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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-07-12
(54)【発明の名称】ＫＣＮＶ２遺伝子治療
(51)【国際特許分類】
C12N 15/85 20060101AFI20240705BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20240705BHJP
C12N 15/864 20060101ALI20240705BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20240705BHJP
A61K 38/17 20060101ALI20240705BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20240705BHJP
A61P 27/02 20060101ALI20240705BHJP
【ＦＩ】
C12N15/85 Z
C12N15/12 ZNA
C12N15/864 100Z
A61K48/00
A61K38/17
A61K35/76
A61P27/02
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024501820
(86)(22)【出願日】2022-07-13
(85)【翻訳文提出日】2024-03-08
(86)【国際出願番号】 IB2022056457
(87)【国際公開番号】W WO2023285986
(87)【国際公開日】2023-01-19
(31)【優先権主張番号】63/221,879
(32)【優先日】2021-07-14
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】517271175
【氏名又は名称】メイラグティーエックス ユーケー アイアイ リミティド
(74)【代理人】
【識別番号】100099759
【弁理士】
【氏名又は名称】青木 篤
(74)【代理人】
【識別番号】100123582
【弁理士】
【氏名又は名称】三橋 真二
(74)【代理人】
【識別番号】100117019
【弁理士】
【氏名又は名称】渡辺 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100141977
【弁理士】
【氏名又は名称】中島 勝
(74)【代理人】
【識別番号】100138210
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 達則
(74)【代理人】
【識別番号】100203828
【弁理士】
【氏名又は名称】喜多村 久美
(72)【発明者】
【氏名】アナスタシオス ジョージアディス
【テーマコード（参考）】
4C084
4C087
【Ｆターム（参考）】
4C084AA02
4C084AA13
4C084BA02
4C084MA58
4C084MA66
4C084NA14
4C084ZA33
4C087AA01
4C087AA02
4C087BC83
4C087CA12
4C087MA58
4C087MA66
4C087NA14
4C087ZA33
(57)【要約】
本明細書では、Ｋｖ８．２の発現のための発現コンストラクト、ウイルスゲノム、及びベクター、ならびに本明細書で開示されるベクターを含む医薬組成物が提供される。また、本明細書に開示される発現コンストラクト及びベクターを使用する方法であって、網膜疾患の治療を必要とする対象における網膜疾患を治療する方法を含み、網膜疾患は、ＫＣＮＶ２遺伝子における１つ以上の変異に関連しており、本明細書に開示されるベクターを対象に投与することを含む、方法が提供される。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
（ａ）光受容体細胞に発現を与えるプロモーター配列、及び（ｂ）Ｋｖ８．２をコードする核酸配列；
を含む発現コンストラクトであって、前記核酸配列は前記プロモーターに作動可能に連結されている、前記発現コンストラクト。
【請求項2】
前記プロモーター配列が、ＣＡＧまたはロドプシンキナーゼ（ＲＫ）プロモーター配列である、請求項１に記載の発現コンストラクト。
【請求項3】
前記プロモーター配列が、配列番号８と少なくとも９０％同一である配列を含む、請求項２に記載の発現コンストラクト。
【請求項4】
前記プロモーター配列が、配列番号８の配列を含む、請求項３に記載の発現コンストラクト。
【請求項5】
前記プロモーター配列が、配列番号７と少なくとも９０％同一である配列を含む、請求項２に記載の発現コンストラクト。
【請求項6】
前記プロモーター配列が、配列番号７の配列を含む、請求項５に記載の発現コンストラクト。
【請求項7】
請求項１～６のいずれか１項に記載の発現コンストラクトであって、転写後調節エレメントをさらに含む、前記発現コンストラクト。
【請求項8】
請求項７に記載の発現コンストラクトであって、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）をさらに含む、前記発現コンストラクト。
【請求項9】
前記ＷＰＲＥが、配列番号１１と少なくとも９０％同一である配列を含む、請求項７に記載の発現コンストラクト。
【請求項10】
前記ＷＰＲＥが、配列番号１１を含む配列を含む、請求項９に記載の発現コンストラクト。
【請求項11】
前記Ｋｖ８．２をコードする前記核酸配列がＷＴ ＫＣＮＶ２遺伝子である、請求項１～１０のいずれか１項に記載の発現コンストラクト。
【請求項12】
前記Ｋｖ８．２をコードする前記核酸配列が、配列番号９と少なくとも９０％同一である配列を含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の発現コンストラクト。
【請求項13】
前記Ｋｖ８．２をコードする前記核酸配列が、配列番号９を含む配列を含む、請求項１２に記載の発現コンストラクト。
【請求項14】
前記Ｋｖ８．２をコードする前記核酸配列がコドン最適化ＫＣＮＶ２遺伝子配列である、請求項１～１０のいずれか１項に記載の発現コンストラクト。
【請求項15】
前記Ｋｖ８．２をコードする前記核酸配列が、配列番号１０と少なくとも９０％同一である配列を含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の発現コンストラクト。
【請求項16】
前記Ｋｖ８．２をコードする前記核酸配列が、配列番号１０を含む配列を含む、請求項１５に記載の発現コンストラクト。
【請求項17】
前記Ｋｖ８．２をコードする前記核酸配列が、配列番号１３と少なくとも９０％同一である配列を含むタンパク質をコードする、請求項１～１６のいずれか１項に記載の発現コンストラクト。
【請求項18】
前記Ｋｖ８．２をコードする前記核酸配列が、配列番号１３を含むタンパク質をコードする、請求項１７に記載の発現コンストラクト。
【請求項19】
前記発現コンストラクトが、ウシ成長ホルモンポリアデニル化（ＢＧＨ－ポリＡ）シグナルをさらに含む、請求項１～１８のいずれか１項に記載の発現コンストラクト。
【請求項20】
前記ポリアデニル化シグナルが、配列番号１２と少なくとも９０％同一である配列を含む、請求項１９に記載の発現コンストラクト。
【請求項21】
前記ポリアデニル化シグナルが配列番号１２を含む、請求項２０に記載の発現コンストラクト。
【請求項22】
請求項１～２１のいずれか１項に記載の発現コンストラクトであって、配列番号１～４からなる群から選択される配列と少なくとも９０％同一である配列を含む、前記発現コンストラクト。
【請求項23】
請求項２２に記載の発現コンストラクトであって、配列番号１～４からなる群から選択される配列を含む、前記発現コンストラクト。
【請求項24】
請求項１～２３のいずれか１項に記載の発現コンストラクトを含む、ベクター。
【請求項25】
請求項２４に記載のベクターであって、ウイルスベクターである、前記ベクター。
【請求項26】
請求項２５に記載のベクターであって、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、前記ベクター。
【請求項27】
請求項２６に記載のベクターであって、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ２に由来するゲノムを含む、前記ベクター。
【請求項28】
請求項２６または２７のいずれか１項に記載のベクターであって、ＡＡＶ７ｍ８由来のキャプシドを含む、前記ベクター。
【請求項29】
請求項２６または２７のいずれか１項に記載のベクターであって、ＡＡＶ５由来のキャプシドを含む、前記ベクター。
【請求項30】
請求項２４～２９のいずれか１項に記載のベクター及び薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項31】
網膜疾患の治療を必要とする対象における網膜疾患を治療するための方法であって、前記網膜疾患が、ＫＣＮＶ２遺伝子における１つ以上の変異と関連しており、請求項２４～２９のいずれか１項に記載のベクターまたは請求項３０に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項32】
前記網膜疾患が、超正常杆体応答を伴う錐体ジストロフィー（ＣＤＳＳＲ）である、請求項３１に記載の方法。
【請求項33】
ＫＣＮＶ２の発現の増加を必要とする対象におけるＫＣＮＶ２の発現を増加させる方法であって、請求項２４～２９のいずれか１項に記載のベクターまたは請求項３０に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項34】
Ｋｖ８．２レベルの増加を必要とする対象における光受容体におけるＫｖ８．２レベルを増加させる方法であって、請求項２４～２９のいずれか１項に記載のベクターまたは請求項３０に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項35】
前記ベクターまたは前記医薬組成物を、眼内注射によって投与する、請求項３１～３４のいずれかに記載の方法。
【請求項36】
前記ベクターまたは前記医薬組成物を、前記対象の網膜中心に注射する、請求項３５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、一般に、分子生物学及び医学の分野に関する。より具体的には、本発明は、網膜疾患の治療のための遺伝子治療のための組成物及び方法を提供する。
【背景技術】
【0002】
Ｋｖ８．２は、ＫＣＮＶ２遺伝子によってコードされる電位依存性カリウムチャネルサブユニットである。ＫＣＮＶ２遺伝子は染色体９ｐ２４．２に位置し、５４５アミノ酸のタンパク質をコードする２つのエクソンで構成されている。このタンパク質は、網膜の桿体及び錐体光受容体の内節（エリプソイド及びマイオイド領域）で発現し、ヒト、マウス、及びマカクの外節には存在しない。Ｋｖ８．２は、他のカリウムサブユニット、例として、桿体及び錐体内節で発現するＫｖ２．１、及びヒトの錐体で発現するが桿体では発現しないＫｖ２．２と相互作用する。Ｋｖ８．２は、Ｋｖ２チャネルとさらに相互作用して、それらの生物物理学的特性を変化させる。
【0003】
Ｋｖ８．２は、これまでヒト疾患に関与していた唯一のカリウムチャネルサブユニットである。Ｋｖ８．２のバリアント／変異は、「超正常桿体反応を伴う錐体ジストロフィー」（ＣＤＳＳＲ）として知られる重度の遺伝性光受容体ジストロフィーを引き起こす。ＣＤＳＳＲの症状には、視力の低下、色覚異常、ｂ波振幅の上昇などの網膜電図応答の変化が含まれる。
【0004】
したがって、ＫＣＮＶ２変異（ＣＤＳＳＲを含むが、これに限定されない）に関連する網膜疾患の治療のための新規治療法が緊急に必要とされている。
【発明の概要】
【0005】
一態様では、本開示は、以下：
（ａ）光受容体細胞において発現を与えるプロモーター配列、及び
（ｂ）Ｋｖ８．２をコードする核酸配列；を含む発現コンストラクトであって、
核酸配列はプロモーターに作動可能に連結されている、発現コンストラクトを提供する。
（ａ）光受容体細胞において発現を与えるプロモーター配列、及び
（ｂ）Ｋｖ８．２をコードする核酸配列；を含む発現コンストラクトであって、
核酸配列はプロモーターに作動可能に連結されている、発現コンストラクトを提供する。
【0006】
実施形態では、プロモーター配列は、ＣＡＧまたはロドプシンキナーゼ（ＲＫ）プロモーター配列である。実施形態では、プロモーター配列は、配列番号８と少なくとも９０％同一である配列を含む。実施形態では、プロモーター配列は配列番号８の配列を含む。他の実施形態では、プロモーター配列は、配列番号７と少なくとも９０％同一である配列を含む。実施形態では、プロモーター配列は配列番号７の配列を含む。
【0007】
実施形態では、発現コンストラクトは転写後調節エレメントをさらに含む。実施形態では、発現コンストラクトはウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）をさらに含む。実施形態では、ＷＰＲＥは、配列番号１１と少なくとも９０％同一である配列を含むか、または配列番号１１の配列を含む。
【0008】
実施形態では、Ｋｖ８．２をコードする核酸配列は、ＷＴ ＫＣＮＶ２遺伝子由来のコード配列（ｃｄｓ）である。実施形態では、Ｋｖ８．２をコードする核酸配列は、配列番号９と少なくとも９０％同一である配列を含む。実施形態では、Ｋｖ８．２をコードする核酸配列は、配列番号９を含む配列を含む。
【0009】
実施形態では、Ｋｖ８．２をコードする核酸配列は、コドン最適化ＫＣＮＶ２遺伝子配列である。実施形態では、Ｋｖ８．２をコードする核酸配列は、配列番号１０と少なくとも９０％同一である配列を含む。実施形態では、Ｋｖ８．２をコードする核酸配列は、配列番号１０を含む配列を含む。
【0010】
いくつかの実施形態では、Ｋｖ８．２をコードする核酸配列は、配列番号１３と少なくとも９０％同一である配列を含むタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、Ｋｖ８．２をコードする核酸配列は、配列番号１３を含むタンパク質をコードする。
【0011】
実施形態では、発現コンストラクトは、ウシ成長ホルモンポリアデニル化（ＢＧＨ－ポリＡ）シグナルをさらに含む。実施形態では、ポリアデニル化シグナルは、配列番号１２と少なくとも９０％同一である配列を含む。実施形態では、ポリアデニル化シグナルは配列番号１２を含む。
【0012】
実施形態では、発現コンストラクトは、配列番号１～４からなる群から選択される配列と少なくとも９０％同一である配列を含む。実施形態では、発現コンストラクトは、配列番号１～４からなる群から選択される配列を含む。
【0013】
別の態様では、本開示は、本明細書に開示される発現コンストラクトを含むベクターを提供する。実施形態では、ベクターはウイルスベクターである。実施形態では、ベクターはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。実施形態では、ベクターは、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ２に由来するゲノムを含む。実施形態では、ベクターは、ＡＡＶ７ｍ８由来のキャプシドを含む。実施形態では、ベクターは、ＡＡＶ５由来のキャプシドを含む。
【0014】
別の態様では、本開示は、本明細書に開示されるベクター及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
【0015】
別の態様では、本開示は、網膜疾患の治療を必要とする対象における網膜疾患を治療するための方法であって、網膜疾患は、ＫＣＮＶ２遺伝子における１つ以上の変異と関連しており、本明細書に開示されるベクターまたは医薬組成物を対象に投与することを含む、方法を提供する。実施形態では、網膜疾患は、超正常杆体応答を伴う錐体ジストロフィー（ＣＤＳＳＲ）である。
【0016】
別の態様では、本開示は、ＫＣＮＶ２の発現の増加を必要とする対象におけるＫＣＮＶ２の発現を増加させる方法であって、本明細書に開示されるベクターまたは医薬組成物を対象に投与することを含む、方法を提供する。
【0017】
別の態様では、本開示は、光受容体におけるＫｖ８．２レベルの増加を必要とする対象の光受容体におけるＫｖ８．２レベルを増加させる方法であって、本明細書に開示されるベクターまたは医薬組成物を対象に投与することを含む、方法を提供する。
【0018】
実施形態では、ベクターまたは医薬組成物は、眼内注射によって投与する。開示された方法の実施形態では、ベクターまたは医薬組成物は、対象の網膜中心に注射する。
【図面の簡単な説明】
【0019】
【図1】発現コンストラクト：ｐＣＡＧ－ＫＣＮＶ２ ＷＴ、ｐＣＡＧ－ＫＣＮＶ２ Ｏｐｔｉ、ｐＲＴ－ＫＣＮＶ２ ＷＴ、及びｐＲＴ－ＫＣＮＶ２ Ｏｐｔｉの概略図を示す。
【図2】ｑＰＣＲにより決定した、ＡＲＰＥ１９細胞におけるＫＣＮＶ２ ＷＴ及びＫＣＮＶ２ ＯｐｔｉのｍＲＮＡレベルと比較した、ＨＥＫ２９３細胞におけるＫＣＮＶ２ ＷＴ及びＫＣＮＶ２ ＯｐｔｉのｍＲＮＡレベルを示す（トランスフェクションの４８時間後）。
【図3】ｐＣＡＧ－ＧＦＰ（上列）、ｐＣＡＧ－ＫＣＮＶ２ Ｏｐｔｉ（中列）、及びｐＣＡＧ－ＫＣＮＶ２ ＷＴ（下列）をトランスフェクトしたＡＲＰＥ１９細胞のＫｖ８．２免疫蛍光を示す。スケールバー＝１０μｍ。
【図4】ＦＡＣＳによって分析されたＨＥＫ２９３細胞からのデータを示す。Ａは、それぞれ、ｐＣＡＧ－ＫＣＮＶ２ ＷＴ及びｐＣＡＧ－ＫＣＮＶ２ Ｏｐｔｉ発現コンストラクトをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞に対する３つの独立した実験からの平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示すＦＡＣＳデータを示す。Ｂは、非トランスフェクト対照対ｐＣＡＧ－ＫＣＮＶ２ ＷＴまたはｐＣＡＧ－ＫＣＮＶ２ Ｏｐｔｉ発現コンストラクトをトランスフェクトした細胞それぞれにおけるＫｖ８．２－Ａｌｅｘａ４８８陽性細胞集団のパーセンテージを示すＦＡＣＳデータを示す。コドン最適化（Ｏｐｔｉ）ベクターと野生型（ＷＴ）ベクターとの間で、％Ｋｖ８．２陽性細胞に有意差はなかった。
【図5】形質導入されたＡＲＰＥ１９細胞における形質導入効率を示す。Ａは、２つの感染多重度（ＭＯＩ）で、示されたＡＡＶ５ベクターをトランスフェクトしたＫｖ８．２免疫標識ＡＲＰＥ１９細胞におけるＫｖ８．２蛍光強度を示す（細胞当たりの平均積分密度）。Ｂは、２つのＭＯＩで、示されたＡＡＶ５ベクターによる形質導入後にＫｖ８．２陽性であったＤＡＰＩ陽性ＡＲＰＥ１９細胞のパーセントを示す。
【図6】網膜オルガノイドの形態を示す。網膜オルガノイド全体のライブ明視野イメージング。形質導入が行われた１４０日目のＷＴ（上段）及びＫＣＮＶ２ ＫＯ網膜オルガノイドの典型的な形態。網膜オルガノイドは積層されており、光受容体の外節（「刷子縁」）、及び時折網膜色素上皮（ＲＰＥ）のクラスターを有する。ＷＴ網膜オルガノイドとノックアウト（ＫＯ）網膜オルガノイドの間には、肉眼での形態学的差異は観察されなかった。
【図7】ＫＣＮＶ２ ＫＯ網膜オルガノイド（Ｋ２８Ｄ５）におけるトランスジェニックＫｖ８．２発現を示す。ＡＡＶ７ｍ８による形質導入から３週間後の共焦点タイルスキャン分析。シグナルは最外層の光受容体細胞層で検出される。スケールバー＝１００μｍ及び１０μｍ。
【図8】網膜内細胞のＡＡＶ７ｍ８形質導入を示す。Ｋｖ８．２及び杆体双極細胞マーカーＰＫＣａで共染色した形質導入網膜凍結切片。ＷＴオルガノイドは、外顆粒層（ＯＮＬ）に加えて、内顆粒層（ＩＮＬ）（破線でＯＮＬから分離されている）にいくつかのＫｖ８．２陽性網膜内細胞（矢印）を含有しているが、Ｋｖ８．２陽性形質導入細胞の大部分は外顆粒層にあった。ｐＲＫ－ＫＣＮＶ２ベクターは、検出可能なＫｖ８．２タンパク質をほとんど生成しなかった（下のパネル）が、ＡＡＶ７ｍ８ ＲＫ－ＫＣＶＮ２ Ｏｐｔｉ条件（＊）のＯＮＬではＫｖ８．２陽性光受容体細胞を若干見ることができた。スケールバー＝１０μｍ。
【図9】ＲＰＥ細胞のＡＡＶ形質導入を示す。光受容体に加えて、オルガノイドにはＲＰＥ細胞が存在する。ＲＰＥは、インビボで見られるように、光受容体外節に隣接する平面シートではなくクラスター（矢印）として存在する。ＲＰＥは極性があり、その頂端面でＣＲＡＬＢＰを発現し（Ａ）、核は基底部に位置する（Ｂ）。ＡＡＶが効率的に形質導入された網膜オルガノイドのＲＰＥ細胞では、細胞質全体で高レベルのＫｖ８．２が検出される。対照的に、ＡＡＶ ＲＫ－ＫＣＮＶ２は、ＲＰＥ細胞において検出可能なレベルのＫｖ８．２発現を生じなかった。
【図10】ＡＡＶ５ ｐＣＡＧ－ＫＣＮＶ２－Ｏｐｔｉ、ＡＡＶ５ ｐＲＫ－ＫＣＮＶ２－Ｏｐｔｉ、ＡＡＶ７ｍ９ ｐＣＡＧ－ＫＣＮＶ２－Ｏｐｔｉ、及びＡＡＶ７ｍ９ ｐＲＫ－ＫＣＮＶ２－Ｏｐｔｉによるミュラーグリア細胞の形質導入をそれぞれ示す。ＣＲＡＬＢＰは、神経網膜に跨り、桿体細胞及び錐体細胞との密着接合を介して外境界膜を形成するミュラーグリア細胞を染色する。ミュラーグリアは、光受容体細胞に近接しているにもかかわらず、Ｋｖ８．２については共染色されなかった。
【図11】トランスジェニックＫｖ８．２発現が細胞膜及び光受容体内節に局在化していることを示す。ロドプシン及びＫｖ８．２で染色した、ＣＡＧプロモーターによって駆動されるコドン最適化ＫＣＮＶ２ベクターとＷＴ ＫＣＮＶ２ベクター（ＣＡＧ ＫＣＮＶ２－ＷＴ及び７ｍ８ ＣＡＧ ＫＣＶＮ２ Ｏｐｔｉ）の両方を備えた７ｍ８ＡＡＶベクターを形質導入されたクローンＫ２８（分化５）。核はＤＡＰＩで対比染色する。
【図12】光受容体内節におけるＫｖ８．２とＫｖ．２．１の共局在を示す。ＷＴオルガノイド対ＡＡＶ５ ＣＡＧ－ＷＴまたはＡＡＶ５ ＣＡＧ－Ｏｐｔｉベクターを形質導入された形質導入ＫＣＮＶ２ ＫＯオルガノイドの高倍率共焦点顕微鏡観察。カリウムチャネルＫｖ２．１は球状内節構造の原形質膜に局在し、ベクター由来のＫｖ８．２はＷＴと同様の発現パターンで内節内において共発現する。
【図13A】ＷＴ、対照、及び形質導入網膜オルガノイドにおけるＴＵＮＥＬ染色を示す。ＤＡＰＩ及びアポトーシスの指標であるターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）で染色したＷＴ網膜オルガノイド凍結切片の全体共焦点タイルスキャン（倍率４０倍）である。ＴＵＮＥＬ反応性は、網膜細胞層（ＩＮＬ及びＯＮＬ）では乏しい～不存在であったが、オルガノイドの中心（破線領域）及び非網膜組織の領域では検出することができた。
【図13B】ＷＴ、対照、及び形質導入網膜オルガノイドにおけるＴＵＮＥＬ染色を示す。定性的には、ＷＴと比較してＫＣＮＶ２ ＫＯオルガノイドにおけるＴＵＮＥＬ反応性の増加はなく、ＡＡＶ７ｍ８で形質導入されたＫＯオルガノイドにおける増加はなかった。
【図13C】ＷＴ、対照、及び形質導入網膜オルガノイドにおけるＴＵＮＥＬ染色を示す。定性的には、ＷＴと比較してＫＣＮＶ２ ＫＯオルガノイドにおけるＴＵＮＥＬ反応性の増加はなく、ＷＴまたはコドン最適化ＫＣＮＶ２を含むＡＡＶ５ベクターを形質導入されたＫＯオルガノイドにおける増加はなかった。
【図14】ＡＡＶ形質導入網膜オルガノイドにおける錐体細胞数を示す。ＬＭオプシン染色を使用して、ＷＴ、ＫＣＮＶ２ ＫＯ、及び示されたベクターを形質導入されたオルガノイドにおける１００μｍあたりの錐体数の平均を決定した。各点は、１つの７μｍ網膜凍結切片から錐体を計数した１つの形質導入オルガノイドを表す。オルガノイド全体を倍率４０倍で画像化し、１μｍあたりの錐体数を計数した（オルガノイドあたり３４～４８３個の間を計数した）。すべてのオルガノイドは錐体細胞が良好に分布していた。非形質導入ＫＣＮＶ２ ＫＯオルガノイドは、ＷＴ非編集対照よりも有意に多くの錐体を有していた（ｐ＝０．００４、対応のないｔ検定）。ＡＡＶ形質導入（すべてのベクターを群分け）によって、ＷＴと比較して錐体数は減少しなかったが（ｐ＝０．２）、非形質導入と比較して錐体数が減少した（ｐ＝０．０２）。エラーバー＝標準偏差
【図15】ｑＰＣＲによって決定された、形質導入網膜オルガノイドにおける相対的なｍＲＮＡレベルを示す。Ａは、ＫＣＮＶ２遺伝子の２つの異なるバージョン：コドン最適化またはＷＴの発現を駆動する光受容体特異的ＲＫまたは構成的ＣＡＧプロモーターのいずれかを含有する異なるＡＡＶベクターを形質導入されたＫＣＮＶ２ ＫＯクローンＫ５、Ｋ１２、及びＫ２８におけるＫＣＮＶ２発現を示す。未処理ＫＯ ＫＣＮＶ２クローン、及びＷＴ同質遺伝子対照、Ｉ５を比較のために含める。グラフは、異なるＡＡＶベクター、すなわちＡＡＶ５－ＣＡＧ－ＫＣＮＶ２ｏｐｔｉ、ＡＡＶ７ｍ８－ＣＡＧ－ＫＣＮＶ２ｏｐｔｉ、ＡＡＶ５－ＲＫ－ＫＣＮＶ２ｏｐｔｉ、またはＡＡＶ７ｍ８－ＲＫ－ＫＣＮＶ２－Ｏｐｔｉによる形質導入の２１日後のコドン最適化ＫＣＮＶ２の発現を示す。結果を、最も発現の低い試料（ＡＡＶ５ ＣＡＧ－ＫＣＮＶ２－Ｏｐｔｉ）と比較したＫＣＮＶ２ ｍＲＮＡ発現の倍数変化として表す。Ｂは、示されたＡＡＶベクターによる形質導入の２１日後のＷＴ ＫＣＮＶ２の発現を示すグラフである。結果を、同じＫＯクローン由来の年齢が一致した非形質導入対照と比較したＷＴ ＫＣＮＶ２ ｍＲＮＡの倍数変化として表す。
【図16A】網膜オルガノイド免疫蛍光の定量化を示す。外顆粒層（ＯＮＬ）における総Ｋｖ８．２蛍光を示す。バー＝測定面積に対して正規化された形質導入オルガノイドの平均蛍光、及びＷＴ対照オルガノイドにおける蛍光％として表す。タイルスキャン画像を取得して、ＯＮＬの全長にわたる蛍光測定値を得た。点線は、非形質導入ＫＯ対照オルガノイドにおける平均「バックグラウンド」シグナルを表す。各点は１つのオルガノイドを表す。ｎ＝独立した実験からの３～４個のオルガノイド。エラーバー＝＋／－ＳＥＭ。７ｍ８及びＡＡＶ５キャプシドの両方において、ＣＡＧプロモーターとＲＫプロモーターの間の総蛍光には有意差があった（それぞれｐ＝０．０３１及び０．０２８、両側、対応のあるスチューデントｔ検定）。コドン最適化（Ｏｐｔｉ）ベクターでは蛍光強度が増加する傾向があるにもかかわらず、ＣＡＧまたはＲＫプロモーターを含むベクターではＷＴとＯｐｔｉの間に有意差はなかった。
【図16B】網膜オルガノイド免疫蛍光の定量化を示す。形質導入ＫＣＮＶ２ ＫＯ、ＷＴ、及びＡＡＶ７ｍ８ Ｋｖ８．２形質導入オルガノイドの光受容体層における代表的な免疫蛍光を示す。Ｋｖ８．２及びカリウムチャネルサブユニットＫｖ．２．１、錐体アレスチン（Ａｒｒ３）及び核をＤＡＰＩで染色する。スケールバー＝１０μｍ。
【図17】形質導入オルガノイドにおけるＫｖ８．２及びＫｖ２．１の相対的共局在を示す。オルガノイド凍結切片をＫｖ．２．１及びＫｖ８．２で共染色し、総共局在化面積をＦＩＪＩのしきい値処理画像で測定し、オルガノイドごとにアッセイされた網膜の長さに対して正規化した。結果を、非形質導入対照と比較した倍数変化として表す。結果を、一元配置ＡＮＯＶＡ及びダネットの多重比較検定によって分析した。＊ｐ＝０．０２、＊＊ｐ＝０．００２。
【図18A】形質導入オルガノイドにおける近接ライゲーションアッセイ（ＰＬＡ）シグナル特異性を示す。Ｋｖ２．１及びＫｖ８．２共染色後のＰＬＡシグナル（点）は、光受容体の内節／外節が位置する外周の網膜オルガノイドに豊富であった。
【図18B】形質導入オルガノイドにおける近接ライゲーションアッセイ（ＰＬＡ）シグナル特異性を示す。ＰＬＡシグナルは、ＫＣＮＶ２ ＫＯオルガノイドのＯＮＬ（光受容体層）にはほとんど存在しなかった。
【図18C】形質導入オルガノイドにおける近接ライゲーションアッセイ（ＰＬＡ）シグナル特異性を示す。オルガノイドあたりの測定面積（ｎ＝３の関心領域（ＲＯＩ））に対して正規化されたＰＬＡ涙点の定量化（画像化されたＪ）である。ＷＴ（クローンＫ２８及びＫ１２）と比較して、ＫＣＮＶ２ ＫＯ光受容体ではＰＬＡシグナルが有意に減少した（ｐ＜０．０３）。エラーバー＝ＳＥＭ。
【図19】ＡＡＶ５及びＡＡＶ７ｍ８形質導入光受容体におけるＰＬＡシグナルを示す。７μｍオルガノイド凍結切片からの６３ｘ最大強度投影。光受容体層（ＯＮＬ）は、核を有さない外網状層の上のＤＡＰＩチャネルに見られる特有の緻密な構造を有する。ＰＬＡシグナル（点）は、Ｋｖ．２．１／Ｋｖ８．２タンパク質間相互作用を示す。ＰＬＡシグナルは、光受容体内節（ＩＳ）の領域内のＯＮＬの頂端に集中していた。形質導入オルガノイドは、ＩＰＳＣクローンＫ１２由来の非形質導入ＫＣＮＶ２ ＫＯオルガノイドよりも高いＰＬＡシグナル密度を有していた。
【図20】形質導入網膜オルガノイドクローン（（Ａ）クローン１２、（Ｂ）クローン２８）におけるＰＬＡ涙点の定量を示す。バーは、測定面積に対して正規化された、視野あたりのＯＮＬ内のＰＬＡ涙点の平均数を表す（１００～１５０の光受容体あたりおよそ３２、視野あたり１０～６００の涙点が計数される）。エラーバー＝ＳＥＭ）。
【発明を実施するための形態】
【0020】
本明細書では、カリウム電位依存性チャネル修飾因子サブファミリーＶメンバー２（Ｋｖ８．２）の発現のための発現コンストラクト、ウイルスゲノム、及びベクター、ならびにＫＣＮＶ２遺伝子の１つ以上の変異に関連する網膜疾患を治療するために発現コンストラクト、ウイルスゲノム、及びベクターを使用する方法が提供される。
【0021】
Ｋｖ８．２
Ｋｖ８．２は、電位依存性カリウムチャネルサブユニットである。ＫＣＮＶ２遺伝子は染色体９ｐ２４．２上に位置し、５４５アミノ酸のＫｖ８．２タンパク質をコードする２つのエクソンを含む。Ｋｖ８．２は機能的ホモマーチャネルを形成することができないが、他のカリウムチャネルサブユニットＫｖ２．１及びＫｖ２．２と相互作用して、それらの生物物理学的特性を変化させる。Ｋｖ８．２は、これまでヒト疾患に関与していた唯一のサイレントサブユニットである。バリアント／変異は、「超正常桿体反応を伴う錐体ジストロフィー」（ＣＤＳＳＲ）として知られる重度の遺伝性光受容体ジストロフィーを引き起こす。
Ｋｖ８．２は、電位依存性カリウムチャネルサブユニットである。ＫＣＮＶ２遺伝子は染色体９ｐ２４．２上に位置し、５４５アミノ酸のＫｖ８．２タンパク質をコードする２つのエクソンを含む。Ｋｖ８．２は機能的ホモマーチャネルを形成することができないが、他のカリウムチャネルサブユニットＫｖ２．１及びＫｖ２．２と相互作用して、それらの生物物理学的特性を変化させる。Ｋｖ８．２は、これまでヒト疾患に関与していた唯一のサイレントサブユニットである。バリアント／変異は、「超正常桿体反応を伴う錐体ジストロフィー」（ＣＤＳＳＲ）として知られる重度の遺伝性光受容体ジストロフィーを引き起こす。
【0022】
ＫＣＮＶ２（Ｋｖ８．２）は、網膜の桿体及び錐体光受容体の内節（エリプソイド及びマイオイド領域）で発現するが、ヒト、マウス、及びマカクの外節には存在しない。Ｋｖ８．２は、桿体及び錐体内節で発現するＫｖ２．１、及びヒトの錐体で発現するが桿体では発現しないＫｖ２．２と相互作用する。
【0023】
ＫＣＮＶ２（Ｋｖ８．２）ホモ接合性ノックアウト（ＫＯ）マウスは、明るい光刺激に対するａ波の減少及びｂ波応答の上昇を伴う網膜電図（ＥＲＧ）を含む、ヒトの障害と多くの類似点を示す。ＫＣＮＶ２ ＫＯマウスは、錐体細胞数の減少（ＷＴの８０％）、網膜全体にわたるＴＵＮＥＬ陽性細胞の増加（１、３、及び６か月齢）、及び外顆粒層の全体的な薄化（ＯＮＬ、６か月齢でＷＴの６０％）を示す。
【0024】
多くの重要な光受容体タンパク質の正確な細胞内局在が以前に実証されている（例えば、ロドプシン、ＲｅｔＧＣ、ＡＢＣＡ４は杆体外節に位置し、バスーン（Ｂａｓｓｏｏｎ）、リブアイ（Ｒｉｂｅｙｅ）はシナプス末端に位置する）。単一細胞ＲＮＡ配列によってヒト網膜オルガノイドにおいてＫＣＮＶ２転写物の存在が検出されているが、ヒト胚性幹細胞（ＨＥＳＣ）または人工多能性幹細胞（ＩＰＳＣ）由来のヒト網膜オルガノイドにおけるカリウムチャネルサブユニットＫｖ８．２、Ｋｖ２．１、及びＫｖ２．２の存在は、どの出版物においてもまだ調査されていない。Ｋｖ８．２とその結合パートナーの機能における種特異的な差異（例えば、マウス網膜にはＫｖ２．２が存在しない）が報告されているため、潜在的なＫＣＮＶ２ ＡＡＶ遺伝子治療の開発にはヒト細胞モデルの使用が重要となっている。
【0025】
ＫＣＮＶ２の変異は、超正常桿体反応を伴う錐体ジストロフィー（ＣＤＳＳＲ）などの光受容体ジストロフィーを含む網膜疾患を引き起こす可能性がある。このような疾患の診断は電気生理学的評価によって確立される；機能的結果は、病期及び固体の年齢に依存する。例えば、ＣＤＳＳＲは、明るい光刺激に対するａ波の減少及びｂ波応答の上昇を伴う網膜電図（ＥＲＧ）に関連している。錐体ジストロフィーの診断は、錐体細胞数の減少（正常の約８０％）の実証によって裏付けることができる。例えば、異常なＫＣＮＶ２発現を有する網膜では、ＴＵＮＥＬ陽性細胞が増加し、外顆粒層が全体的に薄くなっている（ＯＮＬ、正常の６０％）場合がある。
【0026】
発現コンストラクト
一態様では、（ａ）光受容体細胞において発現を与えるプロモーター配列、及び（ｂ）カリウム電位依存性チャネル修飾因子サブファミリーＶメンバー２（Ｋｖ８．２）をコードする核酸配列を含む発現コンストラクトであって；核酸配列はプロモーターに作動可能に連結されている、発現コンストラクトが提供される。本明細書で使用される場合、「作動可能に連結された」とは、Ｋｖ８．２のコード配列と連続する発現制御配列（例えば、プロモーター）と、Ｋｖ８．２の発現を制御するためにトランスでまたは離れて作用する発現制御配列の両方を指す。発現制御配列には、適切な転写開始配列、終結配列、プロモーター配列及びエンハンサー配列；スプライシングシグナル及びポリアデニル化シグナルなどの効率的なＲＮＡプロセシングシグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化させる配列；翻訳効率を高める配列（すなわち、コザックコンセンサス配列）；タンパク質の安定性を高める配列；及び、所望される場合、タンパク質のプロセシング及び／または分泌を強化する配列が含まれる。
一態様では、（ａ）光受容体細胞において発現を与えるプロモーター配列、及び（ｂ）カリウム電位依存性チャネル修飾因子サブファミリーＶメンバー２（Ｋｖ８．２）をコードする核酸配列を含む発現コンストラクトであって；核酸配列はプロモーターに作動可能に連結されている、発現コンストラクトが提供される。本明細書で使用される場合、「作動可能に連結された」とは、Ｋｖ８．２のコード配列と連続する発現制御配列（例えば、プロモーター）と、Ｋｖ８．２の発現を制御するためにトランスでまたは離れて作用する発現制御配列の両方を指す。発現制御配列には、適切な転写開始配列、終結配列、プロモーター配列及びエンハンサー配列；スプライシングシグナル及びポリアデニル化シグナルなどの効率的なＲＮＡプロセシングシグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化させる配列；翻訳効率を高める配列（すなわち、コザックコンセンサス配列）；タンパク質の安定性を高める配列；及び、所望される場合、タンパク質のプロセシング及び／または分泌を強化する配列が含まれる。
【0027】
多数の発現制御配列、例えば天然、構成的、誘導性及び／または組織特異的配列が当技術分野で公知であり、所望の発現のタイプに応じて、遺伝子の発現を駆動するために利用することができる。真核細胞の場合、発現制御配列には典型的には、プロモーター配列、エンハンサー配列、及びスプライスドナー部位及びスプライスアクセプター部位を含み得るポリアデニル化配列が含まれる。ポリアデニル化（ポリＡ）配列は、一般に、Ｋｖ８．２をコードする配列の後に、３’ＩＴＲ配列の前に挿入される。本明細書に開示される方法において有用なｒＡＡＶの別の調節成分は、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）である。ＩＲＥＳ配列を使用して、単一の遺伝子転写物から複数のポリペプチドを産生することができる。ＩＲＥＳ（または他の好適な配列）を使用して、複数のポリペプチド鎖を含有するタンパク質を産生するか、または同じ細胞からまたは同じ細胞内で２つの異なるタンパク質を発現する。例示的なＩＲＥＳは、光受容体、ＲＰＥ及び神経節細胞における導入遺伝子の発現を支持するポリオウイルス内部リボソーム進入配列である。好ましくは、ＩＲＥＳは、ｒＡＡＶベクター中のＫｖ８．２をコードする配列の３’側に位置する。
【0028】
一実施形態では、プロモーター配列はロドプシンキナーゼ（ＲＫ）プロモーター配列を含む。いくつかの実施形態では、プロモーター配列は、配列番号７と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む。一実施形態では、プロモーター配列は配列番号７を含む。
【0029】
一実施形態では、プロモーター配列は、合成サイトメガロウイルス由来プロモーター配列（ＣＡＧ）を含む。いくつかの実施形態では、プロモーター配列は、配列番号８と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む。一実施形態では、プロモーター配列は配列番号８を含む。
【0030】
いくつかの実施形態では、プロモーターは光受容体細胞に特異的である、すなわち、プロモーターは光受容体細胞では活性を有するが、他の細胞型では活性が低下しているか、または活性を有していない。
【0031】
一実施形態では、Ｋｖ８．２をコードする核酸配列は、ＷＴ ＫＣＮＶ２遺伝子由来のコード配列である。いくつかの実施形態では、Ｋｖ８．２をコードする核酸配列は、配列番号９と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む。一実施形態では、Ｋｖ８．２をコードする核酸配列は、配列番号９を含む。
【0032】
一実施形態では、Ｋｖ８．２をコードする核酸配列は、コドン最適化遺伝子配列である。いくつかの実施形態では、Ｋｖ８．２をコードする核酸配列は、配列番号１０と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む。一実施形態では、Ｋｖ８．２をコードする核酸配列は、配列番号１０を含む。
【0033】
いくつかの実施形態では、Ｋｖ８．２をコードする核酸配列は、配列番号１３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含むタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、Ｋｖ８．２をコードする核酸配列は、配列番号１３を含むタンパク質をコードする。
【0034】
一実施形態では、発現コンストラクトは転写後調節エレメントを含む。一実施形態では、発現コンストラクトはウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含む。いくつかの実施形態では、転写後調節エレメントは、配列番号１１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む。一実施形態では、転写後調節エレメントは配列番号１１を含む。
【0035】
一実施形態では、発現コンストラクトはポリアデニル化シグナルを含む。一実施形態では、発現コンストラクトはウシ成長ホルモンポリアデニル化（ＢＧＨ－ポリＡ）シグナルを含む。いくつかの実施形態では、ポリアデニル化シグナルは、配列番号１２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む。一実施形態では、ポリアデニル化シグナルは、配列番号１２を含む。
【0036】
ベクター
一態様では、組換えベクター、及び細胞への導入遺伝子または発現コンストラクトの導入のためのその使用が提供される。いくつかの実施形態では、組換えベクターは、宿主細胞におけるＤＮＡの複製及び適切なレベルでの標的細胞における標的遺伝子の発現をもたらすＤＮＡセグメントを含む追加のＤＮＡエレメントを含む組換えＤＮＡコンストラクトを含む。当業者は、発現制御配列（プロモーター、エンハンサーなど）が、標的細胞における標的遺伝子の発現を促進する能力に基づいて選択されることを理解する。本明細書で使用される「ベクター」とは、インビトロまたはインビボで宿主細胞に送達されるべきポリヌクレオチドを含むビヒクルを意味する。ベクターの非限定的な例としては、組換えプラスミド、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、ミニ染色体、ＤＮＡミニサークル、またはウイルス（ウイルス由来の配列を含む）が挙げられる。ベクターはまた、インビトロまたはインビボのいずれかで宿主細胞に送達される核酸を含むビリオンを指してもよい。いくつかの実施形態では、ベクターは、組換えウイルスゲノムを含むビリオンを指し、ここで、組換えウイルスゲノムは、１つ以上のＩＴＲ及び導入遺伝子を含む。
一態様では、組換えベクター、及び細胞への導入遺伝子または発現コンストラクトの導入のためのその使用が提供される。いくつかの実施形態では、組換えベクターは、宿主細胞におけるＤＮＡの複製及び適切なレベルでの標的細胞における標的遺伝子の発現をもたらすＤＮＡセグメントを含む追加のＤＮＡエレメントを含む組換えＤＮＡコンストラクトを含む。当業者は、発現制御配列（プロモーター、エンハンサーなど）が、標的細胞における標的遺伝子の発現を促進する能力に基づいて選択されることを理解する。本明細書で使用される「ベクター」とは、インビトロまたはインビボで宿主細胞に送達されるべきポリヌクレオチドを含むビヒクルを意味する。ベクターの非限定的な例としては、組換えプラスミド、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、ミニ染色体、ＤＮＡミニサークル、またはウイルス（ウイルス由来の配列を含む）が挙げられる。ベクターはまた、インビトロまたはインビボのいずれかで宿主細胞に送達される核酸を含むビリオンを指してもよい。いくつかの実施形態では、ベクターは、組換えウイルスゲノムを含むビリオンを指し、ここで、組換えウイルスゲノムは、１つ以上のＩＴＲ及び導入遺伝子を含む。
【0037】
一実施形態では、組換えベクターは、ウイルスベクターまたは複数のウイルスベクターの組み合わせである。
【0038】
一態様では、本明細書に開示される発現コンストラクトのいずれかを含むベクターが提供される。
【0039】
一態様では、（ａ）光受容体細胞において発現を与えるプロモーター配列、及び（ｂ）Ｋｖ８．２をコードする核酸配列、を含む核酸を含むベクターであって、Ｋｖ８．２をコードする核酸配列は、プロモーターに作動可能に連結されている、ベクターが提供される。
【0040】
一実施形態では、プロモーター配列は、ロドプシンキナーゼ（ＲＫ）プロモーター配列を含む。いくつかの実施形態では、プロモーター配列は、配列番号７と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む。一実施形態では、プロモーター配列は配列番号７を含む。
【0041】
一実施形態では、プロモーター配列は、合成サイトメガロウイルス由来プロモーター配列（ＣＡＧ）を含む。いくつかの実施形態では、プロモーター配列は、配列番号８と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む。一実施形態では、プロモーター配列は配列番号８を含む。
【0042】
いくつかの実施形態では、プロモーターは、光受容体細胞に特異的である。
【0043】
一実施形態では、Ｋｖ８．２をコードする核酸配列は、ＷＴ ＫＣＮＶ２遺伝子由来のコード配列である。いくつかの実施形態では、Ｋｖ８．２をコードする核酸配列は、配列番号９と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む。一実施形態では、Ｋｖ８．２をコードする核酸配列は、配列番号９を含む。
【0044】
一実施形態では、Ｋｖ８．２をコードする核酸配列は、コドン最適化遺伝子配列である。いくつかの実施形態では、Ｋｖ８．２をコードする核酸配列は、配列番号１０と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む。一実施形態では、Ｋｖ８．２をコードする核酸配列は、配列番号１０を含む。
【0045】
いくつかの実施形態では、Ｋｖ８．２をコードする核酸配列は、配列番号１３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含むタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、Ｋｖ８．２をコードする核酸配列は、配列番号１３を含むタンパク質をコードする。
【0046】
一実施形態では、ベクターは、転写後調節エレメントを含む核酸を含む。一実施形態では、ベクターは、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含む核酸を含む。いくつかの実施形態では、転写後調節エレメントは、配列番号１１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む。一実施形態では、転写後調節エレメントは配列番号１１を含む。
【0047】
一実施形態では、ベクターは、ポリアデニル化シグナルを含む核酸を含む。一実施形態では、ベクターは、ウシ成長ホルモンポリアデニル化（ＢＧＨ－ポリＡ）シグナルを含む核酸を含む。いくつかの実施形態では、ポリアデニル化シグナルは、配列番号１２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む。一実施形態では、ポリアデニル化シグナルは、配列番号１２を含む。
【0048】
一実施形態では、ベクターは、１つ以上の逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含む核酸を含む。一態様では、ＩＴＲ配列はＡＡＶ血清型２に由来する。一実施形態では、５’ＩＴＲ配列は、配列番号５と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む。一実施形態では、５’ＩＴＲ配列は配列番号５を含む。一実施形態では、３’ＩＴＲ配列は、配列番号６と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む。一実施形態では、３’ＩＴＲ配列は配列番号６を含む。
【0049】
いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号１～４からなる群から選択される配列を含む核酸を含む。
【0050】
一実施形態では、以下の１つ以上を含む核酸を含むベクターが提供される：
（ａ）ＲＫプロモーター配列を含むプロモーター配列；
（ｂ）Ｋｖ８．２をコードする核酸配列であって、Ｋｖ８．２をコードする核酸配列がプロモーターに作動可能に連結されている、核酸配列；
（ｃ）ＷＰＲＥ；
（ｄ）ＢＧＨ－ポリＡシグナル；及び
（ｅ）１つ以上のＩＴＲ。いくつかの実施形態では、核酸は２つのＩＴＲ配列を含む。
（ａ）ＲＫプロモーター配列を含むプロモーター配列；
（ｂ）Ｋｖ８．２をコードする核酸配列であって、Ｋｖ８．２をコードする核酸配列がプロモーターに作動可能に連結されている、核酸配列；
（ｃ）ＷＰＲＥ；
（ｄ）ＢＧＨ－ポリＡシグナル；及び
（ｅ）１つ以上のＩＴＲ。いくつかの実施形態では、核酸は２つのＩＴＲ配列を含む。
【0051】
一実施形態では、以下の１つ以上を含む核酸を含むベクターが提供される：
（ａ）ＣＡＧプロモーター配列を含むプロモーター配列；
（ｂ）Ｋｖ８．２をコードする核酸配列であって、Ｋｖ８．２をコードする核酸配列がプロモーターに作動可能に連結されている、核酸配列；
（ｃ）ＷＰＲＥ；
（ｄ）ＢＧＨ－ポリＡシグナル；及び
（ｅ）１つ以上のＩＴＲ。いくつかの実施形態では、核酸は２つのＩＴＲ配列を含む。
（ａ）ＣＡＧプロモーター配列を含むプロモーター配列；
（ｂ）Ｋｖ８．２をコードする核酸配列であって、Ｋｖ８．２をコードする核酸配列がプロモーターに作動可能に連結されている、核酸配列；
（ｃ）ＷＰＲＥ；
（ｄ）ＢＧＨ－ポリＡシグナル；及び
（ｅ）１つ以上のＩＴＲ。いくつかの実施形態では、核酸は２つのＩＴＲ配列を含む。
【0052】
一実施形態では、以下の１つ以上を含む核酸を含むベクターが提供される：
（ａ）ＲＫプロモーター配列を含むプロモーター配列；
（ｂ）Ｋｖ８．２をコードするコドン最適化核酸配列であって、Ｋｖ８．２をコードする核酸配列がプロモーターに作動可能に連結されている、コドン最適化核酸配列；
（ｃ）ＷＰＲＥ；
（ｄ）ＢＧＨ－ポリＡシグナル；及び
（ｅ）１つ以上のＩＴＲ。いくつかの実施形態では、核酸は２つのＩＴＲ配列を含む。
（ａ）ＲＫプロモーター配列を含むプロモーター配列；
（ｂ）Ｋｖ８．２をコードするコドン最適化核酸配列であって、Ｋｖ８．２をコードする核酸配列がプロモーターに作動可能に連結されている、コドン最適化核酸配列；
（ｃ）ＷＰＲＥ；
（ｄ）ＢＧＨ－ポリＡシグナル；及び
（ｅ）１つ以上のＩＴＲ。いくつかの実施形態では、核酸は２つのＩＴＲ配列を含む。
【0053】
一実施形態では、以下の１つ以上を含む核酸を含むベクターが提供される：
（ａ）ＣＡＧプロモーター配列を含むプロモーター配列；
（ｂ）Ｋｖ８．２をコードするコドン最適化核酸配列であって、Ｋｖ８．２をコードする核酸配列がプロモーターに作動可能に連結されている、コドン最適化核酸配列；
（ｃ）ＷＰＲＥ；
（ｄ）ＢＧＨ－ポリＡシグナル；及び
（ｅ）１つ以上のＩＴＲ。いくつかの実施形態では、核酸は２つのＩＴＲ配列を含む。
（ａ）ＣＡＧプロモーター配列を含むプロモーター配列；
（ｂ）Ｋｖ８．２をコードするコドン最適化核酸配列であって、Ｋｖ８．２をコードする核酸配列がプロモーターに作動可能に連結されている、コドン最適化核酸配列；
（ｃ）ＷＰＲＥ；
（ｄ）ＢＧＨ－ポリＡシグナル；及び
（ｅ）１つ以上のＩＴＲ。いくつかの実施形態では、核酸は２つのＩＴＲ配列を含む。
【0054】
一実施形態では、以下の１つ以上を含む核酸を含むベクターが提供される：
（ａ）配列番号７と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む、プロモーター配列を含むプロモーター配列；
（ｂ）Ｋｖ８．２をコードする核酸配列であって、Ｋｖ８．２をコードする核酸配列がプロモーターに作動可能に連結されており、Ｋｖ８．２をコードする核酸配列が、配列番号９と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む、核酸配列；
（ｃ）配列番号１１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む、転写後調節エレメント；
（ｄ）配列番号１２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む、ポリアデニル化シグナル；及び
（ｅ）１つ以上のＩＴＲ。いくつかの実施形態では、核酸は２つのＩＴＲ配列を含む。
（ａ）配列番号７と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む、プロモーター配列を含むプロモーター配列；
（ｂ）Ｋｖ８．２をコードする核酸配列であって、Ｋｖ８．２をコードする核酸配列がプロモーターに作動可能に連結されており、Ｋｖ８．２をコードする核酸配列が、配列番号９と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む、核酸配列；
（ｃ）配列番号１１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む、転写後調節エレメント；
（ｄ）配列番号１２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む、ポリアデニル化シグナル；及び
（ｅ）１つ以上のＩＴＲ。いくつかの実施形態では、核酸は２つのＩＴＲ配列を含む。
【0055】
一実施形態では、以下の１つ以上を含む核酸を含むベクターが提供される：
（ａ）配列番号８と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む、プロモーター配列を含むプロモーター配列；
（ｂ）Ｋｖ８．２をコードする核酸配列であって、Ｋｖ８．２をコードする核酸配列がプロモーターに作動可能に連結されており、Ｋｖ８．２をコードする核酸配列が、配列番号９と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む、核酸配列；
（ｃ）配列番号１１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む、転写後調節エレメント；
（ｄ）配列番号１２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む、ポリアデニル化シグナル；及び
（ｅ）１つ以上のＩＴＲ。いくつかの実施形態では、核酸は２つのＩＴＲ配列を含む。
（ａ）配列番号８と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む、プロモーター配列を含むプロモーター配列；
（ｂ）Ｋｖ８．２をコードする核酸配列であって、Ｋｖ８．２をコードする核酸配列がプロモーターに作動可能に連結されており、Ｋｖ８．２をコードする核酸配列が、配列番号９と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む、核酸配列；
（ｃ）配列番号１１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む、転写後調節エレメント；
（ｄ）配列番号１２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む、ポリアデニル化シグナル；及び
（ｅ）１つ以上のＩＴＲ。いくつかの実施形態では、核酸は２つのＩＴＲ配列を含む。
【0056】
一実施形態では、以下の１つ以上を含む核酸を含むベクターが提供される：
（ａ）配列番号７と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む、プロモーター配列を含むプロモーター配列；
（ｂ）Ｋｖ８．２をコードする核酸配列であって、Ｋｖ８．２をコードする核酸配列がプロモーターに作動可能に連結されており、Ｋｖ８．２をコードする核酸配列が、配列番号１０と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む、核酸配列；
（ｃ）配列番号１１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む、転写後調節エレメント；
（ｄ）配列番号１２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む、ポリアデニル化シグナル；及び
（ｅ）１つ以上のＩＴＲ。いくつかの実施形態では、核酸は２つのＩＴＲ配列を含む。
（ａ）配列番号７と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む、プロモーター配列を含むプロモーター配列；
（ｂ）Ｋｖ８．２をコードする核酸配列であって、Ｋｖ８．２をコードする核酸配列がプロモーターに作動可能に連結されており、Ｋｖ８．２をコードする核酸配列が、配列番号１０と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む、核酸配列；
（ｃ）配列番号１１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む、転写後調節エレメント；
（ｄ）配列番号１２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む、ポリアデニル化シグナル；及び
（ｅ）１つ以上のＩＴＲ。いくつかの実施形態では、核酸は２つのＩＴＲ配列を含む。
【0057】
一実施形態では、以下の１つ以上を含む核酸を含むベクターが提供される：
（ａ）配列番号８と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む、プロモーター配列を含むプロモーター配列；
（ｂ）Ｋｖ８．２をコードする核酸配列であって、Ｋｖ８．２をコードする核酸配列がプロモーターに作動可能に連結されており、Ｋｖ８．２をコードする核酸配列が、配列番号１０と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む、核酸配列；
（ｃ）配列番号１１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む、転写後調節エレメント；
（ｄ）配列番号１２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む、ポリアデニル化シグナル；及び
（ｅ）１つ以上のＩＴＲ。いくつかの実施形態では、核酸は２つのＩＴＲ配列を含む。
（ａ）配列番号８と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む、プロモーター配列を含むプロモーター配列；
（ｂ）Ｋｖ８．２をコードする核酸配列であって、Ｋｖ８．２をコードする核酸配列がプロモーターに作動可能に連結されており、Ｋｖ８．２をコードする核酸配列が、配列番号１０と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む、核酸配列；
（ｃ）配列番号１１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む、転写後調節エレメント；
（ｄ）配列番号１２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む、ポリアデニル化シグナル；及び
（ｅ）１つ以上のＩＴＲ。いくつかの実施形態では、核酸は２つのＩＴＲ配列を含む。
【0058】
一実施形態では、以下の１つ以上を含む核酸を含むベクターが提供される：
（ａ）配列番号７と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む、プロモーター配列；
（ｂ）Ｋｖ８．２タンパク質をコードする核酸配列であって、Ｋｖ８．２タンパク質が、配列番号１３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含み、Ｋｖ８．２タンパク質をコードする核酸配列が、プロモーターに作動可能に連結されている、核酸配列；
（ｃ）配列番号１１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む、転写後調節エレメント；
（ｄ）配列番号１２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む、ポリアデニル化シグナル；及び
（ｅ）１つ以上のＩＴＲ。いくつかの実施形態では、核酸は２つのＩＴＲ配列を含む。
（ａ）配列番号７と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む、プロモーター配列；
（ｂ）Ｋｖ８．２タンパク質をコードする核酸配列であって、Ｋｖ８．２タンパク質が、配列番号１３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含み、Ｋｖ８．２タンパク質をコードする核酸配列が、プロモーターに作動可能に連結されている、核酸配列；
（ｃ）配列番号１１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む、転写後調節エレメント；
（ｄ）配列番号１２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む、ポリアデニル化シグナル；及び
（ｅ）１つ以上のＩＴＲ。いくつかの実施形態では、核酸は２つのＩＴＲ配列を含む。
【0059】
一実施形態では、以下の１つ以上を含む核酸を含むベクターが提供される：
（ａ）配列番号８と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む、プロモーター配列；
（ｂ）Ｋｖ８．２タンパク質をコードする核酸配列であって、Ｋｖ８．２タンパク質が、配列番号１３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含み、Ｋｖ８．２タンパク質をコードする核酸配列が、プロモーターに作動可能に連結されている、核酸配列；
（ｃ）配列番号１１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む、転写後調節エレメント；
（ｄ）配列番号１２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む、ポリアデニル化シグナル；及び
（ｅ）１つ以上のＩＴＲ。いくつかの実施形態では、核酸は２つのＩＴＲ配列を含む。
（ａ）配列番号８と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む、プロモーター配列；
（ｂ）Ｋｖ８．２タンパク質をコードする核酸配列であって、Ｋｖ８．２タンパク質が、配列番号１３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含み、Ｋｖ８．２タンパク質をコードする核酸配列が、プロモーターに作動可能に連結されている、核酸配列；
（ｃ）配列番号１１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む、転写後調節エレメント；
（ｄ）配列番号１２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む、ポリアデニル化シグナル；及び
（ｅ）１つ以上のＩＴＲ。いくつかの実施形態では、核酸は２つのＩＴＲ配列を含む。
【0060】
一実施形態では、以下の１つ以上を含む核酸を含むベクターが提供される：
（ａ）配列番号７を含むプロモーター配列；
（ｂ）Ｋｖ８．２をコードする核酸配列であって、Ｋｖ８．２をコードする核酸配列がプロモーターに作動可能に連結されており、Ｋｖ８．２をコードする核酸配列が配列番号９を含む、核酸配列；
（ｃ）配列番号１１を含む転写後調節エレメント；
（ｄ）配列番号１２の配列を含むポリアデニル化シグナル；及び
（ｅ）１つ以上のＩＴＲ。いくつかの実施形態では、核酸は２つのＩＴＲ配列を含む。
（ａ）配列番号７を含むプロモーター配列；
（ｂ）Ｋｖ８．２をコードする核酸配列であって、Ｋｖ８．２をコードする核酸配列がプロモーターに作動可能に連結されており、Ｋｖ８．２をコードする核酸配列が配列番号９を含む、核酸配列；
（ｃ）配列番号１１を含む転写後調節エレメント；
（ｄ）配列番号１２の配列を含むポリアデニル化シグナル；及び
（ｅ）１つ以上のＩＴＲ。いくつかの実施形態では、核酸は２つのＩＴＲ配列を含む。
【0061】
一実施形態では、以下の１つ以上を含む核酸を含むベクターが提供される：
（ａ）配列番号８を含むプロモーター配列；
（ｂ）Ｋｖ８．２をコードする核酸配列であって、Ｋｖ８．２をコードする核酸配列がプロモーターに作動可能に連結されており、Ｋｖ８．２をコードする核酸配列が配列番号９を含む、核酸配列；
（ｃ）配列番号１１を含む転写後調節エレメント；
（ｄ）配列番号１２の配列を含むポリアデニル化シグナル；及び
（ｅ）１つ以上のＩＴＲ。いくつかの実施形態では、核酸は２つのＩＴＲ配列を含む。
（ａ）配列番号８を含むプロモーター配列；
（ｂ）Ｋｖ８．２をコードする核酸配列であって、Ｋｖ８．２をコードする核酸配列がプロモーターに作動可能に連結されており、Ｋｖ８．２をコードする核酸配列が配列番号９を含む、核酸配列；
（ｃ）配列番号１１を含む転写後調節エレメント；
（ｄ）配列番号１２の配列を含むポリアデニル化シグナル；及び
（ｅ）１つ以上のＩＴＲ。いくつかの実施形態では、核酸は２つのＩＴＲ配列を含む。
【0062】
一実施形態では、以下の１つ以上を含む核酸を含むベクターが提供される：
（ａ）配列番号７を含むプロモーター配列；
（ｂ）Ｋｖ８．２をコードする核酸配列であって、Ｋｖ８．２をコードする核酸配列がプロモーターに作動可能に連結されており、Ｋｖ８．２をコードする核酸配列が配列番号１０を含む、核酸配列；
（ｃ）配列番号１１を含む転写後調節エレメント；
（ｄ）配列番号１２の配列を含むポリアデニル化シグナル；及び
（ｅ）１つ以上のＩＴＲ。いくつかの実施形態では、核酸は２つのＩＴＲ配列を含む。
（ａ）配列番号７を含むプロモーター配列；
（ｂ）Ｋｖ８．２をコードする核酸配列であって、Ｋｖ８．２をコードする核酸配列がプロモーターに作動可能に連結されており、Ｋｖ８．２をコードする核酸配列が配列番号１０を含む、核酸配列；
（ｃ）配列番号１１を含む転写後調節エレメント；
（ｄ）配列番号１２の配列を含むポリアデニル化シグナル；及び
（ｅ）１つ以上のＩＴＲ。いくつかの実施形態では、核酸は２つのＩＴＲ配列を含む。
【0063】
一実施形態では、以下の１つ以上を含む核酸を含むベクターが提供される：
（ａ）配列番号８を含むプロモーター配列；
（ｂ）Ｋｖ８．２をコードする核酸配列であって、Ｋｖ８．２をコードする核酸配列がプロモーターに作動可能に連結されており、Ｋｖ８．２をコードする核酸配列が配列番号１０を含む、核酸配列；
（ｃ）配列番号１１を含む転写後調節エレメント；
（ｄ）配列番号１２の配列を含むポリアデニル化シグナル；及び
（ｅ）１つ以上のＩＴＲ。いくつかの実施形態では、核酸は２つのＩＴＲ配列を含む。
（ａ）配列番号８を含むプロモーター配列；
（ｂ）Ｋｖ８．２をコードする核酸配列であって、Ｋｖ８．２をコードする核酸配列がプロモーターに作動可能に連結されており、Ｋｖ８．２をコードする核酸配列が配列番号１０を含む、核酸配列；
（ｃ）配列番号１１を含む転写後調節エレメント；
（ｄ）配列番号１２の配列を含むポリアデニル化シグナル；及び
（ｅ）１つ以上のＩＴＲ。いくつかの実施形態では、核酸は２つのＩＴＲ配列を含む。
【0064】
一実施形態では、以下の１つ以上を含む核酸を含むベクターが提供される：
（ａ）配列番号７を含むプロモーター配列；
（ｂ）Ｋｖ８．２タンパク質をコードする核酸配列であって、Ｋｖ８．２タンパク質が配列番号１３を含み、Ｋｖ８．２タンパク質をコードする核酸配列がプロモーターに作動可能に連結されている、核酸配列；
（ｃ）配列番号１１を含む転写後調節エレメント；
（ｄ）配列番号１２の配列を含むポリアデニル化シグナル；及び
（ｅ）１つ以上のＩＴＲ。いくつかの実施形態では、核酸は２つのＩＴＲ配列を含む。
（ａ）配列番号７を含むプロモーター配列；
（ｂ）Ｋｖ８．２タンパク質をコードする核酸配列であって、Ｋｖ８．２タンパク質が配列番号１３を含み、Ｋｖ８．２タンパク質をコードする核酸配列がプロモーターに作動可能に連結されている、核酸配列；
（ｃ）配列番号１１を含む転写後調節エレメント；
（ｄ）配列番号１２の配列を含むポリアデニル化シグナル；及び
（ｅ）１つ以上のＩＴＲ。いくつかの実施形態では、核酸は２つのＩＴＲ配列を含む。
【0065】
一実施形態では、以下の１つ以上を含む核酸を含むベクターが提供される：
（ａ）配列番号８を含むプロモーター配列；
（ｂ）Ｋｖ８．２タンパク質をコードする核酸配列であって、Ｋｖ８．２タンパク質が配列番号１３を含み、Ｋｖ８．２タンパク質をコードする核酸配列がプロモーターに作動可能に連結されている、核酸配列；
（ｃ）配列番号１１を含む転写後調節エレメント；
（ｄ）配列番号１２の配列を含むポリアデニル化シグナル；及び
（ｅ）１つ以上のＩＴＲ。いくつかの実施形態では、核酸は２つのＩＴＲ配列を含む。
（ａ）配列番号８を含むプロモーター配列；
（ｂ）Ｋｖ８．２タンパク質をコードする核酸配列であって、Ｋｖ８．２タンパク質が配列番号１３を含み、Ｋｖ８．２タンパク質をコードする核酸配列がプロモーターに作動可能に連結されている、核酸配列；
（ｃ）配列番号１１を含む転写後調節エレメント；
（ｄ）配列番号１２の配列を含むポリアデニル化シグナル；及び
（ｅ）１つ以上のＩＴＲ。いくつかの実施形態では、核酸は２つのＩＴＲ配列を含む。
【0066】
ウイルスベクター
標的細胞、組織、または生物において標的遺伝子を発現させるためのウイルスベクターは、当技術分野で公知であり、例えば、ＡＡＶベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、または合成ウイルスベクター（例えば、キメラウイルス、モザイクウイルス、もしくはシュードタイプウイルス、及び／または外来タンパク質、合成ポリマー、ナノ粒子、もしくは小分子を含有するウイルス）、が挙げられる。
標的細胞、組織、または生物において標的遺伝子を発現させるためのウイルスベクターは、当技術分野で公知であり、例えば、ＡＡＶベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、または合成ウイルスベクター（例えば、キメラウイルス、モザイクウイルス、もしくはシュードタイプウイルス、及び／または外来タンパク質、合成ポリマー、ナノ粒子、もしくは小分子を含有するウイルス）、が挙げられる。
【0067】
ＡＡＶベクター
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、効率的な複製を促進するためにヘルパーウイルスを必要とする小さな一本鎖ＤＮＡウイルスである。ＡＡＶの４．７ｋｂゲノムは、２つの逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）と、それぞれＲｅｐタンパク質及びＣａｐタンパク質をコードする２つのオープンリーディングフレームを特徴とする。Ｒｅｐリーディングフレームは、分子量７８ｋＤ、６８ｋＤ、５２ｋＤ、及び４０ｋＤの４つのタンパク質をコードする。これらのタンパク質は主に、ＡＡＶの複製及びレスキュー及び宿主細胞の染色体へのＡＡＶの組み込みの制御において機能する。Ｃａｐリーディングフレームは、ビリオンキャプシドを形成する、分子量８５ｋＤ（ＶＰ１）、７２ｋＤ（ＶＰ２）、及び６１ｋＤ（ＶＰ３）の３つの構造タンパク質をコードする。ＡＡＶビリオン中の総タンパク質の８０％超がＶＰ３からなる。ｒｅｐ及びｃａｐのオープンリーディングフレームの５’及び３’末端に隣接するのは、約１４１ｂｐ長のＩＴＲである。ＩＴＲは、ＡＡＶの複製、レスキュー、パッケージング、及びＡＡＶゲノムの組み込みに必須の唯一のシス要素である。ｒｅｐドメイン及びｃａｐドメイン全体を切り出し、治療用またはレポーター導入遺伝子で置き換えることができる。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、効率的な複製を促進するためにヘルパーウイルスを必要とする小さな一本鎖ＤＮＡウイルスである。ＡＡＶの４．７ｋｂゲノムは、２つの逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）と、それぞれＲｅｐタンパク質及びＣａｐタンパク質をコードする２つのオープンリーディングフレームを特徴とする。Ｒｅｐリーディングフレームは、分子量７８ｋＤ、６８ｋＤ、５２ｋＤ、及び４０ｋＤの４つのタンパク質をコードする。これらのタンパク質は主に、ＡＡＶの複製及びレスキュー及び宿主細胞の染色体へのＡＡＶの組み込みの制御において機能する。Ｃａｐリーディングフレームは、ビリオンキャプシドを形成する、分子量８５ｋＤ（ＶＰ１）、７２ｋＤ（ＶＰ２）、及び６１ｋＤ（ＶＰ３）の３つの構造タンパク質をコードする。ＡＡＶビリオン中の総タンパク質の８０％超がＶＰ３からなる。ｒｅｐ及びｃａｐのオープンリーディングフレームの５’及び３’末端に隣接するのは、約１４１ｂｐ長のＩＴＲである。ＩＴＲは、ＡＡＶの複製、レスキュー、パッケージング、及びＡＡＶゲノムの組み込みに必須の唯一のシス要素である。ｒｅｐドメイン及びｃａｐドメイン全体を切り出し、治療用またはレポーター導入遺伝子で置き換えることができる。
【0068】
組換えアデノ随伴ウイルス「ｒＡＡＶ」ベクターには、任意のアデノ随伴ウイルス血清型に由来する任意のベクターが含まれる。ｒＡＡＶベクターは、全体または一部が欠失したＡＡＶ野生型遺伝子、好ましくはＲｅｐ及び／またはＣａｐ遺伝子のうちの１つ以上を有することができるが、機能的な隣接ＩＴＲ配列を保持している。
【0069】
いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、ｒＡＡＶゲノム及び１つ以上のキャプシドタンパク質を含むｒＡＡＶビリオンである。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶゲノムは、本明細書に開示される発現カセットを含む。
【0070】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるウイルスベクターは、Ｋｖ８．２をコードする配列に対してそれぞれ５’及び３’に位置するＡＡＶ ５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲを含む核酸を含む。しかし、ある特定の実施形態では、核酸が、タンデムに、例えば、５’－３’で、もしくは頭－尾で、または別の代替配置で配置された５’ＩＴＲ配列及び３’ＩＴＲ配列を含有することが望ましい場合がある。さらに他の実施形態では、核酸がＩＴＲの複数のコピーを含有するか、またはＫｖ８．２をコードする配列の５’及び３’の両方に位置する５’ＩＴＲ（または逆に３’ＩＴＲ）を有することが望ましい場合がある。ＩＴＲ配列は、異種分子のすぐ上流及び／または下流に位置していてもよく、あるいは介在配列が存在していてもよい。ＩＴＲは、野生型ヌクレオチド配列である必要はなく、配列が機能的なレスキュー、複製、及びパッケージングを提供する限り、（例えば、ヌクレオチドの挿入、欠失、または置換によって）改変することができる。ＩＴＲは、本明細書に記載されるように、ＡＡＶ２から、または他のＡＡＶ血清型の中から選択することができる。
【0071】
いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、ＡＡＶベクター、例として、ＡＡＶ１（すなわち、ＡＡＶ１ ＩＴＲ及びＡＡＶ１キャプシドタンパク質を含有するＡＡＶ）、ＡＡＶ２（すなわち、ＡＡＶ２ ＩＴＲ及びＡＡＶ２キャプシドタンパク質を含有するＡＡＶ）、ＡＡＶ３（すなわち、ＡＡＶ３ ＩＴＲ及びＡＡＶ３キャプシドタンパク質を含有するＡＡＶ）、ＡＡＶ４（すなわち、ＡＡＶ４ ＩＴＲ及びＡＡＶ４キャプシドタンパク質を含有するＡＡＶ）、ＡＡＶ５（すなわち、ＡＡＶ５ ＩＴＲ及びＡＡＶ５キャプシドタンパク質を含有するＡＡＶ）、ＡＡＶ６（すなわち、ＡＡＶ６ ＩＴＲ及びＡＡＶ６キャプシドタンパク質を含有するＡＡＶ）、ＡＡＶ７（すなわち、ＡＡＶ７ ＩＴＲ及びＡＡＶ７キャプシドタンパク質を含有するＡＡＶ）、ＡＡＶ８（すなわち、ＡＡＶ８ ＩＴＲ及びＡＡＶ８キャプシドタンパク質を含有するＡＡＶ）、ＡＡＶ９（すなわち、ＡＡＶ９ ＩＴＲ及びＡＡＶ９キャプシドタンパク質を含有するＡＡＶ）、ＡＡＶｒｈ７４（すなわち、ＡＡＶｒｈ７４ ＩＴＲ及びＡＡＶｒｈ７４キャプシドタンパク質を含有するＡＡＶ）、ＡＡＶｒｈ．８（すなわち、ＡＡＶｒｈ．８ ＩＴＲ及びＡＡＶｒｈ．８キャプシドタンパク質を含有するＡＡＶ）、またはＡＡＶｒｈ．１０（すなわち、ＡＡＶｒｈ．１０ ＩＴＲ及びＡＡＶｒｈ．１０キャプシドタンパク質を含有するＡＡＶ）である。
【0072】
いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、１つのＡＡＶ血清型に由来するＩＴＲ、及び異なるＡＡＶ血清型に由来するキャプシドタンパク質を含む、偽型ＡＡＶベクターである。いくつかの実施形態では、偽型ＡＡＶはＡＡＶ２／５（すなわち、ＡＡＶ２ ＩＴＲ及びＡＡＶ５キャプシドタンパク質を含有するＡＡＶ）である。いくつかの実施形態では、偽型ＡＡＶはＡＡＶ２／７ｍ８（すなわち、ＡＡＶ２ ＩＴＲ及びＡＡＶ７ｍ８キャプシドタンパク質を含有するＡＡＶ）である。
【0073】
いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶｒｈ．８、またはＡＡＶｒｈ．１０由来の１つ以上のキャプシドタンパク質のキメラを含有するキャプシドタンパク質など、組換えキャプシドタンパク質を含有する。実施形態では、キャプシドは、ＡＡＶ２バリアントｒＡＡＶ２－レトロ（ＷＯ２０１７／２１８８４２からの配列番号４４、参照により本明細書に組み込まれる）などのバリアントＡＡＶキャプシドである。
【0074】
一態様では、（ａ）光受容体細胞において発現を与えるプロモーター配列、及び（ｂ）Ｋｖ８．２をコードする核酸配列、を含む核酸を含むウイルスゲノムであって、Ｋｖ８．２をコードする核酸配列は、プロモーターに作動可能に連結されている、ウイルスゲノムが提供される。
【0075】
一実施形態では、プロモーター配列は、ＲＫプロモーター配列を含む。いくつかの実施形態では、プロモーター配列は、配列番号７と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む。一実施形態では、プロモーター配列は配列番号７を含む。
【0076】
一実施形態では、プロモーター配列は、ＣＡＧプロモーター配列を含む。いくつかの実施形態では、プロモーター配列は、配列番号８と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む。一実施形態では、プロモーター配列は配列番号８を含む。
【0077】
いくつかの実施形態では、プロモーターは、光受容体細胞に特異的である。
【0078】
一実施形態では、Ｋｖ８．２をコードする核酸配列は、野生型ＫＣＮＶ２遺伝子由来のコード配列である。いくつかの実施形態では、Ｋｖ８．２をコードする核酸配列は、配列番号９と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む。一実施形態では、ＲｅｔＧＣをコードする核酸配列は、配列番号９を含む。
【0079】
一実施形態では、Ｋｖ８．２をコードする核酸配列は、コドン最適化遺伝子配列である。いくつかの実施形態では、Ｋｖ８．２をコードする核酸配列は、配列番号１０と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む。一実施形態では、ＲｅｔＧＣをコードする核酸配列は、配列番号１０を含む。
【0080】
いくつかの実施形態では、Ｋｖ８．２をコードする核酸配列は、配列番号１３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含むタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、Ｋｖ８．２をコードする核酸配列は、配列番号１３を含むタンパク質をコードする。
【0081】
一実施形態では、ウイルスゲノムは、転写後調節エレメントを含む核酸を含む。一実施形態では、ウイルスゲノムは、ＷＰＲＥを含む核酸を含む。いくつかの実施形態では、転写後調節エレメントは、配列番号１１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む。一実施形態では、転写後調節エレメントは配列番号１１を含む。
【0082】
一実施形態では、ウイルスゲノムは、ポリアデニル化シグナルを含む核酸を含む。一実施形態では、ウイルスゲノムは、ＢＧＨ－ポリＡシグナルを含む核酸を含む。いくつかの実施形態では、ポリアデニル化シグナルは、配列番号１２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む。一実施形態では、ポリアデニル化シグナルは、配列番号１２を含む。
【0083】
一態様では、ウイルスゲノムは、１つ以上の逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含む核酸を含む。一実施形態では、ＩＴＲ配列はＡＡＶ血清型２に由来する。一実施形態では、５’ＩＴＲ配列は、配列番号５と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む。一実施形態では、５’ＩＴＲ配列は配列番号５を含む。一実施形態では、３’ＩＴＲ配列は、配列番号６と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む。一実施形態では、３’ＩＴＲ配列は配列番号６を含む。
【0084】
いくつかの実施形態では、ウイルスゲノムは、配列番号１～４の配列のいずれかと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む核酸を含む。いくつかの実施形態では、ウイルスゲノムは、配列番号１～４からなる群から選択される配列を含む核酸を含む。
【0085】
一実施形態では、以下の１つ以上を含む核酸を含むウイルスゲノムが提供される：
（ａ）ＲＫプロモーター配列を含むプロモーター配列；
（ｂ）Ｋｖ８．２をコードする核酸配列であって、Ｋｖ８．２をコードする核酸配列がプロモーターに作動可能に連結されている、核酸配列；
（ｃ）ＷＰＲＥ；
（ｄ）ＢＧＨ－ポリＡシグナル；及び
（ｅ）１つ以上のＩＴＲ。いくつかの実施形態では、ウイルスゲノムは２つのＩＴＲ配列を含む。
（ａ）ＲＫプロモーター配列を含むプロモーター配列；
（ｂ）Ｋｖ８．２をコードする核酸配列であって、Ｋｖ８．２をコードする核酸配列がプロモーターに作動可能に連結されている、核酸配列；
（ｃ）ＷＰＲＥ；
（ｄ）ＢＧＨ－ポリＡシグナル；及び
（ｅ）１つ以上のＩＴＲ。いくつかの実施形態では、ウイルスゲノムは２つのＩＴＲ配列を含む。
【0086】
一実施形態では、以下の１つ以上を含む核酸を含むウイルスゲノムが提供される：
（ａ）ＣＡＧプロモーター配列を含むプロモーター配列；
（ｂ）Ｋｖ８．２をコードする核酸配列であって、Ｋｖ８．２をコードする核酸配列がプロモーターに作動可能に連結されている、核酸配列；
（ｃ）ＷＰＲＥ；
（ｄ）ＢＧＨ－ポリＡシグナル；及び
（ｅ）１つ以上のＩＴＲ。いくつかの実施形態では、ウイルスゲノムは２つのＩＴＲ配列を含む。
（ａ）ＣＡＧプロモーター配列を含むプロモーター配列；
（ｂ）Ｋｖ８．２をコードする核酸配列であって、Ｋｖ８．２をコードする核酸配列がプロモーターに作動可能に連結されている、核酸配列；
（ｃ）ＷＰＲＥ；
（ｄ）ＢＧＨ－ポリＡシグナル；及び
（ｅ）１つ以上のＩＴＲ。いくつかの実施形態では、ウイルスゲノムは２つのＩＴＲ配列を含む。
【0087】
一実施形態では、以下の１つ以上を含む核酸を含むウイルスゲノムが提供される：
（ａ）ＲＫプロモーター配列を含むプロモーター配列；
（ｂ）コドン最適化Ｋｖ８．２をコードする核酸配列であって、Ｋｖ８．２をコードする核酸配列がプロモーターに作動可能に連結されている、核酸配列；
（ｃ）ＷＰＲＥ；
（ｄ）ＢＧＨ－ポリＡシグナル；及び
（ｅ）１つ以上のＩＴＲ。いくつかの実施形態では、ウイルスゲノムは２つのＩＴＲ配列を含む。
（ａ）ＲＫプロモーター配列を含むプロモーター配列；
（ｂ）コドン最適化Ｋｖ８．２をコードする核酸配列であって、Ｋｖ８．２をコードする核酸配列がプロモーターに作動可能に連結されている、核酸配列；
（ｃ）ＷＰＲＥ；
（ｄ）ＢＧＨ－ポリＡシグナル；及び
（ｅ）１つ以上のＩＴＲ。いくつかの実施形態では、ウイルスゲノムは２つのＩＴＲ配列を含む。
【0088】
一実施形態では、以下の１つ以上を含む核酸を含むウイルスゲノムが提供される：
（ａ）ＣＡＧプロモーター配列を含むプロモーター配列；
（ｂ）コドン最適化Ｋｖ８．２をコードする核酸配列であって、Ｋｖ８．２をコードする核酸配列がプロモーターに作動可能に連結されている、核酸配列；
（ｃ）ＷＰＲＥ；
（ｄ）ＢＧＨ－ポリＡシグナル；及び
（ｅ）１つ以上のＩＴＲ。いくつかの実施形態では、ウイルスゲノムは２つのＩＴＲ配列を含む。
（ａ）ＣＡＧプロモーター配列を含むプロモーター配列；
（ｂ）コドン最適化Ｋｖ８．２をコードする核酸配列であって、Ｋｖ８．２をコードする核酸配列がプロモーターに作動可能に連結されている、核酸配列；
（ｃ）ＷＰＲＥ；
（ｄ）ＢＧＨ－ポリＡシグナル；及び
（ｅ）１つ以上のＩＴＲ。いくつかの実施形態では、ウイルスゲノムは２つのＩＴＲ配列を含む。
【0089】
一実施形態では、以下の１つ以上を含む核酸を含むウイルスゲノムが提供される：
（ａ）配列番号７と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む、プロモーター配列；
（ｂ）Ｋｖ８．２をコードする核酸配列であって、Ｋｖ８．２をコードする核酸配列がプロモーターに作動可能に連結されており、Ｋｖ８．２をコードする核酸配列が、配列番号９と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む、核酸配列；
（ｃ）配列番号１１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む、転写後調節エレメント；
（ｄ）配列番号１２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む、ポリアデニル化シグナル；及び
（ｅ）１つ以上のＩＴＲ。いくつかの実施形態では、ウイルスゲノムは２つのＩＴＲ配列を含む。
（ａ）配列番号７と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む、プロモーター配列；
（ｂ）Ｋｖ８．２をコードする核酸配列であって、Ｋｖ８．２をコードする核酸配列がプロモーターに作動可能に連結されており、Ｋｖ８．２をコードする核酸配列が、配列番号９と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む、核酸配列；
（ｃ）配列番号１１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む、転写後調節エレメント；
（ｄ）配列番号１２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む、ポリアデニル化シグナル；及び
（ｅ）１つ以上のＩＴＲ。いくつかの実施形態では、ウイルスゲノムは２つのＩＴＲ配列を含む。
【0090】
一実施形態では、以下の１つ以上を含む核酸を含むウイルスゲノムが提供される：
（ａ）配列番号８と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む、プロモーター配列；
（ｂ）Ｋｖ８．２をコードする核酸配列であって、Ｋｖ８．２をコードする核酸配列がプロモーターに作動可能に連結されており、Ｋｖ８．２をコードする核酸配列が、配列番号９と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む、核酸配列；
（ｃ）配列番号１１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む、転写後調節エレメント；
（ｄ）配列番号１２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む、ポリアデニル化シグナル；及び
（ｅ）１つ以上のＩＴＲ。いくつかの実施形態では、ウイルスゲノムは２つのＩＴＲ配列を含む。
（ａ）配列番号８と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む、プロモーター配列；
（ｂ）Ｋｖ８．２をコードする核酸配列であって、Ｋｖ８．２をコードする核酸配列がプロモーターに作動可能に連結されており、Ｋｖ８．２をコードする核酸配列が、配列番号９と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む、核酸配列；
（ｃ）配列番号１１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む、転写後調節エレメント；
（ｄ）配列番号１２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む、ポリアデニル化シグナル；及び
（ｅ）１つ以上のＩＴＲ。いくつかの実施形態では、ウイルスゲノムは２つのＩＴＲ配列を含む。
【0091】
一実施形態では、以下の１つ以上を含む核酸を含むウイルスゲノムが提供される：
（ａ）配列番号７と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む、プロモーター配列；
（ｂ）コドン最適化Ｋｖ８．２をコードする核酸配列であって、Ｋｖ８．２をコードする核酸配列がプロモーターに作動可能に連結されており、Ｋｖ８．２をコードする核酸配列が、配列番号１０と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む、核酸配列；
（ｃ）配列番号１１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む、転写後調節エレメント；
（ｄ）配列番号１２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む、ポリアデニル化シグナル；及び
（ｅ）１つ以上のＩＴＲ。いくつかの実施形態では、ウイルスゲノムは２つのＩＴＲ配列を含む。
（ａ）配列番号７と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む、プロモーター配列；
（ｂ）コドン最適化Ｋｖ８．２をコードする核酸配列であって、Ｋｖ８．２をコードする核酸配列がプロモーターに作動可能に連結されており、Ｋｖ８．２をコードする核酸配列が、配列番号１０と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む、核酸配列；
（ｃ）配列番号１１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む、転写後調節エレメント；
（ｄ）配列番号１２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む、ポリアデニル化シグナル；及び
（ｅ）１つ以上のＩＴＲ。いくつかの実施形態では、ウイルスゲノムは２つのＩＴＲ配列を含む。
【0092】
一実施形態では、以下の１つ以上を含む核酸を含むウイルスゲノムが提供される：
（ａ）配列番号８と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む、プロモーター配列；
（ｂ）コドン最適化Ｋｖ８．２をコードする核酸配列であって、Ｋｖ８．２をコードする核酸配列がプロモーターに作動可能に連結されており、Ｋｖ８．２をコードする核酸配列が、配列番号１０と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む、核酸配列；
（ｃ）配列番号１１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む、転写後調節エレメント；
（ｄ）配列番号１２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む、ポリアデニル化シグナル；及び
（ｅ）１つ以上のＩＴＲ。いくつかの実施形態では、ウイルスゲノムは２つのＩＴＲ配列を含む。
（ａ）配列番号８と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む、プロモーター配列；
（ｂ）コドン最適化Ｋｖ８．２をコードする核酸配列であって、Ｋｖ８．２をコードする核酸配列がプロモーターに作動可能に連結されており、Ｋｖ８．２をコードする核酸配列が、配列番号１０と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む、核酸配列；
（ｃ）配列番号１１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む、転写後調節エレメント；
（ｄ）配列番号１２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む、ポリアデニル化シグナル；及び
（ｅ）１つ以上のＩＴＲ。いくつかの実施形態では、ウイルスゲノムは２つのＩＴＲ配列を含む。
【0093】
一実施形態では、以下の１つ以上を含む核酸を含むウイルスゲノムが提供される：
（ａ）配列番号７と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む、プロモーター配列；
（ｂ）Ｋｖ８．２タンパク質をコードする核酸配列であって、Ｋｖ８．２タンパク質が、配列番号１３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含み、Ｋｖ８．２タンパク質をコードする核酸配列が、プロモーターに作動可能に連結されている、核酸配列；
（ｃ）配列番号１１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む、転写後調節エレメント；
（ｄ）配列番号１２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む、ポリアデニル化シグナル；及び
（ｅ）１つ以上のＩＴＲ。いくつかの実施形態では、ウイルスゲノムは２つのＩＴＲ配列を含む。
（ａ）配列番号７と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む、プロモーター配列；
（ｂ）Ｋｖ８．２タンパク質をコードする核酸配列であって、Ｋｖ８．２タンパク質が、配列番号１３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含み、Ｋｖ８．２タンパク質をコードする核酸配列が、プロモーターに作動可能に連結されている、核酸配列；
（ｃ）配列番号１１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む、転写後調節エレメント；
（ｄ）配列番号１２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む、ポリアデニル化シグナル；及び
（ｅ）１つ以上のＩＴＲ。いくつかの実施形態では、ウイルスゲノムは２つのＩＴＲ配列を含む。
【0094】
一実施形態では、以下の１つ以上を含む核酸を含むウイルスゲノムが提供される：
（ａ）配列番号８と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む、プロモーター配列；
（ｂ）Ｋｖ８．２タンパク質をコードする核酸配列であって、Ｋｖ８．２タンパク質が、配列番号１３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含み、Ｋｖ８．２タンパク質をコードする核酸配列が、プロモーターに作動可能に連結されている、核酸配列；
（ｃ）配列番号１１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む、転写後調節エレメント；
（ｄ）配列番号１２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む、ポリアデニル化シグナル；及び
（ｅ）１つ以上のＩＴＲ。いくつかの実施形態では、ウイルスゲノムは２つのＩＴＲ配列を含む。
（ａ）配列番号８と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む、プロモーター配列；
（ｂ）Ｋｖ８．２タンパク質をコードする核酸配列であって、Ｋｖ８．２タンパク質が、配列番号１３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含み、Ｋｖ８．２タンパク質をコードする核酸配列が、プロモーターに作動可能に連結されている、核酸配列；
（ｃ）配列番号１１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む、転写後調節エレメント；
（ｄ）配列番号１２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む、ポリアデニル化シグナル；及び
（ｅ）１つ以上のＩＴＲ。いくつかの実施形態では、ウイルスゲノムは２つのＩＴＲ配列を含む。
【0095】
一実施形態では、以下の１つ以上を含む核酸を含むウイルスゲノムが提供される：
（ａ）配列番号７を含むプロモーター配列；
（ｂ）Ｋｖ８．２をコードする核酸配列であって、Ｋｖ８．２をコードする核酸配列がプロモーターに作動可能に連結されており、Ｋｖ８．２をコードする核酸配列が配列番号９を含む、核酸配列；
（ｃ）配列番号１１を含む転写後調節エレメント；
（ｄ）配列番号１２の配列を含むポリアデニル化シグナル；及び
（ｅ）１つ以上のＩＴＲ。いくつかの実施形態では、ウイルスゲノムは２つのＩＴＲ配列を含む。
（ａ）配列番号７を含むプロモーター配列；
（ｂ）Ｋｖ８．２をコードする核酸配列であって、Ｋｖ８．２をコードする核酸配列がプロモーターに作動可能に連結されており、Ｋｖ８．２をコードする核酸配列が配列番号９を含む、核酸配列；
（ｃ）配列番号１１を含む転写後調節エレメント；
（ｄ）配列番号１２の配列を含むポリアデニル化シグナル；及び
（ｅ）１つ以上のＩＴＲ。いくつかの実施形態では、ウイルスゲノムは２つのＩＴＲ配列を含む。
【0096】
一実施形態では、以下の１つ以上を含む核酸を含むウイルスゲノムが提供される：
（ａ）配列番号８を含むプロモーター配列；
（ｂ）Ｋｖ８．２をコードする核酸配列であって、Ｋｖ８．２をコードする核酸配列がプロモーターに作動可能に連結されており、Ｋｖ８．２をコードする核酸配列が配列番号９を含む、核酸配列；
（ｃ）配列番号１１を含む転写後調節エレメント；
（ｄ）配列番号１２の配列を含むポリアデニル化シグナル；及び
（ｅ）１つ以上のＩＴＲ。いくつかの実施形態では、ウイルスゲノムは２つのＩＴＲ配列を含む。
（ａ）配列番号８を含むプロモーター配列；
（ｂ）Ｋｖ８．２をコードする核酸配列であって、Ｋｖ８．２をコードする核酸配列がプロモーターに作動可能に連結されており、Ｋｖ８．２をコードする核酸配列が配列番号９を含む、核酸配列；
（ｃ）配列番号１１を含む転写後調節エレメント；
（ｄ）配列番号１２の配列を含むポリアデニル化シグナル；及び
（ｅ）１つ以上のＩＴＲ。いくつかの実施形態では、ウイルスゲノムは２つのＩＴＲ配列を含む。
【0097】
一実施形態では、以下の１つ以上を含む核酸を含むウイルスゲノムが提供される：
（ａ）配列番号７を含むプロモーター配列；
（ｂ）Ｋｖ８．２をコードする核酸配列であって、Ｋｖ８．２をコードする核酸配列がプロモーターに作動可能に連結されており、Ｋｖ８．２をコードする核酸配列が配列番号１０を含む、核酸配列；
（ｃ）配列番号１１を含む転写後調節エレメント；
（ｄ）配列番号１２の配列を含むポリアデニル化シグナル；及び
（ｅ）１つ以上のＩＴＲ。いくつかの実施形態では、ウイルスゲノムは２つのＩＴＲ配列を含む。
（ａ）配列番号７を含むプロモーター配列；
（ｂ）Ｋｖ８．２をコードする核酸配列であって、Ｋｖ８．２をコードする核酸配列がプロモーターに作動可能に連結されており、Ｋｖ８．２をコードする核酸配列が配列番号１０を含む、核酸配列；
（ｃ）配列番号１１を含む転写後調節エレメント；
（ｄ）配列番号１２の配列を含むポリアデニル化シグナル；及び
（ｅ）１つ以上のＩＴＲ。いくつかの実施形態では、ウイルスゲノムは２つのＩＴＲ配列を含む。
【0098】
一実施形態では、以下の１つ以上を含む核酸を含むウイルスゲノムが提供される：
（ａ）配列番号８を含むプロモーター配列；
（ｂ）Ｋｖ８．２をコードする核酸配列であって、Ｋｖ８．２をコードする核酸配列がプロモーターに作動可能に連結されており、Ｋｖ８．２をコードする核酸配列が配列番号１０を含む、核酸配列；
（ｃ）配列番号１１を含む転写後調節エレメント；
（ｄ）配列番号１２の配列を含むポリアデニル化シグナル；及び
（ｅ）１つ以上のＩＴＲ。いくつかの実施形態では、ウイルスゲノムは２つのＩＴＲ配列を含む。
（ａ）配列番号８を含むプロモーター配列；
（ｂ）Ｋｖ８．２をコードする核酸配列であって、Ｋｖ８．２をコードする核酸配列がプロモーターに作動可能に連結されており、Ｋｖ８．２をコードする核酸配列が配列番号１０を含む、核酸配列；
（ｃ）配列番号１１を含む転写後調節エレメント；
（ｄ）配列番号１２の配列を含むポリアデニル化シグナル；及び
（ｅ）１つ以上のＩＴＲ。いくつかの実施形態では、ウイルスゲノムは２つのＩＴＲ配列を含む。
【0099】
一実施形態では、以下の１つ以上を含む核酸を含むウイルスゲノムが提供される：
（ａ）配列番号７を含むプロモーター配列；
（ｂ）Ｋｖ８．２タンパク質をコードする核酸配列であって、Ｋｖ８．２タンパク質が配列番号１３を含み、Ｋｖ８．２タンパク質をコードする核酸配列がプロモーターに作動可能に連結されている、核酸配列；
（ｃ）配列番号１１を含む転写後調節エレメント；
（ｄ）配列番号１２の配列を含むポリアデニル化シグナル；及び
（ｅ）１つ以上のＩＴＲ。いくつかの実施形態では、ウイルスゲノムは２つのＩＴＲ配列を含む。
（ａ）配列番号７を含むプロモーター配列；
（ｂ）Ｋｖ８．２タンパク質をコードする核酸配列であって、Ｋｖ８．２タンパク質が配列番号１３を含み、Ｋｖ８．２タンパク質をコードする核酸配列がプロモーターに作動可能に連結されている、核酸配列；
（ｃ）配列番号１１を含む転写後調節エレメント；
（ｄ）配列番号１２の配列を含むポリアデニル化シグナル；及び
（ｅ）１つ以上のＩＴＲ。いくつかの実施形態では、ウイルスゲノムは２つのＩＴＲ配列を含む。
【0100】
一実施形態では、以下の１つ以上を含む核酸を含むウイルスゲノムが提供される：
（ａ）配列番号８を含むプロモーター配列；
（ｂ）Ｋｖ８．２タンパク質をコードする核酸配列であって、Ｋｖ８．２タンパク質が配列番号１３を含み、Ｋｖ８．２タンパク質をコードする核酸配列がプロモーターに作動可能に連結されている、核酸配列；
（ｃ）配列番号１１を含む転写後調節エレメント；
（ｄ）配列番号１２の配列を含むポリアデニル化シグナル；及び
（ｅ）１つ以上のＩＴＲ。いくつかの実施形態では、ウイルスゲノムは２つのＩＴＲ配列を含む。
（ａ）配列番号８を含むプロモーター配列；
（ｂ）Ｋｖ８．２タンパク質をコードする核酸配列であって、Ｋｖ８．２タンパク質が配列番号１３を含み、Ｋｖ８．２タンパク質をコードする核酸配列がプロモーターに作動可能に連結されている、核酸配列；
（ｃ）配列番号１１を含む転写後調節エレメント；
（ｄ）配列番号１２の配列を含むポリアデニル化シグナル；及び
（ｅ）１つ以上のＩＴＲ。いくつかの実施形態では、ウイルスゲノムは２つのＩＴＲ配列を含む。
【0101】
アデノウイルス（ＡＶ）ベクターとしては、例えば、Ｅ１及びＥ３領域の欠失により複製欠損性とされたヒトアデノウイルス２型及びヒトアデノウイルス５型に基づくものが挙げられる。転写カセットをＥ１領域に挿入して、Ｅ１／Ｅ３欠失組換えＡＶベクターを得ることができる。アデノウイルスベクターには、ウイルスコード配列を含有しないヘルパー依存性大容量アデノウイルスベクター（大容量、「ガットレス（ｇｕｔｌｅｓｓ）」または「ガッティド（ｇｕｔｔｅｄ）」ベクターとしても知られる）が含まれる。これらのベクターは、ウイルスＤＮＡ複製及びパッケージングに必要なシス作用性エレメントを含有し、主に逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）及びパッケージングシグナル（ＣＹ）を含有する。これらのヘルパー依存性ＡＶベクターゲノムは、数百塩基対から最大およそ３６ｋｂの外来ＤＮＡを担持する可能性がある。
【0102】
あるいは、レンチウイルスベクターなどの他の系を使用することもできる。レンチウイルスベースの系は、非分裂細胞ならびに分裂細胞を形質導入することができるため、例えば、ＣＮＳの非分裂細胞を標的とする用途に有用になる。レンチウイルスベクターは、ヒト免疫不全ウイルスに由来し、そのウイルスと同様に、宿主ゲノムに組み込まれ、非常に長期の遺伝子発現の可能性を提供する。
【0103】
発現カセットを含有する標的遺伝子を担持する、プラスミド、ＹＡＣ、ミニ染色体及びミニサークルを含むポリヌクレオチドはまた、例えば、カチオン性脂質、ポリマー、またはその両方を担体として使用する非ウイルスベクター系によって細胞または生物に導入することができる。コンジュゲートポリ－Ｌ－リシン（ＰＬＬ）ポリマー及びポリエチレンイミン（ＰＥＩ）ポリマー系を使用して、ベクターを細胞に送達することもできる。ベクターを細胞に送達する他の方法には、細胞培養と生物の両方に対する、流体力学的注入、及びエレクトロポレーション、及び超音波の使用が含まれる。遺伝子送達のためのウイルス及び非ウイルス送達系の総説については、参照により本明細書に組み込まれるＮａｙｅｒｏｓｓａｄａｔ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．（Ａｄｖ Ｂｉｏｍｅｄ Ｒｅｓ．２０１２；１：２７）を参照のこと。
【0104】
ｒＡＡＶビリオン産生
本明細書に開示されるｒＡＡＶビリオンは、本明細書に記載される材料及び方法、ならびに当業者に公知の材料及び方法を使用して構築及び産生することができる。本発明の任意の実施形態を構築するために使用されるそのような工学的方法は、核酸操作の当業者に公知であり、遺伝子工学、組換え工学、及び合成技術を含む。例えば、上で引用したＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．；ならびに国際特許公開第ＷＯ９５／１３５９８号を参照のこと。さらに、アデノウイルスキャプシド内でｒＡＡＶカセットを産生するのに好適な方法は、米国特許第５，８５６，１５２号及び同第５，８７１，９８２号に記載されている。
本明細書に開示されるｒＡＡＶビリオンは、本明細書に記載される材料及び方法、ならびに当業者に公知の材料及び方法を使用して構築及び産生することができる。本発明の任意の実施形態を構築するために使用されるそのような工学的方法は、核酸操作の当業者に公知であり、遺伝子工学、組換え工学、及び合成技術を含む。例えば、上で引用したＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．；ならびに国際特許公開第ＷＯ９５／１３５９８号を参照のこと。さらに、アデノウイルスキャプシド内でｒＡＡＶカセットを産生するのに好適な方法は、米国特許第５，８５６，１５２号及び同第５，８７１，９８２号に記載されている。
【0105】
簡単に述べると、ｒＡＡＶゲノムをｒＡＡＶビリオンにパッケージングするために、宿主細胞は、ＡＡＶ ｒｅｐ及びＡＡＶ ｃａｐまたはその機能的断片を発現するのに必要な配列、ならびにＡＡＶ産生に必要なヘルパー遺伝子を含有しなければならない。ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ配列は、本明細書に見出されるＡＡＶ供給源から得られる。ＡＡＶ ｒｅｐ配列及びＡＡＶ ｃａｐ配列は、当業者に公知の任意の様式で宿主細胞に導入することができ、トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポソーム送達、膜融合技術、高速ＤＮＡコーティングペレット、ウイルス感染及びプロトプラスト融合、を含むがこれらに限定されない。一実施形態では、ｒｅｐ配列及びｃａｐ配列は、１つ以上の核酸分子によって宿主細胞にトランスフェクトして、エピソームとして細胞内に安定に存在することができる。別の実施形態では、ｒｅｐ配列及びｃａｐ配列は、細胞のゲノムに安定して組み込まれる。別の実施形態では、宿主細胞内で一過的に発現するｒｅｐ配列及びｃａｐ配列を有する。例えば、そのようなトランスフェクションに有用な核酸分子は、５’から３’に、プロモーター、プロモーターとｒｅｐ遺伝子配列の開始部位との間に挿入される任意のスペーサー、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子配列、及びＡＡＶ ｃａｐ遺伝子配列を含む。
【0106】
ｒｅｐ配列及びｃａｐ配列は、それらの発現制御配列とともに、単一のベクター上に供給してもよく、または各配列をそれ自体のベクター上に供給してもよい。好ましくは、ｒｅｐ配列及びｃａｐ配列は、同じベクター上に供給される。あるいは、ｒｅｐ配列及びｃａｐ配列は、宿主細胞に導入され得る他のＤＮＡ配列を含有するベクター上に供給してもよい。好ましくは、このコンストラクトで使用されるプロモーターは、当業者に公知の任意の好適な構成的プロモーター、誘導性プロモーター、または天然プロモーターであり得る。ｒｅｐタンパク質及びｃａｐタンパク質を提供する分子は、これらの成分を宿主細胞に輸送する任意の形態であってもよい。望ましくは、この分子はプラスミドの形態であり、マーカー遺伝子の配列などの他の非ウイルス配列を含有し得る。この分子はＡＡＶ ＩＴＲを含有せず、一般にＡＡＶパッケージング配列を含有しない。相同組換えの発生を回避するために、このプラスミドでは他のウイルス配列、特にアデノウイルスの配列は避けられる。このプラスミドは、細胞に安定にトランスフェクトすることができるように構築されることが望ましい。
【0107】
ｒｅｐ及びｃａｐを提供する分子は、宿主細胞に一過的にトランスフェクトすることができるが、宿主細胞は、例えばエピソームとして、または宿主細胞の染色体への組み込みによって、宿主細胞内で機能的ｒｅｐ／ｃａｐタンパク質を発現するのに必要な配列で安定に形質転換されることが好ましい。そのような安定にトランスフェクトされた宿主細胞の発現を制御するプロモーターに応じて、ｒｅｐ／ｃａｐタンパク質は一過的に発現することができる（例えば、誘導性プロモーターの使用を通じて）。
【0108】
本発明の実施形態を構築するために使用される方法は、上記の参考文献に記載されているような、従来の遺伝子工学または組換え工学技術である。例えば、ｒＡＡＶは、製造業者の指示に従って、リン酸カルシウム法（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）またはＥｆｆｅｃｔｅｎｅ試薬（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、Ｃａｌｉｆ．）のいずれかを使用するトリプルトランスフェクション法を利用して生成することができる。導入遺伝子を有するプラスミド、ＣＰＡ－ＲＰＥ６５、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐを含有するヘルパープラスミド、ならびにＥ２Ａ、Ｅ４Ｏｒｆ６及びＶＡのアデノウイルスヘルパー機能を供給するプラスミドを用いる、以下の実施例で使用する方法について、Ｈｅｒｚｏｇ ｅｔ ａｌ，１９９９，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃ．，５（１）：５６－６３を参照のこと。本明細書は、本明細書に提供される情報を使用して、特定のコンストラクトの実例を提供するが、当業者は、スペーサー、プロモーター、及び少なくとも１つの翻訳開始及び翻訳停止シグナルを含むその他のエレメントの選択、ならびにポリアデニル化部位の任意選択の付加を使用して、他の好適なコンストラクトを選択し、設計することができる。
【0109】
次に、ｒＡＡＶビリオンは、ｒＡＡＶビリオンにパッケージングされるｒＡＡＶゲノム、ＡＡＶ ｒｅｐ配列及びＡＡＶ ｃａｐ配列を含有する、本明細書に記載のｒＡＡＶウイルスを含有する宿主細胞を、その発現を誘導する調節配列の制御下で培養することによって産生される。他の考えられるヘルパー遺伝子の中でも、好適なウイルスヘルパー遺伝子、例えばアデノウイルスＥ２Ａ、Ｅ４Ｏｒｆ６及びＶＡは、当技術分野で公知の様々な方法で、好ましくは別個のプラスミド上で、培養物に提供することができる。その後、導入遺伝子の発現を誘導する組換えＡＡＶビリオンを、混入ヘルパーウイルスまたはＷＴ ＡＡＶの非存在下で、細胞または細胞培養物から単離する。
【0110】
ＫＣＮＶ２遺伝子の発現は、当技術分野で公知の方法で測定することができる。例えば、標的細胞をインビトロで感染させ、細胞内の導入遺伝子のコピー数をサザンブロッティングまたは定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって監視することができる。ＲＮＡ発現レベルは、ノーザンブロッティングまたは定量的逆転写酵素（ＲＴ）－ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によって監視することができる；またタンパク質発現レベルは、ウェスタンブロッティング、免疫組織化学、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によって、または以下の実施例で詳述する特定の方法によって監視することができる。
【0111】
医薬組成物
本明細書では、本明細書に開示されるベクターのいずれか及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物が提供される。
本明細書では、本明細書に開示されるベクターのいずれか及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物が提供される。
【0112】
Ｋｖ８．２をコードする遺伝子を含有する組換えＡＡＶを、好ましくは従来の方法によって汚染について評価し、次に患者への投与に好適な医薬組成物に製剤化する。
【0113】
このような製剤は、ｐＨを適切な生理学的レベルに維持するために、薬学的及び／または生理学的に許容されるビヒクルまたは担体、特に緩衝生理食塩水または他の緩衝液、例えば、ＨＥＰＥＳ、などの網膜下注射に好適なビヒクルまたは担体の使用を伴う。
【0114】
本発明のベクターは、医薬組成物に製剤化することができる。これらの組成物は、ベクターに加えて、薬学的及び／または生理学的に許容される賦形剤、担体、緩衝液、安定剤、抗酸化剤、防腐剤、または当業者に周知の他の添加剤を含んでもよい。このような材料は非毒性であるべきであり、活性成分の有効性を妨げるものであってはならない。担体または他の材料の正確な性質は、投与経路に従って当業者が決定することができる。医薬組成物は、典型的には液体形態である。液体医薬組成物は、一般に、水、石油、動物油または植物油、鉱油または合成油などの液体担体を含む。追加の担体は、参照により本明細書に組み込まれる国際特許公開第ＷＯ００／１５８２２号に提供されている。生理食塩水、塩化マグネシウム、デキストロース、もしくは他の糖溶液、またはエチレングリコール、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコールなどのグリコールを含めてもよい。場合によっては、界面活性剤、例としてプルロン酸（ＰＦ６８）０．００１％を使用してもよい。場合によっては、リンゲル液、加乳酸リンゲル液、またはハルトマン液を使用する。必要に応じて、防腐剤、安定剤、緩衝剤、抗酸化剤及び／または他の添加剤を含むことができる。
【0115】
遅延放出の場合、ベクターを、生体適合性ポリマーから形成されたマイクロカプセルまたは当技術分野で公知の方法によるリポソーム担体系など、徐放用に製剤化された医薬組成物に含めてもよい。
【0116】
ウイルスを長期保存する場合、グリセロールの存在下で凍結してもよい。
【0117】
治療方法
網膜疾患の治療を必要とする対象における網膜疾患を治療する方法であって、網膜疾患は、ＫＣＮＶ２遺伝子における１つ以上の変異と関連しており、本明細書に開示されるベクターを対象に投与することを含む、方法が、本明細書において提供される。網膜疾患の治療を必要とする対象における網膜疾患を治療する方法において使用するためのベクターであって、網膜疾患は、ＫＣＮＶ２遺伝子における１つ以上の変異と関連している、ベクターが、本明細書において提供される。いくつかの実施形態では、対象はＫＣＮＶ２に変異を有する。
網膜疾患の治療を必要とする対象における網膜疾患を治療する方法であって、網膜疾患は、ＫＣＮＶ２遺伝子における１つ以上の変異と関連しており、本明細書に開示されるベクターを対象に投与することを含む、方法が、本明細書において提供される。網膜疾患の治療を必要とする対象における網膜疾患を治療する方法において使用するためのベクターであって、網膜疾患は、ＫＣＮＶ２遺伝子における１つ以上の変異と関連している、ベクターが、本明細書において提供される。いくつかの実施形態では、対象はＫＣＮＶ２に変異を有する。
【0118】
いくつかの実施形態では、対象は哺乳動物である。本明細書で使用される「哺乳動物」という用語は、ヒト、実験動物、家庭用ペット、及び家畜を含むことを意図しているが、これらに限定されない。哺乳動物には、ヒト、または非ヒト哺乳動物、例としてウシ、ウマ、イヌ、ヒツジ、もしくはネコなどが含まれるが、これらに限定されない。個体及び患者も、本明細書では対象となる。
【0119】
本明細書で使用される「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療される（ｔｒｅａｔｅｄ）」、「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、または「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語は、治療的処置を指し、その目的は、望ましくない生理学的状態、障害または疾患を減速させる（軽減させる）こと、または有益なもしくは所望の臨床結果を得ることである。本発明の目的において、有益なまたは所望の臨床結果としては、症状の軽減；状態、障害、もしくは疾患の程度の低下；病態、障害、もしくは疾患の状態の安定化（すなわち、悪化しない）；状態、障害、もしくは疾患の発症の遅延、または状態、障害、もしくは疾患の進行の遅延；状態、障害、もしくは病状の改善；及び寛解（部分的もしくは完全）、または状態、障害、もしくは疾患の向上または改善が挙げられるが、これらに限定されない。治療には、過剰なレベルの副作用を伴わずに、臨床的に有意な応答を誘発することが含まれる。治療はまた、治療を受けていなかった場合に予測される生存期間と比較して、生存期間を延長することも含む。「予防する」、「予防」などの用語は、明らかな疾患もしくは障害の発症前に作用すること、疾患もしくは障害が発症するのを防ぐこと、または疾患もしくは障害の程度を最小限に抑えるか、あるいはその進行過程を遅らせることを指す。
【0120】
いくつかの実施形態では、網膜疾患は錐体ジストロフィーである。一実施形態では、網膜疾患は、超正常杆体応答を伴う錐体ジストロフィー（ＣＤＳＳＲ）である。
【0121】
一態様では、以下を含む方法が提供される。
（ａ）対象がＫＣＮＶ２遺伝子に変異を保有しているかどうかを決定すること；及び
（ｂ）対象がＫＣＮＶ２遺伝子に変異を保有する場合、本明細書に開示されるベクターを含む医薬組成物を対象に投与すること。
（ａ）対象がＫＣＮＶ２遺伝子に変異を保有しているかどうかを決定すること；及び
（ｂ）対象がＫＣＮＶ２遺伝子に変異を保有する場合、本明細書に開示されるベクターを含む医薬組成物を対象に投与すること。
【0122】
投与の経路及び方法
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるベクターまたは医薬組成物は、眼内注射によって投与する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるベクターまたは医薬組成物は、直接網膜注射、網膜下注射、または硝子体内注射によって投与する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるベクターまたは医薬組成物は、対象の中心網膜に投与する。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるベクターまたは医薬組成物は、眼内注射によって投与する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるベクターまたは医薬組成物は、直接網膜注射、網膜下注射、または硝子体内注射によって投与する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるベクターまたは医薬組成物は、対象の中心網膜に投与する。
【0123】
本発明のベクターの用量は、種々のパラメータに従って、特に治療される患者の年齢、体重及び状態、特定の眼障害及び進行性である場合は障害が進行している程度、投与経路、及び必要なレジメンに従って決定することができる。また、医師は特定の患者に必要な投与経路及び投与量を決定することができる。プロモーター配列の制御下で所望の導入遺伝子をコードする核酸配列を担持するｒＡＡＶの有効量は、望ましくは、約１×１０９～２×１０１２の間のｒＡＡＶゲノム粒子、または１×１０１０～２×１０１１の間のゲノム粒子の範囲である。ゲノム粒子は、本明細書では、配列特異的方法（リアルタイムＰＣＲなど）を用いて定量することができる一本鎖ＤＮＡ分子を含有するＡＡＶキャプシドとして定義される。いくつかの実施形態では、約１×１０９～２×１０１２のｒＡＡＶゲノム粒子は、約１５０～約８００μｌの間の体積で提供される。いくつかの実施形態では、約１×１０１０～２×１０１１のｒＡＡＶゲノム粒子は、約２５０～約５００μｌの間の体積で提供される。これらの範囲のさらに他の用量は、主治医が選択することができる。
【0124】
用量は単回用量として提供してもよいが、僚眼に対して、または何らかの理由（手術合併症など）でベクターが網膜の正しい領域を標的にしなかった場合には、繰り返してもよい。治療は、好ましくは各眼に対する単一の永久治療であるが、例えば将来的に及び／または異なるＡＡＶ血清型による反復注射を考慮してもよい。したがって、本明細書に開示される医薬組成物の「ブースター」投与量を複数回投与することが望ましい場合がある。例えば、眼の標的細胞内の導入遺伝子の持続期間に応じて、ブースター投与量を６か月間隔で、または最初の投与の後から１年ごとに送達することができる。このようなブースター投与量及びその必要性は、例えば、当技術分野で公知の網膜及び視覚機能検査及び視覚行動検査を使用して、主治医が監視することができる。他の同様の検査を使用して、治療対象の状態を経時的に判定してもよい。適切な検査の選択は主治医が行うことができる。さらに代替的に、本明細書に開示される方法はまた、ＷＴ網膜で見られるレベルに近い視覚機能のレベルが可能になるために、単一または複数回の感染においてより大量のベクター含有溶液の注射を伴ってもよい。
【0125】
追加の方法
一態様では、Ｋｖ８．２の発現の増加を必要とする対象におけるＫｖ８．２の発現を増加させる方法であって、本明細書に開示されるベクターを対象に投与することを含む、方法を提供する。一態様では、細胞におけるＫｖ８．２の発現を増加させる方法であって、細胞を本明細書に開示されるベクターと接触させることを含む、方法を提供する。
一態様では、Ｋｖ８．２の発現の増加を必要とする対象におけるＫｖ８．２の発現を増加させる方法であって、本明細書に開示されるベクターを対象に投与することを含む、方法を提供する。一態様では、細胞におけるＫｖ８．２の発現を増加させる方法であって、細胞を本明細書に開示されるベクターと接触させることを含む、方法を提供する。
【0126】
製造品及びキット
本明細書に記載の方法で使用するためのキットまたは製造品も提供される。態様では、キットは、本明細書に記載される組成物（例えば、Ｋｖ８．２コード配列の送達のための組成物）を好適なパッケージングで含む。本明細書に記載される組成物（注射用の眼用組成物など）の適切なパッケージングは当技術分野で公知であり、これには、例えば、バイアル（密封バイアルなど）、容器、アンプル、ボトル、ジャー、柔軟なパッケージング（例えば、密封マイラーまたはビニール袋）などが含まれる。これらの製造品は、さらに、滅菌及び／または密封されてもよい。
本明細書に記載の方法で使用するためのキットまたは製造品も提供される。態様では、キットは、本明細書に記載される組成物（例えば、Ｋｖ８．２コード配列の送達のための組成物）を好適なパッケージングで含む。本明細書に記載される組成物（注射用の眼用組成物など）の適切なパッケージングは当技術分野で公知であり、これには、例えば、バイアル（密封バイアルなど）、容器、アンプル、ボトル、ジャー、柔軟なパッケージング（例えば、密封マイラーまたはビニール袋）などが含まれる。これらの製造品は、さらに、滅菌及び／または密封されてもよい。
【0127】
本明細書に記載の組成物を含むキットも提供される。これらのキットは、本明細書に記載される使用など、組成物の使用方法に関する説明書（複数可）をさらに含んでもよい。本明細書に記載されるキットは、緩衝液、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、及び組成物の投与を実行するためのまたは本明細書に記載される任意の方法を実行するための説明書を含む添付文書を含む、商業的及びユーザーの観点から望ましい他の材料をさらに含み得る。例えば、いくつかの実施形態では、キットは、標的細胞におけるＫｖ８．２タンパク質の発現のためのＫＣＮＶ２導入遺伝子を含むｒＡＡＶ、注射に好適な薬学的に許容される担体、ならびに緩衝液、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、及び注射を行うための説明書を含む添付文書のうちの１つ以上を含む。
【0128】
本発明は、記載された特定の分子、組成物、方法論、またはプロトコルに限定されず、これらは変化し得ることを理解すべきである。本明細書に記載の方法及び材料に類似したまたは同等の、任意の方法及び材料を、本発明の実施形態の実践または試験に使用することができる。さらに、本明細書における本発明の開示は、そのような特定の特徴の全ての考えられる組み合わせを含むことを理解すべきである。例えば、特定の特徴が本発明の特定の態様もしくは実施形態、または特定の請求項に関連して開示されている場合、その特徴も、本発明の他の特定の態様及び実施形態と組み合わせて、及び／または本発明の他の特定の態様及び実施形態との関連で、及び本発明において、一般に、可能な限り使用することができる。
【0129】
本明細書において、２つ以上の定義されたステップを含む方法について言及する場合、それらの定義されたステップは、任意の順序でまたは同時に実行することができ（文脈がその可能性を除外する場合を除く）、この方法には、定義されたステップのいずれかの前、定義されたステップのうちの２つの間、または定義されたステップすべての後に行われる１つ以上の他のステップを含めることができる（文脈によりこれらの可能性が除外される場合を除く）。
【0130】
他のすべての参照特許及び出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。さらに、参照により本明細書に組み込まれる参考文献における用語の定義または使用が、本明細書に提供されるその用語の定義と一致しない、または矛盾する場合、本明細書に提供されるその用語の定義が適用され、参考文献におけるその用語の定義は適用されない。
【0131】
本発明のより良い理解を容易にするために、特定の実施形態の以下の実施例が与えられる。以下の実施例は、本発明の範囲全体を限定または定義するものとして解釈されるべきではない。
【実施例】
【0132】
実施例１：ＡＡＶ－ＫＣＮＶ２発現コンストラクトの設計及び作製
まず、ＫＣＮＶ２ ｃＤＮＡまたはコドン最適化ＫＣＮＶ２ ｃＤＮＡを、ユビキタスＣＡＧプロモーターまたは光受容体特異的ＲＫ１プロモーターの下流のＡＡＶ一本鎖骨格にクローニングした。コザックコンセンサス配列を、プロモーターと導入遺伝子との間に配置した。ウッドチャック肝炎ウイルス変異体６（ＷＰＲＥｍ６）配列を、導入遺伝子とポリＡとの間に配置した。ポリＡ配列は、ウシ成長ホルモンポリＡ（ＢｇｈｐＡ）配列であった。４つの発現コンストラクトの概略図については、図１を参照のこと。クローニングは、ＶｅｃｔｏｒＢｕｉｌｄｅｒ，Ｉｎｃ．（Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ、ＵＳＡ）で実行した。プラスミドを受け取ったら、Ｇｅｎｅｗｉｚ（Ｓｏｕｔｈ Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ、ＮＪ、ＵＳＡ）で完全なシーケンシング（ＩＴＲ領域を含む）を実行し、Ｓｎａｐｇｅｎｅ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して配列をプラスミドマップにアラインメントさせた。４つのコンストラクトを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞へのトリプルトランスフェクションによってＡＡＶ５及び７ｍ８キャプシドの両方にパッケージングし、ＳｉｇｎａＧｅｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ、ＭＤ、ＵＳＡ）で塩化セシウム遠心分離によって精製した。
まず、ＫＣＮＶ２ ｃＤＮＡまたはコドン最適化ＫＣＮＶ２ ｃＤＮＡを、ユビキタスＣＡＧプロモーターまたは光受容体特異的ＲＫ１プロモーターの下流のＡＡＶ一本鎖骨格にクローニングした。コザックコンセンサス配列を、プロモーターと導入遺伝子との間に配置した。ウッドチャック肝炎ウイルス変異体６（ＷＰＲＥｍ６）配列を、導入遺伝子とポリＡとの間に配置した。ポリＡ配列は、ウシ成長ホルモンポリＡ（ＢｇｈｐＡ）配列であった。４つの発現コンストラクトの概略図については、図１を参照のこと。クローニングは、ＶｅｃｔｏｒＢｕｉｌｄｅｒ，Ｉｎｃ．（Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ、ＵＳＡ）で実行した。プラスミドを受け取ったら、Ｇｅｎｅｗｉｚ（Ｓｏｕｔｈ Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ、ＮＪ、ＵＳＡ）で完全なシーケンシング（ＩＴＲ領域を含む）を実行し、Ｓｎａｐｇｅｎｅ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して配列をプラスミドマップにアラインメントさせた。４つのコンストラクトを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞へのトリプルトランスフェクションによってＡＡＶ５及び７ｍ８キャプシドの両方にパッケージングし、ＳｉｇｎａＧｅｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ、ＭＤ、ＵＳＡ）で塩化セシウム遠心分離によって精製した。
【0133】
実施例２：細胞株におけるトランスフェクションによるＣＡＧ発現コンストラクトの検証。
トランスジェニック発現コンストラクトを検証するために、ＨＥＫ２９３及び発生している網膜色素上皮（ＡＲＰＥ１９）細胞に、標準的なヌクレオフェクション技術を使用してトランスフェクトした。最初に、ＣＡＧプロモーターの制御下で、それぞれＷＴ ＫＣＮＶ２遺伝子またはコドン最適化ＫＣＮＶ２遺伝子を含む発現コンストラクト（ｐＣＡＧ－ＫＣＮＶ２ ＷＴ及びｐＣＡＧ－ＫＣＮＶ２ Ｏｐｔｉ）を、細胞にトランスフェクトした。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）導入遺伝子及びヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（ＣＭＶ－ＧＦＰ）を含む発現プラスミドを、対照として使用した。発現を、ｑＰＣＲ、免疫蛍光、及びＦＡＣＳによって検証した。
トランスジェニック発現コンストラクトを検証するために、ＨＥＫ２９３及び発生している網膜色素上皮（ＡＲＰＥ１９）細胞に、標準的なヌクレオフェクション技術を使用してトランスフェクトした。最初に、ＣＡＧプロモーターの制御下で、それぞれＷＴ ＫＣＮＶ２遺伝子またはコドン最適化ＫＣＮＶ２遺伝子を含む発現コンストラクト（ｐＣＡＧ－ＫＣＮＶ２ ＷＴ及びｐＣＡＧ－ＫＣＮＶ２ Ｏｐｔｉ）を、細胞にトランスフェクトした。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）導入遺伝子及びヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（ＣＭＶ－ＧＦＰ）を含む発現プラスミドを、対照として使用した。発現を、ｑＰＣＲ、免疫蛍光、及びＦＡＣＳによって検証した。
【0134】
ｑＰＣＲによるＣＡＧ発現コンストラクトの検証。
ＫＣＮＶ２ ＷＴ及びＫＣＮＶ２ Ｏｐｔｉ ｍＲＮＡレベルを、それぞれｐＣＡＧ－ＫＣＮＶ２ ＷＴまたはｐＣＡＧ－ＫＣＮＶ２ Ｏｐｔｉ発現コンストラクトを用いたＨＥＫ２９３またはＡＲＰＥ１９細胞のそれぞれのヌクレオフェクションの４８時間後に評価した。ｍＲＮＡレベルを、ＷＴ及びＯｐｔｉ転写物を検出するように設計したＴＡＱＭＡＮプライマープローブセットを用いたｑＰＣＲで決定した。発現レベルを、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨ及びβアクチンに対して正規化した。両方の発現プラスミドは、両方の細胞株において検出可能なＫＣＮＶ２ ｍＲＮＡを産生した。同量のプラスミドＤＮＡをトランスフェクションしたにもかかわらず、ＡＲＰＥ１９は４８時間時点でＨＥＫ２９３よりもＷＴ転写物とＯｐｔｉ転写物の両方が少なく、トランスフェクション効率が低いことを示唆していた（図２）。プライマー対間の増幅効率の差異のため、この分析ではＯｐｔｉとＷＴの転写レベルを直接比較することはできない。
ＫＣＮＶ２ ＷＴ及びＫＣＮＶ２ Ｏｐｔｉ ｍＲＮＡレベルを、それぞれｐＣＡＧ－ＫＣＮＶ２ ＷＴまたはｐＣＡＧ－ＫＣＮＶ２ Ｏｐｔｉ発現コンストラクトを用いたＨＥＫ２９３またはＡＲＰＥ１９細胞のそれぞれのヌクレオフェクションの４８時間後に評価した。ｍＲＮＡレベルを、ＷＴ及びＯｐｔｉ転写物を検出するように設計したＴＡＱＭＡＮプライマープローブセットを用いたｑＰＣＲで決定した。発現レベルを、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨ及びβアクチンに対して正規化した。両方の発現プラスミドは、両方の細胞株において検出可能なＫＣＮＶ２ ｍＲＮＡを産生した。同量のプラスミドＤＮＡをトランスフェクションしたにもかかわらず、ＡＲＰＥ１９は４８時間時点でＨＥＫ２９３よりもＷＴ転写物とＯｐｔｉ転写物の両方が少なく、トランスフェクション効率が低いことを示唆していた（図２）。プライマー対間の増幅効率の差異のため、この分析ではＯｐｔｉとＷＴの転写レベルを直接比較することはできない。
【0135】
免疫蛍光によるＣＡＧ発現コンストラクトの検証。
ＡＲＰＥ１９細胞に、ｐＣＡＧ－ＫＣＮＶ２ ＷＴ及びｐＣＡＧ－ＫＣＮＶ２ Ｏｐｔｉ発現コンストラクトをそれぞれヌクレオフェクトした。ＡＲＰＥ１９細胞には、対照としてＬｏｎｚａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍｏｒｒｉｓｖｉｌｌｅ、ＮＣ、ＵＳＡ）製のｐｍａｘＧＦＰ（ＣＡＧプロモーターによって駆動されるＧＦＰ）発現コンストラクトもトランスフェクトした。Ｋｖ８．２タンパク質は、ＫＣＮＶ２ウサギポリクローナル一次抗体（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ ＃ＨＰＡ０３１１３１、１：１００）及びロバ抗ウサギＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５５５二次抗体を使用して検出した。両方のＫＣＮＶ２発現プラスミドをトランスフェクトしたある特定のＡＲＰＥ１９細胞は、免疫蛍光によって検出可能なＫｖ８．２タンパク質を産生した（図３）。検出可能なＫｖ８．２タンパク質を有しなかった多くのＡＲＰＥ１９細胞によって示されるように、トランスフェクションレベルは低かった。Ｋｖ８．２タンパク質は、細胞膜及び細胞質に局在した。
ＡＲＰＥ１９細胞に、ｐＣＡＧ－ＫＣＮＶ２ ＷＴ及びｐＣＡＧ－ＫＣＮＶ２ Ｏｐｔｉ発現コンストラクトをそれぞれヌクレオフェクトした。ＡＲＰＥ１９細胞には、対照としてＬｏｎｚａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍｏｒｒｉｓｖｉｌｌｅ、ＮＣ、ＵＳＡ）製のｐｍａｘＧＦＰ（ＣＡＧプロモーターによって駆動されるＧＦＰ）発現コンストラクトもトランスフェクトした。Ｋｖ８．２タンパク質は、ＫＣＮＶ２ウサギポリクローナル一次抗体（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ ＃ＨＰＡ０３１１３１、１：１００）及びロバ抗ウサギＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５５５二次抗体を使用して検出した。両方のＫＣＮＶ２発現プラスミドをトランスフェクトしたある特定のＡＲＰＥ１９細胞は、免疫蛍光によって検出可能なＫｖ８．２タンパク質を産生した（図３）。検出可能なＫｖ８．２タンパク質を有しなかった多くのＡＲＰＥ１９細胞によって示されるように、トランスフェクションレベルは低かった。Ｋｖ８．２タンパク質は、細胞膜及び細胞質に局在した。
【0136】
蛍光活性化単一細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）によるＣＡＧ発現コンストラクトの検証
ＨＥＫ２９３細胞に、３．５μｇのｐＣＡＧ－ＫＣＮＶ２ ＷＴまたはｐＣＡＧ－ＫＣＮＶ２ Ｏｐｔｉ発現コンストラクトをトランスフェクトし、４８時間後に回収した。ｐＣＭＶ－ＧＦＰ発現コンストラクトを対照として使用した。細胞を、Ｋｖ８．２一次抗体（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ ＃ＨＰＡ０３１１３１、１：１００）及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８抗ウサギ抗体を用いて懸濁液中で染色した。細胞集団を、非トランスフェクト対照に対してゲート処理した（図４）。ＷＴプラスミド中対コドン最適化プラスミド中のＫｖ８．２発現細胞の数には、４８時間で有意差はなかった（ｎ＝３の独立した実験）。
蛍光強度中央値（ＭＦＩ）を使用して、トランスフェクト細胞におけるＫｖ８，２タンパク質発現レベルを定量した。４８時間の時点で、ＫＣＮＶ２ ＷＴ発現コンストラクト対ＫＣＮＶ２ Ｏｐｔｉ発現コンストラクトにおけるＫｖ８．２／Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８染色細胞の蛍光中央値の間に有意差はなかった（ｎ＝３の独立した実験）。
ＨＥＫ２９３細胞に、３．５μｇのｐＣＡＧ－ＫＣＮＶ２ ＷＴまたはｐＣＡＧ－ＫＣＮＶ２ Ｏｐｔｉ発現コンストラクトをトランスフェクトし、４８時間後に回収した。ｐＣＭＶ－ＧＦＰ発現コンストラクトを対照として使用した。細胞を、Ｋｖ８．２一次抗体（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ ＃ＨＰＡ０３１１３１、１：１００）及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８抗ウサギ抗体を用いて懸濁液中で染色した。細胞集団を、非トランスフェクト対照に対してゲート処理した（図４）。ＷＴプラスミド中対コドン最適化プラスミド中のＫｖ８．２発現細胞の数には、４８時間で有意差はなかった（ｎ＝３の独立した実験）。
蛍光強度中央値（ＭＦＩ）を使用して、トランスフェクト細胞におけるＫｖ８，２タンパク質発現レベルを定量した。４８時間の時点で、ＫＣＮＶ２ ＷＴ発現コンストラクト対ＫＣＮＶ２ Ｏｐｔｉ発現コンストラクトにおけるＫｖ８．２／Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８染色細胞の蛍光中央値の間に有意差はなかった（ｎ＝３の独立した実験）。
【0137】
実施例３：ＡＲＰＥ１９細胞における発現コンストラクトのＡＡＶ形質導入
ＡＡＶ５ ＫＣＮＶ２ベクター（ＣＡＧ－ＫＣＮＶ２ ＷＴ、ＣＡＧ－ＫＣＮＶ２ Ｏｐｔｉ、ＲＫ－ＫＣＮＶ２ ＷＴ、及びＲＫ－ＫＣＮＶ２ Ｏｐｔｉ）を、２つの感染多重度（ＭＯＩ）（細胞あたり１Ｅ４ベクターゲノム（ＶＧ）及び細胞あたり１Ｅ５ ＶＧ）でチャンバースライド上のＡＲＰＥ１９細胞に形質導入して、２１日後に固定した。Ｋｖ８．２一次抗体及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５二次抗体で染色した細胞を、共焦点で画像化した。条件ごとに３つの画像（３つのウェルから）を撮影し、ＦＩＪＩで分析する前に盲検化した（Ｉｍａｇｅ Ｊ）。Ｋｖ８．２発現細胞のパーセントをＤＡＰＩに対してスコア化し、Ｋｖ８．２発現細胞の平均染色強度（積分密度）をＦＩＪＩで定量した（Ｉｍａｇｅ Ｊ）。
ＡＡＶ５ ＫＣＮＶ２ベクター（ＣＡＧ－ＫＣＮＶ２ ＷＴ、ＣＡＧ－ＫＣＮＶ２ Ｏｐｔｉ、ＲＫ－ＫＣＮＶ２ ＷＴ、及びＲＫ－ＫＣＮＶ２ Ｏｐｔｉ）を、２つの感染多重度（ＭＯＩ）（細胞あたり１Ｅ４ベクターゲノム（ＶＧ）及び細胞あたり１Ｅ５ ＶＧ）でチャンバースライド上のＡＲＰＥ１９細胞に形質導入して、２１日後に固定した。Ｋｖ８．２一次抗体及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５二次抗体で染色した細胞を、共焦点で画像化した。条件ごとに３つの画像（３つのウェルから）を撮影し、ＦＩＪＩで分析する前に盲検化した（Ｉｍａｇｅ Ｊ）。Ｋｖ８．２発現細胞のパーセントをＤＡＰＩに対してスコア化し、Ｋｖ８．２発現細胞の平均染色強度（積分密度）をＦＩＪＩで定量した（Ｉｍａｇｅ Ｊ）。
【0138】
ＣＡＧプロモーター発現ＡＡＶ（Ｏｐｔｉ及びＷＴ）は、Ｋｖ８．２発現細胞のパーセント及びＫｖ８．２染色強度レベルにおいて、ＲＫ（Ｏｐｔｉ及びＷＴ）よりも高いスコアを有していた。ＣＡＧ Ｏｐｔｉベクター及びＣＡＧ ＷＴベクターは、変動性は高かったが、いずれのＭＯＩにおいてもＫｖ８．２発現細胞において有意に異なる染色強度レベルを有しなかった。ＣＡＧ Ｏｐｔｉは、１Ｅ４条件において有意により多いＫｖ８．２陽性細胞を有していたが、１Ｅ５では有さなかった（図５）。
【0139】
実施例４：オルガノイドにおける発現コンストラクトのＡＡＶ形質導入
発現コンストラクトを用いたオルガノイドのＡＡＶ形質導入のための方法
網膜オルガノイドを９６ウェル低付着プレート（ウェルあたり１つのオルガノイド）に移し、網膜オルガノイドに、１４０日目に８つのＡＡＶ ＫＣＮＶ２コンストラクト（ＡＡＶ５ ＣＡＧ－ＫＣＮＶ２ ＷＴ、ＡＡＶ５ ＣＡＧ－ＫＣＮＶ２ Ｏｐｔｉ、ＡＡＶ５ ＲＫ－ＫＣＮＶ２ ＷＴ、ＡＡＶ５ ＲＫ－ＫＣＮＶ２ Ｏｐｔｉ、ＡＡＶ７ｍ８ ＣＡＧ－ＫＣＮＶ２ ＷＴ、ＡＡＶ７ｍ８ ＣＡＧ－ＫＣＮＶ２ Ｏｐｔｉ、ＡＡＶ７ｍ８ ＲＫ－ＫＣＮＶ２ ＷＴ、及びＡＡＶ７ｍ８ ＲＫ－ＫＣＮＶ２ Ｏｐｔｉ）のうちの１つを、合計１００μＬの培地中、オルガノイドあたり３Ｅ１１ウイルスゲノム（ＶＧ）の用量で形質導入した。翌日、オルガノイドを２４ウェル低付着プレートに移し、培地を３日後に交換した。形質導入のための網膜オルガノイドを、形態に基づいて選択した；透明な積層構造及び目に見える外節の刷子縁（図６）の存在を、固定及び免疫蛍光による分析のために選択した。内部ロゼット構造（光受容体が内部構造に存在する）を有するオルガノイドに、ｑＰＣＲ分析のために形質導入し、ｑＰＣＲ分析において、全オルガノイド由来のｍＲＮＡをアッセイした。
発現コンストラクトを用いたオルガノイドのＡＡＶ形質導入のための方法
網膜オルガノイドを９６ウェル低付着プレート（ウェルあたり１つのオルガノイド）に移し、網膜オルガノイドに、１４０日目に８つのＡＡＶ ＫＣＮＶ２コンストラクト（ＡＡＶ５ ＣＡＧ－ＫＣＮＶ２ ＷＴ、ＡＡＶ５ ＣＡＧ－ＫＣＮＶ２ Ｏｐｔｉ、ＡＡＶ５ ＲＫ－ＫＣＮＶ２ ＷＴ、ＡＡＶ５ ＲＫ－ＫＣＮＶ２ Ｏｐｔｉ、ＡＡＶ７ｍ８ ＣＡＧ－ＫＣＮＶ２ ＷＴ、ＡＡＶ７ｍ８ ＣＡＧ－ＫＣＮＶ２ Ｏｐｔｉ、ＡＡＶ７ｍ８ ＲＫ－ＫＣＮＶ２ ＷＴ、及びＡＡＶ７ｍ８ ＲＫ－ＫＣＮＶ２ Ｏｐｔｉ）のうちの１つを、合計１００μＬの培地中、オルガノイドあたり３Ｅ１１ウイルスゲノム（ＶＧ）の用量で形質導入した。翌日、オルガノイドを２４ウェル低付着プレートに移し、培地を３日後に交換した。形質導入のための網膜オルガノイドを、形態に基づいて選択した；透明な積層構造及び目に見える外節の刷子縁（図６）の存在を、固定及び免疫蛍光による分析のために選択した。内部ロゼット構造（光受容体が内部構造に存在する）を有するオルガノイドに、ｑＰＣＲ分析のために形質導入し、ｑＰＣＲ分析において、全オルガノイド由来のｍＲＮＡをアッセイした。
【0140】
オルガノイドを更に３週間培養し、その後、全オルガノイドの瞬間凍結（ｑＰＣＲ及びウエスタンブロット）または４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）中での４℃での３０分間の固定により回収した。次に、オルガノイドを標準的なリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で２回洗浄し、続いて３０％スクロースを含むＰＢＳ中に４℃にて一晩浸漬した。翌日、オルガノイドを最適な切断温度（ｏｐｔｉｍａｌ ｃｕｔｔｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ、ＯＣＴ）コンパウンドに包埋し、７μｍでの凍結切片化前に－８０℃で保存した。
【0141】
ＫＣＮＶ２ ＫＯオルガノイドの各形質導入について、同じクローン及び分化バッチからの非形質導入対照及びＷＴ（非ＣＲＩＳＰＲ編集）対照を含めた。
【0142】
光受容体細胞の最外層におけるＡＡＶ７ｍ８ ＫＣＮＶ２形質導入
ＡＡＶ形質導入の３週間後、ＫＣＮＶ２ ＫＯ網膜オルガノイドを切片化し、トランスジェニックＫＣＮＶ２タンパク質産物Ｋｖ８．２についてアッセイした。網膜オルガノイド全体の共焦点分析により、ＫＣＮＶ２ ＷＴ及びＫＣＮＶ２コドン最適化ベクターが、ともに光受容体最外層において発現したことが明らかになった（図７）。
ＡＡＶ形質導入の３週間後、ＫＣＮＶ２ ＫＯ網膜オルガノイドを切片化し、トランスジェニックＫＣＮＶ２タンパク質産物Ｋｖ８．２についてアッセイした。網膜オルガノイド全体の共焦点分析により、ＫＣＮＶ２ ＷＴ及びＫＣＮＶ２コドン最適化ベクターが、ともに光受容体最外層において発現したことが明らかになった（図７）。
【0143】
網膜内細胞のＡＡＶ７ｍ８ ＫＣＮＶ２形質導入
形質導入オルガノイド中の網膜内層には、検出可能なＫｖ８．２産物はほとんどなかった。双極性細胞マーカーＰＫＣａとの共染色により、Ｋｖ８．２染色ＰＫＣａ陽性双極性細胞が存在しないことが明らかになったが、ＷＴ網膜オルガノイドは、Ｋｖ８．２に対して免疫陽性のいくつかの網膜内細胞（図７の白い矢印）、おそらくアマクリン細胞、水平細胞または錐体双極細胞を有していた。対照的に、形質導入ＫＣＮＶ２ ＫＯ網膜オルガノイドは、ＣＡＧプロモーター含有ベクターにおける形質導入光受容体での高い発現にもかかわらず、Ｋｖ８．２陽性網膜内細胞をほとんど有さず（図８）、これはＡＡＶがこれらの層にアクセスできないこと及び／または光受容体細胞に対する優先的なベクター指向性を示している。
形質導入オルガノイド中の網膜内層には、検出可能なＫｖ８．２産物はほとんどなかった。双極性細胞マーカーＰＫＣａとの共染色により、Ｋｖ８．２染色ＰＫＣａ陽性双極性細胞が存在しないことが明らかになったが、ＷＴ網膜オルガノイドは、Ｋｖ８．２に対して免疫陽性のいくつかの網膜内細胞（図７の白い矢印）、おそらくアマクリン細胞、水平細胞または錐体双極細胞を有していた。対照的に、形質導入ＫＣＮＶ２ ＫＯ網膜オルガノイドは、ＣＡＧプロモーター含有ベクターにおける形質導入光受容体での高い発現にもかかわらず、Ｋｖ８．２陽性網膜内細胞をほとんど有さず（図８）、これはＡＡＶがこれらの層にアクセスできないこと及び／または光受容体細胞に対する優先的なベクター指向性を示している。
【0144】
網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞のＡＡＶ７ｍ８ ＫＣＮＶ２形質導入
色素性ＲＰＥ細胞及び光受容体は、同じ発生前駆細胞集団に由来する。インビボでは、ＲＰＥ単層は、網膜下空間の境界を画定する光受容体外節に隣接して存在する。網膜オルガノイド内のＲＰＥ細胞は、オルガノイドの外表面上にクラスターを形成して配置されている（図９、左パネル）。存在する場合、ＲＰＥ細胞には、ＡＡＶ５及び７ｍ８の両方が形質導入され、ＣＡＧ－ＫＣＶＮ２は、高レベルのＫｖ８．２タンパク質を発現した。ＲＫ－ＫＣＮＶ２は、おそらくＲＫプロモーターの光受容体特異性に起因して、ＲＰＥ細胞において検出可能なＫｖ８．２を発現しなかった。
色素性ＲＰＥ細胞及び光受容体は、同じ発生前駆細胞集団に由来する。インビボでは、ＲＰＥ単層は、網膜下空間の境界を画定する光受容体外節に隣接して存在する。網膜オルガノイド内のＲＰＥ細胞は、オルガノイドの外表面上にクラスターを形成して配置されている（図９、左パネル）。存在する場合、ＲＰＥ細胞には、ＡＡＶ５及び７ｍ８の両方が形質導入され、ＣＡＧ－ＫＣＶＮ２は、高レベルのＫｖ８．２タンパク質を発現した。ＲＫ－ＫＣＮＶ２は、おそらくＲＫプロモーターの光受容体特異性に起因して、ＲＰＥ細胞において検出可能なＫｖ８．２を発現しなかった。
【0145】
ミュラーグリア細胞のＡＡＶ７ｍ８ ＫＣＮＶ２形質導入
ミュラーグリア細胞は、網膜の全厚に跨り、構造上の支持を提供し、外境界膜及び内境界膜を形成する。ＲＰＥ細胞に加えて、ＣＲＡＬＢＰは、内顆粒層と外顆粒層に跨って外境界膜を形成していることが見られる網膜オルガノイドにおけるミュラーグリアのマーカーである。ＣＲＡＬＢＰとＫｖ８．２との共染色では、これら２つのマーカーの共染色は示されず、ＡＡＶ５及びＡＡＶ７ｍ８が、ミュラーグリア細胞において導入遺伝子を形質導入及び／または発現することを示唆している（図１０）。
ミュラーグリア細胞は、網膜の全厚に跨り、構造上の支持を提供し、外境界膜及び内境界膜を形成する。ＲＰＥ細胞に加えて、ＣＲＡＬＢＰは、内顆粒層と外顆粒層に跨って外境界膜を形成していることが見られる網膜オルガノイドにおけるミュラーグリアのマーカーである。ＣＲＡＬＢＰとＫｖ８．２との共染色では、これら２つのマーカーの共染色は示されず、ＡＡＶ５及びＡＡＶ７ｍ８が、ミュラーグリア細胞において導入遺伝子を形質導入及び／または発現することを示唆している（図１０）。
【0146】
実施例５：ＡＡＶ７ｍ８ ＫＣＮＶ２形質導入細胞におけるＫｖ８．２の局在
光受容体内節におけるＫｖ８．２の局在
内因性ＫＣＮＶ２（Ｋｖ８．２）タンパク質は、杆体及び錐体の内節の原形質膜で発現し、外節では発現しないと報告されている。光受容体タンパク質を正しい細胞内コンパートメントに輸送することは、その機能にとって重要であり、誤って折りたたまれたタンパク質の誤った輸送が、多くの遺伝性網膜変性障害の病原性の根底にある。
光受容体内節におけるＫｖ８．２の局在
内因性ＫＣＮＶ２（Ｋｖ８．２）タンパク質は、杆体及び錐体の内節の原形質膜で発現し、外節では発現しないと報告されている。光受容体タンパク質を正しい細胞内コンパートメントに輸送することは、その機能にとって重要であり、誤って折りたたまれたタンパク質の誤った輸送が、多くの遺伝性網膜変性障害の病原性の根底にある。
【0147】
形質導入網膜オルガノイドをロドプシンで染色したところ、膜性外節構造に正確に局在することが見出された。トランスジェニックｋｖ８．２（７ｍ８ ＣＡＧ－ＷＴ及び７ｍ８ ＣＡＧ－Ｏｐｔｉ）は、光受容体細胞体の内節（ＩＳ）及び原形質膜に局在することが見出された（図１１）。Ｋｖ８．２染色は、外節（ＯＳ）には存在しなかった。これは、ＷＴ及びコドン最適化ベクターの両方から産生されたタンパク質が、翻訳後に適切に輸送されることを示唆する。
【0148】
ＡＡＶ７ｍ８ ＫＣＮＶ２形質導入細胞におけるＫｖ８．２とＫｖ２．１の共局在
ＫＣＶＮ２遺伝子産物Ｋｖ８．２は、網膜におけるカリウムチャネルサブユニットＫｖ２．１と相互作用する。Ｋｖ８．２は、サイレントＫｖチャネルサブユニットであり、従って、より大きなＫｖチャネルサブユニットとのその相互作用を介してのみ機能することができる。ＷＴ網膜オルガノイドにおいて、ａＫｖ２．１抗体は、錐体内節（エリプソイド領域）においてより強いシグナルで光受容体内節を明確に標識した（図１２）。内因性Ｋｖ８．２タンパク質（図１２）は、Ｋｖ２．１と共局在する桿体及び錐体内節に存在した。Ｋｖ８．２が存在しないＫＯ網膜オルガノイドでは、Ｋｖ２．１染色の内節エリプソイドパターンが光受容体で検出される。ＡＡＶ由来Ｋｖ８．２タンパク質（ＷＴベクター及びコドン最適化ベクターの両方）も、形質導入網膜オルガノイドの光受容体内節構造において発現し、両方の導入遺伝子がタンパク質に翻訳され、正しい細胞内コンパートメントに効率的に輸送されることが示された（図１２）。
ＫＣＶＮ２遺伝子産物Ｋｖ８．２は、網膜におけるカリウムチャネルサブユニットＫｖ２．１と相互作用する。Ｋｖ８．２は、サイレントＫｖチャネルサブユニットであり、従って、より大きなＫｖチャネルサブユニットとのその相互作用を介してのみ機能することができる。ＷＴ網膜オルガノイドにおいて、ａＫｖ２．１抗体は、錐体内節（エリプソイド領域）においてより強いシグナルで光受容体内節を明確に標識した（図１２）。内因性Ｋｖ８．２タンパク質（図１２）は、Ｋｖ２．１と共局在する桿体及び錐体内節に存在した。Ｋｖ８．２が存在しないＫＯ網膜オルガノイドでは、Ｋｖ２．１染色の内節エリプソイドパターンが光受容体で検出される。ＡＡＶ由来Ｋｖ８．２タンパク質（ＷＴベクター及びコドン最適化ベクターの両方）も、形質導入網膜オルガノイドの光受容体内節構造において発現し、両方の導入遺伝子がタンパク質に翻訳され、正しい細胞内コンパートメントに効率的に輸送されることが示された（図１２）。
【0149】
実施例６：ＡＡＶ形質導入後のレスキュー及び毒性の評価：
網膜全体のＴＵＮＥＬ反応性の増加が、１、３及び６か月齢のＫＣＮＶ２ ＫＯマウスモデルにおいて報告されており、ｍｍ２あたりの錐体細胞数がＷＴの８０％に減少したことが６か月齢で報告されている。本発明者らの胎児期ＫＣＮＶ２ ＫＯ網膜細胞モデルが形質導入時にこれらの表現型を再現するかどうかを決定するため、及び任意のベクター関連細胞毒性を評価するために、ＴＵＮＥＬ反応性及び錐体細胞数を、ＷＴ対ＫＯオルガノイド及び全てのＡＡＶベクターを形質導入されたＫＯオルガノイドにおいて測定した。
網膜全体のＴＵＮＥＬ反応性の増加が、１、３及び６か月齢のＫＣＮＶ２ ＫＯマウスモデルにおいて報告されており、ｍｍ２あたりの錐体細胞数がＷＴの８０％に減少したことが６か月齢で報告されている。本発明者らの胎児期ＫＣＮＶ２ ＫＯ網膜細胞モデルが形質導入時にこれらの表現型を再現するかどうかを決定するため、及び任意のベクター関連細胞毒性を評価するために、ＴＵＮＥＬ反応性及び錐体細胞数を、ＷＴ対ＫＯオルガノイド及び全てのＡＡＶベクターを形質導入されたＫＯオルガノイドにおいて測定した。
【0150】
ＡＡＶ形質導入オルガノイドにおけるＴＵＮＥＬ反応性
ＴＵＮＥＬは、アポトーシス中に生成される二本鎖ＤＮＡ切断における３’－ヒドロキシル末端を標識することによってＤＮＡ断片化を検出するための方法である。網膜オルガノイド凍結切片におけるＴＵＮＥＬ反応性を、ＫＣＮＶ２ ＫＯ形質導入オルガノイド対非形質導入対照及びＷＴにおいて評価した。
ＴＵＮＥＬは、アポトーシス中に生成される二本鎖ＤＮＡ切断における３’－ヒドロキシル末端を標識することによってＤＮＡ断片化を検出するための方法である。網膜オルガノイド凍結切片におけるＴＵＮＥＬ反応性を、ＫＣＮＶ２ ＫＯ形質導入オルガノイド対非形質導入対照及びＷＴにおいて評価した。
【0151】
図１３Ａは、形質導入３週間後の、ＡＡＶ５ ＣＡＧ－ＫＣＮＶ２－Ｏｐｔｉ処理網膜オルガノイド（クローンＫ２８）のＴＵＮＥＬ染色を示す。ＴＵＮＥＬ陽性細胞は主にオルガノイドの中心（破線）に認められ、網膜細胞層（ＯＮＬ、ＩＮＬ）にはＴＵＮＥＬ陽性細胞が存在しないか、または非常にわずかであった。ＷＴと比較してＫＣＮＶ２ ＫＯ光受容体のＴＵＮＥＬ反応性の増加はなく、このモデルのこの時点では「インビトロ」網膜変性が起こっていないことを示唆している。
【0152】
２つのＡＡＶ血清型のいずれも、ＷＴまたはコドン最適化導入遺伝子によりＯＮＬまたはＩＮＬにおいて有意なレベルのＴＵＮＥＬ陽性細胞を引き起こさなかった（図１３ｂ及び１３ｃ）。このことは、試験したＡＡＶ血清型及び過剰発現トランスジェニックタンパク質が網膜細胞に対して細胞傷害性ではないことを示唆している。オルガノイドの中心にＴＵＮＥＬ陽性細胞が存在することは、他のＨＩＰＳＣ網膜オルガノイドモデルでも広く報告されており、網膜オルガノイドの中心の低酸素及び／またはその中心の細胞への不十分な栄養伝達による可能性が最も高い。
【0153】
ＡＡＶ形質導入オルガノイドにおけるクローン細胞数
ＫＣＮＶ２ ＫＯマウスは、６か月齢でＷＴレベルの８０％までの錐体細胞の軽度の喪失を示す。この表現型がヒト胎児期の網膜オルガノイドで再現されるかどうかを判定するために、ＷＴ網膜オルガノイド及びＫＣＮＶ２ ＫＯ網膜オルガノイドにおける網膜組織１００μｍあたりの錐体細胞を免疫蛍光によって定量した。Ｌ／Ｍオプシン陽性錐体細胞数を、倍率４０倍で撮影したオルガノイド全体のタイルスキャン（７μｍ網膜凍結切片）から計数し、網膜組織の全長に対して正規化した。合計１２のＷＴ網膜オルガノイド及び８の未処理ＫＯ網膜オルガノイドの平均錐体細胞数を計数した。ＷＴと比較して、ＫＣＮＶ２ ＫＯ細胞株では錐体細胞数の有意な増加があった（図１４）。形質導入網膜オルガノイド（すべてのベクターをｎ＝３０に群分け）では、ＷＴオルガノイドと形質導入オルガノイドの間に統計的有意差は示されなかったが（ｐ＝０．２）、非形質導入ＫＯと比較して有意な減少が示された（ｐ＝０．０２）。
ＫＣＮＶ２ ＫＯマウスは、６か月齢でＷＴレベルの８０％までの錐体細胞の軽度の喪失を示す。この表現型がヒト胎児期の網膜オルガノイドで再現されるかどうかを判定するために、ＷＴ網膜オルガノイド及びＫＣＮＶ２ ＫＯ網膜オルガノイドにおける網膜組織１００μｍあたりの錐体細胞を免疫蛍光によって定量した。Ｌ／Ｍオプシン陽性錐体細胞数を、倍率４０倍で撮影したオルガノイド全体のタイルスキャン（７μｍ網膜凍結切片）から計数し、網膜組織の全長に対して正規化した。合計１２のＷＴ網膜オルガノイド及び８の未処理ＫＯ網膜オルガノイドの平均錐体細胞数を計数した。ＷＴと比較して、ＫＣＮＶ２ ＫＯ細胞株では錐体細胞数の有意な増加があった（図１４）。形質導入網膜オルガノイド（すべてのベクターをｎ＝３０に群分け）では、ＷＴオルガノイドと形質導入オルガノイドの間に統計的有意差は示されなかったが（ｐ＝０．２）、非形質導入ＫＯと比較して有意な減少が示された（ｐ＝０．０２）。
【0154】
実施例７：形質導入オルガノイドにおけるトランスジェニックＫＣＮＶ２ ｍＲＮＡ及びＫｖ８．２タンパク質の定量的評価。
形質導入オルガノイドにおけるＫＣＮＶ２ ｍＲＮＡレベルのｑＰＣＲ評価
ベクター駆動型導入遺伝子発現の定量的比較をｑＰＣＲによって行った。ＫＣＮＶ２ ｍＲＮＡ発現レベルを、ＲＫまたはＣＡＧプロモーターによって駆動され、ＡＡＶ２／５またはＡＡＶ２／７ｍ８のいずれかによって送達される、ＷＴ及びコドン最適化バージョンのＫＣＮＶ２遺伝子を形質導入されたＫＣＮＶ２ ＫＯオルガノイドにおいて評価した。クローンＫ１２、Ｋ５及びＫ２８からの形質導入オルガノイド全体を、瞬間凍結により形質導入の２１日後に回収した。ＲＮＡを抽出し、ＤＮＡｓｅ処理し、ＳＯＰ（ＰＲＣＬ－ＳＯＰ－ＲＮＡ精製ｃＤＮＡ合成）に従って０．１μｇのＲＮＡからｃＤＮＡを作製した。遺伝子発現レベルを内因性ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨ及びβアクチンに対して正規化し、ΔΔＣＴ法を使用して相対発現を決定した。
形質導入オルガノイドにおけるＫＣＮＶ２ ｍＲＮＡレベルのｑＰＣＲ評価
ベクター駆動型導入遺伝子発現の定量的比較をｑＰＣＲによって行った。ＫＣＮＶ２ ｍＲＮＡ発現レベルを、ＲＫまたはＣＡＧプロモーターによって駆動され、ＡＡＶ２／５またはＡＡＶ２／７ｍ８のいずれかによって送達される、ＷＴ及びコドン最適化バージョンのＫＣＮＶ２遺伝子を形質導入されたＫＣＮＶ２ ＫＯオルガノイドにおいて評価した。クローンＫ１２、Ｋ５及びＫ２８からの形質導入オルガノイド全体を、瞬間凍結により形質導入の２１日後に回収した。ＲＮＡを抽出し、ＤＮＡｓｅ処理し、ＳＯＰ（ＰＲＣＬ－ＳＯＰ－ＲＮＡ精製ｃＤＮＡ合成）に従って０．１μｇのＲＮＡからｃＤＮＡを作製した。遺伝子発現レベルを内因性ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨ及びβアクチンに対して正規化し、ΔΔＣＴ法を使用して相対発現を決定した。
【0155】
ＡＡＶ５－ＲＫ－コドン最適化ＫＣＮＶ２、ＡＡＶ５－ＣＡＧ－コドン最適化ＫＣＮＶ２、またはＡＡＶ７ｍ８－ＣＡＧ－コドン最適化ＫＣＮＶ２のいずれかを受けた網膜オルガノイドと比較して、ＡＡＶ７ｍ８－ＲＫ－コドン最適化ＫＣＮＶ２を形質導入された網膜オルガノイドにおいて、最も高いレベルのＫＣＮＶ２－Ｏｐｔｉ発現が観察された（図１５ａ）。
【0156】
ＡＡＶ７ｍ８－ＣＡＧ－ＷＴ ＫＣＮＶ２を形質導入されたオルガノイドにおいて、最も高いレベルのベクター由来ＫＣＮＶ２ ＷＴ ｍＲＮＡが観察された。ＡＡＶ７ｍ８－ＣＡＧ－ＷＴ ＫＣＮＶ２で処理したオルガノイドにおけるＫＣＮＶ２発現は、非形質導入ＫＣＮＶ２ ＫＯ対照より約１３８倍高く（図９ｂ）、ＡＡＶ７ｍ８－ＲＫ－ＷＴ ＫＣＮＶ２は、非形質導入対照より約８６倍高かった。ＣＡＧプロモーターまたはＲＫプロモーターのいずれかの制御下で、ＡＡＶ５とともに送達されたＫＣＮＶ２ ＷＴ遺伝子の異なるバージョンを形質導入された網膜オルガノイドは、非形質導入対照より約１０倍高かった（図１５Ｂ）。
【0157】
全体として、ＡＡＶ２－７ｍ８は、網膜オルガノイドにおける光受容体の形質導入においてＡＡＶ５よりも有効であることが見出された。興味深いことに、光受容体特異的ＲＫプロモーターまたは構成的ＣＡＧプロモーターによって駆動されるベクターにおいて、ＷＴ ＫＣＮＶ２ ｍＲＮＡまたはＯｐｔｉ ＫＣＮＶ２ ｍＲＮＡのいずれにおいても有意差はなかった。
【0158】
免疫蛍光によって評価した、形質導入オルガノイドにおけるＫｖ８．２タンパク質レベル。
Ｋｖ８．２タンパク質レベルは、形質導入オルガノイドの外顆粒層で発現した（図７、図１６Ｂを参照のこと）。ベクター間の相対的累積タンパク質レベルを決定するために、オルガノイド凍結切片をＫｖ８．２抗体で染色し、ＯＮＬの総累積蛍光（生の積分密度）をＦＩＪＩで定量し（Ｉｍａｇｅ Ｊ）、測定された総ＯＮＬ面積に対して正規化した。図１６は、同じブロックに包埋され、同じ日に画像化されたＷＴオルガノイドのパーセンテージとして表される総蛍光を示す。７ｍ８キャプシド及びＡＡＶ５キャプシドの両方において、ＣＡＧプロモーターとＲＫプロモーターとの間の総蛍光に有意差があった（それぞれｐ＝０．０３１及び０．０２８、両側、対応のあるスチューデントｔ検定）。コドン最適化（Ｏｐｔｉ）ベクターでは蛍光強度が増加する傾向があるにもかかわらず、ＣＡＧまたはＲＫプロモーターを含むベクターではＷＴとＯｐｔｉの間に有意差はなかった。
Ｋｖ８．２タンパク質レベルは、形質導入オルガノイドの外顆粒層で発現した（図７、図１６Ｂを参照のこと）。ベクター間の相対的累積タンパク質レベルを決定するために、オルガノイド凍結切片をＫｖ８．２抗体で染色し、ＯＮＬの総累積蛍光（生の積分密度）をＦＩＪＩで定量し（Ｉｍａｇｅ Ｊ）、測定された総ＯＮＬ面積に対して正規化した。図１６は、同じブロックに包埋され、同じ日に画像化されたＷＴオルガノイドのパーセンテージとして表される総蛍光を示す。７ｍ８キャプシド及びＡＡＶ５キャプシドの両方において、ＣＡＧプロモーターとＲＫプロモーターとの間の総蛍光に有意差があった（それぞれｐ＝０．０３１及び０．０２８、両側、対応のあるスチューデントｔ検定）。コドン最適化（Ｏｐｔｉ）ベクターでは蛍光強度が増加する傾向があるにもかかわらず、ＣＡＧまたはＲＫプロモーターを含むベクターではＷＴとＯｐｔｉの間に有意差はなかった。
【0159】
実施例８：形質導入網膜オルガノイドにおけるＫｖ８．２及びＫｖ２．１の共局在。
免疫蛍光法によって評価したＫｖ８．２及びＫｖ２．１の相対共局在
Ｋｖ８．２は、電位依存性カリウムチャネルＫｖ２．１とヘテロマーを形成することによって網膜内で機能する。定性的分析により、ベクター由来Ｋｖ８．２と内因性Ｋｖ２．１が光受容体内節に共局在することが明らかになった（図１２）。回復したＫｖ８．２の相対レベルを決定するために、定量的免疫蛍光分析及び共局在分析を行った。７ｕｍオルガノイド凍結切片をＫｖ８．２及びＫｖ２．１で共染色し、オルガノイド切片全体を倍率４０倍で画像化し、その後ＬＳＭソフトウェアでマージしてオルガノイド全体のタイルスキャンを作成し、これをＦＩＪＩ画像解析ソフトウェアにエクスポートした。１ベクターあたりｎ＝３～５個のオルガノイドのタイルスキャンを取得し、ＦＩＪＩ（Ｉｍａｇｅ Ｊ）で分析した。Ｋｖ．２．１とＫｖ８．２の両チャネルでしきい値を超えるピクセルを決定するために、「ｉｍａｇｅ ｃａｌｃｕｌａｔｅ＞ａｎｄ」関数を使用して、内節領域の総共局在面積を決定した。この値は、様々な網膜オルガノイドのサイズを考慮して、関心領域の長さに正規化した。
免疫蛍光法によって評価したＫｖ８．２及びＫｖ２．１の相対共局在
Ｋｖ８．２は、電位依存性カリウムチャネルＫｖ２．１とヘテロマーを形成することによって網膜内で機能する。定性的分析により、ベクター由来Ｋｖ８．２と内因性Ｋｖ２．１が光受容体内節に共局在することが明らかになった（図１２）。回復したＫｖ８．２の相対レベルを決定するために、定量的免疫蛍光分析及び共局在分析を行った。７ｕｍオルガノイド凍結切片をＫｖ８．２及びＫｖ２．１で共染色し、オルガノイド切片全体を倍率４０倍で画像化し、その後ＬＳＭソフトウェアでマージしてオルガノイド全体のタイルスキャンを作成し、これをＦＩＪＩ画像解析ソフトウェアにエクスポートした。１ベクターあたりｎ＝３～５個のオルガノイドのタイルスキャンを取得し、ＦＩＪＩ（Ｉｍａｇｅ Ｊ）で分析した。Ｋｖ．２．１とＫｖ８．２の両チャネルでしきい値を超えるピクセルを決定するために、「ｉｍａｇｅ ｃａｌｃｕｌａｔｅ＞ａｎｄ」関数を使用して、内節領域の総共局在面積を決定した。この値は、様々な網膜オルガノイドのサイズを考慮して、関心領域の長さに正規化した。
【0160】
ＷＴ（ＣＴＲ）と未処理ＫＣＮＶ２ ＫＯオルガノイドとの間には有意差があった（図１６）。７ｍ８ ＣＡＧ－ＷＴ及び７ｍ８ ＣＡＧ－Ｏｐｔｉで処理したオルガノイドでは、平均共局在面積が増加する傾向があったが、その差異は有意には達しなかった（一元配置ＡＮＯＶＡ、ダネットの多重比較検定）。７ｍ８ ＲＫ－ＷＴ及びＲＫ－Ｏｐｔｉの平均共局在面積は未処理と同様であり、この方法で検出可能なベクター由来Ｋｖ８．２発現が欠如していることを示していた。
【0161】
近接ライゲーションアッセイによって評価したＫｖ８．２及びＫｖ２．１の共局在性及び近接性
カリウムチャネルサブユニットＫｖ８．２とＫｖ２．１との間の光受容体におけるタンパク質－タンパク質相互作用を評価するために、近接ライゲーションアッセイ（ＰＬＡ）を開発した。形質導入ＫＣＮＶ２ ＫＯ網膜オルガノイドを、ＷＴ（陽性対照）及び非形質導入ＫＯ（陰性対照）とともに固定し、凍結切片用の同じブロック上のＯＣＴに包埋した。７μｍの凍結切片を、Ｋｖ８．２（ウサギ）及びＫｖ２．１（マウス）抗体、ならびにウサギ及びマウスのＰＬＡプラス及びマイナスプローブで共染色した。ライゲーション及び増幅ステップ（ｄｕｏ ｌｉｎｋ－オレンジ）の後、外顆粒層のＰＬＡ涙点を共焦点顕微鏡により倍率６３倍で視覚化した。オルガノイドを全体として観察すると、光受容体細胞層の位置、具体的には光受容体内節が位置する場所に、明らかにＰＬＡシグナルが集中していた（図１８Ａ）。これにより、予想される細胞型及び細胞内コンパートメントにおけるｋｖ．８．２／Ｋｖ２．１相互作用の特異性が確認される。さらに、特異性は、ＫＣＮＶ２ ＫＯ網膜オルガノイドのＯＮＬにおけるシグナルの有意な減少によって確認された（図１８Ｂ、１８Ｃ）。ＰＬＡシグナルの定量により、同じスライド上で処理されたＷＴオルガノイドと比較して、ＫＣＮＶ２ ＫＯクローン（Ｋ２８及びＫ１２）におけるＯＮＬの面積あたりのＰＬＡ涙点数の有意な減少が明らかになった（図１８Ｃ）。
カリウムチャネルサブユニットＫｖ８．２とＫｖ２．１との間の光受容体におけるタンパク質－タンパク質相互作用を評価するために、近接ライゲーションアッセイ（ＰＬＡ）を開発した。形質導入ＫＣＮＶ２ ＫＯ網膜オルガノイドを、ＷＴ（陽性対照）及び非形質導入ＫＯ（陰性対照）とともに固定し、凍結切片用の同じブロック上のＯＣＴに包埋した。７μｍの凍結切片を、Ｋｖ８．２（ウサギ）及びＫｖ２．１（マウス）抗体、ならびにウサギ及びマウスのＰＬＡプラス及びマイナスプローブで共染色した。ライゲーション及び増幅ステップ（ｄｕｏ ｌｉｎｋ－オレンジ）の後、外顆粒層のＰＬＡ涙点を共焦点顕微鏡により倍率６３倍で視覚化した。オルガノイドを全体として観察すると、光受容体細胞層の位置、具体的には光受容体内節が位置する場所に、明らかにＰＬＡシグナルが集中していた（図１８Ａ）。これにより、予想される細胞型及び細胞内コンパートメントにおけるｋｖ．８．２／Ｋｖ２．１相互作用の特異性が確認される。さらに、特異性は、ＫＣＮＶ２ ＫＯ網膜オルガノイドのＯＮＬにおけるシグナルの有意な減少によって確認された（図１８Ｂ、１８Ｃ）。ＰＬＡシグナルの定量により、同じスライド上で処理されたＷＴオルガノイドと比較して、ＫＣＮＶ２ ＫＯクローン（Ｋ２８及びＫ１２）におけるＯＮＬの面積あたりのＰＬＡ涙点数の有意な減少が明らかになった（図１８Ｃ）。
【0162】
形質導入網膜オルガノイドにおけるＰＬＡシグナルの定量
ＡＡＶベクターを形質導入されたＫＣＮＶ２ ＫＯ網膜オルガノイドは、ＫＣＮＶ２ ｍＲＮＡ及びＫｖ８．２タンパク質を発現する。ベクター由来の翻訳タンパク質の機能は、電位依存性カリウムチャネルｋｖ２．１とヘテロマーを形成する能力に依存する。ベクター由来のＫＣＮＶ２転写物及びタンパク質中のＫｖ８．２の総量を評価することに加えて、ＰＬＡを使用してＫｖ２．１との相互作用の程度を評価した。
ＡＡＶベクターを形質導入されたＫＣＮＶ２ ＫＯ網膜オルガノイドは、ＫＣＮＶ２ ｍＲＮＡ及びＫｖ８．２タンパク質を発現する。ベクター由来の翻訳タンパク質の機能は、電位依存性カリウムチャネルｋｖ２．１とヘテロマーを形成する能力に依存する。ベクター由来のＫＣＮＶ２転写物及びタンパク質中のＫｖ８．２の総量を評価することに加えて、ＰＬＡを使用してＫｖ２．１との相互作用の程度を評価した。
【0163】
クローン株由来の８つの示されたベクターのうちの１つで形質導入されたＫＣＮＶ２ ＫＯオルガノイドを、ＷＴ（陽性対照）及び非形質導入ＫＣＮＶ２ ＫＯオルガノイド（陰性対照）と同じ凍結保存組織ブロックに包埋して、実験をＫＣＮＶ２ ＫＯクローン細胞株Ｋ１２及びＫ２８で繰り返した。上記のように、７μｍの凍結切片を、Ｋｖ８．２（ウサギ）及びＫｖ２．１（マウス）抗体、ならびにウサギ及びマウスのＰＬＡプラス及びマイナスプローブで共染色した。倍率６３倍での最大強度ｚ投影を使用して、視野ごとのＰＬＡ涙点を定量した。各ｚ投影は１００～１５０個の光受容体細胞を捕捉し、１７個（非形質導入）～５５０個の間の涙点（最大シグナル）を含んでいた。Ｋｖ８．２抗体力価を１００分の１から４００分の１に低下させて、ＰＬＡ涙点の合体を伴わないでシグナルを最大化した。図１９は、ＡＡＶ２／５及びＡＡＶ７ｍ８キャプシドの両方で形質導入されたＫＣＮＶ２ ＫＯクローンＫ１２対ＷＴ及び非形質導入からの代表的な最大強度投影を示す。ＰＬＡ涙点は、非形質導入オルガノイドと比較して形質導入オルガノイドにおいて豊富であり、シグナル周波数は光受容体内節の領域の頂端において最も高かった。ＯＮＬ中の涙点を、ＦＩＪＩ（Ｉｍａｇｅ Ｊ）「ａｎａｌｙｓｅ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ」関数を使用して定量した。ＯＮＬサイズの領域差により、測定されたＯＮＬ面積に対するシグナルの正規化が必要になった。
【0164】
ＰＬＡ涙点数に対するＡＡＶ形質導入の有意な効果があった（Ｐ＞０．００１、一元配置ＡＮＯＶＡ）、個々の比較により、すべてのベクターが非形質導入よりも有意に高いシグナルを生成したことが示された（図２０Ａ及び２０Ｂ）。ＣＡＧ ＷＴベクターは、ＲＫ ＷＴベクターよりも有意に高いＰＬＡシグナルを生成した（Ｋ１２ ｐ＝０．０２、Ｋ２８ Ｐ＝０．０１）が、ＣＡＧ ＯｐｔｉベクターとＲＫ Ｏｐｔｉベクターとの間に有意差はなかった（Ｋ１２ ｐ＝０．１７、Ｋ２８ ｐ＝０．７７）。両方のクローンにおいて、７ｍ８ ＲＫ Ｗｔと７ｍ８ ＲＫ Ｏｐｔｉの間に有意差があった（Ｋ１２ ｐ＜０．０００１、Ｋ２８ ｐ＞０．０１）。
【0165】
ＫＣＮＶ２ ＫＯ光受容体におけるより高いＰＬＡシグナルは、より高い機能的タンパク質レベルの指標である。クローンＫ１２における７ｍ８ ＲＫ－ＷＴを除き、すべての７ｍ８ベクターにおいて、シグナルはＷＴレベルと有意に異ならなかった。
【0166】
これは、すべての７ｍ８ベクターが、機能的Ｋｖ２．１／Ｋｖ８．２ヘテロマーのＷＴレベルへの回復が可能になる十分な有効性で、ＫＣＮＶ２をヒト光受容体細胞に送達することができることを示す。
【0167】
【表1-1】
【表1-2】
【表1-3】
【表1-4】
【表1-5】
【表1-6】
【表1-7】
【表1-8】
【表1-9】
【表1-10】
【表1-11】
【表1-12】
【表1-13】
【表1-14】
【表1-15】
【表1-16】
【表1-17】
【表1-18】
【表1-19】
【表1-20】
【表1-21】
【表1-22】
【表1-23】
【表1-24】
【表1-25】
【表1-26】
【表1-27】
【表1-28】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13A】
【図13B】
【図13C】
【図14】
【図15】
【図16A】
【図16B】
【図17】
【図18A】
【図18B】
【図18C】
【図19】
【図20】
【配列表】
【国際調査報告】