特表 2024-525725 ウイルスベクターを改善するための組成物およびその方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-07-12

(54)【発明の名称】ウイルスベクターを改善するための組成物およびその方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/86 20060101AFI20240705BHJP

   C12N 15/11 20060101ALI20240705BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20240705BHJP

   C12N 15/113 20100101ALI20240705BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20240705BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20240705BHJP

   C12N 15/54 20060101ALI20240705BHJP

   C12N 15/55 20060101ALI20240705BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240705BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240705BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20240705BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20240705BHJP

   C12N 9/16 20060101ALN20240705BHJP

   C12N 9/10 20060101ALN20240705BHJP

   C12N 9/14 20060101ALN20240705BHJP

   C07K 14/47 20060101ALN20240705BHJP

【ＦＩ】

C12N15/86 Z ZNA

C12N15/11 Z

C12N15/09 110

C12N15/113 130Z

C12N15/12

C12N15/62 Z

C12N15/54

C12N15/55

C12N5/10

A61K48/00

A61K35/76

A61P25/00

C12N9/16 Z

C12N9/10

C12N9/14

C07K14/47

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024501750

(86)(22)【出願日】2022-07-13

(85)【翻訳文提出日】2024-03-07

(86)【国際出願番号】 US2022073682

(87)【国際公開番号】W WO2023288247

(87)【国際公開日】2023-01-19

(31)【優先権主張番号】63/221,167

(32)【優先日】2021-07-13

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】507189666

【氏名又は名称】デューク ユニバーシティ

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】カンター， ボリス

(72)【発明者】

【氏名】チバ－ファレク， オーニット

(72)【発明者】

【氏名】モンカルボ， マリク

【テーマコード（参考）】

4B065

4C084

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AA95Y

4B065AA97Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065AC20

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA29

4B065CA31

4B065CA44

4C084AA13

4C084NA05

4C084NA13

4C084NA14

4C084ZA011

4C084ZA012

4C084ZA021

4C084ZA022

4C084ZC541

4C084ZC542

4C087AA01

4C087AA02

4C087AA03

4C087BC83

4C087CA12

4C087NA05

4C087NA13

4C087NA14

4C087ZA01

4C087ZA02

4C087ZC54

4H045AA10

4H045AA30

4H045BA10

4H045CA40

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

ＨＤＡＣ枯渇細胞を開発する方法における使用のためのウイルスベクターが本明細書中に開示される。ＨＤＡＣ枯渇細胞において生じる最適化されたウイルスベクターのパッケージング能を増大させる方法、力価を増加させる方法、発現能を増大させる方法、免疫原性および／または毒性を低下させる方法が本明細書中に開示される。本明細書中には、（ｉ）Ｃａｓエンドヌクレアーゼと、（ｉｉ）少なくとも１つのガイドＲＮＡと、（ｉｉｉ）少なくとも１つの導入遺伝子とをコードする核酸配列を含む単離された核酸分子が開示される。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ｉ）Ｃａｓエンドヌクレアーゼと、（ｉｉ）少なくとも１つのガイドＲＮＡと、（ｉｉｉ）ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）を標的とするｓｈＲＮＡとをコードする核酸配列を含むウイルスベクター。

【請求項2】

少なくとも１つの導入遺伝子をさらに含む、請求項１に記載のウイルスベクター。

【請求項3】

前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ９、バリアントＣａｓ９、ｄＣａｓまたはｄＣａｓ９を含む、請求項１に記載のウイルスベクター。

【請求項4】

前記バリアントＣａｓ９が、ＶＱＲ、ＥＱＲまたはＶＲＥＲを含む、請求項３に記載のウイルスベクター。

【請求項5】

前記ｄＣａｓが、ｄＶＱＲ、ｄＥＱＲまたはｄＶＲＥＲを含む、請求項３に記載のウイルスベクター。

【請求項6】

前記核酸配列がさらに、１またはそれを超えるＳｐ１結合部位、１またはそれを超えるＮＦκＢ結合部位、またはそれらの任意の組み合わせをコードする、請求項１に記載のウイルスベクター。

【請求項7】

前記核酸配列がさらに１またはそれを超える調節エレメントを含む、請求項１に記載のウイルスベクター。

【請求項8】

前記１またはそれを超える調節エレメントが、１またはそれを超えるプロモーター、１またはそれを超えるプライマー結合部位（ＰＢＳ）、１またはそれを超えるスプライスドナー（ＳＤ）部位、１またはそれを超えるスプライスアクセプター（ＳＡ）部位、１またはそれを超えるセントラルポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）、１またはそれを超えるポリプリントラクト（ＰＰＴ）、１またはそれを超えるＲｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）、１またはそれを超えるウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）、１またはそれを超えるレトロウイルスベクターパッケージングエレメント、あるいはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項７に記載のウイルスベクター。

【請求項9】

前記レトロウイルスベクターパッケージングエレメントがｐｓｉ（ψ）シグナルを含む、請求項８に記載のウイルスベクター。

【請求項10】

前記１またはそれを超えるプロモーターが、ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）プロモーター、コア伸長因子１αプロモーター（ＥＦＳ）、ヒトＵ６プロモーターの１つまたはそれより多く、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項８に記載のウイルスベクター。

【請求項11】

ウイルス３’ＵＴＲおよび／またはウイルス５’ＵＴＲをさらに含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載のウイルスベクター。

【請求項12】

前記ウイルス３’ＬＴＲがＵ３領域の欠失を含む、請求項１１に記載のウイルスベクター。

【請求項13】

ポリリンカー部位を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載のウイルスベクター。

【請求項14】

前記ポリリンカー部位が、一対のＢｓｍＢＩ部位と、独特のＢｓｒＧＩ部位とを含む、請求項１３に記載のウイルスベクター。

【請求項15】

レポーター遺伝子をさらに含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載のウイルスベクター。

【請求項16】

前記導入遺伝子がポリペプチドをコードする、請求項１～１５のいずれか一項に記載のウイルスベクター。

【請求項17】

前記コードされたポリペプチドが、転写活性化活性、転写抑制活性、転写放出因子活性、ヒストン修飾活性、核酸会合活性、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、デアセチラーゼ活性、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１６に記載のウイルスベクター。

【請求項18】

前記導入遺伝子が神経変性疾患（ＮＤＤ）関連遺伝子をコードする、請求項１～１５のいずれか一項に記載のウイルスベクター。

【請求項19】

前記ＮＤＤ関連遺伝子が、ＡＰＯＥ、ＡＰＰ、ＡＴＸＮ２、ＣＨＭＰ２Ｂ、ＤＣＴＮ１、ＦＩＧ４、ＦＵＳ、ＧＢＡ、ＧＲＮ、ＨＮＲＮＰＡ１、ＨＴＴ、ＬＲＲＫ２、ＭＡＴＲ３、ＯＰＴＮ、ＰＡＲＫ７、ＰＦＮ１、ＰＲＰＨ、ＰＳＥＮ１、ＳＥＴＸ、ＳＩＧＭＡＲ１、ＳＮＣＡ、ＳＯＤ１、ＳＰＧ１１、ＳＱＳＴＭ１、ＴＡＲＤＢＰ、ＴＢＫ１、ＴＢＰ、ＴＲＰＭ７、ＴＵＢＡ４Ａ、ＵＢＱＬＮ２、ＵＣＨＬ１、ＶＡＰＢ、ＶＣＰ、ＶＰＳ３５、それらのフラグメント、それらのバリアント、またはそれらのキメラを含む、請求項１８に記載のウイルスベクター。

【請求項20】

前記ｇＲＮＡが、目的とする遺伝子における領域を標的とする、請求項１～１９のいずれか一項に記載のウイルスベクター。

【請求項21】

前記ＨＤＡＣが、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ６、またはＨＤＡＣ８、あるいはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載のウイルスベクター。

【請求項22】

前記ＨＤＡＣがＨＤＡＣ８を含む、請求項２１に記載のウイルスベクター。

【請求項23】

前記ｓｈＲＮＡが、配列番号１９～配列番号２４のいずれか１つに示される配列を含む、請求項２１に記載のウイルスベクター。

【請求項24】

ＨＤＡＣ^－／^－遺伝子型を生じさせるために細胞株に形質導入する、請求項１～２３のいずれか一項に記載のウイルスベクター。

【請求項25】

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、インテグラーゼ欠損レンチウイルス（ＩＤＬＶ）、またはインテグラーゼコンピテントレンチウイルス（ＩＣＬＶ）を含む、請求項１～２４のいずれか一項に記載のウイルスベクター。

【請求項26】

前記ＨＤＡＣ^－／^－遺伝子型が、生じたウイルスベクターのパッケージング能を増大させ、生じたウイルスベクターの力価を増加させ、生じたウイルスベクターの発現能を増大させ、生じたウイルスベクターの免疫原性および／または毒性を低下させ、生じたウイルスベクターが効率的に形質導入する能力を増大させ、あるいはそれらの任意の組み合わせをもたらす、請求項１～２５のいずれか一項に記載のウイルスベクター。

【請求項27】

ＨＤＡＣ枯渇細胞を開発する方法であって、
１またはそれを超える細胞を請求項１～２６のいずれか一項に記載のウイルスベクターと接触させること
を含み、
前記１またはそれを超える細胞への形質導入の後において、前記標的となったＨＤＡＣの発現および／または活性が低下する、および／または枯渇する、方法。

【請求項28】

前記標的となったＨＤＡＣが、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ８、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項２７に記載の方法。

【請求項29】

前記ＨＤＡＣ枯渇細胞が、ＨＤＡＣ１^－／^－遺伝子型、ＨＤＡＣ２^－／^－遺伝子型、ＨＤＡＣ３^－／^－遺伝子型、ＨＤＡＣ４^－／^－遺伝子型、ＨＤＡＣ６^－／^－遺伝子型、ＨＤＡＣ８^－／^－遺伝子型、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項２７に記載の方法。

【請求項30】

前記ＨＤＡＣ枯渇細胞がＨＤＡＣ８^－／^－であり、しかし、依然として、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ６、またはそれらの任意の組み合わせを発現する、請求項２９に記載の方法。

【請求項31】

ＨＤＡＣの発現および／または活性における前記低下および／または枯渇が完全である、請求項２７～３０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項32】

ＨＤＡＣの発現および／または活性における前記低下および／または枯渇が不完全である、請求項２７～３０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項33】

最適化されたウイルスベクターを生じさせることをさらに含む、請求項２７～３２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項34】

前記最適化されたウイルスベクターが、正常な、または野生型のＨＤＡＣ発現および／またはＨＤＡＣ活性を有する細胞と比較してパッケージング能における増大を明らかに示す、請求項３３に記載の方法。

【請求項35】

前記最適化されたウイルスベクターが、正常な、または野生型のＨＤＡＣ発現および／またはＨＤＡＣ活性を有する細胞と比較して力価における増加を明らかに示す、請求項３３に記載の方法。

【請求項36】

前記最適化されたウイルスベクターが、正常な、または野生型のＨＤＡＣ発現および／またはＨＤＡＣ活性を有する細胞と比較して発現能における増大を明らかに示す、請求項３３に記載の方法。

【請求項37】

前記最適化されたウイルスベクターが、正常な、または野生型のＨＤＡＣ発現および／またはＨＤＡＣ活性を有する細胞と比較して免疫原性および／または毒性における低下を明らかに示す、請求項３３に記載の方法。

【請求項38】

前記最適化されたウイルスベクターが、正常な、または野生型のＨＤＡＣ発現および／またはＨＤＡＣ活性を有する細胞と比較して、効率的に細胞に形質導入する能力における増大を明らかに示す、請求項３３に記載の方法。

【請求項39】

前記最適化されたウイルスベクターが、ＩＣＬＶベクター、ＩＤＬＶベクター、またはＡＡＶベクターを含む、請求項３３に記載の方法。

【請求項40】

前記最適化されたウイルスベクターが分裂細胞および／または非分裂細胞に形質導入することができる、請求項３３に記載の方法。

【請求項41】

治療有効量の前記最適化されたウイルスベクターを投与することを必要とする対象に投与することをさらに含む、請求項３３～４０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項42】

それを必要とする前記対象が遺伝的な欠損または障害を有する、請求項４１に記載の方法。

【請求項43】

それを必要とする前記対象が、ＮＤＤ関連遺伝子に影響を及ぼす遺伝的な欠損または障害を有する、請求項４１に記載の方法。

【請求項44】

前記ＮＤＤ関連遺伝子が、ＡＰＯＥ、ＡＰＰ、ＡＴＸＮ２、ＣＨＭＰ２Ｂ、ＤＣＴＮ１、ＦＩＧ４、ＦＵＳ、ＧＢＡ、ＧＲＮ、ＨＮＲＮＰＡ１、ＨＴＴ、ＬＲＲＫ２、ＭＡＴＲ３、ＯＰＴＮ、ＰＡＲＫ７、ＰＦＮ１、ＰＲＰＨ、ＰＳＥＮ１、ＳＥＴＸ、ＳＩＧＭＡＲ１、ＳＮＣＡ、ＳＯＤ１、ＳＰＧ１１、ＳＱＳＴＭ１、ＴＡＲＤＢＰ、ＴＢＫ１、ＴＢＰ、ＴＲＰＭ７、ＴＵＢＡ４Ａ、ＵＢＱＬＮ２、ＵＣＨＬ１、ＶＡＰＢ、ＶＣＰ、ＶＰＳ３５、それらのフラグメント、それらのバリアント、またはそれらのキメラを含む、請求項４３に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

Ｉ．関連出願の相互参照
本出願は米国仮特許出願第６３／２２１，１６７号（２０２１年７月１３日出願）に対する優先権の利益を主張し、その全体が参照によって本明細書中に組み込まれる。
配列表の参照

【0002】

ＩＩ．配列表の参照
名称が“ＰＯＬ ２２－２０５０－ＷＯ－１０９７２６－７３３５３９”であり、２０２２年７月１３日に作成され、１７３キロバイトのサイズを有する．ｘｍｌファイルとして２０２２年７月１３日に提出された配列表が、米国特許法施行規則§１．５２（ｅ）（５）に従って参照によりここに組み込まれる。

【背景技術】

【0003】

ＩＩＩ．背景
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、遺伝子配列および遺伝子発現の前例のない制御をヒトを含めて多くの種においてもたらすことによってゲノム編集の分野に大変革をもたらしている。しかし、現時点では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエディターに基づく治療用導入遺伝子を含めて様々な治療用導入遺伝子を送達するための理想的なベクタープラットフォームがない。

【0004】

例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターが、遺伝子治療用途のために使用される最も一般的な送達システムである一方で、ＡＡＶベクターは、厳密なパッケージングサイズ限界（最大で４．７ｋｂ）を有しており、このことが、殆どのオールインワンのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系システムについての使用を思い止まらせている。レンチウイルスベクター（ＬＶ）が、大きなＤＮＡペイロード（最大で１１ｋｂ）に適応し、かつ広範囲の分裂細胞および非分裂細胞における堅固な発現を持続させるその能力のために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムのための主要な送達プラットフォームの１つである。しかしながら、ＬＶを臨床試験で用いることは、挿入変異誘発の比較的高いリスクによって妨げられている（Ｏｒｔｉｎｓｋｉ ＰＩら（２０１７）、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ．、５：１５３－１６４）。さらに、ＬＶが送達するＣａｓ９／ｇＲＮＡの長期の発現が、非特異的なＲＮＡ－ＤＮＡ相互作用およびオフターゲットのＤＮＡ擾乱によって特徴づけられる望ましくないオフターゲット影響を引き起すことがある（Ｏｒｔｉｎｓｋｉ ＰＩら（２０１７）、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ．、５：１５３－１６４）。最後に、ウイルスゲノムが、基本転写機構についてはほとんど到達し難いヘテロクロマチン構造にパッケージングされるので、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９送達のために使用されるＬＶの利点が、その産生に関連する低い力価によって相殺されている。
したがって、遺伝子送達システムにおいて必要とされるものが、ＡＡＶベクターおよびＬＶベクターの両方の利点を合わせ持ち、その一方で、これらのベクターの知られている制限を最小限に抑えるベクターである。エピソーム発現を明らかに示し、高い産生収量を有し、高いパッケージング能を有し、かつ強い導入遺伝子発現を生じさせるベクターに関する大きな必要性が満たされていない。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】Ｏｒｔｉｎｓｋｉ ＰＩら（２０１７）、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ．、５：１５３－１６４

【非特許文献2】Ｏｒｔｉｎｓｋｉ ＰＩら（２０１７）、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ．、５：１５３－１６４ ＩＶ．図面の簡単な説明

【図面の簡単な説明】

【0006】

【図1】図１Ａ～図１Ｃはベクター産生を詳述する。図１Ａはレンチウイルスベクターカセットプラスミドの概略マップを示す。上段のバージョンはＳｐ１結合部位を欠いており、一方で、下段のバージョンは２つのＳｐ１結合部位を含有する。他の調節エレメントとして、プライマー結合部位（ＰＢＳ）、スプライスドナー（ＳＤ）およびスプライスアクセプター（ＳＡ）、セントラルポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）およびポリプリントラクト（ＰＰＴ）、Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）、ウッドチャック肝炎ウイルスの転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）、ならびにレトロウイルスベクターパッケージングエレメント（ｐｓｉ（ψ）シグナル）が含まれる。ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）プロモーター、コア伸長因子１αプロモーター（ＥＦＳ）およびヒトＵ６プロモーターもまた含まれる。この自己不活性化ベクター（ＳＩＮ）カセットプラスミドは３’－ＬＴＲのＵ３領域における欠失（－１８ｂｐｓ～－４１８ｂｐｓ）を有している（ＤＵ３）。ポリリンカー部位は、ｓｇＲＮＡのクローニングのために、およびその検証のためにそれぞれ使用される一対のＢｓｍＢＩ部位と、独特のＢｓｒＧＩ部位とを含有する。図１Ｂは、Ｓｐ１部位の有無による組み込み型（ＩＣＬＶ）および非組み込み型（ＩＤＬＶ）のウイルス粒子の産生力価を示す。結果が、１ｎｇのｐ２４ｇａｇを１×１０^４個の粒子と同等と見なすコピー数／ミリリットルで記録される。図１Ｃは、ピューロマイシン耐性コロニーを計数することによって決定される全体的なＩＣＬＶ産生力価を示す。結果が、Ｓｐ１含有ベクターから得られるコロニー数と、Ｓｐ１非含有ベクターから得られるコロニー数との間の比として示される。棒グラフのデータは三連の実験からの平均±ＳＤを表す。

【0007】

【図2】図２はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介ノックアウトの効率を例示する。ｅＧＦＰ枯渇のレベルを、ＩＣＬＶおよびＩＤＬＶによって送達されるｓｇＲＮＡについて、形質導入後（ｐｔ）７日、１４日および２１日での蛍光活性化細胞選別アッセイによって評価した。ナイーブＨＥＫ２９３Ｔ－ｅＧＦＰ細胞（ＧＦＰウイルスにより形質導入されない）およびｓｇＲＮＡ非発現細胞（ｓｇＲＮＡ非存在）が対照として役立った。形質導入後に残存するＧＦＰ陽性細胞の百分率を記録した。ｙ軸は側方散乱を表し、一方で、ｘ軸はＭＦＩを表す。

【0008】

【図3-1】図３Ａは、ＩＤＬＶおよびＩＣＬＶによって送達されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９のＤＮＡ切断のオンターゲット評価を例示する。評価を、ＩＤＬＶ－ｓｇＲＮＡ１／Ｃａｓ９およびＩＣＬＶ－ｓｇＲＮＡ１／Ｃａｓ９により形質導入されるＧＦＰ陽性細胞を様々なＭＯＩで使用して形質導入後７日で行った。図３Ｂは、ＩＣＬＶ－ベクターまたはＩＤＬＶ－ベクターのどちらかにより形質導入されたサンプルの標的ＩｎＤｅｌに関して評価するためのサンガー法の使用を示す。オンターゲット変異の割合を７日目に決定した。図３Ｃは、ＩＣＬＶ－ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９（濃い棒）およびＩＣＬＶ－ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９（薄い棒）によって誘導されるＩｎｄｅｌの形成を例示する。ＩｎＤｅｌを、変異した配列を有する読み取りと総読み取りとの（百分率での）比率として計算した。

【図3-2】同上。

【図3-3】同上。

【図3-4】同上。

【0009】

【図4-1】図４Ａは、ＧＡＢＡ_Ａ受容体α２サブユニットをインビボ（ラット）で枯渇させるためのＩＤＬＶ－ＣＲＩＰＳＲ／Ｃａｓ９システムの効力を評価するためのウエスタンブロット分析の使用を示す。２匹の対照動物（ラット）（レーン１および２）および２匹のＩＤＬＶ－α２／Ｃａｓ９注射動物（ラット）（レーン３および４）を使用した。チューブリン（ＤＭ１Ａ）抗体（約４０ｋＤａ）を負荷対照として使用した。図４Ｂは、対照動物およびＩＤＬＶ－α２／Ｃａｓ９注射動物からのＮＡｃ切片におけるｍＩＰＳＣ法の使用を例示する。図の上部（部分ｉ）におけるイベント頻度の類似性に留意のこと。３つの異なるニューロンからのｍＩＰＳＣ平均（黒色記録線（black trace））は、図の下部（部分ｉｉ）におけるＩＤＬＶ－α２／Ｃａｓ９動物（ラット）からの切片におけるｍＩＰＳＣ持続時間の変動性を例示する。比較を容易にするために、それぞれの記録線を単一の対照ニューロンからのｍＩＰＳＣ平均（灰色記録線）に重ねた。図４Ｃは、すべての記録されたニューロンからのｍＩＰＳＣ減衰時間の分布を例示する。水平の黒色棒をそれぞれの群についての平均値で中央に置いている。図４Ｄは、Ｋ平均法クラスター分析により、ＭＳＮの低速ｍＩＰＳＣ群、中速ｍＩＰＳＣ群および高速ｍＩＰＳＣ群についての中心値が特定されることを例示する（クラスター１、クラスター２およびクラスター３ではそれぞれ、ｎ＝１個、５個および５個のＩＤＬＶ－α２／Ｃａｓ９細胞、一方で、クラスター１、クラスター２およびクラスター３ではそれぞれ、ｎ＝３個、２個および２個の対照細胞）。図４Ｅは、ｍＩＰＳＣ振幅の変動性がＩＤＬＶ－α２／Ｃａｓ９群および対照群における細胞の間で類似していたことを示す。水平の黒色棒をそれぞれの群についての平均値で中央に置いている。

【図4-2】同上。

【0010】

【図5】図５Ａ～図５ＢはＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）ノックダウンの検証を示す。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、ＨＤＡＣに対するｓｈＲＮＡを保有するＬＶにより形質導入した。ここで、代表的な画像により、ＨＤＡＣ２に対するｓｈＲＮＡと、ＨＤＡＣ８に対するｓｈＲＮＡとを使用して達成されるノックダウンが強調される。図５Ａにおいて、上段のグラフは、ｑＲＴ分析を使用して、ナイーブＨＥＫ２９３Ｔ細胞（黒色棒）、ＨＤＡＣ２－ｓｈＲＮＡが形質導入されるその細胞（白色棒）、およびＨＤＡＣ８－ｓｈＲＮＡが形質導入されるその細胞（灰色棒）において測定されるＨＤＡＣ８のｍＲＮＡレベルを示す。図５Ａにおいて、下段のパネルは、ｑＲＴ分析を使用して、ナイーブＨＥＫ２９３Ｔ細胞（黒色棒）、ＨＤＡＣ２－ｓｈＲＮＡが形質導入されるその細胞（白色棒）、およびＨＤＡＣ８－ｓｈＲＮＡが形質導入されるその細胞（灰色棒）において測定されるＨＤＡＣ２のｍＲＮＡレベルを示す。図５Ｂは、ＨＤＡＣ２形質導入細胞およびＨＤＡＣ８形質導入細胞から調製される細胞溶解物に対して行われたＷＢによって評価されるＨＤＡＣ８およびＨＤＡＣ２のタンパク質レベルを示す。ヒトアクチンを負荷対照として使用した。示されるように、ＨＤＡＣ８の特異的かつ堅固なノックダウンが、ＨＤＡＣ８が標的となった細胞において達成され、その一方で、ＨＤＡＣ２タンパク質のレベルが、ＨＤＡＣ２ ＫＤ細胞株において効率的に減少した。

【0011】

【図6】図６は、ナイーブ細胞、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４およびＨＤＡＣ８に対するｓｈＲＮＡを保有する細胞、ならびに酪酸ナトリウム（Ｂｕ）により２．５ｍＭで処理される細胞において生じるＩＤＬＶベクターの効率的な産生を示す。プロットは、記載（Ｔａｇｌｉａｆｉｅｒｒｏ Ｌら（２０１９）、Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ．（１４５）：１０．３７９１／５９２４１）のようなｐ２４ｇａｇ ＥＬＩＳＡを使用する産生の量測定を報告する。さらなる正規化を、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞への形質導入のための等しいウイルス量を適用するために行った。

【0012】

【図7】図７は、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４およびＨＤＡＣ８のそれぞれに対する、ヘアピンを保有するｓｈＲＮＡウイルスで形質導入される細胞、ならびに酪酸ナトリウム（Ｂｕ）により２．５ｍＭで処理される細胞におけるＧＦＰ発現の可視化を報告する。ウイルス量を正規化するために、等しい濃度のｐ２４含有量を使用した。ＧＦＰ発現を、記載（Ｔａｇｌｉａｆｉｅｒｒｏ Ｌら（２０１９）、Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ．（１４５）：１０．３７９１／５９２４１）のような蛍光顕微鏡観察法を使用して評価した。

【0013】

【図8】図８は、非哺乳動物ｓｈＲＮＡ対照プラスミドであるＳＨＣ００２のマップを示す。ＳＨＣ００２は、知られている哺乳動物遺伝子をどれも標的とせず、しかし、ＲＩＳＣと関わる配列を含有する陰性対照である。この非哺乳動物対照はＨＤＡＣノックダウンのための陰性参照として役立った。図８において、Ｕ６はＵ６プロモーターを意味し、ｃｐｐｔはセントラルポリプリントラクトを意味し、ｈＰＧＫはヒトホスホグリセリン酸キナーゼの真核生物プロモーターを意味し、ｐｕｒｏＲは哺乳動物選択のためのピューロマイシン耐性遺伝子を意味し、ＳＩＮ／３￠は、ＬＴＲ３￠が自己不活性化する長い末端反復を意味することを意味し、ｆ１ ｏｒｉはｆ１複製起点を意味し、ａｍｐＲは細菌選択のためのアンピシリン耐性遺伝子を意味し、ｐＵＣ ｏｒｉはｐＵＣ複製起点を意味し、５￠ＬＴＲは５￠の長い末端反復を意味し、ＰｓｉはＲＮＡパッケージングシグナルを意味し、ＲＲＥはｒｅｖ応答エレメントを意味する。

【0014】

【図9-1】図９Ａは、２つのＳｐ１部位と、ＧＦＰに対するｇＲＮＡとを保有する改善されたレンチウイルスベクター骨格を示す。図９Ｂは、ｇＲＮＡ無しで２つのＳｐ１部位を保有する改善されたレンチウイルスベクター骨格を示す。

【図9-2】同上。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0015】

Ｖ．概要
本明細書中には、１またはそれを超える開示された方法を実施する際の使用のための組成物が開示される。

【0016】

本明細書中には、（ｉ）Ｃａｓエンドヌクレアーゼと、（ｉｉ）少なくとも１つのガイドＲＮＡと、（ｉｉｉ）少なくとも１つの導入遺伝子とをコードする核酸配列を含む単離された核酸分子が開示される。

【0017】

本明細書中には、（ｉ）融合産物と、（ｉｉ）少なくとも１つのガイドＲＮＡとをコードする核酸配列を含む単離された核酸分子が開示される。

【0018】

本明細書中には、（ｉ）Ｃａｓエンドヌクレアーゼと、（ｉｉ）少なくとも１つのガイドＲＮＡと、（ｉｉｉ）少なくとも１つの導入遺伝子と、（ｉｖ）ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）を標的とするｓｈＲＮＡとをコードする核酸配列を含む単離された核酸分子が開示される。

【0019】

本明細書中には、（ｉ）融合産物と、（ｉｉ）少なくとも１つのガイドＲＮＡと、（ｉｉｉ）ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）を標的とするｓｈＲＮＡとをコードする核酸配列を含む単離された核酸分子が開示される。

【0020】

本明細書中には、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）を標的とするｓｈＲＮＡをコードする核酸配列を含む単離された核酸分子が開示される。本明細書中には、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）を標的とする１またはそれを超えるｓｈＲＮＡをコードする核酸配列を含む単離された核酸分子が開示される。本明細書中には、１またはそれを超えるヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）を標的とする１またはそれを超えるｓｈＲＮＡをコードする核酸配列を含む単離された核酸分子が開示される。

【0021】

本明細書中には、開示された単離核酸を含むウイルスベクターが開示される。本明細書中には、（ｉ）Ｃａｓエンドヌクレアーゼと、（ｉｉ）少なくとも１つのガイドＲＮＡと、（ｉｉｉ）少なくとも１つの導入遺伝子とをコードする核酸配列を含む単離された核酸分子を含むウイルスベクターが開示される。本明細書中には、（ｉ）融合産物と、（ｉｉ）少なくとも１つのガイドＲＮＡとをコードする核酸配列を含む単離された核酸分子を含むウイルスベクターが開示される。

【0022】

本明細書中には、配列番号２６～配列番号３１のいずれか１つに示される配列を含むウイルスベクターが開示される。

【0023】

本明細書中には、配列番号２６に示される配列を含み、かつ、開示された導入遺伝子を含むウイルスベクターが開示される。本明細書中には、配列番号２７に示される配列を含み、かつ、開示された導入遺伝子を含むウイルスベクターが開示される。本明細書中には、配列番号２８に示される配列を含み、かつ、開示された導入遺伝子を含むウイルスベクターが開示される。本明細書中には、配列番号２９に示される配列を含み、かつ、開示された導入遺伝子を含むウイルスベクターが開示される。本明細書中には、配列番号３０に示される配列を含み、かつ、開示された導入遺伝子を含むウイルスベクターが開示される。本明細書中には、配列番号３１に示される配列を含み、かつ、開示された導入遺伝子を含むウイルスベクターが開示される。

【0024】

本明細書中には、配列番号２６～配列番号３１のいずれか１つに示される配列と、下記導入遺伝子の１つまたはそれより多くを含むウイルスベクターが開示される：ＡＰＯＥ、ＡＰＰ、ＡＴＸＮ２、ＣＨＭＰ２Ｂ、ＤＣＴＮ１、ＦＩＧ４、ＦＵＳ、ＧＢＡ、ＧＲＮ、ＨＮＲＮＰＡ１、ＨＴＴ、ＬＲＲＫ２、ＭＡＴＲ３、ＯＰＴＮ、ＰＡＲＫ７、ＰＦＮ１、ＰＲＰＨ、ＰＳＥＮ１、ＳＥＴＸ、ＳＩＧＭＡＲ１、ＳＮＣＡ、ＳＯＤ１、ＳＰＧ１１、ＳＱＳＴＭ１、ＴＡＲＤＢＰ、ＴＢＫ１、ＴＢＰ、ＴＲＰＭ７、ＴＵＢＡ４Ａ、ＵＢＱＬＮ２、ＵＣＨＬ１、ＶＡＰＢ、ＶＣＰ、ＶＰＳ３５、それらのフラグメント、それらのバリアント、またはそれらのキメラ。

【0025】

本明細書中には、配列番号０１に示される配列と、下記導入遺伝子の１つまたはそれより多くを含むウイルスベクターが開示される：ＡＰＯＥ、ＡＰＰ、ＡＴＸＮ２、ＣＨＭＰ２Ｂ、ＤＣＴＮ１、ＦＩＧ４、ＦＵＳ、ＧＢＡ、ＧＲＮ、ＨＮＲＮＰＡ１、ＨＴＴ、ＬＲＲＫ２、ＭＡＴＲ３、ＯＰＴＮ、ＰＡＲＫ７、ＰＦＮ１、ＰＲＰＨ、ＰＳＥＮ１、ＳＥＴＸ、ＳＩＧＭＡＲ１、ＳＮＣＡ、ＳＯＤ１、ＳＰＧ１１、ＳＱＳＴＭ１、ＴＡＲＤＢＰ、ＴＢＫ１、ＴＢＰ、ＴＲＰＭ７、ＴＵＢＡ４Ａ、ＵＢＱＬＮ２、ＵＣＨＬ１、ＶＡＰＢ、ＶＣＰ、ＶＰＳ３５、それらのフラグメント、それらのバリアント、またはそれらのキメラ。

【0026】

本明細書中には、開示されたウイルスベクターにより形質導入されるウイルスプロデューサー細胞株が開示される。本明細書中には、ＨＤＡＣ－／－遺伝子型を含むウイルスプロデューサー細胞株が開示される。本明細書中には、ＨＤＡＣ１－／－遺伝子型を含むウイルスプロデューサー細胞株が開示される。本明細書中には、ＨＤＡＣ２－／－遺伝子型を含むウイルスプロデューサー細胞株が開示される。本明細書中には、ＨＤＡＣ３－／－遺伝子型を含むウイルスプロデューサー細胞株が開示される。本明細書中には、ＨＤＡＣ４－／－遺伝子型を含むウイルスプロデューサー細胞株が開示される。本明細書中には、ＨＤＡＣ６－／－遺伝子型を含むウイルスプロデューサー細胞株が開示される。本明細書中には、ＨＤＡＣ８－／－遺伝子型を含むウイルスプロデューサー細胞株が開示される。

【0027】

本明細書中には、１またはそれを超える開示された組成物を含むキットが開示される。本明細書中には、開示された方法における使用のための開示された組成物を含むキットが開示される。

【0028】

本明細書中には、ＨＤＡＣ枯渇細胞を開発する方法であって、１またはそれを超える細胞を開示されたウイルスベクターと接触させることを含み、前記１またはそれを超える細胞への形質導入の後において、前記標的となったＨＤＡＣの発現および／または活性が低下する、および／または枯渇する方法が開示される。

【0029】

本明細書中には、ＨＤＡＣ枯渇細胞を開発する方法であって、１またはそれを超える細胞を、（ｉ）Ｃａｓエンドヌクレアーゼと、（ｉｉ）少なくとも１つのガイドＲＮＡと、（ｉｉｉ）少なくとも１つの導入遺伝子とをコードする核酸配列を含む単離された核酸分子を含むウイルスベクターと接触させることを含み、前記１またはそれを超える細胞への形質導入の後において、前記標的となったＨＤＡＣの発現および／または活性が低下する、および／または枯渇する方法が開示される。

【0030】

本明細書中には、ＨＤＡＣ枯渇細胞を開発する方法であって、１またはそれを超える細胞を、（ｉ）融合産物と、（ｉｉ）少なくとも１つのガイドＲＮＡとをコードする核酸配列を含む単離された核酸分子を含むウイルスベクターと接触させることを含み、前記１またはそれを超える細胞への形質導入の後において、前記標的となったＨＤＡＣの発現および／または活性が低下する、および／または枯渇する方法が開示される。

【0031】

本明細書中には、ウイルスベクターのパッケージング能を増大させる方法であって、１またはそれを超える細胞を開示されたウイルスベクターと接触させることを含み、前記１またはそれを超える細胞への形質導入の後において、前記標的となったＨＤＡＣの発現および／または活性が低下し、および／または枯渇し、生じた最適化ウイルスベクターが増大したパッケージング能を有する方法が開示される。本明細書中には、ウイルスベクターのパッケージング能を増大させる方法であって、１またはそれを超える細胞を、（ｉ）Ｃａｓエンドヌクレアーゼと、（ｉｉ）少なくとも１つのガイドＲＮＡと、（ｉｉｉ）少なくとも１つの導入遺伝子とをコードする核酸配列を含む単離された核酸分子を含むウイルスベクターと接触させることを含み、前記１またはそれを超える細胞への形質導入の後において、前記標的となったＨＤＡＣの発現および／または活性が低下し、および／または枯渇し、生じた最適化ウイルスベクターが増大したパッケージング能を有する方法が開示される。本明細書中には、ウイルスベクターのパッケージング能を増大させる方法であって、１またはそれを超える細胞を、（ｉ）融合産物と、（ｉｉ）少なくとも１つのガイドＲＮＡとをコードする核酸配列を含む単離された核酸分子を含むウイルスベクターと接触させることを含み、前記１またはそれを超える細胞への形質導入の後において、前記標的となったＨＤＡＣの発現および／または活性が低下し、および／または枯渇し、生じた最適化ウイルスベクターが増大したパッケージング能を有する方法が開示される。

【0032】

本明細書中には、ウイルスベクターの力価を増加させる方法であって、１またはそれを超える細胞を開示されたウイルスベクターと接触させることを含み、前記１またはそれを超える細胞への形質導入の後において、前記標的となったＨＤＡＣの発現および／または活性が低下し、および／または枯渇し、生じた最適化ウイルスベクターの力価が増加する方法が開示される。本明細書中には、ウイルスベクターの力価を増加させる方法であって、１またはそれを超える細胞を、（ｉ）Ｃａｓエンドヌクレアーゼと、（ｉｉ）少なくとも１つのガイドＲＮＡと、（ｉｉｉ）少なくとも１つの導入遺伝子とをコードする核酸配列を含む単離された核酸分子を含むウイルスベクターと接触させることを含み、前記１またはそれを超える細胞への形質導入の後において、前記標的となったＨＤＡＣの発現および／または活性が低下し、および／または枯渇し、また、生じた最適化ウイルスベクターの力価が増加する方法が開示される。本明細書中には、ウイルスベクターの力価を増加させる方法であって、１またはそれを超える細胞を、（ｉ）融合産物と、（ｉｉ）少なくとも１つのガイドＲＮＡとをコードする核酸配列を含む単離された核酸分子を含むウイルスベクターと接触させることを含み、前記１またはそれを超える細胞への形質導入の後において、前記標的となったＨＤＡＣの発現および／または活性が低下し、および／または枯渇し、生じた最適化ウイルスベクターの力価が増加する方法が開示される。

【0033】

本明細書中には、ウイルスベクターの発現能を増大させる方法であって、１またはそれを超える細胞を開示されたウイルスベクターと接触させることを含み、前記１またはそれを超える細胞への形質導入の後において、前記標的となったＨＤＡＣの発現および／または活性が低下し、および／または枯渇し、生じた最適化ウイルスベクターが増大した発現能を有する方法が開示される。本明細書中には、ウイルスベクターの発現能を増大させる方法であって、１またはそれを超える細胞を、（ｉ）Ｃａｓエンドヌクレアーゼと、（ｉｉ）少なくとも１つのガイドＲＮＡと、（ｉｉｉ）少なくとも１つの導入遺伝子とをコードする核酸配列を含む単離された核酸分子を含むウイルスベクターと接触させることを含み、前記１またはそれを超える細胞への形質導入の後において、前記標的となったＨＤＡＣの発現および／または活性が低下し、および／または枯渇し、生じた最適化ウイルスベクターが増大した発現能を有する方法が開示される。本明細書中には、ウイルスベクターの発現能を増大させる方法であって、１またはそれを超える細胞を、（ｉ）融合産物と、（ｉｉ）少なくとも１つのガイドＲＮＡとをコードする核酸配列を含む単離された核酸分子を含むウイルスベクターと接触させることを含み、前記１またはそれを超える細胞への形質導入の後において、前記標的となったＨＤＡＣの発現および／または活性が低下し、および／または枯渇し、生じた最適化ウイルスベクターが増大した発現能を有する方法が開示される。

【0034】

本明細書中には、ウイルスベクターの免疫原性および／または毒性を低下させる方法であって、１またはそれを超える細胞を開示されたウイルスベクターと接触させることを含み、前記１またはそれを超える細胞への形質導入の後において、前記標的となったＨＤＡＣの発現および／または活性が低下し、および／または枯渇し、生じた最適化ウイルスベクターが低下した免疫原性および／または毒性を有する方法が開示される。本明細書中には、ウイルスベクターの免疫原性および／または毒性を低下させる方法であって、１またはそれを超える細胞を、（ｉ）Ｃａｓエンドヌクレアーゼと、（ｉｉ）少なくとも１つのガイドＲＮＡと、（ｉｉｉ）少なくとも１つの導入遺伝子とをコードする核酸配列を含む単離された核酸分子を含むウイルスベクターと接触させることを含み、前記１またはそれを超える細胞への形質導入の後において、前記標的となったＨＤＡＣの発現および／または活性が低下し、および／または枯渇し、生じた最適化ウイルスベクターが低下した免疫原性および／または毒性を有する方法が開示される。本明細書中には、ウイルスベクターの免疫原性および／または毒性を低下させる方法であって、１またはそれを超える細胞を、（ｉ）融合産物と、（ｉｉ）少なくとも１つのガイドＲＮＡとをコードする核酸配列を含む単離された核酸分子を含むウイルスベクターと接触させることを含み、前記１またはそれを超える細胞への形質導入の後において、前記標的となったＨＤＡＣの発現および／または活性が低下し、および／または枯渇し、生じた最適化ウイルスベクターが低下した免疫原性および／または毒性を有する方法が開示される。

【0035】

本明細書中には、ウイルスベクターが効率的に１またはそれを超える細胞に形質導入する能力を増大させる方法であって、１またはそれを超える細胞を開示されたウイルスベクターと接触させることを含み、前記１またはそれを超える細胞への形質導入の後において、前記標的となったＨＤＡＣの発現および／または活性が低下し、および／または枯渇し、生じた最適化ウイルスベクターが、効率的に細胞に形質導入する増大した能力を有する方法が開示される。本明細書中には、ウイルスベクターが効率的に１またはそれを超える細胞に形質導入する能力を増大させる方法であって、１またはそれを超える細胞を、（ｉ）Ｃａｓエンドヌクレアーゼと、（ｉｉ）少なくとも１つのガイドＲＮＡと、（ｉｉｉ）少なくとも１つの導入遺伝子とをコードする核酸配列を含む単離された核酸分子を含むウイルスベクターと接触させることを含み、前記１またはそれを超える細胞への形質導入の後において、前記標的となったＨＤＡＣの発現および／または活性が低下し、および／または枯渇し、生じた最適化ウイルスベクターが、効率的に細胞に形質導入する増大した能力を有する方法が開示される。本明細書中には、ウイルスベクターが効率的に１またはそれを超える細胞に形質導入する能力を増大させる方法であって、１またはそれを超える細胞を、（ｉ）融合産物と、（ｉｉ）少なくとも１つのガイドＲＮＡとをコードする核酸配列を含む単離された核酸分子を含むウイルスベクターと接触させることを含み、前記１またはそれを超える細胞への形質導入の後において、前記標的となったＨＤＡＣの発現および／または活性が低下し、および／または枯渇し、生じた最適化ウイルスベクターが、効率的に細胞に形質導入する増大した能力を有する方法が開示される。

【発明を実施するための形態】

【0036】

ＶＩ．詳細な説明
本開示は、製剤、配合された組成物、キット、カプセル、容器、および／またはそれらの方法を記載する。別途指定される場合を除き具体的な合成方法に、または別途指定される場合を除き特定の試薬に限定されない発明的局面は、そのため、当然のことながら様々であってもよいことが理解されなければならない。本明細書中で使用される術語は、特定の局面のみを説明するという目的のためであり、限定であることが意図されないこともまた理解されなければならない。本明細書中に記載される方法および材料と類似するものおよび同等であるものはどれも本発明の実施または試験において使用することができるにもかかわらず、例となる方法および材料が次に記載される。

【0037】

本明細書中で言及されるすべての刊行物が、これらの刊行物が引用される方法および／または材料に関連して方法および／または材料を開示するために、また説明するために参照によって本明細書中に組み込まれる。本明細書中で議論される刊行物は、本出願の出願日の前におけるそれらの開示のためにのみ提供されている。本明細書中のいかなるものも、本発明は、先行発明によってそのような刊行物に先行する資格がないことを認めるものとして解釈してはならない。
Ａ．関連がある定義

【0038】

本発明の化合物、組成物、物品、システム、デバイスおよび／または方法が開示され、説明される前に、それらは、別途指定される場合を除き具体的な合成方法に、または別途指定される場合を除き特定の試薬に限定されず、そのため、当然のことながら様々であってもよいことが理解されなければならない。本明細書中で使用される術語は、特定の局面のみを説明するという目的のためであり、限定であることが意図されないこともまた理解されなければならない。本明細書中に記載される方法および材料と類似するものおよび同等であるものはどれも本発明の実施または試験において使用することができるにもかかわらず、例となる方法および材料が次に記載される。

【0039】

本開示により、発明的概念が具体例を参照して説明される。しかしながら、意図は、本開示と一致する発明的概念のすべての改変、均等物および代替物を網羅することである。

【0040】

本明細書および添付された請求項において使用される場合、“ａ”、“ａｎ”および“ｔｈｅ”の単数形態は、内容が明らかにそうでないことを示す場合を除き、複数の参照対象を含む。

【0041】

表現“ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ”（から本質的になる）は、主張（claim）の範囲を、組成物における列挙された成分、または方法における列挙されたステップ、ならびに、主張された組成物または主張された方法の基本的かつ新規な特徴（１つまたは複数）に実質的に影響を及ぼさない成分またはステップに限定する。表現“ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ”（からなる）は、主張において列挙されない成分、ステップまたは要素をどのようなものであれ除外する。表現“ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ”（含むこと）は、“ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ”（含むこと、包含すること）、“ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ”（含有すること）、または“ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ｂｙ”（によって特徴づけられる）と同義であり、包括的であり、または変更可能である。“ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ”（含むこと）は、追加の列挙されない成分またはステップを除外しない。

【0042】

本明細書中で使用される場合、どのような数値であれ数値に言及するとき、用語「少なくとも」は、明記された値の±１０％である範囲の範囲内に含まれる値を意味する。

【0043】

様々な範囲を、一方の「約」特定の値から、および／またはもう一方の「約」特定の値までとして本明細書中では表すことができる。そのような範囲が表されるとき、さらなる局面により、当該一方の値から、および／または当該もう一方の特定の値までが含まれる。同様に、値が先行詞「約」の使用によって近似値として表されるときには、当該特定の値がさらなる局面を形成することが理解される。範囲のそれぞれの端点は、他方の端点に関して、および、他方の端点とは独立して、の両方で有意であることがさらに理解される。多数の値が本明細書中では開示されること、そして、それぞれの値もまた本明細書中では、当該値そのものに加えて、「約」その特定の値として開示されることもまた理解される。例えば、「１０」という値が開示されるならば、「約１０」もまた開示される。２つの特定の１位数の間におけるそれぞれの１位数もまた開示されることもまた理解される。例えば、１０および１５が開示されるならば、１１、１２、１３および１４もまた開示される。

【0044】

組成物における特定の要素または成分の重量部に対する、本明細書および結論となる請求項における言及は、当該要素または成分と、重量部が表される組成物または物品におけるいかなる他の要素または成分との間における重量関係を意味する。したがって、２重量部の成分Ｘおよび５重量部の成分Ｙを含有する化合物では、ＸおよびＹが２：５の重量比で存在しており、これらは、追加の成分が当該混成物に含有されるかどうかにかかわらず、そのような比率で存在する。

【0045】

本明細書中で使用される場合、用語「必要に応じた」または用語「必要に応じて」は、続いて記載された事象または状況が生じる可能性がある、または可能性がないこと、そして、その記載には、前記事象または状況が生じる事例、および前記事象または状況が生じない事例が含まれることを意味する。１つの局面において、開示された方法は必要に応じて、１またはそれを超える追加のステップ、例えば、投与するステップを繰り返すこと、または投与するステップを変更することなどを含むことができる。

【0046】

本明細書中で使用される場合、「ＣＲＩＳＰＲ、すなわち、クラスター化されて規則的な配置の短い回文配列リピート」は、アルツハイマー病またはＬＯＡＤなどの疾患に関連する様々な遺伝的異常を正すための理想的なツールである。このシステムは、ゲノムＤＮＡを直接に標的とするように設計することができる。ＣＲＩＳＰＲシステムは、２つの主要な成分、すなわち、Ｃａｓ９酵素と、ガイド（ｇＲＮＡ）とを必要とする。ｇＲＮＡは、ＤＮＡ結合（例えば、ＮＤＤ関連遺伝子におけるＤＮＡ結合）のための標的となった配列と、Ｃａｓ９結合のための足場配列とを含有する。Ｃａｓ９ヌクレアーゼはしばしば、標的遺伝子、例えば、ＮＤＤ関連遺伝子などを「ノックアウト」するために使用される。また、複数のｇＲＮＡを、複数の遺伝子を同時に抑制し、または活性化し、したがって、これにより処置効力を増大させ、また、標的遺伝子における新たな変異によって潜在的に引き起こされる抵抗性を軽減するために用いることができる。

【0047】

本明細書中で使用される場合、「ＣＲＩＳＰＲ系エンドヌクレアーゼ」には、少なくとも１つのヌクレアーゼドメイン、およびガイドＲＮＡと相互作用する少なくとも１つのドメインを含むＲＮＡ誘導エンドヌクレアーゼが含まれる。この技術分野では知られているように、ガイドＲＮＡはＣＲＩＳＰＲ系エンドヌクレアーゼを核酸中の標的となった部位に向かわせ、その部位で、ＣＲＩＳＰＲ系エンドヌクレアーゼが標的となった核酸配列の少なくとも一方の鎖を切断する。ガイドＲＮＡが標的化切断のための特異性を与えるので、ＣＲＩＳＰＲ系エンドヌクレアーゼは普遍的であり、ＣＲＩＳＰＲ系エンドヌクレアーゼを、異なる標的核酸配列を切断するために異なるガイドＲＮＡとともに使用することができる。ＣＲＩＳＰＲ系エンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに由来するＲＮＡ誘導エンドヌクレアーゼである。

【0048】

１つの局面において、開示されたＣＲＩＳＰＲ系エンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ Ｉ型システム、ＩＩ型システム、またはＩＩＩ型システムに由来することができる。好適なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質の限定されない例には、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ５ｅ（またはＣａｓＤ）、Ｃａｓ６、Ｃａｓ６ｅ、Ｃａｓ６ｆ、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８ａ１、Ｃａｓ８ａ２、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１０ｄ、ＣａｓＦ、ＣａｓＧ、ＣａｓＨ、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１（またはＣａｓＡ）、Ｃｓｅ２（またはＣａｓＢ）、Ｃｓｅ３（またはＣａｓＥ）、Ｃｓｅ４（またはＣａｓＣ）、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｚ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、およびＣｕ１９６６が含まれる。

【0049】

１つの局面において、開示されたＣＲＩＳＰＲ系エンドヌクレアーゼはＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに由来することができる。例えば、１つの局面において、ＣＲＩＳＰＲ系エンドヌクレアーゼはＣａｓ９タンパク質に由来することができる。Ｃａｓ９タンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ、Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｒｉｓｔｉｎａｅｓｐｉｒａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｓｅｕｄｏｍｙｃｏｉｄｅｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｅｌｅｎｉｔｉｒｅｄｕｃｅｎｓ、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉｂｉｒｉｃｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｍｉｃｒｏｓｃｉｌｌａ ｍａｒｉｎａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｃｒｏｃｏｓｐｈａｅｒａ ｗａｔｓｏｎｉｉ、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ａｃｅｔｏｈａｌｏｂｉｕｍ ａｒａｂａｔｉｃｕｍ、Ａｍｍｏｎｉｆｅｘ ｄｅｇｅｎｓｉｉ、Ｃａｌｄｉｃｅｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ ｂｅｃｓｃｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｄｅｓｕｌｆｏｒｕｄｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ ｍａｇｎａ、Ｎａｔｒａｎａｅｒｏｂｉｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｕｓ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ、Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｖｉｎｏｓｕｍ、Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｗａｔｓｏｎｉ、Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｈａｌｏｐｌａｎｋｔｉｓ、Ｋｔｅｄｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｒａｃｅｍｉｆｅｒ、Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｂｉｕｍ ｅｖｅｓｔｉｇａｔｕｍ、Ａｎａｂａｅｎａ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ、Ｎｏｄｕｌａｒｉａ ｓｐｕｍｉｇｅｎａ、Ｎｏｓｔｏｃ ｓｐ．、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｍａｘｉｍａ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｓｐ．、Ｌｙｎｇｂｙａ ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ ｃｈｔｈｏｎｏｐｌａｓｔｅｓ、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ ｓｐ．、Ｐｅｔｒｏｔｏｇａ ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ ａｆｒｉｃａｎｕｓ、またはＡｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ ｍａｒｉｎａからのものであり得る。１つの局面において、ＣＲＩＳＰＲ系ヌクレアーゼは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓからのＣａｓ９タンパク質に由来し得る。

【0050】

本明細書中で使用される場合、「ｄＣａｓ９」は、ＤＮＡに結合することができるが、、それを切断することができない、Ｃａｓ９の酵素不活性な形態を示す。

【0051】

本明細書中で使用される場合、「プロトスペーサー隣接モチーフ」または「ＰＡＭ」は、Ｃａｓ酵素が標的ＤＮＡに結合するために必要である標的配列に隣接する配列を示す。

【0052】

「プロトスペーサー配列」は標的二本鎖ＤＮＡを示し、具体的には、ＣＲＩＳＰＲアレイのスペーサー配列に対して完全に、または実質的に相補的である（およびズする）標的ＤＮＡの部分（例えば、またはゲノムにおける標的領域）を示す。Ｉ型システムにおけるプロトスペーサー配列は３’側末端において、ＰＡＭによって直接挟まれている。スペーサーが、プロトスペーサーに対して相補的であるように設計される。

【0053】

一般に、ｇＲＮＡ（これはまた、交換可能に「ｇＲＮＡ足場」として本明細書中では示される）は適合性の核酸誘導型ヌクレアーゼと複合体形成することができ、かつ標的配列とハイブリダイズすることができ、それによって当該ヌクレアーゼを標的配列に向けることができる。ガイドポリヌクレオチドとの複合体形成が可能である対象核酸誘導型ヌクレアーゼは、ｇＲＮＡとの適合性がある核酸誘導型ヌクレアーゼとして示すことができる。加えて、核酸誘導型ヌクレアーゼとの複合体形成が可能であるｇＲＮＡは、核酸誘導型ヌクレアーゼとの適合性があるガイドポリヌクレオチドまたはガイド核酸として示すことができる。

【0054】

ｇＲＮＡには、足場配列が含まれることが可能である。一般に、「足場配列」には、標的になり得るヌクレアーゼ複合体の形成を促進させるための十分な配列を有するどのような配列も含まれることが可能であり（ただし、標的になり得るヌクレアーゼ複合体には、限定されないが、核酸誘導型ヌクレアーゼが含まれる）、ガイドポリヌクレオチドには、足場配列およびガイド配列が含まれることが可能である。標的になり得るヌクレアーゼ複合体の形成を促進させるための足場配列内の十分な配列には、足場配列内の２つの配列領域の長さに沿っての、例えば、二次構造を形成することに関与する１つまたは２つの配列領域などの長さに沿ってのある程度の相補性が含まれることが可能である。１つの局面において、前記１つまたは２つの配列領域が同じポリヌクレオチドにおいて含まれ、またはコードされる。１つの局面において、前記１つまたは２つの配列領域が別個のポリヌクレオチドにおいて含まれ、またはコードされる。最適なアライメントを、どのようなアルゴリズムであれ好適なアライメントアルゴリズムによって決定することができ、また、最適なアライメントにより、様々な二次構造、例えば、前記１つまたは２つの配列領域のどちらかの内部における自己相補性などをさらに説明することができる。１つの局面において、最適にアラインメントされたときの２つのうちの短い方の長さに沿っての前記１つまたは２つの配列領域の間における相補性の程度が、約２５％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９７．５％、約９９％またはそれ超、あるいは約２５％超、約３０％超、約４０％超、約５０％超、約６０％超、約７０％超、約８０％超、約９０％超、約９５％超、約９７．５％超、約９９％超またはそれ超であることが可能である。１つの局面において、これら２つの配列領域の少なくとも１つは長さにおいて、約５個、約６個、約７個、約８個、約９個、約１０個、約１１個、約１２個、約１３個、約１４個、約１５個、約１６個、約１７個、約１８個、約１９個、約２０個、約２５個、約３０個、約４０個、約５０個またはそれ超、あるいは約５個超、約６個超、約７個超、約８個超、約９個超、約１０個超、約１１個超、約１２個超、約１３個超、約１４個超、約１５個超、約１６個超、約１７個超、約１８個超、約１９個超、約２０個超、約２５個超、約３０個超、約４０個超、約５０個超またはそれ超のヌクレオチドの長さであることが可能である。

【0055】

対象ガイドポリヌクレオチドの足場配列は二次構造を含むことができる。二次構造はシュードノット領域を含むことができる。１つの局面において、核酸誘導型ヌクレアーゼに対するガイドポリヌクレオチドの結合動態が部分的には、足場配列内の二次構造によって決定される。１つの局面において、核酸誘導型ヌクレアーゼに対するガイドポリヌクレオチドの結合動態が部分的には、足場配列内の核酸配列によって決定される。

【0056】

「プロモーター」は、本明細書中で使用される場合、核酸の発現を細胞において与えること、活性化すること、または増強することが可能である合成分子または天然由来分子を意味する。プロモーターは、発現をさらに増強するために、ならびに／あるいは核酸の空間的発現および／または時間的発現を変化させるために、１またはそれを超える特異的な転写調節配列を含む場合がある。プロモーターはまた、転写の開始部位から数千塩基対ものところに位置することができる遠位のエンハンサーエレメントまたはリプレッサーエレメントを含む場合がある。プロモーターは、ウイルス、細菌、真菌、植物、昆虫および動物を含めて様々な供給源に由来することができる。プロモーターは遺伝子成分の発現を構成的に、あるいは発現が生じる細胞、組織もしくは器官に関して、または発現が生じる発達段階に関して、または外部刺激（例えば、生理学的ストレス、病原体、金属イオンまたは誘導剤）に対する応答において差次的に調節する場合がある。プロモーターの代表的な例には、ＥＦＳプロモーター、バクテリオファージＴ７プロモーター、バクテリオファージＴ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｌａｃオペレーター－プロモーター、ｔａｃプロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＲＳＶ－ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ ＩＥプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーターまたはＳＶ４０後期プロモーター、ヒトＵ６（ｈＵ６）プロモーター、およびＣＭＶ ＩＥプロモーターが含まれる。

【0057】

用語「形質転換」、用語「トランスフェクション」および用語「形質導入」は、本明細書中では交換可能に使用されるが、異種核酸分子の細胞への導入を示す。細胞へのそのような導入は安定的または一過性であることが可能である。したがって、１つの局面において、宿主細胞または宿主生物が本開示のポリヌクレオチドにより安定的に形質転換される。１つの局面において、宿主細胞または宿主生物が本開示のポリヌクレオチドにより一過性に形質転換される。ポリヌクレオチドに関連しての「一過性の形質転換」は、ポリヌクレオチドが細胞に導入され、細胞のゲノムに組み込まれないことを意味する。細胞に導入されるポリヌクレオチドに関連しての「安定的に導入する」または「安定的に導入される」によって、導入されたポリヌクレオチドが細胞のゲノムに安定的に取り込まれ、したがって、細胞が当該ポリヌクレオチドにより安定的に形質転換されることが意図される。「安定的形質転換」または「安定的に形質転換される」は、本明細書中で使用される場合、核酸分子が細胞に導入され、当該細胞のゲノムに組み込まれることを意味する。そのため、組み込まれた核酸分子は、その子孫によって、より具体的には、複数の連続する世代の子孫によって引き継がれることが可能である。「ゲノム」には、本明細書中で使用される場合にはまた、核ゲノム、プラスミドおよび色素体ゲノムが含まれ、したがって、例えば、葉緑体ゲノムまたはミトコンドリアゲノムへの核酸構築物の組み込みが含まれる。安定的形質転換は、本明細書中で使用される場合にはまた、染色体外に、例えば、ミニ染色体またはプラスミドとして維持される導入遺伝子を示すことができる。１つの局面において、ヌクレオチド配列、構築物、発現カセットを一過性に発現させることができ、かつ／またはそれらを宿主生物のゲノムに安定的に取り込ませることができる。

【0058】

「導入遺伝子」は、本明細書中で使用される場合、１つの生物から単離されていて、異なる生物に導入される遺伝子配列を含有する遺伝子または遺伝物質を示す。ＤＮＡのこの非ネイティブセグメントは、ＲＮＡまたはタンパク質をトランスジェニック生物において産生する能力を保持する場合があり、あるいはトランスジェニック生物の遺伝暗号の正常な機能を変化させる場合がある。導入遺伝子の導入は、生物の表現型を変化させる潜在性を有する。

【0059】

本明細書中で使用される場合、用語「対象」は、投与の標的、例えば、ヒトを示す。用語「対象」にはまた、飼い慣らされた動物（例えば、ネコ、イヌなど）、家畜（例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギなど）、および実験室動物（例えば、マウス、ウサギ、ラット、モルモット、ショウジョウバエなど）が含まれる。したがって、本明細書中に開示された方法の対象は、脊椎動物、例えば、哺乳動物、魚類、鳥類、爬虫類または両生類であり得る。代替として、本明細書中に開示された方法の対象は、ヒト、非ヒト霊長類、ウマ、ブタ、ウサギ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ネコ、モルモットまたは齧歯類であり得る。この用語は特定の年齢または性別を意味しておらず、したがって、成体および子である対象、ならびに、胎児が、雄性または雌性にかかわらず、包含されることが意図される。１つの局面において、対象はヒト患者であり得る。１つの局面において、対象は、遺伝的な疾患もしくは障害または神経学的な疾患もしくは障害を有する可能性があり、あるいは遺伝的な疾患もしくは障害または神経学的な疾患もしくは障害を有することが疑われる可能性があり、あるいは遺伝的な疾患もしくは障害または神経学的な疾患もしくは障害を発症するリスクがある可能性がある。

【0060】

「標的遺伝子」は、本明細書中で使用される場合、知られている遺伝子産物または推定上の遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列をどのようなものであれ示す。標的遺伝子は、遺伝的な疾患もしくは障害または神経学的な疾患もしくは障害に関与する変異した遺伝子であることが可能である。

【0061】

「標的領域」は、本明細書中で使用される場合、標的遺伝子のエピゲノム修飾のための組成物が、結合し、かつ改変するように設計される標的遺伝子および／または染色体の領域を示す。

【0062】

本明細書中で使用される場合、用語「診断された」は、当業者（例えば、医師）による検査に供されたことがあり、開示された単離核酸分子（isolated nucleic acid molecule）、ＨＤＡＣを標的とする開示されたｓｈＲＮＡ、開示されたウイルスベクター、開示されたプロデューサー細胞、またはそれらの組み合わせの１つまたはそれより多くによって、あるいは開示された方法の１つまたはそれより多くによって診断することができる、または処置することができる状態を有することが見出されたことを意味する。例えば、「遺伝的な疾患もしくは障害または神経学的な疾患もしくは障害と診断さされた」は、当業者（例えば、医師）による検査に供されたことがあり、開示された単離核酸分子、ＨＤＡＣを標的とする開示されたｓｈＲＮＡ、開示されたウイルスベクター、開示されたプロデューサー細胞、またはそれらの組み合わせの１つまたはそれより多くによって、あるいは開示された方法の１つまたはそれより多くによって処置することができる状態を有することが見出されたことを意味する。例えば、「遺伝的な疾患もしくは障害または神経学的な疾患もしくは障害を有することが疑われた」は、当業者（例えば、医師）による検査に供されたことがあり、開示された単離核酸分子、ＨＤＡＣを標的とする開示されたｓｈＲＮＡ、開示されたウイルスベクター、開示されたプロデューサー細胞、またはそれらの組み合わせの１つまたはそれより多くによって、あるいは開示された方法の１つまたはそれより多くによって処置することができそうである状態を有することが見出されたことを意味することができる。１つの局面において、検査は理学的であることが可能であり、様々な試験（例えば、血液検査、遺伝子型判定、生検など）およびアッセイ（例えば、酵素アッセイ）、またはそれらの組み合わせを伴い得る。

【0063】

「患者」は、遺伝的な疾患もしくは障害または神経学的な疾患もしくは障害と診断されている、あるいは遺伝的な疾患もしくは障害または神経学的な疾患もしくは障害を有することが疑われる対象を示し得る。１つの局面において、患者は、遺伝的な疾患または障害と診断されており、あるいは遺伝的な疾患または障害を有することが疑われ、かつ、遺伝的な疾患または障害のための処置を探し求めている、あるいは遺伝的な疾患または障害のための処置を受けている対象を示し得る。

【0064】

本明細書中で使用される場合、表現「障害のための処置を必要としていると特定された」、または同様な表現は、当該障害の処置の必要性に基づいて対象を選択することを示す。例えば、対象を、当業者による早期診断に基づいて、遺伝的な疾患もしくは障害または神経学的な疾患もしくは障害の処置の必要性があるとして特定し、その後で、その遺伝的な疾患もしくは障害または神経学的な疾患もしくは障害のための処置に供することができる。１つの局面において、特定を、診断を下す者とは異なる者によって行うことができる。１つの局面において、投与を、診断を行った者によって行うことができる。

【0065】

本明細書中で使用される場合、用語「神経学的疾患」または用語「神経学的障害」は交換可能に使用されており、対象の脳におけるニューロンに影響を及ぼす望ましくない状態の宿主を示す。これらの疾患には、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、ピック病、クフ病（Ｋｕｆ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、レビー小体病、神経原線維変化、ローゼンタール線維、マロリー硝子質、老人性認知症、重症筋無力症、ジル・ド・ラ・トゥレット症候群、多発性硬化症（ＭＳ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、てんかん、クロイツフェルト・ヤコブ病、難聴－ジトニア（ｄｙｔｏｎｉａ）症候群、リー症候群、レーバー遺伝性視神経症（ＬＨＯＮ）、パーキンソニズム、ジストニア、運動ニューロン疾患、神経障害－運動失調および網膜色素変性症（retinitis pimentosa）（ＮＡＲＰ）、母系遺伝性リー症候群（ＭＩＬＳ）、フリードライヒ運動失調症、遺伝性痙性対麻痺、モール・トラネブヤルグ（Ｍｏｈｒ－Ｔｒａｎｅｂｊａｅｒｇ）症候群、ウィルソン病、散発性アルツハイマー病、散発性筋萎縮性側索硬化症、散発性パーキンソン病、自律神経機能障害、高血圧、睡眠障害、精神神経障害、うつ病、統合失調症、統合失調感情障害、コルサコフ精神病、躁病、不安障害、恐怖症性障害、学習障害または記憶障害、健忘症または加齢性記憶喪失、注意欠陥障害、気分変調性障害、大うつ病性障害、強迫性障害、向精神物質使用障害、パニック障害、双極性感情障害、重度の双極性感情（気分）障害（ＢＰ－１）、片頭痛、活動亢進および運動障害が含まれるが、これらに限定されない。

【0066】

本明細書中で使用される場合、用語「神経学的障害の症状を防止する、または軽減する薬剤」、または用語「神経学的障害の処置のために使用される薬剤」は、開示された神経学的な疾患および障害の１つまたはそれより多くの処置のために使用されるそのような薬物を示す。そのような薬剤の例には、下記のものが含まれるが、それらに限定されない：抗コリン作用剤、例えば、トリヘキシフェニジル（Ａｒｔａｎｅ（登録商標））、ベンズトロピン（Ｃｏｇｅｎｔｉｎ（登録商標））、エトプロパジン（Ｐａｒｓｉｔａｎ（登録商標））；ベンゾジアゼピン類、例えば、ジアゼパム（Ｖａｌｉｕｍ（登録商標））、クロナゼパム（Ｋｌｏｎｏｐｉｎ（登録商標））、ロラゼパム（Ａｔｉｖａｎ（登録商標））；バクロフェン（Ｌｉｏｒｅｓａｌ（登録商標））、ドパミン作動性薬剤、例えば、レボドパ（Ｓｉｎｅｍｅｔ（登録商標））およびブロモクリプチン（Ｐａｒｌｏｄｅｌ（登録商標））；テトラベナジン（Ｘｅｎａｚｉｎｅ（登録商標））、ドパミン枯渇化剤、リトナビル、ロピナビル、など。神経学的障害および／または神経変性疾患の症状および／または合併症を処置する、防止する、抑制する、および／または改善する他の薬剤には、下記のものが含まれる：アカンプロサート錠剤（Ｃａｍｐｒａｌ ＥＣ）、アドレナリン（エピネフリン）（Ｅｍｅｒａｄｅ、ＥｐｉＰｅｎ、Ｊｅｘｔ）、アゴメラチン錠剤（Ｖａｌｄｏｘａｎ）、アルモトリプタン（Ａｌｍｏｇｒａｎ）、アマンタジン、アミスルプリド（Ｓｏｌｉａｎ）、アミトリプチリン（Ｅｌａｖｉｌ）、アポモルヒネ（ＡＰＯ－ｇｏ、Ｄａｃｅｐｔｏｎ）、アリピプラゾール（Ａｂｉｌｉｆｙ）、アリピプラゾール長時間作用注射剤（Ａｂｉｌｉｆｙ Ｍａｉｎｔｅｎａ）、アセナピン錠剤（Ｓｙｃｒｅｓｔ）、アトモキセチン（Ｓｔｒａｔｔｅｒａ）、バクロフェン（Ｌｙｆｌｅｘ、Ｌｉｏｒｅｓａｌ）、ボツリヌス毒素Ａ型（Ｂｏｔｏｘ）、ブロモクリプチン（Ｐａｒｌｏｄｅｌ）、口腔内ミダゾラム（Ｂｕｃｃｏｌａｍ、Ｅｐｉｓｔａｔｕｓ）、ブプレノルフィン（ＢｕＴｒａｎｓ、Ｈａｐｏｃｔａｓｉｎ、Ｔｅｍｇｅｓｉｃ、Ｔｅｐｈｉｎｅ、Ｔｒａｎｓｔｅｃ）、ブスピロン、カベルゴリン錠剤（Ｄｏｓｔｉｎｅｘ、Ｃａｂａｓｅｒ）、カルバマゼピン（Ｃｕｒａｔｉｌ、Ｔｅｇｒｅｔｏｌ）、クロルジアゼポキシド（Ｌｉｂｒｉｕｍ）、クロルプロマジン、シタロプラム（Ｃｉｐｒａｍｉｌ、Ｃｅｌｅｘａ）、クロバザム（Ｆｒｉｓｉｕｍ、Ｐｅｒｉｚａｍ、Ｔａｐｃｌｏｂ、Ｚａｃｃｏ）、クロメチアゾール、クロミプラミン、クロナゼパム、クロザピン（Ｃｌｏｚａｒｉｌ、Ｄｅｎｚａｐｉｎｅ、Ｚａｐｏｎｅｘ）、コベネルドパ（Ｃｏ－ｂｅｎｅｌｄｏｐａ）（Ｍａｄｏｐａｒ）、コカレルドパ（Ｃｏ－ｃａｒｅｌｄｏｐａ）（Ｓｉｎｅｍｅｔ）、ダントロレン（Ｄａｎｔｒｉｕｍ）、デキサンフェタミン（Ａｍｆｅｘａ）、ジアゼパム（Ｄｉａｚｅｍｕｌｓ、Ｓｔｅｓｏｌｉｄ）、ジバルプロエクスナトリウム（Ｄｅｐａｋｏｔｅ）、ドネペジル（Ａｒｉｃｅｐｔ）、ドキセピンカプセル剤、デュロキセチン（Ｃｙｍｂａｌｔａ、Ｄｅｐａｌｔａ、Ｄｕｃｉｌｔｉａ）、エレトリプタン（Ｒｅｌｐａｘ）、エンタカポン（Ｃｏｍｔｅｓｓ）、エスシタロプラム（Ｃｉｐｒａｌｅｘ）、エスリカルバゼピン（Ｚｅｂｉｎｉｘ）、エトスクシミド、フィンゴリモドカプセル剤（Ｇｉｌｅｎｙａ）、フルオキセチン（Ｏｌｅｎａ、Ｐｒｏｚａｃ、Ｐｒｏｚｅｐ）、フルペンチキソール長時間作用注射剤（Ｄｅｐｉｘｏｌ、Ｐｓｙｔｉｘｏｌ）、フルペンチキソール錠剤（Ｄｅｐｉｘｏｌ、Ｆｌｕａｎｘｏｌ）、フルフェナジン長時間作用注射剤（Ｍｏｄｅｃａｔｅ）、フルボキサミン錠剤（Ｆａｖｅｒｉｎ）、片頭痛用フロバトリプタン（Ｍｉｇａｒｄ）、ガバペンチン（Ｎｅｕｒｏｎｔｉｎ）、ガランタミン（Ａｃｕｍｏｒ、Ｃｏｎｓｉｏｎ、Ｅｌｍｉｎｏ、Ｇａａｌｉｎ、Ｇａｌｓｙａ、Ｇａｌｚｅｍｉｃ、Ｇａｔａｌｉｎ、Ｇａｚｙｌａｎ、Ｌｏｔｐｒｏｓｉｎ、Ｌｕｖｅｎｔａ、Ｒｅｍｉｎｙｌ）、ハロペリドール（Ｈａｌｄｏｌ、Ｓｅｒｅｎａｃｅ）、ハロペリドール長時間作用注射剤（Ｈａｌｄｏｌ Ｄｅｃａｎｏａｔｅ）、ヒドロモルホン（Ｐａｌｌａｄｏｎｅ）、イミプラミン錠剤および水剤、ラコサミド（Ｖｉｍｐａｔ）、ラモトリギン（Ｌａｍｉｃｔａｌ）、てんかん用レベチラセタム（Ｋｅｐｐｒａ、Ｄｅｓｉｔｒｅｎｄ）、レボメプロマジン錠剤（Ｎｏｚｉｎａｎ）、リスデキサンフェタミン（Ｅｌｖａｎｓｅ）、リチウム錠剤および水剤（Ｃａｍｃｏｌｉｔ、Ｌｉｓｋｏｎｕｍ、Ｐｒｉａｄｅｌ、Ｌｉ－Ｌｉｑｕｉｄ）、ロフェプラミン、ロプラゾラム、ロラゼパム、ロルメタゼパム錠剤、ルラシドン（Ｌａｔｕｄａ）、メラトニン錠剤（Ｃｉｒｃａｄｉｎ、Ｓｌｅｎｙｔｏ）、メマンチン（Ｅｂｉｘａ、Ｎｅｍｔａｄｉｎｅ）、メチルフェニデート（Ｃｏｎｃｅｒｔａ、Ｅｑｕａｓｙｍ、Ｍｅｄｉｋｉｎｅｔ、Ｒｉｔａｌｉｎ、Ｔｒａｎｑｕｉｌｙｎ）、ミアンセリン、ミドドリン（Ｂｒａｍｏｘ）、ミルタザピン（Ｚｉｓｐｉｎ ＳｏｌＴａｂ）、モクロベミド（Ｍａｎｅｒｉｘ）、モダフィニル錠剤（Ｐｒｏｖｉｇｉｌ）、モルヒネ（Ｍｏｒｐｈｇｅｓｉｃ、Ｏｒａｍｏｒｐｈ、Ｚｏｍｏｒｐｈ）、ナラトリプタン（Ｎａｒａｍｉｇ）、ネオスチグミン、ニトラゼパム（Ｍｏｇａｄｏｎ）、ノルトリプチリン錠剤、オランザピン（Ｚａｌａｓｔａ、Ｚｙｐｒｅｘａ）、オランザピン長時間作用注射剤（Ｚｙｐａｄｈｅｒａ）、オルリスタットカプセル剤（Ａｌｌｉ、Ｂｅａｃｉｔａ、Ｏｒｌｏｓ、Ｘｅｎｉｃａｌ）、オルフェナドリン、オキサゼパム、オクスカルバゼピン（Ｔｒｉｌｅｐｔａｌ）、オキシコドン（Ａｂｔａｒｄ、Ｌｏｎｇｔｅｃ、ＯｘｙＣｏｎｔｉｎ、ＯｘｙＮｏｒｍ、Ｓｈｏｒｔｅｃ）、パリペリドン（Ｉｎｖｅｇａ）、パリペリドン長時間作用注射剤（Ｘｅｐｌｉｏｎ、Ｔｒｅｖｉｃｔａ）、パロキセチン（Ｓｅｒｏｘａｔ）、ペランパネル（Ｆｙｃｏｍｐａ）、ペルゴリド、ペリシアジン、フェノバルビタール、フェニトイン（Ｅｐａｎｕｔｉｎ）、ピラセタム（Ｎｏｏｔｒｏｐｉｌ）、ピゾチフェン錠剤、プラミペキソール錠剤（Ｍｉｒａｐｅｘｉｎ、Ｏｐｒｙｍｅａ、Ｐｉｐｅｘｕｓ、Ｇｌｅｐａｒｋ）、プレガバリン（Ａｌｚａｉｎ、Ａｘａｌｉｄ、Ｌｅｃａｅｎｔ、Ｌｙｒｉｃａ）、プリミドン、プロクロルペラジン（Ｂｕｃｃａｓｔｅｍ、Ｓｔｅｍｅｔｉｌ）、プロシクリジン（Ｋｅｍａｄｒｉｎ）、ピリドスチグミン（Ｍｅｓｔｉｎｏｎ）、クエチアピン（Ｓｅｒｏｑｕｅｌ）、ラサギリン（Ａｚｉｌｅｃｔ）、レボキセチン錠剤（Ｅｄｒｏｎａｘ）、リスペリドン（Ｒｉｓｐｅｒｄａｌ）、リスペリドン長時間作用注射剤（Ｒｉｓｐｅｒｄａｌ Ｃｏｎｓｔａ）、リバスチグミン（Ａｌｚｅｓｔ、Ｅｘｅｌｏｎ、Ｎｉｍｖａｓｔｉｄ）、片頭痛用リザトリプタン（Ｍａｘａｌｔ）、ロピニロール錠剤（Ｒｅｑｕｉｐ、Ａｄａｒｔｒｅｌ）、ロチゴチンパッチ（Ｎｅｕｐｒｏ）、てんかん用ルフィナミド（Ｉｎｏｖｅｌｏｎ）、セレギリン（Ｅｌｄｅｐｒｙｌ）、セルトラリン（Ｌｕｓｔｒａｌ、Ｚｏｌｏｆｔ）、ナトリウムオキシベート（Ｘｙｒｅｍ）、バルプロ酸ナトリウム（Ｅｐｉｌｉｍ、Ｅｐｉｓｅｎｔａ、Ｅｐｉｖａｌ、Ｃｏｎｖｕｌｅｘ）、スルピリド、スマトリプタン（Ｉｍｉｇｒａｎ）、テマゼパム、テトラベナジン錠剤（Ｔａｒｄｉｂｅｎ、Ｘｅｎａｚｉｎｅ）、チアガビン（Ｇａｂｉｔｒｉｌ）、チザニジン、トルカポン（Ｔａｓｍａｒ）、トピラマート（Ｔｏｐａｍａｘ）、トピラマート（Ｔｏｐａｍａｘ）、トラゾドン（Ｍｏｌｉｐａｘｉｎ）、トリヘキシフェニジル、トリミプラミン、バルプロ酸セミナトリウム（Ｂｅｌｖｏ、Ｄｅｐａｋｏｔｅ、Ｓｙｏｎｅｌｌ）、ベンラファキシン（Ｅｆｅｘｏｒ ＸＬ、Ｅｆｆｅｘｏｒ ＸＲ）、ビガバトリン（Ｓａｂｒｉｌ、Ｋｉｇａｂｅｑ）、ボルチオキセチン（Ｂｒｉｎｔｅｌｌｉｘ）、ゾルミトリプタン（Ｚｏｍｉｇ）、ゾルピデム錠剤（Ｓｔｉｌｎｏｃｔ）、ゾニサミド（Ｚｏｎｅｇｒａｎ、Ｄｅｓｉｚｏｎ）、ゾピクロン錠剤（Ｚｉｍｏｖａｎｅ）、およびズクロペンチキソール（Ｃｌｏｐｉｘｏｌ）。１つの局面において、これらの薬剤の１つまたは組み合わせをどのようなものであれ、開示された方法において使用される治療用薬剤とすることができる。

【0067】

「同一の」または「同一性」は、２またはそれを超える核酸またはポリペプチド配列に関連して本明細書中で使用される場合、指定された領域にわたって同じである指定された百分率の残基をこれらの配列が有することを意味する。この百分率は、２つの配列を最適にアラインメントし、２つの配列を指定された領域にわたって比較し、同一の残基が両方の配列において存在する位置の数を、一致した位置の数を与えるために決定し、一致した位置の数を指定された領域における位置の総数で割り、その結果に、配列同一性の百分率を与えるために１００を乗じることによって計算することができる。２つの配列が異なる長さのものである場合、あるいはアラインメントにより、１またはそれを超える互い違いの末端が生じ、比較の指定された領域には単一の配列のみが含まれる場合、単一の配列の残基は、計算の分子ではなく、分母に含まれる。ＤＮＡとＲＮＡとを比較するときには、チミン（Ｔ）とウラシル（Ｕ）とは、同等であるとみなすことができる。同一性を手作業によって、またはコンピューター配列アルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴまたはＢＬＡＳＴ ２．０）を使用することによって行うことができる。

【0068】

ペプチドまたはポリペプチドに関する「バリアント」は、アミノ酸配列がアミノ酸の挿入、欠失または保存的置換によって異なるが、少なくとも１つの生物学的活性を保持する。バリアントはまた、少なくとも１つの生物学的活性を保持するアミノ酸配列を有する参照タンパク質と実質的に同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質を意味する場合がある。アミノ酸の保存的置換、すなわち、あるアミノ酸を、類似する性質（例えば、帯電領域の親水性、程度および分布）の異なるアミノ酸で置き換えることが、典型的には軽微な変化を伴うものとしてこの技術分野では認識されている。このような軽微な変化を、この技術分野では理解されているように、アミノ酸のヒドロパシー指標を考慮することによって、部分的にではあるが、特定することができる。アミノ酸のヒドロパシー指標は、その疎水性および電荷を考慮することに基づく。類似するヒドロパシー指標のアミノ酸が代わりに使用され、タンパク質機能を依然として保持し得ることが、この技術分野では知られている。１つの局面において、±２のヒドロパシー指標を有するアミノ酸が代わりに使用される。アミノ酸の親水性もまた、生物学的機能を保持するタンパク質をもたらすであろう置換を明らかにするために使用される場合がある。ペプチドに関連してアミノ酸の親水性を考慮することにより、そのペプチドの最大局所的平均親水性を計算することができる。様々な置換を、互いに±２以内である親水性値を有するアミノ酸を用いて行うことができる。アミノ酸の疎水性指数および親水性値の両方がそのアミノ酸の特定の側鎖によって影響される。その観察と一致して、生物学的機能と適合するアミノ酸置換が、疎水性、親水性、電荷、サイズおよび他の特性によって明らかにされるようなアミノ酸の相対的類似性、および特にそれらのアミノ酸の側鎖に依存することが理解されている。

【0069】

「ベクター」は、本明細書中で使用される場合、複製起点を含有する核酸配列を意味する。ベクターは、ウイルスベクター、バクテリオファージ、細菌人工染色体または酵母人工染色体であることが可能である。ベクターはＤＮＡベクターまたはＲＮＡベクターであることが可能である。ベクターは自己複製性の染色体外ベクターであることが可能であり、好ましくはＤＮＡプラスミドである。

【0070】

本明細書中で使用される場合、“ｉｎｈｉｂｉｔ”（阻害する）、“ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ”（阻害すること）、および“ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ”（阻害）は、活性、発現、レベル、応答、状態、重症度、疾患、または他の生物学的パラメーターを減らすこと、または低下させることを意味する。これには、活性、発現、レベル、応答、状態、重症度、疾患、または他の生物学的パラメーターの完全な消失が含まれ得るが、これに限定されない。これにはまた、例えば、ネイティブレベルまたは対照レベル（例えば、野生型の、または正常なＨＤＡＣ遺伝子型）と比較した場合の、活性、発現、レベル、応答、状態、重症度、疾患または他の生物学的パラメーターにおける１０％の阻害または減少が含まれることが可能である。したがって、１つの局面において、阻害または減少は、ネイティブレベルまたは対照レベルと比較した場合の１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、またはその間の任意の減少量であることが可能である。１つの局面において、阻害または減少は、ネイティブレベルまたは対照レベルと比較した場合の１０～２０％、２０～３０％、３０～４０％、４０～５０％、５０～６０％、６０～７０％、７０～８０％、８０～９０％、または９０～１００％であることが可能である。１つの局面において、阻害または減少は、ネイティブレベルまたは対照レベルと比較した場合の０～２５％、２５～５０％、５０～７５％、または７５～１００％であることが可能である。１つの局面において、ネイティブレベルまたは対照レベルは疾患前または障害前のレベルであることが可能である。

【0071】

本明細書中で使用される場合、用語“ｉｎｃｒｅａｓｅ”（増大させる、増加させる）、用語“ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ”（増大させること、増加させること）、用語“ｉｎｃｒｅａｓｅｄ”（増大した、増加した）、用語“ｅｎｈａｎｃｅ”（増強する）、用語“ｅｎｈａｎｃｅｄ”（増強された）、用語“ｅｎｈａｎｃｉｎｇ”（増強すること）、および用語“ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ”（増強）（ならびにそれらの文法的変化形）は、対照と比較した場合の少なくとも約２５％、５０％、７５％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％またはそれを超える上昇（例えば、増加した力価、増大した発現能、増大したパッケージング能、増大した形質導入効率、またはそれらの任意の組み合わせ）を表す。

【0072】

「単離された」ポリヌクレオチドまたは「単離された」ポリペプチドは、人の手によってであるが、そのネイティブ環境から離れて存在し、そのため、天然の産物ではないヌクレオチド配列またはポリペプチド配列である。１つの局面において、本開示のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは「単離され」ている。単離されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、天然に存在する生物またはウイルスの他の成分の少なくともいくつかから、例えば、細胞またはウイルスの構造成分、あるいは当該ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに付随して一般に見出される他のポリペプチドまたはポリヌクレオチドから少なくとも部分的に分離される精製された形態で存在することができる。１つの局面において、単離されたポリヌクレオチドおよび／または単離されたポリペプチドは、少なくとも約１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはそれを超える純度である。

【0073】

本明細書中では交換可能に使用される「マルチシストロン性の」または「ポリシストロン性の」は、同じポリヌクレオチドから２つ以上のタンパク質を産生するための２つ以上のコード領域を有するポリヌクレオチドを示す。ポリシストロン性ポリヌクレオチド配列には、（内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、切断ペプチド（ｐ２Ａ、ｔ２Ａ、など）、異なるプロモーターの利用などが含まれることが可能である。

【0074】

本明細書中で使用される場合、用語「パーセント配列同一性」または用語「パーセント同一性」は、２つの配列が最適にアライメントされるときにおいて、試験（「対象」）ポリヌクレオチド分子（またはその相補鎖）と比較した場合の参照（「照会」）ポリヌクレオチド分子（またはその相補鎖）の線状ポリヌクレオチドにおける同一ヌクレオチドの百分率を示す。１つの局面において、「パーセント同一性」はアミノ酸配列における同一アミノ酸の百分率を示すことができる。

【0075】

「変異体遺伝子」または「変異した遺伝子」は、本明細書中では交換可能に使用されるが、検出可能な変異を受けている遺伝子を示す。変異体遺伝子は、遺伝子の正常な伝達および発現に影響を及ぼす変化、例えば、遺伝物質の喪失、獲得または交換を受けている。

【0076】

「ネイティブ」または「野生型」の核酸、ヌクレオチド配列、ポリペプチドまたはアミノ酸配列は、天然に存在する、または内因性の核酸、ヌクレオチド配列、ポリペプチドまたはアミノ酸配列を示す。したがって、例えば、「野生型ｍＲＮＡ」は、生物において天然に存在するｍＲＮＡ、または生物に対して内因性であるｍＲＮＡである。「相同的」核酸は、当該核酸が導入される宿主細胞に天然において関連するヌクレオチド配列である。

【0077】

単語“ｔｒｅａｔ”（処置する）、または単語“ｔｒｅａｔｉｎｇ”（処置すること）、または単語“ｔｒｅａｔｍｅｎｔ”（処置）には、緩和処置、すなわち、疾患、病理学的状態または障害の治癒よりはむしろ症状の救済のために設計される処置；防止的処置、すなわち、関連した疾患、病理学的状態または障害の発症を最小限に抑えること、または部分的もしくは完全に抑制することに向けられる処置；および支持的処置、すなわち、関連した疾患、病理学的状態または障害（例えば、遺伝的な疾患もしくは障害または神経学的な疾患もしくは障害）の改善に向けられる別の特定の治療を補うために用いられる処置が含まれる。１つの局面において、これらの用語は、哺乳動物（例えば、ヒト）を含めて対象の処置をどのようなものであれ包含し、これらの用語には、（ｉ）疾患に罹りやすい可能性があり、しかし、当該疾患を有するとして未だ診断されていない対象において、望ましくない生理学的変化、疾患、病理学的状態または障害が生じることを防止すること；（ｉｉ）生理学的変化、疾患、病理学的状態または障害を抑制すること、すなわち、その発達を停止させること；あるいは（ｉｉｉ）生理学的変化、疾患、病理学的状態または障害を救済すること、すなわち、疾患の退行を引き起こすことが含まれる。例えば、１つの局面において、遺伝的な疾患もしくは障害または神経学的な疾患もしくは障害を処置することにより、対象における確立した遺伝的な疾患もしくは障害または神経学的な疾患もしくは障害の重症度を、対照（例えば、遺伝的な疾患もしくは障害または神経学的な疾患もしくは障害を有しない個体など）と比較した場合に１％～１００％軽減させることができる。１つの局面において、処置することは、遺伝的な疾患もしくは障害または神経学的な疾患もしくは障害の重症度における、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％の軽減を示し得る。例えば、遺伝的な疾患もしくは障害または神経学的な疾患もしくは障害を処置することにより、対象における１またはそれを超える症状を、対照（例えば、遺伝的な疾患もしくは障害または神経学的な疾患もしくは障害を有しない個体など）と比較した場合に１％～１００％軽減させることができる。１つの局面において、処置することは、確立した遺伝的な疾患もしくは障害または神経学的な疾患もしくは障害の１またはそれを超える症状の、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％の軽減を示し得る。処置は遺伝的な疾患もしくは障害または神経学的な疾患もしくは障害の治癒あるいは完全な消失または根絶を必ずしも示していないことが理解される。しかしながら、１つの局面において、処置は、遺伝的な疾患もしくは障害または神経学的な疾患もしくは障害の治癒あるいは完全な消失または根絶を示し得る。

【0078】

本明細書中で使用される場合、用語“ｐｒｅｖｅｎｔ”（防止する）、または用語“ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ”（防止すること）、または用語“ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ”（防止）は、特に事前の行動によって何かが起こることを排除すること、避けること、取り除くこと、未然に防ぐこと、止めること、または妨害することを示す。ｒｅｄｕｃｅ（軽減させる）、ｉｎｈｉｂｉｔ（抑制する、阻害する）、またはｐｒｅｖｅｎｔ（防止する）が本明細書中で使用される場合には、具体的に別途示されている場合を除き、他の２つの単語の使用もまた明示的に開示されることが理解される。１つの局面において、遺伝的な疾患もしくは障害または神経学的な疾患もしくは障害を防止することが意図される。単語“ｐｒｅｖｅｎｔ”（防止する）、および単語“ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ”（防止すること）、および単語“ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ”（防止）はまた、遺伝的な疾患もしくは障害または神経学的な疾患もしくは障害の所与の関連合併症を有しない対象（例えば、個体）がその合併症に進行することから保護するための、あるいは進行することを排除するための予防的措置または防止的措置を示す。

【0079】

本明細書中で使用される場合、「短いヘアピンＲＮＡ」または「ｓｈＲＮＡ」は、プラスミドによるトランスフェクションまたはウイルスによる形質導入を介して細胞に導入することができるＤＮＡベクターに通常の場合にはコードされる配列を示す。この技術分野では知られているように、ｓｈＲＮＡ分子は、その設計に基づいて２つの主要なカテゴリーに、すなわち、単純なステム－ループｓｈＲＮＡと、マイクロＲＮＡ適合ｓｈＲＮＡとに分けることができる。単純なステム－ループｓｈＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（Ｐｏｌ ＩＩＩ）プロモーターの制御のもとで転写されることが多い。５０～７０ヌクレオチドの転写物により、主に一本鎖ＲＮＡの領域（ループ）によって架橋される二本鎖ＲＮＡの１９～２９ｂｐ領域（ステム）と、ジヌクレオチドの３’側突出部とからなるステム－ループ構造が形成される。この単純なステム－ループｓｈＲＮＡは核において転写され、ｐｒｅ－マイクロＲＮＡに類似してＲＮＡｉ経路に入る。より長い（２５０ヌクレオチド超の）マイクロＲＮＡ適合ｓｈＲＮＡは、ネイティブｐｒｉ－マイクロＲＮＡ分子によりよく似ている設計物で、かつ、マイクロＲＮＡ様ミスマッチが含まれてもよいｓｈＲＮＡステム構造からなる設計物であって、ループによって架橋され、かつ、５’側および３’側の内因性マイクロＲＮＡ配列に挟まれた設計物である。このマイクロＲＮＡ適合ｓｈＲＮＡは、単純なステム－ループ・ヘアピンと同様に、これも核において転写され、しかし、内因性ｐｒｉ－マイクロＲＮＡに類似してより早くＲＮＡｉ経路に入ると考えられる。

【0080】

本明細書中で使用される場合、「作動可能に連結される」は、遺伝子の発現が、当該遺伝子が空間的につながるプロモーターの制御のもとにあることを意味する。プロモーターを、その制御のもとにある遺伝子の５’側（上流側）または３’側（下流側）に配置することができる。プロモーターと遺伝子との間の距離は、そのプロモーターと、プロモーターが由来する遺伝子においてプロモーターが制御する遺伝子との間の距離とほぼ同じにすることができる。この技術分野では知られているように、この距離における変動を、プロモーター機能の喪失を伴うことなく受け入れることができる。

【0081】

「アデノ随伴ウイルス」または「ＡＡＶ」は、本明細書中では交換可能に使用されるが、ヒトおよびいくつかの他の霊長類種に感染するパルボウイルス科のデペンドウイルス属に属する小型ウイルスを示すことができる。ＡＡＶは現在、疾患を引き起こすことは知られておらず、結果として、このウイルスは非常に軽度の免疫応答を引き起こす。

【0082】

用語「レンチウイルスベクター」は、本明細書中で使用される場合、１またはそれを超える「異種」（すなわち、非レンチウイルス）核酸配列が含まれるベクターを示すことができる。１つの局面において、本明細書中のレンチウイルスベクターは、レンチウイルスからの１またはそれを超えるタンパク質の非コード配列を含有する場合がある。本明細書中での使用のための「レンチウイルス移入ベクター」には、異種核酸配列、例えば、細胞内に移入されることになる異種核酸配列が含まれる場合があり、また、１またはそれを超えるレンチウイルス遺伝子、あるいはその一部分がさらに含まれる場合がある。本明細書中での使用のための「レンチウイルスパッケージングベクター」には、レンチウイルスタンパク質をコードする１またはそれを超える遺伝子、あるいはその一部分が含まれる場合がある。例えば、レンチウイルスエンベロープタンパク質には、エンベロープ（Ｅｎｖ）タンパク質をコードする遺伝子、またはその一部分が含まれる場合がある。１つの局面において、宿主細胞を、レンチウイルスベクターと、必要に応じて、レンチウイルスのパッケージングタンパク質（例えば、ＶＳＶ－Ｇ、Ｒｅｖ、およびＧａｇ／Ｐｏｌ）を発現させて、レンチウイルス粒子を培養培地に産生させるための追加のベクターとを用いてトランスフェクトすることができる。

【0083】

本明細書中で使用される場合、「キメラの」は、少なくとも２つの成分が、異なる供給源（例えば、異なる生物、異なるコード領域）に由来する核酸分子および／またはポリペプチドを示すことができる。本明細書中でもまた使用されるように、キメラのは、核酸に連結されるポリペプチドを含む構築物を示す。

【0084】

「エピゲノム修飾」は、本明細書中で使用される場合、ゲノムの修飾に由来しない遺伝子活性および遺伝子発現に影響を及ぼす１またはそれを超える染色体における修飾または変化を示す。エピゲノム修飾は、ゲノムに対する機能的に関連のある変化で、ヌクレオチド配列における変化を伴わないものに関係する。エピゲノム修飾には、ヒストンに対する修飾、例えば、アセチル化、メチル化、リン酸化、ユビキチン化および／またはＳＵＭＯ化が含まれる場合がある。エピゲノム修飾には、ＤＮＡに対する修飾、例えば、メチル化が含まれる場合がある。

【0085】

「コード配列」または「コード核酸」は、本明細書中で使用される場合、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸（ＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子）を意味する。コード配列にはさらに、核酸が投与される個体または哺乳動物の細胞において発現を導くことが可能であるプロモーターおよびポリアデニル化シグナルが含まれる調節エレメントに作動可能に連結される開始シグナルおよび終結シグナルが含まれることが可能である。コード配列はコドン最適化されることが可能である。

【0086】

「融合タンパク質」は、本明細書中で使用される場合、元々は別個のタンパク質（例えば、Ｃａｓ、および酵素活性を有するポリペプチド）についてコードしていた２またはそれを超える遺伝子をつなぐことにより作り出されるキメラなタンパク質を示す。融合遺伝子の翻訳により、元のタンパク質のそれぞれに由来する機能的特性を有する単一のポリペプチドがもたらされる。

【0087】

本明細書中で使用される場合、用語「投与すること」および用語「投与」は、開示された治療用薬剤、開示された医薬製剤、またはそれらの組み合わせの１つまたはそれより多くを対象に与える方法をどのようなものであれ示す。そのような様々な方法が当業者には広く知られており、これらには、下記の経路が含まれるが、それらに限定されない：経口投与、経皮投与、吸入による投与、鼻腔投与、局所投与、子宮内投与、肝臓内投与、膣内投与、眼投与、耳内投与、耳投与、脳内投与、直腸投与、舌下投与、頬側投与、および非経口投与（静脈内投与、ＣＳＦ内投与、動脈内投与、筋肉内投与および皮下投与などの注射可能なものが含まれる）。投与にはまた、肝臓動脈内投与、または肝門脈（ＨＰＶ）を介する投与が含まれることが可能である。開示された治療用薬剤、開示された医薬組成物、またはそれらの組み合わせの投与は、直接にＣＮＳへの投与（例えば、実質内送達、脳室内（ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖｅｎｔｒｉｕｌａｒ）送達、髄腔内（ｉｎｔｈｒａｔｈｅｃａｌ）大槽送達、髄腔内（腰椎）送達、深部灰白質送達、深部灰白質への対流増強送達）、またはＰＮＳへの投与を含むことができる。投与は連続的または間欠的であることが可能である。投与は、ウイルスベクター、および／または生じた最適化ウイルスベクターを投与することを含むことができる。

【0088】

１つの局面において、「治療用薬剤（therapeutic agent）」は、局所的または全身的な生物学的効果、生理学的効果または治療的効果を、それが適用される生物学的系においてもたらすことが可能である薬剤を示す「生物学的に活性な薬剤」または「生物学的活性薬剤」または「生物活性薬剤」であることが可能である。例えば、生物活性薬剤は、数ある機能の中でも、感染または炎症を抑制するように、細胞成長および組織再生を増強するように、腫瘍成長を抑制するように、鎮痛薬として作用するように、抗細胞付着を促進するように、また、骨成長を増強するように作用することができる。他の好適な生物活性薬剤には、抗ウイルス剤、ワクチン、ホルモン、抗体（活性な抗体フラグメント、ｓＦｖフラグメント、ＦｖフラグメントおよびＦａｂフラグメントが含まれる）、アプタマー、ペプチド模倣物、機能的核酸、治療用タンパク質、ペプチド、または核酸が含まれることが可能である。他の生物活性薬剤には、投与されるときには生物学的に活性ではなく、しかし、対象に投与されると、代謝または何らかの他の機構を介して生物活性薬剤に変換される薬剤であるプロドラッグが含まれる。加えて、本発明の組成物のどれもが、２またはそれを超える生物活性薬剤の組み合わせを含有することができる。生物学的に活性な薬剤は、様々な対象への投与、例えば、ヒトへの投与（すなわち、医学的投与）、または動物への投与（すなわち、獣医学的投与）に関連して使用され得ることが理解される。本明細書中で使用される場合、生物学的に活性な薬剤の列挙は本質的に、その医薬的に許容される塩を包含する。

【0089】

本明細書中で使用される場合、用語「医薬的に活性な薬剤」には、「薬物」または「ワクチン」が含まれ、この用語は、診断的、治療的、予防医学的または獣医学的な目的のために生物に投与される分子、一群の分子、複合体または物質を意味する。この用語には、臨床的および獣医学的なスクリーニング、防止、予防、治癒、ウェルネス、検出、画像化、診断、治療、手術、モニタリング、化粧品、プロテーゼ、法医学などにおいて有用である調製物を含めて、体外および体内に施された局所的、限局的および全身的な、ヒトおよび動物医薬品、処置、治療薬、栄養補助食品、機能性化粧品、生物製剤、デバイス、診断薬および避妊薬が含まれる。この用語はまた、植物、動物および／またはヒトを接触させることを含む、あるいは、植物、動物および／またはヒトを接触させることが可能である細胞受容体、膜受容体、ホルモン受容体、治療用受容体、微生物、ウイルスまたは選択された標的を認識することが可能である選択された分子または選択された核酸配列を含む、アグリスーティカル、職場、軍事、産業および環境のための治療剤または治療薬に関して使用される場合がある。この用語にはまた、生物活性効果を生じさせる核酸（例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ））、およびそのような核酸を含む化合物が特に含まれることが可能である。医薬的に活性な薬剤には、本明細書中に開示されたカテゴリーおよび具体例が含まれる。カテゴリーが具体例によって限定されることは意図されない。当業者は、本明細書中に開示されたカテゴリーの範囲内に含まれ、かつ、本発明に従って有用である多数の他の化合物もまた認識する。例には、放射線増感剤、放射線増感剤と化学療法剤との組み合わせ、ステロイド類、キサンチン類、ベータ－２－アゴニスト気管支拡張剤、抗炎症剤、鎮痛剤、カルシウムアンタゴニスト、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、ベータ遮断剤、中枢活性なアルファ－アゴニスト、アルファ－１－アンタゴニスト、炭酸脱水酵素阻害剤、プロスタグランジン類似体、アルファアゴニストとベータ遮断剤との組み合わせ、炭酸脱水酵素阻害剤とベータ遮断剤との組み合わせ、抗コリン作用性／鎮痙性薬剤、バソプレシン類似体、抗不整脈剤、抗パーキンソン病剤、抗狭心症／降圧性薬剤、抗凝固剤、抗血小板剤、鎮静剤、抗不安（ａｎｓｉｏｌｙｔｉｃ）剤、ペプチド性薬剤、生体高分子薬剤、抗新生物剤、緩下剤、下痢止め剤、抗菌剤、抗真菌剤、またはワクチンが含まれる。さらなる局面において、医薬的に活性な薬剤は、クマリン、アルブミン；ブロモリジン；ステロイド類、例えば、ベタメタゾン、デキサメタゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、プレドニゾン、トリアムシノロン、ブデソニド、ヒドロコルチゾン、および医薬的に許容され得るヒドロコルチゾン誘導体；キサンチン類、例えば、テオフィリンおよびドキソフィリン（ｄｏｘｏｐｈｙｌｌｉｎｅ）；ベータ－２－アゴニスト気管支拡張剤、例えば、サルブタモール、フェンテロール、クレンブテロール、バンブテロール、サルメテロール、フェノテロール；抗炎症剤、これには、抗喘息性抗炎症剤、抗関節炎抗炎症剤、および非ステロイド性抗炎症剤が含まれ、それらの例には、スルフィド類、メサラミン、ブデソニド、サラゾピリン、ジクロフェナク、医薬的に許容され得るジクロフェナク塩、ニメスリド、ナプロキセン、アセトミノフェン、イブプロフェン、ケトプロフェンおよびピロキシカムが含まれるが、これらに限定されない；鎮痛剤、例えば、サリチル酸系化合物；カルシウムチャネル遮断剤、例えば、ニフェジピン、アムロジピンおよびニカルジピン；アンジオテンシン変換酵素阻害剤、例えば、カプトプリル、ベナゼプリル塩酸塩、ホシノプリルナトリウム、トランドラプリル、ラミプリル、リシノプリル、エナラプリル、キナプリル塩酸塩およびモエキシプリル塩酸塩；ベータ遮断剤（すなわち、ベータアドレナリン作動性遮断薬剤）、例えば、ソタロール塩酸塩、チモロールマレイン酸塩、チモール（ｔｉｍｏｌ）半水和物、レボブノロール塩酸塩、エスモロール塩酸塩、カルテオロール、プロパノロール（ｐｒｏｐａｎｏｌｏｌ）塩酸塩、ベタキソロール塩酸塩、ペンブトロール硫酸塩、メトプロロール酒石酸塩、メトプロロールコハク酸塩、アセブトロール塩酸塩、アテノロール、ピンドロールおよびビソプロロールフマル酸塩；中枢活性なアルファ－２－アゴニスト（すなわち、アルファアドレナリン作動性受容体アゴニスト）、例えば、クロニジン、ブリモニジン酒石酸塩およびアプラクロニジン塩酸塩；アルファ－１－アンタゴニスト、例えば、ドキサゾシンおよびプラゾシン；抗コリン作用性／鎮痙性薬剤、例えば、ジサイクロミン塩酸塩、スコポラミン臭化水素酸塩、グリコピロラート、臭化クリジニウム、フラボキサートおよびオキシブチニン；バソプレシン類似体、例えば、バソプレシンおよびデスモプレシン；プロスタグランジン類似体、例えば、ラタノプロスト、トラボプロストおよびビマトプロスト；コリン作用性薬剤（すなわち、アセチルコリン受容体アゴニスト）、例えば、ピロカルピン塩酸塩およびカルバコール；グルタミン酸受容体アゴニスト、例えば、Ｎ－メチルＤ－アスパラギン酸受容体アゴニストのメマンチン；抗血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）アプタマー、例えば、ペガプタニブ；抗ＶＥＧＦ抗体（これには、抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体が含まれるが、これに限定されない）、例えば、ラニビズマブおよびベバシズマブ；炭酸脱水酵素阻害剤、例えば、メタゾラミド、ブリンゾラミド、ドルゾラミド塩酸塩およびアセタゾラミド；抗不整脈剤、例えば、キニジン、リドカイン、トカイニド塩酸塩、メキシレチン塩酸塩、ジゴキシン、ベラパミル塩酸塩、プロパフェノン塩酸塩、フレカイミド酢酸塩、プロカインアミド塩酸塩、モリシジン塩酸塩およびジイソピラミド（ｄｉｉｓｏｐｙｒａｍｉｄｅ）リン酸塩；抗パーキンソン病剤、例えば、ドパミン、Ｌ－Ｄｏｐａ／カルビドパ、セレギリン、ジヒドロエルゴクリプチン、ペルゴリド、リスリド、アポモルヒネおよびブロモクリプチン；抗狭心症剤および降圧剤、例えば、一硝酸イソソルビド、二硝酸イソソルビド、プロプラノロール、アテノロールおよびベラパミル；抗凝固剤および抗血小板剤、例えば、クマジン、ワルファリン、アセチルサリチル酸およびチクロピジン；鎮静剤、例えば、ベンゾジアザピン類およびバルビツール酸系化合物；抗不安（ａｎｓｉｏｌｙｔｉｃ）剤、例えば、ロラゼパム、ブロマゼパムおよびジアゼパム；ペプチド性薬剤および生体高分子薬剤、例えば、カルシトニン、ロイプロリドおよび他のＬＨＲＨアゴニスト、ヒルジン、シクロスポリン、インスリン、ソマトスタチン、プロチレリン、インターフェロン、デスモプレシン、ソマトトロピン、チモペンチン、ピドチモド、エリスロポイエチン、インターロイキン類、メラトニン、顆粒球／マクロファージ－ＣＳＦおよびヘパリン；抗新生物剤、例えば、エトポシド、リン酸エトポシド、シクロホスファミド、メトトレキサート、５－フルオロウラシル、ビンクリスチン、ドキソルビシン、シスプラチン、ヒドロキシ尿素、ロイコボリンカルシウム、タモキシフェン、フルタミド、アスパラギナーゼ、アルトレタミン、ミトタンおよびプロカルバジン塩酸塩；緩下剤、例えば、センナ濃縮物、カサンスラノール、ビサコジルおよびナトリウムピコスルファート；下痢止め剤、例えば、ジフェノキシン塩酸塩、ロペラミド塩酸塩、フラゾリドン、ジフェノキシラート塩酸塩および微生物；ワクチン、例えば、細菌ワクチンおよびウイルスワクチン；抗菌剤、例えば、ペニシリン類、セファロスポリン類およびマクロライド類な；抗真菌剤、例えば、イミダゾール系誘導剤およびトリアゾール系誘導体；ならびに核酸、例えば、生物学的タンパク質についてコードするＤＮＡ配列、およびアンチセンスオリゴヌクレオチドが可能である。医薬的に活性な薬剤は、様々な対象への投与、例えば、ヒトへの投与（すなわち、医学的投与）、または動物への投与（すなわち、獣医学的投与）に関連して使用され得ることが理解される。本明細書中で使用される場合、医薬的に活性な薬剤の列挙は本質的に、その医薬的に許容される塩を包含する。

【0090】

１つの局面において、「治療用薬剤」は、遺伝的な疾患もしくは障害または神経学的な疾患もしくは障害を有する対象、遺伝的な疾患もしくは障害または神経学的な疾患もしくは障害を有することが疑われる対象、ならびに／あるいは遺伝的な疾患もしくは障害または神経学的な疾患もしくは障害を発症しそうである対象において、所望の臨床成績をもたらす薬剤がどのようなものであれ可能である。１つの局面において、開示された治療用薬剤はオリゴヌクレオチド治療用薬剤であることが可能である。開示されたオリゴヌクレオチド治療用薬剤は、一本鎖または二本鎖のＤＮＡ、ｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）、アンチセンス分子、ｍｉＲＮＡ、モルホリノ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、あるいはそれらの類似体またはコンジュゲートを含むことができる。１つの局面において、開示されたオリゴヌクレオチド治療用薬剤はＡＳＯまたはＲＮＡｉであることが可能である。１つの局面において、開示されたオリゴヌクレオチド治療用薬剤は、１またはそれを超える改変をどのような位置であれ適用可能である位置において含むことができる。

【0091】

１つの局面において、当業者は、遺伝的な疾患もしくは障害または神経学的な疾患もしくは障害を処置するために、または防止するために、１またはそれを超える開示された単離核酸分子、ＨＤＡＣを標的とする１またはそれを超える開示されたｓｈＲＮＡ、１またはそれを超える開示されたウイルスベクター、１またはそれを超える開示されたプロデューサー細胞、あるいはそれらの組み合わせのための効果的な用量、効果的なスケジュール、および効果的な投与経路を決定することができる。１つの局面において、当業者はまた、１またはそれを超える開示された単離核酸分子、ＨＤＡＣを標的とする１またはそれを超える開示されたｓｈＲＮＡ、１またはそれを超える開示されたウイルスベクター、１またはそれを超える開示されたプロデューサー細胞、あるいはそれらの組み合わせの効力を改善するために、投与するステップの局面を変更することができ、変えることができ、または改変することができる。１つの局面において、当業者は、１またはそれを超える開示された単離核酸分子、ＨＤＡＣを標的とする１またはそれを超える開示されたｓｈＲＮＡ、１またはそれを超える開示されたウイルスベクター、１またはそれを超える開示されたプロデューサー細胞、あるいはそれらの組み合わせのための効果的な用量、効果的なスケジュール、および効果的な投与経路を決定することができる。

【0092】

本明細書中で使用される場合、「方法を改変すること」は、開示された方法の１またはそれを超えるステップの１またはそれを超える特徴または局面を改変すること、または変えることを含むことができる。例えば、１つの局面において、開示された方法は、対象に投与される１またはそれを超える開示された単離核酸分子、ＨＤＡＣを標的とする１またはそれを超える開示されたｓｈＲＮＡ、１またはそれを超える開示されたウイルスベクター、１またはそれを超える開示されたプロデューサー細胞、あるいはそれらの組み合わせの量を変えることによって、あるいは１またはそれを超える開示された単離核酸分子、ＨＤＡＣを標的とする１またはそれを超える開示されたｓｈＲＮＡ、１またはそれを超える開示されたウイルスベクター、１またはそれを超える開示されたプロデューサー細胞、あるいはそれらの組み合わせの投与頻度を変えることによって、あるいは対象に投与される１またはそれを超える開示された単離核酸分子、ＨＤＡＣを標的とする１またはそれを超える開示されたｓｈＲＮＡ、１またはそれを超える開示されたウイルスベクター、１またはそれを超える開示されたプロデューサー細胞、あるいはそれらの組み合わせの期間を変えることによって変更することができる。

【0093】

本明細書中で使用される場合、“ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔｌｙ”（併せて）は、（１）時間的に同時に（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ）、または（２）共通した処置スケジュールの経過の間の異なる時間において、を意味する。

【0094】

用語「接触させる」は、本明細書中で使用される場合、１またはそれを超える開示された単離核酸分子、ＨＤＡＣを標的とする１またはそれを超える開示されたｓｈＲＮＡ、１またはそれを超える開示されたウイルスベクター、１またはそれを超える開示されたプロデューサー細胞、またはそれらの組み合わせが影響を意図された標的または標的となった領域に対して直接的または間接的にどちらであれ及ぼすような様式で、１またはそれを超える開示された単離核酸分子、ＨＤＡＣを標的とする１またはそれを超える開示されたｓｈＲＮＡ、１またはそれを超える開示されたウイルスベクター、１またはそれを超える開示されたプロデューサー細胞、またはそれらの組み合わせを標的領域または意図された標的領域と一緒にすることを示す。標的領域は、細胞の集まり、または細胞株（例えば、哺乳動物細胞株など）であることが可能である。標的は分裂細胞および／または非分裂細胞を含むことができる。標的は、生じた最適化ウイルスベクターによって形質導入されることになる細胞、例えば、哺乳動物細胞（例えば、ヒト、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコまたはげっ歯類の細胞）などであることが可能である。１つの局面において、生じた最適化ウイルスベクターによって形質導入されることになる標的細胞は、対象における細胞であることが可能である。１つの局面において、対象はヒト対象であることが可能である。１つの局面において、生じた最適化ウイルスベクターによって形質導入されることになる標的細胞は、対象の中枢神経系における細胞、例えば、脳における有糸分裂終了ニューロンなどであることが可能である。標的領域または意図された標的領域は、対象の器官（例えば、肺、心臓、肝臓、腎臓、脳など）の１つまたはそれより多くであることが可能である。１つの局面において、標的領域または意図された標的領域は、遺伝的な疾患もしくは障害または神経学的な疾患もしくは障害によって冒される細胞または器官が、どのような細胞であれ、またはどのような器官であれ可能である。１つの局面において、標的領域または意図された標的領域は脳または様々なニューロン集団であることが可能である。

【0095】

本明細書中で使用される場合、“ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ”（決定すること）は、遺伝的な疾患もしくは障害または神経学的な疾患もしくは障害の存在および重症度を測定すること、または確認することを示すことができる。遺伝的な疾患もしくは障害または神経学的な疾患もしくは障害の存在および／または重症度を決定するために使用される様々な方法および／または技術が典型的には、医学分野では知られている。例えば、この技術分野は、遺伝的な疾患もしくは障害または神経学的な疾患もしくは障害の存在、重症度、または両方を特定するための、および／または診断するための方法に精通している。１つの局面において、“決定することはまた、１またはそれを超える開示されたＨＤＡＣの発現または活性のレベルを測定すること、または確認することを示すことができる。１つの局面において、“決定することはまた、細胞のＨＤＡＣ遺伝子型、生じた最適化ウイルスベクターのパッケージング能、生じた最適化ウイルスベクターの力価、生じた最適化ウイルスベクターの発現能、生じた最適化ウイルスベクターの免疫原性および／または毒性、生じた最適化ウイルスベクターが効率的に細胞に形質導入する能力、あるいはそれらの任意の組み合わせを測定すること、または確認することを示すことができる。

【0096】

本明細書中で使用される場合、「有効量」および「有効である量」は、所望の結果を達成するためには、例えば、遺伝的な疾患もしくは障害または神経学的な疾患もしくは障害の処置および／または防止などを達成するためには十分である量を示すことができる。本明細書中で使用される場合、用語「有効量」および用語「有効である量」は、望まれない状態（例えば、遺伝的な疾患もしくは障害または神経学的な疾患もしくは障害）に対する所望の効果を達成するためには十分である量を示すことができる。例えば、「治療有効量」は、所望の治療結果を達成するためには、または望まれない症状に対する効果を有するためには十分であり、しかし、有害な副作用を引き起こすには一般に不十分である量を示す。１つの局面において、「治療有効量」は、開示された単離核酸分子、ＨＤＡＣを標的とする開示されたｓｈＲＮＡ、開示されたウイルスベクター、開示されたプロデューサー細胞、またはそれらの組み合わせの量で、（ｉ）特定の疾患、状態または障害（例えば、遺伝的な疾患もしくは障害または神経学的な疾患もしくは障害）を処置する量、（ｉｉ）特定の疾患、状態または障害（例えば、遺伝的な疾患もしくは障害または神経学的な疾患もしくは障害）の１またはそれを超える症状を減弱する、改善する、または排除する量、あるいは（ｉｉｉ）本明細書中に記載される特定の疾患、状態または障害（例えば、遺伝的な疾患もしくは障害または神経学的な疾患もしくは障害）の１またはそれを超える症状の発症を遅らせる量を意味する。任意の特定の患者のための具体的な治療有効用量レベルは、処置されている障害、および障害の重症度を含めた様々な要因；用いられる開示された単離核酸分子、ＨＤＡＣを標的とする開示されたｓｈＲＮＡ、開示されたウイルスベクター、開示されたプロデューサー細胞、またはそれらの組み合わせ；用いられる開示された方法；患者の年齢、体重、全身の健康状態、性別および食事；投与時間；投与経路；用いられる開示された単離核酸分子、ＨＤＡＣを標的とする開示されたｓｈＲＮＡ、開示されたウイルスベクター、開示されたプロデューサー細胞、またはそれらの組み合わせの排出速度；処置の継続期間；用いられる開示された単離核酸分子、ＨＤＡＣを標的とする開示されたｓｈＲＮＡ、開示されたウイルスベクター、開示されたプロデューサー細胞、またはそれらの組み合わせと組み合わせて、または同時に使用される薬物；および医学分野では広く知られている他の同様な要因に依存する。例えば、開示された単離核酸分子、ＨＤＡＣを標的とする開示されたｓｈＲＮＡ、開示されたウイルスベクター、開示されたプロデューサー細胞、またはそれらの組み合わせの用量を、所望の治療効果を達成するために要求されるレベルよりも低いレベルで開始し、投薬量を、所望の効果が達成されるまで徐々に増加させることは、十分に当業者の範囲内である。所望されるならば、有効な日用量を、投与の様々な目的のために複数の用量に分割することができる。その結果、開示された単離核酸分子、ＨＤＡＣを標的とする開示されたｓｈＲＮＡ、開示されたウイルスベクター、開示されたプロデューサー細胞、またはそれらの組み合わせの単回用量は、日用量を構成するためのそのような量またはその約数（submultiple）を含有することができる。投薬量は、どのような禁忌の場合でも個々の医師によって調整することができる。投薬量は様々である可能性があり、毎日１またはそれを超える用量投与で、１日または数日にわたって施すことができる。ガイダンスを、所与のクラスの医薬製品のための適切な投薬量について文献において見出すことができる。１つの局面において、調製物を「予防有効量」で、すなわち、疾患または状態、例えば、遺伝的な疾患もしくは障害または神経学的な疾患もしくは障害などの予防のために有効である量で投与することができる。

【0097】

本明細書中で使用される場合、用語「医薬的に許容され得るキャリア」は、無菌の水性または非水性の液剤、分散液剤、懸濁剤または乳剤、ならびに、使用直前に無菌の注射可能な液剤または分散液剤への再構成のための無菌粉末を示す。好適な水性および非水性のキャリア、希釈剤、溶媒またはビヒクルの例には、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、カルボキシメチルセルロースおよびその好適な混合物、植物油（例えば、オリーブ油）、および注射可能な有機エステル、例えば、オレイン酸エチルが含まれる。１つの局面においては、用いられる医薬用キャリアは、固体、液体、または気体であることが可能である。１つの局面において、固体キャリアの例には、ラクトース、白土、スクロース、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アラビアゴム、ステアリン酸マグネシウムおよびステアリン酸が含まれることが可能である。１つの局面において、液体キャリアの例には、糖シロップ、ピーナッツ油、オリーブ油および水が含まれることが可能である。１つの局面において、ガス状キャリアの例には、二酸化炭素および窒素が含まれることが可能である。開示された組成物を経口剤形のために調製することにおいて、好都合な医薬用媒体はどれも用いることができる。例えば、水、グリコール、油、アルコール、矯味矯臭剤、防腐剤、着色剤などを、経口用液体調製物、例えば、懸濁剤、エリキシル剤および液剤を形成するために使用することができ、その一方で、キャリア、例えば、デンプン、糖、微結晶セルロース、希釈剤、造粒剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤などを、経口用固体調製物、例えば、粉剤・散剤（powder）、カプセル剤および錠剤を形成するために使用することができる。投与が容易であるために、錠剤およびカプセル剤が、固体の医薬用キャリアが用いられる好ましい経口投薬単位である。必要に応じて、錠剤は、標準的な水性技術または非水性技術によって被覆することができる。適切な流動性を、例えば、被覆材（例えば、レシチン）の使用によって、分散液剤の場合には要求された粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使用によって維持することができる。これらの組成物はまた、補助剤、例えば、防腐剤、湿潤化剤、乳化剤および分散剤を含有することができる。微生物の作用の防止を、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などを含めることによって確実にすることができる。等張剤、例えば、糖、塩化ナトリウムなどが含まれることもまた望ましいことであり得る。注射可能な医薬形態の長期吸収を、吸収を遅らせる剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンが含まれることによってもたらすことができる。注射可能なデポー形態が、生分解性ポリマー（例えば、ポリラクチド－ポリグリコリド、ポリ（オルトエステル）およびポリ（酸無水物））における薬物のマイクロカプセルマトリックスを形成することによって作製される。薬物対ポリマーの比率および用いられる特定のポリマーの性質に依存して、薬物放出速度を制御することができる。デポー注射用製剤はまた、身体組織との適合性を有するリポソームまたはマイクロエマルションに薬物を閉じ込めることによって調製される。注射用製剤は、例えば、細菌保持フィルターに通すろ過によって、あるいは滅菌剤を、使用直前に無菌水または他の無菌の注射用媒体に溶解され得る、または分散され得る無菌の固体組成物の形態で組み込むことによって滅菌することができる。好適な不活性キャリアには、ラクトースなどの糖を含ませることが可能である。望ましくは、有効成分の、重量比で少なくとも９５％の粒子が、０．０１～１０マイクロメートルの範囲での有効粒子サイズを有する。

【0098】

本明細書中で使用される場合、用語「賦形剤」は、希釈剤、ビヒクル、防腐剤、結合剤、または安定化剤として一般的に使用される不活性な物質を示し、用語「賦形剤」には、タンパク質（例えば、血清アルブミンなど）、アミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、グリシン、ヒスチジンなど）、脂肪酸およびリン脂質（例えば、アルキルスルホナート、カプリラートなど）、界面活性剤（例えば、ＳＤＳ、ポリソルベート、非イオン性界面活性剤など）、糖類（例えば、スクロース、マルトース、トレハロースなど）、ならびにポリオール（例えば、マンニトール、ソルビトールなど）が含まれるが、これらに限定されない。参考として、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９９０）（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．）もまた参照のこと（これは、その全体が参照によってここに組み込まれる）。

【0099】

本明細書中で使用される場合、用語「添付文書」は、治療用製品の市販包装物に慣例的に含まれる指示で、そのような治療用製品の使用に関する適応症、用法、投薬量、投与、禁忌および／または警告に関する情報を含有する指示を示すために使用される。

【0100】

本明細書中で使用される場合、１またはそれを超える開示された単離核酸分子、ＨＤＡＣを標的とする１またはそれを超える開示されたｓｈＲＮＡ、１またはそれを超える開示されたウイルスベクター、１またはそれを超える開示されたプロデューサー細胞、またはそれらの組み合わせの投与に関連しての用語「組み合わせて」には、２つ以上の治療（例えば、追加の治療用薬剤）の使用が含まれる。１またはそれを超える追加の治療用薬剤「と組み合わせての」投与には、同時（例えば、並行）投与、および任意の順序での連続投与が含まれる。用語「組み合わせて」の使用は、治療が対象に施される順序を制限しない。限定されない例として、第１の治療（例えば、開示された薬剤、開示された治療用薬剤、開示された医薬製剤、またはそれらの組み合わせの１つまたはそれより多く）を、遺伝的な疾患もしくは障害または神経学的な疾患もしくは障害を有する対象、あるいは遺伝的な疾患もしくは障害または神経学的な疾患もしくは障害と診断される対象に対して第２の治療（例えば、１またはそれを超える開示された単離核酸分子、ＨＤＡＣを標的とする１またはそれを超える開示されたｓｈＲＮＡ、１またはそれを超える開示されたウイルスベクター、１またはそれを超える開示されたプロデューサー細胞、またはそれらの組み合わせ、あるいは１またはそれを超える追加の治療用薬剤）を施す前（例えば、１分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間または１２週間）に、施すことと並行して、または施した後（例えば、１分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、または１２週間もしくはそれよりも長く）に施すことができる。

【0101】

開示された薬剤、開示された治療用薬剤、および／または開示された医薬製剤を調製するために使用されることになる成分、ならびに、本明細書中に開示される方法の範囲内で使用される開示された薬剤、開示された治療用薬剤、および／または開示された医薬製剤が開示される。これらの材料および他の材料が本明細書中には開示されており、これらの材料の組み合わせ、サブセット、相互作用、群などが開示されるときには、これらの化合物のそれぞれ様々な個々の組み合わせおよび並び替えならびに集合的な組み合わせおよび並び替えの具体的な参照は明示的に開示され得ないが、それぞれが本明細書中では具体的に意図されており、かつ記載されていることが理解される。例えば、特定の化合物が開示され、また議論され、そして、これらの化合物を含めて多数の分子に対して行うことができる多数の改変が議論されるならば、反することが具体的に示されている場合を除き、化合物および可能であるこれらの改変の組み合わせおよび並び替えはどれもこれもが具体的に意図される。したがって、分子Ａ、分子Ｂおよび分子Ｃの部類が、分子Ｄ、分子Ｅおよび分子Ｆの部類と同様に開示され、組み合わせ分子の一例としてＡ～Ｄが開示されるならば、たとえそれぞれが個々に列挙されていないとしても、それぞれが個々に、また集合的に意図され、このことは、Ａ～Ｅ、Ａ～Ｆ、Ｂ～Ｄ、Ｂ～Ｅ、Ｂ～Ｆ、Ｃ～Ｄ、Ｃ～Ｅ、およびＣ～Ｆといった様々な組み合わせが開示されていると見なされることを意味する。同様に、これらのサブセットまたは組み合わせもまた、どのようなものであれ開示される。したがって、例えば、Ａ～Ｅ、Ｂ～Ｆ、およびＣ～Ｅの部分群が、開示されていると見なされるであろう。この概念は、本発明の組成物を作成する方法および使用する方法におけるステップ（これに限定されない）を含めて本出願のすべての局面に当てはまる。したがって、実施することができる様々な追加のステップが存在するならば、これらの追加ステップのそれぞれが、どのような局面または組み合わせであれ開示された方法の特定の様々な局面とともに、または開示された方法の様々な局面の特定の組み合わせとともに実施され得ることが理解される。
Ｂ．開示された方法における使用のための組成物

【0102】

本明細書中には、１またはそれを超える開示された方法を実施する際の使用のための組成物が開示される。１つの局面において、開示された組成物は、開示された単離核酸分子、開示されたＨＤＡＣを標的とする開示されたｓｈＲＮＡ、開示されたウイルスベクター、開示されたウイルスプロデューサー細胞株、開示されたウイルスベクターによって形質導入される開示された細胞、またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。
１．単離された核酸分子

【0103】

本明細書中には、（ｉ）Ｃａｓエンドヌクレアーゼと、（ｉｉ）少なくとも１つのガイドＲＮＡと、（ｉｉｉ）少なくとも１つの導入遺伝子とをコードする核酸配列を含む単離された核酸分子が開示される。

【0104】

本明細書中には、（ｉ）融合産物と、（ｉｉ）少なくとも１つのガイドＲＮＡとをコードする核酸配列を含む単離された核酸分子が開示される。

【0105】

本明細書中には、（ｉ）Ｃａｓエンドヌクレアーゼと、（ｉｉ）少なくとも１つのガイドＲＮＡと、（ｉｉｉ）少なくとも１つの導入遺伝子と、（ｉｖ）ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）を標的とするｓｈＲＮＡとをコードする核酸配列を含む単離された核酸分子が開示される。

【0106】

本明細書中には、（ｉ）融合産物と、（ｉｉ）少なくとも１つのガイドＲＮＡと、（ｉｉｉ）ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）を標的とするｓｈＲＮＡとをコードする核酸配列を含む単離された核酸分子が開示される。

【0107】

１つの局面において、開示されたＣａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９、ＳｐＣａｓ９、ＳａＣａｓ９、バリアントＣａｓ９、ｄＣａｓまたはｄＣａｓ９を含むことができる。１つの局面において、開示されているコードされたＣａｓ９は、配列番号５２または配列番号５３に示される配列を含むことができる。１つの局面において、開示されているコードされたＣａｓ９は、配列番号５２もしくは配列番号５３に示される配列またはそのフラグメントに対する、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有する配列を有することができる。

【0108】

１つの局面において、開示されたバリアントＣａｓ９は、ＶＱＲ、ＥＱＲまたはＶＲＥＲを含むことができる。１つの局面において、開示されたＶＲＥＲは、配列番号５５に示される配列を含むことができる。１つの局面において、開示されたＶＲＥＲは、配列番号５５に示される配列またはそのフラグメントに対する、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有する配列を有することができる。

【0109】

１つの局面において、開示されたｄＣａｓは、ｄＶＱＲ、ｄＥＱＲまたはｄＶＲＥＲを含むことができる。１つの局面において、開示されているコードされたｄＣａｓは、配列番号５４に示される配列を含むことができる。１つの局面において、開示されているコードされたｄＣａｓ９は、配列番号５４に示される配列またはそのフラグメントに対する、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有する配列を有することができる。

【0110】

ＳｐＣａｓ９（３’ＮＧＧ－ＰＡＭ配列）は、ＳｐＣａｓ９ ＶＱＲ（３’ＮＧＡＮまたは３’ＮＧＮＧ）、ＳｐＣａｓ９ ＥＱＲ（３’ＮＧＡＧ）、またはＳｐＣａｓ９ ＶＲＥＲ（３’ＮＧＣＧ）を含むことができる。

【0111】

１つの局面において、開示された単離核酸分子はさらに、１またはそれを超えるＳｐ１結合部位、１またはそれを超えるＮＦκＢ結合部位、あるいはそれらの任意の組み合わせをコードする核酸配列を含むことができる。１つの局面において、開示された単離核酸分子はさらに、１またはそれを超える調節エレメントをコードする核酸配列を含むことができる。１つの局面において、開示された調節エレメントは、１またはそれを超えるプロモーター、１またはそれを超えるプライマー結合部位（ＰＢＳ）、１またはそれを超えるスプライスドナー（ＳＤ）部位、１またはそれを超えるスプライスアクセプター（ＳＡ）部位、１またはそれを超えるセントラルポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）、１またはそれを超えるポリプリントラクト（ＰＰＴ）、１またはそれを超えるＲｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）、１またはそれを超えるウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）、１またはそれを超えるレトロウイルスベクターパッケージングエレメント、あるいはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。１つの局面において、開示されたレトロウイルスベクターパッケージングエレメントはｐｓｉ（ψ）シグナルを含むことができる。１つの局面において、開示されたプロモーターは、ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）プロモーター、コア伸長因子１αプロモーター（ＥＦＳ）、ヒトＵ６プロモーター、またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。１つの局面において、開示された単離核酸分子はウイルス３’ＵＴＲおよび／またはウイルス５’ＵＴＲを含むことができる。開示された単離核酸分子の１つの局面において、開示された核酸配列は、ウイルス３’ＬＴＲにおけるＵ３領域の欠失を含むことができる。

【0112】

１つの局面において、開示された単離核酸分子はさらに、ポリリンカー部位を含むことができる。１つの局面において、開示されたポリリンカー部位は、一対のＢｓｍＢＩ部位と、独特のＢｓｒＧＩ部位とを含むことができる。１つの局面において、開示された一対のＢｓｍＢＩ部位をｓｇＲＮＡのクローニングのために使用することができる。１つの局面において、開示されたＢｓｒＧＩ部位を、クローニングされたｓｇＲＮＡの検証のために使用することができる。

【0113】

１つの局面において、開示された核酸分子は、レポーター遺伝子をコードする配列を含むことができる。１つの局面において、開示されたレポーター遺伝子を検証のために使用することができる。様々なレポーター遺伝子がこの技術分野では知られている。例えば、１つの局面において、レポーター遺伝子は、検出可能であるタンパク質、または検出可能な産物を産生する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であることが可能である。レポーター遺伝子は、検出可能なシグナルを生成する視覚的なマーカーまたは酵素をコードすることができる：例えば、ｃａｔ、ｌａｃＺ、ｕｄＡ、ｘｙＩＥ、アルカリホスファターゼ遺伝子、ａ－アミラーゼ遺伝子、α－ガラクトシダーゼ遺伝子、α－グルクロニダーゼ遺伝子、ｐラクタマーゼ遺伝子、西洋ワサビペルオキシダーゼ遺伝子、ルシフェリン／ルシフェラーゼ遺伝子、Ｒ遺伝子座遺伝子、チロシナーゼ遺伝子、または蛍光タンパク質をコードする遺伝子（蛍光タンパク質には、青色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、パプリカ蛍光タンパク質もしくは黄色蛍光タンパク質、光変換型蛍光タンパク質、光スイッチ可能な蛍光タンパク質、またはオプチカル・ハイライター蛍光タンパク質、あるいはそれらのバリアントのいずれか（バリアントには、限定されないが、コドン最適化バリアント、迅速折り畳み型バリアント、モノマー型バリアント、安定性増大バリアントおよび蛍光強化バリアントが含まれる）が含まれるが、これらに限定されない）。１つの局面において、開示されたレポーターはＧＦＰを含むことができる。１つの局面において、開示されたＧＦＰは、配列番号０３に示される配列を含むことができる。１つの局面において、開示されているコードされたＧＦＰは、配列番号０４に示される配列を含むことができる。

【0114】

１つの局面において、開示された導入遺伝子はポリペプチドをコードすることができる。１つの局面において、開示されているコードされたポリペプチドは、転写活性化活性、転写抑制活性、転写放出因子活性、ヒストン修飾活性、核酸会合活性、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、デアセチラーゼ活性、またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。１つの局面において、開示されているコードされたポリペプチドはヒストンデアセチラーゼまたはヘテロクロマチンタンパク質１であることが可能である。１つの局面において、開示されているコードされたポリペプチドは転写抑制活性を含むことができる。

【0115】

１つの局面において、開示された導入遺伝子は神経変性疾患（ＮＤＤ）関連遺伝子を含むことができる。１つの局面において、ＮＤＤは、パーキンソン病（ＰＤ）、レビー小体型認知症（ＤＬＢ）、関連したシヌクレイノパチー、アルツハイマー病（ＡＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病（ＨＤ）、またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。１つの局面において、ＮＤＤ関連遺伝子は、ＡＰＯＥ、ＡＰＰ、ＡＴＸＮ２、ＣＨＭＰ２Ｂ、ＤＣＴＮ１、ＦＩＧ４、ＦＵＳ、ＧＢＡ、ＧＲＮ、ＨＮＲＮＰＡ１、ＨＴＴ、ＬＲＲＫ２、ＭＡＴＲ３、ＯＰＴＮ、ＰＡＲＫ７、ＰＦＮ１、ＰＲＰＨ、ＰＳＥＮ１、ＳＥＴＸ、ＳＩＧＭＡＲ１、ＳＮＣＡ、ＳＯＤ１、ＳＰＧ１１、ＳＱＳＴＭ１、ＴＡＲＤＢＰ、ＴＢＫ１、ＴＢＰ、ＴＲＰＭ７、ＴＵＢＡ４Ａ、ＵＢＱＬＮ２、ＵＣＨＬ１、ＶＡＰＢ、ＶＣＰ、ＶＰＳ３５、それらのフラグメント、それらのバリアント、またはそれらのキメラを含むことができる。

【0116】

１つの局面において、開示されているコードされたポリペプチドはヒストンデアセチラーゼ（ｄｅａｃｔｙｌａｓｅ）またはヘテロクロマチンタンパク質１であることが可能である。１つの局面において、開示されているコードされたポリペプチドは転写抑制活性を含むことができる。１つの局面において、開示されるＤＮＭＴ３Ａは、配列番号６０に示されるアミノ酸配列または配列番号６１に示されるヌクレオチド配列を有することができる。１つの局面において、開示されたＤＮＭＴ３Ａは、配列番号６０もしくは配列番号６１に示される配列またはそのフラグメントに対する、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有する配列を有することができる。

【0117】

１つの局面において、少なくとも１つのコードされたポリペプチドは、Ｋｒｕｐｐｅｌ関連ボックス（ＫＲＡＢ）、メチル－ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭｅＣＰ２）の転写抑制ドメイン（ＴＲＤ）、またはＫＲＡＢ－ＭｅＣＰ２の融合物（ＫＲＡＢ－ＭｅＣＰ２）を含むことができる。１つの局面において、ＭｅＣＰ２の開示されたＴＲＤは、配列番号５７に示されるヌクレオチド配列または配列番号５６に示されるアミノ酸配列を有することができる。１つの局面において、ＭｅＣＰ２の開示されたＴＲＤは、配列番号５７もしくは配列番号５６に示される配列またはそのフラグメントに対する、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有する配列を有することができる。

【0118】

１つの局面において、開示されたＫＲＡＢ－ＭｅＣＰ２は、配列番号５８に示されるヌクレオチド配列または配列番号５９に示されるアミノ酸配列を有することができる。１つの局面において、開示されたＫＲＡＢ－ＭｅＣＰ２は、配列番号５８もしくは配列番号５９に示される配列またはそのフラグメントに対する、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有する配列を有することができる。

【0119】

１つの局面において、開示されたＣａｓエンドヌクレアーゼを、開示されたポリペプチドに融合することができる。１つの局面において、開示されたＣａｓエンドヌクレアーゼを、酵素活性を有する開示されたポリペプチドに融合することができる。１つの局面において、開示された融合タンパク質は、開示されたＣａｓエンドヌクレアーゼと、開示されたポリペプチドとをコードすることができる。１つの局面において、開示された融合タンパク質は、開示されたＣａｓエンドヌクレアーゼと、酵素活性を有する開示されたポリペプチドとをコードすることができる。１つの局面において、開示された融合ポリペプチドは、転写活性化活性、転写抑制活性、転写放出因子活性、ヒストン修飾活性、核酸会合活性、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、デアセチラーゼ活性、またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。

【0120】

１つの局面において、開示された融合タンパク質は、ｄＣａｓ９と、ＤＮＭＴ３Ａとを含むことができる。１つの局面において、ｄＣａｓ９－ＤＮＭＴ３Ａ融合タンパク質は、配列番号６２に示されるアミノ酸配列を有することができる。１つの局面において、ｄＣａｓ９－ＤＮＭＴ３Ａ融合タンパク質は、配列番号６３に示される配列によってコードされることが可能である。１つの局面において、開示されたｄＣａｓ９－ＤＮＭＴ３Ａ融合タンパク質は、配列番号６２もしくは配列番号６３に示される配列またはそのフラグメントに対する、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有する配列を有することができる。

【0121】

１つの局面において、開示されたＣａｓエンドヌクレアーゼはｄＶＲＥＲであることが可能であり、ポリペプチドはＤＮＭＴ３Ａであることが可能である。１つの局面において、開示されたｄＶＲＥＲ－ＤＮＭＴ３Ａ融合タンパク質は、配列番号６４に示されるアミノ酸配列を有することができる。１つの局面において、開示されたｄＶＲＥＲ－ＤＮＭＴ３Ａ融合タンパク質は、配列番号６５に示される配列によってコードされることが可能である。１つの局面において、開示されたｄＶＲＥＲ－ＤＮＭＴ３Ａ融合タンパク質は、配列番号６４もしくは配列番号６５に示される配列またはそのフラグメントに対する、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有する配列を有することができる。

【0122】

１つの局面において、開示された融合タンパク質は、ｄＣａｓ９と、Ｋｒｕｐｐｅｌ関連ボックス（ＫＲＡＢ）、メチル－ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭｅＣＰ２）の転写抑制ドメイン（ＴＲＤ）、またはＫＲＡＢ－ＭｅＣＰ２の融合物（ＫＲＡＢ－ＭｅＣＰ２）とを含むことができる。１つの局面において、開示された融合タンパク質は、ｄＶＲＥＲと、Ｋｒｕｐｐｅｌ関連ボックス（ＫＲＡＢ）、メチル－ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭｅＣＰ２）の転写抑制ドメイン（ＴＲＤ）、またはＫＲＡＢ－ＭｅＣＰ２の融合物（ＫＲＡＢ－ＭｅＣＰ２）とを含むことができる。

【0123】

１つの局面において、開示されたｇＲＮＡは、ＤＮＡ結合のための標的となった配列（例えば、目的とする遺伝子、例えば、ＮＤＤ関連遺伝子におけるＤＮＡ結合のための標的となった配列）と、エンドヌクレアーゼ結合（例えば、Ｃａｓ９結合）のための足場配列とを含むことができる。

【0124】

１つの局面において、開示されたｇＲＮＡは、開示された目的とする遺伝子（例えば、ＮＤＤ関連遺伝子など）において、プロモーター領域、メチル化領域、またはそれらの任意の組み合わせを標的とすることができる。

【0125】

１つの局面において、開示された単離核酸分子はさらに、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）を標的とするｓｈＲＮＡをコードする核酸配列を含むことができる。１つの局面において、開示された単離核酸分子はさらに、１またはそれを超えるヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）を標的とする１またはそれを超えるｓｈＲＮＡをコードする核酸配列を含むことができる。１つの局面において、開示された単離核酸配列は、１またはそれを超えるＨＤＡＣを標的とする１またはそれを超えるｓｈＲＮＡをコードすることができる。ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）は、アセチル官能基をヒストンタンパク質および非ヒストンタンパク質の両方のリシン残基から除くことを触媒する酵素である。ヒトでは、亜鉛依存性機構またはＮＡＤ^＋依存性機構のどちらかを、アセチルリシン基質を脱アセチル化するために使用する１８個のＨＤＡＣ酵素が存在する。様々なＨＤＡＣが当業者には知られている。

【0126】

１つの局面において、開示されたＨＤＡＣは、クラスＩ Ｒｐｄ３様タンパク質、クラスＩＩ Ｈｄａ１様タンパク質、クラスＩＩＩ Ｓｉｒ２様タンパク質、またはクラスＩＶタンパク質を含むことができる。１つの局面において、開示されたクラスＩ Ｒｐｄ３様タンパク質は、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ８、またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。１つの局面において、開示されたクラスＩＩ Ｈｄａ１様タンパク質は、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ９、ＨＤＡＣ１０、またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。１つの局面において、開示されたクラスＩＩＩ Ｓｉｒ２様タンパク質は、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、ＳＩＲＴ３、ＳＩＲＴ４、ＳＩＲＴ５、ＳＩＲＴ６、ＳＩＲＴ７、またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。１つの局面において、開示されたクラスＩＶタンパク質はＨＤＡＣ１１を含むことができる。

【0127】

１つの局面において、開示されたＨＤＡＣは、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ６、またはＨＤＡＣ８、あるいはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。１つの局面において、開示されたＨＤＡＣはＨＤＡＣ８であることが可能である。

【0128】

１つの局面において、開示されたＨＤＡＣのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、配列番号０７～配列番号１２のいずれか一つに示される配列を含むことができる。１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ１のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、配列番号０７に示される配列を含むことができる。１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ２のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、配列番号０８に示される配列を含むことができる。１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ３のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、配列番号０９に示される配列を含むことができる。１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ４のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、配列番号１０に示される配列を含むことができる。１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ６のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、配列番号１１に示される配列を含むことができる。１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ８のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、配列番号１２に示される配列を含むことができる。１つの局面において、開示されたＨＤＡＣのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、配列番号０７～配列番号１２のいずれか１つに示される配列に対する、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または９５％超の同一性を有する配列を含むことができる。

【0129】

１つの局面において、開示されているコードされたＨＤＡＣは、配列番号１３～配列番号１８のいずれか１つに示される配列を含むことができる。１つの局面において、開示されているコードされたＨＤＡＣ１は、配列番号１３に示される配列を含むことができる。１つの局面において、開示されているコードされたＨＤＡＣ２は、配列番号１４に示される配列を含むことができる。１つの局面において、開示されているコードされたＨＤＡＣ３は、配列番号１５に示される配列を含むことができる。１つの局面において、開示されているコードされたＨＤＡＣ４は、配列番号１６に示される配列を含むことができる。１つの局面において、開示されているコードされたＨＤＡＣ６は、配列番号１７に示される配列を含むことができる。１つの局面において、開示されているコードされたＨＤＡＣ８は、配列番号１８に示される配列を含むことができる。

【0130】

１つの局面において、開示されているコードされたＨＤＡＣは、配列番号１３～配列番号１８のいずれか１つに示される配列に対する、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または９５％超の同一性を有する配列を含むことができる。

【0131】

１つの局面において、開示されたｓｈＲＮＡは、開示されたクラスＩ Ｒｐｄ３様タンパク質を標的とすることができる。１つの局面において、開示されたｓｈＲＮＡは、開示されたクラスＩＩ Ｈｄａ１様タンパク質を標的とすることができる。１つの局面において、開示されたｓｈＲＮＡは、開示されたクラスＩＩＩ Ｓｉｒ２様タンパク質を標的とすることができる。１つの局面において、開示されたｓｈＲＮＡは、開示されたクラスＩＶタンパク質を標的とすることができる。

【0132】

１つの局面において、開示されたｓｈＲＮＡは、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡ６、ＨＤＡＣ８、またそれらの任意の組み合わせを標的とすることができる。１つの局面において、ＨＤＡＣ１を標的とする開示されたｓｈＲＮＡは、配列番号１９に示される配列を含むことができ、あるいは配列番号１９に示される配列に対する、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または９５％超の同一性を有する配列を含むことができる。

【0133】

１つの局面において、ＨＤＡＣ２を標的とする開示されたｓｈＲＮＡは、配列番号２０に示される配列を含むことができ、あるいは配列番号２０に示される配列に対する、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または９５％超の同一性を有する配列を含むことができる。

【0134】

１つの局面において、ＨＤＡＣ３を標的とする開示されたｓｈＲＮＡは、配列番号２１に示される配列を含むことができ、あるいは配列番号２１に示される配列に対する、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または９５％超の同一性を有する配列を含むことができる。

【0135】

１つの局面において、ＨＤＡＣ４を標的とする開示されたｓｈＲＮＡは、配列番号２２に示される配列を含むことができ、あるいは配列番号２２に示される配列に対する、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または９５％超の同一性を有する配列を含むことができる。

【0136】

１つの局面において、ＨＤＡＣ６を標的とする開示されたｓｈＲＮＡは、配列番号２３に示される配列を含むことができ、あるいは配列番号２３に示される配列に対する、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または９５％超の同一性を有する配列を含むことができる。

【0137】

１つの局面において、ＨＤＡＣ８を標的とする開示されたｓｈＲＮＡは、配列番号２４に示される配列を含むことができ、あるいは配列番号２４に示される配列に対する、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または９５％超の同一性を有する配列を含むことができる。

【0138】

１つの局面において、ＨＤＡＣを標的とするｓｈＲＮＡをコードする開示された核酸配列を、クローンＴＲＣＮ００００１９５４６７、クローンＴＲＣＮ００００００４８１９、クローンＴＲＣＮ００００１９４９９３、クローンＴＲＣＮ００００００４８３２、クローンＴＲＣＮ００００００４８３９、もしくはＴＲＣＮ００００００４８５１、またはそれらの任意の組み合わせから得ることができる。

【0139】

１つの局面において、開示された単離核酸分子が、ウイルスベクター（例えば、アデノ随伴ウイルス、インテグラーゼ欠損型またはインテグラーゼコンピテント型、あるいはその組換えバージョン）内にパッケージングされることが可能である。１つの局面において、開示された単離核酸分子はウイルスベクターのパッケージング能を増大させることができ、ウイルスベクターの力価を増加させることができ、ウイルスベクターの発現能を増大させることができ、ウイルスベクターの免疫原性および／または毒性を低下させることができ、ウイルスベクターが効率的に１またはそれを超える細胞に形質導入する能力を増大させることができ、あるいはそれらの任意の組み合わせをもたらすことができる。

【0140】

１つの局面において、開示された単離核酸分子を細胞において発現させることができる。

【0141】

１つの局面において、生じた最適化ウイルスベクターによって形質導入されることになる細胞は、分裂細胞および／または非分裂細胞を含むことができる。生じた最適化ウイルスベクターによって形質導入されることになる細胞は、哺乳動物細胞、例えば、ヒト、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコまたはげっ歯類の細胞などであることが可能である。１つの局面において、生じた最適化ウイルスベクターによって形質導入されることになる細胞は、対象における細胞であることが可能である。１つの局面において、対象はヒト対象であることが可能である。１つの局面において、生じた最適化ウイルスベクターによって形質導入されることになる細胞は、対象の中枢神経系における細胞、例えば、脳における有糸分裂終了ニューロンなどであることが可能である。

【0142】

１つの局面において、開示された単離核酸分子は、対象（例えば、遺伝的な疾患もしくは障害または神経学的な疾患もしくは障害を有するヒトなど）におけるインビボ使用のための、すべてがそろった遺伝子治療送達システムの一部とすることができる。
２．ウイルスベクター

【0143】

本明細書中には、開示された単離核酸を含むウイルスベクターが開示される。本明細書中には、（ｉ）Ｃａｓエンドヌクレアーゼと、（ｉｉ）少なくとも１つのガイドＲＮＡと、（ｉｉｉ）少なくとも１つの導入遺伝子とをコードする核酸配列を含む単離された核酸分子を含むウイルスベクターが開示される。本明細書中には、（ｉ）融合産物と、（ｉｉ）少なくとも１つのガイドＲＮＡとをコードする核酸配列を含む単離された核酸分子を含むウイルスベクターが開示される。

【0144】

本明細書中には、（ｉ）Ｃａｓエンドヌクレアーゼと、（ｉｉ）少なくとも１つのガイドＲＮＡと、（ｉｉｉ）少なくとも１つの導入遺伝子と、（ｉｖ）ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）を標的とするｓｈＲＮＡとをコードする核酸配列を含む単離された核酸分子を含むウイルスベクターが開示される。

【0145】

本明細書中には、（ｉ）融合産物と、（ｉｉ）少なくとも１つのガイドＲＮＡと、（ｉｉｉ）ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）を標的とするｓｈＲＮＡとをコードする核酸配列を含む単離された核酸分子を含むウイルスベクターが開示される。

【0146】

本開示のウイルスベクターの１つの局面において、開示されたＣａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９、ＳｐＣａｓ９、ＳａＣａｓ９、バリアントＣａｓ９、ｄＣａｓまたはｄＣａｓ９を含むことができる。１つの局面において、開示されているコードされたＣａｓ９は、配列番号５２または配列番号５３に示される配列を含むことができる。１つの局面において、開示されているコードされたＣａｓ９は、配列番号５２もしくは配列番号５３に示される配列またはそのフラグメントに対する、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有する配列を有することができる。

【0147】

１つの局面において、開示されたバリアントＣａｓ９は、ＶＱＲ、ＥＱＲまたはＶＲＥＲを含むことができる。１つの局面において、開示されたＶＲＥＲは、配列番号５５に示される配列を含むことができる。１つの局面において、開示されたＶＲＥＲは、配列番号５５に示される配列またはそのフラグメントに対する、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有する配列を有することができる。

【0148】

１つの局面において、開示されたｄＣａｓは、ｄＶＱＲ、ｄＥＱＲまたはｄＶＲＥＲを含むことができる。１つの局面において、開示されているコードされたｄＣａｓは、配列番号５４に示される配列を含むことができる。１つの局面において、開示されているコードされたｄＣａｓ９は、配列番号１６に示される配列またはそのフラグメントに対する、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有する配列を有することができる。

【0149】

ＳｐＣａｓ９（３’ＮＧＧ－ＰＡＭ配列）は、ＳｐＣａｓ９ ＶＱＲ（３’ＮＧＡＮまたは３’ＮＧＮＧ）、ＳｐＣａｓ９ ＥＱＲ（３’ＮＧＡＧ）、またはＳｐＣａｓ９ ＶＲＥＲ（３’ＮＧＣＧ）を含むことができる。

【0150】

１つの局面において、開示されたウイルスベクターはさらに、１またはそれを超えるＳｐ１結合部位、１またはそれを超えるＮＦκＢ結合部位、あるいはそれらの任意の組み合わせをコードする核酸配列を含むことができる。

【0151】

１つの局面において、開示されたウイルスベクターはさらに、１またはそれを超える調節エレメントをコードする核酸配列を含むことができる。１つの局面において、開示された調節エレメントは、１またはそれを超えるプロモーター、１またはそれを超えるプライマー結合部位（ＰＢＳ）、１またはそれを超えるスプライスドナー（ＳＤ）部位、１またはそれを超えるスプライスアクセプター（ＳＡ）部位、１またはそれを超えるセントラルポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）、１またはそれを超えるポリプリントラクト（ＰＰＴ）、１またはそれを超えるＲｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）、１またはそれを超えるウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）、１またはそれを超えるレトロウイルスベクターパッケージングエレメント、あるいはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。

【0152】

１つの局面において、開示されたレトロウイルスベクターパッケージングエレメントはｐｓｉ（ψ）シグナルを含むことができる。

【0153】

１つの局面において、開示されたプロモーターは、ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）プロモーター、コア伸長因子１αプロモーター（ＥＦＳ）、ヒトＵ６プロモーター、またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。１つの局面において、開示されたウイルスベクターはウイルス３’ＵＴＲおよび／またはウイルス５’ＵＴＲをさらに含むことができる。１つの局面において、開示されたウイルスベクターは、ウイルス３’ＬＴＲにおけるＵ３領域の欠失を含むことができる。

【0154】

１つの局面において、開示されたウイルスベクターはさらに、ポリリンカー部位を含むことができる。１つの局面において、開示されたポリリンカー部位は、一対のＢｓｍＢＩ部位と、独特のＢｓｒＧＩ部位とを含むことができる。１つの局面において、開示された一対のＢｓｍＢＩ部位をｓｇＲＮＡのクローニングのために使用することができる。１つの局面において、開示されたＢｓｒＧＩ部位を、クローニングされたｓｇＲＮＡの検証のために使用することができる。

【0155】

１つの局面において、開示されたウイルスベクターは、レポーター遺伝子をコードする配列を含むことができる。１つの局面において、開示されたレポーター遺伝子を検証のために使用することができる。様々なレポーター遺伝子がこの技術分野では知られている。例えば、１つの局面において、レポーター遺伝子は、検出可能であるタンパク質、または検出可能な産物を産生する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であることが可能である。レポーター遺伝子は、検出可能なシグナルを生成する視覚的なマーカーまたは酵素をコードすることができる：例えば、ｃａｔ、ｌａｃＺ、ｕｄＡ、ｘｙＩＥ、アルカリホスファターゼ遺伝子、ａ－アミラーゼ遺伝子、α－ガラクトシダーゼ遺伝子、α－グルクロニダーゼ遺伝子、ｐラクタマーゼ遺伝子、西洋ワサビペルオキシダーゼ遺伝子、ルシフェリン／ルシフェラーゼ遺伝子、Ｒ遺伝子座遺伝子、チロシナーゼ遺伝子、または蛍光タンパク質をコードする遺伝子（蛍光タンパク質には、青色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、パプリカ蛍光タンパク質もしくは黄色蛍光タンパク質、光変換型蛍光タンパク質、光スイッチ可能な蛍光タンパク質、またはオプチカル・ハイライター蛍光タンパク質、あるいはそれらのバリアントのいずれか（バリアントには、限定されないが、コドン最適化バリアント、迅速折り畳み型バリアント、モノマー型バリアント、安定性増大バリアントおよび蛍光強化バリアントが含まれる）が含まれるが、これらに限定されない）。１つの局面において、開示されたレポーターはＧＦＰを含むことができる。１つの局面において、開示されたＧＦＰは、配列番号０３に示される配列を含むことができる。１つの局面において、開示されているコードされたＧＦＰは、配列番号０４に示される配列を含むことができる。

【0156】

本開示のウイルスベクターの１つの局面において、開示された導入遺伝子はポリペプチドをコードすることができる。１つの局面において、開示されているコードされたポリペプチドは、転写活性化活性、転写抑制活性、転写放出因子活性、ヒストン修飾活性、核酸会合活性、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、デアセチラーゼ活性、またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。１つの局面において、開示されているコードされたポリペプチドはヒストンデアセチラーゼまたはヘテロクロマチンタンパク質１であることが可能である。１つの局面において、開示されているコードされたポリペプチドは転写抑制活性を含むことができる。

【0157】

本開示のウイルスベクターの１つの局面において、開示された導入遺伝子は神経変性疾患（ＮＤＤ）関連遺伝子を含むことができる。１つの局面において、ＮＤＤは、パーキンソン病（ＰＤ）、レビー小体型認知症（ＤＬＢ）、関連したシヌクレイノパチー、アルツハイマー病（ＡＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病（ＨＤ）、またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。１つの局面において、ＮＤＤ関連遺伝子は、ＡＰＯＥ、ＡＰＰ、ＡＴＸＮ２、ＣＨＭＰ２Ｂ、ＤＣＴＮ１、ＦＩＧ４、ＦＵＳ、ＧＢＡ、ＧＲＮ、ＨＮＲＮＰＡ１、ＨＴＴ、ＬＲＲＫ２、ＭＡＴＲ３、ＯＰＴＮ、ＰＡＲＫ７、ＰＦＮ１、ＰＲＰＨ、ＰＳＥＮ１、ＳＥＴＸ、ＳＩＧＭＡＲ１、ＳＮＣＡ、ＳＯＤ１、ＳＰＧ１１、ＳＱＳＴＭ１、ＴＡＲＤＢＰ、ＴＢＫ１、ＴＢＰ、ＴＲＰＭ７、ＴＵＢＡ４Ａ、ＵＢＱＬＮ２、ＵＣＨＬ１、ＶＡＰＢ、ＶＣＰ、ＶＰＳ３５、それらのフラグメント、それらのバリアント、またはそれらのキメラを含むことができる。

【0158】

本開示のウイルスベクターの１つの局面において、開示されているコードされたポリペプチドはヒストンデアセチラーゼまたはヘテロクロマチンタンパク質１であることが可能である。１つの局面において、開示されているコードされたポリペプチドは転写抑制活性を含むことができる。１つの局面において、開示されるＤＮＭＴ３Ａは、配列番号６０に示されるアミノ酸配列または配列番号６１に示されるヌクレオチド配列を有することができる。１つの局面において、開示されたＤＮＭＴ３Ａは、配列番号６０もしくは配列番号６１に示される配列またはそのフラグメントに対する、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有する配列を有することができる。

【0159】

１つの局面において、少なくとも１つのコードされたポリペプチドは、Ｋｒｕｐｐｅｌ関連ボックス（ＫＲＡＢ）、メチル－ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭｅＣＰ２）の転写抑制ドメイン（ＴＲＤ）、またはＫＲＡＢ－ＭｅＣＰ２の融合物（ＫＲＡＢ－ＭｅＣＰ２）を含むことができる。１つの局面において、ＭｅＣＰ２の開示されたＴＲＤは、配列番号５７に示されるヌクレオチド配列または配列番号５６に示されるアミノ酸配列を有することができる。１つの局面において、ＭｅＣＰ２の開示されたＴＲＤは、配列番号５７もしくは配列番号５６に示される配列またはそのフラグメントに対する、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有する配列を有することができる。１つの局面において、開示されたＫＲＡＢ－ＭｅＣＰ２は、配列番号５８に示されるヌクレオチド配列または配列番号５９に示されるアミノ酸配列を有することができる。１つの局面において、開示されたＫＲＡＢ－ＭｅＣＰ２は、配列番号５８もしくは配列番号５９に示される配列またはそのフラグメントに対する、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有する配列を有することができる。

【0160】

本開示のウイルスベクターの１つの局面において、開示されたＣａｓエンドヌクレアーゼを、開示されたポリペプチドに融合することができる。１つの局面において、開示されたＣａｓエンドヌクレアーゼを、酵素活性を有する開示されたポリペプチドに融合することができる。本開示のウイルスベクターの１つの局面において、開示された融合タンパク質は、開示されたＣａｓエンドヌクレアーゼと、開示されたポリペプチドとをコードすることができる。１つの局面において、開示された融合タンパク質は、開示されたＣａｓエンドヌクレアーゼと、酵素活性を有する開示されたポリペプチドとをコードすることができる。１つの局面において、開示された融合ポリペプチドは、転写活性化活性、転写抑制活性、転写放出因子活性、ヒストン修飾活性、核酸会合活性、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、デアセチラーゼ活性、またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。

【0161】

１つの局面において、開示された融合タンパク質は、ｄＣａｓ９と、ＤＮＭＴ３Ａとを含むことができる。１つの局面において、ｄＣａｓ９－ＤＮＭＴ３Ａ融合タンパク質は、配列番号６２に示されるアミノ酸配列を有することができる。１つの局面において、ｄＣａｓ９－ＤＮＭＴ３Ａ融合タンパク質は、配列番号６３に示される配列によってコードされることが可能である。１つの局面において、開示されたｄＣａｓ９－ＤＮＭＴ３Ａ融合タンパク質は、配列番号６２もしくは配列番号６３に示される配列またはそのフラグメントに対する、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有する配列を有することができる。

【0162】

１つの局面において、開示されたＣａｓエンドヌクレアーゼはｄＶＲＥＲであることが可能であり、ポリペプチドはＤＮＭＴ３Ａであることが可能である。１つの局面において、開示されたｄＶＲＥＲ－ＤＮＭＴ３Ａ融合タンパク質は、配列番号６４に示されるアミノ酸配列を有することができる。１つの局面において、開示されたｄＶＲＥＲ－ＤＮＭＴ３Ａ融合タンパク質は、配列番号６５に示される配列によってコードされることが可能である。１つの局面において、開示されたｄＶＲＥＲ－ＤＮＭＴ３Ａ融合タンパク質は、配列番号６４もしくは配列番号６５に示される配列またはそのフラグメントに対する、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有する配列を有することができる。

【0163】

１つの局面において、開示された融合タンパク質は、ｄＣａｓ９と、Ｋｒｕｐｐｅｌ関連ボックス（ＫＲＡＢ）、メチル－ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭｅＣＰ２）の転写抑制ドメイン（ＴＲＤ）、またはＫＲＡＢ－ＭｅＣＰ２の融合物（ＫＲＡＢ－ＭｅＣＰ２）とを含むことができる。１つの局面において、開示された融合タンパク質は、ｄＶＲＥＲと、Ｋｒｕｐｐｅｌ関連ボックス（ＫＲＡＢ）、メチル－ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭｅＣＰ２）の転写抑制ドメイン（ＴＲＤ）、またはＫＲＡＢ－ＭｅＣＰ２の融合物（ＫＲＡＢ－ＭｅＣＰ２）とを含むことができる。

【0164】

本開示のウイルスベクターの１つの局面において、開示されたｇＲＮＡは、ＤＮＡ結合のための標的となった配列（例えば、目的とする遺伝子、例えば、ＮＤＤ関連遺伝子におけるＤＮＡ結合のための標的となった配列）と、エンドヌクレアーゼ結合（例えば、Ｃａｓ９結合）のための足場配列とを含むことができる。

【0165】

１つの局面において、開示されたｇＲＮＡは、開示された目的とする遺伝子（例えば、ＮＤＤ関連遺伝子など）において、プロモーター領域、メチル化領域、またはそれらの任意の組み合わせを標的とすることができる。

【0166】

１つの局面において、開示されたウイルスベクターはさらに、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）を標的とするｓｈＲＮＡをコードする核酸配列を含むことができる。１つの局面において、開示されたウイルスベクターはさらに、１またはそれを超えるヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）を標的とする１またはそれを超えるｓｈＲＮＡをコードする核酸配列を含むことができる。１つの局面において、開示されたウイルスベクターは、１またはそれを超えるＨＤＡＣを標的とする１またはそれを超えるｓｈＲＮＡをコードすることができる。ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）は、アセチル官能基をヒストンタンパク質および非ヒストンタンパク質の両方のリシン残基から除くことを触媒する酵素である。ヒトでは、亜鉛依存性機構またはＮＡＤ^＋依存性機構のどちらかを、アセチルリシン基質を脱アセチル化するために使用する１８個のＨＤＡＣ酵素が存在する。様々なＨＤＡＣが当業者には知られている。

【0167】

１つの局面において、開示されたＨＤＡＣは、クラスＩ Ｒｐｄ３様タンパク質、クラスＩＩ Ｈｄａ１様タンパク質、クラスＩＩＩ Ｓｉｒ２様タンパク質、またはクラスＩＶタンパク質を含むことができる。１つの局面において、開示されたクラスＩ Ｒｐｄ３様タンパク質は、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ８、またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。１つの局面において、開示されたクラスＩＩ Ｈｄａ１様タンパク質は、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ９、ＨＤＡＣ１０、またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。１つの局面において、開示されたクラスＩＩＩ Ｓｉｒ２様タンパク質は、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、ＳＩＲＴ３、ＳＩＲＴ４、ＳＩＲＴ５、ＳＩＲＴ６、ＳＩＲＴ７、またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。１つの局面において、開示されたクラスＩＶタンパク質はＨＤＡＣ１１を含むことができる。

【0168】

１つの局面において、開示されたＨＤＡＣは、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ６、またはＨＤＡＣ８、あるいはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。１つの局面において、開示されたＨＤＡＣはＨＤＡＣ８であることが可能である。

【0169】

１つの局面において、開示されたＨＤＡＣのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、配列番号０７～配列番号１２のいずれか一つに示される配列を含むことができる。１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ１のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、配列番号０７に示される配列を含むことができる。１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ２のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、配列番号０８に示される配列を含むことができる。１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ３のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、配列番号０９に示される配列を含むことができる。１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ４のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、配列番号１０に示される配列を含むことができる。１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ６のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、配列番号１１に示される配列を含むことができる。１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ８のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、配列番号１２に示される配列を含むことができる。１つの局面において、開示されたＨＤＡＣのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、配列番号０７～配列番号１２のいずれか１つに示される配列に対する、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または９５％超の同一性を有する配列を含むことができる。

【0170】

１つの局面において、開示されているコードされたＨＤＡＣは、配列番号１３～配列番号１８のいずれか１つに示される配列を含むことができる。１つの局面において、開示されているコードされたＨＤＡＣ１は、配列番号１３に示される配列を含むことができる。１つの局面において、開示されているコードされたＨＤＡＣ２は、配列番号１４に示される配列を含むことができる。１つの局面において、開示されているコードされたＨＤＡＣ３は、配列番号１５に示される配列を含むことができる。１つの局面において、開示されているコードされたＨＤＡＣ４は、配列番号１６に示される配列を含むことができる。１つの局面において、開示されているコードされたＨＤＡＣ６は、配列番号１７に示される配列を含むことができる。１つの局面において、開示されているコードされたＨＤＡＣ８は、配列番号１８に示される配列を含むことができる。

【0171】

１つの局面において、開示されているコードされたＨＤＡＣは、配列番号１３～配列番号１８のいずれか１つに示される配列に対する、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または９５％超の同一性を有する配列を含むことができる。

【0172】

本開示のウイルスベクターの１つの局面において、開示されたｓｈＲＮＡは、開示されたクラスＩ Ｒｐｄ３様タンパク質を標的とすることができる。１つの局面において、開示されたｓｈＲＮＡは、開示されたクラスＩＩ Ｈｄａ１様タンパク質を標的とすることができる。１つの局面において、開示されたｓｈＲＮＡは、開示されたクラスＩＩＩ Ｓｉｒ２様タンパク質を標的とすることができる。１つの局面において、開示されたｓｈＲＮＡは、開示されたクラスＩＶタンパク質を標的とすることができる。

【0173】

本開示のウイルスベクターの１つの局面において、開示されたｓｈＲＮＡは、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡ６、ＨＤＡＣ８、またそれらの任意の組み合わせを標的とすることができる。

【0174】

１つの局面において、ＨＤＡＣ１を標的とする開示されたｓｈＲＮＡは、配列番号１９に示される配列を含むことができ、あるいは配列番号１９に示される配列に対する、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または９５％超の同一性を有する配列を含むことができる。１つの局面において、ＨＤＡＣ２を標的とする開示されたｓｈＲＮＡは、配列番号２０に示される配列を含むことができ、あるいは配列番号２０に示される配列に対する、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または９５％超の同一性を有する配列を含むことができる。１つの局面において、ＨＤＡＣ３を標的とする開示されたｓｈＲＮＡは、配列番号２１に示される配列を含むことができ、あるいは配列番号２１に示される配列に対する、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または９５％超の同一性を有する配列を含むことができる。１つの局面において、ＨＤＡＣ４を標的とする開示されたｓｈＲＮＡは、配列番号２２に示される配列を含むことができ、あるいは配列番号２２に示される配列に対する、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または９５％超の同一性を有する配列を含むことができる。１つの局面において、ＨＤＡＣ６を標的とする開示されたｓｈＲＮＡは、配列番号２３に示される配列を含むことができ、あるいは配列番号２３に示される配列に対する、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または９５％超の同一性を有する配列を含むことができる。１つの局面において、ＨＤＡＣ８を標的とする開示されたｓｈＲＮＡは、配列番号２４に示される配列を含むことができ、あるいは配列番号２４に示される配列に対する、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または９５％超の同一性を有する配列を含むことができる。

【0175】

本開示のウイルスベクターの１つの局面において、ＨＤＡＣを標的とするｓｈＲＮＡをコードする開示された核酸配列を、クローンＴＲＣＮ００００１９５４６７、クローンＴＲＣＮ００００００４８１９、クローンＴＲＣＮ００００１９４９９３、クローンＴＲＣＮ００００００４８３２、クローンＴＲＣＮ００００００４８３９、もしくはＴＲＣＮ００００００４８５１、またはそれらの任意の組み合わせから得ることができる。

【0176】

１つの局面において、開示されたウイルスベクターは、１またはそれを超える細胞と接触させることができる。１つの局面において、開示されたウイルスベクターは、細胞株に形質導入することができる。

【0177】

１つの局面において、開示されたウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、インテグラーゼ欠損レンチウイルス（ＩＤＬＶ）、またはインテグラーゼコンピテントレンチウイルス（ＩＣＬＶ）を含むことができる。レンチウイルスには、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ピューマレンチウイルス（ＰＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ビスナ／マエディウイルス（ＶＭＶ）、ヒト免疫不全ウイルス１（ＨＩＶ－１）およびヒト免疫不全ウイルス２（ＨＩＶ－２）、またはそれらの組換え体、またはそれらの変異、またはそれらのバリアント、またはそれらのフラグメントが含まれる。

【0178】

１つの局面において、開示されたウイルスベクターは、ＨＤＡＣ^－／^－遺伝子型を生じさせるために細胞株に形質導入することができる。１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ^－／^－細胞株は、生じた最適化ウイルスベクターのパッケージング能を増大させるために使用することができ、生じた最適化ウイルスベクターの力価を増加させることができ、生じた最適化ウイルスベクターの発現能を増大させることができ、生じた最適化ウイルスベクターの免疫原性および／または毒性を低下させることができ、生じた最適化ウイルスベクターが効率的に１またはそれを超える細胞に形質導入する能力を増大させることができ、あるいはそれらの任意の組み合わせをもたらすことができる。

【0179】

本明細書中には、配列番号２６～配列番号３１のいずれか１つに示される配列を含むウイルスベクターが開示される。本明細書中には、配列番号２６～配列番号３１のいずれか１つに示される配列に対する、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または９５％超の同一性を有する配列を含むウイルスベクターが開示される。

【0180】

本明細書中には、配列番号２６に示される配列を含み、かつ、開示された導入遺伝子（例えば、開示されたＮＤＤ関連遺伝子など）を含むウイルスベクターが開示される。本明細書中には、配列番号２７に示される配列を含み、かつ、開示された導入遺伝子（例えば、開示されたＮＤＤ関連遺伝子など）を含むウイルスベクターが開示される。本明細書中には、配列番号２８に示される配列を含み、かつ、開示された導入遺伝子（例えば、開示されたＮＤＤ関連遺伝子など）を含むウイルスベクターが開示される。本明細書中には、配列番号２９に示される配列を含み、かつ、開示された導入遺伝子（例えば、開示されたＮＤＤ関連遺伝子など）を含むウイルスベクターが開示される。本明細書中には、配列番号３０に示される配列を含み、かつ、開示された導入遺伝子（例えば、開示されたＮＤＤ関連遺伝子など）を含むウイルスベクターが開示される。本明細書中には、配列番号３１に示される配列を含み、かつ、開示された導入遺伝子（例えば、開示されたＮＤＤ関連遺伝子など）を含むウイルスベクターが開示される。

【0181】

本明細書中には、配列番号２６～配列番号３１のいずれか１つに示される配列と、下記導入遺伝子の１つまたはそれより多くを含むウイルスベクターが開示される：ＡＰＯＥ、ＡＰＰ、ＡＴＸＮ２、ＣＨＭＰ２Ｂ、ＤＣＴＮ１、ＦＩＧ４、ＦＵＳ、ＧＢＡ、ＧＲＮ、ＨＮＲＮＰＡ１、ＨＴＴ、ＬＲＲＫ２、ＭＡＴＲ３、ＯＰＴＮ、ＰＡＲＫ７、ＰＦＮ１、ＰＲＰＨ、ＰＳＥＮ１、ＳＥＴＸ、ＳＩＧＭＡＲ１、ＳＮＣＡ、ＳＯＤ１、ＳＰＧ１１、ＳＱＳＴＭ１、ＴＡＲＤＢＰ、ＴＢＫ１、ＴＢＰ、ＴＲＰＭ７、ＴＵＢＡ４Ａ、ＵＢＱＬＮ２、ＵＣＨＬ１、ＶＡＰＢ、ＶＣＰ、ＶＰＳ３５、それらのフラグメント、それらのバリアント、またはそれらのキメラ。

【0182】

本明細書中には、配列番号２６～配列番号３１のいずれか１つに示される配列に対する、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または９５％超の同一性を有する配列と、下記導入遺伝子の１つまたはそれより多くを含むウイルスベクターが開示される：ＡＰＯＥ、ＡＰＰ、ＡＴＸＮ２、ＣＨＭＰ２Ｂ、ＤＣＴＮ１、ＦＩＧ４、ＦＵＳ、ＧＢＡ、ＧＲＮ、ＨＮＲＮＰＡ１、ＨＴＴ、ＬＲＲＫ２、ＭＡＴＲ３、ＯＰＴＮ、ＰＡＲＫ７、ＰＦＮ１、ＰＲＰＨ、ＰＳＥＮ１、ＳＥＴＸ、ＳＩＧＭＡＲ１、ＳＮＣＡ、ＳＯＤ１、ＳＰＧ１１、ＳＱＳＴＭ１、ＴＡＲＤＢＰ、ＴＢＫ１、ＴＢＰ、ＴＲＰＭ７、ＴＵＢＡ４Ａ、ＵＢＱＬＮ２、ＵＣＨＬ１、ＶＡＰＢ、ＶＣＰ、ＶＰＳ３５、それらのフラグメント、それらのバリアント、またはそれらのキメラ。

【0183】

本明細書中には、配列番号０１に示される配列を含むウイルスベクターが開示される。本明細書中には、配列番号０１に示される配列に対する、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または９５％超の同一性を有する配列を含むウイルスベクターが開示される。本明細書中には、配列番号０１に示される配列を含み、かつ、開示された導入遺伝子（例えば、開示されたＮＤＤ関連遺伝子など）を含むウイルスベクターが開示される。本明細書中には、配列番号０１に示される配列と、下記導入遺伝子の１つまたはそれより多くを含むウイルスベクターが開示される：ＡＰＯＥ、ＡＰＰ、ＡＴＸＮ２、ＣＨＭＰ２Ｂ、ＤＣＴＮ１、ＦＩＧ４、ＦＵＳ、ＧＢＡ、ＧＲＮ、ＨＮＲＮＰＡ１、ＨＴＴ、ＬＲＲＫ２、ＭＡＴＲ３、ＯＰＴＮ、ＰＡＲＫ７、ＰＦＮ１、ＰＲＰＨ、ＰＳＥＮ１、ＳＥＴＸ、ＳＩＧＭＡＲ１、ＳＮＣＡ、ＳＯＤ１、ＳＰＧ１１、ＳＱＳＴＭ１、ＴＡＲＤＢＰ、ＴＢＫ１、ＴＢＰ、ＴＲＰＭ７、ＴＵＢＡ４Ａ、ＵＢＱＬＮ２、ＵＣＨＬ１、ＶＡＰＢ、ＶＣＰ、ＶＰＳ３５、それらのフラグメント、それらのバリアント、またはそれらのキメラ。

【0184】

本明細書中には、配列番号０１に示される配列に対する、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または９５％超の同一性を有する配列と、下記導入遺伝子の１つまたはそれより多くを含むウイルスベクターが開示される：ＡＰＯＥ、ＡＰＰ、ＡＴＸＮ２、ＣＨＭＰ２Ｂ、ＤＣＴＮ１、ＦＩＧ４、ＦＵＳ、ＧＢＡ、ＧＲＮ、ＨＮＲＮＰＡ１、ＨＴＴ、ＬＲＲＫ２、ＭＡＴＲ３、ＯＰＴＮ、ＰＡＲＫ７、ＰＦＮ１、ＰＲＰＨ、ＰＳＥＮ１、ＳＥＴＸ、ＳＩＧＭＡＲ１、ＳＮＣＡ、ＳＯＤ１、ＳＰＧ１１、ＳＱＳＴＭ１、ＴＡＲＤＢＰ、ＴＢＫ１、ＴＢＰ、ＴＲＰＭ７、ＴＵＢＡ４Ａ、ＵＢＱＬＮ２、ＵＣＨＬ１、ＶＡＰＢ、ＶＣＰ、ＶＰＳ３５、それらのフラグメント、それらのバリアント、またはそれらのキメラ。

【0185】

１つの局面において、生じた最適化ウイルスベクターによって形質導入されることになる細胞は、分裂細胞および／または非分裂細胞を含むことができる。生じた最適化ウイルスベクターによって形質導入されることになる細胞は、哺乳動物細胞、例えば、ヒト、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコまたはげっ歯類の細胞などであることが可能である。１つの局面において、生じた最適化ウイルスベクターによって形質導入されることになる細胞は、対象における細胞であることが可能である。１つの局面において、対象はヒト対象であることが可能である。１つの局面において、生じた最適化ウイルスベクターによって形質導入されることになる細胞は、対象の中枢神経系における細胞、例えば、脳における有糸分裂終了ニューロンなどであることが可能である。

【0186】

１つの局面において、開示されたウイルスベクターは、対象（例えば、遺伝的な疾患もしくは障害または神経学的な疾患もしくは障害を有するヒトなど）におけるインビボ使用のための、すべてがそろった遺伝子治療送達システムの一部とすることができる。

【0187】

本明細書中には、ＨＤＡＣ枯渇細胞を開発する開示された方法によって作製される最適化されたウイルスベクターが開示される。
３．ＨＤＡＣを標的とするｓｈＲＮＡ

【0188】

本明細書中には、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）を標的とするｓｈＲＮＡをコードする核酸配列を含む単離された核酸分子が開示される。本明細書中には、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）を標的とする１またはそれを超えるｓｈＲＮＡをコードする核酸配列を含む単離された核酸分子が開示される。本明細書中には、１またはそれを超えるヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）を標的とする１またはそれを超えるｓｈＲＮＡをコードする核酸配列を含む単離された核酸分子が開示される。

【0189】

１つの局面において、開示されたｓｈＲＮＡは、開示されたＨＤＡＣ、例えば、配列番号０７～配列番号１２のいずれか一つに示される配列を含むＨＤＡＣのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を標的とすることができる。１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ１のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、配列番号０７に示される配列を含むことができる。１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ２のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、配列番号０８に示される配列を含むことができる。１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ３のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、配列番号０９に示される配列を含むことができる。１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ４のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、配列番号１０に示される配列を含むことができる。１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ６のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、配列番号１１に示される配列を含むことができる。１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ８のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、配列番号１２に示される配列を含むことができる。

【0190】

１つの局面において、開示されたｓｈＲＮＡは、開示されたＨＤＡＣ、例えば、配列番号０７～配列番号１２のいずれか１つに示される配列に対する、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または９５％超の同一性を有する配列を含むＨＤＡＣのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を標的とすることができる。

【0191】

１つの局面において、開示されたｓｈＲＮＡは、配列番号１３～配列番号１８のいずれか１つに示される配列を含むコードされたＨＤＡＣを標的とすることができる。１つの局面において、開示されているコードされたＨＤＡＣ１は、配列番号１３に示される配列を含むことができる。１つの局面において、開示されているコードされたＨＤＡＣ２は、配列番号１４に示される配列を含むことができる。１つの局面において、開示されているコードされたＨＤＡＣ３は、配列番号１５に示される配列を含むことができる。１つの局面において、開示されているコードされたＨＤＡＣ４は、配列番号１６に示される配列を含むことができる。１つの局面において、開示されているコードされたＨＤＡＣ６は、配列番号１７に示される配列を含むことができる。１つの局面において、開示されているコードされたＨＤＡＣ８は、配列番号１８に示される配列を含むことができる。

【0192】

１つの局面において、開示されたｓｈＲＮＡは、配列番号１３～配列番号１８のいずれか１つに示される配列に対する、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または９５％超の同一性を有する配列を含むコードされたＨＤＡＣを標的とすることができる。ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）は、アセチル官能基をヒストンタンパク質および非ヒストンタンパク質の両方のリシン残基から除くことを触媒する酵素である。ヒトでは、亜鉛依存性機構またはＮＡＤ^＋依存性機構のどちらかを、アセチルリシン基質を脱アセチル化するために使用する１８個のＨＤＡＣ酵素が存在する。

【0193】

１つの局面において、開示されたｓｈＲＮＡは、開示されたクラスＩ Ｒｐｄ３様タンパク質を標的とすることができる。１つの局面において、開示されたｓｈＲＮＡは、開示されたクラスＩＩ Ｈｄａ１様タンパク質を標的とすることができる。１つの局面において、開示されたｓｈＲＮＡは、開示されたクラスＩＩＩ Ｓｉｒ２様タンパク質を標的とすることができる。１つの局面において、開示されたｓｈＲＮＡは、開示されたクラスＩＶタンパク質を標的とすることができる。１つの局面において、開示された、標的となったＨＤＡＣは、クラスＩ Ｒｐｄ３様タンパク質、クラスＩＩ Ｈｄａ１様タンパク質、クラスＩＩＩ Ｓｉｒ２様タンパク質、またはクラスＩＶタンパク質を含むことができる。１つの局面において、開示された、標的となったクラスＩ Ｒｐｄ３様タンパク質は、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ８、またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。１つの局面において、開示された、標的となったクラスＩＩ Ｈｄａ１様タンパク質は、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ９、ＨＤＡＣ１０、またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。１つの局面において、開示された、標的となったクラスＩＩＩ Ｓｉｒ２様タンパク質は、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、ＳＩＲＴ３、ＳＩＲＴ４、ＳＩＲＴ５、ＳＩＲＴ６、ＳＩＲＴ７、またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。１つの局面において、開示された、標的となったクラスＩＶタンパク質はＨＤＡＣ１１を含むことができる。１つの局面において、開示されたＨＤＡＣは、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ６、またはＨＤＡＣ８を含むことができる。１つの局面において、開示されたｓｈＲＮＡは、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ８、またそれらの任意の組み合わせを標的とすることができる。

【0194】

１つの局面において、ＨＤＡＣ１を標的とする開示されたｓｈＲＮＡは、配列番号１９に示される配列を含むことができ、あるいは配列番号１９に示される配列に対する、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または９５％超の同一性を有する配列を含むことができる。

【0195】

１つの局面において、ＨＤＡＣ２を標的とする開示されたｓｈＲＮＡは、配列番号２０に示される配列を含むことができ、あるいは配列番号２０に示される配列に対する、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または９５％超の同一性を有する配列を含むことができる。

【0196】

１つの局面において、ＨＤＡＣ３を標的とする開示されたｓｈＲＮＡは、配列番号２１に示される配列を含むことができ、あるいは配列番号２１に示される配列に対する、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または９５％超の同一性を有する配列を含むことができる。

【0197】

１つの局面において、ＨＤＡＣ４を標的とする開示されたｓｈＲＮＡは、配列番号２２に示される配列を含むことができ、あるいは配列番号２２に示される配列に対する、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または９５％超の同一性を有する配列を含むことができる。

【0198】

１つの局面において、ＨＤＡＣ６を標的とする開示されたｓｈＲＮＡは、配列番号２３に示される配列を含むことができ、あるいは配列番号２３に示される配列に対する、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または９５％超の同一性を有する配列を含むことができる。

【0199】

１つの局面において、ＨＤＡＣ８を標的とする開示されたｓｈＲＮＡは、配列番号２４に示される配列を含むことができ、あるいは配列番号２４に示される配列に対する、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または９５％超の同一性を有する配列を含むことができる。

【0200】

１つの局面において、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）を標的とするｓｈＲＮＡをコードする開示された核酸配列を、クローンＴＲＣＮ００００１９５４６７、クローンＴＲＣＮ００００００４８１９、クローンＴＲＣＮ００００１９４９９３、クローンＴＲＣＮ００００００４８３２、クローンＴＲＣＮ００００００４８３９、またはＴＲＣＮ００００００４８５１から得ることができる。

【0201】

１つの局面において、開示されたＨＤＡＣを標的とする開示されたｓｈＲＮＡを、開示された単離核酸分子に組み込むことができる。１つの局面において、開示されたＨＤＡＣを標的とする開示されたｓｈＲＮＡを、（ｉ）Ｃａｓエンドヌクレアーゼと、（ｉｉ）少なくとも１つのガイドＲＮＡと、（ｉｉｉ）少なくとも１つの導入遺伝子とをコードする核酸配列を含む開示された単離核酸分子に組み込むことができる。１つの局面において、開示されたＨＤＡＣを標的とする開示されたｓｈＲＮＡを、（ｉ）融合産物と、（ｉｉ）少なくとも１つのガイドＲＮＡとをコードする核酸配列を含む開示された単離核酸分子に組み込むことができる。

【0202】

１つの局面において、開示されたＨＤＡＣを標的とするｓｈＲＮＡをコードする開示された核酸配列が、ウイルスベクター（例えば、アデノ随伴ウイルス、インテグラーゼ欠損型またはインテグラーゼコンピテント型のレンチウイルス、あるいはそれらの組換えバージョン）内にパッケージングされることが可能である。

【0203】

１つの局面において、開示されたＨＤＡＣを標的とするｓｈＲＮＡをコードする開示された核酸配列を細胞において発現させることができる。

【0204】

１つの局面において、開示されたｓｈＲＮＡを、ＨＤＡＣ^－／－遺伝子型をもたらすために使用することができる。１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ１を標的とする開示されたｓｈＲＮＡを、ＨＤＡＣ１^－／－遺伝子型をもたらすために使用することができる。１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ２を標的とする開示されたｓｈＲＮＡを、ＨＤＡＣ２^－／－遺伝子型をもたらすために使用することができる。１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ３を標的とする開示されたｓｈＲＮＡを、ＨＤＡＣ３^－／－遺伝子型をもたらすために使用することができる。１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ４を標的とする開示されたｓｈＲＮＡを、ＨＤＡＣ４^－／－遺伝子型をもたらすために使用することができる。１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ６を標的とする開示されたｓｈＲＮＡを、ＨＤＡＣ６^－／－遺伝子型をもたらすために使用することができる。１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ８を標的とする開示されたｓｈＲＮＡを、ＨＤＡＣ８^－／－遺伝子型をもたらすために使用することができる。

【0205】

１つの局面において、開示されたｓｈＲＮＡを、ＨＤＡＣ^－／－遺伝子型を１またはそれを超える細胞においてもたらすために使用することができる。１つの局面において、開示されたｓｈＲＮＡを、ＨＤＡＣ^－／－遺伝子型を細胞株においてもたらすために使用することができる。１つの局面において、開示されたｓｈＲＮＡを、ＨＤＡＣ^－／－遺伝子型を１またはそれを超える細胞においてもたらすために使用することができ、この場合、ＨＤＡＣ^－／－細胞株を、最適化されたウイルスベクターを生じさせるために使用することができる。１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ^－／－細胞株は、生じた最適化ウイルスベクターのパッケージング能を増大させることができ、生じた最適化ウイルスベクターの力価を増加させることができ、生じた最適化ウイルスベクターの発現能を増大させることができ、生じた最適化ウイルスベクターの免疫原性および／または毒性を低下させることができ、生じた最適化ウイルスベクターが効率的に１またはそれを超える細胞に形質導入する能力を増大させることができ、あるいはそれらの任意の組み合わせをもたらすことができる。

【0206】

１つの局面において、生じた最適化ウイルスベクターによって形質導入されることになる細胞は、分裂細胞および／または非分裂細胞を含むことができる。生じた最適化ウイルスベクターによって形質導入されることになる細胞は、哺乳動物細胞、例えば、ヒト、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコまたはげっ歯類の細胞などであることが可能である。１つの局面において、生じた最適化ウイルスベクターによって形質導入されることになる細胞は、対象における細胞であることが可能である。１つの局面において、対象はヒト対象であることが可能である。１つの局面において、生じた最適化ウイルスベクターによって形質導入されることになる細胞は、対象の中枢神経系における細胞、例えば、脳における有糸分裂終了ニューロンなどであることが可能である。

【0207】

１つの局面において、開示されたＨＤＡＣを標的とするｓｈＲＮＡは、対象（例えば、遺伝的な疾患もしくは障害または神経学的な疾患もしくは障害を有するヒトなど）におけるインビボ使用のための、すべてがそろった遺伝子治療送達システムの一部とすることができる。
４．ウイルスプロデューサー細胞

【0208】

本明細書中には、開示されたウイルスベクターにより形質導入されるウイルスプロデューサー細胞株が開示される。本明細書中には、ＨＤＡＣ^－／－遺伝子型を含むウイルスプロデューサー細胞株が開示される。様々なＨＤＡＣが当業者には知られている。本明細書中には、ＨＤＡＣ１^－／－遺伝子型を含むウイルスプロデューサー細胞株が開示される。本明細書中には、ＨＤＡＣ２^－／－遺伝子型を含むウイルスプロデューサー細胞株が開示される。本明細書中には、ＨＤＡＣ３^－／－遺伝子型を含むウイルスプロデューサー細胞株が開示される。本明細書中には、ＨＤＡＣ４^－／－遺伝子型を含むウイルスプロデューサー細胞株が開示される。本明細書中には、ＨＤＡＣ６^－／－遺伝子型を含むウイルスプロデューサー細胞株が開示される。本明細書中には、ＨＤＡＣ８^－／－遺伝子型を含むウイルスプロデューサー細胞株が開示される。

【0209】

１つの局面において、開示されたウイルスプロデューサー細胞株は、哺乳動物細胞株、例えば、ヒト細胞株、ウマ細胞株、ウシ細胞株、ブタ細胞株、イヌ細胞株、ネコ細胞株またはげっ歯類細胞株（例えば、ラットまたはマウス）であり得る。１つの局面において、開示されたウイルスプロデューサー細胞株は、ＨＥＫ細胞（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞）を含むことができる。

【0210】

１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ^－／－遺伝子型は、ＨＤＡＣ１^－／^－、ＨＤＡＣ２^－／^－、ＨＤＡＣ３^－／^－、ＨＤＡＣ４^－／^－、ＨＤＡＣ６^－／^－、ＨＤＡＣ８^－／^－、またはそれらの任意の組み合わせであることが可能である。１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ^－／^－細胞はＨＤＡＣ１^－／^－であることが可能であり、しかし、依然として、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ８、またはそれらの任意の組み合わせを発現することができる。１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ^－／^－細胞はＨＤＡＣ２^－／^－であることが可能であり、しかし、依然として、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ８、またはそれらの任意の組み合わせを発現することができる。１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ^－／^－細胞はＨＤＡＣ３^－／^－であることが可能であり、しかし、依然として、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ８、またはそれらの任意の組み合わせを発現することができる。１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ^－／^－細胞はＨＤＡＣ４^－／^－であることが可能であり、しかし、依然として、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ８、またはそれらの任意の組み合わせを発現することができる。１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ^－／^－細胞はＨＤＡＣ６^－／^－であることが可能であり、しかし、依然として、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ８、またはそれらの任意の組み合わせを発現することができる。１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ^－／^－細胞はＨＤＡＣ８^－／^－であることが可能であり、しかし、依然として、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ６、またはそれらの任意の組み合わせを発現することができる。

【0211】

１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ^－／^－細胞は、発現および／または活性における完全な低下および／または枯渇（例えば、１００％または約１００％）を含むことができる。１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ^－／^－細胞は、発現および／または活性における不完全な低下および／または枯渇を含むことができる。１つの局面において、発現および／または活性における不完全な低下および／または枯渇は、正常な、または野生型のＨＤＡＣ発現および／またはＨＤＡＣ活性を有する細胞と比較して、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または９５％超の低下および／または枯渇を含むことができる。

【0212】

本明細書中には、（ｉ）Ｃａｓエンドヌクレアーゼと、（ｉｉ）少なくとも１つのガイドＲＮＡと、（ｉｉｉ）少なくとも１つの導入遺伝子とをコードする核酸配列を含む単離された核酸分子を含むウイルスベクターにより形質導入されるウイルスプロデューサー細胞株が開示される。

【0213】

本明細書中には、（ｉ）融合産物と、（ｉｉ）少なくとも１つのガイドＲＮＡとをコードする核酸配列を含む単離された核酸分子を含むウイルスベクターにより形質導入されるウイルスプロデューサー細胞株が開示される。

【0214】

本明細書中には、（ｉ）融合産物と、（ｉｉ）少なくとも１つのガイドＲＮＡと、（ｉｉｉ）ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）を標的とするｓｈＲＮＡとをコードする核酸配列を含む単離された核酸分子を含むウイルスベクターにより形質導入されるウイルスプロデューサー細胞株が開示される。

【0215】

本明細書中には、（ｉ）Ｃａｓエンドヌクレアーゼと、（ｉｉ）少なくとも１つのガイドＲＮＡと、（ｉｉｉ）少なくとも１つの導入遺伝子と、（ｉｖ）ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）を標的とするｓｈＲＮＡとをコードする核酸配列を含む単離された核酸分子を含むウイルスベクターにより形質導入されるウイルスプロデューサー細胞株が開示される。

【0216】

本開示のウイルスベクターの１つの局面において、開示されたＣａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９、ＳｐＣａｓ９、ＳａＣａｓ９、バリアントＣａｓ９、ｄＣａｓまたはｄＣａｓ９を含むことができる。１つの局面において、開示されているコードされたＣａｓ９は、配列番号５２または配列番号５３に示される配列を含むことができる。１つの局面において、開示されているコードされたＣａｓ９は、配列番号５２もしくは配列番号５３に示される配列またはそのフラグメントに対する、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有する配列を有することができる。

【0217】

１つの局面において、開示されたバリアントＣａｓ９は、ＶＱＲ、ＥＱＲまたはＶＲＥＲを含むことができる。１つの局面において、開示されたＶＲＥＲは、配列番号５５に示される配列を含むことができる。１つの局面において、開示されたＶＲＥＲは、配列番号５５に示される配列またはそのフラグメントに対する、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有する配列を有することができる。１つの局面において、開示されたｄＣａｓは、ｄＶＱＲ、ｄＥＱＲまたはｄＶＲＥＲを含むことができる。１つの局面において、開示されているコードされたｄＣａｓは、配列番号５４に示される配列を含むことができる。１つの局面において、開示されているｄＣａｓ９は、配列番号５４に示される配列またはそのフラグメントに対する、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有する配列を有することができる。

【0218】

ＳｐＣａｓ９（３’ＮＧＧ－ＰＡＭ配列）は、ＳｐＣａｓ９ ＶＱＲ（３’ＮＧＡＮまたは３’ＮＧＮＧ）、ＳｐＣａｓ９ ＥＱＲ（３’ＮＧＡＧ）、またはＳｐＣａｓ９ ＶＲＥＲ（３’ＮＧＣＧ）を含むことができる。

【0219】

１つの局面において、開示されたウイルスベクターはさらに、１またはそれを超えるＳｐ１結合部位、１またはそれを超えるＮＦκＢ結合部位、あるいはそれらの任意の組み合わせをコードする核酸配列を含むことができる。

【0220】

１つの局面において、開示された単離核酸分子はさらに、１またはそれを超える調節エレメントをコードする核酸配列を含むことができる。１つの局面において、開示された調節エレメントは、１またはそれを超えるプロモーター、１またはそれを超えるプライマー結合部位（ＰＢＳ）、１またはそれを超えるスプライスドナー（ＳＤ）部位、１またはそれを超えるスプライスアクセプター（ＳＡ）部位、１またはそれを超えるセントラルポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）、１またはそれを超えるポリプリントラクト（ＰＰＴ）、１またはそれを超えるＲｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）、１またはそれを超えるウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）、１またはそれを超えるレトロウイルスベクターパッケージングエレメント、あるいはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。

【0221】

１つの局面において、開示されたレトロウイルスベクターパッケージングエレメントはｐｓｉ（ψ）シグナルを含むことができる。

【0222】

１つの局面において、開示されたプロモーターは、ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）プロモーター、コア伸長因子１αプロモーター（ＥＦＳ）、ヒトＵ６プロモーター、またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。１つの局面において、開示されたウイルスベクターはウイルス３’ＵＴＲおよび／またはウイルス５’ＵＴＲをさらに含むことができる。１つの局面において、開示されたウイルスベクターは、ウイルス３’ＬＴＲにおけるＵ３領域の欠失を含むことができる。

【0223】

１つの局面において、開示されたウイルスベクターはさらに、ポリリンカー部位を含むことができる。１つの局面において、開示されたポリリンカー部位は、一対のＢｓｍＢＩ部位と、独特のＢｓｒＧＩ部位とを含むことができる。１つの局面において、開示された一対のＢｓｍＢＩ部位をｓｇＲＮＡのクローニングのために使用することができる。１つの局面において、開示されたＢｓｒＧＩ部位を、クローニングされたｓｇＲＮＡの検証のために使用することができる。

【0224】

１つの局面において、開示されたウイルスベクターは、レポーター遺伝子をコードする配列を含むことができる。１つの局面において、開示されたレポーター遺伝子を検証のために使用することができる。様々なレポーター遺伝子がこの技術分野では知られている。例えば、１つの局面において、レポーター遺伝子は、検出可能であるタンパク質、または検出可能な産物を産生する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であることが可能である。レポーター遺伝子は、検出可能なシグナルを生成する視覚的なマーカーまたは酵素をコードすることができる：例えば、ｃａｔ、ｌａｃＺ、ｕｄＡ、ｘｙＩＥ、アルカリホスファターゼ遺伝子、ａ－アミラーゼ遺伝子、α－ガラクトシダーゼ遺伝子、α－グルクロニダーゼ遺伝子、ｐラクタマーゼ遺伝子、西洋ワサビペルオキシダーゼ遺伝子、ルシフェリン／ルシフェラーゼ遺伝子、Ｒ遺伝子座遺伝子、チロシナーゼ遺伝子、または蛍光タンパク質をコードする遺伝子（蛍光タンパク質には、青色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、パプリカ蛍光タンパク質もしくは黄色蛍光タンパク質、光変換型蛍光タンパク質、光スイッチ可能な蛍光タンパク質、またはオプチカル・ハイライター蛍光タンパク質、あるいはそれらのバリアントのいずれか（バリアントには、限定されないが、コドン最適化バリアント、迅速折り畳み型バリアント、モノマー型バリアント、安定性増大バリアントおよび蛍光強化バリアントが含まれる）が含まれるが、これらに限定されない）。１つの局面において、開示されたレポーターはＧＦＰを含むことができる。１つの局面において、開示されたＧＦＰは、配列番号０３に示される配列を含むことができる。１つの局面において、開示されているコードされたＧＦＰは、配列番号０４に示される配列を含むことができる。

【0225】

本開示のウイルスベクターの１つの局面において、開示された導入遺伝子はポリペプチドをコードすることができる。１つの局面において、開示されているコードされたポリペプチドは、転写活性化活性、転写抑制活性、転写放出因子活性、ヒストン修飾活性、核酸会合活性、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、デアセチラーゼ活性、またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。１つの局面において、開示されているコードされたポリペプチドはヒストンデアセチラーゼまたはヘテロクロマチンタンパク質１であることが可能である。１つの局面において、開示されているコードされたポリペプチドは転写抑制活性を含むことができる。

【0226】

本開示のウイルスベクターの１つの局面において、開示された導入遺伝子は神経変性疾患（ＮＤＤ）関連遺伝子を含むことができる。１つの局面において、ＮＤＤは、パーキンソン病（ＰＤ）、レビー小体型認知症（ＤＬＢ）、関連したシヌクレイノパチー、アルツハイマー病（ＡＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病（ＨＤ）、またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。１つの局面において、ＮＤＤ関連遺伝子は、ＡＰＯＥ、ＡＰＰ、ＡＴＸＮ２、ＣＨＭＰ２Ｂ、ＤＣＴＮ１、ＦＩＧ４、ＦＵＳ、ＧＢＡ、ＧＲＮ、ＨＮＲＮＰＡ１、ＨＴＴ、ＬＲＲＫ２、ＭＡＴＲ３、ＯＰＴＮ、ＰＡＲＫ７、ＰＦＮ１、ＰＲＰＨ、ＰＳＥＮ１、ＳＥＴＸ、ＳＩＧＭＡＲ１、ＳＮＣＡ、ＳＯＤ１、ＳＰＧ１１、ＳＱＳＴＭ１、ＴＡＲＤＢＰ、ＴＢＫ１、ＴＢＰ、ＴＲＰＭ７、ＴＵＢＡ４Ａ、ＵＢＱＬＮ２、ＵＣＨＬ１、ＶＡＰＢ、ＶＣＰ、ＶＰＳ３５、それらのフラグメント、それらのバリアント、またはそれらのキメラを含むことができる。

【0227】

本開示のウイルスベクターの１つの局面において、開示されているコードされたポリペプチドはヒストンデアセチラーゼ（ｄｅａｃｔｙｌａｓｅ）またはヘテロクロマチンタンパク質１であることが可能である。１つの局面において、開示されているコードされたポリペプチドは転写抑制活性を含むことができる。１つの局面において、開示されるＤＮＭＴ３Ａは、配列番号６０に示されるアミノ酸配列または配列番号６１に示されるヌクレオチド配列を有することができる。１つの局面において、開示されたＤＮＭＴ３Ａは、配列番号６０もしくは配列番号６１に示される配列またはそのフラグメントに対する、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有する配列を有することができる。

【0228】

１つの局面において、少なくとも１つのコードされたポリペプチドは、Ｋｒｕｐｐｅｌ関連ボックス（ＫＲＡＢ）、メチル－ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭｅＣＰ２）の転写抑制ドメイン（ＴＲＤ）、またはＫＲＡＢ－ＭｅＣＰ２の融合物（ＫＲＡＢ－ＭｅＣＰ２）を含むことができる。１つの局面において、ＭｅＣＰ２の開示されたＴＲＤは、配列番号５７に示されるヌクレオチド配列または配列番号５６に示されるアミノ酸配列を有することができる。１つの局面において、ＭｅＣＰ２の開示されたＴＲＤは、配列番号５７もしくは配列番号５６に示される配列またはそのフラグメントに対する、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有する配列を有することができる。１つの局面において、開示されたＫＲＡＢ－ＭｅＣＰ２は、配列番号５８に示されるヌクレオチド配列または配列番号５９に示されるアミノ酸配列を有することができる。１つの局面において、開示されたＫＲＡＢ－ＭｅＣＰ２は、配列番号５８もしくは配列番号５９に示される配列またはそのフラグメントに対する、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有する配列を有することができる。

【0229】

本開示のウイルスベクターの１つの局面において、開示されたＣａｓエンドヌクレアーゼを、開示されたポリペプチドに融合することができる。１つの局面において、開示されたＣａｓエンドヌクレアーゼを、酵素活性を有する開示されたポリペプチドに融合することができる。本開示のウイルスベクターの１つの局面において、開示された融合タンパク質は、開示されたＣａｓエンドヌクレアーゼと、開示されたポリペプチドとをコードすることができる。１つの局面において、開示された融合タンパク質は、開示されたＣａｓエンドヌクレアーゼと、酵素活性を有する開示されたポリペプチドとをコードすることができる。１つの局面において、開示された融合ポリペプチドは、転写活性化活性、転写抑制活性、転写放出因子活性、ヒストン修飾活性、核酸会合活性、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、デアセチラーゼ活性、またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。

【0230】

１つの局面において、開示された融合タンパク質は、ｄＣａｓ９と、ＤＮＭＴ３Ａとを含むことができる。１つの局面において、ｄＣａｓ９－ＤＮＭＴ３Ａ融合タンパク質は、配列番号６２に示されるアミノ酸配列を有することができる。１つの局面において、ｄＣａｓ９－ＤＮＭＴ３Ａ融合タンパク質は、配列番号６３に示される配列によってコードされることが可能である。１つの局面において、開示されたｄＣａｓ９－ＤＮＭＴ３Ａ融合タンパク質は、配列番号６２もしくは配列番号６３に示される配列またはそのフラグメントに対する、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有する配列を有することができる。

【0231】

１つの局面において、開示されたＣａｓエンドヌクレアーゼはｄＶＲＥＲであることが可能であり、ポリペプチドはＤＮＭＴ３Ａであることが可能である。１つの局面において、開示されたｄＶＲＥＲ－ＤＮＭＴ３Ａ融合タンパク質は、配列番号６４に示されるアミノ酸配列を有することができる。１つの局面において、開示されたｄＶＲＥＲ－ＤＮＭＴ３Ａ融合タンパク質は、配列番号６５に示される配列によってコードされることが可能である。１つの局面において、開示されたｄＶＲＥＲ－ＤＮＭＴ３Ａ融合タンパク質は、配列番号６４もしくは配列番号６５に示される配列またはそのフラグメントに対する、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有する配列を有することができる。

【0232】

１つの局面において、開示された融合タンパク質は、ｄＣａｓ９と、Ｋｒｕｐｐｅｌ関連ボックス（ＫＲＡＢ）、メチル－ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭｅＣＰ２）の転写抑制ドメイン（ＴＲＤ）、またはＫＲＡＢ－ＭｅＣＰ２の融合物（ＫＲＡＢ－ＭｅＣＰ２）とを含むことができる。１つの局面において、開示された融合タンパク質は、ｄＶＲＥＲと、Ｋｒｕｐｐｅｌ関連ボックス（ＫＲＡＢ）、メチル－ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭｅＣＰ２）の転写抑制ドメイン（ＴＲＤ）、またはＫＲＡＢ－ＭｅＣＰ２の融合物（ＫＲＡＢ－ＭｅＣＰ２）とを含むことができる。

【0233】

本開示のウイルスベクターの１つの局面において、開示されたｇＲＮＡは、ＤＮＡ結合のための標的となった配列（例えば、目的とする遺伝子、例えば、ＮＤＤ関連遺伝子におけるＤＮＡ結合のための標的となった配列）と、エンドヌクレアーゼ結合（例えば、Ｃａｓ９結合）のための足場配列とを含むことができる。１つの局面において、開示されたｇＲＮＡは、開示された目的とする遺伝子（例えば、ＮＤＤ関連遺伝子など）において、プロモーター領域、メチル化領域、またはそれらの任意の組み合わせを標的とすることができる。

【0234】

１つの局面において、開示されたウイルスベクターはさらに、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）を標的とするｓｈＲＮＡをコードする核酸配列を含むことができる。１つの局面において、開示されたウイルスベクターはさらに、１またはそれを超えるヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）を標的とする１またはそれを超えるｓｈＲＮＡをコードする核酸配列を含むことができる。１つの局面において、開示されたウイルスベクターは、１またはそれを超えるＨＤＡＣを標的とする１またはそれを超えるｓｈＲＮＡをコードすることができる。ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）は、アセチル官能基をヒストンタンパク質および非ヒストンタンパク質の両方のリシン残基から除くことを触媒する酵素である。ヒトでは、亜鉛依存性機構またはＮＡＤ^＋依存性機構のどちらかを、アセチルリシン基質を脱アセチル化するために使用する１８個のＨＤＡＣ酵素が存在する。様々なＨＤＡＣが当業者には知られている。

【0235】

１つの局面において、開示されたＨＤＡＣは、クラスＩ Ｒｐｄ３様タンパク質、クラスＩＩ Ｈｄａ１様タンパク質、クラスＩＩＩ Ｓｉｒ２様タンパク質、またはクラスＩＶタンパク質を含むことができる。１つの局面において、開示されたクラスＩ Ｒｐｄ３様タンパク質は、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ８、またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。１つの局面において、開示されたクラスＩＩ Ｈｄａ１様タンパク質は、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ９、ＨＤＡＣ１０、またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。１つの局面において、開示されたクラスＩＩＩ Ｓｉｒ２様タンパク質は、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、ＳＩＲＴ３、ＳＩＲＴ４、ＳＩＲＴ５、ＳＩＲＴ６、ＳＩＲＴ７、またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。１つの局面において、開示されたクラスＩＶタンパク質はＨＤＡＣ１１を含むことができる。

【0236】

１つの局面において、開示されたＨＤＡＣは、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ６、またはＨＤＡＣ８、あるいはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。１つの局面において、開示されたＨＤＡＣはＨＤＡＣ８であることが可能である。

【0237】

１つの局面において、開示されたＨＤＡＣのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、配列番号０７～配列番号１２のいずれか一つに示される配列を含むことができる。１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ１のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、配列番号０７に示される配列を含むことができる。１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ２のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、配列番号０８に示される配列を含むことができる。１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ３のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、配列番号０９に示される配列を含むことができる。１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ４のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、配列番号１０に示される配列を含むことができる。１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ６のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、配列番号１１に示される配列を含むことができる。１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ８のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、配列番号１２に示される配列を含むことができる。１つの局面において、開示されたＨＤＡＣのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、配列番号０７～配列番号１２のいずれか１つに示される配列に対する、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または９５％超の同一性を有する配列を含むことができる。

【0238】

１つの局面において、開示されているコードされたＨＤＡＣは、配列番号１３～配列番号１８のいずれか１つに示される配列を含むことができる。１つの局面において、開示されているコードされたＨＤＡＣ１は、配列番号１３に示される配列を含むことができる。１つの局面において、開示されているコードされたＨＤＡＣ２は、配列番号１４に示される配列を含むことができる。１つの局面において、開示されているコードされたＨＤＡＣ３は、配列番号１５に示される配列を含むことができる。１つの局面において、開示されているコードされたＨＤＡＣ４は、配列番号１６に示される配列を含むことができる。１つの局面において、開示されているコードされたＨＤＡＣ６は、配列番号１７に示される配列を含むことができる。１つの局面において、開示されているコードされたＨＤＡＣ８は、配列番号１８に示される配列を含むことができる。

【0239】

１つの局面において、開示されているコードされたＨＤＡＣは、配列番号１３～配列番号１８のいずれか１つに示される配列に対する、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または９５％超の同一性を有する配列を含むことができる。

【0240】

本開示のウイルスベクターの１つの局面において、開示されたｓｈＲＮＡは、開示されたクラスＩ Ｒｐｄ３様タンパク質を標的とすることができる。１つの局面において、開示されたｓｈＲＮＡは、開示されたクラスＩＩ Ｈｄａ１様タンパク質を標的とすることができる。１つの局面において、開示されたｓｈＲＮＡは、開示されたクラスＩＩＩ Ｓｉｒ２様タンパク質を標的とすることができる。１つの局面において、開示されたｓｈＲＮＡは、開示されたクラスＩＶタンパク質を標的とすることができる。

【0241】

本開示のウイルスベクターの１つの局面において、開示されたｓｈＲＮＡは、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡ６、ＨＤＡＣ８、またそれらの任意の組み合わせを標的とすることができる。

【0242】

１つの局面において、ＨＤＡＣ１を標的とする開示されたｓｈＲＮＡは、配列番号１９に示される配列を含むことができ、あるいは配列番号１９に示される配列に対する、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または９５％超の同一性を有する配列を含むことができる。１つの局面において、ＨＤＡＣ２を標的とする開示されたｓｈＲＮＡは、配列番号２０に示される配列を含むことができ、あるいは配列番号２０に示される配列に対する、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または９５％超の同一性を有する配列を含むことができる。１つの局面において、ＨＤＡＣ３を標的とする開示されたｓｈＲＮＡは、配列番号２１に示される配列を含むことができ、あるいは配列番号２１に示される配列に対する、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または９５％超の同一性を有する配列を含むことができる。１つの局面において、ＨＤＡＣ４を標的とする開示されたｓｈＲＮＡは、配列番号２２に示される配列を含むことができ、あるいは配列番号２２に示される配列に対する、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または９５％超の同一性を有する配列を含むことができる。１つの局面において、ＨＤＡＣ６を標的とする開示されたｓｈＲＮＡは、配列番号２３に示される配列を含むことができ、あるいは配列番号２３に示される配列に対する、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または９５％超の同一性を有する配列を含むことができる。１つの局面において、ＨＤＡＣ８を標的とする開示されたｓｈＲＮＡは、配列番号２４に示される配列を含むことができ、あるいは配列番号２４に示される配列に対する、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または９５％超の同一性を有する配列を含むことができる。

【0243】

本開示のウイルスベクターの１つの局面において、ＨＤＡＣを標的とするｓｈＲＮＡをコードする開示された核酸配列を、クローンＴＲＣＮ００００１９５４６７、クローンＴＲＣＮ００００００４８１９、クローンＴＲＣＮ００００１９４９９３、クローンＴＲＣＮ００００００４８３２、クローンＴＲＣＮ００００００４８３９、もしくはＴＲＣＮ００００００４８５１、またはそれらの任意の組み合わせから得ることができる。

【0244】

１つの局面において、開示されたウイルスベクターは、１またはそれを超える細胞と接触させることができる。１つの局面において、開示されたウイルスベクターは、開示されたウイルスプロデューサー細胞または開示されたウイルスプロデューサー細胞株をもたらすために細胞株に形質導入することができる。

【0245】

１つの局面において、開示されたウイルスベクターは、ＨＤＡＣ^－／^－遺伝子型を生じさせるために細胞株に形質導入することができる。１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ^－／^－細胞株は生じた最適化ウイルスベクターのパッケージング能を増大させ、生じた最適化ウイルスベクターの力価を増加させ、生じた最適化ウイルスベクターの発現能を増大させ、生じた最適化ウイルスベクターの免疫原性および／または毒性を低下させ、生じた最適化ウイルスベクターが効率的に１またはそれを超える細胞に形質導入する能力を増大させ、あるいはそれらの任意の組み合わせをもたらするために使用することができる。

【0246】

１つの局面において、開示されたウイルスプロデューサー細胞は、生じた最適化ウイルスベクターのパッケージング能を増大させるために使用することができ、生じた最適化ウイルスベクターの力価を増加させることができ、生じた最適化ウイルスベクターの発現能を増大させることができ、生じた最適化ウイルスベクターの免疫原性および／または毒性を低下させることができ、生じた最適化ウイルスベクターが効率的に１またはそれを超える細胞に形質導入する能力を増大させることができ、あるいはそれらの任意の組み合わせをもたらすことができる。

【0247】

１つの局面において、開示されたウイルスプロデューサー細胞株は、最適化されたウイルスベクターを生じさせることができる。１つの局面において、開示されたウイルスプロデューサー細胞株は、生じた最適化ウイルスベクターのパッケージング能を増大させることができ、生じた最適化ウイルスベクターの力価を増加させることができ、生じた最適化ウイルスベクターの発現能を増大させることができ、生じた最適化ウイルスベクターの免疫原性および／または毒性を低下させることができ、生じた最適化ウイルスベクターが効率的に１またはそれを超える細胞に形質導入する能力を増大させることができ、あるいはそれらの任意の組み合わせをもたらすことができる。

【0248】

１つの局面において、開示されている生じた最適化ウイルスベクターは、正常な、または野生型のＨＤＡＣ発現および／またはＨＤＡＣ活性を有するウイルスプロデューサー細胞によって産生されるウイルスベクターと比較して、増加した力価、増大したパッケージング能、増大した発現能、低下した免疫原性および／または毒性、増大した形質導入効率、あるいはそれらの任意の組み合わせを有することができる。

【0249】

１つの局面において、開示されたウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、インテグラーゼ欠損レンチウイルス（ＩＤＬＶ）、またはインテグラーゼコンピテントレンチウイルス（ＩＣＬＶ）を含むことができる。レンチウイルスには、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ピューマレンチウイルス（ＰＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ビスナ／マエディウイルス（ＶＭＶ）、ヒト免疫不全ウイルス１（ＨＩＶ－１）およびヒト免疫不全ウイルス２（ＨＩＶ－２）、またはそれらの組換え体、またはそれらの変異体、またはそれらのバリアント、またはそれらのフラグメントが含まれる。

【0250】

１つの局面において、開示されている生じた最適化ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、インテグラーゼ欠損レンチウイルス（ＩＤＬＶ）、またはインテグラーゼコンピテントレンチウイルス（ＩＣＬＶ）を含むことができる。レンチウイルスには、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ピューマレンチウイルス（ＰＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ビスナ／マエディウイルス（ＶＭＶ）、ヒト免疫不全ウイルス１（ＨＩＶ－１）およびヒト免疫不全ウイルス２（ＨＩＶ－２）、またはそれらの組換え体、またはそれらの変異、またはそれらのバリアント、またはそれらのフラグメントが含まれる。

【0251】

１つの局面において、開示されたウイルスプロデューサー細胞は、開示されている単離されたウイルスベクターを使用して生じさせることができる。

【0252】

１つの局面において、開示されたウイルスプロデューサー細胞は、開示されたウイルスベクターを生じさせるために使用することができる。１つの局面において、開示されたウイルスプロデューサー細胞は、増大したパッケージング能、増加した力価、増大した発現能、低下した免疫原性および／または毒性、ならびに効率的に細胞に形質導入する増大した能力を有するウイルスベクターを生じさせるために使用することができる。

【0253】

１つの局面において、生じた最適化ウイルスベクターによって形質導入されることになる細胞は、分裂細胞および／または非分裂細胞を含むことができる。生じた最適化ウイルスベクターによって形質導入されることになる細胞は、哺乳動物細胞、例えば、ヒト、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコまたはげっ歯類の細胞などであることが可能である。１つの局面において、生じた最適化ウイルスベクターによって形質導入されることになる細胞は、対象における細胞であることが可能である。１つの局面において、対象はヒト対象であることが可能である。１つの局面において、生じた最適化ウイルスベクターによって形質導入されることになる細胞は、対象の中枢神経系における細胞、例えば、脳における有糸分裂終了ニューロンなどであることが可能である。

【0254】

１つの局面において、開示されたウイルスプロデューサー細胞は、対象（例えば、遺伝的な疾患もしくは障害または神経学的な疾患もしくは障害を有するヒトなど）におけるインビボ使用のための、すべてがそろった遺伝子治療送達システムの一部とすることができる。
５．キット

【0255】

本明細書中には、１またはそれを超える開示された組成物を含むキットが開示される。本明細書中には、開示された方法における使用のための開示された組成物を含むキットが開示される。本明細書中には、ＨＤＡＣ枯渇細胞を開発する開示された方法における使用のためのキットが開示される。本明細書中には、ウイルスベクターのパッケージング能を増大させる開示された方法における使用のためのキットが開示される。本明細書中には、ウイルスベクターの力価を増加させる開示された方法における使用のためのキットが開示される。本明細書中には、ウイルスベクターの発現能を増大させる開示された方法における使用のためのキットが開示される。本明細書中には、ウイルスベクターの免疫原性および／または毒性を低下させる開示された方法における使用のためのキットが開示される。本明細書中には、ウイルスベクターが効率的に１またはそれを超える細胞に形質導入する能力を増大させる開示された方法における使用のためのキットが開示される。

【0256】

本明細書中には、開示された方法の１つまたはそれより多くを実施するために必要である試薬を含むキットが開示される。本明細書中には、開示された方法の１つまたはそれより多くを実施するために必要である開示された組成物を含むキットが開示される。本明細書中には、開示された単離核酸分子、ＨＤＡＣを標的とする開示されたｓｈＲＮＡ、開示されたウイルスベクター、開示されたプロデューサー細胞、またはそれらの組み合わせの１つまたはそれより多くを含むキットが開示される。

【0257】

１つの局面において、開示されたキットは細胞または細胞株を含むことができる。１つの局面において、開示された細胞または開示された細胞株は、ＨＥＫ細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３ＦＴ、ＨＥＫ２９３Ｓ、ＨＥＫ２９３ＦＴ、ＨＥＫ２９３ＳＧ、ＨＥＫ２９３ＳＧＧＤ、ＨＥＫ２９３Ｈ、ＨＥＫ２９３Ｅ、ＨＥＫ２９３Ａ、ＨＥＫ２９３ＭＳＲなど）を含むことができる。

【0258】

１つの局面において、開示されたキットは、キットを構成する少なくとも２つの構成成分を含むことができる。一緒になって、これらの構成成分により、所与の目的（例えば、ＨＤＡＣ枯渇細胞を開発することなど）のための機能的ユニットが構成される。要素となる個々の構成成分（individual member components）を物理的に、一緒に、または別個に包装することができる。例えば、キットを使用するための指示を含むキットには、当該指示が物理的に、要素となる他の個々の構成成分とともに含まれてもよく、または含まれなくてもよい。代わりに、指示を、紙の形態で、またはコンピューター読み取り可能な記憶デバイスで供給され得る、もしくはインターネットウェブサイトからダウンロードされ得る電子的な形態でのどちらかでの、要素となる別個の構成成分として、あるいは記録された表示として供給することができる。１つの局面において、開示された方法における使用のためのキットは、開示された単離核酸分子、ＨＤＡＣを標的とする開示されたｓｈＲＮＡ、開示されたウイルスベクター、開示されたプロデューサー細胞、またはそれらの組み合わせを保持する１またはそれを超える容器と、使用のための指示を伴うラベルまたは添付文書とを含むことができる。１つの局面において、好適な容器には、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、ブリスターパックなどが含まれる。容器は、様々な材料から、例えば、ガラスまたはプラスチックから形成されることが可能である。容器は、例えば、開示された単離核酸分子、ＨＤＡＣを標的とする開示されたｓｈＲＮＡ、開示されたウイルスベクター、開示されたプロデューサー細胞、またはそれらの組み合わせを保持することができ、かつ無菌アクセスポートを有することができる（例えば、容器は、点滴静注バッグ、または皮下注射針によって穿刺可能な栓を有するバイアルであることが可能である）。ラベルまたは添付文書は、開示された単離核酸分子、ＨＤＡＣを標的とする開示されたｓｈＲＮＡ、開示されたウイルスベクター、開示されたプロデューサー細胞、またはそれらの組み合わせが、遺伝的な疾患もしくは障害または神経学的な疾患もしくは障害を処置するために、防止するために、抑制するために、および／または改善するために使用され得ることを示すことができる。１つの局面において、開示されたキットは、投与のために必要である追加の構成成分、例えば、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、ニードルおよびシリンジなどを含むことができる。
Ｃ．開示された方法
１．ＨＤＡＣ枯渇細胞を開発する方法

【0259】

本明細書中には、ＨＤＡＣ枯渇細胞を開発する方法であって、１またはそれを超える細胞を開示されたウイルスベクターと接触させることを含み、前記１またはそれを超える細胞への形質導入の後において、前記標的となったＨＤＡＣの発現および／または活性が低下し、および／または枯渇する方法が開示される。本明細書中には、ＨＤＡＣ枯渇細胞を開発する方法であって、１またはそれを超える細胞を、（ｉ）Ｃａｓエンドヌクレアーゼと、（ｉｉ）少なくとも１つのガイドＲＮＡと、（ｉｉｉ）少なくとも１つの導入遺伝子とをコードする核酸配列を含む単離された核酸分子を含むウイルスベクターと接触させることを含み、前記１またはそれを超える細胞への形質導入の後において、前記標的となったＨＤＡＣの発現および／または活性が低下し、および／または枯渇する方法が開示される。様々なウイルスベクターが上記で開示される。本明細書中には、ＨＤＡＣ枯渇細胞を開発する方法であって、１またはそれを超える細胞を、（ｉ）融合産物と、（ｉｉ）少なくとも１つのガイドＲＮＡとをコードする核酸配列を含む単離された核酸分子を含むウイルスベクターと接触させることを含み、前記１またはそれを超える細胞への形質導入の後において、前記標的となったＨＤＡＣの発現および／または活性が低下し、および／または枯渇する方法が開示される。様々なウイルスベクターが上記で論じされる。

【0260】

１つの局面において、開示された形質導入細胞は、哺乳動物細胞株、例えば、ヒト細胞株、ウマ細胞株、ウシ細胞株、ブタ細胞株、イヌ細胞株、ネコ細胞株またはげっ歯類細胞株（例えば、ラットまたはマウス）を含むことができる。１つの局面において、開示された形質導入細胞株は、ＨＥＫ細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３ＦＴ、ＨＥＫ２９３Ｓ、ＨＥＫ２９３ＦＴ、ＨＥＫ２９３ＳＧ、ＨＥＫ２９３ＳＧＧＤ、ＨＥＫ２９３Ｈ、ＨＥＫ２９３Ｅ、ＨＥＫ２９３Ａ、ＨＥＫ２９３ＭＳＲなど）を含むことができる。

【0261】

１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ^－／^－細胞は、生じた最適化ウイルスベクターのパッケージング能を増大させることができる。１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ^－／^－細胞は、生じた最適化ウイルスベクターの力価を増加させることができる。１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ^－／^－細胞は、生じた最適化ウイルスベクターの発現能を増大させることができる。１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ^－／^－細胞はさらに、生じた最適化ウイルスベクターの免疫原性および／または毒性を低下させることができる。１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ^－／^－細胞は、生じた最適化ウイルスベクターが効率的に１つまたは複数の細胞に形質導入する能力を増大させることができる。

【0262】

１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ^－／^－細胞は、正常な、または野生型のＨＤＡＣ発現および／またはＨＤＡＣ活性を有する細胞と比較して、生じた最適化ウイルスベクターのパッケージング能を増大させることができ、生じた最適化ウイルスベクターの力価を増加させることができ、生じた最適化ウイルスベクターの発現能を増大させることができ、生じた最適化ウイルスベクターの免疫原性および／または毒性を低下させることができ、生じた最適化ウイルスベクターが効率的に１またはそれを超える細胞に形質導入する能力を増大させることができ、あるいはそれらの任意の組み合わせをもたらすことができる。

【0263】

１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ^－／^－細胞は、ＨＤＡＣ１^－／^－、ＨＤＡＣ２^－／^－、ＨＤＡＣ３^－／^－、ＨＤＡＣ４^－／^－、ＨＤＡＣ６^－／^－、ＨＤＡＣ８^－／^－、またはそれらの任意の組み合わせであることが可能である。１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ^－／^－細胞はＨＤＡＣ１^－／^－であることが可能であり、しかし、依然として、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ８、またはそれらの任意の組み合わせを発現することができる。１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ^－／^－細胞はＨＤＡＣ２^－／^－であることが可能であり、しかし、依然として、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ８、またはそれらの任意の組み合わせを発現することができる。１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ^－／^－細胞はＨＤＡＣ３^－／^－であることが可能であり、しかし、依然として、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ８、またはそれらの任意の組み合わせを発現することができる。１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ^－／^－細胞はＨＤＡＣ４^－／^－であることが可能であり、しかし、依然として、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ８、またはそれらの任意の組み合わせを発現することができる。１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ^－／^－細胞はＨＤＡＣ６^－／^－であることが可能であり、しかし、依然として、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ８、またはそれらの任意の組み合わせを発現することができる。１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ^－／^－細胞はＨＤＡＣ８^－／^－であることが可能であり、しかし、依然として、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ６、またはそれらの任意の組み合わせを発現することができる。

【0264】

１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ^－／^－細胞は、発現および／または活性における完全な低下および／または枯渇（例えば、１００％または約１００％）を含むことができる。１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ^－／^－細胞は、発現および／または活性における不完全な低下および／または枯渇を含むことができる。１つの局面において、発現および／または活性における不完全な低下および／または枯渇は、正常な、または野生型のＨＤＡＣ発現および／またはＨＤＡＣ活性を有する細胞と比較して、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または９５％超の低下および／または枯渇を含むことができる。

【0265】

１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ^－／^－細胞は、ＩＣＬＶベクターまたはＩＤＬＶベクターを生じさせるために使用することができる。１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ^－／^－細胞は、ＡＡＶベクターまたはｒＡＡＶベクターを生じさせるために使用することができる。１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ枯渇細胞は、高度の製造技術との適合性を有するウイルスベクターを生じさせることができる。

【0266】

１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ^－／^－細胞は、分裂細胞および／または非分裂細胞（例えば、例えば、脳の有糸分裂終了ニューロンなど）に効率的に形質導入することができるウイルスベクターを生じさせることができる。

【0267】

ＨＤＡＣ枯渇細胞を開発する方法の１つの局面において、方法はさらに、治療有効量の生じた最適化ウイルスベクターを投与することを必要とする対象に投与することを含むことができる。１つの局面において、それを必要とする対象は、遺伝的な欠損または障害を有する対象を含むことができる。例えば、１つの局面において、対象は、ＮＤＤ関連遺伝子に影響を及ぼす遺伝的な欠損または障害を有し得る。

【0268】

１つの局面において、ＨＤＡＣ枯渇細胞を開発する開示された方法は、対象（例えば、遺伝的な疾患もしくは障害または神経学的な疾患もしくは障害を有するヒトなど）におけるインビボ使用のための、すべてがそろった遺伝子治療送達システムの一部とすることができる。

【0269】

１つの局面において、開示された方法はさらに、１またはそれを超える細胞のＨＤＡＣ遺伝子型、生じた最適化ウイルスベクターのパッケージング能、生じた最適化ウイルスベクターの力価、生じた最適化ウイルスベクターの発現能、生じた最適化ウイルスベクターの免疫原性および／または毒性、生じた最適化ウイルスベクターが効率的に細胞に形質導入する能力、あるいはそれらの任意の組み合わせを決定することを含み得る。
２．ウイルスベクターのパッケージング能を増大させる方法

【0270】

本明細書中には、ウイルスベクターのパッケージング能を増大させる方法であって、１またはそれを超える細胞を開示されたウイルスベクターと接触させることを含み、前記１またはそれを超える細胞への形質導入の後において、前記標的となったＨＤＡＣの発現および／または活性が低下し、および／または枯渇し、生じた最適化ウイルスベクターが増大したパッケージング能を有する方法が開示される。

【0271】

本明細書中には、ウイルスベクターのパッケージング能を増大させる方法であって、１またはそれを超える細胞を、（ｉ）Ｃａｓエンドヌクレアーゼと、（ｉｉ）少なくとも１つのガイドＲＮＡと、（ｉｉｉ）少なくとも１つの導入遺伝子とをコードする核酸配列を含む単離された核酸分子を含むウイルスベクターと接触させることを含み、前記１またはそれを超える細胞への形質導入の後において、前記標的となったＨＤＡＣの発現および／または活性が低下し、および／または枯渇し、生じた最適化ウイルスベクターが増大したパッケージング能を有する方法が開示される。様々なウイルスベクターが上記で開示される。

【0272】

本明細書中には、ウイルスベクターのパッケージング能を増大させる方法であって、１またはそれを超える細胞を、（ｉ）融合産物と、（ｉｉ）少なくとも１つのガイドＲＮＡとをコードする核酸配列を含む単離された核酸分子を含むウイルスベクターと接触させることを含み、前記１またはそれを超える細胞への形質導入の後において、前記標的となったＨＤＡＣの発現および／または活性が低下し、および／または枯渇し、生じた最適化ウイルスベクターが増大したパッケージング能を有する方法が開示される。様々なウイルスベクターが上記で開示される。

【0273】

本明細書中には、ウイルスベクターのパッケージング能を増大させる方法であって、１またはそれを超える細胞を、（ｉ）Ｃａｓエンドヌクレアーゼと、（ｉｉ）少なくとも１つのガイドＲＮＡと、（ｉｉｉ）少なくとも１つの導入遺伝子と、（ｉｖ）ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）を標的とするｓｈＲＮＡとをコードする核酸配列を含む単離された核酸分子を含むウイルスベクターと接触させることを含み、前記１またはそれを超える細胞への形質導入の後において、前記標的となったＨＤＡＣの発現および／または活性が低下し、および／または枯渇し、生じた最適化ウイルスベクターが増大したパッケージング能を有する方法が開示される。様々なウイルスベクターが上記で開示される。

【0274】

本明細書中には、ウイルスベクターのパッケージング能を増大させる方法であって、１またはそれを超える細胞を、（ｉ）融合産物と、（ｉｉ）少なくとも１つのガイドＲＮＡと、（ｉｉｉ）ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）を標的とするｓｈＲＮＡとをコードする核酸配列を含む単離された核酸分子を含むウイルスベクターと接触させることを含み、前記１またはそれを超える細胞への形質導入の後において、前記標的となったＨＤＡＣの発現および／または活性が低下し、および／または枯渇し、生じた最適化ウイルスベクターが増大したパッケージング能を有する方法が開示される。様々なウイルスベクターが上記で開示される。

【0275】

１つの局面において、開示された形質導入細胞は、哺乳動物細胞株、例えば、ヒト細胞株、ウマ細胞株、ウシ細胞株、ブタ細胞株、イヌ細胞株、ネコ細胞株またはげっ歯類細胞株（例えば、ラットまたはマウス）を含むことができる。１つの局面において、開示された形質導入細胞株は、ＨＥＫ細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３ＦＴ、ＨＥＫ２９３Ｓ、ＨＥＫ２９３ＦＴ、ＨＥＫ２９３ＳＧ、ＨＥＫ２９３ＳＧＧＤ、ＨＥＫ２９３Ｈ、ＨＥＫ２９３Ｅ、ＨＥＫ２９３Ａ、ＨＥＫ２９３ＭＳＲなど）を含むことができる。

【0276】

１つの局面において、パッケージング能を増大させる開示された方法はさらに、生じた最適化ウイルスベクターの力価を増加させることができる。１つの局面において、パッケージング能を増大させる開示された方法はさらに、生じた最適化ウイルスベクターの発現能を増大させることができる。１つの局面において、パッケージング能を増大させる開示された方法はさらに、生じた最適化ウイルスベクターの免疫原性および／または毒性を低下させることができる。１つの局面において、パッケージング能を増大させる開示された方法はさらに、生じた最適化ウイルスベクターが効率的に１つまたは複数の細胞に形質導入する能力を増大させることができる。

【0277】

１つの局面において、パッケージング能を増大させる開示された方法はさらに、正常な、または野生型のＨＤＡＣ発現および／またはＨＤＡＣ活性を有する細胞と比較して、力価を増加させることができ、発現能を増大させることができ、免疫原性および／または毒性を低下させることができ、生じた最適化ウイルスベクターが効率的に１またはそれを超える細胞に形質導入する能力を増大させることができ、あるいはそれらの任意の組み合わせをもたらすことができる。

【0278】

パッケージング能を増大させる開示された方法の１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ^－／^－細胞は、ＨＤＡＣ１^－／^－、ＨＤＡＣ２^－／^－、ＨＤＡＣ３^－／^－、ＨＤＡＣ４^－／^－、ＨＤＡＣ６^－／^－、ＨＤＡＣ８^－／^－、またはそれらの任意の組み合わせであることが可能である。パッケージング能を増大させる開示された方法の１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ^－／^－細胞はＨＤＡＣ１^－／^－であることが可能であり、しかし、依然として、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ８、またはそれらの任意の組み合わせを発現することができる。パッケージング能を増大させる開示された方法の１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ^－／^－細胞はＨＤＡＣ２^－／^－であることが可能であり、しかし、依然として、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ８、またはそれらの任意の組み合わせを発現することができる。パッケージング能を増大させる開示された方法の１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ^－／^－細胞はＨＤＡＣ３^－／^－であることが可能であり、しかし、依然として、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ８、またはそれらの任意の組み合わせを発現することができる。パッケージング能を増大させる開示された方法の１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ^－／^－細胞はＨＤＡＣ４^－／^－であることが可能であり、しかし、依然として、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ８、またはそれらの任意の組み合わせを発現することができる。パッケージング能を増大させる開示された方法の１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ^－／^－細胞はＨＤＡＣ６^－／^－であることが可能であり、しかし、依然として、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ８、またはそれらの任意の組み合わせを発現することができる。パッケージング能を増大させる開示された方法の１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ^－／^－細胞はＨＤＡＣ８^－／^－であることが可能であり、しかし、依然として、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ６、またはそれらの任意の組み合わせを発現することができる。

【0279】

パッケージング能を増加させる開示された方法の１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ^－／^－細胞は、発現および／または活性における完全な低下および／または枯渇（例えば、１００％または約１００％）を含むことができる。１つの局面において、発現および／または活性における不完全な低下および／または枯渇は、正常な、または野生型のＨＤＡＣ発現および／またはＨＤＡＣ活性を有する細胞と比較して、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または９５％超の低下および／または枯渇を含むことができる。

【0280】

１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ^－／^－細胞は、ＩＣＬＶベクターまたはＩＤＬＶベクターを生じさせるために使用することができる。１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ^－／^－細胞は、ＡＡＶベクターまたはｒＡＡＶベクターを生じさせるために使用することができる。１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ枯渇細胞は、高度の製造技術との適合性を有するウイルスベクターを生じさせることができる。

【0281】

パッケージング能を増大させる開示された方法の１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ^－／^－細胞は、分裂細胞および／または非分裂細胞（例えば、例えば、脳の有糸分裂終了ニューロンなど）に効率的に形質導入することができるウイルスベクターを生じさせることができる。

【0282】

パッケージング能を増大させる開示された方法の１つの局面において、方法はさらに、治療有効量の生じた最適化ウイルスベクターを投与することを必要とする対象に投与することを含むことができる。１つの局面において、それを必要とする対象は、遺伝的な欠損または障害を有する対象を含むことができる。例えば、１つの局面において、対象は、ＮＤＤ関連遺伝子に影響を及ぼす遺伝的な欠損または障害を有し得る。

【0283】

１つの局面において、パッケージング能を増大させる開示された方法は、対象（例えば、遺伝的な疾患もしくは障害または神経学的な疾患もしくは障害を有するヒトなど）におけるインビボ使用のための、すべてがそろった遺伝子治療送達システムの一部とすることができる。

【0284】

１つの局面において、開示された方法はさらに、１またはそれを超える細胞のＨＤＡＣ遺伝子型、生じた最適化ウイルスベクターのパッケージング能、生じた最適化ウイルスベクターの力価、生じた最適化ウイルスベクターの発現能、生じた最適化ウイルスベクターの免疫原性および／または毒性、生じた最適化ウイルスベクターが効率的に細胞に形質導入する能力、あるいはそれらの任意の組み合わせを決定することを含み得る。
３．ウイルスベクターの力価を増加させる方法

【0285】

本明細書中には、ウイルスベクターの力価を増加させる方法であって、１またはそれを超える細胞を開示されたウイルスベクターと接触させることを含み、前記１またはそれを超える細胞への形質導入の後において、前記標的となったＨＤＡＣの発現および／または活性が低下し、および／または枯渇し、生じた最適化ウイルスベクターの力価を増加する方法が開示される。様々なウイルスベクターが上記で開示される。

【0286】

本明細書中には、ウイルスベクターの力価を増加させる方法であって、１またはそれを超える細胞を、（ｉ）Ｃａｓエンドヌクレアーゼと、（ｉｉ）少なくとも１つのガイドＲＮＡと、（ｉｉｉ）少なくとも１つの導入遺伝子とをコードする核酸配列を含む単離された核酸分子を含むウイルスベクターと接触させることを含み、前記１またはそれを超える細胞への形質導入の後において、前記標的となったＨＤＡＣの発現および／または活性が低下し、および／または枯渇し、生じた最適化ウイルスベクターの力価を増加する方法が開示される。様々なウイルスベクターが上記で開示される。

【0287】

本明細書中には、ウイルスベクターの力価を増加させる方法であって、１またはそれを超える細胞を、（ｉ）融合産物と、（ｉｉ）少なくとも１つのガイドＲＮＡとをコードする核酸配列を含む単離された核酸分子を含むウイルスベクターと接触させることを含み、前記１またはそれを超える細胞への形質導入の後において、前記標的となったＨＤＡＣの発現および／または活性が低下し、および／または枯渇し、生じた最適化ウイルスベクターの力価を増加する方法が開示される。様々なウイルスベクターが上記で開示される。

【0288】

本明細書中には、ウイルスベクターの力価を増加させる方法であって、１またはそれを超える細胞を、（ｉ）融合産物と、（ｉｉ）少なくとも１つのガイドＲＮＡと、（ｉｉｉ）ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）を標的とするｓｈＲＮＡとをコードする核酸配列を含む単離された核酸分子を含むウイルスベクターと接触させることを含み、前記１またはそれを超える細胞への形質導入の後において、前記標的となったＨＤＡＣの発現および／または活性が低下し、および／または枯渇し、生じた最適化ウイルスベクターが増大したパッケージング能を有する方法が開示される。様々なウイルスベクターが上記で開示される。

【0289】

本明細書中には、ウイルスベクターの力価を増加させる方法であって、１またはそれを超える細胞を、（ｉ）Ｃａｓエンドヌクレアーゼと、（ｉｉ）少なくとも１つのガイドＲＮＡと、（ｉｉｉ）少なくとも１つの導入遺伝子と、（ｉｖ）ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）を標的とするｓｈＲＮＡとをコードする核酸配列を含む単離された核酸分子を含むウイルスベクターと接触させることを含み、前記１またはそれを超える細胞への形質導入の後において、前記標的となったＨＤＡＣの発現および／または活性が低下し、および／または枯渇し、生じた最適化ウイルスベクターの力価を増加する方法が開示される。様々なウイルスベクターが上記で開示される。

【0290】

１つの局面において、開示された形質導入細胞は、哺乳動物細胞株、例えば、ヒト細胞株、ウマ細胞株、ウシ細胞株、ブタ細胞株、イヌ細胞株、ネコ細胞株またはげっ歯類細胞株（例えば、ラットまたはマウス）を含むことができる。１つの局面において、開示された形質導入細胞株は、ＨＥＫ細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３ＦＴ、ＨＥＫ２９３Ｓ、ＨＥＫ２９３ＦＴ、ＨＥＫ２９３ＳＧ、ＨＥＫ２９３ＳＧＧＤ、ＨＥＫ２９３Ｈ、ＨＥＫ２９３Ｅ、ＨＥＫ２９３Ａ、ＨＥＫ２９３ＭＳＲなど）を含むことができる。

【0291】

１つの局面において、ウイルスベクターの力価を増加させる開示された方法はさらに、生じた最適化ウイルスベクターのパッケージング能を増大させることができる。１つの局面において、ウイルスベクターの力価を増加させる開示された方法はさらに、生じた最適化ウイルスベクターの発現能を増大させることができる。１つの局面において、ウイルスベクターの力価を増加させる開示された方法はさらに、生じた最適化ウイルスベクターの免疫原性および／または毒性を低下させることができる。１つの局面において、ウイルスベクターの力価を増加させる開示された方法はさらに、生じた最適化ウイルスベクターが効率的に１つまたは複数の細胞に形質導入する能力を増大させることができる。

【0292】

１つの局面において、ウイルスベクターの力価を増加させる開示された方法はさらに、正常な、または野生型のＨＤＡＣ発現および／またはＨＤＡＣ活性を有する細胞と比較して、パッケージング能を増大させることができ、発現能を増大させることができ、免疫原性および／または毒性を低下させることができ、生じた最適化ウイルスベクターが効率的に１またはそれを超える細胞に形質導入する能力を増大させることができ、あるいはそれらの任意の組み合わせをもたらすことができる。

【0293】

ウイルスベクターの力価を増加させる開示された方法の１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ^－／^－細胞は、ＨＤＡＣ１^－／^－、ＨＤＡＣ２^－／^－、ＨＤＡＣ３^－／^－、ＨＤＡＣ４^－／^－、ＨＤＡＣ６^－／^－、ＨＤＡＣ８^－／^－、またはそれらの任意の組み合わせであることが可能である。ウイルスベクターの力価を増加させる開示された方法の１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ^－／^－細胞はＨＤＡＣ１^－／^－であることが可能であり、しかし、依然として、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ８、またはそれらの任意の組み合わせを発現することができる。ウイルスベクターの力価を増加させる開示された方法の１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ^－／^－細胞はＨＤＡＣ２^－／^－であることが可能であり、しかし、依然として、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ８、またはそれらの任意の組み合わせを発現することができる。ウイルスベクターの力価を増加させる開示された方法の１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ^－／^－細胞はＨＤＡＣ３^－／^－であることが可能であり、しかし、依然として、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ８、またはそれらの任意の組み合わせを発現することができる。ウイルスベクターの力価を増加させる開示された方法の１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ^－／^－細胞はＨＤＡＣ４^－／^－であることが可能であり、しかし、依然として、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ８、またはそれらの任意の組み合わせを発現することができる。ウイルスベクターの力価を増加させる開示された方法の１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ^－／^－細胞はＨＤＡＣ６^－／^－であることが可能であり、しかし、依然として、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ８、またはそれらの任意の組み合わせを発現することができる。ウイルスベクターの力価を増加させる開示された方法の１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ^－／^－細胞はＨＤＡＣ８^－／^－であることが可能であり、しかし、依然として、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ６、またはそれらの任意の組み合わせを発現することができる。

【0294】

ウイルスベクターの力価を増加させる開示された方法の１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ^－／^－細胞は、発現および／または活性における完全な低下および／または枯渇（例えば、１００％または約１００％）を含むことができる。１つの局面において、発現および／または活性における不完全な低下および／または枯渇は、正常な、または野生型のＨＤＡＣ発現および／またはＨＤＡＣ活性を有する細胞と比較して、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または９５％超の低下および／または枯渇を含むことができる。

【0295】

１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ^－／^－細胞は、ＩＣＬＶベクターまたはＩＤＬＶベクターを生じさせるために使用することができる。１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ^－／^－細胞は、ＡＡＶベクターまたはｒＡＡＶベクターを生じさせるために使用することができる。１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ枯渇細胞は、高度の製造技術との適合性を有するウイルスベクターを生じさせることができる。

【0296】

ウイルスベクターの力価を増加させる開示された方法の１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ^－／^－細胞は、分裂細胞および／または非分裂細胞（例えば、例えば、脳の有糸分裂終了ニューロンなど）に効率的に形質導入することができるウイルスベクターを生じさせることができる。

【0297】

ウイルスベクターの力価を増加させる開示された方法の１つの局面において、方法はさらに、治療有効量の生じた最適化ウイルスベクターを投与することを必要とする対象に投与することを含むことができる。１つの局面において、それを必要とする対象は、遺伝的な欠損または障害を有する対象を含むことができる。例えば、１つの局面において、対象は、ＮＤＤ関連遺伝子に影響を及ぼす遺伝的な欠損または障害を有し得る。

【0298】

１つの局面において、ウイルスベクターの力価を増加させる開示された方法は、対象（例えば、遺伝的な疾患もしくは障害または神経学的な疾患もしくは障害を有するヒトなど）におけるインビボ使用のための、すべてがそろった遺伝子治療送達システムの一部とすることができる。

【0299】

１つの局面において、開示された方法はさらに、１またはそれを超える細胞のＨＤＡＣ遺伝子型、生じた最適化ウイルスベクターのパッケージング能、生じた最適化ウイルスベクターの力価、生じた最適化ウイルスベクターの発現能、生じた最適化ウイルスベクターの免疫原性および／または毒性、生じた最適化ウイルスベクターが効率的に細胞に形質導入する能力、あるいはそれらの任意の組み合わせを決定することを含み得る。
４．ウイルスベクターの発現能を増大させる方法

【0300】

本明細書中には、ウイルスベクターの発現能を増大させる方法であって、１またはそれを超える細胞を開示されたウイルスベクターと接触させることを含み、前記１またはそれを超える細胞への形質導入の後において、前記標的となったＨＤＡＣの発現および／または活性が低下し、および／または枯渇し、生じた最適化ウイルスベクターが増大した発現能を有し、増大する方法が開示される。様々なウイルスベクターが上記で開示される。

【0301】

本明細書中には、ウイルスベクターの発現能を増大させる方法であって、１またはそれを超える細胞を、（ｉ）Ｃａｓエンドヌクレアーゼと、（ｉｉ）少なくとも１つのガイドＲＮＡと、（ｉｉｉ）少なくとも１つの導入遺伝子とをコードする核酸配列を含む単離された核酸分子を含むウイルスベクターと接触させることを含み、前記１またはそれを超える細胞への形質導入の後において、前記標的となったＨＤＡＣの発現および／または活性が低下し、および／または枯渇し、生じた最適化ウイルスベクターが増大した発現能を有し、増大する方法が開示される。様々なウイルスベクターが上記で開示される。

【0302】

本明細書中には、ウイルスベクターの発現能を増大させる方法であって、１またはそれを超える細胞を、（ｉ）融合産物と、（ｉｉ）少なくとも１つのガイドＲＮＡとをコードする核酸配列を含む単離された核酸分子を含むウイルスベクターと接触させることを含み、前記１またはそれを超える細胞への形質導入の後において、前記標的となったＨＤＡＣの発現および／または活性が低下し、および／または枯渇し、生じた最適化ウイルスベクターが増大した発現能を有し、増大する方法が開示される。様々なウイルスベクターが上記で開示される。

【0303】

本明細書中には、ウイルスベクターの発現能を増大させる方法であって、１またはそれを超える細胞を、（ｉ）Ｃａｓエンドヌクレアーゼと、（ｉｉ）少なくとも１つのガイドＲＮＡと、（ｉｉｉ）少なくとも１つの導入遺伝子と、（ｉｖ）ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）を標的とするｓｈＲＮＡとをコードする核酸配列を含む単離された核酸分子を含むウイルスベクターと接触させることを含み、前記１またはそれを超える細胞への形質導入の後において、前記標的となったＨＤＡＣの発現および／または活性が低下し、および／または枯渇し、生じた最適化ウイルスベクターが増大した発現能を有し、増大する方法が開示される。様々なウイルスベクターが上記で開示される。

【0304】

本明細書中には、ウイルスベクターの発現能を増大させる方法であって、１またはそれを超える細胞を、（ｉ）融合産物と、（ｉｉ）少なくとも１つのガイドＲＮＡと、（ｉｉｉ）ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）を標的とするｓｈＲＮＡとをコードする核酸配列を含む単離された核酸分子を含むウイルスベクターと接触させることを含み、前記１またはそれを超える細胞への形質導入の後において、前記標的となったＨＤＡＣの発現および／または活性が低下し、および／または枯渇し、生じた最適化ウイルスベクターが増大した発現能を有し、増大する方法が開示される。様々なウイルスベクターが上記で開示される。

【0305】

１つの局面において、開示された形質導入細胞は、哺乳動物細胞株、例えば、ヒト細胞株、ウマ細胞株、ウシ細胞株、ブタ細胞株、イヌ細胞株、ネコ細胞株またはげっ歯類細胞株（例えば、ラットまたはマウス）を含むことができる。１つの局面において、開示された形質導入細胞株は、ＨＥＫ細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３ＦＴ、ＨＥＫ２９３Ｓ、ＨＥＫ２９３ＦＴ、ＨＥＫ２９３ＳＧ、ＨＥＫ２９３ＳＧＧＤ、ＨＥＫ２９３Ｈ、ＨＥＫ２９３Ｅ、ＨＥＫ２９３Ａ、ＨＥＫ２９３ＭＳＲなど）を含むことができる。

【0306】

１つの局面において、ウイルスベクターの発現能を増大させる開示された方法はさらに、生じた最適化ウイルスベクターのパッケージング能を増大させることができる。１つの局面において、ウイルスベクターの発現能を増大させる開示された方法はさらに、生じた最適化ウイルスベクターの力価を増加させることができる。１つの局面において、ウイルスベクターの発現能を増大させる開示された方法はさらに、生じた最適化ウイルスベクターの免疫原性および／または毒性を低下させることができる。１つの局面において、ウイルスベクターの発現能を増大させる開示された方法はさらに、生じた最適化ウイルスベクターが効率的に１つまたは複数の細胞に形質導入する能力を増大させることができる。

【0307】

１つの局面において、ウイルスベクターの発現能させる開示された方法はさらに、正常な、または野生型のＨＤＡＣ発現および／またはＨＤＡＣ活性を有する細胞と比較して、パッケージング能を増大させることができ、力価を増加させることができ、免疫原性および／または毒性を低下させることができ、生じた最適化ウイルスベクターが効率的に１またはそれを超える細胞に形質導入する能力を増大させることができ、あるいはそれらの任意の組み合わせをもたらすことができる。

【0308】

ウイルスベクターの発現能を増大させる開示された方法の１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ^－／^－細胞は、ＨＤＡＣ１^－／^－、ＨＤＡＣ２^－／^－、ＨＤＡＣ３^－／^－、ＨＤＡＣ４^－／^－、ＨＤＡＣ６^－／^－、ＨＤＡＣ８^－／^－、またはそれらの任意の組み合わせであることが可能である。ウイルスベクターの発現能を増大させる開示された方法の１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ^－／^－細胞はＨＤＡＣ１^－／^－であることが可能であり、しかし、依然として、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ８、またはそれらの任意の組み合わせを発現することができる。ウイルスベクターの発現能を増大させる開示された方法の１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ^－／^－細胞はＨＤＡＣ２^－／^－であることが可能であり、しかし、依然として、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ８、またはそれらの任意の組み合わせを発現することができる。ウイルスベクターの発現能を増大させる開示された方法の１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ^－／^－細胞はＨＤＡＣ３^－／^－であることが可能であり、しかし、依然として、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ８、またはそれらの任意の組み合わせを発現することができる。ウイルスベクターの発現能を増大させる開示された方法の１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ^－／^－細胞はＨＤＡＣ４^－／^－であることが可能であり、しかし、依然として、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ８、またはそれらの任意の組み合わせを発現することができる。ウイルスベクターの発現能を増大させる開示された方法の１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ^－／^－細胞はＨＤＡＣ６^－／^－であることが可能であり、しかし、依然として、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ８、またはそれらの任意の組み合わせを発現することができる。ウイルスベクターの発現能を増大させる開示された方法の１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ^－／^－細胞はＨＤＡＣ８^－／^－であることが可能であり、しかし、依然として、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ６、またはそれらの任意の組み合わせを発現することができる。

【0309】

ウイルスベクターの発現能を増加させる開示された方法の１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ^－／^－細胞は、発現および／または活性における完全な低下および／または枯渇（例えば、１００％または約１００％）を含むことができる。１つの局面において、発現および／または活性における不完全な低下および／または枯渇は、正常な、または野生型のＨＤＡＣ発現および／またはＨＤＡＣ活性を有する細胞と比較して、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または９５％超の低下および／または枯渇を含むことができる。

【0310】

１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ^－／^－細胞は、ＩＣＬＶベクターまたはＩＤＬＶベクターを生じさせるために使用することができる。１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ^－／^－細胞は、ＡＡＶベクターまたはｒＡＡＶベクターを生じさせるために使用することができる。１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ枯渇細胞は、高度の製造技術との適合性を有するウイルスベクターを生じさせることができる。

【0311】

ウイルスベクターの発現能を増大させる開示された方法の１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ^－／^－細胞は、分裂細胞および／または非分裂細胞（例えば、例えば、脳の有糸分裂終了ニューロンなど）に効率的に形質導入することができるウイルスベクターを生じさせることができる。

【0312】

ウイルスベクターの発現能を増大させる開示された方法の１つの局面において、方法はさらに、治療有効量の生じた最適化ウイルスベクターを投与することを必要とする対象に投与することを含むことができる。１つの局面において、それを必要とする対象は、遺伝的な欠損または障害を有する対象を含むことができる。例えば、１つの局面において、対象は、ＮＤＤ関連遺伝子に影響を及ぼす遺伝的な欠損または障害を有し得る。

【0313】

１つの局面において、ウイルスベクターの発現能を増大させる開示された方法は、対象（例えば、遺伝的な疾患もしくは障害または神経学的な疾患もしくは障害を有するヒトなど）におけるインビボ使用のための、すべてがそろった遺伝子治療送達システムの一部とすることができる。

【0314】

１つの局面において、開示された方法はさらに、１またはそれを超える細胞のＨＤＡＣ遺伝子型、生じた最適化ウイルスベクターのパッケージング能、生じた最適化ウイルスベクターの力価、生じた最適化ウイルスベクターの発現能、生じた最適化ウイルスベクターの免疫原性および／または毒性、生じた最適化ウイルスベクターが効率的に細胞に形質導入する能力、あるいはそれらの任意の組み合わせを決定することを含み得る。
５．ウイルスベクターの免疫原性および／または毒性を低下させる方法

【0315】

本明細書中には、ウイルスベクターの免疫原性および／または毒性を低下させる方法であって、１またはそれを超える細胞を開示されたウイルスベクターと接触させることを含み、前記１またはそれを超える細胞への形質導入の後において、前記標的となったＨＤＡＣの発現および／または活性が低下し、および／または枯渇し、生じた最適化ウイルスベクターが低下した免疫原性および／または毒性を有する方法が開示される。様々なウイルスベクターが上記で開示される。

【0316】

本明細書中には、ウイルスベクターの免疫原性および／または毒性を低下させる方法であって、１またはそれを超える細胞を、（ｉ）Ｃａｓエンドヌクレアーゼと、（ｉｉ）少なくとも１つのガイドＲＮＡと、（ｉｉｉ）少なくとも１つの導入遺伝子とをコードする核酸配列を含む単離された核酸分子を含むウイルスベクターと接触させることを含み、前記１またはそれを超える細胞への形質導入の後において、前記標的となったＨＤＡＣの発現および／または活性が低下し、および／または枯渇し、生じた最適化ウイルスベクターが低下した免疫原性および／または毒性を有する方法が開示される。様々なウイルスベクターが上記で開示される。

【0317】

本明細書中には、ウイルスベクターの免疫原性および／または毒性を低下させる方法であって、１またはそれを超える細胞を、（ｉ）融合産物と、（ｉｉ）少なくとも１つのガイドＲＮＡとをコードする核酸配列を含む単離された核酸分子を含むウイルスベクターと接触させることを含み、前記１またはそれを超える細胞への形質導入の後において、前記標的となったＨＤＡＣの発現および／または活性が低下し、および／または枯渇し、生じた最適化ウイルスベクターが低下した免疫原性および／または毒性を有する方法が開示される。様々なウイルスベクターが上記で開示される。

【0318】

本明細書中には、ウイルスベクターの免疫原性および／または毒性を低下させる方法であって、１またはそれを超える細胞を、（ｉ）Ｃａｓエンドヌクレアーゼと、（ｉｉ）少なくとも１つのガイドＲＮＡと、（ｉｉｉ）少なくとも１つの導入遺伝子と、（ｉｖ）ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）を標的とするｓｈＲＮＡとをコードする核酸配列を含む単離された核酸分子を含むウイルスベクターと接触させることを含み、前記１またはそれを超える細胞への形質導入の後において、前記標的となったＨＤＡＣの発現および／または活性が低下し、および／または枯渇し、生じた最適化ウイルスベクターが低下した免疫原性および／または毒性を有する方法が開示される。様々なウイルスベクターが上記で開示される。

【0319】

本明細書中には、ウイルスベクターの免疫原性および／または毒性を低下させる方法であって、１またはそれを超える細胞を、（ｉ）融合産物と、（ｉｉ）少なくとも１つのガイドＲＮＡと、（ｉｉｉ）ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）を標的とするｓｈＲＮＡとをコードする核酸配列を含む単離された核酸分子を含むウイルスベクターと接触させることを含み、前記１またはそれを超える細胞への形質導入の後において、前記標的となったＨＤＡＣの発現および／または活性が低下し、および／または枯渇し、生じた最適化ウイルスベクターが低下した免疫原性および／または毒性を有する方法が開示される。様々なウイルスベクターが上記で開示される。

【0320】

１つの局面において、開示された形質導入細胞は、哺乳動物細胞株、例えば、ヒト細胞株、ウマ細胞株、ウシ細胞株、ブタ細胞株、イヌ細胞株、ネコ細胞株またはげっ歯類細胞株（例えば、ラットまたはマウス）を含むことができる。１つの局面において、開示された形質導入細胞株は、ＨＥＫ細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３ＦＴ、ＨＥＫ２９３Ｓ、ＨＥＫ２９３ＦＴ、ＨＥＫ２９３ＳＧ、ＨＥＫ２９３ＳＧＧＤ、ＨＥＫ２９３Ｈ、ＨＥＫ２９３Ｅ、ＨＥＫ２９３Ａ、ＨＥＫ２９３ＭＳＲなど）を含むことができる。

【0321】

１つの局面において、ウイルスベクターの免疫原性および／または毒性を低下させる開示された方法はさらに、生じた最適化ウイルスベクターのパッケージング能を増大させることができる。１つの局面において、ウイルスベクターの免疫原性および／または毒性を低下させる開示された方法はさらに、生じた最適化ウイルスベクターの力価を増加させることができる。１つの局面において、ウイルスベクターの免疫原性および／または毒性を低下させる開示された方法はさらに、生じた最適化ウイルスベクターの発現能を増大させることができる。１つの局面において、ウイルスベクターの免疫原性および／または毒性を低下させる開示された方法はさらに、生じた最適化ウイルスベクターが効率的に１つまたは複数の細胞に形質導入する能力を増大させることができる。

【0322】

１つの局面において、ウイルスベクターの免疫原性および／または毒性を低下させる開示された方法はさらに、正常な、または野生型のＨＤＡＣ発現および／またはＨＤＡＣ活性を有する細胞と比較して、生じた最適化ウイルスベクターのパッケージング能を増大させることができ、生じた最適化ウイルスベクターの力価を増加させることができ、生じた最適化ウイルスベクターの発現能を増大させることができ、生じた最適化ウイルスベクターが効率的に１またはそれを超える細胞に形質導入する能力を増大させることができ、あるいはそれらの任意の組み合わせをもたらすことができる。

【0323】

ウイルスベクターの免疫原性および／または毒性を低下させる開示された方法の１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ^－／^－細胞は、ＨＤＡＣ１^－／^－、ＨＤＡＣ２^－／^－、ＨＤＡＣ３^－／^－、ＨＤＡＣ４^－／^－、ＨＤＡＣ６^－／^－、ＨＤＡＣ８^－／^－、またはそれらの任意の組み合わせであることが可能である。ウイルスベクターの免疫原性および／または毒性を低下させる開示された方法の１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ^－／^－細胞はＨＤＡＣ１^－／^－であることが可能であり、しかし、依然として、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ８、またはそれらの任意の組み合わせを発現することができる。ウイルスベクターの免疫原性および／または毒性を低下させる開示された方法の１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ^－／^－細胞はＨＤＡＣ２^－／^－であることが可能であり、しかし、依然として、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ８、またはそれらの任意の組み合わせを発現することができる。ウイルスベクターの免疫原性および／または毒性を低下させる開示された方法の１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ^－／^－細胞はＨＤＡＣ３^－／^－であることが可能であり、しかし、依然として、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ８、またはそれらの任意の組み合わせを発現することができる。ウイルスベクターの免疫原性および／または毒性を低下させる開示された方法の１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ^－／^－細胞はＨＤＡＣ４^－／^－であることが可能であり、しかし、依然として、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ８、またはそれらの任意の組み合わせを発現することができる。ウイルスベクターの免疫原性および／または毒性を低下させる開示された方法の１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ^－／^－細胞はＨＤＡＣ６^－／^－であることが可能であり、しかし、依然として、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ８、またはそれらの任意の組み合わせを発現することができる。ウイルスベクターの免疫原性および／または毒性を低下させる開示された方法の１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ^－／^－細胞はＨＤＡＣ８^－／^－であることが可能であり、しかし、依然として、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ６、またはそれらの任意の組み合わせを発現することができる。

【0324】

ウイルスベクターの免疫原性および／または毒性を低下させる開示された方法の１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ^－／^－細胞は、発現および／または活性における完全な低下および／または枯渇（例えば、１００％または約１００％）を含むことができる。１つの局面において、発現および／または活性における不完全な低下および／または枯渇は、正常な、または野生型のＨＤＡＣ発現および／またはＨＤＡＣ活性を有する細胞と比較して、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または９５％超の低下および／または枯渇を含むことができる。

【0325】

１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ^－／^－細胞は、ＩＣＬＶベクターまたはＩＤＬＶベクターを生じさせるために使用することができる。１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ^－／^－細胞は、ＡＡＶベクターまたはｒＡＡＶベクターを生じさせるために使用することができる。１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ枯渇細胞は、高度の製造技術との適合性を有するウイルスベクターを生じさせることができる。

【0326】

ウイルスベクターの免疫原性および／または毒性を低下させる開示された方法の１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ^－／^－細胞は、分裂細胞および／または非分裂細胞（例えば、例えば、脳の有糸分裂終了ニューロンなど）に効率的に形質導入することができるウイルスベクターを生じさせることができる。

【0327】

ウイルスベクターの免疫原性および／または毒性を低下させる開示された方法の１つの局面において、方法はさらに、治療有効量の生じた最適化ウイルスベクターを投与することを必要とする対象に投与することを含むことができる。１つの局面において、それを必要とする対象は、遺伝的な欠損または障害を有する対象を含むことができる。例えば、１つの局面において、対象は、ＮＤＤ関連遺伝子に影響を及ぼす遺伝的な欠損または障害を有し得る。

【0328】

１つの局面において、ウイルスベクターの免疫原性および／または毒性を低下させる開示された方法は、対象（例えば、遺伝的な疾患もしくは障害または神経学的な疾患もしくは障害を有するヒトなど）におけるインビボ使用のための、すべてがそろった遺伝子治療送達システムの一部とすることができる。

【0329】

１つの局面において、開示された方法はさらに、１またはそれを超える細胞のＨＤＡＣ遺伝子型、生じた最適化ウイルスベクターのパッケージング能、生じた最適化ウイルスベクターの力価、生じた最適化ウイルスベクターの発現能、生じた最適化ウイルスベクターの免疫原性および／または毒性、生じた最適化ウイルスベクターが効率的に細胞に形質導入する能力、あるいはそれらの任意の組み合わせを決定することを含み得る。
６．ウイルスベクターが効率的に細胞に形質導入する能力を増大させる方法

【0330】

本明細書中には、ウイルスベクターが効率的に１またはそれを超える細胞に形質導入する能力を増大させる方法であって、１またはそれを超える細胞を開示されたウイルスベクターと接触させることを含み、前記１またはそれを超える細胞への形質導入の後において、前記標的となったＨＤＡＣの発現および／または活性が低下し、および／または枯渇し、生じた最適化ウイルスベクターが増大した効率的に細胞に形質導入する能力を有する方法が開示される。様々なウイルスベクターが上記で開示される。

【0331】

本明細書中には、ウイルスベクターが効率的に１またはそれを超える細胞に形質導入する能力を増大させる方法であって、１またはそれを超える細胞を、（ｉ）Ｃａｓエンドヌクレアーゼと、（ｉｉ）少なくとも１つのガイドＲＮＡと、（ｉｉｉ）少なくとも１つの導入遺伝子とをコードする核酸配列を含む単離された核酸分子を含むウイルスベクターと接触させることを含み、前記１またはそれを超える細胞への形質導入の後において、前記標的となったＨＤＡＣの発現および／または活性が低下し、および／または枯渇し、生じた最適化ウイルスベクターが増大した効率的に細胞に形質導入する能力を有する方法が開示される。様々なウイルスベクターが上記で開示される。

【0332】

本明細書中には、ウイルスベクターが効率的に１またはそれを超える細胞に形質導入する能力を増大させる方法であって、１またはそれを超える細胞を、（ｉ）融合産物と、（ｉｉ）少なくとも１つのガイドＲＮＡとをコードする核酸配列を含む単離された核酸分子を含むウイルスベクターと接触させることを含み、前記１またはそれを超える細胞への形質導入の後において、前記標的となったＨＤＡＣの発現および／または活性が低下し、および／または枯渇し、生じた最適化ウイルスベクターが増大した効率的に細胞に形質導入する能力を有する方法が開示される。様々なウイルスベクターが上記で開示される。

【0333】

本明細書中には、ウイルスベクターが効率的に１またはそれを超える細胞に形質導入する能力を増大させる方法であって、１またはそれを超える細胞を、（ｉ）Ｃａｓエンドヌクレアーゼと、（ｉｉ）少なくとも１つのガイドＲＮＡと、（ｉｉｉ）少なくとも１つの導入遺伝子と、（ｉｖ）ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）を標的とするｓｈＲＮＡとをコードする核酸配列を含む単離された核酸分子を含むウイルスベクターと接触させることを含み、前記１またはそれを超える細胞への形質導入の後において、前記標的となったＨＤＡＣの発現および／または活性が低下し、および／または枯渇し、生じた最適化ウイルスベクターが増大した効率的に細胞に形質導入する能力を有する方法が開示される。様々なウイルスベクターが上記で開示される。

【0334】

本明細書中には、ウイルスベクターが効率的に１またはそれを超える細胞に形質導入する能力を増大させる方法であって、１またはそれを超える細胞を、（ｉ）融合産物と、（ｉｉ）少なくとも１つのガイドＲＮＡと、（ｉｉｉ）ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）を標的とするｓｈＲＮＡとをコードする核酸配列を含む単離された核酸分子を含むウイルスベクターと接触させることを含み、前記１またはそれを超える細胞への形質導入の後において、前記標的となったＨＤＡＣの発現および／または活性が低下し、および／または枯渇し、生じた最適化ウイルスベクターが増大した効率的に細胞に形質導入する能力を有する方法が開示される。様々なウイルスベクターが上記で開示される。

【0335】

１つの局面において、開示された形質導入細胞は、哺乳動物細胞株、例えば、ヒト細胞株、ウマ細胞株、ウシ細胞株、ブタ細胞株、イヌ細胞株、ネコ細胞株またはげっ歯類細胞株（例えば、ラットまたはマウス）を含むことができる。１つの局面において、開示された形質導入細胞株は、ＨＥＫ細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３ＦＴ、ＨＥＫ２９３Ｓ、ＨＥＫ２９３ＦＴ、ＨＥＫ２９３ＳＧ、ＨＥＫ２９３ＳＧＧＤ、ＨＥＫ２９３Ｈ、ＨＥＫ２９３Ｅ、ＨＥＫ２９３Ａ、ＨＥＫ２９３ＭＳＲなど）を含むことができる。

【0336】

１つの局面において、ウイルスベクターが効率的に１またはそれを超える細胞に形質導入する能力を増大させる開示された方法はさらに、生じた最適化ウイルスベクターのパッケージング能を増大させることができる。１つの局面において、ウイルスベクターが効率的に１またはそれを超える細胞に形質導入する能力を増大させる開示された方法はさらに、生じた最適化ウイルスベクターの力価を増加させることができる。１つの局面において、ウイルスベクターが効率的に１またはそれを超える細胞に形質導入する能力を増大させる開示された方法はさらに、生じた最適化ウイルスベクターの発現能を増大させることができる。１つの局面において、ウイルスベクターが効率的に１またはそれを超える細胞に形質導入する能力を増大させる開示された方法はさらに、生じた最適化ウイルスベクターの免疫原性および／または毒性を低下させることができる。

【0337】

１つの局面において、ウイルスベクターが効率的に１またはそれを超える細胞に形質導入する能力を増大させる開示された方法はさらに、正常な、または野生型のＨＤＡＣ発現および／またはＨＤＡＣ活性を有する細胞と比較して、生じた最適化ウイルスベクターのパッケージング能を増大させることができ、生じた最適化ウイルスベクターの力価を増加させることができ、発現能を増大させることができ、生じた最適化ウイルスベクターの免疫原性および／または毒性を低下させることができ、あるいはそれらの任意の組み合わせをもたらすことができる。

【0338】

ウイルスベクターが効率的に１またはそれを超える細胞に形質導入する能力を増大させる開示された方法の１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ^－／^－細胞は、ＨＤＡＣ１^－／^－、ＨＤＡＣ２^－／^－、ＨＤＡＣ３^－／^－、ＨＤＡＣ４^－／^－、ＨＤＡＣ６^－／^－、ＨＤＡＣ８^－／^－、またはそれらの任意の組み合わせであることが可能である。ウイルスベクターが効率的に１またはそれを超える細胞に形質導入する能力を増大させる開示された方法の１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ^－／^－細胞はＨＤＡＣ１^－／^－であることが可能であり、しかし、依然として、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ８、またはそれらの任意の組み合わせを発現することができる。ウイルスベクターが効率的に１またはそれを超える細胞に形質導入する能力を増大させる開示された方法の１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ^－／^－細胞はＨＤＡＣ２^－／^－であることが可能であり、しかし、依然として、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ８、またはそれらの任意の組み合わせを発現することができる。ウイルスベクターが効率的に１またはそれを超える細胞に形質導入する能力を増大させる開示された方法の１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ^－／^－細胞はＨＤＡＣ３^－／^－であることが可能であり、しかし、依然として、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ８、またはそれらの任意の組み合わせを発現することができる。ウイルスベクターが効率的に１またはそれを超える細胞に形質導入する能力を増大させる開示された方法の１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ^－／^－細胞はＨＤＡＣ４^－／^－であることが可能であり、しかし、依然として、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ８、またはそれらの任意の組み合わせを発現することができる。ウイルスベクターが効率的に１またはそれを超える細胞に形質導入する能力を増大させる開示された方法の１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ^－／^－細胞はＨＤＡＣ６^－／^－であることが可能であり、しかし、依然として、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ８、またはそれらの任意の組み合わせを発現することができる。ウイルスベクターが効率的に１またはそれを超える細胞に形質導入する能力を増大させる開示された方法の１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ^－／^－細胞はＨＤＡＣ８^－／^－であることが可能であり、しかし、依然として、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ６、またはそれらの任意の組み合わせを発現することができる。

【0339】

ウイルスベクターが効率的に１またはそれを超える細胞に形質導入する能力を増大させる開示された方法の１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ^－／^－細胞は、発現および／または活性における完全な低下および／または枯渇（例えば、１００％または約１００％）を含むことができる。１つの局面において、発現および／または活性における不完全な低下および／または枯渇は、正常な、または野生型のＨＤＡＣ発現および／またはＨＤＡＣ活性を有する細胞と比較して、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または９５％超の低下および／または枯渇を含むことができる。

【0340】

１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ^－／^－細胞は、ＩＣＬＶベクターまたはＩＤＬＶベクターを生じさせるために使用することができる。１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ^－／^－細胞は、ＡＡＶベクターまたはｒＡＡＶベクターを生じさせるために使用することができる。１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ枯渇細胞は、高度の製造技術との適合性を有するウイルスベクターを生じさせることができる。ウイルスベクターが効率的に１またはそれを超える細胞に形質導入する能力を増大させる開示された方法の１つの局面において、開示されたＨＤＡＣ^－／^－細胞は、分裂細胞および／または非分裂細胞（例えば、例えば、脳の有糸分裂終了ニューロンなど）に効率的に形質導入することができるウイルスベクターを生じさせることができる。

【0341】

ウイルスベクターが効率的に１またはそれを超える細胞に形質導入する能力を増大させる開示された方法の１つの局面において、方法はさらに、治療有効量の生じた最適化ウイルスベクターを投与することを必要とする対象に投与することを含むことができる。１つの局面において、それを必要とする対象は、遺伝的な欠損または障害を有する対象を含むことができる。例えば、１つの局面において、対象は、ＮＤＤ関連遺伝子に影響を及ぼす遺伝的な欠損または障害を有し得る。

【0342】

１つの局面において、ウイルスベクターが効率的に１またはそれを超える細胞に形質導入する能力を増大させる開示された方法は、対象（例えば、遺伝的な疾患もしくは障害または神経学的な疾患もしくは障害を有するヒトなど）におけるインビボ使用のための、すべてがそろった遺伝子治療送達システムの一部とすることができる。
Ｄ．その他

【0343】

本明細書中には、Ｓｐ１およびＮＦ－ｋＢが含有されるベクターを含む、配列番号０１で提供される組成物が開示される。本明細書中には、ＧＦＰに対するｇＲＮＡを保有し、配列番号０２で提供される、Ｓｐ１およびＮＦ－ｋＢを含有するベクターを含む組成物が開示される。本明細書中には、ＧＦＰに対するｇＲＮＡを含む、配列番号０５または配列番号０６で提供される組成物が開示される。

【0344】

本明細書中には、ＨＤＡＣ２のＯＲＦを含む、配列番号０８で提供される組成物が開示される。本明細書中には、ＨＤＡＣ３のＯＲＦを含む、配列番号０９で提供される組成物が開示される。本明細書中には、ＨＤＡＣ４のＯＲＦを含む、配列番号１０で提供される組成物が開示される。本明細書中には、ＨＤＡＣ６のＯＲＦを含む、配列番号１１で提供される組成物が開示される。本明細書中には、ＨＤＡＣ８のＯＲＦを含む、配列番号１２で提供される組成物が開示される。

【0345】

本明細書中には、ｓｈＲＮＡクローンＴＲＣＮ００００１９５４６７が標的としている、配列番号１９で提供されるＨＤＡＣ１配列を含む組成物が開示される。本明細書中には、ｓｈＲＮＡクローンＴＲＣＮ００００００４８１９が標的としている、配列番号２０で提供されるＨＤＡＣ２配列を含む組成物が開示される。本明細書中には、ｓｈＲＮＡクローンＴＲＣＮ００００１９４９９３が標的としている、配列番号２１で提供されるＨＤＡＣ３配列を含む組成物が開示される。本明細書中には、ｓｈＲＮＡクローンＴＲＣＮ００００００４８３２が標的としている、配列番号２２で提供されるＨＤＡＣ４配列を含む組成物が開示される。本明細書中には、ｓｈＲＮＡクローンＴＲＣＮ００００００４８３９が標的としている、配列番号２３で提供されるＨＤＡＣ６配列を含む組成物が開示される。本明細書中には、ｓｈＲＮＡクローンＴＲＣＮ００００００４８３９が標的としている、配列番号２４で提供されるＨＤＡＣ８配列を含む組成物が開示される。

【0346】

本明細書中には、哺乳動物遺伝子を標的としないスクランブルｓｈＲＮＡを運搬する、配列番号２５で提供されるｐＬＫ０．１ウイルスベクター骨格を含む組成物が開示される。本明細書中には、ＨＤＡＣ１ ｓｈＲＮＡを運搬する、配列番号２６で提供されるｐＬＫ０．１ウイルスベクター骨格を含む組成物が開示される。本明細書中には、ＨＤＡＣ２ ｓｈＲＮＡを運搬する、配列番号２７で提供されるｐＬＫ０．１ウイルスベクター骨格を含む組成物が開示される。本明細書中には、ＨＤＡＣ３ ｓｈＲＮＡを運搬する、配列番号２８で提供されるｐＬＫ０．１ウイルスベクター骨格を含む組成物が開示される。本明細書中には、ＨＤＡＣ４ ｓｈＲＮＡを運搬する、配列番号２９で提供されるｐＬＫ０．１ウイルスベクター骨格を含む組成物が開示される。本明細書中には、ＨＤＡＣ６ ｓｈＲＮＡを運搬する、配列番号３０で提供されるｐＬＫ０．１ウイルスベクター骨格を含む組成物が開示される。本明細書中には、ＨＤＡＣ８ ｓｈＲＮＡを運搬する、配列番号３１で提供されるｐＬＫ０．１ウイルスベクター骨格を含む組成物が開示される。

【表1-1】

【表1-2】

【表1-3】

【表1-4】

【実施例】

【0347】

ＶＩＩ．実施例
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、遺伝子配列および遺伝子発現の前例のない制御をヒトを含めて多くの種においてもたらすことによってゲノム編集の分野に大変革をもたらしている。レンチウイルスベクター（ＬＶ）は、大きなＤＮＡペイロードに適応し、かつ広範囲の分裂細胞および非分裂細胞における堅固な発現を持続させるその能力に起因して、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムのための主要な送達プラットフォームの１つである。インビボにおける有糸分裂終了ニューロンへのレンチウイルスベクターの効率的な形質導入を明らかに示す最初の刊行物（Ｎａｌｄｉｎｉ Ｌら（１９９６）、Ｓｃｉｅｎｃｅ．２７２（５２５９）：２６３－２６７）以降、数千の研究が、ＣＮＳならびに他の組織および器官への遺伝子送達のためのＨＩＶ系ベクターの使用を探索してきた。このベクターは、パーキンソン病、アルツハイマー病、ウィスコット・アルドリッチ症候群、Ｘ連鎖副腎白質ジストロフィー、異染性白質ジストロフィーなどが含まれる多くの臨床試験において首尾よく使用されている（このことが、Ｋａｎｔｏｒ Ｂら（２０１４）、Ａｄｖ Ｇｅｎｅｔ、８７：７１－１２４において総説される）。レンチウイルスが、ＳＮＣＡ遺伝子をエピジェネティックに標的とするために使用された（Ｋａｎｔｏｒ Ｂら（２０１８）、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．、２６（１１）：２６３８－２６４９）。

【0348】

その成功にもかかわらず、インテグラーゼコンピテントベクター（ＩＣＬＶ）の広範な使用が、挿入変異誘発の比較的高いリスクによって妨げられ得る（Ｏｒｔｉｎｓｋｉ ＰＩら（２０１７）、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ．、５：１５３－１６４）。さらに、ＬＶが送達するＣａｓ９／ｇＲＮＡの長期の発現が、非特異的なＲＮＡ－ＤＮＡ相互作用およびオフターゲットのＤＮＡ擾乱によって特徴づけられる望ましくないオフターゲット影響を引き起すことがある（Ｏｒｔｉｎｓｋｉ ＰＩら（２０１７）、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ．、５：１５３－１６４）。これらの短所を避けるための明白な選択がアデノ関連ベクター（ＡＡＶ）の使用であろう。実際、様々なＡＡＶベクターが近年では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９成分の送達のための広く採用されているプラットフォームになってきている。しかしながら、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９導入遺伝子の大きいサイズが、重大な負担をＡＡＶのパッケージング能に強いている（このことが、Ｒｉｔｔｉｎｅｒ ＪＥら（２０２０）、Ｆｒｏｎｔ Ｍｏｌ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、１３：１４８において総説される）。ＡＡＶベクターとは対照的に、インテグラーゼ欠損レンチウイルスベクター（ＩＤＬＶ）は大きいパッケージング能（最大で１１ｋｂｓ）を有しており、そのため、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９送達のためにより好適である。加えて、ＩＤＬＶでは、広範囲の細胞向性および組織向性、ならびに示された最小限の細胞傷害性および免疫原性が明らかにされる。重要なことに、ＩＤＬＶは非常に弱い組み込み能を保持しており、そのため、そのインテグラーゼコンピテント対応物よりも安全である。

【0349】

しかしながら、ＡＡＶの大きいベクターコピー数は、重篤な毒性を非ヒト霊長類において引き起こす可能性があり、このことから、ウイルスベクターの製造技術を改善することの差し迫った必要性が強調される。実際、製造実務に直接に関連づけられる重大な安全上の懸念が最近では、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）を対象とした第Ｉ／ＩＩ相臨床試験であるＩＧＮＩＴＥ研究を後退させた。（この臨床試験を主導した）スポンサー企業は、ＳＧＴ－００１（新規なＡＡＶ系システム）が注射される２人の患者が重大な有害事象を経験したことを発表した。ＡＡＶをＸ連鎖筋細管ミオパシー（ＸＭＴＭ）の小児において使用する異なる臨床試験において、スポンサー企業は、死亡した３名の少年が高用量の実験用ベクターを受けたことを報告した。なおもさらに、スポンサー企業は、Ｌｅｎｔｉ－Ｇｌｏｂｉｎ（鎌状赤血球病のための遺伝子治療）を評価する臨床試験を、５年超の前に処置された患者が急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を発症した後で中断した。スポンサー企業は最近、利用されたウイルス発現カセットに関連づけられ得る類似する毒性上の懸念を引用して、治験のＳＭＡ１遺伝子治療であるＢＩＩＢ０８９の開発の終了を発表した。すべてのそれらの研究において、重大な懸念が、ウイルスベクター製造プロセスの安全性、効率および拡大縮小可能性に関して表されている。

【0350】

ウイルス媒介遺伝子移入は、神経系への治療用カーゴの送達のための選り抜きの方法を表す。極めて重要なことに、ウイルス媒介遺伝子移入は通常の場合、それが遺伝性障害のための遺伝子置換戦略であれ、ＣＮＳの疾患および障害を処置するためのゲノム改変構築物またはエピゲノム改変構築物の送達であれ、単回注射のみを必要とする。したがって、相当の努力が、ＣＮＳを含めて異なる組織および器官への遺伝子移入のための改善されたベクターシステムの開発に向けられてきたことは理解できる。様々な異なるウイルスベクターは当然のことながら、それらの具体的な適用に合わせられるが、しかし、一般には、いくつかの重要な特性を共有しなければならない。

【0351】

下記に提供される具体的な実施例では、理想的なウイルスベクターが、大きいパッケージング能（これは特大のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓツールの送達のためにとりわけ有益である）、堅固で、かつ持続した発現と対になる効率的な遺伝子移入、発癌性、毒性および病原性の欠如を含めて改善された安全性、ならびに臨床適用のための拡大縮小可能な製造を組み込んでいることが明らかにされる。
実施例１
レンチウイルスベクターカセットプラスミドの構築

【0352】

図１Ａに示されるように、２つのレンチウイルスベクターカセットプラスミドを構築した。上段のバージョンはＳｐ１結合部位を欠いており、一方で、下段のバージョンは２つのＳｐ１結合部位を含有する。他の調節エレメントとして、プライマー結合部位（ＰＢＳ）、スプライスドナー（ＳＤ）およびスプライスアクセプター（ＳＡ）、セントラルポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）およびポリプリントラクト（ＰＰＴ）、Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）、ウッドチャック肝炎ウイルスの転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）、ならびにレトロウイルスベクターパッケージングエレメント（ｐｓｉ（ψ）シグナル）が含まれる。ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）プロモーター、コア伸長因子１αプロモーター（ＥＦＳ）およびヒトＵ６プロモーターもまた含まれる。この自己不活性化ベクター（ＳＩＮ）カセットプラスミドは３’－ＬＴＲのＵ３領域における欠失（－１８ｂｐｓ～－４１８ｂｐｓ）を有している（ＤＵ３）。ポリリンカー部位は、ｓｇＲＮＡのクローニングのために、およびその検証のためにそれぞれ使用される一対のＢｓｍＢＩ部位と、独特のＢｓｒＧＩ部位とを含有する。

【0353】

この目的のために、図１Ｂは、Ｓｐ１部位の有無による組み込み型（ＩＣＬＶ）および非組み込み型（ＩＤＬＶ）のウイルス粒子の産生力価を示す。結果が、１ｎｇのｐ２４ｇａｇを１×１０^４個の粒子と同等と見なすコピー数／ミリリットルで記録された。図１Ｃは、ピューロマイシン耐性コロニーを計数することによって決定される全体的なＩＣＬＶ産生力価を示す。結果が、Ｓｐ１含有ベクターから得られるコロニー数と、Ｓｐ１非含有ベクターから得られるコロニー数との間の比として示される。棒グラフのデータは三連の実験からの平均±ＳＤを表す。
実施例２
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介ノックアウトの効率

【0354】

ｅＧＦＰ枯渇のレベルを、ＩＣＬＶおよびＩＤＬＶによって送達されるｓｇＲＮＡについて、形質導入後（ｐｔ）の７日目、１４日目および２１日目での蛍光活性化細胞選別アッセイによって評価した。ナイーブＨＥＫ２９３Ｔ－ｅＧＦＰ細胞（ＧＦＰウイルスにより形質導入されない細胞）およびｓｇＲＮＡ非発現細胞（ｓｇＲＮＡ非存在）が対照として役立った。形質導入後に残存するＧＦＰ陽性細胞の百分率を記録した。ｙ軸は側方散乱を表し、一方で、ｘ軸はＭＦＩを表す。実施例３
実施例３
オンターゲットＤＮＡ切断の評価

【0355】

図３Ａは、ＩＤＬＶおよびＩＣＬＶによって送達されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９のＤＮＡ切断のオンターゲット評価を示す。評価を、ＩＤＬＶ－ｓｇＲＮＡ１／Ｃａｓ９およびＩＣＬＶ－ｓｇＲＮＡ１／Ｃａｓ９により形質導入されるＧＦＰ陽性細胞を様々なＭＯＩで使用して形質導入後７日で行った。図３Ｂは、ＩＣＬＶ－ベクターまたはＩＤＬＶ－ベクターのどちらかにより形質導入されたサンプルの標的ＩｎＤｅｌに関して評価するためのサンガー法の使用を示す。オンターゲット変異の割合を７日目に決定した。図３Ｃは、ＩＣＬＶ－ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９（濃い棒；配列番号３２～配列番号４１を参照のこと）およびＩＣＬＶ－ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９（薄い棒；配列番号４２～配列番号５１を参照のこと）によって誘導されるＩｎＤｅｌの形成を例示する。ＩｎＤｅｌを、変異した配列を有する読み取りと総読み取りとの（百分率での）比率として計算した。
実施例４
標的遺伝子のインビボ枯渇の評価

【0356】

図４Ａは、ＧＡＢＡ_Ａ受容体α２サブユニットをインビボ（ラット）で枯渇させるためのＩＤＬＶ－ＣＲＩＰＳＲ／Ｃａｓ９システムの効力を評価するためのウエスタンブロット分析の使用を示す。２匹の対照動物（ラット）（レーン１および２）および２匹のＩＤＬＶ－α２／Ｃａｓ９注射動物（ラット）（レーン３および４）を使用した。チューブリン（ＤＭ１Ａ）抗体（約４０ｋＤａ）を負荷対照として使用した。図４Ｂは、対照動物およびＩＤＬＶ－α２／Ｃａｓ９注射動物からのＮＡｃ切片におけるｍＩＰＳＣ法の使用を例示する。図の上部（ｉ）におけるイベント頻度の類似性に留意のこと。３つの異なるニューロンからのｍＩＰＳＣ平均（黒色記録線）は図の下部（ｉｉ）において、ＩＤＬＶ－α２／Ｃａｓ９動物（ラット）からの切片におけるｍＩＰＳＣ持続時間の変動性を例示する。比較を容易にするために、それぞれの記録線を単一の対照ニューロンからのｍＩＰＳＣ平均（灰色記録線）に重ねた。図４Ｃは、すべての記録されたニューロンからのｍＩＰＳＣ減衰時間の分布を例示する。水平の黒色棒をそれぞれの群についての平均値で中央に置いている。図４Ｄは、Ｋ平均法クラスター分析により、ＭＳＮの低速ｍＩＰＳＣ群、中速ｍＩＰＳＣ群および高速ｍＩＰＳＣ群についての中心値が特定されることを例示する（クラスター１、クラスター２およびクラスター３ではそれぞれ、ｎ＝１個、５個および５個のＩＤＬＶ－α２／Ｃａｓ９細胞、一方で、クラスター１、クラスター２およびクラスター３ではそれぞれ、ｎ＝３個、２個および２個の対照細胞）。最後に、図４Ｅは、ｍＩＰＳＣ振幅の変動性がＩＤＬＶ－α２／Ｃａｓ９群および対照群における細胞の間で類似していたことを示す。水平の黒色棒をそれぞれの群についての平均値で中央に置いている。
実施例５
ＨＤＡＣノックダウンの検証

【0357】

図５Ａ～図５ＢはＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）ノックダウンの検証を示す。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、ＨＤＡＣに対するｓｈＲＮＡを保有するＬＶにより形質導入した。ここで、代表的な画像により、ＨＤＡＣ２に対するｓｈＲＮＡと、ＨＤＡＣ８に対するｓｈＲＮＡとを使用して達成されるノックダウンが強調される。図５Ａにおいて、上段のグラフは、ｑＲＴ分析を使用して、ナイーブＨＥＫ２９３Ｔ細胞（黒色棒）、ＨＤＡＣ２－ｓｈＲＮＡが形質導入されるその細胞（白色棒）、およびＨＤＡＣ８－ｓｈＲＮＡが形質導入されるその細胞（灰色棒）において測定されるＨＤＡＣ８のｍＲＮＡレベルを示す。図５Ａにおいて、下段のパネルは、ｑＲＴ分析を使用して、ナイーブＨＥＫ２９３Ｔ細胞（黒色棒）、ＨＤＡＣ２－ｓｈＲＮＡが形質導入されるその細胞（白色棒）、およびＨＤＡＣ８－ｓｈＲＮＡが形質導入されるその細胞（灰色棒）において測定されるＨＤＡＣ２のｍＲＮＡレベルを示す。図５Ｂは、ＨＤＡＣ２形質導入細胞およびＨＤＡＣ８形質導入細胞から調製される細胞溶解物に対して行われたＷＢによって評価されるＨＤＡＣ８およびＨＤＡＣ２のタンパク質レベルを示す。ヒトアクチンを負荷対照として使用した。示されるように、ＨＤＡＣ８の特異的かつ堅固なノックダウンが、ＨＤＡＣ８が標的となった細胞において達成され、その一方で、ＨＤＡＣ２タンパク質のレベルが、ＨＤＡＣ２ ＫＤ細胞株において効率的に減少した。
実施例６
ＨＤＡＣ枯渇細胞において生じるベクターの評価

【0358】

図６は、ナイーブ細胞、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４およびＨＤＡＣ８に対するｓｈＲＮＡを担持する細胞、ならびに酪酸ナトリウム（Ｂｕ）により２．５ｍＭで処理される細胞において生じるＩＤＬＶベクターの効率的な産生を示す。プロットは、記載（Ｔａｇｌｉａｆｉｅｒｒｏ Ｌら（２０１９）、Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ．（１４５）：１０．３７９１／５９２４１）のようなｐ２４ｇａｇ ＥＬＩＳＡを使用する産生の量測定を報告する。さらなる正規化が、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞への形質導入のための等しいウイルス量を適用するために行われる。
実施例７
ＨＤＡＣ枯渇細胞において生じるベクターにおける導入遺伝子発現の評価

【0359】

図７は、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４およびＨＤＡＣ８のそれぞれに対する、ヘアピンを保有するｓｈＲＮＡウイルスで形質導入される細胞、ならびに酪酸ナトリウム（Ｂｕ）により２．５ｍＭで処理される細胞におけるＧＦＰ発現の可視化を報告する。ウイルス量を正規化するために、等しい濃度のｐ２４含有量を使用した。ＧＦＰ発現を、記載（Ｔａｇｌｉａｆｉｅｒｒｏ Ｌら（２０１９）、Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ．（１４５）：１０．３７９１／５９２４１）のような蛍光顕微鏡観察法を使用して評価した。
実施例の概要

【0360】

酪酸ナトリウム（ＳＢ）はＡＡＶベクターおよびＬＶベクターの両方のエピソームゲノムの発現および産生を増加させた（Ｋａｎｔｏｒ Ｂら（２００９）、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．、１０６（４４）：１８７８６－１８７９１；Ｍｏｎａｈａｎ ＰＥら（２０１０）、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．、１８（１１）：１９０７－１９１６）。しかし、ＳＢは、細胞周期停止、細胞分化における変化、およびアポトーシスシグナル伝達を含めたその広範なオフターゲット影響のために、ベクターの産生および発現を増強させるために使用することができない。

【0361】

この技術的障害を克服するために、本明細書中に提示されるデータは、ＩＤＬＶベクター、およびＡＡＶのような他の非組込み型ベクターの産生および発現が、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）活性をプロデューサー細胞株において妨害することによって実質的に増強されたことを示す。実際、ＨＤＡＣ欠失細胞から生じるベクターは、実質的により高い産生力価であり、（ナイーブＨＥＫ２９３Ｔ細胞または野生型ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の発現特徴と比較して）より良好な発現特性を有した。具体的には、本明細書中に提供される実施例は、ＨＤＡＣを不活性化する（それにより、エピソーム型ウイルスのパッケージング能および発現能を妨害する、かつ／または妨げる抑制性クロマチン構成を除く）ための機能喪失スクリーニング方法を記載する。

【0362】

この方法を使用して、ＨＤＡＣ８が、ＩＤＬＶ発現およびＩＤＬＶ産生の負の調節のための重要な因子として特定された。これらのデータは、特異的ノックダウンを介するＨＤＡＣ８の不活性化がＩＤＬＶゲノムの非常に実質的なアップレギュレーションをもたらしたことを明らかに示す。これらの結果は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓが含まれる広範囲の基礎研究ツールおよび治療ツールの効率的な産生のためのＡＡＶ、ＬＶ（ＩＤＬＶおよびＩＣＬＶ）、ならびに他のウイルスおよびベクターを生じさせるために拡張され得る、ＨＤＡＣ８が枯渇するＨＥＫ２９３Ｔ細胞に基づくプロデューサー細胞株を作り出すための道を開いた。

【0363】

そのうえ、本明細書中に記載される新規なプロデューサー細胞の開発により、遺伝子治療に関連づけられるいくつかの大きな課題が回避される。具体的には、開示された最適化ウイルスベクターは、（ｉ）特大のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９成分の送達（これには、例えば、有糸分裂終了ニューロンのような非分裂細胞への送達が含まれる）のための高い効率を有し、（ｉｉ）広範囲の細胞向性のための好適性を明らかにし、（ｉｉｉ）低い細胞傷害性および免疫原性を示し、かつ（ｉｖ）ＡＡＶプラットフォームおよびＬＶプラットフォームの両方に関連のある高度の製造技術との適合性を示す。本明細書中に開示される組成物および方法により、ＡＡＶベクターおよびＬＶベクターの両方の利点を合わせ持ち、一方で、これらのベクターの知られている制限を最小限に抑える遺伝子送達システムが提供された。

【図1】

【図2】

【図3-1】

【図3-2】

【図3-3】

【図3-4】

【図4-1】

【図4-2】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9-1】

【図9-2】

【配列表】

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【国際調査報告】