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特表2024-525479細胞性フィブロネクチン組成物を作製及び使用するためのプロセス
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-07-12
(54)【発明の名称】細胞性フィブロネクチン組成物を作製及び使用するためのプロセス
(51)【国際特許分類】
A61K 38/39 20060101AFI20240705BHJP
A61K 38/18 20060101ALI20240705BHJP
A61K 38/19 20060101ALI20240705BHJP
A61K 47/02 20060101ALI20240705BHJP
A61K 47/36 20060101ALI20240705BHJP
A61K 47/26 20060101ALI20240705BHJP
A61K 47/14 20170101ALI20240705BHJP
A61K 47/38 20060101ALI20240705BHJP
A61P 27/02 20060101ALI20240705BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20240705BHJP
A61K 47/64 20170101ALI20240705BHJP
【ＦＩ】
A61K38/39
A61K38/18
A61K38/19
A61K47/02
A61K47/36
A61K47/26
A61K47/14
A61K47/38
A61P27/02
A61P37/06
A61K47/64
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023580719
(86)(22)【出願日】2022-07-01
(85)【翻訳文提出日】2024-02-08
(86)【国際出願番号】 US2022036036
(87)【国際公開番号】W WO2023278883
(87)【国際公開日】2023-01-05
(31)【優先権主張番号】63/235,605
(32)【優先日】2021-08-20
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/217,952
(32)【優先日】2021-07-02
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】521445029
【氏名又は名称】コンバンジョ・インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】Ｃｏｍｂａｎｇｉｏ， Ｉｎｃ．
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100106518
【弁理士】
【氏名又は名称】松谷 道子
(74)【代理人】
【識別番号】100138911
【弁理士】
【氏名又は名称】櫻井 陽子
(72)【発明者】
【氏名】アルフォード，スペンサー
(72)【発明者】
【氏名】スミス，オードリー
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
【Ｆターム（参考）】
4C076CC10
4C076CC41
4C076DD22
4C076DD23D
4C076DD26
4C076DD38D
4C076DD67D
4C076EE30D
4C076EE33
4C076EE59
4C084AA02
4C084AA03
4C084BA44
4C084CA25
4C084DA01
4C084DA40
4C084DB52
4C084DB54
4C084DB55
4C084DB58
4C084DB62
4C084NA14
4C084ZA331
4C084ZB081
(57)【要約】
本出願は、フィブロネクチン組成物を作製及び使用するための方法及びプロセス、ならびに本明細書に記載の細胞性フィブロネクチン組成物を用いて眼の状態及び／または障害を治療するための方法を提供する。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
フィブロネクチン（ＦＮ）を含む組成物。
【請求項2】
前記ＦＮが、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）由来のＦＮである、請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
前記ＦＮが、ＭＳＣが分泌したＦＮである、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項4】
前記ＦＮが、細胞性ＦＮである、請求項１～３のいずれかに記載の組成物。
【請求項5】
前記細胞性ＦＮが、細胞由来のＦＮであり、前記ＦＮが、１つ以上の成長因子に非共有結合で付加されている、請求項１～４のいずれかに記載の組成物。
【請求項6】
前記細胞性ＦＮが、ＥＤＡ＋及び／またはＥＤＢ＋である、請求項４または５に記載の組成物。
【請求項7】
前記ＦＮが、馴化培地から得られる、請求項１～６のいずれかに記載の組成物。
【請求項8】
前記馴化培地が、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）から得られる、請求項７に記載の組成物。
【請求項9】
前記組成物が、ＭＳＣセクレトームを含む、請求項１～８のいずれかに記載の組成物。
【請求項10】
前記ＭＳＣが、骨髄に由来する、請求項８または９に記載の組成物。
【請求項11】
ＦＧＦ（ＦＧＦ－２など）、ＰＤＧＦ、ＨＧＦ、ＶＥＧＦ、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＩＧＦ－１、ＩＧＦ－２、ＮＧＦ、ニューロトロフィン、及びＥＧＦからなる群から選択される１つ以上の成長因子をさらに含む、請求項１～１０のいずれかに記載の組成物。
【請求項12】
前記ＦＮが、ＦＧＦ（ＦＧＦ－２など）、ＰＤＧＦ、ＨＧＦ、ＶＥＧＦ、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＩＧＦ－１、ＩＧＦ－２、ＮＧＦ、ニューロトロフィン、及びＥＧＦからなる群から選択される１つ以上の成長因子に非共有結合で付加されている、請求項１～１１のいずれかに記載の組成物。
【請求項13】
前記ＦＮが、約０．５～５０ｎｇ／ｍＬの濃度にある、請求項１～１２のいずれかに記載の組成物。
【請求項14】
前記ＦＮが、約２５ｎｇ／ｍＬの濃度にある、請求項１３に記載の組成物。
【請求項15】
前記組成物が、少なくとも約０．１ｎｇ／ｍＬのＰＤＧＦをさらに含む、請求項１～１４のいずれかに記載の組成物。
【請求項16】
組成物が、約０．３～４．５ｎｇ／ｍＬのＨＧＦをさらに含む、請求項１～１５のいずれかに記載の組成物。
【請求項17】
組成物が、約１ｐｇ／ｍＬ～４００ｐｇ／ｍＬのＶＥＧＦをさらに含む、請求項１～１６のいずれかに記載の組成物。
【請求項18】
張性改変剤をさらに含む、請求項１～１７のいずれかに記載の組成物。
【請求項19】
前記張性改変剤が、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、マンニトール、デキストロース、スクロース、ソルビトール、及びグリセリンからなる群から選択される、請求項１８に記載の組成物。
【請求項20】
前記組成物が、０．５～５０ｎｇ／ｍｌのＦＮ、２．２８ｍｇ／ｍｌの一塩基性リン酸ナトリウム、１０～１２ｍｇ／ｍｌの二塩基性リン酸ナトリウム、１１～１３ｍｇ／ｍｌのマンニトール、２～２５ｍｇ／ｍｌのトレハロース二水和物、及び０．５～２ｍｇ／ｍｌのヒプロメロースを含む、請求項１～１９のいずれかに記載の組成物。
【請求項21】
前記組成物が、０．５～５０ｎｇ／ｍｌのＦＮ、２．２８ｍｇ／ｍｌの一塩基性リン酸ナトリウム、１１．４５ｍｇ／ｍｌの二塩基性リン酸ナトリウム、１２．２ｍｇ／ｍｌのマンニトール、２４ｍｇ／ｍｌのトレハロース二水和物、及び１ｍｇ／ｍｌのヒプロメロースを含む、請求項１～１９のいずれかに記載の組成物。
【請求項22】
前記組成物が、０．５～５０ｎｇ／ｍｌのＦＮ、１．３１ｍｇ／ｍｌの一塩基性リン酸ナトリウム、４．５～７ｍｇ／ｍｌの二塩基性リン酸ナトリウム、５．５～７．５ｍｇ／ｍｌのマンニトール、１１～１３ｍｇ／ｍｌのトレハロース二水和物、及び０．１～１．５ｍｇ／ｍｌのヒプロメロースを含む、請求項１～１９のいずれかに記載の組成物。いくつかの実施形態でが、前記ＦＮ組成物は、ＮａＣｌ及び／またはＭｇＣｌ２を含まない。
【請求項23】
前記組成物が、０．５～５０ｎｇ／ｍｌのＦＮ、１．３１ｍｇ／ｍｌの一塩基性リン酸ナトリウム、５．７３ｍｇ／ｍｌの二塩基性リン酸ナトリウム、６．１ｍｇ／ｍｌのマンニトール、１２ｍｇ／ｍｌのトレハロース二水和物、及び０．５ｍｇ／ｍｌのヒプロメロースを含む、請求項１～１９のいずれかに記載の組成物。
【請求項24】
前記組成物が、ＮａＣｌ及び／またはＭｇＣｌ２を含まない、請求項２０～２３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項25】
眼の状態の治療を、それを必要とする対象において行う方法であって、先行請求項のいずれかに記載の組成物を前記対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項26】
前記眼の状態が、網膜病状、慢性移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）、スティーブンス・ジョンソン症候群、眼粘膜類天疱瘡、持続性角膜上皮欠損（ＰＣＥＤ）、ドライアイ、眼神経組織損傷、及び眼への衝撃性損傷（衝撃性損傷、眼の挫傷、または化学熱傷など）からなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項27】
請求項２１または２２に記載の方法に従って、眼の状態の治療を、それを必要とする対象において行うための、請求項１～２６のいずれかに記載の組成物の使用。
【請求項28】
請求項１～２７のいずれかに記載の組成物の作製方法であって、（ａ）細胞培養培地において幹細胞を培養し、それによって、前記幹細胞によって分泌される因子を含む馴化培地を生成させることと、
（ｂ）前記馴化培地を収穫し、それによって収穫馴化培地を得ることと、
（ｃ）前記収穫馴化培地を濾過して、処理された馴化培地を得ることと、
を含む、前記方法。
【請求項29】
前記方法が、前記処理された馴化培地を濃縮することをさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項30】
前記処理された馴化培地が、さらに、製剤緩衝液との緩衝液交換に供される、請求項２８または２９に記載の方法。
【請求項31】
前記製剤緩衝液が、リン酸二／一ナトリウム、クエン酸ナトリウム／クエン酸、ホウ酸／クエン酸ナトリウム、ホウ酸／四ホウ酸ナトリウム、及びクエン酸／リン酸二ナトリウムのうちの１つ以上を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項32】
前記幹細胞が、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）である、請求項２８～３１のいずれかに記載の方法。
【請求項33】
前記細胞培養培地が、無血清である、請求項２８～３２のいずれかに記載の方法。
【請求項34】
前記方法が、ステップ（ａ）の前に、（ｉ）増殖培地において前記幹細胞を培養することと、
（ｉｉ）前記増殖培地をステップ（ａ）の前記細胞培養培地と交換することと、
を含む、請求項２８～３３のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年７月２日出願の米国仮出願第６３／２１７，９５２号及び２０２１年８月２０日出願の米国仮出願第６３／２３５，６０５号に基づく優先権を主張し、これらはすべて、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２１年７月２日出願の米国仮出願第６３／２１７，９５２号及び２０２１年８月２０日出願の米国仮出願第６３／２３５，６０５号に基づく優先権を主張し、これらはすべて、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【0002】
眼への爆風及び鈍的損傷は、網膜コモチオ、外傷性白内障、水晶体への小帯付着の破壊、角の後退、虹彩透析、及び瞳孔括約筋の破裂を含む、眼の内容物に対する一連の機械的破壊を引き起こす可能性がある。これらの損傷の治療は、虹彩の機械的修復（可能な場合）、水晶体のプラスチックレンズインプラントへの交換、及び網膜剥離の修復に限定されている。網膜または前房の細胞構造を修復する治療法がない。さらに、外傷性視神経障害と視神経剥離は、イラクの自由作戦中に専門的な眼のケアを必要とした６つの主要なタイプの眼の損傷の内の１つであり（Ｃｈｏａｎｄ Ｓａｖｉｔｓｋｙ，“Ｏｃｕｌａｒ Ｔｒａｕｍａ Ｃｈａｐｔｅｒ７”，ｉｎ Ｃｏｍｂａｔ Ｃａｓｕａｌｔｙ Ｃａｒｅ：Ｌｅｓｓｏｎｓ ｌｅａｒｎｅｄ ｆｒｏｍ Ｏｅｆ ａｎｄ Ｏｉｆ，ｂｙ Ｂｒｉａｎ Ｅａｓｔ ｂｒｉｄｇｅａｎｄ Ｅｒｉｃ Ｓａｖｉｔｓｋｙ，ｐｐ．２９９－３４２，Ｆｔ．Ｄｅｔｒｉｃｋ，Ｍｄ．：ＢｏｒｄｅｎＩｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＵＳ）Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｏｆｆｉｃｅ，２０１２）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。外傷性頭部損傷の６０％は、神経眼科学的異常を引き起こす（ＶａｎＳｔａｖｅｒｎ、ｅｔ ａｌ、ＪＮｅｕｒｏ－Ｏｐｈｔｈａｍｏｌ２１（２）：１１２－１１７、２００１）（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）その内の半分は視神経に関係する神経または視覚経路が関わっている。ニューロンの外傷性損傷は、軸索損傷及び不可逆的なニューロン喪失をもたらし、永久的な欠損をもたらす。多くの潜在的な神経保護療法が動物で確認されているが、これらの単剤は一般にヒトの臨床試験での療法に変換できなかった（（Ｔｕｒｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．，ＪＮｅｕｒｏｓｕｒｇ１１８（５）：１０７２－１０８５，２０１３，その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。ニューロンの損傷を防ぐために、いくつかの細胞標的に影響を与える併用療法が必要になる可能性がある。
【0003】
角膜は目の最も外側の組織として保護的な役割を果たすが、重度の怪我や病気に対して非常に脆弱である。血管がないため透明性があるが、治癒能力も制限される。角膜損傷は、不可逆的な失明を引き起こす可能性があるため、迅速な介入と積極的な治療が必要である。改善された眼表面治癒療法が極めて必要であることは、化学熱傷ならびに急性慢性移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）、スティーブンス・ジョンソン症候群、眼粘膜類天疱瘡、及び持続性の角膜上皮欠損を引き起こすその他の状態の眼症状などの重度の角膜疾患において特に明白であり、これらは、合計で年間１０万件超発生している。（Ｄｉｅｔｒｉｃｈ－Ｎｔｏｕｋａｓ ｅｔ ａｌ．Ｃｏｒｎｅａ．２０１２，３１（３）：２９９－３１０；ＳｔｅｖｅｎｓｏｎＷ，ｅｔ ａｌ．，ＣｌｉｎＯｐｈｔｈａｌｍｏｌ．２０１３，７：２１５３－２１５８．
ＷｈｉｔｅＫＤ，ｅｔ ａｌ．，ＪＡｌｌｅｒｇｙＣｌｉｎＩｍｍｕｎｏｌＰｒａｃｔ．２０１８；６（１）：３８－６９；ＴａｕｂｅｒＪ．（２００２）Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ Ｄｉｓｅａｓｅｓ Ａｆｆｅｃｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｏｃｕｌａｒ Ｓｕｒｆａｃｅ．Ｉｎ：Ｏｃｕｌａｒ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｍｅｄｉｃａｌａｎｄ Ｓｕｒｇｉｃａｌ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ＮＹ．；ＷｉｒｏｓｔｋｏＢ，ｅｔ ａｌ．，ＯｃｕｌＳｕｒｆ．２０１５Ｊｕｌ；１３（３）：２０４－２１；Ｈａｒｉｎｇ，ＲＳ．，ｅｔ ａｌ．，ＪＡＭＡＯｐｈｔｈａｌｍｏｌ．２０１６Ｏｃｔ１；１３４（１０）：１１１９－１１２４を参照）。
ＷｈｉｔｅＫＤ，ｅｔ ａｌ．，ＪＡｌｌｅｒｇｙＣｌｉｎＩｍｍｕｎｏｌＰｒａｃｔ．２０１８；６（１）：３８－６９；ＴａｕｂｅｒＪ．（２００２）Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ Ｄｉｓｅａｓｅｓ Ａｆｆｅｃｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｏｃｕｌａｒ Ｓｕｒｆａｃｅ．Ｉｎ：Ｏｃｕｌａｒ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｍｅｄｉｃａｌａｎｄ Ｓｕｒｇｉｃａｌ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ＮＹ．；ＷｉｒｏｓｔｋｏＢ，ｅｔ ａｌ．，ＯｃｕｌＳｕｒｆ．２０１５Ｊｕｌ；１３（３）：２０４－２１；Ｈａｒｉｎｇ，ＲＳ．，ｅｔ ａｌ．，ＪＡＭＡＯｐｈｔｈａｌｍｏｌ．２０１６Ｏｃｔ１；１３４（１０）：１１１９－１１２４を参照）。
【0004】
局所点眼薬の開発は、涙液の代謝回転と希釈、鼻涙管ドレナージ、及び反射まばたきを含む、多くの解剖学的制約よって妨げられ、深い眼組織に到達するのは局所投与量の５％未満になることが多いにある（Ｇａｕｄａｎａ ｅｔ ａｌ、２００９）。角膜創傷の場合、最初の外傷が角膜上皮に裂け目を引き起こし、それによって局所的に適用されたＭＳＣ－Ｓの通過が上皮層に浸透することを可能にする。
【0005】
したがって、当分野において、眼を標的とし、外傷に続発する炎症（例えば、火傷、急性炎症、年齢、及び／または酸化ストレス）により悪化する可能性のある届きにくい知覚細胞に治療用ペイロードを送達することのできるような眼の治療法に関するいまだ対処されていない大きな必要性がある。
【発明の概要】
【0006】
本発明は、そのような治療における使用のための、フィブロネクチンを含む組成物、任意選択で、フィブロネクチン（ＦＮ）に非共有結合で付加されている１つ以上の成長因子、及びそのような組成物の作製方法を提供することによってこのニーズを満たす。
【0007】
いくつかの実施形態では、ＦＮは、ＭＳＣ由来のＦＮである。
【0008】
いくつかの実施形態では、ＦＮは、ＭＳＣが分泌したＦＮである。
【0009】
いくつかの実施形態では、ＦＮは、細胞性ＦＮである。
【0010】
いくつかの実施形態では、細胞性ＦＮは、細胞由来のＦＮであり、ＦＮは、１つ以上の成長因子に非共有結合で付加されている。
【0011】
いくつかの実施形態では、細胞性ＦＮは、ＥＤＡ＋及び／またはＥＤＢ＋である。
【0012】
いくつかの実施形態では、細胞性フィブロネクチンは、馴化培地から得られる。
【0013】
いくつかの実施形態では、細胞性フィブロネクチンは、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）によって分泌される。
【0014】
いくつかの実施形態では、馴化培地は、ＭＳＣの培養物から得られる。
【0015】
いくつかの実施形態では、組成物は、ＭＳＣセクレトームを含む。
【0016】
いくつかの実施形態では、ＭＳＣは、骨髄に由来する。いくつかの実施形態では、ＭＳＣは、健康なヒトドナー由来の骨髄に由来する。
【0017】
いくつかの実施形態では、組成物は、ＦＧＦ（ＦＧＦ－２など）、ＰＤＧＦ、ＨＧＦ、ＶＥＧＦ、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＩＧＦ－１、ＩＧＦ－２、ＮＧＦ、ニューロトロフィン、及びＥＧＦからなる群から選択される１つ以上の成長因子をさらに含む。
【0018】
いくつかの実施形態では、細胞性フィブロネクチンは、ＦＧＦ（ＦＧＦ－２など）、ＰＤＧＦ、ＨＧＦ、ＶＥＧＦ、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＩＧＦ－１、ＩＧＦ－２、ＮＧＦ、ニューロトロフィン、及びＥＧＦからなる群から選択される１つ以上の成長因子に結合されている。
【0019】
いくつかの実施形態では、組成物中の細胞性フィブロネクチンは、約０．５～５０ｎｇ／ｍＬの濃度にある。
【0020】
いくつかの実施形態では、組成物中の細胞性フィブロネクチンは、約２５ｎｇ／ｍＬの濃度にある。
【0021】
いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも約０．１ｎｇ／ｍＬのＰＤＧＦをさらに含む。
【0022】
いくつかの実施形態では、組成物は、約０．３～４．５ｎｇ／ｍＬのＨＧＦをさらに含む。
【0023】
いくつかの実施形態では、組成物は、約１ｐｇ／ｍＬ～４００ｐｇ／ｍＬのＶＥＧＦをさらに含む。
【0024】
いくつかの実施形態では、組成物は、張性改変剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、張性改変剤は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、マンニトール、デキストロース、スクロース、ソルビトール、及びグリセリンからなる群から選択される。
【0025】
いくつかの実施形態では、組成物は、０．５～５０ｎｇ／ｍｌのＦＮ、２．２８ｍｇ／ｍｌの一塩基性リン酸ナトリウム、１０～１２ｍｇ／ｍｌの二塩基性リン酸ナトリウム、１１～１３ｍｇ／ｍｌのマンニトール、２～２５ｍｇ／ｍｌのトレハロース二水和物、及び０．５～２ｍｇ／ｍｌのヒプロメロースを含む。
【0026】
いくつかの実施形態では、組成物は、０．５～５０ｎｇ／ｍｌのＦＮ、２．２８ｍｇ／ｍｌの一塩基性リン酸ナトリウム、１１．４５ｍｇ／ｍｌの二塩基性リン酸ナトリウム、１２．２ｍｇ／ｍｌのマンニトール、２４ｍｇ／ｍｌのトレハロース二水和物、及び１ｍｇ／ｍｌのヒプロメロースを含む。
【0027】
いくつかの実施形態では、組成物は、０．５～５０ｎｇ／ｍｌのＦＮ、１．３１ｍｇ／ｍｌの一塩基性リン酸ナトリウム、４．５～７ｍｇ／ｍｌの二塩基性リン酸ナトリウム、５．５～７．５ｍｇ／ｍｌのマンニトール、１１～１３ｍｇ／ｍｌのトレハロース二水和物、及び０．１～１．５ｍｇ／ｍｌのヒプロメロースを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、ＮａＣｌ及び／またはＭｇＣｌ２を含まない。
【0028】
いくつかの実施形態では、組成物は、０．５～５０ｎｇ／ｍｌのＦＮ、１．３１ｍｇ／ｍｌの一塩基性リン酸ナトリウム、５．７３ｍｇ／ｍｌの二塩基性リン酸ナトリウム、６．１ｍｇ／ｍｌのマンニトール、１２ｍｇ／ｍｌのトレハロース二水和物、及び０．５ｍｇ／ｍｌのヒプロメロースを含む。
【0029】
いくつかの実施形態では、組成物は、ＮａＣｌ及び／またはＭｇＣｌ２を含まない。
【0030】
いくつかの実施形態では、本明細書での本開示は、眼の状態の治療を、それを必要とする対象において行う方法を提供し、この方法は、本明細書で提供される組成物を対象に投与することを含む。
【0031】
いくつかの実施形態では、眼の状態は、網膜病状、慢性移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）、スティーブンス・ジョンソン症候群、眼粘膜類天疱瘡、持続性角膜上皮欠損（ＰＣＥＤ）、ドライアイ、眼神経組織損傷、及び眼への衝撃性損傷（衝撃性損傷、眼の挫傷、または化学熱傷など）からなる群から選択される。
【0032】
いくつかの実施形態では、本明細書での本開示は、本明細書に開示の方法に従って、眼の状態の治療を、それを必要とする対象において行うための組成物の使用を提供する。
【0033】
いくつかの実施形態では、本明細書での本開示は、ＦＮ組成物の作製方法を提供し、この方法は、
（ａ）細胞培養培地において幹細胞を培養し、それによって、幹細胞によって分泌される因子を含む馴化培地を生成させることと、
（ｂ）馴化培地を収穫し、それによって収穫馴化培地を得ることと、
（ｃ）収穫馴化培地を濾過して、処理された馴化培地を得ることと、
を含む。
（ａ）細胞培養培地において幹細胞を培養し、それによって、幹細胞によって分泌される因子を含む馴化培地を生成させることと、
（ｂ）馴化培地を収穫し、それによって収穫馴化培地を得ることと、
（ｃ）収穫馴化培地を濾過して、処理された馴化培地を得ることと、
を含む。
【0034】
いくつかの実施形態では、方法は、処理された馴化培地を濃縮することをさらに含む。
【0035】
いくつかの実施形態では、処理された馴化培地は、さらに、製剤緩衝液との緩衝液交換に供される。
【0036】
いくつかの実施形態では、製剤緩衝液は、リン酸二／一ナトリウム、クエン酸ナトリウム／クエン酸、ホウ酸／クエン酸ナトリウム、ホウ酸／四ホウ酸ナトリウム、及びクエン酸／リン酸二ナトリウムのうちの１つ以上を含む。
【0037】
いくつかの実施形態では、幹細胞は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）である。
【0038】
いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、無血清である。
【0039】
いくつかの実施形態では、作製方法は、ステップ（ａ）の前に、
（ｉ）増殖培地において幹細胞を培養することと、
（ｉｉ）増殖培地をステップ（ａ）の細胞培養培地と交換することと、
をさらに含む。
（ｉ）増殖培地において幹細胞を培養することと、
（ｉｉ）増殖培地をステップ（ａ）の細胞培養培地と交換することと、
をさらに含む。
【図面の簡単な説明】
【0040】
【図1】フィブロネクチンの調製、処理、及び使用の実施形態の模式図。
【図2】フィブロネクチンは、ヒト角膜上皮細胞の遊走を刺激する。
【図3】フィブロネクチンを枯渇させると、ヒト角膜上皮細胞の遊走が損なわれる。
【図4】フィブロネクチンを枯渇させると、ヒト角膜上皮細胞のインビトロ創傷閉鎖が損なわれる。
【図5】免疫沈降させたフィブロネクチンが結合ＨＧＦを含むことを示すデータを提供する。
【図6】セクレトーム中のフィブロネクチンの特徴付け。ＭＳＣから単離したセクレトームを、ＥＤＡ配列、ＥＤＢ＋フィブロネクチン、及び一般的なフィブロネクチン（ＦＮ）に特異的な抗体を使用してイムノブロッティングによって評価した。抗ＥＤＡ抗体及び抗ＥＤＢ抗体は共に、フィブロネクチンと交差反応し、このことは、セクレトーム中に存在する種が細胞性フィブロネクチンであることを示している。
【図7】サンドイッチＥＬＩＳＡを使用する細胞性ＥＤＡ＋フィブロネクチンの検出。組換え細胞性フィブロネクチン及びＥＤＡ配列特異的捕捉抗体を使用してＥＤＡ＋フィブロネクチンのＥＬＩＳＡ標準曲線（白抜きの丸印）を確立した。標準曲線の作成に使用する組換えフィブロネクチンに、免疫原として使用するＥＤＡ配列を含めることで、抗ＥＤＡ抗体を生成させた。ＥＤＡサンドイッチＥＬＩＳＡにおいてＭＳＣセクレトームをアッセイし、細胞性フィブロネクチンが容易に検出された（青色のドット）。
【発明を実施するための形態】
【0041】
Ｉ．導入
フィブロネクチン（ＦＮ）は、糖質含量が約５％の巨大糖タンパク質である。特徴的な形態の血漿フィブロネクチンは、４４０，０００ダルトンのジスルフィド結合型二量体であり、各サブユニットは、約２２０，０００ダルトンの分子量を有する。フィブロネクチンは、通常、約３００μｇ／ｍＬの濃度で血漿中に見られ、Ｈｙｎｅｓ，Ｒ．Ｏ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ（２章、１２ページ），ＩＮ：Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎｓ Ｎｅｗ－Ｙｏｒｋ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，１９９０によって報告された方法を使用して抽出及び精製される。血漿フィブロネクチンは、寒冷不溶性グロブリン、抗ゼラチン因子、細胞付着タンパク質、細胞伸展因子、及びオプソニンα２表面結合糖タンパク質を含む、さまざまな他の名称によっても知られている。これらの名称は、フィブロネクチンの生物学的活性（細胞動員、微粒子デブリのオプソニン化、及び創傷収縮の促進など）を反映している。フィブロネクチンの構造及び活性についての説明は、Ｈｙｎｅｓ，Ｒ．Ｏ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ（２章、１２ページ），ＩＮ：Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎｓ Ｎｅｗ－Ｙｏｒｋ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，１９９０、ならびにＨｙｎｅｓ，Ｒ．Ｏ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ（２章、７～２３ページ）及びＷｏｕｎｄ ｈｅａｌｉｎｇ，ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｆｉｂｒｏｓｉｓ（１４章、３４９～６４ページ），ＩＮ：Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎｓ Ｎｅｗ－Ｙｏｒｋ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，１９９０．３、ならびにＢｒｏｔｃｈｉｅ，Ｈ．，Ｗａｋｅｆｉｅｌｄ，Ｄ．Ａｕｓｔｒａｌａｓ Ｊ Ｄｅｒｍａｔｏｌ １９９０；３１：４７－５６（すべて、それら全体が参照によって本明細書に組み込まれる）において見つけることができる。
フィブロネクチン（ＦＮ）は、糖質含量が約５％の巨大糖タンパク質である。特徴的な形態の血漿フィブロネクチンは、４４０，０００ダルトンのジスルフィド結合型二量体であり、各サブユニットは、約２２０，０００ダルトンの分子量を有する。フィブロネクチンは、通常、約３００μｇ／ｍＬの濃度で血漿中に見られ、Ｈｙｎｅｓ，Ｒ．Ｏ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ（２章、１２ページ），ＩＮ：Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎｓ Ｎｅｗ－Ｙｏｒｋ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，１９９０によって報告された方法を使用して抽出及び精製される。血漿フィブロネクチンは、寒冷不溶性グロブリン、抗ゼラチン因子、細胞付着タンパク質、細胞伸展因子、及びオプソニンα２表面結合糖タンパク質を含む、さまざまな他の名称によっても知られている。これらの名称は、フィブロネクチンの生物学的活性（細胞動員、微粒子デブリのオプソニン化、及び創傷収縮の促進など）を反映している。フィブロネクチンの構造及び活性についての説明は、Ｈｙｎｅｓ，Ｒ．Ｏ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ（２章、１２ページ），ＩＮ：Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎｓ Ｎｅｗ－Ｙｏｒｋ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，１９９０、ならびにＨｙｎｅｓ，Ｒ．Ｏ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ（２章、７～２３ページ）及びＷｏｕｎｄ ｈｅａｌｉｎｇ，ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｆｉｂｒｏｓｉｓ（１４章、３４９～６４ページ），ＩＮ：Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎｓ Ｎｅｗ－Ｙｏｒｋ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，１９９０．３、ならびにＢｒｏｔｃｈｉｅ，Ｈ．，Ｗａｋｅｆｉｅｌｄ，Ｄ．Ａｕｓｔｒａｌａｓ Ｊ Ｄｅｒｍａｔｏｌ １９９０；３１：４７－５６（すべて、それら全体が参照によって本明細書に組み込まれる）において見つけることができる。
【0042】
創傷治癒は、通常、炎症期、増殖期、及び再構築期の３相に分けられる。フィブロネクチンは、特に浸潤細胞の接着が可能になるように足場を創出することによって、創傷治癒プロセスの各段階に関与することが報告されている。初期には、多くのメディエーター（フィブロネクチン及びフィブリノゲンなど）が創傷部位に放出される。フィブロネクチンは、創傷への炎症細胞の遊走、及び単球によるデブリの食作用を促進する。その後、血管新生及び再上皮化が生じる。この段階においては、フィブロネクチンは、内皮細胞に対して遊走活性を発揮すると共に、基底膜上への上皮細胞及び線維芽細胞の遊走を促進する。
【0043】
フィブロネクチンは、それがコラーゲンフィブリルの構造化において主な役割を果たす再構築期の必須成分であるようにも思われる。線維性コラーゲンは、組織の引張強度を大幅に増強する線維束を最終的に形成して、創傷閉鎖を生じさせる。血漿フィブロネクチンは、角膜創傷及び下腿潰瘍などにおいて創傷治癒の速度を上昇させる上で有用であると報告されている。
【0044】
フィブロネクチンには、血漿フィブロネクチン及び細胞性フィブロネクチンという２つの形態が存在する。血漿フィブロネクチンは肝細胞によって合成され、血漿に分泌される一方で、細胞性フィブロネクチンは、線維芽細胞、内皮細胞、幹細胞、筋細胞、及び軟骨細胞などの多くの細胞型によって産生される。
【0045】
創傷治癒においては、インビボでの創傷発生後に創傷中に血漿フィブロネクチンが顕著に蓄積することが報告されており、このことは、血小板、線維芽細胞、及び内皮細胞のさまざまな機能（接着、遊走、及び凝集など）に極めて重要であり、血漿フィブロネクチンがインビボでの創傷治癒の加速に適した基質として働く可能性があることを浮き彫りにしている。実際、動物モデルでは、血漿フィブロネクチンを含む暫定的なマトリックスが再上皮化プロセスにおける表皮細胞の接着及び遊走を顕著に支援し、このことは、ヒトの創傷治癒及び組織修復における血漿フィブロネクチンの臨床的な潜在力を示している。
【0046】
物理的及び免疫学的な類似点は多いものの、これら２つクラスのフィブロネクチンは電気泳動的な挙動、溶解性、及び生物学的活性が異なる。Ｔａｍｋｕｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８（７）：４６４１－４７（１９８３）、Ｙａｍａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．８０：４９２－９８（１９７９）、Ｙａｍａｄａ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １６（２５）：２５５２－５９（１９７７）。
【0047】
さらに、ペプチドマッピング（Ｈａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６（２１）：１１，２９２－１１，３００（１９８１））及び免疫学的手法（Ａｔｈｅｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ ２５：１３３－４１（１９８１））によって、血漿フィブロネクチンと細胞性フィブロネクチンと間には一次構造的な相違が見つかっている。最近では、９０アミノ酸のＩＩＩ型構造リピートを正確に１つコードする相違領域がヒト線維芽細胞及び２つのヒト腫瘍細胞株由来のｍＲＮＡでは同定されたが、ヒト肝臓ｍＲＮＡでは検出不可能であった。Ｋｏｒｎｂｌｉｈｔｔ ｅｔ ａｌ．ＥＭＢＯ Ｊ．４（７）：１７５５－５９（１９８５）、Ｋｏｒｎｂｌｉｈｔｔ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．３（１）：２２１－２６（１９８４）、Ｋｏｒｎｂｌｉｈｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２（１４）：５８５３－６８（１９８４）。血漿フィブロネクチンは肝細胞によって合成されることから、このエクストラＩＩＩ型リピートは細胞性フィブロネクチンのユニークドメインである可能性がある。Ｓｃｈｗａｒｚｂａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８２：１４２４－２８（１９８５）、Ｋｏｒｎｂｌｉｈｔｔ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．３（１）：２２１－２６（１９８４）、Ｋｏｒｎｂｌｉｈｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２（１４）：５８５３－６８（１９８４）。血漿フィブロネクチンと細胞性フィブロネクチンとの間の相違についてのさらなる議論は、Ｗ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｆｉｂｒｏｇｅｎｅｓｉｓ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｐａｉｒ ４，２１（２０１１）において提供されている。
【0048】
細胞性フィブロネクチンは、循環血漿フィブロネクチンプールには存在しないフィブロネクチンスプライスバリアントによって特徴付けられる。こうした選択的スプライスバリアントによって、フィブロネクチン配列がエクストラドメイン（ＩＩＩ型ドメイン）（ＥＩＩＩＡ及びＥＩＩＩＢ（またはＥＤＡ及びＥＤＢ）と呼ばれる）を有するようになる。Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ．ｖｏｌ．２１６（１）：１－１４（２００８）、Ｗｈｉｔｅ ａｎｄ Ｍｕｒｏ，ＩＵＢＭＢ Ｌｉｆｅ，６３：５３８－５４６（２０１１）。したがって、いくつかの実施形態では、細胞性フィブロネクチンは、ＥＤＡ＋及び／またはＥＤＢ＋である。いくつかの実施形態では、細胞性フィブロネクチンは、ＥＤＡ＋、ＥＤＢ＋、及び／またはＶ＋である。いくつかの実施形態では、細胞性フィブロネクチンは、ＥＤＡ＋である。いくつかの実施形態では、細胞性フィブロネクチンは、ＥＤＢ＋である。いくつかの実施形態では、細胞性フィブロネクチンは、Ｖ＋である。一方または両方のＩＩＩ型ドメインが組み込まれ得る。細胞性フィブロネクチンは、これらのアイソフォームの混合物であり得る。
【0049】
創傷治癒の促進へのフィブロネクチンの治療応用には多大な関心が寄せられているにもかかわらず、現在までの臨床試験では血漿フィブロネクチンに焦点が当てられている。細胞性フィブロネクチンに関する臨床試験についてはこれまでのところ報告されておらず、血漿フィブロネクチンに関する臨床試験では、眼疾患患者の間で結果に一貫性がないことが示された。例えば、持続性角膜上皮欠損患者では残念なことに血漿フィブロネクチン治療が奏功しないことがＭｃＣｕｌｌｅｙ，ＪＰ．ｅｔ ａｌ．によって報告された。ＭｃＣｕｌｌｅｙ ＪＰ，Ｈｏｒｏｗｉｔｚ Ｂ，Ｈｕｓｓｅｉｎｉ ＺＭ，Ｈｏｒｏｗｉｔｚ Ｍ．Ｔｒａｎｓ Ａｍ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｓｏｃ．１９９３；９１：３６７－８６；考察３８６～９０。
【0050】
さまざまな部位において成長因子がＦＮに結合し得ることを示す研究が増えてきている。したがって、ＦＮは、成長因子を保持して生理学的微小環境中のそれらの局所濃度を上昇させる有効なリザーバーとして働き得る。例えば、ＨＧＦは、ＨＧＦ受容体及びインテグリンならびにＦＮに結合することで、細胞遊走を促進する多量体複合体へと会合することが報告された。Ｒａｈｍａｎ，Ｓａｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．６，１ ８．１７ Ｆｅｂ．２００５。ＦＮは、そのＣ末端ヘパリン－ＩＩドメイン（ＦＮ ＩＩＩ）を介して、ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦ及びＦＧＦファミリーのさまざまな成長因子、ならびにトランスフォーミング増殖因子－β（ＴＧＦ－β）及びニューロトロフィンファミリーに由来にするいくつかの成長因子に結合することも明らかになった。ＦＮによって隔離された成長因子は局所的、持続的、かつ増強されたＧＦ活性を有すると推定されるが、内在性の生化学的特質及び生物物理学的特質を保持する組換えＦＮ及び成長因子を用いる組換え併用療法を開発することは、依然として難易度の高いことである。
【0051】
Ａ．定義
特許請求の範囲及び明細書で使用される用語は、特に明記しない限り、以下に記載されるように定義される。親仮特許出願で使用されている用語と直接矛盾する場合は、本明細書で使用されている用語が優先するものとする。
特許請求の範囲及び明細書で使用される用語は、特に明記しない限り、以下に記載されるように定義される。親仮特許出願で使用されている用語と直接矛盾する場合は、本明細書で使用されている用語が優先するものとする。
【0052】
本明細書で使用される場合、「分離された」とは、元の環境から除去され、したがって「人間の手によって」その自然の状態から変更された材料を指す。
【0053】
本明細書で使用する場合、「濃縮」とは、不要な材料を排除するか、混合物から望ましい材料を選択及び分離することによって、１つ以上の材料を選択的に濃縮または量を増やすことを意味する（例えば、集団内のすべての細胞がマーカーを発現するわけではない不均一な細胞から特定の細胞マーカーを用いて細胞を分離する）。
【0054】
本明細書で使用される場合、「実質的に精製された」という用語は、特定のマーカーまたはマーカーの組み合わせに対して実質的に均質な細胞の集団を意味する。実質的に均質とは、特定のマーカーまたはマーカーの組み合わせに対して少なくとも９０％、好ましくは９５％均質であることを意味する。本明細書で使用される場合、「多能性幹細胞」という用語は真の幹細胞であるが、限られた数のタイプにしか分化することができない。例えば、骨髄には多能性幹細胞が含まれており、血液のすべての細胞を生成するが、他の種類の細胞に分化できない場合がある。
【0055】
本明細書に記載の特定の組成物、増殖条件、培地などを指す場合の「動物を含まない」という用語は、ウシ血清、タンパク質、脂質、炭水化物、核酸、ビタミンなどの非ヒト動物由来材料が、特定の組成物またはプロセスの調製、成長、培養、膨張、貯蔵または配合に使用されないことを意味する。「非ヒト動物由来材料がない」とは、物質が非ヒト動物の体内または物質内に存在または動物の体または物質に接触したことがなく、異種汚染されていないことを意味する。一般に、組換え生産されたヒトタンパク質などの臨床グレードの材料は、そのような組成物及び／またはプロセスの調製、成長、培養、膨張、貯蔵及び／または配合に使用される。
【0056】
細胞組成物に関して「拡張された」という用語は、細胞集団が、以前の方法を使用して得られるよりも有意に高い濃度の細胞を構成することを意味する。例えば、ＡＭＰ細胞の拡張組成物中の羊膜組織の１グラムあたりの細胞レベルは、以前の方法を使用したそのような細胞の約２０倍の倍増と比較して、５継代後の一次培養物中の細胞数よりも少なくとも５０倍及び最大１５０倍高い。別の例では、ＡＭＰ細胞の拡張組成物中の羊膜組織１グラムあたりの細胞のレベルは、３継代後の一次培養物中の細胞の数よりも少なくとも３０倍、最大１００倍高い。したがって、「拡張された」集団は、以前の方法と比較して、羊水組織の１グラムあたりの細胞数が少なくとも２倍、最大で１０倍改善されている。「拡張された」という用語は、細胞の数を増やすために人が介入した状況のみを含むことを意味する。
【0057】
本明細書で使用される場合、「馴化培地」は、特定の細胞または細胞集団が培養され、次いで除去された培地である。細胞を培地で培養すると、他の細胞をサポートしたり、他の細胞の挙動に影響を与えたりする可能性のある細胞因子を分泌する可能性がある。このような因子には、ホルモン、サイトカイン、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）、タンパク質、小胞、抗体、ケモカイン、受容体、抑制剤、及び顆粒が含まれるが、これらに限定されない。細胞因子を含む培地は馴化培地である。馴化培地を調製する方法の例は、米国特許第６，３７２，４９４号に記載されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本明細書で使用される場合、馴化培地はまた、馴化培地または例えば、ＭＳＣ細胞から回収及び／または精製されるタンパク質などの成分を指す。
【0058】
本明細書で使用される場合、「間葉系幹細胞組成物」または「ＭＳＣ組成物」という用語は、ＭＳＣに由来し、場合によってはさらなる処理を受けた馴化培地を意味する。いくつかの実施形態では、「ＭＳＣセクレトーム」は、ＭＳＣに由来する粗馴化培地を指すことができる。いくつかの実施形態では、「ＭＳＣセクレトーム」は、それが本明細書に記載されるようにさらなる処理に供された後に粗馴化培地から得られる組成物を指すことができる。
【0059】
本明細書で使用される場合、「懸濁液」という用語は、分散成分、例えば、サイトカインを含む液体を意味する。分散された成分は、完全に可溶化されるか、部分的に可溶化されるか、懸濁されるか、さもなければ液体中に分散され得る。適切な液体には、水、塩及び／または糖溶液などの浸透圧溶液、細胞培養培地、及び他の水溶液または非水溶液が含まれるが、これらに限定されない。
【0060】
「アミノ酸」とは、天然に存在するアミノ酸及び合成アミノ酸、ならびに天然に存在するアミノ酸と同様の方法で機能するアミノ酸類似体及びアミノ酸模倣体を指す。天然に存在するアミノ酸は、遺伝子コードによってコードされるもの、ならびに後で修飾されるアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ－カルボキシグルタメート、及びＯ－ホスホセリンである。アミノ酸類似体とは、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造を有する化合物、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、及びＲ基に結合されたα炭素、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを指す。そのような類似体は、修飾されたＲ基（例えば、ノルロイシン）または修飾されたペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造を保持する。アミノ酸模倣体とは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様に機能する化学化合物を指す。アミノ酸は、本明細書では、それらの一般に知られている３文字記号またはＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ生化学命名委員会によって推奨される１文字記号のいずれかで呼ぶことができる。同様に、ヌクレオチドは、一般に受け入れられている１文字コードで呼ぶことができる。
【0061】
「アミノ酸置換」は、所定のアミノ酸配列（開始ポリペプチドのアミノ酸配列）における少なくとも１つの既存のアミノ酸残基の、第２の異なる「置換」アミノ酸残基による置換を指す。「アミノ酸挿入」は、所定のアミノ酸配列への少なくとも１つの追加のアミノ酸の組み込みを指す。挿入は通常、１つまたは２つのアミノ酸残基の挿入からなるが、現在のより大きな「ペプチド挿入」、例えば、約３～約５または最大で約１０、１５、または２０のアミノ酸残基の挿入を行うことができる。挿入された残基は、上記に開示されているように、天然に存在する場合もあれば、天然に存在しない場合もある。「アミノ酸欠失」は、所定のアミノ酸配列からの少なくとも１つのアミノ酸残基の除去を指す。
【0062】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、本明細書では交換可能に使用され、アミノ酸残基のポリマーを指す。この用語は、１つ以上のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工化学的類似体であるアミノ酸ポリマー、及び天然に存在するアミノ酸ポリマー、天然に存在しないアミノ酸ポリマーも含む。
【0063】
「核酸」は、一本鎖または二本鎖のいずれかの形態のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド及びそれらのポリマーを指す。特に限定されない限り、この用語は、参照核酸と同様の結合特性を有し、天然に存在するヌクレオチドと同様の方法で代謝される天然ヌクレオチドの既知の類似体を含む核酸を包含する。特に明記しない限り、特定の核酸配列はまた、その保存的に修飾された変異体（例えば、縮重コドン置換）及び相補的配列、ならびに明示的に示された配列も暗黙的に包含する。具体的には、縮重コドン置換は、１つ以上の選択された（またはすべての）コドンの３番目の位置が混合塩基及び／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を生成することによって達成することができる（Ｂａｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：５０８１、１９９１；Ｏｈｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ、Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５－２６０８、１９８５；及びＣａｓｓｏｌ ｅｔ ａｌ、１９９２；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．プローブ８：９１－９８、１９９４）。アルギニンとロイシンの場合、２番目の塩基での修飾も保守的である可能性がある。核酸という用語は、遺伝子、ｃＤＮＡ、及び遺伝子によってコードされるｍＲＮＡと互換的に使用される。本明細書で使用されるポリヌクレオチドは、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドから構成することができ、これらは、非修飾ＲＮＡまたはＤＮＡまたは修飾ＲＮＡまたはＤＮＡであり得る。例えば、ポリヌクレオチドは、一本鎖及び二本鎖ＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖ＲＮＡ、及び一本鎖及び二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖、またはより典型的には二本鎖、または一本鎖領域と二本鎖領域の混合物であり得るＤＮＡ及びＲＮＡを含むハイブリッド分子から構成され得る。さらに、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡまたはＤＮＡ、あるいはＲＮＡとＤＮＡの両方を含む三本鎖領域から構成され得る。ポリヌクレオチドはまた、安定性または他の理由のために修飾された１つ以上の修飾された塩基またはＤＮＡまたはＲＮＡ骨格を含み得る。「修飾された」塩基には、例えば、トリチル化された塩基及びイノシンなどの異常な塩基が含まれる。ＤＮＡとＲＮＡにはさまざまな変更を加えることができ、したがって、「ポリヌクレオチド」は、化学的、酵素的、または代謝的に修飾された形態を包含する。
【0064】
本明細書で使用される場合、「セクレトーム組成物」という用語は、細胞から分泌される１つ以上の物質を含む組成物を指す。特定の実施形態では、セクレトーム組成物は、１つ以上のサイトカイン、１つ以上のエクソソーム、及び／または１つ以上の微小胞を含み得る。セクレトーム組成物は、精製されていても、精製されていなくてもよい。いくつかの実施形態では、セクレトーム組成物は、細胞から分泌されない１つ以上の物質（例えば、培養培地、添加物、栄養素など）をさらに含み得る。いくつかのセクレトーム組成物は、細胞から分泌されない微量の１つ以上の物質（例えば、培地、添加物、栄養素など）だけを含むか、または含まない。
【0065】
本明細書で使用される「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」、「治療（ｔｒｅａｔ）」、または「治療する」などの用語は、ヒトまたは非ヒト哺乳動物（例えば、齧歯動物、猫、犬、馬、牛、羊、及び霊長類など）の任意の治療を含み、疾患または状態の素因がある可能性があるが、まだそれを有すると診断されていない対象において、疾患または状態が発生するのを防ぐことを含む。また、疾患、状態、及び／または関連する症状の抑制（発症の停止）、緩和または改善（退行の原因）、または疾患、状態及び／または任意の関連する症状の治癒（発症または進行の恒久的な停止）も含まれる。本明細書で使用される「治療」、「治療する」、または「治療する」という用語は、哺乳動物、特にヒトの疾患または状態の任意の治療を含み、（ａ）対象において病気や状態の素因があるかもしれないが、まだそれを持っていると診断されていない疾患または状態が発生するのを防ぐこと、（ｂ）疾患または状態を抑制すること、例えば、その発症を阻止すること、（ｃ）疾患または状態を緩和及び／または改善すること、例えば、疾患または状態の退行を引き起こすこと、または（ｄ）疾患または状態を治癒すること、例えば、その発症または進行を停止することを含む。本発明の方法によって治療される対象の集団には、望ましくない状態または疾患に苦しむ対象、ならびに状態または疾患の発症のリスクがある対象が含まれる。いくつかの実施形態では、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」（「治療（ｔｒｅａｔ）」または「治療する」も）は、部分的または完全に緩和、改善、回復、抑制、発症の遅延、重症度の軽減、及び／または特定の疾患、障害、及び／または状態の１つ以上の症状、特徴、及び／または原因の発生率の低下をもたらす治療の任意の投与を指す。いくつかの実施形態では、そのような治療は、関連する疾患、障害、及び／または状態の兆候を示さない対象、及び／または疾患、障害、及び／または状態の初期の兆候のみを示す対象のものであり得る。あるいは、及び／またはさらに、そのような治療は、関連する疾患、障害、及び／または状態の１つ以上の確立された兆候を示す対象のものであり得る。いくつかの実施形態では、治療は、関連する疾患、障害、及び／または状態に罹患していると診断された対象のものであり得る。いくつかの実施形態では、治療は、関連する疾患、障害、及び／または状態の発症のリスクの増加と統計的に相関する１つ以上の感受性因子を有することが知られている対象のものであり得る。
【0066】
本明細書で使用される場合、「創傷」は、機械的（例えば、挫傷、貫通）、熱的、化学的、電気的、放射線、衝撃及び切開による損傷などの外傷性障害、例えば外科手術及び結果的な切開創ヘルニア、瘻などの待機的創傷；急性創傷、慢性創傷、感染した創傷、及び無菌の創傷、ならびに病状（例えば、眼の挫傷）に関連する創傷を含むが、それらに限定されない、通常の組織（内部組織及び／または外部組織）を何らかの原因で崩壊するものである。創傷は動的であり、治癒のプロセスは、創傷時に始まり、最初の創傷閉鎖を超えて安定した創傷閉鎖に到達するまで進行する一連の、統合され相互に関連する細胞プロセスを必要とする連続的なものである。これらの細胞プロセスは、サイトカイン、リンホカイン、成長因子、及びホルモンを含むがこれらに限定されない体液性物質によって媒介または調節される。本発明によれば、「創傷治癒」は、何らかの形態の介入によって、治癒がより速くなるような、及び／または結果として生じる治癒領域がより少ない傷跡となるような、及び／または治癒領域が無傷の組織の強度に近い組織強度を有するような、及び／または創傷組織が、ある程度の機能回復を達成するような、組織修復の自然の細胞プロセス及び体液性物質を改善することを指す。
【0067】
本明細書で使用される場合、「ａ」または「ａｎ」という用語は、１つ以上または少なくとも１つを意味する。
【0068】
本明細書で使用される場合、組成物の「治療上有効な」または「有効な」投与量または量は、所与の病状にプラスの効果をもたらすのに十分な量である。即時ではない場合、治療上有効または有効な投与量または量は、ある期間にわたって、患者の健康及び幸福に顕著なまたは測定可能な効果をもたらす。
【0069】
本明細書で使用される場合、「医薬組成物」は、送達成分と組み合わせた本明細書に記載される組成物の有効量を指す。医薬組成物は、任意選択的に、組成物及び／またはその個々の成分の対象への投与を容易にし得る、薬学的に適切な担体及び賦形剤などの他の成分を含み得る。
【0070】
「薬学的に許容される担体」という用語は、対象に重大な刺激を引き起こさず、投与された化合物の生物学的活性及び特性を無効にしない担体または希釈剤を指す。
【0071】
「賦形剤」という用語は、化合物の投与をさらに容易にするために医薬組成物に添加される不活性物質を指す。
【0072】
本明細書で使用される場合、「混合」、「混合する」などの用語は、成分の機械的プロセスまたは機械的処理を説明する。例えば、混合は、提供された疎水性マトリックスの強力な圧縮及び混合をもたらす、加圧及び折り畳みの繰り返しサイクルまたは同等の処理ステップを実行するという意味であり得る。
【0073】
成体幹細胞は、骨髄、脂肪、歯髄組織など、さまざまな成体組織から採取できる。すべての成体幹細胞は自己複製のケーブルであり、多能性であると考えられているが、それらの治療機能はそれらの起源によって異なる。その結果、成体幹細胞の種類ごとに、特定の病気に適した独自の特性がある。間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は典型的には中胚葉に由来し、多能性であり、様々な組織に分化することができるものから単離された（由来する）非造血性（非血液）幹細胞であり、骨芽細胞（例えば、骨細胞）、軟骨細胞（例えば、軟骨細胞）、筋細胞（例えば、筋肉細胞）及び脂肪細胞（例えば、骨髄脂肪組織を生じさせる脂肪細胞）を含む。本明細書で使用される場合、「単離された」とは、それらの元の環境から除去された細胞を指す。幹細胞は、成長因子など、複数の生物学的プロセスを調節する、または調節するために重要な因子を産生する。成長因子は、細胞の成長及び／または増殖及び／または細胞分化を刺激することができる天然に存在する物質などの薬剤である。一般的に、成長因子はタンパク質またはステロイドホルモンである。本明細書では、「成長因子」及び「因子」などの用語は交換可能に使用されるが、「生物学的因子」という用語は、成長因子に限定されない。
【0074】
ヒト間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、ＣＤ４５－／ＣＤ３１－／ＣＤ７３＋／ＣＤ９０＋／ＣＤ１０５＋／ＣＤ４４＋（またはその適切なサブセット）の表面マーカープロファイルによって特徴付けることができる。（Ｂｏｕｒｉｎ ｅｔ ａｌ、Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ１５（６）：６４１－６４８（２０１３）を参照）。さらに、適切な幹細胞は、単離時にＣＤ３４＋陽性を示すが、培養中にこのマーカーを失う。したがって、本出願に従って使用され得る１つの幹細胞タイプの完全なマーカープロファイルは、ＣＤ４５－／ＣＤ３１－／ＣＤ７３＋／ＣＤ９０＋／ＣＤ１０５＋を含む。マウス幹細胞を利用する別の実施形態では、幹細胞は、ＣＤ３４の代わりにＳｃａ－１マーカーによって特徴付けられ、残りのマーカーは同じままで、上記のヒト細胞と相同であると思われるものを定義する。
【0075】
「馴化培地」または「ＣＭ」という句は、ＭＳＣによって分泌される生物学的因子を含む培地を指す。これは、本明細書では「セクレトーム」、「ＭＳＣ－ＣＭ」、「ＭＳＣセクレトーム」及び／または「ＭＳＣ由来セクレトーム」と呼ばれることもある。また、ＭＳＣによって分泌される生物学的因子を含み、例えば、濾過、精製、及び／または濃縮手順によってさらに処理された、処理された「馴化培地」も提供される。「馴化培地」は、本明細書に詳細に記載されるように、培地中で幹細胞を培養し、幹細胞及びそれらの分泌された幹細胞産物（セクレトーム）を含む得られた培地を、生物学的因子及び分離前に存在していた数よりも少ない幹細胞を含む馴化培地に分離することによって得られる。馴化培地は、本明細書に記載の方法で使用することができ、幹細胞を実質的に含まない（わずかな割合の幹細胞を含み得る）か、または幹細胞を含まない。馴化培地に存在し得る生物学的因子には、タンパク質（例えば、サイトカイン、ケモカイン、成長因子、酵素）、核酸（例えば、ｍｉＲＮＡ）、脂質（例えば、リン脂質）、多糖類、及び／またはそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。これらの生物学的因子の任意の組み合わせは、細胞外小胞（例えば、エクソソーム）の内部または表面に結合するか、または細胞外小胞から分離することができる。
【0076】
Ｂ．組成物及び配合物
本発明は、そのような治療における使用のための、フィブロネクチンを含む組成物、任意選択で、フィブロネクチン（ＦＮ）に非共有結合で付加されている１つ以上の成長因子、及びそのような組成物の作製方法を提供することによってこのニーズを満たす。
本発明は、そのような治療における使用のための、フィブロネクチンを含む組成物、任意選択で、フィブロネクチン（ＦＮ）に非共有結合で付加されている１つ以上の成長因子、及びそのような組成物の作製方法を提供することによってこのニーズを満たす。
【0077】
いくつかの実施形態では、ＦＮは、幹細胞由来である。
【0078】
いくつかの実施形態では、ＦＮは、ＭＳＣ由来のＦＮである。
【0079】
いくつかの実施形態では、ＦＮは、ＭＳＣが分泌したＦＮである。
【0080】
いくつかの実施形態では、ＦＮは、細胞性ＦＮである。いくつかの実施形態では、本発明の細胞性ＦＮは、選択的スプライシングバリアント／アイソフォーム（ＥＤＡ、ＥＤＢ、及びＶ＋など）の混合物である。いくつかの実施形態では、細胞性ＦＮは、ＥＤＡ＋である。いくつかの実施形態では、細胞性ＦＮは、ＥＤＢ＋である。いくつかの実施形態では、細胞性ＦＮは、ＥＤＡ＋及びＥＤＢ＋である。いくつかの実施形態では、細胞性フィブロネクチンは、Ｖ＋である。
【0081】
いくつかの実施形態では、細胞性ＦＮは、細胞由来のＦＮであり、ＦＮは、１つ以上の成長因子に非共有結合で付加されている。
【0082】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物は、馴化培地から得られる。いくつかの実施形態では、馴化培地は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の培養物から得られる。
【0083】
いくつかの実施形態では、ＦＮの含む組成物は、ＭＳＣセクレトーム（処理されたＭＳＣセクレトームを含む）に由来する。
【0084】
いくつかの実施形態では、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）セクレトームを含む馴化培地及び／または間葉系幹細胞（ＭＳＣ）セクレトーム（処理されたＭＳＣセクレトームを含む）を含む組成物が本明細書で提供される。
【0085】
いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、０．１ｎｇ／ｍＬ～１５０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、０．１ｎｇ／ｍＬ～１４０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、０．１ｎｇ／ｍＬ～１３０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、約１３５，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、０．１ｎｇ／ｍＬ～１２０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、０．１ｎｇ／ｍＬ～１１０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、０．１ｎｇ／ｍＬ～１００，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、０．１ｎｇ／ｍＬ～９０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、０．１ｎｇ／ｍＬ～８０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、０．１ｎｇ／ｍＬ～７０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、０．１ｎｇ／ｍＬ～６０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、０．１ｎｇ／ｍＬ～５０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、０．１ｎｇ／ｍＬ～４０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、０．１ｎｇ／ｍＬ～３０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、０．１ｎｇ／ｍＬ～２０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、０．１ｎｇ／ｍＬ～１０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、０．１ｎｇ／ｍＬ～９，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、０．１ｎｇ／ｍＬ～８，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、０．１ｎｇ／ｍＬ～７，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、０．１ｎｇ／ｍＬ～６，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、０．１ｎｇ／ｍＬ～５，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、０．１ｎｇ／ｍＬ～４，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、０．１ｎｇ／ｍＬ～３，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、５０ｎｇ／ｍＬ～１５０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、５０ｎｇ／ｍＬ～１４０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、５０ｎｇ／ｍＬ～１３０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、約１３５，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、５０ｎｇ／ｍＬ～１２０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、５０ｎｇ／ｍＬ～１１０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、５０ｎｇ／ｍＬ～１００，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、５０ｎｇ／ｍＬ～９０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、５０ｎｇ／ｍＬ～８０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、５０ｎｇ／ｍＬ～７０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、５０ｎｇ／ｍＬ～６０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、５０ｎｇ／ｍＬ～５０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、５０ｎｇ／ｍＬ～４０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、５０ｎｇ／ｍＬ～３０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、５０ｎｇ／ｍＬ～２０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、５０ｎｇ／ｍＬ～１０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、５０ｎｇ／ｍＬ～９，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、５０ｎｇ／ｍＬ～８，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、５０ｎｇ／ｍＬ～７，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、５０ｎｇ／ｍＬ～６，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、５０ｎｇ／ｍＬ～５，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、５０ｎｇ／ｍＬ～４，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、５０ｎｇ／ｍＬ～３，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。
【0086】
いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、５００ｎｇ／ｍＬ～１５０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、５００ｎｇ／ｍＬ～１４０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、５００ｎｇ／ｍＬ～１３０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、約１３５，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、５００ｎｇ／ｍＬ～１２０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、５００ｎｇ／ｍＬ～１１０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、５００ｎｇ／ｍＬ～１００，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、５００ｎｇ／ｍＬ～９０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、５００ｎｇ／ｍＬ～８０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、５００ｎｇ／ｍＬ～７０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、５００ｎｇ／ｍＬ～６０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、５００ｎｇ／ｍＬ～５０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、５００ｎｇ／ｍＬ～４０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、５００ｎｇ／ｍＬ～３０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、５００ｎｇ／ｍＬ～２０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、５００ｎｇ／ｍＬ～１０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、５００ｎｇ／ｍＬ～９，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、５００ｎｇ／ｍＬ～８，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、５００ｎｇ／ｍＬ～７，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、５００ｎｇ／ｍＬ～６，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、５００ｎｇ／ｍＬ～５，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、５００ｎｇ／ｍＬ～４，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、５００ｎｇ／ｍＬ～３，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。
【0087】
いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、１０００ｎｇ／ｍＬ～１５０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、１０００ｎｇ／ｍＬ～１４０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、１０００ｎｇ／ｍＬ～１３０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、約１３５，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、１０００ｎｇ／ｍＬ～１２０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、１０００ｎｇ／ｍＬ～１１０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、１０００ｎｇ／ｍＬ～１００，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、１０００ｎｇ／ｍＬ～９０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、１０００ｎｇ／ｍＬ～８０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、１０００ｎｇ／ｍＬ～７０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、１０００ｎｇ／ｍＬ～６０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、１０００ｎｇ／ｍＬ～５０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、１０００ｎｇ／ｍＬ～４０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、１０００ｎｇ／ｍＬ～３０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、１０００ｎｇ／ｍＬ～２０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、１０００ｎｇ／ｍＬ～１０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、１０００ｎｇ／ｍＬ～９，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、１０００ｎｇ／ｍＬ～８，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、１０００ｎｇ／ｍＬ～７，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、１０００ｎｇ／ｍＬ～６，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、１０００ｎｇ／ｍＬ～５，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、１０００ｎｇ／ｍＬ～４，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、１０００ｎｇ／ｍＬ～３，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。
【0088】
いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、５０～５０００ｎｇ／ｍＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、５０～４０００ｎｇ／ｍＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、１００～４０００ｎｇ／ｍＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、１５０～３５００ｎｇ／ｍＬのＦＮを含む。
【0089】
いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、１０００～７０，０００ｎｇ／ｍＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、５００～５０，０００ｎｇ／ｍＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、１０００～４０，０００ｎｇ／ｍＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、１５００～３５，０００ｎｇ／ｍＬのＦＮを含む。
【0090】
いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、約０．５～５０ｇ／ｍＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、５～４５ｎｇ／ｍＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、１０～４０ｎｇ／ｍＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、１５～３５ｎｇ／ｍＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、２０～３０ｎｇ／ｍＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、細胞性ＦＮ組成物は、約２５ｎｇ／ｍＬのＦＮを含む。
【0091】
いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、１つ以上の成長因子をさらに含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の成長因子を含むＦＮ組成物は、ＭＳＣセクレトームに由来する。いくつかの実施形態では、組成物中の細胞性ＦＮは、１つ以上の成長因子に付加されている。いくつかの実施形態では、ＦＮは、１つ以上の成長因子に非共有結合で付加されている。いくつかの実施形態では、１つ以上の成長因子は、ＦＧＦ（ＦＧＦ－２（線維芽細胞増殖因子－２とも称される）など）、ＰＤＧＦ（血小板由来増殖因子とも称される）、ＨＧＦ（肝細胞増殖因子とも称される）、ＶＥＧＦ、ＴＧＦβ１（ＴＧＦベータ１またはトランスフォーミング増殖因子β１とも称される）、ＴＧＦβ２（ＴＧＦベータ２またはトランスフォーミング増殖因子β２とも称される）、ＩＧＦ－１（インスリン増殖因子１とも称される）、ＩＧＦ－２（インスリン増殖因子２とも称される）、ＮＧＦ（神経成長因子とも称される）、ニューロトロフィン、及びＥＧＦ（上皮成長因子とも称される）からなる群から選択される。
【0092】
いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、ＦＧＦをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＦＧＦは、ＦＧＦ－２である。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、ＦＧＦ－２をさらに含む。
【0093】
いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、ＰＤＧＦをさらに含む。いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも約０．１ｎｇ／ｍＬのＰＤＧＦをさらに含む。
【0094】
いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、ＨＧＦをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、０．１～１０ｎｇ／ｍＬまたは２．０＋／－０．３ｎｇ／ｍＬのＨＧＦを含む。
【0095】
いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、ＶＥＧＦをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦは、約１００～８００ｐｇ／ｍＬまたは３０４＋／－４４ｐｇ／ｍＬの濃度にある。
【0096】
いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、ＴＧＦβ１をさらに含む。
【0097】
いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、ＴＧＦβ２をさらに含む。
【0098】
いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、ＩＧＦ－１、ＩＧＦ－２、及びＥＧＦをさらに含む。
【0099】
いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、ＩＧＦ－２をさらに含む。
【0100】
いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、ＮＧＦをさらに含む。
【0101】
いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、ニューロトロフィンをさらに含む。
【0102】
いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、ＥＧＦをさらに含む。
【0103】
いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、約ｐＨ４．５～約ｐＨ８のｐＨで配合される。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、約ｐＨ４．７～約ｐＨ７．８のｐＨで配合される。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、約ｐＨ５．０～約ｐＨ７．５のｐＨで配合される。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、約ｐＨ５．５～約ｐＨ７．５のｐＨで配合される。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、約ｐＨ６～約ｐＨ７．５のｐＨで配合される。
【0104】
いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、約ｐＨ４．５、約ｐＨ５．０、約ｐＨ５．５、約ｐＨ６．０、約ｐＨ６．５、約ｐＨ７．０、約ｐＨ７．４、約ｐＨ８．０のｐＨで配合される。いくつかの実施形態では、細胞性ＦＮ組成物は、約ｐＨ４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、または８．０のｐＨで配合される。
【0105】
いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、特定の成分を含まない。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、細胞培地に見られる特定の成分を含まない。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、生体異物成分（例えば、動物血清）；フェノールレッド；ペプチド及び生体分子＜３ｋＤａ；抗生物質；タンパク質凝集体（例えば、タンパク質凝集体＞２００ｎｍ）；細胞；細胞破片（細胞破片にはエクソソーム／細胞外小胞（ＥＶ）は含まれない；例えば、非エクソソーム、非ＥＶ細胞破片）；ホルモン（例えば、ホルモンにはインスリン及び／またはヒドロコルチゾンが含まれるが、これらに限定されない）；及び／またはＬ－グルタミンからなる群から選択される１つ以上の成分を含まない。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、生体異物成分を含まない。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物はフェノールレッドを含まない。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、３ｋＤａ未満のペプチド及び生体分子を含まない。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は抗生物質を含まない。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、タンパク質凝集体（例えば、２００ｎｍを超えるタンパク質凝集体）を含まない。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は細胞を含まない。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、細胞破片を含まない（細胞破片は、エクソソーム／ＥＶを含まない；例えば、非エクソソーム、非ＥＶ細胞破片）。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、ホルモンを含まない（例えば、ホルモンは、インスリン及び／またはヒドロコルチゾンを含むが、これらに限定されない）。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、Ｌ－グルタミンを含まない。
【0106】
いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、マンニトール、ラクトース、ソルビトール、キシリトール、スクロース、トレハロース、マンノース、マルトース、ラクトース、グルコース、ラフィノース、セロビオース、ゲンチオビオース、イソマルトース、アラビノース、グルコサミン、フルクトース、デキストロース、及び／またはそれらの組み合わせをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、リン酸塩をさらに含む。いくつかの実施形態では、リン酸塩源は、リン酸ナトリウムまたはリン酸カリウムである。いくつかの実施形態では、リン酸塩源はリン酸ナトリウムである。いくつかの実施形態では、リン酸塩源はリン酸カリウムである。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、モノリン酸ナトリウム／ジリン酸ナトリウム、マンニトール、及びトレハロースをさらに含み、組成物は、約ｐＨ７．４のｐＨを有する。
【0107】
いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、グリシン、グリセロール、塩化ナトリウム、塩化カリウム、及び／またはデキストロースを含むがこれらに限定されない１つ以上の追加の薬剤を含むことができる。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、グリシン、グリセロール、塩化ナトリウム、塩化カリウム、及びデキストロースからなる群から選択される１つ以上の追加の薬剤を含むことができる。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、グリシン及びグリセロール、ならびにデキストロースからなる群から選択される１つ以上の追加の薬剤を含むことができる。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、塩化ナトリウム及び塩化カリウムからなる群から選択される１つ以上の追加の薬剤を含むことができる。
【0108】
いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、緩衝系において配合される。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、リン酸二／一ナトリウム、クエン酸ナトリウム／クエン酸、クエン酸／クエン酸ナトリウム、ホウ酸／四ホウ酸ナトリウム、及び／またはクエン酸／リン酸二ナトリウムを含むがこれらに限定されない緩衝系で配合される。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、リン酸二／一ナトリウム、クエン酸ナトリウム／クエン酸、ホウ酸／クエン酸ナトリウム、ホウ酸／四ホウ酸ナトリウム、及び／またはクエン酸／リン酸二ナトリウムからなる群から選択される緩衝系において配合される。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、リン酸二／一ナトリウム緩衝液系で配合される。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、クエン酸ナトリウム／クエン酸緩衝液系で配合される。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、ホウ酸／クエン酸ナトリウム緩衝系で配合される。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、ホウ酸／四ホウ酸ナトリウム緩衝系で配合される。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、クエン酸／リン酸二ナトリウム緩衝液系で配合される。
【0109】
いくつかの実施形態では、リン酸塩源は、リン酸ナトリウムまたはリン酸カリウムである。いくつかの実施形態では、リン酸塩源はリン酸ナトリウムである。いくつかの実施形態では、リン酸塩源はリン酸カリウムである。いくつかの実施形態では、細胞性ＦＮ組成物は、リン酸二ナトリウム／クエン酸、マンニトール、及びトレハロースを含み、組成物は、約ｐＨ６．４のｐＨを有する。
【0110】
いくつかの実施形態では、細胞性ＦＮ組成物は、張性調整剤または張性改変剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、張性調整剤または張性改変剤は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、マンニトール、デキストロース、スクロース、ソルビトール、及び／またはグリセリンを含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、張性調整剤または張性改変剤は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、マンニトール、デキストロース、スクロース、ソルビトール、及び／またはグリセリンからなる群から選択される。
【0111】
いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、接着剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、ヒプロメロース、ポロキサマー４０７、ポロキサマー１８８、ポロキソマー２３７、ポロキソマー３３８、ヒプロメロース（ＨＰＭＣ）、ＨＥＣ，ポリカルボフィル、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ＰＶＡ（ポリビニルアルコール）、ポリイミド、ヒアルロン酸ナトリウム、ジェランガム、ポリ（乳酸－コ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリシロキサン、ポリイミド、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、またはヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、フィブリン接着剤、ポリエチレングリコール、及びＧｅｌＣＯＲＥを含むが、これらに限定されない接着剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、接着剤はヒプロメロースである。いくつかの実施形態では、接着剤はフィブリン接着剤である。いくつかの実施形態では、接着剤はポリエチレングリコールである。いくつかの実施形態では、接着剤はＧｅｌＣＯＲＥである（Ｓａｎｉ，ｅｔ ａｌ．，ＳｃｉｅｎｃｅＡｄｖａｎｃｅｓ，Ｖｏｌ．５，ｎｏ．３（２０１９）を参照）。
【0112】
いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、（ａ）本明細書に記載の方法のいずれか１つによって生成されるＭＳＣセクレトームを含む処理された馴化培地、及び（ｂ）ポリマーを含む。いくつかの実施形態では、細胞性ＦＮ組成物は、本明細書に記載されるように生成されるＭＳＣセクレトームを含む馴化培地及びポリマーを含む。いくつかの実施形態では、細胞性ＦＮ組成物は、本明細書に記載されるように生成されるＭＳＣセクレトームを含む処理された馴化培地及びポリマーを含む。いくつかの実施形態では、ポリマーは、組成物成分が放出され得る生分解性ポリマーであり得る。いくつかの実施形態では、ポリマーは、成分の持続的（遅い）放出を可能にする。
【0113】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＦＮ組成物は、治療用包帯の形態である（例えば、細胞性ＦＮ組成物を含浸させたポリマー）。治療用包帯は、用途に応じて、必要に応じて構成することができる。いくつかの実施形態では、包帯は、形態またはパッチであるか、またはメッシュとして構成される。
【0114】
いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、生体浸透度、例えば、眼への浸透、角膜への浸透、及び／または角膜への浸透を示す。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、眼によって吸収される能力を示す。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、固有の生体浸透度を示す。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、賦形剤対応の生体浸透度を示す。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、より小さな因子のアップレギュレーションによる生体浸透度を示す。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、生物保存剤の存在による生体浸透度を示す。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、生物保存性塩化ベンザルコニウムの存在による生物浸透度を示す。
【0115】
いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、他の治療と比較して、長い半減期を示す、及び／または増加した安定性を有する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される細胞性ＦＮ組成物は、ＭＳＣセクレトームの安定性の増加を可能にするタンパク質のアップレギュレーションを可能にする。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される細胞性ＦＮ組成物は、シャペロンタンパク質をアップレギュレートして、ＭＳＣセクレトーム内の他のタンパク質の安定性を改善することを可能にする。
【0116】
いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、それを必要とする対象に投与された場合、超効力を示す。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、１日１滴または１回の投与で治療効果を可能にする。
【0117】
Ｃ．生産／製造の方法
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される細胞性ＦＮは、細胞によって馴化培地に分泌される。いくつかの実施形態では、細胞は、幹細胞（間葉系幹細胞など）である。いくつかの実施形態では、馴化培地は、細胞性ＦＮ組成物を得る上で望ましくない構成要素を除去するためにさらに処理される。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される細胞性ＦＮは、細胞によって馴化培地に分泌される。いくつかの実施形態では、細胞は、幹細胞（間葉系幹細胞など）である。いくつかの実施形態では、馴化培地は、細胞性ＦＮ組成物を得る上で望ましくない構成要素を除去するためにさらに処理される。
【0118】
いくつかの実施形態では、細胞性ＦＮ組成物（したがって、間葉系幹細胞分泌因子）の由来元である馴化培地は、治療される患者または個体（それを必要とする患者）または別の（ドナー）個体から採取された間葉系幹細胞、すなわち若いかつ／または健康なドナー及び／または商業的に得られた間葉系幹細胞から得ることができる。例えば、治療される個体（自家幹細胞）またはドナー（同種異系幹細胞）から得られたＭＳＣを使用して、本明細書に記載の馴化培地を生成することができ、その後、本明細書に記載の細胞性ＦＮ組成物にさらに処理することができる。
【0119】
本発明によれば、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）セクレトームを作製する方法は、
ｉ．最初の培地で間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を培養することと、
ｉｉ．ステップ（ｉ）からの最初の培地をＭＳＣから取り除くことと、
ｉｉｉ．ステップ（ｉｉ）のＭＳＣを洗浄することと、
ｉｖ．２番目の培地を追加し、約１～５日間培養することと、
ｖ．ステップ（ｉｖ）からの第２の培地を馴化培地として収穫することと、
ｖｉ．ステップ（ｖ）の馴化培地を本明細書に記載のＭＳＣセクレトーム組成物に処理することと、を含む。
ｉ．最初の培地で間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を培養することと、
ｉｉ．ステップ（ｉ）からの最初の培地をＭＳＣから取り除くことと、
ｉｉｉ．ステップ（ｉｉ）のＭＳＣを洗浄することと、
ｉｖ．２番目の培地を追加し、約１～５日間培養することと、
ｖ．ステップ（ｉｖ）からの第２の培地を馴化培地として収穫することと、
ｖｉ．ステップ（ｖ）の馴化培地を本明細書に記載のＭＳＣセクレトーム組成物に処理することと、を含む。
【0120】
いくつかの実施形態では、培養は、細胞を培養するためのバイオリアクターシステムを使用して実施することができる。いくつかの実施形態では、培養は、幹細胞を培養するためのバイオリアクターシステムを使用して実施することができる。いくつかの実施形態では、培養は、間葉系幹細胞を培養するためのバイオリアクターシステムを使用して実施することができる。いくつかの実施形態では、培養は、培地混合技術を使用して実施することができる。いくつかの実施形態では、培養は、ＰＢＳＶｅｒｔｉｃａｌＷｈｅｅｌ（商標）混合技術（ＰＢＳ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．から商業的に利用可能である）を使用して実施することができる。
【0121】
いくつかの実施形態では、ステップ（ｉｖ）において、ステップ（ｖ）の馴化培地をセクレトーム組成物に処理することは、
ａ）ステップ（ｖ）から採取した馴化培地を濾過して細胞粒子を除去することと、
ｂ）ステップ（ａ）からの濾過された馴化培地を濃縮することと、
ｃ）製剤緩衝液と緩衝液交換することと、
を含む。
ａ）ステップ（ｖ）から採取した馴化培地を濾過して細胞粒子を除去することと、
ｂ）ステップ（ａ）からの濾過された馴化培地を濃縮することと、
ｃ）製剤緩衝液と緩衝液交換することと、
を含む。
【0122】
いくつかの実施形態では、ステップｃ）は、リン酸二／一ナトリウム、クエン酸ナトリウム／クエン酸、ホウ酸／クエン酸ナトリウム、ホウ酸／四ホウ酸ナトリウム、及びクエン酸／リン酸二ナトリウムからなる群から選択される緩衝系と緩衝液交換することを含む。
【0123】
いくつかの実施形態では、濾過ステップ（ａ）は、０．４５μｍフィルター、０．２２μｍフィルター、０．８μｍフィルター、及び０．６５ミクロン、低タンパク質結合ＰＶＤＦ膜、及び／またはＰＥＳ（ポリエーテルスルホン）の使用を含む。いくつかの実施形態では、濾過ステップ（ａ）は、０．４５μｍのフィルターの使用を含む。いくつかの実施形態では、濾過ステップ（ａ）は、０．２２μｍフィルターの使用を含む。いくつかの実施形態では、濾過ステップ（ａ）は、０．８μｍフィルターの使用を含む。いくつかの実施形態では、フィルタリングステップ（ａ）は、０．６５ミクロンの使用を含む。いくつかの実施形態では、濾過ステップ（ａ）は、低タンパク質結合ＰＶＤＦ膜の使用を含む。いくつかの実施形態では、濾過工程（ａ）は、ＰＥＳ（ポリエーテルスルホン）の使用を含む。
【0124】
いくつかの実施形態では、濃縮ステップ（ｂ）は、中空繊維フィルター、接線流濾過システム、または遠心分離ベースのサイズ排除技術を使用することを含む。いくつかの実施形態では、濃縮ステップ（ｂ）は、中空繊維フィルター技術を使用することを含む。いくつかの実施形態では、濃縮ステップ（ｂ）は、タンジェンシャルフロー濾過システムを使用することを含む。いくつかの実施形態では、濃縮ステップ（ｂ）は、遠心分離ベースのサイズ排除技術を使用することを含む。
【0125】
いくつかの実施形態では、遠心分離ベースのサイズ排除技術は、３～１０ｋＤａのＭＷカットオフを使用する。いくつかの実施形態では、遠心分離ベースのサイズ排除技術は、少なくとも３ｋＤａＭＷカットオフ、少なくとも４ｋＤａＭＷカットオフ、少なくとも５ｋＤａＭＷカットオフ、少なくとも６ｋＤａＭＷカットオフ、少なくとも７ｋＤａＭＷカットオフ、少なくとも８ｋＤａＭＷカットオフ、少なくとも９ｋＤａＭＷカットオフ、少なくとも１０ｋＤａＭＷカットオフ、少なくとも１１ｋＤａＭＷカットオフ、少なくとも１２ｋＤａＭＷカットオフ、少なくとも１３ｋＤａＭＷカットオフ少なくとも１４ｋＤａＭＷカットオフ、少なくとも１５ｋＤａＭＷカットオフ、少なくとも１６ｋＤａＭＷカットオフ、少なくとも１７ｋＤａＭＷカットオフ、少なくとも１８ｋＤａＭＷカットオフ、少なくとも１９ｋＤａＭＷカットオフ、少なくとも２０ｋＤａＭＷカットオフ、少なくとも２１ｋＤａＭＷカットオフ、少なくとも２２ｋＤａＭＷカットオフ、少なくとも２３ｋＤａＭＷカットオフ、少なくとも２４ｋＤａＭＷカットオフ、少なくとも２５ｋＤａＭＷカットオフ、少なくとも２６ｋＤａＭＷカットオフ、少なくとも２７ｋＤａＭＷカットオフ、少なくとも２８ｋＤａＭＷカットオフ、少なくとも２９ｋＤａＭＷカットオフ、及び／または少なくとも３０ｋＤａＭＷカットオフを使用する。
【0126】
いくつかの実施形態では、本方法は、本明細書で上記に記載されるようなＭＳＣセクレトーム組成物及び／または製剤を生成する。いくつかの実施形態では、第１及び／または第２の培養培地は、ＭＳＣ培地及び／またはＭＳＣ－ＸＦである。
【0127】
ＭＳＣ、またはＭＳＣから分化した細胞は、例えば、本明細書に記載の所望のサイトカイン及び／または所望の治療特性を含む、細胞性ＦＮ及び任意選択の他の所望のセクレトーム成分を含む馴化培地を生成するように作製することができる。例えば、セクレトームは、スーパードナー細胞株のＭＳＣから産生することができる。セクレトームは、商業的に入手したＭＳＣからも産生することができる。来たる実施形態では、同種異系ＭＳＣ（及び／またはそれに由来する細胞）及び／または同種異系ＭＳＣ由来のセクレトーム組成物は、個体の大きなグループのために調製及び保存され得る。同種異系ＭＳＣ（及び／またはそれに由来する細胞）及び／またはＭＳＣ由来のセクレトーム組成物は、人々がそれらを必要とするときに準備ができるように、事前に作製することができる。特定の実施形態では、ＭＳＣ（及び／またはそれに由来する細胞）及び／またはＭＳＣ由来のセクレトーム組成物を処理して、より濃縮された溶液または組成物（例えば、本明細書に記載の間葉系幹細胞由来のセクレトーム組成物またはＭＳＣセクレトーム組成物）を製造することができる。
【0128】
いくつかの実施形態では、最初の培養培地及び第１の培養培地は異なる。いくつかの実施形態では、最初の培地及び第１の培地は同じである。本発明によるＭＳＣセクレトームを含む馴化培地を産生するためにＭＳＣを培養するのに有用な細胞培養培地または培地の非限定的な例には、ｈＭＳＣ Ｍｅｄｉａ Ｂｏｏｓｔｅｒ ＸＦＭ、ｈＭＳＣ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉａ、Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ（ＭＥＭＥ）、ＡＤＣ－１，ＬＰＭ（Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ非含有）、Ｆ１０（ＨＡＭ）、Ｆ１２（ＨＡＭ）、ＤＣＣＭ１、ＤＣＣＭ２、ＲＰＭＩ１６４０、ＢＧＪＭｅｄｉｕｍ（Ｆｉｔｔｏｎ－ＪａｃｋｓｏｎＭｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ有り及び無し）、ＳｔｅｍＰｒｏ、ＭＳＣＧｒｏ、ＭｅｓｅｎＣｕｌｔ、ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ、ＢａｓａｌＭｅｄｉｕｍＥａｇｌｅ（ＢＭＥ－Ｅａｒｌｅ’ｓｓａｌｔｂａｓｅの追加有り）、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ－血清有りまたは無し）、Ｙａｍａｎｅ、ＩＭＥＭ－２０、Ｇｌａｓｇｏｗ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（ＧＭＥＭ）、ＬｅｉｂｏｖｉｔｚＬ－１５ Ｍｅｄｉｕｍ、ＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ Ｍｅｄｉｕｍ、Ｍｅｄｉｕｍ Ｍ１９９（Ｍ１９９Ｅ－Ｅａｒｌｅ’ｓｓａｌｅｂａｓｅ有り）、Ｍｅｄｉｕｍ Ｍ１９９（Ｍ１９９Ｈ－Ｈａｎｋ’ｓｓａｌｔｂａｓｅ有り）、Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ａｌｐｈａ（ＭＥＭ－アルファ）、Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ（ＭＥＭ－Ｅ－Ｅａｒｌｅ’ｓｓａｌｔｂａｓｅ有り）、ＭｉｎｉｍｕｍＥｓｓｅｎｔｉａｌＭｅｄｉｕｍＥａｇｌｅ（ＭＥＭ－Ｈ－Ｈａｎｋ’ｓｓａｌｔｂａｓｅ有り）及びＭｉｎｉｍｕｍＥｓｓｅｎｔｉａｌＭｅｄｉｕｍＥａｇｌｅ（ＭＥＭ－ＮＡＡ欠アミノ酸有り）が挙げられるが、とりわけ、培地１９９、ＣＭＲＬ１４１５、ＣＭＲＬ１９６９、ＣＭＲＬ１０６６、ＮＣＴＣ１３５、ＭＢ７５２６１、ＭＡＢ８７１３、ＤＭ１４５、Ｗｉｌｌｉａｍｓ’Ｇ、Ｎｅｕｍａｎ＆Ｔｙｔｅｌｌ、Ｈｉｇｕｃｈｉ、ＭＣＤＢ３０１、ＭＣＤＢ２０２、ＭＣＤＢ５０１、ＭＣＤＢ４０１、ＭＣＤＢ４１１、ＭＤＢＣ１５３が挙げられる。本発明で使用するための好ましい媒体は、ＭＥＭ－アルファである。これら及びその他の有用な培地は、とりわけＧＩＢＣＯ（ＧｒａｎｄＩｓｌａｎｄ，Ｎ．Ｙ．，ＵＳＡ）及びＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｄｕｓｔｒｉｅｓ（ＢｅｔＨａＥｍｅｋ，Ｉｓｒａｅｌｋ）から入手することができる。これらの培地の多くは、Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ＶｏｌｕｍｅＬＶＩＩＩ，“ＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅ”，ｐｐ．６２７２，ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｗｉｌｌｉａｍ Ｂ．Ｊａｋｏｂｙ ａｎｄ Ｉｒａ Ｈ．Ｐａｓｔａｎ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．に要約されている。
【0129】
いくつかの実施形態では、間葉系幹細胞のための細胞培養培地は、無血清培地であり得る。いくつかの実施形態では、間葉系幹細胞のための細胞培養培地は、血清で補充され得る。いくつかの実施形態では、間葉系幹細胞のための細胞培養培地は、補充されたヒト血小板溶解物であり得る。いくつかの実施形態では、血清は、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含み得る。いくつかの実施形態では、間葉系幹細胞のための細胞培養培地は、ウシまたは他の種の胎児血清などの血清を補充することができる。いくつかの実施形態では、間葉系幹細胞のための細胞培養培地は、細胞増殖を促進し、及び／または細胞の健康を促進するために、メルカプトエタノール及び／または抗生物質などの他の成分で補充することができる。いくつかの実施形態では、間葉系幹細胞のための細胞培養培地は、抗生物質が補充されていない。
【0130】
いくつかの実施形態では、酸素の割合は、細胞増殖を促進し、かつ／または細胞の健康を促進するために変動する。いくつかの実施形態では、酸素は、細胞増殖を促進し、かつ／または細胞の健康を促進するために、５％、１０％、１５％、２０％、または２５％の量である。いくつかの実施形態では、間葉系幹細胞は、細胞増殖を促進し、及び／または細胞の健康を促進するために、部分酸素圧下で増殖される。いくつかの実施形態では、間葉系幹細胞は、細胞増殖を促進し、及び／または細胞の健康を促進するために、低酸素分圧環境下で増殖される。
【0131】
一態様では、本発明は、間葉系幹細胞によって分泌される生物学的因子を含む馴化培地（ＣＭ）を対象とし、ＭＳＣセクレトームを含む馴化培地と呼ぶことができる。馴化培地は、本明細書に記載のように、培地中で間葉系幹細胞を培養し、間葉系幹細胞及びそれらの分泌された間葉系幹細胞産物（生物学的因子及び／またはセクレトームと呼ばれる）を含む得られた培地を、馴化培地で増殖したセクレトーム及び間葉系幹細胞を含有する馴化培地の成分部分に分離することによって得ることができる。分離された馴化培地は、間葉系幹細胞セクレトームを含み、本明細書に記載の方法に従ってさらに処理及び／または使用することができ、間葉系幹細胞を実質的に含まない（少量の幹細胞及び／または微量の幹細胞を含み得る）または間葉系幹細胞を含まない。ＭＳＣセクレトームは、ホルモン、サイトカイン、細胞外マトリックス、タンパク質、小胞、抗体、ケモカイン、受容体、抑制剤、顆粒など、さまざまな生物学的因子で構成されている。本明細書に記載されるように、ＭＳＣセクレトームを含む馴化培地または複数の培地（ＣＭまたはＭＳＣセクレトームを含む馴化培地）をさらに処理して、濃縮された馴化培地（ｐＣＭまたは濃縮ＭＳＣセクレトーム）を生成することができる。
【0132】
いくつかの実施形態では、ＭＳＣセクレトームまたは濃縮ＭＳＣセクレトームを含む馴化培地は、間葉系幹細胞が培養された培養培地に代わって、培養培地中で間葉系幹細胞を培養することによって生成される。いくつかの実施形態では、ＭＳＣセクレトームを含む得られた馴化培地は、収穫（回収）され、次いで、濃縮されたＭＳＣセクレトームを生成するために処理される。特定の実施形態では、ＭＳＣセクレトームを含む収穫された馴化培地の処理は、培地のいくつか、ほとんど、または本質的にすべての除去、または馴化培地の選択された成分のいくつか、ほとんど、または本質的にすべての除去を含む。
【0133】
いくつかの実施形態では、ＭＳＣセクレトームを含む収穫された馴化培地は、濃縮されたＭＳＣセクレトームを産生するために濾過される。いくつかの実施形態では、ＭＳＣセクレトームを含む収穫された馴化培地は、濃縮されたＭＳＣセクレトームを産生するために限外濾過される。
【0134】
一態様では、本明細書で提供されるのは、細胞性ＦＮを含む処理された馴化培地を生成する方法であり、本方法は、（ａ）細胞培養培地中で幹細胞を培養し、それにより間葉系幹細胞によって分泌される因子を含む馴化培地（例えば、間葉系幹細胞セクレトームを含む馴化培地）を生成することと、（ｂ）馴化培地を収穫し、それによって収穫された馴化培地（例えば、収穫された間葉系幹細胞セクレトーム）を生成することと、（ｃ）収穫された馴化培地（例えば、収穫された間葉系幹細胞セクレトーム）を濾過して、処理された馴化培地（間葉系幹細胞セクレトーム）を生成することと、を含む。いくつかの実施形態では、（ａ）の幹細胞は、成長因子を含まない培地で培養される前に、増殖培地で培養される（培養されている）。したがって、いくつかの実施形態では、方法は、（ａ）第１の増殖培地中で間葉系幹細胞を培養することと、（ｂ）第１の増殖培地を第２の増殖培地と交換し、第２の増殖培地で幹細胞を培養し、それにより間葉系幹細胞セクレトームを含む馴化培地を生成することと、（ｃ）間葉系幹細胞セクレトームを含む馴化培地を収穫し、それによって間葉系幹細胞セクレトームを含む収穫された馴化培地を生成することと、（ｄ）収穫された馴化培地を濾過して、間葉系幹細胞セクレトームを含む処理された馴化培地を生成することと、を含む。
【0135】
いくつかの実施形態では、幹細胞は間葉系幹細胞である。間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、骨髄や脂肪組織を含むさまざまな成人組織から単離された（由来する）多能性（全てではないが、複数の細胞系譜に分化することができる）非造血性（非血液）幹細胞である。特定の実施形態では、間葉系幹細胞は、骨髄から単離される。「分離される」とは、元の環境から移転された細胞を指す。ＭＳＣは、脂肪細胞、骨芽細胞、軟骨細胞などの中胚葉系細胞に分化し得る。ＭＳＣは細胞プロセスがほとんどない長くて薄い小さな細胞体を有する。細胞体は、核小体が目立つ大きな丸い核を含み、それは細かく分散したクロマチン粒子に囲まれており、核に明確な外観を与えている。細胞体の残りの部分には、少量のゴルジ装置、粗面小胞体、ミトコンドリア、及びポリソームが含まれている。長くて薄い細胞は広く分散しており、隣接する細胞外マトリックスにはいくつかの網状フィブリルが存在するが、他のタイプのコラーゲンフィブリルがない［Ｂｒｉｇｈｔｏｎ、ｅｔ ａｌ。１９９１ Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｏｎｅ ａｎｄ Ｊｏｉｎｔ Ｓｕｒｇｅｒｙ ７３（６）：８３２－４７］。本明細書に記載のＭＳＣは、以下の分子マーカー（細胞または細胞型の原形質膜に特徴的なタンパク質分子）プロファイルを発現し得る：骨形態形成タンパク質受容体「１」（ＢＭＰＲ＋）；ＣＤ３４＋Ｓｃａｌ＋；Ｌｉｎ”；ＣＤ４４＋；ｃ－ｋｉｔ＋；Ｓｃａ－１＋；Ｔｈｙ－１＋；ＮＯＴＣＨ３；ＪＡＧ１；ＩＴＧＡ１１。ＭＳＣは、他の細胞型特異的マーカーを発現する（ｓｔｅｍｃｅｌｌｓ．ｎｉｈ．ｇｏｖ；Ｋａｌｔｚ，ｅｔ ａｌ．２０１０ Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ Ｏｃｔ１；３１６（１６）：２６０９－１７、参照により本明細書に組み込まれる）。本明細書に記載のＭＳＣは、ＭＳＣの多能性分化能（ＭＳＣがどの細胞型に生じるか）を検出するためのコロニー形成単位アッセイに基づいて同定することができる。ただし、ある程度分化した細胞（前駆細胞）も使用することができる。
【0136】
ｉ．ＦＮ組成物－処理
いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物を得るために、本明細書に記載のＭＳＣセクレトームを含む馴化培地は、いくつかの実施形態では、細胞粒子及び／または他の有害な成分を除去するために収集及び濾過及び／または精製することができる。例えば、上記のステップ（ｖ）で説明したように、ステップ（ｉｖ）から第２の培養培地を馴化培地として収穫する。本明細書で使用される濾過膜は、細胞粒子及び／または他の有害な成分を通過させながら、所望のＭＳＣセクレトーム成分を保持することができるように、適切な膜及び構成を有する当技術分野で知られているもののいずれかから選択され得る。したがって、有害な成分が除去のために通過することを可能にしながら、選択された流体力学的条件下で細胞の保持を可能にする任意の適切な膜を使用することができる。いくつかの実施形態では、約５ミクロンの細孔サイズの上限及び約０．１ミクロンの下限が適切であろう。いくつかの実施形態では、濾過は、ミクロ細孔フィルターを使用して実施することができる。いくつかの実施形態では、濾過は、０．５μｍ～０．２μｍのフィルターを使用して実施することができる。いくつかの実施形態では、濾過は、０．５μｍ、０．４５μｍ、０．４μｍ、０．３５μｍ、０．３μｍ、０．２５μｍ、０．２２μｍ及び／または０．２μｍフィルターを使用して実施することができる。いくつかの実施形態では、濾過は、０．４５μｍのフィルターを使用して実施することができる。いくつかの実施形態では、濾過は、０．２２μｍフィルターを使用して実施することができる。いくつかの実施形態では、濾過／精製は、低タンパク質結合ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜を使用して実施することができる。いくつかの実施形態では、濾過／精製は、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）を使用して実施することができる。
いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物を得るために、本明細書に記載のＭＳＣセクレトームを含む馴化培地は、いくつかの実施形態では、細胞粒子及び／または他の有害な成分を除去するために収集及び濾過及び／または精製することができる。例えば、上記のステップ（ｖ）で説明したように、ステップ（ｉｖ）から第２の培養培地を馴化培地として収穫する。本明細書で使用される濾過膜は、細胞粒子及び／または他の有害な成分を通過させながら、所望のＭＳＣセクレトーム成分を保持することができるように、適切な膜及び構成を有する当技術分野で知られているもののいずれかから選択され得る。したがって、有害な成分が除去のために通過することを可能にしながら、選択された流体力学的条件下で細胞の保持を可能にする任意の適切な膜を使用することができる。いくつかの実施形態では、約５ミクロンの細孔サイズの上限及び約０．１ミクロンの下限が適切であろう。いくつかの実施形態では、濾過は、ミクロ細孔フィルターを使用して実施することができる。いくつかの実施形態では、濾過は、０．５μｍ～０．２μｍのフィルターを使用して実施することができる。いくつかの実施形態では、濾過は、０．５μｍ、０．４５μｍ、０．４μｍ、０．３５μｍ、０．３μｍ、０．２５μｍ、０．２２μｍ及び／または０．２μｍフィルターを使用して実施することができる。いくつかの実施形態では、濾過は、０．４５μｍのフィルターを使用して実施することができる。いくつかの実施形態では、濾過は、０．２２μｍフィルターを使用して実施することができる。いくつかの実施形態では、濾過／精製は、低タンパク質結合ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜を使用して実施することができる。いくつかの実施形態では、濾過／精製は、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）を使用して実施することができる。
【0137】
いくつかの実施形態では、濾過は限外濾過による。いくつかの実施形態では、馴化培地は、３ｋＤのフィルターサイズを使用して濾過される（フィルターサイズよりも大きい分子の処理された馴化培地における精製、脱塩、及び濃縮を達成するため）。いくつかの実施形態では、３ｋＤ未満のフィルターサイズが馴化培地を濾過するために使用され、他の実施形態では、処理された馴化培地が使用される用途に応じて、３ｋＤを超えるフィルターサイズが使用される。他の実施形態では、収穫された馴化培地の限外濾過は、得られるＭＳＣセクレトームを含む処理された馴化培地の成分のサイズを決定するために選択された異なる細孔サイズ（例えば、２ｋＤ、２ｋＤ未満または２ｋＤ超）のフィルターを使用して実施される。
【0138】
いくつかの実施形態では、成長支持培地中の有害な成分は、培地交換によって、好ましくは「クロスフロー濾過」を介して除去される。クロスフロー濾過とは、ＭＳＣセクレトーム細胞の懸濁液が、細胞以外の懸濁液の成分を透過するフィルターと実質的に平行に流れる濾過モードを指す。クロスフロー濾過プロセスは、Ｒｅ＝レイノルズ数、γｗ＝壁せん断速度、ΔＰ＝圧力損失、ＴＭＰ＝膜貫通圧力を含む一連の流体力学パラメータによって特徴付けられる。Ｒｅ、γｗ、及びΔＰは、濾過システムの構造、流れの状態、及び流体の特性に依存する。そのようなクロスフロープロセスは、いくつかの実施形態では、中空繊維濾過システムも含むことができる。例えば、米国特許第５０５３３３４を参照されたく、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0139】
いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、濾過の非存在下及び／または濾過後にさらに濃縮される可能性がある。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、中空繊維接線流技術を使用して濃縮することができる。
【0140】
いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、遠心分離ベースのサイズ排除技術を使用して濃縮することができ、例えば、アミコン及び／またはセントリコンを、濃縮ステップ中に使用することができる。いくつかの実施形態では、サイズカットオフは、３～１０ｋＤａのＭＷカットオフである。いくつかの実施形態では、遠心分離ベースのサイズ排除技術濃縮法中に使用するための分子量カットオフは、少なくとも約３ｋＤａ、少なくとも約４ｋＤａ、少なくとも約５ｋＤａ、少なくとも約６ｋＤａ、少なくとも約７ｋＤａ、少なくとも約８ｋＤａ、少なくとも約９ｋＤａ、または少なくとも約１０ｋＤａ、または少なくとも約１５ｋＤａ、または少なくとも約２０ｋＤａ、または少なくとも約２５ｋＤａ、または少なくとも約３０ｋＤａである。
【0141】
いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、約５倍、約１０倍、約１５倍、約２０倍、約２５倍、約３０倍、約３５倍、約４０倍、約４５倍、約５０倍、約５５倍、約６０倍、約６５倍、約７０倍、約７５倍、約８０倍、約８５倍、約９０倍、約９５倍、または約１００倍に濃縮される。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、濃縮前の馴化培地と比較して、約５倍、約１０倍、約１５倍、約２０倍、約２５倍、約３０倍、約３５倍、約４０倍、約４５倍、約５０倍、約５５倍、約６０倍、約６５倍、約７０倍、約７５倍、約８０倍、約８５倍、約９０倍、９５倍、または約１００倍に濃縮される。
【0142】
いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、濃縮ステップの後に、最終製剤緩衝液にさらに緩衝液交換される。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、濃縮（ｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）ステップの後に、接着剤なしで最終製剤緩衝液にさらに緩衝液交換される。いくつかの実施形態では、緩衝液交換は、ＦＮ組成物の緩衝液成分を変更することを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、緩衝液交換ステップ中に希釈されない。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、緩衝液交換ステップ中に、１％未満、５％未満、１０％未満、１５％未満、２０％未満、または２５％未満に希釈される。
【0143】
いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、微量の培養培地成分のすべてが除去されるように、濃縮ステップの後に緩衝液交換される。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約４未満％、約３％未満、約２％未満、または約１％未満、または約０％の培養培地成分が残っているように、濃縮ステップ後に緩衝液交換される。
【0144】
ｉｉ．ＦＮ組成物－配合
いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、０．１ｎｇ／ｍＬ～１５０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、０．１ｎｇ／ｍＬ～１４０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、０．１ｎｇ／ｍＬ～１３０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、約１３５，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、０．１ｎｇ／ｍＬ～１２０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、０．１ｎｇ／ｍＬ～１１０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、０．１ｎｇ／ｍＬ～１００，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、０．１ｎｇ／ｍＬ～９，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、０．１ｎｇ／ｍＬ～８０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、０．１ｎｇ／ｍＬ～７０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、０．１ｎｇ／ｍＬ～７０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、０．１ｎｇ／ｍＬ～６０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、０．１ｎｇ／ｍＬ～５０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、０．１ｎｇ／ｍＬ～４０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、０．１ｎｇ／ｍＬ～３０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、０．１ｎｇ／ｍＬ～２０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、０．１ｎｇ／ｍＬ～１０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、５０～５０００ｎｇ／ｍＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、１００～４０００ｎｇ／ｍＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、１５０～３５００ｎｇ／ｍＬのＦＮを含む。
いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、０．１ｎｇ／ｍＬ～１５０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、０．１ｎｇ／ｍＬ～１４０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、０．１ｎｇ／ｍＬ～１３０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、約１３５，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、０．１ｎｇ／ｍＬ～１２０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、０．１ｎｇ／ｍＬ～１１０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、０．１ｎｇ／ｍＬ～１００，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、０．１ｎｇ／ｍＬ～９，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、０．１ｎｇ／ｍＬ～８０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、０．１ｎｇ／ｍＬ～７０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、０．１ｎｇ／ｍＬ～７０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、０．１ｎｇ／ｍＬ～６０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、０．１ｎｇ／ｍＬ～５０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、０．１ｎｇ／ｍＬ～４０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、０．１ｎｇ／ｍＬ～３０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、０．１ｎｇ／ｍＬ～２０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、０．１ｎｇ／ｍＬ～１０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、５０～５０００ｎｇ／ｍＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、１００～４０００ｎｇ／ｍＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、１５０～３５００ｎｇ／ｍＬのＦＮを含む。
【0145】
いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、５０ｎｇ／ｍＬ～１５０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、５０ｎｇ／ｍＬ～１４０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、５０ｎｇ／ｍＬ～１３０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、約１３５，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、５０ｎｇ／ｍＬ～１２０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、５０ｎｇ／ｍＬ～１１０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、５０ｎｇ／ｍＬ～１００，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、５０ｎｇ／ｍＬ～９０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、５０ｎｇ／ｍＬ～８０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、５０ｎｇ／ｍＬ～７０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、５０ｎｇ／ｍＬ～６０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、５０ｎｇ／ｍＬ～５０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、５０ｎｇ／ｍＬ～４０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、５０ｎｇ／ｍＬ～３０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、５０ｎｇ／ｍＬ～２０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、５０ｎｇ／ｍＬ～１０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、５０ｎｇ／ｍＬ～９，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、５０ｎｇ／ｍＬ～８，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、５０ｎｇ／ｍＬ～７，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、５０ｎｇ／ｍＬ～６，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、５０ｎｇ／ｍＬ～５，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、５０ｎｇ／ｍＬ～４，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、５０ｎｇ／ｍＬ～３，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。
【0146】
いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、５００ｎｇ／ｍＬ～１５０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、５００ｎｇ／ｍＬ～１４０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、５００ｎｇ／ｍＬ～１３０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、約１３５，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、５００ｎｇ／ｍＬ～１２０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、５００ｎｇ／ｍＬ～１１０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、５００ｎｇ／ｍＬ～１００，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、５００ｎｇ／ｍＬ～９０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、５００ｎｇ／ｍＬ～８０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、５００ｎｇ／ｍＬ～７０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、５００ｎｇ／ｍＬ～６０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、５００ｎｇ／ｍＬ～５０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、５００ｎｇ／ｍＬ～４０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、５００ｎｇ／ｍＬ～３０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、５００ｎｇ／ｍＬ～２０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、５００ｎｇ／ｍＬ～１０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、５００ｎｇ／ｍＬ～９，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、５００ｎｇ／ｍＬ～８，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、５００ｎｇ／ｍＬ～７，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、５００ｎｇ／ｍＬ～６，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、５００ｎｇ／ｍＬ～５，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、５００ｎｇ／ｍＬ～４，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、５００ｎｇ／ｍＬ～３，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。
【0147】
いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、１０００ｎｇ／ｍＬ～１５０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、１０００ｎｇ／ｍＬ～１４０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、１０００ｎｇ／ｍＬ～１３０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、約１３５，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、１０００ｎｇ／ｍＬ～１２０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、１０００ｎｇ／ｍＬ～１１０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、１０００ｎｇ／ｍＬ～１００，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、１０００ｎｇ／ｍＬ～９０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、１０００ｎｇ／ｍＬ～８０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、１０００ｎｇ／ｍＬ～７０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、１０００ｎｇ／ｍＬ～６０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、１０００ｎｇ／ｍＬ～５０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、１０００ｎｇ／ｍＬ～４０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、１０００ｎｇ／ｍＬ～３０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、１０００ｎｇ／ｍＬ～２０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、１０００ｎｇ／ｍＬ～１０，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、１０００ｎｇ／ｍＬ～９，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、１０００ｎｇ／ｍＬ～８，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、１０００ｎｇ／ｍＬ～７，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、１０００ｎｇ／ｍＬ～６，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、１０００ｎｇ／ｍＬ～５，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、１０００ｎｇ／ｍＬ～４，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、１０００ｎｇ／ｍＬ～３，０００ｎｇ／ＭＬのＦＮを含む。
【0148】
いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、１０００～７０，０００ｎｇ／ｍＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、５００～５０，０００ｎｇ／ｍＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、１０００～４０，０００ｎｇ／ｍＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、１５００～３５，０００ｎｇ／ｍＬのＦＮを含む。
【0149】
いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、約０．５～５０ｇ／ｍＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、５～４５ｎｇ／ｍＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、１０～４０ｎｇ／ｍＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、１５～３５ｎｇ／ｍＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、２０～３０ｎｇ／ｍＬのＦＮを含む。
【0150】
いくつかの実施形態では、ＦＮは、上に提供される範囲内の任意の適切な値の濃度にある。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、約２０ｎｇ／ｍＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、約２１ｎｇ／ｍＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、約２２ｎｇ／ｍＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、約２３ｎｇ／ｍＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、約２４ｎｇ／ｍＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、約２５ｎｇ／ｍＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、約２６ｎｇ／ｍＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、約２７ｎｇ／ｍＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、約２８ｎｇ／ｍＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、約２９ｎｇ／ｍＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、約３０ｎｇ／ｍＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、約２５ｎｇ／ｍＬのＦＮを含む。
【0151】
いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、約０．５～２０ｎｇ／ｍＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、約３～８ｎｇ／ｍＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、約３ｎｇ／ｍＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、約３．５ｎｇ／ｍＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、４ｎｇ／ｍＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、約４．５ｎｇ／ｍＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、５ｎｇ／ｍＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、約５．５ｎｇ／ｍＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、６ｎｇ／ｍＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、約６．５ｎｇ／ｍＬのＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、７ｎｇ／ｍＬの細胞性ＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、約７．５ｎｇ／ｍＬの細胞性ＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、約８ｎｇ／ｍＬの細胞性ＦＮを含む。
【0152】
いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、約２ｍｇ～３ｍｇ／ｍＬの一塩基性リン酸ナトリウムを含む配合で調製される。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、約４％～５％／ｍＬの一塩基性リン酸ナトリウムを含む配合で調製される。
【0153】
いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、約１１ｍｇ～１２ｍｇ／ｍＬの二塩基性リン酸ナトリウムを含む配合物で調製される。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、約２１．５％～２３％／ｍＬの二塩基性リン酸ナトリウムを含む配合で調製される。
【0154】
いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、約１１．５ｍｇ～１３ｍｇ／ｍＬのマンニトールを含む配合で調製される。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、約２３％～２５％／ｍＬのマンニトールを含む配合で調製される。
【0155】
いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、約２３ｍｇ～２５ｍｇ／ｍＬのトレハロース二水和物を含む配合で調製される。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、約４６％～４８％／ｍＬのトレハロース二水和物を含む配合で調製される。
【0156】
いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、ヒプロメロースを含まない背後で調製される。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、必要に応じてヒプロメロースを含む配合で調製される。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、約０．５ｍｇ～２ｍｇ／ｍＬのヒプロメロースを含む配合で調製される。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、約１％～３％／ｍＬのヒプロメロースを含む配合で調製される。
【0157】
いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、塩酸及び／または水酸化ナトリウムを含む配合で調製される。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、塩酸を含む配合で調製される。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、水酸化ナトリウムを含む配合で調製される。いくつかの実施形態では、塩酸及び／または水酸化ナトリウムは、所望のｐＨを得るために使用される。
【0158】
いくつかの実施形態では、製剤は、ＮａＣｌを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、ＮａＣｌを含まない。いくつかの実施形態では、製剤は、検出可能なレベルのＮａＣｌを含まない。いくつかの実施形態では、製剤は、ＭｇＣｌ２を含む。いくつかの実施形態では、製剤は、ＭｇＣｌ２を含まない。いくつかの実施形態では、製剤は、検出可能なレベルのＭｇＣｌ２を含まない。いくつかの実施形態では、製剤は、ＮａＣｌまたはＭｇＣｌ２のいずれも含まない。いくつかの実施形態では、製剤は、検出可能なレベルのＮａＣｌまたはＭｇＣｌ２のいずれも含まない。
【0159】
いくつかの実施形態では、ＦＮ製剤は、涙液（例えば、天然起源の涙液及び合成涙液または涙液様溶液を含む）と等張性である。
【0160】
いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、以下の表１に提供される成分を含む配合で調製される。
【表1】
【表2】
【0161】
いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、下記のものを含む。
【表3】
【0162】
いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、下記のものを含む。
【表4】
【0163】
いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、ＮａＣｌを含まず、下記のものを含む。
【表5】
【0164】
いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、ＭｇＣｌ２を含まず、下記のものを含む。
【表6】
【0165】
いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、ＮａＣｌまたはＭｇＣｌ２を含まず、下記のものを含む。
【表7】
【0166】
いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、０．５～５０ｎｇ／ｍｌのＦＮ、２．２８ｍｇ／ｍｌの一塩基性リン酸ナトリウム、１０～１２ｍｇ／ｍｌの二塩基性リン酸ナトリウム、１１～１３ｍｇ／ｍｌのマンニトール、２～２５ｍｇ／ｍｌのトレハロース二水和物、及び０．５～２ｍｇ／ｍｌのヒプロメロースを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、ＮａＣｌ及び／またはＭｇＣｌ２を含まない。
【0167】
いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、０．５～５０ｎｇ／ｍｌのＦＮ、２．２８ｍｇ／ｍｌの一塩基性リン酸ナトリウム、１１．４５ｍｇ／ｍｌの二塩基性リン酸ナトリウム、１２．２ｍｇ／ｍｌのマンニトール、２４ｍｇ／ｍｌのトレハロース二水和物、及び１ｍｇ／ｍｌのヒプロメロースを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、ＮａＣｌ及び／またはＭｇＣｌ２を含まない。
【0168】
いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、０．５～５０ｎｇ／ｍｌのＦＮ、１．３１ｍｇ／ｍｌの一塩基性リン酸ナトリウム、４．５～７ｍｇ／ｍｌの二塩基性リン酸ナトリウム、５．５～７．５ｍｇ／ｍｌのマンニトール、１１～１３ｍｇ／ｍｌのトレハロース二水和物、及び０．１～１．５ｍｇ／ｍｌのヒプロメロースを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、ＮａＣｌ及び／またはＭｇＣｌ２を含まない。
【0169】
いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、０．５～５０ｎｇ／ｍｌのＦＮ、１．３１ｍｇ／ｍｌの一塩基性リン酸ナトリウム、５．７３ｍｇ／ｍｌの二塩基性リン酸ナトリウム、６．１ｍｇ／ｍｌのマンニトール、１２ｍｇ／ｍｌのトレハロース二水和物、及び０．５ｍｇ／ｍｌのヒプロメロースを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、ＮａＣｌ及び／またはＭｇＣｌ２を含まない。
【0170】
Ｄ．アッセイ方法／治療特性
本発明のいくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、特定の成分比／濃度ならびにＦＮ組成物の特性を達成するために処理される。
本発明のいくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、特定の成分比／濃度ならびにＦＮ組成物の特性を達成するために処理される。
【0171】
本発明のいくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、特定の効力性能基準を達成するために処理される。いくつかの実施形態では、緩衝液交換ステップは、ＦＮ組成物の効力を増強する。
【0172】
細胞外小胞は、上記の可溶性及び不溶性物質の積荷を運ぶ膜結合粒子である。「細胞外小胞」という用語は、様々な種の分泌または脱落した小胞のグループを指す。これらは一般に次のサブタイプに分類される：１）通常５０～１５００ｎｍのサイズ範囲を示す微小胞またはＳｈｅｄ微小胞、２）通常３０～１２０ｎｍのサイズ範囲を示すエクソソーム、３）典型的には５００ｎｍ未満（すなわち、＜５００ｎｍ）のサイズ範囲を示す小胞。（例えば、ＷＯ２０１９０１６７９９を参照されたく、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は粒子計数のために及び／またはセクレトームに存在する細胞外小胞（ＥＶ）を定量するために分析することができる。
【0173】
いくつかの実施形態では、ＥＶは、約２．５×１０＾５／ｕＬ、２．６×１０＾５／ｕＬ、２．７×１０＾５／ｕＬ、２．８×１０＾５／ｕＬ、２．９×１０＾５／ｕＬ、３．０ｘ１０＾５／ｕＬ、３．１ｘ１０＾５／ｕＬ、３．２ｘ１０＾５／ｕＬ、３．３ｘ１０＾５／ｕＬ、３．４ｘ１０＾５／ｕＬ、３．５ｘ１０＾５／ｕＬ、３．６ｘ１０＾５／ｕＬ、３．７ｘ１０＾５／ｕＬ、３．８ｘ１０＾５／ｕＬ、３．９ｘ１０＾５／ｕＬ、４．０ｘ１０＾５／ｕＬ、４．１ｘ１０＾５／ｕＬ、４．２ｘ１０＾５／ｕＬ、４．３ｘ１０＾５／ｕＬ、４．４ｘ１０＾５／ｕＬ、４．５ｘ１０＾５／ｕＬ、４．６ｘ１０＾５／ｕＬ、４．７ｘ１０＾５／ｕＬ、４．８ｘ１０＾５／ｕＬ、４．９ｘ１０＾５／ｕＬ、または約５．０ｘ１０＾５／ｕＬの濃度で存在する。いくつかの実施形態では、ＥＶは、約３．８ｘ１０＾５／ｕＬ＋／－０．８ｘ１０＾５の濃度で存在する。
【0174】
いくつかの実施形態では、ＥＶは、約２．５×１０＾５／ｕＬ、２．６×１０＾５／ｕＬ、２．７×１０＾５／ｕＬ、２．８×１０＾５／ｕＬ、２．９×１０＾５／ｕＬ、３．０ｘ１０＾５／ｕＬ、３．１ｘ１０＾５／ｕＬ、３．２ｘ１０＾５／ｕＬ、３．３ｘ１０＾５／ｕＬ、３．４ｘ１０＾５／ｕＬ、３．５ｘ１０＾５／ｕＬ、３．６ｘ１０＾５／ｕＬ、３．７ｘ１０＾５／ｕＬ、３．８ｘ１０＾５／ｕＬ、３．９ｘ１０＾５／ｕＬ、４．０ｘ１０＾５／ｕＬ、４．１ｘ１０＾５／ｕＬ、４．２ｘ１０＾５／ｕＬ、４．３ｘ１０＾５／ｕＬ、４．４ｘ１０＾５／ｕＬ、４．５ｘ１０＾５／ｕＬ、４．６ｘ１０＾５／ｕＬ、４．７ｘ１０＾５／ｕＬ、４．８ｘ１０＾５／ｕＬ、４．９ｘ１０＾５／ｕＬ、または約５．０ｘ１０＾５／ｕＬの濃度で存在し、直径は平均１１０～１２０ｎｍである。いくつかの実施形態では、ＥＶは、約２．５×１０＾５／ｕＬ、２．６×１０＾５／ｕＬ、２．７×１０＾５／ｕＬ、２．８×１０＾５／ｕＬ、２．９×１０＾５／ｕＬ、３．０ｘ１０＾５／ｕＬ、３．１ｘ１０＾５／ｕＬ、３．２ｘ１０＾５／ｕＬ、３．３ｘ１０＾５／ｕＬ、３．４ｘ１０＾５／ｕＬ、３．５ｘ１０＾５／ｕＬ、３．６ｘ１０＾５／ｕＬ、３．７ｘ１０＾５／ｕＬ、３．８ｘ１０＾５／ｕＬ、３．９ｘ１０＾５／ｕＬ、４．０ｘ１０＾５／ｕＬ、４．１ｘ１０＾５／ｕＬ、４．２ｘ１０＾５／ｕＬ、４．３ｘ１０＾５／ｕＬ、４．４ｘ１０＾５／ｕＬ、４．５ｘ１０＾５／ｕＬ、４．６ｘ１０＾５／ｕＬ、４．７ｘ１０＾５／ｕＬ、４．８ｘ１０＾５／ｕＬ、４．９ｘ１０＾５／ｕＬ、または約５．０ｘ１０＾５／ｕＬの濃度で存在し、直径は平均１１２～１１６ｎｍである。いくつかの実施形態では、ＥＶは、約２．５×１０＾５／ｕＬ、２．６×１０＾５／ｕＬ、２．７×１０＾５／ｕＬ、２．８×１０＾５／ｕＬ、２．９×１０＾５／ｕＬ、３．０ｘ１０＾５／ｕＬ、３．１ｘ１０＾５／ｕＬ、３．２ｘ１０＾５／ｕＬ、３．３ｘ１０＾５／ｕＬ、３．４ｘ１０＾５／ｕＬ、３．５ｘ１０＾５／ｕＬ、３．６ｘ１０＾５／ｕＬ、３．７ｘ１０＾５／ｕＬ、３．８ｘ１０＾５／ｕＬ、３．９ｘ１０＾５／ｕＬ、４．０ｘ１０＾５／ｕＬ、４．１ｘ１０＾５／ｕＬ、４．２ｘ１０＾５／ｕＬ、４．３ｘ１０＾５／ｕＬ、４．４ｘ１０＾５／ｕＬ、４．５ｘ１０＾５／ｕＬ、４．６ｘ１０＾５／ｕＬ、４．７ｘ１０＾５／ｕＬ、４．８ｘ１０＾５／ｕＬ、４．９ｘ１０＾５／ｕＬ、または約５．０ｘ１０＾５／ｕＬの濃度で存在し、直径は平均１１４ｎｍである。いくつかの実施形態では、ＥＶは、約３．８×１０＾５／ｕＬ＋／－０．８×１０＾５の濃度で存在し、直径は平均１１４ｎｍである。
【0175】
ｉｉｉ．ＦＮ組成物－治療特性
いくつかの実施形態では、本発明のＦＮ組成物は、細胞性ＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、細胞性ＦＮを含む。いくつかの実施形態では、本発明の細胞性ＦＮは、選択的スプライシングバリアント／アイソフォーム（ＥＤＡ、ＥＤＢ、及びＶ＋など）の混合物である。いくつかの実施形態では、細胞性ＦＮは、ＥＤＡ＋である。いくつかの実施形態では、細胞性ＦＮは、ＥＤＢ＋である。いくつかの実施形態では、細胞性ＦＮは、ＥＤＡ＋及びＥＤＢ＋である。いくつかの実施形態では、細胞性フィブロネクチンは、Ｖ＋である。
いくつかの実施形態では、本発明のＦＮ組成物は、細胞性ＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、細胞性ＦＮを含む。いくつかの実施形態では、本発明の細胞性ＦＮは、選択的スプライシングバリアント／アイソフォーム（ＥＤＡ、ＥＤＢ、及びＶ＋など）の混合物である。いくつかの実施形態では、細胞性ＦＮは、ＥＤＡ＋である。いくつかの実施形態では、細胞性ＦＮは、ＥＤＢ＋である。いくつかの実施形態では、細胞性ＦＮは、ＥＤＡ＋及びＥＤＢ＋である。いくつかの実施形態では、細胞性フィブロネクチンは、Ｖ＋である。
【0176】
いくつかの実施形態では、本開示のＦＮ組成物は、１つ以上の成長因子をさらに含む。
【0177】
いくつかの実施形態では、本開示のＦＮ組成物は、例えば、抗血管新生特性（血管及び／またはリンパ管）、抗線維化特性、抗炎症特性、細胞の遊走、増殖、細胞接着、伸展、生存、ならびに細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の構築及び構造を促進する特性、分裂促進特性、抗酸化ストレス／損傷特性を含む、様々な治療特性を示す。
【0178】
いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、抗線維化特性を示す。いくつかの実施形態では、そのような抗線維化特性は、標準的なアッセイを使用するためにアッセイされ得る。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物に関する様々な因子及び／または活性の存在は、抗線維化特性を示している。いくつかの実施形態では、抗線維化特性を示す因子には、ＦＧＦ（ＦＧＦ－２など）、ＰＤＧＦ、ＨＧＦ、ＶＥＧＦ、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＩＧＦ－１、ＩＧＦ－２、ＮＧＦ、ニューロトロフィン、及びＥＧＦからなる群から選択される１つ以上の成長因子が含まれる。
【0179】
いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、抗炎症特性を示す。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は炎症を抑制する。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、炎症を５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％（例えば、炎症の完全な減少）抑制する。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、肥満細胞の脱顆粒を防止する。
【0180】
いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、例えば、分裂促進及び運動促進活性を含む、細胞の遊走及び増殖を促進する。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物はマイトジェン活性を促進する。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、運動原性活性を促進する。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、ＦＧＦ（ＦＧＦ－２など）、ＰＤＧＦ、ＨＧＦ、ＶＥＧＦ、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＩＧＦ－１、ＩＧＦ－２、ＮＧＦ、ニューロトロフィン、及びＥＧＦからなる群から選択される１つ以上の成長因子をさらに含み、これらは、ＦＮ組成物の追加の細胞遊走活性及び細胞増殖活性を与える。
【0181】
いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、ＦＧＦ（ＦＧＦ－２など）をさらに含み、これは、ＦＮ組成物の追加の細胞遊走活性及び細胞増殖活性を与える。
【0182】
いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、ＨＧＦをさらに含み、これは、ＦＮ組成物の追加の細胞遊走活性及び細胞増殖活性を与える。
【0183】
いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、抗アポトーシス剤をさらに含み、これは、ＦＮ組成物の細胞遊走活性及び細胞増殖活性を与える。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、抗アポトーシス剤（限定されないが、ＦＧＦ－２、ＨＧＦ、及びＩＧＦ－１を含む）を含み、これは、ＦＮ組成物の追加の細胞遊走活性及び細胞増殖活性を与える。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、ＦＧＦ－２、ＨＧＦ、及びＩＧＦ－１からなる群から選択される抗アポトーシス剤を含み、これは、ＦＮ組成物の追加の細胞遊走活性及び細胞増殖活性を与える。
【0184】
ｉｖ．ＦＮ組成物－生物物理学的／生化学的特性
生化学的及び生物物理学的特徴付け：
いくつかの実施形態では、本発明は、ＦＮ組成物の特徴付けのための方法を提供する。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物の特徴付けには、１）ＦＮ組成物中の分子実体の包括的及び／または定量的マッピングすることと、２）生物活性に対する選択された要因の寄与を測定することと、３）生物物理学的パラメータを測定することと、を含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物の特性を決定するために、本明細書に記載されるように、ＦＮ組成物に対して様々な有効性アッセイを実施することができる。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、ＦＮ組成物における分子実体の包括的及び／または定量的マッピング、２）生物活性に対する選択された要因の寄与の測定、３）生物物理学的パラメータの測定に供され得る。いくつかの実施形態では、特徴付けアッセイは、生物物理学的アッセイ、生化学的アッセイ、及びバイオアッセイを含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、特徴付けアッセイは、物理的成分の特徴付け、酸化ストレスアッセイ、安全性分析、安定性アッセイ、増殖アッセイ、遊走アッセイ、血管新生アッセイ、分化／瘢痕化アッセイ、炎症アッセイ、及び／または上皮バリア完全性アッセイを含み得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、特徴付けアッセイは、物理的成分の特徴付け、酸化ストレスアッセイ、安全性分析、安定性アッセイ、増殖アッセイ、遊走アッセイ、血管新生アッセイ、分化／瘢痕化アッセイ、炎症アッセイ、及び／または上皮バリア完全性アッセイからなる群から選択される。
生化学的及び生物物理学的特徴付け：
いくつかの実施形態では、本発明は、ＦＮ組成物の特徴付けのための方法を提供する。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物の特徴付けには、１）ＦＮ組成物中の分子実体の包括的及び／または定量的マッピングすることと、２）生物活性に対する選択された要因の寄与を測定することと、３）生物物理学的パラメータを測定することと、を含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物の特性を決定するために、本明細書に記載されるように、ＦＮ組成物に対して様々な有効性アッセイを実施することができる。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、ＦＮ組成物における分子実体の包括的及び／または定量的マッピング、２）生物活性に対する選択された要因の寄与の測定、３）生物物理学的パラメータの測定に供され得る。いくつかの実施形態では、特徴付けアッセイは、生物物理学的アッセイ、生化学的アッセイ、及びバイオアッセイを含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、特徴付けアッセイは、物理的成分の特徴付け、酸化ストレスアッセイ、安全性分析、安定性アッセイ、増殖アッセイ、遊走アッセイ、血管新生アッセイ、分化／瘢痕化アッセイ、炎症アッセイ、及び／または上皮バリア完全性アッセイを含み得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、特徴付けアッセイは、物理的成分の特徴付け、酸化ストレスアッセイ、安全性分析、安定性アッセイ、増殖アッセイ、遊走アッセイ、血管新生アッセイ、分化／瘢痕化アッセイ、炎症アッセイ、及び／または上皮バリア完全性アッセイからなる群から選択される。
【0185】
物理的成分の特徴付け：
いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物の特徴付けは、生物分析技術の組み合わせを使用する方法を含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物の特徴付けは、ＦＮ組成物の物理的成分を決定することを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物の特徴付けは、タンパク質アレイ、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、質量分析、及びイムノブロッティングの使用を含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物の特徴付けを使用して、ＦＮ組成物内の分子を同定することができる。いくつかの実施形態では、タンパク質アレイは、ＦＮ組成物における因子を同定するために使用され得る。いくつかの実施形態では、質量分析は、ＦＮ組成物における１つ以上の因子の存在を決定するために使用され得る。いくつかの実施形態では、１つ以上の因子のレベルを測定するために定量的技術を使用することができる。いくつかの実施形態では、ＥＬＩＳＡなどの定量的技術を使用して、各因子のレベルを測定することができる。
いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物の特徴付けは、生物分析技術の組み合わせを使用する方法を含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物の特徴付けは、ＦＮ組成物の物理的成分を決定することを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物の特徴付けは、タンパク質アレイ、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、質量分析、及びイムノブロッティングの使用を含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物の特徴付けを使用して、ＦＮ組成物内の分子を同定することができる。いくつかの実施形態では、タンパク質アレイは、ＦＮ組成物における因子を同定するために使用され得る。いくつかの実施形態では、質量分析は、ＦＮ組成物における１つ以上の因子の存在を決定するために使用され得る。いくつかの実施形態では、１つ以上の因子のレベルを測定するために定量的技術を使用することができる。いくつかの実施形態では、ＥＬＩＳＡなどの定量的技術を使用して、各因子のレベルを測定することができる。
【0186】
いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、細胞性ＦＮを含む。いくつかの実施形態では、本発明の細胞性ＦＮは、選択的スプライシングバリアント／アイソフォーム（ＥＤＡ、ＥＤＢ、及びＶ＋など）の混合物である。いくつかの実施形態では、細胞性ＦＮは、ＥＤＡ＋である。いくつかの実施形態では、細胞性ＦＮは、ＥＤＢ＋である。いくつかの実施形態では、細胞性ＦＮは、ＥＤＡ＋及びＥＤＢ＋である。いくつかの実施形態では、細胞性フィブロネクチンは、Ｖ＋である。
【0187】
いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、タンパク質因子及び細胞外小胞（ＥＶ）を含むＭＳＣセクレトームを含む。いくつかの実施形態では、細胞性ＦＮ組成物は栄養因子を含む。
【0188】
いくつかの実施形態では、セクレトームは、３０～２００ｎｍの範囲のサイズの細胞外小胞（ＥＶ）及び１ｍＬあたり１ｘ１０８～５ｘ１０９のＥＶを含む。
【0189】
いくつかの実施形態では、枯渇研究を実施して、重要な因子の個々の寄与を抽出することができる。いくつかの実施形態では、抗体ベースのプルダウン法を使用して、定義された因子をＦＮ組成物から除去することができる。いくつかの実施形態では、枯渇は、ウエスタンブロットによって検証され得、次いで、以下に記載されるように、１つ以上のバイオアッセイによって評価され得る。いくつかの実施形態では、枯渇研究を実施して、タンパク質画分及びＥＶ画分の寄与を評価することができる。
【0190】
酸化ストレス：
いくつかの実施形態では、酸化ストレス防止アッセイは、ＦＮ組成物に対して実施され得る。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、角膜上皮の損傷を防止する。いくつかの実施形態では、細胞性ＦＮ組成物は、炎症の存在を減少させる。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、抗炎症マーカーの存在の増加によって決定されるように、炎症の存在を減少させる。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、例えば、ＩＬ－８などの抗炎症マーカーの存在の増加によって決定されるように、炎症の存在を減少させる。
いくつかの実施形態では、酸化ストレス防止アッセイは、ＦＮ組成物に対して実施され得る。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、角膜上皮の損傷を防止する。いくつかの実施形態では、細胞性ＦＮ組成物は、炎症の存在を減少させる。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、抗炎症マーカーの存在の増加によって決定されるように、炎症の存在を減少させる。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、例えば、ＩＬ－８などの抗炎症マーカーの存在の増加によって決定されるように、炎症の存在を減少させる。
【0191】
安全性の特徴付け：
いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、血液適合性について評価され、無菌性ならびにパイロジェン及びエンドトキシンレベルについての試験を実施することができる。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、血液適合性を評価することができる。いくつかの実施形態では、血液適合性の評価には、溶血及び血球凝集のアッセイが含まれる。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、全身曝露で有害な影響を示さない。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、重度の眼の火傷などの全身曝露で有害な影響を示さない。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は血球凝集活性を示さない。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は溶血を誘発しない。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は溶血活性を誘発しない。
いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、血液適合性について評価され、無菌性ならびにパイロジェン及びエンドトキシンレベルについての試験を実施することができる。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、血液適合性を評価することができる。いくつかの実施形態では、血液適合性の評価には、溶血及び血球凝集のアッセイが含まれる。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、全身曝露で有害な影響を示さない。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、重度の眼の火傷などの全身曝露で有害な影響を示さない。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は血球凝集活性を示さない。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は溶血を誘発しない。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は溶血活性を誘発しない。
【0192】
いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、それが製剤の一部として投与することができるように無菌であり得る。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、エンドトキシンを含まないか、または実質的に含まないものであり得る。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、微生物を含まないか、または実質的に含まないものであり得る。
【0193】
安定性：
いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物の生物物理学的特性を評価及び／または決定することができる。いくつかの実施形態では、蛍光、静的光散乱、及び動的光散乱が、タンパク質の安定性測定基準を特徴付ける。いくつかの実施形態では、セクレトームをさらに特徴付けるために、以下のパラメータを測定することができる：熱融解、熱凝集、デルタＧ、及び／または粘度。いくつかの実施形態では、熱融解アッセイを使用して、ＦＮ組成物の安定性を決定する。いくつかの実施形態では、熱凝集アッセイを使用して、ＦＮ組成物の安定性を決定する。いくつかの実施形態では、デルタＧが、ＦＮ組成物の安定性を決定するための尺度として使用される。いくつかの実施形態では、粘度は、ＦＮ組成物特性として測定される。いくつかの実施形態では、粘度は、ＦＮ組成物の安定性を決定するものである。
いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物の生物物理学的特性を評価及び／または決定することができる。いくつかの実施形態では、蛍光、静的光散乱、及び動的光散乱が、タンパク質の安定性測定基準を特徴付ける。いくつかの実施形態では、セクレトームをさらに特徴付けるために、以下のパラメータを測定することができる：熱融解、熱凝集、デルタＧ、及び／または粘度。いくつかの実施形態では、熱融解アッセイを使用して、ＦＮ組成物の安定性を決定する。いくつかの実施形態では、熱凝集アッセイを使用して、ＦＮ組成物の安定性を決定する。いくつかの実施形態では、デルタＧが、ＦＮ組成物の安定性を決定するための尺度として使用される。いくつかの実施形態では、粘度は、ＦＮ組成物特性として測定される。いくつかの実施形態では、粘度は、ＦＮ組成物の安定性を決定するものである。
【0194】
いくつかの実施形態では、生物物理学的測定基準を使用して、異なるＦＮ組成物製剤を特徴付けるための安定性パラメータを確立することができる。
【0195】
いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、－２０℃、４℃、及び室温（２０℃）で、少なくとも７日間安定である。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、－２０℃、４℃、及び室温（２０℃）で少なくとも１４日間安定である。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、少なくとも７日間、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、または少なくとも１ヶ月間安定である。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、約－２０℃で少なくとも７日間、少なくとも１４日間、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも１ヶ月、少なくとも２ヶ月、または少なくとも３ヶ月間安定である。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、約４℃で少なくとも７日間、少なくとも１４日間、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、または少なくとも１ヶ月間安定である。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、約２０℃（または室温）で少なくとも７日間、少なくとも１４日間、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、または少なくとも１ヶ月間安定である。
【0196】
いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、約－２０℃で少なくとも７日間安定である。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、約４℃で少なくとも７日間安定である。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、約２０℃で少なくとも７日間安定である。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、約２５℃（室温）で少なくとも７日間安定である。
【0197】
いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、約－２０℃で少なくとも１４日間安定である。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、約４℃で少なくとも１４日間安定である。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、約２０℃（または室温）で少なくとも１４日間安定である。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、約２５℃（室温）で少なくとも１４日間安定である。
【0198】
上皮バリア完全性アッセイ
角膜上皮、より正確には、上皮の頂端表面は、角膜の全体的なバリア特性に大きく貢献しており、角膜バリアへの変化は、生体適合性分析の敏感な要因となる。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物の生物物理学的特徴は、上皮バリア完全性アッセイなどによって評価及び／または決定され得る。いくつかの実施形態では、上皮バリア完全性アッセイは、経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）である。いくつかの実施形態では、経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）を評価して、全体的なバリア特性を測定することができる。いくつかの実施形態では、３Ｄ組織は、２ｍＬのＴＥＥＲ緩衝液を含む２４ウェルプレートに移され、１０分間インキュベートされ得る。いくつかの実施形態では、ＴＥＥＲは、上皮ボルトオームメーターＥＶＯＭＯ及びＥｎｄＯｈｍ－１２チャンバー（ＷｏｒｌｄＰｒｅｃｉｓｉｏｎ，Ｓａｒａｓｏｔａ，ＦＬ）を使用して測定することができる。いくつかの実施形態では、手順の最後に、組織は、以下の式を使用して組織生存率評価に使用することができる。
％バリア完全性＝１００ｘ［ＴＥＥＲ（処理組織）／ＴＥＥＲ（プラセボ対照）］
角膜上皮、より正確には、上皮の頂端表面は、角膜の全体的なバリア特性に大きく貢献しており、角膜バリアへの変化は、生体適合性分析の敏感な要因となる。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物の生物物理学的特徴は、上皮バリア完全性アッセイなどによって評価及び／または決定され得る。いくつかの実施形態では、上皮バリア完全性アッセイは、経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）である。いくつかの実施形態では、経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）を評価して、全体的なバリア特性を測定することができる。いくつかの実施形態では、３Ｄ組織は、２ｍＬのＴＥＥＲ緩衝液を含む２４ウェルプレートに移され、１０分間インキュベートされ得る。いくつかの実施形態では、ＴＥＥＲは、上皮ボルトオームメーターＥＶＯＭＯ及びＥｎｄＯｈｍ－１２チャンバー（ＷｏｒｌｄＰｒｅｃｉｓｉｏｎ，Ｓａｒａｓｏｔａ，ＦＬ）を使用して測定することができる。いくつかの実施形態では、手順の最後に、組織は、以下の式を使用して組織生存率評価に使用することができる。
％バリア完全性＝１００ｘ［ＴＥＥＲ（処理組織）／ＴＥＥＲ（プラセボ対照）］
【0199】
いくつかの実施形態では、ＴＥＥＲを使用して、ＦＮ組成物の局所適用後のバリアの完全性に対する効果を評価することができる。いくつかの実施形態では、ＴＥＥＲは、ＥｐｉＣｏｒｎｅａｌ組織モデル（ＭａｔＴｅｋＣｏｒｐ）を利用して、ナイトロジェンマスタード（ＮＭ）への局所曝露によって引き起こされる角膜上皮損傷後のＦＮ組成物の局所適用後のバリア完全性に対する効果を評価するために使用され得る。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、実施例６に記載されるように、例えば、６μｇ／ｍＬ（プラセボ溶液で希釈された）で局所的に適用され得る。いくつかの実施形態では、ＥｐｉＣｏｒｎｅａｌ組織を５ｍｌの培地で標準的な培養条件で２４時間培養した。
【0200】
バイオアッセイ
いくつかの実施形態では、バイオアッセイが、ＦＮ組成物を特徴付けるために使用され得る。いくつかの実施形態では、バイオアッセイは、角膜創傷治癒に関連し得る：上皮細胞の遊走及び増殖、間質細胞の分化（例えば、瘢痕化）、血管新生、及び炎症。いくつかの実施形態では、バイオアッセイは、角膜創傷治癒を媒介するＦＮ組成物の能力を評価するために使用され得る：上皮細胞の遊走及び増殖、間質細胞の分化（瘢痕化）、血管新生及び炎症。いくつかの実施形態では、本明細書で提供及びアッセイされるＦＮ組成物は、細胞性ＦＮを含む。いくつかの実施形態では、本発明の細胞性ＦＮは、選択的スプライシングバリアント／アイソフォーム（ＥＤＡ、ＥＤＢ、及び／またはＶ＋など）の混合物である。いくつかの実施形態では、細胞性ＦＮは、ＥＤＡ＋である。いくつかの実施形態では、細胞性ＦＮは、ＥＤＢ＋である。いくつかの実施形態では、細胞性ＦＮは、ＥＤＡ＋及びＥＤＢ＋である。いくつかの実施形態では、細胞性フィブロネクチンは、Ｖ＋である。
いくつかの実施形態では、バイオアッセイが、ＦＮ組成物を特徴付けるために使用され得る。いくつかの実施形態では、バイオアッセイは、角膜創傷治癒に関連し得る：上皮細胞の遊走及び増殖、間質細胞の分化（例えば、瘢痕化）、血管新生、及び炎症。いくつかの実施形態では、バイオアッセイは、角膜創傷治癒を媒介するＦＮ組成物の能力を評価するために使用され得る：上皮細胞の遊走及び増殖、間質細胞の分化（瘢痕化）、血管新生及び炎症。いくつかの実施形態では、本明細書で提供及びアッセイされるＦＮ組成物は、細胞性ＦＮを含む。いくつかの実施形態では、本発明の細胞性ＦＮは、選択的スプライシングバリアント／アイソフォーム（ＥＤＡ、ＥＤＢ、及び／またはＶ＋など）の混合物である。いくつかの実施形態では、細胞性ＦＮは、ＥＤＡ＋である。いくつかの実施形態では、細胞性ＦＮは、ＥＤＢ＋である。いくつかの実施形態では、細胞性ＦＮは、ＥＤＡ＋及びＥＤＢ＋である。いくつかの実施形態では、細胞性フィブロネクチンは、Ｖ＋である。
【0201】
いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、創傷治癒（眼の創傷治癒など）を促進する能力について評価され得る。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、増殖及び遊走を促進する能力について評価され得る。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、増殖を促進する能力について評価され得る。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、遊走を促進する能力について評価され得る。
【0202】
いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、細胞性ＦＮを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、増殖及び／または遊走を促進する。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、眼の創傷治癒を促進する。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、増殖を促進する。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、遊走を促進する。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、細胞接着を促進する。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、細胞伸展を促進する。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、細胞の生存を促進する。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の適切な構築及び／または構造を促進する。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、スクラッチアッセイを使用して評価することで、治癒促進能力が決定され得る。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、トランスウェル遊走アッセイを使用して評価して、増殖促進能力を決定することができる。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、トランスウェル遊走アッセイを使用して評価することで、遊走促進能力が決定され得る。
【0203】
スクラッチアッセイ
いくつかの実施形態では、本発明のアッセイは、「スクラッチアッセイ」（「スクラッチ創傷アッセイ」、「スクラッチ創傷閉鎖アッセイ」、「創傷閉鎖アッセイ」、または「創傷治癒アッセイ」とも呼ばれる）を含み得る。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は遊走を促進し、この遊走の促進は、「スクラッチアッセイ」を利用して決定及び／または検査される。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は増殖を促進し、この増殖の促進は、スクラッチアッセイを利用して決定及び／または検査される。一般に、スクラッチアッセイ法は、「スクラッチ」とも呼ばれる人工ギャップが集密的な細胞単層で発生することに基づく。「スクラッチ」は、新しく作成されたギャップの端にあるセルが開口部に向かって遊走して「スクラッチ」を閉じる／覆うかどうかを監視することができる。例えば、Ｌｉａｎｇ，Ｃ．，Ｐａｒｋ，Ａ．＆ Ｇｕａｎ，Ｊ．Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｓｃｒａｔｃｈ ａｓｓａｙ：ａ ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔ ａｎｄ ｉｎｅｘｐｅｎｓｉｖｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｅｌｌ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ．Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ ２，３２９－３３３（２００７））を参照されたい。いくつかの実施形態では、スクラッチアッセイは、創傷治癒を誘導する能力を有する候補のスクリーニングに用いられる。
いくつかの実施形態では、本発明のアッセイは、「スクラッチアッセイ」（「スクラッチ創傷アッセイ」、「スクラッチ創傷閉鎖アッセイ」、「創傷閉鎖アッセイ」、または「創傷治癒アッセイ」とも呼ばれる）を含み得る。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は遊走を促進し、この遊走の促進は、「スクラッチアッセイ」を利用して決定及び／または検査される。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は増殖を促進し、この増殖の促進は、スクラッチアッセイを利用して決定及び／または検査される。一般に、スクラッチアッセイ法は、「スクラッチ」とも呼ばれる人工ギャップが集密的な細胞単層で発生することに基づく。「スクラッチ」は、新しく作成されたギャップの端にあるセルが開口部に向かって遊走して「スクラッチ」を閉じる／覆うかどうかを監視することができる。例えば、Ｌｉａｎｇ，Ｃ．，Ｐａｒｋ，Ａ．＆ Ｇｕａｎ，Ｊ．Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｓｃｒａｔｃｈ ａｓｓａｙ：ａ ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔ ａｎｄ ｉｎｅｘｐｅｎｓｉｖｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｅｌｌ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ．Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ ２，３２９－３３３（２００７））を参照されたい。いくつかの実施形態では、スクラッチアッセイは、創傷治癒を誘導する能力を有する候補のスクリーニングに用いられる。
【0204】
一実施形態例では、本明細書で提供されるスクラッチアッセイは、
（ａ）細胞の層を提供するステップと、
（ｂ）細胞の層に創傷ギャップ／スクラッチを導入するステップと、
（ｃ）被検組成物の存在下で創傷ギャップが治癒／閉鎖するかどうかを決定するステップであって、ステップ（ｂ）の前または後のいずれかに組成物を細胞に投与し、創傷ギャップの閉鎖が、被検組成物が眼の創傷治癒を誘導する能力を有することを示す、決定するステップと、
を含む。
（ａ）細胞の層を提供するステップと、
（ｂ）細胞の層に創傷ギャップ／スクラッチを導入するステップと、
（ｃ）被検組成物の存在下で創傷ギャップが治癒／閉鎖するかどうかを決定するステップであって、ステップ（ｂ）の前または後のいずれかに組成物を細胞に投与し、創傷ギャップの閉鎖が、被検組成物が眼の創傷治癒を誘導する能力を有することを示す、決定するステップと、
を含む。
【0205】
いくつかの実施形態では、スクラッチアッセイは、角膜細胞に用いられる。いくつかの実施形態では、アッセイされる細胞は、哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、アッセイされる細胞は、ヒト細胞である。いくつかの実施形態では、スクラッチアッセイは、網膜細胞に用いられる。いくつかの実施形態では、スクラッチアッセイは、上皮細胞に用いられる。いくつかの実施形態では、スクラッチアッセイは、角膜実質細胞に用いられる。いくつかの実施形態では、スクラッチアッセイは、線維芽細胞に用いられる。いくつかの実施形態では、スクラッチアッセイは、視神経細胞に用いられる。いくつかの実施形態では、スクラッチアッセイは、神経節細胞に用いられる。いくつかの実施形態では、スクラッチアッセイは、網膜色素上皮細胞に用いられる。いくつかの実施形態では、スクラッチアッセイは、網膜色素上皮細胞に用いられる。いくつかの実施形態では、スクラッチアッセイは、水晶体上皮細胞に用いられる。いくつかの実施形態では、スクラッチアッセイは、虹彩色素上皮細胞に用いられる。いくつかの実施形態では、スクラッチアッセイは、結膜線維芽細胞に用いられる。いくつかの実施形態では、スクラッチアッセイは、非色素毛様体上皮細胞に用いられる。いくつかの実施形態では、スクラッチアッセイは、線維柱帯細胞に用いられる。いくつかの実施形態では、スクラッチアッセイは、眼球脈絡膜線維芽細胞に用いられる。いくつかの実施形態では、スクラッチアッセイは、結膜上皮細胞に用いられる。
【0206】
いくつかの実施形態では、アッセイされる細胞は、１つ以上のスクラッチ（「ギャップ」または「創傷」とも称される）が導入される時点で集密的な層を形成している。いくつかの実施形態では、アッセイされる細胞の集密的な層は単層である。
【0207】
いくつかの実施形態では、１つ以上のスクラッチが細胞に導入される。いくつかの実施形態では、単一のスクラッチが導入される。いくつかの実施形態では、複数のスクラッチが細胞に導入される。いくつかの実施形態では、１つ以上のスクラッチは、細胞に化学的に導入される。いくつかの実施形態では、１つ以上のスクラッチは、化学熱傷を介して細胞に導入される。いくつかの実施形態では、１つ以上のスクラッチは、既製薬または化合物を介して導入される。一実施形態例では、化学熱傷はアルカリ熱傷である。別の実施形態例では、化学熱傷はナイトロジェンマスタードガス熱傷である。いくつかの実施形態では、１つ以上のスクラッチは、細胞の層を機械的に破壊することによって細胞に導入される。いくつかの実施形態では、１つ以上のスクラッチは、熱ショックによって導入される。いくつかの実施形態では、１つ以上のスクラッチは、レーザーパルスを介して導入される。
【0208】
いくつかの実施形態では、細胞に導入されるスクラッチは、直線状スクラッチを含む。いくつかの実施形態では、細胞に導入されるスクラッチは、クロスハッチ状スクラッチを含む。いくつかの実施形態では、細胞に導入されるスクラッチは、円形スクラッチを含む。いくつかの実施形態では、細胞に導入されるスクラッチは、ジグザグ状スクラッチを含む。いくつかの実施形態では、細胞に導入されるスクラッチは、上述の形状を１つ以上組み合わせたものを含む。
【0209】
いくつかの実施形態では、導入されるスクラッチのサイズ（すなわち、創傷／スクラッチの両側に存在する遊走前線を分離する横断長）は約０．０１ｍｍ～１０ｍｍである。いくつかの実施形態では、スクラッチのサイズは、約０．０１ｍｍ～０．１ｍｍ、約０．１ｍｍ～１ｍｍ、約１ｍｍ～１０ｍｍ、またはこれらの範囲内の任意の適切な値である。
【0210】
いくつかの実施形態では、被検試薬／組成物は、１つ以上のスクラッチが導入された後に細胞に投与される。いくつかの実施形態では、被検試薬／組成物は、１つ以上のスクラッチが導入される前に細胞に投与される。いくつかの実施形態では、被検試薬／組成物はＦＮ組成物である。いくつかの実施形態では、被検試薬／組成物は馴化培地である。いくつかの実施形態では、被検試薬／組成物はバイオポリマー（タンパク質など）である。いくつかの実施形態では、被検試薬／組成物は１つ以上の活性化合物の医薬組成物である。いくつかの実施形態では、被検試薬／組成物は、それが眼の創傷治癒を促進する能力についてスクリーニングされる。
【0211】
いくつかの実施形態では、被検試薬／組成物は、細胞に投与される前に濃縮される。いくつかの実施形態では、被検試薬／組成物は、細胞に投与される前に希釈される。いくつかの実施形態では、被検試薬／組成物は、細胞に投与される前に精製（緩衝液交換など）される。いくつかの実施形態では、被検試薬／組成物は、細胞に投与される前に凍結乾燥される。いくつかの実施形態では、細胞に投与される被検試薬／組成物は、約１０～１００μｇ／ｍＬの活性成分を含む。いくつかの実施形態では、細胞に投与される被検試薬／組成物は、約１０～１００μｇ／ｍＬのタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、細胞に投与される被検試薬／組成物は、約１０～９０μｇ／ｍＬのタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、細胞に投与される被検試薬／組成物は、約２０～８０μｇ／ｍＬのタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、細胞に投与される被検試薬／組成物は、約３０～７０μｇ／ｍＬのタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、細胞に投与される被検試薬／組成物は、約４０～６０μｇ／ｍＬのタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、細胞に投与される被検試薬／組成物は、約４５μｇ／ｍＬのタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、細胞に投与される被検試薬／組成物は、約５０μｇ／ｍＬのタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、細胞に投与される被検試薬／組成物は、約５５μｇ／ｍＬのタンパク質を含む。
【0212】
いくつかの実施形態では、１つ以上のスクラッチの閉鎖は、被検試薬が眼の創傷治癒を促進する能力を有することを示す。いくつかの実施形態では、１つ以上のスクラッチの閉鎖は、被検試薬が細胞増殖を促進する能力を有することを示す。いくつかの実施形態では、１つ以上のスクラッチの閉鎖は、被検試薬が細胞遊走を促進する能力を有することを示す。いくつかの実施形態では、スクラッチの閉鎖は、スクラッチに遊走した細胞の総数として特徴付けられる。いくつかの実施形態では、スクラッチに遊走した細胞の総数は、染色（比色分析または蛍光分析）を行ってまたは行わずに物理的な計数（画像解析ソフトウェア）によって測定される。いくつかの実施形態では、スクラッチに遊走した細胞の総数を吸光度ベースまたは蛍光分析ベースの方法によって測定することで、スクラッチ中の細胞量が分光学的に定量化される。いくつかの実施形態では、スクラッチの閉鎖は、創傷閉鎖の割合またはそれとは別の数学的な値として特徴付けられ、すなわち、最初の創傷表面積から、ある特定の時点の残存スクラッチ表面積を引いたものを、最初のスクラッチ表面積によって割ったものとして特徴付けられる。いくつかの実施形態では、スクラッチの閉鎖は、残存スクラッチ面積の割合として特徴付けられ、すなわち、全体割合から創傷閉鎖の割合を引いたものとして特徴付けられる。いくつかの実施形態では、スクラッチの閉鎖は、スクラッチのサイズ（すなわち、創傷の両側に存在する遊走前線を分離する横断長）として特徴付けられる。いくつかの実施形態では、画像解析ソフトウェアを用いることで、遊走するスクラッチ前線（または境界）を確立し、残存するスクラッチの距離（ピクセル、ｕｍなどで表されるものなど）が測定される。いくつかの実施形態では、スクラッチの閉鎖は、スクラッチの表面積として特徴付けられる。いくつかの実施形態では、スクラッチの表面積（例えば、ピクセル＾２またはμｍ＾２）は、画像解析ソフトウェアによって決定される。いくつかの実施形態では、スクラッチの閉鎖は、時間的な関数として特徴付けられる。いくつかの実施形態では、スクラッチの閉鎖は、スクラッチのすべてまたは一定割合（例えば、５０％）の閉鎖に要する時間として特徴付けられる。いくつかの実施形態では、スクラッチの閉鎖は、時間の関数としての速度（スクラッチの細胞非含有表面積など）として特徴付けられる。いくつかの実施形態では、測定される速度は、細胞遊走距離／遊走時間である。
【0213】
いくつかの実施形態では、１つ以上のスクラッチの閉鎖は、約１～５日間測定される。いくつかの実施形態では、１つ以上のスクラッチの閉鎖は、約２～４日間測定される。いくつかの実施形態では、１つ以上のスクラッチの閉鎖は、約２～３日間測定される。いくつかの実施形態では、１つ以上のスクラッチの閉鎖は、約２日間測定される。いくつかの実施形態では、１つ以上のスクラッチの閉鎖は、約３日間測定される。いくつかの実施形態では、１つ以上のスクラッチの閉鎖は、一定の間隔で測定される。いくつかの実施形態では、１つ以上のスクラッチの閉鎖は、１日１回測定される。いくつかの実施形態では、１つ以上のスクラッチの閉鎖は、連続的に測定される。
【0214】
いくつかの実施形態では、本発明のＦＮ組成物は、本明細書で提供されるスクラッチアッセイにおいて眼の創傷治癒を誘導する。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、本明細書で提供されるスクラッチアッセイにおいて眼の創傷治癒を誘導する。いくつかの実施形態では、本発明のＦＮ組成物は、スクラッチアッセイにおいて創傷閉鎖を少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、またはそれを超える倍数増加させる。いくつかの実施形態では、本発明のＦＮ組成物は、スクラッチアッセイにおいて創傷閉鎖を少なくとも１倍増加させる。いくつかの実施形態では、本発明のＦＮ組成物は、スクラッチアッセイにおいて創傷閉鎖を少なくとも２倍増加させる。いくつかの実施形態では、本発明のＦＮ組成物は、スクラッチアッセイにおいて創傷閉鎖を少なくとも３倍増加させる。いくつかの実施形態では、本発明のＦＮ組成物は、スクラッチアッセイにおいて創傷閉鎖を少なくとも４倍増加させる。いくつかの実施形態では、本発明のＦＮ組成物は、スクラッチアッセイにおいて創傷閉鎖を少なくとも５倍増加させる。いくつかの実施形態では、本発明のＦＮ組成物は、スクラッチアッセイにおいて創傷閉鎖を少なくとも６倍増加させる。いくつかの実施形態では、本発明のＦＮ組成物は、スクラッチアッセイにおいて創傷閉鎖を少なくとも７倍増加させる。いくつかの実施形態では、本発明のＦＮ組成物は、スクラッチアッセイにおいて創傷閉鎖を少なくとも８倍増加させる。いくつかの実施形態では、本発明のＦＮ組成物は、スクラッチアッセイにおいて創傷閉鎖を少なくとも９倍増加させる。いくつかの実施形態では、本発明のＦＮ組成物は、スクラッチアッセイにおいて創傷閉鎖を少なくとも１０倍増加させる。いくつかの実施形態では、本発明のＦＮ組成物は、スクラッチアッセイにおいて創傷閉鎖を少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、またはそれを超える％増加させる。いくつかの実施形態では、本発明のＦＮ組成物は、スクラッチアッセイにおいて創傷閉鎖を少なくとも１０％増加させる。いくつかの実施形態では、本発明のＦＮ組成物は、スクラッチアッセイにおいて創傷閉鎖を少なくとも２０％増加させる。いくつかの実施形態では、本発明のＦＮ組成物は、スクラッチアッセイにおいて創傷閉鎖を少なくとも３０％増加させる。いくつかの実施形態では、本発明のＦＮ組成物は、スクラッチアッセイにおいて創傷閉鎖を少なくとも４０％増加させる。いくつかの実施形態では、本発明のＦＮ組成物は、スクラッチアッセイにおいて創傷閉鎖を少なくとも５０％増加させる。いくつかの実施形態では、本発明のＦＮ組成物は、スクラッチアッセイにおいて創傷閉鎖を少なくとも６０％増加させる。いくつかの実施形態では、本発明のＦＮ組成物は、スクラッチアッセイにおいて創傷閉鎖を少なくとも７０％増加させる。いくつかの実施形態では、本発明のＦＮ組成物は、スクラッチアッセイにおいて創傷閉鎖を少なくとも８０％増加させる。いくつかの実施形態では、本発明のＦＮ組成物は、スクラッチアッセイにおいて創傷閉鎖を少なくとも９０％増加させる。いくつかの実施形態では、本発明のＦＮ組成物は、スクラッチアッセイにおいて創傷閉鎖を少なくとも１００％増加させる。
【0215】
いくつかの実施形態では、本発明のＦＮ組成物は、本明細書で提供されるスクラッチアッセイにおいて眼の創傷治癒を誘導する。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、本明細書で提供されるスクラッチアッセイにおいて眼の創傷治癒を誘導する。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、スクラッチアッセイにおいて創傷閉鎖を少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、またはそれを超える倍数増加させる。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、スクラッチアッセイにおいて創傷閉鎖を少なくとも１倍増加させる。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、スクラッチアッセイにおいて創傷閉鎖を少なくとも２倍増加させる。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、スクラッチアッセイにおいて創傷閉鎖を少なくとも３倍増加させる。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、スクラッチアッセイにおいて創傷閉鎖を少なくとも４倍増加させる。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、スクラッチアッセイにおいて創傷閉鎖を少なくとも５倍増加させる。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、スクラッチアッセイにおいて創傷閉鎖を少なくとも６倍増加させる。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、スクラッチアッセイにおいて創傷閉鎖を少なくとも７倍増加させる。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、スクラッチアッセイにおいて創傷閉鎖を少なくとも８倍増加させる。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、スクラッチアッセイにおいて創傷閉鎖を少なくとも９倍増加させる。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、スクラッチアッセイにおいて創傷閉鎖を少なくとも１０倍増加させる。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、スクラッチアッセイにおいて創傷閉鎖を少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、またはそれを超える％増加させる。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、スクラッチアッセイにおいて創傷閉鎖を少なくとも１０％増加させる。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、スクラッチアッセイにおいて創傷閉鎖を少なくとも２０％増加させる。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、スクラッチアッセイにおいて創傷閉鎖を少なくとも３０％増加させる。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、スクラッチアッセイにおいて創傷閉鎖を少なくとも４０％増加させる。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、スクラッチアッセイにおいて創傷閉鎖を少なくとも５０％増加させる。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、スクラッチアッセイにおいて創傷閉鎖を少なくとも６０％増加させる。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、スクラッチアッセイにおいて創傷閉鎖を少なくとも７０％増加させる。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、スクラッチアッセイにおいて創傷閉鎖を少なくとも８０％増加させる。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、スクラッチアッセイにおいて創傷閉鎖を少なくとも９０％増加させる。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、スクラッチアッセイにおいて創傷閉鎖を少なくとも１００％増加させる。
【0216】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるスクラッチアッセイにおいて眼の創傷治癒をもたらすには、少なくとも３０μｇ／ｍＬの被検試薬が必要である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるスクラッチアッセイにおいて眼の創傷治癒をもたらすには、少なくとも３５μｇ／ｍＬの被検試薬が必要である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるスクラッチアッセイにおいて眼の創傷治癒をもたらすには、少なくとも４０μｇ／ｍＬの被検試薬が必要である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるスクラッチアッセイにおいて眼の創傷治癒をもたらすには、少なくとも４５μｇ／ｍＬの被検試薬が必要である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるスクラッチアッセイにおいて眼の創傷治癒をもたらすには、少なくとも５０μｇ／ｍＬの被検試薬が必要である。
【0217】
いくつかの実施形態では、被検試薬は、ＦＮである。いくつかの実施形態では、ＦＮは、細胞性ＦＮである。
【0218】
トランスウェル遊走アッセイ
いくつかの実施形態では、本発明のアッセイは、「トランスウェル遊走アッセイ」（「トランスウェル細胞浸潤アッセイ」または「トランスウェルアッセイ」とも称される）を含む。いくつかの実施形態では、トランスウェル遊走アッセイを利用することで、細胞の遊走及び／または増殖に対する候補試薬の能力が評価される。いくつかの実施形態では、トランスウェル遊走アッセイを利用することで、細胞遊走に対する候補試薬の能力が評価される。いくつかの実施形態では、トランスウェル遊走アッセイを利用することで、細胞増殖に対する候補試薬の能力が評価される。いくつかの実施形態では、トランスウェル遊走アッセイを利用することで、細胞の遊走／増殖を誘導する能力を有する候補がスクリーニングされる。
いくつかの実施形態では、本発明のアッセイは、「トランスウェル遊走アッセイ」（「トランスウェル細胞浸潤アッセイ」または「トランスウェルアッセイ」とも称される）を含む。いくつかの実施形態では、トランスウェル遊走アッセイを利用することで、細胞の遊走及び／または増殖に対する候補試薬の能力が評価される。いくつかの実施形態では、トランスウェル遊走アッセイを利用することで、細胞遊走に対する候補試薬の能力が評価される。いくつかの実施形態では、トランスウェル遊走アッセイを利用することで、細胞増殖に対する候補試薬の能力が評価される。いくつかの実施形態では、トランスウェル遊走アッセイを利用することで、細胞の遊走／増殖を誘導する能力を有する候補がスクリーニングされる。
【0219】
一実施形態例では、本明細書で提供されるトランスウェル遊走アッセイは、
（ａ）孔を有する膜を含む上部チャンバーに細胞を添加するステップであって、被検試薬／組成物が存在しない基本培地を細胞に補給する、添加するステップと、
（ｂ）被検試薬／組成物を含む容器内に上部チャンバーを設置するステップであって、孔を有する膜によって容器内の被検試薬／組成物から上部チャンバー内の角膜細胞が隔てられる、設置するステップと、
（ｃ）細胞をインキュベートするステップと、
（ｄ）膜を介して遊走する細胞を測定／定量化するステップであって、当該遊走が、被検試薬／組成物が細胞の遊走及び／または増殖を誘導する能力を有することを示す、測定／定量化するステップと、
を含む。
（ａ）孔を有する膜を含む上部チャンバーに細胞を添加するステップであって、被検試薬／組成物が存在しない基本培地を細胞に補給する、添加するステップと、
（ｂ）被検試薬／組成物を含む容器内に上部チャンバーを設置するステップであって、孔を有する膜によって容器内の被検試薬／組成物から上部チャンバー内の角膜細胞が隔てられる、設置するステップと、
（ｃ）細胞をインキュベートするステップと、
（ｄ）膜を介して遊走する細胞を測定／定量化するステップであって、当該遊走が、被検試薬／組成物が細胞の遊走及び／または増殖を誘導する能力を有することを示す、測定／定量化するステップと、
を含む。
【0220】
いくつかの実施形態では、トランスウェル遊走アッセイは、角膜細胞に用いられる。いくつかの実施形態では、トランスウェル遊走アッセイは、網膜細胞に用いられる。いくつかの実施形態では、トランスウェル遊走アッセイは、上皮細胞に用いられる。いくつかの実施形態では、トランスウェル遊走アッセイは、角膜実質細胞に用いられる。いくつかの実施形態では、トランスウェル遊走アッセイは、線維芽細胞に用いられる。いくつかの実施形態では、トランスウェル遊走アッセイは、視神経細胞に用いられる。いくつかの実施形態では、トランスウェル遊走アッセイは、神経節細胞に用いられる。いくつかの実施形態では、トランスウェル遊走アッセイは、網膜色素上皮細胞に用いられる。いくつかの実施形態では、トランスウェル遊走アッセイは、網膜色素上皮細胞に用いられる。いくつかの実施形態では、トランスウェル遊走アッセイは、水晶体上皮細胞に用いられる。いくつかの実施形態では、トランスウェル遊走アッセイは、虹彩色素上皮細胞に用いられる。いくつかの実施形態では、トランスウェル遊走アッセイは、結膜線維芽細胞に用いられる。いくつかの実施形態では、トランスウェル遊走アッセイは、非色素毛様体上皮細胞に用いられる。いくつかの実施形態では、トランスウェル遊走アッセイは、線維柱帯細胞に用いられる。いくつかの実施形態では、トランスウェル遊走アッセイは、眼球脈絡膜線維芽細胞に用いられる。いくつかの実施形態では、トランスウェル遊走アッセイは、結膜上皮細胞に用いられる。
【0221】
いくつかの実施形態では、トランスウェル遊走アッセイの上部チャンバーは、孔を有する膜によって密封される。いくつかの実施形態では、上部チャンバーはガラスチャンバーである。いくつかの実施形態では、上部チャンバーはプラスチックチャンバーである。いくつかの実施形態では、上部チャンバーはボイデンチャンバーである。
【0222】
いくつかの実施形態では、上部チャンバーの膜は、規定された孔径を有するポリカーボネート膜である。いくつかの実施形態では、膜は、基底膜である。いくつかの実施形態では、膜の平均孔径は、アッセイされる細胞のサイズを下回る。いくつかの実施形態では、膜の平均孔径は約１～１５μｍである。いくつかの実施形態では、膜の平均孔径は約３μｍである。いくつかの実施形態では、膜の平均孔径は約５μｍである。いくつかの実施形態では、膜の平均孔径は約８μｍである。いくつかの実施形態では、膜の平均孔径は約１２μｍである。
【0223】
いくつかの実施形態では、上部チャンバーの膜は、事前に処理される。いくつかの実施形態では、膜は、細胞接着及び／または増殖を増強する１つ以上の化合物またはバイオポリマーで事前にコーティングされる。いくつかの実施形態では、膜は、細胞外マトリックスで事前にコーティングされる。いくつかの実施形態では、膜は、コラーゲンで事前にコーティングされる。いくつかの実施形態では、膜は、フィブロネクチンで事前にコーティングされる。いくつかの実施形態では、膜は、ラミニンで事前にコーティングされる。
【0224】
いくつかの実施形態では、基本細胞培養培地を含む上部チャンバーに細胞が添加される。いくつかの実施形態では、上部チャンバー内の基本細胞培養培地は血清を含まない。細胞培養培地の例としては、限定されないが、ｈＭＳＣ Ｍｅｄｉａ Ｂｏｏｓｔｅｒ ＸＦＭ、ｈＭＳＣ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉａ、Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ（ＭＥＭＥ）、ＡＤＣ－１、ＬＰＭ（ウシ血清アルブミン非含有）、Ｆ１０（ＨＡＭ）、Ｆ１２（ＨＡＭ）、ＤＣＣＭ１、ＤＣＣＭ２、ＲＰＭＩ １６４０、ＢＧＪ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｆｉｔｔｏｎ－Ｊａｃｋｓｏｎ改変あり及びなし）、ＳｔｅｍＰｒｏ、ＭＳＣＧｒｏ、ＭｅｓｅｎＣｕｌｔ、ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ、Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ（ＢＭＥ－Ｅａｒｌｅ’ｓ ｓａｌｔ ｂａｓｅの添加あり）、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ－血清含有または血清非含有）、Ｙａｍａｎｅ、ＩＭＥＭ－２０、Ｇｌａｓｇｏｗ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（ＧＭＥＭ）、Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ Ｌ－１５ Ｍｅｄｉｕｍ、ＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ Ｍｅｄｉｕｍ、Ｍｅｄｉｕｍ Ｍ１９９（Ｍ１９９Ｅ－Ｅａｒｌｅ’ｓ ｓａｌｅ ｂａｓｅ含有）、Ｍｅｄｉｕｍ Ｍ１９９（Ｍ１９９Ｈ－Ｈａｎｋ’ｓ ｓａｌｔ ｂａｓｅ含有）、Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ａｌｐｈａ（ＭＥＭ－アルファ）、Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ（ＭＥＭ－Ｅ－Ｅａｒｌｅ’ｓ ｓａｌｔ ｂａｓｅ含有）、Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ（ＭＥＭ－Ｈ－Ｈａｎｋ’ｓ ｓａｌｔ ｂａｓｅ含有）、及びＭｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ（必須アミノ酸を含むＭＥＭ－ＮＡＡ）が挙げられ、その他多数あるが、とりわけ、ｍｅｄｉｕｍ１９９、ＣＭＲＬ１４１５、ＣＭＲＬ１９６９、ＣＭＲＬ１０６６、ＮＣＴＣ１３５、ＭＢ７５２６１、ＭＡＢ８７１３、ＤＭ１４５、Ｗｉｌｌｉａｍｓ’Ｇ、Ｎｅｕｍａｎ ＆ Ｔｙｔｅｌｌ、Ｈｉｇｕｃｈｉ、ＭＣＤＢ３０１、ＭＣＤＢ２０２、ＭＣＤＢ５０１、ＭＣＤＢ４０１、ＭＣＤＢ４１１、ＭＤＢＣ１５３が挙げられる。本発明における使用のための培地の例はＭＥＭ－アルファである。いくつかの実施形態では、アッセイされる細胞は、ゲルを含む上部チャンバーに添加される。いくつかの実施形態では、ゲルは、生体マトリックス（細胞外マトリックスなど）を含む。
【0225】
いくつかの実施形態では、上部チャンバーは、１つ以上の被検試薬／組成物を含む容器内に浮遊される。いくつかの実施形態では、上部チャンバー及び容器は、１つ以上の被検試薬／組成物を除けば、同じ組成物を含む。他の実施形態では、上部チャンバー及び容器は、１つ以上の被検試薬／組成物以外にも、異なる組成物を含む。いくつかの実施形態では、容器は、１つ以上の成長因子を含む。
【0226】
いくつかの実施形態では、容器は反応容器である。いくつかの実施形態では、容器は、マルチウェルプレート中のウェルである。いくつかの実施形態では、容器は、マルチウェルプレート（６ウェルプレート、１２ウェルプレート、２４ウェルプレート、４８ウェルプレート、または９６ウェルプレートなど）中のウェルである。
【0227】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される被検試薬／組成物は、アッセイされる細胞の化学誘引物質を含む。いくつかの実施形態では、被検試薬／組成物は、ＦＮ組成物を含む。いくつかの実施形態では、被検試薬／組成物は、馴化培地を含む。いくつかの実施形態では、被検試薬／組成物は、バイオポリマー（タンパク質など）を含む。いくつかの実施形態では、被検試薬／組成物は、１つ以上の活性化合物の医薬組成物を含む。いくつかの実施形態では、被検試薬／組成物は、それが細胞の遊走及び／または増殖を促進する能力についてスクリーニングされる。
【0228】
いくつかの実施形態では、被検試薬／組成物は、容器内にのみ存在し、上部チャンバーからは排除されている。いくつかの実施形態では、被検試薬／組成物は、上部チャンバー内にも容器内にも存在する。一実施形態例では、上部チャンバーから容器へと被検試薬／組成物の濃度が上昇する濃度勾配が存在する。
【0229】
いくつかの実施形態では、被検試薬／組成物は、添加前に濃縮される。いくつかの実施形態では、被検試薬／組成物は、添加前に希釈される。いくつかの実施形態では、被検試薬／組成物は、添加前に精製（緩衝液交換など）される。いくつかの実施形態では、被検試薬／組成物は、添加前に凍結乾燥される。いくつかの実施形態では、容器内の被検試薬／組成物は、約１０～１００μｇ／ｍＬの活性成分を含む。いくつかの実施形態では、容器内の被検試薬／組成物は、約１０～１００μｇ／ｍＬのタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、容器内の被検試薬／組成物は、約１０～９０μｇ／ｍＬのタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、容器内の被検試薬／組成物は、約２０～８０μｇ／ｍＬのタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、容器内の被検試薬／組成物は、約３０～７０μｇ／ｍＬのタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、容器内の被検試薬／組成物は、約４０～６０μｇ／ｍＬのタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、容器内の被検試薬／組成物は、約４５μｇ／ｍＬのタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、容器内の被検試薬／組成物は、約５０μｇ／ｍＬのタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、容器内の被検試薬／組成物は、約５５μｇ／ｍＬのタンパク質を含む。
【0230】
いくつかの実施形態では、細胞は、上部チャンバーにおいて約６～７２時間インキュベートされる。いくつかの実施形態では、インキュベート時間は約１２時間～６０時間である。いくつかの実施形態では、インキュベート時間は約１８時間～４８時間である。いくつかの実施形態では、インキュベート時間は、これらの範囲内の任意の適切な値である。いくつかの実施形態では、インキュベート時間は約６時間である。いくつかの実施形態では、インキュベート時間は約１８時間である。いくつかの実施形態では、インキュベート時間は約２４時間である。いくつかの実施形態では、インキュベート時間は約３０時間である。いくつかの実施形態では、インキュベート時間は約３６時間である。いくつかの実施形態では、インキュベート時間は約４２時間である。いくつかの実施形態では、インキュベート時間は約４８時間である。
【0231】
いくつかの実施形態では、膜を介して遊走した細胞の総数は、染色（比色分析（例えば、カルセインＡＭ）または蛍光分析（例えば、クリスタルバイオレット））を行ってまたは行わずに物理的な計数（画像解析ソフトウェア）によって測定される。いくつかの実施形態では、生細胞染色を使用して遊走細胞が定量化される。いくつかの実施形態では、膜を介して遊走した細胞の総数を吸光度ベースまたは蛍光分析ベースの方法によって測定することで、細胞量が分光学的に定量化される。いくつかの実施形態では、遊走細胞は、フローサイトメトリーによって定量化される。
【0232】
いくつかの実施形態では、本発明のＦＮ組成物は、本明細書で提供されるトランスウェル遊走アッセイにおいて眼の創傷治癒を誘導する能力を示す。いくつかの実施形態では、本発明のＦＮ組成物は、本明細書で提供されるトランスウェル遊走アッセイにおいて細胞の遊走及び／または増殖を誘導する。いくつかの実施形態では、本発明のＦＮ組成物は、本明細書で提供されるトランスウェル遊走アッセイにおいて細胞遊走を誘導する。いくつかの実施形態では、本発明のＦＮ組成物は、本明細書で提供されるトランスウェル遊走アッセイにおいて細胞増殖を誘導する。いくつかの実施形態では、本発明のＦＮ組成物は、本明細書で提供されるトランスウェル遊走アッセイにおいて眼の創傷治癒を誘導する能力を示す。いくつかの実施形態では、本発明のＦＮ組成物は、本明細書で提供されるトランスウェル遊走アッセイにおいて細胞の遊走及び／または増殖を誘導する。いくつかの実施形態では、本発明のＦＮ組成物は、本明細書で提供されるトランスウェル遊走アッセイにおいて細胞遊走を誘導する。いくつかの実施形態では、本発明のＦＮ組成物は、本明細書で提供されるトランスウェル遊走アッセイにおいて細胞増殖を誘導する。
【0233】
いくつかの実施形態では、本発明のＦＮ組成物は、トランスウェルアッセイにおいて細胞の遊走及び／または増殖を少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、またはそれを超える倍数増加させる。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、トランスウェルアッセイにおいて細胞の遊走及び／または増殖を少なくとも１倍増加させる。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、トランスウェルアッセイにおいて細胞の遊走及び／または増殖を少なくとも２倍増加させる。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、トランスウェルアッセイにおいて細胞の遊走及び／または増殖を少なくとも３倍増加させる。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、トランスウェルアッセイにおいて細胞の遊走及び／または増殖を少なくとも４倍増加させる。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、トランスウェルアッセイにおいて細胞の遊走及び／または増殖を少なくとも５倍増加させる。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、トランスウェルアッセイにおいて細胞の遊走及び／または増殖を少なくとも６倍増加させる。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、トランスウェルアッセイにおいて細胞の遊走及び／または増殖を少なくとも７倍増加させる。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、トランスウェルアッセイにおいて細胞の遊走及び／または増殖を少なくとも８倍増加させる。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、トランスウェルアッセイにおいて細胞の遊走及び／または増殖を少なくとも９倍増加させる。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、トランスウェルアッセイにおいて細胞の遊走及び／または増殖を少なくとも１０倍増加させる。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、トランスウェルアッセイにおいて細胞の遊走及び／または増殖を少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、またはそれを超える％増加させる。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、トランスウェルアッセイにおいて細胞の遊走及び／または増殖を少なくとも１０％増加させる。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、トランスウェルアッセイにおいて細胞の遊走及び／または増殖を少なくとも２０％増加させる。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、トランスウェルアッセイにおいて細胞の遊走及び／または増殖を少なくとも３０％増加させる。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、トランスウェルアッセイにおいて細胞の遊走及び／または増殖を少なくとも４０％増加させる。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、トランスウェルアッセイにおいて細胞の遊走及び／または増殖を少なくとも５０％増加させる。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、トランスウェルアッセイにおいて細胞の遊走及び／または増殖を少なくとも６０％増加させる。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、トランスウェルアッセイにおいて細胞の遊走及び／または増殖を少なくとも７０％増加させる。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、トランスウェルアッセイにおいて細胞の遊走及び／または増殖を少なくとも８０％増加させる。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、トランスウェルアッセイにおいて細胞の遊走及び／または増殖を少なくとも９０％増加させる。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、トランスウェルアッセイにおいて細胞の遊走及び／または増殖を少なくとも１００％増加させる。
【0234】
いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、トランスウェルアッセイにおいて細胞の遊走及び／または増殖を少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、またはそれを超える倍数増加させる。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、トランスウェルアッセイにおいて細胞の遊走及び／または増殖を少なくとも１倍増加させる。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、トランスウェルアッセイにおいて細胞の遊走及び／または増殖を少なくとも２倍増加させる。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、トランスウェルアッセイにおいて細胞の遊走及び／または増殖を少なくとも３倍増加させる。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、トランスウェルアッセイにおいて細胞の遊走及び／または増殖を少なくとも４倍増加させる。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、トランスウェルアッセイにおいて細胞の遊走及び／または増殖を少なくとも５倍増加させる。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、トランスウェルアッセイにおいて細胞の遊走及び／または増殖を少なくとも６倍増加させる。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、トランスウェルアッセイにおいて細胞の遊走及び／または増殖を少なくとも７倍増加させる。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、トランスウェルアッセイにおいて細胞の遊走及び／または増殖を少なくとも８倍増加させる。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、トランスウェルアッセイにおいて細胞の遊走及び／または増殖を少なくとも９倍増加させる。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、トランスウェルアッセイにおいて細胞の遊走及び／または増殖を少なくとも１０倍増加させる。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、トランスウェルアッセイにおいて細胞の遊走及び／または増殖を少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、またはそれを超える％増加させる。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、トランスウェルアッセイにおいて細胞の遊走及び／または増殖を少なくとも１０％増加させる。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、トランスウェルアッセイにおいて細胞の遊走及び／または増殖を少なくとも２０％増加させる。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、トランスウェルアッセイにおいて細胞の遊走及び／または増殖を少なくとも３０％増加させる。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、トランスウェルアッセイにおいて細胞の遊走及び／または増殖を少なくとも４０％増加させる。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、トランスウェルアッセイにおいて細胞の遊走及び／または増殖を少なくとも５０％増加させる。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、トランスウェルアッセイにおいて細胞の遊走及び／または増殖を少なくとも６０％増加させる。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、トランスウェルアッセイにおいて細胞の遊走及び／または増殖を少なくとも７０％増加させる。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、トランスウェルアッセイにおいて細胞の遊走及び／または増殖を少なくとも８０％増加させる。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、トランスウェルアッセイにおいて細胞の遊走及び／または増殖を少なくとも９０％増加させる。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、トランスウェルアッセイにおいて細胞の遊走及び／または増殖を少なくとも１００％増加させる。
【0235】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるトランスウェル遊走アッセイにおいて細胞の遊走及び／または増殖を誘導するには、少なくとも３０μｇ／ｍＬの被検試薬／組成物が必要である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるトランスウェル遊走アッセイにおいて細胞の遊走及び／または増殖を誘導するには、少なくとも３５μｇ／ｍＬの被検試薬／組成物が必要である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるトランスウェル遊走アッセイにおいて細胞の遊走及び／または増殖を誘導するには、少なくとも４０μｇ／ｍＬの被検試薬／組成物が必要である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるトランスウェル遊走アッセイにおいて細胞の遊走及び／または増殖を誘導するには、少なくとも４５μｇ／ｍＬの被検試薬／組成物が必要である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるトランスウェル遊走アッセイにおいて細胞の遊走及び／または増殖を誘導するには、少なくとも５０μｇ／ｍＬの被検試薬／組成物が必要である。
【0236】
いくつかの実施形態では、内皮細胞管形成アッセイは、ＦＮ組成物に対して実施され得る。いくつかの実施形態では、内皮細胞管形成アッセイは、ＦＮ組成物が血管新生促進性ではないことを示し得る。いくつかの実施形態では、内皮細胞管形成アッセイは、ＦＮ組成物の血管新生の可能性の尺度を提供する。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、抗血管新生特性を示す。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は抗血管新生特性である。いくつかの実施形態では、内皮細胞管形成アッセイは、抗血管新生シグナル及び血管新生促進シグナルの比を提供する。いくつかの実施形態では、内皮細胞管形成アッセイは、陰性の結果が、抗：促進比が高いことを確認し、ＦＮ組成物が血管新生を促進しないことを確実にするであろう。いくつかの実施形態では、内皮細胞管形成アッセイが陰性の結果は、抗：促進比が高いことを確認し、ＦＮ組成物がＣＮＶ（脈絡膜血管新生）または一般的な血管新生を促進しないことを確実にする。いくつかの実施形態では、ＴＧＦｂ（ＴＧＦベータまたはＴＧＦβとも称される）誘導性筋線維芽細胞分化の抑制アッセイは、細胞性ＦＮ組成物に対して実施され得る。いくつかの実施形態では、ＴＧＦｂ誘導性筋線維芽細胞分化の抑制アッセイは、ＦＮ組成物が瘢痕化を抑制することを示すために、細胞性ＦＮ組成物に対して実施され得る。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は瘢痕化を防ぐ。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、角膜混濁の瘢痕化を防ぐ。いくつかの実施形態では、細胞性ＦＮ組成物は、低い血管新生誘導を有する。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、低下した血管新生反応を有する。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、低下した血管新生能力を有する。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、血管新生を支持する培地の存在下で血管の正常な形成を損なう及び／または減少させる。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、ＦＮ組成物が未処理の対照と比較した場合、低下した血管新生能力を有する。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、血清含有培地で処理された試料と比較して、低下した血管新生能力を有する。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は血管新生反応を弱める。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、無血清培地によって誘発される血管新生反応を低下させる。いくつかの実施形態では、血管新生反応の低下は、セクレトームと血清含有培地（血管新生反応の低下またはなし）を血清含有培地（血管新生反応）と比較した場合、ＦＮ組成物によって誘導される。いくつかの実施形態では、血管新生応答は、細胞ベースのアッセイにおける管形成によって示される。いくつかの実施形態では、血管新生応答は、内皮細胞管形成アッセイにおける管形成によって示される。
【0237】
分化／瘢痕化：
いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、分化を防止し、瘢痕化を防止する能力について評価することができる。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、瘢痕化を防止及び／または阻害する。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は瘢痕化を防止する。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、他の標準的な治療と比較して、瘢痕化を低減する。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、分化を防止及び／または阻害する。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、筋線維芽細胞の分化を防止及び／または阻害する。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、角膜の透明性の喪失を低減する。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、筋線維芽細胞の分化を防止及び／または阻害することにより、角膜の透明性の喪失を低減する。
いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、分化を防止し、瘢痕化を防止する能力について評価することができる。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、瘢痕化を防止及び／または阻害する。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は瘢痕化を防止する。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、他の標準的な治療と比較して、瘢痕化を低減する。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、分化を防止及び／または阻害する。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、筋線維芽細胞の分化を防止及び／または阻害する。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、角膜の透明性の喪失を低減する。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、筋線維芽細胞の分化を防止及び／または阻害することにより、角膜の透明性の喪失を低減する。
【0238】
いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、分化に関与する因子を調節するＦＮ組成物の能力について評価することができる。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、ＴＧＦＢ２、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＩＩ（通常、分化中に上方制御される）、ＴＦＧＢ３、ＭＭＰ－２、及びＭＭＰ－９（通常、分化中にダウンレギュレーションされる）を含むがこれらに限定されない、分化に関与する因子を調節するＦＮ組成物の能力を評価することができる。いくつかの実施形態では、細胞性ＦＮ組成物は、ＴＧＦＢ２、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＩＩ（通常、分化中に上方制御される）、ＴＦＧＢ３、ＭＭＰ－２、及びＭＭＰ－９（通常、分化中に下方制御される）からなる群から選択される因子を調節する。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、正常な分化の間に上方制御される因子の減少を誘導する。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、正常な分化の間にダウンレギュレーションされる因子の増加を誘導する。いくつかの実施形態では、細胞性ＦＮ組成物は、ＳＭＡなどの因子の発現の減少を誘導する。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、ＦＮ組成物効力を示すＳＭＡなどの因子の発現の減少を誘導する。
【0239】
血管新生：
いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、血管新生を防止する能力について評価することができる。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、血管新生を予防、阻害、抑制、及び／または低減する。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、血管新生を抑制するか、または促進しない。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、血管新生を防止する能力について評価することができる。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、血管新生を防止、阻害、抑制、及び／または低減する。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は血管新生を抑制する。
いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、血管新生を防止する能力について評価することができる。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、血管新生を予防、阻害、抑制、及び／または低減する。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、血管新生を抑制するか、または促進しない。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、血管新生を防止する能力について評価することができる。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、血管新生を防止、阻害、抑制、及び／または低減する。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は血管新生を抑制する。
【0240】
いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、枯渇アッセイを使用してさらに評価することができる。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、特定の因子を枯渇させることができる。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、例えば、ＴＩＭＰ１及び／またはセルピンＥ１を含むがこれらに限定されない特定の因子を枯渇させることができる。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、ＴＩＭＰ１及び／またはセルピンＥ１を枯渇させることができる。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、ＴＩＭＰ１を枯渇させることができる。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、セルピンＥ１を枯渇させることができる。
【0241】
炎症：
いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、炎症を予防、阻害、抑制、及び／または低減する能力について評価することができる。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、炎症を予防、阻害、抑制、及び／または低減する。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は炎症を抑制する。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、炎症を予防、阻害、抑制、及び／または低減する能力を決定するために、インビトロ及び／またはインビボで特徴付けられる。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、インビトロ及び／またはインビボでの炎症を予防、阻害、抑制、及び／または低減する。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、インビトロで炎症を予防、阻害、抑制、及び／または低減する。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、炎症またはインビボでの炎症を予防、阻害、抑制、及び／または低減する。いくつかの実施形態では、組織モデルを使用して、インビトロでの炎症の予防、阻害、抑制、及び／または減少を特徴付けることができる。いくつかの実施形態では、３Ｄ組織モデルを使用して、インビトロでの炎症の予防、阻害、抑制、及び／または低減を特徴付けることができる。いくつかの実施形態では、ナイトロジェンマスタード（ＮＭ）ガス熱傷モデルを使用して、インビトロでの炎症の予防、阻害、抑制、及び／または軽減を評価することができる。いくつかの実施形態では、ナイトロジェンマスタード（ＮＭ）ガス熱傷モデルを使用して、インビトロでの炎症の予防、阻害、抑制、及び／または低減を評価し、インビボ条件の代理として使用することができる。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物による治療及び／または投与に応答するサイトカインプロファイルを決定することができる。いくつかの実施形態では、特定のサイトカインのレベルを決定することができる。いくつかの実施形態では、ＩＬ－８のレベルを決定することができる。いくつかの実施形態では、ＩＬ－８発現のレベルは、ＦＮ組成物で処理された組織において低下させることができる。いくつかの実施形態では、ＩＬ－８発現のレベルは、ＦＮ組成物で処理された組織において低下し、これは、炎症を予防、阻害、抑制、及び／または減少させることを示している。
いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、炎症を予防、阻害、抑制、及び／または低減する能力について評価することができる。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、炎症を予防、阻害、抑制、及び／または低減する。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は炎症を抑制する。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、炎症を予防、阻害、抑制、及び／または低減する能力を決定するために、インビトロ及び／またはインビボで特徴付けられる。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、インビトロ及び／またはインビボでの炎症を予防、阻害、抑制、及び／または低減する。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、インビトロで炎症を予防、阻害、抑制、及び／または低減する。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、炎症またはインビボでの炎症を予防、阻害、抑制、及び／または低減する。いくつかの実施形態では、組織モデルを使用して、インビトロでの炎症の予防、阻害、抑制、及び／または減少を特徴付けることができる。いくつかの実施形態では、３Ｄ組織モデルを使用して、インビトロでの炎症の予防、阻害、抑制、及び／または低減を特徴付けることができる。いくつかの実施形態では、ナイトロジェンマスタード（ＮＭ）ガス熱傷モデルを使用して、インビトロでの炎症の予防、阻害、抑制、及び／または軽減を評価することができる。いくつかの実施形態では、ナイトロジェンマスタード（ＮＭ）ガス熱傷モデルを使用して、インビトロでの炎症の予防、阻害、抑制、及び／または低減を評価し、インビボ条件の代理として使用することができる。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物による治療及び／または投与に応答するサイトカインプロファイルを決定することができる。いくつかの実施形態では、特定のサイトカインのレベルを決定することができる。いくつかの実施形態では、ＩＬ－８のレベルを決定することができる。いくつかの実施形態では、ＩＬ－８発現のレベルは、ＦＮ組成物で処理された組織において低下させることができる。いくつかの実施形態では、ＩＬ－８発現のレベルは、ＦＮ組成物で処理された組織において低下し、これは、炎症を予防、阻害、抑制、及び／または減少させることを示している。
【0242】
Ｅ．治療の方法
本開示は、ＦＧＦ（ＦＧＦ－２など）、ＰＤＧＦ、ＨＧＦ、ＶＥＧＦ、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＩＧＦ－１、ＩＧＦ－２、ＮＧＦ、ニューロトロフィン、及びＥＧＦからなる群から選択される１つ以上の成長因子を任意選択で含むＦＮ組成物（細胞性ＦＮ組成物など）を使用する治療方法も提供する。特に、ＦＮ組成物は眼の状態の治療に使用されている。特に、ＦＮ組成物は、眼疾患を含むがこれに限定されない眼の状態の治療に使用されている。いくつかの実施形態では、眼疾患は、眼の表面に関連している。いくつかの実施形態では、眼疾患は、損傷した眼組織及び／または損傷した眼組織の徴候に関連している。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、創傷治癒の加速を含む、眼の状態の治療において使用を見出す。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、瘢痕化の減少を含む、眼の状態の治療において使用を見出す。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、炎症の軽減を含む、眼の状態の治療において使用を見出す。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、炎症を軽減し、したがって成長を促進することを含む、眼の状態の治療において使用を見出す。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、眼の表面での炎症を軽減するなどの眼の状態の治療において使用を見出す。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、血管新生の減少を含む、眼の状態の治療において使用を見出す。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、角膜における血管新生の減少を含む、眼の状態の治療において使用を見出す。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、ドライアイ治療（例えば、上皮細胞が損傷している場所を含む、重度のドライアイの治療を含む）を含む眼の状態の治療において使用を見出す。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、損傷した眼組織への完全性の回復などの眼の状態の治療において使用を見出す。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、損傷した眼組織の治癒を加速することなどの眼の状態の治療において使用を見出す。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、損傷した眼神経組織の再生などの眼の状態の治療において使用を見出す。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、網膜病状などの眼の状態の治療において使用を見出す。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、ＰＣＥＤに関連する損傷した眼神経組織の再生などの眼の状態の治療において使用を見出す。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、ＰＣＥＤなどの眼の状態の治療において使用を見出す。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、眼表面への炎症性損傷などの眼の状態の治療において使用を見出す。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、例えば、ＧｖＨＤ及び／またはシェーグレン症候群などの眼の状態の治療において使用を見出す。
本開示は、ＦＧＦ（ＦＧＦ－２など）、ＰＤＧＦ、ＨＧＦ、ＶＥＧＦ、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＩＧＦ－１、ＩＧＦ－２、ＮＧＦ、ニューロトロフィン、及びＥＧＦからなる群から選択される１つ以上の成長因子を任意選択で含むＦＮ組成物（細胞性ＦＮ組成物など）を使用する治療方法も提供する。特に、ＦＮ組成物は眼の状態の治療に使用されている。特に、ＦＮ組成物は、眼疾患を含むがこれに限定されない眼の状態の治療に使用されている。いくつかの実施形態では、眼疾患は、眼の表面に関連している。いくつかの実施形態では、眼疾患は、損傷した眼組織及び／または損傷した眼組織の徴候に関連している。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、創傷治癒の加速を含む、眼の状態の治療において使用を見出す。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、瘢痕化の減少を含む、眼の状態の治療において使用を見出す。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、炎症の軽減を含む、眼の状態の治療において使用を見出す。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、炎症を軽減し、したがって成長を促進することを含む、眼の状態の治療において使用を見出す。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、眼の表面での炎症を軽減するなどの眼の状態の治療において使用を見出す。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、血管新生の減少を含む、眼の状態の治療において使用を見出す。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、角膜における血管新生の減少を含む、眼の状態の治療において使用を見出す。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、ドライアイ治療（例えば、上皮細胞が損傷している場所を含む、重度のドライアイの治療を含む）を含む眼の状態の治療において使用を見出す。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、損傷した眼組織への完全性の回復などの眼の状態の治療において使用を見出す。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、損傷した眼組織の治癒を加速することなどの眼の状態の治療において使用を見出す。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、損傷した眼神経組織の再生などの眼の状態の治療において使用を見出す。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、網膜病状などの眼の状態の治療において使用を見出す。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、ＰＣＥＤに関連する損傷した眼神経組織の再生などの眼の状態の治療において使用を見出す。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、ＰＣＥＤなどの眼の状態の治療において使用を見出す。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、眼表面への炎症性損傷などの眼の状態の治療において使用を見出す。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、例えば、ＧｖＨＤ及び／またはシェーグレン症候群などの眼の状態の治療において使用を見出す。
【0243】
いくつかの実施形態では、眼の状態は、網膜病状、慢性移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）、スティーブンス・ジョンソン症候群、眼粘膜類天疱瘡、持続性角膜上皮欠損（ＰＣＥＤ）、ドライアイ、眼神経組織損傷、及び眼への衝撃性損傷（衝撃性損傷、眼の挫傷、または化学熱傷など）からなる群から選択される。
【0244】
いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、創傷治癒を加速させるにおいて使用を見出す。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、瘢痕化を減少させることにおいて使用を見出す。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、炎症を軽減させることにおいて使用を見出す。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、炎症を軽減させる、したがって成長を促進させることにおいて使用を見出す。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、眼表面での炎症を軽減させることにおいて使用を見出す。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、血管新生を減少させることにおいて使用を見出す。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、角膜における血管新生を減少させることにおいて使用を見出す。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、網膜上皮細胞及び網膜神経節細胞の保護及び修復において使用を見出す。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、小柱網の再生の誘導及び眼圧の低減において使用を見出す。
【0245】
いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、眼疾患の治療のために投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるような治療有効量のＦＮ組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、眼の創傷治癒を促進または誘導するために、それを必要とする患者に投与される。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、血管新生を低減及び／または抑制し、瘢痕化を低減及び／または抑制し、視力を促進及び／または維持し、及び／または創傷閉鎖率を増加させる（例えば、創傷閉鎖時間を短縮）ために、それを必要とする患者に投与される。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、血管新生を予防、低減、及び／または抑制するために、それを必要とする患者に投与される。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、瘢痕化の減少を予防、低減、及び／または抑制するために、それを必要とする患者に投与される。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、視力を促進及び／または維持するために、それを必要とする患者に投与される。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、創傷をより速く閉鎖することを促進及び／または誘導するために投与される（例えば、創傷閉鎖に必要な時間を短縮する）。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、視力の保存を促進するために、血管新生を防止、低減、及び／または抑制するか、または促進せず、瘢痕化を低減する。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、血管新生を予防、低減、及び／または抑制するために、そして視力維持を促進するために瘢痕化を低減するために、それを必要とする患者に投与される。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、炎症を予防、軽減、及び／または抑制する。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、炎症を予防、軽減、及び／または抑制するために、それを必要とする患者に投与される。
【0246】
いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、眼の構造への外傷性損傷後の視覚機能障害の治療のために投与される。いくつかの実施形態では、治療は、本明細書に記載されるような治療有効量のＦＮ組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む。
【0247】
いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、衝撃性損傷後の視神経変性の外傷性損傷の治療のために投与される。いくつかの実施形態では、眼への衝撃性損傷は、眼の挫傷及び眼への鈍的損傷からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、視神経の外傷性損傷の治療のために投与される。いくつかの実施形態では、治療は、それを必要とする患者に、本明細書に記載されるような治療有効量のＦＮ組成物を投与することを含む。
【0248】
いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、眼への衝撃性損傷に続く視神経変性を改善するために投与される。いくつかの実施形態では、視神経変性を改善するための方法は、本明細書に記載されるような治療有効量のＦＮ組成物を患者に投与することを含む。いくつかの実施形態では、眼への衝撃性損傷は、眼の挫傷及び眼への鈍的損傷からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、眼への衝撃性損傷は、眼の挫傷である。いくつかの実施形態では、眼への衝撃性損傷は、眼への鈍的損傷である。
【0249】
有効性の読み出しには、例えば、生活の質の向上を含む、症状の軽減及び／または病状の減少が含まれ得る。いくつかの実施形態では、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％の症状の軽減及び／または病状の減少は、治療効果を示す。いくつかの実施形態では、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％の炎症の軽減は、治療効果を示す。いくつかの実施形態では、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％の瘢痕化の減少は、治療効果を示す。いくつかの実施形態では、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％の血管新生の減少は、治療効果を示す。
【0250】
いくつかの実施形態では、疾患または状態は、眼の疾患または眼の状態である。いくつかの実施形態では、疾患または状態は、眼の構造への外傷後の視覚機能障害である。いくつかの実施形態では、疾患または状態は、眼への衝撃的な（例えば、鈍的または非鈍的）損傷である。いくつかの実施形態では、疾患または状態は、眼への化学熱傷を含む火傷である。
【0251】
いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、特定の標的領域に投与される。いくつかの実施形態では、特定の標的領域は目である。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、特定の標的領域に投与され、他の周囲の領域に広がらないように配合される。
【0252】
いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、特定の標的領域に投与され、他の周囲の領域に広がらないように配合される。
【0253】
いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、特定の標的領域に投与され、標的領域に少なくとも１分間、少なくとも約２分間、３つ少なくとも約１分間、少なくとも約４分間、少なくとも約５分、少なくとも約１０分、少なくとも約１５分、少なくとも約２０分、少なくとも約３０分、少なくとも約４０分、少なくとも約５０分、少なくとも約６０分、少なくとも約７０分、少なくとも約８０分、少なくとも約９０分、または少なくとも約２時間留まるように配合される。
【0254】
いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、創傷または損傷の直後に患部に投与される。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、１５秒、３０秒、１分、２分、３分、４分、５分、１０分、１５分、２０分、３０分、４０分、５０分、６０分、７０分、８０分、９０分、２時間、４時間、８時間、１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、または９６時間以内に患部に投与される。
【0255】
いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は局所的に投与される。いくつかの実施形態では、細胞性ＦＮ組成物は、結膜下注射によって投与される。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、それを必要とする対象に投与された場合、超効力を示す。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、１日１回、２、３、４、５、及び／または最大６回局所的に投与される。いくつかの実施形態では、ＦＮ組成物は、１日１滴または１回の投与で治療効果を可能にする。いくつかの実施形態では、１滴は、１日１、２、３、４、５、または６回投与される。いくつかの実施形態では、１滴は、１時間、２時間、３時間、または４時間の間隔で投与される。いくつかの実施形態では、１滴は、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、または１０週間、少なくとも１日１回投与される。いくつかの実施形態では、１滴は、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、または１０週間、少なくとも１日２回投与される。いくつかの実施形態では、１滴は、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、または１０週間、少なくとも１日３回投与される。いくつかの実施形態では、１滴は、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、または１０週間、少なくとも１日４回投与される。いくつかの実施形態では、１滴は、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、または１０週間、少なくとも１日５回投与される。いくつかの実施形態では、１滴は、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、または１０週間、少なくとも１日６回投与される。
【0256】
いくつかの実施形態では、治療方法で使用するためのＦＮ組成物は、低レベルのＶＥＧＦをさらに含む。いくつかの実施形態では、治療方法で使用するためのＦＮ組成物は、１ｐｇ／ｍＬ～４００ｐｇ／ｍＬのＶＥＧＦをさらに含む。
【0257】
いくつかの実施形態では、治療方法で使用するためのＦＮ組成物は、約４．７～約７．５のｐＨを有する。
【0258】
いくつかの実施形態では、治療方法で使用するためのＦＮ組成物は、リン酸二ナトリウム／一ナトリウム、クエン酸ナトリウム／クエン酸、ホウ酸／クエン酸ナトリウム、ホウ酸／四ホウ酸ナトリウム、及びクエン酸／リン酸二ナトリウムからなる群から選択される緩衝系で配合される。
【0259】
いくつかの実施形態では、治療方法で使用するためのＦＮ組成物は、張性改変剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、張性改変剤は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、マンニトール、デキストロース、スクロース、ソルビトール、及びグリセリンからなる群から選択される。
【0260】
いくつかの実施形態では、治療方法で使用するためのＦＮ組成物は、リン酸一ナトリウム／リン酸二ナトリウム、マンニトール、及びトレハロースをさらに含み、組成物は、約ｐＨ７．４のｐＨを有する。
【0261】
いくつかの実施形態では、治療方法で使用するためのＦＮ組成物は、二価カチオンをさらに含む。いくつかの実施形態では、二価カチオンは、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋、及びＺｎ２＋からなる群から選択される。
【0262】
いくつかの実施形態では、治療方法で使用するためのＦＮ組成物は、リン酸二ナトリウム／クエン酸、マンニトール、及びトレハロースをさらに含み、組成物は、約ｐＨ６．４のｐＨを有する。
【0263】
いくつかの実施形態では、治療方法で使用するためのＦＮ組成物は、接着剤をさらに含む。
【0264】
いくつかの実施形態では、治療方法で使用するためのＦＮ組成物は、生体異物成分、フェノールレッド、ペプチド及び生体分子＜３ｋＤａ、抗生物質、タンパク質凝集体＞２００ｎｍ、細胞、非エクソソーム／非細胞外小胞細胞破片、ホルモン、及びＬ－グルタミンからなる群から選択される１つ以上の成分を含まない。
【0265】
いくつかの実施形態では、治療方法で使用するためのＦＮ組成物は、抗血管新生因子または抗瘢痕化因子を含む。
【0266】
Ｆ．キット
キットは、本明細書に開示されるように、容器に入ったＦＮ組成物または同じく容器に入ったＦＮ組成物を調製する際に使用するための馴化培地、及び使用説明書を含むことができる。さらに、キットには、眼の治療に使用するための溶液を調製するための混合用の構成要素、及び混合及び使用のための説明書を含めることができる。
キットは、本明細書に開示されるように、容器に入ったＦＮ組成物または同じく容器に入ったＦＮ組成物を調製する際に使用するための馴化培地、及び使用説明書を含むことができる。さらに、キットには、眼の治療に使用するための溶液を調製するための混合用の構成要素、及び混合及び使用のための説明書を含めることができる。
【0267】
容器は、少なくとも１つのバイアル、ウェル、試験管、フラスコ、ボトル、注射器、または他の容器手段を含むことができ、そこに容器に入ったＦＮ組成物またはＦＮ組成物の調製に使用するための馴化培地を含み、場合によっては、適切に等分される。追加の構成要素が提供される場合、キットには、このコンポーネントを配置できる追加の容器を含めることができる。そのような容器は、所望のバイアルが保持される射出成形または吹込成形されたプラスチック容器を含み得る。容器及び／またはキットには、使用説明書及び／または警告を記載したラベルを含めることができる。
【0268】
本開示は、以下の実施例によってさらに説明され、これは、さらなる限定として解釈されるべきではない。本出願を通して引用されたすべての図及びすべての参考文献、Ｇｅｎｂａｎｋ配列、特許、及び公開された特許出願の内容は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
【0269】
本発明は、ＭＳＣセクレトームを特徴付けるための試験及び／またはアッセイのパネルを含むキットを提供することができ、パネルは、少なくとも２つの特徴付けアッセイを含み、特徴付けアッセイは、物理的成分の特徴付け、酸化ストレスアッセイ、安全性分析、安定性アッセイ、増殖アッセイ、遊走アッセイ、血管新生アッセイ、分化／瘢痕化アッセイ、炎症アッセイ、及び／または上皮バリア完全性アッセイからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、試験及び／またはアッセイのパネルは、本明細書に記載されるように、ＭＳＣセクレトームを同定する。
【0270】
本発明は、ＦＮロット間の一貫性を決定するための試験及び／またはアッセイのパネルを含むキットを提供することができ、パネルは、１つ以上の特徴付けアッセイを含み、特徴付けアッセイは、物理的成分の特徴付け、酸化ストレスアッセイ、安全性分析、安定性アッセイ、増殖アッセイ、遊走アッセイ、血管新生アッセイ、分化／瘢痕化アッセイ、炎症アッセイ、及び／または上皮バリア完全性アッセイからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、試験及び／またはアッセイのパネルは、本明細書に記載されるように、細胞性ＦＮ組成物を同定する。
【実施例】
【0271】
実施例１：フィブロネクチンの特徴付け
ＦＮの同定は、最初に質量分析を行い、その後にＥＬＩＳＡによる定量化を行うことによってＭＳＣセクレトームにおいて実施した。
ＦＮの検出は、約０．５～５０ｎｇ／ｍＬの濃度で馴化培地（すなわち、細胞を除去して直接的に収穫した培地）において実施した。
ＦＮの同定は、最初に質量分析を行い、その後にＥＬＩＳＡによる定量化を行うことによってＭＳＣセクレトームにおいて実施した。
ＦＮの検出は、約０．５～５０ｎｇ／ｍＬの濃度で馴化培地（すなわち、細胞を除去して直接的に収穫した培地）において実施した。
【0272】
細胞ベースのインビトロアッセイの結果から、以下のことが示された：
ＦＮを枯渇させると、創傷閉鎖（スクラッチ創傷アッセイ）が顕著に損なわれた。
ＦＮを枯渇させると、創傷閉鎖（スクラッチ創傷アッセイ）が顕著に損なわれた。
【0273】
ＭＳＣセクレトームを添加すると、ＨＣＥＣの接着及び伸展が促進され、ＦＮを枯渇させると、ＨＣＥＣの接着及び伸展が損なわれ、ＦＮを外来性に添加すると、ＨＣＥＣの接着及び伸展が促進された。
【0274】
フィブロネクチンを外来性に添加すると、ＨＣＥＣのトランスウェル遊走が促進され、ＦＮを枯渇させると、ＨＣＥＣのトランスウェル遊走が損なわれる。
【0275】
フィブロネクチンはヒト角膜上皮細胞の遊走を刺激する。
組換えヒトフィブロネクチン（１ｕｇ／ｍＬ）を外来性に添加すると、３６時間後のトランスウェル膜を介する細胞の遊走が、陰性対照（無血清培地）と比較して顕著に刺激される。ゲンチアナバイオレットで染色したトランスウェル遊走インサートの底部側が示されている（図２）。
組換えヒトフィブロネクチン（１ｕｇ／ｍＬ）を外来性に添加すると、３６時間後のトランスウェル膜を介する細胞の遊走が、陰性対照（無血清培地）と比較して顕著に刺激される。ゲンチアナバイオレットで染色したトランスウェル遊走インサートの底部側が示されている（図２）。
【0276】
フィブロネクチンを枯渇させると、ヒト角膜上皮細胞の遊走が損なわれる。
フィブロネクチンを免疫枯渇させたＭＳＣセクレトームでは、トランスウェル遊走アッセイにおいて、そのままのＭＳＣセクレトームと比較して遊走が損なわれる。ゲンチアナバイオレットで染色したトランスウェル遊走インサートの底部側が示されている（図３）。
フィブロネクチンを免疫枯渇させたＭＳＣセクレトームでは、トランスウェル遊走アッセイにおいて、そのままのＭＳＣセクレトームと比較して遊走が損なわれる。ゲンチアナバイオレットで染色したトランスウェル遊走インサートの底部側が示されている（図３）。
【0277】
フィブロネクチンを枯渇させると、ヒト角膜上皮細胞のインビトロ創傷閉鎖が損なわれる。
フィブロネクチンを免疫枯渇させたＭＳＣセクレトームでは、トランスウェル遊走アッセイにおいて、そのままのＭＳＣセクレトームと比較して創傷ギャップへの細胞の遊走が損なわれる。２４時間後、ＦＮ枯渇ＭＳＣセクレトームで処理した創傷における閉鎖率が１６±１．９％であったこととは対照的に、ＭＳＣセクレトームで処理した細胞での閉鎖率は３０±１．２％であった（図４）。
フィブロネクチンを免疫枯渇させたＭＳＣセクレトームでは、トランスウェル遊走アッセイにおいて、そのままのＭＳＣセクレトームと比較して創傷ギャップへの細胞の遊走が損なわれる。２４時間後、ＦＮ枯渇ＭＳＣセクレトームで処理した創傷における閉鎖率が１６±１．９％であったこととは対照的に、ＭＳＣセクレトームで処理した細胞での閉鎖率は３０±１．２％であった（図４）。
【0278】
実施例２：フィブロネクチンは成長因子に結合する
抗フィブロネクチン捕捉抗体を使用してＭＳＣセクレトームからフィブロネクチンを免疫枯渇させ、プロテインＧ結合型磁気ビーズを使用して単離した。
ＥＬＩＳＡを介して溶解画分及びビーズ画分のＨＧＦをアッセイした。ビーズをＰＢＳで３回洗浄し、１００ｕＬのＰＢＳに再懸濁させた後、８０℃で１０分間加熱した。その後、試料を希釈し、この試料を、組換えＨＧＦを使用して標準曲線を作成してＥＬＩＳＡによって測定した。ｐｇ／ｍＬでのＨＧＦアッセイ結果については図５を参照のこと。
抗フィブロネクチン捕捉抗体を使用してＭＳＣセクレトームからフィブロネクチンを免疫枯渇させ、プロテインＧ結合型磁気ビーズを使用して単離した。
ＥＬＩＳＡを介して溶解画分及びビーズ画分のＨＧＦをアッセイした。ビーズをＰＢＳで３回洗浄し、１００ｕＬのＰＢＳに再懸濁させた後、８０℃で１０分間加熱した。その後、試料を希釈し、この試料を、組換えＨＧＦを使用して標準曲線を作成してＥＬＩＳＡによって測定した。ｐｇ／ｍＬでのＨＧＦアッセイ結果については図５を参照のこと。
【0279】
実施例３：ＭＳＣセクレトームは細胞性フィブロネクチンを含む
免疫学的アッセイを使用してＭＳＣセクレトームを分析した。結果は、ＭＳＣセクレトームが細胞性フィブロネクチンを含んでいたことを実証するものであり、このことは、ＥＤＡ＋及びＥＤＢ＋フィブロネクチンスプライシングバリアントの検出によって裏付けられた。
免疫学的アッセイを使用してＭＳＣセクレトームを分析した。結果は、ＭＳＣセクレトームが細胞性フィブロネクチンを含んでいたことを実証するものであり、このことは、ＥＤＡ＋及びＥＤＢ＋フィブロネクチンスプライシングバリアントの検出によって裏付けられた。
【0280】
セクレトーム中のフィブロネクチンの特徴付け
ＭＳＣから単離したセクレトームを、ＥＤＡ配列、ＥＤＢ＋フィブロネクチン、及び一般的なフィブロネクチン（ＦＮ）に特異的な抗体を使用してイムノブロッティングによって評価した。抗ＥＤＡ抗体及び抗ＥＤＢ抗体は共に、フィブロネクチンと交差反応し、このことは、セクレトーム中に存在する種が細胞性フィブロネクチンであることを示している（図６）。
ＭＳＣから単離したセクレトームを、ＥＤＡ配列、ＥＤＢ＋フィブロネクチン、及び一般的なフィブロネクチン（ＦＮ）に特異的な抗体を使用してイムノブロッティングによって評価した。抗ＥＤＡ抗体及び抗ＥＤＢ抗体は共に、フィブロネクチンと交差反応し、このことは、セクレトーム中に存在する種が細胞性フィブロネクチンであることを示している（図６）。
【0281】
サンドイッチＥＬＩＳＡを使用する細胞性ＥＤＡ＋フィブロネクチンの検出
組換え細胞性フィブロネクチン及びＥＤＡ配列特異的捕捉抗体を使用してＥＤＡ＋フィブロネクチンのＥＬＩＳＡ標準曲線（白抜きの丸印）を確立した。標準曲線の作成に使用する組換えフィブロネクチンに、免疫原として使用するＥＤＡ配列を含めることで、抗ＥＤＡ抗体を生成させた。ＥＤＡサンドイッチＥＬＩＳＡにおいてＭＳＣセクレトームをアッセイし、細胞性フィブロネクチンが容易に検出された（青色のドット）（図７）。
組換え細胞性フィブロネクチン及びＥＤＡ配列特異的捕捉抗体を使用してＥＤＡ＋フィブロネクチンのＥＬＩＳＡ標準曲線（白抜きの丸印）を確立した。標準曲線の作成に使用する組換えフィブロネクチンに、免疫原として使用するＥＤＡ配列を含めることで、抗ＥＤＡ抗体を生成させた。ＥＤＡサンドイッチＥＬＩＳＡにおいてＭＳＣセクレトームをアッセイし、細胞性フィブロネクチンが容易に検出された（青色のドット）（図７）。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【国際調査報告】