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特表2024-525858がんの併用療法におけるＶＥＧＦＲ２およびＴＧＦベータ１に対するｓｉＲＮＡの組成物および使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-07-12
(54)【発明の名称】がんの併用療法におけるＶＥＧＦＲ２およびＴＧＦベータ１に対するｓｉＲＮＡの組成物および使用
(51)【国際特許分類】
A61K 31/713 20060101AFI20240705BHJP
A61K 47/42 20170101ALI20240705BHJP
A61K 9/14 20060101ALI20240705BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240705BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240705BHJP
A61P 27/02 20060101ALI20240705BHJP
A61P 9/00 20060101ALI20240705BHJP
C12N 15/113 20100101ALI20240705BHJP
【ＦＩ】
A61K31/713
A61K47/42
A61K9/14
A61P43/00 121
A61P35/00
A61P27/02
A61P9/00
A61P43/00 105
C12N15/113 140Z
C12N15/113 ZNA
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024502552
(86)(22)【出願日】2022-07-18
(85)【翻訳文提出日】2024-03-08
(86)【国際出願番号】 US2022037519
(87)【国際公開番号】W WO2023288141
(87)【国際公開日】2023-01-19
(31)【優先権主張番号】202110806912.8
(32)【優先日】2021-07-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(31)【優先権主張番号】63/222,418
(32)【優先日】2021-07-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】509127310
【氏名又は名称】サーナオミクス インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110002077
【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人
(72)【発明者】
【氏名】シュ， ジョン
(72)【発明者】
【氏名】ワン， ジーユアン
(72)【発明者】
【氏名】ワン， デリン
(72)【発明者】
【氏名】ルー， パトリック
(72)【発明者】
【氏名】ジア， ワンイン
(72)【発明者】
【氏名】チャン， ジン
(72)【発明者】
【氏名】チュー， シュドン
(72)【発明者】
【氏名】チャン， ジンミン
【テーマコード（参考）】
4C076
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C076AA31
4C076CC10
4C076CC15
4C076CC27
4C076CC50
4C076EE41
4C076FF68
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA02
4C086MA04
4C086MA41
4C086NA14
4C086ZA33
4C086ZA36
4C086ZB21
4C086ZB26
4C086ZC75
(57)【要約】
本開示の技術は、哺乳動物の組織における腫瘍増殖を阻害する方法を提供する。方法は、ＴＧＦ０１タンパク質をコードするｍＲＮＡに結合するｓｉＲＮＡ分子、ＶＥＧＦＲ２タンパク質をコードするｍＲＮＡに結合するｓｉＲＮＡ分子、および薬学的に許容されるポリペプチド重合体を含む薬学的に許容される担体を含む、治療的有効量の組成物を哺乳動物に投与することを含む。本開示の技術は、この組成物を使用するためのさらなる方法も提供する。
【選択図】図１Ａ
【選択図】図１Ａ
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＶＥＧＦＲ２を標的化する第１のｓｉＲＮＡ二重鎖、ＴＧＦβ１を標的化する第２のＲＮＡ二重鎖、および薬学的に許容される担体を含む、ナノ粒子組成物。
【請求項2】
薬学的担体が、分岐状ペプチド、重合体、脂質、およびミセルからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
前記担体が、分岐状ＨＫＰポリペプチドである、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項4】
ＶＥＧＦＲ２を標的化する前記ｓｉＲＮＡが、表１に記載の配列から選択される配列を有し、ＴＧＦβ１を標的化する前記分子が、表２に記載の配列を有する、請求項１から３のいずれか一項に記載のナノ粒子組成物。
【請求項5】
ＶＥＧＦＲ２を標的化する前記ｓｉＲＮＡが、表３に記載の配列から選択される修飾配列を有し、ＴＧＦβ１を標的化する前記分子が、表５に記載の修飾配列を有する、請求項１から３のいずれか一項に記載のナノ粒子組成物。
【請求項6】
ＶＥＧＦＲ２を標的化する前記ｓｉＲＮＡが、配列番号４０または配列番号４１に記載の配列を有し、ＴＧＦβ１を標的化する前記ｓｉＲＮＡ分子が、配列番号３または配列番号６に記載の配列を有する、請求項１から４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項7】
ＨＫＰ（＋Ｈ）ポリペプチドを含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項8】
請求項１から７のいずれか一項に記載の治療的有効量の組成物を対象に投与することを含む、前記対象における疾患を処置するための方法。
【請求項9】
増殖性疾患の進行を遅らせる方法であって、そのような処置を必要とする対象に、請求項１から７のいずれか一項に記載の組成物を投与することによって増殖性疾患の進行を遅らせる、方法。
【請求項10】
増殖性疾患が、乳がん、結腸がん、膵臓がん、および異常な血管新生によって特徴付けられる疾患からなる群から選択され、異常な血管新生によって特徴付けられる前記疾患が、ＡＭＤ、糖尿病性血管障害、および臓器線維症からなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ナノ粒子担体および組成物を含有する製剤と共に、ｓｉＲＮＡ分子の組合せを含有する組成物を提供する。方法は、ポリペプチドと共に製剤中で投与される複数のｓｉＲＮＡを使用する、膵臓がん、乳がん、および前立腺がんを含むがんの処置のためにも提供される。
【背景技術】
【0002】
ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲ２シグナル伝達経路は、腫瘍組織において新血管形成を促進する
血管が栄養分送達および廃棄物処理の細胞への経路であるため、血管新生、または新血管形成は、ホメオスタシス制御ネットワークの不可欠な部分である。血管新生は、生物体発生のプロセス、傷害からの再生、ならびに多くの腫瘍発生にわたって生じる。腫瘍発生における血管新生関与の概念は、Ｉｄｅおよびその他（Ｉｄｅら，１９３９年）；Ａｌｇｉｒｅら，１９４５年）によって７０年以上前に提案され、腫瘍細胞に増殖優位性を与える「血管増殖刺激因子」によって刺激され得る腫瘍組織における新しい血管の頑強な増殖が観察された。この分野の関心は、血管新生阻害剤ががんおよび他の関連障害の処置に適用された、１９７１年のＦｏｌｋｍａｎの提案（Ｆｏｌｋｍａｎ，１９７１年）によって再燃した。
血管が栄養分送達および廃棄物処理の細胞への経路であるため、血管新生、または新血管形成は、ホメオスタシス制御ネットワークの不可欠な部分である。血管新生は、生物体発生のプロセス、傷害からの再生、ならびに多くの腫瘍発生にわたって生じる。腫瘍発生における血管新生関与の概念は、Ｉｄｅおよびその他（Ｉｄｅら，１９３９年）；Ａｌｇｉｒｅら，１９４５年）によって７０年以上前に提案され、腫瘍細胞に増殖優位性を与える「血管増殖刺激因子」によって刺激され得る腫瘍組織における新しい血管の頑強な増殖が観察された。この分野の関心は、血管新生阻害剤ががんおよび他の関連障害の処置に適用された、１９７１年のＦｏｌｋｍａｎの提案（Ｆｏｌｋｍａｎ，１９７１年）によって再燃した。
【0003】
血管新生は、正常な生理的プロセスで生じ、多くの制御因子によって正確に調節されるが、主には血管内皮由来増殖因子（ＶＥＧＦ）による。これは、ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ｂ、ＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＧＦ－Ｄ、ＶＥＧＦ－ＥおよびＶＥＧＦ－Ｆ（組織における最も優性なアイソフォームとしてＶＥＧ－Ｆ１６５）を含むタンパク質のファミリーである。ＶＥＧＦの主な標的細胞は、内皮細胞であるが、他の細胞も標的である。ＶＥＧＦは、細胞膜上のその受容体（ＶＥＧＦＲ１、ＶＳＧＦＲ２、およびＶＥＧＦＲ３）との結合を通して機能する。ＶＥＧＦ受容体は、細胞外の７つの免疫グロブリン相同性ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内制御チロシンキナーゼドメインからなる受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）であり、主に内皮細胞膜で発現される。受容体への結合後、ＶＥＧＦは、一連のシグナル伝達効果を誘発し、内皮細胞増殖、遊走および新血管形成を刺激する。
【0004】
ＶＥＧＦおよびそれらの受容体は、多くの組織におけるホメオスタシスの維持に必須であるが、それらの機能は、ＦＥＧＦ／ＶＥＧＦＲが多くの正常組織におけるホメオスタシスの維持に生理的に必須であるという事実にもかかわらず、腫瘍発生および肥厚性瘢痕形成のような病理過程において主に研究されてきた。ＶＥＧＦ産生は、正常な状況下での組織低酸素症に応答してのみ増加する。しかしながら、ほとんどのがんでは、ＶＥＧＦは過剰発現され（Ｋｅｒｂｅｌ，２００８年）；血管新生が非制御の腫瘍増殖のために増強された栄養要求を満たすように必要とされるため、腫瘍およびそれらの周辺組織内の構造的に異常な新血管新生と関連する。（Ｆｅｒｒａｒａ，２０１０年；Ｊａｉｎ，２００３年；Ｎａｇｙら，２００９年）。ＶＥＧＦ機能性の研究に由来する洞察は、ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲシグナル伝達経路を標的化する治療戦略をもたらした。例えば、ＶＥＧＦ－Ａを阻害するアバスチンは、唯一の成功した薬物である。（Ｆｅｒｒａｒａ ａｎｄ Ａｄａｍｉｓ，２０１６年；Ｊａｙｓｏｎら，２０１６年）。このヒト化モノクローナル抗体は、結腸がん、非扁平上皮非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、腎細胞癌（ＲＣＣ）、多形神経膠芽腫、卵巣がん、および子宮頸がんを含む、多くのがん治療に広く適用された。しかしながら、薬物の組合せを使用する処置が一般的になっており、現在のがん療法の標準治療を反映している。同時に標的化する複数のペプチドまたはタンパク質は、より効果的であると考えられる（Ｇｅｒｂｅｒ ａｎｄ Ｆｅｒｒａｒａ，２００５年）。前臨床試験は、ＶＥＧＦ阻害剤の細胞傷害性剤との組合せから、付加的または相乗的な利点を一貫して示した。
【0005】
ＴＧＦβは、腫瘍発生中のキープレイヤーである。
ＴＧＦβは、増殖、分化、代謝、およびアポトーシスのような基本的な生理的プロセスに関与するプレイオトロピックなサイトカインのグループである。哺乳動物を含む、多細胞生物のホメオスタシスは、ホルモンの複雑なネットワークによって維持および制御され、サイトカインＴＧＦβは、哺乳動物においてのみ存在し、中でもＴＧＦβ１が最も豊富かつ一様に発現される。報告によれば、遠位に効果を及ぼすことができるが、ＴＧＦβ１は、基本的に、主に潜在性の複合体として分泌された後に細胞外マトリックスに保存される場所で、エフェクターとして機能する（Ｃｒａｎｅ ＆ Ｃａｏ，２０１４年；Ａｎｎｅｓら，２００３年）。ＴＧＦβは、局所組織で炎症を引き起こす損傷に応答することができ、局所的な細胞外マトリックスホメオスタシスを迅速に回復するように作用することが証明されている。（Ａｎｎｅｓ，上記）。したがって、この増殖因子の経時的および空間的な活性は、ｉｎ ｖｉｖｏでのその文脈依存的な生理的効果に重要な役割を果たす。
ＴＧＦβは、増殖、分化、代謝、およびアポトーシスのような基本的な生理的プロセスに関与するプレイオトロピックなサイトカインのグループである。哺乳動物を含む、多細胞生物のホメオスタシスは、ホルモンの複雑なネットワークによって維持および制御され、サイトカインＴＧＦβは、哺乳動物においてのみ存在し、中でもＴＧＦβ１が最も豊富かつ一様に発現される。報告によれば、遠位に効果を及ぼすことができるが、ＴＧＦβ１は、基本的に、主に潜在性の複合体として分泌された後に細胞外マトリックスに保存される場所で、エフェクターとして機能する（Ｃｒａｎｅ ＆ Ｃａｏ，２０１４年；Ａｎｎｅｓら，２００３年）。ＴＧＦβは、局所組織で炎症を引き起こす損傷に応答することができ、局所的な細胞外マトリックスホメオスタシスを迅速に回復するように作用することが証明されている。（Ａｎｎｅｓ，上記）。したがって、この増殖因子の経時的および空間的な活性は、ｉｎ ｖｉｖｏでのその文脈依存的な生理的効果に重要な役割を果たす。
【0006】
３つのトランスフォーミング増殖因子β受容体（ＴＧＦβＲ）：ＴＧＦβＲ１、ＴＧＦβＲ２、およびＴＧＦβＲ３がある。（Ｂｉｅｒｉｅ ａｎｄ Ｍｏｓｅｓ，２００６年）。ＴＧＦβリガンドは、ＴＧＦβＲ受容体のヘテロ四量体複合体への結合を通して機能する。ＴＧＦＲβＲ１と２つのＴＧＦβＲ２の両方とも、セリン／トレオニンキナーゼ活性を示し、下流の成分分子、またはＳｍａｄを通したシグナル伝達に関与する（Ｗｒａｎａら，１９９４年；ｔｅｎ Ｄｉｊｋｅら １９９４年）。
【0007】
ホメオスタシスのプレイオトロピックな制御因子として、ＴＧＦβ／ＴＧＦβＲ２受容体シグナル伝達は、通常、標準のシグナル伝達経路を通して伝達され、下流の分子、Ｓｍａｄを制御する。ＴＧＦ－β／ＴβＲＩＩ受容体シグナル伝達は、マイトジェン活性化タンパク質（ＭＡＰ）キナーゼシグナル伝達経路（これらは、ＪＮＫ、ｐ３８、ＥＲＫ、およびＰＩ３Ｋ／ＡＫＴを含む（Ｉｋｕｓｈｉｍａ ａｎｄ Ｍｉｙａｚｏｎｏ，２０１０年））のメンバーも活性化し、活性化は非標準のシグナル伝達経路を通る。
【0008】
ＴＧＦβは、腫瘍発生および腫瘍進行において重要なプレーヤーとして示されており、そのタイトルでの用語「形質転換する」は、正常な線維芽細胞を、係留依存性細胞増殖の表現型から、腫瘍発生の特徴である、ソフトアガーでの係留依存性の細胞コロニーの表現型へと変換するその能力を指す（Ｋｅｓｋｉ－Ｏｊａら、１９８７年）。より最近の研究は、ＴＧＦβが、早期の前悪性増殖において細胞増殖の強力な阻害剤として（Ｒｏｂｅｒｔｓ ＆ Ｗａｋｅｆｉｅｌｄ，２００３年；Ａｄａｍら；１９９４年）、または末期の進行および転移がんにおける腫瘍細胞遊走および増殖のプロモーターとして（Ｌｕら、１９９９年）のいずれかで作用できることを示した。ＴＧＦβ増殖阻害の欠損およびＴＧＦβの発現増加は、神経膠腫および黒色腫、ならびに乳がん、胃がん、子宮内膜がん、卵巣がん、子宮頸がん、神経膠腫および黒色腫を含む、多くの組織／臓器がんにおける悪性変換および進行と関連する。腫瘍細胞における遺伝子およびエピジェネティック変異の蓄積時に、局所的に分泌されたＴＧＦβレベルの進行性増加は、侵襲および転移を促進する、免疫監視の回避、結合組織形成および血管新生の刺激、ならびに上皮間葉転換（ＥＭＴ）の刺激による腫瘍増殖を促進することが研究により示された。ＴＧＦＢシグナル伝達メカニズムにおける重大な異常も明らかにされた：結腸がん進行および薬物耐性において、ＭＥＫ－Ｅｒｋおよびｐ３８経路によるＶＥＧＦの誘導をもたらす、非標準のシグナル伝達経路の刺激（Ｐａｐａｇｅｏｒｇｉｓら，２０１１年）。
【0009】
ＴＧＦβとＶＥＧＦの両方とも、共同的にＴＭＥにおいて免疫寛容を誘導する必須のプレーヤーである
血清中のＴＧＦβのレベルの上昇は、患者の末期のがんで観察されることが多く、喪失したＴＧＦβ抑制効果への補填反応として提案された。（Ｇｏｌｄ，１９９９年）。しかしながら、ＴＧＦβの増加は、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の増殖を誘導することができた。腫瘍微小環境（ＴＭＥ）におけるＴｒｅｇは、Ｔ細胞慣性収束および枯渇を誘導し、免疫寛容を促進する（Ｆｏｎｔｅｎｏｔら，２００３年；Ｙａｍａｇｉｗａら，２００１年）。Ｎａｋａｍｕｒａらは、ＣＴ２６結腸直腸癌細胞におけるＴＧＦβの過剰発現が、免疫コンピテントＢａｌｂ／ｃマウスにおける抗腫瘍Ｔリンパ球応答を抑制することにより、腫瘍増殖を増強したことを報告した。（Ｎａｋａｍｕｒａら，２０１４年）。この期の腫瘍細胞は、非標準のシグナル伝達経路を介した不規則なシグナル活性化によるかまたはＴＧＦ－β経路の成分に体細胞突然変異を得ることにより、ＴＧＦβ媒介性抗増殖制御から逃れることができる（Ｓｅｏａｎｅ，２００６年）。例えば、ＴＧＦ－βは、ＭＣＰ－１（単球走化性タンパク質－１、ＣＣＬ－２としても公知）の分泌を増加させ、ＴＭＥに腫瘍形成性を支持する単球を積極的に動員することができる。（Ｄｉａｚ－Ｖａｌｄｅｓ，Ｎ．ら，２０１１年）。報告は、抗ＰＤ－１耐性が、ＣＣＬ－２、ＣＣＬ－７、ＣＣＬ－８、およびＣＣＬ－１３のレベルの増加と関連し得ることを示した。これらの走化性遺伝子の過剰発現は、ＴＧＦβ活性化によって制御され、ＴＧＦβが、免疫寛容の重要なエンフォーサーであり、免疫チェックポイント療法の最適な有効性を達成するために克服しなければならない障害であることが示された。（Ｈｕｇｏ，Ｗら，２０１６年）。一態様のＴＧＦβは、抑制性ＴＭＥのモデルを助け、別の態様では、インテグリンおよびＶＥＧＦならびにＭＭＰの発現、分泌および活性化も媒介し、内皮細胞の遊走を刺激し、したがって、腫瘍の新血管新生および転移性播種を促進する。（Ｐａｄｕａ ＆ Ｍａｓｓａｇｕｅ，２００９年；Ｈａｇｅｄｏｒｎら，２００１年；Ｂａｃｈｍｅｉｅｒ，２００１年．Ｐｅｒｔｏｖａａｒａら，１９９４年；Ｋａｎｇ，Ｙ．ら，２００３年；ｄｅ Ｊｏｎｇ，Ｊ．Ｓ．ら，１９９８年；Ｈａｓｅｇａｗａら，２００１年；Ｓｃｈａｄｅｎｄｏｒｆら，１９９３年；Ｔａｉ ａｎｄ Ｗａｎｇ，２０１８年）。一方、ＴＧＦβ中和抗体によるＴＧＦβシグナル伝達の阻害は、ヒト乳がんおよび前立腺がんの血管新生を抑制することができ、さらに腫瘍の間の血管新生促進因子としてのＴＧＦβの役割を評価することができる。（Ｔｕｘｈｏｒｎら、２００２年）。
血清中のＴＧＦβのレベルの上昇は、患者の末期のがんで観察されることが多く、喪失したＴＧＦβ抑制効果への補填反応として提案された。（Ｇｏｌｄ，１９９９年）。しかしながら、ＴＧＦβの増加は、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の増殖を誘導することができた。腫瘍微小環境（ＴＭＥ）におけるＴｒｅｇは、Ｔ細胞慣性収束および枯渇を誘導し、免疫寛容を促進する（Ｆｏｎｔｅｎｏｔら，２００３年；Ｙａｍａｇｉｗａら，２００１年）。Ｎａｋａｍｕｒａらは、ＣＴ２６結腸直腸癌細胞におけるＴＧＦβの過剰発現が、免疫コンピテントＢａｌｂ／ｃマウスにおける抗腫瘍Ｔリンパ球応答を抑制することにより、腫瘍増殖を増強したことを報告した。（Ｎａｋａｍｕｒａら，２０１４年）。この期の腫瘍細胞は、非標準のシグナル伝達経路を介した不規則なシグナル活性化によるかまたはＴＧＦ－β経路の成分に体細胞突然変異を得ることにより、ＴＧＦβ媒介性抗増殖制御から逃れることができる（Ｓｅｏａｎｅ，２００６年）。例えば、ＴＧＦ－βは、ＭＣＰ－１（単球走化性タンパク質－１、ＣＣＬ－２としても公知）の分泌を増加させ、ＴＭＥに腫瘍形成性を支持する単球を積極的に動員することができる。（Ｄｉａｚ－Ｖａｌｄｅｓ，Ｎ．ら，２０１１年）。報告は、抗ＰＤ－１耐性が、ＣＣＬ－２、ＣＣＬ－７、ＣＣＬ－８、およびＣＣＬ－１３のレベルの増加と関連し得ることを示した。これらの走化性遺伝子の過剰発現は、ＴＧＦβ活性化によって制御され、ＴＧＦβが、免疫寛容の重要なエンフォーサーであり、免疫チェックポイント療法の最適な有効性を達成するために克服しなければならない障害であることが示された。（Ｈｕｇｏ，Ｗら，２０１６年）。一態様のＴＧＦβは、抑制性ＴＭＥのモデルを助け、別の態様では、インテグリンおよびＶＥＧＦならびにＭＭＰの発現、分泌および活性化も媒介し、内皮細胞の遊走を刺激し、したがって、腫瘍の新血管新生および転移性播種を促進する。（Ｐａｄｕａ ＆ Ｍａｓｓａｇｕｅ，２００９年；Ｈａｇｅｄｏｒｎら，２００１年；Ｂａｃｈｍｅｉｅｒ，２００１年．Ｐｅｒｔｏｖａａｒａら，１９９４年；Ｋａｎｇ，Ｙ．ら，２００３年；ｄｅ Ｊｏｎｇ，Ｊ．Ｓ．ら，１９９８年；Ｈａｓｅｇａｗａら，２００１年；Ｓｃｈａｄｅｎｄｏｒｆら，１９９３年；Ｔａｉ ａｎｄ Ｗａｎｇ，２０１８年）。一方、ＴＧＦβ中和抗体によるＴＧＦβシグナル伝達の阻害は、ヒト乳がんおよび前立腺がんの血管新生を抑制することができ、さらに腫瘍の間の血管新生促進因子としてのＴＧＦβの役割を評価することができる。（Ｔｕｘｈｏｒｎら、２００２年）。
【0010】
特異的ｓｉ ＲＮＡによるＶＥＧＦおよびＴＧＦβの二重標的化阻害は腫瘍増殖を阻止することができる
ホメオスタシスは、互いの機能性を補填するように相互作用する、シグナル経路のさらにより複雑なネットワークによって制御および調節されることが研究により示された。しかしながら、細胞におけるこれらのシームレスに介入した協力は、単一薬物療法の困難な障害を引き起こす。例えば、プレイオトロピックなサイトカインＴＧＦβが、Ｓｍａｄ依存性の標準群、またはＭＡＰＫ分子による非標準のシグナル伝達経路でシグナル伝達を実行することができる。
ホメオスタシスは、互いの機能性を補填するように相互作用する、シグナル経路のさらにより複雑なネットワークによって制御および調節されることが研究により示された。しかしながら、細胞におけるこれらのシームレスに介入した協力は、単一薬物療法の困難な障害を引き起こす。例えば、プレイオトロピックなサイトカインＴＧＦβが、Ｓｍａｄ依存性の標準群、またはＭＡＰＫ分子による非標準のシグナル伝達経路でシグナル伝達を実行することができる。
【0011】
さらに、ますます、より侵襲性および浸潤性の腫瘍の出現をもたらし得る血管新生を防止または弱めることを意図した処置のデータが示された。（Ｂｅｒｇｅｒｓら，２００８年）。近年の報告は、抗血管新生療法に対する腫瘍耐性の発生が根底にあるいくつかのメカニズムを提供する。例えば、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）では、両経路がＮＳＣＬＣで活性であり、互いに補填できるため、ＶＥＧＦを標的化する治療手法はＶＥＧＦＲ標的化療法と対にされるかまたはその逆であるべきである。臨床試験は、ＮＳＣＬＣ患者に二重ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲ阻害の適用を実施した。（Ｋｏｈら、２０１０年）。
【0012】
ＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）は、ｍＲＮＡ発現の生理的制御メカニズムである。それは、標的ｍＲＮＡ分子の発現を減少させるメカニズム、配列特異的な、転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）である。ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）は、１３～２５塩基対（ｂｐ）長の二本鎖ＲＮＡ分子の短い断片である。ｓｉＲＮＡ二重鎖のアンチセンス鎖は、ｍＲＮＡ分子（標的ｍＲＮＡ）の特定の領域に対合し、その翻訳を防止することができる。細胞内では、細胞室内で、アンチセンス鎖が、ＲＮＡ干渉サイレンシング複合体、またはＲＩＳＣと呼ばれるタンパク質粒子へと押し込まれ、次いで標的ｍＲＮＡとアニールするであろう。その後、ＲＩＳＣの酵素成分はｍＲＮＡ分子を切断し、ｍＲＮＡ分解プロセスを開始する。外因的な合成ｓｉＲＮＡの導入は、研究室および臨床実験での特定の遺伝子の調節に有効な方法であることが分かっている。
【0013】
同時二重標的化は、小分子からモノクローナル抗体および核酸（アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）およびｓｉＲＮＡを含む）の範囲の異なる薬物カテゴリーにわたる薬物によって実施され得る。合成ｓｉＲＮＡは類似の化学特性を共有し、それらを投与しやすくするためにユニークに有利にし；異なる遺伝子を標的化するｓｉＲＮＡは同じ製剤内で投与され得る。
【0014】
抗ＴＧＦＢ／ＴＧＦＢＲ２を他のＩＯ標的化剤と対合する戦略は支持を得ている。Ｂｉｎｔｒａｆｕｓｐ ａｌｆａは、両経路を同時にブロックし、ＴＭＥにおける免疫寛容を減少させることによって設計された抗ＰＤ－Ｌ１／ＴＧＦＢＲ２融合コンストラクトである（Ｈａｎｎｅ Ｌｉｎｄら，２０２０年）。Ｂｉｎｔｒａｆｕｓｐ ａｌｆａは、腫瘍細胞がＴＦＧＢ誘導性ＥＭＴを受けるのを防ぎ、それらを他の治療により感受性にし（Ｄａｖｉｄ，２０１７年）、ＮＫおよびＴ細胞をＴＭＥに動員し、腫瘍細胞に対するそれらの細胞傷害性能を増強する（Ｂａｔｌｌｅ ａｎｄ Ｍａｓｓａｇｕｅ，２０１９年）。最終的に、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）によりヒト腫瘍細胞の溶解の増強を媒介することが示された（Ｇｒｅｎｇａ，２０１８年）。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【図1A】ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞株における候補２１ｍｅｒのＶＥＧＦＲ２ ｓｉＲＮＡ配列の予備的なスクリーニング結果を示す図である。
【図1B】ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞株における候補２５ｍｅｒのＶＥＧＦＲ２ ｓｉＲＮＡ配列の予備的なスクリーニング結果を示す図である。
【図2A】Ｕ８７ＭＧ細胞株における候補ＶＥＧＦＲ２ ｓｉＲＮＡ配列の最初のスクリーニング結果を示す図である。
【図2B】Ｕ８７ＭＧ細胞株における候補ＶＥＧＦＲ２ ｓｉＲＮＡ配列の最初のスクリーニング結果を示す図である。
【図3】ＤＬＤ－１細胞株における候補ＴＧＦ－β１ ｓｉＲＮＡ配列の予備的なスクリーニング結果を示す図である。
【図4】ＲＫＯ細胞株における候補ＴＧＦ－β１ ｓｉＲＮＡ配列の予備的なスクリーニング結果を示す図である。
【図5】Ｕ８７ＭＧ細胞株における候補ＴＧＦ－β１ ｓｉＲＮＡ配列の予備的なスクリーニング結果を示す図である。
【図6】ＰＡＮＣ－１細胞株における候補ＴＧＦ－β１ ｓｉＲＮＡ配列の予備的なスクリーニング結果を示す図である。
【図7A】ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞株におけるＶＥＧＦＲ２ ｓｉＲＮＡ修飾前後の候補配列のＥＣ５０曲線の比較を示す図である。
【図7B】ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞株におけるＶＥＧＦＲ２ ｓｉＲＮＡ修飾前後の候補配列のＥＣ５０曲線の比較を示す図である。
【図8A】Ｕ８７ＭＧ細胞株におけるＶＥＧＦＲ２ ｓｉＲＮＡ修飾前後の候補配列のＥＣ５０曲線の比較を示す図である。
【図8B】Ｕ８７ＭＧ細胞株におけるＶＥＧＦＲ２ ｓｉＲＮＡ修飾前後の候補配列のＥＣ５０曲線の比較を示す図である。
【図9A】ＰＡＮＣ－１細胞株におけるＶＥＧＦＲ２ ｓｉＲＮＡ修飾前後の候補配列のＥＣ５０曲線の比較を示す図である。
【図9B】ＰＡＮＣ－１細胞株におけるＶＥＧＦＲ２ ｓｉＲＮＡ修飾前後の候補配列のＥＣ５０曲線の比較を示す図である。
【図10A】異なる細胞株（Ｕ８７ＭＧ）におけるＴＧＦ－β１ ｓｉＲＮＡ修飾前後の候補配列のＥＣ５０曲線の比較を示す図である。
【図10B】異なる細胞株（ＰＡＮＣ－１）におけるＴＧＦ－β１ ｓｉＲＮＡ修飾前後の候補配列のＥＣ５０曲線の比較を示す図である。
【図10C】異なる細胞株（ＲＫＯ）におけるＴＧＦ－β１ ｓｉＲＮＡ修飾前後の候補配列のＥＣ５０曲線の比較を示す図である。
【図10D】異なる細胞株（ＢｘＰＣ３）におけるＴＧＦ－β１ ｓｉＲＮＡ修飾前後の候補配列のＥＣ５０曲線の比較を示す図である。
【図11A】異なる細胞株（ＳＫ－Ｈｅｐ－１）におけるＴＧＦ－β１ ｓｉＲＮＡ修飾前後の候補配列のＥＣ５０曲線の比較を示す図である。
【図11B】異なる細胞株（ＨＵＣＣＴ）におけるＴＧＦ－β１ ｓｉＲＮＡ修飾前後の候補配列のＥＣ５０曲線の比較を示す図である。
【図11C】異なる細胞株（Ａ５４９）におけるＴＧＦ－β１ ｓｉＲＮＡ修飾前後の候補配列のＥＣ５０曲線の比較を示す図である。
【図11D】異なる細胞株（ＤＬＤ－１）におけるＴＧＦ－β１ ｓｉＲＮＡ修飾前後の候補配列のＥＣ５０曲線の比較を示す図である。
【図12A】組成物中のＶＥＧＦＲ２およびＴＧＦ－β１のｓｉＲＮＡ分子の質量比の比較を示す図である。
【図12B】組成物中のＶＥＧＦＲ２およびＴＧＦ－β１のｓｉＲＮＡ分子の質量比の比較を示す図である。
【図13A】マウス膵臓がん（ＰＡＮＣ－１）異種移植モデルにおけるＳＴＰ３５５のｉｎ ｖｉｖｏ薬力学を示す図である。
【図13B】マウス膵臓がん（ＰＡＮＣ－１）異種移植モデルにおけるＳＴＰ３５５のｉｎ ｖｉｖｏ薬力学を示す図である。
【図13C】マウス膵臓がん（ＰＡＮＣ－１）異種移植モデルにおけるＳＴＰ３５５のｉｎ ｖｉｖｏ薬力学を示す図である。
【図14A】乳がん（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１）異種移植腫瘍マウスモデルにおけるＳＴＰ３５５のｉｎ ｖｉｖｏ薬力学を示す図である。
【図14B】乳がん（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１）異種移植腫瘍マウスモデルにおけるＳＴＰ３５５のｉｎ ｖｉｖｏ薬力学を示す図である。
【図15A】免疫コンピテントマウスモデルにおけるヒト化ＰＤＬ１遺伝子座結腸直腸がん腫瘍（ＭＣ３８－ｈＰＤＬ１）へのＳＴＰ３５５のｉｎ ｖｉｖｏ薬力学を示す図である。
【図15B】免疫コンピテントマウスモデルにおけるヒト化ＰＤＬ１遺伝子座結腸直腸がん腫瘍（ＭＣ３８－ｈＰＤＬ１）へのＳＴＰ３５５のｉｎ ｖｉｖｏ薬力学を示す図である。
【図15C】免疫コンピテントマウスモデルにおけるヒト化ＰＤＬ１遺伝子座結腸直腸がん腫瘍（ＭＣ３８－ｈＰＤＬ１）へのＳＴＰ３５５のｉｎ ｖｉｖｏ薬力学を示す図である。
【図16A】免疫コンピテントマウスモデルにおける黒色腫（Ｂ１６）へのＳＴＰ３５５のｉｎ ｖｉｖｏ薬力学を示す図である。
【図16B】免疫コンピテントマウスモデルにおける黒色腫（Ｂ１６）へのＳＴＰ３５５のｉｎ ｖｉｖｏ薬力学を示す図である。
【図16C】免疫コンピテントマウスモデルにおける黒色腫（Ｂ１６）へのＳＴＰ３５５のｉｎ ｖｉｖｏ薬力学を示す図である。
【図16D】免疫コンピテントマウスモデルにおける黒色腫（Ｂ１６）へのＳＴＰ３５５のｉｎ ｖｉｖｏ薬力学を示す図である。
【図17A】マウス乳がん（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１）異種移植モデルにおける組合せ薬物および単一薬物の薬力学比較試験を示す図である。
【図17B】マウス乳がん（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１）異種移植モデルにおける組合せ薬物および単一薬物の薬力学比較試験を示す図である。
【図17C】マウス乳がん（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１）異種移植モデルにおける組合せ薬物および単一薬物の薬力学比較試験を示す図である。
【図18】マウス膵臓がん（ＰＡＮＣ－１）異種移植モデルにおける組合せ薬物および修飾薬物のｉｎ ｖｉｖｏ薬力学比較を示す図である。
【図19】Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおける修飾および非修飾薬物の安定性の比較を示す図である。
【図20】ＴＧＦβ１の染色を含む、組織学試験を示す図である。結果は、ＴＧＦβ１標的発現が、モデルのコントロール群と比較して両方の薬物投与群で顕著に減少したことを示した。
【図21】アポトーシスをもたらす新血管新生の阻害が生じたかどうか評価するＣＤ３１またはＴＵＮＥＬ染色を示す図である。血管新生と関連する標的、ＣＤ３１の発現も、モデルのコントロール群と比較して両方の薬物投与群で顕著に減少した。また、アポトーシス細胞の数の増加も両処置群において観察された。
【図22】ＴＵＮＥＬによって検出されたように、細胞アポトーシスを実証する染色を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0016】
哺乳動物細胞においてＴＧＦβ１タンパク質をコードするｍＲＮＡに結合する第１のｓｉＲＮＡ分子；哺乳動物細胞においてＶＥＧＦタンパク質をコードするｍＲＮＡに結合する第２のｓｉＲＮＡ分子；および薬学的に許容されるポリペプチドを含む薬学的に許容される担体を含有する組成物が提供される。処置のための組成物を使用する方法も提供される。有利には、担体はヒスチジン－リジン共重合体である。組成物は、ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲおよび／またはＴＧＦβ経路に含まれる少なくとも２つの異なるｍＲＮＡ分子の発現を標的化および減少する。
【0017】
一実施形態では、方法は、上記のように治療的有効量の組成物を哺乳動物に投与することにより、哺乳動物の細胞における免疫寛容促進因子および血管新生促進因子を二重に下方制御するために提供される。別の実施形態では、方法は、腫瘍組織に治療的有効量の組成物を投与することにより、哺乳動物の腫瘍組織においてアポトーシスを誘導するために提供される。さらに別の実施形態では、方法は、哺乳動物の組織における腫瘍のサイズを減少させるために提供され、腫瘍組織に治療的有効量の組成物を投与することを含む。さらに別の実施形態では、方法は、哺乳動物の組織における腫瘍のサイズを減少させるために提供され、腫瘍組織に治療的有効量の組成物および治療用モノクローナル抗体を同時投与することを含む。
【0018】
組成物中のｓｉＲＮＡ分子について、以下に記載の配列は、二本鎖ＲＮＡ分子のセンス鎖である。二本鎖ＲＮＡ分子は、平滑末端であるか、または１または２塩基のオーバーハングを有してもよい。有利には、１つまたは両方の鎖は、３’末端に１つまたは２つのデオキシリボヌクレオチド残基を有してもよい。当業者は、ｓｉＲＮＡ分子が、その相補性配列との二重鎖の一部としてセンス鎖（示した）を含有することを理解するであろう。例えば、配列番号ＸのｓｉＲＮＡ分子への本明細書での参照は、センス鎖（配列番号Ｘ）および相当するアンチセンス鎖によって形成された二重鎖を指すと理解されるであろう。
【0019】
本明細書で使用する場合、遺伝子を「サイレンシングすること」は、その遺伝子のタンパク質産物の濃度が少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％もしくはそれ以上減少されるように、その遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の濃度を減少させることを意味する。有利には、遺伝子をサイレンシングすることは、標的ｍＲＮＡの濃度を、所望の臨床効果、例えば腫瘍の縮小または除去が達成される程度まで減少させる。
【0020】
ｓｉＲＮＡ分子は、特定の分子の組成物および構造に応じて、細胞における付加的または相乗的な効果を産生し得る。好ましい実施形態では、それらは相乗的な効果を産生する。
【0021】
本明細書で使用する場合、「ｓｉＲＮＡ分子」は、標的細胞への投与および導入後に、細胞における遺伝子の発現と干渉する、短い、二本鎖ポリヌクレオチドである、二重鎖オリゴヌクレオチドである。例えば、ｓｉＲＮＡは、ｍＲＮＡまたはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）のような、一本鎖（ｓｓ）標的ＲＮＡ分子の少なくとも部分的に相補的なヌクレオチド配列を標的化および結合することができる。標的ｍＲＮＡまたはｍｉＲＮＡは、次いで細胞によって分解される。
【0022】
ｓｉＲＮＡ分子は、当業者に公知の技術を使用して調製され得る。そのような技術の例は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５８９８０３１号、同第６１０７０９４号、同第６５０６５５９号、同第７０５６７０４号ならびに欧州特許第１２１４９４５号および同第１２３０３７５号に記載される。当分野の慣例により、ｓｉＲＮＡ分子が特定のヌクレオチド配列によって同定される場合、配列は二重鎖（二本鎖）分子のセンス鎖を指す。
【0023】
ｓｉＲＮＡ分子は、天然に存在するリボヌクレオチド、すなわち、生細胞で見出されるものから作成され得るか、またはそのヌクレオチドの１つもしくは複数が、以下にさらに記載されるように、当技術分野で公知の技術によって化学的に修飾され得る。その個々のヌクレオチドの１つまたは複数のレベルで修飾されることに加えて、オリゴヌクレオチドの骨格は、例えば、１つまたは複数のホスホジエステル分子をホスホロチオエート結合によって置き換えることにより、修飾されてもよい。さらなる修飾は、ｓｉＲＮＡ分子上でのコンジュゲーションのための小分子（例えば、Ｎ－アセチルガラクトサミンのような糖分子）、アミノ酸分子、ペプチド、コレステロール、および他の大分子の使用を含む。
【0024】
一実施形態では、分子は、約１９～約３４塩基対の長さを有するオリゴヌクレオチドである。本実施形態の一態様では、分子は、約１９～約２７塩基対の長さを有するオリゴヌクレオチドである。別の態様では、分子は、約２１～約２５塩基対の長さを有するオリゴヌクレオチドである。分子は、両末端に平滑末端、またはそれぞれの末端に突出末端（オーバーラップ鎖）、二重鎖の１つの末端に平滑末端および二重鎖の他の末端に突出末端を有してもよい。有利には、１つまたは両方の鎖は、３’末端に１つまたは２つのデオキシリボヌクレオチド残基、例えば、ｄＴ残基を有してもよい。
【0025】
本明細書に記載の組成物では、相対量の２つの異なる分子および共重合体が変わり得る。一部の実施形態では、２つの異なるｓｉＲＮＡ分子の比は、質量で約１：１である。他の実施形態では、２つの異なるｓｉＲＮＡ分子の比は、質量で約１：１であってもよく、共重合体に対するこれらの分子の比は、質量で約１：２．５であってもよい。選択した比率により、組成物は、直径が約４０～４００ｎｍのサイズの範囲を有するナノ粒子を形成し得る。
【0026】
一実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子は、表１および２で同定されるものから選択される。例は、ｈｍＴＦ－２１－ｈｍ３＃およびｈｍＶＲ２－２１－ｈ１＃と名付けられた対であり、以下の配列を有する：
ＴＧＦ－β１－２１－ｈｍ３＃ 配列番号１３：
センス鎖 ５‘－ＡＡＣＵＡＵＵＧＣＵＵＣＡＧＣＵＣＣＡｄＴｄＴ－３’、
アンチセンス ５‘－ＵＧＧＡＧＣＵＧＡＡＧＣＡＡＵＡＧＵＵｄＴｄＴ－３’、および
ＶＥＧＦＲ２－２１－ｈ１＃＃ 配列番号４０：
センス鎖、５’－ＧＣＣＵＡＧＵＧＵＵＵＣＵＣＵＵＧＡＵｄＴｄＴ－３’、
アンチセンス、５’－ＡＵＣＡＡＧＡＧＡＡＡＣＡＣＵＡＧＧＣｄＴｄＴ－３’。
ＴＧＦ－β１－２１－ｈｍ３＃ 配列番号１３：
センス鎖 ５‘－ＡＡＣＵＡＵＵＧＣＵＵＣＡＧＣＵＣＣＡｄＴｄＴ－３’、
アンチセンス ５‘－ＵＧＧＡＧＣＵＧＡＡＧＣＡＡＵＡＧＵＵｄＴｄＴ－３’、および
ＶＥＧＦＲ２－２１－ｈ１＃＃ 配列番号４０：
センス鎖、５’－ＧＣＣＵＡＧＵＧＵＵＵＣＵＣＵＵＧＡＵｄＴｄＴ－３’、
アンチセンス、５’－ＡＵＣＡＡＧＡＧＡＡＡＣＡＣＵＡＧＧＣｄＴｄＴ－３’。
【0027】
これらのｓｉＲＮＡ分子のそれぞれでは、センス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかの１つまたは複数のヌクレオチドは、修飾されたヌクレオチドであり得る。修飾されたヌクレオチドは、安定性を改善し、ｓｉＲＮＡによる免疫刺激を減少することができる。修飾されたヌクレオチドは、例えば、２’－Ｏ－メチル、２’－メトキシエトキシ、２’－フルオロ、２’－アリル、２’－Ｏ－［２－（メチルアミノ）－２－オキソエチル］、４’－チオ、４’－ＣＨ２－Ｏ－２’－架橋、４’－（ＣＨ２）２－Ｏ－２’－架橋、２‘－ＬＮＡ、２’－アミノまたは２’－０－－（Ｎ－メチルカルバメート）リボヌクレオチドであり得る。他の好適な修飾が当技術分野で公知である。
【0028】
さらに、リボヌクレオチド間の１つまたは複数のホスホジエステル結合は、修飾され、ヌクレアーゼ消化に対する耐性を改善することができる。好適な修飾は、ホスホロチオエートおよび／またはホスホロジチオエート修飾結合の使用を含む。
【0029】
ＶＥＧＦＲ２およびＴＧＦβ１を標的化するｓｉＲＮＡを含有するナノ粒子の形成
上記を含有するｓｉＲＮＡ分子は、有利には、対象への投与のためのナノ粒子に製剤化される。ナノ粒子形成の様々な方法が、当技術分野で周知である。例えば、Ｂａｂｕら，ＩＥＥＥ Ｔｒａｎｓ Ｎａｎｏｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，１５：８４９～８６３頁（２０１６年）を参照。
上記を含有するｓｉＲＮＡ分子は、有利には、対象への投与のためのナノ粒子に製剤化される。ナノ粒子形成の様々な方法が、当技術分野で周知である。例えば、Ｂａｂｕら，ＩＥＥＥ Ｔｒａｎｓ Ｎａｎｏｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，１５：８４９～８６３頁（２０１６年）を参照。
【0030】
有利には、ナノ粒子は、１つまたは複数のヒスチジン／リジン（ＨＫＰ）共重合体を使用して形成される。好適なＨＫＰ共重合体は、ＷＯ／２００１／０４７４９６、ＷＯ／２００３／０９０７１９、およびＷＯ／２００６／０６０１８２に記載され、そのそれぞれの内容は、その全体が本明細書に組み込まれる。好適なＨＫＰ重合体の例は、Ｈ３Ｋ４ｂ（単位［ＫＨ３］４Ｋを含有する）およびＨ３Ｋ４ｂ（＋Ｈ）（単位ＫＨ３ＫＨ４［ＫＨ３］２Ｋを含有する）を含む。Ｈ３Ｋ４ｂとＨ３Ｋ４ｂ（＋Ｈ）は両方とも、３つのリジン残基の骨格を有し、リジン側鎖ε－アミノ基およびＮ末端は、［ＫＨ３］４Ｋ）またはＨ３Ｋ４ｂ（＋Ｈ）単位のＣ末端に結合される。分岐状ＨＫＰ担体は、例えば、固相ペプチド合成を含む、当技術分野で周知の方法によって合成され得る。
【0031】
ナノ粒子を形成する方法は、当技術分野で周知である。Ｂａｂｕら、上記。有利には、ナノ粒子は、マイクロ流体ミキサーシステムを使用して形成されてもよく、ＶＥＧＦＲ２を標的化するｓｉＲＮＡおよびＴＧＦβ１を標的化するｓｉＲＮＡは、一定の流速で１つまたは複数のＨＫＰ重合体と混合される。流速は、産生されたナノ粒子のサイズを変えるために変えられ得る。ＨＫＰ共重合体は、有利には、典型的には直径～＜１００～４００ｎｍのｓｉＲＮＡ分子を含有するナノ粒子を形成する。
【0032】
したがって、例えば、ＶＥＧＦＲ２を標的化するｓｉＲＮＡおよびＴＧＦβ１を標的化するｓｉＲＮＡは、ＰＮＩマイクロ流体ミキサーシステム（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｎａｎｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＣＡ）を使用して、ＨＫＰ（＋Ｈ）と、０．５ｍｇ／ｍｌで混合した。全流量（ＴＦＲ）は変えられ、この流速の粒子サイズへの影響は、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｎａｎｏｓｉｚｅｒ ｓｙｓｔｅｍ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｉｎｃ．，Ｗｅｓｔｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ）を使用して、生じる粒子サイズを測定することにより評価した。多分散指数（ＰＤＩ）は、およそ平均サイズのナノ粒子の変化の量の指標である。
【0033】
一実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子は、表１および２で同定されるものから選択される。代表的な例は、ｈｍＴＦ－２１－ｈｍ３＃およびｈｍＶＲ２－２１－ｈ２＃と名付けられた対であり、以下の配列を有する：
ＴＧＦ－β１－２１－ｈｍ３＃ 配列番号１３：
センス鎖、５‘－ＡＡＣＵＡＵＵＧＣＵＵＣＡＧＣＵＣＣＡｄＴｄＴ－３’、
アンチセンス、５‘－ＵＧＧＡＧＣＵＧＡＡＧＣＡＡＵＡＧＵＵｄＴｄＴ－３’、および
ＶＥＧＦＲ２－２１－ｈ２＃配列番号４１：
センス鎖、５’－ＧＧＵＣＣＡＵＵＵＣＡＡＡＵＣＵＣＡＡｄＴｄＴ－３’、
アンチセンス、５’－ＵＵＧＡＧＡＵＵＵＧＡＡＡＵＧＧＡＣＣｄＴｄＴ－３’。
ＴＧＦ－β１－２１－ｈｍ３＃ 配列番号１３：
センス鎖、５‘－ＡＡＣＵＡＵＵＧＣＵＵＣＡＧＣＵＣＣＡｄＴｄＴ－３’、
アンチセンス、５‘－ＵＧＧＡＧＣＵＧＡＡＧＣＡＡＵＡＧＵＵｄＴｄＴ－３’、および
ＶＥＧＦＲ２－２１－ｈ２＃配列番号４１：
センス鎖、５’－ＧＧＵＣＣＡＵＵＵＣＡＡＡＵＣＵＣＡＡｄＴｄＴ－３’、
アンチセンス、５’－ＵＵＧＡＧＡＵＵＵＧＡＡＡＵＧＧＡＣＣｄＴｄＴ－３’。
【0034】
別の例は、ｈｍＴＦ－２１－ｈｍ６＃およびｈｍＶＲ２－２１－ｈ１＃と名付けられた対であり、以下の配列を有する：
ＴＧＦ－β１－２１－ｈｍ６＃ 配列番号１６：
センス鎖、５‘－ＣＧＧＣＡＧＣＵＧＵＡＣＡＵＵＧＡＣＵｄＴｄＴ－３’、
アンチセンス、５‘－ＡＧＵＣＡＡＵＧＵＡＣＡＧＣＵＧＣＣＧｄＴｄＴ－３’、および
ＶＥＧＦＲ２－２１－ｈ１＃ 配列番号４０：
センス鎖、５’－ＧＣＣＵＡＧＵＧＵＵＵＣＵＣＵＵＧＡＵｄＴｄＴ－３’
アンチセンス、５’－ＡＵＣＡＡＧＡＧＡＡＡＣＡＣＵＡＧＧＣｄＴｄＴ－３’。
ＴＧＦ－β１－２１－ｈｍ６＃ 配列番号１６：
センス鎖、５‘－ＣＧＧＣＡＧＣＵＧＵＡＣＡＵＵＧＡＣＵｄＴｄＴ－３’、
アンチセンス、５‘－ＡＧＵＣＡＡＵＧＵＡＣＡＧＣＵＧＣＣＧｄＴｄＴ－３’、および
ＶＥＧＦＲ２－２１－ｈ１＃ 配列番号４０：
センス鎖、５’－ＧＣＣＵＡＧＵＧＵＵＵＣＵＣＵＵＧＡＵｄＴｄＴ－３’
アンチセンス、５’－ＡＵＣＡＡＧＡＧＡＡＡＣＡＣＵＡＧＧＣｄＴｄＴ－３’。
【0035】
さらに別の例では、ｓｉＲＮＡ分子は、ｈｍＴＦ－２１－ｈｍ６＃およびｈｍＶＲ２－２１－ｈ２＃と名付けられた対であり、以下の配列を有する：
ＴＧＦ－β１－２１－ｈｍ６＃ 配列番号１６：
センス鎖、５’－ＣＧＧＣＡＧＣＵＧＵＡＣＡＵＵＧＡＣＵｄＴｄＴ－３’、
アンチセンス、５’－ＡＧＵＣＡＡＵＧＵＡＣＡＧＣＵＧＣＣＧｄＴｄＴ－３’、および
ＶＥＧＦＲ２－２１－ｈ２＃ 配列番号４１：
センス鎖、５’－ＧＧＵＣＣＡＵＵＵＣＡＡＡＵＣＵＣＡＡｄＴｄＴ－３’
アンチセンス、５’－ＵＵＧＡＧＡＵＵＵＧＡＡＡＵＧＧＡＣＣｄＴｄＴ－３’。
ＴＧＦ－β１－２１－ｈｍ６＃ 配列番号１６：
センス鎖、５’－ＣＧＧＣＡＧＣＵＧＵＡＣＡＵＵＧＡＣＵｄＴｄＴ－３’、
アンチセンス、５’－ＡＧＵＣＡＡＵＧＵＡＣＡＧＣＵＧＣＣＧｄＴｄＴ－３’、および
ＶＥＧＦＲ２－２１－ｈ２＃ 配列番号４１：
センス鎖、５’－ＧＧＵＣＣＡＵＵＵＣＡＡＡＵＣＵＣＡＡｄＴｄＴ－３’
アンチセンス、５’－ＵＵＧＡＧＡＵＵＵＧＡＡＡＵＧＧＡＣＣｄＴｄＴ－３’。
【0036】
好適なｓｉＲＮＡ分子は、以下の工程を含む方法を使用して同定され得る所望の活性を有する：（ａ）標的ｍＲＮＡ分子の相補的ヌクレオチド配列を標的化するように設計されたｓｉＲＮＡ分子のコレクションを作成し、ｓｉＲＮＡ分子の標的化鎖がヌクレオチドの様々な配列を含むこと；（ｂ）一次スクリーニング（図１Ａ～１Ｂ）およびＥＣ５０アッセイ（図７～９）を含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏで標的ｍＲＮＡ分子に対する最高の所望の効果を示すｓｉＲＮＡ分子を選択すること；（ｃ）動物腫瘍モデルにおいて選択したｓｉＲＮＡ分子を評価すること（図１３～１５）；ならびに（ｄ）それらのサイレンシング活性および治療効果のため、モデルにおいて最高の有効性を示すｓｉＲＮＡ分子を選択すること。
【0037】
一実施形態では、候補ｓｉＲＮＡの評価のための動物モデルは、ヌードマウスの異種移植モデルである。別の実施形態では、動物疾患モデルは、免疫コンピテントＣ５７ＢＬ／Ｂ６マウスモデルである（図５）。別の実施形態では、方法は、薬学的に許容される担体を工程（ｃ）によって選択されたそれぞれのｓｉＲＮＡ分子に添加し、薬学的組成物を形成する工程および動物腫瘍モデル（複数可）におけるそれぞれの薬学的組成物を評価する工程を含む。
【0038】
ｓｉＲＮＡ配列は、各二重鎖が、少なくとも、ヒトとマウスの両方、またはヒトと非ヒト霊長類の同じ遺伝子を標的化および阻害することができるように調製され得る（表１および２）。一態様では、ｓｉＲＮＡ分子は、ヒトｍＲＮＡ分子および相同マウスｍＲＮＡ分子の両方に結合する。すなわち、ヒトおよびマウスｍＲＮＡ分子は、構造または機能が実質的に同じであるタンパク質をコードする。したがって、マウス疾患モデルにおいて観察された有効性および毒性反応は、ヒトにおいて起こるであろうことを予測する。マウスモデルにおいて試験したｓｉＲＮＡ分子は、ヒトで使用するための薬剤の良い候補であると考えられる。
【0039】
一実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子は表１で同定されたものから選択され、哺乳動物細胞または組織においてＴＧＦβ１ ｍＲＮＡおよびＶＥＧＦＲ２ ｍＲＮＡに同時に結合し、それらの分解を誘導することができる。
【0040】
ｓｉＲＮＡ分子は、薬学的に許容される担体と組み合わされ、哺乳動物への投与のための薬学的組成物を提供する。この実施形態の一態様では、哺乳動物は実験動物であり、イヌ、ネコ、ブタ、非ヒト霊長類、および齧歯類、例えばマウス、ラット、およびギニアピッグを含む。別の態様では、哺乳動物はヒトである。
【0041】
担体は、ｓｉＲＮＡ分子を含有するナノ粒子を形成するヒスチジン－リジン共重合体である。この実施形態の一態様では、担体は、ヒスチジン、リジン、またはアスパラギンの複数の反復を含有する４つまたは３つの分岐を有するリジン骨格またはＲＣＯＯＨ足場を有する、ＨＫＰ種、ＨＫＰシリーズのＨ３Ｋ４ｂ、Ｈ３Ｋ（＋Ｈ）４ｂおよびＨＫ－ＲＣＯＯＨからなる群から選択される。ＨＫＰの水溶液が、質量で２．５：１のＮ／Ｐ比でｓｉＲＮＡと混合された場合、ナノ粒子（直径４０～４００ｎｍの平均サイズ）は自己アセンブルされた。別の態様では、ＨＫＰは、式：（Ｒ）Ｋ（Ｒ）－Ｋ（Ｒ）－（Ｒ）Ｋ（Ｘ）、［式中Ｒ＝ＫＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＫ、またはＲ＝ＫＨＨＨＫＨＨＨＮＨＨＨＮＨＨＨＮ、Ｘ＝Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、Ｋ＝リジン、Ｈ＝ヒスチジン、およびＮ＝アスパラギン］を有し得る。別の態様では、ＨＫＰは、式：（Ｒ）Ｋ（Ｒ）－Ｋ（Ｒ）－（Ｒ）Ｋ（Ｘ）、［式中Ｒ＝ＫＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＫ、またはＲ＝ＫＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＨＫＨＨＨＫ、Ｘ＝Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、Ｋ＝リジン、Ｈ＝ヒスチジン］を有し得る。さらに別の態様では、ＨＫＰは、式：（Ｒ）－Ｌｙｓ（Ｒ）－Ｌｙｓ（Ｒ）－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ａｒｇ－ＣＯＯＨ、［式中Ｒ＝ＫＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＫ］を有し得る。さらに別の態様では、ＨＫＰは、式：（Ｒ）－Ｌｙｓ（Ｒ）－Ｌｙｓ（Ｒ）－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ａｒｇ－ＣＯＯＩＩ、［式中Ｒ＝ＫＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＫ］を有し得る。
【0042】
本明細書に記載の組成物は、（図５Ａ～５Ｄ、組織学的染色）に示すように、哺乳動物の組織の細胞においてＴＧＦ－β１／ＭＡＰＫシグナル伝達およびＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲ２シグナル伝達経路を同時に下方制御するために有用である。一部の実施形態では、投与は、腫瘍組織へであり得る。他の実施形態では、組成物は、皮下注射によって投与される。さらに他の実施形態では、それは静脈内または腹腔内に投与される。一部の実施形態では、哺乳動物はヒトである。治療的有効量の組成物は、ＨＫＰ－ｓｉＲＮＡの製剤中で哺乳動物の組織に投与される。腫瘍増殖は、腫瘍における新血管新生の減少によって阻害された（図１６および２０～２２、ＣＤ３１染色）。
【0043】
ｓｉＲＮＡ分子の有効性の決定
特定の標的ＶＥＧＦＲ２およびＴＧＦβ１ ＲＮＡ配列、ならびに送達されるナノ粒子組成物の用量により、ＶＥＧＦＲ２およびＴＧＦβ１ ＲＮＡの機能の部分的または完全な欠損が観察され得る。少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％もしくはそれ以上の標的細胞において、ＲＮＡレベルまたは発現（ＶＥＧＦＲ２＿およびＴＧＦβ１ ＲＮＡ発現またはコードされたポリペプチド発現のいずれか）の減少または欠損が例示的である。ＶＥＧＦＲ２およびＴＧＦβ１ ＲＮＡレベルまたは発現の阻害は、ＶＥＧＦＲ２およびＴＧＦβ１ ＲＮＡまたはＶＥＧＦＲ２およびＴＧＦβ１ ＲＮＡコードタンパク質のレベルの不在（または観察可能な減少）を指す。特異性は、細胞の他の遺伝子への明確な効果なく、ＶＥＧＦＲ２およびＴＧＦβ１ ＲＮＡを阻害する能力を指す。阻害の結果は、細胞もしくは生物体の外見上の特性の検査により、またはＲＮＡ溶液ハイブリダイゼーション、ヌクレアーゼ保護、ノーザンハイブリダイゼーション、逆転写、マイクロアレイによる遺伝子発現モニタリング、抗体結合、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロッティング、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、他のイムノアッセイ、および蛍光活性化細胞解析（ＦＡＣＳ）のような生化学技術により確かめることができる。本発明のｄｓＲＮＡ剤による標的ＶＥＧＦＲ２およびＴＧＦβ１ ＲＮＡ配列（複数可）の阻害も、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏのいずれかで、ＶＥＧＦＲ２およびＴＧＦβ１関連疾患または障害、例えば腫瘍形成、増殖、転位等の発生／進行時に、そのようなｄｓＲＮＡ剤の投与の効果に基づいて測定され得る。腫瘍またはがん細胞レベルの処置および／または減少は、腫瘍またはがん細胞レベルの増殖の停止もしくは減少、または例えば１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％またはそれ以上の減少を含んでもよく、対数項で測定されてもよく、例えばがん細胞レベルの１０倍、１００倍、１０００倍、１０５倍、１０６倍、または１０７倍の減少が、細胞、組織、または対象へのナノ粒子組成物の投与によって達成することができる。対象は、哺乳動物、例えばヒトであってもよい。
特定の標的ＶＥＧＦＲ２およびＴＧＦβ１ ＲＮＡ配列、ならびに送達されるナノ粒子組成物の用量により、ＶＥＧＦＲ２およびＴＧＦβ１ ＲＮＡの機能の部分的または完全な欠損が観察され得る。少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％もしくはそれ以上の標的細胞において、ＲＮＡレベルまたは発現（ＶＥＧＦＲ２＿およびＴＧＦβ１ ＲＮＡ発現またはコードされたポリペプチド発現のいずれか）の減少または欠損が例示的である。ＶＥＧＦＲ２およびＴＧＦβ１ ＲＮＡレベルまたは発現の阻害は、ＶＥＧＦＲ２およびＴＧＦβ１ ＲＮＡまたはＶＥＧＦＲ２およびＴＧＦβ１ ＲＮＡコードタンパク質のレベルの不在（または観察可能な減少）を指す。特異性は、細胞の他の遺伝子への明確な効果なく、ＶＥＧＦＲ２およびＴＧＦβ１ ＲＮＡを阻害する能力を指す。阻害の結果は、細胞もしくは生物体の外見上の特性の検査により、またはＲＮＡ溶液ハイブリダイゼーション、ヌクレアーゼ保護、ノーザンハイブリダイゼーション、逆転写、マイクロアレイによる遺伝子発現モニタリング、抗体結合、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロッティング、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、他のイムノアッセイ、および蛍光活性化細胞解析（ＦＡＣＳ）のような生化学技術により確かめることができる。本発明のｄｓＲＮＡ剤による標的ＶＥＧＦＲ２およびＴＧＦβ１ ＲＮＡ配列（複数可）の阻害も、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏのいずれかで、ＶＥＧＦＲ２およびＴＧＦβ１関連疾患または障害、例えば腫瘍形成、増殖、転位等の発生／進行時に、そのようなｄｓＲＮＡ剤の投与の効果に基づいて測定され得る。腫瘍またはがん細胞レベルの処置および／または減少は、腫瘍またはがん細胞レベルの増殖の停止もしくは減少、または例えば１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％またはそれ以上の減少を含んでもよく、対数項で測定されてもよく、例えばがん細胞レベルの１０倍、１００倍、１０００倍、１０５倍、１０６倍、または１０７倍の減少が、細胞、組織、または対象へのナノ粒子組成物の投与によって達成することができる。対象は、哺乳動物、例えばヒトであってもよい。
【0044】
薬学的組成物および投与の方法
ナノ粒子組成物は、当技術分野で周知の方法を使用して、薬学的組成物としてさらに製剤化されてもよい。組成物は、投与のその意図した経路と適合性であるように製剤化されてもよい。投与の経路の例は、非経口、例えば静脈内、皮内、皮下、経口（例えば、吸入）、経皮（局所）、経粘膜、および直腸投与を含む。非経口、皮内、または皮下適用のために使用した溶液または懸濁液は、以下の成分：滅菌希釈剤、例えば注射用水、食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒；抗菌剤、例えばベンジルアルコールまたはメチルパラベン；抗酸化剤、例えばアスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウム；キレート剤、例えばエチレンジアミン四酢酸；バッファー、例えば酢酸、シトレートまたはホスフェートおよび浸透圧の調整のための薬剤、例えば塩化ナトリウムまたはデキストロースを含み得る。ｐＨは、酸または塩基、例えば塩酸または水酸化ナトリウムによって調整することができる。非経口製剤は、アンプル、使い捨て注射器またはガラスもしくはプラスチック製の多人数用バイアルに封入され得る。
ナノ粒子組成物は、当技術分野で周知の方法を使用して、薬学的組成物としてさらに製剤化されてもよい。組成物は、投与のその意図した経路と適合性であるように製剤化されてもよい。投与の経路の例は、非経口、例えば静脈内、皮内、皮下、経口（例えば、吸入）、経皮（局所）、経粘膜、および直腸投与を含む。非経口、皮内、または皮下適用のために使用した溶液または懸濁液は、以下の成分：滅菌希釈剤、例えば注射用水、食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒；抗菌剤、例えばベンジルアルコールまたはメチルパラベン；抗酸化剤、例えばアスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウム；キレート剤、例えばエチレンジアミン四酢酸；バッファー、例えば酢酸、シトレートまたはホスフェートおよび浸透圧の調整のための薬剤、例えば塩化ナトリウムまたはデキストロースを含み得る。ｐＨは、酸または塩基、例えば塩酸または水酸化ナトリウムによって調整することができる。非経口製剤は、アンプル、使い捨て注射器またはガラスもしくはプラスチック製の多人数用バイアルに封入され得る。
【0045】
注射用の使用に好適な薬学的組成物は、滅菌水溶液（水溶性）または分散体および滅菌注射用溶液または分散体の即時調製のための滅菌粉末を含む。静脈内投与のため、好適な担体は、生理的食塩水、静菌性水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（登録商標）（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，Ｎ．Ｊ．）またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含む。いずれの場合においても、組成物は滅菌でなければならず、容易な注入性が存在する程度に流動的であるべきである。これは、製造および保存の条件下で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の夾雑作用に対して保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール等）、ならびにそれらの好適な混合物を含有する溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性が、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散体の場合には要求される粒子サイズの維持により、および界面活性剤の使用により維持され得る。微生物の作用の防止は、種々の抗菌および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等によって達成され得る。多くの場合、組成物中に、等張剤、例えば、糖、マンニトール、トレハロース、ソルビトールなどのポリアルコール、塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射用組成物の長期の吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えば、アルミニウムモノステアレートおよびゼラチンを組成物に含むことによってもたらされ得る。
【0046】
滅菌注射用溶液は、必要量の活性化合物を、選択した溶媒中に、上記で列挙される成分の１つまたは組合せと共に組み込み、必要な場合、続いて濾過滅菌することによって調製され得る。一般的に、分散体は、活性化合物を、基本分散媒および上記で列挙した成分から必要とされる他の成分を含む滅菌ビヒクル中へ組み込むことによって調製される。滅菌注射用溶液の調製のための滅菌粉末の場合、調製の好ましい方法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、これにより活性成分プラス先に滅菌濾過したそれらの溶液からの任意のさらなる所望の成分の粉末を得る。
【0047】
組成物はまた、身体からの迅速な排出に対して化合物を保護する担体を用いて調製されてもよく、制御された放出製剤など、移植およびマイクロカプセル化された送達系を含む。酢酸エチレンビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸のような、生分解性、生体適合性重合体が使用され得る。そのような製剤は、標準的な技術を使用して調製され得る。材料は、Ａｌｚａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｎｏｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から商業的に得ることもできる。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体により、感染細胞へ標的化されたリポソームを含む）は、薬学的に許容される担体としても使用され得る。これらは、例えば、米国特許第４５２２８１１号に記載の、当業者に公知の方法に従って調製され得る。
【0048】
投与量および毒性の決定
組成物の毒性および治療有効性は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％を死に至らせる用量）およびＥＤ５０（集団の５０％に治療的に有効な用量）を決定することにより、細胞培養物または実験動物での標準的な製剤手順によって決定され得る。毒性と治療効果の間の用量比は、治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として表すことができる。化合物は、有利には、高い治療指数を示す。
組成物の毒性および治療有効性は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％を死に至らせる用量）およびＥＤ５０（集団の５０％に治療的に有効な用量）を決定することにより、細胞培養物または実験動物での標準的な製剤手順によって決定され得る。毒性と治療効果の間の用量比は、治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として表すことができる。化合物は、有利には、高い治療指数を示す。
【0049】
細胞培養物アッセイおよび動物実験からのデータは、ヒトでの使用のための投与量の範囲の製剤化において使用され得る。組成物の投与量は、有利には、わずかな毒性のまたは毒性のない、ＥＤ５０を含む、循環濃度の範囲内である。投与量は、用いられた投与形態および利用された投与の経路に応じて、この範囲内で変わり得る。本明細書に記載の組成物については、治療的有効量は、初めに細胞培養アッセイから推定され得る。用量は、細胞培養物で決定されたＩＣ５０（すなわち、症状の半数阻害を達成する組成物の濃度）を含む、循環血漿濃度範囲を達成するように動物モデルにおいて製剤化され得る。そのような情報は、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定するために使用され得る。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定されてもよい。
【0050】
本明細書で使用する場合、薬理的または治療的有効量は、意図した薬理的治療または予防結果を産生するために有効なｓｉＲＮＡ組成物の量を指す。語句「薬理的有効量」および「治療的有効量」または「有効量」は、意図した薬理的治療または予防結果を産生するために有効な組成物の量を指す。例えば、所与の臨床処置が有効であると考えられる場合、疾患または障害と関連する測定可能なパラメーターの少なくとも３０％の減少があり、疾患または障害の処置のための治療的有効量の薬物は、そのパラメーターの少なくとも３０％減少させるのに必要な量である。
【0051】
本明細書に記載の組成物の治療的有効量は、およそ１ｐｇ～１０００ｍｇの範囲であり得る。例えば、１０、３０、１００、もしくは１０００ｐｇ、または１０、３０、１００、もしくは１０００ｎｇ、または１０、３０、１００、もしくは１０００μｇ、または１０、３０、１００、もしくは１０００ｍｇ、または１～５ｇの組成物が投与され得る。一般に、本明細書に記載の組成物の好適な投与単位は、１日あたりレシピエントのｋｇ体重あたり０．００１～０．２５ｍｇの範囲、または１日あたりｋｇ体重あたり０．０１～２０μｇの範囲、または１日あたりｋｇ体重あたり０．００１～５μｇの範囲、または１日あたりｋｇ体重あたり１～５００ｎｇの範囲、または１日あたりｋｇ体重あたり０．０１～１０μｇの範囲、または１日あたりｋｇ体重あたり０．１０～５μｇの範囲、または１日あたりｋｇ体重あたり０．１～２．５μｇの範囲である。薬学的組成物は、１日１回、または１日を通して適切な間隔で投与される２回、３回、４回、５回、６回またはそれ以上の分割用量を含有する投与単位で投与されてもよい。その場合、各分割用量に含有されるｄｓＲＮＡは、１日の総投与単位を達成するために相応して少なくなければならない。投与単位は、例えば、数日間にわたり、ｄｓＲＮＡの持続および一定放出を提供する従来の持続放出製剤を使用して、数日間にわたる単回用量のために配合されてもよい。持続放出製剤は、当技術分野で周知である。この実施形態では、投与単位は、相応する複数の一日用量を含有する。製剤にかかわらず、薬学的組成物は、処置される動物またはヒトにおける標的遺伝子の発現を阻害するのに十分な量のｄｓＲＮＡを含有しなければならない。組成物は、複数の単位のｄｓＲＮＡの合計が合わせて十分な用量を含有するような方法で配合され得る。
【0052】
組成物は、１回、１日あたり１回または複数回から週あたり１回または複数回投与されてもよく、１日おきに１回を含む。当業者は、限定はされないが疾患または障害の重症度、事前の処置、健康全般および／または対象の年齢、ならびに他の疾患の存在を含む、特定の因子が対象を効果的に処置するのに必要な投与量およびタイミングに影響し得ることを理解する。さらに、本明細書に記載の治療的有効量の組成物による対象の処置は、単回処置を含んでもよく、または有利には、一連の処置を含み得る。
【0053】
本明細書に記載の好適に製剤化された薬学的組成物は、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、経皮、気道（エアロゾル）、直腸、経膣および局所（頬側および舌下を含む）投与を含む、非経口経路によるなど、当技術分野で公知の手段によって投与されてもよい。有利には、薬学的組成物は、静脈内または非経口点滴または注射によって投与される。
【0054】
処置
本明細書に記載の組成物は、ＶＥＧＦＲ２およびＴＧＦβ１の発現、および特に変更された発現によって特徴付けられる、がんのような増殖性疾患を処置するために使用され得る。例示的ながんは、肝臓がん（例えば、肝細胞癌またはＨＣＣ）、肺がん（例えば、ＮＳＣＬＣ）、結腸直腸がん、前立腺がん、膵臓がん、卵巣がん、子宮頸がん、脳がん（例えば、膠芽細胞腫）、腎がん（例えば、乳頭腎細胞癌）、胃がん、食道がん、髄芽腫、甲状腺癌、横紋筋肉腫、骨肉腫、扁平上皮癌（例えば、口腔扁平上皮癌）、黒色腫、乳がん、および造血障害（例えば、白血病およびリンパ腫、ならびに他の免疫細胞関連障害）を含む。他のがんは、膀胱がん、子宮頸部（子宮）がん、子宮内膜（子宮）がん、頭頸部がん、および口腔咽頭がんを含む。有利には、がんは、頭頸部がん、膀胱がん、膵臓がん、胆管細胞癌、肺がん（ＮＳＣＬＣおよびＳＣＬＣ）、結腸がん、膠芽細胞腫、乳がん、胃腺癌、前立腺がん、卵巣癌、子宮頸がん、ＡＭＬ、ＡＬＬ、骨髄腫または非ホジキンリンパ腫である。
本明細書に記載の組成物は、ＶＥＧＦＲ２およびＴＧＦβ１の発現、および特に変更された発現によって特徴付けられる、がんのような増殖性疾患を処置するために使用され得る。例示的ながんは、肝臓がん（例えば、肝細胞癌またはＨＣＣ）、肺がん（例えば、ＮＳＣＬＣ）、結腸直腸がん、前立腺がん、膵臓がん、卵巣がん、子宮頸がん、脳がん（例えば、膠芽細胞腫）、腎がん（例えば、乳頭腎細胞癌）、胃がん、食道がん、髄芽腫、甲状腺癌、横紋筋肉腫、骨肉腫、扁平上皮癌（例えば、口腔扁平上皮癌）、黒色腫、乳がん、および造血障害（例えば、白血病およびリンパ腫、ならびに他の免疫細胞関連障害）を含む。他のがんは、膀胱がん、子宮頸部（子宮）がん、子宮内膜（子宮）がん、頭頸部がん、および口腔咽頭がんを含む。有利には、がんは、頭頸部がん、膀胱がん、膵臓がん、胆管細胞癌、肺がん（ＮＳＣＬＣおよびＳＣＬＣ）、結腸がん、膠芽細胞腫、乳がん、胃腺癌、前立腺がん、卵巣癌、子宮頸がん、ＡＭＬ、ＡＬＬ、骨髄腫または非ホジキンリンパ腫である。
【0055】
組成物は、上記のように投与されてもよく、有利には、全身的にまたは腫瘍内に送達されてもよい。組成物は、単剤療法として、すなわち別の処置なく投与されてもよく、または１つもしくは複数のさらなる医薬を含む組合せレジメンの一部として投与されてもよい。有利には、組合せレジメンの一部として使用される場合、有効量の少なくとも１つのさらなる化学療法薬を含む。化学療法薬は、例えば、プラチナ含有薬物、例えばシスプラチン、オキサロプラチン、またはカルボプラチンであってもよい。
【実施例】
【0056】
実施例１．ヒトおよびマウスＴＧＦ－β１ ｍＲＮＡに特異的な低分子核酸の選択
所有のコンピューターベースのアルゴリズムに基づき、本発明者らは、以下の特性を有するＴＧＦ－β１の低分子核酸（表１）を設計した：（ａ）最適な熱力学的特性；（ｂ）ＲＩＳＣへの結合の増強；（ｃ）免疫除去活性化ドメイン；（ｄ）ヒトまたはヒト－マウス相同性；（ｅ）所有の知的財産権による配列検索；（ｆ）「オフターゲット効果」を避けるためのｂｌａｓｔ使用；および（ｇ）複数の配列がカクテル内で混合される場合、相互作用しない。各遺伝子の最も強力な低分子核酸は、Ｑ ＲＴ－ＰＣＲ（ＭｉｉＱ，Ｂｉｏ Ｒａｄ）アッセイによって選択された。
所有のコンピューターベースのアルゴリズムに基づき、本発明者らは、以下の特性を有するＴＧＦ－β１の低分子核酸（表１）を設計した：（ａ）最適な熱力学的特性；（ｂ）ＲＩＳＣへの結合の増強；（ｃ）免疫除去活性化ドメイン；（ｄ）ヒトまたはヒト－マウス相同性；（ｅ）所有の知的財産権による配列検索；（ｆ）「オフターゲット効果」を避けるためのｂｌａｓｔ使用；および（ｇ）複数の配列がカクテル内で混合される場合、相互作用しない。各遺伝子の最も強力な低分子核酸は、Ｑ ＲＴ－ＰＣＲ（ＭｉｉＱ，Ｂｉｏ Ｒａｄ）アッセイによって選択された。
【0057】
実施例２．ヒトおよびマウスＶＥＧＦＲ２ ｍＲＮＡに特異的な低分子核酸の選択
所有のコンピューターベースのアルゴリズムに基づき、本発明者らは、以下の特性を有するＶＥＧＦＲ２の低分子核酸（表２）を設計した：ａ．最適な熱力学的特性；ｂ．ＲＩＳＣへの結合の増強；ｃ．免疫活性化構造ドメインの除去；ｄ．ヒトまたはヒト－マウス相同性を有する；ｅ．所有の知的財産による配列検索；ｆ．「オフターゲット効果」を避けるためのｂｌａｓｔ使用；ｇ．カクテル内で混合される場合、複数の配列が相互作用しない。各遺伝子の最も強力な低分子核酸は、Ｑ ＲＴ－ＰＣＲ（ＭｉｉＱ，Ｂｉｏ Ｒａｄ）アッセイによって選択された。
所有のコンピューターベースのアルゴリズムに基づき、本発明者らは、以下の特性を有するＶＥＧＦＲ２の低分子核酸（表２）を設計した：ａ．最適な熱力学的特性；ｂ．ＲＩＳＣへの結合の増強；ｃ．免疫活性化構造ドメインの除去；ｄ．ヒトまたはヒト－マウス相同性を有する；ｅ．所有の知的財産による配列検索；ｆ．「オフターゲット効果」を避けるためのｂｌａｓｔ使用；ｇ．カクテル内で混合される場合、複数の配列が相互作用しない。各遺伝子の最も強力な低分子核酸は、Ｑ ＲＴ－ＰＣＲ（ＭｉｉＱ，Ｂｉｏ Ｒａｄ）アッセイによって選択された。
【0058】
実施例３：２５ヌクレオチド（２５ｍｅｒ）および２１ヌクレオチド（２１ｍｅｒ）の長さを有する低分子核酸のｉｎ ｖｉｔｒｏ効果の予備的なスクリーニング（細胞レベルで、検出標的はＶＥＧＦＲ２）
最も有効な低分子核酸をスクリーニングするために使用した細胞株は、標的遺伝子を発現することができるものであるべきである。この実施例では、ヒトＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞（図１）およびヒトＵ８７細胞（図２）を使用して、ＶＥＧＦＲ２特異的低分子核酸をスクリーニングした。
最も有効な低分子核酸をスクリーニングするために使用した細胞株は、標的遺伝子を発現することができるものであるべきである。この実施例では、ヒトＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞（図１）およびヒトＵ８７細胞（図２）を使用して、ＶＥＧＦＲ２特異的低分子核酸をスクリーニングした。
【0059】
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１およびＵ８７細胞を２４ウェル細胞プレートに播種し（細胞１×１０５個／ウェル）、次いでｓｉＲＮＡ（２１ｍｅｒまたは２５ｍｅｒまたはネガティブコントロール）を市販のトランスフェクション試薬（ｌｉｐｏ２０００）によってトランスフェクトし、ｓｉＲＮＡトランスフェクション濃度は１００ｎＭであった。一方、未処置の細胞は、ブランクコントロールとして設定した。全ＲＮＡは、トランスフェクションの２４時間後に細胞から抽出した。逆転写は、キットを使用して実施し、製造業者の取扱説明書に従ってｃＤＮＡを得た。標的遺伝子ＶＥＧＦＲ２ ｍＲＮＡ発現の相対レベルは、リアルタイムＰＣＲによって決定し、ハウスキーピング遺伝子βアクチンに対してノーマライズした。遺伝子ノックダウンの有効性は、ブランクコントロールのパーセンテージとして表した。結果は、図１および２に示す。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１およびＵ８７－ＭＧ細胞における予備的なスクリーニングの結果に基づき、７５％またはそれ以上のノックダウン効果を有する配列を、続くＥＣ５０データ検出および解析のために選択した。ＶＥＧＦＲ２－２１－ｈ１＃、ＶＥＧＦＲ２－２１－ｈ２＃、ＶＥＧＦＲ２－２１－ｈ５＃、ＶＥＧＦＲ２－２１－ｈ７＃、ＶＥＧＦＲ２－２１－ｈｍ１７＃、ＶＥＧＦＲ２－２１－ｈｍ１８＃、ＶＥＧＦＲ２－２５－ｈ３＃、およびＶＥＧＦＲ２－２５－ｈ４＃を選択し、表３に示したように修飾した（配列番号１０９～１２４）。
【0060】
実施例４．２１ヌクレオチドの長さを有する低分子核酸のｉｎ ｖｉｔｒｏ効果の予備的なスクリーニング（細胞レベルで、検出標的はＴＧＦβ１）
最も有効な低分子核酸をスクリーニングするために使用した細胞株は、標的遺伝子を発現することができるものであるべきである。この実施例では、ヒトＤＬＤ－１細胞（図３）、ヒトＲＫＯ細胞（図４）、ヒトＵ８７－ＭＧ細胞（図５）およびヒトＰＡＮＣ－１細胞（図６）を使用して、ＴＧＦ－β１特異的細胞低分子核酸をスクリーニングした。
最も有効な低分子核酸をスクリーニングするために使用した細胞株は、標的遺伝子を発現することができるものであるべきである。この実施例では、ヒトＤＬＤ－１細胞（図３）、ヒトＲＫＯ細胞（図４）、ヒトＵ８７－ＭＧ細胞（図５）およびヒトＰＡＮＣ－１細胞（図６）を使用して、ＴＧＦ－β１特異的細胞低分子核酸をスクリーニングした。
【0061】
ＤＬＤ－１、ＲＫＯ、Ｕ８７－ＭＧおよびＰＡＮＣ－１細胞を２４ウェル細胞プレートに播種し（細胞１×１０５個／ウェル）、次いでｓｉＲＮＡ（２１ｍｅｒまたはネガティブコントロール）を市販のトランスフェクション試薬（ｌｉｐｏ２０００）によってトランスフェクトした。ｓｉＲＮＡトランスフェクション濃度は１００ｎＭであった。未処置の細胞は、ブランクコントロールとして設定した。全ＲＮＡは、トランスフェクションの２４時間後に細胞から抽出した。逆転写は、キットを使用して実施し、製造業者の取扱説明書に従ってｃＤＮＡを得た。標的遺伝子ＴＧＦ－β１ ｍＲＮＡ発現の相対レベルは、リアルタイムＰＣＲによって決定し、ハウスキーピング遺伝子βアクチンに対してノーマライズした。遺伝子ノックダウンの有効性は、ブランクコントロールのパーセンテージとして表した。結果は、図３～６に示す。ＤＬＤ－１、ＲＫＯ、Ｕ８７－ＭＧおよびＰＡＮＣ－１細胞における予備的なスクリーニングの結果に基づき、７５％またはそれ以上のノックダウン効果を有する配列は、続くＥＣ５０データ検出および解析のために選択した。したがって、ＴＦ１－２１－ｈｍ３＃およびＴＦＩ－２１－ｈｍ６＃を候補配列として選択し、これら２つの配列を修飾した（修飾配列については表４を参照）。
【0062】
実施例５．２５ヌクレオチドおよび２１ヌクレオチドのｓｉＲＮＡ配列の修飾前後のデータ比較（細胞レベルで、検出標的はＶＥＧＦＲ２）
異なる細胞（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、Ｕ８７－ＭＧおよびＰＡＮＣ－１）における修飾前後の候補配列のＥＣ５０を比較した。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＰＡＮＣ－１およびＵ８７－ＭＧ細胞を２４ウェル細胞プレートに播種し（細胞１×１０５個／ウェル）、ｓｉＲＮＡ候補（修飾または非修飾）を異なる細胞に複数の濃度勾配でトランスフェクトした。初代スクリーニングと同じ手順を使用した。最終的に、データは、ソフトウェアＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ８を使用してプロットし、ＥＣ５０値を計算した。
異なる細胞（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、Ｕ８７－ＭＧおよびＰＡＮＣ－１）における修飾前後の候補配列のＥＣ５０を比較した。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＰＡＮＣ－１およびＵ８７－ＭＧ細胞を２４ウェル細胞プレートに播種し（細胞１×１０５個／ウェル）、ｓｉＲＮＡ候補（修飾または非修飾）を異なる細胞に複数の濃度勾配でトランスフェクトした。初代スクリーニングと同じ手順を使用した。最終的に、データは、ソフトウェアＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ８を使用してプロットし、ＥＣ５０値を計算した。
【0063】
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の修飾前後の候補配列のＥＣ５０曲線の比較結果を図７に示す；Ｕ８７－ＭＧ細胞の修飾前後の候補配列のＥＣ５０曲線の比較結果を図８に示す；ＰＡＮＣ－１細胞の修飾前後の候補配列のＥＣ５０曲線の比較結果を図９に示す。表５に要約したデータは、各配列（修飾前後）がＰＡＮＣ－１およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１において低いＥＣ５０値を示し、より顕著なノックダウン効果を示しており、配列ＶＥＧＦＲ２－２１－ｈ５＃、ＶＥＧＦＲ２－２１－ｈ１７＃、ＶＥＧＦＲ２－２１－ｈ１＃、ＶＥＧＦＲ２－２１－ｈ２＃およびＶＥＧＦＲ２－２１－ｈｍ１８＃は非修飾のものよりもよく；Ｕ８７－ＭＧにおける修飾前後の候補ＶＥＧＦＲ２配列のＥＣ５０値は高く、ノックダウン効果は顕著ではなく、図２のＵ８７－ＭＧにおける初代スクリーニング結果と一致するが、修飾前後のノックダウン効果の傾向は、ＰＡＮＣ－１およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１と類似しており、結果は一致したことを示す。
【0064】
実施例６．２１ヌクレオチドのｓｉＲＮＡ配列の修飾前後のデータ比較（細胞レベルで、検出標的はＴＧＦ－β１）
異なる細胞（Ｕ８７－ＭＧ、ＤＬＤ－１、ＳＫ－Ｈｅｐ－１、ＢｘＰＣ３、Ａ５４９、ＨＵＣＣＴ、ＰＡＮＣ－１およびＲＫＯ）における修飾前後の候補配列のＥＣ５０を比較した。Ｕ８７－ＭＧ、ＤＬＤ－１、ＳＫ－Ｈｅｐ－１、ＢｘＰＣ３、Ａ５４９、ＨＵＣＣＴ、ＰＡＮＣ－１およびＲＫＯ細胞を２４ウェル細胞プレートに播種し（細胞１×１０５個／ウェル）、ｓｉＲＮＡ候補（修飾または非修飾）を異なる細胞に複数の濃度勾配でトランスフェクトし、初代スクリーニングと同じ手順を使用した。最終的に、データは、ソフトウェアＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ８を使用してプロットし、ＥＣ５０値を計算した。
異なる細胞（Ｕ８７－ＭＧ、ＤＬＤ－１、ＳＫ－Ｈｅｐ－１、ＢｘＰＣ３、Ａ５４９、ＨＵＣＣＴ、ＰＡＮＣ－１およびＲＫＯ）における修飾前後の候補配列のＥＣ５０を比較した。Ｕ８７－ＭＧ、ＤＬＤ－１、ＳＫ－Ｈｅｐ－１、ＢｘＰＣ３、Ａ５４９、ＨＵＣＣＴ、ＰＡＮＣ－１およびＲＫＯ細胞を２４ウェル細胞プレートに播種し（細胞１×１０５個／ウェル）、ｓｉＲＮＡ候補（修飾または非修飾）を異なる細胞に複数の濃度勾配でトランスフェクトし、初代スクリーニングと同じ手順を使用した。最終的に、データは、ソフトウェアＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ８を使用してプロットし、ＥＣ５０値を計算した。
【0065】
異なる細胞（Ｕ８７ＭＧ、ＰＡＮＣ－１、ＲＫＯ、ＢｘＰＣ３）の修飾前後の候補配列のＥＣ５０曲線の比較結果を図１０に示す。異なる細胞（ＳＫ－Ｈｅｐ－１、ＨＵＣＣＴ、Ａ５４９およびＤＬＤ－１）の修飾前後の候補配列のＥＣ５０曲線。比較結果を図１１に示し、データは表６に要約し、様々な細胞株（Ｕ８７－ＭＧ、ＤＬＤ－１、ＳＫ－Ｈｅｐ－１、ＢｘＰＣ３、Ａ５４９、ＨＵＣＣＴ、ＰＡＮＣ－１およびＲＫＯ）で選択した候補（修飾または非修飾）の普遍性の検討を使用して、修飾前後のＥＣ５０データを比較および解析した。各配列（修飾前後）は、Ｕ８７－ＭＧ、ＤＬＤ－１、ＳＫ－Ｈｅｐ－１、ＢｘＰＣ３、Ａ５４９、ＨＵＣＣＴ、ＰＡＮＣ－１およびＲＫＯにおいて低いＥＣ５０値を示し、より顕著なノックダウン効果を有することを示しており、修飾のノックダウン効果は非修飾よりも良かったことを示した（ＴＦ１－２１－ｈｍ３＃修飾前後のＵ８７－ＭＧおよびＴＦ１－２１－ｈｍ６＃修飾前後のＳＫ－Ｈｅｐ－１のＥＣ５０値を除く）。
【0066】
実施例７．ＶＥＧＦＲ２ ｓｉＲＮＡおよびＴＧＦ－β１ ｓｉＲＮＡの併用効果（細胞レベルで、検出標的はＴＧＦ－β１およびＶＥＧＦＲ２）
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞では、ＶＥＧＦＲ２ ｓｉＲＮＡおよびＴＧＦ－β１ ｓｉＲＮＡのノックダウン効果は、異なる質量比のＶＥＧＦＲ２ ｓｉＲＮＡおよびＴＧＦ－β１ ｓｉＲＮＡで比較した。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を２４ウェル細胞プレートに播種し（細胞１×１０５個／ウェル）、異なる比のｓｉＲＮＡ（それぞれ、ＶＥＧＦＲ２：ＴＧＦ－β１の分子量比は１．５：１．５、１：２、２：１）をトランスフェクトし、ｓｉＲＮＡトランスフェクション濃度は１００ｎＭであり、初代スクリーニングと同じ手順を使用した。最終的に、データは、ソフトウェアＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ８を使用してプロットし、ＥＣ５０値を計算した。結果は図１２に示す。１：２～２：１の質量比内で、ＶＥＧＦＲ２ ｓｉＲＮＡおよびＴＧＦ－β１ ｓｉＲＮＡの併用効果は類似しており、両方ともＶＥＧＦＲ２およびＴＧＦ－β１の発現の阻害の良好な効果を達成することができる。操作の便利さを考え、以下の例は、ＳＴＰ３５５薬中の２つのｓｉＲＮＡの比として１：１の質量比を選択した。
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞では、ＶＥＧＦＲ２ ｓｉＲＮＡおよびＴＧＦ－β１ ｓｉＲＮＡのノックダウン効果は、異なる質量比のＶＥＧＦＲ２ ｓｉＲＮＡおよびＴＧＦ－β１ ｓｉＲＮＡで比較した。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を２４ウェル細胞プレートに播種し（細胞１×１０５個／ウェル）、異なる比のｓｉＲＮＡ（それぞれ、ＶＥＧＦＲ２：ＴＧＦ－β１の分子量比は１．５：１．５、１：２、２：１）をトランスフェクトし、ｓｉＲＮＡトランスフェクション濃度は１００ｎＭであり、初代スクリーニングと同じ手順を使用した。最終的に、データは、ソフトウェアＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ８を使用してプロットし、ＥＣ５０値を計算した。結果は図１２に示す。１：２～２：１の質量比内で、ＶＥＧＦＲ２ ｓｉＲＮＡおよびＴＧＦ－β１ ｓｉＲＮＡの併用効果は類似しており、両方ともＶＥＧＦＲ２およびＴＧＦ－β１の発現の阻害の良好な効果を達成することができる。操作の便利さを考え、以下の例は、ＳＴＰ３５５薬中の２つのｓｉＲＮＡの比として１：１の質量比を選択した。
【0067】
実施例８．薬物候補の活性成分として低分子核酸組成物の選択
本発明の２つの低分子核酸の組合せの新規の薬学的調製物様式を完全使用し、低分子核酸処置の効果を改善するため、以下の組合せ薬が製剤化される：
（１）組合せ１：
ｓｉＲＮＡ分子は、表中でＴＦ１－２１－ｈｍ３＃およびＶＥＧＦＲ２－２１－ｈ１＃と名付けられた対のような、表１および表２で決定したｓｉＲＮＡ分子から選択され、それらの配列は以下の通りである：
ＴＦ１－２１－ｈｍ３＃：
センス鎖：５’－ＡＡＣＵＡＵＵＧＣＵＵＣＡＧＣＵＣＣＡｄＴｄＴ－３’（配列番号３）；
アンチセンス：５’－ＵＧＧＡＧＣＵＧＡＡＧＣＡＡＵＡＧＵＵｄＴｄＴ－３’（配列番号１３）
ＶＥＧＦＲ２－２１－ｈ１＃：
センス鎖：５’－ＧＣＣＵＡＧＵＧＵＵＵＣＵＣＵＵＧＡＵｄＴｄＴ－３’（配列番号４０）
アンチセンス：５’－ＡＵＣＡＡＧＡＧＡＡＡＣＡＣＵＡＧＧＣｄＴｄＴ－３’（配列番号８３）。
（２）組合せ２：
ｓｉＲＮＡ分子は、表中でＴＦ１－２１－ｈｍ３＃およびＶＥＧＦＲ２－２１－ｈ２＃と名付けられた対のような、表１および表２で決定したｓｉＲＮＡ分子から選択され、それらの配列は以下の通りである：
ＴＦ１－２１－ｈｍ３＃：
センス鎖：５’－ＡＡＣＵＡＵＵＧＣＵＵＣＡＧＣＵＣＣＡｄＴｄＴ－３’（配列番号３）
アンチセンス：５’－ＵＧＧＡＧＣＵＧＡＡＧＣＡＡＵＡＧＵＵｄＴｄＴ－３’（配列番号１３）、
ＶＥＧＦＲ２－２１－ｈ２＃：
センス鎖：５’－ＧＧＵＣＣＡＵＵＵＣＡＡＡＵＣＵＣＡＡｄＴｄＴ－３’（配列番号４１）
アンチセンス：５’－ＵＵＧＡＧＡＵＵＵＧＡＡＡＵＧＧＡＣＣｄＴｄＴ－３’（配列番号８４）。
（３）組合せ３：
ｓｉＲＮＡ分子は、表中でＴＦ１－２１－ｈｍ６＃およびＶＥＧＦＲ２－２１－ｈ１＃と名付けられた対のような、表１および表２で決定したｓｉＲＮＡ分子から選択され、それらの配列は以下の通りである：
ＴＦ１－２１－ｈｍ６＃：
センス鎖：５’－ＣＧＧＣＡＧＣＵＧＵＡＣＡＵＵＧＡＣＵｄＴｄＴ－３’（配列番号６）
アンチセンス：５’－ＡＧＵＣＡＡＵＧＵＡＣＡＧＣＵＧＣＣＧｄＴｄＴ－３’（配列番号１６）、
ＶＥＧＦＲ２－２１－ｈ１＃：
センス鎖：５’－ＧＣＣＵＡＧＵＧＵＵＵＣＵＣＵＵＧＡＵｄＴｄＴ－３’（配列番号４０）
アンチセンス：５’－ＡＵＣＡＡＧＡＧＡＡＡＣＡＣＵＡＧＧＣｄＴｄＴ－３’（配列番号８３）。
（４）組合せ４：
ｓｉＲＮＡ分子は、表中でＴＦ１－２１－ｈｍ６＃およびＶＥＧＦＲ２－２１－ｈ２＃と名付けられた対のような、表１および表２で決定したｓｉＲＮＡ分子から選択され、それらの配列は以下の通りである：
ＴＦ１－２１－ｈｍ６＃：
センス鎖：５’－ＣＧＧＣＡＧＣＵＧＵＡＣＡＵＵＧＡＣＵｄＴｄＴ－３’（配列番号６）
アンチセンス：５’－ＡＧＵＣＡＡＵＧＵＡＣＡＧＣＵＧＣＣＧｄＴｄＴ－３’（配列番号１６）
ＶＥＧＦＲ２－２１－ｈ２＃：
センス鎖：５’－ＧＧＵＣＣＡＵＵＵＣＡＡＡＵＣＵＣＡＡｄＴｄＴ－３’（配列番号４１）
アンチセンス：５’－ＵＵＧＡＧＡＵＵＵＧＡＡＡＵＧＧＡＣＣｄＴｄＴ－３’（配列番号８４）。
（５）組合せ５：
ｓｉＲＮＡ分子は、表中でＴＦ１－２１－ｈｍ３＃ｍｏｄおよびＶＥＧＦＲ２－２１－ｈ１＃ｍｏｄと名付けられた対のような、表１および表２で決定したｓｉＲＮＡ分子から選択され、それらの配列は以下の通りである：
ＴＦ１－２１－ｈｍ３＃ｍｏｄ：
センス鎖：５’－ｍＡｍＡｍＣｍＵｍＡｍＵｆＵｆＧｆＣｍＵｍＵｍＣｍＡｍＧｍＣｍＵｍＣｍＣｍＡｄＴｄＴ－３’
アンチセンス：５’－ＰｍＵｆＧｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＧｍＡｍＡｍＧｍＣｍＡｆＡｍＵｍＡｍＧｍＵｍＵｄＴｄＴ－３’、
ＶＥＧＦＲ２－２１－ｈ１＃ｍｏｄ：
センス鎖：５’－ｍＧｍＣｍＣｍＵｍＡｍＧｆＵｆＧｆＵｍＵｍＵｍＣｍＵｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＵｄＴｄＴ－３’
アンチセンス：５’－ＰｍＡｆＵｍＣｍＡｍＡｍＧｍＡｍＧｍＡｍＡｍＡｍＣｍＡｆＣｍＵｍＡｍＧｍＧｍＣｄＴｄＴ－３’。
（６）組合せ６：
ｓｉＲＮＡ分子は、表中でＴＦ１－２１－ｈｍ３＃ｍｏｄおよびＶＥＧＦＲ２－２１－ｈ２＃ｍｏｄと名付けられた対のような、表１および表２で決定したｓｉＲＮＡ分子から選択され、それらの配列は以下の通りである：
ＴＦ１－２１－ｈｍ３＃ｍｏｄ：
センス鎖：５’－ｍＡｍＡｍＣｍＵｍＡｍＵｆＵｆＧｆＣｍＵｍＵｍＣｍＡｍＧｍＣｍＵｍＣｍＣｍＡｄＴｄＴ－３’
アンチセンス：５’－ＰｍＵｆＧｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＧｍＡｍＡｍＧｍＣｍＡｆＡｍＵｍＡｍＧｍＵｍＵｄＴｄＴ－３’、
ＶＥＧＦＲ２－２１－ｈ２＃ｍｏｄ：
センス鎖：５’－ｍＧｍＧｍＵｍＣｍＣｍＡｆＵｆＵｆＵｍＣｍＡｍＡｍＡｍＵｍＣｍＵｍＣｍＡｍＡｄＴｄＴ－３’
アンチセンス：５’－ＰｍＵｆＵｍＧｍＡｍＧｍＡｍＵｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｆＵｍＧｍＧｍＡｍＣｍＣｄＴｄＴ－３’。
（７）組合せ７：
ｓｉＲＮＡ分子は、表中でＴＦ１－２１－ｈｍ６＃ｍｏｄおよびＶＥＧＦＲ２－２１－ｈ１＃ｍｏｄと名付けられた対のような、表１および表２で決定したｓｉＲＮＡ分子から選択され、それらの配列は以下の通りである：
ＴＦ１－２１－ｈｍ６＃ｍｏｄ：
センス鎖：５’－ｍＣｍＧｍＧｍＣｍＡｍＧｆＣｆＵｆＧｍＵｍＡｍＣｍＡｍＵｍＵｍＧｍＡｍＣｍＵｄＴｄＴ－３’
アンチセンス：５’－ＰｍＡｆＧｍＵｍＣｍＡｍＡｍＵｍＧｍＵｍＡｍＣｍＡｍＧｆＣｍＵｍＧｍＣｍＣｍＧｄＴｄＴ－３’、
ＶＥＧＦＲ２－２１－ｈ１＃ｍｏｄ：
センス鎖：５’－ｍＧｍＣｍＣｍＵｍＡｍＧｆＵｆＧｆＵｍＵｍＵｍＣｍＵｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＵｄＴｄＴ－３’
アンチセンス：５’－ＰｍＡｆＵｍＣｍＡｍＡｍＧｍＡｍＧｍＡｍＡｍＡｍＣｍＡｆＣｍＵｍＡｍＧｍＧｍＣｄＴｄＴ－３’。
（８）組合せ８：
ｓｉＲＮＡ分子は、表中でＴＦ１－２１－ｈｍ６＃ｍｏｄおよびＶＥＧＦＲ２－２１－ｈ２＃ｍｏｄと名付けられた対のような、表１および表２で決定したｓｉＲＮＡ分子から選択され、それらの配列は以下の通りである：
ＴＦ１－２１－ｈｍ６＃ｍｏｄ：
センス鎖：５’－ｍＣｍＧｍＧｍＣｍＡｍＧｆＣｆＵｆＧｍＵｍＡｍＣｍＡｍＵｍＵｍＧｍＡｍＣｍＵｄＴｄＴ－３’
アンチセンス：５’－ＰｍＡｆＧｍＵｍＣｍＡｍＡｍＵｍＧｍＵｍＡｍＣｍＡｍＧｆＣｍＵｍＧｍＣｍＣｍＧｄＴｄＴ－３’、
ＶＥＧＦＲ２－２１－ｈ２＃ｍｏｄ：
センス鎖：５’－ｍＧｍＧｍＵｍＣｍＣｍＡｆＵｆＵｆＵｍＣｍＡｍＡｍＡｍＵｍＣｍＵｍＣｍＡｍＡｄＴｄＴ－３’
アンチセンス：５’－ＰｍＵｆＵｍＧｍＡｍＧｍＡｍＵｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｆＵｍＧｍＧｍＡｍＣｍＣｄＴｄＴ－３’。
（９）組合せ９：
ｓｉＲＮＡ分子は、表中でＴＦ１－２１－ｈｍ３＃およびＶＥＧＦＲ２－２１－ｈ１７＃と名付けられた対のような、表１および表２で決定したｓｉＲＮＡ分子から選択され、それらの配列は以下の通りである：
ＴＦ１－２１－ｈｍ３＃：
センス鎖：５’－ＡＡＣＵＡＵＵＧＣＵＵＣＡＧＣＵＣＣＡｄＴｄＴ－３’（配列番号３）
アンチセンス：５’－ＵＧＧＡＧＣＵＧＡＡＧＣＡＡＵＡＧＵＵｄＴｄＴ－３’（配列番号１３）
ＶＥＧＦＲ２－２１－ｈｍ１７＃：
センス鎖：５’－ＧＧＡＣＵＧＧＣＵＵＵＧＧＣＣＣＡＡＵｄＴｄＴ－３’（配列番号５６）
アンチセンス：５’－ＡＵＵＧＧＧＣＣＡＡＡＧＣＣＡＧＵＣＣｄＴｄＴ－３’（配列番号９９）。
（１０）組合せ１０：
ｓｉＲＮＡ分子は、表中でＴＦ１－２１－ｈｍ３＃およびＶＥＧＦＲ２－２１－ｈ１８＃と名付けられた対のような、表１および表２で決定したｓｉＲＮＡ分子から選択され、それらの配列は以下の通りである：
ＴＦ１－２１－ｈｍ３＃：
センス鎖：５’－ＡＡＣＵＡＵＵＧＣＵＵＣＡＧＣＵＣＣＡｄＴｄＴ－３’（配列番号３）
アンチセンス：５’－ＵＧＧＡＧＣＵＧＡＡＧＣＡＡＵＡＧＵＵｄＴｄＴ－３’（配列番号１３）
ＶＥＧＦＲ２－２１－ｈｍ１８＃：
センス鎖：５’－ＧＧＡＡＡＡＡＡＣＡＡＡＡＣＵＧＵＡＡｄＴｄＴ－３’（配列番号５７）
アンチセンス：５’－ＵＵＡＣＡＧＵＵＵＵＧＵＵＵＵＵＵＣＣｄＴｄＴ－３’（配列番号１００）。
（１１）組合せ１１：
ｓｉＲＮＡ分子は、表中でＴＦ１－２１－ｈｍ６＃およびＶＥＧＦＲ２－２１－ｈ１７＃と名付けられた対のような、表１および表２で決定したｓｉＲＮＡ分子から選択され、それらの配列は以下の通りである：
ＴＦ１－２１－ｈｍ６＃：
センス鎖：５’－ＣＧＧＣＡＧＣＵＧＵＡＣＡＵＵＧＡＣＵｄＴｄＴ－３’（配列番号６）
アンチセンス：５’－ＡＧＵＣＡＡＵＧＵＡＣＡＧＣＵＧＣＣＧｄＴｄＴ－３’（配列番号１６）
ＶＥＧＦＲ２－２１－ｈｍ１７＃：
センス鎖：５’－ＧＧＡＣＵＧＧＣＵＵＵＧＧＣＣＣＡＡＵｄＴｄＴ－３’（配列番号５６）
アンチセンス：５’－ＡＵＵＧＧＧＣＣＡＡＡＧＣＣＡＧＵＣＣｄＴｄＴ－３’（配列番号９９）。
（１２）組合せ１２：
ｓｉＲＮＡ分子は、表中でＴＦ１－２１－ｈｍ６＃およびＶＥＧＦＲ２－２１－ｈ１８＃と名付けられた対のような、表１および表２で決定したｓｉＲＮＡ分子から選択され、それらの配列は以下の通りである：
ＴＦ１－２１－ｈｍ６＃：
センス鎖：５’－ＣＧＧＣＡＧＣＵＧＵＡＣＡＵＵＧＡＣＵｄＴｄＴ－３’（配列番号６）
アンチセンス：５’－ＡＧＵＣＡＡＵＧＵＡＣＡＧＣＵＧＣＣＧｄＴｄＴ－３’（配列番号１６）
ＶＥＧＦＲ２－２１－ｈｍ１８＃：
センス鎖：５’－ＧＧＡＡＡＡＡＡＣＡＡＡＡＣＵＧＵＡＡｄＴｄＴ－３’（配列番号５７）
アンチセンス：５’－ＵＵＡＣＡＧＵＵＵＵＧＵＵＵＵＵＵＣＣｄＴｄＴ－３’（配列番号１００）。
（１３）組合せ１３：
ｓｉＲＮＡ分子は、表中でＴＦ１－２１－ｈｍ３＃ｍｏｄおよびＶＥＧＦＲ２－２１－ｈ１７＃ｍｏｄと名付けられた対のような、表１および表２で決定したｓｉＲＮＡ分子から選択され、それらの配列は以下の通りである：
ＴＦ１－２１－ｈｍ３＃ｍｏｄ：
センス鎖：５’－ｍＡｍＡｍＣｍＵｍＡｍＵｆＵｆＧｆＣｍＵｍＵｍＣｍＡｍＧｍＣｍＵｍＣｍＣｍＡｄＴｄＴ－３’
アンチセンス：５’－ＰｍＵｆＧｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＧｍＡｍＡｍＧｍＣｍＡｆＡｍＵｍＡｍＧｍＵｍＵｄＴｄＴ－３’、
ＶＥＧＦＲ２－２１－ｈｍ１７＃ｍｏｄ：
センス鎖：５’－ｍＧｍＧｍＡｍＣｍＵｍＧｆＧｆＣｆＵｍＵｍＵｍＧｍＧｍＣｍＣｍＣｍＡｍＡｍＵｄＴｄＴ－３’
アンチセンス：５’－ＰｍＡｆＵｍＵｍＧｍＧｍＧｍＣｍＣｍＡｍＡｍＡｍＧｍＣｆＣｍＡｍＧｍＵｍＣｍＣｄＴｄＴ－３’。
（１４）組合せ１４：
ｓｉＲＮＡ分子は、表中でＴＦ１－２１－ｈｍ３＃ｍｏｄおよびＶＥＧＦＲ２－２１－ｈ１８＃ｍｏｄと名付けられた対のような、表１および表２で決定したｓｉＲＮＡ分子から選択され、それらの配列は以下の通りである：
ＴＦ１－２１－ｈｍ３＃ｍｏｄ：
センス鎖：５’－ｍＡｍＡｍＣｍＵｍＡｍＵｆＵｆＧｆＣｍＵｍＵｍＣｍＡｍＧｍＣｍＵｍＣｍＣｍＡｄＴｄＴ－３’
アンチセンス：５’－ＰｍＵｆＧｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＧｍＡｍＡｍＧｍＣｍＡｆＡｍＵｍＡｍＧｍＵｍＵｄＴｄＴ－３’、
ＶＥＧＦＲ２－２１－ｈｍ１８＃ｍｏｄ：
センス鎖：５’－ｍＧｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｆＡｆＡｆＣｍＡｍＡｍＡｍＡｍＣｍＵｍＧｍＵｍＡｍＡｄＴｄＴ－３’
アンチセンス：５’－ＰｍＵｆＵｍＡｍＣｍＡｍＧｍＵｍＵｍＵｍＵｍＧｍＵｍＵｆＵｍＵｍＵｍＵｍＣｍＣｄＴｄＴ－３’。
（１５）組合せ１５：
ｓｉＲＮＡ分子は、表中でＴＦ１－２１－ｈｍ６＃ｍｏｄおよびＶＥＧＦＲ２－２１－ｈ１７＃ｍｏｄと名付けられた対のような、表１および表２で決定したｓｉＲＮＡ分子から選択され、それらの配列は以下の通りである：
ＴＦ１－２１－ｈｍ６＃ｍｏｄ：
センス鎖：５’－ｍＣｍＧｍＧｍＣｍＡｍＧｆＣｆＵｆＧｍＵｍＡｍＣｍＡｍＵｍＵｍＧｍＡｍＣｍＵｄＴｄＴ－３’
アンチセンス：５’－ＰｍＡｆＧｍＵｍＣｍＡｍＡｍＵｍＧｍＵｍＡｍＣｍＡｍＧｆＣｍＵｍＧｍＣｍＣｍＧｄＴｄＴ－３’、
ＶＥＧＦＲ２－２１－ｈｍ１７＃ｍｏｄ：
センス鎖：５’－ｍＧｍＧｍＡｍＣｍＵｍＧｆＧｆＣｆＵｍＵｍＵｍＧｍＧｍＣｍＣｍＣｍＡｍＡｍＵｄＴｄＴ－３’
アンチセンス：５’－ＰｍＡｆＵｍＵｍＧｍＧｍＧｍＣｍＣｍＡｍＡｍＡｍＧｍＣｆＣｍＡｍＧｍＵｍＣｍＣｄＴｄＴ－３’。
（１６）組合せ１６：
ｓｉＲＮＡ分子は、表中でＴＦ１－２１－ｈｍ６＃ｍｏｄおよびＶＥＧＦＲ２－２１－ｈ１８＃ｍｏｄと名付けられた対のような、表１および表２で決定したｓｉＲＮＡ分子から選択され、それらの配列は以下の通りである：
ＴＦ１－２１－ｈｍ６＃ｍｏｄ：
センス鎖：５’－ｍＣｍＧｍＧｍＣｍＡｍＧｆＣｆＵｆＧｍＵｍＡｍＣｍＡｍＵｍＵｍＧｍＡｍＣｍＵｄＴｄＴ－３’
アンチセンス：５’－ＰｍＡｆＧｍＵｍＣｍＡｍＡｍＵｍＧｍＵｍＡｍＣｍＡｍＧｆＣｍＵｍＧｍＣｍＣｍＧｄＴｄＴ－３’、
ＶＥＧＦＲ２－２１－ｈｍ１８＃ｍｏｄ：
センス鎖：５’－ｍＧｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｆＡｆＡｆＣｍＡｍＡｍＡｍＡｍＣｍＵｍＧｍＵｍＡｍＡｄＴｄＴ－３’
アンチセンス：５’－ＰｍＵｆＵｍＡｍＣｍＡｍＧｍＵｍＵｍＵｍＵｍＧｍＵｍＵｆＵｍＵｍＵｍＵｍＣｍＣｄＴｄＴ－３’。
本発明の２つの低分子核酸の組合せの新規の薬学的調製物様式を完全使用し、低分子核酸処置の効果を改善するため、以下の組合せ薬が製剤化される：
（１）組合せ１：
ｓｉＲＮＡ分子は、表中でＴＦ１－２１－ｈｍ３＃およびＶＥＧＦＲ２－２１－ｈ１＃と名付けられた対のような、表１および表２で決定したｓｉＲＮＡ分子から選択され、それらの配列は以下の通りである：
ＴＦ１－２１－ｈｍ３＃：
センス鎖：５’－ＡＡＣＵＡＵＵＧＣＵＵＣＡＧＣＵＣＣＡｄＴｄＴ－３’（配列番号３）；
アンチセンス：５’－ＵＧＧＡＧＣＵＧＡＡＧＣＡＡＵＡＧＵＵｄＴｄＴ－３’（配列番号１３）
ＶＥＧＦＲ２－２１－ｈ１＃：
センス鎖：５’－ＧＣＣＵＡＧＵＧＵＵＵＣＵＣＵＵＧＡＵｄＴｄＴ－３’（配列番号４０）
アンチセンス：５’－ＡＵＣＡＡＧＡＧＡＡＡＣＡＣＵＡＧＧＣｄＴｄＴ－３’（配列番号８３）。
（２）組合せ２：
ｓｉＲＮＡ分子は、表中でＴＦ１－２１－ｈｍ３＃およびＶＥＧＦＲ２－２１－ｈ２＃と名付けられた対のような、表１および表２で決定したｓｉＲＮＡ分子から選択され、それらの配列は以下の通りである：
ＴＦ１－２１－ｈｍ３＃：
センス鎖：５’－ＡＡＣＵＡＵＵＧＣＵＵＣＡＧＣＵＣＣＡｄＴｄＴ－３’（配列番号３）
アンチセンス：５’－ＵＧＧＡＧＣＵＧＡＡＧＣＡＡＵＡＧＵＵｄＴｄＴ－３’（配列番号１３）、
ＶＥＧＦＲ２－２１－ｈ２＃：
センス鎖：５’－ＧＧＵＣＣＡＵＵＵＣＡＡＡＵＣＵＣＡＡｄＴｄＴ－３’（配列番号４１）
アンチセンス：５’－ＵＵＧＡＧＡＵＵＵＧＡＡＡＵＧＧＡＣＣｄＴｄＴ－３’（配列番号８４）。
（３）組合せ３：
ｓｉＲＮＡ分子は、表中でＴＦ１－２１－ｈｍ６＃およびＶＥＧＦＲ２－２１－ｈ１＃と名付けられた対のような、表１および表２で決定したｓｉＲＮＡ分子から選択され、それらの配列は以下の通りである：
ＴＦ１－２１－ｈｍ６＃：
センス鎖：５’－ＣＧＧＣＡＧＣＵＧＵＡＣＡＵＵＧＡＣＵｄＴｄＴ－３’（配列番号６）
アンチセンス：５’－ＡＧＵＣＡＡＵＧＵＡＣＡＧＣＵＧＣＣＧｄＴｄＴ－３’（配列番号１６）、
ＶＥＧＦＲ２－２１－ｈ１＃：
センス鎖：５’－ＧＣＣＵＡＧＵＧＵＵＵＣＵＣＵＵＧＡＵｄＴｄＴ－３’（配列番号４０）
アンチセンス：５’－ＡＵＣＡＡＧＡＧＡＡＡＣＡＣＵＡＧＧＣｄＴｄＴ－３’（配列番号８３）。
（４）組合せ４：
ｓｉＲＮＡ分子は、表中でＴＦ１－２１－ｈｍ６＃およびＶＥＧＦＲ２－２１－ｈ２＃と名付けられた対のような、表１および表２で決定したｓｉＲＮＡ分子から選択され、それらの配列は以下の通りである：
ＴＦ１－２１－ｈｍ６＃：
センス鎖：５’－ＣＧＧＣＡＧＣＵＧＵＡＣＡＵＵＧＡＣＵｄＴｄＴ－３’（配列番号６）
アンチセンス：５’－ＡＧＵＣＡＡＵＧＵＡＣＡＧＣＵＧＣＣＧｄＴｄＴ－３’（配列番号１６）
ＶＥＧＦＲ２－２１－ｈ２＃：
センス鎖：５’－ＧＧＵＣＣＡＵＵＵＣＡＡＡＵＣＵＣＡＡｄＴｄＴ－３’（配列番号４１）
アンチセンス：５’－ＵＵＧＡＧＡＵＵＵＧＡＡＡＵＧＧＡＣＣｄＴｄＴ－３’（配列番号８４）。
（５）組合せ５：
ｓｉＲＮＡ分子は、表中でＴＦ１－２１－ｈｍ３＃ｍｏｄおよびＶＥＧＦＲ２－２１－ｈ１＃ｍｏｄと名付けられた対のような、表１および表２で決定したｓｉＲＮＡ分子から選択され、それらの配列は以下の通りである：
ＴＦ１－２１－ｈｍ３＃ｍｏｄ：
センス鎖：５’－ｍＡｍＡｍＣｍＵｍＡｍＵｆＵｆＧｆＣｍＵｍＵｍＣｍＡｍＧｍＣｍＵｍＣｍＣｍＡｄＴｄＴ－３’
アンチセンス：５’－ＰｍＵｆＧｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＧｍＡｍＡｍＧｍＣｍＡｆＡｍＵｍＡｍＧｍＵｍＵｄＴｄＴ－３’、
ＶＥＧＦＲ２－２１－ｈ１＃ｍｏｄ：
センス鎖：５’－ｍＧｍＣｍＣｍＵｍＡｍＧｆＵｆＧｆＵｍＵｍＵｍＣｍＵｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＵｄＴｄＴ－３’
アンチセンス：５’－ＰｍＡｆＵｍＣｍＡｍＡｍＧｍＡｍＧｍＡｍＡｍＡｍＣｍＡｆＣｍＵｍＡｍＧｍＧｍＣｄＴｄＴ－３’。
（６）組合せ６：
ｓｉＲＮＡ分子は、表中でＴＦ１－２１－ｈｍ３＃ｍｏｄおよびＶＥＧＦＲ２－２１－ｈ２＃ｍｏｄと名付けられた対のような、表１および表２で決定したｓｉＲＮＡ分子から選択され、それらの配列は以下の通りである：
ＴＦ１－２１－ｈｍ３＃ｍｏｄ：
センス鎖：５’－ｍＡｍＡｍＣｍＵｍＡｍＵｆＵｆＧｆＣｍＵｍＵｍＣｍＡｍＧｍＣｍＵｍＣｍＣｍＡｄＴｄＴ－３’
アンチセンス：５’－ＰｍＵｆＧｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＧｍＡｍＡｍＧｍＣｍＡｆＡｍＵｍＡｍＧｍＵｍＵｄＴｄＴ－３’、
ＶＥＧＦＲ２－２１－ｈ２＃ｍｏｄ：
センス鎖：５’－ｍＧｍＧｍＵｍＣｍＣｍＡｆＵｆＵｆＵｍＣｍＡｍＡｍＡｍＵｍＣｍＵｍＣｍＡｍＡｄＴｄＴ－３’
アンチセンス：５’－ＰｍＵｆＵｍＧｍＡｍＧｍＡｍＵｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｆＵｍＧｍＧｍＡｍＣｍＣｄＴｄＴ－３’。
（７）組合せ７：
ｓｉＲＮＡ分子は、表中でＴＦ１－２１－ｈｍ６＃ｍｏｄおよびＶＥＧＦＲ２－２１－ｈ１＃ｍｏｄと名付けられた対のような、表１および表２で決定したｓｉＲＮＡ分子から選択され、それらの配列は以下の通りである：
ＴＦ１－２１－ｈｍ６＃ｍｏｄ：
センス鎖：５’－ｍＣｍＧｍＧｍＣｍＡｍＧｆＣｆＵｆＧｍＵｍＡｍＣｍＡｍＵｍＵｍＧｍＡｍＣｍＵｄＴｄＴ－３’
アンチセンス：５’－ＰｍＡｆＧｍＵｍＣｍＡｍＡｍＵｍＧｍＵｍＡｍＣｍＡｍＧｆＣｍＵｍＧｍＣｍＣｍＧｄＴｄＴ－３’、
ＶＥＧＦＲ２－２１－ｈ１＃ｍｏｄ：
センス鎖：５’－ｍＧｍＣｍＣｍＵｍＡｍＧｆＵｆＧｆＵｍＵｍＵｍＣｍＵｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＵｄＴｄＴ－３’
アンチセンス：５’－ＰｍＡｆＵｍＣｍＡｍＡｍＧｍＡｍＧｍＡｍＡｍＡｍＣｍＡｆＣｍＵｍＡｍＧｍＧｍＣｄＴｄＴ－３’。
（８）組合せ８：
ｓｉＲＮＡ分子は、表中でＴＦ１－２１－ｈｍ６＃ｍｏｄおよびＶＥＧＦＲ２－２１－ｈ２＃ｍｏｄと名付けられた対のような、表１および表２で決定したｓｉＲＮＡ分子から選択され、それらの配列は以下の通りである：
ＴＦ１－２１－ｈｍ６＃ｍｏｄ：
センス鎖：５’－ｍＣｍＧｍＧｍＣｍＡｍＧｆＣｆＵｆＧｍＵｍＡｍＣｍＡｍＵｍＵｍＧｍＡｍＣｍＵｄＴｄＴ－３’
アンチセンス：５’－ＰｍＡｆＧｍＵｍＣｍＡｍＡｍＵｍＧｍＵｍＡｍＣｍＡｍＧｆＣｍＵｍＧｍＣｍＣｍＧｄＴｄＴ－３’、
ＶＥＧＦＲ２－２１－ｈ２＃ｍｏｄ：
センス鎖：５’－ｍＧｍＧｍＵｍＣｍＣｍＡｆＵｆＵｆＵｍＣｍＡｍＡｍＡｍＵｍＣｍＵｍＣｍＡｍＡｄＴｄＴ－３’
アンチセンス：５’－ＰｍＵｆＵｍＧｍＡｍＧｍＡｍＵｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｆＵｍＧｍＧｍＡｍＣｍＣｄＴｄＴ－３’。
（９）組合せ９：
ｓｉＲＮＡ分子は、表中でＴＦ１－２１－ｈｍ３＃およびＶＥＧＦＲ２－２１－ｈ１７＃と名付けられた対のような、表１および表２で決定したｓｉＲＮＡ分子から選択され、それらの配列は以下の通りである：
ＴＦ１－２１－ｈｍ３＃：
センス鎖：５’－ＡＡＣＵＡＵＵＧＣＵＵＣＡＧＣＵＣＣＡｄＴｄＴ－３’（配列番号３）
アンチセンス：５’－ＵＧＧＡＧＣＵＧＡＡＧＣＡＡＵＡＧＵＵｄＴｄＴ－３’（配列番号１３）
ＶＥＧＦＲ２－２１－ｈｍ１７＃：
センス鎖：５’－ＧＧＡＣＵＧＧＣＵＵＵＧＧＣＣＣＡＡＵｄＴｄＴ－３’（配列番号５６）
アンチセンス：５’－ＡＵＵＧＧＧＣＣＡＡＡＧＣＣＡＧＵＣＣｄＴｄＴ－３’（配列番号９９）。
（１０）組合せ１０：
ｓｉＲＮＡ分子は、表中でＴＦ１－２１－ｈｍ３＃およびＶＥＧＦＲ２－２１－ｈ１８＃と名付けられた対のような、表１および表２で決定したｓｉＲＮＡ分子から選択され、それらの配列は以下の通りである：
ＴＦ１－２１－ｈｍ３＃：
センス鎖：５’－ＡＡＣＵＡＵＵＧＣＵＵＣＡＧＣＵＣＣＡｄＴｄＴ－３’（配列番号３）
アンチセンス：５’－ＵＧＧＡＧＣＵＧＡＡＧＣＡＡＵＡＧＵＵｄＴｄＴ－３’（配列番号１３）
ＶＥＧＦＲ２－２１－ｈｍ１８＃：
センス鎖：５’－ＧＧＡＡＡＡＡＡＣＡＡＡＡＣＵＧＵＡＡｄＴｄＴ－３’（配列番号５７）
アンチセンス：５’－ＵＵＡＣＡＧＵＵＵＵＧＵＵＵＵＵＵＣＣｄＴｄＴ－３’（配列番号１００）。
（１１）組合せ１１：
ｓｉＲＮＡ分子は、表中でＴＦ１－２１－ｈｍ６＃およびＶＥＧＦＲ２－２１－ｈ１７＃と名付けられた対のような、表１および表２で決定したｓｉＲＮＡ分子から選択され、それらの配列は以下の通りである：
ＴＦ１－２１－ｈｍ６＃：
センス鎖：５’－ＣＧＧＣＡＧＣＵＧＵＡＣＡＵＵＧＡＣＵｄＴｄＴ－３’（配列番号６）
アンチセンス：５’－ＡＧＵＣＡＡＵＧＵＡＣＡＧＣＵＧＣＣＧｄＴｄＴ－３’（配列番号１６）
ＶＥＧＦＲ２－２１－ｈｍ１７＃：
センス鎖：５’－ＧＧＡＣＵＧＧＣＵＵＵＧＧＣＣＣＡＡＵｄＴｄＴ－３’（配列番号５６）
アンチセンス：５’－ＡＵＵＧＧＧＣＣＡＡＡＧＣＣＡＧＵＣＣｄＴｄＴ－３’（配列番号９９）。
（１２）組合せ１２：
ｓｉＲＮＡ分子は、表中でＴＦ１－２１－ｈｍ６＃およびＶＥＧＦＲ２－２１－ｈ１８＃と名付けられた対のような、表１および表２で決定したｓｉＲＮＡ分子から選択され、それらの配列は以下の通りである：
ＴＦ１－２１－ｈｍ６＃：
センス鎖：５’－ＣＧＧＣＡＧＣＵＧＵＡＣＡＵＵＧＡＣＵｄＴｄＴ－３’（配列番号６）
アンチセンス：５’－ＡＧＵＣＡＡＵＧＵＡＣＡＧＣＵＧＣＣＧｄＴｄＴ－３’（配列番号１６）
ＶＥＧＦＲ２－２１－ｈｍ１８＃：
センス鎖：５’－ＧＧＡＡＡＡＡＡＣＡＡＡＡＣＵＧＵＡＡｄＴｄＴ－３’（配列番号５７）
アンチセンス：５’－ＵＵＡＣＡＧＵＵＵＵＧＵＵＵＵＵＵＣＣｄＴｄＴ－３’（配列番号１００）。
（１３）組合せ１３：
ｓｉＲＮＡ分子は、表中でＴＦ１－２１－ｈｍ３＃ｍｏｄおよびＶＥＧＦＲ２－２１－ｈ１７＃ｍｏｄと名付けられた対のような、表１および表２で決定したｓｉＲＮＡ分子から選択され、それらの配列は以下の通りである：
ＴＦ１－２１－ｈｍ３＃ｍｏｄ：
センス鎖：５’－ｍＡｍＡｍＣｍＵｍＡｍＵｆＵｆＧｆＣｍＵｍＵｍＣｍＡｍＧｍＣｍＵｍＣｍＣｍＡｄＴｄＴ－３’
アンチセンス：５’－ＰｍＵｆＧｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＧｍＡｍＡｍＧｍＣｍＡｆＡｍＵｍＡｍＧｍＵｍＵｄＴｄＴ－３’、
ＶＥＧＦＲ２－２１－ｈｍ１７＃ｍｏｄ：
センス鎖：５’－ｍＧｍＧｍＡｍＣｍＵｍＧｆＧｆＣｆＵｍＵｍＵｍＧｍＧｍＣｍＣｍＣｍＡｍＡｍＵｄＴｄＴ－３’
アンチセンス：５’－ＰｍＡｆＵｍＵｍＧｍＧｍＧｍＣｍＣｍＡｍＡｍＡｍＧｍＣｆＣｍＡｍＧｍＵｍＣｍＣｄＴｄＴ－３’。
（１４）組合せ１４：
ｓｉＲＮＡ分子は、表中でＴＦ１－２１－ｈｍ３＃ｍｏｄおよびＶＥＧＦＲ２－２１－ｈ１８＃ｍｏｄと名付けられた対のような、表１および表２で決定したｓｉＲＮＡ分子から選択され、それらの配列は以下の通りである：
ＴＦ１－２１－ｈｍ３＃ｍｏｄ：
センス鎖：５’－ｍＡｍＡｍＣｍＵｍＡｍＵｆＵｆＧｆＣｍＵｍＵｍＣｍＡｍＧｍＣｍＵｍＣｍＣｍＡｄＴｄＴ－３’
アンチセンス：５’－ＰｍＵｆＧｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＧｍＡｍＡｍＧｍＣｍＡｆＡｍＵｍＡｍＧｍＵｍＵｄＴｄＴ－３’、
ＶＥＧＦＲ２－２１－ｈｍ１８＃ｍｏｄ：
センス鎖：５’－ｍＧｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｆＡｆＡｆＣｍＡｍＡｍＡｍＡｍＣｍＵｍＧｍＵｍＡｍＡｄＴｄＴ－３’
アンチセンス：５’－ＰｍＵｆＵｍＡｍＣｍＡｍＧｍＵｍＵｍＵｍＵｍＧｍＵｍＵｆＵｍＵｍＵｍＵｍＣｍＣｄＴｄＴ－３’。
（１５）組合せ１５：
ｓｉＲＮＡ分子は、表中でＴＦ１－２１－ｈｍ６＃ｍｏｄおよびＶＥＧＦＲ２－２１－ｈ１７＃ｍｏｄと名付けられた対のような、表１および表２で決定したｓｉＲＮＡ分子から選択され、それらの配列は以下の通りである：
ＴＦ１－２１－ｈｍ６＃ｍｏｄ：
センス鎖：５’－ｍＣｍＧｍＧｍＣｍＡｍＧｆＣｆＵｆＧｍＵｍＡｍＣｍＡｍＵｍＵｍＧｍＡｍＣｍＵｄＴｄＴ－３’
アンチセンス：５’－ＰｍＡｆＧｍＵｍＣｍＡｍＡｍＵｍＧｍＵｍＡｍＣｍＡｍＧｆＣｍＵｍＧｍＣｍＣｍＧｄＴｄＴ－３’、
ＶＥＧＦＲ２－２１－ｈｍ１７＃ｍｏｄ：
センス鎖：５’－ｍＧｍＧｍＡｍＣｍＵｍＧｆＧｆＣｆＵｍＵｍＵｍＧｍＧｍＣｍＣｍＣｍＡｍＡｍＵｄＴｄＴ－３’
アンチセンス：５’－ＰｍＡｆＵｍＵｍＧｍＧｍＧｍＣｍＣｍＡｍＡｍＡｍＧｍＣｆＣｍＡｍＧｍＵｍＣｍＣｄＴｄＴ－３’。
（１６）組合せ１６：
ｓｉＲＮＡ分子は、表中でＴＦ１－２１－ｈｍ６＃ｍｏｄおよびＶＥＧＦＲ２－２１－ｈ１８＃ｍｏｄと名付けられた対のような、表１および表２で決定したｓｉＲＮＡ分子から選択され、それらの配列は以下の通りである：
ＴＦ１－２１－ｈｍ６＃ｍｏｄ：
センス鎖：５’－ｍＣｍＧｍＧｍＣｍＡｍＧｆＣｆＵｆＧｍＵｍＡｍＣｍＡｍＵｍＵｍＧｍＡｍＣｍＵｄＴｄＴ－３’
アンチセンス：５’－ＰｍＡｆＧｍＵｍＣｍＡｍＡｍＵｍＧｍＵｍＡｍＣｍＡｍＧｆＣｍＵｍＧｍＣｍＣｍＧｄＴｄＴ－３’、
ＶＥＧＦＲ２－２１－ｈｍ１８＃ｍｏｄ：
センス鎖：５’－ｍＧｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｆＡｆＡｆＣｍＡｍＡｍＡｍＡｍＣｍＵｍＧｍＵｍＡｍＡｄＴｄＴ－３’
アンチセンス：５’－ＰｍＵｆＵｍＡｍＣｍＡｍＧｍＵｍＵｍＵｍＵｍＧｍＵｍＵｆＵｍＵｍＵｍＵｍＣｍＣｄＴｄＴ－３’。
【0068】
実施例９．ＳＴＰ３５５医薬の調製
実施例８で組成物９（ＴＦ－２１－ｈｍ３＃およびＶＥＧＦＲ２－２１－ｈｍ１７＃）としてＴＧＦ－β１ ｓｉＲＮＡおよびＶＥＧＦＲ２ ｓｉＲＮＡを選択し、１：１（質量比）の比で溶液中にそれらを混合し、次いで安定なナノ粒子製剤からのポリペプチド担体（ＨＫＰまたはＨＫＰ（＋Ｈ））と混合した。
実施例８で組成物９（ＴＦ－２１－ｈｍ３＃およびＶＥＧＦＲ２－２１－ｈｍ１７＃）としてＴＧＦ－β１ ｓｉＲＮＡおよびＶＥＧＦＲ２ ｓｉＲＮＡを選択し、１：１（質量比）の比で溶液中にそれらを混合し、次いで安定なナノ粒子製剤からのポリペプチド担体（ＨＫＰまたはＨＫＰ（＋Ｈ））と混合した。
【0069】
実施例１０．マウス膵臓がん（ＰＡＮＣ－１）異種移植モデルにおけるＳＴＰ３５５のｉｎ ｖｉｖｏ薬力学
この実施例で使用したＳＴＰ３５５薬は、実施例９で調製したＳＴＰ３５５薬である。ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスは、それぞれ細胞４×１０６個／０．２ｍｌのヒト膵臓がんＰＡＮＣ－１細胞を、背中に皮下接種した。腫瘍体積が約２００ｍｍ３に増殖すると、腫瘍を回収し、直径約２ｍｍの小片に切断し、小片に接種した。平均腫瘍体積が１００ｍｍ３に達すると、マウスは皮下投与された。ＳＴＰ３５５は、１ｍｇ／ｋｇおよび２．５ｍｇ／ｋｇの用量で、週に２回、全部で８回投与により腫瘍内に投与した。他の群は、ポジティブコントロールとしてゲムシタビン（ジェムザール）（３ｍｇ／ｋｇ）を与え、週に２回、全部で８回投与により医薬を腫瘍内に投与した。マウスの腫瘍体積およびマウス体重を定期的に測定し、実験の最後に腫瘍重量を集め、ソフトウェアＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ８によって解析した。平均±ＳＥ。図１３は、ＳＴＰ３５５がマウス膵臓がんに特定の阻害効果を有することを示し、２．５ｍｇ／ｋｇの用量はジェムザールに近い。
この実施例で使用したＳＴＰ３５５薬は、実施例９で調製したＳＴＰ３５５薬である。ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスは、それぞれ細胞４×１０６個／０．２ｍｌのヒト膵臓がんＰＡＮＣ－１細胞を、背中に皮下接種した。腫瘍体積が約２００ｍｍ３に増殖すると、腫瘍を回収し、直径約２ｍｍの小片に切断し、小片に接種した。平均腫瘍体積が１００ｍｍ３に達すると、マウスは皮下投与された。ＳＴＰ３５５は、１ｍｇ／ｋｇおよび２．５ｍｇ／ｋｇの用量で、週に２回、全部で８回投与により腫瘍内に投与した。他の群は、ポジティブコントロールとしてゲムシタビン（ジェムザール）（３ｍｇ／ｋｇ）を与え、週に２回、全部で８回投与により医薬を腫瘍内に投与した。マウスの腫瘍体積およびマウス体重を定期的に測定し、実験の最後に腫瘍重量を集め、ソフトウェアＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ８によって解析した。平均±ＳＥ。図１３は、ＳＴＰ３５５がマウス膵臓がんに特定の阻害効果を有することを示し、２．５ｍｇ／ｋｇの用量はジェムザールに近い。
【0070】
実施例１１．マウス乳がん（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１）異種移植モデルにおけるＳＴＰ３５５の薬力学試験
この実施例で使用したＳＴＰ３５５薬は、実施例９で調製したＳＴＰ３５５薬である。ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスは、それぞれ細胞４×１０６個／０．２ｍｌのヒト乳がんＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を背中に皮下接種し、平均腫瘍体積が１００ｍｍ３に達すると、群投与を開始した。ＳＴＰ３５５は、１ｍｇ／ｋｇの用量で、週に２回、全部で８回投与により腫瘍内投与するか、または２ｍｇ／ｋｇの用量で、週に２回、全部で８回投与により静脈内投与した。ポジティブコントロールとしてパクリタキセル（ＰＴＸ）（５ｍｇ／ｋｇ）を使用し、週に２回、全部で８回投与により腫瘍内に投与した。マウスの腫瘍体積およびマウス体重を定期的に測定し、実験の最後に腫瘍重量を集め、ソフトウェアＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ８によって解析した。データポイントは平均±ＳＥとして計算した。図１４は、ＳＴＰ３５５処置により、２つの投与方法でのマウス乳がんへの阻害効果が、パクリタキセルよりもよく、毒性はパクリタキセルよりもずっと低いことを示している。
この実施例で使用したＳＴＰ３５５薬は、実施例９で調製したＳＴＰ３５５薬である。ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスは、それぞれ細胞４×１０６個／０．２ｍｌのヒト乳がんＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を背中に皮下接種し、平均腫瘍体積が１００ｍｍ３に達すると、群投与を開始した。ＳＴＰ３５５は、１ｍｇ／ｋｇの用量で、週に２回、全部で８回投与により腫瘍内投与するか、または２ｍｇ／ｋｇの用量で、週に２回、全部で８回投与により静脈内投与した。ポジティブコントロールとしてパクリタキセル（ＰＴＸ）（５ｍｇ／ｋｇ）を使用し、週に２回、全部で８回投与により腫瘍内に投与した。マウスの腫瘍体積およびマウス体重を定期的に測定し、実験の最後に腫瘍重量を集め、ソフトウェアＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ８によって解析した。データポイントは平均±ＳＥとして計算した。図１４は、ＳＴＰ３５５処置により、２つの投与方法でのマウス乳がんへの阻害効果が、パクリタキセルよりもよく、毒性はパクリタキセルよりもずっと低いことを示している。
【0071】
実施例１２．免疫コンピテントマウスモデルにおける、ヒト化ＰＤＬ１遺伝子座結腸直腸がん腫瘍（ＭＣ３８－ｈＰＤＬ１）へのＳＴＰ３５５のｉｎ ｖｉｖｏ薬力学
この実施例で使用したＳＴＰ３５５薬は、実施例９で調製したＳＴＰ３５５薬である。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスは、ヒト化ＰＤＬ１遺伝子座結腸直腸がん腫瘍ＭＣ３８－ｈＰＤＬ１細胞を、背中に、接種体積：細胞１×１０６個／１００μＬ／マウス、接種位置：マウスの右もも上部で皮下接種した。平均腫瘍体積が１００ｍｍ３に達すると、群投与を開始し、８匹の動物／群で４群に分けた。この実験では、４ｍｇ／ｋｇおよび６ｍｇ／ｋｇの用量を試験し、モデル群を確立し、ポジティブコントロール群はテセントリプ（Ｔｅｃｅｎｔｒｉｐ）（アテゾリズマブ）であった。薬物は、週に２回、全部で８回投与した。０日目、３日目、７日目、１０日目、１４日目、１７日目、２１日目、２４日目および２８日目に、ノギスにより腫瘍体積を測定し、腫瘍増殖阻害率ＴＧＩ％を式に従って計算した。
計算式：ＴＧＩ％＝［１－（Ｔｉ－Ｔ０）／（Ｖｉ－Ｖ０）］×１００％
Ｔｉは、特定の時点での処置群の平均腫瘍体積を表し、
Ｔ０は、０日目の処置群の平均腫瘍体積を表し、
Ｖｉは、Ｔｉと同じ時点でのモデル群の平均腫瘍体積を表し、
Ｖ０は、０日目のモデル群の平均腫瘍体積を表す。
この実施例で使用したＳＴＰ３５５薬は、実施例９で調製したＳＴＰ３５５薬である。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスは、ヒト化ＰＤＬ１遺伝子座結腸直腸がん腫瘍ＭＣ３８－ｈＰＤＬ１細胞を、背中に、接種体積：細胞１×１０６個／１００μＬ／マウス、接種位置：マウスの右もも上部で皮下接種した。平均腫瘍体積が１００ｍｍ３に達すると、群投与を開始し、８匹の動物／群で４群に分けた。この実験では、４ｍｇ／ｋｇおよび６ｍｇ／ｋｇの用量を試験し、モデル群を確立し、ポジティブコントロール群はテセントリプ（Ｔｅｃｅｎｔｒｉｐ）（アテゾリズマブ）であった。薬物は、週に２回、全部で８回投与した。０日目、３日目、７日目、１０日目、１４日目、１７日目、２１日目、２４日目および２８日目に、ノギスにより腫瘍体積を測定し、腫瘍増殖阻害率ＴＧＩ％を式に従って計算した。
計算式：ＴＧＩ％＝［１－（Ｔｉ－Ｔ０）／（Ｖｉ－Ｖ０）］×１００％
Ｔｉは、特定の時点での処置群の平均腫瘍体積を表し、
Ｔ０は、０日目の処置群の平均腫瘍体積を表し、
Ｖｉは、Ｔｉと同じ時点でのモデル群の平均腫瘍体積を表し、
Ｖ０は、０日目のモデル群の平均腫瘍体積を表す。
【0072】
図１５は、７日からのポジティブコントロール群（テセントリプ（Ｔｅｃｅｎｔｒｉｐ）、４ｍｐｋ、ＢＩＷ＊４Ｗ、Ｉ．Ｐ．）、ＳＴＰ３５５低用量群（４ｍｐｋ、ＢＩＷ＊４Ｗ、Ｉ．Ｖ．）およびＳＴＰ３５５高用量群（６ｍｐｋ、ＢＩＷ＊４Ｗ、Ｉ．Ｖ．）を示す。初めから２８日目まで、腫瘍体積はモデルコントロール群よりも著しく小さく、高用量ＳＴＰ３５５群の効果はポジティブコントロール群に匹敵した。腫瘍重量の結果から、ＳＴＰ３５５高用量群およびコントロール群はモデル群より著しく低く、ＳＴＰ３５５高用量群は、テセントリプ（Ｔｅｃｅｎｔｒｉｐ）と同じ腫瘍増殖への阻害効果を有した。
【0073】
実施例１３．免疫コンピテントマウスモデルにおける黒色腫（Ｂ１６）へのＳＴＰ３５５のｉｎ ｖｉｖｏ薬力学
この実施例で使用したＳＴＰ３５５薬は、実施例９で調製したＳＴＰ３５５薬である。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスは、Ｂ１６－Ｆ０細胞を、背中に、接種体積：細胞１×１０６個／１００μＬ／マウス（５０匹のマウスに接種）、位置：マウスの右背部で皮下接種した。平均腫瘍体積は８０～１００ｍｍ３であり、群での投与を開始した。２ｍｇ／ｋｇの用量を、週に２回、全部で８回投与により静脈内投与し、ポジティブコントロール群は、シスプラチンを投与し、４ｍｇ／ｋｇの用量で腫瘍内に投与し、週に２回、全部で８用量が投与された。図１６は、現在の試験システム下で、ポジティブコントロール群（シスプラチン、４ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｐ．ＱＷ）およびＳＴＰ３５５群（２ｍｇ／ｋｇ、１０μｌ／ｇ、ｉ．ｖ．、Ｑ２Ｄ）は全て、顕著な抗腫瘍効果を示し、ＳＴＰ３５５群はよい効果および低い毒性を有することを示した。
この実施例で使用したＳＴＰ３５５薬は、実施例９で調製したＳＴＰ３５５薬である。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスは、Ｂ１６－Ｆ０細胞を、背中に、接種体積：細胞１×１０６個／１００μＬ／マウス（５０匹のマウスに接種）、位置：マウスの右背部で皮下接種した。平均腫瘍体積は８０～１００ｍｍ３であり、群での投与を開始した。２ｍｇ／ｋｇの用量を、週に２回、全部で８回投与により静脈内投与し、ポジティブコントロール群は、シスプラチンを投与し、４ｍｇ／ｋｇの用量で腫瘍内に投与し、週に２回、全部で８用量が投与された。図１６は、現在の試験システム下で、ポジティブコントロール群（シスプラチン、４ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｐ．ＱＷ）およびＳＴＰ３５５群（２ｍｇ／ｋｇ、１０μｌ／ｇ、ｉ．ｖ．、Ｑ２Ｄ）は全て、顕著な抗腫瘍効果を示し、ＳＴＰ３５５群はよい効果および低い毒性を有することを示した。
【0074】
実施例１４．マウス乳がん（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１）異種移植モデルにおける組合せ薬および単一薬の薬力学的比較試験
組合せ９（ＴＦ１－２１－ｈｍ３＃およびＶＥＧＦＲ２－２１－ｈｍ１７＃）、組合せ１０（ＴＦ１－２１－ｈｍ３＃およびＶＥＧＦＲ２－２１－ｈｍ１８＃）、組合せ１１（ＴＦ１－２１－ｈｍ６＃およびＶＥＧＦＲ２－２１－ｈｍ１７＃）、組合せ１２（ＴＦ１－２１－ｈｍ６＃およびＶＥＧＦＲ２－２１－ｈｍ１８＃）、ＴＧＦ－β１ ｓｉＲＮＡ（ＴＦ１－２１－ｈｍ３＃）、ＴＧＦ－β１ ｓｉＲＮＡ（ＴＦ１－２１－ｈｍ６＃）、ＶＥＧＦＲ２ ｓｉＲＮＡ（ＶＥＧＦＲ２－２１－ｈｍ１７＃）およびＶＥＧＦＲ２ ｓｉＲＮＡ（ＶＥＧＦＲ２－２１－ｈｍ１８＃）をＨＫＰ（＋Ｈ）とセルフアセンブルさせてナノ粒子を形成し、調製したナノ粒子は、ＳＴＰ３５５（３＋１７）、ＳＴＰ３５５（３＋１８）、ＳＴＰ３５５（６＋１７）、ＳＴＰ３５５（６＋１８）、ｓｉＴＧＦ－β１（３）、ｓｉＴＧＦ－β１（６）、ｓｉＶＥＧＦ－Ｒ２（１７）、ｓｉＶＥＧＦ－Ｒ２（１８）としてマークした。
組合せ９（ＴＦ１－２１－ｈｍ３＃およびＶＥＧＦＲ２－２１－ｈｍ１７＃）、組合せ１０（ＴＦ１－２１－ｈｍ３＃およびＶＥＧＦＲ２－２１－ｈｍ１８＃）、組合せ１１（ＴＦ１－２１－ｈｍ６＃およびＶＥＧＦＲ２－２１－ｈｍ１７＃）、組合せ１２（ＴＦ１－２１－ｈｍ６＃およびＶＥＧＦＲ２－２１－ｈｍ１８＃）、ＴＧＦ－β１ ｓｉＲＮＡ（ＴＦ１－２１－ｈｍ３＃）、ＴＧＦ－β１ ｓｉＲＮＡ（ＴＦ１－２１－ｈｍ６＃）、ＶＥＧＦＲ２ ｓｉＲＮＡ（ＶＥＧＦＲ２－２１－ｈｍ１７＃）およびＶＥＧＦＲ２ ｓｉＲＮＡ（ＶＥＧＦＲ２－２１－ｈｍ１８＃）をＨＫＰ（＋Ｈ）とセルフアセンブルさせてナノ粒子を形成し、調製したナノ粒子は、ＳＴＰ３５５（３＋１７）、ＳＴＰ３５５（３＋１８）、ＳＴＰ３５５（６＋１７）、ＳＴＰ３５５（６＋１８）、ｓｉＴＧＦ－β１（３）、ｓｉＴＧＦ－β１（６）、ｓｉＶＥＧＦ－Ｒ２（１７）、ｓｉＶＥＧＦ－Ｒ２（１８）としてマークした。
【0075】
ＮＯＤ ＳＣＩＤマウスは、それぞれ細胞１×１０７個／０．２ｍｌのヒト乳がんＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を、背中に皮下接種した。平均腫瘍体積が１００ｍｍ３に達すると、マウスを１０個の群、８匹のマウス／群に分けた。上記のＳＴＰ３５５薬、ＴＧＦ－β１ ｓｉＲＮＡ単一薬、およびＶＥＧＦＲ２ ｓｉＲＮＡ単一薬を、２ｍｇ／ｋｇの用量で、３日に１回、全部で８回投与により静脈内投与した。パクリタキセル（ＰＴＸ）（５ｍｇ／ｋｇ）を、３日に１回、全部で８用量を腹腔内注射によりポジティブコントロールとして使用した。マウスの腫瘍体積およびマウス体重を定期的に測定し、実験の最後に腫瘍重量を集め、ソフトウェアＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ９によって解析した。データポイントは平均±ＳＥとして計算した。図１７は、ビヒクル群と比較して、ＳＴＰ３５５（３＋１８）薬処置は、マウス乳がんに、ＴＧＦ－β１ ｓｉＲＮＡ単一薬、ＶＥＧＦＲ２ ｓｉＲＮＡ単一薬およびパクリタキセルよりも著しく良い阻害効果を有したことを示す。
【0076】
実施例１５．マウス膵臓がん（ＰＡＮＣ－１）異種移植モデルにおける、組合せ薬および修飾薬のｉｎ ｖｉｖｏ薬力学比較試験
組合せ９（ＴＦ１－２１－ｈｍ３＃およびＶＥＧＦＲ２－２１－ｈｍ１７＃）、組合せ１０（ＴＦ１－２１－ｈｍ３＃およびＶＥＧＦＲ２－２１－ｈｍ１８＃）、組合せ１３（ＴＦ１－２１－ｈｍ３＃ｍｏｄおよびＶＥＧＦＲ２－２１－ｈｍ１７＃ｍｏｄ）、組合せ１４（ＴＦ１－２１－ｈｍ３＃ｍｏｄおよびＶＥＧＦＲ２－２１－ｈｍ１８＃ｍｏｄ）をＨＫＰ（＋Ｈ）とセルフアセンブルさせてナノ粒子を形成し、調製したナノ粒子は、ＳＴＰ３５５（３＋１７）、ＳＴＰ３５５（３＋１８）、ＳＴＰ３５５（３ｍ＋１７ｍ）、ＳＴＰ３５５（３ｍ＋１８ｍ）として記録した。
組合せ９（ＴＦ１－２１－ｈｍ３＃およびＶＥＧＦＲ２－２１－ｈｍ１７＃）、組合せ１０（ＴＦ１－２１－ｈｍ３＃およびＶＥＧＦＲ２－２１－ｈｍ１８＃）、組合せ１３（ＴＦ１－２１－ｈｍ３＃ｍｏｄおよびＶＥＧＦＲ２－２１－ｈｍ１７＃ｍｏｄ）、組合せ１４（ＴＦ１－２１－ｈｍ３＃ｍｏｄおよびＶＥＧＦＲ２－２１－ｈｍ１８＃ｍｏｄ）をＨＫＰ（＋Ｈ）とセルフアセンブルさせてナノ粒子を形成し、調製したナノ粒子は、ＳＴＰ３５５（３＋１７）、ＳＴＰ３５５（３＋１８）、ＳＴＰ３５５（３ｍ＋１７ｍ）、ＳＴＰ３５５（３ｍ＋１８ｍ）として記録した。
【0077】
ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスは、それぞれ細胞４×１０６個／０．２ｍｌのヒト膵臓がんＰＡＮＣ－１細胞を、背中に皮下接種した。平均腫瘍体積が１２０ｍｍ３に達すると、マウスを６個の群、８匹のマウス／群に分けた。ＳＴＰ３５５を、１ｍｇ／ｋｇの用量で、３日に１回、全部で８回投与により腫瘍内に投与し、ゲムシタビン（ジェムザール）（６０ｍｇ／ｋｇ）を、３日に１回、全部で８用量を腹腔内にポジティブコントロールとして投与した。マウスの腫瘍体積および体重を定期的に測定し、ソフトウェアＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ９によって解析した。平均±ＳＥ。図１８は、各投与群がＰＡＮＣ－１腫瘍に特定の阻害効果を有し、効果がゲムシタビンに匹敵し、組合せ薬と修飾薬の間に差がないことを示す。
【0078】
実施例１６．Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおける修飾薬および非修飾薬の比較安定性試験
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを５つの群、６匹のマウス／群に分けた。実施例１５のＳＴＰ３５５（３＋１７）およびＳＴＰ３５５（３ｍ＋１７ｍ）を使用して、マウスにおける非修飾薬ＳＴＰ３５５および修飾薬ＳＴＰ３５５ｍの効果を比較した。安定性のため、コントロールはブランクコントロール群であり、単一用量群（単回用量）は１回投与され、反復投与群（Ｑ２Ｄ×３用量）は２日に１回投与され、３回投与された。最終投与の２４時間後にサンプリングし、リアルタイム蛍光定量的ＰＣＲ法を使用して、肝臓組織におけるＴＧＦ－β１ ｓｉＲＮＡおよびＶＥＧＦ－Ｒ２ ｓｉＲＮＡの含量を決定した。図１９は、修飾薬および非修飾薬の両方が、ｉ．ｐ．投与後の肝臓組織において、より高レベルのＶＥＧＦ－Ｒ２ ｓｉＲＮＡおよびＴＧＦ－β１ ｓｉＲＮＡを検出できたことを示す。同じ投与条件下で、修飾群のｓｉＲＮＡの残量は非修飾群よりも高く；修飾群では、反復投与のｓｉＲＮＡの残量は単回投与よりも高く；また、非修飾群のｓｉＲＮＡの残量も単回投与よりも高かった。これは、修飾後、ｓｉＲＮＡはｉｎ ｖｉｖｏでより安定性を有することを示している。
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを５つの群、６匹のマウス／群に分けた。実施例１５のＳＴＰ３５５（３＋１７）およびＳＴＰ３５５（３ｍ＋１７ｍ）を使用して、マウスにおける非修飾薬ＳＴＰ３５５および修飾薬ＳＴＰ３５５ｍの効果を比較した。安定性のため、コントロールはブランクコントロール群であり、単一用量群（単回用量）は１回投与され、反復投与群（Ｑ２Ｄ×３用量）は２日に１回投与され、３回投与された。最終投与の２４時間後にサンプリングし、リアルタイム蛍光定量的ＰＣＲ法を使用して、肝臓組織におけるＴＧＦ－β１ ｓｉＲＮＡおよびＶＥＧＦ－Ｒ２ ｓｉＲＮＡの含量を決定した。図１９は、修飾薬および非修飾薬の両方が、ｉ．ｐ．投与後の肝臓組織において、より高レベルのＶＥＧＦ－Ｒ２ ｓｉＲＮＡおよびＴＧＦ－β１ ｓｉＲＮＡを検出できたことを示す。同じ投与条件下で、修飾群のｓｉＲＮＡの残量は非修飾群よりも高く；修飾群では、反復投与のｓｉＲＮＡの残量は単回投与よりも高く；また、非修飾群のｓｉＲＮＡの残量も単回投与よりも高かった。これは、修飾後、ｓｉＲＮＡはｉｎ ｖｉｖｏでより安定性を有することを示している。
【0079】
ヒトおよびマウスｍＲＮＡ分子は、構造または機能が実質的に同一であるタンパク質をコードする。したがって、マウス疾患モデルにおいて観察された有効性および毒性応答は、ヒトで起こるであろうことの十分な理解を提供する。より重要なことは、マウスモデルにおいて試験したｓｉＲＮＡ分子は、ヒトにおける薬学的製剤の良い候補である。上記の実施例では、ＳＴＰ３５５薬は、ヒトおよびマウスの相同ｓｉＲＮＡを採用する。
【0080】
本開示は、そのような組成物および方法のある特定の例を記載するが、多くの詳細は例示の目的のために記載され、これらの組成物および方法が他の実施例に影響され、ある特定の詳細が本開示の基本原理から逸脱することなく本明細書に記載の実施例から変更されてもよいことは当業者には明らかであろう。
【0081】
参考
【図1A】
【図1B】
【図2A】
【図2B】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7A】
【図7B】
【図8A】
【図8B】
【図9A】
【図9B】
【図10A】
【図10B】
【図10C】
【図10D】
【図11A】
【図11B】
【図11C】
【図11D】
【図12A】
【図12B】
【図13A】
【図13B】
【図13C】
【図14A】
【図14B】
【図15A】
【図15B】
【図15C】
【図16A】
【図16B】
【図16C】
【図16D】
【図17A】
【図17B】
【図17C】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【手続補正書】
【提出日】2024-03-18
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
【国際調査報告】