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特表2024-525961疾患治療のためのアルファフェトプロテインバイオコンジュゲート
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-07-12
(54)【発明の名称】疾患治療のためのアルファフェトプロテインバイオコンジュゲート
(51)【国際特許分類】
A61K 47/64 20170101AFI20240705BHJP
A61K 31/537 20060101ALI20240705BHJP
A61K 9/08 20060101ALI20240705BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240705BHJP
C07K 14/47 20060101ALN20240705BHJP
C07K 14/82 20060101ALN20240705BHJP
【ＦＩ】
A61K47/64
A61K31/537
A61K9/08
A61P35/00
C07K14/47 ZNA
C07K14/82
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024504144
(86)(22)【出願日】2022-07-23
(85)【翻訳文提出日】2024-02-29
(86)【国際出願番号】 CA2022051144
(87)【国際公開番号】W WO2023000114
(87)【国際公開日】2023-01-26
(31)【優先権主張番号】63/203,467
(32)【優先日】2021-07-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】524028670
【氏名又は名称】アルファ キャンサー テクノロジーズ インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100114775
【弁理士】
【氏名又は名称】高岡 亮一
(74)【代理人】
【識別番号】100121511
【弁理士】
【氏名又は名称】小田 直
(74)【代理人】
【識別番号】100202751
【弁理士】
【氏名又は名称】岩堀 明代
(74)【代理人】
【識別番号】100208580
【弁理士】
【氏名又は名称】三好 玲奈
(74)【代理人】
【識別番号】100191086
【弁理士】
【氏名又は名称】高橋 香元
(72)【発明者】
【氏名】シャーマン，イゴール
(72)【発明者】
【氏名】フリジェリオ，マーク
(72)【発明者】
【氏名】ゴドウィン，アントニー
(72)【発明者】
【氏名】チョウ，ジェユ
【テーマコード（参考）】
4C076
4C086
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C076AA12
4C076AA95
4C076BB13
4C076CC27
4C076DD60Z
4C076DD67Q
4C076EE59
4C076FF36
4C076FF61
4C086AA01
4C086AA02
4C086AA03
4C086AA04
4C086CB22
4C086GA16
4C086MA01
4C086MA02
4C086MA04
4C086MA05
4C086MA17
4C086MA66
4C086NA13
4C086NA14
4C086ZB26
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA72
4H045CA40
4H045EA28
4H045FA74
4H045GA10
(57)【要約】
がん治療のために、ジスルフィド、グルタチオン感受性リンカーを通して細胞毒とリンクしたアルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）を含むバイオコンジュゲートが記述される。好ましい実施形態では、バイオコンジュゲートは、グルタチオン感受性リンカーを介してメイタンシノイド細胞毒にリンクしたＡＦＰバリアントであり、そのため、バイオコンジュゲートは、ＡＦＰ当たり特定の高比または低比の細胞毒のいずれかを含む。
【選択図】図３
【選択図】図３
【特許請求の範囲】
【請求項1】
疾患細胞の治療において有用なバイオコンジュゲートであって、（１）ＡＦＰＲ＋細胞の表面上のアルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）受容体（ＡＦＰＲ）に結合する薬剤と、
（２）ＡＦＰＲ＋細胞に対して毒性である細胞毒（ＣＴ）と、
（３）グルタチオン切断可能なジスルフィヨードリンカーであって、リンカーが、
（ｉ）ＡＦＰＲ結合剤と前記ＣＴとの間に共有結合され、かつ
（ｉｉ）ＣＴをＡＦＰＲ＋細胞へと細胞内で放出するリンカーと、を含む、バイオコンジュゲート。
【請求項2】
前記ＡＦＰＲ結合剤が、成熟した、野生型ＡＦＰのアミノ酸配列、ＡＦＰＲ結合断片のアミノ酸配列、または前記成熟野生型ＡＦＰもしくは前記ＡＦＰ断片のＡＦＰＲ結合バリアントのアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項3】
前記ＡＦＰが、組み換え型ヒトＡＦＰ、またはそのＡＦＰＲ結合断片もしくはバリアントであり、前記バリアントが、１～５個のアミノ酸置換を含む、請求項２に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項4】
前記薬剤が、グリコシル化を欠くＡＦＰである、請求項３に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項5】
前記薬剤が、配列番号３を含む組み換え型［Ａｓｎ２３３Ｇｌｎ］成熟ヒトＡＦＰである、請求項１に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項6】
前記薬剤が配列番号４を含む、請求項１に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項7】
前記組み換え型［Ａｓｎ２３３Ｇｌｎ］ヒトＡＦＰが、トランスジェニック細菌によって産生される、請求項５に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項8】
前記組み換え型［Ａｓｎ２３３Ｇｌｎ］ヒトＡＦＰが、トランスジェニックヤギを含むトランスジェニック哺乳類によって産生される、請求項５に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項9】
前記細胞毒（ＣＴ）が、式：を有する請求項１～８のいずれか一項に記載のバイオコンジュゲート。【化1】
【請求項10】
前記リンカーが前記ＡＦＰＲ結合剤と前記細胞毒との間に連結され、前記細胞毒が、リンカー１ －Ｓ－ＣＨ（ＣＨ３）－（ＣＨ２）２－ＣＯ－－、および
リンカー２ －Ｓ－（ＣＨ２）３－ＣＯ－から選択される、請求項１～８のいずれか一項に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項11】
前記リンカーが前記ＡＦＰＲ結合剤と前記細胞毒との間に連結され、前記細胞毒が、リンカー１ －Ｓ－ＣＨ（ＣＨ３）－（ＣＨ２）２－ＣＯ－－、および
リンカー２ －Ｓ－（ＣＨ２）３－ＣＯ－から選択される、請求項９に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項12】
前記コンジュゲートが、以下に示されるリンカー細胞毒：を含む、請求項１に記載のバイオコンジュゲートの産生において有用なコンジュゲート。【化2】
【請求項13】
前記コンジュゲートが、以下に示されるリンカー細胞毒素：を含む、請求項１に記載のバイオコンジュゲートの産生において有用なコンジュゲート。【化3】
【請求項14】
次式のバイオコンジュゲートであって、【化4】
式中、ＡＦＰが、アルファフェトプロテインのＡＦＰ受容体結合形態である、バイオコンジュゲート。
【請求項15】
前記ｎが、１～１１の範囲内にある、請求項１４に記載のバイオコンジュゲートを含む製剤。
【請求項16】
前記平均ＤＰＲが２～８である、請求項１５に記載の製剤。
【請求項17】
前記平均ＤＰＲが５～７である、請求項１６に記載の製剤。
【請求項18】
前記平均ＤＰＲが５．６～６．１である、請求項１７に記載の製剤。
【請求項19】
前記平均ＤＰＲが約５．９である、請求項１７に記載の製剤。
【請求項20】
前記平均ＤＰＲが３～４．５である、請求項１６に記載の製剤。
【請求項21】
前記平均ＤＰＲが３．６～４．１である、請求項２０に記載の製剤。
【請求項22】
前記平均ＤＰＲが約３．９である、請求項２０に記載の製剤。
【請求項23】
前記ＡＦＰが、配列番号３を含む組み換え型［Ａｓｎ２３３Ｇｌｎ］成熟ヒトＡＦＰである、請求項１４に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項24】
前記ｎが、１～１１の範囲内にある、請求項２３に記載のバイオコンジュゲートを含む製剤。
【請求項25】
前記平均ＤＰＲが２～８である、請求項２４に記載の製剤。
【請求項26】
前記平均ＤＰＲが５～７である、請求項２５に記載の製剤。
【請求項27】
前記平均ＤＰＲが５．６～６．１である、請求項２６に記載の製剤。
【請求項28】
前記平均ＤＰＲが約５．９である、請求項２６に記載の製剤。
【請求項29】
前記平均ＤＰＲが３～４．５である、請求項２４に記載の製剤。
【請求項30】
前記平均ＤＰＲが３．６～４．１である、請求項２４に記載の製剤。
【請求項31】
前記平均ＤＰＲが約３．９である、請求項２４に記載の製剤。
【請求項32】
次式のバイオコンジュゲートであって、【化5】
式中、ＡＰＦが、アルファフェトプロテインのＡＦＰ受容体結合形態である、バイオコンジュゲート。
【請求項33】
前記ｎが、１～１１の範囲内にある、請求項３２に記載のバイオコンジュゲートを含む製剤。
【請求項34】
前記平均ＤＰＲが２～８である、請求項３３に記載の製剤。
【請求項35】
前記平均ＤＰＲが５～７である、請求項３４に記載の製剤。
【請求項36】
前記平均ＤＰＲが５．５～６．１である、請求項３５に記載の製剤。
【請求項37】
前記平均ＤＰＲが約５．８である、請求項３５に記載の製剤。
【請求項38】
前記平均ＤＰＲが３～４．５である、請求項３４に記載の製剤。
【請求項39】
前記平均ＤＰＲが３．４～４．０である、請求項３８に記載の製剤。
【請求項40】
前記平均ＤＰＲが約３．７である、請求項３８に記載の製剤。
【請求項41】
薬学的に許容可能な担体と、請求項１７に記載のバイオコンジュゲートと、を含む、医薬組成物。
【請求項42】
前記担体が水性ビヒクルである、請求項４１に記載の医薬組成物。
【請求項43】
前記水性ビヒクルが、５％スクロースを有するｐＨ７．５の１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝剤である、請求項４２に記載の医薬組成物。
【請求項44】
ＡＦＰＲ＋であるがんを患う対象へと投与するための、請求項４１～４３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項45】
薬学的に許容可能な担体と、請求項１～８、１４、および２６のいずれか一項に記載のバイオコンジュゲートとを含む、医薬組成物。
【請求項46】
前記担体が水性ビヒクルである、請求項４５に記載の医薬組成物。
【請求項47】
前記水性ビヒクルが、５％スクロースを有するｐＨ７．５の１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝剤である、請求項４６に記載の医薬組成物。
【請求項48】
ＡＦＰＲ＋であるがんを患う対象へと投与するための、薬学的に許容可能な担体と、請求項１～８、１４、および２６のいずれか一項に記載のバイオコンジュゲートと、を含む、医薬組成物。
【請求項49】
薬学的に許容可能な担体と、請求項９に記載のバイオコンジュゲートと、を含む、医薬組成物。
【請求項50】
前記担体が水性ビヒクルである、請求項４９に記載の医薬組成物。
【請求項52】
前記水性ビヒクルが、５％スクロースを有するｐＨ７．５の１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝剤である、請求項５０に記載の医薬組成物。
【請求項53】
ＡＦＰＲ＋であるがんを患う対象へと投与するための、請求項５２に記載の医薬組成物。
【請求項54】
薬学的に許容可能な担体と、請求項１０に記載のバイオコンジュゲートと、を含む、医薬組成物。
【請求項55】
前記担体が水性ビヒクルである、請求項５４に記載の医薬組成物。
【請求項56】
前記水性ビヒクルが、５％スクロースを有するｐＨ７．５の１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝剤である、請求項５５に記載の医薬組成物。
【請求項57】
ＡＦＰＲ＋であるがんを患う対象へと投与するための、請求項５６に記載の医薬組成物。
【請求項58】
薬学的に許容可能な担体と、請求項１１に記載のバイオコンジュゲートと、を含む、医薬組成物。
【請求項59】
前記担体が水性ビヒクルである、請求項５８に記載の医薬組成物。
【請求項60】
前記水性ビヒクルが、５％スクロースを有するｐＨ７．５の１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝剤である、請求項５９に記載の医薬組成物。
【請求項61】
ＡＦＰＲ＋であるがんを患う対象へと投与するための、請求項６０に記載の医薬組成物。
【請求項62】
それを必要とする対象内のＡＦＰＲ＋細胞を治療するための方法であって、治療有効量の請求項３１に記載の医薬組成物を対象へと投与することを含む、方法。
【請求項63】
前記ＡＦＰＲ＋細胞が、がん細胞である、請求項６２に記載の方法。
【請求項64】
前記ＡＦＰＲ＋細胞が、ＭＤＳＣである、請求項６２に記載の方法。
【請求項65】
前記ＡＦＰＲ＋細胞が、卵巣がん細胞である、請求項６３に記載の方法。
【請求項66】
前記ＡＦＰＲ＋細胞が、結腸直腸がん細胞である、請求項６３に記載の方法。
【請求項67】
前記ＡＦＰＲ＋細胞が、乳がん細胞である、請求項６３に記載の方法。
【請求項68】
前記ＡＦＰＲ＋細胞が、リンパ腫細胞である、請求項６３に記載の方法。
【請求項69】
それを必要とする対象内のＡＦＰＲ＋細胞を治療するための方法であって、治療有効量の請求項３５に記載の医薬組成物を対象へと投与することを含む、方法。
【請求項70】
前記ＡＦＰＲ＋細胞が、がん細胞である、請求項６９に記載の方法。
【請求項71】
前記ＡＦＰＲ＋細胞が、ＭＤＳＣである、請求項６９に記載の方法。
【請求項72】
前記ＡＦＰＲ＋細胞が、卵巣がん細胞である、請求項７０に記載の方法。
【請求項73】
前記ＡＦＰＲ＋細胞が、結腸直腸がん細胞である、請求項７０に記載の方法。
【請求項74】
前記ＡＦＰＲ＋細胞が、乳がん細胞である、請求項７０に記載の方法。
【請求項75】
前記ＡＦＰＲ＋細胞が、リンパ腫細胞である、請求項７０に記載の方法。
【請求項76】
それを必要とする対象内のＡＦＰＲ＋細胞を治療するための方法であって、治療有効量の請求項４９に記載の医薬組成物を対象へと投与することを含む、方法。
【請求項77】
前記ＡＦＰＲ＋細胞が、がん細胞である、請求項７６に記載の方法。
【請求項78】
前記ＡＦＰＲ＋細胞が、ＭＤＳＣである、請求項７６に記載の方法。
【請求項79】
前記ＡＦＰＲ＋細胞が、卵巣がん細胞である、請求項７７に記載の方法。
【請求項80】
前記ＡＦＰＲ＋細胞が、結腸直腸がん細胞である、請求項７７に記載の方法。
【請求項81】
前記ＡＦＰＲ＋細胞が、乳がん細胞である、請求項７７に記載の方法。
【請求項82】
前記ＡＦＰＲ＋細胞が、リンパ腫細胞である、請求項７７に記載の方法。
【請求項83】
それを必要とする対象内のＡＦＰＲ＋細胞を治療するための方法であって、治療有効量の請求項５６に記載の医薬組成物を対象へと投与することを含む、方法。
【請求項84】
前記ＡＦＰＲ＋細胞が、がん細胞である、請求項８３に記載の方法。
【請求項85】
前記ＡＦＰＲ＋細胞が、ＭＤＳＣである、請求項８３に記載の方法。
【請求項86】
前記ＡＦＰＲ＋細胞が、卵巣がん細胞である、請求項８４に記載の方法。
【請求項87】
前記ＡＦＰＲ＋細胞が、結腸直腸がん細胞である、請求項８４に記載の方法。
【請求項88】
前記ＡＦＰＲ＋細胞が、乳がん細胞である、請求項８４に記載の方法。
【請求項89】
前記ＡＦＰＲ＋細胞が、リンパ腫細胞である、請求項８４に記載の方法。
【請求項90】
ＡＦＰＲ＋であるがんを患う対象の治療のための、治療的な組み合わせにおける使用のための、請求項３１で定義されるような医薬組成物および第二の治療剤。
【請求項91】
前記第二の治療剤が、免疫チェックポイント阻害剤もしくはＣＡＲ－Ｔ剤、または別のがん免疫療法である、請求項９０に記載の使用。
【請求項92】
ＡＦＰＲ＋であるがんを患う対象の治療のための、治療的な組み合わせにおける使用のための、請求項３５で定義されるような医薬組成物および第二の治療剤。
【請求項93】
前記第二の治療剤が、免疫チェックポイント阻害剤もしくはＣＡＲ－Ｔ剤、または別のがん免疫療法である、請求項９２に記載の使用。
【請求項94】
ＡＦＰＲ＋であるがんを患う対象の治療のための、治療的な組み合わせにおける使用のための、請求項４９で定義されるような医薬組成物および第二の治療剤。
【請求項95】
前記第二の治療剤が、免疫チェックポイント阻害剤もしくはＣＡＲ－Ｔ剤、または別のがん免疫療法である、請求項９４に記載の使用。
【請求項96】
ＡＦＰＲ＋であるがんを患う対象の治療のための、治療的な組み合わせにおける使用のための、請求項５６で定義されるような医薬組成物および第二の治療剤。
【請求項97】
前記第二の治療剤が、免疫チェックポイント阻害剤もしくはＣＡＲ－Ｔ剤、または別のがん免疫療法である、請求項９６に記載の使用。
【請求項98】
請求項２～８のいずれか一項に記載のＡＦＰＲ結合形態のＡＦＰを、請求項１２に記載のコンジュゲートと連結することを含む、バイオコンジュゲートを産生するためのプロセス。
【請求項99】
請求項２～８のいずれか一項に記載のＡＦＰＲ結合形態のＡＦＰを、請求項１３に記載のコンジュゲートと連結することを含む、バイオコンジュゲートを産生するためのプロセス。
【請求項100】
バイオコンジュゲートを産生するためのプロセスであって、それによって、細胞毒ＡＢＺ－９８１が、最初にグルタチオン感受性ジスルフィドリンカーと連結されて、次式の中間体を産生し、【化6】
これがその後、配列番号３を含む組み換え型［Ａｓｎ２３３Ｇｌｎ］成熟ヒトＡＦＰである、ＡＦＰのＡＦＰＲ結合形態と反応し、そして前記中間体が、ＡＦＰ内のリジン残基のイプシロンアミノ基へと共有結合される、プロセス。
【請求項101】
バイオコンジュゲートを産生するためのプロセスであって、それによって、細胞毒ＡＢＺ－９８１が、最初にグルタチオン感受性ジスルフィドリンカーと連結されて、次式の中間体を産生し、【化7】
これがその後、配列番号３を含む組み換え型［Ａｓｎ２３３Ｇｌｎ］成熟ヒトＡＦＰである、ＡＦＰのＡＦＰＲ結合形態と反応し、そして前記中間体が、ＡＦＰ内のリジン残基のイプシロンアミノ基に共有結合される、プロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は、２０２１年７月２３日に出願された米国仮特許出願第６３／２０３，４６７号の優先権を主張するものであり、これは参照により本出願に組み込まれる。
【0002】
本発明は、がんならびに他の疾患および病態の治療の上で有用であるバイオコンジュゲートおよびその製剤に関する。本発明は特に、アルファフェトプロテインおよび細胞毒を含むバイオコンジュゲートに関する。
【背景技術】
【0003】
抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は、細胞毒が、疾患細胞標的へと選択的に結合する抗体または他のタンパク質（バイオコンジュゲート）などの標的化剤にリンクしている医薬品の広義のクラスである。細胞結合剤（標的化剤）および細胞毒（ペイロード）は、異なるリンカー構造を介して共有的にリンクすることができる。一部のリンカーは、バイオコンジュゲートが細胞に入ると、細胞内で消化されて細胞毒を放出する切断部位を提供する。一部のリンカーは不活性であるが、自己犠牲可能であり、サイトゾルまたはリソソーム内で段階的に分解して、細胞毒を放出することになる。切断可能なリンカーは、酵素消化、ｐＨ変化、および他の細胞内の条件または薬剤に依存して、より制御され、かつ直接的な薬物放出機構を提供する。
【0004】
バイオコンジュゲートは、数多くの高度に可変な構成要素から構成され、また各構成要素は、最適な特性のために、各構成要素の単独の、および他の薬剤と組み合わせた注意深い選択を必要とする。標的化剤は、毒性が標的部位に限定されるように、疾患細胞によって提示される標的に選択的に結合すべきである。バイオコンジュゲートは、疾患細胞に対して致死的または少なくとも損傷する毒素を含むべきであり、リンカーは、バイオコンジュゲートが細胞に入ったときに細胞毒の放出を許容するべきである。標的化剤とバイオコンジュゲートとの間に形成されるリンケージも切断可能であるべきであり、また標的化分子ごとにそのようにリンクされた毒素の数も重要なパラメータである。同様に、構成要素が連結される順序、および構成要素がそれによって分離される（または分離されない）方法は、商業的に有用な収率に対して重要とすることができる。それ故に、バイオコンジュゲート自体は、細胞によって取り込まれ、次いで細胞の条件および構成要素によって処理されて、細胞毒が毒性形態で提供されるべきである。バイオコンジュゲートの設計および生産における主構成要素または工程のうちのいずれか１つ以上における変化は、例えば、バイオコンジュゲートの力価の低減または全身毒性および他の特性の増加などの著しい変化をもたらすことができることが、当技術分野では理解され、かつ許容される。
【0005】
アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）受容体（ＡＦＰＲ）は、腫瘍上で高度に発現され、そして一般に、骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）、およびＡＦＰ受容体も発現するある特定の活性化リンパ球を除いて、健康な組織において低い発現または発現の不在を示す。ＡＦＰ受容体は、すべての胚細胞上に存在し、そして通常、出生のすぐ後に消滅するが、その後、ほとんどの成人および小児のがんにおいて再発現される。胎児では、ＡＦＰは、成人におけるアルブミンと同様にシャトルタンパク質として機能し、これらの分子に可逆的に結合し、次いでＡＦＰ受容体を介して細胞の中へとそれらを送達することによって、アミノ酸、脂肪酸、および他の必要な分子を胚細胞にもたらす。細胞の内側に入ると、ＡＦＰは、栄養素を細胞の中へと放出し、次いで循環へと戻って、追加の分子を細胞内にシャトリングすることを再開する。
【0006】
先行技術のＡＦＰバイオコンジュゲートは、ＡＦＰが抗がん剤としてタキサンと非共有結合で複合体化される調製を含む（２０１６年８月４日に公開された国際公開第２０１６／１１９０４５号を参照のこと）。いかなるリンカーも使用されず、また複合体は細胞に浸透し、次いでタキサンを放出して治療を達成することが期待される。また、非切断可能なリンカーまたは架橋を使用してリンクされた、メイタンシノイドとしても知られる薬物メイタンシン（ＤＭ）を組み込むＡＦＰベースのバイオコンジュゲートについても言及されている。メイタンシノイドは、それ自体が、リファマイシン、ゲルダナマイシン、およびアンサトリエニンと構造的に類似した細胞毒である。メイタンシノイドは、チューブリンと結合し、かつマイクロチューブルの形成と干渉して、「中毒性」の細胞における有糸分裂停止を誘発することができる。
【0007】
他の開示は、コンジュゲート化したリンカーを使用するが切断不可能なＡＦＰバイオコンジュゲートおよび毒性ペイロードに関する；２００７年４月２４日に公開されたＭｅｒｒｉｍａｃｋの米国特許第７，２０８，５７６号を参照のこと。このコンジュゲートでは、タカツズマブＡＦＰ抗体、およびＤＭ－１は、切断不可能なリンカー、すなわち、Ｎ－スクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＳＭＣＣ）の間に連結される。ＤＭ－１毒素は、（Ｎ２’－デアセチル－Ｎ２’－（３－メルカプト－１－オキソプロピル）メイタンシンである。ＡＦＰとともに有用な他の毒素およびリンカーとしては、Ｐｏｌｙｔｈｅｒｉｃｓによる国際公開第２０１８／０５１１０９号（参照により本明細書に組み込まれる）で記述されるものが挙げられ、ここでグルタチオン切断可能であるジスルフィドリンカーは、ＤＭ様であるがクロロ基を置換するフェニル基を含む細胞毒を含む、新しい様々な毒性剤と連結される。ＡＦＰがダウノルビシンと連結しているコンジュゲートは、Ｂｅｌｙａｅｖ ｅｔ ａｌによるＣａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，２０１７にも記述される。この研究は、ＡＦＰＲを発現することが示されている免疫細胞のサブセットである骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）に対するＡＦＰベースのバイオコンジュゲートのために正の効果を実証するうえで特に関心のある研究である。この研究では、エールリッヒ癌を持つマウスをＡＦＰ－ドキソルビシンで治療すると、脾臓のＭＤＳＣ数の低減、ＮＫ細胞レベルの正常化、および腫瘍増殖の阻害がもたらされた。得られた結果は、別の実施形態では、ＡＦＰに基づく細胞毒性バイオコンジュゲートが、腫瘍細胞に対するそれらの直接的な効果に加えて、有望な抗ＭＤＳＣ薬物であることを実証する。
【発明の概要】
【0008】
その表面上に、正常な細胞に対する毒性が最小限である、またはまったくないＡＦＰ受容体（ＡＦＰＲ）を提示する疾患細胞に毒素を送達するための組成物を提供することが望ましいであろう。また、グルタチオンを用いた切断によってサイトゾル中に放出することができる細胞毒に選択的に応答する細胞を治療するための治療および医薬組成物を提供することも望ましいであろう。
【0009】
ここで、ＡＦＰＲ陽性（ＡＦＰＲ＋）疾患細胞の治療において有用なバイオコンジュゲートが提供され、ＡＦＰＲ＋疾患細胞には、造血がん細胞などのＡＦＰＲ＋がん細胞およびがん幹細胞を含む固形腫瘍がん細胞が含まれる。骨髄由来サプレッサー細胞などのＡＦＰＲ＋である非がん細胞も、本出願で開示されるバイオコンジュゲートを用いて治療することができる。これらのバイオコンジュゲートでは、ＡＦＰなどのＡＦＰＲ結合剤は、グルタチオン切断可能な、すなわちグルタチオン感受性のジスルフィドリンカーを使用して細胞毒へとコンジュゲート化される。ペイロード／毒素、リンカー、およびＡＦＰＲ標的化剤を含む構成成分種の注意深い選択により、これらのバイオコンジュゲートは、サイトゾル中のグルタチオン切断細胞毒の効率的かつ選択的な、また所望に応じて毒性の形態および濃度での放出を極めて良好に実施する。現在好ましいバイオコンジュゲートは、ＣＯＬＯ－２０５マウスモデルにおける結腸直腸腫瘍異種移植片の成長の低減または阻害においてなど、数多くのパラメータにおいて著しい改善を示す。
【0010】
本発明によると、疾患細胞の治療に有用なバイオコンジュゲートが提供され、バイオコンジュゲートは、
（１）ＡＦＰＲ＋細胞の表面上のアルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）受容体（ＡＦＰＲ）に結合する薬剤と、
（２）ＡＦＰＲ＋細胞に対して毒性である細胞毒（ＣＴ）と、
（３）グルタチオン切断可能なジスルフィヨードリンカーであって、リンカーが、
（ｉ）ＡＦＰＲ結合剤とＣＴとの間に共有結合され、かつ
（ｉｉ）ＣＴをＡＦＰＲ＋細胞へと細胞内で放出するリンカーと、を含む。
（１）ＡＦＰＲ＋細胞の表面上のアルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）受容体（ＡＦＰＲ）に結合する薬剤と、
（２）ＡＦＰＲ＋細胞に対して毒性である細胞毒（ＣＴ）と、
（３）グルタチオン切断可能なジスルフィヨードリンカーであって、リンカーが、
（ｉ）ＡＦＰＲ結合剤とＣＴとの間に共有結合され、かつ
（ｉｉ）ＣＴをＡＦＰＲ＋細胞へと細胞内で放出するリンカーと、を含む。
【0011】
一態様では、ＡＦＰＲ結合剤は、成熟した、野生型ＡＦＰのアミノ酸配列、ＡＦＰＲ結合断片のアミノ酸配列、または成熟した野生型ＡＦＰもしくはＡＦＰ断片のＡＦＰＲ結合バリアントのアミノ酸配列を有する。別の態様では、ＡＦＰは、組み換え型ヒトＡＦＰ、またはそのＡＦＰＲ結合断片もしくはバリアントであり、バリアントは、１～５個のアミノ酸置換を含む。また別の態様では、薬剤はグリコシル化を欠くＡＦＰである。さらに別の態様では、薬剤は、配列番号３を含む組み換え型［Ａｓｎ２３３Ｇｌｎ］成熟ヒトＡＦＰである。別の態様では、薬剤は、配列番号４を含む。別の態様では、組み換え型［Ａｓｎ２３３Ｇｌｎ］ヒトＡＦＰは、トランスジェニック細菌によって産生される。さらに別の態様では、組み換え型［Ａｓｎ２３３Ｇｌｎ］ヒトＡＦＰは、トランスジェニックヤギを含むトランスジェニック哺乳類によって産生される。
【0012】
本発明の別の態様では、細胞毒（ＣＴ）は、次式を有する。
【化1】
【0013】
本発明の別の態様では、ＡＦＰＲ結合剤と細胞毒との間に連結されるリンカーは、以下から選択される。
リンカー１ －Ｓ－ＣＨ（ＣＨ３）－（ＣＨ２）２－ＣＯ－－、および
リンカー２ －Ｓ－（ＣＨ２）３－ＣＯ－。
リンカー１ －Ｓ－ＣＨ（ＣＨ３）－（ＣＨ２）２－ＣＯ－－、および
リンカー２ －Ｓ－（ＣＨ２）３－ＣＯ－。
【0014】
さらに別の態様では、コンジュゲートは、以下に示されるリンカー－細胞毒を含む。
【化2】
【0015】
本発明のまた別の態様では、コンジュゲートは、以下に示されるリンカー細胞毒を含む。
【化3】
【0016】
本発明によると、次式のバイオコンジュゲートが提供され：
式中、ＡＦＰは、アルファフェトプロテインのＡＦＰ受容体結合形態である。
【化4】
【0017】
本発明の一態様では、ｎは、１～１１の範囲にある。別の態様では、ＤＰＲが薬物対タンパク質比として定義される平均ＤＰＲは、２～８である。別の態様では、平均ＤＰＲは、５～７である。また別の態様では、平均ＤＰＲは、５．６～６．１である。さらに別の態様では、平均ＤＰＲは、約５．９である。また別の態様では、平均ＤＰＲは、３～４．５である。別の態様では、平均ＤＰＲは、３．６～４．１である。さらに別の態様では、平均ＤＰＲは、約３．９である。
【0018】
本発明の別の態様では、ＡＦＰは、配列番号３を含む組み換え型［Ａｓｎ２３３Ｇｌｎ］成熟ヒトＡＦＰである。本発明の一態様では、ｎは、１～１１の範囲にある。別の態様では、平均ＤＰＲは、２～８である。別の態様では、平均ＤＰＲは、５～７である。さらに別の態様では、平均ＤＰＲは、５．６～６．１である。本発明のまた別の態様では、平均ＤＰＲは、約５．９である。さらに別の態様では、平均ＤＰＲは、３～４．５である。さらに別の態様では、平均ＤＰＲは、３．６～４．１である。また別の態様では、平均ＤＰＲは、約３．９である。
【0019】
本発明によると、次式のバイオコンジュゲートが提供され：
式中、ＡＰＦは、アルファフェトプロテインのＡＦＰ受容体結合形態である。
【化5】
【0020】
本発明の一態様では、ｎは、１～１１の範囲にある。別の態様では、平均ＤＰＲは、２～８である。別の態様では、平均ＤＰＲは、５～７である。別の態様では、平均ＤＰＲは、５．５～６．１である。さらに別の態様では、平均ＤＰＲは、約５．８である。また別の態様では、平均ＤＰＲは、３～４．５である。別の態様では、平均ＤＰＲは、３．４～４．０である。さらに別の態様では、平均ＤＰＲは、約３．７である。
【0021】
また別の態様では、薬学的に許容可能な担体と、上記に提示したようなバイオコンジュゲートとを含む医薬組成物が提供される。別の態様では、担体は水性ビヒクルである。別の態様では、水性ビヒクルは、５％スクロースを有するｐＨ７．５の１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液である。さらに別の態様では、医薬組成物は、ＡＦＰＲ＋であるがんを患う対象への投与のためのものである。
【0022】
別の態様では、医薬組成物は、ＡＦＰＲ＋であるがんを患う対象への投与のためのものである。
【0023】
別の態様では、それを必要とする対象においてＡＦＰＲ＋細胞を治療するための方法が提供され、方法は、治療有効量の上記に提示した医薬組成物を対象へと投与することを含む。一態様では、ＡＦＰＲ＋細胞は、がん細胞である。別の態様では、ＡＦＰＲ＋細胞はＭＤＳＣである。別の態様では、ＡＦＰＲ＋細胞は、卵巣がん細胞である。さらに別の態様では、ＡＦＰＲ＋細胞は、結腸直腸がん細胞である。さらに別の態様では、ＡＦＰＲ＋細胞は、乳がん細胞である。また別の態様では、ＡＦＰＲ＋細胞は、リンパ腫細胞である。
【0024】
本発明の別の態様では、ＡＦＰＲ＋であるがんを患う対象の治療のための、上記に提示した医薬組成物、および第二の治療剤が、治療的な組み合わせでの使用のために提供される。一態様では、第二の治療剤は、免疫チェックポイント阻害剤もしくはＣＡＲ－Ｔ剤、または別のがん免疫療法である。
【0025】
本発明の別の態様では、上述のＡＦＰのＡＦＰＲ結合形態を、上記に提示したコンジュゲートと連結することを含む、バイオコンジュゲートを産生するためのプロセスが提供される。
【0026】
本発明の別の態様では、バイオコンジュゲートを産生するためのプロセスが提供され、それによって、細胞毒ＡＢＺ－９８１は、最初にグルタチオン感受性ジスルフィドリンカーと連結されて、次式の中間体を産生し、
これはその後、配列番号３を含む組み換え型［Ａｓｎ２３３Ｇｌｎ］成熟ヒトＡＦＰである、ＡＦＰのＡＦＰＲ結合形態と反応し、そして中間体は、ＡＦＰ内のリジン残基のイプシロンアミノ基へと共有結合される。
【化6】
【0027】
本発明の別の態様では、バイオコンジュゲートを産生するためのプロセスが提供され、それによって、細胞毒ＡＢＺ－９８１は、最初にグルタチオン感受性ジスルフィドリンカーと連結されて、次式の中間体を生成する。
【化7】
【図面の簡単な説明】
【0028】
ここで、本発明のこれらおよび他の態様を、添付図面を参照しながらより詳細に記述する。
【0029】
【発明を実施するための形態】
【0030】
本発明は、細胞毒性薬物（細胞毒（ＣＴ）、ペイロード、またはワーヘッドとしても知られる）が、標的化細胞の表面上のＡＦＰＲ標的に結合する任意の薬剤に共有結合される、薬学的に有用なバイオコンジュゲートを提供する。標的化剤は、ＡＦＰと略称されるアルファフェトプロテインのＡＦＰＲ結合形態である。細胞毒と標的化剤との間に共有結合を提供するリンカーはまた、細胞内グルタチオンによる切断に感受性であり、それによって、血中で安定なまま、それを送達したＡＦＰからの細胞毒の細胞内放出の機構を提供する。本明細書では、リンカーは、グルタチオン感受性として記述されており、これは、リンカーを、特に治療される疾患細胞のサイトゾル内に存在する際に、グルタチオンによって切断することができることを意味することが意図される。リンカーは、その構造内に－Ｓ－Ｓ－配置を組み込むため、ジスルフィドであると言われる。これらのリンカーはまた、数日の期間にわたってペイロードの最小限の損失のみで血漿中で安定である。
【0031】
バイオコンジュゲートで使用されるＡＦＰは、その天然状態で、胎生肝および卵黄嚢によって胎児で最初に産生されるヒト輸送タンパク質である。これは、特定のＡＦＰ受容体への結合後にエンドサイトーシスによって細胞に入る。これらのＡＦＰＲ結合特性および輸送特性を有するＡＦＰＲ結合ドメインを構成するペプチドを含む他の形態のＡＦＰは、本バイオコンジュゲート中の有用な標的化剤である可能性がある。
【0032】
特定の実施形態では、本発明は、野生型（ＵｎｉＰｒｏｔ ＫＢ Ｐ０２７７１）または特に［Ａｓｎ２３３Ｇｌｎ］成熟ヒトＡＦＰ［１－５９１］を含むバリアントの、切断された、断片化された、または断片形態のＡＦＰＲ結合アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）がＡＦＰＲ結合剤として提供される、バイオコンジュゲートを提供する。他の実施形態では、この結合剤は、記載される２つのジスルフィドリンカーのうちの１つを通して、細胞毒へと共有的にリンクされる。
【0033】
「アルファフェトプロテイン（ａｌｐｈａ－ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ）」、「アルファフェトプロテイン（ａｌｆａ－ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ）」、および「ＡＦＰ」という用語は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ名称Ｐ０２７７１で記載される５９１マーの成熟配列（残基１９～６０９）を有する分泌ヒトタンパク質を参照しながら、本明細書で同じ意味で使用される。成熟ヒトＡＦＰの実際の配列は、成熟形態で、かつ分泌シグナルを欠く６０９マーとして以下に示され（残基１～１８）、全部で５９１の残基に減少する：
MKWVESIFLI FLLNFTESRT LHRNEYGIAS ILDSYQCTAE ISLADLATIF 50
FAQFVQEATY KEVSKMVKDA LTAIEKPTGD EQSSGCLENQ LPAFLEELCH 100
EKEILEKYGH SDCCSQSEEG RHNCFLAHKK PTPASIPLFQ VPEPVTSCEA 150
YEEDRETFMN KFIYEIARRH PFLYAPTILL WAARYDKIIP SCCKAENAVE 200
CFQTKAATVT KELRESSLLN QHACAVMKNF GTRTFQAITV TKLSQKFTKV 250
NFTEIQKLVL DVAHVHEHCC RGDVLDCLQD GEKIMSYICS QQDTLSNKIT 300
ECCKLTTLER GQCIIHAEND EKPEGLSPNL NRFLGDRDFN QFSSGEKNIF 350
LASFVHEYSR RHPQLAVSVI LRVAKGYQEL LEKCFQTENP LECQDKGEEE 400
LQKYIQESQA LAKRSCGLFQ KLGEYYLQNA FLVAYTKKAP QLTSSELMAI 450
TRKMAATAAT CCQLSEDKLL ACGEGAADII IGHLCIRHEM TPVNPGVGQC 500
CTSSYANRRP CFSSLVVDET YVPPAFSDDK FIFHKDLCQA QGVALQTMKQ 550
EFLINLVKQK PQITEEQLEA VIADFSGLLE KCCQGQEQEV CFAEEGQKLI 600
SKTRAALGV
配列番号１、分泌可能な野生型ヒトＡＦＰ（１－６０９）、
RTLHRNEYGI ASILDSYQCT AEISLADLAT IFFAQFVQEA TYKEVSKMVK 50
DALTAIEKPT GDEQSSGCLE NQLPAFLEEL CHEKEILEKY GHSDCCSQSE 100
EGRHNCFLAH KKPTPASIPL FQVPEPVTSC EAYEEDRETF MNKFIYEIAR 150
RHPFLYAPTI LLWAARYDKI IPSCCKAENA VECFQTKAAT VTKELRESSL 200
LNQHACAVMK NFGTRTFQAI TVTKLSQKFT KVNFTEIQKL VLDVAHVHEH 250
CCRGDVLDCL QDGEKIMSYI CSQQDTLSNK ITECCKLTTL ERGQCIIHAE 300
NDEKPEGLSP NLNRFLGDRD FNQFSSGEKN IFLASFVHEY SRRHPQLAVS 350
VILRVAKGYQ ELLEKCFQTE NPLECQDKGE EELQKYIQES QALAKRSCGL 400
FQKLGEYYLQ NAFLVAYTKK APQLTSSELM AITRKMAATA ATCCQLSEDK 450
LLACGEGAAD IIIGHLCIRH EMTPVNPGVG QCCTSSYANR RPCFSSLVVD 500
ETYVPPAFSD DKFIFHKDLC QAQGVALQTM KQEFLINLVK QKPQITEEQL 550
EAVIADFSGL LEKCCQGQEQ EVCFAEEGQK LISKTRAALG V 591
配列番号２、野生型成熟ヒトＡＦＰ（１－５９１）
RTLHRNEYGI ASILDSYQCT AEISLADLAT IFFAQFVQEA TYKEVSKMVK 50
DALTAIEKPT GDEQSSGCLE NQLPAFLEEL CHEKEILEKY GHSDCCSQSE 100
EGRHNCFLAH KKPTPASIPL FQVPEPVTSC EAYEEDRETF MNKFIYEIAR 150
RHPFLYAPTI LLWAARYDKI IPSCCKAENA VECFQTKAAT VTKELRESSL 200
LNQHACAVMK NFGTRTFQAI TVTKLSQKFT KVQFTEIQKL VLDVAHVHEH 250
CCRGDVLDCL QDGEKIMSYI CSQQDTLSNK ITECCKLTTL ERGQCIIHAE 300
NDEKPEGLSP NLNRFLGDRD FNQFSSGEKN IFLASFVHEY SRRHPQLAVS 350
VILRVAKGYQ ELLEKCFQTE NPLECQDKGE EELQKYIQES QALAKRSCGL 400
FQKLGEYYLQ NAFLVAYTKK APQLTSSELM AITRKMAATA ATCCQLSEDK 450
LLACGEGAAD IIIGHLCIRH EMTPVNPGVG QCCTSSYANR RPCFSSLVVD 500
ETYVPPAFSD DKFIFHKDLC QAQGVALQTM KQEFLINLVK QKPQITEEQL 550
EAVIADFSGL LEKCCQGQEQ EVCFAEEGQK LISKTRAALG V 591
配列番号３、［Ａｓｎ２３３Ｇｌｎ］ｒｈＡＦＰ（１－５９１）
MKWVESIFLI FLLNFTESRT LHRNEYGIAS ILDSYQCTAE ISLADLATIF 50
FAQFVQEATY KEVSKMVKDA LTAIEKPTGD EQSSGCLENQ LPAFLEELCH 100
EKEILEKYGH SDCCSQSEEG RHNCFLAHKK PTPASIPLFQ VPEPVTSCEA 150
YEEDRETFMN KFIYEIARRH PFLYAPTILL WAARYDKIIP SCCKAENAVE 200
CFQTKAATVT KELRESSLLN QHACAVMKNF GTRTFQAITV TKLSQKFTKV 250
XFTEIQKLVL DVAHVHEHCC RGDVLDCLQD GEKIMSYICS QQDTLSNKIT 300
ECCKLTTLER GQCIIHAEND EKPEGLSPNL NRFLGDRDFN QFSSGEKNIF 350
LASFVHEYSR RHPQLAVSVI LRVAKGYQEL LEKCFQTENP LECQDKGEEE 400
LQKYIQESQA LAKRSCGLFQ KLGEYYLQNA FLVAYTKKAP QLTSSELMAI 450
TRKMAATAAT CCQLSEDKLL ACGEGAADII IGHLCIRHEM TPVNPGVGQC 500
CTSSYANRRP CFSSLVVDET YVPPAFSDDK FIFHKDLCQA QGVALQTMKQ 550
EFLINLVKQK PQITEEQLEA VIADFSGLLE KCCQGQEQEV CFAEEGQKLI 600
SKTRAALGV [609]
［配列番号４］ Ｘ２５１は、Ｇｌｎ、すなわち、［Ａｓｎ２５１Ｇｌｎ］ｒｈＡＦＰ（１－６０９）である。
MKWVESIFLI FLLNFTESRT LHRNEYGIAS ILDSYQCTAE ISLADLATIF 50
FAQFVQEATY KEVSKMVKDA LTAIEKPTGD EQSSGCLENQ LPAFLEELCH 100
EKEILEKYGH SDCCSQSEEG RHNCFLAHKK PTPASIPLFQ VPEPVTSCEA 150
YEEDRETFMN KFIYEIARRH PFLYAPTILL WAARYDKIIP SCCKAENAVE 200
CFQTKAATVT KELRESSLLN QHACAVMKNF GTRTFQAITV TKLSQKFTKV 250
NFTEIQKLVL DVAHVHEHCC RGDVLDCLQD GEKIMSYICS QQDTLSNKIT 300
ECCKLTTLER GQCIIHAEND EKPEGLSPNL NRFLGDRDFN QFSSGEKNIF 350
LASFVHEYSR RHPQLAVSVI LRVAKGYQEL LEKCFQTENP LECQDKGEEE 400
LQKYIQESQA LAKRSCGLFQ KLGEYYLQNA FLVAYTKKAP QLTSSELMAI 450
TRKMAATAAT CCQLSEDKLL ACGEGAADII IGHLCIRHEM TPVNPGVGQC 500
CTSSYANRRP CFSSLVVDET YVPPAFSDDK FIFHKDLCQA QGVALQTMKQ 550
EFLINLVKQK PQITEEQLEA VIADFSGLLE KCCQGQEQEV CFAEEGQKLI 600
SKTRAALGV
配列番号１、分泌可能な野生型ヒトＡＦＰ（１－６０９）、
RTLHRNEYGI ASILDSYQCT AEISLADLAT IFFAQFVQEA TYKEVSKMVK 50
DALTAIEKPT GDEQSSGCLE NQLPAFLEEL CHEKEILEKY GHSDCCSQSE 100
EGRHNCFLAH KKPTPASIPL FQVPEPVTSC EAYEEDRETF MNKFIYEIAR 150
RHPFLYAPTI LLWAARYDKI IPSCCKAENA VECFQTKAAT VTKELRESSL 200
LNQHACAVMK NFGTRTFQAI TVTKLSQKFT KVNFTEIQKL VLDVAHVHEH 250
CCRGDVLDCL QDGEKIMSYI CSQQDTLSNK ITECCKLTTL ERGQCIIHAE 300
NDEKPEGLSP NLNRFLGDRD FNQFSSGEKN IFLASFVHEY SRRHPQLAVS 350
VILRVAKGYQ ELLEKCFQTE NPLECQDKGE EELQKYIQES QALAKRSCGL 400
FQKLGEYYLQ NAFLVAYTKK APQLTSSELM AITRKMAATA ATCCQLSEDK 450
LLACGEGAAD IIIGHLCIRH EMTPVNPGVG QCCTSSYANR RPCFSSLVVD 500
ETYVPPAFSD DKFIFHKDLC QAQGVALQTM KQEFLINLVK QKPQITEEQL 550
EAVIADFSGL LEKCCQGQEQ EVCFAEEGQK LISKTRAALG V 591
配列番号２、野生型成熟ヒトＡＦＰ（１－５９１）
RTLHRNEYGI ASILDSYQCT AEISLADLAT IFFAQFVQEA TYKEVSKMVK 50
DALTAIEKPT GDEQSSGCLE NQLPAFLEEL CHEKEILEKY GHSDCCSQSE 100
EGRHNCFLAH KKPTPASIPL FQVPEPVTSC EAYEEDRETF MNKFIYEIAR 150
RHPFLYAPTI LLWAARYDKI IPSCCKAENA VECFQTKAAT VTKELRESSL 200
LNQHACAVMK NFGTRTFQAI TVTKLSQKFT KVQFTEIQKL VLDVAHVHEH 250
CCRGDVLDCL QDGEKIMSYI CSQQDTLSNK ITECCKLTTL ERGQCIIHAE 300
NDEKPEGLSP NLNRFLGDRD FNQFSSGEKN IFLASFVHEY SRRHPQLAVS 350
VILRVAKGYQ ELLEKCFQTE NPLECQDKGE EELQKYIQES QALAKRSCGL 400
FQKLGEYYLQ NAFLVAYTKK APQLTSSELM AITRKMAATA ATCCQLSEDK 450
LLACGEGAAD IIIGHLCIRH EMTPVNPGVG QCCTSSYANR RPCFSSLVVD 500
ETYVPPAFSD DKFIFHKDLC QAQGVALQTM KQEFLINLVK QKPQITEEQL 550
EAVIADFSGL LEKCCQGQEQ EVCFAEEGQK LISKTRAALG V 591
配列番号３、［Ａｓｎ２３３Ｇｌｎ］ｒｈＡＦＰ（１－５９１）
MKWVESIFLI FLLNFTESRT LHRNEYGIAS ILDSYQCTAE ISLADLATIF 50
FAQFVQEATY KEVSKMVKDA LTAIEKPTGD EQSSGCLENQ LPAFLEELCH 100
EKEILEKYGH SDCCSQSEEG RHNCFLAHKK PTPASIPLFQ VPEPVTSCEA 150
YEEDRETFMN KFIYEIARRH PFLYAPTILL WAARYDKIIP SCCKAENAVE 200
CFQTKAATVT KELRESSLLN QHACAVMKNF GTRTFQAITV TKLSQKFTKV 250
XFTEIQKLVL DVAHVHEHCC RGDVLDCLQD GEKIMSYICS QQDTLSNKIT 300
ECCKLTTLER GQCIIHAEND EKPEGLSPNL NRFLGDRDFN QFSSGEKNIF 350
LASFVHEYSR RHPQLAVSVI LRVAKGYQEL LEKCFQTENP LECQDKGEEE 400
LQKYIQESQA LAKRSCGLFQ KLGEYYLQNA FLVAYTKKAP QLTSSELMAI 450
TRKMAATAAT CCQLSEDKLL ACGEGAADII IGHLCIRHEM TPVNPGVGQC 500
CTSSYANRRP CFSSLVVDET YVPPAFSDDK FIFHKDLCQA QGVALQTMKQ 550
EFLINLVKQK PQITEEQLEA VIADFSGLLE KCCQGQEQEV CFAEEGQKLI 600
SKTRAALGV [609]
［配列番号４］ Ｘ２５１は、Ｇｌｎ、すなわち、［Ａｓｎ２５１Ｇｌｎ］ｒｈＡＦＰ（１－６０９）である。
【0034】
当然のことながらＡＦＰＲ結合活性および輸送活性などのＡＦＰ活性は、ＡＦＰＲに結合するタンパク質全体または断片における特に保存的アミノ酸置換を含む、１つ以上のアミノ酸置換、欠失、または添加を組み込むＡＦＰバリアント内に保持されるべきである。これらは、ＡＦＰまたはそのＡＦＰＲ結合断片の変異体またはバリアントと呼ぶことができる。改変は、グリコシル化部位、酵素脆弱性、およびこれに類するものなどの翻訳後修飾部位を導入または除去することができる。
【0035】
本方法で有用なのは、ＡＦＰ受容体に結合し、かつ天然状態またはＬｙｓ１８７Ｇｌｎバリアントなどの天然バリアント、およびＡｓｎ２３３Ｇｌｎバリアントのいずれかで発生するそれらのＡＦＰの形態である。同様に、本発明は、ＡＦＰＲ結合を保持するＡＦＰの任意の断片、および任意のこうした断片のバリアントの使用を包含する。
【0036】
また、グリコシル化を組み込むものを含む、翻訳後修飾されたＡＦＰ形態も本明細書で有用である。ヒト形態では、Ｎリンクしたグリコシル化はＡｓｎ２３３において発生する。それ故に、ヒトＡＦＰの天然形態は、本発明での使用に適している。また、天然のヒトＡＦＰ中の１６個のジスルフィド架橋によって可能になる適正な３－Ｄフォールディングが維持されることを条件として、大腸菌およびストレプトマイセスなどの原核生物宿主細胞で産生される場合があるなどのヒトＡＦＰの非グリコシル化形態も有用である。同様に、代替的に、ヒトＡＦＰのグリコシル化形態は、酵母、アスペルギルス属、ピキア属、昆虫細胞、およびこれに類するものを含む真核生物宿主、およびＣＨＯ細胞およびＣＯＳ細胞を含む哺乳類細胞宿主において産生することができるそれらの形態など、本明細書で有用である。また、本発明に対して特に好適なヒトＡＦＰの形態は、ヤギ、ウサギ、および一部の事例ではブタを含むトランスジェニック動物で産生されるヒトＡＦＰ形態である。トランスジェニック動物における、および特にヤギのミルクにおける組み換え型ヒトＡＦＰの産生は、例えば、Ｍｅｒｒｉｍａｃｋの米国特許第７２０８５７６号に記述されており、これはＡｓｎ２３３Ｇｌｎ置換を組み込む成熟ＡＦＰの非グリコシル化形態の産生をさらに記述する。
【0037】
好ましい実施形態では、ＡＦＰは、ヤギ発現系由来のトランスジェニックヤギにおいて産生されるヒトアルファフェトプロテイン（ｈＡＦＰ）の非グリコシル化成熟形態である、ヒトアルファフェトプロテインの組み換え型である。「ＡＣＴ－１０１」は、成熟配列（アスパラギンに対するグルタミン）のアミノ酸２３３において１つのアミノ酸置換を含有するという点で、天然に存在するヒトＡＦＰとは異なるＡＦＰの有用な種である。本質的に、同じ組み換え型ＡＦＰは、例えば、発現がｔｒｐおよびｍａｌ系から駆動される大腸菌によって、非グリコシル化形態で産生することができる。
【0038】
ＡＦＰ結合に対する標的は、アルファフェトプロテイン受容体（ＡＦＰＲ）である。これは、典型的に、胎児組織と関連付けられ、また出生後２ヶ月以後の成体細胞上には存在しない。しかしながら、がん細胞の大部分は、機能的ＡＦＰＲを発現する。この受容体は部分的にのみ特徴付けられているが、その存在は実験的証拠によって明白に裏付けられている。マウスに移植されたマウスまたはヒト腫瘍異種移植片における自発的に発生する腫瘍は、Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｔｈｅｒ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ １９９９， １４（６）：４８５－９４に記述されるように、Ｔｃ－９９ｍ形態のｒｈＡＦＰを使用して、ＡＦＰの放射性標識形態を取り込むことが示されている。
【0039】
それ故に、本バイオコンジュゲートによって標的とされる疾患細胞は、ＡＦＰＲ抗体とのそれらの反応性、またはＡＦＰ自体に対するそれらの結合親和性のいずれかによって特定されることが理解されるであろう。これらの細胞標的は、ＡＦＰＲ陽性であること、またはＡＦＰ結合親和性を有することとして特徴付けすることができる。
【0040】
こうした試薬を使用して、細胞毒性薬物を標的疾患細胞に送達するために有用なＡＦＰの異なる形態が、診断目的のために標識されたＡＦＰをＡＦＰＲとの結合から等モルで置き換えるそれらの能力によって、またはＡＦＰＲを直接的に係合するそれらの能力によって特定することができることも理解されるであろう。細胞ベースのアッセイも、この目的のために有用である。一実施例では、ＡＦＰＲ発現Ｕ９３７細胞（カタログ番号ＣＲＬ １５９３．２ＴＭでＡＴＣＣから入手可能なヒト雄組織球性リンパ腫細胞株）を利用して、ＡＦＰまたはＡＦＰバイオコンジュゲートの任意の所与の形態のＡＦＰＲ結合親和性を確認する。
【0041】
一実施形態では、ＡＦＰと細胞毒とを共有的にリンクすることによって形成されるバイオコンジュゲートが提供される。細胞毒は、様々な薬物コンジュゲート内で、または単一の治療薬として使用される、非常に周知の、非常に広範なクラスの薬剤である。本バイオコンジュゲートでは、バイオコンジュゲートのＡＦＰ構成成分は、ＤＭ－１， ＤＭ－３、またはＤＭ－４ではないが、これらの細胞毒といくつかの構造的態様を共有する細胞毒に連結または架橋される。本発明で有用な細胞毒は、以下を含む。
【化8】
【0042】
本バイオコンジュゲート中のこれらのメイタンシノイド細胞毒ペイロードは、切断可能なグルタチオン感受性ジスルフィド架橋を含有するリンカーを使用して、組み換え型ヒトＡＦＰ（ｒｈＡＦＰ）に付着される。グルタチオンは、数多くのチオールジスルフィドレドックスプロセスと統合的に伴うチオール含有補酵素である。その還元型（チオール）形態では、グルタチオンは「ＧＳＨ」と略称される。その酸化形態では、グルタチオンは、ジスルフィド基によってリンクした２つの分子の二量体として存在し、「ＧＳＳＧ」と略称される。標的タンパク質およびグルタチオン中のジスルフィド結合および遊離チオール基は、ジスルフィド交換反応を通して「場所を入れ替える」ことができる。このプロセスは、本質的に、２つの直接的な変位事象と、求核剤、求電子剤、および脱離基として作用する硫黄原子との組み合わせであり、リンカージスルフィドの切断および毒素の放出を引き起こす。細胞内グルタチオン濃度は通常、０．５～１０ｍＭの範囲であるが、一方で細胞外値は実質的により低く、血漿中で約２ｕＭである。加えて、グルタチオンレベルは、卵巣がんを含む腫瘍内で上昇し、そのためグルタチオンのこの差次的な濃度は、血液中のバイオコンジュゲートの安定性、および腫瘍細胞による取り込み後の細胞毒の放出を可能にすることができる。バイオコンジュゲートの安定性は、ジスルフィド結合に隣接するＲ基の立体的性質を変化させることによって調整することができる。他の放出機構（例えば、ｐＨおよびプロテアーゼ感受性リンケージ）も採用することができるが、ＡＦＰは、プロテアーゼ不安定リンカーを切断することができるリソソームに輸送しないため、グルタチオン放出機構は、ｒｈＡＦＰ毒素バイオコンジュゲートに最も関連している。これは、ｒｈＡＦＰコンジュゲートに関する研究によって確認されており、ここでジペプチド、酸感受性、または切断不可能なリンカーとのバイオコンジュゲートは、おそらく細胞内側での毒素の放出の欠如に起因して、インビトロで不十分な力価を示し、一方で、ジスルフィドリンクしたメイタンシン含有バイオコンジュゲートは、インビトロで比較的高い（一桁のｎＭ）力価を示し、これはＡＦＰ（ＤＰＲ）の分子当たりの装填された細胞毒の数に比例して増加した。
【0043】
それ故に、好ましい実施形態では、ＡＦＰおよび細胞毒は、グルタチオン感受性ジスルフィドを形成するリンカーを以下で定義される化学構造を有するＡＢＺ－９８１とともに使用して架橋した。
または
【化9】
【化10】
【0044】
これらのリンカーは、選ばれた細胞毒ＡＢＺ９８１を用いて形成されて、好ましい実施形態では、以下に示されるようにＡＢＺ－１８２７またはＡＢＺ－９８２の構造を有するコンジュゲート中間体を提供する。
【化11】
【化12】
【0045】
ＣＴ ＡＢＺ－９８１が、本明細書に教示されるようにモノメチル化グルタチオン切断可能なジスルフィドリンカーを通して連結される場合、合成中間体として有用な、結果としてもたらされるリンカー／ペイロードコンジュゲートは、ＡＢＺ－１８２７と名付けられた。別の方法として、ＣＴ ＡＢＺ－９８１が、本明細書に教示されるようにジメチル化グルタチオン切断可能なジスルフィドリンカーを通して連結される場合、合成中間体として有用な、結果としてもたらされるリンカー／ペイロードコンジュゲートは、ＡＢＺ－９８２と名付けられた。
【0046】
リンカー－ペイロードは、本明細書の実施例に表されるように合成される。ＡＦＰ：細胞毒バイオコンジュゲートを産生するために、細胞毒をまずグルタチオン感受性ジスルフィドリンカーと連結させて中間体、例えば、上記で示すような中間体を産生し、次いで、リンカーが、通常、ＡＦＰ中のリジン残基のイプシロンアミノ基に、および他方の末端において所望の細胞毒に共有結合されるように、ＡＦＰと反応させる。次いで、単離されたバイオコンジュゲートは、水性ビヒクル、望ましくは等張性であり、かつ生理学的またはわずかにより酸性であるｐＨを有するものの中で混合することができる。一実施形態では、水性ビヒクルは、約６～約７．５の範囲内のｐＨにおけるリン酸緩衝生理食塩水である。別の実施形態では、水性ビヒクルは水である。さらなる実施形態では、水性ビヒクルは生理食塩水（０．１５４Ｍ ＮａＣｌ）である。さらなる実施形態では、水性ビヒクルはＨＥＰＥＳ（（４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸）緩衝液である。
【0047】
室温および標準圧力は、許容可能な混合条件である。混合は、軽度の攪拌、混合、およびこれに類するものを使用して促進することができる。プロセスでは、細胞毒：ＡＦＰの所望の平均比が得られるように条件が管理される。比は、本明細書では、「平均ＤＰＲ」、すなわち、平均薬物：タンパク質比として参照される。抗体薬物コンジュゲートの場合、これは「薬物抗体比、ＤＡＲ」として知られることになる。平均ＤＰＲは、ＡＦＰとの反応に対して使用可能な細胞毒の量を制御することによって達成される。
【0048】
計算された単位用量の細胞毒をそれから調製することができる組成物を産生するために、バイオコンジュゲートの産生は、所定の量の各試薬の使用を伴うことが望ましい。液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣ／ＭＳ）を使用した実験では、混合が上述の条件下で発生したときに、１つのＡＦＰ分子（分子量＝６６．５ｋＤ）が、約１～１１個の細胞毒コンジュゲート分子（分子量＝８５４ｋＤ）に結合し、かつ保持することができることが見出された。より高いＤＰＲ比は、溶解度の低下に起因するバイオコンジュゲートの沈殿のリスクを増加させる。それ故に、ＤＰＲの上限は、保管中に沈殿することなく、溶液中でバイオコンジュゲートを維持する必要性によって決定される。異なるＤＰＲ値は、モル濃度の観点から各成分の負荷などの条件を改変することによって、または反応媒体のｐＨを改変することによって到達することができる。
【0049】
毒素とタンパク質との間のジスルフィド結合は、例示され、かつ好ましいバイオコンジュゲートに組み込まれたメチル基の分布を組み込むことが望ましいと決定され、ジスルフィド結合は、下記のＡＢＺ１８２７－ＡＦＰに示されるようにモノメチル化される、または下記のＡＢＺ９８２－ＡＦＰに示されるようにジメチル化される。ＡＢＺ１８２７－ＡＦＰは、ＡＢＺ９８２－ＡＦＰより好ましい。このメチル化は、ジスルフィド結合を遮蔽する場合があり、また生物活性とバイオコンジュゲートの安定性との間の望ましく、かつ強化されたバランスを提供する。
【化13】
【0050】
このバイオコンジュゲートは、本明細書ではＡＢＺ１８２７－ＡＦＰと呼ばれる。「ｎ」は、ＡＦＰの各分子に結合された細胞毒／リンカー分子（コンジュゲート中間体）の数を表す。ＡＢＺ１８２７－ＡＦＰは通常、ｎの値の範囲を含有する。ｎの値は、典型的に１～１１の範囲であるが、微量のより高いｎ種の種があってもよい。
【0051】
別の実施形態では、ＡＦＰタンパク質は、以下に示されるリンカー細胞毒へと共有結合する。
【化14】
【0052】
このバイオコンジュゲートは、本明細書ではＡＢＺ９８２－ＡＦＰと呼ばれる。「ｎ」は、ＡＦＰの各分子に結合された細胞毒／リンカー分子（コンジュゲート中間体）の数を表す。ＡＢＺ９８２－ＡＦＰは通常、ｎの値の範囲を含有する。ｎの値は、典型的に１～１１の範囲であるが、微量のより高いｎ種の種があってもよい。
【0053】
本出願で考察されるバイオコンジュゲートは、概して、様々なｎを有するバイオコンジュゲートの混合物から構成される。より限定された範囲のｎを有する、または他の事例では、特定の数の周囲に焦点を合わせたｎの分布を有する、バイオコンジュゲートを調製することができる。バイオコンジュゲートはまた、ｎ（上記で定義されるように、ＤＰＲとしても特定される）の平均値によって調製および特徴付けることもできる。
【0054】
それ故に、本発明は、ある特定の実施形態では、以下に記述されるように、選ばれたＡＦＰを、好ましくはＡＢＺ９８２またはＡＢＺ１８２７である細胞毒／リンカーと連結した結果であるバイオコンジュゲートを提供する。細胞毒構成成分は、ＡＦＰリジン残基上のイプシロンアミノ基などの、一級アミンを介してＡＦＰへと連結される。１つ、２つ以上であるが、通常は１１つを超えない細胞毒を、この様態で各ＡＦＰ分子へと連結することができる。各ＡＦＰタンパク質へと連結された細胞毒の比を操作して、この比に応じて、バイオコンジュゲート生物活性および溶解度を上昇または低減することもできる。
【0055】
ＤＰＲは、バイオコンジュゲートの力価、可溶性、および毒性に影響することが知られている。低いＤＰＲ値は、同じバイオコンジュゲートに対する高いＤＰＲ値と比較して、比較的低い力価と関連付けられる。高いＤＰＲ値は、時に同じバイオコンジュゲートのより低いＤＰＲ値と比較して、比較的より高い毒性と関連付けられるが、常にではない。異なるＤＰＲ値を有するバイオコンジュゲートの調製は、ＡＦＰへの連結のために提供される細胞毒の濃度および反応の持続時間を制御することによって達成される。ＡＦＰと比較して細胞毒の量が多いほど、合成からもたらされるＤＰＲ値が高くなり、約１１のＤＰＲで最大値に到達し、また通常は１１未満である。
【0056】
他の特定の実施形態では、バイオコンジュゲートは、ＡＦＰ分子当たり平均で約２～８個の細胞毒分子であるＤＰＲを有する。
【0057】
１つの具体的な実施形態では、細胞毒／リンカーがＡＢＺ－９８２である場合、ＤＰＲが平均で３～４．５あるという意味では、またはより具体的な実施形態では約３．７＋／－０．３であるという意味では、ＤＰＲは、好適に「低い」。
【0058】
別の実施形態では、細胞毒／リンカーは、ＡＢＺ－９８２であり、ＤＰＲが平均で５～７、またはより具体的な実施形態では約５．８＋／－０．３であるという意味では、ＤＰＲは、好適に「高い」。
【0059】
さらなる実施形態では、毒素／リンカーがＡＢＺ１８２７である場合、ＤＰＲが平均で約５．９＋／－０．３（約６）であるという意味で、ＤＰＲは、好適に「高い」。別の実施形態では、ＤＰＲは、ＡＦＰ当たり５～７ＤＭの範囲内にある。
【0060】
別の実施形態では、毒素／リンカーがＡＢＺ１８２７である場合、バイオコンジュゲートは、約４．５未満の「低い」ＤＰＲを有する。特定の実施形態では、ＤＰＲは、平均で約３．９＋／－０．３（約４）である。
【0061】
表４に示されるように、ＡＢＺ１８２７－ＡＦＰおよびＡＢＺ９８２－ＡＦＰは、ＤＰＲが「高い」場合、インビトロでより強力であるが、ＤＰＲが「低い」場合も同様に力価を保持する。
【0062】
バイオコンジュゲートは、ＡＦＰ結合またはＡＦＰＲ陽性である疾患細胞を呈する対象を治療するために治療的に有用である。標的細胞はまた、単に細胞内細胞毒に対して応答性である細胞が、生命力の低下または不在を示すことを意味する「細胞毒応答性」でもあり、そしてバイオコンジュゲートから放出される細胞毒によって、少なくともそれらの数、サイズ、分布などの観点で、殺傷、枯渇、または低減のいずれかである。ＡＦＰおよび細胞毒は、バイオコンジュゲートの調製の過程において、および内因性投与後に、メイタンシノイドが関連するＡＦＰによって疾患細胞に選択的に、また全身的に低減された毒性で送達されるのに十分な親和性で結合することが見出された。メイタンシノイド送達に対するこのアプローチは、結合した細胞毒の毒性が低いためだけでなく、細胞毒がＡＦＰＲ陽性疾患細胞に選択的に送達されるためもあって、細胞毒の投与の低減、およびその結果として関連付けられた有害事象の低減を可能にし、それ故に正常な健康な細胞を温存することが可能である。さらに、ＡＦＰ：細胞毒バイオコンジュゲートは、生理食塩水またはＨＥＰＥＳ緩衝液などの良性かつ標準的な薬学的なビヒクル中で製剤化することができ、それによって、患者への送達時にそれ自体が毒性の問題を作り出す担体の使用を回避する。
【0063】
バイオコンジュゲートは、その後、治療的な投与のために直ちに製剤化する、その水性ビヒクル中に短時間貯蔵する、好ましくは凍結する、または本明細書に例示されるように長期保管のために凍結乾燥することができる。凍結解凍サイクルは、バイオコンジュゲートの凝集／二量体形成に影響を与えない。バイオコンジュゲートは、２～８℃にて少なくとも３日間、溶液中で分解することなく貯蔵することができる。これらはまた、急速冷凍（≦－６０°Ｃ）で貯蔵することもでき、そして溶液中のバイオコンジュゲートは、凍結／解凍サイクルを通して活性を保持することが示されている。それ故に、別の実施形態では、本発明は、ＨＥＰＥＳ緩衝液中で、凍結乾燥もしくは凍結形態の、または２～８℃で冷蔵された、ＡＦＰ：細胞毒バイオコンジュゲートを提供する。
【0064】
治療的な使用のために、本発明は、バイオコンジュゲートが薬学的に許容可能な担体を用いて製剤化された医薬組成物として、ＡＦＰ：細胞毒バイオコンジュゲートを提供する。一実施形態では、製剤は、注射または注入によってなどの静脈内投与のために適合される。その結果、担体は、注射用の水、生理食塩水、およびこれに類するものなどの水性ビヒクルとすることができる。
【0065】
インビボ投与のために使用される活性成分は、滅菌されることになる。これは、滅菌濾過膜を通した濾過によって遂行される。
【0066】
ＡＦＰコンジュゲート細胞毒の製剤化に使用される任意の他の担体、ビヒクル、または賦形剤は、所望のバイオコンジュゲート安定性を妨害するか、またはＡＦＰＲに対するＡＦＰの結合親和性を変化させる薬剤または条件を回避するために選ぶことができる。有機溶媒は、回避される可能性がある。生理的範囲外のｐＨ、すなわち、約ｐＨ６未満および約ｐＨ８超、を導入する薬剤も、この理由から回避される可能性がある。ＡＦＰ：細胞毒バイオコンジュゲートは、水、または通常の生理食塩水、または特にＨＥＰＥＳ緩衝液中で製剤化されてもよい。水性緩衝生理食塩水（リン酸緩衝生理食塩水を含む）は、生理的に耐えられるｐＨを有し、また好ましい注射または注入経路による投与に適しているため、好ましい。スクロースなどの凝集または沈殿を防止する化合物の添加が望ましい。別の好ましい担体／ビヒクルは、５％のスクロースを有する１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７．５である。
【0067】
ＡＦＰ：細胞毒バイオコンジュゲートは、治療的に有用である。その結果、そして一態様では、本発明は、ＡＦＰＲ陽性またはＡＦＰ結合疾患細胞を提示する対象を治療するための方法を提供し、本方法は、ＡＦＰ結合細胞毒を含むＡＦＰ：細胞毒バイオコンジュゲートを、その疾患細胞の成長および／または増殖を阻害するのに有効な量で、対象へと投与することを含む。
【0068】
ＡＦＰバイオコンジュゲートは有望な抗がん剤であり、これはＡＦＰに対する受容体を発現する腫瘍細胞に対する直接的な効果に加えて、ＭＤＳＣの低減（または除去）に貢献する場合がある。これらは、腫瘍の生命力を支持することができ、また同じ対象内の腫瘍微小環境中に存在する場合、有害であるＡＦＰＲ＋細胞である。これらの細胞の低減、枯渇、または撲滅は、治療効果を強化するための有望な経路である。細胞毒性薬剤とコンジュゲートしたベクター分子としてのＡＦＰは、ＭＤＳＣを具体的に認識し、したがってＭＤＳＣの数を低減するためにがん患者に使用することができる。
【0069】
ＡＦＰ受容体陽性疾患細胞は、検出可能かつ選択的なＡＦＰ受容体結合リガンドを採用するアッセイを使用して、インビボおよびエクスビボの両方での治療のために特定されてもよい。本バイオコンジュゲートによって標的化することができるＡＦＰＲ陽性疾患細胞としては、ＡＦＰＲ陽性がん細胞が挙げられ、ＡＦＰＲ陽性がん細胞としては、一般に、特異性を有するＡＦＰと結合するすべてのがん細胞が挙げられる。腫瘍サイズの低減、または腫瘍成長速度の低減に反映されるように、成長または増殖の所望の阻害を有する細胞毒に応答するＡＦＰＲ陽性疾患細胞にのみ効果が見られる場合があることが予想される。こうした細胞および腫瘍は、「細胞毒応答性」である特性を有し、そして本バイオコンジュゲートを用いた治療のための好ましい標的である。加えて、ＡＦＰＲに結合した後、バイオコンジュゲートが、エンドサイトーシスと呼ばれるプロセスによって膜を通過し、ここで、ＡＦＰＲ－バイオコンジュゲートが小胞内に封入され、かつ細胞の内部に輸送され、それ故に、膜ポンプとの相互作用を回避するため、細胞から細胞毒を能動的に除去する膜ポンプの過剰発現に起因するある特定の細胞毒耐性がん細胞を、本ＡＦＰ：細胞毒製剤で効果的に治療することが可能である。
【0070】
静脈内、筋肉内、皮下、頭蓋内、眼窩内、脳室内、関節内、脊髄内、嚢内、病巣内、腫瘍内腹腔内投与を含む、任意の適切な投与経路、例えば、非経口投与経路を採用することができる。注射または注入による静脈内投与が好ましい可能性がある。
【0071】
ＡＦＰに結合するがん細胞を提示する対象の治療については、ＡＦＰ：細胞毒バイオコンジュゲートの適切な用量は、治療される疾患のタイプ、疾患の重症度および経過、以前の療法、ならびに患者の臨床履歴および薬剤に対する応答に依存することになる。薬剤は、一連の治療／治療の過程にわたって患者に好適に投与される。疾患の進行は、がん療法における実施基準に従ってモニターすることができる。具体的にがんの事例では、それを必要とする対象の効果的な治療は、その成長および／または増殖もしくは成熟の速度の低減を含む、数、体積、分布、生命力、および他の細胞パラメータの低減をもたらすことができる。
【0072】
例えば、疾患のタイプおよび重症度に応じて、３週間に１回投与される場合、例えば、１回以上の別個の投与によって、または注入によってのいずれかで、０．５ｍｇ／ｋｇ～５ｍｇ／ｋｇのＡＦＰバイオコンジュゲート中に存在する約２０μｇ／ｋｇ～２００μｇ／ｋｇの細胞毒が、患者への投与の候補用量である。病態に応じて、週１回もしくは２回、または３週間に１回、または数週間以上にわたる反復投与については、疾患症状の所望の抑制が生じるまで、または疾患の進行が観察されるまで、治療が持続される。しかしながら、他の投与レジメンが有用である場合がある。ＡＦＰ－細胞毒バイオコンジュゲートの重量に基づく単位用量は、例えば、１ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、２５ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、１５０ｍｇ、２００ｍｇ、２５０ｍｇ、３００ｍｇ、および４００ｍｇなど、約５００ｕｇ～５００ｍｇの範囲内とすることができる。製剤化されたバイオコンジュゲートは、各容器、例えば、バイアル内に２、３、４、５、またはそれより多くの単位用量を含む、複数投与形態で提供することができる。バイオコンジュゲートした調製薬はまた、バイオコンジュゲートを含む凍結乾燥または凍結調製薬と、調製薬を投与可能な剤形へと再構成するための別個に包装されたビヒクルとを含む、キット形態でも提供することができる。代替では、キットは、単にバイオコンジュゲートした調製薬、およびその投与可能な剤形への再構成のための取扱説明書を備えてもよい。抗がん療法の進行は、治療される特定の疾患に対して確立された技法およびアッセイによってモニターされる。
【0073】
本バイオコンジュゲートに対する用量ガイダンスについては、市販されているバイオコンジュゲートであるＫＡＤＣＹＬＡ（商標）（アドトラスツズマブエムタンシン）の推奨用量は、疾患進行もしくは許容できない毒性まで、または乳がんを有する患者に対して合計１４サイクルまでの、３週間ごと（２１日サイクル）の静脈内注入と仮定すると３．６ｍｇ／ｋｇであることを理解するべきである。
【0074】
それ故に、当然のことながら、バイオコンジュゲートの有効量は、正常な幹細胞と関連付けられた特性、具体的には特定のがん試料に見出されるすべての細胞型を生じさせる能力を有する、がん細胞（腫瘍または血液がん内に見出される）である、ＡＦＰＲ＋がん幹細胞（ＣＳＣ）を含む、細胞毒応答性かつＡＦＰＲ＋に対して陽性である疾患細胞および悪性腫瘍の成長または増殖の速度を遅延もしくは阻害するための、単位用量として、または治療レジメンの一部として有効な量である。
【0075】
バイオコンジュゲートは、血液がんおよび固形腫瘍を含む、がん細胞およびそれらを含む腫瘍の成長または増殖を阻害するために、様々な細胞毒応答性がんの治療に有用である。対象に投与される組成物の特定の用量は、例えば、投与経路、投与の頻度、レシピエントの状態、および治療されるがんのタイプに依存する。治療に対して好適ながんは、ＡＦＰ受容体を発現するがんである。ＡＦＰＲの実証された発現は、乳がん、卵巣がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん、胃がん、肺がん、リンパ腫、前立腺がん、および肝臓がんを含む、ヒトがんまたはがん細胞株において述べられている。これらのがんの転移はまた、本明細書に記述される方法に従って治療することもできる。
【0076】
「対象」、「患者」、および「レシピエント」という用語はすべて、特にヒトを含むが、他の霊長類、家畜、ペット、ウマ、およびこれに類するものも含む哺乳類を指す。当然のことながら、本バイオコンジュゲートで治療される対象は、内因性ＡＦＰ受容体が対象の健康な細胞および組織上で広まっていないように、少なくとも約３か月齢であるべきである。また、非ヒトを治療するために使用されるバイオコンジュゲートは、その種に特異的なＡＦＰの形態を組み込むことが望ましい。
【0077】
標的化された細胞毒性剤を他の療法と組み合わせて投与することが一般的であり、そのため、当業者であれば、バイオコンジュゲートを免疫療法を含む他のがん療法と組み合わせて使用することができることを理解するであろう。
【0078】
バイオコンジュゲートは、有用な他の治療薬と組み合わせて、それを必要とする対象に投与することができる。１つ以上のさらなる治療薬「と組み合わせた」投与は、同時（同時発生的）および任意の順序での連続投与を含む。他の治療レジメンが、本発明の抗がん剤の投与と組み合わされてもよい。例えば、こうした抗がん剤で治療される患者は、外部ビーム放射などの放射線療法も受けてもよい。別の方法として、または追加的に、化学療法的薬剤または生物学的薬剤が患者に投与されてもよい。こうした化学療法的薬剤または生物学的薬剤の調製および投与スケジュールは、製造業者の取扱説明に従って、または当業者によって経験的に決定されるように使用されてもよい。化学療法剤は、投与もしくはバイオコンジュゲートに先行してもよく、または後に続いてもよく、またはそれらと同時に投与されてもよい。特定の実施形態では、バイオコンジュゲートは、チェックポイント阻害剤またはＣＡＲ－Ｔ調製薬などの免疫刺激剤と組み合わせて使用することができる。なぜなら、こうした免疫抗がん薬の有効性はＭＤＳＣの存在下で減少するためである。ＡＦＰバイオコンジュゲートによるＭＤＳＣの低減（または除去）は、免疫抗がん薬剤の有効性を大幅に強化するはずである。
【0079】
本発明のバイオコンジュゲートおよび医薬組成物は、所望であれば、細胞増殖を低減する、追加的な治療薬、例えば、追加的な抗がん剤、例えば、ＣＡＲ－Ｔ剤、免疫チェックポイント阻害剤、アルキル化剤、スルホン酸アルキル、アジリジン、エチレンイミンおよびメチルアメラミン、アセトゲニン、オーリスタチン、カンプトセシン、ブリオスタチン、カリスタチン、ＣＣ－１０６５、クリプトフィシン、ドラスタチン、デュオカルマイシン、エリュテロビン、パンクラチスタチン、サルコジクチインと、スポンジスタチン、ナイトロジェンマスタード、抗生剤、エンジイン抗生物質、ダイネミシン、ビスホスホネート、エスペラミシン、色素タンパク質エンジイン抗生物質発色団、アクラシノマイシン（ａｃｌａｃｉｎｏｍｙｓｉｎ）、アクチノマイシン、アウトラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、アザシチジン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン（ｃｈｒｏｍｏｍｙｃｉｎｉｓ）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６－ジアゾ－５－オキソ－Ｌ－ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン（ｅｓｏｒｕｂｉｃｉｎ）、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、ケラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン、代謝拮抗剤、エルロチニブ、ベムラフェニブ、クリゾチニブ、ソラフェニブ、イブルチニブ、エンザルタミド、葉酸類似体、プリン類似体、アンドロゲン、抗副腎薬（ａｎｔｉ－ａｄｒｅｎａｌ）、フロリニン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ）などの葉酸補充剤、アセグラトン、アルドホスファミドグリコシド、アミノレブリン酸、エニルウラシル、アムサクリン、ベストラブシル（ｂｅｓｔｒａｂｕｃｉｌ）、ビサントレン、エダトレキサート、デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）、デメコルチン、ジアジクオン、エフロルニチン、酢酸エリプチニウム、エポチロン、エトグルシド、硝酸ガリウム、ヒドロキシ尿素、レンチナン、ロニダイニン（ｌｏｎｉｄａｉｎｉｎｅ）、メイタンシノイド、ミトグアゾン、ミトキサントロン、モピダモール、ニトラエリン（ｎｉｔｒａｅｒｉｎｅ）、ペントスタチン、フェナメット（ｐｈｅｎａｍｅｔ）、ピラルビシン、ロソキサントロン、ポドフィリン酸２－エチルヒドラジド、プロカルバジン、ＰＳ（登録商標）多糖類複合体（ＪＨＳ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、オレゴン州ユージン）、ラゾキサン； リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２’’－トリクロロトリエチルアミン；トリコテシン（特にＴ－２毒素、ベラキュリンＡ（ｖｅｒｒａｃｕｒｉｎ Ａ）、ロリジンＡおよびアングイジン）； ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（「Ａｒａ－Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、クロラムブシル；ゲムシタビン；６－チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；白金類似体、ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ－１６）；イホスファミド；ミトキサントロン； ビンクリスチン；ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；イリノテカン（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ、ＣＰＴ－１ １）、トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ｄｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｌｈｙｌｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）；レチノイド；カペシタビン；コンブレタスタチン；ロイコボリン；オキサリプラチン；ＰＫＣ－アルファの阻害剤（抗体など）、Ｒａｆ、Ｈ－Ｒａｓ、ＥＧＦＲ、およびＶＥＧＦ－Ａ、およびそれらの薬学的に許容可能な塩、酸、もしくは誘導体、またはそれらの組み合わせと組み合わせて使用されてもよい。
【0080】
本発明のバイオコンジュゲートおよび医薬組成物はまた、抗がん抗体またはポリペプチド、例えば、アバゴボマブ、アデカツムマブ、アフツズマブ、アレムツズマブ、アルツモマブ、アマツキシマブ、アナツモマブ、アルシツモマブ、バビツキシマブ、ベクツモマブ、ベバシズマブ、ビバツズマブ、ブリナツモマブ、ブレンツキシマブ、カンツズマブ、カツマキソマブ、セツキシマブ、シタツズマブ、シクスツムマブ、クリバツズマブ、コナツムマブ、ダラツムマブ、ドロジツマブ、デュリゴツマブ、デュシギツマブ、デツモマブ、ダセツズマブ、ダロツズマブ、エクロメキシマブ、エロツズマブ、エンシツキシマブ、エルツマキソマブ、エタラシズマブ、ファーレツズマブ、フィクラツズマブ、フィギツムマブ、フランボツマブ、フツキシマブ、ガニツマブ、ゲムツズマブ、ギレンツキシマブ、グレンバツムマブ、イブリツモマブ、イゴボマブ、イムガツズマブ、インダツキシマブ、イノツズマブ、インテツムマブ、イピリムマブ、イラツムマブ、ラベツズマブ、レクサツムマブ、リンツズマブ、ロルボツズマブ、ルカツムマブ、マパツムマブ、マツズマブ、ミラツズマブ、ミンレツモマブ、ミツモマブ、モキセツモマブ、ナルナツマブ、ナプツモマブ、ネシツムマブ、ニモツズマブ、ノフェツモマブン（ｎｏｆｅｔｕｍｏｍａｂｎ）、オカラツズマブ、オファツムマブ、オララツマブ、オナルツズマブ、オポルツズマブ、オレゴボマブ、パニツムマブ、パルサツズマブ、パトリツマブ、ペムツモマブ、ペルツズマブ、ピンツモマブ、プリツムマブ、ラコツモマブ、ラムシルマブ、ラドレツマブ、リロツムマブ、リツキシマブ、ロバツムマブ、サツモマブ、シブロツズマブ、シルツキシマブ、シムツズマブ、ソリトマブ、タカツズマブ、タプリツモマブ、テナツモマブ、テプロツムマブ、ティガツズマブ、トシツモマブ、トラスツズマブ、ツコツズマブ、ウブリツキシマブ、ベルツズマブ、ボルセツズマブ、ボツムマブ、ザルツムマブ、ＣＣ４９、３Ｆ８、またはそれらの任意の組み合わせと組み合わせて使用されてもよい。
【0081】
本発明の別の実施形態では、本明細書に記述される障害の治療のために有用なＡＦＰ：細胞毒バイオコンジュゲートを含有する製造品が提供される。製造品は、本バイオコンジュゲートを、溶液中に、または凍結乾燥もしくは凍結形態で、容器中に備え、そして好適にラベルを有する。好適な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、および試験管が挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成されてもよい。容器は、病態を治療するために有効な組成物を保持し、また滅菌アクセスポートを有してもよい（例えば、容器は、真皮下注射針によって穿刺可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイアルであってもよい）。容器上の、または容器と関連付けられたラベルは、組成物ががん状態を治療するために使用されることを示す。製造物品は、生理食塩水、ＨＥＰＥＳ緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水、注射用水などを含む、薬学的に許容可能な緩衝剤を含む第二の容器をさらに損なう場合がある。これは、他の緩衝剤、希釈剤、フィルタ、針、シリンジ、および本発明による使用説明書を有する添付文書を含む、商業的および使用の観点から望ましい他の事柄をさらに含む場合がある。ＡＦＰ調製標準などの、本方法に有用な対照薬剤または標準および較正剤も、キットに含むことができる。
【0082】
それ故に、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）受容体は、がん胎児性抗原であり、またがん治療法の新規の標的であることが理解されるであろう。この受容体は、数多くの一般的ながんの表面上で高度に発現されるが、一般に正常な成体細胞上では発現されない。新規のメイタンシノイド毒素をＡＦＰの組み換え型ヒト形態へと共有的にコンジュゲートすることによって、毒素ペイロードを、正常細胞を温存しながら、がん細胞へと選択的に送達することができる。ＡＦＰはヒトタンパク質であるため、ＡＦＰバイオコンジュゲートに対するいかなる有害な免疫反応のリスクも低減される。
【0083】
合成の実施例
２つの形態のバイオコンジュゲートを、それらのリンカー構造のみが異なる（モノメチル対ジメチル）ように調製し、そして一部の事例では、メイタンシノイドＤＭ１ならびに／またはＤＭ３および／もしくはＤＭ４に基づくバイオコンジュゲートと比較した。それらの合成に対する一般的なアプローチを以下に図示し、ここでＲは、試薬細胞毒であり、またＰは、タンパク質、ＡＦＰである。
１）ＡＦＰの調製
グリコシル化を欠く成熟した［Ａｓｎ２３３Ｇｌｎ］ｒｈＡＦＰ（１－５９１）を、トランスジェニックヤギで産生し、そして２００７年４月２４日に公開された米国特許第７２０８５７６号のＭｅｒｒｉｍａｃｋによって記述され、かつ参照により完全に本明細書に組み込まれる様態で、ヤギ乳から回収した。この形態のＡＦＰは、ＡＣＴ－１０１と名付けられ、また成熟ＡＦＰにＡｓｎ２３３Ｇｌｎ置換を組み込む配列番号３を有する。
２）細胞毒の調製：リンカーバイオコンジュゲート
ＡＢＺ９８１と名付けられたメイタンシノイド様細胞毒は、最初に国際公開第２０１８／０５１１０９号に記述される様態で産生され、次いで、以下の様態でジスルフィドグルタチオン感受性リンカーと共有結合した。
２つの形態のバイオコンジュゲートを、それらのリンカー構造のみが異なる（モノメチル対ジメチル）ように調製し、そして一部の事例では、メイタンシノイドＤＭ１ならびに／またはＤＭ３および／もしくはＤＭ４に基づくバイオコンジュゲートと比較した。それらの合成に対する一般的なアプローチを以下に図示し、ここでＲは、試薬細胞毒であり、またＰは、タンパク質、ＡＦＰである。
【化15】
グリコシル化を欠く成熟した［Ａｓｎ２３３Ｇｌｎ］ｒｈＡＦＰ（１－５９１）を、トランスジェニックヤギで産生し、そして２００７年４月２４日に公開された米国特許第７２０８５７６号のＭｅｒｒｉｍａｃｋによって記述され、かつ参照により完全に本明細書に組み込まれる様態で、ヤギ乳から回収した。この形態のＡＦＰは、ＡＣＴ－１０１と名付けられ、また成熟ＡＦＰにＡｓｎ２３３Ｇｌｎ置換を組み込む配列番号３を有する。
２）細胞毒の調製：リンカーバイオコンジュゲート
ＡＢＺ９８１と名付けられたメイタンシノイド様細胞毒は、最初に国際公開第２０１８／０５１１０９号に記述される様態で産生され、次いで、以下の様態でジスルフィドグルタチオン感受性リンカーと共有結合した。
【0084】
一般的な分析方法：リンカーペイロードを、以下に示されるように合成した。使用された溶媒はすべてそのまま使用され、またＳｉｇｍａ ＡｌｄｒｉｃｈまたはＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃのいずれかから購入した。１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを、Ｖａｒｉａｎ Ｉｎｏｖａ ５００ ＭＨｚ ＮＭＲ機器上で記録した。化学シフト（δ）は、分析のために使用したＮＭＲ溶媒に関してｐｐｍで報告された。結合定数（Ｊ）をヘルツ（Ｈｚ）で報告した。クロマトグラフィー純度を、Ｋｉｎｅｔｅｘ（登録商標）１．７μｍ Ｃ１８ １００Åカラム（５０×２．１ｍｍ）および以下の分析的ＵＰＬＣ方法：注入量２～５μＬ、流量０．６ｍＬ／分、２．５～５分にわたって水中１０～９０％アセトニトリル、＝２５４ｎｍにおけるＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣフォトダイオードアレイ（ＰＤＡ）検出器、室温、を使用してＷａｔｅｒｓ ＵＰＬＣ／ＭＳ－５ＳＱＤシステム上で決定した。クロマトグラフィー純度を、Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ（登録商標）ＦａｓｔＧｒａｄｉｅｎｔ ＲＰ－１８ｅ分析カラム（５０×２ｍｍ、Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ、Ｐ／Ｎ １．５２００７．０００１）を使用して、Ａｇｉｌｅｎｔ ６１３０、１２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ、ＬＣ／ＭＳシステム上で決定した。
【0085】
標的化合物の合成
【化16】
【0086】
合成スキーム：
【化17】
【0087】
実験的手順
化合物ＡおよびＡＢＺ－９４７の合成
化合物ＡおよびＡＢＺ－９４７の合成
【化18】
【0088】
化合物Ａ：
室温にてアルゴン下で、２６ｍＬの無水ＴＨＦ中のメイタンシノール（２．６ｇ、４．６０ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（０．５６ｇ、４．６０ｍｍｏｌ）の混合物溶液に、ＺｎＨＭＤＳ（４．６ｍＬ、１１．５０ｍｍｏｌ）を滴加した。混合物を３０分間撹拌して、褐色の懸濁溶液を得た。この溶液に、イソ酪酸無水物を滴加した。得られた溶液を室温にて１．５時間撹拌した。ＬＣ／ＭＳによるアリコートは、反応が完了して、所望の生成物を得たことを示した。粗製を飽和ＮＨ４Ｃｌ溶液（１００ｍＬ）でクエンチし、１００ｍＬの酢酸エチルで希釈し、そして有機層を分離した。水性層を酢酸エチル（１２０ｍＬ×２）で抽出した。組み合わされた有機物を水（５０ｍＬ）、塩水溶液（５０ｍＬ）で洗浄し、そしてＮａ２ＳＯ４上で乾燥した。濃縮後、粗製の褐色の固体を得て、それをＨＰ １２０ｇ ＧｏｌｄカラムＩＳＣＯシステムを使用してＤＣＭ中の５％ＭｅＯＨによって精製して、１．４８ｇ（５１％）のｃｏｍｐ Ａを得た。ＭＳ（ＥＳＩ、ｐｏｓ．）： Ｃ３２Ｈ４３ＣｌＮ２Ｏ９に対する計算値、６３４．２７、実測値６３５．３（Ｍ＋Ｈ）、１２９３．４（２Ｍ＋Ｎａ）。別のバッチを完了し、そして次の工程のために組み合わせた。
室温にてアルゴン下で、２６ｍＬの無水ＴＨＦ中のメイタンシノール（２．６ｇ、４．６０ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（０．５６ｇ、４．６０ｍｍｏｌ）の混合物溶液に、ＺｎＨＭＤＳ（４．６ｍＬ、１１．５０ｍｍｏｌ）を滴加した。混合物を３０分間撹拌して、褐色の懸濁溶液を得た。この溶液に、イソ酪酸無水物を滴加した。得られた溶液を室温にて１．５時間撹拌した。ＬＣ／ＭＳによるアリコートは、反応が完了して、所望の生成物を得たことを示した。粗製を飽和ＮＨ４Ｃｌ溶液（１００ｍＬ）でクエンチし、１００ｍＬの酢酸エチルで希釈し、そして有機層を分離した。水性層を酢酸エチル（１２０ｍＬ×２）で抽出した。組み合わされた有機物を水（５０ｍＬ）、塩水溶液（５０ｍＬ）で洗浄し、そしてＮａ２ＳＯ４上で乾燥した。濃縮後、粗製の褐色の固体を得て、それをＨＰ １２０ｇ ＧｏｌｄカラムＩＳＣＯシステムを使用してＤＣＭ中の５％ＭｅＯＨによって精製して、１．４８ｇ（５１％）のｃｏｍｐ Ａを得た。ＭＳ（ＥＳＩ、ｐｏｓ．）： Ｃ３２Ｈ４３ＣｌＮ２Ｏ９に対する計算値、６３４．２７、実測値６３５．３（Ｍ＋Ｈ）、１２９３．４（２Ｍ＋Ｎａ）。別のバッチを完了し、そして次の工程のために組み合わせた。
【化19】
【0089】
ＡＢＺ－９４７：
水とＴＨＦの混合物を、使用前にアルゴンによって完全に脱気した。１００ｍＬの丸底中の化合物Ａ（３．１０ｇ、４．８８ｍｍｏｌ）、４－（４，４，５，５－テトラメチル－１，３，２－ジオキサボロラン－２－イル）アニリン（１．６０ｇ、７．３２ｍｍｏｌ）、およびＫ３ＰＯ４（４．１４ｇ、１９．５２ｍｍｏｌ）の混合物へと、ＴＨＦ（５０ｍＬ）およびＨ２Ｏ（７ｍＬ）を満たした。撹拌混合物を真空によって脱気し、そしてアルゴンで再充填した。これを３回繰り返し、そしてアルゴンによってさらに脱気した。次いで、ＳｐｈｏｓＰｄ－Ｇ３（０．３８ｇ、０．４８８ｍｍｏｌ、０．１当量）を添加し、そしてセプタムでキャップした。混合物をアルゴン下でさらに脱気し、そして室温にて一晩撹拌した。反応の進行をＬＣ／ＭＳによってモニターして、反応を完了した。ＮＨ４Ｃｌ水溶液（３０ｍＬ）を添加して、反応物をクエンチした。粗製を、セライトのパッドによって濾過して、清浄な溶液を得た。水性層を酢酸エチル（１２０ｍＬ×２）を用いて抽出した。酢酸エチル層を水、塩水で洗浄し、そしてＮａ２ＳＯ４上で乾燥した。濃縮後、粗製の暗黄色の固体を得て、それを１２０ｇ ＧｏｌｄカラムＩＳＣＯシステムを使用してＤＣＭ中の５％ＭｅＯＨによって精製して、３．３７ｇ（８９％）のＡＢＺ－９４７を得た。ＭＳ（ＥＳＩ、ｐｏｓ．）：Ｃ３８Ｈ４９Ｎ３Ｏ９の計算値、６９１．３５；実測値６９２．３（Ｍ＋Ｈ）、１３８３．８（２Ｍ＋Ｈ）。
水とＴＨＦの混合物を、使用前にアルゴンによって完全に脱気した。１００ｍＬの丸底中の化合物Ａ（３．１０ｇ、４．８８ｍｍｏｌ）、４－（４，４，５，５－テトラメチル－１，３，２－ジオキサボロラン－２－イル）アニリン（１．６０ｇ、７．３２ｍｍｏｌ）、およびＫ３ＰＯ４（４．１４ｇ、１９．５２ｍｍｏｌ）の混合物へと、ＴＨＦ（５０ｍＬ）およびＨ２Ｏ（７ｍＬ）を満たした。撹拌混合物を真空によって脱気し、そしてアルゴンで再充填した。これを３回繰り返し、そしてアルゴンによってさらに脱気した。次いで、ＳｐｈｏｓＰｄ－Ｇ３（０．３８ｇ、０．４８８ｍｍｏｌ、０．１当量）を添加し、そしてセプタムでキャップした。混合物をアルゴン下でさらに脱気し、そして室温にて一晩撹拌した。反応の進行をＬＣ／ＭＳによってモニターして、反応を完了した。ＮＨ４Ｃｌ水溶液（３０ｍＬ）を添加して、反応物をクエンチした。粗製を、セライトのパッドによって濾過して、清浄な溶液を得た。水性層を酢酸エチル（１２０ｍＬ×２）を用いて抽出した。酢酸エチル層を水、塩水で洗浄し、そしてＮａ２ＳＯ４上で乾燥した。濃縮後、粗製の暗黄色の固体を得て、それを１２０ｇ ＧｏｌｄカラムＩＳＣＯシステムを使用してＤＣＭ中の５％ＭｅＯＨによって精製して、３．３７ｇ（８９％）のＡＢＺ－９４７を得た。ＭＳ（ＥＳＩ、ｐｏｓ．）：Ｃ３８Ｈ４９Ｎ３Ｏ９の計算値、６９１．３５；実測値６９２．３（Ｍ＋Ｈ）、１３８３．８（２Ｍ＋Ｈ）。
【化20】
【0090】
化合物ＢおよびＡＢＺ－９８１の合成：
【化21】
【0091】
化合物Ｂ：
８ｍＬの無水ＤＭＦ中のＡＢＺ－９４７（２３７ｍｇ、０．０３４２ｍｍｏｌ）、４－（（５－ニトロピリジン－２－イル）ジスルファニル）ペンタン酸（１０１ｍｇ、０．７５３ｍｍｏｌ）、およびＨＡＴＵ（３９０ｍｇ、１．０３ｍｍｏｌ）の撹拌溶液を、０℃に冷却し、続いてＤＩＥＡ（０．２４ｍＬ、１．３７ｍｍｏｌ）をゆっくりと添加した。得られた溶液を室温まで加温させ、一晩撹拌した。ＵＰＬＣを使用したアリコートのプロセスにより、反応の完了が示された。反応混合物を水（２０ｍＬ）および塩水（２０ｍＬ）で希釈した。混合物を酢酸エチル（５０ｍＬ×２）を用いて抽出した。有機層を真空中で濃縮して、粗生成物を得た。粗製をＤＭＳＯ（５ｍＬ）で希釈し、次いで、Ｃ１８ ａｑ．１５０ｇのＩＳＣＯカラム（水中５％ＡＣＮ～９５％ＡＣＮ、修正剤として０．０５％ＡｃＯＨ）によって精製した。純粋な画分を収集し、凍結し、そして凍結乾燥して、淡褐色の固体として２５３ｍｇ（７７％）のＣｏｍｐ Ｂを得た。ＭＳ（ＥＳＩ、ｐｏｓ．）：Ｃ４８Ｈ５９Ｎ５Ｏ１２Ｓ２に対する計算値、９６１．３６；実測値９６２．４２（Ｍ＋Ｈ）。
８ｍＬの無水ＤＭＦ中のＡＢＺ－９４７（２３７ｍｇ、０．０３４２ｍｍｏｌ）、４－（（５－ニトロピリジン－２－イル）ジスルファニル）ペンタン酸（１０１ｍｇ、０．７５３ｍｍｏｌ）、およびＨＡＴＵ（３９０ｍｇ、１．０３ｍｍｏｌ）の撹拌溶液を、０℃に冷却し、続いてＤＩＥＡ（０．２４ｍＬ、１．３７ｍｍｏｌ）をゆっくりと添加した。得られた溶液を室温まで加温させ、一晩撹拌した。ＵＰＬＣを使用したアリコートのプロセスにより、反応の完了が示された。反応混合物を水（２０ｍＬ）および塩水（２０ｍＬ）で希釈した。混合物を酢酸エチル（５０ｍＬ×２）を用いて抽出した。有機層を真空中で濃縮して、粗生成物を得た。粗製をＤＭＳＯ（５ｍＬ）で希釈し、次いで、Ｃ１８ ａｑ．１５０ｇのＩＳＣＯカラム（水中５％ＡＣＮ～９５％ＡＣＮ、修正剤として０．０５％ＡｃＯＨ）によって精製した。純粋な画分を収集し、凍結し、そして凍結乾燥して、淡褐色の固体として２５３ｍｇ（７７％）のＣｏｍｐ Ｂを得た。ＭＳ（ＥＳＩ、ｐｏｓ．）：Ｃ４８Ｈ５９Ｎ５Ｏ１２Ｓ２に対する計算値、９６１．３６；実測値９６２．４２（Ｍ＋Ｈ）。
【化22】
【0092】
ＡＢＺ－９８１：
ＡＣＮ（１ｍＬ）および水（０．８ｍＬ）の混合物中の化合物Ｂ（２２ｍｇ、０．０２０７ｍｍｏｌ）およびＴＣＥＰ・ＨＣｌ（５９ｍｇ、０．２０７ｍｍｏｌ）の溶液に、ｐＨが７～８に達するまで飽和ＮａＨＣＯ３溶液（１．２ｍＬ）をゆっくりと添加した。得られた溶液を室温にて２時間撹拌した。アリコートを取ることによってＬＣ／ＭＳが結果をもたらし、反応が完了した。反応混合物を減圧下で濃縮した。残留物を５０ｍＬの酢酸エチルを用い、続いて塩水（２０ｍＬ）を添加して希釈した。有機物を分離し、そして真空中で濃縮し、これをＣ１８ ａｑ．５０ｇのＩＳＣＯカラム（水中５％ＡＣＮ～９５％ＡＣＮ、修正剤として０．０５％ＡｃＯＨ）によって精製した。純粋な画分を収集し、凍結し、そして凍結乾燥して、白色固体として１４ｍｇ（８３％）のＡＢＺ－９８１を得た。ＭＳ（ＥＳＩ、ｐｏｓ．）：Ｃ４３Ｈ５７Ｎ３Ｏ１０Ｓに対する計算値、８０７．３８；実測値８０８．９２（Ｍ＋Ｈ）。
ＡＣＮ（１ｍＬ）および水（０．８ｍＬ）の混合物中の化合物Ｂ（２２ｍｇ、０．０２０７ｍｍｏｌ）およびＴＣＥＰ・ＨＣｌ（５９ｍｇ、０．２０７ｍｍｏｌ）の溶液に、ｐＨが７～８に達するまで飽和ＮａＨＣＯ３溶液（１．２ｍＬ）をゆっくりと添加した。得られた溶液を室温にて２時間撹拌した。アリコートを取ることによってＬＣ／ＭＳが結果をもたらし、反応が完了した。反応混合物を減圧下で濃縮した。残留物を５０ｍＬの酢酸エチルを用い、続いて塩水（２０ｍＬ）を添加して希釈した。有機物を分離し、そして真空中で濃縮し、これをＣ１８ ａｑ．５０ｇのＩＳＣＯカラム（水中５％ＡＣＮ～９５％ＡＣＮ、修正剤として０．０５％ＡｃＯＨ）によって精製した。純粋な画分を収集し、凍結し、そして凍結乾燥して、白色固体として１４ｍｇ（８３％）のＡＢＺ－９８１を得た。ＭＳ（ＥＳＩ、ｐｏｓ．）：Ｃ４３Ｈ５７Ｎ３Ｏ１０Ｓに対する計算値、８０７．３８；実測値８０８．９２（Ｍ＋Ｈ）。
【化23】
【0093】
化合物ＣおよびＡＢＺ－９８２の合成：
【化24】
【0094】
化合物Ｃ：
化合物Ｂ（４２０ｍｇ、０．４３６ｍｍｏｌ）を有する４０ｍＬの透明なバイアルに、ＤＭＦ（６ｍＬ）を添加し、そして撹拌して、透明な溶液を得た。ＰＢＳ ｐＨ＝７．４緩衝剤（２．０ｍＬ）、続いて４－メルカプトペンタン酸（２３４ｍｇ、１．７４６ｍｍｏｌ）を室温にて添加した。３０分間撹拌し、そしてＬＣ－ＭＳ上で反応の進行をモニターした（反応が完了していない場合、完了まで撹拌した）。反応が完了した後、反応混合物を真空中で濃縮し、１ｍＬのＤＭＳＯで希釈し、そして予め平衡化したＣ１８ ａｑ．１００ｇカラムへと移送した。溶離液（水中１０％ＡＣＮ～９５％ＡＣＮ、修正剤として０．０５％ＡｃＯＨ）を使用して精製を実施した。純粋な画分を収集し、凍結し、そして凍結乾燥して、白色固体として３１７ｍｇ（７７％）のＣｏｍｐ Ｃを得た。ＭＳ（ＥＳＩ、ｐｏｓ．）：Ｃ４８Ｈ６５Ｎ３Ｏ１２Ｓ２に対する計算値、９３９．４０；実測値９４０．５４（Ｍ＋Ｈ）。
化合物Ｂ（４２０ｍｇ、０．４３６ｍｍｏｌ）を有する４０ｍＬの透明なバイアルに、ＤＭＦ（６ｍＬ）を添加し、そして撹拌して、透明な溶液を得た。ＰＢＳ ｐＨ＝７．４緩衝剤（２．０ｍＬ）、続いて４－メルカプトペンタン酸（２３４ｍｇ、１．７４６ｍｍｏｌ）を室温にて添加した。３０分間撹拌し、そしてＬＣ－ＭＳ上で反応の進行をモニターした（反応が完了していない場合、完了まで撹拌した）。反応が完了した後、反応混合物を真空中で濃縮し、１ｍＬのＤＭＳＯで希釈し、そして予め平衡化したＣ１８ ａｑ．１００ｇカラムへと移送した。溶離液（水中１０％ＡＣＮ～９５％ＡＣＮ、修正剤として０．０５％ＡｃＯＨ）を使用して精製を実施した。純粋な画分を収集し、凍結し、そして凍結乾燥して、白色固体として３１７ｍｇ（７７％）のＣｏｍｐ Ｃを得た。ＭＳ（ＥＳＩ、ｐｏｓ．）：Ｃ４８Ｈ６５Ｎ３Ｏ１２Ｓ２に対する計算値、９３９．４０；実測値９４０．５４（Ｍ＋Ｈ）。
【化25】
【0095】
ＡＢＺ－９８２：
化合物Ｃ（３００ｍｇ、０．３１９ｍｍｏｌ）を有する４０ｍＬの透明なバイアルに、ＤＣＭ（１０ｍＬ）を添加し、そして撹拌して、透明な溶液を得た。ＥＤＣＩ（１１０ｍｇ、０．５７４ｍｍｏｌ）、続いてＮＨＳ（５５ｍｇ、０．４７９ｍｍｏｌ）をアルゴン下で氷浴において添加した。得られた溶液を１６～２４時間撹拌し、そしてＬＣ－ＭＳによって反応の進行をモニターした。反応の完了後、粗製を減圧下で濃縮した。粗製を１ｍＬのＤＭＳＯを用いて溶解し、そして予め平衡化したＣ１８ ａｑ．１５０ｇカラムの中へとプラグした。溶離液（水中１０％ＡＣＮ～９５％ＡＣＮ、修正剤として０．０５％ＡｃＯＨ）を使用して精製を実施した。純粋な画分を収集し、凍結し、そして凍結乾燥して、白色固体として２８０ｍｇ（８５％）のＡＢＺ－９８２を得た。ＭＳ（ＥＳＩ、ｐｏｓ．）：Ｃ５２Ｈ６８Ｎ４Ｏ１４Ｓ２に対する計算値、１０３６．４２；実測値１０３７．７１（Ｍ＋Ｈ）。
化合物Ｃ（３００ｍｇ、０．３１９ｍｍｏｌ）を有する４０ｍＬの透明なバイアルに、ＤＣＭ（１０ｍＬ）を添加し、そして撹拌して、透明な溶液を得た。ＥＤＣＩ（１１０ｍｇ、０．５７４ｍｍｏｌ）、続いてＮＨＳ（５５ｍｇ、０．４７９ｍｍｏｌ）をアルゴン下で氷浴において添加した。得られた溶液を１６～２４時間撹拌し、そしてＬＣ－ＭＳによって反応の進行をモニターした。反応の完了後、粗製を減圧下で濃縮した。粗製を１ｍＬのＤＭＳＯを用いて溶解し、そして予め平衡化したＣ１８ ａｑ．１５０ｇカラムの中へとプラグした。溶離液（水中１０％ＡＣＮ～９５％ＡＣＮ、修正剤として０．０５％ＡｃＯＨ）を使用して精製を実施した。純粋な画分を収集し、凍結し、そして凍結乾燥して、白色固体として２８０ｍｇ（８５％）のＡＢＺ－９８２を得た。ＭＳ（ＥＳＩ、ｐｏｓ．）：Ｃ５２Ｈ６８Ｎ４Ｏ１４Ｓ２に対する計算値、１０３６．４２；実測値１０３７．７１（Ｍ＋Ｈ）。
【化26】
【0096】
化合物ＤおよびＡＢＺ－１８２７の合成：
【化27】
【0097】
化合物Ｄ：
化合物Ｂ（５００ｍｇ、０．５１９ｍｍｏｌ）を有する４０ｍＬの透明なバイアルに、ＤＭＦ（７ｍＬ）を添加し、そして撹拌して、透明な溶液を得た。ＰＢＳ ｐＨ＝７．４緩衝剤（２．５ｍＬ）、続いて４－メルカプトブタン酸（２５０ｍｇ、２．０８ｍｍｏｌ）を室温にて添加した。暗色反応混合物を３０分間撹拌し、そしてＬＣ－ＭＳ上で反応の進行をモニターした（反応が完了していない場合、完了まで撹拌した）。反応の完了後、反応混合物を真空中で濃縮し、１ｍＬのＤＭＳＯで希釈し、そして予め平衡化したＣ１８ ａｑ．１５０ｇカラムへと移送した。溶離液（水中１０％ＡＣＮ～９５％ＡＣＮ、修正剤として０．０５％ＡｃＯＨ）を使用して精製を実施した。純粋な画分を収集し、凍結し、そして凍結乾燥して、白色固体として３５１ｍｇ（７３％）のＣｏｍｐ Ｄを得た。ＭＳ（ＥＳＩ、ｐｏｓ．）：Ｃ４７Ｈ６３Ｎ３Ｏ１２Ｓ２に対する計算値、９２５．３９；実測値９２６．７３（Ｍ＋Ｈ）。
化合物Ｂ（５００ｍｇ、０．５１９ｍｍｏｌ）を有する４０ｍＬの透明なバイアルに、ＤＭＦ（７ｍＬ）を添加し、そして撹拌して、透明な溶液を得た。ＰＢＳ ｐＨ＝７．４緩衝剤（２．５ｍＬ）、続いて４－メルカプトブタン酸（２５０ｍｇ、２．０８ｍｍｏｌ）を室温にて添加した。暗色反応混合物を３０分間撹拌し、そしてＬＣ－ＭＳ上で反応の進行をモニターした（反応が完了していない場合、完了まで撹拌した）。反応の完了後、反応混合物を真空中で濃縮し、１ｍＬのＤＭＳＯで希釈し、そして予め平衡化したＣ１８ ａｑ．１５０ｇカラムへと移送した。溶離液（水中１０％ＡＣＮ～９５％ＡＣＮ、修正剤として０．０５％ＡｃＯＨ）を使用して精製を実施した。純粋な画分を収集し、凍結し、そして凍結乾燥して、白色固体として３５１ｍｇ（７３％）のＣｏｍｐ Ｄを得た。ＭＳ（ＥＳＩ、ｐｏｓ．）：Ｃ４７Ｈ６３Ｎ３Ｏ１２Ｓ２に対する計算値、９２５．３９；実測値９２６．７３（Ｍ＋Ｈ）。
【化28】
【0098】
ＡＢＺ－１８２７：
化合物Ｄ（３５０ｍｇ、０．３７７ｍｍｏｌ）を有する４０ｍＬの透明なバイアルに、ＤＣＭ（１０ｍＬ）を添加し、そして撹拌して、透明な溶液を得た。ＥＤＣＩ（１３０ｍｇ、０．６８０ｍｍｏｌ）、続いてＮＨＳ（６５ｍｇ、０．５６５ｍｍｏｌ）をアルゴン下で氷浴において添加した。得られた溶液を１６～２４時間撹拌し、そしてＬＣ－ＭＳによって反応の進行をモニターした。反応の完了後、粗製を減圧下で濃縮した。粗製を１．５ｍＬのＤＭＳＯを用いて溶解し、そして予め平衡化したＣ１８ ａｑ．１５０ｇカラムの中へとプラグした。溶離液（水中１０％ＡＣＮ～９５％ＡＣＮ、修正剤として０．０５％ＡｃＯＨ）を使用して精製を完了した。純粋な画分を収集し、凍結し、そして凍結乾燥して、白色固体として２７０ｍｇ（７０％）のＡＢＺ－１８２７を得た。ＭＳ（ＥＳＩ、ｐｏｓ．）：Ｃ５１Ｈ６６Ｎ４Ｏ１４Ｓ２に対する計算値、１０２２．４０；実測値１０２３．７５（Ｍ＋Ｈ）。
化合物Ｄ（３５０ｍｇ、０．３７７ｍｍｏｌ）を有する４０ｍＬの透明なバイアルに、ＤＣＭ（１０ｍＬ）を添加し、そして撹拌して、透明な溶液を得た。ＥＤＣＩ（１３０ｍｇ、０．６８０ｍｍｏｌ）、続いてＮＨＳ（６５ｍｇ、０．５６５ｍｍｏｌ）をアルゴン下で氷浴において添加した。得られた溶液を１６～２４時間撹拌し、そしてＬＣ－ＭＳによって反応の進行をモニターした。反応の完了後、粗製を減圧下で濃縮した。粗製を１．５ｍＬのＤＭＳＯを用いて溶解し、そして予め平衡化したＣ１８ ａｑ．１５０ｇカラムの中へとプラグした。溶離液（水中１０％ＡＣＮ～９５％ＡＣＮ、修正剤として０．０５％ＡｃＯＨ）を使用して精製を完了した。純粋な画分を収集し、凍結し、そして凍結乾燥して、白色固体として２７０ｍｇ（７０％）のＡＢＺ－１８２７を得た。ＭＳ（ＥＳＩ、ｐｏｓ．）：Ｃ５１Ｈ６６Ｎ４Ｏ１４Ｓ２に対する計算値、１０２２．４０；実測値１０２３．７５（Ｍ＋Ｈ）。
【化29】
【0099】
異なるＤＰＲ値を有するＡＦＰバイオコンジュゲートを調製するために、ＡＦＰタンパク質を、３０ｋＤａのＭＷＣＯフィルタを用いて１０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５緩衝剤へと緩衝剤交換した。緩衝剤交換後、タンパク質濃度を５ｍｇ／ｍＬへと調整した。コンジュゲーション反応のために、少量のＤＭＳＯを反応に添加し、続いてＡＢＺ９８２またはＡＢＺ１８２７リンカーペイロード（ＤＭＳＯを有する１０ｍＭ原液として新たに調製した）を添加した。反応混合物中に存在するＤＭＳＯの総量は、１０％（ｖ／ｖ）、（ＤＰＲ ３～４バイオコンジュゲートについては７当量のリンカーペイロード、ＤＰＲ ５～６バイオコンジュゲートについては１０当量のリンカーペイロード）であった。反応混合物を、室温（２２℃）にて１０ｒｐｍ／分で１６～２０時間、管リボルバー上で混合した。３０ｋＤａのＭＷＣＯフィルタを使用して、粗製バイオコンジュゲートを１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、５％スクロース、ｐＨ７．５へと緩衝剤交換することによって、バイオコンジュゲートを精製した。精製されたバイオコンジュゲートを滅菌濾過し、そして－８０℃で貯蔵した。
【0100】
定義されたＤＰＲを有する生成物について、各コンジュゲーション反応溶液を、等体積の５０ｍＭリン酸ナトリウム、２Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７と混合した。各バイオコンジュゲートを、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７、２０％イソプロパノールの勾配でカラムから溶出した。粗製溶液を等体積の５０ｍＭリン酸ナトリウム、４Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７と混合し、そして得られた溶液を、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、２Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７で平衡化したＴｏｙｏＰｅａｒｌ Ｐｈｅｎｙｌ－６５０Ｓ ＨＩＣカラムへと装填した。異なる値のＤＰＲを含有する画分をプールし、そして濃縮した。濃縮した試料を、ｐＨ７．１～７．５のＰＢＳへと緩衝剤交換し、そして滅菌濾過した（０．２２ｕｍのＰＶＤＦ膜）。ＤＰＲの割り当ては、Ａ２４８／Ａ２８０吸収比に基づく。平均ＤＰＲを、２８０ｎｍでのＨＩＣ分析後の個々のＤＰＲ種の相対ピーク面積から計算した。
【0101】
バイオコンジュゲート試験
リード化合物をインビトロで試験する前に、以下の表１に要約される研究と同様に、Ｕ９３７細胞株だけでなく他の細胞株においても、ＡＦＰ受容体の発現、および蛍光標識されたｒｈＡＦＰに結合し、かつ取り込む細胞の能力を確立した。この研究では、ｒｈＡＦＰを、市販のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ－６４７（ＡＦ－６４７）タンパク質標識キットからの製品プロトコル内に記述される手順を使用して標識した。結合実験を９６ウェルプレートで実施し、そしてプレートリーダーを使用して蛍光を測定した。腫瘍細胞を懸濁液中で培養した、または細胞培養培地中に播種した。各腫瘍細胞株を、ＡＦ－６４７標識されたｒｈＡＦＰを用いて、３７°℃で０．５、２、および５時間インキュベートした（ｎ＝３複製）。氷上で冷却することによってインキュベーションを停止した。懸濁液中の細胞については、細胞および培養培地を遠心分離によって別個に収集し、そして繰り返し洗浄工程に供した。播種した細胞については、トリプシン／ＥＤＴＡを細胞分離のために使用した。ＭＯＬＴ－４を除いて、細胞株の大部分は高い結合を示し、ＭＣＦ７（乳がん）は、試験したすべての細胞株の中で最も高い結合を示し、Ｕ９３７（リンパ腫）およびＣＯＬＯ－２０５（結腸直腸がん）が続いた。
リード化合物をインビトロで試験する前に、以下の表１に要約される研究と同様に、Ｕ９３７細胞株だけでなく他の細胞株においても、ＡＦＰ受容体の発現、および蛍光標識されたｒｈＡＦＰに結合し、かつ取り込む細胞の能力を確立した。この研究では、ｒｈＡＦＰを、市販のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ－６４７（ＡＦ－６４７）タンパク質標識キットからの製品プロトコル内に記述される手順を使用して標識した。結合実験を９６ウェルプレートで実施し、そしてプレートリーダーを使用して蛍光を測定した。腫瘍細胞を懸濁液中で培養した、または細胞培養培地中に播種した。各腫瘍細胞株を、ＡＦ－６４７標識されたｒｈＡＦＰを用いて、３７°℃で０．５、２、および５時間インキュベートした（ｎ＝３複製）。氷上で冷却することによってインキュベーションを停止した。懸濁液中の細胞については、細胞および培養培地を遠心分離によって別個に収集し、そして繰り返し洗浄工程に供した。播種した細胞については、トリプシン／ＥＤＴＡを細胞分離のために使用した。ＭＯＬＴ－４を除いて、細胞株の大部分は高い結合を示し、ＭＣＦ７（乳がん）は、試験したすべての細胞株の中で最も高い結合を示し、Ｕ９３７（リンパ腫）およびＣＯＬＯ－２０５（結腸直腸がん）が続いた。
【0102】
他のＡＦＰ受容体結合研究では、ｒｈＡＦＰは、ＦｌｕｏｒｏＴａTM ＦＩＴＣコンジュゲーションキットを使用して、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ－４８８またはＦＩＴＣで標識され、そして同様の結果を達成した。
【表1】
【0103】
様々な反応条件下で合成されたＤＭ１、ＤＭ３、ＤＭ４、またはＡＢＺ９８１を含有する一連のバイオコンジュゲートは、異なる平均ＤＰＲをもたらす。これらのバイオコンジュゲートの細胞毒性を、腫瘍細胞株（白血病、乳房、結腸直腸、卵巣、および肺）のパネルにおいてインビトロで評価した。結果を以下の表２に要約する。
【0104】
ＡＢＺ９８１コンジュゲートは、シリーズ１のバイオコンジュゲートのうち、最も高いＤＰＲ（７．５）を有したが、Ｕ９３７細胞株では、より低いＤＰＲ（４．４～５．１）で合成された他のコンジュゲートと同様の力価を有した。ＤＭ４コンジュゲート（ＤＰＲ ４．４）はまた、ＭＣＦ－７細胞株でもＡＢＺ９８１コンジュゲートと同様の力価を有した。しかしながら、力価ＤＭ１およびＤＭ３コンジュゲートは、この細胞株ではおよそ３倍より低かった。
【0105】
類似のＤＰＲ（３．５～４）で合成されたシリーズ２のコンジュゲートでは、ＤＭ４コンジュゲートは、調べた細胞株にわたって最も強力であったが、ＡＢＺ９８１コンジュゲート（ＤＰＲ３．５）は、３～１５倍能力が低かった。
【0106】
これらの結果は、インビトロでの力価が必ずしもＤＰＲに関連しないことを示した。
【表2】
【0107】
マウスおよびヒトの血清中で、３７°℃にてそれぞれ３日間および７日間、インキュベートされた、シリーズ２のＡＦＰバイオコンジュゲートをインキュベートするエクスビボ研究を実施した。バイオコンジュゲートを、抗ＡＦＰ抗体が装填されたＩｎｎｏｖａ磁気ビーズ上で捕捉した。捕捉された試料をＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳによって分析して、ＤＰＲプロファイルおよびタンパク質の完全性を確認した。すべてのバイオコンジュゲートは、３日後のマウス血清中の－５．９％～－１３．５％のＤＰＲの平均減少で、また７日後のヒト血清中の－８．１％～１５．８％のＤＰＲの平均減少で、良好な安定性を示した。
【0108】
腫瘍を持つマウスにおける生体内分布／薬物動態
ＣＯＬＯ－２０５腫瘍異種移植片を皮下移植したマウスにおける薬物動態／生体内分布（ＰＫ／ＢＤ）研究での比較試験のためにＤＭ４、ＤＭ１、またはＡＢＺ９８１を含有するバイオコンジュゲートを、およそ４のＤＰＲで再合成した（表３）。
ＣＯＬＯ－２０５腫瘍異種移植片を皮下移植したマウスにおける薬物動態／生体内分布（ＰＫ／ＢＤ）研究での比較試験のためにＤＭ４、ＤＭ１、またはＡＢＺ９８１を含有するバイオコンジュゲートを、およそ４のＤＰＲで再合成した（表３）。
【表3】
【0109】
投与の体積は、尾静脈へと単回ＩＶ注射と同じ量のバイオコンジュゲート（２５ｍｇ／ｋｇ）を各動物のグループへと送達するように調整された。血液試料を注射の０．２５時間後および１時間後に採取し、そして血液および組織試料を４時間、８時間、および２４時間において採取して、バイオコンジュゲートの薬物動態および生体内分布を評価した（時点当たりｎ＝３）。市販のＥＬＩＳＡキットを使用して、ＡＦＰレベルを測定し、遊離メイタンシンおよびその代謝物のレベルをＬＣ／ＭＳによって測定した。血液中の無視できるほどの量の遊離毒素が、この期間にわたって検出され（注射された総用量の≦０．００１％）、マウス血清中のバイオコンジュゲートのエクスビボ安定性と一致した。
【0110】
バイオコンジュゲートの腫瘍取り込みならびに毒素放出および代謝
腫瘍への毒素の送達（遊離メイタンシンプラス代謝物）は、ｎｇ／ｍｇ組織として、または投与された総用量のパーセントとしてのいずれか発現された場合、他のグループと比較して、すべての時点で、ＤＭベースのコンジュゲートと比較して、ＡＦＰ－ＡＢＺ９８１コンジュゲートで最高であった。ＡＦＰ－ＡＢＺ９８１コンジュゲートで達成されたレベルは、それぞれＤＭ１コンジュゲートおよびＤＭ４コンジュゲートよりもおよそ３倍および２２倍高かった。ＡＦＰ－ＡＢＺ９８１コンジュゲートは、ＤＭ４コンジュゲートと比較してインビトロではより強力ではなかったため、これは予想外であった。ＡＦＰに対して正規化された場合のＡＦＰ－ＡＢＺ９８１コンジュゲートグループにおけるピーク遊離毒素レベルは、腫瘍におけるＡＦＰレベルの１８％であり、毒素の有意な割合がＡＦＰに結合したままであることを示唆する。しかしながら、腫瘍における毒素放出は、ＡＦＰ－ＡＢＺ９８１コンジュゲートについては、ＡＦＰ－ＤＭ４およびＡＦＰ－ＤＭ１に対してより高かった（それぞれおよそ１％および９％）。ＡＦＰ－ＡＢＺ９８１コンジュゲートで達成される毒素のより高いレベルは、このコンジュゲートとのジスルフィド結合の両側に単一のメチル基のみが存在するため、立体障害がより少ないことに起因する場合がある。
腫瘍への毒素の送達（遊離メイタンシンプラス代謝物）は、ｎｇ／ｍｇ組織として、または投与された総用量のパーセントとしてのいずれか発現された場合、他のグループと比較して、すべての時点で、ＤＭベースのコンジュゲートと比較して、ＡＦＰ－ＡＢＺ９８１コンジュゲートで最高であった。ＡＦＰ－ＡＢＺ９８１コンジュゲートで達成されたレベルは、それぞれＤＭ１コンジュゲートおよびＤＭ４コンジュゲートよりもおよそ３倍および２２倍高かった。ＡＦＰ－ＡＢＺ９８１コンジュゲートは、ＤＭ４コンジュゲートと比較してインビトロではより強力ではなかったため、これは予想外であった。ＡＦＰに対して正規化された場合のＡＦＰ－ＡＢＺ９８１コンジュゲートグループにおけるピーク遊離毒素レベルは、腫瘍におけるＡＦＰレベルの１８％であり、毒素の有意な割合がＡＦＰに結合したままであることを示唆する。しかしながら、腫瘍における毒素放出は、ＡＦＰ－ＡＢＺ９８１コンジュゲートについては、ＡＦＰ－ＤＭ４およびＡＦＰ－ＤＭ１に対してより高かった（それぞれおよそ１％および９％）。ＡＦＰ－ＡＢＺ９８１コンジュゲートで達成される毒素のより高いレベルは、このコンジュゲートとのジスルフィド結合の両側に単一のメチル基のみが存在するため、立体障害がより少ないことに起因する場合がある。
【0111】
その後、２つの異なる放出機能性を有するＡＢＺ９８１を含有するバイオコンジュゲート（ＡＦＰ－ＡＢＺ９８２およびＡＦＰ－ＡＢＺ１８２７）を、２．５～６．３のＤＰＲで調製した。Ｕ９３７細胞株およびＳＫＯＶ３細胞株におけるインビトロ試験の結果を表４に示す。細胞を、８点濃度範囲にわたって化合物の存在下で４日間インキュベートし、各濃度を３回ずつ試験した。新たに解凍されたＵ９３７細胞を使用して実施された２つの実験は、培養物中で維持されたＵ９３７細胞と類似の結果をもたらした。
【表4】
【0112】
これらのバイオコンジュゲートのＡＦＰ受容体への具体的な結合は、蛍光標識されたｒｈＡＦＰを使用するＵ９３７細胞株における競合実験によって確認された（図１）。簡潔に述べると、培養されたＵ－９３７細胞を、無血清培地へと移送し、３７℃にて２時間の間、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８－標的化ｒｈＡＦＰを用いて共インキュベートし、そして標識化されていないｒｈＡＦＰまたはバイオコンジュゲートの滴定を４℃にて１時間行った。細胞を洗浄し、固定し、そしてフローサイトメトリーによって分析した。
【0113】
表５に目を移すと、ＣＯＬＯ－２０５ヒト腫瘍異種移植片モデルにおけるインビボでの有効性試験のために、ＡＦＰ－ＡＢＺ９８２およびＡＦＰ－ＡＢＺ１８２７（合計で４個）の各々の２つのバイオコンジュゲートを、およそ４個（「低ＤＰＲ」）および６個（「高ＤＰＲ」）のＤＰＲで調製した。移植前のＣＯＬＯ－２０５細胞株における力価を評価した。簡潔に述べると、９６ウェルプレートに、ウェル当たり５０mＬの総体積で、ＣＯＬＯ－２０５細胞を、ウェル当たり５，０００細胞または２，５００細胞のいずれかで播種した。プレートを一晩インキュベートし、次いで３７℃にて７２時間の間バイオコンジュゲートで処理し、次いでＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏアッセイを実施して、細胞生存能力を測定した。試料を３回実行した。高ＤＰＲバイオコンジュゲートは、低ＤＰＲバイオコンジュゲートより強力であり、またインビトロでＣＯＬＯ－２０５に対して同様の力価を示したが、ＡＦＰ－ＡＢＺ９８２高ＤＰＲバイオコンジュゲートは最も強力であり、非コンジュゲート毒素リンカーよりも低いＩＣ５０を有した。
【表5】
【0114】
腫瘍を有するマウスにおける有効性
本実験では、異なる薬物－タンパク質比（ＡＦＰ－ＡＢＺ９８２高ＤＰＲ／低ＤＰＲおよびＡＦＰ－１８２７高ＤＰＲ／低ＤＰＲ）およびわずかに異なるリンカー構造の４つの新規のＡＦＰ－メイタンシノイドバイオコンジュゲートの有効性。上記の４つのＡＢＺ９８１－含有バイオコンジュゲートを再合成し、そしてｐＨ７．５で１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝剤、５％のスクロース中で製剤化した（表６）。腫瘍を有するマウスでの有効性を試験する前に、０、５、１０、２０、および４０ｍｇ／ｋｇの用量での有効性研究（２週間のＱ１Ｄｘ５）に対して使用されるのと同じ投与レジメンを採用して、健康なマウスでの各バイオコンジュゲートについて最大耐量（ＭＴＤ）を決定した。ＭＴＤは、投与期間中に毎日行われた臨床観察、および治療終了時に決定された肝臓酵素（ＡＳＴ／ＡＬＴ）の上昇に基づいた。驚くべきことに、ＡＦＰ－ＡＢＺ１８２７の高ＤＰＲのＭＴＤは、低ＤＰＲに対するＭＴＤより高かった。一般に、より多くの量の毒素を担持するより高いＤＰＲを有するバイオコンジュゲートは、より低いＭＴＤを有することが期待されることになる。
本実験では、異なる薬物－タンパク質比（ＡＦＰ－ＡＢＺ９８２高ＤＰＲ／低ＤＰＲおよびＡＦＰ－１８２７高ＤＰＲ／低ＤＰＲ）およびわずかに異なるリンカー構造の４つの新規のＡＦＰ－メイタンシノイドバイオコンジュゲートの有効性。上記の４つのＡＢＺ９８１－含有バイオコンジュゲートを再合成し、そしてｐＨ７．５で１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝剤、５％のスクロース中で製剤化した（表６）。腫瘍を有するマウスでの有効性を試験する前に、０、５、１０、２０、および４０ｍｇ／ｋｇの用量での有効性研究（２週間のＱ１Ｄｘ５）に対して使用されるのと同じ投与レジメンを採用して、健康なマウスでの各バイオコンジュゲートについて最大耐量（ＭＴＤ）を決定した。ＭＴＤは、投与期間中に毎日行われた臨床観察、および治療終了時に決定された肝臓酵素（ＡＳＴ／ＡＬＴ）の上昇に基づいた。驚くべきことに、ＡＦＰ－ＡＢＺ１８２７の高ＤＰＲのＭＴＤは、低ＤＰＲに対するＭＴＤより高かった。一般に、より多くの量の毒素を担持するより高いＤＰＲを有するバイオコンジュゲートは、より低いＭＴＤを有することが期待されることになる。
【表6】
【0115】
結腸がん異種移植片モデルでは、７週齢のオスの胸腺欠損マウスに、右脇腹に１×１０７個のＣＯＬＯ－２０５細胞を皮下移植した。およそ１００ｍｍ３～２００ｍｍ３の腫瘍を有するマウスを無作為化して、対照（ビヒクル）または４つのバイオコンジュゲートのうちの１つ（１０匹／グループ）を受容させた。動物を、５回の投与後に２日間の休息で２週間毎日処置し、移植後６０日間、腫瘍体積を週に２回評価した。図２および図３は、この研究によって示されるように、結腸がんのＣＯＬＯ ２０５ヒト異種移植片モデルにおける本バイオコンジュゲートの貴重な特性を明らかにする。
【0116】
図２に示すように、ＡＦＰバイオコンジュゲートＡＦＰ－ＡＢＺ９８２および特にＡＦＰ－ＡＢＺ１８２７は、特にＡＦＰ－ＡＢＺ９８２が低ＤＰＲで使用される場合、およびＡＦＰ－ＡＢＺ１８２７が高ＤＰＲで使用される場合、ＣＯＬＯ－２０５腫瘍の成長に劇的な阻害効果を有する。腫瘍重量の統計的に有意な（ｐ＜０．０５）減少が、１７日目から始まり、すべての対照動物が安楽死させられるまで続いた対照と比較して、すべての治療グループで観察された。高ＤＰＲ ＡＦＰ－ＡＢＺ１８２７グループでは、腫瘍退行はより早く（１４日目）発生し、そして１０匹中９匹の動物において、腫瘍体積が検出限界未満に低下した状態で治療中止後まで継続した。
【0117】
図３に示すように、試験されたすべてのバイオコンジュゲートは、ビヒクル対照と比較して、腫瘍を持つマウスの全生存を改善した。ＡＦＰ－ＡＢＺ１８２７高ＤＰＲグループでは、６０日間の観察期間の終了時にすべてのマウスが生存していた一方で、対照群のすべての動物は、制御されていない腫瘍増殖に起因して３８日目までに死亡した。処置したマウスでは毒性のいかなる徴候も観察されなかった。
【0118】
この研究では、高いＤＰＲ ＡＦＰ－ＡＢＺ１８２７は、腫瘍重量を低減し、かつ腫瘍を持つマウスの全生存を改善するという文脈で、低ＤＰＲ均等物および試験されたすべての他のバイオコンジュゲートより優れていた。
【0119】
ＣＯＬＯ－２０５異種移植片モデルにおいて示された異なる用量レベルでの高ＤＰＲ ＡＦＰ－ＡＢＺ１８２７（ＡＣＴ－９０３）のさらなる研究は、３０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、または５０ｍｇ／ｋｇのいずれかの用量での単回ＩＶ注射後１４日目までに腫瘍増殖の著しい低減を示した（ｐ＜０．０５）。この研究では、これらの２つの用量グループに対して２４日目に第二の用量を投与した。このレジメンは、ビヒクル対照群と比較して、４０ｍｇ／ｋｇグループ（ｐ＜０．００１）および５０ｍｇ／ｋｇグループ（ｐ＝０．００３７）において有意に延長された生存と関連付けられた。
【0120】
高ＤＰＲ ＡＦＰ－ＡＢＺ１８２７（ＡＣＴ－９０３）のさらなる研究を、２人の患者に由来する卵巣がんオルガノイドにおいて実行した。蛍光標識されたＡＣＴ－１０１を使用する研究は、化合物が卵巣オルガノイドに結合し、かつ卵巣オルガノイドによって急速に取り込まれたため、ＡＦＰ受容体の存在を確認した。ＡＣＴ－９０３は、両方のオルガノイドにおいて濃度依存的および時間依存の様式で細胞死を効果的に誘導した。アネキシンＶ染色を使用して、実験で使用される陽性対照、既知の細胞毒タプシガルギンおよびスタウロスポリンと同様に、低濃度のＡＣＴ－９０３でさえも７２時間までに大規模なアポトーシスが観察された一方で、非コンジュゲート化タンパク質（ＡＣＴ－１０１）は細胞に対して無害であった。
【0121】
高ＡＣＴ－９０３のさらなる研究を、卵巣がん異種移植片モデルで実行した。５～７週齢のメスの胸腺欠損マウスに、Ａ２７８０卵巣腫瘍細胞を右脇腹に皮下移植した。マウスを、対照（ビヒクル）またはＡＣＴ－９０３を受容するように（５匹／グループ）無作為化した。動物を、５回の投与後に２日間の休息で１０日間毎日処置した。治療前のベースラインでの腫瘍体積は、１０８ｍｍ３～２８８ｍｍ３の範囲であった。移植後６０日間、腫瘍体積を週に２回評価した。図４および図５は、この研究によって示されるように、卵巣がんのＡ２７８０ヒト異種移植片モデルにおける本バイオコンジュゲートの貴重な特性を明らかにする。
【0122】
図４に示すように、ＡＣＴ－９０３は、Ａ２７８０腫瘍の成長に劇的な阻害効果を有する。腫瘍成長曲線は、ＡＣＴ－９０３治療グループにおける腫瘍量の著しい（ｐ＜０．０００１）低減を示し、処置後のすべてのマウスにおいて完全な腫瘍退行（腫瘍が不可視、または触診可能ではない）が生じる。その上、腫瘍の再増殖は、６０日間の観察期間中に治療の終了後には生じなかった。
【0123】
図５に示されるように、ＡＣＴ－９０３は、ビヒクル対照と比較して生存を著しく改善し（ｐ＜０．０００１）、ＡＣＴ－９０３処置グループのすべてのマウスは、対照群ではいかなる生存するマウスもいなかったのと比較して、６０日間の観察期間の終わりまで生存した。
【0124】
それ故に、当然のことながら、ＡＦＰ受容体は、その発現がＭＤＳＣを除く正常組織では一般的に非常に低い、または存在しないが、多くの一般的ながんでは多数存在するため、がん治療法にとって非常に魅力的な新規の標的である。その上、ＡＦＰは、あらゆるヒト胎児が子宮内で曝露される天然に存在するヒトタンパク質であるため、ｒｈＡＦＰ細胞毒バイオコンジュゲートに対するいかなる有害な免疫反応のリスクも低減される。
【0125】
本明細書に記述されるバイオコンジュゲートは、腫瘍細胞の内側では高濃度で存在するが、血流中では低濃度であるグルタチオンによって還元することができるジスルフィドリンカーを含有する。それ故に、本バイオコンジュゲートは、腫瘍上のＡＦＰ受容体の差次的発現と、腫瘍内のグルタチオン濃度の増加との両方に基づいて、二重腫瘍標的化機構を提供する。
【0126】
本明細書に特許請求されるものを含むコンジュゲートは、ＡＦＰ－ＡＢＺ９８２低ＤＰＲおよび高ＤＰＲだけでなく、好ましいＡＦＰ－ＡＢＺ１８２７低ＤＰＲおよび特に高ＤＰＲを含んで、追加の動物モデルへと前向きに取ることができる。これらは、異なる放出機能性とＤＰＲ負荷とを表す。インビトロでの力価は、低ｎＭ範囲であり、Ｕ９３７細胞株内の遊離細胞毒と同程度の高さである。二量体形成は、使用されるコンジュゲーション条件下では問題ではなく、またバイオコンジュゲートは、５％スクロースを有する１０ｍＭのＨＥＰＥＳまたはＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝剤のいずれかで製剤化された場合、２０℃にて少なくとも９６時間の間安定であり、またマウス／ヒト血清で７日間にわたって３７℃にて高い血清安定性を示す。
【0127】
本明細書に引用される出版物、特許出願、および特許を含むすべての参考文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【手続補正書】
【提出日】2024-03-28
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
疾患細胞の治療において有用なバイオコンジュゲートであって、（１）細胞の表面上のアルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）受容体（ＡＦＰＲ）に結合する薬剤と、
（２）前記細胞に対して毒性である細胞毒（ＣＴ）と、
（３）グルタチオン切断可能なジスルフィドリンカーであって、
（ｉ）前記ＡＦＰＲ結合剤と前記ＣＴとの間に共有結合され、かつ
（ｉｉ）前記ＣＴを前記細胞へと細胞内で放出する、リンカーと、を含む、バイオコンジュゲート。
【請求項2】
前記ＡＦＰＲ結合剤が、成熟した、野生型ＡＦＰのアミノ酸配列、ＡＦＰＲ結合断片のアミノ酸配列、または前記成熟野生型ＡＦＰもしくは前記ＡＦＰ断片のＡＦＰＲ結合バリアントのアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項3】
前記ＡＦＰが、組み換え型ヒトＡＦＰ、またはそのＡＦＰＲ結合断片もしくはバリアントであり、前記バリアントが、１～５個のアミノ酸置換を含む、請求項２に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項4】
前記薬剤が、配列番号３を含む組み換え型［Ａｓｎ２３３Ｇｌｎ］成熟ヒトＡＦＰである、請求項１に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項5】
前記薬剤が配列番号４を含む、請求項１に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項6】
前記細胞毒（ＣＴ）が、次式を有する、請求項４に記載のバイオコンジュゲート。【化1】
【請求項7】
前記リンカーが前記ＡＦＰＲ結合剤と前記細胞毒との間に連結され、前記細胞毒が、リンカー１ －Ｓ－ＣＨ（ＣＨ３）－（ＣＨ２）２－ＣＯ－－、および
リンカー２ －Ｓ－（ＣＨ２）３－ＣＯ－から選択される、請求項４に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項8】
前記コンジュゲートが、以下に示されるリンカー細胞毒を含む、請求項１に記載のバイオコンジュゲートの産生において有用なコンジュゲート。【化2】
【請求項9】
次式のバイオコンジュゲートであって、【化3】
式中、ＡＦＰが、アルファフェトプロテインのＡＦＰ受容体結合形態である、バイオコンジュゲート。
【請求項10】
前記平均ＤＰＲが４～８である、請求項９に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項11】
前記平均ＤＰＲが約５．８である、請求項９に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項12】
薬学的に許容可能な担体と、請求項１０に記載のバイオコンジュゲートと、を含む医薬組成物であって、前記薬学的に許容可能な担体が、５％スクロースを有するｐＨ７．５の１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝剤である、医薬組成物。
【請求項13】
それを必要とする対象内のＡＦＰＲ＋骨髄由来サプレッサー細胞を治療するための方法であって、治療有効量の請求項１０に記載の医薬組成物を対象へと投与することを含む、方法。
【請求項14】
請求項４に記載のＡＦＰＲ結合形態のＡＦＰを、請求項８に記載のコンジュゲートと連結することを含む、バイオコンジュゲートを産生するためのプロセス。
【請求項15】
バイオコンジュゲートを産生するためのプロセスであって、それによって、細胞毒ＡＢＺ－９８１が、最初にグルタチオン感受性ジスルフィドリンカーと連結されて、次式の中間体を産生し、【化4】
これがその後、配列番号３を含む組み換え型［Ａｓｎ２３３Ｇｌｎ］成熟ヒトＡＦＰである、ＡＦＰのＡＦＰＲ結合形態と反応し、そして前記中間体が、ＡＦＰ内のリジン残基のイプシロンアミノ基へと共有結合される、プロセス。
【国際調査報告】