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特表2024-525988神経変性疾患を伴うまたは伴わない概日リズム睡眠障害の治療における使用のための、メラフェノキセートおよびその誘導体
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-07-12
(54)【発明の名称】神経変性疾患を伴うまたは伴わない概日リズム睡眠障害の治療における使用のための、メラフェノキセートおよびその誘導体
(51)【国際特許分類】
C07C 219/06 20060101AFI20240705BHJP
A61K 31/221 20060101ALI20240705BHJP
A61P 25/20 20060101ALI20240705BHJP
A61P 25/28 20060101ALI20240705BHJP
A61P 25/14 20060101ALI20240705BHJP
A61P 25/16 20060101ALI20240705BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20240705BHJP
A61K 9/08 20060101ALI20240705BHJP
A61K 9/20 20060101ALI20240705BHJP
A61K 9/48 20060101ALI20240705BHJP
【ＦＩ】
C07C219/06
A61K31/221
A61P25/20
A61P25/28
A61P25/14
A61P25/16
A61P25/00
A61K9/08
A61K9/20
A61K9/48
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024524503
(86)(22)【出願日】2022-07-08
(85)【翻訳文提出日】2024-03-05
(86)【国際出願番号】 EP2022069204
(87)【国際公開番号】W WO2023281112
(87)【国際公開日】2023-01-12
(31)【優先権主張番号】21305942.1
(32)【優先日】2021-07-08
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】524009015
【氏名又は名称】エヌエルエス、ファーマシューティクス、アクチエンゲゼルシャフト
【氏名又は名称原語表記】ＮＬＳ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ＡＧ
(74)【代理人】
【識別番号】100120031
【弁理士】
【氏名又は名称】宮嶋 学
(74)【代理人】
【識別番号】100120617
【弁理士】
【氏名又は名称】浅野 真理
(74)【代理人】
【識別番号】100126099
【弁理士】
【氏名又は名称】反町 洋
(72)【発明者】
【氏名】エリク、コノファル
【テーマコード（参考）】
4C076
4C206
4H006
【Ｆターム（参考）】
4C076AA11
4C076AA36
4C076AA53
4C076BB01
4C076BB31
4C076CC01
4C076FF70
4C206AA01
4C206AA02
4C206AA03
4C206FA03
4C206KA01
4C206KA09
4C206MA01
4C206MA04
4C206MA37
4C206MA55
4C206MA57
4C206MA72
4C206MA83
4C206NA14
4C206ZA02
4C206ZA05
4C206ZA15
4C206ZA16
4H006AA01
4H006AA03
4H006AB21
4H006BJ30
4H006BM72
4H006BP30
4H006BT10
4H006BU44
(57)【要約】
本発明は、概日リズム睡眠障害、および／または概日リズム睡眠神経学的疾患、および／または断眠に関連する任意の医学的状態の予防および／または治療における使用のための、式（Ｉ）の化合物（式中、Ｒ１＝Ｈもしくはアシル基、好ましくはＲ１＝Ｈであり、Ｒ２＝Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉからなる群から選択されるハロゲン原子、好ましくはＲ２＝Ｃｌである。）または薬学的に許容されるその異性体、塩および／もしくは溶媒和物に関する。
［化１］
［化１］
【特許請求の範囲】
【請求項1】
概日リズム睡眠障害、および／または概日リズム睡眠神経学的疾患、および／または断眠に関連する任意の医学的状態、および／または概日リズム崩壊、および／または過眠症の中枢性障害、好ましくはアルツハイマー病の予防および／または治療における使用のための、式（Ｉ）【化1】
Ｒ１＝Ｈまたはアシル基、好ましくはＲ１＝Ｈであり、
Ｒ２＝Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉからなる群から選択されるハロゲン原子、好ましくはＲ２＝Ｃｌである）
の化合物、または薬学的に許容されるその異性体、塩および／もしくは溶媒和物。
【請求項2】
前記概日リズム睡眠障害が、概日リズム睡眠障害、不規則睡眠覚醒型Ｇ４７．２３（ＩＣＤ－１０）；概日リズム睡眠障害、不規則睡眠覚醒型３０７．４５－３（ＤＳＭ－５）；ならびに概日リズム睡眠覚醒障害および不規則睡眠覚醒リズム障害３０７．４５－３（ＩＣＳＤ－３）からなる群から選択される、請求項１に記載の使用のための式（Ｉ）の化合物。
【請求項3】
前記概日リズム睡眠神経学的疾患が、認知症、アルツハイマー病（ＡＤ）、ハンチントン病（ＨＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）および筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を含む神経変性障害の群で選択される、請求項１に記載の使用のための式（Ｉ）の化合物。
【請求項4】
前記概日リズム睡眠神経学的疾患が、アンゲルマン、ウィリアムズ、およびスミスマギニス症候群を含む神経発達障害の群で選択される、請求項１に記載の使用のための式（Ｉ）の化合物。
【請求項5】
前記過眠症の中枢性障害が、ナルコレプシー１型、ナルコレプシー２型、特発性過眠症、クライネ－レヴィン症候群、精神障害に関連する過眠症、医学的障害による過眠症、薬または物質による過眠症、および睡眠不全症候群の群で選択される、請求項１に記載の使用のための式（Ｉ）の化合物。
【請求項6】
０．１ｍｇ／ｋｇ／日～１００ｍｇ／ｋｇ／日である治療用量が、それを必要とする患者に投与される、請求項１から５のいずれか一項に記載の使用のための式（Ｉ）の化合物。
【請求項7】
Ｒ２がパラ位にある、請求項１から６のいずれか一項に記載の使用のための式（Ｉ）の化合物。
【請求項8】
概日リズム睡眠障害、および／または概日リズム睡眠神経学的疾患、および／または断眠に関連する任意の医学的状態、および／または概日リズム崩壊、および／または過眠症の中枢性障害、好ましくはクライネ－レヴィン症候群の予防および／または治療における使用のための、請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物、または薬学的に許容されるその異性体、塩および／もしくは溶媒和物、ならびに薬学的に許容される添加剤を含む、医薬組成物。
【請求項9】
前記概日リズム睡眠障害が、概日リズム睡眠障害、不規則睡眠覚醒型Ｇ４７．２３（ＩＣＤ－１０）；概日リズム睡眠障害、不規則睡眠覚醒型３０７．４５－３（ＤＳＭ－５）；ならびに概日リズム睡眠覚醒障害および不規則睡眠覚醒リズム障害３０７．４５－３（ＩＣＳＤ－３）からなる群から選択される、請求項８に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項10】
前記概日リズム睡眠神経学的疾患が、認知症、アルツハイマー病（ＡＤ）、ハンチントン病（ＨＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）および筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を含む神経変性障害の群で選択される、請求項８に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項11】
前記概日リズム睡眠神経学的疾患が、アンゲルマン、ウィリアムズ、およびスミスマギニス症候群を含む神経発達障害の群で選択される、請求項８に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項12】
前記過眠症の中枢性障害が、ナルコレプシー１型、ナルコレプシー２型、特発性過眠症、クライネ－レヴィン症候群、精神障害に関連する過眠症、医学的障害による過眠症、薬または物質による過眠症、および睡眠不全症候群の群で選択される、請求項８に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項13】
１ｍｇ～８００ｍｇ、好ましくは２０ｍｇ～４００ｍｇの式（Ｉ）の化合物を含む、請求項８から１２のいずれか一項に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項14】
経口または非経口投与に好適な、請求項８から１３のいずれか一項に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項15】
注射可能な溶液のような溶液剤、もしくは錠剤もしくはカプセル剤の形態、または経皮送達システムである、請求項１４に記載の使用のための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
発明の分野
本発明は、概日リズム睡眠障害、および／または概日リズム睡眠神経学的疾患、および／または断眠に関連する任意の医学的状態、および／または概日リズム崩壊、好ましくはアルツハイマー病の予防および／または治療における、メラフェノキセート（Ｍｅｌａｆｅｎｏｘａｔｅ）、２－（１－アダマンチルアミノ）エチル２－（４－クロロフェノキシ）アセテートおよびその誘導体の使用に関する。
本発明は、概日リズム睡眠障害、および／または概日リズム睡眠神経学的疾患、および／または断眠に関連する任意の医学的状態、および／または概日リズム崩壊、好ましくはアルツハイマー病の予防および／または治療における、メラフェノキセート（Ｍｅｌａｆｅｎｏｘａｔｅ）、２－（１－アダマンチルアミノ）エチル２－（４－クロロフェノキシ）アセテートおよびその誘導体の使用に関する。
【背景技術】
【0002】
発明の背景
概日リズムは、全ての生存生物において普遍的であり、ほとんど全ての生理学的機能、とりわけ睡眠および覚醒のサイクルは、概日リズム性を呈する。概日リズムは、環境時間のきっかけがない内因性であり、持続する１。
概日リズムは、全ての生存生物において普遍的であり、ほとんど全ての生理学的機能、とりわけ睡眠および覚醒のサイクルは、概日リズム性を呈する。概日リズムは、環境時間のきっかけがない内因性であり、持続する１。
【0003】
睡眠覚醒サイクルは、ホメオスタシスの過程（覚醒状態の間に増加し、睡眠中に低下する睡眠のための駆動）と概日の過程（睡眠傾向を調節する睡眠覚醒非依存性の２４時間振動リズム）との間の複雑な相互作用により調節される。睡眠に対する概日の駆動は、生物学的な夜間の終了時に最高となり、生物学的な昼間の終了時に最低である。概日リズムに同調する状況では、睡眠に対するホメオスタシスの駆動が睡眠と共に消失する場合、睡眠に対する概日の駆動は、睡眠の固定を促進する代償の手法で増加する。逆に、睡眠に対するホメオスタシスの駆動が生物学的昼間の間に覚醒状態と共に増加する場合、睡眠に対する概日の駆動は、低下し、覚醒状態の固定を助ける２。
【0004】
概日リズム睡眠障害（ＣＲＳＤ）は、概日時計システムの機能不全による睡眠および覚醒の障害、または内因性概日リズムのタイミングと外部から課せられる社会および仕事のサイクルとの間のずれの慢性的もしくは再発パターンから生じ、臨床的に有意な機能的障害をもたらす。
【0005】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、患者の社会的技能および日常タスクを実行する能力に重大な影響を及ぼす記憶および他の認知機能の進行性の喪失で特徴付けられる。患者の脳でのアミロイド斑、過剰リン酸化タウタンパク質の存在は、ＡＤの特徴である。
【0006】
世界で５０００万人より多くの人々が、認知症を抱えて生きており、ＡＤは、症例の７０％を占める。この数字は、２０年ごとに２倍になると予測される３。上昇する数値は、効果的な治療の悲観的な欠如から生じる。したがって、早期段階で進行を管理し、減速するように改変され得るＡＤ病理に寄与する因子を同定し、理解することが重大である。
【0007】
概日リズム睡眠障害は、疾患の早期段階からアルツハイマーの患者で一般的に観察される３～５。さらに、脳の死後分析は、中央の概日時計の中心部の機械での形態学的変化を確認する６。概日リズム崩壊およびＡＤ関連の臨床的証拠は大きくなる。しかし、概日リズム崩壊がＡＤの原因もしくは結果であるか否か、またはどの役割をメラトニンがＡＤの病理生理学において担うかは、完全に解明または理解されない７。
【0008】
メラトニン（Ｎ－アセチル－５－メトキシトリプタミン）は、血液および髄液（ＣＳＦ）に排出される松果体の多機能性神経ホルモンであり、ＣＲＳＤを治療するのに使用される多くの治療の鍵である季節性および概日リズムの調節に重要な役割を担う８。
【0009】
メラトニン産生は、加齢に伴って、神経変性疾患を含むある特定の疾患で減少し、メラトニンの脱調節がヒトの疾患の発症または進行を引き起こし得ることを示す９～１１。ＣＳＦメラトニンレベルは、脳において初期アルツハイマー病のような神経病理学的な変化を伴う高齢の集団では、若い個体のレベルの２分の１のレベルまで有意に低下する１１，１２。事実、松果体を取り除くことが、メラトニンの経口投与により逆転される海馬の変形をもたらすと確認されている１３。アルツハイマー病（ＡＤ）患者でのメラトニン減少の一般的な指標は、睡眠障害、夜間の落ち着きのなさ、および日没現象であり、その全ては、他の集団より高齢の集団で、特にＡＤ患者でより頻繁に観察される１４。
【0010】
睡眠および概日リズムでのその役割に加えて、メラトニンは、ＡＤの細胞および動物の両方のモデルにおいて、神経保護効果、抗酸化防御、抗炎症効果を発揮することが示され、コリンエステラーゼ活性を低減し、ミトコンドリア損傷およびアポトーシスおよび抗アポトーシス活性を防止する１５～１６。
【0011】
抗酸化酵素およびタンパク質の発現の増加は、酸化ストレスの重要なマーカーである。観察は、このようなタンパク質が、本障害での病原性機構において酸化ストレスの関与の可能性を支持する、ＡＤ患者の神経病理学的病変に存在することを示す１０。
【0012】
ＣＲＳＤは、ＡＤの初期の段階から以下がますます報告されている：断眠および不眠症が、ＡＤの病因に関連し、症状および発症に影響を有し得ること；断眠が、β－アミロイドおよびタウのクリアランスを障害する、脳柔組織を通したグリンパティックのバルクフローを障害すること；概日リズム崩壊が、ニューロンにおける酸化ストレスの増加をもたらすこと；断眠および概日リズム崩壊が、メラトニンの神経保護効果を無効にすること；断眠および概日リズム崩壊が、タウの凝集体を凝集する病理学的なストレスの粒子を誘発すること。
【0013】
国際分類システムによると、ＣＲＳＤは、概日リズム睡眠障害、不規則睡眠覚醒型Ｇ４７．２３（ＩＣＤ－１０）；概日リズム睡眠障害、不規則睡眠覚醒型３０７．４５－３（ＤＳＭ－５）；および概日リズム睡眠覚醒障害、不規則睡眠覚醒リズム障害３０７．４５－３（ＩＣＳＤ－３）を含む１７～１９。
【0014】
過眠症の中枢性障害（ＣＤＨ）は、病理学的な日中の眠気および／または不適切な覚醒状態により特徴付けられる。Ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｌｅｅｐ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ、第３版（ＩＣＳＤ－３）は、８個の異なる過眠症の中枢性障害：ナルコレプシー１型、ナルコレプシー２型、特発性過眠症、クライネ－レヴィン症候群、精神障害に関連する過眠症、医学的障害による過眠症、薬または物質による過眠症、および睡眠不全症候群に分類する１７。
【0015】
これらの障害の基礎をなす病理生理学は、明らかではない。
【0016】
クライネ－レヴィン症候群（ＫＬＳ）は、重度過眠症の再発性で再発寛解型エピソード、過剰な量の睡眠（すなわち１日当たり１８～２０時間）の必要性（過眠症）；過剰な食物摂取（強迫性過食、むちゃ食い）；ならびに、認知障害、無感情、現実感消失、気分変化、および異常に抑制されない性欲のような行動の変化で特徴付けられる希少疾患である。
【0017】
本障害は、女性より３倍多く影響を受けるように見え、通常１６歳ぐらいである青年男性に主に影響を及ぼす。起床時、影響を受けた個人は、易刺激性、エネルギー欠乏（嗜眠）、および／または情緒欠如（無感情）を呈す場合がある。彼らはまた、精神病状態を含む錯乱される（見当識を喪失される）幻覚経験を出現し得る。
【0018】
ＫＬＳの症状は周期性である。影響を受けた個人は、症状を経験せずに数週間または数か月進行し得る。存在する場合、症状は、数日から数週間持続し得る。
【0019】
ＫＬＳの正確な原因は知られていない。しかし、研究者は、一部の場合では、遺伝性要因が原因で、一部の個体が本障害を発症する遺伝的素因を有するようになると考えている。ＫＬＳの症状が、睡眠、食欲、および体温のような機能を調節する助けとなる脳の一部（視床下部）の機能不全に関連し得ると考えられている。
【0020】
最近の所見は、ＫＬＳ患者のほぼ半分で海馬を含む中側頭皮質（ｍｅｓｏｔｅｍｐｏｒａｌ ｃｏｒｔｅｘ）で代謝低下症が存在し、これらの代謝低下症の重症度がより最近の障害のマーカーであるという考えを強化する。
【0021】
以前、一部の研究者は、ＫＬＳがＮＴ１として自己免疫障害であり得ると推測した。５００例未満の症例が医学文献で報告されている。しかし、ＫＬＳの症例が多くの場合認識されていないので、本障害は、過少診断され、一般集団にその真の頻度を決定することが難しい。多くの対処療法および予防的治療は、制御された治験を伴わず、症例報告のみに基づいて患者に提供されている。試された様々な刺激剤の１つであるアマンタジンは、ドーパミン再取込み阻害の刺激剤および抗ウイルス特性を伴う薬物であるが、おそらく最も有意な応答を有し、ＫＬＳの全ての提案された治療と比較する系統的な精査においてＡｒｎｕｌｆらにより報告されたような残りの刺激剤と比較して４１％であることを見出されている。
【0022】
作用のその機構は、依然として明らかではない。アマンタジンは、ドーパミン合成および放出を増大し、シナプス前ドーパミン再取込みを遮断し、ＮＭＤＡグルタミン酸作動性受容体アンタゴニストとして作用する。その効果は、多くの場合その後のエピソードで失われた２０。我々の場合、優れた応答は、第２のエピソードでさえ維持されたが、見通しの欠如が早期に結論を出すことを制限している。アマンタジンは、特にＫＬＳのエピソードと考えることができる迅速な効果的な治療である興味深い選択肢であるが、さらなる研究が依然として必要であり、エピソード中ならびにエピソード間のＫＬＳに対する決定的な治療は奨励されてない。ＫＬＳでの過眠症の期間中のドーパミン作動性の減色の証拠が存在し、ドーパミンＤ４受容体遺伝子（ＤＲＤ４）は、最近出版されたように、肥満をもたらし得るむちゃ食いに特に関与され得る。
【0023】
不規則睡眠覚醒リズム障害（ＩＳＷＲＤ）は、稀な概日リズム睡眠障害である。ＩＳＷＲＤの対象は、夜間に継続して睡眠しないことに加えて、日中に断続的で不規則に睡眠する。したがって、ＩＳＷＲＤの攪乱は、正常な概日の断片、または睡眠および覚醒の２４時間の日周パターンと時に呼ばれる２０。
【0024】
ＩＳＷＲＤは、ＡＤの初期の段階で同定され得る。ＩＳＷＲＤの対象はまた、覚醒している間、過剰な日中の眠気および他の認知障害を経験する。ＩＳＷＲＤは、アンゲルマン、ウィリアムズ、およびスミスマギニス症候群を含む、神経発達障害を伴う小児で一般的に見られる８。ＩＳＷＲＤは、認知症およびアルツハイマー病（ＡＤ）のような神経変性障害を伴う高齢の個体で一般的に見られる２１。
【0025】
メラトニンおよびその受容体（ＭＴ１およびＭＴ２、Ｇタンパク質共役型受容体、ＧＰＣＲに属する）は、注目されている。これは、このモノアミンに対する重要な役割を示唆する一部の報告による。これらの中では、メラトニンが興味深いバイオマーカーであり得ると報告するものがあり、髄液でのメラトニンのレベルと神経病理学の重症度との間の逆相関を示す２２。しかし、Ａβ斑および神経原線維変化（ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｉｌｌｉａｒｙ ｔａｎｇｌｅ）の形成を改善することができるので、潜在的な治療剤としてメラトニンを報告する著者も存在する２３。
【0026】
さらに、メラトニン投与は、混乱した概日リズム、認知、学習、記憶、運動機能、気分、睡眠、およびストレス応答を含む、マウスモデルでのＡＤに関係する行動障害を改善する２４，２５。さらに、メラトニンは、アセチルコリン放出を増大し、コリンアセチルトランスフェラーゼを阻害することによりコリン作動系で有益な効果を誘発する２５。さらに、確立していない機構によるセロトニン作動系およびドーパミン作動系のような他のモノアミン系の調節に関連する利点を発揮するようにも見える２３，２５。
【0027】
加えて、メラトニンの化学構造は、抗酸化剤または炎症の調節因子として作用する構造に関する。事実、その投与は、一部の炎症および神経毒性の機構に関係するＣａ２＋の過剰な流入ならびにＭｇ２＋の過剰な流出を制限する２３，２６。
【0028】
クライネ－レヴィン症候群（ＫＬＳ）では、過眠症の発作の間、概日安静活動リズムの振幅は、劇的に減少し、日中の安定性を低減した２７。
【0029】
ＣｒｉｔｃｈｌｅｙおよびＨｏｆｆｍａｎは、１９４２年に症候群を実際に定義し、古典的な論文「Ｔｈｅ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｏｆ Ｐｅｒｉｏｄｉｃ Ｓｏｍｎｏｌｅｎｃｅ ａｎｄ Ｍｏｒｂｉｄ Ｈｕｎｇｅｒ（Ｋｌｅｉｎｅ－Ｌｅｖｉｎ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）」の出版後にその名称を与えた。これは、通常、最大で数週間継続し、完全な回復をもたらすエピソードを伴う青年男性に主に影響を及ぼす。影響を受けた人は、これらのエピソード間で無症状であるが、多数回の再発が起こり得る。各エピソードは、１週間から１～２か月間継続し得る。ＫＬＳの期間は、症候群の臨床的な発現に基づいて異なり得る２８。
【0030】
最近の所見は、ＫＬＳ、概日の調節、および双極性障害の間の関係を示唆し、報告された出生困難を伴うＴＲＡＮＫ１遺伝子の多型がＫＬＳの訴因となり得ることを示す２９。また、ＴＲＡＮＫ１遺伝子は、樹状突起棘、シナプス可塑性、軸索誘導および概日同調過程に生物学的に関するように見え、精神医学的なゲノム規模の関連研究（例えば、初期発症における睡眠の調節に影響を及ぼすＣＡＣＮＡ１Ｃ遺伝子）において強力な関連性を呈する可能性も高くなる３０。メラトニンが臨床的価値のいくつかの利点を有するとしても、文献の広範囲な精査は、メラトニンが、ほとんどのＣＲＳＤを治療するのに十分に効果的ではないことを明らかにした。この天然ホルモンの限定された有用性に対する理由の一部は、循環での極度に短いその半減期、および睡眠維持がまた主要なメラトニン作動性作用の下流の機構により調節されているという真実に関する。より長期の半減期を有するメラトニン受容体アゴニストの開発は、ＣＲＳＤおよび関連する疾患の成功した治療に好適であり得る、差し迫った要求がある３０。
【0031】
１９９０年代半ばのメラトニン受容体のクローニングにもかかわらず、脳におけるメラトニン１（ＭＴ１）受容体の病理生理学的役割への研究が、このメラトニン受容体のサブタイプに対する選択的リガンドの欠如により阻害されている。このＭＴ１選択的リガンドの欠如は、ヒトＭＴ１およびＭＴ２受容体が、それらの結晶構造がないことからも、膜貫通ドメイン内のそれらのアミノ酸配列の約６０％を共有するという事実に部分的に起因し得る３１。
【0032】
遺伝的リスクの変形を伴う個体でのＭＴ１メラトニン受容体レベルの低下は、ニューロンにおけるアミロイド前駆タンパク質β（ＡＰＰβ）のアミロイド形成的処理を増大し、アルツハイマー病（ＡＤ）の病理学的な過程を向上させる。
【0033】
中でも、ＡＰＰのアミロイド形成的処理が、可溶なＡＰＰβのレベルでの４０％の増加により示される通り、ＭＴ１ａメラトニン受容体のレベルが低下した細胞で増大したことを報告している３２。
【0034】
ＡＤおよび交代作業への不耐性の両方を伴うＭＴＮＲ１Ａ（脳でのＭＴ１受容体発現の遺伝子）の低下に関連するｒｓ１２５０６２２８の関連に対する機構的説明のモデルが仮定されている３２。
【0035】
以前に、メラトニンが、ＨＴＴ（ハンチンチン）突然変異細胞モデルでＭＴ１の保持および活性化に沿ってニューロン細胞死を軽減すると示されている。さらに、研究は、ＭＴ１レベルが、野生型マウスよりハンチントン病（ＨＤ）マウスで小さかったことを示した３３。加えて、脳の扁桃および黒質でのＭＴ１レベルの減少は、パーキンソン病（ＰＤ）をもたらす３４。しかし、ＰＤまたはＨＤ症候を緩和し、それらのニューロンアポトーシスを防止することができる選択的メラトニン受容体ＭＴ１アゴニストは、研究されていない。
【0036】
また、メラトニンが、ＭＴ１依存性経路を介してＴＨ１７細胞から分泌されるＩＬ－１７（多発性硬化症に関与するインターロイキン）のレベルを低減することが明らかになっている３５。
【0037】
さらに、メラトニンおよびＭＴ２ではなくＭＴ１のレベルが、野生型マウスのものより筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）マウスの脊髄ではるかに小さいことも示される３６。ゆえに、ＡＬＳにおけるメラトニンの抗アポトーシス効果は、ＭＴ１経路に依存し得る。
【0038】
ＡＬＳは、進行麻痺および最終的な死をもたらす、脳幹での運動ニューロン（ＭＮ）、舌下運動ニューロン（ＨＭＮ）、顔面運動ニューロン（ＦＭＮ）および脊髄の進行性で選択的な変性で特徴付けられる。メラトニンが疾患の進行および死亡率を効果的に遅延させるだけでなく、受容体相互作用タンパク質２（Ｒｉｐ２）／カスパーゼ－１経路およびカスパーゼ－３を不活化し、ＡＬＳの突然変異スーパーオキサイドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）（Ｇ９３Ａ）遺伝子導入マウスモデルにおけるミトコンドリアシトクロムｃの放出を遮断することにより、運動ニューロンの死滅を有意に阻害することが報告されている。ＡＬＳにおけるアポトーシスでのメラトニンの保護効果は、カスパーゼ－１／シトクロムｃ／カスパーゼ－３経路の阻害に関連されることが示された３３。
【0039】
概日リズムおよび覚醒では、一連の完了行動を促進するリラキシン－３／ＲＸＦＰ３シグナル伝達は、より広範に覚醒および動機付けられた行動を駆動するその主たる役割と直結している３７～３９。
【0040】
ストレス応答、摂食および代謝、動機付け、報酬、ならびに性行動に関与したリラキシンファミリーペプチド受容体３（リラキシン－３／ＲＸＦＰ３）であるＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）は、覚醒および行動的活性化、食欲調節、ストレス応答、不安、記憶、睡眠および概日リズムのような情動的行動的機能を調節するために提案されている３９。
【0041】
神経内分泌障害および関連する行動機能不全の治療のための潜在的な治療標的としてＲＸＦＰ３は報告されているが４０、リラキシン－３／ＲＸＦＰ３系およびＫＬＳに基づく証拠は報告されていない。
【0042】
メラフェノキセートは、見出された第１の選択的メラトニン１（ＭＴ１）受容体アゴニストである。その独特な結合プロファイルを考えると、発明者らは、概日リズム睡眠障害、および／または概日リズム睡眠神経学的疾患、および／または断眠に関連する任意の医学的状態、および／または概日リズム崩壊、および／または過眠症の中枢性障害へのその潜在的な利点を仮定する。
【0043】
以前の研究が、メラトニン治療が星状膠細胞および小膠細胞のスコポラミンで誘発された過剰な活性化を改善し、ＴＮＦ－αおよびＩＬ－１βの過剰発現を軽減し、スコポラミンを投与した成体のマウスでの神経炎症および記憶障害を予防したことを同定している１０ので、スコポラミンで誘発された認知障害の動物モデルは、アルツハイマー病（ＡＤ）のような神経変性疾患での認知障害の基礎をなす機構および治療を研究するのに広く使用される４１，４２。
【0044】
スコポラミンは、非選択的抗ムスカリン剤であるが、中枢性コリン作動性シグナル伝達を主に遮断することにより学習および記憶の進行性障害をもたらす４３～４５。スコポラミンが、活性酸素種を生成し、酸化ストレスをもたらし、ＡＤ患者で見られるような、記憶および認知機能の障害をもたらすことは周知の現象である４６，４７。
【0045】
ラクチュコピクリン４７もしくは周知のドネペジル４８のようなアセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）の一部の阻害剤、またはアセチルコリン作動性ニューロンで作用する薬理学的薬剤は、スコポラミンで誘発された脳損傷を軽減することを見出しているが、メラトニン作動性１型受容体単独を選択的に標的化する薬理学的薬剤は、このモデルで効果的であると見出されていない。
【発明の概要】
【0046】
発明の概要
本発明の目的は、概日リズム睡眠障害、および／または概日リズム睡眠神経学的疾患、および／または断眠に関連する任意の医学的状態、および／または概日リズム崩壊、好ましくはアルツハイマー病の予防および／または治療における使用のための、式（Ｉ）
（式中、
Ｒ１＝Ｈまたはアシル基であり
Ｒ２＝Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉからなる群から選択されるハロゲン原子である）
の化合物、または薬学的に許容されるその異性体、塩および／もしくは溶媒和物である。
本発明の目的は、概日リズム睡眠障害、および／または概日リズム睡眠神経学的疾患、および／または断眠に関連する任意の医学的状態、および／または概日リズム崩壊、好ましくはアルツハイマー病の予防および／または治療における使用のための、式（Ｉ）
【化1】
Ｒ１＝Ｈまたはアシル基であり
Ｒ２＝Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉからなる群から選択されるハロゲン原子である）
の化合物、または薬学的に許容されるその異性体、塩および／もしくは溶媒和物である。
【0047】
本発明の別の目的は、概日リズム睡眠障害、および／または神経学的疾患、および／または断眠に関連する任意の医学的状態、および／または概日リズム崩壊、好ましくはアルツハイマー病の予防および／または治療における使用のための、前に定義される式（Ｉ）の化合物または薬学的に許容されるその異性体、塩および／もしくは溶媒和物、ならびに薬学的に許容される添加剤を含む、医薬組成物である。
図
図
【図面の簡単な説明】
【0048】
【図1】開放領域における歩行運動活動でのＮＬＳ－８の効果。差対対照群：全ての場合で有意差なし（ｎｓ）。
【図2】識別指標でのスコポラミンおよびスコポラミン＋ＮＬＳ－８の効果。差対０：＃ｐ≦０．０５、＃＃＃ｐ≦０．００１；差対対照群：＊ｐ≦０．０５；ＮＬＳ－８群対スコポラミン群の差：全ての場合で有意差なし（ｎｓ）。
【図3】選択試行の間の２つの物体の探索時間でのスコポラミンおよびスコポラミン＋ＮＬＳ－８の効果。差対対照群：＊ｐ≦０．０５；差対スコポラミン群：§ｐ≦０．０５。
【発明を実施するための形態】
【0049】
発明の詳細な説明
本発明の第１の主題は、概日リズム睡眠障害、および／または概日リズム睡眠神経学的疾患、および／または断眠に関連する任意の他の医学的状態、および／または概日リズム崩壊、好ましくはアルツハイマー病の予防および／または治療における使用のための、式（Ｉ）
（式中、
Ｒ１＝Ｈまたはアシル基、好ましくはＲ１＝Ｈであり、
Ｒ２＝Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉからなる群から選択されるハロゲン原子、好ましくはＲ２＝Ｃｌである）
の化合物、または薬学的に許容されるその異性体、塩および／もしくは溶媒和物に関する。
本発明の第１の主題は、概日リズム睡眠障害、および／または概日リズム睡眠神経学的疾患、および／または断眠に関連する任意の他の医学的状態、および／または概日リズム崩壊、好ましくはアルツハイマー病の予防および／または治療における使用のための、式（Ｉ）
【化2】
Ｒ１＝Ｈまたはアシル基、好ましくはＲ１＝Ｈであり、
Ｒ２＝Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉからなる群から選択されるハロゲン原子、好ましくはＲ２＝Ｃｌである）
の化合物、または薬学的に許容されるその異性体、塩および／もしくは溶媒和物に関する。
【0050】
Ｒ２は、オルト、メタまたはパラ位であり、好ましくはパラ位である。
【0051】
式（Ｉ）はキラル中心を有する。
【0052】
ゆえに、「異性体」とは、「エナンチオマー」を意味する。
【0053】
本発明によると、別段指定されない場合、用語「式（Ｉ）の化合物」とは、そのラセミ体またはそのエナンチオマーの形態で式（Ｉ）の化合物を指す。
【0054】
「光学的に純粋な式（Ｉ）の化合物」とは、９５％より高い、好ましくは９６％より高い、より好ましくは９７％より高い、さらにより好ましくは９８％より高い、特に好ましくは９９％より高いエナンチオマー過剰率でのエナンチオマーを意味する。
【0055】
Ｒ１＝ＨおよびＲ２＝パラ位でのＣｌの場合、式（Ｉ）の化合物は、メラフェノキセート、２－（１－アダマンチルアミノ）エチル２－（４－クロロフェノキシ）アセテート、１：１のラセミ混合物ならびにＲ－およびＳ－エナンチオマー、それらの塩、特にそれらの塩酸塩である。
【0056】
式（Ｉ）の化合物は、好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ／日～１００ｍｇ／ｋｇ／日、より好ましくは０．５～５０ｍｇ／ｋｇ／日である、それを必要とする患者に投与される治療用量で使用される。
【0057】
本発明の第２の主題は、概日リズム睡眠障害、および／または概日リズム睡眠神経学的疾患、および／または断眠に関連する任意の医学的状態、および／または概日リズム崩壊、好ましくはアルツハイマー病を予防および／または治療する方法であって、上記に定義される式（Ｉ）の化合物または薬学的に許容されるその異性体、塩および／もしくは溶媒和物を、それを必要とする患者に投与することを含む、方法に関する。
【0058】
本発明の第３の主題は、概日リズム睡眠障害、および／または概日リズム睡眠神経学的疾患、および／または断眠に関連する任意の医学的状態、および／または概日リズム崩壊、好ましくはアルツハイマー病の予防および／または治療における使用のための、上記に定義される式（Ｉ）の化合物または薬学的に許容されるその異性体、塩および／もしくは溶媒和物、ならびに薬学的に許容される添加剤を含む、医薬組成物に関する。
【0059】
好ましくは、本発明による使用のための医薬組成物は、１ｍｇ～８００ｍｇ、好ましくは２０ｍｇ～４００ｍｇの式（Ｉ）の化合物を含む。
【0060】
好ましくは、本発明による使用のための医薬組成物は、経口投与、例えば錠剤、カプセル剤、シロップ剤、溶液剤、散剤の形態で、または非経口投与、例えば注射可能な溶液のような溶液剤の形態、およびＴＤＳ（経皮送達システム）に好適である。
【0061】
本発明の第４の主題は、概日リズム睡眠障害、および／または概日リズム睡眠神経学的疾患、および／または断眠に関連する任意の他の医学的状態、および／または概日リズム崩壊、好ましくはアルツハイマー病を予防および／または治療する方法であって、上記に定義される医薬組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、方法に関する。
【0062】
好ましくは、概日リズム睡眠障害は、概日リズム睡眠障害、不規則睡眠覚醒型Ｇ４７．２３（ＩＣＤ－１０）；概日リズム睡眠障害、不規則睡眠覚醒型３０７．４５－３（ＤＳＭ－５）；ならびに概日リズム睡眠覚醒障害および不規則睡眠覚醒リズム障害３０７．４５－３（ＩＣＳＤ－３）からなる群から選択される。
【0063】
好ましくは、前記概日リズム睡眠神経学的疾患は、以下の群で選択される。
１）認知症、アルツハイマー病（ＡＤ）、ハンチントン病（ＨＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）および筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を含む、神経変性障害。
２）アンゲルマン、ウィリアムズ、およびスミスマギニス症候群を含む、神経発達障害。
１）認知症、アルツハイマー病（ＡＤ）、ハンチントン病（ＨＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）および筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を含む、神経変性障害。
２）アンゲルマン、ウィリアムズ、およびスミスマギニス症候群を含む、神経発達障害。
【実施例】
【0064】
実施例
メラフェノキセートは、以下に示す通り、４工程で調製された。
メラフェノキセートは、以下に示す通り、４工程で調製された。
【化3】
【0065】
メラフェノキセートは、各標的に特異的な放射性標識されたリガンドの対照特異的結合の阻害％として計算された１０－５Ｍで試験した。
【0066】
この結合プロファイルパネルは、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ標準的操作手順をしたがって細胞周期調節に関与する天然の動物組織、放射性リガンドおよび特異的な酵素を含む、大まかに等しい数の選択的な中心および末梢の治療に関連する標的で広く定義された。
【0067】
放射性リガンド結合実験に対して、半最大阻害濃度（ＩＣ５０）および半最大有効濃度（ＥＣ５０）値は、Ｈｉｌｌの式の曲線適合を使用して競合曲線の非線形回帰分析により（コンピューターソフトウェアを介して）決定された。阻害定数（Ｋｉ）は、Ｃｈｅｎｇ－Ｐｒｕｓｏｆｆ式（Ｋｉ＝ＩＣ５０／（１＋（Ｌ／ＫＤ））を使用して計算され、Ｌはアッセイにおける放射性リガンドの濃度であり、ＫＤは受容体に対する放射性リガンドの親和性である４９。
【0068】
結果は、対照特異的結合％（［実測特異的結合／対照特異的結合］×１００）として、および試験化合物の存在下で得られる対照特異的結合（１００－［（実測特異的結合／対照特異的結合）×１００］）の阻害％として表される。
【0069】
メラフェノキセートは、ヒトＡ１、Ａ２Ａ、およびＡ３アデノシン受容体、α１－およびα２－アドレナリン作用性受容体、ヒトβ１－アドレナリン作用性受容体、ヒトＡＴ１アンギオテンシン受容体、ベンゾジアゼピン受容体、ヒトブラジキニン受容体、ヒトＣＣＫ１コレシストキニン受容体、ヒトＤ１およびＤ２ドーパミン受容体、ヒトエンドセリン受容体Ａ型、ＧＡＢＡＡ受容体、ヒトガラクトーストランスポーター、ヒトＣＸＣケモカイン受容体、ヒトＣ－Ｃケモカイン受容体１型、Ｈ１およびＨ２ヒスタミン受容体、ヒトＭＣ４メラノコルチン受容体、ＭＴ１、ＭＴ２メラトニン受容体、ヒトＭ１、Ｍ２、およびＭ３ムスカリンアセチルコリン受容体、ヒトＮＫ１、ＮＫ２およびＮＫ３ニューロキニン受容体、ヒトＹ１およびＹ２神経ペプチド受容体、ヒトＮＴＳ１ニューロテンシン受容体、ヒトμ－、δ－、およびκ－オピオイド受容体ならびにオピオイド様受容体、ヒト５－ＨＴ１Ａ、５－ＨＴ１Ｂ、５－ＨＴ２Ａ、５－ＨＴ３，５－ＨＴ５Ａ、５－ＨＴ６、および５－ＨＴ７セロトニン受容体、ソマトスタチン受容体、ヒト血管作用性小腸ペプチド受容体、ヒトバソプレシン受容体、Ｃａ２＋チャネル、Ｋ＋ｖチャネル、ＳＫ＋Ｃａチャネル、Ｎａ＋チャネル、およびＣｌ－チャネルを含んだＣＥＲＥＰ（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ、フランス）による放射性リガンド結合の阻害に対する一連の追加のアッセイで試験された。
【0070】
２５％より低い阻害（または刺激）を示す結果は、有意であるとは考えられず、対照レベル程度のシグナルの変動性に大部分が起因する。低度から中程度の負の値は、現実の意味を有さず、対照レベル程度のシグナルの変動性に起因する。
【0071】
５０％より高い阻害または刺激は、試験化合物の有意な効果と考えられ、２５％～５０％は、より大きな実験間の変動性が起こり得る範囲内である場合にさらに試験することにより確認されるべき軽度から中程度の効果を示している。
【0072】
５０パーセントは、さらなる調査に対して通常のカットオフである（すなわち、濃度－応答曲線からＩＣ５０またはＥＣ５０値の決定）。
【0073】
これらの結合アッセイの重要または適切な所見は、表１にメラフェノキセートに対してそれぞれ提示される。
【表1】
【0074】
メラフェノキセートは、見出された第１のメラトニン１型（ＭＴ１）受容体アゴニストである。その独特な結合プロファイル（表１）は、概日リズム睡眠障害、および／または神経学的疾患、および／または断眠に関連する任意の他の医学的状態、および／または概日リズム崩壊でのその潜在的な利点を示唆する。
【0075】
同定されたメラトニン１（ＭＴ１）受容体アゴニストとしてのメラフェノキセートは、概日リズム睡眠障害（ＣＲＳＤ）および／または、認知症、アルツハイマー病（ＡＤ）、ハンチントン病（ＨＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を含む神経変性障害として、アンゲルマン、ウィリアムズおよびスミスマギニス症候群を含む神経発達障害としての、神経学的疾患、および／または断眠に関連する任意の他の医学的状態、および／または概日リズム崩壊を予防および／または治療するのに使用され得る。
【0076】
メラフェノキセートの作用の機構に対する別の適切な所見は、リラキシンファミリー受容体（ＲＸＦＰ３およびＲＸＦＰ４）を含んだ。
【0077】
リラキシン－３／ＲＸＦＰ３およびリラキシン－４／ＲＸＦＰ４受容体は、神経調節系、ならびに神経精神障害（例えば統合失調症）および神経学的疾患（例えばＡＤ）に対する潜在的な治療標的に関与する３６。ＲＸＦＰ３およびＲＸＦＰ４（以前はＧＰＲ１００またはＧＰＣＲ１４２として公知）は、短期Ｎ末端ドメインを伴う相同なクラスＡのＧタンパク質共役型受容体である。ＲＸＦＰ３またはＲＸＦＰ４のリガンドは、内因性ペプチドおよびその類似体を限定するのみであり、天然産物または合成アゴニストは、ＲＸＦＰ３およびＲＸＦＰ４の二元アゴニストとしてインドール含有誘導物の足場を除いて、現時点で報告されていない３７，５０。
【0078】
リラキシン－３／ＲＸＦＰ３およびリラキシン－４／ＲＸＦＰ４受容体に対するメラフェノキセートのこれらの適切な結合活性は、表２に提示される。
【表2】
【0079】
メラフェノキセートは、ＲＸＦＰ３およびＲＸＦＰ４受容体（試験ＦＲ０９５－００２４７４９－Ｑ Ｅｕｒｏｆｉｎｓ／ｌｅａｄＨｕｎｔｅｒ６／２５／２１；未公表データ）と弱く結合することが見出される。
【0080】
これらのアッセイの化合物は、ＧＰＣＲバイオセンサーアッセイを伴い、この設計に適しているアゴニストおよびアンタゴニスト様式で試験した。
【0081】
細胞操作
１． ｃＡＭＰ Ｈｕｎｔｅｒ細胞株は、標準的な手順によりフリーザー保存液から拡張させた。
２． 細胞は、２０μＬの総体積で白色壁の３８４ウェルマイクロプレートに播種させ、試験前の適切な時間３７℃でインキュベートさせた。
３． ｃＡＭＰ調節は、ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ ＨｉｔＨｕｎｔｅｒ ｃＡＭＰ ＸＳ＋アッセイを使用して決定された。
１． ｃＡＭＰ Ｈｕｎｔｅｒ細胞株は、標準的な手順によりフリーザー保存液から拡張させた。
２． 細胞は、２０μＬの総体積で白色壁の３８４ウェルマイクロプレートに播種させ、試験前の適切な時間３７℃でインキュベートさせた。
３． ｃＡＭＰ調節は、ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ ＨｉｔＨｕｎｔｅｒ ｃＡＭＰ ＸＳ＋アッセイを使用して決定された。
【0082】
Ｇｓアゴニストフォーマット
１． アゴニスト決定のために、細胞は、サンプルとインキュベートして、応答を誘発させた。
２． 媒体は細胞から吸引し、１５μＬの２：１ＨＢＳＳ／１０ｍＭのＨｅｐｅｓ：ｃＡＭＰ ＸＳ＋Ａｂ試薬で置き換えられた。
３． サンプルストックの中間希釈は行われ、アッセイ緩衝液において４×サンプルを生成させた。
４． ５μＬの４×サンプルは細胞に添加され、３７℃または室温で３０または６０分間インキュベートさせた。ビヒクル濃度は１％であった。
１． アゴニスト決定のために、細胞は、サンプルとインキュベートして、応答を誘発させた。
２． 媒体は細胞から吸引し、１５μＬの２：１ＨＢＳＳ／１０ｍＭのＨｅｐｅｓ：ｃＡＭＰ ＸＳ＋Ａｂ試薬で置き換えられた。
３． サンプルストックの中間希釈は行われ、アッセイ緩衝液において４×サンプルを生成させた。
４． ５μＬの４×サンプルは細胞に添加され、３７℃または室温で３０または６０分間インキュベートさせた。ビヒクル濃度は１％であった。
【0083】
Ｇｉアゴニストフォーマット
１． アゴニスト決定のために、細胞は、ＥＣ８０フォルスコリンの存在でサンプルとインキュベートして、応答を誘発させた。
２． 媒体は細胞から吸引し、１５μＬの２：１ＨＢＳＳ／１０ｍＭのＨｅｐｅｓ：ｃＡＭＰ ＸＳ＋Ａｂ試薬で置き換えられた。
３． サンプルストックの中間希釈は行われ、４×ＥＣ８０フォルスコリンを含有するアッセイ緩衝液において４×サンプルを生成させた。
４． ５μＬの４×サンプルは細胞に添加され、３７℃または室温で３０または６０分間インキュベートさせた。最終アッセイビヒクル濃度は１％であった。
１． アゴニスト決定のために、細胞は、ＥＣ８０フォルスコリンの存在でサンプルとインキュベートして、応答を誘発させた。
２． 媒体は細胞から吸引し、１５μＬの２：１ＨＢＳＳ／１０ｍＭのＨｅｐｅｓ：ｃＡＭＰ ＸＳ＋Ａｂ試薬で置き換えられた。
３． サンプルストックの中間希釈は行われ、４×ＥＣ８０フォルスコリンを含有するアッセイ緩衝液において４×サンプルを生成させた。
４． ５μＬの４×サンプルは細胞に添加され、３７℃または室温で３０または６０分間インキュベートさせた。最終アッセイビヒクル濃度は１％であった。
【0084】
アロステリック調節フォーマット
１． アロステリック決定に対して、細胞は、サンプルで予めインキュベートされ、続いてＥＣ２０濃度でアゴニスト導入させた。
２． 媒体は細胞から吸引し、１０μＬの１：１ＨＢＳＳ／１０ｍＭのＨｅｐｅｓ：ｃＡＭＰ ＸＳ＋Ａｂ試薬で置き換えられた。
３． サンプルストックの中間希釈は行われ、アッセイ緩衝液において４×サンプルを生成させた。
４． ５μＬの４×化合物は細胞に添加され、室温または３７℃で３０分間インキュベートさせた。
５． ５μＬの４×ＥＣ２０アゴニストは細胞に添加され、室温または３７℃で３０または６０分間インキュベートさせた。Ｇｉ共役型ＧＰＣＲのために、ＥＣ８０フォルスコリンは含まれた。
１． アロステリック決定に対して、細胞は、サンプルで予めインキュベートされ、続いてＥＣ２０濃度でアゴニスト導入させた。
２． 媒体は細胞から吸引し、１０μＬの１：１ＨＢＳＳ／１０ｍＭのＨｅｐｅｓ：ｃＡＭＰ ＸＳ＋Ａｂ試薬で置き換えられた。
３． サンプルストックの中間希釈は行われ、アッセイ緩衝液において４×サンプルを生成させた。
４． ５μＬの４×化合物は細胞に添加され、室温または３７℃で３０分間インキュベートさせた。
５． ５μＬの４×ＥＣ２０アゴニストは細胞に添加され、室温または３７℃で３０または６０分間インキュベートさせた。Ｇｉ共役型ＧＰＣＲのために、ＥＣ８０フォルスコリンは含まれた。
【0085】
逆アゴニストフォーマット（Ｇｉのみ）
１． 逆アゴニスト決定のために、細胞は、ＥＣ２０フォルスコリンの存在でサンプルと予めインキュベートさせた。
２． 媒体は細胞から吸引し、１５μＬの２：１ＨＢＳＳ／１０ｍＭのＨｅｐｅｓ：ｃＡＭＰ ＸＳ＋Ａｂ試薬で置き換えられた。
３． サンプルストックの中間希釈は行われ、４×ＥＣ２０フォルスコリンを含有するアッセイ緩衝液において４×サンプルを生成させた。
４． ５μＬの４×サンプルは細胞に添加され、３７℃または室温で３０または６０分間インキュベートさせた。最終アッセイビヒクル濃度は１％であった。
１． 逆アゴニスト決定のために、細胞は、ＥＣ２０フォルスコリンの存在でサンプルと予めインキュベートさせた。
２． 媒体は細胞から吸引し、１５μＬの２：１ＨＢＳＳ／１０ｍＭのＨｅｐｅｓ：ｃＡＭＰ ＸＳ＋Ａｂ試薬で置き換えられた。
３． サンプルストックの中間希釈は行われ、４×ＥＣ２０フォルスコリンを含有するアッセイ緩衝液において４×サンプルを生成させた。
４． ５μＬの４×サンプルは細胞に添加され、３７℃または室温で３０または６０分間インキュベートさせた。最終アッセイビヒクル濃度は１％であった。
【0086】
アンタゴニストフォーマット
１． アンタゴニスト決定に対して、細胞は、サンプルで予めインキュベートされ、続いてＥＣ８０濃度でアゴニスト攻撃させた。
２． 媒体は細胞から吸引し、１０μＬの１：１ ＨＢＳＳ／Ｈｅｐｅｓ：ｃＡＭＰ ＸＳ＋Ａｂ試薬で置き換えられた。
３． ５μＬの４×化合物は細胞に添加され、３７℃または室温で３０分間インキュベートさせた。
４． ５μＬの４×ＥＣ８０アゴニストは細胞に添加され、３７℃または室温で３０または６０分間インキュベートさせた。Ｇｉ共役型ＧＰＣＲのために、ＥＣ８０フォルスコリンは含まれた。
１． アンタゴニスト決定に対して、細胞は、サンプルで予めインキュベートされ、続いてＥＣ８０濃度でアゴニスト攻撃させた。
２． 媒体は細胞から吸引し、１０μＬの１：１ ＨＢＳＳ／Ｈｅｐｅｓ：ｃＡＭＰ ＸＳ＋Ａｂ試薬で置き換えられた。
３． ５μＬの４×化合物は細胞に添加され、３７℃または室温で３０分間インキュベートさせた。
４． ５μＬの４×ＥＣ８０アゴニストは細胞に添加され、３７℃または室温で３０または６０分間インキュベートさせた。Ｇｉ共役型ＧＰＣＲのために、ＥＣ８０フォルスコリンは含まれた。
【0087】
シグナル検出
１． 適切な化合物をインキュベートした後、アッセイシグナルは、２０μＬのｃＡＭＰ ＸＳ＋ＥＤ／ＣＬ溶解カクテルで１時間インキュベートし、続いて室温で３時間、２０μＬのｃＡＭＰ ＸＳ＋ＥＡ試薬でインキュベートしながら生成させた。
２． マイクロプレートは、化学発光シグナル検出のためにＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｅｎｖｉｓｉｏｎ（商標）装置とのシグナル生成に続いて読み出した。
１． 適切な化合物をインキュベートした後、アッセイシグナルは、２０μＬのｃＡＭＰ ＸＳ＋ＥＤ／ＣＬ溶解カクテルで１時間インキュベートし、続いて室温で３時間、２０μＬのｃＡＭＰ ＸＳ＋ＥＡ試薬でインキュベートしながら生成させた。
２． マイクロプレートは、化学発光シグナル検出のためにＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｅｎｖｉｓｉｏｎ（商標）装置とのシグナル生成に続いて読み出した。
【0088】
データ分析
１． 化合物活性は、ＣＢＩＳデータ分析スイート（ＣｈｅｍＩｎｎｏｖａｔｉｏｎ、ＣＡ）を使用して分析させた。
２． Ｇｓアゴニスト様式アッセイのために、活性百分率は、以下の式：活性％＝１００％×（試験サンプルの平均ＲＬＵ－ビヒクル対照の平均ＲＬＵ）／（ＭＡＸ対照の平均ＲＬＵ－ビヒクル対照の平均ＲＬＵ）を使用して計算される。
３． Ｇｓの正のアロステリック様式アッセイのために、調節百分率は、以下の式：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｕｒｏｆｉｎｓｄｉｓｃｏｖｅｒｙｓｅｒｖｉｃｅｓ．ｃｏｍ Ｃｏｎｆｉｄｅｎｔｉａｌ ６／２５／２０２１ ５％の調節＝１００％×（試験サンプルの平均ＲＬＵ－ＥＣ２０対照の平均ＲＬＵ）／（ＭＡＸ対照の平均ＲＬＵ－ＥＣ２０の平均ＲＬＵ）を使用して計算させる。
４． Ｇｓアンタゴニストまたは負のアロステリック様式アッセイのために、阻害百分率は、以下の式：阻害％＝１００％×（１－（試験サンプルの平均ＲＬＵ－ビヒクル対照の平均ＲＬＵ）／（ＥＣ８０対照の平均ＲＬＵ－ビヒクル対照の平均ＲＬＵ））を使用して計算される。
５． Ｇｉアゴニスト様式アッセイのために、活性百分率は、以下の式：活性％＝１００％×（１－（試験サンプルの平均ＲＬＵ－ＭＡＸ対照の平均ＲＬＵ）／（ビヒクル対照の平均ＲＬＵ－ＭＡＸ対照の平均ＲＬＵ））を使用して計算される。
６． Ｇｉの正のアゴニスト様式アッセイのために、調節百分率は、以下の式：調節％＝１００％×（１－（試験サンプルの平均ＲＬＵ－ＭＡＸ対照の平均ＲＬＵ）／（ＥＣ２０対照の平均ＲＬＵ－ＭＡＸ対照の平均ＲＬＵ））を使用して計算される。
７． Ｇｉ逆アゴニスト様式アッセイのために、活性百分率は、以下の式：逆アゴニスト活性％＝１００％×（（試験サンプルの平均ＲＬＵ－ＥＣ２０の平均ＲＬＵフォルスコリン）／（フォルスコリンの陽性対照の平均ＲＬＵ－ＥＣ２０対照の平均ＲＬＵ））を使用して計算される。
８． Ｇｉアンタゴニストまたは負のアロステリック様式アッセイのために、阻害百分率は、以下の式：阻害％＝１００％×（試験サンプルの平均ＲＬＵ－ＥＣ８０対照の平均ＲＬＵ）／（フォルスコリンの陽性対照の平均ＲＬＵ－ＥＣ８０対照の平均ＲＬＵ）を使用して計算される。
１． 化合物活性は、ＣＢＩＳデータ分析スイート（ＣｈｅｍＩｎｎｏｖａｔｉｏｎ、ＣＡ）を使用して分析させた。
２． Ｇｓアゴニスト様式アッセイのために、活性百分率は、以下の式：活性％＝１００％×（試験サンプルの平均ＲＬＵ－ビヒクル対照の平均ＲＬＵ）／（ＭＡＸ対照の平均ＲＬＵ－ビヒクル対照の平均ＲＬＵ）を使用して計算される。
３． Ｇｓの正のアロステリック様式アッセイのために、調節百分率は、以下の式：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｕｒｏｆｉｎｓｄｉｓｃｏｖｅｒｙｓｅｒｖｉｃｅｓ．ｃｏｍ Ｃｏｎｆｉｄｅｎｔｉａｌ ６／２５／２０２１ ５％の調節＝１００％×（試験サンプルの平均ＲＬＵ－ＥＣ２０対照の平均ＲＬＵ）／（ＭＡＸ対照の平均ＲＬＵ－ＥＣ２０の平均ＲＬＵ）を使用して計算させる。
４． Ｇｓアンタゴニストまたは負のアロステリック様式アッセイのために、阻害百分率は、以下の式：阻害％＝１００％×（１－（試験サンプルの平均ＲＬＵ－ビヒクル対照の平均ＲＬＵ）／（ＥＣ８０対照の平均ＲＬＵ－ビヒクル対照の平均ＲＬＵ））を使用して計算される。
５． Ｇｉアゴニスト様式アッセイのために、活性百分率は、以下の式：活性％＝１００％×（１－（試験サンプルの平均ＲＬＵ－ＭＡＸ対照の平均ＲＬＵ）／（ビヒクル対照の平均ＲＬＵ－ＭＡＸ対照の平均ＲＬＵ））を使用して計算される。
６． Ｇｉの正のアゴニスト様式アッセイのために、調節百分率は、以下の式：調節％＝１００％×（１－（試験サンプルの平均ＲＬＵ－ＭＡＸ対照の平均ＲＬＵ）／（ＥＣ２０対照の平均ＲＬＵ－ＭＡＸ対照の平均ＲＬＵ））を使用して計算される。
７． Ｇｉ逆アゴニスト様式アッセイのために、活性百分率は、以下の式：逆アゴニスト活性％＝１００％×（（試験サンプルの平均ＲＬＵ－ＥＣ２０の平均ＲＬＵフォルスコリン）／（フォルスコリンの陽性対照の平均ＲＬＵ－ＥＣ２０対照の平均ＲＬＵ））を使用して計算される。
８． Ｇｉアンタゴニストまたは負のアロステリック様式アッセイのために、阻害百分率は、以下の式：阻害％＝１００％×（試験サンプルの平均ＲＬＵ－ＥＣ８０対照の平均ＲＬＵ）／（フォルスコリンの陽性対照の平均ＲＬＵ－ＥＣ８０対照の平均ＲＬＵ）を使用して計算される。
【0089】
アゴニストおよびアンタゴニストアッセイのために、データは、対照リガンドおよびビヒクルの存在で観察された最大および最小の応答に正規化させた。
【0090】
Ｇｉ ｃＡＭＰアッセイのために、以下のフォルスコリン濃度が使用された：
ＲＸＦＰ３ ｃＡＭＰ：２０μＭのフォルスコリン
ＲＸＦＰ４ ｃＡＭＰ：２０μＭのフォルスコリン
ＲＸＦＰ３ ｃＡＭＰ：２０μＭのフォルスコリン
ＲＸＦＰ４ ｃＡＭＰ：２０μＭのフォルスコリン
【0091】
以下のＥＣ８０濃度が使用された：
ＲＸＦＰ３ ｃＡＭＰ：０．０００３μＭのリラキシン－３
ＲＸＦＰ４ ｃＡＭＰ：０．０１μＭのリラキシン－３
ＲＸＦＰ３ ｃＡＭＰ：０．０００３μＭのリラキシン－３
ＲＸＦＰ４ ｃＡＭＰ：０．０１μＭのリラキシン－３
【0092】
マウスにおける新規物体認識（ＮＯＲ）試験でのアルツハイマー病（ＡＤ）、スコポラミンで誘発された健忘のマウスモデルの記憶でのメラフェノキセート（ＮＬＳ－８）の効果
目的
マウスにおける新規物体認識（ＮＯＲ）試験でのスコポラミンで誘発された健忘は、アルツハイマー病（ＡＤ）のｉｎ ｖｉｖｏでのモデルで認識される。
目的
マウスにおける新規物体認識（ＮＯＲ）試験でのスコポラミンで誘発された健忘は、アルツハイマー病（ＡＤ）のｉｎ ｖｉｖｏでのモデルで認識される。
【0093】
本研究の目的は、メラフェノキセート（ＮＬＳ－８）がＮＯＲ試験でスコポラミンにより誘発された健忘を改善するか否かを実験することである。
【0094】
この目的のために、２つの実験は行った：
－ 実験１：自発的な歩行運動活動での６用量でのＮＬＳ－８の効果の検査。
－ 実験２：スコポラミンにより誘発された健忘で、３用量での（自発的な歩行運動活動での有意な変化を誘発しない）ＮＬＳ－８の効果の検査。
－ 実験１：自発的な歩行運動活動での６用量でのＮＬＳ－８の効果の検査。
－ 実験２：スコポラミンにより誘発された健忘で、３用量での（自発的な歩行運動活動での有意な変化を誘発しない）ＮＬＳ－８の効果の検査。
【0095】
実験は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスで行った。
【0096】
実験１
方法
自発的な歩行運動活動でのＮＬＳ－８（６用量）の効果が試験された。この目的のために、動物は、ＮＬＳ－８（３．１２５、６．２５、１２．５、２５、５０および１００ｍｇ／ｋｇ）またはそのビヒクル（対照群）（Ｎ＝６／群）の注射を受け、９０分セッションに対して開放領域に置かれた。歩行運動活動（治療に続く第１、第２および第３の３０分間の期間中の開放領域における運動距離）が、自動的に記録された。
読み出し：運動距離。
データ分析：全群の群比較対対照群の間：非対応スチューデントｔ検定。
方法
自発的な歩行運動活動でのＮＬＳ－８（６用量）の効果が試験された。この目的のために、動物は、ＮＬＳ－８（３．１２５、６．２５、１２．５、２５、５０および１００ｍｇ／ｋｇ）またはそのビヒクル（対照群）（Ｎ＝６／群）の注射を受け、９０分セッションに対して開放領域に置かれた。歩行運動活動（治療に続く第１、第２および第３の３０分間の期間中の開放領域における運動距離）が、自動的に記録された。
読み出し：運動距離。
データ分析：全群の群比較対対照群の間：非対応スチューデントｔ検定。
【0097】
結果
ＮＬＳ－８（３．１２５、６．２５、１２．５、２５、５０および１００ｍｇ／ｋｇ）は、運動距離を有意に改変しなかった（図１）。
ＮＬＳ－８（３．１２５、６．２５、１２．５、２５、５０および１００ｍｇ／ｋｇ）は、運動距離を有意に改変しなかった（図１）。
【0098】
結論
ＮＬＳ－８（３．１２５、６．２５、１２．５、２５、５０および１００ｍｇ／ｋｇ）は、歩行運動活動を有意に改変せず、したがって、試験した任意の用量で可視の副作用を誘発しなかった。
ＮＬＳ－８（３．１２５、６．２５、１２．５、２５、５０および１００ｍｇ／ｋｇ）は、歩行運動活動を有意に改変せず、したがって、試験した任意の用量で可視の副作用を誘発しなかった。
【0099】
この結果に基づいて、スコポラミンにより誘発された健忘の試験において２５、５０、１００および１５０ｍｇ／ｋｇでＮＬＳ－８を試験することを決定した。
【0100】
実験２
方法
実験の第１の工程では、ＮＬＳ－８は、２５、５０および１００ｍｇ／ｋｇで試験された。
方法
実験の第１の工程では、ＮＬＳ－８は、２５、５０および１００ｍｇ／ｋｇで試験された。
【0101】
動物は、６群（Ｎ＝４～１０／群）に分割された。
【0102】
Ｔ＝０分で、これらは、腹腔内（ｉ．ｐ．）経路により以下の治療を受けた：
－ 対照群：ビヒクル。
－ スコポラミン群：スコポラミン（１．２ｍｇ／ｋｇ）。
－ ＮＬＳ－８ ２５群：ＮＬＳ－８（２５ｍｇ／ｋｇ）＋スコポラミン（１．２ｍｇ／ｋｇ）。
－ ＮＬＳ－８ ５０群：ＮＬＳ－８（５０ｍｇ／ｋｇ）＋スコポラミン（１．２ｍｇ／ｋｇ）。
－ ＮＬＳ－８ １００群：ＮＬＳ－８（１００ｍｇ／ｋｇ）＋スコポラミン（１．２ｍｇ／ｋｇ）。
－ ＮＬＳ－８ １５０群：ＮＬＳ－８（１５０ｍｇ／ｋｇ）＋スコポラミン（１．２ｍｇ／ｋｇ）。
－ 対照群：ビヒクル。
－ スコポラミン群：スコポラミン（１．２ｍｇ／ｋｇ）。
－ ＮＬＳ－８ ２５群：ＮＬＳ－８（２５ｍｇ／ｋｇ）＋スコポラミン（１．２ｍｇ／ｋｇ）。
－ ＮＬＳ－８ ５０群：ＮＬＳ－８（５０ｍｇ／ｋｇ）＋スコポラミン（１．２ｍｇ／ｋｇ）。
－ ＮＬＳ－８ １００群：ＮＬＳ－８（１００ｍｇ／ｋｇ）＋スコポラミン（１．２ｍｇ／ｋｇ）。
－ ＮＬＳ－８ １５０群：ＮＬＳ－８（１５０ｍｇ／ｋｇ）＋スコポラミン（１．２ｍｇ／ｋｇ）。
【0103】
治療に続く３０分で、動物は、サンプル試行にかけられた。これらは、２つの同一の物体が提示された円形実験箱に１２分セッションに置かれた（動物の５０％：２つの褐色の円筒状バイアル；動物の５０％：２つの黒色の角柱）。
【0104】
治療に続くｔ＝１２０分で、マウスは、選択試行にかけられた。これらは、２つの異なる物体（バイアルおよびカラム）が提示され、物体の１つ（見慣れた物体と称す）がサンプル試行および新規な物体に提示された同じ実験箱に１２分セッションに再び置かれた。物体の探索は、治療が盲検化され、どの物体が新規なものであり、どの物体が見慣れたものであったかを知らない実験者により記録された。
【0105】
読み出し：
－ 記憶の指標：ＤＩ（識別指標）＝１００×（新規な物体の探索時間－見慣れた物体の探索時間）／（新規な物体の探索時間＋見慣れた物体の探索時間）。
－ 探索の指標：Ｎ＋Ｆ＝新規な物体の探索時間＋見慣れた物体の探索時間。
－ 記憶の指標：ＤＩ（識別指標）＝１００×（新規な物体の探索時間－見慣れた物体の探索時間）／（新規な物体の探索時間＋見慣れた物体の探索時間）。
－ 探索の指標：Ｎ＋Ｆ＝新規な物体の探索時間＋見慣れた物体の探索時間。
【0106】
データ分析：
－ 群比較内：ＤＩ対０（対応スチューデントｔ検定）。
－ 群比較対対照群と対スコポラミン群との間：非対応スチューデントｔ検定。
－ 群比較内：ＤＩ対０（対応スチューデントｔ検定）。
－ 群比較対対照群と対スコポラミン群との間：非対応スチューデントｔ検定。
【0107】
結果
図２に示す通り、識別指標は以下であった。
－ 群比較内：
○ 対照群で０より有意に高かった
○ スコポラミン群で０からの有意差はなかった。
○ ＮＬＳ－８ ５０群で０より有意に高かった。
○ ＮＬＳ－８ ２５、ＮＬＳ－８ １００およびＮＬＳ－８ １５０群で０より有意に高くなかった。
－ 群比較の間：
○ 対照群よりスコポラミン群で有意に低かった。
○ 対照群とＮＬＳ－８群との間に有意差はなかった。
○ スコポラミン群とＮＬＳ－８群との間に有意差はなかった。
－ 図３に示す通り、ＮＬＳ－８ ５０群での物体の探索時間は、対照およびスコポラミン群のものより長かった。全ての他の比較対対照群および対スコポラミン群は、有意ではなかった。
図２に示す通り、識別指標は以下であった。
－ 群比較内：
○ 対照群で０より有意に高かった
○ スコポラミン群で０からの有意差はなかった。
○ ＮＬＳ－８ ５０群で０より有意に高かった。
○ ＮＬＳ－８ ２５、ＮＬＳ－８ １００およびＮＬＳ－８ １５０群で０より有意に高くなかった。
－ 群比較の間：
○ 対照群よりスコポラミン群で有意に低かった。
○ 対照群とＮＬＳ－８群との間に有意差はなかった。
○ スコポラミン群とＮＬＳ－８群との間に有意差はなかった。
－ 図３に示す通り、ＮＬＳ－８ ５０群での物体の探索時間は、対照およびスコポラミン群のものより長かった。全ての他の比較対対照群および対スコポラミン群は、有意ではなかった。
【0108】
結論
これらの結果は、ＮＬＳ－８（２５～１５０ｍｇ／ｋｇ）がスコポラミンにより誘発された健忘を改善することができ、したがってＡＤの認知症状を軽減し得ることを示唆する。
これらの結果は、ＮＬＳ－８（２５～１５０ｍｇ／ｋｇ）がスコポラミンにより誘発された健忘を改善することができ、したがってＡＤの認知症状を軽減し得ることを示唆する。
【0109】
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【図1】
【図2】
【図3】
【国際調査報告】