特表2024-525862栄養素の生物学的利用能及び酸化安定性が改善された、微細藻類ベースの製品
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-07-12
(54)【発明の名称】栄養素の生物学的利用能及び酸化安定性が改善された、微細藻類ベースの製品
(51)【国際特許分類】
C12N 1/12 20060101AFI20240705BHJP
A23L 33/10 20160101ALI20240705BHJP
C12N 13/00 20060101ALN20240705BHJP
C12P 7/6472 20220101ALN20240705BHJP
【ＦＩ】
C12N1/12 C
A23L33/10
C12N13/00
C12P7/6472
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024502561
(86)(22)【出願日】2022-07-27
(85)【翻訳文提出日】2024-01-16
(86)【国際出願番号】 EP2022071103
(87)【国際公開番号】W WO2023006827
(87)【国際公開日】2023-02-02
(31)【優先権主張番号】21188331.9
(32)【優先日】2021-07-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】590002013
【氏名又は名称】ソシエテ・デ・プロデュイ・ネスレ・エス・アー
(74)【代理人】
【識別番号】100088155
【弁理士】
【氏名又は名称】長谷川 芳樹
(74)【代理人】
【識別番号】100140453
【弁理士】
【氏名又は名称】戸津 洋介
(72)【発明者】
【氏名】カネッリ， グレタ
(72)【発明者】
【氏名】ディオニシ， ファビオラ
(72)【発明者】
【氏名】ボルテン， クリストフ ジョセフ
(72)【発明者】
【氏名】ムルシアーノ マルティネス， パトリシア
(72)【発明者】
【氏名】マティス， アレクサンダー
(72)【発明者】
【氏名】ブシュマン， レアンドロ
(72)【発明者】
【氏名】ジャケノッド， リュック
(72)【発明者】
【氏名】クスター， イザベル
【テーマコード（参考）】
4B018
4B033
4B064
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B018LB08
4B018LE05
4B018MD10
4B018MD89
4B018ME02
4B018ME04
4B018MF07
4B018MF12
4B033NG04
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4B064CE03
4B064CE08
4B064DA10
4B065AA83X
4B065AA84X
4B065BB15
4B065BC03
4B065BC09
4B065BC11
4B065BC26
4B065BD01
4B065BD15
4B065BD16
4B065BD44
4B065BD50
4B065CA13
4B065CA41
4B065CA44
(57)【要約】
本発明は、部分的に溶解した微細藻類を含む、ヒトが摂取するための製品を作製する方法であって、ａ）微細藻類の懸濁液を調製するステップであって、前記微細藻類は、緑藻植物門、オクロ植物門、及び不等毛植物門から選択される門に属する、ステップと、ｂ）パルス電界を微細藻類の懸濁液に印加するステップであって、パルス電界は、懸濁液１ｋｇ当たり２５～１５０ｋＪ（ｋｇ ｓｕｓ－１）の比エネルギー入力を有する、ステップと、ｃ）任意選択で、該微細藻類を酵素で処理するステップと、ｄ）バイオマス懸濁液を３００ｒｐｍ、４～３７℃で６～４８時間インキュベートするステップと、ｅ）部分的に溶解した微細藻類のバイオマスを形成するステップと、ｆ）該部分的に溶解した微細藻類のバイオマスを、ヒトが摂取するための製品に添加するステップと、を含む、方法に関する。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
部分的に溶解した微細藻類を含む、ヒトが摂取するための製品を作製する方法であって、ａ．微細藻類の懸濁液を調製するステップであって、前記微細藻類は、緑藻植物門（Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔａ）、オクロ植物門（Ｏｃｈｒｏｐｈｙｔａ）、及び不等毛植物門（Ｈｅｔｅｒｏｋｏｎｔａ）から選択される門に属する、ステップと、
ｂ．パルス電界を前記微細藻類の懸濁液に印加するステップであって、前記パルス電界は、懸濁液１ｋｇ当たり２５～１５０ｋＪ（ｋｇｓｕｓ －１）の比エネルギー入力を有する、ステップと、
ｃ．任意選択で、前記微細藻類の懸濁液に酵素を添加するステップと、
ｄ．部分的に溶解した微細藻類のバイオマスを形成するステップと、
ｅ．ヒトが摂取するための製品の材料として、前記部分的に溶解した微細藻類のバイオマスを添加するステップと、を含む、方法。
【請求項2】
前記微細藻類が、クロレラ種（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）又はオーキセノクロレラ種（Ａｕｘｅｎｏｃｈｌｏｒｅｌｌａ）に属する、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記微細藻類が、クロレラ・ブルガリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、好ましくは、ＣＣＡＬＡ ２５６である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
前記酵素が、エンド－１，４－β－ガラクタナーゼ、ラムノガラクツロナン ラムノヒドロラーゼ及び／又はキチナーゼである、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記パルス電界を印加する前の前記微細藻類の懸濁液の温度が、２～３０℃である、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記パルス電界が、２５～１００ｋＪ ｋｇｓｕｓ
－１の比エネルギー入力を有する、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記パルス電界が、１０ｋＶｃｍ ｃｍ－１～４５ｋＶｃｍ ｃｍ－１、好ましくは１０ｋＶ ｃｍ－１～３５ｋＶ ｃｍ－１の電界強度を有する、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記パルス電界が、５μｓ～２５μｓのパルス長を有する、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記パルス電界が、印加される５～３０のパルス数、好ましくは印加される１０のパルス数を有する、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記パルス電界が、双極性矩形波電気パルス、単極性電気パルス、又は指数関数的減衰電気パルス、好ましくは双極性矩形波電気パルスを含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
前記微細藻類が、前記パルス電界を印加した後に回収され、緩衝液中に再懸濁され、前記緩衝液が、４℃～３７℃の温度を有し、前記微細藻類が、６～７２時間、好ましくは１２～７２時間、前記緩衝液中でインキュベートされる、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
前記緩衝液が、リン酸緩衝液、好ましくはｐＨ６の０．０５Ｍリン酸カリウム緩衝液である、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記微細藻類が、前記パルス電界の印加及び／又は酵素処理後に３μｍ～６μｍの平均粒子サイズを有する、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
ヒトが摂取するための微細藻類の脂質のバイオアクセシビリティを改善する方法であって、ａ．微細藻類の懸濁液を調製するステップであって、前記微細藻類は、緑藻植物門、オクロ植物門、及び不等毛植物門から選択される門に属する、ステップと、
ｂ．パルス電界を前記微細藻類の懸濁液に印加するステップであって、前記パルス電界は、懸濁液１ｋｇ当たり２５～１５０ｋＪ（ｋｇｓｕｓ －１）の比エネルギー入力を有する、ステップと、
ｃ．任意選択で、前記微細藻類の懸濁液に酵素を添加するステップと、を含み、
前記微細藻類の懸濁液が、ステップｂ）及び／又はステップｃ）の後に、４℃～３７℃で６時間～４８時間インキュベートされることを特徴とする、方法。
【請求項15】
ヒトが摂取するための微細藻類における脂質酸化安定性を維持する方法であって、ａ．微細藻類の懸濁液を調製するステップであって、前記微細藻類は、緑藻植物門、オクロ植物門、及び不等毛植物門から選択される門に属する、ステップと、
ｂ．パルス電界を前記微細藻類の懸濁液に印加するステップであって、前記パルス電界は、懸濁液１ｋｇ当たり２５～１５０ｋＪ（ｋｇｓｕｓ －１）の比エネルギー入力を有する、ステップと、
ｃ．任意選択で、前記微細藻類の懸濁液に酵素を添加するステップと、を含む、方法。
【請求項16】
微細藻類のバイオマスを含む、ヒトが摂取するための製品であって、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法によって製造された、製品。
【請求項17】
前記製品がＲＴＤ飲料である、請求項１４に記載の製品。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【0001】
［序論］
微細藻類は、代替オメガ３－ＰＵＦＡ源としてますます注目されており、かかる高価値化合物の一次生産者である。現在、微細藻類のオメガ３－ＰＵＦＡリッチな脂質は、主に抽出により利用される。一方、微細藻類バイオマスの主にクロレラ・ブルガリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、及び一般にスピルリナとして知られているアルトロスピラ・プラテンシス（Ａｒｔｈｏｓｐｉｒａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ）の乾燥粉末（タンパク質及びオメガ３－ＰＵＦＡに富む）は、すでに市場に見ることができる。しかしながら、全細胞を使用すると、脂質の生物学的利用能は制限されることになる。更にオメガ３－ＰＵＦＡは、多くの二重結合を有するため非常に酸化されやすい。酸化は異臭の形成及び栄養価の低下をもたらす。
微細藻類は、代替オメガ３－ＰＵＦＡ源としてますます注目されており、かかる高価値化合物の一次生産者である。現在、微細藻類のオメガ３－ＰＵＦＡリッチな脂質は、主に抽出により利用される。一方、微細藻類バイオマスの主にクロレラ・ブルガリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、及び一般にスピルリナとして知られているアルトロスピラ・プラテンシス（Ａｒｔｈｏｓｐｉｒａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ）の乾燥粉末（タンパク質及びオメガ３－ＰＵＦＡに富む）は、すでに市場に見ることができる。しかしながら、全細胞を使用すると、脂質の生物学的利用能は制限されることになる。更にオメガ３－ＰＵＦＡは、多くの二重結合を有するため非常に酸化されやすい。酸化は異臭の形成及び栄養価の低下をもたらす。
【0002】
微細藻類における全細胞構造の完全性が維持されると、収穫後の湿潤保管中にオメガ３－ＰＵＦＡが酸化から保護されることが示されている。しかしながら、損傷のない（ｉｎｔａｃｔ）細胞壁が存在すると、難消化性多糖によりオメガ３－ＰＵＦＡの生物学的利用能が制限され得る。
【0003】
微細藻類をベースとする製品における栄養素の生物学的利用能及び酸化安定性を向上させることが、明らかに必要とされている。
【発明の概要】
【0004】
本発明は、従来技術を改善し、パルス電界と、細胞壁の酵素処理とを使用することによって、上述のニーズに対処する。
【0005】
本発明は、広義には、溶解した微細藻類、特に部分的に溶解した微細藻類を含む、ヒトが摂取するための製品を製造する方法に関する。
【0006】
より具体的には、本発明は、部分的に溶解した微細藻類を含む、ヒトが摂取するための製品を作製する方法であって、パルス電界を微細藻類の懸濁液に印加するステップと、部分的に溶解した微細藻類のバイオマスを形成するステップと、を含む、方法に関する。
【0007】
より具体的には、本発明は、部分的に溶解した微細藻類を含む、ヒトが摂取するための製品を作製する方法であって、ａ）微細藻類の懸濁液を調製するステップと、ｂ）パルス電界を微細藻類の懸濁液に印加するステップと、ｃ）部分的に溶解した微細藻類のバイオマスを形成するステップと、を含む、方法に関する。
【0008】
より具体的には、本発明は、部分的に溶解した微細藻類を含む、ヒトが摂取するための製品を作製する方法であって、ａ）微細藻類の懸濁液を調製するステップと、ｂ）パルス電界を微細藻類の懸濁液に印加するステップと、ｃ）部分的に溶解した微細藻類のバイオマスを形成するステップと、ｄ）部分的に溶解した微細藻類のバイオマスを、ヒトが摂取するための製品の材料として添加するステップと、を含む、方法に関する。
【0009】
より詳細には、本発明は、部分的に溶解した微細藻類を含む、ヒトが摂取するための製品を作製する方法であって、ａ）微細藻類の懸濁液を調製するステップであって、微細藻類は、緑藻植物門（Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔａ）、オクロ植物門（Ｏｃｈｒｏｐｈｙｔａ）、及び不等毛植物門（Ｈｅｔｅｒｏｋｏｎｔａ）から選択される門に属する、ステップと、ｂ）パルス電界を微細藻類の懸濁液に印加するステップと、ｃ）部分的に溶解した微細藻類のバイオマスを形成するステップと、ｄ）部分的に溶解した微細藻類のバイオマスを、ヒトが摂取するための製品の材料として添加するステップと、を含む、方法に関する。
【0010】
より詳細には、本発明は、部分的に溶解した微細藻類を含む、ヒトが摂取するための製品を作製する方法であって、ａ）微細藻類の懸濁液を調製するステップであって、微細藻類は、緑藻植物門、オクロ植物門、及び不等毛植物門から選択される門に属する、ステップと、ｂ）パルス電界を微細藻類の懸濁液に印加するステップであって、パルス電界は、懸濁液１ｋｇ当たり２５～１５０ｋＪの比エネルギー入力（ｋｇｓｕｓ
－１）を有する、ステップと、ｃ）部分的に溶解した微細藻類のバイオマスを形成するステップと、ｄ）部分的に溶解した微細藻類のバイオマスを、ヒトが摂取するための製品の材料として添加するステップと、を含む、方法に関する。
【0011】
一実施形態では、本発明は、部分的に溶解した微細藻類を含む、ヒトが摂取するための製品を作製する方法であって、ａ）微細藻類の懸濁液を調製するステップであって、微細藻類は、緑藻植物門、オクロ植物門、及び不等毛植物門から選択される門に属する、ステップと、ｂ）パルス電界を微細藻類の懸濁液に印加するステップであって、パルス電界は、懸濁液１ｋｇ当たり２５～１５０ｋＪの比エネルギー入力（ｋｇｓｕｓ
－１）を有する、ステップと、ｃ）任意選択で、微細藻類の懸濁液に酵素を添加するステップと、ｄ）部分的に溶解した微細藻類のバイオマスを形成するステップと、ｅ）部分的に溶解した微細藻類のバイオマスを、ヒトが摂取するための製品の材料として添加するステップと、を含む、方法に関する。
【0012】
一実施形態では、門は、緑藻植物門である。一実施形態では、門は、オクロ植物門である。一実施形態では、門は、不等毛植物門である。
【0013】
一実施形態では、微細藻類は、クロレラ種（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）に属する。一実施形態では、微細藻類は、オーキセノクロレラ種（Ａｕｘｅｎｏｃｈｌｏｒｅｌｌａ）に属する。
【0014】
一実施形態では、微細藻類は、クロレラ・ブルガリス、好ましくはＣＣＡＬＡ ２５６である。
【0015】
一実施形態では、酵素は、ガラクタナーゼ、例えばエンド－１，４－β－ガラクタナーゼである。
【0016】
一実施形態では、酵素は、ラムノヒドロラーゼ、例えばラムノガラクツロナン ラムノヒドロラーゼである。
【0017】
一実施形態では、酵素は、キチナーゼである。
【0018】
一実施形態では、酵素は、エンド－１，４－β－ガラクタナーゼ及びラムノガラクツロナン ラムノヒドロラーゼである。
【0019】
一実施形態では、酵素は、エンド－１，４－β－ガラクタナーゼ、ラムノガラクツロナン ラムノヒドロラーゼ及び／又はキチナーゼである。
【0020】
一実施形態では、パルス電界を印加する前の微細藻類懸濁液の温度は、２～３０℃である。
【0021】
一実施形態では、パルス電界は、２５～１００ｋＪ ｋｇｓｕｓ
－１の比エネルギー入力を有する。
【0022】
一実施形態では、パルス電界は、３０～３５ｋＪ ｋｇｓｕｓ
－１、例えば約３２ｋＪ ｋｇｓｕｓ
－１の比エネルギー入力を有する。
【0023】
一実施形態では、パルス電界は、１０ｋＶ ｃｍ－１～４５ｋＶ ｃｍ－１、好ましくは１０ｋＶ ｃｍ－１～３５ｋＶ ｃｍ－１、より好ましくは２０ｋＶ ｃｍ－１～３０ｋＶ ｃｍ－１の電界強度を有する。
【0024】
一実施形態では、パルス電界は、２０～２５ｋＶ ｃｍ－１の電界強度を有する。
【0025】
一実施形態では、パルス電界は、５μｓ～２５μｓのパルス長を有する。
【0026】
一実施形態では、パルス電界は、２０～２５ｋＶ ｃｍ－１の電界強度及び５μｓのパルス長を有する。
【0027】
一実施形態では、パルス電界は、印加される５～３０のパルス数を有し、好ましくは１０のパルス数が印加される。
【0028】
一実施形態では、パルス電界は、双極性矩形波電気パルスを含む。一実施形態では、パルス電界は単極性電気パルスを含む。一実施形態では、パルス電界は、指数関数的減衰電気パルスを含む。好ましくは、パルス電界は、双極性矩形波電気パルスを含む。
【0029】
一実施形態では、微細藻類は、ＰＥＦ処理後に、例えば約４℃、又は約２５℃、又は約３７℃でインキュベートされる。
【0030】
典型的なインキュベーション時間は、最大約７２時間、例えば、１～７２時間、又は６～７２時間、又は１２～７２時間、又は１８～７２時間、又は２４～７２時間、又は４８～７２時間であり得る。典型的なインキュベーション時間は、約１時間、約６時間、約１２時間、約１８時間、約２４時間、約４８時間、又は約７２時間であり得る。
【0031】
懸濁液は、例えば約３００ｒｐｍで撹拌しながらインキュベートされ得る。
【0032】
一実施形態では、微細藻類は、ＰＥＦ処理後に約４℃で少なくとも２４時間、例えば約４８時間インキュベートされる。
【0033】
一実施形態では、微細藻類は、ＰＥＦ処理後に約２５℃又は約３７℃で少なくとも６時間、例えば約１２時間インキュベートされる。
【0034】
一実施形態では、微細藻類は、好ましくは遠心分離によって回収され、パルス電界を印加した後に緩衝液中に再懸濁され、緩衝液は４℃～３７℃の温度を有し、微細藻類は緩衝液中で６～７２時間、好ましくは１２～７２時間インキュベートされる。
【0035】
一実施形態では、緩衝液は、リン酸緩衝液、好ましくはｐＨ６の０．０５Ｍリン酸カリウム緩衝液である。
【0036】
一実施形態では、微細藻類は、パルス電界の印加又は酵素処理後に３μｍ～６μｍの平均粒子サイズを有する。
【0037】
一実施形態では、微細藻類は、パルス電界の印加及び酵素処理後に３μｍ～６μｍの平均粒子サイズを有する。
【0038】
本発明はさらに、ヒトが摂取するための微細藻類の脂質のバイオアクセシビリティを改善するための方法であって、ａ）微細藻類の懸濁液を調製するステップであって、微細藻類は、緑藻植物門、オクロ植物門、及び不等毛植物門から選択される門に属する、ステップと、ｂ）パルス電界を微細藻類の懸濁液に印加するステップであって、パルス電界は、懸濁液１ｋｇ当たり２５～１５０ｋＪの比エネルギー入力（ｋｇｓｕｓ
－１）を有する、ステップと、ｃ）任意選択で、微細藻類の懸濁液に酵素を添加するステップと、を含み、該微細藻類の懸濁液が、ステップｂ）及び／又はステップｃ）の後に、４℃～３７℃で６時間～４８時間インキュベートされることを特徴とする方法に関する。
【0039】
一実施形態では、微細藻類の懸濁液を、例えば３００ｒｐｍで撹拌しながらインキュベートする。
【0040】
本発明はさらに、ヒトが摂取するための微細藻類における脂質の酸化安定性を維持する方法であって、ａ）微細藻類の懸濁液を調製するステップであって、微細藻類は、緑藻植物門、オクロ植物門、及び不等毛植物門から選択される門に属する、ステップと、ｂ）懸濁液１ｋｇ当たり２５～１５０ｋＪの比エネルギー入力（ｋｇｓｕｓ
－１）を有するパルス電界を微細藻類の懸濁液に印加するステップと、ｃ）任意選択で、微細藻類の懸濁液に酵素を添加するステップと、を含む、方法に関する。
【0041】
本発明はさらに、微細藻類のバイオマスを含む、ヒトが摂取するための製品であって、本発明による方法によって作製された製品に関する。
【0042】
一実施形態では、製品は、例えばＲＴＤ飲料として、ヒトが摂取するためのものである。
【図面の簡単な説明】
【0043】
【図1】図１は、２０ｋＶ ｃｍ－１及び様々なパルス幅（５～２５μｓ）で処理されたＣ．ブルガリスのバイオマス、ならびに５μｓ及び様々な電界強度（２０～３０ｋＶ ｃｍ－１）で処理されたバイオマスの脂質抽出能（％）を示す。
【図3】図３は、ＰＥＦ処理（２０ｋＶ ｃｍ－１で５μｓ）、その後４℃（●）、２５℃（）、及び３７℃（▲）でインキュベートした後のＣ．ブルガリスのバイオマスの、脂質のバイオアクセシビリティ（％）を示す。インキュベーションなし及びインキュベーションありの未処理バイオマスの脂質のバイオアクセシビリティ（４℃、７２時間）も示す（■）。
【発明を実施するための形態】
【0044】
微細藻類調製物
好ましくは、微細藻類は、Ｂｏｌｄ基本培地中で培養される。培地には、約２０ｇ／Ｌグルコースを添加することができる。微細藻類は、暗所で、例えば約２５℃で増殖させてもよい。好ましくは、微細藻類は、増殖させながら、例えば振盪インキュベーター中で約１５０ｒｐｍで振盪する。微細藻類は、例えば、定常期に達したときに、典型的には培養開始から約４日後に収穫されてもよい。次いで、微細藻類を、典型的には、例えば約４℃で、約１００００ｇで約１０分間遠心分離する。得られたペレットをパルス電界処理に使用する。好ましくは、微細藻類は、Ｃ．ブルガリス、例えばＣＣＡＬＡ２５６である。この微細藻類は、Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃ Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ（Ｔｒｅｂｏｎ、チェコ共和国）から購入することができる。
好ましくは、微細藻類は、Ｂｏｌｄ基本培地中で培養される。培地には、約２０ｇ／Ｌグルコースを添加することができる。微細藻類は、暗所で、例えば約２５℃で増殖させてもよい。好ましくは、微細藻類は、増殖させながら、例えば振盪インキュベーター中で約１５０ｒｐｍで振盪する。微細藻類は、例えば、定常期に達したときに、典型的には培養開始から約４日後に収穫されてもよい。次いで、微細藻類を、典型的には、例えば約４℃で、約１００００ｇで約１０分間遠心分離する。得られたペレットをパルス電界処理に使用する。好ましくは、微細藻類は、Ｃ．ブルガリス、例えばＣＣＡＬＡ２５６である。この微細藻類は、Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃ Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ（Ｔｒｅｂｏｎ、チェコ共和国）から購入することができる。
【0045】
パルス電界
典型的には、微細藻類濃度は、ＰＥＦ処理前に約７０ｇ／Ｌである。微細藻類ペレットは、典型的には、例えば約ｐＨ６のリン酸カリウム緩衝液に再懸濁される。導電率（σ）は、約２ｍＳ ｃｍ－１に調整することができる。微細藻類懸濁液のＰＥＦ処理では、平行平板（ｐｌａｔｅ－ｐｌａｔｅ）のエレクトロポレーションキュベットを使用してもよい。電極距離は約４ｍｍとしてもよい。印加電圧を８ｋＶ～１２ｋＶの間で変更してもよい。得られる電界強度は、２０ｋＶ ｃｍ－１～３０ｋＶ ｃｍ－１であり得る。５μｓ～２５μｓのパルス幅が適用されてもよい。パルス回数１０を適用してもよい。ＰＥＦ処理の後、微細藻類は、異なる温度（例えば、約４℃、２５℃、又は３７℃）で異なる時間（０時間、１時間、６時間、１２時間、１８時間、２４時間、４８時間、７２時間）、約３００ｒｐｍでインキュベートすることができる。次いで、微細藻類バイオマスは液体窒素で瞬間凍結させてもよい。
典型的には、微細藻類濃度は、ＰＥＦ処理前に約７０ｇ／Ｌである。微細藻類ペレットは、典型的には、例えば約ｐＨ６のリン酸カリウム緩衝液に再懸濁される。導電率（σ）は、約２ｍＳ ｃｍ－１に調整することができる。微細藻類懸濁液のＰＥＦ処理では、平行平板（ｐｌａｔｅ－ｐｌａｔｅ）のエレクトロポレーションキュベットを使用してもよい。電極距離は約４ｍｍとしてもよい。印加電圧を８ｋＶ～１２ｋＶの間で変更してもよい。得られる電界強度は、２０ｋＶ ｃｍ－１～３０ｋＶ ｃｍ－１であり得る。５μｓ～２５μｓのパルス幅が適用されてもよい。パルス回数１０を適用してもよい。ＰＥＦ処理の後、微細藻類は、異なる温度（例えば、約４℃、２５℃、又は３７℃）で異なる時間（０時間、１時間、６時間、１２時間、１８時間、２４時間、４８時間、７２時間）、約３００ｒｐｍでインキュベートすることができる。次いで、微細藻類バイオマスは液体窒素で瞬間凍結させてもよい。
【0046】
酵素の添加／酵素処理
酵素処理の前に、微細藻類は典型的にはリン酸カリウム緩衝液中に懸濁される。緩衝液濃度は、典型的には約５０ｍＭである。緩衝液は典型的には約ｐＨ６である。微細藻類濃度は約２０ｇ／Ｌにしてもよい。キチナーゼ、ラムノガラクツロナン ラムノヒドロラーゼ、及び／又はエンド－１，４－β－ガラクタナーゼを微細藻類懸濁液に添加してもよい。エンド－１，４－β－ガラクタナーゼは、約ｐＨ６のリン酸カリウム緩衝液中に存在させてもよい。次いで、懸濁液を３７℃、約３００ｒｐｍで約２４時間インキュベートしてもよい。インキュベーション後、バイオマスを液体窒素で瞬間凍結させてもよい。
酵素処理の前に、微細藻類は典型的にはリン酸カリウム緩衝液中に懸濁される。緩衝液濃度は、典型的には約５０ｍＭである。緩衝液は典型的には約ｐＨ６である。微細藻類濃度は約２０ｇ／Ｌにしてもよい。キチナーゼ、ラムノガラクツロナン ラムノヒドロラーゼ、及び／又はエンド－１，４－β－ガラクタナーゼを微細藻類懸濁液に添加してもよい。エンド－１，４－β－ガラクタナーゼは、約ｐＨ６のリン酸カリウム緩衝液中に存在させてもよい。次いで、懸濁液を３７℃、約３００ｒｐｍで約２４時間インキュベートしてもよい。インキュベーション後、バイオマスを液体窒素で瞬間凍結させてもよい。
【0047】
酵素処理と組み合わせたＰＥＦ
微細藻類バイオマスは、典型的には、約５μｓのパルス幅で処理される。電界強度は、約２０ｋＶ ｃｍ－１であってもよい。１０パルスを使用してもよい。リン酸カリウム緩衝液、例えばｐＨ６の５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液で懸濁液を約２０ｇ／Ｌに希釈する前に、酵素を添加してもよい。キチナーゼ、ラムノガラクツロナン ラムノヒドロラーゼ、及び／又はエンド－１，４－β－ガラクタナーゼを添加してもよい。混合後、典型的には、試料を３７℃で約２４時間、約３００ｒｐｍでインキュベートする。インキュベーション後、バイオマスを直ちにスナップ凍結してもよい。
微細藻類バイオマスは、典型的には、約５μｓのパルス幅で処理される。電界強度は、約２０ｋＶ ｃｍ－１であってもよい。１０パルスを使用してもよい。リン酸カリウム緩衝液、例えばｐＨ６の５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液で懸濁液を約２０ｇ／Ｌに希釈する前に、酵素を添加してもよい。キチナーゼ、ラムノガラクツロナン ラムノヒドロラーゼ、及び／又はエンド－１，４－β－ガラクタナーゼを添加してもよい。混合後、典型的には、試料を３７℃で約２４時間、約３００ｒｐｍでインキュベートする。インキュベーション後、バイオマスを直ちにスナップ凍結してもよい。
【0048】
定義
組成が重量％を単位として本明細書に記載される場合、別途記載のない限り、乾燥ベースでの材料混合物を意味する。
組成が重量％を単位として本明細書に記載される場合、別途記載のない限り、乾燥ベースでの材料混合物を意味する。
【0049】
本明細書で使用される場合、用語「約」は、数値範囲内、例えば、参照数字の－３０％から＋３０％の範囲内、又は参照数字の－２０％から＋２０％の範囲内、又は参照数字の－１０％から＋１０％の範囲内、又は参照数字の－５％から＋５％の範囲内、又は参照数字の－１％から＋１％の範囲内の数を指すものと理解されたい。本明細書における全ての数値範囲は、その範囲内の全ての整数又は分数を含むと理解されるべきである。
【0050】
当業者は、本明細書に開示される本発明の全ての特徴を自由に組み合わせることができることを理解するであろう。特に、本発明の組成物について記載された特徴を本発明の方法又は使用と組み合わせてもよく、逆もまた同様である。更に、本発明の異なる実施形態について記載された特徴を組み合わせてもよい。既知の均等物が特定の特徴について存在する場合、このような均等物は、本明細書で具体的に言及されているかのごとく組み込まれる。
【0051】
本発明の更なる利点及び特徴は、図面及び非限定的な実施例から明らかである。
【実施例】
【0052】
以下の実施例は、本発明の範囲内に同様に該当する幾つかの製品及び方法について例示的なものである。本発明の観点から、変更及び改変をなすことができる。当業者であれば、これらの例において、多様な用途に際し本発明の栄養素及び他の要素には合理的な調整がなされ、処方、材料、加工、及び混合物には多岐にわたる変形が存在することを認識されるであろう。
【0053】
実施例１
微細藻類の培養
Ｃ．ブルガリス（ＣＣＡＬＡ ２５６）は、Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃ Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ（Ｔｒｅｂｏｎ、Ｃｚｅｃｈ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ）から購入した。Ｃ．ブルガリスを、振盪インキュベーター（Ｍｕｌｔｉｔｒｏｎ Ｐｒｏ、Ｉｎｆｏｒｓ ＡＧ、Ｂｏｔｔｍｉｎｇｅｎ、スイス）内で、５００ｍＬエルレンマイヤーフラスコ（ワーキングボリューム２５０ｍＬ）中の、２０ｇ／Ｌグルコースを添加したボールド基本培地で、生物学的な三連試料（脂質抽出能実験については二連）として暗所、２５℃及び１５０ｒｐｍで培養した。４日間の培養後、定常期に達したときにバイオマスを回収し、遠心分離した（１００００ｇ、１０分、４℃）。上清を廃棄し、ペレット（新鮮なバイオマス）をさらなる実験に使用した。
微細藻類の培養
Ｃ．ブルガリス（ＣＣＡＬＡ ２５６）は、Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃ Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ（Ｔｒｅｂｏｎ、Ｃｚｅｃｈ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ）から購入した。Ｃ．ブルガリスを、振盪インキュベーター（Ｍｕｌｔｉｔｒｏｎ Ｐｒｏ、Ｉｎｆｏｒｓ ＡＧ、Ｂｏｔｔｍｉｎｇｅｎ、スイス）内で、５００ｍＬエルレンマイヤーフラスコ（ワーキングボリューム２５０ｍＬ）中の、２０ｇ／Ｌグルコースを添加したボールド基本培地で、生物学的な三連試料（脂質抽出能実験については二連）として暗所、２５℃及び１５０ｒｐｍで培養した。４日間の培養後、定常期に達したときにバイオマスを回収し、遠心分離した（１００００ｇ、１０分、４℃）。上清を廃棄し、ペレット（新鮮なバイオマス）をさらなる実験に使用した。
【0054】
Ｃ．ブルガリスの増殖を、７５０ｎｍでの光学密度（ＯＤ）測定（ＧＥＮＥＳＹＳ（商標）１０Ｓ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、米国）によってモニタリングした。ＯＤと乾燥重量（ＤＷ）との間の相関係数は、式（Ｒ２＝０．９７９６）によって示される。
ＤＷ［ｇＬ－１］＝０．５５９６・ＯＤ７５０ｎｍ＋０．４１７９
ＤＷ［ｇＬ－１］＝０．５５９６・ＯＤ７５０ｎｍ＋０．４１７９
【0055】
実施例２
パルス電界
細胞のエレクトロポレーションの前に、微細藻類培養物の濃度及び導電率を標準化した。全てのＰＥＦ実験について、微細藻類濃度を７０ｇ／Ｌに設定した。
パルス電界
細胞のエレクトロポレーションの前に、微細藻類培養物の濃度及び導電率を標準化した。全てのＰＥＦ実験について、微細藻類濃度を７０ｇ／Ｌに設定した。
【0056】
新鮮なバイオマスペレットを、ｐＨ６のリン酸カリウム緩衝液中に再懸濁し、２ｍＳ ｃｍ－１の導電率（σ）に調整した。導電率の調整により、その後のＰＥＦ処理に適合した負荷条件を確保した。微細藻類懸濁液の調製直後に導電率を測定したところ、１．７ｍＳ ｃｍ－１であった。ボルテックス処理後、微細藻類懸濁液の１ｍＬアリコートを、ＰＥＦ処理のために平行平板のエレクトロポレーションキュベット（ＶＷＲ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｂｖｂａ．、Ｌｅｕｖｅｎ、ベルギー）に移した。試料を４ｍｍの電極距離でバッチ処理した。実験装置は、ＲＵＰ６－１５ＣＬパルス発生器（ＧＢＳ－Ｅｌｅｋｔｒｏｎｉｋ、Ｒａｄｅｂｅｒｇ、ドイツ）にキュベットホルダーを接続して構成した。Ｗａｖｅ Ｓｕｒｆｅｒ １０オシロスコープ（Ｔｅｌｅｄｙｎｅ ＬｅＣｒｏｙ ＧｍｂＨ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ドイツ）に接続したＰ６０１５Ａ電圧プローブ（Ｔｅｋｔｒｏｎｉｘ Ｉｎｃ．、Ｂｅａｖｅｒｔｏｎ ＯＲ、米国）を用いてパルス測定を行った。印加電圧を８ｋＶと１２ｋＶの間で変化させ、それぞれ２０ｋＶ ｃｍ－１及び３０ｋＶ ｃｍ－１の電界強度を得た。５μｓ～２５μｓのパルス幅及び１０のパルス数を適用した。様々な組み合わせを体系的に試験して、脂質抽出能に対する影響を調査した。ＰＥＦ処理の後、いくつかのキュベットに由来するバイオマスを合わせ、異なる温度（４℃、２５℃、３７℃）で異なる時間（０時間、１時間、６時間、１２時間、１８時間、２４時間、４８時間、７２時間）、３００ｒｐｍでインキュベートした。インキュベーション後、バイオマスを液体窒素で直ちに急速凍結させ、さらなる分析まで－２０℃で保存した。未処理試料（対照）を濃縮し、同じ導電率に標準化し、インキュベートし、次いで急速凍結させた。図１は、２０ｋＶ ｃｍ－１及び様々なパルス幅（５～２５μｓ）で処理されたＣ．ブルガリスのバイオマス、ならびに５μｓ及び様々な電界強度（２０～３０ｋＶ ｃｍ－１）で処理されたバイオマスの脂質抽出能（％）を示す。
【0057】
電界強度の効果を、５μｓの一定パルス幅で評価した（２０～３０ｋＶ ｃｍ－１）（図２）。両方の実験において、バイオマス懸濁液をＰＥＦ処理後に２５℃で１時間インキュベートした。脂質抽出能は、５μｓでのＰＥＦ処理により未処理対照と比較して増強された。より高いパルス幅、したがってより高いエネルギー入力での処理は、脂質抽出能の改善をもたらさなかった。様々な電界強度及び５μｓの一定パルス幅で脂質抽出能を評価した。バイオマスを２０ｋＶ ｃｍ－１で処理した場合、脂質抽出能は対照よりも１５．８％高かったが、２５ｋＶ ｃｍ－１で処理した場合に最も高い増加に達した（＋２６．９％）。より高い電界強度（３０ｋＶ ｃｍ－１）、すなわちより大きなエネルギー入力では、脂質抽出能が低下した。注目すべきことに、２５ｋＶ ｃｍ－１以上で処理すると、システムの不安定性が生じた。２０ｋＶ ｃｍ－１で５μｓのパルスは、３１．８ｋＪ ｋｇｓｕｓ
－１のエネルギー入力によるμｓＰＥＦ処理を表す。
【0058】
実施例３
酵素処理：
新鮮な微細藻類バイオマスを、ｐＨ６の５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液に２０ｇ／Ｌで懸濁した。キチナーゼ溶液（７００μＬ、微細藻類懸濁液中１ｍｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、スイス）、ラムノガラクツロナン ラムノヒドロラーゼ（３５μＬ、ＮＺＹＴｅｃｈ、ポルトガル）、エンド－１，４－β－ガラクタナーゼ（１．７５μＬ、リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ６中７５０Ｕ／ｍＬ、Ｍｅｇａｚｙｍｅ、アイルランド）を微細藻類懸濁液に添加した。混合後、試料を撹拌プレート上で３７℃、３００ｒｐｍで２４時間インキュベートした。インキュベーション後、バイオマスを液体窒素で直ちに急速凍結し、さらなる分析まで－２０℃で保存した。対照（未処理バイオマス）では、酵素溶液をリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６、５０ｍＭ）で置き換えた。全てのチューブを３００ｒｐｍの撹拌プレート上で３７℃で２４時間インキュベートした。インキュベーション後、試料を回収し、砕氷中で直ちに冷却した。
酵素処理：
新鮮な微細藻類バイオマスを、ｐＨ６の５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液に２０ｇ／Ｌで懸濁した。キチナーゼ溶液（７００μＬ、微細藻類懸濁液中１ｍｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、スイス）、ラムノガラクツロナン ラムノヒドロラーゼ（３５μＬ、ＮＺＹＴｅｃｈ、ポルトガル）、エンド－１，４－β－ガラクタナーゼ（１．７５μＬ、リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ６中７５０Ｕ／ｍＬ、Ｍｅｇａｚｙｍｅ、アイルランド）を微細藻類懸濁液に添加した。混合後、試料を撹拌プレート上で３７℃、３００ｒｐｍで２４時間インキュベートした。インキュベーション後、バイオマスを液体窒素で直ちに急速凍結し、さらなる分析まで－２０℃で保存した。対照（未処理バイオマス）では、酵素溶液をリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６、５０ｍＭ）で置き換えた。全てのチューブを３００ｒｐｍの撹拌プレート上で３７℃で２４時間インキュベートした。インキュベーション後、試料を回収し、砕氷中で直ちに冷却した。
【0059】
実施例４
酵素処理と組み合わせたＰＥＦ
微細藻類バイオマスを、５μｓのパルス幅、２０ｋＶ ｃｍ－１の電界強度、１０パルスで処理した。複数の電気穿孔キュベットからバイオマスを合わせ、次の酵素、すなわちキチナーゼ（７００μＬ、リン酸カリウム緩衝液中１ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ６）、ラムノガラクツロナン ラムノヒドロラーゼ（３５μＬ、ＮＺＹＴｅｃｈ、ポルトガル）、エンド－１，４－β－ガラクタナーゼ（１．７５μＬ、リン酸カリウム緩衝液中７５０Ｕ／ｍＬ、ｐＨ６、Ｍｅｇａｚｙｍｅ、アイルランド）、を添加した後、懸濁液をリン酸カリウム緩衝液５０ｍＭ、ｐＨ６）で２０ｇ／Ｌに希釈した。混合後、試料を３７℃で２４時間、３００ｒｐｍで撹拌プレート上でインキュベートした。インキュベーション後、バイオマスを液体窒素で直ちに急速凍結し、さらなる分析まで－２０℃で保存した。
酵素処理と組み合わせたＰＥＦ
微細藻類バイオマスを、５μｓのパルス幅、２０ｋＶ ｃｍ－１の電界強度、１０パルスで処理した。複数の電気穿孔キュベットからバイオマスを合わせ、次の酵素、すなわちキチナーゼ（７００μＬ、リン酸カリウム緩衝液中１ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ６）、ラムノガラクツロナン ラムノヒドロラーゼ（３５μＬ、ＮＺＹＴｅｃｈ、ポルトガル）、エンド－１，４－β－ガラクタナーゼ（１．７５μＬ、リン酸カリウム緩衝液中７５０Ｕ／ｍＬ、ｐＨ６、Ｍｅｇａｚｙｍｅ、アイルランド）、を添加した後、懸濁液をリン酸カリウム緩衝液５０ｍＭ、ｐＨ６）で２０ｇ／Ｌに希釈した。混合後、試料を３７℃で２４時間、３００ｒｐｍで撹拌プレート上でインキュベートした。インキュベーション後、バイオマスを液体窒素で直ちに急速凍結し、さらなる分析まで－２０℃で保存した。
【0060】
実施例５
脂質抽出能
ヘキサン：イソプロパノール（ＨＩ）抽出効率を測定して脂質抽出能を評価した。ＨＩ抽出効率は、ヘキサン：イソプロパノール（３：２ ｖ／ｖ）によって抽出された遊離脂質を、直接エステル交換によって測定された総脂質と比較した比として表され、パーセンテージとして表される。ＨＩは、損傷のない剛性微細藻類細胞には容易に浸透せず、より低い抽出収率をもたらす。
脂質抽出能
ヘキサン：イソプロパノール（ＨＩ）抽出効率を測定して脂質抽出能を評価した。ＨＩ抽出効率は、ヘキサン：イソプロパノール（３：２ ｖ／ｖ）によって抽出された遊離脂質を、直接エステル交換によって測定された総脂質と比較した比として表され、パーセンテージとして表される。ＨＩは、損傷のない剛性微細藻類細胞には容易に浸透せず、より低い抽出収率をもたらす。
【0061】
ヘキサン：イソプロパノール（３：２ ｖ／ｖ、１．５ｍＬ）を１０ｍｇの凍結乾燥ＰＥＦ処理微細藻類バイオマスに添加し、混合物を３０秒間ボルテックスした。試料を遠心分離し（１０分、７５０ｇ、２５℃）、抽出された脂質を含有する溶媒層を、秤量したフラスコに移した。これらの抽出ステップを合計４回行った。全ての溶媒層を合わせ、続いて溶媒を窒素気流下で蒸発により除去した。抽出された脂質及び乾燥バイオマス中の総脂質を、脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）へのエステル交換時にガスクロマトグラフィー（ＧＣ）によって定量した。簡単に説明すると、１．５Ｎメタノール性塩酸溶液を用いて脂肪酸を直接トランスエステル化し、スプリット注入ポート及び水素炎イオン化検出（ＦＩＤ）（７８９０Ａ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｂａｓｅｌ、スイス）を備えた装置を使用してガスクロマトグラフィーにより分析した。次の温度－時間プログラム：５０℃（０．２分）、５０～１８０℃（１２０℃ ｍｉｎ－１、１８０～２２０℃（６．７℃ ｍｉｎ－１、及び２２０～２５０℃（３０℃ ｍｉｎ－１）を、１０ｍの長さ、０．１ｍｍの内径、及び０．２μｍのフィルムを有する７０％シアノプロピルポリシルフェニレン－シロキサンカラム（ＢＰＸ７０；ＳＧＥ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｍｉｌｔｏｎ Ｋｅｙｎｅｓ、英国）に用いた。ピークの同定は、保持時間をＦＡＭＥ標準（Ｎｕ－Ｃｈｅｋ Ｐｒｅｐ．Ｉｎｃ．、Ｅｌｙｓｉａｎ、米国）と比較することにより実施した。ピーク面積を、ＯｐｅｎＬａｂ ＣＤＳ ＶＬソフトウェア（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｂａｓｅｌ、スイス）で定量化した。
【0062】
実施例６
脂質のバイオアクセシビリティ
標準化されたプロトコル（ＩＮＦＯＧＥＳＴ２．０）に従って、インビトロ消化モデルによって、脂質のバイオアクセシビリティを測定した。簡単に述べると、３００ｒｐｍで撹拌しながら３７℃で三連（ｎ＝３）で消化を行った。口腔相（２分、ｐＨ７）をシミュレートするために、次の溶液、すなわち水（１．１３ｍＬ）、模擬唾液（ＳＳＦ、０．９６ｍＬ）、及びＣａＣｌ２（６μＬ、０．３Ｍ）を凍結乾燥バイオマス（０．３ｇ）と混合した。胃相を開始させるために、模擬胃液（ＳＧＦ、１．９２ｍＬ）及びＣａＣｌ２（１．２μＬ、０．３Ｍ）を経口ボーラスに添加し、ｐＨを３に設定した。ペプシン（０．１２ｍＬ、８００００Ｕ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｂｕｃｈｓ、スイス）及び胃リパーゼ（０．１２ｍＬ、２４００Ｕ／ｍＬ、Ｌｉｐｏｌｙｔｅｃｈ、Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ、Ｆｒａｎｃｅ）を添加し、最終容量を水で４．８ｍＬにした。定期的にｐＨを３に調整した。２時間インキュベートした後、ｐＨを７に設定し、模擬腸液（ＳＩＦ、２．０４ｍＬ）、ＣａＣｌ２（９．６μＬ、０．３Ｍ）、パンクレアチン（１．２ｍＬ、８００Ｕ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、及び胆汁酸塩（０．６ｍＬ、０．１６ｍＭ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加した。水を添加して最終体積を９．６ｍＬとした。２時間のインキュベーション後、完全消化物のアリコート（２ｍＬ）を液体窒素で凍結し、凍結乾燥した。残りの完全な消化物を遠心分離した（３０分、１００００ｇ、４℃）。ミセル相（上清）及びペレットを別々に液体窒素で凍結し、凍結乾燥した。全体的なバイオアクセシビリティが予想される乳児用フォーミュラ（Ａｐｔａｍｉｌ １、Ｍｉｌｕｐａ、Ｄｕｂｌｉｎ、アイルランド）を陽性対照として使用し、インビトロ消化に供した。微細藻類バイオマスを含まない水（１．２ｍＬ）をブランクとして消化して、消化液及び酵素に由来する脂肪酸を定量した。
脂質のバイオアクセシビリティ
標準化されたプロトコル（ＩＮＦＯＧＥＳＴ２．０）に従って、インビトロ消化モデルによって、脂質のバイオアクセシビリティを測定した。簡単に述べると、３００ｒｐｍで撹拌しながら３７℃で三連（ｎ＝３）で消化を行った。口腔相（２分、ｐＨ７）をシミュレートするために、次の溶液、すなわち水（１．１３ｍＬ）、模擬唾液（ＳＳＦ、０．９６ｍＬ）、及びＣａＣｌ２（６μＬ、０．３Ｍ）を凍結乾燥バイオマス（０．３ｇ）と混合した。胃相を開始させるために、模擬胃液（ＳＧＦ、１．９２ｍＬ）及びＣａＣｌ２（１．２μＬ、０．３Ｍ）を経口ボーラスに添加し、ｐＨを３に設定した。ペプシン（０．１２ｍＬ、８００００Ｕ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｂｕｃｈｓ、スイス）及び胃リパーゼ（０．１２ｍＬ、２４００Ｕ／ｍＬ、Ｌｉｐｏｌｙｔｅｃｈ、Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ、Ｆｒａｎｃｅ）を添加し、最終容量を水で４．８ｍＬにした。定期的にｐＨを３に調整した。２時間インキュベートした後、ｐＨを７に設定し、模擬腸液（ＳＩＦ、２．０４ｍＬ）、ＣａＣｌ２（９．６μＬ、０．３Ｍ）、パンクレアチン（１．２ｍＬ、８００Ｕ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、及び胆汁酸塩（０．６ｍＬ、０．１６ｍＭ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加した。水を添加して最終体積を９．６ｍＬとした。２時間のインキュベーション後、完全消化物のアリコート（２ｍＬ）を液体窒素で凍結し、凍結乾燥した。残りの完全な消化物を遠心分離した（３０分、１００００ｇ、４℃）。ミセル相（上清）及びペレットを別々に液体窒素で凍結し、凍結乾燥した。全体的なバイオアクセシビリティが予想される乳児用フォーミュラ（Ａｐｔａｍｉｌ １、Ｍｉｌｕｐａ、Ｄｕｂｌｉｎ、アイルランド）を陽性対照として使用し、インビトロ消化に供した。微細藻類バイオマスを含まない水（１．２ｍＬ）をブランクとして消化して、消化液及び酵素に由来する脂肪酸を定量した。
【0063】
全消化物及びミセル相の脂質含有量を分析した。脂質含有量は、測定された総脂肪酸として表した。脂質のバイオアクセシビリティは、ミセル相に含まれる脂質の量（酵素ブランクのミセル相中の脂質によって補正される）を全消化物中の脂質の量（それぞれ、酵素ブランクの全消化物中の脂質によって補正される）で割ったものとして定義し、パーセンテージ（％）として表した。
【0064】
ＰＥＦ処理（２０ｋＶ ｃｍ－１で５μｓ）したＣ．ブルガリスのバイオマスの、インビトロ消化モデルによる脂質のバイオアクセシビリティを分析した後、異なる温度（４℃、２５℃、３７℃）で７２時間までのインキュベーション条件に供した（図３）。インキュベーション後、藻類懸濁液を液体窒素中で直ちに急速凍結し、次のインビトロ消化のために凍結乾燥した。パラメータのこの組合せは、本試験において以前に試験した実施可能なものの中から、最も高い脂質抽出能をもたらすものとして選択した。
【0065】
図３は、ＰＥＦ処理（２０ｋＶ ｃｍ－１で５μｓ）、その後４℃（●）、２５℃（）、及び３７℃（▲）でインキュベートした後のＣ．ブルガリスのバイオマスの、脂質のバイオアクセシビリティ（％）を示す。インキュベーションなし及びインキュベーションありの未処理バイオマスの脂質のバイオアクセシビリティ（４℃、７２時間）も示す（■）。エラーバーは、生物学的な三連試料（ｎ＝３）間の標準偏差を示す。
【0066】
ＰＥＦ処理なしでのインキュベーション（４℃、７２時間）では、脂質のバイオアクセシビリティは１０．４±１．７％となり、この値は、ＰＥＦ処理し、続いて２５℃又は３７℃で少なくとも６時間のインキュベーション及び４℃で少なくとも２４時間のインキュベーションを行った試料で得られた値よりも低い。いずれのインキュベーション温度でも、ＰＥＦ処理後のインキュベーション時間が長くなると、脂質のバイオアクセシビリティは増加した。図３は、１８％～１９％を最大とする、脂質のバイオアクセシビリティのプラトーを示す。この値には、２５℃又は３７℃のいずれかで維持されたバイオマスの１２時間のインキュベーション後に到達した。脂質のバイオアクセシビリティを１８．７±１．６％とするためには、４℃でより長時間のインキュベーション（４８時間）が必要であった。理論に束縛されることを望むものではないが、さらなる増加が得られなかった理由は、ＰＥＦ処理藻類の水性インキュベーションにより、消化酵素が反応することが難しい大きな独特のボディへの脂肪滴の融合がもたらされたためであり得る。
【0067】
より長時間のインキュベーションでの脂質のバイオアクセシビリティの増加は、ＰＥＦが自己消化酵素の放出を誘導した後、かかる自己消化酵素が細胞壁を分解し、脂質のバイオアクセシビリティの増加に有利に働くという理論と一致する。さらに、脂質のバイオアクセシビリティに関し反応速度のふるまいが温度に比例していることは、酵素活性が温度依存性である機序において内因性酵素が果たす役割をさらに示唆している。このような、酵素により促進されるプロセスは、実際に、非生理学的温度、すなわち４℃では減速され得る。
【0068】
図４は、ＨＰＨによりもたらされた脂質のバイオアクセシビリティが最も高かったことを示す。興味深いことに、この処理後のインキュベートは脂質のバイオアクセシビリティに対していかなる効果も有さなかった。インキュベートなしのＨＰＨは５５．４±２．４％であり、２４時間インキュベーションしたＨＰＨは５６．５±２．２％であった。ＨＰＨによる藻類細胞の機械的破壊は激しくかつ迅速であり、細胞内化合物の水相へのほぼ瞬間的な拡散をもたらす。脂質画分は、追加のインキュベーションを必要とすることなく既に利用可能になっていた。
【0069】
ＰＥＦ処理は、対照（４．０％±２．１％）と比較して脂質のバイオアクセシビリティの１７％の増加を示したが、酵素処理は、脂質のバイオアクセシビリティ（４．３％±３．６％）に対していかなる関連効果も有さなかった。
【0070】
ＰＥＦ処理と組み合わせて酵素をバイオマスに添加した場合、ＰＥＦ処理バイオマス（２０．９％±３．２％）と比較して明確な効果は示されなかった（２４．４％±２．８％）。ＰＥＦ処理の前に酵素を添加した場合には差が報告されなかったことを理由として（データ不掲載）、この実験では酵素をＰＥＦ処理の後に添加した。
【0071】
実施例７
粒子サイズ
処理した新鮮な微細藻類細胞の粒子サイズをＬＳ １３ ３２０レーザー回折粒径分析器（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｂｒｅａ、Ｃａｎａｄａ）で測定することによって、細胞の完全性を三連（ｎ＝３）で評価した。結果は、体積に基づく液滴サイズ分布の平均径（ｄ４３）として示した。
粒子サイズ
処理した新鮮な微細藻類細胞の粒子サイズをＬＳ １３ ３２０レーザー回折粒径分析器（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｂｒｅａ、Ｃａｎａｄａ）で測定することによって、細胞の完全性を三連（ｎ＝３）で評価した。結果は、体積に基づく液滴サイズ分布の平均径（ｄ４３）として示した。
【0072】
図５は、未処理（対照）、ＰＥＦ処理、酵素処理（キチナーゼ＋ラムノヒドロラーゼ＋ガラクタナーゼ）、ＰＥＦ＋酵素処理、及び１００ＭＰａのＨＰＨ処理での、Ｃ．ブルガリス細胞の平均粒径を示す。ＰＥＦ（４．７±０．３μｍ）処理及び酵素（５．０±０．１μｍ）処理は、対照（５．１±０．１μｍ）と比較して粒径のわずかな減少のみをもたらした。ＰＥＦ処理は細胞の完全性を維持して、外観上は損傷のない（ｖｉｓｕａｌｌｙ ｉｎｔａｃｔ）微細藻類細胞をもたらす。自己消化により完全な細胞破壊は伴わずに細胞壁分解が誘導される酵母において示されるように、ＰＥＦ処理後に自己消化プロセスが生じた場合であっても、細胞の損傷のない状態（ｉｎｔａｃｔｎｅｓｓ）は維持される。対照的に、１００ＭＰａでのＨＰＨ処理は、平均粒径を２±０．１μｍに減少させ、微細藻類細胞の顕著な崩壊を引き起こし、１５０ＭＰａで５回通過させた後のＣ．ブルガリスの平均粒子サイズは２．２２μｍであった。ＰＥＦと酵素との組合せは、粒径を４．５±０．１μｍに減少させた。したがって、ＰＥＦ処理は、細胞壁多糖類に対する酵素の作用を促進し、酵素及びＰＥＦの単独よりもわずかに進んだ細胞壁崩壊をもたらしたようである。
【0073】
図５は、未処理（対照）、ＰＥＦ処理、酵素処理（キチナーゼ＋ラムノヒドロラーゼ＋ガラクタナーゼ）、ＰＥＦ＋酵素処理、及び１００ＭＰａのＨＰＨ処理での、Ｃ．ブルガリス細胞の体積基準液滴サイズ分布（ｄ４３）の平均径を示す。エラーバーは、三連（ｎ＝３）の標準偏差を表す。
【0074】
図７は、未処理（対照、●）、酵素処理（キチナーゼ＋ラムノヒドロラーゼ＋ガラクタナーゼ、■）、ＰＥＦ処理（×）、ＰＥＦ＋酵素処理（◆）、及び高圧ホモジナイゼーション処理（ＨＰＨ、▲）での、Ｃ．ブルガリス細胞の体積密度として、粒子サイズ分布（ｑ３、μｍ－１）を示す。
【0075】
実施例８
微生物の増殖
ＰＥＦ処理したバイオマス（４℃で４８時間インキュベートした）の微生物の増殖（総生菌数）を生物学的な三連試料で測定した。バイオマスをＤｉｆｃｏ（商標）マキシマムリカバリー希釈液で二連で希釈し（１０－１、１０－２、１０－３）、２５μＬを汎用増殖培地に播種し、続いて低温（４℃）及び中温（３０℃）条件下でインキュベートした。コロニー形成単位（ＣＦＵ）を２４時間後及び４８時間後に計数し、ＣＦＵ数が２０～２００であるプレートを関連性があるとみなした。
微生物の増殖
ＰＥＦ処理したバイオマス（４℃で４８時間インキュベートした）の微生物の増殖（総生菌数）を生物学的な三連試料で測定した。バイオマスをＤｉｆｃｏ（商標）マキシマムリカバリー希釈液で二連で希釈し（１０－１、１０－２、１０－３）、２５μＬを汎用増殖培地に播種し、続いて低温（４℃）及び中温（３０℃）条件下でインキュベートした。コロニー形成単位（ＣＦＵ）を２４時間後及び４８時間後に計数し、ＣＦＵ数が２０～２００であるプレートを関連性があるとみなした。
【0076】
表１において、微生物増殖は、バイオマス１ｍＬ当たりのコロニー形成単位（ＣＦＵ／ｍＬ）で示す。増殖は、スイス連邦内務省により満足のいくものとみなされる下限（ｍｉｎｉｍｕｍ ｌｉｍｉｔ）値（≦１００ＣＦＵ／ｇ）をはるかに下回った。参照されるガイドラインは、例示的な病原性中温性細菌の大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）についてのものであり、したがって比較によく適している。
【0077】
表１は、ＰＥＦ処理及びインキュベート（４８時間、４℃）したＣ．ブルガリス懸濁液をプレーティングし、４℃及び３０℃で最大４８時間インキュベートした場合の微生物増殖を示す。データは、生物学的な三連試料及び技術的な二連試料（ｎ＝６）の平均値である。
【0078】
【表1】
【0079】
処理及びインキュベートした藻類において微生物の増殖がないことで、懸濁液中に存在し得る外部細菌に由来する酵素活性の可能性が排除された。この結果はさらに、酵素による細胞壁分解活性がもともと（ｉｎｔｒｉｎｓｉｃａｌｌｙ）Ｃ．ブルガリス細胞に存在しており、ＰＥＦによって誘導される、という本発明者らの仮説を裏付けるものである。さらに、これらのデータは、食品安全性の観点から、本明細書に提示されたプロセス（ＰＥＦ、続いて４℃でのインキュベーション）の関連性を示唆した。
【0080】
実施例９
脂質の酸化安定性
二次脂質酸化生成物を測定することによって脂質酸化を調べた。簡単に説明すると、処理したバイオマスを凍結乾燥し、アンバーバイアル（６０ｍｇ）中に保持し、４０℃で０週間、２週間、４週間、６週間、８週間、及び１２週間保存した。二次酸化を三連で評価した（ｎ＝３）。バイオマス（６０ｍｇ）を１．５ｍＬのクロロホルム／メタノール（１／２、ｖ／ｖ）中に分散させた。試料を、マルチチューブボルテックスミキサー（ＤＶＸ－２５００、ＶＷＲ、スイス）中で混合した（２５００ｒｐｍ、１０分）。試料上清（１００μＬ）を、１００μＬの７－（ジエチルアミノ）－２－オキソクロメン－３－カルボヒドラジド（ＣＨＨ）及び５μＬの内部標準（ＩＳＴＤ、ヘキサナール－ｄ１２、アセトニトリル中１０μｇ／ｍＬ）と混合した。サーモミキサー（Ｃｏｍｆｏｒｔ、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、Ｓｃｈｏｎｅｎｂｕｃｈ、スイス）を使用して、１４００ｒｐｍ及び３７℃で１．５時間インキュベートした後、試料をアセトニトリル（１００μＬ）で希釈し、遠心分離した（２５００×ｇ、２０℃）。上清を、超高速液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）（Ｄｉｏｎｅｘ ＵｌｔｉＭａｔｅ ３０００）－ＱＥｘａｃｔｉｖｅ Ｐｌｕｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｂａｓｅｌ、スイス）システムに注入した。（Ｚ）－３－ヘキセナール及びヘキサナールを、それぞれω－３及びω－６の脂肪酸分解経路に由来する揮発性物質として脂質酸化の指標に選択した。応答係数は、内部標準ヘキサナール－ｄ１２の面積に対する揮発性物質の面積の比として表した。
脂質の酸化安定性
二次脂質酸化生成物を測定することによって脂質酸化を調べた。簡単に説明すると、処理したバイオマスを凍結乾燥し、アンバーバイアル（６０ｍｇ）中に保持し、４０℃で０週間、２週間、４週間、６週間、８週間、及び１２週間保存した。二次酸化を三連で評価した（ｎ＝３）。バイオマス（６０ｍｇ）を１．５ｍＬのクロロホルム／メタノール（１／２、ｖ／ｖ）中に分散させた。試料を、マルチチューブボルテックスミキサー（ＤＶＸ－２５００、ＶＷＲ、スイス）中で混合した（２５００ｒｐｍ、１０分）。試料上清（１００μＬ）を、１００μＬの７－（ジエチルアミノ）－２－オキソクロメン－３－カルボヒドラジド（ＣＨＨ）及び５μＬの内部標準（ＩＳＴＤ、ヘキサナール－ｄ１２、アセトニトリル中１０μｇ／ｍＬ）と混合した。サーモミキサー（Ｃｏｍｆｏｒｔ、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、Ｓｃｈｏｎｅｎｂｕｃｈ、スイス）を使用して、１４００ｒｐｍ及び３７℃で１．５時間インキュベートした後、試料をアセトニトリル（１００μＬ）で希釈し、遠心分離した（２５００×ｇ、２０℃）。上清を、超高速液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）（Ｄｉｏｎｅｘ ＵｌｔｉＭａｔｅ ３０００）－ＱＥｘａｃｔｉｖｅ Ｐｌｕｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｂａｓｅｌ、スイス）システムに注入した。（Ｚ）－３－ヘキセナール及びヘキサナールを、それぞれω－３及びω－６の脂肪酸分解経路に由来する揮発性物質として脂質酸化の指標に選択した。応答係数は、内部標準ヘキサナール－ｄ１２の面積に対する揮発性物質の面積の比として表した。
【0081】
さらに、保存した乾燥試料にコードを付し、無作為化し、４名のパネルが臭いを嗅ぐことによって評価した。４名のパネルは、試料の順位をつけ、知覚された風味ノートを説明することによって匂いを評価した。
【0082】
未処理バイオマス（対照）、ＰＥＦ処理、酵素処理（キチナーゼ＋ラムノヒドロラーゼ＋ガラクタナーゼ）、ＰＥＦ＋酵素処理、及びＨＰＨ処理における揮発性物質の産生を調べた。Ｃ．ブルガリスにおいて最も豊富な脂肪酸である、リノール酸（Ｃ１８：２、ｎ６）及びα－リノレン酸（Ｃ１８：３、ｎ３）に関する対象分解産物として、それぞれヘキサナール及び（Ｚ）－３－ヘキセナールの値を図６に示す。
【0083】
図６は、未処理のＣ．ブルガリスバイオマス（対照）（）、ＰＥＦ処理（◆）、酵素処理（ＥＴ、キチナーゼ＋ラムノヒドロラーゼ＋ガラクタナーゼ）（■）、ＰＥＦ＋酵素処理（▲）、及び１００ＭＰａでＨＰＨ処理（●）での、Ｃ．ブルガリスバイオマスについて、４０℃で１２週間保存している間の二次酸化生成物の、Ａ）（Ｚ）－３－ヘキセナール及びＢ）ヘキサナールの発生を示す。シグナルは、対象化合物の面積を内部標準（ＩＳＴＤ）ヘキサナール－ｄ１２の面積で割ったものとして表す。エラーバーは、三連（ｎ＝３）の標準偏差を表す。
【0084】
未処理、ＰＥＦ処理、ＥＴ処理及びＰＥＦ＋ＥＴ処理バイオマスにおける（Ｚ）－３－ヘキセナール及びヘキサナールのシグナルは、１２週間の保存にわたって増加を示さず、顕著な酸化安定性を示した。これらの結果は、ＰＥＦ及びＥＴのいずれもが、脂質画分の品質を保存する穏やかなプロセスであることを示す。ヘキサナール及び（Ｚ）－３－ヘキセナールのＨＰＨ処理バイオマスにおけるシグナル強度は、それぞれ、１２週間後に対照よりも４．１倍及び７．３倍高く、ＨＰＨがバイオマス酸化安定性に対して過酷な効果を有することを示した。ヘキサン及び（Ｚ）－３－ヘキセナールのシグナルは、いずれも０週目から４週目まで減少したが、この減少は、保存より前に、破壊処理によって既に広範囲の酸化が生じていることを示している可能性がある。生成されたアルデヒドのいくつかは、今回の分析では検出されなかったアルコール及び有機酸に変化した可能性がある。
【0085】
官能試験の結果は分析データと一致した。ＨＰＨ処理バイオマスは時間０で既に酸敗臭を呈したのに対して、未処理ならびに酵素及びＰＥＦで処理したバイオマスは、全保存期間にわたって臭いはわずかであった。この結果は、ＰＥＦ処置の有望性を実証する。この技術を用いることにより、Ｃ．ブルガリス（Ｃ．ｖｕｌｇａｒｉｓ）のバイオマスにおける脂質のバイオアクセシビリティを改善し、かつその酸化安定性を維持することができる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【国際調査報告】