ホーム > 特許ランキング > ＶＣＲＥＡＴＥ， ＩＮＣ．
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-07-12
(54)【発明の名称】新規のＴ細胞受容体を作製するための組成物および方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6869 20180101AFI20240705BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240705BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20240705BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20240705BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20240705BHJP
C12N 15/867 20060101ALI20240705BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20240705BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6869 Z ZNA
C12N5/10
C12Q1/02
C12N15/62 Z
C12N15/09 110
C12N15/867 Z
C12N15/12
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024502111
(86)(22)【出願日】2022-07-12
(85)【翻訳文提出日】2024-03-06
(86)【国際出願番号】 US2022036841
(87)【国際公開番号】W WO2023287803
(87)【国際公開日】2023-01-19
(31)【優先権主張番号】63/300,905
(32)【優先日】2022-01-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/344,221
(32)【優先日】2022-05-20
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/222,130
(32)【優先日】2021-07-15
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】524016943
【氏名又は名称】ブイクリエイト・インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】ＶＣＲＥＡＴＥ， ＩＮＣ．
(74)【代理人】
【識別番号】110001195
【氏名又は名称】弁理士法人深見特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】チェン，ビンビン
(72)【発明者】
【氏名】ファスト，イーサン
【テーマコード（参考）】
4B063
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B063QA07
4B063QA13
4B063QQ08
4B063QQ13
4B063QQ42
4B063QR08
4B063QR62
4B063QS32
4B063QS39
4B063QX02
4B065AA93X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA44
4B065CA46
(57)【要約】
本開示は、概して、Ｔ細胞受容体またはＴ細胞受容体ミミックの分野、および新規のＴ細胞受容体または新規のＴ細胞受容体ミミックを得るための方法に関する。記載した組成物および方法は、Ｔ細胞受容体および抗原の対を同定する。組成物および方法はハイスループット解析を可能にし、多くの抗原がＴ細胞受容体の大きなレパートリーと対合され得る。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｔ細胞受容体またはＴ細胞受容体ミミックを得るための方法であって、キメラＴ細胞受容体またはＴ細胞受容体ミミックのレパートリーをコードする第１の複数の核酸を含む複数の操作した免疫細胞を、その天然の機能を減少させる少なくとも１つの突然変異を含む突然変異ウイルスエンベロープタンパク質、およびリガンドライブラリーをコードする複数の核酸、ならびにバーコードおよびＣＲＩＳＰＲ編集システムと相互作用し、免疫細胞のゲノム内の部位にＰｅｇＲＮＡの挿入を指示する第２の核酸配列を含む前記ＰｅｇＲＮＡを含む複数のレンチウイルス粒子と混合することであって、前記リガンドライブラリーからのリガンドが各レンチウイルス粒子の表面に存在する、混合すること；前記操作した免疫細胞に前記レンチウイルス粒子によって形質導入することであって、前記レンチウイルス粒子のリガンドが前記免疫細胞の前記Ｔ細胞受容体または前記Ｔ細胞受容体ミミックに結合する、形質導入すること；前記操作した免疫細胞においてレポーターをコードする核酸を発現すること；前記レポーターを発現する免疫細胞を単離すること；ならびに前記Ｔ細胞受容体または前記Ｔ細胞受容体ミミックをコードする前記核酸および前記バーコードをシークエンシングすることの工程を含む方法。
【請求項2】
前記リガンドが抗原である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記抗原がＭＨＣ分子に融合されるか、またはＭＨＣ分子によって提示される、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記免疫細胞が、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、好中球、マクロファージまたは単球である、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項5】
前記ＴＣＲミミックが、一本鎖抗原相互作用受容体を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項6】
前記ＴＣＲミミック受容体が、共活性化ドメインをさらに含み、前記共活性化ドメインが、ＣＤ３ζ、ＣＤ２８、Ｂ７．１、ＣＤ１３７、ＣＤ１９細胞内活性化ドメイン、ＣＤ６４細胞内活性化ドメイン、ＣＤ３２細胞内活性化ドメイン、ＣＤ１６細胞内活性化ドメイン、ＣＤ２３細胞内活性化ドメイン、またはＬｃｋ活性化ドメインからなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
Ｔ細胞受容体またはＴ細胞受容体ミミックの前記レパートリーが、対象からの複数のＴ細胞のゲノムＤＮＡ、または対象からの複数のＴ細胞から得られた複数のｃＤＮＡに由来する、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項8】
Ｔ細胞受容体またはＴ細胞受容体ミミックの前記レパートリーが、抗原ライブラリーに対してナイーブである対象から、または前記抗原ライブラリーの１つもしくは複数の抗原に対して免疫応答を開始した対象から得られる、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項9】
Ｔ細胞受容体またはＴ細胞受容体ミミックを得るための方法であって、キメラＴ細胞受容体またはＴ細胞受容体ミミックのレパートリーをコードする第１の複数の核酸を含む複数のマクロファージ細胞を、光学レポーター、および抗原ライブラリーをコードする第２の複数の核酸を含む複数の抗原提示細胞と混合することであって、前記抗原ライブラリーの抗原が抗原からのペプチドとＭＨＣ分子の融合体である、混合すること；前記複数のマクロファージ細胞においてキメラＴ細胞受容体の前記レパートリーをコードする前記複数の核酸を発現すること；前記複数の抗原提示細胞において前記抗原ライブラリーをコードする前記複数の核酸を発現すること；抗原提示細胞を貪食したマクロファージ細胞を単離すること；ならびに前記第１の複数の核酸と前記第２の複数の核酸をシークエンシングすることの工程を含む方法。
【請求項10】
Ｔ細胞受容体またはＴ細胞受容体ミミックを得るための方法であって、キメラＴ細胞受容体またはＴ細胞受容体ミミックのレパートリーをコードする第１の複数の核酸を含む複数の操作した免疫細胞を、光学レポーターに結合した膜および抗原ライブラリーをコードする第２の複数の核酸を含む、複数の抗原提示細胞と混合することであって、前記抗原ライブラリーの抗原がＭＨＣ分子によって融合されるかまたは提示され、前記操作した免疫細胞の膜が核酸バーコードのセットと結び付けられ、前記抗原提示細胞の膜が核酸バーコードの第２のセットと結び付けられる、混合すること；前記複数のＴ細胞においてキメラＴ細胞受容体の前記レパートリーをコードする前記複数の核酸を発現すること；前記複数の抗原提示細胞において前記抗原ライブラリーをコードする前記複数の核酸を発現すること；前記抗原提示細胞の前記膜をトロゴサイトーシスした免疫細胞を単離することまたは前記免疫細胞の前記膜をトロゴサイトーシスした抗原提示細胞を単離すること；ならびに前記単離した免疫細胞または前記単離した抗原提示細胞からの前記第１のバーコードおよび前記第２のバーコードをシークエンシングすることの工程を含む方法。
【請求項11】
前記第１の複数の核酸が複数の異なる核酸バーコードをさらに含み、各Ｔ細胞受容体またはＴ細胞受容体ミミックが異なるバーコードと結び付けられる、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項12】
前記第２の複数の核酸が複数の異なる核酸バーコードをさらに含み、各抗原が異なるバーコードと結び付けられる、請求項９～１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項13】
前記第１の複数の核酸の前記シークエンシングすることが前記バーコードをシークエンシングする、請求項９～１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項14】
前記第２の複数の核酸の前記シークエンシングすることが前記バーコードをシークエンシングする、請求項１１～１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項15】
Ｔ細胞受容体の前記レパートリーが、対象からの複数のＴ細胞のゲノムＤＮＡまたは対象からの複数のＴ細胞から得られた複数のｃＤＮＡに由来する、請求項９～１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項16】
前記抗原ライブラリーが、複数のがん関連抗原である、請求項９～１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項17】
前記がん関連抗原が、ＫＲＡＳバリアント対立遺伝子である、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
前記ＫＲＡＳバリアント対立遺伝子が、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｈ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｌ、Ｑ６１Ｈ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｒ、Ａ１１Ｔ、Ｇ１３Ｐ、Ｇ１３Ｄ、または二重突然変異Ｇ１２ＤおよびＱ６１Ｈである、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
前記複数のがん関連抗原が、メソテリン、ジシアロガングリオシド（ＧＤ２）、Ｈｅｒ－２、ＭＵＣ１、ＧＰＣ３、ＥＧＦＲＶＩＩＩ、ＣＥＡ、ＣＤ１９、ＥＧＦＲ、ＰＳＭＡ、ＧＰＣ２、葉酸受容体β、ＩｇＧ Ｆｃ受容体、ＰＳＣＡ、ＰＤ－Ｌ１、ＥＰＣＡＭ、Ｌｅｗｉｓ Ｙ抗原、Ｌ１ＣＡＭ、ＦＯＬＲ、ＣＤ３０、ＣＤ２０、ＥＰＨＡ２、ＰＤ－１、Ｃ－ＭＥＴ、ＲＯＲ１、ＣＬＤＮ１８．２、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ１３３、ＴＳＨＲ、ＣＤ７０、ＥＲＢＢ、ＡＸＬ、細胞死受容体５、ＶＥＧＦＲ－２、ＣＤ１２３、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＴＳＨＲ、ＲＯＲ２、ＣＤ１４７、カッパＩＧＧ、ＩＬ－１３、ＭＵＣ１６、ＩＬ－１３Ｒ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＩＬ１３ＲＡ２、ＤＬＬ３、ＦＡＰ、ＬＭＰ１、ＴＳＨＲ、ＢＣＭＡ、ＮＥＣＴＩＮ－４、ＭＧ７、ＡＦＰ（アルファ－フェトプロテイン）、ＧＰ１００、Ｂ７－Ｈ３、Ｎｅｃｔｉｎ－４、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＲＴ－１、ＨＢＶ、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＴＡＡ、ＧＰ１００、チログロブリン、ＥＢＶ、ＨＰＶ Ｅ６、ＰＲＡＭＥ、ＨＥＲＶ－Ｅ、ＷＴ１、ＧＲＡＳ Ｇ１２Ｖ、ｐ５３、ＴＲＡＩＬ、ＭＡＧＥ－Ａ１０、ＨＰＶ－Ｅ７、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ、ＭＡＧＥ－Ａ６、ＣＤ１９、ＢＣＭＡ、ＣＤ２２、ＣＤ１２３、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ１３８、ＣＤ３８、ＣＤ７、ＳＬＡＭＦ７、ＩＧＧ ＦＣ、ＭＵＣ１、Ｌｅｗｉｓ Ｙ抗原、ＣＤ１３３、ＲＯＲ１、ＦＬＴ３、ＮＫＧ２Ｄ、カッパ軽鎖、ＣＤ３４、ＣＬＬ－１、ＴＳＬＰ、ＣＤ１０、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ４４Ｖ６、ＥＢＶ、ＣＤ５、ＧＰＣ３、ＣＤ５６、インテグリンＢ７、ＣＤ７０、ＭＵＣＬ、ＣＫＩＴ、ＣＬＤＮ１８．２、ＴＲＢＣ１、ＴＡＣ１、ＣＤ５６、ＣＤ４、ＣＤ２、ＣＤ１８、ＣＤ２７、ＣＤ３７、ＣＤ７２、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ８３、ＣＤ１１７、ＣＤ１７２、ＥＲＢＢ３、ＥＲＢＢ４、ＤＲ５、ＨＥＲ２、ＣＳ１、ＩＬ－１ＲＡＰ、ＩＴＧＢ７、ＳＬＣ２Ａ１４、ＳＬＣ４Ａ１、ＳＬＣ６Ａ１１、ＳＬＣ７Ａ３、ＳＬＣ１３Ａ５、ＳＬＣ１９Ａ１、ＳＬＣ２２Ａ１２、ＳＬＣ３４Ａ１、ｓｌｃ４５Ａ３、ＳＬＣ４６Ａ２、Ｆｒａ、ＩＬ－１３Ｒａ２、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ１、ＣＬＤ１８、ＮＡＮＯＧ、ＣＥＡＣＡＭ８、ＴＳＰＡＮ１６、ＧＬＲＢ、ＤＹＲＫ４、ＳＶ２Ｃ、ＳＩＧＬＥＣ８、ＲＢＭＸＬ３、ＨＩＳＴ１ＨＩＴ、ＣＣＲ８、ＣＣＮＢ３、ＡＬＰＰＬ２、ＺＰ２、ＯＴＵＢ２、ＬＩＬＲＡ４、ＧＲＭ２、ＰＧＧ１、ＮＢＩＦ３、ＧＹＰＡ、ＡＬＰＰ、ＳＰＡＴＡ１９、ＦＣＲＬＩ、ＦＣＲＬＡ、ＣＡＣＮＧ３、ＵＰＫ３Ｂ、１２ＵＭＯ４、ＭＵＣ１２、ＨＥＰＡＣＡＭ、ＢＰＩ、ＡＴＰ６Ｖ０Ａ４、ＨＭＭＲ、ＵＰＫ１Ａ、ＡＤＧＲＶ１、ＨＥＲＣ５、Ｃ３ＡＲ１、ＦＡＳＬＧ、ＮＧＢ、ＣＥＬＳＲ３、ＣＤ３Ｇ、ＣＥＡＣＡＭ３、ＴＮＦＲＳＦＢＣ、ＭＳ４ＡＢ、Ｓ１ＰＲ５、ＥＤＮＲＢ、ＳＣＮ３Ａ、ＡＢＣＣ８、ＡＢＣＢ１、ＡＮＯ１、ＫＣＮＤ２、ＨＴＲ４、ＣＡＣＮＢ４、ＨＴＲ４、ＣＮＲ２、２６ＬＲＢ、ＥＸＯＣ１、ＥＮＴＰＰ１、ＩＣＡＭ３、ＡＢＣＧＢ、ＳＣＮ４Ｂ、ＳＰＮ、ＣＤ６８、ＩＴＧＡＬ、ＩＴＧＡＭ、ＳＣＴＲ、ＣＹＹＲ１、ＣＬＣＮ２、ＳＬＡＲＡ３、またはＪＡＧ３を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項20】
前記がん関連抗原が腫瘍ネオ抗原である、請求項１６に記載の方法。
【請求項21】
前記抗原ライブラリーが複数の感染性疾患関連抗原である、請求項９～１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項22】
前記感染性疾患が細菌病原体によって引き起こされる、請求項２５に記載の方法。
【請求項23】
前記感染性疾患がウイルス病原体によって引き起こされる、請求項２５に記載の方法。
【請求項24】
前記免疫細胞がＴ細胞、好中球、マクロファージまたは単球である、請求項９～２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項25】
前記ＴＣＲミミックが、一本鎖抗原相互作用受容体を含む、請求項９～２４のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示の背景
免疫細胞は、病原体の防御、炎症の制御、およびがん細胞の除去を含む、多くの重要な免疫機能に関与する不均一な細胞のグループである。免疫細胞の主要なクラスは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、好中球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、および樹状細胞を含む。それらは機能および形態が異なるが、免疫細胞は全てそれらの表面受容体によって正または負に制御される。
免疫細胞は、病原体の防御、炎症の制御、およびがん細胞の除去を含む、多くの重要な免疫機能に関与する不均一な細胞のグループである。免疫細胞の主要なクラスは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、好中球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、および樹状細胞を含む。それらは機能および形態が異なるが、免疫細胞は全てそれらの表面受容体によって正または負に制御される。
【背景技術】
【0002】
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子に結合した抗原の認識を担うＴリンパ球（すなわち、Ｔ細胞）の表面に見出される分子である。ＴＣＲは、２つの異なるタンパク質鎖から構成されるヘテロ二量体である。ほとんどのＴ細胞（約９５％）では、これら２つのタンパク質鎖はアルファ鎖およびベータ鎖と呼ばれる。しかしながら、少ないパーセンテージのＴ細胞（約５％）では、これら２つのタンパク質鎖はガンマおよびデルタ（ガンマ／デルタ）鎖と呼ばれる。
【0003】
ヒトは、適応免疫系の主要な成分を提供する数十億のＴ細胞受容体を有し、Ｔ細胞受容体応答は、ウイルス感染、がん、および自己免疫を含む疾患からの保護に重要な寄与を提供することが実証された。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
特定の抗原のためのＴ細胞受容体を発見する能力には大きな関心がある。そのようなＴ細胞受容体は、研究ツールとして、ならびに診断および治療適用のために有用である。しかしながら、そのような有用なＴ細胞受容体の同定は困難であり、また同定された後、これらのＴ細胞受容体は、それらがヒトでの治療適用に好適である前に大きな再設計を必要とすることが多い。
【課題を解決するための手段】
【0005】
概要
一態様では、本開示は、ある特定のリガンドに結合する受容体または受容体ミミック（例えば、キメラ受容体）を同定するための組成物および方法に関する。本明細書に記載の組成物および方法は、ハイスループット解析を可能にし得る。受容体（例えば、免疫細胞受容体）の高い多様性のレパートリーは、リガンドのライブラリーに対してスクリーニングされ、互いに相互作用する受容体とリガンドの対を同定することができる。レパートリーの各受容体をコードする各核酸を、核酸によってコードされる受容体を同定するバーコードと結び付けることができる。各リガンドをコードする各核酸も、核酸によってコードされるリガンドを同定するバーコートと結び付けることができる。
一態様では、本開示は、ある特定のリガンドに結合する受容体または受容体ミミック（例えば、キメラ受容体）を同定するための組成物および方法に関する。本明細書に記載の組成物および方法は、ハイスループット解析を可能にし得る。受容体（例えば、免疫細胞受容体）の高い多様性のレパートリーは、リガンドのライブラリーに対してスクリーニングされ、互いに相互作用する受容体とリガンドの対を同定することができる。レパートリーの各受容体をコードする各核酸を、核酸によってコードされる受容体を同定するバーコードと結び付けることができる。各リガンドをコードする各核酸も、核酸によってコードされるリガンドを同定するバーコートと結び付けることができる。
【0006】
一態様では、本開示は、ある特定のリガンドに結合する免疫細胞受容体または免疫細胞受容体ミミック（例えば、キメラ抗原受容体）を同定するための組成物および方法に関する。本明細書に記載の組成物および方法は、ハイスループット解析を可能にし得る。免疫細胞受容体（例えば、Ｔ細胞受容体）の高い多様性のレパートリーは、リガンド（例えば、抗原）のライブラリーに対してスクリーニングされ、互いに相互作用する受容体とリガンドの対を同定することができる。レパートリーの各受容体をコードする各核酸を、核酸によってコードされる受容体を同定するバーコードと結び付けることができる。各リガンドをコードする各核酸も、核酸によってコードされるリガンドを同定するバーコートと結び付けることができる。
【0007】
広範な免疫細胞および／または免疫細胞受容体が、本開示に記載の方法によって使用され得る。Ｔ細胞では、適用可能な受容体は、アルファ ベータＴ細胞受容体、ガンマ デルタＴ細胞受容体、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＬＦＡ１、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ３、ＬＡＴ、ＣＤ２７、ＣＤ９６、ＣＤ２８、ＴＩＧＩＴ、ＩＣＯＳ、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＤＲ３、ＧＩＴＲ、ＣＤ３０、ＳＬＡＭ、ＣＤ２、２Ｂ４、ＴＩＭ１、ＴＩＭ２、ＴＩＭ３、ＣＤ２２６、ＣＤ１６０、ＬＡＧ３、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１１２Ｒ、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２を含む。ＮＫ細胞では、適用可能な受容体は、ＴＲＡＩＬ、ＣＤ１６、ＮＫｐ３０ａｂ、ＮＫＧＣ、ＮＫＧ２Ｄ、２Ｂ４、ＤＮＡＭ－１、ＮＫＧ２Ａ、ＫＩＲ、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＣＤ２７を含む。Ｂ細胞では、適用可能な受容体は、Ｓｉｇｌｅｃ－１０、ＬＩＬＲＢ／ＰＩＲ－Ｂ、ＣＤ３１、ＦＣγＲＩＩＩＢ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３２、ＣＤ４０、ＣＤ４７、ＣＤ５２、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２６７、ＣＤ２６８、ＣＤ２６８、Ｂ細胞受容体、抗体、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥを含む。樹状細胞では、適用可能な受容体は、ＤＮＧＲ－１、ＭＩＣＬ、ＣＬＥＣ１、ＣＬＥＣ１２Ｂ、ＬＯＸ１、マンノース受容体、ＤＣ－ＳＩＧＮ、Ｌ－ＳＩＧＮ、ＳＩＧＮ－Ｒ１、ＬＳＥＣｔｉｎ、ＣＩＲＥ、Ｌａｎｇｅｒｉｎ、ＭＧＬ、スカベンジャー受容体（ＳＲ）、ＤＣ－ＡＳＧＰＲ、ＤＣ－ＳＴＡＭＰ、ＣＤ８０／８６、ＴＬＲ、ＦＩＲＥ、ＦｃＲ、ＤＥＣ２０５、ＢＤＣＡ－２、Ｄｅｃｔｉｎ－２、ＤＣＩＲ、およびケモカイン受容体を含む。マクロファージでは、適用可能な受容体は、ＣＤ３００ａ、ＴＲＥＭ２／ＤＡＰ１２、Ｂａｌ－１、ＴＩＭ４、ＣＲ３、ＳＣＡＲＦ１、ＣＤ３６、ＭＡＲＣＯ、スカベンジャー受容体Ａ１、ＲＡＧＥ、Ａｘｌ、Ｍｅｒ、Ｔｙｒｏ３、ＣＤ９３、Ｓｔａｂｉｌｉｎ２、ＤＮＧＲ－１、ＳＩＲＰを含む。好中球では、適用可能な受容体は、ＣＸＣＲ１、ＦＣγＲＩＩＩＢ、ＦＣγＲＩＩ、ＣＲ３、ＣＲ１、Ｃ３ａＲ、ＴＮＦＲ、ＴＬＲ２／６、Ｃ５ａＲを含む。他の受容体（例えば、Ｇタンパク質共役型受容体、イオンチャネル連結（イオンチャネル型）受容体、および／または酵素連結受容体）も、本開示の方法および組成物で使用され得る。本明細書で使用され得る任意の免疫細胞は、例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞、マクロファージ、単球、および／または好中球を含む。
【0008】
一態様では、上記の受容体のレパートリーは、食細胞、例えばマクロファージ、樹状細胞、好中球、および／またはＴＨＰ－１細胞などに操作により導入され得る。目的の受容体は、それらの内在性細胞内活性化ドメインによってまたは食作用関連細胞内活性化ドメイン（例えば、Ｆｃ受容体細胞内ドメインおよびＣＤ１９細胞内ドメイン）によって操作され得る。受容体の細胞外ドメインは、目的の受容体の細胞外ドメインの野生型または改変バージョンであり得る。
【0009】
一態様では、受容体のレパートリーは、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、好中球、樹状細胞等）に操作により導入され得る。受容体のレパートリーは、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、好中球、樹状細胞等）の表面で発現され、トロゴサイトーシスを使用して、受容体を受容体の抗原／リガンドと分離する。ほとんどの免疫細胞は、トロゴサイトーシスが可能であり、例えば、Ｔ細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、好中球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、および樹状細胞を含む。目的の受容体は、それらの内在性細胞内活性化ドメインによってまたはトロゴサイトーシス関連細胞内活性化ドメイン（例えば、Ｆｃ受容体細胞内ドメインおよびＴＣＲ細胞内ドメイン）によって導入され得る。受容体の細胞外ドメインは、目的の受容体の野生型または改変バージョンであり得る。
【0010】
目的の受容体の抗原／リガンドは、ペプチド、ＭＨＣ－ペプチド複合体、断片、キメラ、または全タンパク質であり得る。抗原／リガンドは、炭水化物、脂肪酸もしくは脂質、または小分子であってもよい。抗原／リガンドは、共有結合または非共有結合によって抗原提示細胞表面と会合させ得る。抗原／リガンドがポリペプチドである場合、それらは、それらの天然の膜貫通ドメインによりまたは合成の膜貫通ドメインにより、抗原提示細胞表面に係留され得る。合成の膜貫通ドメインは、合成の膜貫通ドメインＤＮＡ配列を、抗原／リガンドの所望の部分、一部または全体をコードするＤＮＡ配列と作動可能に連結するようにＤＮＡ配列を操作することによって抗原／リガンド細胞外ドメインに融合され得る。例示的な合成の膜貫通ドメインは、ＣＤ２、ＣＤ３ｄ、ＣＤ３ｇ、ＣＤ３ｚ、ＣＤ４、ＣＤ８Ａ、ＣＤ８Ｂ、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８４、ＣＤ８６、ＣＤ１３７、ＣＤ２４４、ＣＲＡＣＣ、ＣＲＴＡＭ、ＣＬＴＡ－４、ＭＨＣ－Ｉ、ＭＨＣ－ＩＩ、血小板由来増殖因子受容体、ＦＣＧＲ１Ａ、ＦＣＧＲ２Ａ、ＦＣＧ２Ｂ、ＦＣＧＲ３Ａ、ＦＣＲＬ１、ＦＣＲＬ２、ＦＣＲＬ３、ＦＣＲＬ４、ＦＣＲＬ５、ＦＣＲＬ６、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ、ＫＩＲ２ＤＬ５Ｂ、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＬ２、ＫＩＲ３ＤＬ３、ＬＡＧ３、ＧＩＴＲ、ＯＸ４０、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＴＬＲ、ＳＬＡＭＦ、ＬＩＬＲＢ１、ＬＩＬＲＢ２、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＴＩＧＩＴ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、または免疫グロブリン由来の野生型または改変膜貫通ドメインを含む。抗原／リガンドのレパートリーは、作製され、抗原／リガンド提示細胞に操作により導入され得る。場合により、抗原／リガンドライブラリーのバリエーションは、（例えば、無作為に、または部位特異的に）目的の抗原／リガンドの所望の位置へと遺伝子突然変異を導入することによって作製され得る。遺伝子突然変異は、ＤＮＡ断片の置換、欠失、挿入、および再編成であり得る。選択の特異的遺伝子突然変異は、無作為に生成されるか、目的の領域に富化されるか（例えば、リガンドの相互作用ドメイン）、または計算アルゴリズムによって推奨されてもよい。推奨される遺伝子突然変異戦略への計算アルゴリズムの例は、タンパク質構造解析、計算ドッキング、分子動態シミュレーション、回帰、統計ベースの分類、ランダムフォレスト、サポートベクターマシン、および神経ネットワークを含む。
【0011】
免疫細胞受容体または免疫細胞受容体ミミックの抗原／リガンド結合部分は、Ｆｃ受容体の細胞内ドメインに融合され得る。免疫細胞受容体ミミックは、ＭＨＣ：：抗原複合体と結合および相互作用することができる抗体または抗体断片を指す（ａｃａｄｅｍｉｃ．ｏｕｐ．ｃｏｍ／ａｂｔ／ａｒｔｉｃｌｅ／２／１／２２／５２９０１５０）。場合により、これらのキメラ受容体は、Ｆｃ受容体の膜貫通ドメインを含み得るか、またはキメラ受容体は異なる膜貫通ドメインを有し得る。これらのキメラ受容体は、免疫細胞受容体の結合特異性を有し、マクロファージを活性化して、免疫細胞受容体が結合した抗原を提示する標的を貪食することができる。キメラＴＣＲを有するマクロファージ／単球細胞は、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ３、Ｂ７．１、ＣＤ１９細胞内活性化ドメイン、ＣＤ６４細胞内活性化ドメイン、ＣＤ３２細胞内活性化ドメイン、ＣＤ１６細胞内活性化ドメイン、ＣＤ２３細胞内活性化ドメイン、またはＬｃｋ活性化ドメインの１つまたは複数を発現するようにも操作され得る。これらのさらなる改変は、キメラ免疫受容体Ｆｃ融合体に、例えば共刺激ドメインとして含まれ得るか、または単球／マクロファージ細胞で個々に発現され得る。操作した単球／マクロファージが適切な抗原を提示する細胞を貪食する場合、これは、そのバーコードを有する免疫細胞受容体、およびそのバーコードを有する抗原／リガンドを有するマクロファージを産生し得る。そのような個々のマクロファージのシークエンシングは、免疫細胞受容体抗原／リガンド対を同定することができる。
【0012】
Ｔ細胞受容体またはＴ細胞受容体ミミックの抗原結合部分は、Ｆｃ受容体の細胞内ドメインに融合され得る。Ｔ細胞受容体ミミックは、ＭＨＣ：：抗原複合体と結合および相互作用することができる抗体または抗体断片を指す（ａｃａｄｅｍｉｃ．ｏｕｐ．ｃｏｍ／ａｂｔ／ａｒｔｉｃｌｅ／２／１／２２／５２９０１５０）。場合により、これらのキメラ受容体は、Ｆｃ受容体の膜貫通ドメインを含み得るか、またはキメラ受容体は異なる膜貫通ドメインを有し得る。これらのキメラ受容体は、Ｔ細胞受容体の結合特異性を有し、マクロファージを活性化して、Ｔ細胞受容体が結合した抗原を提示する標的を貪食することができる。キメラＴＣＲを有するマクロファージ／単球細胞は、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ３、Ｂ７．１、ＣＤ１９細胞内活性化ドメイン、ＣＤ６４細胞内活性化ドメイン、ＣＤ３２細胞内活性化ドメイン、ＣＤ１６細胞内活性化ドメイン、ＣＤ２３細胞内活性化ドメイン、またはＬｃｋ活性化ドメインの１つまたは複数を発現するようにも操作され得る。これらのさらなる改変は、キメラＴＣＲ－Ｆｃ融合体に、例えば共刺激ドメインとして含まれ得るか、または単球／マクロファージ細胞で個々に発現され得る。操作した単球／マクロファージが適切な抗原を提示する細胞を貪食する場合、これは、そのバーコードを有するＴ細胞受容体、およびそのバーコードを有する抗原を有するマクロファージを産生し得る。そのような個々のマクロファージのシークエンシングは、Ｔ細胞受容体－抗原対を同定することができる。
【0013】
抗原／リガンドライブラリーは、抗原提示細胞（例えば、Ｋ５６２細胞株）で作製することができ、抗原またはリガンドは、場合により、バーコードを有する抗原もしくはリガンドをコードする核酸、または抗原／リガンドポリペプチドおよびバーコードに融合した組換えＭＨＣタンパク質によってコードされ得る。抗原が、非ポリペプチド抗原である場合、抗原提示細胞は、抗原／リガンドを作製するように操作され、それを抗原提示細胞の表面に提示することができる。あるいは、抗原／リガンドは、抗原提示細胞の外で作製し、次いで抗原提示細胞の表面と会合させることができる。提示され得る各抗原／リガンドからのポリペプチド断片は、抗原－ＭＨＣ結合実験、マススペクトロメトリー実験、全長タンパク質配列のスライディングウィンドウ（ウィンドウあたり８～２５）、またはコンピューターアルゴリズムによって提示可能と予測される公知のタンパク質の断片によって同定され得る。抗原由来のこれらの提示可能なペプチド断片は、適切なＭＨＣ分子と融合され、提示される抗原のライブラリーを作製することができる。抗原提示細胞は、Ｋ５６２細胞株（ヒト不死化骨髄性白血病細胞株）または操作したＨＥＫ２９３細胞株であり得る。ＭＨＣ－抗原ポリペプチド融合体を、Ｋ５６２細胞に導入して、抗原ペプチドのライブラリーを作製することができる。場合により、Ｋ５６２細胞は、光学レポーター、例えばＧＦＰによって操作され得る。
【0014】
マクロファージ細胞（例えば、急性単球性白血病由来のヒト単球細胞株であるＴＨＰ－１細胞）の免疫細胞受容体レパートリーは、Ｋ５６２細胞の抗原ライブラリーと混合され得る。抗原ペプチド：ＭＨＣ融合体（または抗原／リガンド）に結合する免疫受容体キメラ受容体または免疫細胞受容体ミミックを有するマクロファージ細胞（例えば、ＴＨＰ－１細胞）は、適切なペプチド：ＭＨＣ融合体（または抗原／リガンド）を提示するＫ５６２細胞を貪食することができる。貪食したＫ５６２細胞を有するマクロファージ細胞（例えば、ＴＨＰ－１細胞）を単離し、個々にシークエンシングして、免疫細胞受容体および抗原／リガンドと結び付けられるバーコードを同定することができる。Ｋ５６２細胞がレポーターを含む場合、そのレポーターは、例えば、フローサイトメトリーを使用して、Ｋ５６２細胞を貪食したマクロファージ細胞（例えば、ＴＨＰ－１細胞）のスクリーニングに使用され得る。あるいは、抗原：ＭＨＣ融合体および免疫受容体キメラ受容体を直接シークエンシングして、免疫細胞受容体および抗原／リガンド対を同定することができる。
【0015】
マクロファージ細胞（例えば、急性単球性白血病由来のヒト単球細胞株であるＴＨＰ－１細胞）のＴ細胞受容体レパートリーは、Ｋ５６２細胞の抗原ライブラリーと混合され得る。抗原ペプチド：ＭＨＣ融合体に結合するＴＣＲキメラ受容体またはＴ細胞受容体ミミックを有するマクロファージ細胞（例えば、ＴＨＰ－１細胞）は、適切なペプチド：ＭＨＣ融合体を提示するＫ５６２細胞を貪食することができる。貪食したＫ５６２細胞を有するマクロファージ細胞（例えば、ＴＨＰ－１細胞）を単離し、個々にシークエンシングして、Ｔ細胞受容体および抗原と結び付けられるバーコードを同定することができる。Ｋ５６２細胞がレポーターを含む場合、そのレポーターは、例えば、フローサイトメトリーを使用して、Ｋ５６２細胞を貪食したマクロファージ細胞（例えば、ＴＨＰ－１細胞）のスクリーニングに使用され得る。あるいは、抗原：ＭＨＣ融合体およびＴＣＲキメラ受容体を直接シークエンシングして、ＴＣＲおよび抗原対を同定することができる。
【0016】
一態様では、キメラＴＣＲを有するマクロファージ／単球／樹状細胞／好中球による貪食は、マクロファージ／単球／樹状細胞／好中球（最終的に分化した細胞ではない場合）、例えば、マクロファージ／単球の分化、Ｔ細胞マクロファージハイブリドーマを使用する分化の刺激、ＣＤ４７経路のブロッキング、またはＣＤ２４経路のブロッキングによって促進され得る。
【0017】
あるいは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、およびマクロファージを含む多くの免疫細胞は、細胞接触依存的および活性化依存的方法で、細胞含有物および膜の一部分を標的細胞と急速に交換する（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｍｄｐｉ．ｃｏｍ／２０７３－４４０９／１０／５／１２５５）。この現象は、「トロゴサイトーシス」と呼ばれる。特に、Ｔ細胞は、抗原を提示する提示細胞によって提示された抗原（複数可）によって活性化された場合、トロゴサイトーシスを受ける（ｈｔｔｐｓ：／／ｐｕｂｍｅｄ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／１７４０６５０７／、ｈｔｔｐｓ：／／ｐｕｂｍｅｄ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／１０５４２１４９／）。２つの細胞間のトロゴサイトーシスによる細胞膜交換は、二方向性である。この開示は、トロゴサイトーシスおよび膜結合ＲＮＡ／ＤＮＡバーコードを使用して、Ｔ細胞のライブラリーと抗原提示細胞のライブラリーの間で抗原／リガンドまたは受容体（例えば、Ｔ細胞受容体）情報を移行させる方法を記載する。抗原提示細胞（ＡＰＣ）または細胞膜のいずれかに抗原／リガンドバーコードまたは受容体（例えば、ＴＣＲ）バーコードＤＮＡまたはＲＮＡを係留することにより、活性化によってトリガーされたトロゴサイトーシスは、下流のシークエンシング解析のため、細胞間でバーコードＤＮＡまたはＲＮＡを自然に移行させる。
【0018】
抗原／リガンドライブラリーは、抗原ポリペプチド（または抗原／リガンド）およびバーコードに融合した組換えＭＨＣタンパク質をコードする核酸を含む、抗原提示細胞（例えば、Ｋ５６２細胞株）で作製することができる。提示され得る各抗原からのポリペプチド断片は、抗原－ＭＨＣ結合実験、マススペクトロメトリー実験、全長タンパク質配列のスライディングウィンドウ（ウィンドウあたり８～２５）、またはコンピューターアルゴリズムによって提示可能と予測される公知のタンパク質の断片によって同定され得る。抗原由来のこれらの提示可能なペプチド断片を、適切なＭＨＣ分子と融合して、提示される抗原のライブラリーを作製することができる。抗原提示細胞は、例えば、Ｋ５６２細胞株（ヒト不死化骨髄性白血病細胞株）または操作したＨＥＫ２９３細胞株を含む任意の抗原提示細胞であり得る。ＭＨＣ－抗原ポリペプチド融合体を、Ｋ５６２細胞に導入して、抗原ペプチドのライブラリーを作製することができる。抗原ＤＮＡまたはＲＮＡバーコードを細胞膜に係留するため、Ｋ５６２細胞または類似のＡＰＣは、膜結合ＤＮＡ結合またはＲＮＡ結合タンパク質（複数可）およびその対応する膜結合ＤＮＡ結合またはＲＮＡ結合タンパク質（複数可）に親和性を有する抗原バーコードＤＮＡまたはＲＮＡを発現する。ＤＮＡ結合またはＲＮＡ結合タンパク質（複数可）は、ＭＨＣタンパク質に融合し得るか、またはＭＨＣタンパク質に非依存的であり得る。抗原バーコードは、ＭＨＣタンパク質に融合し得るか、またはＭＨＣタンパク質に非依存的であり得る。場合により、Ｋ５６２細胞は、光学レポーター、例えばＧＦＰによって操作されるか、または細胞膜色素、例えばＤｉｌによって染色され得る。
【0019】
Ｔ細胞ライブラリーは、免疫細胞受容体（例えば、Ｔ細胞受容体）の多様なセットを有するＴ細胞を含有し得る。上記の抗原提示細胞と類似して、Ｔ細胞は、膜結合ＤＮＡ結合またはＲＮＡ結合タンパク質（複数可）およびその対応する膜結合ＤＮＡ結合またはＲＮＡ結合タンパク質（複数可）に親和性を有する免疫受容体（例えば、ＴＣＲ）バーコードＤＮＡまたはＲＮＡを発現することができる。ＤＮＡ結合またはＲＮＡ結合タンパク質（複数可）は、免疫受容体タンパク質（例えば、ＴＣＲ）に融合し得るか、または免疫受容体タンパク質（例えば、ＴＣＲ）に非依存的であり得る。抗原バーコードは、免疫受容体タンパク質（例えば、ＴＣＲ）に融合し得るか、または免疫受容体タンパク質（例えば、ＴＣＲ）に非依存的であり得る。場合により、Ｔ細胞（複数可）は、光学レポーター、例えば膜結合ＧＦＰによって操作されるか、または細胞膜色素、例えばＤｉｌによって染色され得る。操作したＴ細胞が適切な抗原を提示する細胞と相互作用する場合、それはトロゴサイトーシスにより細胞膜の一片を噛み切ることによりＡＰＣ表面に提示されたバーコードを捕捉し得る。活性化Ｔ細胞は、トランスフェクト／形質導入した蛍光タンパク質、膜結合色素もしくはＡＰＣ表面マーカーを含む抗原提示細胞膜マーカーによるか、またはＣＤ１１ａ、ＣＤ６９、ＣＤ７０、ＣＤ７１、ＣＤ２５、ＣＤ２６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１５４、ＰＤ１、ＩＬ－２、ＮＫＧ２Ｄ、ＴＮＦ－アルファ、ＩＦＮ－ガンマまたはＨＬＡ－ＤＲを含むＴ細胞活性化マーカーにより、ソートまたは富化され得る。トロゴサイトーシスにより、活性化Ｔ細胞は、対応する抗原のＤＮＡまたはＲＮＡバーコードを含有する。そのようなＴ細胞のＤＮＡまたはＲＮＡシークエンシングは、免疫細胞受容体配列（例えば、ＴＣＲ）、抗原配列およびＴ細胞受容体－抗原関係を同定することができる。
【0020】
操作した細胞ライブラリー細胞（例えば、Ｊｕｒｋａｔ）の免疫細胞受容体レパートリー（例えば、ＴＣＲレパートリー）は、Ｋ５６２細胞の抗原ライブラリーと混合され得る。受容体レパートリー細胞は、適切な抗原／リガンド（例えば、ペプチド－ＭＨＣ融合体）を提示するＫ５６２細胞と相互作用し、トロゴサイトーシスによるバーコード移行を生じる。ＡＰＣ（例えば、Ｋ５６２細胞）によって活性化された細胞を単離し、個々にシークエンシングして、受容体（例えば、ＴＣＲなどの免疫細胞受容体）および抗原と結び付けられるバーコードを同定することができる。Ｋ５６２細胞がレポーターを含む場合、そのレポーターは、フローサイトメトリーまたは磁気ビーズ富化を使用して、Ｋ５６２細胞と相互作用した受容体細胞（例えば、Ｊｕｒｋａｔ細胞）のスクリーニングに使用され得る。ソートしたＴ細胞が両バーコードを含有するので、抗原バーコードおよび受容体（例えば、ＴＣＲ）／受容体ミミック（例えば、ＣＡＲ）バーコードを、直接シークエンシングして、受容体および抗原対を同定することができる。
【0021】
同様に、受容体－抗原／リガンド相互作用対は、トロゴサイトーシス後に受容体細胞をシークエンシングすることによっても抽出され得る。抗原／リガンド細胞は、光学レポーター、例えば膜結合ＧＦＰを有するように操作されるか、または色素、例えばＤｉｌによって染色され得る。受容体細胞（例えば、Ｋ５６２細胞）は、抗原／リガンド細胞とのトロゴサイトーシス事象を経験し得、光学レポーターまたは色素を有する抗原／リガンド細胞膜の断片を保持し得る（ｈｔｔｐｓ：／／ｐｕｂｍｅｄ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／３０７００９０３／）。そのようなＫ５６２細胞は、フローサイトメトリーによって選別されるか、または膜結合光学レポーターもしくは色素に基づいて磁気ビーズによって富化され得る。ソートしたＡＰＣ／Ｋ５６２細胞が両バーコードを含有するので、抗原バーコードおよび受容体（例えば、ＴＣＲ）／受容体ミミック（例えば、ＣＡＲ）バーコードを、直接シークエンシングして、受容体（例えば、ＴＣＲ）および抗原／リガンド対を同定することができる。
【0022】
一態様では、抗原／リガンドは、その天然の機能を減少させる少なくとも１つの突然変異を含む突然変異ウイルスエンベロープ糖タンパク質、ｐｅｇＲＮＡ（プライムエディティングガイドＲＮＡ）をコードする核酸、および構造：Ｓ－ＥＴＤ－ＬＧＤ－ＩＲＥＳ－Ｒ（ここで、Ｓはシグナル配列をコードし、ＥＴＤは細胞外標的化ドメインをコードし；ＬＧＤは抗原／リガンドをコードし、ＩＲＥＳは配列内リボソーム侵入部位をコードし、Ｒはレポーター（例えば、蛍光タンパク質または抗生物質耐性などの選択マーカー）をコードする）を含む非ウイルス膜結合タンパク質をコードする核酸を有するレトロウイルス（例えば、レンチウイルス）に操作により導入され得る。ＩＲＥＳおよびＲは場合によるものであり、核酸はＳ－ＥＴＤ－ＬＧＤをコードし得る。ＩＲＥＳ配列は、同様に１つのプロモーターによって２つの遺伝子の共発現を可能にする２Ａ自己切断ペプチド配列（Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｆ２Ａ、およびＥ２Ａ）によって置換されてもよい。抗原／リガンドのレトロウイルスライブラリーと対合される受容体提示細胞は、受容体をコードする核酸に隣接してかまたは近くにｐｅｇＲＮＡの挿入部位を含むように操作される。ｐｅｇＲＮＡ（プライムエディティングガイドＲＮＡ）は、受容体をコードする核酸の近くにかまたは隣接して抗原／リガンドに対応するバーコードを挿入する。レトロウイルスによって形質導入された細胞のシークエンシングは、受容体およびリガンド対を同定する配列の文脈でこのバーコードを同定するであろう。
【発明を実施するための形態】
【0023】
詳細な説明
様々な実施形態が記載される前に、本開示の教示が、記載される特定の実施形態に限定されず、当然変更することができることが理解されるべきである。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を記載する目的のためだけであり、本教示の範囲が添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、限定することを意図しないことも理解されるべきである。
様々な実施形態が記載される前に、本開示の教示が、記載される特定の実施形態に限定されず、当然変更することができることが理解されるべきである。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を記載する目的のためだけであり、本教示の範囲が添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、限定することを意図しないことも理解されるべきである。
【0024】
他に規定しない限り、本明細書で使用される全ての技術および科学用語は、本開示が属する当技術分野の業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似または等しい任意の方法および材料は、本教示の実施または試験でも使用され得るが、一部の例示的な方法および材料はここに記載される。
【0025】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が他に明確に指定しない限り、複数の参照対象を含むことに注意すべきである。特許請求の範囲は、任意の選択要素を除外するようにドラフトされ得ることもさらに注意されたい。したがって、この記載は、請求項要素の引用または「ネガティブな」限定の使用と関連して、「単に（ｓｏｌｅｌｙ）」、「のみ（ｏｎｌｙ）」等のような除外用語の使用のための先行詞として機能することを意図する。物質の濃度またはレベルに関して与えられた数値制限は、文脈が他に明確に指定しない限り、およそであることが意図される。したがって、濃度が、（例えば）１０マイクログラム（「μｇ」）であると示される場合、濃度は、少なくともおよそまたは約１０μｇであると理解されることが意図される。
【0026】
本記載に含まれる組換え技術は、例えば、分子生物学、タンパク質生化学、細胞生物学、免疫学、微生物学の従来の技術を含み、組換えＤＮＡが使用される。例えば、その全てが全ての目的のためにその全体を参照により組み込まれる、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ編（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第３版；ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ Ａｕｓｕｂｅｌら編（２００７）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ；ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．、Ｎ．Ｙ．）；ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎら（１９９１）ＰＣＲ １：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ）；ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎら（１９９５）ＰＣＲ ２：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ編（１９９９）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（２００５）Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ、第５版；Ｇａｉｔ編（１９８４）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；米国特許第４，６８３，１９５号；ＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ編（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ；Ａｎｄｅｒｓｏｎ（１９９９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ；ＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ編（１９８４）Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９８６））；Ｐｅｒｂａｌ（１９８４）Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；ＭｉｌｌｅｒおよびＣａｌｏｓ編（１９８７）Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｍａｋｒｉｄｅｓ編（２００３）Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ；ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ編（１９８７）Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ）；ならびにＨｅｒｚｅｎｂｅｒｇら編（１９９６）Ｗｅｉｒ’ｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙを参照されたい。
【0027】
本開示を読んだ当業者には明らかであるように、本明細書に記載および例示された個々の実施形態のそれぞれは、本教示の範囲または精神を逸脱することなく、他のいくつかの実施形態のいずれかの特徴から容易に区別されるかまたはそれらと組み合わせられ得る別個の成分および特徴を有する。任意の列挙した方法は、列挙した事象の順序で、または論理上可能である任意の他の順序で実行され得る。
【0028】
定義
本明細書で使用される場合、用語「抗原」は、適切な条件下で、特定の免疫応答を誘導する、およびその応答の産物、例えば特定の抗体もしくは特異的に感作したＴリンパ球、またはその両方と反応することができる物質を指す。抗原は、可溶性物質、例えば毒素、外来タンパク質、突然変異タンパク質、自己タンパク質、または粒子、例えば細菌および組織細胞であってもよいが、抗原決定基（エピトープ）として公知のタンパク質または多糖類分子の一部のみが抗体またはリンパ球の特定の受容体と結合する。
本明細書で使用される場合、用語「抗原」は、適切な条件下で、特定の免疫応答を誘導する、およびその応答の産物、例えば特定の抗体もしくは特異的に感作したＴリンパ球、またはその両方と反応することができる物質を指す。抗原は、可溶性物質、例えば毒素、外来タンパク質、突然変異タンパク質、自己タンパク質、または粒子、例えば細菌および組織細胞であってもよいが、抗原決定基（エピトープ）として公知のタンパク質または多糖類分子の一部のみが抗体またはリンパ球の特定の受容体と結合する。
【0029】
本明細書で使用される場合、用語、ＴＣＲの「結合特異性」は、ＴＣＲが結合する抗原の同一性、好ましくはＴＣＲが結合し、Ｔ細胞を活性化するエピトープの同一性を指す。
【0030】
本明細書で使用される場合、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」は、抗原または抗原：ＭＨＣ複合体のエピトープへの結合を主に担うＴＣＲの領域を指す。ＣＤＲは、超可変領域とも呼ばれる。各ＴＣＲのＣＤＲは、典型的には、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３と呼ばれ、Ｎ末端から開始して逐次的に番号付けられ、典型的には、特定のＣＤＲが位置する鎖によっても同定される。異なる特異性を有するＴＣＲ（すなわち、異なる抗原の異なる結合部位）は、異なるＣＤＲを有する。ＣＤＲ内の限られた数のアミノ酸位置のみが、抗原結合に直接関与する。ＣＤＲ内のこれらの位置は、特異性決定残基（ＳＤＲ）と呼ばれる。
【0031】
本明細書で使用される場合、用語「エピトープ」は、特定のＢ細胞および／またはＴ細胞が応答する抗原またはハプテン上の部位を指す。用語は、「抗原決定基」または「抗原決定部位」と交換可能にも使用される。エピトープは、抗体の可変領域結合ポケットと相互作用する結合相互作用を形成することができる抗原または他の巨大分子の部分を含む。
【0032】
本明細書で使用される場合、用語「異種」は、ポリヌクレオチドの部分を参照して使用される場合、核酸が、自然では互いに同じ関係で通常見出されない２つまたはそれよりも多いサブ配列を含むことを示す。例えば、核酸は、典型的には組換えにより産生され、例えば、新しい機能性核酸を作製するように配置された無関係の遺伝子からの２つまたはそれよりも多い配列を有する。同様に、「異種」ポリペプチドまたはタンパク質は、自然では互いに同じ関係で見出されない２つまたはそれよりも多いサブ配列を指す。
【0033】
本明細書で使用される場合、用語「宿主細胞」は、本発明のベクターが導入、発現および／または増やされ得る原核または真核細胞を指す。微生物宿主細胞は、細菌、酵母、顕微鏡的な真菌、ならびに真菌および粘菌のライフサイクルの顕微鏡的段階を含む、原核または真核微生物の細胞である。典型な原核宿主細胞は、様々な株の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を含む。典型的な真核宿主細胞は、酵母もしくは糸状菌、または哺乳動物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞、マウスＮＩＨ ３Ｔ３線維芽細胞、ヒト胎児由来腎臓１９３細胞、または齧歯類骨髄腫もしくはハイブリドーマ細胞である。
【0034】
本明細書で使用される場合、非ヒトタンパク質（例えば、マウスＴＣＲ）の用語「ヒト化」形態は、タンパク質の非ヒト相同体由来の最小配列を含有するキメラタンパク質である。ほとんどの部分では、ヒト化タンパク質は、レシピエントの可変領域残基が非ヒト種（ドナーＴＣＲ）、例えば所望の特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長類由来の可変領域残基（例えば、ＣＤＲ）によって置き換えられるヒトＴＣＲである。
【0035】
本明細書で使用される場合、組成物またはワクチンに対する用語「免疫学的応答」は、目的の組成物またはワクチンに対する細胞および／または抗体媒介性免疫応答の宿主での発生である。通常、「免疫学的応答」は、限定はされないが、１つまたは複数の以下の効果を含む：目的の組成物またはワクチンに含まれる抗原（複数可）に特異的に向けられる抗体、Ｂ細胞、ヘルパーＴ細胞、および／または細胞傷害性Ｔ細胞の産生。好ましくは、宿主は、新しい感染に対する耐性が増強され、および／または疾患の臨床的重症度が低減されるように、治療的または保護的な免疫学的応答のいずれかを示す。そのような保護は、感染した宿主によって通常示される症状の減少または喪失、より早い回復時間および／または感染した宿主におけるウイルス力価の低下のいずれかによって実証される。
【0036】
本明細書で使用される場合、用語「単離された」は、核酸またはポリペプチドの天然源に存在する他の核酸またはポリペプチドからだけでなく、ポリペプチドからも分離された核酸またはポリペプチドを指し、好ましくは、（もしある場合）溶媒、緩衝液、イオン、または通常同じ溶液中に存在する他の成分のみの存在下で見出される核酸またはポリペプチドを指す。用語「単離された」および「精製された」は、それらの天然源に存在する核酸もポリペプチドも包含しない。
【0037】
本明細書で使用される場合、用語「哺乳動物」は、温血脊椎動物を指し、その全てが毛を有し、子供に授乳する。
【0038】
本明細書で使用される場合、「ＭＨＣ分子」、「ＭＨＣタンパク質」または「ＨＬＡタンパク質」は交換可能に使用され、特に、タンパク質抗原のタンパク質切断から生じ、潜在的なＴ細胞エピトープを示すペプチドに結合し、それらを細胞表面に輸送し、そこで特定の細胞、特に、ナイーブＴ細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球、調節性Ｔ細胞、またはヘルパーＴ細胞にそれらを示すことができるタンパク質を意味すると理解されるべきである。ゲノムの主要組織適合性複合体は、その遺伝子産物が細胞表面で発現され、内在性および／または外来抗原の結合および提示に重要であり、したがって免疫学的プロセスを制御するための遺伝子領域を含む。主要組織適合性複合体は、異なるタンパク質をコードする２つの遺伝子群：ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩの分子に分類される。２つのＭＨＣクラスの分子は、異なる抗原起源に特化される。ＭＨＣクラスＩの分子は、内在的に合成された抗原、例えば、ウイルスタンパク質および腫瘍抗原を典型的には提示するが、これらに限定されない。ＭＨＣクラスＩＩの分子は、外因性起源、例えば細菌産物から生じるタンパク質抗原を提示する。
【0039】
本明細書で使用される場合、用語「天然に存在する」は、成分が、組換え手段によって変更されておらず、生物、例えばナイーブ細胞または抗原に曝露された細胞から作出された抗体ライブラリーに前から存在する単一遺伝子によってコードされることを意味する。
【0040】
本明細書で使用される場合、用語「タンパク質」、「ペプチド」、「ポリペプチド」および「ポリペプチド断片」は、本明細書で交換可能に使用されて、任意の長さのアミノ酸残基のポリマーを指す。ポリマーは、線状または分岐状であってもよく、改変アミノ酸またはアミノ酸類似体を含んでもよく、アミノ酸以外の化学部分によって中断されてもよい。用語は、自然にまたは介入；例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または任意の他の操作もしくは改変、例えばラベリングまたは生物活性成分とのコンジュゲーションによって改変されたアミノ酸ポリマーも包含する。
【0041】
本明細書で使用される場合、用語「精製された」は、示された核酸またはポリペプチドが、他の生物学的巨大分子、例えば、ポリヌクレオチド、タンパク質等の実質的に非存在下で存在することを意味する。一実施形態では、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、存在する示された生物学的巨大分子の少なくとも９５重量％、より好ましくは少なくとも９９．８重量％を構成するように精製される（しかし、水、緩衝液、および他の小分子、特に１０００ダルトンより小さい分子量を有する分子が存在し得る）。
【0042】
本明細書で使用される場合、用語「組換え核酸」は、通常自然では見出されない形態の核酸を指す。すなわち、組換え核酸は、自然では核酸に隣接しないヌクレオチド配列に隣接するか、または通常自然では見出されない配列を有する。組換え核酸は、制限エンドヌクレアーゼによる核酸の操作によって、あるいはポリメラーゼ連鎖反応のような技術を使用して最初にｉｎ ｖｉｔｒｏで形成され得る。組換え核酸が作製され、宿主細胞または生物に再導入されると、それは、非組換えにより、すなわちｉｎ ｖｉｔｒｏ操作ではなく宿主細胞のｉｎ ｖｉｖｏでの細胞機構を使用して複製すると理解されるが、そのような核酸は、組換えにより産生されると、続いて非組換えにより複製されるが、依然として本開示の目的のための組換え体であると考えられる。
【0043】
本明細書で使用される場合、用語「組換えポリペプチド」は、組換え核酸から発現されたポリペプチド、またはｉｎ ｖｉｔｒｏで化学的に合成されたポリペプチドを指す。
【0044】
本明細書で使用される場合、用語「レパートリー」または「ライブラリー」は、抗体、Ｔ細胞受容体、または抗体断片、例えばＦａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆｄ、ＬＣ、ＶＨ、もしくはＶＬ、または可変領域のサブ断片、例えば、ヒトドナーに存在する、抗体遺伝子の自然アンサンブル、または「レパートリー」から得られる、ならびに末梢血および脾臓の細胞から主に得られる、例えば交換カセットをコードする遺伝子のライブラリーを指す。一部の実施形態では、ヒトドナーは、「非免疫」、すなわち感染の症状を提示しない。現在の発明では、ライブラリーまたはレパートリーは、所与のＶ領域の部分の交換カセットであるメンバーを含むことが多い。
【0045】
本明細書で使用される場合、「一本鎖ＴＣＲ」は、２つのＴＣＲ鎖がＴＣＲを形成することができるように配置された、ＴＣＲのアルファ鎖とベータ鎖の両方、またはＴＣＲのガンマ鎖とデルタ鎖の両方を有する単一のポリペプチド鎖である。用語は、限定はされないが、リンカー有りまたは無しで、共有結合的に連結しているＴＣＲアルファおよびＴＣＲベータまたはＴＣＲガンマおよびＴＣＲデルタ可変鎖断片をさらに含む。一本鎖ＴＣＲは、場合により、単独でまたはＣＤ２８シグナル伝達ドメインと組み合わせて、ＣＤ３またはＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含み得る。
【0046】
本明細書で使用される場合、「Ｔ細胞」は、通常胸腺で発生する造血細胞であると規定される。Ｔ細胞は、限定はされないが、ナチュラルキラーＴ細胞、調節性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、メモリーＴ細胞、ガンマ デルタＴ細胞および粘膜インバリアントＴ細胞を含む。Ｔ細胞は、限定はされないが、ＣＤ８＋ Ｔ細胞、ＣＤ４＋ Ｔ細胞、Ｔｈ１ Ｔ細胞およびＴｈ２ Ｔ細胞も含む。Ｔ細胞は、初代Ｔ細胞またはＴ細胞株であり得る。
【0047】
本明細書で使用される場合、用語「Ｔ細胞受容体」または「ＴＣＲ」は交換可能に使用され、シグナル伝達の媒介に関与するＣＤ３複合体のインバリアントタンパク質と会合している免疫グロブリンスーパーファミリーのヘテロ二量体細胞表面タンパク質を指す。ＴＣＲは、２つの同族タンパク質鎖：アルファ鎖とベータ鎖またはガンマ鎖とデルタ鎖から構成される。
【0048】
本明細書で使用される場合、用語「ＴＣＲライブラリー」は、ＴＣＲをコードするベクターのポリクローナルコレクションまたはそれらのベクターを含有する細胞を指す。「ＴＣＲライブラリー」は、ＴＣＲをコードするベクターのサブセットまたは選択のコレクションを含み得る。「ＴＣＲライブラリー」は、対象で見出され得るＴＣＲのレパートリーのコレクションを指し得る。「ＴＣＲライブラリー」は、対象で見出されたＴＣＲのレパートリーのサブセットも指し得る。
【0049】
単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が他に明確に指定しない限り、複数の参照対象を含む。同様に、「または（ｏｒ）」という言葉は、文脈が他に明確に指定しない限り、「および（ａｎｄ）」を含むことが意図される。物質、例えば抗原の濃度またはレベルに関して与えられた数値制限は、およそであることが意図される。したがって、濃度が、少なくとも（例えば）２００μｇであると示される場合、濃度は、少なくともおよそ「約（ａｂｏｕｔ）」または「約（ａｂｏｕｔ）」２００μｇであると理解されることが意図される。
【0050】
新規の受容体
広範な免疫細胞および／または免疫細胞受容体は、本開示に記載の方法で使用され得る。Ｔ細胞では、適用可能な受容体は、キメラ抗原受容体、アルファ ベータＴ細胞受容体、ガンマ デルタＴ細胞受容体、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＬＦＡ１、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ３、ＬＡＴ、ＣＤ２７、ＣＤ９６、ＣＤ２８、ＴＩＧＩＴ、ＩＣＯＳ、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＤＲ３、ＧＩＴＲ、ＣＤ３０、ＳＬＡＭ、ＣＤ２、２Ｂ４、ＴＩＭ１、ＴＩＭ２、ＴＩＭ３、ＣＤ２２６、ＣＤ１６０、ＬＡＧ３、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１１２Ｒ、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２を含む。ＮＫ細胞では、適用可能な受容体は、ＴＲＡＩＬ、ＣＤ１６、ＮＫｐ３０ａｂ、ＮＫＧＣ、ＮＫＧ２Ｄ、２Ｂ４、ＤＮＡＭ－１、ＮＫＧ２Ａ、ＫＩＲ、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＣＤ２７を含む。Ｂ細胞では、適用可能な受容体は、Ｓｉｇｌｅｃ－１０、ＬＩＬＲＢ／ＰＩＲ－Ｂ、ＣＤ３１、ＦＣγＲＩＩＩＢ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３２、ＣＤ４０、ＣＤ４７、ＣＤ５２、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２６７、ＣＤ２６８、ＣＤ２６８、Ｂ細胞受容体、抗体、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥを含む。樹状細胞では、適用可能な受容体は、ＤＮＧＲ－１、ＭＩＣＬ、ＣＬＥＣ１、ＣＬＥＣ１２Ｂ、ＬＯＸ１、マンノース受容体、ＤＣ－ＳＩＧＮ、Ｌ－ＳＩＧＮ、ＳＩＧＮ－Ｒ１、ＬＳＥＣｔｉｎ、ＣＩＲＥ、Ｌａｎｇｅｒｉｎ、ＭＧＬ、スカベンジャー受容体（ＳＲ）、ＤＣ－ＡＳＧＰＲ、ＤＣ－ＳＴＡＭＰ、ＣＤ８０／８６、ＴＬＲ、ＦＩＲＥ、ＦｃＲ、ＤＥＣ２０５、ＢＤＣＡ－２、Ｄｅｃｔｉｎ－２、ＤＣＩＲ、およびケモカイン受容体を含む。マクロファージでは、適用可能な受容体は、ＣＤ３００ａ、ＴＲＥＭ２／ＤＡＰ１２、Ｂａｌ－１、ＴＩＭ４、ＣＲ３、ＳＣＡＲＦ１、ＣＤ３６、ＭＡＲＣＯ、スカベンジャー受容体Ａ１、ＲＡＧＥ、Ａｘｌ、Ｍｅｒ、Ｔｙｒｏ３、ＣＤ９３、Ｓｔａｂｉｌｉｎ２、ＤＮＧＲ－１、ＳＩＲＰを含む。好中球では、適用可能な受容体は、ＣＸＣＲ１、ＦＣγＲＩＩＩＢ、ＦＣγＲＩＩ、ＣＲ３、ＣＲ１、Ｃ３ａＲ、ＴＮＦＲ、ＴＬＲ２／６、Ｃ５ａＲを含む。他の受容体（例えば、Ｇタンパク質共役型受容体、イオンチャネル連結（イオンチャネル型）受容体、および／または酵素連結受容体）も、本開示の方法および組成物で使用され得る。本開示でスクリーニングされるリガンドは、標的受容体の公知のリガンド（例えば、ＰＤ－１受容体へのＰＤ－１Ｌ）、または未知の親和性を有する全タンパク質、または未知の親和性を有するペプチドであり得る。
広範な免疫細胞および／または免疫細胞受容体は、本開示に記載の方法で使用され得る。Ｔ細胞では、適用可能な受容体は、キメラ抗原受容体、アルファ ベータＴ細胞受容体、ガンマ デルタＴ細胞受容体、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＬＦＡ１、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ３、ＬＡＴ、ＣＤ２７、ＣＤ９６、ＣＤ２８、ＴＩＧＩＴ、ＩＣＯＳ、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＤＲ３、ＧＩＴＲ、ＣＤ３０、ＳＬＡＭ、ＣＤ２、２Ｂ４、ＴＩＭ１、ＴＩＭ２、ＴＩＭ３、ＣＤ２２６、ＣＤ１６０、ＬＡＧ３、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１１２Ｒ、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２を含む。ＮＫ細胞では、適用可能な受容体は、ＴＲＡＩＬ、ＣＤ１６、ＮＫｐ３０ａｂ、ＮＫＧＣ、ＮＫＧ２Ｄ、２Ｂ４、ＤＮＡＭ－１、ＮＫＧ２Ａ、ＫＩＲ、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＣＤ２７を含む。Ｂ細胞では、適用可能な受容体は、Ｓｉｇｌｅｃ－１０、ＬＩＬＲＢ／ＰＩＲ－Ｂ、ＣＤ３１、ＦＣγＲＩＩＩＢ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３２、ＣＤ４０、ＣＤ４７、ＣＤ５２、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２６７、ＣＤ２６８、ＣＤ２６８、Ｂ細胞受容体、抗体、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥを含む。樹状細胞では、適用可能な受容体は、ＤＮＧＲ－１、ＭＩＣＬ、ＣＬＥＣ１、ＣＬＥＣ１２Ｂ、ＬＯＸ１、マンノース受容体、ＤＣ－ＳＩＧＮ、Ｌ－ＳＩＧＮ、ＳＩＧＮ－Ｒ１、ＬＳＥＣｔｉｎ、ＣＩＲＥ、Ｌａｎｇｅｒｉｎ、ＭＧＬ、スカベンジャー受容体（ＳＲ）、ＤＣ－ＡＳＧＰＲ、ＤＣ－ＳＴＡＭＰ、ＣＤ８０／８６、ＴＬＲ、ＦＩＲＥ、ＦｃＲ、ＤＥＣ２０５、ＢＤＣＡ－２、Ｄｅｃｔｉｎ－２、ＤＣＩＲ、およびケモカイン受容体を含む。マクロファージでは、適用可能な受容体は、ＣＤ３００ａ、ＴＲＥＭ２／ＤＡＰ１２、Ｂａｌ－１、ＴＩＭ４、ＣＲ３、ＳＣＡＲＦ１、ＣＤ３６、ＭＡＲＣＯ、スカベンジャー受容体Ａ１、ＲＡＧＥ、Ａｘｌ、Ｍｅｒ、Ｔｙｒｏ３、ＣＤ９３、Ｓｔａｂｉｌｉｎ２、ＤＮＧＲ－１、ＳＩＲＰを含む。好中球では、適用可能な受容体は、ＣＸＣＲ１、ＦＣγＲＩＩＩＢ、ＦＣγＲＩＩ、ＣＲ３、ＣＲ１、Ｃ３ａＲ、ＴＮＦＲ、ＴＬＲ２／６、Ｃ５ａＲを含む。他の受容体（例えば、Ｇタンパク質共役型受容体、イオンチャネル連結（イオンチャネル型）受容体、および／または酵素連結受容体）も、本開示の方法および組成物で使用され得る。本開示でスクリーニングされるリガンドは、標的受容体の公知のリガンド（例えば、ＰＤ－１受容体へのＰＤ－１Ｌ）、または未知の親和性を有する全タンパク質、または未知の親和性を有するペプチドであり得る。
【0051】
本明細書に記載の組成物および方法は、抗原とＴ細胞受容体またはＴ細胞受容体ミミックの新規の対を見出すために使用され得る。Ｔ細胞受容体ミミックは、ＭＨＣ提示抗原に結合することができる抗体または抗体断片を指す。Ｔ細胞受容体レパートリーは、単球（例えば、マクロファージ）または他の貪食細胞型で作製される。Ｔ細胞受容体の抗原結合部分は、Ｆｃ受容体の全てまたは一部分に融合され、その結果、このキメラ受容体が抗原に結合すると、マクロファージは抗原を貪食する。ＴＣＲ受容体またはＴ細胞受容体ミミックをコードする核酸は、ＴＣＲおよび共活性化ドメイン（例えば、Ｆｃドメイン）を同定するバーコードを含む。ＴＣＲキメラ受容体またはＴ細胞受容体ミミックライブラリーは、適切な単球細胞（例えばマクロファージ）または他の貪食細胞型（例えば、好中球、樹状細胞、マスト細胞等）で発現され得る。
【0052】
本明細書に記載の組成物および方法は、他の受容体およびリガンド（例えば、抗原）の新規の対を見出すために使用され得る。Ｔ細胞受容体およびＴ細胞受容体ミミックに加えて、他の受容体が使用されてもよい。例えば、イオンチャネル連結（イオンチャネル型）受容体、Ｇタンパク質共役型（代謝型）受容体、および酵素連結受容体が、導入遺伝子の発現に関連し得る。使用され得る受容体の１つのクラスは、免疫受容体、例えばＴ細胞受容体、Ｂ細胞受容体（別名、抗原受容体または免疫グロブリン受容体）、および自然免疫受容体などである。
【0053】
Ｔ細胞受容体は、２つの異なるポリペプチド鎖のヘテロ二量体である。ヒトでは、ほとんどのＴ細胞が、アルファ（α）鎖およびベータ（β）鎖から作製されたＴ細胞受容体を有するガンマおよびデルタ（γ／δ）鎖（それぞれ、ＴＲＧおよびＴＲＤによってコードされる）から作製されたＴ細胞受容体を有する。リンパ球からＴ細胞受容体鎖をコードする核酸を増幅するための技術およびプライマーは、当技術分野で周知であり、例えば、その全てが全ての目的のためにその全体を参照により組み込まれる、Ｃｌｏｎｔｅｃｈによって市販されているＳＭＡＲＴｅｒ Ｈｕｍａｎ ＴＣＲ ａ／ｂ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ Ｋｉｔｓ、Ｂｏｒｉａら，ＢＭＣ Ｉｍｍｕｎｏｌ．９巻：５０～５８頁（２００８）；Ｍｏｏｎｋａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １６９巻：４１～５１頁（１９９４）；Ｋｉｍら、ＰＬｏＳ ＯＮＥ ７巻：ｅ３７３３８（２０１２）；Ｓｅｉｔｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０３巻：１２０５７～６２頁（２００６）に記載される。ＴＣＲレパートリーを、別々の鎖として使用して、抗原結合ドメインを形成することができる。ＴＣＲレパートリーは、一本鎖抗原結合ドメインに変換され得る。一本鎖ＴＣＲは、例えば、その全てが全ての目的のためにその全体を参照により組み込まれる、米国特許出願公開第２０１２／０２５２７４２号、Ｓｃｈｏｄｉｎら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３３巻：８１９～８２９頁（１９９６）；Ａｇｇｅｎら、「Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｈｕｍａｎ Ｓｉｎｇｌｅ－Ｃｈａｉｎ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ」、イリノイ大学アーバナ・シャンペーン校の博士論文（２０１０）（そのコピーがｉｄｅａｌｓ．ｉｌｌｉｎｏｉｓ．ｅｄｕ／ｂｉｔｓｔｒｅａｍ／ｈａｎｄｌｅ／２１４２／１８５８５／Ａｇｇｅｎ＿Ｄａｖｉｄ．ｐｄｆ？ｓｅｑｕｅｎｃｅ＝１に見出される）に記載されるものを含む、当技術分野で周知の技術を使用して、ヒトアルファおよびベータ鎖をコードする核酸から作製され得る。
【0054】
Ｂ細胞受容体は、膜結合型である免疫グロブリン、シグナル伝達部分、ＣＤ７９、およびＩＴＡＭを含む。ヒト抗体軽鎖および重鎖をコードする核酸を増幅するための技術およびプライマーは、当技術分野で周知であり、例えば、その全てが全ての目的のためにその全体を参照により組み込まれる、ＰｒｏＧｅｎのヒトＩｇＧおよびＩｇＭライブラリープライマーセット、カタログ番号Ｆ２０００；Ａｎｄｒｉｓ－Ｗｉｄｈｏｐｆら、「Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｆａｂ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ：ＰＣＲ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ Ｌｉｇｈｔ ａｎｄ Ｈｅａｖｙ Ｃｈａｉｎ Ｃｏｄｉｎｇ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ．Ｐｒｏｔｏｃ．２０１１；Ｌｉｍら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１巻：１０８～１１７頁（２０１０）；Ｓｕｎら、Ｗｏｒｌｄ Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２８巻：３８１～３８６頁（２０１２）；Ｃｏｒｏｎｅｌｌａら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２８：ｅ８５（２０００）に記載される。マウス抗体軽鎖および重鎖をコードする核酸を増幅するための技術およびプライマーは、当技術分野で周知であり、例えば、その両方が全ての目的のためにその全体を参照により組み込まれる、米国特許第８，１４３，００７号；Ｗａｎｇら、ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍ．７巻（補遺）：Ｓ９（２００６）に記載される。抗体レパートリーは、抗原結合ドメインにおいて別々の鎖として使用されるか、または一本鎖抗原結合ドメインに変換されてもよい。一本鎖抗体は、例えば、その両方が全ての目的のためにその全体を参照により組み込まれる、Ｐａｎｓｒｉら、ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９巻：６（２００９）；Ｐｅｒａｌｄｉ－Ｒｏｕｘ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌｃ．Ｂｉｏｌ．９０７巻：７３～８３頁（２０１２）に記載されるものを含む、当技術分野で周知の技術を使用して、ヒト軽鎖および重鎖をコードする核酸から作製することができる。一本鎖抗体は、例えば、その両方が全ての目的のためにその全体を参照により組み込まれる、Ｉｍａｉら、Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．２９巻：１３２５～１３３０頁（２００６）；Ｃｈｅｎｇら、ＰＬｏＳ ＯＮＥ６巻：ｅ２７４０６（２０１１）に記載されるものを含む、当技術分野で周知の技術を使用して、マウス軽鎖および重鎖をコードする核酸から作製することができる。
【0055】
自然免疫受容体は、例えば、ＣＤ９４／ＮＫＧ２受容体ファミリー（例えば、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＮＫＧ２Ｈ）、２Ｂ４受容体、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、およびＮＫｐ８０受容体、Ｔｏｌｌ様受容体（例えば、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＲＰ１０５）を含む。
【0056】
７回膜貫通ドメイン受容体としても公知のＧタンパク質連結受容体は、リガンドの受容体結合を、Ｇタンパク質を通して細胞応答にカップリングする、受容体の大きなファミリーである。これらのＧタンパク質は、α、β、およびγサブユニット（それぞれ、Ｇα、Ｇβ、およびＧγとして公知）の三量体であり、ＧＴＰに結合すると活性であり、ＧＤＰに結合すると不活性である。受容体がリガンドに結合すると、構造変化を受け、アロステリックにＧタンパク質を活性化して、ＧＴＰに結合したＧＤＰと交換する。ＧＴＰ結合後、Ｇタンパク質は受容体から解離して、Ｇα－ＧＴＰ単量体およびＧβγ二量体を生じる。Ｇタンパク質連結受容体は、例えば、ロドプシン様受容体、セレクチン受容体、代謝型グルタミン酸／フェロモン受容体、真菌交配フェロモン受容体、サイクリックＡＭＰ受容体、およびｆｒｉｚｚｌｅｄ／ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ受容体を含むクラスに、共にグループ分けされている。Ｇタンパク質受容体は、電磁放射の検出、味覚（味）、臭いの感覚、神経伝達、免疫系制御、増殖、細胞密度感知等を含む、多種多様な生理学的プロセスで使用される。
【0057】
触媒受容体としても公知の酵素連結受容体は、膜貫通受容体であり、細胞外リガンドの結合が、細胞内側で酵素活性を引き起こす。酵素連結受容体は、ポリペプチドの膜貫通部分（またはドメイン）によって共に接合された２つのドメインを有する。２つの末端ドメインは、細胞外リガンド結合ドメインおよび触媒機能を有する細胞内ドメインである。例えば、Ｅｒｂ受容体ファミリー、グリア細胞由来神経栄養因子受容体ファミリー、ナトリウム利尿ペプチド受容体ファミリー、ｔｒｋニューロトロフィン受容体ファミリー、およびｔｏｌｌ様受容体ファミリーを含む、酵素連結受容体の多数のファミリーがある。
【0058】
リガンド依存性イオンチャネルとしても公知のイオンチャネル連結受容体は、受容体へのリガンドの結合に応答して、イオン、例えばＮａ＋、Ｋ＋、Ｃａ２＋およびＣｌ－などが膜を通過できるようにする受容体である。例えば、カチオンｃｙｓ－ループ受容体、アニオンｃｙｓ－ループ受容体、イオンチャネル型グルタミン酸受容体（ＡＭＰＡ受容体、ＮＭＤＡ受容体）、ＧＡＢＡ受容体、５－ＨＴ受容体、ＡＴＰ依存性チャンネル、およびＰＩＰ２依存性チャンネルを含む、リガンド依存性イオンチャネルの多数のファミリーがある。
【0059】
Ｔ細胞受容体レパートリーは、適切なＨＬＡ対立遺伝子（例えば、ＨＬＡ－Ａ０２：０１）を有するドナー／患者から、操作した細胞株（例えば、Ｊｕｒｋａｔ細胞）から作製されるか、または公知の配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ）から合成されてもよい。多様性は、ＶおよびＪ遺伝子の範囲にわたる特定のアルファおよびベータ鎖ＴＣＲを導入するプラスミドを介して操作した細胞に導入され得る。ＣＤＲ３、アルファ、およびベータ遺伝子の組合せは、以下の方法のいずれかでまとめることができる：（１）場合により、抗原標的と相互作用することが公知の、公知の非対合（例えば、ベータまたはアルファ）ＴＣＲのサンプリング（２）場合により、抗原標的と相互作用することが公知の、対合したＴＣＲのサンプリング（３）抗原標的と相互作用することが公知の、公知の対合または非対合ＴＣＲから開始し、結合に重要であることが公知か、結合に重要ではないことが公知のいずれかのエリアのそのＣＤＲ３領域を突然変異させること。
【0060】
他の受容体のレパートリーも、適切なＨＬＡ対立遺伝子（例えば、ＨＬＡ－Ａ０２：０１）を有するドナー／患者から作製されるか、または適切な細胞株から採取されるか、または公知の配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｋに見出される配列）から合成されてもよい。多様性は、当技術分野で公知の方法を使用して受容体のレパートリーに導入され得る（例えば、受容体に突然変異を操作する、鎖のスワッピング、受容体鎖のキメラを作製する、２つまたはそれよりも多いポリペプチドから作製された受容体の鎖のスワッピング等）。
【0061】
目的の受容体をコードするＤＮＡは、個々に、またはプールしたライブラリーフォーマットで合成されてもよい。バリエーション（例えば、多様性）は、目的の受容体の任意の位置に導入された遺伝子突然変異を使用して、受容体ライブラリーまたはレパートリーに導入され得る。あるいは、バリエーションは、鎖のスワッピング技術、または例えば一部のガイド進化法で行われるように、受容体（鎖（複数可））をコードする核酸のセグメントの混合によって導入され得る。遺伝子突然変異は、ＤＮＡ断片の置換、欠失、挿入、および再編成であり得る。選択の特定の遺伝子突然変異は、無作為に生成されるか、目的の領域（例えば、受容体の相互作用ドメイン）に富化されるか、または計算アルゴリズムによって推奨されてもよい。推奨された遺伝子突然変異戦略への計算アルゴリズムの例は、タンパク質構造解析、計算ドッキング、分子動態シミュレーション、回帰、統計ベースの分類、ランダムフォレスト、サポートベクターマシン、および神経ネットワークを含む。
【0062】
目的の受容体の抗原／リガンドは、ペプチド、ＭＨＣ－ペプチド複合体、断片、キメラ、または全タンパク質であり得る。抗原／リガンドは、炭水化物、脂肪酸もしくは脂質、または小分子であってもよい。抗原／リガンドは、共有結合または非共有結合によって抗原提示細胞表面と会合させ得る。抗原／リガンドがポリペプチドである場合、それらは、それらの天然の膜貫通ドメインによりまたは合成の膜貫通ドメインにより、抗原提示細胞表面に係留され得る。合成の膜貫通ドメインは、合成の膜貫通ドメインＤＮＡ配列を、抗原／リガンドの所望の部分、一部または全体をコードするＤＮＡ配列と作動可能に連結するようにＤＮＡ配列を操作することによって抗原／リガンド細胞外ドメインに融合され得る。例示的な合成の膜貫通ドメインは、ＣＤ２、ＣＤ３ｄ、ＣＤ３ｇ、ＣＤ３ｚ、ＣＤ４、ＣＤ８Ａ、ＣＤ８Ｂ、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８４、ＣＤ８６、ＣＤ１３７、ＣＤ２４４、ＣＲＡＣＣ、ＣＲＴＡＭ、ＣＬＴＡ－４、ＭＨＣ－Ｉ、ＭＨＣ－ＩＩ、血小板由来増殖因子受容体、ＦＣＧＲ１Ａ、ＦＣＧＲ２Ａ、ＦＣＧ２Ｂ、ＦＣＧＲ３Ａ、ＦＣＲＬ１、ＦＣＲＬ２、ＦＣＲＬ３、ＦＣＲＬ４、ＦＣＲＬ５、ＦＣＲＬ６、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ、ＫＩＲ２ＤＬ５Ｂ、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＬ２、ＫＩＲ３ＤＬ３、ＬＡＧ３、ＧＩＴＲ、ＯＸ４０、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＴＬＲ、ＳＬＡＭＦ、ＬＩＬＲＢ１、ＬＩＬＲＢ２、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＴＩＧＩＴ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、または免疫グロブリン由来の野生型または改変膜貫通ドメインを含む。抗原／リガンドのレパートリーは、作製され、抗原／リガンド提示細胞に操作により導入され得る。場合により、抗原／リガンドライブラリーのバリエーションは、目的の抗原／リガンドの所望の位置へと（例えば、無作為に、または部位特異的に）遺伝子突然変異を導入することによって作製され得る。遺伝子突然変異は、ＤＮＡ断片の置換、欠失、挿入、および再編成であり得る。選択の特異的遺伝子突然変異は、ランダムに生成されるか、目的の領域（例えば、リガンドの相互作用ドメイン）に富化されるか、または計算アルゴリズムによって推奨されてもよい。推奨される遺伝子突然変異戦略への計算アルゴリズムの例は、タンパク質構造解析、計算ドッキング、分子動態シミュレーション、回帰、統計ベースの分類、ランダムフォレスト、サポートベクターマシン、および神経ネットワークを含む。
【0063】
抗原ライブラリーは、適切なＭＨＣ分子またはペプチドおよびＭＨＣの２つの別々の分子との抗原ポリペプチドの融合体として作製され得る。アルゴリズムは、例えば、その全てが全ての目的のためにその全体を参照により組み込まれる、Ｃｈｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３７巻：１３３２～４３頁（２０１９）、Ｊｕｒｔｚら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９巻：３３６０～６８頁（２０１７）、およびＡｂｅｌｉｎら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ５１巻：７６６～７９頁（２０１９）に開示のものを含む、提示可能な抗原を同定するために使用され得る。抗原－ＭＨＣ融合体をコードする核酸は、場合により、融合体の抗原ポリペプチドを同定するバーコードを含み得る。抗原－ＭＨＣ分子融合体のライブラリーは、融合したかまたは融合していない抗原－ＭＨＣ分子複合体ならびにバーコードをその表面に提示する適切な宿主細胞に入れられる（例えば、Ｋ５６２などの細胞株）。このバーコードは、ＤＮＡまたはＲＮＡであってもよく、細胞膜に直接、ＭＨＣ分子に結合されるか、または発現された場合、バーコードを細胞表面に輸送する別のタンパク質（例えば、ＧＦＰ）に結合され得る。抗原ライブラリーのための宿主細胞は、レポーターも含み得る（例えば、細胞は膜ＧＦＰを発現するように操作され得る）。
【0064】
単球細胞でのＴＣＲ－Ｆｃ融合体のレパートリーは、抗原：：ＭＨＣ融合タンパク質のライブラリーと混合され得る。ＭＨＣに提示された抗原ポリペプチドに結合することができるＴＣＲ抗原結合ドメインを有するマクロファージ細胞は、ＴＣＲ－Ｆｃキメラ受容体のＴＣＲに結合する抗原－ＭＨＣ融合体を提示する細胞を貪食することができる。抗原－ＭＨＣ融合体を提示する細胞がレポーターを含む場合、受容体からのシグナルは、抗原－ＭＨＣ融合体提示細胞を貪食したＴＣＲ－Ｆｃ細胞を分離するために使用され得る。例えば、レポーターが光学レポーターである場合、その光学レポーターは、ＦＡＣｓソーティングを使用して、抗原－ＭＨＣを貪食したＴＣＲ－Ｆｃ細胞を分離するために使用され得る。場合により、キメラＴＣＲレパートリーを有する貪食細胞型は、レポーターを含み得る（例えば、抗原提示細胞レポーターとは異なる光学レポーター）。キメラＴＣＲレパートリーを有する細胞と抗原ライブラリーを有する細胞の両方が異なる光学レポーターを有する場合、ＦＡＣｓソーティングを使用して、両方の光学シグナルを有する細胞を選択することができる（例えば、まず光学シグナルの一方を有する細胞を選択し、次いで他方の光学シグナルを有する細胞を選択することにより）。
【0065】
あるいは、操作した受容体細胞のレパートリー（例えば、ＴＣＲを有する単球）は、リガンドのライブラリー（例えば、抗原－ＭＨＣ融合体タンパク質）と混合することができる。受容体細胞は、操作した細胞（例えば、単球またはマクロファージ）の受容体（例えば、ＴＣＲ）に結合するリガンド（例えば、抗原－ＭＨＣ複合体が融合したかまたは融合していない）を提示する細胞と相互作用し、それに対して活性化する。受容体細胞は、トロゴサイトーシスにより、（リガンドを同定する）細胞表面のＤＮＡまたはＲＮＡバーコードを含む、リガンド細胞の膜の断片を捕捉する。リガンド（例えば抗原－ＭＨＣ融合体）を提示する細胞が膜結合レポーターまたは色素を含む場合、膜結合レポーターからのシグナルを使用して、他の細胞から、リガンド提示細胞（例えば、抗原－ＭＨＣ融合体提示細胞）と相互作用した操作した受容体細胞を分離することができる。例えば、レポーターが光学レポーターである場合、その光学レポーターは、ＦＡＣｓソーティングを使用して、リガンド（例えば、抗原－ＭＨＣ）に対して活性化された受容体細胞を分離するために使用され得る。場合により、トロゴサイトーシスする細胞型は、レポーターを含み得る（例えば、抗原提示細胞レポーターとは異なる光学レポーター）。操作した受容体細胞とリガンドライブラリーを有する細胞の両方が異なる光学レポーターを有する場合、ＦＡＣｓソーティングを使用して、両方の光学シグナルを有する細胞を選択することができる（例えば、まず光学シグナルの一方を有する細胞を選択し、次いで他方の光学シグナルを有する細胞を選択することにより）。
【0066】
リガンド（例えば、抗原－ＭＨＣ）に対して活性化された、操作した受容体細胞（複数可）を、バルクシークエンシングまたは単一細胞シークエンシングのために分離して、受容体－リガンド対を形成した抗原ポリペプチドおよび受容体（例えば、ＴＣＲ可変領域）を同定することができる。受容体およびリガンドのバーコードをシークエンシングして、受容体およびリガンドを同定することができるか、または受容体（例えば、ＴＣＲ可変領域）および受容体（例えば、抗原）をコードする核酸を直接シークエンシングして、受容体およびリガンドを同定することができる。
【0067】
操作した受容体（例えば、Ｔ細胞受容体またはＴ細胞受容体ミミック）のライブラリーは、最大１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、または１０１０個の異なる受容体（例えば、Ｔ細胞受容体）を示し得る。リガンド（例えば、抗原－ＭＨＣ融合体）のライブラリーは、１０３または１０４または１０５または１０６または１０７または１０８または１０９または１０１０個の異なるリガンド（例えば、抗原－ＭＨＣ融合体）を示し得る。
【0068】
バーコード受容体レパートリー
受容体レパートリーは、適切な細胞型由来の目的の受容体（例えば、上記のＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージおよび／または好中球の開示された受容体）をコードする核酸から開始して得ることができる。例えば、Ｔ細胞受容体レパートリーは、ＣＤ８＋ Ｔ細胞、ＣＤ４＋ Ｔ細胞、調節性Ｔ細胞、メモリーＴ細胞、ヘルパーＴ細胞、または細胞傷害性Ｔ細胞の１つまたは複数から得ることができる。Ｔ細胞は、ナイーブであるか、または目的の抗原もしくは他の抗原に曝露されたエフェクターおよび／もしくはメモリーＴ細胞を含んでもよい。メモリーＴ細胞は、ステムセルメモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）、セントラルメモリー細胞（ＴＣＭ）、トランジショナルメモリー細胞（ＴＴＭ）、および／またはエフェクターメモリー細胞（ＴＥＭ）であってもよい。Ｔ細胞は、Ｔｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ９、Ｔｈ１７、Ｔｈ２２、Ｔｒｅｇ、Ｔｆｈおよび細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）であってもよい。Ｔ細胞受容体は、Ｔ細胞（または、Ｔ細胞の亜集団）のゲノムＤＮＡおよび／またはＴ細胞（または、Ｔ細胞の亜集団）のｍＲＮＡのいずれか（または両方）から得ることができる。Ｔ細胞受容体のレパートリーは、当技術分野で周知であり、例えば、その全てが全ての目的のためにその全体を参照により組み込まれる、Ｃｌｏｎｔｅｃｈによって市販されているＳＭＡＲＴｅｒ Ｈｕｍａｎ ＴＣＲ ａ／ｂ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ Ｋｉｔｓ、Ｂｏｒｉａら、ＢＭＣ Ｉｍｍｕｎｏｌ．９巻：５０～５８頁（２００８）；Ｍｏｏｎｋａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １６９巻：４１～５１頁（１９９４）；Ｋｉｍら、ＰＬｏＳ ＯＮＥ ７巻：ｅ３７３３８（２０１２）；Ｓｅｉｔｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０３巻：１２０５７～６２頁（２００６）に記載される技術およびプライマーを使用して得ることができる。Ｔ細胞受容体ポリペプチドを、別々の鎖として使用して、ＴＣＲを形成することができる。あるいは、Ｔ細胞受容体ポリペプチド鎖は、一本鎖ＴＣＲに変換され得る。一本鎖Ｔ細胞受容体は、例えば、その全てが全ての目的のためにその全体を参照により組み込まれる、米国特許出願公開第２０１２／０２５２７４２号、Ｓｃｈｏｄｉｎら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３３巻：８１９～８２９頁（１９９６）；Ａｇｇｅｎら，「Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｈｕｍａｎ Ｓｉｎｇｌｅ－Ｃｈａｉｎ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ」、イリノイ大学アーバナ・シャンペーン校の博士論文（２０１０）（そのコピーがｉｄｅａｌｓ．ｉｌｌｉｎｏｉｓ．ｅｄｕ／ｂｉｔｓｔｒｅａｍ／ｈａｎｄｌｅ／２１４２／１８５８５／Ａｇｇｅｎ＿Ｄａｖｉｄ．ｐｄｆ？ｓｅｑｕｅｎｃｅ＝１に見出される）に記載されるものを含む、当技術分野で周知の技術を使用して、ヒトアルファ鎖およびヒトベータ鎖をコードする核酸から作製され得る。
受容体レパートリーは、適切な細胞型由来の目的の受容体（例えば、上記のＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージおよび／または好中球の開示された受容体）をコードする核酸から開始して得ることができる。例えば、Ｔ細胞受容体レパートリーは、ＣＤ８＋ Ｔ細胞、ＣＤ４＋ Ｔ細胞、調節性Ｔ細胞、メモリーＴ細胞、ヘルパーＴ細胞、または細胞傷害性Ｔ細胞の１つまたは複数から得ることができる。Ｔ細胞は、ナイーブであるか、または目的の抗原もしくは他の抗原に曝露されたエフェクターおよび／もしくはメモリーＴ細胞を含んでもよい。メモリーＴ細胞は、ステムセルメモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）、セントラルメモリー細胞（ＴＣＭ）、トランジショナルメモリー細胞（ＴＴＭ）、および／またはエフェクターメモリー細胞（ＴＥＭ）であってもよい。Ｔ細胞は、Ｔｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ９、Ｔｈ１７、Ｔｈ２２、Ｔｒｅｇ、Ｔｆｈおよび細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）であってもよい。Ｔ細胞受容体は、Ｔ細胞（または、Ｔ細胞の亜集団）のゲノムＤＮＡおよび／またはＴ細胞（または、Ｔ細胞の亜集団）のｍＲＮＡのいずれか（または両方）から得ることができる。Ｔ細胞受容体のレパートリーは、当技術分野で周知であり、例えば、その全てが全ての目的のためにその全体を参照により組み込まれる、Ｃｌｏｎｔｅｃｈによって市販されているＳＭＡＲＴｅｒ Ｈｕｍａｎ ＴＣＲ ａ／ｂ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ Ｋｉｔｓ、Ｂｏｒｉａら、ＢＭＣ Ｉｍｍｕｎｏｌ．９巻：５０～５８頁（２００８）；Ｍｏｏｎｋａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １６９巻：４１～５１頁（１９９４）；Ｋｉｍら、ＰＬｏＳ ＯＮＥ ７巻：ｅ３７３３８（２０１２）；Ｓｅｉｔｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０３巻：１２０５７～６２頁（２００６）に記載される技術およびプライマーを使用して得ることができる。Ｔ細胞受容体ポリペプチドを、別々の鎖として使用して、ＴＣＲを形成することができる。あるいは、Ｔ細胞受容体ポリペプチド鎖は、一本鎖ＴＣＲに変換され得る。一本鎖Ｔ細胞受容体は、例えば、その全てが全ての目的のためにその全体を参照により組み込まれる、米国特許出願公開第２０１２／０２５２７４２号、Ｓｃｈｏｄｉｎら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３３巻：８１９～８２９頁（１９９６）；Ａｇｇｅｎら，「Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｈｕｍａｎ Ｓｉｎｇｌｅ－Ｃｈａｉｎ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ」、イリノイ大学アーバナ・シャンペーン校の博士論文（２０１０）（そのコピーがｉｄｅａｌｓ．ｉｌｌｉｎｏｉｓ．ｅｄｕ／ｂｉｔｓｔｒｅａｍ／ｈａｎｄｌｅ／２１４２／１８５８５／Ａｇｇｅｎ＿Ｄａｖｉｄ．ｐｄｆ？ｓｅｑｕｅｎｃｅ＝１に見出される）に記載されるものを含む、当技術分野で周知の技術を使用して、ヒトアルファ鎖およびヒトベータ鎖をコードする核酸から作製され得る。
【0069】
免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、脾臓組織、胚、および腫瘍を含む、いくつかの起源から得ることができる。免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）は、Ｆｉｃｏｌｌ分離などの、当業者に公知のいくつもの技術を使用して対象から収集した血液の単位から得ることができる。個体の循環する血液由来の免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）は、アフェレーシスまたは白血球除去輸血によって得ることができる。ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡ／ｃＤＮＡを使用して、受容体（例えば、Ｔ細胞受容体）をコードする核酸を得ることができる。
【0070】
腫瘍に浸潤したＴ細胞は、Ｔ細胞レパートリーの起源として使用することができる。Ｔ細胞は、外科手術中に除去され得る。Ｔ細胞は、生検による腫瘍組織の除去後に単離され得る。Ｔ細胞は、当技術分野で公知の任意の好適な方法によって腫瘍試料からのＴ細胞のバルク集団から単離され得る。例えば、Ｔ細胞のバルク集団は、そこから特定の細胞集団が選択され得る細胞懸濁液へと腫瘍試料を解離することによって腫瘍試料から得ることができる。Ｔ細胞のバルク集団を得る好適な方法は、限定はされないが、腫瘍を機械的解離すること（例えば、刻む）、腫瘍を酵素的に解離すること（例えば、消化する）、および吸引（例えば、注射によるように）のいずれか１つまたは複数を含み得る。
【0071】
負の選択によるＴ細胞集団の富化は、負の選択された細胞にユニークな表面マーカーに対する抗体の組合せによって達成することができる。好ましい方法は、負の選択された細胞に存在する細胞表面マーカーに対するモノクローナル抗体のカクテルを使用する、負の磁気免疫付着（negative magnetic immunoadherence）またはフローサイトメトリーを介した細胞ソーティングおよび／または選択である。例えば、負の選択によってＣＤ４＋細胞を富化するため、モノクローナル抗体カクテルは、典型的には、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ－ＤＲ、およびＣＤ８に対する抗体を含む。
【0072】
Ｔ細胞はまた、抗原特異性Ｔ細胞であってもよい。例えば、腫瘍特異的Ｔ細胞が使用され得る。抗原得的Ｔ細胞は、目的の患者、例えばがんまたは感染性疾患に苦しむ患者から単離され得る。抗原特異的Ｔ細胞は、単独でもしくはアジュバントと組み合わせた、または樹状細胞にパルスされた、特定の抗原による対象のワクチン接種によって誘導され得る。拡大での使用のための抗原特異的細胞は、当業者に公知のいくつもの方法を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏでも生成され得る。
【0073】
各Ｔ細胞受容体は、２つのタンパク質鎖：アルファ鎖およびベータ鎖、またはガンマ鎖およびデルタ鎖から作製される。各鎖は、２つの細胞外ドメイン：可変（Ｖ）領域および定常（Ｃ）領域を有する。定常領域は、細胞膜の近位にあり、膜貫通領域および短い細胞質テイルが続くが、可変領域は、抗原：ＭＨＣ複合体に結合する。ＴＣＲアルファ鎖とベータ鎖の両方の可変ドメインは、それぞれ、３つの超可変領域または相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する。通常抗原と接触せず、したがって、ＣＤＲとは考えられないベータ鎖には超可変なさらなるエリアもある（ＨＶ４）。ＣＤＲ３は、プロセシングされた抗原の認識を担う主要なＣＤＲであり、アルファ鎖のＣＤＲ１も抗原性ペプチドのＮ末端部分と相互作用することが示されているが、ベータ鎖のＣＤＲ１はペプチドのＣ末端部分と相互作用する。ＣＤＲ２はＭＨＣを認識する。ベータ鎖のＣＤＲ４は、抗原認識に参加するとは考えられないが、超抗原と相互作用することが示されている。ＴＣＲの定常ドメインは、システイン残基がジスルフィド結合を形成し、２つの鎖間の連結を形成する短い接続配列からなる。
【0074】
ＴＣＲミミックの形態は、キメラＴ細胞受容体またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む。キメラＴ細胞受容体は、適切な細胞質領域を一本鎖ＴＣＲまたはＴ細胞受容体の１つの鎖と融合することによって作製される。一本鎖Ｔ細胞受容体は、全ての目的のためにその全体を参照により組み込まれる、Ｚｈａｎｇら、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １１巻：４８７～４９６頁（２００４）に従って作製され得る。適切な細胞質領域は、Ｆｃ細胞質ドメイン、ＣＤ３ζ、ＣＤ２８、Ｂ７．１、ＣＤ１３７、ＣＤ１９細胞内活性化ドメイン、ＣＤ６４細胞内活性化ドメイン、ＣＤ３２細胞内活性化ドメイン、ＣＤ１６細胞内活性化ドメイン、ＣＤ２３細胞内活性化ドメイン、またはＬｃｋ活性化ドメインの１つまたは複数を含む。キメラＴＣＲにおいて使用され得る共刺激ドメインは、例えば、ＣＤ３ζ、ＣＤ２８、Ｂ７．１、ＣＤ１３７、ＣＤ１９細胞内活性化ドメイン、ＣＤ６４細胞内活性化ドメイン、ＣＤ３２細胞内活性化ドメイン、ＣＤ１６細胞内活性化ドメイン、ＣＤ２３細胞内活性化ドメイン、Ｌｃｋ活性化ドメイン、ＣＤ２７、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０、ＣＤ１６０、Ｂ７－Ｈ３、ＭｙＤ８８等を含む。Ｆｃシグナル伝達ドメイン、および場合により、１つまたは複数の共刺激ドメインと融合したキメラＴ細胞受容体は、ＴＣＲへのリガンド結合に応答して単球／マクロファージの貪食を引き起こすことができる。あるいは、シグナル伝達ドメイン、および場合により、１つまたは複数の共刺激ドメインを有するキメラＴ細胞受容体またはキメラ抗原受容体は、受容体と相互作用する抗原に応答してトロゴサイトーシスを引き起こすことができる。
【0075】
場合により、Ｔ細胞は、膜結合ＤＮＡまたはＲＮＡ結合タンパク質を介して、それらの細胞膜に結合したＴＣＲバーコードを含有する。抗原提示細胞の抗原バーコードは、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡをコードする抗原と同時にまたは逐次的に導入され得る。膜結合核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）結合タンパク質は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写因子結合タンパク質、複製タンパク質Ａ、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９、Ｃａｓ１３、Ｃｐｆ１、ファージＲＮＡ結合タンパク質、細菌一本鎖結合タンパク質、または操作した制限消化酵素から操作され得る。核酸結合タンパク質は結合モチーフを有し、これらは表１にタンパク質の例示的なセットについて記載される。
【0076】
【表1】
【0077】
膜結合核酸結合タンパク質は、（必要な場合）合成の膜貫通ドメインによって操作した核酸結合タンパク質から操作され得る。例示的な合成の膜貫通ドメインは、ＣＤ２、ＣＤ３ｄ、ＣＤ３ｇ、ＣＤ３ｚ、ＣＤ４、ＣＤ８Ａ、ＣＤ８Ｂ、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８４、ＣＤ８６、ＣＤ１３７、ＣＤ２４４、ＣＲＡＣＣ、ＣＲＴＡＭ、ＣＬＴＡ－４、ＭＨＣ－Ｉ、ＭＨＣ－ＩＩ、血小板由来増殖因子受容体、ＦＣＧＲ１Ａ、ＦＣＧＲ２Ａ、ＦＣＧ２Ｂ、ＦＣＧＲ３Ａ、ＦＣＲＬ１、ＦＣＲＬ２、ＦＣＲＬ３、ＦＣＲＬ４、ＦＣＲＬ５、ＦＣＲＬ６、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ、ＫＩＲ２ＤＬ５Ｂ、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＬ２、ＫＩＲ３ＤＬ３、ＬＡＧ３、ＧＩＴＲ、ＯＸ４０、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＴＬＲ、ＳＬＡＭＦ、ＬＩＬＲＢ１、ＬＩＬＲＢ２、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＴＩＧＩＴ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、または免疫グロブリン由来の野生型または改変膜貫通ドメインを含む。核酸結合ドメインは、当技術分野で公知の操作技術を使用して、膜の細胞質側に存在するように操作され得る。例えば、多くの合成の膜貫通ドメインは、膜の細胞質側にポリペプチド鎖のｃ末端を有する。したがって、核酸結合タンパク質は、合成の膜貫通ドメインのｃ末端に操作により導入することができ、こうして、核酸結合タンパク質部分は膜の細胞質側に存在する。バーコードは、ＴＣＲのＣＤＲもしくは抗原のユニーク配列であってもよく、またはバーコードは、発現されたｍＲＮＡがバーコードを含むように受容体もしくは抗原もしくはリガンドをコードする核酸に導入されてもよい。受容体／抗原／リガンドをコードする核酸はまた、発現されたｍＲＮＡが結合モチーフを含むように膜結合核酸結合タンパク質の結合モチーフを含むように操作されてもよい。これは、膜結合核酸結合タンパク質に結合している受容体または抗原のｍＲＮＡを生じる。トロゴサイトーシスが受容体細胞とリガンド提示細胞の間で生じる場合、バーコードを有する膜結合核酸結合タンパク質も移行され、受容体（例えば、ＴＣＲまたはＣＡＲ）およびリガンド（例えば、抗原）の膜結合バーコードを有する両細胞を生じる。
【0078】
キメラＴＣＲのレパートリーは、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、または１０１０個の異なるＴＣＲを有し得る。キメラＴＣＲのレパートリーは、対象の、またはナイーブＴ細胞の、または目的の抗原に対する免疫応答を開始した対象由来もしくは上記のＴ細胞の集団のいずれか由来のＴ細胞のゲノムＤＮＡに見出されるＴＣＲの集団を表し得る。キメラＴＣＲのレパートリーの好適な細胞型は、例えば、ＴＨＰ－１細胞を含むマクロファージの単球である。
【0079】
バーコード抗原／リガンドレパートリー
リガンドライブラリーは、所望のリガンド（例えば、抗原）から作製される。ＨＬＡ遺伝子および抗原配列は、単一ペプチドに融合されるかまたは別々のペプチドとしてコードされ得る。ＨＬＡアルファおよびベータ鎖は、融合されるかまたは別々のペプチドとしてコードされ得る。ＨＬＡは全長タンパク質の断片のみ結合し、提示し得るので、抗原配列は、８～２５アミノ酸長である。コンピューターアルゴリズムは、提示可能な抗原として使用するペプチドを選択するために使用されてもよく、提示可能なペプチド抗原を同定する好適な方法は、その全てが全ての目的のためにその全体を参照により組み込まれる、Ｃｈｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３７巻：１３３２～４３頁（２０１９）、Ｊｕｒｔｚら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９巻：３３６０～６８頁（２０１７）、Ａｂｅｌｉｎら、Ｊ．Ｔｈｅｒｏ．Ｂｉｏｌ．３８９巻：２１４～２２４頁（２０１６）に記載される。
リガンドライブラリーは、所望のリガンド（例えば、抗原）から作製される。ＨＬＡ遺伝子および抗原配列は、単一ペプチドに融合されるかまたは別々のペプチドとしてコードされ得る。ＨＬＡアルファおよびベータ鎖は、融合されるかまたは別々のペプチドとしてコードされ得る。ＨＬＡは全長タンパク質の断片のみ結合し、提示し得るので、抗原配列は、８～２５アミノ酸長である。コンピューターアルゴリズムは、提示可能な抗原として使用するペプチドを選択するために使用されてもよく、提示可能なペプチド抗原を同定する好適な方法は、その全てが全ての目的のためにその全体を参照により組み込まれる、Ｃｈｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３７巻：１３３２～４３頁（２０１９）、Ｊｕｒｔｚら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９巻：３３６０～６８頁（２０１７）、Ａｂｅｌｉｎら、Ｊ．Ｔｈｅｒｏ．Ｂｉｏｌ．３８９巻：２１４～２２４頁（２０１６）に記載される。
【0080】
Ｔ細胞受容体は、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子に結合した抗原を認識することができる。ＭＨＣ分子は、クラスＩ、クラスＩＩ、およびクラスＩＩＩを含む。クラスＩとクラスＩＩ両方のＭＨＣ分子は、免疫応答に役割を果たす。クラスＩのＭＨＣ分子は、重鎖および軽鎖からなり、約８～１１アミノ酸だが、通常９または１０アミノ酸のペプチドに結合し、それをナイーブおよび細胞傷害性Ｔリンパ球に提示することができる。クラスＩのＭＨＣ分子が結合したペプチドは、内在性タンパク質抗原から生じ得る。クラスＩのＭＨＣ分子のアルファ鎖は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－ＢまたはＨＬＡ－Ｃ単量体であってもよく、ベータ鎖はベータ２ミクログロブリンであってもよい。
【0081】
クラスＩＩのＭＨＣ分子は、アルファ鎖およびベータ鎖からなり、約８～２４アミノ酸のペプチドに結合することができ、それをＴ細胞に提示する。ＭＨＣクラスＩＩ分子が結合したペプチドは、細胞外または外因性タンパク質抗原から生じ得る。アルファ鎖およびベータ鎖は、ＨＬＡ－ＤＲ、ＨＬＡ－ＤＱおよびＨＬＡ－ＤＰ単量体であり得る。ＭＨＣクラスＩＩは、全ての細胞型によって発現され得るが、通常、プロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）：マクロファージ、Ｂ細胞、および特に樹状細胞で生じる。ＡＰＣは、抗原性タンパク質を取込み、抗原プロセシングを実施し、その分子画分－エピトープと呼ばれる画分－を戻し、ＭＨＣクラスＩＩ分子内にカップリングしたＡＰＣの表面にそれを提示する（抗原提示）。細胞の表面では、エピトープはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のような免疫構造によって認識され得る。
【0082】
場合により、抗原提示細胞は、膜結合ＤＮＡまたはＲＮＡ結合タンパク質を介して、それらの細胞膜に結合した抗原バーコードを含有する。抗原提示細胞の抗原バーコードは、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡをコードする抗原と同時にまたは逐次的に導入され得る。膜結合ＤＮＡまたはＲＮＡ結合タンパク質は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写因子結合タンパク質、複製タンパク質Ａ、ＣＲＳＩＰＲ Ｃａｓ９、Ｃａｓ１３、Ｃｐｆ１、ファージＲＮＡ結合タンパク質、細菌一本鎖結合タンパク質、または操作した制限消化酵素によって操作され得る。膜結合抗原バーコードは、トロゴサイトーシス時にＡＰＣとＴ細胞の間で情報を移行することができる。
【0083】
ＭＨＣ抗原複合体は、抗原ライブラリーを作出するための以下の方法の１つまたはいずれかの組合せで共に連結され得る：遺伝的に連結するＭＨＣアルファ鎖、ＭＨＣベータ鎖、および可動性リンカー（例えば、ＧＣＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）を有する配列をコードする抗原、遺伝的に連結する、自己切断ペプチド配列（例えば、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、またはＦ２Ａ）を有するＭＨＣ遺伝子、または所望のＭＨＣ対立遺伝子を有する細胞株における抗原ペプチドの過剰発現。抗原ＤＮＡまたはＲＮＡは、ライブラリーのＡＰＣのバルクまたは単一細胞シークエンシングによって回収することができ、天然のバーコードとして機能する。抗原ＤＮＡ／ＲＮＡバーコード（抗原配列）は、ＰＣＲおよび抗原隣接領域を標的化するプライマーを使用して増幅することができる。ＡＰＣがマクロファージによって消費される貪食後、対合した抗原およびＴＣＲデータを、ＤＮＡまたはＲＮＡシークエンシングを介して、１つの細胞（ＡＰＣを「食べた」マクロファージ）から回収することが可能になる。あるいは、Ｔ細胞活性化ならびにＡＰＣおよびＴ細胞が膜片を交換するトロゴサイトーシス後、バーコード（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）は、対合した抗原およびＴＣＲデータを、ＤＮＡまたはＲＮＡシークエンシングを介して、１つの細胞（ＡＰＣまたはＴ細胞は、抗原とＴＣＲバーコードの両方を含有する）から回収することを可能にする。抗原ペプチドを有する一本鎖ＭＨＣ分子を作製するための方法は、例えば、その全てが全ての目的のためにその全体を参照により組み込まれる、Ｍｏｔｔｅｚら、Ｃｅｌｌｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ａ ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ ｃｌａｓｓ Ｉ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｗｉｔｈ ａ ｓｉｎｇｌｅ ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ ｂｏｕｎｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ａｒｅ ｈｉｇｈｌｙ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８１巻：４９３～５０２頁（１９９５）；Ｉｇｎａｔｏｗｉｃｚら、Ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｌａｓｓ ＩＩ ＭＨＣ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｏｕｎｄ ｂｙ ａ ｓｉｎｇｌｅ ｐｅｐｔｉｄｅ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４巻：３８５２～３８６２頁（１９９５）；Ｕｇｅｒら、Ｃｒｅａｔｉｎｇ ＣＴＬ ｔａｒｇｅｔｓ ｗｉｔｈ ｅｐｉｔｏｐｅ－ｌｉｎｋｅｄ Ｂ２ ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０巻：１５９８～１６０５頁（１９９８）；Ｙｕら、Ｃｕｔｔｉｎｇ ｅｄｇｅ：ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ ｔｒｉｍｅｒｓ ｏｆ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｆｏｒｍ ｓｔａｂｌｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｔｈａｔ ｐｏｔｅｎｔｌｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｂ ｃｅｌｌｓ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６８巻：３１４５～３１４９頁（２００２）；Ｈａｎｓｅｎら、Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ａｎｄ Ｂａｓｉｃ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅ－ＭＨＣＩ ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｔｒｉｍｅｒｓ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３１巻：３６３～３６９頁（２０１０）；Ｋｏｔｓｉｏｕら、Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ ｃｌａｓｓ Ｉ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ Ｒｅｄｏｘ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ １５巻：６４５～６５５頁（２０１１）；Ｚｈａｏら、Ｕｓｅ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ＭＨＣ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｃｏ－ａｇｏｎｉｓｍ ｉｎ ｈｕｍａｎ ＣＤ８＋ Ｔ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，Ｊ．Ｖｉｓ．Ｅｘｐ．１４４巻：ｅ５９１２６（２０１９）に記載される。あるいは、ＭＨＣ鎖（クラスＩまたはＩＩ）は、組換えにより別々に作製され、組換え細胞においてアセンブルされて、ＭＨＣ分子を形成する。抗原は、ＭＨＣ分子との組合せのためのペプチドとして、またはＭＨＣ分子に提示され得るペプチドへの分解でプロセシングされる全抗原タンパク質として細胞において共発現され得る。このように抗原：：ＭＨＣ複合体を発現するための方法は、例えば、Ｓｔｅｖｅｎｓら、Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ ｃｌａｓｓ Ｉ ｐｅｐｔｉｄｅ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｕｓｉｎｇ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ，Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．２７３巻：２８７４～２８８４頁（１９９８）；Ｂｒａｅｎｄｓｔｒｕｐら、ＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ ｔｅｔｒａｍｅｒｓ ｆｒｏｍ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｌｐｈａ ａｎｄ ｂｅｔａ ｃｈａｉｎｓ ｒｅｆｏｌｄｅｄ ｗｉｔｈ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｔａｇｇｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ，ＰＬｏＳ ＯＮＥ ８巻：Ｅ７３６４８（２０１３）；Ｓａｉｎｉら、Ｅｍｐｔｙ ｐｅｐｔｉｄｅ ｒｅｃｅｐｔｉｖｅ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｆｏｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｇｅｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ ｃｅｌｌｓ，Ｓｃｉ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４巻：ｅａａｕ９０３９（２０１９）に記載される。
【0084】
抗原ライブラリーで使用され得る感染性疾患抗原は、感染病原体由来の抗原を含む。感染病原体は、細菌病原体またはウイルス病原体であり得る。細菌病原体は、例えば、ブドウ球菌（Staphylococci）、連鎖球菌（Streptococcus）、大腸菌（Escherichia coli）、シュードモナス（Pseudomonas）、サルモネラ（Salmonella）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、淋菌（Neisseria gonorrhoeae）、化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）、Ａ群連鎖球菌（Group A Streptococcus）、Ｂ群連鎖球菌（Group B Streptococcus(ストレプトコッカス・アグラクチア（Streptococcus agalactiae）））、肺炎球菌（Streptococcus pneumoniae）、破傷風菌（Clostridium tetani）、ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pyloris）、レジオネラ・ニューモフィラ（Legionella pneumophilia）の菌株、マイコバクテリア（Mycobacteria sps.）（例えば、結核菌（M. tuberculosis）、マイコバクテリウム・アビウム（M. avium）、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ（M. intracellulare）、マイコバクテリウム・カンサシ（M. kansaii）、またはマイコバクテリウム・ゴルドナエ（M. gordonea））、髄膜炎菌（Neisseria meningitides）、リステリア菌（Listeria monocytogenes）、リケッチア・リケッチイ（R. rickettsia）、サルモネラ属菌（Salmonella spp.）、ブルセラ属菌（Brucella spp.）、赤痢菌属（Shigella spp.）の菌株、ある特定の大腸菌株または侵襲性因子を有する遺伝子を獲得した他の細菌、および抗生物質耐性因子を獲得した前述のいずれかまたは他の細菌を含む。
【0085】
ウイルス病原体は、例えば、エボラ、ジカ、ＲＳＶ、レトロウイルス科（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、ＨＩＶ－１およびＨＩＶ－ＬＰなどのヒト免疫不全ウイルス）、ピコルナウイルス科（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、ポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、エンテロウイルス、ヒトコサッキーウイルス、ライノウイルス、およびエコーウイルス）、風疹ウイルス、コロナウイルス、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス、エボラウイルス、パラインフルエンザウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、インフルエンザウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、パルボウイルス、アデノウイルス科（ＡｄｅｎｏＶｉｒｉｄａｅ）、ヘルペスウイルス科（Ｈｅｒｐｅｓｙｉｒｉｄａｅ）［例えば、１型および２型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、およびヘルペスウイルス］、ポックスウイルス科（Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、天然痘ウイルス、ワクシニアウイルス、およびポックスウイルス）、Ｃ型肝炎ウイルス、エプスタイン－バーウイルス、またはカポジ肉腫ウイルスを含む。
【0086】
抗原ライブラリーは、腫瘍関連抗原、腫瘍ネオ抗原、またはがん細胞で優先的に見出される他の抗原のいずれかを含み得る。抗原ライブラリーで使用され得る腫瘍関連抗原は、腫瘍細胞において過剰または異常に発現された任意の遺伝子またはタンパク質、例えば、メソテリン、ジシアロガングリオシド（ＧＤ２）、Ｈｅｒ－２、ＭＵＣ１、ＧＰＣ３、ＥＧＦＲＶＩＩＩ、ＣＥＡ、ＣＤ１９、ＥＧＦＲ、ＰＳＭＡ、ＧＰＣ２、葉酸受容体β、ＩｇＧ Ｆｃ受容体、ＰＳＣＡ、ＰＤ－Ｌ１、ＥＰＣＡＭ、Ｌｅｗｉｓ Ｙ抗原、Ｌ１ＣＡＭ、ＦＯＬＲ、ＣＤ３０、ＣＤ２０、ＥＰＨＡ２、ＰＤ－１、Ｃ－ＭＥＴ、ＲＯＲ１、ＣＬＤＮ１８．２、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ１３３、ＴＳＨＲ、ＣＤ７０、ＥＲＢＢ、ＡＸＬ、細胞死受容体５、ＶＥＧＦＲ－２、ＣＤ１２３、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＴＳＨＲ、ＲＯＲ２、ＣＤ１４７、カッパＩＧＧ、ＩＬ－１３、ＭＵＣ１６、ＩＬ－１３Ｒ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＩＬ１３ＲＡ２、ＤＬＬ３、ＦＡＰ、ＬＭＰ１、ＴＳＨＲ、ＢＣＭＡ、ＮＥＣＴＩＮ－４、ＭＧ７、ＡＦＰ（アルファ－フェトプロテイン）、ＧＰ１００、Ｂ７－Ｈ３、Ｎｅｃｔｉｎ－４、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＲＴ－１、ＨＢＶ、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＴＡＡ、ＧＰ１００、チログロブリン、ＥＢＶ、ＨＰＶ Ｅ６、ＰＲＡＭＥ、ＨＥＲＶ－Ｅ、ＷＴ１、ＧＲＡＳ Ｇ１２Ｖ、ｐ５３、ＴＲＡＩＬ、ＭＡＧＥ－Ａ１０、ＨＰＶ－Ｅ７、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ、ＭＡＧＥ－Ａ６、ＣＤ１９、ＢＣＭＡ、ＣＤ２２、ＣＤ１２３、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ１３８、ＣＤ３８、ＣＤ７、ＳＬＡＭＦ７、ＩＧＧ ＦＣ、ＭＵＣ１、Ｌｅｗｉｓ Ｙ抗原、ＣＤ１３３、ＲＯＲ１、ＦＬＴ３、ＮＫＧ２Ｄ、カッパ軽鎖、ＣＤ３４、ＣＬＬ－１、ＴＳＬＰ、ＣＤ１０、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ４４Ｖ６、ＥＢＶ、ＣＤ５、ＧＰＣ３、ＣＤ５６、インテグリンＢ７、ＣＤ７０、ＭＵＣＬ、ＣＫＩＴ、ＣＬＤＮ１８．２、ＴＲＢＣ１、ＴＡＣ１、ＣＤ５６、ＣＤ４、ＣＤ２、ＣＤ１８、ＣＤ２７、ＣＤ３７、ＣＤ７２、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ８３、ＣＤ１１７、ＣＤ１７２、ＥＲＢＢ３、ＥＲＢＢ４、ＤＲ５、ＨＥＲ２、ＣＳ１、ＩＬ－１ＲＡＰ、ＩＴＧＢ７、ＳＬＣ２Ａ１４、ＳＬＣ４Ａ１、ＳＬＣ６Ａ１１、ＳＬＣ７Ａ３、ＳＬＣ１３Ａ５、ＳＬＣ１９Ａ１、ＳＬＣ２２Ａ１２、ＳＬＣ３４Ａ１、ｓｌｃ４５Ａ３、ＳＬＣ４６Ａ２、Ｆｒａ、ＩＬ－１３Ｒａ２、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ１、ＣＬＤ１８、ＮＡＮＯＧ、ＣＥＡＣＡＭ８、ＴＳＰＡＮ１６、ＧＬＲＢ、ＤＹＲＫ４、ＳＶ２Ｃ、ＳＩＧＬＥＣ８、ＲＢＭＸＬ３、ＨＩＳＴ１ＨＩＴ、ＣＣＲ８、ＣＣＮＢ３、ＡＬＰＰＬ２、ＺＰ２、ＯＴＵＢ２、ＬＩＬＲＡ４、ＧＲＭ２、ＰＧＧ１、ＮＢＩＦ３、ＧＹＰＡ、ＡＬＰＰ、ＳＰＡＴＡ１９、ＦＣＲＬＩ、ＦＣＲＬＡ、ＣＡＣＮＧ３、ＵＰＫ３Ｂ、１２ＵＭＯ４、ＭＵＣ１２、ＨＥＰＡＣＡＭ、ＢＰＩ、ＡＴＰ６Ｖ０Ａ４、ＨＭＭＲ、ＵＰＫ１Ａ、ＡＤＧＲＶ１、ＨＥＲＣ５、Ｃ３ＡＲ１、ＦＡＳＬＧ、ＮＧＢ、ＣＥＬＳＲ３、ＣＤ３Ｇ、ＣＥＡＣＡＭ３、ＴＮＦＲＳＦＢＣ、ＭＳ４ＡＢ、Ｓ１ＰＲ５、ＥＤＮＲＢ、ＳＣＮ３Ａ、ＡＢＣＣ８、ＡＢＣＢ１、ＡＮＯ１、ＫＣＮＤ２、ＨＴＲ４、ＣＡＣＮＢ４、ＨＴＲ４、ＣＮＲ２、２６ＬＲＢ、ＥＸＯＣ１、ＥＮＴＰＰ１、ＩＣＡＭ３、ＡＢＣＧＢ、ＳＣＮ４Ｂ、ＳＰＮ、ＣＤ６８、ＩＴＧＡＬ、ＩＴＧＡＭ、ＳＣＴＲ、ＣＹＹＲ１、ＣＬＣＮ２、ＳＬＡＲＡ３およびＪＡＧ３を含む。抗原ライブラリーで使用され得る腫瘍ネオ抗原は、腫瘍細胞にユニークなまたは富化された任意の突然変異遺伝子またはタンパク質、例えば、ＡＣＶＲ２Ａ Ｋ４３５ｆｓ、ＡＫＴ１ Ｅ１７Ｋ、ＡＲ Ｑ５８Ｌ、ＡＳＸＬ１ Ｇ６１０、ＡＴＲ Ｋ７７１ｆｓ、ＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ、ＣＨＥＫ２ Ｋ４１６Ｅ、ＣＲＩＰＡＫ Ｒ１５４ｆｓ、ＣＴＮＮＢ１ Ｓ２６Ｆ、ＣＴＮＮＢ１ Ｓ３０Ｃ、ＣＴＮＮＢ１ Ｄ２５Ｎ、ＣＴＮＮＢ１ Ｇ２７Ｒ、ＣＴＮＮＢ１ Ｓ２６Ｃ、ＣＴＮＮＢ１ Ｓ３０Ｆ、ＤＮＭＴ３Ａ Ｒ８８２Ｈ、ＤＮＭＴ３Ａ Ｒ８８２Ｃ、ＥＧＦＲ Ａ２４４Ｖ、ＥＧＦＲ Ｇ５５３Ｖ、ＥＧＦＲ Ａ２４４Ｔ、ＥＧＦＲ Ｒ１７７Ｃ、ＥＧＦＲ Ｌ８１３Ｒ、ＥＰ３００ Ｄ１３９９Ｎ、ＦＢＸＷ７ Ｒ４６５Ｈ、ＦＢＸＷ７ Ｒ５０５Ｇ、ＦＢＸＷ７ Ｒ５０５Ｃ、ＦＢＸＷ７ Ｒ４６５Ｃ、ＦＧＦＲ２ Ｎ５５０Ｋ、ＦＧＦＲ２ Ｓ２５２Ｗ、ＦＧＦＲ３ Ｓ２４９Ｃ、ＦＬＴ３ Ｄ８３５Ｙ、ＧＡＴＡ３ Ｐ４０９ｆｓ、ＩＤＨ１ Ｒ１３２Ｃ、ＩＤＨ１ Ｒ１３２Ｈ、ＩＤＨ２ Ｒ８８Ｑ、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ、ＫＲＡＳ Ｇ１３Ｄ、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ、ＫＲＡＳ Ａ１４６Ｔ、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ａ、ＫＲＡＳ Ｑ６１Ｌ、ＭＴＯＲ Ｓ２２１５Ｙ、ＮＦＥ２Ｌ２ Ｒ１８Ｇ、ＮＦＥ２Ｌ２ Ｅ６３Ｑ、ＮＦＥ２Ｌ２ Ｄ１３Ｈ、ＮＰＭ１ Ｗ２８８ｆｓ、ＮＲＡＳ Ｇ１３Ｄ、ＮＲＡＳ Ｑ６１Ｒ、ＮＲＡＳ Ｇ１２Ｄ、ＮＲＡＳ Ｑ６１Ｋ、ＮＲＡＳ Ｑ６１Ｌ、ＰＩＫ３ＣＡ Ｅ４５３Ｋ、ＰＩＫ３ＣＡ Ｅ５４５Ａ、ＰＩＫ３ＣＡ Ｍ１０４３Ｉ、ＰＩＫ３ＣＡ Ｍ１０４３Ｖ、ＰＩＫ３ＣＡ Ｒ１０８Ｈ、ＰＩＫ３ＣＡ Ｈ１０４７Ｒ、ＰＩＫ３ＣＡ Ｑ５４６Ｋ、ＰＩＫ３ＣＡ Ｇ１１８Ｄ、ＰＩＫ３ＣＡ Ｎ３４５Ｋ、ＰＩＫ３ＣＡ Ｈ１０４７Ｌ、ＰＩＫ３ＣＡ Ｒ８８Ｑ、ＰＩＫ３ＣＡ Ｋ１１１Ｅ、ＰＩＫ３ＣＡ Ｑ５４６Ｒ、ＰＩＫ３ＣＡ Ｑ５４６Ｐ、ＰＩＫ３ＣＡ Ｅ７２６Ｋ、ＰＩＫ３ＣＡ Ｅ５４２Ｋ、ＰＩＫ３ＣＡ Ｅ８１Ｋ、ＰＩＫ３ＣＡ Ｅ５４５Ｋ、ＰＩＫ３ＣＡ Ｃ４２０Ｒ、ＰＩＫ３ＣＡ Ｒ９３Ｑ、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ Ｐ９９Ｒ、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ Ｒ１０３Ｗ、ＰＴＥＮ Ａ３２８ｆｓ、ＰＴＥＮ Ｒ１３０Ｑ、ＰＴＥＮ Ｒ１３０Ｇ、ＰＴＥＮ Ｔ３１９ｆｓ、ＲＰＬ２２ Ｋ１５ｆｓ、ＳＦ３Ｂ１ Ｋ７００Ｅ、ＳＭＡＤ４ Ｒ３６１Ｈ、ＴＧＦＢＲ２ Ｅ１５０ｆｓ、ＴＰ５３ Ｒ２４９Ｍ、ＴＰ５３ Ｅ２８５Ｋ、ＴＰ５３ Ｒ２４９Ｓ、ＴＰ５３ Ｇ２６６Ｖ、ＴＰ５３ Ｒ１５８Ｈ、ＴＰ５３ Ｃ１４１Ｙ、ＴＰ５３ Ｙ２３６Ｃ、ＴＰ５３ Ｖ１７３Ｍ、ＴＰ５３ Ｓ２４１Ｆ、ＴＰ５３ Ｖ１７３Ｌ、ＴＰ５３ Ｅ２７１Ｋ、ＴＰ５３ Ｅ２８６Ｋ、ＴＰ５３ Ｃ２７５Ｙ、ＴＰ５３ Ｒ１１０Ｌ、ＴＰ５３ Ｒ２７３Ｌ、ＴＰ５３ Ｈ１７９Ｙ、ＴＰ５３ Ｖ２１６Ｍ、ＴＰ５３ Ｖ１５７Ｆ、ＴＰ５３ Ｈ１９３Ｒ、ＴＰ５３ Ｔ１２５、ＴＰ５３ Ｉ１９５Ｔ、ＴＰ５３ Ｈ１７９Ｒ、ＴＰ５３ Ｇ２４５Ｓ、ＴＰ５３ Ｒ２８２Ｗ、ＴＰ５３ Ｒ２７３Ｃ、ＴＰ５３ Ｙ２２０Ｃ、ＴＰ５３ Ｒ２４８Ｗ、ＴＰ５３ Ｒ２４８Ｑ、ＴＰ５３ Ｒ２７３Ｈ、ＴＰ５３ Ｒ１７５Ｈ、ＴＰ５３ Ｙ２０５Ｃ、ＴＰ５３ Ｍ２３７Ｉ、ＴＰ５３ Ｃ２３８Ｆ、ＴＰ５３ Ｖ２７２Ｍ、ＴＰ５３ Ｃ２４２Ｆ、ＴＰ５３ Ｌ１９４Ｒ、ＴＰ５３ Ａ１５９Ｖ、ＴＰ５３ Ｇ２４５Ｄ、ＴＰ５３ Ｈ１９３Ｌ、ＴＰ５３ Ｙ１６３Ｃ、ＴＰ５３ Ｒ１５８Ｌ、ＴＰ５３ Ｇ１０８ｆｓ、ＴＰ５３ Ｇ２４５Ｖ、ＴＰ５３ Ｃ２３８Ｙ、ＴＰ５３ Ｃ１７６Ｆ、ＴＰ５３ Ｙ２３４Ｃ、ＴＰ５３ Ｃ１７６Ｙ、ＴＰ５３ Ｋ１３２Ｎ、Ｕ２ＡＦ１ Ｓ３４Ｆ、ＶＨＬ Ｌ８９Ｈ、ＶＨＬ Ｓ１１１Ｎ、ＶＨＬ Ｗ１１７ｆｓを含む。腫瘍ネオ抗原は、単一のヌクレオチド突然変異、フレームシフト突然変異、挿入、欠失、オルタナティブスプライシング、または染色体外の環状ＤＮＡによって生成され得る。
【0087】
ライブラリーに好適な抗原は、膵臓がん、肺がん、結腸がん、および胆管がんで見出されることが多い腫瘍ネオ抗原である、ＫＲＡＳバリアントを含む。以下の表２は、ある特定のがんと関連する共通のＫＲＡＳ突然変異を示す。
【0088】
【表2】
【0089】
これらのＫＲＡＳ突然変異対立遺伝子は、突然変異対立遺伝子に結合することができるが、野生型対立遺伝子には結合することができないＴＣＲのスクリーニングのため、抗原ライブラリーで使用することができる。そのような識別力があるＴＣＲを使用して、これらのＫＲＡＳ突然変異を有するがんの免疫療法を標的化することができる。
【0090】
抗原ライブラリーの好適な細胞型は、抗原提示細胞である。ＡＰＣは、その表面にＭＨＣ分子を欠損し得る。好適な抗原提示細胞は、例えば、Ｋ５６２細胞を含む。
【0091】
また、本明細書では、例えば、ウイルスを作製するために使用した対応する移入プラスミドにこれらの抗原／リガンドバリアントをコードすることにより、分子相互作用を選択する方法としてウイルス向性を、目的を変更して利用し、目的の抗原／リガンドのものにより野生型ウイルス表面タンパク質の結合機能を置き換え、それにより、生じるウイルスがその表面に抗原／リガンドバリアントを提示し、対応する遺伝子配列をパッケージングすることを確実にする、レトロウイルスベースのシステムも記載する。したがって、ウイルスが標的細胞（例えば、提示された抗原／リガンドバリアントの細胞外標的化ドメインに結合する受容体を持つ）に侵入すると、細胞侵入が、所望の位置で標的細胞のゲノムへの提示したタンパク質の遺伝子配列のインテグレーションを生じる。
【0092】
レトロウイルスは、構造：Ｓ－ＥＴＤ－ＬＧＤ－ＩＲＥＳ－Ｒ（ここで、Ｓはシグナル配列をコードし、ＥＴＤは細胞外標的化ドメインをコードし；ＬＧＤは抗原／リガンドをコードし、ＩＲＥＳは配列内リボソーム侵入部位をコードし、Ｒはレポーター（例えば、蛍光タンパク質または抗生物質耐性などの選択マーカー）をコードする）をコードする核酸を有し得る。ＩＲＥＳおよびＲは場合によるものであり、核酸はＳ－ＥＴＤ－ＬＧＤをコードし得る。レトロウイルスは、その天然の侵入機能を減少させる少なくとも１つの突然変異を含む突然変異ウイルスエンベロープタンパク質もコードする。ＩＲＥＳ配列は、１つのプロモーターによって２つの遺伝子の共発現を同様に可能にする、２Ａ自己切断ペプチド配列（Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｆ２Ａ、およびＥ２Ａ）によって置換され得る。
【0093】
本明細書では、その天然の機能を減少させる少なくとも１つの突然変異を有するウイルスエンベロープタンパク質；膜結合ドメイン、細胞外抗原／リガンドドメイン、およびレポーターをコードする核酸を含む非ウイルス膜結合タンパク質を含むレトロウイルスを記載する。本明細書に開示のレトロウイルスは、好適な種のレトロウイルスゲノム（天然に存在するまたは改変された）由来の１つまたは複数のエレメントを有し得る。レトロウイルスは、７つのファミリー：アルファレトロウイルス（トリ白血病ウイルス）、ベータレトロウイルス（マウス乳癌ウイルス）、ガンマレトロウイルス（マウス白血病ウイルス）、デルタレトロウイルス（ウシ白血病ウイルス）、イプシロンレトロウイルス（ウォールアイ皮膚肉腫ウイルス）、レンチウイルス（ヒト免疫不全ウイルス１）、およびスプーマウイルス（ヒトスプーマウイルス）を含む。レトロウイルスの他の例は、全ての目的のためにその全体を参照により組み込まれる、米国特許第７，９０１，６７１号に提供される。
【0094】
改変されたレンチウイルスゲノムは、宿主細胞への核酸の送達のためのウイルスベクターとして有用であり得る。宿主細胞は、レンチウイルスベクター、および場合によりレンチウイルスのパッケージングタンパク質（例えば、ＶＳＶ－Ｇ、Ｒｅｖ、およびＧａｇ／Ｐｏｌ）を発現するためのさらなるベクターをトランスフェクトされて、培養培地中にレンチウイルス粒子を産生することができる。本明細書において有用なレトロウイルス構築物の非限定的な例は、例えば、レンチウイルスベクター、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ベクター、トリ白血病ウイルス（ＡＬＶ）ベクター、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）ベクター、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）ベクター、マウス幹細胞ウイルス、およびヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ）ベクターを含む。これらのレトロウイルス構築物は、対応するレトロウイルス由来のプロウイルス配列を含む。
【0095】
本明細書に記載のレトロウイルスベクターは、安全性の懸念に対処するならびに／またはベクター機能、例えば、パッケージング効率および／もしくはウイルス力価を改善する、当技術分野で公知のさらなる機能性エレメントをさらに含み得る。さらなる情報は、そのそれぞれが全ての目的のためにその全体を参照により組み込まれる、ＵＳ２０１５０３１６５１１、ＷＯ２０１５／１１７０２７、およびＷＯ２０１９／０５６０１５に見出すことができる。
【0096】
ウイルスエンベロープタンパク質は、任意のレトロウイルス（例えば、レンチウイルス）の任意のウイルスエンベロープタンパク質であってもよい。ウイルスエンベロープタンパク質は、ＶＳＶ－Ｇエンベロープタンパク質、麻疹ウイルスエンベロープタンパク質、ニパウイルスエンベロープタンパク質、または球菌ウイルスＧタンパク質であってもよい。ウイルスエンベロープタンパク質の突然変異によって減少される天然の機能は、ウイルス向性（例えば、細胞に感染する、細胞に結合する能力等）であり得る。例えば、突然変異ＶＳＶ－Ｇエンベロープタンパク質は、アミノ酸Ｈ８、Ｋ４７、Ｙ２０９、および／またはＲ３５４で突然変異され得る。突然変異ＶＳＶ－Ｇエンベロープタンパク質は、以下の変化、Ｈ８Ａ、Ｋ４７Ａ、Ｋ４７Ｑ、Ｙ２０９Ａ、Ｒ３５４Ａ、および／またはＲ３５４Ｑの１つまたは複数を有し得る。例示的な突然変異ＶＳＶ－Ｇエンベロープタンパク質は、全ての目的のためにその全体を参照により組み込まれる、Ｎｉｋｏｌｉｃら、「Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ＬＤＬ－ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒｓ ｂｙ ＶＳＶ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ．」Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍ．，２０１８，９：１０２９に記載される。突然変異麻疹ウイルスエンベロープタンパク質は、Ｙ４８１、Ｒ５３３、Ｓ５４８、および／またはＦ５４９に突然変異（複数可）を有し得る。突然変異麻疹ウイルスエンベロープタンパク質は、Ｙ４８１Ａ、Ｒ５３３Ａ、Ｓ５４８Ｌ、および／またはＦ５４９Ｓの１つまたは複数を有し得る。突然変異ニパウイルスエンベロープタンパク質は、Ｅ５０１、Ｗ５０４、Ｑ５３０、および／またはＥ５３３に突然変異（複数可）を有し得る。突然変異麻疹ウイルスエンベロープタンパク質は、Ｅ５０１Ａ、Ｗ５０４Ａ、Ｑ５３０Ａ、および／またはＥ５３３Ａの１つまたは複数を有し得る。突然変異球菌ウイルスＧタンパク質は、Ｋ６４および／またはＲ３７１に突然変異（複数可）を有し得る。突然変異球菌ウイルスＧタンパク質は、Ｋ６４Ｑ、および／またはＲ３７１Ａの１つまたは複数を有し得る。
【0097】
膜結合ドメインは、タンパク質またはペプチドを完全にまたは部分的にレトロウイルスの膜（例えば、エンベロープ）に包埋させるかまたは会合させることができるアミノ酸配列を有するタンパク質またはペプチドである。膜結合ドメインは、細胞外環境への細胞外抗原／リガンドドメインの提示および送達を可能にし得る。膜結合ドメインは、細胞内ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞外ドメインを有し得る。膜結合ドメインは、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）タンパク質またはその断片であり得る。ＭＨＣタンパク質は、クラスＩまたはクラスＩＩ ＭＨＣタンパク質であり得る。
【0098】
レトロウイルスのライブラリーに存在するレトロウイルスは、膜結合ドメインに融合した異なる抗原／リガンドのライブラリーをまとめて含み得る。細胞外抗原／リガンドは、標的細胞に結合することができる。細胞外抗原／リガンドドメインは、細胞または細胞の集団のサブセットの細胞表面に存在するタンパク質または受容体リガンド（例えば、Ｔ細胞受容体）に結合することができる。リガンド－細胞外抗原／リガンドドメインは、Ｔ細胞またはＴ細胞の集団のサブセットの細胞表面に存在する受容体に結合する。レトロウイルスの細胞外抗原／リガンドドメインと細胞の受容体、タンパク質またはリガンドの間のこの結合相互作用は、レトロウイルスを細胞（例えば、抗原特異的細胞、例えば、Ｔ細胞）に侵入させることができる。
【0099】
非ウイルス膜結合タンパク質は、膜結合ドメインと細胞外抗原／リガンドドメインの間に位置するリンカーを含み得る。リンカーは、アミノ酸リンカーであってもよく、リジットリンカー、可動性リンカー、またはオリゴマー化リンカーであってもよい。リジットリンカーは、可動性を欠損するアミノ酸配列であり得る（例えば、少なくとも１つのプロリンを含み得る）。例えば、リジットリンカーは、血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）ストークまたはＣＤ８－アルファストーク由来であり得る。可動性リンカーは、多くの自由度を有するアミノ酸配列である（例えば、小さい側鎖を有する複数のアミノ酸、例えばグリシンまたはアラニンを含み得る）。オリゴマー化リンカーは、別の関連アミノ酸にオリゴマー化することができるアミノ酸である。オリゴマー化リンカーは、二量体、三量体、または四量体を形成することができるアミノ酸配列であり得る。例えば、オリゴマー化リンカーは、ＩｇＧ４ヒンジドメインから作製され得る。
【0100】
本明細書は、レトロウイルスのライブラリーにも関し、ライブラリーは複数のユニークなレトロウイルスを含み、各ユニークなレトロウイルスは、その天然の機能を減少させる少なくとも１つの突然変異を含むウイルスエンベロープタンパク質、膜結合ドメインおよび細胞外標的化ドメインを含む非ウイルス膜結合タンパク質、ならびに場合により、レポーターをコードする核酸を含み、各ユニークなレトロウイルスは、異なるおよびユニークな細胞外標的化ドメインを含む。また、本明細書では、レトロウイルスを含む細胞のライブラリーも記載され、ライブラリーは複数のユニークな細胞を含み、各ユニークな細胞はユニークなレトロウイルスを含む。
【0101】
ライブラリーは、Ｔ細胞の集団のスクリーニングにおける使用のための異なるＭＨＣ－ペプチド融合体をコードする核酸を有する複数のレトロウイルスを含み得る。そのようなライブラリーでは、ウイルス表面に提示されたＭＨＣ－ペプチド融合体は、ＴＣＲ特異的な方法でＴ細胞感染を可能にする。感染したＴ細胞を収集およびシークエンシングし、目的のＴ細胞集団のサブセットに感染することができるＭＨＣ－ペプチドリガンドの同定、ならびにＴＣＲ配列および反応性ＭＨＣ－ペプチドリガンドを同時に追跡する能力を可能にすることができる。ＭＨＣ－ペプチドレトロウイルスライブラリーは、ランダム化したＭＨＣ－ペプチド標的化エレメントを含有するランダム化した移入ベクターを含み得る。ランダムに生じたライブラリーは、変性したオリゴヌクレオチドプライマーを使用して生成され得る。標的化ライブラリーは、抗原のユニークなセットに特異的であり得る（例えば、目的の特定の標的のための全ての可能なウイルスまたは細菌抗原－ヒト免疫不全ウイルス、結核ＴＢ等；または特定の対象の全ての可能なネオ抗原）。抗原／リガンド配列は、受容体または結合タンパク質と相互作用するそれらの機会を最大にするように選択され得る。抗原／リガンドライブラリーのバリエーションは、遺伝子突然変異を、目的の抗原／リガンドの所望の位置に（例えば、ランダムに、または部位特異的に）導入することによって作製され得る。遺伝子突然変異は、ＤＮＡ断片の置換、欠失、挿入、および再編成であり得る。選択の特異的遺伝子突然変異は、ランダムに生成されるか、目的の領域に富化されるか（例えば、リガンドの相互作用ドメイン）、または計算アルゴリズムによって推奨されてもよい。遺伝子突然変異戦略のための計算アルゴリズムの例は、タンパク質構造解析、計算ドッキング、分子動態シミュレーション、回帰、統計ベースの分類、ランダムフォレスト、サポートベクターマシン、および神経ネットワークを含む。
【0102】
バーコード配列は、ランダムに生成された４を超える任意の長さのヌクレオチド配列であり得る。例えば、１５ヌクレオチドのＤＮＡ配列は、４１５＝１ｅ９の多様性を提供し得る。バーコード配列は、マーカー配列をコードするアミノ酸であっても、マーカー配列として純粋に機能するアミノ酸であってもよい。例えば、レトロウイルスプラスミドの１つのデザインは、２つのクローニング部位を含有する：一方は抗原をコードする配列用、一方はバーコード配列用。
【0103】
バーコードとリガンド配列の両方をウイルスプラスミドに挿入し、ＰＣＲまたは大腸菌増幅のいずれかでウイルスプラスミドを増幅した後、プラスミドの一部分は、バルクシークエンシングによってシークエンシングされ得る。バーコードおよびリガンド配列が互いに近いため、バルクシークエンシングデータは、バーコード配列とリガンド配列の間の１対１マッピングを確立することができる。
【0104】
宿主細胞
本明細書に記載のポリペプチド（例えば、ＴＣＲまたは抗原）をコードする核酸は、宿主細胞でのポリペプチドの発現のための適切な発現ベクターへとクローニングされる。宿主細胞は、哺乳動物細胞、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、ブタ、ウシ、ネコ、またはイヌであってもよい。哺乳動物細胞はまた、限定はされないが、サル、チンパンジー、ゴリラ、およびヒトを含む霊長類の細胞であってもよい。哺乳動物細胞は、マウスが他の哺乳動物、最も具体的にはヒトのためのモデルとして通常機能するため、マウス細胞であってもよい（例えばＨａｎｎａ，Ｊ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１８巻：１９２０～２３頁、２００７；Ｈｏｌｔｚｍａｎ，Ｄ．Ｍ．ら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．１０３巻（６号）：Ｒ１５～Ｒ２１、１９９９；Ｗａｒｒｅｎ，Ｒ．Ｓ．ら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．９５巻：１７８９～１７９７頁、１９９５を参照されたい；各刊行物は、全ての目的のためにその全体を参照により組み込まれる）。宿主細胞は、例えば、線維芽細胞、上皮細胞（例えば、腎臓、乳房、前立腺、肺）、ケラチノサイト、肝細胞、脂肪細胞、内皮細胞、および造血細胞（例えば、マクロファージ、他の単球、抗原提示細胞、Ｂ細胞、好中球、マスト細胞、樹状細胞、または他の貪食細胞型）を含む。宿主細胞は、成熟細胞（例えば、最終的に分化した、分裂または非分裂）または胚細胞（例えば、胚盤胞細胞等）または幹細胞であってもよい。宿主細胞は、動物または他の起源由来の細胞株であってもよい。
本明細書に記載のポリペプチド（例えば、ＴＣＲまたは抗原）をコードする核酸は、宿主細胞でのポリペプチドの発現のための適切な発現ベクターへとクローニングされる。宿主細胞は、哺乳動物細胞、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、ブタ、ウシ、ネコ、またはイヌであってもよい。哺乳動物細胞はまた、限定はされないが、サル、チンパンジー、ゴリラ、およびヒトを含む霊長類の細胞であってもよい。哺乳動物細胞は、マウスが他の哺乳動物、最も具体的にはヒトのためのモデルとして通常機能するため、マウス細胞であってもよい（例えばＨａｎｎａ，Ｊ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１８巻：１９２０～２３頁、２００７；Ｈｏｌｔｚｍａｎ，Ｄ．Ｍ．ら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．１０３巻（６号）：Ｒ１５～Ｒ２１、１９９９；Ｗａｒｒｅｎ，Ｒ．Ｓ．ら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．９５巻：１７８９～１７９７頁、１９９５を参照されたい；各刊行物は、全ての目的のためにその全体を参照により組み込まれる）。宿主細胞は、例えば、線維芽細胞、上皮細胞（例えば、腎臓、乳房、前立腺、肺）、ケラチノサイト、肝細胞、脂肪細胞、内皮細胞、および造血細胞（例えば、マクロファージ、他の単球、抗原提示細胞、Ｂ細胞、好中球、マスト細胞、樹状細胞、または他の貪食細胞型）を含む。宿主細胞は、成熟細胞（例えば、最終的に分化した、分裂または非分裂）または胚細胞（例えば、胚盤胞細胞等）または幹細胞であってもよい。宿主細胞は、動物または他の起源由来の細胞株であってもよい。
【0105】
哺乳動物細胞は、ヒトを含む、哺乳動物の循環系で見出される細胞であり得る。例示的な循環系細胞は、中でも、赤血球、血小板、形質細胞、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、好中球等、およびそれらの前駆体細胞を含む。グループとして、これらの細胞は循環する真核細胞であると規定される。そのような循環する細胞は、初代細胞または初代細胞由来であり得る。循環する細胞は、自家、同系または同種異系であってもよい。哺乳動物細胞は、これらの循環する真核細胞のいずれかに由来してもよい。循環する細胞または循環する細胞由来の細胞が使用されてもよい。哺乳動物細胞は、マクロファージまたはマクロファージへの前駆体もしくは前駆細胞であってもよい。単球またはマクロファージ細胞は、ｒａｗ２６４．７細胞、Ｋ５６２細胞またはＴＨＰ－１細胞であってもよい。哺乳動物細胞は、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体もしくは前駆細胞であってもよい。哺乳動物細胞は、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、メモリーＴ細胞、調節性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、粘膜関連インバリアントＴ細胞、ガンマ デルタＴ細胞、または前述の細胞への前駆体もしくは前駆細胞であってもよい。哺乳動物細胞は、ナチュラルキラー細胞、またはナチュラルキラー細胞への前駆体もしくは前駆細胞であってもよい。哺乳動物細胞は、Ｂ細胞、または形質細胞、またはＢ細胞前駆体もしくは前駆細胞であってもよい。哺乳動物細胞は、好中球または好中球前駆体もしくは前駆細胞であってもよい。哺乳動物細胞は、巨核球または巨核球への前駆体もしくは前駆細胞であってもよい。哺乳動物細胞は、抗原提示細胞、例えば単球、マクロファージ、樹状細胞、上皮細胞等であってもよい。ＡＰＣは、その表面にＭＨＣ分子を欠損するように操作されてもよい。そのようなＡＰＣは、抗原ライブラリーのＭＨＣ：抗原融合ポリペプチドからのＭＨＣ分子のみを提示する。
【0106】
本明細書において、宿主細胞として使用され得る任意の免疫細胞は、例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞、マクロファージ、単球、および／または好中球を含む。宿主細胞は、受容体特異的免疫細胞または標的受容体を発現するように遺伝子改変された細胞株であり得る。宿主細胞は、ヒト初代免疫細胞、マウス初代免疫細胞、ラット初代免疫細胞、および不死化哺乳動物細胞株を含む。使用され得る不死化哺乳動物細胞株の例は、Ｊｕｒｋａｔ、Ｋ５６２、Ｔａｌｌ－１０４、Ｒａｊｉ、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｔ、３Ｔ６、Ａ５５９、Ａ９、ＡｔＴ－２０、３Ｔ３、ＢＨＫ－２１、ＢＨＬ－１００、ＢＴ、Ｃａｃｏ－２、Ｃｈａｎｇ、ＣＨＯ－Ｋ１、ＣＯＳ－１、ＣＯＳ－３、ＣＯＳ－７、Ｄａｕｄｉ、Ｈ９、ＨｅＬａ、Ｈｅｐ－２、ＨＬ－６０、ＨＴ－１０８０、ＨＴ－２９、ＨＵＶＥＣ、Ｉ－１０、ＩＭ－９、ＪＥＧ－２、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、Ｌ２、ＫＢ、ＫＧ－１、ＭＣＦ７、ＷＩ－３８、ＷＩＳＨ、ＸＣ、Ｙ１、Ｊｅｋｏ、ＮＫ－９２、ＮＫ－９２ ＭＩ、Ｊ７６、ＣＣＲＦ－ＣＥＭ、ＤＮＤ－４１、ＨＰＢ－ＡＬＬ、ＭＯＬ－４、ＲＰＭＩ－８４０２、ＧＲＡＮＴＡ、ＭＩＮＯ、ＲＥＣ－１、Ｕ－２９４０、ＢＪＡＢ、ＶＡＬ、ＴＨＰ－１、ＭＵＴＺ－３、Ｕ－９３７、ＭＥ－１、ＭＯＬＭ１３、Ｕ－９３７、およびＳＥＭを含む。
【0107】
宿主細胞は、対象から得ることができる。対象は、任意の生きた生物であってもよい。対象の例は、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット、およびそれらのトランスジェニック種を含む。マクロファージ、Ｔ細胞、抗原提示細胞等は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、腹水、胸水、脾臓組織、および腫瘍を含む、いくつかの起源から得ることができる。いくつものマクロファージ細胞株、抗原提示細胞株、またはＴ細胞株が当技術分野で入手可能であり、使用され得る。マクロファージ、抗原提示細胞、またはＴ細胞は、Ｆｉｃｏｌｌ分離などの、当業者に公知のいくつもの技術を使用して対象から収集した血液の単位から得ることができる。個体の循環する血液からの宿主細胞は、アフェレーシスによって得ることができる。アフェレーシス産物は、典型的には、Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球、赤血球、および血小板を含むリンパ球を含有する。アフェレーシスによって収集した細胞を洗浄して、血漿画分を除去し、細胞を後のプロセシング工程のために適切な緩衝液または培地に入れてもよい。細胞は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）によって洗浄されてもよい。代替の態様では、洗浄溶液はカルシウムを欠損し、マグネシウムを欠損してもよく、または全てではないにしても多くの二価の陽イオンを欠損してもよい。カルシウムの非存在下での最初の活性化工程は、活性化の拡大をもたらし得る。
【0108】
一態様では、宿主細胞のゲノムは、ＣＲＩＳＰＲなどの標的化システムによる挿入核酸の挿入のためのユニークな部位を有する第１の核酸によって操作される。宿主細胞は、場合により、例えば、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２ａ（別名、Ｃｐｆ１）、適切なジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＥＮ）、または転写活性化因子様ヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）を含む標的化システムの酵素によって操作され得る。第１の核酸は、宿主細胞の受容体または結合タンパク質をコードする核酸の近くにまたは隣接して操作されてもよい。これは、受容体をコードする核酸の近くのまたは隣接したこの部位への核酸の指向性挿入を可能にする。抗原／リガンドが宿主細胞の受容体／結合タンパク質と相互作用する場合、これは宿主細胞に核酸を導入することができる。この核酸が適切な標的化核酸（例えば、ガイドＲＮＡ）を伴う場合、抗原／リガンドを示す核酸は、受容体をコードする核酸の近くにまたは隣接してインテグレートされ得る。例えば、本明細書に記載のｐｅｇＲＮＡは、この部位に挿入され得る。適切なプライマーは、受容体の核酸（またはバーコード）および抗原／リガンドの核酸（またはバーコード）の両方を増幅および／またはシークエンシングする。
【0109】
核酸
核酸は、少なくとも部分的に、本明細書に記載の個々のペプチド、ポリペプチド、タンパク質およびバーコードをコードし得る。核酸は、天然、合成またはこれらの組合せであってもよい。核酸は、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ＤＮＡまたはｃＤＮＡであってもよい。
核酸は、少なくとも部分的に、本明細書に記載の個々のペプチド、ポリペプチド、タンパク質およびバーコードをコードし得る。核酸は、天然、合成またはこれらの組合せであってもよい。核酸は、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ＤＮＡまたはｃＤＮＡであってもよい。
【0110】
核酸は、発現ベクター、例えば、プラスミド、またはウイルスベクター、または線状ベクター、または染色体ＤＮＡにインテグレートするベクターも含む。発現ベクターは、１つまたは複数の選択された宿主細胞において、ベクターの複製を可能にする核酸配列を含有し得る。そのような配列は、様々な細胞で周知である。プラスミドｐＢＲ３２２からの複製の起源は、ほとんどのグラム陰性細菌に好適である。真核の宿主細胞、例えば哺乳動物細胞では、発現ベクターは宿主細胞の染色体にインテグレートされ、次いで宿主の染色体によって複製され得る。同様に、ベクターは原核細胞の染色体にインテグレートされ得る。
【0111】
発現ベクターは、通常、選択可能マーカーとも呼ばれる、選択遺伝子も含有する。選択可能マーカーは、本発明の宿主細胞を含む、原核細胞および真核細胞について、当技術分野で周知である。通常、選択遺伝子は、選択培養培地中で増殖する、形質転換した宿主細胞の生存または増殖に必要なタンパク質をコードする。選択遺伝子を含有するベクターによって形質転換されない宿主細胞は、培養培地中で生存しない。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質または他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート、またはテトラサイクリンに耐性を付与する、（ｂ）栄養要求性欠損を補足する、または（ｃ）複合培地から入手できない重要な栄養素、例えばバシラス綱のＤ－アラニンラセマーゼをコードする遺伝子を供給するタンパク質をコードする。例示的な選択スキームは、宿主細胞の増殖を停止させる薬物を利用することができる。異種遺伝子によって形質転換が成功したそれらの細胞は、薬物耐性を付与するタンパク質を産生し、したがって選択レジメンで生存する。細菌または真核生物（哺乳動物を含む）システムでの使用のための他の選択可能マーカーは、当技術分野で周知である。
【0112】
哺乳動物宿主細胞において、本明細書に記載のＴＣＲまたは抗原をコードする導入遺伝子を発現することができるプロモーターの例は、ＥＦ１ａプロモーターである。天然ＥＦ１ａプロモーターは、リボソームへのアミノアシルｔＲＮＡの酵素的送達を担う、伸長因子１複合体のアルファサブユニットの発現を駆動する。ＥＦ１ａプロモーターは、哺乳動物発現プラスミドで広く使用され、レンチウイルスベクターにクローニングされた導入遺伝子からの発現の駆動に有効であることが示されている。例えば、全ての目的のためにその全体を参照により組み込まれる、Ｍｉｌｏｎｅら、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１７巻（８号）：１４５３～１４６４頁（２００９）を参照されたい。プロモーターの別の例は、最初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター配列である。このプロモーター配列は、それに作動可能に連結した任意のポリヌクレオチド配列の高レベルの発現を駆動することができる強い構成的プロモーター配列である。他の構成的プロモーター配列も使用されてもよく、限定はされないが、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、マウス乳癌ウイルスプロモーター（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、ＭＮＤプロモーター（骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサーを有する改変ＭｏＭｕＬＶ ＬＴＲのＵ３領域を含有する合成プロモーター、例えば、全ての目的のためにその全体を参照により組み込まれる、Ｌｉら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８９巻、５６～６４頁（２０１０）を参照されたい）、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン－バーウイルス最初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ならびにヒト遺伝子プロモーター、例えば、限定はされないが、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、伸長因子－１ａプロモーター、ヘモグロビンプロモーター、およびクレアチンキナーゼプロモーターを含む。さらに、本明細書の発現ベクターは、構成的プロモーターの使用に限定されない。
【0113】
誘導性プロモーターも、発現ベクターでの使用のために企図される。誘導性プロモーターの例は、限定はされないが、メタロチオネインプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター、テトラサイクリンプロモーター、ｃ－ｆｏｓプロモーター、テトラサイクリンオペレーター（複数可）の制御下でヒトサイトメガロウイルス最初期プロモーターから発現を起こすＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒのＴ－ＲＥｘシステム、およびＩｎｔｒｅｘｏｎのＲｈｅｏＳｗｉｔｃｈプロモーターを含む。その全てが全ての目的のためにその全体を参照により組み込まれる、Ｋａｒｚｅｎｏｗｓｋｉ，Ｄ．ら、ＢｉｏＴｅｃｈｉｑｕｅｓ ３９巻：１９１～１９６頁（２００５）；Ｄａｉ，Ｘ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ ４２巻：２３６～２４５頁（２００５）；Ｐａｌｌｉ，Ｓ．Ｒ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０巻：１３０８～１５１５頁（２００３）；Ｄｈａｄｉａｌｌａ，Ｔ．Ｓ．ら、Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖ．Ｅｎｔｏｍｏｌ．４３巻：５４５～５６９頁（１９９８）；Ｋｕｍａｒ，Ｍ．Ｂ，ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９巻：２７２１１～２７２１８頁（２００４）；Ｖｅｒｈａｅｇｅｎｔ，Ｍ．ら、Ａｎｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７４巻：４３７８～４３８５頁（２００２）；Ｋａｔａｌａｍ，Ａ．Ｋ．，ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １３巻：Ｓ１０３（２００６）；およびＫａｒｚｅｎｏｗｓｋｉ，Ｄ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １３巻：Ｓ１９４（２００６）、米国特許第８，８９５，３０６号、同第８，８２２，７５４号、同第８，７４８，１２５号、同第８，５３６，３５４号。
【0114】
発現ベクターは、典型的には、プロモーターエレメント、例えば、エンハンサーを有して、転写開始の頻度を制御する。典型的には、これらは、開始部位の上流３０～１１０ｂｐの領域に位置するが、いくつかのプロモーターは同様に開始部位の下流に機能性エレメントを含有することが示されている。プロモーターエレメント間のスペーシングは多くの場合フレキシブルであり、そのため、プロモーター機能は、エレメントが互いに関して逆位にまたは移動される場合保存される。チミジンキナーゼ（ｔｋ）プロモーターでは、プロモーターエレメント間のスペーシングは、活性が減少し始める前に５０ｂｐ離れるまで増加され得る。プロモーターに応じて、個々のエレメントは協同的にまたは独立してのいずれかで機能し、転写を活性化することができると思われる。
【0115】
本明細書に記載のポリペプチドを改変することが望ましいこともある。当業者は、所与の核酸構築物に変更を生じさせてバリアントポリペプチドを生成する多くの方法を認識するであろう。そのような周知の方法は、部位特異的突然変異誘発、変性したオリゴヌクレオチドを使用するＰＣＲ増幅、核酸を含有する細胞の突然変異誘発物質または放射線への曝露、所望のオリゴヌクレオチドの化学合成（例えば、ライゲーションおよび／またはクローニングと併せて大きな核酸を生成する）および他の周知の技術（例えば、全ての目的のためにその全体を参照により組み込まれる、ＧｉｌｌａｍおよびＳｍｉｔｈ、Ｇｅｎｅ ８巻：８１～９７頁、１９７９；Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３２８巻：７３１～７３４頁、１９８７を参照されたい）を含む。本明細書に記載のポリペプチドをコードする組換え核酸は、改変されて、選択した生物における核酸の翻訳を増強する好ましいコドンを提供することができる。
【0116】
本発明のポリヌクレオチドは、本明細書に記載のポリヌクレオチドと実質的に同等のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドも含む。ポリヌクレオチドは、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも約８０％、より典型的には少なくとも約９０％、さらにより典型的には少なくとも約９５％の配列同一性を有し得る。ポリヌクレオチドは、上記のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも約８０％、より典型的には少なくとも約９０％、さらにより典型的には少なくとも約９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドの補体を含む。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ（ゲノム、ｃＤＮＡ、増幅、または合成）またはＲＮＡであってもい。そのようなポリヌクレオチドを得るための方法およびアルゴリズムは、当業者に周知であり、例えば、所望の配列同一性のポリヌクレオチドを通常単離し得るハイブリダイゼーション条件を決定するための方法を含み得る。
【0117】
タンパク質類似体またはバリアントをコードする（すなわち、１つまたは複数のアミノ酸が、野生型ポリペプチドとは異なるように設計される）核酸は、プライマー（複数可）が所望の点突然変異を有する、部位特異的突然変異誘発またはＰＣＲ増幅を使用して産生され得る。好適な突然変異誘発技術の詳細な説明については、そのそれぞれが全ての目的のためにその全体を参照により組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）および／またはＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｉｎｃ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｎ．Ｙ（１９９４）を参照されたい。当技術分野で周知の方法を使用する化学合成は、例えば、Ｅｎｇｅｌｓら、Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔｌ版２８巻：７１６～３４頁、１９８９（全ての目的のためにその全体を参照により組み込まれる）によって記載され、そのような核酸を調製するためにも使用され得る。
【0118】
バリアントを作出するためのアミノ酸「置換」は、１つのアミノ酸を、類似の構造および／または化学特性を有する別のアミノ酸によって置き換える結果、すなわち保存アミノ酸置き換えであり得る。アミノ酸置換は、含まれる残基の極性、電荷、可溶性、疎水性、親水性、および／または両親媒性の類似性に基づいて作製され得る。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸は、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンを含み；極性アミノ酸は、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンを含み；正に帯電した（塩基性）アミノ酸は、アルギニン、リジン、およびヒスチジンを含み；負に帯電した（酸性）アミノ酸は、アスパラギン酸およびグルタミン酸を含む。
【0119】
核酸は、好適なプロモーターの制御下で発現されるように、別の核酸に連結され得る。核酸は、核酸の効率的な転写を達成するために、プロモーターまたは転写開始部位と連携する他の調節エレメント、例えば、エンハンサー配列、ポリＡ部位、または終止配列を含む核酸にも連結され得る。核酸に加えて、核酸の発現を確認するためのマーカーであり得る遺伝子（例えば、薬物耐性遺伝子、レポーター酵素をコードする遺伝子、または蛍光タンパク質をコードする遺伝子）が組み込まれてもよい。
【0120】
核酸がｅｘ ｖｉｖｏで細胞に導入される場合、核酸は、細胞への核酸の移動を促進する物質、例えば、前述の賦形剤に加えて、リポソームまたはカチオン性脂質などの核酸を導入するための試薬と組み合わされてもよい。あるいは、核酸を運ぶベクターも有用である。特に、好適なベクターによって運ばれた核酸を含有する生体への投与に好適な形態の組成物が、ｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子治療に好適である。
【0121】
宿主細胞へのポリヌクレオチドの導入
核酸は、トランスフェクション（例えば、全ての目的のためにその全体を参照により組み込まれる、Ｇｏｒｍａｎら Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７９巻２２号（１９８２）：６７７７～６７８１頁）、形質導入（例えば、全ての目的のためにその全体を参照により組み込まれる、ＣｅｐｋｏおよびＰｅａｒ（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｕｎｉｔ ９．９；ＤＯＩ：１０．１００２／０４７１１４２７２７．ｍｂ０９０９ｓ３６）、リン酸カルシウム形質転換（例えば、全ての目的のためにその全体を参照により組み込まれる、Ｋｉｎｇｓｔｏｎ、ＣｈｅｎおよびＯｋａｙａｍａ（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ａｐｐｅｎｄｉｘ １Ｃ；ＤＯＩ：１０．１００２／０４７１１４２３０１．ｎｓａ０１ｃｓ０１）、組換えＤＮＡを微細藻類細胞へと導入する塩化カルシウムおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（クロレラ・エリプソイデア（Chlorella ellipsoidea）のプロトプラストを形質転換するこの方法の使用を報告し、全ての目的のためにその全体を参照により組み込まれる、Ｋｉｍら、（２００２）Ｍａｒ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４巻：６３～７３頁を参照されたい）、細胞透過性ペプチド（例えば、全ての目的のためにその全体を参照により組み込まれる、Ｃｏｐｏｌｏｖｉｃｉ、Ｌａｎｇｅｌ、Ｅｒｉｓｔｅ、およびＬａｎｇｅｌ（２０１４）ＡＣＳ Ｎａｎｏ ２０１４ ８巻（３号）、１９７２～１９９４頁；ＤＯＩ：１０．１０２１／ｎｎ４０５７２６９）、エレクトロポレーション（例えば、これらの参照の両方が全ての目的のためにその全体を参照により組み込まれる、Ｐｏｔｔｅｒ（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｕｎｉｔ １０．１５；ＤＯＩ：１０．１００２／０４７１１４２７３５．ｉｍ１０１５ｓ０３およびＫｉｍら（２０１４）Ｇｅｎｏｍｅ １０１２～１９頁．ｄｏｉ：１０．１１０１／ｇｒ．１７１３２２．１１３、Ｋｉｍら ２０１４は最適化したエレクトロポレーションシステムであるＡｍａｚａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒを記載する）、マイクロインジェクション（例えば、全ての目的のためにその全体を参照により組み込まれる、ＭｃＮｅｉｌ（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｕｎｉｔ ２０．１；ＤＯＩ：１０．１００２／０４７１１４３０３０．ｃｂ２００１ｓ１８）、リポソームまたは細胞融合（例えば、全ての目的のためにその全体を参照により組み込まれる、Ｈａｗｌｅｙ－ＮｅｌｓｏｎおよびＣｉｃｃａｒｏｎｅ（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ａｐｐｅｎｄｉｘ １Ｆ；ＤＯＩ：１０．１００２／０４７１１４２３０１．ｎｓａ０１ｆｓ１０）、機械的操作（例えば、全ての目的のためにその全体を参照により組み込まれる、Ｓｈａｒｏｎら（２０１３）ＰＮＡＳ ２０１３ １１０巻（６号）；ＤＯＩ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１２１８７０５１１０）、遺伝子銃法（例えば、全ての目的のためにその全体を参照により組み込まれる、Ｓａｎｆｏｒｄ、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ．（１９８８）６巻：２９９～３０２頁、米国特許第４，９４５，０５０号を参照されたい）、全ての目的のためにその全体を参照により組み込まれる、酢酸リチウム／ＰＥＧ形質転換（ＧｉｅｔｚおよびＷｏｏｄｓ（２００６）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１３巻，１０７～１２０頁）およびその改変、または宿主細胞への核酸の送達のための他の周知の技術によって真核細胞へと導入され得る。導入されると、本発明の核酸は、エピソームとして発現され得るか、または周知の技術、例えば組換え（例えば、全ての目的のためにその全体を参照により組み込まれる、ＬｉｓｂｙおよびＲｏｔｈｓｔｅｉｎ（２０１５）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ Ｂｉｏｌ．Ｍａｒ ２；７巻（３号）．ｐｉｉ：ａ０１６５３５．ｄｏｉ：１０．１１０１／ｃｓｈｐｅｒｓｐｅｃｔ．ａ０１６５３５）、非相同インテグレーション（例えば、全ての目的のためにその全体を参照により組み込まれる、Ｄｅｙｌｅ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００９）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２００９ Ａｕｇ；１１巻（４号）：４４２～７頁）または転位（可動遺伝因子について上記のように）を使用して宿主細胞のゲノムにインテグレートされ得る。相同および非相同組換えの効率は、標的一本鎖または二本鎖切断（ＤＳＢ）を導入するゲノム編集技術によって促進され得る。ＤＳＢ生成技術の例は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、または同等のシステム（例えば、その全てが全ての目的のためにその全体を参照により組み込まれる、Ｃｏｎｇら Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９巻６１２１号（２０１３）：８１９～８２３頁、Ｌｉら Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ（２０１１）：ｇｋｒ１８８、Ｇａｊら Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３１巻７号（２０１３）：３９７～４０５頁）、トランスポゾン、例えば、Ｓｌｅｅｐｅｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ（例えば、全ての目的のためにその全体を参照により組み込まれる、Ｓｉｎｇｈら（２０１４）Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．２０１４ Ｊａｎ；２５７巻（１号）：１８１～９０頁．ｄｏｉ：１０．１１１１／ｉｍｒ．１２１３７）、例えば、ＦＬＰリコンビナーゼを使用する標的化組換え（例えば、全ての目的のためにその全体を参照により組み込まれる、Ｏ’Ｇｏｒｍａｎ、ＦｏｘおよびＷａｈｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９１）１５巻：２５１（４９９９）：１３５１～１３５５頁）、ＣＲＥ－ＬＯＸ（例えば、ＳａｕｅｒおよびＨｅｎｄｅｒｓｏｎ ＰＮＡＳ（１９８８）：８５巻；５１６６～５１７０頁）、または同等のシステム、あるいは真核細胞ゲノムへと本発明の核酸をインテグレートするための当技術分野で公知の他の技術である。
核酸は、トランスフェクション（例えば、全ての目的のためにその全体を参照により組み込まれる、Ｇｏｒｍａｎら Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７９巻２２号（１９８２）：６７７７～６７８１頁）、形質導入（例えば、全ての目的のためにその全体を参照により組み込まれる、ＣｅｐｋｏおよびＰｅａｒ（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｕｎｉｔ ９．９；ＤＯＩ：１０．１００２／０４７１１４２７２７．ｍｂ０９０９ｓ３６）、リン酸カルシウム形質転換（例えば、全ての目的のためにその全体を参照により組み込まれる、Ｋｉｎｇｓｔｏｎ、ＣｈｅｎおよびＯｋａｙａｍａ（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ａｐｐｅｎｄｉｘ １Ｃ；ＤＯＩ：１０．１００２／０４７１１４２３０１．ｎｓａ０１ｃｓ０１）、組換えＤＮＡを微細藻類細胞へと導入する塩化カルシウムおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（クロレラ・エリプソイデア（Chlorella ellipsoidea）のプロトプラストを形質転換するこの方法の使用を報告し、全ての目的のためにその全体を参照により組み込まれる、Ｋｉｍら、（２００２）Ｍａｒ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４巻：６３～７３頁を参照されたい）、細胞透過性ペプチド（例えば、全ての目的のためにその全体を参照により組み込まれる、Ｃｏｐｏｌｏｖｉｃｉ、Ｌａｎｇｅｌ、Ｅｒｉｓｔｅ、およびＬａｎｇｅｌ（２０１４）ＡＣＳ Ｎａｎｏ ２０１４ ８巻（３号）、１９７２～１９９４頁；ＤＯＩ：１０．１０２１／ｎｎ４０５７２６９）、エレクトロポレーション（例えば、これらの参照の両方が全ての目的のためにその全体を参照により組み込まれる、Ｐｏｔｔｅｒ（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｕｎｉｔ １０．１５；ＤＯＩ：１０．１００２／０４７１１４２７３５．ｉｍ１０１５ｓ０３およびＫｉｍら（２０１４）Ｇｅｎｏｍｅ １０１２～１９頁．ｄｏｉ：１０．１１０１／ｇｒ．１７１３２２．１１３、Ｋｉｍら ２０１４は最適化したエレクトロポレーションシステムであるＡｍａｚａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒを記載する）、マイクロインジェクション（例えば、全ての目的のためにその全体を参照により組み込まれる、ＭｃＮｅｉｌ（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｕｎｉｔ ２０．１；ＤＯＩ：１０．１００２／０４７１１４３０３０．ｃｂ２００１ｓ１８）、リポソームまたは細胞融合（例えば、全ての目的のためにその全体を参照により組み込まれる、Ｈａｗｌｅｙ－ＮｅｌｓｏｎおよびＣｉｃｃａｒｏｎｅ（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ａｐｐｅｎｄｉｘ １Ｆ；ＤＯＩ：１０．１００２／０４７１１４２３０１．ｎｓａ０１ｆｓ１０）、機械的操作（例えば、全ての目的のためにその全体を参照により組み込まれる、Ｓｈａｒｏｎら（２０１３）ＰＮＡＳ ２０１３ １１０巻（６号）；ＤＯＩ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１２１８７０５１１０）、遺伝子銃法（例えば、全ての目的のためにその全体を参照により組み込まれる、Ｓａｎｆｏｒｄ、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ．（１９８８）６巻：２９９～３０２頁、米国特許第４，９４５，０５０号を参照されたい）、全ての目的のためにその全体を参照により組み込まれる、酢酸リチウム／ＰＥＧ形質転換（ＧｉｅｔｚおよびＷｏｏｄｓ（２００６）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１３巻，１０７～１２０頁）およびその改変、または宿主細胞への核酸の送達のための他の周知の技術によって真核細胞へと導入され得る。導入されると、本発明の核酸は、エピソームとして発現され得るか、または周知の技術、例えば組換え（例えば、全ての目的のためにその全体を参照により組み込まれる、ＬｉｓｂｙおよびＲｏｔｈｓｔｅｉｎ（２０１５）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ Ｂｉｏｌ．Ｍａｒ ２；７巻（３号）．ｐｉｉ：ａ０１６５３５．ｄｏｉ：１０．１１０１／ｃｓｈｐｅｒｓｐｅｃｔ．ａ０１６５３５）、非相同インテグレーション（例えば、全ての目的のためにその全体を参照により組み込まれる、Ｄｅｙｌｅ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００９）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２００９ Ａｕｇ；１１巻（４号）：４４２～７頁）または転位（可動遺伝因子について上記のように）を使用して宿主細胞のゲノムにインテグレートされ得る。相同および非相同組換えの効率は、標的一本鎖または二本鎖切断（ＤＳＢ）を導入するゲノム編集技術によって促進され得る。ＤＳＢ生成技術の例は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、または同等のシステム（例えば、その全てが全ての目的のためにその全体を参照により組み込まれる、Ｃｏｎｇら Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９巻６１２１号（２０１３）：８１９～８２３頁、Ｌｉら Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ（２０１１）：ｇｋｒ１８８、Ｇａｊら Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３１巻７号（２０１３）：３９７～４０５頁）、トランスポゾン、例えば、Ｓｌｅｅｐｅｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ（例えば、全ての目的のためにその全体を参照により組み込まれる、Ｓｉｎｇｈら（２０１４）Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．２０１４ Ｊａｎ；２５７巻（１号）：１８１～９０頁．ｄｏｉ：１０．１１１１／ｉｍｒ．１２１３７）、例えば、ＦＬＰリコンビナーゼを使用する標的化組換え（例えば、全ての目的のためにその全体を参照により組み込まれる、Ｏ’Ｇｏｒｍａｎ、ＦｏｘおよびＷａｈｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９１）１５巻：２５１（４９９９）：１３５１～１３５５頁）、ＣＲＥ－ＬＯＸ（例えば、ＳａｕｅｒおよびＨｅｎｄｅｒｓｏｎ ＰＮＡＳ（１９８８）：８５巻；５１６６～５１７０頁）、または同等のシステム、あるいは真核細胞ゲノムへと本発明の核酸をインテグレートするための当技術分野で公知の他の技術である。
【0122】
宿主細胞へとポリヌクレオチドを導入するための化学的手段は、コロイド分散系、例えば、巨大分子複合体、ナノカプセル、微粒子、ビーズ、ならびに水中油系エマルジョン、ミセル、混合ミセル、およびリポソームを含む脂質ベースのシステムを含む。ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでの送達ビヒクルとしての使用のための例示的なコロイド系は、リポソーム（例えば、人工膜ベシクル）である。核酸の最新式の標的化送達の他の方法、例えば、標的化ナノ粒子によるポリヌクレオチドの送達または他の好適なサブミクロンサイズの送達系が利用可能である。
【0123】
新規の受容体
Ｔ細胞受容体および対応する抗原／リガンドは、本明細書に記載のＴＣＲレパートリーを本明細書に記載の抗原ライブラリーと混合し、ある特定の抗原－ＭＨＣ融合タンパク質を有する細胞を貪食した、キメラＴＣＲを有する個々の細胞を分離することによって見出される。あるいは、Ｔ細胞受容体および対応する抗原／リガンドは、本明細書に記載のＴＣＲレパートリーを本明細書に記載の抗原ライブラリーと混合し、トロゴサイトーシスマーカーおよび抗原／ＴＣＲバーコードを有する個々の細胞を分離することによって見出される。例えば、抗原ライブラリーを有する細胞は光学プローブによって標識され得、場合によりＴＣＲレパートリーを有する細胞は、異なる光学プローブによって標識され得る。ＦＡＣｓソーティングは、次いで、抗原ライブラリーから抗原バーコードを得る、ＴＣＲレパートリーから細胞を単離するために使用され得る。次いで、分離した細胞をシークエンシングして、ＴＣＲおよび抗原対を同定する。シークエンシングは、ＴＣＲおよび抗原を同定するために実施され得る。例えば、シークエンシングは、各ＴＣＲおよび各抗原と関連するバーコードを同定することができるか、またはＴＣＲおよび抗原融合体は、全体もしくは部分的にシークエンシングされ得る。これらのシステムおよびこれらの方法のハイスループットは、ＴＣＲおよびＴＣＲが結合する抗原の同定を可能にする。同定されたＴＣＲは、目的の抗原と相互作用することが公知ではない多くの新規のＴＣＲを含む。
Ｔ細胞受容体および対応する抗原／リガンドは、本明細書に記載のＴＣＲレパートリーを本明細書に記載の抗原ライブラリーと混合し、ある特定の抗原－ＭＨＣ融合タンパク質を有する細胞を貪食した、キメラＴＣＲを有する個々の細胞を分離することによって見出される。あるいは、Ｔ細胞受容体および対応する抗原／リガンドは、本明細書に記載のＴＣＲレパートリーを本明細書に記載の抗原ライブラリーと混合し、トロゴサイトーシスマーカーおよび抗原／ＴＣＲバーコードを有する個々の細胞を分離することによって見出される。例えば、抗原ライブラリーを有する細胞は光学プローブによって標識され得、場合によりＴＣＲレパートリーを有する細胞は、異なる光学プローブによって標識され得る。ＦＡＣｓソーティングは、次いで、抗原ライブラリーから抗原バーコードを得る、ＴＣＲレパートリーから細胞を単離するために使用され得る。次いで、分離した細胞をシークエンシングして、ＴＣＲおよび抗原対を同定する。シークエンシングは、ＴＣＲおよび抗原を同定するために実施され得る。例えば、シークエンシングは、各ＴＣＲおよび各抗原と関連するバーコードを同定することができるか、またはＴＣＲおよび抗原融合体は、全体もしくは部分的にシークエンシングされ得る。これらのシステムおよびこれらの方法のハイスループットは、ＴＣＲおよびＴＣＲが結合する抗原の同定を可能にする。同定されたＴＣＲは、目的の抗原と相互作用することが公知ではない多くの新規のＴＣＲを含む。
【0124】
本明細書に記載の方法および組成物は、がん、感染性疾患、自己免疫疾患等の処置において有用な新規のＴＣＲを見出すために使用され得る。これらの疾患と関連する標的抗原が公知であり、抗原と相互作用する新規のＴＣＲを見出すために使用され得る。これらの方法によって同定されたＴＣＲを使用して、これらの疾患を処置するための免疫療法を産生することができる。例えば、多くの腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）が公知である。本明細書に記載の方法および組成物は、ＴＡＡに結合するＴＣＲを見出すために使用され得る、ＴＡＡからの抗原ライブラリーを産生することができる。これらのＴＣＲを使用して、細胞傷害性Ｔ細胞およびナチュラルキラー細胞をがん細胞へと標的化するキメラＴＣＲＳおよび／またはキメラ抗原受容体を作製することができる。同様に、多くの抗原が、様々な感染性疾患について公知である。本明細書に記載の方法および組成物は、これらの感染性疾患を処置するために使用され得るＴＣＲを同定することができる。例えば、Ｆｃシグナル伝達部分（および場合により共活性化因子）とＴＣＲリガンド結合部分を組み合わせるキメラＴＣＲを使用して、感染性疾患を引き起こす微生物因子を貪食するマクロファージまたは他の貪食細胞を作製することができる。あるいは、キメラＴＣＲまたはキメラ抗原受容体は、Ｔ細胞活性化、トロゴサイトーシスおよび抗原／ＴＣＲバーコード交換を誘発する。ＴＣＲを使用して、腫瘍細胞を溶解するヘルパーＴ細胞を活性化する、腫瘍微小環境を活性化する、または中和抗体の産生におけるＢ細胞を支援することができるキメラ抗原受容体を作製することもできる。
【0125】
例示的な腫瘍関連抗原は、ある特定のがんと関連するＫＲＡＳバリアント対立遺伝子である。膵臓がんの９０％、ならびに肺、結腸、および胆管がんの３０％より多くが、これらのＫＲＡＳバリアント対立遺伝子の１つを有する。ＫＲＡＳバリアント対立遺伝子は、例えば、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｈ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｌ、Ｑ６１Ｈ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｒ、Ａ１１Ｔ、Ｇ１３Ｐ、Ｇ１３Ｄ、ならびに二重突然変異Ｇ１２ＤおよびＱ６１Ｈを含む。抗原ライブラリーは、抗原ライブラリーによる提示のための突然変異を含むペプチドに集中するこれらの突然変異ＫＲＡＳバリアント対立遺伝子の一部または全てによって作製される。多くの異なるＴ細胞受容体レパートリーを、ＫＲＡＳ抗原ライブラリーと組み合わせて、異なるＫＲＡＳバリアント対立遺伝子に結合するＴＣＲを見出すことができる。使用したＴ細胞受容体レパートリーは、ＴＣＲ、または目的のがん（例えば、膵臓がん、または肺がん、または結腸がん、または胆管がん）を生き延びたがん患者からのＴＣＲのゲノムライブラリーから起源し得る。ＴＣＲレパートリーは、患者の免疫系ががんと戦うことができたことを示す、免疫療法を受け、生き延びた（または部分的な応答を示した）患者から作製することができる。
【0126】
抗ＫＲＡＳバリアントＴＣＲは、異なるＫＲＡＳバリアント対立遺伝子と野生型ＫＲＡＳの間を区別するそれらの能力について評価され得る。ＫＲＡＳバリアントおよび野生型の、抗ＫＲＡＳバリアントＴＣＲの親和性も評価され得る。抗ＫＲＡＳバリアントＴ細胞受容体は、これらの特徴に基づいてグループに層別化することができ、抗ＫＲＡＳバリアントＴ細胞受容体を使用して免疫療法のためのキメラ抗原受容体を作製することができる。
【0127】
他の腫瘍関連抗原は、例えば、メソテリン、ジシアロガングリオシド（ＧＤ２）、Ｈｅｒ－２、ＭＵＣ１、ＧＰＣ３、ＥＧＦＲＶＩＩＩ、ＣＥＡ、ＣＤ１９、ＥＧＦＲ、ＰＳＭＡ、ＧＰＣ２、葉酸受容体β、ＩｇＧ Ｆｃ受容体、ＰＳＣＡ、ＰＤ－Ｌ１、ＥＰＣＡＭ、Ｌｅｗｉｓ Ｙ抗原、Ｌ１ＣＡＭ、ＦＯＬＲ、ＣＤ３０、ＣＤ２０、ＥＰＨＡ２、ＰＤ－１、Ｃ－ＭＥＴ、ＲＯＲ１、ＣＬＤＮ１８．２、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ１３３、ＴＳＨＲ、ＣＤ７０、ＥＲＢＢ、ＡＸＬ、細胞死受容体５、ＶＥＧＦＲ－２、ＣＤ１２３、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＴＳＨＲ、ＲＯＲ２、ＣＤ１４７、カッパＩＧＧ、ＩＬ－１３、ＭＵＣ１６、ＩＬ－１３Ｒ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＩＬ１３ＲＡ２、ＤＬＬ３、ＦＡＰ、ＬＭＰ１、ＴＳＨＲ、ＢＣＭＡ、ＮＥＣＴＩＮ－４、ＭＧ７、ＡＦＰ（アルファ－フェトプロテイン）、ＧＰ１００、Ｂ７－Ｈ３、Ｎｅｃｔｉｎ－４、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＲＴ－１、ＨＢＶ、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＴＡＡ、ＧＰ１００、チログロブリン、ＥＢＶ、ＨＰＶ Ｅ６、ＰＲＡＭＥ、ＨＥＲＶ－Ｅ、ＷＴ１、ＧＲＡＳ Ｇ１２Ｖ、ｐ５３、ＴＲＡＩＬ、ＭＡＧＥ－Ａ１０、ＨＰＶ－Ｅ７、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ、ＭＡＧＥ－Ａ６、ＣＤ１９、ＢＣＭＡ、ＣＤ２２、ＣＤ１２３、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ１３８、ＣＤ３８、ＣＤ７、ＳＬＡＭＦ７、ＩＧＧ ＦＣ、ＭＵＣ１、Ｌｅｗｉｓ Ｙ抗原、ＣＤ１３３、ＲＯＲ１、ＦＬＴ３、ＮＫＧ２Ｄ、カッパ軽鎖、ＣＤ３４、ＣＬＬ－１、ＴＳＬＰ、ＣＤ１０、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ４４Ｖ６、ＥＢＶ、ＣＤ５、ＧＰＣ３、ＣＤ５６、インテグリンＢ７、ＣＤ７０、ＭＵＣＬ、ＣＫＩＴ、ＣＬＤＮ１８．２、ＴＲＢＣ１、ＴＡＣ１、ＣＤ５６、ＣＤ４、ＣＤ２、ＣＤ１８、ＣＤ２７、ＣＤ３７、ＣＤ７２、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ８３、ＣＤ１１７、ＣＤ１７２、ＥＲＢＢ３、ＥＲＢＢ４、ＤＲ５、ＨＥＲ２、ＣＳ１、ＩＬ－１ＲＡＰ、ＩＴＧＢ７、ＳＬＣ２Ａ１４、ＳＬＣ４Ａ１、ＳＬＣ６Ａ１１、ＳＬＣ７Ａ３、ＳＬＣ１３Ａ５、ＳＬＣ１９Ａ１、ＳＬＣ２２Ａ１２、ＳＬＣ３４Ａ１、ｓｌｃ４５Ａ３、ＳＬＣ４６Ａ２、Ｆｒａ、ＩＬ－１３Ｒａ２、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ１、ＣＬＤ１８、ＮＡＮＯＧ、ＣＥＡＣＡＭ８、ＴＳＰＡＮ１６、ＧＬＲＢ、ＤＹＲＫ４、ＳＶ２Ｃ、ＳＩＧＬＥＣ８、ＲＢＭＸＬ３、ＨＩＳＴ１ＨＩＴ、ＣＣＲ８、ＣＣＮＢ３、ＡＬＰＰＬ２、ＺＰ２、ＯＴＵＢ２、ＬＩＬＲＡ４、ＧＲＭ２、ＰＧＧ１、ＮＢＩＦ３、ＧＹＰＡ、ＡＬＰＰ、ＳＰＡＴＡ１９、ＦＣＲＬＩ、ＦＣＲＬＡ、ＣＡＣＮＧ３、ＵＰＫ３Ｂ、１２ＵＭＯ４、ＭＵＣ１２、ＨＥＰＡＣＡＭ、ＢＰＩ、ＡＴＰ６Ｖ０Ａ４、ＨＭＭＲ、ＵＰＫ１Ａ、ＡＤＧＲＶ１、ＨＥＲＣ５、Ｃ３ＡＲ１、ＦＡＳＬＧ、ＮＧＢ、ＣＥＬＳＲ３、ＣＤ３Ｇ、ＣＥＡＣＡＭ３、ＴＮＦＲＳＦＢＣ、ＭＳ４ＡＢ、Ｓ１ＰＲ５、ＥＤＮＲＢ、ＳＣＮ３Ａ、ＡＢＣＣ８、ＡＢＣＢ１、ＡＮＯ１、ＫＣＮＤ２、ＨＴＲ４、ＣＡＣＮＢ４、ＨＴＲ４、ＣＮＲ２、２６ＬＲＢ、ＥＸＯＣ１、ＥＮＴＰＰ１、ＩＣＡＭ３、ＡＢＣＧＢ、ＳＣＮ４Ｂ、ＳＰＮ、ＣＤ６８、ＩＴＧＡＬ、ＩＴＧＡＭ、ＳＣＴＲ、ＣＹＹＲ１、ＣＬＣＮ２、ＳＬＡＲＡ３、およびＪＡＧ３を含む。
【0128】
他の腫瘍関連抗原は、例えば、補体因子Ｈ（例えば、肺がん、乳がん、他の固形腫瘍）、デルタオピオイド受容体（例えば、小細胞肺がん）、ｃ－Ｍｅｔ（例えば、ＮＳＣＬＣ）、ｇｐＮＭＢ（例えば、メラノーマ、乳がん、他の固形腫瘍）、ＴＲＡＰ－２（例えば、上皮腫瘍および他の固形腫瘍）、ＣＥＡＣＡＭ５（例えば、結腸直腸がん）、ＣＤ５６（例えば、ＳＣＬＣ）、ＣＤ２５（例えば、血液がん）、グアニルシクラーゼＣ（例えば、膵臓がん）、ＣＡＧ（例えば、固形腫瘍）、ＬＩＶ－１（例えば、乳がん）、ＰＴＫ７（例えば、肺がん、結腸直腸がん、乳がん、および卵巣がん）、ＬＡＭＰ－１（例えば、結腸直腸がん、メラノーマ、喉頭がん）、Ｐ－カドヘリン３（例えば、上皮腫瘍）、ＨＥＲ－３（例えば、乳がん）、ＣＤ１３３（例えば、肝細胞癌、膵臓がん、結腸直腸がん、胆管細胞癌）、ＧＰＲＣ５Ｄ（例えば、多発性骨髄腫）、ＢＣＭＡ（例えば、多発性骨髄腫）、ＣＤ１３８（例えば、多発性骨髄腫）、Ｉｇカッパ軽鎖（例えば、白血病、リンパ腫、ＮＨＬ、および多発性骨髄腫）、ＣＤ３０（例えば、ＮＨＬ、ＨＤ）、ＩＬ１３Ｒａ２（例えば、神経膠芽腫）、およびＮＫＧ２Ｄのリガンド（例えば、ＡＭＬ、ＭＤＳ、およびＭＭなどの結合ドメインとしてＮＫＧ２Ｄ受容体を使用する）を含む。
【0129】
あるいは、上記のレトロウイルスは、その表面に受容体または他の結合分子を提示する宿主細胞と使用され得る。レトロウイルス（抗原／リガンドを提示する）および宿主細胞の集団は組み合わされる（例えば、物理的に組み合わせるかまたは接触させる）。宿主細胞の集団は、レポーター（レトロウイルスによって運ばれた核酸にコードされる）の存在または非存在に基づきソートされ得る。レポーターを含有する（例えば、レポーターを発現する）宿主細胞の集団のサブセットは、レポーターを含有しない宿主細胞の集団の残りのサブセットからソートされ得る。細胞の集団のソーティングは、フローサイトメトリー（例えば、蛍光活性化細胞ソーティング）、磁気富化、または抗生物質選択を使用して実施され得る。このＦＡＣｓまたは他のソーティングは、レトロウイルスによって感染された宿主細胞を、感染していない宿主細胞（レトロウイルス核酸を有さない）から分離する。
【0130】
レンチウイルスまたはレトロウイルスは、宿主細胞の感染後に発現されるいくつかの遺伝成分を運ぶことができる：１）抗原／リガンドの遺伝子配列、２）鋳型領域にバーコードを含むプライムエディティングガイドＲＮＡ（ｐｅｇＲＮＡ）、３）ウイルス形質導入の存在を示すレポーター遺伝子（例えば、ＧＦＰなどのレポーター）、および４）他のヘルパータンパク質（例えば、ＭＨＣ）。これらの遺伝成分は、受容体または結合タンパク質を有する宿主細胞（例えば、Ｔ細胞）で発現される。レトロウイルス（例えば、レンチウイルス）は、潜在的な抗原／リガンドおよび宿主細胞の受容体または結合タンパク質に結合するために必要なヘルパータンパク質を示し得る。レポーター遺伝子（例えば、ＧＦＰ）は、レトロウイルス（例えば、レンチウイルス）によって感染した宿主細胞によって発現され、感染していない宿主細胞からの、感染した宿主細胞のスクリーニングおよびソーティング（例えば、ＦＡＣｓによる）を可能にする。レトロウイルス（例えば、レンチウイルス）ベクターは、以下の２つの機能を提供するｐｅｇＲＮＡを送達する：１）受容体または結合タンパク質をコードする核酸の近くにまたは隣接してインテグレートされたユニークな部位を有する配列相同性に基づき、ＣＲＩＳＰＲ編集複合体を特定の挿入部位に標的化する、および２）相同性に基づく修正により、レトロウイルス（例えば、レンチウイルス）核酸（例えば、バーコード配列）を特定の挿入部位に挿入する。
【0131】
レトロウイルス（例えば、レンチウイルス）にパッケージされる構築物は、定常領域および２つの可変領域を有し得る。１つの可変領域は、宿主細胞の標的部位にｐｅｇＲＮＡ足場によって挿入されるバーコードをコードする。第２の可変領域は、抗原／リガンドの可変領域をコードして、受容体／結合タンパク質、例えば、Ｓ－ＥＴＤ－ＬＧＤ－ＩＲＥＳ－Ｒ（ここで、Ｓはシグナル配列をコードし、ＥＴＤは細胞外標的化ドメインをコードし；ＬＧＤは抗原／リガンドをコードし、ＩＲＥＳは配列内リボソーム侵入部位をコードし、Ｒはレポーター（例えば、蛍光タンパク質または抗生物質耐性）をコードする）と相互作用する。ＩＲＥＳおよびＭは場合によるものであり、核酸はＳ－ＥＴＤ－ＬＧＤをコードし得る。ヌクレオチド配列は、Ｉ型制限消化ベースのアセンブリー、Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅアセンブリー、ＧａｔｅｗａｙアセンブリーまたはＧｉｂｓｏｎアセンブリーによって同時にまたは逐次的にこれら２つの可変領域に挿入され得る。Ｉ型制限消化ベースのアセンブリーを使用する場合、２つの異なる消化酵素が各可変領域に使用される。Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅアセンブリーを使用する場合、４つのＩＩ型制限消化部位を導入して、バーコードおよび抗原ヌクレオチド配列を同時に挿入することを可能にし得る。
【0132】
ウイルス構築物のためのフソゲンは、抗原／リガンド－受容体（または結合タンパク質）相互作用時にのみ、細胞間の膜融合を可能にするように操作される。そのようなフソゲンの１つの例は、突然変異水疱性口内炎ウイルスＧタンパク質（ＶＳＶ－Ｇ）である。ＶＳＶ－Ｇは、シュードタイプレンチウイルスに広く使用されてきたウイルスエンベロープタンパク質である。突然変異の例は、宿主細胞のＬＤＬＲのその直接認識および相互作用を妨害する、Ｋ４７ＱおよびＲ３５４Ａである（全ての目的のためにその全体を参照により組み込まれる、Ｎｉｋｏｌｉｃら、２０１８ ＣＩＴＥ）。ここで、ＶＳＶ－Ｇは、ユーザーが規定したリガンド－受容体相互作用に基づき細胞侵入を媒介することができる。
【0133】
レンチウイルスおよび／またはレトロウイルスは、出芽中に、それら自体のウイルス膜として宿主細胞膜を使用することができ、したがって、産生細胞膜に存在する任意のタンパク質がウイルス粒子によって提示され得る。産生細胞は、レンチウイルスおよび／またはレトロウイルス構築物が抗原／リガンドタンパク質配列を含有し、抗原／リガンドタンパク質が膜に結合している限り、それらの細胞膜上に全長抗原／リガンドタンパク質を提示することができる。多くのリガンドは、本来、膜タンパク質（例えば、ＰＤ－Ｌ１およびＭＨＣ－抗原複合体）である。本来、膜に結合していない抗原／リガンドは、それを膜貫通ドメインＤＮＡ配列、例えばウイルス外被タンパク質に融合することにより、細胞膜に係留され得る。例示的な膜貫通ドメインは、ＣＤ２、ＣＤ３ｄ、ＣＤ３ｇ、ＣＤ３ｚ、ＣＤ４、ＣＤ８Ａ、ＣＤ８Ｂ、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８４、ＣＤ８６、ＣＤ１３７、ＣＤ２４４、ＣＲＡＣＣ、ＣＲＴＡＭ、ＣＬＴＡ－４、ＭＨＣ－Ｉ、ＭＨＣ－ＩＩ、血小板由来増殖因子受容体、ＦＣＧＲ１Ａ、ＦＣＧＲ２Ａ、ＦＣＧ２Ｂ、ＦＣＧＲ３Ａ、ＦＣＲＬ１、ＦＣＲＬ２、ＦＣＲＬ３、ＦＣＲＬ４、ＦＣＲＬ５、ＦＣＲＬ６、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ、ＫＩＲ２ＤＬ５Ｂ、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＬ２、ＫＩＲ３ＤＬ３、ＬＡＧ３、ＧＩＴＲ、ＯＸ４０、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＴＬＲ、ＳＬＡＭＦ、ＬＩＬＲＢ１、ＬＩＬＲＢ２、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＴＩＧＩＴ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、または免疫グロブリン由来の野生型または改変膜貫通ドメインを含む。
【0134】
ＭＨＣ－抗原複合体は、一本鎖三量体を使用して、レトロウイルス（例えば、レンチウイルス）に提示され得る（全ての目的のためにその全体を参照により組み込まれる、Ｍｏｔｔｅｚら、Ｃｅｌｌｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ａ ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ ｃｌａｓｓ Ｉ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｗｉｔｈ ａ ｓｉｎｇｌｅ ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ ｂｏｕｎｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ａｒｅ ｈｉｇｈｌｙ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８１巻：４９３～５０２頁（１９９５））。一本鎖三量体は、縦一列にシグナルペプチド、抗原ペプチド、リンカー、ＭＨＣベータ鎖、第２のリンカーおよびＭＨＣアルファ鎖を有し得る。例えば、ヒト増殖ホルモンシグナルペプチドからベータ２ミクログロブリン（ＭＨＣベータ鎖）までをコードするＤＮＡを合成し、ＭＨＣアルファ鎖と共にレンチウイルス構築物に挿入され得る。一本鎖三量体ＤＮＡ（本発明者らのレンチウイルスおよびレトロウイルスプラスミドの一部）をパッケージング細胞株（２９３Ｔ）にコトランスフェクトすることは、膜結合ＭＨＣ－抗原複合体を産生するであろう。レンチウイルスおよびレトロウイルスがそれらのウイルス膜としてパッケージング細胞膜を使用する場合、ＭＨＣ－抗原複合体はウイルス膜に提示され得る。
【0135】
レポーター（例えば、ＧＦＰなどのなレポーター）は、ウイルスの侵入を示す２つの方法で宿主細胞に導入され得る：１）レンチウイルスまたはレトロウイルスは、事前に翻訳されたレポーター遺伝子産物（タンパク質）を運ぶ、２）レンチウイルスまたはレトロウイルスは、レポーター遺伝子を受容体細胞ゲノムに送達およびインテグレートする。ウイルスによりレポーター遺伝子産物を運ぶ例示的な方法は、ＧＦＰをウイルス構造タンパク質（例えば、ウイルスエンベロープタンパク質またはＭタンパク質）と融合することである。レンチウイルスおよびレトロウイルスは、天然では、レポーターを有する構築物を宿主細胞ゲノムに送達する。
【0136】
パッケージング細胞によりレンチウイルスまたはレトロウイルスを産生した後、ウイルス懸濁液は受容体宿主ライブラリーと混合され得る。レンチウイルスまたはレトロウイルスは、それらの間に正しい抗原／リガンド－受容体／結合タンパク質対がある場合、受容体宿主細胞に感染する。レンチウイルスまたはレトロウイルスは、ウイルスＲＮＡおよび関連タンパク質（逆転写酵素および／またはレポータータンパク質）を受容体細胞に送達する。逆転写酵素によってインテグレートされたウイルスＲＮＡまたはウイルスＤＮＡは、レポーター遺伝子産物（例えば、ＧＦＰ）およびｐｅｇＲＮＡ（バーコード配列）を産生することができる。
【0137】
ｐｅｇＲＮＡは、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２ａまたは他の遺伝子編集酵素と相互作用することにより、受容体宿主細胞ゲノム（例えば、受容体遺伝子の近くのまたは隣接する領域）の特定の部位へとバーコードを導入することができる。ＣＲＩＳＰＲ編集酵素は、宿主細胞、レンチウイルスウイルスＤＮＡによって産生されるか、またはエレクトロポレーションによって導入され得る。次いで、バーコードを、受容体（および／またはそのバーコード）によってシークセンスして、抗原／リガンドおよび受容体／結合タンパク質対を同定することができる。
【0138】
ｐｅｇＲＮＡは、以下の３つの成分を有し得る：１）足場領域（定常領域としても公知）、２）配列標的化領域、および３）バーコード領域。配列標的領域は、宿主細胞の挿入部位に特異的である。１ｅ０～１ｅ５の配列標的領域を使用して、受容体宿主細胞の複数の領域を標的化することができるが、各個々のｐｅｇＲＮＡは１つの領域のみを標的化することができる。バーコード領域は、挿入部位に挿入される特異的配列を決定する。１ｅ０～１ｅ１０の異なるバーコードが使用され得る。配列標的化領域およびバーコード領域は、ウイルスプラスミド上で互いに近接し、したがって、それらは同じクローニング部位または別々のクローニング部位を使用することができる。
【0139】
感染細胞は、例えば、フローサイトメトリーＦＡＣＳまたは磁気ビーズプルダウンを使用して、レポーター遺伝子産物（ＧＦＰ）に基づいて単離され得る。磁気ビーズは、表面受容体タンパク質（例えば、ＭＹＣ－タグまたはＦＬＡＧ－タグ）に結合することができるタンパク質または抗体にコンジュゲートされ得る。磁気ビーズに結合した細胞は、感染細胞が富化される。
【0140】
これらの富化した宿主細胞はバルクであり、ハイスループットシークエンシングして受容体／結合タンパク質および抗原／リガンドを同定することができる。このシークエンシングは、ｐｅｇＲＮＡバーコードを同定して、受容体に結合する抗原／リガンドを同定する。ｐｅｇＲＮＡは、受容体遺伝子の近くにまたは隣接して挿入されるため、従来のシークエンシング（１００～６００ｎｔの長さ）またはロングリードシークエンシング（６００～３０，０００ｎｔ）のいずれかを実施して、抗原／リガンドバーコードと受容体／結合タンパク質の間の関係を捉えることができる。バーコード－リガンド関係は、構築物バルクシークエンシングによって先に確立することができるため、結合対は計算により推測され得る。
【0141】
本明細書に開示の本発明は、以下に詳述した実験により、より良く理解されるであろう。しかしながら、当業者は、特定の方法および議論した結果が、後述の特許請求の範囲により完全に記載されるように、単に本発明の例示にすぎないことを容易に認識するであろう。他に示さない限り、本開示は、特定の手順、材料等に限定されず、変化し得るものである。本明細書で使用した用語は、特定の実施形態のみを記載する目的のためであり、限定することを意図しないことも理解されるべきである。
【0142】
実施例１：ＴＣＲミミック様キメラＴＣＲまたはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を作製する
一本鎖Ｔ細胞受容体を、全ての目的のためにその全体を参照により組み込まれる、Ｚｈａｎｇら、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １１巻：４８７～４９６頁（２００４）に従って作製する。適切な細胞質領域を、一本鎖ＴＣＲと融合して、キメラＴ細胞受容体を作製する。細胞質領域は、Ｆｃ細胞質ドメイン、ＣＤ３ζ、ＣＤ２８、Ｂ７．１、ＣＤ１３７、ＣＤ１９細胞内活性化ドメイン、ＣＤ６４細胞内活性化ドメイン、ＣＤ３２細胞内活性化ドメイン、ＣＤ１６細胞内活性化ドメイン、ＣＤ２３細胞内活性化ドメイン、またはＬｃｋ活性化ドメインの１つまたは複数を含む。
一本鎖Ｔ細胞受容体を、全ての目的のためにその全体を参照により組み込まれる、Ｚｈａｎｇら、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １１巻：４８７～４９６頁（２００４）に従って作製する。適切な細胞質領域を、一本鎖ＴＣＲと融合して、キメラＴ細胞受容体を作製する。細胞質領域は、Ｆｃ細胞質ドメイン、ＣＤ３ζ、ＣＤ２８、Ｂ７．１、ＣＤ１３７、ＣＤ１９細胞内活性化ドメイン、ＣＤ６４細胞内活性化ドメイン、ＣＤ３２細胞内活性化ドメイン、ＣＤ１６細胞内活性化ドメイン、ＣＤ２３細胞内活性化ドメイン、またはＬｃｋ活性化ドメインの１つまたは複数を含む。
【0143】
一本鎖または天然の二本鎖ＴＣＲまたは天然の二本鎖ＴＣＲを、Ｔ細胞受容体、Ｆｌｕ－ＴＣＲ１、Ｆｌｕ－ＴＣＲ２、ＤＭＦ－５、１Ｇ４、ＣＳＳ－９４４－８、ＣＳＳ－９３０－１ａ、ＣＳＳ－９３０－１ｂ、ＰＭＥＬ－１、ＰＭＥＬ－２およびＰＭＥＬ－３から作製する。これらのＴＣＲのそれぞれのアルファおよびベータＴＣＲ鎖のある特定の配列は、以下の表３および４である：
【0144】
【表3】
【0145】
【表4】
【0146】
ＴＣＲおよびそれらの抗原の一部は、Ｓｐｉｎｄｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３８巻：６０９～６１９頁（２０２０）に記載される。
【0147】
複数のキメラ抗原受容体を、各一本鎖ＴＣＲについて作製する。ＴＣＲ ＣＤＲ３領域およびその隣接領域（約１５０ｎｔ）は、ＴＣＲ同定のためのバーコードとして機能する。
【0148】
ＴＣＲレパートリーは、ヒトドナー組織（血液を含む）で同定されたＴＣＲ配列、改変された天然のヒトＴＣＲ配列、またはコンピューターアルゴリズムによって生成されたＴＣＲ配列も含み得る。スクリーニングの成功率を増強するため、以下のアプローチの１つを使用してＴＣＲ配列を選択することができる：目的のＨＬＡ対立遺伝子を有するドナーからＴＣＲを選択する、目的の条件によってドナーを選択する（例えば、ＣＭＶ状態もしくはがん状態、またはＴＣＲ配列に基づくアルゴリズムを予測するＨＬＡを使用する。
【0149】
実施例２：ＴＨＰ－１細胞におけるＴＣＲのレパートリー
実施例１で作製したキメラＴＣＲのレパートリーを、ＴＨＰ－１細胞に操作により導入する。個々のＴＨＰ－１細胞が１つの構築物を有し、１つのキメラＴＣＲを発現するように、キメラＴＣＲをコードする構築物を導入する。キメラＴＣＲのレパートリーを有するＴＨＰ－１細胞の集団は、後の工程で使用され得る。
実施例１で作製したキメラＴＣＲのレパートリーを、ＴＨＰ－１細胞に操作により導入する。個々のＴＨＰ－１細胞が１つの構築物を有し、１つのキメラＴＣＲを発現するように、キメラＴＣＲをコードする構築物を導入する。キメラＴＣＲのレパートリーを有するＴＨＰ－１細胞の集団は、後の工程で使用され得る。
【0150】
実施例３：Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるＴＣＲのレパートリー
実施例１で作製したキメラＴＣＲのレパートリーを、Ｊｕｒｋａｔ細胞に操作により導入する。個々のＪｕｒｋａｔ細胞が１つの構築物を有し、１つのキメラＴＣＲを発現するように、キメラＴＣＲをコードする構築物を導入する。キメラＴＣＲのレパートリーを有するＪｕｒｋａｔ細胞の集団は、後の工程で使用され得る。
実施例１で作製したキメラＴＣＲのレパートリーを、Ｊｕｒｋａｔ細胞に操作により導入する。個々のＪｕｒｋａｔ細胞が１つの構築物を有し、１つのキメラＴＣＲを発現するように、キメラＴＣＲをコードする構築物を導入する。キメラＴＣＲのレパートリーを有するＪｕｒｋａｔ細胞の集団は、後の工程で使用され得る。
【0151】
実施例３：Ｋ５６２細胞における抗原ライブラリー
抗原ライブラリーを、適切なインフルエンザＨＬＡ、ヒトＭＡＲＴ－１、エピトープＮＹ－ＥＳＯ－１（ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ）、ＬＭＰ２（ＣＬＧ）、Ａ２／ＭＥＬ（ＫＴＷ）のｐＭＨＣデキストラマー、ｇｐ１００から、ならびにＴ細胞受容体Ｆｌｕ－ＴＣＲ１、Ｆｌｕ－ＴＣＲ２、ＤＭＦ－５、１Ｇ４、ＣＳＳ－９４４－８、ＣＳＳ－９３０－１ａ、ＣＳＳ－９３０－１ｂ、ＰＭＥＬ－１、ＰＭＥＬ－２およびＰＭＥＬ－３のために作製する。ＨＬＡ遺伝子および抗原配列は、単一ペプチドに融合されるか、または別々のペプチドとしてコードされ得る。ＨＬＡアルファおよびベータ鎖は融合されるか、または別々のペプチドとしてコードされ得る。ＨＬＡは全長タンパク質の断片のみに結合し、それを提示することができるため、抗原配列は８～２５アミノ酸長である。コンピューターアルゴリズムは、提示可能な抗原として使用するためのペプチドを選択し、他のエピトープは、全ての目的のためにその全体を参照により組み込まれる、ＩＥＤＢ（ｉｅｄｂ．ｏｒｇ）、例えば、Ｖｉｔａら、Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｅ Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｄａｔａｂａｓｅ（ＩＥＤＢ）：２０１８年改訂で以前に報告されている。抗原提示細胞の抗原バーコードは、抗原をコードするＤＮＡまたはＲＮＡと同時にまたは逐次的に導入され得る。ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかで作製された抗原バーコードは、操作したジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写因子結合タンパク質、複製タンパク質Ａ、ＣＲＳＩＰＲ Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ１３、ファージＲＮＡ結合タンパク質、細菌一本鎖結合タンパク質、または操作した制限消化酵素であり得るＤＮＡまたはＲＮＡ結合タンパク質を介して細胞膜に結合され得る。
抗原ライブラリーを、適切なインフルエンザＨＬＡ、ヒトＭＡＲＴ－１、エピトープＮＹ－ＥＳＯ－１（ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ）、ＬＭＰ２（ＣＬＧ）、Ａ２／ＭＥＬ（ＫＴＷ）のｐＭＨＣデキストラマー、ｇｐ１００から、ならびにＴ細胞受容体Ｆｌｕ－ＴＣＲ１、Ｆｌｕ－ＴＣＲ２、ＤＭＦ－５、１Ｇ４、ＣＳＳ－９４４－８、ＣＳＳ－９３０－１ａ、ＣＳＳ－９３０－１ｂ、ＰＭＥＬ－１、ＰＭＥＬ－２およびＰＭＥＬ－３のために作製する。ＨＬＡ遺伝子および抗原配列は、単一ペプチドに融合されるか、または別々のペプチドとしてコードされ得る。ＨＬＡアルファおよびベータ鎖は融合されるか、または別々のペプチドとしてコードされ得る。ＨＬＡは全長タンパク質の断片のみに結合し、それを提示することができるため、抗原配列は８～２５アミノ酸長である。コンピューターアルゴリズムは、提示可能な抗原として使用するためのペプチドを選択し、他のエピトープは、全ての目的のためにその全体を参照により組み込まれる、ＩＥＤＢ（ｉｅｄｂ．ｏｒｇ）、例えば、Ｖｉｔａら、Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｅ Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｄａｔａｂａｓｅ（ＩＥＤＢ）：２０１８年改訂で以前に報告されている。抗原提示細胞の抗原バーコードは、抗原をコードするＤＮＡまたはＲＮＡと同時にまたは逐次的に導入され得る。ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかで作製された抗原バーコードは、操作したジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写因子結合タンパク質、複製タンパク質Ａ、ＣＲＳＩＰＲ Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ１３、ファージＲＮＡ結合タンパク質、細菌一本鎖結合タンパク質、または操作した制限消化酵素であり得るＤＮＡまたはＲＮＡ結合タンパク質を介して細胞膜に結合され得る。
【0152】
フルデータ生成実験のため、抗原配列のレパートリー（＞１００）をＫ５６２細胞に導入する。抗原配列は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合実験、マススペクトロメトリー実験、タンパク質配列のスライディングウィンドウ（ウィンドウあたり８～２５）、またはコンピューターアルゴリズムによって提示可能と予測される公知のタンパク質の断片で同定されたペプチド配列であり得る。このコンピューターアルゴリズムを、ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合データ、マススペクトロメトリーデータ、または遺伝子発現データのいずれかで訓練して、ＭＨＣ／ＨＬＡ複合体によって提示され可能性が高い配列を同定する。
【0153】
実施例４：抗原ライブラリーに対するキメラＴ細胞受容体レパートリーのスクリーニング
ＴＣＲレパートリーを有するＴＨＰ－１細胞および抗原ライブラリーを有するＫ５６２細胞を、それぞれ、異なる蛍光タンパク質またはそれらの核に制限された生細胞色素によっても標識する。キメラＴＣＲレパートリーを有するＴＨＰ－１細胞を、抗原ライブラリーを有するＫ５６２細胞と混合し、ＴＨＰ－１細胞は、キメラＴＣＲによって認識されたＭＨＣ：抗原融合体を提示するＫ５６２細胞を貪食することができる。インキュベーション後、全ての細胞を、フローサイトメトリーおよび細胞ソーティングによって解析して、両方の蛍光シグナルを有する細胞（ＴＨＰ－１細胞およびＫ５６２細胞が共にあることを示す）を単離する。２つの異なる蛍光シグナルを有する細胞は、Ｋ５６２細胞を貪食したＴＨＰ－１細胞である。この細胞集団を、バルクまたは単一細胞ＤＮＡシークエンシングのいずれかによってシークエンシングする。プライマーを使用して、抗原コード領域（抗原バーコード）およびＣＤＲ３領域（ＴＣＲバーコード）を増幅する。バルクシークエンシングから、抗原およびＴＣＲ配列の結合対を同定する。
ＴＣＲレパートリーを有するＴＨＰ－１細胞および抗原ライブラリーを有するＫ５６２細胞を、それぞれ、異なる蛍光タンパク質またはそれらの核に制限された生細胞色素によっても標識する。キメラＴＣＲレパートリーを有するＴＨＰ－１細胞を、抗原ライブラリーを有するＫ５６２細胞と混合し、ＴＨＰ－１細胞は、キメラＴＣＲによって認識されたＭＨＣ：抗原融合体を提示するＫ５６２細胞を貪食することができる。インキュベーション後、全ての細胞を、フローサイトメトリーおよび細胞ソーティングによって解析して、両方の蛍光シグナルを有する細胞（ＴＨＰ－１細胞およびＫ５６２細胞が共にあることを示す）を単離する。２つの異なる蛍光シグナルを有する細胞は、Ｋ５６２細胞を貪食したＴＨＰ－１細胞である。この細胞集団を、バルクまたは単一細胞ＤＮＡシークエンシングのいずれかによってシークエンシングする。プライマーを使用して、抗原コード領域（抗原バーコード）およびＣＤＲ３領域（ＴＣＲバーコード）を増幅する。バルクシークエンシングから、抗原およびＴＣＲ配列の結合対を同定する。
【0154】
単一細胞シークエンシングから、活性化イベントに関与する対合した抗原およびＴＣＲ配列が同定され得る。抗原またはＴＣＲ読み取りの頻度を使用して、最も相互作用する可能性が高い対を同定することができる。
【0155】
実施例５：抗原ライブラリーに対するＴ細胞受容体レパートリーのスクリーニング
ＴＣＲレパートリーを有するＪｕｒｋａｔ細胞および抗原ライブラリーを有するＫ５６２細胞を、それぞれ異なる膜結合蛍光タンパク質または生細胞色素によっても標識する。さらに、ＴＣＲレパートリーおよび抗原ライブラリーを、核酸結合タンパク質のための適切な結合モチーフによって操作する。Ｊｕｒｋａｔ細胞およびＫ５６２細胞を、核酸結合ドメインが膜の細胞質側に存在するように、核酸結合タンパク質および合成の膜貫通ドメインの融合タンパク質によって操作する。キメラＴＣＲレパートリーを有するＪｕｒｋａｔ細胞を、抗原ライブラリーを有するＫ５６２細胞と混合し、Ｊｕｒｋａｔ細胞は、キメラＴＣＲによって認識されるＭＨＣ：抗原融合体を提示するＫ５６２細胞からの膜片をトロゴサイトーシスすることができる（Ｋ５６２細胞はＫｕｒｋａｔ細胞膜片もトロゴサイトーシスすることができる）。インキュベーション後、全ての細胞を、フローサイトメトリーおよび細胞ソーティングによって解析して、両方の蛍光シグナルを有する細胞（Ｊｕｒｋａｔ細胞がＫ５６２細胞膜をトロゴサイトーシスしたことを示す）を単離する。２つの異なる蛍光シグナルを有する細胞は、Ｋ５６２細胞によって活性化されたＪｕｒｋａｔ細胞である。抗原およびＴＣＲをコードする核酸の部分を、バルクまたは単一細胞ＤＮＡシークエンシングのいずれかによってシークエンシングする。プライマーを使用して、抗原コード領域（および／または抗原バーコード）およびＣＤＲ３領域（および／またはＴＣＲバーコード）を増幅する。バルクシークエンシングから、抗原およびＴＣＲ配列の結合対を同定する。
ＴＣＲレパートリーを有するＪｕｒｋａｔ細胞および抗原ライブラリーを有するＫ５６２細胞を、それぞれ異なる膜結合蛍光タンパク質または生細胞色素によっても標識する。さらに、ＴＣＲレパートリーおよび抗原ライブラリーを、核酸結合タンパク質のための適切な結合モチーフによって操作する。Ｊｕｒｋａｔ細胞およびＫ５６２細胞を、核酸結合ドメインが膜の細胞質側に存在するように、核酸結合タンパク質および合成の膜貫通ドメインの融合タンパク質によって操作する。キメラＴＣＲレパートリーを有するＪｕｒｋａｔ細胞を、抗原ライブラリーを有するＫ５６２細胞と混合し、Ｊｕｒｋａｔ細胞は、キメラＴＣＲによって認識されるＭＨＣ：抗原融合体を提示するＫ５６２細胞からの膜片をトロゴサイトーシスすることができる（Ｋ５６２細胞はＫｕｒｋａｔ細胞膜片もトロゴサイトーシスすることができる）。インキュベーション後、全ての細胞を、フローサイトメトリーおよび細胞ソーティングによって解析して、両方の蛍光シグナルを有する細胞（Ｊｕｒｋａｔ細胞がＫ５６２細胞膜をトロゴサイトーシスしたことを示す）を単離する。２つの異なる蛍光シグナルを有する細胞は、Ｋ５６２細胞によって活性化されたＪｕｒｋａｔ細胞である。抗原およびＴＣＲをコードする核酸の部分を、バルクまたは単一細胞ＤＮＡシークエンシングのいずれかによってシークエンシングする。プライマーを使用して、抗原コード領域（および／または抗原バーコード）およびＣＤＲ３領域（および／またはＴＣＲバーコード）を増幅する。バルクシークエンシングから、抗原およびＴＣＲ配列の結合対を同定する。
【0156】
単一細胞シークエンシングから、活性化イベントに関与する対合した抗原およびＴＣＲ配列が同定され得る。抗原またはＴＣＲ読み取りの頻度を使用して、最も相互作用する可能性が高い対を同定することができる。
【0157】
実施例６：レトロウイルス抗原ライブラリーに対するＴ細胞受容体レパートリーのスクリーニング
上記のＴＣＲレパートリーを有するＪｕｒｋａｔ細胞を、この実施例で使用する。これらのＪｕｒｋａｔ細胞を操作して、Ｃａｓ１２ａを発現させる。レンチウイルス構築物を、ｐｅｇＲＮＡおよびＧＦＰと融合した抗原－ＭＨＣ複合体によって操作する。ｐｅｇＲＮＡは、レンチウイルス構築物を標的化して、Ｊｕｒｋａｔ細胞ゲノムにおけるＴＣＲ遺伝子付近をシークエンシングする。ｐｅｇＲＮＡは、１５ｎｔの長さのランダム配列であり得るバーコード配列を含む（１ｅ９の理論的多様性）。ｐｅｇＲＮＡ配列を、Ｕ６プロモーターによって発現させ、ポリＴ配列によって終結させる。レンチウイルス構築物は、ＧＦＰと融合した一本鎖三量体として導入される抗原－ＭＨＣ複合体のライブラリーを発現する。レンチウイルス粒子は、異なるウイルス粒子に抗原ＭＨＣ複合体ライブラリーを提示する。ＭＨＣ一本鎖三量体の発現を、哺乳動物遺伝子プロモーター（例えば、ＥＦ１ａプロモーター）によって制御する。抗原多様性は１ｅ５であり、アプリケーションに基づいて調整され得る。ＭＨＣ対立遺伝子は、任意のヒトＭＨＣ対立遺伝子または突然変異を有する任意のヒトＭＨＣ対立遺伝子であり得る。バーコードおよびリガンド配列領域の両方は、ＰａｑＣＩクローニング部位を含有する（したがって、異なる切断部位配列を有する４つのＰａｑＣＩ切断部位）。バーコードおよびリガンド配列は、Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅアセンブリーによってレンチウイルス構築物ライブラリーへと導入され得る。プラスミド増幅後、１％の構築物材料が、バーコード－抗原対合を確立するためにシークエンシングされたｐｅｇＲＮＡ－抗原領域を有する。
上記のＴＣＲレパートリーを有するＪｕｒｋａｔ細胞を、この実施例で使用する。これらのＪｕｒｋａｔ細胞を操作して、Ｃａｓ１２ａを発現させる。レンチウイルス構築物を、ｐｅｇＲＮＡおよびＧＦＰと融合した抗原－ＭＨＣ複合体によって操作する。ｐｅｇＲＮＡは、レンチウイルス構築物を標的化して、Ｊｕｒｋａｔ細胞ゲノムにおけるＴＣＲ遺伝子付近をシークエンシングする。ｐｅｇＲＮＡは、１５ｎｔの長さのランダム配列であり得るバーコード配列を含む（１ｅ９の理論的多様性）。ｐｅｇＲＮＡ配列を、Ｕ６プロモーターによって発現させ、ポリＴ配列によって終結させる。レンチウイルス構築物は、ＧＦＰと融合した一本鎖三量体として導入される抗原－ＭＨＣ複合体のライブラリーを発現する。レンチウイルス粒子は、異なるウイルス粒子に抗原ＭＨＣ複合体ライブラリーを提示する。ＭＨＣ一本鎖三量体の発現を、哺乳動物遺伝子プロモーター（例えば、ＥＦ１ａプロモーター）によって制御する。抗原多様性は１ｅ５であり、アプリケーションに基づいて調整され得る。ＭＨＣ対立遺伝子は、任意のヒトＭＨＣ対立遺伝子または突然変異を有する任意のヒトＭＨＣ対立遺伝子であり得る。バーコードおよびリガンド配列領域の両方は、ＰａｑＣＩクローニング部位を含有する（したがって、異なる切断部位配列を有する４つのＰａｑＣＩ切断部位）。バーコードおよびリガンド配列は、Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅアセンブリーによってレンチウイルス構築物ライブラリーへと導入され得る。プラスミド増幅後、１％の構築物材料が、バーコード－抗原対合を確立するためにシークエンシングされたｐｅｇＲＮＡ－抗原領域を有する。
【0158】
レンチウイルス構築物を、パッケージングヘルパープラスミド（例えば、Ｇａｇ－ｐｏｌプラスミドおよびＶＳＶ－Ｇプラスミド）によって操作したＨＥＫ２９３Ｔパッケージング細胞によってパッケージングする。ＶＳＶ－Ｇプラスミドは、ＶＳＶ－Ｇのコード領域に突然変異を含有し、Ｔ細胞上のＬＤＬＲとのＶＳＶ－Ｇの直接相互作用を不可能にするが、抗原－ＴＣＲ相互作用がウイルスを細胞付近に運ぶ場合、ウイルスの侵入を依然として可能にする。ウイルス懸濁液を、パッケージング細胞株のトランスフェクションの４８時間および７２時間後に収集する。膜結合ＧＦＰシグナルをチェックして、通常細胞表面およびウイルス表面に提示されるＧＦＰと融合したＭＨＣ一本鎖三量体を確認する。
【0159】
ＭＨＣ－抗原ライブラリーを有するレンチウイルス粒子のライブラリーを使用して、ＴＣＲレパートリーを有するＪｕｒｋａｔ細胞の集団をトランスフェクトする。レンチウイルス構築物のｐｅｇＲＮＡは、ヒトＴＲＢＣ１（ＴＣＲベータ定常領域１）、ＴＲＢＣ２（ＴＣＲベータ定常領域２）および／またはＴＲＡＣ（ＴＣＲアルファ定常領域）に隣接するＪｕｒｋａｔゲノムへの挿入のための構築物を標的化する。形質導入したＪｕｒｋａｔ細胞を、フローサイトメトリーＦＡＣＳデバイスでＧＦＰシグナルを検出することにより、同定およびソートする。生細胞色素を使用して、死細胞を除去して、ＧＦＰの偽陽性シグナルを減少させることができる。ＧＦＰ発現によりソートしたＪｕｒｋａｔ細胞をプールし、溶解してＤＮＡを抽出する。ＤＮＡを、ＴＣＲおよびレンチウイルスバーコードの増幅プライマーを使用してシークエンシングする。精製したＰＣＲ産物を、ロングリードシークエンシング（例えば、ＰａｃＢｉｏ ＨｉＦｉロングリードシークエンシング）によってバルクシークエンシングフォーマットでシークエンシングする。ＴＣＲ配列と抗原バーコード間の対関係は、バックグラウンド分布と比較して共通のＴＣＲ－抗原対の頻度をランキングすることによって確立され得る。バックグラウンド分布は、計算モデリングまたは陰性対照試料のシークエンシングによって確立され得る。
【0160】
場合により、シークエンシングによって同定された標的抗原は、以下のように検証され得る。抗原は、ＤＮＡプラスミド、ｍＲＮＡ、ペプチド、または全タンパク質によって、ＭＨＣ対立遺伝子が適合した抗原提示細胞株（ＡＰＣ、例えば、初代Ｂ細胞、Ｔ２細胞、またはＫ５６２細胞）に導入され得る。目的のＴＣＲを有するＴ細胞株は、抗原提示ＡＰＣと混合することができ、Ｔ細胞活性化マーカーは、イメージング、ＥＬＩＳＡまたはフローサイトメトリーによって測定することができる。Ｔ細胞活性化マーカーは、ＩＬ－２、ＴＮＦ－アルファ、ＩＦＮ－ガンマ、ＮＦＡＴ媒介転写活性、ＡＰ－１媒介転写活性、ＮＦ－ｋＢ媒介転写活性、ＣＤ６９、ＣＤ１０７ａ、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ３８、トロゴサイトーシス、ＰＤ－１、ＣＤ２５、ＣＤ７１および形態変化を含む。ＴＣＲの正しい標的抗原は、Ｔ細胞およびＡＰＣの同時インキュベーション後に上記のマーカーの１つまたは複数によって測定した場合、Ｔ細胞を活性化する。
【0161】
本明細書に引用した全ての刊行物および特許は、各個々の刊行物または特許が参照により組み込まれることが具体的におよび個々に示されたかのように、参照により本明細書に組み込まれ、刊行物が引用された方法および／または材料を開示および記載するために、参照により本明細書に組み込まれる。
【0162】
当業者は、ただ通常の実験、本明細書に記載の本発明の具体的な実施形態との多くの均等物を使用して認識または確認することができるであろう。そのような均等物は、以下の特許請求の範囲によって包含されることを意図される。
【配列表】
【国際調査報告】