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特表2024-525221アルツハイマー病を治療するためのＳＯＲＬＡミニ受容体
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-07-10
(54)【発明の名称】アルツハイマー病を治療するためのＳＯＲＬＡミニ受容体
(51)【国際特許分類】
C12N 15/12 20060101AFI20240703BHJP
C07K 14/705 20060101ALI20240703BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20240703BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20240703BHJP
C12N 15/85 20060101ALI20240703BHJP
C12N 15/86 20060101ALI20240703BHJP
C12N 15/864 20060101ALI20240703BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240703BHJP
C12N 5/079 20100101ALI20240703BHJP
A61P 25/28 20060101ALI20240703BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240703BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20240703BHJP
A61K 38/16 20060101ALI20240703BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20240703BHJP
A61K 35/12 20150101ALI20240703BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20240703BHJP
【ＦＩ】
C12N15/12 ZNA
C07K14/705
C07K19/00
C12N15/62 Z
C12N15/85 Z
C12N15/86 Z
C12N15/864 100Z
C12N5/10
C12N5/079
A61P25/28
A61P43/00 105
A61K48/00
A61K38/16
A61K35/76
A61K35/12
A61K31/7088
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023579846
(86)(22)【出願日】2022-07-01
(85)【翻訳文提出日】2023-12-26
(86)【国際出願番号】 EP2022068235
(87)【国際公開番号】W WO2023275350
(87)【国際公開日】2023-01-05
(31)【優先権主張番号】21183382.7
(32)【優先日】2021-07-02
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
２．ＴＷＥＥＮ
３．ＮＯＮＩＤＥＴ
(71)【出願人】
【識別番号】509168656
【氏名又は名称】オーフス ウニベルシテット
(74)【代理人】
【識別番号】100114775
【弁理士】
【氏名又は名称】高岡 亮一
(74)【代理人】
【識別番号】100121511
【弁理士】
【氏名又は名称】小田 直
(74)【代理人】
【識別番号】100202751
【弁理士】
【氏名又は名称】岩堀 明代
(74)【代理人】
【識別番号】100208580
【弁理士】
【氏名又は名称】三好 玲奈
(74)【代理人】
【識別番号】100191086
【弁理士】
【氏名又は名称】高橋 香元
(72)【発明者】
【氏名】アンデルセン，オラフ ミカエル
(72)【発明者】
【氏名】ジゼル ジェンセン，アンヌ メッテ
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
4C086
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA93X
4B065AA93Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA44
4C084AA02
4C084AA07
4C084AA13
4C084BA01
4C084BA02
4C084BA08
4C084BA22
4C084CA53
4C084NA14
4C084ZA161
4C084ZA162
4C084ZB211
4C084ZB212
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZA16
4C086ZB21
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB65
4C087BC83
4C087NA13
4C087ZA16
4C087ZB21
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045CA40
4H045DA50
4H045EA21
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、ＳＯＲＬＡのミニ受容体をコードするポリヌクレオチドコンストラクトに関するものである。本発明はさらに、前記ポリヌクレオチドコンストラクトを含むベクター、細胞及び／または組成物に関するものである。本発明はさらに、ＳＯＲＬＡのミニ受容体を表すポリペプチドに関するものである。本発明はさらに、医薬で使用するために、前記ポリヌクレオチドコンストラクトを含む前記ベクター、前記細胞及び／または前記組成物に関するものである。本発明はさらに、アルツハイマー病、またはアルツハイマー病と関連する疾患もしくは障害を治療、予防及び／または緩和する際に使用するために、前記ポリヌクレオチドコンストラクトを含む前記ベクター、前記細胞及び／または前記組成物に関するものである。本発明はさらに、アルツハイマー病、またはアルツハイマー病と関連する疾患もしくは障害を治療する方法に関するものである。本発明はさらに、細胞内のｓＡＰＰαを増加させる方法に関するものである。本発明はさらに、細胞内のＡβ３８、Ａβ４０及び／またはＡβ４２を減少させる方法に関するものである。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
発現時に、ポリペプチドＰをコードするポリヌクレオチドコンストラクトであって、前記ポリヌクレオチドが、ａ．発現時に、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５及び配列番号１６からなる群から選択した１つ以上のアミノ酸配列、または配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５もしくは配列番号１６の前記アミノ酸配列と少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９９％同一であるその生物学的に活性な配列バリアントを含むか、あるいはその配列からなる第１のポリペプチドＱ１をコードする第１のポリヌクレオチドと、
ｂ．発現時に、配列番号１７のアミノ酸配列、もしくは配列番号１７と少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９９％同一である配列を含むか、またはその配列からなる第２のポリペプチドＱ２をコードする第２のポリヌクレオチドと、
ｃ．発現時に、配列番号１８のアミノ酸配列、もしくは配列番号１８と少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９９％同一である配列を含むか、またはその配列からなる第３のポリペプチドＱ３をコードする第３のポリヌクレオチドと、
を含むか、あるいはそれらからなり、
前記ポリペプチドＰが、７００アミノ酸以下を含む前記ポリヌクレオチドコンストラクト。
【請求項2】
Ｐが、ａ．配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５及び配列番号１６のアミノ酸配列を含むか、もしくはその配列からなる、ＳｏｒＬＡのＦｎＩＩＩカセット、あるいは
ＦｎＩＩＩ－１、ＦｎＩＩＩ－２、ＦｎＩＩＩ－３、ＦｎＩＩＩ－４、ＦｎＩＩＩ－５もしくはＦｎＩＩＩ－６から選択したＦｎＩＩＩドメインであって、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５もしくは配列番号１６のアミノ酸配列に対応する前記ＦｎＩＩＩドメイン、またはこれらのいずれかの組み合わせと、
ｂ．配列番号１７のアミノ酸配列を含むか、またはその配列からなる、ＳｏｒＬＡの膜貫通ドメインと、
ｃ．配列番号１８のアミノ酸配列を含むか、またはその配列からなる、ＳｏｒＬＡの細胞質尾部ドメインと、
を含むか、あるいはそれらからなる、請求項１に記載のコンストラクト。
【請求項3】
Ｐが、６８５アミノ酸以下である、先行請求項のいずれか１項に記載のコンストラクト。
【請求項4】
Ｐが、配列番号２１のアミノ酸配列をさらに含む、先行請求項のいずれか１項に記載のコンストラクト。
【請求項5】
Ｐが、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１８のアミノ酸配列を含むか、またはその配列からなる、先行請求項のいずれか１項に記載のコンストラクト。
【請求項6】
Ｐが、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８及び配列番号２１のアミノ酸配列を含むか、またはその配列からなる、先行請求項のいずれか１項に記載のコンストラクト。
【請求項7】
ａ．配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５及び配列番号１６からなる群から選択した１つ以上のアミノ酸配列、または配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５もしくは配列番号１６の前記アミノ酸配列と少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９９％同一であるその生物学的に活性な配列バリアントを含むか、あるいはその配列からなる第１のポリペプチドＱ１と、ｂ．配列番号１７のアミノ酸配列、もしくは配列番号１７と少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９９％同一である配列を含むか、またはその配列からなる第２のポリペプチドＱ２と、
ｃ．配列番号１８のアミノ酸配列、もしくは配列番号１８と少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９９％同一である配列を含むか、またはその配列からなる第３のポリペプチドＱ３と、
を含むか、あるいはそれらからなるポリペプチドＰであって、
７００アミノ酸以下を含む前記ポリペプチドＰ。
【請求項8】
ポリペプチドＱ１、ポリペプチドＱ２及びポリペプチドＱ３の融合タンパク質である、請求項７に記載のポリペプチドＰ。
【請求項9】
ａ．配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５及び配列番号１６のアミノ酸配列を含むか、もしくはその配列からなる、ＳｏｒＬＡのＦｎＩＩＩカセット、あるいはＦｎＩＩＩ－１、ＦｎＩＩＩ－２、ＦｎＩＩＩ－３、ＦｎＩＩＩ－４、ＦｎＩＩＩ－５もしくはＦｎＩＩＩ－６から選択したＦｎＩＩＩドメインであって、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５もしくは配列番号１６のアミノ酸配列に対応する前記ＦｎＩＩＩドメイン、またはこれらのいずれかの組み合わせと、
ｂ．配列番号１７のアミノ酸配列を含むか、またはその配列からなる、ＳｏｒＬＡの膜貫通ドメインと、
ｃ．配列番号１８のアミノ酸配列を含むか、またはその配列からなる、ＳｏｒＬＡの細胞質尾部ドメインと、
を含むか、あるいはそれらからなる、請求項７～８のいずれか１項に記載のポリペプチドＰ。
【請求項10】
６８５アミノ酸以下である、請求項７～９のいずれか１項に記載のポリペプチドＰ。
【請求項11】
配列番号２１のアミノ酸配列をさらに含む、請求項７～１０のいずれか１項に記載のポリペプチドＰ。
【請求項12】
配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１８のアミノ酸配列を含むか、またはその配列からなる、請求項７～１１のいずれか１項に記載のポリペプチドＰ。
【請求項13】
配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８及び配列番号２１のアミノ酸配列を含むか、またはその配列からなる、請求項７～１２のいずれか１項に記載のポリペプチドＰ。
【請求項14】
請求項１～６のいずれかに記載のポリヌクレオチドコンストラクトを含むか、及び／または請求項７～１３のいずれかに記載のポリペプチドＰをコードするベクター。
【請求項15】
ウイルスベクター、プラスミド、コスミド及び人工染色体からなる群から選択されたものである、請求項１４に記載のベクター。
【請求項16】
プラスミドベクターである、請求項１４に記載のベクター。
【請求項17】
ウイルスベクターである、請求項１４に記載のベクター。
【請求項18】
パッケージング能力が、１～４０ｋｂ、例えば１～３０ｋｂ、例えば１～２０ｋｂ、例えば１～１５ｋｂ、例えば１～１０、例えば１～８ｋｂ、例えば２～７ｋｂ、例えば３～６ｋｂ、例えば４～５ｋｂである、請求項１４～１７のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項19】
前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ベクター（ＡＡＶ）、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター及びレトロウイルスベクターからなる群から選択されたものである、請求項１４～１８のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項20】
前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ベクター（ＡＡＶ）である、請求項１４～１９のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項21】
請求項１～６のいずれか１項に記載のコンストラクト、請求項７～１３のいずれか１項に記載のポリペプチドＰ及び／または請求項１４～２０のいずれか１項に記載のベクターを含む細胞。
【請求項22】
真核細胞、好ましくは哺乳動物細胞、より好ましくは霊長類動物細胞、より好ましくはヒト細胞からなる群から選択されたものである、請求項２１に記載の細胞。
【請求項23】
哺乳動物細胞である、請求項２１～２２のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項24】
神経細胞である、請求項２１～２３のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項25】
請求項１～６のいずれか１項に記載のコンストラクト、請求項７～１３のいずれか１項に記載のポリペプチドＰ、請求項１４～２０のいずれか１項に記載のベクター及び／または請求項２１～２４のいずれか１項に記載の細胞を含む組成物。
【請求項26】
医薬組成物である、請求項２６に記載の組成物。
【請求項27】
薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項２５～２６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項28】
医薬で使用するための、請求項１～６のいずれか１項に記載のコンストラクト、請求項７～１３のいずれか１項に記載のポリペプチドＰ、請求項１４～２０のいずれか１項に記載のベクター、請求項２１～２４のいずれか１項に記載の細胞、及び／または請求項２５～２７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項29】
アルツハイマー病、またはアルツハイマー病と関連する疾患もしくは障害を治療、予防及び／または緩和する際に使用するための、請求項１～６のいずれか１項に記載のコンストラクト、請求項７～１３のいずれか１項に記載のポリペプチドＰ、請求項１４～２０のいずれか１項に記載のベクター、請求項２１～２４のいずれか１項に記載の細胞及び／または請求項２５～２７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項30】
前記アルツハイマー病が、早発型アルツハイマー病、晩期発症型アルツハイマー病及び家族性アルツハイマー病からなる群から選択した型のものである、請求項２９に従って使用するためのコンストラクト、ポリペプチドＰ、ベクター、細胞及び／または組成物。
【請求項31】
アルツハイマー病、またはアルツハイマー病と関連する疾患もしくは障害を治療する方法であって、それを必要とする個体に、請求項１～６のいずれか１項に記載のコンストラクト、請求項７～１３のいずれか１項に記載のポリペプチドＰ、請求項１４～２０のいずれか１項に記載のベクター、請求項２１～２４のいずれか１項に記載の細胞及び／または請求項２５～２７のいずれか１項に記載の組成物を投与することを含む前記方法。
【請求項32】
アルツハイマー病、またはアルツハイマー病と関連する疾患もしくは障害を治療、予防及び／または緩和するための医薬を製造するために、請求項１～６のいずれか１項に記載のコンストラクト、請求項７～１３のいずれか１項に記載のポリペプチドＰ、請求項１４～２０のいずれか１項に記載のベクター、請求項２１～２４のいずれか１項に記載の細胞、及び／または請求項２５～２７のいずれか１項に記載の組成物を使用すること。
【請求項33】
細胞内のｓＡＰＰαを増加させる方法であって、細胞に、請求項１～６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドコンストラクト、請求項７～１３いずれか１項に記載のポリペプチドＰ、請求項１４～２０のいずれか１項に記載のベクター、及び／または請求項２５～２７のいずれか１項に記載の組成物を導入することで、前記細胞内のｓＡＰＰαを増加させることを含む前記方法。
【請求項34】
細胞内のＡβ３８、Ａβ４０及び／またはＡβ４２を減少させる方法であって、細胞に、請求項１～６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドコンストラクト、請求項７～１３のいずれか１項に記載のポリペプチドＰ、請求項１４～２０のいずれか１項に記載のベクター、及び／または請求項２５～２７のいずれか１項に記載の組成物を導入することで、前記細胞内のＡβ３８、Ａβ４０及び／またはＡβ４２を減少させることを含む前記方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、タンパク質ＳＯＲＬＡ（Ａ型リピートを有するソルチリン関連受容体）のＦｎＩＩＩカセットドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞質尾部をコードするポリヌクレオチドを含むベクターに関するものである。このベクターは、アルツハイマー病（ＡＤ）の治療、予防及び／または緩和における遺伝子療法に使用できる。
【背景技術】
【0002】
タンパク質ＳＯＲＬＡ（Ａ型リピートを有するソルチリン関連受容体）は、アルツハイマー病（ＡＤ）と関連することがよく知られている。このタンパク質は、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）をエンドソーム外に輸送するために重要であり、このエンドソームでは、ＡＰＰが、アミロイド形成性のプロセシングにより、病原性断片（すなわち、アミロイドβ－ペプチド（Ａβ））となる。ＳＯＲＬＡの補助によるこのＡＰＰ輸送により、β－セクレターゼによってＡＰＰが切断されるのを確実に低減することによって、アミロイドβ（Ａβ）ペプチドの生成が減少する。
【0003】
ＡＤでは、脳内でＡβが蓄積して、脳を損傷させるアミロイド斑が形成される。
【0004】
ＳＯＲＬＡが、エンドソームによるリサイクルに関与する能力は、その細胞質尾部内のモチーフ（すなわち、ＦＡＮＳＨＹモチーフ）に関連付けられており、そのモチーフは、レトロマー複合体との相互作用のために重要であり（Ｆｊｏｒｂａｃｋ ｅｔ ａｌ．２０１２）、カーゴをエンドソーム外に輸送するのを助ける。
【0005】
ＳＯＲＬＡをコードするＳＯＲＬ１遺伝子は、ＡＤとの関連性が大きく、機能喪失型の遺伝子バリアントは、ＡＤ発現の原因とみなされている（Ｓｃｈｅｌｔｅｎｓ ｅｔ ａｌ．２０２１）。さらに、ＳＯＲＬＡは、エンドソームの適切なリサイクルのために重要である。ＡＤ患者は概して、ＳＯＲＬ１遺伝子の状態とは無関係に、エンドソームに異常をきたしている。しかしながら、ＳＯＲＬ１遺伝子のサイズが大きいために、ＳＯＲＬＡを利用した治療アプローチは、現実的ではない。
【0006】
その代わりに、最新の薬理学的な方策は、一部では、レトロマー複合体を安定化する小分子を用いることによって、レトロマーの機能を増大させることを目指している（Ｍｅｃｏｚｚｉ ｅｔ ａｌ．２０１４）。レトロマーの安定性、すなわち活性の増大は、アミロイド形成性のＡＰＰ切断を低減するとともに、それに付随して、非アミロイド形成性の生成物である可溶性ＡＰＰα（ｓＡＰＰα）の生成を増大させることが示されている（Ｍｅｃｏｚｚｉ ｅｔ ａｌ．２０１４）。
【0007】
しかしながら、ＡＤの実現可能な治療法は、現時点では存在せず、ＡＤは依然として、患者及び医療システムの負担が非常に大きい。
【発明の概要】
【0008】
ＳＯＲＬＡは、エンドソームのプロセスに関与するため、ＳＯＲＬＡの発現増加は、ＡＤ患者及びＡＤ発現リスクのある個体にとって有益であろう。しかしながら、ＳＯＲＬ１遺伝子はサイズが大きいため、そのタンパク質の発現増加は、現在利用できる実現可能な遺伝子療法アプローチによって、例えば、パッケージング能力が限られるアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを用いて導入することは全くできない。
【0009】
本発明の発明者は驚くべきことに、ＡＤを治療するための遺伝子療法アプローチに、トランケート型のＳＯＲＬＡを使用できることを発見した。完全長ＳＯＲＬＡは、遺伝子療法アプローチには適さない。完全長ＳＯＲＬＡをコードする遺伝子（ＳＯＲＬ１）は、大きすぎて、遺伝子療法に適するベクターに挿入できないからである。
【0010】
本発明の発明者は、ウイルス遺伝子療法と適合するＳＯＲＬＡミニ受容体をコードするＳＯＲＬＡミニ遺伝子を作製することに成功した。前記ＳＯＲＬＡミニ受容体の発現に必要とされる遺伝子配列の長さは、遺伝子療法に適するベクターに挿入するのに十分に短く、ＳＯＲＬＡミニ遺伝子と称することができる。最も重要なことに、ＳＯＲＬＡミニ受容体は同時に、ＡＤの治療に有益な機能、例えば、エンドソームによるリサイクルへの関与、及びアミロイド形成性のＡＰＰプロセシングを低減する能力を保持している。
【0011】
本発明は、ＳＯＲＬＡの細胞質尾部、膜貫通ドメイン、及び内腔領域の一部、すなわちＦＮＩＩＩカセットドメインを含むＳＯＲＬＡミニ受容体を開示する。
【0012】
本発明の発明者は、開発したこのミニ受容体が、エンドソームエンハンサーの特徴を模することを認識している。換言すると、ＳＯＲＬＡは、エンドソームエンハンサーとみなすことができ、本発明者は、本明細書に開示されているミニ受容体も同様に、エンドソームエンハンサーとみなすことができると認識している。最も重要なことに、その完全長受容体と比べて、いくつかの利点が、そのミニ受容体と関連付けられている。第１に、そのミニ受容体は、ｓＡＰＰαを減少させないが、ｓＡＰＰαは、非アミロイド形成性の生成物であるので、これは有益な特性である（実施例２を参照されたい）。第２に、そのミニ受容体のヌクレオチド配列（すなわちミニ遺伝子）は、遺伝子療法用の実現可能なベクター、例えばＡＡＶベクターにパッケージングするのに十分に小さい。
【0013】
第３に、レトロマー増強化合物の作用は、ＳＯＲＬＡ活性によるものと推測されるので、ＳＯＲＬＡミニ受容体を遺伝子療法に使用することは、レトロマー増強化合物の広範な用途よりも特異的であろう。おそらくは、小分子療法のような他の療法と組み合わせて、レトロマーによる遺伝子療法と、ＳＯＲＬ１による遺伝子療法、例えば、本明細書に開示されているＳＯＲＬＡミニ受容体の両方の用途を組み合わせるのも実現可能であろう。
【0014】
一態様では、本発明は、発現時に、ポリペプチドＰをコードするポリヌクレオチドコンストラクトであって、そのポリヌクレオチドが、
ａ．発現時に、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５及び配列番号１６からなる群から選択した１つ以上のアミノ酸配列、または配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５もしくは配列番号１６の前記アミノ酸配列と少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９９％同一であるその生物学的に活性な配列バリアントを含むか、あるいはその配列からなる第１のポリペプチドＱ１をコードする第１のポリヌクレオチドと、
ｂ．発現時に、配列番号１７のアミノ酸配列、もしくは配列番号１７と少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９９％同一である配列を含むか、またはその配列からなる第２のポリペプチドＱ２をコードする第２のポリヌクレオチドと、
ｃ．発現時に、配列番号１８のアミノ酸配列、もしくは配列番号１８と少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９９％同一である配列を含むか、またはその配列からなる第３のポリペプチドＱ３をコードする第３のポリヌクレオチドと、
を含むか、あるいはそれらからなり、
そのポリペプチドＰが、７００アミノ酸以下を含むポリヌクレオチドコンストラクトに関するものである。
ａ．発現時に、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５及び配列番号１６からなる群から選択した１つ以上のアミノ酸配列、または配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５もしくは配列番号１６の前記アミノ酸配列と少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９９％同一であるその生物学的に活性な配列バリアントを含むか、あるいはその配列からなる第１のポリペプチドＱ１をコードする第１のポリヌクレオチドと、
ｂ．発現時に、配列番号１７のアミノ酸配列、もしくは配列番号１７と少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９９％同一である配列を含むか、またはその配列からなる第２のポリペプチドＱ２をコードする第２のポリヌクレオチドと、
ｃ．発現時に、配列番号１８のアミノ酸配列、もしくは配列番号１８と少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９９％同一である配列を含むか、またはその配列からなる第３のポリペプチドＱ３をコードする第３のポリヌクレオチドと、
を含むか、あるいはそれらからなり、
そのポリペプチドＰが、７００アミノ酸以下を含むポリヌクレオチドコンストラクトに関するものである。
【0015】
別の態様では、本発明は、
ａ．配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５及び配列番号１６からなる群から選択した１つ以上のアミノ酸配列、または配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５もしくは配列番号１６の前記アミノ酸配列と少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９９％同一であるその生物学的に活性な配列バリアントを含むか、あるいはその配列からなる第１のポリペプチドＱ１と、
ｂ．配列番号１７のアミノ酸配列、もしくは配列番号１７と少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９９％同一である配列を含むか、またはその配列からなる第２のポリペプチドＱ２と、
ｃ．配列番号１８のアミノ酸配列、もしくは配列番号１８と少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９９％同一である配列を含むか、またはその配列からなる第３のポリペプチドＱ３と、
を含むか、あるいはそれらからなるポリペプチドＰであって、
７００アミノ酸以下を含むポリペプチドＰに関するものである。
ａ．配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５及び配列番号１６からなる群から選択した１つ以上のアミノ酸配列、または配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５もしくは配列番号１６の前記アミノ酸配列と少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９９％同一であるその生物学的に活性な配列バリアントを含むか、あるいはその配列からなる第１のポリペプチドＱ１と、
ｂ．配列番号１７のアミノ酸配列、もしくは配列番号１７と少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９９％同一である配列を含むか、またはその配列からなる第２のポリペプチドＱ２と、
ｃ．配列番号１８のアミノ酸配列、もしくは配列番号１８と少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９９％同一である配列を含むか、またはその配列からなる第３のポリペプチドＱ３と、
を含むか、あるいはそれらからなるポリペプチドＰであって、
７００アミノ酸以下を含むポリペプチドＰに関するものである。
【0016】
別の態様では、本発明は、前記ポリヌクレオチドコンストラクトを含むか、及び／または前記ポリペプチドＰをコードするベクターに関するものである。
【0017】
さらなる態様では、本発明は、前記コンストラクト及び／または前記ポリペプチドＰ及び／またはベクターを含む細胞に関するものである。
【0018】
さらなる態様では、本発明は、前記コンストラクト、ポリペプチドＰ、ベクター及び／または細胞を含む組成物に関するものである。
【0019】
さらなる態様では、本発明は、医薬で使用するための前記コンストラクト、ポリペプチドＰ、ベクター、細胞及び／または組成物に関するものである。
【0020】
さらなる態様では、本発明は、アルツハイマー病、またはアルツハイマー病と関連する疾患もしくは障害を治療、予防及び／または緩和する際に使用するための前記コンストラクト、ポリペプチドＰ、ベクター、細胞及び／または組成物に関するものである。
【0021】
さらなる態様では、本発明は、アルツハイマー病、またはアルツハイマー病と関連する疾患もしくは障害を治療する方法であって、それを必要とする個体に、前記コンストラクト、ポリペプチドＰ、ベクター、細胞及び／または組成物を投与することを含む方法に関するものである。
【0022】
さらなる態様では、本発明は、アルツハイマー病、またはアルツハイマー病と関連する疾患もしくは障害を治療、予防及び／または緩和するための医薬を製造するために、前記コンストラクト、ポリペプチドＰ、ベクター、細胞及び／または組成物を使用することに関するものである。
【0023】
さらなる態様では、本発明は、細胞内のｓＡＰＰαを増加させる方法であって、細胞に、本発明のポリヌクレオチドコンストラクト、本発明のベクター、本発明のポリペプチドＰ及び／または本発明の組成物を導入することで、前記細胞内のｓＡＰＰαを増加させることを含む方法に関するものである。
【0024】
さらなる態様では、本発明は、細胞内のＡβ３８、Ａβ４０及び／またはＡβ４２を減少させる方法であって、細胞に、本発明のポリヌクレオチドコンストラクト、本発明のベクター、本発明のポリペプチドＰ及び／または本発明の組成物を導入することで、前記細胞内のＡβ３８、Ａβ４０及び／またはＡβ４２を減少させることを含む方法に関するものである。
【図面の簡単な説明】
【0025】
【図1】ＳＯＲＬＡミニ受容体 ＳＯＲＬ１－ｗｔから発現する完全長ＳＯＲＬＡ（ＳＯＲＬＡ－ｗｔ）、及びＳＯＲＬ１－３Ｆｎ（「ミニ遺伝子」）から発現するＳｏｒＬＡミニ受容体（「３Ｆｎミニ受容体」またはＳＯＲＬＡ－３Ｆｎ）の概略図であり、両方のコンストラクトのドメイン構成が示されている（ｗｔ＝野生型）。このミニ受容体は、ＳＯＲＬＡのＦｎＩＩＩドメインを１つ、２つ以上もしくはすべて含むポリペプチドＱ１と、ＳＯＲＬＡの膜貫通ドメインを含むか、もしくはそのドメインからなるポリペプチドＱ２と、ＳＯＲＬＡの細胞質尾部ドメインを含むか、もしくはそのドメインからなるポリペプチドＱ３を含むか、またはそれらからなり、これらのドメインをポリペプチドＰと総称する場合もある。 任意に、そのミニ受容体は、タグ、例えばＦＬＡＧタグを含んでよい。
【図2】ベクターマップ そのベクターコンストラクトの概略図である。
【図3A】ＳＯＲＬＡにおける６個の３Ｆｎドメインの二次構造ベースでの予想アラインメント ３Ｆｎドメインの二次構造であり、溶液構造である。
【図3B】フォールディングトポロジーの概略的な構造と、保存されたアミノ酸である。
【図3C】ＳＯＲＬＡの６個の３Ｆｎドメインの二次構造ベースでの予想アラインメントである。矢印（ａ～ｂ）は、β－ストランドと予測されるものであり、太字のアミノ酸は、３Ｆｎドメインにわたり保存されているものである。様々な３Ｆｎドメインの間で厳密に保存されているアミノ酸は、ほんのわずかであり、配列多様性が強いことが示されている。パネル（Ｃ）でのアラインメントは、パネル（Ｄ）及びさらにはパネル（Ｅ）に続いており、ＳＯＲＬＡの６個の３Ｆｎドメインのアラインメントが一緒に示されている。 保存位置（太字の文字）の下の文字は、それらのドメインの５～６個で保存されている所定のアミノ酸（大文字が使われている）またはそれよりも低い頻度で保存されているアミノ酸（小文字が使われている）位置においては、ｐ／Ｐ（＝Ｐｒｏ）、Ｗ（＝Ｔｒｐ）、Ｙ（＝Ｔｙｒ）、Ｎ（＝Ａｓｎ）、Ｔ（＝Ｔｈｒ）、Ｌ（＝Ｌｅｕ）及びｇ（＝Ｇｌｙ）に対応する。Φという符号は、それらのドメイン配列の所定の位置において、疎水性側鎖を有するアミノ酸を表す目的で使用されている（Ｌ／Ｌｅｕ、Ｖ／Ｖａｌ、Ａ／Ａｌａ、Ｉ／Ｉｌｅ、Ｍ／Ｍｅｔ、Ｆ／Ｐｈｅ）。
【図3D】ＳＯＲＬＡの６個の３Ｆｎドメインの二次構造ベースでの予想アラインメントである。矢印（ｃ～ｃ’）は、β－ストランドと予測されるものであり、太字のアミノ酸は、３Ｆｎドメインにわたり保存されているものである。様々な３Ｆｎドメインの間で厳密に保存されているアミノ酸は、ほんのわずかであり、配列多様性が強いことが示されている。パネル（Ｃ）でのアラインメントは、パネル（Ｄ）及びさらにはパネル（Ｅ）に続いており、ＳＯＲＬＡの６個の３Ｆｎドメインのアラインメントが一緒に示されている。 保存位置（太字の文字）の下の文字は、それらのドメインの５～６個で保存されている所定のアミノ酸（大文字が使われている）またはそれよりも低い頻度で保存されているアミノ酸（小文字が使われている）位置においては、ｐ／Ｐ（＝Ｐｒｏ）、Ｗ（＝Ｔｒｐ）、Ｙ（＝Ｔｙｒ）、Ｎ（＝Ａｓｎ）、Ｔ（＝Ｔｈｒ）、Ｌ（＝Ｌｅｕ）及びｇ（＝Ｇｌｙ）に対応する。Φという符号は、それらのドメイン配列の所定の位置において、疎水性側鎖を有するアミノ酸を表す目的で使用されている（Ｌ／Ｌｅｕ、Ｖ／Ｖａｌ、Ａ／Ａｌａ、Ｉ／Ｉｌｅ、Ｍ／Ｍｅｔ、Ｆ／Ｐｈｅ）。
【図3E】ＳＯＲＬＡの６個の３Ｆｎドメインの二次構造ベースでの予想アラインメントである。矢印（ｅ～ｇ）は、β－ストランドと予測されるものであり、太字のアミノ酸は、３Ｆｎドメインにわたり保存されているものである。様々な３Ｆｎドメインの間で厳密に保存されているアミノ酸は、ほんのわずかであり、配列多様性が強いことが示されている。パネル（Ｃ）でのアラインメントは、パネル（Ｄ）及びさらにはパネル（Ｅ）に続いており、ＳＯＲＬＡの６個の３Ｆｎドメインのアラインメントが一緒に示されている。 保存位置（太字の文字）の下の文字は、それらのドメインの５～６個で保存されている所定のアミノ酸（大文字が使われている）またはそれよりも低い頻度で保存されているアミノ酸（小文字が使われている）位置においては、ｐ／Ｐ（＝Ｐｒｏ）、Ｗ（＝Ｔｒｐ）、Ｙ（＝Ｔｙｒ）、Ｎ（＝Ａｓｎ）、Ｔ（＝Ｔｈｒ）、Ｌ（＝Ｌｅｕ）及びｇ（＝Ｇｌｙ）に対応する。Φという符号は、それらのドメイン配列の所定の位置において、疎水性側鎖を有するアミノ酸を表す目的で使用されている（Ｌ／Ｌｅｕ、Ｖ／Ｖａｌ、Ａ／Ａｌａ、Ｉ／Ｉｌｅ、Ｍ／Ｍｅｔ、Ｆ／Ｐｈｅ）。
【図4A】Ｎ２ａ細胞から回収した溶解液のウエスタンブロット解析結果 ＳＯＲＬＡの非存在下（ＡＰＰ＋ｐｃＤＮＡ）、ＳＯＲＬＡ－ｗｔの存在下（ＡＰＰ＋ＳＯＲＬＡ－ｗｔ、ＡＰＰ＋ＳＯＲＬ１－ｗｔから転写）またはＳＯＲＬＡ－３Ｆｎの存在下（ＡＰＰ＋ＳＯＲＬＡ－３Ｆｎ、ＡＰＰ＋ＳＯＲＬ１－３Ｆｎから転写）で、ＡＰＰをトランスフェクションしたＮ２ａ細胞から得た細胞溶解液の代表的なウエスタンブロット（ＷＢ）解析結果である。細胞溶解液のタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分離して得たブロットは、ＳＯＲＬＡに対する抗体（ＳＯＲＬ１－３Ｆｎ領域を含むＳＯＲＬ１－ＷＴのそれぞれのタンパク質産物を標的とする抗体、例えば、完全長ＳＯＲＬＡ及び本発明のミニ受容体の両方を標的とする抗体）、ＡＰＰに対する抗体（ＡＰＰ上のｍｙｃタグに対する抗ｍｙｃ抗体によって認識する）、及びβ－アクチンに対する抗体でプロービングした。
【図4B】Ｎ２ａ細胞から回収した培地のウエスタンブロット解析 ＳＯＲＬＡの非存在下（ＡＰＰ＋ｐｃＤＮＡ）、ＳＯＲＬＡ－ｗｔの存在下（ＡＰＰ＋ＳＯＲＬＡ－ｗｔ、ＡＰＰ＋ＳＯＲＬ１－ｗｔから転写）またはＳＯＲＬＡ－３Ｆｎの存在下（ＡＰＰ＋ＳＯＲＬＡ－３Ｆｎ、ＡＰＰ＋ＳＯＲＬ１－３Ｆｎから転写）で、ＡＰＰをトランスフェクションしたＮ２ａ細胞から得た馴化培地の代表的なウエスタンブロット（ＷＢ）解析結果である。それぞれの条件は、ｄｕｐｌｉｃａｔｅで、少なくとも５回の独立した実験で試験した。馴化培地試料でのＷＢは、ｓＡＰＰαに対する抗体でプロービングした。 ＳＯＲＬＡ－ｗｔ及び本発明のミニ受容体が、ｓＡＰＰαのレベルに影響を及ぼした程度にかなり差があったことに留意されたい（＊）。本発明のミニ受容体は、ＡＰＰを切断させる点、すなわち、ｓＡＰＰαを増加させるとともに、ｓＡＰＰαを減少させないという点で、ＳＯＲＬＡ－ｗｔよりも優れている。これは、ＡＤ患者にとって有益である。ｓＡＰＰαは、栄養因子であるので、ニューロンの生存のために重要であることが報告されているからである。
【図5】ＷＢ膜の密度計による走査結果 図４におけるウエスタンブロットに関して、ＳＯＲＬ１－ＷＴをトランスフェクションした細胞（ＳＯＲＬＡ－ｗｔを発現）におけるｓＡＰＰα産生を定量したところ、外因性ＳＯＲＬＡ－ｗｔを含まない細胞（＝ブランク）と比べて、ｓＡＰＰαレベルの有意な低下が見られたのに対して、（ＳＯＲＬ１－３Ｆｎのトランスフェクションによる）ＳＯＲＬＡ－３Ｆｎでは、ｓＡＰＰα産生に対する影響は見られなかった（Ｎ＝４、ｎ＝８）。
【図6】ＭＳＤイムノアッセイを用いた、ｓＡＰＰαレベル及びｓＡＰＰβレベルの定量結果 Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）イムノアッセイを用いて、ｓＡＰＰα（Ａ）及びｓＡＰＰβ（Ｂ）を定量し、野生型ＳＯＲＬＡの存在（ＳＯＲＬ１－ＷＴのトランスフェクションによる）によって、ｓＡＰＰαは減少するが、ミニ受容体の存在（ＳＯＲＬ１－３Ｆｎのトランスフェクションによる）によっては、ｓＡＰＰαは影響を受けず、むしろ増加する（Ａ）のに対して、ｓＡＰＰβレベルは、野生型ＳＯＲＬＡの存在下（ＳＯＲＬ１－ＷＴのトランスフェクションによる）でも、ミニ受容体ＳＯＲＬＡ－３Ｆｎの存在下（ＳＯＲＬ１－３Ｆｎのトランスフェクションによる）でも低下することがさらに検証された。
【図7】Ａβ４０ ＥＬＩＳＡアッセイを用いた、Ａβ４０レベルの定量結果 ５つの試料から得た馴化培地で、３回の独立した実験から得たＡβ４０のＥＬＩＳＡアッセイ結果である。ＳＯＲＬＡ－ｗｔ（ＳＯＲＬ１－ｗｔのトランスフェクションによる）及びミニ受容体ＳＯＲＬＡ－３Ｆｎ（ＳＯＲＬ１－３Ｆｎのトランスフェクションによる）の両方とも、いずれの外因性ＳＯＲＬＡタンパク質もトランスフェクションしなかった細胞と比べて、Ａβ４０のレベルが有意に低下した。
【図8A】ＭＳＤイムノアッセイを用いた、Ａβ３８のレベルの定量結果 Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）イムノアッセイを用いた、馴化培地のＡβ３８の定量結果である。３つすべてのＡβ形態のＡβ産生量は、ＳＯＲＬＡ－ｗｔ（ＳＯＲＬ１－ｗｔのトランスフェクションによる）及びミニ受容体ＳＯＲＬＡ－３Ｆｎ（ＳＯＲＬ１－３Ｆｎのトランスフェクションによる）のいずれの存在下でも、外因性ＳＯＲＬＡを含まない試料（ブランク）と比べて有意に減少した。
【図8B】ＭＳＤイムノアッセイを用いた、Ａβ４０のレベルの定量結果 Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）イムノアッセイを用いた、馴化培地のＡβ４０の定量結果である。３つすべてのＡβ形態のＡβ産生量は、ＳＯＲＬＡ－ｗｔ（ＳＯＲＬ１－ｗｔのトランスフェクションによる）及びミニ受容体ＳＯＲＬＡ－３Ｆｎ（ＳＯＲＬ１－３Ｆｎのトランスフェクションによる）のいずれの存在下でも、外因性ＳＯＲＬＡを含まない試料（ブランク）と比べて有意に減少した。
【図8C】ＭＳＤイムノアッセイを用いた、Ａβ４２のレベルの定量結果 Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）イムノアッセイを用いた、馴化培地のＡβ４２の定量結果である。３つすべてのＡβ形態のＡβ産生量は、ＳＯＲＬＡ－ｗｔ（ＳＯＲＬ１－ｗｔのトランスフェクションによる）及びミニ受容体ＳＯＲＬＡ－３Ｆｎ（ＳＯＲＬ１－３Ｆｎのトランスフェクションによる）のいずれの存在下でも、外因性ＳＯＲＬＡを含まない試料（ブランク）と比べて有意に減少した。
【図9】本発明のミニ受容体によるレトロマー複合体の安定化 Ａ）最上部のＶＰＳ２９サブユニットによって二量体化するアーチを形成するコアレトロマーユニットの概略図であり、最下部でも、２つのＶＰＳ２６サブユニットが密接している。 Ｂ）二量体化しているＳＯＲＬＡミニ受容体は、レトロマー複合体を安定させる。
【図10A】ＳＯＲＬＡミニ受容体の生物学的動態は、そのレトロマー結合部位に依存する ＦＡＮＳＨＹモチーフがアラニン残基によって置換されたミニ受容体変異体バリアント、すなわち、レトロマー結合部位を欠損したバリアント（ＦＬＡＧ－ｍｉｎｉ－ＦＡＮＳＨＹ）を作製した。ミニ受容体の変異バリアント（ＦＬＡＧ－ｍｉｎｉ－ＦＡＮＳＨＹ）及び非変異バリアント（ＦＬＡＧ－ｍｉｎｉ－ＷＴ＝ＳＯＲＬＡ－３Ｆｎ）を用いて、細胞にトランスフェクションを行い、前記変異がどの程度、細胞内局在を低下させるかを示した。ＦＬＡＧ－ｍｉｎｉ－ＦＡＮＳＨＹは、ＦＬＡＧ－ｍｉｎｉ－ＷＴよりも、細胞表面に有意に多く見られ、ＦＬＡＧ－ｍｉｎｉ－ＷＴよりも、細胞培地に分泌された。ミニ受容体（変異バリアントと非変異バリアントの比較）では、細胞局在に差が見られたので、これにより、レトロマーも、ミニ受容体のエンドソーム輸送において、役割を果たすことが示唆されている。 ＦＬＡＧ－ｍｉｎｉ－ＷＴまたはＦＬＡＧ－ｍｉｎｉ－ＦＡＮＳＨＹをトランスフェクションした細胞から得た溶解液のウエスタンブロット解析により、両方のバリアントの発現レベルが同程度であることが示された（５回の独立した実験の定量から得た代表的なブロット及び棒グラフ）。
【図10B】これに対して、ＦＬＡＧ－ｍｉｎｉ－ＷＴまたはＦＬＡＧ－ｍｉｎｉ－ＦＡＮＳＨＹをトランスフェクションした細胞から得た溶解液のウエスタンブロット解析により、ＦＬＡＧ－ｍｉｎｉ－ＦＡＮＳＨＹが、ＦＬＡＧ－ｍｉｎｉ－ＷＴ（レーン３及び４）に比べて、培地に有意に多く分泌される（レーン５及び６）ことが示された（５回の独立した実験の定量から得た代表的なブロット及び棒グラフ）。ミニ受容体コンストラクトをいずれも含まない空のベクター（ｐｃＤＮＡ）をネガティブコントロールとして含めた。
【図10C】Ｂ）のウエスタンブロットの定量結果である。
【図10D】トランスフェクション細胞におけるＦＬＡＧ－ｍｉｎｉ－ＷＴ及びＦＬＡＧ－ｍｉｎｉ－ＦＡＮＳＨＹの細胞表面分布を比較したＦＡＣＳ解析である。例えば、陽性細胞の数は、抗体シグナルが所定の閾値に達した細胞と定義したところ、ＦＬＡＧ－ｍｉｎｉ－ＷＴの場合、２回の実験において３２１（上パネル）であったが、この数は、ＦＬＡＧ－ｍｉｎｉ－ＦＡＮＳＨＹをトランスフェクションした細胞では、５９２（下パネル）まで増加した。さらに、そのシグナルは、ＦＬＡＧ－ｍｉｎｉ－ＦＡＮＳＨＹ（平均シグナル５．２８６．２９５、下パネル）の場合と比べて、ＦＬＡＧ－ｍｉｎｉ－ＷＴを発現した細胞の方が低かった（平均シグナル４．６３５．５２２、上パネル）。
【図10E】トランスフェクション細胞におけるＦＬＡＧ－ｍｉｎｉ－ＷＴ及びＦＬＡＧ－ｍｉｎｉ－ＦＡＮＳＨＹの細胞表面分布を比較したＦＡＣＳ解析である。例えば、陽性細胞の数は、抗体シグナルが所定の閾値に達した細胞と定義したところ、ＦＬＡＧ－ｍｉｎｉ－ＷＴの場合、２回の実験において３４７であった（上パネル）が、この数は、ＦＬＡＧ－ｍｉｎｉ－ＦＡＮＳＨＹをトランスフェクションした細胞では、５０９まで増加した（下パネル）。さらに、そのシグナルは、ＦＬＡＧ－ｍｉｎｉ－ＦＡＮＳＨＹ（平均シグナル５．２８５．５０１、下パネル）の場合と比べて、ＦＬＡＧ－ｍｉｎｉ－ＷＴを発現した細胞の方が低かった（平均シグナル４．７３６．３５５、上パネル）。
【図10F】トランスフェクション細胞の細胞表面（洗浄剤／ＴｒｉｔｏｎＸ－１００の非存在下で染色した）のＦＬＡＧ－ｍｉｎｉ－ＷＴ及びＦＬＡＧ－ｍｉｎｉ－ＦＡＮＳＨＹを免疫細胞化学によって検出したものである。 明らかに、細胞表面でのＦＬＡＧ－ｍｉｎｉ－ＦＡＮＳＨＹの蓄積は、ＦＬＡＧ－ｍｉｎｉ－ＷＴと比べて多かった（矢印）。
【図11A】ＳＯＲＬ１の３Ｆｎドメインによる、ＳＯＲＬ１の二量体化 ＳＯＲＬＡの天然ドメインのすべて（ＶＰＳ１０ｐ、ＹＷＴＤ、ＣＲドメイン、ＦｎＩＩＩドメイン）を有するＳＯＲＬＡ－ＷＴタンパク質、異なるタグを有する３Ｆｎミニ受容体バリアント（それぞれ、ｍｉｎｉ－ｍｙｃ及びＦＬＡＧ－ｍｉｎｉ）、ならびに実施例８で用いた可溶性３Ｆｎミニ受容体のドメイン構成を示す概略図である。 Ｖｐｓ１０ｐは、液胞タンパク質ソーティング１０タンパク質、ＹＷＴＤは、チロシントリプトファントレオニンアスパラギン酸、ＣＲは、補体型リピート、３Ｆｎは、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン、ＴＭは、膜貫通部、１０ＣＣは、１０個の保存されたシステイン、ＥＧＦは、上皮細胞成長因子である。
【図11B】ＦＬＡＧタグ付きのミニ受容体及びＳＯＲＬ１－ＷＴを一過性にトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞から得た溶解液の、ＦＬＡＧ抗体を用いた免疫共沈降結果である。ポリクローナルＳＯＲＬ１抗体（ｓｏｌ－ＳＯＲＬＡ）を用いて、溶離液に存在するタンパク質をＷＢによって解析した。
【図11C】ＦＬＡＧタグ付きのミニ受容体及びＭｙｃタグ付きのミニ受容体を一過性にトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞から得た溶解液の免疫共沈降解析結果である。ＦＬＡＧ抗体を用いて、タンパク質を沈降させ、ｍｙｃ抗体を用いて、ＷＢによって検出した。
【図11D】０％または５％の（＋β－メルカプトエタノール）還元剤のいずれかで処置した可溶性３Ｆｎミニ受容体（膜貫通ドメインまたは尾部ドメインを含まない）を一過性にトランスフェクションしたＣＨＯ細胞から得た溶解液及び培地のＷＢ解析結果である。Ｎ末端に３×ＦＬＡＧタグを含む可溶性３Ｆｎミニ受容体コンストラクトの検出に、抗ＦＬＡＧ抗体を用いる。
【図12A】エンドソーム内でのＳＯＲＬＡ二量体化の細胞解析 近接ライゲーションアッセイ（ＰＬＡ）の背後にある原理を示す概略図である。Ｃ末端にＦＬＡＧタグ（ＳＯＲＬ１－ＦＬＡＧ）またはＧＦＰタグ（ＳＯＲＬ１－ＧＦＰ）を有する２つのＳＯＲＬ１コンストラクトが、相互作用する（すなわち二量体化する）と、相当数の工程で、赤色のＰＬＡシグナルが発色する。
【図12B】ＳＯＲＬ１－ＧＦＰ（＊）及びＳＯＲＬ１－ＦＬＡＧを一過性にコトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞の代表的な共焦点顕微鏡画像である。ＦＬＡＧ抗体を用いて、細胞をＳｏｒＬＡに対して免疫染色し（矢印）、核をＤＡＰＩで対比染色した（青色）。スケールバーは５μｍである。我々は、ダブルトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞を用いて、これらの２つの異なるタグが、タグ付きの受容体形態の局在に影響を及ぼすかを試験し、共局在の程度を求めた。この実験から、それらのタグでは、強い重複が見られ、Ｍａｎｄｅｒｓ係数は０．７１であったので、それらのタグにより、細胞局在に差が示されなかったことを我々は観察した。
【図12C】次に、我々は、抗ＦＬＡＧを除外したＰＬＡ設定のコントロール実験を行い、いずれの設定でも、ＰＬＡシグナルの形成が消失した。
【図12D】次に、我々は、抗ＧＦＰをいずれかを除外したＰＬＡ設定のコントロール実験を行い、いずれの設定でも、ＰＬＡシグナルの形成が消失した。
【図12E】一過性にトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞において、ＳＯＲＬ１－ＧＦＰ（＊）とＳＯＲＬ１－ＦＬＡＧとの相互作用のＰＬＡ解析から得た代表的な画像である。ＰＬＡシグナルは、ドットによって表されている（矢印を参照されたい）。スケールバーは５μｍである。Ｍａｎｄｅｒｓ相関係数を用いた、ＧＦＰ（＊）とＰＬＡ（矢印）シグナルとの共在の定量結果である。 我々は、両方の抗体の存在下で、強力なＰＬＡシグナルを観察したことから、２つの完全長ＳＯＲＬＡタンパク質が細胞内で二量体を形成できることが確認された。しかしながら、我々が、ＰＬＡシグナル（ＳＯＲＬＡ二量体を表す）とＳＯＲＬＡ－ＧＦＰ（単量体及び二量体の両方を表す）の共局在の程度を求めたところ、いくつかのＰＬＡシグナルについては、共局在が明らかに見られないことに我々は気づき、Ｍａｎｄｅｒｓ係数により、重複がわずか０．３５であることが確認され、二量体として存在するのは、ＳＯＲＬＡタンパク質の細胞プールのごく一部であることが示唆された。
【図12F】二量体を表すＰＬＡシグナルと、レトロマーコアのＶＰＳ３５サブユニットの共染により、共局在の程度が大きいことが示され、Ｍａｎｄｅｒｓ係数は０．７０であったことから、大半のＳＯＲＬＡ二量体が、レトロマーと一緒に位置することが確認された。
【図13A】ＳＯＲＬ１二量体の細胞内局在は、エンドソーム内である。 Ｖｅｎｕｓ蛍光タンパク質のＮ末端断片（ＳＯＲＬ１－Ｖ１）またはＣ末端断片（ＳＯＲＬ１－Ｖ２）のいずれかのＣ末端融合体を含むＳＯＲＬ１コンストラクトの概略図である。２つのＳＯＲＬ１分子が相互作用すると、Ｖｅｎｕｓ断片が近接して、蛍光βバレル構造を形成可能となる。
【図13B】レトロマーは、ＳＯＲＬ１二量体と特異的に相互作用する。ＨＥＫ２９３細胞に、空のベクターＳＯＲＬ１－ＧＦＰ、ＳＯＲＬ１－Ｖ１、ＳＯＲＬ１－Ｖ２、ＳＯＲＬ１－Ｖ１及びＳＯＲＬ１－Ｖ２の両方（各種のＳＯＲＬＡバリアントを発現する）、またはＳＯＲＬ１－ＷＴをトランスフェクションしてから、ＧＦＰトラップによる免疫沈降を行った。ＳＯＲＬＡ及びＶＰＳ２６Ｂの検出のために、示されている抗体を用いたＷＢによって、その溶離液中のタンパク質を解析した。
【図13C】ＳＯＲＬ１－Ｖ１（上段）、ＳＯＲＬ１－Ｖ２（中断）のいずれかを一過性にトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞、またはＳＯＲＬ１－Ｖ１及びＳＯＲＬ１－Ｖ２の両方をコトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞（下段）から得たＢｉＦＣシグナル（＊）の代表的な免疫蛍光画像である。それらの細胞は、ＳＯＲＬ１抗体で対比免疫染色し（矢印）、核は、ＤＡＰＩで染色した。スケールバーは５μｍである。
【図13D】Ｍａｎｄｅｒｓ相関係数を用いて、Ｖｅｎｕｓシグナルと全ＳＯＲＬ１との共在の定量したものである。
【発明を実施するための形態】
【0026】
定義
本明細書で使用する場合、文脈上明らかに別段に示されている場合を除き、「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」が付された単数形には、複数の言及物が含まれる。
本明細書で使用する場合、文脈上明らかに別段に示されている場合を除き、「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」が付された単数形には、複数の言及物が含まれる。
【0027】
「いくつかの実施形態」という用語は、１つまたは２つ以上の実施形態を含むことができる。
【0028】
「ａ」または「ａｎ」という語の使用は、この文章全体を通じて、あるいは請求項及び／または本明細書における「含む」という用語と併せて用いられている場合、「１つ」を意味することもあるが、「１つ以上」、「少なくとも１つ」及び「１つまたは２つ以上」の意味とも一致する。すなわち、例えば、「ミニ受容体」という場合には、そのようなミニ受容体が複数、例えば１つ以上のミニ受容体、少なくとも１つのミニ受容体または２つ以上のミニ受容体が含まれる。
【0029】
「コンストラクト」という用語は、本明細書で使用する場合、例えば、下記の実施例または請求項に記載されているようなポリヌクレオチドコンストラクトを指す。例えば、このコンストラクトは、本発明のＳＯＲＬＡミニ受容体をコードするＳＯＲＬ１ミニ遺伝子を指す。
【0030】
「ｓｏｒＬＡ」という用語は、本明細書で使用する場合は、ＳＯＲＬＡ、ソルチリン関連受容体、ソルチリン関連受容体１、１１個のリガンド結合リピートを有する低密度リポタンパク質受容体類似体、１１個のリガンド結合リピートを有するＬＤＬＲ類似体、ＬＲ１１、ＳｏｒＬＡ－１、ＬＤＬＲクラスＡリピートを含むソーティングタンパク質関連受容体及びｇｐ２５０という用語と同義である。ヒトｓｏｒＬＡは、ＵｎｉＰｒｏｔにおいて、Ｑ９２６７３というアクセッション番号でアノテーションされている。
【0031】
「野生型」（ＷＴ）という用語は概して、修飾が導入されたタンパク質またはタンパク質断片と比べて、修飾されていないタンパク質またはタンパク質断片として理解する。
【0032】
例えば、実施例１及び２で用いられている「野生型」（ＷＴ）という用語は、天然のタンパク質、すなわち天然のｓｏｒＬＡを説明するものと理解し、完全長ｓｏｒＬＡとして理解してよい。
【0033】
実施例８のいくつかの事例で用いられているような「野生型」（ＷＴ）という用語は、ＦＡＮＳＨＹモチーフがアラニン残基で置換されたミニ受容体変異バリアント（ＦＬＡＧ－ｍｉｎｉ－ＦＡＮＳＨＹ）と比べて、変異されていないミニ受容体バリアント（ＦＬＡＧ－ｍｉｎｉ－ＷＴ＝ＳＯＲＬＡ－３Ｆｎミニ受容体）を説明するものと理解する。
【0034】
「野生型」という用語の理解は、下記の実施例１～８のそれぞれにおいて、さらに明確となる。
【0035】
ＳＯＲＬ１によってコードされるタンパク質は、ＳＯＲＬＡといい、ソルチリン関連受容体、ソルチリン関連受容体１、１１個のリガンド結合リピートを有する低密度リポタンパク質受容体類似体、１１個のリガンド結合リピートを有するＬＤＬＲ類似体、ＬＲ１１、ＳｏｒＬＡ－１、ＬＤＬＲクラスＡリピートを含むソーティングタンパク質関連受容体、ｇｐ２５０としても知られる。ヒトＳＯＲＬＡは例えば、ＵｎｉＰｒｏｔのデータベースにおいて、アクセッション番号Ｑ９２６７３でアノテーションされている（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ９２６７３、ＳＯＲＬ＿ヒト）。ＳＯＲＬＡは、例えば、ニューロンで発現する１型膜タンパク質である。ＳＯＲＬＡは、エンドサイトーシス及びソーティングにおいて役割を果たすことが知られている。
【0036】
ＳＯＲＬ１によってコードされるタンパク質ＳＯＲＬＡは、
－シグナルペプチド（そのタンパク質の成熟中に切り離される。エクソン１によってコードされる）、
－プロペプチド（そのタンパク質の成熟中に、タンパク質分解によってプロセシングされることができる。エクソン１によってコードされる）、
－Ｖｐｓ１０ｐドメイン（Ｖｐｓ１０ｐ－β－プロペラともいう（エクソン２～１３によってコードされる）、
－１０ＣＣドメイン（エクソン１４～１６によってコードされる）、
－ＹＷＴＤドメイン（ＹＷＴＤ－β－プロペラともいう（エクソン１７～２１によってコードされる）、
－上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）ドメイン（エクソン２２によってコードされる、
－ＣＲクラスタードメイン（エクソン２３～３３によってコードされる）、
－３Ｆｎクラスター（３Ｆｎカセット、３Ｆｎリピート、３Ｆｎドメインともいう）（エクソン３４～４６によってコードされる）（６個のフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮＩＩＩまたはＦＮ３）リピートともいう）、
－膜貫通ドメイン及び細胞質尾部ドメイン（エクソン４７～４８によってコードされる）、
を含む。
－シグナルペプチド（そのタンパク質の成熟中に切り離される。エクソン１によってコードされる）、
－プロペプチド（そのタンパク質の成熟中に、タンパク質分解によってプロセシングされることができる。エクソン１によってコードされる）、
－Ｖｐｓ１０ｐドメイン（Ｖｐｓ１０ｐ－β－プロペラともいう（エクソン２～１３によってコードされる）、
－１０ＣＣドメイン（エクソン１４～１６によってコードされる）、
－ＹＷＴＤドメイン（ＹＷＴＤ－β－プロペラともいう（エクソン１７～２１によってコードされる）、
－上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）ドメイン（エクソン２２によってコードされる、
－ＣＲクラスタードメイン（エクソン２３～３３によってコードされる）、
－３Ｆｎクラスター（３Ｆｎカセット、３Ｆｎリピート、３Ｆｎドメインともいう）（エクソン３４～４６によってコードされる）（６個のフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮＩＩＩまたはＦＮ３）リピートともいう）、
－膜貫通ドメイン及び細胞質尾部ドメイン（エクソン４７～４８によってコードされる）、
を含む。
【0037】
本開示全体を通じて、３Ｆｎという用語は、ＦＮＩＩＩまたはＦＮ３（Ｆｎ＝フィブロネクチン）と表されていることもある。
【0038】
ポリヌクレオチド（またはポリペプチド）に関しては、相同性、同一性及び類似性という用語は、本明細書で定義する場合、同義的に用いられており、相同性は、それらの配列をアラインメントし、必要な場合にギャップを導入して、同一性／類似性のパーセントを最大とした後に、候補配列内の核酸（またはアミノ酸）のうち、対応する天然型核酸（またはアミノ酸）の残基と相同である核酸（またはアミノ酸）のパーセンテージを指し、同一性は、対応する天然型核酸（またはアミノ酸）の残基と同一である核酸（またはアミノ酸）のパーセンテージを指し、類似性は、対応する天然型核酸（またはアミノ酸）の残基と類似している核酸（またはアミノ酸）のパーセンテージを指し、保存的置換はいずれも、ＮＣＩＵＢの規則（ｈｆｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈｅｍ．ｑｍｕｌ．ａｃ．ｕｋ／ｉｕｂｍｂ／ｍｉｓｃ／ｎａｓｅｑ．ｈｔｍｌ、ＮＣ－ＩＵＢ、Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ（１９８５））に従って、配列同一性の一部とみなす。特に、類似性のパーセンテージは、類似の生理化学的な特性を有する保存された残基のパーセンテージを指す。５’もしくは３’において伸長もしくは挿入されていても（核酸の場合）、またはＮ’もしくはＣ’において伸長もしくは挿入されていても（ポリペプチドの場合）、同一性または類似性は低下しない。アラインメントを行うための方法及びコンピュータープログラムは、当該技術分野において周知である。概して、２つの配列間の類似性が所与であることにより、これらの配列間の同一性が、類似性と少なくとも等しく、例えば、２つの配列が、互いに８０％類似している場合には、それらの配列の同一性は、８０％以上のはずであるうえに、その同一性は、９０％である場合もあることが暗示される。
【0039】
本明細書で定義する場合、「相同性、類似性または同一性が少なくとも７０％」という用語は、本開示全体を通じて、相同性、類似性または同一性が少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％であることを意味する。
【0040】
「同一性」及び「相同性」という用語は、本明細書では、同義と理解してよい。
【0041】
ＳＯＲＬＡミニ受容体
本明細書に記載されているＳＯＲＬＡミニ受容体は、ＳＯＲＬＡの細胞質尾部、膜貫通領域、及び内腔領域の一部、すなわちＦＮＩＩＩカセットドメインを含む。
本明細書に記載されているＳＯＲＬＡミニ受容体は、ＳＯＲＬＡの細胞質尾部、膜貫通領域、及び内腔領域の一部、すなわちＦＮＩＩＩカセットドメインを含む。
【0042】
図１に示されているように、そのミニ受容体は、ＳＯＲＬＡの１つ以上のＦｎＩＩＩドメイン（例えば、６個すべてのＦｎＩＩドメイン）を含むポリペプチドＱ１、ＳＯＲＬＡの膜貫通ドメインを含むか、もしくはそのドメインからなるポリペプチドＱ２、及びＳＯＲＬＡの細胞質尾部ドメインを含むか、もしくはそのドメインからなるポリペプチドＱ３を含むか、またはそれらからなり、これらのポリペプチドは、ポリペプチドＰと総称する場合もある。
【0043】
任意に、そのミニ受容体は、タグ、例えばＦＬＡＧタグを含んでよい。
【0044】
内腔領域にあり、他の内腔タンパク質と相互作用するＦＮＩＩＩカセットは、そのＳＯＲＬＡミニ受容体の機能特性にとって重要である。すなわち、そのＳＯＲＬＡミニ受容体は、例えば実施例１～６におけるように、ＳＯＲＬＡ－３Ｆｎミニ受容体という場合もある（３ＦＮは、ＦＮＩＩＩカセットの略称である）。そのＳＯＲＬＡミニ受容体を発現する対応のヌクレオチド配列は、ＳＯＲＬ１－３Ｆｎという場合もあり、ＳＯＲＬ１ミニ遺伝子という場合もある。さらに、この文章全体を通じて、かつ本開示に関しては、ＳＯＲＬＡミニ受容体は、単にミニ受容体という場合もある。実施例１～６では、ＳＯＲＬ１－ＷＴまたはＳｏｒＬＡ－ｗｔという呼称は、完全長ＳＯＲＬ１のヌクレオチド配列または完全長ＳｏｒＬＡのタンパク質を指す。すなわち、本発明のミニ受容体またはミニ遺伝子は、完全長の受容体または遺伝子と比較されている。
【0045】
あるいは、上記のＳＯＲＬＡミニ受容体は、本開示では、例えば実施例７～８におけるように、ＦＬＡＧ－ｍｉｎｉ－ＷＴという場合もある。実施例７～８では、樹立したミニ受容体またはミニ受容体（ＦＬＡＧ－ｍｉｎｉ－ＷＴ）は、変異させたミニ受容体バリアント（ＦＬＡＧ－ｍｉｎｉ－ＦＡＮＳＨＹという）と比較されており、その変異は、細胞質尾部内のＦＡＮＳＨＹモチーフに導入されている。
【0046】
一態様では、本発明は、発現時に、ポリペプチドＰをコードするポリヌクレオチドコンストラクトであって、そのポリヌクレオチドが、
ａ．発現時に、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５及び配列番号１６からなる群から選択した１つ以上のアミノ酸配列、または配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５もしくは配列番号１６の前記アミノ酸配列と少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９９％同一であるその生物学的に活性な配列バリアントを含むか、あるいはその配列からなる第１のポリペプチドＱ１をコードする第１のポリヌクレオチドと、
ｂ．発現時に、配列番号１７のアミノ酸配列、もしくは配列番号１７と少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９９％同一である配列を含むか、またはその配列からなる第２のポリペプチドＱ２をコードする第２のポリヌクレオチドと、
ｃ．発現時に、配列番号１８のアミノ酸配列、もしくは配列番号１８と少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９９％同一である配列を含むか、またはその配列からなる第３のポリペプチドＱ３をコードする第３のポリヌクレオチドと、
を含むか、あるいはそれらからなり、
そのポリペプチドＰが、７００アミノ酸以下を含むポリヌクレオチドコンストラクトに関するものである。
ａ．発現時に、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５及び配列番号１６からなる群から選択した１つ以上のアミノ酸配列、または配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５もしくは配列番号１６の前記アミノ酸配列と少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９９％同一であるその生物学的に活性な配列バリアントを含むか、あるいはその配列からなる第１のポリペプチドＱ１をコードする第１のポリヌクレオチドと、
ｂ．発現時に、配列番号１７のアミノ酸配列、もしくは配列番号１７と少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９９％同一である配列を含むか、またはその配列からなる第２のポリペプチドＱ２をコードする第２のポリヌクレオチドと、
ｃ．発現時に、配列番号１８のアミノ酸配列、もしくは配列番号１８と少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９９％同一である配列を含むか、またはその配列からなる第３のポリペプチドＱ３をコードする第３のポリヌクレオチドと、
を含むか、あるいはそれらからなり、
そのポリペプチドＰが、７００アミノ酸以下を含むポリヌクレオチドコンストラクトに関するものである。
【0047】
相当数のヌクレオチドを、第１のポリヌクレオチド、第２のポリヌクレオチド及び／または第３のヌクレオチドの上流及び／または下流（ポリヌクレオチドの５’末端及び／またはポリヌクレオチドの３’末端）に付加してよいことは当業者には明らかであろう。この付加は、そのコンストラクトを最適化するために、例えば、コードされるポリヌクレオチド（すなわち、本発明のポリヌクレオチドＰ）の転写及び／または翻訳、パッケージング効率、あるいは特性を最適化するために行うことができる。本発明のポリペプチドＰは、７００アミノ酸以下を含むので、そのポリヌクレオチドコンストラクト内の追加のヌクレオチドの量は、総数２１００ヌクレオチドに限られる。
【0048】
本開示のいくつかの実施形態では、その第１のポリヌクレオチド、第２のポリヌクレオチド及び／または第３のポリヌクレオチドは、３’末端及び／または５’末端に、さらなるヌクレオチド、例えば１個のさらなるヌクレオチド、例えば２個のさらなるヌクレオチド、例えば３個のさらなるヌクレオチド、例えば４個のさらなるヌクレオチド、例えば５個のさらなるヌクレオチド、例えば６個のさらなるヌクレオチド、例えば７個のさらなるヌクレオチド、例えば８個のさらなるヌクレオチド、例えば９個のさらなるヌクレオチド、例えば１０個のさらなるヌクレオチド、例えば１１個のさらなるヌクレオチド、例えば１２個のさらなるヌクレオチド、例えば１３個のさらなるヌクレオチド、例えば１４個のさらなるヌクレオチド、例えば１５個のさらなるヌクレオチド、例えば１６個のさらなるヌクレオチド、例えば１７個のさらなるヌクレオチド、例えば１８個のさらなるヌクレオチド、例えば１９個のさらなるヌクレオチド、例えば２０個のさらなるヌクレオチド、例えば２１個のさらなるヌクレオチド、例えば２２個のさらなるヌクレオチド、例えば２３個のさらなるヌクレオチド、例えば２４個のさらなるヌクレオチド、例えば２５個のさらなるヌクレオチド、例えば２６個のさらなるヌクレオチド、例えば２７個のさらなるヌクレオチド、例えば２８個のさらなるヌクレオチド、例えば２９個のさらなるヌクレオチド、例えば３０個のさらなるヌクレオチド、例えば３１個のさらなるヌクレオチド、例えば３２個のさらなるヌクレオチド、例えば３３個のさらなるヌクレオチドを含む。
【0049】
その１つ以上のさらなるヌクレオチドは、いずれかの既知の種類のヌクレオチドであってよい。
【0050】
本発明のいくつかの実施形態では、そのポリヌクレオチドコンストラクトは、発現時に、第１のポリペプチドＱ１、第２のポリペプチドＱ２及び第３のポリペプチドＱ３を含む融合タンパク質をコードする。
【0051】
代替的な態様では、本発明は、
ａ．発現時に、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５及び配列番号１６からなる群から選択した１つ以上のアミノ酸配列、もしくは配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５及び配列番号１６の前記アミノ酸配列と少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９９％同一であるその生物学的に活性な配列バリアントを含むか、またはその配列からなる第１のポリペプチドＱ１を含むか、あるいはそのポリペプチドＱ１からなるポリペプチドＰをコードする第１のポリヌクレオチドと、
ｂ．発現時に、配列番号１７のアミノ酸配列、もしくは配列番号１７と少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９９％同一である配列を含むか、またはその配列からなる第２のポリペプチドＱ２をコードする第２のポリヌクレオチドと、
ｃ．発現時に、配列番号１８のアミノ酸配列、もしくは配列番号１８と少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９９％同一である配列を含むか、またはその配列からなる第３のポリペプチドＱ３をコードする第３のポリヌクレオチドと、
を含むポリヌクレオチドコンストラクトに関するものであり、
そのポリペプチドＰは、７００アミノ酸以下を含む。
ａ．発現時に、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５及び配列番号１６からなる群から選択した１つ以上のアミノ酸配列、もしくは配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５及び配列番号１６の前記アミノ酸配列と少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９９％同一であるその生物学的に活性な配列バリアントを含むか、またはその配列からなる第１のポリペプチドＱ１を含むか、あるいはそのポリペプチドＱ１からなるポリペプチドＰをコードする第１のポリヌクレオチドと、
ｂ．発現時に、配列番号１７のアミノ酸配列、もしくは配列番号１７と少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９９％同一である配列を含むか、またはその配列からなる第２のポリペプチドＱ２をコードする第２のポリヌクレオチドと、
ｃ．発現時に、配列番号１８のアミノ酸配列、もしくは配列番号１８と少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９９％同一である配列を含むか、またはその配列からなる第３のポリペプチドＱ３をコードする第３のポリヌクレオチドと、
を含むポリヌクレオチドコンストラクトに関するものであり、
そのポリペプチドＰは、７００アミノ酸以下を含む。
【0052】
本開示のいくつかの実施形態では、Ｐは、
ａ．配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５及び配列番号１６のアミノ酸配列を含むか、もしくはその配列からなる、ＳｏｒＬＡのＦｎＩＩＩカセット、あるいは
ＦｎＩＩＩ－１、ＦｎＩＩＩ－２、ＦｎＩＩＩ－３、ＦｎＩＩＩ－４、ＦｎＩＩＩ－５もしくはＦｎＩＩＩ－６から選択したＦｎＩＩＩドメインであって、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５もしくは配列番号１６のアミノ酸配列に対応する前記ＦｎＩＩＩドメイン、またはこれらのいずれかの組み合わせと、
ｂ．配列番号１７のアミノ酸配列を含むか、またはその配列からなる、ＳｏｒＬＡの膜貫通ドメインと、
ｃ．配列番号１８のアミノ酸配列を含むか、またはその配列からなる、ＳｏｒＬＡの細胞質尾部ドメインと、
を含むか、あるいはそれらからなる。
ａ．配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５及び配列番号１６のアミノ酸配列を含むか、もしくはその配列からなる、ＳｏｒＬＡのＦｎＩＩＩカセット、あるいは
ＦｎＩＩＩ－１、ＦｎＩＩＩ－２、ＦｎＩＩＩ－３、ＦｎＩＩＩ－４、ＦｎＩＩＩ－５もしくはＦｎＩＩＩ－６から選択したＦｎＩＩＩドメインであって、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５もしくは配列番号１６のアミノ酸配列に対応する前記ＦｎＩＩＩドメイン、またはこれらのいずれかの組み合わせと、
ｂ．配列番号１７のアミノ酸配列を含むか、またはその配列からなる、ＳｏｒＬＡの膜貫通ドメインと、
ｃ．配列番号１８のアミノ酸配列を含むか、またはその配列からなる、ＳｏｒＬＡの細胞質尾部ドメインと、
を含むか、あるいはそれらからなる。
【0053】
本開示のいくつかの実施形態では、Ｐは、６８５アミノ酸以下である。
【0054】
場合によっては、タグを含む、本発明のミニ受容体コンストラクトを発現させるのが有益であることもある。当業者は、最も適切なタグを選択するとともに、そのタグの位置を定めることができるであろう。タグは、例えば、ＦＬＡＧタグ（例えば、実施例７～８では、ＦＬＡＧ－ｍｉｎｉという）、ｍｙｃタグ（例えば、実施例７～８では、ｍｉｎｉ－ｍｙｃという）、ＧＦＰタグ、またはＶｅｎｕｓ蛍光タンパク質タグ（例えば、実施例８で使用した）であってよい。
【0055】
そのタグは例えば、そのコンストラクトのＮ末端またはＣ末端の位置に定めてよい。いくつかの事例では、そのコンストラクトのＮ末端にタグの位置を定めて、Ｃ末端を非修飾のままにすることで、そのコンストラクトのＣ末端領域に結合している他の分子、例えば、その細胞質尾部に結合しているレトロマーとの結合のいずれにも、影響が及ぶ可能性がないようにするのが有益なことがある。
【0056】
タグの利用は、そのコンストラクトをｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで追跡して、そのコンストラクトの局在を確認する際に有益であることがある。他の事例、例えば臨床現場では、例えばアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の媒介により、そのコンストラクトを患者の細胞にトランスフェクションするときに、免疫原性応答を誘発する可能性がある不必要なタンパク質部分がいずれも導入されないように、いずれのタグも省くのが有益なことがある。
【0057】
本開示のいくつかの好ましい実施形態では、そのミニ受容体は、いずれのタグも含まない。
【0058】
本開示のいくつかの実施形態では、Ｐは、配列番号２１のアミノ酸配列をさらに含む。
【0059】
本開示のいくつかの実施形態では、Ｐは、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１８のアミノ酸配列を含むか、またはその配列からなる。
【0060】
本開示のいくつかの実施形態では、Ｐは、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８及び配列番号２１のアミノ酸配列を含むか、またはその配列からなる。
【0061】
本開示のいくつかの実施形態では、完全長ＳＯＲＬＡタンパク質とは対照的に、そのコンストラクトは、ＣＲクラスタードメイン、ＹＷＴＤドメイン、Ｖｐｓ１０ｐドメイン及び／またはプロペプチドを含まない。
【0062】
本開示のいくつかの実施形態では、完全長ＳＯＲＬＡタンパク質とは対照的に、そのコンストラクトは、ＣＲクラスタードメインを含まない。
【0063】
本開示のいくつかの実施形態では、完全長ＳＯＲＬＡタンパク質とは対照的に、そのコンストラクトは、ＹＷＴＤドメインを含まない。
【0064】
本開示のいくつかの実施形態では、完全長ＳＯＲＬＡタンパク質とは対照的に、そのコンストラクトは、Ｖｐｓ１０ｐドメインを含まない。
【0065】
本開示のいくつかの実施形態では、完全長ＳＯＲＬＡタンパク質とは対照的に、そのコンストラクトは、プロペプチドを含まない。
【0066】
別の態様では、本発明は、
ａ．配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５及び配列番号１６からなる群から選択した１つ以上のアミノ酸配列、または配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５もしくは配列番号１６の前記アミノ酸配列と少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９９％同一であるその生物学的に活性な配列バリアントを含むか、あるいはその配列からなる第１のポリペプチドＱ１と、
ｂ．配列番号１７のアミノ酸配列、もしくは配列番号１７と少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９９％同一である配列を含むか、またはその配列からなる第２のポリペプチドＱ２と、
ｃ．配列番号１８のアミノ酸配列、もしくは配列番号１８と少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９９％同一である配列を含むか、またはその配列からなる第３のポリペプチドＱ３と、
を含むか、あるいはそれらからなるポリペプチドＰであって、
７００アミノ酸以下を含むポリペプチドＰに関するものである。
ａ．配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５及び配列番号１６からなる群から選択した１つ以上のアミノ酸配列、または配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５もしくは配列番号１６の前記アミノ酸配列と少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９９％同一であるその生物学的に活性な配列バリアントを含むか、あるいはその配列からなる第１のポリペプチドＱ１と、
ｂ．配列番号１７のアミノ酸配列、もしくは配列番号１７と少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９９％同一である配列を含むか、またはその配列からなる第２のポリペプチドＱ２と、
ｃ．配列番号１８のアミノ酸配列、もしくは配列番号１８と少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９９％同一である配列を含むか、またはその配列からなる第３のポリペプチドＱ３と、
を含むか、あるいはそれらからなるポリペプチドＰであって、
７００アミノ酸以下を含むポリペプチドＰに関するものである。
【0067】
本開示のいくつかの実施形態では、その第１のポリペプチドＱ１、第２のポリペプチドＱ２及び／または第３のポリペプチドＱ３は、さらなるアミノ酸、例えば１個のさらなるアミノ酸、例えば２個のさらなるアミノ酸、例えば３個のさらなるアミノ酸、例えば４個のさらなるアミノ酸、例えば５個のさらなるアミノ酸、例えば６個のさらなるアミノ酸、例えば７個のさらなるアミノ酸、例えば８個のさらなるアミノ酸、例えば９個のさらなるアミノ酸、例えば１０個のさらなるアミノ酸、例えば１１個のさらなるアミノ酸、例えば１２個のさらなるアミノ酸、例えば１３個のさらなるアミノ酸、例えば１４個のさらなるアミノ酸、例えば１５個のさらなるアミノ酸、例えば１６個のさらなるアミノ酸、例えば１７個のさらなるアミノ酸、例えば１８個のさらなるアミノ酸、例えば１９個のさらなるアミノ酸、例えば２０個のさらなるアミノ酸、例えば２１個のさらなるアミノ酸、例えば２２個のさらなるアミノ酸、例えば２３個のさらなるアミノ酸、例えば２４個のさらなるアミノ酸、例えば２５個のさらなるアミノ酸、例えば２６個のさらなるアミノ酸、例えば２７個のさらなるアミノ酸、例えば２８個のさらなるアミノ酸、例えば２９個のさらなるアミノ酸、例えば３０個のさらなるアミノ酸、例えば３１個のさらなるアミノ酸、例えば３２個のさらなるアミノ酸、例えば３３個のさらなるアミノ酸を含む。
【0068】
この１つ以上のさらなるアミノ酸は、いずれかの既知の種類のアミノ酸であってよい。
【0069】
本開示のいくつかの実施形態では、そのポリペプチドＰは、ポリペプチドＱ１、Ｑ２及び／またはＱ３の融合タンパク質である。
【0070】
本開示のいくつかの実施形態では、ポリペプチドＱ１、ポリペプチドＱ２及びポリペプチドＱ３の間に、さらなるアミノ酸からなるリンカーが存在する。
【0071】
本開示のいくつかの実施形態では、ポリペプチドＰは、
ａ．配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５及び配列番号１６のアミノ酸配列を含むか、もしくはその配列からなる、ＳｏｒＬＡのＦｎＩＩＩカセット、または
ｂ．ＦｎＩＩＩ－１、ＦｎＩＩＩ－２、ＦｎＩＩＩ－３、ＦｎＩＩＩ－４、ＦｎＩＩＩ－５もしくはＦｎＩＩＩ－６から選択したＦｎＩＩＩドメインであって、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５もしくは配列番号１６のアミノ酸配列に対応する前記ＦｎＩＩＩドメイン、またはこれらのいずれかの組み合わせと、
ｃ．配列番号１７のアミノ酸配列を含むか、またはその配列からなる、ＳｏｒＬＡの膜貫通ドメインと、
ｄ．配列番号１８のアミノ酸配列を含むか、またはその配列からなる、ＳｏｒＬＡの細胞質尾部ドメインと、
を含むか、あるいはそれらからなる。
ａ．配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５及び配列番号１６のアミノ酸配列を含むか、もしくはその配列からなる、ＳｏｒＬＡのＦｎＩＩＩカセット、または
ｂ．ＦｎＩＩＩ－１、ＦｎＩＩＩ－２、ＦｎＩＩＩ－３、ＦｎＩＩＩ－４、ＦｎＩＩＩ－５もしくはＦｎＩＩＩ－６から選択したＦｎＩＩＩドメインであって、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５もしくは配列番号１６のアミノ酸配列に対応する前記ＦｎＩＩＩドメイン、またはこれらのいずれかの組み合わせと、
ｃ．配列番号１７のアミノ酸配列を含むか、またはその配列からなる、ＳｏｒＬＡの膜貫通ドメインと、
ｄ．配列番号１８のアミノ酸配列を含むか、またはその配列からなる、ＳｏｒＬＡの細胞質尾部ドメインと、
を含むか、あるいはそれらからなる。
【0072】
本開示のいくつかの実施形態では、Ｐは、６８５アミノ酸以下である。
【0073】
本開示のいくつかの実施形態では、ポリペプチドＰは、配列番号２１のアミノ酸配列をさらに含む。
【0074】
本開示のいくつかの実施形態では、ポリペプチドＰは、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１８のアミノ酸配列を含むか、またはその配列を含む。
【0075】
本開示のいくつかの実施形態では、ポリペプチドＰは、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８及び配列番号２１のアミノ酸配列を含むか、またはその配列を含む。
【0076】
別の態様では、本発明は、前記ポリヌクレオチドコンストラクトを含むか、及び／または前記ポリペプチドＰをコードするベクターに関するものである。
【0077】
本開示のいくつかの実施形態では、そのベクターは、ウイルスベクター、プラスミド、コスミド及び人工染色体からなる群から選択したものである。
【0078】
本開示のいくつかの実施形態では、そのベクターは、プラスミドベクターである。
【0079】
本開示のいくつかの実施形態では、そのベクターは、ウイルスベクターである。
【0080】
本開示のいくつかの実施形態では、そのベクターは、パッケージング能力が１～４０ｋｂ、例えば１～３０ｋｂ、例えば１～２０ｋｂ、例えば１～１５ｋｂ、例えば１～１０、例えば１～８ｋｂ、例えば２～７ｋｂ、例えば３～６ｋｂ、例えば４～５ｋｂである。
【0081】
本開示のいくつかの実施形態では、そのウイルスベクターは、アデノ随伴ベクター（ＡＡＶ）、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター及びレトロウイルスベクターからなる群から選択したものである。
【0082】
本開示のいくつかの実施形態では、そのウイルスベクターは、アデノ随伴ベクター（ＡＡＶ）である。
【0083】
本開示のいくつかの実施形態では、そのウイルスベクターは、ＡＡＶ９ベクターである。
【0084】
本開示のいくつかの好ましい実施形態では、そのウイルスベクターは、ＡＡＶ９ベクターである。
【0085】
本開示のいくつかの実施形態では、そのベクターは、パッケージング能力が４．７ｋｂであるアデノ随伴ベクター（ＡＡＶ）である。
【0086】
本開示のいくつかの実施形態では、そのベクターは、パッケージング能力が５ｋｂ未満であるアデノ随伴ベクター（ＡＡＶ）である。
【0087】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、パッケージング能力が限られていることは当業者には明らかであろう。パッケージング過剰は、例えば、発現に有害であるか、または発現の成功が限定され、ウイルス力価及びｉｎ ｖｉｖｏトランスダクションの両方を低減させる可能性がある。ＡＡＶベクターのパッケージングを最適化する努力がなされているが、本明細書に開示されている発明は、ＳＯＲＬ１ミニ遺伝子を確立することによって、その問題に対する解決策を提供し、このミニ遺伝子は、６０００ヌクレオチド長を超える完全長ＳＯＲＬ１遺伝子の代わりに、ＡＡＶベクターにパッケージングできる。ＡＡＶベクターは概して、パッケージング能力が４７００ヌクレオチド～５０００ヌクレオチド前後であるとされている。加えて、ＳＯＲＬ１ミニ遺伝子から転写されるＳＯＲＬＡミニ受容体はさらに、本発明に含まれる下記の実施例に記載されているような有益な特性を有する。
【0088】
ヒトＳＯＲＬＡは、ＵｎｉＰｒｏｔにおいて、Ｑ９２６７３というアクセッション番号で、２２１４アミノ酸のタンパク質としてアノテーションされている。このタンパク質は、そのタンパク質を発現／コードする６６４２以上のヌクレオチドに対応する。発現には、さらに上流または下流の配列が必要となることもある。すなわち、完全長ＳＯＲＬ１は、ＡＡＶベクターにパッケージングするには長すぎる。本発明のミニ遺伝子は、この問題を解決する。
【0089】
代替的な態様では、本発明は、前記ポリヌクレオチドコンストラクトを含むＡＡＶベクターに関するものである。
【0090】
さらに代替的な態様では、本発明は、前記ポリヌクレオチドコンストラクトを含むＡＡＶ９ベクターに関するものである。
【0091】
さらなる態様では、本発明は、前記コンストラクト及び／または前記ポリペプチドＰ及び／またはベクターを含む細胞に関するものである。
【0092】
本開示のいくつかの実施形態では、その細胞は、真核細胞、好ましくは哺乳動物細胞、より好ましくは霊長類動物細胞、より好ましくはヒト細胞からなる群から選択したものである。
【0093】
本開示のいくつかの実施形態では、その細胞は、哺乳動物細胞である。
【0094】
本開示のいくつかの実施形態では、その細胞は、神経細胞である。
【0095】
さらなる態様では、本発明は、前記コンストラクト、ポリペプチドＰ、ベクター及び／または細胞を含む組成物に関するものである。
【0096】
本開示のいくつかの実施形態では、その組成物は、医薬組成物である。
【0097】
本開示のいくつかの実施形態では、その組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む。
【0098】
さらなる態様では、本発明は、医薬で使用するための前記コンストラクト、ポリペプチドＰ、ベクター、細胞及び／または組成物に関するものである。
【0099】
さらなる態様では、本発明は、アルツハイマー病、またはアルツハイマー病と関連する疾患もしくは障害を治療、予防及び／または緩和する際に使用するための前記コンストラクト、ポリペプチドＰ、ベクター、細胞及び／または組成物に関するものである。
【0100】
本開示のいくつかの実施形態では、そのアルツハイマー病は、早発型アルツハイマー病、晩期発症型アルツハイマー病及び家族性アルツハイマー病からなる群から選択した種類のものである。
【0101】
ＡＤを発現するリスクがある個体の治療で、本発明を使用できることは当業者には明らかであろう。例えば、ＡＤを発現するリスクがある個体は、ＡＤであると診断または認識された血縁者がいる個体であってよい。
【0102】
代替的な態様では、本発明は、アルツハイマー病を発現するリスクがある個体において、アルツハイマー病、またはアルツハイマー病と関連する疾患もしくは障害を治療及び／または予防する際に使用するための前記コンストラクト、ポリペプチド、ベクター、細胞及び／または組成物に関するものである。
【0103】
本明細書に開示されている発明を用いて、ＡＤ患者において、ＡＤを予防したり、及び／またはＡＤを治療したり、及び／またはＡＤの症状を緩和したりできることは当業者には明らかであろう。ＡＤは、構造レベルで脳に影響を及ぼす重篤な疾患である。したがって、早期、例えば、症状発現の前もしくはＡＤ初期に、または脳構造の実質的なリモデリング前に、本発明のＳＯＲＬ１ミニ遺伝子を供給する（例えばＡＡＶベクターを介して、本発明のＳＯＲＬＡミニ受容体を発現させる）のが有益であることがある。例えば、本明細書に開示されているアプローチは、ＡＤ患者の家族を疾患発現前に治療するのに適用可能であろう。
【0104】
本開示のいくつかの実施形態では、前記コンストラクト、ベクター、細胞及び／または組成物は、ＡＤの症状発現前の個体に投与する。
【0105】
本開示のいくつかの実施形態では、前記コンストラクト、ベクター、細胞及び／または組成物は、ＡＤの症状発現前の個体に投与する。
【0106】
本開示のいくつかの実施形態では、前記コンストラクト、ベクター、細胞及び／または組成物は、家族がＡＤと診断された個体に投与する。
【0107】
あるいは、本明細書に開示されている発明は、初期症状がある患者を治療するのに適用可能であろう。
【0108】
本開示のいくつかの実施形態では、前記コンストラクト、ベクター、細胞及び／または組成物は、ＡＤの初期症状がある個体に投与する。
【0109】
あるいは、本明細書に開示されている発明は、様々な病期のＡＤである患者を治療するのに適用可能であろう。
【0110】
本開示のいくつかの実施形態では、前記コンストラクト、ベクター、細胞及び／または組成物は、ＡＤの様々な程度の症状がある個体に投与する。
【0111】
さらに、本明細書に開示されている発明は、ＳＯＲＬＡの生理機能を回復させるその性質から、ＡＤ後期の患者を治療するのに適用可能である。
【0112】
本開示のいくつかの実施形態では、前記コンストラクト、ベクター、細胞及び／または組成物は、ＡＤ後期の患者に投与する。
【0113】
本開示のいくつかの実施形態では、前記コンストラクト、ベクター、細胞及び／または組成物は、その個体の血縁者がアルツハイマー病と診断されたときに、前記個体に投与する。
【0114】
本開示のいくつかの実施形態では、前記コンストラクト、ベクター、細胞及び／または組成物は、その個体の血縁者が、アルツハイマー病に罹患しているか、または罹患したことがあると分かったときに、前記個体に投与する。
【0115】
例えば、その個体の血縁者が臨床医の診断を受けたときに、前記血縁者がＡＤに罹患していると分かることがある。あるいは、例えば、他の情報源、例えば、家族の記録または記憶から情報を得ることによって、前記個体の血縁者がアルツハイマー病に罹患しているか、または罹患したことがあると分かることがある。
【0116】
個体の血縁者は、その個体の家族として理解してよい。
【0117】
個体の血縁者は、前記個体と遺伝物質を共有している者として理解してよい。
【0118】
例えば、個体の血縁者は、曽祖母である。
【0119】
例えば、個体の血縁者は、曽祖父である。
【0120】
例えば、個体の血縁者は、祖母である。
【0121】
例えば、個体の血縁者は、祖父である。
【0122】
例えば、個体の血縁者は、母親である。
【0123】
例えば、個体の血縁者は、父親である。
【0124】
例えば、個体の血縁者は、同胞である。
【0125】
例えば、個体の血縁者は、兄弟である。
【0126】
例えば、個体の血縁者は、娘である。
【0127】
例えば、個体の血縁者は、息子である。
【0128】
本開示のいくつかの実施形態では、前記コンストラクト、ベクター、細胞及び／または組成物は、その個体の家族の１人以上がアルツハイマー病に罹患していることが確定したら、前記個体に投与する。
【0129】
本開示のいくつかの実施形態では、前記コンストラクト、ベクター、細胞及び／または組成物は、その個体の家族の１人以上がアルツハイマー病に罹患していることが確定したら、前記個体に投与する。
【0130】
ＡＤを発現するリスクは、遺伝する可能性があることは、当業者には明らかであろう。ＡＤを発現するリスクがある個体、例えば、血縁者がＡＤと診断されたときにリスクがある個体に、前記コンストラクト、ベクター、細胞及び／または組成物を投与すると、例えば、疾患発現の前に、ＡＤが予防されたり、ＡＤの症状が低減されたりする可能性が得られることは、当業者には明らかであろう。
【0131】
さらなる態様では、本発明は、アルツハイマー病、またはアルツハイマー病と関連する疾患もしくは障害を治療する方法であって、それを必要とする個体に、前記コンストラクト、ポリペプチドＰ、ベクター、細胞及び／または組成物を投与することを含む方法に関するものである。
【0132】
さらなる態様では、本発明は、アルツハイマー病、またはアルツハイマー病と関連する疾患もしくは障害を治療、予防及び／または緩和するための医薬を製造するために、前記コンストラクト、ポリペプチドＰ、ベクター、細胞及び／または組成物を使用することに関するものである。
【0133】
さらなる態様では、本発明は、細胞内のｓＡＰＰαを増加させる方法であって、細胞に、本発明のポリヌクレオチドコンストラクト、本発明のベクター、本発明のポリペプチドＰ及び／または本発明の組成物を導入することで、前記細胞内のｓＡＰＰαを増加させることを含む方法に関するものである。
【0134】
さらなる態様では、本発明は、細胞内のＡβ３８、Ａβ４０及び／またはＡβ４２を減少させる方法であって、細胞に、本発明のポリヌクレオチドコンストラクト、本発明のベクター、本発明のポリペプチドＰ及び／または本発明の組成物を導入することで、前記細胞内のＡβ３８、Ａβ４０及び／またはＡβ４２を減少させることを含む方法に関するものである。
【0135】
当業者は、本発明のポリヌクレオチドコンストラクト、本発明のベクター、本発明のポリペプチドＰ及び／または本発明の組成物を細胞に導入するのに利用可能な選択肢を選択できるであろう。例えば、ウイルストランスフェクションを使用してよい。
【0136】
本発明のいくつかの実施形態では、前記細胞は、神経細胞である。
【0137】
本発明のいくつかの実施形態では、前記方法は、ｉｎ ｖｉｖｏ法である。
【0138】
本発明のいくつかの実施形態では、前記方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ法である。
【実施例】
【0139】
実施例１：ＳＯＲＬＡミニ受容体の作製
目的
この実施例では、ＳＯＲＬＡ－３Ｆｎミニ受容体の作製を例示する。
目的
この実施例では、ＳＯＲＬＡ－３Ｆｎミニ受容体の作製を例示する。
【0140】
材料及び方法
このミニ受容体コンストラクトは、１回のＰＣＲ反応（Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ ＩＩ Ｆｕｓｉｏｎ）の後に、制限酵素による消化を行ってから、ライゲーションすることによって作製した。プライマー対（Ｆｗｄ：５’－ＣＡＧＧＡＴＣＣＧＡＣＴＡＣＡＡＧＧＡＣＣＡＣＧＡＣＧＧＣＧＡＣＴＡＣＡＡＧＧＡＣＣＡＣＧＡＣＡＴＣＧＡＣＴＡＣＡＡＧＧＡＣＧＡＣＧＡＣＧＡＣＡＡＧＧＡＧＴＴＧＡＣＴＧＴＧＴＡＣＡＡＡＧＴＡＣＡＧ－３’及びｒｅｖ：５’－ＧＴＧＡＡＴＴＣＴＣＡＧＧＣＴＡＴＣＡＣＣＡＴＧＧ－３’）を用いて、Ｇｌｕ１５５２の下流のヒトＳＯＲＬ１断片を終止コドンまで増幅した。すなわち、最終的なアンプリコンには、５’のＢａｍＨＩ制限部位と３’のＥｃｏＲＩ制限部位に挟まれた配列であって、ＦＬＡＧタグ（３ｘ）、（６個のフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮＩＩＩまたはＦＮ３）リピートの３Ｆｎカセット、膜貫通領域、及び細胞質尾部用の配列が含まれていた。最後に、そのミニ受容体のＰＣＲ産物をＰｓｅｃｔａｇ２Ｂ発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に、ＢａｍＨＩ制限部位とＥｃｏＲＩ制限部位との間にクローニングして、マウスＩｇκ－鎖Ｖ－Ｊ２－Ｃシグナルペプチドとインフレームになるようにした。そのアンプリコンの発現産物（ＳＯＲＬＡミニ受容体）は、完全長（野生型）ＳＯＲＬＡと比較した形で、図１に示されている。そのベクターは、図２に示されている。
このミニ受容体コンストラクトは、１回のＰＣＲ反応（Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ ＩＩ Ｆｕｓｉｏｎ）の後に、制限酵素による消化を行ってから、ライゲーションすることによって作製した。プライマー対（Ｆｗｄ：５’－ＣＡＧＧＡＴＣＣＧＡＣＴＡＣＡＡＧＧＡＣＣＡＣＧＡＣＧＧＣＧＡＣＴＡＣＡＡＧＧＡＣＣＡＣＧＡＣＡＴＣＧＡＣＴＡＣＡＡＧＧＡＣＧＡＣＧＡＣＧＡＣＡＡＧＧＡＧＴＴＧＡＣＴＧＴＧＴＡＣＡＡＡＧＴＡＣＡＧ－３’及びｒｅｖ：５’－ＧＴＧＡＡＴＴＣＴＣＡＧＧＣＴＡＴＣＡＣＣＡＴＧＧ－３’）を用いて、Ｇｌｕ１５５２の下流のヒトＳＯＲＬ１断片を終止コドンまで増幅した。すなわち、最終的なアンプリコンには、５’のＢａｍＨＩ制限部位と３’のＥｃｏＲＩ制限部位に挟まれた配列であって、ＦＬＡＧタグ（３ｘ）、（６個のフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮＩＩＩまたはＦＮ３）リピートの３Ｆｎカセット、膜貫通領域、及び細胞質尾部用の配列が含まれていた。最後に、そのミニ受容体のＰＣＲ産物をＰｓｅｃｔａｇ２Ｂ発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に、ＢａｍＨＩ制限部位とＥｃｏＲＩ制限部位との間にクローニングして、マウスＩｇκ－鎖Ｖ－Ｊ２－Ｃシグナルペプチドとインフレームになるようにした。そのアンプリコンの発現産物（ＳＯＲＬＡミニ受容体）は、完全長（野生型）ＳＯＲＬＡと比較した形で、図１に示されている。そのベクターは、図２に示されている。
【0141】
次に、Ｎ２ａ細胞に、そのミニ受容体コードするベクターをトランスフェクションして、そのコンストラクトが正しく発現されることを確認した。続いて、そのトランスフェクションしたＮ２ａ細胞の溶解液を回収し、ＳＯＲＬＡのエクトドメイン（細胞外ドメイン、ＳＯＲＬ１－ＷＴまたはＳＯＲＬ１－３Ｆｎのそれぞれのタンパク質産物を標的とする）を認識する抗体、及びβ－アクチンを認識する抗体を用いたＷＢによって、タンパク質を解析した（図４）。
【0142】
加えて、いくつかのソフトウェア（ＰｓｉＰｒｅｄ、ＳＳｐｒｏ Ｓｃｒａｔｃｈ及びＹａｓｐｉｎ）を用いて、個々のＳＯＲＬＡ ３Ｆｎモジュールのドメイン境界をｉｎ ｓｉｌｉｃｏで求めて、二次構造を予測した。その後、その６個の３Ｆｎドメインのアラインメントを、それらの高度に保存された二次構造、及びほとんど保存されていないアミノ酸に基づいて行った（図３Ｃ）。図３Ａには、３Ｆｎドメインの二次構造が可視化されている。図３Ｂには、保存されたアミノ酸を有する概略的な構造が示されている。
【0143】
本明細書に記載されている例では、そのミニ受容体が、例えば、そのミニ受容体を、確立初期及び概念実証段階の際に利便的な方法で追跡できるＦＬＡＧ－タグを含むように構築されていることに留意されたい。タグが不要であるかまたは望まれない状況で用いるために、例えば、そのミニ受容体を治療現場で使用するときに、例えば、ウイルスベクターを介して、患者の細胞内で発現させるときに、いずれのタグも使用せずに（または代わりのタグを用いて）、ミニ受容体を確立するための手法のうち、本明細書に記載されている手法を当業者は利用できるであろう。
【0144】
完全なミニ受容体コンストラクトのＤＮＡ配列：
ＢａｍＨＩ＋３×ＦＬＡＧタグ＋６×ＦＮ３＋膜貫通ドメイン＋細胞質尾部及び終止コドン＋ＥｃｏＲＩ
下線部分：制限部位
灰色でマーキングされたヌクレオチドは、各ドメインの最後のヌクレオチドである。
ＢａｍＨＩ＋３×ＦＬＡＧタグ＋６×ＦＮ３＋膜貫通ドメイン＋細胞質尾部及び終止コドン＋ＥｃｏＲＩ
下線部分：制限部位
灰色でマーキングされたヌクレオチドは、各ドメインの最後のヌクレオチドである。
【化1】
【0145】
それぞれのドメインのＤＮＡ配列：
ＦｎＩＩＩ－１：
ＧＡＧＴＴＧＡＣＴＧＴＧＴＡＣＡＡＡＧＴＡＣＡＧＡＡＴＣＴＴＣＡＧＴＧＧＡＣＡＧＣＴＧＡＣＴＴＣＴＣＴＧＧＧＧＡＴＧＴＧＡＣＴＴＴＧＡＣＣＴＧＧＡＴＧＡＧＧＣＣＣＡＡＡＡＡＡＡＴＧＣＣＣＴＣＴＧＣＴＴＣＴＴＧＴＧＴＡＴＡＴＡＡＴＧＴＣＴＡＣＴＡＣＡＧＧＧＴＧＧＴＴＧＧＡＧＡＧＡＧＣＡＴＡＴＧＧＡＡＧＡＣＴＣＴＧＧＡＧＡＣＣＣＡＣＡＧＣＡＡＴＡＡＧＡＣＡＡＡＣＡＣＴＧＴＡＴＴＡＡＡＡＧＴＣＴＴＧＡＡＡＣＣＡＧＡＴＡＣＣＡＣＧＴＡＴＣＡＧＧＴＴＡＡＡＧＴＡＣＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＴＣＴＣＡＧＣＡＡＧＧＣＡＣＡＣＡＡＣＡＣＣＡＡＴＧＡＣＴＴＴＧＴＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＡＣＣＣＣＡＧＡＧＧＧＡ
ＦｎＩＩＩ－１：
ＧＡＧＴＴＧＡＣＴＧＴＧＴＡＣＡＡＡＧＴＡＣＡＧＡＡＴＣＴＴＣＡＧＴＧＧＡＣＡＧＣＴＧＡＣＴＴＣＴＣＴＧＧＧＧＡＴＧＴＧＡＣＴＴＴＧＡＣＣＴＧＧＡＴＧＡＧＧＣＣＣＡＡＡＡＡＡＡＴＧＣＣＣＴＣＴＧＣＴＴＣＴＴＧＴＧＴＡＴＡＴＡＡＴＧＴＣＴＡＣＴＡＣＡＧＧＧＴＧＧＴＴＧＧＡＧＡＧＡＧＣＡＴＡＴＧＧＡＡＧＡＣＴＣＴＧＧＡＧＡＣＣＣＡＣＡＧＣＡＡＴＡＡＧＡＣＡＡＡＣＡＣＴＧＴＡＴＴＡＡＡＡＧＴＣＴＴＧＡＡＡＣＣＡＧＡＴＡＣＣＡＣＧＴＡＴＣＡＧＧＴＴＡＡＡＧＴＡＣＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＴＣＴＣＡＧＣＡＡＧＧＣＡＣＡＣＡＡＣＡＣＣＡＡＴＧＡＣＴＴＴＧＴＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＡＣＣＣＣＡＧＡＧＧＧＡ
【0146】
ＦｎＩＩＩ－２：
ＴＴＧＣＣＡＧＡＴＧＣＣＣＣＴＣＧＡＡＡＴＣＴＣＣＡＧＣＴＧＴＣＡＣＴＣＣＣＣＡＧＧＧＡＡＧＣＡＧＡＡＧＧＴＧＴＧＡＴＴＧＴＡＧＧＣＣＡＣＴＧＧＧＣＴＣＣＴＣＣＣＡＴＣＣＡＣＡＣＣＣＡＴＧＧＣＣＴＣＡＴＣＣＧＴＧＡＧＴＡＣＡＴＴＧＴＡＧＡＡＴＡＣＡＧＣＡＧＧＡＧＴＧＧＴＴＣＣＡＡＧＡＴＧＴＧＧＧＣＣＴＣＣＣＡＧＡＧＧＧＣＴＧＣＴＡＧＴＡＡＣＴＴＴＡＣＡＧＡＡＡＴＣＡＡＧＡＡＣＴＴＡＴＴＧＧＴＣＡＡＣＡＣＴＣＴＡＴＡＣＡＣＣＧＴＣＡＧＡＧＴＧＧＣＴＧＣＧＧＴＧＡＣＴＡＧＴＣＧＴＧＧＡＡＴＡＧＧＡＡＡＣＴＧＧＡＧＣＧＡＴＴＣＴＡＡＡＴＣＣＡＴＴＡＣＣＡＣＣＡＴＡＡＡＡＧＧＡＡＡＡ
ＴＴＧＣＣＡＧＡＴＧＣＣＣＣＴＣＧＡＡＡＴＣＴＣＣＡＧＣＴＧＴＣＡＣＴＣＣＣＣＡＧＧＧＡＡＧＣＡＧＡＡＧＧＴＧＴＧＡＴＴＧＴＡＧＧＣＣＡＣＴＧＧＧＣＴＣＣＴＣＣＣＡＴＣＣＡＣＡＣＣＣＡＴＧＧＣＣＴＣＡＴＣＣＧＴＧＡＧＴＡＣＡＴＴＧＴＡＧＡＡＴＡＣＡＧＣＡＧＧＡＧＴＧＧＴＴＣＣＡＡＧＡＴＧＴＧＧＧＣＣＴＣＣＣＡＧＡＧＧＧＣＴＧＣＴＡＧＴＡＡＣＴＴＴＡＣＡＧＡＡＡＴＣＡＡＧＡＡＣＴＴＡＴＴＧＧＴＣＡＡＣＡＣＴＣＴＡＴＡＣＡＣＣＧＴＣＡＧＡＧＴＧＧＣＴＧＣＧＧＴＧＡＣＴＡＧＴＣＧＴＧＧＡＡＴＡＧＧＡＡＡＣＴＧＧＡＧＣＧＡＴＴＣＴＡＡＡＴＣＣＡＴＴＡＣＣＡＣＣＡＴＡＡＡＡＧＧＡＡＡＡ
【0147】
ＦｎＩＩＩ－３：
ＧＴＧＡＴＣＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＡＴＡＴＣＣＡＣＡＴＴＧＡＣＡＧＣＴＡＴＧＧＴＧＡＡＡＡＴＴＡＴＣＴＡＡＧＣＴＴＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＧＧＡＧＡＧＴＧＡＴＡＴＣＡＡＧＧＴＧＡＡＴＧＧＣＴＡＴＧＴＧＧＴＧＡＡＣＣＴＴＴＴＣＴＧＧＧＣＡＴＴＴＧＡＣＡＣＣＣＡＣＡＡＧＣＡＡＧＡＧＡＧＧＡＧＡＡＣＴＴＴＧＡＡＣＴＴＣＣＧＡＧＧＡＡＧＣＡＴＡＴＴＧＴＣＡＣＡＣＡＡＡＧＴＴＧＧＣＡＡＴＣＴＧＡＣＡＧＣＴＣＡＴＡＣＡＴＣＣＴＡＴＧＡＧＡＴＴＴＣＴＧＣＣＴＧＧＧＣＣＡＡＧＡＣＴＧＡＣＴＴＧＧＧＧＧＡＴＡＧＣＣＣＴＣＴＧＧＣＡＴＴＴＧＡＧＣＡＴＧＴＴＡＴＧＡＣＣＡＧＡ
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【0148】
ＦｎＩＩＩ－４：
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【0149】
ＦｎＩＩＩ－５：
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【0150】
ＦｎＩＩＩ－６：
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【0151】
膜貫通ドメイン：
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【0152】
細胞質尾部（終止コドンに下線が引かれている）：
【化2】
【0153】
完全なミニ受容体コンストラクトのアミノ酸配列（ＦＬＡＧタグを含む）
灰色でハイライトされたアミノ酸は、各ドメインの最後のアミノ酸である。
【化3】
【0154】
ＦｎＩＩＩミニ受容体：６８５アミノ酸（ＦＬＡＧタグ、ＦＮＩＩＩカセット、膜貫通ドメイン、細胞質ドメイン）
【0155】
ＦＬＡＧ：ＤＹＫＤＨＤＧＤＹＫＤＨＤＩＤＹＫＤＤＤＤＫ
【0156】
ＦｎＩＩＩ－１：１５５２～１６４９
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【0157】
ＦｎＩＩＩ－２：１６５０～１７４６
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【0158】
ＦｎＩＩＩ－３：１７４７～１８３９
ＶＩＰＰＰＤＩＨＩＤＳＹＧＥＮＹＬＳＦＴＬＴＭＥＳＤＩＫＶＮＧＹＶＶＮＬＦＷＡＦＤＴＨＫＱＥＲＲＴＬＮＦＲＧＳＩＬＳＨＫＶＧＮＬＴＡＨＴＳＹＥＩＳＡＷＡＫＴＤＬＧＤＳＰＬＡＦＥＨＶＭＴＲ
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【0159】
ＦｎＩＩＩ－４：１８４０～１９３１
ＧＶＲＰＰＡＰＳＬＫＡＫＡＩＮＱＴＡＶＥＣＴＷＴＧＰＲＮＶＶＹＧＩＦＹＡＴＳＦＬＤＬＹＲＮＰＫＳＬＴＴＳＬＨＮＫＴＶＩＶＳＫＤＥＱＹＬＦＬＶＲＶＶＶＰＹＱＧＰＳＳＤＹＶＶＶＫＭＩＰＤＳ
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【0160】
ＦｎＩＩＩ－５：１９３２～２０２４
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【0161】
ＦｎＩＩＩ－６：２０２５～２１２１
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【0162】
膜貫通ドメイン：２１２２～２１６０
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【0163】
細胞質尾部：２１６１～２２１４
【化4】
【0164】
数字は、ヒトＳＯＲＬＡ完全長タンパク質のアミノ酸位置である。
【0165】
結果
このクローニング実験により、ＳＯＲＬ１ミニ遺伝子の作製と、ＦＬＡＧタグ（３×）、６個の３Ｆｎモジュール、膜貫通ドメイン及び細胞質尾部からなるＳＯＲＬＡミニ受容体の発現がうまくいったことが示されている。作製したミニ受容体の概略図は、ＳＯＲＬＡ－ｗｔ（ＳＯＲＬ１－ＷＴから転写）と比べた形で、図１に示されている。ミニ受容体（ＳＯＲＬ１－３Ｆｎ）をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルに移したところ、実際の分子サイズは１００ｋＤａ前後で、これは、７４ｋＤａという理論上の質量よりも大きい（図４）。３Ｆｎドメインは、糖鎖付加部位をいくつか含むので、サイズの差は、糖鎖付加に起因する可能性が高い。
このクローニング実験により、ＳＯＲＬ１ミニ遺伝子の作製と、ＦＬＡＧタグ（３×）、６個の３Ｆｎモジュール、膜貫通ドメイン及び細胞質尾部からなるＳＯＲＬＡミニ受容体の発現がうまくいったことが示されている。作製したミニ受容体の概略図は、ＳＯＲＬＡ－ｗｔ（ＳＯＲＬ１－ＷＴから転写）と比べた形で、図１に示されている。ミニ受容体（ＳＯＲＬ１－３Ｆｎ）をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルに移したところ、実際の分子サイズは１００ｋＤａ前後で、これは、７４ｋＤａという理論上の質量よりも大きい（図４）。３Ｆｎドメインは、糖鎖付加部位をいくつか含むので、サイズの差は、糖鎖付加に起因する可能性が高い。
【0166】
結論
要約すると、３Ｆｎカセット、膜貫通領域及び細胞質尾部を含むＳＯＲＬＡ－３Ｆｎミニ受容体の作製及び発現に成功したことを我々は初めて示した。このミニ受容体を下記の実施例で使用して、本発明を機能的に特徴付ける。
要約すると、３Ｆｎカセット、膜貫通領域及び細胞質尾部を含むＳＯＲＬＡ－３Ｆｎミニ受容体の作製及び発現に成功したことを我々は初めて示した。このミニ受容体を下記の実施例で使用して、本発明を機能的に特徴付ける。
【0167】
実施例２：ＳＯＲＬＡミニ受容体は、アミロイド形成性産物のレベルを特異的に低下させる。
目的
この実施例は、ＳＯＲＬＡミニ受容体が、アルツハイマー病に関与する重要なタンパク質及び経路にどのような影響を及ぼすか調べることを目的とした。完全長ＳＯＲＬＡタンパク質がどのようにして、分泌経路においてＡＰＰが輸送されるのを低減するとともに、エンドソームからＡＰＰがリサイクルされるのを増加させて、その結果、ｓＡＰＰａ及びｓＡＰＰｂ／Ａｂペプチド産物の両方が減少するのかを我々は以前に示した（Ａｎｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．２００５）。しかしながら、本発明のミニ受容体は、ＡＰＰタンパク質の直接結合に必要とされるＣＲドメイン（Ｍｅｈｍｅｄｂａｓｉｃ ｅｔ ａｌ．２０１５）も、アミロイド－β（Ａβ）ペプチドに結合すると示唆されているＶＰＳ１０ｐ－ドメイン（Ｋｉｔａｇｏ ｅｔ ａｌ．２０１５）も有さないので、そのミニ受容体を構成するＳＯＲＬＡ残部が、ＡＰＰの生物学的動態に影響を及ぼすのかは分かっていない。
目的
この実施例は、ＳＯＲＬＡミニ受容体が、アルツハイマー病に関与する重要なタンパク質及び経路にどのような影響を及ぼすか調べることを目的とした。完全長ＳＯＲＬＡタンパク質がどのようにして、分泌経路においてＡＰＰが輸送されるのを低減するとともに、エンドソームからＡＰＰがリサイクルされるのを増加させて、その結果、ｓＡＰＰａ及びｓＡＰＰｂ／Ａｂペプチド産物の両方が減少するのかを我々は以前に示した（Ａｎｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．２００５）。しかしながら、本発明のミニ受容体は、ＡＰＰタンパク質の直接結合に必要とされるＣＲドメイン（Ｍｅｈｍｅｄｂａｓｉｃ ｅｔ ａｌ．２０１５）も、アミロイド－β（Ａβ）ペプチドに結合すると示唆されているＶＰＳ１０ｐ－ドメイン（Ｋｉｔａｇｏ ｅｔ ａｌ．２０１５）も有さないので、そのミニ受容体を構成するＳＯＲＬＡ残部が、ＡＰＰの生物学的動態に影響を及ぼすのかは分かっていない。
【0168】
材料及び方法
これに対処するために、我々は、マウス神経芽腫２ａ細胞（Ｎ２ａ）細胞に、（インサートを含まないｐｃＤＮＡプラスミドとともに）ヒトＡＰＰタンパク質発現のためのヒトＡＰＰ－ｍｙｃコンストラクトをトランスフェクションするか、または細胞に、ＳＯＲＬＡ－ｗｔもしくはＳＯＲＬＡ－３Ｆｎ（実施例１に記載されているようなＳＯＲＬＡミニ受容体、もしくは実施例８ではＦＬＡＧ－ミニともいう）をコードするプラスミドとともに、ＡＰＰ－ｍｙｃをコトランスフェクションするかし、ウエスタンブロットアプローチ、及びヒト配列ＡＰＰ断片に特異的なＭｅｓｏｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）アッセイによる所定のＡＰＰ代謝産物の定量を用いて、ＡＰＰのタンパク質分解を解析した（図４、図６及び図８）。ｍｙｃタグにより、抗ｍｙｃ抗体によってＡＰＰ－ｍｙｃを容易に検出可能になる。トランスフェクションから４８時間後、培地を無血清培地に変更し、さらに４８時間、細胞で静置してから、その馴化培地を回収するとともに、細胞を回収した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥを用いて、細胞溶解液及び培地中のタンパク質を分離し、ニトロセルロース膜にブロットした。細胞溶解液においては、ＡＰＰ－ｍｙｃ、ＳＯＲＬＡ及び（ローディングコントロールとしての）β－アクチンを検出するための抗体を用いて、または培地試料においては、ｓＡＰＰαを検出するための抗体を用いて、Ｗｂ解析を行った（図４）。この実験を少なくとも５回繰り返し、細胞のトランスフェクションはｄｕｐｌｉｃａｔｅにした。ＳＯＲＬＡ細胞外ドメイン全体（ｓｏｌ－ＳＯＲＬＡ）に対するポリクローナル抗体を用いたところ、完全長ＳＯＲＬＡを表す２５０ｋＤａに相当するバンドの強度と、ミニ受容体ＳＯＲＬＡを表す１００ｋＤａに相当するバンドの強度が同程度であることが、明らかに視認可能であったことから、これらの２つのＳＯＲＬＡコンストラクトのトランスフェクション効率が同程度であることが示された。
これに対処するために、我々は、マウス神経芽腫２ａ細胞（Ｎ２ａ）細胞に、（インサートを含まないｐｃＤＮＡプラスミドとともに）ヒトＡＰＰタンパク質発現のためのヒトＡＰＰ－ｍｙｃコンストラクトをトランスフェクションするか、または細胞に、ＳＯＲＬＡ－ｗｔもしくはＳＯＲＬＡ－３Ｆｎ（実施例１に記載されているようなＳＯＲＬＡミニ受容体、もしくは実施例８ではＦＬＡＧ－ミニともいう）をコードするプラスミドとともに、ＡＰＰ－ｍｙｃをコトランスフェクションするかし、ウエスタンブロットアプローチ、及びヒト配列ＡＰＰ断片に特異的なＭｅｓｏｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）アッセイによる所定のＡＰＰ代謝産物の定量を用いて、ＡＰＰのタンパク質分解を解析した（図４、図６及び図８）。ｍｙｃタグにより、抗ｍｙｃ抗体によってＡＰＰ－ｍｙｃを容易に検出可能になる。トランスフェクションから４８時間後、培地を無血清培地に変更し、さらに４８時間、細胞で静置してから、その馴化培地を回収するとともに、細胞を回収した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥを用いて、細胞溶解液及び培地中のタンパク質を分離し、ニトロセルロース膜にブロットした。細胞溶解液においては、ＡＰＰ－ｍｙｃ、ＳＯＲＬＡ及び（ローディングコントロールとしての）β－アクチンを検出するための抗体を用いて、または培地試料においては、ｓＡＰＰαを検出するための抗体を用いて、Ｗｂ解析を行った（図４）。この実験を少なくとも５回繰り返し、細胞のトランスフェクションはｄｕｐｌｉｃａｔｅにした。ＳＯＲＬＡ細胞外ドメイン全体（ｓｏｌ－ＳＯＲＬＡ）に対するポリクローナル抗体を用いたところ、完全長ＳＯＲＬＡを表す２５０ｋＤａに相当するバンドの強度と、ミニ受容体ＳＯＲＬＡを表す１００ｋＤａに相当するバンドの強度が同程度であることが、明らかに視認可能であったことから、これらの２つのＳＯＲＬＡコンストラクトのトランスフェクション効率が同程度であることが示された。
【0169】
結果
以前に示されたように（Ａｎｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．２００５）、ＳＯＲＬＡ－ｗｔ（ＳＯＲＬ１－ＷＴから転写）は、ＡＰＰがｓＡＰＰαに切断されるのを阻害し（レーン５及び６）、ＳＯＲＬＡ－ｗｔをトランスフェクションした細胞から得た馴化培地において、ｓＡＰＰαのシグナルを大きく低下させる（図４Ｂ）。
以前に示されたように（Ａｎｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．２００５）、ＳＯＲＬＡ－ｗｔ（ＳＯＲＬ１－ＷＴから転写）は、ＡＰＰがｓＡＰＰαに切断されるのを阻害し（レーン５及び６）、ＳＯＲＬＡ－ｗｔをトランスフェクションした細胞から得た馴化培地において、ｓＡＰＰαのシグナルを大きく低下させる（図４Ｂ）。
【0170】
しかしながら、ウエスタンブロット（Ｗｂ）の検証に基づくと（図４）、ＳＯＲＬＡ－３Ｆｎ（ＳＯＲＬ１－３Ｆｎから転写）をトランスフェクションした細胞では、馴化培地において、ｓＡＰＰαレベルの明らかな低下はいずれも見られなかった（レーン７及び８）。
【0171】
結果として、ＳＯＲＬＡ－ｗｔ及びミニ受容体がｓＡＰＰαレベルに及ぼした作用には、かなり差があった。ミニ受容体は、ＡＰＰを切断させる点、すなわち、ｓＡＰＰαを増加させるとともに、ｓＡＰＰαを減少させないという点で、ＳＯＲＬＡ－ｗｔよりも優れている。このことは、ＡＤ患者にとって有益である。
【0172】
５枚すべてのＷｂ膜のバンド強度の定量によって、これらの結果がさらに確認され、ミニ受容体をトランスフェクションした細胞において、ｓＡＰＰαの減少を検出できなかったことが示された。ｓＡＰＰαレベルは、コントロール細胞よりもかなり高かったほどである（図５）。
【0173】
さらに定量的なＭＳＤ解析によってｓＡＰＰαを測定することによって、この知見を検証した（図６Ａ）。このアッセイでは、試料に由来するｓＡＰＰβの定量も可能であった。ミニ受容体の存在下では、ｓＡＰＰαは増加したが、ｓＡＰＰβのレベルは、コントロール細胞で観察されたレベルよりも低かったことから（図６Ｂ）、アミロイド形成性のＡＰＰプロセシングを選択的に低減する、ミニ受容体の特有の機能が示唆された。換言すると、アミロイド形成性のＡＰＰプロセシングには、ｓＡＰＰβの生成が含まれる一方で、非アミロイド形成性のＡＰＰプロセシングには、ｓＡＰＰαの産生が含まれる。本明細書に示されているデータにより、ミニ受容体が、非アミロイド形成性のプロセシングを補佐することが示されている。
【0174】
したがって、ウイルスでの送達（すなわち遺伝子療法）を可能にする、ミニ受容体コンストラクトのサイズに加えて、アミロイド形成性のプロセシングが特異的に低減されるのは、有益な点である。非アミロイド形成性のｓＡＰＰα断片は、神経栄養作用／有益な作用があるとみなされているからである。
【0175】
したがって、我々は次に、標準的なＥＬＩＳＡプロトコールを用いて、トランスフェクションしたＮ２ａ細胞から得た培地中のＡβ４０レベルを求めた（３回の独立した実験から選択した５個の試料）。以前に示されたように（Ａｎｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．２００５）、Ａβ４０レベルは、ＳＯＲＬＡ－ｗｔの存在下で大きく低下する（図７）。しかしながら、ＳＯＲＬＡ－３Ｆｎをトランスフェクションした細胞から得た培地中でｓＡＰＰβが減少した観察結果（図６Ｂを参照されたい）と一致して、Ａβ４０のレベルは、ＳＯＲＬＡ－３Ｆｎの存在下でも、コントロール細胞と比べて低下した。
【0176】
この知見は、Ａβ３８、Ａβ４０及びＡβ４２という３つのアミロイドβ－ペプチド種の、ＭＳＤによる定量結果によって立証され、この定量では、３つのすべてのＡβ形態が、ＳＯＲＬＡ－３Ｆｎの存在下で、コントロール細胞と比べて、ＳＯＲＬＡ－ｗｔをトランスフェクションした細胞で見られたレベルと同等の低レベルまで有意に減少したことを我々は見出した（図８Ａ～Ｃ）。概して、Ａβ３８、Ａβ４０及びＡβ４２は、エンドソーム状態が不十分なこと／エンドソーム活性が低いことのレポーターとみなされている。したがって、我々は、これらのマーカーの減少により、エンドソーム活性の回復が示唆されると評価する。
【0177】
要約すると、以前の知見と一致して、ｓＡＰＰａ、ｓＡＰＰｂ、ならびに３８アミノ酸長、４０アミノ酸長及び４２アミノ酸長のＡｂ－ペプチド（図８Ａ～Ｃ）のレベルが有意に低下したことによって立証されたように、ＳＯＲＬＡ－ｗｔの存在により、非アミロイド形成性及びアミロイド形成性のプロセシングの両方が低減する。それどころか、驚いたことに、我々は、ＦＬＡＧ－ｍｉｎｉの存在下で、アミロイド形成性のＡＰＰプロセシングが有意に低減したとともに、ｓＡＰＰｂ及び３つのすべてのＡｂペプチド（Ａｂ３８／Ａｂ４０／Ａｂ４２）の産生が有意に低減したことも観察した。しかしながら、完全長ＳＯＲＬＡ－ｗｔでは、ｓＡＰＰａの産生も低下した一方で、ＦＬＡＧ－ｍｉｎｉでは、この非アミロイド形成性の断片が有意に増加した（図６Ａ）。
【0178】
結論
ＳＯＲＬＡ－ｗｔでは、アミロイド形成性及び非アミロイド形成性のＡＰＰプロセシングの両方が低減する一方で、ミニ受容体ＳＯＲＬＡ－３Ｆｎでは、（ｓＡＰＰαは変化しないので、）非アミロイド形成性のプロセシングには影響が及ばない。しかしながら、ミニ受容体は、アミロイド形成性の産物（ｓＡＰＰβ及びＡβ）のレベルを特異的に低下させることができる。この特徴は、レトロマー増強薬で処理した細胞で観察された状況（Ｍｅｃｏｚｚｉ ｅｔ ａｌ．２０１４）と同様である。レトロマーの機能は、アミロイド形成性のプロセシングの主要な細胞部位であるエンドソームから、カーゴ（すなわちＡＰＰ）を輸送することに関連するからである（Ｈａａｓｓ ２０１２）。本発明のミニ受容体は、ＳＯＲＬＡ－ｗｔと同じ細胞質ドメインを有するので、そのミニ受容体は、ＳＯＲＬＡ－ｗｔと同様に、レトロマー依存性のエンドソームリサイクルにも関与する可能性が高い（Ｆｊｏｒｂａｃｋ ｅｔ ａｌ．２０１２）。ＡＰＰがｓＡＰＰαに非アミロイド形成性にプロセシングされるのが、ＳＯＲＬＡ依存性に低下するのは、分泌経路において、ＳＯＲＬＡ－ｗｔ（ＣＲクラスターを含む）の活性に依存している（Ｍｅｈｍｅｄｂａｓｉｃ ｅｔ ａｌ．２０１５）。勘案すると、これにより、これらの２つのプロセシング経路において、ＳＯＲＬＡの独立した役割を示唆するモデルが得られる。ｓＡＰＰαは、神経栄養機能／有益な機能があると推測されるので、これは、最適な薬物プロファイルであり、したがって、薬理学的な介入を最適に設計して、このＡＰＰ断片の生成に影響が及ばないようにすることになる。
ＳＯＲＬＡ－ｗｔでは、アミロイド形成性及び非アミロイド形成性のＡＰＰプロセシングの両方が低減する一方で、ミニ受容体ＳＯＲＬＡ－３Ｆｎでは、（ｓＡＰＰαは変化しないので、）非アミロイド形成性のプロセシングには影響が及ばない。しかしながら、ミニ受容体は、アミロイド形成性の産物（ｓＡＰＰβ及びＡβ）のレベルを特異的に低下させることができる。この特徴は、レトロマー増強薬で処理した細胞で観察された状況（Ｍｅｃｏｚｚｉ ｅｔ ａｌ．２０１４）と同様である。レトロマーの機能は、アミロイド形成性のプロセシングの主要な細胞部位であるエンドソームから、カーゴ（すなわちＡＰＰ）を輸送することに関連するからである（Ｈａａｓｓ ２０１２）。本発明のミニ受容体は、ＳＯＲＬＡ－ｗｔと同じ細胞質ドメインを有するので、そのミニ受容体は、ＳＯＲＬＡ－ｗｔと同様に、レトロマー依存性のエンドソームリサイクルにも関与する可能性が高い（Ｆｊｏｒｂａｃｋ ｅｔ ａｌ．２０１２）。ＡＰＰがｓＡＰＰαに非アミロイド形成性にプロセシングされるのが、ＳＯＲＬＡ依存性に低下するのは、分泌経路において、ＳＯＲＬＡ－ｗｔ（ＣＲクラスターを含む）の活性に依存している（Ｍｅｈｍｅｄｂａｓｉｃ ｅｔ ａｌ．２０１５）。勘案すると、これにより、これらの２つのプロセシング経路において、ＳＯＲＬＡの独立した役割を示唆するモデルが得られる。ｓＡＰＰαは、神経栄養機能／有益な機能があると推測されるので、これは、最適な薬物プロファイルであり、したがって、薬理学的な介入を最適に設計して、このＡＰＰ断片の生成に影響が及ばないようにすることになる。
【0179】
以前の研究により、その１１個のＣＲドメインが欠失しているが、インタクトな３Ｆｎ領域を有するＳＯＲＬＡが、ＡＰＰとも、そのプロセシングともいかに相互作用しなかったか示されたので（Ｍｅｈｍｅｄｂａｓｉｃ ｅｔ ａｌ．２０１５）、ミニ受容体ＳＯＲＬＡ－３Ｆｎが、（ｓＡＰＰβの減少を介して、）アミロイド形成性のＡＰＰプロセシングを低減できることは、驚くべきかつ予想外の利点である。本明細書で示されているデータにより、本発明のミニ受容体をＡＤ患者の脳に送達する治療効果が有望であることが裏付けられている。
【0180】
ＳＯＲＬＡ－ｗｔについて以前に説明されたように（Ｓｐｏｅｌｇｅｎ ｅｔ ａｌ．２００６）、我々は、そのミニ受容体が、ＡＰＰ及びＢＡＣＥ１との複合体を形成すると推測し、我々は、ＳＯＲＬＡの細胞質ドメインが、この三量体複合体の形成を低減できることも見出した。
【0181】
実施例３：ミニ受容体コンストラクトのＦＡＮＳＨＹモチーフに変異を導入して、レトロマー依存性の輸送特性が改善した第２世代のミニ受容体を作製
目的
我々は、ＦＡＮＳＨＹ配列におけるいくつかの変異が、レトロマーとの複合体形成を増大させることができるとともに、このような変異を加えたコンストラクトは、エンドソーム輸送を行う能力と、アミロイド形成性のＡＰＰプロセシングをさらに低減させる能力が改善されるという概念実証を示す。
目的
我々は、ＦＡＮＳＨＹ配列におけるいくつかの変異が、レトロマーとの複合体形成を増大させることができるとともに、このような変異を加えたコンストラクトは、エンドソーム輸送を行う能力と、アミロイド形成性のＡＰＰプロセシングをさらに低減させる能力が改善されるという概念実証を示す。
【0182】
材料及び方法
我々は、ＦＡＮＳＨＹモチーフを含むペプチドのパネルを使用する。そのペプチドは、野生型ＦＡＮＳＨＹ配列、または１つのアミノ酸（複数可）の置換（複数可）のうち、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ解析に基づき、レトロマーに対する親和性を向上させると予測される置換のいずれかを有する。
我々は、ＦＡＮＳＨＹモチーフを含むペプチドのパネルを使用する。そのペプチドは、野生型ＦＡＮＳＨＹ配列、または１つのアミノ酸（複数可）の置換（複数可）のうち、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ解析に基づき、レトロマーに対する親和性を向上させると予測される置換のいずれかを有する。
【0183】
このようなペプチドにおいて、等温滴定熱測定を用いて、レトロマーとの相互作用を試験する。
【0184】
ペプチドとレトロマーとの結合を増大させる変異をＳＯＲＬＡ－３Ｆｎのコンストラクトに導入し、その後、培養（Ｎ２ａ）細胞及び／または初代マウスニューロン養液において、ＡＰＰプロセシングに対する影響を試験する。
【0185】
結果：
我々は、上記の修飾（すなわち置換）を有さないミニ受容体よりも、レトロマーに強力に結合するとともに、アミロイド形成性のＡＰＰプロセシングをかなり低減する１つのミニ受容体バリアントまたはいくつかのミニ受容体バリアントが特定されると予想する。
我々は、上記の修飾（すなわち置換）を有さないミニ受容体よりも、レトロマーに強力に結合するとともに、アミロイド形成性のＡＰＰプロセシングをかなり低減する１つのミニ受容体バリアントまたはいくつかのミニ受容体バリアントが特定されると予想する。
【0186】
結論：
第２世代のミニ受容体（複数可）では、上記の修飾（すなわち置換）を有さないミニ受容体と比べて、エンドソームによるリサイクルがさらに増大し、Ａβレベルがかなり大きく低下するので、トランスレーション値が改善される。
第２世代のミニ受容体（複数可）では、上記の修飾（すなわち置換）を有さないミニ受容体と比べて、エンドソームによるリサイクルがさらに増大し、Ａβレベルがかなり大きく低下するので、トランスレーション値が改善される。
【0187】
実施例４：初代マウスニューロン及びヒトｉＰＳＣ由来ニューロンの培養液に、ＳＯＲＬＡ－３Ｆｎをウイルス送達する方法
目的
培養細胞株におけるように、ニューロン培養液において、ミニ受容体のウイルス送達により、アミロイド形成性のプロセシングが低減されるエビデンスを提供すること。
目的
培養細胞株におけるように、ニューロン培養液において、ミニ受容体のウイルス送達により、アミロイド形成性のプロセシングが低減されるエビデンスを提供すること。
【0188】
材料及び方法
まず、我々は、ＳＯＲＬＡ－３Ｆｎインサートを含む、ＡＡＶ９ベースのウイルスベクター（いずれかのタグの有無にかかわらない）を調製する。次に、我々は、初代皮質（または海馬）ニューロンを野生型マウスから単離し、感染ニューロンと非感染ニューロンにおいて、ウエスタンブロッティング及びＭｅｓｏｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙアッセイを用いて、内因性のマウスＡＰＰ断片について、ＡＰＰプロセシングを比較する。
まず、我々は、ＳＯＲＬＡ－３Ｆｎインサートを含む、ＡＡＶ９ベースのウイルスベクター（いずれかのタグの有無にかかわらない）を調製する。次に、我々は、初代皮質（または海馬）ニューロンを野生型マウスから単離し、感染ニューロンと非感染ニューロンにおいて、ウエスタンブロッティング及びＭｅｓｏｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙアッセイを用いて、内因性のマウスＡＰＰ断片について、ＡＰＰプロセシングを比較する。
【0189】
結果：
感染ニューロンのＡβ分泌量は、非感染ニューロンと比べて減少が見られるが、ｓＡＰＰαのレベルは同程度であると我々は予想する。ＳＯＲＬＡ細胞外ドメインに対する抗体を用いた、細胞溶解液のウエスタンブロットによって、ＳＯＲＬＡ－３Ｆｎの初代ニューロンへの送達の成功が示されるであろう。
感染ニューロンのＡβ分泌量は、非感染ニューロンと比べて減少が見られるが、ｓＡＰＰαのレベルは同程度であると我々は予想する。ＳＯＲＬＡ細胞外ドメインに対する抗体を用いた、細胞溶解液のウエスタンブロットによって、ＳＯＲＬＡ－３Ｆｎの初代ニューロンへの送達の成功が示されるであろう。
【0190】
結論：
ミニ受容体を用いて、初代ニューロンにおいて、Ａβレベルを低下させることができることが示されると我々は予想する。
ミニ受容体を用いて、初代ニューロンにおいて、Ａβレベルを低下させることができることが示されると我々は予想する。
【0191】
実施例５：エンドソーム肥大化のレスキュー
目的
レトロマー増強化合物に関する以前の知見（Ｊｅｓｓｉｃａ Ｙｏｕｎｇ、非公開）と同様に、ＳＯＲＬＡミニ受容体が、ＳＯＲＬ１欠損ニューロン培養液で観察されるエンドソーム肥大化を低減できることを示すため。
目的
レトロマー増強化合物に関する以前の知見（Ｊｅｓｓｉｃａ Ｙｏｕｎｇ、非公開）と同様に、ＳＯＲＬＡミニ受容体が、ＳＯＲＬ１欠損ニューロン培養液で観察されるエンドソーム肥大化を低減できることを示すため。
【0192】
材料及び方法
（Ｋｎｕｐｐ ｅｔ ａｌ，２０２０に公開されているように）ＳＯＲＬ１がノックアウトされたｉＰＳＣ由来ニューロンを用いて、ミニ受容体での処置によって、エンドソーム肥大化がレスキューされるかを我々は調査する。レスキューされる場合には、我々は次に、ＡＰＰ及び／またはＰＳＥＮ１について、疾患アレルを有するｉＰＳＣ由来ニューロンであって、エンドソームサイズの増大（すなわち病原性）も示すニューロン（Ｋｗａｒｔ ｅｔ ａｌ．２０１９）に、同様の「レスキュー実験」を適用する。
（Ｋｎｕｐｐ ｅｔ ａｌ，２０２０に公開されているように）ＳＯＲＬ１がノックアウトされたｉＰＳＣ由来ニューロンを用いて、ミニ受容体での処置によって、エンドソーム肥大化がレスキューされるかを我々は調査する。レスキューされる場合には、我々は次に、ＡＰＰ及び／またはＰＳＥＮ１について、疾患アレルを有するｉＰＳＣ由来ニューロンであって、エンドソームサイズの増大（すなわち病原性）も示すニューロン（Ｋｗａｒｔ ｅｔ ａｌ．２０１９）に、同様の「レスキュー実験」を適用する。
【0193】
ＳＯＲＬ１が標的欠失されたｉＰＳＣ株が樹立されている（Ｋｎｕｐｐ ｅｔ ａｌ．２０２０）（８）。我々は、ＳＯＲＬＡ－３Ｆｎミニ受容体に感染させたＳＯＲＬ１欠損ニューロンにおいて、Ｒａｂ５による免疫細胞化学を用いて、エンドソームサイズを求め、非感染ニューロンと比較する。その後、他のＡＤ関連変異を有するｉＰＳＣ由来ニューロンを、ＳＯＲＬＡ－３Ｆｎミニ受容体に感染させる。
【0194】
結果：
ＳＯＲＬＡ－３Ｆｎは、ＳＯＲＬ１が欠損したｉＰＳＣ由来ニューロンのエンドソームのサイズを、野生型ｉＰＳＣ由来ニューロンと同程度のサイズまで縮小させる（すなわちレスキューする）ことが見出されると我々は予想する。ＡＰＰまたはＰＳＥＮ１の遺伝子に、原因となるバリアントを有するｉＰＳＣ由来ニューロンでは、同様に、ＳＯＲＬＡ－３Ｆｎへの感染により、正常なエンドソームサイズに回復する。
ＳＯＲＬＡ－３Ｆｎは、ＳＯＲＬ１が欠損したｉＰＳＣ由来ニューロンのエンドソームのサイズを、野生型ｉＰＳＣ由来ニューロンと同程度のサイズまで縮小させる（すなわちレスキューする）ことが見出されると我々は予想する。ＡＰＰまたはＰＳＥＮ１の遺伝子に、原因となるバリアントを有するｉＰＳＣ由来ニューロンでは、同様に、ＳＯＲＬＡ－３Ｆｎへの感染により、正常なエンドソームサイズに回復する。
【0195】
結論：
原因となるバリアントと遺伝的に似ているニューロン、すなわち、ＳＯＲＬ１が欠損しているか、またはＡＰＰ及びＰＳＥＮ１に変異を有するニューロンにおいて、ＳＯＲＬＡミニ受容体の遺伝子の送達により、エンドソームの病的な肥大化を低減できることが見出されると我々は予想する。
原因となるバリアントと遺伝的に似ているニューロン、すなわち、ＳＯＲＬ１が欠損しているか、またはＡＰＰ及びＰＳＥＮ１に変異を有するニューロンにおいて、ＳＯＲＬＡミニ受容体の遺伝子の送達により、エンドソームの病的な肥大化を低減できることが見出されると我々は予想する。
【0196】
実施例６：ミニ受容体による、レトロマー複合体の安定化
目的：
ミニ受容体のさらなる開発
目的：
ミニ受容体のさらなる開発
【0197】
背景：
エンドソームの小管膜でアセンブルされるレトロマー複合体の構造であって、ｃｒｙｏＥＭによって解明した構造により、その細胞質部位で、レトロマーのコートが特定されており、そのコートでは、２つのコアレトロマーユニットが、最上部のＶＰＳ２９サブユニットによって二量体化するアーチを形成し、最下部でも、２つのＶＰＳ２６サブユニットが密接している（図９Ａ）。これにより、そのコート構造の基本的なユニットが形成される。以前の研究により、ＳＯＲＬＡの細胞質尾部がＶＰＳ２６と相互作用することが特定されている（Ｆｊｏｒｂａｃｋ ２０１２）。今回、我々は、ＳＯＲＬＡ（及びミニ受容体）の３Ｆｎドメインが、二量体化できることを特定した（図９Ｂ）。したがって、ミニ受容体は、細胞内で発現すると、エンドソーム膜において二量体を形成し、その２つの細胞質尾部が、レトロマー複合体の隣接する２つのＶＰＳ２６サブユニットと相互作用すると推定するのは合理的である。ミニ受容体は、二量体化を誘導するので、そのミニ受容体が存在すると、レトロマーのコート及びエンドソーム小管の活性が安定化する。その結果、ミニ受容体は、レトロマー複合体を安定化する。レトロマー安定性の増大、すなわち活性の増大は、アミロイド形成性のＡＰＰ切断を低減するとともに、それに付随して、非アミロイド形成性の産物である可溶性ＡＰＰα（ｓＡＰＰα）の生成が増大することが示されている（Ｍｅｃｏｚｚｉ ｅｔ ａｌ．２０１４）。
エンドソームの小管膜でアセンブルされるレトロマー複合体の構造であって、ｃｒｙｏＥＭによって解明した構造により、その細胞質部位で、レトロマーのコートが特定されており、そのコートでは、２つのコアレトロマーユニットが、最上部のＶＰＳ２９サブユニットによって二量体化するアーチを形成し、最下部でも、２つのＶＰＳ２６サブユニットが密接している（図９Ａ）。これにより、そのコート構造の基本的なユニットが形成される。以前の研究により、ＳＯＲＬＡの細胞質尾部がＶＰＳ２６と相互作用することが特定されている（Ｆｊｏｒｂａｃｋ ２０１２）。今回、我々は、ＳＯＲＬＡ（及びミニ受容体）の３Ｆｎドメインが、二量体化できることを特定した（図９Ｂ）。したがって、ミニ受容体は、細胞内で発現すると、エンドソーム膜において二量体を形成し、その２つの細胞質尾部が、レトロマー複合体の隣接する２つのＶＰＳ２６サブユニットと相互作用すると推定するのは合理的である。ミニ受容体は、二量体化を誘導するので、そのミニ受容体が存在すると、レトロマーのコート及びエンドソーム小管の活性が安定化する。その結果、ミニ受容体は、レトロマー複合体を安定化する。レトロマー安定性の増大、すなわち活性の増大は、アミロイド形成性のＡＰＰ切断を低減するとともに、それに付随して、非アミロイド形成性の産物である可溶性ＡＰＰα（ｓＡＰＰα）の生成が増大することが示されている（Ｍｅｃｏｚｚｉ ｅｔ ａｌ．２０１４）。
【0198】
材料及び方法
ミニ受容体の二量体化を増大させる方法において、ＡＤに対するその保護活性を向上させる能力を試験する。ある１つの設定では、ミニ受容体を用いた遺伝子療法を目的として、その二量体の強度を上昇させる操作変異を有する型のミニ受容体を樹立する。この型は、未操作のミニ受容体と比べて、活性に優れる。このような変異は、そのミニ受容体の二量体複合体の構造に基づき特定し得る。
ミニ受容体の二量体化を増大させる方法において、ＡＤに対するその保護活性を向上させる能力を試験する。ある１つの設定では、ミニ受容体を用いた遺伝子療法を目的として、その二量体の強度を上昇させる操作変異を有する型のミニ受容体を樹立する。この型は、未操作のミニ受容体と比べて、活性に優れる。このような変異は、そのミニ受容体の二量体複合体の構造に基づき特定し得る。
【0199】
エンドサイトーシスによる取り込みによって、エンドソームの内腔に進入するとともに、ＳＯＲＬＡ ３Ｆｎ二量体の相互作用を増大できる化合物（小分子シャペロンまたは抗体）は、ミニ受容体二量体の強度をさらに上昇させる可能性がある。これについて試験する。
【0200】
結果：
我々は、ミニ受容体をさらに最適化する。
我々は、ミニ受容体をさらに最適化する。
【0201】
結論：
微調整された様々な特性を有する様々な型のミニ受容体を樹立する。
微調整された様々な特性を有する様々な型のミニ受容体を樹立する。
【0202】
実施例７：ＳＯＲＬ１ミニ受容体のＦＡＮＳＨＹモチーフ依存性細胞内輸送
目的：
レトロマーへの結合に関与することが以前に示された、ＳＯＲＬＡの細胞質尾部におけるＦＡＮＳＨＹモチーフが、ＳＯＲＬＡミニ受容体の細胞内輸送にとっても重要であることを示すため。
目的：
レトロマーへの結合に関与することが以前に示された、ＳＯＲＬＡの細胞質尾部におけるＦＡＮＳＨＹモチーフが、ＳＯＲＬＡミニ受容体の細胞内輸送にとっても重要であることを示すため。
【0203】
材料及び方法
ＦＬＡＧ－ｍｉｎｉ－ＷＴ（実施例１及び２では、ＳＯＲＬＡ－３Ｆｎミニ受容体ともいう。Ｎ末端ＦＬＡＧタグを含む。ＷＴは、実施例７においては、ミニ受容体の非変異バリアントを示す野生型である）のコンストラクトを、部位特異的変異誘発の鋳型として使用して、６アミノ酸のＦＡＮＳＨＹモチーフが、標準的な方法及びプライマーを用いて、アラニン残基によって置換された変異体コンストラクト（ＦＬＡＧ－ｍｉｎｉ－ＦＡＮＳＨＹ）を作製した。
ＦＬＡＧ－ｍｉｎｉ－ＷＴ（実施例１及び２では、ＳＯＲＬＡ－３Ｆｎミニ受容体ともいう。Ｎ末端ＦＬＡＧタグを含む。ＷＴは、実施例７においては、ミニ受容体の非変異バリアントを示す野生型である）のコンストラクトを、部位特異的変異誘発の鋳型として使用して、６アミノ酸のＦＡＮＳＨＹモチーフが、標準的な方法及びプライマーを用いて、アラニン残基によって置換された変異体コンストラクト（ＦＬＡＧ－ｍｉｎｉ－ＦＡＮＳＨＹ）を作製した。
【0204】
ＦｕＧｅｎｅ及び下記の標準的なプロトコールを用いて、Ｎ２ａ細胞に、これらの２つのコンストラクトをトランスフェクションし、トランスフェクションから４８時間後に、溶解液及び培地を回収し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、及び完全長ＳＯＲＬＡの細胞外断片を認識するポリクローナル抗体、すなわち、ミニ受容体の細胞外部分にも結合できるポリクローナル抗体を用いたウエスタンブロット（Ｗｂ）実験によって解析した（図１０Ａ及び１０Ｂ）。Ｐｒｉｓｍ６．０というソフトウェアを用いて、５回の独立した実験から得たシグナルの定量値をプロットした（図１０Ｃ）。
【0205】
細胞染色のために、標準的なプロトコールと、ウエスタンブロット解析で用いた抗体と同じ初代ポリクローナルＳＯＲＬＡ抗体と、蛍光色素４８８に結合した蛍光標識抗ウサギ二次抗体とを用いて、トランスフェクション細胞のＦＡＣＳ解析を行った（図１０Ｄ及び図１０Ｅ）。
【0206】
ポリクローナル抗ＳＯＲＬＡ抗体を用いて、トランスフェクション細胞の細胞表面発現も、免疫細胞化学によって検出した。抗体が細胞膜を透過しないように、インキュベート及び洗浄のために、すべての溶液から洗浄剤を除外してある。すなわち、その抗体は、その細胞表面にある受容体分子に結合するのみであると予想される（図１０Ｆ）。
【0207】
結果：
我々は、以前に説明されたように（Ｆｊｏｒｂａｃｋ，２０１２）、ＦＡＮＳＨＹモチーフがアラニン残基に置き換えられているために、レトロマーに結合できないミニ受容体変異体ＦＬＡＧ－ｍｉｎｉ－ＦＡＮＳＨＹを作製した。我々は、ＦＬＡＧ－ｍｉｎｉ－ＷＴ（尾部領域に変異をいずれも有さないミニ受容体。実施例１及び２でＳＯＲＬＡ－３Ｆｎミニ受容体と称したものに相当する）またはＦＬＡＧ－ｍｉｎｉ－ＦＡＮＳＨＹ（尾部領域に変異を有するミニ受容体）のいずれかをトランスフェクションした細胞から得た溶解液及び馴化培地を使用して、レトロマー結合の欠損により、細胞表面からのシェディングがどの程度影響を受けたのかを求めた。これらの２つのミニ受容体バリアントの間では、細胞での発現については、いずれの違いも我々には観察されなかったが（図１０Ａ）、ミニ受容体の変異バリアントの分泌は、非変異バリアントと比べて有意に増加した（図１０Ｂ）ことを我々は見出し、これは、完全長ＳＯＲＬＡタンパク質で観察されるプロセスと似ているが、そのプロセスが増強されたプロセスにおいて、ＴＡＣＥによって、タンパク質分解によって切断されることによる、細胞表面でのシェディングが増大した結果である可能性が高い。これにより、その変異バリアントにおけるレトロマー結合部位の欠失により、そのミニ受容体が、細胞内、すなわちエンドソーム構造内に局在する能力が低減され、その結果、細胞表面での局在が増大したことが示唆されている。これにより、ミニ受容体がエンドソームを安定化させるという仮説がさらに裏付けられる。
我々は、以前に説明されたように（Ｆｊｏｒｂａｃｋ，２０１２）、ＦＡＮＳＨＹモチーフがアラニン残基に置き換えられているために、レトロマーに結合できないミニ受容体変異体ＦＬＡＧ－ｍｉｎｉ－ＦＡＮＳＨＹを作製した。我々は、ＦＬＡＧ－ｍｉｎｉ－ＷＴ（尾部領域に変異をいずれも有さないミニ受容体。実施例１及び２でＳＯＲＬＡ－３Ｆｎミニ受容体と称したものに相当する）またはＦＬＡＧ－ｍｉｎｉ－ＦＡＮＳＨＹ（尾部領域に変異を有するミニ受容体）のいずれかをトランスフェクションした細胞から得た溶解液及び馴化培地を使用して、レトロマー結合の欠損により、細胞表面からのシェディングがどの程度影響を受けたのかを求めた。これらの２つのミニ受容体バリアントの間では、細胞での発現については、いずれの違いも我々には観察されなかったが（図１０Ａ）、ミニ受容体の変異バリアントの分泌は、非変異バリアントと比べて有意に増加した（図１０Ｂ）ことを我々は見出し、これは、完全長ＳＯＲＬＡタンパク質で観察されるプロセスと似ているが、そのプロセスが増強されたプロセスにおいて、ＴＡＣＥによって、タンパク質分解によって切断されることによる、細胞表面でのシェディングが増大した結果である可能性が高い。これにより、その変異バリアントにおけるレトロマー結合部位の欠失により、そのミニ受容体が、細胞内、すなわちエンドソーム構造内に局在する能力が低減され、その結果、細胞表面での局在が増大したことが示唆されている。これにより、ミニ受容体がエンドソームを安定化させるという仮説がさらに裏付けられる。
【0208】
細胞分布の変化の裏付けを得るために、我々は、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）解析を適用して、ＦＬＡＧ－ｍｉｎｉ－ＷＴ及びＦＬＡＧ－ｍｉｎｉ－ＦＡＮＳＨＹの細胞表面での発現を求めた。この方法を用いて、我々は、トランスフェクション細胞の２つの試料について、細胞表面での発現を解析し、細胞表面に変異体コンストラクトを有する細胞の方が多く（ＷＴは３２１／３４７に対して、ＦＡＮＳＨＹは５９２／５０９）、変異ミニ受容体の方が、シグナルも強い（ＷＴは４．６３Ｅ６／４．７３Ｅ６に対して、ＦＡＮＳＨＹは５．２９Ｅ６／５．２９Ｅ６）ことを見出した（図１０Ｄ）。概括的には、すなわち、変異体バリアントＦＬＡＧ－ｍｉｎｉ－ＦＡＮＳＨＹをトランスフェクションした細胞と、非変異体バリアントＦＬＡＧ－ｍｉｎｉ－ＷＴをトランスフェクションした細胞とを比べると、約５０％以上の細胞は、そのミニ受容体を細胞表面に有する。さらに、そのレトロマー結合部位を欠失したミニ受容体（すなわちＦＬＡＧ－ｍｉｎｉ－ＦＡＮＳＨＹ）では、そのミニ受容体の発現レベルも２０％前後上昇した。
【0209】
ＦＬＡＧ－ｍｉｎｉ－ＦＡＮＳＨＹの発現が細胞表面で、ＦＬＡＧ－ｍｉｎｉ－ＷＴと比べて強いことを可視化するために、我々は、トランスフェクション細胞の、免疫細胞化学による解析も行い、洗浄剤の非存在下で、ＳＯＲＬＡに対する一次抗体で染色した細胞の共焦点顕微鏡画像を得ることによって、細胞表面での局在も定め、細胞表面のミニ受容体のみを特定可能にした。代表的な画像により、変異バリアントＦＬＡＧ－ｍｉｎｉ－ＦＡＮＳＨＹの細胞表面シグナルが、非変異バリアントＦＬＡＧ－ｍｉｎｉ－ＷＴの場合よりもどの程度強いかが示されており（図１０Ｅ）、これは、ＦＡＣＳの結果と一致している。
【0210】
結論：
ＦＬＡＧ－ミニ受容体のレトロマー結合部位の欠失により、そのコンストラクトの細胞内での局在が低減され、細胞表面でのその発現が増加するというエビデンスを我々は提供している。これにより、ミニ受容体コンストラクト（例えば、実施例１及び２に記載されているようなコンストラクト）が、レトロマーと相互作用する能力、及び生理的なエンドソームプロセシングが行われるようにするのに必要である重要な機能を果たす能力がさらに確認される。したがって、そのミニ受容体は、機能的であると予想されるとともに、治療現場において、例えば、アルツハイマー病患者へのウイルスの移入を介して有益であると予想される。
ＦＬＡＧ－ミニ受容体のレトロマー結合部位の欠失により、そのコンストラクトの細胞内での局在が低減され、細胞表面でのその発現が増加するというエビデンスを我々は提供している。これにより、ミニ受容体コンストラクト（例えば、実施例１及び２に記載されているようなコンストラクト）が、レトロマーと相互作用する能力、及び生理的なエンドソームプロセシングが行われるようにするのに必要である重要な機能を果たす能力がさらに確認される。したがって、そのミニ受容体は、機能的であると予想されるとともに、治療現場において、例えば、アルツハイマー病患者へのウイルスの移入を介して有益であると予想される。
【0211】
実施例８：３Ｆｎの媒介による、ＳｏｒＬＡまたはＳｏｒＬＡミニ受容体の二量体化は、それとレトロマーとの相互作用であって、エンドソーム輸送を調節する相互作用に必須である
目的：
ＳｏｒＬＡ及びＳｏｒＬＡミニ受容体の結合及び二量体化の能力をさらに調査するため
目的：
ＳｏｒＬＡ及びＳｏｒＬＡミニ受容体の結合及び二量体化の能力をさらに調査するため
【0212】
材料及び方法：
クローニング
いくつかのオンラインソフトウェア（ＰｓｉＰｒｅｄ、ＳＳｐｒｏ、Ｓｃｒａｔｃｈ及びＹａｓｐｉｎ）を用いて、ＳＯＲＬ１ ３Ｆｎカセットのドメイン境界をｉｎ ｓｉｌｉｃｏで求めて、アミノ酸配列において二次構造を予測した。その後、高度に保存された二次構造パターンと、ほとんど保存されていないアミノ酸に基づき、その６個のＳＯＲＬ１ ３Ｆｎドメインのアラインメントを行った。
クローニング
いくつかのオンラインソフトウェア（ＰｓｉＰｒｅｄ、ＳＳｐｒｏ、Ｓｃｒａｔｃｈ及びＹａｓｐｉｎ）を用いて、ＳＯＲＬ１ ３Ｆｎカセットのドメイン境界をｉｎ ｓｉｌｉｃｏで求めて、アミノ酸配列において二次構造を予測した。その後、高度に保存された二次構造パターンと、ほとんど保存されていないアミノ酸に基づき、その６個のＳＯＲＬ１ ３Ｆｎドメインのアラインメントを行った。
【0213】
プライマー対（ｆｗｄ：５’－ＣＡＧＧＡＴＣＣＧＡＣＴＡＣＡＡＧＧＡＣＣＡＣＧＡＣＧＧＣＧＡＣＴＡＣＡＡＧＧＡＣＣＡＣＧＡＣＡＴＣＧＡＣＴＡＣＡＡＧＧＡＣＧＡＣＧＡＣＧＡＣＡＡＧＧＡＧＴＴＧＡＣＴＧＴＧＴＡＣＡＡＡＧＴＡＣＡＧ－３’及びｒｅｖ：５’－ＧＴＧＡＡＴＴＣＴＣＡＧＧＣＴＡＴＣＡＣＣＡＴＧＧ－３’）を用いた一段階ＰＣＲ反応（Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ ＩＩ Ｆｕｓｉｏｎ）であって、ヒトＳＯＲＬ１断片をＧｌｕ１５５２（３Ｆｎカセットの開始点と予測されている）の下流から終止コドンまで増幅する反応によって、ＦＬＡＧ ３Ｆｎミニ受容体を作製した。加えて、そのフォワードプライマーにより、３×ＦＬＡＧタグをコードする配列がアンプリコンの５’末端にが付加される。ＢａｍＨＩ制限酵素及びＥｃｏＲＩ制限酵素を用いて、発現を駆動するためのマウスＩｇκ鎖Ｖ－Ｊ２－Ｃシグナルペプチドを利用して、そのＰＣＲ産物をＰｓｅｃｔａｇ２Ｂ発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。
【0214】
プライマー対（ｆｗｄ：５’－ＣＡＧＧＡＴＣＣＧＡＧＴＴＧＡＣＴＧＴＧＴＡＣＡＡＡＧＴＡＣ－３’及びｒｅｖ：５’－ＧＴＧＡＡＴＴＣＴＣＡＣＡＧＡＴＣＣＴＣＴＴＣＴＧＡＧＡＴＧＡＧＴＴＴＴＴＧＴＴＣＧＧＣＴＡＴＣＡＣＣＡＴＧＧＧ－３’）を用いることによって、ｍｙｃ ３Ｆｎミニ受容体を同様に作製し、ｍｙｃタグは、そのＣ末端に付加した。
【0215】
部位特異的変異誘発
３Ｆｎカセットの推定Ｃ末端に終止コドンを導入する部位特異的変異誘発によって、ＦＬＡＧタグを有する可溶性の３Ｆｎミニ受容体を作製した。プライマーをメーカーからの指示に従って設計した（ｆｗｄ：５’－ＣＣＴＧＣＴＧＴＡＣＧＡＴＧＡＧＴＧＡＧＧＧＴＣＴＧＧＴＧＣＡＧＡＴＧＣ－３’、ｒｅｖ：５’－ＧＣＡＴＣＴＧＣＡＣＣＡＧＡＣＣＣＴＣＡＣＴＣＡＴＣＧＴＡＣＡＧＣＡＧＧ－３’）。ｐｓｅｃｔａｇ２Ｂベクター内のヒトｃＤＮＡ（３Ｆｎミニ受容体）で、Ｑｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ ＸＬという部位特異的変異誘発キット（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて、部位特異的変異誘発を行った。
３Ｆｎカセットの推定Ｃ末端に終止コドンを導入する部位特異的変異誘発によって、ＦＬＡＧタグを有する可溶性の３Ｆｎミニ受容体を作製した。プライマーをメーカーからの指示に従って設計した（ｆｗｄ：５’－ＣＣＴＧＣＴＧＴＡＣＧＡＴＧＡＧＴＧＡＧＧＧＴＣＴＧＧＴＧＣＡＧＡＴＧＣ－３’、ｒｅｖ：５’－ＧＣＡＴＣＴＧＣＡＣＣＡＧＡＣＣＣＴＣＡＣＴＣＡＴＣＧＴＡＣＡＧＣＡＧＧ－３’）。ｐｓｅｃｔａｇ２Ｂベクター内のヒトｃＤＮＡ（３Ｆｎミニ受容体）で、Ｑｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ ＸＬという部位特異的変異誘発キット（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて、部位特異的変異誘発を行った。
【0216】
細胞培養
１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び５％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ，Ｌｏｎｚａ）中で、ＨＥＫ２９３細胞、Ｎ２ａ細胞及びＨｅＬａ細胞を５％ＣＯ２の加湿インキュベーターにおいて、３７℃で培養した。
１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び５％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ，Ｌｏｎｚａ）中で、ＨＥＫ２９３細胞、Ｎ２ａ細胞及びＨｅＬａ細胞を５％ＣＯ２の加湿インキュベーターにおいて、３７℃で培養した。
【0217】
１０％ＦＢＳ及び５％Ｐ／Ｓを添加したＨｙｃｌｏｎｅ（Ｓｉｇｍａ）培地中で、ＣＨＯ細胞を５％ＣＯ２の加湿インキュベーターにおいて、３７℃で成長させた。
【0218】
Ｆｕｇｅｎｅ ６ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔというキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）、及びＤＮＡ鋳型１μｇまたは３μｇのいずれかを用いて、細胞に、異なるＳＯＲＬ１コンストラクト及びミニ受容体コンストラクトを一過性にトランスフェクションした。
【0219】
ＡＰＰの代謝
６ウェルプレートにおいて、１ウェル当たりにおよそ５×１０５個のＮ２ａ細胞を播種し、２４時間成長させた。続いて、細胞に、ＡＰＰ－ｍｙｃとともに、ＳＯＲＬ１－ＷＴ、３Ｆｎミニ受容体をコードするプラスミド、または空のｐｃＤＮＡ３．１ベクターのいずれかを一過性にコトランスフェクションした。４８時間後、その培地を無血清培地（ＳＦＭ）に変更し、さらに４８時間インキュベートしてから、細胞溶解液及び馴化培地を回収した。
６ウェルプレートにおいて、１ウェル当たりにおよそ５×１０５個のＮ２ａ細胞を播種し、２４時間成長させた。続いて、細胞に、ＡＰＰ－ｍｙｃとともに、ＳＯＲＬ１－ＷＴ、３Ｆｎミニ受容体をコードするプラスミド、または空のｐｃＤＮＡ３．１ベクターのいずれかを一過性にコトランスフェクションした。４８時間後、その培地を無血清培地（ＳＦＭ）に変更し、さらに４８時間インキュベートしてから、細胞溶解液及び馴化培地を回収した。
【0220】
イムノブロッティング
細胞上清を回収し、プロテアーゼ阻害剤Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（商標）（Ｒｏｃｈｅ）を添加した溶解緩衝液（１ＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ８．１）、０．５ＭのＥＤＴＡ、１％のＴｒｉｔｏｎ－Ｘ－１００、１％のＮＰ４０）中で、細胞ペレットを氷上で１時間溶解した。ＢＣＡアッセイキット（Ｓｉｇｍａ）を用いて、その溶解液中の総タンパク質含有量を測定した。
細胞上清を回収し、プロテアーゼ阻害剤Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（商標）（Ｒｏｃｈｅ）を添加した溶解緩衝液（１ＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ８．１）、０．５ＭのＥＤＴＡ、１％のＴｒｉｔｏｎ－Ｘ－１００、１％のＮＰ４０）中で、細胞ペレットを氷上で１時間溶解した。ＢＣＡアッセイキット（Ｓｉｇｍａ）を用いて、その溶解液中の総タンパク質含有量を測定した。
【0221】
溶解液及び培地の試料をＳＤＳ及び５％β－メルカプトエタノール（別段に記載のない限り）と混合してから、９５で５分加熱した。４→１２％のＢｉｓ－Ｔｒｉｓプレキャストグラジエントゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル電気泳動によってタンパク質を分離し、ニトロセルロース膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に転写した。その膜を１時間、室温で、ブロッキング緩衝液（Ｔｒｉｓ－Ｂａｓｅ ０．２５Ｍ、ＮａＣｌ ２．５Ｍ、脱脂粉乳２％、Ｔｗｅｅｎ－２０ ２％）中でブロックしてから、一次抗体において一晩、４℃でインキュベートした。膜をＨＲＰコンジュゲート二次抗体（１：１５００）において、１時間、室温でインキュベートし、最後に、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｆｅｍｔｏ Ｍａｘｉｍｕｍ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を用いて、Ｌａｓ－４０００ Ｉｍａｇｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ）で、そのタンパク質を検出した。
【0222】
抗体：抗ＦＬＡＧ（Ｍ２、Ｓｉｇｍａ）、抗ｓＡＰＰα（ＷＯ２）（ＭＡＢＮ１０、Ｍｅｒｃｋ）、抗ｍｙｃ（Ｒ９５１－２５、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、抗ＬＲ１１（ＢＤ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ＳＯＲＬＡタンパク質の細胞外部分全体を認識するために作製した抗ＳＯＲＬＡ（５３８７、自家作製、Ａａｒｈｕｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）、抗ＶＰＳ２６ｂ、抗ＡＰＰ及び抗－βアクチン（Ａ５４４１、Ｓｉｇｍａ）
【0223】
ｓＡＰＰα／ｓＡＰＰβイムノアッセイ（Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ）
ｓＡＰＰα／ｓＡＰＰβデュプレックスアッセイキット（Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を用いて、トランスフェクションしたＮ２ａ細胞から得た上清におけるｓＡＰＰα及びｓＡＰＰβのシェディングレベルを測定した。
ｓＡＰＰα／ｓＡＰＰβデュプレックスアッセイキット（Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を用いて、トランスフェクションしたＮ２ａ細胞から得た上清におけるｓＡＰＰα及びｓＡＰＰβのシェディングレベルを測定した。
【0224】
ｓＡＰＰα及びｓＡＰＰβのキャリブレーターの段階希釈液をメーカーの指示に従って調製した。プレコートしたプレートであって、スポットが４カ所のプレートを室温で、３％のブロッカーＡ溶液において１時間、振とうしながらインキュベートしてから、洗浄緩衝液のＴｒｉｓにおいて、３回洗浄した。キャリブレーター及び未希釈の細胞上清（２５μｌ）をそのプレートに加え、１時間、室温で振とうしながらインキュベートした後、そのプレートを３回洗浄した。最後に、そのウェルを１×Ｒｅａｄ Ｂｕｆｆｅｒ Ｔにおいて、１０分、室温でインキュベートした後、ＳＥＣＴＯＲ（登録商標）Ｉｍａｇｅｒ（Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を用いて、その試料からの電気化学発光シグナルを検出した。Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌで、キャリブレーターから作成した標準曲線にフィッティングすることによって、ｓＡＰＰα及びｓＡＰＰβの濃度を計算した。
【0225】
Ａβペプチドパネル１のイムノアッセイ（Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ）
Ａβパネル１のＶ－ｐｌｅｘアッセイキット（Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）によって、トランスフェクションしたＮ２ａ細胞から得た細胞上清において分泌されたＡβ３８、Ａβ４０及びＡβ４２を定量した。
Ａβパネル１のＶ－ｐｌｅｘアッセイキット（Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）によって、トランスフェクションしたＮ２ａ細胞から得た細胞上清において分泌されたＡβ３８、Ａβ４０及びＡβ４２を定量した。
【0226】
Ａβ３８、Ａβ４０及びＡβ４２のキャリブレーターを混合し、メーカーから指示されたとおり、４倍段階希釈で希釈した。複数スポットのプレートの、プレコートしたウェルを室温で、Ｄｉｌｕｅｎｔ ３５において１時間、室温でブロックし、３回、１×ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０において洗浄した。そのプレートに、検出抗体及びキャリブレーター／未希釈の細胞上清を同時に加え、２時間、室温で振とうしながらインキュベートした。最後に、それらのウェルを３回洗浄し、ＳＥＣＴＯＲ（登録商標）Ｉｍａｇｅｒで電気化学発光シグナルを直ちに解析するために、２×Ｒｅａｄ Ｂｕｆｆｅｒ Ｔを加えた。Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌによって、その試料を標準的曲線にフィッティングすることによって、Ａβ３８、Ａβ４０及びＡβ４２の濃度を計算した。
【0227】
免疫共沈降
ＨＥＫ２９３細胞に、一過性にトランスフェクションしてから、４８時間インキュベートした後、細胞溶解液を回収した。Ｇａｍｍａｂｉｎｄ Ｇセファロースビーズ／ダイナビーズに、２，５μｇの抗ＦＬＡＧ抗体（Ｆ１８０４、Ｓｉｇｍａ）を２時間、転倒回転させながら室温でコートした。ビーズを３回洗浄し、トランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞から得た全タンパク質７０μｇにおいて、一晩、４℃で転倒回転させながらインキュベートした。次に、ビーズを５回洗浄し、５％のβ－メルカプトエタノールを添加したＳＤＳ試料緩衝液を用いて、結合したタンパク質をそのビーズから溶離させた。すべての洗浄工程は、ＰＢＳ＋０，０５％のＴｗｅｅｎ－２０において行った。
ＨＥＫ２９３細胞に、一過性にトランスフェクションしてから、４８時間インキュベートした後、細胞溶解液を回収した。Ｇａｍｍａｂｉｎｄ Ｇセファロースビーズ／ダイナビーズに、２，５μｇの抗ＦＬＡＧ抗体（Ｆ１８０４、Ｓｉｇｍａ）を２時間、転倒回転させながら室温でコートした。ビーズを３回洗浄し、トランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞から得た全タンパク質７０μｇにおいて、一晩、４℃で転倒回転させながらインキュベートした。次に、ビーズを５回洗浄し、５％のβ－メルカプトエタノールを添加したＳＤＳ試料緩衝液を用いて、結合したタンパク質をそのビーズから溶離させた。すべての洗浄工程は、ＰＢＳ＋０，０５％のＴｗｅｅｎ－２０において行った。
【0228】
免疫細胞化学及び共焦点顕微鏡
ポリ－Ｌ－リジン０，１％（Ｓｉｇｍａ）をコートしたガラスカバースリップで、およそ５×１０４個のＨＥＫ２９３細胞を播種してから、２４時間インキュベートした後、トランスフェクションした。細胞には、トランスフェクション試薬Ｆｕｇｅｎｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、ＳＯＲＬ１－ＦＬＡＧ及びＳＯＲＬ１－ＧＦＰをトランスフェクションした。さらに２４時間後、細胞を４％のＰＦＡで１０分、室温で固定した後、ＰＢＳにおいて洗浄した。０，１％のＴｒｉｔｏｎ－ｘ－１００を含むＰＢＳにおいて、カバースリップを洗浄し、１０％のＦＢＳを添加したＰＢＳにおいて、３０分、室温でブロックした。ブロックした後、その細胞を一晩、４℃で、ＦＬＡＧタグに対する一次抗体（Ｆ１８０４ Ｓｉｇｍａ、１：１０００）及びＧＦＰ－タグに対する一次抗体（ａｂ６５５６ Ａｂｃａｍ、１：２０００）とともにインキュベートした。次に、０，１％のＴｒｉｔｏｎ－ｘ－１００を含むＰＢＳにおいて、細胞を洗浄し、二次抗体Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１：５００）において、１時間、室温でインキュベートした。続いて、細胞をＰＢＳにおいて洗浄し、核をＨｏｅｃｈｓｔ（Ａｂｃａｍ、１：５００００）で１０分、室温で対比染色した。最後に、そのカバースリップをスライドガラスにＤＡＫＯ蛍光封入剤（Ａｇｉｌｅｎｔ）でマウントし、乾燥後、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ７８０という共焦点顕微鏡を用いて、染色した細胞をイメージングした。
ポリ－Ｌ－リジン０，１％（Ｓｉｇｍａ）をコートしたガラスカバースリップで、およそ５×１０４個のＨＥＫ２９３細胞を播種してから、２４時間インキュベートした後、トランスフェクションした。細胞には、トランスフェクション試薬Ｆｕｇｅｎｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、ＳＯＲＬ１－ＦＬＡＧ及びＳＯＲＬ１－ＧＦＰをトランスフェクションした。さらに２４時間後、細胞を４％のＰＦＡで１０分、室温で固定した後、ＰＢＳにおいて洗浄した。０，１％のＴｒｉｔｏｎ－ｘ－１００を含むＰＢＳにおいて、カバースリップを洗浄し、１０％のＦＢＳを添加したＰＢＳにおいて、３０分、室温でブロックした。ブロックした後、その細胞を一晩、４℃で、ＦＬＡＧタグに対する一次抗体（Ｆ１８０４ Ｓｉｇｍａ、１：１０００）及びＧＦＰ－タグに対する一次抗体（ａｂ６５５６ Ａｂｃａｍ、１：２０００）とともにインキュベートした。次に、０，１％のＴｒｉｔｏｎ－ｘ－１００を含むＰＢＳにおいて、細胞を洗浄し、二次抗体Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１：５００）において、１時間、室温でインキュベートした。続いて、細胞をＰＢＳにおいて洗浄し、核をＨｏｅｃｈｓｔ（Ａｂｃａｍ、１：５００００）で１０分、室温で対比染色した。最後に、そのカバースリップをスライドガラスにＤＡＫＯ蛍光封入剤（Ａｇｉｌｅｎｔ）でマウントし、乾燥後、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ７８０という共焦点顕微鏡を用いて、染色した細胞をイメージングした。
【0229】
二分子蛍光補完法（ＢｉＦＣ）
ポリ－Ｌ－リジン０，１％をコートしたガラスカバースリップで、およそ５×１０４個のＨＥＫ２９３細胞を播種し、２４時間成長させてから、Ｆｕｇｅｎｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてトランスフェクションした。細胞には、ＳＯＲＬ１－Ｖ１、ＳＯＲＬ１－Ｖ２、ＳＯＲＬ１－ＧＦＰ、またはＳＯＲＬ１－Ｖ１及びＳＯＲＬ１－Ｖ２の両方のいずれかを５００ｎｇトランスフェクションした。トランスフェクションした細胞をさらに２４時間インキュベートし、４％のＰＦＡで１０分固定してから、ＰＢＳにおいて洗浄した。ＩＣＣについて上記したように、１：１００に希釈したＳＯＲＬＡ抗体（ｓｏｌ－ＳＯＲＬＡ、５３６７）及びＤＡＰＩで対比染色を行った。ＤＡＫＯ封入剤（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて、そのカバースリップをスライドガラスにマウントし、細胞を共焦点顕微鏡Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ７８０で可視化した。
ポリ－Ｌ－リジン０，１％をコートしたガラスカバースリップで、およそ５×１０４個のＨＥＫ２９３細胞を播種し、２４時間成長させてから、Ｆｕｇｅｎｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてトランスフェクションした。細胞には、ＳＯＲＬ１－Ｖ１、ＳＯＲＬ１－Ｖ２、ＳＯＲＬ１－ＧＦＰ、またはＳＯＲＬ１－Ｖ１及びＳＯＲＬ１－Ｖ２の両方のいずれかを５００ｎｇトランスフェクションした。トランスフェクションした細胞をさらに２４時間インキュベートし、４％のＰＦＡで１０分固定してから、ＰＢＳにおいて洗浄した。ＩＣＣについて上記したように、１：１００に希釈したＳＯＲＬＡ抗体（ｓｏｌ－ＳＯＲＬＡ、５３６７）及びＤＡＰＩで対比染色を行った。ＤＡＫＯ封入剤（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて、そのカバースリップをスライドガラスにマウントし、細胞を共焦点顕微鏡Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ７８０で可視化した。
【0230】
ｉｎ ｓｉｔｕ近接ライゲーションアッセイ（ＰＬＡ）
０，１％のポリ－Ｌ－リジンをコートしたガラスカバースリップで、ＨＥＫ２９３細胞を播種し、２４時間インキュベートしてから、Ｆｕｇｅｎｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてトランスフェクションした。その細胞に、ＳＯＲＬ１－ＦＬＡＧまたはＳＯＲＬ１－ＧＦＰのいずれかをコードするプラスミド５００ｎｇをコトランスフェクションし、２４時間インキュベートした。トランスフェクションしたその細胞を４％のＰＦＡにおいて１０分固定し、ＰＢＳにおいて洗浄してから、一次抗体においてインキュベートした。細胞を一晩、４℃で、抗ＦＬＡＧ抗体（Ｆ１８０４ Ｍ２、Ｓｉｇｍａ）もしくは抗ＧＦＰ抗体（ａｂ５６６５ウサギ、Ａｂｃａｍ）のいずれか、または１：１０００に希釈した抗ＦＬＡＧ抗体及び１：２０００に希釈した抗ＧＦＰ抗体の両方においてインキュベートした。続いて、０，１％のＴｒｉｔｏｎ－ｘ－１００を含むＰＢＳにおいて、その細胞を洗浄し、ＰＬＡプローブ（Ｓｉｇｍａ）において１時間、３７℃でインキュベートした。次に、細胞を洗浄緩衝液Ａにおいて洗浄し、リガーゼ（Ｓｉｇｍａ）において３０分、３７℃でインキュベートした。続いて、そのカバースリップを緩衝液Ａにおいて洗浄してから、ポリメラーゼ（Ｓｉｇｍａ）において１００分、３７℃でインキュベートした。その後、その細胞の１回目の洗浄を洗浄緩衝液Ｂにおいて行ってから、０，０１×洗浄緩衝液Ｂで１分洗浄した。最後に、ＤＡＰＩを含むＤｕｏｌｉｎｋ（登録商標）Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｍｏｕｔｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｓｉｇｍａ）で、カバースリップをスライドガラスにマウントし、共焦点顕微鏡（ＬＳＭ７８０、Ｚｅｉｓｓ）によってイメージングした。
０，１％のポリ－Ｌ－リジンをコートしたガラスカバースリップで、ＨＥＫ２９３細胞を播種し、２４時間インキュベートしてから、Ｆｕｇｅｎｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてトランスフェクションした。その細胞に、ＳＯＲＬ１－ＦＬＡＧまたはＳＯＲＬ１－ＧＦＰのいずれかをコードするプラスミド５００ｎｇをコトランスフェクションし、２４時間インキュベートした。トランスフェクションしたその細胞を４％のＰＦＡにおいて１０分固定し、ＰＢＳにおいて洗浄してから、一次抗体においてインキュベートした。細胞を一晩、４℃で、抗ＦＬＡＧ抗体（Ｆ１８０４ Ｍ２、Ｓｉｇｍａ）もしくは抗ＧＦＰ抗体（ａｂ５６６５ウサギ、Ａｂｃａｍ）のいずれか、または１：１０００に希釈した抗ＦＬＡＧ抗体及び１：２０００に希釈した抗ＧＦＰ抗体の両方においてインキュベートした。続いて、０，１％のＴｒｉｔｏｎ－ｘ－１００を含むＰＢＳにおいて、その細胞を洗浄し、ＰＬＡプローブ（Ｓｉｇｍａ）において１時間、３７℃でインキュベートした。次に、細胞を洗浄緩衝液Ａにおいて洗浄し、リガーゼ（Ｓｉｇｍａ）において３０分、３７℃でインキュベートした。続いて、そのカバースリップを緩衝液Ａにおいて洗浄してから、ポリメラーゼ（Ｓｉｇｍａ）において１００分、３７℃でインキュベートした。その後、その細胞の１回目の洗浄を洗浄緩衝液Ｂにおいて行ってから、０，０１×洗浄緩衝液Ｂで１分洗浄した。最後に、ＤＡＰＩを含むＤｕｏｌｉｎｋ（登録商標）Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｍｏｕｔｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｓｉｇｍａ）で、カバースリップをスライドガラスにマウントし、共焦点顕微鏡（ＬＳＭ７８０、Ｚｅｉｓｓ）によってイメージングした。
【0231】
ＧＦＰトラップによる免疫沈降
メーカーの指示に従い、ＧＦＰ－Ｔｒａｐ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ（Ｍ－２７０，Ｃｈｒｏｍｏｔｅｋ）を用いて、Ｃ末端とＶｅｎｕｓ断片との相互作用によって形成されたＳＯＲＬ１二量体（及びコントロールとしてのＳＯＲＬ１－ＧＦＰ）を免疫沈降させた。トランスフェクションしたＨＥＫ２９３／ＨｅＬａ細胞から得た全溶解液５００ｎｇを磁気ビーズスラリー２５μｌと１時間、４℃で転倒回転させながらインキュベートした。その後、ビーズを５回、洗浄緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％のＮｏｎｉｄｅｔ－Ｐ４０、０．５ｍＭのＥＤＴＡ）において洗浄し、ＳＤＳ試料緩衝液を用いて溶離した。
メーカーの指示に従い、ＧＦＰ－Ｔｒａｐ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ（Ｍ－２７０，Ｃｈｒｏｍｏｔｅｋ）を用いて、Ｃ末端とＶｅｎｕｓ断片との相互作用によって形成されたＳＯＲＬ１二量体（及びコントロールとしてのＳＯＲＬ１－ＧＦＰ）を免疫沈降させた。トランスフェクションしたＨＥＫ２９３／ＨｅＬａ細胞から得た全溶解液５００ｎｇを磁気ビーズスラリー２５μｌと１時間、４℃で転倒回転させながらインキュベートした。その後、ビーズを５回、洗浄緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％のＮｏｎｉｄｅｔ－Ｐ４０、０．５ｍＭのＥＤＴＡ）において洗浄し、ＳＤＳ試料緩衝液を用いて溶離した。
【0232】
結果：
ＳＯＲＬＡは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、３Ｆｎドメインによって二量体を形成する
我々は、ＳＯＲＬＡの二量体の能力をさらに明らかにするために、６個の３Ｆｎドメイン、膜貫通領域及び細胞質尾部を、Ｎ末端ＦＬＡＧタグ（実施例１及び２にも記載されているようなもの）またはＣ末端ｍｙｃタグ（実施例８ではＦＬＡＧ－ｍｉｎｉ、図１１Ａではｍｉｎｉ－ｍｙｃと称されている）のいずれかとともに含む２つのＳＯＲＬＡミニ受容体コンストラクトを作製した。我々は、これらの膜結合ミニ受容体とは別に、２個、４個及び６個の３Ｆｎドメイン（それぞれ、ｓ３Ｆｎ１－２、ｓ３Ｆｎ１－４及びｓ３Ｆｎ１－６）を含むが、細胞質尾部及び膜貫通領域を含まない可溶性形態のミニ受容体も作製した。
ＳＯＲＬＡは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、３Ｆｎドメインによって二量体を形成する
我々は、ＳＯＲＬＡの二量体の能力をさらに明らかにするために、６個の３Ｆｎドメイン、膜貫通領域及び細胞質尾部を、Ｎ末端ＦＬＡＧタグ（実施例１及び２にも記載されているようなもの）またはＣ末端ｍｙｃタグ（実施例８ではＦＬＡＧ－ｍｉｎｉ、図１１Ａではｍｉｎｉ－ｍｙｃと称されている）のいずれかとともに含む２つのＳＯＲＬＡミニ受容体コンストラクトを作製した。我々は、これらの膜結合ミニ受容体とは別に、２個、４個及び６個の３Ｆｎドメイン（それぞれ、ｓ３Ｆｎ１－２、ｓ３Ｆｎ１－４及びｓ３Ｆｎ１－６）を含むが、細胞質尾部及び膜貫通領域を含まない可溶性形態のミニ受容体も作製した。
【0233】
まず、我々は、ＦＬＡＧ－ｍｉｎｉ及びｍｉｎｉ－ｍｙｃをトランスフェクションした細胞の免疫共沈降解析を用いて、これらの２つの膜結合ミニ受容体が、複合体を形成する能力を試験した。我々は、両方のミニ受容体を共発現させた時に、抗ＦＬＡＧ抗体を用いて、ｍｉｎｉ－ｍｙｃを明らかに沈降させることができた一方で、ｍｉｎｉ－ｍｙｃのみをトランスフェクションしたが、ＦＬＡＧ－ｍｉｎｉを発現させなかった細胞では、ｍｉｎｉ－ｍｙｃの沈降は見られなかった（図１１Ｂ）。これにより、これらの２つのミニ受容体は、複合体を形成するが、大きい方の細胞質複合体の一部であることができる細胞質尾部が、これを媒介する可能性が排除されないことが示されている。
【0234】
ｓ３Ｆｎ１－６コンストラクトの発現を試験した第２の実験設定では、我々は、６個のドメインを有する可溶性ＳＯＲＬＡ断片をトランスフェクションした細胞から得た溶解液及び培地の両方から、タンパク質を通常どおりにＳＤＳ－ＰＡＧＥ分離した後、ＷＢ解析において、二量体に対応する明らかなシグナルを観察した（図１Ｃ）。
【0235】
この二量体形成は、第１の３Ｆｎドメイン及び第６の３Ｆｎドメインに存在するドメイン内ジスルフィド結合を還元するｂ－メルカプトエタノール（β－ＭＥ）によって試料を処置した時に影響を受けやすかったことから、この二量体形成が、正しくフォールディングされた３Ｆｎドメインの構造的一体性に左右されること、及びこれが、ＳＯＲＬＡのＴＭドメイン及び尾部ドメインでは無関係であることが示されている。
【0236】
最後に、我々は、ミニ受容体が、完全長形態のＳＯＲＬＡと相互作用して、ヘテロ二量体を形成できるかも試験した。我々は、ＨＥＫ２９３細胞に、ＦＬＡＧ－ｍｉｎｉと完全長ＳＯＲＬＡをコトランスフェクションし、細胞溶解液を調製し、抗ＦＬＡＧ抗体を用いて、タンパク質を沈降させた。ＳＯＲＬＡの細胞外断片に対するポリクローナル血清による検出を用いたＷＢ解析により、細胞において、ＦＬＡＧ－ｍｉｎｉが、完全長ＳＯＲＬＡも沈降させることが明らかに示された（図１Ｄ）。ＦＬＡＧ－ｍｉｎｉ及び空のベクターをコトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞、または並行して処置したが、ＩＰにおいて抗ＦＬＡＧ抗体を除外したダブルトランスフェクション細胞から得た溶解液をネガティブコントロール実験とした。
【0237】
エンドソームにおけるＳＯＲＬＡ二量体化の細胞解析
次に、我々は、ＳＯＲＬＡ二量体の形成の細胞局在を調べることに目を向けた。我々は、Ｃ末端にＦＬＡＧタグまたはＧＦＰタグを有する完全長ＳＯＲＬＡタンパク質のコンストラクトを調製し（図１２Ａ）、近接ライゲーションアッセイ（ＰＬＡ）を適用して、細胞内で、ＳＯＲＬＡが二量体を形成する場所を調べた。
次に、我々は、ＳＯＲＬＡ二量体の形成の細胞局在を調べることに目を向けた。我々は、Ｃ末端にＦＬＡＧタグまたはＧＦＰタグを有する完全長ＳＯＲＬＡタンパク質のコンストラクトを調製し（図１２Ａ）、近接ライゲーションアッセイ（ＰＬＡ）を適用して、細胞内で、ＳＯＲＬＡが二量体を形成する場所を調べた。
【0238】
２つの標的分子が近接すると（すなわち二量体化すると）ハイブリダイズでき、ローリングサークル増幅を可能にする短いオリゴヌクレオチドのタグを付加した二次抗体を用いて、免疫染色を行った。共焦点顕微鏡による可視化のために、蛍光標識されたオリゴが、そのアンプリコン上の相補的な配列に結合し、それが赤色ドットによって表される。ＦＬＡＧ抗体及びＧＦＰ抗体の両方で同時に染色したところ、強力なＰＬＡシグナルが顕微鏡によって検出され、これらの２つのＳＯＲＬＡ分子間での二量体化が示された。
【0239】
まず、我々は、ダブルトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞を用いて、これらの２つの異なるタグが、これらのタグ付きの受容体形態の局在に影響を及ぼすかを試験し、共局在の程度を求めた。この実験から、それらのタグでは、強い重複が見られ、Ｍａｎｄｅｒｓ係数は０．７１であったので、それらのタグにより、細胞局在に差が示されなかったことを我々は観察した（図１２Ｂ）。次に、我々は、抗ＦＬＡＧ（図１２Ｃ）または抗ＧＦＰ（図１２Ｄ）のいずれかを除外したＰＬＡ設定のコントロール実験を行い、いずれの設定でも、ＰＬＡシグナルの形成が消失した。しかしながら、両方の抗体の存在下では、強力なＰＬＡシグナルを我々は観察し（図１２Ｅ）、２つの完全長ＳＯＲＬＡタンパク質が、細胞内で、二量体を形成できることが確認された。しかしながら、我々が、ＰＬＡシグナル（ＳＯＲＬＡ二量体を表す）とＳＯＲＬＡ－ＧＦＰ（単量体及び二量体の両方を表す）の共局在の程度を求めたところ、いくつかのＰＬＡシグナルについては、共局在が明らかに見られないことに我々は気づき、Ｍａｎｄｅｒｓ係数により、重複がわずか０．３５であることが確認され（図１２Ｅ）、二量体として存在するのは、ＳＯＲＬＡタンパク質の細胞プールのごく一部であることが示唆された。
【0240】
我々及び他の研究者は、エンドソーム内で、ＳＯＲＬＡがいかにレトロマーと結合するかを以前に示し（Ｆｊｏｒｂａｃｋ ｅｔ ａｌ．２０１２）、関連する受容体ソルチリンが、特異的に酸性コンパートメントにおいて、二量体をいかに形成するかを示した（Ｊａｕｌｉｅｎｅ ｅｔ ａｌ．２０１７）。したがって、我々は、ＳＯＲＬＡ二量体も主としてエンドソーム内で形成されるという仮説を立てた。二量体を表すＰＬＡシグナルと、レトロマーコアのＶＰＳ３５サブユニットの共染により、共局在の程度が大きいことが示され、Ｍａｎｄｅｒｓ係数は０．７０であったことから、大半のＳＯＲＬＡ二量体が、レトロマーと一緒に位置することが確認された（図１２Ｆ）。
【0241】
エンドソームのレトロマーのＳＯＲＬＡ二量体への結合
次に、我々は、二分子蛍光補完（ＢｉＦＣ）アッセイを独立したアプローチとして用いて、細胞のＳＯＲＬＡが、単量体と二量体との間で平衡状態で存在することを確認したいと考えた。
次に、我々は、二分子蛍光補完（ＢｉＦＣ）アッセイを独立したアプローチとして用いて、細胞のＳＯＲＬＡが、単量体と二量体との間で平衡状態で存在することを確認したいと考えた。
【0242】
この技法は、スプリット蛍光タンパク質（ＧＦＰなど）の断片であって、ベイトタンパク質に融合した非蛍光性のＮ末端断片と、プレイタンパク質に融合した非蛍光性のＣ末端断片との構造的相補性に基づいている。ベイトタンパク質とプレイタンパク質が相互作用すると、スプリットドメインが近接して、それらのドメインをリフォールディングさせて、フルオロフォアを含む機能的なβバレル構造にする（図１３Ａ）。それにより、２つのタンパク質、我々の事例ではＳＯＲＬＡが二量体化すると、蛍光顕微鏡によって可視化できる蛍光タンパク質の形成が誘導される。
【0243】
したがって、２つのＳＯＲＬＡコンストラクトを操作して、蛍光タンパク質Ｖｅｎｕｓ（ＧＦＰの誘導体）のＮ末端断片（Ｍｅｔ１～Ｇｌｎ１５７）またはＣ末端断片（Ｌｙｓ１５８～Ｌｙｓ２３８）のいずれかからなるＣ末端融合体を含むようにした。これらの２つのＳＯＲＬＡコンストラクトは、蛍光タンパク質ＶｅｎｕｓのＮ末端部分を含むＳＯＲＬＡ－Ｖ１及び蛍光タンパク質ＶｅｎｕｓのＣ末端部分を含むＳＯＲＬＡ－Ｖ２と称した。
【0244】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、２つのＳＯＲＬＡ ＢｉＦＣコンストラクトのそれぞれを個別にトランスフェクションしても、緑色の蛍光シグナルは少しも生成されなかった（図１３Ｃ、上段及び中段のＶｅｎｕｓ）。これに対して、両方のコンストラクトをコトランスフェクションしたところ、特異的な緑色の細胞質シグナルが現れ、ＳＯＲＬＡが二量体化したことが示された（図１３Ｃ、下段、＊）。ＳＯＲＬＡ抗体で同時染色したところ、ＳＯＲＬＡが主に、ＨＥＫ２９３細胞の核周囲領域に局在することを示された以前の研究（Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．２０１２）と一致して、ＳＯＲＬＡ分子が著しく核周囲に局在したこと（矢印）が示された。ＳＯＲＬＡ二量体に特異的な緑色のＶｅｎｕｓシグナルと、抗ＳＯＲＬＡによる染色によって特定された全ＳＯＲＬＡのプールとの重複の定量により、ごく一部のＳＯＲＬＡが二量体として存在することが確認された（Ｍａｎｄｅｒｓ係数は０．３７）（図１３Ｄ）。
【0245】
次に、我々は、レトロマーが、ＳＯＲＬＡ単量体またはＳＯＲＬＡ二量体に優先的に結合するか試験したいと考えた。この目的のために、我々は、フォールディングされた状態で、Ｖｅｎｕｓタンパク質（ならびにＧＦＰ）と相互作用するナノボディに依存するＧＦＰトラップ技法を適用した。しかしながら、そのＧＦＰトラップに用いたナノボディは、Ｖ１ともＶ２とも、Ｖｅｎｕｓタンパク質のこれらの単離部分を沈降させるほど十分な親和性では結合しない。
【0246】
我々は、細胞に、タグなしで、ＳＯＲＬＡ－ＧＦＰ、ＳＯＲＬＡ－Ｖ１、ＳＯＲＬＡ－Ｖ２、ＳＯＲＬＡ－Ｖ１とＳＯＲＬＡ－Ｖ２との組み合わせ、ならびに完全長ＳＯＲＬＡをトランスフェクションし、ＳＯＲＬＡが、ＧＦＰトラップで沈降できる二量体を形成することを確認した（図１３Ｂ）。予想どおり、ＧＦＰトラップを用いると、ＳＯＲＬＡ－ＧＦＰも沈降し、これは、単量体及び二量体のＳＯＲＬＡの両方を表す一方で、再構成されたＶｅｎｕｓタンパク質から得られる沈降物は、ＳＯＲＬＡ二量体部分のみを含むことになる。その膜を、レトロマーのＶＰＳ２６ｂサブユニットに対する抗体でリプロービングすることによって、エンドソームのＳＯＲＬＡ二量体部分が実際に、レトロマーとの複合体で存在することを我々は示すことができた（図１３Ｂ）。このツールにより、ＳＯＲＬＡ単量体及びＳＯＲＬＡ二量体のインタラクトームのさらなる解析が可能になるが、このために、ＳＯＲＬＡがエンドソーム内で二量体を形成し、そのエンドソームにおいて、ＳＯＲＬＡがレトロマーと複合体を形成することが確認されている。
【0247】
結論：
勘案すると、我々のデータは、ＳＯＲＬＡが、その３Ｆｎドメインによって二量体を形成することの初めてのエビデンスを提供する。さらに、そのデータにより、ミニ受容体が、レトロマーと相互作用するのに十分であり、さらには、特定の部分においては（例えば、非アミロイド形成性及びアミロイド形成性のプロセシングに対する作用という部分においては）、完全長ＳｏｒＬＡよりも優れることがさらに裏付けられている。
勘案すると、我々のデータは、ＳＯＲＬＡが、その３Ｆｎドメインによって二量体を形成することの初めてのエビデンスを提供する。さらに、そのデータにより、ミニ受容体が、レトロマーと相互作用するのに十分であり、さらには、特定の部分においては（例えば、非アミロイド形成性及びアミロイド形成性のプロセシングに対する作用という部分においては）、完全長ＳｏｒＬＡよりも優れることがさらに裏付けられている。
【0248】
配列
配列番号１
完全なミニ受容体コンストラクトのＤＮＡ配列
ＢａｍＨＩ ＋ ３Ｘ－ＦＬＡＧ－ＴＡＧ ＋ ６ｘＦＮ３ ＋膜貫通ドメイン＋ 細胞質尾部＋ 終止コドン＋ ＥｃｏＲＩ
ＣＡＧＧＡＴＣＣＧＡＣＴＡＣＡＡＧＧＡＣＣＡＣＧＡＣＧＧＣＧＡＣＴＡＣＡＡＧＧＡＣＣＡＣＧＡＣＡＴＣＧＡＣＴＡＣＡＡＧＧＡＣＧＡＣＧＡＣＧＡＣＡＡＧＧＡＧＴＴＧＡＣＴＧＴＧＴＡＣＡＡＡＧＴＡＣＡＧＡＡＴＣＴＴＣＡＧＴＧＧＡＣＡＧＣＴＧＡＣＴＴＣＴＣＴＧＧＧＧＡＴＧＴＧＡＣＴＴＴＧＡＣＣＴＧＧＡＴＧＡＧＧＣＣＣＡＡＡＡＡＡＡＴＧＣＣＣＴＣＴＧＣＴＴＣＴＴＧＴＧＴＡＴＡＴＡＡＴＧＴＣＴＡＣＴＡＣＡＧＧＧＴＧＧＴＴＧＧＡＧＡＧＡＧＣＡＴＡＴＧＧＡＡＧＡＣＴＣＴＧＧＡＧＡＣＣＣＡＣＡＧＣＡＡＴＡＡＧＡＣＡＡＡＣＡＣＴＧＴＡＴＴＡＡＡＡＧＴＣＴＴＧＡＡＡＣＣＡＧＡＴＡＣＣＡＣＧＴＡＴＣＡＧＧＴＴＡＡＡＧＴＡＣＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＴＣＴＣＡＧＣＡＡＧＧＣＡＣＡＣＡＡＣＡＣＣＡＡＴＧＡＣＴＴＴＧＴＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＡＣＣＣＣＡＧＡＧＧＧＡＴＴＧＣＣＡＧＡＴＧＣＣＣＣＴＣＧＡＡＡＴＣＴＣＣＡＧＣＴＧＴＣＡＣＴＣＣＣＣＡＧＧＧＡＡＧＣＡＧＡＡＧＧＴＧＴＧＡＴＴＧＴＡＧＧＣＣＡＣＴＧＧＧＣＴＣＣＴＣＣＣＡＴＣＣＡＣＡＣＣＣＡＴＧＧＣＣＴＣＡＴＣＣＧＴＧＡＧＴＡＣＡＴＴＧＴＡＧＡＡＴＡＣＡＧＣＡＧＧＡＧＴＧＧＴＴＣＣＡＡＧＡＴＧＴＧＧＧＣＣＴＣＣＣＡＧＡＧＧＧＣＴＧＣＴＡＧＴＡＡＣＴＴＴＡＣＡＧＡＡＡＴＣＡＡＧＡＡＣＴＴＡＴＴＧＧＴＣＡＡＣＡＣＴＣＴＡＴＡＣＡＣＣＧＴＣＡＧＡＧＴＧＧＣＴＧＣＧＧＴＧＡＣＴＡＧＴＣＧＴＧＧＡＡＴＡＧＧＡＡＡＣＴＧＧＡＧＣＧＡＴＴＣＴＡＡＡＴＣＣＡＴＴＡＣＣＡＣＣＡＴＡＡＡＡＧＧＡＡＡＡＧＴＧＡＴＣＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＡＴＡＴＣＣＡＣＡＴＴＧＡＣＡＧＣＴＡＴＧＧＴＧＡＡＡＡＴＴＡＴＣＴＡＡＧＣＴＴＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＧＧＡＧＡＧＴＧＡＴＡＴＣＡＡＧＧＴＧＡＡＴＧＧＣＴＡＴＧＴＧＧＴＧＡＡＣＣＴＴＴＴＣＴＧＧＧＣＡＴＴＴＧＡＣＡＣＣＣＡＣＡＡＧＣＡＡＧＡＧＡＧＧＡＧＡＡＣＴＴＴＧＡＡＣＴＴＣＣＧＡＧＧＡＡＧＣＡＴＡＴＴＧＴＣＡＣＡＣＡＡＡＧＴＴＧＧＣＡＡＴＣＴＧＡＣＡＧＣＴＣＡＴＡＣＡＴＣＣＴＡＴＧＡＧＡＴＴＴＣＴＧＣＣＴＧＧＧＣＣＡＡＧＡＣＴＧＡＣＴＴＧＧＧＧＧＡＴＡＧＣＣＣＴＣＴＧＧＣＡＴＴＴＧＡＧＣＡＴＧＴＴＡＴＧＡＣＣＡＧＡＧＧＧＧＴＴＣＧＣＣＣＡＣＣＴＧＣＡＣＣＴＡＧＣＣＴＣＡＡＧＧＣＣＡＡＡＧＣＣＡＴＣＡＡＣＣＡＧＡＣＴＧＣＡＧＴＧＧＡＡＴＧＴＡＣＣＴＧＧＡＣＣＧＧＣＣＣＣＣＧＧＡＡＴＧＴＧＧＴＴＴＡＴＧＧＴＡＴＴＴＴＣＴＡＴＧＣＣＡＣＧＴＣＣＴＴＴＣＴＴＧＡＣＣＴＣＴＡＴＣＧＣＡＡＣＣＣＧＡＡＧＡＧＣＴＴＧＡＣＴＡＣＴＴＣＡＣＴＣＣＡＣＡＡＣＡＡＧＡＣＧＧＴＣＡＴＴＧＴＣＡＧＴＡＡＧＧＡＴＧＡＧＣＡＧＴＡＴＴＴＧＴＴＴＣＴＧＧＴＣＣＧＴＧＴＡＧＴＧＧＴＡＣＣＣＴＡＣＣＡＧＧＧＧＣＣＡＴＣＣＴＣＴＧＡＣＴＡＣＧＴＴＧＴＡＧＴＧＡＡＧＡＴＧＡＴＣＣＣＧＧＡＣＡＧＣＡＧＧＣＴＴＣＣＡＣＣＣＣＧＴＣＡＣＣＴＧＣＡＴＧＴＧＧＴＴＣＡＴＡＣＧＧＧＣＡＡＡＡＣＣＴＣＣＧＴＧＧＴＣＡＴＣＡＡＧＴＧＧＧＡＡＴＣＡＣＣＧＴＡＴＧＡＣＴＣＴＣＣＴＧＡＣＣＡＧＧＡＣＴＴＧＴＴＧＴＡＴＧＣＡＡＴＴＧＣＡＧＴＣＡＡＡＧＡＴＣＴＣＡＴＡＡＧＡＡＡＧＡＣＴＧＡＣＡＧＧＡＧＣＴＡＣＡＡＡＧＴＡＡＡＡＴＣＣＣＧＴＡＡＣＡＧＣＡＣＴＧＴＧＧＡＡＴＡＣＡＣＣＣＴＴＡＡＣＡＡＧＴＴＧＧＡＧＣＣＴＧＧＣＧＧＧＡＡＡＴＡＣＣＡＣＡＴＣＡＴＴＧＴＣＣＡＡＣＴＧＧＧＧＡＡＣＡＴＧＡＧＣＡＡＡＧＡＴＴＣＣＡＧＣＡＴＡＡＡＡＡＴＴＡＣＣＡＣＡＧＴＴＴＣＡＴＴＡＴＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＴＧＣＣＴＴＡＡＡＡＡＴＣＡＴＡＡＣＡＧＡＡＡＡＴＧＡＴＣＡＴＧＴＴＣＴＴＣＴＧＴＴＴＴＧＧＡＡＡＡＧＣＣＴＧＧＣＴＴＴＡＡＡＧＧＡＡＡＡＧＣＡＴＴＴＴＡＡＴＧＡＡＡＧＣＡＧＧＧＧＣＴＡＴＧＡＧＡＴＡＣＡＣＡＴＧＴＴＴＧＡＴＡＧＴＧＣＣＡＴＧＡＡＴＡＴＣＡＣＡＧＣＴＴＡＣＣＴＴＧＧＧＡＡＴＡＣＴＡＣＴＧＡＣＡＡＴＴＴＣＴＴＴＡＡＡＡＴＴＴＣＣＡＡＣＣＴＧＡＡＧＡＴＧＧＧＴＣＡＴＡＡＴＴＡＣＡＣＧＴＴＣＡＣＣＧＴＣＣＡＡＧＣＡＡＧＡＴＧＣＣＴＴＴＴＴＧＧＣＡＡＣＣＡＧＡＴＣＴＧＴＧＧＧＧＡＧＣＣＴＧＣＣＡＴＣＣＴＧＣＴＧＴＡＣＧＡＴＧＡＧＣＴＧＧＧＧＴＣＴＧＧＴＧＣＡＧＡＴＧＣＡＴＣＴＧＣＡＡＣＧＣＡＧＧＣＴＧＣＣＡＧＡＴＣＴＡＣＧＧＡＴＧＴＴＧＣＴＧＣＴＧＴＧＧＴＧＧＴＧＣＣＣＡＴＣＴＴＡＴＴＣＣＴＧＡＴＡＣＴＧＣＴＧＡＧＣＣＴＧＧＧＧＧＴＧＧＧＧＴＴＴＧＣＣＡＴＣＣＴＧＴＡＣＡＣＧＡＡＧＣＡＣＣＧＧＡＧＧＣＴＧＣＡＧＡＧＣＡＧＣＴＴＣＡＣＣＧＣＣＴＴＣＧＣＣＡＡＣＡＧＣＣＡＣＴＡＣＡＧＣＴＣＣＡＧＧＣＴＧＧＧＧＴＣＣＧＣＡＡＴＣＴＴＣＴＣＣＴＣＴＧＧＧＧＡＴＧＡＣＣＴＧＧＧＧＧＡＡＧＡＴＧＡＴＧＡＡＧＡＴＧＣＣＣＣＴＡＴＧＡＴＡＡＣＴＧＧＡＴＴＴＴＣＡＧＡＴＧＡＣＧＴＣＣＣＣＡＴＧＧＴＧＡＴＡＧＣＣＴＧＡＧＡＡＴＴＣＧＴ
配列番号１
完全なミニ受容体コンストラクトのＤＮＡ配列
ＢａｍＨＩ ＋ ３Ｘ－ＦＬＡＧ－ＴＡＧ ＋ ６ｘＦＮ３ ＋膜貫通ドメイン＋ 細胞質尾部＋ 終止コドン＋ ＥｃｏＲＩ
ＣＡＧＧＡＴＣＣＧＡＣＴＡＣＡＡＧＧＡＣＣＡＣＧＡＣＧＧＣＧＡＣＴＡＣＡＡＧＧＡＣＣＡＣＧＡＣＡＴＣＧＡＣＴＡＣＡＡＧＧＡＣＧＡＣＧＡＣＧＡＣＡＡＧＧＡＧＴＴＧＡＣＴＧＴＧＴＡＣＡＡＡＧＴＡＣＡＧＡＡＴＣＴＴＣＡＧＴＧＧＡＣＡＧＣＴＧＡＣＴＴＣＴＣＴＧＧＧＧＡＴＧＴＧＡＣＴＴＴＧＡＣＣＴＧＧＡＴＧＡＧＧＣＣＣＡＡＡＡＡＡＡＴＧＣＣＣＴＣＴＧＣＴＴＣＴＴＧＴＧＴＡＴＡＴＡＡＴＧＴＣＴＡＣＴＡＣＡＧＧＧＴＧＧＴＴＧＧＡＧＡＧＡＧＣＡＴＡＴＧＧＡＡＧＡＣＴＣＴＧＧＡＧＡＣＣＣＡＣＡＧＣＡＡＴＡＡＧＡＣＡＡＡＣＡＣＴＧＴＡＴＴＡＡＡＡＧＴＣＴＴＧＡＡＡＣＣＡＧＡＴＡＣＣＡＣＧＴＡＴＣＡＧＧＴＴＡＡＡＧＴＡＣＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＴＣＴＣＡＧＣＡＡＧＧＣＡＣＡＣＡＡＣＡＣＣＡＡＴＧＡＣＴＴＴＧＴＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＡＣＣＣＣＡＧＡＧＧＧＡＴＴＧＣＣＡＧＡＴＧＣＣＣＣＴＣＧＡＡＡＴＣＴＣＣＡＧＣＴＧＴＣＡＣＴＣＣＣＣＡＧＧＧＡＡＧＣＡＧＡＡＧＧＴＧＴＧＡＴＴＧＴＡＧＧＣＣＡＣＴＧＧＧＣＴＣＣＴＣＣＣＡＴＣＣＡＣＡＣＣＣＡＴＧＧＣＣＴＣＡＴＣＣＧＴＧＡＧＴＡＣＡＴＴＧＴＡＧＡＡＴＡＣＡＧＣＡＧＧＡＧＴＧＧＴＴＣＣＡＡＧＡＴＧＴＧＧＧＣＣＴＣＣＣＡＧＡＧＧＧＣＴＧＣＴＡＧＴＡＡＣＴＴＴＡＣＡＧＡＡＡＴＣＡＡＧＡＡＣＴＴＡＴＴＧＧＴＣＡＡＣＡＣＴＣＴＡＴＡＣＡＣＣＧＴＣＡＧＡＧＴＧＧＣＴＧＣＧＧＴＧＡＣＴＡＧＴＣＧＴＧＧＡＡＴＡＧＧＡＡＡＣＴＧＧＡＧＣＧＡＴＴＣＴＡＡＡＴＣＣＡＴＴＡＣＣＡＣＣＡＴＡＡＡＡＧＧＡＡＡＡＧＴＧＡＴＣＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＡＴＡＴＣＣＡＣＡＴＴＧＡＣＡＧＣＴＡＴＧＧＴＧＡＡＡＡＴＴＡＴＣＴＡＡＧＣＴＴＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＧＧＡＧＡＧＴＧＡＴＡＴＣＡＡＧＧＴＧＡＡＴＧＧＣＴＡＴＧＴＧＧＴＧＡＡＣＣＴＴＴＴＣＴＧＧＧＣＡＴＴＴＧＡＣＡＣＣＣＡＣＡＡＧＣＡＡＧＡＧＡＧＧＡＧＡＡＣＴＴＴＧＡＡＣＴＴＣＣＧＡＧＧＡＡＧＣＡＴＡＴＴＧＴＣＡＣＡＣＡＡＡＧＴＴＧＧＣＡＡＴＣＴＧＡＣＡＧＣＴＣＡＴＡＣＡＴＣＣＴＡＴＧＡＧＡＴＴＴＣＴＧＣＣＴＧＧＧＣＣＡＡＧＡＣＴＧＡＣＴＴＧＧＧＧＧＡＴＡＧＣＣＣＴＣＴＧＧＣＡＴＴＴＧＡＧＣＡＴＧＴＴＡＴＧＡＣＣＡＧＡＧＧＧＧＴＴＣＧＣＣＣＡＣＣＴＧＣＡＣＣＴＡＧＣＣＴＣＡＡＧＧＣＣＡＡＡＧＣＣＡＴＣＡＡＣＣＡＧＡＣＴＧＣＡＧＴＧＧＡＡＴＧＴＡＣＣＴＧＧＡＣＣＧＧＣＣＣＣＣＧＧＡＡＴＧＴＧＧＴＴＴＡＴＧＧＴＡＴＴＴＴＣＴＡＴＧＣＣＡＣＧＴＣＣＴＴＴＣＴＴＧＡＣＣＴＣＴＡＴＣＧＣＡＡＣＣＣＧＡＡＧＡＧＣＴＴＧＡＣＴＡＣＴＴＣＡＣＴＣＣＡＣＡＡＣＡＡＧＡＣＧＧＴＣＡＴＴＧＴＣＡＧＴＡＡＧＧＡＴＧＡＧＣＡＧＴＡＴＴＴＧＴＴＴＣＴＧＧＴＣＣＧＴＧＴＡＧＴＧＧＴＡＣＣＣＴＡＣＣＡＧＧＧＧＣＣＡＴＣＣＴＣＴＧＡＣＴＡＣＧＴＴＧＴＡＧＴＧＡＡＧＡＴＧＡＴＣＣＣＧＧＡＣＡＧＣＡＧＧＣＴＴＣＣＡＣＣＣＣＧＴＣＡＣＣＴＧＣＡＴＧＴＧＧＴＴＣＡＴＡＣＧＧＧＣＡＡＡＡＣＣＴＣＣＧＴＧＧＴＣＡＴＣＡＡＧＴＧＧＧＡＡＴＣＡＣＣＧＴＡＴＧＡＣＴＣＴＣＣＴＧＡＣＣＡＧＧＡＣＴＴＧＴＴＧＴＡＴＧＣＡＡＴＴＧＣＡＧＴＣＡＡＡＧＡＴＣＴＣＡＴＡＡＧＡＡＡＧＡＣＴＧＡＣＡＧＧＡＧＣＴＡＣＡＡＡＧＴＡＡＡＡＴＣＣＣＧＴＡＡＣＡＧＣＡＣＴＧＴＧＧＡＡＴＡＣＡＣＣＣＴＴＡＡＣＡＡＧＴＴＧＧＡＧＣＣＴＧＧＣＧＧＧＡＡＡＴＡＣＣＡＣＡＴＣＡＴＴＧＴＣＣＡＡＣＴＧＧＧＧＡＡＣＡＴＧＡＧＣＡＡＡＧＡＴＴＣＣＡＧＣＡＴＡＡＡＡＡＴＴＡＣＣＡＣＡＧＴＴＴＣＡＴＴＡＴＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＴＧＣＣＴＴＡＡＡＡＡＴＣＡＴＡＡＣＡＧＡＡＡＡＴＧＡＴＣＡＴＧＴＴＣＴＴＣＴＧＴＴＴＴＧＧＡＡＡＡＧＣＣＴＧＧＣＴＴＴＡＡＡＧＧＡＡＡＡＧＣＡＴＴＴＴＡＡＴＧＡＡＡＧＣＡＧＧＧＧＣＴＡＴＧＡＧＡＴＡＣＡＣＡＴＧＴＴＴＧＡＴＡＧＴＧＣＣＡＴＧＡＡＴＡＴＣＡＣＡＧＣＴＴＡＣＣＴＴＧＧＧＡＡＴＡＣＴＡＣＴＧＡＣＡＡＴＴＴＣＴＴＴＡＡＡＡＴＴＴＣＣＡＡＣＣＴＧＡＡＧＡＴＧＧＧＴＣＡＴＡＡＴＴＡＣＡＣＧＴＴＣＡＣＣＧＴＣＣＡＡＧＣＡＡＧＡＴＧＣＣＴＴＴＴＴＧＧＣＡＡＣＣＡＧＡＴＣＴＧＴＧＧＧＧＡＧＣＣＴＧＣＣＡＴＣＣＴＧＣＴＧＴＡＣＧＡＴＧＡＧＣＴＧＧＧＧＴＣＴＧＧＴＧＣＡＧＡＴＧＣＡＴＣＴＧＣＡＡＣＧＣＡＧＧＣＴＧＣＣＡＧＡＴＣＴＡＣＧＧＡＴＧＴＴＧＣＴＧＣＴＧＴＧＧＴＧＧＴＧＣＣＣＡＴＣＴＴＡＴＴＣＣＴＧＡＴＡＣＴＧＣＴＧＡＧＣＣＴＧＧＧＧＧＴＧＧＧＧＴＴＴＧＣＣＡＴＣＣＴＧＴＡＣＡＣＧＡＡＧＣＡＣＣＧＧＡＧＧＣＴＧＣＡＧＡＧＣＡＧＣＴＴＣＡＣＣＧＣＣＴＴＣＧＣＣＡＡＣＡＧＣＣＡＣＴＡＣＡＧＣＴＣＣＡＧＧＣＴＧＧＧＧＴＣＣＧＣＡＡＴＣＴＴＣＴＣＣＴＣＴＧＧＧＧＡＴＧＡＣＣＴＧＧＧＧＧＡＡＧＡＴＧＡＴＧＡＡＧＡＴＧＣＣＣＣＴＡＴＧＡＴＡＡＣＴＧＧＡＴＴＴＴＣＡＧＡＴＧＡＣＧＴＣＣＣＣＡＴＧＧＴＧＡＴＡＧＣＣＴＧＡＧＡＡＴＴＣＧＴ
【0249】
配列番号２
ＦｎＩＩＩ－１ドメインのＤＮＡ配列
ＧＡＧＴＴＧＡＣＴＧＴＧＴＡＣＡＡＡＧＴＡＣＡＧＡＡＴＣＴＴＣＡＧＴＧＧＡＣＡＧＣＴＧＡＣＴＴＣＴＣＴＧＧＧＧＡＴＧＴＧＡＣＴＴＴＧＡＣＣＴＧＧＡＴＧＡＧＧＣＣＣＡＡＡＡＡＡＡＴＧＣＣＣＴＣＴＧＣＴＴＣＴＴＧＴＧＴＡＴＡＴＡＡＴＧＴＣＴＡＣＴＡＣＡＧＧＧＴＧＧＴＴＧＧＡＧＡＧＡＧＣＡＴＡＴＧＧＡＡＧＡＣＴＣＴＧＧＡＧＡＣＣＣＡＣＡＧＣＡＡＴＡＡＧＡＣＡＡＡＣＡＣＴＧＴＡＴＴＡＡＡＡＧＴＣＴＴＧＡＡＡＣＣＡＧＡＴＡＣＣＡＣＧＴＡＴＣＡＧＧＴＴＡＡＡＧＴＡＣＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＴＣＴＣＡＧＣＡＡＧＧＣＡＣＡＣＡＡＣＡＣＣＡＡＴＧＡＣＴＴＴＧＴＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＡＣＣＣＣＡＧＡＧＧＧＡ
ＦｎＩＩＩ－１ドメインのＤＮＡ配列
ＧＡＧＴＴＧＡＣＴＧＴＧＴＡＣＡＡＡＧＴＡＣＡＧＡＡＴＣＴＴＣＡＧＴＧＧＡＣＡＧＣＴＧＡＣＴＴＣＴＣＴＧＧＧＧＡＴＧＴＧＡＣＴＴＴＧＡＣＣＴＧＧＡＴＧＡＧＧＣＣＣＡＡＡＡＡＡＡＴＧＣＣＣＴＣＴＧＣＴＴＣＴＴＧＴＧＴＡＴＡＴＡＡＴＧＴＣＴＡＣＴＡＣＡＧＧＧＴＧＧＴＴＧＧＡＧＡＧＡＧＣＡＴＡＴＧＧＡＡＧＡＣＴＣＴＧＧＡＧＡＣＣＣＡＣＡＧＣＡＡＴＡＡＧＡＣＡＡＡＣＡＣＴＧＴＡＴＴＡＡＡＡＧＴＣＴＴＧＡＡＡＣＣＡＧＡＴＡＣＣＡＣＧＴＡＴＣＡＧＧＴＴＡＡＡＧＴＡＣＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＴＣＴＣＡＧＣＡＡＧＧＣＡＣＡＣＡＡＣＡＣＣＡＡＴＧＡＣＴＴＴＧＴＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＡＣＣＣＣＡＧＡＧＧＧＡ
【0250】
配列番号３
ＦｎＩＩＩ－２ドメインのＤＮＡ配列
ＴＴＧＣＣＡＧＡＴＧＣＣＣＣＴＣＧＡＡＡＴＣＴＣＣＡＧＣＴＧＴＣＡＣＴＣＣＣＣＡＧＧＧＡＡＧＣＡＧＡＡＧＧＴＧＴＧＡＴＴＧＴＡＧＧＣＣＡＣＴＧＧＧＣＴＣＣＴＣＣＣＡＴＣＣＡＣＡＣＣＣＡＴＧＧＣＣＴＣＡＴＣＣＧＴＧＡＧＴＡＣＡＴＴＧＴＡＧＡＡＴＡＣＡＧＣＡＧＧＡＧＴＧＧＴＴＣＣＡＡＧＡＴＧＴＧＧＧＣＣＴＣＣＣＡＧＡＧＧＧＣＴＧＣＴＡＧＴＡＡＣＴＴＴＡＣＡＧＡＡＡＴＣＡＡＧＡＡＣＴＴＡＴＴＧＧＴＣＡＡＣＡＣＴＣＴＡＴＡＣＡＣＣＧＴＣＡＧＡＧＴＧＧＣＴＧＣＧＧＴＧＡＣＴＡＧＴＣＧＴＧＧＡＡＴＡＧＧＡＡＡＣＴＧＧＡＧＣＧＡＴＴＣＴＡＡＡＴＣＣＡＴＴＡＣＣＡＣＣＡＴＡＡＡＡＧＧＡＡＡＡ
ＦｎＩＩＩ－２ドメインのＤＮＡ配列
ＴＴＧＣＣＡＧＡＴＧＣＣＣＣＴＣＧＡＡＡＴＣＴＣＣＡＧＣＴＧＴＣＡＣＴＣＣＣＣＡＧＧＧＡＡＧＣＡＧＡＡＧＧＴＧＴＧＡＴＴＧＴＡＧＧＣＣＡＣＴＧＧＧＣＴＣＣＴＣＣＣＡＴＣＣＡＣＡＣＣＣＡＴＧＧＣＣＴＣＡＴＣＣＧＴＧＡＧＴＡＣＡＴＴＧＴＡＧＡＡＴＡＣＡＧＣＡＧＧＡＧＴＧＧＴＴＣＣＡＡＧＡＴＧＴＧＧＧＣＣＴＣＣＣＡＧＡＧＧＧＣＴＧＣＴＡＧＴＡＡＣＴＴＴＡＣＡＧＡＡＡＴＣＡＡＧＡＡＣＴＴＡＴＴＧＧＴＣＡＡＣＡＣＴＣＴＡＴＡＣＡＣＣＧＴＣＡＧＡＧＴＧＧＣＴＧＣＧＧＴＧＡＣＴＡＧＴＣＧＴＧＧＡＡＴＡＧＧＡＡＡＣＴＧＧＡＧＣＧＡＴＴＣＴＡＡＡＴＣＣＡＴＴＡＣＣＡＣＣＡＴＡＡＡＡＧＧＡＡＡＡ
【0251】
配列番号４
ＦｎＩＩＩ－３ドメインのＤＮＡ配列
ＧＴＧＡＴＣＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＡＴＡＴＣＣＡＣＡＴＴＧＡＣＡＧＣＴＡＴＧＧＴＧＡＡＡＡＴＴＡＴＣＴＡＡＧＣＴＴＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＧＧＡＧＡＧＴＧＡＴＡＴＣＡＡＧＧＴＧＡＡＴＧＧＣＴＡＴＧＴＧＧＴＧＡＡＣＣＴＴＴＴＣＴＧＧＧＣＡＴＴＴＧＡＣＡＣＣＣＡＣＡＡＧＣＡＡＧＡＧＡＧＧＡＧＡＡＣＴＴＴＧＡＡＣＴＴＣＣＧＡＧＧＡＡＧＣＡＴＡＴＴＧＴＣＡＣＡＣＡＡＡＧＴＴＧＧＣＡＡＴＣＴＧＡＣＡＧＣＴＣＡＴＡＣＡＴＣＣＴＡＴＧＡＧＡＴＴＴＣＴＧＣＣＴＧＧＧＣＣＡＡＧＡＣＴＧＡＣＴＴＧＧＧＧＧＡＴＡＧＣＣＣＴＣＴＧＧＣＡＴＴＴＧＡＧＣＡＴＧＴＴＡＴＧＡＣＣＡＧＡ
ＦｎＩＩＩ－３ドメインのＤＮＡ配列
ＧＴＧＡＴＣＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＡＴＡＴＣＣＡＣＡＴＴＧＡＣＡＧＣＴＡＴＧＧＴＧＡＡＡＡＴＴＡＴＣＴＡＡＧＣＴＴＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＧＧＡＧＡＧＴＧＡＴＡＴＣＡＡＧＧＴＧＡＡＴＧＧＣＴＡＴＧＴＧＧＴＧＡＡＣＣＴＴＴＴＣＴＧＧＧＣＡＴＴＴＧＡＣＡＣＣＣＡＣＡＡＧＣＡＡＧＡＧＡＧＧＡＧＡＡＣＴＴＴＧＡＡＣＴＴＣＣＧＡＧＧＡＡＧＣＡＴＡＴＴＧＴＣＡＣＡＣＡＡＡＧＴＴＧＧＣＡＡＴＣＴＧＡＣＡＧＣＴＣＡＴＡＣＡＴＣＣＴＡＴＧＡＧＡＴＴＴＣＴＧＣＣＴＧＧＧＣＣＡＡＧＡＣＴＧＡＣＴＴＧＧＧＧＧＡＴＡＧＣＣＣＴＣＴＧＧＣＡＴＴＴＧＡＧＣＡＴＧＴＴＡＴＧＡＣＣＡＧＡ
【0252】
配列番号５
ＦｎＩＩＩ－４ドメインのＤＮＡ配列
ＧＧＧＧＴＴＣＧＣＣＣＡＣＣＴＧＣＡＣＣＴＡＧＣＣＴＣＡＡＧＧＣＣＡＡＡＧＣＣＡＴＣＡＡＣＣＡＧＡＣＴＧＣＡＧＴＧＧＡＡＴＧＴＡＣＣＴＧＧＡＣＣＧＧＣＣＣＣＣＧＧＡＡＴＧＴＧＧＴＴＴＡＴＧＧＴＡＴＴＴＴＣＴＡＴＧＣＣＡＣＧＴＣＣＴＴＴＣＴＴＧＡＣＣＴＣＴＡＴＣＧＣＡＡＣＣＣＧＡＡＧＡＧＣＴＴＧＡＣＴＡＣＴＴＣＡＣＴＣＣＡＣＡＡＣＡＡＧＡＣＧＧＴＣＡＴＴＧＴＣＡＧＴＡＡＧＧＡＴＧＡＧＣＡＧＴＡＴＴＴＧＴＴＴＣＴＧＧＴＣＣＧＴＧＴＡＧＴＧＧＴＡＣＣＣＴＡＣＣＡＧＧＧＧＣＣＡＴＣＣＴＣＴＧＡＣＴＡＣＧＴＴＧＴＡＧＴＧＡＡＧＡＴＧＡＴＣＣＣＧＧＡＣＡＧＣ
ＦｎＩＩＩ－４ドメインのＤＮＡ配列
ＧＧＧＧＴＴＣＧＣＣＣＡＣＣＴＧＣＡＣＣＴＡＧＣＣＴＣＡＡＧＧＣＣＡＡＡＧＣＣＡＴＣＡＡＣＣＡＧＡＣＴＧＣＡＧＴＧＧＡＡＴＧＴＡＣＣＴＧＧＡＣＣＧＧＣＣＣＣＣＧＧＡＡＴＧＴＧＧＴＴＴＡＴＧＧＴＡＴＴＴＴＣＴＡＴＧＣＣＡＣＧＴＣＣＴＴＴＣＴＴＧＡＣＣＴＣＴＡＴＣＧＣＡＡＣＣＣＧＡＡＧＡＧＣＴＴＧＡＣＴＡＣＴＴＣＡＣＴＣＣＡＣＡＡＣＡＡＧＡＣＧＧＴＣＡＴＴＧＴＣＡＧＴＡＡＧＧＡＴＧＡＧＣＡＧＴＡＴＴＴＧＴＴＴＣＴＧＧＴＣＣＧＴＧＴＡＧＴＧＧＴＡＣＣＣＴＡＣＣＡＧＧＧＧＣＣＡＴＣＣＴＣＴＧＡＣＴＡＣＧＴＴＧＴＡＧＴＧＡＡＧＡＴＧＡＴＣＣＣＧＧＡＣＡＧＣ
【0253】
配列番号６
ＦｎＩＩＩ－５ドメインのＤＮＡ配列
ＡＧＧＣＴＴＣＣＡＣＣＣＣＧＴＣＡＣＣＴＧＣＡＴＧＴＧＧＴＴＣＡＴＡＣＧＧＧＣＡＡＡＡＣＣＴＣＣＧＴＧＧＴＣＡＴＣＡＡＧＴＧＧＧＡＡＴＣＡＣＣＧＴＡＴＧＡＣＴＣＴＣＣＴＧＡＣＣＡＧＧＡＣＴＴＧＴＴＧＴＡＴＧＣＡＡＴＴＧＣＡＧＴＣＡＡＡＧＡＴＣＴＣＡＴＡＡＧＡＡＡＧＡＣＴＧＡＣＡＧＧＡＧＣＴＡＣＡＡＡＧＴＡＡＡＡＴＣＣＣＧＴＡＡＣＡＧＣＡＣＴＧＴＧＧＡＡＴＡＣＡＣＣＣＴＴＡＡＣＡＡＧＴＴＧＧＡＧＣＣＴＧＧＣＧＧＧＡＡＡＴＡＣＣＡＣＡＴＣＡＴＴＧＴＣＣＡＡＣＴＧＧＧＧＡＡＣＡＴＧＡＧＣＡＡＡＧＡＴＴＣＣＡＧＣＡＴＡＡＡＡＡＴＴＡＣＣＡＣＡＧＴＴＴＣＡＴＴＡ
ＦｎＩＩＩ－５ドメインのＤＮＡ配列
ＡＧＧＣＴＴＣＣＡＣＣＣＣＧＴＣＡＣＣＴＧＣＡＴＧＴＧＧＴＴＣＡＴＡＣＧＧＧＣＡＡＡＡＣＣＴＣＣＧＴＧＧＴＣＡＴＣＡＡＧＴＧＧＧＡＡＴＣＡＣＣＧＴＡＴＧＡＣＴＣＴＣＣＴＧＡＣＣＡＧＧＡＣＴＴＧＴＴＧＴＡＴＧＣＡＡＴＴＧＣＡＧＴＣＡＡＡＧＡＴＣＴＣＡＴＡＡＧＡＡＡＧＡＣＴＧＡＣＡＧＧＡＧＣＴＡＣＡＡＡＧＴＡＡＡＡＴＣＣＣＧＴＡＡＣＡＧＣＡＣＴＧＴＧＧＡＡＴＡＣＡＣＣＣＴＴＡＡＣＡＡＧＴＴＧＧＡＧＣＣＴＧＧＣＧＧＧＡＡＡＴＡＣＣＡＣＡＴＣＡＴＴＧＴＣＣＡＡＣＴＧＧＧＧＡＡＣＡＴＧＡＧＣＡＡＡＧＡＴＴＣＣＡＧＣＡＴＡＡＡＡＡＴＴＡＣＣＡＣＡＧＴＴＴＣＡＴＴＡ
【0254】
配列番号７
ＦｎＩＩＩ－６ドメインのＤＮＡ配列
ＴＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＴＧＣＣＴＴＡＡＡＡＡＴＣＡＴＡＡＣＡＧＡＡＡＡＴＧＡＴＣＡＴＧＴＴＣＴＴＣＴＧＴＴＴＴＧＧＡＡＡＡＧＣＣＴＧＧＣＴＴＴＡＡＡＧＧＡＡＡＡＧＣＡＴＴＴＴＡＡＴＧＡＡＡＧＣＡＧＧＧＧＣＴＡＴＧＡＧＡＴＡＣＡＣＡＴＧＴＴＴＧＡＴＡＧＴＧＣＣＡＴＧＡＡＴＡＴＣＡＣＡＧＣＴＴＡＣＣＴＴＧＧＧＡＡＴＡＣＴＡＣＴＧＡＣＡＡＴＴＴＣＴＴＴＡＡＡＡＴＴＴＣＣＡＡＣＣＴＧＡＡＧＡＴＧＧＧＴＣＡＴＡＡＴＴＡＣＡＣＧＴＴＣＡＣＣＧＴＣＣＡＡＧＣＡＡＧＡＴＧＣＣＴＴＴＴＴＧＧＣＡＡＣＣＡＧＡＴＣＴＧＴＧＧＧＧＡＧＣＣＴＧＣＣＡＴＣＣＴＧＣＴＧＴＡＣＧＡＴＧＡＧＣＴＧＧＧＧＴＣＴ
ＦｎＩＩＩ－６ドメインのＤＮＡ配列
ＴＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＴＧＣＣＴＴＡＡＡＡＡＴＣＡＴＡＡＣＡＧＡＡＡＡＴＧＡＴＣＡＴＧＴＴＣＴＴＣＴＧＴＴＴＴＧＧＡＡＡＡＧＣＣＴＧＧＣＴＴＴＡＡＡＧＧＡＡＡＡＧＣＡＴＴＴＴＡＡＴＧＡＡＡＧＣＡＧＧＧＧＣＴＡＴＧＡＧＡＴＡＣＡＣＡＴＧＴＴＴＧＡＴＡＧＴＧＣＣＡＴＧＡＡＴＡＴＣＡＣＡＧＣＴＴＡＣＣＴＴＧＧＧＡＡＴＡＣＴＡＣＴＧＡＣＡＡＴＴＴＣＴＴＴＡＡＡＡＴＴＴＣＣＡＡＣＣＴＧＡＡＧＡＴＧＧＧＴＣＡＴＡＡＴＴＡＣＡＣＧＴＴＣＡＣＣＧＴＣＣＡＡＧＣＡＡＧＡＴＧＣＣＴＴＴＴＴＧＧＣＡＡＣＣＡＧＡＴＣＴＧＴＧＧＧＧＡＧＣＣＴＧＣＣＡＴＣＣＴＧＣＴＧＴＡＣＧＡＴＧＡＧＣＴＧＧＧＧＴＣＴ
【0255】
配列番号８
膜貫通ドメインのＤＮＡ配列
ＧＧＴＧＣＡＧＡＴＧＣＡＴＣＴＧＣＡＡＣＧＣＡＧＧＣＴＧＣＣＡＧＡＴＣＴＡＣＧＧＡＴＧＴＴＧＣＴＧＣＴＧＴＧＧＴＧＧＴＧＣＣＣＡＴＣＴＴＡＴＴＣＣＴＧＡＴＡＣＴＧＣＴＧＡＧＣＣＴＧＧＧＧＧＴＧＧＧＧＴＴＴＧＣＣＡＴＣＣＴＧＴＡＣＡＣＧ
膜貫通ドメインのＤＮＡ配列
ＧＧＴＧＣＡＧＡＴＧＣＡＴＣＴＧＣＡＡＣＧＣＡＧＧＣＴＧＣＣＡＧＡＴＣＴＡＣＧＧＡＴＧＴＴＧＣＴＧＣＴＧＴＧＧＴＧＧＴＧＣＣＣＡＴＣＴＴＡＴＴＣＣＴＧＡＴＡＣＴＧＣＴＧＡＧＣＣＴＧＧＧＧＧＴＧＧＧＧＴＴＴＧＣＣＡＴＣＣＴＧＴＡＣＡＣＧ
【0256】
配列番号９
細胞質尾部のＤＮＡ配列
ＡＡＧＣＡＣＣＧＧＡＧＧＣＴＧＣＡＧＡＧＣＡＧＣＴＴＣＡＣＣＧＣＣＴＴＣＧＣＣＡＡＣＡＧＣＣＡＣＴＡＣＡＧＣＴＣＣＡＧＧＣＴＧＧＧＧＴＣＣＧＣＡＡＴＣＴＴＣＴＣＣＴＣＴＧＧＧＧＡＴＧＡＣＣＴＧＧＧＧＧＡＡＧＡＴＧＡＴＧＡＡＧＡＴＧＣＣＣＣＴＡＴＧＡＴＡＡＣＴＧＧＡＴＴＴＴＣＡＧＡＴＧＡＣＧＴＣＣＣＣＡＴＧＧＴＧＡＴＡＧＣＣＴＧＡ
細胞質尾部のＤＮＡ配列
ＡＡＧＣＡＣＣＧＧＡＧＧＣＴＧＣＡＧＡＧＣＡＧＣＴＴＣＡＣＣＧＣＣＴＴＣＧＣＣＡＡＣＡＧＣＣＡＣＴＡＣＡＧＣＴＣＣＡＧＧＣＴＧＧＧＧＴＣＣＧＣＡＡＴＣＴＴＣＴＣＣＴＣＴＧＧＧＧＡＴＧＡＣＣＴＧＧＧＧＧＡＡＧＡＴＧＡＴＧＡＡＧＡＴＧＣＣＣＣＴＡＴＧＡＴＡＡＣＴＧＧＡＴＴＴＴＣＡＧＡＴＧＡＣＧＴＣＣＣＣＡＴＧＧＴＧＡＴＡＧＣＣＴＧＡ
【0257】
配列番号１０
（ＦＬＡＧタグを有する）完全なミニ受容体コンストラクトのアミノ酸配列
ＤＹＫＤＨＤＧＤＹＫＤＨＤＩＤＹＫＤＤＤＤＫＥＬＴＶＹＫＶＱＮＬＱＷＴＡＤＦＳＧＤＶＴＬＴＷＭＲＰＫＫＭＰＳＡＳＣＶＹＮＶＹＹＲＶＶＧＥＳＩＷＫＴＬＥＴＨＳＮＫＴＮＴＶＬＫＶＬＫＰＤＴＴＹＱＶＫＶＱＶＱＣＬＳＫＡＨＮＴＮＤＦＶＴＬＲＴＰＥＧＬＰＤＡＰＲＮＬＱＬＳＬＰＲＥＡＥＧＶＩＶＧＨＷＡＰＰＩＨＴＨＧＬＩＲＥＹＩＶＥＹＳＲＳＧＳＫＭＷＡＳＱＲＡＡＳＮＦＴＥＩＫＮＬＬＶＮＴＬＹＴＶＲＶＡＡＶＴＳＲＧＩＧＮＷＳＤＳＫＳＩＴＴＩＫＧＫＶＩＰＰＰＤＩＨＩＤＳＹＧＥＮＹＬＳＦＴＬＴＭＥＳＤＩＫＶＮＧＹＶＶＮＬＦＷＡＦＤＴＨＫＱＥＲＲＴＬＮＦＲＧＳＩＬＳＨＫＶＧＮＬＴＡＨＴＳＹＥＩＳＡＷＡＫＴＤＬＧＤＳＰＬＡＦＥＨＶＭＴＲＧＶＲＰＰＡＰＳＬＫＡＫＡＩＮＱＴＡＶＥＣＴＷＴＧＰＲＮＶＶＹＧＩＦＹＡＴＳＦＬＤＬＹＲＮＰＫＳＬＴＴＳＬＨＮＫＴＶＩＶＳＫＤＥＱＹＬＦＬＶＲＶＶＶＰＹＱＧＰＳＳＤＹＶＶＶＫＭＩＰＤＳＲＬＰＰＲＨＬＨＶＶＨＴＧＫＴＳＶＶＩＫＷＥＳＰＹＤＳＰＤＱＤＬＬＹＡＩＡＶＫＤＬＩＲＫＴＤＲＳＹＫＶＫＳＲＮＳＴＶＥＹＴＬＮＫＬＥＰＧＧＫＹＨＩＩＶＱＬＧＮＭＳＫＤＳＳＩＫＩＴＴＶＳＬＳＡＰＤＡＬＫＩＩＴＥＮＤＨＶＬＬＦＷＫＳＬＡＬＫＥＫＨＦＮＥＳＲＧＹＥＩＨＭＦＤＳＡＭＮＩＴＡＹＬＧＮＴＴＤＮＦＦＫＩＳＮＬＫＭＧＨＮＹＴＦＴＶＱＡＲＣＬＦＧＮＱＩＣＧＥＰＡＩＬＬＹＤＥＬＧＳＧＡＤＡＳＡＴＱＡＡＲＳＴＤＶＡＡＶＶＶＰＩＬＦＬＩＬＬＳＬＧＶＧＦＡＩＬＹＴＫＨＲＲＬＱＳＳＦＴＡＦＡＮＳＨＹＳＳＲＬＧＳＡＩＦＳＳＧＤＤＬＧＥＤＤＥＤＡＰＭＩＴＧＦＳＤＤＶＰＭＶＩＡ
（ＦＬＡＧタグを有する）完全なミニ受容体コンストラクトのアミノ酸配列
ＤＹＫＤＨＤＧＤＹＫＤＨＤＩＤＹＫＤＤＤＤＫＥＬＴＶＹＫＶＱＮＬＱＷＴＡＤＦＳＧＤＶＴＬＴＷＭＲＰＫＫＭＰＳＡＳＣＶＹＮＶＹＹＲＶＶＧＥＳＩＷＫＴＬＥＴＨＳＮＫＴＮＴＶＬＫＶＬＫＰＤＴＴＹＱＶＫＶＱＶＱＣＬＳＫＡＨＮＴＮＤＦＶＴＬＲＴＰＥＧＬＰＤＡＰＲＮＬＱＬＳＬＰＲＥＡＥＧＶＩＶＧＨＷＡＰＰＩＨＴＨＧＬＩＲＥＹＩＶＥＹＳＲＳＧＳＫＭＷＡＳＱＲＡＡＳＮＦＴＥＩＫＮＬＬＶＮＴＬＹＴＶＲＶＡＡＶＴＳＲＧＩＧＮＷＳＤＳＫＳＩＴＴＩＫＧＫＶＩＰＰＰＤＩＨＩＤＳＹＧＥＮＹＬＳＦＴＬＴＭＥＳＤＩＫＶＮＧＹＶＶＮＬＦＷＡＦＤＴＨＫＱＥＲＲＴＬＮＦＲＧＳＩＬＳＨＫＶＧＮＬＴＡＨＴＳＹＥＩＳＡＷＡＫＴＤＬＧＤＳＰＬＡＦＥＨＶＭＴＲＧＶＲＰＰＡＰＳＬＫＡＫＡＩＮＱＴＡＶＥＣＴＷＴＧＰＲＮＶＶＹＧＩＦＹＡＴＳＦＬＤＬＹＲＮＰＫＳＬＴＴＳＬＨＮＫＴＶＩＶＳＫＤＥＱＹＬＦＬＶＲＶＶＶＰＹＱＧＰＳＳＤＹＶＶＶＫＭＩＰＤＳＲＬＰＰＲＨＬＨＶＶＨＴＧＫＴＳＶＶＩＫＷＥＳＰＹＤＳＰＤＱＤＬＬＹＡＩＡＶＫＤＬＩＲＫＴＤＲＳＹＫＶＫＳＲＮＳＴＶＥＹＴＬＮＫＬＥＰＧＧＫＹＨＩＩＶＱＬＧＮＭＳＫＤＳＳＩＫＩＴＴＶＳＬＳＡＰＤＡＬＫＩＩＴＥＮＤＨＶＬＬＦＷＫＳＬＡＬＫＥＫＨＦＮＥＳＲＧＹＥＩＨＭＦＤＳＡＭＮＩＴＡＹＬＧＮＴＴＤＮＦＦＫＩＳＮＬＫＭＧＨＮＹＴＦＴＶＱＡＲＣＬＦＧＮＱＩＣＧＥＰＡＩＬＬＹＤＥＬＧＳＧＡＤＡＳＡＴＱＡＡＲＳＴＤＶＡＡＶＶＶＰＩＬＦＬＩＬＬＳＬＧＶＧＦＡＩＬＹＴＫＨＲＲＬＱＳＳＦＴＡＦＡＮＳＨＹＳＳＲＬＧＳＡＩＦＳＳＧＤＤＬＧＥＤＤＥＤＡＰＭＩＴＧＦＳＤＤＶＰＭＶＩＡ
【0258】
配列番号１１
ＦｎＩＩＩ－１ドメインのアミノ酸配列
ＥＬＴＶＹＫＶＱＮＬＱＷＴＡＤＦＳＧＤＶＴＬＴＷＭＲＰＫＫＭＰＳＡＳＣＶＹＮＶＹＹＲＶＶＧＥＳＩＷＫＴＬＥＴＨＳＮＫＴＮＴＶＬＫＶＬＫＰＤＴＴＹＱＶＫＶＱＶＱＣＬＳＫＡＨＮＴＮＤＦＶＴＬＲＴＰＥＧ
ＦｎＩＩＩ－１ドメインのアミノ酸配列
ＥＬＴＶＹＫＶＱＮＬＱＷＴＡＤＦＳＧＤＶＴＬＴＷＭＲＰＫＫＭＰＳＡＳＣＶＹＮＶＹＹＲＶＶＧＥＳＩＷＫＴＬＥＴＨＳＮＫＴＮＴＶＬＫＶＬＫＰＤＴＴＹＱＶＫＶＱＶＱＣＬＳＫＡＨＮＴＮＤＦＶＴＬＲＴＰＥＧ
【0259】
配列番号１２
ＦｎＩＩＩ－２ドメインのアミノ酸配列
ＬＰＤＡＰＲＮＬＱＬＳＬＰＲＥＡＥＧＶＩＶＧＨＷＡＰＰＩＨＴＨＧＬＩＲＥＹＩＶＥＹＳＲＳＧＳＫＭＷＡＳＱＲＡＡＳＮＦＴＥＩＫＮＬＬＶＮＴＬＹＴＶＲＶＡＡＶＴＳＲＧＩＧＮＷＳＤＳＫＳＩＴＴＩＫＧＫ
ＦｎＩＩＩ－２ドメインのアミノ酸配列
ＬＰＤＡＰＲＮＬＱＬＳＬＰＲＥＡＥＧＶＩＶＧＨＷＡＰＰＩＨＴＨＧＬＩＲＥＹＩＶＥＹＳＲＳＧＳＫＭＷＡＳＱＲＡＡＳＮＦＴＥＩＫＮＬＬＶＮＴＬＹＴＶＲＶＡＡＶＴＳＲＧＩＧＮＷＳＤＳＫＳＩＴＴＩＫＧＫ
【0260】
配列番号１３
ＦｎＩＩＩ－３ドメインのアミノ酸配列
ＶＩＰＰＰＤＩＨＩＤＳＹＧＥＮＹＬＳＦＴＬＴＭＥＳＤＩＫＶＮＧＹＶＶＮＬＦＷＡＦＤＴＨＫＱＥＲＲＴＬＮＦＲＧＳＩＬＳＨＫＶＧＮＬＴＡＨＴＳＹＥＩＳＡＷＡＫＴＤＬＧＤＳＰＬＡＦＥＨＶＭＴＲ
ＦｎＩＩＩ－３ドメインのアミノ酸配列
ＶＩＰＰＰＤＩＨＩＤＳＹＧＥＮＹＬＳＦＴＬＴＭＥＳＤＩＫＶＮＧＹＶＶＮＬＦＷＡＦＤＴＨＫＱＥＲＲＴＬＮＦＲＧＳＩＬＳＨＫＶＧＮＬＴＡＨＴＳＹＥＩＳＡＷＡＫＴＤＬＧＤＳＰＬＡＦＥＨＶＭＴＲ
【0261】
配列番号１４
ＦｎＩＩＩ－４ドメインのアミノ酸配列
ＧＶＲＰＰＡＰＳＬＫＡＫＡＩＮＱＴＡＶＥＣＴＷＴＧＰＲＮＶＶＹＧＩＦＹＡＴＳＦＬＤＬＹＲＮＰＫＳＬＴＴＳＬＨＮＫＴＶＩＶＳＫＤＥＱＹＬＦＬＶＲＶＶＶＰＹＱＧＰＳＳＤＹＶＶＶＫＭＩＰＤＳ
ＦｎＩＩＩ－４ドメインのアミノ酸配列
ＧＶＲＰＰＡＰＳＬＫＡＫＡＩＮＱＴＡＶＥＣＴＷＴＧＰＲＮＶＶＹＧＩＦＹＡＴＳＦＬＤＬＹＲＮＰＫＳＬＴＴＳＬＨＮＫＴＶＩＶＳＫＤＥＱＹＬＦＬＶＲＶＶＶＰＹＱＧＰＳＳＤＹＶＶＶＫＭＩＰＤＳ
【0262】
配列番号１５
ＦｎＩＩＩ－５ドメインのアミノ酸配列
ＲＬＰＰＲＨＬＨＶＶＨＴＧＫＴＳＶＶＩＫＷＥＳＰＹＤＳＰＤＱＤＬＬＹＡＩＡＶＫＤＬＩＲＫＴＤＲＳＹＫＶＫＳＲＮＳＴＶＥＹＴＬＮＫＬＥＰＧＧＫＹＨＩＩＶＱＬＧＮＭＳＫＤＳＳＩＫＩＴＴＶＳＬ
ＦｎＩＩＩ－５ドメインのアミノ酸配列
ＲＬＰＰＲＨＬＨＶＶＨＴＧＫＴＳＶＶＩＫＷＥＳＰＹＤＳＰＤＱＤＬＬＹＡＩＡＶＫＤＬＩＲＫＴＤＲＳＹＫＶＫＳＲＮＳＴＶＥＹＴＬＮＫＬＥＰＧＧＫＹＨＩＩＶＱＬＧＮＭＳＫＤＳＳＩＫＩＴＴＶＳＬ
【0263】
配列番号１６
ＦｎＩＩＩ－６ドメインのアミノ酸配列
ＳＡＰＤＡＬＫＩＩＴＥＮＤＨＶＬＬＦＷＫＳＬＡＬＫＥＫＨＦＮＥＳＲＧＹＥＩＨＭＦＤＳＡＭＮＩＴＡＹＬＧＮＴＴＤＮＦＦＫＩＳＮＬＫＭＧＨＮＹＴＦＴＶＱＡＲＣＬＦＧＮＱＩＣＧＥＰＡＩＬＬＹＤＥＬＧＳ
ＦｎＩＩＩ－６ドメインのアミノ酸配列
ＳＡＰＤＡＬＫＩＩＴＥＮＤＨＶＬＬＦＷＫＳＬＡＬＫＥＫＨＦＮＥＳＲＧＹＥＩＨＭＦＤＳＡＭＮＩＴＡＹＬＧＮＴＴＤＮＦＦＫＩＳＮＬＫＭＧＨＮＹＴＦＴＶＱＡＲＣＬＦＧＮＱＩＣＧＥＰＡＩＬＬＹＤＥＬＧＳ
【0264】
配列番号１７
膜貫通ドメインのアミノ酸配列
ＧＡＤＡＳＡＴＱＡＡＲＳＴＤＶＡＡＶＶＶＰＩＬＦＬＩＬＬＳＬＧＶＧＦＡＩＬＹＴ
膜貫通ドメインのアミノ酸配列
ＧＡＤＡＳＡＴＱＡＡＲＳＴＤＶＡＡＶＶＶＰＩＬＦＬＩＬＬＳＬＧＶＧＦＡＩＬＹＴ
【0265】
配列番号１８
細胞質尾部のアミノ酸配列
ＫＨＲＲＬＱＳＳＦＴＡＦＡＮＳＨＹＳＳＲＬＧＳＡＩＦＳＳＧＤＤＬＧＥＤＤＥＤＡＰＭＩＴＧＦＳＤＤＶＰＭＶＩＡ
細胞質尾部のアミノ酸配列
ＫＨＲＲＬＱＳＳＦＴＡＦＡＮＳＨＹＳＳＲＬＧＳＡＩＦＳＳＧＤＤＬＧＥＤＤＥＤＡＰＭＩＴＧＦＳＤＤＶＰＭＶＩＡ
【0266】
配列番号１９
フォワードプライマー
ＣＡＧＧＡＴＣＣＧＡＣＴＡＣＡＡＧＧＡＣＣＡＣＧＡＣＧＧＣＧＡＣＴＡＣＡＡＧＧＡＣＣＡＣＧＡＣＡＴＣＧＡＣＴＡＣＡＡＧＧＡＣＧＡＣＧＡＣＧＡＣＡＡＧＧＡＧＴＴＧＡＣＴＧＴＧＴＡＣＡＡＡＧＴＡＣＡＧ
フォワードプライマー
ＣＡＧＧＡＴＣＣＧＡＣＴＡＣＡＡＧＧＡＣＣＡＣＧＡＣＧＧＣＧＡＣＴＡＣＡＡＧＧＡＣＣＡＣＧＡＣＡＴＣＧＡＣＴＡＣＡＡＧＧＡＣＧＡＣＧＡＣＧＡＣＡＡＧＧＡＧＴＴＧＡＣＴＧＴＧＴＡＣＡＡＡＧＴＡＣＡＧ
【0267】
配列番号２０
リバースプライマー
ＧＴＧＡＡＴＴＣＴＣＡＧＧＣＴＡＴＣＡＣＣＡＴＧＧ
リバースプライマー
ＧＴＧＡＡＴＴＣＴＣＡＧＧＣＴＡＴＣＡＣＣＡＴＧＧ
【0268】
配列番号２１
Ｆｌａｇタグ
ＤＹＫＤＨＤＧＤＹＫＤＨＤＩＤＹＫＤＤＤＤＫ
Ｆｌａｇタグ
ＤＹＫＤＨＤＧＤＹＫＤＨＤＩＤＹＫＤＤＤＤＫ
【0269】
配列番号２２
（ＦＬＡＧタグを含まない）完全なミニ受容体コンストラクトのアミノ酸配列
ＥＬＴＶＹＫＶＱＮＬＱＷＴＡＤＦＳＧＤＶＴＬＴＷＭＲＰＫＫＭＰＳＡＳＣＶＹＮＶＹＹＲＶＶＧＥＳＩＷＫＴＬＥＴＨＳＮＫＴＮＴＶＬＫＶＬＫＰＤＴＴＹＱＶＫＶＱＶＱＣＬＳＫＡＨＮＴＮＤＦＶＴＬＲＴＰＥＧＬＰＤＡＰＲＮＬＱＬＳＬＰＲＥＡＥＧＶＩＶＧＨＷＡＰＰＩＨＴＨＧＬＩＲＥＹＩＶＥＹＳＲＳＧＳＫＭＷＡＳＱＲＡＡＳＮＦＴＥＩＫＮＬＬＶＮＴＬＹＴＶＲＶＡＡＶＴＳＲＧＩＧＮＷＳＤＳＫＳＩＴＴＩＫＧＫＶＩＰＰＰＤＩＨＩＤＳＹＧＥＮＹＬＳＦＴＬＴＭＥＳＤＩＫＶＮＧＹＶＶＮＬＦＷＡＦＤＴＨＫＱＥＲＲＴＬＮＦＲＧＳＩＬＳＨＫＶＧＮＬＴＡＨＴＳＹＥＩＳＡＷＡＫＴＤＬＧＤＳＰＬＡＦＥＨＶＭＴＲＧＶＲＰＰＡＰＳＬＫＡＫＡＩＮＱＴＡＶＥＣＴＷＴＧＰＲＮＶＶＹＧＩＦＹＡＴＳＦＬＤＬＹＲＮＰＫＳＬＴＴＳＬＨＮＫＴＶＩＶＳＫＤＥＱＹＬＦＬＶＲＶＶＶＰＹＱＧＰＳＳＤＹＶＶＶＫＭＩＰＤＳＲＬＰＰＲＨＬＨＶＶＨＴＧＫＴＳＶＶＩＫＷＥＳＰＹＤＳＰＤＱＤＬＬＹＡＩＡＶＫＤＬＩＲＫＴＤＲＳＹＫＶＫＳＲＮＳＴＶＥＹＴＬＮＫＬＥＰＧＧＫＹＨＩＩＶＱＬＧＮＭＳＫＤＳＳＩＫＩＴＴＶＳＬＳＡＰＤＡＬＫＩＩＴＥＮＤＨＶＬＬＦＷＫＳＬＡＬＫＥＫＨＦＮＥＳＲＧＹＥＩＨＭＦＤＳＡＭＮＩＴＡＹＬＧＮＴＴＤＮＦＦＫＩＳＮＬＫＭＧＨＮＹＴＦＴＶＱＡＲＣＬＦＧＮＱＩＣＧＥＰＡＩＬＬＹＤＥＬＧＳＧＡＤＡＳＡＴＱＡＡＲＳＴＤＶＡＡＶＶＶＰＩＬＦＬＩＬＬＳＬＧＶＧＦＡＩＬＹＴＫＨＲＲＬＱＳＳＦＴＡＦＡＮＳＨＹＳＳＲＬＧＳＡＩＦＳＳＧＤＤＬＧＥＤＤＥＤＡＰＭＩＴＧＦＳＤＤＶＰＭＶＩＡ
（ＦＬＡＧタグを含まない）完全なミニ受容体コンストラクトのアミノ酸配列
ＥＬＴＶＹＫＶＱＮＬＱＷＴＡＤＦＳＧＤＶＴＬＴＷＭＲＰＫＫＭＰＳＡＳＣＶＹＮＶＹＹＲＶＶＧＥＳＩＷＫＴＬＥＴＨＳＮＫＴＮＴＶＬＫＶＬＫＰＤＴＴＹＱＶＫＶＱＶＱＣＬＳＫＡＨＮＴＮＤＦＶＴＬＲＴＰＥＧＬＰＤＡＰＲＮＬＱＬＳＬＰＲＥＡＥＧＶＩＶＧＨＷＡＰＰＩＨＴＨＧＬＩＲＥＹＩＶＥＹＳＲＳＧＳＫＭＷＡＳＱＲＡＡＳＮＦＴＥＩＫＮＬＬＶＮＴＬＹＴＶＲＶＡＡＶＴＳＲＧＩＧＮＷＳＤＳＫＳＩＴＴＩＫＧＫＶＩＰＰＰＤＩＨＩＤＳＹＧＥＮＹＬＳＦＴＬＴＭＥＳＤＩＫＶＮＧＹＶＶＮＬＦＷＡＦＤＴＨＫＱＥＲＲＴＬＮＦＲＧＳＩＬＳＨＫＶＧＮＬＴＡＨＴＳＹＥＩＳＡＷＡＫＴＤＬＧＤＳＰＬＡＦＥＨＶＭＴＲＧＶＲＰＰＡＰＳＬＫＡＫＡＩＮＱＴＡＶＥＣＴＷＴＧＰＲＮＶＶＹＧＩＦＹＡＴＳＦＬＤＬＹＲＮＰＫＳＬＴＴＳＬＨＮＫＴＶＩＶＳＫＤＥＱＹＬＦＬＶＲＶＶＶＰＹＱＧＰＳＳＤＹＶＶＶＫＭＩＰＤＳＲＬＰＰＲＨＬＨＶＶＨＴＧＫＴＳＶＶＩＫＷＥＳＰＹＤＳＰＤＱＤＬＬＹＡＩＡＶＫＤＬＩＲＫＴＤＲＳＹＫＶＫＳＲＮＳＴＶＥＹＴＬＮＫＬＥＰＧＧＫＹＨＩＩＶＱＬＧＮＭＳＫＤＳＳＩＫＩＴＴＶＳＬＳＡＰＤＡＬＫＩＩＴＥＮＤＨＶＬＬＦＷＫＳＬＡＬＫＥＫＨＦＮＥＳＲＧＹＥＩＨＭＦＤＳＡＭＮＩＴＡＹＬＧＮＴＴＤＮＦＦＫＩＳＮＬＫＭＧＨＮＹＴＦＴＶＱＡＲＣＬＦＧＮＱＩＣＧＥＰＡＩＬＬＹＤＥＬＧＳＧＡＤＡＳＡＴＱＡＡＲＳＴＤＶＡＡＶＶＶＰＩＬＦＬＩＬＬＳＬＧＶＧＦＡＩＬＹＴＫＨＲＲＬＱＳＳＦＴＡＦＡＮＳＨＹＳＳＲＬＧＳＡＩＦＳＳＧＤＤＬＧＥＤＤＥＤＡＰＭＩＴＧＦＳＤＤＶＰＭＶＩＡ
【0270】
参照文献
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【図1】
【図2】
【図3-1】
【図3-2】
【図3-3】
【図3-4】
【図4A】
【図4B】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図9】
【図10A】
【図10B】
【図10C】
【図10D】
【図10E】
【図10F】
【図11A】
【図11B】
【図11C】
【図11D】
【図12A】
【図12B】
【図12C】
【図12D】
【図12E】
【図12F】
【図13A】
【図13B】
【図13C】
【図13D】
【配列表】
【国際調査報告】