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特表2024-525690複雑な混合物中の改善された物質定量

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-07-12

(54)【発明の名称】複雑な混合物中の改善された物質定量

(51)【国際特許分類】

C07K 1/16 20060101AFI20240705BHJP

C07K 14/00 20060101ALI20240705BHJP

C07K 7/06 20060101ALI20240705BHJP

C07K 7/08 20060101ALI20240705BHJP

G01N 30/04 20060101ALI20240705BHJP

G01N 30/88 20060101ALI20240705BHJP

G01N 30/26 20060101ALI20240705BHJP

G01N 30/86 20060101ALI20240705BHJP

【ＦＩ】

C07K1/16

C07K14/00 ZNA

C07K7/06

C07K7/08

G01N30/04 P

G01N30/88 J

G01N30/26 A

G01N30/86 J

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024501531

(86)(22)【出願日】2022-07-12

(85)【翻訳文提出日】2024-03-04

(86)【国際出願番号】 EP2022069372

(87)【国際公開番号】W WO2023285412

(87)【国際公開日】2023-01-19

(31)【優先権主張番号】21185031.8

(32)【優先日】2021-07-12

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】514084004

【氏名又は名称】アイエスエーファーマシューティカルズビー．ヴイ．

【氏名又は名称原語表記】ＩＳＡＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓＢ．Ｖ．

(74)【代理人】

【識別番号】100107456

【弁理士】

【氏名又は名称】池田成人

(74)【代理人】

【識別番号】100162352

【弁理士】

【氏名又は名称】酒巻順一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100123995

【弁理士】

【氏名又は名称】野田雅一

(72)【発明者】

【氏名】バーム，ブリジットエリサアンナ

(72)【発明者】

【氏名】ビーナッカー，トーマスヨハネスマリア

【テーマコード（参考）】

4H045

【Ｆターム（参考）】

4H045AA10

4H045AA20

4H045BA09

4H045BA13

4H045BA14

4H045BA15

4H045BA16

4H045BA17

4H045BA18

4H045BA19

4H045BA20

4H045BA21

4H045EA50

4H045GA21

(57)【要約】

開示された発明は、分析化学の分野である。特に、複雑な混合物中の分析物の改善された定量方法、及び正確な量の前記分析物を含む組成物に関する。改善された方法は、安定な参照標準を使用する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

既知量の第１の分析物を含む混合物を製造する方法であって、
ｉ）前記第１の分析物を含む混合物を提供するステップと；
ｉｉ）既知量の参照物質を含む参照標準を提供するステップであって、前記参照物質は前記第１の分析物ではなく、前記参照物質は小分子であり、且つ前記第１の分析物のモル吸光係数と前記参照物質のモル吸光係数との間の比は既知であるステップと；
ｉｉｉ）分光光度法を用いて、前記第１の分析物及び前記参照物質の吸光度を決定し、第１の分析物の吸光度及び参照物質の吸光度の値を得るステップと；
ｉｖ）得られた吸光度値及び既知のモル吸光係数比に基づいて、前記混合物中の前記第１の分析物の含有量を決定するステップと
を含む方法。

【請求項2】

前記第１の分析物がペプチドであり、好ましくは、前記第１の分析物が５～１００アミノ酸、好ましくは１０～５０アミノ酸の長さを有するペプチドである、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記第１の分析物が、配列番号１～１２のいずれか１つによって表される配列を含むペプチドである、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

ステップｉ）において提供される前記混合物がＵＶ透明溶液である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

ステップｉ）において提供される前記混合物が、前記第１の分析物及び溶媒を含み、前記溶媒が、好ましくは、水、イソプロピルアルコール、及びアセトニトリルから選択され、任意選択的に、ギ酸又はトリフルオロ酢酸などの酸が存在する、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

前記混合物が、第２の分析物、及び任意選択的に第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、又は第１５の分析物をさらに含み、好ましくは、各分析物のモル吸光係数と前記参照物質のモル吸光係数との比が既知である、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

各分析物の吸光度がステップｉｉｉ）で決定され、各分析物の含有量がステップｉｖ）で決定される、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

前記ステップｉｉｉ）が、ＨＰＬＣ又はＵＰＬＣなどの分析液体クロマトグラフィーを用いて実施され、任意選択的にステップｉｉｉ）が、以下のサブステップ：
ｉｉｉ－ａ）既知量の参照物質を前記混合物に添加するサブステップ；
ｉｉｉ－ｂ）液体クロマトグラフィーを用いて、前記第１の分析物及び前記参照物質を分離するサブステップ；
ｉｉｉ－ｃ）分光光度計を用いて、前記第１の分析物及び前記参照物質の吸光度を決定し、第１の分析物の吸光度及び参照物質の吸光度の値を得るサブステップ
を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

参照物質及び／又は分析物のモル吸光係数が、１８０～８００ｎｍ、好ましくは２００～６００ｎｍ、より好ましくは２２０ｎｍ、２５４ｎｍ、又は２８０ｎｍなどの２００～４００ｎｍの波長で決定されるモル吸光係数である、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

前記参照物質が、０．１・１０^４Ｌ・ｍｏｌ^－１・ｃｍ^－１～３・１０^４Ｌ・ｍｏｌ^－１・ｃｍ^－１、好ましくは０．９・１０^４Ｌ・ｍｏｌ^－１・ｃｍ^－１～１．５・１０^４Ｌ・ｍｏｌ^－１・ｃｍ^－１のモル吸光係数を有する、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

前記参照標準が、米国薬局方（ＵＳＰ）参照標準である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

前記参照標準が、カフェイン、アセトアミノフェン、スルファジメトキシン、ベラパミル、レセルピン、アミトリプチリン、ナフタレン、ブチルパラベン、ウラシル、スルファグアニジン、Ｖａｌ－Ｔｙｒ－Ｖａｌ、ロイシン－エンケファリン、テルフェナジン又はそれらの塩を含み、好ましくは、カフェイン、アセトアミノフェン、スルファジメトキシン、ベラパミル、レセルピン、アミトリプチリン、ナフタレン、ブチルパラベン、ウラシル、又はそれらの塩を含み、より好ましくは、レセルピン又はそれらの塩を含む標準である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

各ペプチドの重量百分率が、全ての異なるペプチドの平均重量百分率の９３％～１０３％である、請求項３に定義される少なくとも４種の異なるペプチドを含む組成物。

【請求項14】

少なくとも第１の組成物及び第２の組成物を含む複数の組成物であって、前記第１の組成物及び前記第２の組成物が、それぞれ請求項１３に記載の組成物であり、前記組成物が、前記組成物が異なる製造バッチに由来するという点で互いに異なり、前記第１の組成物中に含まれる各ペプチドの重量百分率が、前記第２の組成物中に含まれるその同一ペプチドの重量百分率の９３％～１０３％であり、好ましくは、前記組成物が、
ＤＰ－５Ｐ）それぞれのペプチドが配列番号１～５の１種を含む、５種の異なるペプチド；又は
ＤＰ－７Ｐ）それぞれのペプチドが配列番号６～１２の１種を含む、７種の異なるペプチド
のうちの１つを含む、複数の組成物。

【請求項15】

ｉ）請求項３に記載の少なくとも２種の異なるペプチドを含む組成物と、
ｉｉ）参照標準、好ましくは請求項１１又は１２に記載の参照標準と
の組み合わせ。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

開示された発明は、分析化学の分野のものである。特に、複雑な混合物中の分析物の改善された定量のための方法、及び前記分析物の正確な量を含む組成物に関する。改善された方法は、安定な参照標準を使用する。

【背景技術】

【0002】

薬品中の薬物の正確な識別及び定量は、特に製薬業界にとって興味深いものである。特に、複数の薬物を含む複雑な混合物では、要求される規格を薬品が満たすことを保証することは技術的に困難である。このような規格には、各物質の必要含有量が記載され、任意の不純物の最大許容含有量も記載される。規格は規制上の注意事項であり、薬品の有効性及び安全性を保証するために有用である。

【0003】

薬品中の薬物及び不純物の従来の定量は、参照標準を使用するクロマトグラフィー法に依存している。このような標準は、既知の量の同薬物を含む。これらの方法には、精度を低下させる可能性のある欠点がある。例えば、多くの薬物は吸湿性であるため、正確な濃度の前記物質を含む参照標準の調製が複雑である。さらに、溶液中の標準は、信頼できる測定標準に要求される安定性よりも低い安定性を有することがあるため、各測定前に新鮮な参照標準を調製することが典型的に必要とされる。標準調製の継続的な必要性は面倒であり、異なる測定間の再現性を低下させる可能性がある。

【0004】

この問題は、特にペプチドベースの薬物で顕著である。一般に知られているように（例えば、Ｓｉｇｍａ－ＡｌｄｒｉｃｈＣｏ．によって２００５年に出版された「Ｓｔｏｒａｇｅａｎｄｈａｎｄｌｉｎｇｓｙｎｔｈｅｔｉｃｐｅｐｔｉｄｅｓ－ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ」、インターネットでは、ｗｗｗ．ｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍ／ｄｅｅｐｗｅｂ／ａｓｓｅｔｓ／ｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ／ｍａｒｋｅｔｉｎｇ／ｇｌｏｂａｌ／ｄｏｃｕｍｅｎｔｓ／４０３／４６５／ｐｅｐｔｉｄｅ＿ｈａｎｄｌｉｎｇ＿ｇｕｉｄｅ．ｐｄｆを参照のこと）、ペプチド溶液の保存期間は限られている。Ｎ、Ｑ、Ｃ、Ｍ及びＷなど様々な残基を含むペプチドは、溶液中での保存時に不安定である。滅菌バッファー（ｐＨ５～６）を使用し、アリコートを凍結することによって、ペプチドの保存期間は延びるが、これには凍結保存が必要である。凍結解凍サイクルを繰り返すと、ペプチドに損傷を与える可能性がある。ペプチドの分解を防ぐ、或いは最小限に抑える最も効果的な方法は、凍結乾燥した状態で－２０℃、好ましくは－８０℃で保存することである。ペプチドが溶液の場合、凍結解凍サイクルは避けるべきである。凍結乾燥されたペプチド及び溶液を大気中の酸素に曝露することは、標準の信頼性をさらに低下させる大気中の水分の捕獲を避けるために、最小化されるべきである。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

当技術分野において、保存中の安定性を向上させるために、例えば人工タンパク質中への標準ペプチドの連結を伴う、ペプチド参照標準が開発されている（国際公開第２０１６１５０８５３号パンフレット）。しかしながら、この方法では、参照標準が必要とされる製品の各混合物に対して、大きなポリペプチドを個別に展開させる必要がある。

【0006】

したがって、混合物中の薬物の改善された定量方法が必要とされている。特に、ペプチド薬品中のペプチドベースの薬物の改善された定量方法が必要とされている。参照標準の調製が不要な、薬物の定量分析法が必要とされている。試料をより厳密でない条件下で保存及び取り扱うことができ、さらなる展開を必要とすることなく試料を容易に利用することができる、複雑な薬品の分析方法が必要とされている。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明の一態様は、既知量の第１の分析物を含む混合物を製造する方法であって、
ｉ）第１の分析物を含む混合物を提供するステップと；
ｉｉ）既知量の参照物質を含む参照標準を提供するステップであって、ここで参照物質は第１の分析物ではなく、参照物質は好ましくは小分子であり、且つ第１の分析物のモル吸光係数と参照物質のモル吸光係数との間の比は既知であるステップと；
ｉｉｉ）分光光度法を用いて、第１の分析物及び参照物質の吸光度を決定し、第１の分析物の吸光度及び参照物質の吸光度の値を得るステップと；
ｉｖ）得られた吸光度値及び既知のモル吸光係数比に基づいて、混合物中の第１の分析物の含有量を決定するステップと
を含む方法に関する。

【0008】

いくつかの実施形態において、本発明の方法は、第１の分析物がペプチド、好ましくは５～１００アミノ酸、好ましくは１０～５０アミノ酸の長さを有するペプチドであるようなものである。いくつかの実施形態において、第１の分析物は、配列番号１～１２のいずれか１つによって表される配列を含むペプチドである。いくつかの実施形態において、ステップｉ）において提供される混合物は、ＵＶ透明溶液である。いくつかの実施形態において、ステップｉ）において提供される混合物は、第１の分析物及び溶媒を含み、溶媒は、好ましくは、水、イソプロピルアルコール、及びアセトニトリルから選択され、任意選択的に、ギ酸又はトリフルオロ酢酸などの酸が存在する。いくつかの実施形態において、混合物は、第２の分析物、及び任意選択的に第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、又は第１５の分析物をさらに含み、好ましくは、各分析物のモル吸光係数と参照物質のモル吸光係数との比が既知である。いくつかの実施形態において、各分析物の吸光度はステップｉｉｉ）で決定され、各分析物の含有量はステップｉｖ）で決定される。いくつかの実施形態において、ステップｉｉｉ）は、ＨＰＬＣ又はＵＰＬＣなどの分析液体クロマトグラフィーを用いて実施され、任意選択的にステップｉｉｉ）は、以下のサブステップ：
ｉｉｉ－ａ）既知量の参照物質を混合物に添加するサブステップ；
ｉｉｉ－ｂ）液体クロマトグラフィーを用いて、第１の分析物及び参照物質を分離するサブステップ；
ｉｉｉ－ｃ）分光光度計を用いて、第１の分析物及び参照物質の吸光度を決定し、第１の分析物の吸光度及び参照物質の吸光度の値を得るサブステップ
を含む。

【0009】

いくつかの実施形態において、参照物質及び／又は分析物のモル吸光係数は、１８０～８００ｎｍ、好ましくは２００～６００ｎｍ、より好ましくは２２０ｎｍ、２５４ｎｍ、又は２８０ｎｍなどの２００～４００ｎｍの波長で決定されるモル吸光係数である。いくつかの実施形態において、参照物質は、０．１・１０^４Ｌ・ｍｏｌ^－１・ｃｍ^－１～３・１０^４Ｌ・ｍｏｌ^－１・ｃｍ^－１、好ましくは０．９・１０^４Ｌ・ｍｏｌ^－１・ｃｍ^－１～１．５・１０^４Ｌ・ｍｏｌ^－１・ｃｍ^－１のモル吸光係数を有する。いくつかの実施形態において、参照標準は、米国薬局方（ＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓＰｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ）（ＵＳＰ）参照標準である。いくつかの実施形態において、参照標準は、カフェイン、アセトアミノフェン、スルファジメトキシン、ベラパミル、レセルピン、アミトリプチリン、ナフタレン、ブチルパラベン、ウラシル、スルファグアニジン、Ｖａｌ－Ｔｙｒ－Ｖａｌ、ロイシン－エンケファリン、テルフェナジン又はそれらの塩を含み、好ましくは、カフェイン、アセトアミノフェン、スルファジメトキシン、ベラパミル、レセルピン、アミトリプチリン、ナフタレン、ブチルパラベン、ウラシル、又はそれらの塩を含み、より好ましくは、レセルピン又はそれらの塩を含む標準である。

【0010】

本発明の別の態様は、少なくとも４種の異なるペプチドを含む組成物に関し、前記ペプチドは、配列番号１～１２のいずれか１つで表される配列を含み、各ペプチドの重量百分率は、全ての異なるペプチドの平均重量百分率の９３％～１０３％である。

【0011】

本発明の別の態様は、少なくとも第１の組成物及び第２の組成物を含む、複数の組成物に関し、ここで第１の組成物及び第２の組成物は、それぞれ本発明による組成物であり、組成物は、組成物が異なる製造バッチに由来するという点で互いに異なり、ここで第１の組成物中に含まれる各ペプチドの重量百分率は、第２の組成物中に含まれるその同一ペプチドの重量百分率の９３％～１０３％であり、好ましくは、組成物は、
ＤＰ－５Ｐ）それぞれのペプチドが配列番号１～５の１種を含む、５種の異なるペプチド；又は
ＤＰ－７Ｐ）それぞれのペプチドが配列番号６～１２の１種を含む、７種の異なるペプチド
のうちの１つを含む。

【0012】

本発明の別の態様は、
ｉ）少なくとも２種の異なるペプチドを含む組成物であって、前記ペプチドが配列番号１～１２のいずれか１つによって表される配列を含む組成物と、
ｉｉ）参照標準、好ましくは米国薬局方（ＵＳＰ）参照標準、又はカフェイン、アセトアミノフェン、スルファジメトキシン、ベラパミル、レセルピン、アミトリプチリン、ナフタレン、ブチルパラベン、ウラシル、スルファグアニジン、Ｖａｌ－Ｔｙｒ－Ｖａｌ、ロイシン－エンケファリン、テルフェナジン、又はそれらの塩を含み、好ましくは、カフェイン、アセトアミノフェン、スルファジメトキシン、ベラパミル、レセルピン、アミトリプチリン、ナフタレン、ブチルパラベン、ウラシル、又はそれらの塩を含み、より好ましくは、レセルピン又はそれらの塩を含む参照標準と
の組み合わせに関する。

【図面の簡単な説明】

【0013】

【図1】従来の分析法におけるＤＰ－５Ｐ混合物（５種のペプチド、配列番号１～５、それぞれ番号１～５で示される）のＵＰＬＣ－ＵＶクロマトグラム。ＤＰ－５Ｐ混合物はＡで表され、Ｂはブランク溶液を表す。

【図2】従来の分析法におけるＤＰ－７Ｐ混合物（７種のペプチド、配列番号６～１２、それぞれ番号６～１２で示される）のＵＰＬＣ－ＵＶクロマトグラム。ＤＰ－７Ｐ混合物はＡで表され、Ｂはブランク溶液を表す。

【図3】本発明による方法におけるＤＰ－５Ｐ混合物（５種のペプチド、配列番号１～５、それぞれ番号１～５で示される）ＵＰＬＣ－ＵＶクロマトグラム。

【図4】本発明による方法におけるＤＰ－７Ｐ混合物（７種のペプチド、配列番号６～１２、それぞれ番号６～１２で示される）のＵＰＬＣ－ＵＶクロマトグラム。

【発明を実施するための形態】

【0014】

本発明者らは、驚くべきことに、異なる物質を参照標準として使用することにより、複雑な混合物中の分析物を高い精度で定量できることを見出した。両物質の吸光度を決定し、それらの吸光係数の比を知ることにより、吸光度値、既知の吸光係数比、及び使用された参照標準の既知量に基づいて、分析物の量を計算することができる。これにより、複数の長いペプチドを含む薬物などの複雑な混合物の分析に、魅力的な参照標準を使用することができる。小分子の参照標準も使用可能であり、例えば、市販の参照標準も使用可能である。例えば、米国薬局方（ＵＳＰ）参照標準は、その機関によって認証され、その含有量及び安定性の証明書が付属している。より信頼性の高い参照標準を使用することで、より正確な分析物の定量が可能になる。

【0015】

方法
第一の態様において、本発明は、既知量の第１の分析物を含む混合物を製造するための方法であって、
ｉ）第１の分析物を含む混合物を提供するステップと；
ｉｉ）既知量の参照物質を含む参照標準を提供するステップであって、ここで参照物質は第１の分析物ではなく、参照物質は好ましくは小分子であり、且つ第１の分析物のモル吸光係数と参照物質のモル吸光係数との間の比は既知であるステップと；
ｉｉｉ）分光光度法を用いて、第１の分析物及び参照物質の吸光度を決定し、第１の分析物の吸光度及び参照物質の吸光度の値を得るステップと；
ｉｖ）得られた吸光度値及び既知のモル吸光係数比に基づいて、混合物中の第１の分析物の含有量を決定するステップと
を含む方法を提供する。このような方法を、本明細書中、本発明による方法と記載する。

【0016】

ｉ）混合物の提供
ステップｉ）において、第１の分析物を含む混合物が提供される。混合物は均一であっても不均一であってもよいが、後の分光分析のために、均一混合物が好ましい。混合物は有色であっても無色であってもよい。適切な混合物の例としては、溶液、懸濁液、エマルジョン及びコロイドが挙げられる。溶液が好ましく、典型的には、別の物質（溶媒）に溶解した物質（溶質）を含む均一な混合物である。例えば、第２の分析物や第３の分析物など、複数のさらなる溶質が存在してもよい。緩衝塩、或いは追加の溶媒、又は分析試料若しくは薬学的に許容される組成物中に一般的に見出される他の物質が存在してもよい。所与の溶質の濃度は、溶液全体で同一である。溶液は透明であってもよく、本明細書では透明又はＵＶ（紫外線）透明とも記載される。当業者は、ＵＶ－透明性は溶液一般に関し、第１の分析物又は参照標準による吸収は溶液を不透明にすることとは考えられないことを理解する。一般に、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも９０％のＵＶ光が溶液を透過する場合、溶液はＵＶ透明性である。好ましくは、混合物１ｃｍのＵＶ透明性は、水１ｃｍの透明性の少なくとも１０％以内である。したがって、いくつかの実施形態において、ステップｉ）で提供される混合物は溶液であり、好ましくは、それはＵＶ透明性溶液である。当業者は、混合物という用語がさらに混合物の試料を含むことを理解する。「試料」とは、本発明の方法を用いて分離及び分析されるより大きな混合物の代表的な部分を指す。試料は、希釈された試料、すなわち、その成分の濃度が既知の係数（希釈係数又はＤＦ）だけ減少した試料であってもよい。また、混合物は、測定される分析物が乾燥物質として提供される再構成混合物であってもよい。乾燥分析物は、好ましくは凍結乾燥分析物である。乾燥混合物が提供される場合、その混合物は第１の分析物のみからなる場合もある。再構成後、上記のような実際の混合物が得られる。当業者であれば、分析物を再構成する方法を知っている。例えば、ペプチドの場合、再構成は国際公開第２０１７／２２０４６３号パンフレットに記載されている。

【0017】

本明細書で使用される場合、「分析物」という用語には、本明細書で後述する方法によって分析できることを条件として、あらゆる種類の分子も含まれる。適切な分析物の例としては、ポリペプチド、タンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質、核酸、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチド類似体、ポリヌクレオチド類似体、糖、複合炭水化物、複合脂質、ポリマー、薬物及び薬物様分子のような有機小分子、並びにそれらの混合物が挙げられる。好ましい分析物はペプチドである。分析されるペプチドは、合成されたものであることも、より大きなタンパク質からの消化に由来するものであることも可能である。好ましくは、ペプチドは合成物である。「ペプチド」又は「タンパク質」又は「アミノ酸配列」という用語は、文脈から明らかなように、本明細書中、互換的に使用することができる。ペプチド中の残基は、タンパク質原性アミノ酸であり得るが、非タンパク質原性アミノ酸、例えば、Ｄ－アミノ酸及び翻訳後修飾によって形成された修飾アミノ酸、及び非天然アミノ酸であってもよい。

【0018】

好ましいペプチドはタンパク質抗原由来である。本明細書で使用される場合、「タンパク質抗原」という用語は、被験体において免疫応答を誘導することができる抗原領域を含むタンパク質を指す。ペプチドは、タンパク質抗原から選択されたる連続アミノ酸配列を含む場合、タンパク質抗原に「由来」し、ペプチドは、当業者に既知であり、Ａｕｓｕｂｅｌら，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，第３版，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆ＳｏｎｓＩｎｃ（２００３）、並びにＳａｍｂｒｏｏｋ及びＧｒｅｅｎ，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ．ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，第４版，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ（２０１２）などの標準ハンドブックにも記載されている標準分子ツールボックス法を使用して、任意選択的に、１つ若しくは複数のアミノ酸の欠失、挿入若しくは置換によって、又は付加的なアミノ酸若しくは官能基によるＮ末端及び／若しくはＣ末端の伸長若しくは短縮によってさらに修飾され得る。ペプチドの修飾は、改善された安定性、生物学的利用能、又はＴ細胞へのターゲティングを提供し得る。

【0019】

感染細胞、前癌細胞及び／又は癌細胞によって特異的に発現されたタンパク質抗原が特に好ましい。このようなタンパク質抗原はウイルス性抗原であっても非ウイルス性抗原であってもよい。ウイルス抗原の例は、エプスタインバーウイルス誘導リンパ腫（ＥｐｓｔｅｉｎＢａｒｖｉｒｕｓｉｎｄｕｃｅｄｌｙｍｐｈｏｍａ’ｓ）（ＥＢＶ）、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨｕｍａｎＴｌｙｍｐｈｏｔｒｏｐｈｉｃｖｉｒｕｓ）Ｉ、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨｅｐａｔｉｔｉｓＢｖｉｒｕｓ）（ＨＢＶ）、ヒトパピローマウイルス（Ｈｕｍａｎｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ）（ＨＰＶ）、カポジ肉腫ヘルペスウイルス（Ｋａｐｏｓｉｓａｒｃｏｍａｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ）（ＫＳＨＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨｅｐａｔｉｔｉｓＣｖｉｒｕｓ）（ＨＶＣ）、ＫＳＶ、メルケル細胞癌ウイルス（Ｍｅｒｋｅｌｃｅｌｌｃａｒｃｉｎｏｍａｖｉｒｕ）、ＳＡＲＳ関連コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２など）などに由来する抗原である。ウイルスタンパク質抗原の例は、ＥＢＶ由来のタンパク質抗原、例えば、ＬＭＰ１又は後期膜タンパク質（ｌａｔｅｍｅｍｂｒａｎｅｐｒｏｔｅｉｎ）１（例えば、ＵｎｉｐｒｏｔＫＢＰ０３２３０）及びＬＭＰ２又は後期膜タンパク質２（例えば、ＵｎｉｐｒｏｔＫＢＰＩ３２８５）；ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨｕｍａｎＴｌｙｍｐｈｏｔｒｏｐｈｉｃｖｉｒｕｓ）Ｉ由来のタンパク質抗原、例えば、Ｔａｘタンパク質（例えば、ＵｎｉｐｒｏｔＫＢＰ１４０７９；Ｐ０Ｃ２１３；Ｐ０３４０９）；ＨＢＶ由来のタンパク質抗原、例えば、遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ又はＤ、例えば、タンパク質ｈＢｓＡｇ（例えば、ＵｎｉｐｒｏｔＫＢＱ７７３Ｓ４）、Ｘタンパク質（例えば、ＵｎｉｐｒｏｔＫＢＱ８Ｖ１Ｈ６）、ラージエンベロープタンパク質（例えば、ＵｎｉｐｒｏｔＫＢＰ０３１３８）及びキャプシドタンパク質（例えば、ＵｎｉｐｒｏｔＫＢＰ０３１４７）；ＨＣＶ由来のタンパク質抗原、例えば、ゲノムポリタンパク質（例えば、ＵｎｉｐｒｏｔＫＢＰ２６６６３；Ｑ９９ＩＢ８；Ａ３ＥＺＩ９）及びＨＣＶタンパク質（例えば、ＵｎｉｐｒｏｔＫＢＱ９９３９８）；ＨＰＶ由来のタンパク質抗原、例えば、発癌性遺伝子型６、１１、１６、１８、３１、３３、４５、５２、５８、５９、６８、例えば、Ｅ６オンコプロテイン（例えば、ＵｎｉｐｒｏｔＫＢＰ０３１２６；Ｐ０６４６３）及びＥ７オンコプロテイン（例えば、ＵｎｉｐｒｏｔＫＢＰ０３１２９；Ｐ０６７８８）、ＫＳＨＶ由来のタンパク質抗原、例えば、タンパク質ＯＲＦ３６（例えば、ＵｎｉｐｒｏｔＫＢＦ５ＨＧＨ５）、コア遺伝子ＵＬ４２ファミリータンパク質（例えば、ＵｎｉｐｒｏｔＫＢＱ７７ＺＧ５）、ビリオンイーグレスタンパク質（ｖｉｒｉｏｎｅｇｒｅｓｓｐｒｏｔｅｉｎ）ＵＬ３１ホモログ（例えば、ＵｎｉｐｒｏｔＫＢＦ５Ｈ９８２）、トリプレックスカプシドタンパク質（Ｔｒｉｐｌｅｘｃａｐｓｉｄｐｒｏｔｅｉｎ）ＶＰ１９Ｃホモログ（例えば、ＵｎｉｐｒｏｔＫＢＦ５Ｈ８Ｙ５）、ウイルス性マクロファージ炎症性タンパク質（ｖｉｒａｌｍａｃｒｏｐｈａｇｅｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｐｒｏｔｅｉｎ）２（例えば、ＵｎｉｐｒｏｔＫＢＱ９８１５７）、ｍＲＮＡ輸送因子ＩＣＰ２７ホモログ（例えば、ＵｎｉｐｒｏｔＫＢＱ２ＨＲ７５）、ＯＲＦ５２（例えば、ＵｎｉｐｒｏｔＫＢＦ５ＨＢＬ８）、ウイルス性ＩＲＦ４様タンパク質（ＶｉｒａｌＩＲＦ４－ｌｉｋｅｐｒｏｔｅｉｎ）（例えば、ＵｎｉｐｒｏｔＫＢＱ２ＨＲ７３）、Ｂｃｌ－２（例えば、ＵｎｉｐｒｏｔＫＢＱ７６ＲＩ８）、ラージテグメントタンパク質デネジラーゼ（Ｌａｒｇｅｔｅｇｕｍｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎｄｅｎｅｄｄｙｌａｓｅ）（例えば、ＵｎｉｐｒｏｔＫＢＱ２ＨＲ６４）、Ｖ－サイクリン（Ｖ－ｃｙｃｌｉｎ）（例えば、ＵｎｉｐｒｏｔＫＢ０４０９４６）、ＶＩＲＦ－１（例えば、ＵｎｉｐｒｏｔＫＢＦ５ＨＦ６８）及びＥ３ユビキチン－タンパク質リガーゼＭＩＲ１（例えば、ＵｎｉｐｒｏｔＫＢＰ９０４９５）；抗原タンパク質メルケル細胞癌ウイルス（ａｎｔｉｇｅｎｐｒｏｔｅｉｎＭｅｒｋｅｌｃｅｌｌｃａｒｃｉｎｏｍａｖｉｒｕｓ）、例えば、ラージＴタンパク質（例えば、ＵｎｉｐｒｏｔＫＢＥ２ＩＰＴ４；Ｋ４Ｐ１５９）、例えば、スモールＴタンパク質（例えば、ＵｎｉｐｒｏｔＫＢＢ６ＤＶＸ０；Ｂ６ＤＶＸ６）である。

【0020】

非ウイルス性抗原は、腫瘍特異性抗原及び／又は腫瘍関連抗原であり得る。腫瘍特異性抗原は、腫瘍細胞によってのみ発現され、他の細胞では発現されない抗原であり、Ｋｒａｓ^Ｇ２１Ｄ及び変異体Ｐ５３などの変異タンパク質、或いはＤＮＡの変異及びＤＮＡ修復機構の誤作動によってやがて生じる新抗原であることが多い。腫瘍関連抗原は、腫瘍細胞にも正常細胞にも存在する内因性抗原であるが、ＨＥＲ－２／ｎｅｕ受容体のように、その発現又は細胞局在に調節不全がある。非ウイルス性抗原の非限定的な例は、Ｈｅｒ－２／ｎｅｕ（又はＥｒｂＢ－２、ヒト上皮成長因子受容体２（例えば、ＵｎｉｐｒｏｔＫＢＰ０４６２６）；ＷＴ－１又はウィルムス（Ｗｉｌｍｓ）腫瘍タンパク質（例えば、ＵｎｉｐｒｏｔＫＢＰ１９５４４）；ＮＹ－ＥＳＯ－１又は癌／精巣抗原１（例えば、ＵｎｉｐｒｏｔＫＢＰ７８３５８）；ＭＡＧＥ－Ａ３又はメラノーマ関連抗原－Ａ３（例えば、ＵｎｉｐｒｏｔＫＢＰ４３３５７）；ＢＡＧＥ又はＢメラノーマ抗原（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢＱ１３０７２）；ＣＥＡ又は癌胎児性抗原（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢＱ１３９８４）；ＡＦＰ又はａ－フェトプロテイン（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢＰ０２７７１）；ＸＡＧＥ－ＩＢ又はＸ抗原ファミリーメンバー１（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢＱ９ＨＤ６４）；サバイビン（ｓｕｒｖｉｖｉｎ）又はＢＩＲＣ５、バキュロウイルスｌＡＰ反復含有タンパク質５（例えば、ＵｎｉｐｒｏｔＫＢ０１５３９２）；Ｐ５３（例えば、ＵｎｉｐｒｏｔＫＢＰ０４６３７）；ｈ－ＴＥＲＴ又はテロメラーゼ逆転写酵素（例えば、ＵｎｉｐｒｏｔＫＢ０１４７４６）；メソセリン（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢＨ３ＢＲ９０）；ＰＲＡＭＥ又は腫瘍において優先的に発現されるメラノーマ抗原（例えば、ＵｎｉｐｒｏｔＫＢＰ７８３９５）；ＭＵＣ－１又はムチン－１（例えば、ＵｎｉｐｒｏｔＫＢＰ１５９４１）；Ｍａｒｔ－１／Ｍｅｌａｎ－Ａ又はＴ細胞によって認識されるメラノーマ抗原１（例えば、ＵｎｉｐｒｏｔＫＢＱ１６６５５）；ＧＰ－１００又はメラノサイトタンパク質ＰＭＥＬ（例えば、ＵｎｉｐｒｏｔＫＢＰ４０９６７）；チロシナーゼ（例えば、ＵｎｉｐｒｏｔＫＢＵ３Ｍ８Ｎ０）；チロシナーゼ関連タンパク質－１（例えば、ＵｎｉｐｒｏｔＫＢＰＩ７６４３）；チロシナーゼ関連タンパク質－２（例えば、ＵｎｉｐｒｏｔＫＢ０７５７６７）；ＰＡＰ又はＰＡＰＯＬＡ、ポリ（Ａ）ポリメラーゼアルファ（例えば、ＵｎｉｐｒｏｔＫＢＰ５１００３）；ＰＳＡ又は前立腺特異性抗原（例えば、ＵｎｉｐｒｏｔＫＢＰ０７２８８）；ＰＳＭＡ又は前立腺特異性膜抗原、又はグルタミン酸カルボキシペプチダーゼ２（例えば、ＵｎｉｐｒｏｔＫＢＱ０４６０９）である。

【0021】

ペプチドは、そのペプチドが由来するタンパク質抗原に由来しない追加のアミノ酸を含む結果として、及び／又は修飾アミノ酸及び／又は非天然由来アミノ酸及び／又は共有結合官能基、例えば、フッ素化基、フルオロカーボン基、ヒトＴｏｌｌ様受容体リガンド及び／又はアゴニスト、オリゴヌクレオチド複合体、ＰＳＡ、糖鎖又はグリカン、ｐａｍ３ｃｙｓ及び／又はその誘導体、好ましくは国際公開第２０１３０５１９３６Ａ１号パンフレットに記載されているようなもの、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ－ＯＤＮ）、環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）、ＤＣパルスカセット、破傷風毒素由来ペプチド、ヒトＨＭＧＢ１由来ペプチドを、上記のように、ペプチド内又はペプチドに付加された状態で含む結果として、非天然由来配列を含むか、又はそれらからなり得る。ペプチドは、２－アミノイソ酪酸（Ａｂｕ、システインのイソステア）を含んでいてもよい。ペプチドのシステインはＡｂｕによって置換されていてもよい。ペプチドは、好ましくは、単離されたペプチドであり、すなわち、人為的な操作を受け、天然の環境から除去されたペプチドである。

【0022】

ペプチドは、好ましくは抗原性ペプチドである。本明細書で使用される場合、「抗原性ペプチド」という用語は、免疫原性であり、例えば、ワクチンなどの医薬組成物中などで、対象、例えば動物又はヒト対象に投与された場合に、複合抗原指向性ＣＤ４＋Ｔヘルパー及びＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞応答を誘導することができるペプチドを指す。免疫原性の評価は、放射免疫沈殿、ＥＬＩＳＡ、電気化学発光などの技術分野で標準的なｉｎｖｉｖｏ、ｉｎｖｉｔｒｏ、又はｅｘｖｉｖｏ技術を使用して行うことができる。

【0023】

いくつかの実施形態において、第１の分析物は、好ましくは、５～１００個のアミノ酸の長さを有するペプチドである。好ましくは、ペプチドは、５～１００個のアミノ酸、５～９５個のアミノ酸、５～９０個のアミノ酸、５～８５個のアミノ酸、５～８０個のアミノ酸、５～７５個のアミノ酸、５～７０個のアミノ酸、５～６５個のアミノ酸、５～６０個のアミノ酸、５～５５個のアミノ酸、１０～５０個のアミノ酸、１０～４０個のアミノ酸、１５～４０個のアミノ酸、１７～３９個のアミノ酸、１９～４３個のアミノ酸、２２～４０個のアミノ酸、２２～４５個のアミノ酸、２８～４０個のアミノ酸、又は３０～３９個のアミノ酸、より好ましくは１０～５０個のアミノ酸の長さを有する。好ましくは、ペプチドは、最大で１００、９９、９８、９７、９６、９５、９４、９３、９２、９１、９０、８９、８８、８７、８６、８５、８４、８３、８２、８１、８０、７９、７８、７７、７６、７５、７４、７３、７２、７１、７０、６９、６８、６７、６６、６５、６４、６３、６２、６１、６０、５９、５８、５７、５６、５５、５４、５３、５２、５１、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、又は３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、又は１０個のアミノ酸の長さを有する。好ましくは、ペプチドは、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、又は５０個のアミノ酸の長さを有する。

【0024】

ペプチドは、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、例えば初期ＨＰＶ抗原タンパク質Ｅ２、Ｅ６、又はＥ７由来であってもよい。好ましくは、ＨＰＶタンパク質はＥ６又はＥ７から選択され、血清型６、１１、１６、１８、３１、３３、４５、５２、５８、５９、６８などのハイリスクＨＰＶ血清型、好ましくは血清型１６又は１８由来である。ＨＰＶ由来のペプチドの例は、国際公開第２０１７／２２０４６３号パンフレット及びＰＣＴ／ＥＰ２０２１／０５２７３８号明細書に記載されている。

【0025】

ペプチドはまた、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）由来、例えば表面、ポリメラーゼ、コア又はＸタンパク質抗原タンパク質由来であってもよい。好ましくは、ＨＢＶタンパク質は、遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ又はＤなどの一般的なＨＢＶ遺伝子型から高度に保存された領域から選択される。ＨＢＶ由来のペプチドの例は、国際公開第２０１５／１８７００９号パンフレット及び国際公開第２０２１／１１０９１９号パンフレットに記載されている。

【0026】

さらに、ペプチドは、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）由来、例えば構造タンパク質由来であってもよい。好ましくは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶタンパク質は、スパイクタンパク質、エンベロープタンパク質、膜タンパク質又はヌクレオカプシドタンパク質内の、複数のＴ細胞エピトープを保有する免疫原性領域から選択される。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ由来のペプチドの例は、ＰＣＴ／ＥＰ２０２１／０６０６８８号明細書に記載されている。

【0027】

或いは、腫瘍で優先的に発現されるＰＲＡＭＥ又はメラノーマ抗原のような癌精巣抗原に由来するペプチドでもよい。好ましくは、ペプチドは、ＰＲＡＭＥタンパク質の免疫原性領域を含むように設計される。ＰＲＡＭＥ由来ペプチドの例は、国際公開第２００８／１１８０１７号パンフレット及び国際公開第２０１７／２２０４６３号パンフレットに記載されている。

【0028】

いくつかの実施形態において、第１の分析物は、配列番号１～１２のいずれか１つ、或いは配列番号１～１２のいずれか１つと少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％を有する配列によって表される、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性又は類似性を有する配列によって表される配列を含むペプチドである。より好ましくは、分析物は配列番号１～１２のいずれか１つと少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有する。

【0029】

本明細書で使用される場合、「溶媒」という用語は、本明細書に記載される分析物を適切な濃度で溶解することが可能であるいずれかの溶媒又は溶媒の混合物を含む。当業者は、特定の溶媒の選択が分析物に依存することを理解する。ペプチドの場合、典型的に、ペプチド中のイオン電荷の数及び種類が水溶液中でのその溶解性を決定する。一般に、荷電残基の数が多いペプチドほど水溶液中でより溶解性となる。この一般的な規則に対する多くの例外の中には、非常に疎水性であるペプチド配列、及び凝集する傾向のあるペプチド配列がある。配列の疎水性が凝集の主な原因であるが、ペプチドは広範な水素結合ネットワークによって凝集、又は「ゲル化」することもある。様々な溶媒カテゴリーの特性は、ＹｉｚｈａｋＭａｒｃｕｓ，ＴｈｅＰｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆＳｏｌｖｅｎｔｓ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆ＳｏｎｓＩｎｃ．（１９９８）及びＰｅｔｅｒＡｔｋｉｎｓ，ＰｈｙｓｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，第１１版，ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ（２０１８）などの標準的なハンドブックに記載されている。適切な溶媒の例としては、非極性溶媒（例えば、ペンテン、ヘキサン、ベンゼン、トルエンなどの炭化水素；１，４－ジオキサン、ジエチルエーテル、テトラヒドロフランなどのエーテル；クロロホルムのようなクロロカーボン）、極性非プロトン性溶媒（例えば、ジクロロメタン、酢酸エチル、アセトン、ジメチルホルムアミド、アセトニトリル（ＭｅＣＮ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ニトロメタン、プロピレンカーボネート）、極性プロトン性溶媒（例えば、水、アンモニア、ギ酸、ｎ－ブタノール、イソプロピルアルコール、ｎ－プロパノール、エタノール、メタノール、酢酸、トリフルオロ酢酸）が含まれる。溶媒は、好ましくは、ＨＰＬＣなどの液体クロマトグラフィーの間に使用するのに適している。好ましくは、溶媒は、水、イソプロピルアルコール、及びアセトニトリルから選択される。本発明による混合物は、任意選択的に、異なる溶媒の組み合わせを含むことが可能である。任意選択的に、混合物は、酸又は有機酸、例えば、酢酸、ギ酸、又はトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、好ましくはギ酸又はＴＦＡをさらに含む。

【0030】

いくつかの実施形態において、ステップｉ）において提供される混合物は、第１の分析物、好ましくはペプチド、及び溶媒を含み、溶媒は、好ましくは、水、イソプロピルアルコール、及びアセトニトリルから選択され、任意選択的に、ギ酸又はトリフルオロ酢酸などの酸が存在する。

【0031】

第１の分析物を含む混合物は、さらに１種若しくは複数の分析物を含んでもよい。好ましくは、追加の１種若しくは複数の分析物は、本明細書で前述したようなペプチドである。いくつかの実施形態において、混合物は、第２の分析物、及び任意選択的に、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、又は第１５の分析物をさらに含む。いくつかの実施形態において、混合物は２種の分析物、好ましくはペプチドを含む。いくつかの実施形態において、混合物は、３種の分析物、好ましくはペプチドを含む。いくつかの実施形態において、混合物は、４種の分析物、好ましくはペプチドを含む。いくつかの実施形態において、混合物は、５種の分析物、好ましくはペプチドを含む。いくつかの実施形態において、混合物は、６種の分析物、好ましくはペプチドを含む。いくつかの実施形態において、混合物は、７種の分析物、好ましくはペプチドを含む。いくつかの実施形態において、混合物は、８種の分析物、好ましくはペプチドを含む。いくつかの実施形態において、混合物は、９種の分析物、好ましくはペプチドを含む。いくつかの実施形態において、混合物は、１０種の分析物、好ましくはペプチドを含む。いくつかの実施形態において、混合物は１１種の分析物、好ましくはペプチドを含む。いくつかの実施形態において、混合物は、１２種の分析物、好ましくはペプチドを含む。いくつかの実施形態において、混合物は、１３種の分析物、好ましくはペプチドを含む。いくつかの実施形態において、混合物は、１４種の分析物、好ましくはペプチドを含む。いくつかの実施形態において、混合物は、１５種の分析物、好ましくはペプチドを含む。

【0032】

好ましい混合物は、上記のようなペプチドを含み、混合物は、好ましくは、配列番号１～５（ＤＰ－５Ｐと称される）、又は配列番号６～１２（ＤＰ－７Ｐと称される）を含む。

【0033】

ｉｉ）参照標準の提供
ステップｉｉ）において、既知量の参照物質を含む参照標準が提供され、参照物質は第１の分析物ではなく、第１の分析物のモル吸光係数と参照物質のモル吸光係数との間の比は既知である。参照物質は好ましくは小分子である。参照標準は、別々に提供されてもよいし、ステップｉ）で提供された第１の分析物を含む混合物と組み合わされてもよい。

【0034】

本明細書で使用される場合、「参照標準」という用語は、本明細書中で「薬剤参照標準」とも記載されるが、慣用的な意味を有する。これは一般に、例えば医薬用途のための物質の同一性、品質、量、及び／又は純度を試験するために適切な、高度に特性化された物質を指す。参照標準は、混合物を調製するための標準的な実験技術を用いて、既知量の参照物質から調製されてもよく、或いは市販の供給業者から購入されてもよい。いずれの場合も、参照標準中の参照物質の量は既知であり、本明細書で後述されるように、ステップｉｖ）で混合物中の分析物の含有量を後で決定することができる。参照標準は、本明細書で前述したような物質の混合物であってもよい。参照標準は、本明細書で前述したように、ＵＶ透明性溶液であってもよい。当業者は、この用語が、参照標準の試料及び希釈試料をも包含することを理解する。好ましくは、参照標準は、溶媒又は溶媒の混合物中の既知量の単一参照物質の溶液であり、ここで参照物質は既知濃度で存在する。或いは、参照標準が固体である場合、既知量の溶媒中に溶解させることができ、溶媒は好ましくは分析物混合物に関して記載された通りである。

【0035】

小分子は、好ましくは最大１０００ダルトン、より好ましくは最大９００ダルトン、さらに好ましくは最大５００ダルトンの分子量を有する。小分子は好ましくは有機小分子である。

【0036】

好ましくは、参照標準は米国薬局方（ＵＳＰ）及び／又は欧州薬局方（ＥＤＱＭ）参照標準であり、より好ましくは米国薬局方（ＵＳＰ）参照標準であり；前記標準は好都合には市販品として入手可能である。適切な参照標準の例は、参照物質として、カフェイン（ＵＳＰカタログ番号１０８５００３）、アセトアミノフェン（ＵＳＰカタログ番号１００３００９）、スルファジメトキシン（ＵＳＰカタログ番号１６２６００１）、ベラパミル（ＵＳＰカタログ番号１７１１２０２）、レセルピン（ＵＳＰカタログ番号１６０１０００）、アミトリプチリン（ＵＳＰカタログ番号１０２９００２）、ナフタレン（ＵＳＰカタログ番号１４５７０８３）、ブチルパラベン（ＵＳＰカタログ番号１０８４０００）、ウラシル（ＵＳＰカタログ番号１７０５７５３）及びそれらの塩を含むか、それらから本質的になるか、又はそれらからなり、好ましくはそれらを含む標準である。好ましい参照標準は、レセルピン又はその塩の溶液を含むか、本質的になるか、又はそれらからなり、好ましくはそれらからなる標準である。

【0037】

いくつかの実施形態において、参照標準は、カフェイン、アセトアミノフェン、スルファジメトキシン、ベラパミル、レセルピン、アミトリプチリン、ナフタレン、ブチルパラベン、ウラシル、スルファグアニジン、Ｖａｌ－Ｔｙｒ－Ｖａｌ、ロイシン－エンケファリン、テルフェナジン又はそれらの塩を含む標準であり、好ましくはカフェイン、アセトアミノフェン、スルファジメトキシン、ベラパミル、レセルピン、アミトリプチリン、ナフタレン、ブチルパラベン、ウラシル又はそれらの塩を含む標準であり、より好ましくはレセルピン又はそれらの塩を含む標準である。このような参照標準の例としては、ＱＤａＱＣ参照物質（ＷａｔｅｒｓＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ，カタログ番号１８６００７３４５）及び逆相ＱＣ参照物質（ＷａｔｅｒＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ，カタログ番号１８６００７３４５）などの市販品として入手可能な混合物が挙げられる。

【0038】

本明細書で使用される場合、「モル吸光係数」又は「モル減衰係数」又は「モル吸光率」という用語は、慣用的な意味を有する。これは、所与の波長における物質の光減衰の強さを意味し、前記特性は物質の固有の特性である。モル吸光係数は、平方メートル／モル（ｍ^２／ｍｏｌ）で表すこともできるし、リットル／モル／センチメートル（Ｌ・ｍｏｌ^－１・ｃｍ^－１）で表すこともできる。所与の物質のモル吸光係数は、以下の式Ｉで表されるベール－ランバート（Ｂｅｅｒ－Ｌａｍｂｅｒｔ）の法則を用いて決定され得る：
Α_λ＝ε・ｃ・Ｌ（式Ｉ）
（式中、
Ａ_λは、特定の光の波長における物質の（光の）吸光度を表し、前記吸光度は十進法（１０を底とする）又はネイピア対数（ｅを底とする）であり、
εは、ｍ^２／ｍｏｌ又はＬｍｏｌ^－１・ｃｍ^－１で表される物質のモル吸光係数を表し、
ｃは、ｍｏｌ／Ｌで表される物質のモル濃度を表し、且つ
Ｌは、ｃｍでの光路長を表す）。

【0039】

濃度に関して、この式を解くと、ペプチド又はタンパク質溶液の濃度ｃ＝Ａ／εＬ（Ｌ＝１ｃｍの場合、＝Ａ／ε）を決定するために必要な値を知ることができる。分析物、例えば、ペプチド又はタンパク質溶液の測定された吸光度を、計算又は既知のモル吸光係数で割ると、分析物溶液のモル濃度が得られる。

【0040】

試料に入射する放射力（Ｐ_０）に対する、試料を透過する放射力（Ｐ）の比は透過率（Ｔ）と呼ばれ、Ｔ＝Ｐ／Ｐ_０の式に従う。吸光度（Ａ）は、Ａ＝－ｌｏｇＴ＝ｌｏｇ（１／Ｔ）の式に従い、透過率の逆数の対数（底１０）として定義される。分光光度計では、単色平行光が試料の平面に対して直角に試料に入射する。このような条件下では、試料の透過率及び吸光度は、モル濃度（ｃ）、センチメートル単位の光路長（Ｌ）、及び特定の波長（λ）における溶解物質のモル吸光率（ε）に依存する。関連式は、Ｔ_λ＝１０^εｃＬ及びＡ_λ＝εｃＬである（式Ｉ）。

【0041】

ベール－ランバート（Ｂｅｅｒ－Ｌａｍｂｅｒｔ）の法則は、所与の溶質中に溶解され、且つ所与の波長で測定された所与の物質に関して、モル吸光率が一定である（吸光度が濃度に比例する）ということを意味する。この理由のため、モル吸光度は、モル吸収係数又はモル吸光係数と呼ばれることもある。透過率及び吸光度には単位がないため、モル吸光度の単位は濃度及び光路の単位と相殺されなければならない。したがって、モル吸光度は、Ｍ^－１ｃｍ^－１（Ｌ・ｍｏｌ^－１・ｃｍ^－１）の単位を有する。標準的な実験室分光光度計は、１ｃｍ幅の試料キュベットを使用するように設計されているため、一般的に光路長は１に等しいと仮定され、ほとんどの計算では、この式に従って、この用語は完全に削除される：Ｌ＝１ｃｍの場合、Ａ_λ＝εｃＬ＝εｃ。分光光度計がＨＰＬＣなどのクロマトグラフィー装置にインラインで設置されている場合、装置は一般に、その測定単位で独自の経路長に関して計算する。

【0042】

当業者であれば、ペプチドなどの複雑な分子には単一の正しい吸光係数値は存在しないことを認識する。緩衝液の種類、イオン強度及びｐＨの違いは、吸光度の値に影響を与える可能性がある。したがって、最適な吸光係数値は経験的に決定されるものである。

【0043】

参照物質及び／又は分析物のモル吸光係数は、前記物質及び／又は分析物に適切な波長で決定されてよい。いくつかの実施形態において、参照物質及び／又は分析物のモル吸光係数は、１８０～８００ｎｍ、好ましくは２００～６００ｎｍ、より好ましくは２００ｎｍ、２５４ｎｍ、又は２８０ｎｍなどの２００～４００ｎｍの波長で決定されたモル吸光係数である。いくつかの実施形態において、参照物質及び／又は分析物のモル吸光係数は、少なくとも１８０ｎｍ、少なくとも１９０ｎｍ、少なくとも２００ｎｍ、少なくとも２１０ｎｍ、少なくとも２２０ｎｍ、少なくとも２３０ｎｍ、少なくとも２４０ｎｍ、少なくとも２５０ｎｍ、少なくとも２６０ｎｍ、少なくとも２７０ｎｍ、少なくとも２８０ｎｍ、少なくとも２９０ｎｍ、少なくとも３００ｎｍ、少なくとも３１０ｎｍ、少なくとも３２０ｎｍ、少なくとも３３０ｎｍ、少なくとも３４０ｎｍ、少なくとも３５０ｎｍ、少なくとも３６０ｎｍ、少なくとも３７０ｎｍ、少なくとも３８０ｎｍ、少なくとも３９０ｎｍ、少なくとも４００ｎｍ、少なくとも４１０ｎｍ、少なくとも４２０ｎｍ、少なくとも４３０ｎｍ、少なくとも４４０ｎｍ、少なくとも４５０ｎｍ、少なくとも４６０ｎｍ、少なくとも４７０ｎｍ、少なくとも４８０ｎｍ、少なくとも４９０ｎｍ、少なくとも５００ｎｍ、少なくとも５１０ｎｍ、少なくとも５２０ｎｍ、少なくとも５３０ｎｍ、少なくとも５４０ｎｍ、少なくとも５５０ｎｍ、少なくとも５６０ｎｍ、少なくとも５７０ｎｍ、少なくとも５８０ｎｍ、少なくとも５９０ｎｍ、少なくとも６００ｎｍ、少なくとも６１０ｎｍ、少なくとも６２０ｎｍ、少なくとも６３０ｎｍ、少なくとも６４０ｎｍ、少なくとも６５０ｎｍ、少なくとも６６０ｎｍ、少なくとも６７０ｎｍ、少なくとも６８０ｎｍ、少なくとも６９０ｎｍ、少なくとも７００ｎｍ、少なくとも７１０ｎｍ、少なくとも７２０ｎｍ、少なくとも７３０ｎｍ、少なくとも７４０ｎｍ、少なくとも７５０ｎｍ、少なくとも７６０ｎｍ、少なくとも７７０ｎｍ、少なくとも７８０ｎｍ、少なくとも７９０ｎｍ、又は少なくとも８００ｎｍの波長で決定されたモル吸光係数である。好ましい波長は約２２０ｎｍである。別の好ましい波長は、２５４ｎｍ又は約２５４ｎｍである。別の好ましい波長は、２８０ｎｍ又は約２８０ｎｍである。別の好ましい波長は、５１０ｎｍ又は約５１０ｎｍである。

【0044】

第１の分析物のモル吸光係数及び参照標準中の参照物質のモル吸光係数は既知である。前記値は、所与の分析物及び／又は参照物質について、当該技術分野で入手可能な標準ハンドブック、例えば、ＣＲＣｈａｎｄｂｏｏｋｏｆｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄｐｈｙｓｉｃｓから得られ得る。或いは、所与の波長におけるモル吸光係数は、本発明の方法の一部として、又はその前に、異なるモル濃度における前記分析物及び／又は物質の吸光度を測定することにより、式Ｉを用いて決定され得る。第１の分析物及び参照物質のモル吸光係数は既知であるので、それらの比が決定され得る。このような比は無次元数である。

【0045】

或いは、第１の分析物のモル吸光係数と参照物質中の参照物質のモル吸光係数との比は、分析物と参照物質との間の「相対応答係数」（ＲＲＦ）によって表されてもよい。前記係数は、前記モル吸光係数の比に直接依存し、以下：

【数1】

（式中、
ＲＲＦは、相対応答係数を表し；
ＲＦ_分析物は、分析物の応答係数を表し、ＨＰＬＣなどのクロマトグラフィー装置にインラインで設置された分光光度計を使用して分析物に関して決定された曲線下面積であり；
ＲＦ_参照物質は、参照物質の応答係数を表し、ＨＰＬＣなどのクロマトグラフィー装置にインラインに設置された分光光度計を使用して参照物質に関して決定された曲線下の面積である）のように算出することができる無次元数である。

【0046】

分析物又は参照物質の応答係数（ＲＦ）は、分析物又は参照物質が既知の濃度値（例えば既知のｍｇ／ｍＬ値）で含まれる混合物の（特定の光波長、例えば２２０ｎｍにおける）吸光度を測定することによって決定され得る。次いで、前記分析物又は参照物質の測定された吸光度を、測定された混合物中の既知の濃度で割ることにより、応答係数を算出することができる。前記値は、単一の測定の結果であってもよく、又は精度をさらに高めるために複数の測定の平均値であってもよい。分析物又は参照物質の応答係数は、単一の分析物又は参照物質のみを含む混合物、又は追加の分析物若しくは参照物質が存在する混合物において決定されてよい。相対応答係数の決定例は、本明細書の実験項にさらに記載されている。相対応答係数の決定は、分析物及び参照物質の組ごとに１回実施され得、その後、決定された値はさらなる計算に使用されてもよい。

【0047】

いくつかの実施形態において、参照物質は、０．１・１０^４～３・１０^４Ｌ・ｍｏｌ^－１・ｃｍ^－１、好ましくは０．５・１０^４～２．０・１０^４Ｌ・ｍｏｌ^－１・ｃｍ^－１、より好ましくは０．９・１０^４～１．５・１０^４Ｌ・ｍｏｌ^－１・ｃｍ^－１のモル吸光係数を有する。いくつかの実施形態において、参照物質は、少なくとも０．１・１０^４、少なくとも０．２・１０^４、少なくとも０．３・１０^４、少なくとも０．４・１０^４、少なくとも０．５・１０^４、少なくとも０．６・１０^４、少なくとも０．７・１０^４、少なくとも０．８・１０^４、少なくとも０．９・１０^４、少なくとも０．９５・１０^４、少なくとも１・１０^４、少なくとも１．１・１０^４、少なくとも１．２・１０^４、少なくとも１．３・１０^４、少なくとも１．４・１０^４、少なくとも１．５・１０^４、少なくとも１．６・１０^４、少なくとも１．７・１０^４、少なくとも１．８・１０^４、少なくとも１．９・１０^４、少なくとも２．０・１０^４、少なくとも２．１・１０^４、少なくとも２．２・１０^４、少なくとも２．３・１０^４、少なくとも２．４・１０^４、少なくとも２．５・１０^４、少なくとも２．６・１０^４、少なくとも２．７・１０^４、少なくとも２．８・１０^４、少なくとも２．９・１０^４、又は少なくとも３．０・１０^４Ｌ・ｍｏｌ^－１・ｃｍ^－１のモル吸光係数を有する。好ましいモル吸光係数値は、少なくとも０．９７５・１０^４Ｌ・ｍｏｌ^－１・ｃｍ^－１、又は約０．９７５・１０^４Ｌ・ｍｏｌ^－１・ｃｍ^－１である。

【0048】

第１の分析物を含む混合物が、第２の分析物、及び任意選択的に、本明細書で前述された第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、又は第１５の分析物をさらに含む実施形態において、各分析物のモル吸光係数と参照物質のモル吸光係数との間の比が既知であることが好ましい。前記比は、各分析物のモル吸光係数及び参照物質のモル吸光係数を知ることによって決定され得、このモル吸光係数は、本明細書において前述されたように得ることができる。比はまた、本明細書において前述されたように、各分析物と参照物質との間の相対応答係数によって表してもよい。好ましくは、前記分析物は、本明細書において前述されたようなペプチドである。

【0049】

分析物を含む組成物及び参照標準である組成物の両方が、同一溶媒又は緩衝液成分を有する類似のものであることが好ましい。換言すれば、これらの組成物は、好ましくは、溶解した標準物質及び溶解した分析物においてのみ異なる。ここで、溶解した分析物質は、もちろん、不純物がある場合には、可能な不純物を指すこともある。

【0050】

ステップｉｉｉ）吸光度の決定
ステップｉｉｉ）において、第１の分析物の吸光度及び参照物質の吸光度を、分光光度法、好ましくは紫外－可視分光法を用いて決定し、第１の分析物の吸光度及び参照物質の吸光度の値を得る。第１の分析物を含む混合物が、第２の分析物、及び任意選択的に、本明細書で前述された第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、又は第１５の分析物、或いはさらに追加の分析物をさらに含む実施形態において、それらの吸光度も同様に決定され得る。混合物中の第１の分析物及び参照標準中に含まれる参照物質の吸光度の決定は、任意選択的に、等容量の前記混合物及び参照標準に対して実行され得る。しかしながら、本方法は、等容量に限定されるものではなく、前記比率が既知である限り、いずれの容量の比率も考慮され得る。

【0051】

本明細書で使用される「紫外－可視分光法」又は「紫外－可視分光光度法」という用語は、慣用的な意味を有する。これは、電磁スペクトルの紫外及び完全な隣接可視領域における吸収分光法を指す。また、吸収比の代わりに反射比を用いて本発明を実施することができる反射率分光法を指すこともあるが、吸収が好ましい。吸光度の決定は、本明細書で前述されたように、分析物及び参照物質のモル吸光係数が既知である波長において実施することが好ましい。吸光度の決定は、分光光度計の使用など、日常的な実験技術を使用して実施されてよい。或いは、吸光度の決定は、インライン分光光度計を備えた装置において、分析液体クロマトグラフィーを用いて実施してもよい。分析液体クロマトグラフィーを用いた混合物中の分析物及び参照標準中に含まれる標準物質の吸光度の決定は、別々に実施されてもよく、又は既知量の標準物質が混合物に添加されてもよい。後者の場合、第１の分析物（及び前述された１種若しくは複数のさらなる分析物）及び参照物質を分離し、それらの吸光度値を個別に決定してもよい。

【0052】

液体クロマトグラフィーは周知であり、液体移動相と固体固定相との間で化合物を分配するクロマトグラフィー法が含まれる。液体クロマトグラフィー法は、化合物の分析、定量及び精製に使用される。液体移動相は、手順全体を通して一定の組成を有することができ（アイソクラティック法）、又は移動相の組成を溶離中に変化させることができる（例えば、グラジエント溶離法のような移動相組成の漸進的変化）。「移動相」という用語は、対象化合物を固相（例えば、固相抽出（ＳＰＥ）カートリッジ又はＨＰＬＣカラム中の固相）と接触させ、対象化合物を固相から溶離するために使用される溶媒系（液体など）を表す。「分離」という用語は、液体によって運ばれる混合物が、固定液相又は固相の周囲又は上を流れる際の溶質の差分分布の結果として成分に分離されるプロセスを表す。適切な液体クロマトグラフィー法の例としては、ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ、逆相高速ＨＰＬＣ（ＵＰＬＣ）、超高速液体クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、ＨＩＬＩＣ、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）などが挙げられる。液体クロマトグラフィーのプロトコル及び方法は当技術分野で周知であり、Ｍｅｙｅｒ，ＰｒａｃｔｉｃａｌＨｉｇｈ－ＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅＬｉｑｕｉｄＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，第５版，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆ＳｏｎｓＩｎｃ．（２０１０）、Ｋａｓｔｎｅｒ，ＰｒｏｔｅｉｎＬｉｑｕｉｄＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，６１巻，第１版，ＥｌｓｅｖｉｅｒＳｃｉｅｎｃｅ（１９９９）、及びＬｉｑｕｉｄＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｆａｎａｌｉ，Ｈａｄｄａｄら編，ＥｌｓｅｖｉｅｒＳｃｉｅｎｃｅ（２０１３）などの標準的なハンドブックにも記載されている。適切なクロマトグラフィー法のさらなる例は、本明細書の実験項に提供される。好ましい液体クロマトグラフィー法はＨＰＬＣ及びＵＰＬＣである。クロマトグラフィーは、単一混合物中の複数の分析物の簡便な分光光度分析を可能にするため、本発明による方法にとって非常に魅力的である。

【0053】

したがって、いくつかの実施形態において、ステップｉｉｉ）は、ＨＰＬＣ又はＵＰＬＣなどの分析液体クロマトグラフィーを用いて実施され、任意選択的に以下のサブステップ：
ｉｉｉ－ａ）既知量の参照物質を混合物に添加するサブステップ；
ｉｉｉ－ｂ）液体クロマトグラフィーを用いて、第１の分析物及び参照物質を分離するサブステップ；
ｉｉｉ－ｃ）分光光度計、好ましくは紫外－可視分光法を用いて、第１の分析物及び参照物質の吸光度を決定し、第１の分析物の吸光度及び参照物質の吸光度の値を得るサブステップ
を含む。

【0054】

いくつかの実施形態において、ステップｉｉｉ）は、ＨＰＬＣ又はＵＰＬＣなどの分析液体クロマトグラフィーを用いて実施され、任意選択的に以下のサブステップ：
ｉｉｉ－ａ）既知量の参照物質を混合物に添加するサブステップ；
ｉｉｉ－ｂ）液体クロマトグラフィーを用いて、第１の分析物、第２の分析物、任意選択的に第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、又は第１５の分析物などの１種若しくは複数の追加の分析物、及び参照物質を分離するサブステップ；
ｉｉｉ－ｃ）分光光度法、好ましくは紫外－可視分光法を用いて、第１の分析物及び参照物質の吸光度を決定し、第１の分析物の吸光度及び参照物質の吸光度を得るサブステップ
を含む。

【0055】

好ましくは、吸光度は全ての場合において同一条件を使用して決定する。

【0056】

ステップｉｖ）分析物の含有量の決定
ステップｉｉｉ）の結果、分析物及び参照物質の吸光度が得られる。ステップｉｖ）において、これらの得られた吸光度値及び既知のモル吸光係数の比に基づいて、混合物中の第１の分析物の含有量を決定する。モル吸光係数の既知の比は、本明細書で前述されたように、第１の分析物と参照物質との相対応答係数（ＲＲＦ）によって表してもよい。本明細書で前述されたように、参照物質の量が既知であるため、混合物中の第１の分析物の含有量を計算することが可能になる。したがって、分析物と参照物質との間の関係において単一の変数（分析物の量）のみが未知のままであり、この方程式は既知の情報に基づいて（分析物の量について）解くことができる。

【0057】

第１の分析物を含む混合物が、第２の分析物、及び任意選択的に、本明細書で前述された第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、又は第１５の分析物をさらに含む実施形態において、それらの含有量も同様に決定され得る。当業者は、上記のステップｉ）～ｉｖ）のいずれかを、分析物及び／又は参照標準の各々に対して複数回繰り返してもよいことを理解する。次いで、得られた値を平均し、標準偏差の計算など、当該技術分野における標準的な方法に従って統計学的分析を行うことができる。

【0058】

本明細書で使用される場合、「不純物」という用語は、慣用的な意味を有する。これは、上述の混合物及び参照標準などの混合物のいずれかの成分であって、前記混合物に含まれると定義された物質ではないものを指す。不純物の存在は、純度値を用いて定量化することができ、この純度値は、所望の物質の実際の量・１００を混合物中に含まれる物質の総量で割った無次元比として表すことができる。完全に純粋な材料の純度は単一（１）の純度を有する。混合物中の物質の純度値は、例えば、前記混合物がＵＳＰ参照物質及び標準などの供給業者から購入された場合、既知であり得る。或いは、前記混合物中に含まれる不純物のモル吸光係数が既知であるか、又は上記のように決定される場合、純度値は、本発明の方法を用いて決定され得る。この場合、不純物は混合物中に含まれる分析物として処理される。或いは、前記混合物中に含まれると定義された物質の含有量が定量された後に、前記混合物中の全体的な物質含有量から前記含有量を差し引くことにより、本発明の方法を用いて純度値が決定されてもよい。

【0059】

本発明の方法のステップｉｖ）における混合物中の分析物の含有量の例示的な決定は、実施形態において、以下の式ＩＩＩ：

【数2】

（式中、
分析物の含有量はｍｇで表され、
Ａ_分析物は、分析物の吸光度を表し、
Ｑ_ＲＳは、ｍｇで表される参照物質の量を表し、
Ｐ_ＲＳは、（１以下の比率で表される）参照標準中の参照物質の純度を表し、
ＤＦは希釈係数を表し、
Ａ_ＲＳは、参照物質の吸光度を表し、
ＲＲＦ（相対応答係数）は、本明細書で前述されたように、分析物と参照物質との間のモル吸光係数の比を表す）を用いて実施され得る。

【0060】

或いは、分析物の含有量は、以下の誘導式によって決定することができる。

【数3】

【0061】

当業者は、式ＩＩＩが、混合物及び／又は参照標準の調製手順に応じて、並びに等容量の混合物及び参照標準、又はそれらの既知の比が使用されたかどうかに応じて、さらに適合され得ることを理解する。例えば、分析物を含む混合物が凍結乾燥物を含むバイアルを用いて調製される場合、分析物の含有量はバイアルあたりの分析物の含有量として決定されてもよく、このような適応は十分に当業者の技量の範囲内である。このような適応の例示は、実施例にさらに記載されている。

【0062】

したがって、いくつかの実施形態において、混合物は、本明細書で前述されたように、第２の分析物、及び任意選択的に第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、又は第１５の分析物をさらに含み、好ましくは、各分析物のモル吸光係数と参照物質のモル吸光係数との間の比は既知であり、各分析物の吸光度はステップｉｉｉ）で決定され、各分析物の含有量はステップｉｖ）で決定される。

【0063】

本発明の方法は、分析物、好ましくはペプチドの、それらの製造後に適用され得る下流プロセス中の損失を決定する際に有用である。これは、それらの製造後に本明細書に記載されるように混合物中の分析物の含有量を決定し、次いで混合物に下流プロセスが適用された後に分析物の含有量を決定することによって達成することができる。その後、分析物の含有量の損失を、測定間の分析物の含有量の差として計算することができる。下流プロセス法は当該技術分野で知られており、Ｗｅｓｓｅｌｉｎｇｈ，Ｊ．Ａ及びＫｒｉｊｇｓｍａｎ，Ｊ．，第１版，ＤｏｗｎｓｔｒｅａｍＰｒｏｃｅｓｓｉｎｇｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＤｅｌｆｔＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，（２０１３）、並びにＰｒｏｔｅｉｎＤｏｗｎｓｔｒｅａｍＰｒｏｃｅｓｓｉｎｇ：Ｄｅｓｉｇｎ，ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆＨｉｇｈａｎｄＬｏｗ－ＲｅｓｏｌｕｔｉｏｎＭｅｔｈｏｄｓ，ＬａｂｒｏｕＮ．（編），ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ（２０１４）などの標準的なハンドブックで議論されている。例としては、ｐＨの変更、溶媒抽出、透析、濾過、限外濾過、濃縮、凍結乾燥などが挙げられる。したがって、いくつかの実施形態において、本発明による方法は、分析物濃度を決定するために実行され、その後、濾過などの下流プロセスが実行され、その後、本発明による方法が追加的に実行される。

【0064】

本発明による方法は、複雑な混合物中の分析物及び／又は不純物、特にペプチド薬品中のペプチドベースの薬物及び／又は不純物の定量に関する従来の方法と比較して、以下の利点の少なくとも１つ若しくは複数と関連する：より容易且つ再現性のある参照標準の調製、分析物の定量における増加した精度及び／又は正確さ、異なる製造バッチ、又は同一製造バッチの異なる時点からの混合物中の分析物の定量における減少した測定変動。

【0065】

組成物
本発明は、本明細書で前述されたような分析物を含む組成物を提供し、ここで分析物は、これまで確立が不可能であった正確なマージンの範囲内まで定量される。組成物は、本明細書で前述されたような混合物であってもよい。いくつかの実施形態において、組成物は医薬組成物であり、任意選択的に１種若しくは複数の薬学的に許容される成分をさらに含む。いくつかの実施形態において、組成物はワクチンである。１種又は複数の薬学的に許容される成分は、例えば、薬学的に許容される担体、充填剤、安定剤、保存剤、可溶化剤、ビヒクル、及び希釈剤であり得る。当業者は、特定の成分は、構成される分析物及び組成物の適用に依存することを理解する。適切な薬学的に許容される賦形剤は当該技術分野で知られており、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：ＴｈｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅｏｆＰｈａｒｍａｃｙ，第２３版，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ（２０２０）に見られ得る。

【0066】

いくつかの実施形態において、組成物は、１種若しくは複数の免疫応答刺激化合物又はアジュバントをさらに含む。適切な化合物の例としては、Ｔｏｌｌ様受容体を介して、及び／又はＲＩＧ－１（レチノイン酸誘導性遺伝子－１）タンパク質を介して、及び／又はエンドセリン受容体を介して作用することが知られているアジュバントが挙げられる。自然免疫系を活性化できるアジュバントは、ＴＬＲ１－１０を含むＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）を介して特に良好に活性化可能である。ＴＬＲ受容体を活性化できる化合物、及びその改変体及び誘導体は、当技術分野でよく知られている。ＴＬＲ１は、細菌性リポタンパク質及びそのアセチル化体によって活性化され得、ＴＬＲ２はさらに、グラム陽性細菌性糖脂質、ＬＰＳ、ＬＰＡ、ＬＴＡ、フィンブリア、外膜タンパク質、細菌由来又は宿主由来の熱ショックタンパク質、及びマイコバクテリア性リポアラビノマンナンによって活性化され得る。ＴＬＲ３は、特にウイルス由来のｄｓＲＮＡ、又は化合物ポリ（ＬＣ）によって活性化され得る。ＴＬＲ４は、グラム陰性ＬＰＳ、ＬＴＡ、宿主由来又は細菌由来の熱ショックタンパク質、ウイルスのコートタンパク質又はエンベロープタンパク質、タキソール又はその誘導体、ヒアルロナン含有オリゴ糖及びフィブロネクチンによって活性化され得る。ＴＬＲ５は細菌の鞭毛又はフラジェリンによって活性化され得る。ＴＬＲ６は、マイコバクテリアリポタンパク質、Ｂ群連鎖球菌熱不安定性可溶性因子（ＧＢＳ－Ｆ）又はスタフィロコッカスモジュリンによって活性化され得る。ＴＬＲ７は、イミキモド、レジキモド、及び誘導体のイミキモド又はレジキモド（３Ｍ－０５２など）などのイミダゾキノリンによって活性化され得る。ＴＬＲ９は、メチル化されていないＣｐＧＤＮＡ又はクロマチン－ＩｇＧ複合体によって活性化され得る。特に、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７及びＴＬＲ９は、ウイルス感染に対する自然免疫応答を媒介する上で重要な役割を果たしており、これらの受容体を活性化できる化合物が特に好ましい。特に好ましいアジュバントは、限定されないが、ｄｓＲＮＡ、ポリ（Ｉ：Ｃ）、ポリＩ：ＣＬＣ、ＴＬＲ３及びＴＬＲ９受容体を誘発する非メチル化ＣｐＧＤＮＡ、ＩＣ３１、ＴＬＲ９アゴニスト、ＩＭＳＡＶＡＣ、ＴＬＲ４アゴニスト、ＭｏｎｔａｎｉｄｅＩＳＡ－５１、ＭｏｎｔａｎｉｄｅＩＳＡ７２０（Ｓｅｐｐｉｃ，Ｆｒａｎｃｅによって製造されたアジュバント）を含む合成的に製造された化合物である。ＲＩＧ－１タンパク質は、ＴＬＲ３と同様にｄｓＲＮＡによって活性化されることが知られている（Ｋａｔｏら，（２００５）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１：１９－２８）。特に好ましいＴＬＲリガンドは、ｐａｍ３ｃｙｓ及び／又はその誘導体、好ましくはｐａｍ３ｃｙｓリポペプチド又はその変異体若しくは誘導体、好ましくは国際公開第２０１３０５１９３６Ａ１号パンフレットに記載されているようなもの、より好ましくはＵ－Ｐａｍｌ２又はＵ－Ｐａｍｌ４又はＡＭＰＬＩＶＡＮＴ（登録商標）である。さらに好ましいアジュバントは、環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）及びポリ－ＩＣＬＣである。好ましい実施形態において、アジュバントは、非天然由来のアジュバント、例えば、国際公開第２０１３０５１９３６Ａ１号パンフレットに記載されているようなｐａｍ３ｃｙｓリポペプチド誘導体、ポリ－ＩＣＬＣ、イミダゾキノリン、例えば、イミキモド、レジキモド又はそれらの誘導体、非天然由来配列を有するＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ－ＯＤＮ）、及びペプチドベースのアジュバント、例えば、非天然由来アミノ酸を含むムラミルジペプチド（ＭＤＰ）又は破傷風トキソイドペプチドである。さらに好ましいのは、１０１８ＩＳＳ、アルミニウム塩、Ａｍｐｌｉｖａｘ、ＡＳ１５、ＢＣＧ、ＣＰ－８７０，８９３、ＣｐＧ７９０９、ＣｙａＡ、ｄＳＬＩＭ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＣ３０、ＩＣ３１、ＩｍｕＦａｃｔＥＶ１Ｐ３２１、ＩＳパッチ、ＩＳＳ、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ、Ｊｕｖｌｍｍｕｎｅ、ＬｉｐｏＶａｃ、ＭＦ５９、モノホスホリルリピドＡ、ＭｏｎｔａｎｉｄｅＩＭＳ１３１２、ＭｏｎｔａｎｉｄｅＩＳＡ２０６、ＭｏｎｔａｎｉｄｅＩＳＡ５０Ｖ、ＯＫ－４３２、ＯＭ－１７４、ＯＭ－１９７－ＭＰ－ＥＣ、ＯＮＴＡＫ、ＰｅｐＴｅｌ．ＲＴＭ、ベクターシステム、ＰＬＧＡ微粒子、ＳＲＬ１７２、Ｖｉｒｏｓｏｍｅ及び他のウイルス様粒子、Ｐａｍ３Ｃｙｓ－ＧＤＰＫＨＰＫＳＦ、ＹＦ－１７Ｄ、ＶＥＧＦトラップ、Ｒ８４８、ベータ－グルカン、Ａｑｕｉｌａ’ｓＱＳ２１スティミュロン（ｓｔｉｍｕｌｏｎ）、バジメザン（ｖａｄｉｍｅｚａｎ）、ＡｓＡ４０４（ＤＭＸＡＡ）、ＳＴＩＮＧ（ＩＦＮ遺伝子の刺激剤）アゴニスト（例えば、ｃ－ジ－ＧＭＰＶａｃｃｉＧｒａｄｅ（商標））、ＰＣＩ、ＮＫＴ（ナチュラルキラーＴ細胞）アゴニスト（例えば、アルファガラクトシルセラミド又はアルファ－ＧａｌＣｅｒ、ＲＮＡｄｊｕｖａｎｔ（登録商標）（Ｃｕｒｅｖａｃ）、レチノイン酸誘導性タンパク質Ｉリガンド（例えば、３ｐＲＮＡ又は５’－三リン酸ＲＮＡ）からなる群から選択されるアジュバントである。

【0067】

好ましい実施形態において、組成物はペプチドを含み、そして好ましくは、本明細書において前述されたような、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、又は第１５のペプチドを含む。組成物が、本明細書の他の箇所に記載されるように、好ましくは５又は７種のペプチドを含むように、少なくとも５種のペプチドを含むことが非常に好ましい。

【0068】

複数の異なるペプチドが組成物中に含まれる実施形態において、前記組成物中の重量百分率で表される各ペプチドの含有量が、全ての異なるペプチドの平均重量百分率に可能な限り近いことが有利である。換言すれば、各ペプチドの重量が同量であることである。前記組成物は、複雑な混合物中のペプチドなどの分析物の改善された定量を可能にする本発明の方法を用いて有利に特定され得る。特に、ワクチンなどの医薬組成物において、前記特性は、その有効性を増加させ、潜在的な副作用を減少させ得る。経時的に前記組成物中の各ペプチドの重量含有量を決定することは、それらの安定性を評価するためにさらに特に重要である。また、コンプライアンス要件を満たすことにおいても役立つ。

【0069】

したがって、いくつかの実施形態において、組成物は、本明細書で先に定義されたように、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、少なくとも９種、少なくとも１０種、少なくとも１１種、少なくとも１２種、少なくとも１３種、少なくとも１４種、少なくとも１５種、好ましくは少なくとも４種の異なるペプチドを含み、各ペプチドの重量百分率は、全ての異なるペプチドの平均重量百分率の９３％～１０３％である。そのような重量百分率は、好ましくは、平均の少なくとも９３％を超え、好ましくは９４％を超え、より好ましくは９５％を超え、より好ましくは９６％を超え、より好ましくは９７％を超え、より好ましくは９８％を超え、最も好ましくは９９％を超える。そのような重量百分率は、好ましくは最大でも平均の１０３％未満、より好ましくは１０２％未満、最も好ましくは１０１％未満である。

【0070】

異なるペプチドの重量百分率は、組成物の製造の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１８、２４、３０、３６、４２、４８、５４又は６０ヶ月後、好ましくは４８ヶ月後、５４ヶ月後、又は６０ヶ月後に決定され得る。

【0071】

いくつかの実施形態において、組成物は、本明細書で先に定義されたように、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、少なくとも９種、少なくとも１０種、少なくとも１１種、少なくとも１２種、少なくとも１３種、少なくとも１４種、少なくとも１５種、好ましくは少なくとも４種の異なるペプチドを含み、各ペプチドの重量百分率は、全ての異なるペプチドの平均重量百分率の９５％～１０３％であり、前記重量百分率は、組成物の製造から４８カ月後に決定される。

【0072】

いくつかの実施形態において、組成物は、本明細書で先に定義されたように、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、少なくとも９種、少なくとも１０種、少なくとも１１種、少なくとも１２種、少なくとも１３種、少なくとも１４種、少なくとも１５種、好ましくは少なくとも４種の異なるペプチドを含み、各ペプチドの重量百分率は、全ての異なるペプチドの平均重量百分率の９５％～１０１％であり、前記重量百分率は、組成物の製造から５４ヶ月後に決定される。

【0073】

いくつかの実施形態において、組成物は、本明細書で先に定義されたように、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、少なくとも９種、少なくとも１０種、少なくとも１１種、少なくとも１２種、少なくとも１３種、少なくとも１４種、少なくとも１５種、好ましくは少なくとも４種の異なるペプチドを含み、各ペプチドの重量百分率は、全ての異なるペプチドの平均重量百分率の９３％～１００％であり、前記重量百分率は、組成物の製造から６０ヶ月後に決定される。

【0074】

本明細書に記載の好ましい組成物において、組成物中のペプチドなどの分析物の総重量は、最大１０ｍｇ又は最大５ｍｇ、好ましくは最大４ｍｇ、より好ましくは最大３ｍｇ、最も好ましくは最大約２ｍｇ、例えば２ｍｇである。このような少量のペプチドを正確に秤量し、分析することに関連する技術的課題のために、本明細書に記載されている方法は、各ペプチドが等量などの、あらかじめ決められた量で存在し、ペプチドの量が実際にこれらの所望の量であることを定量し、検証することができる、例えば５種又は７種のペプチドの混合物の提供を可能にする。

【0075】

異なる製造バッチ間の組成物中のペプチドの含有量のばらつきを最小化することは、特にワクチンなどの医薬組成物にとってさらに望ましい。したがって、いくつかの実施形態において、少なくとも第１の組成物及び第２の組成物を含む複数の組成物であって、第１の組成物及び第２の組成物はそれぞれ、本明細書で先に記載されたような組成物であり、組成物は、組成物が異なる製造バッチに由来するという点で互いに異なり、第１の組成物に含まれる各ペプチドの重量百分率は、第２の組成物に含まれるその同一ペプチドの重量百分率の９３～１０３％であり、好ましくは、組成物は、
ＤＰ－５Ｐ）各ペプチドが配列番号１～５の１つを含む、５種の異なるペプチド；又は
ＤＰ－７Ｐ）各ペプチドが配列番号６～１２の１つを含む、７種の異なるペプチド
の１つから構成される。

【0076】

配列番号１～１２のいずれか１つに対する各参照について、好ましくは、ペプチドは、最大４０個のアミノ酸の長さを有する。より好ましくは、ペプチドは、引用された配列番号によって表される配列からなる。好ましくは、第１の組成物中に含まれる各ペプチドの重量百分率は、第２の組成物中に含まれるその同一ペプチドの重量百分率の９５～１０３％であり、より好ましくは９５～１０１％である。いくつかの実施形態において、それは９３～１００％である。仕様は好ましくは安定であり、これは、記載された値が少なくとも１２カ月後、好ましくは２４カ月後、３６カ月後、より好ましくは４８カ月後、さらに好ましくは５４カ月後、最も好ましくは６０カ月後に測定可能であることを意味する。

【0077】

さらなる態様において、本発明は、本明細書で先に記載された組成物と、本明細書で先に記載された参照標準との組み合わせを提供する。いくつかの実施形態において、組み合わせは、
ｉ）少なくとも２種の異なるペプチドを含む組成物であって、各ペプチドが配列番号１～１２の１つを含む組成物、及び
ｉｉ）参照標準、好ましくは、米国薬局方（ＵＳＰ）参照標準である標準、又はカフェイン、アセトアミノフェン、スルファジメトキシン、ベラパミル、レセルピン、アミトリプチリン、ナフタレン、ブチルパラベン、ウラシル、スルファグアニジン、Ｖａｌ－Ｔｙｒ－Ｖａｌ、ロイシン－エンケファリン、テルフェナジン又はそれらの塩を含む標準、より好ましくは、カフェイン、アセトアミノフェン、スルファジメトキシン、ベラパミル、レセルピン、アミトリプチリン、ナフタレン、ブチルパラベン、ウラシル又はそれらの塩を含む標準、最も好ましくは、レセルピン又はそれらの塩を含む標準
の組み合わせである。

【0078】

一般的な定義
「配列同一性」及び「配列類似性」は、２つの配列の長さに応じて、グローバルアラインメントアルゴリズム又はローカルアラインメントアルゴリズムを用いた２つのペプチド配列のアラインメントによって決定することができる。類似の長さの配列は、好ましくは、配列を全長にわたって最適にアラインメントするグローバルアラインメントアルゴリズム（例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈ）を用いてアラインメントされ、一方、実質的に異なる長さの配列は、好ましくは、ローカルアラインメントアルゴリズム（例えば、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎ）を用いてアラインメントされる。配列は、（例えば、プログラムＥＭＢＯＳＳｎｅｅｄｌｅ又はＥＭＢＯＳＳｗａｔｅｒによりデフォルトのパラメーターを用いて最適にアラインメントされた時に）配列同一性の少なくとも一定の最小パーセンテージを共有する場合、「実質的に同一」又は「本質的に類似」と呼ばれることがある（以下に記載）。配列番号への言及は、好ましくは、その全長にわたるその配列番号への言及である。

【0079】

グローバルアラインメントは、２つの配列が類似の長さを有する場合、配列同一性を決定するために適切に使用される。配列が実質的に異なる全長を有する場合、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを用いるものなどのローカルアラインメントが好ましい。ＥＭＢＯＳＳｎｅｅｄｌｅは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈグローバルアラインメントアルゴリズムを使用して、２つの配列をその全長（完全長）にわたってアラインメントし、一致数を最大化し、ギャップ数を最小化する。ＥＭＢＯＳＳｗａｔｅｒはＳｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎローカルアラインメントアルゴリズムを使用する。一般的に、ＥＭＢＯＳＳｎｅｅｄｌｅ及びＥＭＢＯＳＳｗａｔｅｒのデフォルトパラメーターが使用され、ギャップオープンペナルティ＝１０（塩基配列）／１０（タンパク質）及びギャップエクステンションペナルティ＝０．５（塩基配列）／０．５（タンパク質）である。ヌクレオチド配列に関して使用されるデフォルトスコアリングマトリックスはＤＮＡｆｕｌｌであり、タンパク質に関しては、デフォルトスコアリングマトリックスはＢｌｏｓｕｍ６２（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ＆Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，１９９２，ＰＮＡＳ８９，９１５－９１９）である。

【0080】

或いは、類似性又は同一性のパーセンテージは、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴなどのアルゴリズムを使用して、公的データベースに対して検索することによって決定され得る。したがって、本発明のいくつかの実施形態のタンパク質配列はさらに、例えば、他のファミリーメンバー又は関連配列を識別するために、公的データベースに対して検索を行うための「クエリー配列（ｑｕｅｒｙｓｅｑｕｅｎｃｅ）」として使用され得る。このような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら，（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－１０のＢＬＡＳＴｎ及びＢＬＡＳＴｘプログラム（バージョン２．０）を使用して実施することができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、本発明のタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得るために、ＢＬＡＳＴｘプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて行うことができる。比較目的のためのギャップドアラインメントを得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９７）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２５（１７）：３３８９－３４０２に記載されたように、ギャップドＢＬＡＳＴを利用することができる。ＢＬＡＳＴ及びギャップドＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラムのデフォルトパラメーター（例えば、ＢＬＡＳＴｘ及びＢＬＡＳＴｎ）を使用することができる。

【0081】

本明細書及びその特許請求の範囲において、動詞「含む（ｔｏｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及びその活用形は、単語の後に続く項目が含まれるが、特に言及されていない項目が除外されないことを意味する非限定的な意味で使用される。加えて、動詞「からなる（ｔｏｃｏｎｓｉｓｔ）」は、本明細書に記載される組成物が、具体的に特定されたもの以外の、本発明の固有の特性を変更しない追加の成分を含んでもよいことを意味する「本質的にからなる（ｔｏｃｏｎｓｉｓｔｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙｏｆ）」によって置き換えられてもよい。さらに、動詞「からなる（ｔｏｃｏｎｓｉｓｔ）」は、本明細書に記載される方法又は使用が、具体的に特定されたもの以外の、本発明の特有の特性を変更しない追加のステップを含んでもよいことを意味する「本質的にからなる（ｔｏｃｏｎｓｉｓｔｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙｏｆ）」によって置き換えられてもよい。さらに、動詞「からなる（ｔｏｃｏｎｓｉｓｔ）」は、本明細書に記載されるヌクレオチド又はアミノ酸配列が、具体的に特定されたもの以外の、本発明の特有の特性を変更しない追加のヌクレオチド又はアミノ酸を含んでもよいことを意味する「本質的にからなる（ｔｏｃｏｎｓｉｓｔｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙｏｆ）」によって置き換えられてもよい。

【0082】

不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」による要素への言及は、文脈上明らかに要素が１つ及び１つのみであることが要求されない限り、その要素が２つ以上存在する可能性を排除するものではない。したがって、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」は、通常「少なくとも１つ」を意味する。

【0083】

本明細書で使用される場合、「少なくとも」特定の値は、その特定の値以上を意味する。例えば、「少なくとも２」は、「２以上」、すなわち、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、．．．などと同じであると理解される。さらに、本明細書及び特許請求の範囲における第１、第２、第３などの用語は、類似の要素を区別するために使用されるものであり、必ずしも連続的又は時系列的な順序を記載するために使用されるものではない。そのように使用される用語は、適切な状況下では交換可能であり、本明細書に記載される本発明の実施形態は、本明細書に記載又は図示される以外の順序で動作可能であることを理解されたい。数値と関連して使用される場合の「約」又は「およそ」という語（例えば、約１０）は、好ましくは、その値が（１０の）所与の値より１０％、好ましくは５％、より好ましくは１％多いか若しくは少なくてもよいことを意味する。

【0084】

様々な実施形態が本明細書に記載されている。本明細書で特定される各実施形態は、特に断りのない限り、一緒に組み合わせてもよい。本明細書で引用する全ての特許出願、特許、及び印刷刊行物は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。当業者であれば、本発明の実施において使用することが可能な、本明細書に記載されたものと類似又は同等の多くの方法及び材料を認識するであろう。実際に、本発明は、記載された方法及び材料に決して限定されない。

【0085】

【表1】

【実施例】

【0086】

実施例１．ペプチドを含む混合物中のペプチド含有量の決定
未知量のペプチド（配列番号１）を含む混合物が提供され、０．１ｍｇのレセルピンを含む参照標準溶液がさらに提供される。モル吸光係数の比は、式ＩＩを用いて、ペプチドとレセルピンとの間の相対応答係数を計算することにより決定される。相対応答係数を計算するために、既知の濃度のペプチド溶液の２２０ｎｍにおける吸光度を測定し、次いで、測定された吸光度を前記溶液中のペプチドの既知の濃度で割ることによって、最初にペプチドの応答係数が決定される。２２０ｎｍにおけるレセルピンの応答係数も同様に決定する。未知量の前記ペプチドを含む混合物中のペプチド及び参照標準溶液中のレセルピンの吸光度は、ＵＰＬＣ－ＵＶにより２２０ｎｍで決定される。次いで、混合物中のペプチドの未知量を、式ＩＩＩを用いて決定する。

【0087】

実施例２．従来の分析法を用いた、異なるペプチドを含む混合物中のペプチド含有量の決定
一般
ＤＰ－５Ｐ（５種のペプチド、配列番号１～５）及びＤＰ－７Ｐ（７種のペプチド、配列番号６～１２）混合物の個々の関連物質を含む純度及びアッセイを、アセトニトリル及び水の移動相勾配及びλ＝２２０ｎｍでのＵＶ検出を用いる逆相高速ＨＰＬＣ（ＵＰＬＣ）により決定した。

【0088】

クロマトグラフィー条件
カラム：ＲＰＣ１８、例えば、ＷａｔｅｒｓＡｃｑｕｉｔｙ、ＢＥＨ１３０ＰＳＴ（１．７μｍ、１５０×２．１ｍｍ）
試料マトリックス：溶離液Ａ：溶離液Ｂ＝８５：１５（ｖ／ｖ）。
試料濃度：１００μｇ／ｍＬ純ペプチド（各薬物混合物の）、二重（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）
注入量：５μＬ
カラム温度：６５℃
試料温度：５℃
検出：ＵＶ（λ＝２２０ｎｍ）
流速：０．３ｍＬ／分
溶離液Ａ：水中０．０５％ｖ／ｖＴＦＡ及び１％ｖ／ｖアセトニトリル（ＡＣＮ）
溶離液Ｂ：ＡＣＮ中０．０５％ｖ／ｖＴＦＡ

【0089】

【表2】

【0090】

報告
ＤＰ－５Ｐ（配列番号１～５）及びＤＰ－７Ｐ（配列番号６～１２）混合物の両方のペプチド及び関連物質の相対保持時間（ＲＲＴ）は、中央で溶離するペプチドの保持時間を参照して算出した（図１、図２）。この保持時間は、この薬物のメインピークがクロマトグラムのほぼ中央で検出されることから、基準として使用された。関連物質は面積正規化により決定した。個々の関連物質は０．１０％ａ／ａ以上であると報告された。全関連物質は、無視限界０．０５００％ａ／ａ以上の全関連物質の合計として計算された。純度は、全関連物質と１００％との差として算出した。

【0091】

各ペプチドのアッセイは、５種のペプチド（ＤＰ－５Ｐ）又は７種のペプチド（ＤＰ－７Ｐ）を含む参照標準溶液に対して計算され、パーセント及びｍｇ純ペプチド／バイアルで表された。この参照法では、参照物質が分析物そのものであるため、参照物質及び分析物の吸収比は１である。

【0092】

実施例３．本発明による分析法を用いた、異なるペプチドを含む混合物中のペプチドの含有量の測定
一般
実施例１と同様のＵＰＬＣ法を使用して、混合物ＤＰ－５Ｐ（配列番号１～５）及びＤＰ－７Ｐ（配列番号６～１２）中の分析物（すなわち、個々のペプチド）の定量、並びに混合物ＤＰ－５Ｐ及びＤＰ－７Ｐ（凍結乾燥品）の含有量均一性の決定を行った。この方法は、外部参照標準の使用に基づく。この外部参照標準に対する相対応答係数（モル吸光係数の比、ＲＲＦ）は、各ペプチドについて確立されている。ＤＰ－５Ｐ及びＤＰ－７Ｐの純度、個々の関連物質、及びアッセイは、ＡＣＮ／ＩＰＡ及び水の移動相勾配、並びにλ＝２２０ｎｍにおけるＵＶ検出を用いた逆相高速ＨＰＬＣ（ＵＰＬＣ）によって決定された。

【0093】

材料
以下の凍結乾燥ペプチド組成物を使用した：バイアルあたり各ペプチド０．４０ｍｇ（バイアルあたりのタンパク質の全量は２．００ｍｇ）の等しい正味重量で混和された配列番号１～５によって本明細書に表されるペプチドを含むＤＰ－５Ｐ、及びバイアルあたり０．５６ｍｇのＴＦＡ；及びバイアルあたり各ペプチド０．４０ｍｇ（バイアルあたりのタンパク質の全量は２．８０ｍｇ）の等しい正味重量で混和された配列番号６～１２によって本明細書に表されるペプチドを含むＤＰ－７Ｐ、及びバイアルあたり０．９６ｍｇのＴＦＡ。以下の化学物質を使用した：アセトニトリル（Ｂｉｏｓｏｌｖｅ、０１２０４１０２）；ＵＰＬＣ水（Ｔｙｐｅ１、ｍｉｌｌｉ－Ｑ）；トリフルオロ酢酸（ＣｈｅｍＬａｂ、ＣＬｏｏ．２０９４．０００１）；２－プロパノール（ＵＰＬＣ／ＭＳグレード、Ｂｉｏｓｏｌｖｅ、１６２６４１０２）；レセルピン（ＵＳＰ、ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ、１６０１０００）。以下の装置を使用した：ＱｕａｎＲｅｃｏｖｅｒｙバイアル（Ｗａｔｅｒｓ、１８６００９１８６）；グラジエントシステム、オートサンプラー及びＵＶ検出器を備えたＵＰＬＣポンプ（ＷａｔｅｒｓＡｃｑｕｉｔｙ又は同等品）、及びミキサー容量４２５μＬ。

【0094】

溶媒及び溶液の調製
移動相Ａ：水中０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ
移動相Ｂ：７０／３０ＡＣＮ／ＩＰＡ中の０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ
希釈液Ａ：水中０．０５％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ
希釈液Ｂ：ＡＣＮ中０．０５％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ
ブランク溶液：８０／２０（ｖ／ｖ）希釈液Ａ／希釈液Ｂ
パージ溶媒８０／２０（ｖ／ｖ）水／ＡＣＮ
ニードル洗浄：８０／２０（ｖ／ｖ）水／ＡＣＮ中０．０５％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ
ストック参照溶液（１００μｇ／ｍＬレセルピン）

【0095】

５．００ｍｇのレセルピン参照物質を正確に量り、容量５０ｍＬのフラスコに加えた。４０．０ｍＬのブランク溶液を全容ピペットで加えた。溶液をマグネチックスターラーで完全に溶解するまで１０分間撹拌した。溶液をブランク溶液で容量まで希釈し、よく混合した。

【0096】

作用参照溶液（１０μｇ／ｍＬレセルピン）
２．０ｍＬのストック参照溶液１を全容ピペットで容量２０ｍＬのフラスコに移す。ブランク溶液で容量まで希釈し、均質化する。

【0097】

ＬＯＱ溶液（２０ｎｇ／ｍＬレセルピン）
２．０ｍＬの作用参照溶液１を全容ピペットで容量１００ｍＬのフラスコに移す。ブランク溶液で容量まで希釈し、均質化する。上記溶液５ｍＬを全容ピペットで容量５０ｍＬのフラスコに移す。ブランク溶液で希釈し、均質化する。

【0098】

試料溶液
初期密封容器中の凍結乾燥品ＤＰ－５Ｐ及びＤＰ－７Ｐのために試料調製を設定した。医薬品を開封して溶解する前に、バイアルを室温で少なくとも１時間平衡化した。バイアルの内容物を０．８ｍＬの希釈液Ｂで溶解し、マグネチックスターラーを用いて２０分間撹拌した。３．２ｍＬの希釈液Ａを添加した。マグネチックスターラーを用いて、この溶液を２０分間よく撹拌した。バイアルの内容物を溶解した後、試料バイアルを実験台の上に３０分間静置した。溶液を短時間撹拌し、ＨＰＬＣバイアルに移した。

【0099】

クロマトグラフィー条件
カラム：ＡｄｖａｎｃｅＢｉｏＰｅｐｔｉｄｅＭａｐ（２．７μｍ、２５０×２．１ｍｍ）
試料マトリックス；ＡＣＮ：水（１：４ｖ／ｖ）中０．０５％ｖ／ｖＴＦＡ
試料濃度１００μｇ／ｍＬ純ペプチド（各薬物の）、二重
注入量：１０μＬ
カラム温度：４０℃
試料温度：５℃
検出：ＵＶ（λ＝２２０ｎｍ）
流速：０．２ｍＬ／分
ランタイム：６５分
パージ溶媒：８０／２０（ｖ／ｖ）水／ＡＣＮ
ニードル洗浄：８０／２０水／ＡＣＮ（ｖ／ｖ）中の０．０５％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ（２０秒）
シール洗浄：９０／１０（ｖ／ｖ）水／ＭｅＯＨ
溶離モード：グラジエント溶離
溶離液Ａ：水中０．１％ｖ／ｖＴＦＡ
溶離液Ｂ：ＡＣＮ／ＩＰＡ（７０：３０ｖ／ｖ）中０．１％ｖ／ｖＴＦＡ

【0100】

【表3】

【0101】

【表4】

【0102】

相対応答係数（ＲＲＦ）
ＲＲＦは、１２種のペプチド全てについて決定し、上記に示すようにレセルピンに対する各ペプチドの定量を可能にした。決定には、既知濃度の当該ペプチドを含む溶液中の各ペプチドの吸光度と、既知濃度のレセルピンを含む参照標準溶液の吸光度を２２０ｎｍで測定した。各ペプチド及びレセルピンの応答係数は、測定された吸光度を既知の濃度値で割ることにより、上記のように決定された（表５）。次に、式ＩＩを用いて相対応答係数を決定した。

【数4】

【0103】

【表5】

【0104】

アッセイ計算
各分析における各ペプチドの含有量は、作用参照溶液１を用いた一段階外部標準法を用いて決定した。バイアルあたりの個々のペプチドの含有量を算出する式は、式ＩＩＩを用いて以下のようにした。

【0105】

【数5】

Ａ_ＳＬＰ：個別のペプチドの応答（面積）（ＳＬＰはペプチド溶液を意味する）
Ａ_ＲＳ：作用参照溶液１の５回注入における平均応答レセルピン（ＲＳ）（面積）
Ｑ_ＲＳ：作用参照溶液１中のレセルピンの量（ｍｇ）
Ｑ_Ｓ：ＤＰの量：１（バイアル）
Ｐ_ＲＳ：レセルピン（ＲＳ）の純度（１の比、例えば０．９９で表される）
ＤＦ：ＳＬＰ－溶液の希釈係数

【数6】

Ｖ_ＳＬＰ＝バイアルの含有物を溶解するために使用された体積（＝４ｍＬ）
Ｖ_{ストック溶液ＲＳ}＝ストック参照溶液の体積（＝５０ｍＬ）
ＤＦ_１＝作用参照溶液を得るためのストック参照溶液の希釈係数（＝１０）
ＲＲＦ：レセルピン及びＳＬＰの間の相対応答係数（応答係数の比，表５に示される）

【0106】

報告
ＤＰ－５Ｐ及びＤＰ－７Ｐの両方のペプチド及び関連物質に割り当てられた相対保持時間（ＲＲＴ）は、中央で溶離するペプチドの保持時間を参照して算出した（図３、図４）。この保持時間は、この薬物のメインピークがクロマトグラムのほぼ中央に検出されることから、基準として使用された。関連物質は、総応答の正規化によって決定した。

【0107】

個々の関連物質は０．１０％ｗ／ｗ以上であると報告されている。全関連物質は、無視限界０．０５％ｗ／ｗ以上の全関連物質の合計として計算された。純度は、全関連物質と１００％ｗ／ｗとの差として算出した。

【0108】

各薬物のアッセイは、ＵＳＰ参照標準レセルピンに対して計算し、ｍｇ純ペプチド／バイアルで表した。

【0109】

実施例４．例示的なペプチドの含有量の決定及び計算
分析のために、以下の溶液／試料を調製し、本方法に従って注入する：

【0110】

Ｉ．参照溶液
１）５０ｍＬ中５．０８ｍｇのレセルピンからストック溶液を調製する。
２）２ｍＬのストックを合計２０ｍＬまで希釈する（希釈係数（ＤＦ_１）＝１０）。
レセルピンの純度はそのＣｏＡから求める：９８．２％（純度係数０．９８２）。
５回の注入の平均応答は３０８８８４５μＶ＊秒である。

【0111】

ＩＩ．試料溶液
１）ＤＰ－５Ｐに存在する各ペプチド約０．４ｍｇを含むバイアル１本を４ｍＬに溶解。
２）ペプチド４（配列番号４）の注入に関する応答は４９８４３８０μＶ＊秒である。

【0112】

ＩＩＩ．ペプチド４（配列番号４）の溶液の希釈係数（ＤＦ）は以下のように計算される：

【数7】

【0113】

ＩＶ．ここで、ペプチド４（配列番号４）のアッセイは、式ＩＩＩに代入することにより算出することができる：

【数8】

【0114】

実施例５．本発明の方法により改善された結果が得られる
ＤＰ－５Ｐ
表６に示すＤＰ－５Ｐバッチは、溶液中の５種の別々のペプチドをそれぞれ１：１の比率で組み合わせることによって製造した。その後、バイアルに充填された溶液を凍結乾燥し、各ペプチド０．４００ｍｇ（すなわち、合計２．００ｍｇ）を含むバイアルを得た。各ペプチドの含有量は、いくつかの様式で表すことができるが、中でも、バイアル中に存在する実際の量（ｍｇ）、又はバイアルあたり０．４００ｍｇの製造目標に対する量の割合で表すことができる。

【0115】

Ｔ＝０ヶ月（Ｔ０Ｍ）において、ペプチド含有量を実施例２の従来の方法で測定した。Ｔ＝４８ヶ月（Ｔ４８Ｍ）以降は、実施例２の従来法及び実施例３の本発明による方法でペプチド含有量を測定した。結果を表６に示す：

【0116】

【表6】

【0117】

ＤＰ－７Ｐ
表７に示すＤＰ－７Ｐバッチは、溶液中の７種の別々のペプチドをそれぞれ１：１の比率で組み合わせることによって製造した。その後、バイアルに充填された溶液を凍結乾燥し、各ペプチド０．４００ｍｇ（すなわち、合計２．８０ｍｇ）を含むバイアルを得た。各ペプチドの含有量は、いくつかの様式で表すことができるが、中でも、バイアル中に存在する実際の量（ｍｇ）、又はバイアルあたり０．４００ｍｇの製造目標に対する量の割合で表すことができる。

【0118】

Ｔ＝０ヶ月（Ｔ０Ｍ）において、ペプチド含有量を実施例２の従来の方法で測定した。Ｔ＝４８ヶ月（Ｔ４８Ｍ）以降は、実施例２の従来法及び実施例３の本発明による方法でペプチド含有量を測定した。結果を表７に示す：

【0119】

【表7】

【0120】

評価
いくつかの事実が考えられる：
・製造の観点からは、１バイアルあたり０．４ｍｇという目標より高い値は予想されず、同様に２．０ｍｇ（ＤＰ－５Ｐ）及び２．８ｍｇ（ＤＰ７Ｐ）より高い値も予想されない。製造プロセスでは、１ペプチドあたりのペプチド投入量は標的次第であることが保証されているが、あるとしても、例えば、フィルターや他の表面への吸着の可能性などにより、期待される結果がわずかに低くなる可能性がある。したがって、１００％超の値は正確でない確率がより高いが、１００％未満の値はこの問題がない。
・安定性の観点からは、アッセイ値は経時的に増加するのではなく、むしろ経時的に生じる可能性のある劣化により減少すると考えられる。経時的に増加する値は正確でない確率がより高い。
・ペプチドごとに、経時的なレベルの傾向が存在し、下向きの傾向を示すことがある。一般的に、レベルが増加すること（方法のばらつきによるわずかな場合を除く）、又は値が傾向を示さないこと（例えば、経時的に値が交互に増加及び減少すること）は期待されない。

【0121】

結果（及び表８の要約）に示されるように、本発明の方法は、従来の方法よりも著しく改善された定量を示す。

【0122】

【表8】