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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-07-12
(54)【発明の名称】脂肪由来細胞株の単離方法及びその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 5/0775 20100101AFI20240705BHJP
C12N 5/00 20060101ALI20240705BHJP
C12N 5/077 20100101ALI20240705BHJP
A23J 1/04 20060101ALI20240705BHJP
A23L 33/115 20160101ALI20240705BHJP
A61K 8/98 20060101ALI20240705BHJP
A61Q 90/00 20090101ALI20240705BHJP
【ＦＩ】
C12N5/0775
C12N5/00
C12N5/077
A23J1/04
A23L33/115
A61K8/98
A61Q90/00
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024500671
(86)(22)【出願日】2022-07-08
(85)【翻訳文提出日】2024-03-11
(86)【国際出願番号】 SG2022050482
(87)【国際公開番号】W WO2023282855
(87)【国際公開日】2023-01-12
(31)【優先権主張番号】10202107584T
(32)【優先日】2021-07-09
(33)【優先権主張国・地域又は機関】SG
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】503231882
【氏名又は名称】エージェンシー フォー サイエンス，テクノロジー アンド リサーチ
(74)【代理人】
【識別番号】110002860
【氏名又は名称】弁理士法人秀和特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】チュウ，ジャン ミン ラモニー
(72)【発明者】
【氏名】ルウィン，キン オー アンジェラ
(72)【発明者】
【氏名】ウォン，イェ キ チェリル
(72)【発明者】
【氏名】杉井 重紀
【テーマコード（参考）】
4B018
4B065
4C083
【Ｆターム（参考）】
4B018LB06
4B018LB10
4B018LE01
4B018LE05
4B018MD07
4B018MD74
4B018ME02
4B018MF14
4B065AA90X
4B065AC14
4B065BD25
4B065CA24
4B065CA41
4B065CA50
4C083AA071
4C083CC01
4C083FF01
(57)【要約】
本技術は、動物から脂肪由来細胞株を単離する方法、動物から含脂肪細胞を単離する方法、及び単離されたその脂肪由来細胞株に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
動物から脂肪由来細胞株を単離する方法であって、（ａ）動物から脂肪組織試料を得ること、
（ｂ）（ａ）の前記脂肪組織試料から間質血管細胞を採取すること、
（ｃ）血清の存在下で（ｂ）の前記間質血管細胞を増殖させること、
（ｄ）前記細胞の増殖に基づいて前記増殖した間質血管細胞のクローン選択を行うこと、及び
（ｅ）（ｄ）の前記選択の結果に基づいて１又は複数の脂肪由来細胞株を単離すること、を含む、方法。
【請求項2】
前記単離された細胞株が老化状態に入らないことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
（ｄ）における前記増殖した間質血管細胞が約１６～約３０継代増殖し続ける場合、前記単離された脂肪由来細胞株は（ｅ）において単離される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
前記間質血管細胞が、血清及びウシ胎児血清（ＦＢＳ）の存在下で増殖する、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記脂肪組織が、内臓脂肪組織、皮下脂肪組織、筋肉内脂肪組織、又は筋肉間脂肪組織である、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
リノール酸－オレイン酸アルブミン（ＬＡＯＡ）、インスリン、血清、並びに所望により３－イソブチル－１－メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）、デキサメタゾン、及びインドメタシンのうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は全てを含む、脂肪生成誘導組成物。
【請求項7】
塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）及びウシ胎児血清（ＦＢＳ）をさらに含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項8】
動物から含脂肪細胞を得る方法であって、（ａ）前記動物の組織試料から脂肪由来細胞を単離すること、
（ｂ）請求項６又は７に記載の脂肪生成誘導組成物の存在下で前記脂肪由来細胞を培養すること、及び
（ｃ）（ｂ）の前記細胞培養物から含脂肪細胞を得ること、を含む、方法。
【請求項9】
前記脂肪由来細胞が、ビタミン及びオメガ３脂肪酸の存在下でさらに培養される、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
工程（ｂ）の前記脂肪由来細胞が、少なくとも約３日間、又は約６日間、又は約９日間培養される、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項11】
（ｂ）において約３日間培養した後、前記血清、３－イソブチル－１－メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）、デキサメタゾン、及びインドメタシンが除去される、請求項８～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
前記方法が、バイオリアクター内で行われる、請求項８～１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
前記バイオリアクターがマイクロキャリアを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
工程（ａ）が、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法に従って行われる、請求項８～１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
請求項１～５のいずれか一項に記載の方法により得られる又は得ることが可能な脂肪由来細胞株であって、少なくとも１６継代を経ても老化状態に入らないことを特徴とする、脂肪由来細胞株。
【請求項16】
前記細胞の倍加時間が約４８時間未満である、請求項１５に記載の細胞株。
【請求項17】
前記細胞が凍結保存されている、請求項１５又は１６に記載の細胞株。
【請求項18】
インビトロでの脂肪由来動物細胞の脂肪生成誘導用キットであって、（ａ）請求項６又は７に記載の組成物、及び
（ｂ）請求項１５～１７のいずれか一項に記載の脂肪由来細胞株又は請求項１～５のいずれか一項に記載の方法に従って得られる単離された脂肪由来細胞株、を含むキット。
【請求項19】
前記動物が家禽、家畜、又は魚類である、請求項１～５及び８～１３のいずれか一項に記載の方法、請求項１５～１７のいずれか一項に記載の細胞株、又は請求項１８に記載のキット。
【請求項20】
前記魚類が硬骨魚（硬骨魚綱）又は軟骨魚（軟骨魚綱）である、請求項１９に記載の方法、細胞株、又はキット。
【請求項21】
前記魚類が下記群から選択される、請求項１９に記載の方法、細胞株、又はキット：カイヤン（Ｐａｎｇａｓｉａｎｏｄｏｎ ｈｙｐｏｐｈｔｈａｌｍｕｓ）、ニホンウナギ（Ａｎｇｕｉｌｌａ ｊａｐｏｎｉｃａ）、ジェイドパーチ（Ｓｃｏｒｔｕｍ ｂａｒｃｏｏ）、及びバラマンディ（Ｌａｔｅｓ ｃａｌｃａｒｉｆｅｒ）。
【請求項22】
前記血清が、同一門の動物から得られる血清である、請求項１～５及び８～１３のいずれか一項に記載の方法又は請求項１８に記載のキット。
【請求項23】
前記血清が、同一種の動物から得られる血清である、請求項１～５及び８～１３のいずれか一項に記載の方法又は請求項１８に記載のキット。
【請求項24】
前記血清が、魚血清である、請求項１～５及び８～１３のいずれか一項に記載の方法又は請求項１８に記載のキット。
【請求項25】
請求項７～１３のいずれか一項に記載の方法により製造される脂肪細胞。
【請求項26】
請求項１５～１７のいずれか一項に記載の細胞株又は請求項２５に記載の脂肪細胞を含む食品。
【請求項27】
前記食品が養殖肉である、請求項２６に記載の食品。
【請求項28】
請求項１５～１７のいずれか一項に記載の細胞株から得られる脂質組成物、又は請求項２５に記載の脂肪細胞から単離された脂肪。
【請求項29】
前記組成物が液体又は固体である、請求項２８に記載の脂質組成物。
【請求項30】
化粧品、食品添加物、又は栄養補助食品における、請求項２８又は２９に記載の脂質組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、概して細胞生物学の分野に関する。特に、本発明は、脂肪由来細胞株を単離し、さらなる使用のためにこれらの細胞株を培養する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
世界人口の増加により、食糧需要に大きな負担がかかっている。２０５０年までに１００億人近くの人口を養うためには、５億７，０００万超の農場からの現在の食料供給システムが陸域及び水域環境に強い圧力をかけている。特に、動物製品の環境への影響は野菜の影響をはるかに上回っており、世界の農地の８０％超、食料生産による温室効果ガス排出量の５６％超を占めている。
【0003】
細胞農業は、従来の家畜や植物の畜産及び収穫よりはむしろ、細胞培養技術に由来する農産物の製造を目的とした新興分野である。細胞農業は、環境負荷が少なく、食品の大規模生産において有望な可能性を有している。さらに、細胞農業には、動物の屠殺がないこと、病害防除が容易であること、生産プロセスにおける抗生物質及び汚染のない生産の可能性があることなどの利点がある。
【0004】
細胞ベースの肉は、培養肉（ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｍｅａｔ）、クリーンミート（ｃｌｅａｎ ｍｅａｔ）、実験室で育てた肉（ｌａｂ－ｇｒｏｗｎ ｍｅａｔ）、又は養殖肉（ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ ｍｅａｔ）とも称され、動物の肉に似た食用の食品構造を作り出すために、細胞農業技術及び動物細胞株のバイオ製造技術を利用している。筋肉は肉製品の主な構成要素であるが、脂肪、特に筋肉内脂肪は肉のジューシーさ及び柔らかさに寄与し、したがって美味しさ及び満腹感を向上させる。米国農務省（ＵＳＤＡ）によると、脂肪は効率的なエネルギー源としても機能し、炭水化物及びタンパク質のエネルギーが４．１ｋｃａｌ／ｇであるのに対し、食品では８．８ｋｃａｌ／ｇのエネルギーを提供する。
【0005】
研究及びマーケティングでの取り組みが急速に進歩し、様々なタンパク質の生産に関する細胞ベースの肉の開発が世間の注目を集めている。しかし、細胞ベースの肉製品の味、栄養価、及び食味を改善するために使用できる細胞ベースの脂肪を生産することはほとんど行われていない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0006】
一態様では、本開示は、（ａ）動物から脂肪組織試料を得ること、（ｂ）（ａ）の前記脂肪組織試料から間質血管細胞を採取すること、（ｃ）血清の存在下で（ｂ）の前記間質血管細胞を増殖させること、（ｄ）前記細胞の増殖に基づいて前記増殖した間質血管細胞のクローン選択を行うこと、及び（ｅ）（ｄ）の前記選択の結果に基づいて１又は複数の脂肪由来細胞株を単離すること、を含む、動物から脂肪由来細胞株を単離する方法に言及する。
【0007】
別の態様では、本開示は、リノール酸－オレイン酸アルブミン（ＬＡＯＡ）、インスリン、血清、並びに所望により３－イソブチル－１－メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）、デキサメタゾン、及びインドメタシンのうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は全てを含む、脂肪生成誘導組成物に言及する。
【0008】
別の態様では、本開示は、動物から含脂肪細胞を得る方法であって、（ａ）前記動物の組織試料から脂肪由来細胞を単離すること、（ｂ）本明細書に開示されるように脂肪生成
誘導組成物の存在下で前記脂肪由来細胞を培養すること、及び（ｃ）（ｂ）の細胞培養物から含脂肪細胞を得ること、を含む、方法に言及する。
誘導組成物の存在下で前記脂肪由来細胞を培養すること、及び（ｃ）（ｂ）の細胞培養物から含脂肪細胞を得ること、を含む、方法に言及する。
【0009】
別の態様では、本開示は、少なくとも１６継代を経ても老化状態に入らないことを特徴とする、本明細書に開示される方法によって得られる又は得ることが可能な脂肪由来細胞株に言及する。
【0010】
別の態様では、本開示は、（ａ）本明細書に開示される組成物、及び（ｂ）本明細書に開示される脂肪由来細胞株又は本明細書に開示される方法に従って得られる単離された脂肪由来細胞株、を含む、インビトロでの脂肪由来動物細胞の脂肪生成誘導用キットに言及する。
【0011】
別の態様では、本開示は、本明細書に開示される方法によって生成される脂肪細胞に言及する。
【0012】
別の態様では、本開示は、本明細書に開示される細胞株又は本明細書に開示される脂肪細胞を含む食品に言及する。
【0013】
別の態様では、本開示は、本明細書に開示される細胞株から得られる脂質組成物又は本明細書に開示される脂肪細胞から単離された脂肪に言及する。
【0014】
別の態様では、本開示は、化粧品、食品添加物、又は栄養補助食品における本明細書に開示の脂質組成物の使用に言及する。
【0015】
本発明は、詳細な説明を参照し、非限定的な実施例及び添付の図面と併せて考慮することにより、よりよく理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0016】
【図1A】図１Ａは、培養肉生産の例示的な手順の概要を示した図である。動物から直接得られた組織を処理し、そこから安定した細胞株を生成する。続いて、前記細胞株を大規模に培養して、例えば、細胞の接着をサポートするマイクロキャリアを使用して大量に増殖させる。増殖後の大量の細胞は、筋細胞及び含脂肪細胞などの目的の細胞種に分化し、食用足場と結合されて培養肉が製造される。
【図2】図２は、動物組織試料から生成された単離脂肪由来幹細胞を示す顕微鏡画像を示した図である。図２Ａに、本明細書に開示される方法を使用した細胞培養におけるカイヤン（Ｐａｎｇａｓｉａｎｏｄｏｎ ｈｙｐｏｐｈｔｈａｌｍｕｓ）から単離された脂肪組織の増殖を示す。魚血清の存在は、新たに単離された脂肪由来細胞の生存に寄与するため、脂肪由来細胞の単離に必要となる。図２Ｂに、本明細書に開示されるものと同様の手順を使用して、異なる動物、例えば、４種の魚類から、本明細書に開示される方法に従って首尾よく単離及び増殖された脂肪由来細胞の画像を示す。スケールバーは２００μｍを表す。
【図3】図３は、本明細書に開示される方法に基づくクローン選択の前後の脂肪由来細胞の形態を示す例示的な画像を示した図である。前記細胞は、クローン選択の前後で一貫して紡錘形を維持する。左パネルに４倍の倍率で細胞を示し（スケールバーは２００μｍを表す）、右パネルに１０倍の倍率で細胞を示す（スケールバーは８０μｍを表す）。
【図4】図４は、様々な濃度の魚血清存在下での脂肪由来細胞の増殖速度を示した図である。本明細書に開示される方法に基づいて得られる単離された脂肪由来細胞は、血清存在下で培養する必要がある。細胞の増殖及び拡大をサポートするのに使用する血清の適切な量を決定するために、カイヤン細胞株を、２０％ＦＢＳ及び滴定濃度の魚血清を含む完全培地で増殖させた。細胞株の細胞増殖は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｂｌｕｅ（登録商標）Ａｓｓａｙを使用して５日間測定した。データは各細胞株の最大蛍光強度のパーセンテージとして表され、４つの細胞株の平均±ＳＥＭとして示されている。アスタリスク（＊）は、一元配置分散分析（ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）とそれに続くテューキー事後検定（Ｔｕｋｅｙ ｐｏｓｔ－ｈｏｃ ｔｅｓｔ）を使用して、０％魚血清中で増殖させた細胞株と比較した場合のｐ＜０．０５を示す。
【図5】図５は、様々な動物の１５％ＦＢＳ及び０．１％血清の存在下での脂肪由来細胞の増殖速度を示した図である。本明細書に開示される方法に基づいて得られる単離された脂肪由来細胞を、パンガシウス（Ｐａｎｇａｓｉｕｓ）又はティラピア（Ｔｉｌａｐｉａ）の魚血清の存在下で培養した。魚血清が魚類細胞株の増殖を維持するのに有利であるかどうかを判断するために、図５に、１５％ＦＢＳ及び０．１％の異なる動物血清を含む完全増殖培地中での４日間にわたる例示的な細胞株Ｐｈ９Ｆ－１ｘの増殖速度を示す。データは、３つの独立したウェルの平均±ＳＥＭとして示されている。アスタリスク（＊）は、一元配置分散分析とそれに続くテューキー事後検定を使用したｐ＜０．０５を示す。
【図6】図６は、様々な濃度のＦＢＳ存在下での脂肪由来細胞の増殖速度を示した図である。本明細書に開示される方法に基づいて得られる単離された脂肪由来細胞は、ＦＢＳ存在下で培養する必要がある。ＦＢＳの適切な量を決定するために、図６Ａに、カイヤンの脂肪由来細胞株を、０．１％魚血清及び滴定濃度のＦＢＳを含む完全培地中で５日間かけて増殖させたことを示す。図６Ｂは、滴定濃度のＦＢＳを含む完全培地中で４日間増殖させたニホンウナギ（Ａｎｇｕｉｌｌａ ｊａｐｏｎｉｃａ）脂肪由来細胞株を示した図である。細胞株の細胞増殖は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｂｌｕｅ（登録商標）Ａｓｓａｙを使用して測定した。データは各細胞株の最大蛍光強度（ＦＩ）のパーセンテージとして表され、４つの細胞株の平均±ＳＥＭとして示されている。アスタリスク（＊）は、一元配置分散分析とそれに続くテューキー事後検定を使用したｐ＜０．０５を示す。
【図7】図７は、経時的に得られたいくつかの脂肪組織由来細胞株の増殖を示した図である。例示的なカイヤン細胞株を、０．１％魚血清及び１５％ＦＢＳを含む完全培地中で５日間かけて増殖させた。別の異なる種のニホンウナギ細胞株を、１０％ＦＢＳを含む完全培地中で４日間かけて増殖させた。細胞株の増殖は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｂｌｕｅ（登録商標）Ａｓｓａｙを使用して測定した。データは、３つの独立したウェルの平均±標準偏差として示されている。細胞株の増殖にはバリエーションがあり、細胞株はその増殖速度に応じて、それぞれ高速増殖細胞株と低速増殖細胞株とに分類される。
【図8】図８は、本発明で開示される単離された脂肪由来細胞株にマイコプラズマ汚染がないことを示した図である。細胞培養上清中のマイコプラズマの存在を、ＭｙｃｏＡＬＥＲＴ（商標）ＰＬＵＳマイコプラズマ検出キットを使用して検出した。１．０未満の相対発光単位（ＲＬＵ）は負とみなす。データは、２～４回の反復の平均として示されている。
【図9】図９は、単離された脂肪由来細胞株を培養するために通常利用可能な例示的な基本培地を示した図である。例示的なカイヤン脂肪由来細胞株は、リーヴォヴィッツ（Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ）Ｌ１５培地、ＭｅｓｅｎＣｕｌｔ（商標）－ＡＣＦ Ｐｌｕｓ培地、及びＳｔｅｍＰｒｏ（商標）ＭＳＣ ＳＦＭ ＣＴＳ培地と比較して、ＤＭＥＭ培地及びＡｄｖａｎｃｅｄ（商標）ＤＭＥＭ培地で著しく速く増殖する。試験した細胞株は、０．１％魚血清を含む異なる培地で増殖させた。細胞株の細胞増殖は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｂｌｕｅ（登録商標）Ａｓｓａｙを使用して５日間測定した。データは、４つの細胞株の平均±ＳＥＭとして示されている。アスタリスク（＊）は、一元配置分散分析とそれに続くテューキー事後検定を使用したｐ＜０．０５を示す。
【図10】図１０は、本明細書に開示される方法に従って単離された例示的な脂肪由来細胞株（カイヤン及びニホンウナギ）の平均集団倍加時間に対する経時的な細胞数を示した図である。高速増殖細胞株であるカイヤン由来のＰｈ９Ｆ－１ｘ及びニホンウナギ由来のＡｊ１Ｃ－１ｘを７２時間増殖させた。核はＣｙＱＵＡＮＴ（商標）直接細胞増殖アッセイで染色し、２４時間ごとに画像化した。２つの細胞株の倍加時間は、それぞれ約１３．７時間及び約３１．２時間と計算される。データは、３つの独立したウェルの平均±標準偏差として示されている。
【図11】図１１は、２１継代目、５４継代目、及び１１３継代目など、高速増殖する魚脂肪由来細胞株Ｐｈ９Ｆ－１ｘの経時的な形態及び細胞数の増加を示した図である（スケールバーは２００μｍを表す）。本明細書に開示される単離された脂肪由来細胞株は、多数の継代後に増殖することができ、紡錘形の外観という同じ形態学的特徴を保持することができる。細胞は、継代前に約７０％コンフルエントになるまで培養で増殖させた。ＣｙＱＵＡＮＴ（商標）直接細胞増殖アッセイで核を染色し、３日間、２４時間ごとにイメージングすることにより、細胞数を測定した。データは、４つの独立したウェルの平均±標準偏差として示されている。
【図12】図１２は、ＤＭＥＭの例示的な誘導培地及び１００μＭのリノール酸－オレイン酸アルブミン（ＬＡＯＡ）を含む脂肪生成誘導カクテルで処理した後、成熟脂肪細胞に分化する、例示的な高速増殖脂肪由来細胞株Ｐｈ９Ｆ－１ｘの脂肪生成誘導を示した図である。図１２Ａに、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２で染色された細胞核及びＡｄｉｐｏＲｅｄ（商標）で染色された中性脂質の画像を示す。画像は１０倍の倍率で撮影されている。スケールバーは１００μｍを表す。図１２Ｂに、脂肪生成のパーセンテージ（中性脂質を発現する細胞の数によって決定される）を示す。図１２Ｃに、処理された細胞の総脂質蓄積（ＡｄｉｐｏＲｅｄ（商標）の総蛍光強度によって決定される）を示す。データは、３つの独立したウェルの平均±標準偏差として示されている。アスタリスク（＊）は、一元配置分散分析とそれに続くテューキー事後検定を使用したｐ＜０．０５を示す。
【図13】図１３は、脂肪生成誘導後に成熟脂肪細胞に分化する例示的なニホンウナギ細胞株及びジェイドパーチ（Ｓｃｏｒｔｕｍ ｂａｒｃｏｏ）細胞株の例示的な画像を示した図である。細胞株は、１００μＭのＬＡＯＡを含む脂肪生成誘導カクテルを含む例示的なＤＭＥＭで処理されている。細胞核はＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２で染色し、中性脂質はＡｄｉｐｏＲｅｄ（商標）で染色した。画像は１０倍の倍率で撮影されている。スケールバーは１００μｍを表す。
【図14】図１４は、成熟脂肪細胞に分化する脂肪由来細胞株Ｐｈ９Ｆ－１ｘの別の例を示した図である。図１４Ａに、ＦＢＳ含有ＤＭＥＭベースの脂肪生成誘導カクテル及びＦＢＳ不含Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ６（商標）ベースの脂肪生成誘導カクテルを使用する例示的な脂肪生成プロトコルを示す概略図を示す。本明細書で使用される例示的なＤＭＥＭベースの脂肪生成誘導カクテルは、高グルコースＤＭＥＭ、ＦＢＳ、魚血清、抗生物質、インスリン、デキサメタゾン、ＩＢＭＸ、インドメタシン、及びＬＡＯＡを含む。本明細書で使用される例示的なＥｓｓｅｎｔｉａｌ ６（商標）ベースの脂肪生成誘導カクテルは、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ６（商標）、魚血清、デキサメタゾン、ＩＢＭＸ、インドメタシン、及びＬＡＯＡを含む。図１４Ｂに、図１４Ａに示される誘導培地を使用した誘導後の含脂肪細胞の例示的な画像を示す。細胞核はＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２で染色し、中性脂質はＡｄｉｐｏＲｅｄ（商標）で染色した。画像は１０倍の倍率で撮影されている。スケールバーは１００μｍを表す。図１４Ｃに、中性脂質を発現する細胞の数によって計算された脂肪生成のパーセンテージ及び総脂質蓄積（ＡｄｉｐｏＲｅｄ（商標）の総蛍光強度によって決定される）を示す。データは、３つの独立したウェルの平均±標準偏差として示されている。アスタリスク（＊）は、スチューデント（Ｓｔｕｄｅｎｔ）のｔ検定を使用したｐ＜０．０５を示す。
【図15】図１５は、単離された脂肪由来細胞の脂肪生成誘導後の含脂肪細胞の収量及び含脂肪細胞における脂質蓄積レベルを示した図である。例示的な細胞株Ｐｈ９Ｆ－１ｘを、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ６（商標）培地、魚血清、脂肪生成誘導カクテル、及びＬＡＯＡを含む開示された例示的な誘導培地の１つで９日間かけて処理した。誘導期間中の異なる日に、細胞核はＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２で染色し、中性脂質はＡｄｉｐｏＲｅｄ（商標）で染色した。画像は１０倍の倍率で撮影されている。スケールバーは１００μｍを表す。データは、３つの独立したウェルの平均±標準偏差として示されている。アスタリスク（＊）及びハッシュ（＃）は、それぞれ、一元配置分散分析とそれに続くテューキー事後検定を使用して６日目及び９日目と比較した場合のｐ＜０．０５を示す。
【図16】図１６は、脂肪生成誘導に使用される成分の様々な組み合わせを示した図である。Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ６（商標）、魚血清、ＬＡＯＡ、ＩＢＭＸ、及びデキサメタゾンで６日間処理した後の魚脂肪由来細胞株では、最も高いレベルの脂質蓄積が観察された。データは、３つの独立したウェルの平均±標準偏差として示されている。アスタリスク（＊）は、一元配置分散分析とそれに続くテューキー事後検定を使用した、ＩＢＭＸ、デキサメタゾン、インドメタシン、及びＬＡＯＡによる処理と比較した場合のｐ＜０．０５を示す。
【図17】図１７は、例示的な脂肪由来細胞株において、異なる濃度のＬＡＯＡの処理により脂肪生成を受ける細胞のパーセンテージを示した図である。本明細書に開示される脂肪生成誘導カクテルは、ＬＡＯＡを必要とする。脂肪生成誘導に適したＬＡＯＡの量を滴定するために、例示的な細胞株Ｐｈ９Ｆ－１ｘを、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ６（商標）培地、魚血清、ＩＢＭＸ、デキサメタゾン、及び異なる濃度のＬＡＯＡで６日間かけて処理した。細胞核はＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２で染色し、中性脂質はＡｄｉｐｏＲｅｄ（商標）で染色した。画像は１０倍の倍率で撮影されている。スケールバーは１００μｍを表す。データは、３つの独立したウェルの平均±標準偏差として示されている。アスタリスク（＊）は、一元配置分散分析とそれに続くテューキー事後検定を使用したｐ＜０．０５を示す。
【図18】図１８は、脂肪生成の異なる時点、例えば、脂肪生成の０日目～３日目、３日目～６日目、又は０日目～６日目におけるＬＡＯＡの添加を示し、どの期間でＬＡＯＡが脂肪生成誘導に必要であるかを検討した図である。例示的な細胞株Ｐｈ９Ｆ－１ｘを、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ６（商標）培地、魚血清、ＩＢＭＸ、及びデキサメタゾンの存在下で、６日間にわたって、（Ａ）０日目～３日目、（Ｂ）３日目～６日目、又は（Ｃ）０日目～６日目に１００μＭのＬＡＯＡで処理した。細胞核はＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２で染色し、中性脂質はＡｄｉｐｏＲｅｄ（商標）で染色した。画像は１０倍の倍率で撮影されている。スケールバーは１００μｍを表す。図１８Ｄ及び図１８Ｅに、中性脂質を発現する細胞の数によって決定された脂肪生成のパーセンテージ及びＡｄｉｐｏＲｅｄ（商標）の総蛍光強度によって決定された総脂質蓄積をそれぞれ示す。データは、３つの独立したウェルの平均±標準偏差として示されている。アスタリスク（＊）は、一元配置分散分析とそれに続くテューキー事後検定を使用したｐ＜０．０５を示す。
【図19】図１９は、ＬＡＯＡ、オレイン酸アルブミン（ＯＡＡ）、又はリノール酸アルブミン（ＬＡＡ）をそれぞれ使用した脂肪由来細胞株における脂肪生成率を示した図である。例示的な細胞株Ｐｈ９Ｆ－１ｘを、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ６（商標）培地、魚血清、ＩＢＭＸ、及びデキサメタゾンの存在下、１００μＭのＬＡＯＡ、ＯＡＡ、又はＬＡＡで６日間かけて処理した。細胞核はＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２で染色し、中性脂質はＡｄｉｐｏＲｅｄ（商標）で染色した。画像は１０倍の倍率で撮影されている。スケールバーは１００μｍを表す。データは、３つの独立したウェルの平均±標準偏差として示されている。アスタリスク（＊）は、一元配置分散分析とそれに続くテューキー事後検定を使用したｐ＜０．０５を示す。
【図20】図２０は、脂肪生成誘導の３日目及び／又は６日目における脂肪生成並びに脂質合成に関与する遺伝子の発現プロファイルの変化を要約した図である。例示的な細胞株Ｐｈ９Ｆ－１ｘを、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ６（商標）培地、魚血清、ＬＡＯＡ、ＩＢＭＸ、及びデキサメタゾンで６日間かけて処理した。データは、３つの独立したウェルの平均±標準偏差として示されている。アスタリスク（＊）は、一元配置分散分析とそれに続くテューキー事後検定を使用したｐ＜０．０５を示す。
【図21】図２１は、脂肪生成の異なる時点での脂肪生成誘導カクテルにおける血清の使用を説明した図である。本明細書に開示される方法に記載されるように、脂肪由来細胞は血清の存在下で培養される。導入期間全体にわたって血清が必要かどうかが検討される。魚由来の例示的な細胞株Ｐｈ９Ｆ－１ｘを、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ６（商標）培地、ＬＡＯＡ、ＩＢＭＸ、及びデキサメタゾンの存在下で、（Ａ）魚血清なし、（Ｂ）魚血清あり（０日目～３日目）、又は（Ｃ）魚血清あり（０日目～６日目）で６日間かけて処理した。細胞核はＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２で染色し、中性脂質はＡｄｉｐｏＲｅｄ（商標）で染色した。画像は１０倍の倍率で撮影されている。スケールバーは１００μｍを表す。図２１Ｄに、中性脂質を発現する細胞の数によって決定される脂肪生成のパーセンテージを示す。図２１Ｅに、ＡｄｉｐｏＲｅｄ（商標）の総蛍光強度によって決定される、処理細胞における総脂質蓄積を示す。データは、３つの独立したウェルの平均±標準偏差として示されている。アスタリスク（＊）は、一元配置分散分析とそれに続くテューキー事後検定を使用したｐ＜０．０５を示す。
【図22】図２２は、脂肪由来細胞株の脂肪生成における様々なビタミンの添加の効果を示した図である。Ｐｈ９Ｆ－１ｘの例示的な細胞株を、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ６（商標）培地、魚血清、ＬＡＯＡ、ＩＢＭＸ、及びデキサメタゾンの存在下で、１００μＭの酢酸α－トコフェロール、Ｄ－パントテン酸、ビタミンＤ３、又はビオチンで６日間かけて処理した。データは、３つの独立したウェルの平均±標準偏差として示されている。
【図23】図２３は、脂肪生成分化中の異なる時点における、別の例示的な脂肪由来細胞株Ａｊ１Ｃ－１ｘにおける脂質強度のレベルを示した図である。ニホンウナギ細胞株をＥｓｓｅｎｔｉａｌ ６（商標）培地、脂肪生成誘導カクテル、及びＬＡＯＡで５日間かけて処理した。中性脂質をＡｄｉｐｏＲｅｄ（商標）で染色し、蛍光強度を毎日測定した。データは、３つの独立したウェルの平均±標準偏差として示されている。アスタリスク（＊）及びハッシュ（＃）は、一元配置分散分析とそれに続くテューキー事後検定を使用したｐ＜０．０５を示す。
【図24】図２４は、脂肪生成誘導におけるＬＡＯＡの異なる濃度並びに別の例示的な細胞株であるニホンウナギ（Ａｎｇｕｉｌｌａ ｊａｐｏｎｉｃａ）由来のＡｊ１Ｃ－１ｘにおける脂肪生成の効率及び総脂質強度におけるそれらの効果を示した図である。細胞株をＥｓｓｅｎｔｉａｌ ６（商標）培地、脂肪生成誘導カクテル、及びＬＡＯＡで３日間かけて処理した。細胞核はＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２で染色し、中性脂質はＡｄｉｐｏＲｅｄ（商標）で染色した。画像は１０倍の倍率で撮影されている。スケールバーは１００μｍを表す。データは、３つの独立したウェルの平均±標準偏差として示されている。アスタリスク（＊）は、一元配置分散分析とそれに続くテューキー事後検定を使用したｐ＜０．０５を示す。
【図25】図２５は、脂肪由来細胞株の脂肪生成の効率に対するＤＨＡ及び／又はＥＰＡの添加の効果を説明した図である。例示的な細胞株Ｐｈ９Ｆ－１ｘを、脂肪生成の最終３日間、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ６（商標）培地、魚血清、及びＬＡＯＡの存在下で、異なる濃度の（Ａ）ＤＨＡ及び（Ｂ）ＥＰＡ又は（Ｃ）５０μＭのＤＨＡと５０μＭのＥＰＡとの組み合わせで処理した。データは、３つの独立したウェルの平均±標準偏差として示されている。
【図26】図２６は、ＤＨＡ及びＥＰＡ含有脂肪生成誘導カクテルによる脂肪生成誘導の３日目及び６日目における、脂肪生成遺伝子、例えば、ＰＰＡＲγ及びＣ／ＥＢＰβの上方制御を示した図である。例示的な細胞株Ｐｈ９Ｆ－１ｘを、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ６（商標）培地、魚血清、ＬＡＯＡ、ＩＢＭＸ、デキサメタゾン、ＤＨＡ、及びＥＰＡで６日間かけて処理した。データは、３つの独立したウェルの平均±標準偏差として示されている。アスタリスク（＊）は、スチューデントのｔ検定を使用したｐ＜０．０５を示す。
【図27】図２７は、２９及び１０４という高い継代数で脂肪生成能を保持する例示的な細胞株Ｐｈ９Ｆ－１ｘの画像を示した図である。２９継代目及び１０４継代目のＰｈ９Ｆ－１ｘを、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ６（商標）培地、脂肪生成誘導カクテル、及びＬＡＯＡで６日間かけて処理した。細胞核はＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２で染色し、中性脂質はＡｄｉｐｏＲｅｄ（商標）で染色した。画像は１０倍の倍率で撮影されている。スケールバーは１００μｍを表す。データは、３つの独立したウェルの平均±標準偏差として示されている。アスタリスク（＊）は、一元配置分散分析とそれに続くテューキー事後検定を使用したｐ＜０．０５を示す。
【図28】図２８は、３次元撹拌スピナーフラスコ内でＣｙｔｏｄｅｘ（登録商標）１マイクロキャリアを使用して単離細胞株Ｐｈ９Ｆ－１ｘを培養する例を示した図である。例示的な細胞株Ｐｈ９Ｆ－１ｘは、マイクロキャリア内で接着、増殖、及び分化した。図２８Ａは、Ｃｙｔｏｄｅｘ（登録商標）１上で３日間増殖させ、ＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓで３０分間処理したＰｈ９Ｆ－１ｘ細胞の生存率及び細胞数を示した図である。細胞をトリパンブルーで染色し、ＬＵＮＡ（商標）自動セルカウンターを使用して計数した。図２８Ｂは、マイクロキャリアに付着した細胞核をＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２で染色し、Ｎｉｋｏｎ Ａ１Ｒ＋ｓｉ共焦点顕微鏡で撮像した画像を示した図である。図２８Ｃは、３次元培養系において６日間かけてＥｓｓｅｎｔｉａｌ ６（商標）培地、脂肪生成誘導カクテル、及びＬＡＯＡで処理した培養細胞の脂肪生成を示した図である。細胞核はＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２で染色し、中性脂質はＡｄｉｐｏＲｅｄ（商標）で染色した。画像はＮ－ＳＴＯＲＭ／ＴＩＲＦ顕微鏡を使用して撮影されている。スケールバーは１００μｍを表す。
【発明を実施するための形態】
【0017】
定義
通常、「脂肪」という用語が使用される場合、考察の文脈に応じて、「脂肪組織」又は「脂肪分子」のいずれかを指すものとして理解され得る。本明細書において使用される場合、「脂肪」という用語は、主に脂肪細胞からなる結合組織である「脂肪性（ｆａｔｔｙ）組織」又は「脂肪（ａｄｉｐｏｓｅ）組織」を指す。その組織は主に皮膚の下（皮下脂肪）に見られるが、筋肉内又は筋肉間の沈着物（筋肉間脂肪及び筋肉内脂肪）、内臓及びそれらの膜のひだ（腸間膜脂肪などの内臓脂肪）、並びに骨髄にも見られる。脂肪組織に蓄えられる脂肪は、食事の脂肪に由来するか、動物の体内で生成される。
通常、「脂肪」という用語が使用される場合、考察の文脈に応じて、「脂肪組織」又は「脂肪分子」のいずれかを指すものとして理解され得る。本明細書において使用される場合、「脂肪」という用語は、主に脂肪細胞からなる結合組織である「脂肪性（ｆａｔｔｙ）組織」又は「脂肪（ａｄｉｐｏｓｅ）組織」を指す。その組織は主に皮膚の下（皮下脂肪）に見られるが、筋肉内又は筋肉間の沈着物（筋肉間脂肪及び筋肉内脂肪）、内臓及びそれらの膜のひだ（腸間膜脂肪などの内臓脂肪）、並びに骨髄にも見られる。脂肪組織に蓄えられる脂肪は、食事の脂肪に由来するか、動物の体内で生成される。
【0018】
本明細書で使用する場合、「アディポサイト（ａｄｉｐｏｃｙｔｅ）」又は「リポサイト（ｌｉｐｏｃｙｔｅ）」としても知られる用語「脂肪細胞」は、過剰なエネルギーをトリグリセリド液滴の形態で蓄える脂肪組織の特殊な細胞を指す。本明細書で使用する「トリグリセリド」という用語は、単一分子のグリセロール及び３分子の脂肪酸から構成されるエネルギー豊富な化合物を指す。トリグリセリドは動植物油脂の主成分として機能する。動物性トリグリセリドは重要なエネルギー源であり、脂肪組織、血流、及び心筋に存在する。
【0019】
本明細書で使用する「脂肪酸」という用語は、動物性若しくは植物性の脂肪、油、又はワックスに由来するか、エステル化された形態で含まれる脂肪族モノカルボン酸を指す。天然脂肪酸は通常４～２８個の炭素の鎖（通常は分岐がなく偶数）を有し、飽和又は不飽和であってもよい。
【0020】
本明細書で使用される場合、「油」という用語は、室温で液体であるトリグリセリドを指す。脂肪と油との主な違いは、脂肪は室温で固体の形態をとる大量の飽和脂肪酸で構成されているのに対し、油は室温で液体の形態をとる主に不飽和脂肪酸で構成されていることである。短鎖脂肪酸及び／又は不飽和脂肪酸の割合が増加すると、油脂の融点が低下する。
【0021】
本明細書で使用される場合、「間質血管画分」という用語は、脂肪組織から得られる不均一な画分を指す。これは、脂肪間質細胞、含脂肪細胞前駆細胞、線維芽細胞、免疫細胞
、上皮細胞、内皮細胞、並びに循環系及び神経系に関連する他の細胞種を含むいくつかの種類の細胞を含む。脂肪組織を破壊してこれらの細胞を抽出し、これらの細胞の採取を容易にする様々な技術がある。「間質血管細胞」という用語は、間質血管画分に含まれる異種細胞を総称する。
、上皮細胞、内皮細胞、並びに循環系及び神経系に関連する他の細胞種を含むいくつかの種類の細胞を含む。脂肪組織を破壊してこれらの細胞を抽出し、これらの細胞の採取を容易にする様々な技術がある。「間質血管細胞」という用語は、間質血管画分に含まれる異種細胞を総称する。
【0022】
本明細書で使用される場合、培養細胞の「増殖速度」という用語は、特定の期間内に細胞集団の数が増加する速度を広く指す。本明細書に記載されるように、例えば、細胞の増殖速度は、集団の数が２倍になるのにかかる時間である倍加時間によって定量化することができる。
【0023】
本明細書に開示されるように、「脂質」という用語は、非極性溶媒、例えば炭化水素に可溶な巨大生体分子を指す。脂質には、脂肪酸、ワックス、ステロール、脂溶性ビタミン（ビタミンＡ、Ｄ、Ｅ、及びＫなど）、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、及びリン脂質が含まれる。
【0024】
本明細書で使用される場合、「高速増殖（ｆａｓｔ－ｇｒｏｗｉｎｇ）細胞株」という用語は、同じ種の全ての単離細胞株の増殖速度の中央値よりも高い増殖速度を有する細胞株を指す。本明細書で使用される場合、「低速増殖（ｓｌｏｗ－ｇｒｏｗｉｎｇ）細胞株」という用語は、同じ種の全ての単離細胞株の増殖速度の中央値よりも低い増殖速度を有する細胞株を指す。例えば、図７に示すように、カイヤン及びニホンウナギから単離された、いくつかの細胞株は時間の経過とともに細胞数の急激な増加を示すが、他の細胞株はより平坦な増殖曲線を示す。
【0025】
本明細書で使用される「養殖肉」又は「培養肉」という用語は、タンパク質及び動物性脂肪の食物源として動物を捕獲又は飼育する必要がなく、インビトロで動物細胞を養殖又は培養することによって生産される動物肉（魚介類及び内臓肉を含む）を指す。養殖肉又は培養肉は、典型的には、食用又は生分解性足場上に播種された１又は複数の種類の培養細胞（例えば、筋肉細胞）と、添加剤、例えば、追加の栄養素又は香味料とを含む。
【0026】
本明細書で使用される場合、「食用足場」又は「生分解性足場」という用語は、培養肉製品又は養殖肉製品の製造に使用される三次元メッシュを指す。「食用足場」又は「生分解性足場」は、インビトロで細胞に構造的支持を提供するだけでなく、機械的及び生化学的合図（ｃｕｅ）も提供する。通常使用される足場成分としては、コラーゲン及びゼラチンなどが挙げられる。
【0027】
発明の詳細な説明
増加する人口に食糧を供給するという環境圧力の増大により、細胞培養技術から農産物、特に肉を生産することを目的とした新興分野である細胞農業による解決策が求められている。培養肉生産の全体的な手順を図１Ａに示す。典型的には、細胞を食用動物種の生検から単離し、指数関数的に増殖し、筋芽細胞及び含脂肪細胞などの成熟細胞型に分化する能力を有する幹細胞株／前駆細胞株を派生させる。大規模培養で細胞が増殖した後、幹細胞／前駆細胞が刺激されて、筋肉細胞などの成熟細胞型になる。これらの細胞は、食用足場及び他の食品グレードの材料と組み合わされて、最終的に消費される肉を構成し得る。
増加する人口に食糧を供給するという環境圧力の増大により、細胞培養技術から農産物、特に肉を生産することを目的とした新興分野である細胞農業による解決策が求められている。培養肉生産の全体的な手順を図１Ａに示す。典型的には、細胞を食用動物種の生検から単離し、指数関数的に増殖し、筋芽細胞及び含脂肪細胞などの成熟細胞型に分化する能力を有する幹細胞株／前駆細胞株を派生させる。大規模培養で細胞が増殖した後、幹細胞／前駆細胞が刺激されて、筋肉細胞などの成熟細胞型になる。これらの細胞は、食用足場及び他の食品グレードの材料と組み合わされて、最終的に消費される肉を構成し得る。
【0028】
肉製品の主な構成要素は筋肉であるが、脂肪は肉の美味しさ及び栄養価に貢献する。栄養素の観点では、脂肪はトリグリセリド、リン脂質、ステロール、及び遊離脂肪酸などの脂質分子を指すことが多い。対照的に、本開示で検討される肉の固体成分に言及する場合、脂肪は典型的には脂肪性（脂肪）細胞又は組織を意味する。食品成分に関する脂肪細胞（含脂肪細胞）と脂肪分子（脂質）との特性の違いを図１Ｂにまとめる。食品関連種に由来する含脂肪細胞及びその幹細胞／前駆細胞は、動物の肉製品における脂質の主な部位で
ある。
ある。
【0029】
タンパク質を標的とした細胞ベースの肉の開発における研究及びマーケティングの取り組みは急速に進歩しているにもかかわらず、細胞ベースの脂肪を生産することについてはほとんど成し遂げられていない。大規模製造に充分な量の培養肉脂肪を得るには、安定して急速増殖する細胞株が必要である。しかしながら、これまでのところ、動物脂肪由来の細胞株の単離及び培養の進歩は限られている。本開示は、単離された脂肪由来細胞に関連する方法、単離された細胞株、及びその生成物を提供する。
【0030】
本明細書に開示されるように、動物から脂肪由来細胞株を単離する方法が記載される。一例では、本開示は、動物から脂肪組織試料を得ることを含む、動物から脂肪由来細胞株を単離する方法を記載する。本開示で得られる脂肪組織試料は、脂肪組織、内臓脂肪、皮下脂肪、骨髄脂肪、腸間膜脂肪、又は筋肉に含まれる筋肉内／筋間脂肪であり得るが、これらに限定されない。
【0031】
別の例では、本開示は、動物から脂肪組織試料を得ること、及び得られた前記脂肪組織試料から間質血管細胞を採取すること、を含む、動物から脂肪由来細胞株を単離する方法を記載する。当業者には理解されるように、組織試料から間質血管細胞を採取する方法は当技術分野で公知である。例えば、異種タイプの間質血管細胞を含む間質血管画分は、酵素消化によって組織試料から単離することができる。脂肪組織試料は、切断又はミンチ化することによって断片化し、コラゲナーゼＩＶ型、又はコラゲナーゼＩＶ型とディスパーゼＩＩとを組み合わせて消化することができる。あるいは、異種タイプの間質血管細胞を含む間質血管画分は、外植片培養によって組織試料から単離することができる。脂肪組織試料は、切断又はミンチ化することによって断片化し、間質血管細胞が組織試料の外に移動して増殖するまで培養することができる。
【0032】
別の例では、本開示は、動物から脂肪組織試料を得ること、得られた前記脂肪組織試料から間質血管細胞を採取すること、及び血清の存在下で前記間質血管細胞を増殖させること、を含む、動物から脂肪由来細胞株を単離する方法を記載する。本明細書で使用される「血清」という用語は、凝固には関与しない血液の液体及び溶質成分を指す。これは、凝固因子（フィブリノーゲン及びプロトロンビンなど）を含まない血漿、又は全ての細胞及び凝固因子が除去された血液として定義される場合がある。血清は、当技術分野で公知の方法、例えば、血球から分離するための遠心分離によって得ることができる。血清の量は、０．１％～２％、０．２％～１．８％、０．４％～１．６％、０．６％～１．２％、又は０．８％～１％である。いくつかのさらなる例では、血清は魚血清である。同じ宿主からの血清（すなわち、ニワトリ細胞の場合はニワトリ血清）の使用は、脂肪細胞の単離には通常使用されない。これまでの研究のほとんどは、広く入手可能で手頃な価格であるため、ウシ血清のみを使用した。本発明者らは、自家血清又は同一門の動物由来の血清（すなわち、魚血清、鳥血清、ブタ血清）が間質血管画分（ＳＶＦ）の単離において重要な役割を果たすことを見出した。いくつかの例では、間質血管細胞は、血清含有増殖培地の存在下で増殖される。いくつかの例では、間質血管細胞は、血清を含む完全増殖培地の存在下で増殖される。さらなる例では、血清含有完全増殖培地は基本培地を含む。基本培地は動物細胞培養に適した任意の培地であり得ることが当業者には理解され、イーグル最小必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、イスコフ（Ｉｓｃｏｖｅ）基本ＤＭＥＭ（ＩＭＤＭ）、ロズウェルパーク記念研究所培地（ＲＰＭＩ）、１９９培地、１０９培地、ハム（Ｈａｍ）Ｆ－１０培地、ハム（Ｈａｍ）Ｆ－１２培地、マッコイ（ＭｃＣｏｙ）５Ａ培地、リーヴォヴィッツ（Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ）Ｌ－１５培地、Ａｄｖａｎｃｅｄ（商標）ＤＭＥＭ、ＭｅｓｅｎＣｕｌｔ（商標）－ＡＣＦ Ｐｌｕｓ培地、及びＳｔｅｍＰｒｏ（商標）ＭＳＣ ＳＦＭ ＣＴＳ培地が挙げられるが、これらに限定されない。この組成物が、細胞培養において通常使用される他のサプリメント、例えば、
アミノ酸、ビタミン、無機塩、グルコース、増殖因子、ホルモン、及び付着因子と組み合わせて使用できることは、当業者には理解される。また、本明細書で開示される培地は、細胞増殖に適切なｐＨ及び浸透圧を維持することも理解される。当業者であれば、細胞培養の温度、湿度、及びガス雰囲気は細胞の種類によるものであり、規定どおりに最適化できることが容易に理解される。例えば、細胞は約２０～３７℃で約１～１．５時間培養される。
アミノ酸、ビタミン、無機塩、グルコース、増殖因子、ホルモン、及び付着因子と組み合わせて使用できることは、当業者には理解される。また、本明細書で開示される培地は、細胞増殖に適切なｐＨ及び浸透圧を維持することも理解される。当業者であれば、細胞培養の温度、湿度、及びガス雰囲気は細胞の種類によるものであり、規定どおりに最適化できることが容易に理解される。例えば、細胞は約２０～３７℃で約１～１．５時間培養される。
【0033】
いくつかの例では、間質血管細胞は酵素消化によって採取される。例えば、間質血管細胞は、コラゲナーゼ又はコラゲナーゼ及びディスパーゼによって単離することができる。一例では、間質血管細胞は、１％ＢＳＡ及び５０ｍｇ／ｍＬグルコースを含むハンクス（Ｈａｎｋ’ｓ）緩衝塩溶液（ＨＢＳＳ）中の１ｍｇ／ｍＬ Ｉ型コラゲナーゼ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ社）を使用して単離される。別の例では、間質血管細胞は、２．５ｍＭの塩化カルシウムを含むＨＢＳＳに含まれる１ｍｇ／ｍＬのＩＶ型コラゲナーゼを使用して単離される。さらに別の例では、間質血管細胞は、２．５ｍＭ塩化カルシウムを含むＨＢＳＳ中で０．５ｍｇ／ｍＬのＩＶ型コラゲナーゼ及び２．４ｍｇ／ｍＬのディスパーゼＩＩを使用して単離される。他の例では、間質血管細胞は外植片培養によって採取される。例えば、間質血管細胞は、断片化された組織試料を増殖培地中で培養し、組織試料から移動する細胞を採取することによって単離することができる。さらなる例では、間質血管細胞は、組織試料の酵素消化又は外植片培養後の濾過によって採取される。いくつかの例では、間質血管細胞はナイロンフィルターで濾過される。
【0034】
いくつかの例では、採取された間質血管細胞は、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）の存在下で増殖される。ＦＢＳの濃度は、約１％～２０％、約２％～１５％、約１０％～１５％、約２％、約１０％、又は約１５％である。いくつかの例では、間質血管細胞は、血清の存在下で増殖される。いくつかの例では、間質血管細胞は、細胞が約７０％コンフルエンスに達するまで増殖される。いくつかの例では、間質血管細胞は、１～３０継代、６～１２継代、８～１１継代、又は９～１０継代後まで増殖される。いくつかの例では、間質血管細胞は、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）の存在下で増殖される。いくつかの例では、間質血管細胞は、ヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）の存在下で増殖される。いくつかの例では、間質血管細胞は、魚類の塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）の存在下で増殖される。いくつかの例では、間質血管細胞は、鳥類の塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）の存在下で増殖される。さらなる例では、ヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）の濃度は、約５～１００ｎｇ／ｍＬ、約１０～８０ｎｇ／ｍＬ、約２０～６０ｎｇ／ｍＬ、又は約３０～４０ｎｇ／ｍＬである。
【0035】
別の例では、本開示は、動物から脂肪組織試料を得ること、得られた前記脂肪組織試料から間質血管細胞を採取すること、採取した前記間質血管細胞を増殖させること、各ウェルの増殖速度に基づいて前記増殖した間質血管細胞のクローン選択を行うこと、を含む、動物から脂肪由来細胞株を単離する方法を記載する。いくつかの例では、増殖した間質血管細胞は、コーティングされたマルチウェルプレートで選別される。マルチウェルプレートのコーティングは、プレートへの細胞の付着を容易にするためのものであることは、当業者には理解される。コーティングは、ポリアミノ酸（例えば、ポリ－Ｌ－リジン、ポリ－Ｄ－リジン、ポリ－オルニチン）、ゼラチン、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、又はオステオポンチンであり得るが、これらに限定されない。さらに、マルチウェルプレートは、６ウェルプレート、１２ウェルプレート、２４ウェルプレート、４８ウェルプレート、又は９６ウェルプレートであってもよいが、これらに限定されないことも当業者には理解される。さらなる例では、増殖した間質血管細胞を、約１０細胞／ウェルの細胞密度でコーティングされたマルチウェルプレートに選別する。いくつかのさらなる例では、各ウェルに播種される細胞密度は、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、又は約１５細胞／ウェ
ルであり得る。さらなる例では、マルチウェルプレート内の選別された細胞は、増殖培地の存在下で約１０日間増殖される。いくつかの例では、選別された細胞は、完全増殖培地の存在下で増殖される。さらなる例では、完全増殖培地は基本培地を含む。基本培地は動物細胞培養に適した任意の培地であり得ることが当業者には理解され、イーグル最小必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、イスコフ（Ｉｓｃｏｖｅ）基本ＤＭＥＭ（ＩＭＤＭ）、ロズウェルパーク記念研究所培地（ＲＰＭＩ）、１９９培地、１０９培地、ハム（Ｈａｍ）Ｆ－１０培地、ハム（Ｈａｍ）Ｆ－１２培地、マッコイ（ＭｃＣｏｙ）５Ａ培地、リーヴォヴィッツ（Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ）Ｌ－１５培地、Ａｄｖａｎｃｅｄ（商標）ＤＭＥＭ、ＭｅｓｅｎＣｕｌｔ（商標）－ＡＣＦ Ｐｌｕｓ培地、及びＳｔｅｍＰｒｏ（商標）ＭＳＣ ＳＦＭ ＣＴＳ培地が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの例では、選別された細胞はウシ胎児血清（ＦＢＳ）の存在下で増殖される。ＦＢＳの濃度は、約１％～２０％、約２％～１５％、約１０％～１５％、約２％、約１０％、又は約１５％であり得る。いくつかの例では、選別された細胞は血清の存在下で増殖される。さらに、血清の濃度は、約０．１％～２％、約０．２％～１．８％、約０．４％～１．６％、約０．６％～１．２％、又は約０．８％～１％であることが当業者には理解される。いくつかの例では、血清は同一門の動物から得られる。いくつかの例では、血清は同一種から得られる。いくつかのさらなる例では、血清は魚血清である。いくつかの他の例では、血清は鳥血清又はブタ血清である。いくつかの例では、マルチウェルプレート内の選別された細胞は、増殖培地の存在下で約１５日間増殖され、約７０％コンフルエンスに達した細胞は、継代によりさらに増殖される。技術常識及び当業者によって理解されるように、培養物中の細胞の増殖が約６０％コンフルエンス、約６５％コンフルエンス、約７０％コンフルエンス、約７５％コンフルエンス、約８０％コンフルエンス、又は約８５％コンフルエンスに達した時点で、培養細胞は再度継代可能である。例えば、以下の表１に示すように、約１５日後、１１２０個のウェルのうち４１個が少なくとも７０％コンフルエンスに達した。
ルであり得る。さらなる例では、マルチウェルプレート内の選別された細胞は、増殖培地の存在下で約１０日間増殖される。いくつかの例では、選別された細胞は、完全増殖培地の存在下で増殖される。さらなる例では、完全増殖培地は基本培地を含む。基本培地は動物細胞培養に適した任意の培地であり得ることが当業者には理解され、イーグル最小必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、イスコフ（Ｉｓｃｏｖｅ）基本ＤＭＥＭ（ＩＭＤＭ）、ロズウェルパーク記念研究所培地（ＲＰＭＩ）、１９９培地、１０９培地、ハム（Ｈａｍ）Ｆ－１０培地、ハム（Ｈａｍ）Ｆ－１２培地、マッコイ（ＭｃＣｏｙ）５Ａ培地、リーヴォヴィッツ（Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ）Ｌ－１５培地、Ａｄｖａｎｃｅｄ（商標）ＤＭＥＭ、ＭｅｓｅｎＣｕｌｔ（商標）－ＡＣＦ Ｐｌｕｓ培地、及びＳｔｅｍＰｒｏ（商標）ＭＳＣ ＳＦＭ ＣＴＳ培地が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの例では、選別された細胞はウシ胎児血清（ＦＢＳ）の存在下で増殖される。ＦＢＳの濃度は、約１％～２０％、約２％～１５％、約１０％～１５％、約２％、約１０％、又は約１５％であり得る。いくつかの例では、選別された細胞は血清の存在下で増殖される。さらに、血清の濃度は、約０．１％～２％、約０．２％～１．８％、約０．４％～１．６％、約０．６％～１．２％、又は約０．８％～１％であることが当業者には理解される。いくつかの例では、血清は同一門の動物から得られる。いくつかの例では、血清は同一種から得られる。いくつかのさらなる例では、血清は魚血清である。いくつかの他の例では、血清は鳥血清又はブタ血清である。いくつかの例では、マルチウェルプレート内の選別された細胞は、増殖培地の存在下で約１５日間増殖され、約７０％コンフルエンスに達した細胞は、継代によりさらに増殖される。技術常識及び当業者によって理解されるように、培養物中の細胞の増殖が約６０％コンフルエンス、約６５％コンフルエンス、約７０％コンフルエンス、約７５％コンフルエンス、約８０％コンフルエンス、又は約８５％コンフルエンスに達した時点で、培養細胞は再度継代可能である。例えば、以下の表１に示すように、約１５日後、１１２０個のウェルのうち４１個が少なくとも７０％コンフルエンスに達した。
【0036】
【表1】
【0037】
別の例では、本開示は、動物から脂肪組織試料を得ること、得られた前記脂肪組織試料から間質血管細胞を採取すること、血清の存在下で前記間質血管細胞を増殖させること、各ウェルの増殖に基づいて前記増殖した間質血管細胞のクローン選択を行うこと、及び前
記選択の結果に基づいて１又は複数の脂肪由来細胞株を単離すること、を含む、動物から脂肪由来細胞株を単離する方法を記載する。いくつかの例では、単離された細胞株は老化状態に入らない。いくつかの例では、増殖中の１６継代目、１７継代目、１８継代目、１９継代目、２０継代目、２１継代目、２２継代目、２３継代目、２４継代目、２５継代目、２６継代目、２７継代目、２８継代目、２９継代目、又は３０継代目以前に、単離された細胞株は老化状態に入らない。いくつかの例では、増殖中に１６継代目、１７継代目、１８継代目、１９継代目、２０継代目、２１継代目、２２継代目、２３継代目、２４継代目、２５継代目、２６継代目、２７継代目、２８継代目、２９継代目、又は３０継代目に達した場合、１又は複数の脂肪由来細胞株が単離される。いくつかの例では、１又は複数の単離された脂肪由来細胞株は、約２０継代培養後に老化状態に入らない。いくつかの例では、１又は複数の単離された脂肪由来細胞株は、約１６～３０継代培養後に老化状態に入らない。１又は複数のウェルから単離された脂肪由来細胞は、安定な細胞株とみなされる。図３に記載されているように、顕微鏡画像は、例示的な動物種であるカイヤン及びニホンウナギのクローン選択前後の脂肪由来細胞の形態を示している。マルチウェルプレート内の細胞は、クローン選択の前後で一貫した紡錘形形態を示した。
記選択の結果に基づいて１又は複数の脂肪由来細胞株を単離すること、を含む、動物から脂肪由来細胞株を単離する方法を記載する。いくつかの例では、単離された細胞株は老化状態に入らない。いくつかの例では、増殖中の１６継代目、１７継代目、１８継代目、１９継代目、２０継代目、２１継代目、２２継代目、２３継代目、２４継代目、２５継代目、２６継代目、２７継代目、２８継代目、２９継代目、又は３０継代目以前に、単離された細胞株は老化状態に入らない。いくつかの例では、増殖中に１６継代目、１７継代目、１８継代目、１９継代目、２０継代目、２１継代目、２２継代目、２３継代目、２４継代目、２５継代目、２６継代目、２７継代目、２８継代目、２９継代目、又は３０継代目に達した場合、１又は複数の脂肪由来細胞株が単離される。いくつかの例では、１又は複数の単離された脂肪由来細胞株は、約２０継代培養後に老化状態に入らない。いくつかの例では、１又は複数の単離された脂肪由来細胞株は、約１６～３０継代培養後に老化状態に入らない。１又は複数のウェルから単離された脂肪由来細胞は、安定な細胞株とみなされる。図３に記載されているように、顕微鏡画像は、例示的な動物種であるカイヤン及びニホンウナギのクローン選択前後の脂肪由来細胞の形態を示している。マルチウェルプレート内の細胞は、クローン選択の前後で一貫した紡錘形形態を示した。
【0038】
いくつかの例では、単離された１又は複数複数の脂肪由来細胞株は、血清の存在下で増殖培地の存在下で培養される。血清の濃度は、約０．１％～２％、約０．２％～１．８％、約０．４％～１．６％、約０．６％～１．２％、又は約０．８％～１％であり得ることが当業者には理解される。図２Ａ及び図４に示すように、例えば、単離された細胞株は、様々な濃度、例えば、約０．１％、約０．２％、約０．３％、約０．４％、約０．５％、約１％、約１．５％、及び約２％の血清の存在下で増殖を示す。いくつかのさらなる例では、血清は魚血清である。いくつかの例では、単離された細胞株は、血清含有完全増殖培地の存在下で培養される。さらなる例では、完全増殖培地は基本培地を含む。基本培地は動物細胞培養に適した任意の培地であり得ることが当業者には理解され、イーグル最小必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、イスコフ（Ｉｓｃｏｖｅ）基本ＤＭＥＭ（ＩＭＤＭ）、ロズウェルパーク記念研究所培地（ＲＰＭＩ）、１９９培地、１０９培地、ハム（Ｈａｍ）Ｆ－１０培地、ハム（Ｈａｍ）Ｆ－１２培地、マッコイ（ＭｃＣｏｙ）５Ａ培地、リーヴォヴィッツ（Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ）Ｌ－１５培地、Ａｄｖａｎｃｅｄ（商標）ＤＭＥＭ、ＭｅｓｅｎＣｕｌｔ（商標）－ＡＣＦ Ｐｌｕｓ培地、及びＳｔｅｍＰｒｏ（商標）ＭＳＣ ＳＦＭ ＣＴＳ培地が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの例では、単離された細胞株はウシ胎児血清（ＦＢＳ）の存在下で培養される。ＦＢＳの濃度は、約１％～２０％、約２％～１５％、約１０％～１５％、約２％、約１０％、又は約１５％であり得ることが当業者には理解される。例えば、図６に示すように、単離された細胞は、様々な濃度のＦＢＳの存在下で培養される。他の例では、単離された１又は複数の脂肪由来細胞株は凍結保存される。
【0039】
いくつかの例では、本開示は、（ａ）動物から脂肪組織試料を得ること、（ｂ）（ａ）の前記脂肪組織試料から間質血管細胞を採取すること、（ｃ）血清の存在下で（ｂ）の前記間質血管細胞を増殖させること、（ｄ）各ウェルの増殖速度に基づいて前記増殖した間質血管細胞のクローン選択を行うこと、及び（ｅ）（ｄ）の前記選択の結果に基づいて１又は複数の脂肪由来細胞株を単離すること、を含む、動物から脂肪由来細胞株を単離する方法を記載する。いくつかの例では、前記組織試料は動物から得られる。さらなる例では、前記動物は家禽、家畜、又は魚類である。例えば、前記動物は、雛鳥、アヒル、ガチョウ、七面鳥、ハト、又はウズラである。いくつかの例では、前記動物はウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタである。他の例では、前記動物には硬骨魚（硬骨魚綱）又は軟骨魚（軟骨魚綱）が含まれるが、これらに限定されない。別の例では、前記動物は、カイヤン、ニホンウナギ、ジェイドパーチ、及びバラマンディである。
【0040】
本明細書に開示されるように、脂肪生成誘導組成物が記載される。一例では、本開示は
、リノール酸－オレイン酸アルブミン（ＬＡＯＡ）、インスリン、及び血清を含む脂肪生成誘導組成物を記載する。一例では、本開示は、リノール酸－オレイン酸アルブミン（ＬＡＯＡ）、インスリン、血清、並びに３－イソブチル－１－メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）、デキサメタゾン、及びインドメタシンのうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は全てを含む、脂肪生成誘導組成物を記載する。したがって、いくつかの例では、脂肪生成誘導組成物は、リノール酸－オレイン酸アルブミン（ＬＡＯＡ）、インスリン、血清、及び３－イソブチル－１－メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）を含む。いくつかの例では、脂肪生成誘導組成物は、リノール酸－オレイン酸アルブミン（ＬＡＯＡ）、インスリン、血清、及びデキサメタゾンを含む。いくつかの例では、脂肪生成誘導組成物は、リノール酸－オレイン酸アルブミン（ＬＡＯＡ）、インスリン、血清、及びインドメタシンを含む。当業者に理解されるように、本明細書で使用されるＬＡＯＡという用語は、リノール酸とオレイン酸との混合物、及びアルブミンを指す。いくつかの例では、脂肪生成誘導組成物は、少なくとも１０μＭ、又は少なくとも２０μＭ、又は少なくとも３０μＭ、又は少なくとも４０μＭ、又は少なくとも５０μＭの濃度のＬＡＯＡを含む。いくつかの例では、脂肪生成誘導組成物は、約５０～１００μＭ、約１００～１５０μＭ、又は約１５０～２００μＭの濃度のＬＡＯＡを含む。例えば、図１７及び図２４に示すように、ＬＡＯＡの濃度は、約５０μＭ、又は約１００μＭ、又は約１５０μＭ、又は約２００μＭ、好ましくは約１００μＭの濃度であり得る。
、リノール酸－オレイン酸アルブミン（ＬＡＯＡ）、インスリン、及び血清を含む脂肪生成誘導組成物を記載する。一例では、本開示は、リノール酸－オレイン酸アルブミン（ＬＡＯＡ）、インスリン、血清、並びに３－イソブチル－１－メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）、デキサメタゾン、及びインドメタシンのうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は全てを含む、脂肪生成誘導組成物を記載する。したがって、いくつかの例では、脂肪生成誘導組成物は、リノール酸－オレイン酸アルブミン（ＬＡＯＡ）、インスリン、血清、及び３－イソブチル－１－メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）を含む。いくつかの例では、脂肪生成誘導組成物は、リノール酸－オレイン酸アルブミン（ＬＡＯＡ）、インスリン、血清、及びデキサメタゾンを含む。いくつかの例では、脂肪生成誘導組成物は、リノール酸－オレイン酸アルブミン（ＬＡＯＡ）、インスリン、血清、及びインドメタシンを含む。当業者に理解されるように、本明細書で使用されるＬＡＯＡという用語は、リノール酸とオレイン酸との混合物、及びアルブミンを指す。いくつかの例では、脂肪生成誘導組成物は、少なくとも１０μＭ、又は少なくとも２０μＭ、又は少なくとも３０μＭ、又は少なくとも４０μＭ、又は少なくとも５０μＭの濃度のＬＡＯＡを含む。いくつかの例では、脂肪生成誘導組成物は、約５０～１００μＭ、約１００～１５０μＭ、又は約１５０～２００μＭの濃度のＬＡＯＡを含む。例えば、図１７及び図２４に示すように、ＬＡＯＡの濃度は、約５０μＭ、又は約１００μＭ、又は約１５０μＭ、又は約２００μＭ、好ましくは約１００μＭの濃度であり得る。
【0041】
いくつかの例では、脂肪生成誘導組成物は、リノール酸－オレイン酸アルブミン（ＬＡＯＡ）、インスリン、血清、３－イソブチル－１－メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）、及びデキサメタゾンを含む。いくつかの例では、脂肪生成誘導組成物は、リノール酸－オレイン酸アルブミン（ＬＡＯＡ）、インスリン、血清、デキサメタゾン、及びインドメタシンを含む。いくつかの例では、脂肪生成誘導組成物は、リノール酸－オレイン酸アルブミン（ＬＡＯＡ）、インスリン、血清、インドメタシン、及び３－イソブチル－１－メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）を含む。いくつかのさらなる例では、脂肪生成誘導組成物は、リノール酸－オレイン酸アルブミン（ＬＡＯＡ）、インスリン、血清、インドメタシン、３－イソブチル－１－メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）、及びデキサメタゾンを含む。例えば、図１６に示すように、本明細書で開示される脂肪生成誘導組成物は、単離された例示的な脂肪由来細胞株の脂肪生成誘導を支持する。いくつかの例では、血清は魚血清である。
【0042】
いくつかの例では、本開示は、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）及びウシ胎児血清（ＦＢＳ）をさらに含む、本明細書で開示される脂肪生成誘導組成物について記載する。いくつかの例では、本開示は、ヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）及びウシ胎児血清（ＦＢＳ）をさらに含む、本明細書で開示される脂肪生成誘導組成物について記載する。いくつかの例では、本開示は、魚類塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）及びウシ胎児血清（ＦＢＳ）をさらに含む、本明細書で開示される脂肪生成誘導組成物について記載する。いくつかの例では、本開示は、鳥類塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）及びウシ胎児血清（ＦＢＳ）をさらに含む、本明細書で開示される脂肪生成誘導組成物について記載する。さらなる例では、ヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）は、約５～１００ｎｇ／ｍＬ、約１０～８０ｎｇ／ｍＬ、約２０～６０ｎｇ／ｍＬ、又は約３０～４０ｎｇ／ｍＬであり得る。さらなる例では、ＦＢＳの濃度は、約１％～２０％、約２％～１５％、約１０％～１５％、約２％、約１０％、又は約１５％であり得る。いくつかの例では、脂肪生成誘導組成物は、基本培地と組み合わせて使用することができる。基本培地は動物細胞培養に適した任意の培地であり得ることが当業者には理解され、イーグル最小必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、イスコフ（Ｉｓｃｏｖｅ）基本ＤＭＥＭ（ＩＭＤＭ）、ロズウェルパーク記念研究所培地（ＲＰＭＩ）、１９９培地、１０９培地、ハム（Ｈａｍ）Ｆ－１０培地、ハム（Ｈａｍ）Ｆ－１２培地、マッコイ（ＭｃＣｏｙ）５Ａ培地、リーヴォヴィッツ（Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ）Ｌ－１５培地、Ａｄｖａｎｃｅｄ（商標）ＤＭＥＭ、ＭｅｓｅｎＣｕｌｔ（商標）－ＡＣＦ Ｐｌｕｓ培地
、及びＳｔｅｍＰｒｏ（商標）ＭＳＣ ＳＦＭ ＣＴＳ培地が挙げられるが、これらに限定されない。この組成物が、細胞培養において通常使用される他のサプリメント、例えば、アミノ酸、ビタミン、無機塩、グルコース、増殖因子、ホルモン、及び付着因子と組み合わせて使用できることは、当業者には理解される。また、本明細書で開示される脂肪生成誘導組成物は、細胞増殖に適切なｐＨ及び浸透圧を維持することも理解される。当業者であれば、細胞培養の温度、湿度、及びガス雰囲気は細胞の種類によるものであり、規定どおりに最適化できることが容易に理解される。
、及びＳｔｅｍＰｒｏ（商標）ＭＳＣ ＳＦＭ ＣＴＳ培地が挙げられるが、これらに限定されない。この組成物が、細胞培養において通常使用される他のサプリメント、例えば、アミノ酸、ビタミン、無機塩、グルコース、増殖因子、ホルモン、及び付着因子と組み合わせて使用できることは、当業者には理解される。また、本明細書で開示される脂肪生成誘導組成物は、細胞増殖に適切なｐＨ及び浸透圧を維持することも理解される。当業者であれば、細胞培養の温度、湿度、及びガス雰囲気は細胞の種類によるものであり、規定どおりに最適化できることが容易に理解される。
【0043】
本明細書に開示されるように、動物から含脂肪細胞を得る方法が記載される。一例では、本開示は、動物から含脂肪細胞を得る方法であって、前記動物の組織試料から脂肪由来細胞を単離することを含む、方法を記載する。例えば、前記組織試料は脂肪組織であり得る。いくつかの例では、本開示で得られる脂肪組織試料は、脂肪組織、内臓脂肪、皮下脂肪、骨髄脂肪、腸間膜脂肪、又は筋肉に含まれる筋肉内／筋間脂肪であり得るが、これらに限定されない。組織試料から脂肪由来細胞を単離する方法は、例えば、先に開示した方法であり得る。当業者であれば、他の方法を使用して得られる単離された脂肪由来細胞が、本明細書に開示される動物から含脂肪細胞を得る方法に適用可能であることを理解することができるであろう。いくつかの例では、前記組織試料は動物から得られる。さらなる例では、前記動物は家禽、家畜、又は魚類である。例えば、前記動物は、雛鳥、アヒル、ガチョウ、七面鳥、ハト、又はウズラである。いくつかの例では、前記動物はウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタである。他の例では、前記動物には硬骨魚（硬骨魚綱）又は軟骨魚（軟骨魚綱）が含まれるが、これらに限定されない。別の例では、前記動物は、カイヤン、ニホンウナギ、ジェイドパーチ、及びバラマンディである。
【0044】
いくつかの例では、本開示は、動物から含脂肪細胞を得る方法であって、前記動物の組織試料から脂肪由来細胞を単離すること、及び本明細書に開示されるように脂肪生成誘導組成物の存在下で前記脂肪由来細胞を培養すること、を含む、方法を記載する。いくつかの例では、前記脂肪由来細胞は、任意の１又は複数のビタミン又はオメガ３脂肪酸のさらなる存在下で培養される。例えば、図２２及び図２５は、ビタミンＤ３、ビタミンＣ、又はオメガ３脂肪酸（例えば、ＤＨＡ、ＥＰＡを含む）の添加が脂肪生成誘導効率に悪影響を及ぼさないことを示している。さらなる例では、脂肪由来細胞は、本明細書に開示される脂肪生成誘導組成物の存在下で、少なくとも約３日間、または約６日間、又は約９日間培養される。いくつかの例では、脂肪生成誘導は少なくとも約６日である。たとえば、図１５に示すように、脂肪生成を起こしている細胞の割合は、３日目から約８０％になる。いくつかの例では、前記脂肪由来細胞は、本明細書に開示される脂肪生成誘導組成物の存在下で培養され、血清、３－イソブチル－１－メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）、デキサメタゾン、及びインドメタシンは、約３日間、約４日間間、約５日間、約６日間の培養後に任意選択で除去され得る。
【0045】
いくつかの例では、本開示は、動物から含脂肪細胞を得る方法であって、前記動物の組織試料から脂肪由来細胞を単離すること、本明細書に開示されるように脂肪生成誘導組成物の存在下で前記脂肪由来細胞を培養すること、及び細胞培養物から含脂肪細胞を得ること、を含む、方法を記載する。いくつかの例では、本明細書に開示される動物から含脂肪細胞を得る方法は、大規模細胞培養で行われる。いくつかの例では、本明細書に開示される動物から含脂肪細胞を得る方法は、バイオリアクター内で行われる。いくつかの例では、前記バイオリアクターは懸濁培養系を含む。いくつかの例では、前記懸濁培養系はマイクロキャリアである。例えば、図２８に示すように、前記含脂肪細胞は、培養細胞の接着のためのマイクロキャリアを含むバイオリアクターを使用して得られる。
【0046】
いくつかの例では、本開示は、動物から含脂肪細胞を取得する方法であって、前記動物の組織試料から脂肪由来細胞を単離すること、本明細書に開示されるように脂肪生成誘導
組成物の存在下で前記脂肪由来細胞を培養すること、及び細胞培養物から含脂肪細胞を得ること、を含む、方法を記載する。いくつかの例では、前記動物の組織試料から脂肪由来細胞を単離する工程は、本明細書に開示される方法に基づく。
組成物の存在下で前記脂肪由来細胞を培養すること、及び細胞培養物から含脂肪細胞を得ること、を含む、方法を記載する。いくつかの例では、前記動物の組織試料から脂肪由来細胞を単離する工程は、本明細書に開示される方法に基づく。
【0047】
本明細書に開示されるように、脂肪由来細胞株が記載される。一例では、本開示は、本明細書に開示される方法によって得られる又は得ることが可能な脂肪由来細胞株に関する。いくつかの例では、本開示は、（ａ）動物から脂肪組織試料を得ること、（ｂ）（ａ）の前記脂肪組織試料から間質血管細胞を採取すること、（ｃ）（ｂ）の前記間質血管細胞を増殖させること、（ｄ）各ウェルの増殖速度に基づいて前記増殖した間質血管細胞のクローン選択を行うこと、及び（ｅ）（ｄ）の前記選択の結果に基づいて１又は複数の脂肪由来細胞株を単離すること、を含む、動物から脂肪由来細胞株を単離する方法によって得られる又は得ることが可能な脂肪由来細胞株に言及する。別の例では、本開示は、少なくとも２１継代を経ても老化状態に入らないことを特徴とする、本明細書に開示される方法によって得られる又は得ることが可能な脂肪由来細胞株に言及する。例示的な脂肪由来細胞株を用いて図１１に示すように、この細胞株は２１継代を超えてさらに１００継代を超えるまで細胞培養物中で安定して増殖する。いくつかの例では、前記細胞株は、少なくとも１６継代、少なくとも２１継代、少なくとも３０継代、少なくとも５０継代、少なくとも８０継代、又は少なくとも１００継代後に老化状態に入らないことを特徴とする。また、図２７には、例えば、少なくとも２９継代、又は少なくとも１０４継代を受けた細胞について、例示的な細胞株が、本明細書に開示される方法を使用して脂肪生成誘導を受ける能力を依然として示すことも示されている。
【0048】
いくつかの例では、脂肪由来細胞株は、Ｐｈ９Ｆ－１ｘ（寄託受託番号：ＣＢＡ２０２２００３９）又はＡｊ１Ｃ－１ｘであり得る。本明細書に開示される例示的な細胞株Ｐｈ９Ｆ－１ｘは、シンガポール科学技術研究庁（Ａｇｅｎｃｙ ｆｏｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ，
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ （Ａ＊ＳＴＡＲ））の組織下の研究所の１つである分子細胞生物学研究所（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ （ＩＭＣＢ））所属の発明者の一人であるＬａｍｏｎｙ Ｃｈｅｗによる寄託受託番号ＣＢＡ２０２２００３９として、ブダペスト条約に基づいて２０２２年６月１６日にＣｅｌｌＢａｎｋ Ａｕｓｔｒａｌｉａに寄託されている。前記寄託細胞株は、２０２２年６月２０日にＣｅｌｌＢａｎｋ Ａｕｓｔｒａｌｉａによって生存可能であることが試験されている。
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ （Ａ＊ＳＴＡＲ））の組織下の研究所の１つである分子細胞生物学研究所（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ （ＩＭＣＢ））所属の発明者の一人であるＬａｍｏｎｙ Ｃｈｅｗによる寄託受託番号ＣＢＡ２０２２００３９として、ブダペスト条約に基づいて２０２２年６月１６日にＣｅｌｌＢａｎｋ Ａｕｓｔｒａｌｉａに寄託されている。前記寄託細胞株は、２０２２年６月２０日にＣｅｌｌＢａｎｋ Ａｕｓｔｒａｌｉａによって生存可能であることが試験されている。
【0049】
本明細書に開示されるように、細胞株Ｐｈ９Ｆ－１ｘ（寄託受託番号：ＣＢＡ２０２２００３９）が記載される。いくつかの例では、前記細胞株は脂肪由来細胞株である。いくつかの例では、細胞株Ｐｈ９Ｆ－１ｘは、少なくとも１６継代、少なくとも２１継代、少なくとも３０継代、少なくとも５０継代、少なくとも８０継代、又は少なくとも１００継代後に老化状態に入らないことを特徴とする。いくつかの例では、前記細胞株は、本明細書に開示される脂肪由来細胞株を単離する方法によって得ることができる又は得ることが可能である。いくつかの例では、前記細胞株は、本明細書に開示される脂肪生成誘導組成物を用いて脂肪生成を誘導するために使用され得る。いくつかのさらなる例では、前記細胞株は、本明細書に開示されるように脂肪生成誘導組成物の存在下で前記脂肪由来細胞を培養する工程（ｂ）から始まる本明細書に開示される方法に基づいて、動物から含脂肪細胞を得るために使用することができる。
【0050】
本明細書に開示されるように、細胞株Ａｊ１Ｃ－１ｘが記載される。いくつかの例では、前記細胞株は脂肪由来細胞株である。いくつかの例では、細胞株Ａｊ１Ｃ－１ｘは、少なくとも１６継代、少なくとも２１継代、少なくとも３０継代、少なくとも５０継代、少なくとも８０継代、又は少なくとも１００継代後に老化状態に入らないことを特徴とする。いくつかの例では、前記細胞株は、本明細書に開示される脂肪由来細胞株を単離する方
法によって得ることができる又は得ることが可能である。いくつかの例では、前記細胞株は、本明細書に開示される脂肪生成誘導組成物を用いて脂肪生成を誘導するために使用され得る。いくつかのさらなる例では、前記細胞株は、本明細書に開示されるように脂肪生成誘導組成物の存在下で前記脂肪由来細胞を培養する工程（ｂ）から始まる本明細書に開示される方法に基づいて、動物から含脂肪細胞を得るために使用することができる。
法によって得ることができる又は得ることが可能である。いくつかの例では、前記細胞株は、本明細書に開示される脂肪生成誘導組成物を用いて脂肪生成を誘導するために使用され得る。いくつかのさらなる例では、前記細胞株は、本明細書に開示されるように脂肪生成誘導組成物の存在下で前記脂肪由来細胞を培養する工程（ｂ）から始まる本明細書に開示される方法に基づいて、動物から含脂肪細胞を得るために使用することができる。
【0051】
いくつかの例では、本明細書に開示される脂肪由来細胞株は、無制限の空間及び栄養素によって指数関数的に増殖する。いくつかの例では、本明細書に開示される脂肪由来細胞株は、最初の７２時間以内に指数関数的に増殖する。いくつかの例では、倍加時間は約４８時間未満である。いくつかの例では、倍加時間は約１０～４８時間である。さらなる例では、本明細書に開示される脂肪由来細胞株は、約１２～４８時間の倍加時間を有する。実施例８は、例えば、例示的な細胞株がそれぞれ約１３．７時間及び約３１．２時間であると測定された倍加時間を有することを実証している。
【0052】
いくつかの例では、本明細書に開示される脂肪由来細胞株は、本明細書に開示される増殖培地中で培養される又は凍結保存される。いくつかの例では、本明細書に開示される脂肪由来細胞株は、マイコプラズマ汚染を含まない。いくつかの例では、脂肪由来細胞株は動物から得られる又は動物から得ることが可能である。さらなる例では、前記動物は家禽、家畜、又は魚類である。例えば、前記動物は、雛鳥、アヒル、ガチョウ、七面鳥、ハト、又はウズラであり得る。いくつかの例では、前記動物はウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタであり得る。他の例では、前記動物は硬骨魚（硬骨魚綱）又は軟骨魚（軟骨魚綱）であり得るが、これらに限定されない。別の例では、前記動物は、カイヤン、ニホンウナギ、ジェイドパーチ、及びバラマンディであり得る。
【0053】
本明細書に開示されるように、インビトロでの脂肪由来動物細胞の脂肪生成誘導のためのキットが記載される。一例では、インビトロでの脂肪由来動物細胞の脂肪生成誘導のためのキットは、本明細書に開示される脂肪生成誘導組成物及び本明細書に開示される脂肪由来細胞株を含む。別の例では、本明細書に開示される脂肪生成誘導組成物と、本明細書に開示される方法に従って得られる単離された脂肪由来細胞株とを含む、インビトロでの脂肪由来動物細胞の脂肪生成誘導のためのキットである。
【0054】
本明細書に開示されるように、本明細書に開示される方法によって生成される脂肪細胞が記載される。いくつかの例では、前記脂肪細胞は含脂肪細胞である。
【0055】
本明細書に開示されるように、本明細書に開示される細胞株を含む食品が記載される。一例では、食品は、本明細書に開示される脂肪細胞を含む。いくつかの例では、食品は肉を含む。いくつかの例では、食品は養殖肉である。本明細書に開示される細胞株又は本明細書に開示される脂肪細胞を含む食品が、他の細胞型、例えば、成熟筋細胞及び食用の食品グレード材料の三次元足場と組み合わせることによって製造されることは、当業者によって理解される。いくつかの例では、食品は魚肉を含む。
【0056】
本明細書に開示されるように、脂質組成物が記載される。一例では、前記脂質組成物は、本明細書に開示される脂肪由来細胞株から得られる。別の例では、前記脂質組成物は、本明細書に開示されるように脂肪細胞から得られる。いくつかの例では、前記脂質組成物は、室温下で液体形態又は固体形態である。いくつかの例では、前記脂質組成物は魚油である。
【0057】
本明細書に開示されるように、本明細書に開示される脂質組成物の使用が記載される。いくつかの例では、前記脂質は使用前に工業的処理を受ける。いくつかの例では、前記脂質は化粧品の製造に使用される。いくつかの例では、前記脂質は栄養補助食品として使用
される。いくつかの例では、前記脂質は食品添加物として使用される。
される。いくつかの例では、前記脂質は食品添加物として使用される。
【0058】
本明細書に例示的に記載された開示は、本明細書に具体的に開示されていないいかなる要素（単数又は複数）、限定（単数又は複数）も存在しない場合でも、適切に実施することができる。したがって、例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」などの用語は、制限なく拡大的に解釈されるものとする。さらに、本明細書で使用される用語及び表現は、限定ではなく説明の用語として使用されており、そのような用語及び表現の使用において、図示及び説明された特徴又はその一部と同等のものを除外する意図はないが、本発明の特許請求の範囲内で様々な変更が可能であることが認識される。したがって、本発明は、好ましい実施形態及び所望の特徴によって具体的に開示されたが、本明細書に開示された本明細書で具体化される発明の修正及び変形が当業者によって可能であり、そのような修正および変形は、本発明の範囲内にあるものとみなされることを理解されたい。
【0059】
本開示は、本明細書において広範かつ概説的に説明された。概説的な開示の範囲内に含まれるより狭い種及び下位の概説的なグループ分けのそれぞれも、本発明の一部を形成する。これには、削除された内容が本明細書に具体的に記載されているかどうかに関係なく、本発明の主題を属から削除する但し書き又は否定的な限定を伴う発明の概説が含まれる。他の実施形態は、以下の特許請求の範囲及び非限定的な例の範囲内にある。さらに、本発明の特徴又は態様がマーカッシュ群に関して説明される場合、当業者は、本発明がマーカッシュ群の任意の個々のメンバー又はメンバーのサブグループに関しても説明されることを認識するであろう。
【実施例】
【0060】
実験セクション
動物
０．７～１．０ｋｇのパンガシウス（Ｐａｔｉｎ ｆｉｓｈ）であるカイヤン（Ｐａｎｇａｓｉａｎｏｄｏｎ ｈｙｐｏｐｈｔｈａｌｍｕｓ）を、地元の養殖業者のＫｈａｉｓｅｎｇ Ｔｒａｄｉｎｇ ＆ Ｆｉｓｈ Ｆａｒｍ Ｐｔｅ． Ｌｔｄ．（シンガポール）から取得した。０．１～０．２ｋｇのニホンウナギ（Ａｎｇｕｉｌｌａ ｊａｐｏｎｉｃａ）を、Ｍａｎ Ｍａｎ Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｕｎａｇｉ Ｒｅｓｔａｕｒａｎｔ（シンガポール）から取得した。０．７～１．０ｋｇのバラマンディ（Ｌａｔｅｓ ｃａｌｃａｒｉｆｅｒ）及びオーストラリアジェイドパーチ（Ｓｃｏｒｔｕｍ ｂａｒｃｏｏ）を、別の地元の養殖業者のＡｐｏｌｌｏ Ｍａｒｉｎｅ Ｓｅａｆｏｏｄ（シンガポール）から取得した。前記魚をメタンスルホン酸トリカイン溶液に浸漬して屠殺し、続いて頭部を切り落とした。安楽死後、幹細胞を単離するために約０．６～１．５ｇの腸間膜脂肪を切除した。場合によっては、筋肉内脂肪又は筋肉間脂肪を含む筋肉を細胞単離に使用した。さらに、背部静脈穿刺により約１０ｍＬの血液を採取し、４℃で１８時間保存した。２，０００×ｇで１５分間遠心分離した後、血清を収集した。血清を５６℃で３０分間熱処理し、さらなる処理まで－３０℃で保存した。生きた動物の取り扱いを伴うすべての手順は、シンガポール科学技術研究庁（Ａ＊ＳＴＡＲ）の施設内動物管理使用委員会（ＩＡＣＵＣ）の承認に従って実施した（ＩＡＣＵＣ番号２０１５７０）。
動物
０．７～１．０ｋｇのパンガシウス（Ｐａｔｉｎ ｆｉｓｈ）であるカイヤン（Ｐａｎｇａｓｉａｎｏｄｏｎ ｈｙｐｏｐｈｔｈａｌｍｕｓ）を、地元の養殖業者のＫｈａｉｓｅｎｇ Ｔｒａｄｉｎｇ ＆ Ｆｉｓｈ Ｆａｒｍ Ｐｔｅ． Ｌｔｄ．（シンガポール）から取得した。０．１～０．２ｋｇのニホンウナギ（Ａｎｇｕｉｌｌａ ｊａｐｏｎｉｃａ）を、Ｍａｎ Ｍａｎ Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｕｎａｇｉ Ｒｅｓｔａｕｒａｎｔ（シンガポール）から取得した。０．７～１．０ｋｇのバラマンディ（Ｌａｔｅｓ ｃａｌｃａｒｉｆｅｒ）及びオーストラリアジェイドパーチ（Ｓｃｏｒｔｕｍ ｂａｒｃｏｏ）を、別の地元の養殖業者のＡｐｏｌｌｏ Ｍａｒｉｎｅ Ｓｅａｆｏｏｄ（シンガポール）から取得した。前記魚をメタンスルホン酸トリカイン溶液に浸漬して屠殺し、続いて頭部を切り落とした。安楽死後、幹細胞を単離するために約０．６～１．５ｇの腸間膜脂肪を切除した。場合によっては、筋肉内脂肪又は筋肉間脂肪を含む筋肉を細胞単離に使用した。さらに、背部静脈穿刺により約１０ｍＬの血液を採取し、４℃で１８時間保存した。２，０００×ｇで１５分間遠心分離した後、血清を収集した。血清を５６℃で３０分間熱処理し、さらなる処理まで－３０℃で保存した。生きた動物の取り扱いを伴うすべての手順は、シンガポール科学技術研究庁（Ａ＊ＳＴＡＲ）の施設内動物管理使用委員会（ＩＡＣＵＣ）の承認に従って実施した（ＩＡＣＵＣ番号２０１５７０）。
【0061】
増殖培地
特に明記しない限り、全ての細胞培養試薬及び化学薬品はＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ
Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社（米国）から購入した。完全増殖培地は高グルコースＤＭＥＭ、２０％熱不活化ＦＢＳ、２％熱不活化魚血清、３００Ｕ／ｍＬのペニシリン、３００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、及び５ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを含む。Ａｄｖａｎｃｅｄ（商標）ＤＭＥＭには、２％熱不活化ＦＢＳ、０．１％熱処理魚血清、５ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ、及び２ｍＭのＬ－グルタミンを添加した。リーヴォヴィッツ（Ｌｅｉｂｏｖｉｔ
ｚ）Ｌ－１５培地には、１５％熱不活化ＦＢＳ、０．１％熱処理魚血清、及び５ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを添加した。ＭｅｓｅｎＣｕｌｔ（商標）－ＡＣＦ Ｐｌｕｓ培地（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）及びＳｔｅｍＰｒｏ（商標）ＭＳＣ ＳＦＭ
ＣＴＳ培地には、０．１％熱処理魚血清及び２ｍＭのＬ－グルタミンを添加した。
特に明記しない限り、全ての細胞培養試薬及び化学薬品はＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ
Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社（米国）から購入した。完全増殖培地は高グルコースＤＭＥＭ、２０％熱不活化ＦＢＳ、２％熱不活化魚血清、３００Ｕ／ｍＬのペニシリン、３００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、及び５ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを含む。Ａｄｖａｎｃｅｄ（商標）ＤＭＥＭには、２％熱不活化ＦＢＳ、０．１％熱処理魚血清、５ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ、及び２ｍＭのＬ－グルタミンを添加した。リーヴォヴィッツ（Ｌｅｉｂｏｖｉｔ
ｚ）Ｌ－１５培地には、１５％熱不活化ＦＢＳ、０．１％熱処理魚血清、及び５ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを添加した。ＭｅｓｅｎＣｕｌｔ（商標）－ＡＣＦ Ｐｌｕｓ培地（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）及びＳｔｅｍＰｒｏ（商標）ＭＳＣ ＳＦＭ
ＣＴＳ培地には、０．１％熱処理魚血清及び２ｍＭのＬ－グルタミンを添加した。
【0062】
魚脂肪由来細胞の単離
間質血管画分を、酵素消化によって切除した腸間膜脂肪から単離した。簡潔には、脂肪組織又は筋肉組織を等量（脂肪重量１グラムあたり１マイクロリットル）のハンクス（Ｈａｎｋ’ｓ）平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）に浸し、滅菌ハサミを使用してミンチ化した。ミンチ化した脂肪組織を、１ｍｇ／ｍＬのＩＶ型コラゲナーゼ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社、米国ニュージャージー州）及び５ｍＭの塩化カルシウムを含む等量（脂肪重量１ｇ当たり１ｍＬ）のＨＢＳＳ中で３７℃で１時間消化した。あるいは、ミンチ化した脂肪組織を、０．５ｍｇ／ｍＬのＩＶ型コラゲナーゼ、２．４ｍｇ／ｍＬのディスパーゼＩＩ、及び２．５ｍＭの塩化カルシウムを含む等量（脂肪重量１グラム当たり１マイクロリットル）のＨＢＳＳ中で３７℃で１時間消化した。消化した脂肪組織試料を１００μｍナイロンフィルターに通し、４００×ｇで５分間遠心分離した。細胞ペレットを塩化アンモニウム－塩化カリウム（ＡＣＫ）溶解緩衝液に２分間再懸濁し、４０μｍナイロンフィルターに通した。細胞を完全増殖培地に再懸濁し、ゼラチンコートした（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）６ウェルプレート上において２８℃で５％ＣＯ２含有加湿雰囲気中で増殖させた。細胞培養培地を２日ごとに交換し、７０％コンフルエントに達した時点で細胞を０．０５％トリプシン－エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）又はＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓと共に２８℃で２分間インキュベートすることによって継代した。
間質血管画分を、酵素消化によって切除した腸間膜脂肪から単離した。簡潔には、脂肪組織又は筋肉組織を等量（脂肪重量１グラムあたり１マイクロリットル）のハンクス（Ｈａｎｋ’ｓ）平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）に浸し、滅菌ハサミを使用してミンチ化した。ミンチ化した脂肪組織を、１ｍｇ／ｍＬのＩＶ型コラゲナーゼ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社、米国ニュージャージー州）及び５ｍＭの塩化カルシウムを含む等量（脂肪重量１ｇ当たり１ｍＬ）のＨＢＳＳ中で３７℃で１時間消化した。あるいは、ミンチ化した脂肪組織を、０．５ｍｇ／ｍＬのＩＶ型コラゲナーゼ、２．４ｍｇ／ｍＬのディスパーゼＩＩ、及び２．５ｍＭの塩化カルシウムを含む等量（脂肪重量１グラム当たり１マイクロリットル）のＨＢＳＳ中で３７℃で１時間消化した。消化した脂肪組織試料を１００μｍナイロンフィルターに通し、４００×ｇで５分間遠心分離した。細胞ペレットを塩化アンモニウム－塩化カリウム（ＡＣＫ）溶解緩衝液に２分間再懸濁し、４０μｍナイロンフィルターに通した。細胞を完全増殖培地に再懸濁し、ゼラチンコートした（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）６ウェルプレート上において２８℃で５％ＣＯ２含有加湿雰囲気中で増殖させた。細胞培養培地を２日ごとに交換し、７０％コンフルエントに達した時点で細胞を０．０５％トリプシン－エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）又はＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓと共に２８℃で２分間インキュベートすることによって継代した。
【0063】
あるいは、脂肪由来細胞は、外植片培養によって切除された腸間膜脂肪から単離した。脂肪組織を直径約４～５ｍｍの小片にミンチ化し、上記のように完全増殖培地に再懸濁した。細胞が組織から移動し、３０％～４０％コンフルエントに達するまで、細胞培養培地を７日ごとに交換した。その後、７０％コンフルエントになるまで細胞培養培地を２日ごとに交換した。
【0064】
細胞株の樹立
細胞を９継代目まで増殖させ、ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ（商標）ＩＩセルソーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、米国）を使用して１０細胞／ウェルの細胞密度でゼラチンコート９６ウェル平底黒色プレートに選別した。前記細胞を完全増殖培地で増殖させ、５％ＣＯ２含有加湿雰囲気中、２８℃でインキュベートした。１０日後、少なくとも７０％コンフルエントのウェルを増殖させた。２０継代目に達した細胞を細胞株とみなし、バンバンカー（ＢＡＭＢＡＮＫＥＲ）（登録商標）凍結培地を使用して液体窒素中で凍結保存した。
細胞を９継代目まで増殖させ、ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ（商標）ＩＩセルソーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、米国）を使用して１０細胞／ウェルの細胞密度でゼラチンコート９６ウェル平底黒色プレートに選別した。前記細胞を完全増殖培地で増殖させ、５％ＣＯ２含有加湿雰囲気中、２８℃でインキュベートした。１０日後、少なくとも７０％コンフルエントのウェルを増殖させた。２０継代目に達した細胞を細胞株とみなし、バンバンカー（ＢＡＭＢＡＮＫＥＲ）（登録商標）凍結培地を使用して液体窒素中で凍結保存した。
【0065】
細胞増殖の測定
細胞を、滴定濃度のＦＢＳ又は魚血清を含む増殖培地の１ｍＬ当たり５０，０００細胞の細胞密度で再懸濁した。前記細胞をゼラチンコートした９６ウェル平底黒色プレートに播種し、５％ＣＯ２含有加湿雰囲気中、２８℃でインキュベートした。製造元の指示に従い、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｂｌｕｅ（登録商標）Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、米国）を使用して、前記細胞の細胞増殖を５日間評価した。簡潔には、毎日、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｂｌｕｅ（登録商標）試薬を細胞に添加し、２８℃でインキュベートした。２時間後、Ｔｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００ Ｐｒｏを使用して５６０／５９０の励起／発光波長で蛍光強度を測定した。
細胞を、滴定濃度のＦＢＳ又は魚血清を含む増殖培地の１ｍＬ当たり５０，０００細胞の細胞密度で再懸濁した。前記細胞をゼラチンコートした９６ウェル平底黒色プレートに播種し、５％ＣＯ２含有加湿雰囲気中、２８℃でインキュベートした。製造元の指示に従い、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｂｌｕｅ（登録商標）Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、米国）を使用して、前記細胞の細胞増殖を５日間評価した。簡潔には、毎日、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｂｌｕｅ（登録商標）試薬を細胞に添加し、２８℃でインキュベートした。２時間後、Ｔｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００ Ｐｒｏを使用して５６０／５９０の励起／発光波長で蛍光強度を測定した。
【0066】
マイコプラズマ汚染の検出
細胞をＴ７５フラスコ内で２日間、７０％コンフルエンスになるまで増殖させた。細胞培養上清を収集し、製造元の指示に従ってＭｙｃｏＡｌｅｒｔ（商標）ＰＬＵＳマイコプラズマ検出キット（Ｌｏｎｚａ社）を使用してマイコプラズマの存在を検出した。Ｔｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ１０００プレートリーダーを使用して発光を測定した。
細胞をＴ７５フラスコ内で２日間、７０％コンフルエンスになるまで増殖させた。細胞培養上清を収集し、製造元の指示に従ってＭｙｃｏＡｌｅｒｔ（商標）ＰＬＵＳマイコプラズマ検出キット（Ｌｏｎｚａ社）を使用してマイコプラズマの存在を検出した。Ｔｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ１０００プレートリーダーを使用して発光を測定した。
【0067】
細胞集団の倍加時間の測定
細胞を完全増殖培地に再懸濁し、ゼラチンコートした９６ウェル平底黒色プレートにウェル当たり１０００又は１５００細胞の細胞密度で加えた。細胞を、５％ＣＯ２含有加湿雰囲気中、２８℃で３日間インキュベートした。毎日、細胞核を製造元の指示に従ってＣｙＱＵＡＮＴ（商標）細胞増殖アッセイで染色した。２８℃で１時間インキュベートした後、シンガポールのバイオポリス（Ｂｉｏｐｏｌｉｓ）にあるＳＢＩＣ－ニコンイメージングセンター（ＳＢＩＣ－Ｎｉｋｏｎ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｃｅｎｔｒｅ）のＮ－ＳＴＯＲＭ／ＴＩＲＦ顕微鏡を使用して細胞を画像化し、ＮＩＳ－Ｅｌｅｍｅｎｔソフトウェア（株式会社ニコン、東京、日本）を使用して細胞数を測定した。
細胞を完全増殖培地に再懸濁し、ゼラチンコートした９６ウェル平底黒色プレートにウェル当たり１０００又は１５００細胞の細胞密度で加えた。細胞を、５％ＣＯ２含有加湿雰囲気中、２８℃で３日間インキュベートした。毎日、細胞核を製造元の指示に従ってＣｙＱＵＡＮＴ（商標）細胞増殖アッセイで染色した。２８℃で１時間インキュベートした後、シンガポールのバイオポリス（Ｂｉｏｐｏｌｉｓ）にあるＳＢＩＣ－ニコンイメージングセンター（ＳＢＩＣ－Ｎｉｋｏｎ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｃｅｎｔｒｅ）のＮ－ＳＴＯＲＭ／ＴＩＲＦ顕微鏡を使用して細胞を画像化し、ＮＩＳ－Ｅｌｅｍｅｎｔソフトウェア（株式会社ニコン、東京、日本）を使用して細胞数を測定した。
【0068】
魚類脂肪由来細胞株の脂肪生成
脂肪由来細胞の脂肪生成が誘導された。細胞を完全増殖培地１ｍＬ当たり１００，０００細胞の細胞密度で再懸濁し、ゼラチンコートした９６ウェル平底黒色プレートに１００μＬ／ウェルで播種した。細胞を、５％ＣＯ２含有加湿雰囲気中、２８℃でインキュベートした。２日後、前記細胞をＨＢＳＳで３回洗浄し、高グルコースダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、１５％熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、０．１％熱不活化魚血清、３００Ｕ／ｍＬのペニシリン、３００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、並びに５００μＭの３－イソブチル－１－メチルキサンチン（ＩＢＭＸ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）、１μＭのデキサメタゾン、１６７ｎＭのインスリン、及び１００μＭのインドメタシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）を含む脂肪生成誘導カクテル１で細胞を誘導することによって脂肪生成を開始した。脂肪生成誘導の３日後及び６日後、細胞をＤＭＥＭ、１５％ＦＢＳ、０．１％魚血清、３００Ｕ／ｍＬのペニシリン、３００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、及び１６７ｎＭのインスリンを含む脂肪生成誘導カクテル２で誘導した。リノール酸－オレイン酸アルブミン（ＬＡＯＡ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ、Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ、Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社）、オレイン酸アルブミン（ＯＡＡ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社）、及びリノール酸アルブミン（ＬＡＡ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社）を必要に応じて脂肪生成誘導カクテルに追加してもよい。脂肪生成誘導の９日後、製造元の指示に従って、細胞をＡｄｉｐｏＲｅｄ（商標）アッセイ試薬（Ｌｏｎｚａ社、米国）で染色し、４％パラホルムアルデヒドで固定し、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２で対比染色した。Ｎ－ＳＴＯＲＭ／ＴＩＲＦ顕微鏡を使用して細胞を画像化し、ＮＩＳ－Ｅｌｅｍｅｎｔソフトウェアを使用して分析した。
脂肪由来細胞の脂肪生成が誘導された。細胞を完全増殖培地１ｍＬ当たり１００，０００細胞の細胞密度で再懸濁し、ゼラチンコートした９６ウェル平底黒色プレートに１００μＬ／ウェルで播種した。細胞を、５％ＣＯ２含有加湿雰囲気中、２８℃でインキュベートした。２日後、前記細胞をＨＢＳＳで３回洗浄し、高グルコースダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、１５％熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、０．１％熱不活化魚血清、３００Ｕ／ｍＬのペニシリン、３００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、並びに５００μＭの３－イソブチル－１－メチルキサンチン（ＩＢＭＸ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）、１μＭのデキサメタゾン、１６７ｎＭのインスリン、及び１００μＭのインドメタシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）を含む脂肪生成誘導カクテル１で細胞を誘導することによって脂肪生成を開始した。脂肪生成誘導の３日後及び６日後、細胞をＤＭＥＭ、１５％ＦＢＳ、０．１％魚血清、３００Ｕ／ｍＬのペニシリン、３００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、及び１６７ｎＭのインスリンを含む脂肪生成誘導カクテル２で誘導した。リノール酸－オレイン酸アルブミン（ＬＡＯＡ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ、Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ、Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社）、オレイン酸アルブミン（ＯＡＡ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社）、及びリノール酸アルブミン（ＬＡＡ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社）を必要に応じて脂肪生成誘導カクテルに追加してもよい。脂肪生成誘導の９日後、製造元の指示に従って、細胞をＡｄｉｐｏＲｅｄ（商標）アッセイ試薬（Ｌｏｎｚａ社、米国）で染色し、４％パラホルムアルデヒドで固定し、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２で対比染色した。Ｎ－ＳＴＯＲＭ／ＴＩＲＦ顕微鏡を使用して細胞を画像化し、ＮＩＳ－Ｅｌｅｍｅｎｔソフトウェアを使用して分析した。
【0069】
遺伝子発現解析
ＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を使用して全ＲＮＡを抽出し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＶ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を使用してｃＤＮＡに逆転写した。ＣＦＸ９６リアルタイムＰＣＲ検出系で、ＳｓｏＡｄｖａｎｃｅｄ（商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ－ｒａｄ社）を使用して、脂肪生成分化に関与する様々な遺伝子（ＰＰＡＲ－γ、Ｃ／ＥＢＰα、Ｃ／ＥＢＰβ、ＦＡＳ、ＨＳＬα、ＨＳＬβ、ＬＰＬ）の発現を調べた。相対的な遺伝子発現をβ－アクチンに対して正規化し、２－ΔΔＣＴ法を使用して計算した。プライマーは、ＮＣＢＩデータベース上のカイヤンの予測配列に基づいて、Ｐｒｉｍｅｒ３バージョン４．１．０を使用して設計した。
ＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を使用して全ＲＮＡを抽出し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＶ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を使用してｃＤＮＡに逆転写した。ＣＦＸ９６リアルタイムＰＣＲ検出系で、ＳｓｏＡｄｖａｎｃｅｄ（商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ－ｒａｄ社）を使用して、脂肪生成分化に関与する様々な遺伝子（ＰＰＡＲ－γ、Ｃ／ＥＢＰα、Ｃ／ＥＢＰβ、ＦＡＳ、ＨＳＬα、ＨＳＬβ、ＬＰＬ）の発現を調べた。相対的な遺伝子発現をβ－アクチンに対して正規化し、２－ΔΔＣＴ法を使用して計算した。プライマーは、ＮＣＢＩデータベース上のカイヤンの予測配列に基づいて、Ｐｒｉｍｅｒ３バージョン４．１．０を使用して設計した。
【0070】
オメガ３脂肪酸の測定
オメガ３脂肪酸は、シンガポールのデューク国立大学（Ｄｕｋｅ－Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ（ＮＵＳ））のメタボロミクス施設（Ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃｓ Ｆａｃｉｌｉｔｙ）の記載に従ってわずかに変更を加えて抽出及び測定した。細胞を冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、冷０．１％ギ酸中で掻爬した。次いで、前記細胞を４℃で３０分間ボルテックスで混合した。細胞抽出物のタンパク質濃度は、Ｐｉｅｒｃｅ（商標）還元剤対応マイクロプレートＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、米国）を製造元の指示に従って使用して測定した。細胞抽出物を等量のアセトニトリルと混合し、質量分析のためにデューク国立大学のメタボロミクス施設に送付した。
オメガ３脂肪酸は、シンガポールのデューク国立大学（Ｄｕｋｅ－Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ（ＮＵＳ））のメタボロミクス施設（Ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃｓ Ｆａｃｉｌｉｔｙ）の記載に従ってわずかに変更を加えて抽出及び測定した。細胞を冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、冷０．１％ギ酸中で掻爬した。次いで、前記細胞を４℃で３０分間ボルテックスで混合した。細胞抽出物のタンパク質濃度は、Ｐｉｅｒｃｅ（商標）還元剤対応マイクロプレートＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、米国）を製造元の指示に従って使用して測定した。細胞抽出物を等量のアセトニトリルと混合し、質量分析のためにデューク国立大学のメタボロミクス施設に送付した。
【0071】
スピナーフラスコ内のＣｙｔｏｄｅｘ（登録商標）１マイクロキャリア上の魚類細胞株の増殖及び脂肪生成
細胞株は、製造業者の指示に従い、Ｃｙｔｏｄｅｘ（登録商標）１マイクロキャリア（Ｃｙｔｉｖａ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社、米国）上で増殖させた。簡潔には、６．６７×１０６細胞、０．２グラムのマイクロキャリア、及び４０ｍＬの完全増殖培地を、１２５ｍＬスピナーフラスコ中で混合し、２０回転／分（ｒｐｍ）で撹拌した。２時間後、撹拌速度を４０ｒｐｍに増加した。２４時間後、３０ｍＬの完全増殖培地をフラスコに加えた。増殖培地を補充するために、細胞－マイクロキャリア凝集体を２分間静置し、使用済み培地の５０％を２日ごとに新しい培地と交換した。細胞株の脂肪生成分化を誘導するために、細胞－マイクロキャリア凝集体を魚血清、脂肪生成誘導カクテル、及びＬＡＯＡを含むＥｓｓｅｎｔｉａｌ ６（商標）培地で６日間処理した。
細胞株は、製造業者の指示に従い、Ｃｙｔｏｄｅｘ（登録商標）１マイクロキャリア（Ｃｙｔｉｖａ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社、米国）上で増殖させた。簡潔には、６．６７×１０６細胞、０．２グラムのマイクロキャリア、及び４０ｍＬの完全増殖培地を、１２５ｍＬスピナーフラスコ中で混合し、２０回転／分（ｒｐｍ）で撹拌した。２時間後、撹拌速度を４０ｒｐｍに増加した。２４時間後、３０ｍＬの完全増殖培地をフラスコに加えた。増殖培地を補充するために、細胞－マイクロキャリア凝集体を２分間静置し、使用済み培地の５０％を２日ごとに新しい培地と交換した。細胞株の脂肪生成分化を誘導するために、細胞－マイクロキャリア凝集体を魚血清、脂肪生成誘導カクテル、及びＬＡＯＡを含むＥｓｓｅｎｔｉａｌ ６（商標）培地で６日間処理した。
【0072】
細胞数を測定するために、細胞－マイクロキャリア凝集体を７０ｍＬのＰＢＳで３回洗浄し、７０ｍＬのＴｒｙｐｌｅ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓで処理し、２８℃で１５０ｒｐｍで撹拌した。７０μｍセルストレーナー（ＳＰＬ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社、韓国）を使用して細胞及びマイクロキャリアを分離し、トリパンブルー染色（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、米国）で計数した。マイクロキャリアへの細胞の接着を視覚化するために、細胞をメーカーの指示に従ってＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２で染色し、バイオポリスのＳＢＩＣ－ニコンイメージングセンターにあるＮｉｋｏｎ Ａ１Ｒ＋ｓｉ共焦点顕微鏡を使用して画像化した。
【0073】
統計分析
特に明記しない限り、全てのデータは平均値±ＳＥＭとして表示される。各変数の有意差（Ｐ＜０．０５）は、まず一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）、続いてテューキー事後検定を使用して決定した。全ての分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（グラフパッドプリズム）５．０３（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ社、カリフォルニア州サンディエゴ）を使用して実施した。
特に明記しない限り、全てのデータは平均値±ＳＥＭとして表示される。各変数の有意差（Ｐ＜０．０５）は、まず一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）、続いてテューキー事後検定を使用して決定した。全ての分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（グラフパッドプリズム）５．０３（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ社、カリフォルニア州サンディエゴ）を使用して実施した。
【0074】
実施例１
脂肪由来初代細胞の単離
カイヤンの脂肪組織をコラゲナーゼＩＶ型で消化し、２％魚血清の非存在下又は存在下において完全ＤＭＥＭ中で増殖させた。結果は、カイヤン脂肪由来細胞の単離及び増殖に成功したことを示している。バラマンディ、ニホンウナギ、及びオーストラリアジェイドパーチからの脂肪由来細胞も、同じ方法を使用して単離し、正常に増殖させた（図２Ｂ）。魚血清が存在しない場合と比較して、増殖培地に魚血清が存在した場合、培養３日後及び６日後に新たに単離された細胞の細胞密度が高くなった（図２Ａ）。結果は、魚血清が新たに単離されたカイヤン脂肪由来細胞の生存に寄与していることを示唆している。
脂肪由来初代細胞の単離
カイヤンの脂肪組織をコラゲナーゼＩＶ型で消化し、２％魚血清の非存在下又は存在下において完全ＤＭＥＭ中で増殖させた。結果は、カイヤン脂肪由来細胞の単離及び増殖に成功したことを示している。バラマンディ、ニホンウナギ、及びオーストラリアジェイドパーチからの脂肪由来細胞も、同じ方法を使用して単離し、正常に増殖させた（図２Ｂ）。魚血清が存在しない場合と比較して、増殖培地に魚血清が存在した場合、培養３日後及び６日後に新たに単離された細胞の細胞密度が高くなった（図２Ａ）。結果は、魚血清が新たに単離されたカイヤン脂肪由来細胞の生存に寄与していることを示唆している。
【0075】
実施例２
クローン選択
脂肪由来初代細胞は不均一な細胞集団からなるため、カイヤンの細胞を１０継代増殖させ、２％魚血清を含むＤＭＥＭを含む９６ウェルプレートにウェル当たり１０細胞ずつに分割した。１５日後、１１２０ウェルのうち４１ウェルが少なくとも７０％コンフルエンスに達した（表１）。これらのウェル内の細胞は、クローン選択の前後で同じ紡錘形の形態を示した（図３）。これらの細胞を、今後の実験のために増殖及び凍結保存した。２０継代よりも多く増殖できた細胞を魚脂肪由来細胞株とみなした。
クローン選択
脂肪由来初代細胞は不均一な細胞集団からなるため、カイヤンの細胞を１０継代増殖させ、２％魚血清を含むＤＭＥＭを含む９６ウェルプレートにウェル当たり１０細胞ずつに分割した。１５日後、１１２０ウェルのうち４１ウェルが少なくとも７０％コンフルエンスに達した（表１）。これらのウェル内の細胞は、クローン選択の前後で同じ紡錘形の形態を示した（図３）。これらの細胞を、今後の実験のために増殖及び凍結保存した。２０継代よりも多く増殖できた細胞を魚脂肪由来細胞株とみなした。
【0076】
ニホンウナギの細胞を、２％魚血清含有ＤＭＥＭ中で６継代増殖させた。次いで、細胞を、２％魚血清含有又は非含有ＤＭＥＭを含む９６ウェルプレートにウェル当たり１細胞ずつに分割した。１３日後、２％魚血清を含むＤＭＥＭの１９２ウェル中８ウェルが少なくとも７０％コンフルエンスに達し、魚血清を含まないＤＭＥＭの１９２ウェル中６ウェルが少なくとも７０％コンフルエンスに達した（表１）。これらのウェル内の細胞も、クローン選択の前後で同じ紡錘形の形態を示した（図３）。これらの細胞を、今後の実験のために増殖及び凍結保存した。
【0077】
実施例３
低濃度の血清における脂肪由来細胞の増殖
血清の入手可能性及びコストが、脂肪由来細胞又は細胞株の増殖の限界となるため、カイヤン細胞株を、魚類細胞株の増殖を支持できる魚血清の最小濃度を決定するために、魚血清の滴定濃度で増殖させた。魚血清の非存在下（０％）と比較して、少なくとも０．１％の魚血清の存在下で増殖させたカイヤン細胞株は、４日後及び５日後に有意に高い蛍光強度を示した（図４）。結果は、増殖培地中に少なくとも０．１％の魚血清が存在すると、魚類細胞株の増殖が促進されることを示している。０．１～２％の魚血清の存在下で増殖させた魚類細胞株の増殖には有意差はなかった。したがって、データは、カイヤン細胞株の増殖を支持するには０．１％の魚血清が必要であることを示唆している。
低濃度の血清における脂肪由来細胞の増殖
血清の入手可能性及びコストが、脂肪由来細胞又は細胞株の増殖の限界となるため、カイヤン細胞株を、魚類細胞株の増殖を支持できる魚血清の最小濃度を決定するために、魚血清の滴定濃度で増殖させた。魚血清の非存在下（０％）と比較して、少なくとも０．１％の魚血清の存在下で増殖させたカイヤン細胞株は、４日後及び５日後に有意に高い蛍光強度を示した（図４）。結果は、増殖培地中に少なくとも０．１％の魚血清が存在すると、魚類細胞株の増殖が促進されることを示している。０．１～２％の魚血清の存在下で増殖させた魚類細胞株の増殖には有意差はなかった。したがって、データは、カイヤン細胞株の増殖を支持するには０．１％の魚血清が必要であることを示唆している。
【0078】
実施例４
自己血清の存在下での脂肪由来細胞の増殖
例示的な細胞株Ｐｈ９Ｆ－１ｘは、マス魚、チョウザメ魚、ウマ、及びウシの血清と比較して、パンガシウス及びティラピアの魚血清の存在下で増殖される。脂肪由来細胞の増殖速度を比較する。例示的な細胞株Ｐｈ９Ｆ－１ｘは、マス魚、チョウザメ魚、ウマ、及びウシの血清と比較して、パンガシウス及びティラピア魚血清の存在下でより速い速度で増殖することが示されている。これは、自己血清又は同門の動物由来の血清は、細胞の単離又は維持中の細胞増殖に役割を果たすことを意味している。
自己血清の存在下での脂肪由来細胞の増殖
例示的な細胞株Ｐｈ９Ｆ－１ｘは、マス魚、チョウザメ魚、ウマ、及びウシの血清と比較して、パンガシウス及びティラピアの魚血清の存在下で増殖される。脂肪由来細胞の増殖速度を比較する。例示的な細胞株Ｐｈ９Ｆ－１ｘは、マス魚、チョウザメ魚、ウマ、及びウシの血清と比較して、パンガシウス及びティラピア魚血清の存在下でより速い速度で増殖することが示されている。これは、自己血清又は同門の動物由来の血清は、細胞の単離又は維持中の細胞増殖に役割を果たすことを意味している。
【0079】
実施例５
脂肪由来細胞の増殖にはＦＢＳを要すること
次に、魚類細胞株の増殖を支持するＦＢＳの濃度を検討した。カイヤン細胞株及びニホンウナギ細胞株は、ＦＢＳの非存在下では増殖しなかった（図５）。対照的に、カイヤン細胞株及びニホンウナギ細胞株は、ＦＢＳの存在下で増殖した。これは、魚類細胞株の増殖を支持するにはＦＢＳが必要であることを示している。
脂肪由来細胞の増殖にはＦＢＳを要すること
次に、魚類細胞株の増殖を支持するＦＢＳの濃度を検討した。カイヤン細胞株及びニホンウナギ細胞株は、ＦＢＳの非存在下では増殖しなかった（図５）。対照的に、カイヤン細胞株及びニホンウナギ細胞株は、ＦＢＳの存在下で増殖した。これは、魚類細胞株の増殖を支持するにはＦＢＳが必要であることを示している。
【0080】
カイヤン細胞株は、５日後、ＦＢＳの非存在下で増殖した細胞株（１０．２±１０．１％）と比較して、１５％ＦＢＳの存在下で有意に高い増殖率（９１．５±４．９％）を示した（図５Ａ）。他の濃度のＦＢＳの存在下で増殖させた細胞株の増殖速度に有意差はなかった。
【0081】
ニホンウナギ細胞株は、４日後、２０％ＦＢＳ（６３．１±２．８％）及び５％ＦＢＳ（６８．３±２３．２％）で増殖させた細胞株と比較して、１０％ＦＢＳ（１００％）の
存在下で有意に高い増殖率を示した（図５Ｂ）。１５％ＦＢＳの存在下で増殖させた細胞株と比較して、１０％ＦＢＳの存在下で増殖させた細胞株の増殖に有意差はなかった。
存在下で有意に高い増殖率を示した（図５Ｂ）。１５％ＦＢＳの存在下で増殖させた細胞株と比較して、１０％ＦＢＳの存在下で増殖させた細胞株の増殖に有意差はなかった。
【0082】
実施例６
高速増殖細胞株及び低速増殖細胞株の同定
細胞増殖速度は、養殖肉の生産における最も重要な要素の１つである。様々な魚脂肪由来細胞株の増殖速度を特徴付けるために、８つのカイヤン細胞株の増殖速度を５日間にわたって調べた。増殖アッセイにより、Ｐｈ９Ｆ－１ｘ（白四角で示す）は他の細胞株と比較してより速く増殖することが明らかになった（図６）。
高速増殖細胞株及び低速増殖細胞株の同定
細胞増殖速度は、養殖肉の生産における最も重要な要素の１つである。様々な魚脂肪由来細胞株の増殖速度を特徴付けるために、８つのカイヤン細胞株の増殖速度を５日間にわたって調べた。増殖アッセイにより、Ｐｈ９Ｆ－１ｘ（白四角で示す）は他の細胞株と比較してより速く増殖することが明らかになった（図６）。
【0083】
５つのニホンウナギ細胞株の増殖速度も４日間にわたって調べた。増殖アッセイにより、Ａｊ１Ｃ－１ｘ（白四角で示す）は他の細胞株と比較してより速く増殖することが明らかになった（図６）。Ｐｈ９Ｆ－１ｘ及びＡｊ１Ｃ－１ｘの両方を脂肪生成研究のために選択した。
【0084】
実施例７
細胞株におけるマイコプラズマ汚染の検出
マイコプラズマ感染は細胞培養中によく起こる問題であり、細胞株の増殖速度を低下させることが知られている。単離された脂肪由来細胞株でマイコプラズマ汚染が発生していないことを確認するため、高速増殖する魚類細胞株のＰｈ９Ｆ－１ｘ及びＡｊ１Ｃ－１ｘ、並びにその他の低速増殖するクローンの培養上清で、マイコプラズマの存在を検査した。マイコプラズマアッセイにより、９個の細胞培養上清の相対発光単位が１．０未満であることが明らかになり、単離された脂肪由来細胞株がマイコプラズマに感染していないことが示された。さらに、２つの単離された細胞株であるＰｈ９Ｆ－１ｘ及びＡｊ１Ｃ－１ｘと他のクローンとの間の増殖速度の違いは、マイコプラズマ汚染によるものではなかった。
細胞株におけるマイコプラズマ汚染の検出
マイコプラズマ感染は細胞培養中によく起こる問題であり、細胞株の増殖速度を低下させることが知られている。単離された脂肪由来細胞株でマイコプラズマ汚染が発生していないことを確認するため、高速増殖する魚類細胞株のＰｈ９Ｆ－１ｘ及びＡｊ１Ｃ－１ｘ、並びにその他の低速増殖するクローンの培養上清で、マイコプラズマの存在を検査した。マイコプラズマアッセイにより、９個の細胞培養上清の相対発光単位が１．０未満であることが明らかになり、単離された脂肪由来細胞株がマイコプラズマに感染していないことが示された。さらに、２つの単離された細胞株であるＰｈ９Ｆ－１ｘ及びＡｊ１Ｃ－１ｘと他のクローンとの間の増殖速度の違いは、マイコプラズマ汚染によるものではなかった。
【0085】
実施例８
細胞増殖に適合する増殖培地の特定
ＤＭＥＭとは別に、多くの研究では、ヒト脂肪由来幹細胞の増殖を支持するために、ＭｅｓｅｎＣｕｌｔ（商標）－ＡＣＦ Ｐｌｕｓ培地及びＳｔｅｍＰｒｏ（商標）ＭＳＣ ＳＦＭ ＣＴＳ培地を使用し、培養細胞の増殖を支持するために、リーヴォヴィッツ（Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ）Ｌ１５増殖培地を使用している。単離された脂肪由来細胞株の増殖を支持可能な最も適切な増殖培地を決定するために、カイヤン細胞株を様々な増殖培地で増殖させた。細胞増殖アッセイにより、ＤＭＥＭ及びＡｄｖａｎｃｅｄ（商標）ＤＭＥＭで増殖させたカイヤン脂肪由来細胞株は、リーヴォヴィッツ（Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ）Ｌ１５培地、ＭｅｓｅｎＣｕｌｔ（商標）－ＡＣＦ Ｐｌｕｓ培地、及びＳｔｅｍＰｒｏ（商標）ＭＳＣ ＳＦＭ ＣＴＳ培地と比較して、著しく高い増殖速度を示すことが明らかになった。ＤＭＥＭとＡｄｖａｎｃｅｄ（商標）ＤＭＥＭとで増殖させた魚類細胞株の増殖には有意差はなかった。下流実験（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ）はＤＭＥＭを使用して実施した。
細胞増殖に適合する増殖培地の特定
ＤＭＥＭとは別に、多くの研究では、ヒト脂肪由来幹細胞の増殖を支持するために、ＭｅｓｅｎＣｕｌｔ（商標）－ＡＣＦ Ｐｌｕｓ培地及びＳｔｅｍＰｒｏ（商標）ＭＳＣ ＳＦＭ ＣＴＳ培地を使用し、培養細胞の増殖を支持するために、リーヴォヴィッツ（Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ）Ｌ１５増殖培地を使用している。単離された脂肪由来細胞株の増殖を支持可能な最も適切な増殖培地を決定するために、カイヤン細胞株を様々な増殖培地で増殖させた。細胞増殖アッセイにより、ＤＭＥＭ及びＡｄｖａｎｃｅｄ（商標）ＤＭＥＭで増殖させたカイヤン脂肪由来細胞株は、リーヴォヴィッツ（Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ）Ｌ１５培地、ＭｅｓｅｎＣｕｌｔ（商標）－ＡＣＦ Ｐｌｕｓ培地、及びＳｔｅｍＰｒｏ（商標）ＭＳＣ ＳＦＭ ＣＴＳ培地と比較して、著しく高い増殖速度を示すことが明らかになった。ＤＭＥＭとＡｄｖａｎｃｅｄ（商標）ＤＭＥＭとで増殖させた魚類細胞株の増殖には有意差はなかった。下流実験（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ）はＤＭＥＭを使用して実施した。
【0086】
実施例９
細胞集団の倍加時間の推定
集団倍加時間が短いことは、製品の拡張性と費用対効果を決定するため、細胞ベースの肉の重要な特徴である。単離された細胞株の増殖速度を測定するために、高速増殖するカイヤン細胞株のＰｈ９Ｆ－１ｘ及びニホンウナギ細胞株Ａｊ１Ｃ－１ｘをそれぞれウェルあたり１０００細胞及び１５００細胞で播種し、核の数を２４時間ごとに測定した。Ｐｈ９Ｆ－１ｘ及びＡｊ１Ｃ－１ｘは７２時間にわたって指数関数的に増殖し、平均集団倍加時間はそれぞれ１３．７時間及び３１．２時間であることが示された。他の細胞株のおお
よその倍加時間は４８時間未満であるが、ほとんどの細胞株は１０～４８時間の範囲であった。
細胞集団の倍加時間の推定
集団倍加時間が短いことは、製品の拡張性と費用対効果を決定するため、細胞ベースの肉の重要な特徴である。単離された細胞株の増殖速度を測定するために、高速増殖するカイヤン細胞株のＰｈ９Ｆ－１ｘ及びニホンウナギ細胞株Ａｊ１Ｃ－１ｘをそれぞれウェルあたり１０００細胞及び１５００細胞で播種し、核の数を２４時間ごとに測定した。Ｐｈ９Ｆ－１ｘ及びＡｊ１Ｃ－１ｘは７２時間にわたって指数関数的に増殖し、平均集団倍加時間はそれぞれ１３．７時間及び３１．２時間であることが示された。他の細胞株のおお
よその倍加時間は４８時間未満であるが、ほとんどの細胞株は１０～４８時間の範囲であった。
【0087】
実施例１０
継代初期及び継代後期における細胞株の細胞形態
初代細胞は通常、増殖速度の低下並びに紡錘形から拡大された、平坦な、及び不規則な形状への細胞形態の変化によって示されるように、１０～１５継代後に老化状態に入る。可能な継代数及び細胞分裂の回数は、細胞ベースの肉の拡張性又は大規模生産を制限するため、細胞ベースの肉では潜在的な懸念事項となる。したがって、Ｐｈ９Ｆ－１ｘを完全培地で増殖させ、８０％コンフルエンスに達した時点で１：５の比率で継代培養した。この細胞株は、約２２６の集団倍加レベルに相当する１１３継代を超えて増殖することができた。明視野画像により、Ｐｈ９Ｆ－１ｘが異なる継代にわたって紡錘形の形態を保持していることも明らかになった。さらなる細胞増殖アッセイにより、１０７継代目のＰｈ９Ｆ－１ｘの増殖速度が３１継代目のＰｈ９Ｆ－１ｘよりも速いことが明らかになった。これらのデータは、Ｐｈ９Ｆ－１ｘが老化状態に入らず、細胞ベースの肉の大規模生産に使用できる可能性があることを示唆している。
継代初期及び継代後期における細胞株の細胞形態
初代細胞は通常、増殖速度の低下並びに紡錘形から拡大された、平坦な、及び不規則な形状への細胞形態の変化によって示されるように、１０～１５継代後に老化状態に入る。可能な継代数及び細胞分裂の回数は、細胞ベースの肉の拡張性又は大規模生産を制限するため、細胞ベースの肉では潜在的な懸念事項となる。したがって、Ｐｈ９Ｆ－１ｘを完全培地で増殖させ、８０％コンフルエンスに達した時点で１：５の比率で継代培養した。この細胞株は、約２２６の集団倍加レベルに相当する１１３継代を超えて増殖することができた。明視野画像により、Ｐｈ９Ｆ－１ｘが異なる継代にわたって紡錘形の形態を保持していることも明らかになった。さらなる細胞増殖アッセイにより、１０７継代目のＰｈ９Ｆ－１ｘの増殖速度が３１継代目のＰｈ９Ｆ－１ｘよりも速いことが明らかになった。これらのデータは、Ｐｈ９Ｆ－１ｘが老化状態に入らず、細胞ベースの肉の大規模生産に使用できる可能性があることを示唆している。
【0088】
実施例１１
脂肪生成誘導培地及びリノール酸－オレイン酸アルブミン（ＬＡＯＡ）を使用した脂肪生成の誘導
脂肪由来細胞株の最も重要な特徴は、制御された方法で成熟脂肪細胞に分化する能力である。ＩＢＭＸ、デキサメタゾン、インスリン、及びインドメタシンを含む脂肪生成誘導カクテルは、ヒト又はマウスの脂肪由来幹細胞を成熟脂肪細胞に分化させるために通常使用される。ここでは、Ｐｈ９Ｆ－１ｘを脂肪生成誘導カクテル１で３日間処理し、続いて脂肪生成誘導カクテル２で６日間処理した。染色結果により、脂肪生成誘導カクテルは、非刺激細胞と比較して、脂質を発現する細胞の数（図１２Ａ及び図１２Ｂ）及び総脂質強度（図１２Ａ及び図１２Ｃ）を有意に増加させなかったことが明らかになった。
脂肪生成誘導培地及びリノール酸－オレイン酸アルブミン（ＬＡＯＡ）を使用した脂肪生成の誘導
脂肪由来細胞株の最も重要な特徴は、制御された方法で成熟脂肪細胞に分化する能力である。ＩＢＭＸ、デキサメタゾン、インスリン、及びインドメタシンを含む脂肪生成誘導カクテルは、ヒト又はマウスの脂肪由来幹細胞を成熟脂肪細胞に分化させるために通常使用される。ここでは、Ｐｈ９Ｆ－１ｘを脂肪生成誘導カクテル１で３日間処理し、続いて脂肪生成誘導カクテル２で６日間処理した。染色結果により、脂肪生成誘導カクテルは、非刺激細胞と比較して、脂質を発現する細胞の数（図１２Ａ及び図１２Ｂ）及び総脂質強度（図１２Ａ及び図１２Ｃ）を有意に増加させなかったことが明らかになった。
【0089】
脂肪生成を増強するために、魚脂肪由来細胞株を、１００μＭのリノール酸－オレイン酸アルブミン（ＬＡＯＡ）を含む脂肪生成誘導カクテルで処理した。染色結果により、脂質を発現する細胞の数及び相対的な脂質蓄積が、ＬＡＯＡを含まない脂肪生成誘導カクテル及び非刺激対照と比較して、ＬＡＯＡを含む脂肪生成誘導カクテルでの処理後に有意に高かったことが明らかになった（図１２）。
【0090】
実施例１２
他の単離細胞株の脂肪生成分化
概念実証として、ニホンウナギ及びジェイドパーチからの細胞株も、前述のように、ＬＡＯＡを含む脂肪生成誘導カクテルで９日間処理した。染色の結果は、脂質蓄積の増加によって示されるように、ニホンウナギ細胞株及びジェイドパーチ細胞株の両方が成熟脂肪細胞に分化したことを明らかにした（図１３）。
他の単離細胞株の脂肪生成分化
概念実証として、ニホンウナギ及びジェイドパーチからの細胞株も、前述のように、ＬＡＯＡを含む脂肪生成誘導カクテルで９日間処理した。染色の結果は、脂質蓄積の増加によって示されるように、ニホンウナギ細胞株及びジェイドパーチ細胞株の両方が成熟脂肪細胞に分化したことを明らかにした（図１３）。
【0091】
実施例１３
ＦＢＳ不含培地での単離された細胞株の培養
細胞ベースの肉にＦＢＳを使用すると、持続可能性、費用対効果、ロット間のばらつき、及び動物虐待に関する懸念が生じる。ＦＢＳ不含培地（例えば、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ６（商標）培地）は、幹細胞の増殖又は分化を支持する、フィーダーフリー（ｆｅｅｄｅｒ－ｆｒｅｅ）、ゼノフリー（ｘｅｎｏ－ｆｒｅｅ）、及び無血清培地である。ここで、図２４Ａに示すように、ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地及びＦＢＳ不含必須基礎培地におけるＰｈ９Ｆ－１ｘの脂肪生成能を比較した。これまで、ＤＭＥＭが例示的な基礎培地として使用されていたが、これには脂肪生成を誘導するために脂肪生成誘導カクテル及びＬＡＯＡ
が必要となる。この脂肪生成誘導カクテルには１６７ｎＭのインスリンが含まれている。但し、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ６（商標）基礎培地は既に３．３４μＭのインスリンを含んでいる。したがって、脂肪生成中にインスリンをＥｓｓｅｎｔｉａｌ ６（商標）基礎培地に添加しなかった。
ＦＢＳ不含培地での単離された細胞株の培養
細胞ベースの肉にＦＢＳを使用すると、持続可能性、費用対効果、ロット間のばらつき、及び動物虐待に関する懸念が生じる。ＦＢＳ不含培地（例えば、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ６（商標）培地）は、幹細胞の増殖又は分化を支持する、フィーダーフリー（ｆｅｅｄｅｒ－ｆｒｅｅ）、ゼノフリー（ｘｅｎｏ－ｆｒｅｅ）、及び無血清培地である。ここで、図２４Ａに示すように、ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地及びＦＢＳ不含必須基礎培地におけるＰｈ９Ｆ－１ｘの脂肪生成能を比較した。これまで、ＤＭＥＭが例示的な基礎培地として使用されていたが、これには脂肪生成を誘導するために脂肪生成誘導カクテル及びＬＡＯＡ
が必要となる。この脂肪生成誘導カクテルには１６７ｎＭのインスリンが含まれている。但し、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ６（商標）基礎培地は既に３．３４μＭのインスリンを含んでいる。したがって、脂肪生成中にインスリンをＥｓｓｅｎｔｉａｌ ６（商標）基礎培地に添加しなかった。
【0092】
染色結果は、Ｐ＝０．０６７５の境界線有意性ではあるが、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ６（商標）ベースの脂肪生成誘導培地が、ＤＭＥＭベースの脂肪生成誘導培地と比較して、脂質を発現する細胞の数を増加させることを示した（図１４Ｂ及び図１４Ｃ）。最も重要なことは、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ６（商標）ベースの脂肪生成誘導培地は、ＤＭＥＭベースの脂肪生成誘導培地と比較して総脂質強度を大幅に増強したことである。したがって、本発明者らは、単離された脂肪由来細胞株が、ＦＢＳ不含脂肪生成誘導培地中で成熟脂肪細胞に分化できることを実証した。
【0093】
実施例１４
Ｐｈ９Ｆ－１ｘの脂肪生成誘導期間における滴定
費用対効果の高い方法で高い割合の成熟脂肪細胞及び高レベルの脂質蓄積を得るために、Ｐｈ９Ｆ－１ｘ及びＡｊ１Ｃ－１ｘを、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ６（商標）培地、脂肪生成誘導カクテル、及びＬＡＯＡを使用した脂肪生成誘導の様々な時点でＡｄｉｐｏＲｅｄ（商標）試薬で染色した。染色の結果、脂肪生成誘導の３日目から９日目までの成熟脂肪細胞の割合に有意差がないことが明らかになった。興味深いことに、６日目及び９日目の成熟脂肪細胞の総脂質含有量は、０日目、３日目、４日目、及び５日目と比較して有意に高かった。さらに、６日目及び９日目の成熟脂肪細胞の総脂質含有量には有意差はなかった。
Ｐｈ９Ｆ－１ｘの脂肪生成誘導期間における滴定
費用対効果の高い方法で高い割合の成熟脂肪細胞及び高レベルの脂質蓄積を得るために、Ｐｈ９Ｆ－１ｘ及びＡｊ１Ｃ－１ｘを、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ６（商標）培地、脂肪生成誘導カクテル、及びＬＡＯＡを使用した脂肪生成誘導の様々な時点でＡｄｉｐｏＲｅｄ（商標）試薬で染色した。染色の結果、脂肪生成誘導の３日目から９日目までの成熟脂肪細胞の割合に有意差がないことが明らかになった。興味深いことに、６日目及び９日目の成熟脂肪細胞の総脂質含有量は、０日目、３日目、４日目、及び５日目と比較して有意に高かった。さらに、６日目及び９日目の成熟脂肪細胞の総脂質含有量には有意差はなかった。
【0094】
実施例１５
脂肪生成における脂肪生成誘導カクテルの成分分析
Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ６（商標）基礎培地には、単離された脂肪由来細胞株で脂肪生成を誘導するために、ＬＡＯＡ及び脂肪生成誘導カクテルを添加した。脂肪生成誘導カクテルは、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ６（商標）に既に含まれているインスリン、ＩＢＭＸ、デキサメタゾン、及びインドメタシンからなる。脂肪生成誘導カクテルの各成分の効率を調べるために、Ｐｈ９Ｆ－１ｘをＥｓｓｅｎｔｉａｌ ６（商標）培地、魚血清、ＬＡＯＡ、並びにデキサメタゾン、ＩＢＭＸ、及びインドメタシンの様々な組み合わせで処理した。染色結果から、ＩＢＭＸ、デキサメタゾン、及びインドメタシンの様々な組み合わせで処理した後の成熟脂肪細胞の割合に有意差がないことが明らかになった。また、ＩＢＭＸ及びデキサメタゾンによる処理では、ＩＢＭＸ、デキサメタゾン、及びインドメタシンによる処理と比較して、成熟脂肪細胞の総脂質含有量が有意に高くなることが明らかになった。
脂肪生成における脂肪生成誘導カクテルの成分分析
Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ６（商標）基礎培地には、単離された脂肪由来細胞株で脂肪生成を誘導するために、ＬＡＯＡ及び脂肪生成誘導カクテルを添加した。脂肪生成誘導カクテルは、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ６（商標）に既に含まれているインスリン、ＩＢＭＸ、デキサメタゾン、及びインドメタシンからなる。脂肪生成誘導カクテルの各成分の効率を調べるために、Ｐｈ９Ｆ－１ｘをＥｓｓｅｎｔｉａｌ ６（商標）培地、魚血清、ＬＡＯＡ、並びにデキサメタゾン、ＩＢＭＸ、及びインドメタシンの様々な組み合わせで処理した。染色結果から、ＩＢＭＸ、デキサメタゾン、及びインドメタシンの様々な組み合わせで処理した後の成熟脂肪細胞の割合に有意差がないことが明らかになった。また、ＩＢＭＸ及びデキサメタゾンによる処理では、ＩＢＭＸ、デキサメタゾン、及びインドメタシンによる処理と比較して、成熟脂肪細胞の総脂質含有量が有意に高くなることが明らかになった。
【0095】
実施例１６
脂肪生成中のＬＡＯＡの有効濃度の特定
ＬＡＯＡは脂肪由来細胞株の脂肪生成誘導中に最も重要な成分の１つであるが、脂肪生成誘導培地の中で最も高価な成分である。費用効果が高く効率的な脂肪生成誘導培地を開発するために、Ｐｈ９Ｆ－１ｘを様々な濃度のＬＡＯＡで処理した。ＡｄｉｐｏＲｅｄ（商標）染色により、５０μＭ及び１００μＭのＬＡＯＡは、ＬＡＯＡの非存在下と比較して、成熟脂肪細胞の割合及びその総脂質含有量を有意に増強したことが明らかになった。対照的に、より高濃度のＬＡＯＡ（１５０μＭ及び２００μＭ）では、成熟脂肪細胞の割合及びその総脂質含有量は増加しなかった。１００μＭのＬＡＯＡは、５０μＭのＬＡＯＡと比較して、成熟脂肪細胞の割合及びその総脂質含有量を増強するとみられる。
脂肪生成中のＬＡＯＡの有効濃度の特定
ＬＡＯＡは脂肪由来細胞株の脂肪生成誘導中に最も重要な成分の１つであるが、脂肪生成誘導培地の中で最も高価な成分である。費用効果が高く効率的な脂肪生成誘導培地を開発するために、Ｐｈ９Ｆ－１ｘを様々な濃度のＬＡＯＡで処理した。ＡｄｉｐｏＲｅｄ（商標）染色により、５０μＭ及び１００μＭのＬＡＯＡは、ＬＡＯＡの非存在下と比較して、成熟脂肪細胞の割合及びその総脂質含有量を有意に増強したことが明らかになった。対照的に、より高濃度のＬＡＯＡ（１５０μＭ及び２００μＭ）では、成熟脂肪細胞の割合及びその総脂質含有量は増加しなかった。１００μＭのＬＡＯＡは、５０μＭのＬＡＯＡと比較して、成熟脂肪細胞の割合及びその総脂質含有量を増強するとみられる。
【0096】
実施例１７
脂肪生成誘導中のＬＡＯＡ添加のタイミングの特定
これまでのところ、脂肪生成を誘導するために、単離された脂肪由来細胞株をＥｓｓｅｎｔｉａｌ ６（商標）、魚血清、ＩＢＭＸ、デキサメタゾン、及びＬＡＯＡで３日間処理し、続いてＥｓｓｅｎｔｉａｌ ６（商標）、魚血清、及びＬＡＯＡでさらに３日間処理した。細胞ベースの脂肪の生成コストを削減するために、Ｐｈ９Ｆ－１ｘを、脂肪生成の０日目～３日目（図１８Ａ）、３日目～６日目（図１８Ｂ）、又は０日目～６日目（図１８Ｃ）の間ＬＡＯＡで処理した。ＡｄｉｐｏＲｅｄ（商標）染色により、０日目から６日目までのＬＡＯＡの添加により、ＬＡＯＡを０日目～３日目又は３日目～６日目のみにおいて添加した場合と比較して、６日目終了時点で成熟脂肪細胞の割合（図１７Ｄ）及びその総脂質含有量（図１８Ｅ）が有意に増加したことが明らかになった。したがって、高レベルの脂質蓄積を有する成熟脂肪細胞を高い割合で得るには、魚脂肪由来細胞株の脂肪生成誘導全体を通じてＬＡＯＡを添加する必要がある。
脂肪生成誘導中のＬＡＯＡ添加のタイミングの特定
これまでのところ、脂肪生成を誘導するために、単離された脂肪由来細胞株をＥｓｓｅｎｔｉａｌ ６（商標）、魚血清、ＩＢＭＸ、デキサメタゾン、及びＬＡＯＡで３日間処理し、続いてＥｓｓｅｎｔｉａｌ ６（商標）、魚血清、及びＬＡＯＡでさらに３日間処理した。細胞ベースの脂肪の生成コストを削減するために、Ｐｈ９Ｆ－１ｘを、脂肪生成の０日目～３日目（図１８Ａ）、３日目～６日目（図１８Ｂ）、又は０日目～６日目（図１８Ｃ）の間ＬＡＯＡで処理した。ＡｄｉｐｏＲｅｄ（商標）染色により、０日目から６日目までのＬＡＯＡの添加により、ＬＡＯＡを０日目～３日目又は３日目～６日目のみにおいて添加した場合と比較して、６日目終了時点で成熟脂肪細胞の割合（図１７Ｄ）及びその総脂質含有量（図１８Ｅ）が有意に増加したことが明らかになった。したがって、高レベルの脂質蓄積を有する成熟脂肪細胞を高い割合で得るには、魚脂肪由来細胞株の脂肪生成誘導全体を通じてＬＡＯＡを添加する必要がある。
【0097】
実施例１８
脂肪生成中のＬＡＯＡの成分分析
ＬＡＯＡは、リノール酸（ＬＡＡ）及びオレイン酸（ＯＡＡ）が結合したウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の混合物である。魚脂肪由来細胞株の脂肪生成促進におけるＬＡＯＡ、ＯＡＡ、及びＬＡＡの有効性をそれぞれ比較した。ＡｄｉｐｏＲｅｄ（商標）染色により、ＬＡＯＡ及びＯＡＡがＬＡＡと比較して成熟脂肪細胞の割合を有意に増強したことが明らかになった。さらに、ＬＡＯＡは、ＯＡＡ及びＬＡＡと比較して、含脂肪細胞の総脂質含有量を有意に増加させた。
脂肪生成中のＬＡＯＡの成分分析
ＬＡＯＡは、リノール酸（ＬＡＡ）及びオレイン酸（ＯＡＡ）が結合したウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の混合物である。魚脂肪由来細胞株の脂肪生成促進におけるＬＡＯＡ、ＯＡＡ、及びＬＡＡの有効性をそれぞれ比較した。ＡｄｉｐｏＲｅｄ（商標）染色により、ＬＡＯＡ及びＯＡＡがＬＡＡと比較して成熟脂肪細胞の割合を有意に増強したことが明らかになった。さらに、ＬＡＯＡは、ＯＡＡ及びＬＡＡと比較して、含脂肪細胞の総脂質含有量を有意に増加させた。
【0098】
実施例１９
魚脂肪由来細胞株における脂肪生成中のトランスクリプトーム解析
ＡｄｉｐｏＲｅｄ（商標）染色とは別に、単離された脂肪由来細胞株が脂肪生成誘導において成熟脂肪細胞に分化することを強化するために、脂肪生成及び脂質合成に関与する様々な遺伝子の発現も調べた。ＰＰＡＲγは脂肪生成のマスター調節因子として知られており、ＰＰＡＲγの発現は脂肪生成の異なる日数にわたって有意に増強されることが示された。初期脂肪生成転写因子であるＣ／ＥＢＰβ及びＣ／ＥＢＰδは、脂肪生成の初期段階で発現され、脂肪生成の後期段階で減少することが知られている。ＰＰＡＲγ、Ｃ／ＥＢＰβ、及びＣ／ＥＢＰδの発現は、脂肪生成の後期段階でのＣ／ＥＢＰαの発現を促進する。Ｃ／ＥＢＰβの発現は、脂肪生成の３日目に有意に増強され、６日目に減少することが示された。逆に、Ｃ／ＥＢＰδの発現は検出限界未満であった。Ｃ／ＥＢＰαの発現は、脂肪生成の６日目に有意に増強されることも示された。
魚脂肪由来細胞株における脂肪生成中のトランスクリプトーム解析
ＡｄｉｐｏＲｅｄ（商標）染色とは別に、単離された脂肪由来細胞株が脂肪生成誘導において成熟脂肪細胞に分化することを強化するために、脂肪生成及び脂質合成に関与する様々な遺伝子の発現も調べた。ＰＰＡＲγは脂肪生成のマスター調節因子として知られており、ＰＰＡＲγの発現は脂肪生成の異なる日数にわたって有意に増強されることが示された。初期脂肪生成転写因子であるＣ／ＥＢＰβ及びＣ／ＥＢＰδは、脂肪生成の初期段階で発現され、脂肪生成の後期段階で減少することが知られている。ＰＰＡＲγ、Ｃ／ＥＢＰβ、及びＣ／ＥＢＰδの発現は、脂肪生成の後期段階でのＣ／ＥＢＰαの発現を促進する。Ｃ／ＥＢＰβの発現は、脂肪生成の３日目に有意に増強され、６日目に減少することが示された。逆に、Ｃ／ＥＢＰδの発現は検出限界未満であった。Ｃ／ＥＢＰαの発現は、脂肪生成の６日目に有意に増強されることも示された。
【0099】
さらに、脂肪由来細胞株の脂肪生成中の様々な脂質合成遺伝子の発現も調べた。ＨＳＬα及びＬＰＬの発現は、脂肪生成の３日目及び６日目に有意に増強されることが示された。ＨＳＬβの発現は脂肪生成の６日目に著しく増強され、ＦＡＳの発現は脂肪生成の３日目に有意に増強された。
【0100】
まとめると、単離された脂肪由来細胞株は、細胞内脂質の蓄積、脂肪生成転写因子の発現、及び脂質合成遺伝子の発現によって示されるように、脂肪生成誘導により脂肪生成を受けることが示された。
【0101】
実施例２０
脂肪生成中の血清の除去
魚血清が存在しない場合、魚脂肪由来細胞株の細胞増殖が大幅に減少するため、血清は増殖培地の重要な成分である（図５）。血清の使用は持続可能ではなく、細胞ベースの脂肪の大規模生産を制限する可能性があるため、０日目又は３日目の魚血清の除去が魚脂肪由来細胞株の脂肪生成レベルに影響を与えるかどうかを検討した。染色結果は、０日目に
魚血清を除去すると、０日目～３日目（図２１Ｂ）及び０日目～６日目（図２１Ｃ）で魚血清が存在した場合に比べて細胞数が著しく減少することを示した（図２１Ａ）。ＡｄｉｐｏＲｅｄ（商標）染色では、魚血清の存在に関係なく、成熟脂肪細胞のパーセンテージに差異は示されなかったが（図２１Ｄ）、脂肪生成中の魚血清の非存在（０日目の除去）により、魚血清が存在した場合と比較して総脂質含有量が有意に低下した（図２１Ｅ）。興味深いことに、３日目に魚血清を除去しても、脂肪生成全体を通して魚血清が存在した場合（０日目～６日目）と比較して、成熟脂肪細胞の割合と総脂質含有量に有意差は生じない。したがって、データは、細胞ベースの脂肪の生成に影響を与えることなく、脂肪生成の最終３日間に血清を除去できることを示唆している。
脂肪生成中の血清の除去
魚血清が存在しない場合、魚脂肪由来細胞株の細胞増殖が大幅に減少するため、血清は増殖培地の重要な成分である（図５）。血清の使用は持続可能ではなく、細胞ベースの脂肪の大規模生産を制限する可能性があるため、０日目又は３日目の魚血清の除去が魚脂肪由来細胞株の脂肪生成レベルに影響を与えるかどうかを検討した。染色結果は、０日目に
魚血清を除去すると、０日目～３日目（図２１Ｂ）及び０日目～６日目（図２１Ｃ）で魚血清が存在した場合に比べて細胞数が著しく減少することを示した（図２１Ａ）。ＡｄｉｐｏＲｅｄ（商標）染色では、魚血清の存在に関係なく、成熟脂肪細胞のパーセンテージに差異は示されなかったが（図２１Ｄ）、脂肪生成中の魚血清の非存在（０日目の除去）により、魚血清が存在した場合と比較して総脂質含有量が有意に低下した（図２１Ｅ）。興味深いことに、３日目に魚血清を除去しても、脂肪生成全体を通して魚血清が存在した場合（０日目～６日目）と比較して、成熟脂肪細胞の割合と総脂質含有量に有意差は生じない。したがって、データは、細胞ベースの脂肪の生成に影響を与えることなく、脂肪生成の最終３日間に血清を除去できることを示唆している。
【0102】
実施例２１
脂肪生成中のビタミンの添加
ビタミンＣ及びビタミンＤは脂肪生成を調節することが報告されている。ビタミンＣは、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ６（商標）培地などの一部の細胞培養培地に既に存在している。したがって、脂肪生成における他のビタミンの役割も検討した。ＡｄｉｐｏＲｅｄ（商標）染色の結果から、１００μＭの酢酸α－トコフェロール、Ｄ－パントテン酸、ビタミンＤ３、又はビオチンは、６日後に成熟脂肪細胞の割合及びその総脂質含有量を有意に増加させないことが明らかになった。興味深いことに、ビタミンＤ３（強度：３．５×１０９）は、境界線統計的有意性で成熟脂肪細胞（強度：１．９×１０９）の総脂質含有量を増加させた。
脂肪生成中のビタミンの添加
ビタミンＣ及びビタミンＤは脂肪生成を調節することが報告されている。ビタミンＣは、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ６（商標）培地などの一部の細胞培養培地に既に存在している。したがって、脂肪生成における他のビタミンの役割も検討した。ＡｄｉｐｏＲｅｄ（商標）染色の結果から、１００μＭの酢酸α－トコフェロール、Ｄ－パントテン酸、ビタミンＤ３、又はビオチンは、６日後に成熟脂肪細胞の割合及びその総脂質含有量を有意に増加させないことが明らかになった。興味深いことに、ビタミンＤ３（強度：３．５×１０９）は、境界線統計的有意性で成熟脂肪細胞（強度：１．９×１０９）の総脂質含有量を増加させた。
【0103】
実施例２２
ニホンウナギ細胞株の脂肪生成期間の特定
カイヤン細胞株の脂肪生成条件を最適化した後、ニホンウナギ細胞株であるＡｊ１Ｃ－１ｘの最適な脂肪生成条件も決定する。まず、５日間の脂肪生成中のＡｊ１Ｃ－１ｘにおける脂質蓄積レベルを比較することにより、脂肪生成誘導の適切な期間を検討した。データは、ＡｄｉｐｏＲｅｄ（商標）の蛍光強度が他の日と比較して３ 日目に有意に高かったことを明らかにした（図２３）。したがって、成熟したＡｊ１Ｃ－１ｘ含脂肪細胞において最高レベルの脂質強度を得るには、３日間が脂肪生成誘導の効果的な期間であると考えられる。
ニホンウナギ細胞株の脂肪生成期間の特定
カイヤン細胞株の脂肪生成条件を最適化した後、ニホンウナギ細胞株であるＡｊ１Ｃ－１ｘの最適な脂肪生成条件も決定する。まず、５日間の脂肪生成中のＡｊ１Ｃ－１ｘにおける脂質蓄積レベルを比較することにより、脂肪生成誘導の適切な期間を検討した。データは、ＡｄｉｐｏＲｅｄ（商標）の蛍光強度が他の日と比較して３ 日目に有意に高かったことを明らかにした（図２３）。したがって、成熟したＡｊ１Ｃ－１ｘ含脂肪細胞において最高レベルの脂質強度を得るには、３日間が脂肪生成誘導の効果的な期間であると考えられる。
【0104】
実施例２３
ニホンウナギ細胞株の脂肪生成期間におけるＬＡＯＡの有効濃度の同定
他の実施例で以前に実証したように、ＬＡＯＡはカイヤン細胞株における脂肪生成の重要な決定因子の１つである。別の例では、Ａｊ１Ｃ－１ｘ細胞株も異なる濃度のＬＡＯＡで処理した。ＡｄｉｐｏＲｅｄ（商標）染色により、１００μＭのＬＡＯＡが、０μＭ及び５０μＭのＬＡＯＡと比較して、成熟脂肪細胞の割合及びその総脂質含有量を有意に増強したことが明らかになった（図２４）。さらに、１００、１５０、２００、及び５００μＭのＬＡＯＡの間では、成熟脂肪細胞の割合及びその総脂質含有量に有意差はない。
ニホンウナギ細胞株の脂肪生成期間におけるＬＡＯＡの有効濃度の同定
他の実施例で以前に実証したように、ＬＡＯＡはカイヤン細胞株における脂肪生成の重要な決定因子の１つである。別の例では、Ａｊ１Ｃ－１ｘ細胞株も異なる濃度のＬＡＯＡで処理した。ＡｄｉｐｏＲｅｄ（商標）染色により、１００μＭのＬＡＯＡが、０μＭ及び５０μＭのＬＡＯＡと比較して、成熟脂肪細胞の割合及びその総脂質含有量を有意に増強したことが明らかになった（図２４）。さらに、１００、１５０、２００、及び５００μＭのＬＡＯＡの間では、成熟脂肪細胞の割合及びその総脂質含有量に有意差はない。
【0105】
実施例２４
脂肪生成中のオメガ３脂肪酸の添加
ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）及びエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）などのオメガ３脂肪酸は、心血管疾患のリスクを軽減することが知られているため、栄養や養殖肉において重要な役割を果たしている。ＤＨＡ及びＥＰＡは、脂肪生成及び褐変の様々な段階に影響を与えることが報告されている。したがって、Ｐｈ９Ｆ－１ｘの脂肪生成中のＤＨＡ及びＥＰＡの役割を、脂肪生成の最終３日間に異なる濃度のＤＨＡ及びＥＰＡを添加することによって検討した。ＡｄｉｐｏＲｅｄ（商標）染色の結果は、ＤＨＡ（図２５Ａ）又はＥＰＡ（図２５Ｂ）が成熟脂肪細胞の割合及びその総脂質含有量に有意な影響を及ぼさないことを示した。染色結果から、１００μＭのＤＨＡが脂肪生成後の核数を有意に減少させ
ることも明らかになった（図２５Ａ）。
脂肪生成中のオメガ３脂肪酸の添加
ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）及びエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）などのオメガ３脂肪酸は、心血管疾患のリスクを軽減することが知られているため、栄養や養殖肉において重要な役割を果たしている。ＤＨＡ及びＥＰＡは、脂肪生成及び褐変の様々な段階に影響を与えることが報告されている。したがって、Ｐｈ９Ｆ－１ｘの脂肪生成中のＤＨＡ及びＥＰＡの役割を、脂肪生成の最終３日間に異なる濃度のＤＨＡ及びＥＰＡを添加することによって検討した。ＡｄｉｐｏＲｅｄ（商標）染色の結果は、ＤＨＡ（図２５Ａ）又はＥＰＡ（図２５Ｂ）が成熟脂肪細胞の割合及びその総脂質含有量に有意な影響を及ぼさないことを示した。染色結果から、１００μＭのＤＨＡが脂肪生成後の核数を有意に減少させ
ることも明らかになった（図２５Ａ）。
【0106】
脂肪生成中のＤＨＡ及びＥＰＡの併用効果を調べるために、５０μＭのＤＨＡ及び５０μＭのＥＰＡを脂肪生成の最終３日間に添加した。ＡｄｉｐｏＲｅｄ（商標）染色の結果は、５０μＭのＤＨＡ及び５０μＭのＥＰＡの組み合わせが、成熟脂肪細胞の割合及びその総脂質含有量に有意な影響を及ぼさなかったことを明らかにした（図２５Ｃ）。さらに、総核数には影響しなかった。したがって、５０μＭのＤＨＡ及び５０μＭのＥＰＡを脂肪生成の最終３日間に脂肪生成誘導カクテルに添加して、Ｐｈ９Ｆ－１ｘ成熟脂肪細胞におけるオメガ３脂肪酸のレベルを高めることができた。
【0107】
実施例２５
ＤＨＡ及びＥＰＡの存在下での脂肪生成中のトランスクリプトーム解析
脂肪生成のマスター調節因子であるＰＰＡＲγ及び初期脂肪生成転写因子Ｃ／ＥＢＰβの遺伝子発現も、脂肪生成誘導カクテルを使用したＰｈ９Ｆ－１ｘの分化後に検討した。遺伝子発現解析により、ＰＰＡＲγ及びＣ／ＥＢＰβの両方の発現が脂肪生成の３日目及び６日目に有意に増強されることが明らかになった。
ＤＨＡ及びＥＰＡの存在下での脂肪生成中のトランスクリプトーム解析
脂肪生成のマスター調節因子であるＰＰＡＲγ及び初期脂肪生成転写因子Ｃ／ＥＢＰβの遺伝子発現も、脂肪生成誘導カクテルを使用したＰｈ９Ｆ－１ｘの分化後に検討した。遺伝子発現解析により、ＰＰＡＲγ及びＣ／ＥＢＰβの両方の発現が脂肪生成の３日目及び６日目に有意に増強されることが明らかになった。
【0108】
まとめると、細胞内脂質の蓄積及び脂肪生成遺伝子の発現によって示されるように、Ｐｈ９Ｆ－１ｘは脂肪生成誘導カクテルを使用して成熟脂肪細胞に分化することが示された。
【0109】
実施例２６
高い継代数におけるＰｈ９Ｆ－１ｘの脂肪生成能
単離された脂肪由来細胞株、例えば、Ｐｈ９Ｆ－１ｘは、前述のように１００継代以上増殖できる。高い継代数におけるＰｈ９Ｆ－１ｘの脂肪生成の可能性を確認するために、２９継代目及び１０４継代目でのＰｈ９Ｆ－１ｘの脂肪生成及び脂質蓄積の割合を比較した。ＡｄｉｐｏＲｅｄ（商標）染色により、１０４継代目のＰｈ９Ｆ－１ｘが、刺激なしと比較して、脂肪生成誘導培地での刺激後に脂肪生成及び脂質蓄積の割合を有意に増強したことが明らかになった（図２７）。さらに、２９継代目及び１０４継代目で刺激されたＰｈ９Ｆ－１ｘ間では、脂肪生成及び脂質蓄積の割合に有意差はない。データは、本発明者らの魚類細胞株Ｐｈ９Ｆ－１ｘが高い継代数でも脂肪生成能を保持していることを示している。
高い継代数におけるＰｈ９Ｆ－１ｘの脂肪生成能
単離された脂肪由来細胞株、例えば、Ｐｈ９Ｆ－１ｘは、前述のように１００継代以上増殖できる。高い継代数におけるＰｈ９Ｆ－１ｘの脂肪生成の可能性を確認するために、２９継代目及び１０４継代目でのＰｈ９Ｆ－１ｘの脂肪生成及び脂質蓄積の割合を比較した。ＡｄｉｐｏＲｅｄ（商標）染色により、１０４継代目のＰｈ９Ｆ－１ｘが、刺激なしと比較して、脂肪生成誘導培地での刺激後に脂肪生成及び脂質蓄積の割合を有意に増強したことが明らかになった（図２７）。さらに、２９継代目及び１０４継代目で刺激されたＰｈ９Ｆ－１ｘ間では、脂肪生成及び脂質蓄積の割合に有意差はない。データは、本発明者らの魚類細胞株Ｐｈ９Ｆ－１ｘが高い継代数でも脂肪生成能を保持していることを示している。
【0110】
実施例２７
成熟Ｐｈ９Ｆ－１ｘ含脂肪細胞におけるＤＨＡ及びＥＰＡの測定
ＤＨＡ及びＥＰＡなどのオメガ３脂肪酸は、心血管疾患のリスクを軽減することが広く知られているため、健康的な食事と養殖肉の重要な成分に不可欠である。Ｐｈ９Ｆ－１ｘ成熟脂肪細胞におけるオメガ３脂肪酸の濃度を測定した。質量分析データにより、Ｐｈ９Ｆ－１ｘ成熟脂肪細胞には２０ｇのタンパク質ごとに３．８６ｇのＤＨＡ及び０．１５８ｇのＥＰＡが含まれていることが明らかになった。米国農務省（ＵＳＤＡ）が発表したデータと比較すると、Ｐｈ９Ｆ－１ｘ成熟脂肪細胞中のＤＨＡ及びＥＰＡの総濃度は、天然のアトランティックサーモン及びクロマグロなどの他の高級魚よりも高かった。したがって、本明細書に開示される成熟脂肪細胞は、養殖肉の原料として高い栄養価を有する。
成熟Ｐｈ９Ｆ－１ｘ含脂肪細胞におけるＤＨＡ及びＥＰＡの測定
ＤＨＡ及びＥＰＡなどのオメガ３脂肪酸は、心血管疾患のリスクを軽減することが広く知られているため、健康的な食事と養殖肉の重要な成分に不可欠である。Ｐｈ９Ｆ－１ｘ成熟脂肪細胞におけるオメガ３脂肪酸の濃度を測定した。質量分析データにより、Ｐｈ９Ｆ－１ｘ成熟脂肪細胞には２０ｇのタンパク質ごとに３．８６ｇのＤＨＡ及び０．１５８ｇのＥＰＡが含まれていることが明らかになった。米国農務省（ＵＳＤＡ）が発表したデータと比較すると、Ｐｈ９Ｆ－１ｘ成熟脂肪細胞中のＤＨＡ及びＥＰＡの総濃度は、天然のアトランティックサーモン及びクロマグロなどの他の高級魚よりも高かった。したがって、本明細書に開示される成熟脂肪細胞は、養殖肉の原料として高い栄養価を有する。
【0111】
【表2】
【0112】
実施例２８
Ｃｙｔｏｄｅｘ（登録商標）１マイクロキャリア上のＰｈ９Ｆ－１ｘの増殖及び脂肪生成分化
マイクロキャリアは、コスト及び物理的設置面積の要件を削減しながら、細胞培養の拡張性を大幅に高めることができるため、足場依存性細胞株の大規模培養を支持するために広く使用されている。ここでは、動物成分を含まず、持続可能な方法で生産できるため、単離された細胞株の増殖と分化のためにＣｙｔｏｄｅｘ（登録商標）１を選択した。Ｐｈ９Ｆ－１ｘをスピナーフラスコ内のＣｙｔｏｄｅｘ（登録商標）１上で３日間増殖させ、ＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓで３０分間処理した。トリパンブルー染色により、３０分後でも細胞の８０％超が生存しており、細胞の生存率が処理の影響を受けていないことが明らかになった。データはまた、１８分間の処理で５．１６×１０７個の細胞という最も高い細胞収量を生じ（図２８Ａ）、初期細胞播種密度よりも７．７倍高かったことも明らかにした。核染色は、Ｐｈ９Ｆ－１ｘがＣｙｔｏｄｅｘ（登録商標）１に接着していることも示した（図２８Ｂ）。まとめると、単離された魚類細胞株は、３次元スピナーフラスコ内のＣｙｔｏｄｅｘ（登録商標）１マイクロキャリア上に接着して増殖できるため、大規模培養に使用できることが示されている。
Ｃｙｔｏｄｅｘ（登録商標）１マイクロキャリア上のＰｈ９Ｆ－１ｘの増殖及び脂肪生成分化
マイクロキャリアは、コスト及び物理的設置面積の要件を削減しながら、細胞培養の拡張性を大幅に高めることができるため、足場依存性細胞株の大規模培養を支持するために広く使用されている。ここでは、動物成分を含まず、持続可能な方法で生産できるため、単離された細胞株の増殖と分化のためにＣｙｔｏｄｅｘ（登録商標）１を選択した。Ｐｈ９Ｆ－１ｘをスピナーフラスコ内のＣｙｔｏｄｅｘ（登録商標）１上で３日間増殖させ、ＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓで３０分間処理した。トリパンブルー染色により、３０分後でも細胞の８０％超が生存しており、細胞の生存率が処理の影響を受けていないことが明らかになった。データはまた、１８分間の処理で５．１６×１０７個の細胞という最も高い細胞収量を生じ（図２８Ａ）、初期細胞播種密度よりも７．７倍高かったことも明らかにした。核染色は、Ｐｈ９Ｆ－１ｘがＣｙｔｏｄｅｘ（登録商標）１に接着していることも示した（図２８Ｂ）。まとめると、単離された魚類細胞株は、３次元スピナーフラスコ内のＣｙｔｏｄｅｘ（登録商標）１マイクロキャリア上に接着して増殖できるため、大規模培養に使用できることが示されている。
【0113】
単離された細胞株を、Ｃｙｔｏｄｅｘ（登録商標）１マイクロキャリア上での脂肪生成の可能性についてさらに検討した。ＡｄｉｐｏＲｅｄ（商標）染色の結果は、刺激されたＰｈ９Ｆ－１ｘ細胞がＡｄｉｐｏＲｅｄ（商標）によって染色されたのに対し、刺激されていない細胞はＡｄｉｐｏＲｅｄ（商標）によって染色されなかったことを示している。データは、Ｐｈ９Ｆ－１ｘが３次元スピナーフラスコ内のＣｙｔｏｄｅｘ（登録商標）１マイクロキャリア上で分化できることを示している。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【国際調査報告】