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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-07-12
(54)【発明の名称】混合試料中のリンパ球の量の決定
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/68 20180101AFI20240705BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/68
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024504149
(86)(22)【出願日】2022-07-22
(85)【翻訳文提出日】2024-03-19
(86)【国際出願番号】 EP2022070694
(87)【国際公開番号】W WO2023002046
(87)【国際公開日】2023-01-26
(31)【優先権主張番号】2110555.6
(32)【優先日】2021-07-22
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(31)【優先権主張番号】2203451.6
(32)【優先日】2022-03-11
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】524028795
【氏名又は名称】ザ フランシス クリック インスティテュート リミテッド
(71)【出願人】
【識別番号】511226591
【氏名又は名称】ユニバーシティー カレッジ ロンドン
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＣＯＬＬＥＧＥ ＬＯＮＤＯＮ
(74)【代理人】
【識別番号】100079108
【弁理士】
【氏名又は名称】稲葉 良幸
(74)【代理人】
【識別番号】100109346
【弁理士】
【氏名又は名称】大貫 敏史
(74)【代理人】
【識別番号】100117189
【弁理士】
【氏名又は名称】江口 昭彦
(74)【代理人】
【識別番号】100134120
【弁理士】
【氏名又は名称】内藤 和彦
(72)【発明者】
【氏名】ベンサム，ロバート
(72)【発明者】
【氏名】ワトキンス，トーマス ベンジャミン キングドン
(72)【発明者】
【氏名】マクグラナハン，ニコラス
(72)【発明者】
【氏名】スワントン，チャールズ
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QQ03
4B063QQ08
4B063QQ28
4B063QQ42
4B063QQ52
4B063QR08
4B063QR32
4B063QR35
4B063QR77
4B063QS39
4B063QX04
(57)【要約】
【課題】複数の細胞型からのゲノム材料を含む混合試料中のリンパ球の分画率を決定するための方法が記載される。
【解決手段】本方法は、ＶＤＪ組換えを受けるゲノム遺伝子座の少なくとも一部を含む所定のゲノム関心領域に沿った試料に関するリード深度プロファイルを取得することと、関心領域のサブセットから導出されたベースラインリード深度を参照して、リード深度を正規化することによって、複数のリード深度比（ｒｉ）を取得することと、ＶＤＪ組換えにより欠失される可能性が高い関心領域のサブセットに関する要約されたリード深度比値（ｒＶＤＪ）を取得することと、試料中のリンパ球の分画率（ｆ）を、要約されたリード深度比値（ｒＶＤＪ）の関数として決定することと、を含む。リンパ球分画率に基づいて診断又は予後予測を提供する方法、及び関連のシステム及び製品についても記載される。
【選択図】図１
【解決手段】本方法は、ＶＤＪ組換えを受けるゲノム遺伝子座の少なくとも一部を含む所定のゲノム関心領域に沿った試料に関するリード深度プロファイルを取得することと、関心領域のサブセットから導出されたベースラインリード深度を参照して、リード深度を正規化することによって、複数のリード深度比（ｒｉ）を取得することと、ＶＤＪ組換えにより欠失される可能性が高い関心領域のサブセットに関する要約されたリード深度比値（ｒＶＤＪ）を取得することと、試料中のリンパ球の分画率（ｆ）を、要約されたリード深度比値（ｒＶＤＪ）の関数として決定することと、を含む。リンパ球分画率に基づいて診断又は予後予測を提供する方法、及び関連のシステム及び製品についても記載される。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
複数の細胞型からのゲノム材料を含む混合試料中のリンパ球の分画率を決定するための方法であって、ＶＤＪ組換えを受けるゲノム遺伝子座の少なくとも一部を含む所定のゲノム関心領域に沿ったリード深度を含む前記試料のリード深度プロファイルを取得することと、
前記関心領域のサブセットから導出されたベースラインリード深度を参照して、前記所定の関心領域に沿って前記リード深度を正規化することによって、複数のリード深度比（ｒｉ）を取得することと、
ＶＤＪ組換えにより欠失される可能性が高い前記関心領域のサブセットに関する要約されたリード深度比値（ｒＶＤＪ）を取得することと、
前記試料中のリンパ球の前記分画率（ｆ）を、前記要約されたリード深度比値（ｒＶＤＪ）の関数として決定することと
を含む方法。
【請求項2】
ＶＤＪ組換えを受けるゲノム遺伝子座が、ＴＣＲＡ、ＴＣＲＢ、ＴＣＲＧ、ＴＣＲＤ、ＩＧＨ、ＩＧＬ、又はＩＧＫ遺伝子座から選択され、及び／又はリンパ球の前記分画率が、Ｔリンパ球の分画率、Ｂリンパ球の分画率、αβＴリンパ球の分画率、γδＴリンパ球の分画率、前記ＴＣＲＡ、ＴＣＲＢ、ＴＣＲＧ、ＴＣＲＤ、ＩＧＨ、ＩＧＬ、若しくはＩＧＫ遺伝子座の任意の遺伝子セグメントを含むＢ細胞若しくはＴ細胞の分画率、又は表８に列挙されている任意の遺伝子セグメントを含むＢ細胞若しくはＴ細胞の分画率である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記所定の関心領域が、前記ＴＣＲＡ、ＴＣＲＢ、ＴＣＲＧ、ＴＣＲＤ、ＩＧＨ、ＩＧＬ、又はＩＧＫ遺伝子座からの１つ又は複数のエクソンを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記所定の関心領域が、前記ＴＣＲＡ、ＴＣＲＢ、ＴＣＲＧ、ＴＣＲＤ、ＩＧＨ、ＩＧＬ、又はＩＧＫ遺伝子座からの複数のエクソンを含み、前記複数のエクソンが、前記それぞれの遺伝子座のＶ、Ｄ、及びＣセグメントのそれぞれに対応する少なくとも１つのエクソンを含む、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項5】
前記複数のエクソンが、前記それぞれの遺伝子座の複数のＶセグメントに対応するエクソンを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
リード深度プロファイルが、配列決定データから、好ましくは全エクソーム配列決定、全ゲノム配列決定、又はパネル配列決定データから得られる、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記試料中のリンパ球の前記分画率（ｆ）を前記要約されたリード深度比値（ｒＶＤＪ）の関数として決定することが、前記試料中のリンパ球の前記分画率（ｆ）を、前記要約されたリード深度比値（ｒＶＤＪ）と、前記混合試料中での、前記所定の関心領域内で異数性である異常細胞の分画率（ｐ）と、及び前記所定の関心領域内の前記異常細胞のコピー数（ΨＴ）との関数として決定することを含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記試料中のリンパ球の前記分画率（ｆ）を決定することが、【数1】
【請求項9】
前記試料中のリンパ球の前記分画率（ｆ）を決定することが、【数2】
【請求項10】
ＶＤＪ組換えにより欠失される可能性が高い前記関心領域の前記サブセットが、ＶＤＪ組換えを受ける前記ゲノム遺伝子座の最後のＶセグメントの終了位置と、ＶＤＪ組換えを受ける前記ゲノム遺伝子座のＪセグメントの開始位置と、の間にある領域を含み、好ましくは、ＶＤＪ組換えにより欠失される可能性が高い前記関心領域の前記サブセットが、ＶＤＪ組換えを受ける前記ゲノム遺伝子座の１つ又は複数のＤセグメント（例えば全てのＤセグメントなど）を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
モデルを前記複数のリード深度比に当てはめることをさらに含み、ＶＤＪ組換えにより欠失される可能性が高い前記関心領域のサブセットに関する要約されたリード深度比値（ｒＶＤＪ）を取得することが、ＶＤＪ組換えにより欠失される可能性が高い前記関心領域の前記サブセット内の前記モデルの前記値に基づいて、要約されたリード深度比値を取得することを含み、任意選択で、前記モデルが、一般化線形モデル、前記関心領域内の複数のＶ及びＪ遺伝子の位置に対応するように選択された複数の切断点を有する区分的制約付き線形モデル、又は、前記リード深度からのセグメント使用と、前記関心領域内の複数のＶ及びＪ遺伝子のそれぞれの使用の以前の分布とをモデル化するベイズモデルである、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
前記関心領域のサブセットからベースラインリード深度を取得することをさらに含み、好ましくは、前記ベースラインリード深度が、前記関心領域の前記被験体全体にわたる要約されたリード深度値である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
前記ベースラインリード深度を取得するために使用される前記関心領域の前記サブセットが、ＶＤＪ組換えにより欠失される可能性が低い前記関心領域のサブセットである、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
ＶＤＪ組換えにより欠失される可能性が低い前記関心領域の前記サブセットが、ＶＤＪ組換えを受ける前記ゲノム遺伝子座の最初のｎ個のＶセグメントを含み、及び／又はＶＤＪ組換えにより欠失される可能性が低い前記関心領域の前記サブセットが、ＶＤＪ組換えを受ける前記ゲノム遺伝子座の前記Ｃセグメントを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
リード深度プロファイルを取得することが、前記所定の関心領域にわたる複数の生のリード深度値を取得すること、及び前記リード深度値を平滑化することを含み、任意選択で、前記リード深度値を平滑化することが、所定の幅のウィンドウにわたる対応するローリング中央値によって前記生のリード深度値を置き換えることを含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
前記混合試料が血液試料又は腫瘍試料であり、及び／又は前記方法が、被験体から、複数の細胞型からのゲノム材料を含む混合試料を取得すること、及び／又は、被験体から、１つ又は複数のインビトロステップによって、複数の細胞型からのゲノム材料を含む混合試料からリード深度データを取得することをさらに含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
前記決定されたリンパ球分画率及び／又はそこから導出される任意の値を、例えばユーザインターフェースを介してユーザに提供することをさらに含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
がんと診断された被験体に関する予後予測を提供する方法であって、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法を使用して、前記被験体からの１つ又は複数の腫瘍試料中の前記リンパ球分画率を決定することを含む方法。
【請求項19】
がんと診断された被験体が免疫療法に応答する可能性が高いかどうかを決定する方法であって、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法を使用して、前記被験体からの１つ又は複数の腫瘍試料中の前記リンパ球分画率を決定することを含む方法。
【請求項20】
被験体がＴ細胞リンパ球減少症を有するかどうかを決定する方法であって、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法を使用して、前記被験体からの１つ又は複数の試料中の前記リンパ球分画率を決定することを含む方法。
【請求項21】
プロセッサと、前記プロセッサによって実行されるときに、請求項１～１５又は１７～２０のいずれか一項に記載の方法のステップを前記プロセッサに実行させる命令を含むコンピュータ可読媒体と、
を備えるシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
開示の分野
本開示は、試料に由来するリード深度プロファイルに基づいて、腫瘍試料又は血液試料などの複数の細胞型を含む混合試料中のＴリンパ球又はＢリンパ球などのリンパ球の分画率を推定する方法、並びにそのような方法を実行するためのシステム及び関連の製品に関する。また、患者からの腫瘍試料からの推定される腫瘍浸潤リンパ球分画率に少なくとも部分的に基づいて、がん患者に関する予後予測を提供する方法も記載される。
本開示は、試料に由来するリード深度プロファイルに基づいて、腫瘍試料又は血液試料などの複数の細胞型を含む混合試料中のＴリンパ球又はＢリンパ球などのリンパ球の分画率を推定する方法、並びにそのような方法を実行するためのシステム及び関連の製品に関する。また、患者からの腫瘍試料からの推定される腫瘍浸潤リンパ球分画率に少なくとも部分的に基づいて、がん患者に関する予後予測を提供する方法も記載される。
【背景技術】
【0002】
背景
リンパ球は、ヒトの健康及び疾患に重要な役割を果たす人体の仕組みの重要な部分である。例えば、腫瘍の場合、免疫系は、腫瘍形成とその後のがんの進展との両方に影響を及ぼす重要な因子の１つとして広く認識されている。特にＴ細胞は、ネオアンチゲンを保有するがん細胞を排除することでがん免疫微小環境の重要な役割を果たしており、したがって腫瘍試料内のＴ細胞の数は重要な臨床因子である。実際、臨床所見での腫瘍の免疫微小環境の状態は、免疫療法に関する予後予測因子であり且つ応答予測因子であり得る。近年、免疫療法、特にチェックポイント阻害薬（ＣＰＩ）が、多くのがん種に対する革新的な治療法として登場している。実際、悪性黒色腫及び非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）は、抗ＣＴＬ４療法又は抗ＰＤＬ１療法後の無病生存率と全生存率との両方において顕著な改善を示している（Robert et al., 2011；Schadendorf et al., 2015；Topalian et al., 2012）。しかし、免疫療法に対する応答は普遍的ではなく、臨床的に有益な応答は、一部の患者でしか生じない（Goodman et al., 2017）。したがって、どの患者がＣＰＩの恩恵を受けるかを決定することは非常に重要である。
リンパ球は、ヒトの健康及び疾患に重要な役割を果たす人体の仕組みの重要な部分である。例えば、腫瘍の場合、免疫系は、腫瘍形成とその後のがんの進展との両方に影響を及ぼす重要な因子の１つとして広く認識されている。特にＴ細胞は、ネオアンチゲンを保有するがん細胞を排除することでがん免疫微小環境の重要な役割を果たしており、したがって腫瘍試料内のＴ細胞の数は重要な臨床因子である。実際、臨床所見での腫瘍の免疫微小環境の状態は、免疫療法に関する予後予測因子であり且つ応答予測因子であり得る。近年、免疫療法、特にチェックポイント阻害薬（ＣＰＩ）が、多くのがん種に対する革新的な治療法として登場している。実際、悪性黒色腫及び非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）は、抗ＣＴＬ４療法又は抗ＰＤＬ１療法後の無病生存率と全生存率との両方において顕著な改善を示している（Robert et al., 2011；Schadendorf et al., 2015；Topalian et al., 2012）。しかし、免疫療法に対する応答は普遍的ではなく、臨床的に有益な応答は、一部の患者でしか生じない（Goodman et al., 2017）。したがって、どの患者がＣＰＩの恩恵を受けるかを決定することは非常に重要である。
【0003】
最新のデータは、ＣＰＩに対する応答が主に以下の２つの特徴によって支配されることを示唆している：次世代配列決定（ＮＧＳ）から予測することができるネオアンチゲンの存在などの免疫刺激；及びその刺激に応答し得るＴ細胞の存在。浸潤性Ｔ細胞の存在は、長い間、卵巣がん（Zhang et al., 2003）や大腸がん（Galon et al., 2006）などのがん種における生存率の向上に関連付けられてきた。より最近の研究は、ネオアンチゲンの予測可能性に焦点を当てており、腫瘍変異負荷（ＴＭＢ）の増加が、免疫療法に対する応答の最良の予測因子の１つとして現れている（Samstein et al., 2019）。Litchfield et al (2020)による最近の研究は、ＣＰＩ応答の様々な潜在的なバイオマーカが汎がんＣＰＩ処理データセットでどの程度機能するかを体系的に調査した。特定された最良の予測性の２つの特徴は、あらゆるがん細胞に存在する変異を反映するクローン性ＴＭＢと、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の存在を示すＴ細胞に関するＲＮＡ配列決定由来のトランスクリプトームシグネチャ（例えば、ＣＤ８Ａ ＲＮＡ発現）とであった。
【0004】
したがって、ＴＩＬの存在と量の両方を推定することががん治療において非常に重要である。しかし、現時点では、ＴＩＬを推定するための普遍的な先進の方法はない。CIBERSORT（Newman et al., 2015）などのマイクロアレイシグネチャ、及びＲＮＡ－ｓｅｑ用のCIBERSORTx（Newman et al., 2019）、ESTIMATE（Yoshihara et al., 2013）、及びDanaherらによって編集されたものなどのＲＮＡ－ｓｅｑシグネチャが、腫瘍試料中のＴＩＬのトランスクリプトームシグネチャを定量化するために使用されている。代替として、免疫浸潤の存在は、ヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）組織病理学的スライドに基づいて、又は代替として、適切な細胞特異的染色、最も一般的には免疫組織化学的特性によって判定することができる。Ｔ細胞のより多くの表現型の知識が必要とされる場合、ＴＣＲの非常に多様なＶＤＪ組換えＣＤＲ３領域をコードする配列に関する濃縮後に、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の配列決定を行うことができる（Bolotin et al., 2012）。これらの方法は全て、腫瘍試料などの混合試料中の免疫細胞を同定する目的で専用のデータを獲得する必要がある。最近、McGrath et al. (2017)において、Ｔ細胞の再構成されたリード（超可変ＣＤｒ３にまたがり、Ｖ及びＪセグメントの両方を含むリード）を分離することによって、ＷＥＳデータを使用して試料中のＴＣＲレパートリーを特徴付けるアプローチが提案された。しかし、このアプローチは、非常に高い配列決定深度を必要とし、非Ｔ細胞集団での異数性の存在（例えばがんの場合によく起こる）に対処できず、ＴＣＲレパートリーを特徴付けることにしか適していない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
したがって、既存の方法の欠点の１つ又は複数を軽減する、混合試料中のリンパ球の量を決定するための新規の方法の必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【0006】
発明の簡単な説明
大まかに言うと、本発明者らは、腫瘍変異負荷を計算し、標的療法のためにアクショナブル（actionable）な変異を同定するために、全エクソーム配列決定（ＷＥＳ）、さらには全ゲノム配列決定（ＷＧＳ）が腫瘍試料に対して頻繁に行われることを認識した。同様に、このタイプのデータは、新生児ケアなど他の疾患の文脈でも収集される頻度がますます高まっている。しかし、現時点では、ＷＥＳを使用して免疫浸潤レベルを正確に推測することはできない。したがって、本発明者らは、ＶＤＪ組換え、例えばＴ細胞受容体アルファ（ＴＣＲＡ）遺伝子のＶＤＪ組換え中のＴ細胞受容体切除サークル（ＴＲＥＣ）に由来するシグナルを使用して、ＷＥＳ／ＷＧＳ又は同様のデータからＴ細胞（又はＢ細胞）分画率を推定するための方法を開発する。このスコアは、試料中のＴ細胞（場合によってはＢ細胞）の割合を直接測定する。本発明者らはさらに、このスコアが、TRACERx100コホートにおけるＲＮＡ配列決定及び組織病理学的ＴＩＬスコアリングに基づく直交免疫浸潤スコアと有意に相関することを実証した。免疫療法を受けている患者コホートのメタ解析を使用して、本発明者らは、このスコアががん免疫療法に対する応答を予測可能であり、変異負荷に勝る予測値を提供することを確認した。本発明者らはさらに、血液由来の生殖細胞系列試料からもＴ細胞分画率を計算することができることを実証することによって、本方法の幅広い適用性を示した。したがって、本方法は、ＷＥＳ（又はＷＧＳ）腫瘍試料の免疫微小環境の研究可能性を広げ、これは、直交データが利用可能でない場合には特に有用である。
大まかに言うと、本発明者らは、腫瘍変異負荷を計算し、標的療法のためにアクショナブル（actionable）な変異を同定するために、全エクソーム配列決定（ＷＥＳ）、さらには全ゲノム配列決定（ＷＧＳ）が腫瘍試料に対して頻繁に行われることを認識した。同様に、このタイプのデータは、新生児ケアなど他の疾患の文脈でも収集される頻度がますます高まっている。しかし、現時点では、ＷＥＳを使用して免疫浸潤レベルを正確に推測することはできない。したがって、本発明者らは、ＶＤＪ組換え、例えばＴ細胞受容体アルファ（ＴＣＲＡ）遺伝子のＶＤＪ組換え中のＴ細胞受容体切除サークル（ＴＲＥＣ）に由来するシグナルを使用して、ＷＥＳ／ＷＧＳ又は同様のデータからＴ細胞（又はＢ細胞）分画率を推定するための方法を開発する。このスコアは、試料中のＴ細胞（場合によってはＢ細胞）の割合を直接測定する。本発明者らはさらに、このスコアが、TRACERx100コホートにおけるＲＮＡ配列決定及び組織病理学的ＴＩＬスコアリングに基づく直交免疫浸潤スコアと有意に相関することを実証した。免疫療法を受けている患者コホートのメタ解析を使用して、本発明者らは、このスコアががん免疫療法に対する応答を予測可能であり、変異負荷に勝る予測値を提供することを確認した。本発明者らはさらに、血液由来の生殖細胞系列試料からもＴ細胞分画率を計算することができることを実証することによって、本方法の幅広い適用性を示した。したがって、本方法は、ＷＥＳ（又はＷＧＳ）腫瘍試料の免疫微小環境の研究可能性を広げ、これは、直交データが利用可能でない場合には特に有用である。
【0007】
したがって、第１の態様では、本開示は、複数の細胞型からのゲノム材料を含む混合試料中のリンパ球の分画率を決定するための方法であって、ＶＤＪ組換えを受けるゲノム遺伝子座の少なくとも一部を含む所定のゲノム関心領域に沿ったリード深度を含む試料のリード深度プロファイルを取得することと、関心領域のサブセットから導出されたベースラインリード深度を参照して、所定の関心領域に沿ってリード深度を正規化することによって、複数のリード深度比（ｒｉ）を取得することと、ＶＤＪ組換えにより欠失される可能性が高い関心領域のサブセットに関する要約されたリード深度比値（ｒＶＤＪ）を取得することと、試料中のリンパ球の分画率（ｆ）を、要約されたリード深度比値（ｒＶＤＪ）の関数として決定することとを含む方法を提供する。
【0008】
本方法は、以下の任意選択の特徴の任意の１つ又は複数を有することがある。
【0009】
混合試料は、細胞若しくは組織試料（この場合、試料は、それぞれのゲノム材料をそれぞれ含む複数の細胞型を含むことがある）、又はそれらに由来する核酸の試料でよい。
【0010】
ＶＤＪ組換えを受けるゲノム遺伝子座は、ＴＣＲＡ、ＴＣＲＢ、ＴＣＲＧ、ＴＣＲＤ、ＩＧＨ、ＩＧＬ、又はＩＧＫ遺伝子座から選択されることがある。したがって、リンパ球の分画率は、Ｔリンパ球の分画率、Ｂリンパ球の分画率、αβＴリンパ球の分画率、γδＴリンパ球の分画率、ＴＣＲＡ、ＴＣＲＢ、ＴＣＲＧ、ＴＣＲＤ、ＩＧＨ、ＩＧＬ、若しくはＩＧＫ遺伝子座での任意の遺伝子セグメントを含むＢ細胞若しくはＴ細胞の分画率、又は表８に列挙された任意の遺伝子セグメント若しくは別の種での対応する遺伝子セグメントを含むＢ細胞若しくはＴ細胞の分画率であり得る（表８に列挙される座標は単なる指標であり、特に、別の参照配列での対応する座標が使用されてもよい）。ＶＤＪ組換えを受けるゲノム遺伝子座は、ＴＣＲＡ、ＴＣＲＢ、ＴＣＲＧ、又はＩＧＨ遺伝子座から選択されることがある。所定の関心領域は、ＴＣＲＡ、ＴＣＲＢ、ＴＣＲＧ、ＴＣＲＤ、ＩＧＨ、ＩＧＬ、又はＩＧＫ遺伝子座からの１つ又は複数のエクソンを含むことがある。所定の関心領域は、ＴＣＲＡ、ＴＣＲＢ、ＴＣＲＧ、又はＩＧＨ遺伝子座からの１つ又は複数のエクソンを含むことがある。所定の関心領域は、ＴＣＲＡ、ＴＣＲＢ、ＴＣＲＧ、ＴＣＲＤ、ＩＧＨ、ＩＧＬ、又はＩＧＫ遺伝子座からの複数のエクソンを含むことがあり、複数のエクソンは、それぞれの遺伝子座のＶ、Ｄ、及びＣセグメントのそれぞれに対応する少なくとも１つのエクソンを含む。複数のエクソンは、それぞれの遺伝子座のＶ、Ｄ、Ｊ、及びＣセグメントのそれぞれに対応する少なくとも１つのエクソンを含むことがある。複数のエクソンは、それぞれの遺伝子座の複数のＶセグメントに対応するエクソンを含むことがある。所定の関心領域は、ＴＣＲＡ、ＴＣＲＢ、ＴＣＲＧ、ＴＣＲＤ、ＩＧＨ、ＩＧＬ、又はＩＧＫ遺伝子座からの複数のＶ、Ｄ、Ｊ、及び／又はＣセグメントをコードする領域を含むことがある。所定の関心領域は、ＴＣＲＡ、ＴＣＲＢ、ＴＣＲＧ、ＴＣＲＤ、ＩＧＨ、ＩＧＬ、又はＩＧＫ遺伝子座からの複数のＶ、Ｄ、Ｊ、及び／又はＣセグメントにある１つ又は複数の領域を含むことがある。所定の関心領域は、ＴＣＲＡ、ＴＣＲＢ、ＴＣＲＧ、ＴＣＲＤ、ＩＧＨ、ＩＧＬ、又はＩＧＫ遺伝子座からの全てのエクソンを含むことがある。所定の関心領域は、ＴＣＲＡ、ＴＣＲＢ、ＴＣＲＧ、ＴＣＲＤ、ＩＧＨ、ＩＧＬ、又はＩＧＫ遺伝子座の全て（すなわち、エクソンとイントロンとの両方を含む）を含むことがある。
【0011】
所定の関心領域は、ＴＣＲＡ、ＴＣＲＢ、ＴＣＲＧ、ＴＣＲＤ、ＩＧＨ、ＩＧＬ、又はＩＧＫ遺伝子座からのエクソンのサブセットを含むことがある。所定の関心領域は、ＴＣＲＡ、ＴＣＲＢ、ＴＣＲＧ、ＴＣＲＤ、ＩＧＨ、ＩＧＬ、又はＩＧＫ遺伝子座のサブセットを含むことがある。例えば、所定の領域は、例えば、リードデータの収集に使用されるプラットフォームに起因する偏り、エクソン若しくは領域でのＧＣ含量に関連する偏り、又はエクソン若しくは領域でのカバレッジに関連する偏りなど、体系的な偏りに関連すると判断された任意のエクソン又は領域を除外することができる。例えば、一部のエクソン捕捉キットは、予想から逸脱した特定のエクソンでのカバレッジをもたらす偏りに関連していることが示されている。同様に、特定の領域は、例えば配列決定又はアライメントプロセスでのアーチファクトにより、全ゲノム配列決定で予想されるよりもカバレッジが低い又は高いことがある。そのようなエクソン又は領域は、例えば異なるプラットフォーム（例えば異なる捕捉キット）を使用して獲得されたものなど、同じ体系的な偏りを受けることを予想されないデータセット間でリードカバレッジを比較することによって特定することができる。例えば、複数の候補エクソン又は領域の平均ｌｏｇＲ比を、第１の試料セット及び第２の試料セット（２つの試料セットが同じ系統的な偏りを受けるとは予想されない）について計算することができ、各試料セットにわたる中央値を、複数の候補エクソン又は領域のそれぞれについて比較して、２つの試料セット間で大幅に異なるエクソン又は領域を特定することができる。例えば、閾値（例えば０．５）を超えるｌｏｇＲの中央値間の差を、偏りを受ける可能性が高いエクソン／領域を除外するための基準として使用することができる。予想よりもカバレッジが低い又は高い領域は、複数の試料にわたる平均リード深度比データにモデル、例えば一般化線形モデルを当てはめ、当てはめられたモデルから所定の距離内にない要約された値（例えば平均値又は中央値）に関連付けられる所定のサイズ（例えば、１００ｂｐ、２００ｂｐ、５００ｂｐ、１０００ｂｐ）の任意の領域を除去することによって特定することができる。この代わりに又はこれに加えて、予想よりもカバレッジが低い又は高い領域は、複数の試料に関してリンパ球の分画率を決定し、ゲノムワイド関連性解析を行って、決定されたリンパ球分画率に関連する一塩基多型を同定することによって特定することができ、ここで、関連性の存在は、一塩基多型を含む所定のサイズの領域でのカバレッジの偏りを示す。したがって、本方法は、複数の試料に関してリンパ球の分画率を決定し、ゲノムワイド関連性研究を行って、決定されたリンパ球分画率に関連する一塩基多型を同定し、その一塩基多型を含む試料を選択し、選択された試料にわたる平均リード深度比データにモデルを当てはめ、当てはめられたモデルから所定の距離内にない要約された値（例えば平均値又は中央値）に関連する所定のサイズ（例えば１００ｂｐ、２００ｂｐ、５００ｂｐ、１０００ｂｐ）の領域を除去することによって、全ゲノム配列決定において予想されるよりもカバレッジが低い又は高い領域を特定することを含むことができる。
【0012】
リード深度又はリード深度比は、使用されるリード深度データ獲得プラットフォームに関連する偏りを補正するために処理され得る。例えば、リード深度／リード深度比はＧＣ補正され得る。リード深度データのＧＣ補正は、あらゆる位置でのリード深度に対するＧＣ含量の影響を捕捉する線形モデルを使用して行うことができ、モデルの残差が、正規化されたリード深度値を表す。リード深度に対するＧＣ含量の影響は、エクソン又は領域レベル（ＧＣｅｘｏｎ／ＧＣｒｅｇｉｏｎ）でＧＣ含量を反映する項（ここで、領域は、例えば１０００ｂｐ（この場合、ＧＣｒｅｇｉｏｎは「ＧＣ１０００ｂｐ」と呼ばれることがある）などの所定のサイズのウィンドウとして定義することができる）、及び所定の関心領域全体のレベルでＧＣ含量を反映する項（例えば所定の関心領域に沿って１０００ｂｐウィンドウを使用するなど、平滑化されたデータに当てはめられたモデル、例えば線形モデルから得られるＧＣｍａｃｒｏ）によって表すことができる。例えば、ｌｍ（ｂａｓｅｐａｉｒ～ＧＣｅｘｏｎ＋ＧＣ２
ｅｘｏｎ＋ＧＣｍａｃｒｏ＋ＧＣ２
ｍａｃｒｏ）、又は同等にｌｍ（ｂａｓｅｐａｉｒ～ＧＣｒｅｇｉｏｎ＋ＧＣ２
ｒｅｇｉｏｎ＋ＧＣｍａｃｒｏ＋ＧＣ２
ｍａｃｒｏ）（特にｌｍ（ｂａｓｅｐａｉｒ～ＧＣ１０００ｂｐ＋ＧＣ２
１０００ｂｐ＋ＧＣｍａｃｒｏ＋ＧＣ２
ｍａｃｒｏ））の形式の線形モデルを使用することができ、ここで、「ｂａｓｅｐａｉｒ」は、あらゆる位置でのリード深度である。そのようなモデルの残差は、補正されたカバレッジ値として使用することができる。補正された（例えばＧＣ補正された）リード深度値を使用して、関心領域のサブセットから導出されるベースラインリード深度、及びＶＤＪ組換えにより欠失される可能性が高い関心領域のサブセットに関する要約されたリード深度比値（ｒＶＤＪ）を決定することができる。例えば、関心領域のそれぞれのサブセットでの補正値の中央値（又は、例えば中心性の統計的尺度など、他の要約された規準）を使用することができる。関心領域のサブセットが複数のゲノム位置（例えば、ＶＤＪ組換えを受ける可能性が高い領域の先頭及び末尾など）を含む場合、例えば最高値など、複数の中央値のうちの１つを使用することができる。リード深度プロファイルは、配列決定データ、好ましくは全エクソーム配列決定、全ゲノム配列決定（ローパスＷＧＳを含み、浅いゲノム配列決定（shallow genome sequencing）とも呼ばれる）、又はパネル配列決定データから取得することができる。リード深度プロファイルがパネル配列決定データから得られるとき、パネル配列決定データは、所定のゲノム関心領域に関するデータを含む。例えば、データは、所定のゲノム関心領域を含む複数のゲノム領域を標的とする捕捉プローブを使用して取得されていることがある。リード深度プロファイルは、少なくとも０．１倍、少なくとも０．５倍、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、好ましくは少なくとも１５倍、好ましくは少なくとも２０倍、より好ましくは少なくとも３０倍の配列決定深度を有する配列決定データから取得され得る。リード深度プロファイルは、少なくとも１０倍、好ましくは少なくとも１５倍、好ましくは少なくとも２０倍、より好ましくは少なくとも３０倍の配列決定深度を有する全エクソーム配列決定データから取得され得る。リード深度プロファイルは、少なくとも０．１倍、少なくとも０．５倍、少なくとも２倍、少なくとも５倍、又は少なくとも１０倍、好ましくは少なくとも２倍の配列決定深度を有する全ゲノム配列決定データから取得され得る。リード深度プロファイルは、例えば１０倍、好ましくは１５倍などの閾値未満の配列決定深度を有するエクソンを除去するためにフィルタリングされている配列決定データから取得され得る。リード深度プロファイルは、閾値（例えば２倍など）未満の配列決定深度を有する領域（例えば１０００ｂｐなどの固定サイズのウィンドウを使用して定義される）を除去するためにフィルタリングされた配列決定データから取得され得る。閾値（例えば１０倍又は１５倍など）を超える配列決定深度を有する所定のゲノム関心領域内に所定数未満のエクソンしか含まない配列決定データは破棄されることがある。例えば、閾値（例えば１５倍）を超える配列決定深度を有する所定の関心領域（例えばＴＣＲＡ遺伝子座）内に３０個未満のエクソンしか含まないデータは破棄されることがある。そのような場合、試料に関して新たな配列データが獲得されることがあり、又はデータが十分なカバレッジを有する別の所定のゲノム関心領域を調査するために配列データが使用されることがある。
【0013】
要約されたリード深度値は、要約された対数リード深度比でもよい。対数は、底２の対数でよい。試料中のリンパ球の分画率（ｆ）を要約されたリード深度比値（ｒＶＤＪ）の関数として決定することが、試料中のリンパ球の分画率（ｆ）を要約されたリード深度比値（ｒＶＤＪ）と、混合試料中での、所定の関心領域内で異数性である異常細胞の分画率（ｐ）と、所定の関心領域内の異常細胞のコピー数（ΨＴ）との関数として決定することを含むことがある。混合試料中の異常細胞の分画率（ｐ）、及び所定の関心領域内での異常細胞のコピー数（ΨＴ）は、例えば、Van Loo et al.に記載されたASCAT法、又はRiester et al. (2016)に記載され、http://bioconductor.org/packages/PureCN/で入手可能なpureCN法など、当技術分野で知られている方法を使用して異常細胞特異的コピー数プロファイルを取得することによって決定され得る。試料中のリンパ球の分画率（ｆ）を決定することが、
としてｆの値を決定することを含み、ここでγは定数である。試料中のリンパ球の分画率（ｆ）を決定することが、
としてｆの値を決定することを含み、ここでγは定数である。パラメータγは、リード深度データを取得するために使用される解析プラットフォームに応じて調整することができる。例えば、Illumina Hiseqを使用するとき、γの値は＝１になり得る（すなわち、このパラメータを全ての式から除去することができる）。理論に束縛されることを望まないが、パラメータγは、理論的に予想される値と比較したｌｏｇＲプロファイル（「ｒ」とも呼ばれる。この場合、ｌｏｇＲは、関心領域と参照領域とのリード深度の対数比である）のプラットフォーム関連の「圧縮（compaction）」を捉えていると考えられる。例えば、同じコピー数を有すると予想される領域を比較するとき、ｒはゼロに等しくすべきである。したがって、このパラメータは、制御環境での期待値と比較することによって、特定のプラットフォームに関して設定されることがある。当業者には理解されるように、ΨＴ＝２及び／又はｐ＝０の場合（すなわち、試料が異常な細胞を含まない、又は他の領域を参照して異常とみなされ得る試料中の細胞が関心領域において異数体でない）、式（３）は式（７）と等価である。したがって、試料が異常細胞を含むことが予想されないとき（例えば生殖細胞系列試料）には式（３）を使用することができる。式（３）はまた、ｐ及び／又はΨＴが未知である、不確かである、又は信頼できないとき（すなわち、所定の関心領域での異常細胞の割合及び／又はそれらの平均コピー数が未知である、不確かである、又は信頼できないとき）にも使用することができる。例えば、式（７）の結果が１－ｐを超える場合には、式（３）を使用することができる。理論に束縛されることを望まないが、本発明者らは、実際に試料が異常細胞を含む場合でさえ、リンパ球が混合試料中の細胞の比較的小さい割合を占める限り、式（３）が適切であると考える。
【数1】
【数2】
【0014】
ＶＤＪ組換えにより欠失される可能性が高い関心領域のサブセットは、ＶＤＪ組換えを受けるゲノム遺伝子座の最後のＶセグメントの終了位置と、ＶＤＪ組換えを受けるゲノム遺伝子座のＪセグメントの開始位置との間にある領域を含むことがある。ＶＤＪ組換えにより欠失される可能性が高い関心領域のサブセットは、ＶＤＪを受けるゲノム遺伝子座の１つ又は複数のＤセグメント（例えば全てのＤセグメントなど）を含むことがある。ＶＤＪ組換えにより欠失される可能性が高い関心領域のサブセットは、好ましくは、Ｖ又はＣセグメントを含まない。この代わりに又はこれに加えて、ＶＤＪ組換えにより欠失される可能性が高い関心領域のサブセットは、Ｊセグメントを含まない。ＶＤＪ組換えにより欠失される可能性が高い関心領域のサブセットは、最後のＶ遺伝子セグメントと、ＶＤＪ組換えを受けるゲノム遺伝子座のＪセグメントをコードする最初のセグメント、又はＴＣＲＡの場合にはＴＣＲδ鎖の一部をコードする最初のセグメント、若しくは別の所定の関心領域内の任意の対応するセグメントとの間のギャップを含む、そのギャップからなる、又はそのギャップに含まれることがある。例えば、ＴＣＲＡ遺伝子座を調べて、本発明者らは、（８００００ｂｐのサイズを有し、位置２２８０００００から始まる（領域ｃｈｒ１４：２２８０００００－２２８８００００をもたらす）ように丸めた最後のＴＣＲＡ ＶセグメントとＴＣＲデルタ遺伝子の最初のセグメントとの間のギャップとして最大ＶＤＪ組換えの位置を定義することが適切であることを見出した。他の定義も可能であり、この領域のサイズの小さな変化が方法の性能に悪影響を及ぼすことは予想されない。最大ＶＤＪ組換えの領域は、他のＶＤＪ遺伝子座に関しても同様のアプローチを使用して定義することができ、すなわち、最後のＶ遺伝子セグメントと最初のＪ遺伝子セグメントとの間の領域の周囲又は内部に少なくとも部分的に位置する領域を定義することによって定義することができる。最大ＶＤＪ組換えの領域は、表７のゲノム座標、又は他の種若しくは参照ゲノムに関する対応する座標を使用して、それぞれのＶＤＪ遺伝子座について定義することができる。ＶＤＪ組換えにより欠失される可能性が高い関心領域のサブセットは、ＶＤＪ組換えを受けるゲノム遺伝子座の任意のＶ又はＪセグメントに対応する領域を含むことがある。これは、リンパ球の分画率が、ＴＣＲＡ、ＴＣＲＢ、ＴＣＲＧ、ＴＣＲＤ、ＩＧＨ、ＩＧＬ、若しくはＩＧＫ遺伝子座での任意の遺伝子セグメントを含むＢ細胞若しくはＴ細胞の分画率、又は表８に列挙された任意の遺伝子セグメント若しくは別の種での対応する遺伝子セグメントを含むＢ細胞若しくはＴ細胞の分画率であるときに使用することができる。
【0015】
本方法は、モデルを複数のリード深度比に当てはめることをさらに含むことがあり、ＶＤＪ組換えにより欠失される可能性が高い関心領域のサブセットに関する要約されたリード深度比値（ｒＶＤＪ）を取得することが、ＶＤＪ組換えにより欠失される可能性が高い関心領域のサブセット内のモデルの値に基づいて、要約されたリード深度比値を取得することを含むことがある。モデルは、所定のゲノム関心領域に沿ったゲノム位置の関数として対数リード深度比を捕捉することができる。複数のリード深度比は、本明細書では「リード深度比プロファイル」と呼ばれることもある。当業者には理解されるように、複数のリード深度比はゲノム座標に沿って相互に編成され、したがって、この複数の値にモデルを当てはめるという言及は、ゲノム座標の関数として複数のリード深度比を含むデータシリーズにモデルを適合させることを表す。モデルは、一般化加算モデル、区分定数モデル、又はベイズモデルなどの一般化線形モデルでよい。モデルは、関心領域内の複数のＶ及びＪ遺伝子の位置に対応するように選択された複数の切断点を有する区分的制約付き線形モデルでもよい。例えば、モデルは、表８に列挙された遺伝子の開始及び終了から、表８に列挙されたゲノム位置から、又は他の種若しくは参照ゲノムでの対応する遺伝子若しくは位置から選択される複数の切断点を有する区分的制約付き線形モデルでもよい。モデルは一般化線形モデルでもよく、配列データは、全エクソーム配列決定などのパネル捕捉法を使用して取得されていてもよい。モデルは区分的制約付き線形モデルでもよく、配列データは、全ゲノム配列決定を使用して取得されていてもよい。区分的制約付き線形モデルは、以下のさらなる制約の１つ又は複数（又は全て）を有することがある：モデルは、所定のゲノム関心領域内の最初のＶセグメントの前に値０を有することがある；モデルは、所定のゲノム関心領域内の最後のＪセグメントの後に値０を有することがある；モデルは、所定のゲノム関心領域内の後続の各Ｖセグメントの値が、ゲノム座標に沿って先行セグメントの値よりも低い値を有するようなものであり得る；モデルは、所定のゲノム関心領域内の後続の各Ｊセグメントの値が、ゲノム座標に沿って先行セグメントの値よりも高い値を有するようなものであり得る。平滑化された曲線（連続的定数か区分的定数かに関わらず）をデータに当てはめる任意のアプローチを、本開示の文脈において使用することができる。別の例として、モデルは、リード深度からのセグメント使用と、関心領域内の複数のＶ及びＪ遺伝子のそれぞれの使用の以前の分布とをモデル化するベイズモデルでもよい。関心領域における複数のＶ及びＪ遺伝子それぞれの使用の事前分布は、一様分布でよい。そのような分布は、各遺伝子が使用される等しい尤度を定義することができる。関心領域での複数のＶ及びＪ遺伝子それぞれの使用の事前分布は、参照集団でのＶ及びＪ遺伝子（セグメント）使用の事前知識を使用する分布でもよい。例えば、参照集団から得られるＴ細胞受容体配列決定データを使用して、参照集団でのＶ及びＪ遺伝子使用の分布を決定することができる。参照集団はヒト集団でよい。参照集団は、年齢、性別、及びＨＬＡ型から選択される１つ又は複数の特定の特徴を有するヒト集団でもよい。モデルはベイズモデルでもよく、配列データは、全ゲノム配列決定を使用して取得されていてもよい。ベイズモデルは、勾配ベースのマルコフ連鎖モンテカルロ（ＭＣＭＣ）法を使用して実装されて、関心領域での各Ｖ及びＪ遺伝子のセグメント使用に関する確率分布を計算することができる。
【0016】
一般に、要約された値は、中央値、平均、トリム平均、又は複数の値の中心性の任意の他の既知の統計的規準でよい。領域に関する要約されたリード深度比値は、その領域内の複数のリード深度比値に関する中心性の統計的規準でよい。モデル（例えば一般化加算モデル）がリード深度比プロファイルに当てはめられる実施形態では、領域に関する要約されたリード深度比値は、領域内での当てはめられたモデルの値に関する中心性の統計的規準として取得され得る。例えば、領域全体にわたる当てはめられたモデルの平均を使用することができる。区分的定数モデルがリード深度比プロファイルに当てはめられる実施形態では、領域に関する要約されたリード深度比値は、その領域に対応するセグメント又はその領域に対応する複数のセグメントに関する当てはめられたモデルの値、又はその領域内のセグメントに関するモデルの値として取得され得る。例えば、上述したように制約された区分的定数モデルを使用して、ＶＤＪ組換えにより欠失される可能性が高い関心領域のサブセットに関する要約されたリード深度比値が、モデルの最小値（これはまたモデルの０からの最大偏差に等しい）として選択されることがある。
【0017】
リンパ球の分画率が、ＴＣＲＡ、ＴＣＲＢ、ＴＣＲＧ、ＴＣＲＤ、ＩＧＨ、ＩＧＬ、若しくはＩＧＫ遺伝子座での任意の遺伝子セグメントを含むＢ細胞若しくはＴ細胞の分画率、又は表８に列挙された任意の遺伝子セグメント若しくは別の種での対応する遺伝子セグメントを含むＢ細胞若しくはＴ細胞の分画率であるとき、ＶＤＪ組換えにより欠失される可能性が高い関心領域のサブセットは、上記の遺伝子セグメントに対応し得る。遺伝子セグメントに関する要約されたリード深度比値は、遺伝子セグメントに関する要約されたリード深度比値と、先行する遺伝子セグメントに関する要約されたリード深度比値との差、又は差の絶対値でもよい。要約されたリード深度比の値は、要約された対数リード深度比でもよい。要約されたリード深度比は、リード深度比に当てはめられたモデルの値から取得され得る。どの対数も、底２の対数でよい。
【0018】
本方法は、複数のリード深度比に当てはめられたモデルに関する尤度を取得することをさらに含むことがあり、所定の閾値未満の尤度は、試料内の過剰なノイズを示す。本方法は、複数の候補モデル、及び複数の候補モデルの当てはめに関連する１つ又は複数の統計的規準（尤度及び／又は信頼区間など）を取得することと、統計的規準に基づいて候補モデルを選択することとをさらに含むことがある。例えば、所定の範囲内の信頼区間を有する尤度が最高のモデルを選択することができる。複数の候補モデルを取得することは、例えば、１０、３０、５０、又は１００モデルなど所定の数のモデルを取得することを含むことがある。
【0019】
本方法は、関心領域のサブセットからベースラインリード深度を取得することをさらに含むことがある。ベースラインリード深度は、関心領域の上記被験体全体にわたる要約されたリード深度値でよい。例えば、ベースラインリード深度は、関心領域の所定のサブセットにわたる中央値リード深度でもよい。ベースラインリード深度を取得するために使用される関心領域のサブセットは、ＶＤＪ組換えにより欠失される可能性が低い関心領域のサブセットでもよい。ＶＤＪ組換えにより欠失される可能性が低い関心領域のサブセットは、ＶＤＪ組換えを受けるゲノム遺伝子座の最初のｎ個のＶセグメントを含むことがある。ＶＤＪ組換えにより欠失される可能性が低い関心領域のサブセットは、ＶＤＪ組換えを受けるゲノム遺伝子座のＣセグメントを含むことがある。好ましくは、ベースラインリード深度を取得するために使用される関心領域のサブセットは、ＶＤＪ組換えを受けるゲノム遺伝子座のＤ又はＪセグメントを含まない。実際、本明細書に開示される方法によれば、調査中のＶＤＪ遺伝子座の先頭、末尾、若しくは先頭と末尾の両方（両方ではなく）、又はＶＤＪ組換えによる影響を受けないコピー数値を有すると仮定することができる他の近接領域を使用することが可能である。ベースラインリード深度を取得するために使用される関心領域のサブセットは、表７でのゲノム座標、又は他の種若しくは参照ゲノムに関する対応する座標を使用して、それぞれのＶＤＪ遺伝子座について定義することができる。
【0020】
理論に束縛されることを望まないが、より長い正規化領域の使用（例えば、先頭領域と末尾領域の両方を使用する、及び／又は先頭領域の長さを増加させる）は、リード深度データにおいて典型的なノイズを有利に補償すると考えられる。例えば、先頭領域を拡張して、頻繁に失われる可能性が低い多数のＶセグメントを含めることができ、データが利用可能な場合（例えば全ゲノム配列決定データを使用するときなど）には遺伝子の外側の領域を含めることもできる。さらに、ＶＤＪ組換えに関連付けられるシグナルは遺伝子の先頭よりも遺伝子の末尾に近いので（Ｊセグメントが遺伝子の末尾の近くにクラスタ化されるため。一方、Ｖセグメントはより大きく広がっている）、遺伝子の先頭でのシグナルの使用が有益であると考えられる。さらに、例えば遺伝子座の前又は後など、調査中のＶＤＪ遺伝子座の外側の領域を使用することも可能である。しかし、対象の遺伝子座からの距離が増加すると、見られるシグナルががん細胞内の異なるコピー数事象に対応する可能性が高くなり、したがって、調査中のＶＤＪ遺伝子座での腫瘍コピー数を反映しなくなる。パラメータｎは、適切な訓練データを使用して、例えばリンパ球分画率の直交規準と比較したときに訓練データにわたるリンパ球分画率の最も正確な推定量をもたらすｎの値を選択することによって決定することができる。リンパ球分画率の直交規準は、例えば、トランスクリプトームデータ及び／又は組織病理学データに基づいて取得され得る。パラメータｎは、８～１６の間、１０～１４の間、例えば１０、１１、又は１２でよい。
【0021】
リード深度プロファイルを取得することは、所定の関心領域にわたって複数の生のリード深度値を取得することと、リード深度値を平滑化することとを含むことがある。リード深度値を平滑化することは、所定の幅のウィンドウにわたる対応するローリング中央値によって生のリード深度値を置き換えることを含むことがある。ウィンドウの所定の幅は、約２０ｂｐ～約２００ｂｐの間、又は約５０ｂｐ～約１５０ｂｐの間で選択され得る。例えば、リード深度プロファイルは、所定の関心領域に沿って５０ｂｐウィンドウでローリング中央値を計算することによって得られた値を含むこともある。本方法を使用して取得されたリンパ球分画率の推定量を、Danaherスコアなどリンパ球分画率の直交規準に対する様々な候補ウィンドウサイズと比較することによって、特定のデータセット、データのタイプ、又は状況についてウィンドウの適切なサイズを経験的に決定することができる。
【0022】
混合試料は、血液試料又は腫瘍試料でよい。本方法は、被験体から、複数の細胞型からのゲノム材料を含む混合試料を取得することをさらに含むことがある。本方法は、被験体から、１つ又は複数のインビトロステップによって、複数の細胞型からのゲノム材料を含む混合試料からリード深度データを取得することをさらに含むことがある。１つ又は複数のインビトロステップは、核酸抽出、ライブラリ調製、標的配列捕捉、配列決定、及び／又はコピー数アレイへのハイブリダイゼーションを含むことがある。当業者には理解されるように、試料中の核酸の存在を示すデータが例えば配列決定によって得られると、当技術分野で知られているように又は本明細書に記載されるように、例えば品質管理ステップ、参照ゲノムアライメントステップ（マッピングとも呼ばれる）、正規化ステップなどの追加のステップを適用することができる。本方法は、１つ又は複数のさらなる混合試料に対して本態様の任意の実施形態の方法を繰り返すことをさらに含むことがあり、ここで、最初の混合試料とさらなる混合試料とは同じ被験体から取得されており、最初の混合試料とさらなる混合試料とは腫瘍試料である。本方法は、最初の混合試料及びさらなる混合試料に関するリンパ球の分画率（ｆ）に基づいて、１つ又は複数の要約されたリンパ球の分画率を取得することをさらに含むことがある。要約されたリンパ球の分画率は、最初の混合試料及びさらなる混合試料にわたる平均分画率、最初の混合試料及びさらなる混合試料にわたる最小分画率、最初の混合試料及びさらなる混合試料にわたる最大分画率、及び／又は最初の混合試料及びさらなる混合試料にわたる最小分画率と最初の混合試料及びさらなる混合試料にわたる最大分画率との倍率差として取得され得る。被験体について複数の混合試料が利用可能である場合、単一試料に関する個々のリンパ球分画率の代わりに、要約されたリンパ球の分画率の１つ又は複数を使用して、以下にさらに述べるように予後予測を提供することができる。例えば、複数の試料にわたる最小分画率、複数の混合試料にわたる最小及び最大分画率、及び／又は最初の混合試料及びさらなる混合試料にわたる最小分画率と最初の混合試料及びさらなる混合試料にわたる最大分画率との倍率差を使用して、被験体に関する予後予測を提供することができる。好ましくは、予後予測は、複数の試料にわたる最小分画率を使用して提供される。
【0023】
本方法は、決定されたリンパ球分画率及び／又はそこから導出される任意の値を、例えばユーザインターフェースを介してユーザに提供することをさらに含むことがある。そこから導出される値は、診断又は予後予測指標を含むことがある。
【0024】
当業者には理解されるように、（少なくともゲノムＤＮＡの配列決定によって通常生成されるデータの量に起因する）本明細書に記載の操作の複雑さは、人間の精神活動の範囲を超えるほどである。したがって、（試料調製又は獲得ステップが記載されている場合など）文脈上別段の指示がない限り、本明細書に記載の方法の全てのステップはコンピュータで実行される。
【0025】
本開示の方法は、異なる診断及び／又は予後予測が被験体からの試料中の異なるレベルのリンパ球に関連することがある多くの臨床状況において使用できる。したがって、本開示は、リンパ球分画率の状態（例えば腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）状態）に従って被験体の集団を層別化するための方法にも関し、本方法は、集団内の各被験体からの１つ又は複数の試料（例えば腫瘍試料）に対して本開示の第１の態様の方法を実施することを含む。例えば、患者の１つ又は複数の腫瘍試料について推定されたリンパ球分画率に応じて、被験体を「免疫コールド」群と「免疫ホット」群に分けることができる。これは、個別化医療及び／又は臨床試験のための患者の識別に特に応用することができる。免疫コールドとして分類された患者は、免疫ホットとして分類された患者と比較して、チェックポイント阻害薬の使用など免疫療法に対する応答性が低いと予想される。したがって、免疫ホットは、免疫療法の恩恵を受ける可能性がより高いことがあり、免疫コールドは、代替治療選択肢の恩恵を受ける可能性がより高いことがある。この代わりに又はこれに加えて、分類された患者は、免疫ホットとして分類された患者よりも生存予後が不良になることがある。したがって、本開示の方法は、がんと診断された被験体を、１つ又は複数の免疫療法に対する異なる予後予測及び／又は感受性の予測を有する少なくとも２つの群に分類する際にも使用できる。
【0026】
したがって、さらなる態様によれば、本開示は、がんと診断された被験体に関する予後予測を提供する方法であって、第１の態様の任意の実施形態の方法を使用して、被験体からの１つ又は複数の腫瘍試料中のリンパ球分画率を決定することを含む方法を提供する。また、がんと診断された被験体をモニタリングする方法であって、第１の態様の任意の実施形態の方法を使用して、第１の時点で獲得された被験体からの１つ又は複数の腫瘍試料、及びさらなる時点で獲得された被験体からの１つ又は複数の腫瘍試料中のリンパ球分画率を決定することを含む方法も記載される。例えば、最初の時点は治療前でよく、さらなる時点は治療後でよい。代替として、最初の時点とさらなる時点とはどちらも治療後でよい。治療は、免疫療法を含む任意の抗がん療法を伴っていてよい。予後予測を提供する又は被験体をモニタリングする方法は、試料中のリンパ球分画率（例えばＴリンパ球分画率など）に応じて、試料を免疫ホット又は免疫コールドとして分類することをさらに含むことがある。例えば、閾値（例えば、約０．１、すなわち約１０％）を超えるリンパ球分画率を有する試料は免疫ホットとして分類されることがあり、閾値以下のリンパ球分画率を有する試料はコールドとして分類されることがある。本方法は、免疫コールドとして分類された患者からの試料の数に応じて、被験体を予後良好群と予後不良群とに分類することをさらに含むこともある。例えば、異なる腫瘍領域からの試料を解析するとき、免疫コールドとして分類された試料の数が閾値（例えば２など）以上であると、被験体が予後不良群に分類されることがある。予後不良群は、予後良好群と比較して、無再発生存率の減少及び／又は全生存率の減少と関連していることがある。リンパ球分画率及び／又は免疫コールド試料の数に関する閾値は、適切な訓練コホートを使用して、例えば、大幅に異なる予後予測に関連する群間で患者を分類することができる様々な閾値の性能を評価することによって決定することができる。がんと診断された被験体が免疫療法に応答する可能性が高いかどうかを決定する方法であって、第１の態様の任意の実施形態の方法を使用して被験体からの１つ又は複数の腫瘍試料中のリンパ球分画率を決定することを含む方法も記載される。本方法は、免疫療法に応答する可能性が高いと診断された被験体に免疫療法を投与することをさらに含むことがある。本方法は、免疫療法に応答する可能性が高いと診断された被験体に、免疫療法を伴う治療を推奨することを含むことがある。本方法は、被験体が免疫療法に応答する可能性が低いと診断された場合に、代替療法（例えば従来の化学療法や放射線療法など）を投与すること、及び／又は被験体に代替療法を伴う治療を推奨することを含むことがある。
【0027】
本方法は、免疫療法に応答する可能性が高い群と、免疫療法に応答する可能性が低い群とに被験体を分類することをさらに含むこともある。実際、本発明者らは、本開示に従って決定された、腫瘍中、さらには血液試料中のＴ細胞分画率が、免疫療法に対する応答の予測因子であることを実証した。例えば、本方法は、試料中のリンパ球分画率（例えばＴリンパ球分画率など）に応じて、試料を免疫ホット又は免疫コールドとして分類することをさらに含むことがある。例えば、閾値（例えば、約０．１、すなわち約１０％）を超えるリンパ球分画率を有する試料は免疫ホットとして分類されることがあり、閾値以下のリンパ球分画率を有する試料はコールドとして分類されることがある。次いで、被験体からの１つ又は複数の試料が免疫コールドである場合、その被験体を、免疫療法に応答する可能性が低い群に分類することができる。代替として、被験体からの試料が閾値未満のリンパ球分画率を有する場合、被験体は、免疫療法に応答する可能性が低い群に分類されることがあり、そうでない場合には、免疫療法に応答する可能性が高い群に分類されることがある。
【0028】
免疫療法は、免疫系の機能を調節する、及び／又はがんを治療するために既存の免疫機能を利用する任意の療法であり得る。免疫療法は、Ｔ細胞転移療法（腫瘍浸潤リンパ球（又はＴＩＬ）療法及びＣＡＲ－Ｔ細胞療法）、療法用抗体、がん治療ワクチン、チェックポイント阻害薬療法、及び免疫系調節因子（例えばインターフェロン及びインターロイキン）から選択されることがある。本方法は、被験体からの１つ又は複数の試料中のリンパ球分画率と、被験体に関する推定される腫瘍変異負荷とに基づいて、免疫療法（例えばＣＰＩ療法）に応答する可能性が高い群と、免疫療法（例えばＣＰＩ療法）に応答する可能性が低い群とに被験体を分類することを含むことがある。そのような分類は、多変量分類モデル（例えば、訓練された一般化線形モデルを使用する分類法）を使用して取得することができる。分類モデルのパラメータ（例えば、閾値、多変量モデルのパラメータ）は、適切な訓練コホートを使用して、例えば既知の免疫療法応答状態を有する被験体の群を使用して決定することができる。
【0029】
被験体がＴ細胞リンパ球減少症を有するかどうかを判定する方法であって、第１の態様の任意の実施形態の方法を使用して被験体からの１つ又は複数の試料中のリンパ球分画率を決定することを含む方法も記載される。１つ又は複数の試料は、血液試料でもよい。被験体は、新生児被験体でもよい。被験体がＴ細胞リンパ球減少症を有するかどうかを決定する方法は、重症複合免疫不全症をスクリーニングするための方法の文脈で行うことができる。本方法は、被験体をリンパ球減少症に関して治療すること、又は被験体にリンパ球減少症の治療を推奨することをさらに含むこともある。
【0030】
異常なリンパ球数に関連する疾患、障害、又は症状を有すると被験体を診断する方法であって、第１の態様の任意の実施形態の方法を使用して被験体からの１つ又は複数の試料中のリンパ球分画率を決定することを含む方法も記載される。また、異常なリンパ球数に関連する疾患、障害、又は症状を有すると診断された被験体をモニタリングする方法であって、第１の態様の任意の実施形態の方法を使用して被験体からの１つ又は複数の試料中のリンパ球分画率を決定することを含む方法も記載される。異常なリンパ球数に関連する疾患、障害、又は症状は、自己免疫疾患、骨髄疾患、又は感染症であり得る。
【0031】
さらなる態様によれば、本開示は、
少なくとも１つのプロセッサと、命令を含む少なくとも１つの非一時的なコンピュータ可読媒体とを備えるシステムであって、命令が、少なくとも１つのプロセッサによって実行されるときに、ＶＤＪ組換えを受けるゲノム遺伝子座の少なくとも一部を含む所定のゲノム関心領域に沿ったリード深度を含む試料のリード深度プロファイルを取得する操作と、関心領域のサブセットから導出されたベースラインリード深度を参照して、所定の関心領域に沿ってリード深度を正規化することによって、複数のリード深度比（ｒｉ）を取得する操作と、ＶＤＪ組換えにより欠失される可能性が高い関心領域のサブセットに関する要約されたリード深度比値（ｒＶＤＪ）を取得する操作と、試料中のリンパ球の分画率（ｆ）を、要約されたリード深度比値（ｒＶＤＪ）の関数として決定する操作とを少なくとも１つのプロセッサに実行させる、システムを提供する。本態様によるシステムは、第１の態様に関連して述べた任意の特徴を備えることがある。
少なくとも１つのプロセッサと、命令を含む少なくとも１つの非一時的なコンピュータ可読媒体とを備えるシステムであって、命令が、少なくとも１つのプロセッサによって実行されるときに、ＶＤＪ組換えを受けるゲノム遺伝子座の少なくとも一部を含む所定のゲノム関心領域に沿ったリード深度を含む試料のリード深度プロファイルを取得する操作と、関心領域のサブセットから導出されたベースラインリード深度を参照して、所定の関心領域に沿ってリード深度を正規化することによって、複数のリード深度比（ｒｉ）を取得する操作と、ＶＤＪ組換えにより欠失される可能性が高い関心領域のサブセットに関する要約されたリード深度比値（ｒＶＤＪ）を取得する操作と、試料中のリンパ球の分画率（ｆ）を、要約されたリード深度比値（ｒＶＤＪ）の関数として決定する操作とを少なくとも１つのプロセッサに実行させる、システムを提供する。本態様によるシステムは、第１の態様に関連して述べた任意の特徴を備えることがある。
【0032】
本態様によるシステムは、前述の態様の任意の実施形態の方法を実行するように構成され得る。特に、少なくとも１つの非一時的なコンピュータ可読媒体は、少なくとも１つのプロセッサによって実行されるときに、少なくとも１つのプロセッサに、第１の態様に関連して述べた任意の操作を含む操作を実行させる命令を含むことがある。システムは、プロセッサと動作可能に接続して、以下のうちの１つ又は複数をさらに備えることができる：ユーザインターフェースであり、命令により、プロセッサは、ユーザへの出力のために、少なくともリンパ球の推定量又はそこから導出される値をユーザインターフェースに提供する；１つ又は複数の配列リード深度データ獲得デバイス（例えば配列決定デバイスなど）；１つ又は複数のデータストア、例えばシーケンスリード深度データストア。
【0033】
さらなる態様によれば、少なくとも１つのプロセッサによって実行されるとき、少なくとも１つのプロセッサに、本明細書に記載の任意の態様の任意の実施形態の方法を実行させる命令を含む非一時的なコンピュータ可読媒体が提供される。
【0034】
さらなる態様によれば、コードがコンピュータ上で実行されるとき、コンピュータに、本明細書に記載の任意の態様の任意の実施形態の方法を実行させるコードを含むコンピュータプログラムが提供される。
【0035】
本発明は、明らかに許容可能でない又は明示的に回避されている場合は除き、記載された態様及び好ましい特徴の組合せを含む。本発明のこれら及びさらなる態様及び実施形態を、添付の実施例及び図面を参照して以下でさらに詳細に述べる。
【図面の簡単な説明】
【0036】
図面の簡単な説明
【図1】混合試料中のリンパ球分画率を決定する方法を概略的に示すフローチャートである。
【図2】混合試料中のリンパ球分画率を決定するためのシステムの一実施形態を示す図である。
【図3A】ＶＤＪ組換えシグナルを使用した、本明細書に記載の混合試料中のリンパ球分画率の決定の背景にある生物学的概念を概略的に示す図であり、標準的な腫瘍及びそれにマッチした生殖細胞系列の解析における体細胞コピー数変化の利得又は損失事象を検出するために、リード深度比シグナルがどのように使用されるかを概略的に示す。この解析では、細胞は、腫瘍細胞、Ｔ細胞、及び他の全ての間質細胞という３つの異なる細胞タイプからなる。
【図3B】ＶＤＪ組換えシグナルを使用した、本明細書に記載の混合試料中のリンパ球分画率の決定の背景にある生物学的概念を概略的に示す図であり、ＶＤＪ組換えとＴＲＥＣの除去に関連してＴＣＲＡ遺伝子に焦点を当てたときに、この同じプロセスがどのように作用するかを概略的に示す図である。左下のパネルは、１４ｑの周囲の領域と比較して、ＴＣＲＡ遺伝子内のTRACERx100データセットで検出された切断点の数の増加を示し、ＴＲＥＣシグナルが捕捉されることを示唆する。
【図4A】マッチした腫瘍と比較して高い血液中のＴ細胞含量のレベルを示す２つのTRACERx100領域におけるリード深度比の例を示すプロットである。ＶＤＶセグメントは、ＴＣＲα遺伝子座とＴＣＲδ遺伝子座との両方の可変セグメントを表す。
【図4B】マッチした血液と比較して高い腫瘍中のＴ細胞含量のレベルを示す２つのTRACERx100領域におけるリード深度比の例を示すプロットである。ＶＤＶセグメントは、ＴＣＲα遺伝子座とＴＣＲδ遺伝子座との両方の可変セグメントを表す。
【図6A】様々な局所コピー数及び腫瘍純度値に関するナイーブＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率スコアに関する理論値を示す図である。点及び線は、実際のＴ細胞分画率によって色付けされており、直線の水平線は、点があるべき位置を示す。
【図6B】TRACERx100コホートにわたるＴＣＲＡ遺伝子の局所コピー数の分布を示す図である。
【図6C】TRACERx100コホートにわたる腫瘍純度の分布を示す図である。
【図6D】TRACERx100コホートに関するコピー数ごとの正確なスコアとナイーブスコアを示す図である。見て分かるように、コピー数が１である場合にはナイーブスコアは過大推定であり、コピー数が２を超える他の場合には過小推定である。
【図7】細胞株データを使用した、本明細書に記載のアプローチの検証の結果を示す図である。Ｔ細胞由来の細胞株又は非Ｔ細胞由来の細胞株のいずれかのＷＥＳからの、計算されたＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率の円グラフが示されている。
【図8A】シミュレートされたデータを使用して本明細書に記載のアプローチを検証した結果を示す図であり、バックグラウンドＴＣＲＡコピー数が２であり、Ｔ細胞分画率値が０．０１～０．９９の範囲であるシミュレートされたデータセットにおける、計算されたＴ細胞分画率と実際のＴ細胞分画率を示す。
【図8B】シミュレートされたデータを使用して本明細書に記載のアプローチを検証した結果を示す図であり、２４％のＴ細胞及び７５％の腫瘍からなる試料（ＴＣＲＡコピー数＝１）からのシミュレートされた対数リード深度比を示す。
【図8C】シミュレートされたデータを使用して本明細書に記載のアプローチを検証した結果を示す図であり、様々な腫瘍コピー数及び純度に関する、計算されたナイーブＴ細胞分画率と実際の分画率と差を示す。
【図8D】シミュレートされたデータを使用して本明細書に記載のアプローチを検証した結果を示す図であり、様々な腫瘍コピー数及び純度に関する、ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率と実際の分画率との差を示す。
【図9A】TRACERx100データにおける免疫浸潤の直交規準との比較によって、本明細書に記載のアプローチを検証した結果を示す図であり、推定されたＴ細胞分画率と、ＣＤ８＋、Ｔ細胞、及び総ＴＩＬに関するDanaher ＲＮＡベースのスコアとの関連性を示す。
【図9B】TRACERx100データにおける免疫浸潤の直交規準との比較によって、本明細書に記載のアプローチを検証した結果を示す図であり、ＲＮＡ－ｓｅｑ（Danaher、Davoli、EPIC、TIMER、CIBERSORT、及びxCell）又はＤＮＡ（ＴＩＬ ＥｘＴＲＥＣＴ及びＣＤＲ３ ＶＤＪスコア）に基づく、病理学ＴＩＬスコアと、ＣＤ８＋Ｔ細胞含量の尺度との関連性を示す。
【図9C】TRACERx100データにおける免疫浸潤の直交規準との比較によって、本明細書に記載のアプローチを検証した結果を示す図であり、推定されたＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率と、Danaher、Davoli、EPIC、TIMER、CIBERSORT、及びxCell法からの様々な免疫関連細胞タイプに関するＲＮＡベースのスコアとの関連性を示す。スコアは、Spearmanのρ係数によって評価されたＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率との関連性の強さに従って並べられている。
【図9D】TRACERx100データにおける免疫浸潤の直交規準との比較によって、本明細書に記載のアプローチを検証した結果を示す図であり、ｉＤＮＡ法に基づくＣＤＲ３ ＶＤＪリードスコアとＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率との関連性を示す。
【図10A】免疫浸潤の直交規準との比較によって本明細書に記載のアプローチを検証した結果を示す図であり、メチル化データから計算されたTRACERx100データにおけるＴＣＧＡ ＬＵＡＤ及びＬＵＳＣ試料のリンパ球分画率と、CIBERSORTで計算されたＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率（Ａ）との比較を示す。
【図10B】免疫浸潤の直交規準との比較によって本明細書に記載のアプローチを検証した結果を示す図であり、メチル化データから計算されたTRACERx100データにおけるＴＣＧＡ ＬＵＡＤ及びＬＵＳＣ試料のリンパ球分画率と、CIBERSORTで計算されたＣＤ８＋Ｔ細胞分画率との比較を示す。
【図11A】推定されたＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率に対するリードカバレッジ（Ａ～Ｂ）又は潜在的なＦＦＰＥ関連の変化（Ｃ）の影響に関して本明細書に記載のアプローチを検証した結果を示す図であり、異なる深度への５つのTRACERx100領域のダウンサンプリングを示す。
【図11B】推定されたＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率に対するリードカバレッジ（Ａ～Ｂ）又は潜在的なＦＦＰＥ関連の変化（Ｃ）の影響に関して本明細書に記載のアプローチを検証した結果を示す図であり、様々な深度レベルへのシミュレートされたデータのダウンサンプリングを示す。
【図11C】推定されたＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率に対するリードカバレッジ（Ａ～Ｂ）又は潜在的なＦＦＰＥ関連の変化（Ｃ）の影響に関して本明細書に記載のアプローチを検証した結果を示す図であり、ＣＰＩ１０００＋コホート内の膀胱腫瘍及び悪性黒色腫に関するＦＦＰＥ及び新鮮凍結試料でのＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率（非ＧＣ補正）値を示す。
【図11D】推定されたＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率に対するリードカバレッジ（Ａ～Ｂ）又は潜在的なＦＦＰＥ関連の変化（Ｃ）の影響に関して本明細書に記載のアプローチを検証した結果を示す図であり、最高のＣＤＲ３リード数を有する５つのTRACERx100領域の様々な深度へのダウンサンプリング、及びその結果得られたＣＤＲ３リード数を示す。
【図12A】TRACERx100コホート内の予後予測指標を得るためにＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率を使用した結果を示す図であり、ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率推定量から推測される、＜１０％のＴ細胞含量を有する領域の数によって定義される、高リスク患者と低リスク患者との間の生存率の差を示すカプラン・マイヤー曲線を示す。
【図12B】TRACERx100コホート内の予後予測指標を得るためにＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率を使用した結果を示す図であり、TRACERx100でのＬＵＡＤ及びＬＵＳＣ組織学的サブタイプに関するカプラン・マイヤー曲線を示す。
【図12C】TRACERx100コホート内の予後予測指標を得るためにＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率を使用した結果を示す図であり、TRACERx100でのＬＵＡＤ及びＬＵＳＣ組織学的サブタイプに関するカプラン・マイヤー曲線を示す。
【図13A】ＴＣＧＡコホート内のＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率の解析の結果を示す図であり、ＴＣＧＡ ＬＵＡＤ及びＬＵＳＣでの全生存率を示すカプラン・マイヤー曲線であり、患者は、各群内のＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率の中央値によって分けられている。
【図13B】ＴＣＧＡコホート内のＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率の解析の結果を示す図であり、ＬＵＡＤ単独での全生存率を示すカプラン・マイヤー曲線であり、患者は、各群内のＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率の中央値によって分けられている。
【図13C】ＴＣＧＡコホート内のＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率の解析の結果を示す図であり、ＬＵＳＣ単独での全生存率を示すカプラン・マイヤー曲線であり、患者は、各群内のＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率の中央値によって分けられている。
【図14】TRACERx100コホート内のＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率の解析の結果を示す図である。箱ひげ図が、TRACERx100での血液と腫瘍との間のＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率推定量の差を示す。
【図15】TRACERx100コホート内のＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率の解析の結果を示す図である。組織学的特徴によって分けられた血液Ｔ細胞分画率と腫瘍Ｔ細胞分画率との比較。同じ患者からの領域は線で結ばれており、線のタイプは、全ての腫瘍領域が、TRACERx100でのマッチした血液Ｔ細胞分画率と比較して高いＴ細胞分画率を有する（長い破線）か、低いＴ細胞分画率を有する（実線）か、又は不均一なＴ細胞分画率を有する（短い破線）かによって決まっている。
【図16A】TRACERx100コホート内のＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率の解析の結果を示す図であり、TRACERx100コホート内の血液試料と腫瘍試料との間のＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率の差を示す箱ひげ図である。
【図16B】TRACERx100コホート内のＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率の解析の結果を示す図であり、TRACERx100コホート内の血中ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率の予測子を示す。
【図16C】TRACERx100コホート内のＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率の解析の結果を示す図であり、ＬＵＡＤ（上）とＬＵＳＣ（下）を腫瘍内に存在するコールド領域の数（左から右に増加）で割った値によって分けた、マルチ領域TRACERx100コホートに関するカプラン・マイヤー曲線を示す。ホット領域及びコールド領域は、全ての腫瘍領域の平均（０．０８０９５）を閾値として使用することによって定義した。各カプラン・マイヤー曲線において、含める患者は、閾値の定義に使用されるコールド領域の数よりも多い合計領域を有する患者に限定した。
【図16D】TRACERx100コホート内のＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率の解析の結果を示す図であり、TRACERx100コホート全体、並びにＬＵＡＤ及びＬＵＳＣ患者個別でのＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率に関連する様々なマルチ領域尺度に無病生存率を関係付ける個別のCox回帰モデルのハザード比を示す。相対領域免疫回避スコアは、最大領域ＴＣＲＡスコアを最小領域（上位９５％ＣＩ）ＴＣＲＡスコアで割った値として定義される。
【図16E】TRACERx100コホート内のＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率の解析の結果を示す図であり、最小及び最大領域ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率、腫瘍ステージ、年齢、及び性別を含むTRACERx100コホート全体のCox比例ハザードモデルを示す。
【図16F】TRACERx100コホート内のＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率の解析の結果を示す図であり、ＬＵＡＤ（上）とＬＵＳＣ（下）を腫瘍内に存在するコールド領域の数（左から右に増加）で割った値によって分けた、マルチ領域TRACERx100コホートに関するカプラン・マイヤー曲線を示す。ホット領域及びコールド領域は、全ての腫瘍領域の中央値（０．０７３６）を閾値として使用することによって定義した。各カプラン・マイヤー曲線において、含める患者は、閾値の定義に使用されるコールド領域の数よりも多い合計領域を有する患者に限定した。
【図17A】ＴＣＧＡコホート内のＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率の解析の結果を示す図であり、ＴＣＧＡコホート内のＬＵＡＤに関して、血液試料と腫瘍試料との間のＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率の差を示す箱ひげ図である。
【図17B】ＴＣＧＡコホート内のＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率の解析の結果を示す図であり、ＴＣＧＡコホート内のＬＵＳＣに関して、血液試料と腫瘍試料との間のＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率の差を示す箱ひげ図である。
【図17C】ＴＣＧＡコホート内のＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率の解析の結果を示す図であり、ＴＣＧＡコホート内の血液でのＬＵＡＤとＬＵＳＣとの間のＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率の差を示す箱ひげ図である。
【図17D】ＴＣＧＡコホート内のＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率の解析の結果を示す図であり、腫瘍試料でのＬＵＡＤとＬＵＳＣとの間のＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率の差を示す箱ひげ図である。
【図17E】ＴＣＧＡコホート内のＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率の解析の結果を示す図であり、ＴＣＧＡ ＬＵＡＤ及びＬＵＳＣコホート内の血中ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率の予測子を示す。
【図17F】ＴＣＧＡコホート内のＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率の解析の結果を示す図であり、ＴＣＧＡ ＬＵＡＤコホートの平均（０．１０９）を閾値として使用してコホートを免疫ホット群とコールド群に分けた、ＴＣＧＡ ＬＵＡＤコホートにおける全生存率及び無増悪生存率のカプラン・マイヤー曲線を示す。
【図17G】ＴＣＧＡコホート内のＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率の解析の結果を示す図であり、全生存率（ＯＳ）と無増悪生存率（ＰＦＳ）との両方に関するＴＣＧＡ ＬＵＡＤ及びＬＵＳＣコホートに関するＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率についての個別のCox回帰モデルのハザード比を示す。
【図17H】ＴＣＧＡコホート内のＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率の解析の結果を示す図であり、全生存率及び無増悪生存率について０～０．１６の異なる閾値（０．００２５刻み）に基づいて腫瘍試料をホットとコールドに分けた、ＴＣＧＡに関するカプラン・マイヤープロットからのＬｏｇ２（ハザード比）を示す。
【図17I】ＴＣＧＡコホート内のＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率の解析の結果を示す図であり、ホット腫瘍とコールド腫瘍を区別するための閾値としてＴＣＧＡ ＬＵＡＤコホートの平均（０．１０９）を使用した、全生存率及び無増悪生存率についてのＴＣＧＡ ＬＵＳＣコホート及びＴＣＧＡ ＬＵＡＤ ＆ ＬＵＳＣコホートに関するカプラン・マイヤー曲線を示す。
【図18A】TRACERx100コホートにおける血液試料中のＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率の性差を示す箱ひげ図である。
【図18B】ＴＣＧＡコホートにおける血液試料中のＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率の性差を示す箱ひげ図である。
【図18C】RACERx100コホートにおける生殖細胞系列血液試料に関する年齢とＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率との関連性を示す箱ひげ図である。
【図18D】ＴＣＧＡコホートにおける生殖細胞系列血液試料に関する年齢とＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率との関連性を示す箱ひげ図である。
【図19】ＣＰＩ１０００＋データセットのコホートの概要を示す図である。
【図20】ＣＰＩ１０００＋メタコホートにわたる非応答群と応答群とに関する計算された腫瘍ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率の有意差を示すバイオリンプロットを示す図である。０．１での黒い点線は、腫瘍を分けて、免疫ホット又はコールドのいずれかとして分類する。
【図21】ＣＰＩ１０００＋データにおけるクローン性ＴＭＢに対する腫瘍ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率を示すプロットを示す図である。破線は、コホートを高／低変異負荷及びホット／コールド腫瘍を有する４つの象限に分ける。差し込まれている円グラフは、ＣＰＩ療法に応答した患者の割合を示す。
【図22】個々のがん種の少なくとも１０人の患者、及びＤＮＡとＲＮＡ配列データの両方を含む複数のコホートにわたる免疫応答の予測子の単変量メタ解析の結果を示す図である。左のパネル：応答の予測値に関して、様々な臨床因子のＯＲ値及び関連のｐ値を示すフォレストプロット。右のパネル：ＣＰＩ１０００＋データセットでの個々の研究にわたるＯＲ値のヒートマップ。ＲＮＡ－ｓｅｑとＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率との両方を利用可能なコホートに焦点を当てている。
【図23】ＣＰＩ１０００＋データセットにおけるＣＰＩ応答を予測するためのＧＬＭモデルのＲＯＣプロットを示す図である（１：クローン性ＴＭＢ、３：クローン性ＴＭＢ＋ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率、２：クローン性ＴＭＢ＋ＣＤ８Ａ発現、４：クローン性ＴＭＢ＋ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率＋ＣＤ８Ａ発現）。
【図24A】ＣＰＩ肺データセットのコホートの概要を示す図である。上のパネルの赤い線は、ＣＰＩに対する応答がある（０．１０）又は応答がない（０．００７０）患者のＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率の中央値を反映している。腫瘍ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率は多くの場合にゼロであることに留意されたい。
【図24B】ＤＮＡ配列決定データを含むがＲＮＡ配列決定データは含んでいない３つのＮＳＣＬＣ ＣＰＩデータセットにわたる単変量メタ解析の結果を示す図である。
【図25】リード深度正規化（図５でのステップ２を参照）で使用されるＴＣＲＡ Ｖセグメントの数に応じた、TRACERx100コホート内の全ての領域に関するＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率（上）、使用されるセグメントの数に応じた、非ゼロであるTRACERx100コホート内の領域の割合（中央）、及び正規化に使用されるＶセグメントの数に応じた、Danaher Ｔ細胞遺伝子シグネチャとの相関の－ｌｏｇ（ｐ値）（下）を示す図である。
【図26A】ＴＣＧＡデータで使用されるエクソン捕捉プロセスにおける偏りの影響の調査を示す図であり、ＴＣＧＡ ＬＵＡＤコホートからの単一試料におけるエクソンに関する対数リード深度比の例を示すプロットを示す。特定のセグメント、特にＪ遺伝子エクソンは、カバレッジの偏りを示す二峰性分布を示す。
【図26B】ＴＣＧＡデータで使用されるエクソン捕捉プロセスにおける偏りの影響の調査を示す図であり、TRACERx100（青）又はＴＣＧＡ ＬＵＡＤ（赤）コホートでの選択された範囲のエクソンに関する対数比値の中央値を示す。ＴＣＧＡ ＬＵＡＤコホート内の多くのエクソンは、はるかに低いカバレッジを有し、したがって低い対数比値を有する。
【図26C】ＴＣＧＡデータで使用されるエクソン捕捉プロセスにおける偏りの影響の調査を示す図であり、ＧＣ補正前のＴＣＧＡコホートに関する縮小されたエクソンセットを使用したＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率を示す。
【図26D】ＴＣＧＡデータで使用されるエクソン捕捉プロセスにおける偏りの影響の調査を示す図であり、ＧＣ補正後のＴＣＧＡコホートに関する縮小されたエクソンセットを使用したＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率を示す。
【図27A】血液及び悪性組織内のＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率の感染関連決定因子の調査を示す図であり、KRAKENからの微生物リードと、血液試料中のＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率との関連性を示す。
【図27B】血液及び悪性組織内のＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率の感染関連決定因子の調査を示す図であり、KRAKENからの微生物リードと、腫瘍試料中のＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率との関連性を示す。
【図27C】血液及び悪性組織内のＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率の感染関連決定因子の調査を示す図であり、ＬＵＡＤにおいて、正規化されたリード数が腫瘍内のＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率と有意に関連付けられる微生物種を示す。
【図27D】血液及び悪性組織内のＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率の感染関連決定因子の調査を示す図であり、ＬＵＳＣにおいて、正規化されたリード数が腫瘍内のＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率と有意に関連付けられる微生物種を示す。
【図28A】マルチ領域データを用いた、血液及び悪性組織でのＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率の決定因子の調査を示す図であり、正常な血液試料とペアにされたマルチ領域の顕微切除組織を含むＰＮＥコホートの概要プロットを示す。
【図28B】マルチ領域データを用いた、血液及び悪性組織でのＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率の決定因子の調査を示す図であり、ＰＮＥコホートにおける血中ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率の予測子を示す。
【図28C】マルチ領域データを用いた、血液及び悪性組織でのＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率の決定因子の調査を示す図であり、ＰＮＥコホートにおける血中ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率の予測子を示す。
【図28D】マルチ領域データを用いた、血液及び悪性組織でのＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率の決定因子の調査を示す図であり、Messaoudene et al.の乳がんコホートにおけるＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率に対する腫瘍試料位置の影響を示す。
【図28E】マルチ領域データを用いた、血液及び悪性組織でのＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率の決定因子の調査を示す図であり、Messaoudene et al.のTRACERx100コホートにおけるＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率に対する腫瘍試料位置の影響を示す。
【図28F】マルチ領域データを用いた、血液及び悪性組織でのＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率の決定因子の調査を示す図であり、ゲノム因子からのＰＮＥ試料中のＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率に関する線形モデルを示す。
【図28G】マルチ領域データを用いた、血液及び悪性組織でのＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率の決定因子の調査を示す図であり、ＬＵＡＤ及びＬＵＳＣにおける血液及び腫瘍試料でのＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率との関連性について試験した５９の微生物種に関するＬｏｇ１０ ｐ値を示す。赤い線は、Ｐ＝０．０００４２３での有意性閾値を表す。
【図28H】マルチ領域データを用いた、血液及び悪性組織でのＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率の決定因子の調査を示す図であり、ＰＮＥコホートにおける平均ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率の概要を示す。
【図29A】マルチサンプル汎がんコホート内でのサブクローン性ＳＣＮＡと免疫不均一性との関連性の調査を示す図であり、マルチサンプル汎がんコホートにわたる免疫不均一性の概要を示す。赤い破線は、０．１のＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率である。
【図29B】マルチサンプル汎がんコホート内でのサブクローン性ＳＣＮＡと免疫不均一性との関連性の調査を示す図であり、均一に免疫ホット（本明細書では、全ての領域が≧０．１のＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率を有すると定義される）、均一に免疫コールド（本明細書では、全ての領域が＜０．１のＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率を有すると定義される）、又はホットとコールドの両方の領域を含む不均一、という３つのカテゴリーのうちの１つにおける患者の割合を示す。
【図29C】マルチサンプル汎がんコホート内でのサブクローン性ＳＣＮＡと免疫不均一性との関連性の調査を示す図であり、比較においていずれかの領域に固有のＳＣＮＡ変化を伴うゲノムの合計比率として定義されるペアワイズＳＣＮＡ不均一性に対してプロットされた、非常に類似したＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率（ペアごとの差＜０．１）を有する１対の領域と、非常に異なるＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率（ペアごとの差≧０．１）を有する１対の領域との両方を有するものと定義される不均一な免疫浸潤を有するマルチサンプルの患者のサブセット（ｎ＝５８）を示す。多数の領域を有する腫瘍からの偏りを加味するために、データは腫瘍ごとに平均化される。
【図29D】マルチサンプル汎がんコホート内でのサブクローン性ＳＣＮＡと免疫不均一性との関連性の調査を示す図であり、下のパネルでは、ゲノムにわたってサブクローン性利得（濃い赤色－０の水平線よりも上）又は損失（濃い青色－０よりも下）を有する汎がんの複数試料コホートにおける腫瘍の数を示す。水平線は、サブクローン性利得又は損失を有する３０個を超える腫瘍を有する領域を表す（「方法」参照）。上のパネルでは、ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率とサブクローン利得（濃い赤色の点）又は損失（濃い青色の点）との関連性について試験した、１６０個のサイトバンド領域の－ｌｏｇ１０（ｐ値）を示す。赤い水平線は有意性閾値を示し、１つの領域のみが有意であり、染色体１２ｑ２４．３１－３２では損失事象がある。
【図29E】マルチサンプル汎がんコホート内でのサブクローン性ＳＣＮＡと免疫不均一性との関連性の調査を示す図であり、染色体１２ｑ２４．３１－３２でのサブクローン性損失事象がある領域とない領域との間でのＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率の変化を示す。
【図29F】マルチサンプル汎がんコホート内でのサブクローン性ＳＣＮＡと免疫不均一性との関連性の調査を示す図であり、損失のある領域と損失のない領域とに対して行った、１２ｑ２４．３１－３２のサブクローン性損失を含むTRACERx100腫瘍のLimma-Voom解析からのボルケーノプロットを示す。複数の仮説の調整後、８つの遺伝子のみが有意であり、そのうちの３つ（ＳＰＰＬ３、ＡＢＣＢ９、及びＯＧＦＯＤ２）が損失領域にあり、標識されている。
【図30】ＷＧＳデータに関する図５の方法の実装を示す図である。ＧＣ補正と品質管理のためにビンベースのアプローチを使用するＧＡＭモデルと、Ｖ及びＪセグメントの既知の位置を使用するセグメントモデルとの２つの代替案が示されている。セグメントモデルは、以下の制約を有する。１．対数リード深度比を、Ｖ（Ｄ）Ｊセグメントの位置にアライメントする一定のセグメントからなる線形モデルとしてモデル化する。２．モデルは、最初のＶセグメントの前に値０を有する。３．Ｖセグメントは、ゲノム内に出現する順序で単調減少している。例えば、ＴＲＶＡ２＜ＴＲＶＡ１。４．Ｊセグメントは、ゲノム内に出現する順序で単調増加している。５．モデルは、最後のセグメントの後に値０を有する。
【図32A】TRACERx100コホートを使用したＷＧＳ Ｔ細胞ＥｘＴＲＥＣＴモデルのベンチマーキングの結果を示す図であり、ＷＧＳとＷＥＳのＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率スコアの比較を示す。
【図32B】TRACERx100コホートを使用したＷＧＳ Ｔ細胞ＥｘＴＲＥＣＴモデルのベンチマーキングの結果を示す図であり、Ｔ細胞に関するRNAseq Danaherスコアと比較したＷＧＳ Ｔ細胞分画率スコアを示す。
【図32C】TRACERx100コホートを使用したＷＧＳ Ｔ細胞ＥｘＴＲＥＣＴモデルのベンチマーキングの結果を示す図であり、TRACERx100コホート全体を使用した、Ｂ細胞に関するRNAseq Danaherスコアと比較したＷＧＳ Ｂ細胞分画率スコアを示す。
【図32D】TRACERx100コホートを使用したＷＧＳ Ｔ細胞ＥｘＴＲＥＣＴモデルのベンチマーキングの結果を示す図であり、セグメントモデル対数尤度試料が低い試料を除去した試料を含むコホートを使用した、Ｂ細胞に関するRNAseq Danaherスコアと比較したＷＧＳ Ｂ細胞分画率スコアを示す。
【図32E】TRACERx100コホートを使用したＷＧＳ Ｔ細胞ＥｘＴＲＥＣＴモデルのベンチマーキングの結果を示す図であり、ＷＧＳ ＧＡＭモデルからのＴ細胞分画率スコアの比較を示す。
【図32F】TRACERx100コホートを使用したＷＧＳ Ｔ細胞ＥｘＴＲＥＣＴモデルのベンチマーキングの結果を示す図であり、ＷＧＳセグメントモデルからのＴ細胞分画率スコアの比較を示す。
【図32G】TRACERx100コホートを使用したＷＧＳ Ｔ細胞ＥｘＴＲＥＣＴモデルのベンチマーキングの結果を示す図であり、セグメントモデルからのＴＲＤＶ１セグメント分画率と、ＴＣＲＤ遺伝子セグメントに関するKallistoからのＴＰＭ（１００万当たりの転写産物）のＲＮＡスコアとの比較を示す。
【図33】減少された配列決定深度を有する図３０の方法のロバスト性の解析結果を示す図である。Ｔ細胞ＥｘＴＲＥＣＴスコアは、ＧＡＭモデル又はセグメントモデルのいずれかを使用して、ダウンサンプリングされたｂａｍに関して取得した。
【図34F】ＴＣＲ及びＢＣＲの多様性を調査するための図３０でのセグメントモデルの使用を示す図であり、マッチしたＲＮＡｓｅｑデータからMiXCRで呼び出されたＶセグメントと、Ｔ細胞ＥｘＴＲＥＣＴセグメントモデルから呼び出されたＶセグメントとの数の比較を示す。
【図34G】ＴＣＲ及びＢＣＲの多様性を調査するための図３０でのセグメントモデルの使用を示す図であり、マッチしたＲＮＡｓｅｑデータからMiXCRで呼び出されたＶセグメントと、Ｔ細胞ＥｘＴＲＥＣＴセグメントモデルから呼び出されたＶセグメントとの数の比較を示す。
【発明を実施するための形態】
【0037】
詳細な説明
本発明の説明において、以下の用語を採用し、以下に示すように定義することを意図する。
本発明の説明において、以下の用語を採用し、以下に示すように定義することを意図する。
【0038】
「及び／又は」は、本明細書で使用するとき、他方の有無に関係なく、指定された２つの特徴又は構成要素のそれぞれの具体的な開示として解釈されるものとする。例えば、「Ａ及び／又はＢ」は、本明細書でそれぞれが個々に記載されているかのように、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂ、並びに（ｉｉｉ）Ａ及びＢのそれぞれの具体的な開示として解釈されるものとする。
【0039】
「試料」とは、本明細書で使用するとき、細胞又は組織試料（例えば生検による）、生体液、抽出物（例えば被験体から得られるＤＮＡ抽出物）でよく、そこから、ゲノム配列決定（全ゲノム配列決定、全エクソーム配列決定、標的配列決定（「パネル」配列決定とも呼ばれる））又はコピー数アレイプロファイリングなどのゲノム解析のためにゲノム材料を得ることができる。試料は、（例えば生検により）被験体から得られる細胞、組織、又は生体液試料でよい。そのような試料は、「被験体試料」と呼ばれることがある。特に、試料は、血液試料若しくは腫瘍試料、又はそれらに由来する試料でよい。試料は、被験体から新たに得られたものでも、ゲノム解析前に処理及び／又は保管されているもの（例えば、凍結された、固定された、又は１つ又は複数の精製、濃縮、若しくは抽出ステップを施されたもの）でもよい。特に、試料は、細胞又は組織培養試料でよい。したがって、本明細書に記載の試料は、細胞又はそれらに由来するゲノム材料を含む任意のタイプの試料を表すことがあり、被験体から得られた生物学的試料からのものでも、例えば細胞株から得られた試料からのものでもよい。試料は、好ましくは、有顎脊椎動物（例えば有顎脊椎動物細胞試料又は有顎脊椎動物被験体からの試料など）、適切には哺乳動物（例えば、特にマウスやラットなどのモデル動物を含む、哺乳動物細胞試料また哺乳動物被験体からの試料など）、好ましくはヒト（例えばヒト細胞試料又はヒト被験体からの試料など）からのものである。いくつかの実施形態では、試料は、ヒト被験体などの被験体から得られた試料である。さらに、試料は輸送及び／又は保管されることがあり、収集は、ゲノム配列データ獲得（例えば配列決定）の場所から離れた場所で行われることがあり、及び／又はコンピュータ実装方法ステップは、試料収集の場所及び／又はゲノム配列データ獲得（例えば配列決定）の場所から離れた場所で行われることがある（例えば、コンピュータ実装方法ステップは、「クラウド」プロバイダなどのネットワーク接続されたコンピュータによって行われることがある）。
【0040】
「混合試料」とは、複数の細胞種、又は複数の細胞種に由来する遺伝物質を含むと仮定される試料を表す。被験体から得られた試料、例えば腫瘍試料は、典型的には混合試料である（１つ又は複数の精製及び／又は分離ステップを施されない限り）。好ましくは、混合試料は、リンパ球を含む、又はリンパ球を含むと仮定（予想）される試料である。適切には、試料は、リンパ球及び少なくとも１つの他の細胞型を含む。例えば、試料は腫瘍試料でよい。「腫瘍試料」とは、腫瘍に由来する、又は腫瘍から得られる試料を表す。そのような試料は、腫瘍細胞、免疫細胞（例えばリンパ球など）、及び他の正常な（非腫瘍）細胞を含むことがある。腫瘍試料の文脈では、「純度」という用語は、腫瘍細胞である試料中の細胞の割合（「がん細胞分画率」又は「腫瘍分画率」と呼ばれることもある）、又は細胞由来の遺伝物質を含む試料の場合には細胞の同等の割合を表す。遺伝物質を含む試料の文脈では、腫瘍分画率は、例えばASCAT（Van Loo et al., 2010）、ABSOLUTE（Carter et al., 2012）、ichorCNA（Adalsteinsson et al., 2017）など、腫瘍ゲノムと生殖細胞系列ゲノムのデコンボリューションを試みる配列解析プロセスを使用して推定することができる。腫瘍試料の文脈では、試料中のリンパ球は、「腫瘍浸潤リンパ球」（ＴＩＬ）と呼ばれることもある。腫瘍試料は、被験体からの原発腫瘍試料、腫瘍関連リンパ節試料、又は転移部位からの試料でよい。腫瘍細胞又は腫瘍細胞に由来する遺伝物質を含む試料は、体液試料でよい。したがって、腫瘍細胞に由来する遺伝物質は、循環腫瘍ＤＮＡ又はエクソソーム内の腫瘍ＤＮＡでよい。この代わりに又はこれに加えて、試料は循環腫瘍細胞を含むこともある。混合試料は、遺伝物質を抽出するために処理されている細胞、組織、又は体液の試料でよい。生物学的試料から遺伝物質を抽出するための方法は、当技術分野で知られている。リンパ球は、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、又はそれらの混合物でよい。特に、Ｔリンパ球は、αβＴリンパ球及び／又はγδリンパ球を含むことがある。Ｂリンパ球は、ＩＧＬ軽鎖を有するＢ細胞及び／又はＩＧＫ軽鎖を有するＢ細胞を含むことがある。
【0041】
「リンパ球分画率」という用語は、リンパ球である、又は特定のタイプのリンパ球（例えば、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、αβＴリンパ球、ＴＣＲ又はＢＣＲ遺伝子での任意の選択された遺伝子セグメントを含むＴリンパ球又はＢリンパ球など）である混合試料中のＤＮＡ含有細胞の割合を表す。「Ｔリンパ球分画率」という用語は、Ｔリンパ球である混合試料中のＤＮＡ含有細胞の割合を表す。「Ｂリンパ球分画率」という用語は、Ｂリンパ球である混合試料中のＤＮＡ含有細胞の割合を表す。本開示の文脈では、リンパ球分画率は、定量化されている特定のリンパ球集団においてＶＤＪ組換えを受けるゲノム領域に由来するシグナルに基づいて推定される。したがって、リンパ球分画率は、より特定的には、ＶＤＪ組換えを受けた所定のゲノム関心領域を有することによって特徴付けられるリンパ球である混合試料中のＤＮＡ含有細胞の割合を表すことがある。所定のゲノム関心領域は、ＴＣＲＡ／ＴＣＲＤ、ＴＣＲＢ、ＴＣＲＧ、ＩＧＨ、ＩＧＬ、又はＩＧＫ遺伝子の領域（本明細書では、ＴＣＲＡ／ＴＣＲＤ、ＴＣＲＢ、ＴＣＲＧ、ＩＧＨ、ＩＧＬ、及びＩＧＫ遺伝子座とも呼ぶ）でよい。調査対象の種によっては、有袋類やサメに存在する特定のＴＣＲの遺伝子座（例えばＴＣＲμ）など、他のあまり一般的でない遺伝子座を使用することもできる。本方法で使用される所定の関心領域（ゲノム遺伝子座）の選択に応じて、リンパ球分画率は、リンパ球の異なる部分集団を捉えることがある。例えば、ＴＣＲＢ遺伝子座を使用することで、αβＴリンパ球分画率の定量化が可能になり得る。別の例として、ＴＣＲＤ遺伝子座はＴＣＲＡ遺伝子座内に完全に含まれていると考えられるので、ＴＣＲＡ遺伝子座を使用することで、複合のαβＴリンパ球及びγδＴリンパ球分画率の定量化が可能になり得る。さらに、ＴＣＲＡ遺伝子座内のＴＣＲＤに対応する１つ又は複数のセグメントを使用することで、γδＴリンパ球であるαβリンパ球及びγδＴリンパ球の分画率の定量化が可能になり得る。ＴＣＲＤに対応する特定のセグメントの選択は、そのセグメントを使用して推定される分画率と、ＴＣＲＤ分画率を示す直交規準との相関に応じて行うことができる。別の例として、ＴＣＲＧ又はＴＣＲＤ遺伝子座を使用することで、γδＴリンパ球分画率の定量化が可能になり得る。ＴＣＲＤ遺伝子座は非常に小さく、したがってそれほど多くの有益なシグナルを含むとは予想されないため、γδＴリンパ球分画率の定量化にはＴＣＲＧ遺伝子座の使用が好ましいこともある。逆に、ＴＣＲＡ遺伝子座とＴＣＲＢ遺伝子座又はＴＣＲＧ遺伝子座との両方を使用することで、αβＴリンパ球分画率とγδＴリンパ球分画率との個別の定量化が可能になり得る。さらに別の例として、ＩＧＨ遺伝子座を使用することで、Ｂ細胞（ＩＧＬ軽鎖を有するかＩＧＫ軽鎖を有するかに関係なく）の定量化が可能になり得て、一方、ＩＧＬ又はＩＧＫ遺伝子座を使用することで、ＩＧＬ軽鎖又はＩＧＫ軽鎖のいずれかを有するＢ細胞の定量化が可能になり得る。さらに、リンパ球の複数の部分集団について個別のリンパ球分画率を定量化することができる。これらを追加して、リンパ球の複数又は全ての部分集団を表すリンパ球分画率を得ることができる。さらに、一部の混合試料は、主に又は排他的に単一のリンパ球集団を含むと仮定されることがある。したがって、単一の所定のゲノム関心領域を使用して推定されるリンパ球分画率が、その試料に関する（全体の）リンパ球分画率を表すと仮定することができる。例えば、試料が主にＴリンパ球を含むと仮定することができ（又は逆の言い方をすると、Ｔリンパ球の割合に比べて比較的小さい割合のＢリンパ球を含むと仮定することができ）、その大部分はαβＴリンパ球であると予想することができる。したがって、そのような場合、リンパ球分画率は、ＴＣＲＡ又はＴＣＲＢ遺伝子座に対応する単一の所定のゲノム関心領域を使用して推定される。同様に、一部の混合試料は、主に又は排他的に単一のＴリンパ球集団を含むと仮定されることがある。したがって、単一の所定のゲノム関心領域を使用して推定されるリンパ球分画率が、その試料に関する（全体の）Ｔリンパ球分画率を表すと仮定することができる。例えば、αβＴリンパ球は、試料中に存在する主要なタイプのＴリンパ球であると仮定することができ、それにより、ＴＣＲＡ又はＴＣＲＢ遺伝子座に対応する単一の所定のゲノム関心領域を使用してＴリンパ球分画率を推定することができる。別の例として、ＴＣＲＤ遺伝子座は、ＴＣＲＡ遺伝子座内に完全に含まれていると考えられ（ＴＣＲＡ／ＴＣＲＤと呼ばれる遺伝子座を共に形成する）、それにより、この単一の所定のゲノム関心領域を使用して推定されるリンパ球分画率は、試料に関する（全体の）Ｔリンパ球分画率（特にαβＴリンパ球及びγδＴリンパ球を含む）を表すと仮定することができる。
【0042】
ＴＣＲＡ遺伝子とは、ホモサピエンスにおける遺伝子ＩＤ６９５５（ＨＧＮＣ記号：ＴＲＡ）を有するＴ細胞受容体アルファ遺伝子座、又は他の有顎脊椎動物における任意の相同領域を表す。ホモサピエンスでは、この遺伝子は、１４番染色体の位置ＮＣ＿００００１４．９（２１６２１９０４．．２２５５２１３２）（アセンブリＧＲＣｈ３８．ｐ１３）にあり、この位置は、位置ＮＣ＿００００１４．８（２２０９００５７．．２３０２１０７５）（アセンブリＧＲＣｈ３７．ｐ１３）とも呼ばれる。相同遺伝子座の例としては、マウスｔｃｒａ遺伝子座（遺伝子ＩＤ：２１４７３、１４番染色体、アセンブリＧＲＣｍ３９－ＮＣ＿００００８０．７（５２６６５４２４．．５４４６１６５５）、アセンブリＧＲＣｍ３８．ｐ６－ＮＣ＿００００８０．６（５２４２７９６７．．５４２２４１９８））が挙げられる。最大Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えの領域として、及びＴＣＲＡ遺伝子（及びＴＣＲＤ遺伝子など、その中の任意の遺伝子）に関するベースラインリード深度を取得するために使用される領域として使用することができる座標の例が表７に提供されている。
【0043】
ＴＣＲＢ遺伝子とは、ホモサピエンスにおける遺伝子ＩＤ６９５７（ＨＧＮＣ記号：ＴＲＢ）を有するＴ細胞受容体ベータ遺伝子座、又は他の有顎脊椎動物における任意の相同領域を表す。ホモサピエンスでは、この遺伝子は、７番染色体の位置ＮＣ＿０００００７．１４（１４２２９９０１１．．１４２８１３２８７）（アセンブリＧＲＣｈ３８．ｐ１３）又はＮＣ＿０００００７．１３（１４１９９８８５１．．１４２５１０９７２）（アセンブリＧＲＣｈ３７．ｐ１３）にある。相同遺伝子座の例としては、マウスｔｃｒｂ遺伝子座（遺伝子ＩＤ：２１５７７、６番染色体、アセンブリＧＲＣｍ３９－ＮＣ＿００００７２．７（４０８６８２３０．．４１５３５３０５）又はアセンブリＧＲＣｍ３８．ｐ６－ＮＣ＿００００７２．６（４０８９１２９６．．４１５５８３７１））が挙げられる。最大Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えの領域として、及びＴＣＲＢ遺伝子に関するベースラインリード深度を取得するために使用される領域として使用することができる座標の例が表７に提供されている。
【0044】
ＴＣＲＧ遺伝子とは、ホモサピエンスにおける遺伝子ＩＤ６９６５（ＨＧＮＣシンボル：ＴＲＧ）を有するＴ細胞受容体ガンマ遺伝子座、又は他の有顎脊椎動物における任意の相同領域を表す。ホモサピエンスでは、この遺伝子は、７番染色体の位置ＮＣ＿０００００７．１４（３８２４００２４．．３８３６８０５５、補体）（ＧＲＣｈ３８．ｐ１３）又はＮＣ＿０００００７．１３（３８２７９６２５．．３８４０７６５６、補体）（ＧＲＣｈ３７．ｐ１３）にある。相同遺伝子座の例としては、マウスｔｃｒｇ遺伝子座（遺伝子ＩＤ：１１００６７、１３番染色体、アセンブリＧＲＣｍ３９－ＮＣ＿００００７９．７（１９３６２２１２．．１９５４０６４６）、アセンブリＧＲＣｍ３８．ｐ６－ＮＣ＿００００７９．６（１９１７８０４２．．１９３５６４７６））が挙げられる。最大Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えの領域として、及びＴＣＲＧ遺伝子に関するベースラインリード深度を取得するために使用される領域として使用することができる座標の例が表７に提供されている。
【0045】
ＴＣＲＤ遺伝子とは、ホモサピエンスにおける遺伝子ＩＤ６９６４（ＨＧＮＣシンボル：ＴＲＤ）を有するＴ細胞受容体デルタ遺伝子座、又は他の有顎脊椎動物における任意の相同領域を表す。ホモサピエンスでは、この遺伝子は、１４番染色体の位置ＮＣ＿００００１４．９（２２４２２５４６．．２２４６６５７７）（ＧＲＣｈ３８．ｐ１３）又はＮＣ＿００００１４．８（２２８９１５３７．．２２９３５５６９）（ＧＲＣｈ３７．ｐ１３）にある。相同遺伝子座の例としては、マウスｔｃｒｄ遺伝子座（遺伝子ＩＤ：１１００６６、１４番染色体、アセンブリＧＲＣｍ３９－ＮＣ＿００００８０．７（５４１８３５３０．．５４３９６６５５）、アセンブリＧＲＣｍ３８．ｐ６－ＮＣ＿００００８０．６（５３９４６０７３．．５４１５９１９８））が挙げられる。最大Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えの領域として、及びＴＣＲＤ遺伝子に関するベースラインリード深度を取得するために使用される領域として使用することができる座標の例が表７（ＴＣＲＡで使用される領域を参照して）及び表８（ＴＣＲＡ遺伝子座内のＴＣＲＤセグメントを参照して）に提供されている。
【0046】
ＩＧＨ遺伝子とは、ホモサピエンスにおける遺伝子ＩＤ３４９２（ＨＧＮＣシンボル：ＩＧＨ）を有する免疫グロブリン重遺伝子座、又は他の有顎脊椎動物における任意の相同領域を表す。ホモサピエンスでは、この遺伝子は、１４番染色体の位置ＮＣ＿００００１４．９（１０５５８６４３７．．１０６８７９８４４、補体）（ＧＲＣｈ３８．ｐ１３）又はＮＣ＿００００１４．８（１０６０３２６１４．．１０７２８８０５１、補体）（ＧＲＣｈ３７．ｐ１３）にある。相同遺伝子座の例としては、マウスＩｇｈ遺伝子座（遺伝子ＩＤ：１１５０７、１２番染色体、アセンブリＧＲＣｍ３９－ＮＣ＿００００７８．７（１１３２２２３８８．．１１５９７３５７４、補体）、アセンブリＧＲＣｍ３８．ｐ６－ＮＣ＿００００７８．６（１１３２５８７６８．．１１６００９９５４、補体））が挙げられる。最大Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えの領域として、及びＩＧＨ遺伝子に関するベースラインリード深度を取得するために使用される領域として使用することができる座標の例が表７に提供されている。
【0047】
ＩＧＬ遺伝子とは、ホモサピエンスにおける遺伝子ＩＤ３５３５（ＨＧＮＣシンボル：ＩＧＬ）を有する免疫グロブリンラムダ遺伝子座、又は他の有顎脊椎動物における任意の相同領域を表す。ホモサピエンスでは、この遺伝子は、２２番染色体の位置ＮＣ＿００００２２．１１（２２０２６０７６．．２２９２２９１３）（ＧＲＣｈ３８．ｐ１３）又はＮＣ＿００００２２．１０（２２３８０４７４．．２３２６５０８５）（ＧＲＣｈ３７．ｐ１３）にある。相同遺伝子座の例としては、マウスＩｇｌ遺伝子座（遺伝子ＩＤ：１１１５１９、１６番染色体、アセンブリＧＲＣｍ３９－ＮＣ＿００００８２．７（１８８４５６０８．．１９０７９５９４、補体）、アセンブリＧＲＣｍ３８．ｐ６－ＮＣ＿００００８２．６（１９０２６８５８．．１９２６０８４４、補体））が挙げられる。
【0048】
ＩＧＫ遺伝子とは、ホモサピエンスにおける遺伝子ＩＤ５０８０２（ＨＧＮＣシンボル：ＩＧＫ）を有する免疫グロブリンカッパ遺伝子座、又は他の有顎脊椎動物における任意の相同領域を表す。ホモサピエンスでは、この遺伝子は、２番染色体の位置ＮＣ＿０００００２．１２（８８８５７３６１．．９０２３５３６８）（ＧＲＣｈ３８．ｐ１３）又はＮＣ＿０００００２．１１（８９８９０５６８．．９０２７４２３５）、（８９１５６８７４．．８９６３０４３６、補体）（ＧＲＣｈ３７．ｐ１３）にある。相同遺伝子座の例としては、マウスＩｇｋ遺伝子座（遺伝子ＩＤ：２４３４６９、６番染色体、アセンブリＧＲＣｍ３９－ＮＣ＿００００７２．７（６７５３２６２０．．７０７０３７３８）、アセンブリＧＲＣｍ３８．ｐ６－ＮＣ＿００００７２．６（６７５５５６３６．．７０７２６７５４））が挙げられる。
【0049】
「配列データ」という用語は、特定の配列を有する試料中のゲノム材料の存在及び好ましくはその量も示す情報を表す。そのような情報は、配列決定技術を使用して、例えば次世代配列決定（ＮＧＳ、例えば全エクソーム配列決定（ＷＥＳ）、全ゲノム配列決定（ＷＧＳ）、又は捕捉されたゲノム遺伝子座の配列決定（標的又はパネル配列決定）など）を使用して、又は例えばコピー数多型アレイなどのアレイ技術若しくは他の分子計数アッセイを使用して取得することができる。ＮＧＳ技術が使用されるとき、配列データは、特定の配列を有する配列決定リードの数のカウントを含むことがある。配列データは、当技術分野で知られている方法（Bowtie（Langmead et al., 2009）など）を使用して、参照配列、例えば参照ゲノムにマッピングすることができる。したがって、配列決定リード又は等価の非デジタルシグナルの数は、特定のゲノム位置に関連付けられることがある（「ゲノム位置」とは、配列データがマッピングされた参照ゲノム内の位置を表す）。「リード深度」という用語は、特定のゲノム位置にマッピングする試料中のゲノム材料の量を示すシグナルを表す。そのようなシグナルは、配列決定技術を使用して、例えば次世代配列決定（ＮＧＳ、例えばＷＥＳ、ＷＧＳ、又は捕捉されたゲノム遺伝子座の配列決定など）を使用して、又は例えばコピー数多型アレイなどのアレイ技術を使用して取得することができる。ＮＧＳ技術が使用されるとき、リード深度は、その言葉の一般的な意味の範囲内でのリード深度、すなわちゲノム位置にマッピングする配列決定リードの数のカウントでよい。アレイ技術が使用されるとき、リード深度は、特定のゲノム位置に関連付けられる強度値でよく、これを対照と比較して、特定の位置にマッピングするゲノム材料の量の指標を提供することができる。「リード深度プロファイル」という用語は、複数のゲノム位置に関するリード深度値の集合を表す。例えば、特定のゲノム位置ｉでのリード深度は、参照ゲノムでの位置ｉにある塩基でのリード深度を表すことがあり、リード深度プロファイルは、１つ又は複数の関心領域内の複数の位置ｉに関するリード深度を表すことがある。
【0050】
本明細書で使用するとき、「治療」とは、治療されている疾患の１つ又は複数の症状を、治療前の症状と比較して軽減、緩和、又は除去することを表す。「予防」（prevention又はprophylaxis）とは、疾患の症状の発症を遅延又は予防することを表す。予防は、絶対的である（疾患が起こらない）ことも、一部の個人でのみ又は限られた期間にわたってのみ有効なこともある。
【0051】
本明細書で使用するとき、「コンピュータシステム」という用語は、システムを具現化するため、又は上述した実施形態による方法を実行するためのハードウェア、ソフトウェア、及びデータストレージデバイスを含む。例えば、コンピュータシステムは、処理装置（中央処理装置（ＣＰＵ）及び／又はグラフィック処理装置（ＧＰＵ）など）、入力手段、出力手段、及びデータストレージを備えることがあり、これらは、１つ又は複数の接続されたコンピューティングデバイスとして具現化されることがある。好ましくは、コンピュータシステムは、ディスプレイを有し、又はディスプレイを有するコンピューティングデバイスを備え、（例えばビジネスプロセスの設計において）視覚的な出力表示を提供する。データストレージは、ＲＡＭ、ディスクドライブ、又は他のコンピュータ可読媒体を含むことがある。コンピュータシステムは、ネットワークによって接続され、そのネットワークを介して互いに通信することができる複数のコンピューティングデバイスを含むことがある。コンピュータシステムがクラウドコンピュータからなる又はクラウドコンピュータを備えることもあることが明示的に想起される。
【0052】
本明細書で使用するとき、「コンピュータ可読媒体」という用語は、限定はしないが、コンピュータ又はコンピュータシステムによって直接読み取る及びアクセスすることができる任意の非一時的な媒体を含む。媒体は、限定はしないが、フロッピーディスク、ハードディスク記憶媒体、及び磁気テープなどの磁気記憶媒体；光ディスクやＣＤ－ＲＯＭなどの光記憶媒体；ＲＡＭ、ＲＯＭ、及びフラッシュメモリを含むメモリなどの電気記憶媒体；並びに磁気／光記憶媒体など上記の媒体のハイブリッド及び組合せを含むことができる。
【0053】
混合試料中のリンパ球分画率の決定
本開示は、少なくとも所定のゲノム関心領域に関するリード深度データを含む試料からのリード深度データを使用して、混合試料中のリンパ球分画率を決定するための方法を提供する。図１を参照して例示的な方法を述べる。任意選択のステップ１０で、複数の細胞型からのゲノム材料を含む混合試料を被験体から得ることができる。任意選択のステップ１２で、例えば、全エクソーム配列決定、全ゲノム配列決定、又はパネル配列決定のうちの１つを使用して試料中のゲノム材料を配列決定することによって、混合試料から配列リード／リード深度データを取得することができる。ステップ１４で、所定のゲノム関心領域に沿ったリード深度を含む試料に関するリード深度プロファイルが取得される。これは、所定の関心領域にわたって複数の生のリード深度値を取得するステップ１４Ａと、リード深度値を平滑化及び／又は補正（例えばＧＣ補正）するステップ１４Ｂとを含むことがある。
本開示は、少なくとも所定のゲノム関心領域に関するリード深度データを含む試料からのリード深度データを使用して、混合試料中のリンパ球分画率を決定するための方法を提供する。図１を参照して例示的な方法を述べる。任意選択のステップ１０で、複数の細胞型からのゲノム材料を含む混合試料を被験体から得ることができる。任意選択のステップ１２で、例えば、全エクソーム配列決定、全ゲノム配列決定、又はパネル配列決定のうちの１つを使用して試料中のゲノム材料を配列決定することによって、混合試料から配列リード／リード深度データを取得することができる。ステップ１４で、所定のゲノム関心領域に沿ったリード深度を含む試料に関するリード深度プロファイルが取得される。これは、所定の関心領域にわたって複数の生のリード深度値を取得するステップ１４Ａと、リード深度値を平滑化及び／又は補正（例えばＧＣ補正）するステップ１４Ｂとを含むことがある。
【0054】
ステップ１６で、関心領域のサブセットからベースラインリード深度が取得される。これは、ベースラインリード深度を取得するために、ＶＤＪ組換えにより欠失される可能性が低い関心領域のサブセットとして使用することができる関心領域のサブセットを特定する任意選択のステップ１６Ａを含むことがある。例えば、ＶＤＪ組換えにより欠失される可能性が低い関心領域は、ＶＤＪ組換えを受けるゲノム遺伝子座の最初のｎ個のＶセグメントを含む。パラメータｎは、適切な訓練データを使用して、例えばリンパ球分画率の直交規準と比較したときに訓練データにわたるリンパ球分画率の最も正確な推定量をもたらすｎの値を選択することによって決定することができる。リンパ球分画率の直交規準は、例えば、トランスクリプトームデータ及び／又は組織病理学データに基づいて取得され得る。
【0055】
ステップ１８で、ステップ１６において取得されたベースラインリード深度を参照して、所定の関心領域に沿ったリード深度を正規化することによって、複数のリード深度比（ｒｉ）が取得される。これは、（複数のリード深度比（ｒｉ）を含む）リード深度比プロファイルにモデルを当てはめて、平滑化されたリード深度プロファイルを取得する任意選択のステップ１８Ａを含むことがある。ステップ２０で、ＶＤＪ組換えにより欠失される可能性が高い関心領域のサブセットに関して、要約されたリード深度比値（ｒＶＤＪ）が取得される（任意選択で、ＶＤＪ組換えにより欠失される可能性が高い関心領域のサブセットにおいて、ステップ１８Ａで当てはめられたモデルの値に基づいて）。
【0056】
ステップ２２で、混合試料中の異常細胞の分画率（ｐ）（ここで、異常細胞とは、所定の関心領域内で異数性である細胞である）、及び所定の関心領域内での異常細胞のコピー数（ΨＴ）が、当技術分野で知られている方法を使用して異常細胞に特異的なコピー数プロファイルを取得することによって任意選択で決定され得る。ステップ２４で、試料中のリンパ球の分画率（ｆ）が、ステップ２０で取得された要約されたリード深度比値（ｒＶＤＪ）の関数として決定される。これは、要約されたリード深度比値（ｒＶＤＪ）の関数としての試料中のリンパ球の分画率（ｆ）、混合試料中の異常細胞の分画率（ｐ）、及び所定の関心領域内の異常細胞のコピー数（ΨＴ）を決定することを含むことがある。
【0057】
任意選択のステップ２６で、決定されたリンパ球分画率及び／又はそこから導出される任意の値が、例えばユーザインターフェースを介してユーザに提供され得る。そこから導出される値は、以下でさらに述べるように、予後予測及び／又は診断情報を含むことがある。
【0058】
用途
上記の方法には、様々な臨床状況での用途がある。例えば、がんの文脈では、腫瘍試料、又は好ましくは腫瘍からの複数の試料中のリンパ球分画率を決定することにより、腫瘍の免疫状態の指標が提供され得る。これは、非小細胞肺がん（本明細書で実証）、卵巣がん（例えば、Zhang et al., 2003を参照）、大腸がん（例えば、Galon et al., 2006を参照）、乳がん（例えば、Dieci et al., 2018を参照）、及び悪性黒色腫を含む様々ながんに関する予後予測値を有することが示されている。本発明者らは、血液及び／又は腫瘍試料中のＴ及び／又はＢ細胞分画率が、少なくともいくつかのがん種における予後を示唆することを実証した（実施例６、図３５を参照）。
上記の方法には、様々な臨床状況での用途がある。例えば、がんの文脈では、腫瘍試料、又は好ましくは腫瘍からの複数の試料中のリンパ球分画率を決定することにより、腫瘍の免疫状態の指標が提供され得る。これは、非小細胞肺がん（本明細書で実証）、卵巣がん（例えば、Zhang et al., 2003を参照）、大腸がん（例えば、Galon et al., 2006を参照）、乳がん（例えば、Dieci et al., 2018を参照）、及び悪性黒色腫を含む様々ながんに関する予後予測値を有することが示されている。本発明者らは、血液及び／又は腫瘍試料中のＴ及び／又はＢ細胞分画率が、少なくともいくつかのがん種における予後を示唆することを実証した（実施例６、図３５を参照）。
【0059】
したがって、被験体からの腫瘍の免疫状態の方法であって、被験体からの１つ又は複数の腫瘍試料中のリンパ球分画率を決定することを含む方法も本明細書に記載される。
【0060】
さらに、がんと診断された被験体に関する予後予測を提供する方法であって、被験体からの１つ又は複数の腫瘍試料中のリンパ球分画率を決定することを含む方法も本明細書に記載される。本方法は、試料中のリンパ球分画率（例えばＴリンパ球分画率など）に応じて、試料を免疫ホット又は免疫コールドとして分類することをさらに含むことがある。例えば、閾値（例えば、約０．１、すなわち約１０％）を超えるリンパ球分画率を有する試料は免疫ホットとして分類されることがあり、閾値以下のリンパ球分画率を有する試料はコールドとして分類されることがある。本方法は、免疫コールドとして分類された患者からの試料の数に応じて、被験体を予後良好群と予後不良群とに分類することをさらに含むこともある。例えば、異なる腫瘍領域からの試料を解析するとき、免疫コールドとして分類された試料の数が閾値（例えば２など）以上であると、被験体が予後不良群に分類されることがある。予後不良群は、予後良好群と比較して、無再発生存率の減少及び／又は全生存率の減少と関連していることがある。リンパ球分画率及び／又は免疫コールド試料の数に関する閾値は、適切な訓練コホートを使用して、例えば、大幅に異なる予後予測に関連する群間で患者を分類することができる様々な閾値の性能を評価することによって決定することができる。
【0061】
さらに、引き続きがんの文脈で、ＴＩＬの存在は、特にチェックポイント阻害薬（ＣＰＩ）（例えば、Litchfield et al., 2020を参照）、しかしまたＴ細胞転移療法（腫瘍浸潤リンパ球（又はＴＩＬ）療法及びＣＡＲ－Ｔ細胞療法）、療法用抗体、がん治療ワクチン、及び免疫系調節因子（例えばインターフェロン及びインターロイキン）も含む免疫療法に対する応答の可能性の増加に関連していることが示されている。したがって、がんと診断された被験体が免疫療法による治療から恩恵を受ける可能性が高いかどうかを決定する方法であって、被験体からの１つ又は複数の腫瘍試料中のリンパ球分画率を決定することを含む方法も本明細書に記載される。免疫療法は、がんを治療するために免疫系の機能を調節する任意の療法でよい。実際、任意のそのような療法は、腫瘍内の免疫細胞の有無によって影響を及ぼされる可能性が高いと考えられる。いくつかの実施形態では、免疫療法はＣＰＩ療法である。ＣＰＩ療法は、例えば、抗ＣＴＬ４薬又は抗ＰＤＬ１薬による治療を含む。本方法は、免疫療法に応答する可能性が高い群と、免疫療法に応答する可能性が低い群とに被験体を分類することをさらに含むこともある。例えば、本方法は、試料中のリンパ球分画率（例えばＴリンパ球分画率など）に応じて、試料を免疫ホット又は免疫コールドとして分類することをさらに含むことがある。次いで、被験体からの１つ又は複数の試料が免疫コールドである場合、その被験体を、免疫療法（例えばＣＰＩ療法）に応答する可能性が低い群に分類することができる。代替として、被験体からの試料が閾値未満のリンパ球分画率を有する場合、被験体は、免疫療法（例えばＣＰＩ療法）に応答する可能性が低い群に分類されることがあり、そうでない場合には、免疫療法（例えばＣＰＩ療法）に応答する可能性が高い群に分類されることがある。代替として、本方法は、被験体からの１つ又は複数の試料中のリンパ球分画率と、被験体に関する推定される腫瘍変異負荷とに基づいて、ＣＰＩ療法に応答する可能性が高い群と、ＣＰＩ療法に応答する可能性が低い群とに被験体を分類することをさらに含むことがある。そのような分類は、多変量モデルを使用して取得され得る。分類モデルのパラメータ（例えば、閾値、多変量モデルのパラメータ）は、適切な訓練コホートを使用して決定され得る。
【0062】
本明細書に記載のリンパ球分画率は、被験体が重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）及び／又はＴ細胞リンパ球減少症を有するかどうかを判定するために使用することもできる。これは、新生児ケアの文脈で特に使用される。実際、本方法の以前には、ＳＣＩＤは通常、全血球数を使用して同定されていた。これは、理論的には、ＴＲＥＣ自体の配列決定及び定量化を使用して確認することができるが、実際の臨床現場でこれが行われることはほとんどない。したがって、ＷＥＳからのデータを使用してＳＣＩＤに関する診断を行うことができる機能は、潜在的に有害な生殖細胞系列変異を同定するために新生児のゲノムスクリーニングの一部として実施されることが増えており、非常に価値がある。したがって、本開示はまた、被験体、特に新生児被験体におけるＴ細胞リンパ球減少症及び／又はＳＣＩＤを同定する方法であって、被験体からの１つ又は複数の試料中で、本明細書に記載のリンパ球分画率を決定することを含む方法に関する。試料は、例えば血液試料でよい。
【0063】
本方法はまた、試料中の免疫細胞又は特定の種類の免疫細胞の有無又は量が診断又は予後予測を示唆する任意の臨床状況において使用することができる。例えば、一部の自己免疫疾患は、一部の骨髄疾患（例えば、再生不良性貧血など）や感染症（例えば、ＨＩＶ、敗血症、インフルエンザ、マラリア、ウイルス性肝炎、結核、腸チフスなど）と同様に、リンパ球数の減少（例えば、狼瘡、関節リウマチなど）に関連付けられる。したがって、異常なリンパ球数に関連付けられる疾患、障害、又は症状を有するものとして被験体を診断する方法であって、被験体からの１つ又は複数の試料中のリンパ球分画率を決定することを含む方法も本明細書に記載される。
【0064】
本明細書に記載のリンパ球分画率は、例えばＧＷＡＳ解析によって、一塩基多型（ＳＮＰ）などの１つ又は複数の生殖細胞系列変異が例えば血液試料中のＴ／Ｂ細胞分画率の増加又は減少に関連付けられるかどうかを決定するために使用することもできる。これは、Ｔ細胞分画率の増加／減少の原因となり得るバリアント（生殖細胞系列変異）を同定するのに役立つことがある。
【0065】
システム
図２は、本開示による、混合試料中のリンパ球分画率を決定するため、及び／又はリンパ球分画率に少なくとも部分的に基づいて予後予測若しくは治療推奨を提供するためのシステムの一実施形態を示す。このシステムは、プロセッサ１０１及びコンピュータ可読メモリ１０２を備えるコンピューティングデバイス１を備える。図示される実施形態では、コンピューティングデバイス１は、ユーザインターフェース１０３も備え、ユーザインターフェース１０３は、画面として示されているが、例えば聴覚又は視覚的な信号によってユーザに情報を伝達する任意の他の手段を含むこともある。コンピューティングデバイス１は、例えばネットワーク６を介して、配列決定マシンなどのリード深度データ獲得手段３、及び／又はリード深度データを記憶する１つ又は複数のデータベース２に通信可能に接続される。１つ又は複数のデータベースは、例えば参照配列やパラメータなど、コンピューティングデバイス１によって使用することができる他のタイプの情報をさらに記憶することができる。コンピューティングデバイスは、スマートフォン、タブレット、パーソナルコンピュータ、又は他のコンピューティングデバイスでよい。コンピューティングデバイスは、本明細書に記載されるように、混合試料中のリンパ球分画率を決定するための方法を実行するように構成される。代替実施形態では、コンピューティングデバイス１は、リモートコンピューティングデバイス（図示せず）と通信するように構成され、リモートコンピューティングデバイス自体が、本明細書に記載されるように、混合試料中のリンパ球分画率を決定する方法を実行するように構成される。そのような場合、リモートコンピューティングデバイスは、リンパ球分画率を決定する方法の結果をコンピューティングデバイスに送信するように構成されることもある。コンピューティングデバイス１とリモートコンピューティングデバイスとの間の通信は、有線又は無線接続を介していてよく、ローカル又はパブリックネットワークを介して、例えばパブリックインターネットやWiFi（登録商標）を介して行うことができる。リード深度データ獲得手段は、コンピューティングデバイス１と有線接続することができ、又は図示されるように、例えばWiFi（登録商標）などの無線接続を介して通信することが可能であり得る。コンピューティングデバイス１とリード深度データ獲得手段３との間の接続は、直接的でも間接的（例えばリモートコンピュータを介するなど）でもよい。リード深度データ獲得手段３は、核酸試料、例えば細胞及び／又は組織試料から抽出されたゲノムＤＮＡ試料からリード深度データを獲得するように構成される。いくつかの実施形態では、試料は、ＤＮＡ精製、断片化、ライブラリ調製、標的配列捕捉（例えばエクソン捕捉及び／又はパネル配列捕捉など）などの１つ又は複数の前処理ステップを受けることがある。好ましくは、試料は増幅を受けていないか、又は増幅を受けている場合には、その増幅が、例えば一意の分子識別子の使用などの増幅バイアス制御手段の存在下で行われた。ゲノムコピー数プロファイル（全ゲノムであるか配列特異的であるかにかかわらず）の決定に使用するのに適した任意の試料調製プロセスを、本開示の文脈内で使用することができる。リード深度データ獲得手段は、好ましくは次世代シーケンサである。配列データ獲得手段３は、（生の、又は一部処理された）配列データを記憶することができる１つ又は複数のデータベース２と直接的又は間接的に接続することがある。
図２は、本開示による、混合試料中のリンパ球分画率を決定するため、及び／又はリンパ球分画率に少なくとも部分的に基づいて予後予測若しくは治療推奨を提供するためのシステムの一実施形態を示す。このシステムは、プロセッサ１０１及びコンピュータ可読メモリ１０２を備えるコンピューティングデバイス１を備える。図示される実施形態では、コンピューティングデバイス１は、ユーザインターフェース１０３も備え、ユーザインターフェース１０３は、画面として示されているが、例えば聴覚又は視覚的な信号によってユーザに情報を伝達する任意の他の手段を含むこともある。コンピューティングデバイス１は、例えばネットワーク６を介して、配列決定マシンなどのリード深度データ獲得手段３、及び／又はリード深度データを記憶する１つ又は複数のデータベース２に通信可能に接続される。１つ又は複数のデータベースは、例えば参照配列やパラメータなど、コンピューティングデバイス１によって使用することができる他のタイプの情報をさらに記憶することができる。コンピューティングデバイスは、スマートフォン、タブレット、パーソナルコンピュータ、又は他のコンピューティングデバイスでよい。コンピューティングデバイスは、本明細書に記載されるように、混合試料中のリンパ球分画率を決定するための方法を実行するように構成される。代替実施形態では、コンピューティングデバイス１は、リモートコンピューティングデバイス（図示せず）と通信するように構成され、リモートコンピューティングデバイス自体が、本明細書に記載されるように、混合試料中のリンパ球分画率を決定する方法を実行するように構成される。そのような場合、リモートコンピューティングデバイスは、リンパ球分画率を決定する方法の結果をコンピューティングデバイスに送信するように構成されることもある。コンピューティングデバイス１とリモートコンピューティングデバイスとの間の通信は、有線又は無線接続を介していてよく、ローカル又はパブリックネットワークを介して、例えばパブリックインターネットやWiFi（登録商標）を介して行うことができる。リード深度データ獲得手段は、コンピューティングデバイス１と有線接続することができ、又は図示されるように、例えばWiFi（登録商標）などの無線接続を介して通信することが可能であり得る。コンピューティングデバイス１とリード深度データ獲得手段３との間の接続は、直接的でも間接的（例えばリモートコンピュータを介するなど）でもよい。リード深度データ獲得手段３は、核酸試料、例えば細胞及び／又は組織試料から抽出されたゲノムＤＮＡ試料からリード深度データを獲得するように構成される。いくつかの実施形態では、試料は、ＤＮＡ精製、断片化、ライブラリ調製、標的配列捕捉（例えばエクソン捕捉及び／又はパネル配列捕捉など）などの１つ又は複数の前処理ステップを受けることがある。好ましくは、試料は増幅を受けていないか、又は増幅を受けている場合には、その増幅が、例えば一意の分子識別子の使用などの増幅バイアス制御手段の存在下で行われた。ゲノムコピー数プロファイル（全ゲノムであるか配列特異的であるかにかかわらず）の決定に使用するのに適した任意の試料調製プロセスを、本開示の文脈内で使用することができる。リード深度データ獲得手段は、好ましくは次世代シーケンサである。配列データ獲得手段３は、（生の、又は一部処理された）配列データを記憶することができる１つ又は複数のデータベース２と直接的又は間接的に接続することがある。
【0066】
以下は例として提示するものであり、特許請求の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【実施例】
【0067】
実施例
免疫微小環境は、腫瘍の進展に影響を及ぼし、免疫療法に関する予後予測因子であり且つ応答予測因子であり得る。しかし、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の測定は、適切なデータの不足によって制限される。ＤＮＡの全エクソーム配列決定（ＷＥＳ）は、腫瘍変異負荷を計算し、アクショナブルな変異を同定するためによく実施される。これらの例では、本発明者らは、Ｔ細胞受容体アルファ（ＴＣＲＡ）遺伝子のＶＤＪ組換え中のＴ細胞受容体除去サークル（ＴＲＥＣ）損失からのシグナルを使用して、ＷＥＳ試料からＴ細胞分画率を推定するための方法を開発する。本方法は、例えばＴＩＬを測定するために、がん試料を含む様々なタイプの臨床的に重要な試料に適用可能である。これらの例では、本発明者らは、このスコアが直交ＴＩＬ推定量と有意に相関し、新鮮凍結試料又はホルマリン固定パラフィン包埋試料から計算することができることを示す。血中ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率は、腫瘍中の免疫浸潤、細菌配列決定リードの存在と相関され、女性の方が高かった。腫瘍ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率は、肺腺がんの予後予測因子となり、免疫療法で治療された腫瘍のメタアナリシスを使用して、このスコアが免疫療法に対する応答予測因子となり、変異負荷に勝る価値を提供することが明らかになった。このスコアをマルチサンプル汎がんコホートに適用して、腫瘍内の免疫浸潤の広範な多様性が明らかになった。ＳＰＰＬ３を含む１２ｑ２４．３１－３２のサブクローン性損失は、ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率の低下と関連付けられた。本明細書に記載の方法であるＴ細胞ＥｘＴＲＥＣＴ（Ｔ細胞エクソームＴＲＥＣツール）は、ＷＥＳ試料のＴ細胞浸潤を解明する。
免疫微小環境は、腫瘍の進展に影響を及ぼし、免疫療法に関する予後予測因子であり且つ応答予測因子であり得る。しかし、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の測定は、適切なデータの不足によって制限される。ＤＮＡの全エクソーム配列決定（ＷＥＳ）は、腫瘍変異負荷を計算し、アクショナブルな変異を同定するためによく実施される。これらの例では、本発明者らは、Ｔ細胞受容体アルファ（ＴＣＲＡ）遺伝子のＶＤＪ組換え中のＴ細胞受容体除去サークル（ＴＲＥＣ）損失からのシグナルを使用して、ＷＥＳ試料からＴ細胞分画率を推定するための方法を開発する。本方法は、例えばＴＩＬを測定するために、がん試料を含む様々なタイプの臨床的に重要な試料に適用可能である。これらの例では、本発明者らは、このスコアが直交ＴＩＬ推定量と有意に相関し、新鮮凍結試料又はホルマリン固定パラフィン包埋試料から計算することができることを示す。血中ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率は、腫瘍中の免疫浸潤、細菌配列決定リードの存在と相関され、女性の方が高かった。腫瘍ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率は、肺腺がんの予後予測因子となり、免疫療法で治療された腫瘍のメタアナリシスを使用して、このスコアが免疫療法に対する応答予測因子となり、変異負荷に勝る価値を提供することが明らかになった。このスコアをマルチサンプル汎がんコホートに適用して、腫瘍内の免疫浸潤の広範な多様性が明らかになった。ＳＰＰＬ３を含む１２ｑ２４．３１－３２のサブクローン性損失は、ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率の低下と関連付けられた。本明細書に記載の方法であるＴ細胞ＥｘＴＲＥＣＴ（Ｔ細胞エクソームＴＲＥＣツール）は、ＷＥＳ試料のＴ細胞浸潤を解明する。
【0068】
実施例１－ＷＥＳデータからの試料中のＴ細胞分画率の推定
導入
腫瘍内のＴＩＬのレベルの決定は、腫瘍の免疫微小環境を理解するためにも、免疫療法に対する応答を予測するためにも非常に重要である。しかし、現時点では、ＴＩＬを推定するための普遍的な先進の方法はない。CIBERSORT（Newman et al., 2015）などのマイクロアレイシグネチャ、及びＲＮＡ－ｓｅｑ用のCIBERSORTx（Newman et al., 2019）、ESTIMATE（Yoshihara et al., 2013）、及びDanaherらによって編集されたものなどのＲＮＡ－ｓｅｑシグネチャが、腫瘍試料中のＴＩＬのトランスクリプトームシグネチャを定量化するために使用されている。代替として、免疫浸潤の存在は、ヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）組織病理学的スライドに基づいて、又は代替として、適切な細胞特異的染色、最も一般的には免疫組織化学的特性によって判定することができる。Ｔ細胞のより多くの表現型の知識が必要とされる場合、ＴＣＲの非常に多様なＶＤＪ組換えＣＤＲ３領域をコードする配列に関する濃縮後に、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の配列決定を行うことができる（Bolotin et al., 2012）。
導入
腫瘍内のＴＩＬのレベルの決定は、腫瘍の免疫微小環境を理解するためにも、免疫療法に対する応答を予測するためにも非常に重要である。しかし、現時点では、ＴＩＬを推定するための普遍的な先進の方法はない。CIBERSORT（Newman et al., 2015）などのマイクロアレイシグネチャ、及びＲＮＡ－ｓｅｑ用のCIBERSORTx（Newman et al., 2019）、ESTIMATE（Yoshihara et al., 2013）、及びDanaherらによって編集されたものなどのＲＮＡ－ｓｅｑシグネチャが、腫瘍試料中のＴＩＬのトランスクリプトームシグネチャを定量化するために使用されている。代替として、免疫浸潤の存在は、ヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）組織病理学的スライドに基づいて、又は代替として、適切な細胞特異的染色、最も一般的には免疫組織化学的特性によって判定することができる。Ｔ細胞のより多くの表現型の知識が必要とされる場合、ＴＣＲの非常に多様なＶＤＪ組換えＣＤＲ３領域をコードする配列に関する濃縮後に、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の配列決定を行うことができる（Bolotin et al., 2012）。
【0069】
既存のほとんどのＴ細胞定量化方法における重大な欠点は、それらの方法がＷＥＳに加えて追加の材料、時間、専門知識を必要とすることである。したがって、これらの方法は免疫応答の予測に役立ち得る追加の知識を提供するが、臨床現場へのこれらの方法の適用には、時間と支出の両方の増加が必要とされ、すでに高い免疫療法のコストにさらに加わる。
【0070】
本実施例では、本発明者らは、試料内のＴ細胞分画率をＷＥＳデータから直接推定するための方法を提案する。本方法は、ＶＤＪ組換え及びＴ細胞受容体切除サークル（ＴＲＥＣ）の切除からの、体細胞コピー数に基づくシグナルを利用する。
【0071】
本方法は、全ゲノム配列決定法と標的パネルベース方法との両方を含む任意の形式のＮＧＳプラットフォームから計算され、さらにＶＤＪ組換えを受ける全ての遺伝子に拡張できる可能性を有する。
【0072】
結果
Ｔ細胞多様性はＶＤＪ組換えの産物であり、Ｔ細胞受容体遺伝子内の様々な遺伝子セグメントが組み換わっている。この結果、多数の選択されていない遺伝子セグメントがＴＲＥＣとしてＴＣＲＡ遺伝子から切除される。このプロセスは、Ｔ細胞と他の細胞との間でのコピー数の相違をもたらし、Ｔ細胞はＴＣＲＡ遺伝子内で欠失事象を実質的に受ける。
Ｔ細胞多様性はＶＤＪ組換えの産物であり、Ｔ細胞受容体遺伝子内の様々な遺伝子セグメントが組み換わっている。この結果、多数の選択されていない遺伝子セグメントがＴＲＥＣとしてＴＣＲＡ遺伝子から切除される。このプロセスは、Ｔ細胞と他の細胞との間でのコピー数の相違をもたらし、Ｔ細胞はＴＣＲＡ遺伝子内で欠失事象を実質的に受ける。
【0073】
標準的な体細胞コピー数変化推定ツール（例えば、ASCAT（Van Loo et al., 2010）、Sequenza（Favero et al., 2015）、FACETS（Shen & Seshan, 2015）、又はABSOLUTE（Carter et al., 2012））は、原理的には、がんの体細胞コピー数変化プロファイルを取得するために以下の２つの関連するシグナルに依拠する：腫瘍試料中のヘテロ接合性ＳＮＰの相対頻度を反映するＢ対立遺伝子頻度；及び腫瘍試料とそれにマッチした生殖細胞系列（多くの場合、血液試料からのバフィーコート）との間のリードの比率の対数を反映するリード深度比。リード深度比の任意の逸脱は、（図３Ａに示されるように）特に腫瘍中のコピー数の変化を反映すると仮定される。しかし、ＴＣＲＡ遺伝子の文脈では、この仮定は当てはまらない。腫瘍中の体細胞コピー数変化のみを反映するのではなく、ＴＣＲＡ遺伝子に重なるリード深度比の逸脱は、同様に腫瘍試料中に存在するＴ細胞のＴＣＲＡ遺伝子内の欠失事象の検出も反映する。これが損失事象であるか利得事象であるかは、（図３Ｂに示されるように）腫瘍試料と比較した血液中に存在するＴ細胞の割合の相違によって決まる。具体的には、配列決定された腫瘍試料中のＴ細胞含量が血液試料と比較して低い場合、腫瘍試料中で同定されるＴＣＲＡ遺伝子からのリードがより多く、増幅シグナルを生じる（対数リード深度比＞０）。逆に、腫瘍中のＴ細胞含量が血液と比較して高い場合には、ＴＣＲＡリードが少なく、体細胞コピー数変化推定ツールは、欠失又は損失事象（リード深度比＜０）を推測する。
【0074】
マルチ領域配列決定を受けた非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）腫瘍のTRACERx100コホート（Jamal－Hanjani et al., 2017）のASCAT由来の体細胞コピー数変化プロファイルを調べて、本発明者らは、両方の切断点がＴＣＲＡ遺伝子内にある体細胞コピー数変化セグメントが、（図１Ｂに示されるように）ＷＥＳを受けた腫瘍領域の１６５／３２７で発生したことに注目した。TRACERx100コホートでのそのような２つのケースを調べて、リード深度比が、Ｄゲノムセグメントのゲノム位置でピークを成していることが分かった。この位置は、（図４に示されるように）ＴＲＥＣ内に最も頻繁に含まれる位置である。したがって、これらのデータは、ＴＲＥＣのシグナルをＷＥＳデータから同定することができることを示唆する。
【0075】
このシグナルを明示的に利用して個々の試料内のＴ細胞分画率を計算するために、本発明者らは、ＴＩＬ ＥｘＴＲＥＣＴ（T cell Exome T－cell Receptor Excision Circle Tool）を開発した。簡潔には、ＴＩＬ ＥｘＴＲＥＣＴは、ＴＣＲＡ遺伝子内でのリード深度比の解析に依拠して、ＷＥＳ試料中のＴ細胞浸潤を直接測定する。まず、ＶＤＪ組換えによる影響を受けていないＴＣＲＡの最初と最後でのゲノムセグメントを対照として使用して、ＴＣＲＡ遺伝子内の各位置でのリード深度を計算し、カバレッジ値の元のリード深度と対照ゲノムセグメント内の値の中央値との間で修正された対数リード深度比を計算する。最後に、配列決定された試料内の腫瘍細胞の分画率（腫瘍純度）とＴＣＲＡ周辺の局所的体細胞コピー数との両方が分かっていることを前提として、対数（底２）リード深度比の偏差の大きさに基づいて、Ｔ細胞分画率の正確な推定量を計算することができる。腫瘍純度及び局所体細胞コピー数の知識が利用可能でない場合には、同様の予測値を有することを本発明者らが実証するナイーブ推定を行うこともできる（図５に示される方法のセクションで詳細に説明する）。特に、ＲＮＡ－ｓｅｑスコアとは異なり、ＴＣＲＡスコアは、Ｔ細胞の割合の直接的な測定値を表す。本明細書では以後、これを「ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率」と呼ぶ。
【0076】
ＴＩＬ ＥｘＴＲＥＣＴの詳細な説明、並びに正規化のためのセグメントの選択及び選択されたエクソンの品質管理などパラメータの最適化については、以下の「方法」において述べる。ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率の精度を、以下の実施例２に記載の４つの直交アプローチを使用して検証した。次いで実施例３及び４で、その臨床的有用性を、２つの別個のアプローチを使用して実証した。最後に、実施例５で、様々な試料タイプでのＴ細胞免疫浸潤の重要な決定因子の評価におけるその使用を調査した。
【0077】
方法
腫瘍試料内の様々な細胞におけるＴＣＲＡ遺伝子座の周辺での局所コピー数値の定義
二倍体であることが知られているＴ細胞及び他の間質細胞内には、ＴＣＲＡ遺伝子の２つのコピーがあり、ＴＣＲＡ遺伝子座の周辺でのコピー数は２に等しいと言うことができる。Ｔ細胞内で、ＶＤＪ組換え中に常に失われるＴＣＲＡ遺伝子座内の領域があると仮定すると、これにより、（図３Ｂに示されるように）この小さいゲノムセグメントでのコピー数は０になる。腫瘍細胞では、１４番染色体（ＴＣＲＡ遺伝子が位置する）にわたってコピー数の利得と損失の両方があり得て、２とは異なることがあるＴＣＲＡ遺伝子の異なるコピー数状態が生じ得る。本方法は、がん細胞中の体細胞変化に由来するＴＣＲＡ遺伝子内の切断点が存在しないことを仮定している（しかし、腫瘍細胞では、領域は全体として二倍体ではないことがある）。
腫瘍試料内の様々な細胞におけるＴＣＲＡ遺伝子座の周辺での局所コピー数値の定義
二倍体であることが知られているＴ細胞及び他の間質細胞内には、ＴＣＲＡ遺伝子の２つのコピーがあり、ＴＣＲＡ遺伝子座の周辺でのコピー数は２に等しいと言うことができる。Ｔ細胞内で、ＶＤＪ組換え中に常に失われるＴＣＲＡ遺伝子座内の領域があると仮定すると、これにより、（図３Ｂに示されるように）この小さいゲノムセグメントでのコピー数は０になる。腫瘍細胞では、１４番染色体（ＴＣＲＡ遺伝子が位置する）にわたってコピー数の利得と損失の両方があり得て、２とは異なることがあるＴＣＲＡ遺伝子の異なるコピー数状態が生じ得る。本方法は、がん細胞中の体細胞変化に由来するＴＣＲＡ遺伝子内の切断点が存在しないことを仮定している（しかし、腫瘍細胞では、領域は全体として二倍体ではないことがある）。
【0078】
以下の２つのサブセクションでより詳細に説明するように、ＴＣＲＡ遺伝子の先頭（ｃｈｒ１４：２２０９００５７（ｈｇ１９））での平均コピー数は、ASCATを使用して試料中の全てのがん細胞から推測され、ＴＣＲＡ遺伝子での局所腫瘍コピー数と呼ばれる。これは、以下の式（７）によって提供されるＳＣＮＡ認識ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率での用語として使用される。さらに、腫瘍の体細胞コピー数変化情報が入手可能でないとき、ＳＣＮＡナイーブＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率（式（３））を使用することができ、これはナイーブＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率と呼ばれる。
【0079】
ＷＥＳデータからのＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率の計算
Van Loo et al. (2010)に記載されているASCATアプローチ（腫瘍の対立遺伝子特異的コピー数解析）は、腫瘍細胞と非異常細胞との混合を含む試料から抽出されたＤＮＡから対立遺伝子特異的コピー数を推定するための方法を提供する。以下の公式は、ゲノム位置ｉでの腫瘍倍数性を推定するためにASCATによって使用された式（Van Loo et al., 2010）であり、その位置でのＢ対立遺伝子頻度に関する第２の式（Van Loo et al.を参照）と組み合わせたものである。
Van Loo et al. (2010)に記載されているASCATアプローチ（腫瘍の対立遺伝子特異的コピー数解析）は、腫瘍細胞と非異常細胞との混合を含む試料から抽出されたＤＮＡから対立遺伝子特異的コピー数を推定するための方法を提供する。以下の公式は、ゲノム位置ｉでの腫瘍倍数性を推定するためにASCATによって使用された式（Van Loo et al., 2010）であり、その位置でのＢ対立遺伝子頻度に関する第２の式（Van Loo et al.を参照）と組み合わせたものである。
【0080】
【数3】
【0081】
ここで、ｒｉは、位置ｉでのｌｏｇＲ（ゲノム遺伝子座での総コピー数を定量化する総シグナル強度の尺度）であり、γは、使用される技術に依存する定数であり（例えば、Illumina Hiseqに関してはγ＝１の値が使用され得る）、ｐは、腫瘍純度（試料中の細胞集団の中での腫瘍細胞の分画率）であり、ｎＡｉ及びｎＢｉは、対立遺伝子特異的コピー数値であり、係数２は、正常組織について仮定される二倍体のコピー数を表し、ΨＳは、腫瘍試料の平均倍数性である。配列決定データと共にASCATを使用するとき、ｒｉは、ゲノム位置ｉでのリード深度比の対数（底２）であり、ここで、比は、同じゲノム位置での腫瘍試料と生殖細胞系列試料とに関するカバレッジ間の比である。
【0082】
本研究では、狙いは、試料中の細胞集団の中でのＴ細胞の分画率を特定することであった。さらに、この試料は、ゲノム遺伝子座ｉで未知の倍数性を有することがある異常細胞（例えば腫瘍細胞）を含むことがある。Van Loo et al.で調査された混合集団から類推して、ｒｉ値は、他の（非Ｔ）細胞の中にＴ細胞を含む試料と、Ｔ細胞を含まない試料とのカバレッジの比を表す。例えば、腫瘍生検試料及びそれにマッチした血液試料は、腫瘍患者についてよく利用可能である。実際には、非腫瘍試料を使用してｒｉを定量化することができる腫瘍状況とは対照的に、Ｔ細胞が明確に欠如している患者からの試料は知られていない。実際、腫瘍試料及びそれにマッチした血液試料の両方がＴ細胞を含む可能性が高い。したがって、本発明者らは、（以下のセクションで詳細に説明するように）単一の試料からｌｏｇＲを推定する新たな公式及び方法を考案した。簡潔には、これは、ＶＤＪ組換えの影響を受けないコピー数値を有すると仮定される通常のバックグラウンド率として、ＴＣＲＡ遺伝子の先端と末端でのゲノム領域のカバレッジの中央値を使用することによって計算される（ｃｈｒ１４：２２０９００５７－２２２９８２２３、ｈｇ１９ではｃｈｒ１４：２３０１６４４７－２３２２１０７６）。次いで、本発明者らは、ＴＣＲＡゲノム領域にわたるカバレッジをこの中央値で割ることによって、ＴＣＲＡ遺伝子全体（ｃｈｒ１４：２２０９００５７－２３２２１０７６）にわたるｒＴに関する推定量を作成する。したがって、このケースは、以下のように表すことができる。
【0083】
【数4】
【0084】
ここで、ｆは、試料のＴ細胞分画率であり、ｎＴは、ＴＣＲＡ遺伝子座（又は定量化すべき細胞のタイプに応じて、調査中の他のＶＤＪ遺伝子座）でのＴ細胞のコピー数であり、γは、使用される技術に依存する定数であり（例えば、Illumina Hiseqではγ＝１の値が使用され得る）、ｒｉは、以下で説明するように単一の試料から計算されたｌｏｇＲであり、ΨＳｉは、ＴＣＲＡ遺伝子座（又は調査中の任意の他のＶＤＪ遺伝子座）でのＴ細胞を除いた試料に関するコピー数であり、ΨＳは、ＶＤＪ組換えによる変化を考慮に入れない試料全体に関するこの遺伝子座でのコピー数である。ＶＤＪ組換えの最大点（ｒＶＤＪと呼ばれる）を見ていると仮定すると、ｎＴ≒０と仮定することができる。したがって、この位置では、式（２）は、式（２ｂ）に簡略化される。
【0085】
【数5】
【0086】
この時点で、２つの異なる状況が存在し得る：（ａ）例えば、平均倍数性が常に２である正常な試料（例えば血液試料の場合）、又は平均倍数性が２ではないことがあるが、存在するＴ細胞の分画率が小さい試料（例えば低いＴ細胞含量を有するがん試料）に関して、ΨＳ≒ΨＳｉと仮定することができる場合；（ｂ）上記の仮定は、例えばＴ細胞含量が小さくない腫瘍試料では当てはまらない場合。ケース（ａ）は、式２を式（３）に単純化するのに役立つ。
【0087】
【数6】
【0088】
これを、「ナイーブＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率」の式と呼ぶ。（ａ）での仮定が当てはまらない場合（ケース（ｂ））、ΨＳとΨＳｉに関する以下の式を使用することができる：
ΨＳｉ＝２（１－ｐ’）＋ｐ’ΨＴ （４）
ΨＳ＝２（１－ｐ）＋ｐΨＴ （５）
ΨＳｉ＝２（１－ｐ’）＋ｐ’ΨＴ （４）
ΨＳ＝２（１－ｐ）＋ｐΨＴ （５）
【0089】
【数7】
【0090】
ここで、ΨＴは、ＴＣＲＡ遺伝子座での局所腫瘍コピー数（ASCATを使用して試料中の全てのがん細胞から推測される、ＴＣＲＡ遺伝子の開始位置（ｃｈｒ１４：２２０９００５７（ｈｇ１９））での平均コピー数として計算される）であり、ｐ’は、最大ＶＤＪ組換えの位置にＴ細胞ＤＮＡが存在しないことを考慮に入れた、調整された腫瘍純度である。ΨＴは、ＴＣＲＡ遺伝子座（又は調査中の任意の他のＶＤＪ遺伝子座）の開始位置での全てのがん細胞（すなわち、それぞれのサブクローンがその遺伝子座で異なるコピー数を有することがある全てのサブクローンにわたって）からの平均コピー数として計算される。これは、この遺伝子の先頭が、ＶＤＪ組換えからのシグナルを示さないと予想されるからである。したがって、遺伝子の末尾もＶＤＪ組換えからのシグナルを示さないと予想されるので、結果に影響を及ぼすことなく、任意の実施形態において先頭の代わりに遺伝子の末尾を使用することもできる。理論に束縛されることを望まないが、ＶＤＪ組換えに関連付けられるシグナルは遺伝子の先頭よりも遺伝子の末尾に近いので（Ｊセグメントが遺伝子の末尾の近くにクラスタ化されるため。一方、Ｖセグメントはより大きく広がっている）、遺伝子の先頭でのシグナルの使用が有益であると考えられる。さらに、任意の実施形態において、例えば遺伝子座の前又は後など、調査中のＶＤＪ遺伝子座の外側の領域にある全てのがん細胞からの平均コピー数を使用することも可能である（そのようなデータが利用可能な場合、例えば全エクソーム配列決定ではなく全ゲノム配列決定が使用される場合）。しかし、対象の遺伝子座からの距離が増加すると、見られるシグナルががん細胞内の異なるコピー数事象に対応する可能性が高くなり、したがって、調査中のＶＤＪ遺伝子座での腫瘍コピー数を反映しなくなる。
【0091】
式（４）、（５）、及び（６）を式（２）に代入すると、式（７）が得られる。
【0092】
【数8】
【0093】
式（７）は、式（３）の「より完全な」バージョン（すなわち、式（３）を得るために立てられた全ての仮定を用いない式（２）の解）を表す。したがって、式（７）から始めて同じ仮定を適用することによって、式（３）を回復することが可能である。特に、これらががん細胞ではない（正常の２とは異なる倍数性を有する細胞でない；ｐ＝０）場合、式（７）は、即座に式（３）に単純化される。同様に、存在する腫瘍細胞でのＴＣＲＡの周辺の局所コピー数が正常な細胞と同じ（ΨＴ＝２）である場合にも、この公式は、式（３）に単純化される。したがって、式（３）は、正常組織からの試料中のＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率を計算するために使用することができ、又は腫瘍純度若しくはコピー数の状態が未知である場合のナイーブ推定として使用することができる。
【0094】
言い換えると、試料の非がん成分（１－ｐ）は、Ｔ細胞及び非Ｔ細胞サブセットに分けることによって書き換えることができる。すなわち、
（１－ｐ）＝（１－ｐ）ｆ’＋（１－ｐ）（１－ｆ’）
ここで、ｆ’は、Ｔ細胞である非腫瘍細胞の分画率を表し、以下の式のように、Ｔ細胞である試料の総Ｔ細胞分画率（ｆ）に関係する。
（１－ｐ）＝（１－ｐ）ｆ’＋（１－ｐ）（１－ｆ’）
ここで、ｆ’は、Ｔ細胞である非腫瘍細胞の分画率を表し、以下の式のように、Ｔ細胞である試料の総Ｔ細胞分画率（ｆ）に関係する。
【0095】
【数9】
【0096】
対立遺伝子特異的コピー数を無視して、ゲノム遺伝子座ｉでの腫瘍の総コピー数をΨＴとし、Ｔ細胞コンパートメントのコピー数をｎＴとし、非Ｔ細胞正常細胞コンパートメントのコピー数を全てのゲノム遺伝子座で２とすると、以下の式が得られる。
【0097】
【数10】
【0098】
ここで、Ｔ細胞中のＴＣＲＡ遺伝子でのＶＤＪ組換え事象におけるゲノム位置を考察する。この位置ではｎＴ→０であり、さらにこの位置では、本明細書に記載するようにｒＶＤＪがリード深度比から直接推定されると仮定する。ΨＳは、ＶＤＪ組換えを考慮に入れない試料の平均コピー数として計算され、すなわち、ΨＳ＝２（１－ｐ）＋ｐΨＴである。したがって、ＶＤＪ組換えのゲノム遺伝子座では、以下の式が成り立つ。
【0099】
【数11】
【0100】
この式へのｆ’に関する式の代入、及び試料内のＴ細胞分画率に関する式の変形は、上記の式（７）によって提供されることが分かる。対数比ｒＶＤＪの値が＞０である場合、結果として得られる分画率は負になることに留意されたい。このような場合、試料にはＴＩＬが存在せず、試料ノイズのみが測定されていると仮定することができる。したがって、ｆを０に設定することができる。逆に、腫瘍純度ｐが既知である場合（及び／又は腫瘍純度の計算に誤差がないと仮定することができる場合）、１－ｐよりも高いｆの値は尤もらしくなく（試料の腫瘍純度＋Ｔ細胞分画率を１よりも大きくすることはできないので）、より高い値が得られた場合には、ｆをこの値に切り捨てることができる。
【0101】
ＷＥＳにおける単一試料からの対数リード深度比の計算
式（３）（Ｔ細胞含量のナイーブ推定の場合）又は式（７）（腫瘍コピー数及び純度が既知である場合）からＴ細胞分画率を計算するために、対数リード深度比ｒｉを、生のカバレッジデータから（すなわち、定量化すべき細胞集団をそれぞれ含む又は含まないマッチした試料からではなく、単一の試料から）推定する必要がある。
式（３）（Ｔ細胞含量のナイーブ推定の場合）又は式（７）（腫瘍コピー数及び純度が既知である場合）からＴ細胞分画率を計算するために、対数リード深度比ｒｉを、生のカバレッジデータから（すなわち、定量化すべき細胞集団をそれぞれ含む又は含まないマッチした試料からではなく、単一の試料から）推定する必要がある。
【0102】
簡潔には、このｌｏｇＲは、ＴＣＲＡ遺伝子（又は定量化すべき細胞のタイプに応じて、調査中の任意の他のＶＤＪ遺伝子座）の先端と末端でのゲノム領域のカバレッジの中央値を、ＶＤＪ組換えの影響を受けないコピー数値を有すると仮定される正常バックグラウンド率として使用することによって計算される。上で説明したように、任意の実施形態において、調査中のＶＤＪ遺伝子座の先頭若しくは末尾（両方ではない）、又はＶＤＪ組換えによって影響を受けないコピー数値を有すると仮定することができる他の（好ましくは近くの）領域を使用することも可能である。理論に束縛されることを望まないが、より長い正規化領域の使用（例えば、先頭領域と末尾領域の両方を使用する、及び／又は先頭領域の長さを増加させる）は、リード深度データにおいて典型的なノイズを有利に補償すると考えられる。例えば、先頭領域を拡張して、頻繁に失われる可能性が低い多数のＶセグメントを含めることができ、データが利用可能な場合（例えば全ゲノム配列決定データを使用するときなど）には遺伝子の外側の領域を含めることもできる。このケースでは、以下の領域を使用した：ｃｈｒ１４：２２０９００５７－２２２９８２２３及びｃｈｒ１４：２３０１６４４７－２３２２１０７６（ｈｇ１９）。次いで、ＴＣＲＡゲノム領域（又は調査中の任意の他のＶＤＪ遺伝子座）にわたるカバレッジをこの中央値で割ることによって、ＴＣＲＡ遺伝子全体（この場合には、ｃｈｒ１４：２２０９００５７－２３２２１０７６（ｈｇ１９））にわたるｒｉに関する推定量が得られる。この背景にある考え方が図５に示されている。
【0103】
より詳細には、アライメントされたＢＡＭファイルからｈｇ１９（ＧＲＣｈ３７に基づく）又はｈｇ３８（ＧＲＣｈ２８）のいずれかに（データセットに応じて。例えばＴＣＧＡデータがｈｇ３８に事前アライメントされて取得されたが、ＴＲＡＣＥＲｘ及び他のデータはｈｇ１９に施設内で（in house）アライメントされた）、個々の塩基レベルでのカバレッジが、samtools（バージョン1.3.1）の深度関数（パラメータ、－ｑ２０－Ｑ２０を有する）を使用して抽出される。これが行われた後、SureSelectヒト全エクソンプローブ（バージョン５）によって定義される既知のエクソン内の塩基のみがＴＲＡＣＥＲｘ内で使用され、次いで、各エクソン内で、リードが、５０塩基対のウィンドウにおいてローリング中央値（すなわち、各５０ｂｐウィンドウ内の中央値が新たな値として取られる）で正規化される。ウィンドウのサイズは固定されず、いくつかの実施形態では、例えば２０～２００ｂｐの間又は５０～１５０ｂｐの間など、５０ｂｐよりも大きい又は小さいウィンドウを使用することができることに留意されたい。本方法を使用して取得されたリンパ球分画率の推定量を、Danaherスコアなどリンパ球分画率の直交規準に対する様々な候補ウィンドウサイズと比較することによって、特定のデータセット、データのタイプ、又は状況についてウィンドウの適切なサイズを経験的に決定することができる。
【0104】
ベースラインカバレッジ値の中央値は、遺伝子の先頭と末尾の領域（ｃｈｒ１４：２２０９００５７－２２２９８２２３及びｃｈｒ１４：２３０１６４４７－２３２２１０７６（ｈｇ１９）。ＴＣＲＡの最初の１２個のＶセグメント及びＣセグメントに対応する）を用いて、ＶＤＪ組換えによる影響を受けないと仮定されるＴＣＲＡの領域内で計算される。次いで、全てのカバレッジ値がこの値で割られ、次いで、「単一試料」対数比を計算するために対数が取られる。ｒＶＤＪの計算を完了するために、最大ＶＤＪ組換えの位置でのモデルの平均値をｒＶＤＪに関する値として取って、一般化加法モデルがデータに当てはめられる。一般化加法モデルは、共変量の平滑関数と線形予測子の従来のパラメトリック成分との合計によって線形予測子が与えられる一般化線形モデルである。モデルは、平滑化されたラインをデータに実質的に当てはめ、これを行うための任意のアプローチを本開示の文脈で使用することができる（例えば、任意のタイプの一般化線形モデル、又は例えば区分的定数モデルの当てはめなど任意の他の平滑化アプローチを使用する）。このケースでは、Ｒでの「geom_smooth」関数を使用してモデルを当てはめた。これは、mgcvパッケージの「gam」関数（mgcv::gam）を公式ｙ～ｓ（ｘ，ｂｓ＝ｃｓ）と共に使用する（詳細は、https://rdrr.io/cran/mgcv/man/gam.htmlを参照）。この実装は、ペナルティ付き回帰スプラインを使用する一般化加法モデルの平滑関数を表す。このプロセスの図は、図５に示されている。最大ＶＤＪ組換えの位置は、最後のＴＣＲＡ ＶセグメントとＴＣＲデルタ遺伝子の最初のセグメントとの間のギャップとして定義され、８００００ｂｐ（８０ｋｂｐ）のサイズを有するように丸められ、位置２２８０００００から始まる（領域ｃｈｒ１４：２２８０００００－２２８８００００をもたらす）。これについては以下で説明する。他の定義も可能であり、この領域のサイズを少し変えても大きな相違は生じないと予想される。最大ＶＤＪ組換えの領域は、他のＶＤＪ遺伝子座に関しても同様のアプローチを使用して定義することができ、すなわち、最後のＶ遺伝子セグメントと最初のＪ遺伝子セグメントとの間の領域の周囲又は内部に少なくとも部分的に位置する領域、例えば最後のＶ遺伝子セグメントと最初のＪ遺伝子セグメントとの間のギャップに対応する領域を定義し、任意選択で、操作を容易にするために例えば最近傍ｋｂｐ又は最近傍１０ｋｂｐなどに丸めることによって定義することができる。
【0105】
要約すると、多くの腫瘍試料について式（７）を使用することができ、これにはＴＣＲＡ遺伝子での腫瘍純度と腫瘍コピー数との両方の知識が必要である。全ての血液由来試料及び多くの腫瘍においてそうであるようにＴＣＲＡでのコピー数が正確に２である特別なケースでは、式（３）を使用してＴ細胞分画率を計算することができ、正確である。さらに、ＴＣＲＡでの腫瘍純度及び腫瘍コピー数が未知である場合、式（３）は、Ｔ細胞分画率に関するナイーブ推定として機能することができる（しかし、上述した仮定が成り立つか否かに応じて、このナイーブ推定は正確ではないことがある）。これについて次のセクションで考察する。
【0106】
ナイーブＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率と、Ｔ細胞分画率の正確な推定量
図６Ａは、式（２）、（３）、及び（７）から導出された理論値に基づき、様々な局所コピー数値及び腫瘍純度について、Ｔ細胞に関する推定ナイーブ値と様々な実際のＴ細胞分画率値との（理論上の）差を示す。低いＴ細胞分画率、及び２に近い局所コピー数値では、この推定は非常に正確である。図６Ｂ～Ｃは、TRACERx100コホートからの実データを使用して（このデータに関するより多くの情報は実施例２で提供される）、局所ＴＣＲＡコピー数の分布がモード２を有し、腫瘍純度値が典型的には低いことを示す。図６Ｄは、局所ＴＣＲＡコピー数が２ではないケースについて、ナイーブ推定量と計算された正確なＴ細胞分画率との相関を示す。
図６Ａは、式（２）、（３）、及び（７）から導出された理論値に基づき、様々な局所コピー数値及び腫瘍純度について、Ｔ細胞に関する推定ナイーブ値と様々な実際のＴ細胞分画率値との（理論上の）差を示す。低いＴ細胞分画率、及び２に近い局所コピー数値では、この推定は非常に正確である。図６Ｂ～Ｃは、TRACERx100コホートからの実データを使用して（このデータに関するより多くの情報は実施例２で提供される）、局所ＴＣＲＡコピー数の分布がモード２を有し、腫瘍純度値が典型的には低いことを示す。図６Ｄは、局所ＴＣＲＡコピー数が２ではないケースについて、ナイーブ推定量と計算された正確なＴ細胞分画率との相関を示す。
【0107】
対数比（ｒＶＤＪ）の推定に使用されるセグメントの最適化
ｒＶＤＪの計算は、（ｉ）最大ＶＤＪ組換えのセグメント、及び（ｉｉ）（上で説明したように比を計算することによって）ＴＣＲＡゲノム領域にわたるカバレッジが比較される「正常ベースライン」を計算するために使用すべきセグメントの選択を必要とする。
ｒＶＤＪの計算は、（ｉ）最大ＶＤＪ組換えのセグメント、及び（ｉｉ）（上で説明したように比を計算することによって）ＴＣＲＡゲノム領域にわたるカバレッジが比較される「正常ベースライン」を計算するために使用すべきセグメントの選択を必要とする。
【0108】
最大ＶＤＪ組換えの位置を表す限局性セグメントに関しては、最後のＶ遺伝子セグメントとＴＣＲδ鎖の一部をコードする最初のセグメントとの間のギャップを使用した（ｈｇ１９、ｃｈｒ１４：２２８０００００－２２８８００００）。ゲノムのこの領域は、理論上は、Ｔ細胞受容体切除サークル（ＴＲＥＣ）内にある可能性が高く、ＴＲＥＣを測定するＰＣＲプライマのために以前に使用された領域（Kuss et al., 2005）と重複する。上で説明したように、対象のＶＤＪ遺伝子座の最後のＶセグメントと最初のＪセグメントとの間の任意の領域を使用することができる。
【0109】
ＶＤＪ組換えで一般的に失われる可能性が低いＶ遺伝子セグメントを使用する正常ベースラインの計算では、配列決定ノイズがあるため、領域をできるだけ広くすることが望ましい（ＷＥＳでの単一試料からの対数比の計算を参照）。しかし、より多くのＶ遺伝子セグメントが選択されるほど、これらの遺伝子セグメントがＴＲＥＣによって切除された場所にＴ細胞クロノタイプが存在する可能性が高くなる（したがって、その領域でのカバレッジがＶＤＪ組換えによって影響を及ぼされることになる）。
【0110】
局所セグメントに関しては、以下に概説する最適化スキームを使用して、最初のｎ個のＶ遺伝子セグメントと、最後のＣセグメントとを選択した。最初のｎ個のＶセグメントを順に取り、TRACERx100コホート全体にわたってスコア（ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率、ｆ、非ＧＣ補正）を計算した（このコホートについてのさらなる詳細は実施例２を参照）。Ｖセグメントの数は、どのｎが、ｆの非ゼロ値を最も多く有し、計算されたＴ細胞分画率とＴ細胞浸潤に関するDanaherトランスクリプトームスコア（Ｔ細胞浸潤の比較規準。実施例２を参照）との関連性を最大化したかに基づいて選択した。使用されるセグメントの長さがノイズのレベルを低下させることが判明した（すなわち、使用されるセグメントが多いほど、ノイズの観点から、より良い正規化が行われる）が、いくつかのケースで長すぎる場合には、特定のＴ細胞クロノタイプから欠失されたセグメントと重複する（すなわち、より長いセグメントは、１つ又は複数のＴ細胞クロノタイプで失われた１つ又は複数のセグメントを含む可能性が高くなる）。したがって、控えめに見積もって、Danaherスコアとの高い関連性と、できるだけ短いセグメントとの妥協点として、最初の１２個のＶセグメントを選択して使用した（図２５に示される。ここで、上のプロットは、TRACERx100データにおいて正規化に使用されるＶセグメントの数の関数としてＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率を示し、中央のプロットは、非ゼロ試料の対応する分画率を示し、下のプロットは、Spearmanの方法を使用して評価されたDanaher Ｔ細胞シグネチャとの相関の有意性を示す）。結果に大きな影響を及ぼすことなく、他の数のセグメント、例えば最初の１１個のＶセグメントなどを使用することもできることに留意されたい。
【0111】
ＴＩＬ ＥｘＴＲＥＣＴ内で使用されるＧＣ正規化方法
ＧＣ含量は、シーケンスカバレッジ値を偏らせることが知られている。したがって、ＴＩＬ ＥｘＴＲＥＣＴは、Ｔ細胞分画率の計算前にＧＣ含量によってカバレッジ値を正規化することができる。これを行うために、ＧＣ含量は、各ＴＣＲＡエクソンに関するＧＣ含量（ＧＣｅｘｏｎ）が計算される局所エクソンレベルと、より大きなマクロスケール（ＧＣｍａｃｒｏ）との２つのスケールで計算される。このより大きなスケールでは、ＧＣ含量は、ＴＣＲＡ遺伝子全体にわたって１０００ｂｐウィンドウで計算される。次いで、一般化加法モデルをこのデータに当てはめて、ＴＣＲＡ遺伝子にわたるマクロスケールＧＣ含量に関する平滑化された値を作成する。ＧＣ含量を正規化するために、全てのＴＣＲＡエクソン内のあらゆる塩基対のカバレッジ値を以下の線形モデルに入れる。
ＧＣ含量は、シーケンスカバレッジ値を偏らせることが知られている。したがって、ＴＩＬ ＥｘＴＲＥＣＴは、Ｔ細胞分画率の計算前にＧＣ含量によってカバレッジ値を正規化することができる。これを行うために、ＧＣ含量は、各ＴＣＲＡエクソンに関するＧＣ含量（ＧＣｅｘｏｎ）が計算される局所エクソンレベルと、より大きなマクロスケール（ＧＣｍａｃｒｏ）との２つのスケールで計算される。このより大きなスケールでは、ＧＣ含量は、ＴＣＲＡ遺伝子全体にわたって１０００ｂｐウィンドウで計算される。次いで、一般化加法モデルをこのデータに当てはめて、ＴＣＲＡ遺伝子にわたるマクロスケールＧＣ含量に関する平滑化された値を作成する。ＧＣ含量を正規化するために、全てのＴＣＲＡエクソン内のあらゆる塩基対のカバレッジ値を以下の線形モデルに入れる。
【0112】
【数12】
【0113】
次いで、このモデルの残差を、新たなＧＣ正規化カバレッジ値として取る。特に明記しない限り、本明細書で使用される全てのＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率は、ＧＣ補正されている。
【0114】
ＧＣ補正後、スコアのベースラインは、ＴＣＲＡ遺伝子の先頭と末尾（ｃｈｒ１４：２２０９００５７－２２２９８２２３及びｃｈｒ１４：２３０１６４４７－２３２２１０７６（ｈｇ１９））で中央値を取り、最大ＶＤＪ組換えの位置（ｃｈｒ１４：２２８０００００－２２８８００００）で一般化加法モデル（ＧＡＭ）の中央値を取ることによって再調整される。理論上、Ｔ細胞分画率が負になることはあり得ず、このために必然的にｃｈｒ１４：２２８０００００－２２８８００００での対数リード深度比が≦０でなければならないので、２つの中央値の最大値が新たなベースラインとして採用され、０に設定される。
【0115】
ＴＩＬ ＥｘＴＲＥＣＴ内での信頼区間の計算
ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率に関する９５％信頼区間を、以下の２つの要素を考慮して計算した：１）ＧＣ補正後の最終ベースライン調整におけるノイズ；２）ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率の最終計算で使用されるＧＡＭモデルの当てはめの不確実性。
ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率に関する９５％信頼区間を、以下の２つの要素を考慮して計算した：１）ＧＣ補正後の最終ベースライン調整におけるノイズ；２）ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率の最終計算で使用されるＧＡＭモデルの当てはめの不確実性。
【0116】
ベースライン調整でのノイズを考慮に入れるために、調整値に関する９５％信頼区間は、正規化に使用される領域でのカバレッジ値の標準偏差の１．９６倍として計算した。ＧＡＭモデルの当てはめに関して、Ｒパッケージ「gratia」（v0.5.1）を使用して、同時信頼区間を計算した（confint関数を使用）。最後に、これら２つの不確実性の原因を組み合わせて、９５％信頼区間を生成した。
【0117】
過大評価された腫瘍ＴＣＲＡコピー数によるＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率の偏り
ＴＣＲＡ腫瘍コピー数の過大評価された値は、ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率に関する値の増加につながる。これは、ASCATなどのコピー数セグメンテーションアルゴリズムから選択されたソリューションの品質が低いために生じる可能性がある。これが当てはまることを示す１つの指標は、ＴＩＬ ＥｘＴＲＥＣＴからの計算されたＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率が、１－腫瘍純度の値を超えているかどうかである。これらのケースでは、所与のコピー数ソリューションは信頼できないと考えられ、代わりにＴＣＲＡ腫瘍コピー数が２であると仮定するＴ細胞分画率に関するナイーブ推定が代替ソリューションとして使用される。
ＴＣＲＡ腫瘍コピー数の過大評価された値は、ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率に関する値の増加につながる。これは、ASCATなどのコピー数セグメンテーションアルゴリズムから選択されたソリューションの品質が低いために生じる可能性がある。これが当てはまることを示す１つの指標は、ＴＩＬ ＥｘＴＲＥＣＴからの計算されたＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率が、１－腫瘍純度の値を超えているかどうかである。これらのケースでは、所与のコピー数ソリューションは信頼できないと考えられ、代わりにＴＣＲＡ腫瘍コピー数が２であると仮定するＴ細胞分画率に関するナイーブ推定が代替ソリューションとして使用される。
【0118】
実施例２－ＷＥＳ由来のＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率の検証
導入
実施例１で述べたＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率規準の精度を評価するために、本発明者らは４つの直交アプローチを使用した。
導入
実施例１で述べたＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率規準の精度を評価するために、本発明者らは４つの直交アプローチを使用した。
【0119】
第一に、Ｔ細胞含量の陽性及び陰性対照として、細胞株からのＷＥＳデータを使用した。第二に、様々なＴ細胞分画率値を含むシミュレート次世代配列決定（ＮＧＳ）データを使用した。シミュレートされたデータは、スコアの精度に対する局所腫瘍ＴＣＲＡコピー数及び腫瘍純度の影響を調査するためにも使用した。第三に、本発明者らは、スコアが複数のＮＳＣＬＣコホート内の直交免疫関連データにどの程度匹敵するかを検査した。第四に、本発明者らは、スコアが、免疫含量を推測するための代替のＤＮＡベースの方法とどの程度類似しているかを計算した。
【0120】
結果
実施例１で述べたアプローチの第１の検証として、本発明者らは、ゲノムの複雑さの度合いが異なる四倍体及び二倍体クローンを含むＨＣＴ１１６細胞株に由来する１４個の独立した試料（Lopez et al. 2020）と、cancer cell line encyclopaediaからのＴ細胞リンパ腫から得た細胞株に由来する３つの試料（ＪＵＲＫＡＴ、ＰＥＥＲ、及びＨＰＢ－ＡＬＬ）（Ghandi et al. 2019）とからなる細胞株からのＷＥＳデータを利用した。理論上は、ＨＣＴ１１６細胞株からのＮＧＳではＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率がゼロであるはずであり、Ｔ細胞リンパ腫由来の細胞株（全てＶＤＪ組換えが行われているはずである）は、ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率が１であるはずである（Ｔ細胞としての細胞の１００％を反映する）。確認できるように、ＨＣＴ１１６細胞株は全て、（図７に示されるような）それらの二倍体又は四倍体の状態に関係なく、計算された分画率が０であった。逆に、３つのＴ細胞由来の細胞株は、ナイーブ推定で計算されたスコアが１に近かった（約０．９５～約０．９６）（図７を参照）。正確に１００％の推定分画率からのこのわずかな差は、技術的要因（例えば、ミスアライメントされたリード）又は生物学的要因によって説明される可能性が高い。
実施例１で述べたアプローチの第１の検証として、本発明者らは、ゲノムの複雑さの度合いが異なる四倍体及び二倍体クローンを含むＨＣＴ１１６細胞株に由来する１４個の独立した試料（Lopez et al. 2020）と、cancer cell line encyclopaediaからのＴ細胞リンパ腫から得た細胞株に由来する３つの試料（ＪＵＲＫＡＴ、ＰＥＥＲ、及びＨＰＢ－ＡＬＬ）（Ghandi et al. 2019）とからなる細胞株からのＷＥＳデータを利用した。理論上は、ＨＣＴ１１６細胞株からのＮＧＳではＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率がゼロであるはずであり、Ｔ細胞リンパ腫由来の細胞株（全てＶＤＪ組換えが行われているはずである）は、ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率が１であるはずである（Ｔ細胞としての細胞の１００％を反映する）。確認できるように、ＨＣＴ１１６細胞株は全て、（図７に示されるような）それらの二倍体又は四倍体の状態に関係なく、計算された分画率が０であった。逆に、３つのＴ細胞由来の細胞株は、ナイーブ推定で計算されたスコアが１に近かった（約０．９５～約０．９６）（図７を参照）。正確に１００％の推定分画率からのこのわずかな差は、技術的要因（例えば、ミスアライメントされたリード）又は生物学的要因によって説明される可能性が高い。
【0121】
第２の検証アプローチとして、二値（有無）に勝るＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率の精度をさらに評価するために、様々なＴ細胞分画率に関して、様々なＴ細胞分画率値を含むシミュレートＮＧＳデータを取得した（「方法」を参照）。図８Ａで見られるように、バックグラウンドＴＣＲＡコピー数を２とした試料中でのシミュレートされたＴ細胞分画率と計算されたＴ細胞分画率との間には、非常に有意な、ほぼ完璧な関係があった（ρ＝１、ｐ＜２．２ｅ－１６）。スコアの精度に対する局所腫瘍ＴＣＲＡコピー数（「方法」を参照）及び腫瘍純度の影響のさらなる調査を、シミュレートされたデータを用いて調査し、（図８Ｃ～Ｄに示されるように）シミュレートされたＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率と推定されたＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率との間に有意な関係があることも実証された。
【0122】
第３の検証アプローチとして、本発明者らは、スコアが、TRACERx100コホート内、また肺腺がん（ＬＵＡＤ）ＴＣＧＡ（Cancer Genome Atlas Research Network, 2014）及び肺扁平上皮がん（ＬＵＳＣ）（Cancer Genome Atlas Research Network, 2012）コホート内の直交免疫関連データにどの程度匹敵するかを検査した。これらのＮＳＣＬＣコホートは、ＲＮＡ－ｓｅｑ、組織病理学的スライド、及びメチル化データを含む様々な異なるデータタイプからのＴ細胞含量に関する推定量を含んでいた。
【0123】
TRACERx100コホートは、１００人の患者からの１００個の腫瘍に由来する、ＷＥＳを受けた３２７の腫瘍領域で構成されており、それぞれ、やはりＷＥＳを受けたマッチした生殖細胞系列血液試料を含む（表１を参照）。また、これらの腫瘍領域のうち１８９個は、マッチしたＲＮＡ－ｓｅｑデータを有しており、そこからトランスクリプトームベースの免疫スコアを計算することができた。
【0124】
【表1】
【0125】
特に、本発明者らは、スコアが、TRACERx100コホート内の直交する非ＷＥＳ免疫関連データにどの程度匹敵するかを検査した。Danaher et al.、Davoli et al.、xCell、TIMER、EPIC、及びCIBERSORTからの様々な細胞型に関する免疫関連シグネチャスコアを、ＲＮＡ－ｓｅｑデータ（Rosenthal et al., 2019）を用いて１８９のTRACERx100領域について計算した。ＷＥＳからのＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率は、様々な方法から導出された複数の免疫スコアと有意な正の関係を有することが判明した。最も強い関連性がある上位３つの項目は、全てＴ細胞関連であった（Danaher Ｔｈ１：ρ＝０．６８，Ｐ＝９．０ｅ－２３、xCell ＣＤ８ Ｔ細胞メモリρ＝０．６７，Ｐ＝２．３ｅ－２２、及びDanaher Ｔ細胞：ρ＝０．６７，Ｐ＝２．９４ｅ－２２）。ＮＫ細胞に関するDavoliスコア（ρ＝０．６７，Ｐ＝３．９２ｅ－２２）及び、xCellで同定された活性化樹状細胞（ρ＝０．６１，Ｐ＝１．２６ｅ－１７）など他の非Ｔ細胞スコアも非常に高くランク付けされ、腫瘍免疫微小環境の複雑さを示し、またＴ細胞浸潤が他の免疫細胞からの浸潤と強い相関性を有することを示す。ＷＥＳからのＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率は、ＣＤ８＋細胞（ρ＝０．６２，Ｐ＝９．６ｅ－２０）、Ｔ細胞（ρ＝０．６３，Ｐ＝２．３ｅ－２０）、及び合計ＴＩＬ（ρ＝０．５９，Ｐ＝１．４ｅ－１７）に対応するDanaherトランスクリプトームシグネチャと有意な正の関係を有することが判明した（図９Ａ、９Ｃに示される）。
【0126】
ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率をさらに確認するために、本発明者らは、８８人の患者について入手可能な、病理学者によって手動で検査及びスコア付けされた病理組織学的Ｈ＆Ｅスライドに基づいて、ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率とＴＩＬスコアとの関連性を評価した。確認できるように、ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率は、病理学ＴＩＬ分画率推定量と有意に相関した。とりわけ、病理学ＴＩＬ分画率推定量は、ＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞を排他的に含むわけではなく、したがってその推定量とＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率との完全な相関は予想されない。
【0127】
第４のアプローチとして、本発明者らは、合計カバレッジに対してＶＤＪ組換え後のＣＤＲ３領域にアライメントする各ＷＥＳでのリード数（ＣＤＲ３ ＶＤＪスコア、詳細については「方法」を参照）に基づいて免疫含量を推測する代替のＤＮＡベースの方法｛Levy et al｝とスコアがどの程度類似しているかを計算した。TRACERx100コホートにおいて、本発明者らは、ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率とＣＲＤ３ ＶＤＪスコアとの有意な正の相関を観察した（図９Ｄ、ρ＝０．３６、Ｐ＝１．４ｅ－１３）。しかし、本発明者らは、ＴＲＡＣＥＥＲｘ１００コホートでの高いカバレッジにもかかわらず、ＣＤＲ３ ＶＤＪスコアは、配列決定深度によって大幅に制約されることに注目した。ＣＤＲ３領域にアライメントするリードの数は典型的には非常に少ない（Ｑ１＝０、中央値＝２、平均＝２．３３５、Ｑ３＝３、最大＝１４）。Ｔ細胞ＥｘＴＲＥＣＴ由来のＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率及びＣＤＲ３ ＶＤＪスコアが配列決定カバレッジの相違に対してどの程度ロバストであるかを明示的に定量化するために、本発明者らは（以下に述べる）２つの相補的な方法を採用した。
【0128】
次に、ＲＮＡ－ｓｅｑデータと病理由来のＴＩＬスコアとの両方を含む腫瘍領域のサブセット（１４７領域）を選択して、本発明者らは、ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率、ＣＤＲ３ ＶＤＪスコア、及びＣＤ８＋細胞に関する６つのＲＮＡ－ｓｅｑベースの免疫尺度（Danaher、Davoli、xCell、TIMER、CIBERSORT、及びEPIC）がＴＩＬスコア（図９Ｂに示される）にどの程度匹敵するかを評価することもできた。Danaher ＣＤ８＋スコアは、病理学ＴＩＬと最も強い関連性（ρ＝０．４９）を有し、次いで本発明者らのＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率（ρ＝０．４１）、Davoli（ρ＝０．４）、xCell（ρ＝０．３６）、CIBERSORT（ρ＝０．２３）、TIMER（ρ＝０．２）、ＣＤＲ３ ＶＤＪスコア（ρ＝０．２）、及びEPIC（ρ＝０．０８２）であり、EPIC以外の全てが有意に関連していた。したがって、ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率の推定は、代替のＤＮＡベースの尺度を大幅に改良し、免疫細胞腫瘍浸潤量を明らかにするという点で先進のＲＮＡ－ｓｅｑベースの免疫シグネチャに匹敵するが、多くの既存の方法とは異なり、Ｔ細胞分画率の正確な点推定量を提供する。
【0129】
さらに、本発明者らは、ＴＣＧＡからのより低いカバレッジ（ＴＲＡＣＥＲｘにおける深度中央値４２６Ｘと比較して、カバレッジ中央値：ＬＵＡＤ＝８４、ＬＵＳＣ＝８８．２）を有する独立したＮＳＣＬＣデータセットにおけるＴＩＬ ＥｘＴＲＥＣＴをさらに評価した。ＬＵＡＤ及びＬＵＳＣコホートを構成する試料が表２に記載されている。本発明者らは、ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率をThorsson et al（Thorsson et al., 2018）からの免疫関連データと相関させた。Thorsson et al.では、ＤＮＡメチル化及びＲＮＡ－ｓｅｑ CIBERSORTベースのＴ細胞ＣＤ８分画率から「白血球分画率」と呼ばれる試料中の総ＴＩＬの尺度が計算された。
【0130】
【表2】
【0131】
CIBERSORTベースのＣＤ８＋Ｔ細胞推定量と比較して、ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率は、Thorrsonらによって使用されたメチル化由来の白血球分画率とより強い関連性を有し（図１０に示されるように、ρ＝０．２９、Ｐ＝１．２ｅ－１８ ｖｓ．ρ＝０．１、Ｐ＝０．０００９７）、ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率が総ＴＩＬのメチル化ベースの尺度とよく相関していること、及びこれがＴ細胞含量の特定のＲＮＡ尺度よりも潜在的に優れていることの両方を示す。
【0132】
さらに、本発明者らは、ＴＩＬ ＥｘＴＲＥＣＴからのＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率が配列決定カバレッジの相違に対してどの程度ロバストであるかを試験することを試みた。具体的には、正確なＴ細胞分画率推定量を得るために必要な最小配列決定深度を確認するために、本発明者らは、２つの相補的な方法を採用した。第一に、TRACERx100からの５つのＮＳＣＬＣ腫瘍領域を選択した。ＴＩＬ ＥｘＴＲＥＣＴからのＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率は０～０．３５の範囲であった。次いで、これらの領域を、５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、及び２００倍のカバレッジに、個別に１０回ダウンサンプリングした。本発明者らは、Ｔ細胞分画率推定量が３０倍以上（ρ＝０．８４、Ｐ＝１．４ｅ－１４）のカバレッジで一貫したままであることを発見した（図１１Ａに示される）。これと一貫性を保って、シミュレートされたデータは、３０倍のカバレッジと既知のＴ細胞分画率との間の信頼できる対応関係を示した（図１１Ｂに示される。ρ＝０．９６、Ｐ＝１．９ｅ－１４）。本発明者らは、（図１１Ａに示されるように）カバレッジが１０倍であっても有用な情報が取得可能であり得るが、２０倍以下のカバレッジではＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率が忠実度を失い始めることを観察した。これは、特に検出限界を下回り始めるより低いＴ細胞分画率に関するノイズの増加によるものである可能性が高い。したがって、３０倍未満（１０倍及び２０倍を含む）のカバレッジは、高いＴ細胞分画率と低いＴ細胞分画率とを区別するのに依然として有用であり得るが、非常に低いＴ細胞分画率の信頼できる推定量を取得するには十分ではないことがある。０．１未満のＴ細胞分画率が一般的であるため、３０倍以上のカバレッジの使用は、さらなる確実性と幅広い適用性を提供する上で有利であり得る。対照的に、本発明者らは、Ｔ細胞浸潤を決定するためのＣＤＲ３法が低い配列決定カバレッジによって大きく歪められていることを発見した。最高のＣＤＲ３リードを有する５つの試料を選択し、５０倍のカバレッジにダウンサンプリングしたとき、１つの試料では３つのリードが検出され、残りの試料では１つのＣＤＲ３リードのみであった（図１１Ｄ）。これと一貫性を保って、Levy et al.によるＴＣＧＡ ＢＲＣＡ解析でも、腫瘍の５６％でＣＤＲ３リードが同定されなかったことは注目に値する。
【0133】
最後に、本発明者らは、複数の異なるデータセットでの試験から、試料が新鮮凍結かホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）かに依存してＴ細胞分画率に体系的な有意差がないことを特定した（「方法」及び図１１Ｃを参照）。これは、本方法が、ＦＦＰＥ特有のＤＮＡ変化に敏感でないことを示唆する。
【0134】
したがって、本明細書に記載のＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率推定方法は、代替のＤＮＡベースの尺度を改良し、免疫細胞腫瘍浸潤量を明らかにするという点で先進のＲＮＡ－ｓｅｑベースの免疫シグネチャに匹敵するが、多くの既存の方法とは異なり、Ｔ細胞分画率の正確な点推定量を提供する。さらに、Ｔ細胞ＥｘＴＲＥＣＴは、ＷＥＳを受けた任意の試料に適用することができ、したがって腫瘍試料と血液試料との両方におけるＴ細胞分画率の解析を可能にする。
【0135】
方法
統計
この例での全ての統計試験及び他の全ての統計試験をＲ３．６．１で行った。試料サイズを事前決定するために統計的方法は使用しなかった。相関性を含む試験を、Ｒパッケージggpubr（v0.4.0）からの「stat_cor」をSpearmanの方法と共に使用して行った。分布の比較を含む試験は、特に明記されていない限り、「wilcox.test」を使用して又はペアでないオプションを使用して、「stat_compare_means」を使用して行った。対応するウィルコクソン検定に関する効果量を、rstatixパッケージ（v0.6.0）からの「wilcox_effsize」関数を使用して測定した。ハザード比及びｐ値を、カプラン・マイヤー曲線とCox比例ハザードモデルとの両方に関して「survival」パッケージ（v3.2－3）を使用して計算した。全ての統計試験について、含まれるデータポイントの数が、対応する図にプロットされる又はアノテーションを付けられる。
統計
この例での全ての統計試験及び他の全ての統計試験をＲ３．６．１で行った。試料サイズを事前決定するために統計的方法は使用しなかった。相関性を含む試験を、Ｒパッケージggpubr（v0.4.0）からの「stat_cor」をSpearmanの方法と共に使用して行った。分布の比較を含む試験は、特に明記されていない限り、「wilcox.test」を使用して又はペアでないオプションを使用して、「stat_compare_means」を使用して行った。対応するウィルコクソン検定に関する効果量を、rstatixパッケージ（v0.6.0）からの「wilcox_effsize」関数を使用して測定した。ハザード比及びｐ値を、カプラン・マイヤー曲線とCox比例ハザードモデルとの両方に関して「survival」パッケージ（v3.2－3）を使用して計算した。全ての統計試験について、含まれるデータポイントの数が、対応する図にプロットされる又はアノテーションを付けられる。
【0136】
免疫ホット及びコールド腫瘍領域の定義
これらの実施例を通じて、免疫ホット領域は、ＴＩＬ ＥｘＴＲＥＣＴによって測定したときに１０％を超えるＴ細胞を含む領域として定義し、免疫コールド領域は、１０％未満のＴ細胞を含む領域として定義した。この閾値は専門知識に基づいて定義し、解析の文脈及び目的に応じて他の閾値を使用することもできた。
これらの実施例を通じて、免疫ホット領域は、ＴＩＬ ＥｘＴＲＥＣＴによって測定したときに１０％を超えるＴ細胞を含む領域として定義し、免疫コールド領域は、１０％未満のＴ細胞を含む領域として定義した。この閾値は専門知識に基づいて定義し、解析の文脈及び目的に応じて他の閾値を使用することもできた。
【0137】
新鮮凍結試料とＦＦＰＥ試料の比較
新鮮凍結試料とＦＦＰＥ試料との両方でＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率が信頼でき一貫していることを試験するために、ＣＰＩ応答コホートにおける６つの異なる研究について非ＧＣ補正ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率を計算した。これらの研究のうちの３つでは、ＦＦＰＥ組織由来のＷＥＳを利用し（ｎ＝４６０）、他の３つでは、新鮮凍結組織由来のＷＥＳ試料を利用した（ｎ＝３５７）。線形モデルを当てはめ、組織学及びＦＦＰＥ状態によってＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率を予測したところ（表６）、がん種がこの有意性の主な作用因子であり、ＦＦＰＥ状態は重要ではないことが明らかになった。さらに、ＦＦＰＥ試料及び新鮮凍結ＷＥＳ試料を有する悪性黒色腫及び膀胱腫瘍については、有意差は見られなかった（図１１Ｃ）。したがって、ＷＥＳ試料が新鮮凍結組織に由来するかＦＦＰＥ組織に由来するかは、ＴＩＬ ＥｘＴＲＥＣＴによって計算されるＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率の値に大きな影響を及ぼさないと結論付けることができる。
新鮮凍結試料とＦＦＰＥ試料との両方でＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率が信頼でき一貫していることを試験するために、ＣＰＩ応答コホートにおける６つの異なる研究について非ＧＣ補正ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率を計算した。これらの研究のうちの３つでは、ＦＦＰＥ組織由来のＷＥＳを利用し（ｎ＝４６０）、他の３つでは、新鮮凍結組織由来のＷＥＳ試料を利用した（ｎ＝３５７）。線形モデルを当てはめ、組織学及びＦＦＰＥ状態によってＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率を予測したところ（表６）、がん種がこの有意性の主な作用因子であり、ＦＦＰＥ状態は重要ではないことが明らかになった。さらに、ＦＦＰＥ試料及び新鮮凍結ＷＥＳ試料を有する悪性黒色腫及び膀胱腫瘍については、有意差は見られなかった（図１１Ｃ）。したがって、ＷＥＳ試料が新鮮凍結組織に由来するかＦＦＰＥ組織に由来するかは、ＴＩＬ ＥｘＴＲＥＣＴによって計算されるＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率の値に大きな影響を及ぼさないと結論付けることができる。
【0138】
【表3】
【0139】
シミュレートされたデータ
非ＧＣ補正ＴＣＲＡ Ｔ細胞スコアの結果を試験するためのシミュレートされたデータは、MASCoTE（Zaccaria & Raphael, 2020）腫瘍シミュレーション法からのツールと組み合わせてART Illumina（バージョン2.5.8）（Huang, Li, Myers, & Marth, 2012）を使用して作成した。簡潔には、ARTを使用して、カバレッジ３０及びリード長１５０を有するHiSeq 2500 DNAシーケンサからのヒト１４番染色体に関するシミュレートされたペアエンドＦＡＳＴＱファイルを生成した（パラメータ－ｐ－ｓｓ ＨＳ２５－ｆ ３０－ｎａ－１ １５０－ｍ ２００－ｓ １０）。ここで、－ｓｓは配列決定プラットフォームを表し、－ｆはカバレッジを表し、－ｌはリード長を表し、－ｍはＤＮＡフラグメントの平均サイズを表し、－ｓはフラグメントサイズの標準偏差を表し、－ｎａは、出力アライメントファイルを提供することができないことを示す（詳細については、https://manpages.debian.org/stretch/art－nextgen－simulation－tools/art_illumina.1を参照）。次いで、これらのＦＡＳＴＱファイルを、bwa mem（v0.7.15）を使用してヒトゲノムｈｇ１９にアライメントした。次いで、Picardツール（バージョン1.107）を使用して、得られたＢＡＭファイルをクリーンアップ、ソート、及びインデックス付けした。ＴＣＲＡ遺伝子でのカバレッジのみがシミュレートされたデータの試験に重要であるので、ｃｈｒ１４：２０００００００－２４００００００にマッピングする全てのリードのsamtools（バージョン1.3.1）ビューを用いてＢＡＭファイルを作成した。このＢＡＭファイルは、正常細胞及び腫瘍細胞のためのテンプレートとして役立った。ｃｈｒ１４：２０００００００－２２５０００００又はｃｈｒ１４：２３００００００－２４００００００にマッピングしたリードのみを抽出し、これらの結果を、samtools mergeを用いて単一のＢＡＭファイルにマージすることによって、このＢＡＭファイルからＴ細胞テンプレートを作成した。したがって、このＴ細胞ＢＡＭファイルは、位置ｃｈｒ１４：２２５０００００－２３００００００の間に、人為的に作成された１００％の欠失を含む。このギャップの両側の領域のいずれかに一部マッピングしたリードは含まれていた（すなわち欠失されなかった）。リードサイズは１５０ｂｐであるので、これらのリードの有無は欠失のサイズに比べて重要ではないと考えられる。このＴ細胞及び正常／がんＢＡＭファイルを使用して、MASCoTE法で使用されるＭｉｘＢａｍ．ｐｙモジュールを用いて、様々な混合ＢＡＭファイルを生成した。これにより、混合物のゲノム長とコピー数との両方に応じて正常／がん及びＴ細胞ＢＡＭをサンプリングすることにより、混合ＢＡＭが作成される。このようにして、異なるがん体細胞コピー数変化値を有する異なる割合の正常細胞、Ｔ細胞、及びがん細胞の集団を含むシミュレートされたデータを作成することができた。
非ＧＣ補正ＴＣＲＡ Ｔ細胞スコアの結果を試験するためのシミュレートされたデータは、MASCoTE（Zaccaria & Raphael, 2020）腫瘍シミュレーション法からのツールと組み合わせてART Illumina（バージョン2.5.8）（Huang, Li, Myers, & Marth, 2012）を使用して作成した。簡潔には、ARTを使用して、カバレッジ３０及びリード長１５０を有するHiSeq 2500 DNAシーケンサからのヒト１４番染色体に関するシミュレートされたペアエンドＦＡＳＴＱファイルを生成した（パラメータ－ｐ－ｓｓ ＨＳ２５－ｆ ３０－ｎａ－１ １５０－ｍ ２００－ｓ １０）。ここで、－ｓｓは配列決定プラットフォームを表し、－ｆはカバレッジを表し、－ｌはリード長を表し、－ｍはＤＮＡフラグメントの平均サイズを表し、－ｓはフラグメントサイズの標準偏差を表し、－ｎａは、出力アライメントファイルを提供することができないことを示す（詳細については、https://manpages.debian.org/stretch/art－nextgen－simulation－tools/art_illumina.1を参照）。次いで、これらのＦＡＳＴＱファイルを、bwa mem（v0.7.15）を使用してヒトゲノムｈｇ１９にアライメントした。次いで、Picardツール（バージョン1.107）を使用して、得られたＢＡＭファイルをクリーンアップ、ソート、及びインデックス付けした。ＴＣＲＡ遺伝子でのカバレッジのみがシミュレートされたデータの試験に重要であるので、ｃｈｒ１４：２０００００００－２４００００００にマッピングする全てのリードのsamtools（バージョン1.3.1）ビューを用いてＢＡＭファイルを作成した。このＢＡＭファイルは、正常細胞及び腫瘍細胞のためのテンプレートとして役立った。ｃｈｒ１４：２０００００００－２２５０００００又はｃｈｒ１４：２３００００００－２４００００００にマッピングしたリードのみを抽出し、これらの結果を、samtools mergeを用いて単一のＢＡＭファイルにマージすることによって、このＢＡＭファイルからＴ細胞テンプレートを作成した。したがって、このＴ細胞ＢＡＭファイルは、位置ｃｈｒ１４：２２５０００００－２３００００００の間に、人為的に作成された１００％の欠失を含む。このギャップの両側の領域のいずれかに一部マッピングしたリードは含まれていた（すなわち欠失されなかった）。リードサイズは１５０ｂｐであるので、これらのリードの有無は欠失のサイズに比べて重要ではないと考えられる。このＴ細胞及び正常／がんＢＡＭファイルを使用して、MASCoTE法で使用されるＭｉｘＢａｍ．ｐｙモジュールを用いて、様々な混合ＢＡＭファイルを生成した。これにより、混合物のゲノム長とコピー数との両方に応じて正常／がん及びＴ細胞ＢＡＭをサンプリングすることにより、混合ＢＡＭが作成される。このようにして、異なるがん体細胞コピー数変化値を有する異なる割合の正常細胞、Ｔ細胞、及びがん細胞の集団を含むシミュレートされたデータを作成することができた。
【0140】
本方法を使用するシミュレートされたデータを、腫瘍純度＝［０．２５、０．５、０．７５］、腫瘍コピー数＝［１、３、４、５］、及びＴ細胞分画率＝［０．０１～０．２５、０．０１刻み］の可能な全ての組合せについて、及び０．０１刻みで０．０１～０．９９の範囲のＴ細胞分画率を有する腫瘍コピー数２について作成した。このシミュレートされたデータの作成後、ＷＥＳに適用される標準的なＴＩＬ ＥｘＴＲＥＣＴ法（実施例１に記載）で行われるように、ＴＣＲＡ遺伝子のエクソン内の位置からのリードのみを使用してＴ細胞分画率を計算した。ＴＣＲＡの周辺での局所コピー数を１として、Ｔ細胞が２４％、腫瘍が７５％のシミュレートされた単一の実行に関する出力の例が図８Ｂに示されている。図８Ｃ及び図８Ｄは、様々な局所腫瘍コピー数及び純度値でのシミュレートされた値と計算値との差を示す。ナイーブスコアは、コピー数が２未満のときにはＴ細胞分画率を過大推定し、２を超えるときには過小推定する。しかし、正確なスコアはラインｙ＝ｘに従い、それが実際に正確であることを示す。
【0141】
ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率推定に対する配列決定深度の影響の調査
より低いカバレッジの影響を評価するために、５つのTRACERx100領域を、それらが表すＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率の範囲に基づいて選択した（高＝０．３５、中＝０．１５６、低＝０．０５３、非常に低い＝０．０１０、なし＝０）。簡単にするために、全ての領域が、局所ＴＣＲＡ腫瘍コピー数２を有するものとした。研究としてのTRACERx100では、カバレッジの中央値が４３０．９１倍であった。これらの試料は様々な深度を有していたが、samtoolsビューを－ｓオプションと共に使用して、領域の元の深度を考慮に入れて、アライメントされたＢＡＭファイルを特定の深度までダウンサンプリングした。このようにして、異なるランダムシードから作成された１０個のダウンサンプリングされた深度を作成し、２００、１００、７５、５０、４０、３０、２０、１０、及び５倍のカバレッジの深度でＢＡＭファイルを形成した。これらのＢＡＭを生成するためのダウンサンプリングの後、上述した方法を使用して、非ＧＣ補正ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率を推定した。
より低いカバレッジの影響を評価するために、５つのTRACERx100領域を、それらが表すＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率の範囲に基づいて選択した（高＝０．３５、中＝０．１５６、低＝０．０５３、非常に低い＝０．０１０、なし＝０）。簡単にするために、全ての領域が、局所ＴＣＲＡ腫瘍コピー数２を有するものとした。研究としてのTRACERx100では、カバレッジの中央値が４３０．９１倍であった。これらの試料は様々な深度を有していたが、samtoolsビューを－ｓオプションと共に使用して、領域の元の深度を考慮に入れて、アライメントされたＢＡＭファイルを特定の深度までダウンサンプリングした。このようにして、異なるランダムシードから作成された１０個のダウンサンプリングされた深度を作成し、２００、１００、７５、５０、４０、３０、２０、１０、及び５倍のカバレッジの深度でＢＡＭファイルを形成した。これらのＢＡＭを生成するためのダウンサンプリングの後、上述した方法を使用して、非ＧＣ補正ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率を推定した。
【0142】
捕捉キットのエクソン偏り検出、及びＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率の計算に使用されるエクソンの品質管理
一般的な品質管理ステップとして、ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率の計算に使用する前に、十分なカバレッジについて全てのエクソンをチェックした。中央値が１５倍未満のエクソンは除去し、３０個を超えるエクソンがこの閾値未満であった場合には、低いカバレッジにより試料を不合格としてマークした。
一般的な品質管理ステップとして、ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率の計算に使用する前に、十分なカバレッジについて全てのエクソンをチェックした。中央値が１５倍未満のエクソンは除去し、３０個を超えるエクソンがこの閾値未満であった場合には、低いカバレッジにより試料を不合格としてマークした。
【0143】
ＴＣＧＡデータセットを解析する過程で、使用した捕捉キット（Agilent SureSelect v2に基づく広範なカスタムセット）による偏りが観察された。この偏りは、Wangら（Wang, Kim, & Chuang, 2018）によって以前に述べられており、ＴＣＲＡを含む４８３３個の遺伝子に影響を与える。この偏りは、特定のエクソンのカバレッジを予想よりもはるかに低くし、したがってスコアの計算に干渉した。この偏りの一例は、図２６Ａで見ることができる。この問題を解決するために、本発明者らは、TRACERx100及びＴＣＧＡ ＬＵＡＤコホート内で、個々のエクソンにおける平均ｌｏｇＲ比（すなわち、上で説明したように、最初の１２個のＶセグメント及びＣセグメントでのリードカバレッジの中央値に対するエクソンにおけるリードカバレッジの対数比の平均）を計算した（図２６Ｂを参照）。ＴＣＧＡ ＬＵＳＣコホートはこの解析には使用しなかったが、本発明者らは、このコホートからの結果がＴＣＧＡ ＬＵＡＤコホートの結果と大きく異なるとは予想していない。０．５を超える中央値の差を有するエクソン（各エクソンごとに、各コホート内の全ての試料にわたって中央値を計算し、次いでコホート間の中央値の差を検査する）にフラグを付け、ＴＣＧＡ解析から除去した。これにより、９９／１９２のエクソンが除外された。以下の解析では、これらのエクソンがTRACERx100データから除去され（ただし、偏りは、使用された捕捉キットに関連していると考えられるので、このデータは、ＴＣＧＡデータと同じ偏りを受けるとは予想されない）、偏りがないときのこの縮小されたセットの使用における相違が最小限である（偏りが存在するときに観察することができる大きな影響に比べて）ことを示すことに留意されたい。Agilent SureSelect v2捕捉キットを使用した特にＣＰＩデータセット（Rizvi et al., 2015；Shim et al., 2020）内の他のコホートも、同じ偏りを有することが観察され（すなわち、同じエクソンに影響を及ぼす偏り。上述したように全てのエクソンに関する中央値を計算し、これらと、偏りの影響を受けたデータセット（すなわちこの場合にはＴＣＧＡ ＬＵＡＤコホート）からのエクソンの中央値との相関を調べることによって示される）、この縮小されたエクソンセットを用いて計算されたスコアを有する。さらに、ＧＣ補正後、ＴＣＲδ遺伝子セグメントの１つにおいてAgilent SureSelect v2捕捉キットを使用したとき、単一のエクソンで偏りが観察された。このセグメントは、ＴＣＲＡ分画率を計算するために使用される限局性領域内にあるので、また、縮小されたセット内のエクソンの数がより少ないので、このエクソンの小さな変化が、計算されたスコアに大きな影響を生み出す可能性がある。ＧＣ補正後、これがはるかに顕著であることが判明し、したがって、この効果が大きいＴＣＧＡなどのコホートでは、このエクソンも解析から除去した。
【0144】
本発明者らは、縮小されたエクソンセットを、追加のＴＣＲδ遺伝子セグメントも除去されたＴＣＧＡコホートに適用し、ＴＣＲＡ Ｔ細胞スコアを比較したところ、ＬＵＡＤとＬＵＳＣとの両方からの腫瘍試料についてＴＣＧＡコホートとＴＲＡＣＥＲｘコホートとの間での大きな相違を観察した（図２６Ｃ：ウィルコクソン検定、ＬＵＡＤ：Ｐ＜２．２ｅ－１６ＬＵＳＣ：Ｐ＜２．２ｅ－１６）。しかし、この相違は、この縮小されたたエクソンセット内のＧＣの偏りに完全に起因するものである。ＧＣ補正法が使用されるとき、ＬＵＡＤ患者とのＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率の有意差はわずかであり、これはおそらくコホート集団の相違によりわずかにだけ有意である（図２６Ｄ、ウィルコクソン検定、ＬＵＡＤ：Ｐ＝０．０２８、ＬＵＳＣ：Ｐ＝０．９７）。
【0145】
本明細書における任意のコホートで使用された任意の他の捕捉キットで検出された、ＧＣ補正によって修正可能な偏り以外の他の偏りはなかった。しかし、Nimblegen捕捉キットを使用したコホートは、Agilent捕捉キットから定義されたエクソンのコホートとは十分に異なることが判明した。Nimblegen捕捉キットからの全ての試料は、Nimblegenエクソン捕捉領域から直接定義されたエクソンを使用して計算した。また、Nextera Rapid Capture及びIDT xGen Exome Research Panelなどいくつかの捕捉キットは、ＴＣＲＡ遺伝子内で極端に低いカバレッジを有することが確認された。これらのキットのエクソーム捕捉領域を手動でチェックしたところ、ＴＣＲＡ遺伝子内の領域がそれらの設計に含まれていないことが判明した。これらのキットを使用するデータセットに関して、ＴＩＬ ＥｘＴＲＥＣＴを使用してＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率を計算することはできない。
【0146】
ＣＤＲ３ ＶＤＪスコアの計算
Levy et al.で概説されている手順に従って、ＣＤＲ３ ＶＤＪスコアを計算した。ＴＣＲＢ（ｈｇ１９：ｃｈｒ７：１４２０００８１７－１４２５１０９９３）にアライメントする最初のリードと、アライメントされないリードとをsamtoolsで抽出し、この得られたｂａｍを、bedtoolsを使用してｆａｓｔｑに変換し、次いで、得られた出力に対してツールIMSEQ（v1.1.0）を使用して、ＣＤＲ３領域にアライメントするＶＤＪ組換えリードを同定し、アライメントされたリードの数を、元のｂａｍファイル内のリードの総数（samtools flagstatで測定）によって正規化して、ＣＤＲ３ ＶＤＪスコアを作成した。
Levy et al.で概説されている手順に従って、ＣＤＲ３ ＶＤＪスコアを計算した。ＴＣＲＢ（ｈｇ１９：ｃｈｒ７：１４２０００８１７－１４２５１０９９３）にアライメントする最初のリードと、アライメントされないリードとをsamtoolsで抽出し、この得られたｂａｍを、bedtoolsを使用してｆａｓｔｑに変換し、次いで、得られた出力に対してツールIMSEQ（v1.1.0）を使用して、ＣＤＲ３領域にアライメントするＶＤＪ組換えリードを同定し、アライメントされたリードの数を、元のｂａｍファイル内のリードの総数（samtools flagstatで測定）によって正規化して、ＣＤＲ３ ＶＤＪスコアを作成した。
【0147】
TRACERx100患者
ＮＳＣＬＣ ＴＲＡＣＥＲｘ研究（https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01888601、独立研究倫理委員会によって承認済み、１３／ＬＯ／１５４６）によってプロスペクティブに解析された最初の１００人の患者を本研究に使用した。これは、Jamal－Hanjani et al.（Jamal－Hanjani et al., 2017）に元々記載されていた１００人の患者のコホートと同一である。このコホートを簡単に説明すると、ＴＲＡＣＥＲｘ研究への参加にはインフォームドコンセントが必須の要件だった。このＮＳＣＬＣコホートは、男性６８人、女性３２人の患者からなり、年齢の中央値は６８歳であった。最後に、このコホートは、主に初期段階の腫瘍（Ｉａ（２６）、Ｉｂ（３６）、ＩＩａ（１３）、ＩＩｂ（１１）、ＩＩＩａ（１３）、及びＩＩＩｂ（１））で構成されており、２８人の患者は補助療法も受けていた。ＷＥＳ（ｈｇ１９にアライメントされた）試料とＲＮＡ－ｓｅｑ試料とはどちらも、最初の１００人の患者に関するＴＲＡＣＥＲｘ研究から取得した。これらの試料を処理するための方法は、以前に記載されている通りである（Jamal－Hanjani et al., 2017）。特にＷＥＳ試料については、製造業者の指示に従って、Agilent Human All Exome V5キットのカスタムバージョンを使用してエクソーム捕捉を行った。
ＮＳＣＬＣ ＴＲＡＣＥＲｘ研究（https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01888601、独立研究倫理委員会によって承認済み、１３／ＬＯ／１５４６）によってプロスペクティブに解析された最初の１００人の患者を本研究に使用した。これは、Jamal－Hanjani et al.（Jamal－Hanjani et al., 2017）に元々記載されていた１００人の患者のコホートと同一である。このコホートを簡単に説明すると、ＴＲＡＣＥＲｘ研究への参加にはインフォームドコンセントが必須の要件だった。このＮＳＣＬＣコホートは、男性６８人、女性３２人の患者からなり、年齢の中央値は６８歳であった。最後に、このコホートは、主に初期段階の腫瘍（Ｉａ（２６）、Ｉｂ（３６）、ＩＩａ（１３）、ＩＩｂ（１１）、ＩＩＩａ（１３）、及びＩＩＩｂ（１））で構成されており、２８人の患者は補助療法も受けていた。ＷＥＳ（ｈｇ１９にアライメントされた）試料とＲＮＡ－ｓｅｑ試料とはどちらも、最初の１００人の患者に関するＴＲＡＣＥＲｘ研究から取得した。これらの試料を処理するための方法は、以前に記載されている通りである（Jamal－Hanjani et al., 2017）。特にＷＥＳ試料については、製造業者の指示に従って、Agilent Human All Exome V5キットのカスタムバージョンを使用してエクソーム捕捉を行った。
【0148】
ＴＣＧＡ ＬＵＡＤ及びＬＵＳＣコホート
ＴＣＧＡ ＬＵＡＤ及びＬＵＳＣコホートからのアライメントされたＢＡＭファイル（ｈｇ３８）を、ゲノムデータコモンズ（データセットＩＤ：ｐｈｓ０００１７８．ｖ１０．ｐ８）からダウンロードした。ASCAT（v2.4.2）を使用して試料純度及び倍数性呼び出しを生成し、ＴＣＧＡデータの以前の解析（Middleton et al., 2020）から取得した。簡潔には、腫瘍と正常のペア試料（データセットＩＤ：ｐｈｓ０００１７８．ｖ１０．ｐ８）からのAffymetrix SNP6プロファイルを、PennCNVライブラリ（K. Wang et al., 2007）によって処理し、ASCATで処理する前にＧＣ補正されたＢＡＦ及び対数比を取得した。白血球分画率及びＣＤ８＋分画率を含む免疫関連データは、Thorsson et al. 2018から獲得した。
ＴＣＧＡ ＬＵＡＤ及びＬＵＳＣコホートからのアライメントされたＢＡＭファイル（ｈｇ３８）を、ゲノムデータコモンズ（データセットＩＤ：ｐｈｓ０００１７８．ｖ１０．ｐ８）からダウンロードした。ASCAT（v2.4.2）を使用して試料純度及び倍数性呼び出しを生成し、ＴＣＧＡデータの以前の解析（Middleton et al., 2020）から取得した。簡潔には、腫瘍と正常のペア試料（データセットＩＤ：ｐｈｓ０００１７８．ｖ１０．ｐ８）からのAffymetrix SNP6プロファイルを、PennCNVライブラリ（K. Wang et al., 2007）によって処理し、ASCATで処理する前にＧＣ補正されたＢＡＦ及び対数比を取得した。白血球分画率及びＣＤ８＋分画率を含む免疫関連データは、Thorsson et al. 2018から獲得した。
【0149】
がん細胞株データ
Lopez et al., 2020に記載されているように、非Ｔ細胞由来の細胞株ＨＣＴ１１６をIllumina HiSeq 2500で配列決定し、ｈｇ１９を使用してbwa memとアライメントした。Ｔ細胞由来の細胞株は、アクセッション番号ＰＲＪＮＡ５２３３８０の下でSequence Read Archive（ＳＲＡ）からダウンロードしたGhandi et al. 2019に記載されているデータセットからのものとした。ＶＤＪ組換えを受けていないので前駆体Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病由来の細胞株が除外されることを保証して、Ｔ細胞由来の細胞株を選択した。このプロセスにより、ＪＵＲＫＡＴ、ＨＰＢ－ＡＬＬ、ＰＥＥＲの３つの細胞株からのＷＥＳデータが選択された。マッチする生殖細胞系列試料なしでASCATを実行するのは難しいため、全ての細胞株の働き（cell line work）にナイーブＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率を使用した。
Lopez et al., 2020に記載されているように、非Ｔ細胞由来の細胞株ＨＣＴ１１６をIllumina HiSeq 2500で配列決定し、ｈｇ１９を使用してbwa memとアライメントした。Ｔ細胞由来の細胞株は、アクセッション番号ＰＲＪＮＡ５２３３８０の下でSequence Read Archive（ＳＲＡ）からダウンロードしたGhandi et al. 2019に記載されているデータセットからのものとした。ＶＤＪ組換えを受けていないので前駆体Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病由来の細胞株が除外されることを保証して、Ｔ細胞由来の細胞株を選択した。このプロセスにより、ＪＵＲＫＡＴ、ＨＰＢ－ＡＬＬ、ＰＥＥＲの３つの細胞株からのＷＥＳデータが選択された。マッチする生殖細胞系列試料なしでASCATを実行するのは難しいため、全ての細胞株の働き（cell line work）にナイーブＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率を使用した。
【0150】
直交免疫尺度：１．ＲＮＡ－ｓｅｑシグネチャ
ＴＲＡＣＥＲｘで計算されたＴＩＬスコアと最も強く相関することが以前に実証されている（Rosenthal et al., 2019）ので、Danaher et al.（Danaher et al., 2018）の方法を、ＲＮＡ－ｓｅｑ尺度からＴ細胞含量を推定する主要な方法として使用した。ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率に対して試験された他のＲＮＡ－ｓｅｑシグネチャは、Davoli法（Davoli, Uno, Wooten, & Elledge, 2017）、xCell（Aran, Hu, & Butte, 2017）、TIMER（Li et al., 2017）、及びEPIC（Racle, de Jonge, Baumgaertner, Speiser, & Gfeller, 2017）であった。
ＴＲＡＣＥＲｘで計算されたＴＩＬスコアと最も強く相関することが以前に実証されている（Rosenthal et al., 2019）ので、Danaher et al.（Danaher et al., 2018）の方法を、ＲＮＡ－ｓｅｑ尺度からＴ細胞含量を推定する主要な方法として使用した。ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率に対して試験された他のＲＮＡ－ｓｅｑシグネチャは、Davoli法（Davoli, Uno, Wooten, & Elledge, 2017）、xCell（Aran, Hu, & Butte, 2017）、TIMER（Li et al., 2017）、及びEPIC（Racle, de Jonge, Baumgaertner, Speiser, & Gfeller, 2017）であった。
【0151】
直交免疫尺度：２．病理学ＴＩＬスコア
Rosenthal et al.（Rosenthal et al., 2019）に以前に記載されているように、国際免疫腫瘍学バイオマーカワーキンググループ（International Immuno－Oncology Biomarker Working Group）によって開発された、国際的に確立されたガイドラインを使用した組織病理学スライド（Hendry et al., 2017）から、ＴＩＬを推定した。簡潔には、腫瘍領域に対する間質領域の相対的な割合を、所与の腫瘍領域の病理学スライドから決定した。間質コンパートメントについてＴＩＬを報告した（＝間質ＴＩＬのパーセント）。間質ＴＩＬのパーセントを決定するために使用した分母は、間質細胞の数（すなわち、単核炎症細胞核を表す総間質核の分画率）ではなく、間質組織の面積（すなわち、腫瘍間の間質面積全体に対して単核炎症細胞が占める面積）であった。本方法は、訓練を受けた病理学者の間で再現可能であることが実証されている（Denkert et al., 2016）。個人間の一致を行い、これは高い再現性を示した。国際免疫腫瘍学バイオマーカワーキンググループは、ヘマトキシリンエオシンスライド上での最適なＴＩＬ評価に関して病理学者を訓練するための、無料で利用できるトレーニングツールを開発している（www.tilsincancer.org）。
Rosenthal et al.（Rosenthal et al., 2019）に以前に記載されているように、国際免疫腫瘍学バイオマーカワーキンググループ（International Immuno－Oncology Biomarker Working Group）によって開発された、国際的に確立されたガイドラインを使用した組織病理学スライド（Hendry et al., 2017）から、ＴＩＬを推定した。簡潔には、腫瘍領域に対する間質領域の相対的な割合を、所与の腫瘍領域の病理学スライドから決定した。間質コンパートメントについてＴＩＬを報告した（＝間質ＴＩＬのパーセント）。間質ＴＩＬのパーセントを決定するために使用した分母は、間質細胞の数（すなわち、単核炎症細胞核を表す総間質核の分画率）ではなく、間質組織の面積（すなわち、腫瘍間の間質面積全体に対して単核炎症細胞が占める面積）であった。本方法は、訓練を受けた病理学者の間で再現可能であることが実証されている（Denkert et al., 2016）。個人間の一致を行い、これは高い再現性を示した。国際免疫腫瘍学バイオマーカワーキンググループは、ヘマトキシリンエオシンスライド上での最適なＴＩＬ評価に関して病理学者を訓練するための、無料で利用できるトレーニングツールを開発している（www.tilsincancer.org）。
【0152】
実施例３－TRACERx100及びＴＣＧＡ ＮＳＣＬＣコホートにおけるＷＥＳ由来のＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率の予後予測値の評価
導入
ＴＩＬ ＥｘＴＲＥＣＴの潜在的な臨床的有用性を調べるために、本発明者らはまず、ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率がTRACERx100 ＮＳＣＬＣコホートにおいて予後予測因子であるかどうかを考察した。TRACERx100コホート内の試料からの組織病理学的Ｈ＆Ｅスライドから推測されるＴＩＬレベルは、以前に無病生存率と関連付けられている（AbdulJabbar et al., 2020）。したがって、本発明者らは、本明細書に記載の新規のＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率を使用して同様の関連性を確認することができるかどうかを調べた。また、ＴＣＧＡからのデータを使用して同様の調査を行った。
導入
ＴＩＬ ＥｘＴＲＥＣＴの潜在的な臨床的有用性を調べるために、本発明者らはまず、ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率がTRACERx100 ＮＳＣＬＣコホートにおいて予後予測因子であるかどうかを考察した。TRACERx100コホート内の試料からの組織病理学的Ｈ＆Ｅスライドから推測されるＴＩＬレベルは、以前に無病生存率と関連付けられている（AbdulJabbar et al., 2020）。したがって、本発明者らは、本明細書に記載の新規のＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率を使用して同様の関連性を確認することができるかどうかを調べた。また、ＴＣＧＡからのデータを使用して同様の調査を行った。
【0153】
最後に、本発明者らは、独自のアプローチを使用して、これらのコホート内のマッチした血液試料中のＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率を定量化した。
【0154】
結果
患者の腫瘍内の免疫コールド領域の数に応じて（≧２の免疫コールド領域。ここで、免疫コールド領域は、ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率≦０．１の領域として定義される）、TRACERx100 ＮＳＣＬＣコホート内の患者を２つの群に分けたところ、有意差が明らかになった。すなわち、観察された２つ以上の免疫コールド領域の存在は、無再発生存率の減少と関連していることが判明した（図１２Ａを参照、ログランク検定Ｐ＝０．００６８、ＨＲ＝２．３）。≧２の免疫コールド領域という閾値は、専門知識に基づいて選択した（例えば、AbdulJabbar et al., 2020を参照）。組織学的特性によってコホートを分けると、この有意性は、主にＬＵＡＤ患者に由来するが、ＬＵＳＣ患者の無再発生存率には有意性がないことが明らかになった（図１２Ｂ、ＬＵＡＤ：Ｐ＝０．００３７、ＨＲ＝４．１；図１２Ｃ、ＬＵＳＣ：Ｐ＝ｎｓ、ＨＲ＝１．１２を参照）。
患者の腫瘍内の免疫コールド領域の数に応じて（≧２の免疫コールド領域。ここで、免疫コールド領域は、ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率≦０．１の領域として定義される）、TRACERx100 ＮＳＣＬＣコホート内の患者を２つの群に分けたところ、有意差が明らかになった。すなわち、観察された２つ以上の免疫コールド領域の存在は、無再発生存率の減少と関連していることが判明した（図１２Ａを参照、ログランク検定Ｐ＝０．００６８、ＨＲ＝２．３）。≧２の免疫コールド領域という閾値は、専門知識に基づいて選択した（例えば、AbdulJabbar et al., 2020を参照）。組織学的特性によってコホートを分けると、この有意性は、主にＬＵＡＤ患者に由来するが、ＬＵＳＣ患者の無再発生存率には有意性がないことが明らかになった（図１２Ｂ、ＬＵＡＤ：Ｐ＝０．００３７、ＨＲ＝４．１；図１２Ｃ、ＬＵＳＣ：Ｐ＝ｎｓ、ＨＲ＝１．１２を参照）。
【0155】
TRACERx100コホートにおけるこの結果は、ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率がＬＵＡＤ患者の無再発生存率と有意な関連性を有することを示唆する。しかし、本発明者らが、ＴＣＧＡ ＬＵＡＤデータセット（表２）における全生存率もＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率に関連するかどうかを評価したところ、ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率＜０．１を有する免疫コールド領域の定義に基づいて患者を２つのカテゴリーに分けたとき、有意な関係性は観察されなかった（図１３、ログランク検定、Ｐ＝ｎｓを参照）。ＴＣＧＡデータセットは単一領域であり、サンプリングバイアスを受け、均一にコールドの領域である腫瘍と単一のコールド領域である腫瘍とを有する患者を区別することができない。TRACERx100と比べたＴＣＧＡコホート内での有意性の欠如は、生存率を予測する際のマルチ領域免疫データの重要性を示唆する。
【0156】
腫瘍試料中のＴＣＲＡ Ｔ細胞浸潤の推定に加えて、ＴＩＬ ＥｘＴＲＥＣＴは、TRACERx100コホートからのマッチした血液試料にも適用することができる。本発明者らは、マッチした血液試料が、それらとペアを成す対応する原発腫瘍試料よりも有意に高いＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率を有することを観察した（図１４参照、ウィルコクソン検定Ｐ＝０．００１２、効果量＝０．１６）。しかし、この割合は、ＤＮＡを含む細胞の割合を反映し、したがって赤血球が考慮される場合、血液中のＴ細胞のこの割合がはるかに低くなることに留意すべきである。特に、腫瘍ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率は、マッチした血液と比較して腫瘍領域で一貫して低いわけではなかった。実際、実質的に半数未満の腫瘍領域（１３９／３３９）は、マッチした血液よりも高いＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率を腫瘍領域内に含んでいた。これを領域レベルではなく患者レベルで要約すると、４４人の患者は、全ての領域で、マッチした血液試料よりもスコアが低く、２４人の患者は、全ての領域で、マッチした血液試料よりもスコアが高く、残りの３２人は不均一であった。本発明者らはまた、腫瘍ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率が、ＬＵＡＤとＬＵＳＣ（ＬＵＡＤ：ρ＝０．３９、Ｐ＝１．２ｅ－０７、ＬＵＳＣ：ρ＝０．４５、Ｐ＝７．８ｅ－０７、図１５を参照）との両方において血液ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率と有意に関連していることを観察した（TRACERx100データを使用。データのマルチ領域性により、１つの血液試料が複数の腫瘍領域にマッチされる）。これは、血液中のＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率と、同じ患者からの腫瘍とが関連していることを示唆する。
【0157】
本発明者らは、TRACERx100コホートを組織学的特性によって分けて、血中ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率が、ＬＵＳＣと比較してＬＵＡＤ患者において有意に高く、（図１６Ａ、左のプロットを参照。ウィルコクソン検定Ｐ＝０．００５３、効果量＝０．２９）、原発腫瘍試料も、ＬＵＳＣ腫瘍と比較してＬＵＡＤにおいて同定されたＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率がより高い（図１６Ａ、右プロットを参照。ウィルコクソン検定、Ｐ＝２．２ｅ－１２、効果量＝０．４２）ことを見出した。同様の結果がＴＣＧＡ腫瘍でも観察され（図１７Ａ～Ｄを参照）、本発明者らは、試料タイプに応じた有意差も見出し、血液中で見られるＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率が原発腫瘍よりも高かった（図１７Ａ及びＢを参照。ウィルコクソン検定、ＬＵＡＤ：Ｐ＜２．２ｅ－１６、効果量＝０．２８、ＬＵＳＣ：Ｐ＜２．２ｅ－１６、効果量＝０．３８）。これらの結果は、強い免疫応答を刺激する腫瘍が、血中を循環するより高いＴ細胞レベルをもたらす可能性があり、又は潜在的に、血中のＴ細胞レベルの上昇により腫瘍内でより強い免疫応答が生じる可能性があることを示唆する。
【0158】
血液試料中のＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率の変化を説明することができる因子をさらに調査するために、本発明者らは、性別及び年齢を含む患者の臨床的特徴を考察した。実際、加齢中のヒト免疫系にはかなりの性的二型性があり（Marquez et al., 2020）、ＣＤ８＋Ｔ細胞含量の減少は、加齢と男性との両方に関連していることに注目した。TRACERx100コホートとＴＣＧＡコホートとの両方に関して、血液試料中のＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率に関して男性患者と女性患者との間に有意差があり、女性においてレベルの増加が見られた（TRACERx100：図１８Ａ、ウィルコクソン検定Ｐ＝０．０２７、効果量＝０．２２。ＴＣＧＡ：図１８Ｂ、ウィルコクソン検定、Ｐ＝１．２ｅ－５、効果量＝０．１２）。年齢の影響は比較的弱かった。TRACERx100コホートは、有意ではないわずかな負の傾向を示し（図１８Ｃを参照：ρ＝－０．０９１、Ｐ＝０．３７）、ＴＣＧＡコホートは、弱いが有意な関連性を示した（図１８Ｄを参照：ρ＝－０．０９５、Ｐ＝０．０１３）。
【0159】
さらなる解析において、本発明者らは、ＬＵＡＤとＬＵＳＣとを別々に解析し、腫瘍内に存在するコールド領域の数に基づいて患者を免疫ホット群とコールド群とのいずれかに分けた。ここでは、全ての腫瘍領域での平均ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率（０．０８１）に基づく単純な閾値を使用し、各閾値で使用されるコールド領域の数を超える腫瘍に解析を限定した。図１６Ｃでの結果は、ＬＵＡＤについて、閾値で使用されるコールド領域の数を増加するにつれて、免疫ホット群とコールド群との間で生存率により大きな有意性が生じることを示している（ＬＵＡＤ：≧２コールド領域、ＨＲ＝３．１、Ｐ＝０．００６３ ログランク検定、ＬＵＡＤ：≧３コールド領域、ＨＲ＝７．３、Ｐ＝０．０００２４ ログランク検定）。対照的に、ＬＵＳＣについては、異なる閾値のいずれについても、免疫コールド群と免疫ホット群との間で生存率に有意差はなかった（図１６Ｃ）。免疫ホット領域又はコールド領域に関する閾値として平均の代わりに中央値（０．０７４）を使用しても同様の結果が得られた（図１６Ｆ）。
【0160】
また、単一領域ＴＣＧＡ ＬＵＡＤコホートにおいて、本発明者らは、ホット腫瘍とコールド腫瘍との間の閾値として平均（０．１１）を使用して、ホット腫瘍とコールド腫瘍との間の生存率における有意性を見出した（全生存率（ＯＳ）：ＨＲ＝０．６１、Ｐ＝０．００４３、無増悪生存率（ＰＦＳ）：ＨＲ＝０．６７、Ｐ＝０．０１６。図１７Ｆを参照）。ＯＳとＰＦＳとの両方について、同様の結果をもたらす様々な可能な閾値があった（図１７Ｈ）。免疫ホット腫瘍及びコールド腫瘍を定義するために同じ閾値を使用すると、ＴＣＧＡ ＬＵＳＣコホートにおけるＯＳ又はＰＦＳのいずれについても生存率との有意な関連性は見られなかった（図１７Ｉ）。
【0161】
次いで、本発明者らは、Cox回帰モデルを使用して、ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率に関係する異なるマルチ領域スコアを使用する連続解析が、同様に生存率に関して予後予測可能であるかどうかを確かめた。本発明者らは、各患者について以下の４つのスコアを選択して研究した：１）全領域にわたる平均ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率（腫瘍での全体的なＴ細胞浸潤の指標となる）、２）全ての領域にわたる最小ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率、３）全ての領域にわたる最大ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率、及び４）最大領域のＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率を、最小領域のＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率の上位９５％信頼区間（０又は非常に小さい数による除算を避けるため）で割った値として定義されるＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率の発散。このスコアは、最大及び最小のＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率を有する領域間の倍率差を表し、高い場合にはＴ細胞の発散／不均一性を示し、おそらく免疫回避を受けたサブクローンを示すことがある。相対領域免疫回避スコアは最小スコアと最大スコアとによって決定されるので、本発明者らは、これらのスコアの両方を含むCoxモデルも構築した。この解析の結果は、図１６Ｄ及び１７Ｇに要約されている最低のＴＣＲＡスコア３２を有する腫瘍領域の重要性と一貫性を保って、腫瘍領域にわたる最小ＴＣＲＡ分画率は、ＴＲＡＣＥＲｘコホート全体で予後予測因子であった（ＨＲ＝０．５２、Ｐ＝０．０４８）。しかし、平均及び最大ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率はいずれのグループでも有意ではなかった。ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率発散スコアは、ＬＵＡＤで有意であった（ＨＲ＝２．２、Ｐ＝０．０２３ ログランク検定）。最小ＴＣＲＡスコアと最大ＴＣＲＡスコアとの両方を含むモデルは、コホート全体（最小：ＨＲ＝０．５、Ｐ＝０．００５、最大：ＨＲ＝１．５、Ｐ＝０．０６１）とＬＵＡＤサブセット（最小：ＨＲ＝０．３６、Ｐ＝０．０１６、最大：ＨＲ＝２．５２、Ｐ＝０．０２９）との両方で有意であった（図１６Ｄを参照）。これは、ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率の不均一性を考察するときに、予測可能性が追加されることを示唆する。ＬＵＳＣでは有意なＴＣＲＡ関連スコアがなく、最大ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率は、最小と組み合わせて、ＬＵＡＤでのみ有意であった。
【0162】
最小及び最大ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率を、腫瘍ステージ、性別、及び年齢などの他の臨床表現型と組み合わせたとき、最小ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率は依然として有意であった（ＨＲ＝０．５２、Ｐ＝０．０２２、図１６Ｅを参照）。全生存率（ＯＳ）と無増悪生存率（ＰＦＳ）との両方について単一領域ＴＣＧＡ生存率データを調べると、単変量Coxモデルでは、ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率はどの比較においても有意ではなく、最も近い関連性はＯＳモデルでのＴＣＧＡ ＬＵＡＤであった（ＨＲ＝０．８５、Ｐ＝０．０６９）。
【0163】
総合して、このデータは、ＴＣＲＡ Ｔ細胞がＬＵＡＤ患者の生存率に関して予後予測因子であることを示唆していると本発明者らは考える。特に、本発明者らは、TRACERx100コホートでは、その小さいサイズにもかかわらず、より強い全体的なシグナルが見られることに注目した。これは、マルチ領域データによって明らかにされる腫瘍内の免疫不均一性の重要性を示す。
【0164】
方法
実施例１～２を参照。
実施例１～２を参照。
【0165】
患者のマルチサンプル腫瘍コホート
ＴＲＡＣＥＲｘコホートを、Watkinsらによって最近提示されたコホートのサブセットと組み合わせることによって、マルチサンプル汎がんコホート（表５を参照）を作成した。腫瘍は、ＴＩＬ ＥｘＴＲＥＣＴを使用してＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率を計算することができる原発腫瘍内に配列決定された少なくとも２つの領域を有する場合に含まれた。したがって、最終的なコホートは、これらの患者についてやはり配列決定された任意の転移試料の追加を含むマルチ領域の原発腫瘍データセットからなっていた。
ＴＲＡＣＥＲｘコホートを、Watkinsらによって最近提示されたコホートのサブセットと組み合わせることによって、マルチサンプル汎がんコホート（表５を参照）を作成した。腫瘍は、ＴＩＬ ＥｘＴＲＥＣＴを使用してＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率を計算することができる原発腫瘍内に配列決定された少なくとも２つの領域を有する場合に含まれた。したがって、最終的なコホートは、これらの患者についてやはり配列決定された任意の転移試料の追加を含むマルチ領域の原発腫瘍データセットからなっていた。
【0166】
【表4】
【0167】
TRACERx100に加えて、以下のデータセットを、最終的なマルチサンプル汎がんコホートに結合した。
１．Brastianos et al.－異なる組織型に由来する脳転移の研究に焦点を当てたコホート。このコホートから、マルチ領域の原発（primary）試料を含む腫瘍のみが含まれた。
２．Gerlinger et al.－明細胞腎がん（ＫＩＲＣ）患者のマルチサンプル原発コホート（primary cohort）。
３．Harbst et al.－皮膚悪性黒色腫（ＳＫＣＭ）患者のマルチ領域の原発コホート。
４．Lamy et al.－膀胱がん患者（ＢＬＣＡ）のマルチ領域の原発コホート。
５．Savas et al.－ＥＲ＋及びトリプルネガティブ乳がん患者（ＢＲＣＡ ＥＲ＋及びＴＮＢＣ）の複数試料コホート。
６．Suzuki et al.－神経膠腫のマルチ領域の原発コホート。
７．Turajlic et al.－明細胞腎がん（ＫＩＲＣ）、腎乳頭がん（ＫＩＲＰ）、及び嫌色素性腎がん（ＫＩＣＨ）患者のマルチ領域の原発コホート。
８．Messaudene et al.－ＨＥＲ２＋及びＥＲ＋乳がん患者のマルチ領域の原発コホート。
１．Brastianos et al.－異なる組織型に由来する脳転移の研究に焦点を当てたコホート。このコホートから、マルチ領域の原発（primary）試料を含む腫瘍のみが含まれた。
２．Gerlinger et al.－明細胞腎がん（ＫＩＲＣ）患者のマルチサンプル原発コホート（primary cohort）。
３．Harbst et al.－皮膚悪性黒色腫（ＳＫＣＭ）患者のマルチ領域の原発コホート。
４．Lamy et al.－膀胱がん患者（ＢＬＣＡ）のマルチ領域の原発コホート。
５．Savas et al.－ＥＲ＋及びトリプルネガティブ乳がん患者（ＢＲＣＡ ＥＲ＋及びＴＮＢＣ）の複数試料コホート。
６．Suzuki et al.－神経膠腫のマルチ領域の原発コホート。
７．Turajlic et al.－明細胞腎がん（ＫＩＲＣ）、腎乳頭がん（ＫＩＲＰ）、及び嫌色素性腎がん（ＫＩＣＨ）患者のマルチ領域の原発コホート。
８．Messaudene et al.－ＨＥＲ２＋及びＥＲ＋乳がん患者のマルチ領域の原発コホート。
【0168】
様々なデータセットにおけるマルチ領域配列決定のためのサブ領域の選択
全てのマルチ領域コホートにおいて、２つの主な基準を念頭に置いて様々な方法（関連の文献を参照）によって領域を選択した。第１の基準は、ゲノム解析という主目的のために、高品質の突然変異及びコピー数解析を保証するために、間質を犠牲にして腫瘍含量を最大化することであり、第２の基準は、各領域が腫瘍の物理的に個別の及び離散した部分を表すことである。これらが別個の位置にない場合には、異なる手段を使用した。例えば、TRACERx100コホートでは、配列決定された領域は、最小で３ｍｍの間隔であった。
全てのマルチ領域コホートにおいて、２つの主な基準を念頭に置いて様々な方法（関連の文献を参照）によって領域を選択した。第１の基準は、ゲノム解析という主目的のために、高品質の突然変異及びコピー数解析を保証するために、間質を犠牲にして腫瘍含量を最大化することであり、第２の基準は、各領域が腫瘍の物理的に個別の及び離散した部分を表すことである。これらが別個の位置にない場合には、異なる手段を使用した。例えば、TRACERx100コホートでは、配列決定された領域は、最小で３ｍｍの間隔であった。
【0169】
実施例４－ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率が、免疫チェックポイント遮断に対する応答を予測可能である
導入
ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率が臨床的に有用であり得る研究領域をさらに調べるために、本発明者らは、ＣＰＩ１０００＋コホートからのデータ（Litchfield et al, 2020）を使用して、免疫チェックポイント遮断に対する応答を予測するためにＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率を利用することができるかどうかを評価した。
導入
ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率が臨床的に有用であり得る研究領域をさらに調べるために、本発明者らは、ＣＰＩ１０００＋コホートからのデータ（Litchfield et al, 2020）を使用して、免疫チェックポイント遮断に対する応答を予測するためにＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率を利用することができるかどうかを評価した。
【0170】
結果
ＣＰＩ１０００＋コホート（Litchfield et al, 2020）マルチ研究データセットは、８つの主要ながん種にわたって抗ＣＴＬ４療法又は抗ＰＤＬ１療法のいずれかを受けたＣＰＩ（チェックポイント阻害薬）治療後の１０７０個の腫瘍からなる（図１９及び表３を参照）。応答は、患者が完全奏効（ＣＲ）又は部分奏効（ＰＲ）を伴う放射線学的応答を示すこととして定義し、一方、非応答群は、ＲＥＣＩＳＴ基準による安定疾患（ＳＤ）又は進行性疾患（ＰＤ）として定義した。表３は、ＷＥＳデータとＲＮＡ－ｓｅｑデータとの両方を含む腫瘍のパーセンテージを詳細に示す。
ＣＰＩ１０００＋コホート（Litchfield et al, 2020）マルチ研究データセットは、８つの主要ながん種にわたって抗ＣＴＬ４療法又は抗ＰＤＬ１療法のいずれかを受けたＣＰＩ（チェックポイント阻害薬）治療後の１０７０個の腫瘍からなる（図１９及び表３を参照）。応答は、患者が完全奏効（ＣＲ）又は部分奏効（ＰＲ）を伴う放射線学的応答を示すこととして定義し、一方、非応答群は、ＲＥＣＩＳＴ基準による安定疾患（ＳＤ）又は進行性疾患（ＰＤ）として定義した。表３は、ＷＥＳデータとＲＮＡ－ｓｅｑデータとの両方を含む腫瘍のパーセンテージを詳細に示す。
【0171】
【表5】
【0172】
ＣＰＩに対する応答を予測する際の腫瘍ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率の重要性と一貫性を保って、本発明者らは、コホート全体にわたって応答群と非応答群との間のＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率の有意差を観察した（図２０を参照、Ｐ＝２．３ｅ－７、効果量＝０．１７）。応答群に関する腫瘍ＤＮＡ試料中のＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率の中央値は０．０５３（Ｑ１＝０、Ｑ３＝０．１７）であり、一方、非応答群では０．０００２６８（Ｑ１＝０、Ｑ３＝０．０８４）であった。免疫コールド腫瘍（ここでは、＜０．１のＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率を有する腫瘍として定義される）に関しては、非応答群において非常に有意に高かった（図２１、免疫コールド腫瘍は点線よりも下の腫瘍、７８％対６３％、Fisherの正確な検定、オッズ比（ＯＲ）＝０．４７、Ｐ＝２．２５ｅ－０６）。
【0173】
変異負荷（高：総クローン性ＴＭＢ≧６８、低：クローン性ＴＭＢ＜６８）と免疫微小環境（ホット：ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率≧０．０１６、コールド：ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率＜０．０１６）との両方によってコホートを分けると、ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率と応答との関連性は、変異負荷とは無関係であることが分かる（図２１を参照）。低い変異負荷の患者では、免疫ホット腫瘍の応答率は２１％であるのに対し、免疫コールド腫瘍の応答率は８％である。高い変異負荷の腫瘍では、腫瘍が免疫ホットの場合には４５％の応答率であり、コールドの場合には３０％の応答率である。
【0174】
ＲＮＡ－ｓｅｑベースの測定と比較したＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率の有用性をさらに評価するために、ＲＮＡ－ｓｅｑとＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率との両方を有する個々のがん種に由来する１０個よりも多い試料を用いた全ての研究を、単変量メタ解析のために選択した（図２２を参照。７つの研究及び５つのがん種にわたる５５７人の患者）。予想通り、ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率（オッズ比（ＯＲ）＝１．３９、Ｐ＝０．００８５８）、クローン性ＴＭＢ（ＯＲ＝１．５９、Ｐ＝６．０２１ｅ－０５）、及びＣＤ８Ａ発現（ＯＲ＝１．４５、Ｐ＝０．０００４４７９）は全て、応答と有意に関連することが分かった。血液からのＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率も腫瘍純度も、応答と有意な関連性は見られず、腫瘍と血液のＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率の差は有意傾向があった（ＯＲ＝１．２７、Ｐ＝０．０１６）。
【0175】
次いで、本発明者らは、腫瘍ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率がＴＭＢ（腫瘍変異負荷）に勝る追加の臨床的有用性を提供するかどうか、さらにそれがＣＤ８Ａ発現などのＲＮＡ－ｓｅｑ尺度よりも大きく応答の予測を改善するかどうかを評価した。本発明者らは、患者が応答群であるか非応答群であるかを予測するために４つの一般化線形モデル（ＧＬＭ）を作成した。第１のモデルは、クローン性ＴＭＢのみからなり、第２及び第３のモデルは、クローン性ＴＭＢをＣＤ８Ａ ＲＮＡ－ｓｅｑ発現又はＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率と組み合わせて使用した。第４のモデルは、ＣＤ８Ａ発現及びＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率の両方と組み合わせたクローン性ＴＭＢを使用した。ＣＤ８Ａ発現又はＴＣＲＡのいずれかを使用すると、モデルの予測値が改善された（図２３を参照。クローン性ＴＭＢ単独の場合の０．６２と比較して、ＣＤ８Ａ発現ではＡＵＣ＝０．６６、ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率ではＡＵＣ＝０．７０）。しかし、これらのうち、クローン性ＴＭＢ＋ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率に関するモデル（ＲＯＣ検定、Ｐ＝０．００２８、ＧＬＭ：クローン性ＴＭＢ＋ＴＣＲＡ、ＡＵＣ＝０．６８、ＧＬＭ：クローン性ＴＭＢ、ＡＵＣ＝０．６２）のみが、クローン性ＴＭＢ単独と比較して有意であった。ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率をＣＤ８Ａ発現と組み合わせても、モデルの予測値を有意に増加させることはできなかった（図２３を参照。クローン性ＴＭＢ＋ＴＣＲＡモデルＰ＝０．７２に対して、ＡＵＣ＝０．６８、ＲＯＣ検定）。しかし、４つのモデル全ての変数の有意性を調べると、ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率はＣＤ８Ａよりも有意であり（ＧＬＭ：クローン性ＴＭＢ＋ＴＣＲＡ、Ｐ＝４．６２ｅ－０５；ＧＬＭ：クローン性ＴＭＢ＋ＣＤ８Ａ、Ｐ＝０．０００４３１）、単一モデルに結合されるとき、ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率は依然として有意であったが、ＣＤ８Ａ発現は有意でなかった（ＴＣＲＡ、Ｐ＝０．００６０１、ＣＤ８Ａ、Ｐ＝０．０６２４６）。
【0176】
まとめると、これらの結果は、腫瘍ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率をＣＤ８＋浸潤のＲＮＡ－ｓｅｑ尺度の代替として使用することができ、さらに、ＷＥＳベースのＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率推定がＴＭＢ推定量に予後予測値を追加することを示唆する。
【0177】
多くの場合にはＲＮＡ－ｓｅｑが利用可能でないことを考慮して、本発明者らは次に、複合ＮＳＣＬＣ ＣＰＩコホートにおけるＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率の予測可能性を評価した（表４を参照）。図２４Ａは、ＷＥＳでアッセイされた２６６人の患者を含むこのコホートの概要を提供し、重要なことに、ＲＮＡ－ｓｅｑ又は他の直交免疫尺度を含んでいない。単変量解析を実行したこの肺ＣＰＩコホートの解析（図２４Ｂを参照）から、ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率（ＯＲ＝１．４４、Ｐ＝０．００５）及び血液ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率（ＯＲ＝１．３９、Ｐ＝０．００１５）は、ＣＰＩに対する応答と有意に関連することが分かった。個々の研究については、ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率が、HellmanコホートとShimコホートとの両方でＯＲ＞１を有していたが、Rizviコホートでは有さず、対照的に、血液ＴＣＲＡは、３つの個別の研究全てでＯＲ＞１を有していた。これらの結果は、ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率をＷＥＳデータのみから計算することができること、並びにＮＳＣＬＣ及びマッチした血液からのそのような推定量が免疫療法に対する応答の予測因子であることを示す。
【0178】
【表6】
【0179】
方法
実施例１～２を参照。
実施例１～２を参照。
【0180】
ＣＰＩ１０００＋コホートのメタ解析
ＣＰＩ１０００＋コホートは、Litchfield et al. (2020)に詳細に述べられており、以下のデータセットを含む。
１．Snyder et al.（Snyder et al., 2014）、進行性悪性黒色腫の抗ＣＴＬＡ－４治療後のコホート。
２．Van Allen et al.（Van Allen et al., 2016）、進行性悪性黒色腫の抗ＣＴＬＡ－４治療後のコホート。
３．Hugo et al.（Hugo et al., 2016）、進行性悪性黒色腫の抗ＰＤ－１治療後のコホート。
４．Riaz et al.（Riaz et al., 2017）、進行性悪性黒色腫の抗ＰＤ－１治療後のコホート。
５．Cristescu et al.（Cristescu et al., 2018）、進行性悪性黒色腫の抗ＰＤ－１治療後のコホート。
６．Cristescu et al.（Cristescu et al., 2018）、進行性頭頸部がんの抗ＰＤ－１治療後のコホート。
７．Cristescu et al.（Cristescu et al., 2018）、抗ＰＤ－１で治療後の「他の全ての腫瘍タイプ」のコホート（ＫＥＹＮＯＴＥ－０２８及びＫＥＹＮＯＴＥ－０１２研究から）。
８．Snyder et al.（Snyder et al., 2017）、転移性尿路上皮がんの抗ＰＤ－Ｌ１治療後のコホート。
９．Mariathasan et al.（Mariathasan et al., 2018）、転移性尿路上皮がんの抗ＰＤ－Ｌ１治療後のコホート。
１０．McDermot et al.（McDermott etal., 2018）、転移性腎細胞がんの抗ＰＤ－Ｌ１治療後のコホート。
１１．Rizvi et al.（Rizvi et al., 2015）、非小細胞肺がんの抗ＰＤ－１治療後のコホート。
１２．Hellman et al.、Litchfield et al., 2020によって使用された抗ＰＤ－１治療後の非小細胞肺がん試料のコホート。
１３．Le et al.（Le et al., 2015）、抗ＰＤ－１療法での治療後の大腸がんコホート。
ＣＰＩ１０００＋コホートは、Litchfield et al. (2020)に詳細に述べられており、以下のデータセットを含む。
１．Snyder et al.（Snyder et al., 2014）、進行性悪性黒色腫の抗ＣＴＬＡ－４治療後のコホート。
２．Van Allen et al.（Van Allen et al., 2016）、進行性悪性黒色腫の抗ＣＴＬＡ－４治療後のコホート。
３．Hugo et al.（Hugo et al., 2016）、進行性悪性黒色腫の抗ＰＤ－１治療後のコホート。
４．Riaz et al.（Riaz et al., 2017）、進行性悪性黒色腫の抗ＰＤ－１治療後のコホート。
５．Cristescu et al.（Cristescu et al., 2018）、進行性悪性黒色腫の抗ＰＤ－１治療後のコホート。
６．Cristescu et al.（Cristescu et al., 2018）、進行性頭頸部がんの抗ＰＤ－１治療後のコホート。
７．Cristescu et al.（Cristescu et al., 2018）、抗ＰＤ－１で治療後の「他の全ての腫瘍タイプ」のコホート（ＫＥＹＮＯＴＥ－０２８及びＫＥＹＮＯＴＥ－０１２研究から）。
８．Snyder et al.（Snyder et al., 2017）、転移性尿路上皮がんの抗ＰＤ－Ｌ１治療後のコホート。
９．Mariathasan et al.（Mariathasan et al., 2018）、転移性尿路上皮がんの抗ＰＤ－Ｌ１治療後のコホート。
１０．McDermot et al.（McDermott etal., 2018）、転移性腎細胞がんの抗ＰＤ－Ｌ１治療後のコホート。
１１．Rizvi et al.（Rizvi et al., 2015）、非小細胞肺がんの抗ＰＤ－１治療後のコホート。
１２．Hellman et al.、Litchfield et al., 2020によって使用された抗ＰＤ－１治療後の非小細胞肺がん試料のコホート。
１３．Le et al.（Le et al., 2015）、抗ＰＤ－１療法での治療後の大腸がんコホート。
【0181】
これらの研究のうち、Snyder et al.（Snyder et al., 2017）は、ＴＣＲＡ遺伝子内のカバレッジが非常に不良であったため、解析から除外した。全ての試料を、純度及びコピー数データを有するbwa mem（v0.7.15）を使用してｈｇ１９にアライメントし、Litchfield et al. (2020)に記載されているようにASCATから計算した。特に、１００８／１１２５（９０％）の試料がＷＥＳデータを有し、９４１／１１２５（８３％）の試料が、コピー数計算を可能にするのに十分な純度及びカバレッジを有し、ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率を計算できるようにした。これらの試料のうち８３３／１１２５（７４％）は、マッチしたＲＮＡ－ｓｅｑデータを有し、Ｔ細胞推定量の直交評価が可能であった。このデータセットの拡張に関して（Shim et al.（Shim etal., 2020））、ＮＳＣＬＣ抗ＰＤ－１治療後のコホートを特異的ＮＳＣＬＣ解析のために追加した。
【0182】
ＣＰＩ応答に関する単変量及び多変量モデル
単変量モデルでは、Litchfield et al. (2020)からの適応された手順に従った。主な違いは、完全なデータ（ＣＤ８Ａ、クローン性ＴＭＢ、及びＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率に関するＲＮＡ－ｓｅｑ）を有する試料のみを含めたことである。単変量モデルのメタ解析は、Ｒパッケージ「meta」（バージョン4.13-0）を使用して行った。多変量モデルは、デフォルト値を使用する「stats」Ｒパッケージからの関数「glm」を使用して、一般化線形モデルで作成した。ＲＯＣ曲線解析のためにＲパッケージ「ROCR」（バージョン1.0-11）を使用した。
単変量モデルでは、Litchfield et al. (2020)からの適応された手順に従った。主な違いは、完全なデータ（ＣＤ８Ａ、クローン性ＴＭＢ、及びＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率に関するＲＮＡ－ｓｅｑ）を有する試料のみを含めたことである。単変量モデルのメタ解析は、Ｒパッケージ「meta」（バージョン4.13-0）を使用して行った。多変量モデルは、デフォルト値を使用する「stats」Ｒパッケージからの関数「glm」を使用して、一般化線形モデルで作成した。ＲＯＣ曲線解析のためにＲパッケージ「ROCR」（バージョン1.0-11）を使用した。
【0183】
実施例５－血液、正常組織、及び悪性組織中のＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率の決定因子
以前の解析は必然的に腫瘍組織内のＴ細胞浸潤に焦点を当てているが、本明細書に記載のＴＩＬ ＥｘＴＲＥＣＴ法は、ＷＥＳを受けた任意の試料中のＴ細胞浸潤を調べる機会を提供する。したがって、本実施例では、本発明者らは、様々な試料タイプでのＴ細胞免疫浸潤の主要な決定因子を評価するための解析を行った。
以前の解析は必然的に腫瘍組織内のＴ細胞浸潤に焦点を当てているが、本明細書に記載のＴＩＬ ＥｘＴＲＥＣＴ法は、ＷＥＳを受けた任意の試料中のＴ細胞浸潤を調べる機会を提供する。したがって、本実施例では、本発明者らは、様々な試料タイプでのＴ細胞免疫浸潤の主要な決定因子を評価するための解析を行った。
【0184】
結果
本発明者らはまず、腫瘍解析のための正常対照として採取された血液中のＴ細胞浸潤の程度を調べた。TRACERx100コホート内では、血液中のＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率は男性に比べて女性で有意に高く、腫瘍試料ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率と血液ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率との間に有意な正の関係が観察された（図１６Ｂ、組織学的特性：Ｐ＝０．０６６、ＥＳ＝０．１９；性別：Ｐ＝０．００５７、ＥＳ＝０．２８；平均腫瘍浸潤：ρ＝０．４２、Ｐ＝１．７ｅ－０５）。これらのデータは、腫瘍免疫浸潤が、循環する血液中のＴ細胞レベルに影響を及ぼす可能性があることを示唆する。性別及び平均腫瘍浸潤は、ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率の有意な単変量予測子であり、喫煙状況、年齢、組織学的特性を加味する血中ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率を予測する線形モデルでも依然として有意であった。対照的に、多変量モデルでは、ＬＵＡＤ患者とＬＵＳＣ患者との間で血液中のＴ細胞浸潤に有意差は観察されなかった。本発明者らはまた、ＴＣＧＡ ＬＵＡＤ及びＬＵＳＣコホートから採取したマッチした血液試料を解析し、血液中のＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率を予測する線形モデルにおいて性別及び腫瘍組織学的特性が強い関連性を示すという同様の結果を見出した（図１７Ｅ）。
本発明者らはまず、腫瘍解析のための正常対照として採取された血液中のＴ細胞浸潤の程度を調べた。TRACERx100コホート内では、血液中のＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率は男性に比べて女性で有意に高く、腫瘍試料ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率と血液ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率との間に有意な正の関係が観察された（図１６Ｂ、組織学的特性：Ｐ＝０．０６６、ＥＳ＝０．１９；性別：Ｐ＝０．００５７、ＥＳ＝０．２８；平均腫瘍浸潤：ρ＝０．４２、Ｐ＝１．７ｅ－０５）。これらのデータは、腫瘍免疫浸潤が、循環する血液中のＴ細胞レベルに影響を及ぼす可能性があることを示唆する。性別及び平均腫瘍浸潤は、ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率の有意な単変量予測子であり、喫煙状況、年齢、組織学的特性を加味する血中ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率を予測する線形モデルでも依然として有意であった。対照的に、多変量モデルでは、ＬＵＡＤ患者とＬＵＳＣ患者との間で血液中のＴ細胞浸潤に有意差は観察されなかった。本発明者らはまた、ＴＣＧＡ ＬＵＡＤ及びＬＵＳＣコホートから採取したマッチした血液試料を解析し、血液中のＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率を予測する線形モデルにおいて性別及び腫瘍組織学的特性が強い関連性を示すという同様の結果を見出した（図１７Ｅ）。
【0185】
次いで、本発明者らは、上で及び表２で述べたように、ＴＣＧＡからのより低いカバレッジを有する独立したＮＳＣＬＣデータセットでＴ細胞ＥｘＴＲＥＣＴを評価した。ＬＵＡＤ及びＬＵＳＣ ＴＣＧＡ患者からの血液試料で、広く一貫した結果が観察された（図１７Ｅ）。
【0186】
血液でのＴ細胞浸潤に影響を及ぼし得る別の因子は、体内の他の場所でのウイルス又は細菌感染の存在である。この仮説を調べるために、本発明者らは、Poore et al.に提示されたデータを使用し、バイオインフォマティクスツールKRAKENを使用して、ＬＵＡＤ及びＬＵＳＣ ＴＣＧＡコホートからのＷＧＳ血液試料及びＲＮＡ－ｓｅｑ腫瘍試料からのマイクロバイオームリードの数を定量化した。本発明者らは、微生物リード数が多い血液試料（中央値６．８１より大きい）が、数が少ない群よりも有意に高い血中ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率を有することを観察した（図２７Ａ、Ｐ＝０．０００９２、ＥＳ＝０．３１、ウィルコクソン検定）。対照的に、総微生物リード数と腫瘍ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率との間に関連性は観察されなかった。これは、ウイルス又は細菌の存在ががんで見られるＴ細胞分画率のレベルを引き上げないことを示唆する（図２７Ｂ、Ｐ＝ｎ．ｓ）。次いで、本発明者らは、個々の種のレベルで、ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率に関連するウイルス又は細菌が存在するかどうかを検査した（「方法」を参照）。血液試料について複数の仮説を調整した後でも、有意な関連性はなかった。腫瘍試料については、ＬＵＡＤ腫瘍とＬＵＳＣ腫瘍とに関し、それぞれウィリアムシア属（genus Williamsia）及びパエニクロストリジウム属（genus Paeniclostridium）の細菌について１件のヒットがあった（図２７Ｃ及び２８Ｇ、ＬＵＡＤでのウィリアムシア（Williamsia）：ρ＝－０．１７、Ｐ＝０．０００１１、ＦＤＲ Ｐ＝０．０１３、図２７Ｄ及び２８Ｇ、ＬＵＳＣでのパエニクロストリジウム（Paeniclostridium）：ρ＝－０．２、Ｐ＝０．０００１３、ＦＤＲ Ｐ＝０．０１５）。しかし、これらはどちらも、ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率がより低い場合、正規化されたｌｏｇ－ｃｐｍ値が高い数値であった。これは、これらの細菌種の存在がＴ細胞浸潤の増加をもたらさないことがあり、免疫コールド腫瘍微小環境を利用する日和見種であり得ることを示唆する。
【0187】
血中ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率の重要な決定因子をさらに理解するために、本発明者らは、血液と生理学的に正常な食道上皮（ＰＮＥ）組織との両方に由来するＷＥＳ配列決定試料を調べた。特に、本発明者らは、Yokyama et al.に記載されているように、生理学的に正常な食道上皮（ＰＮＥ）組織に由来する顕微解剖されたＷＥＳ配列決定試料を含むデータセットを検査した。ここで、血液試料中で広範なＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率が計算されたが、ＰＮＥ組織の大部分は、検出可能なＴ細胞浸潤を有さなかった（図２８Ａ、図２８Ｈ）。参加者をＰＮＥ試料中のＴ細胞浸潤の有無に応じて分けると、血中ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率との有意な関連性が明らかになり（図２８Ｂ、Ｐ＝０．０２１、ＥＳ＝０．２９）、ここでも腫瘍試料と同様に、正常組織での高レベルのＴ細胞浸潤が、血液中で見られるＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率に影響を及ぼすことが示された。血液中のＴ細胞分画率を予測する線形モデルでは、正常組織での浸潤レベルのみが有意に独立して予測因子であった（図２８Ｃ）。別個の線形モデルでは、正常組織変異負荷又はがんドライバ変異状態などのゲノム因子は、ＰＮＥ組織でのＴ細胞浸潤の予測因子でないことが分かった（図２８Ｆ）。これは、検出されたＴ細胞浸潤が、進行中の免疫監視によるものではなく、微生物感染の存在によるものであり得ることを示唆する。
【0188】
腫瘍組織でのＴ細胞浸潤に影響を及ぼす因子をさらに評価するために、本発明者らは、最近発表された複数試料データの汎がんコホート（Watkins et al.）を利用し、同じ腫瘍の異なる領域が異なるレベルの免疫浸潤を示し得る程度、及びこの相違に関してゲノム塩基を同定することができるかどうかを調査した。本発明者らは、合計で、１４のがん種の１８２の腫瘍から、７３９の腫瘍領域でのＴ細胞浸潤を評価することができた（表５を参照）。
【0189】
コホートにわたって様々なＴ細胞浸潤が観察された（図２９Ａ、範囲０～５８％）。興味深いことに、配列決定された細胞を５１％含む３番目に高いスコアは、患者ＲＭＨ００２からのＫＩＲＣ腫瘍の単一領域内のＴ細胞を表すことが判明した。特に、患者ＲＭＨ００２は、腎摘出術前に抗血管新生薬スニチニブで１４週間治療されており、スニチニブ治療は、ＫＩＲＣ腫瘍でのＴ細胞浸潤を増加させることが示されている（Haywood et al.）。腫瘍内のＴ細胞湿潤の多様性の程度を定量化するために、本発明者らは、計算されたＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率が全ての領域にわたって均一にホットであるかどうか（本明細書では、全ての領域で、コホート内の平均ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率が≧０．１１であると定義する）、均一にコールドであるかどうか（全ての領域で＜０．１１であると定義する）、又はＴ細胞分画率が不均一であるかどうかに基づいて、各腫瘍を３つのカテゴリーのうちの１つに分類した。がん種によって評価された、均一にホット、均一にコールド、及び不均一な免疫浸潤を有する腫瘍の割合には有意差があり（図２９Ｂ、カイ自乗検定：Ｐ＝１．６２ｅ－０７）、ＢＲＣＡ ＥＲ＋腫瘍が最も不均一であり（８３％）、ＬＵＳＣ腫瘍が最小の不均一性であった（２２％）。また、免疫浸潤の程度、及びがん種にわたる異なる免疫群のカテゴリー「均一にホット」、「均一にコールド」、又は「不均一」の割合にも明らかな差があった。例えば、ＢＬＣＡとＬＵＳＣとは同程度の数の不均一な腫瘍を含んでいたが（３６％対３７％）、ＢＬＣＡ腫瘍の約６４％が均一にホットであり、０％が均一にコールドであった。一方、ＬＵＡＤでは、３７％の腫瘍が均一にコールドであり、２５％が均一にホットであった。これは、特定のがん種、とりわけＢＲＣＡ ＥＲ＋、ＢＲＣＡ ＨＥＲ＋、ＬＵＡＤ、及びＫＩＲＣに関して、非常に局所的な免疫浸潤が存在し、かなりのサンプリングバイアスを受ける可能性があることを示唆する。
【0190】
次に、本発明者らは、ゲノム多様性と免疫多様性との間に関係があるかどうかを検査し、単一の腫瘍内で不均一な免疫応答をもたらし得る潜在的なメカニズムとして、サブクローン性ＳＣＮＡの不均一性を調査した。本発明者らはまず、少なくとも３つの試料と、Ｔ細胞分画率の不均一な混合とを含む腫瘍に解析を限定した（「方法」を参照）。任意の２つの領域間でのペアワイズＳＣＮＡ不均一性を、いずれかの領域に一意のＳＣＮＡを有するゲノムの割合の合計として計算した。図２９Ｃは、ペアワイズ解析により、腫瘍内でＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率のより大きな差を有する領域のペア（≧全てのペアワイズ距離の平均０．０６５）が、より高いレベルのペアワイズＳＣＮＡ不均一性を有する可能性がより高いことを示す（全ての事象：Ｐ＝０．０００２１、効果量＝０．３５２；利得事象：Ｐ＝０．００４５、効果量＝０．３２４；損失又はＬＯＨ事象：Ｐ＝０．０２４、効果量＝０．２５７、ｎ＝７７）。
【0191】
次に、任意の特定のサブクローンＳＣＮＡ事象が免疫欠失又は活性化と関連しているかどうかを調べるために、本発明者らは、全汎がんの複数試料コホートでの３０を超える腫瘍においてサブクローン性で損失又は利得を受けたサイトバンド領域を特定し（図２９Ｄ）、これらの損失又は利得事象がＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率の変化と関連しているかどうかを試験した。１つのサイトバンドレベル事象のみ、すなわち１２ｑ２４．３１－３２のサブクローン性損失のみが、ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率の減少と有意に関連することが分かった（図２９Ｅ：Ｐ＝１．３ｅ－０５、効果量＝０．７３５）。
【0192】
この効果が単一の遺伝子によるものであるかどうかを決定するために、本発明者らは、TRACERx100コホート内で１２ｑ２４．３１－３２のサブクローン性損失を有する腫瘍を選択し、関連するＲＮＡ－ｓｅｑデータに対して差次的遺伝子発現解析を実行した。１６１６８個の遺伝子を試験した後、複数試験補正後に以下の８個のみが有意に残った：ＳＰＰＬ３、Ｃ１２ｏｒｆ７６、ＬＹＲＭ９、ＣＩＴ、ＵＢＥ３Ｂ、ＡＢＣＢ９、ＯＧＦＯＤ２、及びＵＳＰ３０（図２９Ｆ）。特に、ＳＰＰＬ３は、最も有意な遺伝子であり、ＡＢＣＢ９及びＯＧＦＯＤ２と共に１２ｑ２４．３１に位置する。ＳＰＰＬ３は、細胞表面のスフィンゴ糖脂質を上方制御するＢ３ＧＮＴ５酵素活性を増強し、それによりクラスＩ ＨＬＡ機能を妨げ、ＣＤ８＋Ｔ細胞活性化を低下させることが最近判明している（Jongsma et al.）。したがって、これらのデータは、１２ｑ２４．３１のサブクローン性損失が、免疫回避のメカニズムとして、がん種にわたる腫瘍の進展（コホート内の腫瘍の１８．７％又は３４／１８２で生じる）の際に選択され得ることを示唆する。
【0193】
方法
実施例１～４を参照。
実施例１～４を参照。
【0194】
KRAKEN ＴＣＧＡ解析
Poore et al.によって行われたKRAKEN（Wood & Salzberg）解析から出力された前処理されたマイクロバイオームデータを、ftp://ftp.microbio.me/pub/cancer_microbiome_analysis/からダウンロードした。
Poore et al.によって行われたKRAKEN（Wood & Salzberg）解析から出力された前処理されたマイクロバイオームデータを、ftp://ftp.microbio.me/pub/cancer_microbiome_analysis/からダウンロードした。
【0195】
血液試料と腫瘍試料との両方に関する高及び低KRAKENマイクロバイオーム群を作成するために、正規化されたｌｏｇ－ｃｐｍ値を含むファイルKraken－TCGA－Voom－SNM－Most－Stringent－Filtering－Data.csvをダウンロードし、各試料ごとに行を加算し、全体的な「マイクロバイオーム」スコアを得た。次いで、このスコアの中央値に基づいて、試料を高群と低群に分けた。
【0196】
ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率に影響を及ぼす任意の個々の微生物種の役割を調査するために、生データファイルKraken－TCGA－Raw－Data－17625－Samples.csvから呼び出されるＴＣＧＡ ＬＵＡＤ及びＬＵＳＣコホートにおいて合計で１０００個未満の生のリードを有する全ての種を除去することによって、Kraken－TCGA－Voom－SNM－Most－Stringent－Filtering－Data.csvファイルからの種の縮小リストを選択した。これにより合計で５９の微生物種が残り、これらを、ＬＵＡＤとＬＵＳＣの両方での血液及び腫瘍試料に関してSpearmanの相関を使用して、ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率との関連性について個別に検査した。
【0197】
汎がんの複数試料コホートにおける利得、損失、及びＬＯＨ事象の特定
全エクソーム配列決定の解析を、Jamal－Hanjani et al.に以前に記載されているように行った。各試料ごとのコピー数セグメンテーション、腫瘍純度、及び倍数性を、以前に記載されているように（Jamal－Hanjani et al.）、ASCAT（Van Loo et al.）を使用して推定した。これらのデータを複数試料ＳＣＮＡ推定アプローチへの入力として使用して、ヘテロ接合性の損失の存在、並びに試料の倍数性に対する損失、中立、利得、及び増幅コピー数状態について、ゲノム全体の推定量を生成した。腫瘍の全ての試料で≧５の対数比値を有する各コピー数セグメントに存在する対数比値を、Ｐ＜０．０１の閾値を有する片側ｔ検定を使用して、試料倍数調整した３つの対数比閾値と比較して検査した。これらの対数比閾値は、二倍体腫瘍において、損失の場合には＜ｌｏｇ２［１．５／２］、利得の場合には＞ｌｏｇ２［２．５／２］に相当した。損失又は利得として分類されなかったセグメントは中立として分類した。各セグメントについて、倍数性の定義に対するこれらの値を、単一の腫瘍からの全ての試料にわたるヘテロ接合性検出の損失と組み合わせた。
全エクソーム配列決定の解析を、Jamal－Hanjani et al.に以前に記載されているように行った。各試料ごとのコピー数セグメンテーション、腫瘍純度、及び倍数性を、以前に記載されているように（Jamal－Hanjani et al.）、ASCAT（Van Loo et al.）を使用して推定した。これらのデータを複数試料ＳＣＮＡ推定アプローチへの入力として使用して、ヘテロ接合性の損失の存在、並びに試料の倍数性に対する損失、中立、利得、及び増幅コピー数状態について、ゲノム全体の推定量を生成した。腫瘍の全ての試料で≧５の対数比値を有する各コピー数セグメントに存在する対数比値を、Ｐ＜０．０１の閾値を有する片側ｔ検定を使用して、試料倍数調整した３つの対数比閾値と比較して検査した。これらの対数比閾値は、二倍体腫瘍において、損失の場合には＜ｌｏｇ２［１．５／２］、利得の場合には＞ｌｏｇ２［２．５／２］に相当した。損失又は利得として分類されなかったセグメントは中立として分類した。各セグメントについて、倍数性の定義に対するこれらの値を、単一の腫瘍からの全ての試料にわたるヘテロ接合性検出の損失と組み合わせた。
【0198】
ペアワイズサブクローン性ＳＣＮＡスコア
ペアワイズサブクローン性ＳＣＮＡ尺度を計算するために、前の方法セクションで概説した分類を使用して、ペアワイズサブクローン性ＳＣＮＡスコアの３つの群を作成した。まず、本発明者らは、倍数性又はＬＯＨに対する利得又は損失のいずれかによって影響を及ぼされるセグメントを異常とみなし、単一患者の疾患からの領域の各ペアを比較し、両方の試料で異常である場合には異常領域をクローン性として分類し、一方のみの試料で異常である場合にはサブクローン性として分類した。これと同じプロセスを、倍数性に対する利得に関してのみ繰り返し、次いで倍数性及びＬＯＨに対する損失を合わせて検討した。
ペアワイズサブクローン性ＳＣＮＡ尺度を計算するために、前の方法セクションで概説した分類を使用して、ペアワイズサブクローン性ＳＣＮＡスコアの３つの群を作成した。まず、本発明者らは、倍数性又はＬＯＨに対する利得又は損失のいずれかによって影響を及ぼされるセグメントを異常とみなし、単一患者の疾患からの領域の各ペアを比較し、両方の試料で異常である場合には異常領域をクローン性として分類し、一方のみの試料で異常である場合にはサブクローン性として分類した。これと同じプロセスを、倍数性に対する利得に関してのみ繰り返し、次いで倍数性及びＬＯＨに対する損失を合わせて検討した。
【0199】
サイトバンドレベルＳＣＮＡ解析
腫瘍間での比較を可能にするために、セグメントをｈｇ１９サイトバンドにマッピングした。複数のセグメントがサイトバンドにマッピングされる場合、サイトバンドとの最大の重複を有するセグメントのＳＣＮＡ状態（倍数性に対する利得又は損失）を選択した。ＳＣＮＡ利得及び損失解析に関して、サイトバンドレベル事象がコホート全体にわたって３０回を超えてサブクローン性で発生した場合、それらを選択した。次いで、同じ領域内でこの閾値を通るバンド（例えば、１ｐ３６上の全てのサイトバンド）を共にグループ化した。対応のあるウィルコクソン検定を使用して、サブクローン性ＳＣＮＡ事象を有する単一患者内の腫瘍領域が、事象のない領域に対してＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率の有意差を有するかどうかを評価した。
腫瘍間での比較を可能にするために、セグメントをｈｇ１９サイトバンドにマッピングした。複数のセグメントがサイトバンドにマッピングされる場合、サイトバンドとの最大の重複を有するセグメントのＳＣＮＡ状態（倍数性に対する利得又は損失）を選択した。ＳＣＮＡ利得及び損失解析に関して、サイトバンドレベル事象がコホート全体にわたって３０回を超えてサブクローン性で発生した場合、それらを選択した。次いで、同じ領域内でこの閾値を通るバンド（例えば、１ｐ３６上の全てのサイトバンド）を共にグループ化した。対応のあるウィルコクソン検定を使用して、サブクローン性ＳＣＮＡ事象を有する単一患者内の腫瘍領域が、事象のない領域に対してＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率の有意差を有するかどうかを評価した。
【0200】
不均一な免疫浸潤を有する複数試料腫瘍の選択
腫瘍を含めるには、少なくとも３つの領域が配列決定されており、以下の２つの要件を満たさなければならなかった。１）ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率の差が≧０．１であると定義される免疫浸潤の大きな変化を有する１対の領域を有すること、及び２）ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率の差が０．１未満であると定義される免疫浸潤の小さな変化を有する又は変化が全くない１対の領域を有すること。この要件に合う腫瘍の一例は、それぞれ０．０１、０．０１、及び０．２のＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率を有する３つの領域Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３を有する腫瘍である。Ｒ１－Ｒ２ペアは、ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率の差が０であり、Ｒ１－Ｒ３ペアとＲ２－Ｒ３ペアとはどちらも大きな差０．１９を有する。マルチサンプル腫瘍コホート内で、５８人の患者がこれらの基準に合致した。
腫瘍を含めるには、少なくとも３つの領域が配列決定されており、以下の２つの要件を満たさなければならなかった。１）ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率の差が≧０．１であると定義される免疫浸潤の大きな変化を有する１対の領域を有すること、及び２）ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率の差が０．１未満であると定義される免疫浸潤の小さな変化を有する又は変化が全くない１対の領域を有すること。この要件に合う腫瘍の一例は、それぞれ０．０１、０．０１、及び０．２のＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率を有する３つの領域Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３を有する腫瘍である。Ｒ１－Ｒ２ペアは、ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率の差が０であり、Ｒ１－Ｒ３ペアとＲ２－Ｒ３ペアとはどちらも大きな差０．１９を有する。マルチサンプル腫瘍コホート内で、５８人の患者がこれらの基準に合致した。
【0201】
サブクローン性１２ｑ２４．３１－３２損失を有する患者に関するＲＮＡ－ｓｅｑ差次的遺伝子発現解析
サブクローン性１２ｑ２４．３１－３２損失を有するTRACERx100 ＲＮＡ－ｓｅｑ患者に対して、差次的遺伝子発現解析を行った。Ｒ４．０．０を使用して、最初にedgeRＲパッケージ（バージョン3.32.1）を、試料固有のＴＭＭ（Ｍ値のトリム平均）正規化に使用し、次いで、標準のedgeRフィルタリング法を使用して、低い発現を有する遺伝子をフィルタ除去し、その後、limmaＲパッケージ（バージョン3.46.0）からのLimma－Voom法を使用してVoomフィットを計算し、遺伝子発現差に関するｐ値を取得した。阻害因子及びｐ値として、患者及び組織学的特徴に関して加味される比較が、複数の試験についてＦＤＲ補正された。次いで、R EnhancedVolcanoパッケージ（バージョン1.8.0）を用いて結果を視覚化した。
サブクローン性１２ｑ２４．３１－３２損失を有するTRACERx100 ＲＮＡ－ｓｅｑ患者に対して、差次的遺伝子発現解析を行った。Ｒ４．０．０を使用して、最初にedgeRＲパッケージ（バージョン3.32.1）を、試料固有のＴＭＭ（Ｍ値のトリム平均）正規化に使用し、次いで、標準のedgeRフィルタリング法を使用して、低い発現を有する遺伝子をフィルタ除去し、その後、limmaＲパッケージ（バージョン3.46.0）からのLimma－Voom法を使用してVoomフィットを計算し、遺伝子発現差に関するｐ値を取得した。阻害因子及びｐ値として、患者及び組織学的特徴に関して加味される比較が、複数の試験についてＦＤＲ補正された。次いで、R EnhancedVolcanoパッケージ（バージョン1.8.0）を用いて結果を視覚化した。
【0202】
実施例６－ＷＧＳデータからの試料中のＴ細胞分画率の推定、Ｂ細胞分画率の推定、及び免疫クロノタイプの調査
導入
実施例１に記載し、実施例２～５で例示したアプローチは、全ゲノム配列データが利用可能な場合、αβＴ細胞以外の免疫細胞コンパートメントが対象である場合、及び／又は例えばクロノタイプを調査するために特定のＶ及びＪセグメントの使用が対象である場合など、さらなる状況を調査するために使用することができる。本実施例では、本発明者らは、ＷＧＳデータに関して実施例１で述べた一般的なアプローチの実装を実証する。ＷＥＳデータとＷＧＳデータとの両方を含むTRACERx100コホートのサブセットを利用することによって、本発明者らは、ＷＥＳデータでの使用とＷＧＳデータでの使用との間で高い一致性を示す方法のＷＧＳバージョンを検証した。さらに、本発明者らは、ＷＧＳ試料内のより大きいカバレッジを利用して、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えの性質を考慮に入れるリード深度比のモデリングに関する代替モデル（セグメントモデル）を提供する。本発明者らは、直交ＲＮＡ－ｓｅｑデータを使用して、スコアが免疫微小環境を正確に描写していることを示し、ダウンサンプリングを使用して、本方法が２倍の深度まで正確であることを示す。次いで、本発明者らは、このアプローチを使用して、γδＴ細胞の分画率並びにＴＣＲ及びＢＣＲの多様性を調査することができることも示す。最後に、本発明者らは、大きな汎がんコホートでの生存率を研究するための本方法の使用も実証する（データは図示せず）。
導入
実施例１に記載し、実施例２～５で例示したアプローチは、全ゲノム配列データが利用可能な場合、αβＴ細胞以外の免疫細胞コンパートメントが対象である場合、及び／又は例えばクロノタイプを調査するために特定のＶ及びＪセグメントの使用が対象である場合など、さらなる状況を調査するために使用することができる。本実施例では、本発明者らは、ＷＧＳデータに関して実施例１で述べた一般的なアプローチの実装を実証する。ＷＥＳデータとＷＧＳデータとの両方を含むTRACERx100コホートのサブセットを利用することによって、本発明者らは、ＷＥＳデータでの使用とＷＧＳデータでの使用との間で高い一致性を示す方法のＷＧＳバージョンを検証した。さらに、本発明者らは、ＷＧＳ試料内のより大きいカバレッジを利用して、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えの性質を考慮に入れるリード深度比のモデリングに関する代替モデル（セグメントモデル）を提供する。本発明者らは、直交ＲＮＡ－ｓｅｑデータを使用して、スコアが免疫微小環境を正確に描写していることを示し、ダウンサンプリングを使用して、本方法が２倍の深度まで正確であることを示す。次いで、本発明者らは、このアプローチを使用して、γδＴ細胞の分画率並びにＴＣＲ及びＢＣＲの多様性を調査することができることも示す。最後に、本発明者らは、大きな汎がんコホートでの生存率を研究するための本方法の使用も実証する（データは図示せず）。
【0203】
結果
全エクソーム配列決定（ＷＥＳ）とは異なり、ＷＧＳは、ゲノム全体にわたるカバレッジを含む。コピー数変化を推定する文脈において、これは、以下のようないくつかの重要な進歩をもたらす。１）均一なカバレッジにより、コピー数切断点の位置の正確な特定が可能になる、及び２）ＧＣ含量による偏り、又は参照対立遺伝子の偏りなどの偏りが少なくなる。したがって、本発明者らは、ＷＧＳに適用された実施例１に記載のＴ細胞ＥｘＴＲＥＣＴ３法が、より低い深度においてより高い精度でＴ細胞分画率を推定することができる可能性を有すると推論した。さらに、（上述したＴＣＲＡに加えて）他の６つの遺伝子ＴＣＲＤ、ＴＣＲＧ、ＴＣＲＢ、ＩＧＨ、ＩＧＫ、及びＩＧＬもＶ（Ｄ）Ｊ組換えを受け、同様に定量化することができる可能性があり、場合により、試料内のαβ及びγδＴ細胞コンパートメント並びにＢ細胞の推定を可能にする。多くのＷＧＳデータセットには付随する免疫データが欠けているため、これは特に有益である。本明細書に記載の方法は、追加のデータを必要とせずに、任意のＷＧＳ試料の試料の包括的な免疫プロファイルを提供することができる。
全エクソーム配列決定（ＷＥＳ）とは異なり、ＷＧＳは、ゲノム全体にわたるカバレッジを含む。コピー数変化を推定する文脈において、これは、以下のようないくつかの重要な進歩をもたらす。１）均一なカバレッジにより、コピー数切断点の位置の正確な特定が可能になる、及び２）ＧＣ含量による偏り、又は参照対立遺伝子の偏りなどの偏りが少なくなる。したがって、本発明者らは、ＷＧＳに適用された実施例１に記載のＴ細胞ＥｘＴＲＥＣＴ３法が、より低い深度においてより高い精度でＴ細胞分画率を推定することができる可能性を有すると推論した。さらに、（上述したＴＣＲＡに加えて）他の６つの遺伝子ＴＣＲＤ、ＴＣＲＧ、ＴＣＲＢ、ＩＧＨ、ＩＧＫ、及びＩＧＬもＶ（Ｄ）Ｊ組換えを受け、同様に定量化することができる可能性があり、場合により、試料内のαβ及びγδＴ細胞コンパートメント並びにＢ細胞の推定を可能にする。多くのＷＧＳデータセットには付随する免疫データが欠けているため、これは特に有益である。本明細書に記載の方法は、追加のデータを必要とせずに、任意のＷＧＳ試料の試料の包括的な免疫プロファイルを提供することができる。
【0204】
上述した方法は、ＷＥＳ捕捉キットからのエクソンセグメントの代わりに１０００ｂｐウィンドウにＧＣ補正及び品質管理を適用し、近くの領域よりもはるかに高い又は低いリード深度を有するという点で外れ値であるというエビデンスが取れた任意の１００ｂｐゲノムウィンドウを特定するために追加の品質管理を適用することによって、ＷＧＳに適応させた（詳細については「方法」を参照のこと）。この適応された方法（「適応ＧＡＭ」と呼ぶ）の概要が図３０に与えられている。さらに、本発明者らは、限局性領域及び正規化領域に関して異なるゲノム遺伝子座を選択することによって、同じＷＧＳ法をＴＣＲＢ、ＴＣＲＧ、及びＩＧＨに適用することができた（使用したゲノム位置については表７を参照。図３１に例としてＣＲＵＫ００８５Ｔ１－Ｒ３のプロットを示す）。この特定のデータセットは、ＩＧＬ及びＩＧＫに関する方法の例示には適していなかった。なぜなら、これらの遺伝子座内の配列アライメントの品質には大きな問題があり、おそらく、それらの高い複雑さ及び参照配列の品質により、均一で偏りのない形で短いリード配列をマッピングすることが困難であるからである。それにもかかわらず、例えばより高品質の参照配列を利用することによって、より高品質のアライメントが利用可能である場合、同じ方法をこれらの遺伝子座に適用可能である。同様に、ＴＣＲＡ内でのＴＣＲＤの遺伝子座のサイズが小さいため、本方法はＴＣＲＤに直接は適用されなかった。しかし、以下に述べるセグメント使用ベースのアプローチは、ＴＣＲＤセグメントを含むＴ細胞の分画率を推定することができた。
【0205】
ＷＧＳデータへの適用のベンチマーキング
ＷＧＳデータでの均一なカバレッジを利用するために、平滑な一般化線形モデル（ＧＡＭ）に対する代替モデルを設計した。これは区分的制約付き線形モデルであり、切断点がＶ（Ｄ）Ｊ遺伝子座内のＶ及びＪセグメントの既知の位置に強制的に配置される。この「セグメントモデル」は、方法及び図３０で述べられており、ＧＡＭモデルに勝る以下の理論的利点を有する：１）実際のＶ（Ｄ）Ｊ組換え生物学に基づいている；２）個別のＶ及びＪ遺伝子セグメントに関する個々の分画率を計算することができ、セグメント使用及びＴ又はＢ細胞受容体の多様性についての洞察が得られる、及び；３）ＴＣＲＤ特異的セグメントの分画率を、γδＴ細胞の指標として使用することができる。このモデルは、対象の領域にわたる十分なカバレッジを有する任意の配列決定データと共に使用することができる。特定のＷＥＳデータでは、使用される特定のエクソン捕捉キットが、対象の領域でのカバレッジに大きなギャップを有するので、このアプローチは（理論的には可能であるが）それほど有利ではなかった。しかし、他の捕捉データセットではそうではないこともある。
ＷＧＳデータでの均一なカバレッジを利用するために、平滑な一般化線形モデル（ＧＡＭ）に対する代替モデルを設計した。これは区分的制約付き線形モデルであり、切断点がＶ（Ｄ）Ｊ遺伝子座内のＶ及びＪセグメントの既知の位置に強制的に配置される。この「セグメントモデル」は、方法及び図３０で述べられており、ＧＡＭモデルに勝る以下の理論的利点を有する：１）実際のＶ（Ｄ）Ｊ組換え生物学に基づいている；２）個別のＶ及びＪ遺伝子セグメントに関する個々の分画率を計算することができ、セグメント使用及びＴ又はＢ細胞受容体の多様性についての洞察が得られる、及び；３）ＴＣＲＤ特異的セグメントの分画率を、γδＴ細胞の指標として使用することができる。このモデルは、対象の領域にわたる十分なカバレッジを有する任意の配列決定データと共に使用することができる。特定のＷＥＳデータでは、使用される特定のエクソン捕捉キットが、対象の領域でのカバレッジに大きなギャップを有するので、このアプローチは（理論的には可能であるが）それほど有利ではなかった。しかし、他の捕捉データセットではそうではないこともある。
【0206】
マッチしたＷＥＳ及びＷＧＳが利用可能である３２２個のTRACERx100試料と直交ＲＮＡｓｅｑデータを含む１２６個のＷＧＳ試料とのセットでＴ及びＢ細胞の分画率を決定することによって、ＷＧＳデータに適用されたＧＡＭモデルとセグメントモデルとの両方の精度を試験した。ＧＡＭモデルを使用してＷＥＳ及びＷＧＳ ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率を比較して、本発明者らは、血液試料（ρ＝０．７１、Ｐ＝４．７ｅ－１６、図３２Ａ）と腫瘍試料（ρ＝０．７２、Ｐ＜２．２ｅ－１６、図３２Ａ）との両方において有意な相関を見出した。セグメントモデルを使用して、本発明者らは、ＧＡＭベースのＷＥＳスコアとの同様の有意な相関を見出した（血液：ρ＝０．６９、Ｐ＝６．７ｅ－１５；腫瘍：ρ＝０．７、Ｐ＜２．２ｅ－１６、図３２Ａ）。しかし、どちらのモデルでも、ＷＧＳ値は、Ｔ細胞分画率が低いほど高くなることが分かった。これは、ＷＧＳデータで可能な精度及び感度の向上によるものであり得る。これを裏付けるため、直交TRACERx100 ＲＮＡｓｅｑデータを検査すると、Danaher Ｔ細胞スコアとのより強い相関が、マッチしたＷＥＳスコアよりもＷＧＳスコアで見られた（ＷＥＳ：ρ＝０．６４、Ｐ＝１．６ｅ－１５、（Danaher Ｔ細胞スコア）＝）１．９＋８．３（ＥｘＴＲＥＣＴ Ｔ細胞分画率（ＷＥＳ））、ＷＧＳ（ＧＡＭ）：ρ＝０．８２、Ｐ＜２．２ｅ－１６、ＷＧＳ（セグメントモデル）：ρ＝０．８１、Ｐ＜２．２ｅ－１６、図３２Ｂ）。
【0207】
他の遺伝子座に関するアプローチの検証
マッチしたＲＮＡｓｅｑデータから計算されたDanaherスコアを使用して、ＴＣＲＢ及びＴＣＲＧから計算されたＴ細胞分画率と、ＩＧＨから計算されたＢ細胞分画率との精度を直交的に検証した。Ｔ細胞Danaherスコアとの有意な相関が、ＴＣＲＢ（ＧＡＭ：ρ＝０．６６、Ｐ＜２．２ｅ－１６；セグメントモデル：ρ＝０．８１、Ｐ＜２．２ｅ－１６、図３２Ｂ）及びＴＣＲＧ（ＧＡＭ：ρ＝０．６４、Ｐ＝３．１ｅ－１６、セグメントモデル：ρ＝０．８、Ｐ＜２．２ｅ－１６、図３２Ｃ）に関して見られ、Ｂ細胞Danaherスコアとの有意な相関が、ＩＧＨ（ＧＡＭ：ρ＝０．４７、Ｐ＝２．３ｅ－８；セグメントモデル：ρ＝０．４４、Ｐ＝２．１ｅ－０７、図３２Ｃ）に関して見られた。セグメントモデルからのＢ細胞分画率スコアについては、Ｂ細胞分画率が高いがＢ細胞Danaherスコアが低いという明らかな外れ値の点がいくつかあった。これらのスコアは、セグメントモデルからの非常に低い対数尤度値を有する傾向があり、非常にノイズの多い試料及び低い適合性を示した。対数尤度＜０を有する全ての試料を除去することにより、Ｂ細胞Danaherスコアとの相関が向上した（ＧＡＭ：ρ＝０．４１、Ｐ＝４．３ｅ－０６；セグメントモデル：ρ＝０．６、Ｐ＝５．１ｅ－１３）。全体として、これらの結果は、セグメントモデルが、ＧＡＭモデルからの対応する値よりもDanaherスコアとの強い関連性を有するスコアを生成することを示す。
マッチしたＲＮＡｓｅｑデータから計算されたDanaherスコアを使用して、ＴＣＲＢ及びＴＣＲＧから計算されたＴ細胞分画率と、ＩＧＨから計算されたＢ細胞分画率との精度を直交的に検証した。Ｔ細胞Danaherスコアとの有意な相関が、ＴＣＲＢ（ＧＡＭ：ρ＝０．６６、Ｐ＜２．２ｅ－１６；セグメントモデル：ρ＝０．８１、Ｐ＜２．２ｅ－１６、図３２Ｂ）及びＴＣＲＧ（ＧＡＭ：ρ＝０．６４、Ｐ＝３．１ｅ－１６、セグメントモデル：ρ＝０．８、Ｐ＜２．２ｅ－１６、図３２Ｃ）に関して見られ、Ｂ細胞Danaherスコアとの有意な相関が、ＩＧＨ（ＧＡＭ：ρ＝０．４７、Ｐ＝２．３ｅ－８；セグメントモデル：ρ＝０．４４、Ｐ＝２．１ｅ－０７、図３２Ｃ）に関して見られた。セグメントモデルからのＢ細胞分画率スコアについては、Ｂ細胞分画率が高いがＢ細胞Danaherスコアが低いという明らかな外れ値の点がいくつかあった。これらのスコアは、セグメントモデルからの非常に低い対数尤度値を有する傾向があり、非常にノイズの多い試料及び低い適合性を示した。対数尤度＜０を有する全ての試料を除去することにより、Ｂ細胞Danaherスコアとの相関が向上した（ＧＡＭ：ρ＝０．４１、Ｐ＝４．３ｅ－０６；セグメントモデル：ρ＝０．６、Ｐ＝５．１ｅ－１３）。全体として、これらの結果は、セグメントモデルが、ＧＡＭモデルからの対応する値よりもDanaherスコアとの強い関連性を有するスコアを生成することを示す。
【0208】
ＴＣＲＡ、ＴＣＲＢ、及びＴＣＲＧからの異なるＴ細胞分画率を比較すると、ＴＣＲＢ Ｔ細胞分画率はＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率と高い相関があったが、ＧＡＭモデルではその値は約半分であり（ρ＝０．６９、Ｐ＜２．２ｅ－１６、ｙ＝０．０００５９＋０．４９ｘ、図３２Ｅ）、セグメントモデルでは半分をわずかに超えていた（ρ＝０．９１、Ｐ＜２．２ｅ－１６、ｙ＝０．０３３＋０．５７ｘ、図３２Ｆ）。これはおそらく、ＴＣＲＢ対立遺伝子の１つだけが頻繁にＶ（Ｄ）Ｊ組換えを受ける対立遺伝子の除外に起因する。対照的に、ＴＣＲＧ Ｔ細胞分画率は、意外にも、典型的にはγδＴ細胞として特徴付けられるＣＤ３＋Ｔ細胞の１～５％よりも高く、ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率とも高い相関があることが分かった（ＧＡＭ：ρ＝０．７１、Ｐ＜２．２ｅ－１６、ｙ＝－０．０２８＋０．７１、図３２Ｅ及びセグメントモデル：ρ＝０．９４、Ｐ＜２．２ｅ－１６、ｙ＝０．００５＋ｘ）。ＧＡＭモデルではＴＣＲＡと比較してＴＣＲＧ分画率が０に近い試料の数が有意に多かったが（１．７％のＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率＜１ｅ－５に対して、３２．８％のＴＣＲＧ Ｔ細胞分画率＜１ｅ－５）、このシグナルが完全にγδＴ細胞によるものである場合には、試料の大部分での高い分画率、及びセグメントモデルにおける２つの間のほぼ正確な相関は生物学的に尤もらしくないと広く考えられる。代わりに、αβＴ細胞は、それらの最終的な系列を決定する前に最初にＴＣＲＧ遺伝子座の再配列を受けることが知られており、セグメントモデルからの結果は、再配列されたＴＣＲＧ遺伝子座を有することがαβＴ細胞のほぼ普遍的な特徴であり、ＴＣＲＧ遺伝子座は、Ｔ細胞分画率の正確な尺度を提供することができることを示唆する。
【0209】
ＴＣＲＤ遺伝子座は、ＴＣＲＡ遺伝子座内に完全に位置し、大量のノイズがあるため、利用可能なデータを含むＧＡＭモデルを使用してγδＴ細胞の分画率に関するスコアを正確に生成するにはサイズが小さすぎる。しかし、セグメントモデルを使用して、ＴＣＲＤ遺伝子セグメントに由来するセグメントを含むＴ細胞の分画率を計算することができ、したがってγδＴ細胞から生じるＴ細胞の分画率を計算することができる。ＴＲＤＶ１に関するセグメントベースのスコアは、TRACERx100コホートにおけるＴＣＲＤセグメントＴＲＤＶ１（ρ＝０．２５、Ｐ＝０．００１１、図３２Ｇ）、ＴＲＤＪ１＋ＴＲＤＪ２＋ＴＲＤＪ３＋ＴＲＤＪ４（ρ＝０．１５、Ｐ＝０．０４７、図３２Ｇ）、ＴＲＤＣ（ρ＝０．２３、Ｐ＝０．００２１、図３２Ｇ）に関するＴＰＭ ＲＮＡｓｅｑ値と有意に相関することが分かった。
【0210】
深度要件の調査
ＴＣＲＡ、ＴＣＲＢ、ＴＣＲＧ、又はＩＧＨ遺伝子座のいずれかからの様々なＴ及びＢ細胞分画率を表すTRACERx100試料のサブセット（ｎ＝１９）をダウンサンプリング解析のために選択して、ＧＡＭ又はセグメントモデルのいずれかが完全な深度スコアを総括することができる最低深度を確かめた。samtoolsを使用して、各試料を６０倍、３０倍、１０倍、５倍、２倍、１倍、０．５倍、又は０．１倍の深度までランダムに４回ダウンサンプリングした。この解析の結果は図３３に与えられており、全てのケースで、ＧＡＭモデルとセグメントモデルとの両方について２倍での全深度値に対する高い忠実度を示す（ＴＣＲＡ ＧＡＭ：ρ＝０．８３、Ｐ＜２．２ｅ－１６、ＴＣＲＡ ｓｅｇ：ρ＝０．７５、Ｐ＝７．５ｅ－１５、ＴＣＲＢ ＧＡＭ：ρ＝０．４６、Ｐ＝２．７ｅ－０５、ＴＣＲＢ ｓｅｇ：ρ＝０．５３、Ｐ＝８．４ｅ－０７、ＴＣＲＧ ＧＡＭ：ρ＝０．５、Ｐ＝４．２ｅ－０６、ＴＣＲＧ ｓｅｇ：ρ＝０．６１ Ｐ＝５ｅ－０９、Ｔ細胞平均ＧＡＭ：ρ＝０．７４、Ｐ＝１．９ｅ－１４、Ｔ細胞平均ｓｅｇ：ρ＝０．７６Ｐ＝１．４ｅ－１５、ＩＧＨ ＧＡＭ：ρ＝０．３７、Ｐ＝０．００１１、ＩＧＨ ｓｅｇ：ρ＝０．５６、Ｐ＝１．３ｅ－０７、図３３Ａ～Ｊ）。しかし、この低い深度では、多くの場合、値は縮小される（例えば、１倍でのＴ細胞平均セグメントモデルはρ＝０．５９を有するが、全深度値と比較すると、線ｙ＝－０．０２８＋１．６ｘ上に点がある）。これらの低い深度のダウンサンプリングファイルでのスコアの観察される高い忠実度により、ビン（例えば、約１００ｂｐ～約１００００ｂｐのビン、具体的には１００ｂｐ～１０００ｂｐの間の値が特に有用である可能性が高い。上述したようにベンチマーキングアプローチを使用して近似値を選択することができる）でのカバレッジを計算することによって、ＧＡＭモデル又はセグメントモデルのいずれかを使用してローパスＷＧＳ試料（例えば、０．１倍以上、０．１倍～０．５倍の間、０．１倍～２倍の間など）で非常に良好に機能するようにＴ細胞ＥｘＴＲＥＣＴ法を設計することができる。
ＴＣＲＡ、ＴＣＲＢ、ＴＣＲＧ、又はＩＧＨ遺伝子座のいずれかからの様々なＴ及びＢ細胞分画率を表すTRACERx100試料のサブセット（ｎ＝１９）をダウンサンプリング解析のために選択して、ＧＡＭ又はセグメントモデルのいずれかが完全な深度スコアを総括することができる最低深度を確かめた。samtoolsを使用して、各試料を６０倍、３０倍、１０倍、５倍、２倍、１倍、０．５倍、又は０．１倍の深度までランダムに４回ダウンサンプリングした。この解析の結果は図３３に与えられており、全てのケースで、ＧＡＭモデルとセグメントモデルとの両方について２倍での全深度値に対する高い忠実度を示す（ＴＣＲＡ ＧＡＭ：ρ＝０．８３、Ｐ＜２．２ｅ－１６、ＴＣＲＡ ｓｅｇ：ρ＝０．７５、Ｐ＝７．５ｅ－１５、ＴＣＲＢ ＧＡＭ：ρ＝０．４６、Ｐ＝２．７ｅ－０５、ＴＣＲＢ ｓｅｇ：ρ＝０．５３、Ｐ＝８．４ｅ－０７、ＴＣＲＧ ＧＡＭ：ρ＝０．５、Ｐ＝４．２ｅ－０６、ＴＣＲＧ ｓｅｇ：ρ＝０．６１ Ｐ＝５ｅ－０９、Ｔ細胞平均ＧＡＭ：ρ＝０．７４、Ｐ＝１．９ｅ－１４、Ｔ細胞平均ｓｅｇ：ρ＝０．７６Ｐ＝１．４ｅ－１５、ＩＧＨ ＧＡＭ：ρ＝０．３７、Ｐ＝０．００１１、ＩＧＨ ｓｅｇ：ρ＝０．５６、Ｐ＝１．３ｅ－０７、図３３Ａ～Ｊ）。しかし、この低い深度では、多くの場合、値は縮小される（例えば、１倍でのＴ細胞平均セグメントモデルはρ＝０．５９を有するが、全深度値と比較すると、線ｙ＝－０．０２８＋１．６ｘ上に点がある）。これらの低い深度のダウンサンプリングファイルでのスコアの観察される高い忠実度により、ビン（例えば、約１００ｂｐ～約１００００ｂｐのビン、具体的には１００ｂｐ～１０００ｂｐの間の値が特に有用である可能性が高い。上述したようにベンチマーキングアプローチを使用して近似値を選択することができる）でのカバレッジを計算することによって、ＧＡＭモデル又はセグメントモデルのいずれかを使用してローパスＷＧＳ試料（例えば、０．１倍以上、０．１倍～０．５倍の間、０．１倍～２倍の間など）で非常に良好に機能するようにＴ細胞ＥｘＴＲＥＣＴ法を設計することができる。
【0211】
免疫細胞レパートリー多様性を調査するためにＥｘＴＲＥＣＴアプローチを使用することができる
より一般的なＴＣＲ及びＢＣＲの多様性への洞察を得るために、上述したアプローチの使用を調査した。これは、セグメントモデルの最適な当てはめから予測されるＶ及びＪセグメント使用を検査することによって試料内で行った。図３４Ａ～Ｃは、ＴＲＡＣＥＲｘ患者ＣＲＵＫ００８５において、様々な腫瘍領域及び生殖細胞系列血液試料にわたってＴＣＲＡ、ＴＣＲＢ、及びＴＣＲＧについて使用されるＶセグメントの割合を示し、図３４Ｄは、ＴＲＡＣＥＲｘ患者ＣＲＵＫ００４５におけるＩＧＨに関するＶセグメント使用を示す。これらは、最大の組換えの位置に基づいて上で説明したのと同じｆに関する式を使用して取得することができるが、代わりに、ｒＶＤＪの値として関連セグメントに関するモデル推定量を使用して取得することもできる。これらのクロノタイププロットは、Ｔ細胞の半分以上がＲ４でのＶセグメントＴＲＡＶ１８を使用すると予想され、ＴＲＢＶ２９＿１の割合が高いＣＲＵＫ００８５の場合など、より広いクロノタイプを有する試料を同定することができる本方法の可能性を示している。ＴＲＡＶセグメントについて図３４Ｅで示されるように、コホート全体にわたって、セグメント使用の割合の変化をプロットすることが可能である。この場合、明確なクラスタが形成されているにもかかわらず、組織学的特徴、臨床上の性別、又は腫瘍試料のデータか血液試料のデータかとの明確な関係性はなかった。バイオインフォマティクスソフトウェアMiXCR（Bolotin et al, 2015）を使用して、呼び出されたＶセグメントと、マッチしたＲＮＡｓｅｑデータから呼び出されたＶセグメントとを比較すると、Ｔ細胞ＥｘＴＲＥＣＴセグメントモデルから呼び出されたＶセグメントの数との有意な相関が特定された（ＴＣＲＡ：ρ＝０．５４、Ｐ＝１．５ｅ－１２、ＴＣＲＢ：ρ＝０．３９、Ｐ＝６．６ｅ－０７、ＴＣＲＧ：ρ＝０．２９、Ｐ＝０．０００２５、ＩＧＨ：ρ＝０．４２、Ｐ＝５．９ｅ－０８、図３４Ｆ～Ｉ）。しかし、MiXCRで呼び出されるＶセグメントの数は、全てのケースでＴ細胞ＥｘＴＲＥＣＴモデルよりも顕著に多く、当てはめられるモデルが過剰に単純化されており、完全なＴＣＲ又はＢＣＲの多様性を捉えていないことを示唆する。これは、単に「最適な」ソリューションではなく、最も適合するソリューションの試料を得ることにより、モデルから選択されたＶ及びＪセグメントを拡張することによって対処することができる。例えば、（データへの当てはめの観点から）上位１０、２０、３０、５０、又は１００のソリューションを選択し、例えばそれらの信頼区間に基づいて調査して、完全なＴＣＲ又はＢＣＲの多様性を捉えるモデルを選択することができる。ＴＣＲ又はＢＣＲの多様性のいくつかの特徴ががんの予後及び／又は療法に対する応答を示唆することが示されているため、これらの結果は特に重要である。例えば、様々なタイプの多様性に関連するＢ細胞遺伝子発現シグネチャは、乳がん及び卵巣がんの予後を示唆することが分かっており（Iglesia et al., 2014）、ＴＣＲベースラインのクローン性及び治療後の拡張の決定を含むＴＣＲレパートリー解析が、チェックポイント阻害薬療法に対する応答のバイオマーカ源であることが示されており（Aversa et al., 2020、Hopkins et al., 2018）、ベースラインでのＴＩＬでのＴＣＲの多様性は、様々ながんで予後予測因子であることが分かった（Valpione et al., 2021）。
より一般的なＴＣＲ及びＢＣＲの多様性への洞察を得るために、上述したアプローチの使用を調査した。これは、セグメントモデルの最適な当てはめから予測されるＶ及びＪセグメント使用を検査することによって試料内で行った。図３４Ａ～Ｃは、ＴＲＡＣＥＲｘ患者ＣＲＵＫ００８５において、様々な腫瘍領域及び生殖細胞系列血液試料にわたってＴＣＲＡ、ＴＣＲＢ、及びＴＣＲＧについて使用されるＶセグメントの割合を示し、図３４Ｄは、ＴＲＡＣＥＲｘ患者ＣＲＵＫ００４５におけるＩＧＨに関するＶセグメント使用を示す。これらは、最大の組換えの位置に基づいて上で説明したのと同じｆに関する式を使用して取得することができるが、代わりに、ｒＶＤＪの値として関連セグメントに関するモデル推定量を使用して取得することもできる。これらのクロノタイププロットは、Ｔ細胞の半分以上がＲ４でのＶセグメントＴＲＡＶ１８を使用すると予想され、ＴＲＢＶ２９＿１の割合が高いＣＲＵＫ００８５の場合など、より広いクロノタイプを有する試料を同定することができる本方法の可能性を示している。ＴＲＡＶセグメントについて図３４Ｅで示されるように、コホート全体にわたって、セグメント使用の割合の変化をプロットすることが可能である。この場合、明確なクラスタが形成されているにもかかわらず、組織学的特徴、臨床上の性別、又は腫瘍試料のデータか血液試料のデータかとの明確な関係性はなかった。バイオインフォマティクスソフトウェアMiXCR（Bolotin et al, 2015）を使用して、呼び出されたＶセグメントと、マッチしたＲＮＡｓｅｑデータから呼び出されたＶセグメントとを比較すると、Ｔ細胞ＥｘＴＲＥＣＴセグメントモデルから呼び出されたＶセグメントの数との有意な相関が特定された（ＴＣＲＡ：ρ＝０．５４、Ｐ＝１．５ｅ－１２、ＴＣＲＢ：ρ＝０．３９、Ｐ＝６．６ｅ－０７、ＴＣＲＧ：ρ＝０．２９、Ｐ＝０．０００２５、ＩＧＨ：ρ＝０．４２、Ｐ＝５．９ｅ－０８、図３４Ｆ～Ｉ）。しかし、MiXCRで呼び出されるＶセグメントの数は、全てのケースでＴ細胞ＥｘＴＲＥＣＴモデルよりも顕著に多く、当てはめられるモデルが過剰に単純化されており、完全なＴＣＲ又はＢＣＲの多様性を捉えていないことを示唆する。これは、単に「最適な」ソリューションではなく、最も適合するソリューションの試料を得ることにより、モデルから選択されたＶ及びＪセグメントを拡張することによって対処することができる。例えば、（データへの当てはめの観点から）上位１０、２０、３０、５０、又は１００のソリューションを選択し、例えばそれらの信頼区間に基づいて調査して、完全なＴＣＲ又はＢＣＲの多様性を捉えるモデルを選択することができる。ＴＣＲ又はＢＣＲの多様性のいくつかの特徴ががんの予後及び／又は療法に対する応答を示唆することが示されているため、これらの結果は特に重要である。例えば、様々なタイプの多様性に関連するＢ細胞遺伝子発現シグネチャは、乳がん及び卵巣がんの予後を示唆することが分かっており（Iglesia et al., 2014）、ＴＣＲベースラインのクローン性及び治療後の拡張の決定を含むＴＣＲレパートリー解析が、チェックポイント阻害薬療法に対する応答のバイオマーカ源であることが示されており（Aversa et al., 2020、Hopkins et al., 2018）、ベースラインでのＴＩＬでのＴＣＲの多様性は、様々ながんで予後予測因子であることが分かった（Valpione et al., 2021）。
【0212】
汎がんコホートにおける、がんの免疫環境と、生存率、臨床的決定因子、及びがん種との関連性
Ｔ細胞ＥｘＴＲＥＣＴセグメントモデルを、２０の異なるがん種にわたる１５０００以上の参加者からなる大規模な汎がんＷＧＳコホートに適用した。この解析は、ＴＣＲＡ、ＴＣＲＢ、及びＴＣＲＧに由来するＴ細胞分画率、ＩＧＨからのＢ細胞分画率、並びに個々のＶ及びＪ遺伝子セグメントに関する分画率を提供した。これらの参加者の大多数は、マッチした血液生殖細胞系ＷＧＳ試料を有し、残りの大多数の血液がん患者は、唾液又は他の正常組織からのマッチする生殖細胞系試料を有していた。これにより、大規模な汎がんコホートにおいて初めて、サンプリング時の患者血液中の免疫分画率の相違を調査する機会が得られた。
Ｔ細胞ＥｘＴＲＥＣＴセグメントモデルを、２０の異なるがん種にわたる１５０００以上の参加者からなる大規模な汎がんＷＧＳコホートに適用した。この解析は、ＴＣＲＡ、ＴＣＲＢ、及びＴＣＲＧに由来するＴ細胞分画率、ＩＧＨからのＢ細胞分画率、並びに個々のＶ及びＪ遺伝子セグメントに関する分画率を提供した。これらの参加者の大多数は、マッチした血液生殖細胞系ＷＧＳ試料を有し、残りの大多数の血液がん患者は、唾液又は他の正常組織からのマッチする生殖細胞系試料を有していた。これにより、大規模な汎がんコホートにおいて初めて、サンプリング時の患者血液中の免疫分画率の相違を調査する機会が得られた。
【0213】
この解析により、血液及び腫瘍試料における、がん種内及びがん種間における免疫ランドスケープの範囲での広範な多様性（ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率、０．０１を超える分画率を有するモデルによって呼び出されるＴＲＡＶセグメントの数によって測定されるＴＣＲ多様性）が明らかになった。ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率と、セグメントモデルで呼び出されるＴＲＡＶセグメントの数との両方に関して、線形モデルを当てはめて、性別、年齢、及び祖先へのこれらの値の依存性を確かめることも可能である。これらのモデルを、血中ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率及び予測されるＴＲＡＶセグメントの数に関して当てはめて、例えば、汎がんコホートにおけるＴ細胞分画率及び多様性の減少に年齢が関連していること、及びこれが様々ながんサブタイプにわたって異なる程度で観察されるかどうかを調査することができる。
【0214】
そのような解析を、Ｔ細胞ＥｘＴＲＥＣＴからのＩＧＨ Ｂ細胞分画率スコアに関して行い、様々ながん種にわたる血液及び腫瘍中でのＩＧＨ Ｂ細胞分画率、並びにＩＧＨ Ｂ細胞分画率及び多様性の臨床的決定因子（例えば、性別、年齢、祖先）を調査することもできる。
【0215】
血液中のＴ細胞分画率の決定に対する生殖細胞系列及び祖先の寄与を確かめるために、PLINK、及びがん又は汎がんコホート内の非血縁患者のセットを使用してＧＷＡＳ解析を行うことができる（「方法」を参照）。性能を高めるために、血中ＴＣＲＡ、ＴＣＲＢ、及びＴＣＲＧ Ｔ細胞分画率値についてＧＷＡＳを個別に実行することができる。これらの値は、ゲノムの様々な領域から独立して計算され、３つ全てにおいて推奨される有意水準（Ｐ＜１ｅ－５）を超えるヒットを調べることにより、それらが、（実際のＴ細胞分画率シグナルではなく）マッピング品質及びカバレッジ値の低下に関連付けられるＶ（Ｄ）Ｊ遺伝子内のＳＮＰから生じるデータ内のノイズ又はアーチファクトの結果ではないことを確信することができる。次いで、これらのＧＷＡＳの１つ又は３つ全てで特定された任意のＳＮＰに関して、様々ながん種でのこれらのＳＮＰの濃縮を見ることができる。
【0216】
最後に、病院エピソード統計での最新記録から、例えばがんの診断日、死亡記録、及び最新のフォローアップ時間に関する使用データなどの生存データを解析することができる。次いで、例えば血液及び腫瘍試料中でＴＣＲＡ Ｔ細胞及びＩＧＨ Ｂ細胞分画率に関してカプラン・マイヤー曲線を得することができ、各場合に、中央値によってコホートを高い分画率又は低い分画率に分ける。この解析は、血液／腫瘍中のＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率又は血液／腫瘍中のＩＧＨ Ｂ細胞分画率が生存率と有意に関連しているかどうかを調査するために使用することができる。
【0217】
最後に、免疫細胞分画率と他の臨床的特徴との関係性、及び様々ながん種にわたるその不均一性をより良く理解するために、血液及び腫瘍中のＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率と、血液及び腫瘍中のＩＧＨ Ｂ細胞分画率と、血液及び腫瘍中のγδＴ細胞の代用因子としてのＴＲＤＶ１ Ｔ細胞分画率とで構成されるCox比例モデルを当てはめることができる。Coxモデルは、Ｔ又はＢ細胞分画率との生じ得る交絡する関連性を加味するために、年齢及び性別、並びに患者が術前に化学療法を受けたかどうかも含むことができる。この最後の因子は、がんが臨床的にどの程度悪性であったか又は後期のステージであったかに関する代用因子として含めることができる。がんのステージなどの代替規準を使用することもできる。そのような解析の結果は、任意の特定のコホートで実行されたCoxモデルからのｚスコアのヒートマップを見ることによって検査することができる。これにより、血液／腫瘍中のＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率又は血液／腫瘍中のＩＧＨ Ｂ細胞分画率が、汎がんコホート及び任意の個々のがん種において重大なリスクであるかどうかを明らかにすることができる。
【0218】
方法
ＷＧＳからＴ細胞分画率を計算するための全体的なプロセスは、実施例１での方法に綿密に従った。これは、以前に定義した先頭と末尾でのＴＣＲＡ遺伝子座内の領域を使用してカバレッジを正規化し、Illumina Hiseqに関してγ＝１を使用して、単一試料のリード深度比、及びＴ細胞分画率に関する式（３）又は（７）での公式を計算することを含む。唯一の相違点は、ｒＶＤＪの計算の詳細（最大Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えの位置でのリード深度比の０からの偏差）にある。特に、実施例１に記載のＧＣ補正法を、捕捉キットによって述べたエクソンではなくＷＧＳに作用するように適応させた。ＧＣ含量は、上で説明したように、１０００ｂｐウィンドウ内（ＧＣ１０００ｂｐ）と、全ての１０００ｂｐセグメントにわたってＧＡＭモデルを使用して計算された平滑化バージョン（ＧＣｍａｃｒｏ）との２つのスケールで計算した。次いで、以下の線形モデルからの残差を当てはめて採用することによって、カバレッジ値をＧＣ含量に関して正規化した。
ＷＧＳからＴ細胞分画率を計算するための全体的なプロセスは、実施例１での方法に綿密に従った。これは、以前に定義した先頭と末尾でのＴＣＲＡ遺伝子座内の領域を使用してカバレッジを正規化し、Illumina Hiseqに関してγ＝１を使用して、単一試料のリード深度比、及びＴ細胞分画率に関する式（３）又は（７）での公式を計算することを含む。唯一の相違点は、ｒＶＤＪの計算の詳細（最大Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えの位置でのリード深度比の０からの偏差）にある。特に、実施例１に記載のＧＣ補正法を、捕捉キットによって述べたエクソンではなくＷＧＳに作用するように適応させた。ＧＣ含量は、上で説明したように、１０００ｂｐウィンドウ内（ＧＣ１０００ｂｐ）と、全ての１０００ｂｐセグメントにわたってＧＡＭモデルを使用して計算された平滑化バージョン（ＧＣｍａｃｒｏ）との２つのスケールで計算した。次いで、以下の線形モデルからの残差を当てはめて採用することによって、カバレッジ値をＧＣ含量に関して正規化した。
【0219】
【数13】
【0220】
これは、局所ＧＣ含量が個々のエクソンのレベル（ＧＣｅｘｏｎ）ではなく１０００ｂｐウィンドウのレベル（ＧＣ１０００ｂｐ）で計算されたことを除いて、実施例１で述べたものと同一である。
【0221】
最終ステップとして、ロバストな品質管理プロセスにより、１）コホート全体にわたる、又は２）コホートのサブセットに関連付けられ、既知の生殖細胞系列ゲノムバリアントにリンクされる、カバレッジに関する外れ値であった任意のＶ（Ｄ）遺伝子内の任意の１００ｂｐセグメントを特定した。最初のステップに関して、全てのＧＥＬ肺コホートのセットについて、全てのＶ（Ｄ）Ｊ遺伝子の平均ＧＣ補正比を計算した。これにより、周囲の領域と比較して極端に低いカバレッジ、又は極端に高いカバレッジを有するセグメントが明らかになった。ＧＡＭモデルを平均ＧＣ補正比に当てはめることにより、当てはめられたラインからの特定の閾値（±０．２５）を上回るもの及び下回るものを除外することができる。これはＴＣＲＡでは良好に機能したが、ＴＣＲＢなどの他の遺伝子では、ＧＡＭモデルの当てはめを妨げるクラスタ化された大きなセグメントが存在した。これらについて、いくつかの明らかな外れ値領域、例えばＴＣＲＢに関して０．２５を超える平均ＧＣ比を有する全ての領域を最初に手動で除去した。このようにして特定されたセグメントの除去後、PLINKソフトウェアを使用したＧＷＡＳ解析（Renteria et al., 2013を参照）の後、偏りを有する追加のセグメントが特定された。特に、ＧＷＡＳ解析を、Ｔ又はＢ細胞分画率に関連する任意のＳＮＰを特定するために行った。特定のエクソンにおいてカバレッジの偏りを有する遺伝子領域を特定し、除去のためにフラグを立てた。スコアを再計算し、偏りの除去をチェックするためにＧＷＡＳプロセスを繰り返した。除去されたセグメントは、特定の生殖細胞系列遺伝子型に関連する周囲領域と比べてカバレッジが過小又は過多であり、純粋にこのアーチファクトにより、遺伝子内の特定のバリアントをＴ又はＢ細胞分画率と強く関連させる。これらの場合、関連する遺伝子型を有する特定の試料を選択し、平均ＧＣ補正率を計算した。次いで、追加の外れ値セグメントを特定し、上述したのと同じ手順で削除のためのフラグを立て、PLINK／ＧＷＡＳ解析を再実行して、さらなるアーチファクトセグメントが存在しないことを保証した。
【0222】
本方法は、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えを受ける他のＴ細胞受容体遺伝子、ＴＣＲＢ及びＴＣＲＧ並びにＢ細胞受容体ＩＧＨにも拡張され、上記の方法を使用し、しかしリード深度比の正規化に使用される位置と、最大偏差が予想される位置とを再定義した。一般に、最大偏差は、最後のＶセグメントと最初のＪセグメントの間に位置すると予想することができ、それに応じて領域を選択した。これは表７に与えられている。
【0223】
【表7】
【0224】
同様に、本方法は、セグメント使用を調べるためにも適用され、上述の方法を使用したが、ｒＶＤＪの値には、調査中の特定の遺伝子に対応する特定のセグメントに関するセグメントモデルからの推定量（特に、特定のセグメント及び先行するセグメントに関するセグメントモデルからの推定量の差の絶対値。すなわち、図３１に示されるように、調査中のセグメントの開始時に、Ｖセグメントが考慮されるかＪセグメントが考慮されるかに応じて、減少又は増加）を使用した。したがって、表７での正規化領域は、以下の表８での各遺伝子（遺伝子ｈｇｎｃ ｓｙｍｂｏｌ－ｓｔａｒｔ＿ｈｇ３８－ｅｎｄ＿ｈｇ３８として提供される）に関する「最大Ｖ（Ｄ）Ｊ組換え領域」に相当するセグメントと共に使用される。γδＴ細胞の分画率の推定のために、ＴＲＤＶ１、ＴＲＤＶ２、ＴＲＤＪ１、ＴＲＤＪ２、ＴＲＤＪ３、及びＴＲＤＪ４のいずれかを使用することができる（これらは全てＴＣＲＡ遺伝子座内に位置する）。本発明者らは、ＶセグメントＴＲＤＶ１が、γδＴ細胞に関連するＲＮＡｓｅｑ値と最も強く相関することを見出した。したがって、本実施例では、このセグメントをγδＴ細胞の分画率の推定に使用した。本実施例では、セグメント使用を調べるときにセグメントモデルを使用し、対応するセグメントに関するモデルからの推定量がｒＶＤＪの値を表す。しかし、表７及び８で提供される同じ領域は、好ましくはカバレッジがこれらの領域の研究を可能にするときにはＧＡＭと組み合わせて使用することができ、調査すべき複数のセグメントのそれぞれについて要約された値を推定し、１対の連続するセグメントの第２のものに関するｒＶＤＪとして連続セグメント間の差を決定する。
【0225】
【表8】
【0226】
【表9】
【0227】
【表10】
【0228】
【表11】
【0229】
【表12】
【0230】
新たなＴ細胞ＥｘＴＲＥＣＴＶ（Ｄ）Ｊセグメントモデルの作成
実施例１に記載の方法は、ＧＡＭモデルを使用してｒＶＤＪを計算し、したがって試料内のＴ細胞分画率を計算する。ＧＡＭモデルは、平滑化されたプロセスとしてのＶ（Ｄ）Ｊ組換えのプロセスのモデル化を簡素化する。これは、どのエクソーム捕捉キットによっても配列決定されていないＴＣＲＡ遺伝子座内のゲノムの大きなセグメントでのカバレッジの不均一さにより、ＷＥＳデータを使用するときに有用である。これは、データ内のノイズに対する脆弱性が増大するという犠牲を伴う。さらに、これは、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えプロセスの既知の生物学的現実と合致するようには制約されない。ＷＥＳデータの場合、調査中の遺伝子座内のカバレッジが均一でないとき、利益がコストを上回る。しかし、ＷＧＳデータ（又は捕捉された特定の領域によるこの偏りを受けない任意の他のデータ）を使用すると、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えの生物学的プロセスに直接基づくモデルを使用することが可能である。これは、リード深度比を一連の一定の区分的セグメントとしてモデル化することによって実装され、切断点の位置は、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換え後の欠失部位の取り得る先頭を表し、これは、Ｖ及びＪ遺伝子セグメントの位置から既知であり、したがってモデルに対する制約として提供することができる。したがって、本発明者らは、セグメントが事前に選択され、Ｖ及びＪセグメントの位置とアライメントするモデルを作成した。さらに、モデルは、リード深度比が０から始まり、そこから最大Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えの点まで単調減少する必要があるというＶ（Ｄ）Ｊ組換えからの知識によって制約されることがある。例えば、ＴＣＲＡＶ（Ｄ）Ｊ組換えでは、一部のＴＣＲ鎖のみが最初のＴＣＲＶ－１セグメントを選択し、他の全てのＶセグメントは欠失されるが、最後のＶセグメント後には全てのＴＣＲ鎖が欠失を有する。同様にＪセグメントに関しても、これらは０に達するまで単調増加する必要がある。
実施例１に記載の方法は、ＧＡＭモデルを使用してｒＶＤＪを計算し、したがって試料内のＴ細胞分画率を計算する。ＧＡＭモデルは、平滑化されたプロセスとしてのＶ（Ｄ）Ｊ組換えのプロセスのモデル化を簡素化する。これは、どのエクソーム捕捉キットによっても配列決定されていないＴＣＲＡ遺伝子座内のゲノムの大きなセグメントでのカバレッジの不均一さにより、ＷＥＳデータを使用するときに有用である。これは、データ内のノイズに対する脆弱性が増大するという犠牲を伴う。さらに、これは、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えプロセスの既知の生物学的現実と合致するようには制約されない。ＷＥＳデータの場合、調査中の遺伝子座内のカバレッジが均一でないとき、利益がコストを上回る。しかし、ＷＧＳデータ（又は捕捉された特定の領域によるこの偏りを受けない任意の他のデータ）を使用すると、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えの生物学的プロセスに直接基づくモデルを使用することが可能である。これは、リード深度比を一連の一定の区分的セグメントとしてモデル化することによって実装され、切断点の位置は、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換え後の欠失部位の取り得る先頭を表し、これは、Ｖ及びＪ遺伝子セグメントの位置から既知であり、したがってモデルに対する制約として提供することができる。したがって、本発明者らは、セグメントが事前に選択され、Ｖ及びＪセグメントの位置とアライメントするモデルを作成した。さらに、モデルは、リード深度比が０から始まり、そこから最大Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えの点まで単調減少する必要があるというＶ（Ｄ）Ｊ組換えからの知識によって制約されることがある。例えば、ＴＣＲＡＶ（Ｄ）Ｊ組換えでは、一部のＴＣＲ鎖のみが最初のＴＣＲＶ－１セグメントを選択し、他の全てのＶセグメントは欠失されるが、最後のＶセグメント後には全てのＴＣＲ鎖が欠失を有する。同様にＪセグメントに関しても、これらは０に達するまで単調増加する必要がある。
【0231】
このモデルを当てはめるために、Ｖ及びＪ遺伝子に対応する既知の切断点を有する生じ得る各セグメント（表８を参照）を、１と０のベクトルに変換した。ここで、領域内では１であり、領域外では０である。次いで、（Ｒパッケージｒｅｓｔｒｉｋｔｏｒ ｖ０．３からの関数を使用する）制約付き線形モデルを使用して、これらのベクトルを正規化されたリード比データに当てはめる。ここで、ｎ個のＶセグメントとｍ個のＪセグメントのそれぞれに対して以下のように選択された不等式制約を用いる：Ｖ１＜０；Ｖ２＜Ｖ１；…；Ｖｎ＜Ｖｎ－１；Ｊ１＞Ｖｎ；Ｊ２＞Ｊ１；．…；Ｊｍ＞Ｊｍ－１；Ｊｍ＜０。これらの適合値を使用すると、モデルの最大偏差、例えば最後のＶセグメントからの値と、個々のセグメント、例えばγδＴ細胞を表すＴＣＲＡ遺伝子座内のＴＲＤＶ１又はＴＲＤＶ２のいずれかに関連するセグメントからの個々の分画率とから、合計のＴ又はＢ細胞分画率を計算することができる。
【0232】
PLINKによるＧＷＡＳ解析
PLINKを、血液からのＷＧＳ生殖細胞系列試料を含む非血縁参加者のコホートに対して実行し、最初の２０の遺伝的ＰＣ、性別、年齢、及び疾患タイプに関する共変量を用いて制御した。PLINKの入力は、コホート全体でＭＡＦ＞０．００１を有するように前処理され、欠損及び十分な深度を含むＱＣフィルタを通過し、バリアント正規化を受け、全ての多重対立遺伝子バリアントを二対立遺伝子にされ、全てのバリアントがアライメントされて倹約的である（parsimonious）ことを保証されたバリアントであった。PLINKを実行する前のこれらの事前設定フィルタ及びＱＣに加えて、Ｒ２閾値０．２で５００ｋｂウィンドウでＬＤプルーニングを実行し、コホート内で全てのバリアントがＭＡＦ＞０．００１を有し、遺伝子型欠損が０．２以下であることを保証した。最後に、PLINKを実行する前に、閾値０．０００００１でハーディー・ワインベルク（Hardy-Weinberg）平衡検定を行った。
PLINKを、血液からのＷＧＳ生殖細胞系列試料を含む非血縁参加者のコホートに対して実行し、最初の２０の遺伝的ＰＣ、性別、年齢、及び疾患タイプに関する共変量を用いて制御した。PLINKの入力は、コホート全体でＭＡＦ＞０．００１を有するように前処理され、欠損及び十分な深度を含むＱＣフィルタを通過し、バリアント正規化を受け、全ての多重対立遺伝子バリアントを二対立遺伝子にされ、全てのバリアントがアライメントされて倹約的である（parsimonious）ことを保証されたバリアントであった。PLINKを実行する前のこれらの事前設定フィルタ及びＱＣに加えて、Ｒ２閾値０．２で５００ｋｂウィンドウでＬＤプルーニングを実行し、コホート内で全てのバリアントがＭＡＦ＞０．００１を有し、遺伝子型欠損が０．２以下であることを保証した。最後に、PLINKを実行する前に、閾値０．０００００１でハーディー・ワインベルク（Hardy-Weinberg）平衡検定を行った。
【0233】
実施例７－議論
免疫系は、腫瘍形成とその後のがんの進展との両方に影響を及ぼす重要な因子の１つとして広く認識されている。Ｔ細胞は、ネオアンチゲンを保有するがん細胞を排除することでがん免疫微小環境の重要な役割を果たしており、したがって腫瘍試料内のＴ細胞の数は、疾患の経過を決定し得る重要な臨床因子である。がんの文脈では、腫瘍の発生を促す体細胞変化を特徴付けるために、主に腫瘍組織のバルクＤＮＡ配列決定が使用されてきた。しかし、本発明者らは、本明細書で提示する方法により、ＤＮＡ配列決定を試料の免疫微小環境の研究にも利用することができることを実証する。
免疫系は、腫瘍形成とその後のがんの進展との両方に影響を及ぼす重要な因子の１つとして広く認識されている。Ｔ細胞は、ネオアンチゲンを保有するがん細胞を排除することでがん免疫微小環境の重要な役割を果たしており、したがって腫瘍試料内のＴ細胞の数は、疾患の経過を決定し得る重要な臨床因子である。がんの文脈では、腫瘍の発生を促す体細胞変化を特徴付けるために、主に腫瘍組織のバルクＤＮＡ配列決定が使用されてきた。しかし、本発明者らは、本明細書で提示する方法により、ＤＮＡ配列決定を試料の免疫微小環境の研究にも利用することができることを実証する。
【0234】
ＴＲＥＣは、新生児における重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）のスクリーニングの文脈で以前に臨床的に検査されており（van der Spek, Groenwold, van der Burg, & van Montfrans, 2015）、そこでは、ＴＲＥＣの欠如がＴ細胞リンパ球減少症の推測に使用されている。しかし、これらのスクリーニング法はＴＲＥＣ自体の配列決定及び定量化に基づいており、ＷＥＳデータには基づいていない。乳がん単細胞ゲノム配列決定の最近の研究は、ＴＣＲＡ遺伝子内のＴ細胞での欠失事象を同定した（Baslan et al., 2020）。ここで、本発明者らは、この研究に基づいて、実施例１で詳細に述べるように、ＴＲＥＣを明示的に使用してＷＥＳ試料中のＴ細胞分画率を推定する。
【0235】
本明細書に記載の方法（ＴＩＬ ＥｘＴＲＥＣＴ）は、免疫浸潤の正確な推定量を提供し、その推定量が臨床的有用性を示す。本発明者らは、ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率推定量が直交免疫尺度と強く相関され、がん細胞株及びシミュレートされたＷＥＳデータがそれらの信頼性を裏付けることを見出した（実施例２）。さらに、本発明者らは、推測されたＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率がＬＵＡＤにおいて予後予測因子であることを実証し、この知見をＴＣＧＡ ＬＵＡＤコホートで検証する（実施例３）。これに関連して、本発明者らは、ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率が汎がんコホートにおけるＣＰＩに対する応答と関連しており、クローン性ＴＭＢ単独の予測値を改善することを示した（実施例４）。本発明者らはさらに、血液及び腫瘍試料中のＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率が、ＩＧＨ Ｂ細胞分画率と同様に、汎がんコホート及び多くの特定のがん種における生存率の予測因子であることを実証した（実施例６）。ＴＲＤＶ１ Ｔ細胞分画率に基づいて推定されたγδＴ細胞の分画率は、特定のがん種における生存率の予測因子であることが分かった。
【0236】
さらに、ＴＩＬ ＥｘＴＲＥＣＴは、データセットでＴ細胞（又はＢ細胞）の分画率を計算できるようにした。これは以前は不可能であった。これを利用して、本発明者らは、血液中のＴ細胞分画率が不均一であり、男性よりも女性において有意に高く（現在の知見と一貫性がある）、予想通り微生物感染症にも関連していることを実証した（実施例５）。既知の免疫関連性を総括するだけでなく、以前の免疫アノテーションがないデータセットに対してＴ細胞ＥｘＴＲＥＣＴを使用することができることが示された。ＲＮＡ－ｓｅｑを含まない汎がんの複数試料コホートにおいて、本発明者らは、異なるがん種にわたるＴ細胞浸潤の不均一性の程度の顕著な変化を観察する（実施例５）。この不均一性の多くはサブクローン性ＳＣＮＡによって引き起こされているように見え、本発明者らは、１２ｑ２４．３１－３２のサブクローン性損失がＴ細胞浸潤の有意な減少と関連していることを特定した。これは、細胞表面のスフィンゴ糖脂質の上方制御を引き起こし、それによってクラスＩ ＨＬＡ分子の機能を妨げるＳＰＰＬ３の発現の低下に関連していることがある。この損失は、複数のがん種における免疫回避メカニズムである可能性があり、サブクローン性で、したがって腫瘍の進展軌跡の後期に頻繁に生じる。
【0237】
実施例２において、本発明者らは、ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率が、異なるプラットフォームからの及び複数の異なるデータセットにわたる直交免疫尺度と強く相関していることを実証した。がん細胞株及びシミュレートされたＷＥＳデータにより、このスコアが、配列決定された試料内のＴ細胞の分画率に関する信頼できる推定量を提供することが裏付けられた。高い深度のTRACERx100試料のシミュレーション及びダウンサンプリングは、３０倍のカバレッジが、信頼できるＴ細胞分画率を計算するのに十分なシグナルを提供することを示す（しかし、より低いカバレッジを使用して高いＴ細胞含量と低いＴ細胞含量とを区別することができ、これは、より粗いバイオマーカとして有用であり得る）。この比較的低いカバレッジは、ほとんどのＤＮＡ配列決定データセットに適用可能であることを意味する。実施例６では、本発明者らは、本方法をＷＧＳデータに適用することができ、ＷＥＳよりも高い解像度を有するシグナルをＴＣＲＡ領域の外側で、より低い深度でさえ得ることができることを実証する。本発明者らは、直交ＲＮＡ－ｓｅｑデータを使用して、スコアが免疫微小環境を正確に描写していることを示し、ダウンサンプリングを使用して、本方法が２倍の深度まで正確であることを示す。実施例６で、本発明者らはさらに、γδＴ細胞分画率と、ＴＣＲ及びＢＣＲの多様性との両方を調査するための方法の可能性を実証する。ＷＥＳ及びＷＧＳ以外に、ＴＣＲＡ遺伝子（又は調査中のＶ（Ｄ）Ｊ組換えが行われている任意の遺伝子）を標的とする任意のＮＧＳ法が、このアプローチと適合性を有し得る。理論に束縛されることを望まないが、配列決定データは、例えばＳＮＰアレイデータに好ましいと考えられる。なぜなら、ＳＮＰアレイデータは通常、対象のＶＤＪ遺伝子座の主領域での解像度がかなり低いからである。さらに、ＴＣＲＡ遺伝子（又は調査中のＶ（Ｄ）Ｊ組換えを受けている遺伝子）を特異的に標的とし、ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率（又はＴＣＲＤ、ＴＣＲＧ、ＴＣＲＢ、ＩＧＨ、ＩＧＫ、又はＩＧＬ細胞分画率）を提供する標的パネルベース配列決定アプローチを使用することができる。実際、そのようなアプローチを、診断ツールとしてのその使用を容易にするために、ＴＭＢを推定する現在のパネルベースの配列決定アプローチと組み合わせることは容易に想起できる。配列決定プラットフォーム固有の定数（式（２）、（３）、及び（７）でのγ。ここで、値１はＷＥＳ又はＷＧＳデータに適している）は、使用する配列決定プラットフォームに応じて調整することができる。さらに、ＧＣ含量の偏りなどのプラットフォーム固有の偏りを評価して考慮に入れることもできる。
【0238】
これらの理由により、ＴＩＬ ＥｘＴＲＥＣＴは、通常であればＴ細胞含量の不偏推定量を有さない以前に公開されたＮＧＳがんデータセットの再解析の文脈において有用であり得る。ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率はまた、実施例４で実証したような免疫療法に対する応答との関連性、及び実施例６で実証したような生存率との関連性により、臨床における単純なバイオマーカとしての価値があり得る。
【0239】
手動又はデジタルで評価する前にＦＦＰＥブロックを取得、切断、染色する必要があるイメージングスライドなど、試料から免疫関連データを提供する他の方法もあるが、多くの場合、これらは利用可能でない又はロジスティクスの面で煩雑である。一方、Ｔ細胞ＥｘＴＲＥＣＴは、研究で及び臨床でもますます一般的に使用されているＤＮＡ配列決定プラットフォームと組み合わせて使用することができる。
【0240】
本方法は、がん研究の枠組みの中で開発されたが、より幅広い臨床現場での応用を検討する価値がある。この尺度は、健康な又は疾患のある任意の組織又は血液から得られる任意のＮＧＳ解析から計算することができる。がんコホート内のマッチした血液試料の解析により、血中ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率と患者のがん種及び性別との間の有意な関係が実証され、このアプローチの可能性が示された（実施例３及び実施例６も参照）。さらに、肺ＣＰＩコホートでの血液試料のみの解析により、腫瘍試料自体の解析を行わずに、推測されるＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率が免疫療法に対する応答の予測因子であることが分かった（図２４Ｂ）。さらに、血液試料中のＴＲＥＣレベルの非ＮＧＳポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）定量化は、乳がん（Page et al.）及び前立腺がん（Madan et al.）での免疫療法の試験において、胸腺でのＴ細胞の生成を監視するために既に使用されている。さらに、Ｔ細胞ＥｘＴＲＥＣＴは、腫瘍学以外にも応用され得る。血中ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率の将来の臨床的用途の１つは、ＳＣＩＤ（治療に迅速な造血幹細胞移植が必要な重度のＴ細胞欠失をもたらすことが多い、まれな先天性症候群）の文脈におけるものであり得て、その場合、ＴＩＬ ＥｘＴＲＥＣＴを、新生児のゲノムスクリーニングと組み合わせて、潜在的な損傷を及ぼす生殖細胞系列変異とＴ細胞含量の減少とを同時に特定する。残念ながら、本明細書の執筆時点では、ＳＣＩＤは、出生児の５万人に１人が罹患しているにもかかわらず、ほとんどの国で日常的な新生児スクリーニングの対象ではなく、大部分の症例は、重度の日和見感染症の後でのみ診断され、治療が手遅れになることが多い（Chan et al.）。ＴＩＬ ＥｘＴＲＥＣＴは、遺伝性疾患に関する新生児スクリーニング遺伝子パネル内にＴＣＲＡを含めることによってＳＣＩＤを特定できる可能性がある。
【0241】
Ｔ細胞とＶＤＪ組換えとは有顎脊椎動物での適応免疫系の決定的特徴であるので、本明細書で提示される全般的な方法は、種にとらわれない。上記の実施例に記載したＴＩＬ ＥｘＴＲＥＣＴ法はヒトゲノム用に最適化されているが、本方法を、多くの研究用モデル生物（マウス、ニワトリ、フェレットなどを含む）を含む他の種にも拡張することができる（主に、使用すべき対応する特定のゲノム領域を定義し、任意の領域固有の偏りを評価してそれに対処することによって）。ＶＤＪ組換えは、ＴＣＲＡ Ｔ細胞分画率推定に対するこの新規のアプローチを裏付けるが、ＴＣＲ－α受容体をコードする遺伝子に特有のものではないことも注目に値する。他のＴＣＲ遺伝子、すなわちβ、γ、及びδも、ＢＣＲ免疫グロブリン遺伝子ＩＧＨ、ＩＧＬ、ＩＧＫと同様に、ＶＤＪ組換えを受ける。したがって、本方法は、実施例６で実証したように、ＩＧＬ又はＩＧＫ軽鎖のいずれかを有するαβ、γδＴ細胞とＢ細胞との両方の分画率を計算するために使用することもできる。これらは、例えば、（ｈｇ１９）：ＴＣＲＢ ｃｈｒ７：１４１９９８８５１－１４２５１０９７２；ＴＣＲＧ ｃｈｒ７：３８２７９６２５－３８４０７６５６；ＩＧＨ ｃｈｒ１４：１０６０３２６１４－１０７２８８０５１；ＩＧＬ ｃｈｒ２２：２２３８０４７４－２３２６５０８５；ＩＧＫ ｃｈｒ２：８９１５６６７４－９０２７４２３５、又は表７及び８の領域など、適切な染色体領域を使用することができ、領域固有の偏りを評価してそれに対処する。これらの他の免疫細胞タイプは一般的にあまり普及していないので、データ内のノイズや試料内の対象の細胞の分画率によってはこれらの一部は良好に機能しない可能性もあるが、この拡張された方法は、ＤＮＡ配列決定データのみを利用してがん試料の免疫微小環境の詳細な説明を提供できる可能性がある（実施例６で実証される）。
【0242】
要約すると、本明細書に記載するアプローチ、すなわちＴＩＬ ＥｘＴＲＥＣＴは、ＲＮＡ配列決定を必要とせずに、ヒト及びモデルシステムデータセットの両方において、体細胞変化と共に免疫浸潤を特徴付けるための費用対効果の高い技法を提供することによって、基礎研究とトランスレーショナル研究との両方で重要な用途があり得る。
【0243】
参考文献
AbdulJabbar et al. (2020). Geospatial immune variability illuminates differential evolution of lung adenocarcinoma. Nature Medicine, 26(7), 1054－1062.
Aran, D., Hu, Z., & Butte, A. J. (2017). xCell: Digitally portraying the tissue cellular heterogeneity landscape. Genome Biology, 18(1), 1－14.
Aversa I, Malanga D, Fiume G, Palmieri C. Molecular T－Cell Repertoire Analysis as Source of Prognostic and Predictive Biomarkers for Checkpoint Blockade Immunotherapy. Int J Mol Sci. 2020 Mar 30;21(7):2378.
Baslan et al. (2020). Novel insights into breast cancer copy number genetic heterogeneity revealed by single－cell genome sequencing. ELife, 9, 1－21.
Bolotin et al. (2012). Next generation sequencing for TCR repertoire profiling: Platform－specific features and correction algorithms. European Journal of Immunology, 42(11), 3073－3083.
Bolotin, D. A. et al. MiXCR: software for comprehensive adaptive immunity profiling. Nat. Methods 12, 380－381 (2015).
Brastianos, P. K. et al. Genomic characterization of brain metastases reveals branched evolution and potential therapeutic targets. Cancer Discov. 5, 1164－1177 (2015).
Cancer Genome Atlas Research Network. (2012). Comprehensive genomic characterization of squamous cell lung cancers. Nature, 489(7417), 519－525.
Cancer Genome Atlas Research Network. (2014). Comprehensive molecular profiling of lung adenocarcinoma. Nature, 511(7511), 543－550.
Carter et al. (2012). Absolute quantification of somatic DNA alterations in human cancer. Nature Biotechnology, 30(5), 413－421.
Chan, K. & Puck, J. M. Development of population－based newborn screening for severe combined immunodeficiency. J. Allergy Clin. Immunol. 115, 391－398 (2005).
Cristescu et al. (2018). Pan－tumor genomic biomarkers for PD－1 checkpoint blockade－based immunotherapy. Science, 362(6411).
Danaher et al.(2018). Pan－cancer adaptive immune resistance as defined by the Tumor Inflammation Signature (TIS): Results from The Cancer Genome Atlas (TCGA). Journal for ImmunoTherapy of Cancer, 6(1), 1－17.
Davoli, T., Uno, H., Wooten, E. C., & Elledge, S. J. (2017). Tumor aneuploidy correlates with markers of immune evasion and with reduced response to immunotherapy. Science, 355(6322).
Denkert et al. (2016). Standardized evaluation of tumor－infiltrating lymphocytes in breast cancer: Results of the ring studies of the international immuno－oncology biomarker working group. Modern Pathology, 29(10), 1155－1164.
Dieci et al. (2018) Update on tumor－infiltrating lymphocytes (TILs) in breast cancer, including recommendations to assess TILs in residual disease after neoadjuvant therapy and in carcinoma in situ: A report of the International Immuno－Oncology Biomarker Working Group on Breast Cancer. Seminars in Cancer Biology, Volume 52, Part 2, 2018, Pages 16－25.
Favero et al. (2015). Sequenza: Allele－specific copy number and mutation profiles from tumor sequencing data. Annals of Oncology, 26(1), 64－70.
Galon et al. (2006). Type, density, and location of immune cells within human colorectal tumors predict clinical outcome. Science, 313(5795), 1960－1964.
Gerlinger, M. et al. Intratumor Heterogeneity and Branched Evolution Revealed by Multiregion Sequencing. N. Engl. J. Med. 366, 883－892 (2012).
Gerlinger, M. et al. Genomic architecture and evolution of clear cell renal cell carcinomas defined by multiregion sequencing. Nat. Genet. 46, 225－233 (2014).
Ghandi et al. (2019). Next－generation characterization of the Cancer Cell Line Encyclopedia. Nature, 569(7757), 503－508.
Goodman et al. (2017). Tumor mutational burden as an independent predictor of response to immunotherapy in diverse cancers. Molecular Cancer Therapeutics, 16(11), 2598－2608.
Harbst, K. et al. Multiregion whole－exome sequencing uncovers the genetic evolution and mutational heterogeneity of early－stage metastatic melanoma. Cancer Res. 76, 4765－4774 (2016).
Haywood et al. Sunitinib’s effect on tumor infiltration of CD8 T cells in renal cell carcinoma (RCC) and modulation of their function by altering VEGF－induced upregulation of PD1 expression. Journal of Clinical Oncology, 34(2),591 (2016).
Hendry, S., Salgado, R., Gevaert, T., Russell, P. A., John, T., Thapa, B., … Fox, S. B. (2017). Assessing Tumor－infiltrating Lymphocytes in Solid Tumors. Advances In Anatomic Pathology (Vol. 24).
Hopkins et al. T cell receptor repertoire features associated with survival in immunotherapy－treated pancreatic ductal adenocarcinoma. JCI Insight. 2018 Jul 12;3(13):e122092.
Huang, W., Li, L., Myers, J. R., & Marth, G. T. (2012). ART: A next－generation sequencing read simulator. Bioinformatics, 28(4), 593－594.
Hugo et al. (2016). Genomic and Transcriptomic Features of Response to Anti－PD－1 Therapy in Metastatic Melanoma. Cell, 165(1), 35－44.
Iglesia et al. Prognostic B－cell signatures using mRNA－seq in patients with subtype－specific breast and ovarian cancer. Clin Cancer Res. 2014 Jul 15;20(14):3818－29.
Jamal－Hanjani et al.(2017). Tracking the Evolution of Non－Small－Cell Lung Cancer. New England Journal of Medicine, 376(22), 2109－2121.
Jongsma et al. The SPPL3－Defined Glycosphingolipid Repertoire Orchestrates HLA Class I－Mediated Immune Responses. Immunity. 2021 Jan 12;54(1):132－150.e9. doi: 10.1016/j.immuni.2020.11.003. Epub 2020 Dec 2. Erratum in: Immunity. 2021 Feb 9;54(2):387. PMID: 33271119.
Lamy, P. et al. Paired exome analysis reveals clonal evolution and potential therapeutic targets in urothelial carcinoma. Cancer Res. 76, 5894－5906 (2016).
Le, D. T., Uram, J. N., Wang, H., Bartlett, B. R., Kemberling, H., Eyring, A. D., … Diaz, L. A. (2015). PD－1 Blockade in Tumors with Mismatch－Repair Deficiency. New England Journal of Medicine, 372(26), 2509－2520.
Levy, E., Marty, R., Garate Calderon, V.et al.Immune DNA signature of T－cell infiltration in breast tumor exomes.Sci Rep6,30064 (2016).
Li et al. (2017). TIMER: A web server for comprehensive analysis of tumor－infiltrating immune cells. Cancer Research, 77(21), e108－e110.
Litchfield et al. Meta－analysis of tumor and T cell－intrinsic mechanisms of sensitization to checkpoint inhibition. Cell 184.3 (2021): 596－614.
Lopez et al. (2020). Interplay between whole－genome doubling and the accumulation of deleterious alterations in cancer evolution. Nature Genetics, 52(3), 283－293.
Madan, R. A. et al. Clinical and immunologic impact of short－course enzalutamide alone and with immunotherapy in non－metastatic castration sensitive prostate cancer. J. Immunother. Cancer 9, (2021).
Mariathasan et al. (2018). TGFβ attenuates tumour response to PD－L1 blockade by contributing to exclusion of T cells. Nature, 554(7693), 544－548.
Marquez et al. (2020). Sexual－dimorphism in human immune system aging. Nature Communications, 11(1).
McDermott et al. (2018). Clinical activity and molecular correlates of response to atezolizumab alone or in combination with bevacizumab versus sunitinib in renal cell carcinoma. Nature Medicine, 24(6), 749－757.
McGrath et al. Detecting T cell receptor rearrangements in silico from non－targeted DNA－sequencing (WGS/WES). bioRxiv preprint doi.org/10.1101/201947; October 13, 2017.
Messaoudene, M. et al. T－cell bispecific antibodies in node－positive breast cancer: Novel therapeutic avenue for MHC class i loss variants. Ann. Oncol. 30, 934－944 (2019).
Middleton et al. (2020). The National Lung Matrix Trial of personalized therapy in lung cancer. Nature, 583(7818), 807－812.
Newman et al. (2015). Robust enumeration of cell subsets from tissue expression profiles. Nature Methods, 12(5), 453－457.
Newman et al. (2019). Determining cell type abundance and expression from bulk tissues with digital cytometry. Nature Biotechnology, 37(7), 773－782.
Page, D. B. et al. A phase II study of dual immune checkpoint blockade (ICB) plus androgen receptor (AR) blockade to enhance thymic T－cell production and immunotherapy response in metastatic breast cancer (MBC). J. Clin. Oncol. 37, TPS1106－TPS1106 (2019).
Poore GD, Kopylova E, Zhu Q, et al. Microbiome analyses of blood and tissues suggest cancer diagnostic approach. Nature. 2020;579(7800):567－574.
Racle et al. (2017). Simultaneous enumeration of cancer and immune cell types from bulk tumor gene expression data. ELife, 6, 1－25.
Riaz et al.(2017). Tumor and Microenvironment Evolution during Immunotherapy with Nivolumab. Cell, 171(4), 934－949.e15.
Renteria ME, Cortes A, Medland SE. Using PLINK for Genome－Wide Association Studies (GWAS) and data analysis. Methods Mol Biol. 2013;1019:193－213.
Riester, M., Singh, A.P., Brannon, A.R.et al.PureCN: copy number calling and SNV classification using targeted short read sequencing.Source Code Biol Med11,13 (2016).
Rizvi et al. (2015). Mutational landscape determines sensitivity to PD－1 blockade in non－small cell lung cancer. Science, 348(6230), 124－128.
Robert et al. (2011). Ipilimumab plus Dacarbazine for Previously Untreated Metastatic Melanoma. New England Journal of Medicine, 364(26), 2517－2526.
Rosenthal et al. (2019). Neoantigen－directed immune escape in lung cancer evolution. Nature, 567(7749), 479－485.
Samstein et al. (2019). Tumor mutational load predicts survival after immunotherapy across multiple cancer types. Nature Genetics, 51(2), 202－206.
Savas, P. et al. The Subclonal Architecture of Metastatic Breast Cancer: Results from a Prospective Community－Based Rapid Autopsy Program “CASCADE”. PLoS Med. 13, 1－25 (2016).
Schadendorf et al. (2015). Pooled analysis of long－term survival data from phase II and phase III trials of ipilimumab in unresectable or metastatic melanoma. Journal of Clinical Oncology, 33(17), 1889－1894.
Shen, R., & Seshan, V. (2015). FACETS : Fraction and Allele－Specific Copy Number Estimates from Tumor Sequencing. Memorial Sloan－Kettering Cancer Center, Dept. of Epidemiology & Biostatistics Working Paper Series., 1, 50. Retrieved from http://biostats.bepress.com/mskccbiostat/paper29
Shim et al. (2020). HLA－corrected tumor mutation burden and homologous recombination deficiency for the prediction of response to PD－(L)1 blockade in advanced non－small－cell lung cancer patients. Annals of Oncology, 31(7), 902－911.
Snyder et al. (2014). Genetic Basis for Clinical Response to CTLA－4 Blockade in Melanoma. New England Journal of Medicine, 371(23), 2189－2199.
Snyder et al. (2017). Contribution of systemic and somatic factors to clinical response and resistance to PD－L1 blockade in urothelial cancer: An exploratory multi－omic analysis. PLoS Medicine, 14(5), 1－24.
Suzuki, H. et al. Mutational landscape and clonal architecture in grade II and III gliomas. Nat. Genet. 47, 458－468 (2015).
Thorsson et al. (2018). The Immune Landscape of Cancer. Immunity, 48(4), 812－830.e14.
Topalian et al. (2012). Safety, Activity, and Immune Correlates of Anti－PD－1 Antibody in Cancer. New England Journal of Medicine, 366(26), 2443－2454.
Turajlic, S. et al. Deterministic Evolutionary Trajectories Influence Primary Tumor Growth: TRACERx Renal. Cell 173, 595－610.e11 (2018).
Valpione, S., Mundra, P.A., Galvani, E.et al.The T cell receptor repertoire of tumor infiltrating T cells is predictive and prognostic for cancer survival.Nat Commun12,4098 (2021).
Van Allen et al. (2016). Erratum for the report “genomic correlates of response to CTLA－4 blockade in metastatic melanoma.” Science, 352(6283), 207－212.
van der Spek, J., Groenwold, R. H. H., van der Burg, M., & van Montfrans, J. M. (2015). TREC Based Newborn Screening for Severe Combined Immunodeficiency Disease: A Systematic Review. Journal of Clinical Immunology, 35(4), 416－430.
Van Loo et al. (2010). Allele－specific copy number analysis of tumors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 107(39), 16910－16915.
Wang et al. (2007). PennCNV: An integrated hidden Markov model designed for high－resolution copy number variation detection in whole－genome SNP genotyping data. Genome Research, 17(11), 1665－1674.
Wang, V. G., Kim, H., & Chuang, J. H. (2018). Whole－exome sequencing capture kit biases yield false negative mutation calls in TCGA cohorts. PLoS ONE, 13(10), 1－14.
Watkins, T. B. K. et al. Pervasive chromosomal instability and karyotype order in tumour evolution. Nature 587, 126－132 (2020).
Yokoyama, A., Kakiuchi, N., Yoshizato, T. et al. Age－related remodelling of oesophageal epithelia by mutated cancer drivers. Nature 565, 312－317 (2019).
Yoshihara et al. (2013). Inferring tumour purity and stromal and immune cell admixture from expression data. Nature Communications, 4.
Zaccaria, S., & Raphael, B. J. (2020). Accurate quantification of copy－number aberrations and whole－genome duplications in multi－sample tumor sequencing data. Nature Communications, 11(1).
Zhang et al. (2003). Intratumoral T Cells, Recurrence, and Survival in Epithelial Ovarian Cancer. New England Journal of Medicine, 348(3), 203－213.
Wood, D. E. & Salzberg, S. L. Kraken: Ultrafast metagenomic sequence classification using exact alignments. Genome Biol. 15, (2014).
AbdulJabbar et al. (2020). Geospatial immune variability illuminates differential evolution of lung adenocarcinoma. Nature Medicine, 26(7), 1054－1062.
Aran, D., Hu, Z., & Butte, A. J. (2017). xCell: Digitally portraying the tissue cellular heterogeneity landscape. Genome Biology, 18(1), 1－14.
Aversa I, Malanga D, Fiume G, Palmieri C. Molecular T－Cell Repertoire Analysis as Source of Prognostic and Predictive Biomarkers for Checkpoint Blockade Immunotherapy. Int J Mol Sci. 2020 Mar 30;21(7):2378.
Baslan et al. (2020). Novel insights into breast cancer copy number genetic heterogeneity revealed by single－cell genome sequencing. ELife, 9, 1－21.
Bolotin et al. (2012). Next generation sequencing for TCR repertoire profiling: Platform－specific features and correction algorithms. European Journal of Immunology, 42(11), 3073－3083.
Bolotin, D. A. et al. MiXCR: software for comprehensive adaptive immunity profiling. Nat. Methods 12, 380－381 (2015).
Brastianos, P. K. et al. Genomic characterization of brain metastases reveals branched evolution and potential therapeutic targets. Cancer Discov. 5, 1164－1177 (2015).
Cancer Genome Atlas Research Network. (2012). Comprehensive genomic characterization of squamous cell lung cancers. Nature, 489(7417), 519－525.
Cancer Genome Atlas Research Network. (2014). Comprehensive molecular profiling of lung adenocarcinoma. Nature, 511(7511), 543－550.
Carter et al. (2012). Absolute quantification of somatic DNA alterations in human cancer. Nature Biotechnology, 30(5), 413－421.
Chan, K. & Puck, J. M. Development of population－based newborn screening for severe combined immunodeficiency. J. Allergy Clin. Immunol. 115, 391－398 (2005).
Cristescu et al. (2018). Pan－tumor genomic biomarkers for PD－1 checkpoint blockade－based immunotherapy. Science, 362(6411).
Danaher et al.(2018). Pan－cancer adaptive immune resistance as defined by the Tumor Inflammation Signature (TIS): Results from The Cancer Genome Atlas (TCGA). Journal for ImmunoTherapy of Cancer, 6(1), 1－17.
Davoli, T., Uno, H., Wooten, E. C., & Elledge, S. J. (2017). Tumor aneuploidy correlates with markers of immune evasion and with reduced response to immunotherapy. Science, 355(6322).
Denkert et al. (2016). Standardized evaluation of tumor－infiltrating lymphocytes in breast cancer: Results of the ring studies of the international immuno－oncology biomarker working group. Modern Pathology, 29(10), 1155－1164.
Dieci et al. (2018) Update on tumor－infiltrating lymphocytes (TILs) in breast cancer, including recommendations to assess TILs in residual disease after neoadjuvant therapy and in carcinoma in situ: A report of the International Immuno－Oncology Biomarker Working Group on Breast Cancer. Seminars in Cancer Biology, Volume 52, Part 2, 2018, Pages 16－25.
Favero et al. (2015). Sequenza: Allele－specific copy number and mutation profiles from tumor sequencing data. Annals of Oncology, 26(1), 64－70.
Galon et al. (2006). Type, density, and location of immune cells within human colorectal tumors predict clinical outcome. Science, 313(5795), 1960－1964.
Gerlinger, M. et al. Intratumor Heterogeneity and Branched Evolution Revealed by Multiregion Sequencing. N. Engl. J. Med. 366, 883－892 (2012).
Gerlinger, M. et al. Genomic architecture and evolution of clear cell renal cell carcinomas defined by multiregion sequencing. Nat. Genet. 46, 225－233 (2014).
Ghandi et al. (2019). Next－generation characterization of the Cancer Cell Line Encyclopedia. Nature, 569(7757), 503－508.
Goodman et al. (2017). Tumor mutational burden as an independent predictor of response to immunotherapy in diverse cancers. Molecular Cancer Therapeutics, 16(11), 2598－2608.
Harbst, K. et al. Multiregion whole－exome sequencing uncovers the genetic evolution and mutational heterogeneity of early－stage metastatic melanoma. Cancer Res. 76, 4765－4774 (2016).
Haywood et al. Sunitinib’s effect on tumor infiltration of CD8 T cells in renal cell carcinoma (RCC) and modulation of their function by altering VEGF－induced upregulation of PD1 expression. Journal of Clinical Oncology, 34(2),591 (2016).
Hendry, S., Salgado, R., Gevaert, T., Russell, P. A., John, T., Thapa, B., … Fox, S. B. (2017). Assessing Tumor－infiltrating Lymphocytes in Solid Tumors. Advances In Anatomic Pathology (Vol. 24).
Hopkins et al. T cell receptor repertoire features associated with survival in immunotherapy－treated pancreatic ductal adenocarcinoma. JCI Insight. 2018 Jul 12;3(13):e122092.
Huang, W., Li, L., Myers, J. R., & Marth, G. T. (2012). ART: A next－generation sequencing read simulator. Bioinformatics, 28(4), 593－594.
Hugo et al. (2016). Genomic and Transcriptomic Features of Response to Anti－PD－1 Therapy in Metastatic Melanoma. Cell, 165(1), 35－44.
Iglesia et al. Prognostic B－cell signatures using mRNA－seq in patients with subtype－specific breast and ovarian cancer. Clin Cancer Res. 2014 Jul 15;20(14):3818－29.
Jamal－Hanjani et al.(2017). Tracking the Evolution of Non－Small－Cell Lung Cancer. New England Journal of Medicine, 376(22), 2109－2121.
Jongsma et al. The SPPL3－Defined Glycosphingolipid Repertoire Orchestrates HLA Class I－Mediated Immune Responses. Immunity. 2021 Jan 12;54(1):132－150.e9. doi: 10.1016/j.immuni.2020.11.003. Epub 2020 Dec 2. Erratum in: Immunity. 2021 Feb 9;54(2):387. PMID: 33271119.
Lamy, P. et al. Paired exome analysis reveals clonal evolution and potential therapeutic targets in urothelial carcinoma. Cancer Res. 76, 5894－5906 (2016).
Le, D. T., Uram, J. N., Wang, H., Bartlett, B. R., Kemberling, H., Eyring, A. D., … Diaz, L. A. (2015). PD－1 Blockade in Tumors with Mismatch－Repair Deficiency. New England Journal of Medicine, 372(26), 2509－2520.
Levy, E., Marty, R., Garate Calderon, V.et al.Immune DNA signature of T－cell infiltration in breast tumor exomes.Sci Rep6,30064 (2016).
Li et al. (2017). TIMER: A web server for comprehensive analysis of tumor－infiltrating immune cells. Cancer Research, 77(21), e108－e110.
Litchfield et al. Meta－analysis of tumor and T cell－intrinsic mechanisms of sensitization to checkpoint inhibition. Cell 184.3 (2021): 596－614.
Lopez et al. (2020). Interplay between whole－genome doubling and the accumulation of deleterious alterations in cancer evolution. Nature Genetics, 52(3), 283－293.
Madan, R. A. et al. Clinical and immunologic impact of short－course enzalutamide alone and with immunotherapy in non－metastatic castration sensitive prostate cancer. J. Immunother. Cancer 9, (2021).
Mariathasan et al. (2018). TGFβ attenuates tumour response to PD－L1 blockade by contributing to exclusion of T cells. Nature, 554(7693), 544－548.
Marquez et al. (2020). Sexual－dimorphism in human immune system aging. Nature Communications, 11(1).
McDermott et al. (2018). Clinical activity and molecular correlates of response to atezolizumab alone or in combination with bevacizumab versus sunitinib in renal cell carcinoma. Nature Medicine, 24(6), 749－757.
McGrath et al. Detecting T cell receptor rearrangements in silico from non－targeted DNA－sequencing (WGS/WES). bioRxiv preprint doi.org/10.1101/201947; October 13, 2017.
Messaoudene, M. et al. T－cell bispecific antibodies in node－positive breast cancer: Novel therapeutic avenue for MHC class i loss variants. Ann. Oncol. 30, 934－944 (2019).
Middleton et al. (2020). The National Lung Matrix Trial of personalized therapy in lung cancer. Nature, 583(7818), 807－812.
Newman et al. (2015). Robust enumeration of cell subsets from tissue expression profiles. Nature Methods, 12(5), 453－457.
Newman et al. (2019). Determining cell type abundance and expression from bulk tissues with digital cytometry. Nature Biotechnology, 37(7), 773－782.
Page, D. B. et al. A phase II study of dual immune checkpoint blockade (ICB) plus androgen receptor (AR) blockade to enhance thymic T－cell production and immunotherapy response in metastatic breast cancer (MBC). J. Clin. Oncol. 37, TPS1106－TPS1106 (2019).
Poore GD, Kopylova E, Zhu Q, et al. Microbiome analyses of blood and tissues suggest cancer diagnostic approach. Nature. 2020;579(7800):567－574.
Racle et al. (2017). Simultaneous enumeration of cancer and immune cell types from bulk tumor gene expression data. ELife, 6, 1－25.
Riaz et al.(2017). Tumor and Microenvironment Evolution during Immunotherapy with Nivolumab. Cell, 171(4), 934－949.e15.
Renteria ME, Cortes A, Medland SE. Using PLINK for Genome－Wide Association Studies (GWAS) and data analysis. Methods Mol Biol. 2013;1019:193－213.
Riester, M., Singh, A.P., Brannon, A.R.et al.PureCN: copy number calling and SNV classification using targeted short read sequencing.Source Code Biol Med11,13 (2016).
Rizvi et al. (2015). Mutational landscape determines sensitivity to PD－1 blockade in non－small cell lung cancer. Science, 348(6230), 124－128.
Robert et al. (2011). Ipilimumab plus Dacarbazine for Previously Untreated Metastatic Melanoma. New England Journal of Medicine, 364(26), 2517－2526.
Rosenthal et al. (2019). Neoantigen－directed immune escape in lung cancer evolution. Nature, 567(7749), 479－485.
Samstein et al. (2019). Tumor mutational load predicts survival after immunotherapy across multiple cancer types. Nature Genetics, 51(2), 202－206.
Savas, P. et al. The Subclonal Architecture of Metastatic Breast Cancer: Results from a Prospective Community－Based Rapid Autopsy Program “CASCADE”. PLoS Med. 13, 1－25 (2016).
Schadendorf et al. (2015). Pooled analysis of long－term survival data from phase II and phase III trials of ipilimumab in unresectable or metastatic melanoma. Journal of Clinical Oncology, 33(17), 1889－1894.
Shen, R., & Seshan, V. (2015). FACETS : Fraction and Allele－Specific Copy Number Estimates from Tumor Sequencing. Memorial Sloan－Kettering Cancer Center, Dept. of Epidemiology & Biostatistics Working Paper Series., 1, 50. Retrieved from http://biostats.bepress.com/mskccbiostat/paper29
Shim et al. (2020). HLA－corrected tumor mutation burden and homologous recombination deficiency for the prediction of response to PD－(L)1 blockade in advanced non－small－cell lung cancer patients. Annals of Oncology, 31(7), 902－911.
Snyder et al. (2014). Genetic Basis for Clinical Response to CTLA－4 Blockade in Melanoma. New England Journal of Medicine, 371(23), 2189－2199.
Snyder et al. (2017). Contribution of systemic and somatic factors to clinical response and resistance to PD－L1 blockade in urothelial cancer: An exploratory multi－omic analysis. PLoS Medicine, 14(5), 1－24.
Suzuki, H. et al. Mutational landscape and clonal architecture in grade II and III gliomas. Nat. Genet. 47, 458－468 (2015).
Thorsson et al. (2018). The Immune Landscape of Cancer. Immunity, 48(4), 812－830.e14.
Topalian et al. (2012). Safety, Activity, and Immune Correlates of Anti－PD－1 Antibody in Cancer. New England Journal of Medicine, 366(26), 2443－2454.
Turajlic, S. et al. Deterministic Evolutionary Trajectories Influence Primary Tumor Growth: TRACERx Renal. Cell 173, 595－610.e11 (2018).
Valpione, S., Mundra, P.A., Galvani, E.et al.The T cell receptor repertoire of tumor infiltrating T cells is predictive and prognostic for cancer survival.Nat Commun12,4098 (2021).
Van Allen et al. (2016). Erratum for the report “genomic correlates of response to CTLA－4 blockade in metastatic melanoma.” Science, 352(6283), 207－212.
van der Spek, J., Groenwold, R. H. H., van der Burg, M., & van Montfrans, J. M. (2015). TREC Based Newborn Screening for Severe Combined Immunodeficiency Disease: A Systematic Review. Journal of Clinical Immunology, 35(4), 416－430.
Van Loo et al. (2010). Allele－specific copy number analysis of tumors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 107(39), 16910－16915.
Wang et al. (2007). PennCNV: An integrated hidden Markov model designed for high－resolution copy number variation detection in whole－genome SNP genotyping data. Genome Research, 17(11), 1665－1674.
Wang, V. G., Kim, H., & Chuang, J. H. (2018). Whole－exome sequencing capture kit biases yield false negative mutation calls in TCGA cohorts. PLoS ONE, 13(10), 1－14.
Watkins, T. B. K. et al. Pervasive chromosomal instability and karyotype order in tumour evolution. Nature 587, 126－132 (2020).
Yokoyama, A., Kakiuchi, N., Yoshizato, T. et al. Age－related remodelling of oesophageal epithelia by mutated cancer drivers. Nature 565, 312－317 (2019).
Yoshihara et al. (2013). Inferring tumour purity and stromal and immune cell admixture from expression data. Nature Communications, 4.
Zaccaria, S., & Raphael, B. J. (2020). Accurate quantification of copy－number aberrations and whole－genome duplications in multi－sample tumor sequencing data. Nature Communications, 11(1).
Zhang et al. (2003). Intratumoral T Cells, Recurrence, and Survival in Epithelial Ovarian Cancer. New England Journal of Medicine, 348(3), 203－213.
Wood, D. E. & Salzberg, S. L. Kraken: Ultrafast metagenomic sequence classification using exact alignments. Genome Biol. 15, (2014).
【0244】
本明細書で引用する全ての参考文献は、個々の出版物、特許、又は特許出願の全体を参照により援用することが具体的に且つ個別に示されているかのような程度で、あらゆる目的でそれらの全体を参照により本明細書に援用する。
【0245】
本出願は、２０２１年７月２２日に出願された英国特許出願第２１１０５５５．６号及び２０２２年３月１１日に出願された英国特許出願第２２０３４５１．６号の優先権を主張する。両方の優先権出願の全内容を、あらゆる目的のために参照により本明細書に援用する。
【0246】
本明細書に記載する具体的な実施形態は、例として提供するものであり、限定として提供するものではない。記載される技術の範囲及び精神から逸脱することなく、記載される組成物、方法、及び技術の使用の様々な修正及び変形が当業者には明らかであろう。本明細書におけるサブタイトルは、便宜的にのみ含まれており、いかなる形でも本開示を限定するものとして解釈されるべきではない。
【0247】
本明細書に記載する任意の実施形態の方法は、コンピュータプログラムとして、又はコンピュータ上で実行されるときに上述した方法を実行するように構成されたコンピュータプログラムを含むコンピュータプログラム製品又はコンピュータ可読媒体として提供することもできる。
【0248】
文脈上別段の指示がない限り、上述した特徴の説明及び定義は、本発明の任意の特定の態様又は実施形態に限定されず、記載した全ての態様及び実施形態に等しく適用される。
【0249】
本明細書及び特許請求の範囲を通じて、以下の用語は、文脈上明らかに別段の指示がない限り、本明細書に明示的に関連付けられた意味を有する。「一実施形態において」という語句は、本明細書で使用するとき、同じ実施形態を指すこともあるが、必ずしも同じ実施形態を指すわけではない。さらに、「別の実施形態において」という語句は、本明細書で使用するとき、異なる実施形態を指すこともあるが、必ずしも異なる実施形態を指すわけではない。したがって、以下で述べるように、本発明の範囲又は精神から逸脱することなく、本発明の様々な実施形態を容易に組み合わせることができる。
【0250】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用するとき、文脈上明らかに別段の指示がない限り、単数形「a」、「an」、及び「the」は複数の指示対象を含むことに留意されたい。本明細書において、範囲は、「約」ある特定の値から、及び／又は「約」別の特定の値までとして表現されることがある。そのような範囲が表現されるとき、別の実施形態は、上記１つの特定の値から及び／又は上記他の特定の値までを含む。同様に、先行詞「約」の使用によって値が近似値として表現されるとき、特定の値が別の実施形態を成すことを理解されたい。数値に関する用語「約」は任意選択であり、例えば±１０％を意味する。
【0251】
以下の特許請求の範囲を含め、本明細書全体を通じて、文脈上別段の要求がない限り、「備える」及び「含む」という語、及び「備えて」、「備え」、及び「含み」などの語形変化は、指定された整数、ステップ、又は整数若しくはステップの群の包含を示唆し、任意の他の整数、ステップ、又は整数若しくはステップの群の除外を示唆するものではないことを理解されたい。
【0252】
本発明の他の態様及び実施形態は、文脈上別段の指示がない限り、用語「を備える」を、用語「からなる」又は「から本質的になる」に置き換えて上述した態様及び実施形態を提供する。
【0253】
以上の説明、添付の特許請求の範囲、又は添付図面で開示される特徴は、それらの特定の形式で、又は開示される機能を実施するための手段、若しくは開示される結果を得るための方法若しくはプロセスの観点から適宜表現されるが、本発明をその多様な形態で実現するために、個別に、そのような特徴の任意の組合せで利用することができる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6A】
【図6B-C】
【図6D】
【図7】
【図8A】
【図8B】
【図8C-D】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【図9D】
【図10A-B】
【図11A-B】
【図11C】
【図11D】
【図12A-C】
【図13A-C】
【図14】
【図15】
【図16A】
【図16B】
【図16C】
【図16D】
【図16E】
【図16F】
【図17A-D】
【図17E】
【図17F-G】
【図17H-I】
【図18A-B】
【図18C-D】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24A-B】
【図25】
【図26A】
【図26B】
【図26C-D】
【図27A-D】
【図28A-E】
【図28F-H】
【図29A-C】
【図29D】
【図29E-F】
【図30】
【図31-1】
【図31-2】
【図32A-E】
【図32F-G】
【図33A-D】
【図33E-I】
【図33F-J】
【図34A-B】
【図34C-D】
【図34E】
【図34E-1】
【図34F-I】
【国際調査報告】