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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-07-12
(54)【発明の名称】マスサイトメトリーのための金属含有ポリマー
(51)【国際特許分類】
C08F 8/30 20060101AFI20240705BHJP
C08F 20/00 20060101ALI20240705BHJP
G01N 15/10 20240101ALN20240705BHJP
【ＦＩ】
C08F8/30
C08F20/00
G01N15/10 A
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024500546
(86)(22)【出願日】2022-07-08
(85)【翻訳文提出日】2024-01-29
(86)【国際出願番号】 CA2022051073
(87)【国際公開番号】W WO2023279211
(87)【国際公開日】2023-01-12
(31)【優先権主張番号】63/219,787
(32)【優先日】2021-07-08
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/359,182
(32)【優先日】2022-07-07
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】524004847
【氏名又は名称】ザ ガバニング カウンシル オブ ザ ユニバーシティ オブ トロント
(71)【出願人】
【識別番号】524007169
【氏名又は名称】スタンダード バイオトゥールズ カナダ インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100114775
【弁理士】
【氏名又は名称】高岡 亮一
(74)【代理人】
【識別番号】100121511
【弁理士】
【氏名又は名称】小田 直
(74)【代理人】
【識別番号】100202751
【弁理士】
【氏名又は名称】岩堀 明代
(74)【代理人】
【識別番号】100208580
【弁理士】
【氏名又は名称】三好 玲奈
(74)【代理人】
【識別番号】100191086
【弁理士】
【氏名又は名称】高橋 香元
(72)【発明者】
【氏名】ウィニク，ミッチェル エー．
(72)【発明者】
【氏名】ウォン，エドモンド チ ンガ
(72)【発明者】
【氏名】チャン，イェフェン
(72)【発明者】
【氏名】マジョニス，ダニエル
(72)【発明者】
【氏名】リウ，ペン
【テーマコード（参考）】
4J100
【Ｆターム（参考）】
4J100AL08P
4J100BA05H
4J100BA08H
4J100BA11H
4J100BA27H
4J100BA28H
4J100BA34H
4J100BB07P
4J100BC43P
4J100BC65H
4J100BC66H
4J100BD04H
4J100CA01
4J100CA31
4J100FA03
4J100FA04
4J100FA19
4J100HA35
4J100HA61
4J100HA62
4J100HC13
4J100HC47
4J100HC55
4J100HC63
4J100HE14
4J100JA53
(57)【要約】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
式Ｉの化合物【化1】
Ａは、ポリマー骨格であり、場合によっては、前記ポリマーは、線状ポリマー、分岐ポリマー、超分岐ポリマー、コポリマー、またはそれらの組み合わせである；
各Ｂは、独立して、場合によっては、Ｃ１～Ｃ６ ＣＯＯＨ、Ｃ１～Ｃ６アルコキシ、Ｃ１～Ｃ６アルキルホスホネート、アルキルエーテル、ポリエーテル、もしくはそれらの組み合わせから選択される１つまたは複数の極性官能基で置換された、窒素含有５員～７員の複素環である；ならびに
Ｌは、存在しないかリンカーである；
各Ｌ２は、独立して存在しないかリンカーである；
各Ｒ２は、独立して、溶解度調節剤、反応性官能基、生体分子、またはそれらの組み合わせから選択される第１の修飾基である；
Ｘは、エステル、エーテルおよびアミドから選択される官能基である；
各Ｌ１は、独立して存在しないかリンカーである；
各Ｒ１は、独立して、Ｈ、Ｃ１～Ｃ８アルキル、Ｃ２～Ｃ８アルケニル、Ｃ３～Ｃ８シクロアルキル、ＯＨ、Ｃ１～Ｃ１０アルコキシ、Ｃ１～Ｃ１０アルキルアミン、溶解度調節剤、反応性官能基、生体分子およびそれらの組み合わせである；
ｎは、０～７の整数である；
ｍは、０～４の整数である；
ｐは、０～３の整数である；ならびに
ｑは、０超の整数である）。
【請求項2】
各Ｂが、独立して、窒素含有５員または６員のヘテロアリールであり、場合によっては、各Ｂが、独立して、場合によっては、ＣＯＯＨ、Ｃ１～Ｃ６アルコキシ、Ｃ１～Ｃ６アルキルホスホネート、アルキルエーテル、ポリエーテル、もしくはそれらの組み合わせから選択される１つもしくは複数の極性官能基で置換されたピリジンまたはイミダゾールであり、そして、場合によっては、１つまたは複数のＢが、軟質金属に配位されている、および／または１つもしくは複数の生体分子にコンジュゲートしている、請求項１に記載の化合物。
【請求項3】
１つまたは複数のＢが、場合によっては、Ｒｅ、Ｐｔ、Ｐｄ、Ｎｂ、Ｔｃ、Ｈｇ、Ａｇ、Ａｕ、Ｍｏ、Ｒｕ、Ｒｈ、Ｃｄ、Ｗ、Ｏｓ、もしくはそれらの混合物から選択される軟質金属に配位されている、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項4】
Ｒ１またはＲ２が、生体分子であり、場合によっては、前記生体分子が、抗体などのアフィニティ試薬である、請求項１から３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項5】
Ｘが、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ４－または－ＮＲ４Ｃ（Ｏ）－であり、Ｒ４が、ＨまたはＣ１～Ｃ４アルキルである、請求項１から４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項6】
Ｘが、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ４－であり、式Ｉａ【化2】
【化3】
【請求項7】
Ｘが、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ４－であり、式Ｉｃ【化4】
【化5】
【化6】
【化7】
式中、各Ｒ３が、Ｈ、Ｃ１～Ｃ５アルキル、Ｃ２～Ｃ５アルケニル、Ｃ１～Ｃ６ ＣＯＯＨ、Ｃ１～Ｃ６アルコキシ、Ｃ１～Ｃ６アルキルホスホネート、アルキルエーテル、またはポリエーテルから独立して選択される、
請求項１から５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項8】
各Ｒ３が、Ｈ、－（ＣＨ２）１～３ＣＯＯＨ、－（ＣＨ２）１～３Ｏ（ＣＨ２）１～２ＣＨ３、－（ＣＨ２）２～４ＯＨ、－（ＣＨ２）２～５Ｐ（Ｏ）（ＯＣＨ２ＣＨ３）２、または－ＣＨ２ＣＨ（ＯＭｅ）２から独立して選択される、および／またはｎが、２、３、４、もしくは５である、ｍが、０、１、もしくは２である、またはｐが、１もしくは２である、請求項７または８に記載の化合物。
【請求項9】
Ａが、ポリアクリレート、ポリアクリルアミド、ポリエーテル、ポリアミノ酸、ポリビニルアミン、ポリ（２－オキサゾリン）、ポリエチレングリコール、多糖、デンドリマー、それらのコポリマー、またはそれらの組み合わせから選択される、請求項１から８のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項10】
各リンカーが、Ｃ３～Ｃ８アルキルアミン、Ｃ３～Ｃ８アルキレン、Ｃ３～Ｃ８シクロアルキル、Ｃ３～Ｃ８ヘテロシクロアルキル、５員もしくは６員のアリールもしくはヘテロアリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、Ｃ３～Ｃ８シクロアルキルアリール、Ｃ３～Ｃ８シクロアルキルヘテロアリール、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、アミド、アミン、チオエーテル、マレイミド－チオールコンジュゲート、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、またはそれらの混合物を独立して含むか、それらから独立して選択され、場合によっては、前記アミン、アルキレン、アリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルキルアリール、およびシクロアルキルヘテロアリールのそれぞれが、独立して、非置換であるか、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ１～Ｃ６アルケニル、Ｃ３～Ｃ８シクロアルキル、Ｃ３～Ｃ８ヘテロシクロアルキル、アミド、エステル、アリール、ヘテロアリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、Ｃ３～Ｃ８シクロアルキルアリール、Ｃ３～Ｃ８シクロアルキルヘテロアリール、ＣＮ、もしくはそれらの混合物から選択される１つもしくは複数の置換基で置換されている、請求項１から９のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項11】
各Ｌ１および／またはＬ２が、Ｃ３～Ｃ８アルキレン、Ｃ３～Ｃ８アルキルアミン、エステル、アミン、アミド、チオエーテル、マレイミド－チオールコンジュゲート、ＰＥＧ、もしくはそれらの混合物を独立して含むか、それらから独立して選択され、場合によっては、前記アルキレンおよびアルキルがそれぞれ、独立して非置換であるか、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ１～Ｃ６アルケニル、Ｃ３～Ｃ８シクロアルキル、Ｃ３～Ｃ８ヘテロシクロアルキル、アミド、エステル、アリール、ヘテロアリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、Ｃ３～Ｃ８シクロアルキルアリール、Ｃ３～Ｃ８シクロアルキルヘテロアリール、ＣＮ、もしくはそれらの混合物から選択される１つもしくは複数の置換基で置換されている、請求項１から１０のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項12】
各Ｒ２の前記第１の修飾基の前記溶解度調節剤および前記第２の修飾基の前記溶解度調節剤が、それぞれ独立して、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、糖、オリゴ糖、またはポリ（カルボキシルベタイン）メタクリレートもしくはポリ（スルホベタイン）メタクリレート（ＰＢＳＭＡ）などの双性イオンポリマーを含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項13】
前記反応性官能基が、１つまたは複数の生体分子への結合のためのものであり、場合によっては、前記１つまたは複数の生体分子が、小分子、ポリペプチド、オリゴヌクレオチド、脂質、炭水化物、アフィニティ試薬、場合によっては、抗体、もしくはそれらの混合物からそれぞれ独立して選択される、請求項１から１２のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項14】
【化8】
【化9】
から選択され、
式中、ｓが、約１～約５０、約２～約４０、約５～約３０、約１０～約３０、約５～約３５、または約２０～約３０であり、ｒが、約３～約２００、約６～約３０、または約１０～約２５であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｌ１、Ｌ２およびＲ３が、それぞれ請求項７から８のいずれか一項で定義された通りである、
請求項１に記載の化合物。
【請求項15】
【化10】
式中、ｓが、約１～約５０、約２～約４０、約５～約３０、約１０～約３０、約５～約３５、または約２０～約３０であり、ｒが、約３～約２００、約６～約３０、または約１０～約２５であり、Ｒ３が、請求項７から８のいずれか一項で定義された通りである、
請求項１に記載の化合物。
【請求項16】
式Ｉの化合物が、１個または複数個の金属Ｍにキレート化され、式ＩＩ【化11】
請求項１から１５のいずれか一項に記載の式Ｉの化合物。
【請求項17】
マスサイトメトリーにおける使用のための、請求項１から１５のいずれか一項で定義された通りの式Ｉの化合物または請求項１６で定義された通りの式ＩＩの化合物。
【請求項18】
複数のキレート基を含む線状または分岐ポリマーを含む元素タグであって、各キレート基が、軟質金属を結合することができ、前記軟質金属が、単一同位体であり、少なくとも１つのキレート基が、前記軟質金属の軟質金属原子にキレート化されている、元素タグ。
【請求項19】
キットであって、軟質金属の単一同位体の複数の軟質金属原子を含む同位体組成物；および
２つの窒素含有５員または６員の複素環を含む複数のキレート基を含む線状または分岐ポリマーを含む元素タグ（前記元素タグの各キレート基は、前記同位体組成物の少なくとも１個の軟質金属原子を含むか、前記同位体組成物の少なくとも１個の軟質金属原子を結合することができる）
を含み；
場合によっては、放射性軟質金属をいずれも含まない、キット。
【請求項20】
前記元素タグが、生体分子を結合するように官能化されている、および／または生体分子に結合している、請求項１９に記載のキット。
【請求項21】
前記同位体組成物が、前記元素タグとは別に提供される軟質金属溶液であり、各キレート基が、前記同位体組成物の少なくとも１個の軟質金属原子を結合することができる、請求項１９または２０に記載のキット。
【請求項22】
さらに、生体分子、場合によっては、オリゴヌクレオチドもしくは抗体を含み、および／またはさらに、追加の同位体組成物を含み、前記追加の同位体組成物が、前記同位体組成物の前記軟質金属の前記単一同位体とは異なる軟質金属の追加の単一同位体の複数の追加の軟質金属原子を含む、請求項１９から２１のいずれか一項に記載のキット。
【請求項23】
各元素タグが、独立して、請求項１から１５のいずれか一項で定義された通りの式Ｉの化合物または請求項１６で定義された通りの式ＩＩの化合物である、請求項１９から２２のいずれか一項に記載のキット。
【請求項24】
方法であって、軟質金属の単一同位体の複数の軟質金属原子を含む同位体組成物を提供するステップ；
それぞれ独立して２つの窒素含有５員もしくは６員の複素環を含む複数のキレート基を含む線状または分岐ポリマーを含む元素タグ（各キレート基は、前記同位体組成物の少なくとも１個の前記軟質金属原子を結合することができる）を提供するステップ；ならびに
前記同位体組成物の前記軟質金属原子を前記元素タグの前記１つまたは複数のキレート基に結合するステップ
を含み；
前記軟質金属原子が、非放射性である、方法。
【請求項25】
前記同位体組成物が、同位体の天然混合物を含まず、場合によっては、前記方法が、追加の同位体組成物を提供するステップを含み、前記追加の同位体組成物が、前記同位体組成物の前記非放射性の軟質金属の前記単一同位体とは異なる非放射性の軟質金属の追加の単一同位体の複数の追加の軟質金属原子を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項26】
生体試料中の検体の分析のための方法であって、（ｉ）元素タグ付きアフィニティ試薬を前記検体とインキュベートするステップであって、前記元素タグ付きアフィニティ試薬が、元素タグでタグ付けされたアフィニティ試薬を含み、前記元素タグが、それぞれ独立して２つの窒素含有５員もしくは６員の複素環を含む複数のキレート基を有する線状または分岐ポリマーを含み、前記元素タグがさらに、軟質金属の単一同位体の複数の軟質金属原子を含む、ステップ；
（ここで：
前記元素タグの各キレート基は、少なくとも１個の前記軟質金属原子を含むか、少なくとも１個の前記軟質金属原子を結合することができ、
前記軟質金属原子は、非放射性であり、そして
前記アフィニティ試薬は、前記検体を特異的に結合する）
（ｉｉ）未結合の元素タグ付きアフィニティ試薬を、結合した元素タグ付きアフィニティ試薬から分離するステップ；ならびに
（ｉｉｉ）前記検体に結合している前記アフィニティ試薬に結合した前記元素タグを、質量分析原子分光法により分析するステップ
を含む、方法。
【請求項27】
前記元素タグ付きアフィニティ試薬を前記検体とインキュベートするステップが：２つまたはそれ以上の差別的な元素タグ付きアフィニティ試薬を２つまたはそれ以上の検体とインキュベートするステップであって、前記元素タグ付きアフィニティ試薬が、前記２つまたはそれ以上の検体と特異的に結合して２つまたはそれ以上の差別的にタグ付けされた検体を生成するステップを含み、前記アフィニティ試薬に結合した前記元素タグを分析するステップが、前記２つまたはそれ以上の検体に結合した前記差別的な元素タグを質量分析原子分光法により分析するステップを含む、
請求項２６に記載の方法。
【請求項28】
前記元素タグ付きアフィニティ試薬が、生体試料中の検体に結合するように構成され、前記生体試料が、細胞を含む、請求項２６または２７に記載の方法。
【請求項29】
前記軟質金属が、Ｒｅ、Ｐｔ、Ｐｄ、Ｎｂ、Ｔｃ、Ｈｇ、Ａｇ、Ａｕ、Ｍｏ、Ｒｕ、Ｒｈ、Ｃｄ、Ｗ、Ｏｓ、またはそれらの混合物から選択される、請求項２６から２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項30】
前記元素タグが、請求項１から１５のいずれか一項で定義された通りの式Ｉの化合物、または請求項１６で定義された通りの式ＩＩの化合物であるか、それを含む、請求項２４から７４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本開示は、２０２１年７月８日に出願された米国特許出願番号第６３／２１９，７８７号、および２０２２年７月７日に出願された米国特許出願番号第６３／３５９，１８２号からの優先権の利益を主張し、その内容は参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれている。
本開示は、２０２１年７月８日に出願された米国特許出願番号第６３／２１９，７８７号、および２０２２年７月７日に出願された米国特許出願番号第６３／３５９，１８２号からの優先権の利益を主張し、その内容は参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれている。
【0002】
本開示は、マスサイトメトリーのための元素タグとしての金属含有ポリマー、特に軟質金属含有ポリマーに関する。
【背景技術】
【0003】
金属含有ポリマーは、２０世紀に開発された重要なクラスのポリマーの１つである。１，２異なる金属ユニットを従来の有機ポリマーに組み込むことにより、新規の磁気的、光学的、電子的、触媒的および生理活性的特性を有する機能性ポリマーを得ることができ、検知、触媒、生体イメージング、薬物送達、抗癌剤および殺生物剤などの多様な分野で幅広い適用が認められている。３～７近年、マスサイトメトリーとして既知の新規の１細胞プロテオミクス技術は、スペクトルのオーバーラップによる従来のフローサイトメトリーの多重化能力の限界に対処するために開発された。８この技術の特徴は、誘導結合プラズマ飛行時間型質量分析（ＩＣＰ－ＭＳ）検出と組み合わせた金属タグ付き抗体の使用である。異なる重金属イオンの同位体で抗体をタグ付けすることにより、異なる質量チャンネルにおける信号を同時にモニターすることにより個々の細胞で複数のバイオマーカーの発現を調査することができる。マスサイトメトリーの開発は、金属含有ポリマーが高パラメータ１細胞解析のための元素質量タグとして使用される新たな機会を提供する。
【0004】
１５年にわたり、数種類の金属キレートポリマーは、マスサイトメトリーへの適用のために、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）または１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０－四酢酸（ＤＯＴＡ）などのペンダントアミノカルボキシレートキレート化剤を用いて開発されている。９～１３これらのキレート化剤は、ランタニド、イットリウムおよびビスマスなどの硬質金属イオンの結合に特に効果的である。これらのポリマータグを用いて、研究者らは、細胞あたり４０超の異なるバイオマーカーを測定することができる。これらのキレート化剤は、ＰｄまたはＰｔなどの軟質金属のイオンの結合に効果が低い。１つの研究では、マスサイトメトリー用途におけるプラチナまたはパラジウムイオンのための担体としての多種多様のアミノカルボキシレートペンダント基を有する一連の金属キレートポリマーが調査された。１４金属含有ポリマーを調製することができるが、それらは標的バイオマーカーを染色することができず、細胞に関連する軟質リガンド（おそらくチオール）との相互作用を通じて重金属を失うように見えた。しかし、マスサイトメトリーにさらに新しい金属を導入する、使用することができる質量チャンネルの数を増やす、そして、このようにマスサイトメトリーの能力を拡大するといった要望は依然として大きくなっている。
【発明の概要】
【0005】
本明細書で記載されているものは、Ｒｅ、Ｈｇ、またはＡｇを含む軟質金属イオンを結合するのに適切なジピコリルアミン（ＤＰＡ）およびイミダゾールなどの複素環ペンダント基を有する金属キレートポリマーである。これらのポリマーが、マスサイトメトリー用途に有効であることが示されている。本明細書の実施形態において示されるように、金属タグ付き抗体は、１細胞免疫表現型解析について正確な定量を提供し、マスサイトメトリー免疫測定法のための市販試薬と組み合わせて使用することができる。ＤＰＡキレート基を含むポリマーは、ＰＢＭＣの４－ｐｌｅｘアッセイで使用され、細胞集団を定量することができることが示された。ＤＰＡは、多数の異なる分極可能な重金属イオンにとって有効な金属キレート化剤である。したがって、これらの結果は、マスサイトメトリーに新しい質量単位を導入する。
【0006】
得られるキレートは、リガンド置換に対して非常に素晴らしい安定性およびＴｃ（Ｉ）およびＲｅ（Ｉ）のｄ６低スピン電子配置による分解を示す。１７，１９，２０安定性が、同様の電子配置の他の軟質金属で観察され得ることが理解され得る。各軟質金属元素が複数の天然に存在する同位体を有しているので、軟質金属キレートポリマーは、マスサイトメトリー用途のための新規質量チャンネルを可能にする。
【0007】
マスサイトメトリー用途で使用される金属含有ポリマーは、１つまたは複数の以下の特徴を有する可能性がある：第１に、ポリマーは、鎖長の分布が比較的狭い可能性があり、そのため、各標識抗体は、同様の数の金属イオンを保持している。第２に、金属は、用途での保存中（例えば、凍結乾燥された形態で）、および／またはマスサイトメトリー実験が行われる可能性がある時間にわたって、水溶液中での使用中にほとんどまたは全く交換されないように結合することができる。第３に、ポリマーは、抗体コンジュゲーションのための官能基を含む可能性がある。最後に、ポリマーは、バイオアッセイが水性媒体中で実行されるので、水溶性であり得る。上記の複数の特徴を同時に満たすことは、統合的課題を表している。
【0008】
一態様において、本開示は、式Ｉ
【0009】
【化1】
【0010】
（式中、
Ａは、ポリマー骨格であり、場合によっては、ポリマーは、線状ポリマー、分岐ポリマー、超分岐ポリマー、コポリマー、またはそれらの組み合わせである；
各Ｂは、独立して、場合によっては、Ｃ１～Ｃ６ ＣＯＯＨ、Ｃ１～Ｃ６アルコキシ、Ｃ１～Ｃ６アルキルホスホネート、アルキルエーテル、ポリエーテル、もしくはそれらの組み合わせから選択される１つまたは複数の極性官能基で置換されている窒素含有５員～７員の複素環である；
Ｌは、存在しないかリンカーである；
各Ｌ２は、独立して存在しないかリンカーである；
各Ｒ２は、独立して、溶解度調節剤、反応性官能基、生体分子、またはそれらの組み合わせから選択される第１の修飾基である；
Ｘは、エステル、エーテルおよびアミドから選択される官能基である；
各Ｌ１は、独立して存在しないかリンカーである；
各Ｒ１は、独立して、Ｈ、Ｃ１～Ｃ８アルキル、Ｃ３～Ｃ８シクロアルキル、ＯＨ、Ｃ１～Ｃ１０アルコキシ、Ｃ１～Ｃ１０アルキルアミン、溶解度調節剤、反応性官能基、生体分子およびそれらの組み合わせである；
ｎは、０～５０の整数である；
ｍは、０～４０の整数である；
ｐは、０～３０の整数である；ならびに
ｑは、０超の整数である）
の化合物を含む。
Ａは、ポリマー骨格であり、場合によっては、ポリマーは、線状ポリマー、分岐ポリマー、超分岐ポリマー、コポリマー、またはそれらの組み合わせである；
各Ｂは、独立して、場合によっては、Ｃ１～Ｃ６ ＣＯＯＨ、Ｃ１～Ｃ６アルコキシ、Ｃ１～Ｃ６アルキルホスホネート、アルキルエーテル、ポリエーテル、もしくはそれらの組み合わせから選択される１つまたは複数の極性官能基で置換されている窒素含有５員～７員の複素環である；
Ｌは、存在しないかリンカーである；
各Ｌ２は、独立して存在しないかリンカーである；
各Ｒ２は、独立して、溶解度調節剤、反応性官能基、生体分子、またはそれらの組み合わせから選択される第１の修飾基である；
Ｘは、エステル、エーテルおよびアミドから選択される官能基である；
各Ｌ１は、独立して存在しないかリンカーである；
各Ｒ１は、独立して、Ｈ、Ｃ１～Ｃ８アルキル、Ｃ３～Ｃ８シクロアルキル、ＯＨ、Ｃ１～Ｃ１０アルコキシ、Ｃ１～Ｃ１０アルキルアミン、溶解度調節剤、反応性官能基、生体分子およびそれらの組み合わせである；
ｎは、０～５０の整数である；
ｍは、０～４０の整数である；
ｐは、０～３０の整数である；ならびに
ｑは、０超の整数である）
の化合物を含む。
【0011】
別の態様において、本開示は、式Ｉの化合物を含み、式Ｉの化合物は、１個または複数個の金属Ｍにキレート化され、化合物は、式ＩＩ
【0012】
【化2】
【0013】
の構造またはその誘導体もしくは塩を有する。
【0014】
別の態様において、本開示は、１つまたは複数の式Ｉの化合物および１個または複数個の金属Ｍを含む組成物を含む。
【0015】
別の態様において、本開示は、マスサイトメトリーで使用するための式Ｉまたは式ＩＩの化合物を含む。
【0016】
別の態様において、本開示は、複数のキレート基を含む線状または分岐ポリマーを含む元素タグを含み、少なくとも１つのキレート基は、軟質金属の軟質金属原子にキレート化され、軟質金属は、単一同位体である。
【0017】
別の態様において、本開示は
軟質金属の単一同位体の複数の軟質金属原子を含む同位体組成物；および
２つの窒素含有５員もしくは６員の複素環を含む複数のキレート基を含む線状または分岐ポリマーを含む元素タグ（各キレート基は、同位体組成物の少なくとも１個の軟質金属原子を含むか、同位体組成物の少なくとも１個の軟質金属原子を結合することができる）
を含むキットを含み；
キットは、放射性軟質金属をいずれも含まない。
軟質金属の単一同位体の複数の軟質金属原子を含む同位体組成物；および
２つの窒素含有５員もしくは６員の複素環を含む複数のキレート基を含む線状または分岐ポリマーを含む元素タグ（各キレート基は、同位体組成物の少なくとも１個の軟質金属原子を含むか、同位体組成物の少なくとも１個の軟質金属原子を結合することができる）
を含むキットを含み；
キットは、放射性軟質金属をいずれも含まない。
【0018】
別の態様において、本開示は：
軟質金属の単一同位体の複数の軟質金属原子を含む同位体組成物を提供するステップ；
それぞれ独立して２つの窒素含有５員または６員の複素環を含む複数のキレート基を含む線状または分岐ポリマーを含む元素タグ（各キレート基は、同位体組成物の少なくとも１個の軟質金属原子を結合することができる）を提供するステップ；ならびに
同位体組成物の軟質金属原子を元素タグの１つまたは複数のキレート基に結合するステップ
を含む方法を含み；
軟質金属原子は、非放射性である。
軟質金属の単一同位体の複数の軟質金属原子を含む同位体組成物を提供するステップ；
それぞれ独立して２つの窒素含有５員または６員の複素環を含む複数のキレート基を含む線状または分岐ポリマーを含む元素タグ（各キレート基は、同位体組成物の少なくとも１個の軟質金属原子を結合することができる）を提供するステップ；ならびに
同位体組成物の軟質金属原子を元素タグの１つまたは複数のキレート基に結合するステップ
を含む方法を含み；
軟質金属原子は、非放射性である。
【0019】
別の態様において、本開示は、生体試料中の検体の分析のための方法を含み、その方法は：
（ｉ）元素タグ付きアフィニティ試薬を検体とインキュベートするステップであって、元素タグ付きアフィニティ試薬が、元素タグでタグ付けされたアフィニティ試薬を含み、元素タグが、それぞれ独立して２つの窒素含有５員もしくは６員の複素環を含む複数のキレート基を有する線状または分岐ポリマーを含み、元素タグがさらに、軟質金属の単一同位体の複数の軟質金属原子を含む、ステップ；
（ここで：
元素タグの各キレート基は、少なくとも１個の軟質金属原子を含むか、少なくとも１個の軟質金属原子を結合することができ、
軟質金属原子は、非放射性であり、そして
アフィニティ試薬は、検体を特異的に結合する）
（ｉｉ）未結合の元素タグ付きアフィニティ試薬を、結合した元素タグ付きアフィニティ試薬から分離するステップ；ならびに
（ｉｉｉ）検体に結合しているアフィニティ試薬に結合した元素タグを、質量分析原子分光法により分析するステップ
を含む。
（ｉ）元素タグ付きアフィニティ試薬を検体とインキュベートするステップであって、元素タグ付きアフィニティ試薬が、元素タグでタグ付けされたアフィニティ試薬を含み、元素タグが、それぞれ独立して２つの窒素含有５員もしくは６員の複素環を含む複数のキレート基を有する線状または分岐ポリマーを含み、元素タグがさらに、軟質金属の単一同位体の複数の軟質金属原子を含む、ステップ；
（ここで：
元素タグの各キレート基は、少なくとも１個の軟質金属原子を含むか、少なくとも１個の軟質金属原子を結合することができ、
軟質金属原子は、非放射性であり、そして
アフィニティ試薬は、検体を特異的に結合する）
（ｉｉ）未結合の元素タグ付きアフィニティ試薬を、結合した元素タグ付きアフィニティ試薬から分離するステップ；ならびに
（ｉｉｉ）検体に結合しているアフィニティ試薬に結合した元素タグを、質量分析原子分光法により分析するステップ
を含む。
【0020】
本開示の例証的実施形態を、図面に関連してさらに説明する。
【図面の簡単な説明】
【0021】
【図3】図３（ａ）～図３（ｅ）は、異なる力価でのヒトＰＢＭＣ内の１７０Ｅｒ－ＣＤ３対１８７Ｒｅ－ＣＤ２０の二軸散布図である。図３（ｆ）は、最適力価でのヒトＰＭＢＣ内の１７０Ｅｒ－ＣＤ３対１４７Ｓｍ－ＣＤ２０の二軸散布図である。
【図11】図１１（ａ）は、ビス－Ｍａｌ－ＰＥＧ６の１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ）スペクトルである。図１１（ｂ）は、ビス－Ｍａｌ－ＰＥＧ６およびレニウム塩混合物の１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ）スペクトルである。
【図13】図１３（ａ）は、ＰＢＳ中のＲｅ担持ポリマー化合物ＩＩ－１のＵＶ－可視スペクトルである。図１３（ｂ）は、純ＣＤ２０抗体のＦＰＬＣクロマトグラムである。図１３（ｃ）は、抗体－ポリマーコンジュゲートのＦＰＬＣクロマトグラムである。
【図21】図２１は、（ａ）Ｐｔ担持ポリマー１４－３／ＩＩ－６（矢印は、Ｐｔでの金属化後のピリジルプロトンの化学シフト変化を示す）、および（ｂ）Ｈｇ担持ポリマー１４－２／ＩＩ－５（矢印は、Ｈｇでの金属化後のピリジルプロトンの化学シフト変化を示す）の１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ）スペクトルである。
【図25】図２５は、種々の濃度のポリマーコンジュゲートでＣＤ２０抗体にコンジュゲートした本開示のポリマーを含むレニウムタグ付き双性イオン性溶解度調節剤によるＰＢＭＣからのＣＤ２０＋Ｂ細胞の同定のマスサイトメトリー免疫測定結果である。Ｍａｘｐａｒ（商標）１４７Ｓｍ－ＣＤ２０コンジュゲートを陽性対照として使用した。
【図26】図２６は、種々の濃度のポリマーコンジュゲートで、ＣＤ８ａ抗体にコンジュゲートした本開示のポリマーを含むレニウムタグ付き双性イオン性溶解度調節剤によるＰＢＭＣからのＣＤ８＋Ｔ細胞の同定のマスサイトメトリー免疫測定結果である。Ｍａｘｐａｒ（商標）１４６Ｎｄ－ＣＤ８ａコンジュゲートを陽性対照として使用した。
【図27】図２７は、種々の濃度のポリマーコンジュゲートで、ＣＤ２０抗体にコンジュゲートした本開示のポリマーを含むレニウムタグ付き双性イオン性溶解度調節剤を用いてＰＢＭＣ内で非Ｔ／Ｂ細胞（ＣＤ３－ＣＤ２０－）から得られた１８７Ｒｅシグナルおよび１４７Ｓｍシグナルのシグナル分配ヒストグラムを示すグラフである。Ｍａｘｐａｒ（商標）１４７Ｓｍ－ＣＤ２０コンジュゲートを対照として使用した。
【図28】図２８は、種々の濃度のポリマーコンジュゲートで、ＣＤ８ａ抗体にコンジュゲートした本開示のポリマーを含むレニウムタグ付き双性イオン性溶解度調節剤を用いてＰＢＭＣ内でＢ細胞（ＣＤ３－ＣＤ２０＋）から得られた１８７Ｒｅシグナルおよび１４６Ｎｄシグナルのシグナル分配ヒストグラムを示すグラフである。Ｍａｘｐａｒ（商標）１４６Ｎｄ-ＣＤ８ａコンジュゲートを対照として使用した。
【発明を実施するための形態】
【0022】
Ｉ．定義
特に指示がない限り、本段落および他の段落に記載の定義および実施形態は、当業者に理解されるように、それらが適している、本明細書に記載の本開示のすべての実施形態および態様に適用されることが意図される。
特に指示がない限り、本段落および他の段落に記載の定義および実施形態は、当業者に理解されるように、それらが適している、本明細書に記載の本開示のすべての実施形態および態様に適用されることが意図される。
【0023】
本明細書で使用される用語「本開示の化合物（ｃｏｍｐｏｕｎｄ ｏｆ ｔｈｅ ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅ）」または「本開示の化合物（ｃｏｍｐｏｕｎｄ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｔ ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅ）」などは、式Ｉまたは式ＩＩの化合物、それらの塩、溶媒和物および／または誘導体を指す。
【0024】
本明細書で使用される用語「および／または（ａｎｄ／ｏｒ）」は、列記された項目が個々にまたは組み合わせて存在するか、使用されることを意味する。事実上、この用語は、「少なくとも１つの」または「１つまたは複数の」列記された項目が使用されるか存在することを意味する。その薬学的に許容される塩および／または溶媒和物に関する用語「および／または（ａｎｄ／ｏｒ）」は、本開示の化合物が、個々の塩および水和物として存在し、同様に、例えば本開示の化合物の塩の溶媒和物と組み合わせて存在することを意味する。
【0025】
本開示で使用されるように、単数形「ａ（１つの）」、「ａｎ（１つの）」および「ｔｈｅ（その）」は、文脈上明確にそうでないことが指示されていない限り、複数の参照を含む。例えば、「化合物（ａ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」を含む一実施形態は、１つの化合物、または２つもしくはそれ以上の追加の化合物を有する、ある特定の態様を提示すると理解されるべきである。
【0026】
追加のまたは第２の化合物などの「追加の」または「第２の」構成要素を含む実施形態において、本明細書で使用される第２の構成要素は、他の構成要素または第１の構成要素とは化学的に異なる。例えば、第２の構成要素および第１の構成要素が、同じキレート化剤を有する可能性がある場合、第２の構成要素にキレート化される金属は、第１の構成要素にキレート化される金属とは異なる可能性がある。「第３の」構成要素は、他の、第１の、および第２の構成要素とは異なり、さらに、列挙されたまたは「追加の」構成要素は、同様に異なる。
【0027】
本開示および特許請求の範囲で使用されるように、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」（ならびに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」などのあらゆる形態の含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ））、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」（ならびに「有する（ｈａｖｅ）」および「有する（ｈａｓ）」などのあらゆる形態の有する（ｈａｖｉｎｇ））、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」（ならびに「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」などのあらゆる形態の含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ））または「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」（ならびに「含む（ｃｏｎｔａｉｎ）」および「含む（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」などのあらゆる形態の含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ））は、包括的であるか制限がなく、追加の、列挙されていない要素または工程段階を排除しない。
【0028】
本明細書で使用される用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」およびその派生語は、述べられた特徴、要素、構成要素、基、整数、および／またはステップの存在を明示する閉じた用語であることが意図され、また、他の述べられていない特徴、要素、構成要素、基、整数および／またはステップの存在を排除する。
【0029】
本明細書で使用される用語「本質的にそれからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」は、述べられた特徴、要素、構成要素、基、整数、および／またはステップの存在ならびにこれらの特徴、要素、構成要素、基、整数、および／またはステップの基本的および新規の特徴に実質的に影響しないものを明示することを意図している。
【0030】
本明細書で使用される用語「適切な」は、特定の化合物または条件の選択が、実行される特定の合成操作、変換される分子の同定および／または化合物の特定の使用に依存しているが、その選択が、当技術分野において訓練を受けた技能の範囲内であることを意味する。
【0031】
本開示の実施形態において、本明細書に記載の化合物は、少なくとも１つの不斉中心を有する場合がある。化合物が１つ以上の不斉中心を保持する場合、それらは、ジアステレオマーとして存在する場合がある。すべてのそのような異性体および任意の割合でのそれらの混合物が、本開示の範囲内に包含されることが理解されるべきである。化合物の立体化学が、本明細書に列記された任意の所与の化合物で示されるようなものである可能性がある一方で、そのような化合物が、ある特定の量（例えば、２０％未満、適切には１０％未満、より適切には５％未満）の代替の立体化学を有する本開示の化合物を含む場合もあることがさらに理解されるべきである。分離、精製もしくは部分精製の光学異性体またはそれらのラセミ混合物としてのあらゆる光学異性体が、本開示の範囲内に含まれることが意図される。
【0032】
本開示の化合物はまた、異なる互変異性型で存在する場合があり、化合物を形成するあらゆる互変異性型、およびそれらの混合物が、本開示の範囲内に含まれることが意図される。
【0033】
この説明は、当業者により使用される多数の化学用語および略語を指す。それにも関わらず、選択された用語の定義は、明確さおよび一貫性のために提供される。
【0034】
本明細書で使用される用語「約（ａｂｏｕｔ）」、「実質的に（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ）」および「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」は、最終の結果が大きく変化しないような修飾された用語の合理的な偏差の量を意味する。これらの程度の用語は、この偏差がそれを修飾する単語の意味を否定しない場合、または文脈上特にそうでないことが当業者に示唆されていない限り、修飾された用語の少なくともまたは最大±５％の偏差を含むものとして解釈されるべきである。
【0035】
本明細書で使用される用語「アルキル」は、単独で使用される場合でも、別の基の一部として使用される場合でも、直鎖または分岐鎖の飽和アルキル基を意味する。当該アルキル基において可能である炭素原子の数は、接頭語「Ｃｎ１～ｎ２」により指示される。例えば、用語Ｃ１～１０アルキルは、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個の炭素原子を有するアルキル基を意味する。
【0036】
用語「アルキレン」は、単独で使用される場合でも、別の基の一部として使用される場合でも、直鎖または分岐鎖の飽和アルキレン基、すなわち、その両末端に置換基を含む飽和の炭素鎖を意味する。当該アルキレン基で可能である炭素原子の数は、接頭語「Ｃｎ１～ｎ２」により指示される。例えば、用語Ｃ２～６アルキレンは、２個、３個、４個、５個または６個の炭素原子を有するアルキレン基を意味する。
【0037】
「利用可能な水素原子」または「利用可能な原子」におけるような用語「利用可能な」は、置換基により置き換えることができることが当業者に既知である原子を指す。
【0038】
本明細書で使用される用語「アミン」または「アミノ」は、単独で使用される場合でも、別の基の一部として使用される場合でも、一般式ＮＲ’Ｒ’’（式中、Ｒ’およびＲ’’は、水素またはＣ１～６アルキルからそれぞれ独立して選択される）の基を指す。
【0039】
本明細書で使用される用語「シクロアルキル」は、単独で使用される場合でも、別の基の一部として使用される場合でも、１つまたは複数の環を含む飽和の炭素環式基を意味する。当該シクロアルキル基で可能である炭素原子の数は、数的接頭語「Ｃｎ１～ｎ２」により指示される。例えば、用語Ｃ３～１０シクロアルキルは、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個の炭素原子を有するシクロアルキル基を意味する。
【0040】
本明細書で使用される用語「アリール」は、単独で使用される場合でも、別の基の一部として使用される場合でも、少なくとも１つの芳香族環を含む炭素環式基を指す。本開示の一実施形態において、フェニル、インダニルまたはナフチルなどのアリール基は、６個、９個または１０個の炭素原子を含む。
【0041】
本明細書で使用される用語「複素環」、「複素環の」などは、単独で使用される場合でも、別の基の一部として使用される場合でも、１個または複数個の原子が、Ｏ、ＳおよびＮから選択されるヘテロ原子である少なくとも１つの芳香族環または非芳香族環を含む環状基を指す。複素環基は、飽和または不飽和のいずれかである（すなわち、１つまたは複数の二重結合を含む）。複素環基が、接頭語Ｃｎ１～ｎ２を含む場合、この接頭語は、１個または複数個、適切には１～５個の環原子が上で定義した通りのヘテロ原子で置き換えられている、対応する炭素環式基における炭素原子の数を指示する。
【0042】
本明細書で使用される用語「ヘテロアリール」、「ヘテロ芳香族の」などは、単独で使用される場合でも、別の基の一部として使用される場合でも、１個または複数個の元素がＯ、ＳおよびＮから選択されるヘテロ原子である少なくとも１つのヘテロ芳香環を含む環状基を指す。ヘテロアリール基が、接頭語Ｃｎ１～ｎ２を含む場合、この接頭語は、１個または複数個、適切には１～５個の環原子が上で定義した通りのヘテロ原子で置き換えられている、対応する炭素環式基における炭素原子の数を指示する。
【0043】
アリールおよびシクロ基を含むすべての環状基は、１つまたは１つ以上の環を含む（すなわち、多環式である）。環状基が１つ以上の環を含む場合、環は、縮合しているか、架橋しているか、スピロ縮合しているか、１つの結合により結合されている可能性がある。
【0044】
第２の環と「縮合」している第１の環は、第１の環と第２の環とが、その間の２個の隣接する原子を共有していることを意味する。
【0045】
第２の環と「架橋」している第１の環は、第１の環と第２の環とが、その間の２個の隣接していない原子を共有することを意味する。
【0046】
第２の環と「スピロ縮合」している第１の環は、第１の環と第２の環とが、その間の１個の原子を共有していることを意味する。
【0047】
本明細書で使用される用語「ハロ」は、ハロゲン原子を指し、フルオロ、クロロ、ブロモおよびヨードを含む。
【0048】
用語「場合によっては置換された」は、非置換であるか、１つまたは複数の置換基で置換されている基、構造、または分子を指す。
【0049】
本明細書で使用される用語「ａｔｍ」は、周囲環境を指す。
【0050】
本明細書で使用される用語「ＭＳ」は、質量分析法を指す。
【0051】
本明細書で使用される用語「ａｑ．」は、水性を指す。
【0052】
本明細書で使用される用語「保護基」または「ＰＧ」などは、分子の異なる部分を操作するか反応させている間、分子のそれらの反応性部分における副反応を防ぐために分子の反応性部分を保護するまたはマスクする化学部分を指す。操作または反応が完了した後、保護基は、分子の残りの部分を劣化または分解しない条件下で除去される。適切な保護基の選択は、当業者により行うことができる。多くの従来の保護基は、当技術分野において既知であり、例えば、「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」ＭｃＯｍｉｅ，Ｊ．Ｆ．Ｗ．Ｅｄ．，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，１９７３、Ｇｒｅｅｎｅ，Ｔ．Ｗ．およびＷｕｔｓ，Ｐ．Ｇ．Ｍ．，「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，第３版，１９９９ならびにＫｏｃｉｅｎｓｋｉ，Ｐ．Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐｓ，第３版，２００３，Ｇｅｏｒｇ Ｔｈｉｅｍｅ Ｖｅｒｌａｇ（Ａｍｅｒｉｃａｓ）に説明されている。
【0053】
本明細書で使用される用語「不活性有機溶媒」は、一般に、所望の合成変換を干渉したり阻害したりしないので、所与の反応において一緒に組み合わせられる化合物に存在する官能基と非反応性であると考えられている溶媒を指す。有機溶媒は、典型的に非極性であり、水溶液中で不溶性である化合物を溶解する。
【0054】
本明細書で使用される用語「細胞」は、１つの細胞または複数の細胞を指し、細胞培養または場合によっては対象のいずれかにある細胞を含む。
【0055】
本明細書で使用される用語「溶媒和物」は、適切な溶媒の分子が、結晶格子に組み込まれている化合物、または化合物の塩もしくは誘導体を意味する。適切な溶媒の例には、エタノール、水などが含まれ得る。水が溶媒である場合、分子は、「水和物」と呼ばれる。
【0056】
本明細書で使用される用語「抗体」は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ならびにそれらのキメラ抗体および結合フラグメントを含む、いずれかおよびすべての抗体ならびにそのフラグメントを含むことが意図される。抗体は、組換え源由来のものおよび／または遺伝子導入動物で産生されたものである可能性がある。抗体は、従来の技術を使用して断片化され得る。例えば、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、抗体をペプシンで処理することにより生成され得る。得られるＦ（ａｂ’）２フラグメントは、Ｆａｂ’フラグメントを生成するためにジスルフィド結合を還元するように処理され得る。パパイン消化は、Ｆａｂフラグメントの形成をもたらすことができる。Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｄｓ－ｓｃＦｖ、二量体、ミニボディ、ダイアボディ、二重特異性抗体フラグメントおよび他のフラグメントもまた、組換え技術により合成することができる。本明細書で使用される抗体フラグメントは、結合フラグメントを意味する。
【0057】
本明細書で使用される用語「オリゴヌクレオチド」は、天然に存在する、および天然には存在しない塩基、糖、および糖間（intersugar）（骨格）結合からなるヌクレオチドまたはヌクレオシドモノマーの配列を含む核酸を指し、一本鎖および二本鎖の分子、ＲＮＡおよびＤＮＡを含む。オリゴヌクレオチドは、天然には存在しないモノマーを含む、長い（例えば、１０００超のモノマーおよび最大１０Ｋのモノマー）か、中程度のサイズ（例えば、両端値を含む２００～１０００のヌクレオチド）か、短い、例えば２００未満のモノマー、１００のモノマー、５０のモノマーのものである可能性がある。用語「オリゴヌクレオチド」には、例えば、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ、ＲＮＡから逆転写された）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、「アンチセンスオリゴヌクレオチド」および「ｍｉＲＮＡ」ならびに「モルホリノオリゴヌクレオチド」、「ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド」などのオリゴヌクレオチド類縁体、または当業者に既知の任意のオリゴヌクレオチドもしくはその類縁体が含まれる。
【0058】
本明細書で使用される用語「元素タグ」、「タグ」などは、支持分子構造に結合した１つまたは多くの同位体（軟質金属など）を有するか、前記元素もしくは同位体を結合することができる、１つの元素または多数の元素を含む化学部分を指す。元素タグはまた、元素タグを目的の分子または標的分子（例えば、検体などの生体分子）に結合させる手段を含むことができる。異なる元素タグは、タグの元素組成に基づいて識別される可能性がある。元素タグは、所与の同位体の多くのコピーを含むことができ、各タグにおける各同位体の再生可能なコピー数を有することができる。その元素組成または同位体組成が他のタグのものとは異なるので、元素タグは、同じ試料中の多数の他の元素タグから機能的に識別可能である。
【0059】
本明細書で使用される用語「ＩＣＰ－ＭＳ」は、誘導結合プラズマ質量分析計－高感度質量分析法ベースの元素分析装置を指す。異なるＩＣＰ－ＭＳ構成は、使用される質量選択技術により主に識別され、例えば、四重極または飛行時間型（ＩＣＰ－ＴＯＦ）または磁場セクター型（高分解能ＩＣＰ－ＭＳ）であり得る。広範囲の構成、能力および修飾を有する多くの市販のＩＣＰ－ＭＳモデルがある。
【0060】
本明細書で使用される用語「ポリマー」は、１個または数個の構成単位の追加または削除により著しく変化しない一連の特性を提供するのに十分な量で互いに結合した１つまたは複数の原子の種または原子団（構成単位）の複数の繰り返しにより特徴づけられた分子で構成される物質を指す。（ＩＵＰＡＣ定義、Ｅ．Ｓ．Ｗｈｉｔｅ，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｆ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｓｃｉ．１９９７，３７，１７１－１９２を参照されたい）。ポリマー分子は、その骨格、分子の長さにわたる原子の接続された結合、および各構成単位の骨格部分に結合したペンダント基の観点から考えることができる。ペンダント基は、多くの場合、主鎖とは化学的および機能的に異なる。金属イオンに高親和性を有するペンダント基は、それらのイオンのキレート基またはリガンドとして機能することができる。いくらかの場合、ポリマーは、約１０～約３００単位を有することができる。
【0061】
本明細書で使用される用語「コポリマー」は、２つまたはそれ以上の化学的に異なる構成単位からなるポリマーを指す。「線状ポリマー」は、構成単位の線状の配列により特徴づけられるポリマーである。「ブロックコポリマー」は、異なるタイプの構成単位の配列に結合している共通のタイプの構成単位の配列を有する線状ポリマーである。「分岐ポリマー」は、ポリマーの骨格から追加のポリマー鎖（分岐）が出ているポリマーである。一般的には、「主鎖」として最も長い線状の配列を指す。分岐鎖の構成単位の化学組成が、主鎖のものとは異なる分岐ポリマーは、「グラフトコポリマー」と呼ばれる。
【0062】
本明細書で使用される用語「スターポリマー」は、共通の構成単位またはコアから出ている複数の線状ポリマー鎖を有するポリマーを指す。本明細書で使用される用語「超分岐ポリマー」は、骨格原子が木の形状で配置されている複数の分岐ポリマーを指す。これらのポリマーは、「デンドリマー」に関連しており、３つの識別される建築的特徴:イニシエータコア（initiator core）、イニシエータコア（initiator core）に半径方向に結合した繰り返し単位で構成される内部層（ジェネレーション）、および最外ジェネレーションに結合した末端官能性の外面を有する。「デンドリマー」は、それらの異常な対称性、高分岐、および最大化された（テレケリック）末端官能性により超分岐ポリマーと異なる。
【0063】
本明細書で使用される用語「金属タグ付きポリマー」（また、「ポリマー性金属タグ担体」、または「金属－ポリマーコンジュゲート」、または「キレート誘導体化ポリマー」）などは、それらに結合した金属原子を有する少なくとも１つのペンダントキレート基を保持するポリマー骨格からなる多種多様の元素タグを指す。これらの金属タグ付きポリマーは、線状、スター、分岐、もしくは超分岐ホモポリマーまたはコポリマーおよびブロックもしくはグラフトコポリマーであり得るがこれらに限定されない。
【0064】
本明細書で使用される用語「金属結合ペンダント基」は、金属または金属の同位体を結合することができるポリマー上のペンダント基である。それはまた、キレート化剤と呼ばれる可能性がある。
【0065】
本明細書で使用される用語「キレート化」は、リガンド、キレート剤（chelant）、キレート化剤またはキレート剤（chelating agent）を金属イオンに結合して、金属錯体、キレートを形成するプロセスを指す。Ｈ２ＯまたはＮＨ３などの単一の単座配位子とは対照的に、多座のキレート化剤は、金属イオンとの複数の結合を形成する。
【0066】
本明細書で使用される用語「金属」は、以下の原子番号、３、４、１１～１３、１９～３３、３７～５２、５５～８４、８７～１０２の１つを有する元素を指す。
【0067】
本明細書で使用される用語「軟質金属」は、ピアソンの硬いおよび軟らかいルイス酸および塩基の理論にしたがって軟質と考えられる金属を指す。
【0068】
単一同位体に言及する場合、実質的に金属の単一同位体を指すと想定される。例えば、単一同位体は、微量の金属の他の同位体および／または微量の別の金属を含むことができる。例えば、実質的に単一同位体は、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、もしくは少なくとも９９．９％のいずれか１つの同位体の純度を有する、または１００％の純度の同位体を有する同位体を意味することができる。例えば、単一同位体は、約９５％または９５％超の同位体および約５％または５％未満の他の同位体を含むことができる。いくらかの実施形態において、単一同位体は、約９７％または９７％超の同位体および約３％または３％未満の他の同位体を含むことができる。いくらかの実施形態において、単一同位体は、約９８％または９８％超の同位体および約２％または２％未満の他の同位体を含むことができる。いくらかの実施形態において、単一同位体は、約９９％または９９％超の同位体および約１％または１％未満の他の同位体を含むことができる。いくらかの実施形態において、単一同位体は、約９９．５％または９９．５％超の同位体および約０．５％または０．５％未満の他の同位体を含むことができる。いくらかの実施形態において、単一同位体は、約９９．９％または９９．９％超の同位体および約０．１％または０．１％未満の他の同位体を含むことができる。いくらかの実施形態において、単一同位体は、１００％の同位体を含む。
【0069】
用語Ｍｎ、ＭｗおよびＰＤＩ（多分散性指数）：Ｍｗ／Ｍｎは、それぞれ、数および平均分子量を示すために使用され、多分散性指数は、分子量分布を説明する。
【0070】
本明細書でのエンドポイントによる数値範囲の記述には、その範囲内に包含されるすべての数および端数が含まれる（例えば、１～５には、１、１．５、２、２．７５、３、３．９０、４、および５が含まれる）。また、すべての数字およびその端数は、用語「約（ａｂｏｕｔ）」により修飾されると仮定されることが理解されるべきである。
【0071】
さらに、特定のセクションに記載の定義および実施形態は、当業者に理解されるように適切であると説明された、本明細書の他の実施形態に適用可能であることが意図される。例えば、以下の節では、本開示の異なる態様は、より詳細に定義されている。そのように定義された各態様は、明示的に反対であることが示されない限り、任意の他の態様または複数の態様と組み合わされる場合がある。特に、好ましいまたは都合のよいものと示されたいずれかの特徴は、好ましいまたは都合のよいものと示された任意の他の特徴または複数の特徴と組み合わされる場合がある。
【0072】
本明細書に記載の範囲について、部分範囲もまた、例えば、それらの間の０．１刻みで想定されている。例えば、範囲が０ｐｐｍ～約５ｐｐｍである場合、０．１ｐｐｍ～約５ｐｐｍ、０ｐｐｍ～約４．９ｐｐｍ、０．１ｐｐｍ～約４．９ｐｐｍなども想定されている。
【0073】
ＩＩ．化合物、組成物およびキット
一態様において、本開示は、式Ｉ
一態様において、本開示は、式Ｉ
【0074】
【化3】
【0075】
（式中、
Ａは、ポリマー骨格であり、場合によっては、ポリマーは、線状ポリマー、分岐ポリマー、超分岐ポリマー、コポリマー、またはそれらの組み合わせである；
各Ｂは、独立して、場合によっては、Ｃ１～Ｃ６ ＣＯＯＨ、Ｃ１～Ｃ６アルコキシ、Ｃ１～Ｃ６アルキルホスホネート、アルキルエーテル、ポリエーテル、もしくはそれらの組み合わせから選択される１つまたは複数の極性官能基で置換されている窒素含有５員～７員の複素環である；
Ｌは、存在しないかリンカーである；
各Ｌ２は、独立して存在しないかリンカーである；
各Ｒ２は、独立して、溶解度調節剤、反応性官能基、生体分子、またはそれらの組み合わせから選択される第１の修飾基である；
Ｘは、エステル、エーテルおよびアミドから選択される官能基である；
各Ｌ１は、独立して存在しないかリンカーである；
各Ｒ１は、独立して、Ｈ、Ｃ１～Ｃ８アルキル、Ｃ１～Ｃ８アルキル、Ｃ２～Ｃ８アルケニル、Ｃ３～Ｃ８シクロアルキル、ＯＨ、Ｃ１～Ｃ１０アルコキシ、Ｃ１～Ｃ１０アルキルアミン、溶解度調節剤、反応性官能基、生体分子およびそれらの組み合わせである；
ｎは、０～５０の整数である；
ｍは、０～４０の整数である；
ｐは、０～３０の整数である；ならびに
ｑは、０超の整数である）
の化合物を含む。
Ａは、ポリマー骨格であり、場合によっては、ポリマーは、線状ポリマー、分岐ポリマー、超分岐ポリマー、コポリマー、またはそれらの組み合わせである；
各Ｂは、独立して、場合によっては、Ｃ１～Ｃ６ ＣＯＯＨ、Ｃ１～Ｃ６アルコキシ、Ｃ１～Ｃ６アルキルホスホネート、アルキルエーテル、ポリエーテル、もしくはそれらの組み合わせから選択される１つまたは複数の極性官能基で置換されている窒素含有５員～７員の複素環である；
Ｌは、存在しないかリンカーである；
各Ｌ２は、独立して存在しないかリンカーである；
各Ｒ２は、独立して、溶解度調節剤、反応性官能基、生体分子、またはそれらの組み合わせから選択される第１の修飾基である；
Ｘは、エステル、エーテルおよびアミドから選択される官能基である；
各Ｌ１は、独立して存在しないかリンカーである；
各Ｒ１は、独立して、Ｈ、Ｃ１～Ｃ８アルキル、Ｃ１～Ｃ８アルキル、Ｃ２～Ｃ８アルケニル、Ｃ３～Ｃ８シクロアルキル、ＯＨ、Ｃ１～Ｃ１０アルコキシ、Ｃ１～Ｃ１０アルキルアミン、溶解度調節剤、反応性官能基、生体分子およびそれらの組み合わせである；
ｎは、０～５０の整数である；
ｍは、０～４０の整数である；
ｐは、０～３０の整数である；ならびに
ｑは、０超の整数である）
の化合物を含む。
【0076】
別の態様において、本開示は、式Ｉの化合物を含み、式Ｉの化合物は、１個または複数個の金属Ｍにキレート化され、化合物は、式ＩＩ
【0077】
【化4】
【0078】
の構造またはその誘導体もしくは塩を有する。
【0079】
別の態様において、本開示は、１つもしくは複数の式Ｉの化合物または１つもしくは複数の式ＩＩの化合物、および溶媒を含む組成物を含む。
【0080】
別の態様において、本開示は、マスサイトメトリーで使用するための式Ｉまたは式ＩＩの化合物を含む。
【0081】
いくらかの実施形態において、ポリマー骨格Ａは、１０～３００のモノマー単位を含むことができる。
【0082】
いくらかの実施形態において、ｎは、０～２０、１～１０、または０～７の整数である。いくらかの実施形態において、ｍは、０～３０、０～２０、０～１０、または０～４の整数である。いくらかの実施形態において、ｐは、０～２０、０～１０、０～５または０～３の整数である。いくらかの実施形態において、ｑは、０超の整数である。例えば、ｑは、２～３００、２～２００、２～１５０、２～１００、４～８０、４～６０、４～２０、４～１２、または１０～６０の整数である。例えば、ｑは、少なくとも２、少なくとも４、または少なくとも１０である整数である。例えば、ｑは、最大３００、最大２５０、最大２００、最大１５０、最大１００、最大８０、最大６０、最大２０、最大１２、または最大１０である整数である。いくらかの実施形態において、ｑは、マスサイトメトリーをイメージングするために組織を染色するため、またはサスペンションマスサイトメトリーにおける細胞内標的を標識するために使用される場合など、立体障害を回避するためおよび／またはバックグラウンドを低減するために、１以上であるが２０未満である可能性がある。いくらかの実施形態において、ｎは、０～７の整数である；ｍは、０～４の整数である；ｐは、０～３の整数である；およびｑは、０超の整数である。例えば、ｎは、２、３、４、または５である。いくらかの実施形態において、ｍは、０、１、または２である。いくらかの実施形態において、ｐは、１または２である。
【0083】
本明細書で使用されるように、第１の修飾基または第２の修飾基などの用語「修飾基」は、化学物質もしくはポリマーなどの化学構造に結合する場合、化学物質もしくはポリマーなどの化学構造の官能性および／または特性を修飾する、変化させる、調節する、または変更する、基、部分、構造、および／または置換基を指す。例えば、修飾基は、化学物質の溶解性、反応性、および／もしくは疎水性、または別の化学物質への化学物質の親和性を修飾する、変化させる、調節するまたは変更することができる。いくらかの実施形態において、修飾基は、溶解度調節剤、および／または反応性官能基であり得る。
【0084】
本明細書で使用されるように、「溶解度調節剤」は、化学物質またはオリゴマーもしくはポリマーなどの化学構造に結合する場合、水中での化学物質もしくは化学構造の溶解性を修飾する、変化させる、調節する、または変更する基、部分、構造および／または置換基を指す。例えば、溶解度調節剤には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、双性イオンポリマー、または電荷ポリマーなどの水溶性ポリマーが含まれ得る。双性イオンポリマーには、ポリ（スルホベタインメタクリレート）（ＰＳＢＭＡ）およびポリ（カルボキシベタインメタクリレート）（ＰＣＢＭＡ）が含まれ得る。いくらかの実施形態において、各Ｒ２の第１の修飾基の溶解度調節剤および第２の修飾基の溶解度調節剤は、それぞれ独立して、ポリエチルグリコール（polyethylglycol）（ＰＥＧ）、糖、オリゴ糖、またはポリ（カルボキシルベタイン）メタクリレートもしくはポリ（スルホベタイン）メタクリレート（ＰＢＳＭＡ）などの双性イオンポリマーを含む。溶解度調節剤は、溶解度調節剤がなかった場合と比べて、溶液（例えば、水溶液、６～８またはその間でのｐＨで緩衝された溶液など）中にあり得るポリマーの量において２倍の増加など、ポリマー（例えば、本明細書に記載の金属が担持されたポリマー）の溶解度を高める可能性がある。ある特定の態様において、溶解度調節剤は、溶解度調節剤がなかった場合と比べて、ポリマー（例えば、本明細書に記載の金属が担持されたポリマー）の溶解度を高める可能性がある。いくらかの実施形態において、オリゴマーは、最大１０のモノマー単位を有することができる。いくらかの実施形態において、溶解度調節剤は、約１０～約５０００単位を有するポリマーを含むことができる。例えば、溶解度調節剤は、ＰＥＧ基であり得る。例えば、ＰＥＧ基は、約１０～約３５０単位、約１０～約３００単位、約１０～約２５０単位、約１０～２００単位、約１０～１５０単位、または約１１０単位のエチレングリコールを有することができる。例えば、ＰＥＧ基は、少なくとも１０、少なくとも２０、または少なくとも３０単位のエチレングリコールを有することができる。例えば、ＰＥＧ基は、最大３００、最大２５０、最大２００、最大１５０、最大１００、または最大５０単位のエチレングリコールを有することができる。例えば、ＰＥＧ基は、約５０００ｇ／ｍｏｌ～約１００００ｇ／ｍｏｌのＭｎを有することができる。
【0085】
ある特定の態様において、溶解度調節剤はまた、本開示の化合物の試料中の標的への非特異的結合を低減することができる。いくらかの実施形態において、ある特定の溶解度調節剤が、非特異的結合を低減するのにより効果的であることが示されている。例えば、双性イオン性溶解度調節剤が、ＰＥＧ溶解度調節剤よりも小さい非特異的結合を示すことが示されている。
【0086】
いくらかの実施形態において、金属Ｍの少なくとも一部分またはすべては、１つまたは複数の溶解度調節剤に配位され得る。例えば、溶解度調節剤は、金属Ｍのリガンドであり得る。いくらかの実施形態において、溶解度調節剤は、チオール小分子を含むことができる。例えば、チオール小分子は、グルタチオン、システイン、チオグリコール酸、メルカプトコハク酸、チオグリコール酸メチル、ジメルカプロール、ジメルカプトコハク酸、２，３－ジメルカプト－１－プロパンスルホネート、およびそれらの組み合わせから選択され得る。いくらかの実施形態において、溶解度調節剤は、グルタチオンである。溶解度調節剤が、リガンド交換反応により金属Ｍに配位され得ることが理解され得る。
【0087】
本明細書で使用されるように、「反応性官能基」は、別の原子団または単一の原子と相互作用または反応して２個の原子団の間または２個の原子の間の化学的相互作用を形成する原子団または単一の原子を指す。例えば、１つまたは複数の反応性官能基を化学物質また
はポリマーなどの化学構造の上に結合させると、化学物質またはポリマーなどの化学構造の反応性を修飾するまたは変化させ、化学物質または化学構造が、別の化学物質または生体分子などの化学構造の上で原子団と相互作用または反応することを可能にする。いくらかの場合、所与の反応性官能基が、特定の官能基と相互作用または反応して、化学的相互作用を形成することができることが理解され得る。例えば、アジドがクリックケミストリーに適しており、マレイミドがチオールと反応することができることが知られている。いくらかの実施形態において、化学的相互作用は、共有結合性またはイオン性である。例えば、化学的相互作用は、共有結合性である。いくらかの実施形態において、反応性官能基は、１つまたは複数の生体分子への結合のためのものである。いくらかの実施形態において、各Ｒ２の第１の修飾基の反応性官能基および第２の修飾基の反応性官能基は、それぞれ独立して、カルボン酸、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、テトラフルオロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、マレイミド、チオール、アジド、ジベンゾシクロオクチン（ＤＢＣＯ）、トランス－シクロオクテン（ＴＣＯ）、テトラジン、フラン、ヒドラジド、またはアルデヒドから選択される。
はポリマーなどの化学構造の上に結合させると、化学物質またはポリマーなどの化学構造の反応性を修飾するまたは変化させ、化学物質または化学構造が、別の化学物質または生体分子などの化学構造の上で原子団と相互作用または反応することを可能にする。いくらかの場合、所与の反応性官能基が、特定の官能基と相互作用または反応して、化学的相互作用を形成することができることが理解され得る。例えば、アジドがクリックケミストリーに適しており、マレイミドがチオールと反応することができることが知られている。いくらかの実施形態において、化学的相互作用は、共有結合性またはイオン性である。例えば、化学的相互作用は、共有結合性である。いくらかの実施形態において、反応性官能基は、１つまたは複数の生体分子への結合のためのものである。いくらかの実施形態において、各Ｒ２の第１の修飾基の反応性官能基および第２の修飾基の反応性官能基は、それぞれ独立して、カルボン酸、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、テトラフルオロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、マレイミド、チオール、アジド、ジベンゾシクロオクチン（ＤＢＣＯ）、トランス－シクロオクテン（ＴＣＯ）、テトラジン、フラン、ヒドラジド、またはアルデヒドから選択される。
【0088】
反応性官能基が、さらなる反応に必要になるまで、反応性官能基が、適切な保護基で可逆的に保護またはキャップされ得ることが理解され得る。例えば、チオールは、マレイミドまたは当技術分野で既知の他の基などのチオールキャップ基でキャップされ得る。例えば、チオール含有ポリマーは、ジスルフィド二量体として一時的に保護することができるか、一時的に存在することができ、既知の方法（例えばＤＴＴ還元）を使用して還元し、必要に応じてチオール基を曝露することができる。したがって、本明細書に記載の反応性官能基がまた、反応性官能基の保護されたバージョンも含むと考えられる。
【0089】
本明細書で使用されるように、金属が非放射性である場合、金属が、本質的に非放射性であることを意味する。例えば、放射性金属は、放射線検出アッセイでの使用に適している減衰率を有することができるが、非放射性金属は、放射線検出アッセイに適していないか、放射標識の分野で使用される一般的な放射線検出アッセイの検出限界未満の減衰率を有することができる。いくらかの実施形態において、非放射性金属は、約１５０，０００年を超える、２００，０００年を超える、または約２１０，０００年を超える半減期を有することができる。例えば、９９Ｔｃ同位体が２１０，０００年の半減期を有しており、したがって本開示の目的のために非放射性であるとみなされることが知られている。
【0090】
いくらかの実施形態において、各Ｂは、独立して５員または６員の複素環である。例えば、各Ｂは、独立して置換または非置換のテトラヒドロピロールであり得る。いくらかの実施形態において、各Ｂは、独立して、窒素含有５員または６員のヘテロアリールであり、場合によっては、ＣＯＯＨ、Ｃ１～Ｃ６アルコキシ、Ｃ１～Ｃ６アルキルホスホネート、アルキルエーテル、ポリエーテル、もしくはそれらの組み合わせから選択される１つまたは複数の極性官能基で置換されており、そして、場合によっては、１つまたは複数のＢは、軟質金属に配位されている、および／または１つもしくは複数の生体分子にコンジュゲートしている。
【0091】
例えば、各Ｂは、独立してピリジンまたはイミダゾールであり、場合によっては、Ｃ１～Ｃ５アルキル、Ｃ２～Ｃ５アルケニル、ＣＯＯＨ、Ｃ１～Ｃ６アルコキシ、Ｃ１～Ｃ６アルキルホスホネート、アルキルエーテル、ポリエーテル、またはそれらの組み合わせから選択される１つまたは複数の極性官能基で置換されており、そして、場合によっては、１つまたは複数のＢは、軟質金属に配位されている、および／または１つもしくは複数の生体分子にコンジュゲートしている。
【0092】
同じ窒素に結合した２つのＢは、本質的に同じキレート基ではないと考えられる。それにも関わらず、合成の容易さから外れて、同じ窒素に結合した２つのＢは、同じであり得る。
【0093】
いくらかの実施形態において、１つまたは複数のＢは、軟質金属に配位されている。式Ｉの化合物のＢのすべてが、金属に配位されている必要はないと考えられる。例えば、いくらかの実施形態において、約３０％～約９５％、約４０％～約９０％、約５０％～約８５％のＢは、金属に配位されている。いくらかの実施形態において、少なくとももしくは約５０％、少なくとももしくは約５５％、少なくとももしくは約６０％、少なくとももしくは約６５％、少なくとももしくは約７０％、少なくとももしくは約７５％、少なくとももしくは約８０％、または少なくとももしくは約８５％のＢは、金属に配位されている。いくらかの実施形態において、最大９５％、最大９０％、最大８５％、最大８０％、最大７５％、最大７０％、または最大６５％のＢは、金属に配位されている。いくらかの実施形態において、約７５％～約８０％のＢは、金属に配位されている。いくらかの実施形態において、Ｂはすべて、金属に配位されている。理論に縛られることを望むことなく、同じ窒素原子に結合した２つのＢが、二座の様式で、同じ金属原子にキレート化することができることが理解され得る。
【0094】
いくらかの実施形態において、Ｂは、場合によっては置換されたピリジンである。
【0095】
いくらかの実施形態において、Ｂは、置換または非置換のイミダゾールである。場合によっては、Ｂは、２置換または４置換のイミダゾールである。適切なイミダゾールベースのキレート化剤には、Ｍａｒｅｓｃａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，２０１０，２１，１０３２（その内容は、その全体が参照により組み込まれている）に記載のものが含まれる。
【0096】
いくらかの実施形態において、Ｒ１は、生体分子である。例えば、Ｒ１は、抗体であり得る。いくらかの実施形態において、Ｒ１は、アフィニティ試薬である。
【0097】
いくらかの実施形態において、Ｒ２は、生体分子である。例えば、Ｒ２は、抗体であり得る。いくらかの実施形態において、Ｒ２は、アフィニティ試薬である。
【0098】
いくらかの実施形態において、Ｘは、アミドである。例えば、Ｘは、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ４－または－ＮＲ４Ｃ（Ｏ）－（式中、Ｒ４は、ＨまたはＣ１～Ｃ４アルキルである）である。
【0099】
いくらかの実施形態において、Ｘは、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ４－であり、化合物は、式Ｉａ
【0100】
【化5】
【0101】
の構造を有する。
【0102】
いくらかの実施形態において、Ｘは、－ＮＲ４Ｃ（Ｏ）－であり、化合物は、式Ｉｂ
【0103】
【化6】
【0104】
の構造を有する。
【0105】
いくらかの実施形態において、Ｘは、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ４－であり、化合物は、式Ｉｃ
【0106】
【化7】
【0107】
（式中、各Ｒ３は、Ｈ、Ｃ１～Ｃ５アルキル、Ｃ２～Ｃ５アルケニル、Ｃ１～Ｃ６ ＣＯＯＨ、Ｃ１～Ｃ６アルコキシ、Ｃ１～Ｃ６アルキルホスホネート、アルキルエーテル、またはポリエーテルから独立して選択される）
の構造を有する。
の構造を有する。
【0108】
いくらかの実施形態において、Ｘは、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ４－であり、化合物は、式Ｉｄまたは式Ｉｅ
【0109】
【化8】
【0110】
の構造を有する。
【0111】
いくらかの実施形態において、Ｘは、－ＮＲ４Ｃ（Ｏ）－であり、化合物は、式Ｉｆ
【0112】
【化9】
【0113】
（式中、各Ｒ３は、Ｈ、Ｃ１～Ｃ５アルキル、Ｃ２～Ｃ５アルケニル、Ｃ１～Ｃ６ ＣＯＯＨ、Ｃ１～Ｃ６アルコキシ、Ｃ１～Ｃ６アルキルホスホネート、アルキルエーテル、またはポリエーテルから独立して選択される）
の構造を有する。
の構造を有する。
【0114】
いくらかの実施形態において、Ｘは、－ＮＲ４Ｃ（Ｏ）－であり、化合物は、式Ｉｇまたは式Ｉｈ
【0115】
【化10】
【0116】
の構造を有する。
【0117】
いくらかの実施形態において、Ｒ４は、Ｈである。いくらかの実施形態において、Ｒ４は、Ｃ１～Ｃ３アルキルである。
【0118】
いくらかの実施形態において、式Ｉの化合物は、式Ｉｉ
【0119】
【化11】
【0120】
（式中、Ａ１は、Ａのモノマーであり、ｒは、約３～約３００、約３～約２５０、約３～約２００、約３～約１５０、約３～約１００、約３～約５０、約６～約３０、または約１０～約２５である）の構造を有する。いくらかの実施形態において、ｒは、最大３００、最大２５０、最大２００、最大１５０、最大１００、最大５０、最大３０、または最大２５である。いくらかの実施形態において、ｒは、少なくとも３、少なくとも６、または少なくとも１０である。場合によっては、ポリマー骨格Ａは、線状ポリマーまたはコポリマーである。
【0121】
いくらかの実施形態において、式Ｉの化合物は、式Ｉｊ
【0122】
【化12】
【0123】
（式中、Ａ１およびＡ２は、それぞれ、Ａのモノマーであり、ｒは、約３～約３００、約３～約２５０、約３～約２００、約３～約１５０、約３～約１００、約３～約５０、約６～約３０、または約１０～約２５であり、ポリマー骨格Ａは、線状のコポリマーである）の構造を有する。いくらかの実施形態において、ｒは、最大３００、最大２５０、最大２００、最大１５０、最大１００、最大５０、最大３０、または最大２５である。いくらかの実施形態において、ｒは、少なくとも３、少なくとも６、または少なくとも１０である。
【0124】
いくらかの実施形態において、各Ｒ３は、Ｈ、－（ＣＨ２）１～３ＣＯＯＨ、－（ＣＨ２）１～３Ｏ（ＣＨ２）１～２ＣＨ３、－（ＣＨ２）２～４ＯＨ、－（ＣＨ２）２～５Ｐ（Ｏ）（ＯＣＨ２ＣＨ３）２、または－ＣＨ２ＣＨ（ＯＭｅ）２から独立して選択される。
【0125】
いくらかの実施形態において、Ａは、ポリアクリレート、ポリアクリルアミド、ポリエーテル、ポリアミノ酸、ポリビニルアミン、ポリ（２－オキサゾリン）、ポリエチレングリコール、多糖、デンドリマー、それらのコポリマー、またはそれらの組み合わせから選択される。
【0126】
例えば、Ａは、ポリアミノ酸であり得る。例えば、ポリアミノ酸は、場合によっては置換されたポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、ポリリジン、ポリ（２，４－ジメチルアミノ酪酸）（ポリＤａｂ）、ポリ（２，４－ジアミノピメリン酸）（ポリＤａｐ）、それらの誘導体、またはそれらの組み合わせであり得る。
【0127】
本開示の化合物のポリマー骨格Ａは、コポリマーであり得ると考えられる。例えば、それは、ＰＥＧを含むコポリマーであり得る。
【0128】
いくらかの実施形態において、ポリマー骨格は、線状ポリマーである。例えば、式Ｉの化合物は、以下に示す構造を有することができる。
【0129】
【化13】
【0130】
いくらかの実施形態において、ポリマー骨格は、超分岐ポリマー、またはグラフトポリマーなどの分岐ポリマーである。代表的な式Ｉの化合物の表現には以下に示す構造が含まれる。
【0131】
【化14】
【0132】
各ａ（例えばａ１、ａ２、…、ａｒ）は、ポリマー骨格のモノマー単位である。式Ｉの化合物のポリマー骨格は、ホモポリマーまたはコポリマーであり得る。コポリマーには、グラフトコポリマーまたはブロックコポリマーが含まれ得る。各モノマー単位（例えば、ａ、ａ１、ａ２、…、ａｒ）は、例えばホモポリマーにおいて同じである可能性があるか、例えばコポリマーにおいて異なる可能性があることが理解され得る。例えば、ａ２は、ａ１と同じモノマーである可能性があるか、異なるモノマーである可能性がある。同様に、ａ３は、ａ２および／またはａ１と同じモノマーである可能性があるか、異なるモノマーである可能性がある。
【0133】
少なくとも１つのモノマー単位ａが、構造
【0134】
【化15】
【0135】
に結合していると考えられ、後者は、軟質金属などの金属にキレート化することができる。いくらかの実施形態において、ポリマー骨格の各モノマー単位は、
【0136】
【化16】
【0137】
に結合している。いくらかの他の実施形態において、すべてではないが、ポリマー骨格のモノマー単位のいくらかは、
【0138】
【化17】
【0139】
に結合している。
【0140】
いくらかの実施形態において、第１の修飾基Ｒ２は、ポリマー骨格の末端に存在することができる。例えば、ポリマー骨格の両端は、任意のリンカーＬ２を介して第１の修飾基Ｒ２で官能化され得、各第１の修飾基Ｒ２および各リンカーＬ２は、本明細書において独立して定義される。いくらかの実施形態において、ポリマー骨格の末端のいくらかは、すべてではないが、任意のリンカーＬ２を介して第１の修飾基Ｒ２で官能化され得、各第１の修飾基Ｒ２および各リンカーＬ２は、本明細書において独立して定義される。
【0141】
いくらかの実施形態において、ポリマー骨格は、異なるペンダント基を含むモノマーのコポリマーであり得る。例えば、ポリアクリルアミド骨格において、アクリルアミドモノマーが、溶解度修飾基または反応性官能基などのキレート化剤のペンダント基または修飾基に結合している可能性があると想定される。コポリマー骨格を有する本開示の代表的なポリマー化合物を以下に示す。
【0142】
【化18】
【0143】
いくらかの実施形態において、重合の度合い（ＤＰ）は、およそ１～１０００（１～２０００の骨格原子）であり得る。より大きなポリマーも同じ官能性で本発明の範囲内であり、当業者に理解されるように可能である。典型的に、重合の度合いは、１０～２５０である。ポリマーは、比較的狭い多分散性をもたらす経路により合成に適している可能性がある。ポリマーは、１．１～１．２の範囲内のＭｗ／Ｍｎの値になるはずの、原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）、可逆的付加－開裂連鎖移動（ＲＡＦＴ）重合または開環重合により合成される可能性がある。代替の戦略は、およそ１．０２～１．０５のＭｗ／Ｍｎを有するポリマーが得られるアニオン重合を含む。したがって、ポリマーは、１．０２～１．５、例えば１．０２～１．２、１．０２～１．０５、または１．２～１．５の多分散性指数を有する可能性がある。これらの方法は、開始剤または停止剤の選択を通じて末端基の制御を可能にする。これにより、リンカーを結合させることができるポリマーを合成することが可能になる。後のステップでリガンド結合遷移金属単位（例えば、軟質金属単位）を結合することができる繰り返し単位に、官能性ペンダント基を含むポリマーを調製する戦略を採用することができる。この実施形態には、いくらかの利点がある。それは、リガンド含有モノマーの重合を実行する際に生じる可能性がある複雑さを回避する。さらに、ポリマー骨格は、軟質金属含有ポリマーのすべてではないにしてもほとんどに適用することができる既知のものである。したがって、ポリマーは、一般的な平均鎖長および鎖長分布を有する可能性がある。
【0144】
いくらかの実施形態において、各リンカーは、Ｃ３～Ｃ８アルキルアミン、Ｃ３～Ｃ８アルキレン、Ｃ３～Ｃ８シクロアルキル、Ｃ３～Ｃ８ヘテロシクロアルキル、５員もしくは６員のアリールまたはヘテロアリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、Ｃ３～Ｃ８シクロアルキルアリール、Ｃ３～Ｃ８シクロアルキルヘテロアリール、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、アミド、アミン、チオエーテル、マレイミド－チオールコンジュゲート、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、またはそれらの混合物を独立して含むか、それらから独立して選択され、場合によっては、アミン、アルキレン、アリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルキルアリール、およびシクロアルキルヘテロアリールのそれぞれは、独立して非置換であるか、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ１～Ｃ６アルケニル、Ｃ３～Ｃ８シクロアルキル、Ｃ３～Ｃ８ヘテロシクロアルキル、アミド、エステル、アリール、ヘテロアリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、Ｃ３～Ｃ８シクロアルキルアリール、Ｃ３～Ｃ８シクロアルキルヘテロアリール、ＣＮ、またはそれらの混合物から選択される１つもしくは複数の置換基で置換されている。
【0145】
いくらかの実施形態において、各Ｌ２は、Ｃ３～Ｃ８アルキレン、Ｃ３～Ｃ８アルキルアミン、エステル、アミン、アミド、チオエーテル、マレイミド－チオールコンジュゲート、ＰＥＧ、またはそれらの混合物を独立して含むか、それらから独立して選択され、場合によっては、アルキレンおよびアルキルはそれぞれ、独立して非置換であるか、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ１～Ｃ６アルケニル、Ｃ３～Ｃ８シクロアルキル、Ｃ３～Ｃ８ヘテロシクロアルキル、アミド、エステル、アリール、ヘテロアリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、Ｃ３～Ｃ８シクロアルキルアリール、Ｃ３～Ｃ８シクロアルキルヘテロアリール、ＣＮ、またはそれらの混合物から選択される１つもしくは複数の置換基で置換されている。
【0146】
いくらかの実施形態において、各Ｌ１は、Ｃ３～Ｃ８アルキレン、Ｃ３～Ｃ８アルキルアミン、エステル、アミン、アミド、チオエーテル、マレイミド－チオールコンジュゲート、ＰＥＧ、またはそれらの混合物を独立して含むか、それらから独立して選択され、場合によっては、アルキレンおよびアルキルはそれぞれ、独立して非置換であるか、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ１～Ｃ６アルケニル、Ｃ３～Ｃ８シクロアルキル、Ｃ３～Ｃ８ヘテロシクロアルキル、アミド、エステル、アリール、ヘテロアリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、Ｃ３～Ｃ８シクロアルキルアリール、Ｃ３～Ｃ８シクロアルキルヘテロアリール、ＣＮ、またはそれらの混合物から選択される１つもしくは複数の置換基で置換されている。
【0147】
いくらかの実施形態において、Ｌは、存在しないかＣ３～Ｃ８アルキルアミンである。
【0148】
いくらかの実施形態において、リンカーが、そのリンカーを化合物の残りに結合する官能基を含むことができることが理解される。
【0149】
生体分子は、タンパク質、オリゴヌクレオチド、脂質、炭水化物、もしくは小分子またはそれらの組み合わせとして分類される可能性がある。代わりにまたはさらに、生体分子は、その官能性により分類される可能性がある。生体分子は、特に限定されず、生体分子を本開示の化合物にコンジュゲートするために異なる官能基化を使用することができる。例えば、オリゴヌクレオチドは、一本鎖ＤＮＡ分子である可能性があり、場合によっては、ストリンジェントな条件下で標的核酸検体（例えば、試料核酸生体分子）またはオリゴヌクレオチドにハイブリダイズするｃＤＮＡは、アプタマーであり得る。例えば、生体分子は、試料に内在する標的ｍＲＮＡなどの標的オリゴヌクレオチドを特異的にハイブリダイズする（例えば、試料オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする）オリゴヌクレオチドであり得る。ハイブリダイゼーションは、８超、１０超、１５超、または２０超のヌクレオチドである配列のものである可能性がある。
【0150】
ある特定の態様において、生体分子は、その官能性により分類される可能性がある。例えば、生体分子は、アフィニティ試薬、抗原（例えば、アフィニティ試薬により特異的に結合された検体）、または酵素基質である可能性がある。アフィニティ試薬は、抗体（例えば、またはそのフラグメント）、アプタマー、受容体（例えば、またはその一部）、または標的（例えば、ビオチンを特異的に結合するストレプトアビジンなどのアビジン）を特異的に結合する任意の他の生体分子である可能性がある。例えば、元素タグは、抗体と関連している可能性があり、試料中のその標的抗原の存在、例えばサイトカイン、ウイルスタンパク質、癌バイオマーカーなどの存在を検出および／または分析するために使用される可能性がある。ある特定の方法およびキットにおいて、元素タグは、（例えば、本開示の化合物を多数の異なるアッセイのいずれかに適合させることを可能にするために）ビオチンで官能化された別の生体分子の結合のためにアビジンで官能化される可能性がある。抗原は、抗体などのアフィニティ試薬により特異的に結合されるエピトープを含むタンパク質（またはそのペプチド配列）である可能性がある。例えば、本開示の化合物は、ウイルス抗原（例えば、ウイルスタンパク質配列）に結合する可能性があり、本明細書でさらに説明されるように、ウイルス抗原を特異的に結合する、試料中の抗体の存在を検出するために使用される可能性がある。酵素基質は、特異的酵素により、例えば酸化還元酵素、転移酵素、加水分解酵素、リアーゼ、異性化酵素またはリガーゼにより作用される任意の基質である可能性がある。例えば、基質は、プロテアーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、メチルトランスフェラーゼ、脱メチル化酵素などの酵素用の基質であるタンパク質（例えば、またはそのペプチド配列）であり得る。非タンパク質基質には、例えば、制限酵素により開裂可能な制限配列もしくはＤＮＡ修復のための部位（ニックなど）を含む二本鎖のオリゴヌクレオチド、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼにより標的化された配列を含むオリゴヌクレオチド配列、または当業者に既知の任意の非タンパク質基質が含まれる。例えば、本開示の化合物は、基質に結合され、基質を修飾する酵素を含む試料に曝露される可能性があり、基質の修飾（またはその欠乏）は、（例えば、本明細書でさらに説明されるように）検出される可能性がある。
【0151】
いくらかの実施形態において、１つまたは複数の生体分子は、小分子、ポリペプチド、オリゴヌクレオチド、脂質、炭水化物、またはそれらの混合物からそれぞれ独立して選択される。
【0152】
いくらかの実施形態において、１つまたは複数の生体分子は、それぞれ独立して、アフィニティ試薬であり、場合によっては、アフィニティ試薬は、抗体である。
【0153】
いくらかの実施形態において、アフィニティ試薬は、抗体またはその結合フラグメントであるかそれを含む。抗体は、例えば、ビオチン化抗体または結合フラグメントであり得、本開示の化合物に直接的にまたは間接的に付加され得る。
【0154】
いくらかの実施形態において、式Ｉの化合物は、
【0155】
【化19】
【0156】
（式中、ｒは、約３～約３００、約３～約２５０、約３～約２００、約３～約１５０、約３～約１００、約３～約５０、約６～約３０、または約１０～約２５であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｌ１、Ｌ２およびＲ３はそれぞれ、本明細書で定義された通りである）から選択される。いくらかの実施形態において、ｒは、最大３００、最大２５０、最大２００、最大１５０、最大１００、最大５０、最大３０、または最大２５である。いくらかの実施形態において、ｒは、少なくとも３、少なくとも６、または少なくとも１０である。
【0157】
いくらかの実施形態において、式Ｉの化合物は、
【0158】
【化20】
【0159】
（式中、ｓは、約１～約５０、約２～約４０、約５～約３０、約１０～約３０、約５～約３５、または約２０～約３０であり、ｒは、約３～約３００、約３～約２５０、約３～約２００、約３～約１５０、約３～約１００、約３～約５０、約６～約３０、または約１０～約２５であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｌ１、Ｌ２およびＲ３はそれぞれ、本明細書で定義される通りである）から選択される。いくらかの実施形態において、ｒは、最大３００、最大２５０、最大２００、最大１５０、最大１００、最大５０、最大３０、または最大２５である。いくらかの実施形態において、ｒは、少なくとも３、少なくとも６、または少なくとも１０である。
【0160】
いくらかの実施形態において、式Ｉの化合物は、
【0161】
【化21】
【0162】
（式中、ｓは、約１～約５０、約２～約４０、約５～約３０、約１０～約３０、約５～約３５、または約２０～約３０であり、ｒは、約３～約３００、約３～約２５０、約３～約２００、約３～約１５０、約３～約１００、約３～約５０、約６～約３０、または約１０～約２５であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｌ１、Ｌ２およびＲ３は、それぞれ本明細書で定義される通りである）から選択される。いくらかの実施形態において、ｒは、最大３００、最大２５０、最大２００、最大１５０、最大１００、最大５０、最大３０、または最大２５である。いくらかの実施形態において、ｒは、少なくとも３、少なくとも６、または少なくとも１０である。
【0163】
いくらかの実施形態において、式Ｉの化合物は、
【0164】
【化22】
【0165】
（式中、ｓは、約１～約５０、約２～約４０、約５～約３０、約１０～約３０、約５～約３５、または約２０～約３０であり、ｒは、約３～約３００、約３～約２５０、約３～約２００、約３～約１５０、約３～約１００、約３～約５０、約６～約３０、または約１０～約２５であり、Ｒ３は、本明細書で定義されている通りである）から選択される。いくらかの実施形態において、ｒは、最大３００、最大２５０、最大２００、最大１５０、最大１００、最大５０、最大３０、または最大２５である。いくらかの実施形態において、ｒは、少なくとも３、少なくとも６、または少なくとも１０である。
【0166】
いくらかの実施形態において、式Ｉの化合物は、
【0167】
【化23】
【0168】
から選択される。
【0169】
いくらかの実施形態において、式ＩＩの化合物は、
【0170】
【化24】
【0171】
（式中、Ｒは、Ｈ、
【0172】
【化20】
【0173】
、または当技術分野で既知の他の適切なチオールキャップ基から選択される）である。いくらかの実施形態において、Ｒは、ジスルフィド結合を介して二量体を形成する第２の式ＩＩの化合物を意味する。
【0174】
ＤＰＡ、ビス（（１－メチル－イミダゾール－４－イル－）メチル）アミン、ビス（（１－メチル－イミダゾール－２－イル－）メチル）アミン、ビス（（１Ｈ－イミダゾール－４－イル－）メチル）アミンおよびビス（（１Ｈ－イミダゾール－２－イル－）メチル）アミンなどのビス－複素環式キレート化剤が、金属、特に軟質金属を安定してキレート化することができることが理解され得る。ＤＰＡ、ビス（（１－メチル－イミダゾール－４－イル－）メチル）アミン、ビス（（１－メチル－イミダゾール－２－イル－）メチル）アミン、ビス（（１Ｈ－イミダゾール－４－イル－）メチル）アミンおよびビス（（１Ｈ－イミダゾール－２－イル－）メチル）アミンなどのビス－複素環式キレート化剤を含む、１つまたは複数のペンダント基を含む本開示のポリマー化合物は、軟質金属を含む金属をキレート化することができる。金属にキレート化される場合、本開示の化合物は、新規質量チャンネルを、金属の安定同位体により表されるマスサイトメトリーなどの用途に導入する。
【0175】
本明細書の実施例は、Ｒｅ、Ｐｔ、Ｈｇ、およびＡｇを含む金属を有する本開示のポリマー化合物を使用して形成された代表的なキレートを示す。ＤＰＡなどのキレート化剤が、非ポリマー環境で他の軟質金属を用いて安定なキレートを形成することができることが知られている。したがって、ＤＰＡ、ビス（（１－メチル－イミダゾール－４－イル－）メチル）アミン、ビス（（１－メチル－イミダゾール－２－イル－）メチル）アミン、ビス（（１Ｈ－イミダゾール－４－イル－）メチル）アミン、およびビス（（１Ｈ－イミダゾール－２－イル－）メチル）アミンなどのキレート化剤を保持する本開示のポリマー化合物は、同様に他の軟質金属にキレート化することができる。
【0176】
例えば、Ｓｅｕｂｅｒｔら［「Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ＧＮＡ／ＤＮＡ ｍｅｔａｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂａｓｅ ｐａｉｒｓ」，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２０１１，４７，１１０４１－１１０４３］は、ＤＰＡにキレート化されたＡｕ（ＩＩＩ）のコンピュータ分析を報告した。Ｍｅｓｓｏｒｉら［Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０００，４３，３５４１－３５４８］は、ジアミンおよびトリアミンを有する一連のＡｕ（ＩＩＩ）錯体を報告した。
【0177】
ＤＰＡとのモリブデン錯体［Ｍｏ（ｄｉｐｉｃ）（ＣＯ）３］は、ｖａｎ Ｓｔａｖｅｒｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ｏｆ ［Ｌｅｕ５］－ｅｎｋｅｐｈａｌｉｎ ｗｉｔｈ ｏｒｇａｎｏｍｅｔａｌｌｉｃ Ｍｏ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｂｙ ｓｏｌｉｄ－ｐｈａｓｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２００２，１４０６－１４０７により報告されている。
【0178】
Ｍｉｎａｒｄら［Ｉｎ ｓｉｔｕ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｗａｔｅｒ－ｓｔａｂｌｅ ａｎｄ －ｓｏｌｕｂｌｅ ｒｕｔｈｅｎｉｕｍ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｏｆ ｐｙｒｉｄｉｎｅ－ｂａｓｅｄ ｃｈｅｌａｔｅ－ｌｉｇａｎｄｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｕｓｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｈｙｄｒｏｄｅｏｘｙｇｅｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｏｍａｓｓ－ｒｅｌａｔｅｄ ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ ｉｎ ａｑｕｅｏｕｓ ａｃｉｄｉｃ ｍｅｄｉｕｍ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃａｔａｌｙｓｉｓ Ａ：Ｃｈｅｍｉｃａｌ ４２２（２０１６）１７５－１８７］は、［ＲｕＩＩＩ（ＤＭＦ）６］（ＯＴｆ）３が、水溶液中、ジピコリルアミンと反応することができ、これにより Ｒｕ（ＩＩＩ）をＲｕ（ＩＩ）に還元したことを報告した。［Ｒｕ（２，２’－ジピコリルアミン）（ＯＨ２）３］（ＯＴｆ）２は、１５０℃まで安定している。
【0179】
Ｌｏｎｎｏｎら［Ｒｈｏｄｉｕｍ，ｐａｌｌａｄｉｕｍ ａｎｄ ｐｌａｔｉｎｕｍ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｏｆ ｔｒｉｓ（ｐｙｒｉｄｙｌａｌｋｙｌ）ａｍｉｎｅ ａｎｄ ｔｒｉｓ（ｂｅｎｚｉｍｉｄａｚｏｌｙｌｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｅ Ｎ４－ｔｒｉｐｏｄａｌ ｌｉｇａｎｄｓ，Ｄａｌｔｏｎ Ｔｒａｎｓ．，２００６，３７８５－３７９７，ＤＯＩ：１０．１０３９／ｂ６０２５５６ｋ］は、トリス（２－ピリジルメチル）アミンを用いてＲｈ、Ｐｄ、およびＰｔの結晶構造を調製した。
【0180】
Ｓｏｎｇら［Ｃａｄｍｉｕｍ（ＩＩ） ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｎ０－ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ Ｎ，Ｎ－ｄｉ（２－ｐｉｃｏｌｙｌ）ａｍｉｎｅ：Ｔｈｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ ｖｅｒｓｕｓ ｄｉｍｅｒｉｃ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｉｓ ａｆｆｅｃｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ Ｎ’－ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｇｒｏｕｐ ｏｎ ｔｈｅ ａｍｉｎｅ ｍｏｉｅｔｙ，Ｊ．Ｏｒｇａｎｏｍｅｔａｌｌｉｃ Ｃｈｅｍ．７８３（２０１５）５５ｅ６３，ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｊｏｒｇａｎｃｈｅｍ．２０１５．０２．０１１］は、Ｎ－アルキルジピコリルアミン誘導体がＣｄ２＋との二量体錯体を形成する傾向にあることを示した。
【0181】
したがって、ＤＰＡおよびビス（（１Ｈ－イミダゾール－２－イル－）メチル）アミンなどの複素環式キレート化剤を含む本開示のポリマー化合物が、金属の安定同位体に基づくマスサイトメトリー用途のために多くの異なる軟質金属をキレート化し、多数の新規質量チャンネルを開くために使用することができると考えられる。非限定的要約を、以下の表１に示す。
【0182】
【表1】
【0183】
いくらかの実施形態において、Ｍは、軟質金属である。例えば、Ｍは、Ｒｅ、Ｐｔ、Ｐｄ、Ｎｂ、Ｔｃ、Ｈｇ、Ａｇ、Ａｕ、Ｍｏ、Ｒｕ、Ｒｈ、Ｃｄ、Ｗ、Ｏｓ、またはそれらの混合物から選択することができる。
【0184】
いくらかの実施形態において、Ｍは、非放射性である。本開示の化合物が放射線検出アッセイで使用され得ると考えられている。したがって、化合物が放射線検出アッセイで使用される場合、Ｍは、放射性であり得る。
【0185】
いくらかの実施形態において、Ｍは、同位体濃縮されている。例えば、Ｍは、同位体の天然に存在する混合物を含まない。
【0186】
別の態様において、本開示は、マスサイトメトリーでの使用のために本明細書で定義された式ＩＩの化合物を含む。
【0187】
別の態様において、本開示は、複数のキレート基を含む線状または分岐ポリマーを含む元素タグを含み、少なくとも１つのキレート基は、軟質金属の軟質金属原子にキレート化され、軟質金属は、単一同位体である。
【0188】
いくらかの実施形態において、元素タグは、本開示の化合物である。
【0189】
別の態様において、本開示は、
軟質金属の単一同位体の複数の軟質金属原子を含む同位体組成物；および
２つの窒素含有５員または６員の複素環を含む複数のキレート基を含む線状または分岐ポリマーを含む元素タグ（各キレート基は、同位体組成物の少なくとも１個の軟質金属原子を含むか、同位体組成物の少なくとも１個の軟質金属原子を結合することができる）
を含むキットを含む。
軟質金属の単一同位体の複数の軟質金属原子を含む同位体組成物；および
２つの窒素含有５員または６員の複素環を含む複数のキレート基を含む線状または分岐ポリマーを含む元素タグ（各キレート基は、同位体組成物の少なくとも１個の軟質金属原子を含むか、同位体組成物の少なくとも１個の軟質金属原子を結合することができる）
を含むキットを含む。
【0190】
いくらかの実施形態において、キットは、放射性軟質金属をいずれも含まない。
【0191】
いくらかの実施形態において、同位体組成物は、同位体の天然混合物を含まない。
【0192】
元素タグが、生体分子を結合するように官能化され得ると考えられている。例えば、元素タグは、生体分子に共有結合され得る。
【0193】
いくらかの実施形態において、キットはさらに、生体分子を含む。
【0194】
例えば、生体分子は、オリゴヌクレオチドであり得る。例えば、生体分子は、抗体または他のアフィニティ試薬であり得る。
【0195】
いくらかの場合、各キレート基は、同位体組成物の少なくとも１個の軟質金属原子を含む。
【0196】
いくらかの実施形態において、同位体組成物は、元素タグから別個に提供される軟質金属溶液であり、各キレート基は、同位体組成物の少なくとも１個の軟質金属原子を結合することができる。
【0197】
いくらかの実施形態において、キットはさらに、追加の同位体組成物を含む。例えば、追加の同位体組成物は、同位体組成物の軟質金属の単一同位体とは異なる軟質金属の追加の単一同位体の複数の追加の軟質金属原子を含む。
【0198】
いくらかの実施形態において、キットはさらに、複数の追加のキレート基を含む追加の線状または分岐ポリマーを含む追加の元素タグを含む。
【0199】
いくらかの態様において、元素タグの線状または分岐ポリマーの各キレート基は、同位体組成物の少なくとも１個の軟質金属原子を含み、追加の元素タグの追加の線状または分岐ポリマーの各追加のキレート基は、追加の同位体組成物の少なくとも１個の追加の軟質金属原子を含む。
【0200】
いくらかの実施形態において、各元素タグは、異なる抗体に共有結合している。
【0201】
一実施形態において、各キレート基は、同位体組成物の少なくとも１個の軟質金属原子を結合することができ、各キレート基は、ジピコリルアミンまたはビス（（１Ｈ－イミダゾール－２－イル）メチル）アミンから選択され、各イミダゾールは、場合によっては、Ｃ１～Ｃ６ ＣＯＯＨ、Ｃ１～Ｃ６アルコキシ、Ｃ１～Ｃ６アルキルホスホネート、アルキルエーテル、ポリエーテル、またはそれらの組み合わせから選択される１つまたは複数の極性官能基で置換されている。
【0202】
いくらかの実施形態において、キットはさらに、元素タグの抗体への共有結合のための試薬を含む。
【0203】
いくらかの実施形態において、各元素タグは、独立して、本明細書に記載の式Ｉの化合物または本明細書に記載の式ＩＩの化合物である。
【0204】
上記実施形態に記載のキットは、１つまたは複数の溶解度調節剤を（例えば、キレート基として同じペンダント基に）含む元素タグなど、本明細書に記載の任意の追加の態様を有する可能性がある。
【0205】
ＩＩＩ．方法および使用
別の態様において、本開示は：
軟質金属の単一同位体の複数の軟質金属原子を含む同位体組成物を提供するステップ；
それぞれ独立して２つの窒素含有５員または６員の複素環を含む複数のキレート基（各キレート基は、同位体組成物の少なくとも１個の軟質金属原子を結合することができる）を含む線状または分岐ポリマーを含む元素タグを提供するステップ；ならびに
同位体組成物の軟質金属原子を元素タグの１つまたは複数のキレート基に結合するステップ
を含む方法を含む。
別の態様において、本開示は：
軟質金属の単一同位体の複数の軟質金属原子を含む同位体組成物を提供するステップ；
それぞれ独立して２つの窒素含有５員または６員の複素環を含む複数のキレート基（各キレート基は、同位体組成物の少なくとも１個の軟質金属原子を結合することができる）を含む線状または分岐ポリマーを含む元素タグを提供するステップ；ならびに
同位体組成物の軟質金属原子を元素タグの１つまたは複数のキレート基に結合するステップ
を含む方法を含む。
【0206】
いくらかの実施形態において、軟質金属原子は、非放射性である。
【0207】
いくらかの実施形態において、同位体組成物は、同位体の天然混合物を含まない。
【0208】
いくらかの実施形態において、方法はさらに、追加の同位体組成物を提供するステップを含むことができ追加の同位体組成物は、同位体組成物の非放射性軟質金属の単一同位体とは異なる非放射性軟質金属の追加の単一同位体の複数の追加の軟質金属原子を含む。
【0209】
例えば、方法はさらに、複数のキレート基を含む追加の線状または分岐ポリマーを含む追加の元素タグを提供するステップを含む。
【0210】
いくらかの実施形態において、元素タグの線状または分岐ポリマーの各キレート基は、同位体組成物の少なくとも１個の軟質金属原子を含み、追加の元素タグの追加の線状または分岐ポリマーの各追加のキレート基は、追加の等方性組成物の少なくとも１個の追加の軟質金属原子を含む。
【0211】
いくらかの実施形態において、方法はさらに：
生体分子を提供するステップ；および
生体分子を元素タグに共有結合するステップ
を含む。
生体分子を提供するステップ；および
生体分子を元素タグに共有結合するステップ
を含む。
【0212】
別の態様において、本開示は、生体試料中の検体の分析のための方法であって：
（ｉ）元素タグ付きアフィニティ試薬を検体とインキュベートするステップであって、元素タグ付きアフィニティ試薬が、元素タグでタグ付けされたアフィニティ試薬を含み、元素タグが、それぞれ独立して２つの窒素含有５員もしくは６員の複素環を含む複数のキレート基を有する線状または分岐ポリマーを含み、元素タグがさらに、軟質金属の単一同位体の複数の軟質金属原子を含む、ステップ；
（ここで：
元素タグの各キレート基は、少なくとも１個の軟質金属原子を含むか、少なくとも１個の軟質金属原子を結合することができ、
アフィニティ試薬は、検体を特異的に結合する）
（ｉｉ）未結合の元素タグ付きアフィニティ試薬を、結合した元素タグ付きアフィニティ試薬から分離するステップ；ならびに
（ｉｉｉ）検体に結合しているアフィニティ試薬に結合した元素タグを、質量分析原子分光法により分析するステップ
を含む方法を含む。
（ｉ）元素タグ付きアフィニティ試薬を検体とインキュベートするステップであって、元素タグ付きアフィニティ試薬が、元素タグでタグ付けされたアフィニティ試薬を含み、元素タグが、それぞれ独立して２つの窒素含有５員もしくは６員の複素環を含む複数のキレート基を有する線状または分岐ポリマーを含み、元素タグがさらに、軟質金属の単一同位体の複数の軟質金属原子を含む、ステップ；
（ここで：
元素タグの各キレート基は、少なくとも１個の軟質金属原子を含むか、少なくとも１個の軟質金属原子を結合することができ、
アフィニティ試薬は、検体を特異的に結合する）
（ｉｉ）未結合の元素タグ付きアフィニティ試薬を、結合した元素タグ付きアフィニティ試薬から分離するステップ；ならびに
（ｉｉｉ）検体に結合しているアフィニティ試薬に結合した元素タグを、質量分析原子分光法により分析するステップ
を含む方法を含む。
【0213】
いくらかの実施形態において、軟質金属原子は、非放射性である。
【0214】
いくらかの実施形態において、軟質金属は、同位体の天然混合物を含まない。
【0215】
いくらかの実施形態において、元素タグ付きアフィニティ試薬を検体とインキュベートするステップは：
２つまたはそれ以上の差別的な元素タグ付きアフィニティ試薬を２つまたはそれ以上の検体とインキュベートするステップであって、元素タグ付きアフィニティ試薬が、２つまたはそれ以上の検体と特異的に結合して２つまたはそれ以上の差別的にタグ付けされた検体を生成するステップを含み、アフィニティ試薬に結合した元素タグを分析するステップが、２つまたはそれ以上の検体に結合した差別的な元素タグを質量分析原子分光法により分析するステップを含む。
２つまたはそれ以上の差別的な元素タグ付きアフィニティ試薬を２つまたはそれ以上の検体とインキュベートするステップであって、元素タグ付きアフィニティ試薬が、２つまたはそれ以上の検体と特異的に結合して２つまたはそれ以上の差別的にタグ付けされた検体を生成するステップを含み、アフィニティ試薬に結合した元素タグを分析するステップが、２つまたはそれ以上の検体に結合した差別的な元素タグを質量分析原子分光法により分析するステップを含む。
【0216】
いくらかの場合、アフィニティ試薬はさらに、蛍光標識で標識される。
【0217】
いくらかの実施形態において、質量分析原子分光法は、ＩＣＰ－ＭＳである。一実施形態において、質量分析原子分光法は、質量分析計ベースのフローサイトメーターによるものである。
【0218】
いくらかの実施形態において、アフィニティ試薬は、抗体である。
【0219】
いくらかの実施形態において、アフィニティ試薬は、ビオチンを特異的に結合する。
【0220】
いくらかの実施形態において、アフィニティ試薬は、オリゴヌクレオチドである。
【0221】
いくらかの実施形態において、元素タグ付きアフィニティ試薬は、生体試料中の検体と結合するように構成され、生体試料は、細胞を含む。いくらかの実施形態において、元素タグ付きアフィニティ試薬は、生体試料中の検体と結合するように構成され、軟質金属は、生体試料中に天然には存在しない元素である。
【0222】
いくらかの実施形態において、軟質金属は、Ｒｅ、Ｐｔ、Ｐｄ、Ｎｂ、Ｔｃ、Ｈｇ、Ａｇ、Ａｕ、Ｍｏ、Ｒｕ、Ｒｈ、Ｃｄ、Ｗ、Ｏｓ、またはそれらの混合物から選択される。
【0223】
いくらかの実施形態において、元素タグは、本明細書に記載の式Ｉの化合物、または本明細書に記載の式ＩＩの化合物である。
【0224】
上記実施形態の方法は、１つまたは複数の溶解度調節剤を（例えば、キレート基として同じペンダント基に）含む元素タグなどの本明細書に記載の任意の追加の態様を有する可能性がある。
【0225】
本開示はまた、以下の実施形態を提供する：
【0226】
実施形態１． 式Ｉの化合物
【0227】
【化21】
【0228】
（式中、
Ａは、ポリマー骨格であり、場合によっては、ポリマーは、線状ポリマー、分岐ポリマー、超分岐ポリマー、コポリマー、またはそれらの組み合わせである；
各Ｂは、独立して、場合によっては、Ｃ１～Ｃ６ ＣＯＯＨ、Ｃ１～Ｃ６アルコキシ、Ｃ１～Ｃ６アルキルホスホネート、アルキルエーテル、ポリエーテル、もしくはそれらの組み合わせから選択される１つまたは複数の極性官能基で置換された、窒素含有５員～７員の複素環である；ならびに
Ｌは、存在しないかリンカーである；
各Ｌ２は、独立して存在しないかリンカーである；
各Ｒ２は、独立して、溶解度調節剤、反応性官能基、生体分子、またはそれらの組み合わせから選択される第１の修飾基である；
Ｘは、エステル、エーテルおよびアミドから選択される官能基である；
各Ｌ１は、独立して存在しないかリンカーである；
各Ｒ１は、独立して、Ｈ、Ｃ１～Ｃ８アルキル、Ｃ２～Ｃ８アルケニル、Ｃ３～Ｃ８シクロアルキル、ＯＨ、Ｃ１～Ｃ１０アルコキシ、Ｃ１～Ｃ１０アルキルアミン、溶解度調節剤、反応性官能基、生体分子およびそれらの組み合わせである；
ｎは、０～７の整数である；
ｍは、０～４の整数である；
ｐは、０～３の整数である；ならびに
ｑは、０超の整数である）。
Ａは、ポリマー骨格であり、場合によっては、ポリマーは、線状ポリマー、分岐ポリマー、超分岐ポリマー、コポリマー、またはそれらの組み合わせである；
各Ｂは、独立して、場合によっては、Ｃ１～Ｃ６ ＣＯＯＨ、Ｃ１～Ｃ６アルコキシ、Ｃ１～Ｃ６アルキルホスホネート、アルキルエーテル、ポリエーテル、もしくはそれらの組み合わせから選択される１つまたは複数の極性官能基で置換された、窒素含有５員～７員の複素環である；ならびに
Ｌは、存在しないかリンカーである；
各Ｌ２は、独立して存在しないかリンカーである；
各Ｒ２は、独立して、溶解度調節剤、反応性官能基、生体分子、またはそれらの組み合わせから選択される第１の修飾基である；
Ｘは、エステル、エーテルおよびアミドから選択される官能基である；
各Ｌ１は、独立して存在しないかリンカーである；
各Ｒ１は、独立して、Ｈ、Ｃ１～Ｃ８アルキル、Ｃ２～Ｃ８アルケニル、Ｃ３～Ｃ８シクロアルキル、ＯＨ、Ｃ１～Ｃ１０アルコキシ、Ｃ１～Ｃ１０アルキルアミン、溶解度調節剤、反応性官能基、生体分子およびそれらの組み合わせである；
ｎは、０～７の整数である；
ｍは、０～４の整数である；
ｐは、０～３の整数である；ならびに
ｑは、０超の整数である）。
【0229】
実施形態２． 各Ｂが、独立して、窒素含有５員または６員のヘテロアリールであり、場合によっては、ＣＯＯＨ、Ｃ１～Ｃ６アルコキシ、Ｃ１～Ｃ６アルキルホスホネート、アルキルエーテル、ポリエーテル、またはそれらの組み合わせから選択される１つまたは複数の極性官能基で置換されており、そして、場合によっては、１つまたは複数のＢが、軟質金属に配位されている、および／または１つもしくは複数の生体分子にコンジュゲートしている、実施形態１の化合物。
【0230】
実施形態３． 各Ｂが、独立してピリジンまたはイミダゾールであり、場合によっては、ＣＯＯＨ、Ｃ１～Ｃ６アルコキシ、Ｃ１～Ｃ６アルキルホスホネート、アルキルエーテル、ポリエーテル、またはそれらの組み合わせから選択される１つまたは複数の極性官能基で置換されており、そして、場合によっては、１つまたは複数のＢが、軟質金属に配位されている、および／または１つもしくは複数の生体分子にコンジュゲートしている、実施形態１または２の化合物。
【0231】
実施形態４． １つまたは複数のＢが、軟質金属に配位されている、実施形態１から３のいずれか１つの化合物。
【0232】
実施形態５． Ｒ１またはＲ２が、生体分子であり、場合によっては、生体分子が、抗体などのアフィニティ試薬である、実施形態１から４のいずれか１つの化合物。
【0233】
実施形態６． Ｘが、アミドである、実施形態１から５のいずれか１つの化合物。
【0234】
実施形態７． Ｘが、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ４－または－ＮＲ４Ｃ（Ｏ）－であり、Ｒ４が、ＨまたはＣ１～Ｃ４アルキルである、実施形態６の化合物。
【0235】
実施形態８． Ｘが、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ４－であり、化合物が、式Ｉａ
【0236】
【化22】
【0237】
の構造を有する、実施形態１から７のいずれか１つの化合物。
【0238】
実施形態９． Ｘが、－ＮＲ４Ｃ（Ｏ）－であり、化合物が、式Ｉｂ
【0239】
【化23】
【0240】
の構造を有する、実施形態１から７のいずれか１つの化合物。
【0241】
実施形態１０． Ｘが、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ４－であり、化合物が、式Ｉｃ
【0242】
【化24】
【0243】
（式中、各Ｒ３は、Ｈ、Ｃ１～Ｃ５アルキル、Ｃ２～Ｃ５アルケニル、Ｃ１～Ｃ６ ＣＯＯＨ、Ｃ１～Ｃ６アルコキシ、Ｃ１～Ｃ６アルキルホスホネート、アルキルエーテル、またはポリエーテルから独立して選択される）
の構造を有する、実施形態１から７のいずれか１つの化合物。
の構造を有する、実施形態１から７のいずれか１つの化合物。
【0244】
実施形態１１． 化合物が、式Ｉｄまたは式Ｉｅ
【0245】
【化25】
【0246】
の構造を有する、実施形態１０の化合物。
【0247】
実施形態１２． Ｘが、－ＮＲ４Ｃ（Ｏ）－であり、化合物が、式Ｉｆ
【0248】
【化26】
【0249】
（式中、各Ｒ３は、Ｈ、Ｃ１～Ｃ５アルキル、Ｃ２～Ｃ５アルケニル、Ｃ１～Ｃ６ ＣＯＯＨ、Ｃ１～Ｃ６アルコキシ、Ｃ１～Ｃ６アルキルホスホネート、アルキルエーテル、またはポリエーテルから独立して選択される）
の構造を有する、実施形態１から７のいずれか１つの化合物。
の構造を有する、実施形態１から７のいずれか１つの化合物。
【0250】
実施形態１３． 化合物が、式Ｉｇまたは式Ｉｈ
【0251】
【化27】
【0252】
の構造を有する、実施形態１２の化合物。
【0253】
実施形態１４． 各Ｒ３が、Ｈ、－（ＣＨ２）１～３ＣＯＯＨ、－（ＣＨ２）１～３Ｏ（ＣＨ２）１～２ＣＨ３、－（ＣＨ２）２～４ＯＨ、－（ＣＨ２）２～５Ｐ（Ｏ）（ＯＣＨ２ＣＨ３）２、または－ＣＨ２ＣＨ（ＯＭｅ）２から独立して選択される、実施形態１０から１３のいずれか１つの化合物。
【0254】
実施形態１５． ｎが、２、３、４、または５である、実施形態１から１４のいずれか１つの化合物。
【0255】
実施形態１６． ｍが、０、１、または２である、実施形態１から１５のいずれか１つの化合物。
【0256】
実施形態１７． ｐが、１または２である、実施形態１から１６のいずれか１つの化合物。
【0257】
実施形態１８． Ａが、ポリアクリレート、ポリアクリルアミド、ポリエーテル、ポリアミノ酸、ポリビニルアミン、ポリ（２－オキサゾリン）、ポリエチレングリコール、多糖、デンドリマー、それらのコポリマー、またはそれらの組み合わせから選択される、実施形態１から１７のいずれか１つの化合物。
【0258】
実施形態１９． Ａが、ポリアミノ酸である、実施形態１８の化合物。
【0259】
実施形態２０． ポリアミノ酸が、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、ポリリジン、ポリ（２，４－ジメチルアミノ酪酸）（ポリＤａｂ）、ポリ（２，４－ジアミノピメリン酸）（ポリＤａｐ）、それらの誘導体、またはそれらの組み合わせである、実施形態１８または１９の化合物。
【0260】
実施形態２１． 各リンカーが、Ｃ３～Ｃ８アルキルアミン、Ｃ３～Ｃ８アルキレン、Ｃ３～Ｃ８シクロアルキル、Ｃ３～Ｃ８ヘテロシクロアルキル、５員または６員のアリールもしくはヘテロアリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、Ｃ３～Ｃ８シクロアルキルアリール、Ｃ３～Ｃ８シクロアルキルヘテロアリール、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、アミド、アミン、チオエーテル、マレイミド－チオールコンジュゲート、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、またはそれらの混合物を独立して含むか、それらから独立して選択され、場合によっては、アミン、アルキレン、アリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルキルアリール、およびシクロアルキルヘテロアリールのそれぞれが、独立して非置換であるか、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ１～Ｃ６アルケニル、Ｃ３～Ｃ８シクロアルキル、Ｃ３～Ｃ８ヘテロシクロアルキル、アミド、エステル、アリール、ヘテロアリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、Ｃ３～Ｃ８シクロアルキルアリール、Ｃ３～Ｃ８シクロアルキルヘテロアリール、ＣＮ、またはそれらの混合物から選択される１つまたは複数の置換基で置換されている、実施形態１から２０のいずれか１つの化合物。
【0261】
実施形態２２． 各Ｌ２が、Ｃ３～Ｃ８アルキレン、Ｃ３～Ｃ８アルキルアミン、エステル、アミン、アミド、チオエーテル、マレイミド－チオールコンジュゲート、ＰＥＧ、またはそれらの混合物を独立して含むか、それらから独立して選択され、場合によっては、アルキレンおよびアルキルがそれぞれ、独立して非置換であるか、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ１～Ｃ６アルケニル、Ｃ３～Ｃ８シクロアルキル、Ｃ３～Ｃ８ヘテロシクロアルキル、アミド、エステル、アリール、ヘテロアリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、Ｃ３～Ｃ８シクロアルキルアリール、Ｃ３～Ｃ８シクロアルキルヘテロアリール、ＣＮ、またはそれらの混合物から選択される１つまたは複数の置換基で置換されている、実施形態１から２１のいずれか１つの化合物。
【0262】
実施形態２３． 各Ｌ１が、Ｃ３～Ｃ８アルキレン、Ｃ３～Ｃ８アルキルアミン、エステル、アミン、アミド、チオエーテル、マレイミド－チオールコンジュゲート、ＰＥＧ、またはそれらの混合物を独立して含むか、それらから独立して選択され、場合によっては、アルキレンおよびアルキルがそれぞれ、独立して非置換であるか、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ１～Ｃ６アルケニル、Ｃ３～Ｃ８シクロアルキル、Ｃ３～Ｃ８ヘテロシクロアルキル、アミド、エステル、アリール、ヘテロアリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、Ｃ３～Ｃ８シクロアルキルアリール、Ｃ３～Ｃ８シクロアルキルヘテロアリール、ＣＮ、またはそれらの混合物から選択される１つまたは複数の置換基で置換されている、実施形態１から２２のいずれか１つの化合物。
【0263】
実施形態２４． Ｌが、存在しないかＣ３～Ｃ８アルキルアミンである、実施形態１から２３のいずれか１つの化合物。
【0264】
実施形態２５． 各Ｒ２の第１の修飾基の溶解度調節剤および第２の修飾基の溶解度調節剤が、それぞれ独立して、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、糖、オリゴ糖、またはポリ（カルボキシルベタイン）メタクリレートもしくはポリ（スルホベタイン）メタクリレート（ＰＢＳＭＡ）などの双性イオンポリマーを含む、実施形態１から２４のいずれか１つの化合物。
【0265】
実施形態２６． 反応性官能基が、１つまたは複数の生体分子に結合するためのものである、実施形態１から２５のいずれか１つの化合物。
【0266】
実施形態２７． 各Ｒ２の第１の修飾基の反応性官能基および第２の修飾基の反応性官能基が、カルボン酸、マレイミド、チオール、アジド、ジベンゾシクロオクチン（ＤＢＣＯ）、トランス－シクロオクテン（ＴＣＯ）、テトラジン、フラン、またはアルデヒドからそれぞれ独立して選択される、実施形態１から２６のいずれか１つの化合物。
【0267】
実施形態２８． １つまたは複数の生体分子が、小分子、ポリペプチド、オリゴヌクレオチド、脂質、炭水化物、またはそれらの混合物からそれぞれ独立して選択される、実施形態１から２７のいずれか１つの化合物。
【0268】
実施形態２９． １つまたは複数の生体分子が、それぞれ独立して、アフィニティ試薬であり、場合によっては、アフィニティ試薬が、抗体である、実施形態２８の化合物。
【0269】
実施形態３０． 化合物が、
【0270】
【化33】
【0271】
（式中、ｒは、約３～約２００、約６～約３０、または約１０～約２５であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｌ１、Ｌ２およびＲ３は、それぞれ実施形態１０から１４のいずれか１つで定義される通りである）
から選択される、実施形態１の化合物。
から選択される、実施形態１の化合物。
【0272】
実施形態３１． 化合物が、
【0273】
【化34】
【0274】
（式中、ｓは、約１～約５０、約２～約４０、約５～約３０、約１０～約３０、約５～約３５、または約２０～約３０であり、ｒは、約３～約２００、約６～約３０、または約１０～約２５であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｌ１、Ｌ２およびＲ３は、それぞれ実施形態１０から１４のいずれか１つで定義される通りである）
から選択される、実施形態１の化合物。
から選択される、実施形態１の化合物。
【0275】
実施形態３２． 化合物が、
【0276】
【化35】
【0277】
（式中、ｓは、約１～約５０、約２～約４０、約５～約３０、約１０～約３０、約５～約３５、または約２０～約３０であり、ｒは、約３～約２００、約６～約３０、または約１０～約２５であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｌ１、Ｌ２およびＲ３は、それぞれ実施形態１０から１４のいずれか１つで定義される通りである）
から選択される、実施形態１の化合物。
から選択される、実施形態１の化合物。
【0278】
実施形態３３． 化合物が、
【0279】
【化36】
【0280】
（式中、ｓは、約１～約５０、約２～約４０、約５～約３０、約１０～約３０、約５～約３５、または約２０～約３０であり、ｒは、約３～約２００、約６～約３０、または約１０～約２５であり、Ｒ３は、実施形態１０から１４のいずれか１つで定義される通りである）
から選択される、実施形態１の化合物。
から選択される、実施形態１の化合物。
【0281】
実施形態３４． 実施形態１から３３のいずれか１つで定義される通りの式Ｉの化合物であって、１個または複数個の金属Ｍにキレート化され、式ＩＩ
【0282】
【化37】
【0283】
またはその誘導体もしくは塩の構造を有する、式Ｉの化合物。
【0284】
実施形態３５． Ｍが、軟質金属である、実施形態３４の化合物。
【0285】
実施形態３６． Ｍが、Ｒｅ、Ｐｔ、Ｐｄ、Ｎｂ、Ｔｃ、Ｈｇ、Ａｇ、Ａｕ、Ｍｏ、Ｒｕ、Ｒｈ、Ｃｄ、Ｗ、Ｏｓ、またはそれらの混合物から選択される、実施形態３４または３５の化合物。
【0286】
実施形態３７． Ｍが、非放射性である、実施形態３４から３６のいずれか１つの化合物、または実施形態３５から３７のいずれか１つの組成物。
【0287】
実施形態３８． Ｍが、同位体濃縮されている、実施形態３４から３７のいずれか１つの化合物、または実施形態３５から３８のいずれか１つの組成物。
【0288】
実施形態３９． それぞれ独立して実施形態１から３３のいずれか１つで定義される通りである１つもしくは複数の式Ｉの化合物、またはそれぞれ独立して実施形態３４から３８のいずれか１つで定義される通りである１つもしくは複数の式ＩＩの化合物、および溶媒を含む、組成物。
【0289】
実施形態４０． マスサイトメトリーにおける使用のための、実施形態１から３３のいずれか１つで定義される通りである式Ｉの化合物または実施形態３４から３８のいずれか１つで定義される通りである式ＩＩの化合物。
【0290】
実施形態４１． 各キレート基が、軟質金属を結合することができ、軟質金属が、単一同位体であり、少なくとも１つのキレート基が、軟質金属の軟質金属原子にキレート化される複数のキレート基を含む線状または分岐ポリマーを含む、元素タグ。
【0291】
実施形態４２． キットであって、
軟質金属の単一同位体の複数の軟質金属原子を含む同位体組成物；および
２つの窒素含有５員または６員の複素環を含む複数のキレート基を含む線状または分岐ポリマーを含む元素タグ（元素タグの各キレート基は、同位体組成物の少なくとも１個の軟質金属原子を含むか、同位体組成物の少なくとも１個の軟質金属原子を結合することができる）
を含み；
場合によっては、放射性軟質金属をいずれも含まない、
キット。
軟質金属の単一同位体の複数の軟質金属原子を含む同位体組成物；および
２つの窒素含有５員または６員の複素環を含む複数のキレート基を含む線状または分岐ポリマーを含む元素タグ（元素タグの各キレート基は、同位体組成物の少なくとも１個の軟質金属原子を含むか、同位体組成物の少なくとも１個の軟質金属原子を結合することができる）
を含み；
場合によっては、放射性軟質金属をいずれも含まない、
キット。
【0292】
実施形態４３． 同位体組成物が、同位体の天然混合物を含まない、実施形態４２のキット。
【0293】
実施形態４４． 元素タグが、生体分子を結合するように官能化されている、実施形態４２または４３のキット。
【0294】
実施形態４５． 元素タグが、生体分子に共有結合している、実施形態４２または４３のキット。
【0295】
実施形態４６． さらに、生体分子を含む、実施形態４２から４４のいずれか１つのキット。
【0296】
実施形態４７． 生体分子が、オリゴヌクレオチドである、実施形態４３から４６のいずれか１つのキット。
【0297】
実施形態４８． 生体分子が、抗体である、実施形態４３から４６のいずれか１つのキット。
【0298】
実施形態４９． 各キレート基が、同位体組成物の少なくとも１個の軟質金属原子を含む、実施形態４２から４８のいずれか１つのキット。
【0299】
実施形態５０． 同位体組成物が、元素タグから別個に提供される軟質金属溶液であり、各キレート基が、同位体組成物の少なくとも１個の軟質金属原子を結合することができる、実施形態４２から４８のいずれか１つのキット。
【0300】
実施形態５１． さらに、追加の同位体組成物を含み、追加の同位体組成物が、同位体組成物の軟質金属の単一同位体とは異なる軟質金属の追加の単一同位体の複数の追加の軟質金属原子を含む、実施形態４２から５０のいずれか１つのキット。
【0301】
実施形態５２． さらに、複数の追加のキレート基を含む追加の線状または分岐ポリマーを含む追加の元素タグを含む、実施形態５１のキット。
【0302】
実施形態５３． 元素タグの線状または分岐ポリマーの各キレート基が、同位体組成物の少なくとも１個の軟質金属原子を含み、追加の元素タグの追加の線状または分岐ポリマーの各追加のキレート基が、追加の同位体組成物の少なくとも１個の追加の軟質金属原子を含む、実施形態５２のキット。
【0303】
実施形態５４． 各元素タグが、異なる抗体に共有結合している、実施形態４２から５３のいずれか１つのキット。
【0304】
実施形態５５． 各キレート基が、同位体組成物の少なくとも１個の軟質金属原子を結合することができ、各キレート基が、ジピコリルアミンまたはビス（（１Ｈ－イミダゾール－２－イル）メチル）アミンから選択され、各イミダゾールが、場合によっては、Ｃ１～Ｃ６ ＣＯＯＨ、Ｃ１～Ｃ６アルコキシ、Ｃ１～Ｃ６アルキルホスホネート、アルキルエーテル、ポリエーテル、またはそれらの組み合わせから選択される１つまたは複数の極性官能基で置換されている、実施形態４２から５４のいずれか１つのキット。
【0305】
実施形態５６． さらに、元素タグの抗体への共有結合のための試薬を含む、実施形態４２から５５のいずれか１つのキット。
【0306】
実施形態５７． 各元素タグが、独立して、実施形態１から３３のいずれか１つで定義される通りである式Ｉの化合物または実施形態３４から３８のいずれか１つで定義される通りである式ＩＩの化合物である、実施形態４２から５６のいずれか１つのキット。
【0307】
実施形態５８． 方法であって：
軟質金属の単一同位体の複数の軟質金属原子を含む同位体組成物を提供するステップ；
それぞれ独立して２つの窒素含有５員もしくは６員の複素環を含む複数のキレート基を含む線状または分岐ポリマーを含む元素タグ（各キレート基は、同位体組成物の少なくとも１個の軟質金属原子を結合することができる）を提供するステップ；ならびに
同位体組成物の軟質金属原子を元素タグの１つまたは複数のキレート基に結合するステップ
を含み；
軟質金属原子が、非放射性である、方法。
軟質金属の単一同位体の複数の軟質金属原子を含む同位体組成物を提供するステップ；
それぞれ独立して２つの窒素含有５員もしくは６員の複素環を含む複数のキレート基を含む線状または分岐ポリマーを含む元素タグ（各キレート基は、同位体組成物の少なくとも１個の軟質金属原子を結合することができる）を提供するステップ；ならびに
同位体組成物の軟質金属原子を元素タグの１つまたは複数のキレート基に結合するステップ
を含み；
軟質金属原子が、非放射性である、方法。
【0308】
実施形態５９． 同位体組成物が、同位体の天然混合物を含まない、実施形態５８の方法。
【0309】
実施形態６０． さらに、追加の同位体組成物を提供するステップを含み、追加の同位体組成物が、同位体組成物の非放射性軟質金属の単一同位体とは異なる非放射性軟質金属の追加の単一同位体の多数の追加の軟質金属原子を含む、実施形態５９の方法。
【0310】
実施形態６１． さらに、複数のキレート基を含む追加の線状または分岐ポリマーを含む追加の元素タグを提供するステップを含む、実施形態５８から６０のいずれか１つの方法。
【0311】
実施形態６２． 元素タグの線状または分岐ポリマーの各キレート基が、同位体組成物の少なくとも１個の軟質金属原子を含み、追加の元素タグの追加の線状または分岐ポリマーの各追加のキレート基が、追加の等方性組成物の少なくとも１個の追加の軟質金属原子を含む、実施形態５８から６１のいずれか１つの方法。
【0312】
実施形態６３． さらに：
生体分子を提供するステップ；および
生体分子を元素タグに共有結合するステップ
を含む、実施形態５８から６２のいずれか１つの方法。
生体分子を提供するステップ；および
生体分子を元素タグに共有結合するステップ
を含む、実施形態５８から６２のいずれか１つの方法。
【0313】
実施形態６４． 生体試料中の検体の分析のための方法であって、
（ｉ）元素タグ付きアフィニティ試薬を検体とインキュベートするステップであって、元素タグ付きアフィニティ試薬が、元素タグでタグ付けされたアフィニティ試薬を含み、元素タグが、それぞれ独立して２つの窒素含有５員もしくは６員の複素環を含む複数のキレート基を有する線状または分岐ポリマーを含み、元素タグがさらに、軟質金属の単一同位体の複数の軟質金属原子を含む、ステップ；
（ここで：
元素タグの各キレート基は、少なくとも１個の軟質金属原子を含むか、少なくとも１個の軟質金属原子を結合することができ、
軟質金属原子は、非放射性であり、そして
アフィニティ試薬は、検体を特異的に結合する）
（ｉｉ）未結合の元素タグ付きアフィニティ試薬を、結合した元素タグ付きアフィニティ試薬から分離するステップ；ならびに
（ｉｉｉ）検体に結合しているアフィニティ試薬に結合した元素タグを、質量分析原子分光法により分析するステップ
を含む、方法。
（ｉ）元素タグ付きアフィニティ試薬を検体とインキュベートするステップであって、元素タグ付きアフィニティ試薬が、元素タグでタグ付けされたアフィニティ試薬を含み、元素タグが、それぞれ独立して２つの窒素含有５員もしくは６員の複素環を含む複数のキレート基を有する線状または分岐ポリマーを含み、元素タグがさらに、軟質金属の単一同位体の複数の軟質金属原子を含む、ステップ；
（ここで：
元素タグの各キレート基は、少なくとも１個の軟質金属原子を含むか、少なくとも１個の軟質金属原子を結合することができ、
軟質金属原子は、非放射性であり、そして
アフィニティ試薬は、検体を特異的に結合する）
（ｉｉ）未結合の元素タグ付きアフィニティ試薬を、結合した元素タグ付きアフィニティ試薬から分離するステップ；ならびに
（ｉｉｉ）検体に結合しているアフィニティ試薬に結合した元素タグを、質量分析原子分光法により分析するステップ
を含む、方法。
【0314】
実施形態６５． 軟質金属が、同位体の天然混合物を含まない、実施形態６４の方法。
【0315】
実施形態６６． 元素タグ付きアフィニティ試薬を検体とインキュベートするステップが：
２つまたはそれ以上の差別的な元素タグ付きアフィニティ試薬を２つまたはそれ以上の検体とインキュベートするステップであって、元素タグ付きアフィニティ試薬が、２つまたはそれ以上の検体と特異的に結合して２つまたはそれ以上の差別的にタグ付けされた検体を生成するステップを含み、アフィニティ試薬に結合した元素タグを分析するステップが、２つまたはそれ以上の検体に結合した差別的な元素タグを質量分析原子分光法により分析するステップを含む、
実施形態６４または６５の方法。
２つまたはそれ以上の差別的な元素タグ付きアフィニティ試薬を２つまたはそれ以上の検体とインキュベートするステップであって、元素タグ付きアフィニティ試薬が、２つまたはそれ以上の検体と特異的に結合して２つまたはそれ以上の差別的にタグ付けされた検体を生成するステップを含み、アフィニティ試薬に結合した元素タグを分析するステップが、２つまたはそれ以上の検体に結合した差別的な元素タグを質量分析原子分光法により分析するステップを含む、
実施形態６４または６５の方法。
【0316】
実施形態６７． アフィニティ試薬がさらに、蛍光標識で標識される、実施形態６４から６６のいずれか１つの方法。
【0317】
実施形態６８． 質量分析原子分光法が、ＩＣＰ－ＭＳである、実施形態６４から６７のいずれか１つの方法。
【0318】
実施形態６９． 質量分析原子分光法が、質量分析計ベースのフローサイトメーターによるものである、実施形態６４から６７のいずれか１つの方法。
【0319】
実施形態７０． アフィニティ試薬が、抗体である、実施形態６４から６９のいずれか１つの方法。
【0320】
実施形態７１． アフィニティ試薬が、ビオチンを特異的に結合する、実施形態６４から７０のいずれか１つの方法。
【0321】
実施形態７２． アフィニティ試薬が、オリゴヌクレオチドである、実施形態６４から６９のいずれか１つの方法。
【0322】
実施形態７３． 元素タグ付きアフィニティ試薬が、生体試料中の検体に結合するように構成され、生体試料が、細胞を含む、実施形態６４から７２のいずれか１つの方法。
【0323】
実施形態７４ 軟質金属が、Ｒｅ、Ｐｔ、Ｐｄ、Ｎｂ、Ｔｃ、Ｈｇ、Ａｇ、Ａｕ、Ｍｏ、Ｒｕ、Ｒｈ、Ｃｄ、Ｗ、Ｏｓ、またはそれらの混合物から選択される、実施形態６４から７３のいずれか１つの方法。
【0324】
実施形態７５． 軟質金属が、生体試料中に天然には存在しない元素である、実施形態６４から７４のいずれか１つの方法。
【0325】
実施形態７６． 元素タグが、実施形態１から３３のいずれか１つで定義される通りである式Ｉの化合物、または実施形態３４で定義される通りである式ＩＩの化合物であるかそれを含む、実施形態５４から７５のいずれか１つの方法。
【0326】
上記開示は、一般に本開示を説明する。より完全な理解は、以下の特定の実施例を参照することにより得られ得る。これらの実施例は、単に例証の目的でのみ記載され、本出願の範囲を限定することを意図するものではない。状況が便宜を示唆または提供する可能性がある場合、形態における変更および等価物の置換が考えられる。特定の用語が、本明細書で使用されているが、そのような用語は、説明的な意味で意図されており、限定を目的とするものではない。
【0327】
実施例
本開示が、現在好ましい実施例と考えられているものを参照して説明されているが、本開示が、開示された実施例に限定されないことが理解されるべきである。それとは反対に、本開示は、添付の特許請求の範囲の精神および範囲内に含まれる種々の修飾および等価の配置に及ぶことが意図される。
本開示が、現在好ましい実施例と考えられているものを参照して説明されているが、本開示が、開示された実施例に限定されないことが理解されるべきである。それとは反対に、本開示は、添付の特許請求の範囲の精神および範囲内に含まれる種々の修飾および等価の配置に及ぶことが意図される。
【0328】
実施例１
キレートポリマー化合物Ｉ－１の調製
ペンダント基がマスサイトメトリーに有用な質量チャンネルの数を増やすレニウムをキレート化することができるペンダント基に結合した、ジピコリルアミン（ＤＰＡ）キレート化剤を有するポリマーを合成した。金属－キレート化剤ポリマーの合成および使用される材料を説明する。
キレートポリマー化合物Ｉ－１の調製
ペンダント基がマスサイトメトリーに有用な質量チャンネルの数を増やすレニウムをキレート化することができるペンダント基に結合した、ジピコリルアミン（ＤＰＡ）キレート化剤を有するポリマーを合成した。金属－キレート化剤ポリマーの合成および使用される材料を説明する。
【0329】
本開示の代表的なキレートポリマー化合物Ｉ－１を、スキーム２にしたがって調製した。代表的な活性化エステルポリマー２－１を、代表的なＬｙｓ－ＤＰＡキレート化剤１－４と反応させた。その後、得られるポリマー２－２を、ＰＥＧおよびマレイミドを含む修飾基に結合させ、化合物Ｉ－１を得た。キレート化剤１－４を、スキーム１にしたがって合成した。本開示の他の化合物が、以下に記載されるように、適切な修飾がある、同様の方法、技術および原理を使用して生成され得ることが理解され得る。
【0330】
材料
トリエチルアミン（ＴＥＡ、カタログ番号４７１２８３）、塩化アクリロイル（カタログ番号５４９７９７）、２－（ドデシルチオカルボノチオイルチオ）－２－メチルプロピオン酸（ＤＤＭＡＴ）、カタログ番号７２３０１０）、２，２’－アゾビス（２－メチルプロピオニトリル）（ＡＩＢＮ、カタログ番号４４１０９）、Ｎε－Ｂｏｃ－Ｌ－リジン（カタログ番号３５９６６１）、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（ＳＴＡＢ、カタログ番号３１６３９３）、２－ピリジンカルボキシアルデヒド（カタログ番号Ｐ６２００３）、ＨＣｌ（ジオキサン中で４Ｍ、カタログ番号３４５５４７）、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩溶液（ＴＣＥＰ、カタログ番号６４６５４７）をシグマ・アルドリッチから得た。ペンタフルオロフェノールをマトリックス・サイエンティフィクから購入した（カタログ番号００６０５８）。ｍＰＥＧ６－ＮＨ２（カタログ番号２８１２０４）をＣｈｅｍＰｅｐから得た。ビス－Ｍａｌ－ＰＥＧ６（カタログ番号ＢＰ－２２１５２）をブロードファームから得た。４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴＭＭ、カタログ番号Ｄ４６１２４５）をＴｏｒｏｎｔｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから購入した。すべての有機溶媒（無水物）を商業的供給源から得、さらなる精製なしで使用した。
トリエチルアミン（ＴＥＡ、カタログ番号４７１２８３）、塩化アクリロイル（カタログ番号５４９７９７）、２－（ドデシルチオカルボノチオイルチオ）－２－メチルプロピオン酸（ＤＤＭＡＴ）、カタログ番号７２３０１０）、２，２’－アゾビス（２－メチルプロピオニトリル）（ＡＩＢＮ、カタログ番号４４１０９）、Ｎε－Ｂｏｃ－Ｌ－リジン（カタログ番号３５９６６１）、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（ＳＴＡＢ、カタログ番号３１６３９３）、２－ピリジンカルボキシアルデヒド（カタログ番号Ｐ６２００３）、ＨＣｌ（ジオキサン中で４Ｍ、カタログ番号３４５５４７）、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩溶液（ＴＣＥＰ、カタログ番号６４６５４７）をシグマ・アルドリッチから得た。ペンタフルオロフェノールをマトリックス・サイエンティフィクから購入した（カタログ番号００６０５８）。ｍＰＥＧ６－ＮＨ２（カタログ番号２８１２０４）をＣｈｅｍＰｅｐから得た。ビス－Ｍａｌ－ＰＥＧ６（カタログ番号ＢＰ－２２１５２）をブロードファームから得た。４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴＭＭ、カタログ番号Ｄ４６１２４５）をＴｏｒｏｎｔｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから購入した。すべての有機溶媒（無水物）を商業的供給源から得、さらなる精製なしで使用した。
【0331】
リジンベースのレニウムキレート化剤の合成
スキーム１に示すように、（ｉ）Ｂｏｃ保護リジン前駆体の直接還元的アルキル化２０、（ｉｉ）塩酸（ジオキサン中のＨＣｌ）によるＢｏｃ脱保護、続いて（ｉｉｉ）ＮａＯＨを用いるアミン塩酸塩の遊離塩基への変換による３つのステップで、キレート化剤１－４を調製した。反応中間体および得られる生成物を、１Ｈ－ＮＭＲにより特徴づけ、それらの構造を確認した（図６）。
スキーム１に示すように、（ｉ）Ｂｏｃ保護リジン前駆体の直接還元的アルキル化２０、（ｉｉ）塩酸（ジオキサン中のＨＣｌ）によるＢｏｃ脱保護、続いて（ｉｉｉ）ＮａＯＨを用いるアミン塩酸塩の遊離塩基への変換による３つのステップで、キレート化剤１－４を調製した。反応中間体および得られる生成物を、１Ｈ－ＮＭＲにより特徴づけ、それらの構造を確認した（図６）。
【0332】
【化38】
【0333】
ジクロロエタン（４５ｍＬ）中のＮε－Ｂｏｃ－Ｌ－リジン１－１（２ｇ）およびＳＴＡＢ（４．５ｇ）の混合物に、２－ピリジンカルボキシアルデヒド（１．８５ｇ、５ｍＬのジクロロエタンに溶解）を０℃、窒素下で添加した。懸濁液を室温で約５時間撹拌し、均質な鮮黄色になった。反応混合物を脱イオン水（３０ｍＬ）で分解し、ジクロロエタン（１００ｍＬ）で希釈した。分離した有機相を、脱イオン水（３０ｍＬ×４）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、回転式蒸発により濃縮して、ｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）保護リジンベースのキレート化剤１－２（２．５ｇ）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ８．５３（ｄｄｄ，Ｊ＝５．１，１．８，０．９Ｈｚ，２Ｈ），７．６５（ｔｄ，Ｊ＝７．７，１．８Ｈｚ，２Ｈ），７．３２（ｄｔ，Ｊ＝７．９，１．１Ｈｚ，２Ｈ），７．２０（ｄｄｄ，Ｊ＝７．６，５．０，１．２Ｈｚ，２Ｈ），４．７０（ｓ，１Ｈ），４．１０（ｄ，Ｊ＝３．８Ｈｚ，４Ｈ），３．４７（ｄｄ，Ｊ＝７．８，６．５Ｈｚ，１Ｈ），３．１６～３．０７（ｍ，２Ｈ），２．０４～１．９２（ｍ，１Ｈ），１．８８～１．７２（ｍ，１Ｈ），１．５２～１．４５（ｍ，４Ｈ），１．４３（ｓ，９Ｈ）。
【0334】
Ｂｏｃ基を除去するため、塩化水素溶液（ジオキサン中で４Ｍ、７ｍＬ）を、ＤＣＭ（５ｍＬ）中の上記化合物１－２（１．５ｇ）の溶液に、０℃で徐々に添加した。得られる溶液を２４時間、室温で撹拌した。黄色沈澱物が、反応中に形成した。溶媒を棄て、沈澱物をメタノール（５ｍＬ）に溶解し、ジエチルエーテル（１５ｍＬ）中で沈澱させた。沈澱物を遠心分離（２７００×ｇ、１０分）により回収した。この溶解－沈澱サイクルを、もう一度繰り返した。最後に、沈澱物を真空オーブン中、室温（room temperate）で２４時間乾燥させて、Ｂｏｃ脱保護リジンベースのＤＰＡキレート化剤をアミン塩１－３（１．３ｇ）として得た。１Ｈ ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ８．６８（ｄｄｄ，Ｊ＝６．０，１．６，０．７Ｈｚ，２Ｈ），８．４９（ｔｄ，Ｊ＝７．９，１．６Ｈｚ，２Ｈ），８．０５（ｄｔ，Ｊ＝８．０，１．０Ｈｚ，２Ｈ），７．９２（ｄｄｄ，Ｊ＝７．５，５．９，１．３Ｈｚ，２Ｈ），４．４２（ｑ，Ｊ＝１６．５Ｈｚ，４Ｈ），３．５７～３．５１（ｍ，１Ｈ），２．９６（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，２Ｈ），１．９２（ｄｄｄ，Ｊ＝９．９，８．４，５．８Ｈｚ，１Ｈ），１．８９～１．８２（ｍ，１Ｈ），１．６９～１．６１（ｍ，２Ｈ），１．５２～１．４４（ｍ，２Ｈ）。
【0335】
アミン塩を遊離塩基に変換するため、濃ＮａＯＨ溶液（５Ｍ）を、アミン塩の溶液（０．５ｇ、２ｍＬの水に溶解した）に、約１３のｐＨに到達するまで、０℃で徐々に添加した。その後、塩基性溶液を凍結乾燥し、淡茶色固体を得た。ジクロロメタン（５ｍＬ）を添加して、遊離塩基を溶解した。未溶解固体を、遠心分離（１６０００×ｇ、１０分）により除去した。上清を回収し、濃縮し、真空下、室温で２４時間乾燥させて、最終のリジンベースのＤＰＡキレート化剤を遊離塩基１－４（０．３ｇ）として得た。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ８．２４（ｄｄｄ，Ｊ＝５．０，１．８，０．９Ｈｚ，２Ｈ），７．６０（ｔｄ，Ｊ＝７．７，１．８Ｈｚ，２Ｈ），７．３７（ｄｔ，Ｊ＝７．９，１．２Ｈｚ，２Ｈ），７．１４（ｄｄｄ，Ｊ＝７．６，５．０，１．２Ｈｚ，２Ｈ），３．９５（ｄ，Ｊ＝１４．６Ｈｚ，２Ｈ），３．７９（ｄ，Ｊ＝１４．６Ｈｚ，２Ｈ），３．２１（ｄｄ，Ｊ＝８．５，６．３Ｈｚ，１Ｈ），２．５９（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），１．７５～１．６４（ｍ，２Ｈ），１．４５～１．２６（ｍ，４Ｈ）。
【0336】
アクリル酸ペンタフルオロフェニル（ＰＦＰＡ）モノマーの合成
活性化エステルポリマー２－１を調製するため、トリエチルアミン（１８．３ｍＬ）をペンタフルオロフェノール（１３０ｍＬのジクロロメタン中で２０ｇ）の溶液に、窒素下、０℃で徐々に添加し、続いて１０．６ｍＬの塩化アクリロイルを添加することにより、アクリル酸ペンタフルオロフェニル（ＰＦＰＡ）モノマーを、最初に合成した。反応混合物を、０℃で２時間、その後室温で一晩撹拌した。塩を濾過により除去した。溶液を回転式蒸発により濃縮し、その後、溶離液としてヘキサンを用いるシリカゲルカラムクロマトグラフィを使用して精製した。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ６．７１（ｄｄ，Ｊ＝１７．３，１．０Ｈｚ，１Ｈ），６．３７（ｄｄ，Ｊ＝１７．３，１０．６Ｈｚ，１Ｈ），６．１７（ｄｄ，Ｊ＝１０．５，０．９Ｈｚ，１Ｈ）。１９Ｆ ＮＭＲ（５６４ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ－１５３．１７～－１５３．２７（ｍ），－１５８．７４（ｔ，Ｊ＝２１．５Ｈｚ），－１６３．１１（ｔｄ，Ｊ＝２３．０，２２．５，５．４Ｈｚ）。
活性化エステルポリマー２－１を調製するため、トリエチルアミン（１８．３ｍＬ）をペンタフルオロフェノール（１３０ｍＬのジクロロメタン中で２０ｇ）の溶液に、窒素下、０℃で徐々に添加し、続いて１０．６ｍＬの塩化アクリロイルを添加することにより、アクリル酸ペンタフルオロフェニル（ＰＦＰＡ）モノマーを、最初に合成した。反応混合物を、０℃で２時間、その後室温で一晩撹拌した。塩を濾過により除去した。溶液を回転式蒸発により濃縮し、その後、溶離液としてヘキサンを用いるシリカゲルカラムクロマトグラフィを使用して精製した。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ６．７１（ｄｄ，Ｊ＝１７．３，１．０Ｈｚ，１Ｈ），６．３７（ｄｄ，Ｊ＝１７．３，１０．６Ｈｚ，１Ｈ），６．１７（ｄｄ，Ｊ＝１０．５，０．９Ｈｚ，１Ｈ）。１９Ｆ ＮＭＲ（５６４ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ－１５３．１７～－１５３．２７（ｍ），－１５８．７４（ｔ，Ｊ＝２１．５Ｈｚ），－１６３．１１（ｔｄ，Ｊ＝２３．０，２２．５，５．４Ｈｚ）。
【0337】
ＰＦＰＡモノマーのＲＡＦＴ重合
活性化エステルポリマー２－１、ポリ（アクリル酸ペンタフルオロフェニル）（ＰＰＦＰＡ）の合成は、可逆的付加－開裂連鎖移動（ＲＡＦＴ）重合により達成された。２１，２２スターラーバーを備えたシュレンクフラスコ内で、１，４－ジオキサン（６．０ｍＬ）中、連鎖移動剤（ＣＴＡ）として２－（ドデシルチオカルボノチオイルチオ）－２－メチルプロパン酸（ＤＤＭＡＴ、０．２８ｍｍｏｌ）および熱開始剤として２，２’－アゾビス（２－メチルプロピオニトリル）（ＡＩＢＮ、０．０２８ｍｍｏｌ）を使用して、７０℃で重合を実行した。溶液を３回の凍結－ポンプ－融解サイクルにより脱気し、その後、フラスコを密封し、予熱した油浴（７０℃）に９時間入れた。重合後、溶液を冷水により室温まで冷却し、空気に曝露した。ポリマーを過剰の冷ヘキサン（３０ｍＬ）中で沈澱させた。得られたポリマーを、クロロホルム（５ｍＬ）に溶解し、再度ヘキサン（３０ｍＬ）中で沈澱させた。この溶解－沈澱プロセスを３回繰り返した。真空中、室温で一晩乾燥させた後、最終のポリマー、ポリ（ＰＦＰＡ）２－１を黄色粉末として得た。
活性化エステルポリマー２－１、ポリ（アクリル酸ペンタフルオロフェニル）（ＰＰＦＰＡ）の合成は、可逆的付加－開裂連鎖移動（ＲＡＦＴ）重合により達成された。２１，２２スターラーバーを備えたシュレンクフラスコ内で、１，４－ジオキサン（６．０ｍＬ）中、連鎖移動剤（ＣＴＡ）として２－（ドデシルチオカルボノチオイルチオ）－２－メチルプロパン酸（ＤＤＭＡＴ、０．２８ｍｍｏｌ）および熱開始剤として２，２’－アゾビス（２－メチルプロピオニトリル）（ＡＩＢＮ、０．０２８ｍｍｏｌ）を使用して、７０℃で重合を実行した。溶液を３回の凍結－ポンプ－融解サイクルにより脱気し、その後、フラスコを密封し、予熱した油浴（７０℃）に９時間入れた。重合後、溶液を冷水により室温まで冷却し、空気に曝露した。ポリマーを過剰の冷ヘキサン（３０ｍＬ）中で沈澱させた。得られたポリマーを、クロロホルム（５ｍＬ）に溶解し、再度ヘキサン（３０ｍＬ）中で沈澱させた。この溶解－沈澱プロセスを３回繰り返した。真空中、室温で一晩乾燥させた後、最終のポリマー、ポリ（ＰＦＰＡ）２－１を黄色粉末として得た。
【0338】
３０：１：０．１のモノマー－対－ＣＴＡ対開始剤のモル比（［Ｍ］：［ＣＴＡ］：［Ｉ］）を選択し、得られたポリマー２－１の分子量を調整して９，４００ｇ／ｍｏｌの見かけの数平均分子量（Ｍｎ
ＧＰＣ）および約７３％の変換率で得られる比較的狭い分子量分布（Ｄ＝１．２５）にした（図４）。
【0339】
１Ｈ ＮＭＲ分光法を使用して、ドデシル鎖末端（δ＝０．８８ｐｐｍ）について、ＰＰＦＰＡ骨格ピークの積分（δ＝３．１１ｐｐｍ）をメチル単位のものと比較することにより、重合の度合い（ＤＰ）を決定した（図５Ｓ２）。対応するポリマー２－１のＤＰは、約２０であった。ポリマー２－１の１９Ｆ ＮＭＲスペクトルは、－１５３．２、－１５６．８、および－１６２．３ｐｐｍでポリマー骨格に沿ったペンタフルオロフェニル基に対応する２：１：２の積算比の３つのブロードピークを示した（図５）。
【0340】
リジンベースのレニウムキレート化剤を有するポリ（ＰＦＰＡ）のアミノリシス
次に、ポリマー２－１を、わずかに過剰のリジンベースのキレート化剤１－４を用いて（ＰＦＰＡ繰り返し単位に関して１．６当量）室温で処置し、ポリマー２－２を得た（スキーム２、ステップａ）。上記スキーム１に示すように、キレート化剤１－４を３つのステップで調製した。アミノリシス反応を、１９Ｆ ＮＭＲ分光法によりモニターした。経時的に、骨格に沿ったＰＦＰＡ単位に対応するブロードシグナルが消失し、一方で、放出されたペンタフルオロフェノールに対応するシャープなシグナルが出現した（図７）。一晩室温で撹拌した（１３時間）後、１００μＬのエタノールアミンを反応混合物に添加し、反応混合物を３時間撹拌した。ポリマーをジエチルエーテル（５０ｍＬ）中で沈澱させ、その後、Ｈ２Ｏに溶解した。スピンフィルタ（アミコン、ウルトラ－１５、３ｋＤａ）を使用して過剰のキレート化剤を除去し、Ｈ２Ｏで２回、ＰＢＳ緩衝液で３回、Ｈ２Ｏで３回洗浄した。凍結乾燥後、ポリマー２－２（ポリＤＰＡ）を淡茶色粉末として得た。
次に、ポリマー２－１を、わずかに過剰のリジンベースのキレート化剤１－４を用いて（ＰＦＰＡ繰り返し単位に関して１．６当量）室温で処置し、ポリマー２－２を得た（スキーム２、ステップａ）。上記スキーム１に示すように、キレート化剤１－４を３つのステップで調製した。アミノリシス反応を、１９Ｆ ＮＭＲ分光法によりモニターした。経時的に、骨格に沿ったＰＦＰＡ単位に対応するブロードシグナルが消失し、一方で、放出されたペンタフルオロフェノールに対応するシャープなシグナルが出現した（図７）。一晩室温で撹拌した（１３時間）後、１００μＬのエタノールアミンを反応混合物に添加し、反応混合物を３時間撹拌した。ポリマーをジエチルエーテル（５０ｍＬ）中で沈澱させ、その後、Ｈ２Ｏに溶解した。スピンフィルタ（アミコン、ウルトラ－１５、３ｋＤａ）を使用して過剰のキレート化剤を除去し、Ｈ２Ｏで２回、ＰＢＳ緩衝液で３回、Ｈ２Ｏで３回洗浄した。凍結乾燥後、ポリマー２－２（ポリＤＰＡ）を淡茶色粉末として得た。
【0341】
【化39】
【0342】
精製後、ポリマー２－２の１Ｈ ＮＭＲは、キレート化剤１－４の導入に対応する一連の共鳴を示し、一方で、１９Ｆスペクトルは、シグナルを示さなかった（図８）。これらのＮＭＲ研究により、ポリマー骨格に沿ったほぼ定量的なキレート化剤１－４の組み込みを有するＰＦＰＡ単位の完全な修飾が示唆される。さらに、メタノール中のポリマー２－２のＵＶ－可視スペクトルは、ごくわずかな３０９ｎｍでの吸光度を示し、アミノリシス中のトリチオカーボネート基の開裂を示唆した（図９）。しかし、キレート化剤の２－ピリジル基からの吸収に対応する、２６２ｎｍに位置するシャープな吸光度ピークが観察された。
【0343】
１－４のカルボン酸（ＣＯＯＨ）部分は、２つの目的を果たすことができる。第１に、カルボキシレートイオンが、金属担持ポリマーの水溶性を改善することが予想される。第２に、この金属－ポリマー錯体は、正味の正電荷を有することができる。各ペンダント基において正電荷を有するポリマーは、一般に負電荷の外膜を有する細胞と非特異的に相互作用することができる。カルボキシレートは、潜在的な対イオンを提供し、そのため、各ペンダント基は、双性イオン性である。レニウム担持ポリマー２－２が、水またはＰＢＳ緩衝液中で低溶解度を有することが分かった。水溶解度をさらに改善するため、スキーム２、ステップｂに示すように、ポリマー２－２を短いメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ６－ＮＨ２）で修飾した。ここでの目標は、ポリマーの水溶性を高めるだけでなく、正電荷の錯体を細胞との相互作用から保護するためにＰＥＧコロナを提供することでもある。
【0344】
ｍＰＥＧ６－ＮＨ２を用いるポリマー２－２のＰＥＧ化
最初に、ポリマー２－２（５０．３ｍｇ）を、ＰＢ緩衝液（４ｍＬ、０．２Ｍ、ｐＨ８．０）中、過剰の（４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチル－モルホリニウムクロリド）（ＤＭＴＭＭ、１ｍＬのＨ２Ｏ中で２８８ｍｇ、各カルボン酸基に対して約８モル当量）で処理した（スキーム２、ステップｂ）。反応混合物を室温で５分間撹拌し、カルボン酸官能基を活性化させた。これに続いて、過剰のｍＰＥＧ６－ＮＨ２（各カルボン酸基に対して約７モル当量）を素早く添加し、反応溶液を一晩（１５時間）、室温で撹拌した。続いて、本明細書ではポリマー２－３と呼ばれるポリマー２－２のＰＥＧ化バージョンを得た。スピンフィルタ（アミコン、ウルトラ－１５、１０ｋＤａ）を使用してポリマー２－３を精製し、Ｈ２Ｏで３回、ＰＢＳ緩衝液で２回、Ｈ２Ｏで３回洗浄した。凍結乾燥後、最終のポリマー、ポリＤＰＡ－ｍＰＥＧ６２－３を、淡茶色固体として得た。
最初に、ポリマー２－２（５０．３ｍｇ）を、ＰＢ緩衝液（４ｍＬ、０．２Ｍ、ｐＨ８．０）中、過剰の（４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチル－モルホリニウムクロリド）（ＤＭＴＭＭ、１ｍＬのＨ２Ｏ中で２８８ｍｇ、各カルボン酸基に対して約８モル当量）で処理した（スキーム２、ステップｂ）。反応混合物を室温で５分間撹拌し、カルボン酸官能基を活性化させた。これに続いて、過剰のｍＰＥＧ６－ＮＨ２（各カルボン酸基に対して約７モル当量）を素早く添加し、反応溶液を一晩（１５時間）、室温で撹拌した。続いて、本明細書ではポリマー２－３と呼ばれるポリマー２－２のＰＥＧ化バージョンを得た。スピンフィルタ（アミコン、ウルトラ－１５、１０ｋＤａ）を使用してポリマー２－３を精製し、Ｈ２Ｏで３回、ＰＢＳ緩衝液で２回、Ｈ２Ｏで３回洗浄した。凍結乾燥後、最終のポリマー、ポリＤＰＡ－ｍＰＥＧ６２－３を、淡茶色固体として得た。
【0345】
ポリマー２－３の１Ｈ ＮＭＲスペクトルにより、ｍＰＥＧ６のメトキシ基およびエチレングリコール繰り返し単位に対応する３．３２ｐｐｍおよび３．５９ｐｐｍでの新しいピークの出現で、ＰＥＧ化が確認される（図１０）。レニウム担持実験により、金属担持ポリマー２－３が水およびＰＢＳ緩衝液の両方に溶解性であることが確認された。
【0346】
マレイミド官能基のポリマー２－３への結合
マレイミド官能基を組み込むように、ポリマー２－３をさらに修飾した（スキーム２、ステップｃ）。第１に、前のステップで形成されている可能性があるジスルフィド結合はいずれも、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）で還元された。Ｈ２Ｏ（１ｍＬ）中のポリマー２－３（１０ｍｇ）の溶液に、ＴＣＥＰ（８０μＬ、０．５Ｍ）を添加した。反応溶液中のＴＣＥＰの濃度は、約５０ｍＭであった。反応混合物を室温で１時間撹拌した。その後、スピンフィルタ（アミコン、ウルトラ－１５、１０ｋＤａ）を使用して、ポリマーを酢酸溶液（約５ｍＭ、ｐＨ３．５）で２回洗浄し、過剰のＴＣＥＰを除去した。
マレイミド官能基を組み込むように、ポリマー２－３をさらに修飾した（スキーム２、ステップｃ）。第１に、前のステップで形成されている可能性があるジスルフィド結合はいずれも、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）で還元された。Ｈ２Ｏ（１ｍＬ）中のポリマー２－３（１０ｍｇ）の溶液に、ＴＣＥＰ（８０μＬ、０．５Ｍ）を添加した。反応溶液中のＴＣＥＰの濃度は、約５０ｍＭであった。反応混合物を室温で１時間撹拌した。その後、スピンフィルタ（アミコン、ウルトラ－１５、１０ｋＤａ）を使用して、ポリマーを酢酸溶液（約５ｍＭ、ｐＨ３．５）で２回洗浄し、過剰のＴＣＥＰを除去した。
【0347】
その後、新たに還元されたチオール基を過剰のビスマレイミド（ビス－Ｍａｌ－ＰＥＧ６）と反応させ、マレイミド官能化化合物Ｉ－１を与えた。このあとすぐ、濃縮ポリマー溶液（約３００μＬ）を２ドラムのガラスバイアルに移し、０．５ｍＬのＰＢ緩衝液（０．２Ｍ、ｐＨ７．０）を添加し、続いてビス－Ｍａｌ－ＰＥＧ６（１２０μＬのＤＭＦ中で２２ｍｇ）を添加した。反応溶液を室温で９０分間撹拌した。その後、スピンフィルタ（アミコン、ウルトラ－１５、１０ｋＤａ）を使用して化合物Ｉ－１を精製し、Ｈ２Ｏで２回、ＰＢ緩衝液（０．２Ｍ、ｐＨ７．０）で１回、Ｈ２Ｏで３回洗浄した。洗浄後、濃縮ポリマー溶液を１２０００×ｇで１０分間遠心分離し、未溶解固体を除去した。上清を取り出し、凍結乾燥して、最終ポリマー、ポリＤＰＡ－ｍＰＥＧ６－Ｍａｌ化合物Ｉ－１を淡茶色固体として得た。
【0348】
化合物Ｉ－１の１Ｈ ＮＭＲスペクトルは、マレイミドに対応する６．８９ｐｐｍの新たなピークの出現を示した（図１）。８．２７ｐｐｍでのこのピークの積分の、キレート化剤プロトンの積分に対する比は、１：２０であり、マレイミド官能基のポリマーへのほぼ定量的な組み込みを示唆する。
【0349】
化合物Ｉ－１へのレニウム担持
金属担持は、わずかに過剰のレニウム塩［ＮＥｔ４］２［Ｒｅ（ＣＯ）３Ｂｒ３］２４（３ｍｇ、各キレート化剤に対して１．２倍、０．５ｍＬの無水ＭｅＯＨに溶解）を有する２ドラムのガラスバイアル中、化合物Ｉ－１（２ｍＬの無水ＭｅＯＨ中で２．１ｍｇ）をインキュベートすることにより達成された。反応混合物を３７℃で２時間、撹拌なしでインキュベートした。インキュベーション後、溶液を、予めＨ２Ｏ（１２ｍＬ）が充填されたアミコンスピンフィルタ（ウルトラ－１５、１０ｋＤａ）に注いだ。ポリマーをＨ２Ｏで３回洗浄した。洗浄後、ポリマー溶液を凍結乾燥し、レニウム担持ポリマーを得た。
金属担持は、わずかに過剰のレニウム塩［ＮＥｔ４］２［Ｒｅ（ＣＯ）３Ｂｒ３］２４（３ｍｇ、各キレート化剤に対して１．２倍、０．５ｍＬの無水ＭｅＯＨに溶解）を有する２ドラムのガラスバイアル中、化合物Ｉ－１（２ｍＬの無水ＭｅＯＨ中で２．１ｍｇ）をインキュベートすることにより達成された。反応混合物を３７℃で２時間、撹拌なしでインキュベートした。インキュベーション後、溶液を、予めＨ２Ｏ（１２ｍＬ）が充填されたアミコンスピンフィルタ（ウルトラ－１５、１０ｋＤａ）に注いだ。ポリマーをＨ２Ｏで３回洗浄した。洗浄後、ポリマー溶液を凍結乾燥し、レニウム担持ポリマーを得た。
【0350】
図２（ａ）は、芳香族領域におけるＲｅ担持化合物Ｉ－１（化合物ＩＩ－１）の１Ｈ ＮＭＲの部分を表す。非担持ポリマーと比較して、すべてのピリジルプロトンシグナルは、Ｒｅ（Ｉ）の電子吸引性誘起効果のために低磁場にシフトした。重要なことに、マレイミド基は、これらの反応条件下で残存した（図１１）。図２（ｂ）に示すように、担持の成功は、フーリエ変換近赤外（ＦＴＩＲ）分光法によりさらに確認された。レニウム塩は、１８４８および１９９８ｃｍ－１で２つの強力なカルボニル吸収を示した。化合物Ｉ－１は、それぞれＰＥＧにおけるアミド基のＣ＝Ｏ伸縮およびエーテルＣ－Ｏ－Ｃ結合の振動に対応する１６５０および１０９５ｃｍ－１で吸収バンドを示した。２５担持後、カルボニル基に対応する２つの新たな吸収バンドが、１９０８および２０３０ｃｍ－１で出現し、ｆａｃ－［Ｒｅ（ＣＯ）３］＋コアの存在を示唆した。レニウム担持ポリマーを長期保存のために凍結乾燥し、バイオコンジュゲーション反応の前に緩衝液に再溶解することができる（図１２に示した凍結乾燥試料）。
【0351】
実施例２
Ｒｅ担持ポリマー化合物ＩＩ－１を一次抗体で標識し、マスサイトメトリー免疫測定法で使用した。
Ｒｅ担持ポリマー化合物ＩＩ－１を一次抗体で標識し、マスサイトメトリー免疫測定法で使用した。
【0352】
Ｒｅ担持ポリマーの抗体標識
マスサイトメトリー免疫測定法において代表的な元素タグ化合物ＩＩ－１の性能を評価するため、標準Ｍａｘｐａｒ（商標）抗体標識プロトコルにしたがって、一次抗体、ＣＤ２０を、ポリマータグで標識した。簡潔に言うと、抗体をＴＣＥＰにより部分還元し、スピンフィルタ内で洗浄し、その後、過剰のポリマーと混合し、混合物を３７℃で１時間インキュベートした。抗体－ポリマーコンジュゲートを高速タンパク質液体クロマトグラフィにより精製し、過剰の非共役ポリマーを除去した（図１３）。
マスサイトメトリー免疫測定法において代表的な元素タグ化合物ＩＩ－１の性能を評価するため、標準Ｍａｘｐａｒ（商標）抗体標識プロトコルにしたがって、一次抗体、ＣＤ２０を、ポリマータグで標識した。簡潔に言うと、抗体をＴＣＥＰにより部分還元し、スピンフィルタ内で洗浄し、その後、過剰のポリマーと混合し、混合物を３７℃で１時間インキュベートした。抗体－ポリマーコンジュゲートを高速タンパク質液体クロマトグラフィにより精製し、過剰の非共役ポリマーを除去した（図１３）。
【0353】
抗体価測定実験
その後、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）で抗体価測定実験を実行し、精製コンジュゲートの性能を評価した。これらの実験において、１５４Ｓｍ－ＣＤ４５、１６０Ｇｄ－ＣＤ１４、１７０Ｅｒ－ＣＤ３および１８７／１８５Ｒｅ－ＣＤ２０を含む４－ｐｌｅｘ抗体パネル（フリューダイムＭａｘｐａｒ（商標）試薬）でヒトＰＢＭＣを染色した。１８７／１８５Ｒｅ－ＣＤ２０が１４７Ｓｍ－ＣＤ２０で置き換えられた別の染色パネルを、陽性対照として使用した。１８７／１８５Ｒｅ－ＣＤ２０コンジュゲートを、０．１μｇ／ｍＬ、０．３μｇ／ｍＬ、０．５μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬおよび２．５μｇ／ｍＬの濃度で滴定した。図３に示すように、１８７／１８５Ｒｅ－ＣＤ２０は、ＰＢＭＣ中の残りの細胞サブセットからのＣＤ２０＋Ｂ細胞サブセットの明確な分離を可能にする。さらに、０．３μｇ／ｍＬでの１８７／１８５Ｒｅ－ＣＤ２０（図３（ｂ））または最適力価での１４７Ｓｍ－ＣＤ２０（図３（ｆ））のいずれかを使用することにより、ＰＢＭＣ内の主要な細胞サブセットの高度に同等の割合を達成した。これらの結果から、レニウムタグ付け抗体が、１細胞免疫表現型解析実験のための正確な定量を提供し、マスサイトメトリー免疫測定法のための市販試薬と組み合わせて使用することができることが示唆される。
その後、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）で抗体価測定実験を実行し、精製コンジュゲートの性能を評価した。これらの実験において、１５４Ｓｍ－ＣＤ４５、１６０Ｇｄ－ＣＤ１４、１７０Ｅｒ－ＣＤ３および１８７／１８５Ｒｅ－ＣＤ２０を含む４－ｐｌｅｘ抗体パネル（フリューダイムＭａｘｐａｒ（商標）試薬）でヒトＰＢＭＣを染色した。１８７／１８５Ｒｅ－ＣＤ２０が１４７Ｓｍ－ＣＤ２０で置き換えられた別の染色パネルを、陽性対照として使用した。１８７／１８５Ｒｅ－ＣＤ２０コンジュゲートを、０．１μｇ／ｍＬ、０．３μｇ／ｍＬ、０．５μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬおよび２．５μｇ／ｍＬの濃度で滴定した。図３に示すように、１８７／１８５Ｒｅ－ＣＤ２０は、ＰＢＭＣ中の残りの細胞サブセットからのＣＤ２０＋Ｂ細胞サブセットの明確な分離を可能にする。さらに、０．３μｇ／ｍＬでの１８７／１８５Ｒｅ－ＣＤ２０（図３（ｂ））または最適力価での１４７Ｓｍ－ＣＤ２０（図３（ｆ））のいずれかを使用することにより、ＰＢＭＣ内の主要な細胞サブセットの高度に同等の割合を達成した。これらの結果から、レニウムタグ付け抗体が、１細胞免疫表現型解析実験のための正確な定量を提供し、マスサイトメトリー免疫測定法のための市販試薬と組み合わせて使用することができることが示唆される。
【0354】
実施例３
ＤＰＡによりキレート化された１個または複数個のプラチナ原子を有するキレート化剤
ペンダント基（ペンダント基は、マスサイトメトリーに有用なプラチナをキレート化することができる）に結合したジピコリルアミン（ＤＰＡ）キレート化剤を有するポリマーを合成した。使用されるプラチナおよび材料を有する代表的な金属－キレート化剤ポリマーの合成を説明する。
ＤＰＡによりキレート化された１個または複数個のプラチナ原子を有するキレート化剤
ペンダント基（ペンダント基は、マスサイトメトリーに有用なプラチナをキレート化することができる）に結合したジピコリルアミン（ＤＰＡ）キレート化剤を有するポリマーを合成した。使用されるプラチナおよび材料を有する代表的な金属－キレート化剤ポリマーの合成を説明する。
【0355】
材料
実施例１と同様にポリマー２－２を使用して、ポリマー３－２を調製した（スキーム３）。アジド－ＰＥＧ６－ＮＨ２（カタログ番号７６１７２）およびテトラクロロ白金酸カリウム（Ｋ２ＰｔＣｌ４、カタログ番号５２０８５３）をシグマ・アルドリッチから得た。
実施例１と同様にポリマー２－２を使用して、ポリマー３－２を調製した（スキーム３）。アジド－ＰＥＧ６－ＮＨ２（カタログ番号７６１７２）およびテトラクロロ白金酸カリウム（Ｋ２ＰｔＣｌ４、カタログ番号５２０８５３）をシグマ・アルドリッチから得た。
【0356】
アジド－ＰＥＧ６－ＮＨ２を用いるポリマー２のＰＥＧ化
１Ｈ－ＮＭＲを使用して、得られたポリマー３－２を特徴づけた（図１４）。ＦＴＩＲはさらに、アジド基の組み込みの成功を確認する（図１５）。エンドキャップされたポリマー３－１の溶液（２ｍＬのＰＢ緩衝液中で２０ｍｇ、０．２Ｍ、ｐＨ８．０）に、ＤＭＴＭＭ溶液（０．５ｍＬのＨ２Ｏ中で１２４ｍｇ、各ＣＯＯＨに対して約８倍）を添加した。溶液を室温で５分間撹拌し、ＣＯＯＨ基を活性化させた。５分後、ｍＰＥＧ６－ＮＨ２（５４ｍｇ、各ＣＯＯＨに対して３．５倍当量）およびアジド－ＰＥＧ６－ＮＨ２（６４ｍｇ、各ＣＯＯＨに対して３．５倍当量）を含むＰＥＧの混合物を添加した。反応混合物を室温で一晩撹拌した。スピンフィルタ（アミコン、ウルトラ－５、１０ｋＤａ）を使用して得られたポリマー３－２を精製し、Ｈ２Ｏで３回、ＰＢ緩衝液（０．２Ｍ、ｐＨ７．６）で２回、Ｈ２Ｏで３回洗浄した。その後、ポリマー溶液を一晩凍結乾燥し、最終生成物３－２を得た。
１Ｈ－ＮＭＲを使用して、得られたポリマー３－２を特徴づけた（図１４）。ＦＴＩＲはさらに、アジド基の組み込みの成功を確認する（図１５）。エンドキャップされたポリマー３－１の溶液（２ｍＬのＰＢ緩衝液中で２０ｍｇ、０．２Ｍ、ｐＨ８．０）に、ＤＭＴＭＭ溶液（０．５ｍＬのＨ２Ｏ中で１２４ｍｇ、各ＣＯＯＨに対して約８倍）を添加した。溶液を室温で５分間撹拌し、ＣＯＯＨ基を活性化させた。５分後、ｍＰＥＧ６－ＮＨ２（５４ｍｇ、各ＣＯＯＨに対して３．５倍当量）およびアジド－ＰＥＧ６－ＮＨ２（６４ｍｇ、各ＣＯＯＨに対して３．５倍当量）を含むＰＥＧの混合物を添加した。反応混合物を室温で一晩撹拌した。スピンフィルタ（アミコン、ウルトラ－５、１０ｋＤａ）を使用して得られたポリマー３－２を精製し、Ｈ２Ｏで３回、ＰＢ緩衝液（０．２Ｍ、ｐＨ７．６）で２回、Ｈ２Ｏで３回洗浄した。その後、ポリマー溶液を一晩凍結乾燥し、最終生成物３－２を得た。
【0357】
【化40】
【0358】
ポリマー３－２へのプラチナ担持 ポリマー３－２に対するプラチナ担持を、スキーム４）にしたがって実行した。１Ｈ－ＮＭＲを使用して、Ｐｔのキレート化が成功したことを確認した（図１６）。２ドラム（約７ｍＬ）のガラスバイアル中のポリマー３－２の溶液（５．５ｍＬの無水ＭｅＯＨ中で５．８ｍｇ）に、Ｋ２ＰｔＣｌ４（２００μＬ、ＤＭＳＯ中５０ｍＭ、各キレート化剤に対して１．２倍当量）の溶液を添加した。バイアルをアルミニウム箔で包み、昼光への曝露を回避した。反応混合物を、油浴中、撹拌なしで２時間、４５℃でインキュベートした。インキュベーション後、溶液を、予めＨ２Ｏ（１０ｍＬ）が充填されたアミコンスピンフィルタ（ウルトラ－１５、１０ｋＤａ）に注いだ。得られたポリマー４－１（化合物ＩＩ－２）の溶液を、ＮａＣｌ溶液（２０ｍＭ）で３回、Ｈ２Ｏで１回洗浄した。洗浄後、ポリマー溶液を凍結乾燥し、Ｐｔ担持ポリマー４－１を得た。
【0359】
【化41】
【0360】
実施例４
Ｐｔ担持ポリマーを、一次抗体で標識し、マスサイトメトリー免疫測定法で使用した。
Ｐｔ担持ポリマーを、一次抗体で標識し、マスサイトメトリー免疫測定法で使用した。
【0361】
Ｐｔ担持ポリマーの抗体標識
マスサイトメトリー免疫測定法においてポリマー元素タグ４－１／ＩＩ－２の性能を評価するため、一次抗体、ＣＤ２０を、ポリマー元素タグ４－１／ＩＩ－２で標識した。ＣＤ２０ Ａｂ（１６０μｇ、１．６ｍｇ／ｍＬ）で修飾したジベンゾシクロオクチン（ＤＢＣＯ）の溶液に、Ｐｔ担持ポリマー４－１の溶液を添加した（５０μＬのＨ２Ｏ中で０．２７ｍｇ、Ａｂに対して約１３倍のモル過剰）。反応混合物を室温で２時間、その後、４℃で一晩ボルテックスした。スピンフィルタ（アミコン、ウルトラ－０．５、１００ｋＤａ）を使用して、コンジュゲートをＰＢＳで５回洗浄することにより精製した。
マスサイトメトリー免疫測定法においてポリマー元素タグ４－１／ＩＩ－２の性能を評価するため、一次抗体、ＣＤ２０を、ポリマー元素タグ４－１／ＩＩ－２で標識した。ＣＤ２０ Ａｂ（１６０μｇ、１．６ｍｇ／ｍＬ）で修飾したジベンゾシクロオクチン（ＤＢＣＯ）の溶液に、Ｐｔ担持ポリマー４－１の溶液を添加した（５０μＬのＨ２Ｏ中で０．２７ｍｇ、Ａｂに対して約１３倍のモル過剰）。反応混合物を室温で２時間、その後、４℃で一晩ボルテックスした。スピンフィルタ（アミコン、ウルトラ－０．５、１００ｋＤａ）を使用して、コンジュゲートをＰＢＳで５回洗浄することにより精製した。
【0362】
抗体価測定実験
抗体価測定実験を以下に記載するように実行した。図１７は、ＣＤ２０－ＰｏｌｙＰｔがＴ細胞からのＢ細胞の分離において０．５μｇ／ｍＬまたは１．０μｇ／ｍＬのいずれかの力価で有効であったことを示す。
抗体価測定実験を以下に記載するように実行した。図１７は、ＣＤ２０－ＰｏｌｙＰｔがＴ細胞からのＢ細胞の分離において０．５μｇ／ｍＬまたは１．０μｇ／ｍＬのいずれかの力価で有効であったことを示す。
【0363】
異なるＭａｘｐａｒ（登録商標）ＭＣＰ－ＡｂコンジュゲートをｎａｔＰｔ－Ａｂコンジュゲートと混合することにより、抗体染色カクテル（７０μＬ）を調製した。ｎａｔＰｔ－ＣＤ２０を用いる免疫測定法のために、４つの抗体染色カクテルを調製した。１つのカクテルには、Ｍａｘｐａｒ（登録商標）ＭＣＰ－Ａｂコンジュゲート（すなわち、１５４Ｓｍ－ＣＤ４５、１６０Ｇｄ－ＣＤ１４、１７０Ｅｒ－ＣＤ３および１４７Ｓｍ－ＣＤ２０）のみが含まれており、陽性対照として使用した。他の３つのカクテルは、Ｍａｘｐａｒ（登録商標）ＭＣＰ－Ａｂコンジュゲート（すなわち、１５４Ｓｍ－ＣＤ４５、１６０Ｇｄ－ＣＤ１４および１７０Ｅｒ－ＣＤ３）およびｎａｔＰｔ－ＣＤ２０コンジュゲートの両方で構成され、各カクテルにおけるｎａｔＰｔ－ＣＤ２０コンジュゲートの濃度は、それぞれ０．５μｇ／ｍＬ、１．０μｇ／ｍＬおよび２．５μｇ／ｍＬの力価で異なっていた。
【0364】
染色プロセスのため、ＰＢＭＣ懸濁液（３０μＬのＭａｘｐａｒ（登録商標）細胞染色緩衝液中で約３００万個の細胞、Ｆｃブロックされた）を、抗体カクテル（７０μＬ）に添加した。混合物を穏やかにボルテックスし、室温で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を細胞染色緩衝液で２回洗浄し、その後、１．６％ホルムアルデヒド／ＰＢＳ溶液を用いて室温で１０分間固定した。固定された細胞をペレット化し、細胞挿入溶液（Ｉｒ－インターカレーター、１ｍＬ、終濃度：１２５ｎＭ）を添加した。その後、細胞を４℃で一晩インキュベートした。インキュベーション後、細胞を、細胞染色緩衝液で２回、Ｍａｘｐａｒ（登録商標）セルアクイジション溶液で２回洗浄した。ペレット化した細胞を、ＥＱ（商標）四元素キャリブレーションビーズを含むセルアクイジション溶液（１ｍＬあたり１００万個の細胞）に懸濁し、マスサイトメトリー分析に供した。
【0365】
単核球によるＣＤ２０－ＰｏｌｙＰｔコンジュゲートの取り込みも観察された。
【0366】
実施例５
ＤＰＡによりキレート化された１個または複数個の水銀原子を有するキレート化剤
ペンダント基（ペンダント基は、マスサイトメトリーに有用な水銀をキレート化することができる）に結合したジピコリルアミン（ＤＰＡ）キレート化剤を有するポリマーを合成した。代表的な水銀－キレート化剤ポリマーの合成および使用した材料を説明する。
ＤＰＡによりキレート化された１個または複数個の水銀原子を有するキレート化剤
ペンダント基（ペンダント基は、マスサイトメトリーに有用な水銀をキレート化することができる）に結合したジピコリルアミン（ＤＰＡ）キレート化剤を有するポリマーを合成した。代表的な水銀－キレート化剤ポリマーの合成および使用した材料を説明する。
【0367】
材料
ＰｏｌｙＤＰＡポリマー（２－３）を実施例１で説明されたように調製した。酢酸水銀（カタログ番号１７６１０９）およびメタノール（カタログ番号３２２４１５）をシグマ・アルドリッチから購入した。
ＰｏｌｙＤＰＡポリマー（２－３）を実施例１で説明されたように調製した。酢酸水銀（カタログ番号１７６１０９）およびメタノール（カタログ番号３２２４１５）をシグマ・アルドリッチから購入した。
【0368】
ポリＤＰＡ（ポリマー２－３）へのＨｇ担持
２ドラムのガラスバイアル内でポリマー２－３（２ｍＬのメタノール中で２．５ｍｇのポリマー）の溶液に、Ｈｇ塩（０．５ｍＬのメタノール中で１．５ｍｇのＨｇ（ＯＡｃ）２、ＤＰＡキレート化剤に対して１．４倍過剰）の溶液を添加し、続いて穏やかに旋回させた。得られた溶液を、４０℃で２時間、撹拌なしでインキュベートした（スキーム５）。インキュベーション後、溶液を、予め水（１．５ｍＬ）が充填されたスピンフィルタ（アミコンウルトラ４、１０ｋＤａ）に注いだ。得られたポリマー５－１／ＩＩ－３の溶液を、水（２７００ｇ、２０分）で３回洗浄し、その後、一晩凍結乾燥して、最終生成物を得た。ＮＭＲ測定のため、ポリマー５－１／ＩＩ－３をＤ２Ｏに再溶解した。１Ｈ－ＮＭＲを使用して、水銀のキレート化が成功したことを確認した（図１８および図１９）。
２ドラムのガラスバイアル内でポリマー２－３（２ｍＬのメタノール中で２．５ｍｇのポリマー）の溶液に、Ｈｇ塩（０．５ｍＬのメタノール中で１．５ｍｇのＨｇ（ＯＡｃ）２、ＤＰＡキレート化剤に対して１．４倍過剰）の溶液を添加し、続いて穏やかに旋回させた。得られた溶液を、４０℃で２時間、撹拌なしでインキュベートした（スキーム５）。インキュベーション後、溶液を、予め水（１．５ｍＬ）が充填されたスピンフィルタ（アミコンウルトラ４、１０ｋＤａ）に注いだ。得られたポリマー５－１／ＩＩ－３の溶液を、水（２７００ｇ、２０分）で３回洗浄し、その後、一晩凍結乾燥して、最終生成物を得た。ＮＭＲ測定のため、ポリマー５－１／ＩＩ－３をＤ２Ｏに再溶解した。１Ｈ－ＮＭＲを使用して、水銀のキレート化が成功したことを確認した（図１８および図１９）。
【0369】
【化42】
【0370】
実施例６
ＤＰＡによりキレート化された１個または複数個の銀原子を有するキレート化剤
ペンダント基（ペンダント基は、マスサイトメトリーに有用な銀をキレート化することができる）に結合したジピコリルアミン（ＤＰＡ）キレート化剤を有するポリマーを合成した。代表的な銀－キレート化剤ポリマーの合成および使用した材料を説明する。
ＤＰＡによりキレート化された１個または複数個の銀原子を有するキレート化剤
ペンダント基（ペンダント基は、マスサイトメトリーに有用な銀をキレート化することができる）に結合したジピコリルアミン（ＤＰＡ）キレート化剤を有するポリマーを合成した。代表的な銀－キレート化剤ポリマーの合成および使用した材料を説明する。
【0371】
材料
ポリマー２－３を、実施例１で説明されたように調製した。過塩素酸銀（カタログ番号２２６５４８）、およびメタノール（カタログ番号３２２４１５）を、シグマ・アルドリッチから購入した。
ポリマー２－３を、実施例１で説明されたように調製した。過塩素酸銀（カタログ番号２２６５４８）、およびメタノール（カタログ番号３２２４１５）を、シグマ・アルドリッチから購入した。
【0372】
ポリＤＰＡ（ポリマー２－３）へのＡｇ担持
２ドラムのガラスバイアル中、ポリマー２－３（２ｍＬのメタノール中で２．５ｍｇのポリマー）の溶液に、Ａｇ塩（０．５ｍＬのメタノール中で１．０ｍｇのＡｇＣｌＯ４、ＤＰＡキレート化剤に対して１．２倍過剰）の溶液を添加し、続いて穏やかに旋回させた。得られた溶液を、４０℃で２時間、撹拌なしでインキュベートした（スキーム６）。インキュベーション後、溶液を、予め水（１．５ｍＬ）が充填されたスピンフィルタ（アミコンウルトラ４、１０ｋＤａ）に注いだ。得られたポリマー６－１／ＩＩ－４の溶液を水（２７００ｇ、２０分）で３回洗浄し、その後、一晩凍結乾燥し、最終生成物を得た。ＮＭＲ測定のため、ポリマー６－１／ＩＩ－４をＤ２Ｏに再溶解した。１Ｈ－ＮＭＲを使用して、銀のキレート化が成功したことを確認した（図１８および図２０）。
２ドラムのガラスバイアル中、ポリマー２－３（２ｍＬのメタノール中で２．５ｍｇのポリマー）の溶液に、Ａｇ塩（０．５ｍＬのメタノール中で１．０ｍｇのＡｇＣｌＯ４、ＤＰＡキレート化剤に対して１．２倍過剰）の溶液を添加し、続いて穏やかに旋回させた。得られた溶液を、４０℃で２時間、撹拌なしでインキュベートした（スキーム６）。インキュベーション後、溶液を、予め水（１．５ｍＬ）が充填されたスピンフィルタ（アミコンウルトラ４、１０ｋＤａ）に注いだ。得られたポリマー６－１／ＩＩ－４の溶液を水（２７００ｇ、２０分）で３回洗浄し、その後、一晩凍結乾燥し、最終生成物を得た。ＮＭＲ測定のため、ポリマー６－１／ＩＩ－４をＤ２Ｏに再溶解した。１Ｈ－ＮＭＲを使用して、銀のキレート化が成功したことを確認した（図１８および図２０）。
【0373】
【化43】
【0374】
機器類
１Ｈ ＮＭＲおよび１９Ｆ ＮＭＲ実験を、アジレントＤＤ２ ５００ＭＨｚ分光分析装置またはアジレントＤＤ２ ６００ＭＨｚ分光分析装置で実行した。
１Ｈ ＮＭＲおよび１９Ｆ ＮＭＲ実験を、アジレントＤＤ２ ５００ＭＨｚ分光分析装置またはアジレントＤＤ２ ６００ＭＨｚ分光分析装置で実行した。
【0375】
ＵＶ－可視測定を、アジレントＣａｒｙ ３００ ＵＶ－可視分光光度計で実行した。
【0376】
ＦＴ－ＩＲ測定を、ＡＴＲアクセサリーを有するパーキンエルマーＳｐｅｃｔｒｕｍ Ｔｗｏ（商標）赤外分光計で実行した。すべてのスペクトルを、１ｃｍ－１の解像度で、５００～４０００ｃｍ－１の範囲内で回収した。
【0377】
ＧＰＣ測定を、Ｖｉｓｃｏｔｅｋ ＶＥ３５８０屈折率（ＲＩ）検出器を備えたウォーターズ５１５ＨＰＬＣで実行した。２．５ｇ／Ｌテトラ－ｎ－ブチルアンモニウムブロミド（ＴＢＡＢ）を含むテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）を、溶離液として使用した（３５℃、流量＝０．６ｍＬ／分）。システムをＰＭＭＡ標準でキャリブレートした。
【0378】
ＦＰＬＣ実験を、ＡＫＴＡ ｐｕｒｅ ２５Ｌシステムで実行した。ポリマー－抗体コンジュゲートの精製のため、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）２００ １０／３００ＧＬカラムを使用した。
【0379】
マスサイトメトリー実験を、フリューダイムカナダ（マーカム、ＯＮ）のＣｙＴＯＦ（登録商標）Ｈｅｌｉｏｓ（商標）システムで実行した。データをＦＣＳ３．０ファイルフォーマットで取得し、ＦｌｏｗＪｏソフトウエアにより処理した。
【0380】
実施例７
溶解度調節剤としての双性イオン性のポリ（スルホベタインメタクリレート）ＰＳＢＭＡの調製
材料
４－シアノ－４－（フェニルカルボノチオイルチオ）ペンタン酸（ＣＴＡ試薬）、２－（Ｎ－３－スルホプロピル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウム）エチルメタクリレート（ＳＢＭＡ）、４，４’－アゾビス（４－シアノ吉草酸）（ＡＣＶＡ）、２，２，２－トリフルオロエタノール（ＴＦＥ）を、シグマ・アルドリッチから得た。
溶解度調節剤としての双性イオン性のポリ（スルホベタインメタクリレート）ＰＳＢＭＡの調製
材料
４－シアノ－４－（フェニルカルボノチオイルチオ）ペンタン酸（ＣＴＡ試薬）、２－（Ｎ－３－スルホプロピル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウム）エチルメタクリレート（ＳＢＭＡ）、４，４’－アゾビス（４－シアノ吉草酸）（ＡＣＶＡ）、２，２，２－トリフルオロエタノール（ＴＦＥ）を、シグマ・アルドリッチから得た。
【0381】
実験の詳細
１０ｍＬシュレンクフラスコで、ＣＴＡ（１４．５１ｍｇ、５．１９×１０－２ｍｍｏｌ、１．０当量）、ＳＢＭＡ（５０１ｍｇ、１．７８ｍｍｏｌ、３５当量）、およびＡＣＶＡ（１．６９２ｍｇ、５．１３×１０－３ｍｍｏｌ、０．１当量）をＴＦＥ（２．６３ｍＬ）に溶解した。重合溶液を、３回の凍結－ポンプ－融解サイクルに供した。重合溶液を、予熱した油浴中、７０℃で８時間加熱した。シュレンクフラスコを液体窒素に投入することを介して溶液を凍結することにより重合をクエンチした。重合溶液を融解した後、４℃で一晩保存した。粗重合溶液のアリコートの１Ｈ－ＮＭＲ解析により、モノマー変換が約７０％であったことが示された。過剰の溶媒を、真空中、ロータリーエバポレータを使用して蒸発させた。粗ポリマー混合物を、ＴＦＥ（約１ｍＬ）に再溶解し、メタノール（約１３ｍＬ）中で沈澱させ、２７００ｒｃｆで５分間遠心分離した：このプロセスを３回繰り返した。その後、得られたポリマーを真空で一晩乾燥させ、所望のポリマーを得た。固体生成物は、ピンク色と白色の固体とが明確に分離されていた。
１０ｍＬシュレンクフラスコで、ＣＴＡ（１４．５１ｍｇ、５．１９×１０－２ｍｍｏｌ、１．０当量）、ＳＢＭＡ（５０１ｍｇ、１．７８ｍｍｏｌ、３５当量）、およびＡＣＶＡ（１．６９２ｍｇ、５．１３×１０－３ｍｍｏｌ、０．１当量）をＴＦＥ（２．６３ｍＬ）に溶解した。重合溶液を、３回の凍結－ポンプ－融解サイクルに供した。重合溶液を、予熱した油浴中、７０℃で８時間加熱した。シュレンクフラスコを液体窒素に投入することを介して溶液を凍結することにより重合をクエンチした。重合溶液を融解した後、４℃で一晩保存した。粗重合溶液のアリコートの１Ｈ－ＮＭＲ解析により、モノマー変換が約７０％であったことが示された。過剰の溶媒を、真空中、ロータリーエバポレータを使用して蒸発させた。粗ポリマー混合物を、ＴＦＥ（約１ｍＬ）に再溶解し、メタノール（約１３ｍＬ）中で沈澱させ、２７００ｒｃｆで５分間遠心分離した：このプロセスを３回繰り返した。その後、得られたポリマーを真空で一晩乾燥させ、所望のポリマーを得た。固体生成物は、ピンク色と白色の固体とが明確に分離されていた。
【0382】
【化44】
【0383】
ポリマー７－１などのＰＳＢＭＡは、場合によっては、例えばスキーム８に示すように、ジアミンリンカーを介して、化合物２－２などのポリマーキレート化剤に結合することができる。例えば、４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチル－モルホリニウムクロリド（ＤＭＴＭＭ）または他の同様の化学物質をカップリング剤として使用することができる。
【0384】
【化45】
【0385】
実施例８ イミダゾールベースのキレートポリマーの調製
イミダゾールベースのキレート化剤が、ＤＰＡベースのキレート化剤の調製において実施例１で使用されたものと類似の方法を使用して調製され得ることが理解され得る。代表的な合成を、スキーム９に示す。リジン－イミダゾールキレート化剤の他の例には、Ｍａｒｅｓｃａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，２０１０，２１，１０３２－１０４２（その内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている）に記載のものが含まれている。
イミダゾールベースのキレート化剤が、ＤＰＡベースのキレート化剤の調製において実施例１で使用されたものと類似の方法を使用して調製され得ることが理解され得る。代表的な合成を、スキーム９に示す。リジン－イミダゾールキレート化剤の他の例には、Ｍａｒｅｓｃａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，２０１０，２１，１０３２－１０４２（その内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている）に記載のものが含まれている。
【0386】
【化46】
【0387】
Ｎε保護リジン９－１は、還元的アミノ化によりα－アミノ基で２つのイミダゾール基により官能化され得、リジン－イミダゾールキレート化剤９－４に達するまで脱保護され得る。得られると、スキーム２のものと同様の手順により、リジン－イミダゾールキレート化剤を、ポリマー足場に組み込むことができる。代表的な方法を、スキーム１０に示す。
【0388】
【化47】
【0389】
活性化エステルポリマー１０－１を、化合物９－４などのリジン－イミダゾールキレート化剤に結合させて、キレートポリマー１０－２／化合物Ｉ－７を得ることができる。場合によっては、溶解度調節剤（例えばＰＥＧ）などの修飾基では、ポリマー１０－３／化合物Ｉ－８が得られる。さらに、反応性官能基（例えばマレイミド）を、ポリマー１０－３に結合させて、ポリマー１０－４／化合物Ｉ－９を得ることができる。
【0390】
実施例９ 双性イオン性溶解度調節剤を用いるＤＰＡキレート化剤含有ポリマーの調製
２つの代表的な双性イオン性のスルホベタイン溶解度調節剤を調製し、化合物１２－１などのＤＰＡキレート化剤含有ポリマーに結合させた。
２つの代表的な双性イオン性のスルホベタイン溶解度調節剤を調製し、化合物１２－１などのＤＰＡキレート化剤含有ポリマーに結合させた。
【0391】
３－（（３－アミノプロピル）－ジメチルアンモニオ）プロパン－１－スルホネート１１－４を、スキーム１１に示すように、以前報告された合成手順に基づいて調製した。（２６）
【0392】
【化48】
【0393】
化合物１１－２：
ジ－ｔｅｒｔ－ブチルジカーボネート（１５．６ｇ、７１．５ｍｍｏｌ）を、５０ｍＬの１，４－ジオキサン中の３－（ジメチルアミノ）－１－プロピルアミン（４．９ｇ、６ｍＬ、４７．７ｍｍｏｌ）の溶液に添加した。溶液を０℃で２時間撹拌し、さらに一晩、室温で１８時間撹拌した。１８時間後、溶媒を真空で除去し、５０ｍＬのＭｉｌｌｉＱ水を粗生成物に添加した。生成物を酢酸エチル（３０ｍＬ）で３回抽出した。酢酸エチルを乾燥させて、化合物１１－２として、淡黄色の透明な油を与えた。さらなる精製なしで、生成物を以下の合成ステップで使用した。
ジ－ｔｅｒｔ－ブチルジカーボネート（１５．６ｇ、７１．５ｍｍｏｌ）を、５０ｍＬの１，４－ジオキサン中の３－（ジメチルアミノ）－１－プロピルアミン（４．９ｇ、６ｍＬ、４７．７ｍｍｏｌ）の溶液に添加した。溶液を０℃で２時間撹拌し、さらに一晩、室温で１８時間撹拌した。１８時間後、溶媒を真空で除去し、５０ｍＬのＭｉｌｌｉＱ水を粗生成物に添加した。生成物を酢酸エチル（３０ｍＬ）で３回抽出した。酢酸エチルを乾燥させて、化合物１１－２として、淡黄色の透明な油を与えた。さらなる精製なしで、生成物を以下の合成ステップで使用した。
【0394】
化合物１１－３：
化合物１１－２（１当量、２．５ｇ、０．０１２ｍｏｌ）を１５ｍＬの無水ＤＭＦに溶解した。１，３－プロパンスルトン（１．４当量、２．１１３ｇ、０．０１７ｍｏｌ）を、化合物１１－２の溶液に添加し、室温で３日間撹拌した。淡黄色の粘性油が残るまで、粗生成物を真空で乾燥させて、ＤＭＦを除去した。粘性油をジエチルエーテル（３０ｍＬ）で洗浄し、続いて酢酸エチル（３０ｍＬ）で別に洗浄して残りの１，３－プロパンスルトンを除去した。油を凍結乾燥し、化合物１１－３として白色固体を与えた。
化合物１１－２（１当量、２．５ｇ、０．０１２ｍｏｌ）を１５ｍＬの無水ＤＭＦに溶解した。１，３－プロパンスルトン（１．４当量、２．１１３ｇ、０．０１７ｍｏｌ）を、化合物１１－２の溶液に添加し、室温で３日間撹拌した。淡黄色の粘性油が残るまで、粗生成物を真空で乾燥させて、ＤＭＦを除去した。粘性油をジエチルエーテル（３０ｍＬ）で洗浄し、続いて酢酸エチル（３０ｍＬ）で別に洗浄して残りの１，３－プロパンスルトンを除去した。油を凍結乾燥し、化合物１１－３として白色固体を与えた。
【0395】
化合物１１－４:
化合物１１－３（４ｇ、０．０１２ｍｏｌ）を、５０ｍＬのＤＣＭに溶解し、０℃まで冷却すると、わずかに濁り、わずかに白色の溶液となった。０℃まで冷却後、ジオキサン（５ｍＬ）中の４Ｍ ＨＣｌを溶液に添加し、１時間撹拌したままにした。１時間後、溶液は透明になり、固体の白色塊状沈澱物が形成した。溶媒を真空で除去し、乾固させ、ＤＣＭ／イソプロパノール／ＭｅＯＨ（１０：５：１ｖ／ｖ比）で沈澱させた。沈澱生成物は、ベタついた白色塊であり、それを凍結乾燥した。最終生成物、化合物１１－４を白色固体として得、真空密封袋に入れて冷凍庫で保存した。化合物１１－４の１Ｈ ＮＭＲスペクトルを図２２に示す。
化合物１１－３（４ｇ、０．０１２ｍｏｌ）を、５０ｍＬのＤＣＭに溶解し、０℃まで冷却すると、わずかに濁り、わずかに白色の溶液となった。０℃まで冷却後、ジオキサン（５ｍＬ）中の４Ｍ ＨＣｌを溶液に添加し、１時間撹拌したままにした。１時間後、溶液は透明になり、固体の白色塊状沈澱物が形成した。溶媒を真空で除去し、乾固させ、ＤＣＭ／イソプロパノール／ＭｅＯＨ（１０：５：１ｖ／ｖ比）で沈澱させた。沈澱生成物は、ベタついた白色塊であり、それを凍結乾燥した。最終生成物、化合物１１－４を白色固体として得、真空密封袋に入れて冷凍庫で保存した。化合物１１－４の１Ｈ ＮＭＲスペクトルを図２２に示す。
【0396】
化合物１２－２／Ｉ－１１
スキーム１２に示すように、その後、スルホベタイン１１－４をＤＰＡ含有ポリマーキレート化剤１２－１に結合させ、化合物１２－２／ポリマーＩ－１１を得た。
スキーム１２に示すように、その後、スルホベタイン１１－４をＤＰＡ含有ポリマーキレート化剤１２－１に結合させ、化合物１２－２／ポリマーＩ－１１を得た。
【0397】
【化49】
【0398】
ＤＰＡキレート化剤含有ポリマー１２－１を、０．４ｍＬの０．２Ｍ ｐＨ８リン酸ナトリウム緩衝液に溶解した。ＤＭＴＭＭ（２８．８ｍｇ、０．１０４ｍｍｏｌ、ペンダント基１つにつき７．３当量）を、０．１ｍＬのＭｉｌｌｉＱ水に溶解し、ポリマー溶液に添加して、５分間事前反応させた。５分後、スルホベタイン１１－４（１４．５８ｍｇ、０．０６５ｍｍｏｌ、ペンダント基１つにつき５当量）を、ＤＰＡキレート化剤含有ポリマー１２－１溶液に添加し、反応混合物を一晩、室温で２０時間撹拌した。２０時間後、３ｋ ＭＷＣＯアミコンウルトラ４ｍＬスピンフィルタを使用して反応混合物を精製し、ＭｉｌｌｉＱ水で５回洗浄した。保持液を取り出し、凍結乾燥して、生成物、１２－２を与えた。化合物１２－２／Ｉ－１１の１Ｈ ＮＭＲスペクトルを、図２３に示す。
【0399】
化合物Ｉ－１２
ＰＢＳＭＡ７－１を、実施例７のスキーム７に示すように調製した。その後、スキーム１３に示すように、エチレンジアミンリンカーを７－１に結合させ、得られた化合物１３－１を、ＤＰＡキレート化剤含有ポリマー１２－１に結合させて、ポリマーＩ－１２を生成した。化合物Ｉ－１２の１Ｈ ＮＭＲスペクトルを、図２４に示す。
ＰＢＳＭＡ７－１を、実施例７のスキーム７に示すように調製した。その後、スキーム１３に示すように、エチレンジアミンリンカーを７－１に結合させ、得られた化合物１３－１を、ＤＰＡキレート化剤含有ポリマー１２－１に結合させて、ポリマーＩ－１２を生成した。化合物Ｉ－１２の１Ｈ ＮＭＲスペクトルを、図２４に示す。
【0400】
【化50】
【0401】
ＤＰＡ－キレート化剤含有ポリマー、化合物１２－１（Ｄｐ＝２０、Ｍｎ＝６０００ｇ／ｍｏｌ、０．０００５ｍｍｏｌ、３ｍｇ）を、０．１ｍＬの０．２Ｍ、ｐＨ８リン酸ナトリウム緩衝液に溶解した。０．１ｍＬのＭｉｌｌｉＱ水中のＤＭＴＭＭ（ペンダント基１つにつき７．３当量、２０．２０ｍｇ、０．０７３ｍｍｏｌ）溶液を、ＤＰＡ－キレート化剤含有ポリマー溶液に添加し、１０分間事前反応させた。その後、化合物１３－１（Ｍｎ＝５６００ｇ／ｍｏｌ、１１２ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ、ペンダントアミン１つにつき２当量）を、事前反応させたＤＰＡ－キレート化剤含有ポリマー、化合物１２－１溶液に添加し、一晩、室温で約２０時間撹拌したままにした。ＭｉｌｌｉＱ水で２回、２０ｍＭ ＮａＣｌ溶液で２回、再度ＭｉｌｌｉＱ水で３回のアミコンウルトラ－４ｍＬ １０ｋＤａ ＭＷＣＯ、スピンフィルタを使用して粗生成物を精製し、凍結乾燥してポリマー、化合物１３－２／Ｉ－１２を生成した。
【0402】
代わりに、スキーム１３ａにしたがって、化合物１３－１を調製することができる。
【0403】
【化51】
【0404】
４－シアノ－４－（フェニルカルボノチオイルチオ）ペンタン酸１３ａ－１（５００ｍｇ、１．７９ｍｍｏｌ、１当量）、ＥＤＣ（５５５．８ｍｇ、３．５８ｍｍｏｌ、２当量）、およびＮＨＳ（４１２ｍｇ、３．５８ｍｍｏｌ、２当量）を、最小限の量のアセトニトリルに溶解し、１５分間ボルテックスした。次に、Ｎ－Ｂｏｃ－エチレンジアミン１３ａ－２（４３０ｍｇ、２．６８５ｍｍｏｌ、１．５当量）を添加し、一晩撹拌した。２４時間後、圧縮空気で反応を乾燥させ、その後、シリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィで精製した。溶媒系は、１００％ＤＣＭから１：１ ＤＣＭ／ＥｔＯＡｃのグラジェント溶離であった。精製された生成物を真空で乾燥させて、所望の生成物、Ｎ－ｂｏｃ ＣＴＡ１３ａ－３として、赤ピンクの固体を与えた。
【0405】
Ｎ－ｂｏｃ ＣＴＡ１３ａ－３（４５ｍｇ、０．１０６７ｍｍｏｌ）、ＳＢＭＡモノマー１３ａ－５（１．４ｇ、２．２５２ｍｍｏｌ）、および４，４’－アゾビス（４－シアノ吉草酸）開始剤１３ａ－４（３．０３８ｍｇ、０．０１０８ｍｍｏｌ）を、４ｍＬの２，２，２－トリフルオロエタノールに溶解し、溶液を窒素ガスで２０分間通気した。溶液を窒素ガスで２０分間通気した後、反応を７０℃で６時間撹拌した。６時間後、反応を空気に曝露し、粗生成物の少量のアリコートをＨ ＮＭＲ用に採取し、トリフルオロ酢酸（１．７ｍＬ）を残りの粗生成物に添加し、一晩室温で撹拌してＢｏｃ基を加水分解した。２１時間後、試料を７：３ジエチルエーテル／メタノールで沈澱させ、２．７ｋ ｒｃｆで１５分間遠心分離して沈降させてペレット化した。上清を棄てた。ペレットを２，２，２－トリフルオロエタノールで一度再溶解し、７：３ジエチルエーテル／メタノールで再沈澱させ、同じ条件下で再度遠心分離した。このプロセスを２回繰り返した。試料を真空で乾燥させて、化合物１３－１を与えた。
【0406】
実施例１０ 種々の溶解度調節剤を用いる金属－キレート化ＤＰＡキレート化剤含有ポリマーの調製
３つのＤＰＡキレート化剤含有ポリマー（スキーム１４）を、実施例３および９に記載の方法に基づいて調製した。各ポリマーを、それぞれＫ２ＰｔＣｌ４またはＨｇＣｌ２を使用してプラチナまたは水銀で金属化した。プラチナ金属化を、メタノール中、４５℃で２時間実行した。水銀金属化を、メタノール中、室温で１時間実行した。金属化の成功は、ピリジルプロトンの化学シフトにおける変化によってプロトンＮＭＲにより評価された。化合物１４－２／ＩＩ－７および１４－３／ＩＩ－８のＮＭＲスペクトルを、図２１に示す。
３つのＤＰＡキレート化剤含有ポリマー（スキーム１４）を、実施例３および９に記載の方法に基づいて調製した。各ポリマーを、それぞれＫ２ＰｔＣｌ４またはＨｇＣｌ２を使用してプラチナまたは水銀で金属化した。プラチナ金属化を、メタノール中、４５℃で２時間実行した。水銀金属化を、メタノール中、室温で１時間実行した。金属化の成功は、ピリジルプロトンの化学シフトにおける変化によってプロトンＮＭＲにより評価された。化合物１４－２／ＩＩ－７および１４－３／ＩＩ－８のＮＭＲスペクトルを、図２１に示す。
【0407】
【化52】
【0408】
ＤＰＡ－キレート化剤含有ポリマー１２－１（Ｄｐ＝２０、Ｍｎ＝６０００ｇ／ｍｏｌ、０．０００５ｍｍｏｌ、３ｍｇ）を、０．１ｍＬの０．２Ｍ、ｐＨ８リン酸ナトリウム緩衝液に溶解した。０．１ｍＬのＭｉｌｌｉＱ水中のＤＭＴＭＭ（ペンダント基１つにつき７．３当量、２０．２０ｍｇ、０．０７３ｍｍｏｌ）溶液を、ＤＰＡ－キレート化剤含有ポリマー溶液に添加し、１０分間事前反応させた。その後、ポリ（ＳＢＭＡ）１３－１（Ｍｎ＝５６００ｇ／ｍｏｌ、１１２ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ、ペンダントアミン１つにつき２当量）を、事前反応させたＤＰＡ－キレート化剤含有ポリマー、化合物１２－１溶液に添加し、一晩、室温で約２０時間撹拌したままにした。ＭｉｌｌｉＱ水で２回、２０ｍＭ ＮａＣｌ溶液で２回、再度ＭｉｌｌｉＱ水で３回のアミコンウルトラ－４ｍＬ １０ｋＤａ ＭＷＣＯ、スピンフィルタを使用して粗生成物を精製し、凍結乾燥してポリマー、化合物１３－２／Ｉ－１２を生成した。
【0409】
【化53】
【0410】
化合物１３－２／Ｉ－１２（１１．６ｍｇを、メタノール／２，２，２－トリフルオロエタノール（１：１の体積比）に溶解した）。ＨｇＣｌ２の溶液（２ｍｇ／ｍＬ、７ｍＭ、３６０ｍＬ）を化合物１３－２／Ｉ－１２溶液に添加し、室温で撹拌した。赤色沈澱物が、１０分以内に形成し、反応を室温で１時間、撹拌したままにした。１０ｋ ｒｃｆで１０分間の遠心分離で赤色沈澱物をペレット化した。上清を棄て、ペレットをさらにＭｅＯＨで２回洗浄した。赤色ペレットを凍結乾燥して、化合物１４－６／ＩＩ－１１を与えた。（２７から採用された方法論）
【0411】
化合物１３－２／Ｉ－１２（２０ｍｇを水性ＭｅＯＨ（１：１の体積比）に溶解した）。Ｋ２ＰｔＣｌ４の溶液（５０ｍＭ、３６０ｍＬ）を化合物１３－２／Ｉ－１２に添加し、その後、４５℃で２時間加熱すると、黄色溶液となった。黄色溶液をＭｉｌｌｉＱ水で２回、２０ｍＭ ＮａＣｌ溶液で３回と、ＭｉｌｌｉＱ水で１回の洗浄のアミコンウルトラ－１５ｍＬ １０ｋ ＭＷＣＯスピンフィルタでスピン濾過した。その後、試料を凍結乾燥して、化合物１４－７／ＩＩ－１２を与えた。
【0412】
金属化反応も、溶媒系として２，２，２－トリフルオロエタノールおよびＭｅＯＨ／２，２，２－トリフルオロエタノールで行うことができる。
【0413】
実施例１１ 双性イオン性溶解度調節剤を用いるレニウム含有抗体コンジュゲートポリマーのマスサイトメトリーテスト
双性イオン性溶解度調節剤を含む本開示のレニウム－キレート化ポリマーを、抗体にコンジュゲートし、マスサイトメトリーを使用して非特異的結合について評価した。
双性イオン性溶解度調節剤を含む本開示のレニウム－キレート化ポリマーを、抗体にコンジュゲートし、マスサイトメトリーを使用して非特異的結合について評価した。
【0414】
抗体コンジュゲーション
マスサイトメトリー免疫測定法における双性イオン性溶解度調節剤を有するレニウムタグ付きポリマーの性能を評価するため、改定されたＭａｘｐａｒ（商標）抗体標識プロトコルにしたがって、２つの一次抗体、ＣＤ２０およびＣＤ８ａをポリマータグで標識した。簡潔に言うと、抗体をＴＣＥＰにより部分的に還元し、スピンフィルタ（３０ｋＤａ）で洗浄し、その後、過剰（２０倍）のＤＢＣＯ－ＰＥＧ４－マレイミドと混合した。混合物を３７℃で３０分間インキュベートした。スピンフィルタ（３０ｋＤａ）を使用してＤＢＣＯ修飾Ａｂを精製し、その後、所望のポリマー質量タグと混合した。混合物を３７℃で９０分間インキュベートした。過剰のポリマーを、スピンフィルタ（１００ｋＤａ）により除去した。
マスサイトメトリー免疫測定法における双性イオン性溶解度調節剤を有するレニウムタグ付きポリマーの性能を評価するため、改定されたＭａｘｐａｒ（商標）抗体標識プロトコルにしたがって、２つの一次抗体、ＣＤ２０およびＣＤ８ａをポリマータグで標識した。簡潔に言うと、抗体をＴＣＥＰにより部分的に還元し、スピンフィルタ（３０ｋＤａ）で洗浄し、その後、過剰（２０倍）のＤＢＣＯ－ＰＥＧ４－マレイミドと混合した。混合物を３７℃で３０分間インキュベートした。スピンフィルタ（３０ｋＤａ）を使用してＤＢＣＯ修飾Ａｂを精製し、その後、所望のポリマー質量タグと混合した。混合物を３７℃で９０分間インキュベートした。過剰のポリマーを、スピンフィルタ（１００ｋＤａ）により除去した。
【0415】
マスサイトメトリー滴定実験
その後、抗体価測定実験を、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）で実行し、コンジュゲートの性能を評価した。これらの実験において、１４５Ｎｄ－ＣＤ４、１４６Ｎｄ－ＣＤ８ａ、１６５Ｈｏ－ＣＤ１６、１５４Ｓｍ－ＣＤ４５、１６０Ｇｄ－ＣＤ１４、１７０Ｅｒ－ＣＤ３および１４７Ｓｍ－ＣＤ２０を含む７－ｐｌｅｘ抗体パネル（フリューダイムＭａｘｐａｒ（商標）試薬）でヒトＰＢＭＣを染色した。レニウムコンジュゲートの滴定のため、１４７Ｓｍ－ＣＤ２０および１４６Ｎｄ－ＣＤ８ａが１８７／１８５Ｒｅ－ＣＤ２０および１８７／１８５Ｒｅ－ＣＤ８ａで置き換えられた別個の染色パネルを使用した。１８７／１８５Ｒｅ－ＣＤ２０／ＣＤ８ａコンジュゲートを、０．２５μｇ／ｍＬ、０．５μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬおよび２．０μｇ／ｍＬの濃度で滴定した。図２５に示すように、１８７／１８５Ｒｅ－ＣＤ２０は、ＰＢＭＣ中の残りの細胞サブセットからのＣＤ２０＋Ｂ細胞サブセットの明確な分離を可能にする。同様に、１８７／１８５Ｒｅ－ＣＤ８ａもまた、すべての力価でＰＢＭＣ中の残りの細胞サブセットからのＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットの明確な分離を可能にする（図２６）。重要なことには、図２７および図２８に示すように、コンジュゲートは両方とも、他の細胞集団への最小の非特異的結合を示した。レニウムタグ付きＣＤ２０コンジュゲートは、非Ｔ／Ｂ細胞への最小の非特異的結合を示した。（図２７）レニウムタグ付きＣＤ８ａコンジュゲートは、Ｂ細胞への最小の非特異的結合を示した。（図２８）
その後、抗体価測定実験を、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）で実行し、コンジュゲートの性能を評価した。これらの実験において、１４５Ｎｄ－ＣＤ４、１４６Ｎｄ－ＣＤ８ａ、１６５Ｈｏ－ＣＤ１６、１５４Ｓｍ－ＣＤ４５、１６０Ｇｄ－ＣＤ１４、１７０Ｅｒ－ＣＤ３および１４７Ｓｍ－ＣＤ２０を含む７－ｐｌｅｘ抗体パネル（フリューダイムＭａｘｐａｒ（商標）試薬）でヒトＰＢＭＣを染色した。レニウムコンジュゲートの滴定のため、１４７Ｓｍ－ＣＤ２０および１４６Ｎｄ－ＣＤ８ａが１８７／１８５Ｒｅ－ＣＤ２０および１８７／１８５Ｒｅ－ＣＤ８ａで置き換えられた別個の染色パネルを使用した。１８７／１８５Ｒｅ－ＣＤ２０／ＣＤ８ａコンジュゲートを、０．２５μｇ／ｍＬ、０．５μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬおよび２．０μｇ／ｍＬの濃度で滴定した。図２５に示すように、１８７／１８５Ｒｅ－ＣＤ２０は、ＰＢＭＣ中の残りの細胞サブセットからのＣＤ２０＋Ｂ細胞サブセットの明確な分離を可能にする。同様に、１８７／１８５Ｒｅ－ＣＤ８ａもまた、すべての力価でＰＢＭＣ中の残りの細胞サブセットからのＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットの明確な分離を可能にする（図２６）。重要なことには、図２７および図２８に示すように、コンジュゲートは両方とも、他の細胞集団への最小の非特異的結合を示した。レニウムタグ付きＣＤ２０コンジュゲートは、非Ｔ／Ｂ細胞への最小の非特異的結合を示した。（図２７）レニウムタグ付きＣＤ８ａコンジュゲートは、Ｂ細胞への最小の非特異的結合を示した。（図２８）
【0416】
ＰＥＧ修飾Ｒｅ含有ポリマーとの比較
双性イオン性溶解度調節剤の非特異的結合特性を、他の溶解度調節剤と比較して評価するため、ＰＥＧ修飾ポリマーを合成し、実施例１に記載の方法に基づいてＲｅ金属にキレート化した。マスサイトメトリー実験のため、両ポリマーを、種々の濃度（１ｕｇ／ｍＬ、２ｕｇ／ｍＬおよび５ｕｇ／ｍＬ）で抗体染色カクテルと混合し、得られた抗体カクテルを使用して、上記の通常の染色プロトコルにしたがってＰＢＭＣを染色した。このＰＥＧ修飾ポリマーが、ＰＢＭＣ中の主要な細胞サブセットへの非特異的結合を１ｕｇ／ｍＬで示したことが観察された。（図２９を参照されたい）
双性イオン性溶解度調節剤の非特異的結合特性を、他の溶解度調節剤と比較して評価するため、ＰＥＧ修飾ポリマーを合成し、実施例１に記載の方法に基づいてＲｅ金属にキレート化した。マスサイトメトリー実験のため、両ポリマーを、種々の濃度（１ｕｇ／ｍＬ、２ｕｇ／ｍＬおよび５ｕｇ／ｍＬ）で抗体染色カクテルと混合し、得られた抗体カクテルを使用して、上記の通常の染色プロトコルにしたがってＰＢＭＣを染色した。このＰＥＧ修飾ポリマーが、ＰＢＭＣ中の主要な細胞サブセットへの非特異的結合を１ｕｇ／ｍＬで示したことが観察された。（図２９を参照されたい）
【0417】
ＰＥＧ溶解度調節剤で修飾された本開示のポリマーは、双性イオン性溶解度調節剤で修飾されたポリマーと比較して、より高いＰＢＭＣへの非特異的結合を示した。（図２９を参照されたい）双性イオン性溶解度調節剤で修飾されたポリマーは、ＰＢＭＣの主要なサブセットへの最小の非特異的結合を５ｕｇ／ｍＬで示した。双性イオン修飾レニウムポリマーは、ＰＥＧ修飾レニウムポリマーよりもかなり低いＰＢＭＣへの非特異的結合を示した。
【0418】
実施例１２ Ｈ－Ｄａｐジピコリルアミンキレート化剤の調製
Ｈ－Ｄａｐジピコリルアミンベースのキレート化剤を、スキーム１６に示すように調製した。
Ｈ－Ｄａｐジピコリルアミンベースのキレート化剤を、スキーム１６に示すように調製した。
【0419】
【化54】
【0420】
Ｈ－Ｄａｐ（Ｂｏｃ）－ＯＭｅＨＣｌ１６－１（０．５ｇ、１．８６ｍｍｏｌ、１当量）を約３０ｍＬの無水アセトニトリルに溶解し、３０分間撹拌しながらＮ２（ｇ）で通気した。次に、２－ピコリルクロリド塩酸塩（２．２当量、６７１．２１ｍｇ、４．０９２ｍｍｏｌ）、Ｋ２ＣＯ３（３．２当量、５．９５ｍｍｏｌ、８２２．６ｍｇ）を連続的に添加し、反応を室温で２時間撹拌した。２時間撹拌した後、ヨウ化カリウム（１当量、６７９．２７ｍｇ、４．０９２ｍｍｏｌ）を添加し、反応を加熱して還流（約８５℃）で撹拌した。その後、反応を一晩（約１８時間）反応させたままにした。試料を真空で乾燥させてアセトニトリルを除去した。乾燥した粗生成物をＤＣＭに再溶解させた。ＤＣＭ有機相を３×１００ｍＬの水で洗浄した。有機相を回収して真空で乾燥し、褐色固体として生成物、Ｈ－Ｄａｐ Ｂｏｃ－ＯＭｅジピコリルアミン１６－２を与えた。
【0421】
Ｈ－Ｄａｐ Ｂｏｃ－ＯＭｅジピコリルアミン１６－２（１８５ｍｇ）をＭｉｌｌｉＱ水および濃ＨＣｌの１：１混合物（約６Ｍ ＨＣｌにする）４０ｍＬに溶解した。その後、試料を１１０℃で一晩還流した（反応開始時間：１１：４０ａｍ）。２４時間後、反応混合物を真空で乾燥させた。試料を約２０ｍＬのＭｉｌｌｉＱ水に再溶解し、１Ｍ ＮａＯＨで塩基性にして酸を中和した（ｐＨ試験紙で調べた）。試料を一晩凍結乾燥し、その後、ＤＣＭで再溶解した。その後、ＤＣＭ相を２．７ｋ ｒｃｆで１５分間遠心分離し、中和由来のあらゆる塩を除去した。生成物１６－３を乾燥させ、暗褐色固体として回収した。化合物１６－３の１Ｈ ＮＭＲスペクトルを、図３０に示す。
【0422】
本明細書で説明されるように、本開示のポリマーの調製にキレート化剤１６－３を使用した。
【0423】
実施例１３ リガンド交換を通じた調節剤の金属含有ポリマーへの付加
溶解度調節剤などの調節剤は、グルタチオンなどの小分子とのリガンド交換により、金属中心を介して金属含有ポリマーに導入されている。（スキーム１７および１８）
溶解度調節剤などの調節剤は、グルタチオンなどの小分子とのリガンド交換により、金属中心を介して金属含有ポリマーに導入されている。（スキーム１７および１８）
【0424】
【化55】
【0425】
【化56】
【0426】
水銀含有ポリマーまたはプラチナ含有ポリマー（２５０ｕＬ中に３ｍｇ）を含む溶液に、グルタチオン溶液（３２５ｍＭ、５０ｕＬ）を添加し、反応を室温で１５分間穏やかにボルテックスした。その後、２．７ｋ ｒｃｆでＭｉｌｌｉＱ水を用いて８回、アミコン、ウルトラ－０．５、３ｋＤａで試料をスピン濾過した。試料を凍結乾燥し、ポリマーを与えた。
【0427】
本明細書に記載のリガンド交換反応のために１つまたは複数のチオール官能基を含む小分子チオールの他の例には、システイン、チオグリコール酸、メルカプトコハク酸、チオグリコール酸メチル、ジメルカプロール、ジメルカプトコハク酸、２，３－ジメルカプト－１－プロパンスルホネートが含まれるがこれらに限定されない。
【0428】
グルタチオンリガンドを含むポリマーは、ハロゲン化物リガンドを有する元のポリマーと比較して、より可溶性であったことが観察された。例えば、Ｈｇポリマーについては、ＭｉｌｌｉＱ水中で未溶解の種が観察された。これらの沈澱物を、０．２ｕｍナイロンシリンジフィルタを使用して濾取した。グルタチオンの添加により、沈澱物を再溶解することができ、その後、アミコン、ウルトラ－０．５、３ｋＤａスピンフィルタを使用して、それらをスピン濾過により精製した。１Ｈ ＮＭＲは、（水に）再溶解した種が、ＤＰＡ－スルホベタイン修飾ポリマーであったことを示した。したがって、金属中心で溶解度調節剤を導入するためのリガンド交換は、溶解度を高めることができた。
【0429】
いくつかの本開示のグルタチオン修飾Ｐｔ含有ポリマーを調製し、溶解度調節剤としてグルタチオンリガンドがないそれらの対応物と比較した：
【0430】
【表2】
【0431】
ポリマーを抗体にコンジュゲートし、実施例１１に記載のものに基づいてマスサイトメトリー法を使用して非特異的結合について評価した。結果を図３１に示す。マスサイトメトリー結果で示されるように、グルタチオン修飾ポリマーは、テストされたポリマーすべてについてより小さい非特異的結合を示した。
【0432】
本出願は、実施例を参照して説明している一方で、特許請求の範囲は、実施例に記載される実施形態により限定されるべきではないが、全体として、本明細書と一致している最も広い解釈を与えるべきであると理解されるべきである。
【0433】
すべての刊行物、特許、および特許出願は、あたかも個々の刊行物、特許、または特許出願のそれぞれが、その全体が参照により組み込まれることが具体的で個別に示されたのと同じ範囲で、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれている。本出願の用語が、参照により本明細書に組み込まれる文書内で異なって定義されていることが判明した場合、本明細書で提供された定義は、その用語についての定義として機能する。
【0434】
本明細書で言及された文献の引用
【表3】
【図1】
【図2】
【図3(a)】
【図3(b)】
【図3(c)】
【図3(d)】
【図3(e)】
【図3(f)】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14A】
【図14B】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【国際調査報告】