特表 2024-525977 ＨＩＶ及び／またはＳＩＶに感染した細胞のマーカ及びその応用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-07-12

(54)【発明の名称】ＨＩＶ及び／またはＳＩＶに感染した細胞のマーカ及びその応用

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/04 20060101AFI20240705BHJP

   C12N 15/54 20060101ALI20240705BHJP

   C12N 15/113 20100101ALI20240705BHJP

   C07K 16/40 20060101ALI20240705BHJP

   C12N 9/12 20060101ALI20240705BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/04

C12N15/54 ZNA

C12N15/113 130Z

C07K16/40

C12N9/12

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024504818

(86)(22)【出願日】2021-09-30

(85)【翻訳文提出日】2024-03-22

(86)【国際出願番号】 CN2021122082

(87)【国際公開番号】W WO2023004994

(87)【国際公開日】2023-02-02

(31)【優先権主張番号】202110855712.1

(32)【優先日】2021-07-28

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】516367039

【氏名又は名称】中国医科大学附属第一医院

(74)【代理人】

【識別番号】110000659

【氏名又は名称】弁理士法人広江アソシエイツ特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】梁国新

(72)【発明者】

【氏名】尚▲紅▼

【テーマコード（参考）】

4B063

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B063QA01

4B063QA19

4B063QQ03

4B063QQ08

4B063QQ27

4B063QR32

4B063QR35

4B063QR48

4B063QS33

4B063QS34

4B063QX01

4H045AA11

4H045DA76

4H045EA22

4H045EA53

(57)【要約】

ＨＩＶ及び／またはＳＩＶに感染した細胞中のマーカ及びその応用であって、マーカはＰＬＫ（Ｐｏｌｏ－ｌｉｋｅ－ｋｉｎａｓｅ）である。ＰＬＫタンパク質の活性を阻害し、またはそれを除去することにより、リザーバを活性化せずにウイルスを放出させるという目的を実現することで、それを生理状態下で検出することができ、さらに体内で免疫システムまたは薬によって識別、除去させることもできる。ＰＬＫタンパク質の活性を強化することで、ＨＩＶ及び／またはＳＩＶに感染した細胞内でウイルスの放出を直接阻害することができる。それにより、ＨＩＶ及び／またはＳＩＶ感染の診断及び抗ウイルス治療に新しい標的を提供し、ウイルス感染の早期の迅速な検出及び極早期の治療に投薬の根拠と保障を提供しており、重要な臨床的価値を有している。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＨＩＶ及び／またはＳＩＶに感染した細胞中のマーカにおいて、前記マーカがＰＬＫタンパク質であることを特徴とする、マーカ。

【請求項2】

前記マーカのＰＬＫタンパク質がＰＬＫ３タンパク質であることを特徴とする、請求項１に記載のＨＩＶ及び／またはＳＩＶに感染した細胞中のマーカ。

【請求項3】

前記マーカのＰＬＫ３タンパク質はＰＬＫ３－２０１タンパク質であり、前記ＰＬＫ３－２０１タンパク質のアミノ酸配列は配列番号１に示す通りであることを特徴とする、請求項２に記載のＨＩＶ及び／またはＳＩＶに感染した細胞中のマーカ。

【請求項4】

ＨＩＶ感染の検出及び除去に用いる細胞の調製における、ＰＬＫタンパク質活性を阻害できる物質の使用であって、
前記ＰＬＫタンパク質活性を阻害できる物質が、
Ｉ、小分子化合物、
ＩＩ、Ｗｏｒｔｍａｎｎｉｎ、Ｖｏｌａｓｅｒｔｉｂ、ＢＩ２５３６、ＧＷ８４３６８２Ｘ、ＴＡＫ９６０、Ｐｏｌｏｘｉｎ、ＬＦＭ－Ａ１３、ＳＥＢ１３ Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、ＴＣ－Ｓ ７００５、ＴＡＫ－９６０ ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、ＳＥＢ１３及びＴＡＫ－９６０ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅを含むＰＬＫプロテアーゼインヒビター、
ＩＩＩ、ＰＬＫタンパク質の特異性抗体またはその抗原結合フラグメント、
ＩＶ、ＰＬＫタンパク質の標的阻害剤としてのｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ、
のうちの少なくとも１種の物質を含むことを特徴とする、
使用。

【請求項5】

前記ＰＬＫタンパク質活性の阻害がＰＬＫ３タンパク質活性の阻害であることを特徴とする、請求項４に記載のＰＬＫタンパク質活性を阻害できる物質のＨＩＶ感染の検出及び除去に用いる細胞の調製における使用。

【請求項6】

ＨＩＶ及び／またはＳＩＶに感染した細胞を検出する方法において、前記方法が、感染した細胞中のＰＬＫタンパク質活性を阻害することによって、該細胞に検出可能な子孫ウイルスを放出させて検出の目的を果たすというものであることを特徴とする、方法。

【請求項7】

ＨＩＶ及び／またはＳＩＶに感染した細胞を除去する方法において、前記方法が、ＨＩＶ及び／またはＳＩＶに感染した細胞中のＰＬＫタンパク質活性を阻害することによって該細胞に子孫ウイルスを放出させ、さらに特にキラーＣＤ８＋Ｔ細胞を主なエフェクタ細胞とするヒト免疫システムに特異的に識別され、または関連する抗ウイルス薬に識別されて、ＨＩＶ及び／またはＳＩＶに感染した細胞を除去する目的を果たすというものであることを特徴とする、方法。

【請求項8】

前記ＨＩＶ及び／またはＳＩＶに感染した細胞が、ＨＩＶ及び／またはＳＩＶに感染した細胞、ＨＩＶ及び／またはＳＩＶに感染した末梢血細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、樹状細胞及びグリア細胞を含むことを特徴とする、請求項６または７に記載の方法。

【請求項9】

前記方法におけるＰＬＫタンパク質活性の阻害が、ＰＬＫ３タンパク質活性の阻害であることを特徴とする、請求項６または７に記載の方法。

【請求項10】

ＨＩＶ及び／またはＳＩＶに感染した細胞内でウイルスの放出を直接阻害する方法において、前記方法が、ＰＬＫタンパク質の発現を増強することによってＨＩＶ及び／またはＳＩＶに感染した細胞内のウイルスの放出を直接阻害することができるものであることを特徴とする、方法。

【請求項11】

前記ＨＩＶ及び／またはＳＩＶに感染した細胞が、ＨＩＶ及び／またはＳＩＶに感染した細胞、ＨＩＶ及び／またはＳＩＶに感染した末梢血細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、樹状細胞及びグリア細胞を含むことを特徴とする、請求項１０に記載のＨＩＶ及び／またはＳＩＶに感染した細胞内でウイルスの放出を直接阻害する方法。

【請求項12】

前記方法におけるＰＬＫタンパク質発現の増強がＰＬＫ３タンパク質発現の増強であることを特徴とする、請求項１０に記載のＨＩＶ及び／またはＳＩＶに感染した細胞内でウイルスの放出を直接阻害する方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明はバイオ医薬分野に関する。具体的には、ＨＩＶ及び／またはＳＩＶに感染した細胞中のマーカ及びその応用に関わり、より具体的には、本発明は、ＰＬＫタンパク質をＨＩＶ及び／またはＳＩＶに感染した細胞の検出及び該細胞の除去のための用途、ＨＩＶ及び／またはＳＩＶに感染した細胞に処理を行うことによって該細胞を検出及び除去する方法を提供しており、またＨＩＶ及び／またはＳＩＶに感染した細胞内のウイルス放出を阻害する方法も提供している。

【背景技術】

【0002】

ＨＩＶ感染はすでに地球上の生命の健康に対する重大な脅威となっているが、現時点の抗ＨＩＶ療法では、ウイルスのアクティブレプリケーションを有効にコントロールできるだけで、徹底的に根治することはできない。ＨＩＶ感染者が抗ウイルス治療（Ｈｉｇｈｌｙ Ａｃｔｉｖｅ Ａｎｔｉｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ Ｔｈｅｒａｐｙ，ＨＡＡＲＴ）を行うと、血漿中のウイルス負荷が急速に減少し、最小検出限界（＜２０コピー／ｍｌ）以下になる。しかし、抗ウイルス治療を一旦中止すると、体内のウイルスは急速にリバウンドする。そのため、ほとんどのエイズ患者は、生涯にわたって抗ウイルス治療を行わなければならない（極めて少数のエリートコントローラを除く）。薬の使用を停止した後、ウイルスが急速にリバウンドし、病状が再発して根治が難しい主要な原因は「ＨＩＶリザーバ細胞」の存在であり、これもエイズが完全治愈を実現しにくい最も根本的な原因である。そのため、これらＨＩＶに感染したリザーバ細胞に対する有効かつ安全な検出方法及び除去方法を見つける必要がある。

【0003】

既存のＨＩＶリザーバの検出方法は、基本的にすべて実験室条件下でＨＩＶリザーバ細胞を活性化すること、例えば、植物性凝集素（ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ，ＰＨＡ）などに類似する物質を添加してＨＩＶリザーバ細胞を活性化することにより、大量に子孫ウイルスを放出させ、放出されたウイルス量を検出し、ＨＩＶリザーバ細胞のおおよその存在量を推定するというものである。この検出方法の欠点は、（１）標準化及び定量化ができないこと、（２）ＨＩＶリザーバ細胞は、一旦活性化されると、ウイルスの放出を促進することはできるが、ＨＩＶリザーバの重要な生理特性を喪失してしまうこと、という点にある。そのため、放出されたウイルスは、すでに潜伏ウイルスの特徴を有していないのである。

【0004】

この分野では、理論上、国際的に広く認められているショック・アンド・キル療法（Ｓｈｏｃｋ＆Ｋｉｌｌ）を基本的な治療原則とする方法が研究されている。既存の検出方法と同様に、Ｓｈｏｃｋ＆Ｋｉｌｌ治療の原則においても、まず潜伏逆転剤（Ｌａｔｅｎｔ ｒｅｖｅｒｓａｌ ａｇｅｎｔｓ，ＬＲＡ）がリザーバ細胞内の潜伏ウイルスを活性化／Ｓｈｏｃｋさせ、その後、キラーＣＤ８＋Ｔ細胞によって発現させ、除去させる。しかし、治療方法の研究の面で現在遭遇している重要な問題は、ＣＤ４＋Ｔリザーバ細胞中の潜伏ウイルスのＬＲＡｓを活性化しても、リザーバ細胞に特異的に作用するわけではなく、生体が安定バランスを崩したり、ヒト免疫システムが非特異的に活性化したりすることになる。そのため、現在の手段を採用してＳｈｏｃｋ＆Ｋｉｌｌ治療を行うと、患者の生体の安定バランスが崩れ、免疫が混乱し、命を落とすことさえある。つまり、Ｓｈｏｃｋ＆Ｋｉｌｌ療法は基礎実験上では成功したが、臨床治療に入ることができなかったのである。サル免疫不全ウイルス（Ｓｉｍｉａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ，ＳＩＶ）はアフリカミドリザルウイルスとも呼ばれ、ＨＩＶに類似した特性を有する、アフリカ霊長類のレトロウイルスである。

【0005】

上で述べたように、ＨＩＶ及び／またはＳＩＶに感染した細胞の中からマーカを探し出すことで、ＨＩＶリザーバ細胞を活性化せず、生体の安定バランスを崩すことなく、引き続き大量の子孫ウイルスの放出を促進させることで、安全な生理条件下でこれらの細胞を検出することができること、しかも体内で自己免疫システムまたは関連する抗ウイルス薬によって識別及び除去されること、及びＨＩＶ及び／またはＳＩＶに感染した細胞内でウイルスの放出を直接阻害することのすべてが、重要な臨床的意味を有しているのである。

【0006】

Ｐｏｌｏ様キナーゼ（Ｐｏｌｏ－ｌｉｋｅ Ｋｉｎａｓｅ，ＰＬＫ）は細胞周期のプロセスにおける重要な制御因子であり、ファミリーメンバーには主にＰＬＫ１、ＰＬＫ２、ＰＬＫ３、ＰＬＫ４及びＰＬＫ５が含まれる。その中で、ある研究では、ＰＬＫ３が細胞ストレス反応や遺伝子二重鎖断裂修復に関係していることを指摘している。細胞系では、ＰＬＫ３タンパク質は微小管依存的に中心体と結合し、有糸分裂に関与し、かつ有糸分裂装置に位置決めされている。キナーゼ喪失突然変異体の発現は、微小管動態の変化とアポトーシスにより引き起こされる細胞形態異常をもたらした。しかし現在のところ、ＰＬＫ３タンパク質の、ＨＩＶ及び／またはＳＩＶに感染した細胞内における具体的な機能メカニズムなどの情報に関する報道はない。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

上記の問題を解決するために、本発明では、ＨＩＶ及び／またはＳＩＶに感染した細胞中のマーカ及びその応用を提供している。該マーカ（即ちＰＬＫタンパク質）の助けを借りて、ＨＩＶ及び／またはＳＩＶに感染した細胞を処理し、これらの細胞に子孫ウイルスを放出させることで、該細胞を検出及び除去する方法とを提供しており、また、ＨＩＶ及び／またはＳＩＶに感染した細胞の子孫ウイルスの放出を直接阻害する方法も提供している。

【0008】

上記の目的を実現するために、本発明では以下の技術手法を提供している。

【0009】

本発明では、ＨＩＶ及び／またはＳＩＶに感染した細胞中のマーカを提供しており、その特徴は、上記マーカがＰＬＫタンパク質であるという点にある。

【0010】

さらに、上記マーカのＰＬＫタンパク質はＰＬＫ３タンパク質である。

【0011】

さらに、上記マーカのＰＬＫ３タンパク質はＰＬＫ３－２０１タンパク質であり、上記ＰＬＫ３－２０１タンパク質のアミノ酸配列は配列番号１に示す通りである。

【0012】

本発明はさらに、ＰＬＫタンパク質活性を阻害可能な物質の、ＨＩＶ及び／またはＳＩＶ感染の検出及び除去のための細胞の調製における用途を提供しており、上記ＰＬＫタンパク質活性を阻害可能な物質は、
Ｉ、小分子化合物、
ＩＩ、Ｗｏｒｔｍａｎｎｉｎ、Ｖｏｌａｓｅｒｔｉｂ、ＢＩ２５３６、ＧＷ８４３６８２Ｘ、ＴＡＫ９６０、Ｐｏｌｏｘｉｎ、ＬＦＭ－Ａ１３、ＳＥＢ１３ Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、ＴＣ－Ｓ ７００５、ＴＡＫ－９６０ ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、ＳＥＢ１３及びＴＡＫ－９６０ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅを含むＰＬＫプロテアーゼインヒビター、
ＩＩＩ、ＰＬＫタンパク質の特異性抗体またはその抗原結合フラグメント、
ＩＶ、ＰＬＫタンパク質の標的阻害剤としてのｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ、
のうちの少なくとも１種の物質を含むことを特徴とする。

【0013】

さらに、上記ＰＬＫタンパク質活性の阻害は、ＰＬＫ３タンパク質活性の阻害である。

【0014】

本発明はさらに、ＨＩＶ及び／またはＳＩＶに感染した細胞を検出する方法を提供しており、上記方法は、感染した細胞中のＰＬＫタンパク質活性を阻害することによって、該細胞に検出可能な子孫ウイルスの大量放出を開始させて検出の目的を果たすことを特徴とする。

【0015】

本発明はさらに、ＨＩＶ及び／またはＳＩＶに感染した細胞を除去する方法を提供しており、上記方法は、ＨＩＶ及び／またはＳＩＶに感染した細胞中のＰＬＫタンパク質活性を阻害することによって、ＨＩＶ及び／またはＳＩＶに感染した細胞に子孫ウイルスの大量放出を開始させ、それによりヒト免疫システムに特異的に識別され、または関連する抗ウイルス薬に識別されて、ＨＩＶ及び／またはＳＩＶに感染した細胞を除去する目的を果たすことを特徴とする。

【0016】

さらに、上記ＨＩＶ及び／またはＳＩＶに感染した細胞を検出及び除去する方法は、上記ＨＩＶ及び／またはＳＩＶに感染した細胞が、ＨＩＶ及び／またはＳＩＶに感染した細胞、ＨＩＶ及び／またはＳＩＶに感染した末梢血細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、樹状細胞及びグリア細胞を含むことを特徴とする。

【0017】

さらに、上記ＨＩＶ及び／またはＳＩＶに感染した細胞を検出及び除去する方法は、上記方法におけるＰＬＫタンパク質活性の阻害がＰＬＫ３タンパク質活性の阻害であることを特徴とする。

【0018】

本発明はさらに、ＨＩＶ及び／またはＳＩＶに感染した細胞内でウイルスの放出を直接阻害する方法を提供しており、上記方法は、ＰＬＫタンパク質の活性を強化することによってＨＩＶ及び／またはＳＩＶに感染した細胞内のウイルスの放出を直接阻害することができることを特徴とする。

【0019】

好適には、ＨＩＶ及び／またはＳＩＶに感染した細胞内でウイルスの放出を直接阻害する上記方法は、上記ＨＩＶ及び／またはＳＩＶに感染した細胞が、ＨＩＶ及び／またはＳＩＶに感染した末梢血細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、樹状細胞及びグリア細胞を含むことを特徴とする。

【0020】

さらに、ＨＩＶ及び／またはＳＩＶに感染した細胞内でウイルスの放出を直接阻害する上記方法は、上記方法におけるＰＬＫタンパク質活性の強化が、ＰＬＫ３タンパク質発現の強化であることを特徴とする。

【0021】

従来技術と比較すると、本発明の有益な効果は以下の通りである。

【0022】

本発明では、ＨＩＶ及び／またはＳＩＶに感染した細胞がウイルスを放出することに関連する新しい標的を初めて発見している。ＰＬＫ３タンパク質の活性を阻害し、またはそれを除去することにより、リザーバを活性化せずに細胞が大量の子孫ウイルスを放出することを促すという目的を果たすことで、それを生理状態下で検出することができ、さらに体内で免疫システムまたは関連する抗ウイルス薬に識別、除去させることもできる。従来の検査方法では、体外で細胞を強烈に活性化させる必要があり、感染した細胞の生理（休止）特徴の変化が生じ、しかもプロウイルスが完全であるか否かを区別できず、リザーバの大きさを過大評価してしまうので、検査結果の真実性や精度が不十分であり、まだ臨床に応用することはできていない。

【0023】

それと同時に、本発明では、ＰＬＫ３タンパク質の活性を強化することで、ＨＩＶ及び／またはＳＩＶに感染した細胞内でウイルスの放出を直接阻害することができ、ウイルスを永久に細胞内に封じ込めるという目的を達成できることを初めて発見している。つまり、ＰＬＫ３タンパク質の活性を阻害すること、またはそれを除去すること、あるいはＰＬＫ３タンパク質の活性を強化することは、いずれもＨＩＶ感染の抗ウイルス治療にとって有益なのである。

【0024】

以上のように、本発明は、ＨＩＶ及び／またはＳＩＶ感染の診断及び抗ウイルス治療に全く新しい理論的根拠及び全く新しい標的を提供するとともに、ウイルス検出のウィンドウ期間を有効に短縮することができ、感染の極めて早い時期に細胞レベルを通して微量の感染性ウイルスを検出し、ＨＩＶ及び／またはＳＩＶ感染の早期診断及び極早期治療に投薬の根拠と保障を提供することができるので、重要な臨床応用的価値を有している。

【図面の簡単な説明】

【0025】

【図1】図１は、ＰＬＫ３タンパク質発現ベクターをトランスフェクションした後の、上澄み液中のＨＩＶの感染率の比較図である。

【図2】図２は、ＰＬＫ３タンパク質発現ベクターをトランスフェクションした後の、ｐ２４含有量の比較図である。

【図3】図３は、ＰＬＫ３タンパク質発現ベクターをトランスフェクションした後の、ウイルス粒子に関連するゲノムＲＮＡ含有量の比較図である。

【図4】図４は、ＰＬＫ３タンパク質発現ベクターをトランスフェクションした後の、ＨＩＶ Ｇａｇ ＲＮＡ含有量の比較図である。

【図5】図５は、ＰＬＫ３タンパク質発現ベクターをトランスフェクションした後の、野生型Ｇａｇタンパク質とコドンが最適化されたＧａｇタンパク質の含有量の比較図である。

【図6】図６は、ＰＬＫ３タンパク質発現ベクターをトランスフェクションした後の、上澄み液中のＨＢＶウイルス含有量の比較図である。

【図7】図７は、ＰＬＫ１、ＰＬＫ２、ＰＬＫ３、ＰＬＫ４及びＰＬＫ５タンパク質発現ベクターで２９３Ｔ細胞をトランスフェクションした後の、上澄み液中のＨＩＶ－１含有量の比較図である。

【図8】図８は、ＰＬＫ３タンパク質発現ベクターをトランスフェクションした後の、上澄み液中のＨＩＶ－１含有量比較図である。

【図9】図９は、ＰＬＫ３タンパク質発現ベクターをトランスフェクションした後の、上澄み液中の異なるエンベロープ（ＶＳＶ－Ｇ、ＨＩＶ－１_ＤｏＬ、ＨＩＶ－１_{ＳＦ１６２}、ＨＩＶ－１_８９．６、ＨＩＶ－１_ＡＤ８）ウイルスの含有量の比較図である。

【図10】図１０は、ＰＬＫ３タンパク質発現ベクターをトランスフェクションした後の、ＨＩＶ Ｇａｇ ＲＮＡ含有量の比較図である。

【図11】図１１は、ＰＬＫ１、ＰＬＫ２、ＰＬＫ３、ＰＬＫ４及びＰＬＫ５タンパク質発現ベクターをトランスフェクションした後の、上澄み液中のＣＣＲ５向性ＨＩＶ－１_ＡＤ８含有量の比較図である。

【図12】図１２は、ＰＬＫ１、ＰＬＫ２、ＰＬＫ３、ＰＬＫ４及びＰＬＫ５タンパク質発現ベクターをトランスフェクションした後の、上澄み液中のＣＣＲ５とＣＸＣＲ４（両向性）ＨＩＶ－１_８９．６の含有量の比較図である。

【図13】図１３は、ＰＬＫ１、ＰＬＫ２、ＰＬＫ３、ＰＬＫ４及びＰＬＫ５タンパク質発現ベクターをトランスフェクションした後の、上澄み液中のＣＣＲ５向性ＨＩＶ－１_ＢａＬ含有量の比較図である。

【図14】図１４は、ＰＬＫ１、ＰＬＫ２、ＰＬＫ３、ＰＬＫ４及びＰＬＫ５タンパク質発現ベクターをトランスフェクションした後の、上澄み液中のＨＩＶ－２_ＲＯＤ含有量の比較図である。

【図15】図１５は、ＰＬＫ１、ＰＬＫ２、ＰＬＫ３、ＰＬＫ４及びＰＬＫ５タンパク質発現ベクターをトランスフェクションした後の、上澄み液中のＳＩＶ_ａｇｍ含有量の比較図である。

【図16】図１６は、ＨＩＶ－１の感染に対するＰＬＫ３キナーゼ阻害剤ＧＷ８４３６８２Ｘの作用の影響図である。

【図17】図１７は、ＰＬＫ３キナーゼ喪失突然変異発現ベクターをトランスフェクションした後の、ＨＩＶ－１感染に対する作用の影響図である。

【発明を実施するための形態】

【0026】

発明の詳細な説明
以下では、具体的な実施形態と結び付けて、本発明について詳細に記述しているが、その目的は、前述の技術内容をより適切に理解させることであって、前述の技術内容を制限することではない。実質的に、同一または類似する原理により行われる改良は、すべて本発明で保護を請求している請求項の範囲内にある。

【実施例】

【0027】

実施例１

【0028】

ＨＩＶリザーバ細胞のヒトＰＬＫ３タンパク質は、ＨＩＶ－１ウイルスタンパク質の翻訳を阻害する作用を有しており、ＨＩＶ－１に対して特異的な阻害性を持つ。

【0029】

ＰＬＫ３の作用を検証するために、ＨＩＶ－１ウイルスベクターを異なるＰＬＫ３タンパク質発現レベルを有する２９３Ｔ細胞に処理したところ、ＰＬＫ３タンパク質発現のない２９３Ｔ細胞と比較して、これらのＰＬＫ３タンパク質発現を含む２９３Ｔ細胞は、ＨＩＶの感染性を最大約１／１５０のレベルまで低下させられることがわかった。具体的な試験のステップは次の通りである。２９３Ｔ細胞を３×ＦＬＡＧを用いてマーキングしたＰＬＫ３タンパク質発現ベクターでトランスフェクションし、陰性対照群を含めて、ｐＮＬ４．３を用いて処理した。トランスフェクションを４８時間行い、上澄み液をＴＺＭ－ｂｌ指示細胞の感染に用いて、ウイルス感染レベルを取得した。毎回の測定データからは、いずれもバックグラウンドＲＬＵが差し引かれている（図１）。

【0030】

ＰＬＫ３タンパク質の過剰発現がある場合は、培養上澄み液中のウイルス粒子のコア抗原ｐ２４及びウイルス粒子のゲノムＲＮＡの含有量も大幅に減少する。具体的な試験のステップは次の通りである。図１と類似する前処理ステップを採用して、ｐ２４酵素結合免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）を行い（図２）、特定のプローブのｑＰＣＲに基づいて、ウイルス粒子に関するゲノムＲＮＡ（Ｖｉｒｉｏｎ ＲＮＡ）を測定した（図３）。

【0031】

しかし、ＰＬＫ３タンパク質の過剰発現は、細胞内ウイルスＧａｇ転写レベルには影響していない。これは、ＰＬＫ３タンパク質の過剰発現はＨＩＶ－１のタンパク質発現を著しく減少させたものの、ＨＩＶ－１の転写には影響しなかったことを表している。また、ＰＬＫ３タンパク質と関連するウイルスＧａｇタンパク質も著しく減少しており、これはＰＬＫ３がＨＩＶタンパク質の翻訳を特異的に阻害する過程に関わっていることを表している。具体的な試験のステップは次の通りである。すべてのＲＮＡを抽出してｑＰＣＲを行い、ＨＩＶ－１のＧａｇ転写レベルを測定した（図４）。細胞を集めてフローサイトメトリー試験を行い、かつ特異性抗体を用いてＨＩＶ－１ｐ２４タンパク質の発現レベルを検出した（図５）。

【0032】

２９３Ｔ細胞中のＰＬＫ３タンパク質の過剰発現がＣＭＶプロモータが駆動するＨＢＶ（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ）ウイルスに対する作用を検出し、ＰＬＫ３タンパク質がＨＩＶ－１に特異的に作用するか否かを判断した結果、完全なＨＢＶの複製を発見した。つまり、ＰＬＫ３タンパク質はＨＢＶの複製及び放出に影響しないということである。具体的な試験のステップは以下の通りである。実験グループの２９３Ｔ細胞を３×ＦＬＡＧでマーキングしたＰＬＫ３発現ベクターでトランスフェクションし、陰性対照群と共にＨＢＶレプリコン（ＣＭＶプロモータ）を用いて処理した。４８時間後、ＨＢｓ酵素結合免疫吸着測定を用いて、培養上澄み液中のＨＢＶウイルス粒子を検出した（図６）。

【0033】

実施例２

【0034】

ヒトＰＬＫ（ＰＬＫ１、ＰＬＫ２、ＰＬＫ３、ＰＬＫ４及びＰＬＫ５）タンパク質ファミリーの中で、ＰＬＫ３タンパク質だけがＨＩＶ－１タンパク質の翻訳を阻害する作用を有し、ＨＩＶ－１に対して特異的な阻害性を持っている。また、チンパンジーのＰＬＫ３タンパク質にもＨＩＶ－１タンパク質の翻訳を阻害する作用があり、ＨＩＶ－１に対して特異的な阻害性を持っている。

【0035】

ヒトＰＬＫタンパク質は、具体的には、ＰＬＫ１タンパク質、ＰＬＫ２タンパク質、ＰＬＫ３タンパク質、ＰＬＫ４タンパク質及びＰＬＫ５タンパク質の５種類がある。５種類すべてのヒトＰＬＫタンパク質と霊長類ＰＬＫ３タンパク質の抗ＨＩＶ－１活性を検出した。陰性対照群に比べて、様々な発現量のヒトＰＬＫ３は、ＨＩＶ－１の感染性を陰性対照群の１／１１～１／１１５まで低下させている。また、ヒトＰＬＫ１タンパク質、ＰＬＫ２タンパク質、ＰＬＫ４タンパク質及びＰＬＫ５タンパク質は抗ＨＩＶ－１活性を示さなかった。チンパンジー（ｃｈｉｍｐａｎｚｅｅ）ＰＬＫ３タンパク質及びマカク（ｍａｃａｃａ）ＰＬＫ３タンパク質も、ＨＩＶ－１の感染性を低下させることができ、その低下の幅はヒトＰＬＫ３タンパク質とは僅かな差しかない。これは、霊長類のＰＬＫ３ファミリータンパク質がすべて抗ＨＩＶ－１活性を有する可能性があることを表している。具体的な試験のステップは以下の通りである。２９３Ｔ細胞を、それぞれ３×ＦＬＡＧでマーキングしたヒトＰＬＫ１、ＰＬＫ２、ＰＬＫ３、ＰＬＫ４及びＰＬＫ５タンパク質発現ベクター、３×ＦＬＡＧでマーキングしたチンパンジーＰＬＫ３タンパク質発現ベクター、及び３×ＦＬＡＧでマーキングしたマカクＰＬＫ３タンパク質ベクターを用いてトランスフェクションし、陰性対照群を含めて、すべてｐＮＬ４．３で処理した。トランスフェクションの４８時間後に、上澄み液をＴＺＭ－ｂｌ指示細胞の感染に用いて、ウイルス感染レベルを取得した。毎回の測定データからは、いずれもバックグラウンドＲＬＵが差し引かれている（図７、８）。

【0036】

実施例３

【0037】

ＰＬＫ３タンパク質はＨＩＶ－１に対して阻害性を有しており、該阻害性は、Ｇａｇの転写に影響を及ぼすことなく、ＣＸＣＲ４向性及びＣＣＲ５向性エンベロープタンパク質に包まれたＨＩＶに対していずれも阻害作用を有することに現れている。

【0038】

ヒトＰＬＫ３タンパク質はＨＩＶ－１感染を阻止する非常に強い能力を示しており、しかもＧａｇ転写には影響していない。具体的な試験プロセスは次の通りである。３×ＦＬＡＧでマーキングしたＰＬＫ３タンパク質発現ベクターを用いて２９３Ｔ細胞をトランスフェクションし、陰性対照群を含めてｐＮＬ４．３ΔＥ－ＧＦＰ及びそれぞれＶＳＶ－Ｇ、ｐＤｏＬ－ｇｐ１６０、ｐＳＦ１６２－ｇｐ１６０、ｐＡＤ８－ｇｐ１６０またはｐ８９．６－ｇｐ１６０を発現するベクターにより処理した。トランスフェクションの４８時間後、上澄み液をＴＺＭ－ｂｌ指示細胞の感染に用い、ウイルスの感染レベルを取得した。毎回の測定データからは、いずれもバックグラウンドＲＬＵが差し引かれている（図９）。抽出されたすべてのＲＮＡにｑＰＣＲを行ってＧａｇ転写物を定量化し、ホスホグリセルアルデヒドデヒドロゲナーゼによって規格化した（図１０）。

【0039】

実施例４

【0040】

ＰＬＫ３タンパク質は、ＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２及びＳＩＶに対して阻害性を有しており、該阻害性は、野生型ＣＣＲ５向性ウイルス（ＡＤ８及びＢａＬ）、両向性ウイルス（８９．６）、ＨＩＶ－２_ＲＯＤ及びＳＩＶ_ａｇｍに対していずれも阻害作用を有することに現れている。

【0041】

ヒトＰＬＫ３の発現は、ＨＩＶ－１_ＡＤ８、ＨＩＶ－１_ＢａＬ、ＨＩＶ－１_８９．６、ＨＩＶ－２_ＲＯＤ及びＳＩＶ_ａｇｍ感染に対する制限能力も表している。具体的な試験のステップは次の通りである。３×ＦＬＡＧでマーキングしたＰＬＫ３タンパク質発現ベクターを用いて２９３Ｔ細胞をトランスフェクションし、陰性対照群も含めていずれもウイルスベクターｐＡＤ８（図１１）、ｐ８９．６（図１２）、ｐＢａＬ（図１３）、ｐＨＩＶ－２_ＲＯＤ（図１４）及びｐＳＩＶ_ａｇｍ（図１５）を用いて処理した。トランスフェクションの４８時間後、上澄み液をＴＺＭ－ｂｌ指示細胞の感染に用い、ウイルスの感染レベルを取得した。毎回の測定データからは、いずれもバックグラウンドＲＬＵが差し引かれている。

【0042】

実施例５

【0043】

ＰＬＫ３には、ＨＩＶ－１に対する阻害作用を実現するためのキナーゼ活性が必要である。ＰＬＫ３キナーゼ阻害剤またはキナーゼドメイン喪失突然変異は、ＨＩＶ－１に対するＰＬＫ３の阻害作用を阻害することができる。

【0044】

ヒトＰＬＫ３はＰｏｌｏ様キナーゼである。ＰＬＫ３キナーゼ阻害剤ＧＷ８４３６８２Ｘを使用する処理では、ＰＬＫ３の発現レベルに変化はなかったが、その抗ウイルス能は阻害された。ＧＷ８４３６８２ＸまたはＰＬＫ３キナーゼドメイン突然変異ベクターを使用してそれぞれを処理し、結果を観察した。ＧＷ８４３６８２ＸまたはＰＬＫ３キナーゼドメイン突然変異は、ヒトＰＬＫ３の抗ＨＩＶ－１ウイルス能を阻害することができた。具体的な試験のステップは次の通りである。３×ＦＬＡＧでマーキングしたＰＬＫ３タンパク質発現ベクターを用いて、２４時間トランスフェクションした後、陰性対照群も含めていずれもＮＬ４．３．Ｌｕｃ（ＶＳＶ－Ｇ）を用いて処理を行った。それと同時に、ＧＷ８４３６８２Ｘを用いて細胞を処理した。トランスフェクションの４８時間後に、細胞を集めてフローサイトメトリー検査を行った（図１６）。３×ＦＬＡＧでマーキングしたＰＬＫ３キナーゼドメイン喪失突然変異タンパク質発現ベクターを用いて、２４時間トランスフェクションした後、陰性対照群も含めてＮＬ４．３．Ｌｕｃ（ＶＳＶ－Ｇ）を用いて処理を行った。トランスフェクションの４８時間後に、細胞を集めてフローサイトメトリー検査を行った（図１７）。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【配列表】

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【手続補正書】

【提出日】2024-03-22

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＨＩＶに感染した細胞を検出する製品の調製における、ＰＬＫ３タンパク質を検出する試薬の使用であって、
前記ＰＬＫ３タンパク質はＰＬＫ３－２０１タンパク質であり、前記ＰＬＫ３－２０１タンパク質のアミノ酸配列は配列番号１に示す通りである、使用。

【請求項2】

ＨＩＶに感染した細胞の検出及び除去に用いる製品の調製における、ＰＬＫ３タンパク質活性を阻害できる物質の使用であって、
前記ＰＬＫ３タンパク質はＰＬＫ３－２０１タンパク質であり、前記ＰＬＫ３－２０１タンパク質のアミノ酸配列は配列番号１に示す通りであり、
前記ＰＬＫ３タンパク質活性を阻害できる物質が、
Ｉ、小分子化合物、
ＩＩ、Ｗｏｒｔｍａｎｎｉｎ、Ｖｏｌａｓｅｒｔｉｂ、ＢＩ２５３６、ＧＷ８４３６８２Ｘ、ＴＡＫ９６０、Ｐｏｌｏｘｉｎ、ＬＦＭ－Ａ１３、ＳＥＢ１３ Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、ＴＣ－Ｓ ７００５、ＴＡＫ－９６０ ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、ＳＥＢ１３及びＴＡＫ－９６０ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅを含むＰＬＫ３プロテアーゼインヒビター、
ＩＩＩ、ＰＬＫ３タンパク質の特異性抗体またはその抗原結合フラグメント、
ＩＶ、ＰＬＫ３タンパク質の標的阻害剤としてのｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ、
のうちの少なくとも１種の物質を含むことを特徴とする、使用。

【請求項3】

ＨＩＶに感染した細胞を検出する製品の調製における、ＰＬＫ３タンパク質活性を阻害する物質の使用であって、
前記製品は、感染した細胞中のＰＬＫ３タンパク質活性を阻害することによって、該細胞に検出可能な子孫ウイルスの放出を実現させており、
前記ＰＬＫ３タンパク質はＰＬＫ３－２０１タンパク質であり、前記ＰＬＫ３－２０１タンパク質のアミノ酸配列は配列番号１に示す通りである、使用。

【請求項4】

ＨＩＶに感染した細胞を除去する製品の調製における、ＰＬＫ３タンパク質活性を阻害する物質の使用であって、
前記製品は、ＨＩＶに感染した細胞内のＰＬＫ３タンパク質活性を阻害することによって該細胞に子孫ウイルスを放出させ、さらにキラーＣＤ８＋Ｔ細胞を主なエフェクタ細胞とするヒト免疫システムに特異的に識別され、または関連する抗ウイルス薬に識別されることを実現しており、
前記ＰＬＫ３タンパク質はＰＬＫ３－２０１タンパク質であり、前記ＰＬＫ３－２０１タンパク質のアミノ酸配列は配列番号１に示す通りである、使用。

【請求項5】

前記ＨＩＶに感染した細胞が、末梢血細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、樹状細胞及びグリア細胞を含むことを特徴とする、請求項３または４に記載の使用。

【請求項6】

抗ＨＩＶウイルス製品の調製における、ＰＬＫ３タンパク質の発現を増加させる試薬の使用であって、
前記製品は、ＰＬＫ３タンパク質の発現を増強することによってＨＩＶに感染した細胞内のウイルスの放出を直接阻害することを実現しており、
前記ＰＬＫ３タンパク質はＰＬＫ３－２０１タンパク質であり、前記ＰＬＫ３－２０１タンパク質のアミノ酸配列は配列番号１に示す通りである、使用。

【請求項7】

前記ＨＩＶに感染した細胞が、末梢血細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、樹状細胞及びグリア細胞を含むことを特徴とする、請求項６に記載の使用。

【国際調査報告】