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特表2024-525331超高感度無抽出脂肪酸定量法を使用した、医薬製剤中のポリソルベートの加水分解のモニタリング方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-07-12
(54)【発明の名称】超高感度無抽出脂肪酸定量法を使用した、医薬製剤中のポリソルベートの加水分解のモニタリング方法
(51)【国際特許分類】
G01N 27/62 20210101AFI20240705BHJP
H01J 49/16 20060101ALI20240705BHJP
H01J 49/42 20060101ALI20240705BHJP
H01J 49/00 20060101ALI20240705BHJP
G01N 33/15 20060101ALI20240705BHJP
G01N 30/88 20060101ALI20240705BHJP
G01N 30/72 20060101ALI20240705BHJP
B01J 20/287 20060101ALI20240705BHJP
C07K 16/00 20060101ALN20240705BHJP
【ＦＩ】
G01N27/62 X
G01N27/62 V
H01J49/16 500
H01J49/42 150
H01J49/00 400
G01N33/15 Z
G01N30/88 C
G01N30/72 C
B01J20/287
C07K16/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023577114
(86)(22)【出願日】2022-06-14
(85)【翻訳文提出日】2024-01-18
(86)【国際出願番号】 US2022033492
(87)【国際公開番号】W WO2022266143
(87)【国際公開日】2022-12-22
(31)【優先権主張番号】63/210,340
(32)【優先日】2021-06-14
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】507302748
【氏名又は名称】リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100102978
【弁理士】
【氏名又は名称】清水 初志
(74)【代理人】
【識別番号】100205707
【弁理士】
【氏名又は名称】小寺 秀紀
(74)【代理人】
【識別番号】100160923
【弁理士】
【氏名又は名称】山口 裕孝
(74)【代理人】
【識別番号】100119507
【弁理士】
【氏名又は名称】刑部 俊
(74)【代理人】
【識別番号】100142929
【弁理士】
【氏名又は名称】井上 隆一
(74)【代理人】
【識別番号】100148699
【弁理士】
【氏名又は名称】佐藤 利光
(74)【代理人】
【識別番号】100188433
【弁理士】
【氏名又は名称】梅村 幸輔
(74)【代理人】
【識別番号】100128048
【弁理士】
【氏名又は名称】新見 浩一
(74)【代理人】
【識別番号】100129506
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 智彦
(74)【代理人】
【識別番号】100114340
【弁理士】
【氏名又は名称】大関 雅人
(74)【代理人】
【識別番号】100214396
【弁理士】
【氏名又は名称】塩田 真紀
(74)【代理人】
【識別番号】100121072
【弁理士】
【氏名又は名称】川本 和弥
(74)【代理人】
【識別番号】100221741
【弁理士】
【氏名又は名称】酒井 直子
(74)【代理人】
【識別番号】100114926
【弁理士】
【氏名又は名称】枝松 義恵
(72)【発明者】
【氏名】チャン シシ
(72)【発明者】
【氏名】シャオ フイ
(72)【発明者】
【氏名】リ ニン
【テーマコード（参考）】
2G041
4H045
【Ｆターム（参考）】
2G041DA05
2G041EA04
2G041FA10
2G041FA12
2G041GA03
2G041HA01
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045DA76
4H045EA50
4H045GA45
(57)【要約】
本発明は、概して、医薬製剤中の遊離脂肪酸を定量する方法に関する。具体的には、本発明は、抽出ステップを使用せずに、液体クロマトグラフィ－質量分析を使用して、医薬物質、ポリソルベート、及び遊離脂肪酸を含む医薬製剤中の、ポリソルベートの加水分解によって放出される遊離脂肪酸を定量する方法に関する。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
医薬製剤中の遊離脂肪酸を定量するための方法であって、（ａ）医薬物質、ポリソルベート、及び遊離脂肪酸を含む製剤をインキュベートすることと、
（ｂ）前記遊離脂肪酸を分離するために、前記製剤を液体クロマトグラフィに供することと、
（ｃ）前記遊離脂肪酸を定量するために、質量分析計を使用することと
を含み、
前記遊離脂肪酸が、前記製剤を液体クロマトグラフィに供する前に、前記製剤から抽出されない、方法。
【請求項2】
前記製剤をインキュベートする前に、前記製剤に内部標準遊離脂肪酸を加えることを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記定量された遊離脂肪酸濃度を前記内部標準に対して補正することを更に含む、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
既知の濃度のスパイク脂肪酸を使用して、検量線を作成することであって、前記定量された遊離脂肪酸濃度が、前記検量線に対して補正される、検量線を作成することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
少なくとも１回の追加のインキュベーション時間を使用して、請求項１に記載のステップを繰り返すことと、経時的な遊離脂肪酸濃度の変化率を決定するために、各繰り返しで得られた遊離脂肪酸の定量を比較することと
を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
前記医薬物質が、薬物、化合物、核酸、毒素、ペプチド、タンパク質、融合タンパク質、抗体、抗体断片、抗体のＦａｂ領域、抗体－薬物複合体、又はタンパク質医薬物質である、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
前記医薬物質が、モノクローナル抗体である、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
前記医薬物質の濃度が、約１ｍｇ／ｍＬ～約２００ｍｇ／ｍＬである、請求項１に記載の方法。
【請求項9】
前記ポリソルベートが、ポリソルベート２０又はポリソルベート８０である、請求項１に記載の方法。
【請求項10】
前記ポリソルベート濃度が、約０．００１％～約１％である、請求項１に記載の方法。
【請求項11】
前記遊離脂肪酸が、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、オレイン酸、ステアリン酸、リノール酸、又はそれらの組み合わせを含む群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項12】
前記遊離脂肪酸の濃度が、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１００μｇ／ｍＬである、請求項１に記載の方法。
【請求項13】
前記インキュベーションが、プラスチックチューブ内又はガラスバイアル内で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項14】
前記インキュベーションが、約０時間～約３６か月行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項15】
前記インキュベーションが、約５℃～約３７℃で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項16】
前記内部標準が、重同位体で標識される、請求項２に記載の方法。
【請求項17】
前記内部標準が、ラウリン酸－ｄ２３、ミリスチン酸－ｄ２７、オレイン酸－１３Ｃ１８、又はそれらの組み合わせを含む群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
液体クロマトグラフィシステムが、前記質量分析計につなげられている、請求項１に記載の方法。
【請求項19】
前記液体クロマトグラフィが、逆相クロマトグラフィである、請求項１に記載の方法。
【請求項20】
前記質量分析計が、エレクトロスプレーイオン化質量分析計である、請求項１に記載の方法。
【請求項21】
前記質量分析計が、トリプル四重極質量分析計である、請求項１に記載の方法。
【請求項22】
前記質量分析計が、ＬＣ－ＭＳ分析又はＬＣ－ＭＲＭ－ＭＳ分析を行うことができる、請求項１に記載の方法。
【請求項23】
前記製剤が、１つ以上の賦形剤を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項24】
前記製剤が、ヒスチジンを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項25】
前記逆相クロマトグラフィに使用されるカラムが、Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ４カラムである、請求項１９に記載の方法。
【請求項26】
前記ポリソルベートの濃度が、約１％である、請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本願は、２０２１年６月１４日に出願された米国仮特許出願第６３／２１０，３４０号の優先権及び利益を主張し、当該米国仮特許出願は、参照により本明細書に組み込まれる。
本願は、２０２１年６月１４日に出願された米国仮特許出願第６３／２１０，３４０号の優先権及び利益を主張し、当該米国仮特許出願は、参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
分野
本願は、医薬製剤中のポリソルベートの加水分解によって放出される遊離脂肪酸を定量するためのアッセイ方法に関する。
本願は、医薬製剤中のポリソルベートの加水分解によって放出される遊離脂肪酸を定量するためのアッセイ方法に関する。
【背景技術】
【0003】
背景
薬物製品のうち、タンパク質ベースのバイオ医薬品は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を用いた臨床試験が過去数年間で大幅に増加していることからもわかるように、高レベルの選択性、効力、及び有効性を提供する重要なクラスの薬物である。臨床的及び商業的に実現可能なバイオ医薬品にとって重要な側面の１つは、製造プロセス及び保存期間という点での薬物製品の安定性である。ポリソルベートなどの界面活性剤が、タンパク質ベースのバイオ医薬品の物理的安定性を高めるためによく使用される。市販されているモノクローナル抗体治療薬の７０％以上には、タンパク質ベースのバイオ医薬品に物理的安定性を与えるために、界面活性剤の１つであるポリソルベートが０．００１％～０．１％含まれている。
薬物製品のうち、タンパク質ベースのバイオ医薬品は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を用いた臨床試験が過去数年間で大幅に増加していることからもわかるように、高レベルの選択性、効力、及び有効性を提供する重要なクラスの薬物である。臨床的及び商業的に実現可能なバイオ医薬品にとって重要な側面の１つは、製造プロセス及び保存期間という点での薬物製品の安定性である。ポリソルベートなどの界面活性剤が、タンパク質ベースのバイオ医薬品の物理的安定性を高めるためによく使用される。市販されているモノクローナル抗体治療薬の７０％以上には、タンパク質ベースのバイオ医薬品に物理的安定性を与えるために、界面活性剤の１つであるポリソルベートが０．００１％～０．１％含まれている。
【0004】
ポリソルベートの酵素的加水分解は、バイオ医薬品製剤におけるポリソルベート分解の主な経路として認識されており、分解の結果、望ましくない粒子形成を促進する遊離脂肪酸が放出される。放出された遊離脂肪酸の定量は、ポリソルベートの分解レベルをモニタリングするために使用できる。ごく最近では、液体クロマトグラフィ－質量分析（ＬＣ－ＭＳ）が遊離脂肪酸の高感度検出法として使用される。しかし、現在の遊離脂肪酸の定量法では、サンプルをクロマトグラフィに供して分析する前に固相抽出（ＳＰＥ）などの抽出ステップが必要であるが、これには時間のかかるサンプルの追加処理が必要となり、ハイスループット分析が制限される。
【0005】
分析前に遊離脂肪酸の抽出を必要としない、医薬製剤中の遊離脂肪酸を定量する改良された方法の必要性が存在することが理解されるであろう。
【発明の概要】
【0006】
概要
医薬製剤中のポリソルベートの分解の特性評価は、安定した医薬物質の製造において重要な問題である。医薬製剤中の遊離脂肪酸を確実かつ効率的に定量する改良された方法が必要とされている。本願は、抽出ステップを必要とせずに、医薬製剤中の遊離脂肪酸を高感度に定量する方法を提供する。
医薬製剤中のポリソルベートの分解の特性評価は、安定した医薬物質の製造において重要な問題である。医薬製剤中の遊離脂肪酸を確実かつ効率的に定量する改良された方法が必要とされている。本願は、抽出ステップを必要とせずに、医薬製剤中の遊離脂肪酸を高感度に定量する方法を提供する。
【0007】
本開示は、医薬製剤中の遊離脂肪酸を定量するための方法を提供する。いくつかの例示的な実施形態では、本方法は、（ａ）医薬物質、ポリソルベート、及び遊離脂肪酸を含む製剤をインキュベートすることと、（ｂ）上記遊離脂肪酸を分離するために、前記製剤を液体クロマトグラフィに供することと、（ｃ）上記遊離脂肪酸を定量するために質量分析計を使用することと、を含み、上記遊離脂肪酸は、上記製剤を液体クロマトグラフィに供する前に、上記製剤から抽出されない。
【0008】
一態様では、本方法は、製剤をインキュベートする前に、上記製剤に内部標準遊離脂肪酸を加えることを更に含む。別の態様では、当該方法は、定量された遊離脂肪酸濃度を内部標準に対して補正することを更に含む。更に、別の態様では、当該方法は、既知の濃度のスパイク脂肪酸を使用して、検量線を作成することを更に含み、定量された遊離脂肪酸濃度は、検量線に対して補正される。
【0009】
一態様では、本方法は、少なくとも１回の追加のインキュベーション時間を使用して、方法のステップを繰り返すことと、経時的な遊離脂肪酸濃度の変化率を決定するために、各繰り返しで得られた遊離脂肪酸の定量を比較することと、を更に含む。
【0010】
一態様では、医薬物質は、薬物、化合物、核酸、毒素、ペプチド、タンパク質、融合タンパク質、抗体、抗体断片、抗体のＦａｂ領域、抗体－薬物複合体、又はタンパク質医薬物質である。特定の態様では、医薬物質は、モノクローナル抗体である。別の態様では、医薬物質の濃度は、約１ｍｇ／ｍＬ～約２００ｍｇ／ｍＬである。
【0011】
一態様では、ポリソルベートは、ポリソルベート２０（ＰＳ２０）又はポリソルベート８０（ＰＳ８０）である。別の態様では、ポリソルベートの濃度は、約０．００１％～約１％である。特定の態様では、ポリソルベートの濃度は、約１％である。
【0012】
一態様では、遊離脂肪酸は、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、オレイン酸、ステアリン酸、リノール酸、又はそれらの組み合わせを含む群から選択される。別の態様では、遊離脂肪酸の濃度は、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１００μｇ／ｍＬである。
【0013】
一態様では、インキュベーションは、プラスチックチューブ内又はガラスバイアル内で行われる。別の態様では、インキュベーションは、約０時間～約３６か月行われる。更に、別の態様では、インキュベーションは、約５℃～約３７℃で行われる。
【0014】
一態様では、内部標準は、重同位体で標識される。特定の態様では、内部標準は、ラウリン酸－ｄ２３、ミリスチン酸－ｄ２７、オレイン酸－１３Ｃ１８、又はそれらの組み合わせを含む群から選択される。
【0015】
一態様では、液体クロマトグラフィシステムは、質量分析計につなげられている。別の態様では、液体クロマトグラフィは、逆相クロマトグラフィである。特定の態様では、逆相クロマトグラフィに使用されるカラムは、Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ４カラムである。
【0016】
一態様では、質量分析計は、エレクトロスプレーイオン化質量分析計である。別の態様では、質量分析計は、トリプル四重極質量分析計である。更に、別の態様では、質量分析計は、ＬＣ－ＭＳ又は液体クロマトグラフィ多重反応モニタリング質量分析法（ＬＣ－ＭＲＭ－ＭＳ）の分析を行うことができる。
【0017】
一態様では、製剤は、１つ以上の賦形剤を更に含む。更なる態様では、製剤は、ヒスチジンを更に含む。
【0018】
本発明のこれら及び他の態様は、以下の説明及び添付の図面と併せて考慮すると、よりよく評価され、理解されるであろう。以下の説明は、様々な実施形態及びその多くの特定の詳細を示すが、例示として与えられるものであり、限定するものではない。本発明の範囲内で、多くの置換、修正、追加、又は再配置を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【0019】
【図1A】例示的な実施形態による、ポリソルベート中の主要な予想されるポリエチレンオキシド（ＰＯＥ）エステルの化学構造の図を示す。
【図1B】例示的な実施形態による、ポリソルベートの加水分解及び遊離脂肪酸（ＦＦＡ）の形成の図を示す。
【図2A】例示的な実施形態による、ポリソルベート分析のためのＬＣ－ＭＳ及び液体クロマトグラフィ－荷電エアロゾル検出（ＬＣ－ＣＡＤ）アッセイを示す。
【図2B】例示的な実施形態による、２Ｄ－ＬＣ－ＣＡＤによって分離及び検出された、ＰＳ２０標準物質（Ａ）、及びｍＡｂ製剤中のＰＳ２０（Ｂ）の、ＣＡＤクロマトグラフィを示す。標識されたピークは、ＰＯＥソルビタンモノラウレート（１）、ＰＯＥイソソルビドモノラウレート（２）、ＰＯＥソルビタンモノミリステート（３）、ＰＯＥイソソルビドモノミリステート（４）、ＰＯＥモノパルミチン酸イソソルビド（５）、ＰＯＥモノステアリン酸イソソルビド（６）、ＰＯＥソルビタン混合ジエステル（７～９）、ＰＯＥソルビタントリラウレートとＰＯＥソルビタンテトララウレート（１０）である。
【図2C】例示的な実施形態による、２Ｄ－ＬＣ－ＣＡＤによって分離及び検出された、ＰＳ８０標準物質（Ａ）、及びｍＡｂ製剤中のＰＳ２０（Ｂ）の、ＣＡＤクロマトグラフィを示す。標識されたピークは、モノリノレン酸ＰＯＥソルビタン（１）、モノオレイン酸ＰＯＥイソソルビド（２）、モノオレイン酸ＰＯＥソルビタンとモノオレイン酸ＰＯＥ（３）、ＰＯＥジオレイン酸ソルビタン（４）、ＰＯＥイソソルビドジオレイン酸とＰＯＥジオレイン酸（５）、ＰＯＥソルビタン混合トリオレイン酸とテトラオレイン酸（６）である。
【図2D】例示的な実施形態による、１０ｍＭのヒスチジン、ｐＨ６．０中、３７℃で０日（Ａ、Ｔ０）及び５日（Ｂ、Ｔ５）インキュベートした７５ｍｇ／ｍＬのｍＡｂ－７中の０．１％のＰＳ２０のクロマトグラムを示す。
【図4】例示的な実施形態による、２００ｍｇ／ｍＬのｍＡｂ－３製剤中のミリスチン酸濃度の経時的変化を示す。
【図5A】例示的な実施形態による、経時的なミリスチン酸－ｄ２７の損失百分率を示す。
【図5B】例示的な実施形態による、経時的なオレイン酸－１３Ｃ１８の損失百分率を示す。
【図6A】例示的な実施形態による、プラスチックチューブ（１）又はガラスバイアル（２）における経時的なラウリン酸－ｄ２３の損失百分率を示す。
【図6B】例示的な実施形態による、プラスチックチューブ（１）又はガラスバイアル（２）における経時的なミリスチン酸－ｄ２７の損失百分率を示す。
【図7】図７Ａは、例示的な実施形態による、異なるＷａｔｅｒｓ社のガラスバイアルを使用した２週間にわたるラウリン酸－ｄ２３の回収を示す。図７Ｂは、例示的な実施形態による、Ｗａｔｅｒｓ社のガラスバイアル１８６０００３２７Ｃ中での７日間のインキュベーションにわたる８つのｍＡｂのラウリン酸－ｄ２３の回収を示す。
【図8A】例示的な実施形態による、ラウリン酸－ｄ２３補正を行わない、プラスチックチューブ（１）又はガラスバイアル（２）内のラウリン酸濃度の経時的変化を示す。
【図8B】例示的な実施形態による、ミリスチン酸－ｄ２７補正を行わない、プラスチックチューブ（１）又はガラスバイアル（２）内のミリスチン酸濃度の経時的変化を示す。
【図8C】例示的な実施形態による、ラウリン酸－ｄ２３補正を行った、プラスチックチューブ（１）又はガラスバイアル（２）内のラウリン酸濃度の経時的変化を示す。
【図8D】例示的な実施形態による、ミリスチン酸－ｄ２７補正を行った、プラスチックチューブ（１）又はガラスバイアル（２）内のミリスチン酸濃度の経時的変化を示す。
【図9A】例示的な実施形態による、ＰＳ２０分解測定のためのサンプル調製手順を示す。
【図9B】例示的な実施形態による、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）及びＦＦＡの保持時間を示す。標識されたピークは、ラウリン酸Ｃ１２（１）、ミリスチン酸Ｃ１４（２）、リノール酸Ｃ１８：２（３）、パルミチン酸Ｃ１６（４）、オレイン酸Ｃ１８：１（５）、及びステアリン酸Ｃ１８：０（６）である。
【図9C】例示的な実施形態による、１０ｍｇ／ｍＬのｍＡｂ－５中のラウリン酸、ミリスチン酸、及びオレイン酸の検量線を示す。
【図9D】例示的な実施形態による、（Ｉ）注入量２０μＬの１０ｍｇ／ｍＬのｍＡｂ－５又は（ＩＩ）注入量５μＬの８０％／２０％のイソプロパノール／メタノール（ＩＰＡ／ＭｅＯＨ）にスパイクされた１μｇ／ｍＬのラウリン酸、ミリスチン酸、オレイン酸の混合物の比較を示す。
【図9E】例示的な実施形態による、３日間のインキュベーションによるｍＡｂ－１、ｍＡｂ－６、及びＰＳ２０の、抽出あり又はなしの遊離脂肪酸含有量の定量を示す。
【図10】例示的な実施形態による、ＰＳ２０及びＰＳ８０からの最も一般的な脂肪酸を含むＩＰＡ／ＭｅＯＨ中のスパイクＦＦＡ混合物の総イオン電流（ＴＩＣ）クロマトグラムを示す。標識されたピークは、ラウリン酸Ｃ１２（１）、ミリスチン酸Ｃ１４（２）、リノール酸Ｃ１８：２（３）、パルミチン酸Ｃ１６（４）、オレイン酸Ｃ１８：１（５）、及びステアリン酸Ｃ１８：０（６）である。トレースＩは、ＩＰＡ／ＭｅＯＨにスパイクされた遊離脂肪酸の混合物の５μＬの注入である。トレースＩＩは、ＩＰＡ／ＭｅＯＨにおける遊離脂肪酸の混合物の２０μＬの注入である。
【図11A】例示的な実施形態による、ＰＳ２０の百分率の減少と相関するラウリン酸（Ｃ１２）及びミリスチン酸（Ｃ１４）のＦＦＡ濃度の定量を示す。ＰＳ２０及びＦＦＡ含有量は、２℃～８℃で保存されたｍＡｂ－１製剤中で経時的に測定された。
【図11B】例示的な実施形態による、インキュベーション中に放出されたオレイン酸によって定量された、３６か月にわたる５℃でのｍＡｂ－１におけるＰＳ８０分解（実線）、及びＬＣ－ＣＡＤを使用して測定されたＰＳ８０種（破線）を示す。
【図11C】例示的な実施形態による、インキュベーション中に放出されたラウリン酸によって定量された、３６か月の５℃でのｍＡｂ－２におけるＰＳ２０分解（実線）、及びＬＣ－ＣＡＤを使用して測定されたＰＳ２０種（破線）を示す。
【図12A】例示的な実施形態による、ｍＡｂ－１におけるＰＳ８０分解によるオレイン酸放出速度の３７℃での日数と５℃での月数の比較を示す。３７℃でｍＡｂ－１を３日モニタリングし（１）、５℃でｍＡｂ－１を１５か月モニタリングする（２）。
【図12B】例示的な実施形態による、ｍＡｂ－２におけるＰＳ２０分解によるラウリン酸放出速度の３７℃での日数と５℃での月数の比較を示す。３７℃でｍＡｂ－２を６日モニタリングし（１）、５℃でｍＡｂ－１を１２か月モニタリングした（２）。
【図12C】例示的な実施形態による、ＬＣ－ＭＲＭによって測定された、５℃でのｍＡｂ－３におけるＰＳ８０の分解によって放出されたオレイン酸（月）と、ｍＡｂ－１に基づいて確立された式１による推定値との比較を示し、ドットとトレースは測定値を表し、ひし形は推定値を表す。
【図12D】例示的な実施形態による、ＬＣ－ＭＲＭによって測定された、５℃でのｍＡｂ－４におけるＰＳ２０の分解によって放出されたラウリン酸（月）と、ｍＡｂ－２に基づいて確立された式２による推定値との比較を示し、ドットとトレースは測定値を表し、ひし形は推定値を表す。
【図13A】例示的な実施形態による、ＰＯＥエステル種の２Ｄ－ＬＣ－ＣＡＤ測定を使用したＰＳ２０の分解を示す。
【図13B】例示的な実施形態による、抽出を必要としないＦＦＡ定量を使用した、ＰＳ２０の分解を示す。
【図14A】例示的な実施形態による、４℃～８℃で３６か月の保存中のｍＡｂ－２中のＰＳ２０レベルを示す。
【図14B】例示的な実施形態による、ＰＳ２０分解によって４℃～８℃で３６か月の保存中にｍＡｂ－２薬物製品中で測定された２μｍ粒子／ｍＬを示す。
【図14C】例示的な実施形態による、ＰＳ２０の分解により、ｍＡｂ－２薬物製品中のラウリン酸及びミリスチン酸の濃度が４℃～８℃での３６か月の保存中に増加し、ミリスチン酸濃度は１８か月後に増加が停止したが（ミリスチン酸：４）、２μｍ粒子は１８か月目に顕著に増加し、ｍＡｂ－２の保存期間がＰＳ２０の分解によって放出されたミリスチン酸によって制限されることを示す。
【図15】例示的な実施形態による、３７℃で３日インキュベートした場合のｍＡｂ－１、ｍＡｂ－７及びＰＳ２０中のラウリン酸の定量の比較を示す。
【発明を実施するための形態】
【0020】
詳細な説明
ポリソルベート２０（ＰＳ２０）及びポリソルベート８０（ＰＳ８０）は、タンパク質の安定性を向上させ、タンパク質製品を凝集や変性から保護するために、バイオ医薬品のタンパク質製剤で最も一般的に使用される非イオン性界面活性剤である（Ｍａｒｔｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ．１０６（７）：１７２２－１７３５（２０１７）；Ｋｉｅｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ ９７（１９）：４３４７－４３６６（２００８）；Ｄｗｉｖｅｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｐｈａｒｍ ５５２（１－２）：４２２－４３６（２０１８））。図１Ａに示すように、ＰＳ２０及びＰＳ８０の主構造はモノラウレートとモノオレエートで、それぞれラウリン酸（Ｃ１２：０）とオレイン酸（Ｃ１８：１）でエステル化されたポリエチレンオキシド（ＰＯＥ）鎖を持つソルビタン頭部基で構成される。ＰＳ２０及びＰＳ８０においてエステル化された脂肪酸の組成は表１に示される（Ｍａｒｔｏｓ ｅｔ ａｌ．）。薬物製品中の典型的なポリソルベート（ＰＳ）濃度は、保存期間にわたってタンパク質の安定性を維持するために０．００１％～０．１％（ｗ／ｖ）の範囲である（Ｍａｒｔｏｓ ｅｔ ａｌ．）。
ポリソルベート２０（ＰＳ２０）及びポリソルベート８０（ＰＳ８０）は、タンパク質の安定性を向上させ、タンパク質製品を凝集や変性から保護するために、バイオ医薬品のタンパク質製剤で最も一般的に使用される非イオン性界面活性剤である（Ｍａｒｔｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ．１０６（７）：１７２２－１７３５（２０１７）；Ｋｉｅｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ ９７（１９）：４３４７－４３６６（２００８）；Ｄｗｉｖｅｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｐｈａｒｍ ５５２（１－２）：４２２－４３６（２０１８））。図１Ａに示すように、ＰＳ２０及びＰＳ８０の主構造はモノラウレートとモノオレエートで、それぞれラウリン酸（Ｃ１２：０）とオレイン酸（Ｃ１８：１）でエステル化されたポリエチレンオキシド（ＰＯＥ）鎖を持つソルビタン頭部基で構成される。ＰＳ２０及びＰＳ８０においてエステル化された脂肪酸の組成は表１に示される（Ｍａｒｔｏｓ ｅｔ ａｌ．）。薬物製品中の典型的なポリソルベート（ＰＳ）濃度は、保存期間にわたってタンパク質の安定性を維持するために０．００１％～０．１％（ｗ／ｖ）の範囲である（Ｍａｒｔｏｓ ｅｔ ａｌ．）。
【0021】
（表１）ＰＳ２０及びＰＳ８０の脂肪酸組成
【0022】
ＰＳは、自動酸化と加水分解という２つの主要な経路を介して分解されやすいことが知られている（Ｄｗｉｖｅｄｉ ｅｔ ａｌ．；Ｋｉｓｈｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ．２８（５）：１１９４－１２１０（２０１１）；Ｌａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ．１０９（１０）：６３３－６３９（２０２０）；Ｋｉｓｈｏｒｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ．１００（２）：７２１－７３１（２０１１））。図１Ｂに示すように、酵素による加水分解は、高濃度タンパク質製剤におけるＰＳ分解の主な経路であると考えられており、その結果、医薬製剤中の望ましくない粒子形成を引き起こす遊離脂肪酸（ＦＦＡ）が蓄積する。酸化はＰＳ分解の２番目の主要な経路であり、過酸化物、アルデヒド、ケトン、短鎖エステル化ＰＯＥソルビタン／イソソルビド種の形成につながる（Ｋｉｓｈｏｒｅ ｅｔ ａｌ．２０１１ａ；Ｌａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．；Ｋｉｓｈｏｒｅ ｅｔ ａｌ．２０１１ｂ；Ｄｏｎｂｒｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ．６７（１２）：１６７６－１６８１（１９７８）；Ｙａｏ ｅｔ ａｌ．Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ．２６（１０）：２３０３－２３１３（２００９））。ＰＳの加水分解は、ＰＳ濃度を低下させるだけでなく、特に２℃～８℃の保存温度で蓄積されたＦＦＡの溶解度が低いことから粒子の形成にも関連するため、薬物製品の品質に対する大きな脅威として認識される（Ｄｏｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ．１１０（２）：６８７－６９２（２０２１）；Ｓａｇｇｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ．１１０（３）：１０９３－１１０２（２０２１）；Ｄｏｓｈｉ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ．１２（１１）：３７９２－３８０４（２０１５））。
【0023】
薬物製品中に存在する残留リパーゼ又はエステラーゼがＰＳ加水分解の主な原因である（Ｃｈｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．１１４（５）：１００６－１０１５（２０１７）；Ｈａｌｌ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ．１０５（５）：１６３３－１６４２（２０１６）；Ｌａｂｒｅｎｚ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ．１０３（８）：２２６８－２２７７（２０１４）；ＭｃＳｈａｎ ｅｔ ａｌ．ＰＤＡ Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈｎｏｌ．７０（４）：３３２－３４５（２０１６）；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ．１０９（１１）：３３００－３３０７（２０２０）；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ．１０９（９）：２７１０－２７１８（２０２０））。通常、最終薬物製品中の残留リパーゼの濃度は、下流の複数の精製ステップを経た後では非常に低く（１０ｐｐｍ未満）、ＰＳ分解の影響は、通常の保存温度（２℃～８℃）で数か月又は数年保存した後まで顕著ではない。従って、リパーゼ活性をより早い時点で観察できる加速条件でこの低いリパーゼ活性をモニタリングすることが望ましい。
【0024】
ＰＳ種又はＦＦＡを定量することによってＰＳ分解を直接的又は間接的に測定するための様々なアッセイが開発されている。ＰＳの直接定量は通常、蛍光ミセルアッセイ（Ｂｒｉｔｏ ｅｔ ａｌ．Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５２（２）：２５０－２５５（１９８６）；Ｋｈｏｓｓｒａｖｉ ｅｔ ａｌ．Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ．１９（５）：６３４－６３９（２００２））、液体クロマトグラフィ－荷電エアロゾル検出 （ＬＣ－ＣＡＤ）（Ｈｅｗｉｔｔ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ａ．１２１５（１－２）：１５６－１６０（２００８））、蒸気光散乱検出（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ｓｃｉ．５０（７）：５９８－６０７（２０１２））、又はＬＣ－質量分析（ＬＣ－ＭＳ）プロファイリング（Ｋｈｏｓｓｒａｖｉ ｅｔ ａｌ．；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１２；Ｂｏｒｉｓｏｖ ｅｔ ａｌ．Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ．８３（１０）：３９３４－３９４２（２０１１）；Ｈｖａｔｔｕｍ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｍｅｄ Ａｎａｌ．６２：７－１６（２０１２）；Ｂｏｒｉｓｏｖ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ．１０４（３）：１００５－１０１８（２０１５））によって行われる。間接的なＰＳ定量では、ＦＦＡは、通常、抽出及び誘導体化後に分光光度計で測定される（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ．１２（１１）：３８０５－３８１５（２０１５））。しかし、これらの方法のほとんどは、精度、感度、正確さ、及び／又はスループットのいずれかが欠けている。
【0025】
例えば、高性能ＬＣ－ＣＡＤ（ＨＰＬＣ－ＣＡＤ）を使用したＰＳ定量は、ＣＡＤシグナルの一般的な相対標準偏差パーセント（％ＲＳＤ）が１１％であるため、精度が低いことが知られ、（Ｓｏｌｉｖｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｍｅｄ Ａｎａｌ．１４３：６８－７６（２０１７）；Ｈｏｎｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ｂ Ａｎａｌｙｔ Ｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｍｅｄ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．１１１６：１－８（２０１９））、それは、ＰＳ含有量の小さな変化を検出するためのこの技術の適用を制限する。ＰＳの加水分解から生成されるＦＦＡの定量はＴｏｍｌｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．によって提案され、いくつかのグループによって採用されている（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．）。しかし、この方法では、固相抽出とＦＦＡの誘導体化が含まれるため、サンプル前処理に複数のステップが必要であり、スループットが低く、変動性が高くなる。最近、いくつかのグループが、薬物製品中に放出されるＦＦＡ含有量の定量に、より高感度な方法であるＬＣ－ＭＳを適用し、この方法がＰＳ分解の高感度で信頼性の高い定量技術として機能できることを実証した（Ｈｏｎｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．；Ｐｕｓｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ａ．１５９９：１３６－１４３（２０１９）；Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ １０８（８）：２８８０－２８８６（２０１９））。しかし、これらの方法は全て、ＭＳ検出前に抽出ステップを必要とし、時間がかかる。
【0026】
本明細書は、ポリソルベート濃度の小さな変化を検出するために使用できる、抽出を必要としない定量法を開示する。インキュベーション条件は、ＦＦＡの検出を最大化し、物理吸着によるＦＦＡの損失を最小限に抑えるように最適化される。更に、正確な定量を確保するために、インキュベーション前に内部標準（ＩＳＴＤ）が導入される。以下に記載の例は、このアプローチにより、複数の薬物製品における低レベルのＰＳ分解を１日以内に検出できることを実証する。最適化されたインキュベーション条件は、どのリパーゼが存在するかに関係なく、ＰＳ２０又はＰＳ８０の分解に適用できる。加速保存条件下で短期間に測定されたＦＦＡの放出を使用して、典型的な保存条件でのポリソルベートの長期分解を予測するモデルを導出する方法も提供される。
【0027】
別段記載されない限り、本明細書で使用される全ての技術及び科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載される方法及び材料と同様又は同等の任意の方法及び材料は、実施又は試験において使用され得るが、特定の方法及び材料が、これより記載される。
【0028】
「１つの（ａ）」という用語は、「少なくとも１つ」を意味すると理解されるべきであり、「約」及び「およそ」という用語は、当業者によって理解されるように標準的な変動を可能にすると理解されるべきであり、範囲が提供される場合、端点が含まれる。本明細書で使用される場合、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語は、非限定的であることを意味し、それぞれ「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」を意味すると理解される。
【0029】
いくつかの例示的な実施形態では、本開示は、医薬製剤中の遊離脂肪酸を定量するための方法を提供する。医薬製剤は、例えば、医薬物質、ポリソルベート、及び遊離脂肪酸を含み得る。医薬物質は、追加の賦形剤を含み得る。いくつかの例示的な実施形態では、追加の賦形剤はヒスチジンである。
【0030】
本明細書で使用される場合、「組成物」という用語は、１つ以上の薬学的に許容されるビヒクルと一緒に製剤化される医薬物質を指す。
【0031】
本明細書で使用される場合、「医薬物質」という用語は、薬物製品の生物学的に活性な成分を含み得る。医薬物質は、薬理活性を与えること、または疾患の診断、治療、軽減、処置、予防に直接効果をもたらすこと、又は動物の生理学的機能を回復、矯正、若しくは修飾することに直接効果をもたらすことを目的として、薬物製品に使用される任意の物質又は物質の組み合わせを指す。医薬物質を調製するための非限定的方法は、発酵プロセス、組換えＤＮＡ、天然資源からの単離及び回収、化学合成、又はそれらの組み合わせの使用を含み得る。いくつかの例示的な実施形態では、医薬物質は、薬物、化合物、核酸、毒素、ペプチド、タンパク質、融合タンパク質、抗体、抗体断片、抗体のＦａｂ領域、抗体－薬物複合体、又はタンパク質医薬物質である。
【0032】
いくつかの例示的な実施形態では、製剤中の医薬物質濃度は、約１ｍｇ／ｍＬ、約２ｍｇ／ｍＬ、約３ｍｇ／ｍＬ、約４ｍｇ／ｍＬ、約５ｍｇ／ｍＬ、約６ｍｇ／ｍＬ、約７ｍｇ／ｍＬ、約８ｍｇ／ｍＬ、約９ｍｇ／ｍＬ、約１０ｍｇ／ｍＬ、約１５ｍｇ／ｍＬ、約２０ｍｇ／ｍＬ、約３０ｍｇ／ｍＬ、約４０ｍｇ／ｍＬ、約５０ｍｇ／ｍＬ、約６０ｍｇ／ｍＬ、約７０ｍｇ／ｍＬ、約８０ｍｇ／ｍＬ、約９０ｍｇ／ｍＬ、約１００ｍｇ／ｍＬ、約１１０ｍｇ／ｍＬ、約１２０ｍｇ／ｍＬ、約１３０ｍｇ／ｍＬ、約１４０ｍｇ／ｍＬ、約１５０ｍｇ／ｍＬ、約１６０ｍｇ／ｍＬ、約１７０ｍｇ／ｍＬ、約１８０ｍｇ／ｍＬ、約１９０ｍｇ／ｍＬ、又は約２００ｍｇ／ｍＬであり得る。
【0033】
本明細書で使用される場合、「タンパク質」又は「タンパク質医薬物質」という用語は、共有結合したアミド結合を有する任意のアミノ酸ポリマーを含み得る。タンパク質は、当技術分野で一般に「ポリペプチド」として知られる、１つ以上のアミノ酸ポリマー鎖を含む。「ポリペプチド」は、ペプチド結合を介して連結されたアミノ酸残基、関連する天然に存在する構造変異体、及びその合成非天然に存在する類似体、関連する天然に存在する構造変異体、及びその合成非天然に存在する類似体から構成されるポリマーを指す。「合成ペプチド又はポリペプチド」は、非天然に存在するペプチド又はポリペプチドを指す。合成ペプチド又はポリペプチドは、例えば、自動ポリペプチド合成装置を使用して合成することができる。様々な固相ペプチド合成法が当業者に知られている。タンパク質は、単一の機能性生体分子を形成するために１つまたは複数のポリペプチドを含み得る。タンパク質は、抗体断片、ナノボディ、組換え抗体キメラ、サイトカイン、ケモカイン、ペプチドホルモンなどを含み得る。目的のタンパク質は、生物治療用タンパク質、研究又は治療に使用される組換えタンパク質、トラップタンパク質及び他のキメラ受容体Ｆｃ融合タンパク質、キメラタンパク質、抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト抗体、及び二重特異性抗体のいずれかを含み得る。タンパク質は、昆虫バキュロウイルス系、酵母系（例えば、ピキア種）、哺乳類系（例えば、ＣＨＯ細胞及びＣＨＯ－Ｋ１細胞のようなＣＨＯ誘導体）などの組換え細胞ベースの生産系を使用して生産できる。生物治療用タンパク質及びその生産について論じた最近の総説については、Ｇｈａｄｅｒｉ ｅｔ ａｌ．“Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｐｌａｔｆｏｒｍｓ ｆｏｒ ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ， ｉｍｐａｃｔ， ａｎｄ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ｏｆ ｎｏｎ－ｈｕｍａｎ ｓｉａｌｙｌａｔｉｏｎ”（Ｄａｒｉｕｓ Ｇｈａｄｅｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｐｌａｔｆｏｒｍｓ ｆｏｒ ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ，ｉｍｐａｃｔ，ａｎｄ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ｏｆ ｎｏｎ－ｈｕｍａｎ ｓｉａｌｙｌａｔｉｏｎ，２８ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＧＥＮＥＴＩＣ ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ ＲＥＶＩＥＷＳ １４７－１７６（２０１２）、その教示全体が本明細書に組み込まれる）を参照のこと。タンパク質は組成と溶解度に基づいて分類できるため、球状タンパク質、繊維状タンパク質などの単純タンパク質、核タンパク質、糖タンパク質、ムコタンパク質、色素タンパク質、リンタンパク質、金属タンパク質、リポタンパク質などの複合タンパク質、及び一次派生タンパク質、二次派生タンパク質などの派生タンパク質を含む。
【0034】
いくつかの例示的な実施形態では、タンパク質医薬物質は、組換えタンパク質、抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、抗体断片、モノクローナル抗体、融合タンパク質、ｓｃＦｖ、及びそれらの組み合わせであり得る。
【0035】
本明細書で使用される場合、「組換えタンパク質」という用語は、適切な宿主細胞に導入された組換え発現ベクターに担持される遺伝子の転写及び翻訳の結果として生成されるタンパク質を指す。ある特定の例示的な実施形態では、組換えタンパク質は、抗体、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、または完全ヒト抗体であり得る。ある特定の例示的な実施形態では、組換えタンパク質は、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、又はＩｇＥからなる群から選択されるアイソタイプの抗体であり得る。ある特定の例示的な実施形態では、抗体分子は全長抗体（例えば、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４免疫グロブリン）であり、あるいは抗体は断片（例えば、Ｆｃ断片又はＦａｂ断片）であり得る。
【0036】
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、ジスルフィド結合によって相互接続された４つのポリペプチド鎖、２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖を含む免疫グロブリン分子、並びにその多量体（例えば、ＩｇＭ）を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＨＣＶＲ又はＶＨと略す）及び重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３の３つのドメインを含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＬＣＶＲ又はＶＬと略す）及び軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメイン（ＣＬ１）を含む。ＶＨ及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保存された領域と散在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域に更に細分できる。各ＶＨ及びＶＬは、３つのＣＤＲと４つのＦＲで構成され、アミノ末端からカルボキシ末端に向かってＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４の順序で配置される。本発明の異なる実施形態では、抗ｂｉｇ－ＥＴ－１抗体（又はその抗原結合部分）のＦＲは、ヒト生殖系列配列と同一であり得、又は天然若しくは人工的に修飾され得る。アミノ酸コンセンサス配列は、２つ以上のＣＤＲの並列分析に基づいて定義することができる。本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、完全な抗体分子の抗原結合断片も含む。本明細書で使用される場合、抗体の「抗原結合部分」、抗体の「抗原結合断片」などの用語は、抗原に特異的に結合して複合体を形成する、任意の天然に存在する、酵素的に入手可能な、合成、又は遺伝子操作されたポリペプチド若しくは糖タンパク質を含む。抗体の抗原結合断片は、例えば、タンパク質分解消化又は抗体可変ドメイン及び必要に応じて定常ドメインをコードするＤＮＡの操作及び発現を伴う組換え遺伝子工学技術などの任意の適切な標準技術を使用して、完全な抗体分子から誘導され得る。このようなＤＮＡは既知である、及び／又は、例えば、商業的供給元、ＤＮＡライブラリ（例えば、ファージ抗体ライブラリを含む）から容易に入手可能である、又は合成することができる。ＤＮＡは、化学的又は分子生物学技術を使用して配列決定及び操作され、例えば、１つ以上の可変ドメイン及び／又は定常ドメインを適切な配置に配置したり、コドンを導入したり、システイン残基を作成したり、アミノ酸を修飾、追加又は削除したりすることができる。
【0037】
本明細書で使用される場合、「抗体断片」は、例えば、抗体の抗原結合領域又は可変領域などの、無傷の抗体の一部を含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ｓｃＦｖ断片、Ｆｖ断片、ｄｓＦｖダイアボディ、ｄＡｂ断片、Ｆｄ’断片、Ｆｄ断片及び単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）領域、並びにトリアボディ、テトラボディ、直鎖状抗体、一本鎖抗体分子及び抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。Ｆｖ断片は、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖の可変領域の組み合わせであり、ｓｃＦｖタンパク質は、免疫グロブリンの軽鎖と重鎖の可変領域がペプチドリンカーによって接続される組換え一本鎖ポリペプチド分子である。いくつかの例示的な実施形態では、抗体断片は、親抗体と同じ抗原に結合する断片である親抗体の十分なアミノ酸配列を含み、いくつかの例示的な実施形態では、断片は、親抗体と同等の親和性で抗原に結合する、及び／又は抗原への結合に関して親抗体と競合する。抗体断片は、いかなる手段によって産生され得る。例えば、抗体断片は、無傷の抗体の断片化によって酵素的又は化学的に生成することができる、及び／又は部分的な抗体配列をコードする遺伝子から組換え的に生成することができる。任意選択的に、又は更に、抗体断片は、全体又は部分的に合成的に生成され得る。抗体断片は、必要に応じて、一本鎖抗体断片を含み得る。任意選択的に、又は更に、抗体断片は、例えば、ジスルフィド結合によって一緒に連結された複数の鎖を含み得る。抗体断片は、必要に応じて、多分子複合体を含み得る。機能的抗体断片は、典型的には少なくとも約５０個のアミノ酸を含み、より典型的には少なくとも約２００個のアミノ酸を含む。
【0038】
「二重特異性抗体」という用語は、２つ以上のエピトープに選択的に結合できる抗体を含む。二重特異性抗体は一般に、２つの異なる重鎖を含み、各重鎖は、２つの異なる分子（例えば、抗原）上、又は同じ分子（例えば、同じ抗原上）のいずれかで異なるエピトープに特異的に結合する。二重特異性抗体が２つの異なるエピトープ（第１エピトープと第２エピトープ）に選択的に結合できる場合、第１エピトープに対する第１重鎖の親和性は一般に、第２エピトープに対する第１重鎖の親和性よりも少なくとも１～２桁又は３桁若しくは４桁低くなり、また、その逆も同様である。二重特異性抗体によって認識されるエピトープは、同じ標的上に存在することも、異なる標的上に存在することもできる（例えば、同じタンパク質上又は異なるタンパク質上）。二重特異性抗体は、例えば、同じ抗原の異なるエピトープを認識する重鎖を組み合わせることによって作製することができる。例えば、同じ抗原の異なるエピトープを認識する重鎖可変配列をコードする核酸配列は、異なる重鎖定常領域をコードする核酸配列に融合することができ、そのような配列は免疫グロブリン軽鎖を発現する細胞内で発現させることができる。
【0039】
典型的な二重特異性抗体は、それぞれ３つの重鎖ＣＤＲ、次いでＣＨ１ドメイン、ヒンジ、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを持つ２つの重鎖と、抗原結合特異性を与えないが各重鎖と会合することができる、又は各重鎖と会合することができ、重鎖抗原結合領域によって結合される１つ以上のエピトープに結合することができる、又は各重鎖と会合することができ、１つ若しくは２つの重鎖を１つ若しくは両方のエピトープに結合させることができる、免疫グロブリン軽鎖とを有する。ＢｓＡｂは、Ｆｃ領域（ＩｇＧ様）を持つものとＦｃ領域を欠くものの２つの主要なクラスに分類でき、後者は通常、Ｆｃを含むＩｇＧ及びＩｇＧ様二重特異性分子よりも小さい。ＩｇＧ様ｂｓＡｂとしては、トリオマブ、ｋｎｏｂｓ ｉｎｔｏ ｈｏｌｅｓ ＩｇＧ（ｋｉｈ ＩｇＧ）、ｃｒｏｓｓＭａｂ、ｏｒｔｈ－Ｆａｂ ＩｇＧ、二重可変ドメインＩｇ（ＤＶＤ－Ｉｇ）、ツー・イン・ワン若しくは二重作用Ｆａｂ（ＤＡＦ）、ＩｇＧ一本鎖Ｆｖ（ＩｇＧ－ｓｃＦｖ）、又はκλボディなどの様々なフォーマットが挙げられるが、これらに限定されない。非ＩｇＧ様の様々なフォーマットは、タンデムｓｃＦｖ、ダイアボディフォーマット、一本鎖ダイアボディ、タンデムダイアボディ（ＴａｎｄＡｂ）、二重アフィニティーリターゲティング分子（ＤＡＲＴ）、ＤＡＲＴ－Ｆｃ、ナノボディ、又はドック・アンド・ロック（ＤＮＬ）法によって生産される抗体を含む（（Ｇａｏｗｅｉ Ｆａｎ，Ｚｕｊｉａｎ Ｗａｎｇ ＆ Ｍｉｎｇｊｕ Ｈａｏ，Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， ８ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＨＥＭＡＴＯＬＯＧＹ ＆ ＯＮＣＯＬＯＧＹ １３０；Ｄａｆｎｅ Ｍｕｅｌｌｅｒ ＆ Ｒｏｌａｎｄ Ｅ．Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ＨＡＮＤＢＯＯＫ ＯＦ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ２６５－３１０（２０１４）、その教示全体が本明細書に組み込まれる）。
【0040】
本明細書で使用される場合、「多重特異性抗体」は、少なくとも２つの異なる抗原に対する結合特異性を有する抗体を指す。このような分子は、通常、２つの抗原（例えば、二重特異性抗体、ｂｓＡｂ）とのみ結合するが、三重特異性抗体及びＫＩＨ三重特異性などの追加の特異性を有する抗体も、本明細書に開示されるシステム及び方法によって対処することができる。
【0041】
本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」という用語は、ハイブリドーマ技術によって産生される抗体に限定されない。モノクローナル抗体は、当技術分野で利用可能な又は公知の任意の手段によって、任意の真核生物、原核生物、又はファージクローンを含む単一クローンに由来することができる。本開示で有用なモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換え、及びファージディスプレイ技術、又はそれらの組み合わせの使用を含む、当技術分野で公知の広範な技術を使用して調製することができる。
【0042】
いくつかの例示的な実施形態では、タンパク質医薬物質は、哺乳類細胞から生成され得る。哺乳類細胞はヒト由来又は非ヒト由来であってもよく、初代上皮細胞（例えば、ケラチノサイト、子宮頸部上皮細胞、気管支上皮細胞、気管上皮細胞、腎上皮細胞及び網膜上皮細胞）、確立された細胞株及びその菌株（例えば、２９３胚腎細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅＬａ子宮頸部上皮細胞及びＰＥＲ－Ｃ６網膜細胞、ＭＤＢＫ（ＮＢＬ－１）細胞、９１１細胞、ＣＲＦＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＣＨＯ細胞、ＢｅＷｏ細胞、Ｃｈａｎｇ細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ ５６２細胞、ＨｅＬａ ２２９細胞、ＨｅＬａ Ｓ３細胞、Ｈｅｐ－２細胞、ＫＢ細胞、ＬＳＩ８０細胞、ＬＳ１７４Ｔ細胞、ＮＣＩ－Ｈ－５４８細胞、ＲＰＭＩ２６５０細胞、ＳＷ－１３細胞、Ｔ２４細胞、ＷＩ－２８ ＶＡ１３細胞、２ＲＡ細胞、ＷＩＳＨ細胞、ＢＳ－Ｃ－Ｉ細胞、ＬＬＣ－ＭＫ２細胞、クローンＭ－３細胞、１－１０細胞、ＲＡＧ細胞、ＴＣＭＫ－１細胞、Ｙ－ｌ細胞、ＬＬＣ－ＰＫｉ細胞、ＰＫ（１５）細胞、ＧＨｉ細胞、ＧＨ３細胞、Ｌ２細胞、ＬＬＣ－ＲＣ２５６細胞、ＭＨｉＣｉ細胞、ＸＣ細胞、ＭＤＯＫ細胞、ＶＳＷ細胞、及びＴＨ－Ｉ細胞、Ｂ１細胞、ＢＳＣ－１細胞、ＲＡｆ細胞、ＲＫ－細胞、ＰＫ－１５細胞又はそれらの誘導体）任意の組織又は器官（心臓、肝臓、腎臓、結腸、腸、食道、胃、神経組織（脳、脊髄）、肺、血管組織（動脈、静脈、毛細血管）、リンパ組織（リンパ腺、アデノイド、扁桃体、骨髄、血液）、脾臓を含むが、これらに限定されない）からの線維芽細胞及び線維芽細胞様細胞株（例えば、ＣＨＯ細胞、ＴＲＧ－２細胞、ＩＭＲ－３３細胞、Ｄｏｎ細胞、ＧＨＫ－２１細胞、シトルリン血症細胞、Ｄｅｍｐｓｅｙ細胞、デトロイト５５１細胞、デトロイト５１０細胞、デトロイト５２５細胞、デトロイト５２９細胞、デトロイト５３２細胞、デトロイト５３９細胞、デトロイト５４８細胞、デトロイト５７３細胞、ＨＥＬ ２９９細胞、ＩＭＲ－９０細胞）、ＭＲＣ－５細胞、ＷＩ－３８細胞、ＷＩ－２６細胞、Ｍｉｄｉ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＶ－１細胞、ＣＯＳ－１細胞、ＣＯＳ－３細胞、ＣＯＳ－７細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＤＢＳ－ＦｒｈＬ－２細胞、ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞、Ｆ９細胞、ＳＶ－Ｔ２細胞、Ｍ－ＭＳＶ－ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞、Ｋ－ＢＡＬＢ細胞、ＢＬＯ－１１細胞、ＮＯＲ－１０細胞、Ｃ３Ｈ／ＩＯＴＩ／２細胞、ＨＳＤＭｉＣ３細胞、ＫＬＮ２０５細胞、ＭｃＣｏｙ細胞、マウスＬ細胞、菌株２０７１（マウスＬ）細胞、Ｌ－Ｍ株（マウスＬ）細胞、Ｌ－ＭＴＫ’（マウスＬ）細胞、ＮＣＴＣクローン２４７２及び２５５５、ＳＣＣ－ＰＳＡ１細胞、スイス／３Ｔ３細胞、インドスエード細胞、ＳＩＲＣ細胞、Ｃｎ細胞及びＪｅｎｓｅｎ細胞、Ｓｐ２／０、ＮＳ０、ＮＳ１細胞又はそれらの誘導体）を含み得る。
【0043】
いくつかの例示的な実施形態では、組成物は、疾患又は障害の治療、予防及び／又は改善のために使用され得る。本発明の医薬製剤を投与することによって治療及び／又は予防することができる例示的な非限定的疾患及び障害は、感染症、呼吸器疾患、神経因性、神経性又は傷害性疼痛に関連する疾患に起因する疼痛、遺伝疾患、先天性疾患、がん、ヘルペス様、慢性特発性蕁麻疹、強皮症、肥厚性瘢痕、ホイップル病、良性前立腺過形成、軽度、中等度又は重度の喘息、アレルギー反応などの肺疾患、川崎病、鎌状赤血球症、チャーグ・シュトラウス症候群、バセドウ病、子癇前症、シェーグレン症候群、自己免疫性リンパ増殖症候群、自己免疫性溶血性貧血、バレット食道、自己免疫性ブドウ膜炎、結核、腎臓病、慢性関節リウマチを含む関節炎、クローン病や潰瘍性大腸炎を含む炎症性腸疾患、全身性エリテマトーデス、炎症性疾患、ＨＩＶ感染症、ＡＩＤＳ、ＬＤＬアフェレーシス、ＰＣＳＫ９活性化突然変異（機能獲得型突然変異、「ＧＯＦ」）に起因する疾患、ヘテロ接合体家族性高コレステロール血症（ｈｅＦＨ）に起因する疾患、原発性高コレステロール血症、脂質異常、胆汁うっ滞性肝疾患、ネフローゼ症候群、甲状腺機能低下、肥満、アテローム性動脈硬化、心血管疾患、神経変性疾患、新生児発症多系統炎症性疾患（ＮＯＭ ＩＤ／ＣＩＮＣＡ）、マックル・ウェルズ症候群（ＭＷＳ）、家族性感冒自己炎症症候群（ＦＣＡＳ）、家族性地中海熱（ＦＭＦ）、腫瘍壊死因子受容体関連周期性症候群（ＴＲＡＰＳ）、全身型若年性特発性関節炎（スティール病）、１型糖尿病と２型糖尿病、自己免疫疾患、運動ニューロン疾患、目の病気、性感染症、結核、ＶＥＧＦアンタゴニストによって改善、阻害、又は軽減される疾患又は症状、ＰＤ－１阻害剤によって改善、阻害、又は軽減される疾患又は症状、インターロイキン抗体によって改善、阻害、又は軽減される疾患又は症状、ＮＧＦ抗体によって改善、阻害、又は軽減される疾患又は症状、ＰＣＳＫ９抗体によって改善、阻害、又は軽減される疾患又は症状、ＡＮＧＰＴＬ抗体によって改善、阻害、又は軽減される疾患又は症状、アクチビン抗体によって改善、阻害、又は軽減される疾患又は症状、ＧＤＦ抗体によって改善、阻害、又は軽減される疾患又は症状、Ｆｅｌ ｄ１抗体によって改善、阻害、又は軽減される疾患又は症状、ＣＤ抗体によって改善、阻害、又は軽減される疾患又は症状、Ｃ５抗体又はその組み合わせによって改善、阻害、又は軽減される疾患又は症状を含む。
【0044】
いくつかの例示的な実施形態では、組成物は患者に投与され得る。投与は、当業者に許容される任意の経路を介して行うことができる。非限定的投与経路は、経口、局所、又は非経口を含む。ある特定の非経口経路を介した投与は、滅菌注射器又は持続注入システムなどの他の何らかの機械装置によって推進される針又はカテーテルを通して、本発明の製剤を患者の体内に導入することを含み得る。本発明によって提供される組成物は、シリンジ、注射器、ポンプ、又は非経口投与用の当該技術分野で認識されている他の任意の装置を使用して投与することができる。本発明の組成物は、肺又は鼻腔内での吸収のためのエアロゾルとして投与することもできる。組成物はまた、口腔投与など、粘膜を介して吸収するために投与され得る。
【0045】
いくつかの実施形態では、製剤は、緩衝剤、増量剤、等張化剤、可溶化剤、及び保存剤を含むがこれらに限定されない賦形剤を更に含み得る。他の追加の賦形剤もまた、機能に基づいて選択することができ、製剤との適合性は、例えば、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ：ＴＨＥ ＳＣＩＥＮＣＥ ＡＮＤ ＰＲＡＣＴＩＣＥ ＯＦ ＰＨＡＲＭＡＣＹ，（２００５）、Ｕ． Ｓ．Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ：Ｎａｔｉｏｎａｌ ｆｏｒｍｕｌａｒｙ、ＬＯＵＩＳ ＳＡＮＦＯＲＤ ＧＯＯＤＭＡＮ ＥＴ ＡＬ．，ＧＯＯＤＭＡＮ ＆ ＧＩＬＭＡＮＳ ＴＨＥ ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＩＣＡＬ ＢＡＳＩＳ ＯＦ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ（２００１）、ＫＥＮＮＥＴＨ Ｅ．ＡＶＩＳ，ＨＥＲＢＥＲＴ Ａ．ＬＩＥＢＥＲＭＡＮ ＆ ＬＥＯＮ ＬＡＣＨＭＡＮ，ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＤＯＳＡＧＥ ＦＯＲＭＳ：ＰＡＲＥＮＴＥＲＡＬ ＭＥＤＩＣＡＴＩＯＮＳ（１９９２）、Ｐｒａｆｕｌ Ａｇｒａｗａｌａ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：Ｔａｂｌｅｔｓ．Ｖｏｌｕｍｅ １， ７９ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １８８（１９９０）、ＨＥＲＢＥＲＴ Ａ．ＬＩＥＢＥＲＭＡＮ， ＭＡＲＴＩＮ Ｍ．ＲＩＥＧＥＲ ＆ ＧＩＬＢＥＲＴ Ｓ．ＢＡＮＫＥＲ，ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＤＯＳＡＧＥ ＦＯＲＭＳ：ＤＩＳＰＥＲＳＥ ＳＹＳＴＥＭＳ（１９９６）、ＭＹＲＡ Ｌ．ＷＥＩＮＥＲ ＆ ＬＯＩＳ Ａ．ＫＯＴＫＯＳＫＩＥ，ＥＸＣＩＰＩＥＮＴ ＴＯＸＩＣＩＴＹ ＡＮＤ ＳＡＦＥＴＹ（２０００）（それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）に見いだされ得る。
【0046】
いくつかの実施形態では、組成物中の界面活性剤は、ポリソルベートであり得る。本明細書で使用される場合、「ポリソルベート」は、撹拌、凍結融解プロセス、空気／水界面などの様々な物理的ストレスから抗体を保護するために製剤開発で使用される一般的な賦形剤を指し（Ｅｍｉｌｙ Ｈａ，Ｗｅｉ Ｗａｎｇ ＆ Ｙ．Ｊｏｈｎ Ｗａｎｇ，Ｐｅｒｏｘｉｄｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ８０ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ，９１ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ ２２５２－２２６４（２００２）；Ｂｒｕｃｅ Ａ．Ｋｅｒｗｉｎ，Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅｓ ２０ ａｎｄ ８０ Ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｅ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ Ｐａｔｈｗａｙｓ，９７ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ ２９２４－２９３５（２００８）；Ｈａｎｎｓ－Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ Ｍａｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ Ｂｅｈａｖｉｏｒ ｏｆ ａ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ ａｎｄ ａ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ Ｓｔｅｒｉｌｉｚｉｎｇ－Ｇｒａｄｅ Ｆｉｌｔｅｒｓ，９９ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２６２０－２６２７（２０１０））、ポリオキシエチレンソルビタンの脂肪酸エステルからなる非イオン性両親媒性界面活性剤を含み得る。エステルには、ポリオキシエチレンソルビタン頭部基、及び飽和モノラウレート側鎖（ポリソルベート２０、ＰＳ２０）又は不飽和モノオレエート側鎖（ポリソルベート８０、ＰＳ８０）のいずれかを含み得る。いくつかの態様では、ポリソルベートは、製剤中に約０．００１％～１％（重量／体積）の範囲で存在することができる。ポリソルベートは、様々な脂肪酸鎖の混合物も含み得、例えば、ポリソルベート８０は、オレイン酸、パルミチン酸、ミリスチン酸、ステアリン酸脂肪酸を含み、モノオレイン酸画分が多分散混合物の約５８％を占める（Ｎｉｔｉｎ Ｄｉｘｉｔ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｓｉｄｕａｌ Ｈｏｓｔ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｍｏｔｅｓ Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ２０ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｉｎ ａ Ｓｕｌｆａｔａｓｅ Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｌｅａｄｉｎｇ ｔｏ Ｆｒｅｅ Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ，１０５ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ １６５７－１６６６ （２０１６））。ポリソルベートの非限定的例は、ポリソルベート－２０、ポリソルベート－４０、ポリソルベート－６０、ポリソルベート－６５、及びポリソルベート－８０を含む。
【0047】
ポリソルベートは、ｐＨ及び温度に依存して自動酸化されやすい可能性があり、更に、紫外線への曝露によっても不安定になる可能性があり（Ｒａｖｕｒｉ Ｓ．ｋ．Ｋｉｓｈｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅｓ ２０ ａｎｄ ８０：Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ Ｔｈｅｒｍａｌ Ａｕｔｏｘｉｄａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ，１００ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ ７２１－７３１（２０１１））、その結果、ソルビタン頭部基とともに溶液中に遊離脂肪酸が生成される。ポリソルベートから生じる遊離脂肪酸は、炭素数６～２０の脂肪族脂肪酸を含む。遊離脂肪酸の非限定的例としては、オレイン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ミリスチン酸、ラウリン酸、又はそれらの組み合わせが挙げられる。
【0048】
いくつかの例示的な態様では、ポリソルベートは遊離脂肪酸粒子を形成することができる。遊離脂肪酸粒子のサイズは少なくとも約５μｍであり得る。更に、これらの脂肪酸粒子は、そのサイズに応じて可視粒子（約１００μｍ超）、可視未満粒子（約１００μｍ未満であり、ミクロン（１～１００μｍ）とミクロン未満（１００ｎｍ～１０００ｎｍ）に細分できる）、及びナノメートル粒子（約１００ｎｍ未満）に分類できる（Ｌｉｎｄａ Ｎａｒｈｉ， Ｊｅｒｅｍｙ Ｓｃｈｍｉｔ ＆ Ｄｅｅｐａｋ Ｓｈａｒｍａ，Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ，１０１ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ ４９３－４９８）。いくつかの例示的な態様では、脂肪酸粒子は、可視粒子であり得る。可視粒子は、目視検査によって判定できる。いくつかの例示的な態様では、脂肪酸粒子は、可視未満粒子であり得る。可視未満粒子は、米国薬局方（ＵＳＰ）に準拠した光遮断法によってモニタリングすることができる。脂肪酸粒子の増加により、製品が許容できる品質でなくなる可能性があるため、脂肪酸粒子の増加率が製品の保存期間の尺度として使用され得る。遊離脂肪酸が製剤中に放出され、可溶性の濃度を超えると、脂肪酸粒子が形成され、それによって溶液から沈殿することがある。従って、ポリソルベートの分解又は放出された遊離脂肪酸の濃度を測定することは、脂肪酸粒子の形成の指標となり得、予測される製品の保存期間を延長することによっても可能である。
【0049】
いくつかの例示的な態様では、製剤中のポリソルベート濃度は、約０．００１％ｗ／ｖ、約０．００２％ｗ／ｖ、約０．００３％ｗ／ｖ、約０．００４％ｗ／ｖ、約０．００５％ｗ／ｖ、約０．００６％ｗ／ｖ、約０．００７％ｗ／ｖ、約０．００８％ｗ／ｖ、約０．００９％ｗ／ｖ、約０．０１％ｗ／ｖ、約０．０１５％ｗ／ｖ、約０．０２％ｗ／ｖ、０．０２５％ｗ／ｖ、約０．０３％ｗ／ｖ、約０．０３５％ｗ／ｖ、約０．０４％ｗ／ｖ、約０．０４５％ｗ／ｖ、約０．０５％ｗ／ｖ、約０．０６％ｗ／ｖ、約０．０７％ｗ／ｖ、約０．０８％ｗ／ｖ、約０．０９％ｗ／ｖ、約０．１％ｗ／ｖ、約０．２％ｗ／ｖ、約０．３％ｗ／ｖ、約０．４％ｗ／ｖ、約０．５％ｗ／ｖ、約０．６％ｗ／ｖ、約０．７％ｗ／ｖ、約０．８％ｗ／ｖ、約０．９％ｗ／ｖ、又は約１％ｗ／ｖであり得る。例示的な実施形態では、製剤中のポリソルベート濃度は、約１％ｗ／ｖである。
【0050】
いくつかの例示的な態様では、製剤中の医薬物質濃度は、製剤中の遊離脂肪酸濃度は、約１０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ、約４００ｎｇ／ｍＬ、約５００ｎｇ／ｍＬ、約６００ｎｇ／ｍＬ、約７００ｎｇ／ｍＬ、約８００ｎｇ／ｍＬ、約９００ｎｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ、約３μｇ／ｍＬ、約４μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ、約６μｇ／ｍＬ、約７μｇ／ｍＬ、約８μｇ／ｍＬ、約９μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ、約３０μｇ／ｍＬ、又は約４０μｇ／ｍＬであり得る。
【0051】
いくつかの例示的な態様では、ポリソルベートは、組成物中に存在する宿主細胞タンパク質によって分解され得る。本明細書で使用される場合、「宿主細胞タンパク質」という用語は、宿主細胞に由来するタンパク質を含み、所望の医薬物質とは無関係な場合もある。宿主細胞タンパク質は、製造プロセスに由来し得るプロセス関連の不純物であり得、細胞基質由来、細胞培養由来、下流由来の３つの主要なカテゴリを含み得る。細胞基質由来の不純物は、宿主生物由来のタンパク質及び核酸（宿主細胞のゲノム、ベクター、又は全ＤＮＡ）を含むが、これらに限定されない。細胞培養由来の不純物は、誘導物質、抗生物質、血清、及びその他の培地成分を含むが、これらに限定されない。下流由来の不純物は、酵素、化学的及び生化学的処理試薬（例えば、臭化シアン、グアニジン、酸化剤及び還元剤）、無機塩（例えば、重金属、ヒ素、非金属イオン）、溶媒、担体、リガンド（例えば、モノクローナル抗体）、及びその他の浸出物を含むが、これらに限定されない。いくつかの例示的な実施形態では、宿主細胞タンパク質は、リパーゼ又はエステラーゼであり得る。製剤中の残留リパーゼ活性は、ポリソルベートの分解、遊離脂肪酸の放出、又は可視脂肪酸粒子若しくは可視未満脂肪酸粒子の濃度を測定することによって間接的に評価することができる。
【0052】
本明細書で使用される場合、「液体クロマトグラフィ」という用語は、液体によって運ばれる生物学的／化学的混合物が、静止した液相又は固相を通って流れる（又は流れ込む）際の成分の分布の差の結果として、成分に分離できるプロセスを指す。液体クロマトグラフィの非限定的例は、逆相液体クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ、アフィニティークロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、親水性相互作用クロマトグラフィ、又は混合モードクロマトグラフィを含む。例示的な実施形態では、ブチル逆相カラムが使用される。例示的な実施形態では、Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ４カラムが使用される。
【0053】
本明細書で使用される場合、「質量分析計」という用語は、特定の分子種を認識し、その正確な質量を測定できる装置を含む。当該用語は、ポリペプチド又はペプチドを特性評価することができる任意の分子検出器を含むことを意味する。質量分析計は、イオン源、質量分析器、検出器という３つの主要な部分を含む。イオン源の役割は、気相イオンを生成することである。検体の原子、分子、クラスタは気相に移送され、同時に（エレクトロスプレーイオン化のように）又は別のプロセスを通じてイオン化される。イオン源の選択は用途によって異なる。いくつかの例示的な実施形態では、質量分析計は、タンデム質量分析計であり得る。本明細書で使用される場合、「タンデム質量分析」という用語は、複数段階の質量選択と質量分離を使用してサンプル分子の構造情報を取得する技術を含む。前提条件は、最初の質量選択ステップの後に、予測可能かつ制御可能な方法で断片が形成されるように、サンプル分子が気相に変換されてイオン化されることである。多段階ＭＳ／ＭＳ又はＭＳｎは、有意義な情報が得られる、又はフラグメントイオン信号が検出可能である限り、先ず前駆体イオンを選択して分離し（ＭＳ２）、断片化し、一次フラグメントイオンを分離し（ＭＳ３）、断片化し、二次フラグメントイオンを分離し（ＭＳ４）、などによって実行することができる。タンデムＭＳは、様々な分析器の組み合わせで成功裏に実行される。ある特定の用途にどの分析器を組み合わせるかは、感度、選択性、速度だけでなく、サイズ、コスト、可用性など、様々な要因によって決まる。タンデムＭＳ法の２つの主要なカテゴリは、タンデムインスペースとタンデムインタイムであり、しかし、タンデムインタイム分析器が空間内で結合されたりタンデムインスペース分析器と結合されたハイブリッドも存在する。タンデムインスペース質量分析計は、イオン源、前駆体イオン活性化装置、及び少なくとも２つの非トラップ型質量分析器を含む。特定のｍ／ｚ分離機能は、機器の１つのセクションでイオンが選択され、中間領域で解離され、生成イオンがｍ／ｚ分離とデータ収集のために別の分析器に送信されるように設計できる。タンデムインタイムでは、イオン源で生成された質量分析計イオンを同じ物理装置内で捕捉、分離、断片化し、ｍ／ｚ分離することができる。
【0054】
いくつかの態様では、本願の方法又はシステムにおける質量分析計は、エレクトロスプレーイオン化質量分析計、ナノエレクトロスプレーイオン化質量分析計、又はトリプル四重極質量分析計であり得、質量分析計は、液体クロマトグラフィシステムに接続され得、質量分析計は、ＬＣ－ＭＳ（液体クロマトグラフィ－質量分析）又はＬＣ－ＭＲＭ－ＭＳ（液体クロマトグラフィ－多重反応モニタリング－質量分析）分析を行うことができる。
【0055】
本明細書で使用される場合、「質量分析器」という用語は、質量に応じて種、つまり原子、分子、又はクラスタを分離できる装置を含む。使用され得る質量分析計の非限定的例は、飛行時間型（ＴＯＦ）、磁気／電気セクタ、四重極質量フィルタ（Ｑ）、四重極イオントラップ（ＱＩＴ）、オービトラップ、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴（ＦＴＩＣＲ）及び加速器質量分析（ＡＭＳ）の技術である。
【0056】
本明細書で使用される場合、「エレクトロスプレーイオン化」又は「ＥＳＩ」という用語は、溶液を含むエレクトロスプレーニードルの先端と対向電極との間に電位差を与えることによって発生する高電荷液滴の流れを大気圧下で形成して脱溶媒することにより、溶液中のカチオン又はアニオンが気相に移行するスプレーイオン化プロセスを指す。溶液中の電解質イオンから気相イオンを生成するには、一般に３つの主要なステップがある。それらは、以下のとおりである：（ａ）ＥＳ注入チップで荷電液滴を生成すること、（ｂ）溶媒の蒸発と繰り返しの液滴崩壊による荷電液滴の収縮により、気相イオンを生成できる小さな高度に荷電した液滴を生成すること、及び（ｃ）非常に小さく、高度に荷電した液滴から気相イオンを生成するメカニズム。段階（ａ）～（ｃ）は通常、装置の大気圧領域で発生する。いくつかの例示的な実施形態では、エレクトロスプレーイオン化質量分析計は、ナノエレクトロスプレーイオン化質量分析計であり得る。
【0057】
本明細書で使用される場合、「抽出」という用語は、混合物中の化合物を、その特有の物理的及び化学的特性に基づいて他の化合物から分離するために使用されるプロセスを指す。混合物の種類と分離される化合物の種類に基づいて、固相抽出（ＳＰＥ）、液液抽出（ＬＬＥ）、電気抽出（ＥＥ）など、抽出には多くの種類がある。現在の遊離脂肪酸の定量法は、ＬＣ－ＭＳなどによる分析前に製剤から遊離脂肪酸を抽出することに依存する。この抽出ステップにより、分析用のサンプルの成分が簡素化されるが、その代償として、時間のかかるステップが導入され、結果にばらつきが生じる可能性がある。いくつかの例示的な実施形態では、本願は、抽出ステップを行わずに製剤中の遊離脂肪酸を定量する方法を記載する。
【0058】
本開示は、医薬製剤中の遊離脂肪酸を定量するための方法を提供する。いくつかの例示的な実施形態では、本方法は、（ａ）医薬物質、ポリソルベート、及び遊離脂肪酸を含む製剤をインキュベートするステップと、（ｂ）前記製剤を液体クロマトグラフィに供して、上記遊離脂肪酸を分離するステップと、（ｃ）質量分析計を使用して、上記遊離脂肪酸を定量するステップであって、上記遊離脂肪酸は、上記製剤を液体クロマトグラフィに供する前に、上記製剤から抽出されないステップとを含む。
【0059】
いくつかの態様では、上記遊離脂肪酸の定量は、前記ポリソルベートの分解の測定として使用される。いくつかの態様では、上記遊離脂肪酸の定量は、上記医薬製剤中の残留リパーゼ活性の測定として使用される。いくつかの態様では、前記遊離脂肪酸の定量は、脂肪酸粒子形成の測定として使用される。いくつかの態様では、前記遊離脂肪酸の定量は、上記医薬製剤の保存期間を予測するために使用される。保存期間は、遊離脂肪酸粒子が可溶性となる濃度を超える遊離脂肪酸粒子濃度の増加に基づいて予測することができ、その結果、脂肪酸粒子が形成され、医薬製剤が許容できないものとなる可能性がある。
【0060】
いくつかの態様では、遊離脂肪酸の測定を改善するために、医薬製剤中のポリソルベート濃度を最適化することができる。実施例１に記載したように、過度に高濃度のポリソルベートは、イオン抑制及び医薬物質の希釈を引き起こす可能性がある。しかし、濃度が低すぎると、放出されたＦＦＡが吸着によって過度に失われる可能性がある。一態様では、ポリソルベートの最適濃度は、約１％である。
【0061】
以下の実施例５に示す式１及び２は、長期のＦＦＡ放出及びＰＳ分解を予測するために本発明の無抽出法を使用するためのモデルを提供する。例えば、本発明の定量法は、加速保存条件、例えば、約３７℃、及び典型的な保存条件、例えば、約５℃での製剤に適用することができる。約３７℃での日数に対応する約５℃での月数を表す線形方程式を導き出すことができる。表３及び表４に示すように、３７℃での数日にわたる放出されたＦＦＡ濃度の変化率を使用して、５℃での数か月にわたる放出されたＦＦＡ濃度の変化を予測できる。この方法と、ＦＦＡが沈殿して脂肪酸粒子を形成し得る溶解度の既知の限界を使用すると、数日にわたる簡単かつ迅速な測定によって医薬物質の保存期間を予測でき得る。
【0062】
本発明は、前述の製剤（複数可）、医薬物質（複数可）、賦形剤（複数可）、タンパク質（複数可）、抗体（複数可）、細胞（複数可）、組成物（複数可）、ポリソルベート（複数可）、遊離脂肪酸（複数可）、宿主細胞タンパク質（複数可）、液体クロマトグラフィシステム（複数可）又は質量分析計（複数可）のいずれにも限定されず、任意の製剤（複数可）、医薬物質（複数可）、賦形剤（複数可）、タンパク質（複数可）、抗体（複数可）、細胞（複数可）、組成物（複数可）、ポリソルベート（複数可）、遊離脂肪酸（複数可）、宿主細胞タンパク質（複数可）、液体クロマトグラフィシステム（複数可）又は質量分析計（複数可）が、任意の適切な手段によって選択され得ることが理解される。
【0063】
本発明は、以下の実施例を参照することによってより完全に理解されるであろう。しかし、それらは本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【実施例】
【0064】
材料
ギ酸、メタノール（ＭｅＯＨ）、イソプロパノール（ＩＰＡ）、及びアセトニトリル（ＡＣＮ）は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）から購入した。酢酸アンモニウム、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、オレイン酸、ステアリン酸、リノール酸、ラウリン酸－ｄ２３（ＣＡＳ番号５９１５４－４３－７）、ミリスチン酸－ｄ２７（ＣＡＳ番号６０６５８－４１－５）及びオレイン酸－１３Ｃ１８（ＣＡＳ番号２８７１００－８２－７）は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入した。超精製ＰＳ２０は、Ｃｒｏｄａ（Ｅａｓｔ Ｙｏｒｋｓｈｉｒｅ、ＵＫ）から購入した。全てのｍＡｂは、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．で調製された。Ｏａｓｉｓ ＭＡＸカラム、Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ４カラム、及びＡｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＣＳＨ Ｃ１８カラムは、Ｗａｔｅｒｓ（Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）から購入した。ガラスバイアルはＷａｔｅｒｓ社から購入し、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（登録商標） ＬｏＢｉｎｄ微量遠心管は、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入した。ヒト肝臓カルボキシルエステラーゼ（ＣＥＳ－１）は、Ａｂｃａｍ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ＵＫ）から購入した。
ギ酸、メタノール（ＭｅＯＨ）、イソプロパノール（ＩＰＡ）、及びアセトニトリル（ＡＣＮ）は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）から購入した。酢酸アンモニウム、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、オレイン酸、ステアリン酸、リノール酸、ラウリン酸－ｄ２３（ＣＡＳ番号５９１５４－４３－７）、ミリスチン酸－ｄ２７（ＣＡＳ番号６０６５８－４１－５）及びオレイン酸－１３Ｃ１８（ＣＡＳ番号２８７１００－８２－７）は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入した。超精製ＰＳ２０は、Ｃｒｏｄａ（Ｅａｓｔ Ｙｏｒｋｓｈｉｒｅ、ＵＫ）から購入した。全てのｍＡｂは、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．で調製された。Ｏａｓｉｓ ＭＡＸカラム、Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ４カラム、及びＡｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＣＳＨ Ｃ１８カラムは、Ｗａｔｅｒｓ（Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）から購入した。ガラスバイアルはＷａｔｅｒｓ社から購入し、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（登録商標） ＬｏＢｉｎｄ微量遠心管は、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入した。ヒト肝臓カルボキシルエステラーゼ（ＣＥＳ－１）は、Ａｂｃａｍ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ＵＫ）から購入した。
【0065】
ｍＡｂ－１は、検出可能な濃度のリソソーム酸性リパーゼ（ＬＡＬ）（０．５ｐｐｍ未満）を含む抗体である。ｍＡｂ－２、ｍＡｂ－３、及びｍＡｂ－６も、様々な濃度のＬＡＬ（１ｐｐｍ未満）を含む抗体である。ｍＡｂ－４は、抗体の処理中サンプルであり、ｍＡｂ－５は、同じ抗体を更に精製したものである。ｍＡｂ－７は、２℃～８℃で６か月保存した後に粒子仕様を満たさなかったＩｇＧ４抗体サンプルである。
【0066】
脂肪酸定量のためのＰＳ２０加水分解のインキュベーション条件の最適化
本発明の脂肪酸定量法に使用されるｍＡｂ製剤中のＰＳ２０の加水分解は、６０μＬの２００ｍｇ／ｍＬのｍＡｂ－３（１０ｍＭのヒスチジン、ｐＨ６．３）と、０．６２μＬ、１．２６μＬ、３．２μＬ及び６．８μＬの１０％ＰＳ２０（１．５μＬのＩＳＴＤ混合物（２０％のメタノール中の２００μｇ／ｍＬのラウリン酸－ｄ２３、４０μｇ／ｍＬのミリスチン酸－ｄ２７、及びオレイン酸－１３Ｃ１８）を含む、又は含まない）とを、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆプラスチックチューブ（カテゴリ番号０２２４３１０６４）又はＷａｔｅｒｓ社のガラスバイアル（ＳＫＵ ６０００００６６８ＣＶ）中に混合し、３７℃で１又は３日インキュベートすることによって最適化された。インキュベーションサンプルは、抽出後にＬＣ多重反応モニタリング（ＬＣ－ＭＲＭ）によって分析された（表２）。
本発明の脂肪酸定量法に使用されるｍＡｂ製剤中のＰＳ２０の加水分解は、６０μＬの２００ｍｇ／ｍＬのｍＡｂ－３（１０ｍＭのヒスチジン、ｐＨ６．３）と、０．６２μＬ、１．２６μＬ、３．２μＬ及び６．８μＬの１０％ＰＳ２０（１．５μＬのＩＳＴＤ混合物（２０％のメタノール中の２００μｇ／ｍＬのラウリン酸－ｄ２３、４０μｇ／ｍＬのミリスチン酸－ｄ２７、及びオレイン酸－１３Ｃ１８）を含む、又は含まない）とを、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆプラスチックチューブ（カテゴリ番号０２２４３１０６４）又はＷａｔｅｒｓ社のガラスバイアル（ＳＫＵ ６０００００６６８ＣＶ）中に混合し、３７℃で１又は３日インキュベートすることによって最適化された。インキュベーションサンプルは、抽出後にＬＣ多重反応モニタリング（ＬＣ－ＭＲＭ）によって分析された（表２）。
【0067】
（表２）インキュベーション条件の最適化
【0068】
製剤化ｍＡｂからのＦＦＡの抽出
インキュベーション条件は、抽出後にＬＣ－ＭＲＭを使用して脂肪酸含有量を測定するために最適化された。最適化された沈殿バッファと抽出時間を備えた、Ｈｏｎｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．によって開発された抽出プロトコルを使用して、ｍＡｂ溶液から脂肪酸を抽出した（Ｈｏｎｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．）。ラウリン酸－ｄ２３、ミリスチン酸－ｄ２７、及びオレイン酸－１３Ｃ１８を８０％のＩＰＡ／２０％のメタノールで希釈し、各重同位体標識脂肪酸の最終濃度１μｇ／ｍＬの沈殿バッファを得た。次に、１０μＬの製剤化したｍＡｂを９０μＬの抽出バッファに加えた。サンプルをボルテックスで混合し、室温（２５℃）で２．５時間維持した。ｍＡｂを沈殿させ、２５℃、１４，０００ｒｃｆで３０分遠心分離することによって遠心分離した。続いて、４０μＬの上清を９６ウェルプレートに移し、５μＬをＬＣ－ＭＲＭに供して定量した。ＩＳＴＤとインキュベートしたｍＡｂの場合、表２に示すように、重同位体標識脂肪酸を加えずに８０％のＩＰＡと２０％のＭｅＯＨを混合することで沈殿バッファを調製した。
インキュベーション条件は、抽出後にＬＣ－ＭＲＭを使用して脂肪酸含有量を測定するために最適化された。最適化された沈殿バッファと抽出時間を備えた、Ｈｏｎｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．によって開発された抽出プロトコルを使用して、ｍＡｂ溶液から脂肪酸を抽出した（Ｈｏｎｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．）。ラウリン酸－ｄ２３、ミリスチン酸－ｄ２７、及びオレイン酸－１３Ｃ１８を８０％のＩＰＡ／２０％のメタノールで希釈し、各重同位体標識脂肪酸の最終濃度１μｇ／ｍＬの沈殿バッファを得た。次に、１０μＬの製剤化したｍＡｂを９０μＬの抽出バッファに加えた。サンプルをボルテックスで混合し、室温（２５℃）で２．５時間維持した。ｍＡｂを沈殿させ、２５℃、１４，０００ｒｃｆで３０分遠心分離することによって遠心分離した。続いて、４０μＬの上清を９６ウェルプレートに移し、５μＬをＬＣ－ＭＲＭに供して定量した。ＩＳＴＤとインキュベートしたｍＡｂの場合、表２に示すように、重同位体標識脂肪酸を加えずに８０％のＩＰＡと２０％のＭｅＯＨを混合することで沈殿バッファを調製した。
【0069】
脂肪酸定量用に調製された製剤化抗体中のポリソルベート２０の加水分解
脂肪酸定量によって分析された製剤化ｍＡｂ中のＰＳ２０の加水分解は、Ｗａｔｅｒｓ社のガラスバイアル内で６０μＬの２００ｍｇ／ｍＬのｍＡｂ（１０ｍＭのヒスチジン（ｐＨ６．３）、６．８μＬの１０％のＰＳ２０）と１．５μＬのＩＳＴＤ混合物（２０％のＭｅＯＨ中の２００μｇ／ｍＬのラウリン酸－ｄ２３及び４０μｇ／ｍＬのミリスチン－ｄ２７酸）を、ラウリン酸－ｄ２３ ５μｇ／ｍＬ及びミリスチン酸－ｄ２７１μｇ／ｍＬの最終濃度になるように混合し、３７℃で１又は３日間インキュベートすることによって試験された。図９Ａに示すように、ＬＣ－ＭＲＭ分析の前に、各溶液の１つのアリコート（４μＬ）を水で最終体積８０μＬに希釈した。
脂肪酸定量によって分析された製剤化ｍＡｂ中のＰＳ２０の加水分解は、Ｗａｔｅｒｓ社のガラスバイアル内で６０μＬの２００ｍｇ／ｍＬのｍＡｂ（１０ｍＭのヒスチジン（ｐＨ６．３）、６．８μＬの１０％のＰＳ２０）と１．５μＬのＩＳＴＤ混合物（２０％のＭｅＯＨ中の２００μｇ／ｍＬのラウリン酸－ｄ２３及び４０μｇ／ｍＬのミリスチン－ｄ２７酸）を、ラウリン酸－ｄ２３ ５μｇ／ｍＬ及びミリスチン酸－ｄ２７１μｇ／ｍＬの最終濃度になるように混合し、３７℃で１又は３日間インキュベートすることによって試験された。図９Ａに示すように、ＬＣ－ＭＲＭ分析の前に、各溶液の１つのアリコート（４μＬ）を水で最終体積８０μＬに希釈した。
【0070】
ＦＦＡのＬＣ－ＭＲＭ定量
ＬＣ－ＭＲＭ分析を、Ａｇｉｌｅｎｔ １２９０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ｕｌｔｒａ－ＨＰＬＣ（ＵＨＰＬＣ）（Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ）を備えたＡｇｉｌｅｎｔ ６４９５ ＱＱＱ質量分析計（Ａｇｉｌｅｎｔ、デラウェア州ウィルミントン）で行った。このステップでは、２０ｍＭの酢酸アンモニウム水溶液を移動相Ａとして、メタノールを移動相Ｂとして使用して、２０μＬの希釈サンプルをＡｃｑｕｉｔｙ ＢＥＨ Ｃ４カラム（２．１×５０ｍｍ、１．７ｍｍ）に４０℃で注入した。注入後、カラムを３５％の移動相Ｂで０．５分間平衡化し、４．５分かけて９０％のＢまで直線的に増加させ、１．５分間保持し、その後、３５％の移動相Ｂで２．９分間再平衡化した。溶出は０．４ｍＬ／分で行われ、１～７分のピークは、ガス温度２００℃、ガス流量１２Ｌ／分、ネブライザーガス圧力２０ｐｓｉ、シースガス温度３００℃、シースガス流量１１Ｌ／分、キャピラリー電圧－３０００Ｖ、及びノズル電圧５００Ｖで、ネガティブモードで動作するＥＳＩソースを使用して分析した。ラウリン酸とラウリン酸－ｄ２３は、１９９．１／１９９．１及び２２２．３／２２２．３でモニタリングし、ミリスチン酸とミリスチン酸－ｄ２７は、２２７．２／２２７．２及び２５４．４／２５４．４でモニタリングし、パルミチン酸、オレイン酸、オレイン酸－１３Ｃ１８、ステアリン酸、及びリノール酸は、ＣＥ５でそれぞれ２５５．２／２５５．２、２８１．２／２８１．２、２９９．２／２９９．２、２８３．２／２８３．２、及び２７９．２／２７９．２でモニタリングした。次に、５μｇ／ｍＬのラウリン酸－ｄ２３、１μｇ／ｍＬのミリスチン酸－ｄ２７、及び１μｇ／ｍＬのオレイン酸－１３Ｃ１８と混合した１ｍＬの１０ｍｇ／ｍＬのｍＡｂ－５に、２０μＬの脂肪酸混合物（メタノール中のラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、オレイン酸、ステアリン酸、及びリノール酸の０．５ｍｇ／ｍＬの混合物）を加えて、１０μｇ／ｍＬのスパイク脂肪酸ストック溶液を調製した。脂肪酸ストック溶液と１０ｍｇ／ｍＬのｍＡｂ－５を混合することにより、一連の１：１希釈によって１２個の較正標準物質を調製した（５μｇ／ｍＬのラウリン酸－ｄ２３、１μｇ／ｍＬのミリスチン酸－ｄ２７、及び１μｇ／ｍＬのオレイン酸－１３Ｃ１８を使用）。ピーク積分は、Ｓｋｙｌｉｎｅによって行われ、脂肪酸濃度は、
に対して、スパイク脂肪酸濃度プロットから作成された検量線に基づいて計算された。
ＬＣ－ＭＲＭ分析を、Ａｇｉｌｅｎｔ １２９０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ｕｌｔｒａ－ＨＰＬＣ（ＵＨＰＬＣ）（Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ）を備えたＡｇｉｌｅｎｔ ６４９５ ＱＱＱ質量分析計（Ａｇｉｌｅｎｔ、デラウェア州ウィルミントン）で行った。このステップでは、２０ｍＭの酢酸アンモニウム水溶液を移動相Ａとして、メタノールを移動相Ｂとして使用して、２０μＬの希釈サンプルをＡｃｑｕｉｔｙ ＢＥＨ Ｃ４カラム（２．１×５０ｍｍ、１．７ｍｍ）に４０℃で注入した。注入後、カラムを３５％の移動相Ｂで０．５分間平衡化し、４．５分かけて９０％のＢまで直線的に増加させ、１．５分間保持し、その後、３５％の移動相Ｂで２．９分間再平衡化した。溶出は０．４ｍＬ／分で行われ、１～７分のピークは、ガス温度２００℃、ガス流量１２Ｌ／分、ネブライザーガス圧力２０ｐｓｉ、シースガス温度３００℃、シースガス流量１１Ｌ／分、キャピラリー電圧－３０００Ｖ、及びノズル電圧５００Ｖで、ネガティブモードで動作するＥＳＩソースを使用して分析した。ラウリン酸とラウリン酸－ｄ２３は、１９９．１／１９９．１及び２２２．３／２２２．３でモニタリングし、ミリスチン酸とミリスチン酸－ｄ２７は、２２７．２／２２７．２及び２５４．４／２５４．４でモニタリングし、パルミチン酸、オレイン酸、オレイン酸－１３Ｃ１８、ステアリン酸、及びリノール酸は、ＣＥ５でそれぞれ２５５．２／２５５．２、２８１．２／２８１．２、２９９．２／２９９．２、２８３．２／２８３．２、及び２７９．２／２７９．２でモニタリングした。次に、５μｇ／ｍＬのラウリン酸－ｄ２３、１μｇ／ｍＬのミリスチン酸－ｄ２７、及び１μｇ／ｍＬのオレイン酸－１３Ｃ１８と混合した１ｍＬの１０ｍｇ／ｍＬのｍＡｂ－５に、２０μＬの脂肪酸混合物（メタノール中のラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、オレイン酸、ステアリン酸、及びリノール酸の０．５ｍｇ／ｍＬの混合物）を加えて、１０μｇ／ｍＬのスパイク脂肪酸ストック溶液を調製した。脂肪酸ストック溶液と１０ｍｇ／ｍＬのｍＡｂ－５を混合することにより、一連の１：１希釈によって１２個の較正標準物質を調製した（５μｇ／ｍＬのラウリン酸－ｄ２３、１μｇ／ｍＬのミリスチン酸－ｄ２７、及び１μｇ／ｍＬのオレイン酸－１３Ｃ１８を使用）。ピーク積分は、Ｓｋｙｌｉｎｅによって行われ、脂肪酸濃度は、
【0071】
２Ｄ－ＣＡＤ測定用に調製された製剤化抗体における、ＰＳ２０の加水分解
製剤化ｍＡｂ中のＰＳ２０の加水分解は、２７μＬの２００ｍｇ／ｍＬのｍＡｂ（１０ｍＭのヒスチジン（ｐＨ６．３）、３μＬの０．５％のＰＳ２０）を混合し、その後、３７℃で１２又は２８日インキュベートすることにより、二次元液体クロマトグラフィ－荷電エアロゾル検出（２Ｄ－ＬＣ－ＣＡＤ）によって分析された。ＬＣ－ＣＡＤ分析の前に、各溶液の１つのアリコート（６μＬ）を、６９μＬの１０ｍＭのヒスチジン（ｐＨ６．０）を加えることで希釈した。
製剤化ｍＡｂ中のＰＳ２０の加水分解は、２７μＬの２００ｍｇ／ｍＬのｍＡｂ（１０ｍＭのヒスチジン（ｐＨ６．３）、３μＬの０．５％のＰＳ２０）を混合し、その後、３７℃で１２又は２８日インキュベートすることにより、二次元液体クロマトグラフィ－荷電エアロゾル検出（２Ｄ－ＬＣ－ＣＡＤ）によって分析された。ＬＣ－ＣＡＤ分析の前に、各溶液の１つのアリコート（６μＬ）を、６９μＬの１０ｍＭのヒスチジン（ｐＨ６．０）を加えることで希釈した。
【0072】
ＰＳ分解を分析する２Ｄ－ＬＣ－ＣＡＤ
図２Ａに示すように、ＣＨＯ無細胞培地又は製剤化抗体におけるＰＳ２０の分解を、２Ｄ－ＨＰＬＣ－ＣＡＤシステムによって分析した。設定の詳細は、Ｂｏｒｉｓｏｖ ｅｔ ａｌ．によって以前に説明される。ＰＳは、Ｏａｓｉｓ ＭＡＸカラム（２．１×２０ｍｍ、３０ｍｍ）によって、製剤化されたｍＡｂから分離され、初期勾配は、９９％の溶媒Ａ（０．１％のギ酸水溶液）と１％の溶媒Ｂ（０．１％のギ酸アセトニトリル溶液）で１分間保持された。次に、勾配を１．５分かけて２０％の溶媒Ｂまで増加させ、更に１．５分かけて１％まで減少させた。溶媒Ｂの増加及び減少の勾配サイクルを１０分にわたって３回繰り返して、ＰＳからのｍＡｂの完全な除去を確保した。切り替え弁を介して、Ａｃｑｕｉｔｙ ＢＥＨ Ｃ４カラム（２．１×５０ｍｍ、１．７ｍｍ）を使用してＰＳを逆相クロマトグラフィによって分離に供した。分離中、１０分間の勾配サイクルの終了時に、溶媒Ｂを１．５分かけて１％から２０％に増加させ、次に、溶媒Ｂを４５分で９９％まで徐々に増加させ、５分間保持し、続いて１％のＢで５分間平衡化ステップを行った。流量は、０．１ｍＬ／分、カラム温度は、４０℃に維持した。
図２Ａに示すように、ＣＨＯ無細胞培地又は製剤化抗体におけるＰＳ２０の分解を、２Ｄ－ＨＰＬＣ－ＣＡＤシステムによって分析した。設定の詳細は、Ｂｏｒｉｓｏｖ ｅｔ ａｌ．によって以前に説明される。ＰＳは、Ｏａｓｉｓ ＭＡＸカラム（２．１×２０ｍｍ、３０ｍｍ）によって、製剤化されたｍＡｂから分離され、初期勾配は、９９％の溶媒Ａ（０．１％のギ酸水溶液）と１％の溶媒Ｂ（０．１％のギ酸アセトニトリル溶液）で１分間保持された。次に、勾配を１．５分かけて２０％の溶媒Ｂまで増加させ、更に１．５分かけて１％まで減少させた。溶媒Ｂの増加及び減少の勾配サイクルを１０分にわたって３回繰り返して、ＰＳからのｍＡｂの完全な除去を確保した。切り替え弁を介して、Ａｃｑｕｉｔｙ ＢＥＨ Ｃ４カラム（２．１×５０ｍｍ、１．７ｍｍ）を使用してＰＳを逆相クロマトグラフィによって分離に供した。分離中、１０分間の勾配サイクルの終了時に、溶媒Ｂを１．５分かけて１％から２０％に増加させ、次に、溶媒Ｂを４５分で９９％まで徐々に増加させ、５分間保持し、続いて１％のＢで５分間平衡化ステップを行った。流量は、０．１ｍＬ／分、カラム温度は、４０℃に維持した。
【0073】
２Ｄ－ＬＣシステムは、定量のために７５ｐｓｉの窒素圧下で動作するＣｏｒｏｎａ Ｕｌｔｒａ ＣＡＤ検出器と組み合わせたＴｈｅｒｍｏ ＵｌｔｉＭａｔｅ ３０００で設定された。システム制御とデータ分析には、Ｃｈｒｏｍｅｌｅｏｎ１０ソフトウェアを使用した。図２Ｂ及び２Ｃに示すように、各エステルのピーク面積を分離してＣＡＤクロマトグラムから統合し、その面積を合計して、ＰＳ２０中の損なわれていないエステル総量を計算した。この研究で使用したＰＳ２０の残りの百分率は、図２Ｄに示すように、各時点でのＰＯＥエステルのピーク面積の合計を時間０でのピーク面積の合計と比較することによって計算した。
【0074】
実施例１ インキュベーションのために加えられる百分率の最適化
最高のＰＳ分解速度を達成するために、様々なパラメータを変更することでインキュベーション条件を最適化した。ＰＳ２０の％の影響は、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ＬｏＢｉｎｄ微量遠心管内の２００ｍｇ／ｍＬのｍＡｂ－３溶液に様々な百分率のＰＳ（０．１％、０．２％、０．５％、及び１％）を加え、３７℃で１、４、又は６日間インキュベートすることによって決定された。ＭＳシグナルの潜在的なイオン抑制とｍＡｂの更なる希釈を避けるために、ＰＳ２０の％は１％以下に維持された。各時点からのサンプルを抽出し、ＬＣ－ＭＲＭ－ＭＳに供して、放出されたＦＦＡを定量した。図３Ａに示すように、ラウリン酸の濃度は、０．１％、０．２％、０．５％のＰＳ２０と比較して、１％のＰＳ２０でのインキュベーション下ではるかに速く増加した。同様に、図４に示すように、ミリスチン酸濃度も１％のＰＳ２０で最も急速な増加を示した。興味深いことに、４日間のインキュベーション後のラウリン酸の濃度が５μｇ／ｍＬ未満であり、製剤中ラウリン酸の溶解度（２０μｇ／ｍＬ超）よりもはるかに低いという事実にもかかわらず、放出されたＦＦＡの増加は４日間のインキュベーション後に停止又は減速した。この発見は、ＰＳ２０の連続的な加水分解にもかかわらず、放出された脂肪酸がインキュベーション中に失われたことを示唆している。
最高のＰＳ分解速度を達成するために、様々なパラメータを変更することでインキュベーション条件を最適化した。ＰＳ２０の％の影響は、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ＬｏＢｉｎｄ微量遠心管内の２００ｍｇ／ｍＬのｍＡｂ－３溶液に様々な百分率のＰＳ（０．１％、０．２％、０．５％、及び１％）を加え、３７℃で１、４、又は６日間インキュベートすることによって決定された。ＭＳシグナルの潜在的なイオン抑制とｍＡｂの更なる希釈を避けるために、ＰＳ２０の％は１％以下に維持された。各時点からのサンプルを抽出し、ＬＣ－ＭＲＭ－ＭＳに供して、放出されたＦＦＡを定量した。図３Ａに示すように、ラウリン酸の濃度は、０．１％、０．２％、０．５％のＰＳ２０と比較して、１％のＰＳ２０でのインキュベーション下ではるかに速く増加した。同様に、図４に示すように、ミリスチン酸濃度も１％のＰＳ２０で最も急速な増加を示した。興味深いことに、４日間のインキュベーション後のラウリン酸の濃度が５μｇ／ｍＬ未満であり、製剤中ラウリン酸の溶解度（２０μｇ／ｍＬ超）よりもはるかに低いという事実にもかかわらず、放出されたＦＦＡの増加は４日間のインキュベーション後に停止又は減速した。この発見は、ＰＳ２０の連続的な加水分解にもかかわらず、放出された脂肪酸がインキュベーション中に失われたことを示唆している。
【0075】
インキュベーション中に脂肪酸が失われる理由を調査するために、同位体標識脂肪酸が使用された。様々な百分率のＰＳ２０（０．１％、０．２％、０．５％、及び１％）を、５μｇ／ｍＬのラウリン酸－ｄ２３、１μｇ／ｍＬのミリスチン酸－ｄ２７、及び１μｇ／ｍＬのオレイン酸－１３Ｃ１８を含む２００ｍｇ／ｍＬのｍＡｂ３とインキュベートし、続いて脂肪酸の抽出と定量を行った。３つの重同位体標識脂肪酸の全てで継続的な損失が観察された。図３Ｂに示すように、１％のＰＳ２０の添加は、６日目に０．１％のＰＳ２０よりもラウリン酸の損失を防ぐのに５倍効果的であり、これが、１％のＰＳ２０でのインキュベーション下で６日目にラウリン酸濃度が増加し続けた理由を説明している。ラウリン酸濃度は、０．５％、０．２％、又は０．１％のＰＳ２０とインキュベートした場合、６日目に増加が停止するか、更には減速した。図５Ａ及び５Ｂに示すように、重同位体標識ミリスチン酸及びオレイン酸についても同じ損失傾向が観察された。脂肪酸の炭素鎖長が増加するにつれて、脂肪酸の損失は遅くなる。１％のＰＳ２０との６日間のインキュベーション後に失われたオレイン酸は１５％のみであるが、ラウリン酸では５０％、ミリスチン酸では３４％である。
【0076】
実施例２ インキュベーション容器の最適化
ＰＳ２０の百分率が高いほど脂肪酸の損失を遅らせることができるという発見は、脂肪酸の損失がインキュベーション容器への吸着によって生じる可能性があることを示唆している。Ｙａｏ ｅｔ．ａｌによる最近の研究では、プラスチックがメタボロミクス試験におけるパルミチン酸塩の定量の不正確さを引き起こすことを示した（Ｙａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃｓ １２（２０１６））。脂肪酸の定量に対する容器の影響を評価するために、５μｇ／ｍＬのラウリン酸－ｄ２３、１μｇ／ｍＬのミリスチン酸－ｄ２７、及び１μｇ／ｍＬのオレイン酸－１３Ｃ１８を含む２００ｍｇ／ｍＬのｍＡｂ－３を、１％のＰＳ２０とともにＥｐｐｅｎｄｏｒｆ ＬｏＢｉｎｄプラスチックチューブ及びＷａｔｅｒｓ社のガラスバイアル（ＳＫＵ．１８６０００３２７Ｃ）中、３７℃で１、３、又は５日インキュベートした。含有脂肪酸を抽出し、ラウリン酸については図６Ａに、ミリスチン酸については図６Ｂに定量結果を示す。Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ＬｏＢｉｎｄプラスチックチューブをＷａｔｅｒｓ社のガラスバイアルに置き換えると、重同位体標識脂肪酸の損失が大幅に低下した。従って、本発明の脂肪酸定量法におけるインキュベーションにはガラスバイアルが好ましい。図７Ａ及び７Ｂに示すように、濃度は大幅に低下するものの、ガラスバイアル中では脂肪酸の損失が依然として発生することに留意すべきである。容器の吸着効果を完全に排除するには、更に最適化する必要がある。
ＰＳ２０の百分率が高いほど脂肪酸の損失を遅らせることができるという発見は、脂肪酸の損失がインキュベーション容器への吸着によって生じる可能性があることを示唆している。Ｙａｏ ｅｔ．ａｌによる最近の研究では、プラスチックがメタボロミクス試験におけるパルミチン酸塩の定量の不正確さを引き起こすことを示した（Ｙａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃｓ １２（２０１６））。脂肪酸の定量に対する容器の影響を評価するために、５μｇ／ｍＬのラウリン酸－ｄ２３、１μｇ／ｍＬのミリスチン酸－ｄ２７、及び１μｇ／ｍＬのオレイン酸－１３Ｃ１８を含む２００ｍｇ／ｍＬのｍＡｂ－３を、１％のＰＳ２０とともにＥｐｐｅｎｄｏｒｆ ＬｏＢｉｎｄプラスチックチューブ及びＷａｔｅｒｓ社のガラスバイアル（ＳＫＵ．１８６０００３２７Ｃ）中、３７℃で１、３、又は５日インキュベートした。含有脂肪酸を抽出し、ラウリン酸については図６Ａに、ミリスチン酸については図６Ｂに定量結果を示す。Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ＬｏＢｉｎｄプラスチックチューブをＷａｔｅｒｓ社のガラスバイアルに置き換えると、重同位体標識脂肪酸の損失が大幅に低下した。従って、本発明の脂肪酸定量法におけるインキュベーションにはガラスバイアルが好ましい。図７Ａ及び７Ｂに示すように、濃度は大幅に低下するものの、ガラスバイアル中では脂肪酸の損失が依然として発生することに留意すべきである。容器の吸着効果を完全に排除するには、更に最適化する必要がある。
【0077】
実施例３ ＩＳＴＤとのインキュベーション：重同位体標識脂肪酸
典型的には、ＩＳＴＤは、インキュベーション後、標的の脂肪酸を正確に計算できるようにＬＣ－ＭＲＭ－ＭＳ分析前に追加される。インキュベーション中に吸着損失が発生するという上記発見から、重脂肪酸と軽脂肪酸はインキュベーション中に同じ速度で減少するため、脂肪酸の吸着損失の影響を考慮して、代わりに重同位体標識脂肪酸をインキュベーション前に加えた。５μｇ／ｍＬのラウリン酸－ｄ２３、１μｇ／ｍＬのミリスチン酸－ｄ２７、及び１μｇ／ｍＬのオレイン酸－１３Ｃ１８を含むｍＡｂ３（２００ｍｇ／ｍＬ）を、１％のＰＳ２０とともにＥｐｐｅｎｄｏｒｆ ＬｏＢｉｎｄプラスチックチューブ及びＷａｔｅｒｓ社のガラスバイアル中、３７℃で１、３、又は５日インキュベートした。ＩＳＴＤによる補正を行わずにピークＦＦＡ面積から計算した定量結果を、図８Ａ及び８Ｂに示す。測定されたＦＦＡは、ガラスバイアルとプラスチックバイアルで異なる値を示し、ガラスバイアルの方が顕著に高い値を示した。ＩＳＴＤによる補正後、ラウリン酸及びミリスチン酸の濃度は両方の容器で同じであると測定され、図８Ｃ及び８Ｄに示すように、インキュベーションステップの前にＩＳＴＤを加える新規なアプローチが容器の影響をうまく排除したことを示した。更に、ラウリン酸及びミリスチン酸の濃度は両方とも、ＩＳＴＤ補正後の方が補正なしの場合よりも高く、本発明の方法を使用したより正確な定量が示唆された。
典型的には、ＩＳＴＤは、インキュベーション後、標的の脂肪酸を正確に計算できるようにＬＣ－ＭＲＭ－ＭＳ分析前に追加される。インキュベーション中に吸着損失が発生するという上記発見から、重脂肪酸と軽脂肪酸はインキュベーション中に同じ速度で減少するため、脂肪酸の吸着損失の影響を考慮して、代わりに重同位体標識脂肪酸をインキュベーション前に加えた。５μｇ／ｍＬのラウリン酸－ｄ２３、１μｇ／ｍＬのミリスチン酸－ｄ２７、及び１μｇ／ｍＬのオレイン酸－１３Ｃ１８を含むｍＡｂ３（２００ｍｇ／ｍＬ）を、１％のＰＳ２０とともにＥｐｐｅｎｄｏｒｆ ＬｏＢｉｎｄプラスチックチューブ及びＷａｔｅｒｓ社のガラスバイアル中、３７℃で１、３、又は５日インキュベートした。ＩＳＴＤによる補正を行わずにピークＦＦＡ面積から計算した定量結果を、図８Ａ及び８Ｂに示す。測定されたＦＦＡは、ガラスバイアルとプラスチックバイアルで異なる値を示し、ガラスバイアルの方が顕著に高い値を示した。ＩＳＴＤによる補正後、ラウリン酸及びミリスチン酸の濃度は両方の容器で同じであると測定され、図８Ｃ及び８Ｄに示すように、インキュベーションステップの前にＩＳＴＤを加える新規なアプローチが容器の影響をうまく排除したことを示した。更に、ラウリン酸及びミリスチン酸の濃度は両方とも、ＩＳＴＤ補正後の方が補正なしの場合よりも高く、本発明の方法を使用したより正確な定量が示唆された。
【0078】
実施例４ ＬＣ－ＭＲＭ－ＭＳを使用した、医薬製剤中の脂肪酸の抽出を必要としない定量
医薬製剤中の個々のＦＦＡを定量するためのこれまでの全ての方法には抽出が含まれており、それは、このステップによってＬＣ－ＭＲＭ－ＭＳ分析前のサンプル組成が大幅に簡素化されるためである。しかし、いかなるサンプル処理ステップの追加も、定量にばらつきを生じさせ、時間と労力が増加する可能性があるため、ハイスループット分析の目標が損なわれる。抽出ステップを回避できれば、ＦＦＡ定量の効率を大幅に向上させることができる。ＰＳ分解の脂肪酸定量では、サンプル組成は非常にシンプルで、主要成分はＰＳ、ＦＦＡ、及び組換えタンパク質（ｍＡｂなど）の３つだけである。３つの成分をクロマトグラフィで分離できる場合は、直接注入が可能である。ｍＡｂからＦＦＡを確実に分離し、ｍＡｂによるカラムの閉塞を回避するために、Ｃ４カラムを選択した。原理の証明として、ＦＦＡ標準物質を１０ｍｇ／ｍＬのｍＡｂ－５（抽出を行わないＦＦＡ定量の最終ｍＡｂ濃度に等しい［２００ｍｇ／ｍＬのｍＡｂの２０倍希釈］）にスパイクし、脂肪酸検出のためにサンプルをＬＣ－ＭＳに直接注入した。図９Ｂに示すように、本方法により、通常、ＰＳ２０分解後に形成される複数のＦＦＡ（ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸）の混合物のベースライン分離が可能になる。ＰＳ８０分解後に形成される分解物であるパルミチン酸、リノール酸、及びオレイン酸は、ＴＩＣでは部分的に重なったが、別のｍ／ｚチャネルでは十分に分離できる。図９Ｃは、１９ｎｇ／ｍＬ～１０μｇ／ｍＬの濃度範囲にわたって、ｍＡｂ－５にスパイクされた主要なＰＳ２０及びＰＳ８０のＦＦＡ分解物（ラウリン酸、ミリスチン酸、オレイン酸）について、線形回帰Ｒ２＞０．９９９で、高い特異性及び直線性が達成され得ることを実証する。ラウリン酸、ミリスチン酸、オレイン酸の検出限界は、それぞれ２２、６８０、２１１ｎｇｌ／ｍＬと測定された。ラウリン酸とオレイン酸の検出限界は低いため、ＰＳ２０とＰＳ８０の微妙な変化をモニタリングできる。０．０２％のＰＳ２０が分解されると、１７．８１μｇ／ｍＬのラウリン酸の増加が観察され、これは、本方法がＰＳ２０の変化を０．００００２４％という低い値でモニタリングできることを意味する。ＰＳ８０では、０．０２５％のＰＳ８０の分解による、３３．２５μｇ／ｍＬのオレイン酸の増加が観察され、これは、０．０００１６％のＰＳ８０の減少が検出できることを示す。
医薬製剤中の個々のＦＦＡを定量するためのこれまでの全ての方法には抽出が含まれており、それは、このステップによってＬＣ－ＭＲＭ－ＭＳ分析前のサンプル組成が大幅に簡素化されるためである。しかし、いかなるサンプル処理ステップの追加も、定量にばらつきを生じさせ、時間と労力が増加する可能性があるため、ハイスループット分析の目標が損なわれる。抽出ステップを回避できれば、ＦＦＡ定量の効率を大幅に向上させることができる。ＰＳ分解の脂肪酸定量では、サンプル組成は非常にシンプルで、主要成分はＰＳ、ＦＦＡ、及び組換えタンパク質（ｍＡｂなど）の３つだけである。３つの成分をクロマトグラフィで分離できる場合は、直接注入が可能である。ｍＡｂからＦＦＡを確実に分離し、ｍＡｂによるカラムの閉塞を回避するために、Ｃ４カラムを選択した。原理の証明として、ＦＦＡ標準物質を１０ｍｇ／ｍＬのｍＡｂ－５（抽出を行わないＦＦＡ定量の最終ｍＡｂ濃度に等しい［２００ｍｇ／ｍＬのｍＡｂの２０倍希釈］）にスパイクし、脂肪酸検出のためにサンプルをＬＣ－ＭＳに直接注入した。図９Ｂに示すように、本方法により、通常、ＰＳ２０分解後に形成される複数のＦＦＡ（ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸）の混合物のベースライン分離が可能になる。ＰＳ８０分解後に形成される分解物であるパルミチン酸、リノール酸、及びオレイン酸は、ＴＩＣでは部分的に重なったが、別のｍ／ｚチャネルでは十分に分離できる。図９Ｃは、１９ｎｇ／ｍＬ～１０μｇ／ｍＬの濃度範囲にわたって、ｍＡｂ－５にスパイクされた主要なＰＳ２０及びＰＳ８０のＦＦＡ分解物（ラウリン酸、ミリスチン酸、オレイン酸）について、線形回帰Ｒ２＞０．９９９で、高い特異性及び直線性が達成され得ることを実証する。ラウリン酸、ミリスチン酸、オレイン酸の検出限界は、それぞれ２２、６８０、２１１ｎｇｌ／ｍＬと測定された。ラウリン酸とオレイン酸の検出限界は低いため、ＰＳ２０とＰＳ８０の微妙な変化をモニタリングできる。０．０２％のＰＳ２０が分解されると、１７．８１μｇ／ｍＬのラウリン酸の増加が観察され、これは、本方法がＰＳ２０の変化を０．００００２４％という低い値でモニタリングできることを意味する。ＰＳ８０では、０．０２５％のＰＳ８０の分解による、３３．２５μｇ／ｍＬのオレイン酸の増加が観察され、これは、０．０００１６％のＰＳ８０の減少が検出できることを示す。
【0079】
最小限のサンプル前処理でＦＦＡの定量を可能にする鍵となる脂肪酸定量に対するｍＡｂマトリックスの影響を評価するために、３つの代表的な脂肪酸標準物質（ラウリン酸、ミリスチン酸、オレイン酸）を１０ｍｇ／ｍＬのｍＡｂ－５及び８０％のＩＰＡ／２０％のメタノールにスパイクした。水溶液では、有機溶液と比較して、逆相クロマトグラフィでより多くの注入量（２０μＬ）が可能になる。図１０に示すように、ＩＰＡ／ＭｅＯＨ中のＦＦＡを５μＬ超で注入すると、ピークの分割が発生した。従って、ピークＦＦＡ面積を比較するために、１０ｍｇ／ｍＬのｍＡｂ－５中の２０μＬの脂肪酸と８０％のＩＰＡ／２０％のメタノール中の５μＬの脂肪酸を逆相ＬＣに注入した。図９Ｄに示すように、このアプローチの感度は、ｍＡｂマトリックスによって損なわれることはなかった。ラウリン酸とオレイン酸の回収率は、ＩＰＡ／ＭｅＯＨ溶液よりもｍＡｂマトリックスの方が高かったのに対し、ミリスチン酸の回収率は、ｍＡｂマトリックスとＩＰＡ／ＭｅＯＨ溶液で同等であった。
【0080】
図９Ｅに示すように、抽出あり又はなしのアプローチを用いたＦＦＡ定量の精度を、０．５ｐｐｍ未満の濃度の活性リパーゼ（ＬＡＬ）を含む２つのｍＡｂについて評価した。ｍＡｂ－１は、リパーゼ活性レベルが低い抗体である。２℃～８℃で１８か月間インキュベートした後、この製剤化抗体では０．０２％のＰＳ２０分解が観察された。ｍＡｂ－６は、ｍＡｂ－１と同等のＬＡＬ濃度を持つ抗体である。両方のｍＡｂを１％のＰＳ２０とともに３日インキュベートした後、ＬＣ－ＭＲＭ－ＭＳ分析に供した。抽出を必要としない方法によるＦＦＡ定量の精度は、抽出ベースの方法と比較した場合、ｍＡｂマトリックスの影響を受けず、どちらの方法でも同等の結果を示した。ＲＳＤ％はどちらの方法でも１５％未満であった。この結果は、本発明の方法が、抽出ステップの追加の複雑さを伴うことなく、従来の方法と同じ精度でＦＦＡ放出を測定できることを実証する。図９Ｅはまた、陰性対照（ｍＡｂ又はリパーゼを含まないＰＳ２０のみ）についてのＦＦＡの定量を示し、リパーゼ活性を有するｍＡｂを含むサンプル中で測定された脂肪酸の量と陰性対照との間の差が、測定における変動よりもはるかに大きいことを明確に示す。
【0081】
実施例５ 脂肪酸生成とＰＳ分解の相関関係の検証
ＦＦＡ形成がＰＳ分解と正の関係があることはよく理解されているが、脂肪酸定量を使用したＰＳ分解の間接測定とＰＳ分解の直接測定との間の直接比較は不足している。ここでは、安定性試験を受けた抗体（ｍＡｂ－１）のインキュベーション後に、放出されたＦＦＡ濃度の増加とＰＳ２０の百分率の減少とが比較された。ｍＡｂ－１を、２℃～８℃で６、１２、及び最大１８か月間インキュベートした。ＦＦＡ含有量及びＰＳ２０含有量の両方を各時点で測定したが、これら２つの数値は、図１１Ａに示すように、相関係数が０．９９を超えて、高度に相関した。ラウリン酸の測定は線Ｃ１２に示され、ミリスチン酸の測定は線Ｃ１４に示される。更に、５℃で３６か月にわたってｍＡｂ－１におけるＰＳ８０分解を調査した場合、図１１Ｂに示すように、放出されたオレイン酸は、ＬＣ－ＣＡＤを使用して測定されたＰＳ８０種と相関し、放出されたオレイン酸とＰＳ８０分解とは、最初の約１５か月間は直線的に増加し、その後両方の速度が減少した。同様に、ｍＡｂ－２のＰＳ２０分解を５℃で３６か月間調査した場合、図１１Ｃに示すように、放出されたラウリン酸は、ＬＣ－ＣＡＤを使用して測定されたＰＳ２０種と相関し、放出されたラウリン酸とＰＳ２０分解とは、最初の約１２か月間は直線的に増加し、その後両方の速度が減少した。まとめると、これらの発見は、ＰＳ分解の測定として脂肪酸定量を使用することの有効性を実証する。
ＦＦＡ形成がＰＳ分解と正の関係があることはよく理解されているが、脂肪酸定量を使用したＰＳ分解の間接測定とＰＳ分解の直接測定との間の直接比較は不足している。ここでは、安定性試験を受けた抗体（ｍＡｂ－１）のインキュベーション後に、放出されたＦＦＡ濃度の増加とＰＳ２０の百分率の減少とが比較された。ｍＡｂ－１を、２℃～８℃で６、１２、及び最大１８か月間インキュベートした。ＦＦＡ含有量及びＰＳ２０含有量の両方を各時点で測定したが、これら２つの数値は、図１１Ａに示すように、相関係数が０．９９を超えて、高度に相関した。ラウリン酸の測定は線Ｃ１２に示され、ミリスチン酸の測定は線Ｃ１４に示される。更に、５℃で３６か月にわたってｍＡｂ－１におけるＰＳ８０分解を調査した場合、図１１Ｂに示すように、放出されたオレイン酸は、ＬＣ－ＣＡＤを使用して測定されたＰＳ８０種と相関し、放出されたオレイン酸とＰＳ８０分解とは、最初の約１５か月間は直線的に増加し、その後両方の速度が減少した。同様に、ｍＡｂ－２のＰＳ２０分解を５℃で３６か月間調査した場合、図１１Ｃに示すように、放出されたラウリン酸は、ＬＣ－ＣＡＤを使用して測定されたＰＳ２０種と相関し、放出されたラウリン酸とＰＳ２０分解とは、最初の約１２か月間は直線的に増加し、その後両方の速度が減少した。まとめると、これらの発見は、ＰＳ分解の測定として脂肪酸定量を使用することの有効性を実証する。
【0082】
放出された遊離脂肪酸濃度は、典型的な保存温度での長期的なＰＳ分解を予測する形で、より暖かい温度で保存するとはるかに急速に上昇した。オレイン酸については図１２Ａに、ラウリン酸については図１２Ｂに示すように、例えば、わずか数日後、３７℃で保存されたＰＳの放出された遊離脂肪酸濃度は、４℃～８℃で数か月又は数年間保存されたＰＳの放出された遊離脂肪酸濃度と相関する。
【0083】
ｍＡｂ－１及びｍＡｂ－２の安定性データに基づいて、加速保存条件からの測定値を使用して、数か月間にわたる典型的な保存条件における薬物製品からのＦＦＡ放出を予測するためのモデルが作成された。オレイン酸の放出に関して、３７℃での保存日ごとに５℃で保存した場合の同等の月数は、式１（５℃での月数＝１．１３＊３７℃での日数－０．３６）で表すことができる。ラウリン酸の場合、同じ関係が式２（５℃での月数＝２．５１＊３７℃での日数－０．０２）によって表すことができる。
【0084】
オレイン酸については表３に、ラウリン酸については表４に示すように、本発明のＬＣ－ＭＲＭ法によって測定された各保存条件下での放出されたＦＦＡの量を、上記モデルを使用した放出ＦＦＡの予測量と比較した。放出されたオレイン酸の量を予測するために、式１を、３７℃で数日インキュベートした後の測定されたオレイン酸濃度に適用して、式３（オレイン酸濃度（μｇ／ｍＬ）＝３．８４＊５℃での月数＋１．７６）を導き出した。放出されたラウリン酸の量を予測するために、式２を、３７℃で数日インキュベートした後の測定されたラウリン酸濃度に適用して、式４（ラウリン酸濃度（μｇ／ｍＬ）＝０．１１＊５℃での月数－０．０４）を導き出した。
【0085】
結果として、これらのデータは、本発明の方法を使用して３７℃で保存した場合の数日間にわたるＦＦＡ放出の測定を、本モデルとともに使用して、通常の保存温度４℃～８℃で数か月間にわたるＦＦＡ放出、ひいてはＰＳ２０又はＰＳ８０分解とリパーゼ活性を予測できることを実証する。
【0086】
（表３）ＬＣ－ＭＲＭによって測定された、５℃でのｍＡｂ－３におけるＰＳ８０分解によって放出されたオレイン酸（月）と、ｍＡｂ－１に基づいて確立された式１による推定値との比較
【0087】
（表４）ＬＣ－ＭＲＭによって測定された、５℃でのｍＡｂ－４におけるＰＳ２０分解によって放出されたラウリン酸放出率（月）と、ｍＡｂ－２に基づいて確立された式２による推定値との比較
【0088】
実施例６ 直接的なＰＳ分解測定と間接的なＦＦＡ定量測定との比較の事例研究
５つのｍＡｂ及び陰性対照におけるＰＳ２０分解を、抽出ベースの方法と抽出を使用しない方法の両方で分析し、ＰＳ２０分解を確実に定量するのに必要な時間を比較した。図１３に示すように、５つのｍＡｂは全て、低濃度の活性リパーゼを含んだ。ｍＡｂ－１のＬＡＬ濃度は、０．５ｐｐｍ未満である。ｍＡｂ－２とｍＡｂ－３には同じリパーゼがわずかに異なる濃度で含まれるが、それでも１ｐｐｍ未満である。ｍＡｂ－４は低濃度のリパーゼを含む抗体の製造途中のサンプルで、ｍＡｂ－５は最終濃縮ｍＡｂ製品（ＦＣＰ）である。このサンプルでは、図１４Ａ及び図１４Ｂに見られるように、２℃～８℃で１８か月間保存した後、微粒子の顕著な増加及びＰＳ２０回収率の継続的な減少が観察された。
５つのｍＡｂ及び陰性対照におけるＰＳ２０分解を、抽出ベースの方法と抽出を使用しない方法の両方で分析し、ＰＳ２０分解を確実に定量するのに必要な時間を比較した。図１３に示すように、５つのｍＡｂは全て、低濃度の活性リパーゼを含んだ。ｍＡｂ－１のＬＡＬ濃度は、０．５ｐｐｍ未満である。ｍＡｂ－２とｍＡｂ－３には同じリパーゼがわずかに異なる濃度で含まれるが、それでも１ｐｐｍ未満である。ｍＡｂ－４は低濃度のリパーゼを含む抗体の製造途中のサンプルで、ｍＡｂ－５は最終濃縮ｍＡｂ製品（ＦＣＰ）である。このサンプルでは、図１４Ａ及び図１４Ｂに見られるように、２℃～８℃で１８か月間保存した後、微粒子の顕著な増加及びＰＳ２０回収率の継続的な減少が観察された。
【0089】
放出されたＦＦＡが薬物製品中での溶解度を超えることにより、粒子数が増加し、製品の保存期間が制限される。図１４Ｂに示すように、ｍＡｂ－２薬物製品で測定した２μｍ粒子／ｍＬは、４℃～８℃で３６か月間の保存中に増加した。逆に、図１４Ｃに示すように、遊離脂肪酸濃度は、薬物製品中での溶解度を超えた後、増加が停止した。ｍＡｂ－２薬物製品中のラウリン酸及びミリスチン酸濃度は、ＰＳ２０分解により、４℃～８℃で３６か月間の保存中に増加した。しかし、ミリスチン酸濃度は１８か月後に増加が停止したが、２μｍ粒子は１８か月で大幅に増加し、これは、ｍＡｂ－２の保存期間がＰＳ２０分解によって放出されたミリスチン酸によって制限されることを示唆していまる。従って、薬物製品中の脂肪酸濃度を測定することにより、ＦＦＡ（ラウリン酸、ミリスチン酸）の溶解度を決定できるため、これを、上記予測モデルに基づいて薬物製品の保存期間を計算するために使用できる。
【0090】
このような低いリパーゼ活性を有するｍＡｂであっても、図１３Ｂに示すように、ＬＣ－ＭＲＭ－ＭＳによるＦＦＡ定量を使用することにより、陽性のＰＳ２０分解を１日以内に確実に定量することができる。より高いリパーゼ活性を持つｍＡｂ（例えば、２℃～８℃で６か月保存した後に粒子仕様を満たさなかったｍＡｂ－７）の場合、図１５に示すように、リパーゼ活性はインキュベーションの２時間以内に検出できる。対照的に、図１３Ａに示すように、２Ｄ－ＬＣ－ＣＡＤによる直接ＰＳ定量法は、ＣＡＤの１１％の方法変動を超えるために少なくとも４～１９日を必要とする。
【0091】
同様の戦略を、ｍＡｂ製剤中の低レベルのＰＳ８０分解の測定にも適用できる。インキュベーション中に放出されたオレイン酸の増加を定量することによって、たとえこの濃度の変化がＣＡＤを使用するＰＳ８０含有量の直接測定によって捕捉できないとしても、本発明の方法を使用して微量レベルのＰＳ８０分解を検出することができる。例えば、肝臓のカルボキシルエステラーゼ（５０ｎｇ／ｍＬ）を、０．２％のＰＳ８０を含む２００ｍｇ／ｍＬのｍＡｂ－５にスパイクし、３７℃で最大９日間インキュベートした。ＣＡＤとの９日間のインキュベーション後にＰＳ８０濃度の低下は観察されなかったが（図１６Ａ）、一方、本発明の無抽出法を使用すると、わずか３日間のインキュベーションでもｍＡｂ（０．２７９μｇ／ｍＬはＰＳ８０の０．０００２％減少に相当）中のオレイン酸濃度の増加が明らかに検出された（図１６Ｂ）。
【0092】
ポリソルベートは残留リパーゼによって加水分解を受ける可能性があり、薬物製品中に望ましくない粒子が形成されたり、極端な場合には分解して製剤が不安定になったりすることがある。ほとんどの場合、最終薬物製品中のリパーゼ活性は非常に低いため、従来の方法を使用した安定性試験でＰＳ分解が観察されるまでに数か月、更には数年かかる場合がある。従って、ＰＳ分解を測定するための、迅速かつ高感度かつ正確な方法が緊急に必要とされている。本開示は、脂肪酸抽出ステップを行わずにＦＦＡを正確に定量するために最適化されたインキュベーション条件で開発された迅速なリパーゼ活性アッセイについて説明する。ラウリン酸（２２ｎｇ／ｍＬ）及びオレイン酸（２１１ｎｇ／ｍＬ）の検出限界は低いため、ラウリン酸又はオレイン酸の増加レベルをモニタリングすることで、わずか０．００００２４％のＰＳ２０の減少又は０．０００１６％のＰＳ８０の減少を検出することが可能になった。このステップでは、インキュベーション容器への吸着を防ぐことで放出されたＦＦＡを保存できることが示されるため、以前の方法と比較してより高い百分率のＰＳ２０が適用された。ガラスバイアルはプラスチック容器と比較して脂肪酸の吸着を最小限に抑えることができるため、インキュベーションに適した容器であることがわかった。プロセス全体を通じて重同位体標識脂肪酸をＩＳＴＤとして使用することにより、容器の吸着効果を制御でき、それによってこの方法の精度が保証される。
【0093】
ＰＳ２０加水分解を受ける安定性サンプルについて、ＰＳ２０定量によるＰＳ分解の直接測定と、放出されたＦＦＡ定量によるＰＳ２０分解の間接測定との間で比較を行った。インキュベーション中の放出されたＦＦＡの濃度増加とＰＳ２０の減少とは高度に相関することが実証され、新しく開発された方法がＰＳ分解の正確な測定であることが実証された。新しく開発された方法は、ＰＳ分解をモニタリングするために２Ｄ－ＬＣ－ＣＡＤよりもはるかに高い感度を提供する。事例研究では、リパーゼ活性の低い多数のｍＡｂにおけるＰＳ２０分解を検出するのに必要な時間をこれら２つの方法で比較したところ、新しく開発された方法ではｍＡｂ薬物製品中の低レベルのリパーゼ活性を１日以内に検出できることが実証された。この新しいハイスループットアッセイを使用すると、ＰＳ分解を数日以内にモニタリングでき、以前の方法に比べて劇的な改善が見られる。
【0094】
更に、加速温度での迅速に測定された分解を使用して、典型的な保存温度で数か月にわたるポリソルベートの分解を予測するモデルが提供され、残留リパーゼ活性、ＰＳ分解、製品の保存期間を迅速かつ簡単に予測できる。
【図1A】
【図1B】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図3】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図6A】
【図6B】
【図7】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図8D】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【図9D】
【図9E】
【図10】
【図11A】
【図11B】
【図11C】
【図12A】
【図12B】
【図12C】
【図12D】
【図13A】
【図13B】
【図14A】
【図14B】
【図14C】
【図15】
【図16】
【国際調査報告】