、
ｚ）１つ以上のカーゴタンパク質又はカーゴＲＮＡを発現し、任意選択で、カーゴタンパク質又はカーゴＲＮＡが、アルファ顆粒標的化シグナルを含み、任意選択で、血小板因子４（platelet factor 4、ＰＦ４）又はフォン・ヴィレブランド因子（ｖＷｆ）を含む、
ａａ）少なくとも２つのＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲを発現し、任意選択で、少なくとも３、４、５、６、７、８、９又は少なくとも１０の異なるＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲを発現する、
ｂｂ）少なくとも２つのＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲを発現し、少なくとも２つのＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲの標的結合ドメインが、異なる標的に対して指向されている、
ｃｃ）少なくとも２つのＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲを発現し、少なくとも２つのＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲの標的結合ドメインが、異なる標的に対して指向されており、
ｉ）第１のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲの血小板調節ドメインが、血小板活性化ドメイン、任意選択で脱顆粒誘発ドメイン、任意選択でＩＴＡＭ含有ドメインであり、第２のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲの血小板調節ドメインが、血小板阻害ドメインであり、任意選択で血小板脱顆粒の誘発を防止するドメインであり、任意選択でＩＴＡＭ含有ドメインである、
ｉｉ）第１のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲの血小板調節ドメインが、血小板活性化ドメイン、任意選択で脱顆粒誘発ドメイン、任意選択でＩＴＡＭ含有ドメインであり、第２のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲの血小板調節ドメインが、血小板活性化ドメイン、任意選択で脱顆粒誘発ドメイン、任意選択でＩＴＡＭ含有ドメインである、
ｄｄ）ともに作動して論理回路を形成する、少なくとも２つのＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付け標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲを発現する、
ｅｅ）１つ以上のカーゴを発現し、任意選択で、カーゴが、
ａ）タンパク質又はペプチドであって、任意選択で、
ｉ）抗体若しくはその抗原結合フラグメント、例えば腫瘍抗原若しくは新抗原に結合する抗体若しくはその抗原結合フラグメント、
ｉｉ）ヌクレアーゼなどの酵素、例えばＴＡＬＥＮ、
ｉｉｉ）サイトカイン、例えばＩＬ－１０、又は
ｉｖ）ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質、例えばＣａｓ９、
ｖ）二重特異性タンパク質、例えば二重特異性抗体若しくは任意選択でＴ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）、
ｖｉ）エキソソーム標的化ドメインを含む融合タンパク質であり、融合タンパク質が、
ａ）カーゴタンパク質又はペプチドと、
ｂ）エキソソーム標的化ドメインと、を含み、任意選択で、エキソソーム標的化ドメインが、
ｉ）エキソソーム特異的膜タンパク質又はそのエキソソーム膜標的化部分、例えば、
テトラスパニン、例えばＣＤ６３、又は
非テトラスパニン、例えばＰＴＧＦＲＮ若しくはＢＡＳＰ１
ｉｉ）可溶性タンパク質由来のエキソソーム標的化配列、任意選択でＮｅｄｄ４ユビキチンリガーゼのＷＷドメイン、
ｉｉｉ）ユビキチンタグ、及び／又は
ｉｖ）タグ結合ドメイン、任意選択でタグに対して指向されたナノボディ、任意選択でＧＦＰに対して指向されたナノボディを含むか若しくはそれらからなる群から選択される、タンパク質又はペプチド。
ｂ）核酸であって、任意選択で、
ｉ）例えばｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、及びクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）配列から選択される、ＲＮＡ、及び／又は
ｉｉ）エキソソーム標的化ドメインを含むＲＮＡであって、任意選択で、エキソソーム標的化ドメインが、
ａ）エキソソーム標的化ヘアピン若しくは直鎖状モチーフ、
ｂ）ウイルスエキソソーム標的化ＲＮＡ若しくはそのエキソソーム標的化フラグメントを含むか若しくはそれらからなる群から選択される、ＲＮＡ、
ｉｉｉ）アプタマードメインを含むＲＮＡであって、任意選択で、アプタマードメインが、
ａ）ＭＳ２結合ステムループ、
ｂ）Ｃ／Ｄボックス、及び／若しくは
ｃ）ＡＵリッチエレメントから選択され、任意選択で、ＲＮＡが、Ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡである、ＲＮＡである、核酸を含む群から選択される、
ｆｆ）融合タンパク質を発現し、融合タンパク質が、
ｉ）エキソソーム膜タンパク質に融合されたバクテリオファージコートタンパク質ＭＳ２（任意選択で、エキソソーム膜タンパク質は、Ｌａｍｐ２ｂ、ＶＳＶＧ、ＣＤ６３を含むか若しくはそれらからなる群から選択される）、及び／又は
ｉｉ）エキソソーム膜タンパク質に融合された古細菌リボソームタンパク質Ｌ７Ａｅ（任意選択で、エキソソーム膜タンパク質は、Ｌａｍｐ２ｂ、ＶＳＶＧ、ＣＤ６３を含むか若しくはそれらからなる群から選択される）、及び／又は
ｉｉｉ）ＣＤ９－ＨｕＲ融合タンパク質を含み、
任意選択で、融合タンパク質が、光活性化された二量体化タンパク質を更に含む、
ｇｇ）ｍＲＮＡから１つ以上のカーゴを、１つ以上の
ＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲを標的に結合するときにのみ翻訳し、任意選択で、カーゴが、
ａ）タンパク質又はペプチド、任意選択で、
ｉ）抗体若しくはその抗原結合フラグメント、例えば腫瘍抗原若しくは新抗原に結合する抗体若しくはその抗原結合フラグメント、
ｉｉ）ヌクレアーゼなどの酵素、例えばＴＡＬＥＮ、
ｉｉｉ）サイトカイン、例えばＩＬ－１０、又は
ｉｖ）ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質、例えばＣａｓ９、
ｖ）二重特異性タンパク質、例えば二重特異性抗体若しくは任意選択でＴ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）である、タンパク又はペプチド、
ｂ）核酸であって、いくつかの実施形態では、
ｉ）例えばｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、及びクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）配列から選択される、ＲＮＡである、核酸を含む群から選択され、
任意選択で、カーゴが、Ｂｃｌ－３ ｍＲＮＡ非翻訳領域、任意選択で５′ＵＴＲから発現されるように操作されている。
【0440】
したがって、いくつかの実施形態では、本発明はまた、カーゴタンパク質若しくはペプチド又はカーゴＲＮＡをコードする核酸を提供する。いくつかの実施形態では、タンパク質又はペプチドは、抗体又はその抗原結合フラグメント、酵素（ヌクレアーゼ、例えばＴＡＬＥＮなど）、サイトカイン、又はＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（CRISPR associated protein 9、Ｃａｓ９）から選択される。いくつかの実施形態では、カーゴＲＮＡは、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、及びクラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート（ＣＲＩＳＰＲ）配列から選択される。好ましい実施形態では、核酸は、巨核球及び／又は血小板における発現を駆動するのに好適な配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、カーゴタンパク質、カーゴペプチド又はカーゴＲＮＡをコードする核酸は、プロモーターなどの異種発現制御配列に作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、核酸は、カーゴタンパク質若しくはペプチド又はカーゴＲＮＡをコードし、また、巨核球特異的プロモーター又は血小板特異的プロモーターを含む。いくつかの実施形態では、核酸は、カーゴタンパク質若しくはペプチド又はカーゴＲＮＡをコードし、巨核球特異的プロモーター又は血小板特異的プロモーターなどの異種配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、カーゴタンパク質若しくはペプチド又はカーゴＲＮＡをコードするＤＮＡである。
【0441】
本発明は、前述の請求項のいずれか一項に記載の有効量の任意の１つ以上の操作された巨核球、操作された血小板、及び／又はＣＰＲを投与することを含む、カーゴを送達する方法を提供する。
【0442】
本発明は、本発明の１つ以上のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲを発現する本発明の前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシを含む標的化送達システムを提供する。いくつかの実施形態では、標的化送達システムは、治療的標的化送達システムである。いくつかの実施形態では、標的化送達システムは、非治療的送達システムである。好ましい実施形態では、システムは、エフェクターシャーシを含む。
【0443】
本発明はまた、本発明による１つ以上のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲを発現する本発明のプロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシを含む非血栓形成性標的化送達システムを提供し、ここで、前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシは、血栓形成性経路標的化送達システムを破壊するように操作されている。いくつかの実施形態では、非血栓形成性標的化送達システムは、非血栓形成性治療的標的化送達システムである。いくつかの実施形態では、非血栓形成性標的化送達システムは、非血栓形成性の非治療的送達システムである。好ましい実施形態では、システムは、エフェクターシャーシを含む。
【0444】
好ましい実施形態では、標的化送達システム又は非血栓形成性標的化送達システムは、１つ以上のカーゴを更に含む。カーゴの選好は、本明細書に記載されているとおりである。
【0445】
本明細書に記載の様々な成分、前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシ、ＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲ及びシステムを使用して、標的部位への特定のカーゴの送達を介して、及び／又は特定の抗原に対するＴ細胞の活性化を介して、ある範囲の疾患を治療又は予防することができることは明らかである。したがって、本明細書に記載の本発明の様々な実施形態は、対象における疾患、障害、又は状態を治療する方法を提供し、当該方法は、対象に、本発明の１つ以上の前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシ、本発明の１つ以上のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲを投与すること、好ましくは前述の治療送達システムを投与することを含む。
【0446】
当業者は、所与の疾患に対する適切な標的に向けられるように、本発明のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲを設計することができる。
【0447】
本明細書に記載されるような前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシのうちのいずれか、例えば、本発明の１つ以上のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲを発現する操作された前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシは、を使用して、カーゴを特定の細胞又は組織、例えば腫瘍に送達することができる。前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシに治療カーゴがロードされている場合、標的へのＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲの結合は、治療カーゴの局所的送達をもたらす。例えば、毒素、例えばアルファ顆粒に貯蔵された毒素をロードされた前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシを、ＣＰＲを使用して腫瘍に標的化すると、脱顆粒及び腫瘍への毒素の局所送達がもたらされる。
【0448】
加えて又は代替的に、特定のカーゴを送達するのではなく、前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシは、抗原特異的Ｔ細胞に結合してそれらの機能を上方制御して規定の抗原を発現する腫瘍を排除するように、ＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲを、適切な標的結合ドメインとともに含み得る。逆に、自己免疫疾患を媒介する抗原特異的Ｔ細胞は、橋本甲状腺炎、１型糖尿病、多発性硬化症などの様々な一般的な疾患で知られている定義された抗原で、破壊の標的となる可能性がある。
【0449】
上記のように、前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシは、例えば血小板又は血小板様膜結合細胞フラグメントが血栓形成能を保持している場合、それはＣＰＲを介して腫瘍に標的化され、腫瘍から酸素を奪うことができる。
【0450】
本明細書に記載の前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシは、がん性細胞を死滅させるように操作され得る。例えば、ＣＤ１９は、がん性Ｂ細胞白血病（ＢＣＬ）を治療するＴＲＡＩＬ発現血小板を標的とした。ＣＤ１９を標的としたＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＢＣＬと比較して臨床で大きな期待を示す。ＴＮＦスーパーファミリーメンバー（ＴＲＡＩＬ）及びＦａｓリガンド（Fas ligand、ＦＡＳＬ）は、ＣＤ４０刺激時にアポトーシスを介してＢＣＬ死を誘導することが示されている（Ｄｉｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．「Ｆａｓ－ｌｉｇａｎｄ （ＣＤ１７８）ａｎｄ ＴＲＡＩＬ ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃａｌｌｙ ｉｎｄｕｃｅ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｏｆ ＣＤ４０－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｈｒｏｎｉｃ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｂ ｃｅｌｌｓ」．Ｂｌｏｏｄ，２００５を参照し、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。ＣＤ４０Ｌは、活性化された血小板に自然に曝露され（Ｈｅｎｎ ｅｔ ａｌ．「ＣＤ４０ ｌｉｇａｎｄ ｏｎ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｌａｔｅｌｅｔｓ ｔｒｉｇｇｅｒｓ ａｎ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ」．Ｎａｔｕｒｅ，１９９８を参照し、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、したがって、ＢＣＬに結合したときにＦＡＳＬ／ＴＲＡＩＬ依存性細胞死経路を活性化する可能性があり。ＦＡＳＬは、活性化された血小板に自然に曝露される（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．「Ｐｌａｔｅｌｅｔｓ ｉｎｄｕｃｅ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｖｉａ ｍｅｍｂｒａｎｅ－ｂｏｕｎｄ ＦａｓＬ」．Ｂｌｏｏｄ，２０１５を参照し、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。ＴＲＡＩＬを発現する血小板は、マウスの前立腺がん転移を減少させるために使用されてきた（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．「Ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｐｌａｔｅｌｅｔｓ ｔｏ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｅ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ」．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，２０１６を参照し、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。一実施形態では、ＣＤ１９－単鎖可変フラグメント（single－chain variable fragment、ｓｃＦｖ）－ＩＴＡＭを提示し、ＴＲＡＩＬ、ＣＤ４０Ｌ、及びＦＡＳＬリガンドを含有する休止血小板は、Ｂ細胞上のＣＤ１９及びＣＤ１９－ｓｃＦｖ－ＩＴＡＭの結合によって活性化される。活性化すると、血小板表面にＴＲＡＩＬ、ＣＤ４０Ｌ、及びＦＡＳＬが提示される。白血病細胞の血小板誘発性死は、ＣＤ４０ＬがＢ細胞のＣＤ４０受容体に結合してＦＡＳＬ／ＴＲＡＩＬ依存性細胞死経路を活性化することによって媒介される。
【0451】
ある特定の実施形態では、前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシは、インビボで新抗原特異的Ｔ細胞の増殖を指示するように操作され得る。新抗原は多くのヒト腫瘍に存在し、コンピューターで特定することができる。エクスビボでのＴ細胞の増殖及び再注入は、標的とされた腫瘍の死滅をもたらす。免疫チェックポイント阻害により、Ｔ細胞は、新抗原を発現している腫瘍を殺すことができる（しかしながら、非特異性は重篤な副作用を引き起こす）。巨核球は、外因性ペプチドを含むＭＨＣクラス１分子をロードし、これらを血小板に移すことができる。新抗原は巨核球で発現する可能性があり、ＭＨＣクラス１－ＩＴＡＭ融合タンパク質は、チェックポイント阻害剤を刺激することができる。これにより、新抗原特異的Ｔ細胞のインビボ増殖が可能になる。例えば、血小板は、ＭＨＣ１－新抗原－ＩＴＡＭを発現するように操作され得る。操作された血小板及びＴ細胞の両方が、ＭＨＣ１－新抗原－ＩＴＡＭと新抗原特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）との相互作用によって活性化される。活性化により、血小板の表面に細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ４）及びプログラム細胞死１（ＰＤ－１）が提示され、それぞれ、Ｔ細胞上のＣＴＬＡ４阻害剤（ＣＴＬＡ４ｉ）及びＰＤ－１阻害剤（ＰＤ－１ｉ）と相互作用する。最大のＴ細胞の活性化及び増殖は、チェックポイントの遮断によって達成される。
【0452】
したがって、一実施形態では、本発明は、疾患の治療又は予防に使用するための、本明細書に記載されるような前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ若しくはエフェクターシャーシ、又は治療送達システム若しくは治療標的化送達システム若しくは非血栓形成性治療送達システムを提供する。
【0453】
ある範囲の疾患が、本明細書に記載の成分を使用して治療又は予防され得、当業者は、１つ以上のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲの標的結合ドメインが、
治療／予防される疾患に応じて、適切な標的に結合するように設計される必要があることを認知している。加えて、前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシにロードされるカーゴは、治療又は予防される疾患に依存する。
治療／予防される疾患に応じて、適切な標的に結合するように設計される必要があることを認知している。加えて、前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシにロードされるカーゴは、治療又は予防される疾患に依存する。
【0454】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ若しくはエフェクターシャーシ、又は治療送達システム若しくは治療標的送達システム若しくは非血栓形成性治療送達システムを使用して、特定の疾患に対してワクチン接種することができる。
【0455】
いくつかの実施形態では、疾患、障害、又は状態は、がん、自己免疫疾患又は自己免疫障害、遺伝子疾患、心血管疾患、及び感染症、例えば細菌又はウイルス感染症、例えばＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２による感染症であり得るが、これらに限定されない。
【0456】
いくつかの実施形態では、がんは、参照により本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０２０／０５３２４７号の９～１１頁の段落［００１９］に記載されているがんのうちのいずれかから選択される。
【0457】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の操作された血小板は、自己免疫状態を治療するために使用され得る。
【0458】
いくつかの実施形態では、自己免疫疾患又は自己免疫障害は、参照により本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０２０／０５３２４７号の１１～１２頁の段落［００２０］に記載されている自己免疫疾患又は自己免疫障害のうちのいずれかから選択される。
【0459】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシは、自己免疫疾患を治療するために自己抗原特異的Ｔ細胞を抑制するために使用され得る。いくつかの実施形態では、前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシ（例えば、操作された血小板）中のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲは、自己抗原と関連する組織に特異的な領域を含み得る。例えば、組織は、脂肪組織、副腎、腹水、膀胱、血液、骨、骨髄、脳、子宮頸部、結合組織、耳、胚組織、食道、目、心臓、腸、腎臓、喉頭、肝臓、肺、リンパ、リンパ節、乳腺、口、筋肉、神経、卵巣、膵臓、副甲状腺、咽頭、下垂体、胎盤、前立腺、唾液腺、皮膚、胃、精巣、胸腺、甲状腺、トンシル、気管、臍帯、子宮、血管、及び脾臓からなる群から選択される。
【0460】
参照により本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０２０／０５３２４７号の１２９～１３０頁の表１２は、Ｈａｙｔｅｒらからの神経系自己免疫障害の非網羅的リストについての分子標的及び／又は組織標的を示し、参照により本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０２０／０５３２４７号の１３０頁の表１３は、Ｈａｙｔｅｒらからの内分泌系自己免疫障害の非網羅的リストについての分子標的及び／又は組織標的を示す。参照により本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０２０／０５３２４７号の１３１頁の表１４は、Ｈａｙｔｅｒ，ｅｔ ａｌ．による胃腸系自己免疫障害の非網羅的リストについての分子標的及び／又は組織標的を示す。参照により本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０２０／０５３２４７号の１３１頁の表１５は、Ｈａｙｔｅｒ，ｅｔ ａｌ．による造血自己免疫障害の非網羅的リストについての分子標的及び／又は組織標的を示す。参照により本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０２０／０５３２４７号の１３２頁の表１６は、Ｈａｙｔｅｒ，ｅｔ ａｌ．による筋骨格系自己免疫障害の非網羅的リストについての分子標的及び／又は組織標的を示す。参照により本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０２０／０５３２４７号の１３２～１３３頁の表１７は、Ｈａｙｔｅｒ，ｅｔ ａｌ．による皮膚及び粘液自己免疫障害の非網羅的なリストについての分子標的及び／又は組織標的を示す。参照により本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０２０／０５３２４７号の１３３頁の表１８は、Ｈａｙｔｅｒ，ｅｔ ａｌ．による皮膚自己免疫障害の非網羅的リストについての分子標的及び／又は組織標的を示す。参照により本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０２０／０５３２４７号の１３３頁の表１９は、Ｈａｙｔｅｒ，ｅｔ ａｌ．による心臓血管自己免疫障害の非網羅的リストについての分子標的及び／又は組織標的を示す。参照により本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０２０／０５３２４７号の１３４頁の表２０は、Ｈａｙｔｅｒ，ｅｔ ａｌ．による他の自己免疫障害の非網羅的リストについての分子標的及び／又は組織標的を示す。
【0461】
本明細書に記載の本発明の様々な実施形態は、対象の免疫系における活性を低減する方法を提供し、当該方法は、少なくとも１つのＳＡＰＲを発現する血小板又は操作された血小板を対象に投与することを含み、ＳＡＰＲの標的結合ドメインは、腫瘍抗原、新抗原、又は自己抗原に由来するペプチドに結合した主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子を含む。いくつかの実施形態では、操作された血小板は、抗炎症性サイトカイン、例えばＩＬ－１０を含む。当業者は、他の好適な抗炎症性サイトカインを認識している。
【0462】
いくつかの実施形態では、ＳＡＰＲは、ＭＨＣクラスＩ分子を発現する。いくつかの実施形態では、ＳＡＰＲは、ＭＨＣクラスＩＩ分子を発現する。いくつかの実施形態では、ＭＨＣ分子は、抗原に対する免疫応答を刺激する。いくつかの実施形態では、抗原は、がん、自己免疫、遺伝性疾患、心血管疾患及び感染症からなる群から選択される少なくとも１つの疾患、障害、又は状態に関連している。
【0463】
本明細書に記載の本発明の様々な実施形態は、対象におけるインビボ遺伝子編集又は遺伝子治療の方法を提供し、当該方法は、編集される組織に特異的な本明細書に記載のキメラ血小板受容体を含む操作された血小板を対象に投与することであって、操作された血小板は、ゲノム操作機序をロードしたアデノウイルス又はＳｅｎｄａｉウイルスを覆っている、投与することと、組織でゲノム機序を放出することと、を含む。いくつかの実施形態では、ゲノム機構は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集システムである。
【0464】
本明細書に記載の本発明の様々な実施形態は、前述の治療的送達システムの使用を提供し、キメラ受容体は、対象の疾患、障害、又は状態の治療において、疾患、障害、又は状態に関連する抗原に特異的である。本明細書に記載の使用のいくつかの実施形態では、疾患、障害、又は状態は、がん、自己免疫、遺伝性疾患、心血管疾患及び感染症からなる群から選択される。
【0465】
本明細書に記載の使用のいくつかの実施形態では、がんは、参照により本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０２０／０５３２４７号の１４～１６頁の段落［００３０］に記載のがんのうちのいずれかであり得るが、これらに限定されない。
【0466】
本明細書に記載の使用のいくつかの実施形態では、疾患、障害、又は状態は、限定されないが、参照により本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０２０／０５３２４７号の１６頁の段落［００３１］に記載の自己免疫疾患、障害、又は状態のうちのいずれかなどの自己免疫である。
【0467】
本明細書の本発明の様々な実施形態は、（ａ）キメラ血小板受容体を提示する操作された血小板であって、操作された血小板は、非血栓形成性及び非免疫原性となるように前駆巨核球を遺伝子修飾することによって産生され、任意選択で、低減した炎症促進効果を有するように操作されている、操作された血小板と、（ｂ）本明細書で定義されるカーゴ、毒素、タンパク質、小分子薬物、造影剤、放射性ヌクレオチド薬物、放射性ヌクレオチドタグ付抗体、又はそれらの任意のコンジュゲート、及び血小板内の小胞内にパッケージされた核酸からなる群から選択される少なくとも１つの治療剤と、を含む治療的送達システムを提供し、ｉ）治療剤は、核酸又はタンパク質であり、ローディングは、前駆巨核球での発現を介して起こるか、又はｉｉ）治療剤は、操作された血小板を治療剤とともにインキュベートすることによってロードされる。
【0468】
上記のように、ｉＰＳＣから直接血小板を産生することが可能である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の操作された血小板又は血小板様膜結合細胞フラグメントは、Ｉｔｏら（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｃｅｌｌ，１７４（３）：６３６－６４８．ｅ１８，２０１８）に記載されている技術を使用して産生することができる。Ｉｔｏは、ｉＰＳＣ前駆体から血小板を臨床規模で生産する方法を提供する。乱流は、ヒト誘導人工多能性幹細胞（induced pluripotent stem cell、ｉＰＳＣ）からの血小板の臨床規模エクスビボ産生のために血小板生合成を活性化することが観察された（同書）。不死化巨核球前駆体細胞系（immortalized megakaryocyte progenitor cell line、ｉｍＭＫＣＬ）に由来するｉＰＳＣを、乱流エネルギー及び剪断応力の物理的パラメータを制御しながら、バイオリアクター内で可溶性因子インスリン様成長因子結合タンパク２（Like Growth Factor Binding Protein 2、ＩＧＦＢＰ２）、マクロファージ遊走阻止因子（migration inhibitory factor、ＭＩＦ）、及びナルジリシンコンベルターゼ（nardilysin convertase、ＮＲＤＣ）と組み合わせた（同書）。１０１１を超える血小板の産生が観察された（同上）。血小板は、ドナーに由来するものと同様に機能することが観察された（同上）。
【0469】
本明細書における本発明のある特定の実施形態では、ｉｍＭＫＣＬは、レンチウイルスを使用して、がん由来ＭＹＣ（ｃ－ＭＹＣ）／ポリコームリングフィンガーがん原遺伝子（ＢＭＩ－１）及びＢＣＬ２ｌ様１（ＢＣＬ－ＸＬ）遺伝子を本発明のｉＰＳＣに導入することによって確立され得る（例えば、ｉＰＳＣは、本明細書に記載の操作修飾のうちの１つ以上を含み得る）。追加の遺伝子が導入又は削除されて、編集された巨核球が生じる可能性があり、実際、血小板特異的プロモーターでさえ以前に特徴付けられている。これらの遺伝子は、ドキソルビシン（ＤＯＸ）などの薬剤の存在下で誘導性の遺伝子発現を提供する。ｉｍＭＫＣＬは、培養が望まれるまで凍結保存することができる。巨核球の増殖は、細胞株を薬剤と接触させることによって刺激され、挿入された遺伝子の発現をもたらす。遺伝子発現を停止し、血小板産生を可能にするために、薬剤が除去される。
【0470】
輸血用の血小板の保管に関する現在の連邦医薬品局（ＦＤＡ）承認の規則では、２２℃での保管が必要であり、６日以内に使用する必要がある。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｓｌｉｃｈｔｅｒ ｅｔ ａｌ．「Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｌｅｅｄｉｎｇ ｉｎ Ｓｅｖｅｒｅｌｙ Ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃ Ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ｏｆ Ｄｉｍｅｔｈｙｌ Ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ（ＤＭＳＯ）Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖｅｄ Ｐｌａｔｅｌｅｔｓ（ＣＰＰ）Ｉｓ Ｓａｆｅ－Ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ａ Ｐｈａｓｅ １ Ｄｏｓｅ Ｅｓｃａｌａｔｉｏｎ Ｓａｆｅｔｙ Ｔｒｉａｌ」．Ｂｌｏｏｄ，２０１６は、ＤＭＳＯで凍結した場合に２年間凍結保存が可能であると仮定する。ポジティブな第１相試験の後、第２相及び第３相試験が進行中である。重度の血小板減少症及び活動性出血を有する患者における凍結保存された血小板（cryopreserved platelet、ＣＰＰ）の最大３つの連続単位の注入は、「安全であり、ＣＰＰが凍結保存プロセスから生じる凝血原表現型を有するにもかかわらず、血栓性合併症のいかなる証拠もない」ようであった。したがって、凍結保存された血小板は、世界保健機関（World Health Organization、ＷＨＯ）の出血グレードを使用して測定されるように、血小板減少症患者における出血を安定化、低減、又は停止するための有効性を有する可能性が高い。非凝固目的で使用される凍結保存された血小板が、現在のＦＤＡ規則に従って保存された血小板と同じくらい効果的であるという仮説を損なう証拠は見つからなかった。
【0471】
本明細書に記載の本発明の様々な実施形態は、血小板又は血小板様膜結合細胞フラグメントのインビトロ産生の方法を提供し、当該方法は、複数の不死前駆体細胞、例えば人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）前駆体に発現系をトランスフェクトすることであって、発現系がｉＰＳＣに見出されない薬剤によって誘導される、トランスフェクトすることと、発現系を薬剤と接触させて巨核球を拡張することによって巨核球前駆体細胞株を樹立することと、巨核球を、
前述のキメラ血小板受容体をコードする核酸配列の挿入；
毒素をコードする核酸配列の挿入；
カーゴ、例えばタンパク質若しくはペプチドであるカーゴ、又はＲＮＡ、例えばｍＲＮＡをコードする核酸の挿入；
治療剤又は造影剤、例えば、タンパク質若しくはペプチドである治療剤又は造影剤、あるいはＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ、例えば、治療剤又は造影剤をコードする核酸の挿入；
血小板受容体、メディエーター、及び／若しくはシグナル伝達タンパク質をコードする核酸配列の欠失若しくは変異；並びに／又は
欠失若しくは変異のない血小板よりも免疫原性が低い血小板をもたらす核酸配列の欠失若しくは変異のうちの少なくとも１つを有するように操作することと、
巨核球の血小板への分化を誘導するために、発現系から薬剤を除去することと、を含む。
前述のキメラ血小板受容体をコードする核酸配列の挿入；
毒素をコードする核酸配列の挿入；
カーゴ、例えばタンパク質若しくはペプチドであるカーゴ、又はＲＮＡ、例えばｍＲＮＡをコードする核酸の挿入；
治療剤又は造影剤、例えば、タンパク質若しくはペプチドである治療剤又は造影剤、あるいはＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ、例えば、治療剤又は造影剤をコードする核酸の挿入；
血小板受容体、メディエーター、及び／若しくはシグナル伝達タンパク質をコードする核酸配列の欠失若しくは変異；並びに／又は
欠失若しくは変異のない血小板よりも免疫原性が低い血小板をもたらす核酸配列の欠失若しくは変異のうちの少なくとも１つを有するように操作することと、
巨核球の血小板への分化を誘導するために、発現系から薬剤を除去することと、を含む。
【0472】
いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣは、ｉＰＳＣに導入された発現系であって、ｉＰＳＣに見出されない作用物質によって誘導される発現系を既に含む。したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、血小板（又は本明細書に記載のＳｙｎｌｅｔ）のインビトロ産生のための方法を提供し、当該方法は、ｉＰＳＣに導入された発現系（すなわち、非天然発現系である）を含むｉＰＳＣから巨核球前駆体細胞株を樹立することであって、発現系が、ｉＰＳＣにおいて見出されない作用物質によって誘導され、発現系を当該作用物質と接触させて巨核球を増殖させることを含む、樹立することと、巨核球を、
前述のキメラ血小板受容体をコードする核酸配列の挿入；
毒素をコードする核酸配列の挿入；
カーゴ、例えばタンパク質若しくはペプチドであるカーゴ、又はＲＮＡ、例えばｍＲＮＡをコードする核酸の挿入；
治療剤又は造影剤、例えば、タンパク質若しくはペプチドである治療剤又は造影剤、あるいはＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ、例えば、治療剤又は造影剤をコードする核酸の挿入；
血小板受容体、メディエーター、及び／若しくはシグナル伝達タンパク質をコードする核酸配列の欠失若しくは変異；並びに／又は
欠失若しくは変異のない血小板よりも免疫原性が低い血小板をもたらす核酸配列の欠失若しくは変異のうちの少なくとも１つを有するように操作することと、
巨核球の血小板への分化を誘導するために、発現系から薬剤を除去することと、を含む。
前述のキメラ血小板受容体をコードする核酸配列の挿入；
毒素をコードする核酸配列の挿入；
カーゴ、例えばタンパク質若しくはペプチドであるカーゴ、又はＲＮＡ、例えばｍＲＮＡをコードする核酸の挿入；
治療剤又は造影剤、例えば、タンパク質若しくはペプチドである治療剤又は造影剤、あるいはＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ、例えば、治療剤又は造影剤をコードする核酸の挿入；
血小板受容体、メディエーター、及び／若しくはシグナル伝達タンパク質をコードする核酸配列の欠失若しくは変異；並びに／又は
欠失若しくは変異のない血小板よりも免疫原性が低い血小板をもたらす核酸配列の欠失若しくは変異のうちの少なくとも１つを有するように操作することと、
巨核球の血小板への分化を誘導するために、発現系から薬剤を除去することと、を含む。
【0473】
いくつかの実施形態では、方法は、巨核球前駆体細胞株を、巨核球前駆体細胞株にロードされる外因性カーゴとともにインキュベートすることを含む。外因性カーゴは、カーゴを、巨核球前駆体細胞株、例えば、タンパク質又はペプチド；ＲＮＡ若しくはｍＲＮＡなどの核酸、又はＤＮＡベクターなどのベクター；ウイルスベクター；小分子；治療剤及び／若しくは造影剤、又はエキソソーム、例えば、第２のカーゴをプレロードされたエキソソーム；あるいは１つ又は複数のナノ粒子にロードするのに有益であると考えられる、任意の外因性カーゴであり得る。カーゴ及びカーゴをロードする方法の選好は、本明細書の他の箇所に記載されている。
【0474】
いくつかの実施形態では、方法は、巨核球前駆体細胞株から産生された血小板を、血小板にロードされる外因性カーゴとともにインキュベートすることを含む。外因性カーゴは、カーゴを、血小板、例えば、タンパク質又はペプチド；ＲＮＡ若しくはｍＲＮＡなどの核酸、又はＤＮＡベクターなどのベクター；ウイルスベクター；小分子；治療剤及び／若しくは造影剤及び／若しくはエキソソーム、例えば第２のカーゴをプレロードされたエキソソーム、あるいは１つ又は複数のナノ粒子にロードするのに有益であると考えられる、任意の外因性カーゴであり得る。カーゴ及びカーゴをロードする方法の選好は、本明細書の他の箇所に記載されている。
【0475】
本明細書では、遺伝子記号をＥＮＳＥＭＢＬ遺伝子ＩＤとともに使用して、ヒト由来の遺伝子を指す。特に明記しない限り、各遺伝子記号に対応する遺伝子名及びＥＮＳＥＭＢＬ遺伝子（ＥＮＳＧ）ＩＤは、参照により本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０２０／０５３２４７号の１９～２３頁の表１に示されている。この表における各ＥＮＳＥＭＢＬエントリの固有の識別子は、ＥＮＳＧラベルの後の識別子の最初の５つの先行ゼロ（０）を削除するように変更された。
【0476】
本明細書では、記号及び名称をＥＮＳＥＭＢＬタンパク質ＩＤとともに使用して、ヒト由来のタンパク質を指す。特に断りのない限り、タンパク質名（本明細書でタンパク質を指すために使用される場合）と、記号及び各記号に対応するＥＮＳＥＭＢＬタンパク質（ＥＮＳＰ）ＩＤと、参照により本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０２０／０５３２４７号の２３～３１頁の表２に示す。各ＥＮＳＥＭＢＬエントリの固有の識別子は、ＥＮＳＰラベルの後の識別子の最初の５つの先行ゼロ（０）を削除するように変更された。
【0477】
ＣＤ３又はＣＤ３は、分化クラスター２（複数のサブユニット）としても知られている。ＦＣＥＲ２又はＣＤ２３は、（ＩｇＥ受容体としても知られている。ＮＴ５Ｅは、５’－ヌクレオチダーゼとしても知られている。Ｆ９、Ｆ１０は、活性化Ｆ９、Ｆ１０としても知られている。ＡＣＶＲＬ１は、アクチビン受容体様キナーゼ１としても知られている。ＡＦＰは、アルファフェトプロテインとしても知られている。ＡＮＧＰＴＬ３は、アンジオポエチン３としても知られている。ＢＳＧ又はＣＤ１４７は、ベイシジンとしても知られている。ＡＰＰ又はＮ／ａは、ベータアミロイドとしても知られている。ＣＡＬＣＡは、カルシトニン遺伝子関連ペプチドとしても知られている。ＣＡ９は、炭酸脱水酵素９（ＣＡ－ＩＸ）としても知られている。ＭＹＨ７は、心筋ミオシンとしても知られている。ＭＥＴは、ｃ－Ｍｅｔとしても知られている。Ｆ３は、凝固因子ＩＩＩとしても知られている。ＣＬＥＣ６Ａは、樹状細胞関連レクチン２としても知られている。ＥＧＦＲ又はＥＧＦＲは、伸長成長因子受容体としても知られている。ＥＮＧは、エンドグリンとしても知られている。ＥＰＨＡ３は、エフリン受容体Ａ３としても知られている。ＦＧＢ又はフィブリンＩＩ、ベータ鎖としても知られている。ＦＮ１は、フィブロネクチンエキストラドメイン－Ｂとしても知られている。ＦＯＬＨ１は、葉酸ヒドロラーゼとしても知られている。ＦＯＬＲ２は、葉酸受容体２としても知られている。ＦＯＬＲ１は、葉酸受容体アルファとしても知られている。ＦＺＤ１は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体としても知られている。Ｂ４ＧＡＬＮＴ１は、ＧＤ２ガングリオシドとしても知られている。ＳＴ８ＳＩＡ１は、ＧＤ３ガングリオシドとしても知られている。ＭＭＰ９は、ゼラチナーゼＢとしても知られている。ＴＹＲＰ１又はＴＹＲＰ１は、糖タンパク質７５としても知られている。ＧＰＣ３は、グリピカン３としても知られている。ＣＳＦ２ＲＡは、ＧＭＣＳＦ受容体α鎖としても知られている。ＩＧＦ１Ｒ又はＣＤ２２１は、ＩＧＦ－１受容体としても知られている。ＩＬ３１ＲＡは、ＩＬ３１ＲＡとしても知られている。ＩＴＧＡ２Ｂ又はＣＤ４１は、インテグリンα－ＩＩｂとしても知られている。ＩＴＧＡ５は、インテグリンα５としても知られている。ＩＴＧＢ３は、インテグリンαＩＩｂβ３としても知られている。ＩＴＧＢ７は、インテグリンβ７としても知られている。ＩＦＮＧは、インターフェロンガンマとしても知られている。ＩＦＮＡＲ１、ＩＦＮＡＲ２は、インターフェロンα／β受容体としても知られている。ＣＸＣＬ１０は、インターフェロンガンマ誘導タンパク質としても知られている。ＩＬ１２Ａ又はＩＬ－１２は、インターロイキン１２としても知られている。ＩＬ１３又はＩＬ－１３は、インターロイキン１３としても知られている。ＩＬ１７Ａ又はＩＬ１７Ａは、インターロイキン１７アルファとしても知られている。ＩＬ１７Ｆ又はＩＬ１７Ｆは、インターロイキン１７Ｆとしても知られている。ＩＬ２又はＩＬ２は、インターロイキン２としても知られている。ＩＬ２２又はＩＬ－２２は、インターロイキン２２としても知られている。ＩＬ２３Ａ又はＩＬ２３は、インターロイキン２３としても知られている。ＩＬ６又はＩＬ６は、インターロイキン６としても知られている。ＳＥＬＬ又はＣＤ６２Ｌは、Ｌ－セレクチンとしても知られている。ＭＳＬＮは、メソセリンとしても知られている。ＭＵＣ１は、ムチンＣａｎＡｇとしても知られている。ＭＡＤＣＡＭ１は、粘膜アドレシン細胞接着分子としても知られている。ＭＡＧは、ミエリン関連糖タンパク質としても知られている。ＮＥＣＴＩＮ４は、ネクチン－４としても知られている。ＣＡＳＰ２は、神経アポトーシス調節プロテイナーゼ２としても知られている。ＰＴＤＳＳ１は、ホスファチジルセリンとしても知られている。ＰＤＧＦＲＢは、血小板由来成長因子受容体ベータとしても知られている。ＲＨＤ、ＲＨＣＥは、アカゲザル因子としても知られている。ＲＳＰＯ３は、ルートプレート固有のスポンジン３としても知られている。ＳＥＬＰは、セレクチンＰとしても知られている。ＳＡＡ１又はＳＡＡ２は、血清アミロイドＡタンパク質としても知られている。ＡＰＣＳは、血清アミロイドＰ成分としても知られている。Ｓ１ＰＲ１は、スフィンゴシン－１－リン酸としても知られている。ＭＡＰＴは、タウタンパク質としても知られている。ＴＮＣは、テネイシンＣとしても知られている。ＴＮＦＲＳＦ１２Ａは、ＴＷＥＡＫ受容体としても知られている。ＶＩＭは、ビメンチンとしても知られている。ＶＷＦは、フォンウィルブランド因子としても知られている。ＩＬ２ＲＡ又はＣＤ２５は、ＩＬ－２受容体のα鎖としても知られている。
【0478】
本発明が、本明細書に記載の前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ若しくはエフェクターシャーシ、ＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ若しくはｅＰＡＲ、又は送達システムのうちのいずれか１つ以上を含む様々な組成物を提供することは、当業者には明らかである。
【0479】
本教示は、本発明の前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシのうちのいずれか１つ以上を、及び任意選択で少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤又は不活性成分を含む薬学的組成物を更に含む。更に、医薬品は、本明細書に記載の治療的送達システムを含み得る。
【0480】
薬学的組成物及び投与量についての選好は、参照により本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０２０／０５３２４７号の段落［０１９７］～［２３７］に記載されているとおりである。
【0481】
本明細書の様々な場所で、本開示の組成物の特徴又は機能は、グループ又は範囲で開示されている。本開示が、そのようなグループ及び範囲のメンバーの全ての個々のサブコンビネーションを含むことが特に意図されている。以下は、用語定義の非限定的なリストである。
【0482】
本明細書で使用される場合、「抗原」という用語は、それが対象に導入されるか、又はがん発生自体によって生じる腫瘍抗原などの対象によって産生されるときに免疫応答を誘発する分子として定義される。この免疫応答には、抗体産生、又は細胞傷害性Ｔリンパ球及びＴヘルパー細胞などの特定の免疫学的能力のある細胞の活性化、あるいはその両方が含まれる場合がある。
【0483】
本明細書で使用される場合、「約（approximately）」又は「約（about）」という用語は、関心のある１つ以上の値に適用される場合、記載された参照値と同様の値を指す。ある特定の実施形態では、「約（approximately）」又は「約（about）」という用語は、特に明記されていない限り、又は文脈から明らかでない限り、記載された基準値のいずれかの方向に２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１以下（より大きい又は小さい）の範囲内にある値の範囲を指す（そのような数が１００を超える場合を除く）。
【0484】
本明細書で使用される場合、「関連する」、「共役」、「連結される」、「付着する」、及び「繋留される」という用語は、２つ以上の部分に関して使用される場合、部位が直接又は連結剤として機能する１つ以上の追加の部位を介して互いに物理的に関連又は連結されて、構造が使用される条件下、例えば生理学的条件下で部分が物理的に結合したままであるように十分に安定な構造を形成することを意味している。「結合」は、厳密に直接共有化学結合を介する必要はない。また、「関連する」エンティティが物理的に関連したままになるように、イオン結合又は水素結合、又はハイブリダイゼーションベースの接続性が十分に安定していることを示唆している場合もある。
【0485】
本明細書で使用される場合、「がん」という用語は、体内の異常な細胞の制御されない成長を特徴とする様々な疾患の広いグループを指す。調節されていない細胞分裂と成長は、隣接する組織に侵入する悪性腫瘍の形成をもたらし、最終的にはリンパ系又は血流を介して体の離れた部分に転移する。
【0486】
本明細書で使用される場合、「サイトカイン」という用語は、免疫系の機能に影響を及ぼし、調節することができる多くの細胞型によって産生される多面発現機能を有する小さな可溶性因子のファミリーを指す。
【0487】
本明細書で使用される場合、「送達」という用語は、化合物、物質、実体、部分、カーゴ又はペイロードを送達する行為又は方法を指す。「送達剤」は、細胞、対象、又は他の生物系細胞への１つ以上の物質（本発明の化合物及び／又は組成物を含むがこれらに限定されない）のインビボ送達を少なくとも部分的に促進する任意の薬剤を指す。
【0488】
本明細書で使用される場合、本明細書に記載の本発明の実施形態は、それらが、出発点、野生型又は天然分子から変化する、構造的又は化学的であるかどうかにかかわらず、特徴又は特性を有するように設計される場合に「操作される」。
【0489】
本明細書で使用される場合、核酸配列の「発現」は、以下の事象のうちの１つ以上を指す：（１）ＤＮＡ配列からのＲＮＡテンプレートの産生（例えば、転写による）、（２）ＲＮＡ転写物のプロセシング（例えば、スプライシング、編集、５’キャップ形成、及び／又は３’末端プロセシングによる）、（３）ポリペプチド又はタンパク質へのＲＮＡの翻訳、（４）ポリペプチド又はタンパク質のフォールディング、並びに（５）ポリペプチド又はタンパク質の翻訳後修飾。
【0490】
本明細書で使用される場合、「製剤」は、少なくとも本発明の化合物及び／又は組成物並びに送達剤を含む。
【0491】
本明細書で使用される場合、本明細書で使用される「フラグメント」は、一部を指す。例えば、タンパク質のフラグメントは、全長タンパク質を消化することによって得られたポリペプチドを含み得る。いくつかの実施形態では、タンパク質のフラグメントは、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、２５０以上のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、抗体のフラグメントは、抗体の一部を含む。
【0492】
本明細書で使用される場合、「免疫細胞」という用語は、２つの主要な系統、骨髄前駆体（単球、マクロファージ、樹状細胞、巨核球、顆粒球などの骨髄細胞を生じさせる）及びリンパ系前駆体（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞などのリンパ系細胞を生じさせる）を生じさせる、骨髄中の造血幹細胞に由来する免疫系の任意の細胞を指す。例示的な免疫系細胞としては、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４－ＣＤ８－ダブルネガティブＴ細胞、Ｔγδ細胞、Ｔαβ細胞、制御性Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、及び樹状細胞が挙げられる。マクロファージ及び樹状細胞は、「抗原提示細胞」又は「ＡＰＣ」と呼ばれることがあり、これらは、ペプチドと複合体を形成したＡＰＣの表面にある主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）受容体がＴ細胞の表面のＴＣＲと相互作用する。
【0493】
本明細書で使用される場合、「インビトロ」という用語は、生物（例えば、動物、植物、又は微生物）内ではなく、人工環境、例えば、試験管又は反応容器、細胞培養、ペトリ皿などで発生する事象を指す。
【0494】
本明細書で使用される場合、「インビボ」という用語は、生物（例えば、動物、植物、若しくは微生物又はそれらの細胞若しくは組織）内で発生する事象を指す。
【0495】
本明細書で使用される場合、「リンカー」又は「標的化ドメイン」は、所望の抗原を認識して結合するキメラ血小板受容体の一部を指す。
【0496】
本明細書で使用される場合、「チェックポイント因子」は、その機能がプロセスの接合部で作用する任意の部分又は分子である。例えば、チェックポイントタンパク質、リガンド、又は受容体は、細胞周期を停止又は加速するように機能する可能性がある。
【0497】
本明細書で使用される場合、「メッセンジャーＲＮＡ」（ｍＲＮＡ）という用語は、目的のポリペプチドをコードし、翻訳されて、インビトロ、インビボ、インサイチュ又はエクスビボでコードされた目的のポリペプチドを産生することができる任意のポリヌクレオチドを指す。
【0498】
本明細書で使用される場合、「変異」という用語は、変化（change）及び／又は改変（alteration）を指す。いくつかの実施形態では、変異は、タンパク質（ペプチド及びポリペプチドを含む）及び／又は核酸（ポリ核酸を含む）への変化（change）及び／又は改変（alteration）であり得る。いくつかの実施形態では、変異は、タンパク質及び／又は核酸配列への変化（change）及び／又は改変（alteration）を含む。そのような変化（change）及び／又は改変（alteration）は、１つ以上のアミノ酸（タンパク質及び／又はペプチドの場合）及び／又はヌクレオチド（核酸及び／又は多核酸、例えばポリヌクレオチドの場合）の付加、置換及び／又は欠失を含み得る。変異がアミノ酸及び／又はヌクレオチドの付加及び／又は置換を含むいくつかの実施形態では、そのような付加及び／又は置換は、１つ以上のアミノ酸及び／又はヌクレオチド残基を含み得、かつ改変されたアミノ酸及び／又はヌクレオチドを含み得る。得られた構築物、分子、又は変異、変化（change）、又は改変（alteration）の配列は、本明細書では変異体と呼ばれ得る。
【0499】
本明細書で使用される場合、本明細書で使用される「新抗原」という用語は、腫瘍細胞に存在するが正常細胞には存在せず、胸腺におけるそれらの同族抗原特異的Ｔ細胞の欠失を誘発しない腫瘍抗原（すなわち、中枢性寛容）を指す。これらの腫瘍新抗原は、病原体と同様の「外来」シグナルを提供して、がん免疫療法に必要な効果的な免疫応答を誘導する可能性がある。新抗原は、特定の腫瘍に限定される場合がある。新抗原は、ミスセンス変異を有するペプチド／タンパク質（ミスセンス新抗原）、又は新規のオープンリーディングフレーム（ｎｅｏＯＲＦ）からの長く完全に新規のアミノ酸のストレッチを有する新しいペプチドである。一部の腫瘍では、フレーム外の挿入又は欠失（マイクロサテライト不安定性を引き起こすＤＮＡミスマッチ修復の欠陥による）、遺伝子融合、終止コドンのリードスルー変異、又は不適切にスプライシングされたＲＮＡの翻訳によって、いくつかの腫瘍に生成され得るＳａｅｔｅｒｄａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，２００１，９８：１３２５５－１３２６０を参照し、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【0500】
本明細書で使用される場合、本明細書で使用される「薬学的に許容される賦形剤」という用語は、薬学的組成物中に存在し、対象において実質的に非毒性及び非炎症性であるという特性を有する活性剤以外の任意の成分（例えば、本明細書に記載される）を指す。いくつかの実施形態では、薬学的に許容される賦形剤は、活性剤を懸濁及び／又は溶解することができるビヒクルである。賦形剤としては、例えば、付着防止剤、抗酸化剤、結合剤、コーティング、圧縮助剤、崩壊剤、染料（色素）、乳化剤、乳化剤、充填剤（希釈剤）、フィルム形成剤又はコーティング、フレーバー、香料、流動促進剤（流動促進剤）、潤滑剤、防腐剤、印刷インク、吸着剤、懸濁剤又は分散剤、甘味料、及び水和水が挙げられ得る。例示的な賦形剤としては、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム（二塩基性）、ステアリン酸カルシウム、クロスカルメロース、架橋ポリビニルピロリドン、クエン酸、クロスポビドン、システイン、エチルセルロース、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、マルチトール、マンニトール、メチオニン、メチルセルロース、メチルパラベン、微結晶セルロース、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポビドン、アルファ化デンプン、プロピルパラベン、パルミチン酸レチニル、シェラック、二酸化ケイ素、カルボキシメチルセルロースナトリウム、クエン酸ナトリウム、ナトリウムデンプングリコレート、ソルビトール、デンプン（トウモロコシ）、ステアリン酸、スクロース、タルク、二酸化チタン、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビタミンＣ、及びキシリトールが挙げられるが、これらに限定されない。
【0501】
本明細書に記載の化合物の薬学的に許容される塩は、酸又は塩基部分がその塩形態である（例えば、遊離塩基基を適切な有機酸と反応させることによって生成される）開示された化合物の形態である。薬学的に許容される塩の例としては、アミンなどの塩基性残基の鉱酸塩又は有機酸塩、カルボン酸などの酸性残基のアルカリ塩又は有機塩などが挙げられるが、これらに限定されない。代表的な酸付加塩としては、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、樟脳酸塩、樟脳スルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコネート、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミスルホン酸塩、ヘプトン酸塩、ヘキサン酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化水素酸塩、２－ヒドロキシエタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウレート、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２－ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３－フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクレート、ピバレート、プロピオン酸塩、ステアレート、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアネート、トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩などが挙げられる。代表的なアルカリ又はアルカリ土類金属塩としては、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなど、並びにアンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチルアミンなどが挙げられるが、これらに限定されない、無毒のアンモニウム、四級アンモニウム、及びアミンカチオンが挙げられる。薬学的に許容される塩としては、例えば、非毒性の無機又は有機酸からの従来の非毒性の塩が挙げられる。いくつかの実施形態では、薬学的に許容される塩は、従来の化学的方法によって、塩基性又は酸性部分を含む親化合物から調製される。一般に、そのような塩は、これらの化合物の遊離酸又は塩基形態を、水中又は有機溶媒中、あるいは２つの混合物、一般に、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノール、又はアセトニトリルなどの非水性媒体中の化学量論量の適切な塩基又は酸と反応させることによって調製することができる。好適な塩のリストは、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ‘ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８５，ｐ．１４１８、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｕｓｅ，Ｐ．Ｈ．Ｓｔａｈｌ ａｎｄ Ｃ．Ｇ．Ｗｅｒｍｕｔｈ（ｅｄｓ．），Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ，２００８、及びＢｅｒｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，６６，１－１９（１９７７）（これらの各々は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に見出される。
【0502】
本明細書で使用される場合、「対象」又は「患者」という用語は、例えば、実験、診断、予防、及び／又は治療の目的で、本発明による組成物が投与され得る任意の生物を指す。典型的な対象としては、動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類、及びヒトなどの哺乳動物）及び／又は植物が挙げられる。
【0503】
本明細書で使用される場合、「Ｔ細胞」という用語は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を産生する免疫細胞を指す。
【0504】
本明細書で使用される場合、「Ｔ細胞受容体」（ＴＣＲ）という用語は、可変抗原結合ドメイン、定常ドメイン、膜貫通領域、及びＭＨＣ受容体に結合した抗原ペプチドに特異的に結合することができる短い細胞質尾部を有する免疫グロブリンスーパーファミリーメンバーを指す。ＴＣＲは細胞の表面又は可溶型で見られ、一般にα鎖及びβ鎖（それぞれ、ＴＣＲα及びＴＣＲβとしても知られている）、又はγ鎖及びδ鎖（それぞれ、ＴＣＲγ及びＴＣＲδとしても知られている）を持つヘテロ二量体で構成されている。ＴＣＲ鎖の細胞外部分（例えば、α鎖、β鎖）は、２つの免疫グロブリンドメイン、Ｎ末端に可変ドメイン（例えば、α鎖可変ドメイン又はＶα、β鎖可変ドメイン又はＶβ）を含み、細胞膜に隣接する１つの定常ドメイン（例えば、α鎖定常ドメイン又はＣα及びβ鎖定常ドメイン又はＣβ）を含有する。免疫グロブリンと同様に、可変ドメインは、フレームワーク領域（framework region、ＦＲ）によって分離された相補性決定領域（complementary determining region、ＣＤＲ）を含有する。
【0505】
本明細書で使用される場合、「治療有効量」という用語は、感染症、疾患、障害、及び／又は状態の発症を治療、改善、診断、予防、及び／又は遅延させるために、感染症、疾患、障害、及び／若しくは状態に罹患しているか、又はそれらに感染しやすい対象に投与された場合に十分である送達される薬剤（例えば、核酸、薬剤、治療剤、診断剤、予防剤など）の量を意味する。いくつかの実施形態では、治療有効量は、単回投与で提供される。いくつかの実施形態では、治療有効量は、複数の用量を含む投薬レジメンで投与される。当業者は、いくつかの実施形態では、単位剤形が、そのような投薬レジメンの一部として投与されたときに有効な量を含む場合、治療有効量の特定の薬剤又は実体を含むとみなされ得ることを理解する。
【0506】
本明細書で使用される場合、「治療（treatment）」又は「治療（treating）」という用語は、有益又は所望の結果を得るためのアプローチを示し、好ましくは、有益又は所望の臨床結果を含む。そのような有益な又は望ましい臨床結果としては、以下の：がん性細胞若しくは他の疾患の増殖を減少させる（又は破壊する）こと、がんに見られるがん性細胞の転移を減少させること、腫瘍のサイズを縮小すること、病気に起因する症状を減少させること、病気に苦しむ人々の生活の質の向上させること、病気の治療に必要な他の薬の投与量を減少させること、病気の進行を遅延させること、及び／又は個人の生存を延長させること、のうちの１つ以上が挙げられる、これらに限定されない。
【0507】
本明細書で使用される場合、「治療剤」という用語は、生物学的、薬学的、又は化学的化合物を指す。非限定的な例としては、単純又は複雑な有機又は無機分子、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、抗体、抗体誘導体、抗体フラグメント、受容体、及び可溶性因子が挙げられる。
【0508】
等価物及び範囲
当業者は、本明細書に記載の本発明による特定の実施形態に対する多くの等価物を認識するか、又は日常的な実験以上のことを用いずに確認することができる。本発明の範囲は、上記の説明に限定されることを意図するものではなく、むしろ、添付の特許請求の範囲に記載されるとおりである。
当業者は、本明細書に記載の本発明による特定の実施形態に対する多くの等価物を認識するか、又は日常的な実験以上のことを用いずに確認することができる。本発明の範囲は、上記の説明に限定されることを意図するものではなく、むしろ、添付の特許請求の範囲に記載されるとおりである。
【0509】
請求項において、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」などの冠詞は、反対に示されない限り、又は文脈から明らかでない限り、１つ又は複数を意味し得る。グループの１つ以上のメンバー間に「又は」を含む請求項又は説明は、反対に示されない限り、又は文脈から明らかでない限り、グループメンバーの１つ、複数、又は全てが、指定されていない限り、所与の製品又はプロセスに存在するか、採用されているか、又は関連している場合に満たされているとみなされる。本発明は、グループの正確に１つのメンバーが、所与の製品又はプロセスに存在するか、使用されるか、又はそうでなければ関連する実施形態を含む。本発明は、所与の製品又はプロセスに複数の、又はグループ全体のメンバーが存在する、使用される、又は他の方法で関連する実施形態を含む。
【0510】
また、「含む」という用語は、オープンで許可することを意図しているが、追加の要素又は工程を含める必要はないことにも注意されたい。本明細書において「含む」という用語が使用される場合、「からなる」という用語もまた、包含され、開示される。
【0511】
範囲が指定されている場合、エンドポイントが含まれる。更に、特に示されない限り、又は文脈及び当業者の理解から明らかでない限り、範囲として表される値は、文脈から明らかに指示されない限り、本発明の異なる実施形態において、範囲の下限の単位の１０分の１に、述べられた範囲内の任意の特定の値又は下位範囲を想定できることが理解される。
【0512】
加えて、先行技術に該当する本発明の任意の特定の実施形態は、特許請求の範囲のうちの１つ以上から明示的に除外され得ることが理解されるべきである。そのような実施形態は当業者に知られているとみなされるので、除外が本明細書に明示的に記載されていなくても、それらは除外され得る。本発明の組成物の任意の特定の実施形態（例えば、任意の抗生物質、治療剤又は活性成分；任意の製造方法；任意の使用方法など）は、先行技術の存在に関連するか否かにかかわらず、何らかの理由で、いずれか１つ以上の特許請求の範囲から除外され得る。
【0513】
使用されている単語は限定ではなく説明の単語であり、本発明のより広い態様における真の範囲及び精神から逸脱することなく、添付の特許請求の範囲内で変更を加えることができることを理解されたい。
【0514】
本明細書に記載されているのは、本明細書に記載の操作された血小板の設計、製造、投与、及び／又は製剤のための組成物及び方法である。いくつかの実施形態では、操作された血小板は、野生型血小板を活性化しない標的による活性化時に送達するために小胞にカーゴを運ぶことができる。いくつかの実施形態では、次いで、本発明の操作された血小板は、標的による活性化時に送達するために小胞にカーゴを運ぶが、標的は野生型血小板を活性化しない。例えば、ＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲが結合する標的は、典型的には野生型血小板を活性化する標的ではないが、標的結合ＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲとの相互作用を介して操作された血小板を活性化する標的である。
【0515】
本発明を以下の非限定的実施例によって更に例示する。本明細書に記載されているものと類似又は同等の任意の材料及び方法を、本発明の実施又は試験に使用することができるが、次に、好ましい材料及び方法を説明する。本発明の他の特徴、目的及び利点は、説明から明らかになるであろう。説明では、文脈が明確に別のことを指示しない限り、単数形には複数形も含まれる。別段定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾が生じた場合には、本発明の記載は、制御するであろう。
【図面の簡単な説明】
【0516】
【図1-1】ゲノム編集最適化／ガイドＩＤ。Ａ）ＣＲＩＳＰＲガイドの選択及びスクリーニング手順の概略図。
【図1-2】ゲノム編集最適化／ガイドＩＤ。Ｂ）ｉＰＳＣのプール内でのガイドＫＯ生成効率（Ｓｙｎｔｈｅｇｏ ＩＣＥアルゴリズムによって予測される）。
【図1-3】ゲノム編集最適化／ガイドＩＤ。Ｃ）最高効率のガイドヌクレオフェクションの要約及び繰り返し。結果当たりのＮ＝２、エラーバーは標準偏差を示す。
【図2-1】順次編集プロセス－＞７ｘＫＯ。Ａ）順次ノックアウトアプローチの概略図。
【図2-2】順次編集プロセス－＞７ｘＫＯ。Ｂ）順次ＫＯアプローチ中の生細胞数の定量化。ＰＩ染色の除外に基づいて同定された生細胞。Ｃ）順次ＫＯアプローチ全体でのプールされたノックアウト効率。各Ｃａｓ９ ＲＮＰヌクレオフェクションイベントで、細胞の半分がゲノムＤＮＡ抽出のために採取され、以前の全ての標的部位のアンプリコンが増幅され、Ｓｙｎｔｈｅｇｏ ＩＣＥを使用してＫＯレベルがスクリーニングされた。
【図3】７ｘＫＯクローン同定。Ａ）７ｘＫＯプールの単一細胞ソートから産生されたクローン内の遺伝子ＫＯのＳｙｎｔｈｅｇｏ ＩＣＥの結果を示す表。Ｂ）（Ａ）で結果が得られなかった、更に拡張されたクローンから生成されたアンプリコンでのＳｙｎｔｈｅｇｏ ＩＣＥ分析の繰り返し。
【図4-1】細胞の７ｘＫＯプールは、巨核球様表現型に向けてプログラムを転送する。Ａ）ドキシサイクリンを使用したフォワードプログラミング誘導の１０日後の７ｘＫＯプールのＭＫ分化マーカーパネル及び生存率分析に基づくフローサイトメトリー。編集されていないプール及び７ｘＫＯプールの両方で実行される。
【図4-2】細胞の７ｘＫＯプールは、巨核球様表現型に向けてプログラムを転送する。Ａ）ドキシサイクリンを使用したフォワードプログラミング誘導の１０日後の７ｘＫＯプールのＭＫ分化マーカーパネル及び生存率分析に基づくフローサイトメトリー。編集されていないプール及び７ｘＫＯプールの両方で実行される。
【図4-3】細胞の７ｘＫＯプールは、巨核球様表現型に向けてプログラムを転送する。Ａ）ドキシサイクリンを使用したフォワードプログラミング誘導の１０日後の７ｘＫＯプールのＭＫ分化マーカーパネル及び生存率分析に基づくフローサイトメトリー。編集されていないプール及び７ｘＫＯプールの両方で実行される。
【図4-4】細胞の７ｘＫＯプールは、巨核球様表現型に向けてプログラムを転送する。Ａ）ドキシサイクリンを使用したフォワードプログラミング誘導の１０日後の７ｘＫＯプールのＭＫ分化マーカーパネル及び生存率分析に基づくフローサイトメトリー。編集されていないプール及び７ｘＫＯプールの両方で実行される。
【図4-5】細胞の７ｘＫＯプールは、巨核球様表現型に向けてプログラムを転送する。Ｂ）（Ａ）と同様だが、フォワードプログラミングの導入から１３日後。
【図4-6】細胞の７ｘＫＯプールは、巨核球様表現型に向けてプログラムを転送する。Ｂ）（Ａ）と同様だが、フォワードプログラミングの導入から１３日後。
【図4-7】細胞の７ｘＫＯプールは、巨核球様表現型に向けてプログラムを転送する。Ｂ）（Ａ）と同様だが、フォワードプログラミングの導入から１３日後。
【図4-8】細胞の７ｘＫＯプールは、巨核球様表現型に向けてプログラムを転送する。Ｂ）（Ａ）と同様だが、フォワードプログラミングの導入から１３日後。
【図5-1】細胞の７ｘＫＯプールは、標準的なアゴニストによって活性化されない。Ａ）固定後のドキシサイクリン添加後１３日目にＰ－セレクチンについて染色された、編集されていないＭＫ及び７ｘＫＯプールの顕微鏡画像。Ｂ）（Ａ）と同様だが、ＴＲＡＰ６（１０ｕＭ）及びＣＲＰ（１０ｕｇ／ｍｌ）を３０分間添加した後、固定する。Ｃ）３００ｎｇ／ｍＬのＰＭＡで刺激されたＭＫにおけるＰ－セレクチン曝露のフローサイトメトリーアッセイ。ビヒクル対照又はＰＭＡを生きたＭＫに加え、示されているヒストグラムは、アゴニスト／ビヒクル添加の７～１０分後のＰ－セレクチン染色のものである。このアッセイは、７ｘＫＯクローン（プールではない）で実行され、ドキシサイクリン添加後１５日目に実行された。
【図5-2】細胞の７ｘＫＯプールは、標準的なアゴニストによって活性化されない。Ａ）固定後のドキシサイクリン添加後１３日目にＰ－セレクチンについて染色された、編集されていないＭＫ及び７ｘＫＯプールの顕微鏡画像。Ｂ）（Ａ）と同様だが、ＴＲＡＰ６（１０ｕＭ）及びＣＲＰ（１０ｕｇ／ｍｌ）を３０分間添加した後、固定する。Ｃ）３００ｎｇ／ｍＬのＰＭＡで刺激されたＭＫにおけるＰ－セレクチン曝露のフローサイトメトリーアッセイ。ビヒクル対照又はＰＭＡを生きたＭＫに加え、示されているヒストグラムは、アゴニスト／ビヒクル添加の７～１０分後のＰ－セレクチン染色のものである。このアッセイは、７ｘＫＯクローン（プールではない）で実行され、ドキシサイクリン添加後１５日目に実行された。
【図6】受容体の設計及びレンチウイルスの形質導入。Ａ）ＣＰＲ受容体設計ＩＤ。Ｂ）レンチウイルスにパッケージされたＣＰＲ発現ベクターの概略図。Ａに列挙されているＣＰＲ及びＴ２Ａ配列を使用して、マルチシストロン性転写産物として発現したｍＣｈｅｒｒｙ。発現はＥＦ１ａプロモーターによって駆動される。Ｃ）形質導入の２日後の（Ａ）でＣＰＲ配列を発現するレンチウイルスで形質導入されたｉＰＳＣの顕微鏡画像
【図7】ｉＰＳＣ細胞表面での受容体発現。Ａ）ＣＰＲ受容体設計ＩＤ。Ｂ）ＣＰＲ発現のＣＤ１９－ＦＩＴＣベースの染色によってアッセイされたｍＣｈｅｒｒｙ発現及びＣＰＲ表面局在。レンチウイルスによる形質導入の１０日後。
【図8-1】受容体を発現する細胞ＦｏＰ及び発現保持。Ａ）ドキシサイクリンを使用したフォワードプログラミング誘導の１０日及び１６日後のＣＰＲ３発現細胞のＭＫ分化マーカーパネル及び生存率分析に基づくフローサイトメトリー。
【図8-2】受容体を発現する細胞ＦｏＰ及び発現保持。Ａ）ドキシサイクリンを使用したフォワードプログラミング誘導の１０日及び１６日後のＣＰＲ３発現細胞のＭＫ分化マーカーパネル及び生存率分析に基づくフローサイトメトリー。
【図8-3】受容体を発現する細胞ＦｏＰ及び発現保持。Ａ）ドキシサイクリンを使用したフォワードプログラミング誘導の１０日及び１６日後のＣＰＲ３発現細胞のＭＫ分化マーカーパネル及び生存率分析に基づくフローサイトメトリー。
【図8-4】受容体を発現する細胞ＦｏＰ及び発現保持。Ａ）ドキシサイクリンを使用したフォワードプログラミング誘導の１０日及び１６日後のＣＰＲ３発現細胞のＭＫ分化マーカーパネル及び生存率分析に基づくフローサイトメトリー。
【図8-5】受容体を発現する細胞ＦｏＰ及び発現保持。Ｂ）ドキシサイクリン添加の１０日後のＣＰＲ３発現ＭＫ及び未染色ＭＫのＦＭＣ６３－ＦＩＴＣ染色を使用して定量化されたＣＰＲ３表面発現。
【図9-1】受容体発現ＭＫは、ＣＤ１９＋ｖｅ細胞に応答して活性化／脱顆粒する。Ａ）ＢＪＡＢ（ＣＤ１９＋ｖｅ Ｂ細胞）又はＪｕｒｋａｔｓ（ＣＤ１９陰性Ｔ細胞）のいずれかとの３０分間のインキュベーション後の、ＣＰＲ３又は非形質導入対照を発現する固定ＭＫでのＰ－セレクチン染色の顕微鏡画像。
【図9-2】受容体発現ＭＫは、ＣＤ１９＋ｖｅ細胞に応答して活性化／脱顆粒する。Ｂ）（Ａ）で画像化された試料のＰ－セレクチン染色のフローサイトメトリーによる定量化。Ｃ）示された比較におけるＰ－セレクチン染色のＭＦＩ倍率変化。ＭＦＩはバックグラウンド減算後に計算され、ＣＤ４２陽性ＭＫ細胞集団内で実行された。
【図10】本発明の血小板の血栓形成能の低下を示す概略図。
【図11】ＭＡＬＩＫ，Ｎ，ＪＥＮＫＩＮＳ ＡＭ，ＭＥＬＬＯＭ Ｊ，ＢＡＩＬＥＹ Ｇ．Ｒｅｇｅｎ．Ｍｅｄ．（２０１９）１４（１１），９８３－９８９から引用
【図12-1】Ｙｅ，Ｑ ｅｔ ａｌ（２０２０）Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，ＤＯＩ：１０．１１１１／ｃｐｒ．１２９４６から引用。免疫応答を抑制するためのｈＰＳＣの戦略的遺伝子編集。（Ａ）ＨＬＡクラスＩ及びクラスＩ分子の概略的構造。
【図12-2】Ｙｅ，Ｑ ｅｔ ａｌ（２０２０）Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，ＤＯＩ：１０．１１１１／ｃｐｒ．１２９４６から引用。免疫応答を抑制するためのｈＰＳＣの戦略的遺伝子編集。（Ｂ）免疫応答を抑制するためのｈＰＳＣの戦略的遺伝子編集。
【図13】ＣＤ４０Ｌ＋血小板又は可溶性ＣＤ４０Ｌによって活性化されたＣＤ４０＋Ｔ細胞と免疫細胞及び非免疫細胞との相互作用から生じる多面的効果。Ｔｈｅ ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｂｏｗｅｌ ｄｉｓｅａｓｅ Ｄａｎｅｓｅ ｅｔ ａｌ ２００４ Ｇｕｔ ５３：１０３５－１０４３から引用
【図14】細胞傷害性リンパ球によるＮＫＧ２Ｄ媒介腫瘍免疫認識からのＴＧＦ－β媒介回避。細胞傷害性リンパ球上のＮＫＧ２Ｄ下方制御は、ＮＫＧ２ＤＬを発現する悪性細胞の免疫監視及びその後の腫瘍排除を損なう。腫瘍細胞は、ＮＫ細胞及び細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）に局所的かつ全身的に作用する可溶性ＴＧＦ－β及びＴＧＦ－β含有エキソソームの両方を放出し、それによって、ＮＫＧ２Ｄの下方制御を誘導する。加えて、腫瘍由来エキソソームは、ＮＫＧ２Ｄ表面発現を下方制御する能力を有するＮＫＧ２ＤＬ及びｍｉＲＮＡを含有し得る。ＴＧＦ－βはまた、自己分泌又は傍分泌様式で腫瘍細胞に作用し、それによってＮＫＧ２ＤＬ発現を低減し、更にＮＫＧ２Ｄ－ＮＫＧ２ＤＬ軸によるがん免疫監視を破壊する。ＴＧＦ－βの他の主要な供給源は、血小板並びに調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）及び骨髄由来サプレッサー細胞である。ＴＧＦ－βによるＮＫＧ２Ｄ媒介腫瘍免疫の障害、Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２０１９ ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．３３８９／ｆｉｍｍｕ．２０１９．０２６８９
【図15】血小板とがん：ＴＧＦｂとの間の密接なクロストーク。（Ａ）がん細胞におけるＥＭＴ誘導は、血小板媒介転移形成に関与する重要な機構であり、典型的な上皮マーカーのレベルの低下及び血栓形成促進性を有する多くの間葉系マーカーの発現の増加を特徴とする。これは、がん細胞による血小板の活性化及び血小板受容体ＴＰに結合するＴＸＡ２の放出をもたらし、血小板応答の増幅を可能にする。ＰＧＥ２、ＰＤＧＦ、及びＴＧＦ－βは、ＥＭＴの誘導を媒介し、したがって腫瘍浸潤及び転移形成をもたらす血小板由来メディエーターである。（Ｂ）血小板は、ＭＨＣ－Ｉを含む、がん細胞への血小板タンパク質の移動を特徴とする、いわゆる「血小板擬態」現象により、免疫監視からの保護をがん細胞に提供することによって転移を促進する。結果として生じる「虚偽表示の表現型」は、腫瘍細胞自己喪失の認識を破壊し、それによって、ＮＫ細胞による細胞傷害性及びＩＦＮ－γ産生を損なう。また、ＧＡＲＰは潜在型ＴＧＦ－βを活性化し、調節性Ｔ細胞によって媒介されるがん細胞に対する免疫応答の抑制を促進する。ＴＧＦ－βの血小板放出は、インターフェロン－γ産生及びＮＫ細胞の細胞傷害性を損なう。
【図16】３ｘＫＯプール頻度の決定。 実施例５に記載されるように、ＩＣＥ解析ソフトウェア（Ｓｙｎｔｈｅｇｏ）を使用して頻度を決定した。
【図17-1】３ｘＫＯプールフォワードプログラミング効率 Ａ）ドキシサイクリンを使用したフォワードプログラミング誘導の１０日後の３ｘＫＯプールのＭＫ分化マーカーパネル及び生存率分析に基づくフローサイトメトリー。編集されていないプール及び７ｘＫＯプールの両方で実行される。フォワードプログラミング及びマーカーに関する更なる方法の詳細は、実施例６に見出すことができる。（Ａ）３ｘＫＯ ＩＴＧＡ２Ｂ／ＨＰＳ１／ＰＡＲ１プール、（Ｂ）３ｘＫＯ ＩＴＧＡ２Ｂ／ＨＰＳ１／Ｐ２Ｙ１２プール及び（Ｃ）編集されていない野生型に対して実行される。
【図17-2】３ｘＫＯプールフォワードプログラミング効率 Ａ）ドキシサイクリンを使用したフォワードプログラミング誘導の１０日後の３ｘＫＯプールのＭＫ分化マーカーパネル及び生存率分析に基づくフローサイトメトリー。編集されていないプール及び７ｘＫＯプールの両方で実行される。フォワードプログラミング及びマーカーに関する更なる方法の詳細は、実施例６に見出すことができる。（Ａ）３ｘＫＯ ＩＴＧＡ２Ｂ／ＨＰＳ１／ＰＡＲ１プール、（Ｂ）３ｘＫＯ ＩＴＧＡ２Ｂ／ＨＰＳ１／Ｐ２Ｙ１２プール及び（Ｃ）編集されていない野生型に対して実行される。
【図17-3】３ｘＫＯプールフォワードプログラミング効率 Ａ）ドキシサイクリンを使用したフォワードプログラミング誘導の１０日後の３ｘＫＯプールのＭＫ分化マーカーパネル及び生存率分析に基づくフローサイトメトリー。編集されていないプール及び７ｘＫＯプールの両方で実行される。フォワードプログラミング及びマーカーに関する更なる方法の詳細は、実施例６に見出すことができる。（Ａ）３ｘＫＯ ＩＴＧＡ２Ｂ／ＨＰＳ１／ＰＡＲ１プール、（Ｂ）３ｘＫＯ ＩＴＧＡ２Ｂ／ＨＰＳ１／Ｐ２Ｙ１２プール及び（Ｃ）編集されていない野生型に対して実行される。
【図17-4】３ｘＫＯプールフォワードプログラミング効率 Ａ）ドキシサイクリンを使用したフォワードプログラミング誘導の１０日後の３ｘＫＯプールのＭＫ分化マーカーパネル及び生存率分析に基づくフローサイトメトリー。編集されていないプール及び７ｘＫＯプールの両方で実行される。フォワードプログラミング及びマーカーに関する更なる方法の詳細は、実施例６に見出すことができる。（Ａ）３ｘＫＯ ＩＴＧＡ２Ｂ／ＨＰＳ１／ＰＡＲ１プール、（Ｂ）３ｘＫＯ ＩＴＧＡ２Ｂ／ＨＰＳ１／Ｐ２Ｙ１２プール及び（Ｃ）編集されていない野生型に対して実行される。
【図17-5】３ｘＫＯプールフォワードプログラミング効率 Ａ）ドキシサイクリンを使用したフォワードプログラミング誘導の１０日後の３ｘＫＯプールのＭＫ分化マーカーパネル及び生存率分析に基づくフローサイトメトリー。編集されていないプール及び７ｘＫＯプールの両方で実行される。フォワードプログラミング及びマーカーに関する更なる方法の詳細は、実施例６に見出すことができる。（Ａ）３ｘＫＯ ＩＴＧＡ２Ｂ／ＨＰＳ１／ＰＡＲ１プール、（Ｂ）３ｘＫＯ ＩＴＧＡ２Ｂ／ＨＰＳ１／Ｐ２Ｙ１２プール及び（Ｃ）編集されていない野生型に対して実行される。
【図17-6】３ｘＫＯプールフォワードプログラミング効率 Ａ）ドキシサイクリンを使用したフォワードプログラミング誘導の１０日後の３ｘＫＯプールのＭＫ分化マーカーパネル及び生存率分析に基づくフローサイトメトリー。編集されていないプール及び７ｘＫＯプールの両方で実行される。フォワードプログラミング及びマーカーに関する更なる方法の詳細は、実施例６に見出すことができる。（Ａ）３ｘＫＯ ＩＴＧＡ２Ｂ／ＨＰＳ１／ＰＡＲ１プール、（Ｂ）３ｘＫＯ ＩＴＧＡ２Ｂ／ＨＰＳ１／Ｐ２Ｙ１２プール及び（Ｃ）編集されていない野生型に対して実行される。
【図18】Ｂ２Ｍガイドスクリーニング 実施例５に記載されるように、ＩＣＥ解析ソフトウェア（Ｓｙｎｔｈｅｇｏ）を使用して頻度を決定した。
【図19】ＧＡＲＰ／ＬＲＣＣ３２ノックアウトガイドスクリーニング 実施例５に記載されるように、ＩＣＥ解析ソフトウェア（Ｓｙｎｔｈｅｇｏ）を使用して頻度を決定した。
【図20-1】ＰＢＭＫに由来するＰＬＰの表面上のＣＡＲ発現。抗ＦＭＣ６３抗体で標的化された抗ＣＤ１９ Ｓｔｅｍｓｐａｎ ＳＦＥＭ２（Ｓｔｅｍｓｐａｎ １００ｘＭＫ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号０２６９６）中のサイトカインのカクテルを使用して、成体の末梢血由来ＨＳＣを巨核球に分化させた。分化誘導後７日目に、細胞にレンチウイルス１粒子を形質導入した（図６Ａ、図Ｂ）。１０日目に、抗ＣＡＲ抗体を使用して、ＣＡＲの表面発現をアッセイした。加えて、ＰＬＰは、これらの現在分化した培養ＰＢＭＫから生成され、可溶性ｍＣｈｅｒｒｙ及び表面ＣＡＲ発現の両方を含有することが示された。ＲＰＭＩ高グルコース中で６時間培養することにより、ＭＫからＰＬＰを生成した。
【図20-2】ＰＢＭＫに由来するＰＬＰの表面上のＣＡＲ発現。抗ＦＭＣ６３抗体で標的化された抗ＣＤ１９ Ｓｔｅｍｓｐａｎ ＳＦＥＭ２（Ｓｔｅｍｓｐａｎ １００ｘＭＫ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号０２６９６）中のサイトカインのカクテルを使用して、成体の末梢血由来ＨＳＣを巨核球に分化させた。分化誘導後７日目に、細胞にレンチウイルス１粒子を形質導入した（図６Ａ、図Ｂ）。１０日目に、抗ＣＡＲ抗体を使用して、ＣＡＲの表面発現をアッセイした。加えて、ＰＬＰは、これらの現在分化した培養ＰＢＭＫから生成され、可溶性ｍＣｈｅｒｒｙ及び表面ＣＡＲ発現の両方を含有することが示された。ＲＰＭＩ高グルコース中で６時間培養することにより、ＭＫからＰＬＰを生成した。
【図21】レンチウイルスで形質導入されたｉＰＳＣ－ＭＫに由来するＰＬＰの表面上のＣＡＲ発現 図２２、図２４及び図２５についてのｉＰＳＣフォワードプログラミング及びレンチウイルス添加プロトコル（１０日目）の概略図。
【図22】ｉＰＳＣ－ＭＫに由来するＰＬＰの表面上のＣＡＲ発現 巨核球系統へのフォワードプログラミングを受けているｉＰＳＣのレンチウイルス形質導入後、１５日目に、ＣＡＲ結合抗体を使用して表面レベルＣＡＲの発現について細胞をアッセイした。ｉＰＳＣ－ＭＫは、形質導入のために１０日目に使用されたウイルスの量（ＭＯＩによって測定される）に用量応答的に表面レベルのＣＡＲを発現した。これらのｉＰＳＣ－ＭＫに由来するＰＬＰは、同様のＭＯＩ依存性用量応答性を示した。
【図23-1】ＭＫ及びＰＬＰにおけるＲＮＡローディング。（Ａ）ＲＮＡローディング戦略の概略設計。ＢＡＳＰ１は管腔エキソソームタンパク質であり、したがって、ヘアピン結合タンパク質であるＬ７Ａｅへのその融合は、ＰＬＰエキソソームへのＲＮＡのローディングを可能にするはずである。（Ｂ）ＦｏＰ ｉＰＳＣ巨核球を、最小ＢＡＳＰ１－ｍＳｃａｒｌｅｔ－Ｌ７Ａｅ融合タンパク質を発現するプラスミドでヌクレオフェクトし、３日後（分化後Ｄ１６）にフィブリノーゲン上に播種し、固定（２％ホルムアルデヒド）後、Ｚｅｉｓｓ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ ７上で、０．５×チューブレンズを用いて５０×対物レンズで造影した。造影の前に、細胞を透過処理し（ＰＢＳ＋０．３％ ＴＷＥＥＮ２０）、その後にマウス抗ＣＤ６２Ｐ（ＡｂＣａｍ ａｂ２５５８２２）＋ヤギ抗マウスＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ Ｐｌｕｓ ６４７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色した。
【図23-2】ＭＫ及びＰＬＰにおけるＲＮＡローディング。（Ａ）ＲＮＡローディング戦略の概略設計。ＢＡＳＰ１は管腔エキソソームタンパク質であり、したがって、ヘアピン結合タンパク質であるＬ７Ａｅへのその融合は、ＰＬＰエキソソームへのＲＮＡのローディングを可能にするはずである。（Ｂ）ＦｏＰ ｉＰＳＣ巨核球を、最小ＢＡＳＰ１－ｍＳｃａｒｌｅｔ－Ｌ７Ａｅ融合タンパク質を発現するプラスミドでヌクレオフェクトし、３日後（分化後Ｄ１６）にフィブリノーゲン上に播種し、固定（２％ホルムアルデヒド）後、Ｚｅｉｓｓ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ ７上で、０．５×チューブレンズを用いて５０×対物レンズで造影した。造影の前に、細胞を透過処理し（ＰＢＳ＋０．３％ ＴＷＥＥＮ２０）、その後にマウス抗ＣＤ６２Ｐ（ＡｂＣａｍ ａｂ２５５８２２）＋ヤギ抗マウスＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ Ｐｌｕｓ ６４７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色した。
【図24】ＣＤ３４／４１ ＫＯ ｉＰＳＣ由来ＭＫは、ロバストなＣＡＲ発現を示す 巨核球系列へのフォワードプログラミングを受けている１０日目のＣＤ３４及びＣＤ４１ ＫＯ ｉＰＳＣのレンチウイルス形質導入後、１３日目に、ＣＡＲ結合抗体を使用して表面レベルＣＡＲの発現について細胞をアッセイした。
【実施例】
【0517】
実施例１．実験室での血小板産生の樹立
ｉＰＳＣ－ｉＭＫＣＬは、ｔｈｅ Ｋｏｊｉ Ｅｔｏ Ｌａｂ ａｔ Ｍｅｇａｋａｒｙｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｋｙｏｔｏ ｏｆｆｉｃｅ／Ｋｙｏｔｏ Ｌａｂ：Ｋｙｏｔｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ，９３，Ａｗａｔａｃｈｏ，Ｃｈｕｄｏｊｉ，Ｓｈｉｍｏｇｙｏ－ｋｕ，Ｋｙｏｔｏ，６００－８８１５，ＪＡＰＡＮ ａｎｄ ｔｈｅ Ｔｏｋｙｏ ｏｆｆｉｃｅ：３３７ Ｂｌｄｇ＃１，Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｏｋｙｏ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ４－６－１，Ｓｈｉｒｏｋａｎｅｄａｉ，Ｍｉｎａｔｏ－ｋｕ，Ｔｏｋｙｏ，１０８－８６３９，ＪＡＰＡＮ，ｉｎ ａｄｄｉｔｉｏｎ ｔｏ ａ ＶＥＲＭＥＳ（商標）ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ（Ｓａｔａｋｅ Ｍｕｌｔｉｍｉｘ）から得られ、迅速で高品質の血小板産生を可能にする。
ｉＰＳＣ－ｉＭＫＣＬは、ｔｈｅ Ｋｏｊｉ Ｅｔｏ Ｌａｂ ａｔ Ｍｅｇａｋａｒｙｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｋｙｏｔｏ ｏｆｆｉｃｅ／Ｋｙｏｔｏ Ｌａｂ：Ｋｙｏｔｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ，９３，Ａｗａｔａｃｈｏ，Ｃｈｕｄｏｊｉ，Ｓｈｉｍｏｇｙｏ－ｋｕ，Ｋｙｏｔｏ，６００－８８１５，ＪＡＰＡＮ ａｎｄ ｔｈｅ Ｔｏｋｙｏ ｏｆｆｉｃｅ：３３７ Ｂｌｄｇ＃１，Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｏｋｙｏ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ４－６－１，Ｓｈｉｒｏｋａｎｅｄａｉ，Ｍｉｎａｔｏ－ｋｕ，Ｔｏｋｙｏ，１０８－８６３９，ＪＡＰＡＮ，ｉｎ ａｄｄｉｔｉｏｎ ｔｏ ａ ＶＥＲＭＥＳ（商標）ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ（Ｓａｔａｋｅ Ｍｕｌｔｉｍｉｘ）から得られ、迅速で高品質の血小板産生を可能にする。
【0518】
代替的に、主要なオピニオンリーダー（key opinion leader、ＫＯＬ）との協議の後に選択された、選択された巨核球系統が取得され、培養される。バックアップ細胞株を樹立し、－８０℃で保存する。血小板の生産は、ＶＥＲＭＥＳ（商標）バイオリアクター、又は参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＩｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１７４（３）：６３６－６４８．ｅ１８，２０１８で特定された６つの要因を備えた振とうフラスコで行うことができる。この方法は、３日間で約２．４×１０６血小板／ｍｌを生成すると仮定されている。本明細書に記載の技術を組み合わせたハイブリッドアプローチも使用することができる。例えば、Ｍｅｇ０１細胞（Ｓｉｇｍａ ＡｌｄｒｉｃｈからのＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－２０２１（商標））は、乱流のあるバイオリアクターで６つの因子と組み合わせて、臨床的な翻訳を減らすことができる。
【0519】
血小板が活性であることを確認するために、ＣＤ６２（特に活性化時に血小板に表示される）のインビトロアッセイを実行することができる。例えば、血小板ＣＤ６２は、活性化の前にフローサイトメトリーを使用して測定される。アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、トロンビン、又はコラーゲンを追加して血小板を活性化し、次いでＣＤ６２の表面曝露の割合を測定する。
【0520】
実施例２．非血栓形成性血小板の生成
前駆体細胞株が樹立されると、血小板産生の前に編集することができる。血小板の血栓形成に影響を与える遺伝子などの遺伝子がノックアウトされる可能性がある。Ｃａｓ９は、編集プロセスを支援するためにレトロウイルスを使用して巨核球に導入される場合がある。次いで、ガイドＲＮＡ（guide RNA、ｇＲＮＡ）エレクトロポレーションが実行される。分解（ＴＩＤＥ）分析によるインデルの追跡は、所望の領域のノックアウトを確認するために実行される。
前駆体細胞株が樹立されると、血小板産生の前に編集することができる。血小板の血栓形成に影響を与える遺伝子などの遺伝子がノックアウトされる可能性がある。Ｃａｓ９は、編集プロセスを支援するためにレトロウイルスを使用して巨核球に導入される場合がある。次いで、ガイドＲＮＡ（guide RNA、ｇＲＮＡ）エレクトロポレーションが実行される。分解（ＴＩＤＥ）分析によるインデルの追跡は、所望の領域のノックアウトを確認するために実行される。
【0521】
細胞のクローニング効率も測定され、細胞を単独でプレーティングして増殖できることを確認する。本明細書に記載の本発明のいくつかの実施形態では、編集された血小板の機能は、血小板機能のインビトロアッセイを使用して測定され、例えば、マイクロ流体チップは、凝集を試験するために市販されている。
【0522】
次いで、血小板は、インビボ機能テストに移される。内因性マウス血小板を枯渇させることができる、Ｂｏｕｌａｆｔａｌｉ ｅｔ ａｌ．２０１３に示されているマウスモデルを使用することができる（Ｂｏｕｌａｆｔａｌｉ ｅｔ ａｌ．「Ｐｌａｔｅｌｅｔ ＩＴＡＭ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｓ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｆｏｒ ｖａｓｃｕｌａｒ ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ ｉｎ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ」．ＪＣＩ，２０１３を参照され、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。ＣＬＥＣ－２ノックアウト（ｋｎｏｃｋ－ｏｕｔ、ＫＯ）ヒト血小板の株が生成され、対照株として機能する。
【0523】
非血栓形成性血小板（ＣＬＥＣ－２及び血管内皮カドヘリン（ｖｅ））は、色素又はベータ－ｇａｌ（β－Ｇａｌ）と組み合わされる。各マウスには、対照（ＣＬＥＣ－２）のヒト血小板及び非血栓形成性の編集された血小板の混合物が輸血される。マウスは、ヘモグロビン（Ｈｂ）の皮膚の蓄積又は尾静脈の出血時間など、アッセイのプロトコルに従って負傷される。
【0524】
アッセイの結果として形成された血餅は、編集された血小板の存在について観察される。マウスをロドシチン（ＣＬＥＣ－２を介して作用するヘビ毒成分）で処理し、編集された血小板のＣＬＥＣ－２依存性血小板凝集を引き起こす。血餅の存在についてマウスを検査する。血餅が存在しない場合、編集された血小板は本当に血栓形成性ではない。
【0525】
実施例３．ＣＰＲを発現する血小板の生成
編集された血小板がＣＰＲを使用して操作された刺激によって活性化できるかどうかをテストするために、血小板受容体を含有する既知のＩＴＡＭ（ＧＰＶＩ、ＣＬＥＣ－２、及びＦＣｇＲ２Ａ）と抗原に特異的なモデル単鎖抗体（例えば、ＣＤ１９）との間でＣＰＲを設計した。構築物は、追加のコピーとして、又は内因性血小板受容体遺伝子座へのノックインによって導入され、受容体の同族の細胞外ドメインを置き換える。ＣＰＲを発現する血小板はインビトロで生成され、ＣＤ１９を発現する細胞株（例えば、ＮＡＬＭ－６細胞株）及び対照ＣＤ１９陰性細胞株（例えば、Ｂ１６黒色腫細胞株）に曝露される。
編集された血小板がＣＰＲを使用して操作された刺激によって活性化できるかどうかをテストするために、血小板受容体を含有する既知のＩＴＡＭ（ＧＰＶＩ、ＣＬＥＣ－２、及びＦＣｇＲ２Ａ）と抗原に特異的なモデル単鎖抗体（例えば、ＣＤ１９）との間でＣＰＲを設計した。構築物は、追加のコピーとして、又は内因性血小板受容体遺伝子座へのノックインによって導入され、受容体の同族の細胞外ドメインを置き換える。ＣＰＲを発現する血小板はインビトロで生成され、ＣＤ１９を発現する細胞株（例えば、ＮＡＬＭ－６細胞株）及び対照ＣＤ１９陰性細胞株（例えば、Ｂ１６黒色腫細胞株）に曝露される。
【0526】
ＣＤ１９の存在に応答してその後に活性化するＣＰＲ発現血小板の能力は、顕微鏡検査によってインビトロでアッセイされる。いくつかの実施形態では、遺伝子（例えば、ＴＲＡＩＬ）は、操作された血小板による細胞傷害性を増加させるために発現される。
【0527】
同様の技術を使用して、ＣＰＲは、既知のＩＴＡＭを含有する血小板受容体（ＧＰＶＩ、ＣＬＥＣ－２、及びＦＣｇＲ２Ａ）並びに単鎖ＭＨＣクラス１及びＭＨＣクラス２受容体の部分を含むように操作される。使用されるＭＨＣ受容体のバリアントは、使用されるモデル、例えば、Ａｓｔａｒｔｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓからのニューヨーク食道扁平上皮がん１（ＮＹ－ＥＳＯ－１）によって決まる。構築物は、追加のコピーとして、又はその同族の細胞外ドメインを置き換える内因性血小板受容体遺伝子座へのノックインによって導入される。これらのＣＰＲを発現する血小板はインビトロで産生され、ペプチド抗原が試料に添加される。ＣＰＲを発現する血小板は、ペプチド－ＭＨＣに応答するＴ細胞株（又は混合Ｔ細胞のナイーブバッチ）に曝露され、曝露に対するＴ細胞応答が観察される。血小板には、Ｔ細胞応答を変更できるかどうかを判断するために、様々なサイトカインカクテルがロードされる。
【0528】
実施例４．非血栓形成性ＣＰＲ発現血小板をインビボで試験する
ＣＤ１９を発現する黒色腫細胞株（又は他の黒色腫細胞株）に由来する非血栓形成性血小板は、受動的に又はレトロウイルス形質導入により、ＣＴＬＡ４及びＰＤ－１抗体を含むように操作される。免疫担当性マウスはこれらの血小板で治療され、黒色腫治療についてチェックされる。
ＣＤ１９を発現する黒色腫細胞株（又は他の黒色腫細胞株）に由来する非血栓形成性血小板は、受動的に又はレトロウイルス形質導入により、ＣＴＬＡ４及びＰＤ－１抗体を含むように操作される。免疫担当性マウスはこれらの血小板で治療され、黒色腫治療についてチェックされる。
【0529】
ＣＤ１９ Ｎａｌｍ－６ Ｂ細胞白血病モデルを使用すると、ＴＲＡＩＬは、非血栓形成性血小板で発現する。ＦＡＳＬ及びＣＤ４０Ｌは既に存在しており、ＴＲＡＩＬと相乗作用してＢ細胞白血病死を誘導する。腫瘍を有するＮＯＤ ｓｃｉｄガンママウス（ＮＳＧ）マウスは、操作された血小板で治療される。アプローチを検証するための治療上の利益について、マウスを観察する。
【0530】
代替的に、実験的自己免疫性脳脊髄炎（experimental autoimmune encephalomyelitis、ＥＡＥ）は、前述のプロトコル（マルトース結合タンパク質（maltose binding protein、ＭＢＰ）でワクチン接種）を使用してマウスにおいて誘導される。マウスＭＨＣを含むヒト血小板及び／又はマウスＭＨＣを含むＬ８０５７マウス細胞には、免疫化に使用されるＭＢＰペプチドがロードされる。更に、血小板には、細胞傷害性成分（特定の細胞を殺すため）及びＴＧＦ－β及び他の抗炎症剤のうちの少なくとも１つがロードされる。明確に定義された臨床スコアシステムを使用して、上記が非血栓形成性ＣＰＲ発現血小板のインビボでの有効性をテストするための効果的なモデルシステムであるかどうかを確認する。
【0531】
実施例５－実施例６及び７の材料及び方法
ＣＲＩＳＰＲガイド設計
ガイドは、遺伝子の標的エクソンの最初の共通エクソンを特定することによって設計された。このエクソンは、ガイド選択のためのＣＲＩＳＰＯＲアルゴリズムへの入力として使用された。表２１にリストされている、エクソン全体の分布及び特異性スコアに基づいて、標的遺伝子ごとに４つのガイドが選択された。
ＣＲＩＳＰＲガイド設計
ガイドは、遺伝子の標的エクソンの最初の共通エクソンを特定することによって設計された。このエクソンは、ガイド選択のためのＣＲＩＳＰＯＲアルゴリズムへの入力として使用された。表２１にリストされている、エクソン全体の分布及び特異性スコアに基づいて、標的遺伝子ごとに４つのガイドが選択された。
【0532】
レンチウイルスｉＰＳＣ形質導入
ＣＰＲ構築物及びｍＣｈｅｒｒｙを含有する複製欠損レンチウイルス粒子は、Ｆｌａｓｈ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓによって産生された。ｈｉＰＳＣ株は、ルーチン培養培地中１０μｇｍｌ－１のＰｒｏｔａｍｉｎｅ Ｓｕｌｆａｔｅ（Ｓｉｇｍａ）の存在下で、１００の感染多重度を使用したＬＶＰへの１８～２４時間の単一曝露によってルーチン的に形質導入された。
ＣＰＲ構築物及びｍＣｈｅｒｒｙを含有する複製欠損レンチウイルス粒子は、Ｆｌａｓｈ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓによって産生された。ｈｉＰＳＣ株は、ルーチン培養培地中１０μｇｍｌ－１のＰｒｏｔａｍｉｎｅ Ｓｕｌｆａｔｅ（Ｓｉｇｍａ）の存在下で、１００の感染多重度を使用したＬＶＰへの１８～２４時間の単一曝露によってルーチン的に形質導入された。
【0533】
ｉＰＳＣクローニング
ＨｉＰＳＣは、９６ウェルプレートへの単細胞選別によってクローン化された。選別の前日、ｉＰＳＣをＣｌｏｎｅＲ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で処理した。９６ウェルプレートをＢｉｏｌａｍｉｎｉｎ５２１ＬＮ（Ｂｉｏｌａｍｉｎａ）でコーティングした。ＣｌｏｎｅＲは、選別後２日目まで培地に保管された。ウェルをＲｅＬｅＳｒで処理し、コロニーを２４ウェルプレートに再播種することにより、選別の１５～２０日後にコロニーを回収した。
ＨｉＰＳＣは、９６ウェルプレートへの単細胞選別によってクローン化された。選別の前日、ｉＰＳＣをＣｌｏｎｅＲ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で処理した。９６ウェルプレートをＢｉｏｌａｍｉｎｉｎ５２１ＬＮ（Ｂｉｏｌａｍｉｎａ）でコーティングした。ＣｌｏｎｅＲは、選別後２日目まで培地に保管された。ウェルをＲｅＬｅＳｒで処理し、コロニーを２４ウェルプレートに再播種することにより、選別の１５～２０日後にコロニーを回収した。
【0534】
フローサイトメトリー及び染色
単一細胞懸濁液は、ＦＩＴＣ－、ＰＥ－、ＰＥ－Ｃｙ７－、ＡＰＣ－、及びＡＰＣ－Ｈ７結合抗体の組み合わせを使用して室温で２０分間染色された。バックグラウンド蛍光は、蛍光色素が一致するアイソタイプ対照抗体及び単色染色細胞を使用して定義された補正マトリックスに対して設定された。
単一細胞懸濁液は、ＦＩＴＣ－、ＰＥ－、ＰＥ－Ｃｙ７－、ＡＰＣ－、及びＡＰＣ－Ｈ７結合抗体の組み合わせを使用して室温で２０分間染色された。バックグラウンド蛍光は、蛍光色素が一致するアイソタイプ対照抗体及び単色染色細胞を使用して定義された補正マトリックスに対して設定された。
【0535】
ＣＲＩＳＰＲ編集－スクリーニング
ヌクレオフェクション培地の２４時間前に、ＣｌｏｎｅＲを含有する培地と交換した。ヌクレオフェクションの日に、１μｌの６１ｐｍｏｌ／μＬのＡｌｔ－Ｒ ＨｉＦｉ Ｃａｓ９ Ｖ３（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を２μｌの９１．５ｐｍｏｌ／μＬのｓｇＲＮＡとＴＥ（Ｓｙｎｔｈｅｇｏ）（１：３モル比）で直接混合し、室温で少なくとも１時間インキュベートした。ヌクレオフェクション当たり１００，０００～５００，０００のＨｉＰＳＣをＧＣＤＲ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で回収した。採取した細胞をスピンダウンし、２０μＬのヌクレオフェクションバッファーＰ３（Ｌｏｎｚａ）に再懸濁した。次いで、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡミックスを２０μＬの細胞／バッファーＰ３ミックスに加え、４Ｄ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒシステム（Ｌｏｎｚａ）を備えた１６ウェルＮｕｃｌｅｏｃｕｖｅｔｔｅ Ｓｔｒｉｐを使用してヌクレオフェクションを行った。ヌクレオフェクションに続いて、８０μＬの培地をヌクレオキュベットウェルに添加し、細胞を、ＣｌｏｎｅＲ含有培地で２４ウェルプレートの単一ウェルに再プレートした。２日後にｍＴｅＳＲ Ｐｌｕｓの培地が変更された。
ヌクレオフェクション培地の２４時間前に、ＣｌｏｎｅＲを含有する培地と交換した。ヌクレオフェクションの日に、１μｌの６１ｐｍｏｌ／μＬのＡｌｔ－Ｒ ＨｉＦｉ Ｃａｓ９ Ｖ３（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を２μｌの９１．５ｐｍｏｌ／μＬのｓｇＲＮＡとＴＥ（Ｓｙｎｔｈｅｇｏ）（１：３モル比）で直接混合し、室温で少なくとも１時間インキュベートした。ヌクレオフェクション当たり１００，０００～５００，０００のＨｉＰＳＣをＧＣＤＲ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で回収した。採取した細胞をスピンダウンし、２０μＬのヌクレオフェクションバッファーＰ３（Ｌｏｎｚａ）に再懸濁した。次いで、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡミックスを２０μＬの細胞／バッファーＰ３ミックスに加え、４Ｄ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒシステム（Ｌｏｎｚａ）を備えた１６ウェルＮｕｃｌｅｏｃｕｖｅｔｔｅ Ｓｔｒｉｐを使用してヌクレオフェクションを行った。ヌクレオフェクションに続いて、８０μＬの培地をヌクレオキュベットウェルに添加し、細胞を、ＣｌｏｎｅＲ含有培地で２４ウェルプレートの単一ウェルに再プレートした。２日後にｍＴｅＳＲ Ｐｌｕｓの培地が変更された。
【0536】
ＣＲＩＳＰＲ編集－シーケンシャル
ヌクレオフェクション培地の２４時間前に、ＣｌｏｎｅＲを含有する培地と交換した。ヌクレオフェクションの日に、５μｌの６１ｐｍｏｌ／μＬのＡｌｔ－Ｒ ＨｉＦｉ Ｃａｓ９ Ｖ３（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を１０μｌの９１．５ｐｍｏｌ／μＬのｓｇＲＮＡとＴＥ（Ｓｙｎｔｈｅｇｏ）（１：３モル比）で直接混合し、室温で少なくとも１時間インキュベートした。ヌクレオフェクション当たり１～２５０万のＨｉＰＳＣを、ＧＣＤＲ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で採取した。採取した細胞をスピンダウンし、１００μＬのヌクレオフェクションバッファーＰ３（Ｌｏｎｚａ）に再懸濁した。次いで、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡミックスを１００μＬの細胞／バッファーＰ３ミックスに添加し、１００μＬのＮｕｃｌｅｏｃｕｖｅｔｔｅと４Ｄ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒシステム（Ｌｏｎｚａ）を使用してヌクレオフェクションを行った。ヌクレオフェクションに続いて、４００μＬの培地をヌクレオキュベットウェルに添加し、細胞を、ＣｌｏｎｅＲ含有培地で、６ウェルプレートの２つのウェル及び２４ウェルプレートの１つのウェルに再プレートした。２日後にｍＴｅＳＲ Ｐｌｕｓの培地が変更された。細胞は、その後のヌクレオフェクションが行われる前に、回復するために合計３～４日与えられた。
ヌクレオフェクション培地の２４時間前に、ＣｌｏｎｅＲを含有する培地と交換した。ヌクレオフェクションの日に、５μｌの６１ｐｍｏｌ／μＬのＡｌｔ－Ｒ ＨｉＦｉ Ｃａｓ９ Ｖ３（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を１０μｌの９１．５ｐｍｏｌ／μＬのｓｇＲＮＡとＴＥ（Ｓｙｎｔｈｅｇｏ）（１：３モル比）で直接混合し、室温で少なくとも１時間インキュベートした。ヌクレオフェクション当たり１～２５０万のＨｉＰＳＣを、ＧＣＤＲ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で採取した。採取した細胞をスピンダウンし、１００μＬのヌクレオフェクションバッファーＰ３（Ｌｏｎｚａ）に再懸濁した。次いで、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡミックスを１００μＬの細胞／バッファーＰ３ミックスに添加し、１００μＬのＮｕｃｌｅｏｃｕｖｅｔｔｅと４Ｄ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒシステム（Ｌｏｎｚａ）を使用してヌクレオフェクションを行った。ヌクレオフェクションに続いて、４００μＬの培地をヌクレオキュベットウェルに添加し、細胞を、ＣｌｏｎｅＲ含有培地で、６ウェルプレートの２つのウェル及び２４ウェルプレートの１つのウェルに再プレートした。２日後にｍＴｅＳＲ Ｐｌｕｓの培地が変更された。細胞は、その後のヌクレオフェクションが行われる前に、回復するために合計３～４日与えられた。
【0537】
ＣＲＩＳＰＲ ＫＯの定量化
ジェノタイピングは、ＧＣＤＲ又はＲｅＬｅＳｒを使用してＨｉＰＳＣ細胞を最初に採取することによって実行された。ゲノムＤＮＡは、メーカーの指示に従って、Ｋａｐａ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｅｘｔｒａｃｔキット（Ｒｏｃｈｅ）を使用して抽出した。ゲノムＤＮＡ抽出後、標的化遺伝子座特異的プライマーを使用して標的ゲノム領域を増幅した（表２を参照されたい）。ＰＣＲフラグメントをＰＣＲ精製し、Ｓａｎｇｅｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Ｓｏｕｒｃｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に提出した。次いで、これらの配列をＩＣＥ分析ソフトウェア（Ｓｙｎｔｈｅｇｏ）に入力し、編集効率を定量化した。
ジェノタイピングは、ＧＣＤＲ又はＲｅＬｅＳｒを使用してＨｉＰＳＣ細胞を最初に採取することによって実行された。ゲノムＤＮＡは、メーカーの指示に従って、Ｋａｐａ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｅｘｔｒａｃｔキット（Ｒｏｃｈｅ）を使用して抽出した。ゲノムＤＮＡ抽出後、標的化遺伝子座特異的プライマーを使用して標的ゲノム領域を増幅した（表２を参照されたい）。ＰＣＲフラグメントをＰＣＲ精製し、Ｓａｎｇｅｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Ｓｏｕｒｃｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に提出した。次いで、これらの配列をＩＣＥ分析ソフトウェア（Ｓｙｎｔｈｅｇｏ）に入力し、編集効率を定量化した。
【0538】
ｉＰＳＣ細胞培養及びＭＫへのフォワードプログラミング
ｉＰＳＣ細胞株ＲＣＩＢ－１０は、ドキシサイクリン誘導性プロモーターからのＴＡＬ１、ＦＬＩ１、ＧＡＴＡ１の同時発現により、巨核球にフォワードプログラミングされた（例えば、Ｄａｌｂｙ ｔｈｅｓｉｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ「Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ａ ｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｅ－ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ ｂｉ－ｐｏｔｅｎｔ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ」；及びＭｏｒｅａｕ １４ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２０１７ 「Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ Ｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｅｓ ｆｒｏｍ Ｈｕｍａｎ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ」ＢＢＴＳ Ａｎｎｕａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ Ｇｌａｓｇｏｗ ２０１７）を参照されたい）。親のＲＣＩＢ－１０株は、もともと、ドナー細胞株からのヒトＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、及びＭＹＣリプログラミング因子のエピソームベクター媒介発現によって誘導された。
ｉＰＳＣ細胞株ＲＣＩＢ－１０は、ドキシサイクリン誘導性プロモーターからのＴＡＬ１、ＦＬＩ１、ＧＡＴＡ１の同時発現により、巨核球にフォワードプログラミングされた（例えば、Ｄａｌｂｙ ｔｈｅｓｉｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ「Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ａ ｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｅ－ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ ｂｉ－ｐｏｔｅｎｔ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ」；及びＭｏｒｅａｕ １４ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２０１７ 「Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ Ｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｅｓ ｆｒｏｍ Ｈｕｍａｎ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ」ＢＢＴＳ Ａｎｎｕａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ Ｇｌａｓｇｏｗ ２０１７）を参照されたい）。親のＲＣＩＢ－１０株は、もともと、ドナー細胞株からのヒトＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、及びＭＹＣリプログラミング因子のエピソームベクター媒介発現によって誘導された。
【0539】
細胞をドキシサイクリンを用いた標準条件下で１０日間培養し、その時点で細胞を回収した。
【0540】
巨核球へのＨＳＣ分化
Ｓｔｅｍｓｐａｎ ＳＦＥＭ２（Ｓｔｅｍｓｐａｎ １００ｘＭＫ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号０２６９６）中のサイトカインのカクテルを使用して、成体の末梢血由来ＨＳＣを巨核球に分化させた。プロトコルは、製造業者のウェブサイト上で入手可能である。末梢血ＨＳＣは、分化のＤ１０～Ｄ１３でＰＬＰ産生に対して適格になる。
Ｓｔｅｍｓｐａｎ ＳＦＥＭ２（Ｓｔｅｍｓｐａｎ １００ｘＭＫ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号０２６９６）中のサイトカインのカクテルを使用して、成体の末梢血由来ＨＳＣを巨核球に分化させた。プロトコルは、製造業者のウェブサイト上で入手可能である。末梢血ＨＳＣは、分化のＤ１０～Ｄ１３でＰＬＰ産生に対して適格になる。
【0541】
ＰＬＰ産生
巨核球を標準増殖培地からＲＰＭＩ １６４０＋２５ｍＭグルコース含有培地に移すことによって、巨核球からＰＬＰを産生した。この工程は、ＰＬＰ産生をもたらしたが、ＰＬＰ産生に必須ではなく、ＰＬＰは、標準培養培地から採取することができる。
巨核球を標準増殖培地からＲＰＭＩ １６４０＋２５ｍＭグルコース含有培地に移すことによって、巨核球からＰＬＰを産生した。この工程は、ＰＬＰ産生をもたらしたが、ＰＬＰ産生に必須ではなく、ＰＬＰは、標準培養培地から採取することができる。
【0542】
Ｐ－セレクチンベースの活性化アッセイ（ＣＲＰ／ＴＲＡＰ－６／ＰＭＡ）
既知のアゴニストとの混合に応答したＭＫの活性化をアッセイするために、１００，０００～５００，０００ＭＫを最初に１００Ｇで８分間遠心分離によって回収し、抗Ｐ－セレクチン抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、クローンＡＫ４，１μＬ／１００μＬの細胞の可変フルオロフォア）を含有する１００μＬのタイロードバッファー（１３４ｍＭのＮａＣｌ、１２ｍＭのＮａＨＣＯ３、２．９ｍＭのＫＣｌ、０．３４ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）に再懸濁した。生細胞がフローによってアッセイされた場合、これは、細胞を再懸濁することなく、チューブから直接サンプリングすることによって実行された。続いてアゴニストを添加し、ＭＫと４０分間インキュベートした後、１％ＰＦＡで１５分間固定した。ＰＦＡ固定後、細胞を３００μＬのタイロードバッファーに再懸濁し、抗ＣＤ４２抗体（１μＬ／１００μＬ）を添加して成熟ＭＫを同定した。ＭＫは、共焦点顕微鏡を使用したイメージング又はフローサイトメトリーのいずれかによって分析された。ＣＲＰ（Ｃａｍｂｃｏｌ）を１０μｇ／ｍｌの濃度で、ＴＲＡＰ－６（Ａｂｃａｍ）を１０μＭの濃度で、ＰＭＡ（Ｓｉｇｍａ）を３００ｎｇ／ｍＬの濃度で細胞に添加した。細胞をアゴニストとして使用した場合（Ｊｕｒｋａｔｓ、ＤＳＭＺカタログ番号：ＡＣＣ２８２及びＢＪＡＢ－Ｂ細胞リンパ腫株、Ｇｈｅｖａｅｒｔラボストック）、ＭＫに対して１：１の数で添加した。
既知のアゴニストとの混合に応答したＭＫの活性化をアッセイするために、１００，０００～５００，０００ＭＫを最初に１００Ｇで８分間遠心分離によって回収し、抗Ｐ－セレクチン抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、クローンＡＫ４，１μＬ／１００μＬの細胞の可変フルオロフォア）を含有する１００μＬのタイロードバッファー（１３４ｍＭのＮａＣｌ、１２ｍＭのＮａＨＣＯ３、２．９ｍＭのＫＣｌ、０．３４ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）に再懸濁した。生細胞がフローによってアッセイされた場合、これは、細胞を再懸濁することなく、チューブから直接サンプリングすることによって実行された。続いてアゴニストを添加し、ＭＫと４０分間インキュベートした後、１％ＰＦＡで１５分間固定した。ＰＦＡ固定後、細胞を３００μＬのタイロードバッファーに再懸濁し、抗ＣＤ４２抗体（１μＬ／１００μＬ）を添加して成熟ＭＫを同定した。ＭＫは、共焦点顕微鏡を使用したイメージング又はフローサイトメトリーのいずれかによって分析された。ＣＲＰ（Ｃａｍｂｃｏｌ）を１０μｇ／ｍｌの濃度で、ＴＲＡＰ－６（Ａｂｃａｍ）を１０μＭの濃度で、ＰＭＡ（Ｓｉｇｍａ）を３００ｎｇ／ｍＬの濃度で細胞に添加した。細胞をアゴニストとして使用した場合（Ｊｕｒｋａｔｓ、ＤＳＭＺカタログ番号：ＡＣＣ２８２及びＢＪＡＢ－Ｂ細胞リンパ腫株、Ｇｈｅｖａｅｒｔラボストック）、ＭＫに対して１：１の数で添加した。
【0543】
国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０２０／０５３２４７号の１５４～１６１頁に提示され、ｇＲＮＡプライマー配列、アンプリコンプライマー、及び培地レシピを提示する表２１～２３は、参照により本明細書に組み込まれる。表２１及び２２を便宜上以下に再現する。
【0544】
【表4-1】
【0545】
【表4-2】
【0546】
【表4-3】
【0547】
本明細書の他の箇所で言及されるように、当業者は、ヌクレオチドＡＧＴＣを使用してＲＮＡ分子の配列を提供することが慣習的であることを理解するであろう。しかしながら、当業者は、ＲＮＡにおいてＴがウラシルで置換されていることを知っている。したがって、ＲＮＡ分子に関連する本明細書に記載の任意の配列は、Ｔ又はＵで書かれ得るが、実際には、ＲＮＡ分子は、ＴではなくＵを含む。
【0548】
【表5-1】
【0549】
【表5-2】
【0550】
実施例６
非血栓形成性のｉＰＳＣ由来の血小板様前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシを生成するには、内因性血栓プロセスの主要コンポーネントをコードする遺伝子を削除する必要がある。この例では、対象となる遺伝子はＣｏｘ１、ＧＰＶＩ、ＨＰＳ１、ＩＴＧＡ２Ｂ、Ｐ２Ｙ１２、Ｐａｒ１、Ｐａｒ４であった。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を介したＩＮ／ＤＥＬ生成は、遺伝子ノックアウト（ＫＯ）の方法として選択された。まず、ガイドは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを上記の標的に標的とするように設計された（図１Ａ）。標的ごとに４つのガイドが設計され、Ｃａｓ９タンパク質と複合体としてｉＰＳＣにヌクレオフェクトされ、プール内の遺伝子編集効率がサンガーシーケンシング及びＴＩＤＥ又はＳｙｎｔｈｅｇｏ ＩＣＥアルゴリズムによって測定された。各標的のＫＯが８０％を超える高効率ガイドが、ガイド画面で識別された（図１Ｂ）。これらのガイドは、再現性のある高い編集効率を生成した（図１Ｃ）。
非血栓形成性のｉＰＳＣ由来の血小板様前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシを生成するには、内因性血栓プロセスの主要コンポーネントをコードする遺伝子を削除する必要がある。この例では、対象となる遺伝子はＣｏｘ１、ＧＰＶＩ、ＨＰＳ１、ＩＴＧＡ２Ｂ、Ｐ２Ｙ１２、Ｐａｒ１、Ｐａｒ４であった。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を介したＩＮ／ＤＥＬ生成は、遺伝子ノックアウト（ＫＯ）の方法として選択された。まず、ガイドは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを上記の標的に標的とするように設計された（図１Ａ）。標的ごとに４つのガイドが設計され、Ｃａｓ９タンパク質と複合体としてｉＰＳＣにヌクレオフェクトされ、プール内の遺伝子編集効率がサンガーシーケンシング及びＴＩＤＥ又はＳｙｎｔｈｅｇｏ ＩＣＥアルゴリズムによって測定された。各標的のＫＯが８０％を超える高効率ガイドが、ガイド画面で識別された（図１Ｂ）。これらのガイドは、再現性のある高い編集効率を生成した（図１Ｃ）。
【0551】
非血栓形成前駆体ｉＰＳＣ株を生成するには、これらのＫＯを全て同じ細胞に導入する必要がある。これを実現するために、シーケンシャル編集プロトコルが設計された（図２Ａ）。簡単に説明すると、以前に特定された高効率ガイドを特徴とするＣａｓ９ ＲＮＰ複合体は、同じ集団のｉＰＳＣに順次ヌクレオフェクトされ、各ヌクレオフェクションの間に３～４日休止した。このプロトコルは、約３．５週間のプロセスを通じて、細胞の生存率又は増殖に悪影響を及ぼさなかった（図２Ｂ）。遺伝子ＫＯは、シーケンシャルヌクレオフェクションプロトコル全体で以前にヒットした各標的について定量化された。遺伝子ＫＯの希釈は観察されず（ＫＯ自体が有害である場合に発生する可能性がある）、驚くほど高い遺伝子編集効率が全ての標的で観察された（ＣＯＸ１を除く全ての標的で＞９４％）（図２Ｃ）。シーケンシャルＫＯプロトコルに従って、単一細胞を９６ウェルプレートに分類し、クローンコロニーを形成して成長させた。その後、これらのコロニーを分離し、配列を決定した。３つの７ｘＫＯクローンが同定された（図３）。
【0552】
これらのｉＰＳＣ細胞内でＫＯされた巨核球（ＭＫ）特異的遺伝子の数を考えると、これらのｉＰＳＣ細胞が依然としてＭＫ様細胞に分化できるかどうかについては不明なままであった。これを理解するために、ｉＰＳＣは、ドキシサイクリンを介したＭＫ特異的転写因子ＧＡＴＡ１、ＴＡＬ１、及びＦＬＩ１の誘導によってＭＫにフォワードプログラムされた。既知の明確に定義されたＭＫマーカーの細胞表面発現及び生存率を、フォワードプログラミングプロセス中にアッセイした（図４Ａ及びＢ）。この研究は７ｘＫＯＭＫのプールで実施されたが、プール内の編集効率が非常に高いことを考えると、細胞の９０％超が少なくとも６つのＫＯを備えている可能性がある。フォワードプログラミングプロセス中、フォワードプログラミングの効率やＭＫの実行可能性への影響は観察されなかった。ＣＤ４１は、私たちの標的遺伝子の１つであるＩＴＧＡ２Ｂである。したがって、７ｘＫＯ集団内でのＣＤ４１発現の欠如は、シーケンシングベースのアプローチによって予測されるように、この遺伝子のタンパク質レベルＫＯを検証した。
【0553】
７ｘＫＯ ＭＫの非血栓形成性、及びそれらの保持された機能を検証するために、既知の血小板アゴニストに対する脱顆粒反応を研究した。ＭＫには、血小板と同じコアシグナル伝達機構、原形質膜、及び成分が含まれているため（血小板はＭＫのフラグメントである場合）、ここでは実際の血小板の代理としてＭＫを使用した。ＭＫで見られる結果は、血小板に直接変換されると予想される。脱顆粒をアッセイするために、細胞表面のＰ－セレクチン曝露をマーカーとして使用した。Ｐ－セレクチンはアルファ顆粒膜タンパク質であり、通常は血小板表面には存在しない。血小板が活性化されると、アルファ顆粒は原形質膜と融合し、その内容物をエキソサイトーシスし（脱顆粒）、それらの膜成分は原形質膜と混合する。したがって、Ｐ－セレクチンは、蛍光抗体を介した染色によって露出され、検出可能になる。休止中の７ｘＫＯＭＫは、編集されていない野生型ＭＫよりも低い基礎レベルのＰ－セレクチン曝露を特徴とする（図５Ａ）。２つの古典的な血小板アゴニストであるＣＲＰ及びＴＲＡＰ６（それぞれＧＰＶＩとＰＡＲ１を介してシグナルを送る－両方とも７ｘＫＯプールでＫＯ）で刺激すると、７ｘＫＯ ＭＫプールでＰ－セレクチン染色の増加は観察されなかった。これは、Ｐ－セレクチンを増加させ、細胞の小さな凝集体を形成し始めたように見える未編集のＭＫとは対照的である（図５Ｂ）。重要なことに、７ｘＫＯ株内で除去されたシグナル伝達経路をバイパスするアゴニストであるＰＭＡで７ｘＫＯ ＭＫを刺激すると、７ｘＫＯ ＭＫは未編集のＭＫよりも優れていないとしてもＰ－セレクチンを曝露した（図５Ｃ）。これらの活性化実験と先に述べた細胞表面マーカー実験を総合すると、ｉＰＳＣ細胞において我々の非血栓性候補遺伝子を欠失させても、ＭＫ様細胞への分化能力は損なわれず、また欠失させないシグナル伝達機構に応答して脱顆粒するＭＫの能力も損なわれないことが示された。
【0554】
血小板には、ＩＴＡＭドメインを含有する受容体、具体的にはＣＬＥＣ２、ＦＣＥＲＧ及びＦＣＧＲ２Ａが含まれる。ＣＬＥＣ２はＩＩ型膜タンパク質であり、ＦＣＥＲＧ及びＦＣＧＲ２ＡはＩ型膜タンパク質である。Ｉ型膜タンパク質は、ｓｃＦＶ ｆａｂドメイン（及び他のＮ末端標的化機構）との融合に適している。したがって、キメラ血小板受容体（ＣＰＲ）は、ＦＭＣ６３抗体に由来するＢ細胞抗原ＣＤ１９を標的とするｓｃＦＶ、ヒンジドメイン、並びにＦＣＥＲＧ及びＦＣＧＲ２Ａの膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインの間の融合として設計された。これにより、４つの潜在的な受容体設計が得られた（図６Ａ）。これらのデザインは、Ｔ２Ａペプチド分割配列で連結されたｍＣｈｅｒｒｙ蛍光タンパク質を持つ、マルチシストロン構築物としてレンチウイルス発現ベクターに挿入された（図６Ｂ）。ウイルス粒子をｉＰＳＣに形質導入し、ｍＣｈｅｒｒｙ発現により形質導入効率を調べた。注目すべきｍＣｈｅｒｒｙ発現は、４つのレンチウイルス発現ベクター全てで検出され、形質導入されていない対照には存在しなかった（図６Ｃ）。
【0555】
受容体自体が発現し、細胞表面に局在していることを検証するために、ウイルスで形質導入されたｉＰＳＣをＦＩＴＣで蛍光標識した組換えＣＤ１９で染色した。ＣＤ１９－ＦＩＴＣは、ｉＰＳＣが細胞表面に正しい方向で抗ＣＤ１９ ｓｃＦＶを発現している場合にのみ、ｉＰＳＣに標識付けする必要がある。特に、形質導入陽性（すなわち、ｍＣｈｅｒｒｙ陽性）のコロニーはＣＤ１９－ＦＩＴＣにも陽性であり、設計されたＣＰＲが折りたたまれ、それらを発現する細胞の原形質膜に正しく局在することを示す（図７）。
【0556】
ｉＰＳＣ株を発現するクローン高ＣＰＲ３をＭＫにフォワードプログラムした。全ての古典的なＭＫ特異的マーカーがこれらの細胞内で発現されたため、ＣＰＲ３構築物の発現はｉＰＳＣがプログラムを転送する能力に影響を与えなかった。ＭＫの生存率は、ＣＰＲ３の発現によっても影響を受けなかった（図８Ａ）。ＣＤ４１はこれらの細胞内でクローン的にＫＯされるため、その発現の欠如が予想されることに注意されたい。ＣＰＲ３が発現し、この発現がＭＫ細胞表面で維持されていることを検証するために、ＣＤ１９－ＦＩＴＣ染色を実施した（図８Ｂ）。ＣＰＲ表面発現が観察され、ＭＫ分化がレンチウイルス発現構築物を沈黙させなかったこと、又は何らかの形で受容体の局在を改変させなかったことを示す。
【0557】
血小板特異的ＣＡＲの正確な表面局在化を更に確認するために、造血幹細胞由来巨核球においてＣＰＲ１を発現させた。ＣＰＲ１レンチウイルス形質導入（共役ＣＰＲ及びｍＣｈｅｒｒｙ発現を特徴とする）後、ｍＣｈｅｒｒｙレベルと表面ｓｃＦＶ発現レベルとの間に強い正の相関があった。これは、ＣＰＲ１が折りたたまれ、巨核球の表面に良好に局在化し得ることを実証する（図２０パート１）。重要なことに、これらの巨核球からのＰＬＰ産生に続いて、ＰＬＰはまた、表面常在の正確に配向されたＣＰＲ１を発現することが示された。これらの結果は、その後、ｉＰＳＣ由来巨核球及びそれらに由来するＰＬＰにおいても繰り返された（図２２）。重要なことに、ＣＰＲ１／ＣＡＲ１は、非血栓形成性７ｘＫＯクローン３４株（図２５）及び対照ＣＤ３４／ＣＤ４１ ＫＯ株（図２４）において表面に局在した。これは、非血栓形成性血小板「シャーシ」がＣＰＲで機能化され得るという実験的証拠を実証する。
【0558】
ＣＰＲの機能を研究するために、ＣＰＲ３発現ＭＫ及び対照の非形質導入ＭＫを、ＣＤ１９を発現するＢ細胞白血病株（ＢＪＡＢ）又はＣＤ１９陰性のＴ細胞白血病株（Ｊｕｒｋａｔｓ）と混合し、Ｐ－セレクチン曝露を以前と同様に測定した。混合細胞集団の顕微鏡イメージングは、ＣＤ１９＋ｖｅ ＢＪＡＢと混合した場合に、特にＣＰＲ３発現ＭＫ内でのＰ－セレクチン曝露の増加を示した（図９Ａ）。この結果は、Ｐ－セレクチン曝露のＦＡＣＳベースの測定によって定量的に確認された（図９Ｂ及びＣ）。ＢＪＡＢ細胞は非形質導入ＭＫを活性化せず、ＣＤ１９陰性ジャーカットはＣＰＲ３発現ＭＫを活性化しない。これらの結果は、ＣＰＲ３構築物がＣＤ１９陽性ＢＪＡＢ細胞によるトリガーに応答してＭＫ脱顆粒を特異的に刺激することを示す。血小板はＭＫの細胞質フラグメントであり、コアシグナル伝達機構がそれらの間で共有されていることを考えると（共有された細胞質が与えられた場合）、これらの結果は、ＣＰＲ３発現ＭＫから産生されたときに血小板に変換されるはずであると予想される。追加的に、７ｘＫＯ ＭＫは、同族の受容体が削除されていないアゴニストに応答して活性化及び脱顆粒する能力を保持しているという観察結果を考慮すると、７ｘＫＯ株内のＣＰＲ３発現は、ＣＤ１９陽性細胞と混合すると脱顆粒を引き起こすと予想される。外部ＣＰＲ標的化ドメインの交換可能な性質を考えると、標的の特異性は、標的係合でＭＫ脱顆粒をトリガーするためにここに示されているのと同じ内部シグナル伝達ドメインを保持しながら、代替の標的化機構に抗ＣＤ１９ ｓｃＦＶを交換することによって改変することができる。
【0559】
実施例７－非血栓形成性活性のために設計されたｉＰＳＣノックアウト株の試験
各々が３つの遺伝子ノックアウトを有する、２つの異なるｉＰＳＣ細胞株を生成した。
クローン１：ｉＴＧＡ２ｂ ＫＯ、ＰＡＲ１ ＫＯ、ＨＰＳ１ ＫＯ
クローン２：ｉＴＧＡ２ｂ ＫＯ、Ｐ２Ｙ１２ ＫＯ、ＨＰＳ１ ＫＯ
各々が３つの遺伝子ノックアウトを有する、２つの異なるｉＰＳＣ細胞株を生成した。
クローン１：ｉＴＧＡ２ｂ ＫＯ、ＰＡＲ１ ＫＯ、ＨＰＳ１ ＫＯ
クローン２：ｉＴＧＡ２ｂ ＫＯ、Ｐ２Ｙ１２ ＫＯ、ＨＰＳ１ ＫＯ
【0560】
各クローンは、血栓形成に関与する３つの重要なプロセスにおいて表現型的に欠損するように設計されている。
●ｉＴＧＡ２ｂの不活化は、刺激（フィブリノーゲン）の認識に必須であるＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体を不活化し、損傷した内皮の下の基底膜の曝露をもたらす。
●ＰＡＲ１又はＰ２Ｙ１２の不活性化は、それぞれトロンビン及びＡＤＰの受容体を不活性化する。これらのアゴニストは、活性化された血小板によって放出されて更なる血小板を成長中の血栓に動員する、血小板由来二次メッセンジャーである。
●ＨＰＳ１の不活性化は、血小板における高密度顆粒の形成を妨げる。高密度顆粒は、ＡＤＰ及びセロトニンなどの血小板活性化の二次メディエーターを含有し、放出する。したがって、血小板における高密度顆粒の除去は、ｉＰＳＣ由来ノックアウト血小板への正常な野生型血小板動員を防止する。
●ｉＴＧＡ２ｂの不活化は、刺激（フィブリノーゲン）の認識に必須であるＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体を不活化し、損傷した内皮の下の基底膜の曝露をもたらす。
●ＰＡＲ１又はＰ２Ｙ１２の不活性化は、それぞれトロンビン及びＡＤＰの受容体を不活性化する。これらのアゴニストは、活性化された血小板によって放出されて更なる血小板を成長中の血栓に動員する、血小板由来二次メッセンジャーである。
●ＨＰＳ１の不活性化は、血小板における高密度顆粒の形成を妨げる。高密度顆粒は、ＡＤＰ及びセロトニンなどの血小板活性化の二次メディエーターを含有し、放出する。したがって、血小板における高密度顆粒の除去は、ｉＰＳＣ由来ノックアウト血小板への正常な野生型血小板動員を防止する。
【0561】
上記遺伝子のノックアウトを特徴とするｉＰＳＣを、実施例５に記載の方法論を使用して生成した。標的遺伝子に使用したガイドＲＮＡは、各遺伝子について実施例５に記載したとおりであった。これらのｉＰＳＣ ＫＯ株に由来する巨核球及び血小板は、「シャーシ」血小板又は巨核球と記載される。実験がシャーシ血小板の使用を記載する場合、シャーシ巨核球が代用され得る。
【0562】
以下に、操作された血小板における血栓形成活性の非存在を実証するために設計された一連の実験（インビトロ及びインビボ）を記載する。これらのアッセイは文献に十分に記載されており、シャーシ血小板の研究に適合されている。
【0563】
上記遺伝子のＫＯを特徴とするｉＰＳＣプールの生成は、以前に同定されたガイド（実施例５）を使用して生成されている（図１６）。これらのノックアウトプールは、巨核球表現型に対するフォワードプログラミングアプローチを使用して分化されており、既知のＭＫ表面マーカーの発現に基づいて分化するそれらの能力が確認されている（図１７）。
【0564】
Ａ．シャーシ血小板がインビトロで一次／主要血小板活性化刺激に応答しないことの実証
コラーゲン又はフィブリノーゲンのいずれかでコーティングされたフローチャンバーは、血小板の接着及び活性化を観察するための十分に検証された方法を表す。フィブリノーゲンは、ＩＴＧＡ２Ｂ ＫＯを介して破壊されるｇｐＩＩｂ／ＩＩＩａ複合体によって結合される。血小板を含有する試料をチャンバーに通し、様々な特徴について試験する：（ｉ）顕微鏡による結合事象の目視検査／計数、（ｉｉ）Ｐ－セレクチン標的化抗体による任意の結合血小板のＩＦ染色による、又はカルシウムフラックスＣＤ４０Ｌ及びアネキシンＶ染色による血小板活性化状態。この実験における肯定的な結果は、第１の例におけるフローチャンバーへのシャーシ血小板結合の欠如及び／又は低減であり、任意の結合したシャーシ血小板は活性化されるべきではない。
コラーゲン又はフィブリノーゲンのいずれかでコーティングされたフローチャンバーは、血小板の接着及び活性化を観察するための十分に検証された方法を表す。フィブリノーゲンは、ＩＴＧＡ２Ｂ ＫＯを介して破壊されるｇｐＩＩｂ／ＩＩＩａ複合体によって結合される。血小板を含有する試料をチャンバーに通し、様々な特徴について試験する：（ｉ）顕微鏡による結合事象の目視検査／計数、（ｉｉ）Ｐ－セレクチン標的化抗体による任意の結合血小板のＩＦ染色による、又はカルシウムフラックスＣＤ４０Ｌ及びアネキシンＶ染色による血小板活性化状態。この実験における肯定的な結果は、第１の例におけるフローチャンバーへのシャーシ血小板結合の欠如及び／又は低減であり、任意の結合したシャーシ血小板は活性化されるべきではない。
【0565】
Ｂ．シャーシがインビトロでアゴニスト／二次メッセンジャーに応答しないことの実証
このアッセイでは、懸濁液中の血小板を、規定された用量漸増血小板メディエーター（トロンビン、ＡＤＰ）で処理し、血小板活性化状態を、以下のマーカーについて染色／フローサイトメトリーによって測定する：ＣＤ６２ｐ／Ｐ－セレクチン、ＰＦ４放出、並びに必要に応じてカルシウムフラックス、ＣＤ４０Ｌ及びアネキシンＶ染色などの他の活性化マーカー。このアッセイにおける肯定的な結果は、シャーシ血小板における活性化の低減及び／又は不在である。対照実験では、血小板活性化（受容体ＰＡＲ１／Ｐ２Ｙ１２活性化とは独立して）の能力を、血小板をロドサイチン又はポドプラニンで処理することによって確認する。これらの２つの分子は、血小板Ｃｌｅｃ２受容体を介してシグナル伝達し、血小板Ｃｌｅｃ２受容体は、血小板媒介止血にとって重要な受容体ではなく、したがって、シャーシ上に無傷のまま残すことができる。
このアッセイでは、懸濁液中の血小板を、規定された用量漸増血小板メディエーター（トロンビン、ＡＤＰ）で処理し、血小板活性化状態を、以下のマーカーについて染色／フローサイトメトリーによって測定する：ＣＤ６２ｐ／Ｐ－セレクチン、ＰＦ４放出、並びに必要に応じてカルシウムフラックス、ＣＤ４０Ｌ及びアネキシンＶ染色などの他の活性化マーカー。このアッセイにおける肯定的な結果は、シャーシ血小板における活性化の低減及び／又は不在である。対照実験では、血小板活性化（受容体ＰＡＲ１／Ｐ２Ｙ１２活性化とは独立して）の能力を、血小板をロドサイチン又はポドプラニンで処理することによって確認する。これらの２つの分子は、血小板Ｃｌｅｃ２受容体を介してシグナル伝達し、血小板Ｃｌｅｃ２受容体は、血小板媒介止血にとって重要な受容体ではなく、したがって、シャーシ上に無傷のまま残すことができる。
【0566】
Ｃ． 正常（ドナー）血小板とインビトロで混合した場合、シャーシ血小板が血小板活性化刺激に応答しないことの実証
このアッセイでは、シャーシ血小板をドナー由来血小板の存在下でインキュベートし、混合物をトロンビン及びＡＤＰなどの用量漸増血小板メディエーターとともにインキュベートする。このアッセイは、シャーシ血小板が活性化の可溶性メディエーターと活性化された正常血小板との組み合わせに曝露されるため、シャーシ血小板についてのよりストリンジェントな試験を表し、したがって、より生理学的に関連する状態を表す。このアッセイは、フィブリノーゲン又はコラーゲンでコーティングされたフローチャンバー中で、チャンバーをとおる示差的に染色されたドナー由来血小板及びシャーシ血小板の５０：５０混合物の流れを用いて行われる。
このアッセイでは、シャーシ血小板をドナー由来血小板の存在下でインキュベートし、混合物をトロンビン及びＡＤＰなどの用量漸増血小板メディエーターとともにインキュベートする。このアッセイは、シャーシ血小板が活性化の可溶性メディエーターと活性化された正常血小板との組み合わせに曝露されるため、シャーシ血小板についてのよりストリンジェントな試験を表し、したがって、より生理学的に関連する状態を表す。このアッセイは、フィブリノーゲン又はコラーゲンでコーティングされたフローチャンバー中で、チャンバーをとおる示差的に染色されたドナー由来血小板及びシャーシ血小板の５０：５０混合物の流れを用いて行われる。
【0567】
分析される特徴は、（ｉ）血小板計数のための蛍光顕微鏡法、（ｉｉ）結合血小板の活性化状態（例えば、ＣＤ６２ｐ／Ｐ－セレクチン、ＰＦ４放出、並びに必要に応じてカルシウムフラックス、ＣＤ４０Ｌ及びアネキシンＶ染色などの他の活性化マーカー）である。同じ実験設定を、シャーシ血小板と全血との同時インキュベーション及びフィブリノーゲン又はコラーゲンでコーティングされたチャンバーを通して混合物を流すことによって更に延長する。
【0568】
血栓の蛍光顕微鏡検査は、任意の染色された操作された血小板が存在するかどうかを実証し、シャーシ血小板が捕捉されている場合、それらの活性化状態は、一次マーカーであるＰ－セレクチン、又は代替／追加マーカーとしてのカルシウムフラックス、ＣＤ４０Ｌ及びアネキシンＶ染色を使用するＩＦによって確認される。
【0569】
このアッセイにおける肯定的な結果は以下のとおりである。
●シャーシ血小板濃度を変化させた場合、血栓サイズに著しい変化がない。
●血栓内へのシャーシ血小板取り込みの不在又は低減
●いずれかのシャーシ血小板が血栓によって捕捉される場合、それらは活性化されるべきではない
●シャーシ血小板濃度を変化させた場合、血栓サイズに著しい変化がない。
●血栓内へのシャーシ血小板取り込みの不在又は低減
●いずれかのシャーシ血小板が血栓によって捕捉される場合、それらは活性化されるべきではない
【0570】
Ｄ．シャーシ血小板がインビボでの血栓形成に寄与しないことの実証
この実験の目的は、血栓形成のインビボモデルにおけるシャーシ血小板の表現型性能を試験することである。これは、シャーシ血小板における血栓形成プログラムを設計するために取られたアプローチのより深いレベルの検証を提供する。
この実験の目的は、血栓形成のインビボモデルにおけるシャーシ血小板の表現型性能を試験することである。これは、シャーシ血小板における血栓形成プログラムを設計するために取られたアプローチのより深いレベルの検証を提供する。
【0571】
ヒト血小板はマウスマクロファージによって急速に分解されるため、その免疫系（例えば、ＮＳＧ）の大部分を欠くマウスモデルが必要とされる。加えて、マウス特異的抗ＣＤ４１抗体を使用する内因性マウス血小板の抗体媒介枯渇が、内因性血小板による混入効果の欠如を確実にするために含まれる。標識されたシャーシ血小板をマウスにＩＶ注射し、その後、レーザー媒介精巣挙筋血管損傷を局所的に適用して血栓形成を刺激する。損傷部位でのインビボ蛍光造影を使用して、（ｉ）血栓サイズを測定し、（ｉｉ）血栓内へのシャーシ血小板取り込みを測定する。
【0572】
肯定的な結果は、以下を含む。
●血栓のサイズは、投与された操作された血小板の数によって著しく変化しない
●操作された血小板は、成長血栓の一部ではない
●操作された血小板が血栓の一部になる場合、それらは（血栓除去時にエクスビボでアッセイされるように）活性化されない。
●血栓のサイズは、投与された操作された血小板の数によって著しく変化しない
●操作された血小板は、成長血栓の一部ではない
●操作された血小板が血栓の一部になる場合、それらは（血栓除去時にエクスビボでアッセイされるように）活性化されない。
【0573】
Ｅ．シャーシ血小板が正常な止血能力に影響を与えないことの実証
上記のように、この実験は、ＮＳＧマウス及びマウス血小板枯渇技術（例えば、マウスＣＤ４２結合モノクローナル抗体の注入）の使用を含む。ここでは、マウスに様々な割合のシャーシ血小板及びドナー血小板を接種する。マウスの尾に切れ目を入れ、マウスが出血を止めるまでの時間をアッセイする。
上記のように、この実験は、ＮＳＧマウス及びマウス血小板枯渇技術（例えば、マウスＣＤ４２結合モノクローナル抗体の注入）の使用を含む。ここでは、マウスに様々な割合のシャーシ血小板及びドナー血小板を接種する。マウスの尾に切れ目を入れ、マウスが出血を止めるまでの時間をアッセイする。
【0574】
この実験における肯定的な結果は以下のとおりである。
●ドナー血小板の注入は、短時間枠内で出血を防止する
●操作された血小板の注入は、出血を予防しないか、又はドナー血小板よりも出血を予防しない
●ドナー血小板の存在における操作された血小板の注入は、同じ濃度でのドナー血小板単独に対する出血時間に影響を与えない
●ドナー血小板の注入は、短時間枠内で出血を防止する
●操作された血小板の注入は、出血を予防しないか、又はドナー血小板よりも出血を予防しない
●ドナー血小板の存在における操作された血小板の注入は、同じ濃度でのドナー血小板単独に対する出血時間に影響を与えない
【0575】
２．同種免疫の低減のために設計されたβ２Ｍノックアウト系統の試験
上記のように（１．１ベータ２ミクログロブリン（ｂ２Ｍ）発現の破壊を参照されたい）、β２Ｍ遺伝子の破壊は、いくつかの状況において有利であると予想される。β２Ｍノックアウトは、ｉＰＳＣ細胞からのＭＫ及びＰＬＰの分化及び産生に影響を及ぼさず、表現型又は機能にも影響を及ぼさない。
上記のように（１．１ベータ２ミクログロブリン（ｂ２Ｍ）発現の破壊を参照されたい）、β２Ｍ遺伝子の破壊は、いくつかの状況において有利であると予想される。β２Ｍノックアウトは、ｉＰＳＣ細胞からのＭＫ及びＰＬＰの分化及び産生に影響を及ぼさず、表現型又は機能にも影響を及ぼさない。
【0576】
上記遺伝子のノックアウトを特徴とするｉＰＳＣを、実施例５に記載の方法論を使用して生成した。Ｂ２Ｍを標的とするガイドＲＮＡを実施例５に記載されるように設計し、高効率ガイドをスクリーニングによって選択した（図１８）。
【0577】
このβ２Ｍノックアウトを特徴付けるために、フローサイトメトリーを使用して、β２Ｍ及びＨＬＡの非存在を評価し、ここで、本発明者らの細胞上で発現される特異的ＨＬＡは、遺伝子型決定によって決定されている。本発明者らの細胞の特異的ＨＬＡ及びβ２Ｍに対して標的化された抗体は、ノックアウト後のこれらのタンパク質の非存在を特徴付けるために使用される（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ １４：４９－５９）。
【0578】
ＨＬＡ活性の低減の特徴付けは、補体依存性細胞傷害性及び抗体媒介細胞傷害性を評価することによって行われ、ＨＬＡ ＫＯは、溶解の低減によって特徴付けられる（Ｍｏｌ Ｍｅｄ ２２：２７４－２８５）。細胞を補体結合ドナー特異的抗ＨＬＡ抗体とともにインキュベートする。非特異的（細胞上に発現されないＨＬＡに特異的）を対照として使用する。補体の添加のみが、ＨＬＡ発現ＭＫの溶解を実証する。代替的に、抗体依存性細胞傷害キットを、本発明者らのｉＰＳＣのＨＬＡを標的とする特異的抗体とともに使用する。β２Ｍ ＫＯは、ＨＬＡ発現の低減によってＡＤＣＣの溶解能を低減する。
【0579】
３．シャーシ血小板活性化時の成熟ＴＧＦβ放出の低減のために設計されたＧＡＲＰノックアウト系統の試験
血小板は、全身的に、並びに腫瘍微小環境において、分裂促進性ＴＧＦβタンパク質の主要な供給源である。血小板は、潜在型トランスフォーミング増殖因子ベータ（Latent Transforming Growth Factor Beta、ＬＴＧＦβ）の受容体である表面糖タンパク質－Ａ反復優勢タンパク質（Glycoprotein-A Repetitions Predominant Protein、ＧＡＲＰ）を発現する。ＬＴＧＦβにおいて、成熟ＴＧＦβタンパク質は、潜伏関連ペプチド（latency-associated peptide、ＬＡＰ）に結合し、それによってＴＧＦ－ベータ受容体への結合が妨げられる。脱顆粒すると、活性化血小板は、ＧＡＲＰを劇的に上方制御し、結合したＬＴＧＦβを成熟ＴＧＦβに変換する。ＧＡＲＰの血小板特異的欠失は、腫瘍微小環境におけるＴＧＦβ活性を鈍化させ、予め確立されたがんに対する防御免疫性を増強したことが示されている（Ｍｅｔｅｌｌｉ，Ａ．ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍａｙ １，１９８（１ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）１２６．１７）。
血小板は、全身的に、並びに腫瘍微小環境において、分裂促進性ＴＧＦβタンパク質の主要な供給源である。血小板は、潜在型トランスフォーミング増殖因子ベータ（Latent Transforming Growth Factor Beta、ＬＴＧＦβ）の受容体である表面糖タンパク質－Ａ反復優勢タンパク質（Glycoprotein-A Repetitions Predominant Protein、ＧＡＲＰ）を発現する。ＬＴＧＦβにおいて、成熟ＴＧＦβタンパク質は、潜伏関連ペプチド（latency-associated peptide、ＬＡＰ）に結合し、それによってＴＧＦ－ベータ受容体への結合が妨げられる。脱顆粒すると、活性化血小板は、ＧＡＲＰを劇的に上方制御し、結合したＬＴＧＦβを成熟ＴＧＦβに変換する。ＧＡＲＰの血小板特異的欠失は、腫瘍微小環境におけるＴＧＦβ活性を鈍化させ、予め確立されたがんに対する防御免疫性を増強したことが示されている（Ｍｅｔｅｌｌｉ，Ａ．ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍａｙ １，１９８（１ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）１２６．１７）。
【0580】
上記遺伝子のノックアウトを特徴とするｉＰＳＣを、実施例５に記載される方法論を使用して生成した。ＬＲＲＣ３２を標的とするガイドＲＮＡを実施例５に記載されるように設計し、高効率ガイドをスクリーニングによって選択した（図１９）。
【0581】
ＬＲＲＣ３２ノックアウトは、ｉＰＳＣ細胞からのＭＫ及びＰＬＰの分化及び産生に影響を与えず、表現型又は機能にも影響を与えない（ＰＬｏＳ ＯＮＥ １２（３）：ｅ０１７３３２９）。
【0582】
ＬＲＲＣ３２ノックアウトは、ＭＫ及び血小板表面にＧＡＲＰタンパク質が存在しないことを実証するために、ＧＡＲＰ特異的抗体を使用するフローサイトメトリーによって評価される、ＧＡＲＰの低減を特徴とする。
【0583】
ＧＡＲＰノックアウトの機能は、ＴＧＦＢ結合の低減によって現れる。これは、ＷＴ及びＫＯ血小板に結合したＴＧＦベータの測定によって決定される。ＴＧＦベータをＷＴ及びＫＯ血小板とともにインキュベートし、成功したＫＯはＴＧＦＢ結合の低減を特徴とする。ＴＧＦベータの血小板への結合は、フローサイトメトリー又はＥＬＩＳＡを特徴とする。
【0584】
ＧＡＲＰ ＫＯがＴＧＦベータ免疫細胞阻害を減低減することができるかどうかを評価するために、血小板をＴ細胞とともにインキュベートして、結合したＴＧＦベータによって引き起こされる活性の低減を実証する。活性化の低減は、ＩＦＮｇなどのサイトカイン放出によって測定される（Ｓｃｉ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２（１１）：ｅａａｉ７９１１）。ＧＡＲＰのノックアウトは、ＴＧＦベータ結合能力を低減し、したがって、血小板から観察される阻害を低減する。
【0585】
４．エキソソームＲＮＡ標的化の試験
血小板アルファ顆粒は、エキソソームを含有する。エキソソームは、約５０～２００ｎｍのサイズの小胞であり、カーゴとして核酸を含有することができる。エキソソーム産生細胞は、以前に生成されている。
血小板アルファ顆粒は、エキソソームを含有する。エキソソームは、約５０～２００ｎｍのサイズの小胞であり、カーゴとして核酸を含有することができる。エキソソーム産生細胞は、以前に生成されている。
【0586】
巨核球、したがって血小板エキソソームへの外因性ＲＮＡローディングを駆動するために、エキソソーム常在タンパク質を、ＲＮＡヘアピン結合タンパク質との融合物として操作することができる。ＲＮＡヘアピン結合タンパク質の２つの例は、Ｌ７Ａｅ及びＭＳ２である（概略図を図２３Ａに示す）。最初に、Ｌ７Ａｅに融合された既知のエキソソーム常在タンパク質（ＢＡＳＰ１）の正確な顆粒局在が、巨核球において確認された（図２３Ｂ）。ＲＮＡの共局在化を示すために、２つの異なるＲＮＡ構築物（一方はヘアピンのセットを特徴とし、他方はヘアピンを特徴としない）を試験する。ＲＮＡの局在化は、ＲＮＡ ＦＩＳＨによって確認され、蛍光標識されたＢＡＳＰ１－Ｌ７Ａｅタンパク質に対するヘアピン含有ＲＮＡの共局在化が起こる。
【0587】
【表6】
【0588】
【表7】
【0589】
ＲＮＡ及びエキソソーム指向性ローディング構築物の正確な局在化が血小板及び巨核球において示されたら、活性化時の血小板及び巨核球からのエキソソームの放出を調べた。血小板及び巨核球は、既知のアゴニスト（例えば、ＰＭＡ、ＣＲＰ／ＴＲＡＰ－６／ＡＤＰ）を使用して活性化され、これはアルファ顆粒エキソサイトーシス（さもなければ、脱顆粒と呼ばれる）を駆動する。エキソソームは、市販のキット又は遠心分離に基づくアプローチのいずれかによって収集される。ＲＮＡをエキソソームから抽出し、外因性ＲＮＡの存在又は非存在についてｑＰＣＲによってアッセイする。陰性対照として、非標的化（すなわち、ヘアピン陰性）ＲＮＡを使用し、ＢＡＳＰ－Ｌ７Ａｅを発現しない巨核球／血小板バックグラウンドにおけるヘアピン含有ＲＮＡも試験する。これにより、巨核球及び血小板アルファ顆粒へのＲＮＡのエキソソーム特異的ローディング、並びに血小板及び巨核球が、あるアゴニスト単独に応答してこれらのロードされたエキソソームを条件付きで放出する能力が確認される。
【0590】
いくつかの近くの細胞において遺伝子発現を駆動するこれらのロードされたエキソソームの能力を実証するために、本発明者らのヘアピン標的化アプローチによってロードされたＲＮＡは、レポーター遺伝子ＯＲＦ（例えば、ＧＦＰ）を特徴とする。標的細胞の近傍で血小板又は巨核球が活性化されると、レポーターＲＮＡを含有するエキソソームは、血小板又は巨核球アルファ顆粒から放出された後、近傍の細胞によって取り込まれる。フローサイトメトリー分析を実行することによって、標的細胞は、特異的細胞表面マーカー発現に基づいてゲート化され、次いで、レポーター遺伝子発現のレベルが測定される。レポーター遺伝子発現は、外因性ＲＮＡが巨核球又は血小板エキソソームコンパートメントに適切に標的化された場合、及び血小板又は巨核球の活性化の際にのみ、標的細胞においてのみ増加する。
【0591】
５．血小板ＭＨＣ－Ｂ２Ｍ－ＣＡＲによる抗原特異的Ｔ細胞標的化
単一タンパクへのＭＨＣ、Ｂ２Ｍ、抗原由来ペプチド及び内部血小板ＣＡＲシグナル伝達ドメインの融合は、抗原特異的Ｔ細胞へのカーゴ含有ｓｙｎｌｅｔの標的化を可能にする。この仮説を試験するために、概念実証ペプチド－ＭＨＣ－Ｂ２Ｍ－ＣＡＲ構築物（ＭＨＣ－ＣＡＲ）を操作して、ＨＬＡ－Ａ＊０２との関連でＭＡＲＴ１及びＮＹ－ＥＳＯ－１を標的化した。異なる膜貫通ドメイン領域及び内部シグナル伝達領域を利用して、異なるバリアントを生成した。
単一タンパクへのＭＨＣ、Ｂ２Ｍ、抗原由来ペプチド及び内部血小板ＣＡＲシグナル伝達ドメインの融合は、抗原特異的Ｔ細胞へのカーゴ含有ｓｙｎｌｅｔの標的化を可能にする。この仮説を試験するために、概念実証ペプチド－ＭＨＣ－Ｂ２Ｍ－ＣＡＲ構築物（ＭＨＣ－ＣＡＲ）を操作して、ＨＬＡ－Ａ＊０２との関連でＭＡＲＴ１及びＮＹ－ＥＳＯ－１を標的化した。異なる膜貫通ドメイン領域及び内部シグナル伝達領域を利用して、異なるバリアントを生成した。
【0592】
【表8】
【0593】
【表9】
【0594】
【表10】
【0595】
【表11】
【0596】
【表12】
【0597】
【表13】
【0598】
【表14】
【0599】
【表15】
【0600】
【表16】
【0601】
【表17】
【0602】
【表18】
【0603】
【表19】
【0604】
【表20】
【0605】
【表21】
【0606】
【表22】
【0607】
【表23】
【0608】
ＭＨＣ－ＣＡＲの発現について最初にアッセイするために、それらをＢ２Ｍ ＫＯ ｉＰＳＣ及びＭＫ細胞株に挿入する。ＭＨＣ－ＣＡＲの表面発現は、Ｂ２Ｍ表面発現（これは、Ｂ２Ｍを含有するＭＨＣ－ＣＡＲの非存在下では、Ｂ２Ｍ ＫＯバックグラウンドには存在しない）のＦＡＣＳベースの測定によって確認される。ＭＨＣ－ＣＡＲの機能的発現を更に確認するために、組換えＴＣＲ及びペプチド－ＭＨＣに対して特異的に産生された抗体も使用される。
【0609】
ＭＨＣ－ＣＡＲの導入並びにｉＰＳＣ、巨核球及び血小板における発現の確認後、ｃａｒの機能性が調査される。ＭＨＣ－ＣＡＲを標的とすることが知られているＴＣＲを発現する、Ｊｕｒｋａｔ又はいくつかの他のＴ細胞株を、ＭＨＣ－ＣＡＲを発現する血小板又は巨核球と混合する。血小板活性化は、ＦＡＣＳによって測定されるような血小板表面上のＰ－セレクチン（若しくはいくつかの他の脱顆粒依存性表面マーカー）の曝露を通して、又は血小板カーゴ放出のＥＬＩＳＡベースの検出を通して、標的ＴＣＲを発現するＴ細胞への結合時にアッセイされる。
【0610】
ＭＨＣ－ＣＡＲを発現するＳｙｎｌｅｔに異なるカーゴをロードし、次いで、それらのカーゴがＴＣＲを発現するＴ細胞活性化状態を刺激する能力についてアッセイする（例えば、Ｔ細胞サイトカイン生産、Ｔ細胞増殖、既知の活性化マーカーについてのＴ細胞性ＦＡＣのＥＬＩＳＡベースの測定、及び顕微鏡又はＦＡＣによって測定されるＴ細胞性ＮＦＡＴレポーター遺伝子活性化の測定などの遺伝的アプローチを介して）。
【0611】
本発明はまた、参照により本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０２０／０５３２４７号の段落［０２８７］～［３５３］に記載されている、いくつかの特定の実施形態を提供する。
【0612】
本発明はまた、番号付けされた段落として提示される以下の実施形態を提供する。
１． キメラ血小板受容体（ＣＰＲ）であって、受容体が、
ａ）血小板調節ドメインである細胞内ドメインと、
ｂ）標的を認識して結合する異種標的結合ドメインと、を含む、キメラ血小板受容体。
２． 標的結合ドメインが、対象にとって内因性である標的に結合し、任意選択で、標的が、ヒト標的である、段落１に記載のＣＰＲ。
３． 標的が、細胞表面又は組織表面に存在する、先行の段落のいずれかに記載のＣＰＲ。
４． 標的が、ＣＰＲが血小板膜に存在する場合、標的が標的結合ドメインに結合した後、ＣＰＲが原形質膜上にクラスター化するような標的である、先行の段落いずれかに記載のＣＰＲ。
５． ＣＰＲが血小板膜に存在する場合、標的が標的結合ドメインに結合した後、血小板調節ドメインが活性化される、先行の段落のいずれかに記載のＣＰＲ。
６． ＣＰＲが血小板原形質膜に存在する場合、標的への標的結合ドメインの結合後、ＣＰＲが血小板原形質膜の表面にクラスター化し、当該クラスター化が、血小板調節ドメインを活性化するのに十分である、先行の段落のいずれかに記載のＣＰＲ。
７． 標的結合ドメインが、ヒト標的結合ドメイン配列、又はヒト標的結合ドメイン配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％若しくは１００％の配列同一性を有する配列を含む、先行の段落のいずれかに記載のＣＰＲ。
８． 標的結合ドメインが、非ヒト標的結合ドメイン配列、任意選択で、
ヒト化配列、又は
マウス由来の配列を含む、先行の段落のいずれかに記載のＣＰＲ。
９． 当該標的結合ドメインが、当該標的に特異的に結合する標的結合リガンド又はそのフラグメントを含む、先行の段落のいずれかに記載のＣＰＲ。
１１． 当該標的結合ドメインが、当該標的に特異的に結合する抗体又は抗体フラグメントを含む、先行の段落のいずれかに記載のＣＰＲ。
１２． 当該標的結合ドメインが、可変重鎖ドメイン及び／又は可変軽鎖ドメイン、任意選択でｓｃＦＶを含む、先行の段落のいずれかに記載のＣＰＲ。
１３． 標的が、腫瘍抗原、新抗原又は自己抗原である、先行の段落のいずれかに記載のＣＰＲ。
１４． 標的が、
ａ）疾患、障害若しくは状態に関連する抗原、及び／又は
ｂ）対象の体内の標的組織若しくは細胞（任意選択で、標的組織又は細胞が、がん組織又は細胞である）、及び／又は
ｃ）自己免疫Ｂ細胞である、先行の段落のいずれかに記載のＣＰＲ。
１５． 標的結合ドメインが、
ａ）ＦＣＥＲＧ ＥＣドメイン、ＣＬＥＣ１ ＥＣドメイン、ＦＣＧＲ２ ＥＣドメイン、ＧＰＶＩＡ ＥＣドメイン、ＣＥＡＣＡＭ１ ＥＣドメイン、Ｇ６ｂ－Ｂ ＥＣドメイン、ＬＩＬＲＢ２ ＥＣドメイン、ＰＥＣＡＭ１ ＥＣドメイン、ＴＬＴ１ ＥＣドメイン及び／又はＦＣＥＲＧ ＥＣドメイン、ＣＬＥＣ１ ＥＣドメイン、ＦＣＧＲ２ ＥＣドメイン、ＧＰＶＩＡ ＥＣドメイン、ＣＥＡＣＡＭ１ ＥＣドメイン、Ｇ６ｂ－Ｂ ＥＣドメイン、ＬＩＬＲＢ２ ＥＣドメイン、ＰＥＣＡＭ１ ＥＣドメイン及び／若しくはＴＬＴ１ ＥＣドメインに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％若しくは１００％の配列同一性を有する配列、並びに／あるいは
ｂ）標的結合ドメインが、参照により本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０２０／０５３２４７号の４６～４９頁に記載のドメイン若しくはその部分のうちのいずれか１つ以上、又は参照により本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０２０／０５３２４７号の４６～４９頁に記載のドメイン若しくはその部分のうちのいずれか１つ以上に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％若しくは１００％の配列同一性を有する配列のうちの少なくとも１つを含む、先行の段落のいずれかに記載のＣＰＲ。
１６． 標的結合ドメインが、自己免疫に関連するペプチド、
以下のタンパク質：ＭＯＧ、ＧＡＤ６５、ＭＡＧ、ＰＭＰ２２、ＴＰＯ、ＶＧＫＣ、ＰＬＰ、ＡＣｈＲ、ＴＲＩＢ２、ＮＭＤＡ、ＧｌｕＲ、ＧＡＤ２、ＡＲＭＣ９、ＣＹＰ２１Ａ２、ＣＡＳＲ、ＮＡＳＰ、インスリン、ＴＳＨＲ、甲状腺ペルオキシダーゼ、アシオグリコタンパク質受容体、ＣＹＰ２Ｄ６、ＬＦ、ＴＴＧ、Ｈ／Ｋ ＡＴＰ－ａｓｅ、第ＸＩＩＩ因子、ベータ２－ＧＰＩ、ＩＴＧＢ２、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＰ ＩＩｂ／ＩＩａ、ＣＯＬＩＩ、ＦＢＧベータアルファ、ＭＰＯ、ＣＹＯ、ＰＲＴＮ３、ＴＧＭ、ＣＯＬＶＩＩ、ＣＯＩＬ、ＤＳＧ１、ＤＳＧ３、ＳＯＸ１０、７０ＳＮＲＮＰ７０、ＳＡＧ及びａ３（ＩＶ）ＮＣ１コラーゲンのうちのいずれか１つ以上のペプチド若しくは部分、又は
以下のタンパク質：ＭＯＧ、ＧＡＤ６５、ＭＡＧ、ＰＭＰ２２、ＴＰＯ、ＶＧＫＣ、ＰＬＰ、ＡＣｈＲ、ＴＲＩＢ２、ＮＭＤＡ、ＧｌｕＲ、ＧＡＤ２、ＡＲＭＣ９、ＣＹＰ２１Ａ２、ＣＡＳＲ、ＮＡＳＰ、インスリン、ＴＳＨＲ、甲状腺ペルオキシダーゼ、アシオグリコタンパク質受容体、ＣＹＰ２Ｄ６、ＬＦ、ＴＴＧ、Ｈ／Ｋ ＡＴＰ－ａｓｅ、第ＸＩＩＩ因子、ベータ２－ＧＰＩ、ＩＴＧＢ２、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＰ ＩＩｂ／ＩＩａ、ＣＯＬＩＩ、ＦＢＧベータアルファ、ＭＰＯ、ＣＹＯ、ＰＲＴＮ３、ＴＧＭ、ＣＯＬＶＩＩ、ＣＯＩＬ、ＤＳＧ１、ＤＳＧ３、ＳＯＸ１０、７０ＳＮＲＮＰ７０、ＳＡＧ及びａ３（ＩＶ）ＮＣ１コラーゲンのうちのいずれか１つ以上に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％若しくは１００％の配列同一性を有するペプチド若しくは部分を含む、先行の段落のいずれかに記載のＣＰＲ。
１７． 標的結合ドメインが、標的に結合し、当該標的が、
ａ）対象の体内の組織上又は対象の細胞上若しくは特定の位置に見出される内因性標的であり、
ｂ）対象の組織上、又は組織の特定のサブセット上、又は血漿若しくは血液中、任意選択でヒト対象において、任意選択で血液中に存在し、
ｃ）１つ以上の疾患状態の間にのみ提示され、任意選択で、標的が、腫瘍細胞中で生じる新抗原であり、
ｄ）通常は標的を発現しない組織若しくは細胞上に著しい量で、任意選択で異常なレベルでのみ存在し、及び／又は１つ以上の疾患状態の間に局在化してのみ存在し、
ｅ）抗原、任意選択で腫瘍新抗原又は腫瘍特異的抗原であり、
ｆ）ＣＤ１９であり、
ｇ）サイトカイン受容体であり、
ｈ）コラーゲンではなく、
ｉ）人工若しくは外因性標的であり、
ｊ）デザイナー薬物であり、
ｋ）ＤＲＥＡＤＤを使用して設計された薬物であり、
ｌ）参照により本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０２０／０５３２４７号の２３～３１頁の表２から選択されるタンパク質であり、
ｍ）ＣＤ２７６であり、かつ／あるいは
ｎ）ＩＬ２、ＫＬＫ、アミロイド、Ｎｏｔｃｈ受容体及び／若しくはＯＬＲ１である、標的に結合する、先行の段落のいずれかに記載のＣＰＲ。
１８． 標的結合ドメインが、
ａ）抗体若しくはその抗原結合フラグメントであり、
ｂ）抗体の可変重鎖ドメイン及び／若しくは抗体の可変軽鎖ドメインを含み、かつ／又は
ｃ）カッパ軽鎖若しくはそのフラグメント標的化を含む、先行の段落のいずれかに記載のＣＰＲ。
１９． 標的結合ドメインが、自己免疫に関連するタンパク質又はペプチドの一部を含む、先行の段落のいずれかに記載のＣＰＲ。
２０． 血小板調節ドメインが、血小板活性化ドメイン、任意選択でＩＴＡＭを含むドメイン、任意選択で血小板ＩＴＡＭを含むドメインであり、任意選択でＩＴＡＭを含むドメイン、任意選択で血小板ＩＴＡＭを含むドメインに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％又は１００％の配列同一性を有するドメインである、先行の段落のいずれかに記載のＣＰＲ。
２１．ＣＰＲが血小板の膜に存在する場合、活性化されると、血小板活性化ドメインが、
ａ）血小板の脱顆粒をもたらす、
ｂ）血小板からの内容物の放出をもたらす、
ｃ）血小板の原形質膜上に血小板内内容物の存在をもたらす、
ｄ）原形質膜からのブレブ形成を介した細胞外小胞の放出をもたらす、及び／又は
ｅ）両凹ディスクから完全に広がった細胞フラグメントへの血小板の形状の変化をもたらす、先行の段落のいずれかに記載のＣＰＲ。
２２． 血小板活性化ドメインが、血小板脱顆粒誘発ドメインである、先行の段落のいずれかに記載のＣＰＲ。
２３． 血小板調節ドメインが、血小板の活性化を防止する血小板活性化阻害ドメインであり、任意選択で、血小板活性化阻害ドメインが、ＩＴＩＭを含むドメインであり、任意選択で、ＩＴＩＭを含むドメインに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％又は１００％の配列同一性を有するドメインである、先行の段落のいずれかに記載のＣＰＲ。
２４．ＣＰＲが血小板の膜に存在する場合、及び血小板活性化ドメインの阻害が活性化される場合、活性化ドメインの血小板阻害が、
ａ）血小板の脱顆粒を防止する、
ｂ）血小板からの内容物の放出を防止する、
ｃ）血小板の原形質膜上の細胞内内容物の存在を防止する、
ｄ）原形質膜からのブレブ形成を介した細胞外小胞の放出を防止する、及び／又は
ｅ）両凹ディスクから完全に広がった細胞フラグメントへの血小板の形状の変化を防止する、先行の段落のいずれかに記載のＣＰＲ。
２５． 血小板活性化ドメインが、血小板脱顆粒誘発ドメインである、先行の段落のいずれかに記載のＣＰＲ。
２６． 血小板調節ドメインが、ヒト調節ドメイン配列を含む、先行の段落のいずれかに記載のＣＰＲ。
２７． 血小板調節ドメインが、非ヒト調節ドメイン配列、任意選択でマウス由来の配列を含む、先行の段落のいずれかに記載のＣＰＲ。
２８． 血小板調節ドメインが、ＣＰＲがともに使用される前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシに対して内因性であり、任意選択で、血小板調節ドメインが、ｉＰＳＣ、巨核球又は血小板に対して内因性である、先行の段落のいずれかに記載のＣＰＲ。
２９． 血小板調節ドメインが、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）受容体由来のドメインを含まず、任意選択で、糖タンパク質ＶＩ（ＧＰＶＩ）、Ｃ型レクチン様受容体２（ＣＬＥＣ－２）、ＩｇＧ受容体ＩＩａのＦｃフラグメント（ＦＣｇＲ２Ａ）、高親和性免疫グロブリンイプシロン受容体サブユニットガンマ（ＦＣＥＲＧ）、Ｃ型レクチンドメインファミリー１（ＣＬＥＣ１）、又はＩｇＧ受容体ＩＩのＦｃフラグメント（ＦＣＧＲ２）からの１つ以上のドメイン、それらの部分又はフラグメントを含まない、先行の段落のいずれかに記載のＣＰＲ。
３０． ＣＰＲが血小板原形質膜に局在する場合、標的が標的結合ドメインに結合した後、血小板調節ドメインが血小板の脱顆粒を誘発する、先行の段落のいずれかに記載のＣＰＲ。
３１． 血小板調節ドメインが、血小板脱顆粒誘発ドメインであり、
免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）受容体からの１つ以上のドメインを含み、任意選択で、糖タンパク質ＶＩ（ＧＰＶＩ）、Ｃ型レクチン様受容体２（ＣＬＥＣ－２）、ＩｇＧ受容体ＩＩａのＦｃフラグメント（ＦＣｇＲ２Ａ）、高親和性免疫グロブリンイプシロン受容体サブユニットガンマ（ＦＣＥＲＧ）、Ｃ型レクチンドメインファミリー１（ＣＬＥＣ１）、若しくはＩｇＧ受容体ＩＩのＦｃフラグメント（ＦＣＧＲ２）からの１つ以上のドメイン、それらの部分若しくはフラグメントを含むか、又は
ＩＴＡＭを含むドメイン、任意選択で、血小板ＩＴＡＭを含むドメインに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％若しくは１００％の配列同一性を有する、任意選択で、糖タンパク質ＶＩ（ＧＰＶＩ）、Ｃ型レクチン様受容体２（ＣＬＥＣ－２）、ＩｇＧ受容体ＩＩａのＦｃフラグメント（ＦＣｇＲ２Ａ）、高親和性免疫グロブリンイプシロン受容体サブユニットガンマ（ＦＣＥＲＧ）、Ｃ型レクチンドメインファミリー１（ＣＬＥＣ１）、若しくはＩｇＧ受容体ＩＩのＦｃフラグメント（ＦＣＧＲ２）からの１つ以上のドメイン、それらの部分若しくはフラグメントに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％若しくは１００％の配列同一性を有するドメインを含む、先行の段落のいずれかに記載のＣＰＲ。
３２． 血小板調節ドメインが、血小板脱顆粒の誘発を阻害する血小板活性化ドメインの阻害であり、１つ以上のＩＴＩＭモチーフを含み、任意選択で、１つ以上のＩＴＩＭモチーフが、ＰＥＣＡＭ１、ＴＬＴ１、ＬＩＬＲＢ２、ＣＥＡＣＡＭ１又はＧ６ｂ－Ｂ由来のＩＴＩＭモチーフであり、任意選択で、
ＬＩＬＲＢ２由来のＩＴＩＭドメインが、参照により本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０２０／０５３２４７号の４４頁の表５に示される配列番号３４であり、
ＰＥＣＡＭ１由来のＩＴＩＭドメインが、参照により本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０２０／０５３２４７号の４４頁の表５に示される配列番号３８であり、
ＣＥＡＣＡＭ１由来のＩＴＩＭドメインが、参照により本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０２０／０５３２４７号の４４頁の表５に示される配列番号２４である、先行の段落のいずれかに記載のＣＰＲ。
３３． 血小板調節ドメインが、天然の血小板調節ドメイン配列に対して１つ以上の変異、挿入又は欠失を含む、先行の段落のいずれかに記載のＣＰＲ。
３４． 天然の調節ドメイン配列に対する１つ以上の変異、挿入又は欠失が、１つ以上の変異を含まない血小板調節ドメインを含むＣＰＲに対して、ＣＰＲの感受性を増加させる、先行の段落のいずれかに記載のＣＰＲ。
３５． 天然の調節ドメイン配列に対する１つ以上の変異、挿入又は欠失が、１つ以上の変異を含まない血小板調節ドメインを含むＣＰＲに対して、ＣＰＲの感受性を減少させる、先行の段落のいずれかに記載のＣＰＲ。
３６．血小板調節ドメインが、天然に存在する血小板調節ドメインに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％又は１００％の配列同一性を含む、先行の段落のいずれか１つに記載のＣＰＲ。
３７． シグナルペプチド及び／又はリンカー配列を更に含み、任意選択で、
シグナルペプチドが、表１に示される配列の一部を含むか若しくはそれからなり、かつ／又は、
シグナルペプチドが、参照により本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０２０／０５３２４７号の４６頁の表７の配列のうちのいずれかの一部を含むか若しくはそれからなり、かつ／又は
任意選択で、リンカーが、参照により本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０２０／０５３２４７号の５１頁に記載されているリンカー若しくはその部分を含むか若しくはそれからなる、先行の段落のいずれかに記載のＣＰＲ。
３８． 膜貫通ドメインを更に含み、任意選択で、膜貫通ドメインが、参照により本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０２０／０５３２４７号の４９～５０頁に記載されている膜貫通ドメイン又はその部分のうちのいずれか１つ以上を含むか又はそれらからなる、先行の段落のいずれかに記載のＣＰＲ。
３９． ＣＰＲが、参照により本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０２０／０５３２４７号の５０頁及び５１頁に記載されている細胞内ドメイン又はその部分を含むか又はそれからなる細胞内ドメインを含む、先行の段落のいずれかに記載のＣＰＲ。
４０． ＣＰＲが、参照により本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０２０／０５３２４７号の４１～６３頁に記載されているドメインの組み合わせを含むか又はそれからなる、先行の段落のいずれかに記載のＣＰＲ。
４１． ユニバーサルキメラ血小板受容体であって、受容体が、
ａ）血小板調節ドメインである細胞内ドメインと、
ｂ）異種タグ結合ドメインと、を含む、ユニバーサルキメラ血小板受容体。
４２． タグ及び標的結合ドメインを含むタグ付標的化ペプチドであって、任意選択で、タグ付標的化ペプチドが、可溶性ペプチドである、タグ付標的化ペプチド。
４３． タグが、ロイシンジッパーである、段落４３に記載のタグ付標的化ペプチド。
４４． 異種タグ結合ドメインが、タグ付標的化ペプチド上に存在するタグに結合し、タグ付標的化ペプチドが、タグ及び標的結合ドメインを含み、かつ
ユニバーサルＣＰＲが血小板原形質膜に位置する場合、標的への標的結合ドメインの同時結合の非存在下でのユニバーサルＣＰＲへの標的化ペプチドの結合は、血小板調節ドメインを活性化するのに十分ではない、段落４１に記載のユニバーサルＣＰＲ。
４５． 異種タグ結合ドメインが、標的化ペプチド上に存在するタグに結合し、ユニバーサルＣＰＲが血小板原形質膜に位置する場合、標的へのタグ付標的結合ドメインの同時結合の非存在下での、ユニバーサルＣＰＲへの標的化ペプチドの結合が、血小板調節ドメインの活性化をもたらすのに十分な受容体クラスター化を引き起こさない、段落４１又は４４に記載のユニバーサルＣＰＲ。
４６． タグ付標的化ペプチドが、可溶性ペプチドである、先行の段落２に記載のユニバーサルＣＰＲ。
４７． 異種タグ結合ドメインが、ロイシンジッパーを含む、先行の段落のいずれかに記載のユニバーサルＣＰＲ。
４８． 段落４１及び４４～４７のいずれかに記載のユニバーサルＣＰＲと、段落４２又は４３に記載の標的化ペプチドと、を含む、複合体であって、ユニバーサルＣＰＲが、異種タグ結合ドメインを介してタグ付標的化ペプチド上の対応するタグに結合している、複合体。
４９． 標的結合ドメインが、意図される対象に対して内因性である標的に結合し、任意選択で、標的がヒト標的である、段落４２若しくは４３に記載のタグ付標的化ペプチド又は段落４８に記載の複合体。
５０． 標的が、細胞表面又は組織表面に存在する、段落４２、４３若しくは４９のいずれかに記載のタグ付標的化ペプチド、又は段落４８若しくは４９に記載の複合体。
５１． 複合体が血小板の原形質膜に位置する場合、標的が、複合体による標的結合が原形質膜上の複合体クラスター化をもたらすような標的であり、任意選択で、当該クラスター化が、血小板調節ドメインを活性化するのに十分である、段落４８～５０のいずれかに記載の複合体。
５２． 複合体が血小板原形質膜に位置する場合、標的への複合体の結合が、血小板調節ドメインを活性化する、段落４８～５１のいずれかに記載の複合体。
５３． 標的結合ドメインが、ヒト標的結合ドメイン配列又はヒト標的結合ドメイン配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％若しくは１００％の配列同一性を有する配列を含む、段落４２、４３、４９若しくは５０のいずれかに記載のタグ付標的化ペプチド又は段落４８～５２のいずれかに記載の複合体。
５４． 標的結合ドメインが、非ヒト標的結合ドメイン配列、任意選択で、
ヒト化配列、又は
マウス由来の配列を含む、段落４２、４３、４９、５０若しくは５３のいずれかに記載のタグ付標的化ペプチド又は段落４８～５３のいずれかに記載の複合体。
５５． 当該標的結合ドメインが、当該標的に特異的に結合する標的結合リガンド又はそのフラグメントを含む、段落４２、４３、４９、５０、５３若しくは５４のいずれかに記載のタグ付標的化ペプチド又は段落４８～５４のいずれかに記載の複合体。
５６． 当該標的結合ドメインが、当該標的に特異的に結合する抗体又は抗体フラグメントを含む、段落４２、４３、４９、５０、若しくは５３～５５ ５４のいずれかに記載のタグ付標的化ペプチド又は段落４８～５５のいずれかに記載の複合体。
５７． 当該標的結合ドメインが、可変重鎖ドメイン及び／又は可変軽鎖ドメイン、任意選択で、ｓｃＦＶを含む、段落４２、４３、４９、５０、若しくは５３～５６のいずれかに記載のタグ付標的化ペプチド又は段落４８～５６のいずれかに記載の複合体。
５８． 標的が、腫瘍抗原、新抗原又は自己抗原である、段落４２、４３、４９、５０若しくは５３～５７のいずれかに記載のタグ付標的化ペプチド又は段落４８～５７のいずれかに記載の複合体。
５９． 標的が、
ａ）疾患、障害若しくは状態に関連する抗原、及び／又は
ｂ）対象の体内の標的組織若しくは細胞であり、任意選択で、標的組織又は細胞が、がん組織又は細胞である、段落４２、４３、４９、５０、若しくは５３～５８のいずれかに記載のタグ付標的化ペプチド又は段落４８～５８のいずれかに記載の複合体。
６０． 標的結合ドメインが、
ａ）ＦＣＥＲＧ ＥＣドメイン、ＣＬＥＣ１ ＥＣドメイン、ＦＣＧＲ２ ＥＣドメイン、ＧＰＶＩＡ ＥＣドメイン、ＣＥＡＣＡＭ１ ＥＣドメイン、Ｇ６ｂ－Ｂ ＥＣドメイン、ＬＩＬＲＢ２ ＥＣドメイン、ＰＥＣＡＭ１ ＥＣドメイン、及び／若しくはＴＬＴ１ ＥＣドメイン、又はＦＣＥＲＧ ＥＣドメイン、ＣＬＥＣ１ ＥＣドメイン、ＦＣＧＲ２ ＥＣドメイン、ＧＰＶＩＡ ＥＣドメイン、ＣＥＡＣＡＭ１ ＥＣドメイン、Ｇ６ｂ－Ｂ ＥＣドメイン、ＬＩＬＲＢ２ ＥＣドメイン、ＰＥＣＡＭ１ ＥＣドメイン及び／若しくはＴＬＴ１ ＥＣドメインに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％若しくは１００％の配列同一性を有する配列、並びに／あるいは
ｂ）標的結合ドメインが、参照により本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０２０／０５３２４７号の４６～４９頁に記載のドメイン若しくはその部分のうちのいずれか１つ以上、又は参照により本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０２０／０５３２４７号の４６～４９頁に記載のドメイン若しくはその部分のうちのいずれか１つ以上に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％若しくは１００％の配列同一性を有する配列のうちの少なくとも１つを含む、段落４２、４３、４９、５０、若しくは５３～５９のいずれかに記載のタグ付標的化ペプチド又は段落４８～５９のいずれかに記載の複合体。
６１． 標的結合ドメインが、自己免疫に関連するペプチド、任意選択で、
以下のタンパク質：ＭＯＧ、ＧＡＤ６５、ＭＡＧ、ＰＭＰ２２、ＴＰＯ、ＶＧＫＣ、ＰＬＰ、ＡＣｈＲ、ＴＲＩＢ２、ＮＭＤＡ、ＧｌｕＲ、ＧＡＤ２、ＡＲＭＣ９、ＣＹＰ２１Ａ２、ＣＡＳＲ、ＮＡＳＰ、インスリン、ＴＳＨＲ、甲状腺ペルオキシダーゼ、アシオグリコタンパク質受容体、ＣＹＰ２Ｄ６、ＬＦ、ＴＴＧ、Ｈ／Ｋ ＡＴＰ－ａｓｅ、第ＸＩＩＩ因子、ベータ２－ＧＰＩ、ＩＴＧＢ２、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＰ ＩＩｂ／ＩＩａ、ＣＯＬＩＩ、ＦＢＧベータアルファ、ＭＰＯ、ＣＹＯ、ＰＲＴＮ３、ＴＧＭ、ＣＯＬＶＩＩ、ＣＯＩＬ、ＤＳＧ１、ＤＳＧ３、ＳＯＸ１０、７０ＳＮＲＮＰ７０、ＳＡＧ及びａ３（ＩＶ）ＮＣ１コラーゲンのうちのいずれか１つ以上のペプチド若しくは部分、又は
以下のタンパク質：ＭＯＧ、ＧＡＤ６５、ＭＡＧ、ＰＭＰ２２、ＴＰＯ、ＶＧＫＣ、ＰＬＰ、ＡＣｈＲ、ＴＲＩＢ２、ＮＭＤＡ、ＧｌｕＲ、ＧＡＤ２、ＡＲＭＣ９、ＣＹＰ２１Ａ２、ＣＡＳＲ、ＮＡＳＰ、インスリン、ＴＳＨＲ、甲状腺ペルオキシダーゼ、アシオグリコタンパク質受容体、ＣＹＰ２Ｄ６、ＬＦ、ＴＴＧ、Ｈ／Ｋ ＡＴＰ－ａｓｅ、第ＸＩＩＩ因子、ベータ２－ＧＰＩ、ＩＴＧＢ２、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＰ ＩＩｂ／ＩＩａ、ＣＯＬＩＩ、ＦＢＧベータアルファ、ＭＰＯ、ＣＹＯ、ＰＲＴＮ３、ＴＧＭ、ＣＯＬＶＩＩ、ＣＯＩＬ、ＤＳＧ１、ＤＳＧ３、ＳＯＸ１０、７０ＳＮＲＮＰ７０、ＳＡＧ及びａ３（ＩＶ）ＮＣ１コラーゲンのうちのいずれか１つ以上に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％若しくは１００％の配列同一性を有するペプチド若しくは部分を含む、段落４２、４３、４９、５０、若しくは５３～６０のいずれかに記載のタグ付標的化ペプチド又は段落４８～６０のいずれかに記載の複合体。
６２． 標的結合ドメインが、
ａ）対象の体内の組織上又は対象の細胞上若しくは特定の位置に見出される内因性標的であり、
ｂ）対象の組織上、又は組織の特定のサブセット上、又は血漿若しくは血液中、任意選択でヒト対象において、任意選択で血液中に存在し、
ｃ）１つ以上の疾患状態の間にのみ提示され、任意選択で、標的が、腫瘍細胞中で生じる新抗原であり、
ｄ）通常は標的を発現しない組織若しくは細胞上に著しい量で、任意選択で異常なレベルでのみ存在し、及び／又は１つ以上の疾患状態の間に局在化してのみ存在し、
ｅ）抗原、任意選択で腫瘍新抗原又は腫瘍特異的抗原であり、
ｆ）ＣＤ１９であり、
ｇ）サイトカイン受容体であり、
ｈ）コラーゲンではなく、
ｉ）人工若しくは外因性標的であり、
ｊ）デザイナー薬物であり、
ｋ）ＤＲＥＡＤＤを使用して設計された薬物であり、
ｌ）参照により本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０２０／０５３２４７号の２３～３１頁の表２から選択されるタンパク質であり、
ｍ）ＣＤ２７６であり、かつ／あるいは
ｎ）ＩＬ２、ＫＬＫ、アミロイド、Ｎｏｔｃｈ受容体及び／若しくはＯＬＲ１である、標的に結合する、先行の段落のいずれかに記載の段落４２、４３、４９、５０、若しくは５３～６１のいずれかに記載のタグ付標的化ペプチド又は段落４８～６１のいずれかに記載の複合体。
６３． 標的結合ドメインが、
ａ）抗体若しくはその抗原結合フラグメントであり、
ｂ）抗体の可変重鎖ドメイン及び／若しくは抗体の可変軽鎖ドメインを含み、かつ／又は
ｃ）カッパ軽鎖若しくはそのフラグメント標的化を含む、段落４２、４３、４９、５０、若しくは５３～６２のいずれかに記載のタグ付標的化ペプチド又は段落４８～６２のいずれかに記載の複合体。
６４． 標的結合ドメインが、自己免疫に関連するタンパク質又はペプチドの部分を含む、段落４２、４３、４９、５０、若しくは５３～６３のいずれかに記載のタグ付標的化ペプチド又は段落４８～６３のいずれかに記載の複合体。
６５． 血小板調節ドメインが、血小板活性化ドメイン、任意選択でＩＴＡＭを含むドメイン、任意選択で血小板ＩＴＡＭを含むドメインであり、任意選択でＩＴＡＭを含むドメイン、任意選択で血小板ＩＴＡＭを含むドメインに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％又は１００％の配列同一性を有するドメインである、段落４１及び４４～４７のいずれかに記載のユニバーサルＣＰＲ又は段落４８～６４のいずれかに記載の複合体。
６６． 血小板調節ドメインが、血小板活性化ドメインであり、任意選択で、血小板活性化ドメインが、脱顆粒誘発ドメインである、段落４１、４４～４７及び６５のいずれかに記載のユニバーサルＣＰＲ又は段落４８～６５のいずれかに記載の複合体。
６７． ユニバーサルＣＰＲ又は複合体が血小板の膜に存在する場合、活性化されると、血小板活性化ドメインが、
ａ）血小板の脱顆粒をもたらす、
ｂ）血小板からの内容物の放出をもたらす、
ｃ）血小板の原形質膜上に細胞内内容物の存在をもたらす、
ｄ）原形質膜からのブレブ形成を介した細胞外小胞の放出をもたらす、及び／又は
ｅ）両凹ディスクから完全に広がった細胞フラグメントへの血小板の形状の変化をもたらす、段落４１、４４～４７、６５及び６６のいずれかに記載のユニバーサルＣＰＲ又は段落４８～６６のいずれかに記載の複合体。
６８． 血小板活性化ドメインが、血小板脱顆粒誘発ドメインである、段落４１、４４～４７、及び６５～６７のいずれかに記載のユニバーサルＣＰＲ又は段落４８～６７のいずれかに記載の複合体。
６９． 血小板調節ドメインが、血小板の活性化を防止する血小板活性化阻害ドメインであり、任意選択で、血小板活性化阻害ドメインが、ＩＴＩＭを含むドメインであり、任意選択で、ＩＴＩＭを含むドメインに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％又は１００％の配列同一性を有するドメインである、段落４１、４４～４７、及び６５～６８のいずれかに記載のユニバーサルＣＰＲ又は段落４８～６８のいずれかに記載の複合体。
７０．ユニバーサルＣＰＲ又は複合体が血小板の膜に存在する場合、及び血小板活性化ドメインの阻害が活性化される場合、血小板活性化阻害ドメインが、
ａ）血小板の脱顆粒を防止する、
ｂ）血小板からの内容物の放出を防止する、
ｃ）血小板の原形質膜上の細胞内内容物の存在を防止する、
ｄ）原形質膜からのブレブ形成を介した細胞外小胞の放出を防止する、及び／又は
ｅ）両凹ディスクから完全に広がった細胞フラグメントへの血小板の形状の変化を防止する、段落４１、４４～４７、及び６５～６９のいずれかに記載のユニバーサルＣＰＲ又は段落４８～６９のいずれかに記載の複合体。
７１． 血小板調節ドメインが、ヒト調節ドメイン配列を含む、段落４１、４４～４７、及び６５～７０のいずれかに記載のユニバーサルＣＰＲ又は段落４８～７０のいずれかに記載の複合体。
７２． 血小板調節ドメインが、非ヒト調節ドメイン配列、任意選択で、マウス由来の配列を含む、段落４１、４４～４７、及び６５～７１のいずれかに記載のユニバーサルＣＰＲ又は段落４８～７１のいずれかに記載の複合体。
７３． 血小板調節ドメインが、ユニバーサルＣＰＲ又は複合体が使用される前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシに対して内因性であり、任意選択で、血小板調節ドメインが、ｉＰＳＣ、巨核球又は血小板に対して内因性である、段落４１、４４～４７及び６５～７２のいずれかに記載のユニバーサルＣＰＲ又は段落４８～７２のいずれかに記載の複合体。
７４． 血小板調節ドメインが、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）受容体由来のドメインを含まず、任意選択で、糖タンパク質ＶＩ（ＧＰＶＩ）、Ｃ型レクチン様受容体２（ＣＬＥＣ－２）、ＩｇＧ受容体ＩＩａのＦｃフラグメント（ＦＣｇＲ２Ａ）、高親和性免疫グロブリンイプシロン受容体サブユニットガンマ（ＦＣＥＲＧ）、Ｃ型レクチンドメインファミリー１（ＣＬＥＣ１）、又はＩｇＧ受容体ＩＩのＦｃフラグメント（ＦＣＧＲ２）からの１つ以上のドメイン、それらの部分又はフラグメントを含まない、段落４１、４４～４７、及び６５～７３のいずれかに記載のユニバーサルＣＰＲ又は段落４８～７３のいずれかに記載の複合体。
７５． ユニバーサルＣＰＲ又は複合体が血小板原形質膜に局在する場合、標的が標的結合ドメインに結合すると、血小板調節ドメインが血小板の脱顆粒を誘発する、段落４１、４４～４７、及び６５～７４のいずれかに記載のユニバーサルＣＰＲ又は段落４８～７４のいずれかに記載の複合体。
７６． 血小板調節ドメインが、血小板脱顆粒誘発ドメインであり、
免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）受容体からの１つ以上のドメインを含み、任意選択で、糖タンパク質ＶＩ（ＧＰＶＩ）、Ｃ型レクチン様受容体２（ＣＬＥＣ－２）、ＩｇＧ受容体ＩＩａのＦｃフラグメント（ＦＣｇＲ２Ａ）、高親和性免疫グロブリンイプシロン受容体サブユニットガンマ（ＦＣＥＲＧ）、Ｃ型レクチンドメインファミリー１（ＣＬＥＣ１）、若しくはＩｇＧ受容体ＩＩのＦｃフラグメント（ＦＣＧＲ２）からの１つ以上のドメイン、それらの部分若しくはフラグメントを含むか、又は
ＩＴＡＭを含むドメイン、任意選択で、血小板ＩＴＡＭを含むドメインに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％若しくは１００％の配列同一性を有する、任意選択で、糖タンパク質ＶＩ（ＧＰＶＩ）、Ｃ型レクチン様受容体２（ＣＬＥＣ－２）、ＩｇＧ受容体ＩＩａのＦｃフラグメント（ＦＣｇＲ２Ａ）、高親和性免疫グロブリンイプシロン受容体サブユニットガンマ（ＦＣＥＲＧ）、Ｃ型レクチンドメインファミリー１（ＣＬＥＣ１）、若しくはＩｇＧ受容体ＩＩのＦｃフラグメント（ＦＣＧＲ２）からの１つ以上のドメイン、それらの部分若しくはフラグメントに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％若しくは１００％の配列同一性を有するドメインを含む、段落４１、４４～４７、及び６５～７５のいずれかに記載のユニバーサルＣＰＲ又は段落４８～７５のいずれかに記載の複合体。
７７． 血小板調節ドメインが、血小板脱顆粒の誘発を阻害し、１つ以上のＩＴＩＭモチーフを含むドメインであり、任意選択で、１つ以上のＩＴＩＭモチーフが、ＰＥＣＡＭ１、ＴＬＴ１、ＬＩＬＲＢ２、ＣＥＡＣＡＭ１又はＧ６ｂ－Ｂ由来のＩＴＩＭモチーフであり、任意選択で、ＩＴＩＭドメインが、
ＬＩＬＲＢ２由来のＩＴＩＭドメインが、参照により本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０２０／０５３２４７号の４４頁の表５に示される配列番号３４であり、
ＰＥＣＡＭ１由来のＩＴＩＭドメインが、参照により本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０２０／０５３２４７号の４４頁の表５に示される配列番号３８であり、
ＣＥＡＣＡＭ１由来のＩＴＩＭドメインが、参照により本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０２０／０５３２４７号の４４頁の表５に示される配列番号２４である、段落４１、４４～４７、及び６５～７６のいずれかに記載のユニバーサルＣＰＲ又は段落４８～７６のいずれかに記載の複合体。
７８． 血小板調節ドメインが、天然の血小板調節ドメイン配列に対して１つ以上の変異、挿入又は欠失を含む、段落４１、４４～４７及び６５～７７のいずれかに記載のユニバーサルＣＰＲ又は段落４８～７７のいずれかに記載の複合体。
７９． 天然の調節ドメイン配列に対する１つ以上の変異、挿入又は欠失が、１つ以上の変異を含まない血小板調節ドメインを含むユニバーサルＣＰＲ又はユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体に対して、ユニバーサルＣＰＲ又はユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体の感受性を増加させる、段落７８に記載のユニバーサルＣＰＲ又は段落７８に記載の複合体。
８０． ネイティブ調節ドメイン配列に対する１つ以上の変異、挿入又は欠失が、１つ以上の変異を含まない血小板調節ドメインを含むユニバーサルＣＰＲ又はユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体に対して、ユニバーサルＣＰＲ又はユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体の感受性を減少させる、段落７８に記載のユニバーサルＣＰＲ又は段落７８に記載の複合体。
８１．血小板調節ドメインが、天然に存在する血小板調節ドメインに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％又は１００％の配列同一性を含む、段落４１、４４～４７、及び６５～８０のいずれかに記載のユニバーサルＣＰＲ又は段落４８～８０のいずれかに記載の複合体。
８２． シグナルペプチド及び／又はリンカー配列を更に含み、任意選択で、
シグナルペプチドが、表１に示される配列の一部を含むか若しくはそれからなり、かつ／又は、
シグナルペプチドが、参照により本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０２０／０５３２４７号の４６頁の表７の配列のうちのいずれかの一部を含むか若しくはそれからなりり、かつ／又は
任意選択で、リンカーが、参照により本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０２０／０５３２４７号の５１頁に記載されているリンカー若しくはその部分を含むか若しくはそれからなる、段落４１、４４～４７及び６５～８１のいずれかに記載のユニバーサルＣＰＲ又は段落４８～８１のいずれかに記載の複合体。
８３． 膜貫通ドメインを更に含み、任意選択で、膜貫通ドメインが、参照により本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０２０／０５３２４７号の４９～５０頁に記載されている膜貫通ドメイン又はその部分のうちのいずれか１つ以上を含むか又はそれらからなる、段落４１、４４～４７及び６５～８２のいずれかに記載のユニバーサルＣＰＲ又は段落４８～８２のいずれかに記載の複合体。
８４． ＣＰＲが、参照により本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０２０／０５３２４７号の５０頁及び５１頁に記載されている細胞内ドメイン又はその部分を含むか又はそれからなる細胞内ドメインを含む、段落４１、４４～４７及び６５～８３のいずれかに記載のユニバーサルＣＰＲ又は段落４８～８３のいずれかに記載の複合体。
８５． ＣＰＲが、参照により本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０２０／０５３２４７号の４１～６３頁に記載されているドメインの組み合わせを含むか又はそれからなる、段落４１、４４～４７及び６５～８４のいずれかに記載のユニバーサルＣＰＲ又は段落４８～８４のいずれかに記載の複合体。
８６． 異種標的結合ドメインを含む、合成抗原提示受容体（ＳＡＰＲ）であって、標的結合ドメインが、
ａ）細胞外ドメインであって、
ｉ）ＭＨＣ－１タンパク質若しくはそのフラグメント、又はヒトＭＨＣ－１タンパク質若しくはそのフラグメントに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％若しくは１００％の配列同一性を有するタンパク質若しくはそのフラグメント、又は
ｉｉ）ＭＨＣ－２タンパク質若しくはそのフラグメント、又はヒトＭＨＣ－２タンパク質若しくはそのフラグメントに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％若しくは１００％の配列同一性を有するタンパク質若しくはそのフラグメントを含む、細胞外ドメインと、
ｂ）細胞内血小板調節ドメインであって、
当該
ＭＨＣ－１タンパク質若しくはそのフラグメント、又はヒトＭＨＣ－１タンパク質若しくはそのフラグメントに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％若しくは１００％の配列同一性を有するタンパク質若しくはそのフラグメント、又は
ＭＨＣ－２タンパク質若しくはそのフラグメント、又はヒトＭＨＣ－２タンパク質若しくはそのフラグメントに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％若しくは１００％の配列同一性を有するタンパク質若しくはそのフラグメントが、
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）に結合することができる、細胞内血小板調節ドメインと、を含む、合成抗原提示受容体。
８７． 当該細胞外ドメインが、
異種標的結合ドメインであって、
ａ）ＭＨＣ－１タンパク質若しくはそのフラグメント、又はヒトＭＨＣ－１タンパク質若しくはそのフラグメントに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％若しくは１００％の配列同一性を有するタンパク質若しくはそのフラグメント、及び抗原ペプチド（当該ＭＨＣ－１タンパク質若しくはそのフラグメント、又はヒトＭＨＣ－１タンパク質若しくはそのフラグメントに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％若しくは１００％の配列同一性を有するタンパク質若しくはそのフラグメント、及び抗原ペプチドが、ＴＣＲに結合することができる）、並びに／又は
ｂ）ＭＨＣ－２タンパク質若しくはそのフラグメント、又はヒトＭＨＣ－１タンパク質若しくはそのフラグメントに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％若しくは１００％の配列同一性を有するタンパク質若しくはそのフラグメント、及び抗原ペプチド（当該ＭＨＣ－２タンパク質若しくはそのフラグメント、又はヒトＭＨＣ－１タンパク質若しくはそのフラグメントに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％若しくは１００％の配列同一性を有するタンパク質若しくはそのフラグメント、及び抗原ペプチドが、ＴＣＲに結合することができる）を含む、異種標的結合ドメインを含む、段落８６に記載のＳＡＰＲ。
８８． 抗原ペプチドが、
ａ）がん、自己免疫状態、遺伝子疾患、心血管疾患及び／若しくは感染症に関連する、並びに／又は
ｂ）
ｉ）国際公開第２０１５１５３１０２号の２０６～２０７頁の表Ｆ、２０８頁の表Ｇ、２０８～２０９頁の表Ｈ、２０９～２１１頁の表Ｉ、２１２頁の表Ｊ、２１９～２２１頁の表４、２２１～２３０頁の表５、２３１～２３４頁の表６、２３５～２４２頁の表７及び２４３頁の表８９（これらのセクションは参照により本明細書に組み込まれる）に列挙されている抗原ペプチド、
ｉｉ）国際公開第２０１５１５３１０２号の２０６～２０７頁の表Ｆ、２０８頁の表Ｇ、２０８～２０９頁の表Ｈ、２０９～２１１頁の表Ｉ、２１２頁の表Ｊ、２１９～２２１頁の表４、２２１～２３０頁の表５、２３１～２３４頁の表６、２３５～２４２頁の表７、及び２４３頁の表８９（これらのセクションは参照により本明細書に組み込まれる）に列挙される抗原ペプチドに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％若しくは１００％の配列同一性を有する配列から選択される、並びに／又は
ｃ）
ｉ）国際公開第２０１９／１２６８１８号の４７～８６頁の表１、３２１頁の表１４、３２１頁の表１５、３２７頁の表１６、３２８頁の表１７、３２８～３２９頁の表１８、２２１～２２３頁の表１９、３３３～３３４頁の表２０、３４０～３４２頁の表２１、３４４～３４７頁の表２２、３４７～３４８頁の表２３、及び３４９～３５２頁の表２４（これらのセクションは参照により本明細書に組み込まれる）に列挙される抗原ペプチド、又は
ｉｉ）国際公開第２０１９／１２６８１８号の４７～８６頁の表１、３２１頁の表１４、３２１頁の表１５、３２７頁の表１６、３２８頁の表１７、３２８～３２９頁の表１８、２２１～２２３頁の表１９、３３３～３３４頁の表２０、３４０～３４２頁の表２１、３４４～３４７頁の表２２、３４７～３４８頁の表２３、及び３４９～３５２頁の表２４（これらのセクションは参照により本明細書に組み込まれる）に列挙されている抗原ペプチドに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％又は１００％の配列同一性を有する配列から選択される、
ｄ）
ｉ）以下のタンパク質：ＭＯＧ、ＧＡＤ６５、ＭＡＧ、ＰＭＰ２２、ＴＰＯ、ＶＧＫＣ、ＰＬＰ、ＡＣｈＲ、ＴＲＩＢ２、ＮＭＤＡ、ＧｌｕＲ、ＧＡＤ２、ＡＲＭＣ９、ＣＹＰ２１Ａ２、ＣＡＳＲ、ＮＡＳＰ、インスリン、ＴＳＨＲ、甲状腺ペルオキシダーゼ、アシオグリコタンパク質受容体、ＣＹＰ２Ｄ６、ＬＦ、ＴＴＧ、Ｈ／Ｋ ＡＴＰ－ａｓｅ、第ＸＩＩＩ因子、ベータ２－ＧＰＩ、ＩＴＧＢ２、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＰ ＩＩｂ／ＩＩａ、ＣＯＬＩＩ、ＦＢＧベータアルファ、ＭＰＯ、ＣＹＯ、ＰＲＴＮ３、ＴＧＭ、ＣＯＬＶＩＩ、ＣＯＩＬ、ＤＳＧ１、ＤＳＧ３、ＳＯＸ１０、７０ＳＮＲＮＰ７０、ＳＡＧ及びａ３（ＩＶ）ＮＣ１コラーゲンのうちのいずれか１つ以上、又は
ｉｉ）以下のタンパク質：ＭＯＧ、ＧＡＤ６５、ＭＡＧ、ＰＭＰ２２、ＴＰＯ、ＶＧＫＣ、ＰＬＰ、ＡＣｈＲ、ＴＲＩＢ２、ＮＭＤＡ、ＧｌｕＲ、ＧＡＤ２、ＡＲＭＣ９、ＣＹＰ２１Ａ２、ＣＡＳＲ、ＮＡＳＰ、インスリン、ＴＳＨＲ、甲状腺ペルオキシダーゼ、アシオグリコタンパク質受容体、ＣＹＰ２Ｄ６、ＬＦ、ＴＴＧ、Ｈ／Ｋ ＡＴＰ－ａｓｅ、第ＸＩＩＩ因子、ベータ２－ＧＰＩ、ＩＴＧＢ２、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＰ ＩＩｂ／ＩＩａ、ＣＯＬＩＩ、ＦＢＧベータアルファ、ＭＰＯ、ＣＹＯ、ＰＲＴＮ３、ＴＧＭ、ＣＯＬＶＩＩ、ＣＯＩＬ、ＤＳＧ１、ＤＳＧ３、ＳＯＸ１０、７０ＳＮＲＮＰ７０、ＳＡＧ及びａ３（ＩＶ）ＮＣ１コラーゲンのうちのいずれか１つ以上に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％若しくは１００％の配列同一性を有する配列から選択される、ペプチド又はその抗原部分を含む、８６又は８７に記載のＳＡＰＲ。
８９． 細胞外ドメインが、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）に結合することができる、段落８６～８８のいずれかに記載のＳＡＰＲ。
９０． 細胞外ドメインが、ヒト標的結合ドメイン配列を含む、段落８６～８９のいずれかに記載のＳＡＰＲ。
９１． 細胞外ドメインが、非ヒト標的結合ドメイン配列、任意選択で、
ヒト化配列、又は
マウス由来の配列を含む、段落８６～９０のいずれかに記載のＳＡＰＲ。
９２． 血小板調節ドメインが、血小板活性化ドメイン、任意選択でＩＴＡＭを含むドメイン、任意選択で血小板ＩＴＡＭを含むドメインであり、任意選択でＩＴＡＭを含むドメイン、任意選択で血小板ＩＴＡＭを含むドメインに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％又は１００％の配列同一性を有するドメインである、段落８６～９１のいずれかに記載のＳＡＰＲ。
９３． 血小板調節ドメインが、血小板活性化ドメインであり、任意選択で、血小板活性化ドメインが、脱顆粒誘発ドメインである、段落８６～９２のいずれかに記載のＳＡＰＲ。
９４． ＳＡＰＲが血小板の膜に存在する場合、活性化されると、血小板活性化ドメインが、
ａ）血小板の脱顆粒をもたらす、
ｂ）血小板からの内容物の放出をもたらす、
ｃ）血小板の原形質膜上に細胞内内容物の存在をもたらす、
ｄ）原形質膜からのブレブ形成を介した細胞外小胞の放出をもたらす、及び／又は
ｅ）両凹ディスクから完全に広がった細胞フラグメントへの血小板の形状の変化をもたらす、段落８６～９３のいずれかに記載のＳＡＰＲ。
９５． 血小板活性化ドメインが、血小板脱顆粒誘発ドメインである、段落８６～９４のいずれかに記載のＳＡＰＲ。
９６． 血小板調節ドメインが、血小板の活性化を防止する血小板活性化阻害ドメインであり、任意選択で、血小板活性化阻害ドメインが、ＩＴＩＭを含むドメインであり、任意選択で、ＩＴＩＭを含むドメインに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％又は１００％の配列同一性を有するドメインである、段落８６～９５のいずれかに記載のＳＡＰＲ。
９７． ＳＡＰＲが血小板の膜に存在する場合、及び血小板活性化ドメインの阻害が活性化される場合、血小板活性化阻害ドメインが、
ａ）血小板の脱顆粒を防止する、
ｂ）血小板からの内容物の放出を防止する、
ｃ）血小板の原形質膜上の細胞内内容物の存在を防止する、
ｄ）原形質膜からのブレブ形成を介した細胞外小胞の放出を防止する、及び／又は
ｅ）両凹ディスクから完全に広がった細胞フラグメントへの血小板の形状の変化を防止する、段落８６～９６のいずれかに記載のＳＡＰＲ。
９８． 血小板活性化ドメインが、血小板脱顆粒誘発ドメインである、段落８６～９７のいずれかに記載のＳＡＰＲ。
９９． 血小板調節ドメインが、ヒト調節ドメイン配列を含む、段落８６～９８のいずれかに記載のＳＡＰＲ。
１００． 血小板調節ドメインが、非ヒト調節ドメイン配列、任意選択でマウス由来の配列を含む、段落８６～９９のいずれかに記載のＳＡＰＲ。
１０１． 血小板調節ドメインが、ＳＡＰＲがともに使用される前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシに対して内因性であり、任意選択で、血小板調節ドメインが、ｉＰＳＣ、巨核球又は血小板に対して内因性である、段落８６～１００のいずれかに記載のＳＡＰＲ。
１０２． 血小板調節ドメインが、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）受容体由来のドメインを含まず、任意選択で、糖タンパク質ＶＩ（ＧＰＶＩ）、Ｃ型レクチン様受容体２（ＣＬＥＣ－２）、ＩｇＧ受容体ＩＩａのＦｃフラグメント（ＦＣｇＲ２Ａ）、高親和性免疫グロブリンイプシロン受容体サブユニットガンマ（ＦＣＥＲＧ）、Ｃ型レクチンドメインファミリー１（ＣＬＥＣ１）、又はＩｇＧ受容体ＩＩのＦｃフラグメント（ＦＣＧＲ２）からの１つ以上のドメイン、それらの部分又はフラグメントを含まない、段落８６～１０１のいずれかに記載のＳＡＰＲ。
１０３． ＳＡＰＲが血小板原形質膜に局在する場合、標的が標的結合ドメインに結合すると、血小板調節ドメインが血小板の脱顆粒を誘発する、段落８６～１０２のいずれかに記載のＳＡＰＲ。
１０４． 血小板調節ドメインが、血小板脱顆粒誘発ドメインであり、
免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）受容体からの１つ以上のドメインを含み、任意選択で、糖タンパク質ＶＩ（ＧＰＶＩ）、Ｃ型レクチン様受容体２（ＣＬＥＣ－２）、ＩｇＧ受容体ＩＩａのＦｃフラグメント（ＦＣｇＲ２Ａ）、高親和性免疫グロブリンイプシロン受容体サブユニットガンマ（ＦＣＥＲＧ）、Ｃ型レクチンドメインファミリー１（ＣＬＥＣ１）、若しくはＩｇＧ受容体ＩＩのＦｃフラグメント（ＦＣＧＲ２）からの１つ以上のドメイン、それらの部分若しくはフラグメントを含むか、又は
ＩＴＡＭを含むドメイン、任意選択で、血小板ＩＴＡＭを含むドメインに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％若しくは１００％の配列同一性を有する、任意選択で、糖タンパク質ＶＩ（ＧＰＶＩ）、Ｃ型レクチン様受容体２（ＣＬＥＣ－２）、ＩｇＧ受容体ＩＩａのＦｃフラグメント（ＦＣｇＲ２Ａ）、高親和性免疫グロブリンイプシロン受容体サブユニットガンマ（ＦＣＥＲＧ）、Ｃ型レクチンドメインファミリー１（ＣＬＥＣ１）、若しくはＩｇＧ受容体ＩＩのＦｃフラグメント（ＦＣＧＲ２）からの１つ以上のドメイン、それらの部分若しくはフラグメントに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％若しくは１００％の配列同一性を有するドメインを含む、段落８６～１０４のいずれかに記載のＳＡＰＲ。
１０５． 血小板調節ドメインが、血小板脱顆粒の誘発を阻害する血小板活性化ドメインの阻害であり、１つ以上のＩＴＩＭモチーフを含み、任意選択で、１つ以上のＩＴＩＭモチーフが、ＰＥＣＡＭ１、ＴＬＴ１、ＬＩＬＲＢ２、ＣＥＡＣＡＭ１又はＧ６ｂ－Ｂ由来のＩＴＩＭモチーフであり、任意選択で、
ＬＩＬＲＢ２由来のＩＴＩＭドメインが、参照により本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０２０／０５３２４７号の４４頁の表５に示される配列番号３４であり、
ＰＥＣＡＭ１由来のＩＴＩＭドメインが、参照により本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０２０／０５３２４７号の４４頁の表５に示される配列番号３８であり、
ＣＥＡＣＡＭ１由来のＩＴＩＭドメインが、参照により本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０２０／０５３２４７号の４４頁の表５に示される配列番号２４である、段落８６～１０４のいずれかに記載のＳＡＰＲ。
１０６． 血小板調節ドメインが、天然の血小板調節ドメイン配列に対して１つ以上の変異、挿入又は欠失を含む、段落８６～１０５のいずれかに記載のＳＡＰＲ。
１０７． 天然の調節ドメイン配列に対する１つ以上の変異、挿入又は欠失が、１つ以上の変異を含まない血小板調節ドメインを含むＳＡＰＲに対して、ＳＡＰＲの感受性を増加させる、段落８６～１０６のいずれかに記載のＳＡＰＲ。
１０８． 天然の調節ドメイン配列に対する１つ以上の変異、挿入又は欠失が、１つ以上の変異を含まない血小板調節ドメインを含むＳＡＰＲに対して、ＳＡＰＲの感受性を減少させる、段落８６～１０７のいずれかに記載のＳＡＰＲ。
１０９．血小板調節ドメインが、天然に存在する血小板調節ドメインに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％又は１００％の配列同一性を含む、段落８６～１０８のいずれかに記載のＳＡＰＲ。
１１０． シグナルペプチド及び／又はリンカー配列を更に含み、任意選択で、
シグナルペプチドが、表１に示される配列の一部を含むか若しくはそれからなり、かつ／又は、
シグナルペプチドが、参照により本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０２０／０５３２４７号の４６頁の表７の配列のうちのいずれかの一部を含むか若しくはそれからなりり、かつ／又は
任意選択で、リンカーが、参照により本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０２０／０５３２４７号の５１頁に記載されているリンカー若しくはその部分を含むか若しくはそれからなる、段落８６～１０９のいずれかに記載のＳＡＰＲ。
１１１． 膜貫通ドメインを更に含み、任意選択で、膜貫通ドメインが、参照により本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０２０／０５３２４７号の４９～５０頁に記載されている膜貫通ドメイン又はその部分のうちのいずれか１つ以上を含むか又はそれらからなる、段落８６～１１０のいずれかに記載のＳＡＰＲ。
１１２． ＳＡＰＲが、参照により本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０２０／０５３２４７号の５０頁及び５１頁に記載されている細胞内ドメイン又はその部分を含むか又はそれからなる細胞内ドメインを含む、段落８６～１１１のいずれかに記載のＳＡＰＲ。
１１３． ＳＡＰＲが、参照により本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０２０／０５３２４７号の４１～６３頁に記載されているドメインの組み合わせを含むか又はそれからなる、段落８６～１１２のいずれかに記載のＳＡＰＲ。
１１４． プロテアーゼ認識部位が、天然の認識部位を切断するプロテアーゼではないプロテアーゼによって切断されるように操作されている、操作されたプロテアーゼ活性化受容体（ｅＰＡＲ）。
１１５． 血小板の原形質膜に存在する場合、プロテアーゼ認識部位の切断が、
ａ）血小板の脱顆粒、
ｂ）血小板からの内容物の放出、
ｃ）血小板の原形質膜上の細胞内内容物の存在、
ｄ）原形質膜からのブレブ形成を介した細胞外小胞の放出、及び／又は
ｅ）両凹ディスクから完全に広がった細胞フラグメントへの血小板の形状の変化をもたらす、段落１１４に記載のｅＰＡＲ。
１１６． プロテアーゼの切断が、ｅＰＡＲのフラグメントの放出をもたらし、ｅＰＡＲのフラグメントが、シグナル伝達分子であり、細胞内シグナル伝達をもたらす、段落１１３又は１１５に記載のｅＰＡＲ。
１１７． プロテアーゼ認識部位が、腫瘍微小環境において見出されるプロテアーゼに対するプロテアーゼ認識部位であるように操作され、任意選択で、腫瘍微小環境において見出されるプロテアーゼに対するプロテアーゼ認識部位が、マトリックスメタロプロテアーゼ、メタロペプチダーゼ、カテプシンＢ、ウロキナーゼ又はカスパーゼを含むか又はそれらからなる群から選択される、段落１１３～１１５のいずれかに記載のｅＰＡＲ。
１１８． プロテアーゼ認識部位が、意図される対象に関して直交性プロテアーゼ認識部位であるように操作される、段落１１３～１１７のいずれかに記載のｅＰＡＲ。
１１９． プロテアーゼ認識部位が、ウイルスプロテアーゼ認識部位、任意選択で、タバコエッチウイルス核封入体－ａエンドペプチダーゼ（ＴＥＶプロテアーゼ）、Ｃ型肝炎ウイルスのＮＳ２－３プロテアーゼ（ＨＣＶプロテアーゼ）、又はタバコ葉脈斑紋ウイルス（ＴＶＭＶプロテアーゼ）であるように操作される、段落１１３～１１８のいずれかに記載のｅＰＡＲ。
１２０． ｅＰＡＲがＧＰＣＲであり、任意選択で、操作されたＰＡＲ１、ＰＡＲ２、ＰＡＲ３又はＰＡＲ４である、段落１１３～１１９のいずれかに記載のｅＰＡＲ。
１２１． ｅＰＡＲが、天然に存在するＰＡＲに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％又は１００％の配列同一性を含む、段落１１３～１２０のいずれかに記載のｅＰＡＲ。
１２２． 段落４１、４４～４７及び６５～８５のいずれかに記載のＣＰＲ、又は段落４８～８５のいずれかに記載の複合体、又は段落８６～１１３のいずれかに記載のＳＡＰＲ、又は段落１１４～１２１のいずれかに記載のｅＰＡＲをコードする、核酸。
１２３． 核酸が、ＤＮＡである、段落１２２に記載の核酸。
１２４． 核酸が、ＲＮＡである、段落１２２に記載の核酸。
１２５． 核酸が、異種発現配列、任意選択で、異種プロモーターに作動可能に連結されている、段落１２２～１２４のいずれかに記載の核酸。
１２６． 巨核球特異的プロモーターを更に含む、段落１２２～１２５のいずれかに記載の核酸。
１２７． プロモーターが、誘導性プロモーター、任意選択で、意図される対象において誘導性であるプロモーターである、段落１２２～１２６のいずれかに記載の核酸。
１２８． プロモーターが、構成的プロモーター、任意選択で、意図される対象において構成的であるプロモーターである、段落１２２～１２７のいずれかに記載の核酸。
１２９． 任意選択で、ベクターが、プラスミド又は環状核酸である、段落１２２～１２７のいずれかに記載の核酸を含む、ベクター。
１３０． 段落１２２～１２８のいずれかに記載の核酸又は段落１２９に記載のベクターを含む、ウイルスベクター又はウイルス粒子。
１３１．シャーシであって、
ａ）先行の段落のいずれかに記載の１つ以上のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ、若しくはｅＰＡＲＳ、
ｂ）先行の段落のいずれかに記載のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ＳＡＰＲ、若しくはｅＰＡＲをコードする、先行の段落のいずれかに記載の１つ以上の核酸、
ｃ）先行の段落のいずれかに記載のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ＳＡＰＲ、若しくはｅＰＡＲをコードする先行の段落のいずれかに記載の１つ以上の核酸を含む、先行の段落のいずれかに記載の１つ以上のベクター、及び／又は
ｄ）先行の段落のいずれかに記載のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ＳＡＰＲ、又はｅＰＡＲをコードする先行の段落のいずれかに記載の１つ以上の核酸を含む、先行の段落のいずれかに記載の１つ以上のウイルスベクターを含む、シャーシ。
１３２． シャーシが、
１つ以上のシグナル伝達経路を調節するように操作されておらず、任意選択で、血栓形成経路を破壊するように操作されておらず、かつ／又は血小板炎症シグナル伝達経路を破壊するように操作されておらず、かつ／又は操作されたプロデューサー若しくはエフェクターシャーシの免疫原性を低下させるように操作されていない、並びに／あるいは
前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシの１つ以上の基本機能を増強又は破壊するように操作されておらず、任意選択で、１つ以上又は基本機能が、自然免疫応答及び／又は適応免疫応答、炎症、血管新生、アテローム性動脈硬化症、リンパ発達及び腫瘍成長に関与する、段落１３１に記載のシャーシ。
１３３．操作されたシャーシであって、シャーシが、
１つ以上のシグナル伝達経路を調節するように操作されている、任意選択で、血栓形成経路を破壊するように操作されている、かつ／又は血小板炎症シグナル伝達経路を破壊するように操作されている、かつ／又は操作された血小板の免疫原性を低下させるように操作されている、並びに／あるいは
シャーシの１つ以上の基本機能を増強又は破壊するように操作されており、任意選択で、１つ以上又は基本機能が、自然免疫応答及び／又は適応免疫応答、炎症、血管新生、アテローム性動脈硬化症、リンパ発達及び腫瘍成長に関与する、シャーシ。
１３４．シャーシが、
ａ）先行の段落のいずれかに記載の１つ以上のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ、若しくはｅＰＡＲＳ、
ｂ）先行の段落のいずれかに記載のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ＳＡＰＲ、若しくはｅＰＡＲをコードする、先行の段落のいずれかに記載の１つ以上の核酸、
ｃ）ＣＰＲをコードする先行の段落のいずれかに記載の１つ以上の核酸を含む、先行の段落のいずれかに記載の１つ以上のベクター、ｄ）先行の段落のいずれかに記載のユニバーサルＣＰＲ、ＳＡＰＲ、若しくはｅＰＡＲ、及び／又は
先行の段落のいずれかに記載のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ＳＡＰＲ、若しくはｅＰＡＲをコードする先行の段落のいずれかに記載の１つ以上の核酸を含む、先行の段落のいずれかに記載の１つ以上のウイルスベクターのうちのいずれか１つ以上を含むように更に操作されている、段落６６に記載の操作されたシャーシ。
１３５．シャーシが、
ａ）先行の段落のいずれかに記載の１つ以上のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ、若しくはｅＰＡＲＳ、
ｂ）先行の段落のいずれかに記載の１つ以上の核酸、
ｃ）先行の段落のいずれかに記載の１つ以上のベクター、及び／又は
ｄ）先行の段落のいずれかに記載の１つ以上のウイルスベクターのうちのいずれか１つ以上を発現しない、先行の段落のいずれかに記載の操作されたシャーシ。
１３６． シャーシ又は操作されたシャーシが、
ａ）前駆体シャーシであり、任意選択で、骨髄系幹細胞、ｉＰＳＣ、脂肪細胞、脂肪由来間葉系間質／幹細胞株（ＡＳＣＬ）、若しくはプロデューサーシャーシを産生することができるがん細胞株、若しくはプロデューサーシャーシを産生することができる他の不死細胞であるか、
ｂ）プロデューサーシャーシであり、任意選択で、巨核芽球、巨核球、巨核球様細胞、血小板、血小板様膜結合細胞フラグメント若しくは無核細胞フラグメントを形成することができるがん細胞株、例えばＭＥＧ０１若しくはＤＡＭＩがん細胞株、又は血小板、血小板様膜結合細胞フラグメント若しくは無核細胞フラグメントを形成することができる他の不死細胞であるか、あるいは
ｃ）エフェクターシャーシであり、任意選択で、血小板、血小板様膜結合細胞フラグメント又は無核細胞フラグメントである、エフェクターシャーシである、先行の段落のいずれかに記載のシャーシ又は操作されたシャーシ。
１３７． シャーシが、プロデューサーシャーシへの分化を駆動し、任意選択で、巨核球又は巨核球様細胞への分化を駆動するように修飾されており、任意選択で、巨核球又は巨核球様細胞に分化するようにフォワードプログラムされている、先行の段落のいずれかに記載のシャーシ又は操作されたシャーシ。
１３８． シャーシ又は操作されたシャーシが、プロデューサーシャーシ又は操作されたプロデューサーシャーシであり、プロデューサーシャーシ又は操作されたプロデューサーシャーシが、血小板、血小板様膜結合細胞フラグメント若しくは無核細胞フラグメントを産生することができる巨核芽球、血小板、血小板様膜結合細胞フラグメント若しくは無核細胞フラグメントを産生することができる巨核球、又は血小板、血小板様膜結合細胞フラグメント若しくは無核細胞フラグメントを産生することができる巨核球様細胞である、先行の段落のいずれかに記載のシャーシ又は操作されたシャーシ。
１３９． シャーシ又は操作されたシャーシが、巨核芽球、巨核球、巨核球様細胞、血小板、血小板様膜結合細胞フラグメント若しくは無核細胞フラグメントを形成することができるがん細胞株、例えばＭＥＧ０１若しくはＤＡＭＩがん細胞株、又は血小板、血小板様膜結合細胞フラグメント若しくは無核細胞フラグメントを形成することができる他の不死細胞である、プロデューサーシャーシ又は操作されたプロデューサーシャーシであり、
巨核芽球、巨核球、巨核球様細胞、血小板、血小板様膜結合細胞フラグメント若しくは無核細胞フラグメントを形成することができるがん細胞株、例えばＭＥＧ０１若しくはＤＡＭＩがん細胞株、又は血小板、血小板様膜結合細胞フラグメント若しくは無核細胞フラグメントを形成することができる他の不死細胞が、
ａ）偽足伸長をもたらすことができ、かつ／又は
ｂ）ＴＵＢＢ１を発現する、先行の段落のいずれかに記載のシャーシ又は操作されたシャーシ。
１４０． シャーシ又は操作されたシャーシが、エフェクターシャーシ又は操作されたエフェクターシャーシであり、エフェクターシャーシ又は操作されたエフェクターシャーシが、血小板、血小板様膜結合細胞フラグメント、又は無核細胞フラグメントであり、血小板、血小板様膜結合細胞フラグメント、又は無核細胞フラグメントが、先行の段落のいずれかに記載のプロデューサーシャーシ又は操作されたプロデューサーシャーシのフラグメント化によって産生されており、
任意選択で、操作されたエフェクターシャーシが、ＴＵＢＢ１タンパク質を含む、先行の段落のいずれかに記載のシャーシ又は操作されたシャーシ。
１４１． シャーシ又は操作されたシャーシが、エフェクターシャーシ又は操作されたエフェクターシャーシであり、エフェクターシャーシ又は操作されたエフェクターシャーシが、血小板凝集アッセイにおいて凝集しない血小板、血小板様膜結合細胞フラグメント、又は無核細胞フラグメントである、先行の段落のいずれかに記載のシャーシ又は操作されたシャーシ。
１４２． シャーシ又は操作されたシャーシが、先行の段落のいずれかに記載のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ＳＡＰＲ、若しくはｅＰＡＲをコードする先行の段落のいずれかに記載の１つ以上の核酸、及び／又は先行の段落のいずれかに記載のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ＳＡＰＲ、若しくはｅＰＡＲをコードする先行の段落のいずれかに記載の１つ以上のベクターを含む、先行の段落のいずれかに記載のシャーシ又は操作されたシャーシ。
１４３． シャーシ又は操作されたシャーシが、前駆体若しくはプロデューサーシャーシ又は操作された前駆体若しくはプロデューサーシャーシであり、１つ以上の核酸が、前駆体若しくはプロデューサーシャーシ又は操作された前駆体若しくはプロデューサーシャーシのゲノム核酸内の位置から発現され、任意選択で、
１）第１のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ、若しくはｅＰＡＲをコードする核酸が、第１の遺伝子座の第１の対立遺伝子に導入されており、かつ／又は第１のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ、若しくはｅＰＡＲをコードする核酸が、第１の遺伝子座の第２の対立遺伝子に導入されており、かつ／あるいは
２）第１のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ、又はｅＰＡＲをコードする核酸が、第１の遺伝子座の第１の対立遺伝子に導入されており、第２のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ、又はｅＰＡＲをコードする第２の核酸が、第２の遺伝子座の第１の対立遺伝子に導入されており、かつ／あるいは
３）第１のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ、又はｅＰＡＲをコードする核酸が、第１の遺伝子座の第１の対立遺伝子に導入されており、第２のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ、又はｅＰＡＲをコードする第２の核酸が、第１の遺伝子座の第２の対立遺伝子に導入されている、段落１４２に記載のシャーシ又は操作されたシャーシ。
１４４． １つ以上の核酸が、エピソーム的に発現される、段落１４２に記載のシャーシ又は操作されたシャーシ。
１４５． シャーシ又は操作されたシャーシが、ベータ２ミクログロブリン遺伝子からの発現が阻害されるように操作されており、任意選択で、ベータ２ミクログロブリン遺伝子がノックアウト又は欠失されている、先行の段落のいずれかに記載のシャーシ又は操作されたシャーシ。
１４６． シャーシ又は操作されたシャーシが、哺乳動物シャーシ、任意選択でヒトシャーシ、ウシシャーシ、ウマシャーシ又はマウスシャーシである、先行の段落のいずれかに記載のシャーシ又は操作されたシャーシ。
１４７． シャーシが、血小板血栓形成経路を破壊するように操作されている、先行の段落のいずれかに記載の操作されたシャーシ。
１４８． シャーシが、血栓形成の可能性が低減されるように操作されていないシャーシに対して、血栓形成が低減されるように操作されており、任意選択で、操作されたシャーシが、血栓形成の可能性を有しない、先行の段落のいずれかに記載の操作されたシャーシ。
１４９． シャーシが、血栓形成経路に関与する少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、又は少なくとも１０個の遺伝子の破壊又は欠失を含み、任意選択で、遺伝子が、
血栓形成の一次刺激の認識に関与するタンパク質、
血栓形成の二次メディエーターの認識に関与するタンパク質、及び／又は
血栓形成の二次メディエーターの放出に関与するタンパク質、をコードする遺伝子の群から選択される、先行の段落のいずれかに記載の操作されたシャーシ。
１５０． シャーシが、少なくとも
血栓形成の一次刺激の認識に関与するタンパク質をコードする１つの遺伝子、
血栓形成の二次メディエーターの認識に関与するタンパク質をコードする１つの遺伝子、及び
血栓形成の二次メディエーターの放出に関与するタンパク質をコードする１つの遺伝子、の破壊又は欠失を含み、
任意選択で、少なくとも
血栓形成の一次刺激の認識に関与するタンパク質をコードする２つの遺伝子、
血栓形成の二次メディエーターの認識に関与するタンパク質をコードする２つの遺伝子、及び
血栓形成の二次メディエーターの放出に関与するタンパク質をコードする２つの遺伝子、の破壊を含み、
任意選択で、少なくとも
血栓形成の一次刺激の認識に関与するタンパク質をコードする３つの遺伝子、
血栓形成の二次メディエーターの認識に関与するタンパク質をコードする３つの遺伝子、及び
血栓形成の二次メディエーターの放出に関与するタンパク質をコードする３つの遺伝子、の破壊を含む、先行の段落のいずれかに記載の操作されたシャーシ。
１５１．
血栓形成の一次刺激の認識に関与するタンパク質をコードする少なくとも１つ、２つ、若しくは３つの遺伝子が、ＧＰＩｂ／Ｖ／ＩＸ及びＧＰＶＩ（ＧＰ６）、ＩＴＧＡ２Ｂ、ＣＬＥＣ２、インテグリンｓ ａＩＩｂｂ３、ａ２ｂ１、ａ５ｂ１及びａ６ｂ１からなる群から選択されるか、若しくはＧＰＶＩ及びＩＴＧＡ２Ｂからなる群から選択され、
血栓形成の二次メディエーターの認識に関与するタンパク質をコードする少なくとも１つ、２つ、若しくは３つが、Ｐａｒ１、Ｐａｒ４、Ｐ２Ｙ１２、ＧＰＩｂ／Ｖ／ＩＸ、トロンボキサン受容体（ＴＢＸＡ２Ｒ）、Ｐ２Ｙ１、Ｐ２Ｘ１及びインテグリンａＩＩｂｂ３からなる群から選択されるか、又はＰａｒ１、Ｐａｒ４及びＰ２Ｙ１２からなる群から選択され、かつ／あるいは
血栓形成の二次メディエーターの放出に関与するタンパク質をコードする少なくとも１つ、２つ、若しくは３つの遺伝子が、Ｃｏｘ１、ＨＰＳ及びトロンボキサンＡシンターゼ（ＴＢＸＡＳ１）からなる群から選択されるか、又はＣｏｘ１及びＨＰＳからなる群から選択される、先行の段落のいずれかに記載の操作されたシャーシ。
１５２． 以下の遺伝子：
ＧＰＶＩ、ＩＴＧＡ２Ｂ、Ｐａｒ１、Ｐａｒ４、Ｐ２Ｙ１２、Ｃｏｘ１及びＨＰＳの各々が、破壊又は欠失される、先行の段落のいずれかに記載の操作されたシャーシ。
１５３． シャーシが、エフェクターシャーシであり、
ａ）通常は血餅形成をもたらす内因性刺激に応答せず、
ｂ）他の活性化血小板によって動員されず、かつ／又は
ｃ）活性化すると、患者の内因性血小板を動員及び活性化することができない、先行の段落のいずれかに記載の操作されたシャーシ。
１５４． シャーシが、操作されていないシャーシに対して免疫原性が低減されるように操作されている、先行の段落のいずれかに記載の操作されたシャーシ。
１５５．
ａ）内因性ＭＨＣクラス１及び／若しくはＭＨＣクラス２の機能が破壊されており、かつ／又は
ｂ）β２ミクログロブリン遺伝子からの発現が破壊されている、先行の段落のいずれかに記載の操作されたシャーシ。
１５６． β２ミクログロブリン遺伝子が、ノックアウトされている、先行の段落のいずれかに記載の操作されたシャーシ。
１５７． β２ミクログロブリン遺伝子からの発現が、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集、又はｓｈＲＮＡ、任意選択で、ｓｈＲＮＡのレンチウイルス送達の使用によって破壊されている、先行の段落のいずれかに記載の操作されたシャーシ。
１５８． シャーシが、１つ以上のＨＬＡ遺伝子からの破壊された発現を有するように操作されている、先行の段落のいずれかに記載の操作されたシャーシ。
１５９． シャーシが、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ及び／又はＨＬＡ－Ｃのうちのいずれか１つ以上からの発現が破壊されるように操作されており、任意選択で、ＨＬＡ－Ａ及びＨＬＡ－Ｂの発現は完全に破壊されているが、ＨＬＡ－Ｃの発現は部分的に破壊されており、任意選択で、ＨＬＡ－Ａ及びＨＬＡ－Ｂの両方の対立遺伝子からの発現は破壊されているが、ＨＬＡ－Ｃの一方の対立遺伝子のみからの発現は破壊されている、段落１５８に記載の操作されたシャーシ。
１６０． シャーシが、ＨＬＡクラスＩｂ遺伝子のうちのいずれか１つ以上、任意選択で、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ４７及びＰＤ－Ｌ１のうちのいずれか１つ以上を過剰発現するように操作されている、先行の段落のいずれかに記載の操作されたシャーシ。
１６１． シャーシが、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ４７及びＰＤ－Ｌ１のうちのいずれか１つ以上を過剰発現するように操作されており、任意選択で、ベータ２ミクログロブリン遺伝子からの発現を阻害するように操作されている、先行の段落のいずれかに記載の操作されたシャーシ。
１６２． シャーシが、１つ以上の免疫調節遺伝子を過剰発現するように操作されており、任意選択で、１つ以上の免疫調節遺伝子が、ＣＤ４７及びＰＤ－Ｌ１を含む群から選択される、先行の段落のいずれかに記載の操作されたシャーシ。
１６３． プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシが、産生物がカーゴの効力に悪影響を及ぼし得る１つ以上の遺伝子を排除するように操作されている、先行の段落のいずれかに記載の操作されたプロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシ。
１６４． シャーシが、自然応答／適応応答を上方又は下方調整するように操作されている、先行の段落のいずれかに記載の操作されたシャーシ。
１６５． シャーシが、炎症、血管新生、アテローム性動脈硬化症、リンパ発達及び腫瘍増殖を低減するように操作されている、先行の段落のいずれかに記載の操作されたシャーシ。
１６６． シャーシが、操作されたカーゴの生物学的作用に間接的に対抗する可能性が高い接着タンパク質及び／又はカーゴ実体をコードする１つ以上の遺伝子を破壊するように操作されている、先行の段落のいずれかに記載の操作されたシャーシ。
１６７． シャーシが、ＴＧＦｂ及び／又はＧＡＲＰ及び／又はＣＤ４０Ｌの発現を下方制御又は阻害するように操作されている、先行の段落のいずれかに記載の操作されたシャーシ。
１６８． シャーシが、ＣＤ３６、ＮＯＤ２、ＳＲＢ１、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ６、ＴＬＲ９、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ９３（Ｃ１ｑＲｐ）、Ｃ３ａＲ、ＣＤ８８（Ｃ５ａＲ）、ＣＤ８９（ＦｃａＲ１）、ＣＤ２３（ＦｃｅＲ１）、ＣＤ３２（ＦｃｇＲＩＩａ）、ＭＨＣクラス１、ＣＤ１９１（ＣＣＲ１）、ＣＤ１９３（ＣＣＲ３）、ＣＤ１９４（ＣＣＲ４）、ＣＤ１８４（ＣＸＣＲ４）、ＣＸ３ＣＲ１、ＣＤ１０２（ＩＣＡＭ－２）、ＪＡＭ－Ｃ／ＪＡＭ－３、ＣＤ６２Ｐ（Ｐ－セレクチン）、ＣＤ３１（ＰＥＣＡＭ－１）、ＣＤ１５０（ＳＬＡＭＦ１）、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ５、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ４／ＰＦ４、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ８、ＮＡＰ２（ＣＸＣＬ７）、ＩＬ－１ｂのうちのいずれか１つ以上の発現を下方制御若しくは阻害するように操作されている、先行の段落のいずれかに記載の操作されたシャーシ。
１６９． シャーシが、ＴＧＦｂ及び／又はＧＡＲＰ２の発現を破壊又は阻害するように操作されている、先行の段落のいずれかに記載の操作されたシャーシ。
１７０． シャーシが、Ｓｉｇｌｅｃ－７、Ｓｉｇｌｅｃ－９、Ｓｉｇｌｅｃ－１１及びＴＧＦｂのうちのいずれか１つ以上の発現を破壊又は阻害するように操作されている、先行の段落のいずれかに記載の操作されたシャーシ。
１７１． シャーシが、Ｔ細胞シグナル伝達を増強し、免疫応答を刺激するために１つ以上のＩＴＡＭ受容体を発現するように操作されている、先行の段落のいずれかに記載の操作されたシャーシ。
１７２． シャーシが、操作されていないシャーシに対して免疫原性が低減されるように操作されており、シャーシが、
ａ）ＭＨＣクラス１遺伝子又はタンパク質の機能が破壊されている、
ｂ）β２ミクログロブリン遺伝子からの発現が破壊されており、任意選択でβ２ミクログロブリン遺伝子がノックアウトされている、
ｃ）１つ以上のＨＬＡ遺伝子からの発現が破壊されている、
ｄ）ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ及び／又はＨＬＡ－Ｃのうちのいずれか１つ以上からの発現が破壊されており、任意選択で、ＨＬＡ－Ａ及びＨＬＡ－Ｂの発現は完全に破壊されているが、ＨＬＡ－Ｃの発現は部分的に破壊されており、任意選択で、ＨＬＡ－Ａ及びＨＬＡ－Ｂの両方の対立遺伝子からの発現は破壊されているが、ＨＬＡ－Ｃの一方の対立遺伝子のみからの発現は破壊されている、
ｅ）ＨＬＡクラスＩｂ遺伝子のうちのいずれか１つ以上、任意選択でＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ４７及びＰＤ－Ｌ１のうちのいずれか１つ以上を過剰発現する、
ｆ）ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ４７及びＰＤ－Ｌ１のうちのいずれか１つ以上を過剰発現するように操作されており、任意選択で、ベータ２ミクログロブリン遺伝子からの発現が破壊されるように操作されている、並びに／又は
ｇ）１つ以上の免疫調節遺伝子を過剰発現する（任意選択で、１つ以上の免疫調節遺伝子が、ＣＤ４７及びＰＤ－Ｌ１を含む群から選択される）ように操作されている、先行の段落のいずれかに記載の操作されたシャーシ。
１７３． シャーシが、
ａ）ＭＨＣクラス１遺伝子又はタンパク質の機能が破壊されている、
ｂ）β２ミクログロブリン遺伝子からの発現が破壊されており、任意選択でβ２ミクログロブリン遺伝子がノックアウトされている、
ｃ）１つ以上のＨＬＡ遺伝子からの発現が破壊されている、
ｄ）ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ及び／又はＨＬＡ－Ｃのうちのいずれか１つ以上からの発現が破壊されており、任意選択で、ＨＬＡ－Ａ及びＨＬＡ－Ｂの発現は完全に破壊されているが、ＨＬＡ－Ｃの発現は部分的に破壊されており、任意選択で、ＨＬＡ－Ａ及びＨＬＡ－Ｂの両方の対立遺伝子からの発現は破壊されているが、ＨＬＡ－Ｃの一方の対立遺伝子のみからの発現は破壊されている、
ｅ）ＨＬＡクラスＩｂ遺伝子のうちのいずれか１つ以上、任意選択でＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ４７及びＰＤ－Ｌ１のうちのいずれか１つ以上を過剰発現する、
ｆ）ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ４７及びＰＤ－Ｌ１のうちのいずれか１つ以上を過剰発現する（任意選択で、ベータ２ミクログロブリン遺伝子からの発現が破壊されるように操作されている）、並びに／又は
ｇ）１つ以上の免疫調節遺伝子を過剰発現する（任意選択で、１つ以上の免疫調節遺伝子が、ＣＤ４７及びＰＤ－Ｌ１を含む群から選択される）、
ｈ）産物がカーゴの効力に悪影響を及ぼし得る１つ以上の遺伝子又は遺伝子産物を排除する、
ｉ）自然応答／適応応答を上方又は下方に調整する、
ｊ）炎症、血管新生、アテローム性動脈硬化症、リンパ発達及び腫瘍増殖を低減する、
ｋ）操作されたカーゴの生物学的作用に間接的に対抗する可能性が高い接着タンパク質及び／又はカーゴ実体をコードする１つ以上の遺伝子の発現が破壊されており、より大きな正味の治療効果をもたらす可能性がある、
ｌ）ＴＧＦｂ及び／又はＧＡＲＰ及び／又はＣＤ４０Ｌの発現を下方制御又は阻害する、
ｎ）ＣＤ３６、ＮＯＤ２、ＳＲＢ１、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ６、ＴＬＲ９、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ９３（Ｃ１ｑＲｐ）、Ｃ３ａＲ、ＣＤ８８（Ｃ５ａＲ）、ＣＤ８９（ＦｃａＲ１）、ＣＤ２３（ＦｃｅＲ１）、ＣＤ３２（ＦｃｇＲＩＩａ）、ＭＨＣクラス１、ＣＤ１９１（ＣＣＲ１）、ＣＤ１９３（ＣＣＲ３）、ＣＤ１９４（ＣＣＲ４）、ＣＤ１８４（ＣＸＣＲ４）、ＣＸ３ＣＲ１、ＣＤ１０２（ＩＣＡＭ－２）、ＪＡＭ－Ｃ／ＪＡＭ－３、ＣＤ６２Ｐ（Ｐ－セレクチン）、ＣＤ３１（ＰＥＣＡＭ－１）、ＣＤ１５０（ＳＬＡＭＦ１）、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ５、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ４／ＰＦ４、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ８、ＮＡＰ２（ＣＸＣＬ７）、ＩＬ－１ｂのうちのいずれか１つ以上の発現を下方制御若しくは阻害する、
ｏ）ＴＧＦｂ及び／又はＧＡＲＰの発現を破壊又は阻害する、
ｑ）Ｓｉｇｌｅｃ－７、Ｓｉｇｌｅｃ－９、Ｓｉｇｌｅｃ－１１又はＴＧＦｂのうちのいずれか１つ以上の発現を破壊又は阻害する、
ｓ）ＧＰＩｂ／Ｖ／ＩＸ及びＧＰＶＩ（ＧＰ６）、ＩＴＧＡ２Ｂ、ＣＬＥＣ２、インテグリンαＩＩｂｂ３、ａ２ｂ１、ａ５ｂ１及びａ６ｂ１、ＧＰＶＩ及びＩＴＧＡ２Ｂのうちのいずれか１つ以上の発現を破壊又は阻害する、
ｔ）Ｐａｒ１、Ｐａｒ４、Ｐ２Ｙ１２、ＧＰＩｂ／Ｖ／ＩＸ、トロンボキサン受容体（ＴＢＸＡ２Ｒ）、Ｐ２Ｙ１、Ｐ２Ｘ１及びインテグリンαＩＩｂｂ３のうちのいずれか１つ以上、又はＰａｒ１、Ｐａｒ４及びＰ２Ｙ１２からなる群からのいずれか１つ以上の発現を破壊又は阻害する、
ｕ）Ｃｏｘ１、Ｃｏｘ２、ＨＰＳ、プロトロンビン、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、フォン・ヴィレブランド因子及びトロンボキサン－Ａシンターゼ（ＴＢＸＡＳ１）のうちのいずれか１つ以上の発現を破壊又は阻害する、
ｖ）血小板又は血小板様膜結合細胞フラグメントの活性化に応答して目的のタンパク質又はＲＮＡを合成し、任意選択で、目的のタンパク質又はＲＮＡが、ＢＣＬ－３ ｍＲＮＡ非翻訳領域、任意選択で５′ＵＴＲから発現される、
ｚ）１つ以上のカーゴタンパク質又はカーゴＲＮＡを発現し、任意選択で、カーゴタンパク質又はカーゴＲＮＡが、アルファ顆粒標的化シグナルを含み、任意選択で、血小板因子４（ＰＦ４）又はフォン・ヴィレブランド因子（ｖＷｆ）を含む、
ａａ）先行の段落のいずれかに記載の少なくとも２つのＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲを発現し、任意選択で、先行の段落のいずれかに記載の少なくとも３、４、５、６、７、８、９又は少なくとも１０の異なるＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲを発現する、
ｂｂ）先行の段落のいずれかに記載の少なくとも２つのＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲを発現し、少なくとも２つのＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲの標的結合ドメインが、異なる標的に対して指向されている、
ｃｃ）先行の段落のいずれかに記載の少なくとも２つのＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲを発現し、少なくとも２つのＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲの標的結合ドメインが、異なる標的に対して指向されている、
ｉ）第１のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲの血小板調節ドメインが、血小板活性化ドメイン、任意選択で脱顆粒誘発ドメイン、任意選択でＩＴＡＭ含有ドメインであり、第２のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲの血小板調節ドメインが、血小板阻害ドメインであり、任意選択で血小板脱顆粒の誘発を防止するドメインであり、任意選択でＩＴＡＭ含有ドメインである、
ｉｉ）第１のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲの血小板調節ドメインが、血小板活性化ドメイン、任意選択で脱顆粒誘発ドメイン、任意選択でＩＴＡＭ含有ドメインであり、第２のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲの血小板調節ドメインが、血小板活性化ドメイン、任意選択で脱顆粒誘発ドメイン、任意選択でＩＴＡＭ含有ドメインである、
ｄｄ）ともに作動して論理回路を形成する、先行の段落のいずれかに記載の少なくとも２つのＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付け標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲを発現する、
ｅｅ）１つ以上のカーゴを発現し、任意選択で、カーゴが、
ａ）タンパク質又はペプチドであって、任意選択で、
ｉ）抗体若しくはその抗原結合フラグメント、例えば腫瘍抗原若しくは新抗原に結合する抗体若しくはその抗原結合フラグメント、
ｉｉ）ヌクレアーゼなどの酵素、例えばＴＡＬＥＮ、
ｉｉｉ）サイトカイン、例えばＩＬ－１０、又は
ｉｖ）ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質、例えばＣａｓ９、
ｖ）二重特異性タンパク質、例えば二重特異性抗体若しくは任意選択でＴ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）、
ｖｉ）エキソソーム標的化ドメインを含む融合タンパク質であり、融合タンパク質が、
ａ）カーゴタンパク質又はペプチドと、
ｂ）エキソソーム標的化ドメインと、を含み、任意選択で、エキソソーム標的化ドメインが、
ｉ）エキソソーム特異的膜タンパク質又はそのエキソソーム膜標的化部分、例えば、
テトラスパニン、例えばＣＤ６３、又は
非テトラスパニン、例えばＰＴＧＦＲＮ若しくはＢＡＳＰ１
ｉｉ）可溶性タンパク質由来のエキソソーム標的化配列、任意選択でＮｅｄｄ４ユビキチンリガーゼのＷＷドメイン、
ｉｉｉ）ユビキチンタグ、及び／又は
ｉｖ）タグ結合ドメイン、任意選択でタグに対して指向されたナノボディ、任意選択でＧＦＰに対して指向されたナノボディを含むか若しくはそれらからなる群から選択される、タンパク質又はペプチド。
ｂ）核酸であって、任意選択で、
ｉ）例えばｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、及びクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）配列から選択される、ＲＮＡ、及び／又は
ｉｉ）エキソソーム標的化ドメインを含むＲＮＡであって、任意選択で、エキソソーム標的化ドメインが、
ａ）エキソソーム標的化ヘアピン若しくは直鎖状モチーフ、
ｂ）ウイルスエキソソーム標的化ＲＮＡ若しくはそのエキソソーム標的化フラグメントを含むか若しくはそれらからなる群から選択される、ＲＮＡ、
ｉｉｉ）アプタマードメインを含むＲＮＡであって、任意選択で、アプタマードメインが、
ａ）ＭＳ２結合ステムループ、
ｂ）Ｃ／Ｄボックス、及び／若しくは
ｃ）ＡＵリッチエレメントから選択され、任意選択で、ＲＮＡが、Ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡである、ＲＮＡである、核酸を含む群から選択される、
ｆｆ）融合タンパク質を発現し、融合タンパク質が、
ｉ）エキソソーム膜タンパク質に融合されたバクテリオファージコートタンパク質ＭＳ２（任意選択で、エキソソーム膜タンパク質は、Ｌａｍｐ２ｂ、ＶＳＶＧ、ＣＤ６３を含むか若しくはそれらからなる群から選択される）、及び／又は
ｉｉ）エキソソーム膜タンパク質に融合された古細菌リボソームタンパク質Ｌ７Ａｅ（任意選択で、エキソソーム膜タンパク質は、Ｌａｍｐ２ｂ、ＶＳＶＧ、ＣＤ６３を含むか若しくはそれらからなる群から選択される）、及び／又は
ｉｉｉ）ＣＤ９－ＨｕＲ融合タンパク質を含み、
任意選択で、融合タンパク質が、光活性化された二量体化タンパク質を更に含む、
ｇｇ）１つ以上のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲｓ又はｅＰＡＲｓの標的への結合の際にのみ１つ以上のカーゴを発現し、任意選択で、カーゴが、
ａ）タンパク質又はペプチド、任意選択で、
ｉ）抗体若しくはその抗原結合フラグメント、例えば腫瘍抗原若しくは新抗原に結合する抗体若しくはその抗原結合フラグメント、
ｉｉ）ヌクレアーゼなどの酵素、例えばＴＡＬＥＮ、
ｉｉｉ）サイトカイン、例えばＩＬ－１０、又は
ｉｖ）ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質、例えばＣａｓ９、
ｖ）二重特異性タンパク質、例えば二重特異性抗体若しくは任意選択でＴ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）である、タンパク又はペプチド、
ｂ）核酸であって、いくつかの実施形態では、
ｉ）例えばｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、及びクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）配列から選択される、ＲＮＡである、核酸を含む群から選択され、
任意選択で、カーゴが、Ｂｃｌ－３ ｍＲＮＡ非翻訳領域、任意選択で５′ＵＴＲから発現されるように操作されている、先行の段落のいずれかに記載の操作されたシャーシ。
１７４． シャーシ又は操作されたシャーシが、１つ以上のカーゴを含み、任意選択で、操作されたシャーシが、
ａ）１つ以上のカーゴをロードされており、かつ／又は
ｂ）１つ以上のカーゴを提供するように操作されている、先行の段落のいずれかに記載のシャーシ又は操作されたシャーシ。
１７５． カーゴが、
ａ）タンパク質又はペプチドであって、いくつかの実施形態では、
ｉ）抗体若しくはその抗原結合フラグメント、例えば腫瘍抗原若しくは新抗原に結合する抗体若しくはその抗原結合フラグメント、
ｉｉ）ヌクレアーゼなどの酵素、例えばＴＡＬＥＮ、
ｉｉｉ）サイトカイン、例えばＩＬ－１０、又は
ｉｖ）ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質、例えばＣａｓ９、
ｖ）二重特異性タンパク質、例えば二重特異性抗体若しくは任意選択でＴ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）である、タンパク又はペプチド、
ｂ）核酸であって、いくつかの実施形態では、
ｉ）例えばｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、及びクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）配列から選択される、ＲＮＡ、又は
ｉｉ）ＤＮＡベクターである、核酸、
ｃ）毒素、
ｄ）小分子薬物、造影剤、放射性ヌクレオチド薬物、放射性ヌクレオチドタグ付抗体、又はそれらの任意のコンジュゲート、
ｅ）ＡＡＶなどのウイルスベクター、
ｆ）腫瘍溶解性ウイルスなどのウイルス、
ｇ）ＣＲＩＳＰＲ媒介遺伝子編集を実行するための薬剤、
ｈ）エキソソーム、例えば第２のカーゴをプレロードされたエキソソーム、及び／あるいは
ｉ）１つ又は複数のナノ粒子。
あるいはそれらの任意の組み合わせのうちのいずれか１つ以上から選択される、先行の段落のいずれかに記載のシャーシ又は操作されたシャーシ。
１７６． カーゴが、内因的に発現されたカーゴであり、
任意選択で、内因的に発現されたカーゴが、
ａ）タンパク質又はペプチドであって、いくつかの実施形態では、
ｉ）抗体若しくはその抗原結合フラグメント、例えば腫瘍抗原若しくは新抗原に結合する抗体若しくはその抗原結合フラグメント、
ｉｉ）ヌクレアーゼなどの酵素、例えばＴＡＬＥＮ、
ｉｉｉ）サイトカイン、例えばＩＬ－１０、又は
ｉｖ）ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質、例えばＣａｓ９、
ｖ）二重特異性タンパク質、例えば二重特異性抗体若しくは任意選択でＴ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）である、タンパク又はペプチド、
ｂ）核酸であって、いくつかの実施形態では、
ｉ）例えばｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、及びクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）配列から選択される、ＲＮＡである、核酸のうちのいずれか１つ以上である、先行の段落のいずれかに記載のシャーシ又は操作されたシャーシ。
１７７． カーゴが、シャーシ又は操作されたシャーシに外因的にロードされ、
任意選択で、外因的にロードされたカーゴが、
ａ）タンパク質又はペプチドであって、いくつかの実施形態では、
ｉ）抗体若しくはその抗原結合フラグメント、例えば腫瘍抗原若しくは新抗原に結合する抗体若しくはその抗原結合フラグメント、
ｉｉ）ヌクレアーゼなどの酵素、例えばＴＡＬＥＮ、
ｉｉｉ）サイトカイン、例えばＩＬ－１０、又は
ｉｖ）ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質、例えばＣａｓ９、
ｖ）二重特異性タンパク質、例えば二重特異性抗体若しくは任意選択でＴ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）である、タンパク又はペプチド、
ｂ）核酸であって、いくつかの実施形態では、
ｉ）例えばｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、及びクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）配列から選択される、ＲＮＡである、核酸のうちのいずれか１つ以上である、先行の段落のいずれかに記載のシャーシ又は操作されたシャーシ。
１７８． シャーシ又は操作されたシャーシが、カーゴを含み、カーゴが、シャーシ又は操作されたシャーシの中又は上に、任意選択で細胞質の中に、原形質膜の中に、又は細胞外表面に外因的にロードされている、先行の段落のいずれかに記載のシャーシ又は操作されたシャーシ。
１７９． シャーシ又は操作されたシャーシが、カーゴを含む場合、カーゴが、エキソソーム標的化ドメインを含む、先行の段落のいずれかに記載のシャーシ又は操作されたシャーシ。
１８０． カーゴが、融合タンパク質であるタンパク質又はペプチドであり、
ａ）カーゴタンパク質又はペプチドと、
ｂ）エキソソーム標的化ドメインと、を含み、任意選択で、エキソソーム標的化ドメインが、
ｉ）エキソソーム特異的膜タンパク質又はそのエキソソーム膜標的化部分、例えば、
テトラスパニン、例えばＣＤ６３、又は
非テトラスパニン、例えばＰＴＧＦＲＮ若しくはＢＡＳＰ１
ｉｉ）可溶性タンパク質由来のエキソソーム標的化配列、任意選択でＮｅｄｄ４ユビキチンリガーゼのＷＷドメイン、
ｉｉｉ）ユビキチンタグ、及び／又は
ｉｖ）タグ結合ドメイン、任意選択でタグに対して指向されたナノボディ、任意選択でＧＦＰに対して指向されたナノボディ、及び／又は
ｖ）表Ａに列挙されたタンパク質から選択されるタンパク質を含むか若しくはそれらからなる群から選択される、段落１７９に記載のシャーシ又は操作されたシャーシ。
１８１． カーゴが、ＲＮＡであり、エキソソーム標的化ドメインが、
ａ）エキソソーム標的化ヘアピン若しくは直鎖状モチーフ、
ｂ）ウイルスエキソソーム標的化ＲＮＡ若しくはそのエキソソーム標的化フラグメント、
ｃ）アプタマー、任意選択で、
ｉ）ＭＳ２結合ステムループ、
ｉｉ）Ｃ／Ｄボックス、及び／若しくは
ｉｉｉ）ＡＵリッチエレメントであり、任意選択で、ＲＮＡが、Ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡである、段落１７９に記載のシャーシ又は操作されたシャーシ。
１８２． シャーシ又は操作されたシャーシが、融合タンパク質を発現するように操作されており、融合タンパク質が、
ａ）エキソソーム膜タンパク質に融合されたバクテリオファージコートタンパク質ＭＳ２（任意選択で、エキソソーム膜タンパク質は、Ｌａｍｐ２ｂ、ＶＳＶＧ、ＣＤ６３、若しくは表Ａのタンパク質のうちのいずれかを含むか若しくはそれらからなる群から選択される）、及び／又は
ｂ）エキソソーム膜タンパク質に融合された古細菌リボソームタンパク質Ｌ７Ａｅを含む融合タンパク質（任意選択で、エキソソーム膜タンパク質は、Ｌａｍｐ２ｂ、ＶＳＶＧ、ＣＤ６３、若しくは表Ａのタンパク質のうちのいずれかを含むか若しくはそれらからなる群から選択される）、及び／又は
ｃ）エキソソーム膜タンパク質に融合されたアプタマー結合タンパク質（任意選択で、エキソソーム膜タンパク質は、Ｌａｍｐ２ｂ、ＶＳＶＧ、ＣＤ６３、若しくは表Ａのタンパク質のうちのいずれかを含むか若しくはそれらからなる群から選択される）を含む、先行の段落のいずれかに記載のシャーシ又は操作されたシャーシ。
１８３． 融合タンパク質が、光活性化二量体化タンパク質を更に含む、段落１８２に記載のシャーシ又は操作されたシャーシ。
１８４． シャーシ又は操作されたシャーシが、ＭＳ２結合ステムループであるエキソソーム標的化ドメインを含むＲＮＡであるカーゴを含む場合、シャーシ又は操作されたシャーシが、融合タンパク質を発現するように操作されており、融合タンパク質が、エキソソーム膜タンパク質に融合されたバクテリオファージコートタンパク質ＭＳ２を含み、任意選択で、エキソソーム膜タンパク質が、Ｌａｍｐ２ｂ、ＶＳＶＧ、ＣＤ６３、又は表Ａのタンパク質のうちのいずれかを含むか又はそれらからなる群から選択され、
任意選択で、融合タンパク質が、光活性化二量体化ドメインを更に含む、先行の段落のいずれかに記載のシャーシ又は操作されたシャーシ。
１８５． シャーシ又は操作されたシャーシが、Ｃ／Ｄボックスであるエキソソーム標的化ドメインを含むＲＮＡであるカーゴを含む場合、シャーシ又は操作されたシャーシが、融合タンパク質を発現するように操作されており、融合タンパク質が、エキソソーム膜タンパク質に融合された古細菌リボソームタンパク質Ｌ７Ａｅを含み、任意選択で、エキソソーム膜タンパク質が、Ｌａｍｐ２ｂ、ＶＳＶＧ、ＣＤ６３、又は表Ａのタンパク質のうちのいずれかを含むか又はそれらからなる群から選択され、
任意選択で、融合タンパク質が、光活性化二量体化ドメインを更に含む、先行の段落のいずれかに記載のシャーシ又は操作されたシャーシ。
１８６． シャーシ又は操作されたシャーシが、アプタマーを含むＲＮＡであるカーゴを含む場合、シャーシ又は操作されたシャーシが、融合タンパク質を発現するように操作されており、融合タンパク質が、エキソソーム膜タンパク質に融合されたアプタマーによって結合され得るタンパク質又はそのフラグメントを含み、任意選択で、エキソソーム膜タンパク質が、Ｌａｍｐ２ｂ、ＶＳＶＧ、ＣＤ６３、又は表Ａのタンパク質のうちのいずれかを含むか又はそれらからなる群から選択され、
任意選択で、融合タンパク質が、光活性化二量体化ドメインを更に含む、先行の段落のいずれかに記載のシャーシ又は操作されたシャーシ。
１８７． シャーシ又は操作されたシャーシが、ＡＵリッチエレメントであるエキソソーム標的化ドメインを含むＲＮＡであるカーゴを含む場合、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシが、融合タンパク質を発現するように操作されており、融合タンパク質が、ＣＤ９－ＨｕＲ融合タンパク質である、先行の段落のいずれかに記載のシャーシ又は操作されたシャーシ。
１８８． カーゴが、Ｃａｓタンパク質、任意選択でＣａｓ９タンパク質をコードするＲＮＡである、先行の段落のいずれかに記載のシャーシ又は操作されたシャーシ。
１８９． 前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシが、１つ以上のｓｇＲＮＡを発現するように操作されている、先行の段落のいずれかに記載のシャーシ又は操作されたシャーシ。
１９０．
シャーシ又は操作されたシャーシが、１つ以上のカーゴをコードする核酸を含み、
任意選択で、
核酸が、異種配列を含み、
カーゴが、異種カーゴであり、かつ／又は
カーゴが、１つ以上の標的化配列を含み、任意選択で、エキソソーム標的化ドメインを含む、先行の段落のいずれかに記載のシャーシ又は操作されたシャーシ。
１９１． シャーシ又は操作されたシャーシが、先行の段落によって定義されるＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲのうちのいずれか１つ以上を含み、シャーシ又は操作されたシャーシが、
ａ）ＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、若しくはＳＡＰＲのうちのいずれか１つ以上の標的結合ドメインが、標的に結合する場合、及び／又は
ｂ）ｅＰＡＲが、プロテアーゼによって切断される場合のみに発現されるカーゴを内因的に発現し、
任意選択で、
カーゴが、シャーシ又は対象に対して毒性であり、かつ／又は
カーゴが、Ｂｃｌ－３ ｍＲＮＡ非翻訳領域、任意選択で５’ＵＴＲから発現される、先行の段落のいずれか１つに記載のシャーシ又は操作されたシャーシ。
１９２． シャーシ又は操作されたシャーシが、カーゴを含み、カーゴが、シャーシ又は操作されたシャーシの中又は上に、任意選択で細胞質の中に、原形質膜の中に、又は細胞外表面に外因的にロードされている、先行の段落のいずれかに記載のシャーシ又は操作されたシャーシ。
１９３． カーゴをコードする核酸であって、任意選択で、カーゴが、
ａ）タンパク質又はペプチド、任意選択で、
ｉ）抗体若しくはその抗原結合フラグメント、例えば腫瘍抗原若しくは新抗原に結合する抗体若しくはその抗原結合フラグメント、
ｉｉ）ヌクレアーゼなどの酵素、例えばＴＡＬＥＮ、
ｉｉｉ）サイトカイン、例えばＩＬ－１０、又は
ｉｖ）ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質、例えばＣａｓ９、
ｖ）二重特異性タンパク質、例えば二重特異性抗体若しくは任意選択でＴ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）である、タンパク又はペプチド、
ｂ）核酸、任意選択でＲＮＡ、任意選択でｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、及びクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）配列から選択される、ＲＮＡから選択され、
任意選択で、カーゴが、標的化ドメインを含み、任意選択で、エキソソーム標的化ドメインを含む、核酸。
１９４． 核酸が、アルファ顆粒局在化シグナルとインフレームでカーゴをコードし、任意選択で、アルファ顆粒局在化シグナルは、ｖＷｆのＰＦ４から選択される、段落１９３に記載の核酸。
１９５． シャーシ又は操作されたシャーシが、段落９３又は１９４に記載の核酸を含み、先行の段落のいずれかに記載のシャーシ又は操作されたシャーシ。
１９６． シャーシ又は操作されたシャーシが、カーゴを含み、カーゴが、顆粒内、任意選択でアルファ顆粒内、エキソソーム内、任意選択でアルファ顆粒とともに位置するエキソソーム内、細胞質内、原形質膜内、及び／又は原形質膜の外表面に貯蔵又は位置する、先行の段落のいずれかに記載のシャーシ又は操作されたシャーシ。
１９７． シャーシ又は設計されたシャーシが、カーゴを含み、カーゴが、
治療剤、
造影剤、
非治療剤、及び／又は
化粧剤である、先行の段落のいずれかに記載のシャーシ又は操作されたシャーシ。
１９８． シャーシ又は操作されたシャーシが、先行の段落のいずれかに記載の１つ以上のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲを発現するエフェクターシャーシであり、任意選択で、標的化送達システムが、治療的標的化送達システム又は非治療的送達システムである、先行の段落のいずれかに定義されるシャーシ又は操作されたシャーシを含む標的化送達システム。
１９９． 操作されたシャーシが、先行の段落のいずれかに記載の１つ以上のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲを発現する操作されたエフェクターシャーシであり、エフェクターシャーシが、血栓形成性経路を破壊するように操作されており、標的化送達システムが、非血栓形成性治療的標的化送達システム又は非血栓形成性非治療的送達システムである、先行の段落のいずれかに記載の操作されたシャーシを含む、非血栓形成性標的化送達システム。
２００． 系が、１つ以上のカーゴを更に含み、任意選択でカーゴが、１つ以上の標的化ドメインを含み、任意選択でエキソソーム標的化ドメインを含む、先行の段落の標的化送達システム又は非血栓形成性標的化送達システム。
２０１． 任意選択で、シャーシが、エフェクターシャーシである、先行の段落のいずれかに記載のシャーシ若しくは操作されたシャーシ、並びに／又は医薬において使用するための先行の段落のいずれかに記載のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ若しくはｅＰＡＲ。
２０１． 任意選択で、シャーシ又は操作されたシャーシが、エフェクターシャーシ又は操作されたエフェクターシャーシである、治療的若しくは造影カーゴを送達するか、又はがん、自己免疫疾患、遺伝性疾患、心血管疾患及び／若しくは感染症を治療若しくは予防する際に使用するための、先行の段落のいずれかに記載のシャーシ若しくは操作されたシャーシ、及び／又はＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲ。
２０２． カーゴを送達する方法であって、有効量の、先行の段落のいずれかに記載のシャーシ又は操作されたシャーシのうちのいずれか１つ以上を投与することを含み、任意選択で、シャーシ又は操作されたシャーシが、先行の段落のいずれかに記載の１つ以上のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付き標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲを含み、任意選択で、シャーシ又は操作されたシャーシが、エフェクターシャーシ又は操作されたエフェクターシャーシである、方法。
２０３． 体内の標的細胞、組織又は部位への標的化カーゴ送達の方法であって、方法が、有効量の、先行の段落のいずれかに記載のシャーシ又は操作されたシャーシのうちのいずれか１つ以上を投与することを含み、任意選択で、シャーシ又は操作されたシャーシが、先行の段落のいずれかに記載の１つ以上のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲを含み、ＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲの標的化ドメインが、体内の標的細胞、組織又は部位に結合し、操作されたシャーシが、エフェクターシャーシ又は操作されたエフェクターシャーシである、方法。
２０４． カーゴの送達を必要とする対象にカーゴを送達する、非治療的方法。
２０５． 有効量の、先行の段落のいずれかに記載のシャーシ又は操作されたシャーシのうちのいずれか１つ以上を投与することを含む、治療の方法であって、任意選択で、シャーシ又は操作されたシャーシが、先行の段落のいずれかに記載の１つ以上のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲを含み、任意選択で、方法が、がん、自己免疫疾患、遺伝性疾患、心血管疾患及び／又は感染症のうちのいずれか１つ以上の治療又は予防のためのものであり、任意選択で、シャーシ又は操作されたシャーシが、エフェクターシャーシ又は操作されたエフェクターシャーシである、方法。
２０６． 任意選択で、シャーシ又は操作されたシャーシが、先行の段落のいずれかに記載の１つ以上のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲを含む、疾患又は感染症の治療又は予防のための、任意選択で、がん、自己免疫疾患、遺伝性疾患、心血管疾患、及び／又は感染症のうちのいずれか１つ以上を治療又は予防するための医薬品の製造における、先行の段落のいずれかに記載のシャーシ又は操作されたシャーシのうちのいずれか１つ以上の使用であって、任意選択で、シャーシ又は操作されたシャーシが、エフェクターシャーシ又は操作されたエフェクターシャーシである、使用。
２０７． シャーシ又は操作されたシャーシを、それを必要とする患者に投与することによって、先行の段落のいずれかに記載のシャーシ又は操作されたシャーシを使用してカーゴ、任意選択で、治療剤を送達する方法であって、任意選択で、シャーシ又は操作されたシャーシが、先行の段落のいずれかに記載の１つ以上のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチド、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲを含み、任意選択で、シャーシ又は操作されたシャーシが、エフェクターシャーシ又は操作されたエフェクターシャーシである、方法。
２０８． 以下の：
ａ）先行の段落のいずれか１つ以上に記載のシャーシ、
ｂ）先行の段落のいずれか１つ以上に記載の操作されたシャーシ、
ｃ）先行の段落のいずれか１つ以上に記載の操作された血小板又は血小板様膜結合細胞フラグメント、
ｄ）治療剤及び／若しくは造影剤、
ｅ）先行の段落のいずれか１つ以上に記載のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ若しくはｅＰＡＲ、及び／又は
ｆ）先行の段落のいずれか１つ以上に記載のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲをコードする核酸、
ｇ）先行の段落のいずれか１つ以上に定義される１つ以上のカーゴをコードする核酸、及び／又は
ｈ）先行の段落のいずれか１つ以上に定義される１つ以上のカーゴのうちのいずれか２つ以上を含む、キット。
２０９． カーゴを含むエキソソームの標的化送達のための方法であって、先行の段落のいずれかに記載のシャーシ又は操作されたシャーシを、それを必要とする対象に投与することを含み、
ａ）シャーシ又は操作されたシャーシが、１つ以上のキメラ血小板受容体（ＣＰＲ）、ユニバーサルキメラ血小板受容体（ユニバーサルＣＰＲ）、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、合成抗原提示受容体（ＳＡＰＲ）、又は操作されたプロテアーゼ活性化受容体（ｅＰＡＲＳ）を発現し、任意選択で、少なくとも１つのＣＰＲ又はユニバーサルＣＰＲを含み、
ｂ）シャーシ又は操作されたシャーシが、カーゴ及び／又はシャーシ若しくは操作されたシャーシの操作によってエキソソームに標的化されているカーゴを含む、カーゴを含むエキソソームの標的化送達のための方法。
２１０． カーゴが、
ａ）タンパク質又はペプチドであって、いくつかの実施形態では、
ｉ）抗体若しくはその抗原結合フラグメント、例えば腫瘍抗原若しくは新抗原に結合する抗体若しくはその抗原結合フラグメント、
ｉｉ）ヌクレアーゼなどの酵素、例えばＴＡＬＥＮ、
ｉｉｉ）サイトカイン、例えばＩＬ－１０、又は
ｉｖ）ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質、例えばＣａｓ９、
ｖ）二重特異性タンパク質、例えば二重特異性抗体若しくは任意選択でＴ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）である、タンパク又はペプチド、
ｂ）核酸であって、いくつかの実施形態では、
ｉ）例えばｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、及びクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）配列から選択される、ＲＮＡ、又は
ｉｉ）ＤＮＡベクターである、核酸、
ｃ）毒素、
ｄ）小分子薬物、造影剤、放射性ヌクレオチド薬物、放射性ヌクレオチドタグ付抗体、又はそれらの任意のコンジュゲート、
ｅ）ＡＡＶなどのウイルスベクター、
ｆ）腫瘍溶解性ウイルスなどのウイルス、
ｇ）ＣＲＩＳＰＲ媒介遺伝子編集を実行するための薬剤、
ｈ）エキソソーム、例えば第２のカーゴをプレロードされたエキソソーム、及び／あるいは
ｉ）１つ又は複数のナノ粒子、
あるいはそれらの任意の組み合わせのうちのいずれか１つ以上から選択される、段落２０９に記載の方法。
２１１． シャーシ又は操作されたシャーシが、エキソソーム標的化ドメインを含むカーゴを内因的に発現するように操作されており、
Ａ）カーゴがタンパク質又はペプチドである場合、タンパク質又はペプチドが、
ｉ）カーゴタンパク質又はペプチドと、
ｉｉ）エキソソーム標的化ドメインと、を含む、融合タンパク質であり、任意選択で、エキソソーム標的化ドメインが、
ａ）エキソソーム特異的膜タンパク質又はそのエキソソーム膜標的化部分、任意選択で、
テトラスパニン、例えばＣＤ６３、又は
非テトラスパニン、例えばＰＴＧＦＲＮ若しくはＢＡＳＰ１
ｂ）可溶性タンパク質由来のエキソソーム標的化配列、任意選択でＮｅｄｄ４ユビキチンリガーゼのＷＷドメイン、
ｃ）ユビキチンタグ、及び／又は
ｄ）タグ結合ドメイン、任意選択でタグに対して指向されたナノボディ、任意選択でＧＦＰに対して指向されたナノボディ、及び／又は
ｅ）表Ａに列挙されたタンパク質から選択されるタンパク質を含むか若しくはそれらからなる群から選択され、
Ｂ）カーゴがＲＮＡであり、エキソソーム標的化ドメインが、
ａ）エキソソーム標的化ヘアピン若しくは直鎖状モチーフ、
ｂ）ウイルスエキソソーム標的化ＲＮＡ若しくはそのエキソソーム標的化フラグメント、
ｃ）アプタマー、任意選択で、
ｉ）ＭＳ２結合ステムループ、
ｉｉ）Ｃ／Ｄボックス、及び／若しくは
ｉｉｉ）ＡＵリッチエレメントであり、任意選択で、ＲＮＡが、Ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡであり、
任意選択で、
カーゴが、ＭＳ２結合ステムループを含むＲＮＡであり、シャーシ又は操作されたシャーシがまた、エキソソーム膜タンパク質に融合されたバクテリオファージコートタンパク質ＭＳ２を含む融合タンパク質を発現するように操作され、任意選択で、エキソソーム膜タンパク質が、Ｌａｍｐ２ｂ、ＶＳＶＧ、ＣＤ６３又は表Ａのタンパク質のうちのいずれかを含むか又はそれらからなる群から選択され、任意選択で、融合タンパク質が、光活性化二量体化タンパク質を更に含み、
カーゴが、Ｃ／Ｄボックスを含むＲＮＡであり、シャーシ又は操作されたシャーシがまた、エキソソーム膜タンパク質に融合された古細菌Ｌ７リボソームＬ７Ａｅタンパク質を含む融合タンパク質を発現するように操作され、任意選択で、エキソソーム膜タンパク質が、Ｌａｍｐ２ｂ、ＶＳＶＧ、ＣＤ６３又は表Ａのタンパク質のうちのいずれかを含むか又はそれらからなる群から選択され、任意選択で、融合タンパク質が、光活性化二量体化タンパク質を更に含み、
カーゴが、ＡＵリッチエレメントを含むＲＮＡであり、シャーシ又は操作されたシャーシが、ＣＤ９－ＨｕＲ融合タンパク質である融合タンパク質を発現するように操作されており、任意選択で、融合タンパク質が、光活性化二量体化タンパク質を更に含み、
カーゴが、アプタマーを含むＲＮＡであり、シャーシ又は操作されたシャーシが、エキソソーム膜タンパク質に融合されたアプタマー結合タンパク質（ＲＮＡ中に存在するアプタマーに結合する）を含む融合タンパク質を発現するように操作されており、任意選択で、エキソソーム膜タンパク質が、Ｌａｍｐ２ｂ、ＶＳＶＧ、ＣＤ６３又は表Ａのタンパク質のうちのいずれかを含むか又はそれらからなる群から選択され、任意選択で、融合タンパク質が、光活性化二量体化タンパク質を更に含む、段落２０９又は２１０に記載の方法。
２１０． シャーシ又は操作されたシャーシに、エキソソーム標的化ドメインを含むカーゴを外因的にロードされており、任意選択で、
Ａ）カーゴがタンパク質又はペプチドである場合、タンパク質又はペプチドが、
ｉ）カーゴタンパク質又はペプチドと、
ｉｉ）エキソソーム標的化ドメインと、を含む、融合タンパク質であり、任意選択で、エキソソーム標的化ドメインが、
ａ）エキソソーム特異的膜タンパク質又はそのエキソソーム膜標的化部分、任意選択で、
テトラスパニン、例えばＣＤ６３、又は
非テトラスパニン、例えばＰＴＧＦＲＮ若しくはＢＡＳＰ１
ｂ）可溶性タンパク質由来のエキソソーム標的化配列、任意選択でＮｅｄｄ４ユビキチンリガーゼのＷＷドメイン、
ｃ）ユビキチンタグ、及び／又は
ｄ）タグ結合ドメイン、任意選択でタグに対して指向されたナノボディ、任意選択でＧＦＰに対して指向されたナノボディ、及び／又は
ｅ）表Ａに列挙されたタンパク質から選択されるタンパク質を含むか若しくはそれらからなる群から選択され、
Ｂ）カーゴがＲＮＡであり、エキソソーム標的化ドメインが、
ａ）エキソソーム標的化ヘアピン若しくは直鎖状モチーフ、
ｂ）ウイルスエキソソーム標的化ＲＮＡ若しくはそのエキソソーム標的化フラグメント、
ｃ）アプタマー、任意選択で、
ｉ）ＭＳ２結合ステムループ、
ｉｉ）Ｃ／Ｄボックス、及び／若しくは
ｉｉｉ）ＡＵリッチエレメントであり、任意選択で、ＲＮＡが、Ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡであり、
任意選択で、
カーゴが、ＭＳ２結合ステムループを含むＲＮＡであり、シャーシ又は操作されたシャーシがまた、エキソソーム膜タンパク質に融合されたバクテリオファージコートタンパク質ＭＳ２を含む融合タンパク質を発現するように操作され、任意選択で、エキソソーム膜タンパク質が、Ｌａｍｐ２ｂ、ＶＳＶＧ、ＣＤ６３又は表Ａのタンパク質のうちのいずれかを含むか又はそれらからなる群から選択され、任意選択で、融合タンパク質が、光活性化二量体化タンパク質を更に含み、
カーゴが、Ｃ／Ｄボックスを含むＲＮＡであり、シャーシ又は操作されたシャーシがまた、エキソソーム膜タンパク質に融合された古細菌Ｌ７リボソームＬ７Ａｅタンパク質を含む融合タンパク質を発現するように操作され、任意選択で、エキソソーム膜タンパク質が、Ｌａｍｐ２ｂ、ＶＳＶＧ、ＣＤ６３又は表Ａのタンパク質のうちのいずれかを含むか又はそれらからなる群から選択され、任意選択で、融合タンパク質が、光活性化二量体化タンパク質を更に含み、
カーゴが、ＡＵリッチエレメントを含むＲＮＡであり、シャーシ又は操作されたシャーシが、ＣＤ９－ＨｕＲ融合タンパク質である融合タンパク質を発現するように操作されており、任意選択で、融合タンパク質が、光活性化二量体化タンパク質を更に含み、
カーゴが、アプタマーを含むＲＮＡであり、シャーシ又は操作されたシャーシが、エキソソーム膜タンパク質に融合されたアプタマー結合タンパク質（ＲＮＡ中に存在するアプタマーに結合する）を含む融合タンパク質を発現するように操作されており、任意選択で、エキソソーム膜タンパク質が、Ｌａｍｐ２ｂ、ＶＳＶＧ、ＣＤ６３又は表Ａのタンパク質のうちのいずれかを含むか又はそれらからなる群から選択され、任意選択で、融合タンパク質が、光活性化二量体化タンパク質を更に含む、段落２０９に記載の方法。
２１１． 治療的カーゴを含むエキソソームの、それを必要とする対象への標的化送達における使用のための、医薬における使用のための、任意選択でがん、自己免疫疾患、遺伝性疾患、心血管疾患及び／又は感染症の治療又は予防における使用のためのものであり、
操作されたシャーシが、カーゴ及び／又はシャーシ若しくは操作されたシャーシの操作によってエキソソームに標的化されているカーゴを含む操作されたエフェクターシャーシである、先行の段落のいずれかに記載の操作されたシャーシ。
２１２． カーゴが、
ａ）タンパク質又はペプチドであって、いくつかの実施形態では、
ｉ）抗体若しくはその抗原結合フラグメント、例えば腫瘍抗原若しくは新抗原に結合する抗体若しくはその抗原結合フラグメント、
ｉｉ）ヌクレアーゼなどの酵素、例えばＴＡＬＥＮ、
ｉｉｉ）サイトカイン、例えばＩＬ－１０、又は
ｉｖ）ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質、例えばＣａｓ９、
ｖ）二重特異性タンパク質、例えば二重特異性抗体若しくは任意選択でＴ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）である、タンパク又はペプチド、
ｂ）核酸であって、いくつかの実施形態では、
ｉ）例えばｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、及びクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）配列から選択される、ＲＮＡ、又は
ｉｉ）ＤＮＡベクターである、核酸、
ｃ）毒素、
ｄ）小分子薬物、造影剤、放射性ヌクレオチド薬物、放射性ヌクレオチドタグ付抗体、又はそれらの任意のコンジュゲート、
ｅ）ＡＡＶなどのウイルスベクター、
ｆ）腫瘍溶解性ウイルスなどのウイルス、
ｇ）ＣＲＩＳＰＲ媒介遺伝子編集を実行するための薬剤、
ｈ）エキソソーム、例えば第２のカーゴをプレロードされたエキソソーム、及び／あるいは
ｉ）１つ又は複数のナノ粒子、
あるいはそれらの任意の組み合わせのうちのいずれか１つ以上から選択される、段落２１１に記載の使用のための操作されたシャーシ。
２１３． シャーシ又は操作されたシャーシが、エキソソーム標的化ドメインを含むカーゴを内因的に発現するように操作されており、
Ａ）カーゴがタンパク質又はペプチドである場合、タンパク質又はペプチドが、
ｉ）カーゴタンパク質又はペプチドと、
ｉｉ）エキソソーム標的化ドメインと、を含む、融合タンパク質であり、任意選択で、エキソソーム標的化ドメインが、
ａ）エキソソーム特異的膜タンパク質又はそのエキソソーム膜標的化部分、任意選択で、
テトラスパニン、例えばＣＤ６３、又は
非テトラスパニン、例えばＰＴＧＦＲＮ若しくはＢＡＳＰ１
ｂ）可溶性タンパク質由来のエキソソーム標的化配列、任意選択でＮｅｄｄ４ユビキチンリガーゼのＷＷドメイン、
ｃ）ユビキチンタグ、及び／又は
ｄ）タグ結合ドメイン、任意選択でタグに対して指向されたナノボディ、任意選択でＧＦＰに対して指向されたナノボディ、及び／又は
ｅ）表Ａに列挙されたタンパク質から選択されるタンパク質を含むか若しくはそれらからなる群から選択され、
Ｂ）カーゴがＲＮＡであり、エキソソーム標的化ドメインが、
ａ）エキソソーム標的化ヘアピン若しくは直鎖状モチーフ、
ｂ）ウイルスエキソソーム標的化ＲＮＡ若しくはそのエキソソーム標的化フラグメント、
ｃ）アプタマー、任意選択で、
ｉ）ＭＳ２結合ステムループ、
ｉｉ）Ｃ／Ｄボックス、及び／若しくは
ｉｉｉ）ＡＵリッチエレメントであり、任意選択で、ＲＮＡが、Ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡであり、
任意選択で、
カーゴが、ＭＳ２結合ステムループを含むＲＮＡであり、シャーシ又は操作されたシャーシがまた、エキソソーム膜タンパク質に融合されたバクテリオファージコートタンパク質ＭＳ２を含む融合タンパク質を発現するように操作され、任意選択で、エキソソーム膜タンパク質が、Ｌａｍｐ２ｂ、ＶＳＶＧ、ＣＤ６３又は表Ａのタンパク質のうちのいずれかを含むか又はそれらからなる群から選択され、任意選択で、融合タンパク質が、光活性化二量体化タンパク質を更に含み、
カーゴが、Ｃ／Ｄボックスを含むＲＮＡであり、シャーシ又は操作されたシャーシがまた、エキソソーム膜タンパク質に融合された古細菌Ｌ７リボソームＬ７Ａｅタンパク質を含む融合タンパク質を発現するように操作され、任意選択で、エキソソーム膜タンパク質が、Ｌａｍｐ２ｂ、ＶＳＶＧ、ＣＤ６３又は表Ａのタンパク質のうちのいずれかを含むか又はそれらからなる群から選択され、任意選択で、融合タンパク質が、光活性化二量体化タンパク質を更に含み、
カーゴが、ＡＵリッチエレメントを含むＲＮＡであり、シャーシ又は操作されたシャーシが、ＣＤ９－ＨｕＲ融合タンパク質である融合タンパク質を発現するように操作されており、任意選択で、融合タンパク質が、光活性化二量体化タンパク質を更に含み、
カーゴが、アプタマーを含むＲＮＡであり、シャーシ又は操作されたシャーシが、エキソソーム膜タンパク質に融合されたアプタマー結合タンパク質（ＲＮＡ中に存在するアプタマーに結合する）を含む融合タンパク質を発現するように操作されており、任意選択で、エキソソーム膜タンパク質が、Ｌａｍｐ２ｂ、ＶＳＶＧ、ＣＤ６３又は表Ａのタンパク質のうちのいずれかを含むか又はそれらからなる群から選択され、任意選択で、融合タンパク質が、光活性化二量体化タンパク質を更に含む、段落２１１又は２１２に記載の使用のための操作されたシャーシ。
２１４． シャーシ又は操作されたシャーシに、エキソソーム標的化ドメインを含むカーゴを外因的にロードされており、任意選択で、
Ａ）カーゴがタンパク質又はペプチドである場合、タンパク質又はペプチドが、
ｉ）カーゴタンパク質又はペプチドと、
ｉｉ）エキソソーム標的化ドメインと、を含む、融合タンパク質であり、任意選択で、エキソソーム標的化ドメインが、
ａ）エキソソーム特異的膜タンパク質又はそのエキソソーム膜標的化部分、任意選択で、
テトラスパニン、例えばＣＤ６３、又は
非テトラスパニン、例えばＰＴＧＦＲＮ若しくはＢＡＳＰ１
ｂ）可溶性タンパク質由来のエキソソーム標的化配列、任意選択でＮｅｄｄ４ユビキチンリガーゼのＷＷドメイン、
ｃ）ユビキチンタグ、及び／又は
ｄ）タグ結合ドメイン、任意選択でタグに対して指向されたナノボディ、任意選択でＧＦＰに対して指向されたナノボディ、及び／又は
ｅ）表Ａに列挙されたタンパク質から選択されるタンパク質を含むか若しくはそれらからなる群から選択され、
Ｂ）カーゴがＲＮＡであり、エキソソーム標的化ドメインが、
ａ）エキソソーム標的化ヘアピン若しくは直鎖状モチーフ、
ｂ）ウイルスエキソソーム標的化ＲＮＡ若しくはそのエキソソーム標的化フラグメント、
ｃ）アプタマー、任意選択で、
ｉ）ＭＳ２結合ステムループ、
ｉｉ）Ｃ／Ｄボックス、及び／若しくは
ｉｉｉ）ＡＵリッチエレメントであり、任意選択で、ＲＮＡが、Ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡであり、
任意選択で、
カーゴが、ＭＳ２結合ステムループを含むＲＮＡであり、シャーシ又は操作されたシャーシがまた、エキソソーム膜タンパク質に融合されたバクテリオファージコートタンパク質ＭＳ２を含む融合タンパク質を発現するように操作され、任意選択で、エキソソーム膜タンパク質が、Ｌａｍｐ２ｂ、ＶＳＶＧ、ＣＤ６３又は表Ａのタンパク質のうちのいずれかを含むか又はそれらからなる群から選択され、任意選択で、融合タンパク質が、光活性化二量体化タンパク質を更に含み、
カーゴが、Ｃ／Ｄボックスを含むＲＮＡであり、シャーシ又は操作されたシャーシがまた、エキソソーム膜タンパク質に融合された古細菌Ｌ７リボソームＬ７Ａｅタンパク質を含む融合タンパク質を発現するように操作され、任意選択で、エキソソーム膜タンパク質が、Ｌａｍｐ２ｂ、ＶＳＶＧ、ＣＤ６３又は表Ａのタンパク質のうちのいずれかを含むか又はそれらからなる群から選択され、任意選択で、融合タンパク質が、光活性化二量体化タンパク質を更に含み、
カーゴが、ＡＵリッチエレメントを含むＲＮＡであり、シャーシ又は操作されたシャーシが、ＣＤ９－ＨｕＲ融合タンパク質である融合タンパク質を発現するように操作されており、任意選択で、融合タンパク質が、光活性化二量体化タンパク質を更に含み、
カーゴが、アプタマーを含むＲＮＡであり、シャーシ又は操作されたシャーシが、エキソソーム膜タンパク質に融合されたアプタマー結合タンパク質（ＲＮＡ中に存在するアプタマーに結合する）を含む融合タンパク質を発現するように操作されており、任意選択で、エキソソーム膜タンパク質が、Ｌａｍｐ２ｂ、ＶＳＶＧ、ＣＤ６３又は表Ａのタンパク質のうちのいずれかを含むか又はそれらからなる群から選択され、任意選択で、融合タンパク質が、光活性化二量体化タンパク質を更に含む、段落２１１又は２１２に記載の使用のための操作されたシャーシ。
２１５． 治療的カーゴを含むエキソソームの、それを必要とする対象への標的化送達における使用のための、医薬における使用のための、任意選択でがん、自己免疫疾患、遺伝性疾患、心血管疾患及び／又は感染症の治療又は予防における使用のための医薬品の製造における操作されたシャーシの使用であって、
操作されたシャーシが、カーゴ及び／又はシャーシ若しくは操作されたシャーシの操作によってエキソソームに標的化されているカーゴを含む操作されたエフェクターシャーシである、先行の段落のいずれかに記載の操作されたシャーシの使用。
２１６． カーゴが、
ａ）タンパク質又はペプチドであって、いくつかの実施形態では、
ｉ）抗体若しくはその抗原結合フラグメント、例えば腫瘍抗原若しくは新抗原に結合する抗体若しくはその抗原結合フラグメント、
ｉｉ）ヌクレアーゼなどの酵素、例えばＴＡＬＥＮ、
ｉｉｉ）サイトカイン、例えばＩＬ－１０、又は
ｉｖ）ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質、例えばＣａｓ９、
ｖ）二重特異性タンパク質、例えば二重特異性抗体若しくは任意選択でＴ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）である、タンパク又はペプチド、
ｂ）核酸であって、いくつかの実施形態では、
ｉ）例えばｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、及びクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）配列から選択される、ＲＮＡ、又は
ｉｉ）ＤＮＡベクターである、核酸、
ｃ）毒素、
ｄ）小分子薬物、造影剤、放射性ヌクレオチド薬物、放射性ヌクレオチドタグ付抗体、又はそれらの任意のコンジュゲート、
ｅ）ＡＡＶなどのウイルスベクター、
ｆ）腫瘍溶解性ウイルスなどのウイルス、
ｇ）ＣＲＩＳＰＲ媒介遺伝子編集を実行するための薬剤、
あるいはそれらの任意の組み合わせのうちのいずれか１つ以上から選択される、段落２１５に記載の使用。
２１７． シャーシ又は操作されたシャーシが、エキソソーム標的化ドメインを含むカーゴを内因的に発現するように操作されており、
Ａ）カーゴがタンパク質又はペプチドである場合、タンパク質又はペプチドが、
ｉ）カーゴタンパク質又はペプチドと、
ｉｉ）エキソソーム標的化ドメインと、を含む、融合タンパク質であり、任意選択で、エキソソーム標的化ドメインが、
ａ）エキソソーム特異的膜タンパク質又はそのエキソソーム膜標的化部分、任意選択で、
テトラスパニン、例えばＣＤ６３、又は
非テトラスパニン、例えばＰＴＧＦＲＮ若しくはＢＡＳＰ１
ｂ）可溶性タンパク質由来のエキソソーム標的化配列、任意選択でＮｅｄｄ４ユビキチンリガーゼのＷＷドメイン、
ｃ）ユビキチンタグ、及び／又は
ｄ）タグ結合ドメイン、任意選択でタグに対して指向されたナノボディ、任意選択でＧＦＰに対して指向されたナノボディ、及び／又は
ｅ）表Ａに列挙されたタンパク質から選択されるタンパク質を含むか若しくはそれらからなる群から選択され、
Ｂ）カーゴがＲＮＡであり、エキソソーム標的化ドメインが、
ａ）エキソソーム標的化ヘアピン若しくは直鎖状モチーフ、
ｂ）ウイルスエキソソーム標的化ＲＮＡ若しくはそのエキソソーム標的化フラグメント、
ｃ）アプタマー、任意選択で、
ｉ）ＭＳ２結合ステムループ、
ｉｉ）Ｃ／Ｄボックス、及び／若しくは
ｉｉｉ）ＡＵリッチエレメントであり、任意選択で、ＲＮＡが、Ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡであり、
任意選択で、
カーゴが、ＭＳ２結合ステムループを含むＲＮＡであり、シャーシ又は操作されたシャーシがまた、エキソソーム膜タンパク質に融合されたバクテリオファージコートタンパク質ＭＳ２を含む融合タンパク質を発現するように操作され、任意選択で、エキソソーム膜タンパク質が、Ｌａｍｐ２ｂ、ＶＳＶＧ、ＣＤ６３又は表Ａのタンパク質のうちのいずれかを含むか又はそれらからなる群から選択され、任意選択で、融合タンパク質が、光活性化二量体化タンパク質を更に含み、
カーゴが、Ｃ／Ｄボックスを含むＲＮＡであり、シャーシ又は操作されたシャーシがまた、エキソソーム膜タンパク質に融合された古細菌Ｌ７リボソームＬ７Ａｅタンパク質を含む融合タンパク質を発現するように操作され、任意選択で、エキソソーム膜タンパク質が、Ｌａｍｐ２ｂ、ＶＳＶＧ、ＣＤ６３又は表Ａのタンパク質のうちのいずれかを含むか又はそれらからなる群から選択され、任意選択で、融合タンパク質が、光活性化二量体化タンパク質を更に含み、
カーゴが、ＡＵリッチエレメントを含むＲＮＡであり、シャーシ又は操作されたシャーシが、ＣＤ９－ＨｕＲ融合タンパク質である融合タンパク質を発現するように操作されており、任意選択で、融合タンパク質が、光活性化二量体化タンパク質を更に含み、
カーゴが、アプタマーを含むＲＮＡであり、シャーシ又は操作されたシャーシが、エキソソーム膜タンパク質に融合されたアプタマー結合タンパク質（ＲＮＡ中に存在するアプタマーに結合する）を含む融合タンパク質を発現するように操作されており、任意選択で、エキソソーム膜タンパク質が、Ｌａｍｐ２ｂ、ＶＳＶＧ、ＣＤ６３又は表Ａのタンパク質のうちのいずれかを含むか又はそれらからなる群から選択され、任意選択で、融合タンパク質が、光活性化二量体化タンパク質を更に含む、段落２１５又は２１６に記載の使用。
２１８． シャーシ又は操作されたシャーシに、エキソソーム標的化ドメインを含むカーゴを外因的にロードされており、任意選択で、
Ａ）カーゴがタンパク質又はペプチドである場合、タンパク質又はペプチドが、
ｉ）カーゴタンパク質又はペプチドと、
ｉｉ）エキソソーム標的化ドメインと、を含む、融合タンパク質であり、任意選択で、エキソソーム標的化ドメインが、
ａ）エキソソーム特異的膜タンパク質又はそのエキソソーム膜標的化部分、任意選択で、
テトラスパニン、例えばＣＤ６３、又は
非テトラスパニン、例えばＰＴＧＦＲＮ若しくはＢＡＳＰ１
ｂ）可溶性タンパク質由来のエキソソーム標的化配列、任意選択でＮｅｄｄ４ユビキチンリガーゼのＷＷドメイン、
ｃ）ユビキチンタグ、及び／又は
ｄ）タグ結合ドメイン、任意選択でタグに対して指向されたナノボディ、任意選択でＧＦＰに対して指向されたナノボディ、及び／又は
ｅ）表Ａに列挙されたタンパク質から選択されるタンパク質を含むか若しくはそれらからなる群から選択され、
Ｂ）カーゴがＲＮＡであり、エキソソーム標的化ドメインが、
ａ）エキソソーム標的化ヘアピン若しくは直鎖状モチーフ、
ｂ）ウイルスエキソソーム標的化ＲＮＡ若しくはそのエキソソーム標的化フラグメント、
ｃ）アプタマー、任意選択で、
ｉ）ＭＳ２結合ステムループ、
ｉｉ）Ｃ／Ｄボックス、及び／若しくは
ｉｉｉ）ＡＵリッチエレメントであり、任意選択で、ＲＮＡが、Ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡであり、
任意選択で、
カーゴが、ＭＳ２結合ステムループを含むＲＮＡであり、シャーシ又は操作されたシャーシがまた、エキソソーム膜タンパク質に融合されたバクテリオファージコートタンパク質ＭＳ２を含む融合タンパク質を発現するように操作され、任意選択で、エキソソーム膜タンパク質が、Ｌａｍｐ２ｂ、ＶＳＶＧ、ＣＤ６３又は表Ａのタンパク質のうちのいずれかを含むか又はそれらからなる群から選択され、任意選択で、融合タンパク質が、光活性化二量体化タンパク質を更に含み、
カーゴが、Ｃ／Ｄボックスを含むＲＮＡであり、シャーシ又は操作されたシャーシがまた、エキソソーム膜タンパク質に融合された古細菌Ｌ７リボソームＬ７Ａｅタンパク質を含む融合タンパク質を発現するように操作され、任意選択で、エキソソーム膜タンパク質が、Ｌａｍｐ２ｂ、ＶＳＶＧ、ＣＤ６３又は表Ａのタンパク質のうちのいずれかを含むか又はそれらからなる群から選択され、任意選択で、融合タンパク質が、光活性化二量体化タンパク質を更に含み、
カーゴが、ＡＵリッチエレメントを含むＲＮＡであり、シャーシ又は操作されたシャーシが、ＣＤ９－ＨｕＲ融合タンパク質である融合タンパク質を発現するように操作されており、任意選択で、融合タンパク質が、光活性化二量体化タンパク質を更に含み、
カーゴが、アプタマーを含むＲＮＡであり、シャーシ又は操作されたシャーシが、エキソソーム膜タンパク質に融合されたアプタマー結合タンパク質（ＲＮＡ中に存在するアプタマーに結合する）を含む融合タンパク質を発現するように操作されており、任意選択で、エキソソーム膜タンパク質が、Ｌａｍｐ２ｂ、ＶＳＶＧ、ＣＤ６３又は表Ａのタンパク質のうちのいずれかを含むか又はそれらからなる群から選択され、任意選択で、融合タンパク質が、光活性化二量体化タンパク質を更に含む、段落２１５又は２１６に記載の使用。
１． キメラ血小板受容体（ＣＰＲ）であって、受容体が、
ａ）血小板調節ドメインである細胞内ドメインと、
ｂ）標的を認識して結合する異種標的結合ドメインと、を含む、キメラ血小板受容体。
２． 標的結合ドメインが、対象にとって内因性である標的に結合し、任意選択で、標的が、ヒト標的である、段落１に記載のＣＰＲ。
３． 標的が、細胞表面又は組織表面に存在する、先行の段落のいずれかに記載のＣＰＲ。
４． 標的が、ＣＰＲが血小板膜に存在する場合、標的が標的結合ドメインに結合した後、ＣＰＲが原形質膜上にクラスター化するような標的である、先行の段落いずれかに記載のＣＰＲ。
５． ＣＰＲが血小板膜に存在する場合、標的が標的結合ドメインに結合した後、血小板調節ドメインが活性化される、先行の段落のいずれかに記載のＣＰＲ。
６． ＣＰＲが血小板原形質膜に存在する場合、標的への標的結合ドメインの結合後、ＣＰＲが血小板原形質膜の表面にクラスター化し、当該クラスター化が、血小板調節ドメインを活性化するのに十分である、先行の段落のいずれかに記載のＣＰＲ。
７． 標的結合ドメインが、ヒト標的結合ドメイン配列、又はヒト標的結合ドメイン配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％若しくは１００％の配列同一性を有する配列を含む、先行の段落のいずれかに記載のＣＰＲ。
８． 標的結合ドメインが、非ヒト標的結合ドメイン配列、任意選択で、
ヒト化配列、又は
マウス由来の配列を含む、先行の段落のいずれかに記載のＣＰＲ。
９． 当該標的結合ドメインが、当該標的に特異的に結合する標的結合リガンド又はそのフラグメントを含む、先行の段落のいずれかに記載のＣＰＲ。
１１． 当該標的結合ドメインが、当該標的に特異的に結合する抗体又は抗体フラグメントを含む、先行の段落のいずれかに記載のＣＰＲ。
１２． 当該標的結合ドメインが、可変重鎖ドメイン及び／又は可変軽鎖ドメイン、任意選択でｓｃＦＶを含む、先行の段落のいずれかに記載のＣＰＲ。
１３． 標的が、腫瘍抗原、新抗原又は自己抗原である、先行の段落のいずれかに記載のＣＰＲ。
１４． 標的が、
ａ）疾患、障害若しくは状態に関連する抗原、及び／又は
ｂ）対象の体内の標的組織若しくは細胞（任意選択で、標的組織又は細胞が、がん組織又は細胞である）、及び／又は
ｃ）自己免疫Ｂ細胞である、先行の段落のいずれかに記載のＣＰＲ。
１５． 標的結合ドメインが、
ａ）ＦＣＥＲＧ ＥＣドメイン、ＣＬＥＣ１ ＥＣドメイン、ＦＣＧＲ２ ＥＣドメイン、ＧＰＶＩＡ ＥＣドメイン、ＣＥＡＣＡＭ１ ＥＣドメイン、Ｇ６ｂ－Ｂ ＥＣドメイン、ＬＩＬＲＢ２ ＥＣドメイン、ＰＥＣＡＭ１ ＥＣドメイン、ＴＬＴ１ ＥＣドメイン及び／又はＦＣＥＲＧ ＥＣドメイン、ＣＬＥＣ１ ＥＣドメイン、ＦＣＧＲ２ ＥＣドメイン、ＧＰＶＩＡ ＥＣドメイン、ＣＥＡＣＡＭ１ ＥＣドメイン、Ｇ６ｂ－Ｂ ＥＣドメイン、ＬＩＬＲＢ２ ＥＣドメイン、ＰＥＣＡＭ１ ＥＣドメイン及び／若しくはＴＬＴ１ ＥＣドメインに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％若しくは１００％の配列同一性を有する配列、並びに／あるいは
ｂ）標的結合ドメインが、参照により本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０２０／０５３２４７号の４６～４９頁に記載のドメイン若しくはその部分のうちのいずれか１つ以上、又は参照により本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０２０／０５３２４７号の４６～４９頁に記載のドメイン若しくはその部分のうちのいずれか１つ以上に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％若しくは１００％の配列同一性を有する配列のうちの少なくとも１つを含む、先行の段落のいずれかに記載のＣＰＲ。
１６． 標的結合ドメインが、自己免疫に関連するペプチド、
以下のタンパク質：ＭＯＧ、ＧＡＤ６５、ＭＡＧ、ＰＭＰ２２、ＴＰＯ、ＶＧＫＣ、ＰＬＰ、ＡＣｈＲ、ＴＲＩＢ２、ＮＭＤＡ、ＧｌｕＲ、ＧＡＤ２、ＡＲＭＣ９、ＣＹＰ２１Ａ２、ＣＡＳＲ、ＮＡＳＰ、インスリン、ＴＳＨＲ、甲状腺ペルオキシダーゼ、アシオグリコタンパク質受容体、ＣＹＰ２Ｄ６、ＬＦ、ＴＴＧ、Ｈ／Ｋ ＡＴＰ－ａｓｅ、第ＸＩＩＩ因子、ベータ２－ＧＰＩ、ＩＴＧＢ２、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＰ ＩＩｂ／ＩＩａ、ＣＯＬＩＩ、ＦＢＧベータアルファ、ＭＰＯ、ＣＹＯ、ＰＲＴＮ３、ＴＧＭ、ＣＯＬＶＩＩ、ＣＯＩＬ、ＤＳＧ１、ＤＳＧ３、ＳＯＸ１０、７０ＳＮＲＮＰ７０、ＳＡＧ及びａ３（ＩＶ）ＮＣ１コラーゲンのうちのいずれか１つ以上のペプチド若しくは部分、又は
以下のタンパク質：ＭＯＧ、ＧＡＤ６５、ＭＡＧ、ＰＭＰ２２、ＴＰＯ、ＶＧＫＣ、ＰＬＰ、ＡＣｈＲ、ＴＲＩＢ２、ＮＭＤＡ、ＧｌｕＲ、ＧＡＤ２、ＡＲＭＣ９、ＣＹＰ２１Ａ２、ＣＡＳＲ、ＮＡＳＰ、インスリン、ＴＳＨＲ、甲状腺ペルオキシダーゼ、アシオグリコタンパク質受容体、ＣＹＰ２Ｄ６、ＬＦ、ＴＴＧ、Ｈ／Ｋ ＡＴＰ－ａｓｅ、第ＸＩＩＩ因子、ベータ２－ＧＰＩ、ＩＴＧＢ２、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＰ ＩＩｂ／ＩＩａ、ＣＯＬＩＩ、ＦＢＧベータアルファ、ＭＰＯ、ＣＹＯ、ＰＲＴＮ３、ＴＧＭ、ＣＯＬＶＩＩ、ＣＯＩＬ、ＤＳＧ１、ＤＳＧ３、ＳＯＸ１０、７０ＳＮＲＮＰ７０、ＳＡＧ及びａ３（ＩＶ）ＮＣ１コラーゲンのうちのいずれか１つ以上に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％若しくは１００％の配列同一性を有するペプチド若しくは部分を含む、先行の段落のいずれかに記載のＣＰＲ。
１７． 標的結合ドメインが、標的に結合し、当該標的が、
ａ）対象の体内の組織上又は対象の細胞上若しくは特定の位置に見出される内因性標的であり、
ｂ）対象の組織上、又は組織の特定のサブセット上、又は血漿若しくは血液中、任意選択でヒト対象において、任意選択で血液中に存在し、
ｃ）１つ以上の疾患状態の間にのみ提示され、任意選択で、標的が、腫瘍細胞中で生じる新抗原であり、
ｄ）通常は標的を発現しない組織若しくは細胞上に著しい量で、任意選択で異常なレベルでのみ存在し、及び／又は１つ以上の疾患状態の間に局在化してのみ存在し、
ｅ）抗原、任意選択で腫瘍新抗原又は腫瘍特異的抗原であり、
ｆ）ＣＤ１９であり、
ｇ）サイトカイン受容体であり、
ｈ）コラーゲンではなく、
ｉ）人工若しくは外因性標的であり、
ｊ）デザイナー薬物であり、
ｋ）ＤＲＥＡＤＤを使用して設計された薬物であり、
ｌ）参照により本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０２０／０５３２４７号の２３～３１頁の表２から選択されるタンパク質であり、
ｍ）ＣＤ２７６であり、かつ／あるいは
ｎ）ＩＬ２、ＫＬＫ、アミロイド、Ｎｏｔｃｈ受容体及び／若しくはＯＬＲ１である、標的に結合する、先行の段落のいずれかに記載のＣＰＲ。
１８． 標的結合ドメインが、
ａ）抗体若しくはその抗原結合フラグメントであり、
ｂ）抗体の可変重鎖ドメイン及び／若しくは抗体の可変軽鎖ドメインを含み、かつ／又は
ｃ）カッパ軽鎖若しくはそのフラグメント標的化を含む、先行の段落のいずれかに記載のＣＰＲ。
１９． 標的結合ドメインが、自己免疫に関連するタンパク質又はペプチドの一部を含む、先行の段落のいずれかに記載のＣＰＲ。
２０． 血小板調節ドメインが、血小板活性化ドメイン、任意選択でＩＴＡＭを含むドメイン、任意選択で血小板ＩＴＡＭを含むドメインであり、任意選択でＩＴＡＭを含むドメイン、任意選択で血小板ＩＴＡＭを含むドメインに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％又は１００％の配列同一性を有するドメインである、先行の段落のいずれかに記載のＣＰＲ。
２１．ＣＰＲが血小板の膜に存在する場合、活性化されると、血小板活性化ドメインが、
ａ）血小板の脱顆粒をもたらす、
ｂ）血小板からの内容物の放出をもたらす、
ｃ）血小板の原形質膜上に血小板内内容物の存在をもたらす、
ｄ）原形質膜からのブレブ形成を介した細胞外小胞の放出をもたらす、及び／又は
ｅ）両凹ディスクから完全に広がった細胞フラグメントへの血小板の形状の変化をもたらす、先行の段落のいずれかに記載のＣＰＲ。
２２． 血小板活性化ドメインが、血小板脱顆粒誘発ドメインである、先行の段落のいずれかに記載のＣＰＲ。
２３． 血小板調節ドメインが、血小板の活性化を防止する血小板活性化阻害ドメインであり、任意選択で、血小板活性化阻害ドメインが、ＩＴＩＭを含むドメインであり、任意選択で、ＩＴＩＭを含むドメインに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％又は１００％の配列同一性を有するドメインである、先行の段落のいずれかに記載のＣＰＲ。
２４．ＣＰＲが血小板の膜に存在する場合、及び血小板活性化ドメインの阻害が活性化される場合、活性化ドメインの血小板阻害が、
ａ）血小板の脱顆粒を防止する、
ｂ）血小板からの内容物の放出を防止する、
ｃ）血小板の原形質膜上の細胞内内容物の存在を防止する、
ｄ）原形質膜からのブレブ形成を介した細胞外小胞の放出を防止する、及び／又は
ｅ）両凹ディスクから完全に広がった細胞フラグメントへの血小板の形状の変化を防止する、先行の段落のいずれかに記載のＣＰＲ。
２５． 血小板活性化ドメインが、血小板脱顆粒誘発ドメインである、先行の段落のいずれかに記載のＣＰＲ。
２６． 血小板調節ドメインが、ヒト調節ドメイン配列を含む、先行の段落のいずれかに記載のＣＰＲ。
２７． 血小板調節ドメインが、非ヒト調節ドメイン配列、任意選択でマウス由来の配列を含む、先行の段落のいずれかに記載のＣＰＲ。
２８． 血小板調節ドメインが、ＣＰＲがともに使用される前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシに対して内因性であり、任意選択で、血小板調節ドメインが、ｉＰＳＣ、巨核球又は血小板に対して内因性である、先行の段落のいずれかに記載のＣＰＲ。
２９． 血小板調節ドメインが、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）受容体由来のドメインを含まず、任意選択で、糖タンパク質ＶＩ（ＧＰＶＩ）、Ｃ型レクチン様受容体２（ＣＬＥＣ－２）、ＩｇＧ受容体ＩＩａのＦｃフラグメント（ＦＣｇＲ２Ａ）、高親和性免疫グロブリンイプシロン受容体サブユニットガンマ（ＦＣＥＲＧ）、Ｃ型レクチンドメインファミリー１（ＣＬＥＣ１）、又はＩｇＧ受容体ＩＩのＦｃフラグメント（ＦＣＧＲ２）からの１つ以上のドメイン、それらの部分又はフラグメントを含まない、先行の段落のいずれかに記載のＣＰＲ。
３０． ＣＰＲが血小板原形質膜に局在する場合、標的が標的結合ドメインに結合した後、血小板調節ドメインが血小板の脱顆粒を誘発する、先行の段落のいずれかに記載のＣＰＲ。
３１． 血小板調節ドメインが、血小板脱顆粒誘発ドメインであり、
免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）受容体からの１つ以上のドメインを含み、任意選択で、糖タンパク質ＶＩ（ＧＰＶＩ）、Ｃ型レクチン様受容体２（ＣＬＥＣ－２）、ＩｇＧ受容体ＩＩａのＦｃフラグメント（ＦＣｇＲ２Ａ）、高親和性免疫グロブリンイプシロン受容体サブユニットガンマ（ＦＣＥＲＧ）、Ｃ型レクチンドメインファミリー１（ＣＬＥＣ１）、若しくはＩｇＧ受容体ＩＩのＦｃフラグメント（ＦＣＧＲ２）からの１つ以上のドメイン、それらの部分若しくはフラグメントを含むか、又は
ＩＴＡＭを含むドメイン、任意選択で、血小板ＩＴＡＭを含むドメインに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％若しくは１００％の配列同一性を有する、任意選択で、糖タンパク質ＶＩ（ＧＰＶＩ）、Ｃ型レクチン様受容体２（ＣＬＥＣ－２）、ＩｇＧ受容体ＩＩａのＦｃフラグメント（ＦＣｇＲ２Ａ）、高親和性免疫グロブリンイプシロン受容体サブユニットガンマ（ＦＣＥＲＧ）、Ｃ型レクチンドメインファミリー１（ＣＬＥＣ１）、若しくはＩｇＧ受容体ＩＩのＦｃフラグメント（ＦＣＧＲ２）からの１つ以上のドメイン、それらの部分若しくはフラグメントに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％若しくは１００％の配列同一性を有するドメインを含む、先行の段落のいずれかに記載のＣＰＲ。
３２． 血小板調節ドメインが、血小板脱顆粒の誘発を阻害する血小板活性化ドメインの阻害であり、１つ以上のＩＴＩＭモチーフを含み、任意選択で、１つ以上のＩＴＩＭモチーフが、ＰＥＣＡＭ１、ＴＬＴ１、ＬＩＬＲＢ２、ＣＥＡＣＡＭ１又はＧ６ｂ－Ｂ由来のＩＴＩＭモチーフであり、任意選択で、
ＬＩＬＲＢ２由来のＩＴＩＭドメインが、参照により本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０２０／０５３２４７号の４４頁の表５に示される配列番号３４であり、
ＰＥＣＡＭ１由来のＩＴＩＭドメインが、参照により本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０２０／０５３２４７号の４４頁の表５に示される配列番号３８であり、
ＣＥＡＣＡＭ１由来のＩＴＩＭドメインが、参照により本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０２０／０５３２４７号の４４頁の表５に示される配列番号２４である、先行の段落のいずれかに記載のＣＰＲ。
３３． 血小板調節ドメインが、天然の血小板調節ドメイン配列に対して１つ以上の変異、挿入又は欠失を含む、先行の段落のいずれかに記載のＣＰＲ。
３４． 天然の調節ドメイン配列に対する１つ以上の変異、挿入又は欠失が、１つ以上の変異を含まない血小板調節ドメインを含むＣＰＲに対して、ＣＰＲの感受性を増加させる、先行の段落のいずれかに記載のＣＰＲ。
３５． 天然の調節ドメイン配列に対する１つ以上の変異、挿入又は欠失が、１つ以上の変異を含まない血小板調節ドメインを含むＣＰＲに対して、ＣＰＲの感受性を減少させる、先行の段落のいずれかに記載のＣＰＲ。
３６．血小板調節ドメインが、天然に存在する血小板調節ドメインに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％又は１００％の配列同一性を含む、先行の段落のいずれか１つに記載のＣＰＲ。
３７． シグナルペプチド及び／又はリンカー配列を更に含み、任意選択で、
シグナルペプチドが、表１に示される配列の一部を含むか若しくはそれからなり、かつ／又は、
シグナルペプチドが、参照により本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０２０／０５３２４７号の４６頁の表７の配列のうちのいずれかの一部を含むか若しくはそれからなり、かつ／又は
任意選択で、リンカーが、参照により本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０２０／０５３２４７号の５１頁に記載されているリンカー若しくはその部分を含むか若しくはそれからなる、先行の段落のいずれかに記載のＣＰＲ。
３８． 膜貫通ドメインを更に含み、任意選択で、膜貫通ドメインが、参照により本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０２０／０５３２４７号の４９～５０頁に記載されている膜貫通ドメイン又はその部分のうちのいずれか１つ以上を含むか又はそれらからなる、先行の段落のいずれかに記載のＣＰＲ。
３９． ＣＰＲが、参照により本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０２０／０５３２４７号の５０頁及び５１頁に記載されている細胞内ドメイン又はその部分を含むか又はそれからなる細胞内ドメインを含む、先行の段落のいずれかに記載のＣＰＲ。
４０． ＣＰＲが、参照により本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０２０／０５３２４７号の４１～６３頁に記載されているドメインの組み合わせを含むか又はそれからなる、先行の段落のいずれかに記載のＣＰＲ。
４１． ユニバーサルキメラ血小板受容体であって、受容体が、
ａ）血小板調節ドメインである細胞内ドメインと、
ｂ）異種タグ結合ドメインと、を含む、ユニバーサルキメラ血小板受容体。
４２． タグ及び標的結合ドメインを含むタグ付標的化ペプチドであって、任意選択で、タグ付標的化ペプチドが、可溶性ペプチドである、タグ付標的化ペプチド。
４３． タグが、ロイシンジッパーである、段落４３に記載のタグ付標的化ペプチド。
４４． 異種タグ結合ドメインが、タグ付標的化ペプチド上に存在するタグに結合し、タグ付標的化ペプチドが、タグ及び標的結合ドメインを含み、かつ
ユニバーサルＣＰＲが血小板原形質膜に位置する場合、標的への標的結合ドメインの同時結合の非存在下でのユニバーサルＣＰＲへの標的化ペプチドの結合は、血小板調節ドメインを活性化するのに十分ではない、段落４１に記載のユニバーサルＣＰＲ。
４５． 異種タグ結合ドメインが、標的化ペプチド上に存在するタグに結合し、ユニバーサルＣＰＲが血小板原形質膜に位置する場合、標的へのタグ付標的結合ドメインの同時結合の非存在下での、ユニバーサルＣＰＲへの標的化ペプチドの結合が、血小板調節ドメインの活性化をもたらすのに十分な受容体クラスター化を引き起こさない、段落４１又は４４に記載のユニバーサルＣＰＲ。
４６． タグ付標的化ペプチドが、可溶性ペプチドである、先行の段落２に記載のユニバーサルＣＰＲ。
４７． 異種タグ結合ドメインが、ロイシンジッパーを含む、先行の段落のいずれかに記載のユニバーサルＣＰＲ。
４８． 段落４１及び４４～４７のいずれかに記載のユニバーサルＣＰＲと、段落４２又は４３に記載の標的化ペプチドと、を含む、複合体であって、ユニバーサルＣＰＲが、異種タグ結合ドメインを介してタグ付標的化ペプチド上の対応するタグに結合している、複合体。
４９． 標的結合ドメインが、意図される対象に対して内因性である標的に結合し、任意選択で、標的がヒト標的である、段落４２若しくは４３に記載のタグ付標的化ペプチド又は段落４８に記載の複合体。
５０． 標的が、細胞表面又は組織表面に存在する、段落４２、４３若しくは４９のいずれかに記載のタグ付標的化ペプチド、又は段落４８若しくは４９に記載の複合体。
５１． 複合体が血小板の原形質膜に位置する場合、標的が、複合体による標的結合が原形質膜上の複合体クラスター化をもたらすような標的であり、任意選択で、当該クラスター化が、血小板調節ドメインを活性化するのに十分である、段落４８～５０のいずれかに記載の複合体。
５２． 複合体が血小板原形質膜に位置する場合、標的への複合体の結合が、血小板調節ドメインを活性化する、段落４８～５１のいずれかに記載の複合体。
５３． 標的結合ドメインが、ヒト標的結合ドメイン配列又はヒト標的結合ドメイン配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％若しくは１００％の配列同一性を有する配列を含む、段落４２、４３、４９若しくは５０のいずれかに記載のタグ付標的化ペプチド又は段落４８～５２のいずれかに記載の複合体。
５４． 標的結合ドメインが、非ヒト標的結合ドメイン配列、任意選択で、
ヒト化配列、又は
マウス由来の配列を含む、段落４２、４３、４９、５０若しくは５３のいずれかに記載のタグ付標的化ペプチド又は段落４８～５３のいずれかに記載の複合体。
５５． 当該標的結合ドメインが、当該標的に特異的に結合する標的結合リガンド又はそのフラグメントを含む、段落４２、４３、４９、５０、５３若しくは５４のいずれかに記載のタグ付標的化ペプチド又は段落４８～５４のいずれかに記載の複合体。
５６． 当該標的結合ドメインが、当該標的に特異的に結合する抗体又は抗体フラグメントを含む、段落４２、４３、４９、５０、若しくは５３～５５ ５４のいずれかに記載のタグ付標的化ペプチド又は段落４８～５５のいずれかに記載の複合体。
５７． 当該標的結合ドメインが、可変重鎖ドメイン及び／又は可変軽鎖ドメイン、任意選択で、ｓｃＦＶを含む、段落４２、４３、４９、５０、若しくは５３～５６のいずれかに記載のタグ付標的化ペプチド又は段落４８～５６のいずれかに記載の複合体。
５８． 標的が、腫瘍抗原、新抗原又は自己抗原である、段落４２、４３、４９、５０若しくは５３～５７のいずれかに記載のタグ付標的化ペプチド又は段落４８～５７のいずれかに記載の複合体。
５９． 標的が、
ａ）疾患、障害若しくは状態に関連する抗原、及び／又は
ｂ）対象の体内の標的組織若しくは細胞であり、任意選択で、標的組織又は細胞が、がん組織又は細胞である、段落４２、４３、４９、５０、若しくは５３～５８のいずれかに記載のタグ付標的化ペプチド又は段落４８～５８のいずれかに記載の複合体。
６０． 標的結合ドメインが、
ａ）ＦＣＥＲＧ ＥＣドメイン、ＣＬＥＣ１ ＥＣドメイン、ＦＣＧＲ２ ＥＣドメイン、ＧＰＶＩＡ ＥＣドメイン、ＣＥＡＣＡＭ１ ＥＣドメイン、Ｇ６ｂ－Ｂ ＥＣドメイン、ＬＩＬＲＢ２ ＥＣドメイン、ＰＥＣＡＭ１ ＥＣドメイン、及び／若しくはＴＬＴ１ ＥＣドメイン、又はＦＣＥＲＧ ＥＣドメイン、ＣＬＥＣ１ ＥＣドメイン、ＦＣＧＲ２ ＥＣドメイン、ＧＰＶＩＡ ＥＣドメイン、ＣＥＡＣＡＭ１ ＥＣドメイン、Ｇ６ｂ－Ｂ ＥＣドメイン、ＬＩＬＲＢ２ ＥＣドメイン、ＰＥＣＡＭ１ ＥＣドメイン及び／若しくはＴＬＴ１ ＥＣドメインに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％若しくは１００％の配列同一性を有する配列、並びに／あるいは
ｂ）標的結合ドメインが、参照により本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０２０／０５３２４７号の４６～４９頁に記載のドメイン若しくはその部分のうちのいずれか１つ以上、又は参照により本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０２０／０５３２４７号の４６～４９頁に記載のドメイン若しくはその部分のうちのいずれか１つ以上に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％若しくは１００％の配列同一性を有する配列のうちの少なくとも１つを含む、段落４２、４３、４９、５０、若しくは５３～５９のいずれかに記載のタグ付標的化ペプチド又は段落４８～５９のいずれかに記載の複合体。
６１． 標的結合ドメインが、自己免疫に関連するペプチド、任意選択で、
以下のタンパク質：ＭＯＧ、ＧＡＤ６５、ＭＡＧ、ＰＭＰ２２、ＴＰＯ、ＶＧＫＣ、ＰＬＰ、ＡＣｈＲ、ＴＲＩＢ２、ＮＭＤＡ、ＧｌｕＲ、ＧＡＤ２、ＡＲＭＣ９、ＣＹＰ２１Ａ２、ＣＡＳＲ、ＮＡＳＰ、インスリン、ＴＳＨＲ、甲状腺ペルオキシダーゼ、アシオグリコタンパク質受容体、ＣＹＰ２Ｄ６、ＬＦ、ＴＴＧ、Ｈ／Ｋ ＡＴＰ－ａｓｅ、第ＸＩＩＩ因子、ベータ２－ＧＰＩ、ＩＴＧＢ２、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＰ ＩＩｂ／ＩＩａ、ＣＯＬＩＩ、ＦＢＧベータアルファ、ＭＰＯ、ＣＹＯ、ＰＲＴＮ３、ＴＧＭ、ＣＯＬＶＩＩ、ＣＯＩＬ、ＤＳＧ１、ＤＳＧ３、ＳＯＸ１０、７０ＳＮＲＮＰ７０、ＳＡＧ及びａ３（ＩＶ）ＮＣ１コラーゲンのうちのいずれか１つ以上のペプチド若しくは部分、又は
以下のタンパク質：ＭＯＧ、ＧＡＤ６５、ＭＡＧ、ＰＭＰ２２、ＴＰＯ、ＶＧＫＣ、ＰＬＰ、ＡＣｈＲ、ＴＲＩＢ２、ＮＭＤＡ、ＧｌｕＲ、ＧＡＤ２、ＡＲＭＣ９、ＣＹＰ２１Ａ２、ＣＡＳＲ、ＮＡＳＰ、インスリン、ＴＳＨＲ、甲状腺ペルオキシダーゼ、アシオグリコタンパク質受容体、ＣＹＰ２Ｄ６、ＬＦ、ＴＴＧ、Ｈ／Ｋ ＡＴＰ－ａｓｅ、第ＸＩＩＩ因子、ベータ２－ＧＰＩ、ＩＴＧＢ２、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＰ ＩＩｂ／ＩＩａ、ＣＯＬＩＩ、ＦＢＧベータアルファ、ＭＰＯ、ＣＹＯ、ＰＲＴＮ３、ＴＧＭ、ＣＯＬＶＩＩ、ＣＯＩＬ、ＤＳＧ１、ＤＳＧ３、ＳＯＸ１０、７０ＳＮＲＮＰ７０、ＳＡＧ及びａ３（ＩＶ）ＮＣ１コラーゲンのうちのいずれか１つ以上に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％若しくは１００％の配列同一性を有するペプチド若しくは部分を含む、段落４２、４３、４９、５０、若しくは５３～６０のいずれかに記載のタグ付標的化ペプチド又は段落４８～６０のいずれかに記載の複合体。
６２． 標的結合ドメインが、
ａ）対象の体内の組織上又は対象の細胞上若しくは特定の位置に見出される内因性標的であり、
ｂ）対象の組織上、又は組織の特定のサブセット上、又は血漿若しくは血液中、任意選択でヒト対象において、任意選択で血液中に存在し、
ｃ）１つ以上の疾患状態の間にのみ提示され、任意選択で、標的が、腫瘍細胞中で生じる新抗原であり、
ｄ）通常は標的を発現しない組織若しくは細胞上に著しい量で、任意選択で異常なレベルでのみ存在し、及び／又は１つ以上の疾患状態の間に局在化してのみ存在し、
ｅ）抗原、任意選択で腫瘍新抗原又は腫瘍特異的抗原であり、
ｆ）ＣＤ１９であり、
ｇ）サイトカイン受容体であり、
ｈ）コラーゲンではなく、
ｉ）人工若しくは外因性標的であり、
ｊ）デザイナー薬物であり、
ｋ）ＤＲＥＡＤＤを使用して設計された薬物であり、
ｌ）参照により本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０２０／０５３２４７号の２３～３１頁の表２から選択されるタンパク質であり、
ｍ）ＣＤ２７６であり、かつ／あるいは
ｎ）ＩＬ２、ＫＬＫ、アミロイド、Ｎｏｔｃｈ受容体及び／若しくはＯＬＲ１である、標的に結合する、先行の段落のいずれかに記載の段落４２、４３、４９、５０、若しくは５３～６１のいずれかに記載のタグ付標的化ペプチド又は段落４８～６１のいずれかに記載の複合体。
６３． 標的結合ドメインが、
ａ）抗体若しくはその抗原結合フラグメントであり、
ｂ）抗体の可変重鎖ドメイン及び／若しくは抗体の可変軽鎖ドメインを含み、かつ／又は
ｃ）カッパ軽鎖若しくはそのフラグメント標的化を含む、段落４２、４３、４９、５０、若しくは５３～６２のいずれかに記載のタグ付標的化ペプチド又は段落４８～６２のいずれかに記載の複合体。
６４． 標的結合ドメインが、自己免疫に関連するタンパク質又はペプチドの部分を含む、段落４２、４３、４９、５０、若しくは５３～６３のいずれかに記載のタグ付標的化ペプチド又は段落４８～６３のいずれかに記載の複合体。
６５． 血小板調節ドメインが、血小板活性化ドメイン、任意選択でＩＴＡＭを含むドメイン、任意選択で血小板ＩＴＡＭを含むドメインであり、任意選択でＩＴＡＭを含むドメイン、任意選択で血小板ＩＴＡＭを含むドメインに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％又は１００％の配列同一性を有するドメインである、段落４１及び４４～４７のいずれかに記載のユニバーサルＣＰＲ又は段落４８～６４のいずれかに記載の複合体。
６６． 血小板調節ドメインが、血小板活性化ドメインであり、任意選択で、血小板活性化ドメインが、脱顆粒誘発ドメインである、段落４１、４４～４７及び６５のいずれかに記載のユニバーサルＣＰＲ又は段落４８～６５のいずれかに記載の複合体。
６７． ユニバーサルＣＰＲ又は複合体が血小板の膜に存在する場合、活性化されると、血小板活性化ドメインが、
ａ）血小板の脱顆粒をもたらす、
ｂ）血小板からの内容物の放出をもたらす、
ｃ）血小板の原形質膜上に細胞内内容物の存在をもたらす、
ｄ）原形質膜からのブレブ形成を介した細胞外小胞の放出をもたらす、及び／又は
ｅ）両凹ディスクから完全に広がった細胞フラグメントへの血小板の形状の変化をもたらす、段落４１、４４～４７、６５及び６６のいずれかに記載のユニバーサルＣＰＲ又は段落４８～６６のいずれかに記載の複合体。
６８． 血小板活性化ドメインが、血小板脱顆粒誘発ドメインである、段落４１、４４～４７、及び６５～６７のいずれかに記載のユニバーサルＣＰＲ又は段落４８～６７のいずれかに記載の複合体。
６９． 血小板調節ドメインが、血小板の活性化を防止する血小板活性化阻害ドメインであり、任意選択で、血小板活性化阻害ドメインが、ＩＴＩＭを含むドメインであり、任意選択で、ＩＴＩＭを含むドメインに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％又は１００％の配列同一性を有するドメインである、段落４１、４４～４７、及び６５～６８のいずれかに記載のユニバーサルＣＰＲ又は段落４８～６８のいずれかに記載の複合体。
７０．ユニバーサルＣＰＲ又は複合体が血小板の膜に存在する場合、及び血小板活性化ドメインの阻害が活性化される場合、血小板活性化阻害ドメインが、
ａ）血小板の脱顆粒を防止する、
ｂ）血小板からの内容物の放出を防止する、
ｃ）血小板の原形質膜上の細胞内内容物の存在を防止する、
ｄ）原形質膜からのブレブ形成を介した細胞外小胞の放出を防止する、及び／又は
ｅ）両凹ディスクから完全に広がった細胞フラグメントへの血小板の形状の変化を防止する、段落４１、４４～４７、及び６５～６９のいずれかに記載のユニバーサルＣＰＲ又は段落４８～６９のいずれかに記載の複合体。
７１． 血小板調節ドメインが、ヒト調節ドメイン配列を含む、段落４１、４４～４７、及び６５～７０のいずれかに記載のユニバーサルＣＰＲ又は段落４８～７０のいずれかに記載の複合体。
７２． 血小板調節ドメインが、非ヒト調節ドメイン配列、任意選択で、マウス由来の配列を含む、段落４１、４４～４７、及び６５～７１のいずれかに記載のユニバーサルＣＰＲ又は段落４８～７１のいずれかに記載の複合体。
７３． 血小板調節ドメインが、ユニバーサルＣＰＲ又は複合体が使用される前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシに対して内因性であり、任意選択で、血小板調節ドメインが、ｉＰＳＣ、巨核球又は血小板に対して内因性である、段落４１、４４～４７及び６５～７２のいずれかに記載のユニバーサルＣＰＲ又は段落４８～７２のいずれかに記載の複合体。
７４． 血小板調節ドメインが、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）受容体由来のドメインを含まず、任意選択で、糖タンパク質ＶＩ（ＧＰＶＩ）、Ｃ型レクチン様受容体２（ＣＬＥＣ－２）、ＩｇＧ受容体ＩＩａのＦｃフラグメント（ＦＣｇＲ２Ａ）、高親和性免疫グロブリンイプシロン受容体サブユニットガンマ（ＦＣＥＲＧ）、Ｃ型レクチンドメインファミリー１（ＣＬＥＣ１）、又はＩｇＧ受容体ＩＩのＦｃフラグメント（ＦＣＧＲ２）からの１つ以上のドメイン、それらの部分又はフラグメントを含まない、段落４１、４４～４７、及び６５～７３のいずれかに記載のユニバーサルＣＰＲ又は段落４８～７３のいずれかに記載の複合体。
７５． ユニバーサルＣＰＲ又は複合体が血小板原形質膜に局在する場合、標的が標的結合ドメインに結合すると、血小板調節ドメインが血小板の脱顆粒を誘発する、段落４１、４４～４７、及び６５～７４のいずれかに記載のユニバーサルＣＰＲ又は段落４８～７４のいずれかに記載の複合体。
７６． 血小板調節ドメインが、血小板脱顆粒誘発ドメインであり、
免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）受容体からの１つ以上のドメインを含み、任意選択で、糖タンパク質ＶＩ（ＧＰＶＩ）、Ｃ型レクチン様受容体２（ＣＬＥＣ－２）、ＩｇＧ受容体ＩＩａのＦｃフラグメント（ＦＣｇＲ２Ａ）、高親和性免疫グロブリンイプシロン受容体サブユニットガンマ（ＦＣＥＲＧ）、Ｃ型レクチンドメインファミリー１（ＣＬＥＣ１）、若しくはＩｇＧ受容体ＩＩのＦｃフラグメント（ＦＣＧＲ２）からの１つ以上のドメイン、それらの部分若しくはフラグメントを含むか、又は
ＩＴＡＭを含むドメイン、任意選択で、血小板ＩＴＡＭを含むドメインに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％若しくは１００％の配列同一性を有する、任意選択で、糖タンパク質ＶＩ（ＧＰＶＩ）、Ｃ型レクチン様受容体２（ＣＬＥＣ－２）、ＩｇＧ受容体ＩＩａのＦｃフラグメント（ＦＣｇＲ２Ａ）、高親和性免疫グロブリンイプシロン受容体サブユニットガンマ（ＦＣＥＲＧ）、Ｃ型レクチンドメインファミリー１（ＣＬＥＣ１）、若しくはＩｇＧ受容体ＩＩのＦｃフラグメント（ＦＣＧＲ２）からの１つ以上のドメイン、それらの部分若しくはフラグメントに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％若しくは１００％の配列同一性を有するドメインを含む、段落４１、４４～４７、及び６５～７５のいずれかに記載のユニバーサルＣＰＲ又は段落４８～７５のいずれかに記載の複合体。
７７． 血小板調節ドメインが、血小板脱顆粒の誘発を阻害し、１つ以上のＩＴＩＭモチーフを含むドメインであり、任意選択で、１つ以上のＩＴＩＭモチーフが、ＰＥＣＡＭ１、ＴＬＴ１、ＬＩＬＲＢ２、ＣＥＡＣＡＭ１又はＧ６ｂ－Ｂ由来のＩＴＩＭモチーフであり、任意選択で、ＩＴＩＭドメインが、
ＬＩＬＲＢ２由来のＩＴＩＭドメインが、参照により本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０２０／０５３２４７号の４４頁の表５に示される配列番号３４であり、
ＰＥＣＡＭ１由来のＩＴＩＭドメインが、参照により本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０２０／０５３２４７号の４４頁の表５に示される配列番号３８であり、
ＣＥＡＣＡＭ１由来のＩＴＩＭドメインが、参照により本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０２０／０５３２４７号の４４頁の表５に示される配列番号２４である、段落４１、４４～４７、及び６５～７６のいずれかに記載のユニバーサルＣＰＲ又は段落４８～７６のいずれかに記載の複合体。
７８． 血小板調節ドメインが、天然の血小板調節ドメイン配列に対して１つ以上の変異、挿入又は欠失を含む、段落４１、４４～４７及び６５～７７のいずれかに記載のユニバーサルＣＰＲ又は段落４８～７７のいずれかに記載の複合体。
７９． 天然の調節ドメイン配列に対する１つ以上の変異、挿入又は欠失が、１つ以上の変異を含まない血小板調節ドメインを含むユニバーサルＣＰＲ又はユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体に対して、ユニバーサルＣＰＲ又はユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体の感受性を増加させる、段落７８に記載のユニバーサルＣＰＲ又は段落７８に記載の複合体。
８０． ネイティブ調節ドメイン配列に対する１つ以上の変異、挿入又は欠失が、１つ以上の変異を含まない血小板調節ドメインを含むユニバーサルＣＰＲ又はユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体に対して、ユニバーサルＣＰＲ又はユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体の感受性を減少させる、段落７８に記載のユニバーサルＣＰＲ又は段落７８に記載の複合体。
８１．血小板調節ドメインが、天然に存在する血小板調節ドメインに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％又は１００％の配列同一性を含む、段落４１、４４～４７、及び６５～８０のいずれかに記載のユニバーサルＣＰＲ又は段落４８～８０のいずれかに記載の複合体。
８２． シグナルペプチド及び／又はリンカー配列を更に含み、任意選択で、
シグナルペプチドが、表１に示される配列の一部を含むか若しくはそれからなり、かつ／又は、
シグナルペプチドが、参照により本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０２０／０５３２４７号の４６頁の表７の配列のうちのいずれかの一部を含むか若しくはそれからなりり、かつ／又は
任意選択で、リンカーが、参照により本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０２０／０５３２４７号の５１頁に記載されているリンカー若しくはその部分を含むか若しくはそれからなる、段落４１、４４～４７及び６５～８１のいずれかに記載のユニバーサルＣＰＲ又は段落４８～８１のいずれかに記載の複合体。
８３． 膜貫通ドメインを更に含み、任意選択で、膜貫通ドメインが、参照により本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０２０／０５３２４７号の４９～５０頁に記載されている膜貫通ドメイン又はその部分のうちのいずれか１つ以上を含むか又はそれらからなる、段落４１、４４～４７及び６５～８２のいずれかに記載のユニバーサルＣＰＲ又は段落４８～８２のいずれかに記載の複合体。
８４． ＣＰＲが、参照により本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０２０／０５３２４７号の５０頁及び５１頁に記載されている細胞内ドメイン又はその部分を含むか又はそれからなる細胞内ドメインを含む、段落４１、４４～４７及び６５～８３のいずれかに記載のユニバーサルＣＰＲ又は段落４８～８３のいずれかに記載の複合体。
８５． ＣＰＲが、参照により本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０２０／０５３２４７号の４１～６３頁に記載されているドメインの組み合わせを含むか又はそれからなる、段落４１、４４～４７及び６５～８４のいずれかに記載のユニバーサルＣＰＲ又は段落４８～８４のいずれかに記載の複合体。
８６． 異種標的結合ドメインを含む、合成抗原提示受容体（ＳＡＰＲ）であって、標的結合ドメインが、
ａ）細胞外ドメインであって、
ｉ）ＭＨＣ－１タンパク質若しくはそのフラグメント、又はヒトＭＨＣ－１タンパク質若しくはそのフラグメントに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％若しくは１００％の配列同一性を有するタンパク質若しくはそのフラグメント、又は
ｉｉ）ＭＨＣ－２タンパク質若しくはそのフラグメント、又はヒトＭＨＣ－２タンパク質若しくはそのフラグメントに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％若しくは１００％の配列同一性を有するタンパク質若しくはそのフラグメントを含む、細胞外ドメインと、
ｂ）細胞内血小板調節ドメインであって、
当該
ＭＨＣ－１タンパク質若しくはそのフラグメント、又はヒトＭＨＣ－１タンパク質若しくはそのフラグメントに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％若しくは１００％の配列同一性を有するタンパク質若しくはそのフラグメント、又は
ＭＨＣ－２タンパク質若しくはそのフラグメント、又はヒトＭＨＣ－２タンパク質若しくはそのフラグメントに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％若しくは１００％の配列同一性を有するタンパク質若しくはそのフラグメントが、
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）に結合することができる、細胞内血小板調節ドメインと、を含む、合成抗原提示受容体。
８７． 当該細胞外ドメインが、
異種標的結合ドメインであって、
ａ）ＭＨＣ－１タンパク質若しくはそのフラグメント、又はヒトＭＨＣ－１タンパク質若しくはそのフラグメントに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％若しくは１００％の配列同一性を有するタンパク質若しくはそのフラグメント、及び抗原ペプチド（当該ＭＨＣ－１タンパク質若しくはそのフラグメント、又はヒトＭＨＣ－１タンパク質若しくはそのフラグメントに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％若しくは１００％の配列同一性を有するタンパク質若しくはそのフラグメント、及び抗原ペプチドが、ＴＣＲに結合することができる）、並びに／又は
ｂ）ＭＨＣ－２タンパク質若しくはそのフラグメント、又はヒトＭＨＣ－１タンパク質若しくはそのフラグメントに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％若しくは１００％の配列同一性を有するタンパク質若しくはそのフラグメント、及び抗原ペプチド（当該ＭＨＣ－２タンパク質若しくはそのフラグメント、又はヒトＭＨＣ－１タンパク質若しくはそのフラグメントに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％若しくは１００％の配列同一性を有するタンパク質若しくはそのフラグメント、及び抗原ペプチドが、ＴＣＲに結合することができる）を含む、異種標的結合ドメインを含む、段落８６に記載のＳＡＰＲ。
８８． 抗原ペプチドが、
ａ）がん、自己免疫状態、遺伝子疾患、心血管疾患及び／若しくは感染症に関連する、並びに／又は
ｂ）
ｉ）国際公開第２０１５１５３１０２号の２０６～２０７頁の表Ｆ、２０８頁の表Ｇ、２０８～２０９頁の表Ｈ、２０９～２１１頁の表Ｉ、２１２頁の表Ｊ、２１９～２２１頁の表４、２２１～２３０頁の表５、２３１～２３４頁の表６、２３５～２４２頁の表７及び２４３頁の表８９（これらのセクションは参照により本明細書に組み込まれる）に列挙されている抗原ペプチド、
ｉｉ）国際公開第２０１５１５３１０２号の２０６～２０７頁の表Ｆ、２０８頁の表Ｇ、２０８～２０９頁の表Ｈ、２０９～２１１頁の表Ｉ、２１２頁の表Ｊ、２１９～２２１頁の表４、２２１～２３０頁の表５、２３１～２３４頁の表６、２３５～２４２頁の表７、及び２４３頁の表８９（これらのセクションは参照により本明細書に組み込まれる）に列挙される抗原ペプチドに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％若しくは１００％の配列同一性を有する配列から選択される、並びに／又は
ｃ）
ｉ）国際公開第２０１９／１２６８１８号の４７～８６頁の表１、３２１頁の表１４、３２１頁の表１５、３２７頁の表１６、３２８頁の表１７、３２８～３２９頁の表１８、２２１～２２３頁の表１９、３３３～３３４頁の表２０、３４０～３４２頁の表２１、３４４～３４７頁の表２２、３４７～３４８頁の表２３、及び３４９～３５２頁の表２４（これらのセクションは参照により本明細書に組み込まれる）に列挙される抗原ペプチド、又は
ｉｉ）国際公開第２０１９／１２６８１８号の４７～８６頁の表１、３２１頁の表１４、３２１頁の表１５、３２７頁の表１６、３２８頁の表１７、３２８～３２９頁の表１８、２２１～２２３頁の表１９、３３３～３３４頁の表２０、３４０～３４２頁の表２１、３４４～３４７頁の表２２、３４７～３４８頁の表２３、及び３４９～３５２頁の表２４（これらのセクションは参照により本明細書に組み込まれる）に列挙されている抗原ペプチドに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％又は１００％の配列同一性を有する配列から選択される、
ｄ）
ｉ）以下のタンパク質：ＭＯＧ、ＧＡＤ６５、ＭＡＧ、ＰＭＰ２２、ＴＰＯ、ＶＧＫＣ、ＰＬＰ、ＡＣｈＲ、ＴＲＩＢ２、ＮＭＤＡ、ＧｌｕＲ、ＧＡＤ２、ＡＲＭＣ９、ＣＹＰ２１Ａ２、ＣＡＳＲ、ＮＡＳＰ、インスリン、ＴＳＨＲ、甲状腺ペルオキシダーゼ、アシオグリコタンパク質受容体、ＣＹＰ２Ｄ６、ＬＦ、ＴＴＧ、Ｈ／Ｋ ＡＴＰ－ａｓｅ、第ＸＩＩＩ因子、ベータ２－ＧＰＩ、ＩＴＧＢ２、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＰ ＩＩｂ／ＩＩａ、ＣＯＬＩＩ、ＦＢＧベータアルファ、ＭＰＯ、ＣＹＯ、ＰＲＴＮ３、ＴＧＭ、ＣＯＬＶＩＩ、ＣＯＩＬ、ＤＳＧ１、ＤＳＧ３、ＳＯＸ１０、７０ＳＮＲＮＰ７０、ＳＡＧ及びａ３（ＩＶ）ＮＣ１コラーゲンのうちのいずれか１つ以上、又は
ｉｉ）以下のタンパク質：ＭＯＧ、ＧＡＤ６５、ＭＡＧ、ＰＭＰ２２、ＴＰＯ、ＶＧＫＣ、ＰＬＰ、ＡＣｈＲ、ＴＲＩＢ２、ＮＭＤＡ、ＧｌｕＲ、ＧＡＤ２、ＡＲＭＣ９、ＣＹＰ２１Ａ２、ＣＡＳＲ、ＮＡＳＰ、インスリン、ＴＳＨＲ、甲状腺ペルオキシダーゼ、アシオグリコタンパク質受容体、ＣＹＰ２Ｄ６、ＬＦ、ＴＴＧ、Ｈ／Ｋ ＡＴＰ－ａｓｅ、第ＸＩＩＩ因子、ベータ２－ＧＰＩ、ＩＴＧＢ２、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＰ ＩＩｂ／ＩＩａ、ＣＯＬＩＩ、ＦＢＧベータアルファ、ＭＰＯ、ＣＹＯ、ＰＲＴＮ３、ＴＧＭ、ＣＯＬＶＩＩ、ＣＯＩＬ、ＤＳＧ１、ＤＳＧ３、ＳＯＸ１０、７０ＳＮＲＮＰ７０、ＳＡＧ及びａ３（ＩＶ）ＮＣ１コラーゲンのうちのいずれか１つ以上に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％若しくは１００％の配列同一性を有する配列から選択される、ペプチド又はその抗原部分を含む、８６又は８７に記載のＳＡＰＲ。
８９． 細胞外ドメインが、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）に結合することができる、段落８６～８８のいずれかに記載のＳＡＰＲ。
９０． 細胞外ドメインが、ヒト標的結合ドメイン配列を含む、段落８６～８９のいずれかに記載のＳＡＰＲ。
９１． 細胞外ドメインが、非ヒト標的結合ドメイン配列、任意選択で、
ヒト化配列、又は
マウス由来の配列を含む、段落８６～９０のいずれかに記載のＳＡＰＲ。
９２． 血小板調節ドメインが、血小板活性化ドメイン、任意選択でＩＴＡＭを含むドメイン、任意選択で血小板ＩＴＡＭを含むドメインであり、任意選択でＩＴＡＭを含むドメイン、任意選択で血小板ＩＴＡＭを含むドメインに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％又は１００％の配列同一性を有するドメインである、段落８６～９１のいずれかに記載のＳＡＰＲ。
９３． 血小板調節ドメインが、血小板活性化ドメインであり、任意選択で、血小板活性化ドメインが、脱顆粒誘発ドメインである、段落８６～９２のいずれかに記載のＳＡＰＲ。
９４． ＳＡＰＲが血小板の膜に存在する場合、活性化されると、血小板活性化ドメインが、
ａ）血小板の脱顆粒をもたらす、
ｂ）血小板からの内容物の放出をもたらす、
ｃ）血小板の原形質膜上に細胞内内容物の存在をもたらす、
ｄ）原形質膜からのブレブ形成を介した細胞外小胞の放出をもたらす、及び／又は
ｅ）両凹ディスクから完全に広がった細胞フラグメントへの血小板の形状の変化をもたらす、段落８６～９３のいずれかに記載のＳＡＰＲ。
９５． 血小板活性化ドメインが、血小板脱顆粒誘発ドメインである、段落８６～９４のいずれかに記載のＳＡＰＲ。
９６． 血小板調節ドメインが、血小板の活性化を防止する血小板活性化阻害ドメインであり、任意選択で、血小板活性化阻害ドメインが、ＩＴＩＭを含むドメインであり、任意選択で、ＩＴＩＭを含むドメインに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％又は１００％の配列同一性を有するドメインである、段落８６～９５のいずれかに記載のＳＡＰＲ。
９７． ＳＡＰＲが血小板の膜に存在する場合、及び血小板活性化ドメインの阻害が活性化される場合、血小板活性化阻害ドメインが、
ａ）血小板の脱顆粒を防止する、
ｂ）血小板からの内容物の放出を防止する、
ｃ）血小板の原形質膜上の細胞内内容物の存在を防止する、
ｄ）原形質膜からのブレブ形成を介した細胞外小胞の放出を防止する、及び／又は
ｅ）両凹ディスクから完全に広がった細胞フラグメントへの血小板の形状の変化を防止する、段落８６～９６のいずれかに記載のＳＡＰＲ。
９８． 血小板活性化ドメインが、血小板脱顆粒誘発ドメインである、段落８６～９７のいずれかに記載のＳＡＰＲ。
９９． 血小板調節ドメインが、ヒト調節ドメイン配列を含む、段落８６～９８のいずれかに記載のＳＡＰＲ。
１００． 血小板調節ドメインが、非ヒト調節ドメイン配列、任意選択でマウス由来の配列を含む、段落８６～９９のいずれかに記載のＳＡＰＲ。
１０１． 血小板調節ドメインが、ＳＡＰＲがともに使用される前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシに対して内因性であり、任意選択で、血小板調節ドメインが、ｉＰＳＣ、巨核球又は血小板に対して内因性である、段落８６～１００のいずれかに記載のＳＡＰＲ。
１０２． 血小板調節ドメインが、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）受容体由来のドメインを含まず、任意選択で、糖タンパク質ＶＩ（ＧＰＶＩ）、Ｃ型レクチン様受容体２（ＣＬＥＣ－２）、ＩｇＧ受容体ＩＩａのＦｃフラグメント（ＦＣｇＲ２Ａ）、高親和性免疫グロブリンイプシロン受容体サブユニットガンマ（ＦＣＥＲＧ）、Ｃ型レクチンドメインファミリー１（ＣＬＥＣ１）、又はＩｇＧ受容体ＩＩのＦｃフラグメント（ＦＣＧＲ２）からの１つ以上のドメイン、それらの部分又はフラグメントを含まない、段落８６～１０１のいずれかに記載のＳＡＰＲ。
１０３． ＳＡＰＲが血小板原形質膜に局在する場合、標的が標的結合ドメインに結合すると、血小板調節ドメインが血小板の脱顆粒を誘発する、段落８６～１０２のいずれかに記載のＳＡＰＲ。
１０４． 血小板調節ドメインが、血小板脱顆粒誘発ドメインであり、
免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）受容体からの１つ以上のドメインを含み、任意選択で、糖タンパク質ＶＩ（ＧＰＶＩ）、Ｃ型レクチン様受容体２（ＣＬＥＣ－２）、ＩｇＧ受容体ＩＩａのＦｃフラグメント（ＦＣｇＲ２Ａ）、高親和性免疫グロブリンイプシロン受容体サブユニットガンマ（ＦＣＥＲＧ）、Ｃ型レクチンドメインファミリー１（ＣＬＥＣ１）、若しくはＩｇＧ受容体ＩＩのＦｃフラグメント（ＦＣＧＲ２）からの１つ以上のドメイン、それらの部分若しくはフラグメントを含むか、又は
ＩＴＡＭを含むドメイン、任意選択で、血小板ＩＴＡＭを含むドメインに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％若しくは１００％の配列同一性を有する、任意選択で、糖タンパク質ＶＩ（ＧＰＶＩ）、Ｃ型レクチン様受容体２（ＣＬＥＣ－２）、ＩｇＧ受容体ＩＩａのＦｃフラグメント（ＦＣｇＲ２Ａ）、高親和性免疫グロブリンイプシロン受容体サブユニットガンマ（ＦＣＥＲＧ）、Ｃ型レクチンドメインファミリー１（ＣＬＥＣ１）、若しくはＩｇＧ受容体ＩＩのＦｃフラグメント（ＦＣＧＲ２）からの１つ以上のドメイン、それらの部分若しくはフラグメントに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％若しくは１００％の配列同一性を有するドメインを含む、段落８６～１０４のいずれかに記載のＳＡＰＲ。
１０５． 血小板調節ドメインが、血小板脱顆粒の誘発を阻害する血小板活性化ドメインの阻害であり、１つ以上のＩＴＩＭモチーフを含み、任意選択で、１つ以上のＩＴＩＭモチーフが、ＰＥＣＡＭ１、ＴＬＴ１、ＬＩＬＲＢ２、ＣＥＡＣＡＭ１又はＧ６ｂ－Ｂ由来のＩＴＩＭモチーフであり、任意選択で、
ＬＩＬＲＢ２由来のＩＴＩＭドメインが、参照により本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０２０／０５３２４７号の４４頁の表５に示される配列番号３４であり、
ＰＥＣＡＭ１由来のＩＴＩＭドメインが、参照により本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０２０／０５３２４７号の４４頁の表５に示される配列番号３８であり、
ＣＥＡＣＡＭ１由来のＩＴＩＭドメインが、参照により本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０２０／０５３２４７号の４４頁の表５に示される配列番号２４である、段落８６～１０４のいずれかに記載のＳＡＰＲ。
１０６． 血小板調節ドメインが、天然の血小板調節ドメイン配列に対して１つ以上の変異、挿入又は欠失を含む、段落８６～１０５のいずれかに記載のＳＡＰＲ。
１０７． 天然の調節ドメイン配列に対する１つ以上の変異、挿入又は欠失が、１つ以上の変異を含まない血小板調節ドメインを含むＳＡＰＲに対して、ＳＡＰＲの感受性を増加させる、段落８６～１０６のいずれかに記載のＳＡＰＲ。
１０８． 天然の調節ドメイン配列に対する１つ以上の変異、挿入又は欠失が、１つ以上の変異を含まない血小板調節ドメインを含むＳＡＰＲに対して、ＳＡＰＲの感受性を減少させる、段落８６～１０７のいずれかに記載のＳＡＰＲ。
１０９．血小板調節ドメインが、天然に存在する血小板調節ドメインに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％又は１００％の配列同一性を含む、段落８６～１０８のいずれかに記載のＳＡＰＲ。
１１０． シグナルペプチド及び／又はリンカー配列を更に含み、任意選択で、
シグナルペプチドが、表１に示される配列の一部を含むか若しくはそれからなり、かつ／又は、
シグナルペプチドが、参照により本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０２０／０５３２４７号の４６頁の表７の配列のうちのいずれかの一部を含むか若しくはそれからなりり、かつ／又は
任意選択で、リンカーが、参照により本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０２０／０５３２４７号の５１頁に記載されているリンカー若しくはその部分を含むか若しくはそれからなる、段落８６～１０９のいずれかに記載のＳＡＰＲ。
１１１． 膜貫通ドメインを更に含み、任意選択で、膜貫通ドメインが、参照により本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０２０／０５３２４７号の４９～５０頁に記載されている膜貫通ドメイン又はその部分のうちのいずれか１つ以上を含むか又はそれらからなる、段落８６～１１０のいずれかに記載のＳＡＰＲ。
１１２． ＳＡＰＲが、参照により本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０２０／０５３２４７号の５０頁及び５１頁に記載されている細胞内ドメイン又はその部分を含むか又はそれからなる細胞内ドメインを含む、段落８６～１１１のいずれかに記載のＳＡＰＲ。
１１３． ＳＡＰＲが、参照により本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０２０／０５３２４７号の４１～６３頁に記載されているドメインの組み合わせを含むか又はそれからなる、段落８６～１１２のいずれかに記載のＳＡＰＲ。
１１４． プロテアーゼ認識部位が、天然の認識部位を切断するプロテアーゼではないプロテアーゼによって切断されるように操作されている、操作されたプロテアーゼ活性化受容体（ｅＰＡＲ）。
１１５． 血小板の原形質膜に存在する場合、プロテアーゼ認識部位の切断が、
ａ）血小板の脱顆粒、
ｂ）血小板からの内容物の放出、
ｃ）血小板の原形質膜上の細胞内内容物の存在、
ｄ）原形質膜からのブレブ形成を介した細胞外小胞の放出、及び／又は
ｅ）両凹ディスクから完全に広がった細胞フラグメントへの血小板の形状の変化をもたらす、段落１１４に記載のｅＰＡＲ。
１１６． プロテアーゼの切断が、ｅＰＡＲのフラグメントの放出をもたらし、ｅＰＡＲのフラグメントが、シグナル伝達分子であり、細胞内シグナル伝達をもたらす、段落１１３又は１１５に記載のｅＰＡＲ。
１１７． プロテアーゼ認識部位が、腫瘍微小環境において見出されるプロテアーゼに対するプロテアーゼ認識部位であるように操作され、任意選択で、腫瘍微小環境において見出されるプロテアーゼに対するプロテアーゼ認識部位が、マトリックスメタロプロテアーゼ、メタロペプチダーゼ、カテプシンＢ、ウロキナーゼ又はカスパーゼを含むか又はそれらからなる群から選択される、段落１１３～１１５のいずれかに記載のｅＰＡＲ。
１１８． プロテアーゼ認識部位が、意図される対象に関して直交性プロテアーゼ認識部位であるように操作される、段落１１３～１１７のいずれかに記載のｅＰＡＲ。
１１９． プロテアーゼ認識部位が、ウイルスプロテアーゼ認識部位、任意選択で、タバコエッチウイルス核封入体－ａエンドペプチダーゼ（ＴＥＶプロテアーゼ）、Ｃ型肝炎ウイルスのＮＳ２－３プロテアーゼ（ＨＣＶプロテアーゼ）、又はタバコ葉脈斑紋ウイルス（ＴＶＭＶプロテアーゼ）であるように操作される、段落１１３～１１８のいずれかに記載のｅＰＡＲ。
１２０． ｅＰＡＲがＧＰＣＲであり、任意選択で、操作されたＰＡＲ１、ＰＡＲ２、ＰＡＲ３又はＰＡＲ４である、段落１１３～１１９のいずれかに記載のｅＰＡＲ。
１２１． ｅＰＡＲが、天然に存在するＰＡＲに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％又は１００％の配列同一性を含む、段落１１３～１２０のいずれかに記載のｅＰＡＲ。
１２２． 段落４１、４４～４７及び６５～８５のいずれかに記載のＣＰＲ、又は段落４８～８５のいずれかに記載の複合体、又は段落８６～１１３のいずれかに記載のＳＡＰＲ、又は段落１１４～１２１のいずれかに記載のｅＰＡＲをコードする、核酸。
１２３． 核酸が、ＤＮＡである、段落１２２に記載の核酸。
１２４． 核酸が、ＲＮＡである、段落１２２に記載の核酸。
１２５． 核酸が、異種発現配列、任意選択で、異種プロモーターに作動可能に連結されている、段落１２２～１２４のいずれかに記載の核酸。
１２６． 巨核球特異的プロモーターを更に含む、段落１２２～１２５のいずれかに記載の核酸。
１２７． プロモーターが、誘導性プロモーター、任意選択で、意図される対象において誘導性であるプロモーターである、段落１２２～１２６のいずれかに記載の核酸。
１２８． プロモーターが、構成的プロモーター、任意選択で、意図される対象において構成的であるプロモーターである、段落１２２～１２７のいずれかに記載の核酸。
１２９． 任意選択で、ベクターが、プラスミド又は環状核酸である、段落１２２～１２７のいずれかに記載の核酸を含む、ベクター。
１３０． 段落１２２～１２８のいずれかに記載の核酸又は段落１２９に記載のベクターを含む、ウイルスベクター又はウイルス粒子。
１３１．シャーシであって、
ａ）先行の段落のいずれかに記載の１つ以上のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ、若しくはｅＰＡＲＳ、
ｂ）先行の段落のいずれかに記載のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ＳＡＰＲ、若しくはｅＰＡＲをコードする、先行の段落のいずれかに記載の１つ以上の核酸、
ｃ）先行の段落のいずれかに記載のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ＳＡＰＲ、若しくはｅＰＡＲをコードする先行の段落のいずれかに記載の１つ以上の核酸を含む、先行の段落のいずれかに記載の１つ以上のベクター、及び／又は
ｄ）先行の段落のいずれかに記載のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ＳＡＰＲ、又はｅＰＡＲをコードする先行の段落のいずれかに記載の１つ以上の核酸を含む、先行の段落のいずれかに記載の１つ以上のウイルスベクターを含む、シャーシ。
１３２． シャーシが、
１つ以上のシグナル伝達経路を調節するように操作されておらず、任意選択で、血栓形成経路を破壊するように操作されておらず、かつ／又は血小板炎症シグナル伝達経路を破壊するように操作されておらず、かつ／又は操作されたプロデューサー若しくはエフェクターシャーシの免疫原性を低下させるように操作されていない、並びに／あるいは
前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシの１つ以上の基本機能を増強又は破壊するように操作されておらず、任意選択で、１つ以上又は基本機能が、自然免疫応答及び／又は適応免疫応答、炎症、血管新生、アテローム性動脈硬化症、リンパ発達及び腫瘍成長に関与する、段落１３１に記載のシャーシ。
１３３．操作されたシャーシであって、シャーシが、
１つ以上のシグナル伝達経路を調節するように操作されている、任意選択で、血栓形成経路を破壊するように操作されている、かつ／又は血小板炎症シグナル伝達経路を破壊するように操作されている、かつ／又は操作された血小板の免疫原性を低下させるように操作されている、並びに／あるいは
シャーシの１つ以上の基本機能を増強又は破壊するように操作されており、任意選択で、１つ以上又は基本機能が、自然免疫応答及び／又は適応免疫応答、炎症、血管新生、アテローム性動脈硬化症、リンパ発達及び腫瘍成長に関与する、シャーシ。
１３４．シャーシが、
ａ）先行の段落のいずれかに記載の１つ以上のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ、若しくはｅＰＡＲＳ、
ｂ）先行の段落のいずれかに記載のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ＳＡＰＲ、若しくはｅＰＡＲをコードする、先行の段落のいずれかに記載の１つ以上の核酸、
ｃ）ＣＰＲをコードする先行の段落のいずれかに記載の１つ以上の核酸を含む、先行の段落のいずれかに記載の１つ以上のベクター、ｄ）先行の段落のいずれかに記載のユニバーサルＣＰＲ、ＳＡＰＲ、若しくはｅＰＡＲ、及び／又は
先行の段落のいずれかに記載のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ＳＡＰＲ、若しくはｅＰＡＲをコードする先行の段落のいずれかに記載の１つ以上の核酸を含む、先行の段落のいずれかに記載の１つ以上のウイルスベクターのうちのいずれか１つ以上を含むように更に操作されている、段落６６に記載の操作されたシャーシ。
１３５．シャーシが、
ａ）先行の段落のいずれかに記載の１つ以上のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ、若しくはｅＰＡＲＳ、
ｂ）先行の段落のいずれかに記載の１つ以上の核酸、
ｃ）先行の段落のいずれかに記載の１つ以上のベクター、及び／又は
ｄ）先行の段落のいずれかに記載の１つ以上のウイルスベクターのうちのいずれか１つ以上を発現しない、先行の段落のいずれかに記載の操作されたシャーシ。
１３６． シャーシ又は操作されたシャーシが、
ａ）前駆体シャーシであり、任意選択で、骨髄系幹細胞、ｉＰＳＣ、脂肪細胞、脂肪由来間葉系間質／幹細胞株（ＡＳＣＬ）、若しくはプロデューサーシャーシを産生することができるがん細胞株、若しくはプロデューサーシャーシを産生することができる他の不死細胞であるか、
ｂ）プロデューサーシャーシであり、任意選択で、巨核芽球、巨核球、巨核球様細胞、血小板、血小板様膜結合細胞フラグメント若しくは無核細胞フラグメントを形成することができるがん細胞株、例えばＭＥＧ０１若しくはＤＡＭＩがん細胞株、又は血小板、血小板様膜結合細胞フラグメント若しくは無核細胞フラグメントを形成することができる他の不死細胞であるか、あるいは
ｃ）エフェクターシャーシであり、任意選択で、血小板、血小板様膜結合細胞フラグメント又は無核細胞フラグメントである、エフェクターシャーシである、先行の段落のいずれかに記載のシャーシ又は操作されたシャーシ。
１３７． シャーシが、プロデューサーシャーシへの分化を駆動し、任意選択で、巨核球又は巨核球様細胞への分化を駆動するように修飾されており、任意選択で、巨核球又は巨核球様細胞に分化するようにフォワードプログラムされている、先行の段落のいずれかに記載のシャーシ又は操作されたシャーシ。
１３８． シャーシ又は操作されたシャーシが、プロデューサーシャーシ又は操作されたプロデューサーシャーシであり、プロデューサーシャーシ又は操作されたプロデューサーシャーシが、血小板、血小板様膜結合細胞フラグメント若しくは無核細胞フラグメントを産生することができる巨核芽球、血小板、血小板様膜結合細胞フラグメント若しくは無核細胞フラグメントを産生することができる巨核球、又は血小板、血小板様膜結合細胞フラグメント若しくは無核細胞フラグメントを産生することができる巨核球様細胞である、先行の段落のいずれかに記載のシャーシ又は操作されたシャーシ。
１３９． シャーシ又は操作されたシャーシが、巨核芽球、巨核球、巨核球様細胞、血小板、血小板様膜結合細胞フラグメント若しくは無核細胞フラグメントを形成することができるがん細胞株、例えばＭＥＧ０１若しくはＤＡＭＩがん細胞株、又は血小板、血小板様膜結合細胞フラグメント若しくは無核細胞フラグメントを形成することができる他の不死細胞である、プロデューサーシャーシ又は操作されたプロデューサーシャーシであり、
巨核芽球、巨核球、巨核球様細胞、血小板、血小板様膜結合細胞フラグメント若しくは無核細胞フラグメントを形成することができるがん細胞株、例えばＭＥＧ０１若しくはＤＡＭＩがん細胞株、又は血小板、血小板様膜結合細胞フラグメント若しくは無核細胞フラグメントを形成することができる他の不死細胞が、
ａ）偽足伸長をもたらすことができ、かつ／又は
ｂ）ＴＵＢＢ１を発現する、先行の段落のいずれかに記載のシャーシ又は操作されたシャーシ。
１４０． シャーシ又は操作されたシャーシが、エフェクターシャーシ又は操作されたエフェクターシャーシであり、エフェクターシャーシ又は操作されたエフェクターシャーシが、血小板、血小板様膜結合細胞フラグメント、又は無核細胞フラグメントであり、血小板、血小板様膜結合細胞フラグメント、又は無核細胞フラグメントが、先行の段落のいずれかに記載のプロデューサーシャーシ又は操作されたプロデューサーシャーシのフラグメント化によって産生されており、
任意選択で、操作されたエフェクターシャーシが、ＴＵＢＢ１タンパク質を含む、先行の段落のいずれかに記載のシャーシ又は操作されたシャーシ。
１４１． シャーシ又は操作されたシャーシが、エフェクターシャーシ又は操作されたエフェクターシャーシであり、エフェクターシャーシ又は操作されたエフェクターシャーシが、血小板凝集アッセイにおいて凝集しない血小板、血小板様膜結合細胞フラグメント、又は無核細胞フラグメントである、先行の段落のいずれかに記載のシャーシ又は操作されたシャーシ。
１４２． シャーシ又は操作されたシャーシが、先行の段落のいずれかに記載のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ＳＡＰＲ、若しくはｅＰＡＲをコードする先行の段落のいずれかに記載の１つ以上の核酸、及び／又は先行の段落のいずれかに記載のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ＳＡＰＲ、若しくはｅＰＡＲをコードする先行の段落のいずれかに記載の１つ以上のベクターを含む、先行の段落のいずれかに記載のシャーシ又は操作されたシャーシ。
１４３． シャーシ又は操作されたシャーシが、前駆体若しくはプロデューサーシャーシ又は操作された前駆体若しくはプロデューサーシャーシであり、１つ以上の核酸が、前駆体若しくはプロデューサーシャーシ又は操作された前駆体若しくはプロデューサーシャーシのゲノム核酸内の位置から発現され、任意選択で、
１）第１のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ、若しくはｅＰＡＲをコードする核酸が、第１の遺伝子座の第１の対立遺伝子に導入されており、かつ／又は第１のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ、若しくはｅＰＡＲをコードする核酸が、第１の遺伝子座の第２の対立遺伝子に導入されており、かつ／あるいは
２）第１のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ、又はｅＰＡＲをコードする核酸が、第１の遺伝子座の第１の対立遺伝子に導入されており、第２のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ、又はｅＰＡＲをコードする第２の核酸が、第２の遺伝子座の第１の対立遺伝子に導入されており、かつ／あるいは
３）第１のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ、又はｅＰＡＲをコードする核酸が、第１の遺伝子座の第１の対立遺伝子に導入されており、第２のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ、又はｅＰＡＲをコードする第２の核酸が、第１の遺伝子座の第２の対立遺伝子に導入されている、段落１４２に記載のシャーシ又は操作されたシャーシ。
１４４． １つ以上の核酸が、エピソーム的に発現される、段落１４２に記載のシャーシ又は操作されたシャーシ。
１４５． シャーシ又は操作されたシャーシが、ベータ２ミクログロブリン遺伝子からの発現が阻害されるように操作されており、任意選択で、ベータ２ミクログロブリン遺伝子がノックアウト又は欠失されている、先行の段落のいずれかに記載のシャーシ又は操作されたシャーシ。
１４６． シャーシ又は操作されたシャーシが、哺乳動物シャーシ、任意選択でヒトシャーシ、ウシシャーシ、ウマシャーシ又はマウスシャーシである、先行の段落のいずれかに記載のシャーシ又は操作されたシャーシ。
１４７． シャーシが、血小板血栓形成経路を破壊するように操作されている、先行の段落のいずれかに記載の操作されたシャーシ。
１４８． シャーシが、血栓形成の可能性が低減されるように操作されていないシャーシに対して、血栓形成が低減されるように操作されており、任意選択で、操作されたシャーシが、血栓形成の可能性を有しない、先行の段落のいずれかに記載の操作されたシャーシ。
１４９． シャーシが、血栓形成経路に関与する少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、又は少なくとも１０個の遺伝子の破壊又は欠失を含み、任意選択で、遺伝子が、
血栓形成の一次刺激の認識に関与するタンパク質、
血栓形成の二次メディエーターの認識に関与するタンパク質、及び／又は
血栓形成の二次メディエーターの放出に関与するタンパク質、をコードする遺伝子の群から選択される、先行の段落のいずれかに記載の操作されたシャーシ。
１５０． シャーシが、少なくとも
血栓形成の一次刺激の認識に関与するタンパク質をコードする１つの遺伝子、
血栓形成の二次メディエーターの認識に関与するタンパク質をコードする１つの遺伝子、及び
血栓形成の二次メディエーターの放出に関与するタンパク質をコードする１つの遺伝子、の破壊又は欠失を含み、
任意選択で、少なくとも
血栓形成の一次刺激の認識に関与するタンパク質をコードする２つの遺伝子、
血栓形成の二次メディエーターの認識に関与するタンパク質をコードする２つの遺伝子、及び
血栓形成の二次メディエーターの放出に関与するタンパク質をコードする２つの遺伝子、の破壊を含み、
任意選択で、少なくとも
血栓形成の一次刺激の認識に関与するタンパク質をコードする３つの遺伝子、
血栓形成の二次メディエーターの認識に関与するタンパク質をコードする３つの遺伝子、及び
血栓形成の二次メディエーターの放出に関与するタンパク質をコードする３つの遺伝子、の破壊を含む、先行の段落のいずれかに記載の操作されたシャーシ。
１５１．
血栓形成の一次刺激の認識に関与するタンパク質をコードする少なくとも１つ、２つ、若しくは３つの遺伝子が、ＧＰＩｂ／Ｖ／ＩＸ及びＧＰＶＩ（ＧＰ６）、ＩＴＧＡ２Ｂ、ＣＬＥＣ２、インテグリンｓ ａＩＩｂｂ３、ａ２ｂ１、ａ５ｂ１及びａ６ｂ１からなる群から選択されるか、若しくはＧＰＶＩ及びＩＴＧＡ２Ｂからなる群から選択され、
血栓形成の二次メディエーターの認識に関与するタンパク質をコードする少なくとも１つ、２つ、若しくは３つが、Ｐａｒ１、Ｐａｒ４、Ｐ２Ｙ１２、ＧＰＩｂ／Ｖ／ＩＸ、トロンボキサン受容体（ＴＢＸＡ２Ｒ）、Ｐ２Ｙ１、Ｐ２Ｘ１及びインテグリンａＩＩｂｂ３からなる群から選択されるか、又はＰａｒ１、Ｐａｒ４及びＰ２Ｙ１２からなる群から選択され、かつ／あるいは
血栓形成の二次メディエーターの放出に関与するタンパク質をコードする少なくとも１つ、２つ、若しくは３つの遺伝子が、Ｃｏｘ１、ＨＰＳ及びトロンボキサンＡシンターゼ（ＴＢＸＡＳ１）からなる群から選択されるか、又はＣｏｘ１及びＨＰＳからなる群から選択される、先行の段落のいずれかに記載の操作されたシャーシ。
１５２． 以下の遺伝子：
ＧＰＶＩ、ＩＴＧＡ２Ｂ、Ｐａｒ１、Ｐａｒ４、Ｐ２Ｙ１２、Ｃｏｘ１及びＨＰＳの各々が、破壊又は欠失される、先行の段落のいずれかに記載の操作されたシャーシ。
１５３． シャーシが、エフェクターシャーシであり、
ａ）通常は血餅形成をもたらす内因性刺激に応答せず、
ｂ）他の活性化血小板によって動員されず、かつ／又は
ｃ）活性化すると、患者の内因性血小板を動員及び活性化することができない、先行の段落のいずれかに記載の操作されたシャーシ。
１５４． シャーシが、操作されていないシャーシに対して免疫原性が低減されるように操作されている、先行の段落のいずれかに記載の操作されたシャーシ。
１５５．
ａ）内因性ＭＨＣクラス１及び／若しくはＭＨＣクラス２の機能が破壊されており、かつ／又は
ｂ）β２ミクログロブリン遺伝子からの発現が破壊されている、先行の段落のいずれかに記載の操作されたシャーシ。
１５６． β２ミクログロブリン遺伝子が、ノックアウトされている、先行の段落のいずれかに記載の操作されたシャーシ。
１５７． β２ミクログロブリン遺伝子からの発現が、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集、又はｓｈＲＮＡ、任意選択で、ｓｈＲＮＡのレンチウイルス送達の使用によって破壊されている、先行の段落のいずれかに記載の操作されたシャーシ。
１５８． シャーシが、１つ以上のＨＬＡ遺伝子からの破壊された発現を有するように操作されている、先行の段落のいずれかに記載の操作されたシャーシ。
１５９． シャーシが、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ及び／又はＨＬＡ－Ｃのうちのいずれか１つ以上からの発現が破壊されるように操作されており、任意選択で、ＨＬＡ－Ａ及びＨＬＡ－Ｂの発現は完全に破壊されているが、ＨＬＡ－Ｃの発現は部分的に破壊されており、任意選択で、ＨＬＡ－Ａ及びＨＬＡ－Ｂの両方の対立遺伝子からの発現は破壊されているが、ＨＬＡ－Ｃの一方の対立遺伝子のみからの発現は破壊されている、段落１５８に記載の操作されたシャーシ。
１６０． シャーシが、ＨＬＡクラスＩｂ遺伝子のうちのいずれか１つ以上、任意選択で、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ４７及びＰＤ－Ｌ１のうちのいずれか１つ以上を過剰発現するように操作されている、先行の段落のいずれかに記載の操作されたシャーシ。
１６１． シャーシが、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ４７及びＰＤ－Ｌ１のうちのいずれか１つ以上を過剰発現するように操作されており、任意選択で、ベータ２ミクログロブリン遺伝子からの発現を阻害するように操作されている、先行の段落のいずれかに記載の操作されたシャーシ。
１６２． シャーシが、１つ以上の免疫調節遺伝子を過剰発現するように操作されており、任意選択で、１つ以上の免疫調節遺伝子が、ＣＤ４７及びＰＤ－Ｌ１を含む群から選択される、先行の段落のいずれかに記載の操作されたシャーシ。
１６３． プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシが、産生物がカーゴの効力に悪影響を及ぼし得る１つ以上の遺伝子を排除するように操作されている、先行の段落のいずれかに記載の操作されたプロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシ。
１６４． シャーシが、自然応答／適応応答を上方又は下方調整するように操作されている、先行の段落のいずれかに記載の操作されたシャーシ。
１６５． シャーシが、炎症、血管新生、アテローム性動脈硬化症、リンパ発達及び腫瘍増殖を低減するように操作されている、先行の段落のいずれかに記載の操作されたシャーシ。
１６６． シャーシが、操作されたカーゴの生物学的作用に間接的に対抗する可能性が高い接着タンパク質及び／又はカーゴ実体をコードする１つ以上の遺伝子を破壊するように操作されている、先行の段落のいずれかに記載の操作されたシャーシ。
１６７． シャーシが、ＴＧＦｂ及び／又はＧＡＲＰ及び／又はＣＤ４０Ｌの発現を下方制御又は阻害するように操作されている、先行の段落のいずれかに記載の操作されたシャーシ。
１６８． シャーシが、ＣＤ３６、ＮＯＤ２、ＳＲＢ１、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ６、ＴＬＲ９、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ９３（Ｃ１ｑＲｐ）、Ｃ３ａＲ、ＣＤ８８（Ｃ５ａＲ）、ＣＤ８９（ＦｃａＲ１）、ＣＤ２３（ＦｃｅＲ１）、ＣＤ３２（ＦｃｇＲＩＩａ）、ＭＨＣクラス１、ＣＤ１９１（ＣＣＲ１）、ＣＤ１９３（ＣＣＲ３）、ＣＤ１９４（ＣＣＲ４）、ＣＤ１８４（ＣＸＣＲ４）、ＣＸ３ＣＲ１、ＣＤ１０２（ＩＣＡＭ－２）、ＪＡＭ－Ｃ／ＪＡＭ－３、ＣＤ６２Ｐ（Ｐ－セレクチン）、ＣＤ３１（ＰＥＣＡＭ－１）、ＣＤ１５０（ＳＬＡＭＦ１）、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ５、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ４／ＰＦ４、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ８、ＮＡＰ２（ＣＸＣＬ７）、ＩＬ－１ｂのうちのいずれか１つ以上の発現を下方制御若しくは阻害するように操作されている、先行の段落のいずれかに記載の操作されたシャーシ。
１６９． シャーシが、ＴＧＦｂ及び／又はＧＡＲＰ２の発現を破壊又は阻害するように操作されている、先行の段落のいずれかに記載の操作されたシャーシ。
１７０． シャーシが、Ｓｉｇｌｅｃ－７、Ｓｉｇｌｅｃ－９、Ｓｉｇｌｅｃ－１１及びＴＧＦｂのうちのいずれか１つ以上の発現を破壊又は阻害するように操作されている、先行の段落のいずれかに記載の操作されたシャーシ。
１７１． シャーシが、Ｔ細胞シグナル伝達を増強し、免疫応答を刺激するために１つ以上のＩＴＡＭ受容体を発現するように操作されている、先行の段落のいずれかに記載の操作されたシャーシ。
１７２． シャーシが、操作されていないシャーシに対して免疫原性が低減されるように操作されており、シャーシが、
ａ）ＭＨＣクラス１遺伝子又はタンパク質の機能が破壊されている、
ｂ）β２ミクログロブリン遺伝子からの発現が破壊されており、任意選択でβ２ミクログロブリン遺伝子がノックアウトされている、
ｃ）１つ以上のＨＬＡ遺伝子からの発現が破壊されている、
ｄ）ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ及び／又はＨＬＡ－Ｃのうちのいずれか１つ以上からの発現が破壊されており、任意選択で、ＨＬＡ－Ａ及びＨＬＡ－Ｂの発現は完全に破壊されているが、ＨＬＡ－Ｃの発現は部分的に破壊されており、任意選択で、ＨＬＡ－Ａ及びＨＬＡ－Ｂの両方の対立遺伝子からの発現は破壊されているが、ＨＬＡ－Ｃの一方の対立遺伝子のみからの発現は破壊されている、
ｅ）ＨＬＡクラスＩｂ遺伝子のうちのいずれか１つ以上、任意選択でＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ４７及びＰＤ－Ｌ１のうちのいずれか１つ以上を過剰発現する、
ｆ）ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ４７及びＰＤ－Ｌ１のうちのいずれか１つ以上を過剰発現するように操作されており、任意選択で、ベータ２ミクログロブリン遺伝子からの発現が破壊されるように操作されている、並びに／又は
ｇ）１つ以上の免疫調節遺伝子を過剰発現する（任意選択で、１つ以上の免疫調節遺伝子が、ＣＤ４７及びＰＤ－Ｌ１を含む群から選択される）ように操作されている、先行の段落のいずれかに記載の操作されたシャーシ。
１７３． シャーシが、
ａ）ＭＨＣクラス１遺伝子又はタンパク質の機能が破壊されている、
ｂ）β２ミクログロブリン遺伝子からの発現が破壊されており、任意選択でβ２ミクログロブリン遺伝子がノックアウトされている、
ｃ）１つ以上のＨＬＡ遺伝子からの発現が破壊されている、
ｄ）ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ及び／又はＨＬＡ－Ｃのうちのいずれか１つ以上からの発現が破壊されており、任意選択で、ＨＬＡ－Ａ及びＨＬＡ－Ｂの発現は完全に破壊されているが、ＨＬＡ－Ｃの発現は部分的に破壊されており、任意選択で、ＨＬＡ－Ａ及びＨＬＡ－Ｂの両方の対立遺伝子からの発現は破壊されているが、ＨＬＡ－Ｃの一方の対立遺伝子のみからの発現は破壊されている、
ｅ）ＨＬＡクラスＩｂ遺伝子のうちのいずれか１つ以上、任意選択でＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ４７及びＰＤ－Ｌ１のうちのいずれか１つ以上を過剰発現する、
ｆ）ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ４７及びＰＤ－Ｌ１のうちのいずれか１つ以上を過剰発現する（任意選択で、ベータ２ミクログロブリン遺伝子からの発現が破壊されるように操作されている）、並びに／又は
ｇ）１つ以上の免疫調節遺伝子を過剰発現する（任意選択で、１つ以上の免疫調節遺伝子が、ＣＤ４７及びＰＤ－Ｌ１を含む群から選択される）、
ｈ）産物がカーゴの効力に悪影響を及ぼし得る１つ以上の遺伝子又は遺伝子産物を排除する、
ｉ）自然応答／適応応答を上方又は下方に調整する、
ｊ）炎症、血管新生、アテローム性動脈硬化症、リンパ発達及び腫瘍増殖を低減する、
ｋ）操作されたカーゴの生物学的作用に間接的に対抗する可能性が高い接着タンパク質及び／又はカーゴ実体をコードする１つ以上の遺伝子の発現が破壊されており、より大きな正味の治療効果をもたらす可能性がある、
ｌ）ＴＧＦｂ及び／又はＧＡＲＰ及び／又はＣＤ４０Ｌの発現を下方制御又は阻害する、
ｎ）ＣＤ３６、ＮＯＤ２、ＳＲＢ１、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ６、ＴＬＲ９、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ９３（Ｃ１ｑＲｐ）、Ｃ３ａＲ、ＣＤ８８（Ｃ５ａＲ）、ＣＤ８９（ＦｃａＲ１）、ＣＤ２３（ＦｃｅＲ１）、ＣＤ３２（ＦｃｇＲＩＩａ）、ＭＨＣクラス１、ＣＤ１９１（ＣＣＲ１）、ＣＤ１９３（ＣＣＲ３）、ＣＤ１９４（ＣＣＲ４）、ＣＤ１８４（ＣＸＣＲ４）、ＣＸ３ＣＲ１、ＣＤ１０２（ＩＣＡＭ－２）、ＪＡＭ－Ｃ／ＪＡＭ－３、ＣＤ６２Ｐ（Ｐ－セレクチン）、ＣＤ３１（ＰＥＣＡＭ－１）、ＣＤ１５０（ＳＬＡＭＦ１）、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ５、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ４／ＰＦ４、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ８、ＮＡＰ２（ＣＸＣＬ７）、ＩＬ－１ｂのうちのいずれか１つ以上の発現を下方制御若しくは阻害する、
ｏ）ＴＧＦｂ及び／又はＧＡＲＰの発現を破壊又は阻害する、
ｑ）Ｓｉｇｌｅｃ－７、Ｓｉｇｌｅｃ－９、Ｓｉｇｌｅｃ－１１又はＴＧＦｂのうちのいずれか１つ以上の発現を破壊又は阻害する、
ｓ）ＧＰＩｂ／Ｖ／ＩＸ及びＧＰＶＩ（ＧＰ６）、ＩＴＧＡ２Ｂ、ＣＬＥＣ２、インテグリンαＩＩｂｂ３、ａ２ｂ１、ａ５ｂ１及びａ６ｂ１、ＧＰＶＩ及びＩＴＧＡ２Ｂのうちのいずれか１つ以上の発現を破壊又は阻害する、
ｔ）Ｐａｒ１、Ｐａｒ４、Ｐ２Ｙ１２、ＧＰＩｂ／Ｖ／ＩＸ、トロンボキサン受容体（ＴＢＸＡ２Ｒ）、Ｐ２Ｙ１、Ｐ２Ｘ１及びインテグリンαＩＩｂｂ３のうちのいずれか１つ以上、又はＰａｒ１、Ｐａｒ４及びＰ２Ｙ１２からなる群からのいずれか１つ以上の発現を破壊又は阻害する、
ｕ）Ｃｏｘ１、Ｃｏｘ２、ＨＰＳ、プロトロンビン、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、フォン・ヴィレブランド因子及びトロンボキサン－Ａシンターゼ（ＴＢＸＡＳ１）のうちのいずれか１つ以上の発現を破壊又は阻害する、
ｖ）血小板又は血小板様膜結合細胞フラグメントの活性化に応答して目的のタンパク質又はＲＮＡを合成し、任意選択で、目的のタンパク質又はＲＮＡが、ＢＣＬ－３ ｍＲＮＡ非翻訳領域、任意選択で５′ＵＴＲから発現される、
ｚ）１つ以上のカーゴタンパク質又はカーゴＲＮＡを発現し、任意選択で、カーゴタンパク質又はカーゴＲＮＡが、アルファ顆粒標的化シグナルを含み、任意選択で、血小板因子４（ＰＦ４）又はフォン・ヴィレブランド因子（ｖＷｆ）を含む、
ａａ）先行の段落のいずれかに記載の少なくとも２つのＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲを発現し、任意選択で、先行の段落のいずれかに記載の少なくとも３、４、５、６、７、８、９又は少なくとも１０の異なるＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲを発現する、
ｂｂ）先行の段落のいずれかに記載の少なくとも２つのＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲを発現し、少なくとも２つのＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲの標的結合ドメインが、異なる標的に対して指向されている、
ｃｃ）先行の段落のいずれかに記載の少なくとも２つのＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲを発現し、少なくとも２つのＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲの標的結合ドメインが、異なる標的に対して指向されている、
ｉ）第１のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲの血小板調節ドメインが、血小板活性化ドメイン、任意選択で脱顆粒誘発ドメイン、任意選択でＩＴＡＭ含有ドメインであり、第２のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲの血小板調節ドメインが、血小板阻害ドメインであり、任意選択で血小板脱顆粒の誘発を防止するドメインであり、任意選択でＩＴＡＭ含有ドメインである、
ｉｉ）第１のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲの血小板調節ドメインが、血小板活性化ドメイン、任意選択で脱顆粒誘発ドメイン、任意選択でＩＴＡＭ含有ドメインであり、第２のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲの血小板調節ドメインが、血小板活性化ドメイン、任意選択で脱顆粒誘発ドメイン、任意選択でＩＴＡＭ含有ドメインである、
ｄｄ）ともに作動して論理回路を形成する、先行の段落のいずれかに記載の少なくとも２つのＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付け標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲを発現する、
ｅｅ）１つ以上のカーゴを発現し、任意選択で、カーゴが、
ａ）タンパク質又はペプチドであって、任意選択で、
ｉ）抗体若しくはその抗原結合フラグメント、例えば腫瘍抗原若しくは新抗原に結合する抗体若しくはその抗原結合フラグメント、
ｉｉ）ヌクレアーゼなどの酵素、例えばＴＡＬＥＮ、
ｉｉｉ）サイトカイン、例えばＩＬ－１０、又は
ｉｖ）ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質、例えばＣａｓ９、
ｖ）二重特異性タンパク質、例えば二重特異性抗体若しくは任意選択でＴ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）、
ｖｉ）エキソソーム標的化ドメインを含む融合タンパク質であり、融合タンパク質が、
ａ）カーゴタンパク質又はペプチドと、
ｂ）エキソソーム標的化ドメインと、を含み、任意選択で、エキソソーム標的化ドメインが、
ｉ）エキソソーム特異的膜タンパク質又はそのエキソソーム膜標的化部分、例えば、
テトラスパニン、例えばＣＤ６３、又は
非テトラスパニン、例えばＰＴＧＦＲＮ若しくはＢＡＳＰ１
ｉｉ）可溶性タンパク質由来のエキソソーム標的化配列、任意選択でＮｅｄｄ４ユビキチンリガーゼのＷＷドメイン、
ｉｉｉ）ユビキチンタグ、及び／又は
ｉｖ）タグ結合ドメイン、任意選択でタグに対して指向されたナノボディ、任意選択でＧＦＰに対して指向されたナノボディを含むか若しくはそれらからなる群から選択される、タンパク質又はペプチド。
ｂ）核酸であって、任意選択で、
ｉ）例えばｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、及びクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）配列から選択される、ＲＮＡ、及び／又は
ｉｉ）エキソソーム標的化ドメインを含むＲＮＡであって、任意選択で、エキソソーム標的化ドメインが、
ａ）エキソソーム標的化ヘアピン若しくは直鎖状モチーフ、
ｂ）ウイルスエキソソーム標的化ＲＮＡ若しくはそのエキソソーム標的化フラグメントを含むか若しくはそれらからなる群から選択される、ＲＮＡ、
ｉｉｉ）アプタマードメインを含むＲＮＡであって、任意選択で、アプタマードメインが、
ａ）ＭＳ２結合ステムループ、
ｂ）Ｃ／Ｄボックス、及び／若しくは
ｃ）ＡＵリッチエレメントから選択され、任意選択で、ＲＮＡが、Ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡである、ＲＮＡである、核酸を含む群から選択される、
ｆｆ）融合タンパク質を発現し、融合タンパク質が、
ｉ）エキソソーム膜タンパク質に融合されたバクテリオファージコートタンパク質ＭＳ２（任意選択で、エキソソーム膜タンパク質は、Ｌａｍｐ２ｂ、ＶＳＶＧ、ＣＤ６３を含むか若しくはそれらからなる群から選択される）、及び／又は
ｉｉ）エキソソーム膜タンパク質に融合された古細菌リボソームタンパク質Ｌ７Ａｅ（任意選択で、エキソソーム膜タンパク質は、Ｌａｍｐ２ｂ、ＶＳＶＧ、ＣＤ６３を含むか若しくはそれらからなる群から選択される）、及び／又は
ｉｉｉ）ＣＤ９－ＨｕＲ融合タンパク質を含み、
任意選択で、融合タンパク質が、光活性化された二量体化タンパク質を更に含む、
ｇｇ）１つ以上のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲｓ又はｅＰＡＲｓの標的への結合の際にのみ１つ以上のカーゴを発現し、任意選択で、カーゴが、
ａ）タンパク質又はペプチド、任意選択で、
ｉ）抗体若しくはその抗原結合フラグメント、例えば腫瘍抗原若しくは新抗原に結合する抗体若しくはその抗原結合フラグメント、
ｉｉ）ヌクレアーゼなどの酵素、例えばＴＡＬＥＮ、
ｉｉｉ）サイトカイン、例えばＩＬ－１０、又は
ｉｖ）ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質、例えばＣａｓ９、
ｖ）二重特異性タンパク質、例えば二重特異性抗体若しくは任意選択でＴ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）である、タンパク又はペプチド、
ｂ）核酸であって、いくつかの実施形態では、
ｉ）例えばｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、及びクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）配列から選択される、ＲＮＡである、核酸を含む群から選択され、
任意選択で、カーゴが、Ｂｃｌ－３ ｍＲＮＡ非翻訳領域、任意選択で５′ＵＴＲから発現されるように操作されている、先行の段落のいずれかに記載の操作されたシャーシ。
１７４． シャーシ又は操作されたシャーシが、１つ以上のカーゴを含み、任意選択で、操作されたシャーシが、
ａ）１つ以上のカーゴをロードされており、かつ／又は
ｂ）１つ以上のカーゴを提供するように操作されている、先行の段落のいずれかに記載のシャーシ又は操作されたシャーシ。
１７５． カーゴが、
ａ）タンパク質又はペプチドであって、いくつかの実施形態では、
ｉ）抗体若しくはその抗原結合フラグメント、例えば腫瘍抗原若しくは新抗原に結合する抗体若しくはその抗原結合フラグメント、
ｉｉ）ヌクレアーゼなどの酵素、例えばＴＡＬＥＮ、
ｉｉｉ）サイトカイン、例えばＩＬ－１０、又は
ｉｖ）ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質、例えばＣａｓ９、
ｖ）二重特異性タンパク質、例えば二重特異性抗体若しくは任意選択でＴ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）である、タンパク又はペプチド、
ｂ）核酸であって、いくつかの実施形態では、
ｉ）例えばｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、及びクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）配列から選択される、ＲＮＡ、又は
ｉｉ）ＤＮＡベクターである、核酸、
ｃ）毒素、
ｄ）小分子薬物、造影剤、放射性ヌクレオチド薬物、放射性ヌクレオチドタグ付抗体、又はそれらの任意のコンジュゲート、
ｅ）ＡＡＶなどのウイルスベクター、
ｆ）腫瘍溶解性ウイルスなどのウイルス、
ｇ）ＣＲＩＳＰＲ媒介遺伝子編集を実行するための薬剤、
ｈ）エキソソーム、例えば第２のカーゴをプレロードされたエキソソーム、及び／あるいは
ｉ）１つ又は複数のナノ粒子。
あるいはそれらの任意の組み合わせのうちのいずれか１つ以上から選択される、先行の段落のいずれかに記載のシャーシ又は操作されたシャーシ。
１７６． カーゴが、内因的に発現されたカーゴであり、
任意選択で、内因的に発現されたカーゴが、
ａ）タンパク質又はペプチドであって、いくつかの実施形態では、
ｉ）抗体若しくはその抗原結合フラグメント、例えば腫瘍抗原若しくは新抗原に結合する抗体若しくはその抗原結合フラグメント、
ｉｉ）ヌクレアーゼなどの酵素、例えばＴＡＬＥＮ、
ｉｉｉ）サイトカイン、例えばＩＬ－１０、又は
ｉｖ）ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質、例えばＣａｓ９、
ｖ）二重特異性タンパク質、例えば二重特異性抗体若しくは任意選択でＴ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）である、タンパク又はペプチド、
ｂ）核酸であって、いくつかの実施形態では、
ｉ）例えばｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、及びクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）配列から選択される、ＲＮＡである、核酸のうちのいずれか１つ以上である、先行の段落のいずれかに記載のシャーシ又は操作されたシャーシ。
１７７． カーゴが、シャーシ又は操作されたシャーシに外因的にロードされ、
任意選択で、外因的にロードされたカーゴが、
ａ）タンパク質又はペプチドであって、いくつかの実施形態では、
ｉ）抗体若しくはその抗原結合フラグメント、例えば腫瘍抗原若しくは新抗原に結合する抗体若しくはその抗原結合フラグメント、
ｉｉ）ヌクレアーゼなどの酵素、例えばＴＡＬＥＮ、
ｉｉｉ）サイトカイン、例えばＩＬ－１０、又は
ｉｖ）ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質、例えばＣａｓ９、
ｖ）二重特異性タンパク質、例えば二重特異性抗体若しくは任意選択でＴ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）である、タンパク又はペプチド、
ｂ）核酸であって、いくつかの実施形態では、
ｉ）例えばｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、及びクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）配列から選択される、ＲＮＡである、核酸のうちのいずれか１つ以上である、先行の段落のいずれかに記載のシャーシ又は操作されたシャーシ。
１７８． シャーシ又は操作されたシャーシが、カーゴを含み、カーゴが、シャーシ又は操作されたシャーシの中又は上に、任意選択で細胞質の中に、原形質膜の中に、又は細胞外表面に外因的にロードされている、先行の段落のいずれかに記載のシャーシ又は操作されたシャーシ。
１７９． シャーシ又は操作されたシャーシが、カーゴを含む場合、カーゴが、エキソソーム標的化ドメインを含む、先行の段落のいずれかに記載のシャーシ又は操作されたシャーシ。
１８０． カーゴが、融合タンパク質であるタンパク質又はペプチドであり、
ａ）カーゴタンパク質又はペプチドと、
ｂ）エキソソーム標的化ドメインと、を含み、任意選択で、エキソソーム標的化ドメインが、
ｉ）エキソソーム特異的膜タンパク質又はそのエキソソーム膜標的化部分、例えば、
テトラスパニン、例えばＣＤ６３、又は
非テトラスパニン、例えばＰＴＧＦＲＮ若しくはＢＡＳＰ１
ｉｉ）可溶性タンパク質由来のエキソソーム標的化配列、任意選択でＮｅｄｄ４ユビキチンリガーゼのＷＷドメイン、
ｉｉｉ）ユビキチンタグ、及び／又は
ｉｖ）タグ結合ドメイン、任意選択でタグに対して指向されたナノボディ、任意選択でＧＦＰに対して指向されたナノボディ、及び／又は
ｖ）表Ａに列挙されたタンパク質から選択されるタンパク質を含むか若しくはそれらからなる群から選択される、段落１７９に記載のシャーシ又は操作されたシャーシ。
１８１． カーゴが、ＲＮＡであり、エキソソーム標的化ドメインが、
ａ）エキソソーム標的化ヘアピン若しくは直鎖状モチーフ、
ｂ）ウイルスエキソソーム標的化ＲＮＡ若しくはそのエキソソーム標的化フラグメント、
ｃ）アプタマー、任意選択で、
ｉ）ＭＳ２結合ステムループ、
ｉｉ）Ｃ／Ｄボックス、及び／若しくは
ｉｉｉ）ＡＵリッチエレメントであり、任意選択で、ＲＮＡが、Ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡである、段落１７９に記載のシャーシ又は操作されたシャーシ。
１８２． シャーシ又は操作されたシャーシが、融合タンパク質を発現するように操作されており、融合タンパク質が、
ａ）エキソソーム膜タンパク質に融合されたバクテリオファージコートタンパク質ＭＳ２（任意選択で、エキソソーム膜タンパク質は、Ｌａｍｐ２ｂ、ＶＳＶＧ、ＣＤ６３、若しくは表Ａのタンパク質のうちのいずれかを含むか若しくはそれらからなる群から選択される）、及び／又は
ｂ）エキソソーム膜タンパク質に融合された古細菌リボソームタンパク質Ｌ７Ａｅを含む融合タンパク質（任意選択で、エキソソーム膜タンパク質は、Ｌａｍｐ２ｂ、ＶＳＶＧ、ＣＤ６３、若しくは表Ａのタンパク質のうちのいずれかを含むか若しくはそれらからなる群から選択される）、及び／又は
ｃ）エキソソーム膜タンパク質に融合されたアプタマー結合タンパク質（任意選択で、エキソソーム膜タンパク質は、Ｌａｍｐ２ｂ、ＶＳＶＧ、ＣＤ６３、若しくは表Ａのタンパク質のうちのいずれかを含むか若しくはそれらからなる群から選択される）を含む、先行の段落のいずれかに記載のシャーシ又は操作されたシャーシ。
１８３． 融合タンパク質が、光活性化二量体化タンパク質を更に含む、段落１８２に記載のシャーシ又は操作されたシャーシ。
１８４． シャーシ又は操作されたシャーシが、ＭＳ２結合ステムループであるエキソソーム標的化ドメインを含むＲＮＡであるカーゴを含む場合、シャーシ又は操作されたシャーシが、融合タンパク質を発現するように操作されており、融合タンパク質が、エキソソーム膜タンパク質に融合されたバクテリオファージコートタンパク質ＭＳ２を含み、任意選択で、エキソソーム膜タンパク質が、Ｌａｍｐ２ｂ、ＶＳＶＧ、ＣＤ６３、又は表Ａのタンパク質のうちのいずれかを含むか又はそれらからなる群から選択され、
任意選択で、融合タンパク質が、光活性化二量体化ドメインを更に含む、先行の段落のいずれかに記載のシャーシ又は操作されたシャーシ。
１８５． シャーシ又は操作されたシャーシが、Ｃ／Ｄボックスであるエキソソーム標的化ドメインを含むＲＮＡであるカーゴを含む場合、シャーシ又は操作されたシャーシが、融合タンパク質を発現するように操作されており、融合タンパク質が、エキソソーム膜タンパク質に融合された古細菌リボソームタンパク質Ｌ７Ａｅを含み、任意選択で、エキソソーム膜タンパク質が、Ｌａｍｐ２ｂ、ＶＳＶＧ、ＣＤ６３、又は表Ａのタンパク質のうちのいずれかを含むか又はそれらからなる群から選択され、
任意選択で、融合タンパク質が、光活性化二量体化ドメインを更に含む、先行の段落のいずれかに記載のシャーシ又は操作されたシャーシ。
１８６． シャーシ又は操作されたシャーシが、アプタマーを含むＲＮＡであるカーゴを含む場合、シャーシ又は操作されたシャーシが、融合タンパク質を発現するように操作されており、融合タンパク質が、エキソソーム膜タンパク質に融合されたアプタマーによって結合され得るタンパク質又はそのフラグメントを含み、任意選択で、エキソソーム膜タンパク質が、Ｌａｍｐ２ｂ、ＶＳＶＧ、ＣＤ６３、又は表Ａのタンパク質のうちのいずれかを含むか又はそれらからなる群から選択され、
任意選択で、融合タンパク質が、光活性化二量体化ドメインを更に含む、先行の段落のいずれかに記載のシャーシ又は操作されたシャーシ。
１８７． シャーシ又は操作されたシャーシが、ＡＵリッチエレメントであるエキソソーム標的化ドメインを含むＲＮＡであるカーゴを含む場合、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシが、融合タンパク質を発現するように操作されており、融合タンパク質が、ＣＤ９－ＨｕＲ融合タンパク質である、先行の段落のいずれかに記載のシャーシ又は操作されたシャーシ。
１８８． カーゴが、Ｃａｓタンパク質、任意選択でＣａｓ９タンパク質をコードするＲＮＡである、先行の段落のいずれかに記載のシャーシ又は操作されたシャーシ。
１８９． 前駆体シャーシ、プロデューサーシャーシ又はエフェクターシャーシが、１つ以上のｓｇＲＮＡを発現するように操作されている、先行の段落のいずれかに記載のシャーシ又は操作されたシャーシ。
１９０．
シャーシ又は操作されたシャーシが、１つ以上のカーゴをコードする核酸を含み、
任意選択で、
核酸が、異種配列を含み、
カーゴが、異種カーゴであり、かつ／又は
カーゴが、１つ以上の標的化配列を含み、任意選択で、エキソソーム標的化ドメインを含む、先行の段落のいずれかに記載のシャーシ又は操作されたシャーシ。
１９１． シャーシ又は操作されたシャーシが、先行の段落によって定義されるＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲのうちのいずれか１つ以上を含み、シャーシ又は操作されたシャーシが、
ａ）ＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、若しくはＳＡＰＲのうちのいずれか１つ以上の標的結合ドメインが、標的に結合する場合、及び／又は
ｂ）ｅＰＡＲが、プロテアーゼによって切断される場合のみに発現されるカーゴを内因的に発現し、
任意選択で、
カーゴが、シャーシ又は対象に対して毒性であり、かつ／又は
カーゴが、Ｂｃｌ－３ ｍＲＮＡ非翻訳領域、任意選択で５’ＵＴＲから発現される、先行の段落のいずれか１つに記載のシャーシ又は操作されたシャーシ。
１９２． シャーシ又は操作されたシャーシが、カーゴを含み、カーゴが、シャーシ又は操作されたシャーシの中又は上に、任意選択で細胞質の中に、原形質膜の中に、又は細胞外表面に外因的にロードされている、先行の段落のいずれかに記載のシャーシ又は操作されたシャーシ。
１９３． カーゴをコードする核酸であって、任意選択で、カーゴが、
ａ）タンパク質又はペプチド、任意選択で、
ｉ）抗体若しくはその抗原結合フラグメント、例えば腫瘍抗原若しくは新抗原に結合する抗体若しくはその抗原結合フラグメント、
ｉｉ）ヌクレアーゼなどの酵素、例えばＴＡＬＥＮ、
ｉｉｉ）サイトカイン、例えばＩＬ－１０、又は
ｉｖ）ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質、例えばＣａｓ９、
ｖ）二重特異性タンパク質、例えば二重特異性抗体若しくは任意選択でＴ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）である、タンパク又はペプチド、
ｂ）核酸、任意選択でＲＮＡ、任意選択でｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、及びクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）配列から選択される、ＲＮＡから選択され、
任意選択で、カーゴが、標的化ドメインを含み、任意選択で、エキソソーム標的化ドメインを含む、核酸。
１９４． 核酸が、アルファ顆粒局在化シグナルとインフレームでカーゴをコードし、任意選択で、アルファ顆粒局在化シグナルは、ｖＷｆのＰＦ４から選択される、段落１９３に記載の核酸。
１９５． シャーシ又は操作されたシャーシが、段落９３又は１９４に記載の核酸を含み、先行の段落のいずれかに記載のシャーシ又は操作されたシャーシ。
１９６． シャーシ又は操作されたシャーシが、カーゴを含み、カーゴが、顆粒内、任意選択でアルファ顆粒内、エキソソーム内、任意選択でアルファ顆粒とともに位置するエキソソーム内、細胞質内、原形質膜内、及び／又は原形質膜の外表面に貯蔵又は位置する、先行の段落のいずれかに記載のシャーシ又は操作されたシャーシ。
１９７． シャーシ又は設計されたシャーシが、カーゴを含み、カーゴが、
治療剤、
造影剤、
非治療剤、及び／又は
化粧剤である、先行の段落のいずれかに記載のシャーシ又は操作されたシャーシ。
１９８． シャーシ又は操作されたシャーシが、先行の段落のいずれかに記載の１つ以上のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲを発現するエフェクターシャーシであり、任意選択で、標的化送達システムが、治療的標的化送達システム又は非治療的送達システムである、先行の段落のいずれかに定義されるシャーシ又は操作されたシャーシを含む標的化送達システム。
１９９． 操作されたシャーシが、先行の段落のいずれかに記載の１つ以上のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲを発現する操作されたエフェクターシャーシであり、エフェクターシャーシが、血栓形成性経路を破壊するように操作されており、標的化送達システムが、非血栓形成性治療的標的化送達システム又は非血栓形成性非治療的送達システムである、先行の段落のいずれかに記載の操作されたシャーシを含む、非血栓形成性標的化送達システム。
２００． 系が、１つ以上のカーゴを更に含み、任意選択でカーゴが、１つ以上の標的化ドメインを含み、任意選択でエキソソーム標的化ドメインを含む、先行の段落の標的化送達システム又は非血栓形成性標的化送達システム。
２０１． 任意選択で、シャーシが、エフェクターシャーシである、先行の段落のいずれかに記載のシャーシ若しくは操作されたシャーシ、並びに／又は医薬において使用するための先行の段落のいずれかに記載のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ若しくはｅＰＡＲ。
２０１． 任意選択で、シャーシ又は操作されたシャーシが、エフェクターシャーシ又は操作されたエフェクターシャーシである、治療的若しくは造影カーゴを送達するか、又はがん、自己免疫疾患、遺伝性疾患、心血管疾患及び／若しくは感染症を治療若しくは予防する際に使用するための、先行の段落のいずれかに記載のシャーシ若しくは操作されたシャーシ、及び／又はＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲ。
２０２． カーゴを送達する方法であって、有効量の、先行の段落のいずれかに記載のシャーシ又は操作されたシャーシのうちのいずれか１つ以上を投与することを含み、任意選択で、シャーシ又は操作されたシャーシが、先行の段落のいずれかに記載の１つ以上のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付き標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲを含み、任意選択で、シャーシ又は操作されたシャーシが、エフェクターシャーシ又は操作されたエフェクターシャーシである、方法。
２０３． 体内の標的細胞、組織又は部位への標的化カーゴ送達の方法であって、方法が、有効量の、先行の段落のいずれかに記載のシャーシ又は操作されたシャーシのうちのいずれか１つ以上を投与することを含み、任意選択で、シャーシ又は操作されたシャーシが、先行の段落のいずれかに記載の１つ以上のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲを含み、ＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲの標的化ドメインが、体内の標的細胞、組織又は部位に結合し、操作されたシャーシが、エフェクターシャーシ又は操作されたエフェクターシャーシである、方法。
２０４． カーゴの送達を必要とする対象にカーゴを送達する、非治療的方法。
２０５． 有効量の、先行の段落のいずれかに記載のシャーシ又は操作されたシャーシのうちのいずれか１つ以上を投与することを含む、治療の方法であって、任意選択で、シャーシ又は操作されたシャーシが、先行の段落のいずれかに記載の１つ以上のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲを含み、任意選択で、方法が、がん、自己免疫疾患、遺伝性疾患、心血管疾患及び／又は感染症のうちのいずれか１つ以上の治療又は予防のためのものであり、任意選択で、シャーシ又は操作されたシャーシが、エフェクターシャーシ又は操作されたエフェクターシャーシである、方法。
２０６． 任意選択で、シャーシ又は操作されたシャーシが、先行の段落のいずれかに記載の１つ以上のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲを含む、疾患又は感染症の治療又は予防のための、任意選択で、がん、自己免疫疾患、遺伝性疾患、心血管疾患、及び／又は感染症のうちのいずれか１つ以上を治療又は予防するための医薬品の製造における、先行の段落のいずれかに記載のシャーシ又は操作されたシャーシのうちのいずれか１つ以上の使用であって、任意選択で、シャーシ又は操作されたシャーシが、エフェクターシャーシ又は操作されたエフェクターシャーシである、使用。
２０７． シャーシ又は操作されたシャーシを、それを必要とする患者に投与することによって、先行の段落のいずれかに記載のシャーシ又は操作されたシャーシを使用してカーゴ、任意選択で、治療剤を送達する方法であって、任意選択で、シャーシ又は操作されたシャーシが、先行の段落のいずれかに記載の１つ以上のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチド、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲを含み、任意選択で、シャーシ又は操作されたシャーシが、エフェクターシャーシ又は操作されたエフェクターシャーシである、方法。
２０８． 以下の：
ａ）先行の段落のいずれか１つ以上に記載のシャーシ、
ｂ）先行の段落のいずれか１つ以上に記載の操作されたシャーシ、
ｃ）先行の段落のいずれか１つ以上に記載の操作された血小板又は血小板様膜結合細胞フラグメント、
ｄ）治療剤及び／若しくは造影剤、
ｅ）先行の段落のいずれか１つ以上に記載のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ若しくはｅＰＡＲ、及び／又は
ｆ）先行の段落のいずれか１つ以上に記載のＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲ、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、ＳＡＰＲ又はｅＰＡＲをコードする核酸、
ｇ）先行の段落のいずれか１つ以上に定義される１つ以上のカーゴをコードする核酸、及び／又は
ｈ）先行の段落のいずれか１つ以上に定義される１つ以上のカーゴのうちのいずれか２つ以上を含む、キット。
２０９． カーゴを含むエキソソームの標的化送達のための方法であって、先行の段落のいずれかに記載のシャーシ又は操作されたシャーシを、それを必要とする対象に投与することを含み、
ａ）シャーシ又は操作されたシャーシが、１つ以上のキメラ血小板受容体（ＣＰＲ）、ユニバーサルキメラ血小板受容体（ユニバーサルＣＰＲ）、ユニバーサルＣＰＲとタグ付標的化ペプチドとの複合体、合成抗原提示受容体（ＳＡＰＲ）、又は操作されたプロテアーゼ活性化受容体（ｅＰＡＲＳ）を発現し、任意選択で、少なくとも１つのＣＰＲ又はユニバーサルＣＰＲを含み、
ｂ）シャーシ又は操作されたシャーシが、カーゴ及び／又はシャーシ若しくは操作されたシャーシの操作によってエキソソームに標的化されているカーゴを含む、カーゴを含むエキソソームの標的化送達のための方法。
２１０． カーゴが、
ａ）タンパク質又はペプチドであって、いくつかの実施形態では、
ｉ）抗体若しくはその抗原結合フラグメント、例えば腫瘍抗原若しくは新抗原に結合する抗体若しくはその抗原結合フラグメント、
ｉｉ）ヌクレアーゼなどの酵素、例えばＴＡＬＥＮ、
ｉｉｉ）サイトカイン、例えばＩＬ－１０、又は
ｉｖ）ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質、例えばＣａｓ９、
ｖ）二重特異性タンパク質、例えば二重特異性抗体若しくは任意選択でＴ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）である、タンパク又はペプチド、
ｂ）核酸であって、いくつかの実施形態では、
ｉ）例えばｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、及びクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）配列から選択される、ＲＮＡ、又は
ｉｉ）ＤＮＡベクターである、核酸、
ｃ）毒素、
ｄ）小分子薬物、造影剤、放射性ヌクレオチド薬物、放射性ヌクレオチドタグ付抗体、又はそれらの任意のコンジュゲート、
ｅ）ＡＡＶなどのウイルスベクター、
ｆ）腫瘍溶解性ウイルスなどのウイルス、
ｇ）ＣＲＩＳＰＲ媒介遺伝子編集を実行するための薬剤、
ｈ）エキソソーム、例えば第２のカーゴをプレロードされたエキソソーム、及び／あるいは
ｉ）１つ又は複数のナノ粒子、
あるいはそれらの任意の組み合わせのうちのいずれか１つ以上から選択される、段落２０９に記載の方法。
２１１． シャーシ又は操作されたシャーシが、エキソソーム標的化ドメインを含むカーゴを内因的に発現するように操作されており、
Ａ）カーゴがタンパク質又はペプチドである場合、タンパク質又はペプチドが、
ｉ）カーゴタンパク質又はペプチドと、
ｉｉ）エキソソーム標的化ドメインと、を含む、融合タンパク質であり、任意選択で、エキソソーム標的化ドメインが、
ａ）エキソソーム特異的膜タンパク質又はそのエキソソーム膜標的化部分、任意選択で、
テトラスパニン、例えばＣＤ６３、又は
非テトラスパニン、例えばＰＴＧＦＲＮ若しくはＢＡＳＰ１
ｂ）可溶性タンパク質由来のエキソソーム標的化配列、任意選択でＮｅｄｄ４ユビキチンリガーゼのＷＷドメイン、
ｃ）ユビキチンタグ、及び／又は
ｄ）タグ結合ドメイン、任意選択でタグに対して指向されたナノボディ、任意選択でＧＦＰに対して指向されたナノボディ、及び／又は
ｅ）表Ａに列挙されたタンパク質から選択されるタンパク質を含むか若しくはそれらからなる群から選択され、
Ｂ）カーゴがＲＮＡであり、エキソソーム標的化ドメインが、
ａ）エキソソーム標的化ヘアピン若しくは直鎖状モチーフ、
ｂ）ウイルスエキソソーム標的化ＲＮＡ若しくはそのエキソソーム標的化フラグメント、
ｃ）アプタマー、任意選択で、
ｉ）ＭＳ２結合ステムループ、
ｉｉ）Ｃ／Ｄボックス、及び／若しくは
ｉｉｉ）ＡＵリッチエレメントであり、任意選択で、ＲＮＡが、Ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡであり、
任意選択で、
カーゴが、ＭＳ２結合ステムループを含むＲＮＡであり、シャーシ又は操作されたシャーシがまた、エキソソーム膜タンパク質に融合されたバクテリオファージコートタンパク質ＭＳ２を含む融合タンパク質を発現するように操作され、任意選択で、エキソソーム膜タンパク質が、Ｌａｍｐ２ｂ、ＶＳＶＧ、ＣＤ６３又は表Ａのタンパク質のうちのいずれかを含むか又はそれらからなる群から選択され、任意選択で、融合タンパク質が、光活性化二量体化タンパク質を更に含み、
カーゴが、Ｃ／Ｄボックスを含むＲＮＡであり、シャーシ又は操作されたシャーシがまた、エキソソーム膜タンパク質に融合された古細菌Ｌ７リボソームＬ７Ａｅタンパク質を含む融合タンパク質を発現するように操作され、任意選択で、エキソソーム膜タンパク質が、Ｌａｍｐ２ｂ、ＶＳＶＧ、ＣＤ６３又は表Ａのタンパク質のうちのいずれかを含むか又はそれらからなる群から選択され、任意選択で、融合タンパク質が、光活性化二量体化タンパク質を更に含み、
カーゴが、ＡＵリッチエレメントを含むＲＮＡであり、シャーシ又は操作されたシャーシが、ＣＤ９－ＨｕＲ融合タンパク質である融合タンパク質を発現するように操作されており、任意選択で、融合タンパク質が、光活性化二量体化タンパク質を更に含み、
カーゴが、アプタマーを含むＲＮＡであり、シャーシ又は操作されたシャーシが、エキソソーム膜タンパク質に融合されたアプタマー結合タンパク質（ＲＮＡ中に存在するアプタマーに結合する）を含む融合タンパク質を発現するように操作されており、任意選択で、エキソソーム膜タンパク質が、Ｌａｍｐ２ｂ、ＶＳＶＧ、ＣＤ６３又は表Ａのタンパク質のうちのいずれかを含むか又はそれらからなる群から選択され、任意選択で、融合タンパク質が、光活性化二量体化タンパク質を更に含む、段落２０９又は２１０に記載の方法。
２１０． シャーシ又は操作されたシャーシに、エキソソーム標的化ドメインを含むカーゴを外因的にロードされており、任意選択で、
Ａ）カーゴがタンパク質又はペプチドである場合、タンパク質又はペプチドが、
ｉ）カーゴタンパク質又はペプチドと、
ｉｉ）エキソソーム標的化ドメインと、を含む、融合タンパク質であり、任意選択で、エキソソーム標的化ドメインが、
ａ）エキソソーム特異的膜タンパク質又はそのエキソソーム膜標的化部分、任意選択で、
テトラスパニン、例えばＣＤ６３、又は
非テトラスパニン、例えばＰＴＧＦＲＮ若しくはＢＡＳＰ１
ｂ）可溶性タンパク質由来のエキソソーム標的化配列、任意選択でＮｅｄｄ４ユビキチンリガーゼのＷＷドメイン、
ｃ）ユビキチンタグ、及び／又は
ｄ）タグ結合ドメイン、任意選択でタグに対して指向されたナノボディ、任意選択でＧＦＰに対して指向されたナノボディ、及び／又は
ｅ）表Ａに列挙されたタンパク質から選択されるタンパク質を含むか若しくはそれらからなる群から選択され、
Ｂ）カーゴがＲＮＡであり、エキソソーム標的化ドメインが、
ａ）エキソソーム標的化ヘアピン若しくは直鎖状モチーフ、
ｂ）ウイルスエキソソーム標的化ＲＮＡ若しくはそのエキソソーム標的化フラグメント、
ｃ）アプタマー、任意選択で、
ｉ）ＭＳ２結合ステムループ、
ｉｉ）Ｃ／Ｄボックス、及び／若しくは
ｉｉｉ）ＡＵリッチエレメントであり、任意選択で、ＲＮＡが、Ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡであり、
任意選択で、
カーゴが、ＭＳ２結合ステムループを含むＲＮＡであり、シャーシ又は操作されたシャーシがまた、エキソソーム膜タンパク質に融合されたバクテリオファージコートタンパク質ＭＳ２を含む融合タンパク質を発現するように操作され、任意選択で、エキソソーム膜タンパク質が、Ｌａｍｐ２ｂ、ＶＳＶＧ、ＣＤ６３又は表Ａのタンパク質のうちのいずれかを含むか又はそれらからなる群から選択され、任意選択で、融合タンパク質が、光活性化二量体化タンパク質を更に含み、
カーゴが、Ｃ／Ｄボックスを含むＲＮＡであり、シャーシ又は操作されたシャーシがまた、エキソソーム膜タンパク質に融合された古細菌Ｌ７リボソームＬ７Ａｅタンパク質を含む融合タンパク質を発現するように操作され、任意選択で、エキソソーム膜タンパク質が、Ｌａｍｐ２ｂ、ＶＳＶＧ、ＣＤ６３又は表Ａのタンパク質のうちのいずれかを含むか又はそれらからなる群から選択され、任意選択で、融合タンパク質が、光活性化二量体化タンパク質を更に含み、
カーゴが、ＡＵリッチエレメントを含むＲＮＡであり、シャーシ又は操作されたシャーシが、ＣＤ９－ＨｕＲ融合タンパク質である融合タンパク質を発現するように操作されており、任意選択で、融合タンパク質が、光活性化二量体化タンパク質を更に含み、
カーゴが、アプタマーを含むＲＮＡであり、シャーシ又は操作されたシャーシが、エキソソーム膜タンパク質に融合されたアプタマー結合タンパク質（ＲＮＡ中に存在するアプタマーに結合する）を含む融合タンパク質を発現するように操作されており、任意選択で、エキソソーム膜タンパク質が、Ｌａｍｐ２ｂ、ＶＳＶＧ、ＣＤ６３又は表Ａのタンパク質のうちのいずれかを含むか又はそれらからなる群から選択され、任意選択で、融合タンパク質が、光活性化二量体化タンパク質を更に含む、段落２０９に記載の方法。
２１１． 治療的カーゴを含むエキソソームの、それを必要とする対象への標的化送達における使用のための、医薬における使用のための、任意選択でがん、自己免疫疾患、遺伝性疾患、心血管疾患及び／又は感染症の治療又は予防における使用のためのものであり、
操作されたシャーシが、カーゴ及び／又はシャーシ若しくは操作されたシャーシの操作によってエキソソームに標的化されているカーゴを含む操作されたエフェクターシャーシである、先行の段落のいずれかに記載の操作されたシャーシ。
２１２． カーゴが、
ａ）タンパク質又はペプチドであって、いくつかの実施形態では、
ｉ）抗体若しくはその抗原結合フラグメント、例えば腫瘍抗原若しくは新抗原に結合する抗体若しくはその抗原結合フラグメント、
ｉｉ）ヌクレアーゼなどの酵素、例えばＴＡＬＥＮ、
ｉｉｉ）サイトカイン、例えばＩＬ－１０、又は
ｉｖ）ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質、例えばＣａｓ９、
ｖ）二重特異性タンパク質、例えば二重特異性抗体若しくは任意選択でＴ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）である、タンパク又はペプチド、
ｂ）核酸であって、いくつかの実施形態では、
ｉ）例えばｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、及びクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）配列から選択される、ＲＮＡ、又は
ｉｉ）ＤＮＡベクターである、核酸、
ｃ）毒素、
ｄ）小分子薬物、造影剤、放射性ヌクレオチド薬物、放射性ヌクレオチドタグ付抗体、又はそれらの任意のコンジュゲート、
ｅ）ＡＡＶなどのウイルスベクター、
ｆ）腫瘍溶解性ウイルスなどのウイルス、
ｇ）ＣＲＩＳＰＲ媒介遺伝子編集を実行するための薬剤、
ｈ）エキソソーム、例えば第２のカーゴをプレロードされたエキソソーム、及び／あるいは
ｉ）１つ又は複数のナノ粒子、
あるいはそれらの任意の組み合わせのうちのいずれか１つ以上から選択される、段落２１１に記載の使用のための操作されたシャーシ。
２１３． シャーシ又は操作されたシャーシが、エキソソーム標的化ドメインを含むカーゴを内因的に発現するように操作されており、
Ａ）カーゴがタンパク質又はペプチドである場合、タンパク質又はペプチドが、
ｉ）カーゴタンパク質又はペプチドと、
ｉｉ）エキソソーム標的化ドメインと、を含む、融合タンパク質であり、任意選択で、エキソソーム標的化ドメインが、
ａ）エキソソーム特異的膜タンパク質又はそのエキソソーム膜標的化部分、任意選択で、
テトラスパニン、例えばＣＤ６３、又は
非テトラスパニン、例えばＰＴＧＦＲＮ若しくはＢＡＳＰ１
ｂ）可溶性タンパク質由来のエキソソーム標的化配列、任意選択でＮｅｄｄ４ユビキチンリガーゼのＷＷドメイン、
ｃ）ユビキチンタグ、及び／又は
ｄ）タグ結合ドメイン、任意選択でタグに対して指向されたナノボディ、任意選択でＧＦＰに対して指向されたナノボディ、及び／又は
ｅ）表Ａに列挙されたタンパク質から選択されるタンパク質を含むか若しくはそれらからなる群から選択され、
Ｂ）カーゴがＲＮＡであり、エキソソーム標的化ドメインが、
ａ）エキソソーム標的化ヘアピン若しくは直鎖状モチーフ、
ｂ）ウイルスエキソソーム標的化ＲＮＡ若しくはそのエキソソーム標的化フラグメント、
ｃ）アプタマー、任意選択で、
ｉ）ＭＳ２結合ステムループ、
ｉｉ）Ｃ／Ｄボックス、及び／若しくは
ｉｉｉ）ＡＵリッチエレメントであり、任意選択で、ＲＮＡが、Ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡであり、
任意選択で、
カーゴが、ＭＳ２結合ステムループを含むＲＮＡであり、シャーシ又は操作されたシャーシがまた、エキソソーム膜タンパク質に融合されたバクテリオファージコートタンパク質ＭＳ２を含む融合タンパク質を発現するように操作され、任意選択で、エキソソーム膜タンパク質が、Ｌａｍｐ２ｂ、ＶＳＶＧ、ＣＤ６３又は表Ａのタンパク質のうちのいずれかを含むか又はそれらからなる群から選択され、任意選択で、融合タンパク質が、光活性化二量体化タンパク質を更に含み、
カーゴが、Ｃ／Ｄボックスを含むＲＮＡであり、シャーシ又は操作されたシャーシがまた、エキソソーム膜タンパク質に融合された古細菌Ｌ７リボソームＬ７Ａｅタンパク質を含む融合タンパク質を発現するように操作され、任意選択で、エキソソーム膜タンパク質が、Ｌａｍｐ２ｂ、ＶＳＶＧ、ＣＤ６３又は表Ａのタンパク質のうちのいずれかを含むか又はそれらからなる群から選択され、任意選択で、融合タンパク質が、光活性化二量体化タンパク質を更に含み、
カーゴが、ＡＵリッチエレメントを含むＲＮＡであり、シャーシ又は操作されたシャーシが、ＣＤ９－ＨｕＲ融合タンパク質である融合タンパク質を発現するように操作されており、任意選択で、融合タンパク質が、光活性化二量体化タンパク質を更に含み、
カーゴが、アプタマーを含むＲＮＡであり、シャーシ又は操作されたシャーシが、エキソソーム膜タンパク質に融合されたアプタマー結合タンパク質（ＲＮＡ中に存在するアプタマーに結合する）を含む融合タンパク質を発現するように操作されており、任意選択で、エキソソーム膜タンパク質が、Ｌａｍｐ２ｂ、ＶＳＶＧ、ＣＤ６３又は表Ａのタンパク質のうちのいずれかを含むか又はそれらからなる群から選択され、任意選択で、融合タンパク質が、光活性化二量体化タンパク質を更に含む、段落２１１又は２１２に記載の使用のための操作されたシャーシ。
２１４． シャーシ又は操作されたシャーシに、エキソソーム標的化ドメインを含むカーゴを外因的にロードされており、任意選択で、
Ａ）カーゴがタンパク質又はペプチドである場合、タンパク質又はペプチドが、
ｉ）カーゴタンパク質又はペプチドと、
ｉｉ）エキソソーム標的化ドメインと、を含む、融合タンパク質であり、任意選択で、エキソソーム標的化ドメインが、
ａ）エキソソーム特異的膜タンパク質又はそのエキソソーム膜標的化部分、任意選択で、
テトラスパニン、例えばＣＤ６３、又は
非テトラスパニン、例えばＰＴＧＦＲＮ若しくはＢＡＳＰ１
ｂ）可溶性タンパク質由来のエキソソーム標的化配列、任意選択でＮｅｄｄ４ユビキチンリガーゼのＷＷドメイン、
ｃ）ユビキチンタグ、及び／又は
ｄ）タグ結合ドメイン、任意選択でタグに対して指向されたナノボディ、任意選択でＧＦＰに対して指向されたナノボディ、及び／又は
ｅ）表Ａに列挙されたタンパク質から選択されるタンパク質を含むか若しくはそれらからなる群から選択され、
Ｂ）カーゴがＲＮＡであり、エキソソーム標的化ドメインが、
ａ）エキソソーム標的化ヘアピン若しくは直鎖状モチーフ、
ｂ）ウイルスエキソソーム標的化ＲＮＡ若しくはそのエキソソーム標的化フラグメント、
ｃ）アプタマー、任意選択で、
ｉ）ＭＳ２結合ステムループ、
ｉｉ）Ｃ／Ｄボックス、及び／若しくは
ｉｉｉ）ＡＵリッチエレメントであり、任意選択で、ＲＮＡが、Ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡであり、
任意選択で、
カーゴが、ＭＳ２結合ステムループを含むＲＮＡであり、シャーシ又は操作されたシャーシがまた、エキソソーム膜タンパク質に融合されたバクテリオファージコートタンパク質ＭＳ２を含む融合タンパク質を発現するように操作され、任意選択で、エキソソーム膜タンパク質が、Ｌａｍｐ２ｂ、ＶＳＶＧ、ＣＤ６３又は表Ａのタンパク質のうちのいずれかを含むか又はそれらからなる群から選択され、任意選択で、融合タンパク質が、光活性化二量体化タンパク質を更に含み、
カーゴが、Ｃ／Ｄボックスを含むＲＮＡであり、シャーシ又は操作されたシャーシがまた、エキソソーム膜タンパク質に融合された古細菌Ｌ７リボソームＬ７Ａｅタンパク質を含む融合タンパク質を発現するように操作され、任意選択で、エキソソーム膜タンパク質が、Ｌａｍｐ２ｂ、ＶＳＶＧ、ＣＤ６３又は表Ａのタンパク質のうちのいずれかを含むか又はそれらからなる群から選択され、任意選択で、融合タンパク質が、光活性化二量体化タンパク質を更に含み、
カーゴが、ＡＵリッチエレメントを含むＲＮＡであり、シャーシ又は操作されたシャーシが、ＣＤ９－ＨｕＲ融合タンパク質である融合タンパク質を発現するように操作されており、任意選択で、融合タンパク質が、光活性化二量体化タンパク質を更に含み、
カーゴが、アプタマーを含むＲＮＡであり、シャーシ又は操作されたシャーシが、エキソソーム膜タンパク質に融合されたアプタマー結合タンパク質（ＲＮＡ中に存在するアプタマーに結合する）を含む融合タンパク質を発現するように操作されており、任意選択で、エキソソーム膜タンパク質が、Ｌａｍｐ２ｂ、ＶＳＶＧ、ＣＤ６３又は表Ａのタンパク質のうちのいずれかを含むか又はそれらからなる群から選択され、任意選択で、融合タンパク質が、光活性化二量体化タンパク質を更に含む、段落２１１又は２１２に記載の使用のための操作されたシャーシ。
２１５． 治療的カーゴを含むエキソソームの、それを必要とする対象への標的化送達における使用のための、医薬における使用のための、任意選択でがん、自己免疫疾患、遺伝性疾患、心血管疾患及び／又は感染症の治療又は予防における使用のための医薬品の製造における操作されたシャーシの使用であって、
操作されたシャーシが、カーゴ及び／又はシャーシ若しくは操作されたシャーシの操作によってエキソソームに標的化されているカーゴを含む操作されたエフェクターシャーシである、先行の段落のいずれかに記載の操作されたシャーシの使用。
２１６． カーゴが、
ａ）タンパク質又はペプチドであって、いくつかの実施形態では、
ｉ）抗体若しくはその抗原結合フラグメント、例えば腫瘍抗原若しくは新抗原に結合する抗体若しくはその抗原結合フラグメント、
ｉｉ）ヌクレアーゼなどの酵素、例えばＴＡＬＥＮ、
ｉｉｉ）サイトカイン、例えばＩＬ－１０、又は
ｉｖ）ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質、例えばＣａｓ９、
ｖ）二重特異性タンパク質、例えば二重特異性抗体若しくは任意選択でＴ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）である、タンパク又はペプチド、
ｂ）核酸であって、いくつかの実施形態では、
ｉ）例えばｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、及びクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）配列から選択される、ＲＮＡ、又は
ｉｉ）ＤＮＡベクターである、核酸、
ｃ）毒素、
ｄ）小分子薬物、造影剤、放射性ヌクレオチド薬物、放射性ヌクレオチドタグ付抗体、又はそれらの任意のコンジュゲート、
ｅ）ＡＡＶなどのウイルスベクター、
ｆ）腫瘍溶解性ウイルスなどのウイルス、
ｇ）ＣＲＩＳＰＲ媒介遺伝子編集を実行するための薬剤、
あるいはそれらの任意の組み合わせのうちのいずれか１つ以上から選択される、段落２１５に記載の使用。
２１７． シャーシ又は操作されたシャーシが、エキソソーム標的化ドメインを含むカーゴを内因的に発現するように操作されており、
Ａ）カーゴがタンパク質又はペプチドである場合、タンパク質又はペプチドが、
ｉ）カーゴタンパク質又はペプチドと、
ｉｉ）エキソソーム標的化ドメインと、を含む、融合タンパク質であり、任意選択で、エキソソーム標的化ドメインが、
ａ）エキソソーム特異的膜タンパク質又はそのエキソソーム膜標的化部分、任意選択で、
テトラスパニン、例えばＣＤ６３、又は
非テトラスパニン、例えばＰＴＧＦＲＮ若しくはＢＡＳＰ１
ｂ）可溶性タンパク質由来のエキソソーム標的化配列、任意選択でＮｅｄｄ４ユビキチンリガーゼのＷＷドメイン、
ｃ）ユビキチンタグ、及び／又は
ｄ）タグ結合ドメイン、任意選択でタグに対して指向されたナノボディ、任意選択でＧＦＰに対して指向されたナノボディ、及び／又は
ｅ）表Ａに列挙されたタンパク質から選択されるタンパク質を含むか若しくはそれらからなる群から選択され、
Ｂ）カーゴがＲＮＡであり、エキソソーム標的化ドメインが、
ａ）エキソソーム標的化ヘアピン若しくは直鎖状モチーフ、
ｂ）ウイルスエキソソーム標的化ＲＮＡ若しくはそのエキソソーム標的化フラグメント、
ｃ）アプタマー、任意選択で、
ｉ）ＭＳ２結合ステムループ、
ｉｉ）Ｃ／Ｄボックス、及び／若しくは
ｉｉｉ）ＡＵリッチエレメントであり、任意選択で、ＲＮＡが、Ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡであり、
任意選択で、
カーゴが、ＭＳ２結合ステムループを含むＲＮＡであり、シャーシ又は操作されたシャーシがまた、エキソソーム膜タンパク質に融合されたバクテリオファージコートタンパク質ＭＳ２を含む融合タンパク質を発現するように操作され、任意選択で、エキソソーム膜タンパク質が、Ｌａｍｐ２ｂ、ＶＳＶＧ、ＣＤ６３又は表Ａのタンパク質のうちのいずれかを含むか又はそれらからなる群から選択され、任意選択で、融合タンパク質が、光活性化二量体化タンパク質を更に含み、
カーゴが、Ｃ／Ｄボックスを含むＲＮＡであり、シャーシ又は操作されたシャーシがまた、エキソソーム膜タンパク質に融合された古細菌Ｌ７リボソームＬ７Ａｅタンパク質を含む融合タンパク質を発現するように操作され、任意選択で、エキソソーム膜タンパク質が、Ｌａｍｐ２ｂ、ＶＳＶＧ、ＣＤ６３又は表Ａのタンパク質のうちのいずれかを含むか又はそれらからなる群から選択され、任意選択で、融合タンパク質が、光活性化二量体化タンパク質を更に含み、
カーゴが、ＡＵリッチエレメントを含むＲＮＡであり、シャーシ又は操作されたシャーシが、ＣＤ９－ＨｕＲ融合タンパク質である融合タンパク質を発現するように操作されており、任意選択で、融合タンパク質が、光活性化二量体化タンパク質を更に含み、
カーゴが、アプタマーを含むＲＮＡであり、シャーシ又は操作されたシャーシが、エキソソーム膜タンパク質に融合されたアプタマー結合タンパク質（ＲＮＡ中に存在するアプタマーに結合する）を含む融合タンパク質を発現するように操作されており、任意選択で、エキソソーム膜タンパク質が、Ｌａｍｐ２ｂ、ＶＳＶＧ、ＣＤ６３又は表Ａのタンパク質のうちのいずれかを含むか又はそれらからなる群から選択され、任意選択で、融合タンパク質が、光活性化二量体化タンパク質を更に含む、段落２１５又は２１６に記載の使用。
２１８． シャーシ又は操作されたシャーシに、エキソソーム標的化ドメインを含むカーゴを外因的にロードされており、任意選択で、
Ａ）カーゴがタンパク質又はペプチドである場合、タンパク質又はペプチドが、
ｉ）カーゴタンパク質又はペプチドと、
ｉｉ）エキソソーム標的化ドメインと、を含む、融合タンパク質であり、任意選択で、エキソソーム標的化ドメインが、
ａ）エキソソーム特異的膜タンパク質又はそのエキソソーム膜標的化部分、任意選択で、
テトラスパニン、例えばＣＤ６３、又は
非テトラスパニン、例えばＰＴＧＦＲＮ若しくはＢＡＳＰ１
ｂ）可溶性タンパク質由来のエキソソーム標的化配列、任意選択でＮｅｄｄ４ユビキチンリガーゼのＷＷドメイン、
ｃ）ユビキチンタグ、及び／又は
ｄ）タグ結合ドメイン、任意選択でタグに対して指向されたナノボディ、任意選択でＧＦＰに対して指向されたナノボディ、及び／又は
ｅ）表Ａに列挙されたタンパク質から選択されるタンパク質を含むか若しくはそれらからなる群から選択され、
Ｂ）カーゴがＲＮＡであり、エキソソーム標的化ドメインが、
ａ）エキソソーム標的化ヘアピン若しくは直鎖状モチーフ、
ｂ）ウイルスエキソソーム標的化ＲＮＡ若しくはそのエキソソーム標的化フラグメント、
ｃ）アプタマー、任意選択で、
ｉ）ＭＳ２結合ステムループ、
ｉｉ）Ｃ／Ｄボックス、及び／若しくは
ｉｉｉ）ＡＵリッチエレメントであり、任意選択で、ＲＮＡが、Ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡであり、
任意選択で、
カーゴが、ＭＳ２結合ステムループを含むＲＮＡであり、シャーシ又は操作されたシャーシがまた、エキソソーム膜タンパク質に融合されたバクテリオファージコートタンパク質ＭＳ２を含む融合タンパク質を発現するように操作され、任意選択で、エキソソーム膜タンパク質が、Ｌａｍｐ２ｂ、ＶＳＶＧ、ＣＤ６３又は表Ａのタンパク質のうちのいずれかを含むか又はそれらからなる群から選択され、任意選択で、融合タンパク質が、光活性化二量体化タンパク質を更に含み、
カーゴが、Ｃ／Ｄボックスを含むＲＮＡであり、シャーシ又は操作されたシャーシがまた、エキソソーム膜タンパク質に融合された古細菌Ｌ７リボソームＬ７Ａｅタンパク質を含む融合タンパク質を発現するように操作され、任意選択で、エキソソーム膜タンパク質が、Ｌａｍｐ２ｂ、ＶＳＶＧ、ＣＤ６３又は表Ａのタンパク質のうちのいずれかを含むか又はそれらからなる群から選択され、任意選択で、融合タンパク質が、光活性化二量体化タンパク質を更に含み、
カーゴが、ＡＵリッチエレメントを含むＲＮＡであり、シャーシ又は操作されたシャーシが、ＣＤ９－ＨｕＲ融合タンパク質である融合タンパク質を発現するように操作されており、任意選択で、融合タンパク質が、光活性化二量体化タンパク質を更に含み、
カーゴが、アプタマーを含むＲＮＡであり、シャーシ又は操作されたシャーシが、エキソソーム膜タンパク質に融合されたアプタマー結合タンパク質（ＲＮＡ中に存在するアプタマーに結合する）を含む融合タンパク質を発現するように操作されており、任意選択で、エキソソーム膜タンパク質が、Ｌａｍｐ２ｂ、ＶＳＶＧ、ＣＤ６３又は表Ａのタンパク質のうちのいずれかを含むか又はそれらからなる群から選択され、任意選択で、融合タンパク質が、光活性化二量体化タンパク質を更に含む、段落２１５又は２１６に記載の使用。
【図1-1】
【図1-2】
【図1-3】
【図2-1】
【図2-2】
【図3】
【図4-1】
【図4-2】
【図4-3】
【図4-4】
【図4-5】
【図4-6】
【図4-7】
【図4-8】
【図5-1】
【図5-2】
【図6】
【図7】
【図8-1】
【図8-2】
【図8-3】
【図8-4】
【図8-5】
【図9-1】
【図9-2】
【図10】
【図11】
【図12-1】
【図12-2】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17-1】
【図17-2】
【図17-3】
【図17-4】
【図17-5】
【図17-6】
【図18】
【図19】
【図20-1】
【図20-2】
【図21】
【図22】
【図23-1】
【図23-2】
【図24】
【図25】
【配列表】
【国際調査報告】