知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
▶ バンダ・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドの特許一覧
特表2024-525837アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）遺伝子阻害及び処置
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-07-12
(54)【発明の名称】アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）遺伝子阻害及び処置
(51)【国際特許分類】
A61K 31/7088 20060101AFI20240705BHJP
C12N 15/113 20100101ALI20240705BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240705BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20240705BHJP
A61P 25/02 20060101ALI20240705BHJP
A61P 21/00 20060101ALI20240705BHJP
【ＦＩ】
A61K31/7088
C12N15/113 Z ZNA
A61P35/00
A61P35/02
A61P25/02
A61P21/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024502210
(86)(22)【出願日】2022-07-13
(85)【翻訳文提出日】2024-02-20
(86)【国際出願番号】 US2022073668
(87)【国際公開番号】W WO2023288240
(87)【国際公開日】2023-01-19
(31)【優先権主張番号】63/222,336
(32)【優先日】2021-07-15
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/224,362
(32)【優先日】2021-07-21
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】313006588
【氏名又は名称】バンダ・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】ＶＡＮＤＡ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ ＩＮＣ．
(74)【代理人】
【識別番号】110001519
【氏名又は名称】弁理士法人太陽国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】プルズィホドゼン、バルトロミエイ
(72)【発明者】
【氏名】スミースゼク、サンドラ
【テーマコード（参考）】
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C086AA01
4C086AA02
4C086BC71
4C086MA01
4C086MA04
4C086MA66
4C086NA14
4C086ZA21
4C086ZA94
4C086ZB21
4C086ZB26
4C086ZB27
4C086ZC54
(57)【要約】
本発明の実施形態は一般にアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）に関し、より詳細には、ＡＳＯを使用してタンパク質合成を調節するための組成物及び方法に関する。ある実施形態では、本発明は、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）と診断された患者を処置する方法であって、かかる疾患を処置するのに有効な量のＪＡＫ２（ＡＳＯ－Ｔ－ＪＡＫ２）化合物をコードする核酸分子を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を患者に投与することを含む方法を提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）と診断された患者を処置する方法であって、前記患者に、ＭＤＳ疾患を処置するのに有効な量のＡＳＯ－Ｔ－ＪＡＫ２化合物を投与することを含む方法。
【請求項2】
前記ＡＳＯ－Ｔ－ＪＡＫ２化合物が、配列番号２、配列番号３、又はその両方を標的とする、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記ＡＳＯ－Ｔ－ＪＡＫ２化合物が、配列番号４又は配列番号５を含むヌクレオチド配列を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記ＡＳＯ－Ｔ－ＪＡＫ２化合物の前記量が、前記患者におけるＪＡＫ２の発現を阻害するのに十分な量である、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
真性赤血球増加症（ＰＶ）と診断された患者を処置する方法であって、ＰＶ疾患を処置するのに有効な量のＡＳＯ－Ｔ－ＪＡＫ２化合物を前記患者に投与することを含む方法。
【請求項6】
前記ＡＳＯ－Ｔ－ＪＡＫ２化合物が、配列番号２、配列番号３、又はその両方を標的とする、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
前記ＡＳＯ－Ｔ－ＪＡＫ２化合物が、配列番号４又は配列番号５を含むヌクレオチド配列を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
前記ＡＳＯ－Ｔ－ＪＡＫ２化合物の前記量が、前記患者におけるＪＡＫ２の発現を阻害するのに十分な量である、請求項５に記載の方法。
【請求項9】
個人（individual）におけるＪＡＫ２遺伝子の発現を阻害する方法であって、前記個人におけるＪＡＫ２発現を阻害するのに有効な量のＡＳＯ－Ｔ－ＪＡＫ２化合物を前記個人に投与する工程を含む、方法。
【請求項10】
前記ＡＳＯ－Ｔ－ＪＡＫ２化合物が、配列番号２、配列番号３、又はその両方を標的とする、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
前記ＡＳＯ－Ｔ－ＪＡＫ２化合物が、配列番号４又は配列番号５を含むヌクレオチド配列を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
ＪＡＫ２をコードする核酸分子を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）。
【請求項13】
前記ＡＳＯが、配列番号２、配列番号３、又はその両方を標的とする、請求項１２に記載のＡＳＯ。
【請求項14】
前記ＡＳＯが、配列番号４及び配列番号５からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１３に記載のＡＳＯ。
【請求項15】
請求項１２に記載のＡＳＯ；及び医薬的に許容される希釈剤、担体、アジュバント、又はそれらの組み合わせ
を含む医薬組成物。
【請求項16】
滅菌非経口剤形をさらに含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項17】
シャルコー・マリー・トゥース病２型（ＣＭＴ２）と診断された患者を処置する方法であって、ＣＭＴ２疾患を処置するのに有効な量のＡＳＯ－Ｔ－ＩＧＨＭＢＰ２化合物を前記患者に投与することを含む、方法。
【請求項18】
前記患者がシャルコー・マリー・トゥース病２型Ｓ(ＣＭＴ２Ｓ）と診断されている、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
前記ＡＳＯ－Ｔ－ＩＧＨＭＢＰ２化合物が配列番号７を標的とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
前記ＡＳＯ－Ｔ－ＩＧＨＭＢＰ２化合物が、配列番号９を含むヌクレオチド配列を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項21】
前記ＡＳＯ－Ｔ－ＩＧＨＭＢＰ２化合物が、配列番号８を含むヌクレオチド配列を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項22】
前記ＡＳＯ－Ｔ－ＩＧＨＭＢＰ２化合物が、配列番号１０、配列番号１１、及び配列番号１２からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項23】
前記ＡＳＯ－Ｔ－ＩＧＨＭＢＰ２化合物が、配列番号１５内の１３～３５ヌクレオチド長のヌクレオチド配列を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項24】
ＩＧＨＭＢＰ２遺伝子のＣ３１４０１Ａ変異を有する個人（individual）における前記の変異したＩＧＨＭＢＰ２遺伝子の発現を阻害する方法であって、前記個人における変異体ＩＧＨＭＢＰ２遺伝子の発現を阻害するのに有効な量のＡＳＯ－Ｔ－ＩＧＨＭＢＰ２化合物を前記個人に投与する工程を含む、方法。
【請求項25】
前記ＡＳＯ－Ｔ－ＩＧＨＭＢＰ２化合物が配列番号７を標的とする、請求項２４に記載の方法。
【請求項26】
前記ＡＳＯ－Ｔ－ＩＧＨＭＢＰ２化合物が、配列番号９を含むヌクレオチド配列を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項27】
前記ＡＳＯ－Ｔ－ＩＧＨＭＢＰ２化合物が、配列番号８を含むヌクレオチド配列を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項28】
前記ＡＳＯ－Ｔ－ＩＧＨＭＢＰ２化合物が、配列番号１０、配列番号１１、及び配列番号１２からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項29】
前記ＡＳＯ－Ｔ－ＩＧＨＭＢＰ２化合物が、配列番号１５中の１３～３５ヌクレオチド長のヌクレオチド配列を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項30】
変異ＩＧＨＭＢＰ２遺伝子をコードする核酸分子を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）。
【請求項31】
前記ＡＳＯが配列番号７を標的とする、請求項３０に記載のＡＳＯ。
【請求項32】
配列番号９を含むヌクレオチド配列を含む、請求項３１に記載のＡＳＯ。
【請求項33】
配列番号８を含むヌクレオチド配列を含む、請求項３２に記載のＡＳＯ。
【請求項34】
配列番号１０、配列番号６１１及び配列番号１２からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項３２に記載のＡＳＯ。
【請求項35】
配列番号１５中の１３～３５ヌクレオチド長のヌクレオチド配列を含む、請求項３２に記載のＡＳＯ。
【請求項36】
請求項３０に記載のＡＳＯ；及び医薬的に許容される希釈剤、担体、アジュバント、又はそれらの組み合わせ
を含む医薬組成物。
【請求項37】
滅菌非経口剤形をさらに含む、請求項３６に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願への相互参照
本出願は２０２１年７月１５日に出願された同時係属中の米国仮特許出願第６３／２２２，３３６号及び２０２１年７月２１日に出願された米国仮特許出願第６３／２２４，３６２号の優先権を主張し、その各々は、完全に記載されているのと同様に本明細書に組み込まれる。
配列表
２０２２年６月１９日に作成され６３ｋｂを含む電子ファイル「＼ｔｘｔ＿ＶＡＮＤ－２２４－ＰＣＴ．ｘｍｌ」に含まれる配列表は、本明細書に組み込まれる。
本出願は２０２１年７月１５日に出願された同時係属中の米国仮特許出願第６３／２２２，３３６号及び２０２１年７月２１日に出願された米国仮特許出願第６３／２２４，３６２号の優先権を主張し、その各々は、完全に記載されているのと同様に本明細書に組み込まれる。
配列表
２０２２年６月１９日に作成され６３ｋｂを含む電子ファイル「＼ｔｘｔ＿ＶＡＮＤ－２２４－ＰＣＴ．ｘｍｌ」に含まれる配列表は、本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【0002】
本発明は特定の新規なアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）に関し、より詳細には、その医薬組成物、及びＡＳＯを使用してタンパク質合成を調節することが治療的価値を有しうる特定の疾患又は状態を処置するための方法に関する。より詳細には、本発明の態様は、真性赤血球増加症（ＰＶ）及び骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、ならびにシャルコー・マリー・トゥース病２型（ＣＭＴ２）疾患などの公知の障害の処置に関する。
【0003】
ＰＶは、赤血球過形成、骨髄性白血球増加症、血小板増加症、及び脾腫を特徴とする骨髄増殖性疾患である。ＰＶと診断された個人（individual）のほとんどは、ＪＡＫ２遺伝子の６１７位にバリンからフェニルアラニンへの変異（Ｖ６１７Ｆ）を有する。
【0004】
ＭＤＳは、しばしば貧血をもたらす、無効造血（ineffective hematopoiesis）を特徴とするクローン性血液幹細胞障害の一群である。ＭＤＳのいくつかの症例は、同じＪＡＫ２遺伝子のＶ６１７Ｆ突然変異、特に血小板数の増加に関連している。
【0005】
ＪＡＫ２遺伝子は、細胞増殖、発生、分化、及びヒストン修飾、ならびにサイトカイン及び増殖因子のシグナル伝達に関与する非受容体チロシンキナーゼをコードする。
【0006】
遺伝性の運動神経及び感覚神経の障害としても知られるシャルコー・マリー・トゥース病（ＣＭＴ）は、末梢神経及び筋肉制御に関与する神経に損傷を引き起こす。症状は進行性であり、しばしば足及び下肢から始まり、次いで指、手、及び腕に進む。
【0007】
ＣＭＴのほぼ全ての症例は遺伝する。４０個を超える遺伝子がＣＭＴと関連している。いくつかの遺伝子は２つ以上の形態のＣＭＴと関連し、いくつかの形態のＣＭＴは、２個以上の遺伝子と関連する。したがって、１人の個人は、２つ以上の遺伝性突然変異の結果として、２つ以上の形態のＣＭＴに罹患しうる。全ＣＭＴ症例のうち半数超は、第１７染色体上のＰＭＰ２２遺伝子の重複によって引き起こされる。その他の形態のＣＭＴは、Ｘ連鎖変異によって引き起こされる。
【0008】
ＣＭＴ２型（ＣＭＴ２）は、神経軸索に影響を及ぼすＣＭＴのあまり一般的ではないサブタイプである。ＣＭＴ２のほとんどの形態は常染色体優性パターンで遺伝するが、ＣＭＴ２Ｓ型（ＣＭＴ２Ｓ）を含むいくつかの形態は常染色体劣性パターンで遺伝する。したがって、ＣＭＴ２Ｓに付随する症状は、典型的にはＣＭＴ２の常染色体優性型よりも重症度が低い。ＣＭＴ２Ｓに関連する変異は第１１染色体上のＩＧＨＭＢＰ２（免疫グロブリンμＤＮＡ結合タンパク質２）遺伝子の変異であり、異常なＲＮＡプロセシング及び軸索ニューロパシーをもたらす。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
「アンチセンスオリゴヌクレオチド」又は「ＡＳＯ」は、ｍＲＮＡ分子を不活性化することを含む、遺伝子発現が阻害され得るような様式で、標的ＲＮＡ配列にハイブリダイズする、合成マルチヌクレオチドＲＮＡ化合物を指す。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明は、ＭＤＳと診断された患者を処置する方法であって、ＭＤＳを処置するのに有効な量のＡＳＯ－Ｔ－ＪＡＫ２化合物を前記患者に投与することを含む方法を提供する。本発明によれば、ＡＳＯ－Ｔ－ＪＡＫ２化合物は、ＪＡＫ２をコードする核酸分子を標的とする任意のアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を指す。さらに、ＭＤＳを処置するのに有効なＡＳＯ－Ｔ－ＪＡＫ２化合物の量は、患者におけるＪＡＫ２タンパク質発現を阻害するのに有効な量の化合物の投与を必要とする。
【0011】
上記のように、「ＡＳＯ－Ｔ－ＪＡＫ２」という用語は、遺伝子ＪＡＫ２をコードする核酸分子を標的とするＡＳＯを指す。「核酸分子」という用語は、ポリヌクレオチド化合物、すなわちＲＮＡへの言及である。「アンチセンスオリゴヌクレオチド」又は「ＡＳＯ」は、ｍＲＮＡ化合物を不活性化することを含む、遺伝子発現が阻害され得るような様式で、標的ＲＮＡにハイブリダイズする、合成マルチヌクレオチドＤＮＡ化合物を指す。例示的なＡＳＯ－Ｔ－ＪＡＫ２化合物を本明細書に開示する（配列番号２及び配列番号３をそれぞれ標的とする配列番号４及び配列番号５）。さらなるＡＳＯ－Ｔ－ＪＡＫ２化合物は、標的ＲＮＡ配列に特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを開発するための当技術分野で公知の方法によって、同定及び調製することができる。
【0012】
「ＡＳＯ－Ｔ－ＩＧＨＭＢＰ２」という用語は、ＩＧＨＭＢＰ２遺伝子をコードする核酸分子を標的とするＡＳＯを指す。「核酸分子」という用語は、ポリヌクレオチド化合物、すなわちＲＮＡへの言及である。例示的なＡＳＯ－Ｔ－ＩＧＨＭＢＰ２化合物を開示し、以下に詳細に記載する。さらなるＡＳＯ－Ｔ－ＩＧＨＭＢＰ２化合物は、標的ＲＮＡ配列に特異的なＡＳＯを開発するための当技術分野で公知の方法によって、同定及び調製することができる。
【0013】
上記で言及した「患者」は、疾患又は障害、特にＰＶ又はＭＤＳ又はＣＭＴ２Ｓと診断された、それに罹患している、又はそれを発症するリスクがある、又はそれに罹患している、又はそれに罹患している個人を指す。
【0014】
別の実施形態では、本発明は、ＰＶを処置するのに有効な量のＡＳＯ－Ｔ－ＪＡＫ２化合物を、ＰＶと診断された患者に投与することを含む、前記患者を処置する方法を提供する。ＰＶを処置するのに有効なＡＳＯ－Ｔ－ＪＡＫ２化合物の量は、患者におけるＪＡＫ２タンパク質発現を阻害するのに有効な量である。
【0015】
さらに別の実施形態では、本発明は、個人におけるＪＡＫ２遺伝子の発現を阻害する方法であって、かかる阻害を達成するのに有効な量のＡＳＯ－Ｔ－ＪＡＫ２化合物を個人に投与することを含む方法を提供する。
【0016】
さらに別の実施形態において、本発明は、新規なＡＳＯ－Ｔ－ＪＡＫ２化合物を提供する。上記のように、かかる化合物には配列番号４及び配列番号５のオリゴヌクレオチドが含まれるが、これらに限定されない。いったんヌクレオチド塩基配列が決定されればＡＳＯを調製する方法が、当技術分野に多数存在する。ＡＳＯがＲＮＡ結合でタンパク質発現を阻害する遺伝子の遺伝子配列を同定するためにも同様に、ＡＳＯ－Ｔ－ＪＡＫ２化合物に係る適切な塩基配列の決定が、当技術分野で公知の戦略によって達成される。
【0017】
ＡＳＯ－Ｔ－ＪＡＫ２の投与による個々の患者の処置では、用量及び投与計画を容易に決定することができる。ＡＳＯの承認された投与例は、ヌシネルセン（Ｓｐｉｎｒａｚａとして販売される）、ミポメルセン（Ｋｙｎａｍｒｏとして販売される）、ホミビルセン（Ｖｉｔｒａｖｅｎｅとして販売される）など、当業界では数多く知られている。特定の状況においては、バイオアベイラビリティ、作用期間、又は他の治療効果を最適化するために、誘導体化された又は修飾された形態のＡＳＯ－Ｔ－ＪＡＫ２を投与することが有利であり得る。このような修飾／誘導体化のための方法は、当技術分野で公知である。一般に、Drug Delivery Trends in Clinical Trails and Translational Medicine: challenges and opportunities in delivery of nucleic acid-based therapeutics、J Pharm Sci. (２０１１ １月； １００（１）： ３８－５２を参照されたい。本発明の目的のためには、ＡＳＯは静脈内投与されるが、経口投与を含む他の投与経路も可能である。かかる代替投与経路は、本明細書に記載のＡＳＯに適用可能である。
【0018】
したがって、本発明のさらなる態様は、処置対象の患者にＡＳＯ－Ｔ－ＪＡＫ２化合物を投与するために使用される医薬組成物である。これらには、薬剤の静脈内投与のために従来使用されているタイプの無菌非経口剤形が含まれる。かかる医薬組成物は、必要とされ得るエクシピエント（excipients）を含有する。これらは、完成剤形の製造のための当技術分野において公知であるように、１つ以上の希釈剤、担体、アジュバント、又はそれらの組み合わせを含みうる。
【0019】
一実施形態では、本発明は、シャルコー・マリー・トゥース病２型（ＣＭＴ２）と診断された患者を処置する方法であって、前記患者に、かかる疾患を処置するのに有効な量のＡＳＯ－Ｔ－ＩＧＨＭＢＰ２化合物を投与することを含む方法を提供する。
【0020】
別の実施形態では、本発明は、ＩＧＨＭＢＰ２遺伝子のＣ３１４０１Ａ変異を保有する個人における変異ＩＧＨＭＢＰ２遺伝子の発現を阻害する方法であって、個人における変異ＩＧＨＭＢＰ２遺伝子の発現を阻害するのに有効な量のＡＳＯ－Ｔ－ＩＧＨＭＢＰ２化合物を個人に投与することを含む方法を提供する。
【0021】
さらに別の実施形態では、本発明は、変異ＩＧＨＭＢＰ２遺伝子をコードする核酸分子を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を提供する。かかるＡＳＯは、医薬的に許容される希釈剤、担体、アジュバント、又はそれらの組み合わせと組み合わせて、医薬組成物中に含まれ得る。
【0022】
いったんＡＳＯのヌクレオチド塩基配列が決定されればそれを調製するための多くの方法が、当技術分野に存在する。ＡＳＯがＲＮＡ結合でタンパク質発現を阻害する遺伝子の遺伝子配列を同定するためにも同様に、ＡＳＯ－Ｔ－ＩＧＨＭＢＰ２化合物に係る適切な塩基配列の決定が、当技術分野で公知の戦略によって達成される。
【0023】
ＡＳＯ－ＴＩＧＨＭＢＰ２の投与による個々の患者の処置では、用量及び投与計画を容易に決定することができる。ＡＳＯの承認された投与の例は、ヌシネルセン（Ｓｐｉｎｒａｚａとして販売される）、ミポメルセン（Ｋｙｎａｍｒｏとして販売される）、ホミビルセン（Ｖｉｔｒａｖｅｎｅとして販売される）など、当業界では数多く知られている。特定の状況においては、バイオアベイラビリティ、作用期間、又は他の治療効果を最適化するために、誘導体化又は修飾形態でＡＳＯ－ＴＩＧＨＭＢＰ２を投与することが有利であり得る。このような修飾／誘導体化のための方法は、当技術分野で公知である。一般に、Drug Delivery Trends in Clinical Trails and Translational Medicine: challenges and opportunities in delivery of nucleic acid-based therapeutics、J Pharm Sci. (２０１１ １月； １００（１）： ３８－５２を参照されたい。本発明の目的のためには、ＡＳＯは静脈内投与されるが、経口投与を含む他の投与経路も可能である。かかる代替投与経路は、本明細書に記載のＡＳＯに適用可能である。
【0024】
したがって、本発明のさらなる態様は、処置対象の患者にＡＳＯ－ＴＩＧＨＭＢＰ２化合物を投与するために使用される医薬組成物である。これらには、薬剤の静脈内投与のために従来使用されているタイプの無菌非経口剤形が含まれる。かかる医薬組成物は、必要とされ得るエクシピエントを含有する。これらは、完成剤形の製造のための当技術分野において公知であるように、１つ以上の希釈剤、担体、アジュバント、又はそれらの組み合わせを含みうる。
【0025】
本発明のこれら及び他の特徴は、本発明の様々な実施形態を示す添付図面と併せて、本発明の様々な態様の以下の詳細な説明からより容易に理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0026】
【発明を実施するための形態】
【0027】
本発明は、合成ＡＳＯによる結合を受けやすいＪＡＫ２プレｍＲＮＡ（pre-mRNA）中の標的配列を提供する。そのように結合すると、ＪＡＫ２遺伝子の発現が阻害される。ＭＤＳ及びＰＶと診断された患者において、ＪＡＫ２発現のかかる阻害は、障害の有効な処置方法を提供する。
【0028】
上記のように、ＭＤＳ及びＰＶは両方とも、ＪＡＫ２タンパク質のＶ６１７Ｆ変異と関連している。野生型ＪＡＫ２タンパク質配列は、６１７位のアミノ酸がバリンである配列番号１に示される。
【0029】
本発明の一態様では、ＪＡＫ２プレｍＲＮＡ分子内の標的領域がＡＳＯと結合した場合、ＪＡＫ２タンパク質の合成を阻害することができることが同定される。この領域は１９ｂｐ配列
【0030】
【化1】
【0031】
及び、より短い１６ｂｐ配列
【0032】
【化2】
【0033】
を含む。
【0034】
相補的なＡＳＯ配列はそれぞれ
【0035】
【化3】
【0036】
及び
【0037】
【化4】
【0038】
である。
【0039】
これらの配列はそれぞれ、ＪＡＫ２プレｍＲＮＡのイントロンとエクソンとを架橋する。これらの配列を含むＡＳＯがＪＡＫ２プレｍＲＮＡに結合すると、プレｍＲＮＡの成熟ｍＲＮＡへのプロセシングが妨げられ、ＪＡＫ２タンパク質の合成が同様に妨げられる。
【0040】
ＪＡＫ２プレｍＲＮＡに結合してＪＡＫ２タンパク質合成を阻害する配列番号４及び／又は配列番号５を有するＡＳＯの有効性を試験するために、３つのヒト細胞株（ＳＥＴ－２、ＨＥＬ、ＣＭＫ）をこれらのＡＳＯのそれぞれとインキュベートし、シクロヘキシミドで処理する。４８時間インキュベートした後、処理した細胞株を回収し、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（Ｒ）（ＣＴＧ）分析及びＲＮＡ抽出に供する。細胞株及び培養培地に関するデータを以下の表１に示す。
【0041】
【表1】
【0042】
細胞を増殖期間中に回収し、Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ Ｋ２を用いて計数する。１００万個の細胞を、６ウェルプレートのそれぞれのウェルにおいて、上掲の培地中でインキュベートし、５％ＣＯ２を含む３７℃の加湿インキュベーター中でインキュベートする。
【0043】
２４時間後、培地を交換し、ＡＳＯを添加し、インキュベーションを同じ条件下でさらに２４時間続ける。次いで、シクロヘキシミドを最終濃度０．１ｍｇ／ｍＬになるように添加する。シクロヘキシミドの添加の２４時間後、培地及び細胞を１５ｍＬのコニカルチューブ中で合わせ、５０μＬの一定分量の細胞を、ＣＴＧアッセイ用の９６ウェルアッセイプレートに添加する。発光は、ＢｉｏＴｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ ｎｅｏ２ Ｍｕｌｔｉ－ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒを用いて記録する。残りの細胞を４℃で遠心して、トリゾール試薬によるＲＮＡ抽出のための細胞ペレットを収集する。
【0044】
図１は、ＳＥＴ－２細胞株についての上述のＣＴＧアッセイの結果を示す。第１列は、ＡＳＯを含まないアッセイビヒクルの結果である。平均相対発光単位（ＲＬＵ）は３，０００，０００を超える。ＲＬＵは、アッセイウェル中の生存細胞の数に比例する。
【0045】
第２列はオフターゲット対照ＡＳＯ（すなわち、ＪＡＫ２プレｍＲＮＡ又はｍＲＮＡを標的としていないＡＳＯ）が使用される場合のアッセイの結果を示す。平均ＲＬＵはビヒクルと比較して低減されるが、依然として２，５００，０００を超える。
【0046】
図１の第３列は、配列番号４又は配列番号５を含むＡＳＯを添加した場合のアッセイの結果を示す。ここで、平均ＲＬＵは２，０００，０００未満に減少し、いくつかのサンプルでは約１，５００，０００に減少する。これは、ビヒクルと比較しての、ＲＬＵの有意な減少、したがって細胞生存率の有意な減少を構成する。
【0047】
これらの結果は、ＪＡＫ２遺伝子の発現を定量するための次世代シーケンシング（ＮＧＳ）を使用するＲＮＡシーケンシングによって確認される。図２Ａ及び図２Ｂは、それぞれ、配列番号４又は配列番号５を含むＡＳＯで処理されたＳＥＴ－２細胞のアッセイウェルの蛍光（ＧＦＰ）画像及び明視野画像を示す。図３Ａ及び図３Ｂは、同じＡＳＯで処理したＨＥＬ細胞の蛍光画像及び明視野画像をそれぞれ示す。それぞれの場合において、蛍光は、未処理細胞におけるものよりも低く、配列番号４又は配列番号５を含むＡＳＯと共にインキュベートされた試料中における成熟ＪＡＫ２ ｍＲＮＡの減少を実証している。
【0048】
したがって、本発明の実施形態はＪＡＫ２の発現を阻害するために、配列番号４、配列番号５、又はその両方を含むＡＳＯを個人に投与すること；ＭＤＳ、ＰＶ、又はその両方の処置としてのかかる投与；配列番号２、配列番号３、又はその両方を標的とするＡＳＯ；配列番号４又は配列番号５を含むヌクレオチド配列を有するＡＳＯ；及び、医薬的に許容される希釈剤、担体、アジュバント、又はその組み合わせと組み合わせてかかるＡＳＯを含む組成物を含む。
【0049】
他の態様では、本発明は、合成ＡＳＯによる結合を受けやすい変異体ＩＧＨＭＢＰ２プレｍＲＮＡ中の標的配列を提供する。そのように結合すると、変異体ＩＧＨＭＢＰ２遺伝子の発現が阻害される。突然変異についてヘテロ接合性であるＣＭＴ２Ｓと診断された患者において、かかる阻害は、ＩＧＨＭＢＰ２タンパク質の「レスキュー」又は正常な機能への復帰をもたらす可能性がある。
【0050】
野生型ＩＧＨＭＢＰ２遺伝子の完全な配列を、添付の配列表に配列番号６として示す。３１４０１位のヌクレオチドはシトシンである。ＣＭＴ２Ｓに関連する変異では、このヌクレオチドはアデニンである。
【0051】
本発明の一態様では、得られる変異体ＩＧＨＭＢＰ２プレｍＲＮＡ分子内の標的領域が、ＡＳＯと結合した場合に、変異体ＩＧＨＭＢＰ２タンパク質の合成を阻害することができることが同定される。変異体ＩＧＨＭＢＰ２遺伝子内の当該領域は、Ｃ３１４０１Ａ変異を含む１９ｂｐ配列
【0052】
【化5】
【0053】
を含む。
相補的ＡＳＯ配列は
相補的ＡＳＯ配列は
【0054】
【化6】
【0055】
である。
【0056】
配列番号３を含むＡＳＯは変異体ＩＧＨＭＢＰ２プレｍＲＮＡのイントロン及びエクソンを架橋し、プレｍＲＮＡに結合すると、変異体ＩＧＨＭＢＰ２タンパク質の合成を妨げる。
【0057】
変異体ＩＧＨＭＢＰ２プレｍＲＮＡへの結合及び変異体ＩＧＨＭＢＰ２タンパク質合成の阻害における配列番号８を含むＡＳＯの有効性を試験するために、ＣＭＴ２Ｓを有する患者の線維芽細胞株を、１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ１６４０培地中で、配列番号８を含むＡＳＯと共にインキュベートし、シクロヘキシミドで処理する。４８時間のインキュベーション後、処理された細胞を回収し、ＲＮＡ抽出及びウエスタンブロット分析についてＩＧＨＭＢＰ２タンパク質発現を決定する。
【0058】
より具体的には、１００万個の細胞を、５％二酸化炭素を含む３７℃の加湿インキュベーターにおいて、上記のＲＰＭＩ１６４０培地２ｍＬ中でインキュベートする。２４時間後、培地を交換し、ＡＳＯを添加し、インキュベーションをさらに２４時間続ける。次いで、シクロヘキシミドを最終濃度０．１ｍｇ／ｍＬになるように添加する。シクロヘキシミド添加の２４時間後、培地及び細胞を１５ｍＬのコニカルチューブ中で合わせ、回転させて、トリゾール試薬によるＲＮＡ抽出のための細胞ペレットを収集する。ＲＮＡ抽出は例えば、ＱｉａｇｅｎのＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔを用いて行われる。次いで、ウエスタンブロット分析を実施して、試料中の野生型タンパク質及び変異体タンパク質の濃度を決定する。
【0059】
【0060】
【0061】
配列番号８を含むＡＳＯ以外の又は配列番号８を含むＡＳＯに加えてのＡＳＯも、本発明を実施するのに有用であり得る。本出願人は、ＡＳＯの変異体ＩＧＨＭＢＰ２プレｍＲＮＡへの結合を識別することを可能にするのに十分な特異性を有する配列の基礎を提供する、配列番号８内の「コア」１１ヌクレオチド配列を同定した。当業者が理解するように、本明細書に記載されるものなどの効率的かつ有効なＡＳＯ療法は、ＡＳＯの標的配列への結合を確実に識別するのに十分な長さを有するＡＳＯの使用を必要とする。長さが１３ヌクレオチド～３５ヌクレオチドである配列を含み、配列番号９のコア配列を含むＡＳＯが、本発明の実施形態を実施する際に使用するのに十分な長さを有するものである。
【0062】
【化7】
【0063】
したがって、配列番号４を含み、２～２４個の隣接するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を有するＡＳＯは、本発明の実施形態を実施するのに有用である。このようなヌクレオチド配列としては、例えば、配列番号１０、１１、及び配列番号１２の１３ヌクレオチド配列と同程度に短い配列が挙げられる。
【0064】
【化8】
【0065】
このようなヌクレオチド配列には、例えば、３５ヌクレオチド配列の長さのあるような配列番号１３及び配列番号１４の配列も含まれる。
【0066】
【化9】
【0067】
より一般的には、１３ヌクレオチド～３５ヌクレオチド長のヌクレオチド配列を有するＡＳＯは配列番号９のコア配列を含み、１５個もの上流ヌクレオチド及び／又は１２個もの下流ヌクレオチドを有する。ＡＳＯ「配列ウィンドウ」を配列番号１５に示す。
【0068】
【化10】
【0069】
本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに即していない限り、複数形も含むことが意図される。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び／又は「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は本明細書で使用される場合、述べられた特徴、整数、ステップ、動作、要素、及び／又は構成要素の存在を指定するが、１つ又は複数の他の特徴、整数、ステップ、動作、要素、構成要素、及び／又はそれらの群の存在又は追加を排除しないことはさらに理解されよう。
【0070】
本明細書は最良の形態を含む本発明を開示するための例を使用し、また、当業者が、任意のデバイス又はシステムを作製及び使用すること、ならびに任意の関連する又は組み込まれた方法を実行することを含む、本発明を実施することを可能にする。本発明の特許可能な範囲は、特許請求の範囲によって定義され、当業者に想起される他の例を含みうる。かかる他の例は、それらが特許請求の範囲の文言と異ならない構造要素を有する場合、又はそれらが特許請求の範囲の文言と実質的に相違しない均等の構造要素を含む場合、特許請求の範囲内にあることが意図される。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図3A】
【図3B】
【図4A】
【図4B】
【図5A】
【図5B】
【配列表】
【国際調査報告】