特表 2024-525686 ＡＡＶカプシド比を決定するための液体クロマトグラフィーアッセイ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-07-12

(54)【発明の名称】ＡＡＶカプシド比を決定するための液体クロマトグラフィーアッセイ

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/70 20060101AFI20240705BHJP

   G01N 30/88 20060101ALI20240705BHJP

   G01N 30/02 20060101ALI20240705BHJP

   G01N 30/50 20060101ALI20240705BHJP

   G01N 30/26 20060101ALI20240705BHJP

   G01N 30/34 20060101ALI20240705BHJP

   C12Q 1/68 20180101ALI20240705BHJP

   C12N 15/864 20060101ALN20240705BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/70

G01N30/88 D

G01N30/88 J

G01N30/02 B

G01N30/50

G01N30/26 A

G01N30/34 E

C12Q1/68

C12N15/864 100Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024501502

(86)(22)【出願日】2022-07-11

(85)【翻訳文提出日】2024-02-08

(86)【国際出願番号】 US2022036728

(87)【国際公開番号】W WO2023287725

(87)【国際公開日】2023-01-19

(31)【優先権主張番号】63/220,651

(32)【優先日】2021-07-12

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/275,138

(32)【優先日】2021-11-03

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/359,554

(32)【優先日】2022-07-08

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/359,557

(32)【優先日】2022-07-08

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】597160510

【氏名又は名称】リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】ＲＥＧＥＮＥＲＯＮ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ， ＩＮＣ．

(74)【代理人】

【識別番号】100127926

【弁理士】

【氏名又は名称】結田 純次

(74)【代理人】

【識別番号】100216105

【弁理士】

【氏名又は名称】守安 智

(72)【発明者】

【氏名】ヨナタン・ヴェルト

(72)【発明者】

【氏名】リー・ジー

(72)【発明者】

【氏名】ディンヂィァン・リウ

【テーマコード（参考）】

4B063

【Ｆターム（参考）】

4B063QA01

4B063QQ10

4B063QQ13

4B063QR79

4B063QR80

4B063QS17

4B063QX01

(57)【要約】

組換えＡＡＶ粒子の試料中のインタクトなアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシド成分の相対存在量を決定するための方法が開示されている。実施形態では、本方法は、ゴーストピークの存在を最小化又は排除して、分析精度を最大化し、製品の品質及び一貫性を確保する、システム再生プロセスを含む。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

異種核酸分子を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子の試料中のインタクトなウイルスカプシド成分の相対存在量を決定するための方法であって、
（ａ）液体クロマトグラフィー（ＬＣ）機器及びアニオン交換カラム（ＡＥＸカラム）を備える液体クロマトグラフィーシステム上でシステム再生プロセスを実施することであって、前記システム再生プロセスが、（ｉ）前記ＡＥＸカラムを少なくとも１０カラム体積（ＣＶ）の移動相Ａで洗浄することと、（ｉｉ）前記ＡＥＸカラムを少なくとも１０ＣＶの精製水で洗浄することと、（ｉｉｉ）前記ＡＥＸカラムを、精製水中に１５％～２１％ｖ／ｖのエタノールを含む少なくとも２０ＣＶの洗浄溶液で洗浄することと、（ｉｖ）前記ＬＣ機器の液体運搬構成要素を前記洗浄溶液で少なくとも０．５ｍＬ／分の流量において少なくとも３０分間洗浄することと、を含み、
移動相Ａが、８～９のｐＨにおいて精製水中に１５ｍＭ～２５ｍＭのビストリスプロパン及び１ｍＭ～３ｍＭの塩化マグネシウムを含み、前記精製水が、２５℃における約１８．２ＭΩ．ｃｍの抵抗率及び５ｐｐｂ未満の全有機体炭素を有する、システム再生プロセスを実施することと、
（ｂ）前記ＬＣ機器及び前記ＡＥＸカラムの前記液体運搬構成要素から前記洗浄溶液をパージすることを含む、前記液体クロマトグラフィーシステム上でシステム平衡化プロセスを実施することと、
（ｃ）試料分離プロセスを実施することであって、前記試料分離プロセスが、（ｉ）１つ以上のブランク試料を前記液体クロマトグラフィーシステムに導入し、前記液体クロマトグラフィーシステムを通して移動相Ａ、移動相Ｂ、及び移動相Ｃの分離勾配を実行することと、（ｉｉ）１つ以上の参照標準試料を前記液体クロマトグラフィーシステムに導入し、前記液体クロマトグラフィーシステムを通して移動相Ａ、移動相Ｂ、及び移動相Ｃの分離勾配を実行することと、（ｉｉｉ）前記ＡＡＶ粒子の１つ以上の試験試料を前記液体クロマトグラフィーシステムに導入し、前記１つ以上の試験試料が、試料溶液中にインタクトな空ＡＡＶカプシド及びインタクトな完全ＡＡＶカプシドを含み、前記液体クロマトグラフィーシステムを通して移動相Ａ、移動相Ｂ、及び移動相Ｃの分離勾配を実行して、前記インタクトな完全ＡＡＶカプシドから前記インタクトな空ＡＡＶカプシドを分離することと、を含み、
移動相Ｂが、８～９のｐＨにおいて、精製水中に１５ｍＭ～２５ｍＭのビストリスプロパン、２５０ｍＭ～１Ｍの塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣ）、及び１ｍＭ～３ｍＭの塩化マグネシウムを含み、移動相Ｃが、精製水中に１．５Ｍ～２．５Ｍの塩化ナトリウムを含む、試料分離プロセスを実施することと、
（ｄ）前記１つ以上の試験試料の各々において前記インタクトな空ＡＡＶカプシドの量及び前記インタクトな完全ＡＡＶカプシドの量を同定して、前記ＡＡＶ粒子の試料中の前記インタクトなウイルスカプシド成分の相対存在量を決定することと、を含む、方法。

【請求項2】

異種核酸分子を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子の試料中のインタクトなウイルスカプシド成分の相対存在量を決定するための方法であって、
（ａ）液体クロマトグラフィー（ＬＣ）機器及びアニオン交換カラム（ＡＥＸカラム）を備える液体クロマトグラフィーシステム上でシステム再生プロセスを実施することであって、前記システム再生プロセスが、（ｉ）前記ＡＥＸカラムを少なくとも１０カラム体積（ＣＶ）の移動相Ａで洗浄することと、（ｉｉ）前記ＡＥＸカラムを少なくとも１０ＣＶの精製水で洗浄することと、（ｉｉｉ）任意選択的に、前記ＡＥＸカラムの配向を逆転させて、前記ＡＥＸカラム内の流動を逆転させることと、（ｉｖ）前記ＡＥＸカラムを、精製水中に１５％～２１％ｖ／ｖのエタノールを含む少なくとも２０ＣＶの洗浄溶液で洗浄することと、（ｖ）前記ＬＣ機器から前記ＡＥＸカラムを除去することと、（ｖｉ）前記ＬＣ機器の液体運搬構成要素を前記洗浄溶液で少なくとも０．５ｍＬ／分の流量において少なくとも３０分間洗浄することと、を含み、
移動相Ａが、８～９のｐＨにおいて精製水中に１５ｍＭ～２５ｍＭのビストリスプロパン及び１ｍＭ～３ｍＭの塩化マグネシウムを含み、前記精製水が、２５℃における約１８．２ＭΩ．ｃｍの抵抗率及び５ｐｐｂ未満の全有機体炭素を有する、システム再生プロセスを実施することと、
（ｂ）（ｉ）前記ＡＥＸカラムを前記ＬＣ機器に再設置することと、（ｉｉ）前記ＬＣ機器及び前記ＡＥＸカラムの前記液体運搬構成要素から前記洗浄溶液をパージすることと、を含む、前記液体クロマトグラフィーシステム上でシステム平衡化プロセスを実施することと、
（ｃ）試料分離プロセスを実施することであって、前記試料分離プロセスが、（ｉ）１つ以上のブランク試料を前記液体クロマトグラフィーシステムに導入し、前記液体クロマトグラフィーシステムを通して移動相Ａ、移動相Ｂ、及び移動相Ｃの分離勾配を実行することと、（ｉｉ）１つ以上の参照標準試料を前記液体クロマトグラフィーシステムに導入し、前記液体クロマトグラフィーシステムを通して移動相Ａ、移動相Ｂ、及び移動相Ｃの分離勾配を実行することと、（ｉｉｉ）前記ＡＡＶ粒子の１つ以上の試験試料を前記液体クロマトグラフィーシステムに導入し、前記１つ以上の試験試料が、試料溶液中にインタクトな空ＡＡＶカプシド及びインタクトな完全ＡＡＶカプシドを含み、前記液体クロマトグラフィーシステムを通して移動相Ａ、移動相Ｂ、及び移動相Ｃの分離勾配を実行して、前記インタクトな完全ＡＡＶカプシドから前記インタクトな空ＡＡＶカプシドを分離することと、を含み、
移動相Ｂが、８～９のｐＨにおいて、精製水中に１５ｍＭ～２５ｍＭのビストリスプロパン、２５０ｍＭ～１Ｍの塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣ）、及び１ｍＭ～３ｍＭの塩化マグネシウムを含み、移動相Ｃが、精製水中に１．５Ｍ～２．５Ｍの塩化ナトリウムを含む、試料分離プロセスを実施することと、
（ｄ）前記１つ以上の試験試料の各々において前記インタクトな空ＡＡＶカプシドの量及び前記インタクトな完全ＡＡＶカプシドの量を同定して、前記ＡＡＶ粒子の試料中の前記インタクトなウイルスカプシド成分の相対存在量を決定することと、を含む、方法。

【請求項3】

前記洗浄溶液が、精製水中に１８％±１％ｖ／ｖのエタノールを含む、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

前記試料溶液が、１ｍＭ～１００ｍＭの塩化ナトリウムを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記試料溶液が、６０ｍＭ～１００ｍＭの塩化ナトリウムを含む、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

前記試料溶液が、０．００３％ｗ／ｖ～０．００７％ｗ／ｖの界面活性剤を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

前記試料溶液が、０．００５％ｗ／ｖ±０．００１％ｗ／ｖの界面活性剤を含む、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

前記界面活性剤が、ポロキサマー１８８である、請求項６又は７に記載の方法。

【請求項9】

前記システム平衡化プロセスが、（ｉ）少なくとも０．５ｍＬ／分の流量において少なくとも１０分間、精製水で前記ＬＣ機器及び前記ＡＥＸカラムの前記液体運搬構成要素から前記洗浄溶液をパージすることと、（ｉｉ）前記ＡＥＸカラムを少なくとも１０ＣＶの精製水で洗浄することと、（ｉｉｉ）前記ＡＥＸカラムを少なくとも１０ＣＶの移動相Ａで洗浄することと、（ｉｖ）前記ＡＥＸカラムを少なくとも２０ＣＶの移動相Ｂで洗浄することと、（ｖ）前記ＡＥＸカラムを少なくとも２０ＣＶの移動相Ａで洗浄することと、を含む、請求項１及び３～８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

前記システム平衡化プロセスが、（ｉ）少なくとも０．５ｍＬ／分の流量において少なくとも１０分間、精製水で前記ＬＣ機器の前記液体担持構成要素から前記洗浄溶液をパージすることと、（ｉｉ）前記ＡＥＸカラムを前記ＬＣ機器に再設置することと、（ｉｉｉ）前記ＡＥＸカラムを少なくとも１０ＣＶの精製水で洗浄することと、（ｉｖ）前記ＡＥＸカラムを少なくとも１０ＣＶの移動相Ａで洗浄することと、（ｖ）前記ＡＥＸカラムを少なくとも２０ＣＶの移動相Ｂで洗浄することと、（ｖｉ）前記ＡＥＸカラムを少なくとも２０ＣＶの移動相Ａで洗浄することと、を含む、請求項２～８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

前記システム平衡化プロセスを実施することが、前記ＡＥＸカラムを前記ＬＣ機器に再設置する前に、前記ＬＣ機器の前記液体運搬構成要素を精製水で少なくとも０．５ｍＬ／分の流量において少なくとも１０分間洗浄することを更に含む、請求項２～１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

精製水で前記ＬＣ機器の前記液体運搬構成要素から前記洗浄溶液をパージすることが、少なくとも０．５ｍＬ／分の流量で少なくとも３０分間実施される、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

前記少なくとも１０ＣＶが、１０～２０ＣＶを含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

前記少なくとも２０ＣＶが、２０～３０ＣＶを含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

前記試料分離プロセスが、（ｉ）前記液体クロマトグラフィーシステムに３つのブランク試料、続いて、４つの参照標準試料、続いて、２つのブランク試料、続いて、１～１０個の試験試料、続いて、参照標準試料、続いて、ブランク試料を導入することと、（ｉｉ）それぞれ、各試料について、前記液体クロマトグラフィーシステムを通して移動相Ａ、移動相Ｂ、及び移動相Ｃの前記分離勾配を実行することと、を含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項16】

前記分離勾配が、０．８ｍＬ／分の流量で３６分間実行される、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項17】

前記分離勾配が、順に、（ｉ）１分間の９０％の移動相Ａ及び１０％の移動相Ｂと、（ｉｉ）２０分の期間にわたって移動相Ａを９０％から５８％まで低減し、移動相Ｂを１０％から４２％まで増加させることと、（ｉｉｉ）４分間の１００％の移動相Ｃと、（ｉｖ）少なくとも１０分間の９０％の移動相Ａ及び１０％の移動相Ｂと、を含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項18】

前記試験試料が≧５×１０^１２ウイルスゲノム／ｍＬ（ｖｇ／ｍＬ）を含む場合、前記１つ以上の試験試料を希釈緩衝液中で１．５～３倍希釈することを更に含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

前記液体クロマトグラフィーシステムに導入された前記１つ以上の試験試料の各々が、約１０マイクロリットルを含む、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

前記液体クロマトグラフィーシステムに導入された前記１つ以上の試験試料の各々が、約２０マイクロリットルを含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項21】

前記移動相Ａが、８．５±０．１のｐＨにおいて、精製水中に２０ｍＭ±２ｍＭのビストリスプロパン、及び２ｍＭ±０．２ｍＭの塩化マグネシウムを含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項22】

前記移動相Ｂが、８．５±０．１のｐＨにおいて、精製水中に２０ｍＭ±２ｍＭのビストリスプロパン、５００ｍＭ±５０ｍＭのＴＭＡＣ、及び２ｍＭ±０．２ｍＭの塩化マグネシウムを含む、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項23】

前記移動相Ｃが、精製水中に２Ｍ±０．２Ｍの塩化ナトリウムを含む、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項24】

前記ＡＡＶ粒子が、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ－ＤＪ、ＡＡＶ－ＤＪ／８、ＡＡＶ－Ｒｈ１０、ＡＡＶ－ｒｅｔｒｏ、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ８－ＰＨＰ．ｅＢ、又はＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｓの粒子である、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項25】

前記ＡＡＶ粒子が、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ５、又はＡＡＶ８の粒子である、請求項２４に記載の方法。

【請求項26】

前記ＡＡＶ粒子が、血清型ＡＡＶ８の粒子である、請求項２５に記載の方法。

【請求項27】

前記液体クロマトグラフィーシステムにおける以前の試料実行からブランク試料実行への繰り越しが、以前の試料の完全カプシドピークの０．３％以下である、請求項１～２６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項28】

前記以前の試料が、参照標準試料である、請求項２７に記載の方法。

【請求項29】

前記以前の試料が、試験試料である、請求項２７に記載の方法。

【請求項30】

前記繰り越しが、前記以前の試料の完全カプシドピークの０．１５％以下である、請求項２７～２９のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、アニオン交換クロマトグラフィーを使用して、異種核酸分子を含む組換えＡＡＶ粒子の試料中のインタクトなアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシド成分の相対存在量を決定するための方法に関する。

【背景技術】

【0002】

非エンベロープ一本鎖ＤＮＡウイルスであるアデノ随伴ウイルスは、インビボで広範囲の種及び組織を形質導入するその能力、免疫毒性の低いリスク、並びに軽度の自然及び適応免疫応答に起因して、遺伝子療法のために遺伝物質を宿主細胞に送達するための治療剤の魅力的なクラスとして出現している。ＡＡＶなどのウイルスベクターの複雑な性質は、堅調な製品試験及び特性評価を可能にするための具体的な分析方法を必要とする。

【0003】

製造アプローチとは無関係に、ＡＡＶ産生の１つの特性は、異種の目的の遺伝子（ＧＯＩ）を含まない空カプシドの形成である。空カプシドのレベルは、大きく変化し得る。治療転帰に対する空カプシドの効果は、不完全に理解されているが、空カプシドの量は、製品の品質及び一貫性を確保するために厳重に監視される必要がある。

【0004】

複数の方法が、ＡＡＶ試料中の空カプシドを定量化するために記載されており、アニオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）が、血清型１、２、及び８の完全ＡＡＶ粒子の精製及び濃縮に使用されている（Ｗａｎｇ、下記）。更に、ＡＡＶ血清型６．２の正確な定量化のためのＡＥＸの適用は、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１５：２５７－２６３，２０１９で考察されている。特に、Ｗａｎｇは、クロマトグラフィー条件下でのＡＡＶカプシドの構造的完全性が、空カプシド及び完全カプシドの分離方法のための必要条件であり、２ｍＭのＭｇＣｌ_２の存在が広範なピークの消失及びピークの強度の増加をもたらしたが、より高い濃度のＭｇＣｌ_２が更なる改善を提供しなかったことを報告している。Ｗａｎｇは、移動相における塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣ）の使用が、ＮａＣｌに対して分離を改善し、分離が７．５～９．０の範囲内のより高いｐＨ値において改善され、空カプシドと完全カプシドとの間の分解能に対する緩衝剤の影響が小さく、ビストリスプロパン（ＢＴＰ）が、試験された薬剤間で最良の分離を生じたことを更に報告している。

【0005】

製品の品質及び一貫性については、特に、製造管理及び品質管理に関する基準（ＧＭＰ）リリースアッセイとの関連で、潜在的な分析誤差源の最小化又は排除が最重要である。１つのそのような分析誤差源は、クロマトグラムで予想外に観察される、アーチファクト又は疑似ピークとしばしば称される、「ゴーストピーク」の存在である。そのようなゴーストピークが、液体クロマトグラフィーシステム内の不純物又はアーチファクトから生じ得るため、それらの存在は、仕様外調査要件をもたらすか、又はＧＭＰ製品アッセイのために時間がかかるか、若しくは許容できない、一貫性のない不正確な結果につながり得る。

【発明の概要】

【0006】

本開示は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子の試料中のインタクトなウイルスカプシド成分の相対存在量を決定するための方法を対象とする。

【0007】

一態様では、本開示は、異種核酸分子を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子の試料中のインタクトなウイルスカプシド成分の相対存在量を決定するための方法であって、（ａ）液体クロマトグラフィー（ＬＣ）機器及びアニオン交換カラム（ＡＥＸカラム）を備える液体クロマトグラフィーシステム上でシステム再生プロセスを実施することであって、システム再生プロセスが、（ｉ）ＡＥＸカラムを少なくとも１０カラム体積（ＣＶ）の移動相Ａで洗浄することと、（ｉｉ）ＡＥＸカラムを少なくとも１０ＣＶの精製水で洗浄することと、（ｉｉｉ）ＡＥＸカラムを、精製水中に１５％～２１％ｖ／ｖのエタノールを含む少なくとも２０ＣＶの洗浄溶液で洗浄することと、（ｉｖ）ＬＣ機器の液体運搬構成要素を洗浄溶液で少なくとも０．５ｍＬ／分の流量において少なくとも３０分間洗浄することと、を含み、移動相Ａが、８～９のｐＨにおいて精製水中に１５ｍＭ～２５ｍＭのビストリスプロパン及び１ｍＭ～３ｍＭの塩化マグネシウムを含み、精製水が、２５℃における約１８．２ＭΩ．ｃｍの抵抗率及び５ｐｐｂ未満の全有機体炭素を有する、システム再生プロセスを実施することと、（ｂ）ＬＣ機器及びＡＥＸカラムの液体運搬構成要素から洗浄溶液をパージすることを含む、液体クロマトグラフィーシステム上でシステム平衡化プロセスを実施することと、（ｃ）試料分離プロセスを実施することであって、試料分離プロセスが、（ｉ）１つ以上のブランク試料を液体クロマトグラフィーシステムに導入し、液体クロマトグラフィーシステムを通して移動相Ａ、移動相Ｂ、及び移動相Ｃの分離勾配を実行することと、（ｉｉ）１つ以上の参照標準試料を液体クロマトグラフィーシステムに導入し、液体クロマトグラフィーシステムを通して移動相Ａ、移動相Ｂ、及び移動相Ｃの分離勾配を実行することと、（ｉｉｉ）ＡＡＶ粒子の１つ以上の試験試料を液体クロマトグラフィーシステムに導入し、１つ以上の試験試料が、試料溶液中にインタクトな空ＡＡＶカプシド及びインタクトな完全ＡＡＶカプシドを含み、液体クロマトグラフィーシステムを通して移動相Ａ、移動相Ｂ、及び移動相Ｃの分離勾配を実行して、インタクトな完全ＡＡＶカプシドからインタクトな空ＡＡＶカプシドを分離することと、を含み、移動相Ｂが、８～９のｐＨにおいて、精製水中に１５ｍＭ～２５ｍＭのビストリスプロパン、２５０ｍＭ～１Ｍの塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣ）、及び１ｍＭ～３ｍＭの塩化マグネシウムを含み、移動相Ｃが、精製水中に１．５Ｍ～２．５Ｍの塩化ナトリウムを含む、試料分離プロセスを実施することと、（ｄ）１つ以上の試験試料の各々においてインタクトな空ＡＡＶカプシドの量及びインタクトな完全ＡＡＶカプシドの量を同定して、ＡＡＶ粒子の試料中のインタクトなウイルスカプシド成分の相対存在量を決定することと、を含む、方法を提供する。

【0008】

一態様では、本開示は、異種核酸分子を含むＡＡＶ粒子の試料中のインタクトなウイルスカプシド成分の相対存在量を決定するための方法であって、（ａ）液体クロマトグラフィー（ＬＣ）機器及びアニオン交換カラム（ＡＥＸカラム）を備える液体クロマトグラフィーシステム上でシステム再生プロセスを実施することであって、システム再生プロセスが、（ｉ）ＡＥＸカラムを少なくとも１０カラム体積（ＣＶ）の移動相Ａで洗浄することと、（ｉｉ）ＡＥＸカラムを少なくとも１０ＣＶの精製水で洗浄することと、（ｉｉｉ）任意選択的に、ＡＥＸカラムの配向を逆転させて、ＡＥＸカラム内の流動を逆転させることと、（ｉｖ）ＡＥＸカラムを、精製水中に１５％～２１％ｖ／ｖのエタノールを含む少なくとも２０ＣＶの洗浄溶液で洗浄することと、（ｖ）ＬＣ機器からＡＥＸカラムを除去することと、（ｖｉ）ＬＣ機器の液体運搬構成要素を洗浄溶液で少なくとも０．５ｍＬ／分の流量において少なくとも３０分間洗浄することと、を含み、移動相Ａが、８～９のｐＨにおいて精製水中に１５ｍＭ～２５ｍＭのビストリスプロパン及び１ｍＭ～３ｍＭの塩化マグネシウムを含み、精製水が、２５℃における約１８．２ＭΩ．ｃｍの抵抗率及び５ｐｐｂ未満の全有機体炭素を有する、システム再生プロセスを実施することと、（ｂ）（ｉ）ＡＥＸカラムをＬＣ機器に再設置することと、（ｉｉ）ＬＣ機器及びＡＥＸカラムの液体運搬構成要素から洗浄溶液をパージすることと、を含む、液体クロマトグラフィーシステム上でシステム平衡化プロセスを実施することと、（ｃ）試料分離プロセスを実施することであって、試料分離プロセスが、（ｉ）１つ以上のブランク試料を液体クロマトグラフィーシステムに導入し、液体クロマトグラフィーシステムを通して移動相Ａ、移動相Ｂ、及び移動相Ｃの分離勾配を実行することと、（ｉｉ）１つ以上の参照標準試料を液体クロマトグラフィーシステムに導入し、液体クロマトグラフィーシステムを通して移動相Ａ、移動相Ｂ、及び移動相Ｃの分離勾配を実行することと、（ｉｉｉ）ＡＡＶ粒子の１つ以上の試験試料を液体クロマトグラフィーシステムに導入し、１つ以上の試験試料が、試料溶液中にインタクトな空ＡＡＶカプシド及びインタクトな完全ＡＡＶカプシドを含み、液体クロマトグラフィーシステムを通して移動相Ａ、移動相Ｂ、及び移動相Ｃの分離勾配を実行して、インタクトな完全ＡＡＶカプシドからインタクトな空ＡＡＶカプシドを分離することと、を含み、移動相Ｂが、８～９のｐＨにおいて、精製水中に１５ｍＭ～２５ｍＭのビストリスプロパン、２５０ｍＭ～１Ｍの塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣ）、及び１ｍＭ～３ｍＭの塩化マグネシウムを含み、移動相Ｃが、精製水中に１．５Ｍ～２．５Ｍの塩化ナトリウムを含む、試料分離プロセスを実施することと、（ｄ）１つ以上の試験試料の各々においてインタクトな空ＡＡＶカプシドの量及びインタクトな完全ＡＡＶカプシドの量を同定して、ＡＡＶ粒子の試料中のインタクトなウイルスカプシド成分の相対存在量を決定することと、を含む、方法を提供する。

【0009】

場合によっては、洗浄溶液は、精製水中に１８％±１％ｖ／ｖのエタノールを含む。

【0010】

上記又は本明細書で考察される方法の様々な実施形態のうちのいずれかでは、試料溶液は、１ｍＭ～１００ｍＭの塩化ナトリウムを含む。場合によっては、試料溶液は、６０ｍＭ～１００ｍＭの塩化ナトリウムを含む。

【0011】

上記又は本明細書で考察される方法の様々な実施形態のうちのいずれかでは、試料溶液は、０．００３％ｗ／ｖ～０．００７％ｗ／ｖの界面活性剤を含む。場合によっては、試料溶液は、０．００５％ｗ／ｖ±０．００１％ｗ／ｖの界面活性剤を含む。いくつかの実施形態では、界面活性剤は、ポロキサマー１８８である。

【0012】

いくつかの実施形態では、システム平衡化プロセスは、（ｉ）少なくとも０．５ｍＬ／分の流量において少なくとも１０分間、精製水でＬＣ機器及びＡＥＸカラムの液体運搬構成要素から洗浄溶液をパージすることと、（ｉｉ）ＡＥＸカラムを少なくとも１０ＣＶの精製水で洗浄することと、（ｉｉｉ）ＡＥＸカラムを少なくとも１０ＣＶの移動相Ａで洗浄することと、（ｉｖ）ＡＥＸカラムを少なくとも２０ＣＶの移動相Ｂで洗浄することと、（ｖ）ＡＥＸカラムを少なくとも２０ＣＶの移動相Ａで洗浄することと、を含む。

【0013】

いくつかの実施形態では、（ｉ）少なくとも０．５ｍＬ／分の流量において少なくとも１０分間、精製水でＬＣ機器の液体運搬構成要素から洗浄溶液をパージすることと、（ｉｉ）ＡＥＸカラムをＬＣ機器に再設置することと、（ｉｉｉ）ＡＥＸカラムを少なくとも１０ＣＶの精製水で洗浄することと、（ｉｖ）ＡＥＸカラムを少なくとも１０ＣＶの移動相Ａで洗浄することと、（ｖ）ＡＥＸカラムを少なくとも２０ＣＶの移動相Ｂで洗浄することと、（ｖｉ）ＡＥＸカラムを少なくとも２０ＣＶの移動相Ａで洗浄することと、を含む。場合によっては、システム平衡化プロセスを実施することは、ＡＥＸカラムをＬＣ機器に再設置する前に、ＬＣ機器の液体運搬構成要素を精製水で少なくとも０．５ｍＬ／分の流量において少なくとも１０分間洗浄することを更に含む。場合によっては、精製水でＬＣ機器の液体運搬構成要素から洗浄溶液をパージすることは、少なくとも０．５ｍＬ／分の流量で少なくとも３０分間実施される。

【0014】

場合によっては、少なくとも１０ＣＶは、１０～２０ＣＶを含む。場合によっては、少なくとも２０ＣＶは、２０～３０ＣＶを含む。

【0015】

いくつかの実施形態では、試料分離プロセスは、（ｉ）液体クロマトグラフィーシステムに３つのブランク試料、続いて、４つの参照標準試料、続いて、２つのブランク試料、続いて、１～１０個の試験試料、続いて、参照標準試料、続いて、ブランク試料を導入することと、（ｉｉ）それぞれ、各試料について、液体クロマトグラフィーシステムを通して移動相Ａ、移動相Ｂ、及び移動相Ｃの分離勾配を実行することと、を含む。

【0016】

いくつかの実施形態では、分離勾配は、０．８ｍＬ／分の流量で３６分間実行される。

【0017】

いくつかの実施形態では、分離勾配は、順に、（ｉ）１分間の９０％の移動相Ａ及び１０％の移動相Ｂと、（ｉｉ）２０分の期間にわたって移動相Ａを９０％から５８％まで低減し、移動相Ｂを１０％から４２％まで増加させることと、（ｉｉｉ）４分間の１００％の移動相Ｃと、（ｉｖ）少なくとも１０分間の９０％の移動相Ａ及び１０％の移動相Ｂと、を含む。

【0018】

いくつかの実施形態では、試験試料が≧５×１０^１２ウイルスゲノム／ｍＬ（ｖｇ／ｍＬ）を含む場合、１つ以上の試験試料を希釈緩衝液中で１．５～３倍（例えば、２．３倍）希釈することを更に含む。

【0019】

いくつかの実施形態では（例えば、試験試料が≧５×１０^１２ｖｇ／ｍＬを含有する場合）、液体クロマトグラフィーシステムに導入された１つ以上の試験試料の各々は、約１０マイクロリットルを含む。いくつかの実施形態では（例えば、試験試料が＜５×１０^１２ｖｇ／ｍＬを含有する場合）、液体クロマトグラフィーシステムに導入された１つ以上の試験試料の各々は、約２０マイクロリットルを含む。

【0020】

いくつかの実施形態では、移動相Ａは、８．５±０．１のｐＨにおいて、精製水中に２０ｍＭ±２ｍＭのビストリスプロパン、及び２ｍＭ±０．２ｍＭの塩化マグネシウムを含む。

【0021】

いくつかの実施形態では、移動相Ｂは、８．５±０．１のｐＨにおいて、精製水中に２０ｍＭ±２ｍＭのビストリスプロパン、５００ｍＭ±５０ｍＭのＴＭＡＣ、及び２ｍＭ±０．２ｍＭの塩化マグネシウムを含む。

【0022】

いくつかの実施形態では、移動相Ｃは、精製水中に２Ｍ±０．２Ｍの塩化ナトリウムを含む。

【0023】

様々な実施形態のうちのいずれかでは、ＡＡＶ粒子は、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ－ＤＪ、ＡＡＶ－ＤＪ／８、ＡＡＶ－Ｒｈ１０、ＡＡＶ－ｒｅｔｒｏ、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ８－ＰＨＰ．ｅＢ、又はＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｓの粒子である。場合によっては、ＡＡＶ粒子は、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ５、又はＡＡＶ８の粒子である。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ粒子は、血清型ＡＡＶ８の粒子である。

【0024】

本方法の様々な実施形態のうちのいずれかでは、液体クロマトグラフィーシステムにおける以前の試料実行からブランク試料実行への繰り越しは、以前の試料の完全カプシドピークの０．３％以下である。場合によっては、以前の試料は、参照標準試料である。場合によっては、以前の試料は、試験試料である。いくつかの実施形態では、繰り越しは、以前の試料の完全カプシドピークの０．１５％以下である。

【0025】

様々な実施形態では、上記又は本明細書で考察される実施形態の特徴又は構成要素のうちのいずれかが、組み合わせられてもよく、そのような組み合わせは、本開示の範囲内に包含される。上記又は本明細書で考察される任意の具体的な値は、範囲の上限及び下限を表す値を有する範囲を列挙するように、上記又は本明細書で考察される別の関連する値と組み合わせられてもよく、そのような範囲は、本開示の範囲内に包含される。

【0026】

他の実施形態は、後に続く発明を実施するための形態の検討から明らかになるであろう。

【発明を実施するための形態】

【0027】

本発明を記載する前に、記載される特定の方法及び実験条件が変化し得るため、本発明は、そのような方法及び条件に限定されないことを理解されたい。本発明の範囲が添付の特許請求の範囲のみによって限定されるため、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを記載する目的のためであり、限定的であることを意図していないことも理解されたい。

【0028】

別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。本明細書で使用される場合、「約」という用語は、特定の言及される数値に関して使用されると、値が言及される値から１％以下だけ変化し得ることを意味する。例えば、本明細書で使用される場合、「約１００」という表現には、９９及び１０１、並びにその間の全ての値（例えば、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４など）が含まれる。

【0029】

本明細書で使用される場合、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語は、非限定的であるように意図され、それぞれ、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」を意味すると理解される。

【0030】

本明細書に記載されるものと同様又は同等の任意の方法及び材料を本発明の実践又は試験に使用することができるが、好ましい方法及び材料をこれから記載する。本明細書で言及される全ての特許、出願、及び非特許刊行物は、参照によりそれらの全体で本明細書に組み込まれる。
選択された略語
ＬＣ：液体クロマトグラフィー
ＣＶ：カラム体積
ｒＡＡＶ：組換えＡＡＶ粒子又はカプシド
ＡＡＶ：アデノ随伴ウイルス
ＡＥＸ－アニオン交換クロマトグラフィー
ＧＯＩ－目的の遺伝子

【0031】

定義
「インタクトなウイルスカプシド成分」とは、インタクトであり（すなわち、それらの構成要素部分（例えば、異なるウイルスタンパク質）に変性又は別様に分解若しくは崩壊されていない）、ウイルスカプシドの構造特性（例えば、ＡＡＶカプシドの２０面体立体構造）を保持する、ウイルスカプシド（例えば、空ウイルスカプシド、部分的完全ウイルスカプシド、及び／又は完全ウイルスカプシド）を指す。

【0032】

「空ウイルスカプシド」又は「空カプシド」という用語は、異種核酸分子（例えば、治療用遺伝子）を含まないカプシドを指す。

【0033】

「部分的完全ウイルスカプシド」又は「部分的完全カプシド」という用語は、異種核酸分子（例えば、治療用遺伝子）の一部のみを含むカプシドを指す。

【0034】

「完全ウイルスカプシド」又は「完全カプシド」という用語は、完全異種核酸分子（例えば、治療用遺伝子又は目的の遺伝子）を含むカプシドを指す。

【0035】

本明細書で使用される場合の「試料」という用語は、例えば、分離及び分析を含む、本発明の方法による操作を受ける、少なくとも１つのウイルスカプシド成分（すなわち、空カプシド、部分的完全カプシド、及び／又は完全カプシド）を含むウイルス粒子（例えば、ＡＡＶ粒子）の混合物を指す。

【0036】

「分析」又は「分析すること」という用語は、互換的に使用され、目的のウイルス粒子又は構成要素部分（例えば、ＡＡＶカプシド）を分離、検出、単離、精製、及び／又は特性評価する様々な方法のうちのいずれかを指す。例としては、液体クロマトグラフィー（例えば、ＡＥＸ）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0037】

本明細書で使用される場合の「接触させること」は、溶液相又は固相中の少なくとも２つの物質を一緒にすること、例えば、クロマトグラフィー材料の固定相を、ウイルス粒子又はウイルスタンパク質を含む試料などの試料と接触させることを含む。

【0038】

本明細書で使用される場合、「液体クロマトグラフィー」という用語は、液体によって運ばれる化学混合物が、固定液相又は固体相の周囲又は上を流動する際の化学物質の微分分布の結果として成分に分離され得る、プロセスを指す。液体クロマトグラフィーの非限定的な例としては、イオン交換クロマトグラフィー（例えば、アニオン交換クロマトグラフィー）が挙げられる。

【0039】

「アデノ随伴ウイルス」又は「ＡＡＶ」は、非エンベロープで約４．７ｋｂのゲノムである、一本鎖ＤＮＡを有する非病原性パルボウイルスであり、２０面体立体構造を有する。ＡＡＶは、アデノウイルス調製物の汚染物質として１９６５年に最初に発見された。ＡＡＶは、ディペンドウイルス属及びパルボウイルス科に属し、複製のためにヘルペスウイルス又はアデノウイルスのいずれかからのヘルパー機能を必要とする。ヘルパーウイルスの非存在下では、ＡＡＶは、１９ｑ１３．４位でヒト１９番染色体に統合することによって、潜伏を設定することができる。ＡＡＶゲノムは、２つのＡＡＶ遺伝子Ｒｅｐ及びＣａｐの各々に１つずつ、２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）からなる。ＡＡＶ ＤＮＡ末端は、１４５ｂｐの逆位末端反復（ＩＴＲ）を有し、１２５個の末端塩基は、パリンドロームであり、特徴的なＴ字型ヘアピン構造につながる。

【0040】

本明細書で使用される場合の「ポリヌクレオチド」又は「核酸」という用語は、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドのいずれかである、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。したがって、本用語には、一本鎖、二本鎖又は多重鎖ＤＮＡ若しくはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、又はプリン塩基及びピリミジン塩基、若しくは他の天然、化学あるいは生化学的修飾、非天然、若しくは誘導体化ヌクレオチド塩基を含む、ポリマーが含まれるが、これらに限定されない。核酸の骨格は、糖及びリン酸基（典型的にはＲＮＡ又はＤＮＡで見出され得る）、又は修飾若しくは置換された糖若しくはリン酸基を含むことができる。

【0041】

「組換えＡＡＶ粒子」とは、少なくとも１つ、例えば、２つのＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）に隣接し得る、１つ以上の異種配列（例えば、ＡＡＶ起源ではない核酸配列）を含む、アデノ随伴ウイルス粒子を指す。そのようなｒＡＡＶ粒子は、好適なヘルパーウイルスに感染しており（又は好適なヘルパー機能を発現しており）、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子産物（すなわち、ＡＡＶ Ｒｅｐ及びＣａｐタンパク質）を発現している宿主細胞に存在する場合に複製及びパッケージ化され得る。

【0042】

「ウイルス粒子」とは、少なくとも１つのウイルスカプシドタンパク質及びカプシド封入ウイルスゲノムから構成されるウイルス粒子を指す。

【0043】

「異種」とは、実体が比較されるか、又は導入されるか、若しくは組み込まれる、残りの実体と遺伝子型的に明確に異なる実体に由来することを意味する。例えば、遺伝子操作技法によって異なる細胞型に導入される核酸は、異種核酸である（発現されると、異種ポリペプチドをコードすることができる）。同様に、ウイルス粒子に組み込まれる細胞配列（例えば、遺伝子又はその一部）は、ウイルス粒子に関する異種ヌクレオチド配列である。

【0044】

「逆位末端反復」又は「ＩＴＲ」配列は、反対の配向にあるウイルスゲノムの末端で見出される比較的短い配列である。「ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）」配列は、一本鎖ＡＡＶゲノムの両方の末端に存在する約１４５ヌクレオチド配列である。

【0045】

本明細書で使用される場合の「単離される」という用語は、成分が自然に生じるか、又はトランスジェニックで発現される、生物の細胞中の他の生物学的成分から実質的に分離、産生、又は精製されている生物学的成分（核酸、ペプチド、タンパク質、脂質、ウイルス粒子、又は代謝産物など）を指す。

【0046】

本明細書で使用される場合の「ベクター」とは、インビトロ又はインビボのいずれかで宿主細胞内に送達される核酸を含む、組換えプラスミド又はウイルスを指す。

【0047】

「組換えウイルスベクター」とは、１つ以上の異種配列（すなわち、ウイルス起源ではない核酸配列）を含む組換えポリヌクレオチドベクターを指す。

【0048】

「アニオン交換クロマトグラフィー」又はＡＥＸという用語は、ジエチル－アミノエチル基などの正電荷を持つ基を含むイオン交換樹脂を使用して、それらの電荷に基づいて物質を分離する、プロセスを含むことを意図している。溶液中、樹脂は、正電荷を持つ対イオンで被覆される。

【0049】

液体クロマトグラフィー機器の「液体運搬構成要素」という用語は、例えば、試料及び移動相を注入点（手動又はオートサンプラーによるかどうかにかかわらず）からカラムへ、及びカラムから検出器へ運搬する、ＨＰＬＣ又はＵＰＬＣ機器のそれらの要素を指す。

【0050】

概要
本開示は、ウイルス粒子（例えば、ＡＡＶ粒子）の試料のウイルスカプシド成分の敏感かつ定量的な特性評価を提供する、液体クロマトグラフィー方法を提供する。ＡＡＶ粒子の試料のウイルスカプシド成分などのウイルス粒子組成物のウイルスカプシド成分の特性評価は、製品の品質及び一貫性を確保して、組成物の安全性及び有効性を維持するために必要である。

【0051】

組換えウイルスベクター組成物（例えば、ＡＡＶベクター組成物）は、産生から生じる様々なレベルの空及び完全カプシド成分を含むことができる。本方法は、ウイルス粒子の試料中のウイルスカプシド成分の比を同定及び定量化するための分析技法を提供する。

【0052】

ウイルスカプシド成分の相対存在量を決定するための方法
本開示の態様は、異種の目的の遺伝子を含むＡＡＶ粒子の試料中のインタクトなウイルスカプシド成分の相対存在量を決定するための方法を対象とする。一般に、本方法は、アニオン交換クロマトグラフィーを使用するＡＡＶカプシド成分の分離と、分離された成分のピーク面積に基づく空及び完全カプシド成分の相対存在量の決定と、を含む。

【0053】

場合によっては、本方法は、（ａ）液体クロマトグラフィー（ＬＣ）機器及びアニオン交換カラム（ＡＥＸカラム）を備える液体クロマトグラフィーシステム上でシステム再生プロセスを実施して、試験試料の分析の正確性及び再現性に影響を及ぼし得る、参照標準試料又は以前の試験試料からブランク試料への繰り越しの割合（例えば、参照標準完全カプシドピークの面積カウントの０．１５％未満）を低減又は排除することと、（ｂ）液体クロマトグラフィーシステム上でシステム平衡化プロセスを実施して、ＬＣ機器及びＡＥＸカラムの液体運搬構成要素から、再生プロセスからの洗浄物質を取り除くことと、（ｃ）空及び完全ＡＡＶカプシドを含む１つ以上の試験試料に試料分離プロセスを実施して、１つ以上の試験試料中の各カプシド成分の相対存在量を決定することと、を含む。

【0054】

場合によっては、本方法は、（ａ）液体クロマトグラフィー（ＬＣ）機器及びアニオン交換カラム（ＡＥＸカラム）を備える液体クロマトグラフィーシステム上でシステム再生プロセスを実施することであって、システム再生プロセスが、（ｉ）ＡＥＸカラムを少なくとも１０カラム体積（ＣＶ）の移動相Ａで洗浄することと、（ｉｉ）ＡＥＸカラムを少なくとも１０ＣＶの精製水で洗浄することと、（ｉｉｉ）ＡＥＸカラムを、精製水中に１５％～２１％ｖ／ｖのエタノールを含む少なくとも２０ＣＶの洗浄溶液で洗浄することと、（ｉｖ）ＬＣ機器の液体運搬構成要素を洗浄溶液で少なくとも０．５ｍＬ／分の流量において少なくとも３０分間洗浄することと、を含み、移動相Ａが、８～９のｐＨにおいて精製水中に１５ｍＭ～２５ｍＭのビストリスプロパン及び１ｍＭ～３ｍＭの塩化マグネシウムを含み、精製水が、２５℃における約１８．２ＭΩ．ｃｍの抵抗率及び５ｐｐｂ未満の全有機体炭素を有する、システム再生プロセスを実施することと、（ｂ）ＬＣ機器及びＡＥＸカラムの液体運搬構成要素から洗浄溶液をパージすることを含む、液体クロマトグラフィーシステム上でシステム平衡化プロセスを実施することと、（ｃ）試料分離プロセスを実施することであって、試料分離プロセスが、（ｉ）１つ以上のブランク試料を液体クロマトグラフィーシステムに導入し、液体クロマトグラフィーシステムを通して移動相Ａ、移動相Ｂ、及び移動相Ｃの分離勾配を実行することと、（ｉｉ）１つ以上の参照標準試料を液体クロマトグラフィーシステムに導入し、液体クロマトグラフィーシステムを通して移動相Ａ、移動相Ｂ、及び移動相Ｃの分離勾配を実行することと、（ｉｉｉ）ＡＡＶ粒子の１つ以上の試験試料を液体クロマトグラフィーシステムに導入し、１つ以上の試験試料が、試料溶液中にインタクトな空ＡＡＶカプシド及びインタクトな完全ＡＡＶカプシドを含み、液体クロマトグラフィーシステムを通して移動相Ａ、移動相Ｂ、及び移動相Ｃの分離勾配を実行して、インタクトな完全ＡＡＶカプシドからインタクトな空ＡＡＶカプシドを分離することと、を含み、移動相Ｂが、８～９のｐＨにおいて、精製水中に１５ｍＭ～２５ｍＭのビストリスプロパン、２５０ｍＭ～１Ｍの塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣ）、及び１ｍＭ～３ｍＭの塩化マグネシウムを含み、移動相Ｃが、精製水中に１．５Ｍ～２．５Ｍの塩化ナトリウムを含む、試料分離プロセスを実施することと、（ｄ）１つ以上の試験試料の各々においてインタクトな空ＡＡＶカプシドの量及びインタクトな完全ＡＡＶカプシドの量を同定して、ＡＡＶ粒子の試料中のインタクトなウイルスカプシド成分の相対存在量を決定することと、を含む。

【0055】

場合によっては、本方法は、（ａ）液体クロマトグラフィー（ＬＣ）機器及びアニオン交換カラム（ＡＥＸカラム）を備える液体クロマトグラフィーシステム上でシステム再生プロセスを実施することであって、システム再生プロセスが、（ｉ）ＡＥＸカラムを少なくとも１０カラム体積（ＣＶ）の移動相Ａで洗浄することと、（ｉｉ）ＡＥＸカラムを少なくとも１０ＣＶの精製水で洗浄することと、（ｉｉｉ）任意選択的に、ＡＥＸカラムの配向を逆転させて、ＡＥＸカラム内の流動を逆転させることと、（ｉｖ）ＡＥＸカラムを、精製水中に１５％～２１％ｖ／ｖのエタノールを含む少なくとも２０ＣＶの洗浄溶液で洗浄することと、（ｖ）ＬＣ機器からＡＥＸカラムを除去することと、（ｖｉ）ＬＣ機器の液体運搬構成要素を洗浄溶液で少なくとも０．５ｍＬ／分の流量において少なくとも３０分間洗浄することと、を含み、移動相Ａが、８～９のｐＨにおいて精製水中に１５ｍＭ～２５ｍＭのビストリスプロパン及び１ｍＭ～３ｍＭの塩化マグネシウムを含み、精製水が、２５℃における約１８．２ＭΩ．ｃｍの抵抗率及び５ｐｐｂ未満の全有機体炭素を有する、システム再生プロセスを実施することと、（ｂ）（ｉ）ＡＥＸカラムをＬＣ機器に再設置することと、（ｉｉ）ＬＣ機器及びＡＥＸカラムの液体運搬構成要素から洗浄溶液をパージすることと、を含む、液体クロマトグラフィーシステム上でシステム平衡化プロセスを実施することと、（ｃ）試料分離プロセスを実施することであって、試料分離プロセスが、（ｉ）１つ以上のブランク試料を液体クロマトグラフィーシステムに導入し、液体クロマトグラフィーシステムを通して移動相Ａ、移動相Ｂ、及び移動相Ｃの分離勾配を実行することと、（ｉｉ）１つ以上の参照標準試料を液体クロマトグラフィーシステムに導入し、液体クロマトグラフィーシステムを通して移動相Ａ、移動相Ｂ、及び移動相Ｃの分離勾配を実行することと、（ｉｉｉ）ＡＡＶ粒子の１つ以上の試験試料を液体クロマトグラフィーシステムに導入し、１つ以上の試験試料が、試料溶液中にインタクトな空ＡＡＶカプシド及びインタクトな完全ＡＡＶカプシドを含み、液体クロマトグラフィーシステムを通して移動相Ａ、移動相Ｂ、及び移動相Ｃの分離勾配を実行して、インタクトな完全ＡＡＶカプシドからインタクトな空ＡＡＶカプシドを分離することと、を含み、移動相Ｂが、８～９のｐＨにおいて、精製水中に１５ｍＭ～２５ｍＭのビストリスプロパン、２５０ｍＭ～１Ｍの塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣ）、及び１ｍＭ～３ｍＭの塩化マグネシウムを含み、移動相Ｃが、精製水中に１．５Ｍ～２．５Ｍの塩化ナトリウムを含む、試料分離プロセスを実施することと、（ｄ）１つ以上の試験試料の各々においてインタクトな空ＡＡＶカプシドの量及びインタクトな完全ＡＡＶカプシドの量を同定して、ＡＡＶ粒子の試料中のインタクトなウイルスカプシド成分の相対存在量を決定することと、を含む。

【0056】

方法の様々な実施形態（以下で考察される界面活性剤濃度を有するものを含む）では、試料溶液は、２ｍＭ～１００ｍＭの塩化ナトリウムを含有し得る。場合によっては、試料溶液は、６０ｍＭ～１００ｍＭの塩化ナトリウムを含有する。

【0057】

方法の様々な実施形態（上記で考察される塩化ナトリウム濃度を有するものを含む）では、試料溶液は、０．００３％ｗ／ｖ～０．００７％ｗ／ｖの界面活性剤を含有し得る。場合によっては、試料溶液は、０．００５％ｗ／ｖ±０．００１％ｗ／ｖの界面活性剤を含有し得る。いくつかの実施形態では、界面活性剤は、ポロキサマー（例えば、ポロキサマー１８８）である。

【0058】

方法の様々な実施形態では、液体クロマトグラフィーシステムは、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）システム又は超高速液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）システムであり得る。ＨＰＬＣ及びＵＰＬＣとは、クロマトグラフィー充填材料又はマトリックス（固定相）を有するカラムを通して高圧で溶媒（移動相として知られる）中の試料混合物又は分析物をポンプ注入する、カラムクロマトグラフィーの形態を指す。試料は、移動キャリアガス流、例えば、ヘリウム又は窒素によって運搬される。固定相カラムは、移動相混合物又は分析物と相互作用するクロマトグラフィー媒体又は樹脂から構成される。試料の手動注入が依然として可能であるが、典型的なＨＰＬＣ／ＵＰＬＣシステムは、完全に自動化され、コンピュータによって制御される。注入器又はオートサンプラーが、検出器に更に接続されるカラムハードウェアを収容するための装置に接続されて採用され得る。ＨＰＬＣ及びＵＰＬＣのタイプは、当該技術分野で周知である。ＵＰＬＣは、典型的には、ＨＰＬＣよりも高い圧力で動作し、ＨＰＬＣに対して縮小された粒径を有するカラムを採用し得る。ＨＰＬＣ及びＵＰＬＣ機器は、当該技術分野で周知であり、当業者によく知られているであろう。

【0059】

本方法の様々な実施形態では、１つ又は複数の移動相は、例えば、ビストリスプロパン（ＢＴＰ）などの緩衝組成物を含む。移動相緩衝液濃度は、変化し得る。例えば、約１ｍＭ～約１００ｍＭ（例えば、１～５０ｍＭ）の濃度が使用され得る。様々な実施形態では、緩衝液濃度は、１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭ、１１ｍＭ、１２ｍＭ、１３ｍＭ、１４ｍＭ、１５ｍＭ、１６ｍＭ、１７ｍＭ、１８ｍＭ、１９ｍＭ、２０ｍＭ、２１ｍＭ、２２ｍＭ、２３ｍＭ、２４ｍＭ、２５ｍＭ、２６ｍＭ、２７ｍＭ、２８ｍＭ、２９ｍＭ、３０ｍＭ、３１ｍＭ、３２ｍＭ、３３ｍＭ、３４ｍＭ、３５ｍＭ、３６ｍＭ、３７ｍＭ、３８ｍＭ、３９ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、５０ｍＭ、５５ｍＭ、６０ｍＭ、６５ｍＭ、７０ｍＭ、７５ｍＭ、８０ｍＭ、８５ｍＭ、９０ｍＭ、９５ｍＭ、又は１００ｍＭであり得る。場合によっては、緩衝液濃度は、（例えば、ＢＴＰの）１０ｍＭ～３０ｍＭ、又は１５ｍＭ～２５ｍＭであり得る。場合によっては、緩衝液濃度は、（例えば、ＢＴＰの）２０ｍＭ±２ｍＭであり得る。場合によっては、緩衝液濃度は、（例えば、ＢＴＰの）約２０ｍＭであり得る。

【0060】

本方法の様々な実施形態では、１つ又は複数の移動相は、１つ以上の塩、例えば、塩化マグネシウム、塩化ナトリウム、及び／又は塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣ）を含有し得る。いくつかの実施形態では、塩は、約０．１ｍＭ～約５Ｍ、又は約０．２ｍＭ、約０．３ｍＭ、約０．４ｍＭ、約０．５ｍＭ、約０．６ｍＭ、約０．７ｍＭ、約０．８ｍＭ、約０．９ｍＭ、約１ｍＭ、約１．２５ｍＭ、約１．５ｍＭ、約１．７５ｍＭ、約２ｍＭ、約２．２５ｍＭ、約２．５ｍＭ、約２．７５ｍＭ、約３ｍＭ、約３．２５ｍＭ、約３．５ｍＭ、約３．７５ｍＭ、約４ｍＭ、約４．２５ｍＭ、約４．５ｍＭ、約４．７５ｍＭ、約５ｍＭ、約６ｍＭ、約７ｍＭ、約８ｍＭ、約９ｍＭ、約１０ｍＭ、約５０ｍＭ、約１００ｍＭ、約１５０ｍＭ、約２００ｍＭ、約２５０ｍＭ、約３００ｍＭ、約３５０ｍＭ、約４００ｍＭ、約４５０ｍＭ、約５００ｍＭ、約５５０ｍＭ、約６００ｍＭ、約６５０ｍＭ、約７００ｍＭ、約７５０ｍＭ、約８００ｍＭ、約８５０ｍＭ、約９００ｍＭ、約９５０ｍＭ、約１．０Ｍ、約１．５Ｍ、約２Ｍ、約３Ｍ、約３．５Ｍ、約４Ｍ、約４．５Ｍ、又は約５Ｍの濃度であり得る。場合によっては、移動相（例えば、移動相Ａ及び移動相Ｂ）は、約１ｍＭ～約３ｍＭのＭｇＣｌ_２を含有し得る。場合によっては、移動相（例えば、移動相Ａ及び移動相Ｂ）は、約１．５ｍＭ～約２．５ｍＭのＭｇＣｌ_２を含有し得る。場合によっては、移動相（例えば、移動相Ａ及び移動相Ｂ）は、約２ｍＭのＭｇＣｌ_２を含有し得る。場合によっては、移動相（例えば、移動相Ｃ）は、約１Ｍ～約３ＭのＮａＣｌを含有し得る。場合によっては、移動相（例えば、移動相Ｃ）は、約１．５Ｍ～約２．５ＭのＮａＣｌを含有し得る。場合によっては、移動相（例えば、移動相Ｃ）は、約２ＭのＮａＣｌを含有し得る。場合によっては、移動相（例えば、移動相Ｂ）は、約１００ｍＭ～約９００ｍＭのＴＭＡＣを含有し得る。場合によっては、移動相（例えば、移動相Ｂ）は、約２５０ｍＭ～約７５０ｍＭのＴＭＡＣを含有し得る。場合によっては、移動相（例えば、移動相Ｂ）は、約４００ｍＭ～約６００ｍＭのＴＭＡＣを含有し得る。場合によっては、移動相（例えば、移動相Ｂ）は、約５００ｍＭのＴＭＡＣを含有し得る。

【0061】

方法の様々な実施形態では、１つ又は複数の移動相は、約７．５～約９．５の範囲のｐＨにおいて精製水中に緩衝液及び／又は塩を含有する。１つ又は複数の移動相のｐＨは、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９．０、９．１、９．２、９．３、９．４、又は９．５であり得る。場合によっては、ｐＨは、約８．０～約９．０である。場合によっては、ｐＨは、約８．３～約８．７である。場合によっては、ｐＨは、約８．５である。精製水は、ミリＱ水であり得る。ミリＱ水は、当業者によく知られているであろうミリＱ水精製システム（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）から産生される精製水である。ミリＱ水は、２５℃における約１８．２ＭΩ．ｃｍの抵抗率及び５ｐｐｂ未満の全有機体炭素を有する。

【0062】

本明細書で考察されるシステム再生プロセスは、精製水中に約１８％ｖ／ｖのエタノールを含む洗浄溶液を含む。様々な実施形態では、エタノール濃度は、約１０％ｖ／ｖ～約２６％ｖ／ｖであり得る。場合によっては、エタノール濃度は、約１５％ｖ／ｖ～約２１％ｖ／ｖであり得る。いくつかの実施形態では、洗浄溶液のエタノール濃度は、精製水（例えば、ミリＱ水）中で約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％、約２０％、約２１％、約２２％、約２３％、約２４％、約２５％、又は約２６％ｖ／ｖである。

【0063】

一実施形態では、本明細書で考察されるシステム再生プロセスは、（ｉ）ＡＥＸカラムを少なくとも１０カラム体積（ＣＶ）の移動相Ａで洗浄することと、（ｉｉ）ＡＥＸカラムを少なくとも１０ＣＶの精製水で洗浄することと、（ｉｉｉ）ＡＥＸカラムを、精製水中に１５％～２１％ｖ／ｖのエタノールを含む少なくとも２０ＣＶの洗浄溶液で洗浄することと、（ｉｖ）ＬＣ機器の液体運搬構成要素を洗浄溶液で少なくとも０．５ｍＬ／分の流量において少なくとも３０分間洗浄することと、を含む。別の実施形態では、本明細書で考察されるシステム再生プロセスは、（ｉ）ＡＥＸカラムを少なくとも１０カラム体積（ＣＶ）の移動相Ａで洗浄することと、（ｉｉ）ＡＥＸカラムを少なくとも１０ＣＶの精製水で洗浄することと、（ｉｉｉ）任意選択的に、ＡＥＸカラムの配向を逆転させて、ＡＥＸカラム内の流動を逆転させることと、（ｉｖ）ＡＥＸカラムを、精製水中に１５％～２１％ｖ／ｖのエタノールを含む少なくとも２０ＣＶの洗浄溶液で洗浄することと、（ｖ）ＬＣ機器からＡＥＸカラムを除去することと、（ｖｉ）ＬＣ機器の液体運搬構成要素を洗浄溶液で少なくとも０．５ｍＬ／分の流量において少なくとも３０分間洗浄することと、を含む。場合によっては、少なくとも１０ＣＶへの言及は、１０ＣＶ～２０ＣＶに対応する。場合によっては、少なくとも１０ＣＶへの言及は、１０ＣＶ、１１ＣＶ、１２ＣＶ、１３ＣＶ、１４ＣＶ、１５ＣＶ、１６ＣＶ、１７ＣＶ、１８ＣＶ、１９ＣＶ、２０ＣＶ、２１ＣＶ、２２ＣＶ、２３ＣＶ、２４ＣＶ、２５ＣＶ、３０ＣＶ、３５ＣＶ、又は４０ＣＶに対応する。同様に、少なくとも２０ＣＶへの言及は、いくつかの実施形態では、２０ＣＶ～３０ＣＶに対応し得る。場合によっては、少なくとも２０ＣＶへの言及は、２０ＣＶ、２１ＣＶ、２２ＣＶ、２３ＣＶ、２４ＣＶ、２５ＣＶ、２６ＣＶ、２７ＣＶ、２８ＣＶ、２９ＣＶ、３０ＣＶ、３１ＣＶ、３２ＣＶ、３３ＣＶ、３４ＣＶ、３５ＣＶ、３６ＣＶ、３７ＣＶ、３８ＣＶ、３９ＣＶ、又は４０ＣＶに対応する。同様に、システム再生プロセスに関連する、少なくとも３０分間の少なくとも０．５ｍＬ／分の流量への言及は、いくつかの実施形態では、０．５ｍＬ／分～１ｍＬ／分、又は０．５ｍＬ／分～０．８ｍＬ／分の流量に対応し得る。いくつかの実施形態では、少なくとも３０分間の少なくとも０．５ｍＬ／分の流量への言及は、３０分、３１分、３２分、３３分、３４分、３５分、３６分、３７分、３８分、３９分、４０分、４５分、５０分、５５分、又は６０分間の持続時間にわたる、０．５ｍＬ／分、０．６ｍＬ／分、０．７ｍＬ／分、０．８ｍＬ／分、０．９ｍＬ／分、又は１ｍＬ／分の流量を指す。同様に、少なくとも１０分の持続時間への言及は、例えば、１０分、１１分、１２分、１３分、１４分、１５分、１６分、１７分、１８分、１９分、２０分、２１分、２２分、２３分、２４分、２５分、２６分、２７分、２８分、又は２９分を指す。

【0064】

様々な実施形態では、システム再生プロセスを実施することは、以前の試料（例えば、参照標準試料又は以前の試験試料）からブランク試料へのカプシド成分の繰り越しの低減又は除去をもたらす。場合によっては、ブランク試料は、参照標準完全カプシドピーク又は以前の試験試料の完全カプシドピークの面積カウントの０．３％未満を含む。場合によっては、ブランク試料は、参照標準完全カプシドピーク又は以前の試験試料の完全カプシドピークの面積カウントの０．２５％未満を含む。場合によっては、ブランク試料は、参照標準完全カプシドピーク又は以前の試験試料の完全カプシドピークの面積カウントの０．２％未満を含む。場合によっては、ブランク試料は、参照標準完全カプシドピーク又は以前の試験試料の完全カプシドピークの面積カウントの０．１５％未満を含む。

【0065】

本明細書で考察されるシステム平衡化プロセスは、概して、ＬＣ機器及びＡＥＸカラムの液体運搬構成要素から洗浄材料（例えば、エタノール含有洗浄溶液）を除去し、かつ試料分離のためにカラムを準備するように設計されている。場合によっては、システム平衡化プロセスは、（ｉ）少なくとも０．５ｍＬ／分の流量において少なくとも３０分間、精製水でＬＣ機器の液体運搬構成要素から洗浄溶液をパージすることと、（ｉｉ）（以前に除去された場合）ＡＥＸカラムをＬＣ機器に再設置することと、（ｉｉｉ）ＡＥＸカラムを少なくとも１０ＣＶの精製水で洗浄することと、（ｉｖ）ＡＥＸカラムを少なくとも１０ＣＶの移動相Ａで洗浄することと、（ｖ）ＡＥＸカラムを少なくとも２０ＣＶの移動相Ｂで洗浄することと、（ｖｉ）ＡＥＸカラムを少なくとも２０ＣＶの移動相Ａで洗浄することと、を含む。場合によっては、少なくとも１０ＣＶへの言及は、１０ＣＶ～２０ＣＶに対応する。場合によっては、少なくとも１０ＣＶへの言及は、１０ＣＶ、１１ＣＶ、１２ＣＶ、１３ＣＶ、１４ＣＶ、１５ＣＶ、１６ＣＶ、１７ＣＶ、１８ＣＶ、１９ＣＶ、２０ＣＶ、２１ＣＶ、２２ＣＶ、２３ＣＶ、２４ＣＶ、２５ＣＶ、３０ＣＶ、３５ＣＶ、又は４０ＣＶに対応する。同様に、少なくとも２０ＣＶへの言及は、いくつかの実施形態では、２０ＣＶ～３０ＣＶに対応し得る。場合によっては、少なくとも２０ＣＶへの言及は、２０ＣＶ、２１ＣＶ、２２ＣＶ、２３ＣＶ、２４ＣＶ、２５ＣＶ、２６ＣＶ、２７ＣＶ、２８ＣＶ、２９ＣＶ、３０ＣＶ、３１ＣＶ、３２ＣＶ、３３ＣＶ、３４ＣＶ、３５ＣＶ、３６ＣＶ、３７ＣＶ、３８ＣＶ、３９ＣＶ、又は４０ＣＶに対応する。同様に、システム平衡化プロセスに関連する、少なくとも３０分間の少なくとも０．５ｍＬ／分の流量への言及は、いくつかの実施形態では、０．５ｍＬ／分～１ｍＬ／分、又は０．５ｍＬ／分～０．８ｍＬ／分の流量に対応し得る。いくつかの実施形態では、少なくとも３０分間の少なくとも０．５ｍＬ／分の流量への言及は、３０分、３１分、３２分、３３分、３４分、３５分、３６分、３７分、３８分、３９分、４０分、４５分、５０分、５５分、又は６０分間の持続時間にわたる、０．５ｍＬ／分、０．６ｍＬ／分、０．７ｍＬ／分、０．８ｍＬ／分、０．９ｍＬ／分、又は１ｍＬ／分の流量を指す。同様に、少なくとも１０分の持続時間への言及は、例えば、１０分、１１分、１２分、１３分、１４分、１５分、１６分、１７分、１８分、１９分、２０分、２１分、２２分、２３分、２４分、２５分、２６分、２７分、２８分、又は２９分を指す。

【0066】

いくつかの実施形態では、分離プロセスは、勾配として実行される１つ又は複数の移動相を含む。移動相の勾配は、例えば、２つ、３つ、又はそれ以上の移動相が使用される場合に使用することができる。勾配では、クロマトグラフィー実行にわたって、第１の移動相の濃度又は割合が、減少し得る一方で、第２の移動相の濃度又は割合は、増加する。場合によっては、クロマトグラフィー実行の過程中に、第１の移動相及び第２の移動相の両方の濃度を減少させることができる一方で、第３の移動相の濃度又は割合は、（例えば、一時的に）増加する。例えば、第１の移動相の割合は、クロマトグラフィー実行の一部の間に、又はクロマトグラフィー実行にわたって、約１００％、約９９％、約９５％、約９０％、約８５％、約８０％、約７５％、約７０％、約６５％、約６０％、約５０％、約４５％、若しくは約４０％～約０％、約１％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、又は約４０％から減少し得る。別の実施例として、第２の移動相の割合は、同じ実行の一部の間に、又は同じ実行にわたって、約０％、約１％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、若しくは約４０％～約１００％、約９９％、約９５％、約９０％、約８５％、約８０％、約７５％、約７０％、約６５％、約６０％、約５０％、約４５％、又は約４０％から増加し得る。別の実施例として、第１の移動相及び第２の移動相の割合は、クロマトグラフィー実行の一部の間に、又はクロマトグラフィー実行にわたって、約１００％、約９９％、約９５％、約９０％、約８５％、約８０％、約７５％、約７０％、約６５％、約６０％、約５０％、約４５％、又は約４０％～約０％、約１％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、又は約４０％から減少し得、第３の移動相の割合は、同じ実行の一部の間に、又は同じ実行にわたって、約０％、約１％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、又は約４０％～約１００％、約９９％、約９５％、約９０％、約８５％、約８０％、約７５％、約７０％、約６５％、約６０％、約５０％、約４５％、又は約４０％から増加し得る。ある特定の態様では、クロマトグラフィー実行における移動相Ａの割合は、経時的に減少し、次いで、経時的に増加する。ある特定の態様では、クロマトグラフィー実行における移動相Ｂの割合は、経時的に増加し、次いで、減少し、次いで、再び増加する。ある特定の態様では、移動相Ｃの割合は、経時的にクロマトグラフィー実行において増加し、次いで、減少する。任意選択的に、第１及び第２の移動相の濃度又は割合は、クロマトグラフィー実行の終了時にその開始値に戻ることができる。割合は、線形勾配として、又は非線形（例えば、段階的）様式で徐々に変化し得る。例えば、勾配は、多相性、例えば、二相性、三相性などであり得る。

【0067】

場合によっては、分離勾配は、順に、（ｉ）ある期間（例えば、１～５分）にわたる８５％～９５％の移動相Ａ及び５％～１５％の移動相Ｂと、（ｉｉ）ある期間（例えば、１０～３０分）にわたって移動相Ａを８５～９５％から５０７０％まで低減し、移動相Ｂを５～１５％から３０～５０％まで増加させることと、（ｉｉｉ）ある期間（例えば、１～１５分）にわたる１００％の移動相Ｃと、（ｉｖ）ある期間（例えば、５～１５分）にわたる８５％～９５％の移動相Ａ及び５％～１５％の移動相Ｂと、を含む。一実施形態では、分離勾配は、順に、（ｉ）１分間の９０％の移動相Ａ及び１０％の移動相Ｂと、（ｉｉ）２０分の期間にわたって移動相Ａを９０％から５８％まで低減し、移動相Ｂを１０％から４２％まで増加させることと、（ｉｉｉ）５分間の１００％の移動相Ｃと、（ｉｖ）１０分間の９０％の移動相Ａ及び１０％の移動相Ｂと、を含む。

【0068】

いくつかの例示的な実施形態では、１つ又は複数の移動相は、約０．０５ｍＬ／分～約１ｍＬ／分、又は約０．０５ｍＬ／分～約０．０８ｍＬ／分の液体クロマトグラフィーカラムを通した流量を有することができる。場合によっては、流量は、約０．０５ｍＬ／分、約０．０６ｍＬ／分、約０．０７ｍＬ／分、約０．０８ｍＬ／分、約０．０９ｍＬ／分、約０．１ｍＬ／分、約０．１５ｍＬ／分、約０．２ｍＬ／分、約０．２５ｍＬ／分、約０．３ｍＬ／分、約０．３５ｍＬ／分、約０．４ｍＬ／分、約０．４５ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分、約０．５５ｍＬ／分、約０．６ｍＬ／分、約０．６５ｍＬ／分、約０．７ｍＬ／分、約０．７５ｍＬ／分、約０．８ｍＬ／分、約０．８５ｍＬ／分、約０．９ｍＬ／分、約０．９５ｍＬ／分、又は約１ｍＬ／分である。場合によっては、流量は、約０．８ｍＬ／分である。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の移動相の実行時間は、勾配として実行されるかどうかにかかわらず、約１分～６０分である。他の実施形態では、１つ又は複数の移動相の実行時間は、約１分、約２分、約３分、約４分、約５分、約６分、約７分、約８分、約９分、約１０分、約１１分、約１２分、約１３分、約１４分、約１５分、約１６分、約１７分、約１８分、約１９分、約２０分、約２１分、約２２分、約２３分、約２４分、約２５分、約２６分、約２７分、約２８分、約２９分、約３０分、約３１分、約３２分、約３３分、約３４分、約３５分、約３６分、約３７分、約３８分、約３９分、約４０分、約４１分、約４２分、約４３分、約４４分、又は約４５分である。

【0069】

様々な実施形態では、液体クロマトグラフィーシステムへの試料注入又は導入は、試料当たり約２０μＬに制限される。場合によっては、注入体積は、約５μＬ～約２０μＬである。場合によっては、注入体積は、約５μＬ、約６μＬ、約７μＬ、約８μＬ、約９μＬ、約１０μＬ、約１１μＬ、約１２μＬ、約１３μＬ、約１４μＬ、約１５μＬ、約１６μＬ、約１７μＬ、約１８μＬ、約１９μＬ、又は約２０μＬである。

【0070】

任意の特定の試験試料中のウイルス価に応じて、試料は、試料希釈緩衝液中で希釈され得る。場合によっては、試料希釈緩衝液は、ｐＨ７．３において、精製水中に１０ｍＭのリン酸ナトリウム、及び０．００５％ｗ／ｖのポロキサマー１８８を含む。例えば、ウイルス価が５Ｅ＋１２ｖｇ／ｍＬ以上である場合において、試験試料は、液体クロマトグラフィーシステムへの注入又は導入の前に、試料希釈緩衝液で１．５～３倍に希釈され得る。場合によっては、試験試料は、試料希釈緩衝液で１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、２．１倍、２．２倍、２．３倍、２．４倍、２．５倍、２．６倍、２．７倍、２．８倍、２．９倍、又は３倍に希釈される。様々な実施形態では、試験試料は（ウイルス価に基づいて希釈されるかどうかにかかわらず）、約０．００１％～約０．０１％ｗ／ｖの界面活性剤を含む試料溶液中に含有され得る。場合によっては、試料溶液は、０．００４％～０．００６％ｗ／ｖの界面活性剤を含む。場合によっては、試料溶液は、約０．００５％ｗ／ｖの界面活性剤を含む。様々な実施形態では、界面活性剤は、ポロキサマー１８８などのポロキサマーであり得る。

【0071】

様々な実施形態では、液体クロマトグラフィーシステムに注入又は導入された（例えば、試料溶液中の）試験試料は、約２ｍＭ～約１００ｍＭの塩化ナトリウムを含む。場合によっては、試験試料は、約６０ｍＭ～約１００ｍＭを含む。様々な実施形態では、試験試料は、約１．８ｍＭ、約１．９ｍＭ、約２ｍＭ、約５ｍＭ、約１０ｍＭ、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、約２５ｍＭ、約３０ｍＭ、約３５ｍＭ、約４０ｍＭ、約４５ｍＭ、約５０ｍＭ、約５５ｍＭ、約６０ｍＭ、約６５ｍＭ、約７０ｍＭ、約７５ｍＭ、約８０ｍＭ、約８５ｍＭ、約９０ｍＭ、約９５ｍＭ、又は約１００ｍＭの塩化ナトリウムを含む。

【0072】

本明細書で考察される方法の様々な実施形態では、液体クロマトグラフィーシステムは、蛍光検出と共に使用され得る。いくつかの実施形態では、励起及び発光のための波長は、それぞれ、２８０ｎｍ±２０ｎｍ及び３５０ｎｍ±２０ｎｍに設定される。いくつかの実施形態では、検出器の応答時間は、０．５秒に設定される。いくつかの実施形態では、応答時間は、クロマトグラフィーピークにわたって少なくとも２０個のデータ点を生成するように設定される。いくつかの実施形態では、応答時間は、約０．１～１．０秒に設定される。

【0073】

ウイルス粒子
ある特定の態様では、ウイルス粒子は、ＡＡＶ粒子であり、開示される方法を使用して、ＡＡＶ粒子の試料中のウイルスカプシド成分の相対存在量を決定することができる。ＡＡＶ粒子は、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）粒子であり得る。ｒＡＡＶ粒子は、異種導入遺伝子又は異種核酸分子をコードするＡＡＶベクターを含む。

【0074】

ある特定の態様では、ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１カプシド、ＡＡＶ２カプシド、ＡＡＶ３カプシド、ＡＡＶ４カプシド、ＡＡＶ５カプシド、ＡＡＶ６カプシド、ＡＡＶ７カプシド、ＡＡＶ８カプシド、ＡＡＶｒｈ８カプシド、ＡＡＶ９カプシド、ＡＡＶ１０カプシド、ＡＡＶ１１カプシド、ＡＡＶ１２カプシド、又はそのバリアントを含む。ある特定の態様では、ＡＡＶ粒子は、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ－ＤＪ、ＡＡＶ－ＤＪ／８、ＡＡＶ－Ｒｈ１０、ＡＡＶ－ｒｅｔｒｏ、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ８－ＰＨＰ．ｅＢ、又はＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｓの粒子である。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ粒子は、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ５、又はＡＡＶ８の粒子である。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ粒子は、血清型ＡＡＶ８の粒子である。

【0075】

いくつかの態様では、ウイルス粒子（例えば、ＡＡＶ粒子）は、異種核酸分子（例えば、治療用遺伝子又は目的の遺伝子）を含む。いくつかの態様では、異種核酸分子は、プロモーターに動作可能に連結される。例示的なプロモーターとしては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター、ＲＳＶ ＬＴＲ、ＭｏＭＬＶ ＬＴＲ、ホスホグリセリン酸キナーゼ－１（ＰＧＫ）プロモーター、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター及びＣＫ６プロモーター、トランスサイレチンプロモーター（ＴＴＲ）、ＴＫプロモーター、テトラサイクリン応答性プロモーター（ＴＲＥ）、ＨＢＶプロモーター、ｈＡＡＴプロモーター、ＬＳＰプロモーター、キメラ肝臓特異的プロモーター（ＬＳＰ）、Ｅ２Ｆプロモーター、テロメラーゼ（ｈＴＥＲＴ）プロモーター、サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリベータ－アクチン／ウサギベータ－グロビンプロモーター、並びに伸長因子１－アルファプロモーター（ＥＦ１－アルファ）プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの態様では、プロモーターは、ヒトベータ－グルクロニダーゼプロモーター、又はニワトリベータ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーターに連結されたサイトメガロウイルスエンハンサーを含む。プロモーターは、構成的、誘導性、又は抑制性プロモーターであり得る。いくつかの態様では、本発明は、ＣＢＡプロモーターに動作可能に連結された本開示の異種導入遺伝子をコードする核酸を含む、組換えベクターを提供する。場合によっては、導入遺伝子のための天然プロモーター又はその断片が使用される。天然プロモーターは、導入遺伝子の発現が天然発現を模倣するべきであることが所望されるときに使用され得る。天然プロモーターは、導入遺伝子の発現が、時間的若しくは発生的に、又は組織特異的な様式で、又は具体的な転写刺激に応答して調節されなければならないときに使用され得る。更なる態様では、エンハンサー要素、ポリアデニル化部位、又はコザックコンセンサス配列などの他の天然発現制御要素もまた、天然発現を模倣するために使用され得る。

【0076】

様々な態様では、ウイルス粒子は、哺乳類細胞ＡＡＶ産生システム（例えば、２９３Ｔ又はＨＥＫ２９３細胞に基づくもの）及び昆虫細胞ＡＡＶ産生システム（例えば、ｓｆ９昆虫細胞に基づくもの、及び／又はバキュロウイルスヘルパーベクターを使用するもの）などの任意の公知の産生システムによって取得され得る。ウイルス粒子は、不連続塩化セシウム密度勾配などの周知の技法又はカラムベースの下流プロセスなどの他のプロセスを使用することによって、細胞培養物から精製され得る。

【実施例】

【0077】

以下の実施例は、本発明の方法及び組成物をどのように作製し使用するかという完全な開示及び説明を当業者に提供するように記載され、発明者がその発明とみなすものの範囲を限定することを意図していない。使用される数字（例えば、量、温度など）に関して正確性を確保するための努力がなされているが、いくらかの実験誤差及び偏差を考慮に入れるべきである。別段の指示がない限り、部は重量部、分子量は平均分子量、温度は摂氏、圧力は大気圧又は大気圧付近である。

【0078】

実施例１：空及び完全ＡＡＶカプシドの相対存在量の分離及び同定
空ＡＡＶ８カプシド及び完全ＡＡＶ８カプシド（目的の遺伝子を含む）を含む試料を、アニオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィーによって分離し、カプシド成分の相対存在量を決定した。蛍光検出器を装備したＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ Ｈ－Ｃｌａｓｓシステム（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）上のＢＩＡ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，ＣＩＭａｃ ＡＡＶ Ｅｍｐｔｙ／Ｆｕｌｌ ０．１ｍＬ分離カラム（１．３μｍ細孔径、５．２ｍｍ直径×４．９５ｍｍ長さ）（カタログ番号１１０．８５０３－１．３）を使用して、ＡＥＸ分離を実施した。移動相Ａ（ＭＰＡ）は、ｐＨ８．５においてミリＱ水中に２０ｍＭのビストリスプロパン及び２ｍＭのＭｇＣｌ_２を含有し、移動相Ｂ（ＭＰＢ）は、ｐＨ８．５においてミリＱ水中に２０ｍＭのビストリスプロパン、５００ｍＭの塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣ）、及び２ｍＭのＭｇＣｌ_２を含有し、移動相Ｃ（ＭＰＣ）は、ミリＱ水中に２ＭのＮａＣｌを含有した。ＡＥＸの流量は、０．８ｍＬ／分であり、勾配は、以下の表１に示される通りであった。

【表1】

【0079】

各試料を、ｐＨ７．３においてミリＱ水中に１０ｍＭのリン酸ナトリウム及び０．００５％ｗ／ｖのポロキサマー１８８を含有する試料希釈緩衝液で８０ｍＭのＮａＣｌまで希釈し、１０マイクロリットルの体積をＵＰＬＣシステムに注入した。それぞれ、２８０ｎｍ及び３５０ｎｍの励起（Ｅｘ）波長及び発光（Ｅｍ）波長とともに蛍光検出器を使用して、データを記録した。

【0080】

分離プロトコルは、以下の表２に示されるように、ある範囲のウイルスゲノム負荷にわたって直線性及び精度を示した。

【表2】

【0081】

この方法（以下の表３に示す個々の片国）を使用して様々なパラメータを評価し、ｐＨ８．５におけるＴＭＡＣ、５０ｍＭの初期ＴＭＡＣ濃度、及び１分の初期保持、１分当たり８ｍＭ ＴＭＡＣの勾配傾斜、２ｍＭのＭｇＣｌ_２濃度を含有する移動相で最良の分離が達成されることを確認した。

【表3】

【0082】

２０マイクロリットル（例えば、２５μＬ及び３０μＬ）を超える注入体積が、空及び完全カプシド成分の不良な分離をもたらした、ピーク形状の劣化をもたらした（データは示されていない）。

【0083】

実施例２：試料溶液中の塩化ナトリウム濃度の評価
実施例１に詳述される分離プロトコルを使用するが、試験試料溶液中の塩化ナトリウムの濃度を変化させて、方法の性能を一連の試験試料で評価した。試験試料溶液中に１８０、１４０、１００、９０、８０、７０、６０、３０、１０、及び１．８ｍＭの塩化ナトリウムを含有するように、１．０５Ｅ＋１４ｖｇ／ｍＬのＡＡＶ８－ＧＯＩ試料を希釈した。１．８ｍＭ～１００ｍＭの範囲の塩化ナトリウム濃度を有する試料は、方法の性能に影響を及ぼさなかった（面積／ｖｇは、これらの試料にわたって同様である）が、１００ｍＭ超（１４０ｍＭ及び１８０ｍＭ）の塩化ナトリウム濃度を含む試料は、試料カプシドの分離に悪影響を及ぼした（空カプシド対完全カプシドの分離の改善が、１４０ｍＭ及び１８０ｍＭに対して１００ｍＭのＮａＣｌで観察された）。結果が、以下の表４に示される。

【表4】

【0084】

ＮａＣｌの非存在は、分離に悪影響を及ぼした（データは示されていない）。

【0085】

実施例３：試料溶液中の界面活性剤濃度の評価
界面活性剤の存在が試料溶液（すなわち、ＬＣシステムに注入された試験試料組成物）中で望ましいかどうかを評価するために、ポロキサマー１８８あり（０．００５％ｗ／ｖ）及びなし（０．０００１％ｗ／ｖ）の、ｐＨ７．３における１０ｍＭのリン酸塩、１８０ｍＭの塩化ナトリウムで、１．０５Ｅ＋１４ｖｇ／ｍＬのＡＡＶ８－ＧＯＩを５０倍希釈した。２つの試料は、希釈時に２．１Ｅ＋１２ｖｇ／ｍＬを含有し、３７℃で１日間インキュベートし、ＡＥＸクロマトグラフィーのために８０ｍＭの塩化ナトリウムを含有するように希釈した。

【0086】

ポロキサマー１８８の濃度を０．００５％ｗ／ｖから０．０００１％ｗ／ｖまで減少させることにより、ＡＥＸクロマトグラフィーを介して回収されたＡＡＶ材料の顕著な損失（＞２０％損失）をもたらし、試料溶液中の界面活性剤の所望性が確認された。

【0087】

実施例４：ブランク試料への繰り越し％についてのシステム再生プロセスの評価
実施例１に詳述される分離プロトコルを使用して、システム再生の効果を評価した。参照標準を試料希釈緩衝液中で２．３倍希釈し、ＵＰＬＣシステムに注入し、続いて、ブランク注入を行った。ブランク面積カウントは、参照標準完全カプシドピークの面積カウントの０．３５％であった。このプロセスが、第２の実験で繰り返され、ブランク面積カウントは、参照標準完全カプシドピークの面積数の１．３３％であった。

【0088】

ブランク注入における顕著なゴーストピークの識別後、（ｉ）ＡＥＸカラムを少なくとも１０カラム体積（ＣＶ）の移動相Ａで洗浄することと、（ｉｉ）ＡＥＸカラムを少なくとも１０ＣＶの精製水で洗浄することと、（ｉｉｉ）ＡＥＸカラムの配向を逆転させて、ＡＥＸカラム内の流動を逆転させることと、（ｉｖ）ＡＥＸカラムを、精製水中に１５％～２１％ｖ／ｖのエタノールを含む少なくとも２０ＣＶの洗浄溶液で洗浄することと、（ｖ）ＬＣ機器からＡＥＸカラムを除去することと、（ｖｉ）ＬＣ機器の液体運搬構成要素を洗浄溶液で少なくとも０．５ｍＬ／分の流量において１０分間洗浄することと、を含む、システム再生プロセスを実施した。再生後、洗浄溶液をＬＣ機器及びＡＥＸカラムからパージし、カラムを、ミリＱ水、移動相Ａ、及び移動相Ｂで平衡化した。以前のように、参照標準を試料希釈緩衝液中で２．３倍希釈し、ＵＰＬＣシステムに注入し、続いて、ブランク注入を行った。この第２の参照標準注入後のブランク面積カントは、参照標準完全カプシドピークの面積カウントの０．１１％であった。このプロセスが、第２の実験で繰り返され、ブランク面積カウントは、参照標準完全カプシドピークの面積数の０．０８％であった。このデータから証明されるように、システム再生プロセスは、ブランク注入への繰り越し％著しく低減し、結果の再現性は、低変動性、及びシステム再生プロセスを使用して繰り越しを制御する能力を示す。

【0089】

本発明は、本明細書に記載される具体的な実施形態によって範囲を限定されるものではない。実際には、本明細書に記載されるものに加えて本発明の様々な修正が、前述の記載から当業者に明らかとなるであろう。そのような変更は、添付される特許請求の範囲の内にあることを意図している。

【国際調査報告】