特表 2024-525215 単離膵島を保存するための培地及び単離膵島の保存方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-07-10

(54)【発明の名称】単離膵島を保存するための培地及び単離膵島の保存方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/071 20100101AFI20240703BHJP

【ＦＩ】

C12N5/071

【審査請求】有

【予備審査請求】有

(21)【出願番号】P 2023579439

(86)(22)【出願日】2021-06-30

(85)【翻訳文提出日】2023-12-21

(86)【国際出願番号】 PL2021050051

(87)【国際公開番号】W WO2023277715

(87)【国際公開日】2023-01-05

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】523480934

【氏名又は名称】ポルビオニカ スポルカ ジー オグラニクゾナ オドパウイエドジアルノシア

(74)【代理人】

【識別番号】100163991

【弁理士】

【氏名又は名称】加藤 慎司

(72)【発明者】

【氏名】ウツォラ，ミヒャル

(72)【発明者】

【氏名】クラック，マルタ

(72)【発明者】

【氏名】バーマン，アンドレフ

(72)【発明者】

【氏名】ブリニアルスキー，トマス

(72)【発明者】

【氏名】コソヴスカ，カタルツィーナ

【テーマコード（参考）】

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065BB18

4B065BB19

(57)【要約】

本発明は、単離された膵島を保存するための培地、及び、単離された膵島を保存するための方法に関する。このような培地は、生理学的温度及び冷蔵の両方で膵島を保存するのに適している。
【選択図】図９

【特許請求の範囲】

【請求項1】

単離膵島を保存するための培地であって、市販培地ＣＭＲＬ１０６６又はＲＰＭＩをベースとしており、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質の添加物を含んでいることを特徴とする、培地。

【請求項2】

前記ベースが前記市販培地ＣＭＲＬ１０６６である、請求項１に記載の培地。

【請求項3】

前記ＥＣＭタンパク質の添加剤が、以下のタンパク質を培地１Ｌ当たり適量の重量で含んでいる、請求項１又は２に記載の培地。
－培地の６７～１００ｍｇ／Ｌ、好ましくは培地の８４．３ｍｇ／Ｌの量のラミニン
－培地の５～８ｍｇ／Ｌ、好ましくは培地の６．７ｍｇ／Ｌの量のヒアルロン酸
－培地の３２～４８ｍｇ／Ｌ、好ましくは培地の４０．７ｍｇ／Ｌの量のコラーゲンＩ
－培地の１００～１４５ｍｇ／Ｌ、好ましくは培地の１２２．３ｍｇ／Ｌの量のコラーゲンＩＶ

【請求項4】

前記ＥＣＭタンパク質の添加剤が、以下のタンパク質を培地の体積に対して適切な体積％で含んでおり、
－ラミニン：培地の６．７４～１０．１２体積％、好ましくは８．４３体積％、
－ヒアルロン酸：培地の０．１０～０．１６体積％、好ましくは０．１３体積％、
－コラーゲンＩ：培地の３．２６～４．８８体積％、好ましくは４．０７体積％；及び
－コラーゲンＩＶ：培地の９．７８～１４．６７体積％、好ましくは１２．２３体積％、
ここで、濃度１ｍｇ／ｍＬのラミニン、濃度５ｍｇ／ｍＬのヒアルロン酸、濃度１ｍｇ／ｍＬのコラーゲンＩ、及び濃度１ｍｇ／ｍＬのコラーゲンＩＶが培地に添加される、請求項３に記載の培地。

【請求項5】

前記ヒアルロン酸は、高分子ヒアルロン酸又は低分子ヒアルロン酸であってもよい、請求項３又は４に記載の培地。

【請求項6】

前記ＥＣＭタンパク質の添加物として、界面活性剤を含まない、好ましくは動物由来のｄＥＣＭ溶液が使用されている、請求項１又は２に記載の培地。

【請求項7】

前記ＥＣＭタンパク質の添加剤を、１～２．５体積％、好ましくは１％含有している、請求項６に記載の培地。

【請求項8】

前記培地が、凍結防止剤及び／又は抗生物質及び／又は殺菌剤及び／又はグルコース及び／又は血清及び／又はアミノ酸を更に含んでいる、請求項１乃至７の何れか１項に記載の培地。

【請求項9】

好ましくはベース培地５００ｍＬ当たり５ｍＬの量のＬ－グルタミン、好ましくはベース培地５００ｍＬ当たり５ｍＬの量の１００Ｘペニシリン－ストレプトマイシン、好ましくはベース培地５００ｍＬ当たり５ｍＬの量のアムホテリシンＢ、好ましくはベース培地５００ｍＬ当たり２８０ｍＭグルコース溶液１０ｍＬに相当する量のグルコース、及び、好ましくはベース培地５００ｍＬ当たり５０ｍＬの量のＦＢＳを含んでいる、請求項８に記載の培地。

【請求項10】

請求項１乃至９の何れか１項に記載の培地中で、４～３７℃、好ましくは４℃の温度で、単離膵島を保存することを特徴とする、単離膵島の保存方法。

【請求項11】

膵島を培地中に配置する前に、膵島が処理されているか、又は、未処理のままにされていることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

前記培地の成分を構成するｄＥＣＭ溶液の形態のＥＣＭタンパク質の添加剤が、特許出願ＥＰ１９２１８１９１に記載の方法によって得られることを特徴とする、請求項１０又は１１に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、単離された膵島を保存するための補充培地、及び、単離された膵島を保存するための方法に関する。このような培地は、生理学的温度及び冷蔵の両方で膵島を保存するのに適している。

【背景技術】

【0002】

単離された細胞、組織、及び器官を保存するための多くの培地が当技術分野で知られている。このような培地には、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）及びタンパク質添加剤などの様々な成分が含まれている。

【0003】

文献ＫＲ１０２０１７００１１６７６Ａは、脱細胞化生体組織（ＥＣＭ）由来の濃縮物を使用して幹細胞を肝細胞に分化させる方法を開示しており、ＥＣＭは、哺乳動物の肝臓、心臓、腎臓、胃、小腸、結腸、脾臓、膀胱、肺、又は肌に由来していてもよい。著者らは、ＥＣＭは、ｉｎ ｖｉｖｏ細胞特有の微小環境を模倣しており、特定の組織から天然の細胞外マトリックスを取得して使用することで最適な増殖環境を提供できると指摘している。彼らはまた、コラーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、又はマトリゲルの単一タンパク質を組み合わせて使用しても、そのような結果が得られないことにも注目している。実施形態では、肝臓由来ＥＣＭ（ＬＥＣＭ）が、２、５、１０、及び２０％で培地に添加されている。

【0004】

文献ＷＯ２０１９１８５０１７Ａは、Ｌ－グルタミン及びｐＨ調節剤を補充した基本培地に基づく肝細胞及びオルガノイドを培養するための培地に関する。肝細胞の生存を改善するために、肝細胞をＥＣＭと接触させるが、ＥＣＭは天然由来であっても市販由来のもの（例えば、Ｍａｔｒｉｘｇｅｌ ＴＭ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）であってもよい。

【0005】

次に、文献ＢＲ１１２０１３００２２４９Ａ２は、上皮成長因子（ＥＧＦ）、Ｗｎｔアゴニスト、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、及びニコチンアミドを補充した基本培地中でＥＣＭ（マトリゲル）と接触させた肝臓断片由来の幹細胞の培養に関する。

【0006】

別の文献であるＵＳ２００８０２４１９１９Ａ１は、ラミニン、フィブロネクチン、コラーゲン、及びゼラチンを含み得るＥＣＭを含有する培地を含む細胞培養用の容器を含んだ胚性幹細胞を培養するためのシステムを記載している。ＥＣＭ成分も溶液中に存在する可能性がある。培地には、ｂＦＧＦ、インスリン、及びアスコルビン酸も含まれている。

【0007】

文献ＵＳ２００３００２６７８８Ａ１には、培養細胞の独特の特性を保存するために組織ドナーから採取されたＥＣＭを含む細胞外マトリックス（ＥＣＭ）片の使用が記載されている。

【0008】

文献ＡＵ２００２３１４６２１Ａ１は、ラミニン及び／又はＩＶ型コラーゲンであり得るＥＣＭ成分を含有する培地中で、血管組織を有する器官から単離された細胞クラスター（ランゲルハンス島）を培養するための方法に関する。

【0009】

文献ＵＳ５９８５５３９Ａは、ＥＣＭ成分（コラーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、プロテオグリカン又はグリコサミノグリカン）を含む細胞培養培地溶液を血管系を通して臓器に灌流することを含む、動物臓器を再構築する方法に関する。例としては、０．２５％のＩ型コラーゲンの使用が挙げられる。

【0010】

文献ＥＰ０７０３９７８Ａ１には、細胞、特に造血細胞及び骨髄間質細胞の短期及び長期の増殖及び成長のための無血清又は血清除去培地が記載されている。この培地は、Ｉｓｃｏｖｅの改変ダルベッコ培地などの標準的な培地に基づいている。コラーゲン（好ましくはＩ型及びＩＶ型）、フィブロネクチン、及びラミニンなどの細胞外マトリックスの成分は、表面への細胞接着に使用される。

【0011】

文献ＵＳ２００８０２４８５７０Ａ１は、他の細胞外マトリックス成分（例えば、コラーゲンＩ、ＩＩＩ及びＩＶ、塩基性接着分子、プロテオグリカン又はそれらのグリコサミノグリカン）の有無、並びに、ホルモン及び／又は成長因子の有無にかかわらず、ヒアルロン酸上又はヒアルロン酸中でｅｘ ｖｉｖｏで肝臓前駆体を含む肝臓細胞を増殖させる方法を開示している。ＥＣＭを含む組成物も開示されている。実施例は、１％ヒアルロン酸ゲルの使用を開示している。

【0012】

文献ＵＳ２０１１０１５０８２３Ａ１は、０．０１～１００：１の重量比でコラーゲンとヒアルロン酸とを含むゲル、及び、幹細胞を培養するためのその使用を開示している。その実施形態では、細胞を、２０％ウシ胎児血清及び２００Ｕ／ｍＬゲンタマイシンを添加した低グルコースＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に１０^５～１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度で再懸濁させ、種々の量のヒアルロン酸と混合して懸濁液を形成している。コラーゲンはブタの真皮から得られ、０．０１Ｎ ＨＣｌに溶解されて、ｐＨ４～７のコラーゲン溶液が生成された。コラーゲン溶液を、同じ容量の幹細胞を含む懸濁液と混合して、６ｍｇ／ｍＬのコラーゲンと０．０５ｍｇ／ｍＬ、０．２ｍｇ／ｍＬ若しくは０．５ｍｇ／ｍＬのヒアルロン酸、又は９ｍｇ／ｍＬのコラーゲンと０．２ｍｇ／ｍＬのヒアルロン酸とを含む混合物が形成された。

【0013】

文献ＵＳ２００７０１５５００９Ａ１には、（ａ）単離された肝臓前駆細胞を提供すること、及び、（ｂ）肝臓からの細胞外マトリックス成分の層上で単離された肝臓由来前駆細胞を培養することを含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの肝臓前駆細胞の増殖方法が記載されている。細胞外マトリックス成分は、ＩＩＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、ラミニン、ヒアルロナン、又はそれらの組み合わせからなる群から選択され得る。

【0014】

文献ＷＯ２０１３１１６４４６Ａ１は、コラーゲン又はコラーゲン－ラミニン懸濁液における平滑筋培養物に関する。

【0015】

文献ＣＮ１８１６２７９Ｂは、液体栄養基剤を含有する、臓器、生物組織、又は生細胞を保存するための培地に関するものであり、高分子量ヒアルロン酸及び塩化ナトリウムを含み、動物由来の成分を含まないことを特徴としている。培地は、８０～４０００ｍｇ／ｌ、好ましくは１００～２００ｍｇ／ｌ、好ましくは１００～１６０ｍｇ／ｌの高分子量ヒアルロン酸を含有している。培地は、ＣＭＲＬ１０６６培地に基づいていてもよい。

【0016】

文献ＷＯ２００７００９９８１Ａ１には、例えば５０ｍｇ／Ｌのヒアルロン酸を補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に基づいた組織培養培地が記載されている。

【0017】

文献ＣＮ１１２６０８８９９Ａは、球状腫瘍組織培養における血清培地の使用に関する。１．３ｍｇ／Ｌコラーゲンを含むＦ－１２培地をベースとしたコラーゲンゲルも培養に使用されている。

【0018】

文献ＪＰ１９９３１８４３５６Ａは、無脊椎動物の神経組織を培養するための培地及び方法を開示している。ターゲット培地は、（Ａ）Ｌ－１５培地、（Ｂ）不活化血清、（Ｃ）グルコース、及び（Ｄ）抗生物質を含むコラーゲンゲルから構成されている。好ましくは、成分Ｂの量は培地に対して１０～２０重量％であり、成分Ｃの量は好ましくは１０～２０ｍｇ／ｍＬである。培地中のコラーゲン含有量は、０．１～０．３重量％が好ましい。

【0019】

文献ＵＳ７５５０２９４Ｂ２は、ＣＭＲＬ１０６６に基づく培地中で細胞、組織、及び器官をｉｎ ｖｉｖｏで培養する方法を開示しており、一方、文献ＪＰ１９８８１４６７８５Ａは、Ｌ－カルニチンを補充した培地（例えばＣＭＲＬ１０６６）中での動物細胞の培養を記載している。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0020】

本発明の目的は、単離された膵島を、生理学的温度及び冷蔵の両方で、分泌特性を損なうことなく保存できる培地を開発することである。これは、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）又はその単離タンパク質を適切な割合で市販の培地に添加することによって達成された。

【発明を実施するための形態】

【0021】

本発明による、単離膵島を保存するための培地は、市販培地ＣＭＲＬ１０６６又はＲＰＭＩをベースとしており、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質の添加物を含んでいる。

【0022】

好ましくは、ベースは、市販培地ＣＭＲＬ１０６６である。

【0023】

好ましくは、前記ＥＣＭタンパク質の添加剤が、以下のタンパク質を培地１Ｌ当たり適量の重量で含んでいる：
－培地の６７～１００ｍｇ／Ｌ、好ましくは培地の８４．３ｍｇ／Ｌの量のラミニン
－培地の５～８ｍｇ／Ｌ、好ましくは培地の６．７ｍｇ／Ｌの量のヒアルロン酸
－培地の３２～４８ｍｇ／Ｌ、好ましくは培地の４０．７ｍｇ／Ｌの量のコラーゲンＩ
－培地の１００～１４５ｍｇ／Ｌ、好ましくは培地の１２２．３ｍｇ／Ｌの量のコラーゲンＩＶ

【0024】

好ましくは、前記ＥＣＭタンパク質の添加剤は、以下のタンパク質を培地の体積に対して適切な体積％で含んでいる：
－ラミニン：培地の９．７８～１４．６７体積％、好ましくは１２．２３体積％、
－ヒアルロン酸：培地の０．１０～０．１６体積％、好ましくは０．１３体積％、
－コラーゲンＩ：培地の３．２６～４．８８体積％、好ましくは４．０７体積％；及び
－コラーゲンＩＶ：培地の９．７８～１４．６７体積％、好ましくは１２．２３体積％、
ここで、開始濃度１ｍｇ／ｍＬのラミニン、濃度５ｍｇ／ｍＬのヒアルロン酸、濃度１ｍｇ／ｍＬのコラーゲンＩ、及び濃度１ｍｇ／ｍＬのコラーゲンＩＶが培地に添加される。

【0025】

好ましくは、前記ヒアルロン酸は、高分子ヒアルロン酸又は低分子ヒアルロン酸であってもよい。

【0026】

好ましくは、前記ＥＣＭタンパク質の添加物として、界面活性剤を含まない、好ましくは動物由来のｄＥＣＭ溶液が使用されている。

【0027】

好ましくは、培地は、１体積％～２．５体積％、好ましくは１％のＥＣＭタンパク質の添加物を含んでいる。

【0028】

好ましくは、前記培地は、凍結防止剤及び／又は抗生物質及び／又は殺菌剤及び／又はグルコース及び／又は血清及び／又はアミノ酸を更に含んでいる。

【0029】

好ましくは、培地は、ベース培地５００ｍＬ当たり５ｍＬの量のＬ－グルタミン、好ましくはベース培地５００ｍＬ当たり５ｍＬの量の１００Ｘペニシリン－ストレプトマイシン、好ましくはベース培地５００ｍＬ当たり５ｍＬの量のアムホテリシンＢ、好ましくはベース培地５００ｍＬ当たり２８０ｍＭグルコース溶液１０ｍＬに相当する量のグルコース、及び、好ましくはベース培地５００ｍＬ当たり５０ｍＬの量のＦＢＳを含んでいる。

【0030】

本発明による単離膵島の保存方法は、本発明による培地中で、４～３７℃、好ましくは４℃の温度で、単離膵島を保存することを特徴としている。

【0031】

好ましくは、膵島を培地中に配置する前に、膵島が処理されているか、又は、未処理のままとされている。

【0032】

好ましくは、前記培地の成分を構成するｄＥＣＭ溶液の形態のＥＣＭタンパク質の添加剤は、特許出願ＥＰ１９２１８１９１に記載の方法によって得られる。

【図面の簡単な説明】

【0033】

本実施形態における本発明の目的は、下記の図面に示されている。

【0034】

図１～３は、４℃及び３７℃の温度で２４時間膵島をインキュベートした後の未処理膵島及び処理膵島の機能性を示すグラフであり、培地には、１及び２．５％の界面活性剤を含まないＥＣＭが富化されたＣＭＲＬ１０６６培地が含まれ、対照サンプルはＣＭＲＬ１０６６培地中でインキュベートした。

【0035】

図４～６は、４℃及び３７℃の温度で４８時間膵島をインキュベートした後の未処理膵島及び処理膵島の機能性を示すグラフであり、培地には、１及び２．５％の界面活性剤を含まないＥＣＭが富化されたＣＭＲＬ１０６６培地が含まれ、対照サンプルはＣＭＲＬ１０６６培地中でインキュベートした。

【0036】

図７は、４℃及び３７℃の温度で７２時間膵島をインキュベートした後の未処理膵島及び処理膵島の機能性を示すグラフであり、培地には、１及び２．５％の界面活性剤を含まないＥＣＭが富化されたＣＭＲＬ１０６６培地が含まれ、対照サンプルはＣＭＲＬ１０６６培地中でインキュベートした。

【0037】

図８は、４℃及び３７℃の温度で９６時間膵島をインキュベートした後の未処理膵島の機能性を示すグラフであり、培地には、１及び２．５％の界面活性剤を含まないＥＣＭが富化されたＣＭＲＬ１０６６培地が含まれている。

【0038】

図９は、４℃の温度で１２０時間膵島をインキュベートした後の未処理膵島の機能性を示すグラフであり、培地には、１及び２．５％の界面活性剤を含まないＥＣＭが富化されたＣＭＲＬ１０６６培地が含まれ、Ｂ２－ＥＣＭ１％、未処理、４℃であり、Ｅ１－未処理の対照、４℃であり、Ｅ２－ＥＣＭ２．５％、未処理、４℃である。

【0039】

図１０は、４℃の温度で７２時間膵島をインキュベートした後の未処理膵島の機能性を示すグラフであり、培地には、市販の添加材であるラミニン、ヒアルロン酸、コラーゲンＩ及びＩＶが富化されたＣＭＲＬ１０６６培地が含まれている。

【0040】

図の下軸は１５分ごとの時点を表している。１－低グルコース対照点；２、３－低グルコースでの１５分及び３０分後の測定、４－高グルコース対照での測定、５～８－高グルコースでの１５、３０、４５及び６０分における測定、９－低グルコース対照点；１０～１３－低グルコースでの１５、３０、４５、及び６０分における測定。

【0041】

本発明による培地は、単離された膵島を保存するために使用される。前記培地は、生理学的温度条件下、即ち３７℃、及び、冷蔵状態、即ち標準的な冷蔵保存温度、即ち４℃の両方で膵島を保存するのに適している。

【0042】

Ｌｌａｃｕａらが発表した文献データ（Ｃｏｌｌａｇｅｎ ｔｙｐｅ ＶＩ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｈｕｍａｎ ｉｓｌｅｔ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏｉｓｏｌａｔｉｎｇ ｍｉｃｒｏｃａｐｓｕｌｅｓ ｆｏｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｄｉａｂｅｔｅｓ． ＩＳＬＥＴＳ （２０１８）， ｖｏｌ． １０， ｎｏ． ２， ６０－６８）によれば、膵島を単離する際に、膵島を取り囲んで内分泌細胞同士を連結するＥＣＭ粒子が、コラゲナーゼを添加する結果として損傷する。これは、膵島の構成成分であるラミニン並びにコラーゲンＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、及びＶＩ型の両方に悪影響を及ぼし、最終的にはＥＣＭ構造全体に損傷を与える。外部から供給されるＥＣＭ又はＥＣＭ成分を培地に補充すると、生存率が向上し、膵島の機能が維持される。生化学組成、繊維構造、粘弾性特性などの培地によって提供される条件が標的臓器の条件に近いため、細胞は増殖することができる。

【0043】

本発明の目的において、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質は、好ましくは動物起源（例えば、豚、牛、羊などに由来する）のＥＣＭ、好ましくは脱細胞化／無細胞（ｄＥＣＭ）ＥＣＭ、好ましくは欧州特許出願ＥＰ１９２１８１９１に記載された方法を用いて得られるＥＣＭ、又は、市販のＥＣＭタンパク質、即ち、ラミニン、ヒアルロン酸、コラーゲンＩ、及びコラーゲンＩＶの適切な比率の混合物である、ＥＣＭを定義している。

【0044】

好ましい実施形態において、培地中のＥＣＭの各タンパク質成分は以下の通りである：
－ラミニン：培地の８．４３体積％、
－ヒアルロン酸：培地の０．１３体積％、
－コラーゲンＩ：培地の４．０７体積％、
－コラーゲンＩＶ：培地の１２．２３体積％、

【0045】

ここで、開始濃度１ｍｇ／ｍＬのラミニン、濃度５ｍｇ／ｍＬのヒアルロン酸、濃度１ｍｇ／ｍＬのコラーゲンＩ、及び濃度１ｍｇ／ｍＬのコラーゲンＩＶが培地に添加される。

【0046】

本発明による混合物に使用されるヒアルロン酸は、高分子量の酸であってもよく、低分子量の酸であってもよい。

【0047】

培地はまた、凍結保護剤、抗生物質、殺菌剤、グルコース、血清（ＦＢＳ）、当該技術分野で通常使用される濃度で添加されたアミノ酸などの他の任意の成分を含んでいてもよく、例えば、培地は、ＦＢＳ、Ｄ－グルコース、抗生物質（ペニシリン，ストレプトマイシン，アムホテリシンＢ，セファロスポリン）の混合物、及びＬ－グルタミンを含んでいてもよい。

【0048】

本発明による培地は、上記各成分を適当な割合で混合することにより得られる。混合は、ディップスティックを使用して手動で行うことも、マグネチックスターラーなどの適切なスターラーを使用して自動的に行うこともできる。好ましくは、選択された方法に関係なく、混合は無菌条件下で行われる。

【0049】

本発明において、上記及び下記で使用される「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」という語は、本発明による組成物の調製プロセスの過程、例えば成分を測定する過程で生じる可能性のある不正確さを反映して、表示値から＋／－５％の偏差として理解されるべきである。

【0050】

実施形態

【0051】

以下の実施形態を実行すべく、試験材料を得るために、多数の手順が実施された。これらの手順は、各実施形態に共通であるため、例自体を説明する前に説明する。
１） 素材の準備（ｈａｒｖｅｓｔｉｎｇ）

【0052】

膵臓は、繁殖豚から採取した。膵臓採取の第一段階では、十二指腸口付近の膵管を切開し、そこに氷冷保存液ＵＷ２０ｍＬを逆行的に注入した。洗浄後、膵臓をハサミを使用して周囲の組織から分離し、５００ｍＬの氷冷ＵＷ保存液を入れた滅菌バッグに入れ、砕いた氷の入った容器に入れて隔離実験室に移した。全平均温虚血時間は１０分であった。

【0053】

２）膵島の分離

【0054】

膵島の分離は、臓器が分離ラボに届けられた直後に開始された。最初の行程では、膵臓に３ステップの除染プロセスが行われた。臓器を除染するために、膵臓を１×ＰＢＳ中の５％ベタジンの氷冷溶液に５分間浸漬した。次いで、膵臓を冷抗生物質溶液（ペニシリン／ストレプトマイシン－１ｘＰＢＳ中１０，０００Ｕ／１０，０００Ｕ）で２回洗浄した。次の行程では、残りの血管、リンパ節、脂肪組織を除去することにより、臓器を機械的に洗浄した。洗浄プロセスは、低温条件下で実行された。次いで、臓器の重量を測定した後、コラゲナーゼＮＢ８（２．７３ｍｇ／ｇ膵臓）及び中性プロテアーゼ（１００ＤＭＣ‐Ｕ）の氷冷溶液を用いて、膵管に近位に挿入したカテーテルを介して注入した（１５０ｍＬのリンゲル液、ｐＨ７．２～７．４、１８ｍＭのＨＥＰＥＳ、７ｍＭのＣａＣｌ_２及び０．０５％のＮａＨＣＯ_３）。液体は、Ｗｉｒｓｕｎｇチューブを通して約５ｍＬ／分の速度で投与した。膵臓の重量を量り、機械的に断片化し、Ｒｉｃｏｒｄｉチャンバに入れた。次いで、システムに１リットルのプライミング溶液（ｐＨ７．２～７．４のリンゲル液中、１．２５％ニコチンアミド、０．５％グルコース、０．０２５％ＮａＨＣＯ_３、３７℃に加熱、１４ｍＭＨＥＰＥＳ、５ｍＭピルビン酸ナトリウム、及び４４Ｕ／４４Ｕペニシリン／ストレプトマイシン）を充填した。ビーズを入れたＲｉｃｏｒｄｉチャンバを振盪することにより、膵臓の消化を機械的に補助した。消化の進行は，３０～６０秒ごとにシステムから作動液のサンプルを採取し、それらを０．１％ジチゾンで染色し、顕微鏡下で膵島を定量することによりモニターした。大量の膵島が視野に現れた場合、消化は、システムに約２００ｍＬのＦＢＳを添加し、冷却器を氷の中に置くことによってクエンチされた（恣意的評価；平均消化時間は１９分４０秒であった－グループ間に統計的差異は認められなかった）。その後、プライミング溶液を５ｌ希釈溶液（ｐＨ７．２～７．４のリンゲル液中、１．２％ニコチンアミド、０．０５％グルコース、０．０２５５％ＮａＨＣＯ_３、１４ｍＭのＨＥＰＥＳ、及び４．３ｍＭのピルビン酸ナトリウム）に置き換えた。得られた濾液を、あらかじめ４℃に冷却しておいた５ｍＬのＦＢＳを満たした１５０ｍＬコーニングチューブに集めた。次に、膵島を含む濾液を遠心分離した：７５０ｘｇ、２分、４℃。上清を除去し、膵島及び消化された外分泌組織を含むペレットを１００ｍＬのＳｔｏｒｅ Ｐｒｏｔｅｃｔ溶液（ＵＷ溶液）に懸濁した。単離された膵島相当量を計数するために、１００μｌの膵島懸濁液サンプルを収集し、２～３滴の０．１％ジチゾンを加えた。

【0055】

膵島は標準化された方法で計数され、得られた結果はＩＥＱ数に変換された。

【0056】

３）単離された膵島の任意選択的な精製

【0057】

膵島を精製するために、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅを試薬として使用して、単離された膵島から外分泌組織を除去した。
－膵島ペレットを１０ｍＬのＨｉｓｔｏｐａｑｕｅに懸濁し、ペレットを穏やかに砕き、続いて別の５ｍＬのＨｉｓｔｏｐａｑｕｅを懸濁ペレットに添加した；すべての試薬は室温であった。
－１５ｍＬのＨＢＳＳ（ＦＢＳを含まない）をＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ内の膵島の層に滴下した。
－これを勾配精製し、２１００ｒｐｍで２４分間遠心分離した。
－遠心分離後、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ層全体をペレットから収集した（約１５ｍＬ）。
－収集した層を５０ｍＬのＦａｌｃｏｎチューブに移し、５０ｍＬＨＢＳＳ＋１０％ＦＢＳで満たした。
－これを１０００ｒｐｍで２分間遠心分離した。
－上清を除去して最終容量を３０ｍＬとし、新鮮なＨＢＳＳ＋１０％ＦＢＳを最大５０ｍＬまで充填した。
－これを１０００ｒｐｍで２分間遠心分離した。
－上清を除去して最終容量２０ｍＬを残し、新鮮なＨＢＳＳ＋１０％ＦＢＳで最大５０ｍＬまで満たした。
－これを１０００ｒｐｍで２分間遠心分離した。
－上清を除去して最終体積１０ｍＬを残し、新鮮なＨＢＳＳ＋１０％ＦＢＳを最大５０ｍＬまで充填した。
－これを１０００ｒｐｍで２分間遠心分離した。
－上清を除去して最終容量５ｍＬを残した。
－この体積では、膵島が懸濁されていた。
－得られた膵島を重量で数えた。
－膵島のみを１０ｍＬのＦａｌｃｏｎチューブに収集した。
－これを１０００ｒｐｍで２分間遠心分離した。

【0058】

或いは、ＣＯＢＥデバイスを使用して膵島を扱うこともできる。これには、勾配精製（Ｉｓｌｅｔ勾配１．１０８及び１．０６９又は別の勾配溶液を使用）も含まれる。

【0059】

テスト用サンプルの準備

【0060】

種々の保存条件における試料の熱安定性を試験するために、適切な培地を調製し、試料当たり３０００個のｉＥＱ膵島を３ｍＬの培地中に懸濁させた。サンプルを試験温度で１２０時間インキュベートし、２４時間ごとにサンプリングを実行し、島の機能を評価するためにＧＳＩＳテストを実行した。

【0061】

全ての実施形態において、３ｍＬの市販のＣＲＬ１０６６塩基培地（重炭酸ナトリウムを含まないＬ－グルタミンを含むＣＭＲＬ１０６６、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｉｎｃ． ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍ／ｄｅｅｐｗｅｂ／ａｓｓｅｔｓ／ｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ／ｐｒｏｄｕｃｔ／ｄｏｃｕｍｅｎｔｓ／２５４／３ ０８／ｃ０４２２ｄａｔ．ｐｄｆ）を使用した。

【0062】

何れの場合も、試験サンプル及び対照サンプルの両方について、使用前にＣＭＲＬ１０６６培地に追加成分（培地５００ｍＬあたり）を補充した：
・Ｌ－グルタミン－５ｍＬ
・１００Ｘペニシリン／ストレプトマイシン－５ｍＬ
・アムホテリシンＢ－５ｍＬ
・グルコース２８０ｍＭ－１０ｍＬ
・ＦＢＳ－５０ｍＬ

【0063】

４）膵島機能の評価

【0064】

膵島の機能は、グルコース刺激インスリン分泌（ＧＳＩＳ）を使用して評価した。２．５及び１６．７ｍＭグルコースの溶液を、滅菌Ｋｒｅｂｓ緩衝液（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、１１５ｍＭのＮａＣｌ、２４ｍＭのＮａＨＣＯ_３、５ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｂｘ６Ｈ_２Ｏ、０．１％ＢＳＡ、２．５ｍＭのＣａＣｌ_２ｘ２Ｈ_２Ｏ）中でグルコースを希釈することによって調製し、０．２２μｍフィルタを通して濾過した。溶液は事前に３７℃に加熱されており、両方の溶液からサンプルは収集されなかった。３０００ＩＥＱを各インサートに配置し、２．５ｍＭグルコース溶液に浸した。３０分後、インサートをティッシュペーパ上で乾燥させ、１６．７ｍＭのグルコース溶液中に６０分間置き、乾燥させ、更に６０分間２．５ｍＭのグルコース溶液中に置いた。

【0065】

それぞれ１００μＬのサンプルを１５分ごとに収集した。試験全体を通じて、プレートは、細胞培養インキュベータ内で３７℃において保管され、ＧＳＩＳテスト中に収集されたすべてのサンプルは、ＥＬＩＳＡテストを実行する前に－８０℃で凍結された。ＥＬＩＳＡ検査は、インスリンＥＬＩＳＡキットを使用して実行された。

【0066】

実施例１－膵島を、ｄＥＣＭ溶液の形態のＥＣＭ調製物を含有する培地中で４℃及び３７℃で保存する。

【0067】

以下の成分を混合することにより、それぞれＥＣＭ調製物の濃度が１％及び２．５％の培地が得られた。

【表1】

【0068】

実験を行うために、各培地３ｍＬを処理済み及び未処理の膵島と混合し、１２０時間インキュベートした。実験結果を図１～５に示す。対照サンプルは、添加剤を含まないＣＭＲＬ１０６６培地であった。

【0069】

ＥＣＭの追加は、膵島の機能に大きな影響を与えた。同様の効果は、保存温度を下げ、単離直後の未処理の島を使用した場合にも観察された。

【0070】

得られたグラフは、膵島の機能が、３７℃で２４時間保存した場合、４℃で保存した場合よりも２倍以上低下したことを明確に示している。また、膵島の機能性は、未処理の場合に優れていたことも観察できる（４℃で２４時間保存した後、未処理の膵島の活性は、処理した膵島の活性よりも１００単位近く高かった）。

【0071】

また、ＥＣＭの添加が膵島機能に大きな影響を与えたことにも注目すべきである。２．５％ＥＣＭで得られた結果は、対照サンプルの結果より１５％高くなったが、１％ＥＣＭ調製物で得られた結果よりは低くなった。したがって、膵島を貯蔵するための最適条件は次の通りである：ＣＭＲＬ１０６６市販培地中のＥＣＭ調製物含量１％、温度４℃、未処理の膵島。

【0072】

実施例２－ＥＣＭタンパク質混合物の形態のＥＣＭ調製物を含有する培地中で膵島を４℃で保存する。

【0073】

ＥＣＭタンパク質成分の混合物を含む培地は、以下の成分を混合することによって得られた：

【表2】

【0074】

実験を行うために、３ｍＬの培地を未処理の膵島と混合し、それぞれ４℃で７２時間インキュベートした。実験結果を図６に示す。対照サンプルは、添加剤を含まないＣＭＲＬ１０６６培地であった。

【0075】

７２時間のインキュベーション後、本発明による培地に保存された膵島機能の増加が、対照サンプルと比較して観察された。

【0076】

高分子量ヒアルロン酸と低分子量ヒアルロン酸との間に差はなかった（図１０は平均的な結果を示している）。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【国際調査報告】