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特表2024-525933ミトコンドリア置換を使用して免疫細胞疲弊を低減させるための方法および組成物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-07-12
(54)【発明の名称】ミトコンドリア置換を使用して免疫細胞疲弊を低減させるための方法および組成物
(51)【国際特許分類】
C12N 5/0783 20100101AFI20240705BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240705BHJP
A61P 31/12 20060101ALI20240705BHJP
A61P 31/20 20060101ALI20240705BHJP
A61P 31/18 20060101ALI20240705BHJP
A61P 31/14 20060101ALI20240705BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20240705BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20240705BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240705BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240705BHJP
【ＦＩ】
C12N5/0783 ZNA
C12N5/10
A61P31/12
A61P31/20
A61P31/18
A61P31/14
A61K35/17
A61P1/16
A61P43/00 107
A61P35/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024503829
(86)(22)【出願日】2022-05-18
(85)【翻訳文提出日】2024-01-19
(86)【国際出願番号】 IB2022054638
(87)【国際公開番号】W WO2022243905
(87)【国際公開日】2022-11-24
(31)【優先権主張番号】63/190,115
(32)【優先日】2021-05-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】524026492
【氏名又は名称】イメル バイオセラピューティクス， インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】五條 理志
(72)【発明者】
【氏名】上 大介
【テーマコード（参考）】
4B065
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA94X
4B065AA94Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065CA24
4B065CA44
4B065CA46
4C087AA01
4C087AA02
4C087AA03
4C087BB37
4C087BB65
4C087CA04
4C087CA05
4C087NA14
4C087ZA75
4C087ZB22
4C087ZB26
4C087ZB33
4C087ZC55
(57)【要約】
本開示は疲弊T細胞からミトコンドリア置換T細胞を作製するための方法および組成物であって、疲弊T細胞ミトコンドリアDNA(mtDNA)を減少させるステップと、単離された外因性ミトコンドリアと共に十分な期間にわたってインキュベートして、少なくとも1つの疲弊マーカーの発現が少なくとも5%、少なくとも10%、20%（例えば、多くても1.25分の１に）少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、またはそれよりも大きく変更された、ミトコンドリア置換Ｔ細胞を生成するステップとを含み、ミトコンドリア置換Ｔ細胞が、疲弊Ｔ細胞と比べて改善されたエフェクター機能を有する、方法および組成物を提供する。さらに、本開示は、ミトコンドリア置換T細胞を投与することを伴う、加齢性疾患（例えば、がんまたは自己免疫疾患）を処置するまたは好転させる方法ならびに慢性感染症（例えば、慢性ウイルス感染症）の症状を好転させるための方法も提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
疲弊Ｔ細胞からミトコンドリア置換Ｔ細胞を作製するための方法であって、内因性ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）コピー数が減少した疲弊Ｔ細胞を、単離された外因性ミトコンドリアと共に十分な期間にわたってインキュベートして、プログラム細胞死－１（ＰＤ－１）の発現が、前記ミトコンドリア置換Ｔ細胞が作製される前記疲弊Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現と比べて、多くても１．１分の１に低減したミトコンドリア置換Ｔ細胞を生成するステップ
を含み、
前記ミトコンドリア置換Ｔ細胞が、前記疲弊Ｔ細胞と比べて改善されたエフェクター機能を有する、方法。
【請求項2】
疲弊Ｔ細胞からミトコンドリア置換Ｔ細胞を作製するための方法であって、（ａ）疲弊Ｔ細胞に、ミトコンドリア標的化配列（ＭＴＳ）とＸｂａＩＲとを含む融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列をエレクトロポレーションして、内因性ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）コピー数を減少させるステップと、
（ｂ）内因性ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）コピー数が減少した前記疲弊Ｔ細胞を、単離された外因性ミトコンドリアと共に十分な期間にわたってインキュベートして、ＰＤ－１の発現が、前記ミトコンドリア置換Ｔ細胞が作製される前記疲弊Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現と比べて、多くても１．１分の１に低減したミトコンドリア置換Ｔ細胞を生成するステップと
を含み、前記ミトコンドリア置換Ｔ細胞が、前記疲弊Ｔ細胞と比べて改善されたエフェクター機能を有する、方法。
【請求項3】
前記疲弊Ｔ細胞の前記単離された外因性ミトコンドリアとのインキュベーションが、ラパマイシンの存在下で行われる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
ラパマイシンが、１００ｎＭ～１０００ｎＭの濃度で存在する、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
ＰＤ－１の発現が多くても１．２分の１に低減する、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
ＰＤ－１の発現が多くても１．２５分の１に低減する、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
ＰＤ－１の発現が多くても１．５分の１に低減する、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
ＰＤ－１の発現が多くても２分の１に低減する、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
ＰＤ－１の発現が多くても５分の１に低減する、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
ＰＤ－１の発現が約１．１分の１～約１．５分の１に低減する、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
Ｔ細胞免疫グロブリンおよびムチンドメイン含有タンパク質３（ＴＩＭ３）、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）、Ｔ細胞免疫グロブリンおよびＩＴＩＭドメイン（ＴＩＧＩＴ）、ＴＯＸ、またはこれらの組合せの発現を低減させる、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
前記単離された外因性ミトコンドリアが、細胞１×１０６個当たりタンパク質約２０μｇ～約８０μｇである、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
前記ミトコンドリア置換Ｔ細胞が、少なくとも２０％の前記外因性ｍｔＤＮＡを含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
前記ミトコンドリア置換Ｔ細胞が、ＴａｑＭａｎ一塩基多型（ＳＮＰ）アッセイによって測定して少なくとも２０％の外因性ｍｔＤＮＡかつ８０％以下の外因性ｍｔＤＮＡを含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
前記ミトコンドリア置換Ｔ細胞が生成されるのに十分な期間が、少なくともおよそ２４時間である、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
前記ミトコンドリア置換Ｔ細胞が生成されるのに十分な期間が、少なくとも３６時間である、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
前記ミトコンドリア置換Ｔ細胞が生成されるのに十分な期間が、少なくとも４８時間である、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
前記ミトコンドリア置換Ｔ細胞が生成されるのに十分な期間が、約２４時間～約７２時間である、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項19】
前記改善されたエフェクター機能が、増大した増殖、増大した細胞傷害、サイトカインの増加した分泌、またはこれらの組合せを含む、請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項20】
前記疲弊Ｔ細胞が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項21】
前記疲弊Ｔ細胞が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝子改変されている、請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項22】
請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法によって生成されたミトコンドリア置換Ｔ細胞。
【請求項23】
請求項２０または２１に記載の方法によって生成されたミトコンドリア置換Ｔ細胞。
【請求項24】
有効量の、請求項２２に記載のミトコンドリア置換Ｔ細胞と、薬学的に許容される担体とを含む組成物。
【請求項25】
慢性ウイルス感染症の症状の好転を、それを必要とする対象において行うための方法であって、前記対象に、請求項２４に記載の組成物を投与するステップを含む、方法。
【請求項26】
前記慢性ウイルス感染症が、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染症、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染症、サイトメガロウイルス感染症（ＣＭＶ）、および重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）－２感染症である、請求項２５に記載の方法。
【請求項27】
有効量の、請求項２３に記載のミトコンドリア置換Ｔ細胞と、薬学的に許容される担体とを含む組成物。
【請求項28】
がんの処置を、それを必要とする対象において行うための方法であって、前記対象に、請求項２４または２７に記載の組成物を投与するステップを含む、方法。
【請求項29】
がんの症状の好転を、それを必要とする対象において行うための方法であって、前記対象に、請求項２４または２７に記載の組成物を投与するステップを含む、方法。
【請求項30】
Ｔ細胞疲弊に関連する、Ｔ細胞疲弊が伴う、またはＴ細胞疲弊によって引き起こされる疾患または状態の処置を、それを必要とする対象において行うための方法であって、前記対象に、請求項２４または２７に記載の組成物を投与するステップを含み、前記疾患または状態が、（ａ）がん；
（ｂ）ウイルス感染症；
（ｃ）細菌感染症；
（ｄ）肥満症もしくは代謝障害；
（ｅ）アルコール症；
（ｆ）運動過剰；
（ｇ）過度の精神的ストレス；
（ｈ）低酸素症；
（ｉ）傷害；
（ｊ）老化；
（ｋ）加齢性免疫学的機能障害；
（ｌ）線維化疾患；
（ｍ）黄斑疾患；
（ｎ）筋肉変性疾患；または
（ｏ）神経変性疾患
である、方法。
【請求項31】
Ｔ細胞疲弊に関連する、Ｔ細胞疲弊が伴う、またはＴ細胞疲弊によって引き起こされる疾患または状態の症状の好転を、それを必要とする対象において行うための方法であって、前記対象に、請求項２４または２７に記載の組成物を投与するステップを含み、前記疾患または状態が、（ａ）がん；
（ｂ）ウイルス感染症；
（ｃ）細菌感染症；
（ｄ）肥満症もしくは代謝障害；
（ｅ）アルコール症；
（ｆ）運動過剰；
（ｇ）過度の精神的ストレス；
（ｈ）低酸素症；
（ｉ）傷害；
（ｊ）老化；
（ｋ）加齢性免疫学的機能障害；
（ｌ）線維化疾患；
（ｍ）黄斑疾患；
（ｎ）筋肉変性疾患；または
（ｏ）神経変性疾患
である、方法。
【請求項32】
Ｔ細胞疲弊に関連する、またはＴ細胞疲弊が関与する、またはＴ細胞疲弊によって引き起こされる疾患または状態の処置を、それを必要とする対象において行うための方法であって、前記対象に、請求項２４または２７に記載の組成物を投与するステップを含み、前記疾患または状態が、（ａ）ＣＤ８＋Ｔ細胞機能障害；
（ｂ）ＣＤ４＋Ｔ細胞機能障害；
（ｃ）Ｔ細胞プライミングの機能障害；
（ｄ）メモリーＴ細胞機能障害；
（ｅ）エフェクターＢ細胞機能障害；
（ｆ）Ｂ細胞プライミングの機能障害；
（ｇ）メモリーＢ細胞機能障害；
（ｈ）先天性リンパ球系細胞機能障害；
（ｉ）先天性Ｔ細胞機能障害；または
（ｊ）先天性Ｂ細胞機能障害
である、方法。
【請求項33】
前記対象がヒトである、請求項２５、２６または２８から３２のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる２０２１年５月１８日出願の米国仮出願第６３／１９０，１１５号の利益を主張するものである。
【0002】
１．配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる配列表を含む。前記ＡＳＣＩＩコピーは２０２２年５月１８日に作成されたものであり、名称は１４５９５－００９－２２８＿ＳＬ．ｔｘｔ、サイズは２，４１０バイトである。
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる配列表を含む。前記ＡＳＣＩＩコピーは２０２２年５月１８日に作成されたものであり、名称は１４５９５－００９－２２８＿ＳＬ．ｔｘｔ、サイズは２，４１０バイトである。
【0003】
２．分野
本開示は、一部において、ミトコンドリア置換を使用して免疫細胞疲弊を低減させるための方法および組成物に関する。具体的な態様では、本開示は、疲弊Ｔ細胞からミトコンドリア置換Ｔ細胞を作製するための方法であって、（ａ）疲弊Ｔ細胞に、ＸｂａＩＲ（例えば、ミトコンドリア標的化配列（ＭＴＳ）とＸｂａＩＲとを含む融合タンパク質）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列をエレクトロポレーションして、内因性ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）コピー数を減少させるステップと、（ｂ）ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）コピー数が減少した疲弊Ｔ細胞を、単離された外因性ミトコンドリアと共に十分な期間にわたってインキュベートして、ミトコンドリア置換Ｔ細胞を生成するステップであって、その結果、ミトコンドリア置換Ｔ細胞における疲弊マーカー（例えば、プログラム細胞死－１（ＰＤ－１））の発現が疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％（例えば、多くても１．２５分の１に）、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、またはそれよりも大きく低減する、ステップを含む、方法に関する。本開示は、そのようなミトコンドリア置換Ｔ細胞を使用して疾患（例えば、がん）および慢性ウイルス感染症を処置するための治療方法にも関する。
本開示は、一部において、ミトコンドリア置換を使用して免疫細胞疲弊を低減させるための方法および組成物に関する。具体的な態様では、本開示は、疲弊Ｔ細胞からミトコンドリア置換Ｔ細胞を作製するための方法であって、（ａ）疲弊Ｔ細胞に、ＸｂａＩＲ（例えば、ミトコンドリア標的化配列（ＭＴＳ）とＸｂａＩＲとを含む融合タンパク質）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列をエレクトロポレーションして、内因性ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）コピー数を減少させるステップと、（ｂ）ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）コピー数が減少した疲弊Ｔ細胞を、単離された外因性ミトコンドリアと共に十分な期間にわたってインキュベートして、ミトコンドリア置換Ｔ細胞を生成するステップであって、その結果、ミトコンドリア置換Ｔ細胞における疲弊マーカー（例えば、プログラム細胞死－１（ＰＤ－１））の発現が疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％（例えば、多くても１．２５分の１に）、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、またはそれよりも大きく低減する、ステップを含む、方法に関する。本開示は、そのようなミトコンドリア置換Ｔ細胞を使用して疾患（例えば、がん）および慢性ウイルス感染症を処置するための治療方法にも関する。
【背景技術】
【0004】
３．背景
Ｔ細胞疲弊には、一般に、例えば慢性ウイルス感染症およびがんの状況における慢性抗原刺激から生じるＴ細胞機能障害の状態が伴う（Wherry, E. (2011) Nat Immunol 12, 492-499を参照されたい）。Ｔ細胞疲弊の特質として、エフェクター機能が不十分であること、阻害性受容体が持続的に発現していること、および／または、転写の状態が機能的なエフェクターもしくはメモリーＴ細胞とは異なることが挙げられる。疲弊により、感染症および腫瘍の最適な制御が妨げられる。
Ｔ細胞疲弊には、一般に、例えば慢性ウイルス感染症およびがんの状況における慢性抗原刺激から生じるＴ細胞機能障害の状態が伴う（Wherry, E. (2011) Nat Immunol 12, 492-499を参照されたい）。Ｔ細胞疲弊の特質として、エフェクター機能が不十分であること、阻害性受容体が持続的に発現していること、および／または、転写の状態が機能的なエフェクターもしくはメモリーＴ細胞とは異なることが挙げられる。疲弊により、感染症および腫瘍の最適な制御が妨げられる。
【0005】
患者の免疫系が腫瘍を攻撃する力を支持し、強化するための有望な戦略として、がん免疫療法が最近現れた。免疫療法の手法の１つは、患者自身のＴ細胞を採取し、工学的に操作して患者のがんを処置することを伴うものである。Ｔ細胞を工学的に操作するための２つの例示的な手法として、特定のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するように患者のＴ細胞を工学的に操作すること、またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するようにＴ細胞を工学的に操作することが挙げられる。ＴＣＲは、腫瘍細胞の内部に存在する抗原も認識することができる天然に存在する受容体を使用する。これらの抗原の小片は細胞表面と往復し、ＭＨＣ複合体と称されるタンパク質の集合の一部として免疫系に「提示」される。他方では、ＣＡＲは、がん細胞の表面上の特定の抗原を認識し得る抗体の部分を含む。治療として潜在性があるにもかかわらず、ＣＡＲ－Ｔ細胞は疲弊もし、それらの機能性を回復することができるように免疫チェックポイント遮断が必要になり得る。
Ｔ細胞疲弊はまた、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｂ型肝炎（ＨＢＶ）、およびＣ型肝炎（ＨＣＶ）などの種々のヒト慢性ウイルス感染症においても報告されている。Ｔ細胞疲弊はまた、より一般的には、マラリアおよびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓなどのある特定の非ウイルス感染症の間に生じる、抗原が持続する条件下でも発生する。
Ｔ細胞疲弊はまた、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｂ型肝炎（ＨＢＶ）、およびＣ型肝炎（ＨＣＶ）などの種々のヒト慢性ウイルス感染症においても報告されている。Ｔ細胞疲弊はまた、より一般的には、マラリアおよびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓなどのある特定の非ウイルス感染症の間に生じる、抗原が持続する条件下でも発生する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0006】
【非特許文献1】Wherry, E. (2011) Nat Immunol 12, 492-499
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0007】
したがって、慢性的に抗原刺激を受けている状況においてＴ細胞疲弊を低減および／または逆転させる、まだ対処されていない重要な必要性が存在する。
【0008】
４．概要
一態様では、疲弊Ｔ細胞からミトコンドリア置換Ｔ細胞を作製するための方法であって、ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）が減少した疲弊Ｔ細胞を、単離された外因性ミトコンドリアと共に十分な期間にわたってインキュベートして、１つ、２つまたはそれよりも多くのＴ細胞疲弊のマーカーの発現（例えば、ＰＤ－１発現）が、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞による１つ、２つまたはそれよりも多くのＴ細胞疲弊のマーカーの発現と比べて、低減したミトコンドリア置換Ｔ細胞を生成するステップを含む、方法が本明細書で提供される。具体的な実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞による１つ、２つまたはそれよりも多くのＴ細胞疲弊のマーカーの発現が低減することにより、Ｔ細胞の１つ、２つまたはそれよりも多くの改善されたエフェクター機能が示される。具体的な実施形態では、疲弊Ｔ細胞からミトコンドリア置換Ｔ細胞を作製するための方法であって、内因性ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）コピー数が減少した疲弊Ｔ細胞を、単離された外因性ミトコンドリアと共に十分な期間にわたってインキュベートして、プログラム細胞死－１（ＰＤ－１）の発現が、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現と比べて、少なくとも５％、少なくとも１０％、２０％（例えば、多くても１．２５分の１に）、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、またはそれよりも大きく低減したミトコンドリア置換Ｔ細胞を生成するステップを含む、方法が本明細書で提供される。別の実施形態では、疲弊Ｔ細胞からミトコンドリア置換Ｔ細胞を作製するための方法であって、（ａ）疲弊Ｔ細胞に、ＸｂａＩＲをコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列をエレクトロポレーションして、内因性ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）コピー数を減少させるステップと、（ｂ）内因性ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）コピー数が減少した疲弊Ｔ細胞を、単離された外因性ミトコンドリアと共に十分な期間にわたってインキュベートして、プログラム細胞死－１（ＰＤ－１）の発現が、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現と比べて、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％（例えば、多くても１．２５分の１に）、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、またはそれよりも大きく低減したミトコンドリア置換Ｔ細胞を生成するステップを含む、方法が本明細書で提供される。別の実施形態では、疲弊Ｔ細胞からミトコンドリア置換Ｔ細胞を作製するための方法であって、（ａ）疲弊Ｔ細胞に、ミトコンドリア標的化配列（ＭＴＳ）とＸｂａＩＲとを含む融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列をエレクトロポレーションして、内因性ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）コピー数を減少させるステップと、（ｂ）内因性ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）コピー数が減少した疲弊Ｔ細胞を、単離された外因性ミトコンドリアと共に十分な期間にわたってインキュベートして、プログラム細胞死－１（ＰＤ－１）の発現が、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現と比べて、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％（例えば、多くても１．２５分の１に）、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、またはそれよりも大きく低減したミトコンドリア置換Ｔ細胞を生成するステップとを含む、方法が本明細書で提供される。一部の実施形態では、核酸配列はＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）である。一部の実施形態では、核酸配列はＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ）である。
一態様では、疲弊Ｔ細胞からミトコンドリア置換Ｔ細胞を作製するための方法であって、ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）が減少した疲弊Ｔ細胞を、単離された外因性ミトコンドリアと共に十分な期間にわたってインキュベートして、１つ、２つまたはそれよりも多くのＴ細胞疲弊のマーカーの発現（例えば、ＰＤ－１発現）が、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞による１つ、２つまたはそれよりも多くのＴ細胞疲弊のマーカーの発現と比べて、低減したミトコンドリア置換Ｔ細胞を生成するステップを含む、方法が本明細書で提供される。具体的な実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞による１つ、２つまたはそれよりも多くのＴ細胞疲弊のマーカーの発現が低減することにより、Ｔ細胞の１つ、２つまたはそれよりも多くの改善されたエフェクター機能が示される。具体的な実施形態では、疲弊Ｔ細胞からミトコンドリア置換Ｔ細胞を作製するための方法であって、内因性ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）コピー数が減少した疲弊Ｔ細胞を、単離された外因性ミトコンドリアと共に十分な期間にわたってインキュベートして、プログラム細胞死－１（ＰＤ－１）の発現が、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現と比べて、少なくとも５％、少なくとも１０％、２０％（例えば、多くても１．２５分の１に）、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、またはそれよりも大きく低減したミトコンドリア置換Ｔ細胞を生成するステップを含む、方法が本明細書で提供される。別の実施形態では、疲弊Ｔ細胞からミトコンドリア置換Ｔ細胞を作製するための方法であって、（ａ）疲弊Ｔ細胞に、ＸｂａＩＲをコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列をエレクトロポレーションして、内因性ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）コピー数を減少させるステップと、（ｂ）内因性ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）コピー数が減少した疲弊Ｔ細胞を、単離された外因性ミトコンドリアと共に十分な期間にわたってインキュベートして、プログラム細胞死－１（ＰＤ－１）の発現が、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現と比べて、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％（例えば、多くても１．２５分の１に）、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、またはそれよりも大きく低減したミトコンドリア置換Ｔ細胞を生成するステップを含む、方法が本明細書で提供される。別の実施形態では、疲弊Ｔ細胞からミトコンドリア置換Ｔ細胞を作製するための方法であって、（ａ）疲弊Ｔ細胞に、ミトコンドリア標的化配列（ＭＴＳ）とＸｂａＩＲとを含む融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列をエレクトロポレーションして、内因性ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）コピー数を減少させるステップと、（ｂ）内因性ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）コピー数が減少した疲弊Ｔ細胞を、単離された外因性ミトコンドリアと共に十分な期間にわたってインキュベートして、プログラム細胞死－１（ＰＤ－１）の発現が、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現と比べて、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％（例えば、多くても１．２５分の１に）、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、またはそれよりも大きく低減したミトコンドリア置換Ｔ細胞を生成するステップとを含む、方法が本明細書で提供される。一部の実施形態では、核酸配列はＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）である。一部の実施形態では、核酸配列はＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ）である。
【0009】
具体的な態様では、疲弊Ｔ細胞からミトコンドリア置換Ｔ細胞を作製するための方法であって、内因性ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）コピー数が減少した疲弊Ｔ細胞を、単離された外因性ミトコンドリアと共に十分な期間にわたってインキュベートして、疲弊Ｔ細胞と比べて改善されたエフェクター機能を有するミトコンドリア置換Ｔ細胞を生成するステップを含む、方法が本明細書で提供される。具体的な実施形態では、疲弊Ｔ細胞からミトコンドリア置換Ｔ細胞を作製するための方法であって、内因性ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）コピー数が減少した疲弊Ｔ細胞を、単離された外因性ミトコンドリアと共に十分な期間にわたってインキュベートして、プログラム細胞死－１（ＰＤ－１）の発現が、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現と比べて、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％（例えば、多くても１．２５分の１に）、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、またはそれよりも大きく低減したミトコンドリア置換Ｔ細胞を生成するステップを含み、ミトコンドリア置換Ｔ細胞が、疲弊Ｔ細胞と比べて改善されたエフェクター機能を有する、方法が本明細書で提供される。一部の実施形態では、核酸配列はＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）である。一部の実施形態では、核酸配列はＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ）である。
【0010】
別の実施形態では、疲弊Ｔ細胞からミトコンドリア置換Ｔ細胞を作製するための方法であって、（ａ）疲弊Ｔ細胞に、ＸｂａＩＲをコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列（具体的な実施形態では、核酸配列は、ミトコンドリア標的化配列（ＭＴＳ）とＸｂａＩＲとを含む融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む）をエレクトロポレーションして、内因性ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）コピー数を減少させるステップと、（ｂ）内因性ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）コピー数が減少した疲弊Ｔ細胞を、単離された外因性ミトコンドリアと共に十分な期間にわたってインキュベートして、疲弊Ｔ細胞と比べて改善されたエフェクター機能を有するミトコンドリア置換Ｔ細胞を生成するステップとを含む、方法が本明細書で提供される。具体的な実施形態では、疲弊Ｔ細胞からミトコンドリア置換Ｔ細胞を作製するための方法であって、（ａ）疲弊Ｔ細胞に、ＸｂａＩＲをコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列（具体的な実施形態では、核酸配列は、ミトコンドリア標的化配列（ＭＴＳ）とＸｂａＩＲとを含む融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む）をエレクトロポレーションして、内因性ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）コピー数を減少させるステップと、（ｂ）内因性ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）コピー数が減少した疲弊Ｔ細胞を、単離された外因性ミトコンドリアと共に十分な期間にわたってインキュベートして、ＰＤ－１の発現が、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現と比べて、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％（例えば、多くても１．２５分の１に）、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、またはそれよりも大きく低減したミトコンドリア置換Ｔ細胞を生成するステップとを含み、ミトコンドリア置換Ｔ細胞が、疲弊Ｔ細胞と比べて改善されたエフェクター機能を有する、方法が本明細書で提供される。一部の実施形態では、核酸配列はＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）である。一部の実施形態では、核酸配列はＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ）である。
【0011】
一部の実施形態では、ＰＤ－１の発現は、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現と比べて、およそ５％～およそ６０％、およそ１０％～およそ５０％、およそ２０％～およそ５０％、およそ１０％～およそ４０％、およそ１０％～およそ３０％、およそ１０％～およそ２０％、およそ２０％～およそ４０％、またはおよそ２０％～およそ３０％低減する。
【0012】
ある特定の実施形態では、疲弊Ｔ細胞の単離された外因性ミトコンドリアとのインキュベーションは、ラパマイシンの存在下で行われる。具体的な実施形態では、ラパマイシンは１００ｎＭ～１０００ｎＭの濃度で存在する。
【0013】
ある特定の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現は、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現と比べて、多くても１．１分の１に低減する。ある特定の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現は、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現と比べて、多くても１．１５分の１に低減する。ある特定の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現は、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現と比べて、多くても１．２０分の１に低減する。ある特定の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現は、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現と比べて、多くても１．２５分の１に低減する。ある特定の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現は、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現と比べて、多くても１．３分の１に低減する。ある特定の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現は、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現と比べて、多くても１．４分の１に低減する。ある特定の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現は、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現と比べて、多くても１．５分の１に低減する。一部の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現は、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現と比べて、多くても２分の１に低減する。一部の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現は、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現と比べて、多くても５分の１に低減する。ある特定の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現は、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現と比べて、少なくとも５％低減する。ある特定の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現は、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現と比べて、多くても１０％低減する。ある特定の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現は、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現と比べて、多くても１５％低減する。ある特定の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現は、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現と比べて、多くても２０％低減する。ある特定の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現は、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現と比べて、多くても２５％低減する。ある特定の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現は、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現と比べて、多くても３０％低減する。ある特定の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現は、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現と比べて、多くても３５％低減する。ある特定の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現は、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現と比べて、多くても４０％低減する。ある特定の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現は、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現と比べて、多くても４５％低減する。ある特定の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現は、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現と比べて、多くても５０％低減する。ある特定の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現は、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現と比べて、多くても６０％低減する。一部の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現は、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現と比べて、およそ５％～およそ６０％低減する。一部の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現は、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現と比べて、およそ１０％～およそ５０％低減する。一部の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現は、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現と比べて、およそ２０％～およそ５０％低減する。一部の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現は、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現と比べて、およそ１０％～およそ４０％低減する。一部の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現は、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現と比べて、およそ１０％～およそ３０％低減する。一部の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現は、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現と比べて、およそ１０％～およそ２０％低減する。一部の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現は、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現と比べて、およそ１０％～およそ３０％低減する。一部の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現は、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現と比べて、およそ２０％～およそ４０％低減する。一部の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現は、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現と比べて、およそ１０％～およそ３０％低減する。一部の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現は、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現と比べて、およそ２０％～およそ３０％低減する。ある特定の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現は、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現と比べて、およそ１．１分の１～およそ２．０分の１に低減する。ある特定の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現は、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現と比べて、およそ１．１分の１～およそ１．７５分の１に低減する。ある特定の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現は、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現と比べて、およそ１．１分の１～およそ１．５分の１に低減する。ある特定の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現は、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現と比べて、およそ１．１分の１～およそ１．２５分の１に低減する。.ある特定の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現は、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現と比べて、およそ１．２５分の１～およそ２．０分の１に低減する。ある特定の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現は、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現と比べて、およそ１．２５分の１～およそ５．０分の１に低減する。ある特定の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現は、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現と比べて、およそ１．２５分の１～およそ１．５分の１に低減する。
【0014】
一部の実施形態では、方法により、ＰＤ－１、Ｔ細胞免疫グロブリンおよびムチンドメイン含有タンパク質３（ＴＩＭ３）、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）、Ｔ細胞免疫グロブリンおよびＩＴＩＭドメイン（ＴＩＧＩＴ）、ＴＯＸ、またはこれらの組合せの発現が低減する。
【0015】
ある特定の実施形態では、単離された外因性ミトコンドリアは、疲弊Ｔ細胞１×１０６個当たりタンパク質約２０μｇ～約８０μｇである。
【0016】
一部の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞は、少なくとも２０％の外因性ｍｔＤＮＡを含む。ある特定の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞は、ＴａｑＭａｎ一塩基多型（ＳＮＰ）アッセイによって測定して少なくとも２０％の外因性ｍｔＤＮＡかつ８０％以下の外因性ｍｔＤＮＡを含む。
【0017】
具体的な実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞が生成されるのに十分な期間は、少なくともおよそ２４時間である。ある特定の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞が生成されるのに十分な期間は、少なくとも３６時間である。一部の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞が生成されるのに十分な期間は、少なくとも４８時間である。ある特定の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞が生成されるのに十分な期間は、約２４時間～約４８時間、約３６時間～４８時間、約２４時間～約７２時間、または約４８時間～約７２時間である。
【0018】
一部の実施形態では、改善されたエフェクター機能は、以下のうちの１つ、２つもしくはそれよりも多く、または以下の全てを含む：増大した増殖、増大した細胞傷害、またはサイトカインの増加した分泌。
【0019】
ある特定の実施形態では、疲弊Ｔ細胞は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む。具体的な実施形態では、疲弊Ｔ細胞は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝子改変されている。
【0020】
別の態様では、本明細書に記載の方法によって生成されたミトコンドリア置換Ｔ細胞、およびそのような細胞を含む組成物が本明細書で提供される。
【0021】
別の態様では、有効量の本開示のミトコンドリア置換Ｔ細胞と、薬学的に許容される担体とを含む組成物が本明細書で提供される。
【0022】
別の態様では、慢性ウイルス感染症の症状の好転を、それを必要とする対象において行うための方法であって、対象に、有効量の本開示のミトコンドリア置換Ｔ細胞と、薬学的に許容される担体とを含む組成物を投与するステップを含む、方法が本明細書で提供される。ある特定の実施形態では、慢性ウイルス感染症は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染症、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染症、サイトメガロウイルス感染症（ＣＭＶ）、または重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）－コロナウイルス（ＣｏＶ）－２感染症である。具体的な実施形態では、対象はヒトである。
【0023】
別の態様では、がんの処置を、それを必要とする対象において行うための方法であって、対象に、有効量の本開示のミトコンドリア置換Ｔ細胞と、薬学的に許容される担体とを含む組成物を投与するステップを含む、方法が本明細書で提供される。具体的な実施形態では、対象はヒトである。
【0024】
別の態様では、有効量の、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする外因性ポリヌクレオチドを含むミトコンドリア置換Ｔ細胞と、薬学的に許容される担体とを含む組成物が本明細書で提供される。具体的な実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝子改変されている。
【0025】
別の態様では、がんの処置を、それを必要とする対象において行うための方法であって、対象に、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む本明細書に記載のミトコンドリア置換Ｔ細胞と、薬学的に許容される担体とを含む組成物を投与するステップを含む、方法が本明細書で提供される。別の態様では、がんの症状の好転を、それを必要とする対象において行うための方法であって、対象に、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む本明細書に記載のミトコンドリア置換Ｔ細胞と、薬学的に許容される担体とを含む組成物を投与するステップを含む、方法が本明細書で提供される。具体的な実施形態では、対象はヒトである。
【0026】
別の態様では、Ｔ細胞疲弊に関連する、Ｔ細胞疲弊が伴う、またはＴ細胞疲弊によって引き起こされる疾患または状態の処置を、それを必要とする対象において行うための方法であって、対象に、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む本明細書に記載のミトコンドリア置換Ｔ細胞を含む組成物を投与するステップを含み、疾患または状態が、（ａ）がん；（ｂ）ウイルス感染症（例えば、慢性ウイルス感染症）；（ｃ）細菌感染症；（ｄ）肥満症もしくは代謝障害；（ｅ）アルコール症；（ｆ）運動過剰；（ｇ）過度の精神的ストレス；（ｈ）低酸素症；（ｉ）傷害；（ｊ）老化；（ｋ）加齢性免疫学的機能障害；（ｌ）線維化疾患；（ｍ）黄斑疾患；（ｎ）筋肉変性疾患；または（ｏ）神経変性疾患である、方法が本明細書で提供される。別の態様では、Ｔ細胞疲弊に関連する、Ｔ細胞疲弊が伴う、またはＴ細胞疲弊によって引き起こされる疾患または状態の症状の好転を、それを必要とする対象において行うための方法であって、対象に、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む本明細書に記載のミトコンドリア置換Ｔ細胞を含む組成物を投与するステップを含み、疾患または状態が、（ａ）がん；（ｂ）ウイルス感染症（例えば、慢性ウイルス感染症）；（ｃ）細菌感染症；（ｄ）肥満症もしくは代謝障害；（ｅ）アルコール症；（ｆ）運動過剰；（ｇ）過度の精神的ストレス；（ｈ）低酸素症；（ｉ）傷害；（ｊ）老化；（ｋ）加齢性免疫学的機能障害；（ｌ）線維化疾患；（ｍ）黄斑疾患；（ｎ）筋肉変性疾患；または（ｏ）神経変性疾患である、方法が本明細書で提供される。具体的な実施形態では、対象はヒトである。
【0027】
別の態様では、Ｔ細胞疲弊に関連する、またはＴ細胞疲弊が関与する、またはＴ細胞疲弊によって引き起こされる疾患または状態の処置を、それを必要とする対象において行うための方法であって、対象に、本明細書に記載のミトコンドリア置換Ｔ細胞を含む組成物を投与するステップを含み、疾患または状態が、（ａ）ＣＤ８＋Ｔ細胞機能障害；（ｂ）ＣＤ４＋Ｔ細胞機能障害；（ｃ）Ｔ細胞プライミングの機能障害；（ｄ）メモリーＴ細胞機能障害；（ｅ）エフェクターＢ細胞機能障害；（ｆ）Ｂ細胞プライミングの機能障害；（ｇ）メモリーＢ細胞機能障害；（ｈ）先天性リンパ球系細胞機能障害；（ｉ）先天性Ｔ細胞機能障害；（ｊ）先天性Ｂ細胞機能障害、または（ｋ）（ａ）～（ｊ）の組合せである、方法が本明細書で提供される。別の態様では、（ａ）ＣＤ８＋Ｔ細胞機能障害；（ｂ）ＣＤ４＋Ｔ細胞機能障害；（ｃ）Ｔ細胞プライミングの機能障害；（ｄ）メモリーＴ細胞機能障害；（ｅ）エフェクターＢ細胞機能障害；（ｆ）Ｂ細胞プライミングの機能障害；（ｇ）メモリーＢ細胞機能障害；（ｈ）先天性リンパ球系細胞機能障害；（ｉ）先天性Ｔ細胞機能障害；（ｊ）先天性Ｂ細胞機能障害、または（ｋ）（ａ）～（ｊ）の組合せに関連するまたはそれを伴う疾患または状態の症状を好転させるための方法が本明細書で提供される。具体的な実施形態では、対象はヒトである。
５．図面の簡単な説明
５．図面の簡単な説明
【図面の簡単な説明】
【0028】
【図1】ヒトＴ細胞疲弊のモジュレーションを例示する実験系のスキーム。エフリンＢ型受容体４（ＥＰＨＢ４）特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞の、ＥＰＨＢ４を構成的に発現するヒト横紋筋肉腫細胞であるＲｈ３０との３日間の共培養により、疲弊マーカーであるＰＤ－１が増加した。３日目に、ＸｂａＩＲ ｍＲＮＡを使用してＣＡＲ－Ｔ細胞における内因性ミトコンドリアＤＮＡを枯渇させた。５日目に、正常ヒト由来線維芽細胞（ＮＨＤＦ）由来ドナーミトコンドリアをＣＡＲ－Ｔ細胞と共培養して、ミトコンドリア置換（Ｍｉｒ）ＣＡＲ－Ｔ細胞（Ｍｉｒ ＣＡＲ－Ｔ細胞）を生成させた。７日目に、ＦＡＣＳおよびＴａｑＭａｎ ＳＮＰアッセイを実施した。
【0029】
【0030】
【図3-1】７日目の、無染色ＣＡＲ－Ｔ細胞（図３Ａ）、対照としてのＣＡＲ－Ｔ細胞（図３Ｂ）、およびＭｉｒ ＣＡＲ－Ｔ細胞（図３Ｃ）におけるＣＤ３／ＰＤ－１発現のＦＡＣＳ分析。ｘ軸はＰＤ－１であり、ｙ軸はＣＤ３である。
【図3-2】同上。
【図3-3】同上。
【0031】
【図4-1】２日目のＰＤ－１抗原の発現分析（図４Ａ）、および、Ｍｉｒ ＣＡＲ－Ｔ細胞では親疲弊ＣＡＲ－Ｔ細胞と比べてＰＤ－１抗原の発現が低減していることを例示する平均蛍光強度（ＭＦＩ）の棒グラフ（図４Ｂ）。
【図4-2】同上。
【発明を実施するための形態】
【0032】
６．詳細な説明
疲弊Ｔ細胞からミトコンドリア置換Ｔ細胞を作製するための方法であって、内因性ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）コピー数が減少した疲弊Ｔ細胞を、単離された外因性ミトコンドリアと共に十分な期間にわたってインキュベートして、Ｔ細胞疲弊のマーカー（例えば、プログラム細胞死－１（ＰＤ－１））の発現が、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞によるＴ細胞疲弊のマーカーの発現と比べて、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％（例えば、多くても１．２５分の１に）、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、またはそれよりも大きく低減したミトコンドリア置換Ｔ細胞を生成するステップを伴う、方法が本明細書で提供される。本明細書に開示されるミトコンドリア置換Ｔ細胞には、例えば慢性ウイルス感染症の症状またはがんの症状を好転させるための治療としての有用性がある。
疲弊Ｔ細胞からミトコンドリア置換Ｔ細胞を作製するための方法であって、内因性ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）コピー数が減少した疲弊Ｔ細胞を、単離された外因性ミトコンドリアと共に十分な期間にわたってインキュベートして、Ｔ細胞疲弊のマーカー（例えば、プログラム細胞死－１（ＰＤ－１））の発現が、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞によるＴ細胞疲弊のマーカーの発現と比べて、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％（例えば、多くても１．２５分の１に）、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、またはそれよりも大きく低減したミトコンドリア置換Ｔ細胞を生成するステップを伴う、方法が本明細書で提供される。本明細書に開示されるミトコンドリア置換Ｔ細胞には、例えば慢性ウイルス感染症の症状またはがんの症状を好転させるための治療としての有用性がある。
【0033】
本明細書で使用される場合、「ミトコンドリア置換Ｔ細胞」という用語は、一般に、内因性ミトコンドリアおよび／または内因性ｍｔＤＮＡが外因性ミトコンドリアおよび／または外因性ｍｔＤＮＡによって置換されたＴ細胞を意味することが意図されている。ある特定の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞は、Ｔ細胞内の全ての内因性ミトコンドリアおよび／または内因性ｍｔＤＮＡが外因性ミトコンドリアおよび／または外因性ｍｔＤＮＡによって置換されたものである。具体的な実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞は、外因性ミトコンドリアによって置換された内因性ミトコンドリアを有する。そのような状況では、内因性ミトコンドリアの外因性ミトコンドリアによる置換は、ｍｔＤＮＡを評価することによって評価される。具体的な実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞は、ある特定のパーセンテージの内因性ｍｔＤＮＡが外因性ｍｔＤＮＡによって置換されたものである。一部の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞は、Ｔ細胞内の内因性ミトコンドリアおよび／または内因性ｍｔＤＮＡの約５％もしくはそれよりも多く、約１０％もしくはそれよりも多く、約２０％もしくはそれよりも多く、約３０％もしくはそれよりも多く、約４０％もしくはそれよりも多く、約５０％もしくはそれよりも多く、約６０％もしくはそれよりも多く、約７０％もしくはそれよりも多く、約８０％もしくはそれよりも多く、約９０％もしくはそれよりも多く、または約９５％もしくはそれよりも多くが外因性ミトコンドリアおよび／または外因性ｍｔＤＮＡによって置換されたものである。ある特定の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞は、Ｔ細胞内の内因性ミトコンドリアおよび／または内因性ｍｔＤＮＡの約５％～約１０％、約１０％～約２０％、約１０％～約３０％、約１０％～約４０％、約２０％～約４０％、約２５％～約５０％、約２５％～約７５％、約５０％～約７５％、約４０％～約５０％、約７５％またはそれよりも多く～約８５％、約７５％～約９５％、約３０％～約９０％、約４０％～約９０％、約５０％～約９０％、約３０％～約８５％、約４０％～約８５％、約５０％～約８５％、約３０％～約８０％、約４０％～約８０％、約５０％～約８０％、約３０％～約７５％、約４０％～約７５％、約５０％～約７５％、約６０％～約９０％、約６０％～約８５％、約６０％～約８０％、約６０％～約７５％が外因性ミトコンドリアおよび／または外因性ｍｔＤＮＡによって置換されたものである。一部の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞は、Ｔ細胞内の内因性ミトコンドリアおよび／または内因性ｍｔＤＮＡの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％が外因性ミトコンドリアおよび／または外因性ｍｔＤＮＡによって置換されたものである。
【0034】
本明細書で使用される場合、「単離された」という用語は、ミトコンドリアに関して使用される場合、一般に、その天然の生物学的環境の他の細胞構成成分から物理的に分離されたまたは取り出されたミトコンドリアを指す。具体的な実施形態では、下記の実施例に記載されている技法を使用してミトコンドリアを単離する。
【0035】
本明細書で使用される場合、「単離された」という用語は、細胞に関して使用される場合、一般に、参照される細胞が天然に見いだされる場合の少なくとも１つの構成成分を実質的に含まない細胞を意味する。用語は、その天然の環境において見いだされる場合の一部または全部の構成成分から取り出された細胞を含む。用語はまた、細胞が天然に存在しない環境において見いだされる場合の少なくとも１つ、一部または全部の構成成分から取り出された細胞も含む。したがって、単離された細胞は、それが天然に見いだされる場合、または天然に存在しない環境において成長する、貯蔵されるもしくは存在する場合の他の物質から部分的にまたは完全に分離されたものである。単離された細胞の具体的な例として、他の細胞型（例えば、非Ｔ細胞）から富化された、部分的に純粋な細胞（例えば、Ｔ細胞）、および実質的に純粋な細胞（例えば、Ｔ細胞）が挙げられる。したがって、単離されたものである参照される細胞は、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％、他の細胞および／または物質を含まず純粋なものであり得る。具体的な実施形態では、下記の実施例に記載されている技法を使用して、参照される細胞を単離する。
【0036】
本明細書で使用される場合、「外因性」という用語は、当業者には一般に理解される。一般に、「外因性」という用語は、レシピエント細胞に由来するものではない細胞内材料（例えば、ミトコンドリアまたはｍｔＤＮＡ）を指す。例えば、下記の実施例に記載のように、外因性ミトコンドリアまたはｍｔＤＮＡを、Ｔ細胞に導入された線維芽細胞から単離することができる。
【0037】
本明細書で使用される場合、「内因性」という用語は、当業者には一般に理解される。一般に、「内因性」という用語は、レシピエント細胞に対してネイティブな細胞内材料（例えば、ミトコンドリアまたはｍｔＤＮＡ）を指す。
【0038】
本明細書で使用される場合、「有効量」という用語は、一般に、関連性のある条件下で所望の結果（複数可）を実現するために必要な化合物または組成物の量を指す。
【0039】
本明細書で使用される場合、「約」または「およそ」という用語は、数と併せて使用される場合、一般に、参照される数だけでなく、参照される数の１％、５％、１０％、１５％または２０％以内の任意の数を指す。
【0040】
本明細書で使用される場合、「十分な期間」という用語は、一般に、所望の結果（複数可）がもたらされる時間の量を指す。
【0041】
本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、一般に、動物を意味することが意図されている。対象は、ヒトまたは非ヒト哺乳動物、例えば、イヌ、ネコ、ウシ科動物、ウマ科動物、マウス、ラット、ウサギ、またはこれらのトランスジェニック種であり得る。「対象」は、「患者」、例えばヒト患者を指す場合もあることが理解される。
【0042】
本明細書で使用される場合、「ＸｂａＩＲ」という用語は、以下のＤＮＡの配列を認識し、切断する制限エンドヌクレアーゼＸｂａＩであるという典型的な意味を有する：
【化1】
【0043】
本明細書で使用される場合、「実質的に含まない」という用語は、一般に、適当なアッセイ（例えば、ヌクレオチドに関してはＰＣＲ、またはタンパク質に関してはイムノアッセイ）の検出閾値またはそれに近い量を意味することが意図されている。用語は、ＸｂａＩＲまたはＸｂａＩをコードするヌクレオチド（例えば、ＭＴＳとＸｂａＩＲとを含む融合タンパク質）に関して使用される場合、一般に、ｍｔＤＮＡの置換に干渉しない量を意味することが意図されている。
【0044】
本明細書で提供される実施形態の実施には、別段の指定のない限り、当業者の技能の範囲内である分子生物学、微生物学、および免疫学の従来の技法が用いられる。そのような技法は、文献において十分に説明されている。参考とするのに特に適したテキストの例として、以下が挙げられる：Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York (2001); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, MD (1999); Glover, ed., DNA Cloning, Volumes I and II (1985); Gait, ed., Oligonucleotide Synthesis (1984); Hames & Higgins, eds., Nucleic Acid Hybridization (1984); Hames & Higgins, eds., Transcription and Translation (1984); Freshney, ed., Animal Cell Culture: Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, 1986); Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, London); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice (Springer Verlag, N.Y., 2d ed. 1987); and Weir & Blackwell, eds., Handbook of Experimental Immunology, Volumes I-IV (1986)。
６．１ 疲弊Ｔ細胞からミトコンドリア置換Ｔ細胞を作製する方法
６．１ 疲弊Ｔ細胞からミトコンドリア置換Ｔ細胞を作製する方法
【0045】
本開示は、外因性ミトコンドリアの疲弊Ｔ細胞への導入により、Ｔ細胞疲弊表現型を減少させることができるという発見に一部基づく。さらに、本開示は、外因性ミトコンドリアの疲弊Ｔ細胞への導入により、疲弊Ｔ細胞のエフェクター機能を改善することができるという発見に一部基づく。したがって、一態様では、疲弊Ｔ細胞からミトコンドリア置換Ｔ細胞を作製するための方法であって、内因性ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）コピー数が減少した疲弊Ｔ細胞を、単離された外因性ミトコンドリアと共に十分な期間にわたってインキュベートして、少なくとも１つのＴ細胞疲弊のマーカー（例えば、ＰＤ－１発現またはＩＬ－２分泌）のレベルが、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞による少なくとも１つのＴ細胞疲弊のマーカーのレベルと比べて、変更された（例えば、低減または増加した）ミトコンドリア置換Ｔ細胞を生成するステップを含む、方法が本明細書で提供される。ある特定の実施形態では、少なくとも１つのＴ細胞疲弊のマーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも０．１倍に増加するか、または０．１分の１に低減する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも０．２倍に増加するか、または０．２分の１に低減する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも０．３倍に増加するか、または０．３分の１に低減する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも０．４倍に増加するか、または０．４分の１に低減する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも０．５倍に増加するか、または０．５分の１に低減する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも０．６倍に増加するか、または０．６分の１に低減する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも０．７倍に増加するか、または０．７分の１に低減する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも０．８倍に増加するか、または０．８分の１に低減する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも０．９倍に増加するか、または０．９分の１に低減する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも１．０倍に増加するか、または１．０分の１に低減する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも１．１倍に増加するか、または１．１分の１に低減する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも１．１５倍に増加するか、または１．１５分の１に低減する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも１．２０倍に増加するか、または１．２０分の１に低減する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも１．２５倍に増加するか、または１．２５分の１に低減する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも１．３倍に増加するか、または１．３分の１に低減する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも１．４倍に増加するか、または１．４分の１に低減する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも１．５倍に増加するか、または１．５分の１に低減する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも１．７５倍に増加するか、または１．７５分の１に低減する。一部の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも２倍に増加するか、または２分の１に低減する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも２．５倍に増加するか、または２．５分の１に低減する。一部の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも３倍に増加するか、または３分の１に低減する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも４倍に増加するか、または４分の１に低減する。一部の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも５倍に増加するか、または５分の１に低減する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、およそ０．２倍の増加～およそ１．２５倍の増加を示すか、またはおよそ０．２分の１の減少～およそ１．２５分の１の減少を示す。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、およそ０．２倍の増加～およそ１．０倍の増加を示すか、またはおよそ０．２分の１の減少～およそ１．０分の１の減少を示す。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、およそ０．２倍の増加～およそ０．８倍の増加を示すか、またはおよそ０．２分の１の減少～およそ０．８分の１の減少を示す。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、およそ０．２倍の増加～およそ０．６倍の増加を示すか、またはおよそ０．２分の１の減少～およそ０．６分の１の減少を示す。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、およそ０．８倍の増加～およそ１．２５倍の増加を示すか、またはおよそ０．８分の１の減少～およそ１．２５分の１の減少を示す。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、およそ０．５倍の増加～およそ１．２５倍の増加を示すか、またはおよそ０．５分の１の減少～およそ１．２５分の１の減少を示す。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、およそ０．８倍の増加～およそ１．０倍の増加を示すか、またはおよそ０．８分の１の減少～およそ１．０分の１の減少を示す。一部の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、およそ１．２５倍～およそ１．５０倍、およそ１．５０倍～およそ２倍、およそ１．７５倍～およそ２倍、もしくはおよそ２倍～およそ４倍に増加するか、またはおよそ１．２５分の１～およそ１．５０分の１、およそ１．５０分の１～およそ２分の１、およそ１．７５分の１～およそ２分の１、もしくはおよそ２分の１～およそ４分の１に減少する。具体的な実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞における２つ、３つまたはそれよりも多くのＴ細胞疲弊のマーカーのレベルが、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞による２つ、３つまたはそれよりも多くのマーカーのレベルと比べて変更される。具体的な実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞による１つ、２つ、３つまたはそれよりも多くのＴ細胞疲弊のマーカーのレベルが、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、変更されることにより、Ｔ細胞の１つ、２つまたはそれよりも多くの改善されたエフェクター機能が示される。ある特定の実施形態では、１つ、２つ、３つまたはそれよりも多くのＴ細胞疲弊のマーカーのレベルが、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、ＲＮＡレベルで変更される。一部の実施形態では、１つ、２つ、３つまたはそれよりも多くのＴ細胞疲弊のマーカーのレベルが、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、タンパク質レベルで変更される。ある特定の実施形態では、１つ、２つ、３つまたはそれよりも多くのＴ細胞疲弊のマーカーのレベルが、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、ＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルで変更される。ある特定の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞を生成するための本明細書で提供される方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで実施される。
【0046】
したがって、一態様では、疲弊Ｔ細胞からミトコンドリア置換Ｔ細胞を作製するための方法であって、内因性ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）コピー数が減少した疲弊Ｔ細胞を、単離された外因性ミトコンドリアと共に十分な期間にわたってインキュベートして、少なくとも１つのＴ細胞疲弊のマーカー（例えば、ＰＤ－１発現またはＩＬ－２分泌）のレベルが、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞による少なくとも１つのＴ細胞疲弊のマーカーのレベルと比べて、変更された（例えば、低減または増加した）ミトコンドリア置換Ｔ細胞を生成するステップを含む、方法が本明細書で提供される。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーが、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも５％増加または低減する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーが、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも１０％増加または低減する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーが、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも１５％増加または低減する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーが、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも２０％増加または低減する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーが、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも２５％増加または低減する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーが、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも３０％増加または低減する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーが、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも３５％増加または低減する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーが、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも４０％増加または低減する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーが、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、およそ４５％増加または低減する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーが、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも５０％増加または低減する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーが、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも６０％増加または低減する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーが、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも７０％増加または低減する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーが、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも８０％増加または低減する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーが、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも９０％増加または低減する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーが、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも９５％増加または低減する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも１００％増加する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも２００％増加する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも３００％増加する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも４００％増加する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも５００％増加する。一部の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、およそ５％～およそ５０％、およそ１０％～およそ５０％、およそ１０％～およそ４０％、およそ１０％～およそ３０％、およそ２０％～およそ５０％、およそ２０％～およそ４０％、１０％～およそ２０％、およそ２０％～およそ３０％、およそ２５％～およそ５０％、またはおよそ４０％～およそ６０％増加または低減する。具体的な実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞における２つ、３つまたはそれよりも多くのＴ細胞疲弊のマーカーのレベルが、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞による２つ、３つまたはそれよりも多くのマーカーのレベルと比べて変更される。具体的な実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞による１つ、２つ、３つまたはそれよりも多くのＴ細胞疲弊のマーカーのレベルが、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、変更されることにより、Ｔ細胞の１つ、２つまたはそれよりも多くの改善されたエフェクター機能が示される。ある特定の実施形態では、１つ、２つ、３つまたはそれよりも多くのＴ細胞疲弊のマーカーのレベルが、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、ＲＮＡレベルで変更される。一部の実施形態では、１つ、２つ、３つまたはそれよりも多くのＴ細胞疲弊のマーカーのレベルが、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、タンパク質レベルで変更される。ある特定の実施形態では、１つ、２つ、３つまたはそれよりも多くのＴ細胞疲弊のマーカーのレベルが、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、ＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルで変更される。ある特定の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞を生成するための本明細書で提供される方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで実施される。
【0047】
別の態様では、疲弊Ｔ細胞からミトコンドリア置換Ｔ細胞を作製するための方法であって、（ａ）疲弊Ｔ細胞に、ＸｂａＩＲをコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列（具体的な実施形態では、核酸配列は、ミトコンドリア標的化配列（ＭＴＳ）とＸｂａＩＲとを含む融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む）を用いたトランスフェクトまたは形質転換を行って、内因性ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）コピー数を減少させるステップと、（ｂ）ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）が減少した疲弊Ｔ細胞を、単離された外因性ミトコンドリアと共に十分な期間にわたってインキュベートして、少なくとも１つのＴ細胞疲弊のマーカー（例えば、ＰＤ－１発現またはＩＬ－２分泌）のレベルが、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞による少なくとも１つのＴ細胞疲弊のマーカーのレベルと比べて、変更された（例えば、低減または増加した）ミトコンドリア置換Ｔ細胞を生成するステップとを含む、方法が本明細書で提供される。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも０．１倍に増加するか、または０．１分の１に低減する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも０．２倍に増加するか、または０．２分の１に低減する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも０．３倍に増加するか、または０．３分の１に低減する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも０．４倍に増加するか、または０．４分の１に低減する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも０．５倍に増加するか、または０．５分の１に低減する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも０．６倍に増加するか、または０．６分の１に低減する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも０．７倍に増加するか、または０．７分の１に低減する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも０．８倍に増加するか、または０．８分の１に低減する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも０．９倍に増加するか、または０．９分の１に低減する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも１．０倍に増加するか、または１．０分の１に低減する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも１．１倍に増加するか、または１．１分の１に低減する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも１．１５倍に増加するか、または１．１５分の１に低減する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも１．２０倍に増加するか、または１．２０分の１に低減する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも１．２５倍に増加するか、または１．２５分の１に低減する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも１．３倍に増加するか、または１．３分の１に低減する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも１．４倍に増加するか、または１．４分の１に低減する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも１．５倍に増加するか、または１．５分の１に低減する。一部の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも２倍に増加するか、または多くても２分の１に低減する。一部の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも２．５倍に増加するか、または多くても２．５分の１に低減する。一部の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも３倍に増加するか、または多くても３分の１に低減する。一部の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも５倍に増加するか、または多くても５分の１に低減する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、およそ０．２倍～およそ１．２５倍に増加するか、またはおよそ０．２分の１～およそ１．２５分の１に低減する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、およそ０．２倍～およそ１．０倍に増加するか、またはおよそ０．２分の１～およそ１．０分の１に低減する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、およそ０．２倍～およそ０．８倍に増加するか、またはおよそ０．２分の１～およそ０．８分の１に低減する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、およそ０．２倍～およそ０．６倍に増加するか、またはおよそ０．２分の１～およそ０．６分の１に低減する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、およそ０．８倍～およそ１．２５倍に増加するか、またはおよそ０．８分の１～およそ１．２５分の１に低減する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、およそ０．５倍～およそ１．２５倍に増加するか、またはおよそ０．５分の１～およそ１．２５分の１に低減する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、およそ０．８倍～およそ１．０倍に増加するか、またはおよそ０．８分の１～およそ１．０分の１に低減する。一部の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、およそ１．２５倍～およそ１．５０倍、およそ１．５０倍～およそ２倍、およそ１．７５倍～およそ２倍、もしくはおよそ２倍～およそ４倍に増加するか、またはおよそ１．２５分の１～およそ１．５０分の１、およそ１．５０分の１～およそ２分の１、およそ１．７５分の１～およそ２分の１、もしくはおよそ２分の１～およそ４分の１に低減する。
【0048】
別の態様では、疲弊Ｔ細胞からミトコンドリア置換Ｔ細胞を作製するための方法であって、（ａ）疲弊Ｔ細胞に、ＸｂａＩＲをコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列（具体的な実施形態では、核酸配列は、ミトコンドリア標的化配列（ＭＴＳ）とＸｂａＩＲとを含む融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む）を用いたトランスフェクトまたは形質転換を行って、内因性ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）コピー数を減少させるステップと、（ｂ）ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）が減少した疲弊Ｔ細胞を、単離された外因性ミトコンドリアと共に十分な期間にわたってインキュベートして、少なくとも１つのＴ細胞疲弊のマーカー（例えば、ＰＤ－１発現またはＩＬ－２分泌）のレベルが、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞による少なくとも１つのＴ細胞疲弊のマーカーのレベルと比べて変更された（例えば、低減または増加した）ミトコンドリア置換Ｔ細胞を生成するステップとを含む、方法が本明細書で提供される。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも５％増加または低減する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも１０％増加または低減する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも１５％増加または低減する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも２０％増加または低減する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも２５％増加または低減する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも３０％増加または低減する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも３５％増加または低減する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも４０％増加または低減する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、およそ４５％増加または低減する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも５０％増加または低減する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも６０％増加または低減する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも７０％増加または低減する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも８０％増加または低減する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも９０％増加または低減する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも９５％増加または低減する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも１００％増加する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも２００％増加する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも３００％増加する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも４００％増加する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも５００％増加する。一部の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、およそ５％～およそ５０％、およそ１０％～およそ５０％、およそ１０％～およそ４０％、およそ１０％～およそ３０％、およそ２０％～およそ５０％、およそ２０％～およそ４０％、１０％～およそ２０％、およそ２０％～およそ３０％、およそ２５％～およそ５０％、またはおよそ４０％～およそ６０％増加または低減する。具体的な実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞における２つ、３つまたはそれよりも多くのＴ細胞疲弊のマーカーのレベルが、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞による２つ、３つまたはそれよりも多くのマーカーのレベルと比べて変更される。具体的な実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞による１つ、２つ、３つまたはそれよりも多くのＴ細胞疲弊のマーカーのレベルが、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、変更されることにより、Ｔ細胞の１つ、２つまたはそれよりも多くの改善されたエフェクター機能が示される。ある特定の実施形態では、１つ、２つ、３つまたはそれよりも多くのＴ細胞疲弊のマーカーのレベルが、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、ＲＮＡレベルで変更される。一部の実施形態では、１つ、２つ、３つまたはそれよりも多くのＴ細胞疲弊のマーカーのレベルが、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、タンパク質レベルで変更される。ある特定の実施形態では、１つ、２つ、３つまたはそれよりも多くのＴ細胞疲弊のマーカーのレベルが、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、ＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルで変更される。ある特定の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞を生成するための本明細書で提供される方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで実施される。
【0049】
具体的な態様では、疲弊Ｔ細胞からミトコンドリア置換Ｔ細胞を作製するための方法であって、（ａ）疲弊Ｔ細胞に、ＸｂａＩＲをコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列（具体的な実施形態では、核酸配列は、ミトコンドリア標的化配列（ＭＴＳ）とＸｂａＩＲとを含む融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む）をエレクトロポレーションして、内因性ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）コピー数を減少させるステップと、（ｂ）ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）が減少した疲弊Ｔ細胞を、単離された外因性ミトコンドリアと共に十分な期間にわたってインキュベートして、少なくとも１つのＴ細胞疲弊のマーカー（例えば、ＰＤ－１発現またはＩＬ－２分泌）のレベルが、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞による少なくとも１つのＴ細胞疲弊のマーカーのレベルと比べて変更された（例えば、低減または増加した）ミトコンドリア置換Ｔ細胞を生成するステップとを含む、方法が本明細書で提供される。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーが、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも０．１倍に増加するか、または０．１分の１に低減する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーが、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも０．２倍に増加するか、または０．２分の１に低減する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーが、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも０．３倍に増加するか、または０．３分の１に低減する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーが、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも０．４倍に増加するか、または０．４分の１に低減する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーが、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも０．５倍に増加するか、または０．５分の１に低減する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーが、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも０．６倍に増加するか、または０．６分の１に低減する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーが、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも０．７倍に増加するか、または０．７分の１に低減する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーが、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも０．８倍に増加するか、または０．８分の１に低減する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーが、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも０．９倍に増加するか、または０．９分の１に低減する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーが、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも１．０倍に増加するか、または１．０分の１に低減する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーが、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも１．１倍に増加するか、または１．１分の１に低減する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーが、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも１．１５倍に増加するか、または１．１５分の１に低減する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーが、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも１．２倍に増加するか、または１．２分の１に低減する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーが、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも１．２５倍に増加するか、または１．２５分の１に低減する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーが、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも１．３倍に増加するか、または１．３分の１に低減する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーが、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも１．４倍に増加するか、または１．４分の１に低減する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーが、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも１．５倍に増加するか、または１．５分の１に低減する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーが、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも１．７５倍に増加するか、または１．７５分の１に低減する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーが、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも２．５倍に増加するか、または２．５分の１に低減する。一部の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも３倍に増加するか、または多くても３分の１に低減する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーが、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも４倍に増加するか、または４分の１に低減する。一部の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも２倍に増加するか、または多くても２分の１に低減する。一部の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも５倍に増加するか、または多くても５分の１に低減する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、およそ０．２倍の増加～およそ１．２５倍の増加を示すか、またはおよそ０．２分の１の低減～およそ１．２５分の１の低減を示す。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、およそ０．２倍の増加～およそ１．０倍の増加を示すか、またはおよそ０．２分の１の低減～およそ１．０分の１の低減を示す。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、およそ０．２倍の増加～およそ０．８倍の増加を示すか、またはおよそ０．２分の１の低減～およそ０．８分の１の低減を示す。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、およそ０．２倍の増加～およそ０．６倍の増加を示すか、またはおよそ０．２分の１の低減～およそ０．６分の１の低減を示す。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、およそ０．８倍の増加～およそ１．２５倍の増加を示すか、またはおよそ０．８分の１の低減～およそ１．２５分の１の低減を示す。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、およそ０．５倍の増加～およそ１．２５倍の増加を示すか、またはおよそ０．５分の１の低減～およそ１．２５分の１の低減を示す。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、およそ０．８倍の増加～およそ１．０倍の増加を示すか、またはおよそ０．８分の１の低減～およそ１．０分の１の低減を示す。一部の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、およそ１．２５倍～およそ１．５０倍、およそ１．５０倍～およそ２倍、およそ１．７５倍～およそ２倍、もしくはおよそ２倍～およそ４倍に増加するか、またはおよそ１．２５分の１～およそ１．５０分の１、およそ１．５０分の１～およそ２分の１、およそ１．７５分の１～およそ２分の１、もしくはおよそ２分の１～およそ４分の１に低減する。具体的な実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞における２つ、３つまたはそれよりも多くのＴ細胞疲弊のマーカーのレベルが、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞による２つ、３つまたはそれよりも多くのマーカーのレベルと比べて変更される。具体的な実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞による１つ、２つ、３つまたはそれよりも多くのＴ細胞疲弊のマーカーのレベルが、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、変更されることにより、Ｔ細胞の１つ、２つまたはそれよりも多くの改善されたエフェクター機能が示される。ある特定の実施形態では、１つ、２つ、３つまたはそれよりも多くのＴ細胞疲弊のマーカーのレベルが、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、ＲＮＡレベルで変更される。一部の実施形態では、１つ、２つ、３つまたはそれよりも多くのＴ細胞疲弊のマーカーのレベルが、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、タンパク質レベルで変更される。ある特定の実施形態では、１つ、２つ、３つまたはそれよりも多くのＴ細胞疲弊のマーカーのレベルが、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、ＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルで変更される。ある特定の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞を生成するための本明細書で提供される方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで実施される。
【0050】
具体的な態様では、疲弊Ｔ細胞からミトコンドリア置換Ｔ細胞を作製するための方法であって、（ａ）疲弊Ｔ細胞に、ＸｂａＩＲをコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列（具体的な実施形態では、核酸配列は、ミトコンドリア標的化配列（ＭＴＳ）とＸｂａＩＲとを含む融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む）をエレクトロポレーションして、内因性ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）コピー数を減少させるステップと、（ｂ）ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）が減少した疲弊Ｔ細胞を、単離された外因性ミトコンドリアと共に十分な期間にわたってインキュベートして、少なくとも１つのＴ細胞疲弊のマーカー（例えば、ＰＤ－１発現またはＩＬ－２分泌）のレベルが、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞による少なくとも１つのＴ細胞疲弊のマーカーのレベルと比べて変更された（例えば、低減または増加した）ミトコンドリア置換Ｔ細胞を生成するステップとを含む、方法が本明細書で提供される。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも５％増加または低減する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも１０％増加または低減する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも１５％増加または低減する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも２０％増加または低減する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも２５％増加または低減する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも３０％増加または低減する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも３５％増加または低減する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも４０％増加または低減する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、およそ４５％増加または低減する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも５０％増加または低減する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも６０％増加または低減する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも７０％増加または低減する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも８０％増加または低減する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも９０％増加または低減する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも９５％増加または低減する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも１００％増加する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも２００％増加する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも３００％増加する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも４００％増加する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、少なくとも５００％増加する。一部の実施形態では、少なくとも１つの疲弊マーカーは、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、およそ５％～およそ５０％、およそ１０％～およそ５０％、およそ１０％～およそ４０％、およそ１０％～およそ３０％、およそ２０％～およそ５０％、およそ２０％～およそ４０％、１０％～およそ２０％、およそ２０％～およそ３０％、およそ２５％～およそ５０％、またはおよそ４０％～およそ６０％増加または低減する。具体的な実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞における２つ、３つまたはそれよりも多くのＴ細胞疲弊のマーカーのレベルが、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞による２つ、３つまたはそれよりも多くのマーカーのレベルと比べて変更される。具体的な実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞による１つ、２つ、３つまたはそれよりも多くのＴ細胞疲弊のマーカーのレベルが、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、変更されることにより、Ｔ細胞の１つ、２つまたはそれよりも多くの改善されたエフェクター機能が示される。ある特定の実施形態では、１つ、２つ、３つまたはそれよりも多くのＴ細胞疲弊のマーカーのレベルが、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、ＲＮＡレベルで変更される。一部の実施形態では、１つ、２つ、３つまたはそれよりも多くのＴ細胞疲弊のマーカーのレベルが、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、タンパク質レベルで変更される。ある特定の実施形態では、１つ、２つ、３つまたはそれよりも多くのＴ細胞疲弊のマーカーのレベルが、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、ＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルで変更される。ある特定の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞を生成するための本明細書で提供される方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで実施される。
【0051】
種々のＴ細胞疲弊のマーカーが当技術分野で公知である。Ｔ細胞疲弊マーカーの非限定的な例としては、機能的Ｔ細胞と比べた「免疫チェックポイント受容体」と称される免疫応答を阻害する細胞表面分子［例えば、プログラム細胞死－１（ＰＤ－１）、Ｔ細胞免疫グロブリンおよびムチンドメイン含有タンパク質３（ＴＩＭ３）、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）、Ｔ細胞免疫グロブリンおよびＩＴＩＭドメイン（ＴＩＧＩＴ）、ＣＤ１６０、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）、２Ｂ４／ＣＤ２４４／ＳＬＡＭＦ４］の発現の上昇、ケモカイン（例えば、ＴＮＦ－アルファ、インターフェロン－ガンマ、ｃｃ（ベータ））の産生の低減、ならびにサイトカイン産生（例えば、ＩＬ－２）の低減が挙げられる。Ｔ細胞機能を決定するためのアッセイは当技術分野で公知であり、それらとして、６．３節に記載されているものなどのアッセイが挙げられる。
【0052】
一部の実施形態では、疲弊Ｔ細胞は、機能的Ｔ細胞と比べてレベルが上昇したＴ細胞疲弊マーカーを含む。ある特定の実施形態では、疲弊Ｔ細胞は、機能的Ｔ細胞と比べて発現が増大した、ＰＤ－１、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１５０、ＣＴＬＡ－４、または２Ｂ４／ＣＤ２４４／ＳＬＡＭＦ４からなる群から選択される免疫チェックポイント受容体を含む。一部の実施形態では、疲弊Ｔ細胞は、機能的Ｔ細胞と比べて発現が増大したＰＤ－１を含む。一部の実施形態では、疲弊Ｔ細胞は、機能的Ｔ細胞と比べて発現が増大したＴＩＭ３を含む。一部の実施形態では、疲弊Ｔ細胞は、機能的Ｔ細胞と比べて発現が増大したＬＡＧ３を含む。一部の実施形態では、疲弊Ｔ細胞は、機能的Ｔ細胞と比べて発現が増大したＴＩＧＩＴを含む。一部の実施形態では、疲弊Ｔ細胞は、機能的Ｔ細胞と比べて発現が増大したＣＤ１５０を含む。一部の実施形態では、疲弊Ｔ細胞は、機能的Ｔ細胞と比べて発現が増大したＣＴＬＡ－４を含む。一実施形態では、疲弊Ｔ細胞は、機能的Ｔ細胞と比べて発現が増大した２Ｂ４／ＣＤ２４４／ＳＬＡＭＦ４を含む。
【0053】
一部の実施形態では、疲弊Ｔ細胞は、機能的Ｔ細胞と比べて発現が増大した、ＴＯＸ、ＴＯＸ２、およびＮＲ４Ａからなる群から選択される転写因子を含む。一部の実施形態では、疲弊Ｔ細胞は、機能的Ｔ細胞と比べて発現が増大したＴＯＸを含む。一部の実施形態では、疲弊Ｔ細胞は、機能的Ｔ細胞と比べて発現が増大したＴＯＸ２を含む。一部の実施形態では、疲弊Ｔ細胞は、機能的Ｔ細胞と比べて発現が増大したＮＲ４Ａを含む。
【0054】
一部の実施形態では、疲弊Ｔ細胞は、機能的Ｔ細胞と比べてレベルが低下したＴ細胞疲弊マーカーを含む。ある特定の実施形態では、疲弊Ｔ細胞は、機能的Ｔ細胞と比べて低減したケモカイン産生（例えば、ＴＮＦ－アルファ、インターフェロン－ガンマ、ＣＣ（β－ケモカイン））、および／または低減したサイトカイン産生（例えば、ＩＬ－２）を含む。一部の実施形態では、疲弊Ｔ細胞は、機能的Ｔ細胞と比べて低減したＴＮＦ－αの産生を含む。一部の実施形態では、疲弊Ｔ細胞は、機能的Ｔ細胞と比べて低減したＩＦＮ－γの産生を含む。一部の実施形態では、疲弊Ｔ細胞は、機能的Ｔ細胞と比べて低減したＣＣケモカインの産生を含む。一部の実施形態では、疲弊Ｔ細胞は、機能的Ｔ細胞と比べて低減したＩＬ－２の産生を含む。
【0055】
したがって、一実施形態では、本開示の疲弊Ｔ細胞では免疫チェックポイント受容体の発現が増大しており、本明細書で提供される方法に従って疲弊Ｔ細胞から作製されたミトコンドリア置換Ｔ細胞では疲弊Ｔ細胞と比べて免疫チェックポイント受容体の発現が低減している。ある特定の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞では少なくともＰＤ－１の発現が疲弊Ｔ細胞と比べて低減している。具体的な実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞ではＰＤ－１発現は、疲弊Ｔ細胞と比べて少なくとも１０％低減する。具体的な実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞ではＰＤ－１発現は、疲弊Ｔ細胞と比べて少なくとも２０％低減する。具体的な実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞ではＰＤ－１発現は、疲弊Ｔ細胞と比べて少なくとも３０％低減する。具体的な実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞ではＰＤ－１発現は、疲弊Ｔ細胞と比べて少なくとも４０％低減する。具体的な実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞ではＰＤ－１発現は、疲弊Ｔ細胞と比べて少なくとも５０％低減する。具体的な実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞ではＰＤ－１発現は、疲弊Ｔ細胞と比べて少なくとも６０％低減する。具体的な実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞ではＰＤ－１発現は、疲弊Ｔ細胞と比べて少なくとも７０％低減する。具体的な実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞ではＰＤ－１発現は、疲弊Ｔ細胞と比べて少なくとも８０％低減する。具体的な実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞ではＰＤ－１発現は、疲弊Ｔ細胞と比べて少なくとも９０％低減する。具体的な実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞ではＰＤ－１発現は、疲弊Ｔ細胞と比べて少なくとも９５％低減する。一部の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞では、ＰＤ－１発現が、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、およそ５％～およそ５０％、およそ１０％～およそ５０％、およそ１０％～およそ４０％、およそ１０％～およそ３０％、およそ２０％～およそ５０％、およそ２０％～およそ４０％、およそ１０％～およそ２０％、およそ２０％～およそ３０％、およそ２５％～およそ５０％、またはおよそ４０％～およそ６０％低減する。
【0056】
具体的な実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞では、ＰＤ－１発現が、疲弊Ｔ細胞と比べて多くても１．１分の１に低減する。具体的な実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞では、ＰＤ－１発現が、疲弊Ｔ細胞と比べて多くても１．２分の１に低減する。具体的な実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞では、ＰＤ－１発現が、疲弊Ｔ細胞と比べて多くても１．２５分の１に低減する。具体的な実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞では、ＰＤ－１発現が、疲弊Ｔ細胞と比べて多くても１．３分の１に低減する。具体的な実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞では、ＰＤ－１発現が、疲弊Ｔ細胞と比べて多くても１．４分の１に低減する。具体的な実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞では、ＰＤ－１発現が、疲弊Ｔ細胞と比べて多くても１．５分の１に低減する。具体的な実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞では、ＰＤ－１発現が、疲弊Ｔ細胞と比べて多くても１．６分の１に低減する。具体的な実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞では、ＰＤ－１発現が、疲弊Ｔ細胞と比べて多くても１．７分の１に低減する。具体的な実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞では、ＰＤ－１発現が、疲弊Ｔ細胞と比べて多くても１．８分の１に低減する。具体的な実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞では、ＰＤ－１発現が、疲弊Ｔ細胞と比べて多くても１．９分の１に低減する。具体的な実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞では、ＰＤ－１発現が、疲弊Ｔ細胞と比べて多くても２分の１に低減する。具体的な実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞では、ＰＤ－１発現が、疲弊Ｔ細胞と比べて多くても３分の１に低減する。具体的な実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞では、ＰＤ－１発現が、疲弊Ｔ細胞と比べて多くても４分の１に低減する。具体的な実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞では、ＰＤ－１発現が、疲弊Ｔ細胞と比べて多くても５分の１に低減する。具体的な実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞では、ＰＤ－１発現が、疲弊Ｔ細胞と比べて５分の１よりも大きく低減する。ある特定の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞では、ＰＤ－１発現が、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、およそ０．２分の１～およそ１．２５分の１に低減する。ある特定の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞では、ＰＤ－１発現が、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、およそ０．２分の１～およそ１．０分の１に低減する。ある特定の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞では、ＰＤ－１発現が、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、およそ０．２分の１～およそ０．８分の１に低減する。ある特定の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞では、ＰＤ－１発現が、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、およそ０．２分の１～およそ０．６分の１に低減する。ある特定の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞では、ＰＤ－１発現が、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、およそ０．８分の１～およそ１．２５分の１に低減する。ある特定の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞では、ＰＤ－１発現が、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、およそ０．５分の１～およそ１．２５分の１に低減する。ある特定の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞では、ＰＤ－１発現が、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、およそ０．８分の１～およそ１．０分の１に低減する。一部の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞では、ＰＤ－１発現が、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて、およそ１．２５分の１～およそ１．５０分の１、およそ１．５０分の１～およそ２分の１、およそ１．７５分の１～およそ２分の１、またはおよそ２分の１～およそ４分の１に低減する。
【0057】
具体的な実施形態では、疲弊Ｔ細胞からミトコンドリア置換Ｔ細胞を作製するための方法であって、内因性ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）コピー数が減少した疲弊Ｔ細胞を、単離された外因性ミトコンドリアと共に十分な期間にわたってインキュベートして、プログラム細胞死－１（ＰＤ－１）の発現が、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現と比べて、多くても１．１分の１に低減したミトコンドリア置換Ｔ細胞を生成するステップを含む、方法が本明細書で提供される。ある特定の実施形態では、ＰＤ－１発現は、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現と比べて、多くても１．２分の１に低減する。ある特定の実施形態では、ＰＤ－１発現は、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現と比べて、多くても１．２５分の１に低減する。一部の実施形態では、ＰＤ－１発現は、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現と比べて、多くても１．５０分の１に低減する。ある特定の実施形態では、ＰＤ－１発現は、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現と比べて、多くても１．７５分の１に低減する。一部の実施形態では、ＰＤ－１発現は、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現と比べて、多くても２分の１に低減する。ある特定の実施形態では、ＰＤ－１発現は、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現と比べて、多くても２．５分の１に低減する。一部の実施形態では、ＰＤ－１発現は、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現と比べて、多くても３分の１に低減する。ある特定の実施形態では、ＰＤ－１発現は、多くても４分の１に低減する。ある特定の実施形態では、ＰＤ－１発現は、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現と比べて、およそ１．１分の１～およそ１．２５分の１に低減する。一部の実施形態では、ＰＤ－１発現は、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現と比べて、およそ１．２５分の１～およそ１．５０分の１、およそ１．５０分の１～およそ２分の１、およそ１．７５分の１～およそ２分の１、またはおよそ２分の１～およそ４分の１に低減する。一部の実施形態では、ＰＤ－１発現は、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現と比べて、およそ１．２５分の１～およそ１．５０分の１、およそ１．５０分の１～およそ２分の１、およそ１．７５分の１～およそ２分の１、またはおよそ２分の１～およそ４分の１に低減する。具体的な実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞では、ＰＤ－１および１つ、２つ、３つまたはそれよりも多くの他のＴ細胞疲弊のマーカーの発現が、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞によるＰＤ－１および１つ、２つ、３つまたはそれよりも多くの他のＴ細胞疲弊マーカーの発現と比べて低減する。具体的な実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞による１つ、２つ、３つまたはそれよりも多くのＴ細胞疲弊のマーカーの発現が、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞による同じ１つ、２つ、３つまたはそれよりも多くのマーカーの発現と比べて低減することにより、Ｔ細胞の１つ、２つまたはそれよりも多くの改善されたエフェクター機能が示される。ある特定の実施形態では、ＰＤ－１の発現、一部の実施形態では１つ、２つ、３つまたはそれよりも多くの他のＴ細胞疲弊のマーカーの発現は、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べてＲＮＡレベルで低減する。一部の実施形態では、ＰＤ－１の発現、一部の実施形態では１つ、２つ、３つまたはそれよりも多くの他のＴ細胞疲弊のマーカーの発現は、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞による同じマーカーの発現と比べてタンパク質レベルで低減する。ある特定の実施形態では、ＰＤ－１の発現、一部の実施形態では１つ、２つ、３つまたはそれよりも多くの他のＴ細胞疲弊のマーカーの発現は、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べてＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルで低減する。一部の実施形態では、核酸配列はＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）である。一部の実施形態では、ＲＮＡは修飾されていないＲＮＡである。一部の実施形態では、ＲＮＡは修飾されたＲＮＡである。一部の実施形態では、核酸配列はＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ）である。一部の実施形態では、ＤＮＡは修飾されていないＤＮＡである。一部の実施形態では、ＤＮＡは修飾されたＤＮＡである。修飾されたＲＮＡまたは修飾されたＤＮＡの非限定的な例として、トリチル化塩基、およびイノシンなどの通常のものではない塩基が挙げられる。
【0058】
具体的な実施形態では、疲弊Ｔ細胞からミトコンドリア置換Ｔ細胞を作製するための方法であって、内因性ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）コピー数が減少した疲弊Ｔ細胞を、単離された外因性ミトコンドリアと共に十分な期間にわたってインキュベートして、プログラム細胞死－１（ＰＤ－１）の発現が、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現と比べて、少なくとも５％低減したミトコンドリア置換Ｔ細胞を生成するステップを含む、方法が本明細書で提供される。ある特定の実施形態では、ＰＤ－１発現は、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現と比べて、少なくとも１０％低減する。ある特定の実施形態では、ＰＤ－１発現は、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現と比べて、少なくとも１５％低減する。ある特定の実施形態では、ＰＤ－１発現は、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現と比べて、少なくとも２０％低減する。ある特定の実施形態では、ＰＤ－１発現は、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現と比べて、少なくとも２５％低減する。ある特定の実施形態では、ＰＤ－１発現は、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現と比べて、少なくとも３０％低減する。ある特定の実施形態では、ＰＤ－１発現は、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現と比べて、少なくとも３５％低減する。ある特定の実施形態では、ＰＤ－１発現は、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現と比べて、少なくとも４０％低減する。ある特定の実施形態では、ＰＤ－１発現は、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現と比べて、少なくとも４５％低減する。ある特定の実施形態では、ＰＤ－１発現は、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現と比べて、少なくとも５０％低減する。ある特定の実施形態では、ＰＤ－１発現は、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現と比べて、少なくとも６０％低減する。ある特定の実施形態では、ＰＤ－１発現は、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現と比べて、少なくとも７０％低減する。ある特定の実施形態では、ＰＤ－１発現は、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現と比べて、少なくとも８０％低減する。ある特定の実施形態では、ＰＤ－１発現は、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現と比べて、少なくとも９０％低減する。ある特定の実施形態では、ＰＤ－１発現は、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現と比べて、少なくとも９５％低減する。一部の実施形態では、ＰＤ－１発現は、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現と比べて、およそ５％～およそ５０％、およそ１０％～およそ５０％、およそ１０％～およそ４０％、およそ１０％～およそ３０％、およそ２０％～およそ５０％、およそ２０％～およそ４０％、およそ１０％～およそ２０％、およそ２０％～およそ３０％、およそ２５％～およそ５０％、またはおよそ４０％～およそ６０％低減する。具体的な実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞では、ＰＤ－１および１つ、２つ、３つまたはそれよりも多くの他のＴ細胞疲弊のマーカーの発現が、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞によるＰＤ－１および１つ、２つ、３つまたはそれよりも多くの他のＴ細胞疲弊マーカーの発現と比べて低減する。具体的な実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞による１つ、２つ、３つまたはそれよりも多くのＴ細胞疲弊のマーカーの発現が、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞による同じ１つ、２つ、３つまたはそれよりも多くのマーカーの発現と比べて低減することにより、Ｔ細胞の１つ、２つまたはそれよりも多くの改善されたエフェクター機能が示される。ある特定の実施形態では、ＰＤ－１の発現、一部の実施形態では１つ、２つ、３つまたはそれよりも多くの他のＴ細胞疲弊のマーカーの発現は、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べてＲＮＡレベルで低減する。一部の実施形態では、ＰＤ－１の発現、一部の実施形態では１つ、２つ、３つまたはそれよりも多くの他のＴ細胞疲弊のマーカーの発現は、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞による同じマーカーの発現と比べてタンパク質レベルで低減する。ある特定の実施形態では、ＰＤ－１の発現、一部の実施形態では１つ、２つ、３つまたはそれよりも多くの他のＴ細胞疲弊のマーカーの発現は、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べてＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルで低減する。一部の実施形態では、核酸配列はＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）である。一部の実施形態では、ＲＮＡは修飾されていないＲＮＡである。一部の実施形態では、ＲＮＡは修飾されたＲＮＡである。一部の実施形態では、核酸配列はＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ）である。一部の実施形態では、ＤＮＡは修飾されていないＤＮＡである。一部の実施形態では、ＤＮＡは修飾されたＤＮＡである。修飾されたＲＮＡまたは修飾されたＤＮＡの非限定的な例として、トリチル化塩基、およびイノシンなどの通常のものではない塩基が挙げられる。
【0059】
具体的な実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞では、ＰＤ－１および１つ、２つ、３つまたはそれよりも多くの他のＴ細胞疲弊のマーカーの発現が、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞における対応するマーカーの発現と比べて低減する。具体的な実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞による１つ、２つ、３つまたはそれよりも多くのＴ細胞疲弊のマーカーの発現が、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞における対応するマーカーの発現と比べて低減することにより、Ｔ細胞の１つ、２つまたはそれよりも多くの改善されたエフェクター機能が示される。ある特定の実施形態では、ＰＤ－１の発現、一部の実施形態では１つ、２つ、３つまたはそれよりも多くの他のＴ細胞疲弊のマーカーの発現は、それらの由来となる疲弊Ｔ細胞における対応するマーカーの発現と比べてＲＮＡレベルで低減する。一部の実施形態では、ＰＤ－１の発現、一部の実施形態では１つ、２つ、３つまたはそれよりも多くの他のＴ細胞疲弊のマーカーの発現は、それらの由来となる疲弊Ｔ細胞における対応するマーカーの発現と比べてタンパク質レベルで低減する。ある特定の実施形態では、１つのＰＤ－１の発現、一部の実施形態では１つ、２つ、３つまたはそれよりも多くの他のＴ細胞疲弊のマーカーの発現は、それらの由来となる疲弊Ｔ細胞における対応するマーカーの発現と比べてＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルで低減する。
【0060】
ある特定の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞では、ＰＤ－１の発現が、疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べて多くても１．１分の１、多くても１．２５分の１、多くても１．５分の１、多くても２．０分の１、多くても２．５分の１、多くても３．０分の１、または多くても４．０分の１に低減し、少なくとも１種の追加的な免疫チェックポイント受容体の発現も疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べて低減する。ある特定の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞では、ＰＤ－１の発現が、疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べておよそ１．１分の１～およそ１．２５分の１、１．２５分の１～およそ１．５０分の１、およそ１．５０分の１～およそ２分の１、およそ１．７５分の１～およそ２分の１、またはおよそ２分の１～およそ４分の１に低減し、少なくとも１種の追加的な免疫チェックポイント受容体の発現も疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べて低減する。ある特定の実施形態では、ＰＤ－１の発現および少なくとも１種の追加的な免疫チェックポイント受容体の発現は、疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べてＲＮＡレベルで低減する。一部の実施形態では、ＰＤ－１の発現および少なくとも１種の追加的な免疫チェックポイント受容体の発現は、疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べてタンパク質レベルで低減する。ある特定の実施形態では、ＰＤ－１の発現および少なくとも１種の追加的な免疫チェックポイント受容体の発現は、疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べてＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルで低減する。
【0061】
ある特定の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞では、ＰＤ－１の発現が、疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べて少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％低減し、少なくとも１種の追加的な免疫チェックポイント受容体の発現も疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べて低減する。ある特定の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞では、ＰＤ－１の発現が、疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べておよそ５％～およそ５０％、およそ１０％～およそ５０％、およそ１０％～およそ４０％、およそ１０％～およそ３０％、およそ２０％～およそ５０％、およそ２０％～およそ４０％、およそ１０％～およそ２０％、およそ２０％～およそ３０％、およそ２５％～およそ５０％、またはおよそ４０％～およそ６０％低減し、少なくとも１種の追加的な免疫チェックポイント受容体の発現も疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べて低減する。ある特定の実施形態では、ＰＤ－１の発現および少なくとも１種の追加的な免疫チェックポイント受容体の発現は、疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べてＲＮＡレベルで低減する。一部の実施形態では、ＰＤ－１の発現および少なくとも１種の追加的な免疫チェックポイント受容体の発現は、疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べてタンパク質レベルで低減する。ある特定の実施形態では、ＰＤ－１の発現および少なくとも１種の追加的な免疫チェックポイント受容体の発現は、疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べてＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルで低減する。
【0062】
ある特定の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞では、ＰＤ－１の発現が、疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べて多くても１．１分の１、多くても１．２５分の１、多くても１．５分の１、多くても２．０分の１、多くても２．５分の１、多くても３．０分の１、または多くても４．０分の１に低減し、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１６０、ＣＴＬＡ－４、および２Ｂ４／ＣＤ２４４／ＳＬＡＭＦ４からなる群から選択される少なくとも１種の免疫チェックポイント受容体の発現も疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べて低減する。ある特定の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞では、ＰＤ－１の発現が、疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べておよそ１．１分の１～およそ１．２５分の１、１．２５分の１～およそ１．５０分の１、およそ１．５０分の１～およそ２分の１、およそ１．７５分の１～およそ２分の１、またはおよそ２分の１～およそ４分の１に低減し、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１６０、ＣＴＬＡ－４、および２Ｂ４／ＣＤ２４４／ＳＬＡＭＦ４からなる群から選択される少なくとも１種の免疫チェックポイント受容体の発現も疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べて低減する。ある特定の実施形態では、ＰＤ－１の発現および少なくとも１種の追加的な免疫チェックポイント受容体の発現は、疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べてＲＮＡレベルで低減する。一部の実施形態では、ＰＤ－１の発現および少なくとも１種の追加的な免疫チェックポイント受容体の発現は、疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べてタンパク質レベルで低減する。ある特定の実施形態では、ＰＤ－１の発現および少なくとも１種の追加的な免疫チェックポイント受容体の発現は、疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べてＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルで低減する。
【0063】
ある特定の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞では、ＰＤ－１の発現が、疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べて少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％低減し、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１６０、ＣＴＬＡ－４、および２Ｂ４／ＣＤ２４４／ＳＬＡＭＦ４からなる群から選択される少なくとも１種の免疫チェックポイント受容体の発現も疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べて低減する。ある特定の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞では、ＰＤ－１の発現が、疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べておよそ５％～およそ５０％、およそ１０％～およそ５０％、およそ１０％～およそ４０％、およそ１０％～およそ３０％、およそ２０％～およそ５０％、およそ２０％～およそ４０％、およそ１０％～およそ２０％、およそ２０％～およそ３０％、およそ２５％～およそ５０％、またはおよそ４０％～およそ６０％低減し、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１６０、ＣＴＬＡ－４、および２Ｂ４／ＣＤ２４４／ＳＬＡＭＦ４からなる群から選択される少なくとも１種の免疫チェックポイント受容体の発現も疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べて低減する。ある特定の実施形態では、ＰＤ－１の発現および少なくとも１種の追加的な免疫チェックポイント受容体の発現は、疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べてＲＮＡレベルで低減する。一部の実施形態では、ＰＤ－１の発現および少なくとも１種の追加的な免疫チェックポイント受容体の発現は、疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べてタンパク質レベルで低減する。ある特定の実施形態では、ＰＤ－１の発現および少なくとも１種の追加的な免疫チェックポイント受容体の発現は、疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べてＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルで低減する。
【0064】
ある特定の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞では、ＰＤ－１の発現が、疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べて少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％低減し、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１６０、ＣＴＬＡ－４、および２Ｂ４／ＣＤ２４４／ＳＬＡＭＦ４からなる群から選択される少なくとも１種の免疫チェックポイント受容体の発現も疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べて低減する。ある特定の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞では、ＰＤ－１の発現が、疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べておよそ５％～およそ５０％、およそ１０％～およそ５０％、およそ１０％～およそ４０％、およそ１０％～およそ３０％、およそ２０％～およそ５０％、およそ２０％～およそ４０％、およそ１０％～およそ２０％、およそ２０％～およそ３０％、およそ２５％～およそ５０％、またはおよそ４０％～およそ６０％低減し、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１６０、ＣＴＬＡ－４、および２Ｂ４／ＣＤ２４４／ＳＬＡＭＦ４からなる群から選択される少なくとも１種の免疫チェックポイント受容体の発現も疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べて低減する。ある特定の実施形態では、ＰＤ－１の発現および少なくとも１種の追加的な免疫チェックポイント受容体の発現は、疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べてＲＮＡレベルで低減する。一部の実施形態では、ＰＤ－１の発現および少なくとも１種の追加的な免疫チェックポイント受容体の発現は、疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べてタンパク質レベルで低減する。ある特定の実施形態では、ＰＤ－１の発現および少なくとも１種の追加的な免疫チェックポイント受容体の発現は、疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べてＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルで低減する。
【0065】
ある特定の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞では、ＰＤ－１およびＬＡＧ３の発現が、疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べて多くても１．１分の１、多くても１．２５分の１、多くても１．５分の１、多くても２．０分の１、多くても２．５分の１、多くても３．０分の１、または多くても４．０分の１に低減する。ある特定の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞では、ＰＤ－１およびＴＩＧＩＴの発現が、疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べて多くても１．１分の１、多くても１．２５分の１、多くても１．５分の１、多くても２．０分の１、多くても２．５分の１、多くても３．０分の１、または多くても４．０分の１に低減する。ある特定の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞では、ＰＤ－１およびＣＤ１６０の発現が、疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べて多くても１．１分の１、多くても１．２５分の１、多くても１．５分の１、多くても２．０分の１、多くても２．５分の１、多くても３．０分の１、または多くても４．０分の１に低減する。ある特定の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞では、ＰＤ－１およびＣＴＬＡ－４の発現が、疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べて多くても１．１分の１、多くても１．２５分の１、多くても１．５分の１、多くても２．０分の１、多くても２．５分の１、多くても３．０分の１、または多くても４．０分の１に低減する。ある特定の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞では、ＰＤ－１および２Ｂ４／ＣＤ２４４／ＳＬＡＭＦ４の発現が、疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べて多くても１．１分の１、多くても１．２５分の１、多くても１．５分の１、多くても２．０分の１、多くても２．５分の１、多くても３．０分の１、または多くても４．０分の１に低減する。ある特定の実施形態では、発現は疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べてＲＮＡレベルで低減する。一部の実施形態では、発現は疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べてタンパク質レベルで低減する。ある特定の実施形態では、発現は疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べてＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルで低減する。
【0066】
ある特定の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞では、ＰＤ－１およびＬＡＧ３の発現が、疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べて少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％低減する。ある特定の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞では、ＰＤ－１およびＴＩＧＩＴの発現が、疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べて少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％低減する。ある特定の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞では、ＰＤ－１およびＣＤ１６０の発現が、疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べて少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％低減する。ある特定の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞では、ＰＤ－１およびＣＴＬＡ－４の発現が、疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べて少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％低減する。ある特定の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞では、ＰＤ－１および２Ｂ４／ＣＤ２４４／ＳＬＡＭＦ４の発現が、疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べて少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％低減する。ある特定の実施形態では、発現は疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べてＲＮＡレベルで低減する。一部の実施形態では、発現は疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べてタンパク質レベルで低減する。ある特定の実施形態では、発現は疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べてＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルで低減する。
【0067】
ある特定の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞では、ＰＤ－１の発現が、疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べて多くても１．１分の１、多くても１．２５分の１、多くても１．５分の１、多くても２．０分の１、多くても２．５分の１、多くても３．０分の１、または多くても４．０分の１に低減し、少なくとも２種の追加的な免疫チェックポイント受容体の発現も疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べて低減する。例として、一部の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞では、ＰＤ－１、ＬＡＧ３および２Ｂ４／ＣＤ２４４／ＳＬＡＭＦ４の発現が、疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べて多くても１．１分の１、多くても１．２５分の１、多くても１．５分の１、多くても２．０分の１、多くても２．５分の１、多くても３．０分の１、または多くても４．０分の１に低減する。一部の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞では、ＰＤ－１、ＴＩＧＩＴ、およびＣＤ１６０の発現が、疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べて多くても１．１分の１、多くても１．２５分の１、多くても１．５分の１、多くても２．０分の１、多くても２．５分の１、多くても３．０分の１、または多くても４．０分の１に低減する。一部の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞では、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、およびＬＡＧ３の発現が、疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べて多くても１．１分の１、多くても１．２５分の１、多くても１．５分の１、多くても２．０分の１、多くても２．５分の１、多くても３．０分の１、または多くても４．０分の１に低減する。ある特定の実施形態では、ＰＤ－１の発現および少なくとも２種の追加的な免疫チェックポイント受容体の発現は、疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べてＲＮＡレベルで低減する。一部の実施形態では、ＰＤ－１の発現および少なくとも２種の追加的な免疫チェックポイント受容体の発現は、疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べてタンパク質レベルで低減する。ある特定の実施形態では、ＰＤ－１の発現および少なくとも２種の追加的な免疫チェックポイント受容体の発現は、疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べてＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルで低減する。
【0068】
ある特定の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞では、ＰＤ－１の発現が、疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べて少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％低減し、少なくとも２種の追加的な免疫チェックポイント受容体の発現も疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べて低減する。例として、一部の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞では、ＰＤ－１、ＬＡＧ３および２Ｂ４／ＣＤ２４４／ＳＬＡＭＦ４の発現が、疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べて少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％低減する。一部の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞では、ＰＤ－１、ＴＩＧＩＴ、およびＣＤ１６０の発現が、疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べて少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％低減する。一部の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞では、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、およびＬＡＧ３の発現が、疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べて少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％低減する。ある特定の実施形態では、ＰＤ－１の発現および少なくとも２種の追加的な免疫チェックポイント受容体の発現は、疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べてＲＮＡレベルで低減する。一部の実施形態では、ＰＤ－１の発現および少なくとも２種の追加的な免疫チェックポイント受容体の発現は、疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べてタンパク質レベルで低減する。ある特定の実施形態では、ＰＤ－１の発現および少なくとも２種の追加的な免疫チェックポイント受容体の発現は、疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べてＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルで低減する。
【0069】
ある特定の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞では、ＰＤ－１の発現が、疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べて多くても１．１分の１、多くても１．２５分の１、多くても１．５分の１、多くても２．０分の１、多くても２．５分の１、多くても３．０分の１、または多くても４．０分の１に低減し、少なくとも３種の追加的な免疫チェックポイント受容体の発現も疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べて低減する。例として、一部の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞では、ＰＤ－１、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴおよび２Ｂ４／ＣＤ２４４／ＳＬＡＭＦ４の発現が、疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べて多くても１．１分の１、多くても１．２５分の１、多くても１．５分の１、多くても２．０分の１、多くても２．５分の１、多くても３．０分の１、または多くても４．０分の１に低減する。一部の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞では、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＧＩＴ、およびＣＤ１６０の発現が、疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べて多くても１．１分の１、多くても１．２５分の１、多くても１．５分の１、多くても２．０分の１、多くても２．５分の１、多くても３．０分の１、または多くても４．０分の１に低減する。一部の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞では、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＧＩＴおよびＬＡＧ３の発現が、疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べて多くても１．１分の１、多くても１．２５分の１、多くても１．５分の１、多くても２．０分の１、多くても２．５分の１、多くても３．０分の１、または多くても４．０分の１に低減する。ある特定の実施形態では、ＰＤ－１の発現および少なくとも３種の追加的な免疫チェックポイント受容体の発現は、疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べてＲＮＡレベルで低減する。一部の実施形態では、ＰＤ－１の発現および少なくとも３種の追加的な免疫チェックポイント受容体の発現は、疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べてタンパク質レベルで低減する。ある特定の実施形態では、ＰＤ－１の発現および少なくとも３種の追加的な免疫チェックポイント受容体の発現は、疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べてＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルで低減する。
【0070】
ある特定の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞では、ＰＤ－１の発現が、疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べて少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％低減し、少なくとも３種の追加的な免疫チェックポイント受容体の発現も疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べて低減する。例として、一部の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞では、ＰＤ－１、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴおよび２Ｂ４／ＣＤ２４４／ＳＬＡＭＦ４の発現が、疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べて少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％低減する。一部の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞では、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＧＩＴ、およびＣＤ１６０の発現が、疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べて少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％低減する。一部の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞では、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＧＩＴおよびＬＡＧ３の発現が、疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べて少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％低減する。ある特定の実施形態では、ＰＤ－１の発現および少なくとも３種の追加的な免疫チェックポイント受容体の発現は、疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べてＲＮＡレベルで低減する。一部の実施形態では、ＰＤ－１の発現および少なくとも３種の追加的な免疫チェックポイント受容体の発現は、疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べてタンパク質レベルで低減する。ある特定の実施形態では、ＰＤ－１の発現および少なくとも３種の追加的な免疫チェックポイント受容体の発現は、疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べてＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルで低減する。
【0071】
ある特定の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞では、ＰＤ－１の発現が、疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べて多くても１．１分の１、多くても１．２５分の１、多くても１．５分の１、多くても２．０分の１、多くても２．５分の１、多くても３．０分の１、または多くても４．０分の１に低減し、少なくとも４種の追加的な免疫チェックポイント受容体の発現も疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べて低減する。例として、一部の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞では、ＰＤ－１、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１６０および２Ｂ４／ＣＤ２４４／ＳＬＡＭＦ４の発現が、疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べて多くても１．１分の１、多くても１．２５分の１、多くても１．５分の１、多くても２．０分の１、多くても２．５分の１、多くても３．０分の１、または多くても４．０分の１に低減する。一部の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞では、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ３およびＣＤ１６０の発現が、疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べて多くても１．１分の１、多くても１．２５分の１、多くても１．５分の１、多くても２．０分の１、多くても２．５分の１、多くても３．０分の１、または多くても４．０分の１に低減する。一部の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞では、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３、およびＬＡＧ３の発現が、疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べて多くても１．１分の１、多くても１．２５分の１、多くても１．５分の１、多くても２．０分の１、多くても２．５分の１、多くても３．０分の１、または多くても４．０分の１に低減する。ある特定の実施形態では、ＰＤ－１の発現および少なくとも４種の追加的な免疫チェックポイント受容体の発現は、疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べてＲＮＡレベルで低減する。一部の実施形態では、ＰＤ－１の発現および少なくとも４種の追加的な免疫チェックポイント受容体の発現は、疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べてタンパク質レベルで低減する。ある特定の実施形態では、ＰＤ－１の発現および少なくとも４種の追加的な免疫チェックポイント受容体の発現は、疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べてＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルで低減する。
【0072】
ある特定の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞では、ＰＤ－１の発現が、疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べて少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％低減し、少なくとも４種の追加的な免疫チェックポイント受容体の発現も疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べて低減する。例として、一部の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞では、ＰＤ－１、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１６０および２Ｂ４／ＣＤ２４４／ＳＬＡＭＦ４の発現が、疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べて少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％低減する。一部の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞では、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ３およびＣＤ１６０の発現が、疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べて少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％低減する。一部の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞では、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３、およびＬＡＧ３の発現が、疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べて少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％低減する。ある特定の実施形態では、ＰＤ－１の発現および少なくとも４種の追加的な免疫チェックポイント受容体の発現は、疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べてＲＮＡレベルで低減する。一部の実施形態では、ＰＤ－１の発現および少なくとも４種の追加的な免疫チェックポイント受容体の発現は、疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べてタンパク質レベルで低減する。ある特定の実施形態では、ＰＤ－１の発現および少なくとも４種の追加的な免疫チェックポイント受容体の発現が疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べてＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルで低減する。
【0073】
ある特定の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞では、ＰＤ－１の発現が、疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べて多くても１．１分の１、多くても１．２５分の１、多くても１．５分の１、多くても２．０分の１、多くても２．５分の１、多くても３．０分の１、または多くても４．０分の１に低減し、少なくとも５種の追加的な免疫チェックポイント受容体の発現も疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べて低減する。例として、一部の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞では、ＰＤ－１、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１６０、ＣＴＬＡ－４、および２Ｂ４／ＣＤ２４４／ＳＬＡＭＦ４の発現が、疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べて多くても１．１分の１、多くても１．２５分の１、多くても１．５分の１、多くても２．０分の１、多くても２．５分の１、多くても３．０分の１、または多くても４．０分の１に低減する。一部の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞では、ＰＤ－１、ＴＩＭ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１６０、ＣＴＬＡ－４、および２Ｂ４／ＣＤ２４４／ＳＬＡＭＦ４の発現が、疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べて多くても１．１分の１、多くても１．２５分の１、多くても１．５分の１、多くても２．０分の１、多くても２．５分の１、多くても３．０分の１、または多くても４．０分の１に低減する。一部の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞では、ＰＤ－１、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＣＤ１６０、ＣＴＬＡ－４、および２Ｂ４／ＣＤ２４４／ＳＬＡＭＦ４の発現が、疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べて多くても１．１分の１、多くても１．２５分の１、多くても１．５分の１、多くても２．０分の１、多くても２．５分の１、多くても３．０分の１、または多くても４．０分の１に低減する。例として、一部の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞では、ＰＤ－１、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１６０、ＣＴＬＡ－４、および２Ｂ４／ＣＤ２４４／ＳＬＡＭＦ４の発現が、疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べて多くても１．１分の１、多くても１．２５分の１、多くても１．５分の１、多くても２．０分の１、多くても２．５分の１、多くても３．０分の１、または多くても４．０分の１に低減する。例として、一部の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞では、ＰＤ－１、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ－４、および２Ｂ４／ＣＤ２４４／ＳＬＡＭＦ４の発現が、疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べて多くても１．１分の１、多くても１．２５分の１、多くても１．５分の１、多くても２．０分の１、多くても２．５分の１、多くても３．０分の１、または多くても４．０分の１に低減する。例として、一部の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞では、ＰＤ－１、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１６０、および２Ｂ４／ＣＤ２４４／ＳＬＡＭＦ４の発現が、疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べて多くても１．１分の１、多くても１．２５分の１、多くても１．５分の１、多くても２．０分の１、多くても２．５分の１、多くても３．０分の１、または多くても４．０分の１に低減する。例として、一部の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞では、ＰＤ－１、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１６０、およびＣＴＬＡ－４の発現が、疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べて多くても１．１分の１、多くても１．２５分の１、多くても１．５分の１、多くても２．０分の１、多くても２．５分の１、多くても３．０分の１、または多くても４．０分の１に低減する。ある特定の実施形態では、ＰＤ－１の発現および少なくとも５種の追加的な免疫チェックポイント受容体の発現は、疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べてＲＮＡレベルで低減する。一部の実施形態では、ＰＤ－１の発現および少なくとも５種の追加的な免疫チェックポイント受容体の発現は、疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べてタンパク質レベルで低減する。ある特定の実施形態では、ＰＤ－１の発現および少なくとも５種の追加的な免疫チェックポイント受容体の発現は、疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べてＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルで低減する。
【0074】
ある特定の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞では、ＰＤ－１の発現が、疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べて少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％低減し、少なくとも５種の追加的な免疫チェックポイント受容体の発現も疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べて低減する。例として、一部の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞では、ＰＤ－１、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１６０、ＣＴＬＡ－４、および２Ｂ４／ＣＤ２４４／ＳＬＡＭＦ４の発現が、疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べて少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％低減する。一部の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞では、ＰＤ－１、ＴＩＭ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１６０、ＣＴＬＡ－４、および２Ｂ４／ＣＤ２４４／ＳＬＡＭＦ４の発現が、疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べて少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％低減する。一部の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞では、ＰＤ－１、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＣＤ１６０、ＣＴＬＡ－４、および２Ｂ４／ＣＤ２４４／ＳＬＡＭＦ４の発現が、疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べて少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％低減する。例として、一部の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞では、ＰＤ－１、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１６０、ＣＴＬＡ－４、および２Ｂ４／ＣＤ２４４／ＳＬＡＭＦ４の発現が、疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べて少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％低減する。例として、一部の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞では、ＰＤ－１、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ－４、および２Ｂ４／ＣＤ２４４／ＳＬＡＭＦ４の発現が、疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べて少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％低減する。例として、一部の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞では、ＰＤ－１、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１６０、および２Ｂ４／ＣＤ２４４／ＳＬＡＭＦ４の発現が、疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べて少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％低減する。例として、一部の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞では、ＰＤ－１、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１６０、およびＣＴＬＡ－４の発現が、疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べて少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％低減する。ある特定の実施形態では、ＰＤ－１の発現および少なくとも５種の追加的な免疫チェックポイント受容体の発現は、疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べてＲＮＡレベルで低減する。一部の実施形態では、ＰＤ－１の発現および少なくとも５種の追加的な免疫チェックポイント受容体の発現は、疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べてタンパク質レベルで低減する。ある特定の実施形態では、ＰＤ－１の発現および少なくとも５種の追加的な免疫チェックポイント受容体の発現は、疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べてＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルで低減する。
【0075】
ある特定の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞では、ＰＤ－１の発現が、多くても１．１分の１、多くても１．２５分の１、多くても１．５分の１、多くても２．０分の１、多くても２．５分の１、多くても３．０分の１、または多くても４．０分の１に低減し、少なくとも６種の追加的な免疫チェックポイント受容体の発現も低減する。例として、一部の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞では、ＰＤ－１、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１６０、ＣＴＬＡ－４、および２Ｂ４／ＣＤ２４４／ＳＬＡＭＦ４の発現が、疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べて多くても１．１分の１、多くても１．２５分の１、多くても１．５分の１、多くても２．０分の１、多くても２．５分の１、多くても３．０分の１、または多くても４．０分の１に低減する。ある特定の実施形態では、ＰＤ－１の発現および少なくとも６種の追加的な免疫チェックポイント受容体の発現は、疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べてＲＮＡレベルで低減する。一部の実施形態では、ＰＤ－１の発現および少なくとも６種の追加的な免疫チェックポイント受容体の発現は、疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べてタンパク質レベルで低減する。ある特定の実施形態では、ＰＤ－１の発現および少なくとも６種の追加的な免疫チェックポイント受容体の発現は、疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べてＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルで低減する。
【0076】
ある特定の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞では、ＰＤ－１の発現が、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％低減し、少なくとも６種の追加的な免疫チェックポイント受容体の発現も低減する。例として、一部の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞では、ＰＤ－１、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１６０、ＣＴＬＡ－４、および２Ｂ４／ＣＤ２４４／ＳＬＡＭＦ４の発現が、疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べて少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％低減する。ある特定の実施形態では、ＰＤ－１の発現および少なくとも６種の追加的な免疫チェックポイント受容体の発現は、疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べてＲＮＡレベルで低減する。一部の実施形態では、ＰＤ－１の発現および少なくとも６種の追加的な免疫チェックポイント受容体の発現は、疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べてタンパク質レベルで低減する。ある特定の実施形態では、ＰＤ－１の発現および少なくとも６種の追加的な免疫チェックポイント受容体の発現は、疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べてＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルで低減する。
【0077】
プログラム細胞死－１（ＰＤ－１）の発現、一部の実施形態では１つ、２つ、３つまたはそれよりも多くの他のＴ細胞疲弊のマーカーの発現が、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現と比べて、多くても１．１分の１、多くても１．２５分の１、多くても１．５分の１、多くても２．０分の１、多くても２．５分の１、多くても３．０分の１、または多くても４．０分の１に低減したミトコンドリア置換Ｔ細胞は、Ｔ細胞上の発現ならびにＴ細胞内の発現の両方を包含することが理解される。プログラム細胞死－１（ＰＤ－１）の発現、一部の実施形態では１つ、２つ、３つまたはそれよりも多くの他のＴ細胞疲弊のマーカーの発現が、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現と比べて、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％低減したミトコンドリア置換Ｔ細胞は、Ｔ細胞上の発現ならびにＴ細胞内の発現の両方を包含することが理解される。一部の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞上の、１つ、２つ、３つまたはそれよりも多くの他のＴ細胞疲弊のマーカーの発現は、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞上のＰＤ－１の発現、一部の実施形態では対応する１つ、２つ、３つまたはそれよりも多くの他のＴ細胞疲弊のマーカーの発現と比べて低減する。ある特定の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞では、ＰＤ－１の発現、一部の実施形態では１つ、２つ、３つまたはそれよりも多くの他のＴ細胞疲弊のマーカーの発現が、疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べて、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞内のＰＤ－１の発現と比べて、一部の実施形態では対応する１つ、２つ、３つまたはそれよりも多くの他のＴ細胞疲弊のマーカーの発現と比べて低減する。
【0078】
一部の実施形態では、Ｔ細胞疲弊のマーカーは細胞内タンパク質である。Ｔ細胞疲弊のマーカーとして適切な細胞内タンパク質の非限定的な例としては、転写因子ＴＯＸ、ＴＯＸ２、およびＮＲ４Ａが挙げられる。したがって、一部の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞では、ＴＯＸ、ＴＯＸ２、および／またはＮＲ４Ａの発現が、疲弊Ｔ細胞における対応するマーカーの発現と比べて多くても２分の１に低減する。一部の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞では、ＴＯＸ、ＴＯＸ２、および／またはＮＲ４Ａの発現が、疲弊Ｔ細胞における対応するマーカーの発現と比べて多くても５分の１に低減する。一部の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞では、ＴＯＸ、ＴＯＸ２、および／またはＮＲ４Ａの発現が、疲弊Ｔ細胞における対応するマーカーの発現と比べて多くても１０分の１に低減する。一部の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞では、ＴＯＸ、ＴＯＸ２、および／またはＮＲ４Ａの発現が、疲弊Ｔ細胞における対応するマーカーの発現と比べて多くても１５分の１に低減する。一部の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞では、ＴＯＸ、ＴＯＸ２、および／またはＮＲ４Ａの発現が、疲弊Ｔ細胞における対応するマーカーの発現と比べて多くても２０分の１に低減する。一部の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞では、ＴＯＸ、ＴＯＸ２、および／またはＮＲ４Ａの発現が、疲弊Ｔ細胞における対応するマーカーの発現と比べて２０分の１よりも大きく低減する。
【0079】
一部の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞では、ＴＯＸ、ＴＯＸ２、および／またはＮＲ４Ａの発現が、疲弊Ｔ細胞における対応するマーカーの発現と比べて少なくとも２０％低減する。一部の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞では、ＴＯＸ、ＴＯＸ２、および／またはＮＲ４Ａの発現が、疲弊Ｔ細胞における対応するマーカーの発現と比べて少なくとも３０％低減する。一部の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞では、ＴＯＸ、ＴＯＸ２、および／またはＮＲ４Ａの発現が、疲弊Ｔ細胞における対応するマーカーの発現と比べて少なくとも４０％低減する。一部の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞では、ＴＯＸ、ＴＯＸ２、および／またはＮＲ４Ａの発現が、疲弊Ｔ細胞における対応するマーカーの発現と比べて少なくとも５０％低減する。一部の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞では、ＴＯＸ、ＴＯＸ２、および／またはＮＲ４Ａの発現が、疲弊Ｔ細胞における対応するマーカーの発現と比べて少なくとも６０％低減する。一部の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞では、ＴＯＸ、ＴＯＸ２、および／またはＮＲ４Ａの発現が、疲弊Ｔ細胞における対応するマーカーの発現と比べて７０％よりも大きく低減する。一部の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞では、ＴＯＸ、ＴＯＸ２、および／またはＮＲ４Ａの発現が、疲弊Ｔ細胞における対応するマーカーの発現と比べて８０％よりも大きく低減する。一部の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞では、ＴＯＸ、ＴＯＸ２、および／またはＮＲ４Ａの発現が、疲弊Ｔ細胞における対応するマーカーの発現と比べて９０％よりも大きく低減する。ある特定の実施形態では、発現は疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べてＲＮＡレベルで低減する。一部の実施形態では、発現は疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べてタンパク質レベルで低減する。ある特定の実施形態では、発現は疲弊Ｔ細胞による対応するマーカーの発現と比べてＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルで低減する。
【0080】
一部の実施形態では、疲弊Ｔ細胞は、１つまたは複数の老化のマーカーを示す。老化のマーカーの例としては、共刺激分子（例えば、ＣＤ２７、および／またはＣＤ２８）の発現の低減；ＫＬＲＧ－１および／もしくはＣＤ５７の発現の増大；Ｇ１調節タンパク質（例えば、ｐ１５、ｐ１６、およびｐ２１）の上方調節；Ｃｄｋ２およびサイクリンＤ３発現の下方調節；Ｃｄｋ２およびＣｄｋ６キナーゼ活性の低下；ヒトテロメラーゼＲＮＡ構成成分（ｈＴＥＲＣ）発現の喪失；テロメラーゼ活性の低下；ＴＩＧＩＴの発現の増大；またはこれらの組合せが挙げられる。老化細胞は、一般に、１つまたは複数の表現型マーカー、例えば、炎症性サイトカイン（例えば、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）および／または腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα））、増殖因子、およびプロテアーゼの分泌の増加、ならびに細胞集団倍加の低減および／もしくは速度の低下、テロメアの短縮、ＤＮＡ損傷応答（ＤＤＲ）の増大、またはこれらの組合せも示す。
【0081】
本明細書で提供されている通り、本明細書に記載の方法、例えば、６．１節に記載の方法に従って生成されたミトコンドリア置換Ｔ細胞は、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の由来となる疲弊Ｔ細胞と比べて１つ、２つまたはそれよりも多くの改善されたエフェクター機能を示す。例えば、ミトコンドリア置換Ｔ細胞において改善することができるＴ細胞のエフェクター機能に関しては６．３節を参照されたい。
【0082】
ある特定の実施形態では、改善されたエフェクター機能は、増大した増殖、増大した細胞傷害、サイトカインの増加した分泌、またはこれらの組合せを含む。具体的な実施形態では、改善されたエフェクター機能は、増大した増殖を含む。ある特定の実施形態では、改善されたエフェクター機能は、増大した細胞傷害を含む。一部の実施形態では、改善されたエフェクター機能は、サイトカインの増加した分泌を含む。
【0083】
本明細書で提供されている通り、一態様では、疲弊Ｔ細胞からミトコンドリア置換Ｔ細胞を作製するための方法は、疲弊Ｔ細胞に、ＸｂａＩＲをコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列をエレクトロポレーションして、内因性ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）コピー数を減少させるステップを伴う。一部の実施形態では、ＸｂａＩＲをコードするヌクレオチド配列はＤＮＡを含む。一部の実施形態では、ＸｂａＩＲをコードするヌクレオチド配列はＲＮＡを含む。本明細書で提供されている通り、一態様では、疲弊Ｔ細胞からミトコンドリア置換Ｔ細胞を作製するための方法は、疲弊Ｔ細胞に、ミトコンドリア標的化配列（ＭＴＳ）とＸｂａＩＲとを含む融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列をエレクトロポレーションして、内因性ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）コピー数を減少させるステップを伴う。一部の実施形態では、核酸配列はＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）である。一部の実施形態では、ＲＮＡは修飾されていないＲＮＡである。一部の実施形態では、ＲＮＡは修飾されたＲＮＡである。一部の実施形態では、核酸配列はＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ）である。一部の実施形態では、ＤＮＡは修飾されていないＤＮＡである。一部の実施形態では、ＤＮＡは修飾されたＤＮＡである。修飾されたＲＮＡまたは修飾されたＤＮＡの非限定的な例として、トリチル化塩基、およびイノシンなどの通常のものではない塩基が挙げられる。
【0084】
ヌクレオチド（例えば、プラスミドＤＮＡ発現ベクターカセット内に存在する状態でまたはｍＲＮＡとして）を導入するための様々な方法が当技術分野で公知である。一部の実施形態では、ヌクレオチドをエレクトロポレーションする。具体的な実施形態では、エレクトロポレーション法は、ＭａｘＣｙｔｅ Ｆｌｏｗ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎなどのフローエレクトロポレーションである。他の具体的な実施形態では、エレクトロポレーション法にはＬｏｎｚａのＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）技術などのヌクレオフェクション技術が含まれる。しかし、ヌクレオチドを導入するための上記の方法は非限定的なものであり、ただ単に例示的な方法であることが意図されていること、および、当技術分野で公知の任意の方法をヌクレオチドを導入するために使用することができることが理解される。例えば、一部の実施形態では、ヌクレオチドを、カチオン性脂質トランスフェクション、またはヌクレオチドを細胞に導入する任意の他の手段によって導入する。一部の実施形態では、ヌクレオチドをウイルスによる形質導入によって導入する。
【0085】
ある特定の実施形態では、特に臨床的状況においては、医薬品および医薬部外品の製造管理および品質管理の基準）および医薬品の臨床試験の実施に関する基準を満たしたＭａｘＣｙｔｅエレクトロポレーターをｍＲＮＡトランスフェクションのために使用することができる。ＭａｘＣｙｔｅエレクトロポレーターを製造者のプロトコールに従って使用してトランスフェクションを実施することができる。さらに、上記の方法はただ単に例示的なものであること、およびｍＲＮＡを導入する任意の手段を使用することができることが理解される。
【0086】
ミトコンドリア標的化配列（ＭＴＳ）をエンドヌクレアーゼコード配列に隣接させて組み入れ、それによりミトコンドリアを標的とする融合タンパク質を生じさせることにより、エンドヌクレアーゼのミトコンドリアへの特異的標的化を実施することができる。強力なＭＴＳが同定され、それらのＮ末端に融合されたタンパク質を特定の区画に標的化することが可能であることが示されており、それらはミトコンドリア標的化配列と呼ばれる。本発明の方法に適したＭＴＳは当業者に周知である（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，０３９，５８７号Ｂ２を参照されたい）。例えば、ミトコンドリアマトリックスに対するＭＴＳ、例えば、シトクロムｃオキシダーゼサブユニットＩＶ（ＣＯＸ４）、サブユニットＶＩＩＩ（ＣＯＸ８）、またはサブユニットＸ（ＣＯＸ１０）由来の標的化ペプチドであるＭＴＳを使用することができる。原理上は、任意の核にコードされたミトコンドリアマトリックスもしくは内膜酵素に由来する任意の標的配列、または融合タンパク質をミトコンドリアによって移入されたタンパク質にすることが可能な人工配列（５．５を超える疎水性モーメント、少なくとも２つの塩基性残基、両親媒性アルファヘリックスコンフォメーション；例えば、Bedwell et al., Mol Cell Biol. 9(3) (1989), 1014-1025を参照されたい）が本発明の目的に関して有用である。
【0087】
ある特定の実施形態では、ＭＴＳは、ヒトＭＴＳである。別の実施形態では、ＭＴＳは別の種に由来するものである。そのような配列の非限定的な例は、シトクロムｃオキシダーゼサブユニットＸ（ＣＯＸ１０）ＭＴＳ（ＭＡＡＳＰＨＴＬＳＳＲＬＬＴＧＣＶＧＧＳＶＷＹＬＥＲＲＴ）（配列番号１）、およびシトクロムｃオキシダーゼサブユニットＶＩＩＩ（ＣＯＸ８）ＭＴＳ（ＭＳＶＬＴＰＬＬＬＲＳＬＴＧＳＡＲＲＬＭＶＰＲＡ）（配列番号２）である。ＭＴＳ配列の追加的な非限定的な例は、核ＤＮＡによってコードされ、細胞質において翻訳（産生）され、ミトコンドリアに輸送される個々のミトコンドリアタンパク質それぞれの天然のＭＴＳ、ならびにクエン酸シンターゼ（ｃｓ）、リポアミドデヒドロゲナーゼ（ＬＡＤ）、およびＣ６ＯＲＦ６６（ＯＲＦ）である。種々のＭＴＳは各ミトコンドリア酵素とそれらの間で交換可能であり得る。したがって、一部の実施形態では、ＭＴＳは、ミトコンドリアマトリックスタンパク質を標的とするものである。具体的な実施形態では、ミトコンドリアマトリックスタンパク質は、ヒトシトクロムＣオキシダーゼのサブユニットＶＩＩＩである。
【0088】
ある特定の態様では、本明細書で提供される方法は、ＸｂａＩＲをコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列（具体的な実施形態では、核酸配列は、ミトコンドリア標的化配列（ＭＴＳ）とＸｂａＩＲとを含む融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む）でトランスフェクトもしくは形質転換された、または他の仕方でそれらを含む疲弊Ｔ細胞を培養して、内因性ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）コピー数を減少させるステップを伴う。具体的な態様では、本明細書で提供される方法は、ＸｂａＩＲをコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列でトランスフェクトもしくは形質転換された、または他の仕方でそれらを含む疲弊Ｔ細胞を培養して、最小の細胞傷害性で、細胞が、ＸｂａＩＲをコードするヌクレオチド配列を少なくとも実質的に含まないものになるまで内因性ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）コピー数を減少させるステップを伴う。具体的な態様では、本明細書で提供される方法は、ＸｂａＩＲをコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列でトランスフェクトもしくは形質転換された、または他の仕方でそれらを含む疲弊Ｔ細胞を培養して、最小の細胞傷害性で、細胞がＸｂａＩＲを少なくとも実質的に含まないものになるまで内因性ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）コピー数を減少させるステップを伴う。当業者に公知のまたは本明細書に記載の技法を使用して細胞傷害性を測定することができる。当業者に公知のまたは本明細書に記載の技法（例えば、実施例におけるもの）を使用して、ＸｂａＩＲをコードするヌクレオチドの量（例えば、ＰＣＲもしくはｑＰＣＲ）、またはＸｂａＩＲもしくは融合タンパク質の量（例えば、免疫ブロット）を評価することができる。
【0089】
一部の実施形態では、内因性ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）コピー数を減少させるために十分な期間は、約１日～約１０日である。一部の実施形態では、内因性ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）コピー数を減少させるために十分な期間は、約２日～約７日である。一部の実施形態では、内因性ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）コピー数を減少させるために十分な期間は、約１日～約５日である。一部の実施形態では、内因性ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）コピー数を減少させるために十分な期間は、約２日～約４日である。一部の実施形態では、内因性ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）コピー数を減少させるために十分な期間は、約２日～約３日である。一部の実施形態では、内因性ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）コピー数を減少させるために十分な期間は、約１日～約４日である。一部の実施形態では、内因性ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）コピー数を減少させるために十分な期間は、約１日～約３日である。一部の実施形態では、内因性ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）コピー数を減少させるために十分な期間は、約２日～約７日である。一部の実施形態では、内因性ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）コピー数を減少させるために十分な期間は、約１日である。一部の実施形態では、内因性ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）コピー数を減少させるために十分な期間は、約２日である。一部の実施形態では、内因性ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）コピー数を減少させるために十分な期間は、約３日である。一部の実施形態では、内因性ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）コピー数を減少させるために十分な期間は、約４日である。一部の実施形態では、内因性ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）コピー数を減少させるために十分な期間は、約５日である。一部の実施形態では、内因性ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）コピー数を減少させるために十分な期間は、約６日である。一部の実施形態では、内因性ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）コピー数を減少させるために十分な期間は、約７日である。一部の実施形態では、内因性ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）コピー数を減少させるために十分な期間は、約８日である。一部の実施形態では、内因性ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）コピー数を減少させるために十分な期間は、約９日である。一部の実施形態では、内因性ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）コピー数を減少させるために十分な期間は、約１０日である。
【0090】
ある特定の態様では、本明細書で提供される方法は、疲弊Ｔ細胞の単離された外因性ミトコンドリアとの、有効量のラパマイシンまたはその誘導体の存在下でのインキュベーションを伴う。一部の実施形態では、ラパマイシンまたはその誘導体は、約１００ナノモル（ｎＭ）～約１０００ｎＭの濃度である。一部の実施形態では、ラパマイシンまたはその誘導体は、約２００ナノモル（ｎＭ）～約５００ｎＭの濃度である。一部の実施形態では、ラパマイシンまたはその誘導体は、約３００ナノモル（ｎＭ）～約６００ｎＭの濃度である。一部の実施形態では、ラパマイシンまたはその誘導体は、約４００ナノモル（ｎＭ）～約７００ｎＭの濃度である。
【0091】
ある特定の実施形態では、有効量のラパマイシンまたはその誘導体は、約１００ｎＭの濃度である。一部の実施形態では、有効量のラパマイシンまたはその誘導体は、約１５０ｎＭの濃度である。一部の実施形態では、有効量のラパマイシンまたはその誘導体は、約２００ｎＭの濃度である。一部の実施形態では、有効量のラパマイシンまたはその誘導体は、約２５０ｎＭの濃度である。一部の実施形態では、有効量のラパマイシンまたはその誘導体は、約３００ｎＭの濃度である。一部の実施形態では、有効量のラパマイシンまたはその誘導体は、約３５０ｎＭの濃度である。一部の実施形態では、有効量のラパマイシンまたはその誘導体は、約４００ｎＭの濃度である。一部の実施形態では、有効量のラパマイシンまたはその誘導体は、約４５０ｎＭの濃度である。一部の実施形態では、有効量のラパマイシンまたはその誘導体は、約５００ｎＭの濃度である。一部の実施形態では、有効量のラパマイシンまたはその誘導体は、約５５０ｎＭの濃度である。一部の実施形態では、有効量のラパマイシンまたはその誘導体は、約６００ｎＭの濃度である。一部の実施形態では、有効量のラパマイシンまたはその誘導体は、約６５０ｎＭの濃度である。一部の実施形態では、有効量のラパマイシンまたはその誘導体は、約７００ｎＭの濃度である。一部の実施形態では、有効量のラパマイシンまたはその誘導体は、約７５０ｎＭの濃度である。一部の実施形態では、有効量のラパマイシンまたはその誘導体は、約８００ｎＭの濃度である。一部の実施形態では、有効量のラパマイシンまたはその誘導体は、約８５０ｎＭの濃度である。一部の実施形態では、有効量のラパマイシンまたはその誘導体は、約９００ｎＭの濃度である。一部の実施形態では、有効量のラパマイシンまたはその誘導体は、約１０００ｎＭの濃度である。一部の実施形態では、有効量のラパマイシンまたはその誘導体は、１０００ｎＭよりも高い濃度である。
【0092】
ラパマイシン誘導体（例えば、ラパマイシン類似体、「ラパログ（rapalog）」としても公知）の非限定的な例としては、例えば、テムシロリムス（ＣＡＳ番号１６２６３５－０４－３；Ｃ５６Ｈ８７ＮＯ１６）、エベロリムス（ＣＡＳ番号１５９３５１－６９－６；Ｃ５３Ｈ８３ＮＯ１４）、リダフォロリムス（ＣＡＳ番号５７２９２４－５４－０；Ｃ５３Ｈ８４ＮＯ１４Ｐ）、ＷＹＥ－１２５１３２（ＷＹＥ－１３２）、およびゾタロリムス（ＡＢＴ－５７８）が挙げられる。
【0093】
具体的な実施形態では、本明細書で提供される方法は、疲弊Ｔ細胞の単離された外因性ミトコンドリアとの、有効量のラパマイシンの存在下でのインキュベーションを伴う。一部の実施形態では、ラパマイシンは、約１００ナノモル（ｎＭ）～約１０００ｎＭの濃度である。一部の実施形態では、ラパマイシンは、約２００ｎＭ～約５００ｎＭの濃度である。一部の実施形態では、ラパマイシンは、約３００ｎＭ～約６００ｎＭの濃度である。一部の実施形態では、ラパマイシンは、約４００ｎＭ～約７００ｎＭの濃度である。ある特定の実施形態では、有効量のラパマイシンは、約１００ｎＭの濃度である。一部の実施形態では、有効量のラパマイシンは、約１５０ｎＭの濃度である。一部の実施形態では、有効量のラパマイシンは、約２００ｎＭの濃度である。一部の実施形態では、有効量のラパマイシンは、約２５０ｎＭの濃度である。一部の実施形態では、有効量のラパマイシンは、約３００ｎＭの濃度である。一部の実施形態では、有効量のラパマイシンは、約３５０ｎＭの濃度である。一部の実施形態では、有効量のラパマイシンは、約４００ｎＭの濃度である。一部の実施形態では、有効量のラパマイシンは、約４５０ｎＭの濃度である。一部の実施形態では、有効量のラパマイシンは、約５００ｎＭの濃度である。一部の実施形態では、有効量のラパマイシンは、約５５０ｎＭの濃度である。一部の実施形態では、有効量のラパマイシンは、約６００ｎＭの濃度である。一部の実施形態では、有効量のラパマイシンは、約６５０ｎＭの濃度である。一部の実施形態では、有効量のラパマイシンは、約７００ｎＭの濃度である。一部の実施形態では、有効量のラパマイシンは、約７５０ｎＭの濃度である。一部の実施形態では、有効量のラパマイシンは、約８００ｎＭの濃度である。一部の実施形態では、有効量のラパマイシンは、約８５０ｎＭの濃度である。一部の実施形態では、有効量のラパマイシンは、約９００ｎＭの濃度である。一部の実施形態では、有効量のラパマイシンは、約１０００ｎＭの濃度である。一部の実施形態では、有効量のラパマイシンは、１０００ｎＭよりも高い濃度である。
【0094】
ミトコンドリア置換Ｔ細胞を生成させるために疲弊Ｔ細胞と共にインキュベートされている単離された外因性ミトコンドリアの量は、単離されたミトコンドリアと共インキュベートされる疲弊Ｔ細胞の量などの因子に依存する。一般に、疲弊Ｔ細胞と共にインキュベートされる単離された外因性ミトコンドリアの量は、Ｔ細胞１×１０６個当たり約５μｇ～約１００μｇである。一部の実施形態では、疲弊Ｔ細胞と共にインキュベートされる単離された外因性ミトコンドリアの量は、Ｔ細胞１×１０６個当たり約１０μｇ～約９０μｇである。一部の実施形態では、疲弊Ｔ細胞と共にインキュベートされる単離された外因性ミトコンドリアの量は、Ｔ細胞１×１０６個当たり約２０μｇ～約８０μｇである。一部の実施形態では、疲弊Ｔ細胞と共にインキュベートされる単離された外因性ミトコンドリアの量は、Ｔ細胞１×１０６個当たり約３０μｇ～約７０μｇである。一部の実施形態では、疲弊Ｔ細胞と共にインキュベートされる単離された外因性ミトコンドリアの量は、Ｔ細胞１×１０６個当たり約５μｇである。一部の実施形態では、疲弊Ｔ細胞と共にインキュベートされる単離された外因性ミトコンドリアの量は、Ｔ細胞１×１０６個当たり約１０μｇである。一部の実施形態では、疲弊Ｔ細胞と共にインキュベートされる単離された外因性ミトコンドリアの量は、Ｔ細胞１×１０６個当たり約２０である。一部の実施形態では、疲弊Ｔ細胞と共にインキュベートされる単離された外因性ミトコンドリアの量は、Ｔ細胞１×１０６個当たり約３０μｇである。一部の実施形態では、疲弊Ｔ細胞と共にインキュベートされる単離された外因性ミトコンドリアの量は、Ｔ細胞１×１０６個当たり約４０μｇである。一部の実施形態では、疲弊Ｔ細胞と共にインキュベートされる単離された外因性ミトコンドリアの量は、Ｔ細胞１×１０６個当たり約５０μｇである。一部の実施形態では、疲弊Ｔ細胞と共にインキュベートされる単離された外因性ミトコンドリアの量は、Ｔ細胞１×１０６個当たり約６０μｇである。一部の実施形態では、疲弊Ｔ細胞と共にインキュベートされる単離された外因性ミトコンドリアの量は、Ｔ細胞１×１０６個当たり約７０μｇである。一部の実施形態では、疲弊Ｔ細胞と共にインキュベートされる単離された外因性ミトコンドリアの量は、Ｔ細胞１×１０６個当たり約８０μｇである。一部の実施形態では、疲弊Ｔ細胞と共にインキュベートされる単離された外因性ミトコンドリアの量は、Ｔ細胞１×１０６個当たり約９０μｇである。一部の実施形態では、疲弊Ｔ細胞と共にインキュベートされる単離された外因性ミトコンドリアの量は、Ｔ細胞１×１０６個当たり約１００μｇである。一部の実施形態では、疲弊Ｔ細胞と共にインキュベートされる単離された外因性ミトコンドリアの量は、Ｔ細胞１×１０６個当たり１００μｇよりも多い。
【0095】
本明細書で提供されている通り、本開示の単離された外因性ミトコンドリアは、健康かつ機能的なミトコンドリアを有する種々の型の細胞から得ることができる。ミトコンドリア機能を決定するためのアッセイが当技術分野で公知であり、それらとして、６．３節に記載されているものなどのアッセイが挙げられる。本明細書で提供される方法における使用のためのミトコンドリアの例示的な供給源としては、線維芽細胞、血小板細胞、ならびに他のリンパ球系細胞が挙げられる。ある特定の実施形態では、単離された外因性ミトコンドリアを線維芽細胞から得る。一部の実施形態では、単離された外因性ミトコンドリアを血小板細胞から得る。一部の実施形態では、単離された外因性ミトコンドリアをリンパ球系細胞から得る。
【0096】
本明細書で提供されている通り、単離された外因性ミトコンドリアは、レシピエント細胞に対して自己であっても同種であってもよい。一部の実施形態では、単離された外因性ミトコンドリアは、レシピエント細胞に対して同種である。例えば、単離された外因性ミトコンドリアをレシピエント細胞とは異なる対象から得ることができる。他の実施形態では、単離された外因性ミトコンドリアは自己である。例として、例示的な自己単離された外因性ミトコンドリアとしては、同じ対象から、より早い時点で、例えば、胎盤または臍帯血から単離されたミトコンドリアを挙げることができる。別の例示的な自己外因性ｍｔＤＮＡとして、例えば、レシピエント細胞と同じ対象から単離され、改変された後にレシピエント細胞と置き換えられるドナーｍｔＤＮＡを挙げることができる。
【0097】
ミトコンドリアの単離は、これだけに限定されないが、本明細書に記載のものを含めたいくつかの周知の技法のいずれかによって実現することができる。ある特定の実施形態では、ミトコンドリアの移入における使用のための外因性ミトコンドリアを、例えば、Ｑｐｒｏｔｅｕｍミトコンドリア単離キット（Ｑｉａｇｅｎ、ＵＳＡ）、またはＭＩＴＯＩＳＯ２ミトコンドリア単離キット（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）などの市販のキットを使用して単離する。他の実施形態では、ミトコンドリアの移入における使用のための外因性ミトコンドリアを手動で単離する（例えば、Preble et al. J. Vis. Exp. 2014, 91: e51682；Gasnier et al. Anal Biochem 1993; 212 (1): 173-8およびFrezza et al. Nat Protoc 2007; 2 (2): 287-95を参照されたい）。例えば、例示的なミトコンドリアの手動での単離として、ドナー細胞をペレット化し、培養下で成長させた細胞およそ１０９個に由来する１～２ｍＬの細胞ペレットを洗浄し、低張性緩衝剤中で細胞を膨潤させ、ＤｏｕｎｃｅまたはＰｏｔｔｅｒ－Ｅｌｖｅｈｊｅｍホモジナイザーを用い、ぴったり合う乳棒を使用して細胞を破砕し、分画遠心法によってミトコンドリアを単離することによってドナー細胞からミトコンドリアを単離することが挙げられる。手動での単離として、例えば、スクロース密度勾配超遠心分離、または自由流動電気泳動も挙げることもできる。いかなる特定の方法にも縛られることを望まずに、本明細書に記載のキットおよび手動での方法は例示であること、および任意のミトコンドリアの単離方法を使用することができ、それが当業者の技能の範囲内に入ることが理解される。具体的な実施形態では、８節に記載の方法体系を使用してミトコンドリアを単離し、移入させる。
【0098】
一部の実施形態では、単離されたドナーミトコンドリアは、他の細胞小器官を含まず実質的に純粋なものである。他の実施形態では、単離されたミトコンドリアは不純物を含有する場合があり、ミトコンドリアが豊富である。例えば、一部の実施形態では、単離されたミトコンドリアは、約９０％純粋、約８０％純粋、約７０％純粋、約６０％純粋、約５０％純粋、またはそれらの間の任意の整数である。一般に、単離されたドナーミトコンドリアに含有されるいずれの不純物も、ミトコンドリアの移入時にレシピエント細胞の生存能にも機能にも影響を及ぼさないことが理解される。具体的な実施形態では、外因性ミトコンドリア、外因性ｍｔＤＮＡ、またはこれらの組合せの移入には、ミトコンドリアではない細胞小器官の移入は伴わない。
【0099】
単離されたミトコンドリアの数量および品質は、これだけに限定されないが、本明細書および引用された参考文献に記載のものを含めたいくつかの周知の技法によって容易に決定することができる。例えば、一部の実施形態では、単離されたミトコンドリアの数量を、総タンパク質含量の評価によって決定する。総タンパク質含量を評価するためには、ＢｉｕｒｅｔおよびＬｏｗｒｙの手順（例えば、Hartwig et al., Proteomics, 2009 Jun; 9 (11): 3209-14を参照されたい）、ならびにＢｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイ（Bradford. Anal Biochem. 1976; 72: 248-54））などの様々な方法が利用可能である。他の実施形態では、単離されたミトコンドリアの数量をｍｔＤＮＡコピー数によって決定する。
【0100】
内因性ｍｔＤＮＡが減少した疲弊Ｔ細胞を単離された外因性ミトコンドリアと共にインキュベートして、ミトコンドリア置換Ｔ細胞を生成するために十分な期間は、外因性ミトコンドリアにさらされていない疲弊Ｔ細胞よりも多くの量の外因性ｍｔＤＮＡが検出可能になる任意の期間であってよい。一部の実施形態では、内因性ｍｔＤＮＡが減少した疲弊Ｔ細胞を単離された外因性ミトコンドリアと共にインキュベートして、ミトコンドリア置換Ｔ細胞を生成するために十分な期間は、外因性ｍｔＤＮＡと共にインキュベートしていない疲弊Ｔ細胞に移入される外因性ｍｔＤＮＡの量と比べて、外因性ｍｔＤＮＡの少なくとも２０％が疲弊Ｔ細胞に移入される任意の期間である。一部の実施形態では、内因性ｍｔＤＮＡが減少した疲弊Ｔ細胞を単離された外因性ミトコンドリアと共にインキュベートして、ミトコンドリア置換Ｔ細胞を生成するために十分な期間は、外因性ｍｔＤＮＡと共にインキュベートしていない疲弊Ｔ細胞に移入される外因性ｍｔＤＮＡの量と比べて、外因性ｍｔＤＮＡの少なくとも３０％が疲弊Ｔ細胞に移入される任意の期間である。一部の実施形態では、内因性ｍｔＤＮＡが減少した疲弊Ｔ細胞を単離された外因性ミトコンドリアと共にインキュベートして、ミトコンドリア置換Ｔ細胞を生成するために十分な期間は、外因性ｍｔＤＮＡと共にインキュベートしていない疲弊Ｔ細胞に移入される外因性ｍｔＤＮＡの量と比べて、外因性ｍｔＤＮＡの少なくとも４０％が疲弊Ｔ細胞に移入される任意の期間である。一部の実施形態では、内因性ｍｔＤＮＡが減少した疲弊Ｔ細胞を単離された外因性ミトコンドリアと共にインキュベートして、ミトコンドリア置換Ｔ細胞を生成するために十分な期間は、外因性ｍｔＤＮＡと共にインキュベートしていない疲弊Ｔ細胞に移入される外因性ｍｔＤＮＡの量と比べて、外因性ｍｔＤＮＡの少なくとも５０％が疲弊Ｔ細胞に移入される任意の期間である。一部の実施形態では、内因性ｍｔＤＮＡが減少した疲弊Ｔ細胞を単離された外因性ミトコンドリアと共にインキュベートして、ミトコンドリア置換Ｔ細胞を生成するために十分な期間は、外因性ｍｔＤＮＡと共にインキュベートしていない疲弊Ｔ細胞に移入される外因性ｍｔＤＮＡの量と比べて、外因性ｍｔＤＮＡの少なくとも６０％が疲弊Ｔ細胞に移入される任意の期間である。一部の実施形態では、内因性ｍｔＤＮＡが減少した疲弊Ｔ細胞を単離された外因性ミトコンドリアと共にインキュベートして、ミトコンドリア置換Ｔ細胞を生成するために十分な期間は、外因性ｍｔＤＮＡと共にインキュベートしていない疲弊Ｔ細胞に移入される外因性ｍｔＤＮＡの量と比べて、外因性ｍｔＤＮＡの少なくとも７０％が疲弊Ｔ細胞に移入される任意の期間である。一部の実施形態では、内因性ｍｔＤＮＡが減少した疲弊Ｔ細胞を単離された外因性ミトコンドリアと共にインキュベートして、ミトコンドリア置換Ｔ細胞を生成するために十分な期間は、外因性ｍｔＤＮＡと共にインキュベートしていない疲弊Ｔ細胞に移入される外因性ｍｔＤＮＡの量と比べて、外因性ｍｔＤＮＡの大多数（すなわち、５０％よりも多く）、約２０％～約９５％、約２５％～約９０％、約３０％～約８５％、約３５％～約８０％、約４０％～約７５％、約３０％～約６０％、４０％～約７０％、約４０％～約８５％、約４０％～約８０％、約５０％～約８０％、約６０％～約９０％、約６５％～約９５％が疲弊Ｔ細胞に移入される任意の期間である。当業者に公知のまたは本明細書に記載の技法（例えば、実施例におけるもの）を使用して、外因性ｍｔＤＮＡの疲弊Ｔ細胞への移入を評価することができる。
【0101】
一般に、十分な期間は、少なくともおよそ１２時間および２週間未満である。一部の実施形態では、十分な期間は、少なくとも１２時間である。一部の実施形態では、十分な期間は、少なくとも２４時間である。一部の実施形態では、十分な期間は、少なくとも３６時間である。一部の実施形態では、十分な期間は、少なくとも４８時間である。一部の実施形態では、十分な期間は、およそ２日間またはそれよりも長期である。一部の実施形態では、十分な期間は、およそ７日間またはそれよりも長期である。一部の実施形態では、十分な期間は、およそ２日間～およそ７日間である。一部の実施形態では、十分な期間は、およそ１日間～およそ７日間である。
【0102】
例として、内因性ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）が減少した疲弊Ｔ細胞と単離された外因性ミトコンドリアの単純な共インキュベーションを使用してミトコンドリアの移入を実施することもできる。しかし、Ｔ細胞と単離された外因性ミトコンドリアを必要に応じて遠心分離することによってミトコンドリアの移入を促進することも可能である。ミトコンドリアの移入の他の手段としては、熱ショック、インジェクション、および／またはナノブレードの使用が挙げられる。
【0103】
遠心分離条件は、当業者が容易に決定することができ、細胞およびミトコンドリアが傷つかず、ミトコンドリアの移入が促進される限りはスピードおよび時間を変動させることができる。例として、遠心分離する条件には、室温、およそ１，５００相対遠心力（ＲＣＦ、「ｇ」とも表される）でおよそ５分間遠心分離することが含まれ得る。具体的な実施形態では、遠心分離することは下記の実施例に記載の通りである。
【0104】
一実施形態では、遠心分離することは、室温、およそ５００ＲＣＦでおよそ５分間である。別の実施形態では、遠心分離することは、室温、およそ７５０ＲＣＦでおよそ５分間である。別の実施形態では、遠心分離することは、室温、およそ１，０００ＲＣＦでおよそ５分間である。別の実施形態では、遠心分離することは、室温、およそ１，５００ＲＣＦでおよそ５分間である。別の実施形態では、遠心分離することは、室温、およそ２，０００ＲＣＦでおよそ５分間である。別の実施形態では、遠心分離することは、室温、およそ２，５００ＲＣＦでおよそ５分間である。別の実施形態では、遠心分離することは、室温、およそ３，０００ＲＣＦでおよそ５分間である。
【0105】
一実施形態では、遠心分離することは、室温、およそ５００ＲＣＦでおよそ１０分間である。別の実施形態では、遠心分離することは、室温、およそ７５０ＲＣＦでおよそ１０分間である。別の実施形態では、遠心分離することは、室温、およそ１，０００ＲＣＦでおよそ１０分間である。別の実施形態では、遠心分離することは、室温、およそ１，５００ＲＣＦでおよそ１０分間である。別の実施形態では、遠心分離することは、室温、およそ２，０００ＲＣＦでおよそ１０分間である。別の実施形態では、遠心分離することは、室温、およそ２，５００ＲＣＦでおよそ１０分間である。別の実施形態では、遠心分離することは、室温、およそ３，０００ＲＣＦでおよそ１０分間である。
【0106】
別の実施形態では、遠心分離することは、室温、およそ５００ＲＣＦでおよそ１５分間である。別の実施形態では、遠心分離することは、室温、およそ７５０ＲＣＦでおよそ１５分間である。別の実施形態では、遠心分離することは、室温、およそ１，０００ＲＣＦでおよそ１５分間である。別の実施形態では、遠心分離することは、室温、およそ１，５００ＲＣＦでおよそ１５分間である。別の実施形態では、遠心分離することは、室温、およそ２，０００ＲＣＦでおよそ１５分間である。別の実施形態では、遠心分離することは、室温、およそ２，５００ＲＣＦでおよそ１５分間である。別の実施形態では、遠心分離することは、室温、およそ３，０００ＲＣＦでおよそ１５分間である。
【0107】
別の実施形態では、遠心分離することは、室温、およそ５００ＲＣＦで１時間未満である。別の実施形態では、遠心分離することは、室温、およそ７５０ＲＣＦで１時間未満である。別の実施形態では、遠心分離することは、室温、およそ１，０００ＲＣＦで１時間未満である。別の実施形態では、遠心分離することは、室温、およそ１，５００ＲＣＦで１時間未満である。別の実施形態では、遠心分離することは、室温、およそ２，０００ＲＣＦで１時間未満である。別の実施形態では、遠心分離することは、室温、およそ２，５００ＲＣＦで１時間未満である。別の実施形態では、遠心分離することは、室温、およそ３，０００ＲＣＦで１時間未満である。
【0108】
一実施形態では、遠心分離することは、約４℃、およそ５００ＲＣＦでおよそ５分間である。別の実施形態では、遠心分離することは、約４℃、およそ７５０ＲＣＦでおよそ５分間である。別の実施形態では、遠心分離することは、約４℃、およそ１，０００ＲＣＦでおよそ５分間である。別の実施形態では、遠心分離することは、約４℃、およそ１，５００ＲＣＦでおよそ５分間である。別の実施形態では、遠心分離することは、約４℃、およそ２，０００ＲＣＦでおよそ５分間である。別の実施形態では、遠心分離することは、約４℃、およそ２，５００ＲＣＦでおよそ５分間である。別の実施形態では、遠心分離することは、約４℃、およそ３，０００ＲＣＦでおよそ５分間である。
【0109】
別の実施形態では、遠心分離することは、約４℃、およそ５００ＲＣＦでおよそ１０分間である。別の実施形態では、遠心分離することは、約４℃、およそ７５０ＲＣＦでおよそ１０分間である。別の実施形態では、遠心分離することは、約４℃、およそ１，０００ＲＣＦでおよそ１０分間である。別の実施形態では、遠心分離することは、約４℃、およそ１，５００ＲＣＦでおよそ１０分間である。別の実施形態では、遠心分離することは、約４℃、およそ２，０００ＲＣＦでおよそ１０分間である。別の実施形態では、遠心分離することは、約４℃、およそ２，５００ＲＣＦでおよそ１０分間である。別の実施形態では、遠心分離することは、約４℃、およそ３，０００ＲＣＦでおよそ１０分間である。
【0110】
別の実施形態では、遠心分離することは、約４℃、およそ５００ＲＣＦでおよそ１５分間である。別の実施形態では、遠心分離することは、約４℃、およそ７５０ＲＣＦでおよそ１５分間である。別の実施形態では、遠心分離することは、約４℃、およそ１，０００ＲＣＦでおよそ１５分間である。別の実施形態では、遠心分離することは、約４℃、およそ１，５００ＲＣＦでおよそ１５分間である。別の実施形態では、遠心分離することは、約４℃、およそ２，０００ＲＣＦでおよそ１５分間である。別の実施形態では、遠心分離することは、約４℃、およそ２，５００ＲＣＦでおよそ１５分間である。別の実施形態では、遠心分離することは、約４℃、およそ３，０００ＲＣＦでおよそ１５分間である。
【0111】
別の実施形態では、遠心分離することは、約４℃、およそ５００ＲＣＦで１時間未満である。別の実施形態では、遠心分離することは、約４℃、およそ７５０ＲＣＦで１時間未満である。別の実施形態では、遠心分離することは、約４℃、およそ１，０００ＲＣＦで１時間未満である。別の実施形態では、遠心分離することは、約４℃、およそ１，５００ＲＣＦで１時間未満である。別の実施形態では、遠心分離することは、約４℃、およそ２，０００ＲＣＦで１時間未満である。別の実施形態では、遠心分離することは、約４℃、およそ２，５００ＲＣＦで１時間未満である。別の実施形態では、遠心分離することは、約４℃、およそ３，０００ＲＣＦで１時間未満である。
【0112】
一部の実施形態では、本明細書で提供される方法によって生成されたミトコンドリア置換Ｔ細胞における外因性ｍｔＤＮＡのコピー数と内因性ｍｔＤＮＡのコピー数の比は、４超：１である。一部の実施形態では、比は約４：１である。一部の実施形態では、比は約３：１である。一部の実施形態では、比は約２：１である。一部の実施形態では、比は約１：１である。一部の実施形態では、比は約０．７５：１である。一部の実施形態では、比は約０．５：１である。一部の実施形態では、比は約０．２５：１である。一部の実施形態では、比は約０．１：１である。
【0113】
本明細書で提供される方法に従って置換される内因性ｍｔＤＮＡのレベルは、外因性ｍｔＤＮＡによる内因性ｍｔＤＮＡの完全な置換（すなわち、１００％の置換）がもたらされるものである必要はない。例えば、一部の実施形態では、内因性ｍｔＤＮＡの少なくとも１０％が外因性ｍｔＤＮＡによって置換されている。一部の実施形態では、内因性ｍｔＤＮＡの少なくとも１５％が外因性ｍｔＤＮＡによって置換されている。一部の実施形態では、内因性ｍｔＤＮＡの少なくとも２０％が外因性ｍｔＤＮＡによって置換されている。一部の実施形態では、内因性ｍｔＤＮＡの少なくとも２５％が外因性ｍｔＤＮＡによって置換されている。一部の実施形態では、内因性ｍｔＤＮＡの少なくとも３０％が外因性ｍｔＤＮＡによって置換されている。一部の実施形態では、内因性ｍｔＤＮＡの少なくとも３５％が外因性ｍｔＤＮＡによって置換されている。一部の実施形態では、内因性ｍｔＤＮＡの少なくとも４０％が外因性ｍｔＤＮＡによって置換されている。一部の実施形態では、内因性ｍｔＤＮＡの少なくとも４５％が外因性ｍｔＤＮＡによって置換されている。一部の実施形態では、内因性ｍｔＤＮＡの少なくとも５０％が外因性ｍｔＤＮＡによって置換されている。一部の実施形態では、内因性ｍｔＤＮＡの少なくとも５５％が外因性ｍｔＤＮＡによって置換されている。一部の実施形態では、内因性ｍｔＤＮＡの少なくとも６０％が外因性ｍｔＤＮＡによって置換されている。一部の実施形態では、内因性ｍｔＤＮＡの少なくとも６５％が外因性ｍｔＤＮＡによって置換されている。一部の実施形態では、内因性ｍｔＤＮＡの少なくとも７０％が外因性ｍｔＤＮＡによって置換されている。一部の実施形態では、内因性ｍｔＤＮＡの少なくとも８０％が外因性ｍｔＤＮＡによって置換されている。一部の実施形態では、内因性ｍｔＤＮＡの少なくとも９０％が外因性ｍｔＤＮＡによって置換されている。一部の実施形態では、内因性ｍｔＤＮＡの１００％が外因性ｍｔＤＮＡによって置換されている。一部の実施形態では、内因性ｍｔＤＮＡの大多数（すなわち、５０％よりも多く）が外因性ｍｔＤＮＡによって置換されている。一部の実施形態では、内因性ｍｔＤＮＡの約２０％～約９５％が外因性ｍｔＤＮＡによって置換されている。一部の実施形態では、内因性ｍｔＤＮＡの約２５％～約９０％が外因性ｍｔＤＮＡによって置換されている。一部の実施形態では、内因性ｍｔＤＮＡの約３０％～約８５％が外因性ｍｔＤＮＡによって置換されている。一部の実施形態では、内因性ｍｔＤＮＡの約３５％～約８０％が外因性ｍｔＤＮＡによって置換されている。一部の実施形態では、内因性ｍｔＤＮＡの約４０％～約７５％が外因性ｍｔＤＮＡによって置換されている。一部の実施形態では、内因性ｍｔＤＮＡの約２０％～約９５％が外因性ｍｔＤＮＡによって置換されている。一部の実施形態では、内因性ｍｔＤＮＡの約３０％～約６０％が外因性ｍｔＤＮＡによって置換されている。一部の実施形態では、内因性ｍｔＤＮＡの約４０％～約７０％が外因性ｍｔＤＮＡによって置換されている。一部の実施形態では、内因性ｍｔＤＮＡの約４０％～約８５％が外因性ｍｔＤＮＡによって置換されている。一部の実施形態では、内因性ｍｔＤＮＡの約４０％～約８０％が外因性ｍｔＤＮＡによって置換されている。一部の実施形態では、内因性ｍｔＤＮＡの約３０％～約８５％が外因性ｍｔＤＮＡによって置換されている。一部の実施形態では、内因性ｍｔＤＮＡの約５０％～約８０％が外因性ｍｔＤＮＡによって置換されている。一部の実施形態では、内因性ｍｔＤＮＡの約６０％～約９０％が外因性ｍｔＤＮＡによって置換されている。一部の実施形態では、内因性ｍｔＤＮＡの約６５％～約９５％が外因性ｍｔＤＮＡによって置換されている。当業者に公知のまたは本明細書に記載の技法（例えば、実施例におけるもの）を使用して、外因性ｍｔＤＮＡによる内因性ｍｔＤＮＡの置換を評価することができる。
【0114】
本明細書で提供されている通り、本明細書で提供される方法に従って減少する内因性ｍｔＤＮＡコピー数のレベルは、完全な枯渇である必要はない。一部の実施形態では、内因性ｍｔＤＮＡコピー数の大多数（すなわち、５０％よりも多く）が減少する。一部の実施形態では、内因性ｍｔＤＮＡコピー数の約２０％～約９５％が減少する。一部の実施形態では、内因性ｍｔＤＮＡコピー数の約２５％～約９０％が減少する。一部の実施形態では、内因性ｍｔＤＮＡコピー数の約３０％～約９０％が減少する。一部の実施形態では、内因性ｍｔＤＮＡコピー数の約３０％～約８５％が減少する。一部の実施形態では、内因性ｍｔＤＮＡコピー数の約３５％～約８０％が減少する。一部の実施形態では、内因性ｍｔＤＮＡコピー数の約４０％～約７５％が減少する。一部の実施形態では、内因性ｍｔＤＮＡコピー数の約２０％～約９５％が減少する。一部の実施形態では、内因性ｍｔＤＮＡコピー数の約３０％～約６０％が減少する。一部の実施形態では、内因性ｍｔＤＮＡコピー数の約４０％～約７０％が減少する。一部の実施形態では、内因性ｍｔＤＮＡコピー数の約４０％～約８５％が減少する。一部の実施形態では、内因性ｍｔＤＮＡコピー数の約４０％～約８０％が減少する。一部の実施形態では、内因性ｍｔＤＮＡコピー数の約３０％～約８５％が減少する。一部の実施形態では、内因性ｍｔＤＮＡコピー数の約５０％～約８０％が減少する。一部の実施形態では、内因性ｍｔＤＮＡコピー数の約６０％～約８０％が減少する。一部の実施形態では、内因性ｍｔＤＮＡコピー数の約６０％～約９０％が減少する。一部の実施形態では、内因性ｍｔＤＮＡコピー数の約６５％～約９５％が減少する。一部の実施形態では、内因性ｍｔＤＮＡコピー数の約１０％が減少する。一部の実施形態では、内因性ｍｔＤＮＡコピー数の約１０％が減少する。一部の実施形態では、内因性ｍｔＤＮＡコピー数の約２０％が減少する。一部の実施形態では、内因性ｍｔＤＮＡコピー数の約３０％が減少する。一部の実施形態では、内因性ｍｔＤＮＡコピー数の約４０％が減少する。一部の実施形態では、内因性ｍｔＤＮＡコピー数の約５０％が減少する。一部の実施形態では、内因性ｍｔＤＮＡコピー数の約６０％が減少する。一部の実施形態では、内因性ｍｔＤＮＡコピー数の約７０％が減少する。一部の実施形態では、内因性ｍｔＤＮＡコピー数の約８０％が減少する。一部の実施形態では、内因性ｍｔＤＮＡコピー数の約８５％が減少する。一部の実施形態では、内因性ｍｔＤＮＡコピー数の約９０％が減少する。一部の実施形態では、内因性ｍｔＤＮＡコピー数の約９５％が減少する。当業者に公知のまたは本明細書に記載の技法（例えば、実施例におけるもの）を使用して、減少の前後の内因性ｍｔＤＮＡコピー数の量を評価することができる。
【0115】
ある特定の実施形態では、Ｔ細胞はＣＤ４＋Ｔ細胞である。一部の実施形態では、Ｔ細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞である。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞はダブルポジティブＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞である。一部の実施形態では、Ｔ細胞はＴｒｅｇであるまたはＴｒｅｇを含む。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞は、エフェクターＴ細胞であるまたはエフェクターＴ細胞を含む。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、メモリーＴ細胞、エフェクターＴ細胞、Ｔｒｅｇ、もしくはこれらの組合せである、またはメモリーＴ細胞、エフェクターＴ細胞、Ｔｒｅｇ、もしくはこれらの組合せを含む。
【0116】
一部の実施形態では、Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するように遺伝子改変されたＴ細胞である。例えば、ＴＣＲは、腫瘍細胞の内部に存在する抗原も認識することができる天然に存在する受容体を使用する。他方、ＣＡＲは、がん細胞の表面上の特定の抗原のみを認識することができる抗体の部分を含む。ＣＡＲ－Ｔ細胞およびＴＣＲ Ｔ細胞は、免疫療法において使用されるにもかかわらず、疲弊したものになり得る。したがって、本明細書で提供される通り、一部の実施形態では、本明細書に記載の方法、例えば、６．１節に記載の方法に従って疲弊Ｔ細胞から作製されるミトコンドリア置換Ｔ細胞は、ＣＡＲ－Ｔ細胞またはＴＣＲ Ｔ細胞であってよく、がんの症状を処置するまたは好転させるために対象に投与することができる。本明細書に記載のミトコンドリア置換Ｔ細胞が有益であり得る非限定的な例示的ながんの型としては、血液がん（例えば、急性リンパ性白血病、多発性骨髄腫、Ｂ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫（mantel cell lymphoma））、ならびに固形腫瘍が挙げられる。具体的な実施形態では、対象はヒト対象である。
【0117】
ＣＡＲは、一般に、細胞外標的結合性ドメイン、ヒンジ領域、ＣＡＲを細胞膜に繋ぎ止める膜貫通ドメイン、および活性化シグナルを伝達する１つまたは複数の細胞内ドメインを含むように設計される。ＣＡＲは、共刺激ドメインの数に応じて第１世代（細胞内ドメイン、例えば、ＣＤ３ζのみ）、第２世代（１つの共刺激ドメインと細胞内ドメイン）、または第３世代ＣＡＲ（１つよりも多くの共刺激ドメインと細胞内ドメイン）に分類することができる。新世代ＣＡＲも開発中である（例えば、Guedan S, et al. Mol Ther Methods Clin Dev. 2018 Dec 31; 12: 145-156を参照されたい）。血液学的悪性腫瘍に対するＣＡＲ標的（例えば、ＣＤ１９、ＢＣＭＡ）および固形腫瘍に対するＣＡＲ標的（例えば、ＨＥＲ２、ＰＳＣＡ）が当技術分野で公知であり、いずれの標的も本開示との使用に適する（例えば、Dotti G, et al. Immunol Rev. 2014; 257 (1): 107-126を参照されたい）。ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＣＡＲ－Ｔ細胞の投与を受ける対象に対して自己であっても同種であってもよい。一部の実施形態では、ＣＡＲ－Ｔ細胞は対象に対して同種である。他の実施形態では、ＣＡＲ－Ｔ細胞は自己である。
【0118】
ある特定の実施形態では、ＣＡＲは、腫瘍抗原認識ドメイン、膜貫通ドメイン、および１つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、ＣＡＲは、腫瘍抗原認識ドメイン、膜貫通ドメイン、１つまたは複数の共刺激分子、および１つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインを含む。具体的な実施形態では、ＣＡＲは、腫瘍抗原認識ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインを含む。具体的な実施形態では、ＣＡＲは、腫瘍抗原認識ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞内ドメインおよび少なくとも１つの共刺激ドメインを含む。別の具体的な実施形態では、ＣＡＲは、腫瘍抗原認識ドメイン、膜貫通ドメイン、２つまたはそれよりも多くの共刺激ドメインおよび細胞内ドメインを含む。一部の実施形態では、ＣＡＲは、構成的にまたは誘導性に発現されるケモカインを含む。ある特定の実施形態では、ＣＡＲは、サイトカイン受容体の細胞内ドメイン（例えば、ＩＬ－２Ｒβ鎖断片）を含む。
【0119】
一部の実施形態では、Ｔ細胞は、ＴＣＲを発現するように遺伝子改変されたＴ細胞である。ＴＣＲは、一般に、アルファペプチド鎖およびベータペプチド鎖からなるヘテロ二量体を使用して、ＭＨＣ分子によって提示されるポリペプチド断片を認識し、また、ＴＣＲ Ｔ細胞は、特定の抗原を認識することができる遺伝子操作されたＴＣＲ産物である。一般に、人工的に設計された高親和性ＴＣＲが遺伝子操作技術によってＴ細胞にコードされ、それにより、Ｔ細胞による腫瘍細胞の認識の間の特異的認識および親和性の両方が増強される。ＴＣＲ－Ｔ細胞は、ＴＣＲ－Ｔ細胞の投与を受ける対象に対して自己であっても同種であってもよい。一部の実施形態では、ＴＣＲ－Ｔ細胞は対象に対して同種である。他の実施形態では、ＴＣＲ－Ｔ細胞は自己である。例えば、ＣＡＲ Ｔ細胞を作製する１つの方法についての実施例などの当業者に公知の技法を使用して、ＣＡＲ－Ｔ細胞およびＴＣＲ Ｔ細胞を作製することができる。
【0120】
ある特定の実施形態では、ＴＣＲ Ｔ細胞は、血液学的悪性腫瘍上の抗原（例えば、ＣＭＶ、ＷＴ１、ＨＡ－１）を認識する。ある特定の実施形態では、ＴＣＲ Ｔ細胞は、固形腫瘍上の抗原（例えば、ＨＢＶ、ｐ５３、変異型ＫＲＡＳ）を認識する。ある特定の実施形態では、ＴＣＲ Ｔ細胞は、ＨＩＶに関連するＳＬ９を認識する。
【0121】
本明細書で提供されている通り、本開示に記載の疲弊Ｔ細胞からミトコンドリア置換Ｔ細胞を作製するための方法は、ミトコンドリア置換Ｔ細胞を老化Ｔ細胞から作製することにも適用可能である。老化細胞は、一般に、１つまたは複数の表現型マーカー、例えば、炎症性サイトカイン（例えば、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）および／または腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）、増殖因子、およびプロテアーゼの分泌の増加、ならびに細胞集団倍加の低減および／または速度の低下、テロメアの短縮、ＤＮＡ損傷応答（ＤＤＲ）の増大、またはこれらの組合せを示す。
【0122】
一部の実施形態では、本明細書で提供される方法に従って生成されるミトコンドリア置換Ｔ細胞は、老化細胞から作製され、ミトコンドリア置換Ｔ細胞は、単離された外因性ミトコンドリアと共にインキュベートされていない老化Ｔ細胞と比較して老化の低減を有する。ある特定の実施形態では、本明細書で提供される方法に従って生成されるミトコンドリア置換Ｔ細胞は、老化細胞から作製され、炎症性サイトカイン（例えば、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）および／または腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα））の分泌の低減を有する。ある特定の実施形態では、本明細書で提供される方法に従って生成されるミトコンドリア置換Ｔ細胞は、老化細胞から作製され、増殖因子の分泌の低減を有する。ある特定の実施形態では、本明細書で提供される方法に従って生成されるミトコンドリア置換Ｔ細胞は、老化細胞から作製され、プロテアーゼの分泌の低減を有する。ある特定の実施形態では、本明細書で提供される方法に従って生成されるミトコンドリア置換Ｔ細胞は、老化細胞から作製され、増大した増殖を有する。ある特定の実施形態では、本明細書で提供される方法に従って生成されるミトコンドリア置換Ｔ細胞は、老化細胞から作製され、テロメア短縮の低減を有する。ある特定の実施形態では、本明細書で提供される方法に従って生成されるミトコンドリア置換Ｔ細胞は、老化細胞から作製され、ＤＮＡ損傷応答（ＤＤＲ）の低減を有する。
【0123】
一部の実施形態では、本明細書で提供される方法に従って生成されるミトコンドリア置換Ｔ細胞は、疲弊Ｔ細胞から作製され、ミトコンドリア置換Ｔ細胞は、単離された外因性ミトコンドリアと共にインキュベートされていない疲弊Ｔ細胞と比較して老化の低減を有する。ある特定の実施形態は、本明細書で提供される方法に従って生成されるミトコンドリア置換Ｔ細胞は、疲弊Ｔ細胞から作製され、炎症性サイトカイン（例えば、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）および／または腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα））の分泌の低減を有する。ある特定の実施形態では、本明細書で提供される方法に従って生成されるミトコンドリア置換Ｔ細胞は、疲弊Ｔ細胞から作製され、増殖因子の分泌の低減を有する。ある特定の実施形態では、本明細書で提供される方法に従って生成されるミトコンドリア置換Ｔ細胞は、疲弊Ｔ細胞から作製され、プロテアーゼの分泌の低減を有する。ある特定の実施形態では、本明細書で提供される方法に従って生成されるミトコンドリア置換Ｔ細胞は、疲弊Ｔ細胞から作製され、増大した増殖を有する。ある特定の実施形態では、本明細書で提供される方法に従って生成されるミトコンドリア置換Ｔ細胞は、疲弊Ｔ細胞から作製され、テロメア短縮の低減を有する。ある特定の実施形態では、本明細書で提供される方法に従って生成されるミトコンドリア置換Ｔ細胞は、疲弊Ｔ細胞から作製され、ＤＮＡ損傷応答（ＤＤＲ）の低減を有する。
【0124】
具体的な実施形態では、実施例８．１に記載の方法を使用してミトコンドリア置換Ｔ細胞を生成するための方法が本明細書で提供される。
６．２ 処置方法
６．２ 処置方法
【0125】
本明細書で提供されている通り、本開示の方法に従って生成されたミトコンドリア置換Ｔ細胞は、例えば６．２．１節、６．２．２節および６．２．３節に記載の方法における、細胞に基づく治療（単数または複数）としての使用に適している。例えば、一部の実施形態では、有効量の、６．１節に記載の方法に従って生成されたミトコンドリア置換Ｔ細胞を薬学的に許容される担体と組み合わせて、医薬組成物をもたらすことができる。
【0126】
一部の実施形態では、本明細書に記載の方法に従って生成されたミトコンドリア置換Ｔ細胞を含む組成物（例えば、医薬組成物）が本明細書で提供される。一部の実施形態では、有効量の、本明細書に記載の方法に従って生成されたミトコンドリア置換Ｔ細胞と、薬学的に許容される担体とを含む組成物（例えば、医薬組成物）が本明細書で提供される。
【0127】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される」という用語は、担体に関して使用される場合、担体、希釈剤または賦形剤が毒性でも他の点で望ましくないものでもなく（すなわち、材料を、いかなる望ましくない生物学的効果も引き起こすことなく対象に投与することができる）、製剤の他の成分と適合性であることを意味するものとする。「担体」という用語は、治療薬と共に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指す。そのような医薬担体は、生理食塩溶液などの滅菌された液体であり得る。生理食塩溶液は、医薬組成物が静脈内投与される場合の担体であり得る。生理食塩溶液および水性デキストロースおよびグリセロール溶液も液体担体、特に注射液として用いることができる。組成物はまた、所望であれば、微量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含有してもよい。
【0128】
ある特定の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の有効量は、細胞約１×１０６～約１×１０７個である。一部の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の有効量は、細胞約１０×１０６～約９００×１０６個である。一部の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の有効量は、細胞約５０×１０６～約８００×１０６個である。一部の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の有効量は、細胞約１００×１０６～約７００×１０６個である。一部の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の有効量は、細胞約２００×１０６～約９００×１０６個である。一部の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の有効量は、細胞約２５０×１０６～約７５０×１０６個である。一部の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の有効量は、細胞約５０×１０６個である。一部の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の有効量は、細胞約１５０×１０６個である。一部の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の有効量は、細胞約３００×１０６個である。一部の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の有効量は、細胞約４５０×１０６個である。一部の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の有効量は、細胞約６００×１０６個である。一部の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の有効量は、細胞約８５０×１０６個である。
【0129】
特定の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の有効量は、例えば、対象の体重、または疾患もしくは障害の負荷量に基づいてなど、経験的に決定される。一部の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の有効量は、細胞約１．０×１０６個／ｋｇ～細胞約１．０×１０７個／ｋｇである。一部の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の有効量は、細胞約１．０×１０６個／ｋｇ～細胞約５００×１０６個／ｋｇである。一部の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の有効量は、細胞約１．０×１０６個／ｋｇ～細胞約５０×１０６個／ｋｇである。一部の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の有効量は、細胞約１．０×１０６個／ｋｇ～細胞約１０×１０６個／ｋｇである。一部の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の有効量は、細胞約１．０×１０６個／ｋｇ～細胞約５．０×１０６個／ｋｇである。一部の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の有効量は、細胞約１０×１０６個／ｋｇ～細胞約６００×１０６個／ｋｇである。一部の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の有効量は、細胞約５０×１０６個／ｋｇ～細胞約７５０×１０６個／ｋｇである。一部の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の有効量は、細胞約１．０×１０６個／ｋｇである。一部の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の有効量は、細胞約２．５×１０６個／ｋｇである。一部の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の有効量は、細胞約５．０×１０６個／ｋｇである。一部の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の有効量は、細胞約１０．０×１０６個／ｋｇである。一部の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の有効量は、細胞約５０．０×１０６個／ｋｇである。一部の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の有効量は、細胞約２５０．０×１０６個／ｋｇである。一部の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の有効量は、細胞約５００×１０６個／ｋｇである。
【0130】
ある特定の実施形態では、Ｔ細胞疲弊が生じやすい、治療に適用される任意のＴ細胞療法に対してミトコンドリア置換が有益であり得る。例えば、ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるミトコンドリア置換Ｔ細胞、例えば、６．１節または下に記載の実施例に記載の方法に従って生成されたミトコンドリア置換Ｔ細胞は、がんによってＴ細胞疲弊が引き起こされる状態の処置における使用に適している。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるミトコンドリア置換Ｔ細胞、例えば、６．１節または下に記載の実施例に記載の方法に従って生成されたミトコンドリア置換Ｔ細胞は、ウイルス感染症によってＴ細胞疲弊が引き起こされる状態の処置における使用に適している。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるミトコンドリア置換Ｔ細胞、例えば、６．１節または下に記載の実施例に記載の方法に従って生成されたミトコンドリア置換Ｔ細胞は、細菌感染症によってＴ細胞疲弊が引き起こされる状態の処置における使用に適している。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるミトコンドリア置換Ｔ細胞、例えば、６．１節または下に記載の実施例に記載の方法に従って生成されたミトコンドリア置換Ｔ細胞は、真菌感染症によってＴ細胞疲弊が引き起こされる状態の処置における使用に適している。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるミトコンドリア置換Ｔ細胞、例えば、６．１節または下に記載の実施例に記載の方法に従って生成されたミトコンドリア置換Ｔ細胞は、肥満症または代謝障害によってＴ細胞疲弊が引き起こされる状態の処置における使用に適している。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるミトコンドリア置換Ｔ細胞、例えば、６．１節または下に記載の実施例に記載の方法に従って生成されたミトコンドリア置換Ｔ細胞は、アルコール症によってＴ細胞疲弊が引き起こされる状態の処置における使用に適している。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるミトコンドリア置換Ｔ細胞、例えば、６．１節または下に記載の実施例に記載の方法に従って生成されたミトコンドリア置換Ｔ細胞は、運動過剰によってＴ細胞疲弊が引き起こされる状態の処置における使用に適している。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるミトコンドリア置換Ｔ細胞、例えば、６．１節または下に記載の実施例に記載の方法に従って生成されたミトコンドリア置換Ｔ細胞は、過度の精神的ストレスによってＴ細胞疲弊が引き起こされる状態の処置における使用に適している。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるミトコンドリア置換Ｔ細胞、例えば、６．１節または下に記載の実施例に記載の方法に従って生成されたミトコンドリア置換Ｔ細胞は、低酸素症によってＴ細胞疲弊が引き起こされる状態の処置における使用に適している。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるミトコンドリア置換Ｔ細胞、例えば、６．１節または下に記載の実施例に記載の方法に従って生成されたミトコンドリア置換Ｔ細胞は、傷害によってＴ細胞疲弊が引き起こされる状態の処置における使用に適している。
【0131】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるミトコンドリア置換Ｔ細胞、例えば、６．１節または下に記載の実施例に記載の方法に従って生成されたミトコンドリア置換Ｔ細胞は、加齢によってＴ細胞老化が引き起こされる状態の処置における使用に適している。
【0132】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるミトコンドリア置換Ｔ細胞、例えば、６．１節または下に記載の実施例に記載の方法に従って生成されたミトコンドリア置換Ｔ細胞は、加齢性免疫学的機能障害の処置における使用に適している。
【0133】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるミトコンドリア置換Ｔ細胞、例えば、６．１節または下に記載の実施例に記載の方法に従って生成されたミトコンドリア置換Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞機能障害が認められる疾患状態の処置における使用に適している。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるミトコンドリア置換Ｔ細胞、例えば、６．１節または下に記載の実施例に記載の方法に従って生成されたミトコンドリア置換Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞機能障害が認められる状態の処置における使用に適している。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるミトコンドリア置換Ｔ細胞、例えば、６．１節または下に記載の実施例に記載の方法に従って生成されたミトコンドリア置換Ｔ細胞は、Ｔ細胞プライミングの機能障害が認められる状態の処置における使用に適している。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるミトコンドリア置換Ｔ細胞、例えば、６．１節または下に記載の実施例に記載の方法に従って生成されたミトコンドリア置換Ｔ細胞は、メモリーＴ細胞機能障害が認められる状態の処置における使用に適している。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるミトコンドリア置換Ｔ細胞、例えば、６．１節または下に記載の実施例に記載の方法に従って生成されたミトコンドリア置換Ｔ細胞は、Ｂ細胞機能障害が認められる状態の処置における使用に適している。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるミトコンドリア置換Ｔ細胞、例えば、６．１節または下に記載の実施例に記載の方法に従って生成されたミトコンドリア置換Ｔ細胞は、Ｂ細胞プライミングの機能障害が認められる状態の処置における使用に適している。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるミトコンドリア置換Ｔ細胞、例えば、６．１節または下に記載の実施例に記載の方法に従って生成されたミトコンドリア置換Ｔ細胞は、メモリーＢ細胞機能障害が認められる状態の処置における使用に適している。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるミトコンドリア置換Ｔ細胞、例えば、６．１節または下に記載の実施例に記載の方法に従って生成されたミトコンドリア置換Ｔ細胞は、先天性リンパ球系細胞機能障害が認められる状態の処置における使用に適している。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるミトコンドリア置換Ｔ細胞、例えば、６．１節または下に記載の実施例に記載の方法に従って生成されたミトコンドリア置換Ｔ細胞は、先天性Ｔ細胞機能障害が認められる状態の処置における使用に適している。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるミトコンドリア置換Ｔ細胞、例えば、６．１節または下に記載の実施例に記載の方法に従って生成されたミトコンドリア置換Ｔ細胞は、先天性Ｂ細胞機能障害が認められる状態の処置における使用に適している。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるミトコンドリア置換Ｔ細胞、例えば、６．１節または下に記載の実施例に記載の方法に従って生成されたミトコンドリア置換Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞機能障害が認められる状態の処置における使用に適している。
【0134】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるミトコンドリア置換Ｔ細胞、例えば、６．１節または下に記載の実施例に記載の方法に従って生成されたミトコンドリア置換Ｔ細胞は、Ｔ細胞疲弊が関与するがん患者における疾患状態の処置における使用に適している。例えば、ＰＤ－１のリガンドであるＰＤ－Ｌ１および／またはＰＤ－Ｌ２の発現が、例えば、食道がん、肝細胞癌、軟部肉腫、非小細胞肺がん、乳がん、卵巣がん、黒色腫、膵がん、子宮頸がん、および結腸がんなどのいくつかのヒト悪性腫瘍の予後と相関する。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるミトコンドリア置換Ｔ細胞、例えば、６．１節または下に記載の実施例に記載の方法に従って生成されたミトコンドリア置換Ｔ細胞は、腫瘍へのＴ細胞浸潤の欠如または低減が認められる固形がん患者の処置における使用に適している。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるミトコンドリア置換Ｔ細胞、例えば、６．１節または下に記載の実施例に記載の方法に従って生成されたミトコンドリア置換Ｔ細胞は、Ｔ細胞疲弊表現型または老化表現型のいずれかを示すＴ細胞を有するがん患者の処置における使用に適している。
【0135】
抗がん治療により、処置を受けるがん患者において組織機能障害、および種々の加齢性症状の早発が促進される恐れがある（Wang B, et al., Trends Cancer. 2020 Oct; 6 (10): 838-857を参照されたい）。したがって、一部の実施形態では、本明細書で提供されるミトコンドリア置換Ｔ細胞、例えば、６．１節または下に記載の実施例に記載の方法に従って生成されたミトコンドリア置換Ｔ細胞は、抗がん治療により誘発された老化細胞の蓄積および残存の処置における使用に適している。
【0136】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるミトコンドリア置換Ｔ細胞、例えば、６．１節または下に記載の実施例に記載の方法に従って生成されたミトコンドリア置換Ｔ細胞は、Ｔ細胞疲弊またはＴ細胞老化が認められる線維化疾患の処置における使用に適している。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるミトコンドリア置換Ｔ細胞、例えば、６．１節または下に記載の実施例に記載の方法に従って生成されたミトコンドリア置換Ｔ細胞は、Ｔ細胞疲弊またはＴ細胞老化が認められる黄斑疾患の処置における使用に適している。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるミトコンドリア置換Ｔ細胞、例えば、６．１節または下に記載の実施例に記載の方法に従って生成されたミトコンドリア置換Ｔ細胞は、Ｔ細胞疲弊またはＴ細胞老化が認められる筋肉変性疾患の処置における使用に適している。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるミトコンドリア置換Ｔ細胞、例えば、６．１節または下に記載の実施例に記載の方法に従って生成されたミトコンドリア置換Ｔ細胞は、Ｔ細胞疲弊またはＴ細胞老化が認められる神経変性疾患の処置における使用に適している。
【0137】
ある特定の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞を用いた処置の結果、以下のうちの１つ、２つ、もしくはそれよりも多く、または全てがもたらされる：（１）１つまたは複数の症状の重症度、進行、広がり、および／または発生頻度の低減、（２）１つまたは複数の症状および／または根本原因の消失、（３）１つまたは複数の症状および／またはそれらの根本原因の発生の防止、ならびに（４）損傷の改善または矯正。具体的な実施形態では、処置には、状態、疾患または障害に対する治療的処置ならびに予防的または抑制的措置が含まれる。
【0138】
一部の実施形態では、例えば、６．２．１節、６．２．２節および６．２．３節に記載の方法において、細胞に基づく治療（単数または複数）として使用するためのミトコンドリア置換Ｔ細胞は、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の投与を受ける対象に対して自己または同種である。一部の実施形態では、例えば、６．２．１節、６．２．２節および６．２．３節に記載の方法において、細胞に基づく治療として使用するためのミトコンドリア置換Ｔ細胞は、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の投与を受ける対象に対して自己である。一部の実施形態では、例えば、６．２．１節、６．２．２節および６．２．３節に記載の方法において、細胞に基づく治療として使用するためのミトコンドリア置換Ｔ細胞は、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の投与を受ける対象に対して同種である。
６．２．１ 加齢性疾患を処置する方法
６．２．１ 加齢性疾患を処置する方法
【0139】
一態様では、加齢性疾患の症状を処置するまたは好転させるための方法であって、対象に、有効量の、６．１節に記載の方法に従って生成されたミトコンドリア置換Ｔ細胞と、薬学的に許容される担体とを含む組成物を投与するステップを含む、方法が本明細書で提供される。本明細書で提供される方法の一部の実施形態では、加齢性疾患は、自己免疫疾患、またはがんからなる群から選択される。具体的な実施形態では、対象はヒトである。
【0140】
ある特定の実施形態では、加齢性疾患（例えば、がんまたは自己免疫疾患）の症状を好転させるための方法は、以下のうちの１つ、２つもしくはそれよりも多く、または全てを含む：（１）１つまたは複数の症状の重症度、進行、広がり、および／または発生頻度の低減、（２）１つまたは複数の症状および／または根本原因の消失、（３）１つまたは複数の症状および／またはそれらの根本原因の発生の防止、ならびに（４）損傷の改善または矯正。一実施形態では、加齢性疾患（例えば、がんまたは自己免疫疾患）の症状を好転させるための方法は、症状の重症度の低下を含む。一実施形態では、加齢性疾患（例えば、がんまたは自己免疫疾患）の症状を好転させるための方法は、症状の進行の低減を含む。別の実施形態では、加齢性疾患（例えば、がんまたは自己免疫疾患）の症状を好転させるための方法は、症状の広がりの低減を含む。別の実施形態では、加齢性疾患（例えば、がんまたは自己免疫疾患）の症状を好転させるための方法により、症状の発生頻度が低減する。別の実施形態では、加齢性疾患（例えば、がんまたは自己免疫疾患）の症状を好転させるための方法は、症状の排除を含む。別の実施形態では、加齢性疾患（例えば、がんまたは自己免疫疾患）の症状を好転させるための方法は、加齢性疾患（例えば、がんまたは自己免疫疾患）の症状の発生の防止を含む。別の実施形態では、加齢性疾患（例えば、がんまたは自己免疫疾患）の症状を好転させるための方法は、加齢性疾患（例えば、がんまたは自己免疫疾患）による損傷の改善を含む。別の実施形態では、加齢性疾患（例えば、がんまたは自己免疫疾患）の症状を好転させるための方法は、加齢性疾患（例えば、がんまたは自己免疫疾患）による損傷の矯正を含む。
【0141】
具体的な実施形態では、がんの処置を、それを必要とする対象において行うための方法であって、対象に、有効量の、本明細書に記載の方法（例えば、６．１節または実施例において）に従って生成されたミトコンドリア置換Ｔ細胞と、薬学的に許容される担体とを含む組成物を投与するステップを含む、方法が本明細書で提供される。別の具体的な実施形態では、がんの症状の好転を、それを必要とする対象において行うための方法であって、対象に、有効量の、本明細書に記載の方法（例えば、６．１節または実施例において）に従って生成されたミトコンドリア置換Ｔ細胞と、薬学的に許容される担体とを含む組成物を投与するステップを含む、方法が本明細書で提供される。特定の実施形態では、疲弊Ｔ細胞およびミトコンドリア置換Ｔ細胞は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、疲弊Ｔ細胞およびミトコンドリア置換Ｔ細胞は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝子改変されている。他の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝子改変されている。
【0142】
別の具体的な実施形態では、それを必要とする対象における抗がん治療により誘発された老化細胞の蓄積および残存を処置するための方法であって、対象に、有効量の、本明細書に記載の方法（例えば、６．１節または実施例において）に従って生成されたミトコンドリア置換Ｔ細胞と、薬学的に許容される担体とを含む組成物を投与するステップを含む、方法が本明細書で提供される。別の具体的な実施形態では、それを必要とする対象における抗がん治療により誘発された老化細胞の症状を好転させるための方法であって、対象に、有効量の、本明細書に記載の方法（例えば、６．１節または実施例において）に従って生成されたミトコンドリア置換Ｔ細胞と、薬学的に許容される担体とを含む組成物を投与するステップを含む、方法が本明細書で提供される。
６．２．２ 慢性感染症を処置する方法
６．２．２ 慢性感染症を処置する方法
【0143】
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｂ型肝炎（ＨＢＶ）、およびＣ型肝炎（ＨＣＶ）などの種々のヒト慢性ウイルス感染症、ならびにマラリアおよびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓなどの非ウイルス性慢性感染症においてＴ細胞疲弊も報告されている。したがって、一態様では、それを必要とする対象における慢性感染症の症状を好転させるための方法であって、対象に、有効量の、本明細書に記載の方法（例えば、６．１節または実施例において）に従って生成されたミトコンドリア置換Ｔ細胞と、薬学的に許容される担体とを含む組成物を投与するステップを含む、方法が本明細書で提供される。
【0144】
ある特定の実施形態では、慢性感染症は、ウイルス感染症である。本明細書に記載のミトコンドリア置換Ｔ細胞を用いた処置に適したウイルス感染症の非限定的な例としては、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染症、Ｂ型肝炎（ＨＢＶ）感染症、Ｃ型肝炎（ＨＣＶ）感染症、サイトメガロウイルス感染症、およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症が挙げられる。一実施形態では、慢性ウイルス感染症はＨＩＶである。一実施形態では、慢性ウイルス感染症はＨＢＶ感染症である。別の実施形態では、慢性ウイルス感染症はＨＣＶ感染症である。別の実施形態では、慢性ウイルス感染症はサイトメガロウイルス感染症である。一実施形態では、慢性ウイルス感染症はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症である。他の実施形態では、慢性感染症は非ウイルス感染症である。例えば、ある特定の実施形態では、慢性感染症は細菌または真菌感染症である。
【0145】
ある特定の実施形態では、慢性感染症の症状を好転させるための方法は、以下のうちの１つ、２つ、もしくはそれよりも多く、または全てを含む：（１）１つまたは複数の症状の重症度、進行、広がり、および／または発生頻度の低減、（２）１つまたは複数の症状および／または根本原因の消失、（３）１つまたは複数の症状および／またはそれらの根本原因の発生の防止、ならびに（４）損傷の改善または矯正。一実施形態では、慢性感染症の症状を好転させるための方法は、症状の重症度の低下を含む。一実施形態では、慢性感染症の症状を好転させるための方法は、症状の進行の低減を含む。別の実施形態では、慢性感染症の症状を好転させるための方法は、症状の広がりの低減を含む。別の実施形態では、慢性感染症の症状を好転させるための方法により、症状の発生頻度が低減する。別の実施形態では、慢性感染症の症状を好転させるための方法は、症状の排除を含む。別の実施形態では、慢性感染症の症状を好転させるための方法は、慢性感染症の症状の発生の防止を含む。別の実施形態では、慢性感染症の症状を好転させるための方法は、慢性感染症による損傷の改善を含む。別の実施形態では、慢性感染症の症状を好転させるための方法は、慢性感染症による損傷の矯正を含む。
６．２．３ ミトコンドリア病または障害を処置する方法
６．２．３ ミトコンドリア病または障害を処置する方法
【0146】
別の態様では、それを必要とする対象に対する、ミトコンドリア複合体ＩＩＩ欠損症の症状を好転させるための方法であって、対象に、有効量の、本明細書に記載の方法（例えば、６．１節または実施例において）に従って生成されたミトコンドリア置換Ｔ細胞と、薬学的に許容される担体とを含む組成物を投与するステップを含む、方法が本明細書で提供される。
【0147】
ミトコンドリア複合体ＩＩＩは、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の抑制機能のために必須である。例えば、Ｔｒｅｇ細胞は免疫調節性遺伝子発現および抑制機能を維持するためにミトコンドリア複合体ＩＩＩを必要とすることが示されている（Weinberg, S. et al. Nature vol. 565,7740 (2019) : 495-499を参照されたい）。ミトコンドリア複合体ＩＩＩ欠損症は、遺伝子疾患である。ミトコンドリア複合体ＩＩＩ欠損症は、一般に、ＢＣＳ１Ｌ、ＵＱＣＲＢおよびＵＱＣＲＱ遺伝子の核ＤＮＡの変異によって引き起こされ、常染色体劣性様式で遺伝する。しかし、ＭＴＣＹＢ遺伝子のミトコンドリアＤＮＡの変異によって引きこされる場合もあり、その場合、母親から伝わるまたは散発的に生じ、軽症の状態がもたらされ得る。
【0148】
したがって、一部の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞はＴｒｅｇ細胞であり、ミトコンドリア置換Ｔ細胞は、ミトコンドリア複合体ＩＩＩ欠損症を有する対象に投与される。具体的な実施形態では、対象はヒト対象である。
【0149】
ある特定の実施形態では、ミトコンドリア複合体ＩＩＩ欠損症の症状を好転させるための方法は、以下のうちの１つ、２つ、３つもしくはそれよりも多く、または全てを含む：（１）１つまたは複数の症状の重症度、進行、広がり、および／または発生頻度の低減、（２）１つまたは複数の症状および／または根本原因の消失、（３）１つまたは複数の症状および／またはそれらの根本原因の発生の防止、ならびに（４）損傷の改善または矯正。一実施形態では、ミトコンドリア複合体ＩＩＩ欠損症の症状を好転させるための方法は、症状の重症度の低下を含む。一実施形態では、ミトコンドリア複合体ＩＩＩ欠損症の症状を好転させるための方法は、症状の進行の低減を含む。別の実施形態では、ミトコンドリア複合体ＩＩＩ欠損症の症状を好転させるための方法は、症状の広がりの低減を含む。別の実施形態では、ミトコンドリア複合体ＩＩＩ欠損症の症状を好転させるための方法により、症状の発生頻度が低減する。別の実施形態では、ミトコンドリア複合体ＩＩＩ欠損症の症状を好転させるための方法は、症状の排除を含む。別の実施形態では、ミトコンドリア複合体ＩＩＩ欠損症の症状を好転させるための方法は、ミトコンドリア複合体ＩＩＩ欠損症の症状の発生の防止を含む。別の実施形態では、ミトコンドリア複合体ＩＩＩ欠損症の症状を好転させるための方法は、ミトコンドリア複合体ＩＩＩ欠損症による損傷の改善を含む。別の実施形態では、ミトコンドリア複合体ＩＩＩ欠損症の症状を好転させるための方法は、ミトコンドリア複合体ＩＩＩ欠損症による損傷の矯正を含む。
６．３ 生物学的アッセイ
６．３ 生物学的アッセイ
【0150】
具体的な実施形態では、疲弊Ｔ細胞からのミトコンドリア置換Ｔ細胞の上首尾の生成により、ミトコンドリア置換を伴わない疲弊Ｔ細胞と比べて改善されたエフェクター機能を有するＴ細胞がもたらされる。種々の機能アッセイを使用して、ミトコンドリア置換Ｔ細胞の表現型を評価（ａｓｓｅｓｓ）および評価（ｅｖａｌｕａｔｅ）することができる。
【0151】
一部の実施形態では、ミトコンドリア置換Ｔ細胞は、ミトコンドリア置換を伴わないＴ細胞と比べてミトコンドリア機能の改善を有する。ミトコンドリア機能を評価する方法は当業者には理解されよう。例えば、Ｓｅａｈｏｒｓｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＸＦ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｆｌｕｘ Ａｎａｌｙｚｅｒなどの細胞に基づくアッセイを使用して基礎酸素消費量、解糖速度、ＡＴＰ産生、および呼吸容量の決定を実施して、ミトコンドリア機能不全を評価することができる。同様に、Ｏｒｏｂｏｒｏｓ ０２Ｋ呼吸計を使用して、定量的な機能的ミトコンドリア診断を確立することもできる。上記のアッセイ例は例示的なものであり、ミトコンドリア機能を評価するための全ての方法を包括するものではないことが理解される。
【0152】
細胞増殖の増大もＴ細胞機能の改善の指標であることができる。Ｔ細胞の細胞増殖を測定するための例示的なアッセイは、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイである。ＭＬＲアッセイは、一般に、ミトコンドリア置換Ｔ細胞、例えばＣＤ４＋Ｔ細胞の集団をリンパ球の異なる集団と組み合わせ、増殖を測定することを伴う。一部の実施形態では、本明細書で提供される方法に従って生成されるミトコンドリア置換Ｔ細胞は、疲弊Ｔ細胞と比較して細胞増殖の増大を有する。
【0153】
例えば、細胞傷害性Ｔ細胞における、ミトコンドリア置換細胞の機能を評価するために使用することができる別の例示的なアッセイは、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）アッセイである。ＣＴＬアッセイは、特定の抗原に対するＴ細胞の存在および細胞傷害活性を示し、この免疫機能に対する試験項目の影響を調査することを可能にするものである。したがって、一部の実施形態では、本明細書で提供される方法に従って生成されるミトコンドリア置換Ｔ細胞は、疲弊Ｔ細胞と比較してＣＴＬ応答の増大を有する。
【0154】
Ｃａ２＋シグナル伝達は、Ｔ細胞活性化のために、多数のシグナル伝達経路を迅速に活性化し、統合して、遺伝子の発現および機能に広範にわたる変化を生じさせる手段として極めて重要である。Ｃａ２＋シグナル伝達を評価するための様々なアッセイが当技術分野で公知である（Samakai E, et al., Signaling Mechanisms Regulating T Cell Diversity and Function. Boca Raton (FL): CRC Press/Taylor & Francis; 2018. Chapter 10.を参照されたい）したがって、一部の実施形態では、本明細書で提供される方法に従って生成されるミトコンドリア置換Ｔ細胞は、疲弊Ｔ細胞と比較してＣａ２＋シグナル伝達の増大を有する。
【0155】
テロメア長もミトコンドリア置換細胞の機能の指標として役立つことができる。テロメア長は、当技術分野で公知の任意の方法を使用して評価することができる。１つの例示的な技法は、ｑＰＣＲによって絶対的なテロメア長を測定することによるものである。したがって、一部の実施形態では、本明細書で提供される方法に従って生成されるミトコンドリア置換Ｔ細胞は、疲弊Ｔ細胞と比較してテロメア短縮の低減を有する。
【0156】
一部の実施形態では、ミトコンドリア置換細胞は、Ｔ細胞疲弊の低減を示す。疲弊マーカー（例えば、ＰＤ－１／ＴＩＭ３／ＬＡＧ３）についてのＦＡＣＳ分析を使用して、Ｔ細胞疲弊を評価することができる。したがって、一部の実施形態では、本明細書で提供される方法に従って生成されるミトコンドリア置換Ｔ細胞は、疲弊Ｔ細胞と比較して疲弊の低減を有する。
【0157】
本明細書で提供されている通り、一部の実施形態では、ミトコンドリア置換細胞を生成するために使用されるＴ細胞は老化したものであり、ミトコンドリア置換細胞は、老化の低減を示す。したがって、老化関連分泌表現型（ＳＡＳＰ）を評価することは、機能アッセイとして役立ち得る。ＳＡＳＰには、炎症性サイトカイン（例えば、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）および／または腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）、増殖因子、およびプロテアーゼの分泌の増加、ならびに細胞集団倍加の低減および／または速度の低下、テロメアの短縮、ＤＮＡ損傷応答（ＤＤＲ）の増大、またはこれらの組合せが含まれる。老化マーカー（例えば、ＣＤ５７／ＫＩＲ／ＫＬＲＧ１）についてのＦＡＣＳ分析を用いることもできる。したがって、一部の実施形態では、本明細書で提供される方法に従って生成されるミトコンドリア置換Ｔ細胞は、老化Ｔ細胞と比較して老化の低減を有する。
６．４ ヌクレオチドおよびタンパク質検出アッセイ
６．４ ヌクレオチドおよびタンパク質検出アッセイ
【0158】
当業者に公知のまたは本明細書に記載の技法（例えば、実施例におけるもの）を使用して、ＸｂａＩＲをコードするヌクレオチドの量（例えば、ＰＣＲもしくはｑＰＣＲ）、またはＸｂａＩＲもしくは融合タンパク質の量（例えば、免疫ブロット、ＥＬＩＳＡ）評価することができる。
７．実施形態
７．実施形態
【0159】
本発明は、以下の非限定的な実施形態を提供する。
【0160】
Ａ１
疲弊Ｔ細胞からミトコンドリア置換Ｔ細胞を作製するための方法であって、
内因性ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）コピー数が減少した疲弊Ｔ細胞を、単離された外因性ミトコンドリアと共に十分な期間にわたってインキュベートして、プログラム細胞死－１（ＰＤ－１）の発現が、前記ミトコンドリア置換Ｔ細胞が作製される前記疲弊Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現と比べて、多くても１．１分の１に低減したミトコンドリア置換Ｔ細胞を生成するステップ
を含み、
前記ミトコンドリア置換Ｔ細胞が、前記疲弊Ｔ細胞と比べて改善されたエフェクター機能を有する、方法。
疲弊Ｔ細胞からミトコンドリア置換Ｔ細胞を作製するための方法であって、
内因性ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）コピー数が減少した疲弊Ｔ細胞を、単離された外因性ミトコンドリアと共に十分な期間にわたってインキュベートして、プログラム細胞死－１（ＰＤ－１）の発現が、前記ミトコンドリア置換Ｔ細胞が作製される前記疲弊Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現と比べて、多くても１．１分の１に低減したミトコンドリア置換Ｔ細胞を生成するステップ
を含み、
前記ミトコンドリア置換Ｔ細胞が、前記疲弊Ｔ細胞と比べて改善されたエフェクター機能を有する、方法。
【0161】
Ａ２
疲弊Ｔ細胞からミトコンドリア置換Ｔ細胞を作製するための方法であって、
（ａ）疲弊Ｔ細胞に、ミトコンドリア標的化配列（ＭＴＳ）とＸｂａＩＲとを含む融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列をエレクトロポレーションして、内因性ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）コピー数を減少させるステップと、
（ｂ）内因性ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）コピー数が減少した前記疲弊Ｔ細胞を、単離された外因性ミトコンドリアと共に十分な期間にわたってインキュベートして、ＰＤ－１の発現が、前記ミトコンドリア置換Ｔ細胞が作製される前記疲弊Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現と比べて、多くても１．１分の１に低減したミトコンドリア置換Ｔ細胞を生成するステップと
を含み、前記ミトコンドリア置換Ｔ細胞が、前記疲弊Ｔ細胞と比べて改善されたエフェクター機能を有する、方法。
疲弊Ｔ細胞からミトコンドリア置換Ｔ細胞を作製するための方法であって、
（ａ）疲弊Ｔ細胞に、ミトコンドリア標的化配列（ＭＴＳ）とＸｂａＩＲとを含む融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列をエレクトロポレーションして、内因性ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）コピー数を減少させるステップと、
（ｂ）内因性ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）コピー数が減少した前記疲弊Ｔ細胞を、単離された外因性ミトコンドリアと共に十分な期間にわたってインキュベートして、ＰＤ－１の発現が、前記ミトコンドリア置換Ｔ細胞が作製される前記疲弊Ｔ細胞によるＰＤ－１の発現と比べて、多くても１．１分の１に低減したミトコンドリア置換Ｔ細胞を生成するステップと
を含み、前記ミトコンドリア置換Ｔ細胞が、前記疲弊Ｔ細胞と比べて改善されたエフェクター機能を有する、方法。
【0162】
Ａ３
前記疲弊Ｔ細胞の前記単離された外因性ミトコンドリアとのインキュベーションが、ラパマイシンの存在下で行われる、実施形態Ａ１またはＡ２に記載の方法。
前記疲弊Ｔ細胞の前記単離された外因性ミトコンドリアとのインキュベーションが、ラパマイシンの存在下で行われる、実施形態Ａ１またはＡ２に記載の方法。
【0163】
Ａ４
ラパマイシンが、１００ｎＭ～１０００ｎＭの濃度で存在する、実施形態Ａ３に記載の方法。
ラパマイシンが、１００ｎＭ～１０００ｎＭの濃度で存在する、実施形態Ａ３に記載の方法。
【0164】
Ａ５
ＰＤ－１の発現が多くても１．２分の１に低減する、実施形態Ａ１からＡ４のいずれか一項に記載の方法。
ＰＤ－１の発現が多くても１．２分の１に低減する、実施形態Ａ１からＡ４のいずれか一項に記載の方法。
【0165】
Ａ６
ＰＤ－１の発現が多くても１．２５分の１に低減する、実施形態Ａ１からＡ４のいずれか一項に記載の方法。
ＰＤ－１の発現が多くても１．２５分の１に低減する、実施形態Ａ１からＡ４のいずれか一項に記載の方法。
【0166】
Ａ７
ＰＤ－１の発現が多くても１．５分の１に低減する、実施形態Ａ１からＡ４のいずれか一項に記載の方法。
ＰＤ－１の発現が多くても１．５分の１に低減する、実施形態Ａ１からＡ４のいずれか一項に記載の方法。
【0167】
Ａ８
ＰＤ－１の発現が多くても２分の１に低減する、実施形態Ａ１からＡ４のいずれか一項に記載の方法。
ＰＤ－１の発現が多くても２分の１に低減する、実施形態Ａ１からＡ４のいずれか一項に記載の方法。
【0168】
Ａ９
ＰＤ－１の発現が多くても５分の１に低減する、実施形態Ａ１からＡ４のいずれか一項に記載の方法。
ＰＤ－１の発現が多くても５分の１に低減する、実施形態Ａ１からＡ４のいずれか一項に記載の方法。
【0169】
Ａ１０
ＰＤ－１の発現が約１．１分の１～約１．５分の１に低減する、実施形態Ａ１からＡ４のいずれか一項に記載の方法。
ＰＤ－１の発現が約１．１分の１～約１．５分の１に低減する、実施形態Ａ１からＡ４のいずれか一項に記載の方法。
【0170】
Ａ１１
Ｔ細胞免疫グロブリンおよびムチンドメイン含有タンパク質３（ＴＩＭ３）、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）、Ｔ細胞免疫グロブリンおよびＩＴＩＭドメイン（ＴＩＧＩＴ）、ＴＯＸ、またはこれらの組合せの発現を低減させる、実施形態Ａ１からＡ１０のいずれか一項に記載の方法。
Ｔ細胞免疫グロブリンおよびムチンドメイン含有タンパク質３（ＴＩＭ３）、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）、Ｔ細胞免疫グロブリンおよびＩＴＩＭドメイン（ＴＩＧＩＴ）、ＴＯＸ、またはこれらの組合せの発現を低減させる、実施形態Ａ１からＡ１０のいずれか一項に記載の方法。
【0171】
Ａ１２
前記単離された外因性ミトコンドリアが、細胞１×１０６個当たりタンパク質約２０μｇ～約８０μｇである、実施形態Ａ１からＡ１１のいずれか一項に記載の方法。
前記単離された外因性ミトコンドリアが、細胞１×１０６個当たりタンパク質約２０μｇ～約８０μｇである、実施形態Ａ１からＡ１１のいずれか一項に記載の方法。
【0172】
Ａ１３
前記ミトコンドリア置換Ｔ細胞が、少なくとも２０％の前記外因性ｍｔＤＮＡを含む、実施形態Ａ１からＡ１２のいずれか一項に記載の方法。
前記ミトコンドリア置換Ｔ細胞が、少なくとも２０％の前記外因性ｍｔＤＮＡを含む、実施形態Ａ１からＡ１２のいずれか一項に記載の方法。
【0173】
Ａ１４
前記ミトコンドリア置換Ｔ細胞が、ＴａｑＭａｎ一塩基多型（ＳＮＰ）アッセイによって測定して少なくとも２０％の外因性ｍｔＤＮＡかつ８０％以下の外因性ｍｔＤＮＡを含む、実施形態Ａ１からＡ１２のいずれか一項に記載の方法。
前記ミトコンドリア置換Ｔ細胞が、ＴａｑＭａｎ一塩基多型（ＳＮＰ）アッセイによって測定して少なくとも２０％の外因性ｍｔＤＮＡかつ８０％以下の外因性ｍｔＤＮＡを含む、実施形態Ａ１からＡ１２のいずれか一項に記載の方法。
【0174】
Ａ１５
前記ミトコンドリア置換Ｔ細胞が生成されるのに十分な期間が、少なくともおよそ２４時間である、実施形態Ａ１からＡ１４のいずれか一項に記載の方法。
前記ミトコンドリア置換Ｔ細胞が生成されるのに十分な期間が、少なくともおよそ２４時間である、実施形態Ａ１からＡ１４のいずれか一項に記載の方法。
【0175】
Ａ１６
前記ミトコンドリア置換Ｔ細胞が生成されるのに十分な期間が、少なくとも３６時間である、実施形態Ａ１からＡ１４のいずれか一項に記載の方法。
前記ミトコンドリア置換Ｔ細胞が生成されるのに十分な期間が、少なくとも３６時間である、実施形態Ａ１からＡ１４のいずれか一項に記載の方法。
【0176】
Ａ１７
前記ミトコンドリア置換Ｔ細胞が生成されるのに十分な期間が、少なくとも４８時間である、実施形態Ａ１からＡ１４のいずれか一項に記載の方法。
前記ミトコンドリア置換Ｔ細胞が生成されるのに十分な期間が、少なくとも４８時間である、実施形態Ａ１からＡ１４のいずれか一項に記載の方法。
【0177】
Ａ１８
前記ミトコンドリア置換Ｔ細胞が生成されるのに十分な期間が、約２４時間～約７２時間である、実施形態Ａ１からＡ１４のいずれか一項に記載の方法。
前記ミトコンドリア置換Ｔ細胞が生成されるのに十分な期間が、約２４時間～約７２時間である、実施形態Ａ１からＡ１４のいずれか一項に記載の方法。
【0178】
Ａ１９
前記改善されたエフェクター機能が、増大した増殖、増大した細胞傷害、サイトカインの増加した分泌、またはこれらの組合せを含む、実施形態Ａ１からＡ１８のいずれか一項に記載の方法。
前記改善されたエフェクター機能が、増大した増殖、増大した細胞傷害、サイトカインの増加した分泌、またはこれらの組合せを含む、実施形態Ａ１からＡ１８のいずれか一項に記載の方法。
【0179】
Ａ２０
前記疲弊Ｔ細胞が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、実施形態Ａ１からＡ１９のいずれか一項に記載の方法。
前記疲弊Ｔ細胞が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、実施形態Ａ１からＡ１９のいずれか一項に記載の方法。
【0180】
Ａ２１
前記疲弊Ｔ細胞が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝子改変されている、実施形態Ａ１からＡ１９のいずれか一項に記載の方法。
前記疲弊Ｔ細胞が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝子改変されている、実施形態Ａ１からＡ１９のいずれか一項に記載の方法。
【0181】
Ａ２２
実施形態Ａ１からＡ１９のいずれか一項に記載の方法によって生成されたミトコンドリア置換Ｔ細胞。
実施形態Ａ１からＡ１９のいずれか一項に記載の方法によって生成されたミトコンドリア置換Ｔ細胞。
【0182】
Ａ２３
実施形態Ａ２０またはＡ２１に記載の方法によって生成されたミトコンドリア置換Ｔ細胞。
実施形態Ａ２０またはＡ２１に記載の方法によって生成されたミトコンドリア置換Ｔ細胞。
【0183】
Ａ２４
有効量の、実施形態Ａ２２に記載のミトコンドリア置換Ｔ細胞と、薬学的に許容される担体とを含む組成物。
有効量の、実施形態Ａ２２に記載のミトコンドリア置換Ｔ細胞と、薬学的に許容される担体とを含む組成物。
【0184】
Ａ２５
慢性ウイルス感染症の症状の好転を、それを必要とする対象において行うための方法であって、前記対象に、実施形態Ａ２４に記載の組成物を投与するステップを含む、方法。
慢性ウイルス感染症の症状の好転を、それを必要とする対象において行うための方法であって、前記対象に、実施形態Ａ２４に記載の組成物を投与するステップを含む、方法。
【0185】
Ａ２６
前記慢性ウイルス感染症が、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染症、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染症、サイトメガロウイルス感染症（ＣＭＶ）、および重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）－２感染症である、実施形態Ａ２５に記載の方法。
前記慢性ウイルス感染症が、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染症、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染症、サイトメガロウイルス感染症（ＣＭＶ）、および重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）－２感染症である、実施形態Ａ２５に記載の方法。
【0186】
Ａ２７
有効量の、実施形態Ａ２３に記載のミトコンドリア置換Ｔ細胞と、薬学的に許容される担体とを含む組成物。
有効量の、実施形態Ａ２３に記載のミトコンドリア置換Ｔ細胞と、薬学的に許容される担体とを含む組成物。
【0187】
Ａ２８
がんの処置を、それを必要とする対象において行うための方法であって、前記対象に、実施形態Ａ２４またはＡ２７に記載の組成物を投与するステップを含む、方法。
がんの処置を、それを必要とする対象において行うための方法であって、前記対象に、実施形態Ａ２４またはＡ２７に記載の組成物を投与するステップを含む、方法。
【0188】
Ａ２９
がんの症状の好転を、それを必要とする対象において行うための方法であって、前記対象に、実施形態Ａ２４またはＡ２７に記載の組成物を投与するステップを含む、方法。
がんの症状の好転を、それを必要とする対象において行うための方法であって、前記対象に、実施形態Ａ２４またはＡ２７に記載の組成物を投与するステップを含む、方法。
【0189】
Ａ３０
Ｔ細胞疲弊に関連する、Ｔ細胞疲弊が伴う、またはＴ細胞疲弊によって引き起こされる疾患または状態の処置を、それを必要とする対象において行うための方法であって、前記対象に、実施形態Ａ２４またはＡ２７に記載の組成物を投与するステップを含み、前記疾患または状態が、
（ａ）がん；
（ｂ）ウイルス感染症；
（ｃ）細菌感染症；
（ｄ）肥満症もしくは代謝障害；
（ｅ）アルコール症；
（ｆ）運動過剰；
（ｇ）過度の精神的ストレス；
（ｈ）低酸素症；
（ｉ）傷害；
（ｊ）老化；
（ｋ）加齢性免疫学的機能障害；
（ｌ）線維化疾患；
（ｍ）黄斑疾患；
（ｎ）筋肉変性疾患；または
（ｏ）神経変性疾患
である、方法。
Ｔ細胞疲弊に関連する、Ｔ細胞疲弊が伴う、またはＴ細胞疲弊によって引き起こされる疾患または状態の処置を、それを必要とする対象において行うための方法であって、前記対象に、実施形態Ａ２４またはＡ２７に記載の組成物を投与するステップを含み、前記疾患または状態が、
（ａ）がん；
（ｂ）ウイルス感染症；
（ｃ）細菌感染症；
（ｄ）肥満症もしくは代謝障害；
（ｅ）アルコール症；
（ｆ）運動過剰；
（ｇ）過度の精神的ストレス；
（ｈ）低酸素症；
（ｉ）傷害；
（ｊ）老化；
（ｋ）加齢性免疫学的機能障害；
（ｌ）線維化疾患；
（ｍ）黄斑疾患；
（ｎ）筋肉変性疾患；または
（ｏ）神経変性疾患
である、方法。
【0190】
Ａ３１
Ｔ細胞疲弊に関連する、Ｔ細胞疲弊が伴う、またはＴ細胞疲弊によって引き起こされる疾患または状態の症状の好転を、それを必要とする対象において行うための方法であって、前記対象に、実施形態Ａ２４またはＡ２７に記載の組成物を投与するステップを含み、前記疾患または状態が、
（ａ）がん；
（ｂ）ウイルス感染症；
（ｃ）細菌感染症；
（ｄ）肥満症もしくは代謝障害；
（ｅ）アルコール症；
（ｆ）運動過剰；
（ｇ）過度の精神的ストレス；
（ｈ）低酸素症；
（ｉ）傷害；
（ｊ）老化；
（ｋ）加齢性免疫学的機能障害；
（ｌ）線維化疾患；
（ｍ）黄斑疾患；
（ｎ）筋肉変性疾患；または
（ｏ）神経変性疾患
である、方法。
Ｔ細胞疲弊に関連する、Ｔ細胞疲弊が伴う、またはＴ細胞疲弊によって引き起こされる疾患または状態の症状の好転を、それを必要とする対象において行うための方法であって、前記対象に、実施形態Ａ２４またはＡ２７に記載の組成物を投与するステップを含み、前記疾患または状態が、
（ａ）がん；
（ｂ）ウイルス感染症；
（ｃ）細菌感染症；
（ｄ）肥満症もしくは代謝障害；
（ｅ）アルコール症；
（ｆ）運動過剰；
（ｇ）過度の精神的ストレス；
（ｈ）低酸素症；
（ｉ）傷害；
（ｊ）老化；
（ｋ）加齢性免疫学的機能障害；
（ｌ）線維化疾患；
（ｍ）黄斑疾患；
（ｎ）筋肉変性疾患；または
（ｏ）神経変性疾患
である、方法。
【0191】
Ａ３２
Ｔ細胞疲弊に関連する、またはＴ細胞疲弊が関与する、またはＴ細胞疲弊によって引き起こされる疾患または状態の処置を、それを必要とする対象において行うための方法であって、前記対象に、実施形態Ａ２４またはＡ２７に記載の組成物を投与するステップを含み、前記疾患または状態が、
（ａ）ＣＤ８＋Ｔ細胞機能障害；
（ｂ）ＣＤ４＋Ｔ細胞機能障害；
（ｃ）Ｔ細胞プライミングの機能障害；
（ｄ）メモリーＴ細胞機能障害；
（ｅ）エフェクターＢ細胞機能障害；
（ｆ）Ｂ細胞プライミングの機能障害；
（ｇ）メモリーＢ細胞機能障害；
（ｈ）先天性リンパ球系細胞機能障害；
（ｉ）先天性Ｔ細胞機能障害；または
（ｊ）先天性Ｂ細胞機能障害
である、方法。
Ｔ細胞疲弊に関連する、またはＴ細胞疲弊が関与する、またはＴ細胞疲弊によって引き起こされる疾患または状態の処置を、それを必要とする対象において行うための方法であって、前記対象に、実施形態Ａ２４またはＡ２７に記載の組成物を投与するステップを含み、前記疾患または状態が、
（ａ）ＣＤ８＋Ｔ細胞機能障害；
（ｂ）ＣＤ４＋Ｔ細胞機能障害；
（ｃ）Ｔ細胞プライミングの機能障害；
（ｄ）メモリーＴ細胞機能障害；
（ｅ）エフェクターＢ細胞機能障害；
（ｆ）Ｂ細胞プライミングの機能障害；
（ｇ）メモリーＢ細胞機能障害；
（ｈ）先天性リンパ球系細胞機能障害；
（ｉ）先天性Ｔ細胞機能障害；または
（ｊ）先天性Ｂ細胞機能障害
である、方法。
【0192】
Ａ３３
前記対象がヒトである、実施形態Ａ２５、Ａ２６またはＡ２８からＡ３２のいずれか一項に記載の方法。
前記対象がヒトである、実施形態Ａ２５、Ａ２６またはＡ２８からＡ３２のいずれか一項に記載の方法。
【実施例】
【0193】
８．実施例
この節の実施例は実例として提示するものであり、限定として提示するものではない。以下の実施例は本発明の例示的な実施形態として提示される。以下の実施例は、本発明の広い範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
（実施例１）
８．１ 実施例１：ミトコンドリア置換を使用して免疫細胞疲弊を低減させるための方法および組成物
この節の実施例は実例として提示するものであり、限定として提示するものではない。以下の実施例は本発明の例示的な実施形態として提示される。以下の実施例は、本発明の広い範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
（実施例１）
８．１ 実施例１：ミトコンドリア置換を使用して免疫細胞疲弊を低減させるための方法および組成物
【0194】
以下の実施例では、疲弊Ｔ細胞に対してミトコンドリア置換を使用してＭｉｒ Ｔ細胞を生成することにより、疲弊Ｔ細胞の表現型マーカーを低減することができることを実証する。
８．１．１ 材料および方法
８．１．１ 材料および方法
【0195】
初代ヒトＴリンパ球の単離および細胞培養：末梢血は、倫理委員会による承認の下、自由意志で募集に応じた健康な人から善意で提供された。ヘパリン添加静脈血を標準的な手順に従って肘正中皮静脈から取得した（ＮＰ－ＥＮ０５０７、ＮＩＰＲＯ、Ｏｓａｋａ、Ｊａｐａｎ）。１．０７７ｇ／ｍｌのＰｅｒｃｏｌｌ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、Ｅｎｇｌａｎｄ）を用いた密度勾配遠心分離を使用してヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をヒト末梢血から単離した。細胞を、１０％ウシ胎仔血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）、２０μＭのＩＬ－７、および１０μＭのＩＬ－１５を補充したＴｅｘＭＡＣＳ培地（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）中、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて活性化した細胞培養プレート上で培養した。細胞を、加湿５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃でインキュベートした。
【0196】
ＣＡＲ Ｔ細胞の生成：ＣＡＲ Ｔ細胞は、健康な志願者から採血された末梢血のＴ細胞から、横紋筋肉腫において発現されるエフェドリンＢ型受容体４（ＥＰＨＢ４）のリガンドを有する組換えベクターを移入することによって生成されたものであった（Kubo, H., et al. (2021). "Development of non-viral, ligand-dependent, EPHB4-specific chimeric antigen receptor T cells for treatment of rhabdomyosarcoma." Mol Ther Oncolytics 20: 646-658を参照されたい）。
【0197】
ＣＡＲ Ｔ細胞の疲弊の誘導：ＥＰＨＢ４のリガンドを発現するＣＡＲ Ｔ細胞を、いかなるサイトカインシグナル伝達も伴わずに、ＥＰＨＢ４を発現する横紋筋肉腫細胞であるＲｈ３０細胞と共培養（co-cultivate）した。３日間共培養した後、ＣＡＲ Ｔ細胞は、疲弊Ｔ細胞のマーカーであるＰＤ－１を有意に発現した。ＣＡＲ Ｔが存在し、持続的な抗原刺激があり、支持性シグナル（ＣＤ３、ＣＤ２８、ＩＬ－７、およびＩＬ－１５）が存在しない環境は固形腫瘍の微小環境を模倣するものである。
【0198】
ミトコンドリアの単離およびヒトＴ細胞への移入：ミトコンドリアをＤｓＲｅｄ－Ｍｔ ＥＭＣから以前に記載されている通り分画遠心法によって単離した。簡単に述べると、細胞を培養皿からプロテアーゼ阻害薬混合物（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ、ＵＳＡ）を含有するホモジナイゼーション緩衝剤［ＨＢ；２０ｍＭのＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ７．４）、２２０ｍＭのマンニトールおよび７０ｍＭのスクロース］を用いて回収した。細胞ペレットをＨＢ中に再懸濁させ、氷上で５分間インキュベートした。細胞を、氷上で２７ゲージの針で１０回突き刺すことによって破裂させた。ホモジネートを２回遠心分離して（４００×ｇ、４℃；５分間）、破壊されなかった細胞を除去した。ミトコンドリアを遠心分離（６０００×ｇ、４℃；５分間）によって回収し、ＨＢ中に再懸濁させた。単離されたミトコンドリアの量をＢｉｏ－Ｒａｄタンパク質アッセイキット（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用してタンパク質濃度として表した。疲弊ＣＡＲ－Ｔ生成プロトコールの３日後に、細胞にＭＴＳと融合したＸｂａＩＲをエレクトロポレーションによって受けさせて、ｍｔＤＮＡコピー数を減少させた。遺伝子移入後、細胞を、ＣＤ３／ＣＤ２８をコーティングしたディッシュ上、完全なＴ細胞成長培地中に再プレーティングした。ミトコンドリアの移入を、単離されたミトコンドリアをＣＡＲ－Ｔ由来のρ（－）細胞と共インキュベートし、その後、遠心分離（室温、１，５００×ｇで５分間）することによって実施した。
【0199】
ミトコンドリアＤＮＡのＤ－ループ配列の直接配列決定：ＤＮＡ全体を細胞からＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｔｉｓｓｕｅ（ＭＡＣＨＥＲＥＹ－ＮＡＧＥＬ ＧｍｂＨ ＆ Ｃｏ．ＫＧ）を使用して抽出した。抽出されたＤＮＡを鋳型として使用し、ＧｏＴａｑ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ ＫＫ．）をＧｏＴａｑ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ Ｐｒｏｔｏｃｏｌに従って使用してミトコンドリアＤＮＡのＤ－ループ配列を増幅させた。プライマー配列は、フォワードプライマー：５’－ｃｔｃｔｇｔｔｃｔｔｔｃａｔｇｇｇｇａａｇｃ－３’（配列番号３）およびリバースプライマー：５’－ｃａｔａａａｃｔｇｔｇｇｇｇｇｇｔｇｔｃｔ－３’（配列番号４）であった。増幅後、ＰＣＲ産物を１％アガロースゲルで電気泳動し、１，１３４ｂｐのバンドをＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ ＧｅｌおよびＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ ｋｉｔ（ＭＡＣＨＥＲＥＹ－ＮＡＧＥＬ ＧｍｂＨ ＆ Ｃｏ．ＫＧ）を使用して精製した。抽出されたＰＣＲ産物を、ＰＣＲ増幅に使用したフォワードプライマーおよびＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３７３０ｘｌ ＤＮＡ ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）を使用して配列決定した。
【0200】
ＴａｑＭａｎ一塩基多型（ＳＮＰ）アッセイを使用したｍｔＤＮＡに対するヘテロプラスミー分析：ヘテロプラスミー比を決定するために、ＴａｑＭａｎ ＳＮＰアッセイ用の野生型（ＮＨＤＦ）対立遺伝子特異的ＴａｑＭａｎプローブおよび変異型（ＹＧ細胞）対立遺伝子特異的ＴａｑＭａｎプローブを設計した。抽出されたＤＮＡ（１０ｎｇ）を、ＣＦＸ ｃｏｎｎｅｃｔ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）でＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）を用いた、以下の条件：最初の変性（９５℃で１０分間）後、４０サイクルのＰＣＲ（９５℃で１５秒間および６０℃で１分間）の下での定量的ＰＣＲのために使用した。プライマー配列は、フォワードプライマーとして５’－ＴＴＡＣＴＧＣＣＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＡ－３’（配列番号５）およびリバースプライマーとして５’－ＴＴＧＡＴＧＴＧＧＡＴＴＧＧＧＴＴＴＴＴＡＴＧＴ－３’（配列番号６）であった。野生型（ＮＨＤＦ）に対するプローブはＦＡＭ－ＡＣＡＧＧＴＧＧＴＴＡＡＧＴＡＴＴ－ＭＧＢ（配列番号７）であり、変異（ＹＧ細胞）に対するプローブはＶＩＣ－ＣＡＧＧＴＧＧＴＣＡＡＧＴＡＴ－ＭＧＢ（配列番号８）であった。野生型配列または変異体配列のいずれかについて増幅されたｍｔＤＮＡ Ｄ－ループ断片を含有するプラスミドの分かっているコピー数を使用して較正曲線を作成した。ＴａｑＭａｎ ＳＮＰの検証により、ｍｔＤＮＡ配列に基づいてＹＧ細胞をＮＨＤＦ細胞と区別可能であることが示された（図２Ｂ）。
【0201】
ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＰＤ－１発現の分析：ＣＡＲ－Ｔ細胞（５×１０６個）をヒト横紋筋肉腫Ｒｈ－３０細胞（１×１０７個）と３日間共培養して疲弊させた。培養した細胞をＰＢＳで洗浄し（３００×ｇで５分間）、１×１０５個をＭＡＣＳ緩衝剤（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）２００μｌ中に懸濁させ、ＦＩＴＣ抗ヒトＣＤ２７９（ＰＤ－１）抗体（３２９９０４、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｉｎｃ．）およびＰＥ抗ヒトＣＤ３抗体（３００４０８、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｉｎｃ．）各５μｌ、ならびに７－ＡＡＤ（５５９９２５、Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ）１μｌを添加した。混合物を３７℃で３０分間インキュベートした。ＭＡＣＳ緩衝剤で洗浄後、混合物をＭＡＣＳ緩衝剤５００μｌに懸濁させ、細胞表面上のＰＤ－１発現についてＣｅｌｌ Ｓｏｒｔｅｒ ＭＡ９００（Ｓｏｎｙ）を使用して分析した。ＰＤ－１およびＣＤ３の発現レベルをＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ）を使用して分析した。
【0202】
ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用した平均蛍光強度の測定：ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（バージョン１０．６）の統計関数である幾何平均蛍光強度法を使用して平均蛍光強度（ＭＦＩ）を測定した。簡単に述べると、作業空間内でＦＩＴＣ群を選択し、統計関数ボタンをクリックする。次いで、幾何平均を選択し、ダイアログ内でＦＩＴＣパラメータを選択し、追加ボタンをクリックする。次いで、ＭＦＩ値が作業空間内に表示される。
８．１．２ 結果
８．１．２ 結果
【0203】
Ｒｈ３０ヒト横紋筋肉腫細胞（２×１０５個）を６ウェルディッシュに播種し、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中で培養した。翌日（「０日目」）、ＥＰＨＢ４特異的キメラ抗原受容体ＣＡＲ－Ｔ細胞（１×１０７個）を同じ６ウェルディッシュに添加し、Ｒｈ３０細胞と３日間共インキュベートした。０日目および３日目のＣＡＲ－Ｔ細胞による疲弊マーカーＰＤ－１の発現レベルについてのＦＡＣＳ分析から、ＣＤ３＋／ＰＤ１＋細胞のパーセンテージが１．８４％から共培養後には２３．８％まで上昇したことが示された（図１）。したがって、共培養により疲弊ＣＡＲ－Ｔ細胞が生成された。
【0204】
３日目に、ＣＡＲ－Ｔ細胞にＸｂａＩＲ ｍＲＮＡをエレクトロポレーションすることにより、疲弊ＣＡＲ－Ｔ細胞における内因性ミトコンドリアＤＮＡを枯渇させた。陰性対照として、疲弊ＣＡＲ－Ｔ細胞にＸｂａＩＲ ｍＲＮＡを伴わずエレクトロポレーションのみを行い、同じエレクトロポレーションに供し、ＣＡＲ－Ｔ細胞をＸｂａＩＲ ｍＲＮＡと接触させた。ｍｔＤＮＡ含量の代理マーカーである１２Ｓ ｒＲＮＡが３日目に半減し、それにより、ＸｂａＩＲによって有効なｍｔＤＮＡ減少が引き起こされたことが確認される（図２Ａ）。
【0205】
エレクトロポレーション後、ＣＡＲ－Ｔ細胞を、ＩＬ－７／ＩＬ－１５を伴うＣＤ３／２８をコーティングしたディッシュに再プレーティングし、２日間培養した（図１）。５日目に、正常ヒト由来線維芽細胞（ＮＨＤＦ）由来ドナーミトコンドリアを、ＸｂａＩＲと接触させたまたは接触させていないエレクトロポレーションより導入したＣＡＲ－Ｔ細胞とさらに２日間共培養して、それぞれＭｉｒ ＣＡＲ－Ｔ細胞または陰性対照疲弊ＣＡＲ－Ｔ細胞を生成させた。７日目にＦＡＣＳおよびＴａｑＭａｎ ＳＮＰアッセイを実施した。
【0206】
７日目に測定したＴａｑＭａｎ ＳＮＰアッセイの結果から、Ｍｉｒ ＣＡＲ－Ｔ細胞が約４０％のＮＨＤＦ由来ドナーｍｔＤＮＡを含有することが示された（図２Ｂ）。さらに、７日目のＦＡＣＳ分析から、ＣＤ３＋／ＰＤ－１＋細胞のパーセンテージが無染色細胞については０．０４５％（図３Ａ）、ミトコンドリア枯渇を受けていない疲弊ＣＡＲ－Ｔ細胞については６３．８％（図３Ｂ）、および疲弊Ｍｉｒ ＣＡＲ Ｔ細胞については６６．８％（図３Ｃ）であることが示された。
【0207】
ミトコンドリア置換の２日後のＰＤ－１抗原の発現分析から、疲弊Ｍｉｒ ＣＡＲ－Ｔ細胞上のＰＤ－１発現が、ＸｂａＩＲのエレクトロポレーションによる導入がなされていない疲弊ＣＡＲ－Ｔ細胞と比べておよそ１．３分の１に低減した（すなわち２４％低減した）ことが明らかになった（図４Ａおよび表１）。変化倍率は、疲弊ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＰＤ－１抗原計数を疲弊Ｍｉｒ ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＰＤ－１抗原計数で割ることによって算出した。変化パーセントは以下の通り算出した：［［（疲弊Ｍｉｒ ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＰＤ－１抗原計数）－（疲弊ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＰＤ－１抗原計数）］÷疲弊ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＰＤ－１抗原計数］×１００。
【0208】
表1
【表1】
【0209】
さらに、平均蛍光強度の棒グラフから、Ｍｉｒ ＣＡＲ－Ｔ細胞ではＰＤ－１の強度が低下することが示され、それにより、ＰＤ－１抗原の発現が低減することが示される（図４Ｂ）。
【0210】
総合すると、これらの結果から、疲弊Ｔ細胞におけるミトコンドリア置換により、疲弊の例示的な表現型マーカーであるＰＤ－１の発現を低減させることができることが実証される。そのようなＰＤ－１の発現が低減したＭｉｒ Ｔ細胞には、がんおよび慢性ウイルス感染症などの種々の状態の処置における有用性がある。
【0211】
上記の実施形態は、ただ単に例示的なものであることが意図されており、当業者は、特定の化合物、材料、および手順の多数の等価物を理解するまたは常套的な実験だけを使用して確認することができる。そのような等価物は全て、本発明の範囲内に入り、添付の特許請求の範囲に包含されるものとみなされる。
【図1】
【図2】
【図3-1】
【図3-2】
【図3-3】
【図4-1】
【図4-2】
【配列表】
【国際調査報告】