特表 2024-525231 ｐ３８ ＭＡＰキナーゼ阻害剤で炎症性疾患の治療効果を示す新規な化合物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-07-10

(54)【発明の名称】ｐ３８ ＭＡＰキナーゼ阻害剤で炎症性疾患の治療効果を示す新規な化合物

(51)【国際特許分類】

   C07D 213/50 20060101AFI20240703BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20240703BHJP

   A61K 31/44 20060101ALI20240703BHJP

   A61K 31/404 20060101ALI20240703BHJP

   A61K 31/4439 20060101ALI20240703BHJP

   C07D 209/12 20060101ALI20240703BHJP

   C07D 401/06 20060101ALI20240703BHJP

【ＦＩ】

C07D213/50 CSP

A61P29/00

A61K31/44

A61K31/404

A61K31/4439

C07D209/12

C07D401/06

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024500410

(86)(22)【出願日】2021-12-23

(85)【翻訳文提出日】2024-01-16

(86)【国際出願番号】 KR2021019687

(87)【国際公開番号】W WO2023282414

(87)【国際公開日】2023-01-12

(31)【優先権主張番号】10-2021-0088499

(32)【優先日】2021-07-06

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】523287816

【氏名又は名称】プレイザーセラピューティクス インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】ＰＲＡＺＥＲＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ ＩＮＣ．

(74)【代理人】

【識別番号】100147485

【弁理士】

【氏名又は名称】杉村 憲司

(74)【代理人】

【識別番号】230118913

【弁護士】

【氏名又は名称】杉村 光嗣

(74)【代理人】

【識別番号】100195556

【弁理士】

【氏名又は名称】柿沼 公二

(72)【発明者】

【氏名】イン ギョンス

(72)【発明者】

【氏名】キム ナムジュン

(72)【発明者】

【氏名】イ ジョンギル

(72)【発明者】

【氏名】キム ガヨン

(72)【発明者】

【氏名】キム ギョジン

(72)【発明者】

【氏名】キム ドンファン

(72)【発明者】

【氏名】ド ジミン

(72)【発明者】

【氏名】ソン チェウォン

(72)【発明者】

【氏名】イ ナレ

【テーマコード（参考）】

4C086

【Ｆターム（参考）】

4C086AA01

4C086AA02

4C086AA03

4C086BC13

4C086BC17

4C086GA07

4C086GA08

4C086MA01

4C086MA04

4C086MA52

4C086NA14

4C086ZB11

4C086ZC20

(57)【要約】

本発明は、抗炎症活性を示す新規な化合物に関するものであって、本発明の化合物は、炎症前駆物質の生成に決定的な役割を行って、炎症性疾患を誘発すると知られたｐ３８ ＭＡＰＫに対して優れた阻害効能を有するので、炎症性疾患の治療剤として有用に使われる。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

下記化学式１の化合物またはその薬学的に許容可能な塩；

【化1】

前記式において、

【化2】

Ｒ_２は、Ｈ、ハロゲン、または－Ｃ_１－Ｃ_６アルキルであり、
Ｒ_３は、Ｈまたはハロゲンである。

【請求項2】

前記化合物が、下記化合物からなる群から選択される化合物またはその薬学的に許容可能な塩である、請求項１に記載の化合物：

【請求項3】

請求項１に記載の化合物を含む炎症性疾患の治療または予防用薬学組成物。

【請求項4】

請求項２に記載の化合物を含む炎症性疾患の治療または予防用薬学組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、抗炎症活性を示す新規な化合物に係り、本発明の新規な化合物は、優れたｐ３８ ＭＡＰキナーゼの阻害効能を有るものであって、炎症性疾患の治療剤として有用に使われる。

【背景技術】

【0002】

ｐ３８は、ＭＡＰキナーゼ（ｍｉｔｏｇｅｎ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅｓ、ＭＡＰＫ）ファミリーに属するセリン／トレオニンリン酸化酵素の一種である。ＭＡＰＫ経路は、さまざまな細胞外部の刺激によって活性化されて細胞の特定基質のリン酸化を通じて細胞内さまざまな反応が起こるように切り換えるが、ＭＡＰＫの下位種類としては、ｐ３８以外にもＪＮＫ、ＥＲＫなどがある。ＭＡＰＫは、インスリン（ｉｎｓｕｌｉｎ）、有糸分裂物質（ｍｉｔｏｇｅｎ）、成長因子（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、免疫細胞の活性化刺激などによって活性化されるタンパク質リン酸化酵素であり、細胞表面にある受容体の信号を細胞内に伝達する信号伝達経路で重要な位置を占める。

【0003】

ｐ３８信号伝達体系は、新陳代謝及び細胞死のような過程を調節し、上位段階のリン酸化酵素が下位段階のリン酸化酵素にリン酸基を伝達する一連の連鎖的なリン酸化過程を経る。ｐ３８ ＭＡＰＫとしては、ｐ３８－α、ｐ３８－β、ｐ３８－γ、ｐ３８－δなどが明らかになり、浸透圧（ｏｓｍｏｔｉｃ ｓｈｏｃｋ）、炎症サイトカイン（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ）、ＬＰＳ（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ）、紫外線（ＵＶ）、成長因子（ＧＦ）などによって活性化される。

【0004】

炎症は、さまざまな原因によって発生すると知られているが、多様な研究によれば、多様なストレス刺激によってＭＡＰＫが活性化され、特に、ｐ３８ ＭＡＰＫは、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、ＩＬ－６のような炎症前駆物質（ｐｒｏ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ）の生成に決定的な役割を行って、炎症性疾患を誘発すると知られている（ＮＡＴＵＲＥ ＲＥＶＩＥＷＳ，Ｄｒｕｇ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（２００３），Ｖｏｌ．２，７１７－７２６）。これにより、ｐ３８ ＭＡＰＫの阻害剤として幾つかの低分子化合物（ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）が開発され（大韓民国登録特許第１０－１８７９４８１号など）、ｐ３８のさまざまな低分子阻害剤は、低い濃度でヒト単核細胞でＩＬ－１及びＴＮＦ合成を抑制することにより、炎症調節子の役割を行い、このようなサイトカインの抑制は、炎症反応を調節、緩和または軽減させることができると明らかになった。

【0005】

これと関連して、本発明の発明者らは、ｐ３８ ＭＡＰＫ抑制を通じて抗炎症活性を有する新規な化合物を研究した結果、本発明を完成した。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本発明は、炎症性疾患の効果的な治療のために、ｐ３８ ＭＡＰキナーゼを効果的に抑制して優れた抗炎症効能を有する新規な化合物を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0007】

前記目的を果たすために、本発明は、下記化学式１の化合物またはその薬学的に許容可能な塩を提供する。

【0008】

【化1】

【0009】

前記式において、

【0010】

【化2】

【0011】

Ｒ_２は、Ｈ、ハロゲン、または－Ｃ_１－Ｃ_６、

【0012】

Ｒ_３は、Ｈまたはハロゲンである。

【0013】

具体的に、本発明の化合物は、下記表１の化合物またはその薬学的に許容可能な塩を含みうる。

【0014】

【表1】

【0015】

本発明による化合物を含む炎症性疾患の治療または予防用組成物を提供することができる。

【発明の効果】

【0016】

本発明の化合物は、炎症前駆物質の生成に決定的な役割を行って、炎症性疾患を誘発すると知られたｐ３８ ＭＡＰＫに対して優れた阻害効能を有するので、炎症性疾患の治療剤として有用に使われる。

【図面の簡単な説明】

【0017】

【図1】［図１及び図２］本発明による化合物の炎症サイトカインＩＬ－１β及びＴＮＦαの相対的なｍＲＮＡ発現量を示す図面である。

【図2】［図１及び図２］本発明による化合物の炎症サイトカインＩＬ－１β及びＴＮＦαの相対的なｍＲＮＡ発現量を示す図面である。

【図3】［図３ないし図５］本発明による化合物の炎症サイトカインＩＬ－１β、ＴＮＦα及びＩＬ－６の相対的なｍＲＮＡ発現量を示す図面である。

【図4】［図３ないし図５］本発明による化合物の炎症サイトカインＩＬ－１β、ＴＮＦα及びＩＬ－６の相対的なｍＲＮＡ発現量を示す図面である。

【図5】［図３ないし図５］本発明による化合物の炎症サイトカインＩＬ－１β、ＴＮＦα及びＩＬ－６の相対的なｍＲＮＡ発現量を示す図面である。

【発明を実施するための形態】

【0018】

以下、添付した図面を参照して、当業者が容易に実施できるように本発明の実施形態及び実施例を詳しく説明する。しかし、本発明は、さまざまな形態として具現され、ここで説明する実施形態及び実施例に限定されるものではない。

【0019】

本発明の明細書の全体において、ある部分が、ある構成要素を「含む」するとする時、これは、特に反対となる記載がない限り、他の構成要素を除くものではなく、他の構成要素をさらに含むことができることを意味する。

【0020】

本明細書において、「薬学的に許容可能な塩」は、薬学的に許容可能であり、親化合物（ｐａｒｅｎｔ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）の望ましい薬理活性を保持する塩を意味する。前記塩としては、薬学的に許容されるものであれば、特に限定されるものではない。

【0021】

本明細書において、「アルキル」は、１次、２次、３次または４次の炭素原子を有する炭化水素であり、直鎖状、分枝状または環状、またはこれらの組み合わせである飽和脂肪族基を含む。例えば、アルキル基は、１～２０個の炭素原子（すなわち、Ｃ_１－Ｃ_２０アルキル）、１～１０個の炭素原子（すなわち、Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル）、または１～６個の炭素原子（すなわち、Ｃ_１－Ｃ_６アルキル）を有しうる。適したアルキル基の例としては、メチル（Ｍｅ、－ＣＨ_３）、エチル（Ｅｔ、－ＣＨ_２ＣＨ_３）、１－プロピル（ｎ－Ｐｒ、ｎ－プロピル、－ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_３）、２－プロピル（ｉ－Ｐｒ、ｉ－プロピル、－ＣＨ（ＣＨ_３）_２）、１－ブチル（ｎ－Ｂｕ、ｎ－ブチル、－ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_３）、２－メチル－１－プロピル（ｉ－Ｂｕ、ｉ－ブチル、－ＣＨ_２ＣＨ（ＣＨ_３）_２）、２－ブチル（ｓ－Ｂｕ、ｓ－ブチル、－ＣＨ（ＣＨ_３）ＣＨ_２ＣＨ_３）、２－メチル－２－プロピル（ｔ－Ｂｕ、ｔ－ブチル、－Ｃ（ＣＨ_３）_３）、１－ペンチル（ｎ－ペンチル、－ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_３）、２－ペンチル（－ＣＨ（ＣＨ_３）ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_３）、３－ペンチル（－ＣＨ（ＣＨ_２ＣＨ_３）_２）、２－メチル－２－ブチル（－Ｃ（ＣＨ_３）_２ＣＨ_２ＣＨ_３）、３－メチル－２－ブチル（－ＣＨ（ＣＨ_３）ＣＨ（ＣＨ_３）_２）、３－メチル－１－ブチル（－ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ（ＣＨ_３）_２）、２－メチル－１－ブチル（－ＣＨ_２ＣＨ（ＣＨ_３）ＣＨ_２ＣＨ_３）、１－ヘキシル（－ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_３）、２－ヘキシル（－ＣＨ（ＣＨ_３）ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_３）、３－ヘキシル（－ＣＨ（ＣＨ_２ＣＨ_３）（ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_３））、２－メチル－２－ペンチル（－Ｃ（ＣＨ_３）_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_３）、３－メチル－２－ペンチル（－ＣＨ（ＣＨ_３）ＣＨ（ＣＨ_３）ＣＨ_２ＣＨ_３）、４－メチル－２－ペンチル（－ＣＨ（ＣＨ_３）ＣＨ_２ＣＨ（ＣＨ_３）_２）、３－メチル－３－ペンチル（－Ｃ（ＣＨ_３）（ＣＨ_２ＣＨ_３）_２）、２－メチル－３－ペンチル（－ＣＨ（ＣＨ_２ＣＨ_３）ＣＨ（ＣＨ_３）_２）、２，３－ジメチル－２－ブチル（－Ｃ（ＣＨ_３）_２ＣＨ（ＣＨ_３）_２）、３，３－ジメチル－２－ブチル（－ＣＨ（ＣＨ_３）Ｃ（ＣＨ_３）_３）、及びオクチル（－（ＣＨ_２）_７ＣＨ_３）が挙げられるが、これらに制限されるものではない。

【0022】

しかも、明細書、実施例及び請求項の全般にわたって使われる用語「アルキル」は、非置換及び置換されたアルキル基いずれもを含むものと意図される。

【0023】

本発明で使われる用語「ハロ」及び「ハロゲン」は、ハロゲンを意味し、クロロ、フルオロ、ブロモ、及びヨードを含む。

【0024】

用語「Ｃｘ－ｙ」または「Ｃｘ－Ｃｙ」は、アルキル、アルケニルまたはアルキニルのような化学的残基と共に使われる場合、鎖内にｘないしｙ個の炭素を含有する基を含むものと見なされる。Ｃ_０アルキルは、基が末端位置にある場合には、水素、内部にある場合には、結合を示す。例えば、Ｃ_１－Ｃ_２０アルキル基は、鎖内に１～２０個の炭素原子を含有する。

【0025】

本発明による化合物は、容易に入手可能な出発物質から当業者によく公知された下記の記載の特定の合成プロトコルに対する変形を用いて製造可能である。

【0026】

以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明するが、下記の実施例は、単に説明の目的のためのものであり、本発明の範囲を限定しようとするものではない。

【0027】

［製造例］

【0028】

本発明による化合物の合成方法に使われた機器及び試薬

【0029】

本発明の化合物の合成に使われたあらゆる開始物質と試薬は、Ａｌｄｒｉｃｈ、Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ、ＴＣＩなどから購入し、別途の精製過程なしに使用した。反応に使われた各種の硝子は、８０℃オーブンで乾燥させた状態で使用し、空気及び水分を遮断するために、アルゴンガスや窒素ガスを注入して反応を進めた。

【0030】

本発明のカラムクロマトグラフィー（Ｆｌａｓｈ ｃｏｌｕｍｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）は、シリカゲル６０（２３０－４００ｍｅｓｈ）を用いてヘキサン（Ｈｅｘａｎｅ）、酢酸エチル（Ｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅ）、ジクロロメタン（Ｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ）、メタノール（Ｍｅｔｈａｎｏｌ）などの溶媒を適切に調節して使用した。分析用薄膜クロマトグラフィー（Ｔｈｉｎ－ｌａｙｅｒ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）は、０．２５ｍｍのシリカゲルプレートを使用した。

【0031】

本発明の^１Ｈ－ＮＭＲスペクトルと^１３Ｃ－ＮＭＲスペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ ４００（４００ＭＨｚ ｆｏｒ １Ｈ；１００ＭＨｚ ｆｏｒ １３Ｃ）ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒまたはＶＡＲＩＡＮ ＶＮＭＲＳ ５００（５００ＭＨｚ ｆｏｒ １３Ｃ）ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒを用いて分析した。^１Ｈと^１３Ｃ ＮＭＲ化学シフト値は、ＴＭＳ（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｓｉｌａｎｅ）を内部基準として使用してｐｐｍ単位で表現された。ＮＭＲ信号は、ｍ（ｍｕｌｔｉｐｌｅｔ）、ｓ（ｓｉｎｇｌｅｔ）、ｄ（ｄｏｕｂｌｅｔ）、ｔ（ｔｒｉｐｌｅｔ）、ｑ（ｑｕａｒｔｅｔ）、ｑｕｉｎ（ｑｕｉｎｔｅｔ）、ｂｓ（ｂｒｏａｄ ｓｉｎｇｌｅｔ）、ｂｄ（ｂｒｏａｄ ｄｏｕｂｌｅｔ）、ｄｄ（ｄｏｕｂｌｅｔ ｏｆ ｄｏｕｂｌｅｔｓ）、ｄｔ（ｄｏｕｂｌｅｔ ｏｆ ｔｒｉｐｌｅｔｓ）、ｄｑ（ｄｏｕｂｌｅｔ ｏｆ ｑｕａｒｔｅｔｓ）などで表記され、結合定数は、ヘルツ（Ｈｚ）単位で表現された。

【0032】

本発明の低解像度質量スペクトル（Ｌｏｗ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒａ）と高解像度質量スペクトル（Ｈｉｇｈ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒａ）は、ＶＧ Ｔｒｉｏ－２ ＧＣ－ＭＳまたはＪＥＯＬ ＪＭＳ－７００機器を用いて測定した。

【0033】

一実施形態において、本発明の中間体化合物１０は、下記反応式１によって製造可能である。

【0034】

［反１］

【化3】

【0035】

試薬及び条件：（ａ）Ｎ－ヨードスクシンイミド、硫酸、Ｈ_２Ｏ、ｒ．ｔ．、８５％；（ｂ）シクロプロピルアミン、エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物、ＤＭＦ、ｒ．ｔ、８２％；（ｃ）ｂｉｓ（ｐｉｎａｃｏｌａｔｏ）ｄｉｂｏｒｏｎ、ＰｄＣｌ_２（ｄｐｐｆ）_２、ＫＯＡｃ、ＤＭＦ、９０℃、５０％。

【0036】

商業的に購入可能な３－フルオロ－４－メチル安息香酸（化合物７）を出発物質として、ヨード化反応を通じて化合物８を合成した後、シクロプロピルアミンとのＥＤＣ ｃｏｕｐｌｉｎｇを通じて化合物９を合成した。Ｂｉｓ（ｐｉｎａｃｏｌａｔｏ）ｄｉｂｏｒｏｎとのクロスカップリング（ｃｒｏｓｓ ｃｏｕｐｌｉｎｇ）を通じて主要中間体化合物１０を合成した。

【0037】

一実施形態において、本発明の中間体化合物１６ないし中間体化合物２１は、下記反応式２によって製造可能である。

【0038】

［反２］

【化4】

【0039】

試薬及び条件：（ａ）塩化チオニル、ｒｅｆｌｕｘ；（ｂ）Ｎ，Ｏ－ジメチルヒドロキシルアミン 、Ｅｔ_３Ｎ、ＣＨ_２Ｃｌ_２、ｒ．ｔ．、６２％；（ｃ）４－メトキシフェニルマグネシウム臭化物、ＴＨＦ、０℃、８７％；（ｄ）ＢＢｒ_３、ＣＨ_２Ｃｌ_２、－７８℃ ｔｏ ０℃、７９－８７％；（ｅ）（２，２－ジメチル－１，３－ジオキソラン－４－イル）メチル４－メチルベンゼンスルホン酸、Ｋ_２ＣＯ_３、ＤＭＦ、７０℃、５４－８３％；（ｆ）インドール、ＡｌＣｌ_３、ＣＨ_２Ｃｌ_２、０℃ ｔｏ ｒ．ｔ．、４２％；（ｇ）ＢｎＢｒ、ＮａＨ、ＤＭＦ、０℃、９５－９７％；（ｈ）６－メトキシインドール、ＡｌＣｌ_３、ＺｎＣｌ_２、ＥｔＭｇＢｒ、ＣＨ_２Ｃｌ_２、ｒ．ｔ．、２４％。

【0040】

商業的に購入可能な６－ブロモニコチン酸（化合物１１）と塩化チオニルとを還流して生成された化合物１２を精製過程なしに今後の反応に使用した。Ｗｅｉｎｒｅｂ ａｍｉｄｅを作ってメトキシフェニル基を導入した後、ｄｅｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎして化合物１５を収得し、ｓｏｌｋｅｔａｌを導入して中間体化合物１６を収得した（（６－ブロモピリジン－３－イル）（４－（（２，２－ジメチル－１，３－ジオキソラン－４－イル）メトキシ）フェニル）メタノン）；^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ－ｄ）δ８．７３（ｄｄ、Ｊ＝２．４、０．８Ｈｚ、１Ｈ）、８．０５（ｄｄ、Ｊ＝８．２、２．５Ｈｚ、１Ｈ）、７．４８（ｄｄ、Ｊ＝８．３、０．９Ｈｚ、１Ｈ）、７．３９－７．３２（ｍ、２Ｈ）、７．０６－６．９６（ｍ、２Ｈ）、４．５２（ｐ、Ｊ＝５．７Ｈｚ、１Ｈ）、４．２８（ｔｔ、Ｊ＝６．０、５．１Ｈｚ、２Ｈ）、３．７７（ｄｄ、Ｊ＝８．７、５．１Ｈｚ、２Ｈ）、１．４８（ｓ、３Ｈ）、１．４２（ｓ、３Ｈ）。

【0041】

化合物１２にインドールを導入して中間体化合物１７を合成し、（（６－ブロモピリジン－３－イル）（１Ｈ－インドール－３－イル）メタノン）；^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ６）δ１２．２４（ｓ、１Ｈ）、８．７９（ｄ、Ｊ＝３．１Ｈｚ、０Ｈ）、８．２７－８．１８（ｍ、２Ｈ）、７．６９（ｓ、１Ｈ）、７．５２（ｓ、１Ｈ）、７．３１－７．２４（ｍ、１Ｈ）、７．２６（ｓ、２Ｈ）、そのｂｅｎｚｙｌａｔｉｏｎを通じて中間体化合物１８を収得した（（１－ベンジル－１Ｈ－インドール－３－イル）（６－ブロモピリジン－３－イル）メタノン）；^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ－ｄ）δ８．８１（ｄｄ、Ｊ＝２．４、０．８Ｈｚ、１Ｈ）、８．４５－８．３８（ｍ、１Ｈ）、８．１０（ｄｔ、Ｊ＝８．４、２．０Ｈｚ、１Ｈ）、７．６０（ｄ、Ｊ＝１．５Ｈｚ、１Ｈ）、７．４７（ｄｔ、Ｊ＝８．２、１．１Ｈｚ、１Ｈ）、７．３６（ｓ、２Ｈ）、７．４２－７．２９（ｍ、５Ｈ）、７．２６（ｓ、１Ｈ）、７．２１－７．１２（ｍ、２Ｈ）、５．３８（ｓ、２Ｈ）。

【0042】

６－メトキシインドールと化合物１２との結合反応を行い、ベンジル基としてｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ基を導入した後、ｄｅｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎし、ｓｏｌｋｅｔａｌを導入して中間体化合物２１を収得した（（１－ベンジル－６－（（２，２－ジメチル－１，３－ジオキソラン－４－イル）メトキシ）－１Ｈ－インドール－３－イル）（５－ブロモピリジン－２－イル）メタノン）；^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ－ｄ）δ８．８０（ｄ、Ｊ＝２．４Ｈｚ、１Ｈ）、８．３０（ｄ、Ｊ＝８．７Ｈｚ、１Ｈ）、８．１２－８．０５（ｍ、１Ｈ）、７．５３－７．４２（ｍ、２Ｈ）、７．３４（ｄｄ、Ｊ＝７．３、３．２Ｈｚ、２Ｈ）、７．１５（ｔ、Ｊ＝９．３Ｈｚ、３Ｈ）、７．０２（ｄｄ、Ｊ＝８．８、２．２Ｈｚ、１Ｈ）、６．８３（ｄ、Ｊ＝２．３Ｈｚ、１Ｈ）、５．３１（ｄ、Ｊ＝４．２Ｈｚ、３Ｈ）、４．４８（ｑ、Ｊ＝６．０Ｈｚ、１Ｈ）、４．１７（ｄｄ、Ｊ＝８．４、６．４Ｈｚ、１Ｈ）、４．０８（ｄｄ、Ｊ＝９．４、５．４Ｈｚ、１Ｈ）、３．９３（ｄｄｄ、Ｊ＝１９．６、８．９、５．７Ｈｚ、１Ｈ）、１．４６（ｓ、３Ｈ）、１．４１（ｓ、３Ｈ）。

【0043】

［実施例１］

【0044】

Ｎ－シクロプロピル－３－（５－（４－（２，３－ジヒドロキシプロポキシ）ベンゾイル）ピリジン－２－イル）－５－フルオロ－４－メチルベンズアミド（Ｎ－Ｃｙｃｌｏｐｒｏｐｙｌ－３－（５－（４－（２，３－ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｏｘｙ）ｂｅｎｚｏｙｌ）ｐｙｒｉｄｉｎ－２－ｙｌ）－５－ｆｌｕｏｒｏ－４－ｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚａｍｉｄｅ、化合物１）の製造

【0045】

【化5】

【0046】

本発明の化合物１は、下記製造式１によって製造された。

【0047】

［製造式１］

【化6】

【0048】

試薬及び条件：（ａ）Ｐｄ（ＰＰｈ_３）_４、Ｋ_２ＣＯ_３、ＤＭＦ、９０℃、３６％；（ｂ）ｐ－ＴｓＯＨ、Ｈ_２Ｏ、ＭｅＯＨ、５０℃、５４％。

【0049】

１－１．中間体化合物２２の合成

【0050】

中間体化合物１０（１００．８ｍｇ、０．３１６ｍｍｏｌ）と中間体化合物１６（８２．６ｍｇ、０．２１０ｍｍｏｌ）、Ｋ_２ＣＯ_３（５８．０ｍｇ、０．４２０ｍｍｏｌ）、Ｐｄ（ＰＰｈ_３）_４（２４．３ｍｇ、０．０２１ｍｍｏｌ）とをｄｒｙ ＤＭＦに溶かし、アルゴン置換した後、９０℃下で１時間撹拌した。ＴＬＣで反応が終結されたことを確認した後、室温に反応物の温度を下げ、ｓａｔｕｒａｔｅｄ ａｑｕｅｏｕｓ ＮＨ_４Ｃｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎを用いて反応を終結した。ＥｔＯＡｃとＨ_２Ｏとで生成物を有機層に抽出した後、ＭｇＳＯ_４を用いて脱水し、濾過した濾液を減圧蒸留した後、ｆｌａｓｈ ｃｏｌｕｍｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙを用いて精製して中間体化合物２２を合成した（３７．８ｍｇ、３６％）；^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ－ｄ）δ９．０４（ｄｄ、Ｊ＝２．３、１．０Ｈｚ、１Ｈ）、８．１７（ｄｄ、Ｊ＝８．１、２．２Ｈｚ、１Ｈ）、７．８８（ｄｔ、Ｊ＝９．６、２．８Ｈｚ、２Ｈ）、７．６１（ｄ、Ｊ＝１．９Ｈｚ、１Ｈ）、７．６０－７．５２（ｍ、２Ｈ）、７．０４（ｄｄ、Ｊ＝９．２、２．３Ｈｚ、２Ｈ）、６．４０（ｓ、１Ｈ）、４．５２（ｑ、Ｊ＝４．６、３．３Ｈｚ、１Ｈ）、４．２５－４．１０（ｍ、２Ｈ）、４．１０－４．０２（ｍ、１Ｈ）、３．９８－３．９０（ｍ、１Ｈ）、２．９４－２．８７（ｍ、１Ｈ）、２．３５（ｄ、Ｊ＝２．４Ｈｚ、３Ｈ）、１．４２（ｍ、１Ｈ）、０．９２－０．８１（ｍ、２Ｈ）、０．６７－０．５８（ｍ、２Ｈ）。

【0051】

１－２．化合物１の合成

【0052】

中間体化合物２２（３７．８ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ）、ｐ－ＴｓＯＨ（１１．４ｍｇ、０．０６０ｍｍｏｌ）にＨ_２Ｏ ５００μｌ、ＭｅＯＨ ２ｍＬを滴加した後、室温で撹拌した。ＴＬＣで出発物質が消えたことを確認した後、ＣＨ_２Ｃｌ_２とＨ_２Ｏとで薄めた後、有機層を抽出し、Ｎａ_２ＳＯ_４を用いて脱水した。濾過した濾液を減圧蒸留した後、ｆｌａｓｈ ｃｏｌｕｍｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙを用いて精製して化合物１を最終的に収得した（１９ｍｇ、５４％）；^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ６）δ８．９２（ｄｄ、Ｊ＝２．３、０．９Ｈｚ、１Ｈ）、８．５５（ｄ、Ｊ＝４．２Ｈｚ、１Ｈ）、８．１７（ｄｄ、Ｊ＝８．１、２．２Ｈｚ、１Ｈ）、７．８６－７．７９（ｍ、１Ｈ）、７．８２－７．７１（ｍ、３Ｈ）、７．６７（ｄｄ、Ｊ＝１０．４、１．７Ｈｚ、１Ｈ）、７．１６－７．０５（ｍ、２Ｈ）、５．０２（ｄ、Ｊ＝５．２Ｈｚ、１Ｈ）、４．７０（ｔ、Ｊ＝５．７Ｈｚ、１Ｈ）、４．１６－４．０４（ｍ、１Ｈ）、４．０３－３．９３（ｍ、１Ｈ）、３．８５－３．７５（ｍ、１Ｈ）、３．５０－３．４０（ｍ、２Ｈ）、２．８８－２．７７（ｍ、１Ｈ）、２．２８（ｄ、Ｊ＝２．３Ｈｚ、３Ｈ）、０．７３－０．６０（ｍ、２Ｈ）、０．６０－０．４８（ｍ、２Ｈ）。

【0053】

［実施例２］

【0054】

６－クロロ－Ｎ－シクロプロピル－４’－（１Ｈ－インドール－３－カルボニル）－［１，１’－ビフェニル］－３－カルボキサミド（６－Ｃｈｌｏｒｏ－Ｎ－ｃｙｃｌｏｐｒｏｐｙｌ－４’－（１Ｈ－ｉｎｄｏｌｅ－３－ｃａｒｂｏｎｙｌ）－［１，１’－ｂｉｐｈｅｎｙｌ］－３－ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ、化合物２）の製造

【0055】

【化7】

【0056】

本発明の化合物２は、下記製造式２によって製造された。

【0057】

［製造式２］

【化8】

【0058】

試薬及び条件：（ａ）Ｂｉｓ（ｐｉｎａｃｏｌａｔｏ）ｄｉｂｏｒｏｎ、ＰｄＣｌ_２（ｄｐｐｆ）_２、ＫＯＡｃ、ＤＭＦ、９０℃、３７％；（ｂ）１７、ＰｄＣｌ_２（ＰＰｈ_３）_２、Ｋ_３ＰＯ_４、１，２－ジオキサン、Ｈ_２Ｏ、ｒｅｆｌｕｘ、１０％；（ｃ）シクロプロピルアミン、エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物、ＣＨ_２Ｃｌ_２、ｒ．ｔ．、１２％。

【0059】

２－１．中間体化合物２４の合成

【0060】

商業的に購入可能な３－ブロモ－４－クロロ安息香酸（化合物２３、１．５ｇ、６．３ｍｍｏｌ）とｂｉｓ（ｐｉｎａｃｏｌａｔｏ）ｄｉｂｏｒｏｎ（２．６ｇ、１０．５ｍｍｏｌ）、ＫＯＡｃ（３．１ｇ、３１．８ｍｍｏｌ）、ＰｄＣｌ_２（ｄｐｐｆ）_２とをｄｒｙ ＤＭＦ ２３ｍＬに溶かし、アルゴン置換後、９０℃で反応を進めた。ＴＬＣで反応が終結されたことを確認した後、室温で反応物の温度を減少させた。Ｓａｔｕｒａｔｅｄ ａｑｕｅｏｕｓ ＮＨ_４Ｃｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎを用いて反応を終結し、ＥｔＯＡｃとＨ_２Ｏとで生成物を有機層に抽出した後、ＭｇＳＯ_４を用いて脱水した。濾過した濾液を減圧蒸留した後、ｆｌａｓｈ ｃｏｌｕｍｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙを用いて精製して中間体化合物２４を収得した（６６４ｍｇ、３７％）。

【0061】

２－２．中間体化合物２５の合成

【0062】

中間体化合物１７（５００ｍｇ、１．６７ｍｍｏｌ）と中間体化合物２４（６５９ｍｇ、２．３３ｍｍｏｌ）、ＰｄＣｌ_２（ＰＰｈ_３）_２（１１７ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）、Ｋ_３ＰＯ_４（１．８ｇ、８．３３ｍｍｏｌ）とを１，２－ジオキサン９ｍＬとＨ_２Ｏ ３ｍＬとを混合した溶媒に溶かし、アルゴン置換後、還流した。１８時間後、ＴＬＣで反応が終結されたことを確認し、室温で反応物の温度を減少させた。セライト（Ｃｅｌｉｔｅ）で濾過して残った濾液をＨ_２ＯとＣＨ_２Ｃｌ_２とで薄めた後、生じた固体を濾過し、濾過物を真空減圧して残った溶媒を除去して、別途の精製過程なしに中間体化合物２５を合成した（１０１ｍｇ、１０％）。

【0063】

２－３．化合物２の合成

【0064】

中間体化合物２５（５０ｍｇ、０．１３３ｍｍｏｌ）と１－ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（２９ｍｇ、０．２１３ｍｍｏｌ）とをｄｒｙ ＤＭＦ ０．７ｍＬに溶かし、アルゴン置換後、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン３５μｌ、エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド４７μｌを順次に滴加した。ＴＬＣで反応が終結されたことを確認した後、Ｈ_２Ｏを用いて反応を終結し、ＥｔＯＡｃとＨ_２Ｏとを用いて生成物を有機層に抽出した後、ＭｇＳＯ_４を用いて脱水した。濾過した濾液を減圧蒸留した後、ｆｌａｓｈ ｃｏｌｕｍｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙを用いて精製して化合物２を最終的に収得した（６ｍｇ、１２％）；^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ６）δ１２．１５（ｄ、Ｊ＝３．０Ｈｚ、１Ｈ）、８．６３（ｄ、Ｊ＝４．２Ｈｚ、１Ｈ）、８．３４－８．２７（ｍ、１Ｈ）、８．０４（ｄ、Ｊ＝３．０Ｈｚ、１Ｈ）、７．９７－７．９１（ｍ、３Ｈ）、７．９０（ｄｄ、Ｊ＝８．４、２．２Ｈｚ、１Ｈ）、７．７３（ｄ、Ｊ＝８．４Ｈｚ、１Ｈ）、７．７１－７．６４（ｍ、２Ｈ）、７．５９－７．５３（ｍ、１Ｈ）、７．３４－７．２４（ｍ、２Ｈ）、２．９３－２．８４（ｍ、１Ｈ）、０．７６－０．６６（ｍ、２Ｈ）、０．６６－０．５６（ｍ、２Ｈ）。

【0065】

［実施例３］

【0066】

Ｎ－シクロプロピル－３－（５－（６－（２，３－ジヒドロキシプロポキシ）－１Ｈ－インドール－３－カルボニル）ピリジン－２－イル）－５－フルオロ－４－メチルベンズアミド（Ｎ－Ｃｙｃｌｏｐｒｏｐｙｌ－３－（５－（６－（２，３－ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｏｘｙ）－１Ｈ－ｉｎｄｏｌｅ－３－ｃａｒｂｏｎｙｌ）ｐｙｒｉｄｉｎ－２－ｙｌ）－５－ｆｌｕｏｒｏ－４－ｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚａｍｉｄｅ、化合物３）の製造

【0067】

【化9】

【0068】

本発明の化合物３は、下記製造式３によって製造された。

【0069】

［製造式３］

【化10】

【0070】

試薬及び条件：（ａ）Ｐｄ（ＰＰｈ_３）_４、Ｋ_２ＣＯ_３、ＤＭＦ、９０℃、１００％；（ｂ）Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｔｅｒｔ－ｂｕｔｏｘｉｄｅ、Ｏ_２、ＤＭＳＯ、０℃、１２％；（ｃ）ｐ－ＴｓＯＨ、Ｈ_２Ｏ、ＭｅＯＨ、５０℃、６７％。

【0071】

３－１．中間体化合物２６の合成

【0072】

中間体化合物２１（１２７ｍｇ、０．２４４ｍｍｏｌ）を出発物質として、中間体化合物２２と同じ方法を通じて中間体化合物２６を合成した（１５８ｍｇ、１００％）；^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ－ｄ）δ９．１２（ｓ、１Ｈ）、８．３６（ｄ、Ｊ＝８．８Ｈｚ、１Ｈ）、８．２２（ｄｄ、Ｊ＝８．０、２．２Ｈｚ、１Ｈ）、７．６２－７．４７（ｍ、４Ｈ）、７．４３－７．２７（ｍ、３Ｈ）、７．１８－７．１１（ｍ、２Ｈ）、７．０４（ｄｄ、Ｊ＝８．８、２．２Ｈｚ、１Ｈ）、６．８４（ｄ、Ｊ＝２．２Ｈｚ、１Ｈ）、６．２９（ｓ、１Ｈ）、５．３４（ｓ、２Ｈ）、４．５０（ｐ、Ｊ＝６．０Ｈｚ、１Ｈ）、４．１８（ｄｄ、Ｊ＝８．５、６．４Ｈｚ、１Ｈ）、４．１１－４．０４（ｍ、１Ｈ）、３．９４（ｄｄｄ、Ｊ＝２０．４、８．９、５．８Ｈｚ、２Ｈ）、２．９１（ｄｔ、Ｊ＝７．３、３．８Ｈｚ、１Ｈ）、２．３５（ｄ、Ｊ＝２．４Ｈｚ、３Ｈ）、２．２８－２．２２（ｍ、１Ｈ）、２．０５（ｄ、Ｊ＝０．８Ｈｚ、７Ｈ）、２．０４（ｓ、１Ｈ）、１．４７（ｓ、２Ｈ）、１．４１（ｓ、２Ｈ）、０．８８（ｑ、Ｊ＝６．４Ｈｚ、３Ｈ）、０．６２（ｑ、Ｊ＝６．０、５．５Ｈｚ、２Ｈ）。

【0073】

３－２．中間体化合物２７の合成

【0074】

中間体化合物２６（１５８ｍｇ、０．２４９ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ ０．８ｍＬに溶かした混合物にＯ_２をバブリング（ｂｕｂｂｌｉｎｇ）した後、ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｔｅｒｔ－ｂｕｔｏｘｉｄｅ（１．０Ｍ ｉｎ ＴＨＦ、１．５ｍＬ）を０℃下で徐々に滴加した。ＴＬＣで反応が終結されたことを確認した後、ＥｔＯＡｃで薄め、ｓａｔｕｒａｔｅｄ ａｑｕｅｏｕｓ ＮＨ_４Ｃｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎを用いて反応を終結した。ＥｔＯＡｃと水とで生成物を有機層に抽出した後、ＭｇＳＯ_４を用いて脱水し、濾過した濾液を減圧蒸留した後、ｆｌａｓｈ ｃｏｌｕｍｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙを用いて精製して中間体化合物２７を合成した（１８．１ｍｇ、１２％）。

【0075】

３－３．化合物３の合成

【0076】

中間体化合物２７（１０．０ｍｇ、０．０１８ｍｍｏｌ）を出発物質として、化合物１と同じ方法を通じて化合物３を最終的に収得した（６ｍｇ、６７％）；^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、Ｍｅｔｈａｎｏｌ－ｄ４）δ９．０５（ｄ、Ｊ＝３．７Ｈｚ、１Ｈ）、８．３５（ｄｔ、Ｊ＝７．９、２．７Ｈｚ、１Ｈ）、８．２１（ｄｄ、Ｊ＝８．９、３．３Ｈｚ、１Ｈ）、７．８７（ｄｄ、Ｊ＝３．５、１．７Ｈｚ、１Ｈ）、７．８２－７．７２（ｍ、２Ｈ）、７．６７（ｄ、Ｊ＝１０．２Ｈｚ、１Ｈ）、７．０９（ｔ、Ｊ＝２．８Ｈｚ、１Ｈ）、７．０６－６．９８（ｍ、１Ｈ）、４．１７－４．１１（ｍ、１Ｈ）、４．１０－４．０２（ｍ、２Ｈ）、３．７７－３．７０（ｍ、２Ｈ）、２．８８（ｄ、Ｊ＝７．０Ｈｚ、１Ｈ）、２．３６（ｑ、Ｊ＝２．５Ｈｚ、３Ｈ）、２．０３（ｓ、１Ｈ）、１．３１（ｓ、１Ｈ）、０．８３（ｄ、Ｊ＝６．６Ｈｚ、２Ｈ）、０．６６（ｄ、Ｊ＝５．７Ｈｚ、２Ｈ）。

【0077】

［実施例４］

【0078】

３－（５－（１Ｈ－インドール－３－カルボニル）ピリジン－２－イル）－Ｎ－シクロプロピル－５－フルオロ－４－メチルベンズアミド（（３－（５－（１Ｈ－ｉｎｄｏｌｅ－３－ｃａｒｂｏｎｙｌ）ｐｙｒｉｄｉｎ－２－ｙｌ）－Ｎ－ｃｙｃｌｏｐｒｏｐｙｌ－５－ｆｌｕｏｒｏ－４－ｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚａｍｉｄｅ、化合物４）の製造

【0079】

【化11】

【0080】

本発明の化合物４は、下記製造式４によって製造された。

【0081】

［製造式４］

【化12】

【0082】

試薬及び条件：（ａ）Ｐｄ（ＰＰｈ_３）_４、Ｋ_２ＣＯ_３、ジメトキシエタン、トルエン、イソプロピルアルコール、Ｈ_２Ｏ、ＭＷ、８４％。

【0083】

中間体化合物１０（４８ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）と中間体化合物１７（３０ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）、Ｐｄ（ＰＰｈ_３）_４（１１．６ｍｇ、０．０１ｍｍｏｌ）、Ｋ_２ＣＯ_３（２８ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）とを入れた反応容器に（ジメトキシエタン：トルエン：イソプロピルアルコール：Ｈ_２Ｏ＝１０：１：３：６）に混合した溶媒２ｍＬを滴加した後、アルゴン置換し、容器をＭｉｃｒｏｗａｖｅ ｒｅａｃｔｏｒで１３０℃で３０分間反応を進めた。反応が終わった混合物を室温に冷やした後、水を用いて反応を終結し、ＥｔＯＡｃとＨ_２Ｏとで生成物を有機層に抽出した後、ＭｇＳＯ_４を用いて脱水した。濾過した濾液を減圧蒸留した後、ｆｌａｓｈ ｃｏｌｕｍｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙを用いて精製して化合物４を最終的に収得した（３４．８ｍｇ、８４％）；^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ６）δ１２．２５（ｓ、１Ｈ）、９．０７（ｓ、１Ｈ）、８．６０（ｄ、Ｊ＝３．７Ｈｚ、１Ｈ）、８．３１（ｄ、Ｊ＝７．５Ｈｚ、２Ｈ）、８．１４（ｓ、１Ｈ）、７．８５（ｓ、１Ｈ）、７．８０（ｄ、Ｊ＝８．０Ｈｚ、１Ｈ）、７．７２（ｄ、Ｊ＝１０．９Ｈｚ、１Ｈ）、７．５５（ｄ、Ｊ＝８．５Ｈｚ、１Ｈ）、７．３４－７．２５（ｍ、２Ｈ）、２．８７（ｄｑ、Ｊ＝７．６、４．２、３．３Ｈｚ、１Ｈ）、２．３４（ｓ、３Ｈ）、０．７５－０．６７（ｍ、２Ｈ）、０．６１－０．５７（ｍ、２Ｈ）。

【0084】

［実施例５］

【0085】

３－（５－（１－ベンジル－１Ｈ－インドール－３－カルボニル）ピリジン－２－イル）－Ｎ－シクロプロピル－５－フルオロ－４－メチルベンズアミド（（３－（５－（１－Ｂｅｎｚｙｌ－１Ｈ－ｉｎｄｏｌｅ－３－ｃａｒｂｏｎｙｌ）ｐｙｒｉｄｉｎ－２－ｙｌ）－Ｎ－ｃｙｃｌｏｐｒｏｐｙｌ－５－ｆｌｕｏｒｏ－４－ｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚａｍｉｄｅ、化合物５）の製造

【0086】

【化13】

【0087】

本発明の化合物５は、下記製造式５によって製造された。

【0088】

［製造式５］

【化14】

【0089】

試薬及び条件：（ａ）Ｐｄ（ＰＰｈ_３）_４、Ｋ_２ＣＯ_３、ＤＭＦ、９０℃、９４％。

【0090】

中間体化合物１８（２４．６ｍｇ、０．０６３ｍｍｏｌ）を出発物質として、中間体化合物２２と同じ方法を通じて化合物５を最終的に収得した（２９．７ｍｇ、９４％）；^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ－ｄ）δ９．１３（ｄｄ、Ｊ＝２．２、０．９Ｈｚ、１Ｈ）、８．４８（ｄｄ、Ｊ＝８．２、１．７Ｈｚ、１Ｈ）、８．２３（ｄｄ、Ｊ＝８．０、２．２Ｈｚ、１Ｈ）、７．６９（ｓ、１Ｈ）、７．６２－７．５２（ｍ、３Ｈ）、７．４３－７．２５（ｍ、６Ｈ）、７．１７（ｄｄ、Ｊ＝７．５、２．０Ｈｚ、２Ｈ）、６．３５（ｓ、１Ｈ）、５．４１（ｓ、２Ｈ）、２．９８－２．８２（ｍ、１Ｈ）、２．３５（ｄ、Ｊ＝２．５Ｈｚ、３Ｈ）、０．９６－０．８１（ｍ、２Ｈ）、０．６７－０．５５（ｍ、２Ｈ）。

【0091】

［実施例６］

【0092】

Ｎ－シクロプロピル－３－（５－（１－（２，３－ジヒドロキシプロピル）－１Ｈ－インドール－３－カルボニル）ピリジン－２－イル）－５－フルオロ－４－メチルベンズアミド（Ｎ－Ｃｙｃｌｏｐｒｏｐｙｌ－３－（５－（１－（２，３－ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌ）－１Ｈ－ｉｎｄｏｌｅ－３－ｃａｒｂｏｎｙｌ）ｐｙｒｉｄｉｎ－２－ｙｌ）－５－ｆｌｕｏｒｏ－４－ｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚａｍｉｄｅ、化合物６）の製造

【0093】

【化15】

【0094】

本発明の化合物６は、下記製造式６によって製造された。

【0095】

［製造式６］

【化16】

【0096】

試薬及び条件：（ａ）（２，２－ジメチル－１，３－ジオキソラン－４－イル）メチル４－メチルベンゼンスルホン酸、ＮａＨ、ＤＭＦ、９０℃、１９％；（ｂ）ｐ－ＴｓＯＨ、Ｈ_２Ｏ、ＭｅＯＨ、５０℃、６２％。

【0097】

６－１．中間体化合物２８の合成

【0098】

化合物４（５０ｍｇ、０．１２１ｍｍｏｌ）をｄｒｙ ＤＭＦ １．５ｍＬに溶かした後、ＮａＨ（６０％ ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ ｉｎ ｍｉｎｅｒａｌ ｏｉｌ、７．２４ｍｇ、０．１８１ｍｍｏｌ）を０℃下に入れ、アルゴン置換後、撹拌した。１０分後、（２，２－ジメチル－１，３－ジオキソラン－４－イル）メチル４－メチルベンゼンスルホン酸（５２．０ｍｇ、０．１８１ｍｍｏｌ）、４－ジメチルアミノピリジン（ｃａｔａｌｙｔｉｃ ａｍｏｕｎｔ）を入れ、９０℃まで徐々に温度を上げ、反応を進めた。ＴＬＣを確認して出発物質が消えれば、混合物の温度を室温に冷やし、ｓａｔｕｒａｔｅｄ ａｑｕｅｏｕｓ ＮＨ_４Ｃｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎを用いて反応を終結し、ＥｔＯＡｃとｂｒｉｎｅとで生成物を有機層に抽出した後、ＭｇＳＯ_４を用いて脱水した。濾過した濾液を減圧蒸留した後、ｆｌａｓｈ ｃｏｌｕｍｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙを用いて精製して中間体化合物２８を合成した（１３．５ｍｇ、１９％）。

【0099】

６－２．化合物６の合成

【0100】

中間体化合物２８（１２ｍｇ、０．０２３ｍｍｏｌ）を出発物質として、化合物１と同じ方法を通じて化合物６を最終的に収得した（７ｍｇ、６２％）；^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ－ｄ）δ９．１１（ｓ、１Ｈ）、８．４８－８．４４（ｍ、１Ｈ）、８．２２（ｄｄ、Ｊ＝８．１、２．２Ｈｚ、１Ｈ）、７．７６（ｓ、１Ｈ）、７．５９（ｓ、１Ｈ）、７．５６（ｓ、１Ｈ）、７．５４（ｓ、１Ｈ）、７．４８－７．４３（ｍ、１Ｈ）、７．３８（ｄｄ、Ｊ＝６．２、３．１Ｈｚ、２Ｈ）、６．３５（ｓ、１Ｈ）、４．３９（ｄｄ、Ｊ＝１４．５、４．４Ｈｚ、１Ｈ）、４．２６（ｄｄ、Ｊ＝１４．５、７．３Ｈｚ、１Ｈ）、４．１６（ｓ、１Ｈ）、３．７６（ｄ、Ｊ＝１０．７Ｈｚ、１Ｈ）、３．５８（ｓ、１Ｈ）、２．８９（ｄｄ、Ｊ＝７．０、３．５Ｈｚ、１Ｈ）、２．５２（ｓ、１Ｈ）、２．３５（ｄ、Ｊ＝２．４Ｈｚ、３Ｈ）、１．４０（ｍ、１Ｈ）、０．８７（ｄ、Ｊ＝６．０Ｈｚ、２Ｈ）、０．６３（ｄ、Ｊ＝８．１Ｈｚ、１Ｈ）。

【0101】

［実験例１］

【0102】

Ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ＬｏｇＰ（ＣＬｏｇＰ）を通じた脂質親和性の評価

【0103】

Ｃｈｅｍｄrａｗソフトウェアを用いて化合物１から化合物６まで構造式を書き込んだ後、ＣＬｏｇＰ値を確認し、その結果を下記表２に示した。

【0104】

【表2】

【0105】

前記表２に示すように、従来の薬物を調査して作成されたＬｉｐｉｎｓｋｉ’ｓ ｒｕｌｅ ｏｆ ｆｉｖｅによれば、ＣＬｏｇＰが５未満である場合、経口投与されやすい薬物の特徴を有する。したがって、本発明の化合物は、経口投与薬物として開発可能であることが分かる。

【0106】

［実験例２］

【0107】

ｐ３８α ＭＡＰＫ（ｍｉｔｏｇｅｎ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ）阻害能の評価

【0108】

ｐ３８ ＭＡＰＫを阻害する能力を確認するために、化合物１ないし化合物５を希釈して濃度による阻害効果を確認した。簡略に、１０００、３３３、１１１、３７．０、１２．３、４．１２、１．３７、０．４５７、０．１５２、０．０４９５ｎＭの濃度で化合物を希釈した後、それぞれｐｅｐｔｉｄｅ／ｋｉｎａｓｅ混合物（最終７．０７－２８．３ｎｇ ｐ３８ ａｌｐｈａ、２μＭ Ｓｅｒｉｎｅ／Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ １５、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．０、０．０１％ ＮａＮ_３）とＡＴＰ溶液とを入れた。１時間常温で反応させた後、ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ試薬を入れ、１時間常温で再び反応させた。４４５ｎｍと５２０ｎｍとの波長でＫｉｎａｓｅ阻害能を確認し、その結果を下記表３に示した。

【0109】

【表3】

【0110】

前記表３に示すように、本発明の化合物は、２００ｎＭ以下の濃度でｐ３８ ａｌｐｈａを５０％抑制する強力な阻害剤であるということを確認した。

【0111】

［実験例３］

【0112】

細胞でのｐ３８ ＭＡＰＫタンパク質抑制能の評価

【0113】

ｐ－ｐ３８ ＭＡＰＫの抑制を確認するために、ｐ－ｐ３８ ＭＡＰＫ活性によって炎症を誘発するマクロファージ（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）を癌細胞化させたＲａｗ２６４．７細胞に各化合物を処理した後、ｐ３８ ＭＡＰＫの抑制を確認した。簡略に、Ｒａｗ２６４．７細胞を１０％ウシ胎児血清及びｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（１００Ｕ／ｍｌ）が補充されたＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍで培養した。培養皿でＲａｗ２６４．７細胞に本発明による化合物１ないし化合物５を１μＭずつ処理してＣＯ_２培養器で２４時間培養した後、ＬＰＳ １００ｎｇ／ｍｌずつ処理してＣＯ_２培養器で６時間追加培養した。

【0114】

実験の条件によって細胞の培養終了後、冷たいｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）で洗浄した。以後、細胞を回収して１２００ｒｐｍで３分間遠心分離した。沈殿物を２Ｘ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ（１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ６．８、５０％ Ｇｌｙｃｅｒｏｌ、１０％ ＳＤＳ、２－ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、１％ ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ ｂｌｕｅ）で細胞を溶解し、１００℃で１０分間煮込んだ。製造されたタンパク質サンプルをＳｏｄｉｕｍ Ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ ｐｏｌｙ ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓし、ＰＶＤＦ ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移した。ＰＶＤＦ ｍｅｍｂｒａｎｅのタンパク質と抗体との間の特異的結合反応のために、５％ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ、ＲＭｂｉｏ）溶液でブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）を行った。引き続き、ＢＳＡ溶液を廃棄し、ｍｅｍｂｒａｎｅをＰＢＳ－Ｔ（０．５％ ｔｗｅｅｎ ２０ ｉｎ ＰＢＳ）で洗浄した。Ｍｅｍｂｒａｎｅのタンパク質とａｎｔｉｂｏｄｙの結合反応を４℃で一晩中行い、ＰＢＳ－Ｔで再び洗浄した。最後に、Ｈｏｒｓｅ ｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）が接合された２次抗体（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）をＰＢＳ－Ｔに希釈し、室温で２時間反応させた。Ｌｕｍｉｎａｔａ Ｆｏｒｔｅ ＨＲＰ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用してｍｅｍｂｒａｎｅのタンパク質量を確認し、その結果を下記表４に示した。

【0115】

【表4】

【0116】

前記表４に示すように、免疫ブロットの結果、本発明の化合物は、１μＭの濃度で細胞内のｐ３８リン酸化を効果的に抑制することを確認した。

【0117】

［実験例４］

【0118】

炎症反応によるサイトカインｍＲＮＡ発現抑制能の評価

【0119】

ｐ－ｐ３８ ＭＡＰＫの抑制を確認するために、ｐ－ｐ３８ ＭＡＰＫ活性によって炎症を誘発するマクロファージを癌細胞化させたＲａｗ２６４．７細胞に各化合物を処理した後、ｐ３８ ＭＡＰＫの抑制を確認した。簡略に、Ｒａｗ２６４．７細胞を１０％ウシ胎児血清及びｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（１００Ｕ／ｍｌ）が補充されたＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍで培養した。培養皿でＲａｗ２６４．７細胞に本発明による化合物１ないし化合物５を１μＭずつ処理してＣＯ_２培養器で２４時間培養した後、ＬＰＳ １００ｎｇ／ｍｌずつ処理してＣＯ_２培養器で２４時間追加培養した。

【0120】

実験の条件によって細胞の培養終了後、冷たいｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）で洗浄した。以後、細胞を回収して１２００ｒｐｍで３分間遠心分離した。ＲＮＡは、Ｈｙｂｒｉｄ－Ｒ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＧｅｎｅＡｌｌ（登録商標）、３０５－１０１）から提供する方法によって抽出した。Ｎａｎｏｄｒｏｐを用いてＲＮＡの濃度と純度とを測定した後、ＴＯＰｓｃｒｉｐｔ ＲＴ ＤｒｙＭＩＸ（Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ、ＲＴ２００）から提供する方法によってｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡは、Ｐｒｉｍｅｒと共にＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍｉｘを用いて９５℃で３分反応後、９５℃で１０秒、５５℃で１０秒、７２℃で３０秒反応を３０回繰り返してＲＮＡ発現量を確認した。その結果を下記表５及び表６、及び図１及び図２に示した。

【0121】

【表5】

【0122】

【表6】

【0123】

前記表５及び表６、及び図１及び図２に示すように、本発明の化合物は、炎症反応を発生させるサイトカインＩＬ－１β、ＴＮＦαのｍＲＮＡ発現を抑制することを確認し、本発明の化合物は、ｐ３８の抑制を通じて炎症性サイトカインの生成を抑制することが分かる。

【0124】

［実験例５］

【0125】

細胞炎症反応によるＴＮＦα抑制能の評価

【0126】

ｐ－ｐ３８ ＭＡＰＫの抑制を確認するために、ｐ－ｐ３８ ＭＡＰＫ活性によって炎症を誘発するマクロファージを癌細胞化させたＲａｗ２６４．７細胞に各化合物を処理した後、ｐ３８ ＭＡＰＫの抑制を確認した。簡略に、Ｒａｗ２６４．７細胞を１０％ウシ胎児血清及びｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（１００Ｕ／ｍｌ）が補充されたＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍで培養した。培養皿でＲａｗ２６４．７細胞に本発明による化合物１ないし化合物５を１μＭずつ処理してＣＯ_２培養器で２４時間培養した後、ＬＰＳ １００ｎｇ／ｍｌずつ処理してＣＯ_２培養器で２４時間追加培養した。

【0127】

実験の条件によって細胞の培養終了後、上澄み液を取得して１２００ｒｐｍで３分間遠心分離した。遠心分離した上澄み液をａｎｔｉｂｏｄｙがコーティングされたｐｌａｔｅに分注した後、常温で２時間反応させ、ＰＢＳ－Ｔ（０．５％ ｔｗｅｅｎ ２０ ｉｎ ＰＢＳ）で洗浄した。ＨＲＰが含まれたｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｔｉｂｏｄｙを分注した後、常温で１時間反応させ、４５０ｎｍの波長でタンパク質量を確認し、その結果を下記表７に示した。

【0128】

【表7】

【0129】

前記表７に示すように、本発明の化合物は 炎症反応を発生させるサイトカインＴＮＦαの発生を抑制し、本発明の化合物は、ｐ３８抑制を通じて炎症反応を抑制することが分かる。

【0130】

［実験例６］

【0131】

脳由来の細胞でのｐ３８ ＭＡＰＫタンパク質抑制能の評価

【0132】

脳細胞でのｐ－ｐ３８ ＭＡＰＫの抑制を確認するために、ヒトのｎｅｕｒｏｎを癌細胞化させたＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞に各化合物を処理した後、炎症を誘発させてｐ３８ ＭＡＰＫの抑制を確認した。簡略に、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞を１０％ウシ胎児血清及びｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（１００Ｕ／ｍｌ）が補充されたＭｉｎｉｍｕｍ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ／Ｅａｇｌｅ’ｓ ｂａｌａｎｃｅｄ ｓａｌｔｓで培養した。培養皿でＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞に本発明による化合物４及び化合物６を１μＭずつ処理してＣＯ_２培養器で２４時間培養した後、ＬＰＳ １０００ｎｇ／ｍｌずつ処理してＣＯ_２培養器で６時間追加培養した。

【0133】

実験の条件によって細胞の培養終了後、冷たいｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）で洗浄した。以後、細胞を回収して１２００ｒｐｍで３分間遠心分離した。沈殿物を２Ｘ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ（１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ６．８、５０％ Ｇｌｙｃｅｒｏｌ、１０％ ＳＤＳ、２－ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、１％ ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ ｂｌｕｅ）で細胞を溶解し、１００℃で１０分間煮込んだ。製造されたタンパク質サンプルをＳｏｄｉｕｍ Ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ ｐｏｌｙ ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓし、ＰＶＤＦ ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移した。ＰＶＤＦ ｍｅｍｂｒａｎｅのタンパク質と抗体との間の特異的結合反応のために、５％ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ、ＲＭｂｉｏ）溶液でブロッキングを行った。引き続き、ＢＳＡ溶液を廃棄し、ｍｅｍｂｒａｎｅをＰＢＳ－Ｔ（０．５％ ｔｗｅｅｎ ２０ ｉｎ ＰＢＳ）で洗浄した。Ｍｅｍｂｒａｎｅのタンパク質とａｎｔｉｂｏｄｙの結合反応を４℃で一晩中行い、ＰＢＳ－Ｔで再び洗浄した。最後に、Ｈｏｒｓｅ ｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）が接合された２次抗体（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）をＰＢＳ－Ｔに希釈し、室温で２時間反応させた。Ｌｕｍｉｎａｔａ Ｆｏｒｔｅ ＨＲＰ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用してｍｅｍｂｒａｎｅのタンパク質量を確認し、その結果を下記表８に示した。

【0134】

【表8】

【0135】

前記表８に示すように、免疫ブロットの結果、本発明の化合物４及び化合物６は、１μＭの濃度でヒト由来の細胞内のｐ３８リン酸化を効果的に抑制することを確認した。

【0136】

［実験例７］

【0137】

正常脳細胞でのｐ３８ ＭＡＰＫタンパク質抑制能の評価

【0138】

癌細胞ではなく正常細胞でのｐ－ｐ３８ ＭＡＰＫの抑制を確認するために、ＩＣＲマウスの大脳から採取したｎｅｕｒｏｎ細胞に各化合物を処理し、炎症を誘発してｐ３８ ＭＡＰＫの抑制を確認した。簡略に、妊娠して１７－１８日程度過ぎたＩＣＲマウスの胎児の大脳からｎｅｕｒｏｎを採取して、２％ Ｂ２７ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ、２ｍＭ ｇｌｕｔａｍｉｎｅ及びｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（１００Ｕ／ｍｌ）が補充されたＮｅｕｒｏｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍで７日間培養した。培養皿でｐｒｉｍａｒｙ ｎｅｕｒｏｎに本発明による化合物４及び化合物６を１μＭずつ処理してＣＯ_２培養器で２４時間培養した後、ＬＰＳ １０００ｎｇ／ｍｌずつ処理してＣＯ_２培養器で６時間追加培養した。

【0139】

実験の条件によって細胞の培養終了後、冷たいｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）で洗浄した。以後、細胞を回収して１２００ｒｐｍで３分間遠心分離した。沈殿物を２Ｘ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ（１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ６．８、５０％ Ｇｌｙｃｅｒｏｌ、１０％ ＳＤＳ、２－ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、１％ ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ ｂｌｕｅ）で細胞を溶解し、１００℃で１０分間煮込んだ。製造されたタンパク質サンプルをＳｏｄｉｕｍ Ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ ｐｏｌｙ ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓし、ＰＶＤＦ ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移した。ＰＶＤＦ ｍｅｍｂｒａｎｅのタンパク質と抗体との間の特異的結合反応のために、５％ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ、ＲＭｂｉｏ）溶液でブロッキングを行った。引き続き、ＢＳＡ溶液を廃棄し、ｍｅｍｂｒａｎｅをＰＢＳ－Ｔ（０．５％ ｔｗｅｅｎ ２０ ｉｎ ＰＢＳ）で洗浄した。Ｍｅｍｂｒａｎｅのタンパク質とａｎｔｉｂｏｄｙの結合反応を４℃で一晩中行い、ＰＢＳ－Ｔで再び洗浄した。最後に、Ｈｏｒｓｅ ｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）が接合された２次抗体（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）をＰＢＳ－Ｔに希釈し、室温で２時間反応させた。Ｌｕｍｉｎａｔａ Ｆｏｒｔｅ ＨＲＰ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用してｍｅｍｂｒａｎｅのタンパク質量を確認し、その結果を下記表９に示した。

【0140】

【表9】

【0141】

前記表９に示すように、免疫ブロットの結果、本発明の化合物４及び化合物６は、１μＭの濃度で癌細胞ではなく正常細胞でも炎症によるｐ３８リン酸化を効果的に抑制することを確認した。

【0142】

［実験例８］

【0143】

炎症反応によるサイトカインｍＲＮＡ発現抑制能の評価

【0144】

ｐ－ｐ３８ ＭＡＰＫの抑制を確認するために、脳内でｐ－ｐ３８ ＭＡＰＫ活性によって炎症を誘発するミクログリア（ｍｉｃｒｏｇｌｉａ）を癌細胞化させたＢＶ２細胞に各化合物を処理した後、ｐ３８ ＭＡＰＫの抑制を確認した。簡略に、ＢＶ２細胞を１０％ウシ胎児血清及びｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（１００Ｕ／ｍｌ）が補充されたＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍで培養した。培養皿でＢＶ２細胞に本発明による化合物４及び化合物６を１μＭずつ処理してＣＯ_２培養器で２４時間培養した後、ＬＰＳ １０００ｎｇ／ｍｌずつ処理してＣＯ_２培養器で２４時間追加培養した。

【0145】

実験の条件によって細胞の培養終了後、冷たいｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）で洗浄する。以後、細胞を回収して１２００ｒｐｍで３分間遠心分離した。ＲＮＡは、Ｈｙｂｒｉｄ－Ｒ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＧｅｎｅＡｌｌ（登録商標）、３０５－１０１）から提供する方法によって抽出した。Ｎａｎｏｄｒｏｐを用いてＲＮＡの濃度と純度とを測定した後、ＴＯＰｓｃｒｉｐｔ ＲＴ ＤｒｙＭＩＸ（Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ、ＲＴ２００）から提供する方法によってｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡは、Ｐｒｉｍｅｒと共にＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍｉｘを用いて９５℃で３分反応後、９５℃で１０秒、５５℃で１０秒、７２℃で３０秒反応を３０回繰り返してＲＮＡ発現量を確認した。その結果を下記表１０ないし表１２、及び図３ないし図５に示した。

【0146】

【表10】

【0147】

【表11】

【0148】

【表12】

【0149】

前記表１０ないし表１２、及び図３ないし図５に示すように、本発明の化合物は、炎症サイトカインＩＬ－１β、ＴＮＦα及びＩＬ－６のｍＲＮＡの発生を抑制し、本発明の化合物は、ｐ３８抑制を通じて炎症サイトカインの発現を抑制することが分かる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【手続補正書】

【提出日】2024-01-16

【手続補正1】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００１２

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0012】

Ｒ_２は、Ｈ、ハロゲン、または－Ｃ_１－Ｃ_６ アルキルであり、

【手続補正2】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００３９

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0039】

試薬及び条件：（ａ）Ｎ－ヨードスクシンイミド、硫酸、Ｈ_２Ｏ、ｒ．ｔ．、８５％；（ｂ）シクロプロピルアミン、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物、ＤＭＦ、ｒ．ｔ、８２％；（ｃ）ｂｉｓ（ｐｉｎａｃｏｌａｔｏ）ｄｉｂｏｒｏｎ、ＰｄＣｌ_２（ｄｐｐｆ）_２、ＫＯＡｃ、ＤＭＦ、９０℃、５０％。

【国際調査報告】