特表 2024-525916 抗ＣＬＬ－１抗体及びその用途

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-07-12

(54)【発明の名称】抗ＣＬＬ－１抗体及びその用途

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/28 20060101AFI20240705BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20240705BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240705BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20240705BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20240705BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240705BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240705BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20240705BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240705BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20240705BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240705BHJP

【ＦＩ】

C07K16/28 ZNA

C12N15/13

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

A61K47/68

A61P35/00

A61P35/02

A61K39/395 T

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024503724

(86)(22)【出願日】2022-07-20

(85)【翻訳文提出日】2024-03-18

(86)【国際出願番号】 IB2022056676

(87)【国際公開番号】W WO2023002390

(87)【国際公開日】2023-01-26

(31)【優先権主張番号】10-2021-0095142

(32)【優先日】2021-07-20

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(31)【優先権主張番号】10-2021-0176638

(32)【優先日】2021-12-10

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】524025587

【氏名又は名称】エイビーエル バイオ インク．

【氏名又は名称原語表記】ＡＢＬ ＢＩＯ ＩＮＣ．

【住所又は居所原語表記】１６， Ｄａｅｗａｎｇｐａｎｇｙｏ－ｒｏ ７１２ｂｅｏｎ－ｇｉｌ Ｂｕｎｄａｎｇ－ｇｕ Ｓｅｏｎｇｎａｍ－ｓｉ Ｇｙｅｏｎｇｇｉ－ｄｏ １３４８８ （ＫＲ）

(74)【代理人】

【識別番号】110001139

【氏名又は名称】ＳＫ弁理士法人

(74)【代理人】

【識別番号】100130328

【弁理士】

【氏名又は名称】奥野 彰彦

(74)【代理人】

【識別番号】100130672

【弁理士】

【氏名又は名称】伊藤 寛之

(72)【発明者】

【氏名】ソン、ウンシル

(72)【発明者】

【氏名】クォン、ジョンア

(72)【発明者】

【氏名】キム、ヨンクァン

(72)【発明者】

【氏名】キム、ジュヒ

(72)【発明者】

【氏名】パク、キョンジン

(72)【発明者】

【氏名】パク、スミョン

(72)【発明者】

【氏名】ソン、ビョンジェ

(72)【発明者】

【氏名】ユ、ビョンミン

(72)【発明者】

【氏名】イ、ボラ

(72)【発明者】

【氏名】イ、スヨン

(72)【発明者】

【氏名】イ、シネ

(72)【発明者】

【氏名】イ、ヤンスン

(72)【発明者】

【氏名】イ、ウンヒ

(72)【発明者】

【氏名】イム、ヤンミ

(72)【発明者】

【氏名】ジョン、ジェヒョン

(72)【発明者】

【氏名】ジョン、ジンウォン

【テーマコード（参考）】

4B065

4C076

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA01X

4B065AA57X

4B065AA72X

4B065AA90X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA25

4B065CA44

4C076AA95

4C076CC27

4C076CC41

4C076EE59

4C085AA13

4C085AA14

4C085AA21

4C085AA26

4C085BB01

4C085BB11

4C085BB36

4C085BB41

4C085BB43

4C085EE01

4C085GG02

4C085GG04

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA72

4H045DA76

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

抗ＣＬＬ－１抗体及びその用途が提供され、一態様の抗ＣＬＬ－１抗体によれば、これはＣＬＬ－１に高い結合親和性で結合することができ、Ｔ細胞の活性化を誘導することができるので、ＣＬＬ－１を発現する癌を予防または治療するのに効果的に用いられることができる。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

下記を含む、単離された抗ＣＬＬ－１抗体（ａｎｔｉ－ＣＬＬ－１ ａｎｔｉｂｏｄｙ）またはその抗原結合フラグメント：
（ａ）配列番号１、２及び３からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号４、５及び６からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号７、８、９、１０及び１１からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号１２、１３、１４及び１５からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号１６、１７及び１８からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ２；及び
（ｆ）配列番号１９、２０、２１及び２２からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ３。

【請求項2】

前記抗ＣＬＬ－１抗体またはその断片は、配列番号２３及び２４からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含む請求項１に記載の抗ＣＬＬ－１抗体。

【請求項3】

前記抗ＣＬＬ－１抗体またはその断片は、配列番号５５からなるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含む請求項１または２に記載の抗ＣＬＬ－１抗体。

【請求項4】

前記抗ＣＬＬ－１抗体またはその断片は、配列番号２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５及び７４からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む請求項１～３のいずれか一項に記載の抗ＣＬＬ－１抗体。

【請求項5】

前記抗ＣＬＬ－１抗体またはその断片は、配列番号３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４及び７５からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む請求項１～４のいずれか一項に記載の抗ＣＬＬ－１抗体。

【請求項6】

前記抗ＣＬＬ－１抗体またはその断片は、配列番号４５からなるアミノ酸配列を含む重鎖を含む請求項１～５のいずれか一項に記載の抗ＣＬＬ－１抗体。

【請求項7】

前記抗ＣＬＬ－１抗体またはその断片は、配列番号４６からなるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む請求項１～６のいずれか一項に記載の抗ＣＬＬ－１抗体。

【請求項8】

前記抗ＣＬＬ－１抗体またはその断片は、重鎖可変領域のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３、及び軽鎖可変領域のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３の配列を含み、
（ａ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号１、４及び７であり、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号１２、１６及び１９であるか；
（ｂ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号２、５及び８であり、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号１３、１７及び２０であるか；
（ｃ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号３、６及び９であり、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号１４、１８及び２１であるか；
（ｄ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号１、４及び１０であり、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号１５、１６及び２２であるか；または
（ｅ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号２、５及び１１であり、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号１３、１７及び２０である請求項１～７のいずれか一項に記載の抗ＣＬＬ－１抗体。

【請求項9】

前記抗ＣＬＬ－１抗体またはその抗原結合フラグメントは、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、または完全ヒト抗体である請求項１～８のいずれか一項に記載の抗ＣＬＬ－１抗体。

【請求項10】

前記抗ＣＬＬ－１抗体またはその抗原結合フラグメントは、全体ＩｇＧ、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）_２、ｘＦａｂ、ｓｃＦａｂ、ｄｓＦｖ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、ｓｃＦａｂ－Ｆｃ、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）、ｓｃＡｂ、ｄＡｂ、半ＩｇＧ及びその組み合わせからなる群から選択される請求項１～９のいずれか一項に記載の抗ＣＬＬ－１抗体。

【請求項11】

ＩｇＧ１の形態である請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗ＣＬＬ－１抗体。

【請求項12】

前記抗ＣＬＬ－１抗体またはその抗原結合フラグメントは、Ｆａｂ分子である請求項１～１１のいずれか一項に記載の抗ＣＬＬ－１抗体。

【請求項13】

前記抗ＣＬＬ－１抗体または抗原結合フラグメントは、下記特徴中の一つ以上を持つ請求項１～１２のいずれか一項に記載の抗ＣＬＬ－１抗体：
（ａ）ヒト（ｈｕｍａｎ）ＣＬＬ－１への結合；
（ｂ）カニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍｏｎｋｅｙ）ＣＬＬ－１への結合；
（ｃ）ヒト末梢血単核細胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅｏｃｙｔｅ ｃｅｌｌ：ＰＢＭＣ）表面上のＣＬＬ－１への；
（ｄ）カニクイザルＰＢＭＣ表面上のＣＬＬ－１への結合；及び
（ｅ）癌細胞表面上のＣＬＬ－１への結合。

【請求項14】

細胞傷害剤（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ａｇｅｎｔ）が前記抗ＣＬＬ－１抗体または抗原結合フラグメントの少なくとも一部に接合される請求項１～１３のいずれか一項に記載の抗ＣＬＬ－１抗体。

【請求項15】

前記細胞傷害剤が前記抗ＣＬＬ－１抗体または抗原結合フラグメントにリンカーを介して付着する請求項１４に記載の抗ＣＬＬ－１抗体。

【請求項16】

前記リンカーは、プロテアーゼ（ｐｒｏｔｅａｓｅ）によって切断可能なものである請求項１５に記載の抗ＣＬＬ－１抗体。

【請求項17】

薬剤（ｍｅｄｉｃａｍｅｎｔ）として使用するためのものである請求項１～１６のいずれか一項に記載の抗ＣＬＬ－１抗体。

【請求項18】

癌を治療または予防するのに使用するためのものである請求項１～１７のいずれか一項に記載の抗ＣＬＬ－１抗体。

【請求項19】

式Ａｂ－（Ｌ－Ｄ）ｐを含むイムノコンジュゲート（ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）であって、（ａ）Ａｂは、請求項１～１６のいずれか一項に記載の抗ＣＬＬ－１抗体であり、（ｂ）Ｌはリンカーであり、（ｃ）Ｄは細胞傷害剤であり、（ｄ）ｐは１～８の範囲であるイムノコンジュゲート。

【請求項20】

請求項１～１６のいずれか一項に記載の抗ＣＬＬ－１抗体をコードする単離された核酸。

【請求項21】

請求項２０に記載の単離された核酸を含むベクター。

【請求項22】

請求項２１に記載のベクターを含む宿主細胞。

【請求項23】

請求項１～１６のいずれか一項に記載の抗ＣＬＬ－１抗体を含む医薬組成物。

【請求項24】

癌を治療または予防するための請求項２３に記載の医薬組成物。

【請求項25】

前記癌はＣＬＬ－１を発現する癌であるものである請求項２４に記載の医薬組成物。

【請求項26】

前記癌は、白血病、直腸癌、子宮内膜癌、腎芽腫（ｎｅｐｈｒｏｂｌａｓｔｏｍａ）、基底細胞癌、上咽頭癌、骨腫瘍、食道癌、リンパ腫、ホジキンリンパ腫（Ｈｏｄｇｋｉｎ'ｓ ｌｙｍｐｈｏｍａ）、非ホジキンリンパ腫（ｎｏｎ－Ｈｏｄｇｋｉｎ'ｓ ｌｙｍｐｈｏｍａ）、甲状腺濾胞癌（ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ ｔｈｙｒｏｉｄ ｃａｎｃｅｒ）、肝細胞癌、口腔癌、腎細胞癌、多発性骨髄腫、中皮腫、骨肉腫、骨髄異形成症候群（ｍｙｅｌｏｄｙｓｐｌａｓｔｉｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、間葉系腫瘍、軟部肉腫、脂肪肉腫、消化管間質腫瘍（ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｓｔｒｏｍａｌ ｔｕｍｏｒ）、悪性末梢神経鞘腫瘍（ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｎｅｒｖｅ ｓｈｅａｔｈ ｔｕｍｏｒ：ＭＰＮＳＴ）、ユーイング肉腫（ｅｗｉｎｇ ｓａｒｃｏｍａ）、平滑筋肉腫、間葉系軟骨肉腫、リンパ肉腫、線維肉腫、横紋筋肉腫、奇形腫、神経芽腫、髄芽腫、神経膠腫、良性皮膚腫瘍、バーキットリンパ腫（Ｂｕｒｋｉｔｔ'ｓ ｌｙｍｐｈｏｍａ）、マントル細胞リンパ腫（ｍａｎｔｌｅ ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ｄｉｆｆｕｓｅ ｌａｒｇｅ Ｂ ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ：ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ ｌｙｍｐｈｏｍａ）、辺縁帯リンパ腫（ｍａｒｇｉｎａｌ ｚｏｎｅ ｌｙｍｐｈｏｍａ）、神経外胚葉性腫瘍、上皮腫瘍、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ｃｕｔａｎｅｏｕｓ Ｔ－ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ：ＣＴＣＬ）、末梢性Ｔ細胞リンパ腫（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｔ ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ：ＰＴＣＬ）、末梢性Ｔ細胞リンパ腫、膵臓癌、造血器悪性腫瘍（ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ）、腎臓癌、腫瘍血管系（ｔｕｍｏｒ ｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ）、乳癌、腎臓癌、卵巣癌、上皮性卵巣癌、胃癌、肝臓癌、肺癌、大腸癌、膵臓癌、皮膚癌、膀胱癌、精巣腫瘍、子宮癌、前立腺癌、小細胞肺癌（ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ：ＳＣＬＣ）、非小細胞肺癌（ｎｏｎ－ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ：ＮＳＣＬＣ）、神経芽細胞腫、脳癌、結腸癌、扁平上皮癌、黒色腫、骨髄腫、子宮頸癌、甲状腺癌、頭頸部癌、副腎癌からなる群から選択される請求項２４または２５に記載の医薬組成物。

【請求項27】

前記白血病は、急性リンパ芽球性白血病（ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ：ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ｃｈｒｏｎｉｃ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ：ＣＬＬ）、有毛細胞白血病（ｈａｉｒｙ－ｃｅｌｌ ｌｅｕｋｅｍｉａ）、骨髄異形成症候群（ｍｙｅｌｏｄｙｓｐｌａｓｔｉｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅ：ＭＤＳ）、慢性骨髄性白血病（ｃｈｒｏｎｉｃ ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ ｌｅｕｋｅｍｉａ：ＣＭＬ）および急性骨髄性白血病（ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ：ＡＭＬ）からなる群から選択される請求項２６に記載の医薬組成物。

【請求項28】

請求項１～１６のいずれか一項に記載の抗ＣＬＬ－１抗体の有効量を患者に投与する段階を含む、これを要する患者における癌を治療または予防する方法。

【請求項29】

癌を治療または予防するための薬剤の製造において、請求項１～１６のいずれか一項に記載の抗ＣＬＬ－１抗体の用途。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

＜関連出願に対する相互参照＞
本願は、韓国特許庁に２０２１年７月２０日付けで出願された韓国特許仮出願第１０－２０２１－００９５１４２号、及び２０２１年１２月１０日付けで出願された韓国特許仮出願第１０－２０２１－０１７６６３８号を基礎として、優先権を主張して、これらの開示内容はその全文が本願に参照により組み込まれる。

【0002】

抗ＣＬＬ－１抗体（ａｎｔｉ－ＣＬＬ－１ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）及びその用途を提供する。

【背景技術】

【0003】

急性骨髓性白血病（Ａｃｕｔｅ Ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ：ＡＭＬ）は、成人患者において最もありふれており、かつ致命的な血液悪性腫瘍であって、大部分の患者は予後が良くない。ＡＭＬは、疾病の異質性、特定の標的抗原の不足、及び既存治療後の再発を媒介する白血病幹細胞（ｌｅｕｋｅｍｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ：ＬＳＣ）の存在によって依然として治療しにくい。

【0004】

ＣＬＥＣ１２Ａ（Ｃ－ｔｙｐｅ ｌｅｃｔｉｎ ｄｏｍａｉｎ ｆａｍｉｌｙ １２ ｍｅｍｂｅｒ Ａ；そしてＣＬＬ－１（Ｃ－ｔｙｐｅ ｌｅｃｔｉｎ－ｌｉｋｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅ－１）、ＣＤ３７１、ＤＣＡＬ２（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｌｅｃｔｉｎ ２）、ＭＩＣＬ（ｍｙｅｌｏｉｄ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｃ－ｔｙｐｅ ｌｅｃｔｉｎ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）及びＫＬＲＬ１（ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ ｌｅｃｔｉｎ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－１）として知られている）は、新たに診断されたＡＭＬ及び再発されたＡＭＬの９０％以下で発現される骨髓性分化抗原（ｍｙｅｌｏｉｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｎｔｉｇｅｎ）である。これは細胞外Ｃ末端レクチンドメイン、膜貫通領域及びＮ末端細胞質テールを含むＩＩ型膜貫通糖タンパク質である。

【0005】

モノクローナル抗体（ｍＡｂ）をベースにした療法は、癌に対する重要な治療方式になった。白血病は、このような接近法に非常に好適であり、これは血液、骨髓、脾臓、およびリンパ節に存在する悪性細胞に対して接近可能であり、抗原標的を識別することができる多様な系統と造血分化段階の免疫表現型（ｉｍｍｕｎｏｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ）がよく定義されているからである。急性骨髓性白血病（ＡＭＬ）に対する大部分の研究は、ＣＤ３３に重点を置いていた。しかし、非コンジュゲート抗ＣＤ３３ｍＡｂリンツズマブ（ｌｉｎｔｕｚｕｍａｂ）に対する反応は、ＡＭＬに対して単剤で適度の活性を示し、既存の化学療法と併用した２件のランダム化臨床試験（ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ ｔｒｉａｌｓ）で患者の予後を改善することができなかった。

【0006】

ＣＬＬ－１関連疾患（ＣＬＬ－１－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）、例えば癌の診断及び治療のためにＣＬＬ－１を含むＡＭＬを標的とする安全でかつ効果的な薬剤に対する必要性が当該技術分野で求められている。本発明はこのような要求を満たすとともにまた他の利点を提供する。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本開示内容の一態様は、単離された抗ＣＬＬ－１抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。

【0008】

本開示内容の他の態様は、抗ＣＬＬ－１抗体をコードする単離された核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）を提供する。

【0009】

本開示内容の他の態様は、単離された核酸を含むベクター（ｖｅｃｔｏｒ）を提供する。

【0010】

本開示内容の他の態様は、ベクターを含む宿主細胞（ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ）を提供する。

【0011】

本開示内容の他の態様は、抗ＣＬＬ－１抗体を含む医薬組成物（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）を提供する。

【0012】

本開示内容の他の態様は、患者に有効量の抗ＣＬＬ－１抗体を投与する段階を含む、これを必要とする患者の癌を治療または予防する方法を提供する。

【0013】

本開示内容の他の態様は、癌を治療または予防するための薬剤（ｍｅｄｉｃａｍｅｎｔ）の製造における抗ＣＬＬ－１抗体の用途を提供する。

【0014】

本開示内容の他の態様は、癌を治療または予防するための抗ＣＬＬ－１抗体の用途を提供する。

【課題を解決するための手段】

【0015】

本開示内容の一態様は、下記を含む、単離された抗ＣＬＬ－１抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する：（ａ）配列番号１、２及び３からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ１；（ｂ）配列番号４、５及び６からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ２；（ｃ）配列番号７、８、９、１０及び１１からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ３；（ｄ）配列番号１２、１３、１４及び１５からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ１；（ｅ）配列番号１６、１７及び１８からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ２；及び（ｆ）配列番号１９、２０、２１及び２２からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ３。

【0016】

一実施形態において、抗ＣＬＬ－１抗体またはその断片は、配列番号２３及び２４からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含むことができる。

【0017】

一実施形態において、抗ＣＬＬ－１抗体またはその断片は、配列番号５５からなるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含むことができる。

【0018】

一実施形態において、抗ＣＬＬ－１抗体またはその断片は、配列番号２３及び２４からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む重鎖定常領域と、配列番号５５からなるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域とを含むことができる。

【0019】

一実施形態において、抗ＣＬＬ－１抗体またはその断片は、配列番号２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５及び７４からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含むことができる。

【0020】

一実施形態において、抗ＣＬＬ－１抗体またはその断片は、配列番号３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４及び７５からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むことができる。

【0021】

一実施形態において、抗ＣＬＬ－１抗体またはその断片は、配列番号２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５及び７４からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む重鎖定常領域と、配列番号３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４及び７５からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域とを含むことができる。

【0022】

一実施形態において、抗ＣＬＬ－１抗体またはその断片は、配列番号４５からなるアミノ酸配列を含む重鎖を含むことができる。

【0023】

一実施形態において、抗ＣＬＬ－１抗体またはその断片は、配列番号４６からなるアミノ酸配列を含む軽鎖を含むことができる。

【0024】

一実施形態において、抗ＣＬＬ－１抗体またはその断片は、配列番号４５からなるアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号４６からなるアミノ酸配列を含む軽鎖とを含むことができる。

【0025】

一実施形態において、抗ＣＬＬ－１抗体またはその断片は、重鎖可変領域のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３及び軽鎖可変領域のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３の配列を含むことができ、これは下記のいずれか一つである：（ａ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号１、４、及び７であり、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号１２、１６及び１９である；（ｂ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号２、５、及び８であり、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号１３、１７及び２０である；（ｃ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号３、６、及び９であり、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号１４、１８及び２１である；（ｄ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号１、４、及び１０であり、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号１５、１６及び２２である；及び（ｅ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号２、５、及び１１であり、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号１３、１７及び２０である。

【0026】

一実施形態において、抗ＣＬＬ－１抗体またはその抗原結合フラグメントは、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、または完全ヒト抗体であることができる。

【0027】

一実施形態において、抗ＣＬＬ－１抗体またはその抗原結合フラグメントは、全ＩｇＧ（ｗｈｏｌｅ ＩｇＧ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）_２、ｘＦａｂ、ｓｃＦａｂ、ｄｓＦｖ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、ｓｃＦａｂ－Ｆｃ、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）、ｓｃＡｂ、ｄＡｂ、半ＩｇＧ及びその組み合わせからなる群から選択されることができる。

【0028】

一実施形態で、抗ＣＬＬ－１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ、望ましくはＩｇＧ１の形態であることができる。

【0029】

一実施形態において、抗ＣＬＬ－１抗体またはその抗原結合フラグメントは、Ｆａｂ分子であることができる。

【0030】

一実施形態において、抗ＣＬＬ－１抗体またはその抗原結合フラグメントは、下記特性のいずれか一つ以上を有することができる：（ａ）ヒト（ｈｕｍａｎ）ＣＬＬ－１への結合；（ｂ）カニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍｏｎｋｅｙ）ＣＬＬ－１への結合；（ｃ）ヒト末梢血単核細胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅｏｃｙｔｅ ｃｅｌｌ：ＰＢＭＣ）の表面上のＣＬＬ－１への結合；（ｄ）カニクイザルＰＢＭＣ表面上のＣＬＬ－１への結合；及び（ｅ）癌細胞表面上のＣＬＬ－１への結合。

【0031】

一実施形態において、細胞傷害剤（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ａｇｅｎｔ）は、抗ＣＬＬ－１抗体または抗原結合フラグメントの少なくとも一部に接合されることができる。

【0032】

一実施形態において、細胞傷害剤は、抗ＣＬＬ－１抗体または抗原結合フラグメントにリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）を介して付着できる。

【0033】

一実施形態において、リンカーは、プロテアーゼ（ｐｒｏｔｅａｓｅ）によって切断できる。

【0034】

一実施形態において、抗ＣＬＬ－１抗体は、薬剤として用いるためのものであってもよい。

【0035】

一実施形態において、抗ＣＬＬ－１抗体は、癌の治療または予防に用いるためのものであってもよい。

【0036】

本開示内容の他の態様は、式Ａｂ－（Ｌ－Ｄ）ｐを含むイムノコンジュゲート（ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を提供し、ここで、（ａ）Ａｂは、上記の抗ＣＬＬ－１抗体であり、（ｂ）Ｌはリンカーであり、（ｃ）Ｄは、細胞傷害剤であり、（ｄ）ｐは、１～８の範囲である。

【0037】

本開示内容の他の態様は、抗ＣＬＬ－１抗体をコードする単離された核酸を提供する。

【0038】

本開示内容の他の態様は、単離された核酸を含むベクターを提供する。

【0039】

本開示内容の他の態様は、ベクターを含む宿主細胞を提供する。

【0040】

本開示内容の他の態様は、抗ＣＬＬ－１抗体を含む医薬組成物を提供する。

【0041】

本開示内容の他の態様は、患者に有効量の抗ＣＬＬ－１抗体を投与する段階を含む、これを要する患者の癌を治療または予防する方法を提供する。

【0042】

本開示内容の他の態様は、癌を治療または予防するための薬剤の製造における抗ＣＬＬ－１抗体の用途を提供する。

【0043】

本開示内容の他の態様は、癌を治療または予防するための抗ＣＬＬ－１抗体の用途を提供する。

【0044】

一実施形態で、医薬組成物は癌を治療または予防するためのものであってもよい。

【0045】

一実施形態で、癌は固形癌（ｓｏｌｉｄ ｃａｎｃｅｒ）または血液癌（ｂｌｏｏｄ ｃａｎｃｅｒ）であることができる。

【0046】

一実施形態において、癌は、白血病、直腸癌、子宮内膜癌、腎芽腫（ｎｅｐｈｒｏｂｌａｓｔｏｍａ）、基底細胞癌、上咽頭癌、骨腫瘍、食道癌、リンパ腫、ホジキンリンパ腫（Ｈｏｄｇｋｉｎ'ｓ ｌｙｍｐｈｏｍａ）、非ホジキンリンパ腫（ｎｏｎ－Ｈｏｄｇｋｉｎ'ｓ ｌｙｍｐｈｏｍａ）、甲状腺濾胞癌（ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ ｔｈｙｒｏｉｄ ｃａｎｃｅｒ）、肝細胞癌、口腔癌、腎細胞癌、多発性骨髄腫、中皮腫、骨肉腫、骨髄異形成症候群（ｍｙｅｌｏｄｙｓｐｌａｓｔｉｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、間葉系腫瘍、軟部肉腫、脂肪肉腫、消化管間質腫瘍（ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｓｔｒｏｍａｌ ｔｕｍｏｒ）、悪性末梢神経鞘腫瘍（ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｎｅｒｖｅ ｓｈｅａｔｈ ｔｕｍｏｒ：ＭＰＮＳＴ）、ユーイング肉腫（ｅｗｉｎｇ ｓａｒｃｏｍａ）、平滑筋肉腫、間葉系軟骨肉腫、リンパ肉腫、線維肉腫、横紋筋肉腫、奇形腫、神経芽腫、髄芽腫、神経膠腫、良性皮膚腫瘍、バーキットリンパ腫（Ｂｕｒｋｉｔｔ'ｓ ｌｙｍｐｈｏｍａ）、マントル細胞リンパ腫（ｍａｎｔｌｅ ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ｄｉｆｆｕｓｅ ｌａｒｇｅ Ｂ ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ：ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ ｌｙｍｐｈｏｍａ）、辺縁帯リンパ腫（ｍａｒｇｉｎａｌ ｚｏｎｅ ｌｙｍｐｈｏｍａ）、神経外胚葉性腫瘍、上皮腫瘍、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ｃｕｔａｎｅｏｕｓ Ｔ－ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ：ＣＴＣＬ）、末梢性Ｔ細胞リンパ腫（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｔ ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ：ＰＴＣＬ）、末梢性Ｔ細胞リンパ腫、膵臓癌、造血器悪性腫瘍（ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ）、腎臓癌、腫瘍血管系（ｔｕｍｏｒ ｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ）、乳癌、腎臓癌、卵巣癌、上皮性卵巣癌、胃癌、肝臓癌、肺癌、大腸癌、膵臓癌、皮膚癌、膀胱癌、精巣腫瘍、子宮癌、前立腺癌、小細胞肺癌（ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ：ＳＣＬＣ）、非小細胞肺癌（ｎｏｎ－ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ：ＮＳＣＬＣ）、神経芽細胞腫、脳癌、結腸癌、扁平上皮癌、黒色腫、骨髄腫、子宮頸癌、甲状腺癌、頭頸部癌、副腎癌からなる群から選択され得る。

【0047】

一実施形態において、白血病は、急性リンパ芽球性白血病（ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ：ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ｃｈｒｏｎｉｃ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ：ＣＬＬ）、有毛細胞白血病（ｈａｉｒｙ－ｃｅｌｌ ｌｅｕｋｅｍｉａ）、骨髄異形成症候群（ｍｙｅｌｏｄｙｓｐｌａｓｔｉｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅ：ＭＤＳ）、慢性骨髄性白血病（ｃｈｒｏｎｉｃ ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ ｌｅｕｋｅｍｉａ：ＣＭＬ）および急性骨髄性白血病（ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ：ＡＭＬ）からなる群から選択され得る。

【0048】

一実施形態で、癌はＣＬＬ－１を発現する癌であることができる。

【発明の効果】

【0049】

一態様の抗ＣＬＬ－１抗体によれば、これはＣＬＬ－１に高い結合親和性で結合することができ、Ｔ細胞の活性化を誘導することができるので、ＣＬＬ－１を発現する癌を予防または治療するのに効果的に用いられることができる。

【図面の簡単な説明】

【0050】

【図1】図１は、ｈｕＣＬＬ１－Ｈｉｓをリガンドとして用いる一実施形態による３つのキメラ抗体のリガンド結合活性を示すグラフである。

【図2】図２は、ｈＦｃ－ｈｕＣＬＬ１をリガンドとして用いる一実施形態による３つのキメラ抗体のリガンド結合活性を示すグラフである。

【図3】図３は、ｈＦｃ－カニクイザルＣＬＬ１５０ｎｇ／ｗｅｌｌをリガンドとして用いる一実施形態による３つのキメラ抗体のリガンド結合活性を示すグラフである。

【図4】図４は、ｈＦｃ－カニクイザルＣＬＬ１１００ｎｇ／ｗｅｌｌをリガンドとして用いる一実施形態による３つのキメラ抗体のリガンド結合活性を示すグラフである。

【図5】図５は、一実施形態によるキメラ抗体及びヒト化抗体ｈｕ１６Ｃ６のリガンド結合活性を示すグラフである。

【図6】図６は、一実施形態によるキメラ抗体及びヒト化抗体ｈｕ３３Ｃ２のリガンド結合活性を示すグラフである。

【図7】図７は、一実施形態による多様なヒト化抗体ｈｕ３３Ｃ２のリガンド結合活性を示すグラフである。

【図8】図８は、ＣＬＬ１陰性細胞及び多様なＣＬＬ１－発現癌細胞における一実施形態によるキメラ抗体の細胞結合活性を示すグラフである。

【図9】図９は、ＨＬ６０における一実施形態によるキメラ抗体の細胞結合活性を示すグラフである。

【図10】図１０は、Ｕ９３７における一実施形態によるキメラ抗体の細胞結合活性を示すグラフである。

【図11】図１１は、カニクイザルＣＬＬ－１を過発現するＨＥＫ２９３Ｅにおける一実施形態によるキメラ抗体の細胞結合活性を示すグラフである。

【図12】図１２は、一実施形態によるキメラ抗体及び多様なヒト化抗体ｈｕ３３Ｃ２の細胞結合活性を示すグラフである。

【図13】図１３は、一実施形態によるキメラ抗体及び多様なヒト化抗体ｈｕ１６Ｃ６の細胞結合活性を示すグラフである。

【図14】図１４は、一実施形態によるｃｈ８４Ａ２、ｈｕ１６Ｃ６及びｈｕ３３Ｃ２のＡＤＣＣを示すグラフである。

【図15】図１５は、ＥＯＬ－１における一実施形態によるＡＤＣの細胞増殖抑制活性を示すグラフである。

【図16】図１６は、ＴＨＰ－１における一実施形態によるＡＤＣの細胞増殖抑制活性を示すグラフである。

【図17】図１７は、ＣＬＬ１発現癌細胞における一実施形態による二重特異性抗体の細胞結合活性を示すグラフである。

【図18】図１８は、一実施形態による二重特異性抗体の細胞結合活性を示すグラフである。

【図19】図１９は、一実施形態による二重特異性抗体のＴ細胞活性化を示すグラフである。

【図20】図２０は、ＨＬ－６０における一実施形態による二重特異性抗体のＴ細胞活性化及び細胞溶解活性を示すグラフである。

【図21】図２１は、Ｕ９３７における一実施形態による二重特異性抗体のＴ細胞活性化及び細胞溶解活性を示すグラフである。

【図22】図２２は、一実施形態による二重特異性抗体の抗原－依存的細胞溶解活性を示すグラフである。

【図23】図２３は、Ｕ９３７異種移植モデル（Ｕ９３７ ｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｍｏｄｅｌ）における一実施形態による二重特異性抗体のｉｎ ｖｉｖｏ効果（ｉｎ ｖｉｖｏ ｅｆｆｉｃａｃｙ）を示すグラフである。

【図24】図２４は、ＨＬ６０－Ｌｕ同所性ＡＭＬモデル（ＨＬ６０－Ｌｕ ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ ＡＭＬ ｍｏｄｅｌ）における一実施形態による二重特異性抗体投与でのＢＬＩ（Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｄｅｘ）を示すイメージである。

【図25】図２５は、ＨＬ６０－Ｌｕ同所性ＡＭＬモデルにおける一実施形態による二重特異性抗体投与でのＢＬＩの定量分析結果を示すグラフである（統計分析：Ｔｗｏ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ'ｓ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ ｔｅｓｔ）、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。

【図26】図２６は、ＨＬ６０－Ｌｕ同所性ＡＭＬモデルにおける一実施形態による二重特異性抗体投与でのＢＬＩ（Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｄｅｘ）を示すイメージである。

【図27】図２７は、ＨＬ６０－Ｌｕ同所性ＡＭＬモデルで一実施形態による二重特異性抗体投与でのＢＬＩの定量分析を示すグラフである（＊＊＊＝Ｐ＜０．００５）。

【図28】図２８は、一実施形態による二重特異性抗体投与後に骨髓内腫瘍細胞をＦＡＣＳで測定した結果を示すグラフである。

【図29】図２９は、一実施形態による二重特異性抗体投与後に骨髓内腫瘍細胞をＩＨＣ染色で測定した結果を示すイメージである。

【図30】図３０は、ＡＭＬ芽球（ＡＭＬ ｂｌａｓｔｓ）における一実施形態による二重特異性抗体の細胞溶解活性を示すグラフである。

【図31】図３１は、ＡＭＬ芽球における一実施形態による二重特異性抗体のＴ細胞活性化の活性を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0051】

＜定義＞

【0052】

別途定義しない限り、本願で使われた技術及び科学用語は、本発明の属する技術分野における一般に使われる意味と同じ意味を有する。本明細書を解釈する目的で、下記定義が適用されるはずであり、適切な場合、単数で使われた用語は複数をも含み、その反対の場合も同様である。

【0053】

本願における用語「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は、最も広い意味で使われ、目的する抗原結合活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単一特異性及び多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び抗体断片を含むが、これらに限定されない多様な抗体構造を含む。

【0054】

本願で使われた用語「モノクローナル抗体（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は、実質的に同種である抗体集団から得られた抗体を指し、すなわち当該集団を含む個別抗体は同一であり、及び／または同一のエピトープに結合し、ただし、可能な変異抗体は、自然発生的な突然変異を含むか、またはモノクローナル抗体製剤の生産中に発生することを含み、このような変異は一般的に少量で存在する。典型的に異なる決定基（エピトープ）に対する互いに異なる抗体を含むポリクローナル抗体製剤と異なり、モノクローナル抗体製剤の各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基に対して作用する。

【0055】

本願で使われた用語「単一特異性（ｍｏｎｏｓｐｅｃｉｆｉｃ）」抗体は、一つ以上の結合部位を持つ抗体を意味し、これらの各々は同一の抗原の同一のエピトープに結合する。用語「二重特異性（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）」は、抗体が少なくとも２つの区別される抗原決定基に特異的に結合することができることを意味し、例えば抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）の対によってそれぞれ形成された２つの結合部位が異なる抗原または同一の抗原上の異なるエピトープに結合する。このような二重特異性抗体は１＋１形式である。他の二重特異性抗体形式は、２＋１または１＋２形式（第１の抗原またはエピトープに対する２つの結合部位及び第２の抗原またはエピトープに対する１つの結合部位を含む）、もしくは２＋２形式（第１の抗原またはエピトープに対する２つの結合部位及び第２の抗原またはエピトープに対する２つの結合部位を含む）である。典型的に、二重特異性抗体は２つの抗原結合部位を含み、これらの各々は互いに異なる抗原決定基に対して特異的である。

【0056】

本願で使われる用語「価（ｖａｌｅｎｔ）」とは、抗体または抗体断片における結合ドメインの特定の数の存在をいう。よって、用語「１価（ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ）」、「２価（ｂｉｖａｌｅｎｔ）」、「４価（ｔｅｔｒａｖａｌｅｎｔ）」、及び「６価（ｈｅｘａｖａｌｅｎｔ）」は、抗体におけるそれぞれ１つの結合ドメイン、２つの結合ドメイン、４つの結合ドメイン、及び６つの結合ドメインの存在を示す。本発明による二重特異性抗体は、少なくても「２価（ｂｉｖａｌｅｎｔ）」であり、「３価（ｔｒｉｖａｌｅｎｔ）」または「多価（ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ）」（例えば、「４価（ｔｅｔｒａｖａｌｅｎｔ）」または「６価（ｈｅｘａｖａｌｅｎｔ）」）であることができる。特定の一態様において、本発明の抗体は２つ以上の結合部位を有し、二重特異性である。すなわち、抗体は２つ以上の結合部位が存在する場合（すなわち、抗体が３価または多価の場合）にも二重特異性であってもよい。

【0057】

用語「全長抗体（ｆｕｌｌ ｌｅｎｇｔｈ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」、「インタクトな抗体（ｉｎｔａｃｔ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」及び「全抗体（ｗｈｏｌｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は、天然抗体構造と実質的に類似した構造を持つ抗体を称するために本願で相互交換的に用いられる。「天然抗体（ｎａｔｉｖｅ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」とは、多様な構造を持つ自然発生的な兔疫グロブリン分子をいう。例えば、天然ＩｇＧ－クラス抗体は、２つの軽鎖及び２つの重鎖がジスルフィド結合された、約１５０，０００ダルトン（ｄａｌｔｏｎｓ）のヘテロ四量体糖タンパク質（ｈｅｔｅｒｏｔｅｔｒａｍｅｒｉｃ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ）である。Ｎ末端からＣ末端まで、各重鎖は可変重鎖ドメインまたは重鎖可変ドメインと呼ばれる可変領域（ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ：ＶＨ）、次に重鎖定常領域と呼ばれる３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）を持つ。同様に、Ｎ末端からＣ末端まで、各軽鎖は可変軽鎖ドメインまたは軽鎖可変ドメインと呼ばれる可変領域（ＶＬ）、次に軽鎖定常領域と呼ばれる軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）を持つ。抗体の重鎖は、α（ＩｇＡ）、δ（ＩｇＤ）、ε（ＩｇＥ）、γ（ＩｇＧ）、またはμ（ＩｇＭ）と呼ばれる５つのタイプの中で一つに指定されることができ、このうち一部はサブタイプ、例えばγ１（ＩｇＧ１）、γ２（ＩｇＧ２）、γ３（ＩｇＧ３）、γ４（ＩｇＧ４）、α１（ＩｇＡ１）及びα２（ＩｇＡ２）にさらに分類されることができる。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２つのタイプのうちどちらか一つに指定されることができる。

【0058】

前述したように、可変領域は、抗体が抗原上のエピトープを選択的に認識し、それに特異的に結合するようにする。すなわち、抗体のＶＬドメイン及びＶＨドメイン、または相補性決定領域（ＣＤＲ）のサブセットを組み合わせて３次元抗原結合部位を定義する可変領域を形成する。このような４次抗体構造は、Ｙの各アーム（ａｒｍ）の末端に存在する抗原結合部位を形成する。より具体的に、抗原結合部位はそれぞれのＶＨ及びＶＬ鎖上の３つのＣＤＲによって定義される（すなわち、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２及びＣＤＲ－Ｌ３）。一部の場合に、例えば所定の兔疫グロブリン分子は、ラクダ科種（ｃａｍｅｌｉｄ ｓｐｅｃｉｅｓ）に由来するか、またはラクダ科（ｃａｍｅｌｉｄ）兔疫グロブリンに基づいて操作された場合、完全兔疫グロブリン分子は軽鎖なしに重鎖単独で構成されることができる。例えば、Ｈａｍｅｒｓ－Ｃａｓｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３６３：４４６－４４８（１９９３）を参照する。

【0059】

用語「ＣＤＲ－Ｈ」、「ＨＣＤＲ」及び「ＣＤＲＨ」は、ＣＤＲのＶＨ鎖を称するために本願で相互交換的に使用される（例えば、ＣＤＲ－Ｈ１、ＨＣＤＲ１及びＣＤＲＨ１はＣＤＲのＶＨ１をいう）。用語「ＣＤＲ－Ｌ」、「ＬＣＤＲ」及び「ＣＤＲＬ」は、ＣＤＲのＶＬ鎖を称するいうために本願で相互交換的に使用される（例えば、ＣＤＲ－Ｌ１、ＬＣＤＲ１及びＣＤＲＬ１は、ＣＤＲのＶＬ１をいう）。

【0060】

自然発生的な抗体において、各抗原結合ドメインに存在する６つの「相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）」または「ＣＤＲ」は、抗体が水性環境で３次元立体配列を取るから抗原結合ドメインを形成するために特異的に位置する、短い非隣接したアミノ酸配列である。「フレームワーク（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ）」領域と呼ばれる、抗原結合ドメインにおいて、残りのアミノ酸は、より少ない分子間変動性を示す。フレームワーク領域は、主にβシートの立体配座（β－ｓｈｅｅｔ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を採択し、ＣＤＲは連結されるループを形成し、一部の場合にはβシート構造の一部を形成する。よって、フレームワーク領域は、鎖間、非共有相互作用によって正確な配向にＣＤＲを位置させるスカフォールド（ｓｃａｆｆｏｌｄ）を形成する作用をする。位置されたＣＤＲによって形成された抗原結合ドメインは、免疫反応性抗原上のエピトープに相補的な表面を定義する。このような相補的な表面は同族エピトープに対する抗体の非共有結合を促進する。任意の当該重鎖または軽鎖可変領域に対してＣＤＲ及びフレームワーク領域をそれぞれ含むアミノ酸は、当業者によって容易に識別することができ、これらは正確に定義されているからである（ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ： Ｄｒ． Ａｎｄｒｅｗ Ｃ．Ｒ． Ｍａｒｔｉｎ'ｓ Ｇｒｏｕｐ； "Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，" Ｋａｂａｔ， Ｅ．， ｅｔ ａｌ．， Ｕ．Ｓ． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ， （１９８３）； ａｎｄ Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ， Ｊ． ＭｏＩ． Ｂｉｏｌ．， １９６： ９０１－９１７ （１９８７）参照）。

【0061】

当該技術分野で使われて及び／または許容される用語に対して２つ以上の定義が存在する場合に、本願で使われた用語の定義が明らかに反対に言及しない限り、これらのすべての意味を含むものを意図する。具体例としては、重鎖及び軽鎖ポリペプチドのすべての可変領域内で発見される非隣接抗原結合部位を述べるための用語「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）を使う。これらの特定領域は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．， Ｕ．Ｓ． Ｄｅｐｔ． ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ， "Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ" （１９８３）およびＣｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． ＭｏＩ． Ｂｉｏｌ． １９６： ９０１－９１７ （１９８７）に記載してあり、その全文は本願に参照により組み込まれる。Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａによるＣＤＲの定義は、互いに比較する場合、アミノ酸残基の重複またはサブセットを含む。それにもかかわらず、抗体またはその変異体のＣＤＲを称するための定義の適用は、本願で定義されて使われる用語の範囲内に属するものを意図する。前記引用された各参照文献によって定義されたＣＤＲを含む適切なアミノ酸残基は、比較として下記表（表１）に示す。特定のＣＤＲを含む正確な残基数は、ＣＤＲの配列及び大きさに応じて可変される。当業者は、抗体の可変領域アミノ酸配列を考慮して残基が特定ＣＤＲを含むかどうかを日常的に決めることができる。

【0062】

【0063】

Ｋａｂａｔらは、また任意の抗体に適用し得る可変ドメイン配列に対する番号付けシステムを定義した。当業者は、配列それ自体を超えたいかなる実験データにも頼ることなく、「Ｋａｂａｔ番号付け（Ｋａｂａｔ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ）」システムを任意の可変ドメイン配列に明白に割り当てることができる。本願で使われた、「Ｋａｂａｔ番号付け（Ｋａｂａｔ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ）」とは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．， Ｕ．Ｓ． Ｄｅｐｔ． ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ， "Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ"（１９８３）に提示された番号付けシステムをいう。

【0064】

本願に開示の抗体は、鳥類（ｂｉｒｄｓ）及び哺乳動物（ｍａｍｍａｌｓ）を含む任意の動物源に由来することができる。望ましくは、抗体はヒト、ネズミ（ｍｕｒｉｎｅ）、ろ馬、兎、山羊、モルモット、ラクダ、ラマ、馬またはニワトリの抗体である。

【0065】

本願で使われた、用語「重鎖定常領域（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｃｏｎｓｔａｎｔ ｒｅｇｉｏｎ）」は、兔疫グロブリン重鎖に由来するアミノ酸配列を含む。前記開示のように、重鎖定常領域は修飾されて自然発生的な兔疫グロブリン分子からのアミノ酸配列が可変されることができるということを当業者は理解するはずである。

【0066】

本願に開示の抗体の重鎖定常領域は、異なる兔疫グロブリン分子に由来することができる。例えば、ポリペプチドの重鎖定常領域は、ＩｇＧ１分子に由来するＣＨ１ドメイン及びＩｇＧ３分子に由来するヒンジ領域（ｈｉｎｇｅ ｒｅｇｉｏｎ）を含むことができる。他の例として、重鎖定常領域はＩｇＧ１分子に一部由来し、ＩｇＧ３分子に一部由来するヒンジ領域を含むことができる。他の例として、重鎖部分はＩｇＧ１分子に一部由来し、ＩｇＧ４分子に一部由来するキメラヒンジ（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｈｉｎｇｅ）を含むことができる。

【0067】

本願で使われた、用語「軽鎖定常領域（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ｃｏｎｓｔａｎｔ ｒｅｇｉｏｎ）」は、抗体軽鎖に由来するアミノ酸配列を含む。望ましくは、軽鎖定常領域は、定常カッパドメインまたは定常ラムダドメインの中で少なくとも一つを含む。

【0068】

「軽鎖－重鎖対（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ－ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｐａｉｒ）」とは、軽鎖のＣＬドメインと重鎖のＣＨ１ドメインとの間のジスルフィド結合によって二量体を形成することができる軽鎖及び重鎖のコレクション（ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）をいう。

【0069】

「抗体断片（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔ）」または「抗原結合フラグメント（ａｎｔｉｇｅｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｆｒａｇｍｅｎｔ）」は、インタクトな抗体以外の分子をいい、これはインタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部を含む。免疫学的に機能性である兔疫グロブリンフラグメントには、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）_２、ｘＦａｂ、ｓｃＦａｂ、ｄｓＦｖ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、ｓｃＦａｂ－Ｆｃ、ダイアボディ、ミニボディ、ｓｃＡｂ、ｄＡｂ、半ＩｇＧまたはその組み合わせを含むが、これらに限定されない。Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）_２、ｘＦａｂ及びｓｃＦａｂで使われた用語「Ｆａｂ」には、伝統的なＦａｂ断片及びＰＣＴ／ＣＮ２０１８／１０６７６６（Ｗｕｘｉｂｏｄｙ）に記載されているキメラＦａｂ様ドメインを含むことができる。また、これはヒト、マウス、ラット、ラクダ科または兎を含むが、これに限定されない任意の哺乳動物に由来することができる。抗体の機能的部分、例えば本願に記載の一つ以上のＣＤＲは、２次タンパク質または小分子化合物と共有結合によって連結されることができ、これによって、特定の標的に対する標的治療薬として用いられることができる。用語「抗体断片（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔ）」は、アプタマー（ａｐｔａｍｅｒｓ）、シュピーゲルマー（ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒｓ）及びダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）を含む。また、用語「抗体断片（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔ）」は、特定の抗原に結合して複合体を形成することで抗体のように作用する任意の合成または遺伝子組換えタンパク質を含む。

【0070】

抗体断片は、本願に記載のように、インタクトな抗体のタンパク質分解消化（ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）だけでなく、組換え宿主細胞（例えば大膓菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）またはファージ（ｐｈａｇｅ））による生産を含むが、これに限定されない多様な技術によって製造されることができる。

【0071】

インタクトな抗体のパパイン消化（Ｐａｐａｉｎ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）は、２つの同一の抗原結合フラグメントを生成し、これは重鎖及び軽鎖可変ドメイン及び軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む「Ｆａｂ」断片と呼ばれる。よって、本願で使われた、用語「Ｆａｂ断片（Ｆａｂ ｆｒａｇｍｅｎｔ）」は、軽鎖のＶＬドメイン及び定常ドメイン（ＣＬ）を含む軽鎖断片、及び重鎖のＶＨドメイン及び第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む抗体断片をいう。Ｆａｂ'断片は、抗体ヒンジ領域から一つ以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に幾つかの残基を追加するという点で、Ｆａｂ断片と異なる。Ｆａｂ'－ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基（複数可）が遊離チオール基を有するＦａｂ'断片である。ペプシン処理は、２つの抗原結合部位（２つのＦａｂ断片）及びＦｃ領域の一部を持つＦ（ａｂ'）_２断片を生成する。本願で、「Ｆ（ａｂ'）_２断片」は、前述のごとく、２つの軽鎖、及び可変領域、ＣＨ１及びＣＨ１とＣＨ２ドメインとの間の定常領域の一部を含む２つの重鎖を含み、これによって、２つの重鎖の間に鎖内ジスルフィド結合（ｉｎｔｒａｃｈａｉｎ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｏｎｄ）を形成する。したがって、Ｆ（ａｂ'）_２断片は、２つのＦａｂ'断片で構成され、２つのＦａｂ'断片は、これらの間のジスルフィド結合によって互いに結合する。

【0072】

用語「クロスＦａｂ断片（ｃｒｏｓｓ－Ｆａｂ ｆｒａｇｍｅｎｔ）」または「ｘＦａｂ断片（ｘＦａｂ ｆｒａｇｍｅｎｔ）」または「クロスオーバーＦａｂ断片（ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ Ｆａｂ ｆｒａｇｍｅｎｔ）」とは、重鎖及び軽鎖の可変領域または定常領域が交換されたＦａｂ断片をいう。クロスオーバーＦａｂ分子の２つの異なる鎖組成が可能であり、本発明の二重特異性抗体に含まれ、一方ではＦａｂ重鎖及び軽鎖の可変領域が交換され、すなわち交差Ｆａｂ分子は軽鎖可変領域（ＶＬ）及び重鎖定常領域（ＣＨ１）で構成されたペプチド鎖、及び重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）で構成されたペプチド鎖を含む。また、このようなクロスＦａｂ分子はＣｒｏｓｓＦａｂ_{（ＶＬＶＨ）}と呼ぶ。一方、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の定常領域が交換される場合、クロスオーバーＦａｂ分子は重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）で構成されたペプチド鎖、及び軽鎖可変領域（ＶＬ）及び重鎖定常領域（ＣＨ１）で構成されたペプチド鎖を含む。また、このようなクロスオーバーＦａｂ分子はＣｒｏｓｓＦａｂ_{（ＣＬＣＨ１）}と呼ぶ。

【0073】

「単鎖Ｆａｂ断片（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ Ｆａｂ ｆｒａｇｍｅｎｔ）」または「ｓｃＦａｂ」は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常ドメイン１（ＣＨ１）、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）及びリンカーで構成されたポリペプチドであり、前記抗体ドメイン及び前記リンカーは、Ｎ末端においてＣ末端方向であり、下記順：ａ）ＶＨ－ＣＨ１－リンカー－ＶＬ－ＣＬ、ｂ）ＶＬ－ＣＬ－リンカー－ＶＨ－ＣＨ１、ｃ）ＶＨ－ＣＬ－リンカー－ＶＬ－ＣＨ１またはｄ）ＶＬ－ＣＨ１－リンカー－ＶＨ－ＣＬの中のいずれか一つを有し、前記リンカーは、少なくとも３０個のアミノ酸、望ましくは３２～５０個のアミノ酸を持つポリペプチドである。前記単鎖Ｆａｂ断片は、ＣＬドメインとＣＨ１ドメインとの間の天然ジスルフィド結合により安定化される。また、これらの単鎖Ｆａｂ分子は、システイン残基（例えば、Ｋａｂａｔ番号付けによる可変重鎖における４４位及び可変軽鎖における１００位）の挿入による鎖間ジスルフィド結合の生成によってさらに安定化されることができる。

【0074】

「クロスオーバー単鎖Ｆａｂ断片（ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ Ｆａｂ ｆｒａｇｍｅｎｔ）」または「ｘ－ｓｃＦａｂ」とは、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常ドメイン１（ＣＨ１）、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）及びリンカーで構成されたポリペプチドであり、前記抗体ドメイン及び前記リンカーは、Ｎ末端においてＣ末端方向に、下記順：ａ）ＶＨ－ＣＬ－リンカー－ＶＬ－ＣＨ１及びｂ）ＶＬ－ＣＨ１－リンカー－ＶＨ－ＣＬの中のいずれか一つを有し、前記ＶＨ及びＶＬは、一緒に抗原に特異的に結合する抗原結合ドメインを形成し、前記リンカーは、少なくとも３０個のアミノ酸を持つポリペプチドである。また、これらのｘ－ｓｃＦａｂ分子は、システイン残基（例えば、Ｋａｂａｔ番号付けによる可変重鎖における４４位及び可変軽鎖における１００位）の挿入による鎖間ジスルフィド結合の生成によってさらに安定化されることができる。

【0075】

「Ｆｖ領域（Ｆｖ ｒｅｇｉｏｎ）」は、重鎖及び軽鎖の各可変領域を含むが、定常領域は含まない抗体である。ｓｃＦｖは、Ｆｖが可撓性リンカーによって連結されたものである。ｓｃＦｖ－Ｆｃは、ＦｃがｓｃＦｖに連結されたものである。ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）は、ＣＨ３がｓｃＦｖに連結されたものである。ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）は、ｓｃＦｖの２つの分子を含む。「単鎖可変断片（ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ）」または「ｓｃＦｖ」は、兔疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質をいう。幾つかの態様において、前記領域は、１０個～約２５個のアミノ酸を持つ短いリンカーペプチドと連結される。リンカーは、可撓性のためにグリシンに富んでいてもよく、溶解度のためにセリンまたはスレオニンに富んでいてもよく、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端と連結することができるか、またはその逆に連結することができる。このようなタンパク質は、定常領域の除去及びリンカーの導入にもかかわらず、元の兔疫グロブリンの特異性を維持する。ＳｃＦｖ分子は、当該技術分野によく知られており、例えば米国特許第５，８９２，０１９号に記載されている。

【0076】

「短鎖抗体（ｓｈｏｒｔ－ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ：ｓｃＡｂ）」は、重鎖及び軽鎖可変領域が可撓性リンカーによって連結された重鎖の一つの可変領域または軽鎖定常領域を含む単一ポリペプチド鎖である。短鎖抗体は、例えば米国特許第５，２６０，２０３号を参照することができ、これは本願に参照により開示される。

【0077】

「ドメイン抗体（ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ：ｄＡｂ）」は、重鎖の可変領域または軽鎖の可変領域のみを含む免疫学的に機能性である兔疫グロブリン断片である。一実施形態において、２つ以上のＶＨ領域はペプチドリンカーによって共有結合で連結され、２価ドメイン抗体を形成する。このような２価ドメイン抗体の２つのＶＨ領域は、同一又は異なる抗原を標的とすることができる。

【0078】

本発明による用語「全長ＩｇＧ（ｆｕｌｌ ｌｅｎｇｔｈ ＩｇＧ）」は、本質的に完全なＩｇＧを含むものと定義されるが、これはインタクトなＩｇＧのすべての機能を持つ必要はない。疑心の余地を無くすため、全長ＩｇＧは２つの重鎖及び２つの軽鎖を含む。各鎖には定常（Ｃ）及び可変（Ｖ）領域を含み、これはＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＶＨ、及びＣＬ、ＶＬに指定されたドメインに分けられる。ＩｇＧ抗体は、Ｆａｂ部分に含まれた可変領域ドメインを通じて抗原に結合し、結合後に定常ドメインを通じて、大部分Ｆｃ部分を通じて免疫系の細胞及び分子と相互作用することができる。用語「可変領域ドメイン（ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ）」、「可変領域（ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ）」、「可変ドメイン（ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ）」、「ＶＨ／ＶＬ対（ＶＨ／ＶＬ ｐａｉｒ）」、「ＶＨ／ＶＬ」、「Ｆａｂ部分（Ｆａｂ ｐｏｒｔｉｏｎ）」、「Ｆａｂアーム（Ｆａｂ ａｒｍ）」、「Ｆａｂ」または「アーム（ａｒｍ）」は、本願で相互交換的に使われる。本発明による全長抗体は、目的する特徴を提供する突然変異が存在することができるＩｇＧ分子を含む。このような突然変異は任意の領域の相当部分が欠失していてはならない。しかし、生成されたＩｇＧ分子の結合特性を本質的に変更させないで、一つ又は複数のアミノ酸残基が欠失しているＩｇＧ分子は用語「全長ＩｇＧ」に含まれる。例えば、このようなＩｇＧ分子は、望ましくは、非ＣＤＲ領域で１～１０個のアミノ酸残基が一つ以上欠失していてもよく、ここでアミノ酸の欠失は、ＩｇＧの結合特異性に必須なものではない。

【0079】

全長ＩｇＧ抗体は、その半減期が有利であり、免疫原性のために完全自己（ヒト）分子に最大限近く維持しなければならないから好まれる。本発明によれば、二重特異的ＩｇＧ抗体が使われる。望ましい一実施様態で、二重特異的全長ＩｇＧ１抗体が使われる。ＩｇＧ１は、ヒトにおいてその循環半減期が長いことから好まれる。ヒトで任意の免疫原性を防止するために、本発明による二重特異的ＩｇＧ抗体はヒトＩｇＧ１であることが望ましい。用語「二重特異的（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）」（ｂｓ）は、抗体の一つのアームが第１の抗原に結合することに対し、第２アームは、第２の抗原に結合することを意味し、ここで前記第１の抗原及び第２の抗原は同じではない。本発明によれば、前記第１の抗原及び第２の抗原は、実際に２つの異なる細胞タイプに位置する２つの異なる分子である。用語「［抗体の］一つのアーム」は、望ましくは、全長ＩｇＧ抗体の一つのＦａｂ部分を意味する。内因性免疫細胞を動員して活性化して細胞傷害を媒介する二重特異性抗体は、台頭している次世代抗体治療薬の部類である。これは標的細胞（すなわち、腫瘍細胞）及びエフェクター細胞（すなわち、Ｔ細胞、ＮＫ細胞及びマクロファージ）に対する抗原結合特異性を一つの分子で組み合わせることで達成されることができる（Ｃｕｉ ｅｔ ａｌ． ＪＢＣ ２０１２ （２８７） ２８２０６－２８２１４； Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ， ＭＡＢＳ ２０１２ （４） １８２－１９７； Ｃｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｂａｔｙ， ＭＡＢＳ ２００９ （１） ５３９－５４７； Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ． Ｂｌｏｏｄ ２０１１ （１１７） ４５４２－４５５１； Ｌｏｆｆｌｅｒ ｅｔ ａｌ． ２０００ Ｂｌｏｏｄ ９５：２０９８； Ｚｅｉｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ． １９９９ Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６３：１２４６）。本発明によれば、一つのアームが異常（腫瘍）細胞上のＣＬＬ－１抗原に結合することに対し、第２アームは免疫エフェクター細胞上の抗原に結合する二重特異性抗体を提供する。

【0080】

本願で使われた、用語「抗原結合ドメイン（ａｎｔｉｇｅｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）」または「抗原結合部位（ａｎｔｉｇｅｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ）」は、抗原決定基に特異的に結合する抗体または抗体断片の部分をいう。より具体的に、用語「抗原結合ドメイン」は、抗原の一部または全部に特異的に結合し、ここに相補的な領域を含む抗体の部分をいう。抗原が大きい場合に、抗体または抗体断片は抗原の特定部分にのみ結合することができ、このような部分をエピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）と呼ぶ。抗原結合ドメインは、例えば一つ以上の可変ドメイン（もしくは可変領域と呼ぶ）によって提供されることができる。望ましくは、抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）及び抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。一態様において、抗原結合ドメインは、その抗原に結合してその機能を遮断するか、または部分的に遮断することができる。ＣＬＬ－１またはＣＤ３に特異的に結合する抗原結合ドメインには、本願に追加で定義された抗体及びその断片を含む。また、抗原結合ドメインは、スキャフォールド抗原結合タンパク質、例えば設計されたリピートタンパク質または設計されたリピートドメインに基づく結合ドメインを含むことができる（例えばＷＯ２００２／０２０５６５参照）。

【0081】

本願で使われた、用語「抗原決定基（ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）」は、「抗原（ａｎｔｉｇｅｎ）」及び「エピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）」と同義語であり、抗原結合部分が結合して抗原結合部分－抗原コンジュゲートを形成するポリペプチド巨大分子上の部位（例えば、アミノ酸の連続したストレッチ（ｃｏｎｔｉｇｕｏｕｓ ｓｔｒｅｔｃｈ）または非連続的なアミノ酸の異なる領域で構成された立体形態的な構成）をいう。有用な抗原決定基は、例えば腫瘍細胞の表面、ウイルス感染された細胞の表面、その他罹患した細胞の表面、免疫細胞の表面、無血清血液において、及び／または細胞外マトリックス（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ：ＥＣＭ）で発見されることができる。本願で抗原として有用なタンパク質は、別途明示しない限り、哺乳動物、例えば霊長類（例えば、ヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）を含む任意の脊椎動物供給源由来の任意の天然型のタンパク質であってもよい。特定の一実施形態において、抗原はヒトタンパク質である。本願で特定のタンパク質を言及する場合、これらの用語は「全長」、未処理のタンパク質だけでなく、細胞で処理されて生成されるすべての形態のタンパク質を含む。また、これらの用語は、タンパク質の自然発生的な変異体、例えばスプライス変異体または対立遺伝子変異体を含む。

【0082】

「特異的結合（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂｉｎｄｉｎｇ）」は、結合が抗原に対して選択的であり、所望しないか、または非特異的相互作用と区分し得ることを意味する。特定の抗原に結合する抗体または抗体断片の能力は、酵素結合免疫吸着測定法（ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ：ＥＬＩＳＡ）または当業者によく知られている他の技術、例えば表面プラズモン共鳴（Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ：ＳＰＲ）技術（ＢＩＡｃｏｒｅ機器で分析される）（Ｌｉｌｊｅｂｌａｄ ｅｔ ａｌ．， Ｇｌｙｃｏ Ｊ １７, ３２３－３２９（２０００））、及び伝統的な結合分析（Ｈｅｅｌｅｙ， Ｅｎｄｏｃｒ Ｒｅｓ ２８， ２１７－２２９（２００２））によって測定することができる。

【0083】

「親和性（ａｆｆｉｎｉｔｙ）」または「結合親和性（ｂｉｎｄｉｎｇ ａｆｆｉｎｉｔｙ）」は、分子（例：抗体）及びその結合パートナー（例：抗原）の単一結合部位の間の非共有相互作用の総合の強度を意味する。別途明示しない限り、本願で使われた「結合親和性」とは、結合対のメンバー（例えば、抗体及び抗原）の間の１：１相互作用を反映する固有結合親和性をいう。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、一般に解離定数（Ｋ_Ｄ）で表示されることができ、これは解離速度定数及び結合速度定数（それぞれｋｏｆｆ及びｋｏｎ）の比率である。よって、同等な親和性（ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ ａｆｆｉｎｉｔｉｅｓ）は、速度定数の比率が等しく維持される限り、互いに異なる速度定数を含むことができる。親和性は、本願に記載の方法を含む、当該技術分野に知られた一般的な方法で測定することができる。親和性を測定する特定方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）である。

【0084】

本願で使われた、用語、抗体の「高親和性（ｈｉｇｈ ａｆｆｉｎｉｔｙ）」とは、抗体が標的抗原に対してＫ_Ｄを１０^－９Ｍ以下、より具体的に１０^－１０Ｍ以下有することを意味する。用語、抗体の「低親和性（ｌｏｗ ａｆｆｉｎｉｔｙ）」とは、抗体がＫ_Ｄを１０^－８Ｍ以上有することを意味する。

【0085】

「親和性成熟（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｕｒｅｄ）」抗体とは、抗体の抗原に対する親和性を改善する改変を含まない親抗体と比較して、一つ以上の超可変領域（ＨＶＲ）でこのような改変を一つ以上持つ抗体をいう。

【0086】

用語「ＣＬＬ－１及びＣＤ３に特異的に結合する二重特異性抗体」、「ＣＬＬ－１及びＣＤ３に特異的な二重特異性抗体」または「抗ＣＬＬ－１／抗ＣＤ３抗体」は、本願で相互交換的に使われ、ＣＬＬ－１及びＣＤ３を標的とする抗体が診断剤及び／または治療薬として有用である十分な親和性でＣＬＬ－１及びＣＤ３に結合することができる二重特異性抗体をいう。

【0087】

用語「Ｃ型レクチン様分子－１（Ｃ－ｔｙｐｅ ｌｅｃｔｉｎ－ｌｉｋｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅ－１：ＣＬＬ－１）」は、ＭＩＣＬまたはＣＬＥＣ１２Ａとしても知られており、ＩＩ型膜貫通糖蛋白質及び免疫調節に関与するＣ型レクチン様受容体の大きいファミリーのメンバーである。ＣＬＬ－１は、以前に骨髓由来細胞から確認された。ＣＬＬ－１の細胞内ドメインには、免疫チロシンベース阻害モチーフ（ｉｍｍｕｎｏｔｙｒｏｓｉｎｅ－ｂａｓｅｄ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｍｏｔｉｆ：ＩＴＩＭ）及びＹＸＸＭモチーフを含む。多様な細胞におけるＩＴＩＭ含有受容体のリン酸化は、タンパク質チロシンフォスファターゼＳＨＰ－１、ＳＨＰ－２及びＳＨＩＰの動員による活性化経路の抑制をもたらす。ＹＸＸＭモチーフは、ＰＩ－３キナーゼ、１３のｐ８５サブユニットに対する潜在的なＳＨ２ドメイン結合部位を有し、これは細胞活性化経路に関連して、骨髓細胞に対する阻害及び活性化分子としてＣＬＬ－１の潜在的な二重役割を果たす。実際に、ＣＬＬ－１のＳＨＰ－１及びＳＨＰ－２との結合は、形質移入された骨髓由来細胞株で実験的に立証された。

【0088】

造血細胞においてＣＬＬ－１の発現パターンは制限される。これは具体的に末梢血液及び骨髓に由来する骨髓細胞だけでなく、大部分のＡＭＬ芽球で発見される。近年の研究によれば、ＣＬＬ－１はまたＡＭＬにおいて、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８－区画にある大部分の白血病幹細胞には存在するが、正常及び再生骨髓対照群でＣＤ３４＋／ＣＤ３８－細胞には不在し、これは正常細胞と白血病幹細胞とを区分するのに役立つことが示された。（例えば、Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．， Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ ９５：７１－７８（２０１０）；Ｂａｋｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６４：８４４３－８４５０（２００４）参照）。多くの種に対するＣＬＬ－１のヌクレオシド及びタンパク質配列が知られている。例えば、ヒト配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＡＦ２４７７８８．１及びＵｎｉｐｒｏｔ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｑ５ＱＧＺ９で見当たることができる。

【0089】

用語「ＣＬＬ－１抗体」、「ＣＬＬ－１に結合する抗体」及び「ＣＬＬ－１に結合する抗原結合ドメインを含む抗体」とは、ＣＬＬ－１を標的とする抗体が診断剤及び／または治療剤として有用である十分な親和性でＣＬＬ－１、特に細胞表面で発現されたＣＬＬ－１ポリペプチドに結合することができる抗体をいう。一態様で、抗ＣＬＬ－１抗体の非関連の非ＣＬＬ－１タンパク質への結合程度は、例えば放射性免疫分析（ＲＩＡ）またはフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）またはＢｉａｃｏｒｅシステムのようなバイオセンサーシステムを用いる表面プラズモン共鳴分析による測定時に、抗体のＣＬＬ－１に対する結合の約１０％未満である。所定の態様で、ヒトＣＬＬ－１に結合する抗原結合タンパク質は、ヒトＰＤ１への結合に対する結合親和性のＫ_Ｄ値が≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、または≦０．００１ｎＭ（例えば、１０^－８Ｍ以下、例えば１０^－８Ｍ～１０^－１３Ｍ、例えば１０^－９Ｍ～１０^－１３Ｍ）である。また、用語「抗ＣＬＬ－１抗体」は、ＣＬＬ－１及び異なる抗原に結合することができる二重特異性抗体を含む。

【0090】

用語「ＣＬＬ－１」及び「ＣＬＬ１」は、本願で相互交換的に使われる。

【0091】

本願で使われた用語「免疫エフェクター細胞（ｉｍｍｕｎｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｃｅｌｌ）」または「エフェクター細胞（ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｃｅｌｌ）」とは、哺乳動物免疫系細胞の自然的なレパートリー内にある細胞であって、活性化されれば標的細胞の生存力に影響を及ぼすことができる細胞をいう。免疫エフェクター細胞としては、リンパ系（ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｌｉｎｅａｇｅ）細胞、例えば自然殺害（ＮＫ）細胞、細胞傷害Ｔ細胞を含むＴ細胞、またはＢ細胞を含むだけでなく、骨髄系（ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｉｎｅａｇｅ）細胞、例えば単球またはマクロファージ、樹状細胞及び好中性顆粒球が免疫エフェクター細胞として見なされることができる。したがって、前記エフェクター細胞は、望ましくは、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞または好中性顆粒球である。本発明によれば、エフェクター細胞を異常細胞に動員するということは、免疫エフェクター細胞を異常標的細胞に近く位置させてエフェクター細胞が動員された異常細胞を直接死滅するか、または間接的に死滅を開始することができることを意味する。非特異的相互作用を避けるため、本発明の二重特異性抗体は、これらの免疫エフェクター細胞によって少なくとも過発現される免疫エフェクター細胞上の抗原を身体の他の細胞に比べて特異的に認識することが望ましい。免疫エフェクター細胞に存在する標的抗原は、ＣＤ３、ＣＤ１６、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ６４、ＣＤ８９、ＮＫＧ２Ｄ及びＮＫｐ４６を含むことができる。望ましくは、免疫エフェクター細胞上の抗原は、Ｔ細胞で発現されるＣＤ３、またはその機能的等価物（機能的等価物は、Ｔ細胞上に類似するように分布しており、類似した機能（種類に関連したものであり、量とは必ずしもに関連する必要はない）を持つＣＤ３様分子であることができる）である。また、本願で使われた、用語「ＣＤ３」はＣＤ３の機能的等価物を含む。免疫エフェクター細胞として最も望ましい抗原はＣＤ３ε鎖である。この抗原は、Ｔ細胞を異常細胞に動員するのに非常に効果的なことが示された。よって、本発明による二重特異的ＩｇＧ抗体は、望ましくはＣＤ３εを特異的に認識する一つのアームを含む。

【0092】

用語「ＣＤ３」は、別途明示しない限り、哺乳動物、例えば霊長類（例えば、ヒト）、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）を含む、任意の脊椎動物供給源に由来する任意の天然ＣＤ３をいう。前記用語は、「全長」の未処理ＣＤ３だけでなく、細胞で処理によって発生するすべての形態のＣＤ３を含む。また、前記用語は、ＣＤ３の自然発生的な変異体、例えばスプライス変異体または対立遺伝子変異体を含む。一実施形態で、ＣＤ３は、ヒトＣＤ３、具体的に、ヒトＣＤ３のエプシロンサブユニット（ＣＤ３ε）である。ヒトＣＤ３ε医アミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．Ｐ０７７６６（ｖｅｒｓｉｏｎ １８９）、またはＮＣＢＩ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿０００７２４．１に示されている。カニクイザル［Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ］ＣＤ３εのアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋ ｎｏ．ＢＡＢ７１８４９．１に示されている。

【0093】

用語「抗ＣＤ３抗体」、「ＣＤ３に結合する抗体」及び「ＣＤ３に結合する抗原結合ドメインを含む抗体」は、ＣＤ３を標的とする抗体が診断薬及び／または治療薬として有用である十分な親和性でＣＤ３に結合することができる抗体を意味する。一態様において、抗ＣＤ３抗体の非関連の非ＣＤ３タンパク質に対する結合程度は、例えば放射性免疫分析（ＲＩＡ）による測定時に、抗体のＣＤ３に対する結合の約１０％未満である。所定の実施様態において、ＣＤ３に結合する抗体は、解離定数（Ｋ_Ｄ）が≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、または≦０．００１ｎＭ（例えば、１０－８Ｍ以下、例えば１０^－８Ｍ～１０^－１３Ｍ、例えば１０^－９Ｍ～１０^－１３Ｍ）である。所定の態様において、抗ＣＤ３抗体は、異なる種に由来するＣＤ３の中で保存されたＣＤ３のエピトープに結合する。さらに、用語「抗ＣＤ３抗体」は、ＣＤ３及び異なる抗原に結合することができる二重特異性抗体を含む。

【0094】

用語「マウス（ｍｏｕｓｅ）」抗体は、フレームワーク及びＣＤＲ領域のいずれもマウス生殖細胞系列兔疫グロブリン配列に由来する可変領域を持つ抗体を含むことを意図する。さらに、抗体が定常領域を含む場合、定常領域もマウス生殖細胞系列兔疫グロブリン配列に由来する。本開示内容のマウス抗体は、マウス生殖細胞系列の兔疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏランダムまたは部位特異的突然変異の誘発によって、もしくはｉｎ ｖｉｖｏ体細胞突然変異によって導入された突然変異）を含むことができる。

【0095】

用語「キメラ（ｃｈｉｍｅｒｉｃ）」抗体は、重鎖及び／または軽鎖の一部が特定の供給源または種に由来し、残りの重鎖及び／または軽鎖が異なる供給源または種に由来する抗体をいう。

【0096】

抗体の「クラス（ｃｌａｓｓ）」は、抗体の重鎖が保有する定常ドメインまたは定常領域のタイプをいう。抗体にはＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭの５つの主なクラスがあり、これらの中で一部は、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２にさらに分類されることができる。兔疫グロブリンの多様なクラスにあたる重鎖定常ドメインをそれぞれα、δ、ε、γ及びμと呼ぶ。

【0097】

「ヒト化（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）」抗体は、非ヒトＨＶＲ由来のアミノ酸残基及びヒトＦＲ由来のアミノ酸残基を含むキメラ抗体をいう。所定の実施様態において、ヒト化抗体は少なくとも１つ、通常２つの可変ドメインを実質的に全て含むはずであり、ここで、ＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）の全部または実質的に全部は、非ヒト抗体のＨＶＲに該当し、ＦＲの全部または実質的に全部は、ヒト抗体のＦＲに該当する。

【0098】

ヒト化抗体は、選択的にヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部を含むことができる。抗体、例えば非ヒト抗体の「ヒト化形態（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ｆｏｒｍ）」は、ヒト化を行った抗体をいう。本発明に含まれる「ヒト化抗体（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」の他の形態は、本発明による特性を生成するために、特にＣ１ｑ結合及び／またはＦｃ受容体（ＦｃＲ）結合に関連して、定常領域が元の抗体の定常領域からさらに修飾または変更されたものである。

【0099】

「ヒト（ｈｕｍａｎ）」抗体は、ヒトまたはヒト細胞によって生産されるか、またはヒト抗体レパートリーまたは他のヒト抗体コード配列を活用する非ヒト供給源に由来する抗体のアミノ酸配列に該当するアミノ酸配列を保有する抗体である。ヒト抗体のこのような定義は、特に非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を除く。

【0100】

本願における用語「Ｆｃドメイン」または「Ｆｃ領域」は、定常領域の少なくとも一部を含む兔疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するのに使われる。前記用語には、天然配列Ｆｃ領域及び変異体Ｆｃ領域を含む。ＩｇＧ重鎖のＦｃ領域の境界は、少し可変され得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、一般に、Ｃｙｓ２２６またはＰｒｏ２３０から、重鎖のカルボキシ末端までその定義が拡張される。しかし、宿主細胞が生産した抗体は、重鎖のＣ末端から一つ以上、特に一つまたは２つのアミノ酸の翻訳後切断を行うことができる。したがって、宿主細胞が全長重鎖をコードする特定の核酸分子の発現によって生成する抗体は、全長重鎖を含むことができるか、または全長重鎖の切断された変異体（また、本願では「切断された変異体重鎖」と呼ばれる）を含むことができる。これは、重鎖の最後の２つのＣ末端アミノ酸がグリシン（Ｇ４４６）及びリジン（Ｋ４４７、Ｋａｂａｔ ＥＵ ｉｎｄｅｘに従う番号付け）の場合であってもよい。したがって、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）、またはＣ末端グリシン（Ｇｌｙ４４６）及びリジン（Ｋ４４７）が存在することができるか、または存在しないこともできる。Ｆｃドメイン（または本願に定義されたＦｃドメインのサブユニット）を含む重鎖のアミノ酸配列は、別途明示しない限りＣ末端グリシン－リジンジペプチドなしに本願で表示される。本発明の一実施形態で、本発明による抗体または二重特異性抗体に含まれた、本願に開示のＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖は、更なるＣ末端グリシン－リジンジペプチド（Ｇ４４６及びＫ４４７、Ｋａｂａｔ ＥＵ ｉｎｄｅｘに従う番号付け）を含む。本発明の一実施形態において、本発明による抗体または二重特異性抗体に含まれた、本願に開示のＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖は、更なるＣ末端グリシン残基（Ｇ４４６、Ｋａｂａｔ ＥＵ ｉｎｄｅｘに従う番号付け）を含む。本発明の組成物、例えば本願に記載された医薬組成物は、本発明の抗体または二重特異性抗体の集団を含む。抗体または二重特異性抗体の集団は、全長重鎖を持つ分子及び切断された変異体重鎖を持つ分子を含むことができる。抗体または二重特異性抗体の集団は、全長重鎖を持つ分子及び切断された変異体重鎖を持つ分子の混合物で構成されることができ、ここで抗体または二重特異性抗体の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％は、切断された変異体重鎖を持つ。本発明の一実施形態において、本発明の抗体または二重特異性抗体の集団を含む組成物は、更なるＣ末端グリシン－リジンジペプチド（Ｇ４４６及びＫ４４７、Ｋａｂａｔ ＥＵ ｉｎｄｅｘに従う番号付け）と、本願に開示のＦｃドメインのサブユニットからなる重鎖を含む抗体または二重特異性抗体とを含む。本発明の一実施形態で、本発明の抗体または二重特異性抗体の集団を有する組成物は、更なるＣ末端グリシン残基（Ｇ４４６、Ｋａｂａｔ ＥＵ ｉｎｄｅｘに従う番号付け）と、本願に開示のＦｃドメインのサブユニットを有する重鎖からなる抗体または二重特異性抗体とを含む。本発明の一実施形態で、このような組成物は、本願に開示のＦｃドメインのサブユニットを有する重鎖からなる分子；更なるＣ末端グリシン残基（Ｇ４４６、Ｋａｂａｔ ＥＵ ｉｎｄｅｘに従う番号付け）と、本願に開示のＦｃドメインのサブユニットを有する重鎖からなる分子と、更なるＣ末端グリシン－リジンジペプチド（Ｇ４４６及びＫ４４７、Ｋａｂａｔ ＥＵ ｉｎｄｅｘに従う番号付け）と、本願に開示のＦｃドメインのサブユニットを有する重鎖からなる分子を含む抗体または二重特異性抗体の集団とを含む。本願で別途明示しない限り、Ｆｃ領域または定常領域におけるアミノ酸残基の番号付けは、ＥＵ番号付けシステム（またＥＵ ｉｎｄｅｘと呼ばれる）に従って、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， Ｍｄ．，１９９１に記載のものと同様である（また、前記参照）。本願で使われたＦｃドメインの「サブユニット（ｓｕｂ－ｕｎｉｔ）」とは、二量体Ｆｃドメインを形成する２つのポリペプチド中の一つ、すなわち安定した自己結合が可能な兔疫グロブリン重鎖のＣ末端定常領域を有するポリペプチドをいう。例えば、ＩｇＧＦｃドメインのサブユニットは、ＩｇＧＣＨ２及びＩｇＧＣＨ３定常ドメインを含む。

【0101】

「Ｆｃドメインの第１及び第２サブユニットの結合を促進する修飾」とは、ペプチドバックボーンの操作またはＦｃドメインサブユニットの翻訳後修飾であって、これはＦｃドメインサブユニットを含むポリペプチドと同じポリペプチドが結合して同種二量体を形成することを減少または防止する。本願で使われた結合を促進する修飾は、特に結合しようとする２つのＦｃドメインサブユニット（すなわち、Ｆｃドメインの第１及び第２サブユニット）のそれぞれに対する個々の修飾を含み、ここで修飾は互いに相補的であるから、２つのＦｃドメインサブユニットの結合を促進する。例えば、結合を促進する修飾は、Ｆｃドメインサブユニット中のいずれか一つまたは二つともの構造または電荷を変更してそれぞれ立体的にまたは静電気的に有利な結合を作ることができる。よって、（異種）二量体は、第１Ｆｃドメインサブユニットを含むポリペプチド及び第２Ｆｃドメインサブユニットを含むポリペプチドの間で生じ、これは追加成分が各サブユニット（例えば、抗原結合部分）に融合されるという点で同一でなくてもよい。幾つかの実施形態において、結合を促進する修飾は、Ｆｃドメインのアミノ酸突然変異、具体的にアミノ酸置換を含む。特定の一実施形態で、結合を促進する修飾は、Ｆｃドメインの２個のサブユニットのそれぞれに別途のアミノ酸変異、具体的にアミノ酸置換を含む。

【0102】

用語「ペプチドリンカー（ｐｅｐｔｉｄｅ ｌｉｎｋｅｒ）」とは、一つ以上のアミノ酸、通常約２～２０個のアミノ酸を含むペプチドをいう。ペプチドリンカーは、当該技術分野によく知られているか、または本願に記載されている。好適な非免疫原性リンカーペプチドは、例えば（Ｇ_４Ｓ）_ｎ、（ＳＧ_４）_ｎまたはＧ_４（ＳＧ_４）_ｎペプチドリンカーであり、ここで「ｎ」は一般的に１～１０、通常２～４の数、具体的に２であり、すなわち前記ペプチドはＧＧＧＧＳ（配列番号５８）ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５９）、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号６０）及びＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号６１）からなる群から選択され、かつ配列ＧＳＰＧＳＳＳＳＧＳ（配列番号６２）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号６３）、ＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号６４）、ＧＳＧＳＧＮＧＳ（配列番号６５）、ＧＧＳＧＳＧＳＧ（配列番号６６）、ＧＧＳＧＳＧ（配列番号６７）、ＧＧＳＧ（配列番号６８）、ＧＧＳＧＮＧＳＧ（配列番号６９）、ＧＧＮＧＳＧＳＧ（配列番号７０）及びＧＧＮＧＳＧ（配列番号７１）を含む。

【0103】

用語「エフェクター機能（ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ）」は、抗体アイソタイプによって可変される抗体のＦｃ領域に起因する生物学的活性を意味する。抗体エフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｃｙ ｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ：ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ：ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞食作用（ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ：ＡＤＣＰ）、サイトカイン分泌、抗原提示細胞によるイムノコンジュゲート媒介性抗原取り込み、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）のダウンレギュレーション、及びＢ細胞活性化を含む。

【0104】

本願で使われた、用語「操作する、操作された、操作する」は、ペプチドバックボーンの任意の操作または自然発生または組換えポリペプチドまたはその断片の翻訳後修飾を含むものと見なされる。操作（ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）には、アミノ酸配列、グリコシル化パターン、または個別アミノ酸の側鎖基の修飾だけではなく、このような接近法の組み合わせを含む。

【0105】

本願で使われた用語「アミノ酸変異（ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｍｕｔａｔｉｏｎ）」は、アミノ酸の置換、欠失、挿入及び修飾を含むことを意味する。置換、欠失、挿入及び修飾の任意の組み合わせによって最終構造体に到逹することができ、ただし、最終構造体は目的する特性、例えばＦｃ受容体に対する結合減少または他のペプチドとの結合増加を含まなければならない。アミノ酸配列の欠失及び挿入には、アミノ及び／またはカルボキシ末端の欠失及びアミノ酸の挿入を含む。特定のアミノ酸変異は、アミノ酸置換である。例えば、Ｆｃ領域の結合特性を変更しようとする目的で、非保存的アミノ酸置換、すなわち一つのアミノ酸を構造的及び／または化学的特性が異なる他のアミノ酸で代替するのが特に望ましい。アミノ酸置換には、非自然発生アミノ酸または２０個の標準アミノ酸の自然発生アミノ酸誘導体（例：４－ヒドロキシプロリン、３－メチルヒスチジン、オルニチン、ホモセリン、５－ヒドロキシリジン）による代替を含む。アミノ酸変異は、当該技術分野によく知られている遺伝的または化学的方法を用いて生成されることができる。遺伝的方法には、部位指定突然変異誘発、ＰＣＲ、遺伝子合成などを含むことができる。遺伝子組換え以外の方法、例えば化学修飾によってアミノ酸の側鎖基を変更する方法がまた有用であることができると考えられる。同一のアミノ酸変異を示すために多様な指定（ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎｓ）が本願で使われることができる。例えば、Ｆｃドメインの３２９位でのプロリンからグリシンまでの置換は、３２９Ｇ、Ｇ３２９、Ｇ３２９、Ｐ３２９Ｇ、またはＰｒｏ３２９Ｇｌｙで表されることができる。

【0106】

参照ポリペプチド配列に対する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、必要な場合、最大配列同一性パーセントを達成するためにギャップ（ｇａｐｓ）を取り入れた後、配列同一性の一部として保存的置換を考慮しないで、候補配列でのアミノ酸残基が参照ポリペプチド配列でのアミノ酸残基と同一の比率で定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決めるための整列は、当該技術分野内に属する多様な方式で、例えば公に利用可能なコンピューターソフトウェア、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ、Ｍｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアまたはＦＡＳＴＡプログラムパッケージを用いて達成し得る。当業者は、比較される配列の全長にかけて最大整列を達成するのに必要な任意のアルゴリズムを含めて、配列を整列するための適切なパラメーターを決めることができる。しかし、本願の目的のために、アミノ酸配列同一性（％）の値は、ＢＬＯＳＵＭ５０比較マトリックスとともに、ＦＡＳＴＡパッケージバージョン３６．３．８ｃまたは以後のバージョンのｇｇｓｅａｒｃｈプログラムを用いて生成される。ＦＡＳＴＡプログラムパッケージは、Ｗ．Ｗ． Ｒ． Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｄ． Ｊ． Ｌｉｐｍａｎ （１９８８）， "Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ"、ＰＮＡＳ ８５：２４４４－２４４８； Ｗ． Ｒ． Ｐｅａｒｓｏｎ （１９９６） "Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ" Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２６６：２２７－２５８；およびＰｅａｒｓｏｎ ｅｔ． ａｌ． （１９９７） Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４６：２４－３６に記載されており、ｈｔｔｐ：／／ｆａｓｔａ．ｂｉｏｃｈ．ｖｉｒｇｉｎｉａ．ｅｄｕ／ｆａｓｔａ＿ｗｗｗ２／ｆａｓｔａ＿ｄｏｗｎ。ｓｈｔｍｌにて公に利用可能である。代案的に、ｈｔｔｐ：／／ｆａｓｔａ．ｂｉｏｃｈ．ｖｉｒｇｉｎｉａ．ｅｄｕ／ｆａｓｔａ＿ｗｗｗ２／ｉｎｄｅｘ．ｃｇｉでアクセス可能な公開サーバーを用いて配列を比較することができ、ローカル整列ではないグローバル整列が行われるようにｇｇｓｅａｒｃｈ（ｇｌｏｂａｌｐｒｏｔｅｉｎ：ｐｒｏｔｅｉｎ）プログラム及びデフォルトオプション（ＢＬＯＳＵＭ５０；ｏｐｅｎ：－１０；ｅｘｔ：－２；Ｋｔｕｐ＝２）を用いることができる。アミノ酸同一性パーセント（％）は、アウトプット整列ヘッダー（ｏｕｔｐｕｔ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｈｅａｄｅｒ）に提供される。

【0107】

「イムノコンジュゲート（ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）」は、細胞傷害剤を含むがこれに限定されない、一つ以上の異種分子（複数可）に接合された抗体である。

【0108】

本願で使われた、用語「ポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」は、単数の「ポリペプチド」だけでなく複数の「ポリペプチド」を含むものと意図され、アミド結合（また、ペプチド結合と知られている）によって線形に連結された単量体（アミノ酸）を含む分子をいう。用語「ポリペプチド」は、２以上のアミノ酸の任意の鎖または複数の鎖をいい、特定の長さの生成物を指称するものではない。よって、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、または２以上のアミノ酸の鎖または複数の鎖を指称するのに使われた任意の他の用語は、「ポリペプチド」の定義内に含まれ、用語「ポリペプチド」は、これらの用語のいずれか一つの代わりに、またはこれと相互交換的に使われることができる。また、用語「ポリペプチド」は、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、周知の保護基／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質分解切断、または非自然発生アミノ酸による修飾を含むが、これらに限定されない、ポリペプチドの発現後修飾の生成物を指すことを意図する。ポリペプチドは、自然・生物資源に由来するか、または組換え技術によって生成されることができるが、必ず指定された核酸配列から翻訳されるものではない。これは化学合成を含む、任意の方式で生成されることができる。また用語「ポリペプチド」は、ポリペプチドの変異体及びポリペプチドの誘導体を含む。さらに、「ポリペプチド断片（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ）」は、全長のタンパク質と比較して、アミノ末端のアミノ酸配列の欠失、カルボキシ末端のアミノ酸配列の欠失及び／または内部欠失を持つポリペプチドを意味する。また、このような断片は、全長のタンパク質と比較して修飾されたアミノ酸を含むことができる。一実施形態において、前記断片は約５～９００個のアミノ酸の長さ、例えば少なくとも５、６、８、１０、１４、２０、５０、７０、１００、１１０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０個またはそれを超えるアミノ酸の長さであることができる。本発明の目的を考慮して、有用なポリペプチド断片は、抗原結合ドメインを含む抗体の免疫学的に機能性である断片を含む。ＣＬＬ－１またはＣＤ３結合抗体の場合、このような有用な断片は、１つ、２つまたは３つの重鎖若しくは軽鎖を含むＣＤＲ配列、または重鎖若しくは軽鎖の可変領域若しくは定常領域を含む抗体鎖の全部または一部を含むが、これに限定されない。

【0109】

本願で使われた、ポリペプチドの「変異体（ｖａｒｉａｎｔ）」、たとえば、抗原結合フラグメント、タンパク質または抗体は、一つ以上のアミノ酸残基が他のポリペプチド配列と比較して挿入、欠失、付加及び／または置換されたポリペプチドであり、融合ポリペプチドを含む。また、タンパク質変異体は、タンパク質酵素の切断、リン酸化または他の翻訳後修飾によって修飾されるが、本願に開示の抗体の生物学的活性、例えばＣＬＬ－１に対する特異的結合及び生物学的活性を維持することを含む。変異体は、本願に開示の抗体またはその抗原結合フラグメントの配列に対して、約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、または８０％同一であってもよい。

【0110】

本願で使われた、ポリペプチドの「誘導体（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）」という用語は、他の化学的部分との接合を通じて化学的に修飾されたポリペプチドを意味し、これは挿入、欠失、付加または置換された変異体とは異なっている。

【0111】

本願で使われた、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに関連した用語「組換え体（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）」は、天然に存在しないポリペプチドまたはポリヌクレオチドの形態を意味し、その非制限的な例は、通常一緒に存在しないポリヌクレオチドまたはポリペプチドを組み合わせることで形成されることができる。

【0112】

「相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）」または「同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」または「類似性（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）」は、２つのペプチド同士間の、もしくは２つの核酸分子同士間の配列類似性をいう。相同性は、比較の目的で整列されることができる各配列での位置を比較することで決まることができる。比較された配列での位置が同一の塩基またはアミノ酸によって占有される場合、分子は当該位置で相同である。配列同士間の相同性の程度は、配列によって共有された位置が一致しているかまたは相同である数の関数である。「非関連性（ｕｎｒｅｌａｔｅｄ）」または「非相同性（ｎｏｎ－ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）」配列は、本開示内容の配列のいずれか一つの配列と４０％未満の同一性、望ましくは２５％未満の同一性を共有する。

【0113】

ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド領域（またはポリペプチドまたはポリペプチド領域）が他の配列に対して所定の比率（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％）の「配列同一性（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」を有するということは２個の配列を比較するのにあたり、これらを整列する場合、塩基（またはアミノ酸）が当該パーセント分だけ同一であることを意味する。

【0114】

用語「ポリヌクレオチド」は、単離された核酸分子または構造体、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ウイルス由来ＲＮＡ、またはプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）をいう。ポリヌクレオチドは、従来のホスホジエステル結合または非従来の結合（例えば、アミド結合、例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）で発見されるアミド結合）を含むことができる。用語「核酸分子（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」は、ポリヌクレオチドに存在する任意の一つ以上の核酸セグメント、例えばＤＮＡまたはＲＮＡ断片をいう。

【0115】

「単離された（ｉｓｏｌａｔｅｄ）」核酸分子またはポリヌクレオチドは、その自然環境から採取された核酸分子、ＤＮＡまたはＲＮＡを意味する。例えば、ベクターに含有されたポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドは、本発明の目的のために単離されたものと見なされる。単離されたポリヌクレオチドの追加例としては、異種宿主細胞で維持される組換えポリヌクレオチドまたは溶液中で精製された（部分的にまたは実質的に）ポリヌクレオチドを含む。単離されたポリヌクレオチドは、通常ポリヌクレオチド分子を含む細胞に含有されたポリヌクレオチド分子を含むが、ポリヌクレオチド分子は、染色体外に（ｅｘｔｒａｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌｌｙ）または天然染色体位置と異なる染色体位置に存在する。単離されたＲＮＡ分子には、本発明のｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏＲＮＡ転写体だけでなく、プラス鎖及びマイナス鎖の形態、及び二本鎖の形態を含む。本発明による単離されたポリヌクレオチドまたは核酸には、合成で生成された分子をさらに含む。また、ポリヌクレオチドまたは核酸は、調節エレメント、例えばプローモーター、リボソーム結合部位、または転写ターミネーターであってもよく、またはこれを含んでもよい。また本願で使われた用語「単離された」は、核酸またはペプチドに組換えＤＮＡ技術によって生成される場合、細胞物質、ウイルス物質または培養培地が実質的に存在しないか、または化学的に合成される場合、化学前駆体または他の化学物質が実質的に存在しないことをいう。また用語「単離された」は、細胞またはポリペプチドが、他の細胞タンパク質または組職から単離されることを指すために本願で使われる。単離されたポリペプチドは、精製されたポリペプチド及び組換えポリペプチドの両方ともを含むことを意味する。

【0116】

「［例えば、本発明の抗体または二重特異性抗体］をコードする単離されたポリヌクレオチド（または核酸）」は、単一ベクターまたは個別ベクター内のポリヌクレオチド分子（複数可）を含んで抗体重鎖及び軽鎖（またはその断片）をコードする一つ以上のポリヌクレオチド分子、及び宿主細胞における一つ以上の位置に存在するこのような核酸分子（複数可）をいう。

【0117】

用語「発現カセット（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃａｓｓｅｔｔｅ）」は、標的細胞において特定の核酸の転写を可能にする一連の明示された核酸要素を用いて、組換えまたは合成で生成されたポリヌクレオチドをいう。組換え発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ウイルス、または核酸断片に混入されることができる。通常、発現ベクターの組換え発現カセット部分は、特に転写される核酸配列及びプローモーターを含む。所定の実施様態において、前記発現カセットは、本発明の抗体または二重特異性抗体またはその断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む。

【0118】

用語「ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）」または「発現ベクター（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒ）」は、細胞で作動可能に結合された特定の遺伝子を取り入れて発現させるのに使われるＤＮＡ分子をいう。前記用語には自己複製核酸構造としてのベクターだけでなく、宿主細胞のゲノムに混入されて取り入れたベクターを含む。本発明の発現ベクターは、発現カセットを含む。発現ベクターは、多量の安定したｍＲＮＡの転写を可能にする。発現ベクターが細胞内部に存在する場合、遺伝子によってコードされるリボ核酸分子またはタンパク質が細胞転写及び／または翻訳機械によって生成される。一実施形態で、本発明の発現ベクターは、本発明の抗体または二重特異性抗体またはその断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む発現カセットを含む。

【0119】

用語「宿主細胞（ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ）」、「宿主細胞株（ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）」及び「宿主細胞培養物（ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ）」は、相互交換的に使用され、外因性核酸が導入された細胞（該細胞の子孫を含む）をいう。宿主細胞には継代回数にかかわらず一次形質転換細胞及びそれに由来する子孫を含む「形質転換体（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓ）」及び「形質転換細胞（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｃｅｌｌｓ）」を含む。子孫は、核酸含量が母細胞とまったく同一でなくてもよいが、突然変異を含むことができる。元の形質転換された細胞から選別または選択されたものと同一の機能または生物学的活性を有する突然変異の子孫が本願に含まれる。宿主細胞は、本発明の抗体または二重特異性抗体を生成するのに使われることができる任意のタイプの細胞システムである。宿主細胞には、培養細胞、例えば哺乳動物の培養細胞、例えばＨＥＫ細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳＯ細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髓腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髓腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞またはハイブリドーマ細胞、酵母細胞、昆虫細胞、及び植物細胞を含みと、遺伝子移植動物、遺伝子移植植物または培養植物または動物組職内に含まれた細胞を含む。「活性化Ｆｃ受容体（ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ Ｆｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）」は、抗体のＦｃドメインと結合した後、受容体保有細胞がエフェクター機能を行うように刺激する信号伝逹イベントを誘導するＦｃ受容体である。ヒト活性化Ｆｃ受容体には、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２）、及びＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）を含む。

【0120】

抗体依存性細胞介在性細胞傷害（Ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ：ＡＤＣＣ）は、免疫エフェクター細胞によって抗体コーティングされた標的細胞が溶解される免疫機序である。前記標的細胞は、Ｆｃ領域を含む抗体またはその誘導体が一般的にＦｃ領域のＮ末端にあるタンパク質部分を介して特異的に結合する細胞である。本願で使われた、用語「ＡＤＣＣ減少」は、前記定義されたＡＤＣＣの機序によって、標的細胞を取り囲んだ培地中に与えられた抗体濃度において、与えられた時間内に溶解される標的細胞数の減少、またはＡＤＣＣの機序によって、与えられた時間内に与えられた数の標的細胞の溶解を果たすのに必要な標的細胞を取り囲んだ培地中における抗体濃度の増加と定義される。当該ＡＤＣＣは、同一の標準生産、精製、製剤化及び保存方法（当業者によく知られている）を用いて同一のタイプの宿主細胞が生産した同一の抗体によって媒介されるＡＤＣＣに比べて減少したが、操作されなかった。例えば、ＦｃドメインにＡＤＣＣを減少させるアミノ酸置換を含む抗体によって媒介されるＡＤＣＣは、Ｆｃドメインにこのようなアミノ酸置換がない同一の抗体によって媒介されるＡＤＣＣに比べて減少した。ＡＤＣＣの測定に適した分析は、当該技術分野によく知られている（例えば、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ２００６／０８２５１５号またはＰＣＴ国際公開第ＷＯ２０１２／１３０８３１号参照）。

【0121】

薬剤の「有効量（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔ）」とは、薬剤が投与された細胞または組職で生理学的変化をもたらすのに必要な量を意味する。

【0122】

薬剤、例えば医薬組成物の「治療的に有効な量（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔ）」は、目的する治療または予防結果を果たすのに必要な期間の間の投薬における効果的な量を意味する。例えば、薬剤の治療的に有効な量は、例えば疾病の有害効果を除去、減少、遅延、最小化または防止する。

【0123】

「個体（ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ）」、「被験体（ｓｕｂｊｅｃｔ）」または「患者（ｐａｔｉｅｎｔ）」は、哺乳動物である。哺乳動物には家畜（例えば、牛、量、猫、犬及び馬）、霊長類（例えば、ヒト及び非ヒト霊長類、例えば、猿）、兎及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）を含むがこれらに限定されない。特に、個体、被験体または患者はヒトである。

【0124】

用語「医薬組成物（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）」は、その中に含有された活性成分の生物学的活性が有効になる形態であり、前記組成物が投与された被験体に許容できない程度に毒性のある追加成分を含まない製剤をいう。

【0125】

「薬学的に許容可能な担体（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ ｃａｒｒｉｅｒ）」は、医薬組成物における活性成分以外の成分であって、被験体における毒性のない成分をいう。薬学的に許容可能な担体には、緩衝剤、賦形剤、安定化剤または保存剤を含むが、これらに限定されない。

【0126】

本願で使われた、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」（及びその文法的変形、例えば「治療する（ｔｒｅａｔ）」または「治療している（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」）は、治療を受ける個体において、疾病の自然な過程を変更しようとする試みとしての臨床的仲裁を意味し、予防または臨床病理過程中に行うことができる。治療の好ましい効果としては、疾病の発生または再発の防止、症状の緩和、疾病の直接的または間接的病理学的結果の減少、転移の防止、疾病進行速度の減少、疾病状態の改善または緩和、及び予後の寛解または改善を含むが、これに限定されない。幾つかの実施様態において、本発明の抗体または二重特異性抗体は、疾病発病の遅延または疾病進行の遅滞に用いられる。

【0127】

用語「添付書類（ｐａｃｋａｇｅ ｉｎｓｅｒｔ）」は、治療薬の商業的パッケージに慣例的に含まれるガイドラインであって、適応症、使い方、投与量、投与、併用療法、当該治療薬の使用に係わる禁止事項及び／または警告に対する情報を含む。

【0128】

＜抗ＣＬＬ－１抗体＞

【0129】

抗ＣＬＬ－１抗体は、ＣＬＬ－１標的化部分であって、抗ＣＬＬ－１抗体またはその抗原結合フラグメントを含むことができる。抗ＣＬＬ－１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＣＬＬ－１に対する力強い結合及び阻害活性を示すことができるし、治療及び診断用途に有用であることができる。

【0130】

一実施形態において、抗ＣＬＬ－１抗体またはその断片は、ヒトＣＬＬ－１タンパク質に対する特異性を有することができる。

【0131】

一実施形態において、抗ＣＬＬ－１抗体またはその断片は、（ａ）配列番号１、２及び３からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ１；（ｂ）配列番号４、５及び６からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ２；（ｃ）配列番号７、８、９、１０及び１１からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ３；（ｄ）配列番号１２、１３、１４及び１５からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ１；（ｅ）配列番号１６、１７及び１８からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ２；及び（ｆ）配列番号１９、２０、２１及び２２からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ３を含むことができる。

【0132】

本発明の一実施形態による抗体または抗原結合フラグメントの重鎖及び軽鎖可変領域に含まれる抗ＣＬＬ－１のＣＤＲ配列は下記表２に示す。

【0133】

【0134】

一実施形態において、前記表（表２）に開示された軽鎖の各可変領域のＣＤＲ及び重鎖の各可変領域のＣＤＲは自由に組み合わせられることができる。
幾つかの実施様態において、抗体またはその断片は、置換を１個以下、２個以下、または３個以下で含むことができる。

【0135】

一実施形態において、抗ＣＬＬ－１抗体またはその断片は、配列番号２３及び２４からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む重鎖定常領域；または配列番号２３及び２４からなる群から選択されたアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するペプチドを含むことができる。

【0136】

一実施形態において、抗ＣＬＬ－１抗体またはその断片は、配列番号５５からなるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含むことができる。

【0137】

一実施形態において、抗ＣＬＬ－１抗体またはその断片は、配列番号２３及び２４からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む重鎖定常領域と、配列番号５５からなるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域とを含むことができる。

【0138】

一実施形態において、抗ＣＬＬ－１抗体またはその断片は、配列番号２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５及び７４からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；または配列番号２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５及び７４からなる群から選択されたアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するペプチドを含むことができる。

【0139】

一実施形態において、抗ＣＬＬ－１抗体またはその断片は、配列番号３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４及び７５からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；または配列番号３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４及び７５からなる群から選択されたアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するペプチドを含むことができる。

【0140】

一実施形態において、抗ＣＬＬ－１抗体またはその断片は、配列番号２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５及び７４からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；及び配列番号３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４及び７５からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むことができる。

【0141】

一実施形態において、抗ＣＬＬ－１抗体またはその断片は、配列番号４５からなるアミノ酸配列を含む重鎖；または配列番号４５からなるアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するペプチドを含むことができる。

【0142】

一実施形態において、抗ＣＬＬ－１抗体またはその断片は、配列番号４６からなるアミノ酸配列を含む軽鎖；または配列番号４６からなるアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するペプチドを含むことができる。

【0143】

一実施形態において、抗ＣＬＬ－１抗体またはその断片は、配列番号４５からなるアミノ酸配列を含む重鎖；及び配列番号４６からなるアミノ酸配列を含む軽鎖を含むことができる。

【0144】

一実施形態で、抗体または抗原結合フラグメントの重鎖定常領域、重鎖及び軽鎖可変領域、重鎖及び軽鎖は下記表（表３）に例示されることができる。

【0145】

【0146】

他の実施様態において、前記表（表３）に開示された重鎖及び軽鎖の可変領域を自由に組み合わせて多様な形態の抗体を製造することができる。

【0147】

本願に開示の重鎖及び軽鎖可変領域は、それぞれ多様な標的化重鎖及び軽鎖定常領域に結合してインタクトな抗体の重鎖及び軽鎖をそれぞれ形成することができる。また、このような定常領域に結合された重鎖及び軽鎖配列がそれぞれまた組み合わせられてインタクトな抗体構造を形成することができる。

【0148】

抗体の重鎖及び軽鎖の任意の可変領域は定常領域の少なくとも一部に連結されることができる。定常領域は、抗体依存性細胞介在性細胞傷害、抗体依存性細胞食作用及び／または補体依存性細胞傷害などが必要であるか否かによって選択されることができる。例えば、ヒトアイソ型ＩｇＧ１及びＩｇＧ３は、補体依存性細胞傷害を有し、ヒトアイソ型ＩｇＧ２及びＩｇＧ４は、細胞傷害を有さない。また、ヒトＩｇＧ１及びＩｇＧ３は、ヒトＩｇＧ２及びＩｇＧ４よりも強い細胞媒介エフェクター機能を誘導する。例えば、重鎖可変領域は、ＩｇＧ、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４の定常領域に結合することができ、軽鎖可変領域はカッパまたはラムダ定常領域に結合することができる。定常領域の場合、必要に応じて適切なものが用いられることができ、例えばヒトまたはマウス由来のものが用いられることができる。一実施形態において、ヒト重鎖定常領域ＩｇＧ１が用いられる。他の実施様態において、軽鎖定常領域として、ヒトラムダ領域が用いられることができる。

【0149】

本願に開示の任意の可変領域は、定常領域に結合され、これによって重鎖及び軽鎖配列を形成することができる。一実施形態で、本願に開示の重鎖可変領域は、ヒトＩｇＧ１定常領域に結合され、重鎖（全長）を形成することができる。他の実施様態で、本願に開示の軽鎖可変領域は、ヒトラムダ定常領域に結合され、軽鎖（全長）を形成することができる。軽鎖及び重鎖は、多様な組み合わせで組み合わせられ、これによって２個の軽鎖及び２個の重鎖で構成されたインタクトな抗体を形成することができる。

【0150】

他の実施様態において、抗体は重鎖及び軽鎖の組み合わせを含むか、またはこれに必須に構成されることができ、これは配列番号４５及び配列番号４６の配列で表される。

【0151】

しかし、本願に開示の可変領域と組み合わせられるこのような定常領域配列が例示され、当業者はＩｇＧ１重鎖定常領域、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４重鎖定常領域、任意のカッパまたはラムダ軽鎖定常領域、安定性、発現、製造可能性または他の標的化特性のために修飾された定常領域などを含む他の定常領域が用いられてもよいことが分かる。

【0152】

幾つかの実施様態において、抗ＣＬＬ－１抗体の抗原結合フラグメントは、抗体の重鎖ＣＤＲ及び／または軽鎖ＣＤＲを含む任意の断片であってもよく、例えばこれはＦａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）_２、ｘＦａｂ、Ｆｄ（重鎖可変領域及びＣＨ１ドメインを含む）、Ｆｖ（重鎖可変領域及び／または軽鎖可変領域）、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ；任意の手順の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域、並びに重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の間のペプチドリンカーを含むかまたはこれに必須に構成される）、単鎖抗体、ジスルフィド連結されたＦｖ（ｓｄＦｖ）、ｓｃＦａｂ（単鎖Ｆａｂ）、ｓｃＦａｂ－Ｆｃ（ｓｃＦａｂ及びＦｃ領域を含む）、半ＩｇＧ（１個の軽鎖及び１個の重鎖を含む）及び類似物からなる群から選択されることができるが、これに限定されない。

【0153】

本発明は、本願に開示の一つ以上のアミノ酸配列と実質的な配列同一性を有する一つ以上のアミノ酸配列を含むことができる。実質的な同一性（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）とは、配列変異が存在する場合でも本願に開示の効果を維持することを意味する。

【0154】

幾つかの実施様態において、抗ＣＬＬ－１抗体またはその抗原結合フラグメントは、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、または完全ヒト抗体であることができる。

【0155】

一実施形態で、抗ＣＬＬ－１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ポリペプチド（複数可）と融合して融合タンパク質を形成することができる。ポリペプチド（複数可）は抗体または抗原であることができる。一実施形態で、融合タンパク質は多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）の形態であってもよい。

【0156】

一実施形態で、本開示内容は、（ａ）本願に記載の一つ以上の単一ドメイン抗体またはその抗原結合フラグメント（例えば、本願に記載の一つ以上のＣＤＲ）、及び（ｂ）一つ以上の追加のポリペプチドを含む融合タンパク質を提供する。例えば、融合タンパク質は、本願に記載の一つ以上の単一ドメイン抗体及び本願に記載の定常領域またはＦｃ領域を含むことができる。一実施形態において、本願に記載の一つ以上の単一ドメイン抗体またはその抗原結合フラグメント（例えば、本願に記載の一つ以上のＣＤＲ）は、抗体または抗原に非共有結合あるいは共有結合で接合、例えば融合されることができる。

【0157】

＜抗ＣＤ３抗体＞

【0158】

抗ＣＤ３抗体は、ＣＤ３標的化部分であって、抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合フラグメントを含むことができる。抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＣＤ３に対する力強い結合及び阻害活性を示すことができ、治療及び診断用途に有用であることができる。

【0159】

一実施形態で、抗ＣＤ３抗体またはその断片は、ヒトＣＤ３タンパク質、望ましくはヒトＣＤ３Ｅポリペプチドに対する特異性を有することができる。

【0160】

一実施形態において、抗ＣＤ３抗体またはその断片は、（ａ）配列番号４７からなるアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ１と、（ｂ）配列番号４８からなるアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ２と、（ｃ）配列番号４９からなるアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ３と、（ｄ）配列番号５０からなるアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ１と、（ｅ）配列番号５１からなるアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ２と、（ｆ）配列番号５２からなるアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ３とを含むことができる。

【0161】

一実施形態で、前記開示された軽鎖の各可変領域のＣＤＲ及び重鎖の各可変領域のＣＤＲは、自由に組み合わせられることができる。

【0162】

幾つかの実施様態において、抗体またはその断片は、置換を１個以下、２個以下、または３個以下で含むことができる。

【0163】

一実施形態で、抗ＣＤ３抗体またはその断片は、配列番号５３からなるアミノ酸配列を含む重鎖または配列番号５３からなるアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するペプチドと、配列番号５４からなるアミノ酸配列を含む軽鎖または配列番号５４からなるアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するペプチドとを含むことができる。

【0164】

他の実施様態で、前記開示された重鎖及び軽鎖の可変領域を自由に組み合わせて多様な形態の抗体を製造することができる。

【0165】

本願に開示の重鎖及び軽鎖可変領域は、それぞれ多様な標的化重鎖及び軽鎖定常領域に結合してインタクトな抗体の重鎖及び軽鎖をそれぞれ形成することができる。また、このような定常領域に結合された重鎖及び軽鎖配列もそれぞれ組み合わせられてインタクトな抗体構造を形成することができる。

【0166】

抗体の重鎖及び軽鎖の任意の可変領域は、定常領域の少なくとも一部に連結されることができる。定常領域は抗体依存性細胞介在性細胞傷害、抗体依存性細胞食作用及び／または補体依存性細胞傷害などが必要かどうかによって選択されることができる。例えば、ヒトアイソタイプＩｇＧ１及びＩｇＧ３は、補体依存性細胞傷害を有し、ヒトアイソタイプＩｇＧ２及びＩｇＧ４は細胞傷害を有さない。また、ヒトＩｇＧ１及びＩｇＧ３は、ヒトＩｇＧ２及びＩｇＧ４よりも強い細胞媒介エフェクター機能を誘導する。例えば、重鎖可変領域はＩｇＧ、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４の定常領域に結合することができ、軽鎖可変領域はカッパまたはラムダ定常領域に結合することができる。定常領域の場合、必要によって適切なものが用いられることができ、例えば、ヒトまたはマウス由来のものが用いられることができる。一実施形態において、ヒト重鎖定常領域ＩｇＧ１が用いられる。他の実施様態で、軽鎖定常領域として、ヒトラムダ領域が用いられることができる。

【0167】

本願に開示の任意の可変領域は定常領域に結合され、これによって、重鎖及び軽鎖配列を形成することができる。一実施形態で、本願に開示の重鎖可変領域は、ヒトＩｇＧ１定常領域に結合され、重鎖（全長）を形成することができる。他の実施様態で、本願に開示の軽鎖可変領域はヒトラムダ定常領域に結合され、軽鎖（全長）を形成することができる。軽鎖及び重鎖は、多様な組み合わせで組み合わせられ、これによって、２つの軽鎖及び２つの重鎖で構成されたインタクトな抗体を形成することができる。

【0168】

他の実施様態で、抗体は重鎖及び軽鎖の組み合わせを含むか、またはこれに必須に構成されることができ、これは配列番号５３及び配列番号５４の配列で表される。

【0169】

しかし、本願に開示の可変領域と組み合わせられるこのような定常領域配列が例示され、当業者はＩｇＧ１重鎖定常領域、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４重鎖定常領域、任意のカッパまたはラムダ軽鎖定常領域、安定性、発現、製造可能性または他の標的化特性のために修飾された定常領域などを含む他の定常領域が用いられることができることが分かる。

【0170】

幾つかの実施様態において、抗ＣＤ３抗体の抗原結合フラグメントは、抗体の重鎖ＣＤＲ及び／または軽鎖ＣＤＲを含む任意の断片であってもよく、例えばこれはＦａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）_２、ｘＦａｂ、Ｆｄ（重鎖可変領域及びＣＨ１ドメインを含む）、Ｆｖ（重鎖可変領域及び／または軽鎖可変領域）、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ；任意の手順の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域、及び重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の間のペプチドリンカーを含むか、またはこれに必須に構成される）、単鎖抗体、ジスルフィド連結されたＦｖ（ｓｄＦｖ）、ｓｃＦａｂ（単鎖Ｆａｂ）、ｓｃＦａｂ－Ｆｃ（ｓｃＦａｂ及びＦｃ領域を含む）、半ＩｇＧ（１つの軽鎖及び１つの重鎖を含む）及び類似物からなる群から選択されることができるが、これらに限定されない。

【0171】

本発明は、本願に開示の一つ以上のアミノ酸配列と実質的な配列同一性を有する一つ以上のアミノ酸配列を含む。実質的な同一性は、配列変異が存在する場合でも本願に開示の効果を維持することを意味する。

【0172】

一実施形態で、本開示内容は、（ｉ）本願に記載の一つ以上の単一ドメイン抗体またはその抗原結合フラグメント（例えば、本願に記載の一つ以上のＣＤＲ）、及び（ｂ）一つ以上の追加ポリペプチドを含む融合タンパク質を提供する。例えば、融合タンパク質は、本願に記載の一つ以上の単一ドメイン抗体及び本願に記載の定常領域またはＦｃ領域を含むことができる。一実施形態において、本願に記載の一つ以上の単一ドメイン抗体またはその抗原結合フラグメント（例えば、本願に記載の一つ以上のＣＤＲ）は、抗体または抗原に非共有結合または共有結合により接合、例えば融合されることができる。

【0173】

＜抗ＣＬＬ－１／抗ＣＤ３二重特異性抗体＞

【0174】

抗ＣＬＬ－１抗体／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、抗ＣＬＬ－１抗体またはその抗原結合フラグメントと、抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合フラグメントとを含むことができる。抗ＣＬＬ－１抗体／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、治療及び診断用途に有用であることができる。

【0175】

一実施形態で、二重特異性抗体はＣＬＬ－１標的化部分及びＣＤ３標的化部分を含む。

【0176】

一実施形態で、抗ＣＬＬ－１抗体またはその抗原結合フラグメント及び抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合フラグメントは、直接またはペプチドリンカーを介して互いに融合されることができる。

【0177】

一実施形態で、抗ＣＬＬ－１抗体またはその抗原結合フラグメント及び抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合フラグメントは、それぞれ独立にＦａｂ分子であることができる。

【0178】

一実施形態で、前記Ｆａｂ分子は、ヒトＦａｂ分子またはＴＣＲ定常領域を含むキメラＦａｂ様ドメインであることができる。一実施形態で、前記Ｆａｂ分子はキメラまたはヒト化されることができる。

【0179】

一実施形態で、（ａ）抗ＣＬＬ－１抗体またはその抗原結合フラグメントは、抗ＣＬＬ－１抗体またはその抗原結合フラグメントのＦａｂ重鎖のＣ末端で抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合フラグメントのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されることができるか、または（ｂ）抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合フラグメントは、抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合フラグメントのＦａｂ重鎖のＣ末端で抗ＣＬＬ－１抗体またはその抗原結合フラグメントのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されることができる。

【0180】

一実施形態で、抗ＣＬＬ－１／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、第１サブユニット及び第２サブユニットを含むＦｃドメインを含むことができる。

【0181】

一実施形態で、Ｆｃドメインは、追加の突然変異が存在するかまたは不在するヒトＦｃドメインであることができる。Ｆｃドメインにおけるこのような追加の突然変異としては、ＡＤＣＣ活性が存在しないＮ２９７Ａ突然変異または正確な抗体ペアリングを促進するＫＩＨ（ｋｎｏｂ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅ）突然変異を含むことができるが、これに限定されない。

【0182】

一実施形態で、抗ＣＬＬ－１抗体またはその抗原結合フラグメント及び抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合フラグメントは、それぞれＦａｂ分子であることができ、（ａ）抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合フラグメントは、抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合フラグメントのＦａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第１サブユニットのＮ末端に融合されることができ、（ｂ）抗ＣＬＬ－１抗体またはその抗原結合フラグメントは、抗ＣＬＬ－１抗体またはその抗原結合フラグメントのＦａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第２サブユニットのＮ末端に融合されることができる。

【0183】

一実施形態で、抗ＣＬＬ－１抗体またはその抗原結合フラグメントは、第１の抗ＣＬＬ－１抗体またはその抗原結合フラグメントであってもよく、第２の抗ＣＬＬ－１抗体または、その抗原結合フラグメントをさらに含むことができる。

【0184】

一実施形態において、第１の抗ＣＬＬ－１抗体またはその抗原結合フラグメント、抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合フラグメント、及び存在する場合、第２の抗ＣＬＬ－１抗体またはその抗原結合フラグメントはそれぞれＦａｂ分子であることができ；（ａ）抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合フラグメントは、抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合フラグメントのＦａｂ重鎖のＣ末端で第１の抗ＣＬＬ－１抗体またはその抗原結合フラグメントのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されることができ、第１の抗ＣＬＬ－１抗体またはその抗原結合フラグメントは、第１の抗ＣＬＬ－１抗体またはその抗原結合フラグメントのＦａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第１サブユニットのＮ末端に融合されることができるか、または（ｂ）第１の抗ＣＬＬ－１抗体またはその抗原結合フラグメントは、第１の抗ＣＬＬ－１抗体またはその抗原結合フラグメントのＦａｂ重鎖のＣ末端で抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合フラグメントのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されることができ、抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合フラグメントは、抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合フラグメントのＦａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第１サブユニットのＮ末端に融合されることができ、第２の抗ＣＬＬ－１抗体またはその抗原結合フラグメントが、存在する場合、第２の抗ＣＬＬ－１抗体またはその抗原結合フラグメントのＦａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第２サブユニットのＮ末端に融合されることができる。

【0185】

一実施形態で、第１の抗ＣＬＬ－１抗体またはその抗原結合フラグメント、抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合フラグメント及び第２の抗ＣＬＬ－１抗体またはその抗原結合フラグメントは、それぞれＦａｂ分子であり、第１の抗ＣＬＬ－１抗体またはその抗原結合フラグメントは、第１の抗ＣＬＬ－１抗体またはその抗原結合フラグメントのＦａｂ重鎖のＣ末端で抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合フラグメントのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合され、抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合フラグメントは、抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合フラグメントのＦａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第１サブユニットのＮ末端に融合され、第２の抗ＣＬＬ－１抗体またはその抗原結合フラグメントが存在する場合、これは第２の抗ＣＬＬ－１抗体またはその抗原結合フラグメントのＦａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第２サブユニットのＮ末端に融合される。このような構造の遮蔽されたＣＤ３結合部位によって、二重特異性抗体はＴ細胞活性化及びＩＦＮ－γ及びＩＬ－２のサイトカイン発現を強く誘導することができるが、ＣＲＳ－関連サイトカイン、例えばＴＮＦ－α及びＩＬ－６を弱く誘導するので、オフ腫瘍毒性（ｏｆｆ－ｔｕｍｏｒ ｔｏｘｉｃｉｔｙ）が少ないことを示す。

【0186】

一実施形態で、第１の抗ＣＬＬ－１抗体またはその抗原結合フラグメント、及び第２の抗ＣＬＬ－１抗体またはその抗原結合フラグメントは、互いに同一であってもよい。

【0187】

一実施形態で、二重特異性抗体は活性化Ｔ細胞抗原であるＣＬＬ－１及びＣＤ３に同時に結合することができる。一実施形態において、二重特異性抗体は、ＣＬＬ－１及びＣＤ３に同時に結合することでＴ細胞及び標的細胞を架橋させることができる。一実施形態で、このような同時結合は、標的細胞、具体的にＣＬＬ－１発現腫瘍細胞の溶解をもたらす。一実施形態で、このような同時結合はＴ細胞の活性化をもたらす。他の実施様態で、このような同時結合はＴリンパ球、具体的に細胞傷害Ｔリンパ球の細胞反応をもたらして、前記細胞反応は、増殖、分化、サイトカイン分泌、細胞傷害エフェクター分子放出、細胞傷害活性、及び活性化マーカーの発現の群から選択される。

【0188】

一実施形態で、二重特異性抗体はＴ細胞の細胞傷害活性を標的細胞に再指示（ｒｅ－ｄｉｒｅｃｔｉｎｇ）できる。特定の実施形態において、前記再指示（ｒｅ－ｄｉｒｅｃｔｉｏｎ）は標的細胞によるＭＨＣ媒介ペプチド抗原提示及び／またはＴ細胞の特異性と無関係である。具体的に、本発明の任意の実施様態によるＴ細胞は、細胞傷害Ｔ細胞（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃＴｃｅｌｌ）である。幾つかの実施形態において、Ｔ細胞はＣＤ４^＋またはＣＤ８^＋Ｔ細胞、具体的にＣＤ８＋Ｔ細胞である。

【0189】

一実施形態で、一実施形態による二重特異性抗体は、Ｕ９３７及びＨＬ－６０細胞株の存在下にサイトカインの発現、グランザイムＢ及び／またはパーフォリンを誘導することができる。

【0190】

＜コンジュゲート＞

【0191】

本発明は、本願に記載の抗ＣＬＬ－１抗体または抗ＣＬＬ－１／抗ＣＤ３二重特異性抗体が一つ以上の治療薬、例えば細胞傷害剤、化学療法剤、薬物、成長阻害剤、毒素（例：タンパク質毒素、バクテリア、真菌、植物または動物起源の酵素的に活性である毒素、またはその断片）または放射性同位元素に接合された（化学的に結合された）イムノコンジュゲート（ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）を提供する。

【0192】

一実施形態で、イムノコンジュゲートは、抗体薬物複合体（ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ：ＡＤＣ）であって、ここで抗体が前述した治療薬の一つ以上に接合される。抗体は、典型的に一つ以上の治療薬にリンカーを用いて連結される。治療薬及び薬物及びリンカーの例を含むＡＤＣ技術の概要は、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｒｅｖｉｅｗ６８：３－１９（２０１６）に提示されている。

【0193】

他の実施様態において、イムノコンジュゲートは、ジフテリアＡ鎖（ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ Ａ ｃｈａｉｎ）、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素Ａ鎖（緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来）、リシンＡ鎖（ｒｉｃｉｎ Ａ ｃｈａｉｎ）、アブリンＡ鎖（ａｂｒｉｎ Ａ ｃｈａｉｎ）、モデシンＡ鎖（ｍｏｄｅｃｃｉｎ Ａ ｃｈａｉｎ）、αサルシン（ａｌｐｈａ－ｓａｒｃｉｎ）、シナアブラギリ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジアンチン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、ヨウシュヤマゴボウ（Ｐｈｙｔｏｌａｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ－Ｓ）、ツルレイシ（ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害剤、クルシン（ｃｕｒｃｉｎ）、クロチン（ｃｒｏｔｉｎ）、サポンソウ（ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、エノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）、及びトリコセセンス（ｔｒｉｃｏｔｈｅｃｅｎｅｓ）を含むが、これらに限定されない酵素的に活性である毒素またはその断片に接合された本願に記載された抗体を含むことができる。

【0194】

他の実施様態で、イムノコンジュゲートは本願に記載の抗体が放射性原子に接合されて形成された放射性コンジュゲート（ｒａｄｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を含むことができる。放射性コンジュゲートの生産には、多様な放射性同位元素が利用可能である。たとえば、Ａｔ^２１１、Ｉ^１３１、Ｉ^１２５、Ｙ^９０、Ｒｅ^１８６、^{Ｒｅ１８８}、Ｓｍ^１５３、Ｂｉ^２１２、Ｐ^３２、Ｐｂ^２１２及びＬｕの放射性同位元素を含む。放射状コンジュゲートを検出に用いる場合、シンチグラフィー研究（ｓｃｉｎｔｉｇｒａｐｈｉｃ ｓｔｕｄｉｅｓ）のための放射性原子炉、例えばｔｃ９９ｍまたはＩ１２３、核磁気共鳴（ＮＭＲ）映像（また、磁気共鳴映像（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｉｍａｇｉｎｇ）、ＭＲＩと知られている）のためのスピン標識で、例えばヨウ素－１２３、ヨウ素－１３１、インジウム－１１１、フッ素－１９、炭素－１３、窒素－１５、酸素－１７、ガドリニウム、マンガンまたは鉄を含むことができる。

【0195】

抗体及び細胞傷害剤のコンジュゲートは、多様な二官能性タンパク質カップリング剤、例えば３－（２－ピリジルジチオ)プロピオン酸Ｎ－スクシンイミジル（ＳＰＤＰ）、４－（Ｎ－マレイミドメチル)シクロヘキサンカルボン酸Ｎ－スクシンイミジル（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えば、アジポイミド酸ジメチル塩酸塩）、活性エステル（例えば、ジスクシンイミジルスベリン酸塩）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビスアジド化合物（例えば、ビス（ｐ－アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス－ジアゾニウム誘導体（例えばビス－（ｐ－ジアゾニウムベンゾイル）－エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トルエン２，６－ジイソシアネート）、及びビス－活性フッ素化合物（例えば１，５－ジフルオロ－２，４－ジニトロベンゼン）を用いて製造されることができる。例えば、リシン免疫毒素（ｒｉｃｉｎ ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎ）は、Ｖｉｔｅｔｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：１０９８（１９８７）に記載されているように製造されることができる。炭素－１４－標識された1－イソチオシアネートベンジル－３－メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ－ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチド（ｒａｄｉｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）を抗体に接合させるための例示されるキレート剤である。ＷＯ９４／１１０２６を参照する。リンカーは、細胞内で細胞傷害薬物の放出を促進する「切断可能なリンカー（ｃｌｅａｖａｂｌｅ ｌｉｎｋｅｒ）」であってもよい。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ過敏性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカー（Ｃｈａｒｉ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２：１２７－１３１（１９９２）；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，２０８，０２０）を用いることができる。

【0196】

本願のイムノコンジュゲート又はＡＤＣは、ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ－ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ－ＥＭＣＳ、スルホ－ＧＭＢＳ、スルホ－ＫＭＵＳ、スルホ－ＭＢＳ、スルホ－ＳＩＡＢ、スルホ－ＳＭＣＣ、及びスルホ－ＳＭＰＢ、及びＳＶＳＢ（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ－（４－ｖｉｎｙｌｓｕｌｆｏｎｅ）ｂｅｎｚｏａｔｅ）（これは商業的に利用できる（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， Ｉｌｌ．、Ｕ．Ｓ．Ａ））を含むが、これに限定されない架橋剤試薬として製造されたコンジュゲートが考えられるが、これに限定されない。

【0197】

また、接合可能な細胞傷害剤は、例えばピロロベンゾジアゼピン （ＰＢＤ）、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、カムプトテシン、ドキソルビシン、シスプラチン、ベラパミル、フルオロウラシル、オキサリプラチン、ダウノルビシン、イリノテカン、トポテカン、パクリタキセル、カルボプラチン、ゲムシタビン、メトトレキサート、ドセタキセル、アシビシン、アクラルビシン、アコダゾール、アクロニシン、アドゼレシン、アラノシン、アルデスロイキン、アロプリノールナトリウム、アルトレタミン、アミノグルテチミド、アモナフィド、アンプリジェン、アムサクリン、アンドロゲン、アングイジン、アフィジコリングリシネート、アサリー、アスパラギナーゼ、５－アザシチジン、アザチオプリン、ＢＣＧ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｃａｌｍｅｔｔｅ－Ｇｕｅｒｉｎ）、ベーカーズアンチフォール（Ｂａｋｅｒ'ｓ Ａｎｔｉｆｏｌ）、β－２－デオキシチオグアノシン、ビサントレン塩酸塩、硫酸ブレオマイシン、ブスルファン、ブチオニンスルホキシイミン、ＢＷＡ７７３Ｕ８２、ＢＷ５０２Ｕ８３／ＨＣｌ、メシル酸ＢＷ７Ｕ８５、カラセミド（Ｃａｒａｃｅｍｉｄｅ）、カルベチマー（Ｃａｒｂｅｔｉｍｅｒ）、カルボプラチン、カルムスチン（Ｃａｒｍｕｓｔｉｎｅ）、クロラムブシル（Ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、クロロキノキサリンスルホンアミド（ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｏｘａｌｉｎｅ ｓｕｌｆｏｎａｍｉｄｅ）、クロロゾトシン、クロモマイシンＡ３、シスプラチン、クラドリビン、コルチコステロイド、コリネバクテリウムパルブム、ＣＰＴ－１１、クリスナトール、シクロシチジン、シクロホスファミド、シタラビン、シテムベナ、ダビスマレアート、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン塩酸塩、デアザウリジン、デクスラゾキサン、ジアンヒドロガラクチトール、ジアジクオン、ジブロモズルシトール、ダイデムニンＢ、ジエチルジチオカルバミン酸、ジグリコアルデヒド、ジヒドロ－５－アザシチジン、エキノマイシン、エダトレキサート、エデルホシン、エフロルニチン、エリオット溶液(Ｅｌｌｉｏｔｔ'ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、エルサミトルシン、エソルビシン、エストラムスチンリン酸エステル、エストロゲン、エタニダゾール、エチオホス、エトポシド、ファドロゾール、ファザラビン、フェンレチニド、フィルグラスチム、フィナステリド、フラボン酢酸、フロクスウリジン、リン酸フルダラビン、５－フルオロウラシル、Ｆｌｕｏｓｏｌ^ＴＭ、フルタミド、硝酸ガリウム、ゲムシタビン、酢酸ゴセレリン、ヘプスルファム、ヘキサメチレンビスアセタミド、ホモハリントニン（ｈｏｍｏｈａｒｒｉｎｇｔｏｎｉｎｅ）、硫酸ヒドラジン、４－ヒドロキシアンドロステンジオン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン塩酸塩、イホスファミド、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、インターロイキン－１α及びインターロイキン－１β、インターロイキン－３、インターロイキン－４、インターロイキン－６，４－イポメアノール、イプロプラチン、イソトレチノイン、ロイコボリンカルシウム、リュープロリド酢酸塩、レバミゾール、リポソームダウノルビシン、ダウノルビシン封入リポソーム、ロムスチン、ロニダミン、マイタンシン、塩酸メクロレタミン、メルファラン、メノガリル、メルバロン、６－メルカプトプリン、カルメット・ゲラン桿菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｍｅｔｔｅ－ｇｕｅｒｉｎ）のメタノール抽出物、メトトレキサート、Ｎ－メチルホルムアミド、ミフェプリストン、ミトグアゾン、マイトマイシンＣ、ミトタン、ミトキサントロン塩酸塩、単球マクロファージコロニー刺激因子、ナビロン、ナフォキシジン、ネオカルチノスタチン、オクトレオチド酢酸塩、オルマプラチン、オキサリプラチン、パクリタキセル、Ｎ－(ホスホノアセチル)－Ｌ－アスパラギン酸（ＰＡＬＡ）、ペントスタチン、ピペラジンジオン、ピポブロマン、ピラルビシン、ピリトレキシム、塩酸ピロキサントロン、ＰＩＸＹ－３２１、プリカマイシン、ポルフィマーナトリウム、プレドニムスチン、プロカルバジン、プロゲスチン、ピラゾフリン、ラゾキサン、サルグラモスチム、セムスチン、スピロゲルマニウム、スピロムスチン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、スロフェヌル、スラミンナトリウム、タモキシフェン、タキソテール、テガフール、テニポシド、テレフタルアミジン、テロキシロン、チオグアニン、チオテパ、チミジン注射、チアゾフリン、トポテカン、トレミフェン、トレチノイン、トリフロペラジン塩酸塩、トリフルリジン、トリメトレキサート、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ウラシルマスタード、ビンブラスチン硫酸塩、ビンクリスチン硫酸塩、ビンデシン、ビノレルビン、ビンゾリジン、ヨシ８６４（Ｙｏｓｈｉ８６４）、ゾルビシン、これらの薬学的に許容可能な塩、及びこれらの混合物などを含む。

【0198】

＜グリコシル化変異体＞

【0199】

所定の実施様態で、本願に提供された抗体は、抗体がグリコシル化される程度を増加または減少させるために変更されることができる。抗体に対するグリコシル化部位の追加または欠失は、一つ以上のグリコシル化部位が形成または除去されるようにアミノ酸配列を変更することで簡易に達成可能である。

【0200】

抗体がＦｃ領域を含む場合、これに付着したオリゴ糖は変更されることができる。哺乳動物の細胞によって生成された天然抗体は、典型的にＦｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７にＮ連結によって一般的に付着した分岐型の二分岐オリゴ糖（ｂｒａｎｃｈｅｄ、ｂｉａｎｔｅｎｎａｒｙ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）を含む。例えば、Ｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．， ＴＩＢＴＥＣＨ １５：２６－３２（１９９７）を参照する。オリゴ糖は、多様な炭水化物、例えばマンノース、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース及びシアル酸だけでなく、二分岐オリゴ糖構造の「幹（ｓｔｅｍ）」においてＧｌｃＮＡｃに付着したフコースを含むことができる。幾つかの実施形態において、所定の改善された特性を有する抗体変異体を形成するために、本発明の抗体におけるオリゴ糖の修飾を行うことができる。

【0201】

一実施形態において、非フコシル化オリゴ糖、すなわちＦｃ領域に（直接または間接的に）付着したフコースが欠失しているオリゴ糖構造を持つ抗体変異体が提供される。このような非フコシル化オリゴ糖（また「脱フコシル化（ａｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ）」オリゴ糖と呼ばれる）は、特に二分岐オリゴ糖構造の幹において第１ＧｌｃＮＡｃに付着したフコース残基が欠失しているＮ連結オリゴ糖である。一実施形態において、天然または親抗体と比較して、Ｆｃ領域で非フコシル化オリゴ糖の比率が増加された抗体変異体が提供される。例えば、非フコシル化オリゴ糖の比率は、少なくとも約２０％、少なくとも約４０％、少なくとも約６０％、少なくとも約８０％、またはひいては約１００％であってもよい（すなわち、フコシル化オリゴ糖が存在しない）。非フコシル化オリゴ糖の比率は、例えばＷＯ２００６／０８２５１５に記載されているように、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分光分析法で測定時に、Ａｓｎ２９７に付着したすべてのオリゴ糖（例えば、錯体、 混成物及びそのマンノース構造）の和に対する、フコース残基が欠失しているオリゴ糖の（平均）量である。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域における約２９７位（Ｆｃ領域残基のＥＵ番号付け）に位置したアスパラギン残基をいうが、しかし、Ａｓｎ２９７はまた抗体における軽微な配列変化によって、２９７位の上流または下流の約±３個のアミノ酸、すなわち、２９４～３００位の間に位置することができる。Ｆｃ領域における非フコシル化オリゴ糖の比率が増加されたこのような抗体は、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体結合が改善され、及び／またはエフェクター機能、具体的にＡＤＣＣ機能が改善することができる。例えば、ＵＳ２００３／０１５７１０８；ＵＳ２００４／００９３６２１を参照する。

【0202】

フコシル化が減少された抗体を生産することができる細胞株の例として、タンパク質フコシル化が欠失しているＬｅｃ１３ ＣＨＯ細胞（Ｒｉｐｋａ ｅｔ ａｌ．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ． ２４９：５３３－５４５（１９８６）；ＵＳ２００３／０１５７１０８；及びＷＯ２００４／０５６３１２、特に実施例１１）、及びノックアウト細胞株（ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｃｅｌｌｌｉｎｅｓ）、例えばα－１，６－フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８、ノックアウトＣＨＯ細胞（ｋｎｏｃｋｏｕｔ ＣＨＯ ｃｅｌｌｓ）（例えば、Ｙａｍａｎｅ－Ｏｈｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ． ８７：６１４－６２２（２００４）；Ｋａｎｄａ， Ｙ．ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．， ９４（４）：６８０－６８８（２００６）；及びＷＯ２００３／０８５１０７参照）、またはＧＤＰ－フコース合成または輸送体タンパク質の活性が減少または消失した細胞（例えば、ＵＳ２００４２５９１５０、ＵＳ２００５０３１６１３、ＵＳ２００４１３２１４０、ＵＳ２００４１１０２８２参照）を含む。

【0203】

追加の一実施形態で、二分されたオリゴ糖（ｂｉｓｅｃｔｅｄ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ）を持つ抗体変異体が提供され、例えば抗体のＦｃ領域に付着した二分岐オリゴ糖は、ＧｌｃＮＡｃによって二分される。このような抗体変異体は、前述のようにフコシル化が減少されて及び／またはＡＤＣＣ機能が改善されることができる。このような抗体変異体の例としては、例えばＵｍａｎａ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ Ｂｉｏｔｅｃｈｎ Ｂｉｏｅｎｇ ｌ１７、１７６－１８０（１９９９）；Ｆｅｒｒａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎ Ｂｉｏｅｎｇ ９３、８５１－８６１（２００６）；ＷＯ９９／５４３４２；ＷＯ２００４／０６５５４０、ＷＯ２００３／０１１８７８に記載されている。

【0204】

Ｆｃ領域に付着したオリゴ糖に少なくとも一つのガラクトース残基を持つ抗体変異体がも提供される。このような抗体変異体は、ＣＤＣ機能が改善できる。このような抗体変異体は、例えばＷＯ１９９７／３００８７；ＷＯ１９９８／５８９６４；及びＷＯ１９９９／２２７６４に記載されている。

【0205】

＜Ｆｃドメイン＞

【0206】

特定の実施様態において、本発明の抗体または二重特異性抗体は、第１サブユニット及び第２サブユニットからなるＦｃドメインを含むことができる。抗体または二重特異性抗体に関連して本願に記載のＦｃドメインの特徴は、本発明の抗体に含まれたＦｃドメインにも同等に適用されることができるものと理解される。

【0207】

抗体または二重特異性抗体のＦｃドメインは、兔疫グロブリン分子の重鎖ドメインを含む一対のポリペプチド鎖で構成されることができる。例えば、兔疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子のＦｃドメインは、二量体であり、各サブユニットは、ＣＨ２及びＣＨ３ＩｇＧ重鎖定常ドメインを含む。Ｆｃドメインの２つのサブユニットは、互いに安定に結合することができる。一実施形態で、本発明の抗体または二重特異性抗体は、１つ以下のＦｃドメインを含む。

【0208】

一実施形態で、抗体または二重特異性抗体のＦｃドメインは、ＩｇＧＦｃドメインであってもよい。追加の特定の一実施形態において、ＦｃドメインはヒトＦｃドメインであってもよい。

【0209】

＜ヘテロ二量体化を促進するＦｃドメイン修飾＞

【0210】

本発明による抗体または二重特異性抗体は、多様な抗原結合部分を含むことができ、これはＦｃドメインの２つのサブユニットの一つまたはもう一つに融合されることができるので、Ｆｃドメインの２つのサブユニットは、典型的に２つの非同一性のポリペプチド鎖に含まれる。このようなポリペプチドの組換え共発現及び後続する二量体化は、２つのポリペプチドの多くの可能な組み合わせを誘導する。組換え生産にあたり抗体または二重特異性抗体の収率及び純度を改善するために、抗体または二重特異性抗体のＦｃドメインに目的するポリペプチドの結合を促進する修飾を取り入れることが有利である。

【0211】

したがって、特定の実施様態において、本発明による抗体または二重特異性抗体のＦｃドメインは、Ｆｃドメインの第１サブユニット及び第２サブユニットの結合を促進する修飾を含むことができる。ヒトＩｇＧＦｃドメインの２つのサブユニットの間の最も広範囲のタンパク質－タンパク質の相互作用の部位は、ＦｃドメインのＣＨ３ドメインに存在する。よって、一実施形態で、前記修飾はＦｃドメインのＣＨ３ドメインに存在することができる。

【0212】

ヘテロ二量体化を行うために、ＦｃドメインのＣＨ３ドメインでの修飾のための多くの接近法が存在し、これは例えば、ＷＯ９６／２７０１１、ＷＯ９８／０５０４３１、ＥＰ１８７０４５９、ＷＯ２００７／１１０２０５、ＷＯ２００７／１４７９０１、ＷＯ２００９／０８９００４、ＷＯ２０１０／１２９３０４、ＷＯ２０１１／９０７５４、ＷＯ２０１１／１４３５４５、ＷＯ２０１２０５８７６８、ＷＯ２０１３１５７９５４、ＷＯ２０１３０９６２９１によく記載されている。典型的に、このようなすべての接近法で、Ｆｃドメインの第１サブユニットのＣＨ３ドメイン及びＦｃドメインの第２サブユニットのＣＨ３ドメインは、いずれも相補的な方式で操作されて各ＣＨ３ドメイン（またはこれを含む重鎖）は、もうそれ自体とホモ二量体化することができないが、相補的に操作された他のＣＨ３ドメインとヘテロ二量体化を行う（したがって、第１及び第２のＣＨ３ドメインは、ヘテロ二量体化され、それぞれ２つの第１または第２のＣＨ３ドメインの間のホモ二量体は形成されない）。重鎖ヘテロ二量体化を改善するためのこのような多様な接近法が抗体または二重特異性抗体における重鎖／軽鎖ミスペアリング（ｈｅａｖｙ／ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ｍｉｓｐａｉｒｉｎｇ）及びＢｅｎｃｅ Ｊｏｎｅｓ型副産物を減少させる重鎖－軽鎖修飾（例えば、一つの結合アームでＶＨ及びＶＬ交換／代替、及びＣＨ１／ＣＬ界面で反対電荷に荷電されたアミノ酸の置換導入）と組み合わせられた多様な代案として考慮される。

【0213】

特定の一実施形態で、Ｆｃドメインの第１及び第２サブユニットの結合を促進する前記修飾は、いわゆる「ノブ－イントゥ－ホール（ｋｎｏｂ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅ）」修飾であり、これはＦｃドメインの２つのサブユニットの一つに「ノブ（ｋｎｏｂ）」修飾と、Ｆｃドメインの２個のサブユニットのもう一つに「ホール（ｈｏｌｅ）」修飾とを含む。

【0214】

前記ノブ－イントゥ－ホール技術（ｋｎｏｂ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）は、例えばＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏｓ．５，７３１，１６８；７，６９５，９３６；Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔ Ｅｎｇ９，６１７－６２１（１９９６）およびＣａｒｔｅｒ， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈ ２４８，７－１５（２００１）に記載されている。一般に、前記方法は、第１ポリペプチドの界面に突起（「ノブ」）を導入し、第２ポリペプチドの界面には相応する空洞（「ホール」）を導入し、突起を空洞に位置させてヘテロ二量体の形成を促進するとともにホモ二量体の形成を妨害することを含む。突起は、第１ポリペプチドの界面から小さいアミノ酸側鎖をより大きい側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）に代替して製作する。第２ポリペプチドの界面で大きいアミノ酸側鎖をより小さい側鎖（例えば、アラニンまたはトレオニン）で代替することで突起と同一または類似の大きさを有する代償性空洞を形成する。

【0215】

＜Ｆｃ受容体結合及び／またはエフェクター機能を減少させるＦｃドメインの修飾＞

【0216】

Ｆｃドメインは、好適な組職－血液分布の比率及び標的組職で優れた蓄積に寄与する長い血清半減期を含む好適な薬物動力学的特性（ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）を抗体または二重特異性抗体に付与する。しかし、同時に抗体または二重特異性抗体が望ましい抗原保有細胞よりはＦｃ受容体を発現する細胞を標的化するという望ましくない結果をもたらすことができる。さらに、Ｆｃ受容体信号伝逹経路の共活性化は、サイトカイン放出を誘導することができ、これはＴ細胞活性化特性（例えば、第２の抗原結合部分が活性化Ｔ細胞抗原に結合する二重特異性抗体の実施様態における）及び抗体または二重特異性抗体の長い半減期と組み合わせて、全身投与時にサイトカイン受容体の過度な活性化及び深刻な副作用をもたらす恐れがある。Ｔ細胞以外の（Ｆｃ受容体保有）免疫細胞の活性化は、Ｔ細胞、例えばＮＫ細胞による潜在的破壊によって二重特異性抗体（具体的に第２の抗原結合部分が活性化Ｔ細胞抗原に結合する二重特異性抗体）の効能を減少させることができる。

【0217】

したがって、特定の実施様態において、本発明による抗体または二重特異性抗体のＦｃドメインは、天然 ＩｇＧ_１Ｆｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の減少及び／またはエフェクター機能の減少を示すことができる。このような一実施様態で、Ｆｃドメイン（または前記Ｆｃドメインを含む抗体または二重特異性抗体）は、天然ＩｇＧ_１Ｆｃドメイン（または天然ＩｇＧ１Ｆｃドメインを含む抗体または二重特異性抗体）と比較してＦｃ受容体に対する結合親和性の５０％未満、望ましくは２０％未満、より望ましくは１０％未満、最も望ましくは５％未満、及び／または天然ＩｇＧ_１Ｆｃドメイン（または天然ＩｇＧ_１Ｆｃドメインを含む抗体または二重特異性抗体）と比較してエフェクター機能の５０％未満、望ましくは２０％未満、より望ましくは１０％未満、最も望ましくは５％未満を示す。一実施形態において、Ｆｃドメイン（または前記Ｆｃドメインを含む抗体または二重特異性抗体）は、Ｆｃ受容体に実質的に結合せずに、及び／またはエフェクター機能を誘導しない。特定の一実施形態で、Ｆｃ受容体はＦｃγ受容体である。一実施形態で、Ｆｃ受容体はヒトＦｃ受容体であってもよい。一実施形態で、Ｆｃ受容体は活性化Ｆｃ受容体であることができる。特定の一実施形態で、Ｆｃ受容体は活性化ヒトＦｃγ受容体、より具体的に、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩまたはＦｃγＲＩＩａ、最も具体的に、ヒトＦｃγＲＩＩＩａであってもよい。一実施様態で、エフェクター機能はＣＤＣ、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ及びサイトカイン分泌の群から選択される一つ以上であってもよい。特定の一実施形態において、エフェクター機能はＡＤＣＣであることができる。一実施様態で、Ｆｃドメインは天然ＩｇＧ１Ｆｃドメインと比較して、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対して実質的に類似の結合親和性を示すことができる。ＦｃＲｎに対して実質的に類似した結合は、Ｆｃドメイン（または前記Ｆｃドメインを含む抗体または二重特異性抗体）がＦｃＲｎに対する天然ＩｇＧ１Ｆｃドメイン（または天然ＩｇＧ_１Ｆｃドメインを含む抗体または二重特異性抗体）の結合親和性の約７０％超、具体的に約８０％超、より具体的に約９０％超を示す場合に達成される。

【0218】

所定の実施様態で、Ｆｃドメインは非操作されたＦｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性が減少され、及び／またはエフェクター機能が減少されるように操作されることができる。特定の実施様態で、抗体または二重特異性抗体のＦｃドメインは、Ｆｃ受容体に対するＦｃドメインの結合親和性及び／またはエフェクター機能を減少させる一つ以上のアミノ酸変異を含むことができる。典型的に、同一の一つ以上のアミノ酸変異がＦｃドメインの２つのサブユニットそれぞれに存在する。一実施形態で、アミノ酸変異はＦｃ受容体に対するＦｃドメインの結合親和性を減少させることができる。一実施形態で、アミノ酸変異はＦｃ受容体に対するＦｃドメインの結合親和性を少なくとも２倍、少なくとも５倍、または少なくとも１０倍位減少させることができる。Ｆｃ受容体に対するＦｃドメインの結合親和性を減少させる一つ超のアミノ酸変異が存在する実施様態において、これらの組み合わせは、Ｆｃ受容体に対するＦｃドメインの結合親和性を少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、ひいては少なくとも５０倍分だけ減少させることができる。一実施形態において、操作されたＦｃドメインを含む抗体または二重特異性抗体は、非操作されたＦｃドメインを含む抗体または二重特異性抗体と比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の２０％未満、具体的に１０％未満、より具体的に５％未満を示す。特定の一実施形態で、Ｆｃ受容体はＦｃγ受容体であることができる。幾つかの実施形態において、Ｆｃ受容体はヒトＦｃ受容体であることができる。

【0219】

幾つかの実施形態において、Ｆｃ受容体は活性化Ｆｃ受容体であってもよい。特定の一実施形態で、Ｆｃ受容体は活性化ヒトＦｃγ受容体、より具体的に、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩまたはＦｃγＲＩＩａ、最も具体的に、ヒトＦｃγＲＩＩＩａであってもよい。望ましくは、これらの受容体のそれぞれに対する結合が減少される。幾つかの実施形態において、補体成分に対する結合親和性、特にＣ１ｑに対する結合親和性も減少される。一実施形態で、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する結合親和性は減少されない。ＦｃＲｎに対する実質的に類似した結合、すなわちＦｃドメインの前記受容体に対する結合親和性の保存は、Ｆｃドメイン（または前記Ｆｃドメインを含む抗体または二重特異性抗体）がＦｃＲｎに対するＦｃドメインの非操作された形態（またはＦｃドメインの非操作された形態を含む抗体または二重特異性抗体）の結合親和性の約７０％超を示す場合に達成される。Ｆｃドメイン、または前記Ｆｃドメインを含む本発明の二重特異性抗体は、このような親和性の約８０％超、ひいては約９０％超を示すことができる。所定の実施様態で、二重特異性抗体のＦｃドメインは、非操作されたＦｃドメインと比較して、エフェクター機能が減少されるように操作されることができる。エフェクター機能の減少は、下記のいずれか一つ以上を含むことができるが、これに限定されない：補体依存的細胞傷害（ＣＤＣ）の低減、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の減少、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）の減少、サイトカイン分泌の減少、抗原提示細胞によるイムノコンジュゲート媒介抗原吸収の減少、ＮＫ細胞への結合の低減、マクロファージへの結合の低減、単核球への結合の低減、多形核細胞（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌｓ）への結合の低減、アポトーシスを誘導する直接信号伝逹の減少、標的結合された抗体の架橋の低減、樹状細胞成熟の減少、またはＴ細胞プライミングの減少。一実施形態において、エフェクター機能の減少は、ＣＤＣ減少、ＡＤＣＣ減少、ＡＤＣＰ減少、及びサイトカイン分泌減少の群から選択されるいずれか一つ以上であることができる。特定の一実施形態において、エフェクター機能の減少はＡＤＣＣ減少であってもよい。一実施形態で、ＡＤＣＣ減少は、非操作されたＦｃドメイン（または非操作されたＦｃドメインを含む二重特異性抗体）によって誘導されたＡＤＣＣの２０％未満であることができる。

【0220】

一実施形態において、Ｆｃ受容体に対するＦｃドメインの結合親和性及び／またはエフェクター機能を減少させるアミノ酸の変異はアミノ酸置換であることができる。一実施形態で、Ｆｃドメインは、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７、Ｐ３３１及びＰ３２９（Ｋａｂａｔ ＥＵ ｉｎｄｅｘに従う番号付け）の群から選択された位置にアミノ酸置換を含むことができる。より具体的な実施様態において、追加のアミノ酸置換は、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７ＤまたはＰ３３１Ｓ、望ましくはＬ２３４Ａまたは／及びＬ２３５Ａであることができる。

【0221】

＜組成物、製剤及び投与経路＞

【0222】

追加の一態様で、本発明は、例えば下記治療方法のいずれか一つに用いるための、任意の抗体または二重特異性抗体を含む医薬組成物を提供する。一実施形態で、医薬組成物は、本願に提供された任意の抗体または二重特異性抗体及び薬学的に許容可能な担体を含む。他の実施様態において、医薬組成物は、本願により提供された任意の抗体または二重特異性抗体及び、例えば下記記載のような少なくとも一つの追加の治療薬を含む。

【0223】

また、ｉｎ ｖｉｖｏ投与に適する形態で本発明の抗体または二重特異性抗体を生産する方法を提供し、前記方法は、（ａ）本発明による抗体または二重特異性抗体を得る段階と、（ｂ）抗体または二重特異性抗体を少なくとも一つの薬学的に許容可能な担体と製剤化し、これによって、抗体または二重特異性抗体の製剤をｉｎ ｖｉｖｏ投与のために製剤化する段階とを含む。

【0224】

本発明の医薬組成物は、薬学的に許容可能な担体に溶解されるか、または分散した抗体または二重特異性抗体を治療的に有効な量で含む。文言「薬学的にまたは薬理学的に許容可能な（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｏｒｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ）」は、使われた投与量及び濃度で受容者に通常無毒性である、すなわち動物、仮に、例えば好ましくは、ヒトに投与される場合、有害、アレルギーまたは他の不利な反応を起こさない分子実体（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｎｔｉｔｉｅｓ）及び組成物をいう。抗体または二重特異性抗体及び選択的に追加活性成分を含む医薬組成物の製造は、本願に参照により組み込まれたＲｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１８ｔｈ Ｅｄ． Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９０に例示されているように、本開示内容に照らして当業者に知られている。さらに、動物（例えば、ヒト）に投与する場合、製剤はＦＤＡ Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄｓまたは他の国の当該政府で要求する無菌性、発熱性、一般安全性及び純度標準を満たさなければならないということを理解できろう。望ましい組成物は、凍結乾燥製剤または水溶液である。本願で使われた、「薬学的に許容可能な担体」は、任意及びすべての溶媒、緩衝剤、分散媒質、コーティング剤、界面活性剤、抗酸化剤、保存剤（例：抗バックテリア剤、航真菌剤）、等張化剤、吸収遅延剤、塩、保存剤、抗酸化剤、タンパク質、薬物、薬物安定化剤、ポリマー、ゲル、結合剤、賦形剤、崩壊剤、滑剤、甘味剤、風味剤、染料、例えば当業者に知られた物質及びその組み合わせ（例えば、本願に参照により組み込まれたＲｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１８ｔｈ Ｅｄ． Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０，ｐｐ．１２８９－１３２９参照）を含む。任意の既存の担体が活性成分に不向きな場合を除き、治療または医薬組成物でその使用が考慮される。

【0225】

本発明の抗体または二重特異性抗体（及び任意の追加の治療薬）は、非経口、肺内及び鼻腔内を含む任意の適切な手段によって投与することができ、局所治療を目的とする場合には病巣内投与することができる。非経口注入としては、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内または皮下投与を含む。投薬（ｄｏｓｉｎｇ）は、投与が短期または湾性であるかどうかに部分的に依存する、任意の適切な経路、例えば注射、例えば静脈内または皮下注射で行うことができる。

【0226】

非経口組成物には、注射、例えば皮下、皮内、病巣内、静脈内、動脈内、筋肉内、脊髄腔内または腹腔内注射による投与のために設計されたものを含む。注射の場合、本発明の抗体または二重特異性抗体は、水溶液、望ましくは、生理学的に適合な緩衝剤、例えばＨａｎｋｓ溶液、Ｒｉｎｇｅｒ溶液、または生理食塩水緩衝液で製剤化することができる。溶液は、製剤化剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｏｒｙ ａｇｅｎｔｓ）、例えば懸濁化剤、安定化剤及び／または分散化剤を含むことができる。代案的に、抗体または二重特異性抗体は、使用前に、好適なビヒクル、例えば無発熱原性の滅菌水で構成するための粉末形態であることができる。滅菌注射用溶液は、必要に応じて下記に挙げられた多様な他の成分と一緒に適切な溶媒中に本発明の抗体または二重特異性抗体を必要な量で混入させて製造する。滅菌は、例えば滅菌ろ過膜によるろ過によって容易に達成できる。一般に、分散液は、多様な滅菌活性成分を塩基性分散媒質及び／または他の成分を含む滅菌ビヒクルに混入して製造する。滅菌注射用溶液、懸濁液またはエマルジョンの製造のための滅菌粉末の場合、望ましい製造方法としては、真空乾燥または凍結乾燥技術で、既に滅菌ろ過済みの液体媒質からの任意の更なる目的する成分と活性成分の粉末を得る。液体媒質は、必要な場合適宜緩衝させて、液体希釈剤は、まず十分な食塩水またはグルコースで等張性にした後に注射しなければならない。組成物は、製造及び保管条件の下に安定していなければならなく、微生物、例えばバクテリア及び真菌の汚染作用に対して保存しなければならない。エンドトキシン汚染は、安全な水準、例えばタンパク質を０．５ｎｇ／ｍｇ未満で、最小限に維持しなければならないということを理解できろう。好適な薬学的に許容可能な担体には、緩衝剤、例えばリン酸、クエン酸、及び他の有機酸；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；保存剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えばメチルまたはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；及びｍ－クレゾール）；低分子量（約１０個未満の残基）ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、または兔疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジン；グルコース、マンノースまたはデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；キレート剤、例えばＥＤＴＡ；糖、例えばスクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトール；塩形成カウンターイオン、例えばナトリウム；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）；及び／または非イオン性界面活性剤、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含むが、これに限定されない。水性注射懸濁液は、懸濁液の粘度を増加させる化合物、例えばカルボキシルメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、デキストランなどを含むことができる。また、任意に、懸濁液は、適合な安定化剤または高濃縮溶液を製造できるように化合物の溶解度を増加させる活性剤を含むことができる。さらに、活性化合物の懸濁液は、適切な油性注射懸濁液として製造することができる。好適な親油性溶媒またはビヒクルには、脂肪油（ｆａｔｔｙ ｏｉｌｓ）、例えば胡麻油、または合成脂肪酸エステル、例えばエチルクリート（ｅｔｈｙｌ ｃｌｅａｔｓ）またはトリグリセリド、またはリポソームを含む。本発明の抗体または二重特異性抗体を含む医薬組成物は、従来の混合、溶解、乳化、カプセル化、捕獲または凍結乾燥工程によって製造することができる。医薬組成物は、タンパク質を薬学的に使用可能な製剤に加工することを促進する一つ以上の生理学的に許容可能な担体、希釈剤、賦形剤または助剤を用いてっ従来の方式で製剤化できる。適切な製剤は、選択した投与経路によって変わる。

【0227】

＜治療方法及び組成物＞

【0228】

本願に提供された任意の抗体または二重特異性抗体を治療方法に用いることができる。本発明の抗体または二重特異性抗体は、例えば癌治療において兔疫療法剤として用いることができる。

【0229】

治療方法に用いる場合、本発明の抗体または二重特異性抗体は、優れた医療行為と一致する方式で製剤化、投薬、投与される。このような脈絡で考慮すべき要因には、治療すべき特定の障害、治療すべき特定の哺乳動物、個別患者の臨床病態、障害原因、薬剤の伝達部位、投与方法、投与日程、及び医者に知られたその他の要因を含む。

【0230】

一態様で、薬剤（ｍｅｄｉｃａｍｅｎｔ）として用いるための本発明の抗体または二重特異性抗体を提供する。追加の態様において、疾病治療に用いるための本発明の抗体または二重特異性抗体を提供する。所定の実施様態で、治療方法に用いるための本発明の抗体または二重特異性抗体を提供する。

【0231】

一実施形態で、本発明は疾病の治療が必要な個体で疾病治療に用いるための本願に記載の抗体または二重特異性抗体を提供する。所定の実施様態で、本発明は、治療的に有効な量の抗体または二重特異性抗体を個体に投与する段階を含む、疾病を有する個体を治療する方法に用いるための抗体または二重特異性抗体を提供する。一実施形態で、疾病は癌であってもよい。所定の実施様態において、前記方法は、治療的に有効な量の少なくとも一つの追加の治療薬、例えば治療する疾病が癌の場合に抗癌剤を個体に投与する段階をさらに含む。追加の実施様態において、本発明は標的細胞、具体的に腫瘍細胞の溶解を誘導するのに用いるための本願に記載の抗体または二重特異性抗体を提供する。所定の実施様態で、本発明は個体に有効量の抗体または二重特異性抗体を投与して標的細胞の溶解を誘導する段階を含む、個体で標的細胞、具体的に腫瘍細胞の溶解を誘導する方法に用いるための抗体または二重特異性抗体を提供する。任意の前記実施様態による「個体（ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ）」は、哺乳動物、望ましくはヒトである。

【0232】

一実施形態で、治療すべき疾病は癌であることができる。

【0233】

一実施形態で、癌は固形癌または血液癌であることができる。

【0234】

一実施形態で、癌は、白血病、直腸癌、子宮内膜癌、腎芽腫、基底細胞癌、上咽頭癌、骨腫瘍、食道癌、リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、甲状腺濾胞癌、肝細胞癌、口腔癌、腎細胞癌、多発性骨髄腫、中皮腫、骨肉腫、骨髄異形成症候群、間葉系腫瘍、軟部肉腫、脂肪肉腫、消化管間質腫瘍、悪性末梢神経鞘腫瘍（ＭＰＮＳＴ）、ユーイング肉腫、平滑筋肉腫、間葉系軟骨肉腫、リンパ肉腫、線維肉腫、横紋筋肉腫、奇形腫、神経芽腫、髄芽腫、神経膠腫、良性皮膚腫瘍、バーキットリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、神経外胚葉性腫瘍、上皮腫瘍、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）、末梢性Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）、膵臓癌、造血器悪性腫瘍、腎臓癌、腫瘍血管系、乳癌、腎臓癌、卵巣癌、上皮性卵巣癌、胃癌、肝臓癌、肺癌、大腸癌、膵臓癌、皮膚癌、膀胱癌、精巣腫瘍、子宮癌、前立腺癌、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、神経芽細胞腫、脳癌、結腸癌、扁平上皮癌、黒色腫、骨髄腫、子宮頸癌、甲状腺癌、頭頸部癌、副腎癌からなる群から選択され得る。

【0235】

一実施形態で、白血病は、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、有毛細胞白血病、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）および急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）からなる群から選択され、好ましくは、ＡＭＬであることができる。

【0236】

一実施形態で、癌はＣＬＬ－１を発現する癌であることができる。

【0237】

当業者は、多くの場合に抗体または二重特異性抗体が治癒を提供しないが、単に部分的な有益のみを提供することができるということを容易に認識する。幾つかの実施形態において、一部の有益を持つ生理的変化も治療的に有益なものと見なされる。よって、幾つかの実施形態において、生理学的変化を提供する抗体または二重特異性抗体の量は「有効量」または「治療的に有効な量」と見なされる。治療が必要な被験体、患者または個体は典型的に哺乳動物、より具体的にヒトである。

【0238】

幾つかの実施形態において、本発明の抗体または二重特異性抗体の有効量を細胞に投与する。他の実施様態で、本発明の抗体または二重特異性抗体の治療的に有効な量を疾病治療のために個体に投与する。

【0239】

疾病の予防または治療のために、本発明の抗体または二重特異性抗体の適切な投与量（単独で用いられるか、または一つ以上の他の更なる治療薬と併用される場合）は、治療すべき疾病のタイプ、投与経路、患者の体重、抗体または二重特異性抗体のタイプ、疾病の重症度及び経過、抗体または二重特異性抗体が予防または治療の目的で投与されるかどうか、以前または同時治療介入、患者の臨床病歴、及び抗体または二重特異性抗体に対する反応、及び主治医の裁量に依存する。投与を担当する医師は、如何なる場合でも個別被験体に対する組成物内の活性成分（複数可）の濃度及び適切な用量（複数可）を決める。単一または多様な時点にかけた多重投与、ボーラス投与（ｂｏｌｕｓ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）、及びパルス注入（ｐｕｌｓｅ ｉｎｆｕｓｉｏｎ）を含むが、これらに限定されない多様な投薬日程が本願で考慮される。

【0240】

抗体または二重特異性抗体は、患者に一回または一連の治療にかけて適宜投与される。疾病のタイプ及び重症度によって、約１ｎｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇの抗体または二重特異性抗体を患者に投与することができる。

【0241】

以下、本開示内容を、実施例により詳しく説明する。

【0242】

下記実施例は、単に本開示内容を例示するためのものであり、本開示内容を限定するものと解釈されてはならない。

【0243】

＜実施例１：抗ＣＬＬ－１抗体の製造＞

【0244】

＜１．１．マウス免疫化によるモノクローナル抗体スクリーニング＞

【0245】

抗ＣＬＬ－１抗体を製造するために、マウス免疫化を行うことでモノクローナル抗体をスクリーニングした。

【0246】

簡略に、２つのマウス群（ＳＪＬ及びＢａｌｂ／ｃマウス、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ、ＣＡ）をヒト及びカニクイザルＣＬＬ１とＮ末端ヒトＩｇＧ１Ｆｃ融合タンパク質を混合して免疫化した（マウスは自体生産したし、抗原のアミノ酸配列は表４に示した）。
ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）スクリーニング及びＦＡＣＳ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ）分析を通じて、３つのハイブリドーマクローンをヒト及びカニクイザルＣＬＬ１交差反応性クローンでスクリーニングした。３つのクローンは免疫化されたＢａｌｂ／ｃマウス群由来の１６Ｃ６、３３Ｃ２及び８４Ａ２であった。また、すべてのクローンは、ＣＬＬ１発現細胞株（Ｕ９３７、ＨＬ６０）及びＣＬＬ－１を過発現する細胞株（カニクイザルＣＬＬ１及びヒトＣＬＬ１がＨＥＫ２９３Ｅ細胞で過発現される）に陽性に結合した。

【0247】

【0248】

＜１．２．ハイブリドーマ細胞からのモノクローナル抗体の配列分析及び抗体のキメラ化＞

【0249】

実施例１．１．で免疫化されたＢａｌｂ／ｃマウス群から１６Ｃ６、３３Ｃ２及び８４Ａ２を配列分析するために、ハイブリドーマ細胞からモノクローナル抗体を配列分析した。

【0250】

簡略に、ネズミ科（ｍｕｒｉｎｅ）の１６Ｃ６、３３Ｃ２及び８４Ａ２の全ＲＮＡをＴｒｉｚｏｌ試薬（Ａｍｂｉｏｎ社製、Ｃａｔ．Ｎｏ．：１５５９６－０２６）の技術マニュアルに従ってハイブリドーマ細胞から単離した。それからアイソタイプの特異的アンチセンスプライマーまたは汎用プライマーを用いてＲＴ－ＰＣＲを通じて全ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写させた。ＶＨ（可変重鎖）及びＶＬ（可変軽鎖）の抗体断片をｃＤＮＡ末端の迅速増幅（ｒａｐｉｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ ｅｎｄｓ：ＲＡＣＥ）法を用いて増幅させた。増幅された抗体断片をクローニングベクター（ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒｓ）でクローニングした後、配列分析を行った。３つのＣＬＬ１陽性クローンの可変領域及びＣＤＲを表５、表６及び表７に示す。表において、ＨＣＤＲは重鎖のＣＤＲであり、ＬＣＤＲは軽鎖のＣＤＲである。

【0251】

【0252】

【0253】

【0254】

キメラ抗体を生成するために、ネズミ科抗体のＶＨ及びＶＬをヒトＩｇＧ１重鎖定常領域及びヒトカッパ軽鎖定常領域とそれぞれ組み合わせて、発現ベクターにクローニングした。キメラ抗体の定常領域は、ヒトＩｇＧ１に一つを超える突然変異または変更（例えばＡＤＣＣ活性が存在しないＮ２９７Ａ（また「ＮＡ」という））を導入して修飾した。その後、部位特異的突然変異誘発を用いてＮ－グリコシル化残基または翻訳後修飾（ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ＰＴＭ）を除去するために３つクローンの３つの修飾されたキメラ抗体をさらに修飾した。前述の１６Ｃ６、３３Ｃ２及び８４Ａ２の修飾された配列を表８、表９及び表１０に示す。以下、ｃｈ１６Ｃ６は、Ｎ２９７Ａ突然変異体を有する重鎖を含む１６Ｃ６または１６Ｃ６（ＮＡ）のキメラ抗体を意味し、ｃｈ３３Ｃ２は、Ｎ２９７Ａ突然変異体を有する重鎖を含む３３Ｃ２または３３Ｃ２（ＮＡ）のキメラ抗体を意味し、ｃｈ８４Ｃ２は、Ｎ２９７Ａ突然変異体を有する重鎖及びＮ１２Ｓ突然変異体を有する軽鎖を含む８４Ｃ２またはｃｈ８４Ａ２（ＮＡ／Ｎ１２Ｓ）のキメラ抗体を意味する。

【0255】

【0256】

【0257】

【0258】

＜１．３．抗体ヒト化＞

【0259】

実施例１．２．のキメラ抗体をヒト化するため、相同性モデリング（ｈｏｍｏｌｏｇｙｍｏｄｅｌｉｎｇ）を行った。

【0260】

簡略に、相同性モデリングを通じて、ネズミ科抗体のモデリングされた構造が得られ、逆突然変異（ｂａｃｋ ｍｕｔａｔｉｏｎ）に必要な残基を分析した。マウスカウンターパートと最大配列同一性を有するＶＨ及びＶＬに対するヒト受容体フレームワークを選択した。その次に、ネズミ科抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）をヒト受容体フレームワークに移植した。次に、移植された抗体の合理的な逆突然弁の設計を行った。設計されたヒト化抗体を生産し、これらの結合特性を評価した。マウス及びキメラ化クローンの中で、１６Ｃ６及び３３Ｃ２をリード候補抗体として選択した。特に、キメラ抗体のＣＤＲを持つヒト化抗体（すなわち、更なる修飾によってＰＴＭまたはＮ－グリコシル化残基が除去される）を１６Ｃ６（Ｍ１４）及び３３Ｃ２（Ｍ１２）と命名する。１６Ｃ６、１６Ｃ６（Ｍ１４）、３３Ｃ２及び３３Ｃ２（Ｍ１２）のヒト化重鎖及び軽鎖の配列を表１１～１４に示す。以下、ｈｕ１６Ｃ６及びｈｕ１６Ｃ６（Ｍ１４）は、それぞれ１６Ｃ６及び１６Ｃ６（Ｍ１４）のヒト化抗体を意味し、ｈｕ３３Ｃ２及び３３Ｃ２（Ｍ１２）は、それぞれ３３Ｃ２及び３３Ｃ２（Ｍ１２）のヒト化抗体を意味する。

【0261】

【0262】

【0263】

【0264】

【0265】

＜実施例２．抗ＣＬＬ－１単一特異性抗体の活性評価＞

【0266】

＜２．１．リガンド結合活性試験（ＥＬＩＳＡ）＞

【0267】

実施例１．２．の抗体候補物質は、ｈｕＣＬＬ１－Ｈｉｓ及びｈＦｃ－ｈｕＣＬＬ１をリガンドとして用いてＥＬＩＳＡでリガンド結合活性を比較する分析を行った。

【0268】

簡略に、抗原（リガンド）を４℃で一晩コーティングした。抗原がコーティングされたプレートをＰＢＳに溶解された１％ＢＳＡで４℃で２時間の間遮断し、抗体と４℃で２時間の間培養した。各抗体のＥＣ５０（ｎＭ）を調べるため、抗体溶液を４倍連続希釈で５０ｎＭ～０．２ｐＭの濃度で製造し、希釈された抗体を各ウェルに対して処理して、前記プレートを１ＸＰＢＳＴで洗浄した。それからＨＲＰ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）（Ｔｈｅｒｍｏ社製、３１４１４）と接合された塩素抗ヒトＩｇＧＦ（ａｂ'）_２交差吸着された２次抗体を各ウェルに添加し、４℃で１時間の間培養した。洗浄後に、ＴＭＢ（３，３'，５，５'－テトラメチルベンジジン）基質（Ｓｉｇｍａ社製、Ｔ０４４０）を各ウェルに添加して、４５０ｎｍでＯＤをＥＬＩＳＡプレートリーダー（ＥＬＩＳＡ ｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ）で測定した。その結果は図１及び図２に示す。

【0269】

図１は、ｈｕＣＬＬ１－Ｈｉｓをリガンドとして用いる一実施形態による３つのキメラ抗体のリガンド結合活性を示すグラフである。

【0270】

図２は、ｈＦｃ－ｈｕＣＬＬ１をリガンドとして用いる一実施形態による３つのキメラ抗体のリガンド結合活性を示すグラフである。

【0271】

図１及び図２に示したように、一実施形態による３つのキメラ抗体のいずれもヒトＣＬＬ１－Ｈｉｓ及びｈＦｃ－ヒトＣＬＬ１抗原のいずれも強く結合したことを確認した。

【0272】

続いて、実施例１．２．の抗体候補物質は、前述した方式と同様な方式でｈＦｃ－カニクイザルＣＬＬ１５０ｎｇ／ｗｅｌｌ及び１００ｎｇ／ｗｅｌｌをリガンドとして用いてＥＬＩＳＡでリガンド結合活性を比較する分析を行った。Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社製の抗ＣＬＬ－１抗体６Ｅ７を参照として用いた。その結果は図３及び図４に示す。

【0273】

図３は、ｈＦｃ－カニクイザルＣＬＬ１５０ｎｇ／ｗｅｌｌをリガンドとして用いる一実施形態による３つのキメラ抗体のリガンド結合活性を示すグラフである。

【0274】

図４は、ｈＦｃ－カニクイザルＣＬＬ１１００ｎｇ／ｗｅｌｌをリガンドとして用いる一実施形態による３つのキメラ抗体のリガンド結合活性を示すグラフである。

【0275】

図３及び図４に示したように、一実施形態による３つのキメラ抗体皆は抗原濃度に関係なくｈＦｃ－カニクイザルＣＬＬ１に強く結合したことを確認した。また、一実施形態による３つのキメラ抗体のいずれもＧｅｎｅｎｔｅｃｈ社製の抗体６Ｅ７よりも強いリガンド結合活性を有することを確認した。

【0276】

実施例１．２．のキメラ抗体及び実施例１．３．のヒト化抗体のリガンド結合活性を前述したものと同様な方式で比較した。その結果は、図５、６及び７に示す。

【0277】

図５は、一実施形態によるキメラ抗体及びヒト化抗体ｈｕ１６Ｃ６のリガンド結合活性を示すグラフである。

【0278】

図６は、一実施形態によるキメラ抗体及びヒト化抗体ｈｕ３３Ｃ２のリガンド結合活性を示すグラフである。

【0279】

図７は、一実施形態による多様なヒト化抗体ｈｕ３３Ｃ２のリガンド結合活性を示すグラフである。

【0280】

図５～図７に示したように、一実施形態によるヒト化抗体は、一実施形態によるキメラ抗体の結合親和性と同等な結合親和性を示す。ネズミ科またはキメラ抗体のヒト化は、通常結合親和性を減少させるか、または結合親和性さえも損失するから、このような結果は一実施形態によるヒト化抗体が有利であるということを立証した。

【0281】

＜２．２．細胞結合活性テスト（ＦＡＣＳ）＞

【0282】

細胞結合特性を評価するために、実施例１．２．のキメラ抗体候補物質を、ＦＡＣＳを用いてＣＬＬ１陰性細胞（ＨＥＫ２９３Ｅ及びＪｕｒｋａｔ）及び多様なＣＬＬ１発現癌細胞で分析した。

【0283】

簡略に、細胞を抗体と４℃で１時間の間培養した。まず、細胞を分析緩衝液（ＰＢＳの中で１％ＢＳＡ）で洗浄した。次に、ＦＩＴＣ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）（Ｓｉｇｍａ社製、Ｆ９５１２）と接合された抗ヒトＩｇＧＦｃを各ウェルに添加し、４℃で１時間の間培養した。洗浄後、ＦＩＴＣのＭＦＩ（Ｍｅｄｉａｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）をＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）で測定した。その結果は表１５及び図８に示す。

【0284】

【0285】

図８は、ＣＬＬ１陰性細胞及び多様なＣＬＬ１発現癌細胞における一実施形態によるキメラ抗体の細胞結合活性を示すグラフである。
表１５及び図８に示したように、一実施形態による全てのキメラ抗体は、多様なＣＬＬ１発現細胞株で結合力（ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｏｔｅｎｃｙ）を有することを確認した。

【0286】

続いて、実施例１．２．の３つのキメラ抗体の細胞結合特性をＣＬＬ１発現腫瘍細胞株であるＨＬ６０及びＵ９３７で、前述したものと同様な方式でＦＡＣＳを用いて評価した。その結果は図９及び１０に示す。

【0287】

図９は、ＨＬ６０で一実施形態によるキメラ抗体の細胞結合活性を示すグラフである。

【0288】

図１０は、Ｕ９３７で一実施形態によるキメラ抗体の細胞結合活性を示すグラフである。

【0289】

図９及び図１０に示したように、一実施形態による全てのキメラ抗体は白血病細胞株で結合能を有し、特にｃｈ１６Ｃ６及びｃｈ３３Ｃ２クローンが優れた結合能を有することを確認した。

【0290】

続いて、実施例１．２．の３つのキメラ抗体の細胞結合特性を前述したものと同様な方式でＦＡＣＳを用いてＣｙｎｏＣＬＬ１＿ＨＥＫ２９３Ｅで評価した。Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社製の抗ＣＬＬ－１抗体６Ｅ７を参照として用いた。その結果は図１１に示す。

【0291】

図１１は、カニクイザルＣＬＬ－１を過発現するＨＥＫ２９３Ｅにおける一実施形態によるキメラ抗体の細胞結合活性を示すグラフである。

【0292】

図１１に示したように、一実施形態による全てのキメラ抗体は、カニクイザルＣＬＬ－１を過発現するＨＥＫ２９３Ｅで６Ｅ７よりも高い結合能を有することを確認した。また、一実施形態による３つのキメラ抗体は、いずれもＧｅｎｅｎｔｅｃｈ社製の抗体である６Ｅ７よりも高い細胞結合活性を有することを確認した。

【0293】

実施例１．２．のキメラ抗体及び実施例１．３．のヒト化候補物質の抗原結合特性を比較するために、抗体を前述したものと同様な方式でＰＬ２１細胞株を用いて分析した。その結果は図１２及び図１３に示す。

【0294】

図１２は、一実施形態によるキメラ抗体及び多様なヒト化抗体ｈｕ３３Ｃ２の細胞結合活性を示すグラフである。

【0295】

図１３は、一実施形態によるキメラ抗体及び多様なヒト化抗体ｈｕ１６Ｃ６の細胞結合活性を示すグラフである。

【0296】

図１２及び図１３に示したように、一実施形態によるヒト化抗体は、一実施形態によるキメラ抗体の細胞結合活性と同等な細胞結合活性を示した。

【0297】

＜２．３．抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の評価＞

【0298】

エフェクター媒介免疫による腫瘍細胞死滅における一実施形態による抗ＣＬＬ－１抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ活性を評価するために、ＡＤＣＣリポーター生物分析キット（ＡＤＣＣ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｂｉｏａｓｓａｙ ｋｉｔ）（Ｐｒｏｍｅｇａ社製、Ｇ７１０２）を用いた。

【0299】

簡略に、標的細胞（ＨＥＫ２９３－ｈｕＣＬＬ－１、ＨＥＫ２９３、これは外因性ヒトＣＬＬ－１を発現する細胞株である）を実験当日に分析緩衝液（０．５％低いＩｇＧＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０）中に９６ウェル平面白色ボトムプレートにプレーティングした。その後、抗体の一連の希釈物を前記プレートに添加した。ＡＤＣＣエフェクター細胞を各ウェルに添加し、プレートをＣＯ２インキュベーターで３７℃で６時間の間培養した。培養後に、プレートを室温で約１０分間静置させた後に、Ｂｉｏ－Ｇｌｏルシフェラーゼ分析試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ社製、Ｇ７９４０）を各ウェルに添加した。ＡＤＣＣ誘導程度を分析するためにＰＨＥＲＡｓｔｅｒ ＦＳ ＢＭＧ ＬＡＢＴＥＣＨで発光程度を測定した。用量－反応曲線（ｄｏｓｅ－ｒｅｓｐｏｎｓｅｃｕｒｖｅ）は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８を用いて４－パラメーターモデルでフィッティングした。その結果は図１４に示す。

【0300】

図１４は、一実施形態によるｃｈ８４Ａ２、ｈｕ１６Ｃ６及びｈｕ３３Ｃ２のＡＤＣＣを示すグラフである。

【0301】

図１４に示したように、一実施形態による抗体ｈｕ１６Ｃ６（ＶＨ１／ＶＬ１（Ｍ１４））、ｈｕ３３Ｃ２（ＶＨ３／ＶＬ６（Ｍ１２））、ｃｈ８４Ａ２（Ｎ１２Ｓ）はエフェクター細胞によってＡＤＣＣを誘導することを確認した。また、ｈｕ１６Ｃ６（ＶＨ１／ＶＬ１（Ｍ１４））、ｈｕ３３Ｃ２（ＶＨ３／ＶＬ６（Ｍ１２））、ｃｈ８４Ａ２（Ｎ１２Ｓ）のＥＣ５０は、それぞれ１３０．１ｐＭ、１４０．５ｐＭ、及び４１６．５ｐＭであった。

【0302】

＜２．４．ＡＤＣ（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｄｒｕｇ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）の細胞傷害活性の評価＞

【0303】

実施例１．２．のキメラ抗体を含むＡＤＣの細胞傷害を評価するために、前記キメラ抗体を用いて多様なＡＤＣを製造し、その細胞増殖抑制活性を分析した。

【0304】

簡略に、既存の抗体軽鎖の２０５位でのバリン（Ｖ）（Ｋａｂａｔ番号付けに従い、かつ、これは下記にも適用される）をシステイン（Ｃ）に突然変異させ、還元剤、例えばジチオトレイトール（ＤＴＴ）と反応させて抗体軽鎖Ｖ２０５Ｃ上にチオール基を生成し（Ｖ２０５ＣＴ）、チオール基と薬物との間に生成されたチオエーテル結合によって抗体を薬物と接合させた。以下、各キメラ抗体に対して製造された３つのＡＤＳを、「ｃｈ１６Ｃ６（Ｖ２０５Ｃ）－Ｔ－ＡＢ００９」、「ｃｈ３３Ｃ２（Ｖ２０５Ｃ）－Ｔ－ＡＢ００９」、「ｃｈ８４Ａ２（Ｖ２０５Ｃ）－Ｔ－ＡＢ００９」と指称した。また、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社製の抗ＣＬＬ－１抗体６Ｅ７を参照として用い、同様な方式で６Ｅ７のＡＤＣを製造した（以下、「６Ｅ７（Ｎ５４Ａ／Ｖ２０５Ｃ）－Ｔ－ＡＢ００９」と呼ぶ）。

【0305】

その後、前記製造されたＡＤＣの癌細胞増殖抑制活性を商業的に利用可能な癌細胞株（ＥＯＬ－１、ＴＨＰ－１細胞株（ＡＴＣＣ））を用いて測定した。９６－ウェルプレートで、各ウェルに各癌細胞株５０００個の細胞を分取した。２４時間の間培養した後、これらを表１６に示したように５～１０００００ｐＭ濃度（３倍連続希釈）のＡＤＣで処理した。６日後に、ＷＳＴ－８（Ｄｏｊｉｎｄｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．社製）染料を用いて生きている細胞の数を測定した。その結果は表１７、図１５及び図１６に示す。

【0306】

【0307】

【0308】

図１５は、ＥＯＬ－１における一実施形態によるＡＤＣの細胞増殖抑制活性を示すグラフである。

【0309】

図１６は、ＴＨＰ－１における一実施形態によるＡＤＣの細胞増殖抑制活性を示すグラフである。

【0310】

表１７、図１５及び図１６に示したように、抗ＣＬＬ－１モノクローナル抗体である１６Ｃ６、３３Ｃ２及び８４Ａ２は、ＥＯＬ－１及びＴＨＰ－１細胞株において、６Ｅ７よりも癌細胞を死滅する能力が改善されたことを確認した。

【0311】

＜実施例３．抗ＣＬＬ－１／抗ＣＤ３二重特異性抗体の製造＞

【0312】

実施例１．３．で製造された抗ＣＬＬ－１クローンｈｕ３３Ｃ２（ＶＨ３／ＶＬ６（Ｍ１２））、及びＰＣＴ／ＣＮ２０１８／１０６６１８に開示されたＣＤ３クローンを選択し、抗ＣＬＬ－１／抗ＣＤ３二重特異性抗体を製造した。二重特異性抗体は、ＰＣＴ／ＣＮ２０１８／１０６７６６に開示されたＷｕＸｉＢｏｄｙ生成方法（ＷｕＸｉＢｏｄｙ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）によって生産した。

【0313】

簡略に、ＶＬＡ－ＣＬのＤＮＡ断片をＣＭＶプローモーター及びヒト軽鎖信号ペプチドを含む線形化されたベクターに挿入した。ＶＨＢ－ＣＨ１（３３Ｃ２）－（Ｇ_４Ｓ）_３－ＶＨＡ－ＣＨ１（ＣＤ３）またはＶＨＢ－ＣＨ１（３３Ｃ２）－（Ｇ_４Ｓ）_２－ＶＨＡ－ＣＨ１（ＣＤ３）のＤＮＡ断片をノブ突然変異（ｋｎｏｂ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ）のあるヒトＩｇＧ１定常領域ＣＨ２－ＣＨ３を含む線形化されたベクターに挿入した。ＶＨＢ－ＣＨ１のＤＮＡ断片を空洞及びＮ２９７Ａ突然変異のあるヒトＩｇＧ１定常領域ＣＨ２－ＣＨ３を含む線形化されたベクターに挿入した。全てのベクターはＣＭＶプローモーター及びヒト抗体重鎖信号ペプチドを含有している。ＶＨＢ－ＣＬのＤＮＡ断片をＣＭＶプローモーター及びヒト軽鎖信号ペプチドを含有する線形化されたベクターに挿入した。ここで、ＶＬＡ－ＣＬは、抗ＣＤ３抗体の軽鎖可変ドメイン（ＶＬＡ）－抗ＣＤ３抗体の軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）であり、ＶＨＢ－ＣＨ１は、抗ＣＬＬ－１抗体の重鎖可変ドメイン（ＶＨＢ）－抗ＣＬＬ－１抗体の重鎖の第１定常ドメイン（ＣＨ１）であり、Ｇ_４Ｓは、ＧＧＧＧＳのアミノ酸配列で構成されたペプチドリンカーであり、ＶＨＡ－ＣＨ１は抗ＣＤ３抗体の重鎖可変ドメイン（ＶＨＢ）－抗ＣＤ３抗体の重鎖の第１定常ドメイン（ＣＨ１）であり、ＶＨＢ－ＣＬは、抗ＣＬＬ－１抗体の重鎖可変ドメイン（ＶＨＢ）－抗ＣＬＬ－１抗体の軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）である。

【0314】

抗ＣＤ３部分の軽鎖：抗ＣＤ３部分の重鎖：抗ＣＬＬ１部分の重鎖：抗ＣＬＬ１部分の軽鎖の発現のためのＤＮＡ比率は、４：１：１：２であった。生存率が９５％超であるＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞２．９４×１０^６／ｍＬを細胞培養培地３００ｍＬで製造した。プラスミドＤＮＡ及びＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ^ＴＭ２９３試薬を混合した後に、細胞培養培地に添加した。細胞培養物をプラットホームシェーカー（ｐｌａｔｆｏｒｍ ｓｈａｋｅｒ）で回転速度１５０ｒｐｍで培養した。温度を３７℃に維持し、ＣＯ_２水準を８％に維持した。６日間培養後、細胞を４０００ｒｐｍで２５℃で１０分間原審分離してペレット化した。精製及びゲル電気泳動のために上清液を収集した。上清液をＮｕＰＡＧＥ^ＴＭ ４％～１２％のビストリスタンパク質ゲル（Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇｅｌｓ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社製）の指針に従い、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルにローディングして、ＰａｇｅＲｕｌｅｒ^ＴＭ Ｕｎｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｄｄｅｒ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社製）を抗体サンプルとともに用いて抗体の分子量を決めた。各変異体の残りの上清液を後続する精製に用いた。タンパク質Ａカラムに１ｍＬのＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ樹脂をあらかじめパッキングした。細胞培養培地をローディングする前に前記カラムをｐＨ７．０の０．１Ｍ Ｔｒｉｓで平衡化した。引き続き、ローディング後に、ｐＨ７．０の０．１Ｍ Ｔｒｉｓでカラムを洗浄し、ｐＨ３．５の０．１Ｍクエン酸で溶出させた。しかるのち、ｐＨ９．０の０．１Ｍ Ｔｒｉｓを添加して溶出された溶液を中和させた。その後、サンプルをＰＢＳ緩衝液（Ｓａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製、Ｂ５４８１１７－０５００）で透析した。最後に、抗体を０．２μｍフィルターを通じてろ過し、１．５ｍＬチューブに０．２ｍＬまたは０．５ｍＬの分取量で無菌で分割した。抗体を凍結させて、－８０℃で保管し、ＡＢＬにより輸送し、ＷｕＸｉ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓでｉｎ ｖｉｔｒｏで分析を行った。

【0315】

結論的に、リンカーのタイプ（（Ｇ４Ｓ）２または（Ｇ４Ｓ）３）だけが異なる二重特異性抗体の２種を製造した。（Ｇ４Ｓ）２リンカーを持つ二重特異性抗体は、Ｒ２で表示し、（Ｇ４Ｓ）３を持つ二重特異性抗体はＲ３で表示した。二重特異性抗体のアミノ酸配列は表１８に示す。以下、Ｒ２リンカーを持つ二重特異性抗体はまた３３Ｃ２／ＣＤ３－Ｒ２と呼び、また、Ｒ３リンカーを持つ二重特異性抗体は３３Ｃ２／ＣＤ３－Ｒ３と呼ぶ。

【0316】

【0317】

＜実施例４．抗ＣＬＬ１／抗ＣＤ３二重特異性抗体の活性の評価＞

【0318】

＜４．１．ＣＬＬ－１発現細胞における結合活性の評価（ＦＡＣＳ）＞

【0319】

実施例３の二重特異性抗体の腫瘍抗原結合特性を評価するために、哺乳動物細胞で発現されたＣＬＬ１に対する３３Ｃ２／ＣＤ３－Ｒ２及び３３Ｃ２／ＣＤ３－Ｒ３のＣＬＬ１標的化部分の結合能力をＦＡＣＳを用いて分析した。
簡略に、ＣＬＬ１陽性細胞（Ｕ９３７及びＨＬ６０）を３３Ｃ２／ＣＤ３－Ｒ２及び３３Ｃ２／ＣＤ３－Ｒ３抗体と培養した。ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳの中で１％ＢＳＡ）で洗浄した後、ＰＥ－抗ヒトＩｇＧ抗体を各ウェルに添加し、４℃で６０分間培養した。ＰＥ（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）のＭＦＩ（Ｍｅｄｉａｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）をＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒで評価した。一方のアームには抗ＣＤ３抗原結合フラグメントを有し、他方のアームには抗原結合フラグメントが存在しないＢｓＡｂｍｏｃｋ／ＣＤ３を対照群として用いた。Ｍｅｒｕｓの抗ＣＬＬ－１／抗ＣＤ３二重特異性抗体ＭＣＬＡ－１１７を参照として用いた。その結果は図１７及び表１９に示す。

【0320】

【0321】

図１７は、ＣＬＬ１発現癌細胞における一実施形態による二重特異性抗体の細胞結合活性を示すグラフである。

【0322】

図１７及び表１９に示したように、ＣＬＬ１陽性癌細胞株における一実施形態による二重特異性抗体の結合活性は、ＭＣＬＡ－１１７抗体の結合活性よりも有意に高いことを確認した。

【0323】

＜４．２．ＣＤ３－発現細胞における結合活性の評価（ＦＡＣＳ）＞

【0324】

実施例３の二重特異性抗体のＣＤ３結合特性を評価するために、ＣＤ３発現哺乳動物細胞に対する３３Ｃ２／ＣＤ３－Ｒ２及び３３Ｃ２／ＣＤ３－Ｒ３のＣＤ３標的化部分の結合活性をＦＡＣＳを用いて分析した。

【0325】

簡略に、ＣＤ３発現Ｊｕｒｋａｔ細胞株を３３Ｃ２／ＣＤ３－Ｒ２及び３３Ｃ２／ＣＤ３－Ｒ３抗体と培養した。ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳの中で１％ＢＳＡ）で洗浄した後、ＰＥ－抗ヒトＩｇＧ抗体を各ウェルに添加し、４℃で６０分間培養した。ＰＥのＭＦＩ（Ｍｅｄｉａｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）をＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒで評価した。その結果は図１８に示す。

【0326】

図１８は、一実施形態による二重特異性抗体の細胞結合活性を示すグラフである。

【0327】

図１８に示したように、一実施形態による二重特異性抗体は、ＣＤ３発現Ｊｕｒｋａｔ細胞株に用量依存的方法で強く結合したことを確認した。

【0328】

＜４．３．多様なＣＬＬ１発現条件下における二重特異性抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏＴ細胞活性化＞

【0329】

３３Ｃ２／ＣＤ３－Ｒ２及び３３Ｃ２／ＣＤ３－Ｒ３二重特異性抗体（ＢｓＡｂｓ）のＣＬＬ１特異的Ｔ細胞活性化活性を調べるために、ＡＭＬ細胞株（Ｕ９３７及びＨＬ－６０）を用いるＰｒｏｍｅｇａキットを使用した。

【0330】

簡略に、Ｕ９３７またはＨＬ－６０癌細胞の２×１０^４個細胞を１０％ＦＢＳが含まれたＲｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＲＰＭＩ）－１６４０培地中に９６ウェルプレートに分取した。ＢｓＡｂｓ及び１×１０^５ＴＣＲ／ＣＤ３エフェクター細胞（Ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ ｏｆ ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｔ－ｃｅｌｌｓ、ＮＦＡＴ）を添加した。Ｔ－細胞活性化は、５％ＣＯ_２大気中に３７℃で６時間の間培養した後に評価した。その後、Ｂｉｏ－Ｇｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を添加し、発光プレートリーダーで発光を測定した。抗Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２を有する二重特異性抗体（非関連抗体）であるＢｓＡｂｓ Ｕ１Ｒ２、及び抗ＣＤ３抗原結合フラグメントを陰性対照群として用いた。その結果は、図１９及び表２０に示す。

【0331】

図１９は、一実施形態による二重特異性抗体のＴ細胞活性化を示すグラフである。

【0332】

図１９及び表２０に示したように、一実施形態による二重特異性抗体は、ＣＬＬ１－特異的Ｔ－細胞活性化を用量依存的方法で有意に誘導したことに対し、対照群ＢｓＡｂでは効果がなかった。

【0333】

＜４．４．多様なＣＬＬ１発現ＡＭＬ細胞株における二重特異性抗体のＴ細胞活性化及び細胞溶解活性＞

【0334】

実施例３の二重特異性抗体のＴ細胞活性化及び細胞溶解活性を調べるために、ＡＭＬ細胞株（Ｕ９３７またはＨＬ６０）でＦＡＣＳを行った。

【0335】

簡略に、Ｕ９３７またはＨＬ６０懸濁標的細胞（２×１０^４細胞）を９６ウェルＵボトムプレートに分取した。多様な濃度のＢｓＡｂｓまたは対照群分子（Ｕ１Ｒ２）及びヒト精製されたＴ細胞（ＰＢＭＣから精製される）を５：１のエフェクター：標的の比率でプレートに添加した。４８時間後に、Ｔ細胞活性化及び残っているＣＤ３３陽性標的細胞の数をフローサイトメトリーで定量化した。特定の細胞溶解の比率を下記のように計算した：

【0336】

１００－［１００×（ＢｓＡｂｓで処理した標的細胞の数）／（ＰＢＳで処理した標的細胞の数）］。

【0337】

ＣＤ２５及びＣＤ６９の細胞表面水準をＴ細胞活性化マーカーとして用いてＴ細胞をフローサイトメトリーで分析した。ＢｓＡｂｓｍｏｃｋ／ＣＤ３を対照群として用い、Ｍｅｒｕｓの抗ＣＬＬ－１／抗ＣＤ３二重特異性抗体ＭＣＬＡ－１１７を参照として用いた。ＨＬ６０及びＵ９３７でのＥＣ５０結果は、それぞれ図２０及び図２１、及びそれぞれ表２１及び表２２に示す。

【0338】

【0339】

【0340】

図２０は、ＨＬ－６０における一実施形態による二重特異性抗体のＴ細胞活性化及び細胞溶解活性を示すグラフである。

【0341】

図２１は、Ｕ９３７における一実施形態による二重特異性抗体のＴ細胞活性化及び細胞溶解活性を示すグラフである。

【0342】

図２０及び図２１、及び表２１及び表２２に示したように、一実施形態による二重特異性抗体は、ＭＣＬＡ－１１７よりＣＬＬ１－特異的Ｔ細胞活性化（ＣＤ２５及びＣＤ６９上向き調節で測定する）及び癌細胞溶解を用量依存的方法で有意に誘導し、対照群ＢｓＡｂには効果がなかったことを確認した。

【0343】

＜４．５．多様なＣＬＬ１発現細胞株におけるｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害＞

【0344】

抗原依存的溶解を促進する一実施様態による二重特異性抗体の能力を決めるために、ＦａｒＲｅｄ標識されたＵ９３７またはＨＬ６０でＢｓＡｂｓのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害を分析した。

【0345】

簡略に、ＦａｒＲｅｄ標識されたＵ９３７またはＨＬ６０懸濁標的細胞（１．５×１０^４細胞）を９６ウェルＵボトムプレートに分取した。多様な濃度のＢｓＡｂｓまたは対照群分子（Ｕ１Ｒ２）及び多様な供与者から入手したヒトＰＢＭＣエフェクター細胞を１０：１または５：１のエフェクター：標的の比率でプレートに添加した。すべての実験は、三重で遂行した。４８時間後に、フローサイトメトリーでＺｏｍｂｉｅ ＶｉｏｌｅｔＴＭＦｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙキット（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製、Ｃａｔ＃４２３１１４）を用いて標的細胞の死滅を評価した。特定細胞溶解の比率は、下記のように計算した：

【0346】

１００×［ＦａｒＲｅｄ ｐｏｓ死滅細胞／（ＦａｒＲｅｄ ｐｏｓ生きている細胞＋ＦａｒＲｅｄ ｐｏｓ死滅細胞）］

【0347】

その結果は、表２３及び図２２に示す。

【0348】

【0349】

図２２は、一実施形態による二重特異性抗体の抗原依存的細胞溶解活性を示すグラフである。

【0350】

図２２及び表２３に示したように、一実施形態による二重特異性抗体は、ＣＬＬ１－陽性Ｕ９３７及びＨＬ６０細胞のＴ細胞媒介溶解を濃度依存的方法で有意に誘導したことに対し、対照群ＢｓＡｂ（Ｕ１Ｒ２）では効果がなかったことを確認した。

【0351】

＜４．６．異種移植モデル（Ｕ９３７モデル）におけるｉｎ ｖｉｖｏ効果＞

【0352】

実施例３の二重特異性抗体の効果を皮下Ｕ９３７異種移植モデル（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ Ｕ９３７ ｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｍｏｄｅｌ）で評価した。

【0353】

具体的に、Ｕ９３７皮下異種移植片を有するＮＯＧマウスにおけるｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍活性を評価した。簡略な実験計画は下記の通りである：
腫瘍細胞株：Ｕ９３７
マウス：ＮＯＧ群＝９
腫瘍細胞ｓ．ｃ．注射：５×１０^６細胞／匹
５日目の拡張Ｔ細胞ｉ．Ｐ．注射：１×１０^７細胞／匹、供与者（ＡＢＬ０２Ｔ）（Ｅ：Ｔ＝２：１）
６日目のｈＩｇＧ１（Ｆｃ ｂｌｏｃｋ）ｉ．ｐ．注射
７日目の薬物（ＢｓＡｂｓ）ｉ．ｐ．注射開始（１ｍｐｋ、２ＱＷ（２回／週間）、総６回）
グループ化：７日目；
グループ１（対照群）：ＰＢＳ（ビヒクル）；
グループ２：３３Ｃ２／ＣＤ３－Ｒ２；及び
グループ３：３３Ｃ２／ＣＤ３－Ｒ３

【0354】

腫瘍の大きさ、腫瘍増殖抑制中央値（％ＴＧＩ）、及び体重を５、７、１０、１３、１７、２０、及び２４日目に測定した。

【0355】

二重特異性抗体のＣＤ３アーム（ａｒｍ）は、マウスＣＤ３と交差反応性がないから、ヒトＴ細胞を５日目にマウス腹腔内に注射した後に、３３Ｃ２／ＣＤ３－Ｒ２（グループ２）及び３３Ｃ２／ＣＤ３－Ｒ３（グループ３）、またはＰＢＳ（ビヒクル）（グループ１）を１ｍｇ／ｋｇの用量で３週間の間１週間当り２回投与した。腫瘍の大きさ（ｍｍ^３）（＝（Ｗ）×（Ｌ）×（Ｈ）×０．５）、腫瘍増殖抑制中央値（％ＴＧＩ）、及びマウスの体重を測定して、その結果は図２３に示す。

【0356】

図２３は、Ｕ９３７異種移植モデルにおける一実施形態による二重特異性抗体のｉｎ ｖｉｖｏ効果を示すグラフである。

【0357】

図２３に示したように、マウスの体重は、実験群（グループ２及びグループ３）及び対照群（グループ１）のいずれも有意な変化はなかったことを確認した。また、対照群は、実験群である３３Ｃ２／ＣＤ３－Ｒ２、３３Ｃ２／ＣＤ３－Ｒ３ＢｓＡｂｓ－処理マウスと比較して、腫瘍の体積が有意に大きいことを確認した。特に、一実施形態による二重特異性抗体は、Ｕ９３７異種移植モデルで完全な腫瘍退行を誘導した。

【0358】

＜４．７．異種移植モデル（ＨＬ６０－Ｌｕ同所性ＡＭＬモデル）におけるｉｎ ｖｉｖｏ効果＞

【0359】

実施例３の二重特異性抗体の効能評価をＩＶＨＬ６０－Ｌｕ同所性ＡＭＬモデル（ＩＶ ＨＬ６０－Ｌｕ ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ ＡＭＬ ｍｏｄｅｌ）で遂行した。

【0360】

具体的に、ｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍活性は、ＨＬ６０－ＬｕＩＶ（静脈内）異種移植片を有するＮＯＧマウスで評価した。簡略な実験計画は下記の通りである：
腫瘍細胞株：ＨＬ ６０ｌｕｃ
マウス：ＮＯＧ群＝９
腫瘍細胞Ｉ．Ｖ．注射：１×１０^７細胞／匹
５日目の拡張Ｔ細胞ｉ．Ｐ．注射：１．５×１０^７細胞／匹、供与者（ＡＢＬ１４）（Ｅ：Ｔ＝１．５：１）
６日目のｈＩｇＧ１（Ｆｃブロック）ｉ．ｐ．注射、３０ｍｐｋ
７日目の薬物（ＢｓＡｂｓ）ｉ．ｐ．注射開始（２ＱＷ（２回／１週間）、総７回）
グループ化：７日目；
グループ１（対照群）：ＰＢＳ（ビヒクル）；
グループ２：３３Ｃ２／ＣＤ３－Ｒ２；及び
グループ３：３３Ｃ２／ＣＤ３－Ｒ３

【0361】

ＢＬＩ（Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｄｅｘ）を７、１４、２１、及び２８日目に遂行した。

【0362】

一実施形態による二重特異性抗体の効能評価をＨＬ６０－Ｌｕ同所性ＡＭＬモデルで遂行した。具体的に、確立した播種性ＨＬ６０－ｌｕｃモデルで、３３Ｃ２／ＣＤ３－Ｒ２または３３Ｃ２／ＣＤ３－Ｒ３治療はＩＶ注射後にＡＭＬ細胞の骨髓への回帰が確認された後に開始した。

【0363】

簡略に、全身ルシフェラーゼ標識されたＨＬ６０同所性モデルを生成するために、１×１０^７ＨＬ６０－ｌｕｃ細胞を０日目に尾静脈に静脈内注射した。動物を６日目に生物発光の強さによって７つのグループにランダムに割り当てた。

【0364】

７日目から始めて、マウスに０．５ｍｇ／ｋｇの３３Ｃ２／ＣＤ３－Ｒ２、３３Ｃ２／ＣＤ３－Ｒ３またはビヒクルを１週間で２回の腹腔内注射で総７回用量を投与した。ＢＬＩ（Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｄｅｘ）分析を７、１４、２１、及び２８日目に遂行したし、その結果は図２４に示し、その定量分析は、図２５に示す。また、ＴＧＩ中央値を１４、２１、及び２８日目に測定したし、その結果は表２４に示す。

【0365】

図２４は、ＨＬ６０－Ｌｕ同所性ＡＭＬモデルにおける一実施形態による二重特異性抗体投与でのＢＬＩ（Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｄｅｘ）を示すイメージである。

【0366】

図２５は、ＨＬ６０－Ｌｕ同所性ＡＭＬモデルにおける一実施形態による二重特異性抗体投与でのＢＬＩの定量分析結果を示すグラフである（統計分析：Ｔｗｏ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ'ｓ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ ｔｅｓｔ）、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。

【0367】

【0368】

図２４及び図２５、及び表２４に示したように、一実施形態による二重特異性抗体０．５ｍｇ／ｋｇ投与は、２８日目にビヒクル－処理群と比較して、生物発光で評価した結果、腫瘍増殖を有意に（それぞれ９０％、及び８０％）抑制したことを確認した。また、一実施形態による二重特異性抗体の投与は、生物発光で観察時、骨髓、脊椎及び後肢で腫瘍量が有意に減少したことを確認した。

【0369】

＜４．８．異種移植モデル（ＨＬ６０－Ｌｕ同所性ＡＭＬモデル）における有効用量の評価＞

【0370】

ＨＬ６０－Ｌｕ同所性ＡＭＬモデルにおける３３Ｃ２／ＣＤ３－Ｒ３二重特異性抗体の有効用量の評価を、実施例４．７．と同様な方式で行い、ただ二重特異性抗体の投与用量を０．５ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、及び０．００５ｍｇ／ｋｇに変更した。

【0371】

ＢＬＩ（Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｄｅｘ）分析を７、１４、２１、及び２８日目に行い、その結果は図２６に示し、その定量分析は、図２７に示しており、また、１４、２１、及び２８日目にＴＧＩ中央値を測定して、その結果は表２５に示す。また、フローサイトメトリー及びＩＨＣ染色を用いて骨髓内腫瘍細胞を測定し、その結果はそれぞれ図２８及び図２９に示す。

【0372】

図２６は、ＨＬ６０－Ｌｕ同所性ＡＭＬモデルにおける一実施形態による二重特異性抗体投与でのＢＬＩ（Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｄｅｘ）を示すイメージである。

【0373】

図２７は、ＨＬ６０－Ｌｕ同所性ＡＭＬモデルにおける一実施形態による二重特異性抗体投与でのＢＬＩの定量分析を示すグラフである（＊＊＊＝Ｐ＜０．００５）。

【0374】

図２８は、一実施形態による二重特異性抗体投与後に骨髓内腫瘍細胞をＦＡＣＳで測定した結果を示すグラフである。

【0375】

図２９は、一実施形態による二重特異性抗体投与後に骨髓内腫瘍細胞をＩＨＣ染色で測定した結果を示すイメージである。

【0376】

【0377】

図２６及び図２７、及び表２５に示したように、一実施形態による二重特異性抗体０．５ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．００５ｍｇ／ｋｇ投与は、２８日目にビヒクル処理したマウスと比較して、生物発光で評価した結果、腫瘍増殖を有意に（それぞれ９１％、７８％、及び３２％）抑制したことを確認した。また、一実施形態による二重特異性抗体の投与は、生物発光で観察時、骨髓、脊椎及び後肢で腫瘍量が用量依存的方法で有意に減少したことを確認した。

【0378】

図２８及び図２９に示したように、一実施形態による二重特異性抗体の投与で骨髓内腫瘍細胞が有意に減少したことを確認した。また、このような結果は、一実施形態による抗体が癌転移を抑制することができることを意味する。

【0379】

＜４．９．原発性患者由来のＡＭＬ芽球におけるＴ細胞活性化及び細胞傷害＞

【0380】

実施例３の二重特異性抗体の活性を調べるために、原発性患者から入手したＰＢＭＣ由来のＡＭＬ芽球（ＡＭＬ ｂｌａｓｔｓ）を用いた。ＡＭＬ芽球は動物モデルまたは細胞株よりも臨床環境により近い条件にあたる。

【0381】

まず、ＰＢＭＣをＦｉｃｏｌｌ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて密度勾配原審分離に単離して、抗体で染色して、単離直後ＦＡＣＳＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて分析して４名の原発性患者由来のＡＭＬ芽球におけるＣＬＬ１及びＣＤ３３の発現を調べた。データは、ＦｌｏｗＪｏ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）及びＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍｖｅｒ．９（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．社製）ソフトウェアを用いて分析した。ＡＭＬ芽球集団の各ＩｇＧ陰性対照群染色に対して陽性細胞の比率及び相手ＭＦＩを決めた。全血球及びＡＭＬ芽球におけるＣＬＬ１及びＣＤ３の発現結果は表２６に示す。

【0382】

【0383】

４名のＡＭＬ患者サンプルにおいて、ＡＭＬ芽球におけるＣＬＬ１発現中央値は陽性細胞の比率及びＭＦＩ（Ｍｅａｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）側面ともＣＤ３３の発現中央値に類似した。

【0384】

細胞傷害及びＴ細胞活性化を誘導する一施様態による二重特異性抗体の能力をｅｘ ｖｉｖｏ細胞傷害分析で１１名のＡＭＬ患者由来のＰＢＭＣを用いて評価した。

【0385】

簡略に、前述したごとく、ＡＭＬ患者由来の新鮮な血液から単離されたＡＭＬＰＢＭＣｓ（２×１０^５）を９６ウェルＵボトムプレートに三重に分取した。ＢｓＡｂｓを５０ｎＭから１０倍連続希釈してプレートに添加した。Ｕ１Ｒ２は、対照群として用いた。７２時間後に、ＣＬＬ１陽性ＡＭＬ芽球の細胞溶解（％）及びＴ細胞活性化（％）をフローサイトメトリーで分析して、その結果はそれぞれ図３０及び図３１に示す。

【0386】

図３０は、ＡＭＬ芽球における一実施形態による二重特異性抗体の細胞溶解活性を示すグラフである。

【0387】

図３１は、ＡＭＬ芽球における一実施形態による二重特異性抗体のＴ細胞活性化の活性を示すグラフである。

【0388】

図３０に示したように、一実施形態による二重特異性抗体は、ＡＭＬ芽球における細胞傷害を濃度依存的方法で有意に誘導したことを確認した（ＥＣ５０：０．０７～０．２ｎＭ）。図３１に示したように、また、前述のような細胞傷害の結果は、４名の患者サンプルにおけるＴ細胞活性化の増加（ＥＣ５０：０．０００３～０．０４ｎＭ）と相関関係があったことを確認した。これらのデータは、一実施形態による二重特異性抗体がｉｎ ｖｉｖｏ条件に一層類似したｅｘ ｖｉｖｏ環境下でＣＬＬ１陽性ＡＭＬ細胞を死滅するのに効果的であったことを示す。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【配列表】

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【国際調査報告】