▶ イメル バイオセラピューティクス， インコーポレイテッドの特許一覧
特表2024-525941ミトコンドリア置換リンパ球系細胞を生成するための方法および組成物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-07-12
(54)【発明の名称】ミトコンドリア置換リンパ球系細胞を生成するための方法および組成物
(51)【国際特許分類】
C12N 5/10 20060101AFI20240705BHJP
A61K 31/436 20060101ALI20240705BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20240705BHJP
【ＦＩ】
C12N5/10 ZNA
A61K31/436
A61K35/17
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024503894
(86)(22)【出願日】2022-05-18
(85)【翻訳文提出日】2024-01-19
(86)【国際出願番号】 IB2022054639
(87)【国際公開番号】W WO2022243906
(87)【国際公開日】2022-11-24
(31)【優先権主張番号】63/190,078
(32)【優先日】2021-05-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】524026492
【氏名又は名称】イメル バイオセラピューティクス， インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】五條 理志
(72)【発明者】
【氏名】上 大介
【テーマコード（参考）】
4B065
4C086
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA94X
4B065AB01
4B065BA01
4B065BA30
4C086AA01
4C086AA02
4C086CB22
4C086GA16
4C086GA17
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZB22
4C087AA01
4C087AA02
4C087AA03
4C087BB64
4C087CA04
4C087DA31
4C087NA05
4C087ZB02
4C087ZB09
(57)【要約】
本開示は、ミトコンドリア置換リンパ球系細胞、例えばＴ細胞を生成するための方法および組成物であって、内因性ミトコンドリアを減少または枯渇させる手順に供されていないリンパ球系細胞を、単離された外因性ミトコンドリア、および有効量の哺乳類ラパマイシン標的（ｍＴＯＲ）阻害薬と共にインキュベートするステップを伴う方法および組成物を提供する。さらに、本開示は、ヘテロプラスミック免疫細胞に関連する免疫不全を処置する方法、ならびにミトコンドリア複合体ＩＩＩ欠損症の症状を好転させるための方法であって、ミトコンドリア置換リンパ球系細胞を投与するステップを伴う、方法も提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
内因性ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）の少なくとも２０％が外因性ｍｔＤＮＡによって置換されているミトコンドリア置換リンパ球系細胞を生成するための方法であって、内因性ミトコンドリアを減少または枯渇させる手順に供されていないリンパ球系細胞を、単離された外因性ミトコンドリア、および有効量の哺乳類ラパマイシン標的（ｍＴＯＲ）阻害薬と共に十分な期間にわたってインキュベートして、前記外因性ミトコンドリアを前記リンパ球系細胞に非侵襲的に移入し、それにより、前記内因性ｍｔＤＮＡの少なくとも２０％が外因性ｍｔＤＮＡによって置換されているミトコンドリア置換リンパ球系細胞を生成するステップ
を含む、方法。
【請求項2】
前記ｍＴＯＲ阻害薬が、ラパマイシンまたはその誘導体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記ｍＴＯＲ阻害薬が、ラパマイシンである、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記ｍＴＯＲ阻害薬の有効量が、約１００ｎＭ～約１０００ｎＭの濃度である、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記ｍＴＯＲ阻害薬の有効量が、約２００ｎＭ～約５００ｎＭの濃度である、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記ｍＴＯＲ阻害薬の有効量が、約１００ｎＭの濃度である、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記ｍＴＯＲ阻害薬の有効量が、約２００ｎＭの濃度である、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記ｍＴＯＲ阻害薬の有効量が、約５００ｎＭの濃度である、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記ｍＴＯＲ阻害薬の有効量が、約１０００ｎＭの濃度である、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記ミトコンドリア置換リンパ球系細胞が、ＴａｑＭａｎ一塩基多型（ＳＮＰ）アッセイによって測定して少なくとも２０％の外因性ｍｔＤＮＡおよび８０％以下の内因性ｍｔＤＮＡを含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
ミトコンドリア置換リンパ球系細胞を生成するための方法であって、内因性ミトコンドリアを減少または枯渇させる手順に供されていないリンパ球系細胞を、単離された外因性ミトコンドリアおよび約１００ｎＭ～約１０００ｎＭのラパマイシンと共に十分な期間にわたってインキュベートして、前記外因性ミトコンドリアを前記リンパ球系細胞に非侵襲的に移入し、それにより、ミトコンドリア置換リンパ球系細胞を生成するステップを含む、方法。
【請求項12】
前記単離された外因性ミトコンドリアが、細胞１×１０６個当たりタンパク質約２０μｇ～８０μｇである、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
インキュベートするステップの前に前記リンパ球系細胞を遠心分離するステップをさらに含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
遠心分離するステップが、室温、１，５００相対遠心力（ＲＣＦ）でおよそ５分間実施される、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
前記十分な期間が、少なくともおよそ２４時間である、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
前記十分な期間が、少なくとも３６時間である、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
前記十分な期間が、少なくとも４８時間である、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
前記十分な期間が、およそ２日間であるか、またはそれよりも長い、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項19】
前記十分な期間が、およそ７日間であるか、またはそれよりも長い、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項20】
前記十分な期間が、およそ２日間～およそ７日間である、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項21】
ミトコンドリア置換リンパ球系細胞を生成するための方法であって、（ａ）リンパ球系細胞および単離された外因性ミトコンドリアを、細胞ペレットが生成されるのに十分な条件下で遠心分離するステップであって、前記リンパ球系細胞が、内因性ミトコンドリアを減少または枯渇させる手順に供されていない、ステップと、
（ｂ）前記リンパ球系細胞を１００ｎＭ～１０００ｎＭのラパマイシンと共におよそ２４時間またはそれよりも長くインキュベートするステップであって、それにより、ミトコンドリア置換リンパ球系細胞を生成する、ステップ
を含む、方法。
【請求項22】
インキュベートするステップが、およそ７日間であるか、またはそれよりも長い、請求項２１に記載の方法。
【請求項23】
インキュベートするステップが、およそ２日間～およそ７日間である、請求項２１に記載の方法。
【請求項24】
前記リンパ球系細胞が、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、マクロファージ、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、または顆粒球である、請求項１から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項25】
前記リンパ球系細胞が、Ｔ細胞である、請求項２４に記載の方法。
【請求項26】
前記Ｔ細胞が、疲弊Ｔ細胞、老化Ｔ細胞、またはこれらの組合せを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項27】
前記リンパ球系細胞が、ヒトリンパ球系細胞である、請求項１から２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項28】
有効量の、請求項１から２７のいずれか一項に記載の方法によって生成されたミトコンドリア置換リンパ球系細胞と、薬学的に許容される担体とを含む組成物。
【請求項29】
それを必要とする対象に対するミトコンドリア複合体ＩＩＩ欠損症の症状を好転させるための方法であって、前記対象に、請求項２８に記載の組成物を投与するステップを含む、方法。
【請求項30】
それを必要とする対象に対するヘテロプラスミック免疫細胞に関連する免疫不全を処置するための方法であって、前記対象に、請求項２８に記載の組成物を投与するステップを含む、方法。
【請求項31】
前記対象が、逆転写酵素阻害薬を受けている、請求項３０に記載の方法。
【請求項32】
前記対象が、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）を有する、請求項３１に記載の方法。
【請求項33】
前記対象が、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）を有する、請求項３１に記載の方法。
【請求項34】
前記対象が、ヒトである、請求項２９から３３のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる２０２１年５月１８日出願の米国仮出願第６３／１９０，０７８号の利益を主張するものである。
【0002】
１．配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる配列表を含む。前記ＡＳＣＩＩコピーは２０２２年５月１８日に作成されたものであり、名称は１４５９５－００８－２２８＿ＳＬ．ｔｘｔ、サイズは３，６８１バイトである。
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる配列表を含む。前記ＡＳＣＩＩコピーは２０２２年５月１８日に作成されたものであり、名称は１４５９５－００８－２２８＿ＳＬ．ｔｘｔ、サイズは３，６８１バイトである。
【0003】
２．緒言
本開示は、一部において、ミトコンドリア置換リンパ球系細胞を生成するための方法および組成物に関する。具体的な態様では、本開示は、ラパマイシンおよびその等価物を含む組成物を使用し、事前にミトコンドリアを欠失または枯渇させることなく、ミトコンドリア置換リンパ球系細胞（例えば、Ｔ細胞）を生成するための方法、ならびにそのようなミトコンドリア置換リンパ球系細胞を使用して疾患を処置するための治療方法に関する。ミトコンドリア置換リンパ球系細胞を使用して処置することができる疾患には、遺伝性および後天性ミトコンドリアＤＮＡ変異によって引き起こされる疾患、例えばミトコンドリア病だけでなく、ヘテロプラスミック免疫細胞に関連する免疫不全も含まれる。
本開示は、一部において、ミトコンドリア置換リンパ球系細胞を生成するための方法および組成物に関する。具体的な態様では、本開示は、ラパマイシンおよびその等価物を含む組成物を使用し、事前にミトコンドリアを欠失または枯渇させることなく、ミトコンドリア置換リンパ球系細胞（例えば、Ｔ細胞）を生成するための方法、ならびにそのようなミトコンドリア置換リンパ球系細胞を使用して疾患を処置するための治療方法に関する。ミトコンドリア置換リンパ球系細胞を使用して処置することができる疾患には、遺伝性および後天性ミトコンドリアＤＮＡ変異によって引き起こされる疾患、例えばミトコンドリア病だけでなく、ヘテロプラスミック免疫細胞に関連する免疫不全も含まれる。
【背景技術】
【0004】
３．背景
ミトコンドリア機能不全は、遺伝障害などの様々な因子から生じ得る。ある特定の状況では、ミトコンドリア病または障害は、リンパ球の機能に負に影響を及ぼし得る。例えば、ミトコンドリア複合体ＩＩＩは調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の抑制機能に関与し、ミトコンドリア複合体ＩＩＩ欠損症によりＴｒｅｇ機能が損なわれる恐れがある。ミトコンドリア機能不全はまた、遺伝毒性薬剤、加齢、酸化ストレス炎症、および／または傷害の結果として生じる場合もある。例えば、治療剤（例えば、ヌクレオシド／ヌクレオチド逆転写酵素阻害薬）への曝露によりミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）コピー数が減少し得る。健康な細胞から損傷を受けたまたは機能障害性の細胞へのミトコンドリアの移入が、ミトコンドリア機能のレスキューおよび回復に役立つ可能性がある。
ミトコンドリア機能不全は、遺伝障害などの様々な因子から生じ得る。ある特定の状況では、ミトコンドリア病または障害は、リンパ球の機能に負に影響を及ぼし得る。例えば、ミトコンドリア複合体ＩＩＩは調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の抑制機能に関与し、ミトコンドリア複合体ＩＩＩ欠損症によりＴｒｅｇ機能が損なわれる恐れがある。ミトコンドリア機能不全はまた、遺伝毒性薬剤、加齢、酸化ストレス炎症、および／または傷害の結果として生じる場合もある。例えば、治療剤（例えば、ヌクレオシド／ヌクレオチド逆転写酵素阻害薬）への曝露によりミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）コピー数が減少し得る。健康な細胞から損傷を受けたまたは機能障害性の細胞へのミトコンドリアの移入が、ミトコンドリア機能のレスキューおよび回復に役立つ可能性がある。
【0005】
ミトコンドリアをレシピエント細胞に移入する現行の方法としては、内因性ｍｔＤＮＡの部分的または完全な枯渇を伴う方法が挙げられる。例えば、内因性ｍｔＤＮＡを除去するための古典的方法は、低濃度の臭化エチジウム（ＥｔＢｒ）を用いた細胞の長期にわたる処置を伴うものであり、臭化エチジウムは発がん物質および催奇形物質であることが公知であり、それにより治療目的での適用が限定される。ミトコンドリアを移入するための追加的な技法として、侵襲的な機器を使用する方法が挙げられるが、それらはレシピエント細胞に対して有害であり、非効率的である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0006】
リンパ球を伴う細胞に基づく治療が、疾患と闘い、医学的状態を緩和するための手段として出現した。多くの場合、そのような治療のために利用可能なリンパ球の数は限られている。したがって、細胞に対するいかなる改変も、患者への投与に関して安全であるだけでなく、リンパ球に損傷を与えない程度に穏やかなものでなければならない。したがって、リンパ球を伴う細胞に基づく治療の状況を含め、リンパ球にミトコンドリアを移入するための安全かつ有効な方法の開発という重要なまだ対処されていない必要性が存在する。
【0007】
４．概要
一態様では、ミトコンドリア置換リンパ球系細胞を生成するための方法であって、内因性ミトコンドリアを減少または枯渇させる手順に供されていないリンパ球系細胞を、単離された外因性ミトコンドリア、および有効量の哺乳類ラパマイシン標的（ｍＴＯＲ）阻害薬と共に十分な期間にわたってインキュベートして、外因性ミトコンドリアをリンパ球系細胞に非侵襲的に移入し、それにより、内因性ｍｔＤＮＡの少なくとも２０％が外因性ｍｔＤＮＡによって置換されているミトコンドリア置換リンパ球系細胞を生成するステップを含む、方法が本明細書に提供される。具体的な実施形態では、内因性ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）の少なくとも２０％が外因性ｍｔＤＮＡによって置換されているミトコンドリア置換リンパ球系細胞を生成するための方法であって、内因性ミトコンドリアを減少または枯渇させる手順に供されていないリンパ球系細胞を、単離された外因性ミトコンドリア、および有効量の哺乳類ラパマイシン標的（ｍＴＯＲ）阻害薬と共に十分な期間にわたってインキュベートして、外因性ミトコンドリアをリンパ球系細胞に非侵襲的に移入し、それにより、内因性ｍｔＤＮＡの少なくとも２０％が外因性ｍｔＤＮＡによって置換されているミトコンドリア置換リンパ球系細胞を生成するステップを含む、方法が本明細書に提供される。一実施形態では、ｍＴＯＲ阻害薬はラパマイシンまたはその誘導体を含む。具体的な実施形態では、ｍＴＯＲ阻害薬はラパマイシンである。ある特定の実施形態では、ｍＴＯＲ阻害薬の有効量は、約１００ｎＭ～約１０００ｎＭの濃度である。一部の実施形態では、ｍＴＯＲ阻害薬の有効量は、約２００ｎＭ～約５００ｎＭの濃度である。一実施形態では、ｍＴＯＲ阻害薬の有効量は、約１００ｎＭの濃度である。別の実施形態では、ｍＴＯＲ阻害薬の有効量は、約２００ｎＭの濃度である。別の実施形態では、ｍＴＯＲ阻害薬の有効量は、約５００ｎＭの濃度である。別の実施形態では、ｍＴＯＲ阻害薬の有効量は、約１０００ｎＭの濃度である。具体的な実施形態では、ミトコンドリア置換リンパ球系細胞は、ＴａｑＭａｎ一塩基多型（ＳＮＰ）アッセイによって測定して、少なくとも２０％の外因性ｍｔＤＮＡおよび８０％以下の内因性ｍｔＤＮＡを含む。
一態様では、ミトコンドリア置換リンパ球系細胞を生成するための方法であって、内因性ミトコンドリアを減少または枯渇させる手順に供されていないリンパ球系細胞を、単離された外因性ミトコンドリア、および有効量の哺乳類ラパマイシン標的（ｍＴＯＲ）阻害薬と共に十分な期間にわたってインキュベートして、外因性ミトコンドリアをリンパ球系細胞に非侵襲的に移入し、それにより、内因性ｍｔＤＮＡの少なくとも２０％が外因性ｍｔＤＮＡによって置換されているミトコンドリア置換リンパ球系細胞を生成するステップを含む、方法が本明細書に提供される。具体的な実施形態では、内因性ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）の少なくとも２０％が外因性ｍｔＤＮＡによって置換されているミトコンドリア置換リンパ球系細胞を生成するための方法であって、内因性ミトコンドリアを減少または枯渇させる手順に供されていないリンパ球系細胞を、単離された外因性ミトコンドリア、および有効量の哺乳類ラパマイシン標的（ｍＴＯＲ）阻害薬と共に十分な期間にわたってインキュベートして、外因性ミトコンドリアをリンパ球系細胞に非侵襲的に移入し、それにより、内因性ｍｔＤＮＡの少なくとも２０％が外因性ｍｔＤＮＡによって置換されているミトコンドリア置換リンパ球系細胞を生成するステップを含む、方法が本明細書に提供される。一実施形態では、ｍＴＯＲ阻害薬はラパマイシンまたはその誘導体を含む。具体的な実施形態では、ｍＴＯＲ阻害薬はラパマイシンである。ある特定の実施形態では、ｍＴＯＲ阻害薬の有効量は、約１００ｎＭ～約１０００ｎＭの濃度である。一部の実施形態では、ｍＴＯＲ阻害薬の有効量は、約２００ｎＭ～約５００ｎＭの濃度である。一実施形態では、ｍＴＯＲ阻害薬の有効量は、約１００ｎＭの濃度である。別の実施形態では、ｍＴＯＲ阻害薬の有効量は、約２００ｎＭの濃度である。別の実施形態では、ｍＴＯＲ阻害薬の有効量は、約５００ｎＭの濃度である。別の実施形態では、ｍＴＯＲ阻害薬の有効量は、約１０００ｎＭの濃度である。具体的な実施形態では、ミトコンドリア置換リンパ球系細胞は、ＴａｑＭａｎ一塩基多型（ＳＮＰ）アッセイによって測定して、少なくとも２０％の外因性ｍｔＤＮＡおよび８０％以下の内因性ｍｔＤＮＡを含む。
【0008】
具体的な実施形態では、ミトコンドリア置換リンパ球系細胞を生成するための方法であって、内因性ミトコンドリアを減少または枯渇させる手順に供されていないリンパ球系細胞を、単離された外因性ミトコンドリアおよび約１００ｎＭ～約１０００ｎＭのラパマイシンと共に十分な期間にわたってインキュベートして、外因性ミトコンドリアをリンパ球系細胞に非侵襲的に移入し、それにより、ミトコンドリア置換リンパ球系細胞を生成するステップを含む、方法が本明細書に提供される。
【0009】
一部の実施形態では、本明細書に提供される方法は、細胞１×１０６個当たりタンパク質約２０μｇ～８０μｇの単離された外因性ミトコンドリアを含む。ある特定の実施形態では、本明細書に提供される方法は、インキュベートするステップの前にリンパ球系細胞を遠心分離するステップをさらに含む。一実施形態では、遠心分離は、室温、１，５００相対遠心力（ＲＣＦ）でおよそ５分間実施される。
【0010】
一部の実施形態では、本明細書に提供される方法に関して十分な期間は、少なくともおよそ２４時間である。ある特定の実施形態では、本明細書に提供される方法に関して十分な期間は、少なくとも３６時間である。一部の実施形態では、本明細書に提供される方法に関して十分な期間は、少なくとも４８時間である。ある特定の実施形態では、本明細書に提供される方法に関して十分な期間は、およそ２日間であるか、またはそれよりも長い。一部の実施形態では、本明細書に提供される方法に関して十分な期間は、およそ７日間であるか、またはそれよりも長い。一実施形態では、本明細書に提供される方法に関して十分な期間は、およそ２日間～およそ７日間である。
【0011】
さらに別の態様では、ミトコンドリア置換リンパ球系細胞を生成するための方法であって、（ａ）リンパ球系細胞および単離された外因性ミトコンドリアを、細胞ペレットが生成されるのに十分な条件下で遠心分離するステップであって、リンパ球系細胞が、内因性ミトコンドリアを減少または枯渇させる手順に供されていない、ステップと、（ｂ）リンパ球系細胞を１００ｎＭ～１０００ｎＭのラパマイシンと共におよそ２４時間またはそれよりも長くインキュベートするステップであって、それにより、ミトコンドリア置換リンパ球系細胞を生成する、ステップを含む、方法が本明細書に提供される。
【0012】
ある特定の実施形態では、インキュベートするステップは、およそ７日間であるか、またはそれよりも長い。一部の実施形態では、インキュベートするステップは、およそ２日間～およそ７日間である。一部の実施形態では、本明細書に提供される方法のリンパ球系細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、マクロファージ、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、または顆粒球である。ある特定の実施形態では、本明細書に提供される方法のリンパ球系細胞は、Ｔ細胞である。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、疲弊Ｔ細胞、老化Ｔ細胞、またはこれらの組合せを含む。ある特定の実施形態では、本明細書に提供される方法のリンパ球系細胞は、ヒトリンパ球系細胞である。
【0013】
別の態様では、本明細書に記載の方法によって生成されたミトコンドリア置換リンパ球系細胞、およびそのような細胞を含む組成物が本明細書に提供される。
【0014】
別の態様では、有効量の本開示のミトコンドリア置換リンパ球系細胞と、薬学的に許容される担体とを含む組成物が本明細書で提供される。
【0015】
別の態様では、それを必要とする対象に対する、ミトコンドリア複合体ＩＩＩ欠損症の症状を好転させるための方法であって、対象に、有効量の本開示のミトコンドリア置換リンパ球系細胞と、薬学的に許容される担体とを含む組成物を投与するステップを含む、方法が本明細書に提供される。具体的な実施形態では、対象はヒトである。
【0016】
別の態様では、それを必要とする対象に対する、ヘテロプラスミック免疫細胞に関連する免疫不全を処置するための方法であって、対象に、有効量の本開示のミトコンドリア置換リンパ球系細胞と、薬学的に許容される担体とを含む組成物を投与するステップを含む、方法が本明細書に提供される。具体的な実施形態では、対象は、逆転写酵素阻害薬を受けている。ある特定の実施形態では、対象は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）を有する。一部の実施形態では、対象は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）を有する。具体的な実施形態では、対象はヒトである。
【図面の簡単な説明】
【0017】
５．図面の簡単な説明
【図1】ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）配列。ヒトＧＪ Ｔ細胞およびＥＰＣ１００細胞から単離されたＭｔＤＮＡ配列を配列決定し、比較した。Ｄループを配列決定することによってｍｔＤＮＡ配列の差異を検出し、Ｄループ超可変領域１（「ＨＶＲ１」）にいくつかの差異が観察された。
【0018】
【図2-1】ＳＮＰアッセイ用のプライマーおよびプローブ。図２Ａは、ヒトＧＪ Ｔ細胞由来およびＥＰＣ１００細胞由来のヒトｍｔＤＮＡのＨＶＲ１における差異を検出するためのＳＮＰアッセイ用のプライマー（配列番号５および６）とプローブ（配列番号１および２）のセットを示す。図２Ｂは、プライマー（配列番号５および６）およびプローブ（配列番号１および２）がヒトＧＪ Ｔ細胞由来およびＥＰＣ１００細胞由来のヒトｍｔＤＮＡのＨＶＲ１のどこに結合するかを示す。
【図2-2】同上。
【0019】
【0020】
【0021】
【図5-1】図５Ａは、２日目におけるＳＮＰアッセイの結果を示す。図５Ｂは、７日目におけるＳＮＰアッセイの結果を示す。オレンジ色はＮＺＢ Ｔ細胞の内因性ミトコンドリア遺伝子型の比であり、青色はＢ６ ＭＥＦ細胞由来の外因性ミトコンドリア遺伝子型の比である。
【図5-2】同上。
【発明を実施するための形態】
【0022】
６．詳細な説明
ミトコンドリア置換リンパ球系細胞を生成するための方法であって、内因性ミトコンドリアを減少または枯渇させる手順に供されていないリンパ球系細胞を、単離された外因性ミトコンドリア、および有効量の哺乳類ラパマイシン標的（ｍＴＯＲ）阻害薬と共にインキュベートするステップを伴う、方法が本明細書に提供される。本明細書に開示される方法に従って生成されたミトコンドリア置換リンパ球系細胞には、例えば、ミトコンドリア複合体ＩＩＩ欠損症またはヘテロプラスミック免疫細胞に関連する免疫不全の症状を好転させるための、治療としての有用性がある。
ミトコンドリア置換リンパ球系細胞を生成するための方法であって、内因性ミトコンドリアを減少または枯渇させる手順に供されていないリンパ球系細胞を、単離された外因性ミトコンドリア、および有効量の哺乳類ラパマイシン標的（ｍＴＯＲ）阻害薬と共にインキュベートするステップを伴う、方法が本明細書に提供される。本明細書に開示される方法に従って生成されたミトコンドリア置換リンパ球系細胞には、例えば、ミトコンドリア複合体ＩＩＩ欠損症またはヘテロプラスミック免疫細胞に関連する免疫不全の症状を好転させるための、治療としての有用性がある。
【0023】
本明細書で使用される場合、「ミトコンドリア置換リンパ球系細胞」という用語は、一般に、内因性ミトコンドリアおよび／または内因性ｍｔＤＮＡが外因性ミトコンドリアおよび／または外因性ｍｔＤＮＡによって置換されているリンパ球系細胞を意味することが意図されている。ある特定の実施形態では、ミトコンドリア置換リンパ球系細胞は、リンパ球系細胞内の全ての内因性ミトコンドリアおよび／または内因性ｍｔＤＮＡが外因性ミトコンドリアおよび／または外因性ｍｔＤＮＡによって置換されたものである。具体的な実施形態では、ミトコンドリア置換リンパ球系細胞は、外因性ミトコンドリアによって置換された内因性ミトコンドリアを有する。そのような状況では、内因性ミトコンドリアの外因性ミトコンドリアによる置換は、ｍｔＤＮＡマーカーを評価することによって評価される。具体的な実施形態では、ミトコンドリア置換リンパ球系細胞は、ある特定のパーセンテージの内因性ｍｔＤＮＡが外因性ｍｔＤＮＡによって置換されたものである。一部の実施形態では、ミトコンドリア置換リンパ球系細胞は、リンパ球系細胞内の内因性ミトコンドリアおよび／または内因性ｍｔＤＮＡの約５％もしくはそれよりも多く、約１０％もしくはそれよりも多く、約２０％もしくはそれよりも多く、約３０％もしくはそれよりも多く、約４０％もしくはそれよりも多く、約５０％もしくはそれよりも多く、約６０％もしくはそれよりも多く、約７０％もしくはそれよりも多く、約８０％もしくはそれよりも多く、約９０％もしくはそれよりも多く、または約９５％もしくはそれよりも多くが外因性ミトコンドリアおよび／または外因性ｍｔＤＮＡによって置換されたものである。ある特定の実施形態では、ミトコンドリア置換リンパ球系細胞は、リンパ球系細胞内の内因性ミトコンドリアおよび／または内因性ｍｔＤＮＡの約５％～約１０％、約１０％～約２０％、約１０％～約３０％、約１０％～約４０％、約２０％～約４０％、約２５％～約５０％、約２５％～約７５％、約５０％～約７５％、約４０％～約５０％、約７５％またはそれよりも多く～約８５％、約７５％～約９５％が外因性ミトコンドリアおよび／または外因性ｍｔＤＮＡによって置換されたものである。一部の実施形態では、ミトコンドリア置換リンパ球系細胞は、リンパ球系細胞内の内因性ミトコンドリアおよび／または内因性ｍｔＤＮＡの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％が外因性ミトコンドリアおよび／または外因性ｍｔＤＮＡによって置換されたものである。
【0024】
本明細書で使用される場合、「単離された」という用語は、ミトコンドリアに関して使用される場合、一般に、その天然の生物学的環境の他の細胞構成成分から物理的に分離されたまたは取り出されたミトコンドリアを指す。具体的な実施形態では、下記の実施例に記載されている技法を使用してミトコンドリアを単離する。
【0025】
本明細書で使用される場合、「単離された」という用語は、細胞に関して使用される場合、一般に、参照される細胞が天然に見いだされる場合の少なくとも１つの構成成分を実質的に含まない細胞を意味する。用語は、その天然の環境において見いだされる場合の一部または全部の構成成分から取り出された細胞を含む。用語はまた、細胞が天然に存在しない環境において見いだされる場合の少なくとも１つ、一部または全部の構成成分から取り出された細胞も含む。したがって、単離された細胞は、それが天然に見いだされる場合、または天然に存在しない環境において成長する、貯蔵されるもしくは存在する場合の他の物質から部分的にまたは完全に分離されたものである。単離された細胞の具体的な例として、他の細胞型（例えば、非リンパ球系細胞）から富化された、部分的に純粋な細胞（例えば、リンパ球系細胞）、および実質的に純粋な細胞（例えば、リンパ球系細胞）が挙げられる。したがって、単離されたものである参照される細胞は、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％、他の細胞および／または物質を含まず純粋なものであり得る。具体的な実施形態では、下記の実施例に記載されている技法を使用して、参照される細胞を単離する。
【0026】
本明細書で使用される場合、「外因性」という用語は、当業者には理解される。一般に、「外因性」という用語は、レシピエント細胞に由来するものではない細胞内材料（例えば、ミトコンドリアまたはｍｔＤＮＡ）を指す。例えば、下記の実施例に記載のように、外因性ミトコンドリアまたはｍｔＤＮＡを、Ｔ細胞に導入された線維芽細胞から単離することができる。
【0027】
本明細書で使用される場合、「内因性」という用語は、当業者には一般に理解される。一般に、「内因性」という用語は、レシピエント細胞に対してネイティブな細胞内材料（例えば、ミトコンドリアまたはｍｔＤＮＡ）を指す。
【0028】
本明細書で使用される場合、「有効量」という用語は、一般に、関連性のある条件下で所望の結果（複数可）を実現するために必要な化合物または組成物の量を指す。
【0029】
本明細書で使用される場合、「約」または「およそ」という用語は、数と併せて使用される場合、一般に、参照される数だけでなく、参照される数の１％、５％、１０％、１５％または２０％以内の任意の数を指す。
【0030】
本明細書で使用される場合、「十分な期間」という用語は、一般に、所望の結果（複数可）がもたらされる時間の量を指す。
【0031】
本明細書で使用される場合、「非侵襲的に」という用語は、外因性材料（例えば、ミトコンドリアおよび／またはｍｔＤＮＡ）の移入に関して使用される場合、一般に、侵襲的な機器（例えば、ナノブレードもしくはエレクトロポレーション）、または細胞の構造を損なう有害な条件の使用を伴わないことを意味することが意図されている。
【0032】
本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、一般に、動物を意味することが意図されている。対象は、ヒトまたは非ヒト哺乳動物、例えば、イヌ、ネコ、ウシ科動物、ウマ科動物、マウス、ラット、ウサギ、またはこれらのトランスジェニック種であり得る。「対象」は、「患者」、例えばヒト患者を指す場合もあることが理解される。
【0033】
「ヘテロプラスミー」および「ヘテロプラスミック」という用語は当業者には理解される。一般に、「ヘテロプラスミー」および「ヘテロプラスミック」という用語は、個体または試料の中に１種よりも多くの型のｍｔＤＮＡゲノムが存在することを指す。
【0034】
本明細書で提供される実施形態の実施には、別段の指定のない限り、当業者の技能の範囲内である分子生物学、微生物学、および免疫学の従来の技法が用いられる。そのような技法は、文献において十分に説明されている。参考とするのに特に適したテキストの例として、以下が挙げられる：Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York (2001); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, MD (1999); Glover, ed., DNA Cloning, Volumes I and II (1985); Gait, ed., Oligonucleotide Synthesis (1984); Hames & Higgins, eds., Nucleic Acid Hybridization (1984); Hames & Higgins, eds., Transcription and Translation (1984); Freshney, ed., Animal Cell Culture: Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, 1986); Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, London); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice (Springer Verlag, N.Y., 2d ed. 1987); and Weir & Blackwell, eds., Handbook of Experimental Immunology, Volumes I-IV (1986)。
６．１ ミトコンドリア置換細胞（ＭｉｒＣ）を生成する方法
６．１ ミトコンドリア置換細胞（ＭｉｒＣ）を生成する方法
【0035】
本開示は、ｍＴＯＲ阻害薬の使用により、レシピエント細胞の内因性ミトコンドリアおよび／または内因性ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）のいかなる事前の減少も枯渇も必要なくドナーミトコンドリアのレシピエントリンパ球への移入を増強することができるという発見に一部基づく。したがって、一態様では、ｍＴＯＲ阻害薬を使用し、内因性ミトコンドリアおよび／または内因性ｍｔＤＮＡの事前の減少または枯渇のためのいかなる手順も使用せずに、ミトコンドリア置換リンパ球系細胞を生成するための方法が本明細書に提供される。具体的な実施形態では、ミトコンドリア置換リンパ球系細胞を生成するための方法であって、内因性ミトコンドリアを減少または枯渇させる手順に供されていないリンパ球系細胞を、単離された外因性ミトコンドリア、および有効量の哺乳類ラパマイシン標的（ｍＴＯＲ）阻害薬と共に十分な期間にわたってインキュベートして、外因性ミトコンドリアをリンパ球系細胞に非侵襲的に移入し、それにより、ミトコンドリア置換リンパ球系細胞を生成するステップを含む、方法が本明細書に提供される。別の具体的な実施形態では、ミトコンドリア置換リンパ球系細胞を生成するための方法であって、内因性ミトコンドリアを減少または枯渇させる手順に供されていないリンパ球系細胞を、単離された外因性ミトコンドリア、および有効量の哺乳類ラパマイシン標的（ｍＴＯＲ）阻害薬を含む組成物と共に十分な期間にわたってインキュベートして、外因性ミトコンドリアをリンパ球系細胞に非侵襲的に移入し、それにより、ミトコンドリア置換リンパ球系細胞を生成するステップを含む、方法が本明細書に提供される。例えば、内因性ミトコンドリアを減少または枯渇させる手順に供されていないリンパ球系細胞は、ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）枯渇剤（例えば、臭化エチジウム（ＥｔＢｒ）、またはｍｔＤＮＡを分解することが可能な酵素、例えば制限酵素）と接触させていないか、またはそうではなくｍｔＤＮＡ枯渇剤をコードするポリヌクレオチドを用いたトランスフェクトも形質導入もしていないものであり得る。一部の実施形態では、内因性ミトコンドリアを減少または枯渇させる手順に供されていないリンパ球系細胞は、ｍｔＤＮＡを分解することが可能な酵素と接触させてもおらず、ｍｔＤＮＡを分解することが可能な酵素をコードするポリヌクレオチドを用いたトランスフェクトも形質導入もしていないものであり得る。ある特定の実施形態では、ミトコンドリア置換リンパ球系細胞を生成するための本明細書に提供される方法をｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで実施する。
【0036】
本明細書で提供される方法に従って置換される内因性ｍｔＤＮＡのレベルは、外因性ｍｔＤＮＡによる内因性ｍｔＤＮＡの完全な置換（すなわち、１００％の置換）がもたらされるものである必要はない。例えば、一部の実施形態では、内因性ｍｔＤＮＡの少なくとも１０％が外因性ｍｔＤＮＡによって置換されている。一部の実施形態では、内因性ｍｔＤＮＡの少なくとも１５％が外因性ｍｔＤＮＡによって置換されている。一部の実施形態では、内因性ｍｔＤＮＡの少なくとも２０％が外因性ｍｔＤＮＡによって置換されている。一部の実施形態では、内因性ｍｔＤＮＡの少なくとも２５％が外因性ｍｔＤＮＡによって置換されている。一部の実施形態では、内因性ｍｔＤＮＡの少なくとも３０％が外因性ｍｔＤＮＡによって置換されている。一部の実施形態では、内因性ｍｔＤＮＡの少なくとも３５％が外因性ｍｔＤＮＡによって置換されている。一部の実施形態では、内因性ｍｔＤＮＡの少なくとも４０％が外因性ｍｔＤＮＡによって置換されている。一部の実施形態では、内因性ｍｔＤＮＡの少なくとも４５％が外因性ｍｔＤＮＡによって置換されている。一部の実施形態では、内因性ｍｔＤＮＡの少なくとも５０％が外因性ｍｔＤＮＡによって置換されている。一部の実施形態では、内因性ｍｔＤＮＡの少なくとも５５％が外因性ｍｔＤＮＡによって置換されている。一部の実施形態では、内因性ｍｔＤＮＡの少なくとも６０％が外因性ｍｔＤＮＡによって置換されている。一部の実施形態では、内因性ｍｔＤＮＡの少なくとも６５％が外因性ｍｔＤＮＡによって置換されている。一部の実施形態では、内因性ｍｔＤＮＡの少なくとも７０％が外因性ｍｔＤＮＡによって置換されている。一部の実施形態では、内因性ｍｔＤＮＡの少なくとも８０％が外因性ｍｔＤＮＡによって置換されている。一部の実施形態では、内因性ｍｔＤＮＡの少なくとも９０％が外因性ｍｔＤＮＡによって置換されている。一部の実施形態では、内因性ｍｔＤＮＡの１００％が外因性ｍｔＤＮＡによって置換されている。
当業者に公知のまたは本明細書に記載の技法（例えば、実施例におけるもの）を使用して、外因性ｍｔＤＮＡによる内因性ｍｔＤＮＡの置換を測定することができる。
当業者に公知のまたは本明細書に記載の技法（例えば、実施例におけるもの）を使用して、外因性ｍｔＤＮＡによる内因性ｍｔＤＮＡの置換を測定することができる。
【0037】
具体的な実施形態では、内因性ｍｔＤＮＡの少なくとも２０％が外因性ｍｔＤＮＡによって置換されているミトコンドリア置換リンパ球系細胞を生成するための方法であって、内因性ミトコンドリアを減少または枯渇させる手順に供されていないリンパ球系細胞を、単離された外因性ミトコンドリアと、有効量の哺乳類ラパマイシン標的（ｍＴＯＲ）阻害薬と共に十分な期間にわたってインキュベートして、外因性ミトコンドリアをリンパ球系細胞に非侵襲的に移入し、それにより、内因性ｍｔＤＮＡの少なくとも２０％が外因性ｍｔＤＮＡによって置換されているミトコンドリア置換リンパ球系細胞を生成するステップを含む、方法が本明細書に提供される。
【0038】
当業者に公知のまたは本明細書に記載の技法（例えば、実施例におけるもの）を使用して、外因性ｍｔＤＮＡによる内因性ｍｔＤＮＡの置換を測定することができる。例えば、種々の配列決定方法を本明細書に提供される方法のいずれかと組み合わせて使用して、外因性ミトコンドリアおよび／もしくは外因性ｍｔＤＮＡの移入を評価もしくは確認すること、またはヘテロプラスミーを数量化することができる。一般に、ｍｔＤＮＡの差異は、ｍｔＤＮＡのＤループを配列決定することによって検出することができる。Ｄループは、ミトコンドリアゲノムの他のいずれの場所よりも変異が蓄積する頻度が高い領域を２つ含有する。領域は、それぞれ超可変領域（ＨＶＲ）－１およびＨＶＲ２と称される。
【0039】
一部の実施形態では、本明細書に提供される方法に関連して、ｍｔＤＮＡのＤループのＨＶ１および／またはＨＶ２を配列決定することにより、内因性ｍｔＤＮＡおよび外因性ｍｔＤＮＡを配列決定し、数量化する。具体的な実施形態では、配列決定方法は一塩基多型（ＳＮＰ）アッセイを含む。他の実施形態では、配列決定方法はデジタルＰＣＲを含む。具体的な実施形態では、デジタルＰＣＲはドロップレットデジタルＰＣＲである。
【0040】
一般に、ｍＴＯＲ阻害薬の有効量は、約６０ナノモル（ｎＭ）～約１０００ｎＭの濃度である。しかし、ミトコンドリアをリンパ球に移入するために有効なｍＴＯＲ阻害薬の量には、細胞密度、処置時間、ｍＴＯＲ阻害薬の型、およびリンパ球の型を含む因子が影響を及ぼし得る。
【0041】
一部の実施形態では、ｍＴＯＲ阻害薬の有効量は、約６０ｎＭ～約１０００ｎＭの濃度である。一部の実施形態では、ｍＴＯＲ阻害薬の有効量は、約１００ｎＭ～約１０００ｎＭの濃度である。一部の実施形態では、ｍＴＯＲ阻害薬の有効量は、約２００ｎＭ～約５００ｎＭの濃度である。一部の実施形態では、ｍＴＯＲ阻害薬の有効量は、約３００ｎＭ～約６００ｎＭの濃度である。一部の実施形態では、ｍＴＯＲ阻害薬の有効量は、約４００ｎＭ～約７００ｎＭの濃度である。
【0042】
ある特定の実施形態では、ｍＴＯＲ阻害薬の有効量は、約６０ｎＭの濃度である。ある特定の実施形態では、ｍＴＯＲ阻害薬の有効量は、約７０ｎＭの濃度である。ある特定の実施形態では、ｍＴＯＲ阻害薬の有効量は、約８０ｎＭの濃度である。ある特定の実施形態では、ｍＴＯＲ阻害薬の有効量は、約９０ｎＭの濃度である。ある特定の実施形態では、ｍＴＯＲ阻害薬の有効量は、約１００ｎＭの濃度である。一部の実施形態では、ｍＴＯＲ阻害薬の有効量は、約１５０ｎＭの濃度である。一部の実施形態では、ｍＴＯＲ阻害薬の有効量は、約２００ｎＭの濃度である。一部の実施形態では、ｍＴＯＲ阻害薬の有効量は、約２５０ｎＭの濃度である。一部の実施形態では、ｍＴＯＲ阻害薬の有効量は、約３００ｎＭの濃度である。一部の実施形態では、ｍＴＯＲ阻害薬の有効量は、約３５０ｎＭの濃度である。一部の実施形態では、ｍＴＯＲ阻害薬の有効量は、約４００ｎＭの濃度である。一部の実施形態では、ｍＴＯＲ阻害薬の有効量は、約４５０ｎＭの濃度である。一部の実施形態では、ｍＴＯＲ阻害薬の有効量は、約５００ｎＭの濃度である。一部の実施形態では、ｍＴＯＲ阻害薬の有効量は、約５５０ｎＭの濃度である。一部の実施形態では、ｍＴＯＲ阻害薬の有効量は、約６００ｎＭの濃度である。一部の実施形態では、ｍＴＯＲ阻害薬の有効量は、約６５０ｎＭの濃度である。一部の実施形態では、ｍＴＯＲ阻害薬の有効量は、約７００ｎＭの濃度である。一部の実施形態では、ｍＴＯＲ阻害薬の有効量は、約７５０ｎＭの濃度である。一部の実施形態では、ｍＴＯＲ阻害薬の有効量は、約８００ｎＭの濃度である。一部の実施形態では、ｍＴＯＲ阻害薬の有効量は、約８５０ｎＭの濃度である。一部の実施形態では、ｍＴＯＲ阻害薬の有効量は、約９００ｎＭの濃度である。一部の実施形態では、ｍＴＯＲ阻害薬の有効量は、約１０００ｎＭの濃度である。一部の実施形態では、ｍＴＯＲ阻害薬の有効量は、約１０００ｎＭより大きい濃度である。
【0043】
本開示に従ってミトコンドリア置換リンパ球系細胞を生成するために、種々のｍＴＯＲの阻害薬、例えば、６．２節に記載の例示的なｍＴＯＲ阻害薬を使用することができる。ある特定の実施形態では、ｍＴＯＲ阻害薬はラパマイシンまたはその誘導体である。具体的な実施形態では、ｍＴＯＲ阻害薬はラパマイシンである。
【0044】
一部の実施形態では、ｍＴＯＲ阻害薬は、約１００ナノモル（ｎＭ）～約１０００ｎＭの濃度のラパマイシンまたはその誘導体である。一部の実施形態では、ｍＴＯＲ阻害薬は、約２００ナノモル（ｎＭ）～約５００ｎＭの濃度のラパマイシンまたはその誘導体である。一部の実施形態では、ｍＴＯＲ阻害薬は、約３００ナノモル（ｎＭ）～約６００ｎＭの濃度のラパマイシンまたはその誘導体である。一部の実施形態では、ｍＴＯＲ阻害薬は、約４００ナノモル（ｎＭ）～約７００ｎＭの濃度のラパマイシンまたはその誘導体である。
【0045】
ある特定の実施形態では、有効量のラパマイシンまたはその誘導体は、約１００ｎＭの濃度である。一部の実施形態では、有効量のラパマイシンまたはその誘導体は、約１５０ｎＭの濃度である。一部の実施形態では、有効量のラパマイシンまたはその誘導体は、約２００ｎＭの濃度である。一部の実施形態では、有効量のラパマイシンまたはその誘導体は、約２５０ｎＭの濃度である。一部の実施形態では、有効量のラパマイシンまたはその誘導体は、約３００ｎＭの濃度である。一部の実施形態では、有効量のラパマイシンまたはその誘導体は、約３５０ｎＭの濃度である。一部の実施形態では、有効量のラパマイシンまたはその誘導体は、約４００ｎＭの濃度である。一部の実施形態では、有効量のラパマイシンまたはその誘導体は、約４５０ｎＭの濃度である。一部の実施形態では、有効量のラパマイシンまたはその誘導体は、約５００ｎＭの濃度である。一部の実施形態では、有効量のラパマイシンまたはその誘導体は、約５５０ｎＭの濃度である。一部の実施形態では、有効量のラパマイシンまたはその誘導体は、約６００ｎＭの濃度である。一部の実施形態では、有効量のラパマイシンまたはその誘導体は、約６５０ｎＭの濃度である。一部の実施形態では、有効量のラパマイシンまたはその誘導体は、約７００ｎＭの濃度である。一部の実施形態では、有効量のラパマイシンまたはその誘導体は、約７５０ｎＭの濃度である。一部の実施形態では、有効量のラパマイシンまたはその誘導体は、約８００ｎＭの濃度である。一部の実施形態では、有効量のラパマイシンまたはその誘導体は、約８５０ｎＭの濃度である。一部の実施形態では、有効量のラパマイシンまたはその誘導体は、約９００ｎＭの濃度である。一部の実施形態では、有効量のラパマイシンまたはその誘導体は、約１０００ｎＭの濃度である。一部の実施形態では、有効量のラパマイシンまたはその誘導体は、１０００ｎＭよりも高い濃度である。
【0046】
具体的な実施形態では、ミトコンドリア置換リンパ球系細胞を生成するための方法であって、内因性ミトコンドリアを減少または枯渇させる手順に供されていないリンパ球系細胞を、単離された外因性ミトコンドリアおよび約１００ｎＭ～約１０００ｎＭのラパマイシンと共に十分な期間にわたってインキュベートして、外因性ミトコンドリアをリンパ球系細胞に非侵襲的に移入し、それにより、ミトコンドリア置換リンパ球系細胞を生成するステップを含む、方法が本明細書に提供される。
【0047】
一実施形態では、内因性ミトコンドリアを減少または枯渇させる手順に供されていないリンパ球系細胞を、単離された外因性ミトコンドリアおよび約１００ｎＭのｍＴＯＲ阻害薬（例えば、６．２節に記載のｍＴＯＲ阻害薬、例えば、ラパマイシンが挙げられる）と共に約１２時間インキュベートする。別の実施形態では、内因性ミトコンドリアを減少または枯渇させる手順に供されていないリンパ球系細胞を、単離された外因性ミトコンドリアおよび約１００ｎＭのｍＴＯＲ阻害薬（例えば、６．２節に記載のｍＴＯＲ阻害薬、例えば、ラパマイシンが挙げられる）と共に約２４時間インキュベートする。別の実施形態では、内因性ミトコンドリアを減少または枯渇させる手順に供されていないリンパ球系細胞を、単離された外因性ミトコンドリアおよび約１００ｎＭのｍＴＯＲ阻害薬と共に約３６時間インキュベートする。別の実施形態では、内因性ミトコンドリアを減少または枯渇させる手順に供されていないリンパ球系細胞を、単離された外因性ミトコンドリアおよび約１００ｎＭのｍＴＯＲ阻害薬（例えば、６．２節に記載のｍＴＯＲ阻害薬、例えば、ラパマイシンが挙げられる）と共に約４８時間インキュベートする。別の実施形態では、内因性ミトコンドリアを減少または枯渇させる手順に供されていないリンパ球系細胞を、単離された外因性ミトコンドリアおよび約１００ｎＭのｍＴＯＲ阻害薬と共に約２日間インキュベートする。別の実施形態では、内因性ミトコンドリアを減少または枯渇させる手順に供されていないリンパ球系細胞を、単離された外因性ミトコンドリアおよび約１００ｎＭのｍＴＯＲ阻害薬（例えば、６．２節に記載のｍＴＯＲ阻害薬、例えば、ラパマイシンが挙げられる）と共に約２～７日間インキュベートする。別の実施形態では、内因性ミトコンドリアを減少または枯渇させる手順に供されていないリンパ球系細胞を、単離された外因性ミトコンドリアおよび約１００ｎＭのｍＴＯＲ阻害薬（例えば、６．２節に記載のｍＴＯＲ阻害薬、例えば、ラパマイシンが挙げられる）と共に７日間より長くインキュベートする。
【0048】
別の実施形態では、内因性ミトコンドリアを減少または枯渇させる手順に供されていないリンパ球系細胞を、単離された外因性ミトコンドリアおよび約２００ｎＭのｍＴＯＲ阻害薬（例えば、６．２節に記載のｍＴＯＲ阻害薬、例えば、ラパマイシンが挙げられる）と共に約１２時間インキュベートする。別の実施形態では、内因性ミトコンドリアを減少または枯渇させる手順に供されていないリンパ球系細胞を、単離された外因性ミトコンドリアおよび約２００ｎＭのｍＴＯＲ阻害薬（例えば、６．２節に記載のｍＴＯＲ阻害薬、例えば、ラパマイシンが挙げられる）と共に約２４時間インキュベートする。別の実施形態では、内因性ミトコンドリアを減少または枯渇させる手順に供されていないリンパ球系細胞を、単離された外因性ミトコンドリアおよび約２００ｎＭのｍＴＯＲ阻害薬（例えば、６．２節に記載のｍＴＯＲ阻害薬、例えば、ラパマイシンが挙げられる）と共に約３６時間インキュベートする。別の実施形態では、内因性ミトコンドリアを減少または枯渇させる手順に供されていないリンパ球系細胞を、単離された外因性ミトコンドリアおよび約２００ｎＭのｍＴＯＲ阻害薬（例えば、６．２節に記載のｍＴＯＲ阻害薬、例えば、ラパマイシンが挙げられる）と共に約４８時間インキュベートする。別の実施形態では、内因性ミトコンドリアを減少または枯渇させる手順に供されていないリンパ球系細胞を、単離された外因性ミトコンドリアおよび約２００ｎＭのｍＴＯＲ阻害薬（例えば、６．２節に記載のｍＴＯＲ阻害薬、例えば、ラパマイシンが挙げられる）と共に約２日間インキュベートする。別の実施形態では、内因性ミトコンドリアを減少または枯渇させる手順に供されていないリンパ球系細胞を、単離された外因性ミトコンドリアおよび約２００ｎＭのｍＴＯＲ阻害薬（例えば、６．２節に記載のｍＴＯＲ阻害薬、例えば、ラパマイシンが挙げられる）と共に約２～７日間インキュベートする。別の実施形態では、内因性ミトコンドリアを減少または枯渇させる手順に供されていないリンパ球系細胞を、単離された外因性ミトコンドリアおよび約２００ｎＭのｍＴＯＲ阻害薬（例えば、６．２節に記載のｍＴＯＲ阻害薬、例えば、ラパマイシンが挙げられる）と共に７日間より長くインキュベートする。
【0049】
別の実施形態では、内因性ミトコンドリアを減少または枯渇させる手順に供されていないリンパ球系細胞を、単離された外因性ミトコンドリアおよび約３００ｎＭのｍＴＯＲ阻害薬（例えば、６．２節に記載のｍＴＯＲ阻害薬、例えば、ラパマイシンが挙げられる）と共に約１２時間インキュベートする。別の実施形態では、内因性ミトコンドリアを減少または枯渇させる手順に供されていないリンパ球系細胞を、単離された外因性ミトコンドリアおよび約３００ｎＭのｍＴＯＲ阻害薬（例えば、６．２節に記載のｍＴＯＲ阻害薬、例えば、ラパマイシンが挙げられる）と共に約２４時間インキュベートする。別の実施形態では、内因性ミトコンドリアを減少または枯渇させる手順に供されていないリンパ球系細胞を、単離された外因性ミトコンドリアおよび約３００ｎＭのｍＴＯＲ阻害薬（例えば、６．２節に記載のｍＴＯＲ阻害薬、例えば、ラパマイシンが挙げられる）と共に約３６時間インキュベートする。別の実施形態では、内因性ミトコンドリアを減少または枯渇させる手順に供されていないリンパ球系細胞を、単離された外因性ミトコンドリアおよび約３００ｎＭのｍＴＯＲ阻害薬（例えば、６．２節に記載のｍＴＯＲ阻害薬、例えば、ラパマイシンが挙げられる）と共に約４８時間インキュベートする。別の実施形態では、内因性ミトコンドリアを減少または枯渇させる手順に供されていないリンパ球系細胞を、単離された外因性ミトコンドリアおよび約３００ｎＭのｍＴＯＲ阻害薬（例えば、６．２節に記載のｍＴＯＲ阻害薬、例えば、ラパマイシンが挙げられる）と共に約２日間インキュベートする。別の実施形態では、内因性ミトコンドリアを減少または枯渇させる手順に供されていないリンパ球系細胞を、単離された外因性ミトコンドリアおよび約３００ｎＭのｍＴＯＲ阻害薬（例えば、６．２節に記載のｍＴＯＲ阻害薬、例えば、ラパマイシンが挙げられる）と共に約２～７日間インキュベートする。別の実施形態では、内因性ミトコンドリアを減少または枯渇させる手順に供されていないリンパ球系細胞を、単離された外因性ミトコンドリアおよび約３００ｎＭのｍＴＯＲ阻害薬（例えば、６．２節に記載のｍＴＯＲ阻害薬、例えば、ラパマイシンが挙げられる）と共に７日間より長くインキュベートする。
【0050】
別の実施形態では、内因性ミトコンドリアを減少または枯渇させる手順に供されていないリンパ球系細胞を、単離された外因性ミトコンドリアおよび約４００ｎＭのｍＴＯＲ阻害薬（例えば、６．２節に記載のｍＴＯＲ阻害薬、例えば、ラパマイシンが挙げられる）と共に約１２時間インキュベートする。別の実施形態では、内因性ミトコンドリアを減少または枯渇させる手順に供されていないリンパ球系細胞を、単離された外因性ミトコンドリアおよび約４００ｎＭのｍＴＯＲ阻害薬（例えば、６．２節に記載のｍＴＯＲ阻害薬、例えば、ラパマイシンが挙げられる）と共に約２４時間インキュベートする。別の実施形態では、内因性ミトコンドリアを減少または枯渇させる手順に供されていないリンパ球系細胞を、単離された外因性ミトコンドリアおよび約４００ｎＭのｍＴＯＲ阻害薬（例えば、６．２節に記載のｍＴＯＲ阻害薬、例えば、ラパマイシンが挙げられる）と共に約３６時間インキュベートする。別の実施形態では、内因性ミトコンドリアを減少または枯渇させる手順に供されていないリンパ球系細胞を、単離された外因性ミトコンドリアおよび約４００ｎＭのｍＴＯＲ阻害薬（例えば、６．２節に記載のｍＴＯＲ阻害薬、例えば、ラパマイシンが挙げられる）と共に約４８時間インキュベートする。別の実施形態では、内因性ミトコンドリアを減少または枯渇させる手順に供されていないリンパ球系細胞を、単離された外因性ミトコンドリアおよび約４００ｎＭのｍＴＯＲ阻害薬（例えば、６．２節に記載のｍＴＯＲ阻害薬、例えば、ラパマイシンが挙げられる）と共に約２日間インキュベートする。別の実施形態では、内因性ミトコンドリアを減少または枯渇させる手順に供されていないリンパ球系細胞を、単離された外因性ミトコンドリアおよび約４００ｎＭのｍＴＯＲ阻害薬（例えば、６．２節に記載のｍＴＯＲ阻害薬、例えば、ラパマイシンが挙げられる）と共に約２～７日間インキュベートする。別の実施形態では、内因性ミトコンドリアを減少または枯渇させる手順に供されていないリンパ球系細胞を、単離された外因性ミトコンドリアおよび約４００ｎＭのｍＴＯＲ阻害薬（例えば、６．２節に記載のｍＴＯＲ阻害薬、例えば、ラパマイシンが挙げられる）と共に７日間より長くインキュベートする。
【0051】
別の実施形態では、内因性ミトコンドリアを減少または枯渇させる手順に供されていないリンパ球系細胞を、単離された外因性ミトコンドリアおよび約５００ｎＭのｍＴＯＲ阻害薬（例えば、６．２節に記載のｍＴＯＲ阻害薬、例えば、ラパマイシンが挙げられる）と共に約１２時間インキュベートする。別の実施形態では、内因性ミトコンドリアを減少または枯渇させる手順に供されていないリンパ球系細胞を、単離された外因性ミトコンドリアおよび約５００ｎＭのｍＴＯＲ阻害薬（例えば、６．２節に記載のｍＴＯＲ阻害薬、例えば、ラパマイシンが挙げられる）と共に約２４時間インキュベートする。別の実施形態では、内因性ミトコンドリアを減少または枯渇させる手順に供されていないリンパ球系細胞を、単離された外因性ミトコンドリアおよび約５００ｎＭのｍＴＯＲ阻害薬（例えば、６．２節に記載のｍＴＯＲ阻害薬、例えば、ラパマイシンが挙げられる）と共に約３６時間インキュベートする。別の実施形態では、内因性ミトコンドリアを減少または枯渇させる手順に供されていないリンパ球系細胞を、単離された外因性ミトコンドリアおよび約５００ｎＭのｍＴＯＲ阻害薬（例えば、６．２節に記載のｍＴＯＲ阻害薬、例えば、ラパマイシンが挙げられる）と共に約４８時間インキュベートする。別の実施形態では、内因性ミトコンドリアを減少または枯渇させる手順に供されていないリンパ球系細胞を、単離された外因性ミトコンドリアおよび約５００ｎＭのｍＴＯＲ阻害薬（例えば、６．２節に記載のｍＴＯＲ阻害薬、例えば、ラパマイシンが挙げられる）と共に約２日間インキュベートする。別の実施形態では、内因性ミトコンドリアを減少または枯渇させる手順に供されていないリンパ球系細胞を、単離された外因性ミトコンドリアおよび約５００ｎＭのｍＴＯＲ阻害薬（例えば、６．２節に記載のｍＴＯＲ阻害薬、例えば、ラパマイシンが挙げられる）と共に約２～７日間インキュベートする。別の実施形態では、内因性ミトコンドリアを減少または枯渇させる手順に供されていないリンパ球系細胞を、単離された外因性ミトコンドリアおよび約５００ｎＭのｍＴＯＲ阻害薬（例えば、６．２節に記載のｍＴＯＲ阻害薬、例えば、ラパマイシンが挙げられる）と共に７日間より長くインキュベートする。
【0052】
別の実施形態では、内因性ミトコンドリアを減少または枯渇させる手順に供されていないリンパ球系細胞を、単離された外因性ミトコンドリアおよび約６００ｎＭのｍＴＯＲ阻害薬（例えば、６．２節に記載のｍＴＯＲ阻害薬、例えば、ラパマイシンが挙げられる）と共に約１２時間インキュベートする。別の実施形態では、内因性ミトコンドリアを減少または枯渇させる手順に供されていないリンパ球系細胞を、単離された外因性ミトコンドリアおよび約６００ｎＭのｍＴＯＲ阻害薬（例えば、６．２節に記載のｍＴＯＲ阻害薬、例えば、ラパマイシンが挙げられる）と共に約２４時間インキュベートする。別の実施形態では、内因性ミトコンドリアを減少または枯渇させる手順に供されていないリンパ球系細胞を、単離された外因性ミトコンドリアおよび約６００ｎＭのｍＴＯＲ阻害薬（例えば、６．２節に記載のｍＴＯＲ阻害薬、例えば、ラパマイシンが挙げられる）と共に約３６時間インキュベートする。別の実施形態では、内因性ミトコンドリアを減少または枯渇させる手順に供されていないリンパ球系細胞を、単離された外因性ミトコンドリアおよび約６００ｎＭのｍＴＯＲ阻害薬（例えば、６．２節に記載のｍＴＯＲ阻害薬、例えば、ラパマイシンが挙げられる）と共に約４８時間インキュベートする。別の実施形態では、内因性ミトコンドリアを減少または枯渇させる手順に供されていないリンパ球系細胞を、単離された外因性ミトコンドリアおよび約６００ｎＭのｍＴＯＲ阻害薬（例えば、６．２節に記載のｍＴＯＲ阻害薬、例えば、ラパマイシンが挙げられる）と共に約２日間インキュベートする。別の実施形態では、内因性ミトコンドリアを減少または枯渇させる手順に供されていないリンパ球系細胞を、単離された外因性ミトコンドリアおよび約６００ｎＭのｍＴＯＲ阻害薬（例えば、６．２節に記載のｍＴＯＲ阻害薬、例えば、ラパマイシンが挙げられる）と共に約２～７日間インキュベートする。別の実施形態では、内因性ミトコンドリアを減少または枯渇させる手順に供されていないリンパ球系細胞を、単離された外因性ミトコンドリアおよび約６００ｎＭのｍＴＯＲ阻害薬（例えば、６．２節に記載のｍＴＯＲ阻害薬、例えば、ラパマイシンが挙げられる）と共に７日間より長くインキュベートする。
【0053】
別の実施形態では、内因性ミトコンドリアを減少または枯渇させる手順に供されていないリンパ球系細胞を、単離された外因性ミトコンドリアおよび約７００ｎＭのｍＴＯＲ阻害薬（例えば、６．２節に記載のｍＴＯＲ阻害薬、例えば、ラパマイシンが挙げられる）と共に約１２時間インキュベートする。別の実施形態では、内因性ミトコンドリアを減少または枯渇させる手順に供されていないリンパ球系細胞を、単離された外因性ミトコンドリアおよび約７００ｎＭのｍＴＯＲ阻害薬（例えば、６．２節に記載のｍＴＯＲ阻害薬、例えば、ラパマイシンが挙げられる）と共に約２４時間インキュベートする。別の実施形態では、内因性ミトコンドリアを減少または枯渇させる手順に供されていないリンパ球系細胞を、単離された外因性ミトコンドリアおよび約７００ｎＭのｍＴＯＲ阻害薬（例えば、６．２節に記載のｍＴＯＲ阻害薬、例えば、ラパマイシンが挙げられる）と共に約３６時間インキュベートする。別の実施形態では、内因性ミトコンドリアを減少または枯渇させる手順に供されていないリンパ球系細胞を、単離された外因性ミトコンドリアおよび約７００ｎＭのｍＴＯＲ阻害薬（例えば、６．２節に記載のｍＴＯＲ阻害薬、例えば、ラパマイシンが挙げられる）と共に約４８時間インキュベートする。別の実施形態では、内因性ミトコンドリアを減少または枯渇させる手順に供されていないリンパ球系細胞を、単離された外因性ミトコンドリアおよび約７００ｎＭのｍＴＯＲ阻害薬（例えば、６．２節に記載のｍＴＯＲ阻害薬、例えば、ラパマイシンが挙げられる）と共に約２日間インキュベートする。別の実施形態では、内因性ミトコンドリアを減少または枯渇させる手順に供されていないリンパ球系細胞を、単離された外因性ミトコンドリアおよび約７００ｎＭのｍＴＯＲ阻害薬（例えば、６．２節に記載のｍＴＯＲ阻害薬、例えば、ラパマイシンが挙げられる）と共に約２～７日間インキュベートする。別の実施形態では、内因性ミトコンドリアを減少または枯渇させる手順に供されていないリンパ球系細胞を、単離された外因性ミトコンドリアおよび約７００ｎＭのｍＴＯＲ阻害薬（例えば、６．２節に記載のｍＴＯＲ阻害薬、例えば、ラパマイシンが挙げられる）と共に７日間より長くインキュベートする。
【0054】
別の実施形態では、内因性ミトコンドリアを減少または枯渇させる手順に供されていないリンパ球系細胞を、単離された外因性ミトコンドリアおよび約８００ｎＭのｍＴＯＲ阻害薬（例えば、６．２節に記載のｍＴＯＲ阻害薬、例えば、ラパマイシンが挙げられる）と共に約１２時間インキュベートする。別の実施形態では、内因性ミトコンドリアを減少または枯渇させる手順に供されていないリンパ球系細胞を、単離された外因性ミトコンドリアおよび約８００ｎＭのｍＴＯＲ阻害薬（例えば、６．２節に記載のｍＴＯＲ阻害薬、例えば、ラパマイシンが挙げられる）と共に約２４時間インキュベートする。別の実施形態では、内因性ミトコンドリアを減少または枯渇させる手順に供されていないリンパ球系細胞を、単離された外因性ミトコンドリアおよび約８００ｎＭのｍＴＯＲ阻害薬（例えば、６．２節に記載のｍＴＯＲ阻害薬、例えば、ラパマイシンが挙げられる）と共に約３６時間インキュベートする。別の実施形態では、内因性ミトコンドリアを減少または枯渇させる手順に供されていないリンパ球系細胞を、単離された外因性ミトコンドリアおよび約８００ｎＭのｍＴＯＲ阻害薬（例えば、６．２節に記載のｍＴＯＲ阻害薬、例えば、ラパマイシンが挙げられる）と共に約４８時間インキュベートする。別の実施形態では、内因性ミトコンドリアを減少または枯渇させる手順に供されていないリンパ球系細胞を、単離された外因性ミトコンドリアおよび約８００ｎＭのｍＴＯＲ阻害薬（例えば、６．２節に記載のｍＴＯＲ阻害薬、例えば、ラパマイシンが挙げられる）と共に約２日間インキュベートする。別の実施形態では、内因性ミトコンドリアを減少または枯渇させる手順に供されていないリンパ球系細胞を、単離された外因性ミトコンドリアおよび約８００ｎＭのｍＴＯＲ阻害薬（例えば、６．２節に記載のｍＴＯＲ阻害薬、例えば、ラパマイシンが挙げられる）と共に約２～７日間インキュベートする。別の実施形態では、内因性ミトコンドリアを減少または枯渇させる手順に供されていないリンパ球系細胞を、単離された外因性ミトコンドリアおよび約８００ｎＭのｍＴＯＲ阻害薬（例えば、６．２節に記載のｍＴＯＲ阻害薬、例えば、ラパマイシンが挙げられる）と共に７日間より長くインキュベートする。
【0055】
別の実施形態では、内因性ミトコンドリアを減少または枯渇させる手順に供されていないリンパ球系細胞を、単離された外因性ミトコンドリアおよび約９００ｎＭのｍＴＯＲ阻害薬（例えば、６．２節に記載のｍＴＯＲ阻害薬、例えば、ラパマイシンが挙げられる）と共に約１２時間インキュベートする。別の実施形態では、内因性ミトコンドリアを減少または枯渇させる手順に供されていないリンパ球系細胞を、単離された外因性ミトコンドリアおよび約９００ｎＭのｍＴＯＲ阻害薬（例えば、６．２節に記載のｍＴＯＲ阻害薬、例えば、ラパマイシンが挙げられる）と共に約２４時間インキュベートする。別の実施形態では、内因性ミトコンドリアを減少または枯渇させる手順に供されていないリンパ球系細胞を、単離された外因性ミトコンドリアおよび約９００ｎＭのｍＴＯＲ阻害薬（例えば、６．２節に記載のｍＴＯＲ阻害薬、例えば、ラパマイシンが挙げられる）と共に約３６時間インキュベートする。別の実施形態では、内因性ミトコンドリアを減少または枯渇させる手順に供されていないリンパ球系細胞を、単離された外因性ミトコンドリアおよび約９００ｎＭのｍＴＯＲ阻害薬（例えば、６．２節に記載のｍＴＯＲ阻害薬、例えば、ラパマイシンが挙げられる）と共に約４８時間インキュベートする。別の実施形態では、内因性ミトコンドリアを減少または枯渇させる手順に供されていないリンパ球系細胞を、単離された外因性ミトコンドリアおよび約９００ｎＭのｍＴＯＲ阻害薬（例えば、６．２節に記載のｍＴＯＲ阻害薬、例えば、ラパマイシンが挙げられる）と共に約２日間インキュベートする。別の実施形態では、内因性ミトコンドリアを減少または枯渇させる手順に供されていないリンパ球系細胞を、単離された外因性ミトコンドリアおよび約９００ｎＭのｍＴＯＲ阻害薬（例えば、６．２節に記載のｍＴＯＲ阻害薬、例えば、ラパマイシンが挙げられる）と共に約２～７日間インキュベートする。別の実施形態では、内因性ミトコンドリアを減少または枯渇させる手順に供されていないリンパ球系細胞を、単離された外因性ミトコンドリアおよび約９００ｎＭのｍＴＯＲ阻害薬（例えば、６．２節に記載のｍＴＯＲ阻害薬、例えば、ラパマイシンが挙げられる）と共に７日間より長くインキュベートする。
【0056】
別の実施形態では、内因性ミトコンドリアを減少または枯渇させる手順に供されていないリンパ球系細胞を、単離された外因性ミトコンドリアおよび約１０００ｎＭのｍＴＯＲ阻害薬（例えば、６．２節に記載のｍＴＯＲ阻害薬、例えば、ラパマイシンが挙げられる）と共に約１２時間インキュベートする。別の実施形態では、内因性ミトコンドリアを減少または枯渇させる手順に供されていないリンパ球系細胞を、単離された外因性ミトコンドリアおよび約１０００ｎＭのｍＴＯＲ阻害薬（例えば、６．２節に記載のｍＴＯＲ阻害薬、例えば、ラパマイシンが挙げられる）と共に約２４時間インキュベートする。別の実施形態では、内因性ミトコンドリアを減少または枯渇させる手順に供されていないリンパ球系細胞を、単離された外因性ミトコンドリアおよび約１０００ｎＭのｍＴＯＲ阻害薬（例えば、６．２節に記載のｍＴＯＲ阻害薬、例えば、ラパマイシンが挙げられる）と共に約３６時間インキュベートする。別の実施形態では、内因性ミトコンドリアを減少または枯渇させる手順に供されていないリンパ球系細胞を、単離された外因性ミトコンドリアおよび約１０００ｎＭのｍＴＯＲ阻害薬（例えば、６．２節に記載のｍＴＯＲ阻害薬、例えば、ラパマイシンが挙げられる）と共に約４８時間インキュベートする。別の実施形態では、内因性ミトコンドリアを減少または枯渇させる手順に供されていないリンパ球系細胞を、単離された外因性ミトコンドリアおよび約１０００ｎＭのｍＴＯＲ阻害薬（例えば、６．２節に記載のｍＴＯＲ阻害薬、例えば、ラパマイシンが挙げられる）と共に約２日間インキュベートする。別の実施形態では、内因性ミトコンドリアを減少または枯渇させる手順に供されていないリンパ球系細胞を、単離された外因性ミトコンドリアおよび約１０００ｎＭのｍＴＯＲ阻害薬（例えば、６．２節に記載のｍＴＯＲ阻害薬、例えば、ラパマイシンが挙げられる）と共に約２～７日間インキュベートする。別の実施形態では、内因性ミトコンドリアを減少または枯渇させる手順に供されていないリンパ球系細胞を、単離された外因性ミトコンドリアおよび約１０００ｎＭのｍＴＯＲ阻害薬（例えば、６．２節に記載のｍＴＯＲ阻害薬、例えば、ラパマイシンが挙げられる）と共に７日間より長くインキュベートする。
【0057】
一部の実施形態では、ｍＴＯＲ阻害薬（例えば、６．２節に記載のｍＴＯＲ阻害薬、例えば、ラパマイシンが挙げられる）を、リンパ球系細胞および外因性ミトコンドリアとのある特定の期間にわたるインキュベーション後、洗い出すおよび／または細胞培養物中で希釈する。例えば、一部の実施形態では、リンパ球系細胞を外因性ミトコンドリアおよびｍＴＯＲ阻害薬（例えば、６．２節に記載のｍＴＯＲ阻害薬、例えば、ラパマイシンが挙げられる）と共に約１２時間またはそれよりも長くインキュベートした後、培養培地をｍＴＯＲ阻害薬を伴わない新鮮な培地と交換し、次いで、細胞を少なくともさらに１２時間培養する。一部の実施形態では、リンパ球系細胞を外因性ミトコンドリアおよびｍＴＯＲ阻害薬（例えば、６．２節に記載のｍＴＯＲ阻害薬、例えば、ラパマイシンが挙げられる）と共に約２４時間またはそれよりも長くインキュベートした後、培養培地を交換する。一部の実施形態では、リンパ球系細胞を外因性ミトコンドリアおよびｍＴＯＲ阻害薬（例えば、６．２節に記載のｍＴＯＲ阻害薬、例えば、ラパマイシンが挙げられる）と共に約３６時間またはそれよりも長くインキュベートした後、培養培地を交換する。一部の実施形態では、リンパ球系細胞を外因性ミトコンドリアおよびｍＴＯＲ阻害薬（例えば、６．２節に記載のｍＴＯＲ阻害薬、例えば、ラパマイシンが挙げられる）と共に約４８時間またはそれよりも長くインキュベートした後、培養培地を交換する。一部の実施形態では、リンパ球系細胞を外因性ミトコンドリアおよびｍＴＯＲ阻害薬と共に約６０時間またはそれよりも長くインキュベートした後、培養培地を交換する。一部の実施形態では、リンパ球系細胞を、リンパ球系細胞の水分平衡を維持する適切な緩衝剤（例えば、補充を伴うまたは伴わない、ＰＢＳ、ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）、アール平衡塩類溶液（ＥＢＳＳ）、培養培地など）を用いて１回または複数回すすいだ後、ｍＴＯＲ阻害薬を含有しない新鮮な培養培地で培養する。一部の実施形態では、リンパ球系細胞をｍＴＯＲ阻害薬および外因性ミトコンドリアと共にインキュベートし、培養の持続時間にわたって培地を交換しない。
【0058】
一部の実施形態では、ｍＴＯＲ阻害薬（例えば、６．２節に記載のｍＴＯＲ阻害薬、例えば、ラパマイシンが挙げられる）を、リンパ球系細胞および外因性ミトコンドリアとのインキュベーション後、細胞培養物から希釈する。例えば、一部の実施形態では、リンパ球系細胞を外因性ミトコンドリアおよびｍＴＯＲ阻害薬（例えば、６．２節に記載のｍＴＯＲ阻害薬、例えば、ラパマイシンが挙げられる）と共に約１２時間またはそれよりも長くインキュベートした後、培養培地の一部をｍＴＯＲ阻害薬を含まない新鮮な培地と交換し（例えば、培養培地の約２５％、約５０％、または約７５％を新鮮な培地と交換し）、したがって、ｍＴＯＲ阻害薬の濃度を希釈し、次いで、細胞を少なくともさらに１２時間（例えば、約１２時間、約１８時間、約２４時間、約３６時間、約４８時間、約７２時間、約９６時間、約１２０時間、１３２時間、約１４８時間、約１７２時間、約２００時間、約２５０時間、約２７５時間またはそれよりも長く）培養する。一部の実施形態では、リンパ球系細胞を外因性ミトコンドリアおよびｍＴＯＲ阻害薬（例えば、６．２節に記載のｍＴＯＲ阻害薬、例えば、ラパマイシンが挙げられる）と共に約２４時間またはそれよりも長くインキュベートした後、培養培地の一部をｍＴＯＲ阻害薬を含まない新鮮な培地と交換し（例えば、培養培地の約２５％、約５０％、または約７５％を新鮮な培地と交換し）、したがって、ｍＴＯＲ阻害薬の濃度を希釈し、次いで、細胞を少なくともさらに１２時間（例えば、約１２時間、約１８時間、約２４時間、約３６時間、約４８時間、約７２時間、約９６時間、約１２０時間、１３２時間、約１４８時間、約１７２時間、約２００時間、約２５０時間、約２７５時間またはそれよりも長く）培養する。一部の実施形態では、リンパ球系細胞を外因性ミトコンドリアおよびｍＴＯＲ阻害薬（例えば、６．２節に記載のｍＴＯＲ阻害薬、例えば、ラパマイシンが挙げられる）と共に約３６時間またはそれよりも長くインキュベートした後、培養培地の一部をｍＴＯＲ阻害薬を含まない新鮮な培地と交換し（例えば、培養培地の約２５％、約５０％、または約７５％を新鮮な培地と交換し）、したがって、ｍＴＯＲ阻害薬の濃度を希釈し、次いで、細胞を少なくともさらに１２時間（例えば、約１２時間、約１８時間、約２４時間、約３６時間、約４８時間、約７２時間、約９６時間、約１２０時間、１３２時間、約１４８時間、約１７２時間、約２００時間、約２５０時間、約２７５時間またはそれよりも長く）培養する。一部の実施形態では、リンパ球系細胞を外因性ミトコンドリアおよびｍＴＯＲ阻害薬と共に約４８時間またはそれよりも長くインキュベートした後、培養培地の一部をｍＴＯＲ阻害薬を含まない新鮮な培地と交換し（例えば、培養培地の約２５％、約５０％、または約７５％を新鮮な培地と交換し）、したがって、ｍＴＯＲ阻害薬の濃度を希釈し、次いで、細胞を少なくともさらに１２時間（例えば、約１２時間、約１８時間、約２４時間、約３６時間、約４８時間、約７２時間、約９６時間、約１２０時間、１３２時間、約１４８時間、約１７２時間、約２００時間、約２５０時間、約２７５時間またはそれよりも長く）培養する。一部の実施形態では、リンパ球系細胞を外因性ミトコンドリアおよびｍＴＯＲ阻害薬（例えば、６．２節に記載のｍＴＯＲ阻害薬、例えば、ラパマイシンが挙げられる）と共に約６０時間またはそれよりも長くインキュベートした後、培養培地の一部をｍＴＯＲ阻害薬を含まない新鮮な培地と交換し（例えば、培養培地の約２５％、約５０％、または約７５％を新鮮な培地と交換し）、したがって、ｍＴＯＲ阻害薬の濃度を希釈し、次いで、細胞を少なくともさらに１２時間（例えば、約１２時間、約１８時間、約２４時間、約３６時間、約４８時間、約７２時間、約９６時間、約１２０時間、１３２時間、約１４８時間、約１７２時間、約２００時間、約２５０時間、約２７５時間またはそれよりも長く）培養する。一部の実施形態では、リンパ球系細胞を外因性ミトコンドリアおよびｍＴＯＲ阻害薬（例えば、６．２節に記載のｍＴＯＲ阻害薬、例えば、ラパマイシンが挙げられる）と共にインキュベートし、培養の持続時間にわたって培地を交換しない。
【0059】
本明細書に提供される方法に従って生成されるミトコンドリア置換リンパ球系細胞には、種々の型のリンパ球系細胞が含まれ得る。本開示との使用に適したリンパ球系細胞の非限定的な例としては、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、マクロファージ、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、または顆粒球が挙げられる。
【0060】
一部の実施形態では、リンパ球系細胞はＴ細胞である。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞はＣＤ４＋Ｔ細胞である。一部の実施形態では、Ｔ細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞である。ある特定の実施形態では、リンパ球系細胞はＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞の組合せを含む。一部の実施形態では、リンパ球系細胞はＴｒｅｇであるまたはＴｒｅｇを含む。ある特定の実施形態では、リンパ球系細胞は、エフェクターＴ細胞であるまたはエフェクターＴ細胞を含む。一部の実施形態では、リンパ球系細胞は、メモリーＴ細胞、エフェクターＴ細胞、Ｔｒｅｇ、もしくはこれらの組合せである、またはメモリーＴ細胞、エフェクターＴ細胞、Ｔｒｅｇ、もしくはこれらの組合せを含む。具体的な実施形態では、リンパ球系細胞は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）もしくはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする外因性ポリヌクレオチドを含むＴ細胞である、またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）もしくはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする外因性ポリヌクレオチドを含むＴ細胞を含む。具体的な実施形態では、リンパ球系細胞は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）もしくはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝子改変されているＴ細胞である、またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）もしくはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝子改変されているＴ細胞を含む。
【0061】
一部の実施形態では、Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するように遺伝子改変されたＴ細胞である。例えば、ＴＣＲは、腫瘍細胞の内部に存在する抗原も認識することができる天然に存在する受容体を使用する。他方、ＣＡＲは、がん細胞の表面上の特定の抗原のみを認識することができる抗体の部分を含む。ＣＡＲ－Ｔ細胞およびＴＣＲ Ｔ細胞は、免疫療法において使用されるにもかかわらず、疲弊したものになり得る。したがって、本明細書に提供される通り、一部の実施形態では、本明細書に記載の方法、例えば、６．１節に記載の方法に従って作製されるミトコンドリア置換リンパ球系細胞は、ＣＡＲ－Ｔ細胞またはＴＣＲ Ｔ細胞であってよく、がんの症状を処置するまたは好転させるために対象に投与することができる。ＣＡＲ－Ｔ細胞もしくはＴＣＲ ＴであるまたはＣＡＲ－Ｔ細胞もしくはＴＣＲ Ｔを含む本明細書に記載のミトコンドリア置換リンパ球系細胞が有益であり得る非限定的な例示的ながんの型としては、血液がん（例えば、急性リンパ性白血病、多発性骨髄腫、Ｂ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫（mantel cell lymphoma））、ならびに固形腫瘍が挙げられる。具体的な実施形態では、対象はヒト対象である。
【0062】
ＣＡＲは、一般に、細胞外標的結合性ドメイン、ヒンジ領域、ＣＡＲを細胞膜に繋ぎ止める膜貫通ドメイン、および活性化シグナルを伝達する１つまたは複数の細胞内ドメインを含むように設計される。共刺激ドメインの数に応じて、ＣＡＲは、第１世代（細胞内ドメイン、例えば、ＣＤ３ζのみ）、第２世代（１つの共刺激ドメインと細胞内ドメイン）、または第３世代ＣＡＲ（１つよりも多くの共刺激ドメインと細胞内ドメイン）に分類することができる。新世代ＣＡＲも開発中である（例えば、Guedan S, et al.. Mol Ther Methods Clin Dev. 2018 Dec 31; 12: 145-156を参照されたい）。血液学的悪性腫瘍に対するＣＡＲ標的（例えば、ＣＤ１９、ＢＣＭＡ）および固形腫瘍に対するＣＡＲ標的（例えば、ＨＥＲ２、ＰＳＣＡ）が当技術分野で公知であり、いずれの標的も本開示との使用に適する（例えば、Dotti G, et al. Immunol Rev. 2014; 257 (1): 107-126を参照されたい）。ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＣＡＲ－Ｔ細胞の投与を受ける対象に対して自己であっても同種であってもよい。一部の実施形態では、ＣＡＲ－Ｔ細胞は対象に対して同種である。他の実施形態では、ＣＡＲ－Ｔ細胞は対象に対して自己である。
【0063】
ある特定の実施形態では、ＣＡＲは、腫瘍抗原認識ドメイン、膜貫通ドメイン、および１つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、ＣＡＲは、腫瘍抗原認識ドメイン、膜貫通ドメイン、１つまたは複数の共刺激分子、および１つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインを含む。具体的な実施形態では、ＣＡＲは、腫瘍抗原認識ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインを含む。具体的な実施形態では、ＣＡＲは、腫瘍抗原認識ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞内ドメインおよび少なくとも１つの共刺激ドメインを含む。別の具体的な実施形態では、ＣＡＲは、腫瘍抗原認識ドメイン、膜貫通ドメイン、２つまたはそれよりも多くの共刺激ドメインおよび細胞内ドメインを含む。一部の実施形態では、ＣＡＲは、構成的にまたは誘導性に発現されるケモカインを含む。ある特定の実施形態では、ＣＡＲは、サイトカイン受容体の細胞内ドメイン（例えば、ＩＬ－２Ｒβ鎖断片）を含む。
【0064】
一部の実施形態では、Ｔ細胞は、ＴＣＲを発現するように遺伝子改変されたＴ細胞である。ＴＣＲは、一般に、アルファペプチド鎖およびベータペプチド鎖からなるヘテロ二量体を使用して、ＭＨＣ分子によって提示されるポリペプチド断片を認識し、また、ＴＣＲ Ｔ細胞は、特定の抗原を認識することができる遺伝子操作されたＴＣＲ産物である。一般に、人工的に設計された高親和性ＴＣＲが遺伝子操作技術によってＴ細胞にコードされ、それにより、Ｔ細胞による腫瘍細胞の認識の間の特異的認識および親和性の両方が増強される。ＴＣＲ－Ｔ細胞は、ＴＣＲ－Ｔ細胞の投与を受ける対象に対して自己であっても同種であってもよい。一部の実施形態では、ＴＣＲ－Ｔ細胞は対象に対して同種である。他の実施形態では、ＴＣＲ－Ｔ細胞は対象に対して自己である。
【0065】
ある特定の実施形態では、ＴＣＲ Ｔ細胞は、血液学的悪性腫瘍上の抗原（例えば、ＣＭＶ、ＷＴ１、ＨＡ－１）を認識する。ある特定の実施形態では、ＴＣＲ Ｔ細胞は、固形腫瘍上の抗原（例えば、ＨＢＶ、ｐ５３、変異型ＫＲＡＳ）を認識する。ある特定の実施形態では、ＴＣＲ Ｔ細胞は、ＨＩＶに関連するＳＬ９を認識する。
【0066】
一部の実施形態では、本明細書に記載の方法に供されるリンパ球系細胞は、機能障害性Ｔ細胞である。例えば、一部の実施形態では、Ｔ細胞は、疲弊Ｔ細胞、老化Ｔ細胞、またはこれらの組合せを含む。ある特定の実施形態では、リンパ球系細胞は、遺伝性および後天性ミトコンドリアＤＮＡ変異に関連する疾患または障害、例えば、ミトコンドリア病、またはヘテロプラスミック免疫細胞に関連する免疫不全を有する対象（例えば、ヒト対象）から単離されたＴ細胞を含む。
【0067】
ミトコンドリア置換リンパ球系細胞を生成するための本方法は、ヒト細胞および非ヒト細胞を伴い得る。一部の実施形態では、リンパ球系細胞はヒトリンパ球系細胞である。他の実施形態では、リンパ球系細胞は非ヒトリンパ球系細胞（例えば、マウスリンパ球系細胞、サルリンパ球系細胞など）である。
【0068】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の方法に供されるリンパ球系細胞は、遺伝性および後天性ミトコンドリアＤＮＡ変異に関連する疾患または障害、例えば、ミトコンドリア病、またはヘテロプラスミック免疫細胞に関連する免疫不全を有するヒト対象から単離される。一部の実施形態では、本明細書に記載の方法に供されるリンパ球系細胞は、ミトコンドリア置換リンパ球系細胞を治療として施される対象（例えば、ヒト対象）から単離される。言い換えれば、ミトコンドリア置換リンパ球系細胞は、ミトコンドリア置換リンパ球系細胞を用いて処置される対象に対して自己のリンパ球系細胞に由来する。他の実施形態では、本明細書に記載の方法に供されるリンパ球系細胞は、ミトコンドリア置換リンパ球系細胞を治療として施される対象（例えば、ヒト対象）とは異なる対象（例えば、異なるヒト対象）から単離される。言い換えれば、具体的な実施形態では、ミトコンドリア置換リンパ球系細胞は、ミトコンドリア置換リンパ球系細胞を用いて処置される対象に対して同種のリンパ球系細胞に由来する。一部の実施形態では、リンパ球系細胞はＴ細胞である。ある特定の実施形態では、リンパ球系細胞はＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、またはこれらの組合せである。一部の実施形態では、リンパ球系細胞は、ＣＡＲを発現するように遺伝子改変されたＴ細胞である。
【0069】
当業者に公知のまたは本明細書に記載の技法（例えば、実施例に記載のもの）を使用して、リンパ球系細胞を対象（例えば、ヒト対象）から単離することができる。例えば、末梢血リンパ球を対象（例えば、ヒト対象）から単離することができる。一部の実施形態では、リンパ球系細胞のある特定のサブセット（例えば、Ｔ細胞のサブセット、例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞またはこれらの組合せ）を末梢血リンパ球から磁気分離などの当業者に公知のまたは本明細書に記載の技法を使用して単離することができる。
【0070】
ミトコンドリア置換リンパ球系細胞を生成するためにリンパ球系細胞と共にインキュベートする単離された外因性ミトコンドリアの量は、単離されたミトコンドリアと共インキュベートされるリンパ球系細胞の量などの因子に依存する。一般に、リンパ球系細胞と共にインキュベートされる単離された外因性ミトコンドリアの量は、リンパ球系細胞１×１０６個当たり約５μｇ～約１００μｇである。一部の実施形態では、リンパ球系細胞と共にインキュベートされる単離された外因性ミトコンドリアの量は、リンパ球系細胞１×１０６個当たり約１０μｇ～約９０μｇである。一部の実施形態では、リンパ球系細胞と共にインキュベートされる単離された外因性ミトコンドリアの量は、リンパ球系細胞１×１０６個当たり約２０μｇ～約８０μｇである。一部の実施形態では、リンパ球系細胞と共にインキュベートされる単離された外因性ミトコンドリアの量は、リンパ球系細胞１×１０６個当たり約３０μｇ～約７０μｇである。一部の実施形態では、リンパ球系細胞と共にインキュベートされる単離された外因性ミトコンドリアの量は、リンパ球系細胞１×１０６個当たり約４０μｇ～約８０μｇである。一部の実施形態では、リンパ球系細胞と共にインキュベートされる単離された外因性ミトコンドリアの量は、リンパ球系細胞１×１０６個当たり約５μｇである。一部の実施形態では、リンパ球系細胞と共にインキュベートされる単離された外因性ミトコンドリアの量は、リンパ球系細胞１×１０６個当たり約１０μｇである。一部の実施形態では、リンパ球系細胞と共にインキュベートされる単離された外因性ミトコンドリアの量は、リンパ球系細胞１×１０６個当たり約２０μｇである。一部の実施形態では、リンパ球系細胞と共にインキュベートされる単離された外因性ミトコンドリアの量は、リンパ球系細胞１×１０６個当たり約３０μｇである。一部の実施形態では、リンパ球系細胞と共にインキュベートされる単離された外因性ミトコンドリアの量は、リンパ球系細胞１×１０６個当たり約４０μｇである。一部の実施形態では、リンパ球系細胞と共にインキュベートされる単離された外因性ミトコンドリアの量は、リンパ球系細胞１×１０６個当たり約５０μｇである。一部の実施形態では、リンパ球系細胞と共にインキュベートされる単離された外因性ミトコンドリアの量は、リンパ球系細胞１×１０６個当たり約６０μｇである。一部の実施形態では、リンパ球系細胞と共にインキュベートされる単離された外因性ミトコンドリアの量は、リンパ球系細胞１×１０６個当たり約７０μｇである。一部の実施形態では、リンパ球系細胞と共にインキュベートされる単離された外因性ミトコンドリアの量は、リンパ球系細胞１×１０６個当たり約８０μｇである。一部の実施形態では、リンパ球系細胞と共にインキュベートされる単離された外因性ミトコンドリアの量は、リンパ球系細胞１×１０６個当たり約９０μｇである。一部の実施形態では、リンパ球系細胞と共にインキュベートされる単離された外因性ミトコンドリアの量は、リンパ球系細胞１×１０６個当たり約１００μｇである。一部の実施形態では、リンパ球系細胞と共にインキュベートされる単離された外因性ミトコンドリアの量は、リンパ球系細胞１×１０６個当たり１００μｇよりも多い。
【0071】
本明細書で提供されている通り、本開示の単離された外因性ミトコンドリアは、健康かつ機能的なミトコンドリアを有する種々の型の細胞から得ることができる。ミトコンドリア機能を決定するためのアッセイが当技術分野で公知であり、それらとして、６．４節に記載されているものなどのアッセイが挙げられる。本明細書で提供される方法における使用のためのミトコンドリアの例示的な供給源としては、線維芽細胞、血小板細胞、ならびに他のリンパ球系細胞が挙げられる。ある特定の実施形態では、単離された外因性ミトコンドリアを線維芽細胞から得る。一部の実施形態では、単離された外因性ミトコンドリアを血小板細胞から得る。一部の実施形態では、単離された外因性ミトコンドリアをリンパ球系細胞から得る。
【0072】
本明細書で提供されている通り、単離された外因性ミトコンドリアは、レシピエント細胞に対して自己であっても同種であってもよい。一部の実施形態では、単離された外因性ミトコンドリアは、レシピエント細胞に対して同種である。例えば、単離された外因性ミトコンドリアをレシピエント細胞とは異なる対象から得ることができる。他の実施形態では、単離された外因性ミトコンドリアは自己である。例として、例示的な自己単離された外因性ミトコンドリアとしては、同じ対象から、より早い時点で、例えば、胎盤または臍帯血から単離されたミトコンドリアを挙げることができる。別の例示的な自己外因性ｍｔＤＮＡとして、例えば、レシピエント細胞と同じ対象から単離され、改変された後にレシピエント細胞と置き換えられるドナーｍｔＤＮＡを挙げることができる。
【0073】
ある特定の実施形態では、ミトコンドリアを、ｌｅｕｋｏｐａｋ（すなわち、白血球アフェレーシスにより富化された製品）を使用して採取した正常末梢血から得る。一部の実施形態では、ミトコンドリアをＣＤ３４＋細胞から得る。
【0074】
ミトコンドリアの単離は、これだけに限定されないが、本明細書に記載のものを含めたいくつかの周知の技法のいずれかによって実現することができる。ある特定の実施形態では、ミトコンドリアの移入における使用のための外因性ミトコンドリアを、例えば、Ｑｐｒｏｔｅｕｍミトコンドリア単離キット（Ｑｉａｇｅｎ、ＵＳＡ）、またはＭＩＴＯＩＳＯ２ミトコンドリア単離キット（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）などの市販のキットを使用して単離する。他の実施形態では、ミトコンドリアの移入における使用のための外因性ミトコンドリアを手動で単離する（例えば、Preble et al. J. Vis. Exp. 2014, 91: e51682；Gasnier et al. Anal Biochem 1993; 212 (1): 173-8およびFrezza et al. Nat Protoc 2007; 2 (2): 287-95を参照されたい）。例えば、例示的なミトコンドリアの手動での単離として、ドナー細胞をペレット化し、培養下で成長させた細胞およそ１０９個に由来する１～２ｍＬの細胞ペレットを洗浄し、低張性緩衝剤中で細胞を膨潤させ、ＤｏｕｎｃｅまたはＰｏｔｔｅｒ－Ｅｌｖｅｈｊｅｍホモジナイザーを用い、ぴったり合う乳棒を使用して細胞を破砕し、分画遠心法によってミトコンドリアを単離することによってドナー細胞からミトコンドリアを単離することが挙げられる。手動での単離として、例えば、スクロース密度勾配超遠心分離、または自由流動電気泳動も挙げることもできる。いかなる特定の方法にも縛られることを望まずに、本明細書に記載のキットおよび手動での方法は例示であること、および任意のミトコンドリアの単離方法を使用することができ、それが当業者の技能の範囲内に入ることが理解される。
【0075】
一部の実施形態では、単離されたドナーミトコンドリアは、他の細胞小器官を含まず実質的に純粋なものである。他の実施形態では、単離されたミトコンドリアは不純物を含有する場合があり、ミトコンドリアが豊富である。例えば、一部の実施形態では、単離されたミトコンドリアは、約９０％純粋、約８０％純粋、約７０％純粋、約６０％純粋、約５０％純粋、またはそれらの間の任意の整数である。一般に、単離されたドナーミトコンドリアに含有されるいずれの不純物も、ミトコンドリアの移入時にレシピエント細胞の生存能にも機能にも影響を及ぼさないことが理解される。具体的な実施形態では、外因性ミトコンドリア、外因性ｍｔＤＮＡ、またはこれらの組合せの移入には、ミトコンドリアではない細胞小器官の移入は伴わない。
【0076】
単離されたミトコンドリアの数量および品質は、これだけに限定されないが、本明細書および引用された参考文献に記載のものを含めたいくつかの周知の技法によって容易に決定することができる。例えば、一部の実施形態では、単離されたミトコンドリアの数量を、総タンパク質含量の測定によって決定する。総タンパク質含量を評価するためには、ＢｉｕｒｅｔおよびＬｏｗｒｙの手順（例えば、Hartwig et al., Proteomics, 2009 Jun; 9 (11): 3209-14を参照されたい）、ならびにＢｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイ（Bradford. Anal Biochem. 1976; 72: 248-54））などの様々な方法が利用可能である。他の実施形態では、単離されたミトコンドリアの数量をｍｔＤＮＡコピー数によって決定する。
【0077】
外因性ミトコンドリアをリンパ球系細胞に非侵襲的に移入するために十分な期間は、外因性ミトコンドリアにさらされていないリンパ球系細胞よりも多くの量の外因性ｍｔＤＮＡが検出可能になる任意の期間であってよい。一部の実施形態では、外因性ミトコンドリアをリンパ球系細胞に非侵襲的に移入するために十分な期間は、外因性ｍｔＤＮＡと共にインキュベートされていないリンパ球系細胞に移入される外因性ｍｔＤＮＡの量と比べて、少なくとも２０％の外因性ｍｔＤＮＡがリンパ球系細胞に移入される任意の期間である。ある特定の実施形態では、外因性ミトコンドリアをリンパ球系細胞に非侵襲的に移入するために十分な期間は、外因性ｍｔＤＮＡと共にインキュベートされていないリンパ球系細胞に移入される外因性ｍｔＤＮＡの量と比べて、少なくとも３０％の外因性ｍｔＤＮＡがリンパ球系細胞に移入される任意の期間である。一部の実施形態では、外因性ミトコンドリアをリンパ球系細胞に非侵襲的に移入するために十分な期間は、外因性ｍｔＤＮＡと共にインキュベートされていないリンパ球系細胞に移入される外因性ｍｔＤＮＡの量と比べて、少なくとも３０％の外因性ｍｔＤＮＡがリンパ球系細胞に移入される任意の期間である。ある特定の実施形態では、外因性ミトコンドリアをリンパ球系細胞に非侵襲的に移入するために十分な期間は、外因性ｍｔＤＮＡと共にインキュベートされていないリンパ球系細胞に移入される外因性ｍｔＤＮＡの量と比べて、少なくとも４０％の外因性ｍｔＤＮＡがリンパ球系細胞に移入される任意の期間である。一部の実施形態では、外因性ミトコンドリアをリンパ球系細胞に非侵襲的に移入するために十分な期間は、外因性ｍｔＤＮＡと共にインキュベートされていないリンパ球系細胞に移入される外因性ｍｔＤＮＡの量と比べて、少なくとも５０％の外因性ｍｔＤＮＡがリンパ球系細胞に移入される任意の期間である。一部の実施形態では、外因性ミトコンドリアをリンパ球系細胞に非侵襲的に移入するために十分な期間は、外因性ｍｔＤＮＡと共にインキュベートされていないリンパ球系細胞に移入される外因性ｍｔＤＮＡの量と比べて、少なくとも６０％の外因性ｍｔＤＮＡがリンパ球系細胞に移入される任意の期間である。一部の実施形態では、外因性ミトコンドリアをリンパ球系細胞に非侵襲的に移入するために十分な期間は、外因性ｍｔＤＮＡと共にインキュベートされていないリンパ球系細胞に移入される外因性ｍｔＤＮＡの量と比べて、少なくとも７０％の外因性ｍｔＤＮＡがリンパ球系細胞に移入される任意の期間である。当業者に公知のまたは本明細書に記載の技法（例えば、実施例におけるもの）を使用して、外因性ｍｔＤＮＡのリンパ球系細胞への移入を評価することができる。一般に、十分な期間は、少なくともおよそ１２時間および２週間未満である。一部の実施形態では、十分な期間は、少なくとも１２時間である。一部の実施形態では、十分な期間は、少なくとも２４時間である。一部の実施形態では、十分な期間は、少なくとも３６時間である。一部の実施形態では、十分な期間は、少なくとも４８時間である。一部の実施形態では、十分な期間は、およそ２日間またはそれよりも長期である。一部の実施形態では、十分な期間は、およそ７日間またはそれよりも長期である。一部の実施形態では、十分な期間は、およそ２日間～およそ７日間である。
【0078】
一部の実施形態では、本明細書に提供される方法に従って生成されたミトコンドリア置換リンパ球系細胞における外因性ｍｔＤＮＡのコピー数の内因性ｍｔＤＮＡのコピー数に対する比は４超：１である。一部の実施形態では、比は約４：１である。一部の実施形態では、比は約３：１である。一部の実施形態では、比は約２：１である。一部の実施形態では、比は約１：１である。一部の実施形態では、比は約０．７５：１である。一部の実施形態では、比は約０．５：１である。一部の実施形態では、比は約０．２５：１である。一部の実施形態では、比は約０．１：１である。
【0079】
一般に、本明細書に提供される方法は、リンパ球系細胞と単離された外因性ミトコンドリアの単純な共インキュベーションに適合する。しかし、リンパ球系細胞と単離された外因性ミトコンドリアを必要に応じて遠心分離することによってミトコンドリアの移入を促進することも可能である。一部の実施形態では、リンパ球系細胞と単離された外因性ミトコンドリアを遠心分離する前に、リンパ球系細胞は、ｍＴＯＲ阻害薬（例えば、６．２節に記載のｍＴＯＲ阻害薬、例えば、ラパマイシンが挙げられる）で処置されている。一部の実施形態では、ｍＴＯＲ阻害薬、リンパ球系細胞および単離された外因性ミトコンドリアを一緒に遠心分離した後、本明細書に記載の通り一緒にインキュベートする。他の実施形態では、リンパ球系細胞と単離された外因性ミトコンドリアを遠心分離した後にｍＴＯＲ阻害薬を添加する。
【0080】
別の態様では、ミトコンドリア置換リンパ球系細胞を生成するための方法であって、（ａ）リンパ球系細胞および単離された外因性ミトコンドリアを、細胞ペレットが生成されるのに十分な条件下で遠心分離するステップであって、リンパ球系細胞が、内因性ミトコンドリアを減少または枯渇させる手順に供されていない、ステップと、（ｂ）リンパ球系細胞（例えば、Ｔ細胞または本明細書に記載の他のリンパ球系細胞）を１００ｎＭ～１０００ｎＭのラパマイシンと共におよそ２４時間またはそれよりも長くインキュベートするステップであって、それにより、ミトコンドリア置換リンパ球系細胞を生成する、ステップとを含む、方法が本明細書に提供される。
【0081】
リンパ球系細胞の、遠心分離した後のラパマイシンとのインキュベーションは、ミトコンドリア置換リンパ球系細胞が生成するのに十分な任意の時間にわたるものであってよい。一実施形態では、インキュベートするステップは、およそ７日間であるか、またはそれよりも長い。一実施形態では、インキュベートするステップは、およそ２日間～およそ７日間である。一実施形態では、インキュベーション期間中に培地を５０％新鮮な培地に変える。
【0082】
遠心分離条件は、当業者が容易に決定することができ、細胞およびミトコンドリアが傷つかず、ミトコンドリアの移入が促進される限りはスピードおよび時間を変動させることができる。例として、遠心分離する条件には、室温、およそ１，５００相対遠心力（ＲＣＦ、「ｇ」ともいう）でおよそ５分間遠心分離することが含まれ得る。具体的な実施形態では、遠心分離することは下記の実施例に記載の通りである。
【0083】
一実施形態では、遠心分離することは、室温、およそ５００ＲＣＦでおよそ５分間である。別の実施形態では、遠心分離することは、室温、およそ７５０ＲＣＦでおよそ５分間である。別の実施形態では、遠心分離することは、室温、およそ１，０００ＲＣＦでおよそ５分間である。別の実施形態では、遠心分離することは、室温、およそ１，５００ＲＣＦでおよそ５分間である。別の実施形態では、遠心分離することは、室温、およそ２，０００ＲＣＦでおよそ５分間である。別の実施形態では、遠心分離することは、室温、およそ２，５００ＲＣＦでおよそ５分間である。別の実施形態では、遠心分離することは、室温、およそ３，０００ＲＣＦでおよそ５分間である。
【0084】
一実施形態では、遠心分離することは、室温、およそ５００ＲＣＦでおよそ１０分間である。別の実施形態では、遠心分離することは、室温、およそ７５０ＲＣＦでおよそ１０分間である。別の実施形態では、遠心分離することは、室温、およそ１，０００ＲＣＦでおよそ１０分間である。別の実施形態では、遠心分離することは、室温、およそ１，５００ＲＣＦでおよそ１０分間である。別の実施形態では、遠心分離することは、室温、およそ２，０００ＲＣＦでおよそ１０分間である。別の実施形態では、遠心分離することは、室温、およそ２，５００ＲＣＦでおよそ１０分間である。別の実施形態では、遠心分離することは、室温、およそ３，０００ＲＣＦでおよそ１０分間である。
【0085】
別の実施形態では、遠心分離することは、室温、およそ５００ＲＣＦでおよそ１５分間である。別の実施形態では、遠心分離することは、室温、およそ７５０ＲＣＦでおよそ１５分間である。別の実施形態では、遠心分離することは、室温、およそ１，０００ＲＣＦでおよそ１５分間である。別の実施形態では、遠心分離することは、室温、およそ１，５００ＲＣＦでおよそ１５分間である。別の実施形態では、遠心分離することは、室温、およそ２，０００ＲＣＦでおよそ１５分間である。別の実施形態では、遠心分離することは、室温、およそ２，５００ＲＣＦでおよそ１５分間である。別の実施形態では、遠心分離することは、室温、およそ３，０００ＲＣＦでおよそ１５分間である。
【0086】
別の実施形態では、遠心分離することは、室温、およそ５００ＲＣＦで１時間未満である。別の実施形態では、遠心分離することは、室温、およそ７５０ＲＣＦで１時間未満である。別の実施形態では、遠心分離することは、室温、およそ１，０００ＲＣＦで１時間未満である。別の実施形態では、遠心分離することは、室温、およそ１，５００ＲＣＦで１時間未満である。別の実施形態では、遠心分離することは、室温、およそ２，０００ＲＣＦで１時間未満である。別の実施形態では、遠心分離することは、室温、およそ２，５００ＲＣＦで１時間未満である。別の実施形態では、遠心分離することは、室温、およそ３，０００ＲＣＦで１時間未満である。
【0087】
一実施形態では、遠心分離することは、約４℃、およそ５００ＲＣＦでおよそ５分間である。別の実施形態では、遠心分離することは、約４℃、およそ７５０ＲＣＦでおよそ５分間である。別の実施形態では、遠心分離することは、約４℃、およそ１，０００ＲＣＦでおよそ５分間である。別の実施形態では、遠心分離することは、約４℃、およそ１，５００ＲＣＦでおよそ５分間である。別の実施形態では、遠心分離することは、約４℃、およそ２，０００ＲＣＦでおよそ５分間である。別の実施形態では、遠心分離することは、約４℃、およそ２，５００ＲＣＦでおよそ５分間である。別の実施形態では、遠心分離することは、約４℃、およそ３，０００ＲＣＦでおよそ５分間である。
【0088】
別の実施形態では、遠心分離することは、約４℃、およそ５００ＲＣＦでおよそ１０分間である。別の実施形態では、遠心分離することは、約４℃、およそ７５０ＲＣＦでおよそ１０分間である。別の実施形態では、遠心分離することは、約４℃、およそ１，０００ＲＣＦでおよそ１０分間である。別の実施形態では、遠心分離することは、約４℃、およそ１，５００ＲＣＦでおよそ１０分間である。別の実施形態では、遠心分離することは、約４℃、およそ２，０００ＲＣＦでおよそ１０分間である。別の実施形態では、遠心分離することは、約４℃、およそ２，５００ＲＣＦでおよそ１０分間である。別の実施形態では、遠心分離することは、約４℃、およそ３，０００ＲＣＦでおよそ１０分間である。
【0089】
別の実施形態では、遠心分離することは、約４℃、およそ５００ＲＣＦでおよそ１５分間である。別の実施形態では、遠心分離することは、約４℃、およそ７５０ＲＣＦでおよそ１５分間である。別の実施形態では、遠心分離することは、約４℃、およそ１，０００ＲＣＦでおよそ１５分間である。別の実施形態では、遠心分離することは、約４℃、およそ１，５００ＲＣＦでおよそ１５分間である。別の実施形態では、遠心分離することは、約４℃、およそ２，０００ＲＣＦでおよそ１５分間である。別の実施形態では、遠心分離することは、約４℃、およそ２，５００ＲＣＦでおよそ１５分間である。別の実施形態では、遠心分離することは、約４℃、およそ３，０００ＲＣＦでおよそ１５分間である。
【0090】
別の実施形態では、遠心分離することは、約４℃、およそ５００ＲＣＦで１時間未満である。別の実施形態では、遠心分離することは、約４℃、およそ７５０ＲＣＦで１時間未満である。別の実施形態では、遠心分離することは、約４℃、およそ１，０００ＲＣＦで１時間未満である。別の実施形態では、遠心分離することは、約４℃、およそ１，５００ＲＣＦで１時間未満である。別の実施形態では、遠心分離することは、約４℃、およそ２，０００ＲＣＦで１時間未満である。別の実施形態では、遠心分離することは、約４℃、およそ２，５００ＲＣＦで１時間未満である。別の実施形態では、遠心分離することは、約４℃、およそ３，０００ＲＣＦで１時間未満である。一部の実施形態では、本明細書に提供される方法は遠心分離を伴わない。
【0091】
ある特定の実施形態では、リンパ球系細胞をある特定の期間にわたって欠乏状態にした後、リンパ球系細胞をｍＴＯＲ阻害薬（例えば、６．２節に記載のｍＴＯＲ阻害薬、例えば、ラパマイシンが挙げられる）および単離された外因性ミトコンドリアと共にインキュベートする。例えば、一部の実施形態では、リンパ球系細胞を３～６時間、３～９時間、６～９時間、６～１２時間、６～１８時間、１２～２４時間または２４～４８時間にわたって欠乏状態にした後、リンパ球系細胞をｍＴＯＲ阻害薬（例えば、６．２節に記載のｍＴＯＲ阻害薬、例えば、ラパマイシンが挙げられる）および単離された外因性ミトコンドリアと共にインキュベートする。ある特定の実施形態では、リンパ球系細胞からグルコース、必須アミノ酸（例えば、グルタミン）、および／または血清を喪失させることによってリンパ球系細胞を欠乏状態にする。例えば、一部の実施形態では、リンパ球系細胞を１つまたは複数の栄養分を欠く細胞培養培地（例えば、グルコースを含まない、血清を含まない、および／またはグルタミンを含まない）で培養する。
【0092】
ある特定の実施形態では、リンパ球系細胞をある特定の期間にわたって欠乏状態にした後、リンパ球系細胞を単離された外因性ミトコンドリアと共に遠心分離する。例えば、一部の実施形態では、リンパ球系細胞を３～６時間、３～９時間、６～９時間、６～１２時間、６～１８時間、１２～２４時間、または２４～４８時間にわたって欠乏状態にした後、リンパ球系細胞を単離された外因性ミトコンドリアと共に遠心分離する。ある特定の実施形態では、リンパ球系細胞からグルコース、必須アミノ酸（例えば、グルタミン）、および／または血清を喪失させることによってリンパ球系細胞を欠乏状態にする。遠心分離後、リンパ球系細胞（例えば、Ｔ細胞または本明細書に記載の他のリンパ球系細胞）を有効量のｍＴＯＲ阻害薬（例えば、６．２節に記載のｍＴＯＲ阻害薬、例えば、ラパマイシンが挙げられる）と共に、上記の通り外因性ミトコンドリアをリンパ球系細胞に非侵襲的に移入するために十分な期間にわたってインキュベートすることができる。一部の実施形態では、リンパ球系細胞を１つまたは複数の栄養分を欠く細胞培養培地（例えば、グルコースを含まない、血清を含まない、および／またはグルタミンを含まない）で培養した後、リンパ球系細胞を単離された外因性ミトコンドリアと共に遠心分離する。
【0093】
ある特定の実施形態では、リンパ球系細胞をｍＴＯＲ阻害薬（例えば、６．２節に記載のｍＴＯＲ阻害薬、例えば、ラパマイシンが挙げられる）および単離された外因性ミトコンドリアと共にインキュベートするステップは、欠乏条件下で実施される。ある特定の実施形態では、リンパ球系細胞からグルコース、必須アミノ酸（例えば、グルタミン）、および／または血清を喪失させることによってリンパ球系細胞を欠乏状態にする。例えば、一部の実施形態では、リンパ球系細胞を、（１）１つまたは複数の栄養分を欠き（例えば、グルコースを含まない、血清を含まない、および／またはグルタミンを含まない）、かつ（２）有効量のｍＴＯＲ阻害薬（例えば、６．２節に記載のｍＴＯＲ阻害薬、例えば、ラパマイシンが挙げられる）を含有する細胞培養物中でインキュベートする。一部の実施形態では、リンパ球系細胞をｍＴＯＲ阻害薬（例えば、６．２節に記載のｍＴＯＲ阻害薬、例えば、ラパマイシンが挙げられる）および単離された外因性ミトコンドリアと共にインキュベートするステップは、欠乏を伴わない条件下で実施される。
【0094】
具体的な実施形態では、実施例８．１に記載の方法を使用してミトコンドリア置換リンパ球系細胞を生成するための方法が本明細書に提供される。
【0095】
具体的な実施形態では、ミトコンドリア置換リンパ球系細胞は、ミトコンドリア置換リンパ球系細胞の生成元のリンパ球系細胞と比べて１つ、２つまたはそれよりも多くの機能の改善を示す。ミトコンドリア置換リンパ球系細胞において改善することができるリンパ球系細胞の機能に関しては、例えば、６．４節を参照されたい。
６．２ ラパマイシン類似体および他のｍＴＯＲ阻害薬
６．２ ラパマイシン類似体および他のｍＴＯＲ阻害薬
【0096】
シロリムス（ＣＡＳ番号５３１２３－８８－９；Ｃ５１Ｈ７９ＮＯ１３）としても公知のラパマイシン、およびラパマイシン誘導体（例えば、「ラパログ」としても公知のラパマイシン類似体）を含めた種々の化合物がｍＴＯＲを阻害することが分かっている。ラパマイシン誘導体の非限定的な例としては、例えば、テムシロリムス（ＣＡＳ番号１６２６３５－０４－３；Ｃ５６Ｈ８７ＮＯ１６）、エベロリムス（ＣＡＳ番号１５９３５１－６９－６；Ｃ５３Ｈ８３ＮＯ１４）、リダフォロリムス（ＣＡＳ番号５７２９２４－５４－０；Ｃ５３Ｈ８４ＮＯ１４Ｐ）、ＷＹＥ－１２５１３２（ＷＹＥ－１３２）、およびゾタロリムス（ＡＢＴ－５７８）が挙げられる。具体的な実施形態では、ｍＴＯＲ阻害薬はラパマイシンである。
【0097】
一部の実施形態では、本明細書に記載の方法のいずれかにおける使用に適したｍＴＯＲ阻害薬は、例えば、ＡＺＤ８０５５、トリン（Ｔｏｒｉｎ）１、トルキニブ（Ｔｏｒｋｉｎｉｂ）またはオミパリシブ（Ｏｍｉｐａｌｉｓｉｂ）などの、ｍＴＯＲＣ１およびｍＴＯＲＣ２のどちらも阻害するものである。
【0098】
ある特定の実施形態では、本明細書に開示されるｍＴＯＲ阻害薬は、デュアルキナーゼ阻害薬などの、ｍＴＯＲ以外の１種または複数の基質も阻害する。ｍＴＯＲおよび１種または複数の基質に対する特異性を有する阻害薬は当技術分野で公知である。例として、デュアルＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害薬は、ｍＴＯＲおよび別の基質を阻害する、本開示との使用に適したｍＴＯＲ阻害薬の１つの型である。デュアルＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害薬の非限定的な例としては、例えば、ダクトリシブ（Ｄａｃｔｏｌｉｓｉｂ）（ＢＥＺ２３５としても公知）、ＰＩ－１０３、ビミラリシブ（Ｂｉｍｉｒａｌｉｓｉｂ）（ＰＱＲ３０９としても公知）、ＧＤＣ－００８４、およびゲダトリシブ（Ｇｅｄａｔｏｌｉｓｉｂ）が挙げられる。
６．３ 処置方法
６．３ 処置方法
【0099】
本明細書に提供されている通り、本開示の方法に従って生成されたミトコンドリア置換リンパ球系細胞は、例えば６．３．１節および６．３．２節に記載の方法における、細胞に基づく治療として使用するために適している。例えば、一部の実施形態では、有効量の、６．１節に記載の方法に従って生成されたミトコンドリア置換リンパ球系細胞を薬学的に許容される担体と組み合わせて、医薬組成物をもたらすことができる。一部の実施形態では、本明細書に記載の方法に従って、例えば６．１節に記載の方法において生成されたミトコンドリア置換リンパ球系細胞と、薬学的に許容される担体とを含む組成物（例えば、医薬組成物）が本明細書に提供される。一部の実施形態では、有効量の、本明細書に記載の方法に従って、例えば６．１節に記載の方法において生成されたミトコンドリア置換リンパ球系細胞と、薬学的に許容される担体とを含む組成物（例えば、医薬組成物）が本明細書に提供される。
【0100】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される」という用語は、担体に関して使用される場合、担体、希釈剤または賦形剤が毒性でも他の点で望ましくないものでもなく（すなわち、材料を、いかなる望ましくない生物学的効果も引き起こすことなく対象に投与することができる）、製剤の他の成分と適合性であることを意味するものとする。「担体」という用語は、治療薬と共に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指す。そのような医薬担体は、生理食塩水溶液などの滅菌された液体であり得る。生理食塩溶液は、医薬組成物が静脈内投与される場合の担体であり得る。生理食塩溶液および水性デキストロースおよびグリセロール溶液も液体担体、特に注射液として用いることができる。組成物はまた、所望であれば、微量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含有してもよい。
【0101】
ある特定の実施形態では、ミトコンドリア置換リンパ球系細胞の有効量は、細胞約１×１０６～約１×１０７個である。一部の実施形態では、ミトコンドリア置換リンパ球系細胞の有効量は、細胞約１０×１０６～約９００×１０６個である。一部の実施形態では、ミトコンドリア置換リンパ球系細胞の有効量は、細胞約５０×１０６～約８００×１０６個である。一部の実施形態では、ミトコンドリア置換リンパ球系細胞の有効量は、細胞約１００×１０６～約７００×１０６個である。一部の実施形態では、ミトコンドリア置換リンパ球系細胞の有効量は、細胞約２００×１０６～約９００×１０６個である。一部の実施形態では、ミトコンドリア置換リンパ球系細胞の有効量は、細胞約２５０×１０６～約７５０×１０６個である。一部の実施形態では、ミトコンドリア置換リンパ球系細胞の有効量は、細胞約５０×１０６個である。一部の実施形態では、ミトコンドリア置換リンパ球系細胞の有効量は、細胞約１５０×１０６個である。一部の実施形態では、ミトコンドリア置換リンパ球系細胞の有効量は、細胞約３００×１０６個である。一部の実施形態では、ミトコンドリア置換リンパ球系細胞の有効量は、細胞約４５０×１０６個である。一部の実施形態では、ミトコンドリア置換リンパ球系細胞の有効量は、細胞約６００×１０６個である。一部の実施形態では、ミトコンドリア置換リンパ球系細胞の有効量は、細胞約８５０×１０６個である。
【0102】
特定の実施形態では、ミトコンドリア置換リンパ球系細胞の有効量は、例えば、対象の体重、または疾患もしくは障害の負荷量に基づいてなど、経験的に決定される。一部の実施形態では、ミトコンドリア置換リンパ球系細胞の有効量は、細胞約１．０×１０６個／ｋｇ～細胞約１．０×１０７個／ｋｇである。一部の実施形態では、ミトコンドリア置換リンパ球系細胞の有効量は、細胞約１．０×１０６個／ｋｇ～細胞約５００×１０６個／ｋｇである。一部の実施形態では、ミトコンドリア置換リンパ球系細胞の有効量は、細胞約１．０×１０６個／ｋｇ～細胞約５０×１０６個／ｋｇである。一部の実施形態では、ミトコンドリア置換リンパ球系細胞の有効量は、細胞約１．０×１０６個／ｋｇ～細胞約１０×１０６個／ｋｇである。一部の実施形態では、ミトコンドリア置換リンパ球系細胞の有効量は、細胞約１．０×１０６個／ｋｇ～細胞約５．０×１０６個／ｋｇである。一部の実施形態では、ミトコンドリア置換リンパ球系細胞の有効量は、細胞約１０×１０６個／ｋｇ～細胞約６００×１０６個／ｋｇである。一部の実施形態では、ミトコンドリア置換リンパ球系細胞の有効量は、細胞約５０×１０６個／ｋｇ～細胞約７５０×１０６個／ｋｇである。一部の実施形態では、ミトコンドリア置換リンパ球系細胞の有効量は、細胞約１．０×１０６個／ｋｇである。一部の実施形態では、ミトコンドリア置換リンパ球系細胞の有効量は、細胞約２．５×１０６個／ｋｇである。一部の実施形態では、ミトコンドリア置換リンパ球系細胞の有効量は、細胞約５．０×１０６個／ｋｇである。一部の実施形態では、ミトコンドリア置換リンパ球系細胞の有効量は、細胞約１０．０×１０６個／ｋｇである。一部の実施形態では、ミトコンドリア置換リンパ球系細胞の有効量は、細胞約５０．０×１０６個／ｋｇである。一部の実施形態では、ミトコンドリア置換リンパ球系細胞の有効量は、細胞約２５０．０×１０６個／ｋｇである。一部の実施形態では、ミトコンドリア置換リンパ球系細胞の有効量は、細胞約５００×１０６個／ｋｇである。
【0103】
ある特定の実施形態では、ミトコンドリア置換リンパ球系細胞を用いた処置により、以下のうちの１つ、２つ、もしくはそれよりも多く、または全てがもたらされる：（１）１つまたは複数の症状の重症度、進行、広がり、および／または発生頻度の低減、（２）１つまたは複数の症状および／または根本原因の消失、（３）１つまたは複数の症状および／またはそれらの根本原因の発生の防止、ならびに（４）損傷の改善または矯正。具体的な実施形態では、処置には、状態、疾患または障害に対する治療的処置ならびに予防的または抑制的措置が含まれる。
【0104】
一部の実施形態では、例えば６．３．１節および６．３．２節に記載の方法における、細胞に基づく治療として使用するためのミトコンドリア置換リンパ球系細胞は、ミトコンドリア置換リンパ球系細胞の投与を受ける対象に対して自己または同種である。一部の実施形態では、例えば６．３．１節および６．３．２節に記載の方法における、細胞に基づく治療として使用するためのミトコンドリア置換リンパ球系細胞は、ミトコンドリア置換リンパ球系細胞の投与を受ける対象に対して自己である。一部の実施形態では、例えば６．３．１節および６．３．２節に記載の方法における、細胞に基づく治療として使用するためのミトコンドリア置換リンパ球系細胞は、ミトコンドリア置換リンパ球系細胞の投与を受ける対象に対して同種である。
６．３．１ ミトコンドリア病または障害を処置する方法
６．３．１ ミトコンドリア病または障害を処置する方法
【0105】
一態様では、それを必要とする対象に対する、ミトコンドリア複合体ＩＩＩ欠損症の症状を好転させるための方法であって、対象に、有効量の、６．１節に記載の方法に従って生成されたミトコンドリア置換リンパ球系細胞、および薬学的に許容される担体を投与するステップを含む、方法が本明細書に提供される。
【0106】
ミトコンドリア複合体ＩＩＩは、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の抑制機能のために必須である。例えば、Ｔｒｅｇ細胞は免疫調節性遺伝子発現および抑制機能を維持するためにミトコンドリア複合体ＩＩＩを必要とすることが示されている（Weinberg, S. et al. Nature vol. 565,7740 (2019) : 495-499を参照されたい）。ミトコンドリア複合体ＩＩＩ欠損症は、遺伝子疾患である。ミトコンドリア複合体ＩＩＩ欠損症は、一般に、ＢＣＳ１Ｌ、ＵＱＣＲＢおよびＵＱＣＲＱ遺伝子の核ＤＮＡの変異によって引き起こされ、常染色体劣性様式で遺伝する。しかし、ＭＴＣＹＢ遺伝子のミトコンドリアＤＮＡの変異によって引きこされる場合もあり、その場合、母親から伝わるまたは散発的に生じ、軽症の状態がもたらされ得る。
【0107】
したがって、一部の実施形態では、ミトコンドリア置換リンパ球系細胞はＴｒｅｇ細胞であり、ミトコンドリア置換リンパ球系細胞は、ミトコンドリア複合体ＩＩＩ欠損症を有する対象に投与される。具体的な実施形態では、対象はヒト対象である。
【0108】
ある特定の実施形態では、ミトコンドリア複合体ＩＩＩ欠損症の症状を好転させるための方法は、症状の重症度、進行、広がり、および／または発生頻度の低減、症状および／または根本原因の消失、症状および／またはそれらの根本原因の発生の防止、ならびに損傷の改善または矯正を含む。一実施形態では、ミトコンドリア複合体ＩＩＩ欠損症の症状を好転させるための方法は、症状の重症度の低下を含む。一実施形態では、ミトコンドリア複合体ＩＩＩ欠損症の症状を好転させるための方法は、症状の進行の低減を含む。別の実施形態では、ミトコンドリア複合体ＩＩＩ欠損症の症状を好転させるための方法は、症状の広がりの低減を含む。別の実施形態では、ミトコンドリア複合体ＩＩＩ欠損症の症状を好転させるための方法により、症状の発生頻度が低減する。別の実施形態では、ミトコンドリア複合体ＩＩＩ欠損症の症状を好転させるための方法は、症状の排除を含む。別の実施形態では、ミトコンドリア複合体ＩＩＩ欠損症の症状を好転させるための方法は、ミトコンドリア複合体ＩＩＩ欠損症の症状の発生の防止を含む。別の実施形態では、ミトコンドリア複合体ＩＩＩ欠損症の症状を好転させるための方法は、ミトコンドリア複合体ＩＩＩ欠損症による損傷の改善を含む。別の実施形態では、ミトコンドリア複合体ＩＩＩ欠損症の症状を好転させるための方法は、ミトコンドリア複合体ＩＩＩ欠損症による損傷の矯正を含む。
６．３．２ ヘテロプラスミック免疫細胞に関連する免疫不全を処置する方法。
６．３．２ ヘテロプラスミック免疫細胞に関連する免疫不全を処置する方法。
【0109】
それを必要とする対象に対するヘテロプラスミック免疫細胞に関連する免疫不全を処置するための方法であって、対象に、有効量の、６．１節に記載の方法に従って生成されたミトコンドリア置換リンパ球系細胞、および薬学的に許容される担体を投与するステップを含む、方法も本明細書に提供される。
【0110】
ある特定の実施形態では、ヘテロプラスミック免疫細胞は、望ましくない薬理学的副作用の結果である。例えば、ヌクレオシド系逆転写酵素阻害薬（ＮＲＴＩ）は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）－１の複製を阻害するものであり、ＨＩＶの処置に有用である。しかし、ＮＲＴＩでは、ヒト組織において、ＮＲＴＩによるヒトミトコンドリアポリメラーゼγ（ポリγ）の阻害の結果であると思われる副作用も示される。一実施形態では、対象は、逆転写酵素阻害薬を受けている。一実施形態では、対象は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）を有する。具体的な実施形態では、対象はヒトである。
【0111】
同様に、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の処置に関してＦＤＡによって承認された薬物の多くは、逆転写酵素（ＲＴまたはＰ遺伝子産物）を標的とするものであり、ウイルス複製を抑制するヌクレオシドＲＴ阻害薬（ＮＲＴＩ）である。したがって、一部の実施形態では、対象は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）を有する。具体的な実施形態では、対象はヒトである。
【0112】
ヘテロプラスミーは、種々の型の変異からも生じ得る。したがって、本明細書に提供される方法は、ＮＲＴＩ阻害薬によって引き起こされるヘテロプラスミック免疫細胞を処置することに限定されない。
【0113】
一部の実施形態では、ヘテロプラスミック免疫細胞に関連する免疫不全を処置することは、症状の重症度、進行、広がり、および／または発生頻度の低減、症状および／または根本原因の消失、症状および／またはそれらの根本原因の発生の防止、ならびに損傷の改善または矯正を含む。一実施形態では、ヘテロプラスミック免疫細胞に関連する免疫不全を処置することは、免疫不全の重症度の低下を含む。別の実施形態では、ヘテロプラスミック免疫細胞に関連する免疫不全を処置することは、免疫不全の進行の低減を含む。別の実施形態では、ヘテロプラスミック免疫細胞に関連する免疫不全を処置することは、免疫不全の広がりの低減を含む。別の実施形態では、ヘテロプラスミック免疫細胞に関連する免疫不全を処置することは、免疫不全の症状の発生頻度の低減を含む。別の実施形態では、ヘテロプラスミック免疫細胞に関連する免疫不全を処置することは、免疫不全の消失を含む。別の実施形態では、ヘテロプラスミック免疫細胞に関連する免疫不全を処置することは、免疫不全の症状の発生の防止を含む。別の実施形態では、ヘテロプラスミック免疫細胞に関連する免疫不全を処置することは、免疫不全による損傷の改善を含む。別の実施形態では、ヘテロプラスミック免疫細胞に関連する免疫不全を処置することは、免疫不全による損傷の矯正を含む。
６．４ リンパ系機能についての生物学的アッセイ
６．４ リンパ系機能についての生物学的アッセイ
【0114】
ミトコンドリア置換リンパ球系細胞の上首尾の生成により、ミトコンドリア置換（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）を伴わないリンパ球系細胞と比べて機能の改善を有するリンパ球系細胞がもたらされる。種々の機能アッセイを使用して、ミトコンドリア置換リンパ球系細胞の表現型を測定および評価することができる。
【0115】
一部の実施形態では、ミトコンドリア置換リンパ球系細胞は、ミトコンドリア置換を伴わないリンパ球系細胞と比べてミトコンドリア機能の改善を有する。ミトコンドリア機能を評価する方法は当業者には理解されよう。例えば、Ｓｅａｈｏｒｓｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＸＦ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｆｌｕｘ Ａｎａｌｙｚｅｒなどの細胞に基づくアッセイを使用して基礎酸素消費量、解糖速度、ＡＴＰ産生、および呼吸容量の決定を実施して、ミトコンドリア機能不全を評価することができる。同様に、Ｏｒｏｂｏｒｏｓ ０２Ｋ呼吸計を使用して、定量的な機能的ミトコンドリア診断を確立することもできる。上記のアッセイ例は例示的なものであり、ミトコンドリア機能を評価するための全ての方法を包括するものではないことが理解される。
【0116】
細胞増殖の増大もリンパ球系細胞機能の改善の指標であることができる。リンパ球系細胞の細胞増殖を測定するための例示的なアッセイは、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイである。ＭＬＲアッセイは、一般に、ミトコンドリア置換リンパ球系細胞、例えばＣＤ４＋Ｔ細胞の集団をリンパ球の異なる集団と組み合わせ、増殖を測定することを伴う。一部の実施形態では、本明細書に提供される方法に従って生成されるミトコンドリア置換リンパ球系細胞は、単離された外因性ミトコンドリアおよびｍＴＯＲ阻害薬と共にインキュベートされていないリンパ球系細胞と比較して細胞増殖の増大を有する。
【0117】
例えば、細胞傷害性Ｔ細胞における、ミトコンドリア置換細胞の機能を評価するために使用することができる別の例示的なアッセイは、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）アッセイである。ＣＴＬアッセイは、特定の抗原に対するＴ細胞の存在および細胞傷害活性を示し、この免疫機能に対する試験項目の影響を調査することを可能にするものである。したがって、一部の実施形態では、本明細書に提供される方法に従って生成されるミトコンドリア置換リンパ球系細胞は、単離された外因性ミトコンドリアおよびｍＴＯＲ阻害薬と共にインキュベートされていないリンパ球系細胞と比較してＣＴＬ応答の増大を有する。
【0118】
ＤＮＡ安定性はＴ細胞の機能のために重要である。したがって、ミトコンドリア置換細胞の機能を評価するために使用することができる別の非限定的な例示的なアッセイは、ＤＮＡ損傷応答を測定することである。二本鎖切断（ＤＳＢ）はゲノム安定性に対して重大な損傷であり、したがって、細胞恒常性を維持するために迅速にかつ精密に修復される。ＤＳＢに対する初期応答は、Ｓｅｒ－１３９位における軽微なヒストンＨ２Ａバリアントのリン酸化であり、それによりγＨ２ＡＸが形成される。したがって、例として、ヒストン２Ａ Ｘ（Ｈ２ＡＸ）のリン酸化を検出することによってＤＮＡ損傷応答をアッセイすることができ、リン酸化は、例えばフローサイトメトリーによってまたは免疫ブロットによってなど、当技術分野で公知の任意のアッセイを使用して測定することができる。
【0119】
例えば、以下のアッセイを実施して、ＤＮＡ損傷応答を検出することができる：リンパ球系細胞（例えば、Ｔ細胞）をＰＢＳで２回洗浄し、７０％エタノールを用いて懸濁させ、－２０℃で６０分間にわたって冷却し、次いで、ＰＢＳで２回洗浄し、ＰＥ抗Ｈ２Ａ．Ｘホスホ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）およびＡＰＣマウス抗ＣＤ３抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を用い、加湿５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で６０分間にわたって染色する。次いで、細胞を洗浄し、ａｕｔｏＭＡＣＳＴＭ Ｒｕｎｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に再懸濁させ、直後にフローサイトメトリー分析を行う。データをＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ、ＵＳＡ）を使用して分析することができる。
【0120】
Ｃａ２＋シグナル伝達は、リンパ球系細胞（例えば、Ｔ細胞）活性化のために、多数のシグナル伝達経路を迅速に活性化し、統合して、遺伝子の発現および機能に広範にわたる変化を生じさせる手段として極めて重要である。Ｃａ２＋シグナル伝達を測定するための様々なアッセイが当技術分野で公知である（Samakai E, et al., Signaling Mechanisms Regulating T Cell Diversity and Function. Boca Raton (FL): CRC Press/Taylor & Francis; 2018. Chapter 10.を参照されたい）。したがって、一部の実施形態では、本明細書に提供される方法に従って生成されるミトコンドリア置換リンパ球系細胞は、単離された外因性ミトコンドリアおよびｍＴＯＲ阻害薬と共にインキュベートされていないリンパ球系細胞と比較してＣａ２＋シグナル伝達の増大を有する。
【0121】
テロメア長もミトコンドリア置換細胞の機能の指標として役立ち得る。テロメア長は、当技術分野で公知の任意の方法を使用して測定することができる。１つの例示的な技法は、ｑＰＣＲによって絶対的なテロメア長を測定することによるものである。したがって、一部の実施形態では、本明細書に提供される方法に従って生成されるミトコンドリア置換リンパ球系細胞は、単離された外因性ミトコンドリアおよびｍＴＯＲ阻害薬と共にインキュベートされていないリンパ球系細胞と比較してテロメア短縮の低減を有する。
【0122】
本明細書に提供されている通り、一部の実施形態では、ミトコンドリア置換細胞を生成するために使用されるリンパ球系細胞は老化したものであり、ミトコンドリア置換細胞は、老化の低減を示す。したがって、老化関連分泌表現型（（ＳＡＳＰ）の測定は、機能アッセイとして役立ち得る。ＳＡＳＰには、炎症性サイトカイン（例えば、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）および／または腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）、増殖因子、およびプロテアーゼの分泌の増加、ならびに細胞集団倍加の低減および／または速度の低下、テロメアの短縮、ＤＮＡ損傷応答（ＤＤＲ）の増大、またはこれらの組合せが含まれる。老化マーカー（例えば、ＣＤ５７／ＫＩＲ／ＫＬＲＧ１）についてのＦＡＣＳ分析を用いることもできる。したがって、一部の実施形態では、本明細書に提供される方法に従って生成されるミトコンドリア置換リンパ球系細胞は、単離された外因性ミトコンドリアおよびｍＴＯＲ阻害薬と共にインキュベートされていないリンパ球系細胞と比較して老化の低減を有する。
【0123】
一部の実施形態では、ミトコンドリア置換細胞を生成するために使用されるリンパ球系細胞は疲弊Ｔ細胞であり、ミトコンドリア置換細胞はＴ細胞疲弊の低減を示す。疲弊マーカー（例えば、ＰＤ－１／ＴＩＭ３／ＬＡＧ３）についてのＦＡＣＳ分析を使用して、Ｔ細胞疲弊を測定することができる。したがって、一部の実施形態では、本明細書に提供される方法に従って生成されるミトコンドリア置換リンパ球系細胞は、単離された外因性ミトコンドリアおよびｍＴＯＲ阻害薬と共にインキュベートされていないリンパ球系細胞と比較して疲弊の低減を有する。
７．実施形態
７．実施形態
【0124】
本発明は、以下の非限定的な実施形態を提供する。
【0125】
Ａ１
内因性ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）の少なくとも２０％が外因性ｍｔＤＮＡによって置換されているミトコンドリア置換リンパ球系細胞を生成するための方法であって、
内因性ミトコンドリアを減少または枯渇させる手順に供されていないリンパ球系細胞を、単離された外因性ミトコンドリア、および有効量の哺乳類ラパマイシン標的（ｍＴＯＲ）阻害薬と共に十分な期間にわたってインキュベートして、前記外因性ミトコンドリアを前記リンパ球系細胞に非侵襲的に移入し、それにより、前記内因性ｍｔＤＮＡの少なくとも２０％が外因性ｍｔＤＮＡによって置換されているミトコンドリア置換リンパ球系細胞を生成するステップ
を含む、方法。
内因性ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）の少なくとも２０％が外因性ｍｔＤＮＡによって置換されているミトコンドリア置換リンパ球系細胞を生成するための方法であって、
内因性ミトコンドリアを減少または枯渇させる手順に供されていないリンパ球系細胞を、単離された外因性ミトコンドリア、および有効量の哺乳類ラパマイシン標的（ｍＴＯＲ）阻害薬と共に十分な期間にわたってインキュベートして、前記外因性ミトコンドリアを前記リンパ球系細胞に非侵襲的に移入し、それにより、前記内因性ｍｔＤＮＡの少なくとも２０％が外因性ｍｔＤＮＡによって置換されているミトコンドリア置換リンパ球系細胞を生成するステップ
を含む、方法。
【0126】
Ａ２
前記ｍＴＯＲ阻害薬が、ラパマイシンまたはその誘導体を含む、実施形態Ａ１に記載の方法。
前記ｍＴＯＲ阻害薬が、ラパマイシンまたはその誘導体を含む、実施形態Ａ１に記載の方法。
【0127】
Ａ３
前記ｍＴＯＲ阻害薬が、ラパマイシンである、実施形態Ａ１または実施形態Ａ２に記載の方法。
前記ｍＴＯＲ阻害薬が、ラパマイシンである、実施形態Ａ１または実施形態Ａ２に記載の方法。
【0128】
Ａ４
前記ｍＴＯＲ阻害薬の有効量が、約１００ｎＭ～約１０００ｎＭの濃度である、実施形態Ａ１からＡ３のいずれか一項に記載の方法。
前記ｍＴＯＲ阻害薬の有効量が、約１００ｎＭ～約１０００ｎＭの濃度である、実施形態Ａ１からＡ３のいずれか一項に記載の方法。
【0129】
Ａ５
前記ｍＴＯＲ阻害薬の有効量が、約２００ｎＭ～約５００ｎＭの濃度である、実施形態Ａ１からＡ３のいずれか一項に記載の方法。
前記ｍＴＯＲ阻害薬の有効量が、約２００ｎＭ～約５００ｎＭの濃度である、実施形態Ａ１からＡ３のいずれか一項に記載の方法。
【0130】
Ａ６
前記ｍＴＯＲ阻害薬の有効量が、約１００ｎＭの濃度である、実施形態Ａ１からＡ３のいずれか一項に記載の方法。
前記ｍＴＯＲ阻害薬の有効量が、約１００ｎＭの濃度である、実施形態Ａ１からＡ３のいずれか一項に記載の方法。
【0131】
Ａ７
前記ｍＴＯＲ阻害薬の有効量が、約２００ｎＭの濃度である、実施形態Ａ１からＡ３のいずれか一項に記載の方法。
前記ｍＴＯＲ阻害薬の有効量が、約２００ｎＭの濃度である、実施形態Ａ１からＡ３のいずれか一項に記載の方法。
【0132】
Ａ８
前記ｍＴＯＲ阻害薬の有効量が、約５００ｎＭの濃度である、実施形態Ａ１からA３のいずれか一項に記載の方法。
前記ｍＴＯＲ阻害薬の有効量が、約５００ｎＭの濃度である、実施形態Ａ１からA３のいずれか一項に記載の方法。
【0133】
Ａ９
前記ｍＴＯＲ阻害薬の有効量が、約１０００ｎＭの濃度である、実施形態Ａ１からＡ３のいずれか一項に記載の方法。
前記ｍＴＯＲ阻害薬の有効量が、約１０００ｎＭの濃度である、実施形態Ａ１からＡ３のいずれか一項に記載の方法。
【0134】
Ａ１０
前記ミトコンドリア置換リンパ球系細胞が、ＴａｑＭａｎ一塩基多型（ＳＮＰ）アッセイによって測定して少なくとも２０％の外因性ｍｔＤＮＡおよび８０％以下の内因性ｍｔＤＮＡを含む、実施形態Ａ１からＡ９のいずれか一項に記載の方法。
前記ミトコンドリア置換リンパ球系細胞が、ＴａｑＭａｎ一塩基多型（ＳＮＰ）アッセイによって測定して少なくとも２０％の外因性ｍｔＤＮＡおよび８０％以下の内因性ｍｔＤＮＡを含む、実施形態Ａ１からＡ９のいずれか一項に記載の方法。
【0135】
Ａ１１
ミトコンドリア置換リンパ球系細胞を生成するための方法であって、内因性ミトコンドリアを減少または枯渇させる手順に供されていないリンパ球系細胞を、単離された外因性ミトコンドリアおよび約１００ｎＭ～約１０００ｎＭのラパマイシンと共に十分な期間にわたってインキュベートして、前記外因性ミトコンドリアを前記リンパ球系細胞に非侵襲的に移入し、それにより、ミトコンドリア置換リンパ球系細胞を生成するステップを含む、方法。
ミトコンドリア置換リンパ球系細胞を生成するための方法であって、内因性ミトコンドリアを減少または枯渇させる手順に供されていないリンパ球系細胞を、単離された外因性ミトコンドリアおよび約１００ｎＭ～約１０００ｎＭのラパマイシンと共に十分な期間にわたってインキュベートして、前記外因性ミトコンドリアを前記リンパ球系細胞に非侵襲的に移入し、それにより、ミトコンドリア置換リンパ球系細胞を生成するステップを含む、方法。
【0136】
Ａ１２
前記単離された外因性ミトコンドリアが、細胞１×１０６個当たりタンパク質約２０μｇ～８０μｇである、実施形態Ａ１からＡ１１のいずれか一項に記載の方法。
前記単離された外因性ミトコンドリアが、細胞１×１０６個当たりタンパク質約２０μｇ～８０μｇである、実施形態Ａ１からＡ１１のいずれか一項に記載の方法。
【0137】
Ａ１３
インキュベートするステップの前に前記リンパ球系細胞を遠心分離するステップをさらに含む、実施形態Ａ１からＡ１２のいずれか一項に記載の方法。
インキュベートするステップの前に前記リンパ球系細胞を遠心分離するステップをさらに含む、実施形態Ａ１からＡ１２のいずれか一項に記載の方法。
【0138】
Ａ１４
遠心分離するステップが、室温、１，５００相対遠心力（ＲＣＦ）でおよそ５分間実施される、実施形態Ａ１３に記載の方法。
遠心分離するステップが、室温、１，５００相対遠心力（ＲＣＦ）でおよそ５分間実施される、実施形態Ａ１３に記載の方法。
【0139】
Ａ１５
前記十分な期間が、少なくともおよそ２４時間である、実施形態Ａ１からＡ１４のいずれか一項に記載の方法。
前記十分な期間が、少なくともおよそ２４時間である、実施形態Ａ１からＡ１４のいずれか一項に記載の方法。
【0140】
Ａ１６
前記十分な期間が、少なくとも３６時間である、実施形態Ａ１からＡ１４のいずれか一項に記載の方法。
前記十分な期間が、少なくとも３６時間である、実施形態Ａ１からＡ１４のいずれか一項に記載の方法。
【0141】
Ａ１７
前記十分な期間が、少なくとも４８時間である、実施形態Ａ１からＡ１４のいずれか一項に記載の方法。
前記十分な期間が、少なくとも４８時間である、実施形態Ａ１からＡ１４のいずれか一項に記載の方法。
【0142】
Ａ１８
前記十分な期間が、およそ２日間であるか、またはそれよりも長い、実施形態Ａ１からＡ１４のいずれか一項に記載の方法。
前記十分な期間が、およそ２日間であるか、またはそれよりも長い、実施形態Ａ１からＡ１４のいずれか一項に記載の方法。
【0143】
Ａ１９
前記十分な期間が、およそ７日間であるか、またはそれよりも長い、実施形態Ａ１からＡ１４のいずれか一項に記載の方法。
前記十分な期間が、およそ７日間であるか、またはそれよりも長い、実施形態Ａ１からＡ１４のいずれか一項に記載の方法。
【0144】
Ａ２０
前記十分な期間が、およそ２日間～およそ７日間である、実施形態Ａ１からＡ１４のいずれか一項に記載の方法。
前記十分な期間が、およそ２日間～およそ７日間である、実施形態Ａ１からＡ１４のいずれか一項に記載の方法。
【0145】
Ａ２１
ミトコンドリア置換リンパ球系細胞を生成するための方法であって、
（ａ）リンパ球系細胞および単離された外因性ミトコンドリアを、細胞ペレットが生成されるのに十分な条件下で遠心分離するステップであって、前記リンパ球系細胞が、内因性ミトコンドリアを減少または枯渇させる手順に供されていない、ステップと、
（ｂ）前記リンパ球系細胞を１００ｎＭ～１０００ｎＭのラパマイシンと共におよそ２４時間またはそれよりも長くインキュベートするステップであって、それにより、ミトコンドリア置換リンパ球系細胞を生成する、ステップ
を含む、方法。
ミトコンドリア置換リンパ球系細胞を生成するための方法であって、
（ａ）リンパ球系細胞および単離された外因性ミトコンドリアを、細胞ペレットが生成されるのに十分な条件下で遠心分離するステップであって、前記リンパ球系細胞が、内因性ミトコンドリアを減少または枯渇させる手順に供されていない、ステップと、
（ｂ）前記リンパ球系細胞を１００ｎＭ～１０００ｎＭのラパマイシンと共におよそ２４時間またはそれよりも長くインキュベートするステップであって、それにより、ミトコンドリア置換リンパ球系細胞を生成する、ステップ
を含む、方法。
【0146】
Ａ２２
インキュベートするステップが、およそ７日間であるか、またはそれよりも長い、実施形態Ａ２１に記載の方法。
インキュベートするステップが、およそ７日間であるか、またはそれよりも長い、実施形態Ａ２１に記載の方法。
【0147】
Ａ２３
インキュベートするステップが、およそ２日間～およそ７日間である、実施形態Ａ２１に記載の方法。
インキュベートするステップが、およそ２日間～およそ７日間である、実施形態Ａ２１に記載の方法。
【0148】
Ａ２４
前記リンパ球系細胞が、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、マクロファージ、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、または顆粒球である、実施形態Ａ１からＡ２３のいずれか一項に記載の方法。
前記リンパ球系細胞が、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、マクロファージ、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、または顆粒球である、実施形態Ａ１からＡ２３のいずれか一項に記載の方法。
【0149】
Ａ２５
前記リンパ球系細胞が、Ｔ細胞である、実施形態Ａ２４に記載の方法。
前記リンパ球系細胞が、Ｔ細胞である、実施形態Ａ２４に記載の方法。
【0150】
Ａ２６
前記Ｔ細胞が、疲弊Ｔ細胞、老化Ｔ細胞、またはこれらの組合せを含む、実施形態Ａ２５に記載の方法。
前記Ｔ細胞が、疲弊Ｔ細胞、老化Ｔ細胞、またはこれらの組合せを含む、実施形態Ａ２５に記載の方法。
【0151】
Ａ２７
前記リンパ球系細胞が、ヒトリンパ球系細胞である、実施形態Ａ１からＡ２６のいずれか一項に記載の方法。
前記リンパ球系細胞が、ヒトリンパ球系細胞である、実施形態Ａ１からＡ２６のいずれか一項に記載の方法。
【0152】
Ａ２８
有効量の、実施形態Ａ１からＡ２７のいずれか一項に記載の方法によって生成されたミトコンドリア置換リンパ球系細胞と、薬学的に許容される担体とを含む組成物。
有効量の、実施形態Ａ１からＡ２７のいずれか一項に記載の方法によって生成されたミトコンドリア置換リンパ球系細胞と、薬学的に許容される担体とを含む組成物。
【0153】
Ａ２９
それを必要とする対象に対するミトコンドリア複合体ＩＩＩ欠損症の症状を好転させるための方法であって、前記対象に、実施形態Ａ２８に記載の組成物を投与するステップを含む、方法。
それを必要とする対象に対するミトコンドリア複合体ＩＩＩ欠損症の症状を好転させるための方法であって、前記対象に、実施形態Ａ２８に記載の組成物を投与するステップを含む、方法。
【0154】
Ａ３０
それを必要とする対象に対するヘテロプラスミック免疫細胞に関連する免疫不全を処置するための方法であって、前記対象に、実施形態Ａ２８に記載の組成物を投与するステップを含む、方法。
それを必要とする対象に対するヘテロプラスミック免疫細胞に関連する免疫不全を処置するための方法であって、前記対象に、実施形態Ａ２８に記載の組成物を投与するステップを含む、方法。
【0155】
Ａ３１
前記対象が、逆転写酵素阻害薬を受けている、実施形態Ａ３０に記載の方法。
前記対象が、逆転写酵素阻害薬を受けている、実施形態Ａ３０に記載の方法。
【0156】
Ａ３２
前記対象が、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）を有する、実施形態Ａ３１に記載の方法。
前記対象が、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）を有する、実施形態Ａ３１に記載の方法。
【0157】
Ａ３３
前記対象が、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）を有する、実施形態Ａ３１に記載の方法。
前記対象が、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）を有する、実施形態Ａ３１に記載の方法。
【0158】
Ａ３４
前記対象が、ヒトである、実施形態Ａ２９からＡ３３のいずれか一項に記載の方法。
前記対象が、ヒトである、実施形態Ａ２９からＡ３３のいずれか一項に記載の方法。
【実施例】
【0159】
８．実施例
この節の実施例は実例として提示するものであり、限定として提示するものではない。以下の実施例は本発明の例示的な実施形態として提示される。以下の実施例は、本発明の広い範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
（実施例１）
８．１ 実施例１：リンパ球系細胞を用いてミトコンドリア病およびヘテロプラスミーに関連する他の疾患を処置するための方法および組成物
この節の実施例は実例として提示するものであり、限定として提示するものではない。以下の実施例は本発明の例示的な実施形態として提示される。以下の実施例は、本発明の広い範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
（実施例１）
８．１ 実施例１：リンパ球系細胞を用いてミトコンドリア病およびヘテロプラスミーに関連する他の疾患を処置するための方法および組成物
【0160】
本実施例では、リンパ球（例えば、Ｔリンパ球）における内因性ミトコンドリアおよび／またはｍｔＤＮＡを、ラパマイシンを使用し、内因性ｍｔＤＮＡを事前に枯渇させることなく外因性ミトコンドリアによって置換することができることを実証する。
８．１．１ 材料および方法
８．１．１ 材料および方法
【0161】
初代マウスＴリンパ球の単離および細胞培養：全ての動物実験を自施設の動物実験委員会により発行された動物実験ガイドラインに従って実施した（Ｍ２０１９－５３６）。マウスＴリンパ球の単離のために、マウスから、麻酔し屠殺した後に脾臓を取り出した。脾臓をＰＢＳ（ＦＵＪＩＦＩＬＭ Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．）で洗浄し、次いで、すりつぶし、濾過して脾細胞を抽出した。ＥａｓｙＳｅｐマウスＴ細胞単離キット（Ｖｅｒｉｔａｓ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を製造者の推奨に従って使用し、免疫磁気による負の選択によってマウスＴ細胞を脾細胞から高度に精製した。単離されたマウスＴ細胞を、１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、２０ｍＭのＬ－グルタミン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）、２０μＭの組換えヒトＩＬ－２（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ、ＮＪ、ＵＳＡ）を補充したＡｄｖａｎｃｅｄ ＲＰＭＩ１６４０培地で培養し、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ｍｏｕｓｅ Ｔ－ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＣＤ３／ＣＤ２８（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）を用いて活性化した。細胞を、加湿５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃でインキュベートした。
【0162】
ミトコンドリアの単離およびマウスＴ細胞への移入：ミトコンドリアをＢ６マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）から単離した。簡単に述べると、細胞を培養皿からプロテアーゼ阻害薬混合物（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ、ＵＳＡ）を含有するホモジナイゼーション緩衝剤［ＨＢ；２０ｍＭのＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ７．４）、２２０ｍＭのマンニトールおよび７０ｍＭのスクロース］を用いて回収した。細胞ペレットをＨＢ中に再懸濁させ、氷上で５分間インキュベートした。細胞を、氷上で２７ゲージの針で１０回突き刺すことによって破裂させた。ホモジネートを２回遠心分離して（４００×ｇ、４℃；５分間）、破壊されなかった細胞を除去した。ミトコンドリアを遠心分離（６０００×ｇ、４℃；５分間）によって回収し、ＨＢ中に再懸濁させた。単離されたミトコンドリアの量をＢｉｏ－Ｒａｄタンパク質アッセイキット（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用してタンパク質濃度として表した。単離されたミトコンドリアを標準的な培地中でマウスＴ細胞と混合し、室温、１，５００ｇで５分間遠心分離した。ペレットを穏やかに再懸濁させ、種々の濃度のラパマイシンを添加し、５％ＣＯ２下、３７℃で２４時間、インキュベートした。
【0163】
ヒトＴ細胞の単離および細胞培養：ヘパリン添加静脈血を肘正中皮静脈から標準的な手順に従って取得した。１．０７７ｇ／ｍｌのパーコール（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、Ｅｎｇｌａｎｄ）を用いた密度勾配遠心分離を使用し、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をヒト末梢血から単離した。細胞を、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）をコーティングした細胞培養プレート上、１０％ウシ胎仔血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）、２０μＭのＩＬ－７、および１０μＭのＩＬ－１５を補充したＴｅｘＭＡＣＳ培地（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）で培養した。細胞を、加湿５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃でインキュベートした。
【0164】
ミトコンドリアの単離およびヒトＴ細胞への移入：マウスプロトコールと同じプロトコールを使用してヒト初代Ｔ細胞にミトコンドリアを移入するための外因性ミトコンドリアの例示的なドナーとして、不死化ヒト子宮内膜腺由来の間葉細胞株、ＥＰＣ１００（Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ、ＪＣＲＢ１５３８）を使用した。
【0165】
ＭｔＤＮＡ配列決定：ゲノムＤＮＡからｍｔＤＮＡを精製するために（Jayaprakash AD. Nucleic Acids Res. 2015）、エキソヌクレアーゼＶ（ＥｘｏＶ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｌｔｄ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用して核ＤＮＡのみを取り出した。簡単に述べると、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｔｉｓｓｕｅ（ＭＡＣＨＥＲＥＹ－ＮＡＧＥＬ）を使用して全ＤＮＡを細胞から抽出し、７０℃で３０分間加熱して、残った全てのプロテイナーゼＫを不活化した。第１の消化で、全ＤＮＡ試料（３５μｌ中４～８μｇ）に以下のステップで添加した。１０×Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ）４ Ｂｕｆｆｅｒ（６μｌ）、１０ｍＭのＡＴＰ（１２μｌ）、ＮＥＢ－Ｍ０３４５ＳからのＥｘｏＶ（４μｌ）およびＨ２Ｏ（３μｌ）。消化物を３７℃で４８時間放置し、７０℃で３０分間にわたって熱失活させ、Ｎ Ｗｉｚａｒｄ ＳＶ ＧｅｌおよびＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）を使用して精製した。第２の消化で、ＥｘｏＶ処置したＤＮＡ（３５μｌ）に以下を添加した。ＮＥＢ４ １０×Ｂｕｆｆｅｒ（６μｌ）、１０ｍＭのＡＴＰ（１２μｌ）、ＮＥＢ－Ｍ０３４５ＳからのＥｘｏＶ（４μｌ）およびＨ２Ｏ（３μｌ）。消化物を３７℃で１６時間放置し、７０℃で３０分間にわたって熱失活させ、Ｗｉｚａｒｄ ＳＶ ＧｅｌおよびＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）を使用して精製した。これらのＥｘｏＶ処置したｍｔＤＮＡをディープシーケンシングのために処理した。配列決定データをｆａｓｔｑ形式のファイルとして生成した。マッピングされなかったリードを品質のためにフィルタリングし（Ｑ＜２０のヌクレオチドが１０個よりも多く連続する配列を除外した）、参照ミトコンドリアゲノム（ＧＲＣｈ３８）にマッピングし、ＢＡＭファイルに変換した。これらのファイルをｍｔＤＮＡ－ｓｅｒｖｅｒ（mtdna-server.uibk.ac.at/index.html）を用いてヘテロプラスミーについて分析した。
【0166】
ＴａｑＭａｎ一塩基多型（ＳＮＰ）アッセイ：ヒトＧＪ Ｔ細胞とＥＰＣ１００細胞のミトコンドリアＨＶＲ１配列の差異、およびＢ６マウスとＮＺＢマウスのミトコンドリアＮＤ１の差異に基づき、表１および２に記載のプローブおよびプライマーセットを設計した。これらはＴａｑＭａｎ ＳＮＰアッセイにおいて感度および特異度をもたらすものである。変異の比を決定するために、ＴａｑＭａｎ ＳＮＰアッセイ用の野生型対立遺伝子特異的ＴａｑＭａｎプローブおよび変異型対立遺伝子特異的ＴａｑＭａｎプローブを設計した。抽出されたＤＮＡ（１ｎｇ）を、ＣＦＸ ｃｏｎｎｅｃｔ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）でＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）を用いた、以下の条件：最初の変性（９５℃で１０分間）後、４０サイクルのＰＣＲ（９５℃で１５秒間および６０℃で１分間）の下での定量的ＰＣＲのために使用した。標的について増幅されたｍｔＤＮＡ断片を含有するプラスミドの分かっているＣＮを使用して較正曲線を作成した。デルタサイクル閾値に基づく相対的な数量化により、ｍｔＤＮＡ上の１２Ｓ ｒＲＮＡと核ＤＮＡ上のＡＣＴＢ（またはＡｃｔｂ）の含量の比からｍｔＤＮＡコピー数を推定した。
【0167】
表1
【表1】
【0168】
表2
８．１．２ 結果
【表2】
【0169】
図１に示されている通り、ヒトＧＪ Ｔ細胞由来のｍｔＤＮＡ配列とＥＰＣ１００細胞由来のｍｔＤＮＡ配列の差異をＤループの配列決定によって検出し、Ｄループ超可変領域（「ＨＶＲ」）にいくつかの差異が観察された。ＤループＨＶＲの差異に基づき、ミトコンドリア置換（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）を検出するためのＳＮＰアッセイに使用するためのプローブとプライマーのセットを設計した（図２Ａ）。実験試料の前にヒトＧＪ Ｔ細胞とＥＰＣ１００細胞を所与の混合率にした細胞集団を試験試料として使用することによってアッセイのバリデーションを行った。アッセイにより、細胞集団の混合率に従って遺伝子型の正確な比が実証された（データは示していない）。したがって、ＴａｑＭａｎプローブにより、ＧＪ Ｔ細胞由来のｍｔＤＮＡとＥＰＣ１００細胞由来のｍｔＤＮＡを容易に検出し、それらを区別することができる。したがって、ＳＮＰアッセイは、２つの異なる供給源からのｍｔＤＮＡを同定し、それらを区別することを可能にするための有用なツールである。
【0170】
ヒトＧＪ Ｔ細胞を、５％ＦＢＳおよびＩＬ－７およびＩＬ－１５を伴うＴｅｘＭａｃｓ中、ｉｎ ｖｉｔｒｏで２日間培養した。ヒトＧＪ Ｔ細胞をラパマイシンの非存在下または種々の濃度のラパマイシン（５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、または５００ｎＭ）の存在下で、ＥＰＣ１００細胞由来のミトコンドリアを伴ってまたは伴わずに培養することによってミトコンドリアの移入を実施した（「０日目」）。ラパマイシンの存在下で培養後２４時間に、培地の５０％を５％ＦＢＳおよびＩＬ－７およびＩＬ－１５を含むＴｅｘＭａｃｓで補給し、さらなるラパマイシンは添加しなかった。培地を交換した後、細胞をさらに１日間または６日間、全てのミトコンドリアの移入後、合計で２日間または７日間培養した。
【0171】
ヒトＧＪ Ｔ細胞をＥＰＣ１００細胞由来のミトコンドリアと共に培養してから２日、および７日後、ＳＮＰアッセイを行って、ＥＰＣ１００細胞からヒトＧＪ Ｔ細胞へのミトコンドリアの移入を検出した。プロトコールの概略については図３Ａを参照されたい。図３Ｂに示されている通り、５０～５００ｎＭのラパマイシンの存在下で２日間および７日間培養したヒトＧＪ Ｔ細胞ではＥＰＣ１００細胞由来のｍｔＤＮＡが検出されたが、一方、ＥＰＣ１００ミトコンドリアを伴わずに培養したヒトＧＪ Ｔ細胞ではＥＰＣ１００細胞由来のｍｔＤＮＡは検出されなかった。ラパマイシンの存在下でドナーミトコンドリアと接触させたＴ細胞におけるｍｔＤＮＡ含量は、４０～５０％がＥＰＣ１００細胞由来のｍｔＤＮＡからなり、ラパマイシンの量が増加すると共にドナーｍｔＤＮＡの量が増加した。例えば、５０ｎＭのラパマイシンの存在下でドナーミトコンドリアと接触させた後にＴ細胞において検出されたドナーｍｔＤＮＡの部分は７日後に４０％未満であったが、一方、５００ｎＭのラパマイシンの存在下でドナーミトコンドリアと接触させた後にＴ細胞において検出されたドナーｍｔＤＮＡの部分は７日後におよそ５０％であった。したがって、Ｔ細胞をラパマイシンの下で培養した場合、ｍｔＤＮＡのＴ細胞への上首尾の移入を実現するためにミトコンドリア枯渇は必要なかった。
【0172】
ウェル当たり３×１０６個のマウスＮＺＢ Ｔ細胞を、１０％ＦＢＳおよびＩＬ－２／ＣＤ３／ＣＤ２８を伴うＡｄｖａｎｃｅｄ ＲＰＭＩ中、Ｂ６ ＭＥＦ由来のミトコンドリア４０μｇと共に、ラパマイシンの非存在下または種々の濃度のラパマイシン（１００ｎＭ、２００ｎＭ、５００ｎＭまたは１０００ｎＭ）の存在下で、ＮＺＢ Ｔ細胞ｍｔＤＮＡの枯渇なしに培養した。ミトコンドリアドナーとして使用したＢ６ Ｔ細胞は、ｍｔＤＮＡに、Ｂ６ Ｔ細胞を含めた現在の近交系実験用マウス由来のｍｔＤＮＡと比較して、９１の多型を有する。ラパマイシンと共にインキュベートしてから２４時間後、培地の５０％を、１０％ＦＢＳおよびＩＬ－２／ＣＤ３／ＣＤ２８を伴うＡｄｖａｎｃｅｄ ＲＰＭＩで補給し、さらなるラパマイシンは添加しなかった。細胞を合計で２日間または７日間培養した後、ミトコンドリア置換（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）を評価した。
【0173】
細胞をＢ６ ＭＥＦミトコンドリアと共にラパマイシンの存在下または非存在で培養してから２日および７日後、ＳＮＰアッセイを行って、ＮＺＢ Ｔ細胞ｍｔＤＮＡのＢ６ ＭＥＦ ｍｔＤＮＡによる置換を検出した。プロトコールを示すスキームについては図４Ａを、およびウェル中のラパマイシンの力価測定の描写については図４Ｂを参照されたい。図５Ａおよび図５Ｂに示されている通り、ラパマイシンと共に培養した後にはＮＺＢ Ｔ細胞ｍｔＤＮＡの置換の増加が検出されたが、一方、ラパマイシンを伴わない場合にはＮＺＢ Ｔ細胞ｍｔＤＮＡの置換は検出されなかった。例えば、遠心分離および２日間のラパマイシン処置の後、レシピエントＴ細胞に約４５～８０％のドナーｍｔＤＮＡが存在した（図５Ａ）。７日目までに、レシピエントＴ細胞におけるドナーｍｔＤＮＡの量はおよそ７０～９０％に増加した（図５Ｂ）。ＮＺＢ Ｔ細胞ｍｔＤＮＡのＢ６ ＭＥＦ ｍｔＤＮＡによる置換の量は濃度依存的に増加した。さらに、７日目のＮＺＢ Ｔ細胞におけるＢ６ ＭＥＦ ｍｔＤＮＡの量は２日目よりも多かった。
【0174】
総合すると、結果から、Ｔ細胞をドナーミトコンドリアと接触させる際に同時にラパマイシン処置することにより、ミトコンドリアの移入を容易にすることができることが実証される。したがって、本実施例は、ラパマイシンを伴うプロトコールを使用した、Ｔ細胞における、エンドヌクレアーゼによる内因性ｍｔＤＮＡの減少を伴わず、遺伝子操作を伴わない、ミトコンドリア置換（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）の上首尾の提供を実証するものである。
【0175】
上記の実施形態は、ただ単に例示的なものであることが意図されており、当業者は、特定の化合物、材料、および手順の多数の等価物を理解する、または常套的な実験だけを使用して確認することができる。そのような等価物は全て本発明の範囲内に入るとみなされ、添付の特許請求の範囲に包含される。
【図1】
【図2-1】
【図2-2】
【図3】
【図4】
【図5-1】
【図5-2】
【配列表】
【国際調査報告】