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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-07-12
(54)【発明の名称】がんの予防用又は治療用の医薬組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 45/00 20060101AFI20240705BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240705BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240705BHJP
A61K 45/06 20060101ALI20240705BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20240705BHJP
C12Q 1/68 20180101ALI20240705BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20240705BHJP
G01N 33/574 20060101ALI20240705BHJP
C12N 15/113 20100101ALN20240705BHJP
C12N 15/115 20100101ALN20240705BHJP
C07K 16/40 20060101ALN20240705BHJP
【ＦＩ】
A61K45/00
A61P43/00 111
A61P43/00 121
A61P35/00
A61K45/06
A61P35/02
C12Q1/68
G01N33/53 M
G01N33/574 Z
C12N15/113 130Z
C12N15/115 Z ZNA
C07K16/40
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023581025
(86)(22)【出願日】2022-06-28
(85)【翻訳文提出日】2024-02-26
(86)【国際出願番号】 KR2022009183
(87)【国際公開番号】W WO2023277502
(87)【国際公開日】2023-01-05
(31)【優先権主張番号】10-2021-0083887
(32)【優先日】2021-06-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】507175175
【氏名又は名称】インダストリー－アカデミック コーポレーション ファウンデーション，ヨンセイ ユニバーシティ
(71)【出願人】
【識別番号】524003459
【氏名又は名称】ヴェラヴァース
(74)【代理人】
【識別番号】100107766
【弁理士】
【氏名又は名称】伊東 忠重
(74)【代理人】
【識別番号】100070150
【弁理士】
【氏名又は名称】伊東 忠彦
(72)【発明者】
【氏名】チョン，ジェ－ホ
(72)【発明者】
【氏名】キム，ジェ－ウ
(72)【発明者】
【氏名】ファン，ソンスン
(72)【発明者】
【氏名】ユン，ポ ギョン
(72)【発明者】
【氏名】キム，ヒョンヒ
【テーマコード（参考）】
4B063
4C084
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA19
4B063QQ42
4B063QQ52
4B063QR32
4B063QR35
4C084AA20
4C084AA24
4C084MA02
4C084ZB26
4C084ZC75
4H045AA10
4H045AA30
4H045CA40
4H045DA75
4H045EA20
(57)【要約】
本発明は、がん患者、特に上皮間葉転換（ＥＭＴ）亜型のがん患者の予防、緩和、治療方法に関する。本発明は、ＰＨＧＤＨ阻害剤、ＳＨＭＴ阻害剤及びＭＴＨＦＤ２阻害剤を、グルタミナーゼ（ＧＬＳ）遺伝子又はそれをコードするタンパク質の発現量が増加しているがん患者に併用投与することで、１Ｃ代謝をより効果的に阻害し、再発、転移、抗がん剤耐性等のために治療が困難な難治性がん患者のがん細胞増殖抑制に相乗効果をもたらし、がんを極めて効果的に治療することができる方法に関する。また、ＧＬＳ遺伝子又はそれにコードされるタンパク質の発現量を測定することで、患者ごとに初期段階からカスタマイズされた治療方法に関する情報を提供し、治療の成功率を高めることができる。
【選択図】 図８
【選択図】 図８
【特許請求の範囲】
【請求項1】
グルタミナーゼ（ＧＬＳ）遺伝子の発現を阻害するための化合物又はその薬学的に許容される塩と、ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＨＧＤＨ）遺伝子、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（ＳＨＭＴ）遺伝子、及びメチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ＋依存性）２（ＭＴＨＦＤ２）遺伝子及びメテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドラーゼ遺伝子からなる群から選択される遺伝子の発現を阻害するための薬剤又はその薬学的に許容される塩と、
を含む、がんの予防用又は治療用の薬学的組成物。
【請求項2】
薬剤が、遺伝子のｍＲＮＡに特異的に結合し、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ及びアンチセンスオリゴヌクレオチドからなる群から選択される、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項3】
さらに、抗がん剤を含む、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項4】
がんは、上皮間葉転換（ＥＭＴ）亜型である、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項5】
がんは、胃がん、甲状腺がん、副甲状腺がん、卵巣がん、大腸がん、膵臓がん、肝臓がん、乳ガン、子宮頸部がん、肺ガン、非小細胞肺がん、前立腺ガン、胆嚢ガン、胆道がん、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、血液がん、膀胱ガン、頭部ガン、子宮ガン、直腸ガン、脳腫瘍、ガン、食道ガン、小腸がん、内分泌腺ガン、腎臓ガン、軟組織肉腫、尿道がん、陰茎ガン、腎臓細胞がん、腎盂がん、中枢神経系（ＣＮＳ）腫瘍、原発性中枢神経系リンパ種、脊髄腫瘍、脳膠腫、及び下垂体腺腫からなる群から選択されるいずれか一つである、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項6】
グルタミナーゼ（ＧＬＳ）遺伝子によって発現されるタンパク質の機能を阻害するための化合物又はその薬学的に許容される塩とホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＨＧＤＨ）遺伝子、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（ＳＨＭＴ）遺伝子、及びメチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ＋依存性）２（ＭＴＨＦＤ２）遺伝子及びメテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドラーゼ遺伝子からなる群から選択される遺伝子によって発現されるタンパクの機能を阻害するための薬剤又はその薬学的に許容される塩と、
を含む、がんの予防用又は治療用の薬学的組成物。
【請求項7】
薬剤に含まれる化合物が、受容体逆作動薬、拮抗薬、抗体、又はタンパク質に選択的に結合するアプタマーである、請求項６に記載の薬学的組成物。
【請求項8】
さらに、抗がん剤を含む、請求項６に記載の薬学的組成物。
【請求項9】
がんは、上皮間葉転換（ＥＭＴ）亜型である、請求項６に記載の薬学的組成物。
【請求項10】
がんは、胃がん、甲状腺がん、副甲状腺がん、卵巣がん、大腸がん、膵臓がん、肝臓がん、乳ガン、子宮頸部がん、肺ガン、非小細胞肺がん、前立腺ガン、胆嚢ガン、胆道がん、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、血液がん、膀胱ガン、頭部ガン、子宮ガン、直腸ガン、脳腫瘍、ガン、食道ガン、小腸がん、内分泌腺ガン、腎臓ガン、軟組織肉腫、尿道がん、陰茎ガン、腎臓細胞がん、腎盂がん、中枢神経系（ＣＮＳ）腫瘍、原発性中枢神経系リンパ種、脊髄腫瘍、脳膠腫、及び下垂体腺腫からなる群から選択されるいずれか一つである、請求項６に記載の薬学的組成物。
【請求項11】
上皮間葉転換（ＥＭＴ）亜型がある患者を治療するための情報の提供方法であって、目的の物体から単離された生体試料中のＧＬＳ遺伝子又はそれによってコードされるタンパク質の発現レベルを測定すること、と
前記測定された遺伝子又はタンパク質の発現水準が増加する場合、前記遺伝子の発現を阻害するための組成物及び／又は前記タンパク質の機能を抑制する製剤の併用投与を決定すること、
とを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
［１］本発明は、がんの予防用又は治療用の医薬組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
［２］がんは、人類が解決しなければならない難治性疾患の一つであり、世界中でがんを治療するための開発に莫大な資本が投資されており、韓国の場合、毎年１０万人以上が診断され、６０，０００人以上が死亡する疾患の死因の第１位である。
［３］これらのがんの原因となる発がん物質には、喫煙、紫外線、化学物質、食品、その他の環境因子が含まれるが、様々な原因により治療法の開発が困難であり、また、その発生部位によって治療効果も異なる。現在、治療剤として使用されている物質は、毒性が高く、がん細胞を選択的に除去することができないため、がんの発生を予防し、がんが発生した後に治療するために、毒性が低く、効果的な抗がん剤の開発が切実に要求されている。過去１０年間にわたるがん診断及び治療の急速な進歩にもかかわらず、がんの発生による死亡率は高いままである。
［３］これらのがんの原因となる発がん物質には、喫煙、紫外線、化学物質、食品、その他の環境因子が含まれるが、様々な原因により治療法の開発が困難であり、また、その発生部位によって治療効果も異なる。現在、治療剤として使用されている物質は、毒性が高く、がん細胞を選択的に除去することができないため、がんの発生を予防し、がんが発生した後に治療するために、毒性が低く、効果的な抗がん剤の開発が切実に要求されている。過去１０年間にわたるがん診断及び治療の急速な進歩にもかかわらず、がんの発生による死亡率は高いままである。
【0003】
［４］特に、胃がんは、最も一般的な悪性腫瘍の１つであり、世界中でがんによる死亡の３番目に多い原因である。胃がん患者の治療における大きな進歩にもかかわらず、頻繁な再発及び転移、並びに薬剤耐性のために、胃がん患者の治療には依然として限界がある。
【0004】
［５］がんの再発、転移、薬剤耐性に関連するメカニズムについての研究が盛んに行われており、その中でもがん幹細胞仮説が注目されている。研究は、腫瘍の攻撃性、転移、再発、及び化学療法に対する耐性に寄与する幹様細胞の存在を示している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
［６］本発明の目的は、がんの予防、改善又は治療のための医薬組成物を提供することである。
［７］本発明の他の目的は、上皮間葉転換（ＥＭＴ）亜型がんである患者のための治療選択肢に関する情報の提供方法を提供することである。
［８］しかし、本発明が達成しようとする技術的課題は、上記の課題に制限されず、課題が言及されていなくても、下記の記載から当業者に明確に理解されることができる。
［７］本発明の他の目的は、上皮間葉転換（ＥＭＴ）亜型がんである患者のための治療選択肢に関する情報の提供方法を提供することである。
［８］しかし、本発明が達成しようとする技術的課題は、上記の課題に制限されず、課題が言及されていなくても、下記の記載から当業者に明確に理解されることができる。
【課題を解決するための手段】
【0006】
［９］本発明の一実施形態は、がんの予防又は治療のための医薬組成物を提供する。
［１０］本発明の一実施形態では、医薬組成物は、ＧＬＳ遺伝子の発現を阻害するための化合物又はその薬学的に許容される塩と、
ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＨＧＤＨ）遺伝子、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（ＳＨＭＴ）遺伝子、及びメチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ＋依存性）２（ＭＴＨＦＤ２）遺伝子及びメテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドラーゼ遺伝子からなる群から選択される遺伝子の発現を阻害するための薬剤又はその薬学的に許容される塩と、を有効成分として含む。
［１１］本発明の他の実施形態では、医薬組成物は、ＧＬＳ遺伝子遺伝子によって発現されるタンパク質の機能を阻害するための調製物又はその薬学的に許容される塩と、ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＨＧＤＨ）遺伝子、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（ＳＨＭＴ）遺伝子、及びメチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ＋依存性）２（ＭＴＨＦＤ２）遺伝子及びメテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドラーゼ遺伝子からなる群から選択される遺伝子によって発現されるタンパクの機能を阻害するための調製物又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含む。
［１０］本発明の一実施形態では、医薬組成物は、ＧＬＳ遺伝子の発現を阻害するための化合物又はその薬学的に許容される塩と、
ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＨＧＤＨ）遺伝子、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（ＳＨＭＴ）遺伝子、及びメチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ＋依存性）２（ＭＴＨＦＤ２）遺伝子及びメテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドラーゼ遺伝子からなる群から選択される遺伝子の発現を阻害するための薬剤又はその薬学的に許容される塩と、を有効成分として含む。
［１１］本発明の他の実施形態では、医薬組成物は、ＧＬＳ遺伝子遺伝子によって発現されるタンパク質の機能を阻害するための調製物又はその薬学的に許容される塩と、ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＨＧＤＨ）遺伝子、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（ＳＨＭＴ）遺伝子、及びメチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ＋依存性）２（ＭＴＨＦＤ２）遺伝子及びメテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドラーゼ遺伝子からなる群から選択される遺伝子によって発現されるタンパクの機能を阻害するための調製物又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含む。
【0007】
［１２］本発明の「ＧＬＳ遺伝子」は、グルタミンをグルタミン酸とアンモニアに加水分解する反応を触媒するｋ型ミトコンドリアグルタミナーゼをコードする遺伝子である。特に、がん細胞は、大量のエネルギー源及び脂肪酸合成に必要な供給源を得るためにＧＬＳ遺伝子を過剰発現し、それによってグルタミンを分解することが報告されている。本発明の目的のために、がん患者は、ＧＬＳ遺伝子を過剰発現してよく、これは、ＧＬＳ遺伝子の発現又はそれによってコードされるタンパク質の機能を阻害することができる薬剤による増殖又は細胞死の阻害によって特徴付けられてよいか、これらに限定されない。
［１３］本発明のＧＬＳ遺伝子は、配列番号１又は配列番号２で表される塩基配列からなってよいが、これらに限定されない。
［１４］本発明のＧＬＳ遺伝子によってコードされるタンパク質の機能を阻害することができる調製物は、化学式１（ＣＡＳ番号１４３９３９９－５８－２）又は化学式２（ＣＡＳ番号３１４０４５－３９－１）で標識された化合物であってよいが、これらに限定されない。
［１５］［化学式１］
［１３］本発明のＧＬＳ遺伝子は、配列番号１又は配列番号２で表される塩基配列からなってよいが、これらに限定されない。
［１４］本発明のＧＬＳ遺伝子によってコードされるタンパク質の機能を阻害することができる調製物は、化学式１（ＣＡＳ番号１４３９３９９－５８－２）又は化学式２（ＣＡＳ番号３１４０４５－３９－１）で標識された化合物であってよいが、これらに限定されない。
［１５］［化学式１］
【0008】
【化1】
［１７］
［化学式２］
【0009】
【化2】
［１９］本発明の「ＰＨＧＤＨ遺伝子」は、動物細胞におけるＬ－セリン合成の初期段階に関与する酵素をコードする遺伝子である。
［２０］本発明のＰＨＧＤＨ遺伝子は、配列番号３で表される塩基配列からなってよいが、これに限定されない
［２１］本発明の「ＳＨＭＴ遺伝子」は、セリン及びテトラヒドロ葉酸をグリシン及び５，１０－メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素に可逆的に変換することを触媒する遺伝子である。
［２２］本発明のＳＨＭＴ遺伝子は、配列番号４で表される塩基配列からなってよいが、これに限定されない。
［２３］本発明の「ＭＴＨＦＤ２遺伝子」は、メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ活性又はメテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドラーゼ活性がある遺伝子である。
［２４］本発明のＭＴＨＦＤ２遺伝子は、配列番号５で表される塩基配列からなってよいが、これに限定されない。
【0010】
［２５］本発明のＰＨＧＤＨ遺伝子によってコードされるタンパク質の機能を阻害することができる調製物は、以下の化学式３（ＣＡＳ番号１９１６５７１－９０－８）によって表される化合物であってよいが、これらに限定されない。
［２６］［化学式３］
［２６］［化学式３］
【0011】
【化3】
［２８］本発明のＭＴＨＦＤ２遺伝子によりコードされるタンパク質の機能を阻害することができる調製物は、以下の化学式４（ＣＡＳ番号２２２７１４９－２２－４）により表される化合物であり得るが、これらに限定されない。
［２９］［化学式４］
【0012】
【化4】
［３１］本発明のＳＨＭＴ遺伝子によってコードされるタンパク質の機能を阻害することができる調製物は、以下の化学式５（ＣＡＳ番号２１４６０９５－８５－２）によって表される化合物であってよいが、これらに限定されない。
［３２］［化学式５］
【0013】
【化5】
［３４］本発明の目的のために、ＰＨＧＤＨ、ＳＨＭＴ及びＭＴＨＦＤ２遺伝子並びにそれらによってコードされるタンパク質は、ＧＬＳ遺伝子及びそれらによってコードされるタンパク質とともにがん患者において発現が増加しており、その結果、ＧＬＳ遺伝子の発現又はそれらによってコードされるタンパク質の機能を阻害することができる薬物と組み合わせて投与される場合、がん患者におけるがん細胞の増殖阻害及び死滅に対して顕著な相乗効果を発揮することができる。
【0014】
［３５］本発明の「薬学的に許容される塩」は、当業者によって医学的適用に適していると一般に考えられる塩（例えば、そのような塩は、その塩で処置することができる対象に有害ではないため）、又はそれぞれの処置内で許容される副作用を起こす塩である。一般に、上記の薬学的に許容される塩は、米国食品医薬品局、欧州医薬品庁（ＥＭＡ）、又は厚生省の医薬品医療機器総合機構（ＰＭＤＡ）等の規制当局によって許容されると考えられる。
［３６］本発明の医薬組成物は、いずれの場合も、当業者であれば、本発明による特定の化合物又はその生理学的に機能的な誘導体が塩を形成することができるかどうか、すなわち、本発明の阻害剤又はその生理学的に機能的な誘導体に対応する物質が、例えば、アミノ基、カルボン酸基等の電荷があるかどうかを容易に決定することができる。
［３６］本発明の医薬組成物は、いずれの場合も、当業者であれば、本発明による特定の化合物又はその生理学的に機能的な誘導体が塩を形成することができるかどうか、すなわち、本発明の阻害剤又はその生理学的に機能的な誘導体に対応する物質が、例えば、アミノ基、カルボン酸基等の電荷があるかどうかを容易に決定することができる。
【0015】
［３７］本発明の阻害可能な化学製剤が化合物である場合、化合物の例示的な塩としては、酸付加塩又は塩基との塩、特に、医薬において一般的に用いられる薬学的に許容される無機及び有機酸付加塩及び塩基との塩があげられ、これは、水不溶性又は特に水溶性の酸付加物である。化合物の置換基に応じて、塩基との塩もまた好適であり得る。酸付加塩は、例えば、本発明の化合物の溶液を、塩酸、硫酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酢酸、安息香酸、クエン酸、酒石酸、炭酸又はリン酸等の薬学的に許容される酸の溶液と混合することによって形成され得る。同様に、薬学的に許容される塩基付加塩は、アルカリ塩（例えば、ナトリウム又はカリウム塩）；アルカリ土類金属塩（例えば、カルシウム又はマグネシウム塩）；及び適当な有機リガンドと形成される塩（例えば、ハロゲン化物、水酸化物、カルボン酸塩、硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、アルキルスルホン酸塩、及びアリールスルホン酸塩等の反対のアニオンを用いて形成されるアンモニウム、第四級アンモニウム、及びアミンカチオン）である。薬学的に許容される塩の例示としては、酢酸塩、アジフェート、アルギン酸塩、アルギニン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重炭酸塩、重硫酸塩、バイオトレート（ｂｉｏｔｒａｔｅ）、ホウ酸塩、臭化物、酪酸塩、エデト酸カルシウム、カンポート酸塩、カンホスルホン酸塩、カンシル酸塩、炭酸塩、塩化物、クエン酸塩、ジグルコン酸塩、二塩酸塩、ドデシル硫酸塩、エデト酸塩、エジシル酸塩（ｅｄｙｓｙｌａｔｅ）、エタンスルホン酸、ホルム酸塩、フマル酸塩、ガラクト酸塩、ガラクツロン酸塩、グルコン酸塩、グルタミン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキシルソリン酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化水素酸塩、２－ヒドロキシエタンスルホン酸、ヒドロキシナフトエ酸塩、ヨウ化物、イソ酪酸塩、イソチオネート、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、マンデル酸塩、メタンスルホン酸塩（メシル酸塩）、メチル硫酸塩、２－ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パントテン酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３－フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩／二リン酸塩、フタル酸塩、ピクリン酸塩、ピバレート（ｐｉｂａｌａｔｅ）、ポリガラクツロン酸塩、プロピオン酸塩、サリチル酸塩、ステアリン酸塩、硫酸塩、スベリン酸塩、コハク酸塩、タンニン酸塩、酒石酸塩、トシル酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩等であるが、これに限定されない。
【0016】
［３８］本発明の遺伝子の発現を阻害することができる調製物は、化合物であり、当該遺伝子のｍＲＮＡに特異的に結合するｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ及びアンチセンスオリゴヌクレオチドの群から選択されるいずれか一つであってよいが、これらに限定されない。
［３９］本発明のタンパク質の機能を阻害することができる化学製剤は、化合物、受容体逆作動薬、拮抗薬、及びタンパク質に特異的に結合することができる抗体又はアプタマーからなる群から選択されるいずれか１つであってよい。
［３９］本発明のタンパク質の機能を阻害することができる化学製剤は、化合物、受容体逆作動薬、拮抗薬、及びタンパク質に特異的に結合することができる抗体又はアプタマーからなる群から選択されるいずれか１つであってよい。
【0017】
［４０］本発明の「受容体逆作動薬」又は「拮抗薬」は、受容体の生物学的活性を直接的又は間接的に低減することができる分子を意味し、限定されないが、受容体のリガンドと併用さられる場合、リガンドの作用を低減し得る分子が挙げられる。
【0018】
［４１］本発明における「抗体」とは、タンパク質又はペプチド分子の抗原部位に特異的に結合し得るタンパク質様分子を意味し、このような抗体は、各遺伝子を常法に従って発現ベクターにクローニングし、マーカー遺伝子にコードされるタンパク質を取得し、得られたタンパク質から常法に従って調製することができる。
【0019】
［４２］本発明における「アプタマー」とは、所定の標的分子に対して結合活性がある核酸分子を意味する。前記アプタマーは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、修飾された核酸、又はこれらの混合物であってよく、直鎖又はループ形態であってよく、一般的に、アプタマーを構成するヌクレオチドの配列が短いほど、化学合成及び大量生産が容易であり、費用面で有利であり、化学式がきれいであり、生体内での安定性が良く、毒性が低いことが知られている。
【0020】
［４３］本発明の前記がんは、胃がん、甲状腺がん、副甲状腺がん、卵巣がん、大腸がん、膵臓がん、肝臓がん、乳がん、子宮頸部がん、肺がん、非小細胞肺がん、前立腺がん、胆嚢がん、胆道がん、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、血液がん、膀胱がん、腎臓がん、黒色腫、結腸がん、骨肉腫、皮膚がん、頭部がん、子宮がん、直腸がん、脳腫瘍、がん、卵管がん、子宮内膜がん、膣がん、陰嚢がん、食道がん、小腸がん、内分泌腺がん、副腎がん、軟組織肉腫、尿道がん、陰茎がん、尿管がん、腎臓細胞がん、腎盂がん、中枢神経系（ＣＮＳ）腫瘍、原発性ＣＮＳリンパ腫、脊髄腫瘍、脳幹膠腫及び下垂体腺腫からなる群より選択されるいずれか一つであってよく、例えば、胃がんであってよいが、これに限定されない。
［４４］本発明のがんは、転移、再発、及び薬剤耐性がんである不治のがんでありうるが、これらに限定されない。
［４５］本発明におけるがんは、上皮間葉転換（ＥＭＴ）亜型であってよいが、これに限定されない。
［４６］本発明の「ＥＭＴ分子亜型」は、上皮細胞が間葉系細胞に形質転換する過程がある亜型であり、上皮細胞がその外観を失い、間葉系細胞の特徴がある突然変異過程であり、個体形成の発生において重要な過程であることが知られており、がん細胞の成長、薬剤耐性、浸潤及び転移が起こり得る分子亜型をいう。
［４４］本発明のがんは、転移、再発、及び薬剤耐性がんである不治のがんでありうるが、これらに限定されない。
［４５］本発明におけるがんは、上皮間葉転換（ＥＭＴ）亜型であってよいが、これに限定されない。
［４６］本発明の「ＥＭＴ分子亜型」は、上皮細胞が間葉系細胞に形質転換する過程がある亜型であり、上皮細胞がその外観を失い、間葉系細胞の特徴がある突然変異過程であり、個体形成の発生において重要な過程であることが知られており、がん細胞の成長、薬剤耐性、浸潤及び転移が起こり得る分子亜型をいう。
【0021】
［４７］本発明の組成物は、さらに抗がん剤を含んでいてもよい。
［４８］本発明の抗がん剤は、ナイトロジェンマスタード、イマチニブ、オキサリプラチン、リツキシマブ、エルロチニブ、ネラチニブ、ラパチニブ、ゼフィチニブ、バンダンタニブ、ニロチニブ、セマサニブ、ボスチニブ、アクシチニブ、セジラニブ、レスタウルチニブ、トラスツズマブ、ゲフィチニブ、ボルテゾミブ、スニチニブ、カルボプラチン、ソラフェニブ、ベバシズマブ、シスプラチン、セツキシマブ、ビスクマルバム、アスパラギナーゼ、トレチノイン、ヒドロキシカルバミド、ダサチニブ、エストラモスチン、ゲムツズマポゾガマイシン、イブリツモマブ・ツセタン、ヘプタプラチン、メチルアミノレブリン酸、アムサクリン、アレムツズマブ、プロカルバジン、アルプロスタジル、硝酸ホルミウムキトサン、ゲムシタビン、ドキシフルリジン、ペメトレキセド、テガプール、カペシタビン、ジメラシン、オテラシル、アザシチジン、メトトレキサート、ウラシル、シタラビン、フルオロウラシル、フルダゴビン、エノシタビン、フルタミド、ケペシタビン、デシタビン、メルカプトプリン、チオグアニン、クラドリビン、カルモファー、ラリトレキセド、ドセタキセル、パクリタキセル、イリノテカン、ベロテカン、トポテカン、ビノレルビン、エトポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、テニホシド、ドキソルビシン、イダルビシン、エピルビシン、ミトキサントロン、マイトマイシン、ブレロマイシン、ダウノセシンルビシン、ダクチノマイシン、ピラルビシン、アクラルビシン、ペプロマイシン、テムシロリムス、テモゾロミド、ブスルファン、イホスファミド、シクロホスファミド、メルパラン、アルトレタミン、ダカルバジン、チオテパ、ニムスチン、クロラムブシル、ミトラクトール、ロイコボリン、トレトニン、エクメスタン、アミノグルテシミド、アナグレリド、オラパリブ、ナベルビン、パドラゾール、タモキシフェン、トレミフェン、テストステロン、アナストロゾール、レトロゾール、ボロゾールからなる群から選択されるからなる群から選択される１種以上を用いてよい。
［４８］本発明の抗がん剤は、ナイトロジェンマスタード、イマチニブ、オキサリプラチン、リツキシマブ、エルロチニブ、ネラチニブ、ラパチニブ、ゼフィチニブ、バンダンタニブ、ニロチニブ、セマサニブ、ボスチニブ、アクシチニブ、セジラニブ、レスタウルチニブ、トラスツズマブ、ゲフィチニブ、ボルテゾミブ、スニチニブ、カルボプラチン、ソラフェニブ、ベバシズマブ、シスプラチン、セツキシマブ、ビスクマルバム、アスパラギナーゼ、トレチノイン、ヒドロキシカルバミド、ダサチニブ、エストラモスチン、ゲムツズマポゾガマイシン、イブリツモマブ・ツセタン、ヘプタプラチン、メチルアミノレブリン酸、アムサクリン、アレムツズマブ、プロカルバジン、アルプロスタジル、硝酸ホルミウムキトサン、ゲムシタビン、ドキシフルリジン、ペメトレキセド、テガプール、カペシタビン、ジメラシン、オテラシル、アザシチジン、メトトレキサート、ウラシル、シタラビン、フルオロウラシル、フルダゴビン、エノシタビン、フルタミド、ケペシタビン、デシタビン、メルカプトプリン、チオグアニン、クラドリビン、カルモファー、ラリトレキセド、ドセタキセル、パクリタキセル、イリノテカン、ベロテカン、トポテカン、ビノレルビン、エトポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、テニホシド、ドキソルビシン、イダルビシン、エピルビシン、ミトキサントロン、マイトマイシン、ブレロマイシン、ダウノセシンルビシン、ダクチノマイシン、ピラルビシン、アクラルビシン、ペプロマイシン、テムシロリムス、テモゾロミド、ブスルファン、イホスファミド、シクロホスファミド、メルパラン、アルトレタミン、ダカルバジン、チオテパ、ニムスチン、クロラムブシル、ミトラクトール、ロイコボリン、トレトニン、エクメスタン、アミノグルテシミド、アナグレリド、オラパリブ、ナベルビン、パドラゾール、タモキシフェン、トレミフェン、テストステロン、アナストロゾール、レトロゾール、ボロゾールからなる群から選択されるからなる群から選択される１種以上を用いてよい。
【0022】
［４９］本発明における上記「予防」とは、疾患又は病態の発症を阻害又は遅延させるいかなる行為を意味する。本発明の目的のために、組成物は、がん、特にＥＭＴ分子亜型がんの発症を遅延させるか、又はその発症を阻害することを意味する。
［５０］本発明の「治癒」は、疾患又は疾病の進行を遅延、停止、又は逆転させるいかなる行為を意味し、本発明の目的のために、組成物は、がん、特にＥＭＴ分子亜型がんの進行を停止、低減、緩和、排除、又は逆転させることを意味する。
［５０］本発明の「治癒」は、疾患又は疾病の進行を遅延、停止、又は逆転させるいかなる行為を意味し、本発明の目的のために、組成物は、がん、特にＥＭＴ分子亜型がんの進行を停止、低減、緩和、排除、又は逆転させることを意味する。
【0023】
［５１］本発明の医薬組成物は、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、注射剤、軟膏剤、散剤、又は飲料の形態であることを特徴とすることができ、医薬組成物は、ヒト対象によって特徴付けられ得る。
［５２］本発明の医薬組成物は、これらに限定されないが、常法に従って、それぞれ製剤化し、経口剤、外用剤、坐剤、酸等の無菌注射液、顆粒剤、カプセル剤、錠剤、水性懸濁剤等の形態で使用することができる。本発明の医薬組成物は、薬学的に許容される担体を含んでよい。前記薬学的に許容可能な担体は、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、賦形剤、可溶化剤、分散化剤、安定化剤、懸濁剤、着色剤、香料を用いることができ、注射剤の場合、緩衝剤、防腐剤、非崩壊剤、可溶化剤、等張化剤、安定化剤等を、局所適用の場合、基剤、賦形剤、潤滑剤、防腐剤等を用いてよい。
［５３］本発明の医薬組成物の化学製剤は、上記のような薬学的に許容される担体と混合することによって、様々な方法で調製することができる。例えば、経口投与の場合、錠剤、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、ウエハース剤等の形態で調製することができ、注射剤の場合、単位用量のアンプル剤又は多用量の形態で調製することができる。その他、溶液、懸濁液、錠剤、カプセル剤、徐放性化学製剤等に化学的に製剤化することができる。
［５４］本発明の化学製剤に適した担体、賦形剤、及び希釈剤の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、デンプン、アラビアゴム、アルギン酸、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、水、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウム、又は鉱油があげられる。さらに、充填剤、凝集防止剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、乳化剤、保存剤等をさらに含有してよい。
［５５］本発明の医薬組成物の投与経路としては、これらに限定されないが、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、髄腔内、心臓内、経皮、皮下、腹腔内、経鼻、経腸、局所、舌下又は直腸があげられる。経口又は非経口投与が好ましい。本発明において、「非経口」は、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、滑液包内、胸骨内、髄腔内、病巣内、及び頭蓋内注射又は注射技術があげられる。さらに、医薬組成物は、直腸投与用の坐剤の形態で投与することができる。
［５２］本発明の医薬組成物は、これらに限定されないが、常法に従って、それぞれ製剤化し、経口剤、外用剤、坐剤、酸等の無菌注射液、顆粒剤、カプセル剤、錠剤、水性懸濁剤等の形態で使用することができる。本発明の医薬組成物は、薬学的に許容される担体を含んでよい。前記薬学的に許容可能な担体は、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、賦形剤、可溶化剤、分散化剤、安定化剤、懸濁剤、着色剤、香料を用いることができ、注射剤の場合、緩衝剤、防腐剤、非崩壊剤、可溶化剤、等張化剤、安定化剤等を、局所適用の場合、基剤、賦形剤、潤滑剤、防腐剤等を用いてよい。
［５３］本発明の医薬組成物の化学製剤は、上記のような薬学的に許容される担体と混合することによって、様々な方法で調製することができる。例えば、経口投与の場合、錠剤、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、ウエハース剤等の形態で調製することができ、注射剤の場合、単位用量のアンプル剤又は多用量の形態で調製することができる。その他、溶液、懸濁液、錠剤、カプセル剤、徐放性化学製剤等に化学的に製剤化することができる。
［５４］本発明の化学製剤に適した担体、賦形剤、及び希釈剤の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、デンプン、アラビアゴム、アルギン酸、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、水、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウム、又は鉱油があげられる。さらに、充填剤、凝集防止剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、乳化剤、保存剤等をさらに含有してよい。
［５５］本発明の医薬組成物の投与経路としては、これらに限定されないが、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、髄腔内、心臓内、経皮、皮下、腹腔内、経鼻、経腸、局所、舌下又は直腸があげられる。経口又は非経口投与が好ましい。本発明において、「非経口」は、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、滑液包内、胸骨内、髄腔内、病巣内、及び頭蓋内注射又は注射技術があげられる。さらに、医薬組成物は、直腸投与用の坐剤の形態で投与することができる。
【0024】
［５６］本発明の医薬組成物は、用いられる特定の化合物の活性、年齢、体重、一般的な健康状態、性別、化学製剤、投与時間、投与経路、放出速度、薬物の化学製剤、及び予防又は治療される特定の疾患の重症度を含むいくつかの要因に応じて変化してよく、医薬組成物の投与量は、患者の状態、体重、疾患の程度、薬物形態、投与経路及び期間に依存するが、当業者によって適当に選択され得る。それは、１日当たり０．０００１～５０ｍｇ／ｋｇ又は０．００１～５０ｍｇ／ｋｇで投与され得る。１日１回又は数回に分けて投与することができる。上記の投与量は、本発明の範囲を決して限定しない。本発明による医薬組成物は、錠剤、ドラジェ、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤として化学的に製剤化することができる。
【0025】
［５７］本発明の他の実施形態では、投与が必要な実体において、薬学的に有効な用量の、グルタミナーゼ（ＧＬＳ）遺伝子の発現を阻害することができる化学製剤、又はその薬学的に許容される塩と、ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＨＧＤＨ）遺伝子、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（ＳＨＭＴ）遺伝子、及びメチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ＋依存性）２（ＭＴＨＦＤ２）遺伝子及びメテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドラーゼ遺伝子からなる群から選択されるいずれか１つの遺伝子の発現を阻害するための薬剤又はその薬学的に許容される塩と、を含有する薬物に関する。
［５８］本発明のがんの予防又は治療方法において、前記ＧＬＳ、ＰＨＧＤＨ、ＳＨＭＴ又はＭＴＨＦＤ２遺伝子、前記遺伝子の発現を阻害することができる製剤、薬学的に許容される塩及びがんは、前記がんの予防、改善又は治療用組成物で説明したものと同様であり、本明細書の過度な複雑性を避けるために省略する。
［５９］本発明において、「投薬/投与」とは、本発明の所定の組成物をいかなる適当な方法で対象に提供することを意味する。
［６０］本発明において、上記の投与を必要とする「対象」は、哺乳類及び非哺乳類の動物を含んでよい。ここで、前記哺乳動物の例としては、ヒト、非ヒト霊長類、例えばチンパンジー、他の類人猿又はサル種；家畜動物、例えばウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ；愛玩動物、例えばウサギ、イヌ又はネコ；実験動物、例えば齧歯類、例えばラット、マウス又はモルモットが挙げられるが、これらに限定されない。また、本発明において、前記非哺乳類動物の例としては、鳥類又は魚類を挙げられるが、これらに限定されない。
［６１］本発明において上記のように投与される化学製剤は、特に限定されず、固体形態、液体形態、又は吸引用のエアロゾル化学製剤として投与されてよく、使用直前に液状製剤に変換して経口又は非経口投与することを目的とした、固体形態の化学製剤、例えば、酸剤、顆粒剤、カプセル剤、錠剤、水性懸濁液の経口化学製剤、外用剤、坐剤、無菌注射液等として投与されてよく、これらに限定されない。
［５８］本発明のがんの予防又は治療方法において、前記ＧＬＳ、ＰＨＧＤＨ、ＳＨＭＴ又はＭＴＨＦＤ２遺伝子、前記遺伝子の発現を阻害することができる製剤、薬学的に許容される塩及びがんは、前記がんの予防、改善又は治療用組成物で説明したものと同様であり、本明細書の過度な複雑性を避けるために省略する。
［５９］本発明において、「投薬/投与」とは、本発明の所定の組成物をいかなる適当な方法で対象に提供することを意味する。
［６０］本発明において、上記の投与を必要とする「対象」は、哺乳類及び非哺乳類の動物を含んでよい。ここで、前記哺乳動物の例としては、ヒト、非ヒト霊長類、例えばチンパンジー、他の類人猿又はサル種；家畜動物、例えばウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ；愛玩動物、例えばウサギ、イヌ又はネコ；実験動物、例えば齧歯類、例えばラット、マウス又はモルモットが挙げられるが、これらに限定されない。また、本発明において、前記非哺乳類動物の例としては、鳥類又は魚類を挙げられるが、これらに限定されない。
［６１］本発明において上記のように投与される化学製剤は、特に限定されず、固体形態、液体形態、又は吸引用のエアロゾル化学製剤として投与されてよく、使用直前に液状製剤に変換して経口又は非経口投与することを目的とした、固体形態の化学製剤、例えば、酸剤、顆粒剤、カプセル剤、錠剤、水性懸濁液の経口化学製剤、外用剤、坐剤、無菌注射液等として投与されてよく、これらに限定されない。
【0026】
［６２］また、本発明においては、上記投与の際に、本発明の化学製剤とともに、薬学的に許容される担体をさらに投与してよい。ここで、薬学的に許容される担体としては、経口投与の場合には、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、賦形剤、可溶化剤、分散剤、安定化剤、懸濁剤、着色剤、香料等を用いることができ、注射投与の場合には、緩衝剤、保存剤、非単量化剤、可溶化剤、等張化剤、安定化剤等を混合して用いることができ、局所投与の場合には、基剤、賦形剤、滑沢剤、保存剤等を用いることができる。本発明の化合物の化学製剤は、上記のように薬学的に許容される担体と混合することにより、種々の方法で調製することができる。例えば、経口投与の場合には、錠剤、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、ウエハース剤等の形態で調製することができ、注射剤の場合には、単位用量アンプル剤、マルチドーズ剤等の形態で調製することができる。その他、溶液、懸濁液、錠剤、カプセル剤、徐放性製剤などとして化学的に製剤化され得る。
［６３］一方、化学製剤に好適な担体、賦形剤及び希釈剤の例としては、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、デンプン、アラビアゴム、アルギン酸塩、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、水、ヒドロキシ安息香酸メチル
ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、水、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウムまたは鉱油があげられる。さらに、充填剤、凝集防止剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、乳化剤、保存剤などを含有してもよい。
［６３］一方、化学製剤に好適な担体、賦形剤及び希釈剤の例としては、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、デンプン、アラビアゴム、アルギン酸塩、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、水、ヒドロキシ安息香酸メチル
ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、水、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウムまたは鉱油があげられる。さらに、充填剤、凝集防止剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、乳化剤、保存剤などを含有してもよい。
【0027】
［６４］本発明による製剤の投与経路は、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、硬膜内、心筋内、経皮、皮下、腹腔内、経鼻、経腸、局所、舌下又は直腸であるが、これらに限定されるものではない。経口又は非経口投与が好ましい。
［６５］本発明において、「非経口的」とは、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、滑液包内、胸骨内、髄腔内、および頭蓋内注射または注入技術を含む。本発明の医薬組成物はまた、直腸投与用の坐剤の形態で投与することもできる。
［６６］本発明において、「薬学的に有効な量」とは、所望の生物学的結果を提供するのに十分な作動薬の量をいう。その結果は、疾患の徴候、症状または原因の軽減および／または緩和、または生物学的世界における他の望ましい変化であってもよい。例えば、治療的使用のための「有効量」は、疾患の臨床的に有意な軽減を提供するために必要な、本発明で開示される化学製剤の量である。個々の場合における「有効な」の適当な量は、日常的な実験を用いて当業者が決定することができる。したがって、「有効量」という表現は、通常、活性物質が治療効果を有する量を意味する。本実施例において、活性物質は、がん細胞の増殖抑制剤であり、がんの予防、改善または治癒剤である。
［６５］本発明において、「非経口的」とは、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、滑液包内、胸骨内、髄腔内、および頭蓋内注射または注入技術を含む。本発明の医薬組成物はまた、直腸投与用の坐剤の形態で投与することもできる。
［６６］本発明において、「薬学的に有効な量」とは、所望の生物学的結果を提供するのに十分な作動薬の量をいう。その結果は、疾患の徴候、症状または原因の軽減および／または緩和、または生物学的世界における他の望ましい変化であってもよい。例えば、治療的使用のための「有効量」は、疾患の臨床的に有意な軽減を提供するために必要な、本発明で開示される化学製剤の量である。個々の場合における「有効な」の適当な量は、日常的な実験を用いて当業者が決定することができる。したがって、「有効量」という表現は、通常、活性物質が治療効果を有する量を意味する。本実施例において、活性物質は、がん細胞の増殖抑制剤であり、がんの予防、改善または治癒剤である。
【0028】
［６７］本発明の化学製剤は、活動性、年齢、体重、一般的健康状態、性別、化学製剤、投与時間、投与経路、排出率、薬物化学製剤、および予防または治療すべき特定の疾患の重症度を含むいくつかの要因によって変化してよく、製剤の投与量は、患者の状態、体重、疾患の程度、薬物の形態、経路および期間によって変化するが、当業者によって適当に選択され得、１日あたり０．０００１～１００ｍｇ／ｋｇ又は０．００１～１００ｍｇ／ｋｇで投与することができる。１日１回投与することもできるし、数回に分けて投与することもできる。上記の投与量は、本発明の範囲を何ら限定するものではない。本発明による化合物は、錠剤、ドラジェ、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤として化学的に製剤化することができる。
［６８］本発明の製剤は、単独で、又は手術、放射線療法、ホルモン療法、化学療法、及び生体反応調節剤等の方法と組み合わせて使用することができる。
［６９］また、本発明の化学製剤は、他の抗がん剤と併用することができ、このとき、抗がん剤としては、ナイトロジェンマスタード、イマチニブ、オキサリプラチン、リツキシマブ、パニツムマブ、エルロチニブ、ネラチニブ、ラパチニブ、ゼフィチニブ、バンダンタニブ、ニロチニブ、セマサニブ、ボスチニブ、アクシチニブ、セジラニブ、レスタウルチニブ、トラスツズマブ、ゲフィチニブ、ボルテゾミブ、ススットリカニブニチニブ、カルボプラチン、５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）、ベバシズマブ、シスプラチン、セツキシマブ、アプリベルセプト、レゴラフェニブ、ビスクマルバム、アスパラギナーゼ、トレチノイン、ヒドロキシカルバミド、ダサチニブ、エストラモスチン、ゲムツズマブ・オゾガマイシン、イブリツモマブ・ツセタン、ヘプタプラチン、メチルアミノレブリン酸、アムサクリン、アレムツズマブ、プロカルバジン、アルプロスタジル、硝酸ホルミウムキトサン、ゲムシタビン、ドキシフルリジン、ペメトレキセド、テガプール、カペシタビン、ギメラシン、オテラシル
アザシチジン、メトトレキサート、ウラシル、シタラビン、フルオロウラシル、フルダガビン、エノシタビン、フルタミド、デシタビン、メルカプトプリン、チオグアニン、クラドリビン、カルモファー、ラルティトレキセド、インターフェロンアルファファ－２ａ、ドセタキセル、パクリタキセル、イリノテカン、ベロテカン、トポテカン、ビノレルビン、エトポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、テニホシド
ドキソルビシン、イダルビシン、エピルビシン、マイトキサントロン、マイトマイシン、ブレロマイシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、ピラルビシン、アクラビビシン、ペプロマイシン、テムシロリムス、テモゾロミド、５－フルオロウラシル、アドスルファン、イホスファミド、シクロホスファミド、メルパラン、アルトレタミン、ダカルバジン、チオテパ、ニムスチン、クロラムブシル、ミトラクトール、ロイコボリン、トレトニン、エクメスタン、アミノグルテシミド、アナグレリド、ナベルビン、パドラゾール、タモキシフェン、トレミフェン、テストステロン、アナストロゾール、レトロゾール、ボロゾール、ビカルタミド、ロムスチン、カルムスチンが挙げられるが、これらに限定されない。
［６８］本発明の製剤は、単独で、又は手術、放射線療法、ホルモン療法、化学療法、及び生体反応調節剤等の方法と組み合わせて使用することができる。
［６９］また、本発明の化学製剤は、他の抗がん剤と併用することができ、このとき、抗がん剤としては、ナイトロジェンマスタード、イマチニブ、オキサリプラチン、リツキシマブ、パニツムマブ、エルロチニブ、ネラチニブ、ラパチニブ、ゼフィチニブ、バンダンタニブ、ニロチニブ、セマサニブ、ボスチニブ、アクシチニブ、セジラニブ、レスタウルチニブ、トラスツズマブ、ゲフィチニブ、ボルテゾミブ、ススットリカニブニチニブ、カルボプラチン、５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）、ベバシズマブ、シスプラチン、セツキシマブ、アプリベルセプト、レゴラフェニブ、ビスクマルバム、アスパラギナーゼ、トレチノイン、ヒドロキシカルバミド、ダサチニブ、エストラモスチン、ゲムツズマブ・オゾガマイシン、イブリツモマブ・ツセタン、ヘプタプラチン、メチルアミノレブリン酸、アムサクリン、アレムツズマブ、プロカルバジン、アルプロスタジル、硝酸ホルミウムキトサン、ゲムシタビン、ドキシフルリジン、ペメトレキセド、テガプール、カペシタビン、ギメラシン、オテラシル
アザシチジン、メトトレキサート、ウラシル、シタラビン、フルオロウラシル、フルダガビン、エノシタビン、フルタミド、デシタビン、メルカプトプリン、チオグアニン、クラドリビン、カルモファー、ラルティトレキセド、インターフェロンアルファファ－２ａ、ドセタキセル、パクリタキセル、イリノテカン、ベロテカン、トポテカン、ビノレルビン、エトポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、テニホシド
ドキソルビシン、イダルビシン、エピルビシン、マイトキサントロン、マイトマイシン、ブレロマイシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、ピラルビシン、アクラビビシン、ペプロマイシン、テムシロリムス、テモゾロミド、５－フルオロウラシル、アドスルファン、イホスファミド、シクロホスファミド、メルパラン、アルトレタミン、ダカルバジン、チオテパ、ニムスチン、クロラムブシル、ミトラクトール、ロイコボリン、トレトニン、エクメスタン、アミノグルテシミド、アナグレリド、ナベルビン、パドラゾール、タモキシフェン、トレミフェン、テストステロン、アナストロゾール、レトロゾール、ボロゾール、ビカルタミド、ロムスチン、カルムスチンが挙げられるが、これらに限定されない。
【0029】
［７０］本発明の他の実施形態は、ＥＭＴ分子亜型がんがある患者をどのように治療するかについての情報の提供方法を提供する。
［７１］本発明の方法は、目的の物体から単離された生体試料中のＧＬＳ遺伝子又はそれによってコードされるタンパク質の発現レベルを測定し、上記で測定された遺伝子又はタンパク質の発現レベルが増加した場合、前記測定された遺伝子又はタンパク質の発現水準が増加する場合、前記遺伝子の発現を阻害するための組成物及び／又は前記タンパク質の機能を抑制する製剤の併用投与を決定することであって、当該遺伝子とは以下の：
［７２］ＰＨＧＤＨ（ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ）遺伝子
［７３］ＳＨＭＴ（セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ）遺伝子、及び
［７４］ＭＴＨＦＤ２（メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ＋依存性）２、メテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドラーゼ）遺伝子
である。
［７１］本発明の方法は、目的の物体から単離された生体試料中のＧＬＳ遺伝子又はそれによってコードされるタンパク質の発現レベルを測定し、上記で測定された遺伝子又はタンパク質の発現レベルが増加した場合、前記測定された遺伝子又はタンパク質の発現水準が増加する場合、前記遺伝子の発現を阻害するための組成物及び／又は前記タンパク質の機能を抑制する製剤の併用投与を決定することであって、当該遺伝子とは以下の：
［７２］ＰＨＧＤＨ（ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ）遺伝子
［７３］ＳＨＭＴ（セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ）遺伝子、及び
［７４］ＭＴＨＦＤ２（メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ＋依存性）２、メテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドラーゼ）遺伝子
である。
【0030】
［７５］本発明において、「目的の対象」とは、ＧＬＳ遺伝子発現を阻害することができる化学製剤；又はそれによってコードされるタンパク質の機能を阻害することができる薬物のために治療に対する応答が不確かであり、がんを発症したか、又はがんを発症する確率が高い個体を意味する。
［７６］本発明の「生体試料」は、個体から得られるか又は個体に由来するいかなる物質、生物学的体液、組織、又は細胞を意味し、例えば、全血、白血球、末梢血単核細胞、白血球バフィーコート、血漿、及び血清、血液、痰、涙、粘液、鼻洗浄液、鼻汁、呼気、尿、精液、唾液、腹膜洗浄液、骨盤液、嚢胞液、髄膜液、羊水、腺液、膵液、リンパ液、胸膜液、乳頭吸引液、気管支吸引液、滑液、関節吸引液、関節吸引液、臓器分泌液、細胞、細胞抽出液、脳脊髄液などが挙げられるが、これらに限定されない。
［７７］本発明におけるタンパクの発現量を測定する方法は、プロテインチップ解析、免疫測定法、リガンド結合測定法、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ（マトリックス支援レーザーイオン化飛行時間型質量分析）解析、ＳＥＬＤＩ－ＴＯＦ（表面増強レーザーイオン化飛行時間型質量分析）解析、放射線免疫拡散、放射線免疫拡散、オロチン酸免疫拡散方法、ロケット免疫電気泳動、組織免疫染色、補体固定分析、二次元電気泳動解析、液体クロマトグラフィ質量分析（ＬＣ－ＭＳ）、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ（液体クロマトグラフィ／質量分析）、ウエスタンブロット法、及びＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法）からなる群から選択される少なくとも１つであってよい。
［７８］本発明のタンパク質の発現レベルは、タンパク質の発現レベルを測定することができる化学製剤を用いて測定することができる。前記タンパク質の発現水準を測定することができる化学製剤としては、前記タンパク質に特異的に結合する抗体、オリゴペプチド、リガンド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）及びアプタマーからなる群から選択された１種以上であってよい。
［７９］本発明の「抗体」とは、抗原に特異的に結合し、抗原抗体反応を生じる物質をいう。本発明の目的のために、抗体は、タンパク質に特異的に結合する抗体を意味する。本発明の抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、組換え抗体の両方が含まれる。抗体は、当業界で広く知られている技術を用いて容易に調製することができる。例えば、ポリクローナル抗体は、タンパク質の抗原を動物に注射し、その動物から血液を採取して抗体を含む血清を得る工程を含む、当業界で広く知られた方法により作製することができる。これらのポリクローナル抗体は、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、サル、ウマ、ブタ、ウシ、イヌ等のいかなる動物から製造することができる。さらに、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法（Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７６）Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６：５１１－５１９）、又はファージ抗体ライブラリー技術（Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４－６２８，１９９１；Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８，１－５９７，１９９１）として産業界で広く知られている。本発明の方法により調製された抗体は、ゲル電気泳動、透析、塩沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の方法を用いて単離精製することができる。また、本発明の抗体は、２つの全長軽鎖及び２つの全長重鎖がある完全な形態だけでなく、抗体の機能的断片を含む。
［８０］本発明の抗体の機能的断片は、少なくとも抗原結合機能がある断片を意味し、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖを含む。
［８１］ＤＮＡ又はＲＮＡに類似した人工的に合成されたポリマーを指す「ペプチド核酸（ＰＮＡ）」は、１９９１年にＮｉｅｌｓｅｎ、Ｅｇｈｏｌｍ、Ｂｅｒｇ及びＢｕｃｈａｒｄｔ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｄｅｎｍａｒｋ）によって最初に導入された。ＤＮＡはリン酸－リボース糖骨格があるが、ＰＮＡはペプチド結合によって連結された反復Ｎ－（２－アミノエチル）－グリシン骨格を有し、これはＤＮＡ又はＲＮＡに対するその結合強度及び安定性を大きく増加させ、分子生物学、診断アッセイ、及びアンチセンス療法において用いられる。
［８２］本発明の「アプタマー」は、オリゴ核酸又はペプチド分子を意味する。
［８３］本発明のタンパク質を含むアミノ酸配列に基づいて、タンパク質に特異的に結合する抗体、ＰＮＡ、及びアプタマーに対応する化学製剤は、通常の技術者によって容易に製造することができる。
［８４］本発明の遺伝子の発現レベルを測定する方法は、逆転写ポリメラーゼ反応（ＲＴ－ＰＣＲ）、競合的逆転写ポリメラ－ゼ反応（競合的ＲＴ－ＰＣＲ）、リアルタイム逆転写ポリメラーゼ反応（リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ）、ＲＮａｓｅ保護アッセイ（ＲＰＡ；ＲＮａｓｅ保護アッセイ）、ノーザンブロッティング、及びＤＮＡチップの群から選択される少なくとも１つを行うことである。
［８５］本発明の遺伝子の発現レベルは、遺伝子の発現レベルを測定することができる化学製剤を用いて測定することができる。前記遺伝子の発現水準を測定することができる化学製剤は、前記遺伝子に相補的に結合するプライマー、プローブ及びアンチセンスヌクレオチドからなる群から選択された１つ以上であってよい。
［８６］本発明の「プライマー」は、標的遺伝子配列を認識する断片であり、正方向プライマー対及び逆方向プライマー対を含むが、好ましくは特異性及び感度のアッセイ結果を提供するプライマー対を含む。高い特異性は、プライマーの核酸配列が試料中に存在する非標的配列と一致しない場合に与えられ、その結果、プライマーは、相補的プライマー結合部位を含む標的遺伝子配列のみを増幅し、非特異的増幅を誘導しない。
［８７］本発明における「プローブ」とは、試料中の検出対象の標的物質と相補的に結合し得る物質を意味し、該結合を介して試料中の標的物質の存在を特異的に確認し得る物質を意味する。前記プローブの種類は、当業界で通常用いられる物質であって、これに限定されるものではないが、好ましくは、ＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、ＬＮＡ（ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ＲＮＡ、又はＤＮＡであってよく、最も好ましくは、ＰＮＡであってよい。より具体的には、プローブは、生体に由来するか、若しくは類似するか、又はインビトロで製造される生物学的材料、例えば、酵素、タンパク質、抗体、微生物、動物及び植物細胞及び器官、ニューロン、ＤＮＡ、並びにＲＮＡを含む生体材料であり、ＤＮＡは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、オリゴヌクレオチドを含み、ＲＮＡは、ゲノムＲＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチドを含む。
［８８］本発明の「ロックされた核酸」（ＬＮＡ）は、２’－Ｏ、４’－Ｃメチレン架橋を含む核酸類似体を意味する［Ｊ Ｗｅｉｌｅｒ，Ｊ Ｈｕｎｚｉｋｅｒ ａｎｄ Ｊ Ｈａｌｌ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（２００６）１３，４９６．５０２］。ＬＮＡヌクレオシドは、ＤＮＡ及びＲＮＡからの共通の核酸塩基を含み、ワトソンクリック塩基対ルールに従って塩基対を形成することができる。しかしながら、メチレン架橋によって引き起こされる分子の「ロッキング」のために、ＬＮＡはワトソンクリック結合において理想的な形状を形成することができない。ＬＮＡがＤＮＡ又はＲＮＡオリゴヌクレオチドに含まれる場合、それは相補的ヌクレオチド鎖とより迅速に対合し、二重らせんの安定性を増加させることができる。
［８９］本発明の「アンチセンスヌクレオチド」は、ヌクレオチド配列及びユニット間骨格があるオリゴマーを意味し、ここで、アンチセンスオリゴマーは、ワトソンクリック塩基対形成によってＲＮＡ中の標的配列とハイブリダイズされ、典型的には標的配列内でｍＲＮＡ及びＲＮＡ：オリゴマーヘテロ二量体の形成を可能にする。オリゴマーは、標的配列に対して正確な配列相補性又はほぼ相補性を有し得る。
［９０］本発明の遺伝子の配列に基づいて、本発明の遺伝子の配列に基づいて従来の技術者によって遺伝子に相補的に結合するプライマー、プローブなどに対応する化学製剤を容易に製造することができる。
［７６］本発明の「生体試料」は、個体から得られるか又は個体に由来するいかなる物質、生物学的体液、組織、又は細胞を意味し、例えば、全血、白血球、末梢血単核細胞、白血球バフィーコート、血漿、及び血清、血液、痰、涙、粘液、鼻洗浄液、鼻汁、呼気、尿、精液、唾液、腹膜洗浄液、骨盤液、嚢胞液、髄膜液、羊水、腺液、膵液、リンパ液、胸膜液、乳頭吸引液、気管支吸引液、滑液、関節吸引液、関節吸引液、臓器分泌液、細胞、細胞抽出液、脳脊髄液などが挙げられるが、これらに限定されない。
［７７］本発明におけるタンパクの発現量を測定する方法は、プロテインチップ解析、免疫測定法、リガンド結合測定法、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ（マトリックス支援レーザーイオン化飛行時間型質量分析）解析、ＳＥＬＤＩ－ＴＯＦ（表面増強レーザーイオン化飛行時間型質量分析）解析、放射線免疫拡散、放射線免疫拡散、オロチン酸免疫拡散方法、ロケット免疫電気泳動、組織免疫染色、補体固定分析、二次元電気泳動解析、液体クロマトグラフィ質量分析（ＬＣ－ＭＳ）、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ（液体クロマトグラフィ／質量分析）、ウエスタンブロット法、及びＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法）からなる群から選択される少なくとも１つであってよい。
［７８］本発明のタンパク質の発現レベルは、タンパク質の発現レベルを測定することができる化学製剤を用いて測定することができる。前記タンパク質の発現水準を測定することができる化学製剤としては、前記タンパク質に特異的に結合する抗体、オリゴペプチド、リガンド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）及びアプタマーからなる群から選択された１種以上であってよい。
［７９］本発明の「抗体」とは、抗原に特異的に結合し、抗原抗体反応を生じる物質をいう。本発明の目的のために、抗体は、タンパク質に特異的に結合する抗体を意味する。本発明の抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、組換え抗体の両方が含まれる。抗体は、当業界で広く知られている技術を用いて容易に調製することができる。例えば、ポリクローナル抗体は、タンパク質の抗原を動物に注射し、その動物から血液を採取して抗体を含む血清を得る工程を含む、当業界で広く知られた方法により作製することができる。これらのポリクローナル抗体は、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、サル、ウマ、ブタ、ウシ、イヌ等のいかなる動物から製造することができる。さらに、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法（Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７６）Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６：５１１－５１９）、又はファージ抗体ライブラリー技術（Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４－６２８，１９９１；Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８，１－５９７，１９９１）として産業界で広く知られている。本発明の方法により調製された抗体は、ゲル電気泳動、透析、塩沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の方法を用いて単離精製することができる。また、本発明の抗体は、２つの全長軽鎖及び２つの全長重鎖がある完全な形態だけでなく、抗体の機能的断片を含む。
［８０］本発明の抗体の機能的断片は、少なくとも抗原結合機能がある断片を意味し、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖを含む。
［８１］ＤＮＡ又はＲＮＡに類似した人工的に合成されたポリマーを指す「ペプチド核酸（ＰＮＡ）」は、１９９１年にＮｉｅｌｓｅｎ、Ｅｇｈｏｌｍ、Ｂｅｒｇ及びＢｕｃｈａｒｄｔ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｄｅｎｍａｒｋ）によって最初に導入された。ＤＮＡはリン酸－リボース糖骨格があるが、ＰＮＡはペプチド結合によって連結された反復Ｎ－（２－アミノエチル）－グリシン骨格を有し、これはＤＮＡ又はＲＮＡに対するその結合強度及び安定性を大きく増加させ、分子生物学、診断アッセイ、及びアンチセンス療法において用いられる。
［８２］本発明の「アプタマー」は、オリゴ核酸又はペプチド分子を意味する。
［８３］本発明のタンパク質を含むアミノ酸配列に基づいて、タンパク質に特異的に結合する抗体、ＰＮＡ、及びアプタマーに対応する化学製剤は、通常の技術者によって容易に製造することができる。
［８４］本発明の遺伝子の発現レベルを測定する方法は、逆転写ポリメラーゼ反応（ＲＴ－ＰＣＲ）、競合的逆転写ポリメラ－ゼ反応（競合的ＲＴ－ＰＣＲ）、リアルタイム逆転写ポリメラーゼ反応（リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ）、ＲＮａｓｅ保護アッセイ（ＲＰＡ；ＲＮａｓｅ保護アッセイ）、ノーザンブロッティング、及びＤＮＡチップの群から選択される少なくとも１つを行うことである。
［８５］本発明の遺伝子の発現レベルは、遺伝子の発現レベルを測定することができる化学製剤を用いて測定することができる。前記遺伝子の発現水準を測定することができる化学製剤は、前記遺伝子に相補的に結合するプライマー、プローブ及びアンチセンスヌクレオチドからなる群から選択された１つ以上であってよい。
［８６］本発明の「プライマー」は、標的遺伝子配列を認識する断片であり、正方向プライマー対及び逆方向プライマー対を含むが、好ましくは特異性及び感度のアッセイ結果を提供するプライマー対を含む。高い特異性は、プライマーの核酸配列が試料中に存在する非標的配列と一致しない場合に与えられ、その結果、プライマーは、相補的プライマー結合部位を含む標的遺伝子配列のみを増幅し、非特異的増幅を誘導しない。
［８７］本発明における「プローブ」とは、試料中の検出対象の標的物質と相補的に結合し得る物質を意味し、該結合を介して試料中の標的物質の存在を特異的に確認し得る物質を意味する。前記プローブの種類は、当業界で通常用いられる物質であって、これに限定されるものではないが、好ましくは、ＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、ＬＮＡ（ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ＲＮＡ、又はＤＮＡであってよく、最も好ましくは、ＰＮＡであってよい。より具体的には、プローブは、生体に由来するか、若しくは類似するか、又はインビトロで製造される生物学的材料、例えば、酵素、タンパク質、抗体、微生物、動物及び植物細胞及び器官、ニューロン、ＤＮＡ、並びにＲＮＡを含む生体材料であり、ＤＮＡは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、オリゴヌクレオチドを含み、ＲＮＡは、ゲノムＲＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチドを含む。
［８８］本発明の「ロックされた核酸」（ＬＮＡ）は、２’－Ｏ、４’－Ｃメチレン架橋を含む核酸類似体を意味する［Ｊ Ｗｅｉｌｅｒ，Ｊ Ｈｕｎｚｉｋｅｒ ａｎｄ Ｊ Ｈａｌｌ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（２００６）１３，４９６．５０２］。ＬＮＡヌクレオシドは、ＤＮＡ及びＲＮＡからの共通の核酸塩基を含み、ワトソンクリック塩基対ルールに従って塩基対を形成することができる。しかしながら、メチレン架橋によって引き起こされる分子の「ロッキング」のために、ＬＮＡはワトソンクリック結合において理想的な形状を形成することができない。ＬＮＡがＤＮＡ又はＲＮＡオリゴヌクレオチドに含まれる場合、それは相補的ヌクレオチド鎖とより迅速に対合し、二重らせんの安定性を増加させることができる。
［８９］本発明の「アンチセンスヌクレオチド」は、ヌクレオチド配列及びユニット間骨格があるオリゴマーを意味し、ここで、アンチセンスオリゴマーは、ワトソンクリック塩基対形成によってＲＮＡ中の標的配列とハイブリダイズされ、典型的には標的配列内でｍＲＮＡ及びＲＮＡ：オリゴマーヘテロ二量体の形成を可能にする。オリゴマーは、標的配列に対して正確な配列相補性又はほぼ相補性を有し得る。
［９０］本発明の遺伝子の配列に基づいて、本発明の遺伝子の配列に基づいて従来の技術者によって遺伝子に相補的に結合するプライマー、プローブなどに対応する化学製剤を容易に製造することができる。
【発明の効果】
【0031】
［９１］本発明は、がん患者、特にＥＭＴ（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）亜型のがん患者の予防、改善又は治療方法に関し、ＧＬＳ（グルタミナーゼ）遺伝子又はそれがコードするタンパク質の発現量が増加したがん患者において、ＰＨＧＤＨ、ＳＨＭＴ及びＭＴＨＦＤ２阻害剤と併用投与した場合に、１Ｃ代謝がより効果的に阻害され、再発、転移及び抗がん剤耐性のために治療が困難な不治のがん患者におけるがん細胞増殖の阻害に対して相乗効果がある。
［９２］さらに、ＧＬＳ遺伝子又はそれによってコードされるタンパクの発現レベルを測定することによって、早期から各患者への個別化された治療選択肢についての情報の提供により、治療成功率を高めることができる。
［９２］さらに、ＧＬＳ遺伝子又はそれによってコードされるタンパクの発現レベルを測定することによって、早期から各患者への個別化された治療選択肢についての情報の提供により、治療成功率を高めることができる。
【図面の簡単な説明】
【0032】
【図1】［９３］本発明の一実施形態による高齢コホートの胃がん患者における胃トランスクリプトーム解析の結果を示す図である。
【図2】［９４］本発明の一実施形態に係る腸亜型細胞株（ＮＣＩＮ８７、ＳＮＵ６０１）及び幹様亜型細胞株（ＭＫＮ１、ＨＳ７４６Ｔ）におけるＧＬＳ（グルタミナーゼ）遺伝子がコードするタンパク質の発現量をウエスタンブロット分析により確認した結果を示す写真である。
【図3】［９５］本発明の一実施形態による腸亜型オルガノイド（ＧＡ３２６）及び幹様亜型オルガノイド（ＧＡ０７７）に対して行ったゲノム解析の結果を示す図である。
【図4】［９６］本発明の一実施形態に係るグルタミンの存在又は非存在を確認した結果を示すグラフである。
【図5】［９６］本発明の一実施形態に係るグルタミンの類似体であるＤＯＮの濃度に応じた細胞株の増殖レベルを確認した結果を示すグラフである。
【図6】［９６］本発明の一実施形態に係るＧＬＳ阻害剤ＣＢ８３９の濃度に応じた細胞株の増殖レベルを確認した結果を示すグラフである。
【図7】［９６］本発明の一実施形態に係るＢＰＴＥＳの濃度に応じた細胞株の増殖レベルを確認した結果を示すグラフである。
【図8】［９７］本発明の一実施形態に係るＧＬＳ阻害剤ＣＢ８３９の単独処理による幹様亜型オルガノイドのサイズ変化を確認した結果を示す写真である。
【図9】［９８］グルタミンの存在又は非存在、及び本発明の一実施形態によるＰＨＧＤ阻害剤による併用で幹様亜型細胞株の増殖レベルをチェックした結果を示すグラフである。
【図11】［９８］グルタミンの存在又は非存在、及び本発明の一実施形態によるＭＴＦＨＤ２阻害剤による組合せ処理を用いて幹様亜型細胞株の増殖レベルをチェックした結果を示すグラフである。
【図12】［９９］本発明の一実施形態に係るＧＬＳ阻害剤（ＣＢ８３９）とＮＣＴ５０４との併用処理による幹様亜型オルガノイドのサイズ変化を確認した結果を示す写真とグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0033】
［１００］本発明の一実施形態は、グルタミナーゼ（ＧＬＳ）遺伝子の発現を阻害することができる化学製剤又はその薬学的に許容される塩と、ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＨＧＤＨ）遺伝子、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（ＳＨＭＴ）遺伝子、及びメチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ＋依存性）２（ＭＴＨＦＤ２）遺伝子及びメテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドラーゼ遺伝子からなる群から選択される遺伝子の発現を阻害するための薬剤又はその薬学的に許容される塩と、を含む、がんの予防用又は治療用の薬学的組成物があげられる。
［１０１］本発明の他の実施形態では、投与が必要な実体におけるグルタミナーゼ（ＧＬＳ）遺伝子の発現を阻害することができる化学製剤、又はその薬学的に許容される塩；並びにＰＨＧＤＨ（ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ）、ＳＨＭＴ（セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ）遺伝子、及びＭＴＨＦＤ２（メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ＋依存性）２）遺伝子の群から選択されるいずれか１つの遺伝子の発現を阻害することができる薬物、メテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドラーゼ、又はその薬学的に許容される塩を活性成分として含有する組成物を薬学的有効量で投与することを含む、がんの予防、改善又は治療方法に関する。
［１０２］本発明の他の実施形態は、対象の物体から単離された生体試料中のＧＬＳ遺伝子又はそれによってコードされるタンパク質の発現レベルを測定すること；及び上記で測定された遺伝子又はタンパク質の発現レベルが増加した場合、以下の遺伝子の発現を阻害することができる化学製剤；又は以下の遺伝子によってコードされるタンパク質の機能を阻害することができる調製物の同時投与によって判断することを含む。がんの亜型を含むＥＭＴ分子は、治療の選択肢についての情報をどのように提供するかに関連する。
［１０３］以下、本発明を以下の実施形態によって詳細に説明する。ただし、以下の実施形態は本発明の例示に過ぎず、本発明の内容が以下の実施形態によって限定されるものではない。
［１０１］本発明の他の実施形態では、投与が必要な実体におけるグルタミナーゼ（ＧＬＳ）遺伝子の発現を阻害することができる化学製剤、又はその薬学的に許容される塩；並びにＰＨＧＤＨ（ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ）、ＳＨＭＴ（セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ）遺伝子、及びＭＴＨＦＤ２（メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ＋依存性）２）遺伝子の群から選択されるいずれか１つの遺伝子の発現を阻害することができる薬物、メテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドラーゼ、又はその薬学的に許容される塩を活性成分として含有する組成物を薬学的有効量で投与することを含む、がんの予防、改善又は治療方法に関する。
［１０２］本発明の他の実施形態は、対象の物体から単離された生体試料中のＧＬＳ遺伝子又はそれによってコードされるタンパク質の発現レベルを測定すること；及び上記で測定された遺伝子又はタンパク質の発現レベルが増加した場合、以下の遺伝子の発現を阻害することができる化学製剤；又は以下の遺伝子によってコードされるタンパク質の機能を阻害することができる調製物の同時投与によって判断することを含む。がんの亜型を含むＥＭＴ分子は、治療の選択肢についての情報をどのように提供するかに関連する。
［１０３］以下、本発明を以下の実施形態によって詳細に説明する。ただし、以下の実施形態は本発明の例示に過ぎず、本発明の内容が以下の実施形態によって限定されるものではない。
【実施例1】
【0034】
［１０７］胃トランスクリプトーム分析
［１０８］延世大学がんセンターで根治的胃切除術を受けた胃がん患者から新鮮な凍結腫瘍組織を得て、臨床データをマッチングするプロセスを通して胃トランスクリプトーム解析データを得た。この研究は、延世大学校医科大学評価体（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄ；ＩＲＢ）によって行われ、上記の試料は、患者の書面による同意の後に収集された。臨床で検証された分類系に従って、胃がん患者を５つの亜型（胃、炎症、腸、混合、及び幹様分子亜型）に分け、解糖系及びグルタミノリシスに関連する遺伝子を、通常の方法に従ってヒートマップによって分析し、結果を図１に示した。
［１０８］延世大学がんセンターで根治的胃切除術を受けた胃がん患者から新鮮な凍結腫瘍組織を得て、臨床データをマッチングするプロセスを通して胃トランスクリプトーム解析データを得た。この研究は、延世大学校医科大学評価体（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄ；ＩＲＢ）によって行われ、上記の試料は、患者の書面による同意の後に収集された。臨床で検証された分類系に従って、胃がん患者を５つの亜型（胃、炎症、腸、混合、及び幹様分子亜型）に分け、解糖系及びグルタミノリシスに関連する遺伝子を、通常の方法に従ってヒートマップによって分析し、結果を図１に示した。
【0035】
［１０９］図１に示すように、延世大学コホートの胃の患者におけるトランスクリプトーム解析により、ヒートマップに示すように、胃がん亜型の中で幹様亜型（ＥＭＴ分子亜型）として分類された患者におけるＧＬＳ（グルタミナーゼ）遺伝子の発現レベルの増加が確認された。
【実施例2】
【0036】
［１１１］胃がん細胞株におけるＧＬＳ遺伝子及びタンパク質発現レベルの確認
［１１２］ＧＬＳ遺伝子及びタンパク質発現レベルを決定するために、ＮＣＩＮ８７、ＳＮＵ６０１、ＭＫＮ１、及びＨＳ７４６Ｔ細胞株を韓国細胞株バンクから購入した。ここで、ＮＣＩＮ８７及びＳＮＵ６０１細胞株の場合は腸亜型を代表する細胞株であり、ＭＫＮ１及びＨＳ７４６Ｔ細胞株の場合は幹様亜型を代表する細胞株に該当する。これらの購入した細胞株について、ＲＰＭＩ１６４０（１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含む）又はＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン）を、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中で培養した。この時、上記の細胞株については、すべて微小血漿が混入していないかどうかを検査し、マイコプラズマが混入していないことを確認した後、実験に用いた。プロテアーゼ阻害剤混合物（ｇｅｎｅｄｅｐｏｔ）を含有するＥＢＣ２００（２００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．５％ＮＰ－４０）を、各培養細胞株に入れる。細胞を溶解する工程を行った。次に、溶解した細胞からタンパク質を分離した後、ＢＣＡ分析法（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてタンパク質の量を定量し、同量のタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥにロードして電気泳動を行い、ＰＶＤＦ膜（Ｂｉｏｒａｄ）に転写した。転写終了後、５％スキムミルク（ＢＤ ｄｉｆｃｏ）をメンブレンに入れて室温で１時間ブロッキングした後、１：２０００で希釈したＧＬＳタンパク質と１：５０００で希釈したβアクチンに特異的に結合する抗体（ａｂｃａｍ）を入れて４℃で１日間インキュベーションした。その後、５％スキムミルクで希釈した二次抗体を添加し、１時間インキュベートした後、ＬＡＳ ４０００ ｍｉｎｉ（富士フイルム）を用いてタンパク質の発現レベルを確認する。結果を図２に示す。
［１１３］図２に示すように、腸亜型に対応するＮＣＩＮ８７及びＳＮＵ６０１細胞株、幹様亜型に対応するＭＫＮ１及びＨＳ７４６Ｔ細胞株と比較して、ＧＬＳ遺伝子によってコードされるタンパク質の発現レベルが有意に増加したことが見出された。
［１１４］上記の結果から、ＧＬＳ遺伝子によってコードされるタンパク質の発現レベルは、特に、胃がんの他の亜型と比較して幹様亜型において増加することが分かる。
［１１２］ＧＬＳ遺伝子及びタンパク質発現レベルを決定するために、ＮＣＩＮ８７、ＳＮＵ６０１、ＭＫＮ１、及びＨＳ７４６Ｔ細胞株を韓国細胞株バンクから購入した。ここで、ＮＣＩＮ８７及びＳＮＵ６０１細胞株の場合は腸亜型を代表する細胞株であり、ＭＫＮ１及びＨＳ７４６Ｔ細胞株の場合は幹様亜型を代表する細胞株に該当する。これらの購入した細胞株について、ＲＰＭＩ１６４０（１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含む）又はＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン）を、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中で培養した。この時、上記の細胞株については、すべて微小血漿が混入していないかどうかを検査し、マイコプラズマが混入していないことを確認した後、実験に用いた。プロテアーゼ阻害剤混合物（ｇｅｎｅｄｅｐｏｔ）を含有するＥＢＣ２００（２００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．５％ＮＰ－４０）を、各培養細胞株に入れる。細胞を溶解する工程を行った。次に、溶解した細胞からタンパク質を分離した後、ＢＣＡ分析法（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてタンパク質の量を定量し、同量のタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥにロードして電気泳動を行い、ＰＶＤＦ膜（Ｂｉｏｒａｄ）に転写した。転写終了後、５％スキムミルク（ＢＤ ｄｉｆｃｏ）をメンブレンに入れて室温で１時間ブロッキングした後、１：２０００で希釈したＧＬＳタンパク質と１：５０００で希釈したβアクチンに特異的に結合する抗体（ａｂｃａｍ）を入れて４℃で１日間インキュベーションした。その後、５％スキムミルクで希釈した二次抗体を添加し、１時間インキュベートした後、ＬＡＳ ４０００ ｍｉｎｉ（富士フイルム）を用いてタンパク質の発現レベルを確認する。結果を図２に示す。
［１１３］図２に示すように、腸亜型に対応するＮＣＩＮ８７及びＳＮＵ６０１細胞株、幹様亜型に対応するＭＫＮ１及びＨＳ７４６Ｔ細胞株と比較して、ＧＬＳ遺伝子によってコードされるタンパク質の発現レベルが有意に増加したことが見出された。
［１１４］上記の結果から、ＧＬＳ遺伝子によってコードされるタンパク質の発現レベルは、特に、胃がんの他の亜型と比較して幹様亜型において増加することが分かる。
【実施例3】
【0037】
［１１６］患者由来オルガノイドのゲノム解析結果
［１１７］患者由来オルガノイドを得るために、延世大学校医科大学評価体（治験審査委員会）ＩＲＢ）を用いた。患者由来オルガノイドを用いて、腸亜型に対応するＧＡ３２６オルガノイドと、幹様亜型に対応するＧＡ０７７オルガノイドとを作製した。
［１１８］具体的には、臨床的に検証された分類システムに従って腸亜型又は幹様亜型として分類された患者オルガノイドを得、次いで、４０％の高度ＤＭＥＭ／Ｆ１２（ｇｉｂｃｏ）、５０％のＷｎｔ３Ａ細胞培養培地（馴化培地）、１０％のＲ－ｓｐｏｎｄ１細胞培養培地（馴化培地）、１％のＨＥＰＥＳ（ｇｉｂｃｏ）、及び１％のＧｌｕｔａＭａｘ（ｇｉｂｃｏ）を得た。オルガノイドは、マトリゲルを用いて３Ｄ構造を形成するために、０．２％プリモシン（ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）、２％Ｂ－２７（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１０ｍＭニコチンアミド（ｓｉｇｍａ）、１ｍＭ Ｎ－アセチルシステイン（ｓｉｇｍａ）、２μＭ Ａ８３０１、５０ｎｇ／ｍｌ ｍＥＧＦ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１００ｎｇ／ｍｌ ｍＮｏｇｇｉｎ（ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、１ｎＭガストリン（ｓｉｇｍａ）、２００ｎｇ／ｍｌ ｈＦＧＦ１０（ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、及び１２．５μＭ Ｙ－２７６３２（Ｅｎｚｏ）を含有する培地を用いて、マトリゲルを用いて作製した。
［１１９］オルガノイド各々のトランスクリプトーム解析を進めるために、得られたゲノム解析データをＴＰＭに対して正規化し、ＧＬＳ遺伝子並びに一炭素代謝に関連する遺伝子、ＭＴＲ、ＳＨＭＴ１、ＳＨＭＴ２、ＭＴＨＦＤ１及びＭＴＨＦＤ２についてのトランスクリプトーム発現値を同定し、図３に示した。
［１２０］図３に示すように、腸亜型に対応するＧＡ３２６オルガノイドと比較して、ＧＬＳ遺伝子の発現レベルが幹様亜型に対応するＧＡ０７７オルガノイドにおいて有意に増加したことが確認された。
［１２１］上記の結果から、ＧＬＳ遺伝子の発現レベルは、高い患者らしさを有するオルガノイド並びに細胞株において、他の胃がん亜型と比較して幹様亜型において特に増加していることが分かる。
［１１７］患者由来オルガノイドを得るために、延世大学校医科大学評価体（治験審査委員会）ＩＲＢ）を用いた。患者由来オルガノイドを用いて、腸亜型に対応するＧＡ３２６オルガノイドと、幹様亜型に対応するＧＡ０７７オルガノイドとを作製した。
［１１８］具体的には、臨床的に検証された分類システムに従って腸亜型又は幹様亜型として分類された患者オルガノイドを得、次いで、４０％の高度ＤＭＥＭ／Ｆ１２（ｇｉｂｃｏ）、５０％のＷｎｔ３Ａ細胞培養培地（馴化培地）、１０％のＲ－ｓｐｏｎｄ１細胞培養培地（馴化培地）、１％のＨＥＰＥＳ（ｇｉｂｃｏ）、及び１％のＧｌｕｔａＭａｘ（ｇｉｂｃｏ）を得た。オルガノイドは、マトリゲルを用いて３Ｄ構造を形成するために、０．２％プリモシン（ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）、２％Ｂ－２７（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１０ｍＭニコチンアミド（ｓｉｇｍａ）、１ｍＭ Ｎ－アセチルシステイン（ｓｉｇｍａ）、２μＭ Ａ８３０１、５０ｎｇ／ｍｌ ｍＥＧＦ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１００ｎｇ／ｍｌ ｍＮｏｇｇｉｎ（ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、１ｎＭガストリン（ｓｉｇｍａ）、２００ｎｇ／ｍｌ ｈＦＧＦ１０（ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、及び１２．５μＭ Ｙ－２７６３２（Ｅｎｚｏ）を含有する培地を用いて、マトリゲルを用いて作製した。
［１１９］オルガノイド各々のトランスクリプトーム解析を進めるために、得られたゲノム解析データをＴＰＭに対して正規化し、ＧＬＳ遺伝子並びに一炭素代謝に関連する遺伝子、ＭＴＲ、ＳＨＭＴ１、ＳＨＭＴ２、ＭＴＨＦＤ１及びＭＴＨＦＤ２についてのトランスクリプトーム発現値を同定し、図３に示した。
［１２０］図３に示すように、腸亜型に対応するＧＡ３２６オルガノイドと比較して、ＧＬＳ遺伝子の発現レベルが幹様亜型に対応するＧＡ０７７オルガノイドにおいて有意に増加したことが確認された。
［１２１］上記の結果から、ＧＬＳ遺伝子の発現レベルは、高い患者らしさを有するオルガノイド並びに細胞株において、他の胃がん亜型と比較して幹様亜型において特に増加していることが分かる。
【実施例4】
【0038】
［１２３］ＧＬＳ阻害剤による幹様亜型細胞株の細胞増殖の確認
［１２４］腸亜型細胞株であるＮＣＩＮ８７、及び幹様亜型細胞株であるＨＳ７４６Ｔを、それぞれ５０００個の細胞を含む９６ウェルプレート（黒色）に分注し、翌日、グルタミン欠乏培養培地（Ｇｉｂｃｏ）と交換した。その後、ＤＯＮ（１μＭ、５０μＭ、１５０μＭ；ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ、ｃａｔ ｎｏ．Ｓ８６２０）、ＣＢ８３９（１μＭ、５μＭ、２５μＭ；ｃａｙｍａｎ、ｃａｔ ｎｏ．Ｓ７６５５）又はＢＰＴＥＳ（５μＭ、１０μＭ、２５μＭ；ＭＣＥ、ｃａｔ ｎｏ．ＨＹ－１２６８３）を処理し、処理時間を０時間とすると、２４、２８、７２時間に細胞培地を捨て、－８０℃の超低温冷凍庫に保管した。このように保管された細胞株を室温で培養した後、細胞培養キット（ＣｙＱＵＡＮＴ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に含まれているＧＲ ｄｙｅを含む細胞溶解液を２００μｌずつ各ウェルに入れて室温で５分間培養した後、蛍光光度計（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ、ｔｈｅｒｍｏ、ｖａｒｉｏｓｋａｎ ｆｌａｓｈ ３００１）を用いて４８０ｎｍ及び５２０ｎｍ励起で蛍光強度を測定し、０時間の細胞数に標準化して％で定量し、その値を図４～図７に示した。
［１２５］図４に示すように、腸亜型細胞株ＮＣＩＮ８７において、グルタミンを含まない培養培地（Ｇｌｎ－）中では、グルタミン含有培養培地（Ｇｌｎ＋）と比較して細胞増殖が有意に低下したが、幹亜型細胞株ＨＳ７４６Ｔでは、グルタミンを含めても細胞増殖は低下しなかった。
［１２６］図５～７に示すように、腸亜型細胞株ＮＣＩＮ８７において、細胞増殖はグルタミン類似体（ＤＯＮ）及びＧＬＳ活性阻害剤（ＣＢ８３９及びＢＰＴＥＳ）によって阻害されたが、幹様細胞株ＨＳ７４６Ｔの場合、細胞増殖は薬物によって低減されなかった。
［１２７］上記の結果から、幹様亜型、すなわち難治性がんの場合、細胞増殖はグルタミン欠乏又はＧＬＳ活性阻害剤によって阻害されないことが分かる。
［１２４］腸亜型細胞株であるＮＣＩＮ８７、及び幹様亜型細胞株であるＨＳ７４６Ｔを、それぞれ５０００個の細胞を含む９６ウェルプレート（黒色）に分注し、翌日、グルタミン欠乏培養培地（Ｇｉｂｃｏ）と交換した。その後、ＤＯＮ（１μＭ、５０μＭ、１５０μＭ；ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ、ｃａｔ ｎｏ．Ｓ８６２０）、ＣＢ８３９（１μＭ、５μＭ、２５μＭ；ｃａｙｍａｎ、ｃａｔ ｎｏ．Ｓ７６５５）又はＢＰＴＥＳ（５μＭ、１０μＭ、２５μＭ；ＭＣＥ、ｃａｔ ｎｏ．ＨＹ－１２６８３）を処理し、処理時間を０時間とすると、２４、２８、７２時間に細胞培地を捨て、－８０℃の超低温冷凍庫に保管した。このように保管された細胞株を室温で培養した後、細胞培養キット（ＣｙＱＵＡＮＴ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に含まれているＧＲ ｄｙｅを含む細胞溶解液を２００μｌずつ各ウェルに入れて室温で５分間培養した後、蛍光光度計（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ、ｔｈｅｒｍｏ、ｖａｒｉｏｓｋａｎ ｆｌａｓｈ ３００１）を用いて４８０ｎｍ及び５２０ｎｍ励起で蛍光強度を測定し、０時間の細胞数に標準化して％で定量し、その値を図４～図７に示した。
［１２５］図４に示すように、腸亜型細胞株ＮＣＩＮ８７において、グルタミンを含まない培養培地（Ｇｌｎ－）中では、グルタミン含有培養培地（Ｇｌｎ＋）と比較して細胞増殖が有意に低下したが、幹亜型細胞株ＨＳ７４６Ｔでは、グルタミンを含めても細胞増殖は低下しなかった。
［１２６］図５～７に示すように、腸亜型細胞株ＮＣＩＮ８７において、細胞増殖はグルタミン類似体（ＤＯＮ）及びＧＬＳ活性阻害剤（ＣＢ８３９及びＢＰＴＥＳ）によって阻害されたが、幹様細胞株ＨＳ７４６Ｔの場合、細胞増殖は薬物によって低減されなかった。
［１２７］上記の結果から、幹様亜型、すなわち難治性がんの場合、細胞増殖はグルタミン欠乏又はＧＬＳ活性阻害剤によって阻害されないことが分かる。
【実施例5】
【0039】
［１２９］ＧＬＳ阻害剤によるオルガノイドにおける増殖の低減の確認
［１３０］実施例３で作製したＧＡ０７７オルガノイドのそれぞれを５μＭのＣＢ８３９（ｃａｙｍａｎ、カタログ番号Ｓ７６５５）で処理し、処理の時点をＤ０とし、１日目（Ｄ１）、２日目（Ｄ２）、３日目（Ｄ３）、及び４日目（Ｄ４）に光学顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ）で撮影し、中心を通る最長及び最短の直径を画像Ｊを用いて測定し、オルガノイドの直径を２つの値を平均することによって測定した。対照群（ＶＥＨ）；ＤＭＳＯ処置群は実験を５回繰り返し、ＣＢ８３９処置群は実験を６回繰り返した。このように測定されたオルガノイド直径を顕微鏡サイズバーによりμｍに換算し、０日目の直径を基準に平均して数値で表し、図８に示した。
［１３１］図８に示すように、幹様亜型ＧＡ０７７オルガノイドは、ＧＬＳ活性阻害剤に相当するＣＢ８３９によってサイズが減少しなかった。
［１３２］上記の結果から、幹様亜型、すなわち難治性がんの場合、細胞増殖はＧＬＳ活性阻害剤によって阻害されないことが分かる。
［１３０］実施例３で作製したＧＡ０７７オルガノイドのそれぞれを５μＭのＣＢ８３９（ｃａｙｍａｎ、カタログ番号Ｓ７６５５）で処理し、処理の時点をＤ０とし、１日目（Ｄ１）、２日目（Ｄ２）、３日目（Ｄ３）、及び４日目（Ｄ４）に光学顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ）で撮影し、中心を通る最長及び最短の直径を画像Ｊを用いて測定し、オルガノイドの直径を２つの値を平均することによって測定した。対照群（ＶＥＨ）；ＤＭＳＯ処置群は実験を５回繰り返し、ＣＢ８３９処置群は実験を６回繰り返した。このように測定されたオルガノイド直径を顕微鏡サイズバーによりμｍに換算し、０日目の直径を基準に平均して数値で表し、図８に示した。
［１３１］図８に示すように、幹様亜型ＧＡ０７７オルガノイドは、ＧＬＳ活性阻害剤に相当するＣＢ８３９によってサイズが減少しなかった。
［１３２］上記の結果から、幹様亜型、すなわち難治性がんの場合、細胞増殖はＧＬＳ活性阻害剤によって阻害されないことが分かる。
【実施例6】
【0040】
［１３４］併用療法による幹様亜型細胞株における増殖の低減の確認
［１３５］実施例４に記載されるように、幹様亜型細胞株ＨＳ７４６Ｔを分注してインキュベートし、それをグルタミン欠乏培養培地と交換し、ＰＨＧＤＨ阻害剤（２５μＭ）、ＳＨＭＴ阻害剤（１μＭ）又はＭＴＨＦＤ２阻害剤（０．５μＭ）を投与し、細胞生存率アッセイキットを使用した後、細胞生存率アッセイキットを用いて測定された生存率を図９～１１に示した。
［１３６］図９～１１に示すように、グルタミン欠乏単独（Ｇｌｎ（－）／Ｖｅｈ）及び各阻害剤単独（Ｇｌｎ（＋）／ＰＨＧＤＨｉ、Ｇｌｎ（＋）／ＳＨＭＴｉ、Ｇｌｎ（＋）／ＭＴＨＦＤ２ｉ）と比較して、ＰＨＧＤＨ、ＳＨＭＴ、又はＭＴＨＦＤ２阻害剤単独で処理したグルタミン欠乏（Ｇｌｎ（－）／ＰＨＧＤＨｉ、Ｇｌｎ（－）／ＳＨＭＴｉ、Ｇｌｎ（－）／ＭＴＨＦＤ２ｉ）は、幹様亜型細胞系ＨＳ７４６Ｔの生存に対して有意な相乗効果を見出した。
［１３７］上記の結果に基づいて、グルタミン欠乏症及びＧＬＳ阻害剤に耐性である幹様亜型、すなわち、難治性がんの場合、ＰＨＧＤＨ、ＳＨＭＴ、及びＭＴＨＦＤ２阻害剤の組合せは、細胞生存を効果的に阻害することができる。
［１３５］実施例４に記載されるように、幹様亜型細胞株ＨＳ７４６Ｔを分注してインキュベートし、それをグルタミン欠乏培養培地と交換し、ＰＨＧＤＨ阻害剤（２５μＭ）、ＳＨＭＴ阻害剤（１μＭ）又はＭＴＨＦＤ２阻害剤（０．５μＭ）を投与し、細胞生存率アッセイキットを使用した後、細胞生存率アッセイキットを用いて測定された生存率を図９～１１に示した。
［１３６］図９～１１に示すように、グルタミン欠乏単独（Ｇｌｎ（－）／Ｖｅｈ）及び各阻害剤単独（Ｇｌｎ（＋）／ＰＨＧＤＨｉ、Ｇｌｎ（＋）／ＳＨＭＴｉ、Ｇｌｎ（＋）／ＭＴＨＦＤ２ｉ）と比較して、ＰＨＧＤＨ、ＳＨＭＴ、又はＭＴＨＦＤ２阻害剤単独で処理したグルタミン欠乏（Ｇｌｎ（－）／ＰＨＧＤＨｉ、Ｇｌｎ（－）／ＳＨＭＴｉ、Ｇｌｎ（－）／ＭＴＨＦＤ２ｉ）は、幹様亜型細胞系ＨＳ７４６Ｔの生存に対して有意な相乗効果を見出した。
［１３７］上記の結果に基づいて、グルタミン欠乏症及びＧＬＳ阻害剤に耐性である幹様亜型、すなわち、難治性がんの場合、ＰＨＧＤＨ、ＳＨＭＴ、及びＭＴＨＦＤ２阻害剤の組合せは、細胞生存を効果的に阻害することができる。
【実施例7】
【0041】
［１３９］併用療法による幹様亜型オルガノイドにおける増殖の低減の確認
［１４０］実施例５に記載されるように、幹様亜型オルガノイドであるＧＡ０７７を、ＧＬＳ阻害剤（ＣＢ８３９、５μＭ）、ＰＨＧＤＨ阻害剤（ＮＣＴ５０３、５０μＭ）、又はそれらの組合せでそれぞれ処理し、オルガノイド直径の平均値を図１２に示した。
［１４１］図１２に示すように、オルガノイド直径の平均値は、幹様亜型オルガノイドＧＡ０７７をＧＬＳ阻害剤（ＣＢ８３９）又はＰＨＧＤＨ阻害剤（ＮＣＴ５０３）のいずれか単独で処理した場合、それらの組合せ（ｃｏｍｂｉ）と比較して有意に減少した。
［１４２］結果は、グルタミン欠乏及びＧＬＳ阻害剤に耐性である幹様亜型の場合、ＰＨＧＤＨ、ＳＨＭＴ、及びＭＴＨＦＤ２阻害剤の組み合わせが、腫瘍サイズを非常に効果的に低減し得ることを示唆する。
［１４０］実施例５に記載されるように、幹様亜型オルガノイドであるＧＡ０７７を、ＧＬＳ阻害剤（ＣＢ８３９、５μＭ）、ＰＨＧＤＨ阻害剤（ＮＣＴ５０３、５０μＭ）、又はそれらの組合せでそれぞれ処理し、オルガノイド直径の平均値を図１２に示した。
［１４１］図１２に示すように、オルガノイド直径の平均値は、幹様亜型オルガノイドＧＡ０７７をＧＬＳ阻害剤（ＣＢ８３９）又はＰＨＧＤＨ阻害剤（ＮＣＴ５０３）のいずれか単独で処理した場合、それらの組合せ（ｃｏｍｂｉ）と比較して有意に減少した。
［１４２］結果は、グルタミン欠乏及びＧＬＳ阻害剤に耐性である幹様亜型の場合、ＰＨＧＤＨ、ＳＨＭＴ、及びＭＴＨＦＤ２阻害剤の組み合わせが、腫瘍サイズを非常に効果的に低減し得ることを示唆する。
【0042】
［１４４］上記は、本発明の特定の部分について詳細に説明されており、本産業の通常の知識がある者にとって、この特定の説明は、望ましい実施形態に過ぎず、したがって、本発明の範囲は限定されないことは明らかである。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項及びその均等物によって定義される。
【産業上の利用可能性】
【0043】
［１４５］本発明による組成物は、がん細胞の増殖を阻害することができるだけでなく、再発、転移、及び抗がん剤に対する耐性の存在のために治療が困難である不治のがんがある患者におけるがん細胞の増殖の阻害に対して相乗効果を有し、その結果、がんを非常に効果的に治療することができる。
［配列表テキスト］
［１４６］配列番号１．ＧＬＳ
［１４７］
［配列表テキスト］
［１４６］配列番号１．ＧＬＳ
［１４７］
【0044】
【化6】
［１４９］
【0045】
【化7】
［１５１］
【0046】
【化8】
［１５３］
【0047】
【化9】
［１５５］
【0048】
【化10】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【配列表】
【国際調査報告】