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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-07-12
(54)【発明の名称】単一ドメイン抗体によるブドウ膜炎の抑制
(51)【国際特許分類】
A61K 39/395 20060101AFI20240705BHJP
A61P 27/02 20060101ALI20240705BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20240705BHJP
C07K 16/18 20060101ALI20240705BHJP
【ＦＩ】
A61K39/395 N
A61P27/02
C12N15/13 ZNA
C07K16/18
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024525189
(86)(22)【出願日】2022-07-07
(85)【翻訳文提出日】2024-03-04
(86)【国際出願番号】 US2022036420
(87)【国際公開番号】W WO2023283381
(87)【国際公開日】2023-01-12
(31)【優先権主張番号】63/219,161
(32)【優先日】2021-07-07
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】524008672
【氏名又は名称】シン バイオテクノロジー、エルエルシー
(71)【出願人】
【識別番号】510002280
【氏名又は名称】アメリカ合衆国
(74)【代理人】
【識別番号】110000855
【氏名又は名称】弁理士法人浅村特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】シン、シュナンダ
(72)【発明者】
【氏名】エグウアグ、チャールズ
【テーマコード（参考）】
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C085AA14
4C085BB11
4C085BB44
4C085EE01
4H045AA11
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA40
4H045DA75
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を使用して対象のブドウ膜炎を処置および予防する方法であって、前記ｓｄＡｂが配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む方法を提供する。一態様では、対象は、ヒトなどの哺乳動物である。別の態様では、ｓｂＡｂは、１つまたは複数の化合物と組み合わせて使用される。本発明によって処置されるブドウ膜炎は、交感性眼炎、バードショット網膜脈絡膜症、ベーチェット病、フォークト・小柳・原田病および眼サルコイドーシスであり得る。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を使用して対象のブドウ膜炎を処置する方法であって、前記ｓｄＡｂが配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む方法。
【請求項2】
前記対象が哺乳動物である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
対象がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記ｓｂＡｂが１つまたは複数の化合物と組み合わせて使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
前記ブドウ膜炎が、交感性眼炎、バードショット網膜脈絡膜症、ベーチェット病、フォークト・小柳・原田病および眼サルコイドーシスである、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を使用して対象のブドウ膜炎を予防する方法であって、前記ｓｄＡｂが配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む方法。
【請求項7】
前記対象が哺乳動物である、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
対象がヒトである、請求項６に記載の方法。
【請求項9】
前記ｓｂＡｂが１つまたは複数の化合物と組み合わせて使用される、請求項６に記載の方法。
【請求項10】
前記ブドウ膜炎が、交感性眼炎、バードショット網膜脈絡膜症、ベーチェット病、フォークト・小柳・原田病および眼サルコイドーシスである、請求項６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年７月７日に出願された米国仮特許出願第６３／２１９，１６１号の利益を主張し、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２１年７月７日に出願された米国仮特許出願第６３／２１９，１６１号の利益を主張し、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
連邦政府による資金提供通知
本発明は、国立衛生研究所、国立眼科研究所によるプロジェクト番号Ｚ０１＃：ＥＹ０００３１５－２９の下で政府支援を受けてなされた。米国政府は、本発明に一定の権利を有する。
本発明は、国立衛生研究所、国立眼科研究所によるプロジェクト番号Ｚ０１＃：ＥＹ０００３１５－２９の下で政府支援を受けてなされた。米国政府は、本発明に一定の権利を有する。
【0003】
配列表
本出願は、電子形式の配列表と共に出願されている。配列表は、２０２２年７月５日に作成された「配列表」と題されたファイルとして提供され、サイズは２，０００バイトである。配列表の電子形式の情報は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、電子形式の配列表と共に出願されている。配列表は、２０２２年７月５日に作成された「配列表」と題されたファイルとして提供され、サイズは２，０００バイトである。配列表の電子形式の情報は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【0004】
免疫応答および自己免疫疾患を調節するＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＩＬ－２７およびＩＬ－３５などのサイトカインは、ヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ）／ＳＴＡＴ経路の活性化を介してそれらの生物学的活性を媒介する。この進化的に保存されたシグナル伝達経路は、４つのヤヌスキナーゼ（Ｊａｋ１、Ｊａｋ２、Ｊａｋ３、Ｔｙｋ２）ならびに７員シグナル伝達兼転写因子活性化因子（ＳＴＡＴ）ファミリーのタンパク質、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ４、ＳＴＡＴ５ａ、ＳＴＡＴ５ｂおよびＳＴＡＴ６によって調整される。その同族受容体へのサイトカインの結合は、トランスホスホリル化によって必要なＪａｋタンパク質を活性化し、特異的ＳＴＡＴの動員のためのドッキング部位を提供する。受容体複合体に動員されたＳＴＡＴは、重要なチロシン残基でリン酸化され、ホモ二量体またはヘテロ二量体を形成し、核に移行し、そこで特定のＤＮＡ配列に結合して遺伝子転写を活性化する。したがって、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路は、細胞膜から核にシグナルを伝達し、特定の遺伝子発現を連結して細胞の挙動を変化させる迅速な膜対核機構を提供する。
【0005】
ＳＴＡＴ３は、哺乳動物細胞において必須かつ非冗長な役割を果たすので、ＳＴＡＴタンパク質の中で独特である。マウスにおいて、ｓｔａｔ３の遺伝子欠失は、胚致死および出生後３週間以内の死亡をもたらす。ＳＴＡＴ３のＤＮＡ結合ドメインにおけるドミナントネガティブ変異は、治癒がないジョブス症候群として知られるまれな免疫不全障害の原因である。制御されない増殖、細胞増殖および腫瘍形成をもたらすＳＴＡＴ３の異常な活性化の役割について多くが知られているが、ＳＴＡＴ３はＴ細胞において広範囲の機能を有し、リンパ球静止を調節する機構ならびにＴ細胞活性化および生存を制御する機構の収束点として働く。活性化Ｔ細胞の増殖を促進するその役割とは対照的に、ＦｏｘＯ１またはＦｏｘＯ３ａプロモーターに結合し、Ｔ細胞を静止状態に維持するのに必須の役割を果たすこれらのクラスＯフォークヘッド転写因子の発現を上方制御することによって、Ｔ細胞を細胞周期のＧ０期に維持する。さらに、Ｔ細胞におけるＳＴＡＴ３欠損は、ＦｏｘＯ１、ＦｏｘＯ３ａの下方制御およびＩｋＢおよびｐ２７Ｋｉｐ１などのＦｏｘＯ標的遺伝子の著しい減少をもたらし、ＮＦ－ｋＢ活性化およびＩＬ－２の産生の増強をもたらす。一方、ＳＴＡＴ３は、Ｔｈ１７マスター転写因子の活性化、ＲＯＲγｔ転写およびその特徴的な炎症促進性サイトカインＩＬ－１７の発現に必要である。重要なことに、ＣＤ４＋Ｔ細胞に標的化された欠失を有するマウスは、実験的自己免疫ブドウ膜炎（ＥＡＵ）および実験的自己免疫脳脊髄炎の発症に対して耐性であり、ＳＴＡＴ３がこれらの中枢神経系（ＣＮＳ）自己免疫疾患および他の自己炎症性疾患の潜在的な治療標的であることを示している。
【0006】
ＳＴＡＴ３は、細胞内タンパク質であるため、薬理学的に容易に標的化されない。ＳＴＡＴ３ ＳＨ２ドメインまたはＪＡＫもしくはサイトカイン受容体上のキナーゼ阻害部位へのＳＴＡＴ３の結合を特異的に阻害するために、膜透過性疎水性リポヒリックモチーフにカップリングされたＳＴＡＴ３模倣ペプチドを送達するためのいくつかの非侵襲的方法が使用されており、様々な程度で成功している。
【0007】
本発明は、ブドウ膜炎などの症状または疾患を引き起こすＳＴＡＴ３細胞内成分に対する単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、タンパク質およびポリペプチドの使用に関する。本発明はまた、ｓｄＡｂをコードする核酸、タンパク質およびポリペプチド、ならびにｓｄＡｂを含む組成物を含む。本発明は、予防、治療または診断目的のための組成物、ｓｄＡｂ、タンパク質またはポリペプチドの使用を含む。本発明はまた、本発明のｓｄＡｂに向けられたモノクローナル抗体の使用を含む。
【発明の概要】
【0008】
本発明は、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を使用して対象のブドウ膜炎を処置する方法であって、ｓｄＡｂが配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む方法に関する。一態様では、対象は、ヒトなどの哺乳動物である。別の態様では、ｓｂＡｂは、１つまたは複数の化合物と組み合わせて使用される。
【0009】
別の実施形態では、本発明は、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を使用して対象のブドウ膜炎を予防する方法であって、ｓｄＡｂが配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む方法に関する。一態様では、対象は、ヒトなどの哺乳動物である。
【0010】
本発明によって処置されるブドウ膜炎は、交感性眼炎、バードショット網膜脈絡膜症、ベーチェット病、フォークト・小柳・原田病および眼サルコイドーシスであり得る。別の態様では、ｓｂＡｂは、１つまたは複数の化合物と組み合わせて使用される。
本発明のこれらおよび他の特徴、態様、および利点は、以下の説明、添付の特許請求の範囲、および添付の図面に関してよりよく理解されるであろう。
本発明のこれらおよび他の特徴、態様、および利点は、以下の説明、添付の特許請求の範囲、および添付の図面に関してよりよく理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1A】［３Ｈ］－チミジン取り込みアッセイを使用したＴ細胞増殖アッセイの結果を示す。
【図1B】［３Ｈ］－チミジン取り込みアッセイを使用したＨｕｍａｎ Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞増殖アッセイの結果を示す。
【図2A】ＣＦＡ中のＩＲＢＰで免疫し、ＰＢＳまたはＳＢＴ－１００（配列番号１）で処置したＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスのグラフ表示を示し、ＥＡＵの発生を、眼底検査によって評価した。
【図2B】ＣＦＡ中のＩＲＢＰで免疫し、ＰＢＳまたはＳＢＴ－１００（配列番号１）で処置したＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスのグラフ表示を示し、ＥＡＵの発生を、組織学によって評価した。
【図2C】ＣＦＡ中のＩＲＢＰで免疫し、ＰＢＳまたはＳＢＴ－１００（配列番号１）で処置したＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスのグラフ表示を示し、ＥＡＵの発生を、ＥＲＧによって評価した。
【図3A】網膜、ＤＬＮまたは脾臓におけるＴｈ１またはＴｈ１７細胞の細胞内サイトカイン染色を発現するＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセンテージを示す。
【図3B】網膜、ＤＬＮまたは脾臓におけるＲＯＲ－γＴ（Ｂ）を発現するＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセンテージを示す。
【図3C】グランザイムＢを発現するＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセンテージを示す。
【図3D】選別されたＣＤ４＋Ｔ細胞のＥＬＩＳＡ結果を示す。
【図3E】ＥＡＵマウスの脾臓由来の細胞内サイトカイン染色細胞を用いた、誘導ＥＡＵを有するＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスのグラフ表示を示す。
【図4A】ＥＡＵを有するＰＢＳ処置マウスまたはＳＢＴ処置マウスの脾臓細胞のグラフ表示を示し、疾患は、眼底検査によって評価した。
【図4B】ＥＡＵを有するＰＢＳ処置マウスまたはＳＢＴ処置マウスの脾臓細胞のグラフ表示を示し、疾患は、組織病理学によって評価した。
【図4C】ＥＡＵを有するＰＢＳ処置マウスまたはＳＢＴ処置マウスの脾臓細胞のグラフ表示を示し、疾患は、ＥＲＧによって評価した。
【図5A】細胞内サイトカイン染色アッセイによって分析されたＣＤ４＋Ｔ細胞を示す。
【図5B】ＥＬＩＳＡによって分析されたＣＤ４＋Ｔ細胞を示す。
【図5C】細胞内サイトカイン染色アッセイによって分析されたＣＤ４＋Ｔ細胞を示す。
【図5D】マルチプレックスＥＬＩＳＡによって分析されたＣＤ４＋Ｔ細胞を示す。
【発明を実施するための形態】
【0012】
本明細書で使用される場合、以下の用語およびその変形は、そのような用語が使用される文脈によって異なる意味が明確に意図されない限り、以下に示される意味を有する。
【0013】
本明細書で使用される「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」という用語および同様の指示対象は、文脈におけるそれらの使用が特に指示しない限り、単数および複数の両方を包含すると解釈されるべきである。
【0014】
「抗原決定基」という用語は、抗原結合分子（本発明のｓｄＡｂまたはポリペプチドなど）によって、より具体的には抗原結合分子の抗原結合部位によって、認識される抗原上のエピトープを指す。「抗原決定基」および「エピトープ」という用語も互換的に使用され得る。特定の抗原決定基、エピトープ、抗原またはタンパク質に結合することができる、親和性を有する、および／または特異性を有するアミノ酸配列は、抗原決定基、エピトープ、抗原またはタンパク質に「対する」、または「向けられる」と言われる。
【0015】
本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」などの用語の変形は、他の添加剤、成分、整数または工程を排除することを意図しない。
【0016】
本明細書に記載されるｓｄＡｂ、ポリペプチドおよびタンパク質は、アミノ酸残基が類似の化学構造の別のアミノ酸残基で置換され、ポリペプチドの機能、活性または他の生物学的特性にほとんどまたは本質的に影響を及ぼさないアミノ酸置換として一般に記載することができる、いわゆる「保存的」アミノ酸置換を含むことができると考えられる。保存的アミノ酸置換は当技術分野で周知である。保存的置換は、以下の群（ａ）～（ｅ）内の１つのアミノ酸が同じ群内の別のアミノ酸によって置換される置換である：（ａ）小さい脂肪族、非極性またはわずかに極性の残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＰｒｏおよびＧｌｙ；（ｂ）極性の負に荷電した残基およびそれらの（非荷電）アミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、ＧｌｕおよびＧｌｎ；（ｃ）極性の正に荷電した残基：Ｈｉｓ、ＡｒｇおよびＬｙｓ；（ｄ）大きな脂肪族非極性残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＶａｌおよびＣｙｓ；ならびに（ｅ）芳香族残基：Ｐｈｅ、ＴｙｒおよびＴｒｐ。他の保存的置換としては、ＡｌａからＧｌｙまたはＳｅｒへ；ＡｒｇからＬｙｓへ；ＡｓｎからＧｌｎまたはＨｉｓへ；ＡｓｐからＧｌｕへ；ＣｙｓからＳｅｒへ；ＧｌｎからＡｓｎへ；ＧｌｕからＡｓｐへ；ＧｌｙからＡｌａまたはＰｒｏへ；ＨｉｓからＡｓｎまたはＧｌｎへ；ＩｌｅからＬｅｕまたはＶａｌへ；ＬｅｕからＩｌｅまたはＶａｌへ；ＬｙｓからＡｒｇ、ＧｌｎまたはＧｌｕへ；ＭｅｔからＬｅｕ、ＴｙｒまたはＩｌｅへ；ＰｈｅからＭｅｔ、ＬｅｕまたはＴｙｒへ；ＳｅｒからＴｈｒへ；ＴｈｒからＳｅｒへ；ＴｒｐからＴｙｒへ；ＴｙｒからＴｒｐへ；および／またはＰｈｅからＶａｌ、ＩｌｅまたはＬｅｕへの置換が挙げられる。
【0017】
本明細書で使用される「ドメイン」は、一般に、抗体鎖の球状領域、特に重鎖抗体の球状領域、またはそのような球状領域から本質的になるポリペプチドを指す。
【0018】
ｓｄＡｂのアミノ酸配列および構造は、典型的には、「フレームワーク領域１」または「ＦＲ１」；「フレームワーク領域２」または「ＦＲ２」；「フレームワーク領域３」または「ＦＲ３」として；「フレームワーク領域４」または「ＦＲ４」とそれぞれと呼ばれる４つのフレームワーク領域または「ＦＲ」で構成される。フレームワーク領域は、それぞれ「相補性決定領域１」または「ＣＤＲ１」、「相補性決定領域２」または「ＣＤＲ２」、および「相補性決定領域３」または「ＣＤＲ３」と呼ばれる３つの相補性決定領域または「ＣＤＲ」によって中断されている。
【0019】
本明細書で使用される場合、「ヒト化ｓｄＡｂ」という用語は、天然に存在するＶＨＨ配列のアミノ酸配列中の１つまたは複数のアミノ酸残基が、ヒト由来の従来の４鎖抗体からのＶＨドメインの対応する位置に存在するアミノ酸残基の１つまたは複数によって置き換えられたｓｄＡｂを意味する。これは、当技術分野で周知の方法によって行うことができる。例えば、ｓｄＡｂのＦＲは、ヒト可変ＦＲで置き換えることができる。
【0020】
本明細書で使用される場合、「単離された」核酸またはアミノ酸は、それが通常関連する少なくとも１つの他の成分、例えばその供給源または培地、別の核酸、別のタンパク質／ポリペプチド、別の生物学的成分または高分子もしくは汚染物質、不純物または微量成分から分離されている。
【0021】
「哺乳動物」という用語は、哺乳綱に属する個体として定義され、ヒト、家畜および農耕動物、ならびに動物園、スポーツおよびペット動物、例えばウシ、ウマ、ヒツジ、イヌおよびネコを含むがこれらに限定されない。
【0022】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容され得る担体」は、薬学的投与に適合する、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含むことが意図される。適切な担体は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓの最新版（当該分野の標準参照テキスト）に記載されている。そのような担体または希釈剤の好ましい例には、水、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）、および５％ヒト血清アルブミンが含まれるが、これらに限定されない。リポソーム、カチオン性脂質および固定油などの非水性ビヒクルを使用してもよい。薬学的に活性な物質のためのそのような媒体および薬剤の使用は、当技術分野で周知である。任意の従来の媒体または薬剤が上で定義した治療剤と適合しない場合を除いて、本発明の組成物におけるその使用が企図される。
【0023】
「定量的イムノアッセイ」とは、抗体を用いて試料中に存在する抗原の量を測定する任意の手段を指す。定量的イムノアッセイを行うための方法としては、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、特異的分析物標識および再捕捉アッセイ（ＳＡＬＲＡ）、液体クロマトグラフィー、質量分析、蛍光活性化セルソーティングなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【0024】
「溶液」という用語は、溶媒および溶質を含む組成物を指し、真の溶液および懸濁液を含む。溶液の例としては、液体に溶解した固体、液体または気体、および液体に懸濁した微粒子またはミセルが挙げられる。
【0025】
「特異性」という用語は、特定の抗原結合分子または抗原結合タンパク質分子が結合することができる異なる種類の抗原または抗原決定基の数を指す。抗原結合タンパク質の特異性は、親和性および／またはアビディティに基づいて決定することができる。抗原と抗原結合性タンパク質との解離の平衡定数（ＫＤ）によって表される親和性は、抗原決定基と抗原結合性タンパク質上の抗原結合部位との間の結合強度の尺度であり、ＫＤの値が小さいほど、抗原決定基と抗原結合分子との間の結合強度が強くなる（あるいは、親和性は、１／ＫＤである親和定数（ＫＡ）として表すこともできる）。当業者に明らかなように、親和性は、目的の特異的抗原に応じて決定することができる。アビディティは、抗原結合分子と抗原との間の結合の強さの尺度である。アビディティは、抗原決定基と抗原結合分子上のその抗原結合部位との間の親和性と、抗原結合分子上に存在する関連結合部位の数の両方に関連する。抗原または抗原決定基への抗原結合タンパク質の特異的結合は、任意の公知の方法、例えばスキャッチャード解析および／または競合結合アッセイ、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）およびサンドイッチ競合アッセイによって決定することができる。
【0026】
本明細書で使用される場合、「組換え」という用語は、本発明のｓｄＡｂを産生するために使用される遺伝子工学的方法（例えば、クローニングおよび増幅）の使用を指す。
【0027】
「単一ドメイン抗体」、「ｓｄＡｂ」または「ＶＨＨ」は、一般に、３つの相補性決定領域によって中断された４つのフレームワーク領域からなるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはタンパク質として定義することができる。これは、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４と表される。本発明のｓｄＡｂはまた、ｓｄＡｂアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはタンパク質を含む。典型的には、ｓｄＡｂはラマなどのラクダ科動物で産生されるが、当技術分野で周知の技術を使用して合成的に生成することもできる。本明細書で使用される場合、天然に存在する重鎖抗体に存在する可変ドメインは、「ＶＨドメイン」と呼ばれる従来の４鎖抗体に存在する重鎖可変ドメインおよび「ＶＬドメイン」と呼ばれる従来の４鎖抗体に存在する軽鎖可変ドメインと区別するために「ＶＨＨドメイン」とも呼ばれ、「ＶＨＨ」および「ｓｄＡｂ」は本明細書では互換的に使用される。ｓｄＡｂまたはポリペプチドのアミノ酸残基のナンバリングは、Ｋａｂａｔら（「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、ＵＳ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１）によって与えられるＶＨドメインの一般的なナンバリングに従う。このナンバリングによれば、ｓｄＡｂのＦＲ１は位置１～３０のアミノ酸残基を含み、ｓｄＡｂのＣＤＲ１は位置３１～３６のアミノ酸残基を含み、ｓｄＡｂのＦＲ２は位置３６～４９のアミノ酸を含み、ｓｄＡｂのＣＤＲ２は位置５０～６５のアミノ酸残基を含み、ｓｄＡｂのＦＲ３は位置６６～９４のアミノ酸残基を含み、ｓｄＡｂのＣＤＲ３は位置９５～１０２のアミノ酸残基を含み、ｓｄＡｂのＦＲ４は位置１０３～１１３のアミノ酸残基を含む。
【0028】
「合成」という用語は、インビトロ化学合成または酵素合成による産生を指す。
【0029】
本明細書で使用される「標的」という用語は、ｓｄＡｂによって認識される任意の成分、抗原、または部分を指す。「細胞内標的」という用語は、細胞内に存在する任意の成分、抗原、または部分を指す。「膜貫通標的」は、細胞膜内に位置する成分、抗原、または部分である。「細胞外標的」は、細胞の外側に位置する成分、抗原、または部分を指す。
【0030】
本明細書で使用される「治療用組成物」は、医薬組成物、遺伝物質、生物製剤、および他の物質などの治療効果を有することを意図した物質を意味する。遺伝物質には、遺伝子ベクター、遺伝子調節エレメント、遺伝子構造エレメント、ＤＮＡ、ＲＮＡなどの直接的または間接的な遺伝子治療効果を有することが意図される物質が含まれる。生物製剤には、治療効果を有することが意図された生体または生体由来の物質が含まれる。
【0031】
本明細書で使用される場合、「治療有効量」および「予防有効量」という語句は、疾患または疾患の明白な症候の処置、予防、または管理において治療上の利益を提供する量を指す。治療有効量は、疾患、疾患の症候または疾患の傾向を治す、治癒する、緩和する、軽減する、変化させる、矯正する、改良する、改善する、または影響を与える目的で、疾患または症状、疾患の症候または疾患の傾向を処置し得る。治療上有効な具体的な量は、通常の医療従事者によって容易に決定することができ、例えば、疾患の種類、患者の病歴および年齢、疾患の病期、ならびに他の治療薬の投与などの当技術分野で公知の要因に応じて変化し得る。
【0032】
本発明は、細胞内成分に対する単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）の使用、ならびに疾患を処置または予防するためのｓｄＡｂおよびタンパク質をコードするヌクレオチドを含むタンパク質およびポリペプチドの使用に関する。本発明はまた、ｓｄＡｂをコードする核酸、タンパク質およびポリペプチド、ならびにｓｄＡｂを含む組成物を含む。
【0033】
ＳＢＴ－１００（配列番号１）（またはＶＨＨ１３）（配列番号１）と命名された抗ＳＴＡＴ３ ｓｄＡｂのアミノ酸配列を以下に示す：
３つのＣＤＲに下線が引かれている。
【化1】
３つのＣＤＲに下線が引かれている。
【0034】
対応する抗ＳＴＡＴ３ ＳＢＴ－１００ ＤＮＡ配列（配列番号２）は以下である：
【化2】
【0035】
ＳＢＴ－１００（配列番号１）（配列番号１）は、米国特許第Ｓ／Ｎ １４９２２０９３号に以前に記載されており、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【0036】
ＳＴＡＴ３は、細胞の成長、分化および生存を調節する遺伝子の転写を活性化する。Ｔ細胞におけるＳｔａｔ３の遺伝子欠失はＴｈ１７分化を抑止し、ＳＴＡＴ３がＴｈ１７媒介疾患の潜在的な治療標的であることを示唆する。しかしながら、ＳＴＡＴ３などの細胞内タンパク質の治療標的化に対する主な障害は、ＳＴＡＴ３阻害剤を細胞に送達するための効率的な方法の欠如である。この研究では、ＳＴＡＴ３特異的重鎖分子の可変（Ｖ）領域からなる単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）またはナノボディ（ＳＢＴ－１００）を使用した。ＳＢＴ－１００（配列番号１）（配列番号１）がヒトおよびマウス細胞に侵入し、ＳＴＡＴ３活性化の抑制およびリンパ球増殖を濃度依存的に誘導することが見出された。ＳＢＴ－１００（配列番号１）（配列番号１）がインビボで炎症を抑制するのに有効であるかどうかを調べるために、実験的自己免疫性ブドウ膜炎を、眼自己抗原である光受容体間レチノイド結合タンパク質（ＩＲＢＰ）での能動免疫によってＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに誘導した。眼底検査、組織学的検査または光干渉断層法による網膜の分析は、ＳＢＴ－１００（配列番号１）（配列番号１）によるマウスの処置が、ＥＡＵを媒介する病原性Ｔｈ１７細胞の増殖を阻害することによってブドウ膜炎を抑制することを示した。暗および明順応ａ波およびｂ波の網膜電図（ＥＲＧ）記録は、ＳＢＴ－１００（配列番号１）処置が、未処置マウスにおいてＥＡＵを特徴付ける有意な視覚障害の発症からマウスを保護したことを示した。未処置ＥＡＵマウスからの活性化されたＩＲＢＰ特異的Ｔ細胞の養子移入はＥＡＵを誘導したが、ＥＡＵは、ＳＢＴ－１００（配列番号１）処置マウスからのＩＲＢＰ特異的Ｔ細胞を受けたマウスでは有意に減弱した。まとめると、これらの結果は、マウスにおけるＳＢＴ－１００（配列番号１）の有効性を実証し、ヒト自己免疫疾患に対するその治療可能性を示唆する。
【0037】
ＳＢＴ－１００（配列番号１）は、軽鎖を欠くラクダ免疫グロブリン重鎖可変領域に由来する単一ＶＨＨからなるナノボディまたは単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）である。ＳＢＴ－１００（配列番号１）はリンパ球を透過することができ、初代マウスＣＤ４＋リンパ球およびヒトＪｕｒｋａｔＴ細胞のＩＬ－６／ＳＴＡＴ３シグナル伝達経路を阻害する。ＳＢＴ－１００（配列番号１）はまた、インビボで有効であることが示され、病原性Ｔｈ１７細胞の増殖を阻害することによってＥＡＵの発症を抑制する。単一の抗原結合タンパク質として、またはより大きなタンパク質もしくはポリペプチド中の抗原結合ドメインとしての単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）の使用は、従来の抗体または抗体断片の使用を超えるいくつかの重要な利点を提供する。ｓｄＡｂの利点には、抗原に高い親和性および高い選択性で結合するために単一のドメインのみが必要とされること；ｓｄＡｂは、単一の遺伝子から発現することができ、翻訳後修飾を必要としないこと；ｓｄＡｂは、熱、ｐＨ、プロテアーゼおよび他の変性剤または変性条件に対して非常に安定であること；ｓｄＡｂは調製するのに安価であること；ｓｄＡｂは、従来の抗体にはアクセスできない標的およびエピトープにアクセスすることができることが含まれる。
【0038】
本発明のｓｄＡｂは主に治療的使用を意図しているので、哺乳動物、好ましくはヒトの標的に対するものである。しかしながら、本明細書に記載されるｓｄＡｂは、他の種からの標的、例えば霊長類または他の動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ブタまたはイヌ）の１つまたは複数の他の種からの標的と、特に標的に関連する疾患に関連する疾患および障害の動物モデルにおいて交差反応性である可能性がある。
【0039】
本発明はさらに、ｓｄＡｂ、ｓｄＡｂをコードする核酸、宿主細胞、本明細書に記載の産物および組成物の用途および使用に関する。そのような産物または組成物は、例えば、疾患を処置または予防するための医薬組成物であり得る。
【0040】
本発明は、一般に、ｓｄＡｂ、ならびに予防および治療目的に使用することができるそのようなｓｄＡｂの１つまたは複数を含むかまたはそれから本質的になるタンパク質またはポリペプチドに関する。
【0041】
本発明で詳述される方法および組成物は、本明細書に記載される疾患を処置するために使用することができ、本明細書に記載されるかまたは他の方法で公知の任意の投与量および／または製剤、ならびに本明細書に記載されるかまたは他の方法で当業者に公知の任意の投与経路で使用することができる。
【0042】
本発明のｓｄＡｂは、１つまたは複数の化合物と共に使用することができる。１つまたは複数の化合物は、治療応答を増加させ、本発明のｓｄＡｂの有効性を増強することができる。さらに、ｓｄＡｂの有効性は、それをペプチド、ペプチド模倣薬、および他の薬物と組み合わせることによって増加させることができる。
【0043】
ＳＴＡＴ３は、シグナル伝達および転写機能活性化の両方を担うタンパク質のシグナル伝達兼転写因子活性化因子（ＳＴＡＴ）ファミリーのメンバーである。ＳＴＡＴ３は広く発現され、ＥＧＦ、ＩＬ－６、ＰＤＧＦ、ＩＬ－２およびＧ－ＣＳＦなどの様々なサイトカインおよび成長因子に応答して、ＤＮＡ結合タンパク質としてのチロシンおよび／またはセリン上のリン酸化を介して活性化される。ＳＴＡＴ３リン酸化タンパク質は、ＳＴＡＴファミリーの他のメンバーとホモ二量体およびヘテロ二量体を形成し、様々な遺伝子の転写を調節するために核に移行し、その結果、細胞成長、アポトーシス、血管新生、免疫回避、および生存などの多くの細胞プロセスにおいて重要な役割を果たす。
【0044】
ブドウ膜炎は、寛解および再発性眼内炎症の反復サイクルを特徴とする潜在的に視力を脅かす眼内炎症性疾患の多様な群であり、視力障害は、患者の生活の質に影響を及ぼすため、公衆衛生上重要である。網膜へのＴｈ１７細胞の動員の増加は、ブドウ膜炎の病態生理学に関与しており、現在の治療法には、眼周囲または硝子体内のコルチコステロイドが含まれる。しかしながら、慢性ブドウ膜炎の処置のためのそれらの長期使用は、緑内障などの重篤な副作用の発症に関連し、代替療法を開発するための推進力である。Ｔｈ１７細胞を誘導することができない遺伝子改変マウスは、ブドウ膜炎の発症に対して抵抗性であるので、Ｔｈ１７細胞の分化および拡大に必要なＳＴＡＴ３経路を標的化することが、ブドウ膜炎を緩和するための潜在的な治療法として提案されている。しかしながら、ＳＴＡＴ３経路の標的化に対する主な障害は、それが細胞内タンパク質であり、ＳＴＡＴ３特異的抗体がアクセスできないこと、ならびに低分子量ＳＴＡＴ３阻害性ペプチドまたは模倣物の予測不可能な薬物動態学的特徴であることである。
【0045】
２つの同一の重（Ｈ）鎖ポリペプチドおよび２つの同一の軽（Ｌ）鎖ポリペプチドから組み立てられたヘテロ四量体免疫グロブリンから構成される従来のＳＴＡＴ３特異的抗体とは対照的に、この研究においてＳＴＡＴ３シグナル伝達経路を標的とするために使用されるＳＴＡＴ３特異的ナノボディは、独特の１つの抗原結合ドメインから構成される独特のラクダ様単一ドメイン単量体ＶＨＨ抗体である。細胞に浸透しない９０ｋＤａナノボディとは対照的に、ＳＴＡＴ３ ＶＨＨは約１５ｋＤａ（２．５ｎｍ）のサイズであり、細胞に浸透することを可能にし、組織に対して毒性ではない。ブドウ膜炎をマウスに誘導し、次いで、マウスをＳＢＴ－１００（配列番号１）で１日２回処置し、眼底検査、組織学、光干渉断層法および網膜電図検査による眼の分析により、ＳＢＴ－１００（配列番号１）が重度のブドウ膜炎からの保護を与え、ＥＡＵ中のＴｈ１およびＴｈ１７応答の阻害、炎症細胞の拡大および網膜への輸送の低減によって眼炎症を抑制することが明らかになった。結果は、ＳＢＴ－１００（配列番号１）が眼細胞に対して毒性でなく、重度の眼炎症に通常関連する網膜機能の低下を予防したことを示している。ブドウ膜炎の病因におけるＴ細胞の役割が十分に確立されていることと一致して、結果は、ＳＢＴ－１００（配列番号１）で処置したＥＡＵマウスからの細胞の移入が、完全な疾患を発症した未処置ＥＡＵマウスからの細胞の養子移入と比較して、非常に軽度のＥＡＵを誘導したことを示している。まとめると、これらの結果は、ＳＢＴ－１００（配列番号１）免疫療法がヒトのブドウ膜炎の改善に有効であるという示唆的な証拠を提供する。
【0046】
ブドウ膜炎および多発性硬化症などの中枢神経系（ＣＮＳ）自己免疫疾患は、血液網膜関門（ＢＲＢ）、血液脳関門（ＢＢＢ）、および周皮細胞、血管周囲マクロファージ、堅く結合した内皮細胞、ミュラー／ミクログリアのグリア境界によって構成される神経血管系（ＮＶＵ）によって維持される脳、脊髄または神経網膜の免疫特権の破壊の結果として生じる。これらの構造は、末梢免疫系からＣＮＳ組織を隔離し、グランザイムＢを産生するＴｈ１７細胞は、ＢＢＢまたはＢＲＢの破壊を促進することによってＣＮＳ自己免疫疾患を開始する初期事象に関与する。しかしながら、ミクログリア細胞の持続的活性化および他の炎症性細胞の動員は、炎症応答を増幅し、慢性ブドウ膜炎または多発性硬化症に特徴的な病理学を担う。それにもかかわらず、マウスにおいてブドウ膜炎を抑制するためにサイトカインまたは免疫抑制化合物などの生物製剤を使用する介入研究は、疾患改善と病原性Ｔｈ１７細胞の抑制との強い相関を常に示す。その後の研究により、Ｔｈ１７分化および発達に対するＳＴＡＴ３の必要性が明らかにされたが、他の研究では、ＳＴＡＴ３の標的化された欠失がＥＡＥまたはＥＡＵの発達を妨げたことが示された。これらの研究により、Ｔｈ１７細胞を標的とすることが、自己免疫疾患および自己炎症性疾患を抑制および緩和するための実行可能な治療アプローチであるという現在確立されている概念が導かれた。
【0047】
この試験では、ＳＢＴ－１００（配列番号１）免疫療法は、病原性Ｔｈ１およびＴｈ１７細胞ならびにＴｒｅｇ細胞の増殖に拮抗することによってＥＡＵに対する保護を付与した。Ｔｈ１７細胞は疾患の開始に重要な役割を果たすが、データは、Ｔｈ１７を阻害するように設計された治療薬は部分的にしか有効でないことを示唆している。このデータは、ＳＴＡＴ３がＴ細胞において二重の役割を有することを示す以前の研究と一致している：リンパ球静止クラスＯフォークヘッド転写因子の上方制御を介してＩＬ－２産生を阻害することによって、Ｇ０期の非活性化Ｔ細胞を休止細胞として維持するという重要な役割を果たす。ＳＴＡＴ３は静止細胞としてＴ細胞を維持するが、同族抗原と係合してＧ１細胞周期に入った後、ＳＴＡＴ３はすべての哺乳動物細胞の場合のように細胞増殖を促進することに留意されたい。したがって、ＳＴＡＴ３特異的ナノボディは、Ｔｈ１７、Ｔｈ１、Ｔｒｅｇリンパ球、ならびに神経炎症を持続させる炎症性骨髄細胞の抑制を媒介する。
【0048】
ブドウ膜炎は、交感性眼炎、バードショット網膜脈絡膜症、ベーチェット病、フォークト・小柳・原田病および眼サルコイドーシスを含む症候性疾患の群である。それは、米国における重度の視力障害の１０％超を占め、抗体による疾患の処置に対する大きな障害は、ＢＲＢおよび神経網膜血管単位のためにＣＮＳへの進入を制限するそれらのサイズである。結果は、ＳＢＴ－１００（配列番号１）がＢＲＢを通過し、器官特異的自己免疫眼疾患を処置し、インビボでＴＨ１７細胞およびＴＨ１細胞の両方を有意に阻害することができることを示す。さらに、ＳＢＴ－１００（配列番号１）は非毒性であり、脳、脊髄および神経網膜などのＣＮＳ組織に容易に入る。
【0049】
例
例１：ＳＢＴ－１００（配列番号１）は、初代Ｔ細胞におけるＴ細胞増殖およびＳＴＡＴ３活性化を抑制する
例１：ＳＢＴ－１００（配列番号１）は、初代Ｔ細胞におけるＴ細胞増殖およびＳＴＡＴ３活性化を抑制する
【0050】
６～８週齢のＣ５７ＢＬ／６ＪマウスをＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）から購入した。動物をＮＩＨ／ＮＥＩ動物施設に収容し、水および固形飼料への無制限のアクセスにより明暗サイクル下で維持した。すべての動物の世話および手順は人道的であり、米国国立衛生研究所動物管理使用委員会のガイドラインに準拠した。
【0051】
Ｊｕｒｋａｔ細胞、クローンＥ６－１（ＡＴＣＣ（登録商標）ＴＩＢ－１５２（商標））は、ＡＴＣＣ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）から得た。すべての細胞を、３７°Ｃの加湿インキュベーターにおいて完全ＲＰＭＩ １６４０培地（１０％の最終濃度になるようにウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１×ペニシリン－ストレプトマイシン、２ｍＭ Ｌ－グルタミン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）、５μＭの２－メルカプトエタノールを補充）中で培養した。
【0052】
血漿サイトカインをマルチプレックスＥＬＩＳＡによって定量した。血漿を１，０００ｘｇで１０分間の遠心分離によって分離し、ＬＥＧＥＮＤｐｌｅｘマウス炎症パネルを製造業者（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）によって推奨されるように使用してサイトカインを定量した。データ取得をＣｙｔｏＦＬＥＸ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）で行い、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄのＬＥＧＥＮＤｐｌｅｘ（商標）データ分析ソフトウェアを使用して分析した。
【0053】
以前の研究は、ＳＴＡＴ３経路の活性化がＴ細胞増殖およびＴｈ１７分化を調節する一方で、Ｔ細胞におけるＳＴＡＴ３の喪失がＣＮＳ自己免疫疾患の発症を妨げることを示している。この研究では、このラクダ由来ナノボディＳＢＴ－１００がＴｈ１７誘導性自己免疫疾患の抑制に有効であるかどうかを調べるために、膜、血液脳関門（ＢＢＢ）および血液網膜関門（ＢＲＢ）を貫通する抗体を開発した。ＳＢＴ－１００（配列番号１）は、単一の単量体可変抗体ドメインから構成される単一ドメイン、２．５ｎｍ、１５ｋＤａ抗体であり、従来のＦａｂ領域に通常存在する軽鎖および重鎖のＣＨドメインを欠く。ＳＢＴ－１００（配列番号１）が初代Ｔ細胞の細胞質に入り、ＳＴＡＴ３シグナル伝達に拮抗することができるかどうかを決定するために、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの脾臓から細胞を単離し、ＣＤ４特異的磁気ビーズを使用してＴ細胞を選別した。細胞は、ＦＡＣＳ分析によってＣＤ４＋リンパ球であることが示された。
【0054】
ＳＢＴ－１００（配列番号１）がＳＴＡＴ３活性化を阻害できるかどうかを決定するために、細胞を、ＳＢＴ－１００（配列番号１）を含有する培地（１００μｇ／ｍｌまたは５０μｇ／ｍｌ）中で３日間抗ＣＤ３／ＣＤ２８により刺激した。図１に見られるように、ＳＢＴ－１００（配列番号１）は、リンパ球およびＳＴＡＴ３活性化を阻害する。［３Ｈ］－チミジン取り込みおよびリンパ球増殖アッセイによる細胞の分析は、Ｔ細胞増殖の有意な阻害を明らかにした（図１Ａ）。選別したマウス初代ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＳＢＴ－１００（配列番号１）を含有する培地中で抗ＣＤ３／ＣＤ２８で刺激し、３日目に、Ｔ細胞増殖を［３Ｈ］－チミジン取り込みアッセイによって評価した。
【0055】
ＳＴＡＴ３活性化を評価するために、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８で４８時間刺激した後、細胞を洗浄し、０．５％ ＢＳＡを含有する無血清培地中で２時間飢餓状態にし、ＩＬ－６で３０分間再刺激した。ｐＳＴＡＴ３をウエスタンブロットによって検出した。細胞抽出物（２０～４０μｇ／レーン）を還元条件の４～１２％グラジエントＳＤＳ－ＰＡＧＥで分画し、マウスＳＴＡＴ３、ｐＳＴＡＴ３またはｂ－アクチンに特異的な抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）を用いてウエスタンブロット分析を行った。一次抗体は、同じ膜上の２つの標的の検出を可能にするＬｉ－Ｃｏｒ ２色系のための抗マウス－ＩＲＤｙｅ ６８０ＲＤおよび抗ウサギ－ＩＲＤｙｅ ８００ＲＤ二次抗体を使用して検出した。各ウェスタンブロッティング分析を少なくとも３回繰り返した。
【0056】
溶解物のウエスタンブロット分析により、ＳＢＴ－１００の非存在下ではＩＬ－６がＳＴＡＴ３を活性化し（ｐＳＴＡＴ３）、一方、ＳＢＴ－１００（配列番号１）の添加はｐＳＴＡＴ３活性化を濃度依存的様式で抑制することが明らかになった（データは示さず）。さらに、ＳＢＴ－１００（配列番号１）の阻害効果は、［３Ｈ］－チミジン取り込みおよびリンパ球増殖アッセイによって示されるように、ヒトＪｕｒｋａｔＴ細胞の増殖を抑制した（図１Ｂ）。ヒトＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞を、ＳＢＴ－１００（配列番号１）を含有する培地中で抗ＣＤ３／ＣＤ２８で７２時間刺激し、３日目に、Ｔ細胞増殖を［３Ｈ］－チミジン取り込みアッセイによって評価した。データは、少なくとも３回の独立した実験を表し、平均±ＳＥＭとして表される（＊＊ｐ＜０．０１；＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。
【0057】
例２：ＳＢＴ－１００（配列番号１）はブドウ膜炎を改善し、眼内炎症中の視力を維持する
【0058】
実験的自己免疫性ブドウ膜炎（ＥＡＵ）を、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおいて、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）Ｈ３７ＲＡ株（２．５ｍｇ／ｍＬ）を含む完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）と２００μＬエマルジョン（１：１ ｖ／ｖ）中のＩＲＢＰ６５１－６７０－ペプチド（３００μｇ／マウス）を、以前に記載されたように（Ｏｈ，Ｈ．Ｍ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２８７，３０４３６－３０４４３（２０１２）、皮下で能動免疫することにより誘導した。マウスはまた、免疫化と同時に百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）毒素（１μｇ／マウス）の腹腔内注射を受けた。免疫化の－１日目から始まって免疫化後１２日目まで、マウスを１００μＬのＰＢＳまたはＳＢＴ－１００（配列番号１）のいずれかで１日２回処置した（１００μＬ ＰＢＳ中、１０ｍｇ／ｋｇ体重）。各研究について、１群あたり８匹のマウスを使用し、年齢および性別を一致させた。
【0059】
ＥＡＵマウスの網膜における浸潤炎症細胞を特徴付けるために、マウスを安楽死させ、記載のようにＰＢＳで灌流した（Ｏｈら、２０１２）。眼球摘出した眼を培養培地を含むペトリ皿に入れ、角膜縁および水晶体に沿って切断することによって切開顕微鏡下で網膜を単離し、角膜を慎重に除去した。次いで、網膜を剥離し、コラゲナーゼ（１ｍｇ／ｍＬ）およびＤＮａｓｅ（１０μｇ／ｍＬ）を含有するＲＰＭＩ培地に３７°Ｃで２時間移した。組織消化を促進するために、消化組織を３０分毎に定期的にピペッティングした。１０倍体積の完全培地を添加することによって消化を停止した。次いで、細胞を完全培地で２回洗浄し、Ｖｉ－Ｃｅｌｌ ＸＲ細胞生存率分析装置（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して細胞を計数した。
【0060】
臨床疾患を確立し、以前に記載されたように（Ｏｈら、２０１２）、眼底検査および組織学によってスコア化した。眼底検査は、ＥＡＵ誘導後１０日目～２１日目に行った。全身麻酔（ケタミン（１．４ｍｇ／マウス）およびキシラジン（０．１２ｍｇ／マウス）の腹腔内注射）後、１％トロピカミド点眼液（Ａｌｃｏｎ Ｉｎｃ．，Ｆｏｒｔ Ｗｏｒｔｈ，ＴＸ）の局所投与により瞳孔を散大させた。眼底画像は、以前記載されたように（Ｏｈ，Ｈ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１８７，３３３８－３３４６（２０１１））、小型げっ歯類用のＭｉｃｒｏｎ ＩＩＩ網膜撮像顕微鏡（Ｐｈｏｅｎｉｘ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ）またはＮｉｋｏｎ Ｄ９０デジタルカメラと連結された改変Ｋａｒｌ Ｓｔｏｒｚ獣医耳内視鏡を使用してキャプチャした。内視鏡を位置決めし、上、下、外側および内側の視野から見ることによって各眼から少なくとも６つの画像（２つの後中心網膜像、４つの周辺網膜像）を撮影し、各個々の病変を識別し、マッピングし、記録した。網膜炎症の臨床的等級付けシステムは確立された通りであった（Ｏｈら、２０１２）。
眼を、同軸照明を伴う両眼顕微鏡を使用して疾患重症度について調べた。組織学のための眼を免疫化の２０日後に摘出し、１０％緩衝ホルマリンで固定し、垂直瞳孔－視神経面で連続切片にした。すべての切片をヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。
ＥＡＵは、主にＴ細胞媒介性ＣＮＳ自己免疫疾患であり、ヒトブドウ膜炎の十分に特徴付けられたマウスモデルである。このマウスモデルを使用して、ＳＢＴ－１００（配列番号１）がこの臓器特異的ＣＮＳ自己免疫疾患の発症または重症度の抑制に有効であるかどうかを調べた。ＥＡＵを、以前に記載されたように（Ｍａｔｔａｐａｌｌｉｌ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ５６，５４３９－５４４９（２０１５））、ＣＦＡエマルジョン中のＩＲＢＰ６５１－６７０による免疫化によってＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおいて誘導した。マウスを、－１日目からＥＡＵ誘導後１２日目までＰＢＳ（未処置群）またはＳＢＴ－１００（配列番号１）のいずれかで１日２回処置した。ＥＡＵモデルでは、ブドウ膜炎は一般に免疫後（ｐ．ｉ）１３日目～２２日目の間に発症するため、この期間中、眼底検査、組織学、光干渉断層法（ＯＣＴ）および網膜電図検査（ＥＲＧ）によって疾患の進行および重症度を監視した。ＥＡＵ臨床スコアおよび疾患重症度の評価は、視神経円板または網膜血管の変化ならびに眼内の網膜および脈絡膜浸潤の検出に基づいた。
統計データ分析およびグラフプロットは、実験に応じて、ペアワイズ比較のための両側対応のないスチューデントｔ検定または多重ペアワイズｔ検定を用いた一元配置分散分析を使用して、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８を使用して行った。データを平均およびＳＤとして示し、推論の統計学的有意性はｐ＜０．０５に基づいた。データは、少なくとも３回の独立した実験を表し、平均±ＳＥＭとして表される（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。
Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスをＣＦＡ中のＩＲＢＰで免疫し、ＰＢＳまたはＳＢＴ－１００（配列番号１）で処置し、ＥＡＵの発生を、眼底検査（図２Ａ）、組織学（図２Ｂ）、ＯＣＴ（データは示さず）またはＥＲＧ（図２Ｃ）によって評価した。
ブドウ膜炎の初期徴候は、ｐ．ｉ．１４日目までに最初に観察され、その時点とｐ．ｉ．２０日目との間に完全な炎症が観察された。ＰＢＳ処置網膜の眼底画像は、視神経円板縁のかすみおよび乳頭周囲領域の拡大、中程度のカフ形成を伴う網膜血管炎、ならびに黄白色の網膜および脈絡膜浸潤を特徴とする重度の炎症を示す（データは示さず）。対照的に、ＳＢＴ－１００処置マウスの網膜の眼底画像は、非常に低い臨床スコアを有する比較的軽度のＥＡＵを示した（データは示さず）。臨床スコアおよび疾患重症度の評価は、視神経円板または網膜血管の変化ならびに網膜および脈絡膜浸潤に基づいた。眼の断面の組織病理学を免疫後２０日目に行った。未処置ＥＡＵ対照マウスでは、炎症細胞浸潤、視神経円板縁のぼやけ、および血管炎によるいくつかのコンフルエントな病変を伴う特徴的な広範な網膜病変があり、これらはすべて、ＳＢＴ－１００（配列番号１）処置マウスでは軽度であったか、または存在しなかった。ＥＡＵスコアは、ＳＢＴ－１００（配列番号１）処置群と比較して、ＰＢＳ処置群で有意に高かった。眼底検査の結果と一致して、ＰＢＳ処置した２０日目の網膜の組織学は、硝子体内への多数の炎症細胞の浸潤、網膜細胞の破壊、および重度のブドウ膜炎の顕著な特徴である網膜内折り畳みの発達を伴う重度のＥＡＵを明らかにした。
ＯＣＴは、生きている動物の様々な眼構造の内部微細構造の視覚化を可能にする非侵襲的手順であり、以前に記載されたように実行された（Ｏｈら、２０１２）。８２０ｎｍの中心波長広帯域光源（Ｂｉｏｐｔｉｇｅｎ、ＮＣ）を備えたスペクトル領域光干渉断層法（ＳＤ－ＯＣＴ）システムを、対照マウスまたはＥＡＵマウスの眼のインビボ非接触イメージングに使用した。マウスを麻酔し、瞳孔を散大させた。次いで、水平または垂直走査を可能にする容易に回転させることができる調整可能なホルダーを使用してマウスを固定化し、各走査を少なくとも２回行い、毎回再調整した。最適な信号強度およびコントラストが達成されるまで、走査の寸法（深さおよび横方向範囲）を調整した。網膜厚は、システムソフトウェアを使用して、同じ眼からの水平走査および垂直走査の両方から得られたすべての画像の網膜中心領域から測定し、平均した。システムソフトウェアで網膜厚を決定するために使用される方法は、記載の通りであった（Ｇａｂｒｉｅｌｅ，Ｍ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ５２，２２５０－２２５４（２０１１））。
ＯＣＴにより、ＰＢＳ処置マウスの硝子体および視神経頭における炎症細胞の蓄積が明らかにされたが、ＳＢＴ－１００（配列番号１）を受けたマウスの網膜では明らかにされなかった（図２Ｂ）。ＯＣＴ画像は、視神経周囲の浸潤細胞の蓄積および視神経円板への損傷を示す（データは示さず）。免疫後１８日目の明順応（１００ｃｄ．ｓ／ｍ２）および暗順応（１０ｃｄ．ｓ／ｍ２）のａ波およびｂ波は、未処置マウスではＳＢＴ－１００（配列番号１）処置群と比較して有意に低かった。
網膜電図（ＥＲＧ）は、眼内炎症中の視覚機能の変化を検出するための確立された臨床方法であり、網膜の光刺激に応答した電位の変化に基づく。光適応刺激下のＥＲＧは錐体駆動機能を反映し、一方、暗順応ｂ波応答は桿体駆動活性を表す。ＥＲＧ記録の前に、マウスを一晩暗順応させ、実験を前述のように（Ｏｈら、２０１２）、暗赤色照明下で行った。ケタミン（１．４ｍｇ／マウス）およびキシラジン（０．１２ｍｇ／マウス）の単回腹腔内注射でマウスを麻酔し、０．５％トロピカミドおよび０．５％フェニレフリン塩酸塩（参天製薬株式会社、大阪、日本）を含有するミドリアシルで瞳孔を散大させた。ＥＲＧを、光刺激を生成および制御する網膜電図コンソール（Ｅｓｐｉｏｎ Ｅ２；Ｄｉａｇｎｏｓｙｓ ＬＬＣ，Ｌｏｗｅｌｌ，ＭＡ）を使用して記録した。暗順応ＥＲＧを、７段階で送達される、－４～１ ｌｏｇ ｃｄ・ｓ／ｍ２の強度でＧａｎｚｆｅｌｄドーム内に送達される単一フラッシュで記録した。１０ ｃｄ・ｓ／ｍ２のバックグラウンドで明順応ＥＲＧを得て、０．３～１００ ｃｄ・ｓ／ｍ２で６段階で光刺激を開始した。良好な電気的接触を提供し、角膜水分を維持するために、ゴニスコピックプリズム溶液（Ａｌｃｏｎ Ｌａｂｓ，Ｆｏｒｔ Ｗｏｒｔｈ，ＴＸ）を使用した。口の中に基準電極（金線）を入れ、尾の付け根に接地電極（皮下ステンレス針）を置いた。信号を差動的に増幅し、１ｋＨｚの速度でデジタル化した。主要ＥＲＧ成分（ａ波およびｂ波）の振幅を、自動および手動の方法を用いて測定した（Ｅｓｐｉｏｎソフトウェア；Ｄｉａｇｎｏｓｙｓ ＬＬＣ）。ＥＲＧ記録の直後に、眼底の画像化を前述のように行った（Ｏｈ，Ｈ．Ｍ．ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０１１）。
明順応または暗順応条件下でＰＢＳ処置マウスの眼において検出された有意に低いａ波およびｂ波振幅は、ＰＢＳ処置マウスにおける有意な視覚障害を示唆し、一方、ＳＢＴ処置マウスにおいて検出されたより高いａ波およびｂ波振幅は、ブドウ膜炎中のＳＢＴ－１００（配列番号１）媒介性の視力の維持と一致する（図２Ｃ）。
例３：ＳＢＴ－１００（配列番号１）は、病原性Ｔｈ１およびＴｈ１７細胞を阻害することによってマウスのブドウ膜炎を抑制した
マウスおよびヒトのブドウ膜炎は、主にＴｈ１７サブセットのＴ細胞によって媒介されると考えられており、Ｔｈ１サブセットはＥＡＵを有するマウスの眼でも増加するが、ブドウ膜炎の病因におけるその役割は依然として議論の余地がある。この試験で観察されたＥＡＵの改善が、Ｔｈ１７および／またはＴｈ１細胞のレベルのＳＢＴ－１００誘導性低下に由来するかどうかを調べるために、ＥＡＵを有するマウスから細胞を単離した。Ｔｈ１７およびＴｈ１細胞の頻度を、ＳＢＴ－１００（配列番号１）処置マウスの眼、排出リンパ節および脾臓において調べた。
ＥＡＵを、ＣＦＡ中のＩＲＢＰで免疫化しＰＢＳまたはＳＢＴ１００で処置したＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおいて誘導した。排出リンパ節（ＤＬＮ）および脾臓ＤＬＮの単一細胞懸濁液を作製した。脾臓を切開し、４０μｍ細孔セルストレーナーで引き裂くことによって細胞を除去した。ＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄した後、５ｍＬのＡＣＫ ＲＢＣ溶解緩衝液（Ｑｕａｌｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、ＭＤ）を用いて赤血球を３分間溶解した。１０倍容量の培地を添加することによって溶解を停止した。２回洗浄した後、細胞を再懸濁し、２×１０６／ｍＬの濃度で播種した。
細胞内サイトカイン検出のために、細胞をＰＭＡ（５０ｎｇ／ｍｌ）／イオノマイシン（５００ｎｇ／ｍｌ）で５時間再刺激した。最後の３時間にＧｏｌｇｉＰｌｕｇを添加し、推奨されるようにＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍキットを使用して細胞内サイトカイン染色を行った（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）。ＦＡＣＳ分析を、以前に記載されたように（Ｏｈら、２０１２）、タンパク質特異的モノクローナル抗体および対応するアイソタイプ対照Ａｂ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用してＭＡＣＳＱｕａｎｔ分析装置（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で行った。蛍光色素とコンジュゲートしたｍＡｂで染色した試料に対してＦＡＣＳ分析を行い、各実験を色補正した。死細胞を死細胞排除色素（Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅ ｅＦｌｕｏｒ（登録商標）４５０；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で染色した。アイソタイプ対照を使用してゲートを設定した。
炎症誘発性ＩＬ－１７および／またはＩＦＮ－γサイトカインを分泌するＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度を、細胞内サイトカイン染色アッセイによって検出および定量化した。公表された報告と一致して、ＰＢＳ処置マウスにおけるＥＡＵの発生は、眼、脾臓およびＤＬＮにおけるＩＬ－１７発現（Ｔｈ１７）およびＩＦＮγ発現（Ｔｈ１）細胞の有意な増加を伴ったが、ＳＢＴ－１００（配列番号１）で処置したマウスのこれらの組織におけるＴｈ１およびＴｈ１７のはるかに低いパーセンテージが観察された（図３Ａ）。四分円は、ＩＦＮ－γまたはＩＬ－１７を発現するＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセンテージを示す。網膜、ＤＬＮまたは脾臓におけるＲＯＲ－γＴ（図３Ｂ）またはグランザイムＢ（図３Ｃ）を発現するＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセンテージ（図３Ｄ）。ＰＢＳまたはＳＢＴ－１００（配列番号１）で処置したＥＡＵマウスからの選別したＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＩＲＢＰおよびＩＬ－１７Ａでインビトロで再刺激し、３日目の培養上清中に分泌されたＩＦＮ－γをＥＬＩＳＡによって検出した。
これらの結果は、Ｔｈ１７細胞が器官特異的自己免疫疾患の病因に関与していることを暗示する研究と一致している。Ｔｈ１７分化および発達にはＲＯＲ－γｔ転写が必要であり、結果は、Ｔｈ１７細胞の減少がこのＴｈ１７マスター転写因子のより低いレベルの検出と相関することを示している（図３Ｂ）。Ｔｈ１７リンパ球は中枢神経系に輸送され、グランザイムＢ放出を介して細胞溶解効果を媒介し、グランザイムＢを遮断すると、後期／慢性ＥＡＥが改善される。ＳＢＴ－１００の治癒効果と一致して、未処置マウスと比較して、ＳＢＴ－１００で処置したマウス（配列番号１）におけるグランザイムＢを産生するＣＤ４ Ｔ細胞の顕著な減少が観察された（図３Ｃ）。
ＤＬＮ由来の培養ＣＤ４ Ｔ細胞の上清中のＩＬ－１７およびＩＦＮ－γの測定は、ＳＢＴ－１００（配列番号１）処置マウスにおけるこれらのサイトカインのレベル低下と一致した（図３Ｄ）。ＰＢＳまたはＳＢＴ－１００（配列番号１）で処置したＥＡＵマウスの脾臓由来の細胞を、細胞内サイトカイン染色によって分析した（図３Ｅ）。四分円は、Ｆｏｘｐ３、ＣＤ２５および／またはＩＬ－１０を発現するＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセンテージを示す。データは、少なくとも３回の独立した実験を表し、平均±ＳＥＭとして表される（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。驚くべきことに、ＥＡＵのＳＢＴ－１００媒介性阻害は、制御性Ｔ細胞の増加と関連しないことが見出された（図３Ｅ）。
例４：ＳＢＴ－１００（配列番号１）はブドウ膜形成リンパ球の養子移入によって誘導されるブドウ膜炎を抑制する
養子移入実験を行って、ＥＡＵに対するＳＢＴ－１００（配列番号１）誘導性防御がＴ細胞におけるＳＴＡＴ３経路の標的化の直接的な結果であるかどうかを直接調べた。ＥＡＵを有する対照マウスまたはＳＢＴ－１００処置マウスのリンパ節および脾臓から細胞を単離し、細胞をＩＲＢＰ６５１－６７０でエクスビボで再刺激し、３×１０７個の細胞をナイーブＷＴ Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに養子移入した。疾患の進行を評価し、細胞の移入の１２日後に、眼底検査、組織学、ＯＣＴおよびＥＲＧによってＥＡＵスコアを決定した。ＰＢＳ処置マウス由来の細胞を受けたマウスでは炎症細胞の有意な浸潤および血管炎が観察されたが、ＳＢＴ－１００（配列番号１）処置マウス由来の細胞を受けたマウスは重度のＥＡＵから保護された（図４Ａ）。網膜の折り畳みおよび細胞浸潤もまた、ＳＢＴ－１００（配列番号１）処置マウスにおいて減少した（図４Ｂ）。ＯＣＴ画像はまた、視神経周囲の浸潤細胞の有意な蓄積および網膜層の歪みを示す（データは示さず）。有意により高い明順応ａ波およびｂ波、ならびに暗順応ｂ波の実質的な増加が、未処置マウスからの細胞を受けたマウスと比較して、ＳＢＴ－１００（配列番号１）処置マウスからの細胞を受けたマウスの眼において検出された（図４Ｃ）。データは、少なくとも３回の独立した実験を表し、平均±ＳＥＭとして表される（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。これらの結果は、ＳＴＡＴ３経路がブドウ膜炎の改善および視覚機能の維持のための潜在的な治療標的であることを示している。
例５：ＳＢＴ－１００（配列番号１）はブドウ膜炎を媒介する病原性Ｔｈ１およびＴｈ１７細胞の増殖に拮抗した
ＩＲＢＰ／ＣＦＡによる能動免疫化によるＥＡＵの誘導と同様に、ＳＢＴ－１００（配列番号１）で処理したＴ細胞の移入は、対照未処理細胞と比較してＥＡＵの移入において非効率的であった。ＥＬＩＳＡによるサイトカイン分泌の検出のために、細胞をＩＲＢＰ６５１－６７０ペプチドで４８時間特異的に再刺激し、回収した上清を、製造業者によって推奨されるＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡを使用して定量した。
血漿サイトカインをマルチプレックスＥＬＩＳＡによって定量した。血漿を１，０００ｘｇで１０分間の遠心分離によって分離し、ＬＥＧＥＮＤｐｌｅｘマウス炎症パネルを製造業者（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）によって推奨されるように使用してサイトカインを定量した。データ取得をＣｙｔｏＦＬＥＸ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）で行い、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄのＬＥＧＥＮＤｐｌｅｘ（商標）データ分析ソフトウェアを使用して分析した。
四分円は、網膜、ＤＬＮまたは脾臓においてＩＦＮ－γまたはＩＬ－１７を発現するＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセンテージを示し、Ｔｈ１またはＴｈ１７細胞を細胞内サイトカイン染色によって決定した。細胞内サイトカイン染色分析は、ＳＢＴ－１００（配列番号１）で処置したマウスから細胞を受け取ったマウスにおいて病原性Ｔｈ１およびＴｈ１７細胞のレベルの有意な低下を示す（図５Ａ）。ＰＢＳまたはＳＢＴ－１００（配列番号１）で処置したＥＡＵマウスからの選別したＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＩＲＢＰおよびＩＬ－１７Ａでインビトロで再刺激し、３日目の培養上清中に分泌されたＩＦＮ－γをＥＬＩＳＡによって検出した。ＳＢＴ－１００（配列番号１）誘導ＥＡＵ改善は、それぞれＴｈ１およびＴｈ１７の特徴的なサイトカインであるＩＦＮ－γおよびＩＬ－１７の減少と相関した（図５Ｂ）。四分円は、網膜においてＲＯＲ－ｇＴを発現するＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセンテージを示す。いくつかの自己免疫疾患の病因におけるＴｈ１７細胞の十分に確立された役割と一致して、Ｔｈ１７マスター転写因子（ＲＯＲ－γｔ）を発現するＴ細胞のパーセンテージは有意に減少した（図５Ｃ）。ＩＬ１７Ａ、ＩＦＮ－γ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１αおよびＩＬ－１０の血漿レベルはすべて、マルチプレックスＥＬＩＳＡによってＰＢＳ処置マウスおよびＳＢＴ－１００処置マウスにおいて検出された。未処置マウスまたはＳＢＴ－１００処置マウスから細胞を受けたマウスの血清の分析により、ＳＢＴ－１００（配列番号１）処置群からの血清は、ＩＬ－１７、ＩＦＮ－γ、ＩＬ２３、ＧＭ－ＣＳＦおよびＩＬ－１ａを含む炎症促進性サイトカインの有意な減少を有することが明らかになり、ＳＢＴ－１００（配列番号１）処置がＥＡＵを抑制することをさらに示唆する証拠が提供された（図５Ｄ）。データは、少なくとも２回の独立した実験を表し、平均±ＳＥＭとして表される（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。
本発明は、特定の好ましい実施形態を参照してかなり詳細に説明されているが、他の実施形態も可能である。本方法のために開示された工程は、例えば、限定することを意図するものでも、各工程が本方法に必須であることを示すことを意図するものでもなく、例示的な工程にすぎない。したがって、添付の特許請求の範囲は、本開示に含まれる好ましい実施形態の説明に限定されるべきではない。本明細書で引用されるすべての参考文献は、その全体が参照により組み込まれる。
眼を、同軸照明を伴う両眼顕微鏡を使用して疾患重症度について調べた。組織学のための眼を免疫化の２０日後に摘出し、１０％緩衝ホルマリンで固定し、垂直瞳孔－視神経面で連続切片にした。すべての切片をヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。
ＥＡＵは、主にＴ細胞媒介性ＣＮＳ自己免疫疾患であり、ヒトブドウ膜炎の十分に特徴付けられたマウスモデルである。このマウスモデルを使用して、ＳＢＴ－１００（配列番号１）がこの臓器特異的ＣＮＳ自己免疫疾患の発症または重症度の抑制に有効であるかどうかを調べた。ＥＡＵを、以前に記載されたように（Ｍａｔｔａｐａｌｌｉｌ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ５６，５４３９－５４４９（２０１５））、ＣＦＡエマルジョン中のＩＲＢＰ６５１－６７０による免疫化によってＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおいて誘導した。マウスを、－１日目からＥＡＵ誘導後１２日目までＰＢＳ（未処置群）またはＳＢＴ－１００（配列番号１）のいずれかで１日２回処置した。ＥＡＵモデルでは、ブドウ膜炎は一般に免疫後（ｐ．ｉ）１３日目～２２日目の間に発症するため、この期間中、眼底検査、組織学、光干渉断層法（ＯＣＴ）および網膜電図検査（ＥＲＧ）によって疾患の進行および重症度を監視した。ＥＡＵ臨床スコアおよび疾患重症度の評価は、視神経円板または網膜血管の変化ならびに眼内の網膜および脈絡膜浸潤の検出に基づいた。
統計データ分析およびグラフプロットは、実験に応じて、ペアワイズ比較のための両側対応のないスチューデントｔ検定または多重ペアワイズｔ検定を用いた一元配置分散分析を使用して、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８を使用して行った。データを平均およびＳＤとして示し、推論の統計学的有意性はｐ＜０．０５に基づいた。データは、少なくとも３回の独立した実験を表し、平均±ＳＥＭとして表される（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。
Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスをＣＦＡ中のＩＲＢＰで免疫し、ＰＢＳまたはＳＢＴ－１００（配列番号１）で処置し、ＥＡＵの発生を、眼底検査（図２Ａ）、組織学（図２Ｂ）、ＯＣＴ（データは示さず）またはＥＲＧ（図２Ｃ）によって評価した。
ブドウ膜炎の初期徴候は、ｐ．ｉ．１４日目までに最初に観察され、その時点とｐ．ｉ．２０日目との間に完全な炎症が観察された。ＰＢＳ処置網膜の眼底画像は、視神経円板縁のかすみおよび乳頭周囲領域の拡大、中程度のカフ形成を伴う網膜血管炎、ならびに黄白色の網膜および脈絡膜浸潤を特徴とする重度の炎症を示す（データは示さず）。対照的に、ＳＢＴ－１００処置マウスの網膜の眼底画像は、非常に低い臨床スコアを有する比較的軽度のＥＡＵを示した（データは示さず）。臨床スコアおよび疾患重症度の評価は、視神経円板または網膜血管の変化ならびに網膜および脈絡膜浸潤に基づいた。眼の断面の組織病理学を免疫後２０日目に行った。未処置ＥＡＵ対照マウスでは、炎症細胞浸潤、視神経円板縁のぼやけ、および血管炎によるいくつかのコンフルエントな病変を伴う特徴的な広範な網膜病変があり、これらはすべて、ＳＢＴ－１００（配列番号１）処置マウスでは軽度であったか、または存在しなかった。ＥＡＵスコアは、ＳＢＴ－１００（配列番号１）処置群と比較して、ＰＢＳ処置群で有意に高かった。眼底検査の結果と一致して、ＰＢＳ処置した２０日目の網膜の組織学は、硝子体内への多数の炎症細胞の浸潤、網膜細胞の破壊、および重度のブドウ膜炎の顕著な特徴である網膜内折り畳みの発達を伴う重度のＥＡＵを明らかにした。
ＯＣＴは、生きている動物の様々な眼構造の内部微細構造の視覚化を可能にする非侵襲的手順であり、以前に記載されたように実行された（Ｏｈら、２０１２）。８２０ｎｍの中心波長広帯域光源（Ｂｉｏｐｔｉｇｅｎ、ＮＣ）を備えたスペクトル領域光干渉断層法（ＳＤ－ＯＣＴ）システムを、対照マウスまたはＥＡＵマウスの眼のインビボ非接触イメージングに使用した。マウスを麻酔し、瞳孔を散大させた。次いで、水平または垂直走査を可能にする容易に回転させることができる調整可能なホルダーを使用してマウスを固定化し、各走査を少なくとも２回行い、毎回再調整した。最適な信号強度およびコントラストが達成されるまで、走査の寸法（深さおよび横方向範囲）を調整した。網膜厚は、システムソフトウェアを使用して、同じ眼からの水平走査および垂直走査の両方から得られたすべての画像の網膜中心領域から測定し、平均した。システムソフトウェアで網膜厚を決定するために使用される方法は、記載の通りであった（Ｇａｂｒｉｅｌｅ，Ｍ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ５２，２２５０－２２５４（２０１１））。
ＯＣＴにより、ＰＢＳ処置マウスの硝子体および視神経頭における炎症細胞の蓄積が明らかにされたが、ＳＢＴ－１００（配列番号１）を受けたマウスの網膜では明らかにされなかった（図２Ｂ）。ＯＣＴ画像は、視神経周囲の浸潤細胞の蓄積および視神経円板への損傷を示す（データは示さず）。免疫後１８日目の明順応（１００ｃｄ．ｓ／ｍ２）および暗順応（１０ｃｄ．ｓ／ｍ２）のａ波およびｂ波は、未処置マウスではＳＢＴ－１００（配列番号１）処置群と比較して有意に低かった。
網膜電図（ＥＲＧ）は、眼内炎症中の視覚機能の変化を検出するための確立された臨床方法であり、網膜の光刺激に応答した電位の変化に基づく。光適応刺激下のＥＲＧは錐体駆動機能を反映し、一方、暗順応ｂ波応答は桿体駆動活性を表す。ＥＲＧ記録の前に、マウスを一晩暗順応させ、実験を前述のように（Ｏｈら、２０１２）、暗赤色照明下で行った。ケタミン（１．４ｍｇ／マウス）およびキシラジン（０．１２ｍｇ／マウス）の単回腹腔内注射でマウスを麻酔し、０．５％トロピカミドおよび０．５％フェニレフリン塩酸塩（参天製薬株式会社、大阪、日本）を含有するミドリアシルで瞳孔を散大させた。ＥＲＧを、光刺激を生成および制御する網膜電図コンソール（Ｅｓｐｉｏｎ Ｅ２；Ｄｉａｇｎｏｓｙｓ ＬＬＣ，Ｌｏｗｅｌｌ，ＭＡ）を使用して記録した。暗順応ＥＲＧを、７段階で送達される、－４～１ ｌｏｇ ｃｄ・ｓ／ｍ２の強度でＧａｎｚｆｅｌｄドーム内に送達される単一フラッシュで記録した。１０ ｃｄ・ｓ／ｍ２のバックグラウンドで明順応ＥＲＧを得て、０．３～１００ ｃｄ・ｓ／ｍ２で６段階で光刺激を開始した。良好な電気的接触を提供し、角膜水分を維持するために、ゴニスコピックプリズム溶液（Ａｌｃｏｎ Ｌａｂｓ，Ｆｏｒｔ Ｗｏｒｔｈ，ＴＸ）を使用した。口の中に基準電極（金線）を入れ、尾の付け根に接地電極（皮下ステンレス針）を置いた。信号を差動的に増幅し、１ｋＨｚの速度でデジタル化した。主要ＥＲＧ成分（ａ波およびｂ波）の振幅を、自動および手動の方法を用いて測定した（Ｅｓｐｉｏｎソフトウェア；Ｄｉａｇｎｏｓｙｓ ＬＬＣ）。ＥＲＧ記録の直後に、眼底の画像化を前述のように行った（Ｏｈ，Ｈ．Ｍ．ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０１１）。
明順応または暗順応条件下でＰＢＳ処置マウスの眼において検出された有意に低いａ波およびｂ波振幅は、ＰＢＳ処置マウスにおける有意な視覚障害を示唆し、一方、ＳＢＴ処置マウスにおいて検出されたより高いａ波およびｂ波振幅は、ブドウ膜炎中のＳＢＴ－１００（配列番号１）媒介性の視力の維持と一致する（図２Ｃ）。
例３：ＳＢＴ－１００（配列番号１）は、病原性Ｔｈ１およびＴｈ１７細胞を阻害することによってマウスのブドウ膜炎を抑制した
マウスおよびヒトのブドウ膜炎は、主にＴｈ１７サブセットのＴ細胞によって媒介されると考えられており、Ｔｈ１サブセットはＥＡＵを有するマウスの眼でも増加するが、ブドウ膜炎の病因におけるその役割は依然として議論の余地がある。この試験で観察されたＥＡＵの改善が、Ｔｈ１７および／またはＴｈ１細胞のレベルのＳＢＴ－１００誘導性低下に由来するかどうかを調べるために、ＥＡＵを有するマウスから細胞を単離した。Ｔｈ１７およびＴｈ１細胞の頻度を、ＳＢＴ－１００（配列番号１）処置マウスの眼、排出リンパ節および脾臓において調べた。
ＥＡＵを、ＣＦＡ中のＩＲＢＰで免疫化しＰＢＳまたはＳＢＴ１００で処置したＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおいて誘導した。排出リンパ節（ＤＬＮ）および脾臓ＤＬＮの単一細胞懸濁液を作製した。脾臓を切開し、４０μｍ細孔セルストレーナーで引き裂くことによって細胞を除去した。ＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄した後、５ｍＬのＡＣＫ ＲＢＣ溶解緩衝液（Ｑｕａｌｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、ＭＤ）を用いて赤血球を３分間溶解した。１０倍容量の培地を添加することによって溶解を停止した。２回洗浄した後、細胞を再懸濁し、２×１０６／ｍＬの濃度で播種した。
細胞内サイトカイン検出のために、細胞をＰＭＡ（５０ｎｇ／ｍｌ）／イオノマイシン（５００ｎｇ／ｍｌ）で５時間再刺激した。最後の３時間にＧｏｌｇｉＰｌｕｇを添加し、推奨されるようにＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍキットを使用して細胞内サイトカイン染色を行った（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）。ＦＡＣＳ分析を、以前に記載されたように（Ｏｈら、２０１２）、タンパク質特異的モノクローナル抗体および対応するアイソタイプ対照Ａｂ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用してＭＡＣＳＱｕａｎｔ分析装置（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で行った。蛍光色素とコンジュゲートしたｍＡｂで染色した試料に対してＦＡＣＳ分析を行い、各実験を色補正した。死細胞を死細胞排除色素（Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅ ｅＦｌｕｏｒ（登録商標）４５０；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で染色した。アイソタイプ対照を使用してゲートを設定した。
炎症誘発性ＩＬ－１７および／またはＩＦＮ－γサイトカインを分泌するＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度を、細胞内サイトカイン染色アッセイによって検出および定量化した。公表された報告と一致して、ＰＢＳ処置マウスにおけるＥＡＵの発生は、眼、脾臓およびＤＬＮにおけるＩＬ－１７発現（Ｔｈ１７）およびＩＦＮγ発現（Ｔｈ１）細胞の有意な増加を伴ったが、ＳＢＴ－１００（配列番号１）で処置したマウスのこれらの組織におけるＴｈ１およびＴｈ１７のはるかに低いパーセンテージが観察された（図３Ａ）。四分円は、ＩＦＮ－γまたはＩＬ－１７を発現するＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセンテージを示す。網膜、ＤＬＮまたは脾臓におけるＲＯＲ－γＴ（図３Ｂ）またはグランザイムＢ（図３Ｃ）を発現するＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセンテージ（図３Ｄ）。ＰＢＳまたはＳＢＴ－１００（配列番号１）で処置したＥＡＵマウスからの選別したＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＩＲＢＰおよびＩＬ－１７Ａでインビトロで再刺激し、３日目の培養上清中に分泌されたＩＦＮ－γをＥＬＩＳＡによって検出した。
これらの結果は、Ｔｈ１７細胞が器官特異的自己免疫疾患の病因に関与していることを暗示する研究と一致している。Ｔｈ１７分化および発達にはＲＯＲ－γｔ転写が必要であり、結果は、Ｔｈ１７細胞の減少がこのＴｈ１７マスター転写因子のより低いレベルの検出と相関することを示している（図３Ｂ）。Ｔｈ１７リンパ球は中枢神経系に輸送され、グランザイムＢ放出を介して細胞溶解効果を媒介し、グランザイムＢを遮断すると、後期／慢性ＥＡＥが改善される。ＳＢＴ－１００の治癒効果と一致して、未処置マウスと比較して、ＳＢＴ－１００で処置したマウス（配列番号１）におけるグランザイムＢを産生するＣＤ４ Ｔ細胞の顕著な減少が観察された（図３Ｃ）。
ＤＬＮ由来の培養ＣＤ４ Ｔ細胞の上清中のＩＬ－１７およびＩＦＮ－γの測定は、ＳＢＴ－１００（配列番号１）処置マウスにおけるこれらのサイトカインのレベル低下と一致した（図３Ｄ）。ＰＢＳまたはＳＢＴ－１００（配列番号１）で処置したＥＡＵマウスの脾臓由来の細胞を、細胞内サイトカイン染色によって分析した（図３Ｅ）。四分円は、Ｆｏｘｐ３、ＣＤ２５および／またはＩＬ－１０を発現するＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセンテージを示す。データは、少なくとも３回の独立した実験を表し、平均±ＳＥＭとして表される（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。驚くべきことに、ＥＡＵのＳＢＴ－１００媒介性阻害は、制御性Ｔ細胞の増加と関連しないことが見出された（図３Ｅ）。
例４：ＳＢＴ－１００（配列番号１）はブドウ膜形成リンパ球の養子移入によって誘導されるブドウ膜炎を抑制する
養子移入実験を行って、ＥＡＵに対するＳＢＴ－１００（配列番号１）誘導性防御がＴ細胞におけるＳＴＡＴ３経路の標的化の直接的な結果であるかどうかを直接調べた。ＥＡＵを有する対照マウスまたはＳＢＴ－１００処置マウスのリンパ節および脾臓から細胞を単離し、細胞をＩＲＢＰ６５１－６７０でエクスビボで再刺激し、３×１０７個の細胞をナイーブＷＴ Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに養子移入した。疾患の進行を評価し、細胞の移入の１２日後に、眼底検査、組織学、ＯＣＴおよびＥＲＧによってＥＡＵスコアを決定した。ＰＢＳ処置マウス由来の細胞を受けたマウスでは炎症細胞の有意な浸潤および血管炎が観察されたが、ＳＢＴ－１００（配列番号１）処置マウス由来の細胞を受けたマウスは重度のＥＡＵから保護された（図４Ａ）。網膜の折り畳みおよび細胞浸潤もまた、ＳＢＴ－１００（配列番号１）処置マウスにおいて減少した（図４Ｂ）。ＯＣＴ画像はまた、視神経周囲の浸潤細胞の有意な蓄積および網膜層の歪みを示す（データは示さず）。有意により高い明順応ａ波およびｂ波、ならびに暗順応ｂ波の実質的な増加が、未処置マウスからの細胞を受けたマウスと比較して、ＳＢＴ－１００（配列番号１）処置マウスからの細胞を受けたマウスの眼において検出された（図４Ｃ）。データは、少なくとも３回の独立した実験を表し、平均±ＳＥＭとして表される（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。これらの結果は、ＳＴＡＴ３経路がブドウ膜炎の改善および視覚機能の維持のための潜在的な治療標的であることを示している。
例５：ＳＢＴ－１００（配列番号１）はブドウ膜炎を媒介する病原性Ｔｈ１およびＴｈ１７細胞の増殖に拮抗した
ＩＲＢＰ／ＣＦＡによる能動免疫化によるＥＡＵの誘導と同様に、ＳＢＴ－１００（配列番号１）で処理したＴ細胞の移入は、対照未処理細胞と比較してＥＡＵの移入において非効率的であった。ＥＬＩＳＡによるサイトカイン分泌の検出のために、細胞をＩＲＢＰ６５１－６７０ペプチドで４８時間特異的に再刺激し、回収した上清を、製造業者によって推奨されるＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡを使用して定量した。
血漿サイトカインをマルチプレックスＥＬＩＳＡによって定量した。血漿を１，０００ｘｇで１０分間の遠心分離によって分離し、ＬＥＧＥＮＤｐｌｅｘマウス炎症パネルを製造業者（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）によって推奨されるように使用してサイトカインを定量した。データ取得をＣｙｔｏＦＬＥＸ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）で行い、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄのＬＥＧＥＮＤｐｌｅｘ（商標）データ分析ソフトウェアを使用して分析した。
四分円は、網膜、ＤＬＮまたは脾臓においてＩＦＮ－γまたはＩＬ－１７を発現するＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセンテージを示し、Ｔｈ１またはＴｈ１７細胞を細胞内サイトカイン染色によって決定した。細胞内サイトカイン染色分析は、ＳＢＴ－１００（配列番号１）で処置したマウスから細胞を受け取ったマウスにおいて病原性Ｔｈ１およびＴｈ１７細胞のレベルの有意な低下を示す（図５Ａ）。ＰＢＳまたはＳＢＴ－１００（配列番号１）で処置したＥＡＵマウスからの選別したＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＩＲＢＰおよびＩＬ－１７Ａでインビトロで再刺激し、３日目の培養上清中に分泌されたＩＦＮ－γをＥＬＩＳＡによって検出した。ＳＢＴ－１００（配列番号１）誘導ＥＡＵ改善は、それぞれＴｈ１およびＴｈ１７の特徴的なサイトカインであるＩＦＮ－γおよびＩＬ－１７の減少と相関した（図５Ｂ）。四分円は、網膜においてＲＯＲ－ｇＴを発現するＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセンテージを示す。いくつかの自己免疫疾患の病因におけるＴｈ１７細胞の十分に確立された役割と一致して、Ｔｈ１７マスター転写因子（ＲＯＲ－γｔ）を発現するＴ細胞のパーセンテージは有意に減少した（図５Ｃ）。ＩＬ１７Ａ、ＩＦＮ－γ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１αおよびＩＬ－１０の血漿レベルはすべて、マルチプレックスＥＬＩＳＡによってＰＢＳ処置マウスおよびＳＢＴ－１００処置マウスにおいて検出された。未処置マウスまたはＳＢＴ－１００処置マウスから細胞を受けたマウスの血清の分析により、ＳＢＴ－１００（配列番号１）処置群からの血清は、ＩＬ－１７、ＩＦＮ－γ、ＩＬ２３、ＧＭ－ＣＳＦおよびＩＬ－１ａを含む炎症促進性サイトカインの有意な減少を有することが明らかになり、ＳＢＴ－１００（配列番号１）処置がＥＡＵを抑制することをさらに示唆する証拠が提供された（図５Ｄ）。データは、少なくとも２回の独立した実験を表し、平均±ＳＥＭとして表される（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。
本発明は、特定の好ましい実施形態を参照してかなり詳細に説明されているが、他の実施形態も可能である。本方法のために開示された工程は、例えば、限定することを意図するものでも、各工程が本方法に必須であることを示すことを意図するものでもなく、例示的な工程にすぎない。したがって、添付の特許請求の範囲は、本開示に含まれる好ましい実施形態の説明に限定されるべきではない。本明細書で引用されるすべての参考文献は、その全体が参照により組み込まれる。
【図1A】
【図1B】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図3E】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【配列表】
【国際調査報告】