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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-07-12
(54)【発明の名称】尿試料から循環核酸を単離する方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6806 20180101AFI20240705BHJP
C12Q 1/6813 20180101ALI20240705BHJP
C12Q 1/686 20180101ALI20240705BHJP
C12Q 1/6869 20180101ALI20240705BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6806 ZNA
C12Q1/6813 Z
C12Q1/686 Z
C12Q1/6869 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024503629
(86)(22)【出願日】2022-07-19
(85)【翻訳文提出日】2024-03-18
(86)【国際出願番号】 US2022073904
(87)【国際公開番号】W WO2023004327
(87)【国際公開日】2023-01-26
(31)【優先権主張番号】63/223,542
(32)【優先日】2021-07-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】524023435
【氏名又は名称】ジェイビーシー サイエンス インク．
(74)【代理人】
【識別番号】100104411
【弁理士】
【氏名又は名称】矢口 太郎
(72)【発明者】
【氏名】リン、セレナ
(72)【発明者】
【氏名】ソン、ウェイ
(72)【発明者】
【氏名】ワン、ジリ
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA05
4B063QA11
4B063QQ03
4B063QQ42
4B063QQ53
4B063QR32
4B063QR55
4B063QR62
4B063QS10
4B063QS17
4B063QS25
4B063QS34
4B063QS36
(57)【要約】
本明細書に提供されるのは、尿試料などの生物学的試料中に存在する標的無細胞核酸（ｃｆＮＡ）分子を特徴付けるための方法を含む。これは、細胞残屑を除去するための遠心分離などの前処理なしに、生物学的試料から全ｃｆＮＡを単離する工程と、単離された全ｃｆＮＡに基づいて標的ｃｆＮＡ分子を特徴付けする工程とを含む。標的ｃｆＮＡが低分子量（ＬＭＷ）分子である場合、本方法はさらに、特徴付けの前に全ｃｆＮＡからＬＭＷ核酸を得るための分画工程を含む。この方法は、一般的に生物学的試料から細胞残屑を廃棄する既存の方法と比較して、標的ｃｆＮＡ分子のコピーを有意に多く検出することができる。通常廃棄される細胞残屑からｃｆＮＡを実質的に回収する別の方法も提供され、これによっても標的ｃｆＮＡ分子の有意により多くのコピーを検出することができる。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
生物学的試料中に存在する標的無細胞核酸分子を特徴付けるための方法であって、前記方法は、前記生物学的試料から細胞残屑を除去する前処理を行わずに、前記生物学的試料から全無細胞核酸を単離する工程と、および、
前記単離された全無細胞核酸から前記標的無細胞核酸分子を特徴付けする工程と、
を含み、
前記方法は、前記単離する工程で前処理により細胞残屑が除去された場合と比較して、前記生物学的試料中の前記標的無細胞核酸分子のコピーを少なくとも２倍検出することができる、
方法。
【請求項2】
請求項１記載の方法において、前記生物学的試料は、尿試料、血清試料、血漿試料、唾液試料、汗試料、リンパ液試料、またはそれらの任意の組み合わせを含む、方法。
【請求項3】
請求項２記載の方法において、前記生物学的試料が尿試料であり、前記標的無細胞核酸分子が経腎核酸分子またはアポトーシス由来核酸分子の少なくとも１つを含む、方法。
【請求項4】
請求項１または請求項２記載の方法において、前記標的無細胞核酸分子は標的無細胞ＤＮＡ分子であり、前記生物学的試料から全無細胞核酸を単離する前記工程は、
前記尿試料から全無細胞ＤＮＡを単離する工程を含み、および、
前記単離された全無細胞核酸から前記標的無細胞核酸分子を特徴付けする工程は、前記単離された全無細胞ＤＮＡから前記標的無細胞ＤＮＡ分子を特徴付けする工程を含む、
方法。
【請求項5】
請求項４記載の方法において、前記標的無細胞ＤＮＡ分子は約１ｋｂより短い長さを有し、前記方法は、前記尿試料から全無細胞ＤＮＡを単離する前記工程の後、および、前記単離された全無細胞ＤＮＡから前記標的無細胞ＤＮＡ分子を特徴付けする工程の前に、
前記単離された全無細胞ＤＮＡから低分子量ＤＮＡを得る工程をさらに含み、
前記単離された全無細胞ＤＮＡから前記標的無細胞ＤＮＡ分子を特徴付けする工程は、
前記低分子量ＤＮＡから前記標的無細胞ＤＮＡ分子を特徴付けする工程を含む、
方法。
【請求項6】
請求項５記載の方法において、前記単離された全無細胞ＤＮＡから低分子量ＤＮＡを得る工程は、カルボキシル化磁気ビーズに基づくアプローチ、アガロースゲルに基づくクロマトグラフィーアプローチ、またはポリアクリルアミドゲルに基づくクロマトグラフィーアプローチから選択される、サイズ分化アプローチによって行われる、方法。
【請求項7】
請求項５または請求項６記載の方法において、前記低分子量ＤＮＡから前記標的無細胞ＤＮＡ分子を特徴付けする工程は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アッセイ、配列決定アッセイ、またはハイブリダイゼーションアッセイの少なくとも１つによって行われる、方法。
【請求項8】
請求項５～７のいずれか１つに記載の方法において、前記標的無細胞ＤＮＡ分子が、変異Ｋ－ｒａｓ、メチル化ＲＡＳＳＦ１Ａ（ｍ ＲＡＳＳＦ１Ａ）、または、変異ＴＥＲＴ（ｍＴＥＲＴ）から選択される、がん関連ＤＮＡマーカーである、方法。
【請求項9】
請求項５～７のいずれか１つに記載の方法において、前記尿試料は、妊娠中の女性から採取されるものであり、前記標的無細胞ＤＮＡ分子は、性別、常染色体形質、または遺伝的疾患に関連する胎児ＤＮＡマーカーである、方法。
【請求項10】
請求項８記載の方法において、前記胎児ＤＮＡマーカーは、Ｙ染色体（Ｙ－Ｃｈｒ）マーカーを含む、方法。
【請求項11】
請求項５～７のいずれか１つに記載の方法において、前記標的無細胞ＤＮＡ分子は、微生物のＤＮＡマーカーであり、前記微生物は、ウイルス、細菌、または、真菌である、方法。
【請求項12】
請求項１１記載の方法において、前記標的無細胞ＤＮＡ分子は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）のＤＮＡマーカーである、方法。
【請求項13】
請求項１または請求項２記載の方法において、前記標的無細胞核酸分子は標的無細胞ＲＮＡであり、前記生物学的試料から全無細胞核酸を単離する前記工程は、
前記尿試料から全無細胞ＲＮＡを単離する工程を含み、および、
前記単離された全無細胞核酸から前記標的無細胞核酸分子を特徴付けする工程は、
前記単離された全無細胞ＲＮＡから前記標的無細胞ＲＮＡ分子を特徴付けする工程を含む、
方法。
【請求項14】
請求項１３記載の方法において、前記標的無細胞ＲＮＡ分子は、マイクロＲＮＡを含む、方法。
【請求項15】
請求項１～１４のいずれか１つに記載の方法において、前記生物学的試料から全無細胞核酸を単離する工程がキャリアＲＮＡを使用して行われる、方法。
【請求項16】
請求項１～１５のいずれか１つに記載の方法において、前記方法は、前記単離する工程で前処理により細胞残屑が除去された場合と比較して、前記生物学的試料中の前記標的無細胞核酸分子のコピーを少なくとも６倍検出することができる、方法。
【請求項17】
生物学的試料中の標的無細胞核酸分子を特徴付けるための方法であって、前記方法は、前記生物学的試料を前処理する工程であって、
前記生物学的試料を遠心分離して、上清画分およびペレット画分を得る工程と、洗浄液を用いて前記ペレット画分を洗浄して、洗浄除去画分を得る工程と、および、前記上清画分と前記洗浄除去画分とを合わせて、複合画分を得る工程とを含む、
前処理する工程と、
前記複合画分から全無細胞核酸を単離する工程と、および、
前記単離された全無細胞核酸から前記標的無細胞核酸分子を特徴付けする工程と
を含み、
前記方法は、前処理された前記生物学的試料の前記上清画分のみから前記全無細胞核酸が単離される場合と比較して、前記生物学的試料から前記標的無細胞核酸分子のコピーを少なくとも１．２５倍検出することができる、
方法。
【請求項18】
請求項１７記載の方法において、前記洗浄液は約２．０～４．０のｐＨを有する、方法。
【請求項19】
請求項１７記載の方法において、前記洗浄液は、約０．１５～３Ｍの濃度を有する塩を含み、前記塩は、ＮａＣｌ、ＫＣ１、ＭｇＣｌ２、ＬｉＣｌ、クエン酸ナトリウム、またはそれらの任意の組み合わせである、方法。
【請求項20】
請求項１７～１９のいずれか１つに記載の方法において、前記方法は、前記全無細胞核酸が前処理された生物学的試料中の上清画分のみから単離された場合と比較して、前記生物学的試料から前記標的無細胞核酸分子のコピーを少なくとも２倍検出することができる、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願との相互参照
本出願は、２０２１年７月１９日に出願された米国仮出願第６３／２２３，５４２号の利益を主張するものであり、その開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２１年７月１９日に出願された米国仮出願第６３／２２３，５４２号の利益を主張するものであり、その開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【0002】
尿中に例えば循環ＤＮＡ（例えば、無細胞ＤＮＡ、すなわちｃｆＤＮＡ）または循環ＲＮＡ（例えば、無細胞ＲＮＡ、すなわちｃｆＲＮＡ）などの循環核酸（ＮＡ）が存在することは、十分に確立されている。例えば、妊娠中の女性では、細胞外胎児DNAが母体循環中に存在し、母体血液中だけでなく、母体尿試料中にも検出されることが示されているが、その長さははるかに短く、はるかに低い濃度である（Chan et al. 2003; Tsui et al. 2012; Botezatu et al. 2000; Al-Yatama et al. 2001; Majer et al. 2007; Li et al. 2003; Illanes et al. 2006; Koide et al. 2005; Shekhtman et al. 2009）。これらの所見は、これまでの研究で示唆されてきたように、尿ＤＮＡの潜在的な臨床的有用性を明らかに制限するものである。興味深いことに、引用研究のほとんどは、母体尿試料から尿ｃｆＤＮＡを単離し、ＤＮＡ単離前の前処理工程として遠心分離を行って細胞ペレットを除去しており、これは尿試料からｃｆＮＡを回収する既存のアプローチと同様である。循環系胎児遺伝物質は、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）技術などにより、母体ゲノムには全く存在しない胎児遺伝子座を確実に決定するために使用できることが研究で示されており、そのような胎児遺伝子座の例として、母体尿で同定に成功した胎児Ｙ染色体特異的配列がある（Tsui et al. 2012; Al-Yatama et al. 2001; Lin et al. Diagnostics 2021. 11(4)）。我々による研究でも、Ｂ型肝炎ウイルス感染（Lin et al. Hepatology communication 2022; Jain et al. 2018）、ＨＣＣ（Lin et al. Diagnostics 2021. 11(8); Hann et al. 2017; Zhang et al. 2018; Kim et al. 2022）およびＣＲＣ（Botezatu et al. 2000; Su et al. 2004; Su et al. 2005; Song et al. 2012）患者の尿試料において、それぞれ、肝臓由来のＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ＤＮＡ、肝細胞がんＤＮＡバイオマーカー、結腸直腸がん（ＣＲＣ）ＤＮＡバイオマーカーが検出されたことも示された。
【0003】
現在、尿試料からｃｆＮＡを回収するための市販のキットを含むほとんどすべての既存のアプローチは、ＤＮＡ単離の前に、例えば１，０００ｒｐｍで１０分間、あるいはそれより高速で短時間の遠心分離を行い、ＤＮＡ単離効率を高めるために細胞残屑を除去するという前処理に依存している。しかし、これらの既存のｃｆＤＮＡ回収アプローチは、たとえその単離方法が血液ｃｆＮＡ単離に適していたとしても、回収率の低さに悩まされている（Chan et al. 2003; Tsui et al. 2012）。
【発明の概要】
【0004】
既存のｃｆＮＡ検出アプローチに関連する前述の問題に対処するために、本開示は、かなり困難な尿試料のような生物学的試料中に存在する標的無細胞核酸（ｃｆＮＡ）分子を特徴付けるための方法を提供する。
【0005】
本明細書で提供されるそのような方法の１つは、実質的に以下の２つの工程を含む：
【0006】
（１）生物学的試料から細胞残屑を除去する（例えば遠心分離による）生物学的試料の前処理を行わずに、生物学的試料から全無細胞核酸を単離する工程と、および
【0007】
（２）工程（１）で得られた単離された全無細胞核酸から標的無細胞核酸分子を特徴付けする工程。
【0008】
本明細書において、本方法は、単離する工程（１）の前処理により細胞残屑が除去された場合と比較して、生物学的試料中の標的無細胞核酸分子のコピーを少なくとも２倍、好ましくは少なくとも６倍検出することができる。
【0009】
標的ｃｆＮＡ分子が低分子量（ＬＭＷ）ＤＮＡ、すなわち約１ｋｂより短い長さを有する場合、検出感度を高めるために、本方法は、尿試料から全無細胞ＤＮＡを単離した後、単離された全無細胞ＤＮＡから標的無細胞ＤＮＡ分子を特徴付けする前に、単離された全無細胞ＤＮＡから低分子量ＤＮＡを得る工程をさらに含む。これに対応して、単離された全無細胞ＤＮＡから標的無細胞ＤＮＡ分子を特徴付けする工程は、低分子量ＤＮＡから標的無細胞ＤＮＡ分子を特徴付けする工程を含む。
【0010】
本明細書で提供されるこのような別の方法は、以下の３つの主要な工程を含む：
【0011】
（ａ）生物学的試料を前処理する工程であって、具体的には、生物学的試料を遠心分離して、上清画分およびペレット画分を得る工程；洗浄液を用いてペレット画分を洗浄して、洗浄除去画分を得る工程；および上清画分と洗浄除去画分とを合わせて、複合画分を得る工程、を包む、前処理する工程と、
【0012】
（ｂ）工程（ａ）から得られた複合画分から全無細胞核酸を単離する工程と、および、
【0013】
（ｃ）工程（ｂ）から得られた単離された全無細胞核酸から標的無細胞核酸分子を特徴付けする工程。
【0014】
本明細書において、本方法は、前処理された前記生物学的試料の上清画分のみから全無細胞核酸が単離される場合と比較して、生物学的試料から標的無細胞核酸分子のコピーを少なくとも１．２５倍検出することができる。
【0015】
詳細は後述する。
【図面の簡単な説明】
【0016】
【図1】図１は、遠心分離後の細胞ペレットと経腎Ｙ－Ｃｈｒ ＤＮＡの関連を示す。簡単に説明すると、男性胎児を持つ妊娠中の母親の２人のドナー（ドナー１およびドナー２）からの尿の異なるコレクションからそれぞれ１０ｍＬに、１ｘ１０５コピー／ｍＬの合成二本鎖ＤＮＡ、人工スパイクイン（ＳＰＫＮ）をそれぞれスパイクし、１，５００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離し、上清とペレットを分画した。ＤＮＡを単離、溶出し、スパイクコントロールＳＰＫＮおよびＹ－ＣｈｒについてｑＰＣＲアッセイで定量した（Lin et al. Diagnostics 2021. 11(4)）。ＳＰＫＮからの回収率とＹ－Ｃｈｒからの総回収率を計算し、プロットした。
【図2】図２は、遠心分離後の細胞ペレットと経腎ＨＢＶ ＤＮＡの関連を示す。簡単に説明すると、慢性ＨＢＶ感染患者の４人のドナー（ドナー１－３）からの尿の異なるコレクションから各１０ｍＬを、１ｘ１０５コピー／ｍＬの合成二本鎖ＤＮＡ、ＳＰＫＮで各々スパイクし、１，５００ｒｐｍで１０分間、４℃で遠心分離し、上清とペレットを分画した。ＤＮＡを単離、溶出し、表１に詳述するように、スパイクしたコントロールＳＰＫＮとＨＢＶ ｐｏｌ／ＳアッセイのｑＰＣＲアッセイで定量した。ＳＰＫＮインプットからの回収率とＨＢＶ ＤＮＡ総回収率を計算し、プロットした。
【発明を実施するための形態】
【0017】
第１の態様において、本開示は、生物学的試料中に存在する標的無細胞核酸分子を特徴付けるための第１の方法を提供する。第１の方法は、実質的に以下の２つの工程を含む：
【0018】
（１）生物学的試料から細胞残屑を除去する生物学的試料の前処理を行わずに、生物学的試料から全無細胞核酸を単離する工程と、および、
【0019】
（２）工程（１）で得られた単離された全無細胞核酸から標的無細胞核酸分子を特徴付けする工程。
【0020】
本明細書において、本方法は、単離工程(1)の前処理により細胞残屑が除去された場合と比較して、生物学的試料中の標的無細胞核酸分子のコピーを少なくとも２倍検出することができる。
【0021】
本明細書および本開示全体を通して使用される場合、「生物学的試料」という用語は、１または複数の生物学的対象から得られる、尿試料、血清試料、血漿試料、唾液試料、汗試料、またはリンパ液試料の１つまたは組み合わせを含む試料を指す。これらの生物学的試料は核酸を含むが、一般に細胞を含まない。このような生物学的試料は、単一の供給源（例えば、尿試料）から、または尿試料と血漿試料の組み合わせのような複数の供給源の組み合わせから得ることができる。このような生物学的試料は、単一の対象（例えば、がん患者または妊娠中の女性）から得ることもできるし、複数の対象からプールした試料とすることもできる。このような生物学的試料は、新鮮に得られたものであっても、凍結試料から解凍されたものであっても、また、このような処理によってそこから細胞残屑が除去されない限り、処理された生物学的試料であってもよい。
【0022】
本明細書で使用される場合、「核酸」という用語は、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ分子（複数可）を指し、「無細胞核酸」、「循環核酸」などの用語は、上記で定義されるように、１つの特定の生物学的試料（例えば、尿試料または血漿試料）中に存在する（ｅｘｉｓｔ）か、または存在する（ａｒｅ ｐｒｅｓｅｎｔ）１または複数の核酸分子を指す。例えば、尿試料中に存在する無細胞核酸は、経腎ＤＮＡ（すなわち、もともと循環中に由来するＤＮＡが腎濾過を通過して経腎ＤＮＡとなる）を含む可能性があり、またはアポトーシス由来核酸分子（すなわち、尿試料が得られる被験体の尿路由来のアポトーシス細胞に由来する）を含む可能性がある。別の例では、血漿試料中の無細胞核酸は、循環中の他の血液細胞と共存する無細胞核酸に由来する場合がある。ここで、標的の無細胞核酸分子は、ＤＮＡ（例えば、無細胞ＤＮＡまたはｃｆＤＮＡなど）分子またはＲＮＡ分子（例えば、マイクロＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ、無細胞ＲＮＡまたはｃｆＲＮＡなど）であり得る。
【0023】
上記単離工程（１）において、「そこから細胞残滓を除去する、生物学的試料の前処理」という語句は、単離工程(1)の前に行われる、生物学的試料または生物学的試料上での前処理工程を意味し、この前処理工程によって、生物学的試料に含まれる細胞残滓がそこから除去される。このような前処理工程の一般的な例としては、典型的には、生物学的試料を遠心分離する工程（例えば、４℃で１，５００ＲＰＭ、１０分間）が挙げられ、これは、核酸単離および標的マーカー検出の利便性および有効性のために、より清浄な生物学的試料を提供する目的で、ほぼすべての既存の標的無細胞核酸マーカー特性評価法において従来から適用されている。しかし、このような細胞屑除去前処理工程は、遠心分離に限定されるものではなく、他の手段またはアプローチも含むことができることに留意されたい。
【0024】
上記特徴付けする工程（２）において、「特徴付けする工程」、「特徴付けする」、「特徴付け」などは、定性（すなわち、生物学的試料中に目的の無細胞核酸分子が存在するか否かを検出またはモニタリングする工程）および定量（すなわち、生物学的試料中に目的の無細胞核酸分子が存在するか否かのコピー数、重量、比率、濃度などのレベルを決定する工程）のいずれか１つまたは両方を含むものと解釈される。
【0025】
本明細書において、本方法は、単離工程（１）の前処理で細胞残屑が除去された場合と比較して、生物学的試料中の標的無細胞核酸分子のコピーを少なくとも２倍、より好ましくは少なくとも６倍検出することができる。
【0026】
以下の実施例で示されるように、全無細胞核酸が生物学的試料（すなわち尿試料）から直接抽出される場合、標的無細胞ＤＮＡマーカーの検出能力は、生物学的試料が従来の遠心分離前処理を受け、遠心分離後の上清画分のみがＤＮＡ単離および標的マーカー検出に使用される対応する対照実験と比較して、大幅に（最大約３０倍）上昇し得る。
【0027】
例えば、以下に示す実施例３では、妊娠中の母親の尿試料を胎児のＹ－Ｃｈｒ ＤＮＡ検出能力について試験したところ、従来の方法（すなわち、「遠心分離」群の「上清」群）と比較して、遠心分離を伴わない方法（すなわち、「Ｎ．Ｃ．」群）では、尿試料中にそのようなマーカーの６．２倍および１１．７倍のコピーが劇的に検出されることが実証された（表２参照）。
【0028】
以下の実施例４に示す別の実施例では、肝細胞がん（ＨＣＣ）患者の尿試料をＨＣＣマーカー（すなわち、メチル化ＲＡＳＳＦ１Ａ（ｍＲＡＳＳＦ１Ａ）および／または変異ｈＴＥＲＴ（ｍＴＥＲＴ））の検出能力について試験したところ、従来の方法（すなわち、「遠心分離」群における「上清」群）と比較して、遠心分離を含まない方法（すなわち「Ｎ．Ｃ．」群）によって、尿試料中のｍＲＡＳＳＦ１Ａマーカーのコピーが７．１倍および２９．２倍と劇的に検出されることが独自に実証され（表３を参照）、ｍＴＥＲＴマーカーに関しては、本明細書で提供される第１の方法を用いると、従来の方法と比較して、マーカーの少なくとも６倍のコピーが見出され得る。
【0029】
この第１の態様で提供される方法のいくつかの実施形態によれば、生物学的試料は尿試料であり、標的無細胞核酸分子は、経腎核酸分子またはアポトーシス由来核酸分子の少なくとも１つを含む。
【0030】
ここで任意に、標的無細胞核酸分子は標的無細胞ＤＮＡ分子であり、それに対応して、第１の方法は以下の工程を含む：
【0031】
尿試料から全無細胞ＤＮＡを単離する工程と、および、
【0032】
単離された全無細胞ＤＮＡから標的の無細胞ＤＮＡ分子を特徴付けする工程。
【0033】
いくつかの実施形態によれば、標的無細胞ＤＮＡ分子は低分子量（ＬＭＷ）ＤＮＡ、すなわち約１ｋｂより短い長さを有するＤＮＡであり、検出感度を高めるために、本方法は、尿試料から全無細胞ＤＮＡを単離した後、単離された全無細胞ＤＮＡから標的無細胞ＤＮＡ分子を特徴付けする前に、単離された全無細胞ＤＮＡから低分子量ＤＮＡを得る工程をさらに含む。これに対応して、単離された全無細胞ＤＮＡから標的無細胞ＤＮＡ分子を特徴付けする工程は、低分子量ＤＮＡから標的無細胞ＤＮＡ分子を特徴付けする工程を含む。
【0034】
本明細書において、単離された全ＤＮＡから低分子量ＤＮＡを得る工程は、カルボキシル化磁気ビーズに基づくアプローチ、アガロースゲルに基づくクロマトグラフィーアプローチ、またはポリアクリルアミドゲルに基づくクロマトグラフィーアプローチから任意に選択されるサイズ分化アプローチによって行うことができる。
【0035】
本明細書において、低分子量ＤＮＡから標的無細胞ＤＮＡ分子を特徴付けする工程は、任意に、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アッセイ、配列決定アッセイ、またはハイブリダイゼーションアッセイの少なくとも１つによって実現され得る。ＰＣＲアッセイは、通常のＰＣＲアッセイ、リアルタイムＰＣＲアッセイ、定量的ＰＣＲアッセイ等を含む。配列決定アッセイの例は、サンガー配列決定、次世代配列決定を含む。ハイブリダイゼーションアッセイの例は、サザンブロットアッセイ、マイクロアレイアッセイを含む。これらの上記アッセイは、標的無細胞ＤＮＡに特異的に設計された配列を有するプライマー、プローブ等の使用をさらに含み得る。
【0036】
以下の実施例２および４で示されるように、いくつかの実施形態によれば、標的無細胞ＤＮＡ分子は、変異Ｋ－ｒａｓ、メチル化ＲＡＳＳＦ１Ａ（ｍＲＡＳＳＦ１Ａ）、または変異ＴＥＲＴ（ｍＴＥＲＴ）から選択されるがん関連ＤＮＡマーカーである。
【0037】
以下の実施例１及び３に示されるように、いくつかの実施形態によれば、尿試料は妊娠中の女性から得られ、標的無細胞ＤＮＡ分子は、性別、常染色体形質、又は遺伝的疾患に関連する胎児ＤＮＡマーカーである。ここで、胎児ＤＮＡマーカーは、任意にＹ染色体（Ｙ－Ｃｈｒ）マーカーを含むことができる。ここで、常染色体形質には、（例えば、ＲｈＤ陰性女性における）胎児ＲｈＤ状態が含まれ得、遺伝性疾患には、男性性連鎖性疾患、副腎過形成、筋緊張性ジストロフィー、軟骨形成不全、胎児異数性などが含まれ得る。
【0038】
以下の実施例１に示すように、いくつかの実施形態によれば、標的無細胞ＤＮＡ分子は、ＨＢＶ ＤＮＡマーカーを含む。任意に、標的無細胞ＤＮＡ分子は、他のウイルス（例えば、ＨＩＶ、ＨＣＶ、Ｃｏｖｉｄ１９、ＳＡＲＳなど）のＤＮＡマーカーであってもよく、または細菌、真菌などの他の微生物のＤＮＡマーカーであってもよい。
【0039】
任意に、本明細書で提供される方法において、標的無細胞核酸分子は標的無細胞ＲＮＡ分子であり、それに対応して、第１の方法は以下を含む：
【0040】
尿試料から全無細胞ＲＮＡを単離する工程と；および
【0041】
単離された全無細胞ＲＮＡから標的の無細胞ＲＮＡ分子を特徴付けする工程。
【0042】
いくつかの実施形態によれば、標的無細胞ＲＮＡ分子はマイクロＲＮＡを含む。
【0043】
本明細書において、低分子量ＤＮＡから標的無細胞ＤＮＡ分子を特徴付けする工程は、任意に、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）アッセイ、ＲＮＡ配列決定アッセイ、またはハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、ノーザンブロットまたはマイクロアレイアッセイ）の少なくとも１つによって行うことができる。
【0044】
上記のような方法の実施形態のいずれにおいても、生物学的試料から全無細胞核酸を単離する工程は、任意に、ｔＲＮＡなどのキャリアＲＮＡを使用して実施することができる。
【0045】
第２の態様において、本開示はさらに、生物学的試料中の標的無細胞核酸分子を特徴付けるための第２の方法を提供する。第１の態様で上述した第１の方法と比較して、第２の方法は、細胞残屑を除去する遠心分離前処理工程を依然として含む。より具体的には、本方法は以下の３つの主要工程を含む：
【0046】
（ａ）生物学的試料を前処理する工程であって、具体的には、生物学的試料を遠心分離して、上清画分およびペレット画分を得る工程；洗浄液を用いて前記ペレット画分を洗浄して、洗浄除去画分を得る工程；および前記上清画分と前記洗浄除去画分とを合わせて、複合画分を得る工程、と；
【0047】
（ｂ）工程（ａ）から得られた前記複合画分から全無細胞核酸を単離する工程と；および
【0048】
（ｃ）工程（ｂ）から得られた単離された全無細胞核酸から標的無細胞核酸分子を特徴付けする工程。
【0049】
本明細書において、本方法は、前処理した生物学的試料中の上清画分のみから全無細胞核酸を単離した場合と比較して、生物学的試料から少なくとも１．２５倍、好ましくは少なくとも２倍の標的無細胞核酸分子のコピーを検出することができる。
【0050】
後述の実施例で示されるように、上清画分とペレット画分とが別々にＤＮＡマーカー検出を受ける前に遠心前処理された尿試料では、上清画分のみが検査される対照実験（すなわち、「従来のアプローチ」）と比較して、検出のために両方の画分を合わせる場合（すなわち、「組み合わせアプローチ」）、標的無細胞ＤＮＡマーカーを検出する能力が（最大約２０倍）上昇する可能性がある。
【0051】
例えば、以下に示す実施例１および３において、「組み合わせアプローチ」は、対応する「従来のアプローチ」と比較して、胎児Ｙ－Ｃｈｒ ＤＮＡマーカーの１．２６～６．６２倍のコピーを検出する（図１および表２参照）ことができ、ＨＢＶ ＤＮＡマーカーの１．３４～１．９８倍のコピーを検出する（図１および表２参照）ことができると実証された。別の実施例では、以下の実施例４において、「組み合わせアプローチ」は、対応する「従来のアプローチ」と比較して、ｍＲＡＳＳＦ１Ａマーカーの４．４～２１．２倍コピーを検出する（表３参照）ことが可能であり、ｍＴＥＲＴマーカーの少なくとも１４．５倍コピーを検出する（表３参照）ことが可能であることが独立して実証される。
【0052】
この第２の態様で提供される方法の任意の実施形態において、洗浄液は、約２．０～４．０のｐＨを有し得るか、または約０．１５～３Ｍの濃度を有する塩（ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＬｉＣｌ、クエン酸ナトリウム、またはそれらの任意の組み合わせ）を含み得る。
【0053】
以下に、合計４つの具体例を示すが、これらは本明細書に開示した発明をさらに説明するためのものであり、決してその範囲を限定するものと解釈してはならない。
【0054】
実施例
実施例１
実施例１
【0055】
簡単に説明すると、本実施例において、母体の尿から検出可能な男の胎児ＤＮＡまたは慢性ＨＢＶ感染患者からのＨＢＶ ＤＮＡを経腎ＤＮＡの指標として使用し、遠心分離に依存する前処理がｃｆＤＮＡ回収率に与える影響を評価する。
【0056】
１． 材料と方法
【0057】
１．１ 対象と尿試料
【0058】
Ｙ－Ｃｈｒ試験には、男児を妊娠している妊娠第３期のドナー２人からさまざまな日付で採取した保管された尿試料が本研究において用いられた。
【0059】
ＨＢＶ－ＤＮＡ試験では、それぞれＨＢＶ血清ウイルス量が少なくとも１０６ＩＵ／ｍＬ血清であり、および、以前の研究で測定された尿中に検出可能なＨＢＶ ＤＮＡを有していた３人の慢性ＨＢＶ感染ドナーから採取された保存尿試料を用いた。
【0060】
１．２ 尿試料採取
【0061】
簡単に説明すると、５０ｍｌの尿試料をＥＤＴＡ含有尿保存管に１日間隔で２つの異なる時点で採取した。尿試料の採取方法は以下に詳述する。具体的には、尿試料中の可能性のあるヌクレアーゼ活性を阻害するために、採取した新鮮な尿を直ちに０．５ｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）と混合し、最終濃度を１０～５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡとし、－７０℃で保存した。全尿ＤＮＡを単離するため、凍結した尿試料を室温で解凍し、ＤＮＡ単離前に直ちに氷中に置いた。解凍された尿は、１時間以内にＤＮＡ単離のために処理される。
【0062】
１．３ 尿試料の前処理
【0063】
上記で収集した尿試料１５ｍｌに、まず合成二本鎖スパイクイン（ＳＰＫＮ）ＤＮＡ断片を１０５コピー／ｍＬでスパイクし、ＤＮＡ単離の前に遠心分離による前処理を行った。簡単に説明すると、遠心分離による前処理では、尿試料を１，５００ＲＰＭ、４℃で１０分間遠心分離し、上清を回収して細胞残屑「ペレット」から単離した。２つの尿画分（上清とペレット）それぞれからＤＮＡが単離された。
【0064】
１．４ ＤＮＡ単離
【0065】
以下に詳述する全ＤＮＡ単離アプローチに従って、上記の各尿画分からＤＮＡを単離した。具体的には、各尿試料を２Ｍ塩酸グアニジン溶解緩衝液中でプロテイナーゼＫ（１ｍｇ／ｍＬ）により１時間消化した。その後、尿溶解物を０．８容量の６ｍｏｌ／Ｌチオシアン酸グアニジン（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）、１容量のイソプロパノール、５０ｕＬのＭａｇｓｉｌＲｅｄ（カタログ番号：Ａ１６４１、Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マディソン）シリカ磁気ビーズと混合し、穏やかに回転混合させながら室温で一晩インキュベートした。ビーズ－ＤＮＡ複合体を遠心分離し、８０％エタノールで２回洗浄し、ＤＮＡを２０μｌの水で溶出した。
【0066】
１．５ リアルタイムＰＣＲ定量化
【0067】
Ｙ－Ｃｈｒ ｑＰＣＲアッセイを用いたＹ染色体（「Ｃｈｒ」）ＤＮＡ（Lin et al.11(4); Lin et al. Hepatology communication 2021）およびＨＢＶ ｐｏｌ／ｓアッセイを用いたＨＢＶ ＤＮＡのリアルタイムＰＣＲ定量化を、表１に詳述する。Ｙ染色体（Ｙ－Ｃｈｒ）またはＨＢＶ ＤＮＡからの配列は、異なる尿画分中の単離された胎児ＤＮＡまたはＨＢＶ ＤＮＡの量を定量するために、リアルタイム定量ＰＣＲによってＲｏｃｈｅ ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０機器プラットフォームで増幅された。Ｙ染色体ＤＮＡ定量キット（表１に詳述）とＨＢＶ ｐｏｌ／ｓ ＤＮＡ定量キット（表１に詳述）をプロトコールに従って使用し、尿ＤＮＡ試料６μｌを含む１５μｌで各画分を二重に定量した。合成スパイクインＳＰＫＮ ＤＮＡは、メーカーの仕様書に従ってＪＢＳ人工スパイクイン（ＳＰＫＮ）ＤＮＡ定量キットを用いて定量され（表１に詳述）、各ｃｆＤＮＡ試料で回収されたコピーが推定された。
【表1】
【0068】
インプットからのＳＰＫＮ回収率は、式（１）を用いて計算した：
総アウトプット／総インプット×１００％＝インプットからのＳＰＫＮ％； （１）
総アウトプット／総インプット×１００％＝インプットからのＳＰＫＮ％； （１）
【0069】
上清またはペレット画分中のＹ－ＣｈｒまたはＨＢＶ ＤＮＡの分布は、式（２）を用いて計算した：
「ペレット」または「上清」／（ペレット＋上清）×１００％； （２）
「ペレット」または「上清」／（ペレット＋上清）×１００％； （２）
【0070】
図１に示すＹ－Ｃｈｒ ＤＮＡを用いた試験では、外来性のＳＰＫＮ １３１ ｂｐ ｄｓＤＮＡ（配列ＩＤ番号：７）を対照として、遠心分離による上清と細胞ペレットの分画を行った。予想通り、図１の一番上のパネルでは、ＳＰＫＮは上清画分から４８％～９９％の範囲で大部分が回収されたが、ペレット画分からのＳＰＫＮ ＤＮＡの回収は１％～７．２％と極めて少ないことが判明した。興味深く、かつ、予想外に、図１の下部パネルに示すように、ペレット画分から回収できるＹ－Ｃｈｒ ＤＮＡの量は試料によって異なるが、通常ＳＰＫＮ ＤＮＡ対照よりも有意に多く、検出された全Ｙ－Ｃｈｒの２１％～８８％に及ぶ。
【0071】
この結果は、外来的に添加されたＳＰＫＮ ＤＮＡとは異なり、Ｙ－Ｃｈｒ ＤＮＡには細胞残屑ペレットとの予期せぬ会合があることを示している。このことはさらに、ほとんどすべての既存のcfDNA単離および検出方法において一般的に行われている遠心分離前処理では、遠心分離後のペレット画分中の細胞残屑画分への結合により、循環または経腎ＤＮＡからかなりの割合のｃｆＤＮＡが失われることを示唆している。したがって、通常の遠心分離後の「上清」画分に加え、遠心分離後の「ペレット」画分からもｃｆＤＮＡを回収する上述の本開示の第２の態様に記載の方法などを用いれば、回収されるｃｆＤＮＡが実質的に有意に多くなり、有意に多くのコピーのＹ－Ｃｈｒ ＤＮＡマーカーが検出されることになる。「ペレット」画分を「上清」画分と合わせると、図１に示した６つの試験群では、「上清」画分のみと比較して、Ｙ－Ｃｈｒ ＤＮＡマーカーはそれぞれ、およそ１．２６倍（すなわち１／７９．４％）、５．２４倍（すなわち１／１９．１％）、１．５４倍（すなわち１／６４．９％）、６．６２倍（すなわち１／１５．１％）、２．５０倍（すなわち１／３９．９％）、および、１．７２倍（すなわち１／５８．２％）となる。
【0072】
図２に示したＨＢＶ ＤＮＡを用いた試験では、上記の外因性スパイク１３１ ｂｐ ｄｓＤＮＡ（配列ＩＤ番号：７）も、遠心分離による上清と細胞ペレットの分画の対照として使用した。予想通り、図２の上のパネルに示すように、ＳＰＫＮは上清画分から７７％～８２％の範囲でほとんど回収され、ペレット画分からは少量（１．５％～２１．４％）のＳＰＫＮ ＤＮＡしか回収されなかった。興味深いことに、予想外であったが、上記のＹ－Ｃｈｒ ＤＮＡの結果と一致して、図２の下のパネルに示すように、検出されたＨＢＶ ＤＮＡ全体の２６％～５０％の範囲で、かなりの量のＨＢＶ ＤＮＡが細胞残屑ペレットから回収された。このことは、遠心分離の前処理工程の後、上清画分のみを対象とするほとんどすべての既存のｃｆＤＮＡ単離および検出法では失われていた可能性のある、かなりの量のＨＢＶ ＤＮＡが細胞残屑ペレットに付随している可能性があることを示している。
【0073】
従って、図１に示した胎児Ｙ－Ｃｈｒ ＤＮＡマーカーの検出結果と同様に、「ペレット」画分と従来の「上清」画分との組み合わせでは、「上清」画分のみと比較して、図２に示した３つの検査群について、ＨＢＶマーカーをそれぞれ約１．８４倍（すなわち１／５４．３％）、１．３４倍（すなわち１／７４．５％）、および１．９８倍（すなわち１／５０．４％）検出できると予想される。
【0074】
実施例２
【0075】
ゲル電気泳動による高ＭＷ ＤＮＡの除去が結腸直腸疾患患者の尿中の変異Ｋ－ｒａｓ ＤＮＡの検出を促進した。
【0076】
Ｋ－ｒａｓのコドン１２変異を検出するために、制限酵素濃縮ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＥ－ＰＣＲ）を、以前に記載されたように（Su et al. 2004）、全尿ＤＮＡおよび低ＭＷ尿ＤＮＡに対して実施した（特異的プライマーおよびアッセイ条件は表１に示す）。
【0077】
簡単に説明すると、２００μＬの尿に由来する全ＤＮＡまたは分画された低ＭＷ ＤＮＡが各アッセイに用いられた。ＲＥ－ＰＣＲアッセイによるＰＣＲ産物は８７ｂｐであり、２回目のＢｓｔＮＩ消化後に７１ｂｐのフラグメントの出現は、ＤＮＡ試料中の変異Ｋ－ｒａｓ ＤＮＡの証拠である。ＲＥ－ＰＣＲアッセイの検出限界は、反応ごとに野生型ＤＮＡ １００ｎｇあたり変異型Ｋ－ｒａｓの１５コピーである（Su et al. 2004）。アッセイ対照として、変異型（ヒト腺がんＳＷ４８０細胞）または野生型（ヒト肝芽腫ＨｅｐＧ２細胞）のＫ－ｒａｓ配列を有することが知られている供給源から調製したＤＮＡをＰＣＲにかけた。予想通り、図３に示すように、ＨｅｐＧ２細胞から調製したＤＮＡは検出可能なレベルの変異型Ｋ－ｒａｓを含まなかった（２回目のＢｓｔＮＩ消化後に７１ｂｐフラグメントが出現しなかった）が、ＳＷ４８０細胞から調製したＤＮＡは変異型Ｋ－ｒａｓ配列を含んでいた（２回目のＢｓｔＮＩ消化後に７１ｂｐフラグメントが検出された）。検出可能な変異型Ｋ－ｒａｓ ＤＮＡを含む各尿試料について、図３の６つの異なる個体（すなわち、「ＦＸ」、「ＧＤ」、「ＧＧ」、「ＧＩ」、「ＧＭ」、および「ＧＮ」）によって示されるように、全尿ＤＮＡと比較して、低ＭＷ ＤＮＡをアッセイに使用した場合に、変異型Ｋ－ｒａｓ配列の存在がより明白であった。
【0078】
ＬＭＷ ＤＮＡ分画による検出感度の向上を評価するため、２倍連続希釈によるエンドポイント検出を行った。簡単に説明すると、まず全ＤＮＡとＬＭＷ ＤＮＡの両方を５回の２倍連続希釈（１：２、１：４、１：８、１：１６、および、１：３２）に供した。各希釈液をＲＥ－ＰＣＲアッセイに供し、検出可能なＫ－ｒａｓ変異を含む希釈の終点を決定した。Ｌｏｗ／全ＤＮＡの増加倍率を計算し、図３に示した。検出感度は４～１６倍の範囲で増加した。通常、ＬＭＷ ＤＮＡ分画の処理工程では、全ＤＮＡからｃｆＤＮＡが失われるため、これは極めて予想外のことである。前述のように、Ｋ－ｒａｓ ＲＥ－ＰＣＲアッセイは強力なアッセイではなく、その分析感度は１００ｎｇのヒト野生型バックグラウンドＤＮＡの追加で約１０～２０倍に低下する（Ｓｕ ｅｔ ａｌ． ２００４）ため、ＨＭＷ ＤＮＡの除去により検出感度が向上した。全尿ＤＮＡあたりの低ＭＷ（ＬＭＷ）ＤＮＡ中の変異Ｋ－ｒａｓ ＤＮＡ検出の増加倍率を計算し、図３に示した。Ｋ－ｒａｓ変異検出の基質として低ＭＷ尿ＤＮＡを用いると、全尿ＤＮＡを用いた場合と比較して、検出感度が４～１６倍増加した。これは、ＬＭＷ ＤＮＡ分画により高分子量（>１ｋｂ）を除去した場合、尿中のＫ－ｒａｓ変異検出が著しく向上することを示している。
【0079】
実施例３
【0080】
簡単に説明すると、この例では、関連するＹ－Ｃｈｒ ＤＮＡが細胞ペレットから洗浄除去される可能性があることを示唆する指標として、母体尿中で検出可能な男性胎児ＤＮＡを使用して、遠心分離に依存した前処理がｃｆＤＮＡ回収率に及ぼす影響を評価する。
【0081】
１． 材料と方法
【0082】
１．１ 対象と尿試料
【0083】
本研究では、男の胎児を妊娠している妊娠第３期のドナー１人から採取した保管された尿試料を使用した。
【0084】
１．２ 尿試料の採取
【0085】
簡単に説明すると、５０ｍｌの尿試料をＥＤＴＡ含有尿保存管に１日間隔で２つの異なる時点で採取した。尿試料の採取については以下に詳述する。具体的には、尿試料中の可能性のあるヌクレアーゼ活性を阻害するために、新鮮に採取した尿を直ちに０．５ｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）と混合し、最終濃度を１０～５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡとし、－７０℃で保存した。全尿ＤＮＡを単離するため、凍結した尿試料を室温で解凍し、ＤＮＡ単離前に直ちに氷中に置いた。解凍された尿は１時間以内にＤＮＡ単離のために処理される。
【0086】
１．３ 尿試料の前処理
【0087】
上記で採取した尿試料１５ｍｌを、ＤＮＡ単離の前に、遠心分離または遠心分離なし（以下、「Ｎ．Ｃ．」と略す）のいずれかの前処理を行った。簡単に説明すると、遠心分離を伴う前処理では、尿試料を１，５００ＲＰＭ、４℃で１０分間遠心分離し、上清を回収して細胞残屑ペレット（以下、これを「洗浄後ペレット」と区別するために「洗浄前ペレット」と呼ぶ）から単離し、上清を氷上に置き、洗浄前ペレットを１ｍｌのクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．０）で短時間洗浄し、洗浄液を１３，０００ＲＰＭで９０秒間遠心分離して回収し、３つの尿画分（上清、洗浄除去、洗浄後ペレット）尿画分のそれぞれをＤＮＡ単離した。遠心分離を行わない前処理（すなわちＮ．Ｃ．アプローチ）では、尿試料から直接ＤＮＡ単離し、カルボキシル化ビーズを用いて低ＭＷ ＤＮＡ分画を行った。
【0088】
１．４ ＤＮＡの単離
【0089】
以下に詳述する全ＤＮＡ単離アプローチに従って、上記の各尿画分またはＮ．Ｃ．尿試料からＤＮＡを単離した。具体的には、各尿試料を２Ｍ塩酸グアニジン溶解緩衝液中でプロテイナーゼＫ（１ｍｇ／ｍＬ）により１時間消化した。その後、尿溶解物を０．８容量の６ｍｏｌ／Ｌチオシアン酸グアニジン（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）、１容量のイソプロパノール、５０ｕＬのＭａｇｓｉｌＲｅｄ（カタログ番号：Ａ１６４１、Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マディソン）シリカ磁気ビーズと混合し、穏やかに回転混合させながら室温で一晩インキュベートした。ビーズ－ＤＮＡ複合体を遠心分離し、８０％エタノールで２回洗浄し、ＤＮＡを２０μｌの水で溶出した。
【0090】
１．５ Ｙ－ＣｈｒｑＰＣＲアッセイを用いたＹ染色体（「Ｃｈｒ」）ＤＮＡのリアルタイムＰＣＲ定量化
【0091】
Ｙ染色体（Ｙ－Ｃｈｒ）由来の配列は、表１に詳述するように、Ｒｏｃｈｅ ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０装置プラットフォームでリアルタイム定量ＰＣＲにより増幅し、異なる尿画分中の単離された胎児ＤＮＡ量を定量した。表１に詳述するＹ染色体ＤＮＡ定量キット（ＪＢＳ Ｓｃｉｅｎｃｅ， ペンシルバニア州ドイルズタウン）をプロトコールに従って使用し、尿ＤＮＡ試料６μｌを含む１５μｌで各画分を二重に定量した。
【0092】
２． 結果
【0093】
表２は、各画分／試料の検出結果（すなわち、循環無細胞胎児ＤＮＡマーカー「Ｙ－Ｃｈｒ」のコピーを指標として使用した、母体尿試料から循環無細胞胎児ＤＮＡを検出する能力に関する結果）をまとめたものであり、具体的には、遠心分離前処理尿試料および遠心分離前処理なし尿試料（すなわち、Ｎ．Ｃ．尿試料）の各画分／試料、具体的には、「上清」、「洗浄除去」、および「洗浄後ペレット」画分を含む、各画分／試料の検出結果を２つの異なる採尿タイムポイント（すなわち、コレクション＃１および＃２）のそれぞれでまとめたものである。
【0094】
示されるように、「上清」画分には、検出可能なＹ－Ｃｈｒ ＤＮＡが約７．９９および約１．５１コピー（それぞれコレクション＃１および＃２について）含まれており、これは、通常、遠心分離後の上清画分のみを対象とする従来の遠心分離に依存するアプローチによって検出可能な尿試料中の標的ＤＮＡの量を実質的に表している。
【0095】
驚くべきことに、また、予想外なことに、遠心分離後に通常は廃棄されるペレット画分を洗浄すると、得られた「洗浄除去」画分には約２．７８および１．９１コピー（それぞれコレクション＃１および＃２について）のＹ－Ｃｈｒ ＤＮＡが含まれ、「洗浄後ペレット」画分には検出可能なそのような標的ＤＮＡは含まれなかった。「上清」画分および「洗浄除去」画分からのＹ－Ｃｈｒ ＤＮＡのコピーを合算して、回収されたＹ－Ｃｈｒ ＤＮＡの総コピーを求めると（すなわち、「遠心分離後の総回収量」、コレクション＃１および＃２ではそれぞれ１０．７７および３．４２コピー）、回収されたＹ－Ｃｈｒ ＤＮＡは、「上清」のみに比べて約１．４倍および２．３倍（コレクション＃１および＃２ではそれぞれ）になる。このように、遠心分離後の上清画分のみを対象とする従来のＤＮＡ単離法と比較すると、通常廃棄される遠心分離後のペレット画分には、意外にもかなりの割合の標的Ｙ－Ｃｈｒ ＤＮＡが残っていることがわかる。それ以外の場合は失われており、遠心分離後の上清画分から得られたＤＮＡと遠心分離後のペレット画分から得られたＤＮＡを合わせた全標的ＤＮＡの約２５．８％～５５．８％であると推定される（すなわち、コレクション＃１の場合：２．７８／１０．７７＝２５．８％、コレクション＃２の場合：１．９１／３．４２＝５５．８％）。
【0096】
さらに驚くべきことに、予期しないことであるが、通常の遠心分離の前処理工程を完全に省略または除去して、尿試料からＤＮＡを直接単離した場合、それによって検出される標的ＤＮＡのコピーは、遠心分離後の上清画分から検出される標的Ｙ－Ｃｈｒ ＤＮＡよりも劇的に多くなる。具体的には、「遠心分離なし」または「Ｎ．Ｃ．」群で検出可能なＹ－Ｃｈｒ ＤＮＡのコピー数は４９．５８および１７．６２（それぞれコレクション＃１および＃２について）であり、「上清」のみの群と比べて６．２倍および１１．７倍（それぞれコレクション＃１および＃２について）である。したがって、本明細書で開示する遠心分離なしのアプローチと比較して、遠心分離後の上清画分のみに関係する従来の遠心分離を簡略化した方法でＤＮＡ単離を行った場合、標的Ｙ－Ｃｈｒ ＤＮＡの８３．９％～９１．４％が失われる可能性があることがわかる（すなわち、コレクション＃１の場合：（４９．５８－７．９９）／４９．５８＝８３．９％、コレクション＃２の場合：（１７．６２－１．５１）／１７．６２＝９１．４％）。言い換えれば、尿試料からの細胞残屑の除去（例えば、遠心分離前処理による）を必要とする従来のｃｆＤＮＡ単離法と比較して、細胞残屑除去前処理を実質的に除去する本明細書に開示の方法は、検出可能な標的Ｙ－Ｃｈｒ ＤＮＡを約５．２～１０．７倍多く単離することができ、したがって、検出感度が劇的に向上し、尿試料中のそのような標的低分子量（ＬＭＷ）ＤＮＡの検出限界が劇的に低下する。
【表2】
【0097】
実施例４
【0098】
ＨＣＣ関連ＤＮＡマーカーと細胞残屑ペレットとの関連。
【0099】
尿中に２つの既知の検出可能なＨＣＣ ＤＮＡマーカーを有する患者から採取された尿。図４に示すように、それぞれ１０ｍＬの異なる尿アリコートを、遠心分離を行わずに全尿ＤＮＡ単離を行った後、分画して１ｋｂより短い低分子量（ＬＭＷ）ＤＮＡを取得（すなわち、「遠心分離なし」またはＮ．Ｃ．群）、または、または上記の遠心分離前処理とＤＮＡ単離を行って、上清（Ｓｕｐ）またはペレット画分からＤＮＡを取得（すなわち、「遠心分離」群）した。次いで、表１に詳述するように、ＤＮＡをメチル化ＲＡＳＳＦ１Ａ（ｍＲＡＳＳＦ１Ａ）およびｈＴＥＲＴ－１２４変異（すなわちｍＴＥＲＴ）マーカーアッセイに供した。要約結果を表３に示す。
【表3】
【0100】
表３に示すように、ｍＲＡＳＳＦ１Ａマーカーは「遠心分離」群および「遠心分離なし」群のいずれの尿分画からも、量に差はあるものの、再現性よく検出された。従来のｃｆＤＮＡ単離法を適用した場合（すなわち、「遠心分離」群の「上清」画分に対応する場合）、ｍＲＡＳＳＦ１Ａマーカーはわずか１．６コピーしか検出されなかったが、表２に示したＹ－Ｃｈｒの観察結果と同様に、「遠心分離」群の「ペレット」画分からは、より多くのマーカーが検出された（それぞれ、患者＃１では３２．３コピー、＃２では５．４コピー）。したがって、「上清」画分と「ペレット」画分を合わせると、ｍＲＡＳＳＦ１Ａマーカーの総検出可能レベル（すなわち「総回収」）は、遠心分離後の「上清」画分のみを対象とする従来の方法と比較して、約２１．２倍と４．４倍（それぞれ患者＃１と＃２）となる。さらに、遠心分離を行わずにアッセイを行った場合（すなわち、「遠心分離なし」または「Ｎ．Ｃ．」群）、ｍＲＡＳＳＦ１Ａマーカーの総検出可能レベルは、遠心分離後の「上清」画分のみに関係する従来の方法と比較して、約２９．２倍および７．１倍（それぞれ患者＃１と＃２）であった。このような結果は、上記表２に示した胎児Ｙ－Ｃｈｒ ＤＮＡ検出結果と非常によく一致している。
【0101】
ｍＴＥＲＴマーカーについては、２人の患者（＃３および＃４）のいずれにおいても、遠心分離後の「上清」画分において検出限界以下（すなわちＢＬＯＤ）であることが示されており、従来の遠心分離を用いたｃｆＤＮＡ単離および検出アッセイではｍＴＥＲＴマーカーが実質的に検出されないことが示されている。患者＃３では、遠心分離後の「ペレット」画分でも検出限界以下（すなわちＢＬＯＤ）であることが示されているが、ｍＴＥＲＴマーカーを遠心しないアッセイ法（すなわち「遠心分離なし」または「Ｎ．Ｃ．」群）で検出した場合、ｍＴＥＲＴマーカーは約６コピー検出され、「上清」群と比較して少なくとも６倍であった。患者＃４では、遠心分離後の「ペレット」画分に有意に多くのマーカーコピー（すなわち１３．５）が検出され、「Ｎ．Ｃ．」群ではさらに多くのコピー（すなわち１６．５）が検出された。このように、両患者のデータから、遠心分離を行わずにアッセイを行った場合、ｍＴＥＲＴマーカーの総検出可能レベルは、遠心分離後の「上清」画分のみに実質的に関与する従来の方法と比較して、６倍以上であることがさらに示された。
【0102】
ＨＣＣ関連ＤＮＡマーカーはすべてのペレット画分から検出された。このデータは、尿ｃｆＤＮＡ単離から細胞ペレットを除去する前処理の遠心分離によって、目的の経腎ＤＮＡが失われる可能性があることを示している。同一人物からの異なる尿分画は異なる量の細胞残屑を含む可能性があるため、同一患者からの分画間のＤＮＡマーカー量の比較は行わなかった。
【0103】
議論
【0104】
実施例１および２に示すように、経腎胎児ｃｆＤＮＡは、実施例２の表１の洗浄後細胞ペレット試料を除く、母体尿試料のほぼすべての試料または画分において検出可能である。さらに驚くべきことに、実施例２に示されるように、「洗浄除去」画分には相当量の胎児ｃｆＤＮＡが含まれており、これはコレクション＃１試料の「上清」画分の少なくとも１／３であり、コレクション＃２試料の「上清」画分の１．２６倍でさえある。これらの結果は、洗浄前ペレット（実施例２）またはペレット（実施例１）画分は、尿試料の従来の遠心分離前処理後に実質的に通常廃棄されるペレットであるが、胎児ｃｆＤＮＡの驚くほど重要な部分を含んでいることを示している。これは、経腎循環細胞外ＤＮＡ分子の一部が、採取された尿試料中の細胞または細胞残屑と会合していることを示しており、これらの細胞は、典型的な前処理遠心分離速度である１，０００ｒｐｍ、１０分間、またはそれより高速で短時間の遠心分離後、細胞ペレットとともにペレット化される。
【0105】
表２にさらに示されるように、Ｎ．Ｃ．試料で回収されたＹ－Ｃｈｒコピーは、すべての画分を合わせた遠心分離前処理試料のＹ－Ｃｈｒコピーと比較して約４～５倍であるため、Ｎ．Ｃ．アプローチは、驚くべきことに、遠心分離－洗浄除去アプローチよりも、母体尿試料からの曖昧さのない経腎ＤＮＡマーカーである胎児ｃｆＤＮＡを回収する効率がはるかに高いようである。例えば、コレクション＃１では、Ｎ．Ｃ．試料（すなわち４９．５８）と遠心分離前処理済み試料の合計（すなわち７．９９＋２．７８＝１０．７７）の差は約４．６倍である。コレクション＃２では、Ｎ．Ｃ．試料（すなわち１７．６２）と遠心分離前処理済み試料の合計（すなわち１．５１＋１．９１＝３．４２）の差は約５．２倍である。これは、ペレットの洗浄除去を含む各前処理と、後者の単離工程でＤＮＡが失われるためと推測される。そのため、尿試料から経腎ｃｆＤＮＡを回収するには、前処理として遠心分離を行わず、採取した尿試料から直接ＤＮＡを単離する方法が望ましいと考えられる。特筆すべきは、ｄｓＤＮＡ ＳＰＫＮ １３１ｂｐ ＤＮＡフラグメントのような外因性スパイクｃｆＤＮＡは、細胞ペレットとの有意な関連性がほとんど、あるいは全くなく、細胞ペレットからの上清の分画対照として使用できる上清中に残る。このことは、すべての種類のｃｆＤＮＡが、前処理遠心分離で生じた細胞残屑ペレットと同じ程度に会合するわけではないことを示している。実施例３は、前処理遠心分離後のペレット画分にも検出された別の経腎ｃｆＤＮＡ、ＨＣＣ関連ＤＮＡマーカーを提供する。前処理工程としての遠心分離も同様に、ｃｆＤＮＡと同様の物理化学的性質を考慮すると、ｃｆＤＮＡに加えて、ＨＣＣ由来のＤＮＡマーカー、あるいはｍｉＲＮＡやｃｆＲＮＡなどの他の内在性無細胞核酸（ｃｆＮＡ）のかなりの部分が、それによって得られたペレットとともに引き下げられる可能性がある。
【0106】
結論
【0107】
尿中の循環細胞外胎児性ＤＮＡと肝細胞がん由来ＤＮＡおよびＨＢＶ ＤＮＡを含む肝臓由来ＤＮＡを調べたところ、驚くべきことに２つの重要な観察結果が得られた。第一に、尿中のかなりの量の循環由来の無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）または経腎ＤＮＡが、遠心分離によって生成された細胞ペレットに関連付けられている。その結果、尿中ｃｆＤＮＡ単離のために遠心分離を用いて上清を得る前処理を行うと、上清からのみＤＮＡ単離を行った場合、胎児ＤＮＡ、ＨＣＣ ＤＮＡ、結腸直腸がんＤＮＡ、ＨＢＶ ＤＮＡなどの目的のｃｆＤＮＡやその他の経腎ＤＮＡが相当量失われる可能性がある。第二に、尿中の循環由来のｃｆＤＮＡまたは経腎ＤＮＡは１ｋｂ未満の比較的小さなサイズの低分子量（ＬＭＷ）ＤＮＡであるのに対し、細胞内で得られるゲノムＤＮＡははるかに大きなサイズの高分子量（ＨＭＷ）ＤＮＡである。再処理することなく尿のような体液中のｃｆＤＮＡを単離するためには、全尿ＤＮＡを単離した後、バックグラウンドＤＮＡの大部分であるＨＭＷ ＤＮＡを除去することにより、目的のＤＮＡの濃度を高め、検出感度を向上させることができる。尿またはその他の体液中の循環由来ｃｆＤＮＡをサイズ分画によって選択的に濃縮し、ＨＭＷ ＤＮＡを除去してＬＭＷ ＤＮＡを得ることは、以下のような様々な方法によって達成することができるが、これらに限定されるものではない：アガロースまたはポリアクリルアミドゲル上のクロマトグラフィー、イオン対逆相高速液体クロマトグラフィー、自己コーティング、低粘度または他のポリマーマトリックス中のキャピラリー電気泳動、マイクロファブリケーション電気泳動装置での選択的抽出、マイクロチップ電気泳動、吸着膜クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーまたは電気泳動の使用；密度勾配遠心分離、および、マイクロファブリケーションエントロピートラップアレイ、カルボキシル化ビーズなどのナノテクノロジー手段を利用する方法。
【0108】
このようにして、遠心分離や細胞残屑を回収する他の手段を用いることなく、全ＤＮＡを単離し、次いでＨＭＷ ＤＮＡを除去することによって得られるＬＭＷ ＤＮＡ分画は、遺伝性疾患、性別、あるいは早期がん検出、がんスクリーニングのためのがんの遺伝的特徴、および、疾病管理あるいは疾病管理のためのウイルスの遺伝的特徴を検出するリスクのある妊娠における胎児の遺伝形質のその後の決定を可能にするだけではない。
【0109】
このような目的の遺伝的特徴の決定は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術、プローブハイブリダイゼーション、次世代配列決定、核酸アレイ（ＤＮＡチップなど）などの方法によって行うことができる。
【0110】
参考文献
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【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【配列表】
【国際調査報告】