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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-07-12
(54)【発明の名称】組換えタンパク質を生産する新規システム
(51)【国際特許分類】
C12N 15/74 20060101AFI20240705BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240705BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20240705BHJP
C12Q 1/37 20060101ALI20240705BHJP
C12N 15/57 20060101ALI20240705BHJP
C12N 15/31 20060101ALI20240705BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20240705BHJP
【ＦＩ】
C12N15/74 Z
C12N1/21 ZNA
C12N15/62 Z
C12Q1/37
C12N15/57
C12N15/31
C12P21/02 C
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024501852
(86)(22)【出願日】2022-06-28
(85)【翻訳文提出日】2024-03-11
(86)【国際出願番号】 EP2022067738
(87)【国際公開番号】W WO2023285135
(87)【国際公開日】2023-01-19
(31)【優先権主張番号】102021000018254
(32)【優先日】2021-07-12
(33)【優先権主張国・地域又は機関】IT
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522021848
【氏名又は名称】ネミシス リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110001416
【氏名又は名称】弁理士法人信栄事務所
(72)【発明者】
【氏名】カヴァレッティ，リンダ
(72)【発明者】
【氏名】カレンジ，ジャコモ エンリコ
(72)【発明者】
【氏名】コルマネク，ジャン
(72)【発明者】
【氏名】ホメロバ，ダグマー
【テーマコード（参考）】
4B063
4B064
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B063QQ02
4B063QR75
4B063QR80
4B064CA02
4B064CA04
4B064CA19
4B064CC24
4B065AA01X
4B065AA50X
4B065AA50Y
4B065AB01
4B065BA02
4B065BD50
(57)【要約】
本発明は、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）宿主株で組換えタンパク質を生産するための新規システムに関する。この新規システムには、特にアクチノアロムルス（Ａｃｔｉｎｏａｌｌｏｍｕｒｕｓ）エンドペプチダーゼの生産のためのベクターおよび新規組換え宿主株が含まれる。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）宿主細胞における組換えタンパク質の異種発現のための組換えベクターであって、プロモーター、調節エレメント、および前記プロモーターと前記調節エレメントに作動可能に連結された組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットを有し、
－ 前記プロモーターは、配列番号１０の配列を有する人工ｋａｓＯプロモーター（ｋａｓＯｐ＊）であり；
－ 前記調節エレメントは、配列番号１１の配列を有する最適化された合成ＳＲ４０リボソーム結合部位（ＲＢＳ）であり；
－ 目的の組換えタンパク質をコードする前記ポリヌクレオチドは、Ｎ末端のシグナルペプチドを含む組換えタンパク質をコードし；かつ、
－ 前記組換えベクターは、シングルサイト組み込みベクターである、
組換えベクター。
【請求項2】
前記組換えタンパク質が、配列番号１を含む配列もしくは配列番号１からなる配列のアクチノアロムルスエンドペプチダーゼ；Ｅ４０の生物学的に活性な断片；Ｅ４０の天然に存在する対立遺伝子バリアント；または配列番号１に対して少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％もしくは９５％の同一性を有する配列のエンドペプチダーゼである、請求項１に記載の組換えベクター。
【請求項3】
前記組換えタンパク質が、配列番号２を含む配列のヒスチジン標識アクチノアロムルスエンドペプチダーゼである、請求項２に記載の組換えベクター。
【請求項4】
前記シグナルペプチドが、配列番号１２の配列を有するストレプトミセスベネズエラエのスブチリシンインヒビターのＶｓｉシグナルペプチドである、請求項１または２に記載の組換えベクター。
【請求項5】
組換えタンパク質をコードする前記ポリヌクレオチドが、配列番号５、６、１５、１６、１７または１８の配列を含む配列である、請求項１～４のいずれか一項に記載の組換えベクター。
【請求項6】
前記発現カセットが、配列番号２０、２１、２２または２３の配列を有する、請求項１～４のいずれか一項に記載の組換えベクター。
【請求項7】
ストレプトミセスのａｔｔＢ部位に組み込まれるベクターである、請求項１～６のいずれか一項に記載の組換えベクター。
【請求項8】
配列番号２５、２６、２７または２８の配列のベクターである、請求項７に記載の発現ベクター。
【請求項9】
請求項１～８に記載の発現ベクターを含む組換えタンパク質の異種発現のためのストレプトミセス宿主細胞、好ましくはＳ．リビダンス宿主細胞。
【請求項10】
ＴＫ２４株またはＲｅｄＳｔｒｅｐ１．３、１．６もしくは１．９株のＳ．リビダンス宿主細胞である、請求項９に記載の宿主細胞。
【請求項11】
ＤＳＭ３３９３０株またはＤＳＭ３３９３１株のＳ．リビダンス宿主細胞である、請求項９に記載の宿主細胞。
【請求項12】
組換えタンパク質を生産するための請求項１～８に記載の組換えベクターまたは請求項９～１１に記載の宿主細胞の使用であって、前記組換えタンパク質が宿主細胞の培地中に分泌される使用。
【請求項13】
組換えタンパク質を生産する方法であって、以下の工程を含む方法：ｉ）請求項１～８に記載の組換え発現ベクターを含む組換え宿主細胞を提供する工程；
ｉｉ）増殖に適した条件下の培地中で組換え宿主細胞を培養する工程；
ｉｉｉ）組換え宿主細胞によって発現した組換えタンパク質を培地から回収する工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）宿主株で組換えタンパク質を生産するための新規システムに関する。
【0002】
この新規システムには、特にアクチノアロムルス（Ａｃｔｉｎｏａｌｌｏｍｕｒｕｓ）エンドペプチダーゼの生産のためのベクターおよび新規組換え宿主株が含まれる。
【背景技術】
【0003】
組換えＤＮＡ（ｒＤＮＡ）技術は、比較的安価な手順で、目的のポリペプチドを制御し、大規模化可能に生産するための、非常に強力な技術的プラットフォームのセットを提供する。組換えタンパク質は通常、大腸菌、出芽酵母、昆虫、ハムスター、哺乳類細胞における組換えＤＮＡ技術によって得られる。しかし、組換えタンパク質の大量生産の改善に対する需要がある。さらにタンパク質がヒト用途（例えば、食品サプリメントとしての用途、および／またはヒトの病気の予防および／または治療における医薬品としての用途）のために生産される場合、満たすべき非常に厳しい要件がある。放線菌は、ヒトの食用として安全なタンパク源とみなされている。ストレプトミセス属由来の食品酵素の２つの例として、フルクトースシロップの生産に使用されるグルコースイソメラーゼ（非特許文献１）と、Ｓ．ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓ由来の広く利用されているトランスグルタミナーゼがあり、肉や魚の加工品、および日用品や焼き菓子など、最終食品の食感や全体的な品質を向上させる特性のために食品産業で使用されている（非特許文献２）。
【0004】
Ｓ．リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）細胞は、前記細胞で発現した組換えタンパク質が培地中に直接分泌され、放出され得るため、組換えタンパク質を生産するための効率的な宿主細胞であることが知られている。しかしながら、Ｓ．リビダンスでは種々のタンパク質が非常に異なる収率で得られ、この結果は予測不可能である（非特許文献１）。
【0005】
異種のタンパク質の収率を改善するために、Ｓ．リビダンスＴＫ２４（ＴＫ２４タキソノミーＩＤ：４５７４２８）の誘導体株のコレクションが、既知の干渉する可能性のある二次代謝産物遺伝子クラスターを順次欠失させることによって構築された。非特許文献３は、この最適化された菌株コレクションを用いて、３ｇ／Ｌに近い収率でミトラマイシンＡを効率的に生産することを開示している。それでもなお、どのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いても、高収率の再現性は保証されていない。それに加えて、組換えタンパク質生産システムの提供には、まだなお、さらなる改善の余地がある。
【0006】
本発明は、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、好ましくはストレプトミセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）宿主株における組換えタンパク質の効率的な製造のための改良されたシステムを提供することを目的とする。
【0007】
特に、本発明のシステムは、アクチノアロムルス株の組換えエンドペプチダーゼ（エンドペプチダーゼ４０またはＥ４０）の大量生産に特に有用であることが見出された。
【0008】
Ｅ４０天然タンパク質は３９８のアミノ酸残基からなり（配列番号３を参照）、Ｎ末端シグナルペプチドは１位と２７位の間に同定され、タンパク質の成熟型（Ｅ４０ｍａｔ）は天然タンパク質の７４位から始まる配列番号１の配列の３２．５ｋＤａポリペプチドであると予測されている（図１を参照）。
【0009】
以下では、「Ｅ４０プレプロ」は、配列番号３の配列からなるその天然シグナルペプチドまたはその誘導体を含む天然プレプロエンドペプチダーゼを特定するために使用する（例えば、配列番号４の配列を有する標識Ｅ４０プレプロ（ｈｉｓ標識Ｅ４０プレプロ）。以下では、「Ｅ４０ｐｒｅ」は、配列番号９のアミノ酸配列からなるシグナルペプチドを含まないＥ４０プロ酵素を特定するために使用する。以下では、「Ｅ４０ｍａｔ」は、配列番号１からなるアミノ酸配列の成熟エンドペプチダーゼ、またはその誘導体（例えば、配列番号２のアミノ酸配列を有する標識Ｅ４０ｍａｔ（Ｅ４０Ｈｉｓｍａｔ））を特定するために使用する。
【0010】
前記エンドペプチダーゼは、特許文献１に初めて開示されており、非常に迅速かつ効率的にグルテンペプチドを非毒性ペプチドに分解し、胃および腸内環境の全ｐＨ範囲で活性であることが示され（酵素活性は、ｐＨ５で最適であるｐＨ３～６の範囲で示される）、さらに胃腸内因性酵素による分解に耐性であることが示されている。このことから、前記アクチノアロムルスエンドペプチダーゼは、セリアック病（ＣＤ）およびＣＤ関連疾患の治療および／または予防に使用するのに非常に適している。したがって、前記アクチノアロムルスエンドペプチダーゼの効率的で安価な製造方法の開発に強い関心が寄せられている。
【0011】
特許文献２は、Ｓ．リビダンス宿主細胞において組換えアクチノアロムルスエンドペプチダーゼを製造する方法を開示する。ここで、Ｅ４０の発現は、好ましくは、高コピー複製発現ベクター（ｐＩＪ８６、配列番号７）によってＳ．リビダンスＴＫ２４株において行われる。
【0012】
いくつかの複製プラスミドは、特に高コピー数であることから、放線菌における多くのバイオテクノロジーに関連した異種タンパク質の過剰生産に成功裏に利用されてきた。しかし、複製ベクターにはいくつかの欠点がある。例えば、それらは手間のかかるプロトプラスト形質転換によってのみ放線菌に導入でき、放線菌内での安定的な維持には恒久的な抗生物質の選択が必要である。
【0013】
ストレプトミセスゲノムの特定の部位（例えば、特定のインテグラーゼのためのａｔｔＢ部位）に部位特異的に組み込むための、結合／組み込み機能（Ａｔｔ／Ｉｎｔ）をコードするＤＮＡセグメントを含む組み込みベクターも、ストレプトミセスで組換えタンパク質を発現するために採用されてきた。部位特異的組み込みシステムのほとんどは、ストレプトミセス種で同定された様々な放線菌の温帯バクテリオファージ（アクチノファージ）に基づいている。温帯バクテリオファージ（およびその機能エレメントを用いて調製された組み込みベクター）は、ファージ（または組み込みベクター）のａｔｔＰと宿主染色体のａｔｔＢという特異的な結合部位を必要とする組換えプロセスによって、特定の部位で宿主染色体に組み込まれる。
【0014】
いくつかの利点があるにもかかわらず、これらのＡｔｔ／Ｉｎｔシステムには、組み込みプラスミド全体を、大腸菌レプリコン、インテグラーゼ遺伝子、および耐性マーカー遺伝子と統合するなど、いくつかの制限もある。これは、構築物の安定性が影響を受ける可能性があるため、バイオテクノロジー上の重大な障害となりうる。実際、いくつかのＡｔｔ／Ｉｎｔシステムの不安定性が、いくつかのストレプトミセス株で報告されている（非特許文献４）。したがって、これらの組み込みベクター法は、安定なバイオテクノロジー生産株の構築には適さないと考えられてきた。
【0015】
さらに、他のいくつかのエレメント（例えば、発現ベクターにクローン化された発現カセットの調節エレメント）も組換えタンパク質生産システムの効率に関与している。
【0016】
したがって、組換えタンパク質生産の分野において、満足のいくタンパク質の収量を達成し、望ましくない欠点を回避することは、決して容易で明確な課題ではない。
【0017】
本発明は、組換えタンパク質、好ましくは組換えアクチノアロムルスエンドペプチダーゼを、ストレプトミセス、好ましくはＳ．リビダンスの宿主細胞において生産するための、驚くほどに改良されたシステムを提供する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0018】
【特許文献1】国際公開第２０１３／０８３３３８号
【特許文献2】国際公開第２０２１／０１３５５３号
【非特許文献】
【0019】
【非特許文献1】Ａｎｎｅ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１４
【非特許文献2】Ｋｉｅｌｉｓｚｅｋ，ｅｔ ａｌ．Ｆｏｌｉａ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａ，２０１３
【非特許文献3】Ｎｏｖａｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１８）
【非特許文献4】Ｋｏｒｍａｎｅｃ Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０３：５４６３－５４８２，２０１９
【発明の概要】
【0020】
ストレプトミセス宿主細胞、好ましくはＳ．リビダンス株における組換えタンパク質の生産のための本発明のシステムは、強力なプロモーター［配列番号１０の配列の人工ｋａｓＯプロモーター（ｋａｓＯｐ＊）］の制御下、目的の組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチド、およびＰｈｉＣ３１カプシドタンパク質遺伝子（Ｂａｉ ｅｔ ａｌ．２０１５，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １１２，１２１８１－１２１８６）に基づく配列番号１１の配列の合成バリアントＳＲ４０リボソーム結合部位（ＲＢＳ）である調節エレメントを含む発現カセットを有する新規組換えベクターを含む。本発明の組換えベクターは、ファージＰｈｉＢＴ１に基づくシングルサイト組み込みベクターであり、好ましくはストレプトミセスゲノム中のａｔｔＢ部位に組み込まれる。
【0021】
目的の組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、シグナルペプチドを含む組換えプレタンパク質をコードする。好ましい態様において、前記シグナルペプチドは、異種シグナルペプチドであり、より好ましくは、配列番号１２の配列を有する、ストレプトミセスベネズエラエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ）のスブチリシンインヒビターのシグナルペプチドｖｓｉである（Ｌａｍｍｅｒｔｙｎ ｅｔ ａｌ．１９９７ Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ６３，１８０８－１８１３）。
【0022】
好ましくは、目的の組換えタンパク質は、アクチノアロムルスエンドペプチダーゼ、好ましくはアクチノアロムルスエンドペプチダーゼ４０（Ｅ４０）、その生物学的に活性な断片、バリアント、または誘導体である。
【0023】
本発明のシステムは、新規ベクターを含む新規組換え宿主株も含む。また本発明は、宿主細胞の培地中でのその分泌による組換えタンパク質の生産、特にアクチノアロムルスエンドペプチダーゼの生産のための本発明の新規システムの使用、および本発明の新規システムによる組換えタンパク質の生産方法にも関する。
【0024】
驚くべきことに、単一コピーのベクターを使用しているにもかかわらず、本発明のシステムは安定かつ多量の組換えタンパク質の発現を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0025】
【図1】天然Ｅ４０プレプロ酵素（Ｅ４０プレプロ）の配列。そのシグナルペプチドは太字で示され、成熟酵素は下線が付されている。
【図2】クローニングベクターｐＩＪ８６のＢａｍＨＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位の間に挿入されたＥ４０ｐｒｅエンドペプチダーゼをコードするｅ４０遺伝子（６ｘＨｉｓ標識有りと標識無し）を含む先行技術の組換えベクターｐＩＪ８６／ｅ４０のスキーム。プロモーターの－１０および－３５領域（太字および下線）、ＴＳＳ（太字、下線および強調表示）、ならびにｅ４０とのＢａｍＨＩ／ＢｃｌＩ融合体を含むｅｒｍＥｐ＊プロモーター領域（配列番号３０）の配列を、プラスミドのスキームの下に示す。Ｅ４０のアミノ酸は各コドンの２番目の位置にある。
【図3】発現ベクターｐＭＵ１ｓ－ｋａｓＯｐＳＲ４０ｖｓｉ３ｍＲＦＰＡのスキーム。プラスミドのスキームの下に、制限部位（太字と下線）を挿入したｖｓｉ－ｍＲＦＰ融合体の配列を示す。Ｖｓｉシグナルペプチド（太字）とｍＲＦＰ（赤文字）のアミノ酸は各コドンの２番目の位置にある。
【図4】ＴＳＢ培地中で様々な時点まで増殖させたｐＭＵ１ｓ－ｋａｓＯｐＳＲ４０ｖｓｉ３ｍＲＦＰＡを有するＳ．リビダンスＴＫ２４におけるｍＲＦＰ分泌後の培地サンプル２０μｌの１３．５％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（２つの個別のクローン）。レーン：１＝ＬＭＷ標準；２－５＝ＴＫ２４ ｐＭＵ１ｓ－ｋａｓＯｐＳＲ４０ｖｓｉ３ｍＲＦＰＡをそれぞれ２４時間、４８時間、７２時間、１４６時間培養；１０＝ＴＫ２４を４８時間培養。
【図5】強力なｋａｓＯｐ＊プロモーター、最適化された強力なＳＲ４０ ＲＢＳ、およびｖｓｉ－ｍＲＦＰレポーター融合遺伝子のＡＴＧコドンに挿入された単一のＮｄｅＩ部位を含むクローニングベクターｐＬｉｔ－ｋａｓＯｐＳＲ４０ｖｓｉ３ｍＲＦＰのスキーム。
【図6】クローニングベクターｐＬｉｔ ｋａｓＯｐＳＲ４０ｖｓｉ３ｍＲＦＰのＮｄｅＩ部位とＡｖｒＩＩ部位の間に挿入された元のシグナルペプチド配列（それぞれ６ｘＨｉｓ標識有りと標識無し）を有するｅ４０遺伝子全体を含む組換えプラスミドｐＬｉｔ－ｅ４０とｐＬｉｔ－ｅ４０Ｈｉｓのスキーム。プロモーターの－１０および－３５領域（太字および下線）、そのＴＳＳ（太字、下線および強調表示）、ＲＢＳ（太字および下線）、ならびにｅ４０とのＮｄｅＩ融合体を含むｋａｓＯｐ＊プロモーターの配列を、プラスミドのスキームの下に示す。Ｅ４０のアミノ酸は各コドンの２番目の位置にある。
【図7】強力なｋａｓＯｐ＊プロモーター、最適化された強力なＳＲ４０ ＲＢＳ、およびｇｕｓＡレポーター遺伝子のＡＴＧコドンに挿入された単一のＮｄｅＩ部位を含むクローニング発現ベクターｐＭＵ１ｓ－ｋａｓＯｐＳＲ４０ｇｕｓＡのスキーム。プロモーターの－１０および－３５領域（太字および下線）、そのＴＳＳ（太字、下線および強調表示）、ならびにＲＢＳ（太字および下線）を含むこのプロモーターとＲＢＳ領域の配列を、プラスミドのスキームの下に示す。
【図8】クローニングベクターｐＬｉｔ－ｋａｓＯｐＳＲ４０ｖｓｉ３ｍＲＦＰのＮｈｅＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位の間に挿入された、Ｖｓｉとプロ酵素Ｅ４０ｐｒｅのｖｓｉ－ｅ４０ｐｒｅ遺伝子融合体およびＶｓｉと成熟酵素Ｅ４０ｍａｔのｖｓｉ－ｅ４０ｍａｔ遺伝子融合体（それぞれ６ｘＨｉｓ標識有りと標識無し）を含む組換えプラスミドｐＬｉｔ－ｖｓｉｅ４０ｐｒｅ、ｐＬｉｔ－ｅ４０Ｈｉｓｐｒｅ、ｐＬｉｔｖｓｉｅ４０ＨＱＨｉｓｐｒｅ、ｐＬｉｔ－ｖｓｉｅ４０ｍａｔ、ｐＬｉｔ－ｖｓｉｅ４０Ｈｉｓｍａｔのスキーム。プロモーターの－１０および－３５領域（太字および下線）、そのＴＳＳ（太字、下線および強調表示）、ＲＢＳ（太字および下線）、ｖｓｉ－Ｅ４０融合部位のＮｄｅＩとＮｈｅＩを含むｋａｓＯｐ＊プロモーターの配列を、プラスミドのスキームの下に示す。
【図9】クローニングベクターｐＭＵ１ｓ－ｋａｓＯｐＳＲ４０ｇｕｓＡ（図７）のＫｐｎＩ部位とＥｃｏＲＶ部位の間に挿入されたｐＬｉｔプラスミド（図６、８参照）からのＫｐｎＩ ＥｃｏＲＶ ＤＮＡ断片としてｅ４０遺伝子融合体のすべての形態を含む組換えプラスミドｐＭＵ１ｓ－ｅ４０、ｐＭＵ１ｓ－ｅ４０Ｈｉｓ、ｐＭＵ１ｓｖｓｉｅ４０ｐｒｅ、ｐＭＵ１ｓ－ｖｓｉｅ４０Ｈｉｓｐｒｅ、ｐＭＵ１ｓ－ｖｓｉｅ４０ＨＱＨｉｓｐｒｅ、ｐＭＵ１ｓ ｖｓｉｅ４０ｍａｔ、ｐＭＵ１ｓ－ｖｓｉｅ４０Ｈｉｓｍａｔのスキーム。
【図10】クローニングベクターｐＩＪ８６（図２）のＫｐｎＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位の間に挿入されたｐＬｉｔプラスミド（図６、８）からのＫｐｎＩ－ＥｃｏＲＶ ＤＮＡ断片としてｅ４０遺伝子融合体のすべての形態（図６、８に示す）（それぞれ６ｘＨｉｓ標識有りと標識無し）を含む組換えプラスミドｐＩＪ８６－ｋａｓＯｐｅ４０、ｐＩＪ８６－ｋａｓＯｐｅ４０Ｈｉｓ、ｐＩＪ８６－ｖｓｉｅ４０ｐｒｅ、ｐＩＪ８６－ｖｓｉｅ４０Ｈｉｓｐｒｅ、ｐＩＪ８６－ｖｓｉｅ４０ＨＱＨｉｓｐｒｅ、ｐＩＪ８６－ｖｓｉｅ４０ｍａｔ、ｐＩＪ８６－ｖｓｉｅ４０Ｈｉｓｍａｔのスキーム。
【図11】６ｘＨｉｓ標識を有するｅ４０遺伝子を含むプラスミドｐＩＪ８６／ｅ４０ＨｉｓからのｅｒｍＥｐ＊－ｅ４０Ｈｉｓ融合体を含む、組換えプラスミドｐＭＵ１ｓ－ｅｒｍＥｅ４０のスキーム。
【図12】先行技術の高コピー複製プラスミドと結合した野生型および変異型Ｓ．リビダンスＲｅｄＳｔｒｅｐ１．３株におけるＥ４０活性。
【図13】ｅｒｍＥｐ＊プロモーター下で天然Ｅ４０を発現するシングルサイト組み込みプラスミドと結合した野生型および変異型Ｓ．リビダンスＲｅｄＳｔｒｅｐ株におけるＥ４０活性。
【図14A】本発明による、ｋａｓＯｐ＊プロモーターおよび最適化された強力なＳＲ４０ ＲＢＳの下、天然Ｅ４０を発現するシングルサイト組み込みプラスミドと結合した野生型Ｓ．リビダンス株におけるＥ４０活性。
【図14B】本発明による、ｋａｓＯｐ＊プロモーターおよび最適化された強力なＳＲ４０ ＲＢＳの下、Ｈｉｓ標識Ｅ４０を発現するシングルサイト組み込みプラスミドと結合した野生型Ｓ．リビダンス株におけるＥ４０活性。
【図15A】ｋａｓＯｐ＊プロモーターおよび最適化された強力なＳＲ４０ ＲＢＳの下、Ｅ４０を発現する高コピーｐＩＪ８６プラスミドと結合した野生型Ｓ．リビダンス株におけるＥ４０活性。
【図15B】ｋａｓＯｐ＊プロモーターおよび最適化された強力なＳＲ４０ ＲＢＳの下、Ｅ４０Ｈｉｓ標識を発現する高コピーｐＩＪ８６プラスミドと結合した野生型Ｓ．リビダンス株におけるＥ４０活性。
【図16A】ｋａｓＯｐ＊プロモーターおよび最適化された強力なＳＲ４０ ＲＢＳの下、ｖｓｉ－ｅ４０ｐｒｅを含む高コピーｐＩＪ８６プラスミドｐＩＪ８６と結合した野生型Ｓ．リビダンス株におけるＥ４０活性。
【図16B】ｋａｓＯｐ＊プロモーターおよび最適化された強力なＳＲ４０ ＲＢＳの下、Ｈｉｓ標識ｖｓｉ－ｅ４０ｐｒｅを含む高コピーｐＩＪ８６プラスミドｐＩＪ８６と結合した野生型Ｓ．リビダンス株におけるＥ４０活性。
【図16C】ｋａｓＯｐ＊プロモーターおよび最適化された強力なＳＲ４０ ＲＢＳの下、ｖｓｉ－ｅ４０ｍａｔを含む高コピーｐＩＪ８６プラスミドｐＩＪ８６と結合した野生型Ｓ．リビダンス株におけるＥ４０活性。
【図16D】ｋａｓＯｐ＊プロモーターおよび最適化された強力なＳＲ４０ ＲＢＳの下、Ｈｉｓ標識ｖｓｉ－ｅ４０ｍａｔ融合遺伝子を含む高コピーｐＩＪ８６プラスミドｐＩＪ８６と結合した野生型Ｓ．リビダンス株におけるＥ４０活性。
【図17A】ｋａｓＯｐ＊プロモーターおよび最適化された強力なＳＲ４０ ＲＢＳの下、ｖｓｉ－ｅ４０ｐｒｅを含むシングルサイト組み込みプラスミドと結合した野生型Ｓ．リビダンス株におけるＥ４０活性。
【図17B】ｋａｓＯｐ＊プロモーターおよび最適化された強力なＳＲ４０ ＲＢＳの下、Ｈｉｓ標識ｖｓｉ－ｅ４０ｐｒｅを含むシングルサイト組み込みプラスミドと結合した野生型Ｓ．リビダンス株におけるＥ４０活性。
【図18A】ｋａｓＯｐ＊プロモーターおよび最適化された強力なＳＲ４０ ＲＢＳの下、天然Ｅ４０を発現するシングルサイト組み込みプラスミドと結合した野生型または変異型Ｓ．リビダンスＲｅｄＳｔｒｅｐ株におけるＥ４０活性。
【図18B】ｋａｓＯｐ＊プロモーターおよび最適化された強力なＳＲ４０ ＲＢＳの下、天然Ｅ４０Ｈｉｓ標識を発現するシングルサイト組み込みプラスミドと結合した野生型または変異型Ｓ．リビダンスＲｅｄＳｔｒｅｐ株におけるＥ４０活性。
【図19A】ｋａｓＯｐ＊プロモーターおよび最適化された強力なＳＲ４０ ＲＢＳの下、ｖｓｉ－ｅ４０ｐｒｅを発現するシングルサイト組み込みプラスミドと結合した野生型または変異型Ｓ．リビダンスＲｅｄＳｔｒｅｐ株におけるＥ４０活性。
【図19B】ｋａｓＯｐ＊プロモーターおよび最適化された強力なＳＲ４０ ＲＢＳの下、Ｈｉｓ標識ｖｓｉ－ｅ４０ｐｒｅを発現するシングルサイト組み込みプラスミドと結合した野生型または変異型Ｓ．リビダンスＲｅｄＳｔｒｅｐ株におけるＥ４０活性。
【発明を実施するための形態】
【0026】
最初に、本発明は、ストレプトミセス宿主細胞における組換えタンパク質の異種発現のための発現カセットを有する組換えベクターに関する。前記カセットは、プロモーター、前記プロモーターの下流にある調節エレメント、および前記プロモーターおよび前記調節エレメントの下流にあり、それらに作動可能に連結された、組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。
【0027】
用語「ベクター」、「発現ベクター」および「プラスミド」は、本明細書において同じ意味で使用される。
【0028】
本発明のストレプトミセス宿主細胞における組換えタンパク質の異種発現のための発現ベクターは、ＰｈｉＢＴ１ファージ由来のａｔｔＰ部位およびインテグラーゼ遺伝子を含むシングルサイト組み込みベクターであり、より好ましくは、配列番号１３の配列を有する、ストレプトミセスのそのａｔｔＢ部位に組み込まれるベクターである。
【0029】
本発明によるシングルサイト組み込みベクターの例としては、Ｋｏｒｍａｎｅｃ Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２０１９）１０３：５４６３－５４８２に記載のものが挙げられる。
【0030】
好ましい実施形態において、シングルサイト組み込みベクターは、ｐＭＵ１ベクターのバックボーンを有するベクターである（Ｃｒａｎｅｙ ｅｔ ａｌ．２００７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３５，ｅ４６）。
【0031】
前記発現カセットのプロモーターは、配列番号１０の配列の人工ｋａｓＯプロモーター（ｋａｓＯｐ＊）であり；発現カセットの調節エレメントは、配列番号１１の配列の合成リボソーム結合部位（ＳＲ４０ ＲＢＳ）であり；かつ、目的の組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、シグナルペプチドを含む組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチドである。
【0032】
本発明の発現カセットは、ストレプトミセス宿主細胞における組換えタンパク質の異種発現に特に適している。組換えタンパク質は、宿主細胞の増殖に適した条件下の培地中で培養された宿主細胞によって発現し、前記培地中に分泌される。シグナルペプチドは、培地中でのタンパク質の分泌を促進する。
【0033】
場合により、シグナルペプチドは異種シグナルペプチドであり、より好ましくは配列番号１２の配列を有するストレプトミセスベネズエラエのスブチリシンインヒビターのＶｓｉシグナルペプチドである。驚くべきことに、本発明による、目的のタンパク質に融合した異種シグナルペプチドの使用は、タンパク質の天然シグナルペプチドと同様に良好な組換えタンパク質の分泌を提供する。
【0034】
本発明の好ましい実施形態において、発現カセットのポリヌクレオチドによりコードされる組換えタンパク質は、グルテナーゼ活性を有する組換えアクチノアロムルスエンドペプチダーゼである。より好ましくは、前記エンドペプチダーゼは、配列番号１を含む配列のエンドペプチターゼ４０（Ｅ４０）、Ｅ４０の生物学的に活性な断片、Ｅ４０の天然に存在する対立遺伝子バリアント；または配列番号１に対して少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％もしくは９５％の同一性を有する配列のエンドペプチダーゼである。
【0035】
配列番号１は、Ｅ４０の成熟型のポリペプチド配列である。
【0036】
したがって、好ましくは、発現カセットは、配列番号１を含む配列のエンドペプチダーゼＥ４０、Ｅ４０の生物学的に活性な断片、Ｅ４０の天然に存在する対立遺伝子バリアント、または配列番号１に対して少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％もしくは９５％の同一性を有する配列のエンドペプチダーゼをコードするポリヌクレオチドを含む。
【0037】
Ｅ４０の「生物学的に活性な断片」なる用語は、エンドペプチダーゼの特異的なグルテナーゼ活性を維持する部分を指す。Ｅ４０の「生物学的に活性な断片」をコードするポリヌクレオチドは、国際公開第２０２１／０１３５５３号によって開示された通りに同定することができる。
【0038】
目的の組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、遺伝暗号の縮重のために、注釈付き核酸配列とは異なる配列を有する場合があるため、それは、注釈付き核酸配列を有するポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同じタンパク質をコードする。
【0039】
ヌクレオチドまたはアミノ酸配列に言及する場合の「同一性」または「相同性」なる用語は、本明細書では同じ意味で使用され、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列が、比較する特定の領域にわたって残基ごとに同一または相同である程度をいう。配列および同一性または相同性パーセントは、当技術分野で公知の任意の適切なソフトウェアプログラム、例えば、分子生物学の最新プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）に記載されているものを使用して決定することができる（Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，“Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌｌｙ Ａｖａｉｌａｂｌｅ Ｓｏｆｔｗａｒｅ”，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，１９８７，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ３０，Ｓｅｃｔｉｏｎ ７．７．１８，Ｔａｂｌｅ ７．７．１）。好ましいプログラムとしては、ＧＣＧ Ｐｉｌｅｕｐプログラム、ＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ Ｒ．ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ Ｄ．Ｊ．“Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．，Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８８，８５，２４４４－２４４８）およびＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ．Ｆ．，Ｇｉｓｈ Ｗ．，Ｍｉｌｌｅｒ Ｗ．，Ｍｙｅｒｓ Ｅ．Ｗ．，Ｌｉｐｍａｎ Ｄ．Ｊ．“Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９０，２１５，４０３－４１０）を挙げることができる。
【0040】
「対立遺伝子バリアント」なる用語は、同じ染色体座を占める遺伝子の２つ以上の代替型のいずれかを意味する。対立遺伝子変異は突然変異によって自然に生じ、また集団内で表現型の多型をもたらすことがある。遺伝子変異はサイレント（コードされるポリペプチドに変化がない）であることもあれば、アミノ酸配列が変化したポリペプチドをコードすることもある。対立遺伝子バリアントという用語は、遺伝子の対立遺伝子バリアントによってコードされるタンパク質にも言及する。
【0041】
目的の組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、別のポリペプチド、例えばヒスチジン標識などの標識に作動可能に融合したタンパク質をコードし得る。例えば、前記ポリヌクレオチドは、標識タンパク質、例えば配列番号２を含む配列もしくは配列番号２からなる配列の標識Ｅ４０をコードするポリヌクレオチドであり得る。好ましい実施形態において、目的のタンパク質をコードする前記ポリヌクレオチドは、配列番号５、６、１５、１６、１７もしくは１８の配列を含む配列または配列番号５、６、１５、１６、１７もしくは１８の配列からなる配列のポリヌクレオチドであり、発現カセットは、配列番号２０、２１、２２もしくは２３の配列である。
【0042】
したがって、好ましい実施態様において、本発明はシングルサイト組み込みベクターに関し、より好ましくはストレプトミセス宿主細胞（好ましくはＳ．リビダンス株）において、アクチノアロムルスエンドペプチダーゼ、好ましくはアクチノアロムルスエンドペプチダーゼ４０（Ｅ４０）、生物学的に活性な断片、バリアント、またはその誘導体を、配列番号１０の配列の人工ｋａｓＯプロモーター（ｋａｓＯｐ＊）および配列番号１１の配列のリボソーム結合部位（ＲＢＳ）（ＳＲ４０ ＲＢＳ）の制御下で発現させるための発現カセットを有する、ストレプトミセスのＰｈｉＢＴ１ファージのためのａｔｔＢ部位に組み込むベクターに関する。場合により、組換えタンパク質は、シグナルペプチドがＶｓｉシグナルペプチドで置換されたアクチノアロムルスエンドペプチダーゼである。
【0043】
より好ましくは、アクチノアロムルスエンドペプチダーゼ４０（Ｅ４０）の発現のための発現カセットを有するシングルサイト組み込みベクターは、配列番号２５、２６、２７または２８の配列のｐＭＵ１ベクターである。
【0044】
本発明はまた、本発明による発現ベクターを含む組換えタンパク質の異種発現のための宿主細胞、好ましくは組換えストレプトミセス宿主細胞、より好ましくはＳ．リビダンス宿主細胞にも関する。宿主細胞は、野生型Ｓ．リビダンス宿主細胞または変異型Ｓ．リビダンス宿主細胞、例えば、Ｓ．リビダンスＲｅｄＳｔｒｅｐ１．３株（Δａｃｔ、Δｒｅｄ、Δｃｄａ）、Ｓ．リビダンスＲｅｄＳｔｒｅｐ１．６株（Δａｃｔ、Δｒｅｄ、Δｃｄａ、Δｍｅｌ）またはＳ．リビダンスＲｅｄＳｔｒｅｐ１．９株（Δａｃｔ、Δｒｅｄ、Δｃｄａ、Δｍｅｌ、ΔｍａｔＡＢ）のＳ．リビダンス宿主細胞の場合がある（Ｎｏｖａｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。
【0045】
好ましくは、前記宿主細胞は、ブダペスト条約の規定に基づき、２０２１年６月２４日にライプニッツ研究所ＤＳＭＺ・ドイツ微生物細胞培養コレクション（Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ＧｍｂＨ，Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒａｓｓｅ ７Ｂ ３８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ－ＧＥＲＭＡＮＹ）に寄託されたＤＳＭ３３９３０株（ｐＭＵ１ｓ－ｅ４０Ｈｉｓと結合したＳ．リビダンス１．３）ＤＳＭ３３９３１株（ｐＭＵ１ｓ－ｅ４０Ｈｉｓと結合したＳ．リビダンス１．９）の細胞である。
【0046】
次に本発明は、宿主細胞の培地中に分泌される組換えタンパク質の生産のための、本発明の組換えベクターまたは宿主細胞の使用にも関する。
【0047】
有利なことに、本発明のシステムは、安定で多量の目的のタンパク質の生産を提供する。さらにタンパク質は、それが分泌される宿主細胞培地から容易に回収可能である。
【0048】
実際、本発明のシステムはまた、ストレプトミセス宿主細胞において組換えタンパク質を生産するための方法であって、以下の工程を連続して含む方法にも関する：組換えストレプトミセス宿主細胞、好ましくはＳ．リビダンス宿主細胞、より好ましくはＴＫ２４株の宿主細胞を発酵条件下の培地中で培養する工程；前記組換え宿主細胞が本発明による組換え発現ベクターを含む工程；培地の上清を回収する工程、および前記上清から組換えタンパク質を含む調製物を精製する工程。
【0049】
「発酵条件」とは、宿主細胞株が増殖し、目的の化合物（組換えエンドペプチダーゼ）の生産に適した宿主細胞株の培養条件（培地組成、攪拌パラメータ、通気および温度）を意味する。好適な発酵条件は、例えば国際公開第２０２１／０１３５５３号に記載された条件、または以下の実施例に記載された条件の場合がある。
【0050】
本発明の好ましい態様のすべての可能な組み合わせも記載されており、したがって同様に好ましいことが理解されるべきである。
【0051】
本発明の実施形態の例を以下に示すが、これは例示的かつ非限定的な目的で提供される。
【実施例】
【0052】
プラスミド
以下の実施例１～６で調製したプラスミドを表１にまとめた。各プラスミドについて、プロモーター、ＲＢＳ、シグナルペプチド、遺伝子およびベクターのバックボーンを報告する。
以下の実施例１～６で調製したプラスミドを表１にまとめた。各プラスミドについて、プロモーター、ＲＢＳ、シグナルペプチド、遺伝子およびベクターのバックボーンを報告する。
【0053】
【表1】
【0054】
宿主細胞
Ｓ．リビダンス野生型株ＴＫ２４（タキソノミーＩＤ：４５７４２８）およびＳ．リビダンス変異株ＲｅｄＳｔｒｅｐ１．３、１．６、１．９（Ｎｏｖａｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．２０１８）を実施例７～１４で採用し、様々なプラスミドを用いた組換えタンパク質の生産を試験した。
Ｓ．リビダンス野生型株ＴＫ２４（タキソノミーＩＤ：４５７４２８）およびＳ．リビダンス変異株ＲｅｄＳｔｒｅｐ１．３、１．６、１．９（Ｎｏｖａｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．２０１８）を実施例７～１４で採用し、様々なプラスミドを用いた組換えタンパク質の生産を試験した。
【0055】
実施例１
ｐＩＪ８６／ｅ４０およびｐＩＪ８６／ｅ４０Ｈｉｓ（図２）は、先行技術（国際公開第２０２１／０１３５５３号参照）のｐＩＪ８６高コピー複製プラスミドであり、ｅｒｍＥｐ＊プロモーター（比較的弱いｅｒｍＥｐ２および比較的強い変異ｅｒｍＥｐ１＊を含む）下でｅ４０（プレプロｅ４０）をコードする遺伝子を含む。これらはＦｏｎｄａｚｉｏｎｅ Ｉｓｔｉｔｕｔｏ Ｉｎｓｕｂｒｉｃｏ ｄｉ Ｒｉｃｅｒｃｈｅ ｐｅｒ ｌａ Ｖｉｔａ（ＦＩＩＲＶ）から入手した。
ｐＩＪ８６／ｅ４０およびｐＩＪ８６／ｅ４０Ｈｉｓ（図２）は、先行技術（国際公開第２０２１／０１３５５３号参照）のｐＩＪ８６高コピー複製プラスミドであり、ｅｒｍＥｐ＊プロモーター（比較的弱いｅｒｍＥｐ２および比較的強い変異ｅｒｍＥｐ１＊を含む）下でｅ４０（プレプロｅ４０）をコードする遺伝子を含む。これらはＦｏｎｄａｚｉｏｎｅ Ｉｓｔｉｔｕｔｏ Ｉｎｓｕｂｒｉｃｏ ｄｉ Ｒｉｃｅｒｃｈｅ ｐｅｒ ｌａ Ｖｉｔａ（ＦＩＩＲＶ）から入手した。
【0056】
実施例２
ｐＭＵ１ｓ－ｋａｓＯｐＳＲ４０ｇｕｓＡ（図７）は、ＰｈｉＢＴ１ベースの組み込みベクターｐＭＵ１ｓであり（Ｃｒａｎｅｙ ｅｔ ａｌ．２００７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３５，ｅ４６）強力なｋａｓＯｐ＊プロモーターの制御下にあるｇｕｓＡレポーター遺伝子（Ｍｙｒｏｎｏｖｓｋｙｉ ｅｔ ａｌ．２０１１，Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ７７，５３７０－５３８３）と最適化された合成強力ＳＲ４０ ＲＢＳを含む発現カセットを有する（Ｂａｉ ｅｔ ａｌ．２０１５，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １１２，１２１８１－１２１８６）。この組み合わせの活性は１８９７Ｕ／ｇのＧＵＳであり、ｅｒｍＥｐ＊プロモーター下の同じ発現カセットよりも４７倍高かった。
ｐＭＵ１ｓ－ｋａｓＯｐＳＲ４０ｇｕｓＡ（図７）は、ＰｈｉＢＴ１ベースの組み込みベクターｐＭＵ１ｓであり（Ｃｒａｎｅｙ ｅｔ ａｌ．２００７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３５，ｅ４６）強力なｋａｓＯｐ＊プロモーターの制御下にあるｇｕｓＡレポーター遺伝子（Ｍｙｒｏｎｏｖｓｋｙｉ ｅｔ ａｌ．２０１１，Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ７７，５３７０－５３８３）と最適化された合成強力ＳＲ４０ ＲＢＳを含む発現カセットを有する（Ｂａｉ ｅｔ ａｌ．２０１５，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １１２，１２１８１－１２１８６）。この組み合わせの活性は１８９７Ｕ／ｇのＧＵＳであり、ｅｒｍＥｐ＊プロモーター下の同じ発現カセットよりも４７倍高かった。
【0057】
実施例３
シグナルペプチド配列とｍＲＦＰの間にＮｈｅＩ部位が挿入されたｖｓｉシグナルペプチド配列と赤色蛍光タンパク質（ｍＲＦＰ）レポーター遺伝子の融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを調製した。８００ｂｐのＮｄｅＩ－ＮｏｔＩ ＤＮＡ断片として、このｖｓｉ－ｍＲＦＰカセット全体を、実施例２のｐＭＵ１ｓ－ｋａｓＯｐＳＲ４０ｇｕｓＡのｇｕｓＡと置き換えて、ｐＭＵ１ｓ－ｋａｓＯｐＳＲ４０ｖｓｉ３ｍＲＦＰＡベクターを得た（図３）。これは同様に強力なｋａｓＯｐ＊プロモーター、最適化された合成強力ＳＲ４０ ＲＢＳおよびＶｓｉシグナルペプチドを含んでいた。この構築物はｍＲＦＰを強力に分泌した（２７ ８８６ ＦＵ）。ＳＤＳ－ＰＡＧＥでは、濃厚なＴＳＢ培地に分泌されたｍＲＦＰの正確なバンドが明らかになった（図４）。
シグナルペプチド配列とｍＲＦＰの間にＮｈｅＩ部位が挿入されたｖｓｉシグナルペプチド配列と赤色蛍光タンパク質（ｍＲＦＰ）レポーター遺伝子の融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを調製した。８００ｂｐのＮｄｅＩ－ＮｏｔＩ ＤＮＡ断片として、このｖｓｉ－ｍＲＦＰカセット全体を、実施例２のｐＭＵ１ｓ－ｋａｓＯｐＳＲ４０ｇｕｓＡのｇｕｓＡと置き換えて、ｐＭＵ１ｓ－ｋａｓＯｐＳＲ４０ｖｓｉ３ｍＲＦＰＡベクターを得た（図３）。これは同様に強力なｋａｓＯｐ＊プロモーター、最適化された合成強力ＳＲ４０ ＲＢＳおよびＶｓｉシグナルペプチドを含んでいた。この構築物はｍＲＦＰを強力に分泌した（２７ ８８６ ＦＵ）。ＳＤＳ－ＰＡＧＥでは、濃厚なＴＳＢ培地に分泌されたｍＲＦＰの正確なバンドが明らかになった（図４）。
【0058】
実施例４
ｋａｓＯｐ＊プロモーター、最適化されたＳＲ４０ ＲＢＳ、ＡＴＧコドンに単一のＮｄｅＩ部位が挿入されたｖｓｉ－ｍＲＦＰレポーター融合遺伝子を含む９００ｂｐのＫｐｎＩ－ＮｏｔＩ発現カセットを、同じ酵素で消化した標準的な大腸菌クローニングベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にクローニングし、ｐＢＳ－ｋａｓＯｐＳＲ４０ｖｓｉ３ｍＲＦＰを得た。続いて、この断片を、同じ酵素で消化した標準大腸菌クローニングベクターＬＩＴＭＵＳ ２８（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）中の９００ｂｐ ＫｐｎＩ－ＳａｃＩ断片としてこのプラスミドからクローニングし、ｐＬｉｔ－ｋａｓＯｐＳＲ４０ｖｓｉ３ｍＲＦＰを得た（図５）。このプラスミドはヌクレオチド配列決定により確認され、本発明によるベクターにすべてのｅ４０遺伝子をクローニングするためのベクターとして使用された。ＡＴＧ開始コドンからのｅ４０遺伝子全体とそのシグナルペプチド配列（ｅ４０プレプロ）（Ｃ末端に位置する６ｘＨｉｓ標識有りと標識無し）を、ｐＩＪ８６／ｅ４０Ｈｉｓプラスミドから、ＡＴＧ開始コドンにＮｄｅＩ部位を挿入し、ｅ４０停止コドンの後にＳｐｅＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位を挿入し、ＰＣＲ増幅した。ＰＣＲで増幅し、精製した１２００ｂｐのＤＮＡ断片をＮｄｅＩとＳｐｅＩで消化し、ＡｖｒＩＩとＮｄｅＩで消化したｐＬｉｔ－ｋａｓＯｐＳＲ４０ｖｓｉ３ｍＲＦＰにクローニングして、それぞれｐＬｉｔ－ｅ４０またはｐＬｉｔ－ｅ４０Ｈｉｓを得た（図６）。いくつかの陽性クローンを制限酵素マッピングで解析し、続いてヌクレオチド配列決定で検証した。
ｋａｓＯｐ＊プロモーター、最適化されたＳＲ４０ ＲＢＳ、ＡＴＧコドンに単一のＮｄｅＩ部位が挿入されたｖｓｉ－ｍＲＦＰレポーター融合遺伝子を含む９００ｂｐのＫｐｎＩ－ＮｏｔＩ発現カセットを、同じ酵素で消化した標準的な大腸菌クローニングベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にクローニングし、ｐＢＳ－ｋａｓＯｐＳＲ４０ｖｓｉ３ｍＲＦＰを得た。続いて、この断片を、同じ酵素で消化した標準大腸菌クローニングベクターＬＩＴＭＵＳ ２８（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）中の９００ｂｐ ＫｐｎＩ－ＳａｃＩ断片としてこのプラスミドからクローニングし、ｐＬｉｔ－ｋａｓＯｐＳＲ４０ｖｓｉ３ｍＲＦＰを得た（図５）。このプラスミドはヌクレオチド配列決定により確認され、本発明によるベクターにすべてのｅ４０遺伝子をクローニングするためのベクターとして使用された。ＡＴＧ開始コドンからのｅ４０遺伝子全体とそのシグナルペプチド配列（ｅ４０プレプロ）（Ｃ末端に位置する６ｘＨｉｓ標識有りと標識無し）を、ｐＩＪ８６／ｅ４０Ｈｉｓプラスミドから、ＡＴＧ開始コドンにＮｄｅＩ部位を挿入し、ｅ４０停止コドンの後にＳｐｅＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位を挿入し、ＰＣＲ増幅した。ＰＣＲで増幅し、精製した１２００ｂｐのＤＮＡ断片をＮｄｅＩとＳｐｅＩで消化し、ＡｖｒＩＩとＮｄｅＩで消化したｐＬｉｔ－ｋａｓＯｐＳＲ４０ｖｓｉ３ｍＲＦＰにクローニングして、それぞれｐＬｉｔ－ｅ４０またはｐＬｉｔ－ｅ４０Ｈｉｓを得た（図６）。いくつかの陽性クローンを制限酵素マッピングで解析し、続いてヌクレオチド配列決定で検証した。
【0059】
Ｖｓｉとプロ酵素Ｅ４０ｐｒｅの融合体を含むｖｓｉ－ｅ４０ｐｒｅ遺伝子融合体を調製するために、ｐＩＪ８６／ｅ４０Ｈｉｓプラスミドを鋳型とし、プルーフリーディングＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼを使用して、Ａｌａ３４コドンにＮｈｅＩ部位を挿入したプライマーと、ｅ４０停止コドンの後にＳｐｅＩとＨｉｎｄＩＩＩ部位を挿入したプライマーを用いて、ｅ４０ｐｒｅ遺伝子（Ｃ末端に位置する６ｘＨｉｓ標識有りと標識無し）をＰＣＲ増幅した。ＰＣＲで増幅し、精製した１１００ｂｐのＤＮＡ断片をＮｈｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＮｈｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＬｉｔｋａｓＯｐＳＲ４０ｖｓｉ３ｍＲＦＰにクローニングし、それぞれｐＬｉｔ－ｖｓｉｅ４０ｐｒｅまたはｐＬｉｔ－ｖｓｉ４０Ｈｉｓｐｒｅを得た（図８）。いくつかの陽性クローンを制限酵素マッピングで解析し、その後ヌクレオチド配列決定で検証した。クローンの配列決定により、合成したプライマーがＨｉｓ３８ ＣＡＣコドンをＧｌｎ３８ ＣＡＡコドンに置き換える変異を生成した１つのクローンが明らかになった。このプラスミドをさらなる解析のために採取し、ｐＬｉｔｖｓｉ４０ＨＱＨｉｓｐｒｅと標識した。
【0060】
Ｖｓｉと成熟酵素Ｅ４０ｍａｔの融合を含むｖｓｉ－ｅ４０ｍａｔ遺伝子融合体を調製するために、ｐＩＪ８６／ｅ４０Ｈｉｓプラスミドを鋳型とし、プルーフリーディングＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼを使用して、Ａｌａ７３コドンにＮｈｅＩ部位を挿入し、さらにＡｌａ７４コドンをＳｅｒに変化させたプライマーと、ｅ４０停止コドンの後にＳｐｅＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位を挿入したプライマーを用いて、ｅ４０ｍａｔ遺伝子（Ｃ末端に位置する６ｘＨｉｓ標識有りと標識無し）をＰＣＲ増幅した。ＰＣＲで増幅し、精製した１０００ｂｐのＤＮＡ断片をＮｈｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＮｈｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＬｉｔ－ｋａｓＯｐＳＲ４０ｖｓｉ３ｍＲＦＰにクローニングし、それぞれｐＬｉｔ－ｖｓｉｅ４０ｍａｔまたはｐＬｉｔ－ｖｓｉ４０Ｈｉｓｍａｔを得た（図８）。いくつかの陽性クローンを制限酵素マッピングで解析し、その後ヌクレオチド配列決定で検証した。
【0061】
実施例５
ｋａｓＯｐ＊プロモーター、ＲＢＳ、およびｅ４０（その元のシグナルペプチドまたはＶｓｉシグナルペプチドの下、末端に６ｘＨｉｓ標識有りと標識無し）を含むすべてのカセットを、１４００ｂｐのＫｐｎＩ－ＥｃｏＲＶ ＤＮＡ断片として、ｐＬｉｔ－ｅ４０、ｐＬｉｔ－ｅ４０Ｈｉｓ、ｐＬｉｔ－ｖｓｉｅ４０ｐｒｅ、ｐＬｉｔ－ｅ４０Ｈｉｓｐｒｅ、ｐＬｉｔｖｓｉｅ４０ＨＱＨｉｓｐｒｅ、ｐＬｉｔ－ｖｓｉｅ４０ｍａｔ、ｐＬｉｔ－ｖｓｉｅ４０Ｈｉｓｍａｔ（図６、８）からＫｐｎＩとＥｃｏＲＶで消化したｐＭＵ１ｓｋａｓＯｐＳＲ４０ｇｕｓＡ（図７）にクローニングし、ｐＭＵ１ｓ－ｅ４０、ｐＭＵ１ｓ－ｅ４０Ｈｉｓ、ｐＭＵ１ｓ－ｖｓｉｅ４０ｐｒｅ、ｐＭＵ１ｓ－ｖｓｉｅ４０Ｈｉｓｐｒｅ、ｐＭＵ１ｓ－ｖｓｉｅ４０ＨＱＨｉｓｐｒｅ、ｐＭＵ１ｓ－ｖｓｉｅ４０ｍａｔ、ｐＭＵ１ｓ－ｖｓｉｅ４０Ｈｉｓｍａｔベクターを得た（図９）。いくつかの陽性クローンを制限酵素マッピングで解析し、続いてヌクレオチド配列決定で検証した。すべての構築物は、プラスミドをアプラマイシン耐性（ＡｐｒＲ）選択でＳ．リビダンスＴＫ２４に結合させた後、ファージＰｈｉＢＴ１ベースの組み込みシステムを用いてＳ．リビダンスＴＫ２４の染色体の単一位置に組み込むことができる。最終構築物は安定であり、ＡｐｒＲ選択は不要である。
ｋａｓＯｐ＊プロモーター、ＲＢＳ、およびｅ４０（その元のシグナルペプチドまたはＶｓｉシグナルペプチドの下、末端に６ｘＨｉｓ標識有りと標識無し）を含むすべてのカセットを、１４００ｂｐのＫｐｎＩ－ＥｃｏＲＶ ＤＮＡ断片として、ｐＬｉｔ－ｅ４０、ｐＬｉｔ－ｅ４０Ｈｉｓ、ｐＬｉｔ－ｖｓｉｅ４０ｐｒｅ、ｐＬｉｔ－ｅ４０Ｈｉｓｐｒｅ、ｐＬｉｔｖｓｉｅ４０ＨＱＨｉｓｐｒｅ、ｐＬｉｔ－ｖｓｉｅ４０ｍａｔ、ｐＬｉｔ－ｖｓｉｅ４０Ｈｉｓｍａｔ（図６、８）からＫｐｎＩとＥｃｏＲＶで消化したｐＭＵ１ｓｋａｓＯｐＳＲ４０ｇｕｓＡ（図７）にクローニングし、ｐＭＵ１ｓ－ｅ４０、ｐＭＵ１ｓ－ｅ４０Ｈｉｓ、ｐＭＵ１ｓ－ｖｓｉｅ４０ｐｒｅ、ｐＭＵ１ｓ－ｖｓｉｅ４０Ｈｉｓｐｒｅ、ｐＭＵ１ｓ－ｖｓｉｅ４０ＨＱＨｉｓｐｒｅ、ｐＭＵ１ｓ－ｖｓｉｅ４０ｍａｔ、ｐＭＵ１ｓ－ｖｓｉｅ４０Ｈｉｓｍａｔベクターを得た（図９）。いくつかの陽性クローンを制限酵素マッピングで解析し、続いてヌクレオチド配列決定で検証した。すべての構築物は、プラスミドをアプラマイシン耐性（ＡｐｒＲ）選択でＳ．リビダンスＴＫ２４に結合させた後、ファージＰｈｉＢＴ１ベースの組み込みシステムを用いてＳ．リビダンスＴＫ２４の染色体の単一位置に組み込むことができる。最終構築物は安定であり、ＡｐｒＲ選択は不要である。
【0062】
実施例６
ｋａｓＯｐ＊プロモーター、ＲＢＳ、およびｅ４０（その元のシグナルペプチドまたはＶｓｉシグナルペプチドの下、末端に６ｘＨｉｓ標識有りと標識無し）を含むすべてのカセットを、１４００ｂｐのＫｐｎＩ－ＥｃｏＲＶ ＤＮＡ断片として、ｐＬｉｔ－ｅ４０、ｐＬｉｔ－ｅ４０Ｈｉｓ、ｐＬｉｔ－ｖｓｉｅ４０ｐｒｅ、ｐＬｉｔ－ｅ４０Ｈｉｓｐｒｅ、ｐＬｉｔｖｓｉｅ４０ＨＱＨｉｓｐｒｅ、ｐＬｉｔ－ｖｓｉｅ４０ｍａｔ、ｐＬｉｔ－ｖｓｉｅ４０Ｈｉｓｍａｔ（図６、８）から、ＫｐｎＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＩＪ８６にクローニングし、ｐＩＪ８６－ｋａｓＯｐｅ４０、ｐＩＪ８６－ｋａｓＯｐｅ４０Ｈｉｓ、ｐＩＪ８６－ｖｓｉｅ４０ｐｒｅ、ｐＩＪ８６－ｖｓｉｅ４０Ｈｉｓｐｒｅ、ｐＩＪ８６－ｖｓｉｅ４０ＨＱＨｉｓｐｒｅ、ｐＩＪ８６－ｖｓｉｅ４０ｍａｔ、ｐＩＪ８６－ｖｓｉｅ４０Ｈｉｓｍａｔベクターを得た（図１０）。いくつかの陽性クローンを制限酵素マッピングで解析し、続いてヌクレオチド配列決定で検証した。すべての構築物は、プラスミドをＳ．リビダンスＴＫ２４にＡｐｒＲ選択で接合した後、高コピー数（約１００－３００コピー）でＳ．リビダンスＴＫ２４で複製することができる。しかし、永続的なＡｐｒＲ選択が必要であり、若干の不安定性が報告されている。
ｋａｓＯｐ＊プロモーター、ＲＢＳ、およびｅ４０（その元のシグナルペプチドまたはＶｓｉシグナルペプチドの下、末端に６ｘＨｉｓ標識有りと標識無し）を含むすべてのカセットを、１４００ｂｐのＫｐｎＩ－ＥｃｏＲＶ ＤＮＡ断片として、ｐＬｉｔ－ｅ４０、ｐＬｉｔ－ｅ４０Ｈｉｓ、ｐＬｉｔ－ｖｓｉｅ４０ｐｒｅ、ｐＬｉｔ－ｅ４０Ｈｉｓｐｒｅ、ｐＬｉｔｖｓｉｅ４０ＨＱＨｉｓｐｒｅ、ｐＬｉｔ－ｖｓｉｅ４０ｍａｔ、ｐＬｉｔ－ｖｓｉｅ４０Ｈｉｓｍａｔ（図６、８）から、ＫｐｎＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＩＪ８６にクローニングし、ｐＩＪ８６－ｋａｓＯｐｅ４０、ｐＩＪ８６－ｋａｓＯｐｅ４０Ｈｉｓ、ｐＩＪ８６－ｖｓｉｅ４０ｐｒｅ、ｐＩＪ８６－ｖｓｉｅ４０Ｈｉｓｐｒｅ、ｐＩＪ８６－ｖｓｉｅ４０ＨＱＨｉｓｐｒｅ、ｐＩＪ８６－ｖｓｉｅ４０ｍａｔ、ｐＩＪ８６－ｖｓｉｅ４０Ｈｉｓｍａｔベクターを得た（図１０）。いくつかの陽性クローンを制限酵素マッピングで解析し、続いてヌクレオチド配列決定で検証した。すべての構築物は、プラスミドをＳ．リビダンスＴＫ２４にＡｐｒＲ選択で接合した後、高コピー数（約１００－３００コピー）でＳ．リビダンスＴＫ２４で複製することができる。しかし、永続的なＡｐｒＲ選択が必要であり、若干の不安定性が報告されている。
【0063】
最後に、高コピー数シャトルプラスミドｐＩＪ８６／ｅ４０Ｈｉｓからの１５００ｂｐ ＸｂａＩ（クレノウ充填）－ＨｉｎｄＩＩＩ断片を、ＥｃｏＲＶとＨｉｎｄＩＩＩで切断したｐＭＵ１ｓ－ｖｓｉＲＦＰＢベクターにクローニングし、ｐＭＵ１ｓ－ｅｒｍＥｅ４０を得た（図１１）。プラスミドは配列決定によって検証した。
【0064】
実施例７
先行技術の株Ｓ．リビダンス／ｐＩＪ８６／ｅ４０Ｈｉｓを用いたＥ４０活性を測定した。まず、固体のベネットおよびアプラマイシン（Ａｐｒ）培地上での胞子形成後、胞子ストックを調製した。混合胞子と５つの独立した胞子形成コロニーからの胞子の安定性を試験した。コンフルエントな混合胞子（または５つの大きな単一胞子形成コロニー全体）からの１×１ｃｍの胞子形成領域からの胞子懸濁液を、１０ｍｌの培地Ｖ（グルコース２０ｇ／Ｌ、酵母抽出物Ｄｉｆｃｏ ５ｇ／Ｌ、大豆ペプトン Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ １０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ １．５ｇ／Ｌ）を含む三角フラスコ（１００ｍｌ）に接種し、Ａｐｒを最終的に５０μｇ／ｍｌまで添加し、回転振盪機上で２００ｒｐｍ、３０℃で１日間培養した。５個のビーズ（３．５ｍｍ）を加え、さらに１日培養を続けた。この種培養物２ｍｌを、２０ｍｌの培地Ｐ（スクロース３４０ｇ／Ｌ、グルコース１０ｇ／Ｌ、酵母エキス３ｇ／Ｌ、大豆ペプトン５ｇ／Ｌ、麦芽エキス３ｇ／Ｌ）を含む三角フラスコ（１００ｍｌ）に接種し、Ａｐｒを最終的に５０μｇ／ｍｌまで添加し、同じ条件で培養した。２日、５日、６日、７日、８日の時点で、培地１ｍｌをエッペンドルフチューブに取り、遠心分離（１３０００ｒｐｍで１０分間）を行い、上清を新しいチューブに移し、－２０℃で保存した。Ｅ４０活性は、サンプルを４０倍希釈してＳＳＡプロトコル（標準活性アッセイ、ＳＳＡ、９６ウェル透明マイクロタイタープレートで行い、Ｂｉｏｔｅｃマイクロプレートリーダー（Ａ４０５）で測定）によって測定した。５つの独立したコロニーと混合培養物のすべてにおいて、約２０ＡＵ／ｍｌの同等のＥ４０活性が測定された。サンプルはＳＤＳ－ＰＡＧＥでも分析し、すべてＥ４０ ３８ｋＤａのバンドを示した（図示せず）。
先行技術の株Ｓ．リビダンス／ｐＩＪ８６／ｅ４０Ｈｉｓを用いたＥ４０活性を測定した。まず、固体のベネットおよびアプラマイシン（Ａｐｒ）培地上での胞子形成後、胞子ストックを調製した。混合胞子と５つの独立した胞子形成コロニーからの胞子の安定性を試験した。コンフルエントな混合胞子（または５つの大きな単一胞子形成コロニー全体）からの１×１ｃｍの胞子形成領域からの胞子懸濁液を、１０ｍｌの培地Ｖ（グルコース２０ｇ／Ｌ、酵母抽出物Ｄｉｆｃｏ ５ｇ／Ｌ、大豆ペプトン Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ １０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ １．５ｇ／Ｌ）を含む三角フラスコ（１００ｍｌ）に接種し、Ａｐｒを最終的に５０μｇ／ｍｌまで添加し、回転振盪機上で２００ｒｐｍ、３０℃で１日間培養した。５個のビーズ（３．５ｍｍ）を加え、さらに１日培養を続けた。この種培養物２ｍｌを、２０ｍｌの培地Ｐ（スクロース３４０ｇ／Ｌ、グルコース１０ｇ／Ｌ、酵母エキス３ｇ／Ｌ、大豆ペプトン５ｇ／Ｌ、麦芽エキス３ｇ／Ｌ）を含む三角フラスコ（１００ｍｌ）に接種し、Ａｐｒを最終的に５０μｇ／ｍｌまで添加し、同じ条件で培養した。２日、５日、６日、７日、８日の時点で、培地１ｍｌをエッペンドルフチューブに取り、遠心分離（１３０００ｒｐｍで１０分間）を行い、上清を新しいチューブに移し、－２０℃で保存した。Ｅ４０活性は、サンプルを４０倍希釈してＳＳＡプロトコル（標準活性アッセイ、ＳＳＡ、９６ウェル透明マイクロタイタープレートで行い、Ｂｉｏｔｅｃマイクロプレートリーダー（Ａ４０５）で測定）によって測定した。５つの独立したコロニーと混合培養物のすべてにおいて、約２０ＡＵ／ｍｌの同等のＥ４０活性が測定された。サンプルはＳＤＳ－ＰＡＧＥでも分析し、すべてＥ４０ ３８ｋＤａのバンドを示した（図示せず）。
【0065】
実施例８
Ｅ４０活性を、先行技術のプラスミドｐＩＪ８６、ｐＩＪ８６／ｅ４０、およびｐＩＪ８６／ｅ４０Ｈｉｓと結合した２つのＳ．リビダンス株、野生型ＴＫ２４および変異型Ｓ．リビダンスＲｅｄＳｔｒｅｐ１．３を用いて測定した。胞子形成した培養物を、１０ｍｌのＮｉｅｄｅｒｃｏｒｎ培地（３％スクロース、２％コーンスティープリカー、０．２％硫酸アンモニウム、０．７％ＣａＣＯ３、ｐＨ７、蒸留水中）を含む三角フラスコ（１００ｍｌ）に接種し、Ａｐｒを最終的に５０μｇ／ｍｌまで添加し、回転振盪機上で２００ｒｐｍ、３０℃で２日間培養した。
Ｅ４０活性を、先行技術のプラスミドｐＩＪ８６、ｐＩＪ８６／ｅ４０、およびｐＩＪ８６／ｅ４０Ｈｉｓと結合した２つのＳ．リビダンス株、野生型ＴＫ２４および変異型Ｓ．リビダンスＲｅｄＳｔｒｅｐ１．３を用いて測定した。胞子形成した培養物を、１０ｍｌのＮｉｅｄｅｒｃｏｒｎ培地（３％スクロース、２％コーンスティープリカー、０．２％硫酸アンモニウム、０．７％ＣａＣＯ３、ｐＨ７、蒸留水中）を含む三角フラスコ（１００ｍｌ）に接種し、Ａｐｒを最終的に５０μｇ／ｍｌまで添加し、回転振盪機上で２００ｒｐｍ、３０℃で２日間培養した。
【0066】
この種培養物２ｍｌを、２０ｍｌの培地Ｐを含む三角フラスコ（１００ｍｌ）に接種した。Ｅ４０活性を、３、４、５、６、７日目に採取した培養物の上清からなるサンプルの４０倍希釈物を用いて、上記のＳＳＡプロトコルにより測定した。ベクターｐＩＪ８６単独の場合、両方の株で低いバックグラウンドプロテアーゼ活性のみが示された。両構築物ｐＩＪ８６／ｅ４０およびｐＩＪ８６／ｅ４０ＨｉｓのＥ４０活性は、ＴＫ２４株では約１５ＡＵ／ｍｌであり、ＲｅｄＳｔｒｅｐ１．３株では約２０ＡＵ／ｍｌであった（図１２）。
【0067】
実施例９
対照プラスミドｐＭＵ１ｓ－ｅｒｍＥｅ４０を用いて、野生型Ｓ．リビダンスＴＫ２４株と３つの変異株Ｓ．リビダンスＲｅｄＳｔｒｅｐ１．３；１．６；１．９のＥ４０活性を測定した（図１１）。培養物を実施例８と同様に調製した。
対照プラスミドｐＭＵ１ｓ－ｅｒｍＥｅ４０を用いて、野生型Ｓ．リビダンスＴＫ２４株と３つの変異株Ｓ．リビダンスＲｅｄＳｔｒｅｐ１．３；１．６；１．９のＥ４０活性を測定した（図１１）。培養物を実施例８と同様に調製した。
【0068】
単一コピーの染色体組み込み構築物ｐＭＵ１ｓ－ｅｒｍＥｅ４０では、Ｅ４０活性は実施例８の高コピー数ｐＩＪ８６ベクターによる活性に比べてはるかに低かった：野生型Ｓ．リビダンスＴＫ２４においてはｐＭＵ１ｓ－ｅｒｍＥｅ４０では１．１３ＡＵ／ｍｌ、ＲｅｄＳｔｒｅｐ１．６と１．９株においては約３倍高かった（図１３）。
【0069】
実施例１０
Ｅ４０活性を、ｋａｓＯｐ＊プロモーター、強力なＳＲ４０ ＲＢＳ、およびそのオリジナルのシグナルペプチドを有するｅ４０（Ｃ末端ｘＨｉｓ標識無しおよび標識有り）を含むシングルサイト組み込みプラスミドｐＭＵ１ｓ－ｅ４０およびｐＭＵ１ｓ－ｅ４０Ｈｉｓの４つのクローンと結合した野生型Ｓ．リビダンスＴＫ２４株で測定した。培養物を実施例８と同様に調製した。
Ｅ４０活性を、ｋａｓＯｐ＊プロモーター、強力なＳＲ４０ ＲＢＳ、およびそのオリジナルのシグナルペプチドを有するｅ４０（Ｃ末端ｘＨｉｓ標識無しおよび標識有り）を含むシングルサイト組み込みプラスミドｐＭＵ１ｓ－ｅ４０およびｐＭＵ１ｓ－ｅ４０Ｈｉｓの４つのクローンと結合した野生型Ｓ．リビダンスＴＫ２４株で測定した。培養物を実施例８と同様に調製した。
【0070】
プラスミドｐＭＵ１ｓ－ｅ４０を含む３クローン（Ｎｏ．１、２、３）では、Ｅ４０活性は同等の約５５ＡＵ／ｍｌであったが、クローンＮｏ．４では活性ははるかに高かった（２６０ＡＵ／ｍｌ）（図１４Ａ）。同様に、プラスミドｐＭＵ１ｓ－ｅ４０Ｈｉｓを含む３つのクローン（Ｎｏ．１、２、４）では、Ｅ４０活性は同程度の約４５ＡＵ／ｍｌであったが、クローンＮｏ．３では活性ははるかに高かった（１８０ＡＵ／ｍｌ）（図１４Ｂ）。３つの類似クローンと実施例６の単一コピー組み込みプラスミドｐＭＵ１ｓ－ｅｒｍＥｅ４０の比較に基づいて、ｐＭＵ１ｓ－ｅ４０およびｐＭＵ１ｓ－ｅ４０Ｈｉｓは、それぞれ約５０倍と４０倍のＥ４０活性の増加を示す。
【0071】
実施例１１
ｋａｓＯｐ＊プロモーター、強力なＳＲ４０ ＲＢＳ、およびその元のシグナルペプチドまたはｖｓｉシグナルペプチドを有するｅ４０（Ｃ末端Ｈｉｓ標識無しおよび標識有り）を含む高コピーベクターｐＩＪ８６と結合した野生型Ｓ．リビダンスＴＫ２４株からの４つの独立したクローンでＥ４０活性を分析した（ｐＩＪ８６－ｋａｓＯｐｅ４０、ｐＩＪ８６－ｋａｓＯｐｅ４０Ｈｉｓ、ｐＩＪ８６－ｖｓｉｅ４０ｐｒｅ、ｐＩＪ８６－ｖｓｉｅ４０Ｈｉｓｐｒｅ、ｐＩＪ８６－ｖｓｉｅ４０ＨＱＨｉｓｐｒｅ、ｐＩＪ８６－ｖｓｉｅ４０ｍａｔ、ｐＩＪ８６－ｖｓｉｅ４０Ｈｉｓｍａｔ）。その結果、クローン化カセットｋａｓＯｐ＊プロモーター、強力なＳＲ４０ ＲＢＳおよびｅ４０を含むこの高コピー数ベクターが、元のシグナルペプチドを含むもの（図１５）またはＶｓｉシグナルペプチドと融合しているもの（図１６）（Ｃ末端ｘＨｉｓ標識無しおよび標識有り）のいずれにおいても、非常に不安定であることが示された。実際、ｐＩＪ８６－ｋａｓＯｐｅ４０の４つのクローンの場合、４つのクローンのうちの１つは非常に高いＥ４０活性（１５０ＡＵ／ｍｌ）を有し、１つはＥ４０活性が４０ＡＵ／ｍｌであり、他の２つのクローンは活性がゼロであった（図１５Ａ）。同様に、ｐＩＪ８６－ｋａｓＯｐｅ４０Ｈｉｓの４つのクローンの場合、１つのクローンのＥ４０活性はかなり高く（５１ＡＵ／ｍｌ）、もう１つのクローンのＥ４０活性は３８ＡＵ／ｍｌであり、他の２つのクローンの活性はゼロであった（図１５Ｂ）。
ｋａｓＯｐ＊プロモーター、強力なＳＲ４０ ＲＢＳ、およびその元のシグナルペプチドまたはｖｓｉシグナルペプチドを有するｅ４０（Ｃ末端Ｈｉｓ標識無しおよび標識有り）を含む高コピーベクターｐＩＪ８６と結合した野生型Ｓ．リビダンスＴＫ２４株からの４つの独立したクローンでＥ４０活性を分析した（ｐＩＪ８６－ｋａｓＯｐｅ４０、ｐＩＪ８６－ｋａｓＯｐｅ４０Ｈｉｓ、ｐＩＪ８６－ｖｓｉｅ４０ｐｒｅ、ｐＩＪ８６－ｖｓｉｅ４０Ｈｉｓｐｒｅ、ｐＩＪ８６－ｖｓｉｅ４０ＨＱＨｉｓｐｒｅ、ｐＩＪ８６－ｖｓｉｅ４０ｍａｔ、ｐＩＪ８６－ｖｓｉｅ４０Ｈｉｓｍａｔ）。その結果、クローン化カセットｋａｓＯｐ＊プロモーター、強力なＳＲ４０ ＲＢＳおよびｅ４０を含むこの高コピー数ベクターが、元のシグナルペプチドを含むもの（図１５）またはＶｓｉシグナルペプチドと融合しているもの（図１６）（Ｃ末端ｘＨｉｓ標識無しおよび標識有り）のいずれにおいても、非常に不安定であることが示された。実際、ｐＩＪ８６－ｋａｓＯｐｅ４０の４つのクローンの場合、４つのクローンのうちの１つは非常に高いＥ４０活性（１５０ＡＵ／ｍｌ）を有し、１つはＥ４０活性が４０ＡＵ／ｍｌであり、他の２つのクローンは活性がゼロであった（図１５Ａ）。同様に、ｐＩＪ８６－ｋａｓＯｐｅ４０Ｈｉｓの４つのクローンの場合、１つのクローンのＥ４０活性はかなり高く（５１ＡＵ／ｍｌ）、もう１つのクローンのＥ４０活性は３８ＡＵ／ｍｌであり、他の２つのクローンの活性はゼロであった（図１５Ｂ）。
【0072】
同様に、Ｓ．リビダンスＴＫ２４のプラスミドｐＩＪ８６－ｖｓｉｅ４０ｐｒｅ、ｐＩＪ８６－ｖｓｉｅ４０Ｈｉｓｐｒｅ、ｐＩＪ８６－ｖｓｉｅ４０ＨＱＨｉｓｐｒｅ、ｐＩＪ８６－ｖｓｉｅ４０ｍａｔ、ｐＩＪ８６－ｖｓｉｅ４０Ｈｉｓｍａｔの４つのクローンの場合、試験したすべてのクローンでＥ４０活性は非常に低かった（０．５～２．５ＡＵ／ｍｌ）（図１６Ａ－Ｄ）。これらの結果は、単一コピーの染色体に組み込まれた対応物であるｐＭＵ１ｓ－ｅ４０およびｐＭＵ１ｓ－ｅ４０Ｈｉｓが安定で高いＥ４０活性を有していたため（図１４）、驚くべきものであった。
【0073】
実施例１２
ｋａｓＯｐ＊プロモーター、強力なＳＲ４０ ＲＢＳ、およびＶｓｉシグナルペプチドに融合したｅ４０のプロ酵素部分を含むプラスミドｐＭＵ１ｓ－ｖｓｉｅ４０ｐｒｅおよびｐＭＵ１ｓ－ｖｓｉｅ４０Ｈｉｓｐｒｅを用いた４つのクローンすべてで、高いＥ４０活性が認められた（図１７）。プラスミドｐＭＵ１ｓ－ｖｓｉｅ４０ｐｒｅの場合、約５０ＡＵ／ｍｌのＥ４０活性があり、１つのクローンでは最大８５ＡＵ／ｍｌであった（図１７Ａ）。同様に、プラスミドｐＭＵ１ｓ－ｖｓｉｅ４０Ｈｉｓｐｒｅでは、３つのクローンでは約３０ＡＵ／ｍｌ、１つのクローンでは８４ＡＵ／ｍｌの同等のＥ４０活性があった（図１７Ｂ）。これらのＥ４０活性と、実施例９の対照単一コピー組み込みプラスミドｐＭＵ１ｓ－ｅｒｍＥｅ４０と結合した細胞からのＥ４０活性との比較に基づくと、構築物ｐＭＵ１ｓ－ｖｓｉｅ４０ｐｒｅのＥ４０活性は約４５倍（最も活性の高いクローンでは７５倍）増加し、構築物ｐＭＵ１ｓ－ｖｓｉｅ４０ＨｉｓｐｒｅのＥ４０活性は約２６倍増加している（最も活性の高いクローンでは７５倍にもなる）。これらのクローンを、ＴＫ２４の高コピー数プラスミドｐＩＪ８６／ｅ４０Ｈｉｓを有するクローンと比較すると、２つの最良のクローンは５．６倍高いＥ４０活性を示した。さらに、これらのクローンは高い安定性を示した。
ｋａｓＯｐ＊プロモーター、強力なＳＲ４０ ＲＢＳ、およびＶｓｉシグナルペプチドに融合したｅ４０のプロ酵素部分を含むプラスミドｐＭＵ１ｓ－ｖｓｉｅ４０ｐｒｅおよびｐＭＵ１ｓ－ｖｓｉｅ４０Ｈｉｓｐｒｅを用いた４つのクローンすべてで、高いＥ４０活性が認められた（図１７）。プラスミドｐＭＵ１ｓ－ｖｓｉｅ４０ｐｒｅの場合、約５０ＡＵ／ｍｌのＥ４０活性があり、１つのクローンでは最大８５ＡＵ／ｍｌであった（図１７Ａ）。同様に、プラスミドｐＭＵ１ｓ－ｖｓｉｅ４０Ｈｉｓｐｒｅでは、３つのクローンでは約３０ＡＵ／ｍｌ、１つのクローンでは８４ＡＵ／ｍｌの同等のＥ４０活性があった（図１７Ｂ）。これらのＥ４０活性と、実施例９の対照単一コピー組み込みプラスミドｐＭＵ１ｓ－ｅｒｍＥｅ４０と結合した細胞からのＥ４０活性との比較に基づくと、構築物ｐＭＵ１ｓ－ｖｓｉｅ４０ｐｒｅのＥ４０活性は約４５倍（最も活性の高いクローンでは７５倍）増加し、構築物ｐＭＵ１ｓ－ｖｓｉｅ４０ＨｉｓｐｒｅのＥ４０活性は約２６倍増加している（最も活性の高いクローンでは７５倍にもなる）。これらのクローンを、ＴＫ２４の高コピー数プラスミドｐＩＪ８６／ｅ４０Ｈｉｓを有するクローンと比較すると、２つの最良のクローンは５．６倍高いＥ４０活性を示した。さらに、これらのクローンは高い安定性を示した。
【0074】
ｋａｓＯｐ＊プロモーター、強力なＲＢＳ、およびＶｓｉシグナルペプチドに融合した３８Ｈｉｓ／Ｇｌｎ変異を持つｅ４０のプロ酵素部分を含むプラスミドｐＭＵ１ｓ－ｖｓｉｅ４０ＨｉｓＨＱｐｒｅは、その野生型のバリアント（約２７ＡＵ／ｍｌ）と比較してＥ４０活性が部分的に低下したことを示した。
【0075】
実施例１３
ｐＭＵ１ｓ－ｅ４０およびｐＭＵ１ｓ－ｅ４０ＨｉｓをＳ．リビダンス変異株ＲｅｄＳｔｒｅｐ１．３、１．６および１．９と結合した。Ｅ４０活性を、野生型Ｓ．リビダンスＴＫ２４株において、先に分析した実施例１０の４つのクローンとともに４つの独立したクローンで分析した。ｐＭＵ１ｓ－ｅ４０の場合、Ｅ４０活性はＴＫ２４株（５６±７ＡＵ／ｍｌ）よりもＲｅｄＳｔｒｅｐ１．３（７５±１３ＡＵ／ｍｌ）の方が明らかに高かった。ｐＭＵ１ｓ－ｅ４０の場合、Ｅ４０活性はＴＫ２４（５６±７ＡＵ／ｍｌ）よりもＲｅｄＳｔｒｅｐ１．３（７５±１３ＡＵ／ｍｌ）の方が明らかに高かった。Ｅ４０活性はＲｅｄＳｔｒｅｐ１．６（６７±２４ＡＵ／ｍｌ）でも高かったが、ＲｅｄＳｔｒｅｐ１．９のＥ４０活性はＴＫ２４と同程度であった（５２±７ＡＵ／ｍｌ）（図１８Ａ）。ｐＭＵ１ｓ－ｅ４０Ｈｉｓの場合、Ｅ４０活性は４つの株すべてで同様であった：ＷＴ ＴＫ２４（３３±７ＡＵ／ｍｌ）、ＲｅｄＳｔｒｅｐ１．３（２９±６ＡＵ／ｍｌ）、ＲｅｄＳｔｒｅｐ１．６（３１±７ＡＵ／ｍｌ）、ＲｅｄＳｔｒｅｐ１．９（３１±７ＡＵ／ｍｌ）（図１８Ｂ）。
ｐＭＵ１ｓ－ｅ４０およびｐＭＵ１ｓ－ｅ４０ＨｉｓをＳ．リビダンス変異株ＲｅｄＳｔｒｅｐ１．３、１．６および１．９と結合した。Ｅ４０活性を、野生型Ｓ．リビダンスＴＫ２４株において、先に分析した実施例１０の４つのクローンとともに４つの独立したクローンで分析した。ｐＭＵ１ｓ－ｅ４０の場合、Ｅ４０活性はＴＫ２４株（５６±７ＡＵ／ｍｌ）よりもＲｅｄＳｔｒｅｐ１．３（７５±１３ＡＵ／ｍｌ）の方が明らかに高かった。ｐＭＵ１ｓ－ｅ４０の場合、Ｅ４０活性はＴＫ２４（５６±７ＡＵ／ｍｌ）よりもＲｅｄＳｔｒｅｐ１．３（７５±１３ＡＵ／ｍｌ）の方が明らかに高かった。Ｅ４０活性はＲｅｄＳｔｒｅｐ１．６（６７±２４ＡＵ／ｍｌ）でも高かったが、ＲｅｄＳｔｒｅｐ１．９のＥ４０活性はＴＫ２４と同程度であった（５２±７ＡＵ／ｍｌ）（図１８Ａ）。ｐＭＵ１ｓ－ｅ４０Ｈｉｓの場合、Ｅ４０活性は４つの株すべてで同様であった：ＷＴ ＴＫ２４（３３±７ＡＵ／ｍｌ）、ＲｅｄＳｔｒｅｐ１．３（２９±６ＡＵ／ｍｌ）、ＲｅｄＳｔｒｅｐ１．６（３１±７ＡＵ／ｍｌ）、ＲｅｄＳｔｒｅｐ１．９（３１±７ＡＵ／ｍｌ）（図１８Ｂ）。
【0076】
実施例１４
ｐＭＵ１ｓ－ｖｓｉｅ４０ｐｒｅおよびｐＭＵ１ｓ－ｖｓｉｅ４０Ｈｉｓｐｒｅ（ｋａｓＯｐ＊プロモーター、強力なＳＲ４０ ＲＢＳ、およびＶｓｉシグナルペプチドに融合したｅ４０のプロ酵素部分を含む）を、ＲｅｄＳｔｒｅｐ１．３、１．６および１．９変異株に結合させ、Ｅ４０活性を、野生型Ｓ．リビダンスＴＫ２４株において、先に分析した実施例１２の４つのクローンとともに４つの独立したクローンで分析した。組換え細胞は実施例８と同様に増殖させた。
ｐＭＵ１ｓ－ｖｓｉｅ４０ｐｒｅおよびｐＭＵ１ｓ－ｖｓｉｅ４０Ｈｉｓｐｒｅ（ｋａｓＯｐ＊プロモーター、強力なＳＲ４０ ＲＢＳ、およびＶｓｉシグナルペプチドに融合したｅ４０のプロ酵素部分を含む）を、ＲｅｄＳｔｒｅｐ１．３、１．６および１．９変異株に結合させ、Ｅ４０活性を、野生型Ｓ．リビダンスＴＫ２４株において、先に分析した実施例１２の４つのクローンとともに４つの独立したクローンで分析した。組換え細胞は実施例８と同様に増殖させた。
【0077】
ｐＭＵ１ｓ－ｖｓｉｅ４０ｐｒｅベクターの場合、Ｅ４０活性はＴＫ２４（２８．７５±６．２ＡＵ／ｍｌ）よりもＲｅｄＳｔｒｅｐ１．３（４０±１３．３ＡＵ／ｍｌ）の方が高かった。ＲｅｄＳｔｒｅｐ１．６（２９．７５±３．８ＡＵ／ｍｌ）のＥ４０活性は、ＷＴ ＴＫ２４株と同様であった。（図１９Ａ）。ｐＭＵ１ｓ－ｖｓｉｅ４０Ｈｉｓｐｒｅベクターの場合、Ｅ４０活性はＲｅｄＳｔｒｅｐ１．３（３０±３．５ＡＵ／ｍｌ）では再び高く、ＲｅｄＳｔｒｅｐ１．６（２４．７５±０．９ＡＵ／ｍｌ）、ＲｅｄＳｔｒｅｐ１．６（３１±７ＡＵ／ｍｌ）では同様であったが、ＲｅｄＳｔｒｅｐ１．９（２２±２．９ＡＵ／ｍｌ）ではより低かった（図１９Ｂ）。
【0078】
実験データは、本発明によるＰｈｉＢＴ１ファージインテグラーゼに基づく組み込みベクター（ｐＭＵ１ｓ－ｅ４０、ｐＭＵ１ｓ－ｅ４０Ｈｉｓ、ｐＭＵ１ｓ－ｖｓｉｅ４０ｐｒｅ、ｐＭＵ１ｓ－ｖｓｉｅ４０Ｈｉｓｐｒｅ、ｐＭＵ１ｓ－ｖｓｉｅ４０ＨＨＱＨｉｓｐｒｅ、ｐＭＵ１ｓ－ｖｓｉｅ４０ｍａｔ、ｐＭＵ１ｓ－ｖｓｉｅ４０Ｈｉｓｍａｔ）が、Ｅ４０の安定で高い生産を提供することを示す。ｐＭＵ１ｓ－ｅ４０およびｐＭＵ１ｓ－ｅ４０Ｈｉｓベクターは、ｋａｓＯｐ＊プロモーター、最適な強いＳＲ４０ ＲＢＳ、元のシグナルペプチド配列、それに続く元のｅ４０またはｅ４０Ｈｉｓを含み、それぞれ平均５０ＡＵ／ｍｌまたは３５ＡＵ／ｍｌの酵素を生産する最良のベクターである。さらに、Ｅ４０生産に最適な宿主細胞株はＳ．リビダンスＲｅｄＳｔｒｅｐ１．３である。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14A】
【図14B】
【図15A】
【図15B】
【図16A】
【図16B】
【図16C】
【図16D】
【図17A】
【図17B】
【図18A】
【図18B】
【図19A】
【図19B】
【配列表】
【国際調査報告】