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特表2024-525991ヒト又はキメラＴＦＲ１を有する遺伝子組換え非ヒト動物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-07-12
(54)【発明の名称】ヒト又はキメラＴＦＲ１を有する遺伝子組換え非ヒト動物
(51)【国際特許分類】
A01K 67/0275 20240101AFI20240705BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20240705BHJP
C07K 14/705 20060101ALI20240705BHJP
A01K 67/0278 20240101ALI20240705BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20240705BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240705BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20240705BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240705BHJP
A61P 9/10 20060101ALI20240705BHJP
A61P 17/02 20060101ALI20240705BHJP
A61P 25/08 20060101ALI20240705BHJP
A61P 25/16 20060101ALI20240705BHJP
A61P 25/28 20060101ALI20240705BHJP
A61P 21/00 20060101ALI20240705BHJP
A61P 37/08 20060101ALI20240705BHJP
A61P 37/02 20060101ALI20240705BHJP
A61P 11/06 20060101ALI20240705BHJP
A61P 13/12 20060101ALI20240705BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20240705BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20240705BHJP
A61P 19/02 20060101ALI20240705BHJP
A61P 7/04 20060101ALI20240705BHJP
A61P 7/06 20060101ALI20240705BHJP
A61P 1/04 20060101ALI20240705BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20240705BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20240705BHJP
A61P 25/04 20060101ALI20240705BHJP
【ＦＩ】
A01K67/0275 ZNA
C12N15/12
C07K14/705
A01K67/0278
C12N15/09 Z
A61P35/00
A61P35/02
A61K39/395 T
A61P9/10
A61P17/02
A61P25/08
A61P25/16
A61P25/28
A61P21/00
A61P37/08
A61P37/02
A61P11/06
A61P13/12
A61P1/16
A61P17/00
A61P19/02
A61P7/04
A61P7/06
A61P1/04
A61P3/10
A61P25/00
A61P25/04
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024525758
(86)(22)【出願日】2022-07-15
(85)【翻訳文提出日】2024-03-14
(86)【国際出願番号】 CN2022105924
(87)【国際公開番号】W WO2023284850
(87)【国際公開日】2023-01-19
(31)【優先権主張番号】202110808740.8
(32)【優先日】2021-07-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(31)【優先権主張番号】202111238943.4
(32)【優先日】2021-10-25
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】521213200
【氏名又は名称】バイオサイトジェン ファーマシューティカルズ （ベイジン） カンパニー リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100099759
【弁理士】
【氏名又は名称】青木 篤
(74)【代理人】
【識別番号】100123582
【弁理士】
【氏名又は名称】三橋 真二
(74)【代理人】
【識別番号】100117019
【弁理士】
【氏名又は名称】渡辺 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100141977
【弁理士】
【氏名又は名称】中島 勝
(74)【代理人】
【識別番号】100138210
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 達則
(74)【代理人】
【識別番号】100203828
【弁理士】
【氏名又は名称】喜多村 久美
(72)【発明者】
【氏名】リウ チャン
(72)【発明者】
【氏名】シャン チョンチャン
(72)【発明者】
【氏名】チョウ シアオフェイ
【テーマコード（参考）】
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C085AA14
4C085BB31
4C085CC23
4C085DD61
4C085EE03
4C085GG01
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA40
4H045DA50
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】
本開示は、ヒト又はキメラ（例えば、ヒト化）ＴＦＲ１を発現する遺伝子組換え非ヒト動物、及びその使用方法に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ゲノムが、ヒト又はキメラＴＦＲ１（トランスフェリン受容体タンパク質１）をコードする配列を含む少なくとも１つの染色体を含む、遺伝子組換え非ヒト動物。
【請求項2】
前記ヒト又はキメラＴＦＲ１をコードする前記配列は、前記少なくとも１つの染色体内の内因性ＴＦＲ１遺伝子座位において、内因性制御エレメントに作動可能に連結されている、請求項１に記載の動物。
【請求項3】
前記ヒト又はキメラＴＦＲ１をコードする配列は、ヒトＴＦＲ１（ＮＰ＿００３２２５．２（配列番号２））と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列をコードする配列を含む、請求項１又は２に記載の動物。
【請求項4】
前記ヒト又はキメラＴＦＲ１をコードする配列は、配列番号９と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列をコードする配列を含む、請求項１又は２に記載の動物。
【請求項5】
前記ヒト又はキメラＴＦＲ１をコードする配列は、配列番号２のアミノ酸８９～７６０と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列をコードする配列を含む、請求項１又は２に記載の動物。
【請求項6】
前記動物は哺乳類、例えば、サル、げっ歯類、マウス、又はラットである、請求項１～５のいずれか一項に記載の動物。
【請求項7】
前記動物はマウスである、請求項１～６のいずれか一項に記載の動物。
【請求項8】
前記動物は内因性ＴＦＲ１を発現しないか、又は、内因性ＴＦＲ１の発現レベルが低下している、請求項１～７のいずれか一項に記載の動物。
【請求項9】
前記動物は、ヒト又はキメラＴＦＲ１を発現する１つ以上の細胞を有する、請求項１～８のいずれか一項に記載の動物。
【請求項10】
前記動物は、ヒト又はキメラＴＦＲ１を発現する１つ以上の細胞を有し、前記発現されたヒト又はキメラＴＦＲ１は、ヒトトランスフェリン（Ｔｆ）及び鉄と相互作用することができ、鉄－Ｔｆ－ＴＦＲ１錯体を形成して鉄の輸入を促進する、請求項１～９のいずれか一項に記載の動物。
【請求項11】
前記動物は、ヒト又はキメラＴＦＲ１を発現する１つ以上の細胞を有し、前記発現されたヒト又はキメラＴＦＲ１は、内因性トランスフェリン（Ｔｆ）及び鉄と相互作用することができ、鉄－Ｔｆ－ＴＦＲ１錯体を形成して鉄の輸入を促進する、請求項１～９のいずれか一項に記載の動物。
【請求項12】
遺伝子組換え非ヒト動物であって、前記動物のゲノムが、内因性ＴＦＲ１遺伝子座位において、内因性ＴＦＲ１の領域をコードする配列を、ヒトＴＦＲ１の対応する領域をコードする配列で置き換えることを含む、遺伝子組換え非ヒト動物。
【請求項13】
前記ヒトＴＦＲ１の対応する領域をコードする配列は、前記内因性ＴＦＲ１座位において、内因性制御エレメントに作動可能に連結され、前記動物の１つ以上の細胞はヒト又はキメラＴＦＲ１を発現する、請求項１２に記載の動物。
【請求項14】
前記動物は内因性ＴＦＲ１を発現しないか、又は、内因性ＴＦＲ１の発現レベルが低下している、請求項１２又は１３に記載の動物。
【請求項15】
前記置き換えられた座位は、ＴＦＲ１の細胞外領域である、請求項１２～１４のいずれか一項に記載の動物。
【請求項16】
前記動物は、細胞質領域、膜貫通領域、及び細胞外領域を有するキメラＴＦＲ１を発現する１つ以上の細胞を有し、前記細胞外領域は、ヒトＴＦＲ１の細胞外領域と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は９９％同一である配列を含む、請求項１２～１５のいずれか一項に記載の動物。
【請求項17】
前記キメラＴＦＲ１の細胞外領域は、ヒトＴＦＲ１の細胞外領域内に存在する連続配列と同一である、少なくとも１００、２００、３００、４００、５００、６００、６２０、６５０、６６０、６６５、６６６、６６７、６６８、６６９、６７０、６７１、又は６７２個の連続アミノ酸を有する配列を有する、請求項１６に記載の動物。
【請求項18】
前記内因性ＴＦＲ１の領域をコードする配列は、内因性ＴＦＲ１遺伝子のエクソン４、エクソン５、エクソン６、エクソン７、エクソン８、エクソン９、エクソン１０、エクソン１１、エクソン１２、エクソン１３、エクソン１４、エクソン１５、エクソン１６、エクソン１７、エクソン１８、及び／若しくはエクソン１９、又はこれらの一部を含む、請求項１２～１７のいずれか一項に記載の動物。
【請求項19】
前記動物はマウスである、請求項１８に記載の動物。
【請求項20】
前記動物は、前記内因性ＴＦＲ１遺伝子座位における置き換えに関してヘテロ接合である、請求項１２～１９のいずれか一項に記載の動物。
【請求項21】
前記動物は、前記内因性ＴＦＲ１遺伝子座位における置き換えに関してホモ接合である、請求項１２～１９のいずれか一項に記載の動物。
【請求項22】
遺伝子組換え非ヒト動物を作製するための方法であって、前記動物の少なくとも１つの細胞内の、内因性ＴＦＲ１遺伝子座位において、内因性ＴＦＲ１の領域をコードする配列を、ヒトＴＦＲ１の対応する領域をコードする配列で置き換えることを含む、方法。
【請求項23】
前記ヒトＴＦＲ１の対応する領域をコードする配列は、ヒトＴＦＲ１遺伝子のエクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、エクソン６、エクソン７、エクソン８、エクソン９、エクソン１０、エクソン１１、エクソン１２、エクソン１３、エクソン１４、エクソン１５、エクソン１６、エクソン１７、エクソン１８、及び／若しくはエクソン１９、又はこれらの一部を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項24】
前記ヒトＴＦＲ１の対応する領域をコードする配列は、ヒトＴＦＲ１遺伝子のエクソン４の一部；エクソン５、エクソン６、エクソン７、エクソン８、エクソン９、エクソン１０、エクソン１１、エクソン１２、エクソン１３、エクソン１４、エクソン１５、エクソン１６、エクソン１７、エクソン１８；及びエクソン１９の一部を含む、請求項２２又は２３に記載の方法。
【請求項25】
前記ヒトＴＦＲ１の対応する領域をコードする配列は、配列番号２のアミノ酸８９～７６０をコードする、請求項２２～２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項26】
前記領域は、ＴＦＲ１の細胞外領域の中に位置する、請求項２２～２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項27】
前記内因性ＴＦＲ１の領域をコードする配列は、内因性ＴＦＲ１遺伝子のエクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、エクソン６、エクソン７、エクソン８、エクソン９、エクソン１０、エクソン１１、エクソン１２、エクソン１３、エクソン１４、エクソン１５、エクソン１６、エクソン１７、エクソン１８、及び／若しくはエクソン１９、又はこれらの一部を含む、請求項２２～２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項28】
前記動物はマウスであり、前記内因性ＴＦＲ１の領域をコードする配列は、内因性ＴＦＲ１遺伝子のエクソン４の一部；エクソン５、エクソン６、エクソン７、エクソン８、エクソン９、エクソン１０、エクソン１１、エクソン１２、エクソン１３、エクソン１４、エクソン１５、エクソン１６、エクソン１７、エクソン１８；及びエクソン１９の一部を含む、請求項２２～２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項29】
キメラＴＦＲ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの細胞を含む非ヒト動物であって、前記キメラＴＦＲ１ポリペプチドは、ヒトＴＦＲ１の対応する連続アミノ酸配列と同一である、少なくとも５０個の連続アミノ酸残基を含み、前記動物は前記キメラＴＦＲ１ポリペプチドを発現する、非ヒト動物。
【請求項30】
前記キメラＴＦＲ１ポリペプチドは、前記ヒトＴＦＲ１細胞外領域の対応する連続アミノ酸配列と同一である、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも５５０、少なくとも６００、少なくとも６５０、少なくとも６６０、少なくとも６７０、少なくとも６７１、又は少なくとも６７２個の連続アミノ酸残基を有する、請求項２９に記載の動物。
【請求項31】
前記キメラＴＦＲ１ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸８９～７６０と少なくとも９０％、９５％、又は９９％同一である配列を含む、請求項２９又は３０に記載の動物。
【請求項32】
前記ヌクレオチド配列は、前記動物の内因性ＴＦＲ１制御エレメントに作動可能に連結される、請求項２９～３１のいずれか一項に記載の動物。
【請求項33】
前記キメラＴＦＲ１ポリペプチドは、内因性ＴＦＲ１細胞質領域、及び／又は内因性ＴＦＲ１膜貫通領域を含む、請求項２９～３２のいずれか一項に記載の動物。
【請求項34】
前記ヌクレオチド配列は、前記動物の内因性ＴＦＲ１遺伝子座位に組み込まれている、請求項２９～３３のいずれか一項に記載の動物。
【請求項35】
前記キメラＴＦＲ１ポリペプチドは、少なくとも１つのマウスＴＦＲ１活性、及び／又は少なくとも１つのヒトＴＦＲ１活性を有する、請求項２９～３４のいずれか一項に記載の動物。
【請求項36】
キメラＴＦＲ１を発現する遺伝子組換え動物細胞の作製方法であって、内因性ＴＦＲ１遺伝子座位において、内因性ＴＦＲ１の領域をコードするヌクレオチド配列を、ヒトＴＦＲ１の対応する領域をコードするヌクレオチド配列で置き換えることにより、前記キメラＴＦＲ１をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子組換え動物細胞を生成することを含み、前記動物細胞は、前記キメラＴＦＲ１を発現する、方法。
【請求項37】
前記動物はマウスである、請求項３６に記載の方法。
【請求項38】
前記キメラＴＦＲ１は、マウスＴＦＲ１の細胞質領域及び／又は膜貫通領域、並びに
ヒトＴＦＲ１の細胞外領域、
を含む、請求項３６又は３７に記載の方法。
【請求項39】
前記キメラＴＦＲ１をコードする前記ヌクレオチド配列は、内因性ＴＦＲ１調節領域、例えばプロモーターに作動可能に連結される、請求項３６～３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項40】
前記動物は、追加のヒト又はキメラタンパク質をコードする配列をさらに含む、請求項１～２１、及び２９～３５のいずれか一項に記載の動物。
【請求項41】
前記追加のヒト又はキメラタンパク質は、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）、プログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）、細胞毒性Ｔ－リンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー４（ＯＸ４０）、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）、Ｔ細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン含有３（ＴＩＭ－３）、又はＣＤ７３である、請求項４０に記載の動物。
【請求項42】
前記動物又はマウスは、追加のヒト又はキメラタンパク質をコードする配列をさらに含む、請求項２２～２８、及び３６～３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項43】
前記追加のヒト又はキメラタンパク質は、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＯＸ４０、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ３、又はＣＤ７３である、請求項４２に記載の方法。
【請求項44】
癌の治療に対する抗ＴＦＲ１抗体の有効性を測定する方法であって、ａ）前記抗ＴＦＲ１抗体を、請求項１～２１、２９～３５、４０、及び４１のいずれか一項に記載の動物に投与することであって、前記動物は癌を有する、前記投与することと、
ｂ）前記抗ＴＦＲ１抗体の、前記癌に対する阻害効果を測定することと、
を含む、方法。
【請求項45】
前記癌は、ＴＦＲ１を発現する１つ以上の細胞を含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項46】
前記癌は、前記動物に注射される１つ以上の癌細胞を含む、請求項４４又は４５に記載の方法。
【請求項47】
前記抗ＴＦＲ１抗体の、前記癌に対する阻害効果を測定することには、前記動物で腫瘍体積を測定することを伴う、請求項４４～４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項48】
前記癌は、脳腫瘍、乳癌、大腸癌、肝癌、卵巣癌、肺癌、骨肉腫、白血病、及び／又はリンパ腫である、請求項４４～４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項49】
抗ＴＦＲ１抗体及び追加の治療剤の、癌の治療に対する有効性を測定する方法であって、ａ）前記抗ＴＦＲ１抗体及び前記追加の治療剤を、請求項１～２１、２９～３５、４０、及び４１のいずれか一項に記載の動物に投与することであって、前記動物は癌を有する、前記投与することと、
ｂ）前記癌における阻害効果を測定することと、
を含む、方法。
【請求項50】
前記動物は、ヒト又はキメラプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）をコードする配列をさらに含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項51】
前記動物は、ヒト又はキメラプログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）をコードする配列をさらに含む、請求項４９又は５０に記載の方法。
【請求項52】
前記追加の治療剤は、抗ＰＤ－１抗体又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体である、請求項４９～５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項53】
前記癌は、ＴＦＲ１及び／又はＰＤ－Ｌ１を発現する１つ以上の癌細胞を含む、請求項４９～５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項54】
前記癌は、１つ以上の癌細胞を前記動物に注射することにより引き起こされる、請求項４９～５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項55】
前記治療の阻害効果を測定することには、前記動物で腫瘍体積を測定することを伴う、請求項４９～５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項56】
前記動物は、脳腫瘍、乳癌、大腸癌、肝癌、卵巣癌、肺癌、骨肉腫、白血病、及び／又はリンパ腫を有する、請求項４９～５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項57】
治療剤が血液脳関門を通過する送達効率を測定する方法であって、ａ）前記治療剤を、請求項１～２１、２９～３５、４０、及び４１のいずれか一項に記載の動物に投与することと、
ｂ）前記治療剤の濃度を、前記動物の脳内及び／又は血清中で経時的に測定することと、
を含む、方法。
【請求項58】
前記治療剤は、抗ＴＦＲ１抗体又はその抗原結合断片を含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項59】
前記治療剤は、ＴＦＲ１（例えば、ヒトＴＦＲ１）及び第２の抗原を標的にする多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）である、請求項５７に記載の方法。
【請求項60】
前記第２の抗原は、β－セクレターゼ１（ＢＡＣＥ１）又はアミロイドβである、請求項５９に記載の方法。
【請求項61】
前記治療剤の濃度は、少なくとも５時間、少なくとも１０時間、少なくとも１５時間、少なくとも２０時間、又は少なくとも２５時間にわたって測定される、請求項５７～６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項62】
骨疾患を治療するための抗ＴＦＲ１抗体の有効性を測定する方法であって、ａ）前記抗ＴＦＲ１抗体を、請求項１～２１、２９～３５、４０、及び４１のいずれか一項に記載の動物に投与することであって、前記動物は前記骨疾患を有する、前記投与することと、
ｂ）前記骨疾患の治療に関する前記抗ＴＦＲ１抗体の効果を測定することと、
を含む、方法。
【請求項63】
前記骨疾患は、骨折、骨の変質、関節炎、骨の変形、骨粗鬆症、及び／又は大腿骨頭の壊死である、請求項６２に記載の方法。
【請求項64】
神経変性病を治療するための抗ＴＦＲ１抗体の有効性を測定する方法であって、ａ）前記抗ＴＦＲ１抗体を、請求項１～２１、２９～３５、４０、及び４１のいずれか一項に記載の動物に投与することであって、前記動物は前記神経変性病を有する、前記投与することと、
ｂ）前記神経変性病の治療に関する前記抗ＴＦＲ１抗体の効果を測定することと、
を含む、方法。
【請求項65】
前記神経変性病は、脳虚血、脳損傷若しくは癲癇、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、及び／又は脊髄小脳失調症である、請求項６４に記載の方法。
【請求項66】
免疫不全を治療するための抗ＴＦＲ１抗体の有効性を測定する方法であって、ａ）前記抗ＴＦＲ１抗体を、請求項１～２１、２９～３５、４０、及び４１のいずれか一項に記載の動物に投与することであって、前記動物は前記免疫不全を有する、前記投与することと、
ｂ）前記免疫不全の治療に関する前記抗ＴＦＲ１抗体の効果を測定することと、
を含む、方法。
【請求項67】
前記免疫不全は、アレルギー、喘息、心筋炎、腎炎、肝炎、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、強皮症、甲状腺機能亢進症、特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫性溶血性貧血、潰瘍性大腸炎、自己由来の免疫肝疾患、糖尿病、疼痛、及び／又は神経障害である、請求項６６に記載の方法。
【請求項68】
アミノ酸配列を含むタンパク質であって、前記アミノ酸配列は、（ａ）配列番号１、２、又は９に示されるアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号１、２、又は９と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号１、２、又は９と少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列；
（ｄ）配列番号１、２、又は９に示されるアミノ酸配列と、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個以下のアミノ酸が異なるアミノ酸配列；並びに
（ｅ）配列番号１、２、又は９に示されるアミノ酸配列に対して、１、２、３、４、５個、又はそれ以上のアミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入を含むアミノ酸配列
のうちの１つである、タンパク質。
【請求項69】
ヌクレオチド配列を含む核酸であって、前記ヌクレオチド配列は、（ａ）請求項６８に記載のタンパク質をコードする配列；
（ｂ）配列番号３、４、５、６、７、又は８；
（ｃ）配列番号３、４、５、６、７、又は８と少なくとも９０％同一である配列；及び
（ｄ）配列番号３、４、５、６、７、又は８と少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列
のうちの１つである、核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
優先権の主張
本出願は、２０２１年６月１６日に出願された中国特許出願第２０２１１０８０８７４０．８号明細書、及び、２０２１年１０月２５日に出願された中国特許出願第２０２１１１２３８９４３．４号明細書の利益を主張する。上述の出願の内容全体が参照により、本明細書に組み込まれている。
本出願は、２０２１年６月１６日に出願された中国特許出願第２０２１１０８０８７４０．８号明細書、及び、２０２１年１０月２５日に出願された中国特許出願第２０２１１１２３８９４３．４号明細書の利益を主張する。上述の出願の内容全体が参照により、本明細書に組み込まれている。
【0002】
技術分野
本開示は、ヒト又はキメラ（例えば、ヒト化）ＴＦＲ１を発現する遺伝子組換え動物、及びその使用方法に関する。
本開示は、ヒト又はキメラ（例えば、ヒト化）ＴＦＲ１を発現する遺伝子組換え動物、及びその使用方法に関する。
【背景技術】
【0003】
分化クラスター７１（ＣＤ７１）としても知られているトランスフェリン受容体１（ＴＦＲ１）は広範にわたり発現し、高い親和性でトランスフェリン（Ｔｆ）に結合することができる。血液脳関門の内皮細胞で発現するＴＦＲ１を前臨床研究で用いることで、抗体を含む巨大分子を脳に送達させることが可能となる。したがって、ＴＦＲ１を標的にする抗体は、中枢神経系の治療法にとって重要である可能性がある。例えば、ＴＦＲ１を使用して、巨大分子を、血液脳関門を通して輸送し、中枢神経系に治療法を送達することができる。
【0004】
従来の、様々な治療法に対する薬剤研究及び開発には、動物モデルを伴う。しかし、ヒトと動物とでの差が原因で、インビボの薬理学試験に従来の実験動物を用いることで得られる試験結果は、実際の病状、及び、標的部位での相互作用を反映しない可能性があり、結果的に、多くの臨床試験における結果が動物実験結果とは著しく異なることとなる。したがって、ヒト抗体のスクリーニング及び評価に好適なヒト化動物モデルを開発することによって、新しい薬剤開発の効率が著しく改善され、薬剤研究及び開発のコストが著しく低下する。
【発明の概要】
【0005】
本開示は、ヒトＴＦＲ１又はキメラＴＦＲ１を有する動物モデルに関する。動物モデルは、体内でヒトＴＦＲ１又はキメラＴＦＲ１（例えば、ヒト化ＴＦＲ１）タンパク質を発現することができる。当該動物モデルを、ＴＦＲ１遺伝子の機能研究で用いることができ、抗ヒトＴＦＲ１抗体のスクリーニング及び評価で用いることができる。さらに、本明細書に記載の方法により調製される動物モデルを、薬剤スクリーニング、薬力学研究、免疫関連疾患の治療、及び、ヒトＴＦＲ１標的部位の癌治療で用いることができる；当該動物モデルを用いて、新しい薬剤の開発及び設計を容易にし、また、時間及びコストを節約することもまた可能である。まとめると、本開示は、ＴＦＲ１タンパク質の機能研究のための強力なツール、及び、抗癌剤をスクリーニングするためのプラットフォームを提供する。
【0006】
一態様では、本開示は、ゲノムが、ヒト又はキメラＴＦＲ１（トランスフェリン受容体タンパク質１）をコードする配列を含む少なくとも１つの染色体を含む、遺伝子組換え非ヒト動物に関する。いくつかの実施形態では、ヒト又はキメラＴＦＲ１をコードする配列は、少なくとも１つの染色体内の内因性ＴＦＲ１遺伝子座位において、内因性制御エレメントに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、ヒト又はキメラＴＦＲ１をコードする配列は、ヒトＴＦＲ１（ＮＰ＿００３２２５．２（配列番号２））と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列をコードする配列を含む。いくつかの実施形態では、ヒト又はキメラＴＦＲ１をコードする配列は、配列番号９と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列をコードする配列を含む。いくつかの実施形態では、ヒト又はキメラＴＦＲ１をコードする配列は、配列番号２のアミノ酸８９～７６０と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列をコードする配列を含む。いくつかの実施形態では、動物は哺乳類、例えば、サル、げっ歯類、マウス、又はラットである。いくつかの実施形態では、動物はマウスである。いくつかの実施形態では、動物は内因性ＴＦＲ１を発現しないか、又は、内因性ＴＦＲ１の発現レベルが低下している。いくつかの実施形態では、動物は、ヒト又はキメラＴＦＲ１を発現する１つ以上の細胞を有する。いくつかの実施形態では、動物は、ヒト又はキメラＴＦＲ１を発現する１つ以上の細胞を有し、発現されたヒト又はキメラＴＦＲ１は、ヒトトランスフェリン（Ｔｆ）及び鉄と相互作用することができ、鉄－Ｔｆ－ＴＦＲ１錯体を形成して鉄の輸入を促進する。いくつかの実施形態では、動物は、ヒト又はキメラＴＦＲ１を発現する１つ以上の細胞を有し、発現されたヒト又はキメラＴＦＲ１は、内因性トランスフェリン（Ｔｆ）及び鉄と相互作用することができ、鉄－Ｔｆ－ＴＦＲ１錯体を形成して鉄の輸入を促進する。
【0007】
一態様では、本開示は、遺伝子組換え非ヒト動物に関し、いくつかの実施形態では、動物のゲノムは、内因性ＴＦＲ１遺伝子座位において、内因性ＴＦＲ１の領域をコードする配列を、ヒトＴＦＲ１の対応する領域をコードする配列で置き換えることを含む。いくつかの実施形態では、ヒトＴＦＲ１の対応する領域をコードする配列は、内因性ＴＦＲ１座位において、内因性制御エレメントに作動可能に連結され、動物の１つ以上の細胞はヒト又はキメラＴＦＲ１を発現する。いくつかの実施形態では、動物は内因性ＴＦＲ１を発現しないか、又は、内因性ＴＦＲ１の発現レベルが低下している。いくつかの実施形態では、置き換えられた座位は、ＴＦＲ１の細胞外領域である。いくつかの実施形態では、動物は、細胞質領域、膜貫通領域、及び細胞外領域を有するキメラＴＦＲ１を発現する１つ以上の細胞を有し、いくつかの実施形態では、細胞外領域は、ヒトＴＦＲ１の細胞外領域と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は９９％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、キメラＴＦＲ１の細胞外領域は、ヒトＴＦＲ１の細胞外領域内に存在する連続配列と同一である、少なくとも１００、２００、３００、４００、５００、６００、６２０、６５０、６６０、６６５、６６６、６６７、６６８、６６９、６７０、６７１、又は６７２個の連続アミノ酸を有する配列を有する。いくつかの実施形態では、内因性ＴＦＲ１の領域をコードする配列は、内因性ＴＦＲ１遺伝子のエクソン４、エクソン５、エクソン６、エクソン７、エクソン８、エクソン９、エクソン１０、エクソン１１、エクソン１２、エクソン１３、エクソン１４、エクソン１５、エクソン１６、エクソン１７、エクソン１８、及び／若しくはエクソン１９、又はこれらの一部を含む。いくつかの実施形態では、動物はマウスである。いくつかの実施形態では、動物は、内因性ＴＦＲ１遺伝子座位における置き換えに関してヘテロ接合である。いくつかの実施形態では、動物は、内因性ＴＦＲ１遺伝子座位における置き換えに関してホモ接合である。
【0008】
一態様では、本開示は、遺伝子組換え非ヒト動物を作製するための方法であって、上記動物の少なくとも１つの細胞内の、内因性ＴＦＲ１遺伝子座位において、内因性ＴＦＲ１の領域をコードする配列を、ヒトＴＦＲ１の対応する領域をコードする配列で置き換えることを含む、方法に関する。いくつかの実施形態では、ヒトＴＦＲ１の対応する領域をコードする配列は、ヒトＴＦＲ１遺伝子のエクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、エクソン６、エクソン７、エクソン８、エクソン９、エクソン１０、エクソン１１、エクソン１２、エクソン１３、エクソン１４、エクソン１５、エクソン１６、エクソン１７、エクソン１８、及び／若しくはエクソン１９、又はこれらの一部を含む。いくつかの実施形態では、ヒトＴＦＲ１の対応する領域をコードする配列は、ヒトＴＦＲ１遺伝子のエクソン４の一部；エクソン５、エクソン６、エクソン７、エクソン８、エクソン９、エクソン１０、エクソン１１、エクソン１２、エクソン１３、エクソン１４、エクソン１５、エクソン１６、エクソン１７、エクソン１８；及びエクソン１９の一部を含む。いくつかの実施形態では、ヒトＴＦＲ１の対応する領域をコードする配列は、配列番号２のアミノ酸８９～７６０をコードする。いくつかの実施形態では、領域は、ＴＦＲ１の細胞外領域の中に位置する。いくつかの実施形態では、内因性ＴＦＲ１の領域をコードする配列は、内因性ＴＦＲ１遺伝子のエクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、エクソン６、エクソン７、エクソン８、エクソン９、エクソン１０、エクソン１１、エクソン１２、エクソン１３、エクソン１４、エクソン１５、エクソン１６、エクソン１７、エクソン１８、及び／若しくはエクソン１９、又はこれらの一部を含む。いくつかの実施形態では、動物はマウスであり、内因性ＴＦＲ１の領域をコードする配列は、内因性ＴＦＲ１遺伝子のエクソン４の一部；エクソン５、エクソン６、エクソン７、エクソン８、エクソン９、エクソン１０、エクソン１１、エクソン１２、エクソン１３、エクソン１４、エクソン１５、エクソン１６、エクソン１７、エクソン１８；及びエクソン１９の一部を含む。
【0009】
一態様では、本開示は、キメラＴＦＲ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの細胞を含む非ヒト動物に関し、いくつかの実施形態では、キメラＴＦＲ１ポリペプチドは、ヒトＴＦＲ１の対応する連続アミノ酸配列と同一である、少なくとも５０個の連続アミノ酸残基を含み、いくつかの実施形態では、動物はキメラＴＦＲ１ポリペプチドを発現する。いくつかの実施形態では、キメラＴＦＲ１ポリペプチドは、ヒトＴＦＲ１細胞外領域の対応する連続アミノ酸配列と同一である、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも５５０、少なくとも６００、少なくとも６５０、少なくとも６６０、少なくとも６７０、少なくとも６７１、又は少なくとも６７２個の連続アミノ酸残基を有する。いくつかの実施形態では、キメラＴＦＲ１ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸８９～７６０と少なくとも９０％、９５％、又は９９％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、動物の内因性ＴＦＲ１制御エレメントに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、キメラＴＦＲ１ポリペプチドは、内因性ＴＦＲ１細胞質領域、及び／又は内因性ＴＦＲ１膜貫通領域を含む。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、動物の内因性ＴＦＲ１遺伝子座位に組み込まれている。いくつかの実施形態では、キメラＴＦＲ１ポリペプチドは、少なくとも１つのマウスＴＦＲ１活性、及び／又は少なくとも１つのヒトＴＦＲ１活性を有する。
【0010】
一態様では、本開示は、キメラＴＦＲ１を発現する遺伝子組換え動物細胞の作製方法であって、上記方法が、内因性ＴＦＲ１遺伝子座位において、内因性ＴＦＲ１の領域をコードするヌクレオチド配列を、ヒトＴＦＲ１の対応する領域をコードするヌクレオチド配列で置き換えることにより、キメラＴＦＲ１をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子組換え動物細胞を生成することを含む、方法に関し、いくつかの実施形態では、動物細胞は、キメラＴＦＲ１を発現する。いくつかの実施形態では、動物はマウスである。いくつかの実施形態では、キメラＴＦＲ１は、マウスＴＦＲ１の細胞質領域及び／又は膜貫通領域、並びに、ヒトＴＦＲ１の細胞外領域を含む。いくつかの実施形態では、キメラＴＦＲ１をコードするヌクレオチド配列は、内因性ＴＦＲ１調節領域、例えばプロモーターに作動可能に連結される。
【0011】
いくつかの実施形態では、動物は、追加のヒト又はキメラタンパク質をコードする配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、追加のヒト又はキメラタンパク質は、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）、プログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）、細胞毒性Ｔ－リンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー４（ＯＸ４０）、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）、Ｔ細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン含有３（ＴＩＭ－３）、又はＣＤ７３である。
【0012】
一態様では、本開示は、癌（例えば、腫瘍）の治療に対する抗ＴＦＲ１抗体の有効性を測定する方法であって、ａ）上記抗ＴＦＲ１抗体を本明細書に記載する動物に投与することであって、いくつかの実施形態では、上記動物は癌（例えば、腫瘍）を有する、上記投与することと；ｂ）上記抗ＴＦＲ１抗体の、上記癌（例えば、腫瘍）に対する阻害効果を測定することとを含む、方法に関する。いくつかの実施形態では、癌（例えば、腫瘍）は、ＴＦＲ１を発現する１つ以上の細胞を含む。いくつかの実施形態では、癌（例えば、腫瘍）は、動物に注射される１つ以上の癌細胞を含む。いくつかの実施形態では、抗ＴＦＲ１抗体の、癌に対する阻害効果を測定することには、動物で腫瘍体積を測定することを伴う。いくつかの実施形態では、癌は、脳腫瘍、乳癌、大腸癌、肝癌、卵巣癌、肺癌、骨肉腫、白血病、及び／又はリンパ腫である。
【0013】
一態様では、本開示は、抗ＴＦＲ１抗体及び追加の治療剤の、癌の治療に対する有効性を測定する方法であって、ａ）上記抗ＴＦＲ１抗体及び上記追加の治療剤を本明細書に記載する動物に投与することであって、いくつかの実施形態では、上記動物は癌（例えば、腫瘍）を有する、上記投与することと；ｂ）上記癌（例えば、腫瘍）における阻害効果を測定することとを含む、方法に関する。いくつかの実施形態では、動物は、ヒト又はキメラプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）をコードする配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、動物は、ヒト又はキメラプログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）をコードする配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、追加の治療剤は、抗ＰＤ－１抗体又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体である。いくつかの実施形態では、癌は、ＴＦＲ１及び／又はＰＤ－Ｌ１を発現する１つ以上の癌細胞を含む。いくつかの実施形態では、癌は、１つ以上の癌細胞を動物に注射することにより引き起こされる。いくつかの実施形態では、治療の阻害効果を測定することには、動物で腫瘍体積を測定することを伴う。いくつかの実施形態では、動物は、脳腫瘍、乳癌、大腸癌、肝癌、卵巣癌、肺癌、骨肉腫、白血病、及び／又はリンパ腫を有する。
【0014】
一態様では、本開示は、治療剤が血液脳関門を通過する送達効率を測定する方法であって、ａ）上記治療剤を、本明細書に記載する動物に投与することと；ｂ）上記治療剤の濃度を、動物の脳内及び／又は血清中で経時的に測定することとを含む、方法に関する。いくつかの実施形態では、治療剤は、抗ＴＦＲ１抗体又はその抗原結合断片を含む。いくつかの実施形態では、治療剤は、ＴＦＲ１（例えば、ヒトＴＦＲ１）及び第２の抗原を標的にする多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）である。いくつかの実施形態では、第２の抗原は、β－セクレターゼ１（ＢＡＣＥ１）又はアミロイドβである。いくつかの実施形態では、治療剤の濃度は、少なくとも５時間、少なくとも１０時間、少なくとも１５時間、少なくとも２０時間、又は少なくとも２５時間にわたって測定される。
【0015】
一態様では、本開示は、骨疾患を治療するための抗ＴＦＲ１抗体の有効性を測定する方法であって、ａ）上記抗ＴＦＲ１抗体を本明細書に記載する動物に投与することであって、いくつかの実施形態では、上記動物は上記骨疾患を有する、上記投与することと；ｂ）上記骨疾患の治療に関する上記抗ＴＦＲ１抗体の効果を測定することとを含む、方法に関する。いくつかの実施形態では、骨疾患は、骨折、骨の変質、関節炎、骨の変形、骨粗鬆症、及び／又は大腿骨頭の壊死である。
【0016】
一態様では、本開示は、神経変性病を治療するための抗ＴＦＲ１抗体の有効性を測定する方法であって、ａ）上記抗ＴＦＲ１抗体を本明細書に記載する動物に投与することであって、いくつかの実施形態では、上記動物は上記神経変性病を有する、上記投与することと；ｂ）上記神経変性病の治療に関する上記抗ＴＦＲ１抗体の効果を測定することとを含む、方法に関する。いくつかの実施形態では、神経変性病は、脳虚血、脳損傷若しくは癲癇、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、及び／又は脊髄小脳失調症である。
【0017】
一態様では、本開示は、免疫不全を治療するための抗ＴＦＲ１抗体の有効性を測定する方法であって、ａ）上記抗ＴＦＲ１抗体を本明細書に記載する動物に投与することであって、いくつかの実施形態では、上記動物は上記免疫不全を有する、上記投与することと；ｂ）上記免疫不全の治療に関する上記抗ＴＦＲ１抗体の効果を測定することとを含む、方法に関する。いくつかの実施形態では、免疫不全は、アレルギー、喘息、心筋炎、腎炎、肝炎、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、強皮症、甲状腺機能亢進症、特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫性溶血性貧血、潰瘍性大腸炎、自己由来の免疫肝疾患、糖尿病、疼痛、及び／又は神経障害である。
【0018】
一態様では、本開示は、アミノ酸配列を含むタンパク質に関し、いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、以下のうちの１つである：（ａ）配列番号１、２、又は９に示されるアミノ酸配列；（ｂ）配列番号１、２、又は９と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列；（ｃ）配列番号１、２、又は９と少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列；（ｄ）配列番号１、２、又は９に示されるアミノ酸配列と、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個以下のアミノ酸が異なるアミノ酸配列；並びに、（ｅ）配列番号１、２、又は９に示されるアミノ酸配列に対して、１、２、３、４、５個、又はそれ以上のアミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入を含むアミノ酸配列。
【0019】
一態様では、本開示は、ヌクレオチド配列を含む核酸に関し、いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、以下のうちの１つである：（ａ）本明細書に記載するタンパク質をコードする配列；（ｂ）配列番号３、４、５、６、７、又は８；（ｃ）配列番号３、４、５、６、７、又は８と少なくとも９０％同一である配列；並びに、（ｄ）配列番号３、４、５、６、７、又は８と少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列。
【0020】
一態様では、本開示は、本明細書に記載するタンパク質及び／又は核酸を含む細胞に関する。
【0021】
一態様では、本開示は、本明細書に記載するタンパク質及び／又は核酸を含む動物に関する。
【0022】
別の態様では、本開示は、ゲノムが、動物の内因性ＴＦＲ１遺伝子内に破壊を含み、内因性ＴＦＲ１遺伝子の破壊が、内因性ＴＦＲ１遺伝子のエクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、エクソン６、エクソン７、エクソン８、エクソン９、エクソン１０、エクソン１１、エクソン１２、エクソン１３、エクソン１４、エクソン１５、エクソン１６、エクソン１７、エクソン１８、及び／若しくはエクソン１９、又はその一部の欠失を含む、遺伝子組換え非ヒト動物もまた提供する。
【0023】
いくつかの実施形態では、内因性ＴＦＲ１遺伝子の破壊は、内因性ＴＦＲ１遺伝子のエクソン４、エクソン５、エクソン６、エクソン７、エクソン８、エクソン９、エクソン１０、エクソン１１、エクソン１２、エクソン１３、エクソン１４、エクソン１５、エクソン１６、エクソン１７、エクソン１８、及び／又はエクソン１９からなる群から選択される、１つ以上のエクソン、又はエクソンの一部の欠失を含む。
【0024】
いくつかの実施形態では、内因性ＴＦＲ１遺伝子の破壊は、内因性ＴＦＲ１遺伝子のイントロン４、イントロン５、イントロン６、イントロン７、イントロン８、イントロン９、イントロン１０、イントロン１１、イントロン１２、イントロン１３、イントロン１４、イントロン１５、イントロン１６、イントロン１７、及び／又はイントロン１８からなる群から選択される、１つ以上のイントロン、又はイントロンの一部の欠失をさらに含む。
【0025】
いくつかの実施形態では、欠失は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００、３１００、３２００、３３００、３４００、３５００、３６００、３７００、３８００、３９００、４０００、４１００、４２００、４３００、４４００個、又はそれ以上のヌクレオチドを欠失することを含むことができる。
【0026】
いくつかの実施形態では、内因性ＴＦＲ１遺伝子の破壊は、エクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、エクソン６、エクソン７、エクソン８、エクソン９、エクソン１０、エクソン１１、エクソン１２、エクソン１３、エクソン１４、エクソン１５、エクソン１６、エクソン１７、エクソン１８、及び／又はエクソン１９の、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、又は３００個のヌクレオチドの欠失（例えば、エクソン４、エクソン５～１８から、少なくとも１８０個のヌクレオチドの、及び、エクソン１９から、少なくとも２００個のヌクレオチドの、欠失）を含む。
【0027】
本開示はさらに、ヒト化マウスのＴＦＲ１ゲノムＤＮＡ配列、ＤＮＡ配列と一致する、又は相補的な、その転写により得られるｍＲＮＡの逆転写により得られるＤＮＡ配列；そのアミノ酸配列を発現する構築物；その構築物を含む細胞；その細胞を含む組織に関する。
【0028】
本開示はさらに、ヒト細胞の免疫付与プロセスと関連する生成物の開発、ヒト抗体の製造、又は、薬理学、免疫学、微生物学、及び医学における研究用モデルシステムにおける、非ヒト哺乳動物若しくはその子孫、又は腫瘍を有する非ヒト哺乳動物、本明細書に記載する方法により生成される動物モデルの使用に関する。
【0029】
本開示は、ヒト細胞を伴う免疫付与プロセスの動物実験疾患モデルの製造及び利用、病原体の研究、又は、新しい診断方法及び／若しくは治療方法の開発における、非ヒト哺乳動物若しくはその子孫、又は腫瘍を有する非ヒト哺乳動物、本明細書に記載する方法により生成される動物モデルの使用にもまた関する。
【0030】
本開示はさらに、ＴＦＲ１遺伝子機能、ヒトＴＦＲ１抗体、ヒトＴＦＲ１標的部位に対する薬剤又は有効性、並びに免疫関連疾患用薬剤及び抗腫瘍薬剤のスクリーニング、認証、評価、又は研究における、非ヒト哺乳動物若しくはその子孫、又は腫瘍を有する非ヒト哺乳動物、本明細書に記載する方法により生成される動物モデルの使用に関する。
【0031】
別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本発明で使用するための方法及び材料が、本明細書に記載される；他の好適な、当該技術分野において既知の方法及び材料もまた使用することができる。材料、方法、及び例は、例示に過ぎず、限定的であることは意図されない。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、配列、データベースエントリ、及び他の参考文献は、参照によりその全体が援用される。矛盾する場合には、定義を含めて本明細書が優先する。
【0032】
本発明の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明及び図面、並びに特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0033】
【図1】マウス及びヒトＴＦＲ１遺伝子座位を示す概略図である。
【図2】ヒト化ＴＦＲ１遺伝子座位を示す概略図である。
【図3】ＴＦＲ１遺伝子標的法を示す概略図である。
【図4】Ａプローブ及びＮｅｏプローブを用いる組換え後の、細胞のサザンブロットの結果を示す。ＷＴは野生型対照である。
【図5】ＴＦＲ１遺伝子ヒト化マウスにおける、Ｆｌｐ－Ｆｒｔ組換えプロセスを示す概略図である。
【図6A-6D】それぞれ、プライマー対Ｆｒｔ－Ｆ／Ｆｒｔ－Ｒ、ＷＴ－Ｆ／ＷＴ－Ｒ、Ｆｌｐ－Ｆ２／Ｆｌｐ－Ｒ２、及びＷＴ－Ｆ／Ｍｕｔ－ＲによるＦ１世代マウスの、マウスの尾のＰＣＲ同定結果を示す。Ｍはマーカーである。ＰＣは陽性対照である。ＷＴは野生型対照である。Ｈ２Ｏは水対照である。
【図7A-7C】それぞれ、野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウス（＋／＋）、及び、ＴＦＲ１遺伝子ヒト化ホモ接合マウス（Ｈ／Ｈ）の脾細胞における、ヒト化ＴＦＲ１ ｍＲＮＡ、マウスＴＦＲ１ ｍＲＮＡ、及びＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡのＲＴ－ＰＣＲ検出結果を示す。Ｍはマーカーである。Ｈ２Ｏは水対照である。ＧＡＰＤＨは内部参照である。
【図8A-8C】図８Ａは、ＥＬＩＳＡにより測定される、マウス脳組織内での抗ヒトＴＦＲ１抗体ＡｂのＰＫ検出結果を示す。ヒトＩｇＧ１（ｈＩｇＧ）は対照である。図８Ｂは、ＥＬＩＳＡにより測定される、マウス血清中での抗ヒトＴＦＲ１抗体ＡｂのＰＫ検出結果を示す。ヒトＩｇＧ１（ｈＩｇＧ）は対照である。図８Ｃは、マウス脳組織と血清とでの、経時的な、抗ヒトＴＦＲ１抗体Ａｂの濃度比を示す。ヒトＩｇＧ１（ｈＩｇＧ）は対照である。
【図9-1】ヒトＴＦＲ１アミノ酸配列（ＮＰ＿００３２２５．２；配列番号２）と、マウスＴＦＲ１アミノ酸配列（ＮＰ＿０３５７６８．１；配列番号１）とのアラインメントを示す。
【図9-2】ヒトＴＦＲ１アミノ酸配列（ＮＰ＿００３２２５．２；配列番号２）と、マウスＴＦＲ１アミノ酸配列（ＮＰ＿０３５７６８．１；配列番号１）とのアラインメントを示す。
【図10-1】ヒトＴＦＲ１アミノ酸配列（ＮＰ＿００３２２５．２；配列番号２）と、ラットＴＦＲ１アミノ酸配列（ＮＰ＿０７３２０３．１；配列番号３１）とのアラインメントを示す。
【図10-2】ヒトＴＦＲ１アミノ酸配列（ＮＰ＿００３２２５．２；配列番号２）と、ラットＴＦＲ１アミノ酸配列（ＮＰ＿０７３２０３．１；配列番号３１）とのアラインメントを示す。
【発明を実施するための形態】
【0034】
本開示は、ヒト又はキメラ（例えば、ヒト化）ＴＦＲ１を有するトランスジェニック非ヒト動物、及び、その使用方法に関する。
【0035】
鉄は、酸素輸送、エネルギー生成／ミトコンドリア機能、加えて、ＤＮＡ合成及び修復を含む、いくつかの生物学的プロセスにおける必須の元素である。癌細胞の文脈の中では、ＤＮＡ合成を促進することで増殖が増加する一方、ＤＮＡを修復する能力が増加することで、癌細胞の中で一般的な、変異負荷の増加によるＤＮＡの損傷を修復するのに役立つ。鉄代謝の制御における中心的なタンパク質は、トランスフェリン（Ｔｆ）及びその受容体である。鉄の主たる細胞インポーターとして、トランスフェリン受容体１（ＴＦＲ１）の機能は、鉄が関与するプロセスに不可欠であり、ＴＦＲ１による、Ｔｆが結合した鉄の取り込みは一般的に、細胞鉄輸入の主たる源である。
【0036】
鉄のホメオスタシスが破壊されることで、場合により潜在的に細胞に有害な結果がもたらされ得るため、ＴＦＲ１の発現は厳しく制御されている。しかし、ＴＦＲ１は、多くの場合、通常の細胞よりも数倍高いレベルで、多くの異なる種類の癌細胞において過剰発現する。実際、ＴＦＲ１は、普遍的な癌マーカーとして同定されている。ＴＦＲ１の発現の増加は、多数の癌、例えば、食道扁平上皮癌、乳癌、卵巣癌、肺癌、子宮頸癌、膀胱癌、骨肉腫、膵癌、胆管癌、腎細胞癌、肝細胞癌、副腎皮質癌、並びに、神経系の癌、加えて、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、及び非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）などの造血性悪性腫瘍などの固形癌における、ステージの進行及び／又は不十分な予後と相関している。したがって、ＴＦＲ１は、癌に対する潜在的なバイオマーカー及び治療標的とみなされる。
【0037】
さらに、血液脳関門の内皮細胞で発現するＴＦＲ１を用いて、抗体を含む巨大分子を脳に送達させることができる。ＴＦＲ１標的抗体のいくつかは、鉄の取り込みに干渉することなく血液脳関門を通過することが示されている。抗体－ＴｆＲの相互作用の親和性は、血液脳関門の内皮細胞における、トランスサイトーシス性輸送の成功の測定において重要なようである。
【0038】
実験動物モデルは、これらの抗体（例えば、抗ＴＦＲ１抗体）の効果を研究するために不可欠な研究ツールである。一般的な実験動物としては、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、イヌ、サル、ブタ、サカナなどが挙げられる。しかし、ヒトと動物の、遺伝子及びタンパク質配列には多くの違いがあり、多くのヒトタンパク質は、動物の相同タンパク質に結合して生物学的活性を生み出すことができず、多くの臨床試験の結果が、動物実験から得られる結果と一致しないこととなっている。多数の臨床研究が、より良い動物モデルを喫緊に必要としている。遺伝子組換え技術が連続的に開発され、成熟する中で、ヒト細胞又は遺伝子を用いて、ある動物の、類似の内因性細胞又は遺伝子を置き換える、又は置換することで、ヒトに近い生物学的系又は疾患モデルを確立し、ヒト化実験動物モデル（ヒト化動物モデル）を確立することによって、新しい臨床アプローチ又は手段に対して重要なツールが提供されてきた。本文脈において、遺伝子組換え動物モデル、即ち、遺伝操作技術を用いて、ヒトの通常又は変異遺伝子を用いて、動物の相同遺伝子を置き換えることによって、よりヒト遺伝子の系に近い、遺伝子組換え動物モデルを確立することができる。ヒト化動物モデルは、様々な重要用途を有する。例えば、ヒト又はヒト化遺伝子が存在することで、動物は、ヒト機能を有するタンパク質を発見することができ、又は上記タンパク質の一部を発現することができ、ヒトと動物とでの臨床試験の差を大きく低減し、動物レベルでの薬剤スクリーニングの可能性をもたらす。
【0039】
ＴＦＲ１
分化クラスター７１（ＣＤ７１）としても知られているトランスフェリン受容体１（ＴＦＲ１）は広範にわたり発現し、高い親和性でトランスフェリン（Ｔｆ）に結合することができる。ヒトＴＦＲ１は、細胞表面でジスルフィド結合により結合される、二量体（１８０ｋＤａ）として発見される７６０個のアミノ酸からなる、９０ｋＤａのＩＩ型膜貫通糖タンパク質である。ＴＦＲ１モノマーは、Ｔｆ結合部位、膜貫通ドメイン（２８個のアミノ酸）、及び、細胞内Ｎ末端ドメイン（６１個のアミノ酸）を含有する、６７１個のアミノ酸の、大型の細胞外Ｃ末端ドメインで構成される。Ｃ末端細胞外ドメインは、アスパラギン残基２５１、３１７、及び７２７における３つのＮ結合グリコシル化部位、並びに、トレオニン１０４における１つのＯ結合グリコシル化部位を含有し、これらは全て、受容体の十分な機能に必要なものである。
分化クラスター７１（ＣＤ７１）としても知られているトランスフェリン受容体１（ＴＦＲ１）は広範にわたり発現し、高い親和性でトランスフェリン（Ｔｆ）に結合することができる。ヒトＴＦＲ１は、細胞表面でジスルフィド結合により結合される、二量体（１８０ｋＤａ）として発見される７６０個のアミノ酸からなる、９０ｋＤａのＩＩ型膜貫通糖タンパク質である。ＴＦＲ１モノマーは、Ｔｆ結合部位、膜貫通ドメイン（２８個のアミノ酸）、及び、細胞内Ｎ末端ドメイン（６１個のアミノ酸）を含有する、６７１個のアミノ酸の、大型の細胞外Ｃ末端ドメインで構成される。Ｃ末端細胞外ドメインは、アスパラギン残基２５１、３１７、及び７２７における３つのＮ結合グリコシル化部位、並びに、トレオニン１０４における１つのＯ結合グリコシル化部位を含有し、これらは全て、受容体の十分な機能に必要なものである。
【0040】
トランスフェリン（Ｔｆ）は、短いリンカー配列により分離されているＮ－及びＣ－ｌｏｂｅとして知られている、４０ｋＤａのサブユニット２つで構成される、８０ｋＤａの糖タンパク質である。各サブユニットは、１個の遊離第二鉄イオン（Ｆｅ３＋）に結合することができるが故、Ｔｆは、結合した鉄の原子を最大２つ有し得る。鉄遊離形態にあるＴｆ、即ちアポＴｆは、血液中にて高効率でＦｅ３＋に結合し、Ｆｅ３＋を、ＴＦＲ１との相互作用により、内在化のために細胞表面まで輸送する。鉄輸入を制御する膜タンパク質として、ＴＦＲ１は、Ｆｅ３＋に結合したトランスフェリン（Ｔｆ）にナノモル親和性を示す、ＴＦＲファミリーのメンバーである。Ｔｆ－ＴＦＲ１の錯体は、クラスリンが媒介するエンドサイトーシスにより内在化し、ｐＨが５．５まで低下したときにＦｅ３＋はＴｆから解離する。このｐＨでは、アポＴｆ及びＴＦＲ１は依然として会合しており、生理的ｐＨで細胞表面までリサイクルされ、アポＴｆが放出される。
【0041】
トランスフェリン受容体による鉄の取り込みは、癌細胞が鉄を吸収するための重要な方法であるため、腫瘍の開始及び進行に関与したＴＦＲ１、及びその発現が、多くの癌において著しく調節不全に陥ったことが、蓄積した証拠により証明されている。ＴＦＲ１と癌の関係が明らかになっており、ＴＦＲ１が、癌に介入するための貴重な薬学的標的となっている。
【0042】
血液脳関門の内皮細胞で発現するＴＦＲ１を前臨床研究でもまた用いることで、抗体を含む巨大分子を脳に送達させることが可能となる。ＴＦＲ１標的抗体のいくつかは、鉄の取り込みに干渉することなく血液脳関門を通過することが示されている。
【0043】
ＴＦＲ１、Ｔｆの詳細、及びこれらの機能の詳細の説明は、例えば、Ｃａｎｄｅｌａｒｉａ，Ｐ．Ｖ．，ｅｔ ａｌ．“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ １（ＴｆＲ１） ａｓ ｄｉｒｅｃｔ ａｎｔｉ－ｃａｎｃｅｒ ａｇｅｎｔｓ．”Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １２（２０２１）：６０７６９２；及びＳｈｅｎ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ １ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ：ａ ｎｅｗ ｓｉｇｈｔ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ．”Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ８．６（２０１８）：９１６に見出すことができ、これらそれぞれは、その全体が参照により組み込まれている。
【0044】
ヒトゲノムでは、ＴＦＲ１遺伝子（遺伝子ＩＤ：７０３７）座位は、１９個のエクソン、即ち、エクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、エクソン６、エクソン７、エクソン８、エクソン９、エクソン１０、エクソン１１、エクソン１２、エクソン１３、エクソン１４、エクソン１５、エクソン１６、エクソン１７、エクソン１８、及びエクソン１９を有する（図１）。ＴＦＲ１タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端にかけて、細胞質領域、膜貫通領域、及び細胞外領域もまた有する。ヒトＴＦＲ１ ｍＲＮＡに対するヌクレオチド配列はＮＭ＿００３２３４．４であり、ヒトＴＦＲ１に対するアミノ酸配列はＮＰ＿００３２２５．２（配列番号２）である。ヒトＴＦＲ１ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列内での、各エクソン及び各領域の位置を以下に列挙する：
【0045】
【表1】
【0046】
ヒトＴＦＲ１遺伝子（遺伝子ＩＤ：７０３７）は、ヒトゲノムの染色体１６に位置し、これは、ＮＣ＿０００００３．１２の１９６０１８６９４～１９６０８２１２３１に位置する。転写物ＮＭ＿００３２３４．４に基づくと、５’ＵＴＲは、１９６０８２０４３～１９６０８２０９０、及び１９６０７７１００～１９６０７７１２２であり；エクソン１は１９６０８２０９０～１９６０８２０４３であり；第１のイントロンは１９６０８２０４２～１９６０７７１２３であり；エクソン２は１９６０７７１２２～１９６０７７０６４であり；第２のイントロンは１９６０７７０６３～１９６０７５３６１であり；エクソン３は１９６０７５３６０～１９６０７５１５９であり；第３のイントロンは１９６０７５１５８～１９６０７４１２６であり；エクソン４は１９６０７４１２５～１９６０７３９３０であり；第４のイントロンは１９６０７３９２９～１９６０７２１５３であり；エクソン５は１９６０７２１５２～１９６０７２００３であり；第５のイントロンは１９６０７２００２～１９６０７１４９９であり；エクソン６は１９６０７１４９８～１９６０７１３９６であり；第６のイントロンは１９６０７１３９５～１９６０６９５６９であり；エクソン７は１９６０６９５６８～１９６０６９４５５であり；第７のイントロンは１９６０６９４５４～１９６０６８１３１であり；エクソン８は１９６０６８１３０～１９６０６８０３２であり；第８のイントロンは１９６０６８０３１～１９６０６７６５８であり；エクソン９は１９６０６７６５７～１９６０６７５１８であり；第９のイントロンは１９６０６７５１７～１９６０６５６０１であり；エクソン１０は１９６０６５６００～１９６０６５４４３であり；第１０のイントロンは１９６０６５４４２～１９６０６４４２９であり；エクソン１１は１９６０６４４２８～１９６０６４３０９であり；第１１のイントロンは１９６０６４３０８～１９６０６２９４０であり；エクソン１２は１９６０６２９３９～１９６０６２８５４であり；第１２のイントロンは１９６０６２８５３～１９６０６２６４６であり；エクソン１３は１９６０６２６４５～１９６０６２５８２であり；第１３のイントロンは１９６０６２５８１～１９６０６０２４８であり；エクソン１４は１９６０６０２４７～１９６０６０１８０であり；第１４のイントロンは１９６０６０１７９～１９６０５８６３３であり；エクソン１５は１９６０５８６３２～１９６０５８５７４であり；第１５のイントロンは１９６０５８５７３～１９６０５８３６６であり；エクソン１６は１９６０５８３６５～１９６０５８２８４であり；第１６のイントロンは１９６０５８２８３～１９６０５５３０２であり；エクソン１７は１９６０５５３０１～１９６０５５０８０であり；第１７のイントロンは１９６０５５０７９～１９６０５３５５９であり；エクソン１８は１９６０５３５５８～１９６０５３４１８であり；第１８のイントロンは１９６０５３４１７～１９６０５２１８５であり；エクソン１９は１９６０５２１８４～１９６０４９２８４であり、及び３’ＵＴＲは１９６０４９２８４～１９６０５１９４１である。マウスＴＦＲ１座位に関連する全ての情報は、ＮＣＢＩウェブサイトの遺伝子ＩＤ：７０３７において見出すことができる。
【0047】
マウスにおいて、ＴＦＲ１遺伝子座位は、１９個のエクソン、即ち、エクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、エクソン６、エクソン７、エクソン８、エクソン９、エクソン１０、エクソン１１、エクソン１２、エクソン１３、エクソン１４、エクソン１５、エクソン１６、エクソン１７、エクソン１８、及びエクソン１９を有する（図１）。マウスＴＦＲ１タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端にかけて、細胞質領域、膜貫通領域、及び細胞外領域もまた有する。マウスＴＦＲ１ ｍＲＮＡに対するヌクレオチド配列はＮＭ＿０１１６３８．４であり、マウスＴＦＲ１に対するアミノ酸配列はＮＰ＿０３５７６８．１（配列番号１）である。マウスＴＦＲ１ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列内での、各エクソン及び各領域の位置を以下に列挙する：
【0048】
【表2】
【0049】
マウスＴＦＲ１遺伝子（遺伝子ＩＤ：２２０４２）は、マウスゲノムの染色体１６に位置し、これは、ＮＣ＿００００８２．７の３２４２７７１４～３２４５１６１２に位置する。転写物ＮＭ＿０１１６３８．４に基づくと、５’ＵＴＲは、３２４２７７３８～３２４２７８５４、及び３２４３１９８６～３２４３２００８であり；エクソン１は３２４２７７３８～３２４２７８５４であり；第１のイントロンは３２４２７８５５～３２４３１９８５であり；エクソン２は３２４３１９８６～３２４３２０４４であり；第２のイントロンは３２４３２０４５～３２４３３３８３であり；エクソン３は３２４３３３８４～３２４３３５８５であり；第３のイントロンは３２４３３５８６～３２４３４０１０であり；エクソン４は３２４３４０１１～３２４３４２１２であり；第４のイントロンは３２４３４２１３～３２４３５５６６であり；エクソン５は３２４３５５６７～３２４３５７１６であり；第５のイントロンは３２４３５７１７～３２４３５９１４であり；エクソン６は３２４３５９１５～３２４３６０１７であり；第６のイントロンは３２４３６０１８～３２４３７０３５であり；エクソン７は３２４３７０３６～３２４３７１４９であり；第７のイントロンは３２４３７１５０～３２４３７４５０であり；エクソン８は３２４３７４５１～３２４３７５４９であり；第８のイントロンは３２４３７５５０～３２４３７８５４であり；エクソン９は３２４３７８５５～３２４３７９９４であり；第９のイントロンは３２４３７９９５～３２４３９１８３であり；エクソン１０は３２４３９１８４～３２４３９３４１であり；第１０のイントロンは３２４３９３４２～３２４３９９９２であり；エクソン１１は３２４３９９９３～３２４４０１１５であり；第１１のイントロンは３２４４０１１６～３２４４１８７４であり；エクソン１２は３２４４１８７５～３２４４１９６０であり；第１２のイントロンは３２４４１９６１～３２４４２１８９であり；エクソン１３は３２４４２１９０～３２４４２２５３であり；第１３のイントロンは３２４４２２５４～３２４４３１８６であり；エクソン１４は３２４４３１８７～３２４４３２５４であり；第１４のイントロンは３２４４３２５５～３２４４３５８５であり；エクソン１５は３２４４３５８６～３２４４３６４４であり；第１５のイントロンは３２４４３６４５～３２４４３８０１であり；エクソン１６は３２４４３８０２～３２４４３８８３であり；第１６のイントロンは３２４４３８８４～３２４４５３６６であり；エクソン１７は３２４４５３６７～３２４４５５８８であり；第１７のイントロンは３２４４５５８９～３２４４７２９３であり；エクソン１８は３２４４７２９４～３２４４７４３４であり；第１８のイントロンは３２４４７４３５～３２４４８９１１であり；エクソン１９は３２４４８９１２～３２４５１６１２であり；及び３’ＵＴＲは３２４４９１５５～３２４５１６１２である。マウスＴＦＲ１座位に関連する全ての情報は、ＮＣＢＩウェブサイトの遺伝子ＩＤ：２２０４２において見出すことができ、このウェブサイトは、本明細書中にその全体が参照により組み込まれている。
【0050】
図９は、ヒトＴＦＲ１アミノ酸配列（ＮＰ＿００３２２５．２；配列番号２）と、マウスＴＦＲ１アミノ酸配列（ＮＰ＿０３５７６８．１；配列番号１）とのアラインメントを示す。したがって、ヒトとマウスのＴＦＲ１間の対応するアミノ酸残基又は領域は、図９に見出すことができる。
【0051】
他の種のＴＦＲ１遺伝子、タンパク質、及び座位もまた、当該技術分野において既知である。例えば、ドブネズミ（ラット）のＴＦＲ１の遺伝子ＩＤは６４６７８であり、イエネコ（ネコ）のＴＦＲ１の遺伝子ＩＤは４９３８８０であり、イエイヌ（イヌ）のＴＦＲ１の遺伝子ＩＤは４０３７０３であり、イノシシ（ブタ）のＴＦＲ１の遺伝子ＩＤは３９７０６２である。これらの遺伝子に関連する情報（例えば、これらのタンパク質のイントロン配列、エクソン配列、アミノ酸残基）は、例えば、ＮＣＢＩデータベースに見出すことができ、このデータベースは、本明細書中にその全体が参照により組み込まれている。図１０は、ヒトＴＦＲ１アミノ酸配列（ＮＰ＿００３２２５．２；配列番号２）と、ラットＴＦＲ１アミノ酸配列（ＮＰ＿０７３２０３．１；配列番号３１）とのアラインメントを示す。したがって、ヒトとげっ歯類のＴＦＲ１間の対応するアミノ酸残基又は領域は、図１０に見出すことができる。
【0052】
本開示は、ヒト又はキメラ（例えば、ヒト化）ＴＦＲ１ヌクレオチド配列及び／又はアミノ酸配列を提供する。いくつかの実施形態では、マウスのエクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、エクソン６、エクソン７、エクソン８、エクソン９、エクソン１０、エクソン１１、エクソン１２、エクソン１３、エクソン１４、エクソン１５、エクソン１６、エクソン１７、エクソン１８、エクソン１９、細胞質領域、膜貫通領域、及び／又は細胞外領域の配列全体が、対応するヒト配列により置き換えられる。いくつかの実施形態では、マウスのエクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、エクソン６、エクソン７、エクソン８、エクソン９、エクソン１０、エクソン１１、エクソン１２、エクソン１３、エクソン１４、エクソン１５、エクソン１６、エクソン１７、エクソン１８、エクソン１９、細胞質領域、膜貫通領域、及び／又は細胞外領域の「一領域」又は「一部」が、対応するヒト配列により置き換えられる。「一領域」又は「一部」という用語は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、若しくは２０００個のヌクレオチド、又は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６５０、６６０、若しくは６７０個のアミノ酸残基を意味することができる。いくつかの実施形態では、「一領域」又は「一部」は、エクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、エクソン６、エクソン７、エクソン８、エクソン９、エクソン１０、エクソン１１、エクソン１２、エクソン１３、エクソン１４、エクソン１５、エクソン１６、エクソン１７、エクソン１８、エクソン１９、細胞質領域、膜貫通領域、又は細胞外領域と、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％同一であることができる。いくつかの実施形態では、マウスのエクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、エクソン６、エクソン７、エクソン８、エクソン９、エクソン１０、エクソン１１、エクソン１２、エクソン１３、エクソン１４、エクソン１５、エクソン１６、エクソン１７、エクソン１８、及び／又はエクソン１９の一領域、一部、又は配列全体（例えば、エクソン４の一部、エクソン５～１８、及びエクソン１９の一部）は、ヒトのエクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、エクソン６、エクソン７、エクソン８、エクソン９、エクソン１０、エクソン１１、エクソン１２、エクソン１３、エクソン１４、エクソン１５、エクソン１６、エクソン１７、エクソン１８、及び／又はエクソン１９の一領域、一部、又は配列全体（例えば、エクソン４の一部、エクソン５～１８、及びエクソン１９の一部）により置き換えられる。
【0053】
いくつかの実施形態では、細胞質領域、膜貫通領域、細胞外領域、エクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、エクソン６、エクソン７、エクソン８、エクソン９、エクソン１０、エクソン１１、エクソン１２、エクソン１３、エクソン１４、エクソン１５、エクソン１６、エクソン１７、エクソン１８、及び／又はエクソン１９の「一領域」又は「一部」が欠失される。
【0054】
いくつかの実施形態では、本開示は、ゲノムが、キメラ（例えば、ヒト化）ＴＦＲ１ヌクレオチド配列を含む、遺伝子組換え非ヒト動物に関する。いくつかの実施形態では、キメラ（例えば、ヒト化）ＴＦＲ１ヌクレオチド配列は、細胞外領域を含むＴＦＲ１タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、本明細書に記載する細胞外領域は、配列番号２のアミノ酸８９～７６０と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％同一である。いくつかの実施形態では、細胞外領域は、ヒトＴＦＲ１細胞外領域の全体又は一部を含む。いくつかの実施形態では、動物のゲノムは、配列番号３、４、５、６、７、８、又は１０と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％同一である配列を含む。
【0055】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載する遺伝子組換え非ヒト動物は、ヒト又はヒト化ＴＦＲ１タンパク質をコードする配列を含む。いくつかの実施形態では、ＴＦＲ１タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端にかけて、細胞質領域、膜貫通領域、及び細胞外領域を含む。いくつかの実施形態では、ヒト化ＴＦＲ１タンパク質は、ヒト又はヒト化細胞質領域を含む。いくつかの実施形態では、ヒト化ＴＦＲ１タンパク質は、内因性細胞質領域を含む。いくつかの実施形態では、ヒト化ＴＦＲ１タンパク質は、ヒト又はヒト化膜貫通領域を含む。いくつかの実施形態では、ヒト化ＴＦＲ１タンパク質は、内因性膜貫通領域を含む。いくつかの実施形態では、ヒト化ＴＦＲ１タンパク質は、ヒト又はヒト化細胞外領域を含む。いくつかの実施形態では、ヒト化ＴＦＲ１タンパク質は、内因性細胞外領域を含む。
【0056】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載する遺伝子組換え非ヒト動物は、ヒト又はヒト化ＴＦＲ１遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ヒト化ＴＦＲ１遺伝子は１９個のエクソンを含む。いくつかの実施形態では、ヒト化ＴＦＲ１遺伝子は、内因性若しくはヒト化エクソン１、内因性若しくはヒト化エクソン２、内因性若しくはヒト化エクソン３、ヒト若しくはヒト化エクソン４、ヒト若しくはヒト化エクソン５、ヒト若しくはヒト化エクソン６、ヒト若しくはヒト化エクソン７、ヒト若しくはヒト化エクソン８、ヒト若しくはヒト化エクソン９、ヒト若しくはヒト化エクソン１０、ヒト若しくはヒト化エクソン１１、ヒト若しくはヒト化エクソン１２、ヒト若しくはヒト化エクソン１３、ヒト若しくはヒト化エクソン１４、ヒト若しくはヒト化エクソン１５、ヒト若しくはヒト化エクソン１６、ヒト若しくはヒト化エクソン１７、ヒト若しくはヒト化エクソン１８、及び／又は、ヒト若しくはヒト化エクソン１９を含む。いくつかの実施形態では、ヒト化ＴＦＲ１遺伝子は、内因性若しくはヒト化イントロン１、内因性若しくはヒト化イントロン２、ヒト若しくはヒト化イントロン３、ヒト若しくはヒト化イントロン４、ヒト若しくはヒト化イントロン５、ヒト若しくはヒト化イントロン６、ヒト若しくはヒト化イントロン７、ヒト若しくはヒト化イントロン８、ヒト若しくはヒト化イントロン９、ヒト若しくはヒト化イントロン１０、ヒト若しくはヒト化イントロン１１、ヒト若しくはヒト化イントロン１２、ヒト若しくはヒト化イントロン１３、ヒト若しくはヒト化イントロン１４、ヒト若しくはヒト化イントロン１５、ヒト若しくはヒト化イントロン１６、ヒト若しくはヒト化イントロン１７、及び／又は、ヒト若しくはヒト化イントロン１８を含む。いくつかの実施形態では、ヒト化ＴＦＲ１遺伝子は、ヒト又はヒト化５’ＵＴＲを含む。いくつかの実施形態では、ヒト化ＴＦＲ１遺伝子は、ヒト又はヒト化３’ＵＴＲを含む。いくつかの実施形態では、ヒト化ＴＦＲ１遺伝子は、内因性５’ＵＴＲを含む。いくつかの実施形態では、ヒト化ＴＦＲ１遺伝子は、内因性３’ＵＴＲを含む。
【0057】
したがって、いくつかの実施形態では、本開示は、キメラ（例えば、ヒト化）ＴＦＲ１ヌクレオチド配列及び／又はアミノ酸配列もまた提供し、いくつかの実施形態では、配列の少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％が、マウスＴＦＲ１ ｍＲＮＡ配列（例えば、ＮＭ＿０１１６３８．４）、マウスＴＦＲ１アミノ酸配列（例えば、配列番号１）、又は、これらの一部（例えば、エクソン１、エクソン２、エクソン３；エクソン４の一部、及びエクソン１９の一部）と同一であるか、又はこれに由来し、いくつかの実施形態では、配列の少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％が、ヒトＴＦＲ１ ｍＲＮＡ配列（例えば、ＮＭ＿００３２３４．４）、ヒトＴＦＲ１アミノ酸配列（例えば、配列番号２）、又はこれらの一部（例えば、エクソン４の一部；エクソン５～１８；及びエクソン１９の一部）と同一であるか、又はこれに由来する。
【0058】
いくつかの実施形態では、マウスＴＦＲ１（配列番号１）のアミノ酸８９～７６３をコードする配列が置き換えられる。いくつかの実施形態では、配列は、ヒトＴＦＲ１の対応する領域（例えば、ヒトＴＦＲ１（配列番号２）のアミノ酸８９～７６０）をコードする配列により置き換えられる。
【0059】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載する核酸は、プロモーター又は制御エレメント、例えば、内因性マウスＴＦＲ１プロモーター、誘導性プロモーター、エンハンサー、及び／又はマウス若しくはヒト制御エレメントに作動可能に連結される。
【0060】
いくつかの実施形態では、核酸配列は、マウスＴＦＲ１ヌクレオチド配列の一部又は全体（例えば、ＮＭ＿０１１６３８．４のエクソン４の一部；エクソン５～１８；及びエクソン１９の一部）と異なる、少なくとも一部（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００個のヌクレオチド、例えば連続又は非連続ヌクレオチド）を有する。
【0061】
いくつかの実施形態では、核酸配列は、マウスＴＦＲ１ヌクレオチド配列の一部又は全体（例えば、ＮＭ＿０１１６３８．４のエクソン１～３；エクソン４の一部；及びエクソン１９の一部）と同じ、少なくとも一部（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００個のヌクレオチド、例えば連続又は非連続ヌクレオチド）を有する。
【0062】
いくつかの実施形態では、核酸配列は、ヒトＴＦＲ１ヌクレオチド配列の一部又は全体（例えば、ＮＭ＿００３２３４．４のエクソン１、エクソン２、エクソン３；エクソン４の一部、及びエクソン１９の一部）と異なる、少なくとも一部（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００個のヌクレオチド、例えば連続又は非連続ヌクレオチド）を有する。
【0063】
いくつかの実施形態では、核酸配列は、ヒトＴＦＲ１ヌクレオチド配列の一部又は全体（例えば、ＮＭ＿００３２３４．４のエクソン４の一部；エクソン５～１８；及びエクソン１９の一部）と同じ、少なくとも一部（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００個のヌクレオチド、例えば連続又は非連続ヌクレオチド）を有する。
【0064】
いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、マウスＴＦＲ１アミノ酸配列の一部又は全体（例えば、ＮＰ＿０３５７６８．１（配列番号１）のアミノ酸８９～７６３）と異なる、少なくとも一部（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００個のアミノ酸残基、例えば連続又は非連続アミノ酸残基）を有する。
【0065】
いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、マウスＴＦＲ１アミノ酸配列の一部又は全体（例えば、ＮＰ＿０３５７６８．１（配列番号１）のアミノ酸１～８８）と同じ、少なくとも一部（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００個のアミノ酸残基、例えば連続又は非連続アミノ酸残基）を有する。
【0066】
いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、ヒトＴＦＲ１アミノ酸配列の一部又は全体（例えば、ＮＰ＿００３２２５．２（配列番号２）のアミノ酸１～８８）と異なる、少なくとも一部（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００個のアミノ酸残基、例えば連続又は非連続アミノ酸残基）を有する。
【0067】
いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、ヒトＴＦＲ１アミノ酸配列の一部又は全体（例えば、ＮＰ＿００３２２５．２（配列番号２）のアミノ酸８９～７６０）と同じ、少なくとも一部（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００個のアミノ酸残基、例えば連続又は非連続アミノ酸残基）を有する。
【0068】
本開示は、ヒト化ＴＦＲ１マウスアミノ酸配列であって、上記アミノ酸配列が、
ａ）配列番号１、２、又は９に示されるアミノ酸配列；
ｂ）配列番号１、２、又は９に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有する、又は少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列；
ｃ）核酸配列によりコードされるアミノ酸配列であって、上記核酸配列が、低ストリンジェンシー条件、又はストリクトなストリンジェンシー条件下で、配列番号１、２、又は９に示すアミノ酸をコードするヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができる、アミノ酸配列；
ｄ）配列番号１、２、又は９に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の相同性を有する、又は、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％同一であるアミノ酸配列；
ｅ）配列番号１、２、又は９に示すアミノ酸配列と、１０、９、８、７、６、５、４、３、２個以下、又は１個以下のアミノ酸が異なるアミノ酸配列；あるいは
ｆ）配列番号１、２、又は９に示すアミノ酸配列に対して、１つ以上のアミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入を含むアミノ酸配列
からなる群から選択される、アミノ酸配列もまた提供する。
ａ）配列番号１、２、又は９に示されるアミノ酸配列；
ｂ）配列番号１、２、又は９に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有する、又は少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列；
ｃ）核酸配列によりコードされるアミノ酸配列であって、上記核酸配列が、低ストリンジェンシー条件、又はストリクトなストリンジェンシー条件下で、配列番号１、２、又は９に示すアミノ酸をコードするヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができる、アミノ酸配列；
ｄ）配列番号１、２、又は９に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の相同性を有する、又は、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％同一であるアミノ酸配列；
ｅ）配列番号１、２、又は９に示すアミノ酸配列と、１０、９、８、７、６、５、４、３、２個以下、又は１個以下のアミノ酸が異なるアミノ酸配列；あるいは
ｆ）配列番号１、２、又は９に示すアミノ酸配列に対して、１つ以上のアミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入を含むアミノ酸配列
からなる群から選択される、アミノ酸配列もまた提供する。
【0069】
本開示は、ヒト化ＴＦＲ１アミノ酸配列であって、上記アミノ酸配列が、
ａ）配列番号２のアミノ酸８９～７６０の全体又は一部；
ｂ）配列番号２のアミノ酸８９～７６０と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の相同性を有するアミノ酸配列；
ｃ）配列番号２のアミノ酸８９～７６０と、１０、９、８、７、６、５、４、３、２個以下、又は１個以下のアミノ酸が異なるアミノ酸配列；及び
ｄ）配列番号２のアミノ酸８９～７６０に対して、１つ以上のアミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入を含むアミノ酸配列
からなる群から選択される、アミノ酸配列もまた提供する。
ａ）配列番号２のアミノ酸８９～７６０の全体又は一部；
ｂ）配列番号２のアミノ酸８９～７６０と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の相同性を有するアミノ酸配列；
ｃ）配列番号２のアミノ酸８９～７６０と、１０、９、８、７、６、５、４、３、２個以下、又は１個以下のアミノ酸が異なるアミノ酸配列；及び
ｄ）配列番号２のアミノ酸８９～７６０に対して、１つ以上のアミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入を含むアミノ酸配列
からなる群から選択される、アミノ酸配列もまた提供する。
【0070】
本開示は、ヒト化ＴＦＲ１アミノ酸配列であって、上記アミノ酸配列が、
ａ）配列番号１のアミノ酸１～８８の全体又は一部；
ｂ）配列番号１のアミノ酸１～８８と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の相同性を有するアミノ酸配列；
ｃ）配列番号１のアミノ酸１～８８と、１０、９、８、７、６、５、４、３、２個以下、又は１個以下のアミノ酸が異なるアミノ酸配列；及び
ｄ）配列番号１のアミノ酸１～８８に対して、１つ以上のアミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入を含むアミノ酸配列
からなる群から選択される、アミノ酸配列もまた提供する。
ａ）配列番号１のアミノ酸１～８８の全体又は一部；
ｂ）配列番号１のアミノ酸１～８８と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の相同性を有するアミノ酸配列；
ｃ）配列番号１のアミノ酸１～８８と、１０、９、８、７、６、５、４、３、２個以下、又は１個以下のアミノ酸が異なるアミノ酸配列；及び
ｄ）配列番号１のアミノ酸１～８８に対して、１つ以上のアミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入を含むアミノ酸配列
からなる群から選択される、アミノ酸配列もまた提供する。
【0071】
本開示は、ＴＦＲ１核酸（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）配列にもまた関し、核酸配列は、
ａ）配列番号３、４、５、６、７、若しくは８に示す核酸配列、又は、ヒト化マウスＴＦＲ１の相同ＴＦＲ１アミノ酸配列をコードする核酸配列；
ｂ）低ストリンジェンシー条件、又はストリクトなストリンジェンシー条件下で、配列番号３、４、５、６、７、又は８に示すヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができる核酸配列；
ｃ）配列番号３、４、５、６、７、又は８に示すヌクレオチド配列と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の相同性を有する、又は、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％同一である核酸配列；
ｄ）配列番号１、２、又は９に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有する、又は少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列、をコードする核酸配列；
ｅ）配列番号１、２、又は９に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の相同性を有する、又は、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％同一であるアミノ酸配列、をコードする核酸配列；
ｆ）配列番号１、２、又は９に示すアミノ酸配列と、１０、９、８、７、６、５、４、３、２個以下、又は１個以下のアミノ酸が異なるアミノ酸配列、をコードする核酸配列；及び／あるいは
ｇ）配列番号１、２、又は９に示すアミノ酸配列に対して、１つ以上のアミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入を含むアミノ酸配列、をコードする核酸配列
からなる群から選択することができる。
ａ）配列番号３、４、５、６、７、若しくは８に示す核酸配列、又は、ヒト化マウスＴＦＲ１の相同ＴＦＲ１アミノ酸配列をコードする核酸配列；
ｂ）低ストリンジェンシー条件、又はストリクトなストリンジェンシー条件下で、配列番号３、４、５、６、７、又は８に示すヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができる核酸配列；
ｃ）配列番号３、４、５、６、７、又は８に示すヌクレオチド配列と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の相同性を有する、又は、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％同一である核酸配列；
ｄ）配列番号１、２、又は９に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有する、又は少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列、をコードする核酸配列；
ｅ）配列番号１、２、又は９に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の相同性を有する、又は、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％同一であるアミノ酸配列、をコードする核酸配列；
ｆ）配列番号１、２、又は９に示すアミノ酸配列と、１０、９、８、７、６、５、４、３、２個以下、又は１個以下のアミノ酸が異なるアミノ酸配列、をコードする核酸配列；及び／あるいは
ｇ）配列番号１、２、又は９に示すアミノ酸配列に対して、１つ以上のアミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入を含むアミノ酸配列、をコードする核酸配列
からなる群から選択することができる。
【0072】
本開示はさらに、ヒト化マウスのＴＦＲ１ゲノムＤＮＡ配列に関する。ＤＮＡ配列は、その転写により得られる、配列番号５又は８に示す配列と相同なＤＮＡ配列と一致する、又は相補的なｍＲＮＡの逆転写により得られる。
【0073】
本開示は、配列番号１、２、又は９に示す配列と少なくとも９０％の相同性を有する、又は少なくとも９０％同一であり、タンパク質活性を有するアミノ酸配列もまた提供する。いくつかの実施形態では、配列番号１、２、又は１１に示す配列との相同性は、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は少なくとも９９％である。いくつかの実施形態では、前述の相同性は、少なくとも約６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、８０％、又は８５％である。
【0074】
いくつかの実施形態では、配列番号１、２、又は９に示す配列との同一性パーセントは、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は少なくとも９９％である。いくつかの実施形態では、前述の同一性パーセントは、少なくとも約６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、８０％、又は８５％である。
【0075】
本開示は、配列番号３、４、５、６、７、又は８に示す配列と少なくとも９０％の相同性を有し、又は少なくとも９０％同一であり、タンパク質活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列もまた提供する。いくつかの実施形態では、配列番号３、４、５、６、７、又は８に示す配列との相同性は、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は少なくとも９９％である。いくつかの実施形態では、前述の相同性は、少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、８０％、又は８５％である。
【0076】
いくつかの実施形態では、配列番号３、４、５、６、７、又は８に示す配列との同一性パーセントは、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は少なくとも９９％である。いくつかの実施形態では、前述の同一性パーセントは、少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、８０％、又は８５％である。
【0077】
本開示は、本明細書に記載する任意のヌクレオチド配列と、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一である核酸配列、及び、本明細書に記載する任意のアミノ酸配列と、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるアミノ酸配列もまた提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載する任意のペプチドをコードするヌクレオチド配列、又は、本明細書に記載する任意のヌクレオチド配列によりコードされる任意のアミノ酸配列に関する。いくつかの実施形態では、核酸配列は、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、５００、又は６００ヌクレオチド未満である。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、又は２００アミノ酸残基未満である。
【0078】
いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、（ｉ）アミノ酸配列を含み；又は、（ｉｉ）アミノ酸配列からなり、上記アミノ酸配列は、本明細書に記載する配列のいずれか１つである。
【0079】
いくつかの実施形態では、核酸配列は、（ｉ）核酸配列を含み；又は、（ｉｉ）核酸配列からなり、上記核酸配列は、本明細書に記載する配列のいずれか１つである。
【0080】
２つのアミノ酸配列、又は、２つの核酸配列の同一性パーセントを測定するために、最適に比較するために配列をアライメントする（例えば、比較するために、最適にアライメントするように第１及び第２のアミノ酸又は核酸配列の１つ又は両方にギャップを導入してもよく、非相同配列を無視してもよい）。続いて、対応するアミノ酸位置又はヌクレオチド位置にあるアミノ酸残基又はヌクレオチドを比較する。第１の配列の位置が第２の配列の対応する位置のアミノ酸残基又はヌクレオチドと同じものによって占められている場合、分子はその位置で同一である。２つの配列間の同一性パーセントは、２つの配列を最適にアライメントするために導入される必要のあるギャップの数及び各ギャップの長さを考慮して、配列に共有される同一の位置の数の関数である。例えば、２つの配列間の配列比較及び同一性パーセントの測定は、ギャップペナルティ１２、ギャップ伸長ペナルティ４、及び、フレームシフトギャップペナルティ５の、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２スコアリングマトリックスを用いて実施することができる。
【0081】
同様の物理化学的特性（相同性パーセント）が保存されている残基、例えば、ロイシン及びイソロイシンの割合もまた使用して、配列類似性を測定することができる。同様の物理化学的特性を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野において定義されている。 これらのファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖を有するアミノ酸（例えばトレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。多くの場合、相同性割合は、同一性割合よりも高くなる。
【0082】
本明細書に記載するヌクレオチド配列を含む細胞、組織、及び動物（例えば、マウス）、加えて、内因性非ヒトＴＦＲ１座位由来のヒト又はキメラ（例えば、ヒト化）ＴＦＲ１を発現する細胞、組織、及び動物（例えば、マウス）もまた、提供される。
【0083】
遺伝子組換え動物
本明細書で使用する場合、「遺伝子組換え非ヒト動物」という用語は、動物のゲノムの少なくとも１つの染色体内に外来性ＤＮＡを有する非ヒト動物を意味する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え非ヒト動物の、少なくとも１つ以上の細胞、例えば、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％の細胞は、外来性ＤＮＡをそのゲノムに有する。外来性ＤＮＡを有する細胞は、様々な細胞、例えば、内因性細胞、体細胞、免疫細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、抗原提示細胞、マクロファージ、樹状細胞、生殖細胞、胚盤胞、又は、内因性腫瘍細胞であることができる。いくつかの実施形態では、外来性配列（例えば、ヒト配列）、例えば、非ヒト配列の、１つ以上のヒト配列での置き換えを含む、組換え内因性ＴＦＲ１座位を含む遺伝子組換え非ヒト動物を提供する。動物は一般に、即ち、生殖細胞系伝達を通じて、子孫に組換えを伝えることができる。
本明細書で使用する場合、「遺伝子組換え非ヒト動物」という用語は、動物のゲノムの少なくとも１つの染色体内に外来性ＤＮＡを有する非ヒト動物を意味する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え非ヒト動物の、少なくとも１つ以上の細胞、例えば、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％の細胞は、外来性ＤＮＡをそのゲノムに有する。外来性ＤＮＡを有する細胞は、様々な細胞、例えば、内因性細胞、体細胞、免疫細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、抗原提示細胞、マクロファージ、樹状細胞、生殖細胞、胚盤胞、又は、内因性腫瘍細胞であることができる。いくつかの実施形態では、外来性配列（例えば、ヒト配列）、例えば、非ヒト配列の、１つ以上のヒト配列での置き換えを含む、組換え内因性ＴＦＲ１座位を含む遺伝子組換え非ヒト動物を提供する。動物は一般に、即ち、生殖細胞系伝達を通じて、子孫に組換えを伝えることができる。
【0084】
本明細書で使用する場合、「キメラ遺伝子」又は「キメラ核酸」という用語は、遺伝子又は核酸であって、上記遺伝子若しくは上記核酸の２つ以上の部分が異なる種に由来する、又は、上記遺伝子若しくは上記核酸の配列の少なくとも１つが、動物の野生型核酸に対応しない、上記遺伝子又は核酸を意味する。いくつかの実施形態では、キメラ遺伝子又はキメラ核酸は、２つ以上の異なる源に由来する配列、例えば、異なるタンパク質をコードする配列、又は、２つ以上の異なる種の同一（若しくは、相同）タンパク質をコードする配列の、少なくとも一部分を有する。いくつかの実施形態では、キメラ遺伝子又はキメラ核酸は、ヒト化遺伝子又はヒト化核酸である。
【0085】
本明細書で使用する場合、「キメラタンパク質」又は「キメラポリペプチド」という用語は、タンパク質又はタンパク質であって、上記タンパク質若しくは上記ポリペプチドの２つ以上の部分が異なる種に由来する、又は、上記タンパク質又は上記ポリペプチドの配列の少なくとも１つが、動物の野生型アミノ酸配列に対応しない、上記タンパク質又は上記ポリペプチドを意味する。いくつかの実施形態では、キメラタンパク質又はキメラポリペプチドは、２つ以上の異なる源に由来する配列の少なくとも一部分、例えば、異なる種の同一（又は、相同）タンパク質を有する。いくつかの実施形態では、キメラタンパク質又はキメラポリペプチドは、ヒト化タンパク質又はヒト化ポリペプチドである。
【0086】
本明細書で使用する場合、「ヒト化タンパク質」又は「ヒト化ポリペプチド」という用語は、タンパク質又はポリペプチドであって、上記タンパク質又は上記ポリペプチドの少なくとも一部分がヒトタンパク質又はヒトポリペプチドである、上記タンパク質又は上記ポリペプチドを意味する。いくつかの実施形態では、ヒト化タンパク質又はポリペプチドは、ヒトタンパク質又はポリペプチドである。
【0087】
本明細書で使用する場合、「ヒト化核酸」という用語は、核酸であって、上記核酸の少なくとも一部分がヒトに由来する、上記核酸を意味する。いくつかの実施形態では、ヒト化核酸の核酸全体がヒトに由来する。いくつかの実施形態では、ヒト化核酸はヒト化エクソンである。ヒト化エクソンは、例えば、ヒトエクソン又はキメラエクソンであり得る。
【0088】
いくつかの実施形態では、キメラ遺伝子又はキメラ核酸は、ヒト化ＴＦＲ１遺伝子又はヒト化ＴＦＲ１核酸である。いくつかの実施形態では、遺伝子又は核酸の少なくとも１つ以上の部分は、ヒトＴＦＲ１遺伝子に由来し、遺伝子又は核酸の少なくとも１つ以上の部分は、非ヒトＴＦＲ１遺伝子に由来する。いくつかの実施形態では、遺伝子又は核酸は、ＴＦＲ１タンパク質をコードする配列を含む。コードされるＴＦＲ１タンパク質は、機能的である、又は、例えば、トランスフェリンと相互作用する、エンドサイトーシスにより鉄の細胞取込みを制御する、及び、鉄ホメオスタシスを維持する、ヒトＴＦＲ１タンパク質若しくは非ヒトＴＦＲ１タンパク質の少なくとも１つの活性を有する。
【0089】
いくつかの実施形態では、キメラタンパク質又はキメラポリペプチドは、ヒト化ＴＦＲ１タンパク質又はヒト化ＴＦＲ１ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、タンパク質又はポリペプチドのアミノ酸配列の少なくとも１つ以上の部分は、ヒトＴＦＲ１タンパク質に由来し、タンパク質又はポリペプチドのアミノ酸配列の少なくとも１つ以上の部分は非ヒトＴＦＲ１タンパク質に由来する。ヒト化ＴＦＲ１タンパク質又はヒト化ＴＦＲ１ポリペプチドは、機能的である、又は、ヒトＴＦＲ１タンパク質若しくは非ヒトＴＦＲ１タンパク質の少なくとも１つの活性を有する。
【0090】
いくつかの実施形態では、細胞質領域はヒト又はヒト化である。いくつかの実施形態では、細胞質領域は内因性である。いくつかの実施形態では、膜貫通領域はヒトであるか、又はヒト化されている。いくつかの実施形態では、膜貫通領域は内因性である。いくつかの実施形態では、細胞外領域はヒトであるか、又はヒト化されている。いくつかの実施形態では、細胞外領域は内因性である。
【0091】
遺伝子組換え非ヒト動物は、様々な動物、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ウシ科の動物（例えば、ウシ、雄牛、バッファロー）、シカ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、ネコ、イヌ、フェレット、霊長類（例えば、マーモセット、アカゲザル）であることができる。好適な、遺伝子組換え可能な胚幹（ＥＳ）細胞が速やかに入手できない非ヒト動物に関しては、他の方法を用いて、遺伝子組換えされた非ヒト動物を作製する。このような方法としては、例えば、非ＥＳ細胞ゲノム（例えば、線維芽細胞又は人工多能性細胞）を組み換え、核移植を用いて組換えゲノムを好適な細胞、例えば卵母細胞に移すこと、及び、好適な条件下で、非ヒト動物にて組換え細胞（例えば、組換え卵母細胞）を妊娠させて胚を形成することが挙げられる。これらの方法は、当該技術分野において既知であり、例えば、Ａ．Ｎａｇｙ，ｅｔ ａｌ．，“Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ），”Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２００３に記載されており、本明細書中に、その全体が参照により組み込まれる。
【0092】
一態様では、動物は哺乳類、例えば、トビネズミ上科又はネズミ上科のスーパーファミリーである。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え動物はげっ歯類である。げっ歯類は、マウス、ラット、及びハムスターから選択することができる。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え動物は、カンガルーハムスター科（例えば、カンガルーハムスター）、キヌゲネズミ科（例えば、ハムスター、新世界ラット及びマウス、野ネズミ）、ネズミ科（トゥルーマウス及びラット、アレチネズミ、トゲマウス、クレステッドラット）、アシナガマウス科（クライミングマウス、ロックマウス、オジロネズミ、マラガシーラット及びマウス）、トゲヤマネ科（例えば、トゲヤマネ）、並びに、メクラネズミ類（例えば、モグラネズミ、タケネズミ、及びゾコール）から選択されるファミリーに由来する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えげっ歯類は、トゥルーマウス又はラット（ネズミ科族）、アレチネズミ、トゲマウス、及びクレステッドラットから選択される。いくつかの実施形態では、非ヒト動物はマウスである。
【0093】
いくつかの実施形態では、動物は、Ｃ５７ＢＬ／Ａ、Ｃ５７ＢＬ／Ａｎ、Ｃ５７ＢＬ／ＧｒＦａ、Ｃ５７ＢＬ／ＫａＬｗＮ、Ｃ５７ＢＬ／６、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃ５７ＢＬ／６ＢｙＪ、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪ、Ｃ５７ＢＬ／１０、Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ、Ｃ５７ＢＬ／１０Ｃｒ、及びＣ５７ＢＬ／Ｏｌａから選択されるＣ５７ＢＬ株のマウスである。いくつかの実施形態では、マウスは、１２９Ｐ１、１２９Ｐ２、１２９Ｐ３、１２９Ｘ１、１２９Ｓ１（例えば、１２９Ｓ１／ＳＶ、１２９Ｓ１／ＳｖＩｍ）、１２９Ｓ２、１２９Ｓ４、１２９Ｓ５、１２９Ｓ９／ＳｖＥｖＨ、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）、１２９Ｓ７、１２９Ｓ８、１２９Ｔ１、１２９Ｔ２である株からなる群から選択される１２９株である。これらのマウスは、例えば、Ｆｅｓｔｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｖｉｓｅｄ ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ｆｏｒ ｓｔｒａｉｎ １２９ ｍｉｃｅ，Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｇｅｎｏｍｅ １０：８３６（１９９９）；Ａｕｅｒｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ａｎｄ Ｃｈｉｍｅｒａ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ １２９／ＳｖＥｖ－ａｎｄ Ｃ５７ＢＬ／６－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ（２０００）に記載されており、これらは共に、その全体が、本明細書に参照により組み込まれている。いくつかの実施形態では、遺伝子組換えマウスは、１２９株とＣ５７ＢＬ／６株のミックスである。いくつかの実施形態では、マウスは、１２９株のミックス、又は、ＢＬ／６株のミックスである。いくつかの実施形態では、マウスはＢＡＬＢ株、例えば、ＢＡＬＢ／ｃ株である。いくつかの実施形態では、マウスは、ＢＡＬＢ株と別の株とのミックスである。いくつかの実施形態では、マウスは、ハイブリッド株（例えば、５０％のＢＡＬＢ／ｃ－５０％の１２９５４／Ｓｖ；又は、５０％のＣ５７ＢＬ／６－５０％の１２９）に由来する。いくつかの実施形態では、非ヒト動物はげっ歯類である。いくつかの実施形態では、非ヒト動物は、ＢＡＬＢ／ｃ、Ａ、Ａ／Ｈｅ、Ａ／Ｊ、Ａ／ＷｙＳＮ、ＡＫＲ、ＡＫＲ／Ａ、ＡＫＲ／Ｊ、ＡＫＲ／Ｎ、ＴＡ１、ＴＡ２、ＲＦ、ＳＷＲ、Ｃ３Ｈ、Ｃ５７ＢＲ、ＳＪＬ、Ｃ５７Ｌ、ＤＢＡ／２、ＫＭ、ＮＩＨ、ＩＣＲ、ＣＦＷ、ＦＡＣＡ、Ｃ５７ＢＬ／Ａ、Ｃ５７ＢＬ／Ａｎ、Ｃ５７ＢＬ／ＧｒＦａ、Ｃ５７ＢＬ／ＫａＬｗＮ、Ｃ５７ＢＬ／６、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃ５７ＢＬ／６ＢｙＪ、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪ、Ｃ５７ＢＬ／１０、Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ、Ｃ５７ＢＬ（Ｃ５７ＢＬ／１０Ｃｒ、及びＣ５７ＢＬ／Ｏｌａ）、Ｃ５８、ＣＢＡ／Ｂｒ、ＣＢＡ／Ｃａ、ＣＢＡ／Ｊ、ＣＢＡ／ｓｔ、又はＣＢＡ／Ｈバックグラウンドを有するマウスである。
【0094】
いくつかの実施形態では、動物はラットである。ラットは、ウィスターラット、ＬＥＡ株、Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ株、フィッシャー株、Ｆ３４４、Ｆ６、及びＤａｒｋ Ａｇｏｕｔｉから選択することができる。いくつかの実施形態では、ラット株は、ウィスター、ＬＥＡ、Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ、フィッシャー、Ｆ３４４、Ｆ６、及びＤａｒｋ Ａｇｏｕｔｉからなる群から選択される２つ以上の株のミックスである。
【0095】
動物は、ヒト化ＴＦＲ１動物が作製される特定目的に好適な、１つ以上の他の遺伝子組換え、及び／又は他の改変を有することができる。例えば、異種移植片（例えば、ヒトの癌又は腫瘍）を維持するのに好適なマウスは、非ヒト動物の免疫系の全体又は一部を不全にする、不活性化する、又は破壊する、１つ以上の組換えを有することができる。非ヒト動物の免疫系の不全、不活性化、又は破壊としては、例えば、化学的手段（例えば、毒素の投与）、物理的手段（例えば、動物への放射線照射）、及び／又は、遺伝子組換え（例えば、１つ以上の遺伝子のノックアウト）による、造血細胞及び／又は免疫細胞の破壊を挙げることができる。このようなマウスの非限定例としては、例えば、ＮＯＤマウス、ＳＣＩＤマウス、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス、ＩＬ２Ｒγノックアウトマウス、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γｃｎｕｌｌマウス（Ｉｔｏ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γｃｎｕｌｌ ｍｏｕｓｅ：ａｎ ｅｘｃｅｌｌｅｎｔ ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ，Ｂｌｏｏｄ １００（９）：３１７５－３１８２，２００２）、ヌードマウス、並びにＲａｇ１及び／又はＲａｇ２ノックアウトマウスが挙げられる。こちらのマウスを所望により放射線照射し、又は、別の方法で処理し、１つ以上の免疫細胞型を破壊することができる。したがって、様々な実施形態では、内因性非ヒトＴＦＲ１座位の少なくとも一部のヒト化を含むことができ、非ヒト動物の免疫系（又は、免疫系の１つ以上の細胞型）の全体又は一部を不全にする、不活性化する、又は破壊する組換えをさらに含む遺伝子組換えマウスを提供する。いくつかの実施形態では、組換えは、例えば、ＮＯＤマウス、ＳＣＩＤマウス、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス、ＩＬ－２Ｒγノックアウトマウス、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γｃｎｕｌｌマウス、ヌードマウス、Ｒａｇ１及び／又はＲａｇ２ノックアウトマウス、ＮＯＤ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ ＩＬ－２ｒγｎｕｌｌマウス、ＮＯＤ－Ｒａｇ１－／－－ＩＬ２ｒｇ－／－（ＮＲＧ）マウス、Ｒａｇ２－／－－ＩＬ２ｒｇ－／－（ＲＧ）マウス、及びこれらの組み合わせをもたらす組換えからなる群から選択される。これらの遺伝子組換え動物は、ＵＳ２０１５０１０６９６１に記載されており、当該明細書の全体が本明細書に参照により組み込まれている。いくつかの実施形態では、マウスは、成熟ＴＦＲ１コード配列の全体又は一部を、ヒト成熟ＴＦＲ１コード配列で置き換えることを含むことができる。
【0096】
遺伝子組換え非ヒト動物は、内因性非ヒトＴＦＲ１座位の組換えを含む。いくつかの実施形態では、組換えは、成熟ＴＦＲ１タンパク質の少なくとも一部分をコードする（例えば、成熟ＴＦＲ１タンパク質配列と少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である）ヒト核酸配列を含むことができる。本明細書に記載する組換えを含むことができる遺伝子組換え細胞（例えば、ＥＳ細胞、体細胞）もまた提供するが、多くの実施形態では、遺伝子組換え非ヒト動物は、動物の生殖細胞系における、内因性ＴＦＲ１座位の組換えを含む。
【0097】
遺伝子組換え動物は、内因性マウス座位からヒトＴＦＲ１及び／又はキメラ（例えば、ヒト化）ＴＦＲ１を発現することができ、内因性マウスＴＦＲ１遺伝子は、ヒトＴＦＲ１配列の一領域をコードするヒトＴＦＲ１遺伝子及び／若しくはヌクレオチド配列、又は、ヒトＴＦＲ１配列と少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％同一であるアミノ酸配列で置き換えられている。様々な実施形態では、成熟ＴＦＲ１タンパク質の少なくとも１つのタンパク質コード配列をコードするヒト核酸配列を含むように、内因性非ヒトＴＦＲ１座位の全体又は一部を組み換える。
【0098】
いくつかの実施形態では、遺伝子組換えマウスは、マウスプロモーター及び／又はマウス制御エレメントの制御下で、内因性座位からヒトＴＦＲ１及び／又はキメラＴＦＲ１（例えば、ヒト化ＴＦＲ１）を発現する。内因性マウス座位における置き換えにより、適切な細胞型で、かつ、当該技術分野において既知のいくつかの他のトランスジェニックマウスで観察される潜在的な病状をもたらさない方法で、ヒトＴＦＲ１又はキメラＴＦＲ１（例えば、ヒト化ＴＦＲ１）を発現する非ヒト動物がもたらされる。動物で発現するヒトＴＦＲ１又はキメラＴＦＲ１（例えば、ヒト化ＴＦＲ１）は、動物内で、野生型マウス又はヒトＴＦＲ１の１つ以上の機能を維持することができる。例えば、ヒト又は非ヒトＴＦＲ１リガンド（例えば、トランスフェリン）は、発現したＴＦＲ１に結合することができる。さらに、いくつかの実施形態では、動物は内因性ＴＦＲ１を発現しない。いくつかの実施形態では、動物は、野生型動物と比較して、低レベルの内因性ＴＦＲ１を発現する。本明細書で使用する場合、「内因性ＴＦＲ１」という用語は、任意の遺伝子組換えの前に、非ヒト動物（例えば、マウス）の内因性ＴＦＲ１ヌクレオチド配列から発現するＴＦＲ１タンパク質を意味する。
【0099】
動物のゲノムは、ヒトＴＦＲ１（ＮＰ＿００３２２５．２）（配列番号２）と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列をコードする配列を含むことができる。いくつかの実施形態では、ゲノムは、配列番号９と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列をコードする配列を含む。
【0100】
遺伝子組換え動物のゲノムは、内因性ＴＦＲ１遺伝子座位で、内因性ＴＦＲ１の領域をコードする配列を、ヒトＴＦＲ１の対応する領域をコードする配列で置き換えることを含むことができる。いくつかの実施形態では、置き換えられる配列は、内因性ＴＦＲ１遺伝子座位の中の任意の配列、例えば、エクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、エクソン６、エクソン７、エクソン８、エクソン９、エクソン１０、エクソン１１、エクソン１２、エクソン１３、エクソン１４、エクソン１５、エクソン１６、エクソン１７、エクソン１８、エクソン１９、５’－ＵＴＲ、３’－ＵＴＲ、イントロン１、イントロン２、イントロン３、イントロン４、イントロン５、イントロン６、イントロン７、イントロン８、イントロン９、イントロン１０、イントロン１１、イントロン１２、イントロン１３、イントロン１４、イントロン１５、イントロン１６、イントロン１７、イントロン１８などである。いくつかの実施形態では、置き換えられる配列は、内因性ＴＦＲ１遺伝子の調節領域内にある。いくつかの実施形態では、置き換えられる配列は、内因性マウスＴＦＲ１遺伝子座位の、エクソン４、エクソン５、エクソン６、エクソン７、エクソン８、エクソン９、エクソン１０、エクソン１１、エクソン１２、エクソン１３、エクソン１４、エクソン１５、エクソン１６、エクソン１７、エクソン１８、エクソン１９、又はその一部分である。
【0101】
遺伝子組換え動物は、Ｎ末端からＣ末端にかけて、細胞質領域、膜貫通領域、及び細胞外領域を有するヒト又はキメラＴＦＲ１（例えば、ヒト化ＴＦＲ１）を発現する、１つ以上の細胞を有することができる。いくつかの実施形態では、細胞外領域は、ヒトＴＦＲ１の細胞外領域と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、ヒト化ＴＦＲ１の細胞外領域は、ヒトＴＦＲ１と同一である、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６２０、６５０、６６０、６６５、６６６、６６７、６６８、６６９、６７０、６７１、又は６７２個のアミノ酸（例えば、連続又は非連続）を有する配列を有する。いくつかの実施形態では、ヒト化ＴＦＲ１の細胞外領域は、５～７６０個、又は１０～６７２個のアミノ酸（例えば、連続又は非連続）である配列を有する。多くの場合、ヒトＴＦＲ１と非ヒトＴＦＲ１（例えば、マウスＴＦＲ１）は異なるため、ヒトＴＦＲ１に結合する抗体は必ずしも、非ヒトＴＦＲ１と同じ結合親和性を有するわけでなく、又は、非ヒトＴＦＲ１に対して同じ効果を有するわけではない。したがって、ヒト又はヒト化細胞外領域を有する遺伝子組換え動物を使用して、動物モデルにおける、抗ヒトＴＦＲ１抗体の効果をよりよく評価することができる。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え動物のゲノムは、ヒトＴＦＲ１のエクソン４、エクソン５、エクソン６、エクソン７、エクソン８、エクソン９、エクソン１０、エクソン１１、エクソン１２、エクソン１３、エクソン１４、エクソン１５、エクソン１６、エクソン１７、エクソン１８、及び／若しくはエクソン１９の配列の一部若しくは全体、ヒトＴＦＲ１の細胞外領域の配列の一部若しくは全体、又は、配列番号２のアミノ酸８９～７６０の配列の一部若しくは全体に対応するアミノ酸配列をコードする配列を含む。
【0102】
いくつかの実施形態では、遺伝子組換え動物のゲノムは、ヒトＴＦＲ１遺伝子のエクソン４の一部；エクソン５～１８；及びエクソン１９の一部を含む。いくつかの実施形態では、エクソン４の一部は、少なくとも５０、７０、１００、１３０、１５０、１６０、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１８０、１９０、又は１９６ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、エクソン１９の一部は、少なくとも１００、２００、２２０、２３０、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２５０、２７０、３００、５００、７００、１０００、１３００、１５００、１７００、２０００、２２００、２５００、２７００、２９００、又は２９０１ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え動物のゲノムは、ヒトＴＦＲ１遺伝子配列の、約２０～６３４３０、約２０～２２１５８、約２０～５２２４、又は約２０～２０１６個のヌクレオチド（連続又は非連続ヌクレオチド）を含む。
【0103】
いくつかの実施形態では、非ヒト動物は、内因性ＴＦＲ１遺伝子座位において、キメラヒト／非ヒトＴＦＲ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有することができ、キメラヒト／非ヒトＴＦＲ１ポリペプチドのヒト部分は、ヒトＴＦＲ１細胞外ドメインの一部を含み、動物は、動物の細胞表面で機能性ＴＦＲ１を発現する。キメラヒト／非ヒトＴＦＲ１ポリペプチドのヒト部分は、ヒトＴＦＲ１のエクソン４の一部；エクソン５～１８；及び／又はエクソン１９の一部によりコードされるアミノ酸配列を含むことができる。いくつかの実施形態では、キメラヒト／非ヒトＴＦＲ１ポリペプチドのヒト部分は、配列番号２のアミノ酸８９～７６０と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％同一である配列を含むことができる。いくつかの実施形態では、細胞質領域は、配列番号１のアミノ酸１～６５の全体又は一部に対応する配列を含む。いくつかの実施形態では、膜貫通領域は、配列番号１のアミノ酸６６～８８の全体又は一部に対応する配列を含む。
【0104】
いくつかの実施形態では、キメラヒト／非ヒトＴＦＲ１ポリペプチドの非ヒト部分は、内因性非ヒトＴＦＲ１ポリペプチドの膜貫通及び／又は細胞質領域を含む。
【0105】
さらに、遺伝子組換え動物は、内因性ＴＦＲ１座位における置き換えに関してヘテロ接合性であることができる、又は、内因性ＴＦＲ１座位における置き換えに関してホモ接合性であることができる。
【0106】
いくつかの実施形態では、ヒト化ＴＦＲ１座位は、ヒトＴＦＲ１ ５’－ＵＴＲを欠いている。いくつかの実施形態では、ヒト化ＴＦＲ１座位は、内因性（例えば、マウス）５’－ＵＴＲを含む。いくつかの実施形態では、ヒト化は、内因性（例えば、マウス）３’－ＵＴＲを含む。適切な場合、マウス及びヒトＴＦＲ１遺伝子は、その５’隣接配列の類似性に基づくと、同様に制御されるようであると推定することが合理的であり得る。本開示に示すように、マウスの制御エレメントを保持しながら、ＴＦＲ１コード配列のヒト化を含む、内因性マウスＴＦＲ１座位における置き換えを含むヒト化ＴＦＲ１マウスは、病状を示さない。ヒト化ＴＦＲ１に対してヘテロ接合性又はホモ接合性である遺伝子組換えマウスは共に、全体的に正常である。
【0107】
本開示はさらに、上述の方法により生成される非ヒト哺乳動物に関する。いくつかの実施形態では、そのゲノムはヒト遺伝子を含有する。
【0108】
いくつかの実施形態では、非ヒト哺乳動物はげっ歯類であり、好ましくは、非ヒト哺乳動物はマウスである。
【0109】
いくつかの実施形態では、非ヒト哺乳動物は、ヒト化ＴＦＲ１遺伝子によりコードされるタンパク質を発現する。
【0110】
さらに、本開示は、腫瘍を有する非ヒト哺乳動物モデルにもまた関し、上記非ヒト哺乳動物モデルが、本明細書に記載の方法により得られることを特徴とする。いくつかの実施形態では、非ヒト哺乳動物はげっ歯類（例えば、マウス）である。
【0111】
本開示はさらに、非ヒト哺乳動物若しくはその子孫、又は、腫瘍を有する非ヒト哺乳動物に由来する細胞若しくは細胞株、又はその初代細胞培養物；非ヒト哺乳動物若しくはその子孫、又は、腫瘍を有する非ヒト哺乳動物に由来する組織、器官、又はその培養物；及び、非ヒト哺乳動物又はその子孫が腫瘍を有する場合、当該非ヒト哺乳動物又はその子孫、又は、腫瘍を有する非ヒト哺乳動物に由来する腫瘍組織に関する。
【0112】
本開示は、本明細書に記載の方法のいずれかにより作製される非ヒト哺乳動物もまた提供する。いくつかの実施形態では、非ヒト哺乳動物を提供し、遺伝子組換え動物は、動物のゲノム内に、ヒト又はヒト化ＴＦＲ１をコードするＤＮＡを含有する。
【0113】
いくつかの実施形態では、非ヒト哺乳動物は、本明細書に記載する遺伝子構築物（例えば、図２、３、及び５に示す遺伝子構築物）を含む。いくつかの実施形態では、ヒト又はヒト化ＴＦＲ１を発現する非ヒト哺乳動物を提供する。いくつかの実施形態では、ヒト又はヒト化ＴＦＲ１タンパク質の組織特異的発現を提供する。
【0114】
いくつかの実施形態では、特異的なインデューサー又はレプレッサー基質を添加することで、遺伝子組換え動物における、ヒト又はヒト化ＴＦＲ１の発現が制御可能である。いくつかの実施形態では、特異的なインデューサーは、Ｔｅｔ－Ｏｆｆ Ｓｙｓｔｅｍ／Ｔｅｔ－Ｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ、又はＴａｍｏｘｉｆｅｎ Ｓｙｓｔｅｍから選択される。
【0115】
非ヒト哺乳動物は、当該技術分野において既知の任意の非ヒト動物であることができ、これを、本明細書に記載する方法で使用することができる。好ましい非ヒト哺乳動物は哺乳類（例えば、げっ歯類）である。いくつかの実施形態では、非ヒト哺乳動物はマウスである。
【0116】
上述の非ヒト哺乳動物の遺伝、分子、及び挙動分析を実施することができる。本開示は、同一又は他の遺伝子型と交配された、本開示で提供される非ヒト哺乳動物により産生される子孫にもまた関する。
【0117】
本開示は、非ヒト哺乳動物又はその子孫に由来する、細胞株又は初代細胞培養物もまた提供する。細胞培養に基づくモデルは、例えば、以下の方法により調製することができる。細胞培養物は、非ヒト哺乳動物からの単離によって入手することができ、あるいは、細胞は、同じ構築物、及び標準的な細胞トランスフェクション技術を用いて確立された細胞培養物から入手することができる。ヒトＴＦＲ１タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含有する遺伝子構築物の組込みは、様々な方法で検出することができる。
【0118】
（逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）又はサザンブロッティング、及びｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを用いる、ｍＲＮＡ定量化アプローチを含む）核酸レベルでの方法、並びに、（組織化学、イムノブロット分析、及びインビトロ結合研究を含む）タンパク質レベルでの方法を含む、外来性ＤＮＡを検出するために使用可能な多くの分析法が存在する。さらに、対象となる遺伝子の発現レベルを、当業者に周知のＥＬＩＳＡ技術により定量化することができる。多くの標準的な分析法を用いて定量的測定を完了することができる。例えば、ＲＮａｓｅ保護、サザンブロット分析、ＲＮＡドット分析（ＲＮＡｄｏｔ分析）を含む、ＲＴ－ＰＣＲ及びハイブリダイゼーション法を用いて、転写レベルを測定することができる。免疫組織化学染色、フローサイトメトリー、ウェスタンブロット分析もまた用いて、ヒト又はヒト化ＴＦＲ１タンパク質の存在を評価することができる。
【0119】
ベクター
本開示は、ａ）１００～１０，０００ヌクレオチドの長さのＴＦＲ１遺伝子ゲノムＤＮＡから選択される、改変可能な領域の５’末端（５’アーム）に相同なＤＮＡ断片；ｂ）ドナー領域をコードする所望の／ドナーＤＮＡ配列；及び、ｃ）１００～１０，０００ヌクレオチドの長さのＴＦＲ１遺伝子ゲノムＤＮＡから選択される、改変可能な領域の３’末端（３’アーム）に相同な第２のＤＮＡ断片を含む標的化ベクターに関する。
本開示は、ａ）１００～１０，０００ヌクレオチドの長さのＴＦＲ１遺伝子ゲノムＤＮＡから選択される、改変可能な領域の５’末端（５’アーム）に相同なＤＮＡ断片；ｂ）ドナー領域をコードする所望の／ドナーＤＮＡ配列；及び、ｃ）１００～１０，０００ヌクレオチドの長さのＴＦＲ１遺伝子ゲノムＤＮＡから選択される、改変可能な領域の３’末端（３’アーム）に相同な第２のＤＮＡ断片を含む標的化ベクターに関する。
【0120】
いくつかの実施形態では、ａ）改変可能な保存領域の５’末端（５’アーム）に相同なＤＮＡ断片は、ＮＣＢＩ受託番号ＮＣ＿００００８２．７と少なくとも９０％の相同性を有するヌクレオチド配列から選択され；ｃ）改変可能な領域の３’末端（３’アーム）に相同なＤＮＡ断片は、ＮＣＢＩ受託番号ＮＣ＿００００８２．７と少なくとも９０％の相同性を有するヌクレオチド配列から選択される。
【0121】
いくつかの実施形態では、ａ）改変可能な領域の５’末端（５’アーム）に相同なＤＮＡ断片は、ＮＣＢＩ受託番号ＮＣ＿００００８２．７の位置３２４２９７９４～位置３２４３４０３６のヌクレオチドから選択され；ｃ）改変可能な領域の３’末端（３’アーム）に相同なＤＮＡ断片は、ＮＣＢＩ受託番号ＮＣ＿００００８２．７の位置３２４４９１５５～位置３２４５３４４５のヌクレオチドから選択される。
【0122】
いくつかの実施形態では、標的化ベクター内の、選択されるゲノムヌクレオチド配列の長さは、約３ｋｂ、約４ｋｂ、約５ｋｂ、約６ｋｂ、約７ｋｂ、約８ｋｂ、約９ｋｂ、約１０ｋｂ、約１５ｋｂ、約２０ｋｂ、約２１ｋｂ、約２２ｋｂ、約２３ｋｂ、約２４ｋｂ、又は約２５ｋｂ超であることができる。
【0123】
いくつかの実施形態では、改変可能な領域は、ＴＦＲ１遺伝子のエクソン４、エクソン５、エクソン６、エクソン７、エクソン８、エクソン９、エクソン１０、エクソン１１、エクソン１２、エクソン１３、エクソン１４、エクソン１５、エクソン１６、エクソン１７、エクソン１８、及び／又はエクソン１９（例えば、マウスＴＦＲ１遺伝子のエクソン４の一部；エクソン５～１８；及びエクソン１９の一部）である。
【0124】
標的化ベクターは、１つ以上の選択可能なマーカー、例えば、ポジティブ又はネガティブ選択可能なマーカーをさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、ポジティブ選択可能なマーカーは、Ｎｅｏ遺伝子又はＮｅｏカセットである。いくつかの実施形態では、ネガティブ選択可能なマーカーは、ＤＴＡ遺伝子である。
【0125】
いくつかの実施形態では、５’アームの配列を配列番号３に示し、３’アームの配列を配列番号４に示す。
【0126】
いくつかの実施形態では、配列は、ヒト（例えば、ＮＣ＿０００００３．１２の１９６０５１９４２～１９６０７４０９９）に由来する。例えば、標的化ベクターの標的領域は、ヒトＴＦＲ１のヌクレオチド配列の一部又は全体、好ましくは、ヒトＴＦＲ１のエクソン４、エクソン５、エクソン６、エクソン７、エクソン８、エクソン９、エクソン１０、エクソン１１、エクソン１２、エクソン１３、エクソン１４、エクソン１５、エクソン１６、エクソン１７、エクソン１８、及び／又はエクソン１９である。いくつかの実施形態では、ヒト化ＴＦＲ１のヌクレオチド配列は、ＮＣＢＩ受託番号ＮＰ＿００３２２５．２（配列番号２）のヒトＴＦＲ１タンパク質の、全体又は一部をコードする。
【0127】
本開示は、上述の標的化ベクターを含む細胞にもまた関する。
【0128】
加えて、本開示はさらに、前述の標的化ベクターのいずれか１つ、及び、本明細書に記載する構築物の、１つ以上のインビトロ転写物を有する、非ヒト哺乳動物細胞に関する。いくつかの実施形態では、細胞は、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ、又は、そのインビトロ転写物を含む。
【0129】
いくつかの実施形態では、細胞内の遺伝子はヘテロ接合性である。いくつかの実施形態では、細胞内の遺伝子はホモ接合性である。
【0130】
いくつかの実施形態では、非ヒト哺乳動物細胞はマウス細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は受精卵細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は胚幹細胞である。
【0131】
遺伝子組換え動物の作製方法
遺伝子組換え動物は、例えば、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）、相同組換え（ＨＲ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮｓ）、転写活性化様エフェクターベースのヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、及び、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列反復（ＣＲＩＳＰＲ）－Ｃａｓシステムを含む、当該技術分野において既知のいくつかの技術により作製することができる。いくつかの実施形態では、相同組換えを用いる。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ゲノム編集を用いて遺伝子組換え動物を生成する。これらのゲノム編集技術の多くは当該技術分野において既知であり、例えば、Ｙｉｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｆｏｒ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ，”Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ １６．６（２０１７）：３８７－３９９に記載されており、当該刊行物はその全体が参照により組み込まれている。多くの他の方法もまた提供し、これらを、ゲノム編集、例えば、遺伝子組換え核の、除核した卵母細胞へのマイクロインジェクション、及び、除核した卵母細胞の、別の遺伝子組換え細胞との融合で用いることができる。
遺伝子組換え動物は、例えば、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）、相同組換え（ＨＲ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮｓ）、転写活性化様エフェクターベースのヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、及び、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列反復（ＣＲＩＳＰＲ）－Ｃａｓシステムを含む、当該技術分野において既知のいくつかの技術により作製することができる。いくつかの実施形態では、相同組換えを用いる。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ゲノム編集を用いて遺伝子組換え動物を生成する。これらのゲノム編集技術の多くは当該技術分野において既知であり、例えば、Ｙｉｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｆｏｒ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ，”Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ １６．６（２０１７）：３８７－３９９に記載されており、当該刊行物はその全体が参照により組み込まれている。多くの他の方法もまた提供し、これらを、ゲノム編集、例えば、遺伝子組換え核の、除核した卵母細胞へのマイクロインジェクション、及び、除核した卵母細胞の、別の遺伝子組換え細胞との融合で用いることができる。
【0132】
したがって、いくつかの実施形態では、本開示は、動物の少なくとも１つの細胞内の、内因性ＴＦＲ１遺伝子座位において、内因性ＴＦＲ１の領域をコードする配列を、ヒト又はキメラＴＦＲ１の対応する領域をコードする配列で置き換えることを提供する。いくつかの実施形態では、置換えは、生殖細胞、体細胞、胚盤胞、又は線維芽細胞などで生じる。体細胞又は線維芽細胞の核は、除核した卵母細胞に挿入することができる。
【0133】
図３は、マウスＴＦＲ１座位のヒト化方法を示す。図３において、標的方法には、５’末端相同アーム、ヒトＴＦＲ１遺伝子断片、及び３’相同アームを含むベクターが関与する。プロセスには、相同組換えにより、内因性ＴＦＲ１配列をヒト配列で置き換えることを伴うことができる。いくつかの実施形態では、（例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、又はＣＲＩＳＰＲにより）標的部位の上流及び下流において切断を行うことで、ＤＮＡ二本鎖の破壊をもたらすことができ、相同組換えを用いて、内因性ＴＦＲ１配列をヒトＴＦＲ１配列で置き換えることができる。
【0134】
したがって、いくつかの実施形態では、遺伝子組換えヒト化動物の作製方法は、内因性ＴＦＲ１座位（又は部位）において、内因性ＴＦＲ１の領域をコードする配列をコードする核酸を、ヒトＴＦＲ１の対応する領域をコードする配列で置き換えるステップを含むことができる。配列は、ヒトＴＦＲ１遺伝子のエクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、エクソン６、エクソン７、エクソン８、エクソン９、エクソン１０、エクソン１１、エクソン１２、エクソン１３、エクソン１４、エクソン１５、エクソン１６、エクソン１７、エクソン１８、及び／又はエクソン１９の一領域（例えば、領域の一部又は全体）を含むことができる。いくつかの実施形態では、配列は、ヒトＴＦＲ１遺伝子のエクソン４の一部；エクソン５～１８；及びエクソン１９の一部（例えば、ＮＭ＿００３２３４．４の核酸５４８～２５６６）を含む。いくつかの実施形態では、領域は、ＴＦＲ１の細胞外領域の中（例えば、配列番号２のアミノ酸８９～７６０；又は、配列番号１のアミノ酸８９～７６３）に位置する。いくつかの実施形態では、内因性ＴＦＲ１座位は、マウスＴＦＲ１のエクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、エクソン６、エクソン７、エクソン８、エクソン９、エクソン１０、エクソン１１、エクソン１２、エクソン１３、エクソン１４、エクソン１５、エクソン１６、エクソン１７、エクソン１８、及び／又はエクソン１９である。いくつかの実施形態では、配列は、マウスＴＦＲ１遺伝子のエクソン４の一部；エクソン５～１８；及びエクソン１９の一部（例えば、ＮＭ＿０１１６３８．４の核酸４２９～２４５６）を含む。
【0135】
いくつかの実施形態では、マウスのＴＦＲ１座位を改変してキメラヒト／マウスＴＦＲ１ペプチドを発現させる方法は、内因性マウスＴＦＲ１座位において、マウスＴＦＲ１をコードするヌクレオチド配列を、ヒトＴＦＲ１をコードするヌクレオチド配列で置き換えることにより、キメラヒト／マウスＴＦＲ１をコードする配列を生成するステップを含むことができる。
【0136】
いくつかの実施形態では、キメラヒト／マウスＴＦＲ１をコードするヌクレオチド配列は、マウスＴＦＲ１の細胞質領域及び膜貫通領域をコードする第１のヌクレオチド配列；並びに、ヒトＴＦＲ１の細胞外領域をコードする第２のヌクレオチド配列を含むことができる。
【0137】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載するヌクレオチド配列は、互いに重なり合わない（例えば、第１のヌクレオチド配列と第２のヌクレオチド配列は重なり合わない）。いくつかの実施形態では、本明細書に記載するアミノ酸配列は互いに重なり合わない。
【0138】
本開示は、
（ａ）本明細書に記載の方法に基づき、細胞（例えば、受精卵細胞）を提供するステップと、
（ｂ）液体培地内で細胞を培養するステップと、
（ｃ）培養した細胞を、レシピエントのメス非ヒト哺乳動物の卵管又は子宮に移植し、メス非ヒト哺乳動物の子宮で細胞を成長させるステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）における妊娠したメスの、子孫の遺伝子組換えヒト化非ヒト哺乳動物において生殖細胞系伝達を同定するステップと、
を伴う、ＴＦＲ１遺伝子ヒト化動物モデルの確立方法をさらに提供する。
（ａ）本明細書に記載の方法に基づき、細胞（例えば、受精卵細胞）を提供するステップと、
（ｂ）液体培地内で細胞を培養するステップと、
（ｃ）培養した細胞を、レシピエントのメス非ヒト哺乳動物の卵管又は子宮に移植し、メス非ヒト哺乳動物の子宮で細胞を成長させるステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）における妊娠したメスの、子孫の遺伝子組換えヒト化非ヒト哺乳動物において生殖細胞系伝達を同定するステップと、
を伴う、ＴＦＲ１遺伝子ヒト化動物モデルの確立方法をさらに提供する。
【0139】
いくつかの実施形態では、前述の方法における非ヒト哺乳動物はマウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６マウス）である。
【0140】
いくつかの実施形態では、ステップ（ｃ）における非ヒト哺乳動物は、偽妊娠（又は想像妊娠）したメスである。
【0141】
いくつかの実施形態では、上述の方法のための受精卵は、Ｃ５７ＢＬ／６受精卵である。本明細書に記載する方法で用いることができる他の受精卵としては、ＦＶＢ／Ｎ受精卵、ＢＡＬＢ／ｃ受精卵、ＤＢＡ／１受精卵、及びＤＢＡ／２受精卵が挙げられるが、これらに限定されない。
【0142】
受精卵は、任意の非ヒト動物、例えば、本明細書に記載する任意の非ヒト動物に由来することができる。いくつかの実施形態では、受精卵細胞はげっ歯類に由来する。遺伝子構築物を、ＤＮＡのマイクロインジェクションにより受精卵に導入することができる。例えば、マイクロインジェクション後に受精卵を培養することで、培養受精卵を偽妊娠非ヒト動物に移し、この後非ヒト哺乳動物が生まれることで、上述の方法で言及した非ヒト哺乳動物を生成することができる。
【0143】
いくつかの実施形態では、遺伝子組換え動物の作製方法は、例えば、非ヒト動物のＴＦＲ１遺伝子の内因性制御エレメントの直後に、ヒト又はヒト化ＴＦＲ１タンパク質をコードするヌクレオチド配列（例えば、ｃＤＮＡ配列）を挿入することにより、非ヒト動物のＴＦＲ１遺伝子のコードフレームを改変することを含む。例えば、非ヒト動物のＴＦＲ１遺伝子の１つ以上の機能性領域配列をノックアウトし、又は、これに配列を挿入し、非ヒト動物が内因性ＴＦＲ１タンパク質を発現することができない、又は、低レベルの内因性ＴＦＲ１タンパク質を発現するようにすることができる。いくつかの実施形態では、改変された非ヒト動物のＴＦＲ１遺伝子のコーディングフレームは、非ヒト動物のＴＦＲ１遺伝子のエクソン１からエクソン１９のヌクレオチド配列の、全体又は一部であることができる。
【0144】
いくつかの実施形態では、遺伝子組換え動物の作製方法は、非ヒト動物のＴＦＲ１遺伝子の内因性制御エレメントの後に、ヒト若しくはヒト化ＴＦＲ１タンパク質をコードするヌクレオチド配列、及び／又は補助配列を挿入することを含む。いくつかの実施形態では、補助配列は、ＴＦＲ１遺伝子ヒト化動物モデルが、ヒト又はヒト化ＴＦＲ１タンパク質をインビボで発現することができるが、非ヒト動物のＴＦＲ１タンパク質を発現しないようにする終止コドンであることができる。いくつかの実施形態では、補助配列は、ＷＰＲＥ（ＷＨＰ転写後応答エレメント）、及び／又はポリＡを含む。
【0145】
遺伝子組換え動物の使用方法
内因性非ヒト座位において、内因性プロモーター及び／又は制御エレメントの制御下で、非ヒト動物のヒト遺伝子を、相同又はオーソロガスヒト遺伝子又はヒト配列で置き換えることにより、通常のノックアウト＋導入遺伝子動物とは実質的に異なり得る品質及び特徴を備える非ヒト動物をもたらすことができる。通常のノックアウト＋導入遺伝子動物において、内因性座位は取り除かれ、又は損傷を受け、完全ヒト導入遺伝子が動物のゲノムに挿入され、恐らく、ランダムにゲノムに組み込まれる。通常、組み込まれる導入遺伝子の位置は未知である；ヒトタンパク質の発現は、ヒト遺伝子及び／又はタンパク質アッセイ及び／又は機能アッセイの転写により測定される。上流及び／又は下流ヒト配列をヒト導入遺伝子に含めることで、導入遺伝子の発現及び／又は制御を適切に支えることが十分にもたらされることは、明らかに推定される。
内因性非ヒト座位において、内因性プロモーター及び／又は制御エレメントの制御下で、非ヒト動物のヒト遺伝子を、相同又はオーソロガスヒト遺伝子又はヒト配列で置き換えることにより、通常のノックアウト＋導入遺伝子動物とは実質的に異なり得る品質及び特徴を備える非ヒト動物をもたらすことができる。通常のノックアウト＋導入遺伝子動物において、内因性座位は取り除かれ、又は損傷を受け、完全ヒト導入遺伝子が動物のゲノムに挿入され、恐らく、ランダムにゲノムに組み込まれる。通常、組み込まれる導入遺伝子の位置は未知である；ヒトタンパク質の発現は、ヒト遺伝子及び／又はタンパク質アッセイ及び／又は機能アッセイの転写により測定される。上流及び／又は下流ヒト配列をヒト導入遺伝子に含めることで、導入遺伝子の発現及び／又は制御を適切に支えることが十分にもたらされることは、明らかに推定される。
【0146】
場合によっては、ヒト制御エレメント含む導入遺伝子は、反生理的に、又は別の点で不十分に発現し、実際、動物にとって有害であり得る。本開示は、内因性制御エレメントの制御下で、内因性座位においてヒト配列で置き換えることによって、ヒト化動物の生理機能の文脈において、置き換えられた遺伝子の生理機能が有用かつ適切である、有用なヒト化動物をもたらす、生理学的に適切な発現パターン及びレベルがもたらされることを開示する。
【0147】
例えば、生理学的に適切な方法で、ヒト又はヒト化ＴＦＲ１タンパク質を発現する遺伝子組換え動物は、ヒト疾患及び障害に対する治療薬の開発、並びに、動物モデルにおけるこれらのヒト治療薬の毒性及び／又は有効性の評価を含むが、これらに限定されない、様々な用途をもたらす。
【0148】
様々な態様では、ＴＦＲ１とＴＦＲ１リガンド（例えば、トランスフェリン）との相互作用、又は、ＴＦＲ１と抗ヒトＴＦＲ１抗体との相互作用を低下させる、又は遮断することができ、剤が免疫反応を増加させる若しくは低下させることができるか否かを試験し、及び／又は、剤がＴＦＲ１アゴニスト若しくはアンタゴニストであるか否かを測定する試験剤に対して有用な、ヒト又はヒト化ＴＦＲ１を発現する、遺伝子組換え動物を提供する。遺伝子組換え動物は、例えば、疾患が遺伝により誘発される（ノックイン又はノックアウト）、例えば、ヒト疾患の動物モデルであることができる。様々な実施形態では、遺伝子組換え非ヒト動物は、免疫系の不全、例えば、ヒト異種移植片、例えば、ヒト充実性腫瘍又は血液細胞腫瘍（例えば、白血病、リンパ腫、若しくは、Ｂ若しくはＴ細胞腫瘍）を持続させる、又は維持するように遺伝子組み換えされた非ヒト動物をさらに含む。いくつかの実施形態では、抗ＴＦＲ１抗体は、ＴＦＲ１関連シグナル伝達経路を遮断又は阻害する。
【0149】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載する抗ＴＦＲ１抗体は、ＴＦＲ１とトランスフェリンとの相互作用を遮断することで、例えば、エンドサイトーシスによる鉄の輸入を阻害することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載する抗ＴＦＲ１抗体は、ＴＦＲ１と、γアミノ酪酸関連タンパク質（ＧＡＢＡＲＡＰ）、又は、ヒトホメオスタシス鉄調節タンパク質（ＨＦＥ）との相互作用を遮断することができる。
【0150】
いくつかの実施形態では、癌の治療に対する抗ＴＦＲ１抗体の有効性を測定するために、遺伝子組換え動物を用いることができる。本方法は、抗ＴＦＲ１抗体（例えば、抗ヒトＴＦＲ１抗体）を、本明細書に記載する動物に投与することであって、上記動物が腫瘍を有する、上記投与することと、抗ＴＦＲ１抗体の、腫瘍に対する阻害効果を測定することと、を伴う。測定可能な阻害効果としては、例えば、腫瘍サイズ又は腫瘍体積の減少、腫瘍増殖の低減、被験体における、（例えば、治療前の同一被験体、又は、このような治療を伴わない別の被験体における、腫瘍体積の増加率と比較しての）腫瘍体積の増加率の低下、転移の進行リスク又は１つ以上のさらなる転移の進行リスクの低下、生残率の増加、及び、平均余命の増大などを挙げることができる。被験体での腫瘍体積は、例えば、直接測定、ＭＲＩ、又はＣＴにより測定される、様々な方法により測定することができる。さらに、ＴＦＲ１は、多くの他の細胞でもまた発現するため、これらの抗体には繊細なバランスが必要とされる。したがって、内因性ＴＦＲ１と比較して、ほぼ同じ方法でヒト化ＴＦＲ１が機能することで、ヒト化動物での結果を用いて、ヒトにおけるこれらの治療剤の有効性又は毒性を予測することが重要である。いくつかの実施形態では、例えば、補体媒介細胞傷害（ＣＭＣ）、又は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導して、癌細胞を殺傷することにより、ＴＦＲ１を発現するがん細胞に対して、抗ＴＦＲ１抗体を直接標的とすることができる。
【0151】
いくつかの実施形態では、腫瘍は、動物に注射される１つ以上の癌細胞（例えば、ヒト又はマウス癌細胞）を含む。いくつかの実施形態では、抗ＴＦＲ１抗体は、トランスフェリンがＴＦＲ１に結合するのを妨げる。いくつかの実施形態では、抗ＴＦＲ１抗体は、トランスフェリンがＴＦＲ１に結合するのを妨げない。
【0152】
いくつかの実施形態では、遺伝子組換え動物を用いて、抗ＴＦＲ１抗体がＴＦＲ１アゴニスト又はアンタゴニストであるか否かを測定することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載する方法を設計して、ＴＦＲ１での剤（例えば、抗ＴＦＲ１抗体）の効果、例えば、剤が、免疫細胞を刺激する、若しくは免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、若しくはＮＫ細胞）を阻害することができるか否か、剤が、サイトカインの産生を増加又は減少させることができるか否か、剤が、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、若しくはＮＫ細胞）を活性若しくは不活性化することができるか否か、剤が血液脳関門を通過することができるか否か；剤が免疫反応を上方制御する、若しくは免疫反応を下方制御することができるか否か、及び／又は、剤が、補体媒介細胞傷害（ＣＭＣ）若しくは抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導することができるか否か、もまた測定する。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え動物は、被験体における疾患、例えば癌を治療するための治療剤の有効用量を測定するために使用することができる。
【0153】
腫瘍における阻害効果は、当該技術分野において既知の方法、例えば、動物における腫瘍体積を測定すること、及び／又は、腫瘍（体積）阻害割合（ＴＧＩＴＶ）を測定することによってもまた測定することができる。腫瘍増殖阻害割合は、ＴＧＩＴＶ（％）＝（１－ＴＶｔ／ＴＶｃ）×１００［式中、ＴＶｔ及びＴＶｃは、治療群及び対照群における平均腫瘍体積（又は重量）である］を用いて計算することができる。
【0154】
いくつかの実施形態では、抗ＴＦＲ１抗体は、様々な癌を治療するために設計される。本明細書で使用する場合、「癌」という用語は、自律増殖能を有する細胞、即ち、急速に増殖する細胞増殖を特徴とする異常な状況又は状態を意味する。この用語は、組織変化の種類又は侵襲性のステージに関係なく、あらゆる種類の癌性増殖又は発癌性プロセス、転移性組織又は悪性形質転換細胞、組織、又は器官を含むことを意味する。本明細書で使用する場合、「腫瘍」という用語は、癌性細胞、例えば、癌性細胞の塊を意味する。本明細書に記載の方法を用いて治療又は診断可能な癌としては、肺、胸、甲状腺、リンパ系、胃腸、及び尿生殖器に影響を与えるなどの、様々な器官系の悪性腫瘍、加えて、大部分の大腸癌、腎細胞癌、前立腺癌及び／又は精巣腫瘍、肺の非小細胞癌、小腸癌、並びに食道癌などの悪性腫瘍を含む腺癌が挙げられる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載する剤は、被験体における癌腫を治療又は診断するために設計される。「癌腫」という用語は当該技術分野において認知されており、呼吸器系癌、消化器系癌、泌尿生殖器系癌、精巣癌、乳癌、前立腺癌、内分泌系癌、及び黒色腫を含む、上皮又は内分泌腺組織の悪性腫瘍を意味する。いくつかの実施形態では、癌は腎癌又は黒色腫である。例示的な癌腫としては、子宮頸、肺、前立腺、胸、頭頸、結腸、及び卵巣の組織から形成される癌腫が挙げられる。この用語は、例えば、癌性及び肉腫性組織で構成される悪性腫瘍を含む癌肉腫もまた含む。「腺癌」とは、腺組織に由来する癌腫、又は、腫瘍細胞が認識可能な腺構造を形成する癌腫を意味する。「肉腫」という用語は当該技術分野において認知されており、間葉由来の悪性腫瘍を意味する。
【0155】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載する癌は、リンパ腫、非小細胞肺癌、子宮頸癌、白血病、卵巣癌、鼻咽頭癌、乳癌、子宮体癌、大腸癌、直腸癌、胃癌、膀胱癌、膠腫、肺癌、気管支癌、骨肉腫、前立腺癌、膵癌、肝及び胆管癌、食道癌、腎臓癌、甲状腺癌、頭頸癌、精巣癌、グリア芽腫、星状膠細胞腫、黒色腫、骨髄異常増殖症候群、並びに肉腫である。いくつかの実施形態では、白血病は、急性リンパ性（リンパ芽球性）白血病、急性骨髄性白血病、骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、多発性骨髄腫、形質細胞性白血病、及び慢性骨髄性白血病から選択される。いくつかの実施形態では、リンパ腫は、Ｂ細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、及びワルデンストレームマクログロブリン血症を含む、ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫から選択される。いくつかの実施形態では、肉腫は、骨肉腫、ユーイング肉腫、平滑筋肉腫、滑膜肉腫、軟部組織肉腫、血管肉腫、脂肪肉腫、線維肉腫、横紋筋肉腫、及び軟骨肉腫からなる群から選択される。特定の実施形態では、腫瘍は、乳癌、卵巣癌、子宮体癌、黒色腫、腎臓癌、肺癌、又は肝癌である。
【0156】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載する癌は、固形癌（例えば、食道扁平上皮癌、乳癌、卵巣癌、肺癌、子宮頸癌、膀胱癌、骨肉腫、膵癌、胆管癌、腎細胞癌、肝細胞癌、副腎皮質癌）、神経系の癌、又は、造血性悪性腫瘍（例えば、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、若しくは非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ））である。
【0157】
いくつかの実施形態では、ＴＦＲ１抗体は、脳腫瘍、乳癌、大腸癌、肝癌、卵巣癌、肺癌、骨肉腫、白血病、及び／又はリンパ腫を治療するために設計される。
【0158】
いくつかの実施形態では、抗ＴＦＲ１抗体は、関節リウマチ、クローン病、全身性エリテマトーデス、強直性脊椎炎、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、潰瘍性大腸炎、又は強皮症を含む様々な自己免疫疾患を治療するために設計される。いくつかの実施形態では、抗ＴＦＲ１抗体は、アレルギー、喘息、及び／又はアトピー性皮膚炎を含む、様々な免疫不全を治療するために設計される。したがって、本明細書に記載する方法を用いて、免疫反応の阻害における、抗ＴＦＲ１抗体の有効性を測定することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載する免疫不全は、アレルギー、喘息、心筋炎、腎炎、肝炎、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、強皮症、甲状腺機能亢進症、特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫性溶血性貧血、潰瘍性大腸炎、自己免疫性肝疾患、糖尿病、疼痛、及び／又は神経障害などである。
【0159】
いくつかの実施形態では、抗ＴＦＲ１抗体は、様々な骨疾患、例えば、骨折、骨の変質、関節炎、骨の変形、骨粗鬆症、及び／又は、大腿骨頭の壊死を治療するために設計される。いくつかの実施形態では、抗ＴＦＲ１抗体は、様々な神経変性疾患、例えば、脳虚血、脳損傷若しくは癲癇、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、及び／又は脊髄小脳失調症を治療するために設計される。
【0160】
本開示は、抗体（例えば、抗ＴＦＲ１抗体）の毒性を測定する方法もまた提供する。本方法は、抗体を、本明細書に記載する動物に投与することを伴う。次に、当該動物の体重変化、赤血球数、ヘマトクリット、及び／又はヘモグロビンを評価する。いくつかの実施形態では、抗体は、赤血球（ＲＢＣ）、ヘマトクリット、又はヘモグロビンを、２０％、３０％、４０％、又は５０％を超えて低下させることができる。いくつかの実施形態では、動物は、対照群の体重（例えば、抗体で治療されていない動物の平均体重）より、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、又は４０％を超えて下回る体重を有することができる。
【0161】
いくつかの実施形態では、疾患又は状態を治療するための抗ＴＦＲ１抗体の有効性を測定するために、本明細書に記載する遺伝子組換え動物を使用することができる。いくつかの実施形態では、疾患又は状態は、鉄摂取、又は鉄関連代謝と関連している。本方法は、抗ＴＦＲ１抗体（例えば、抗ヒトＴＦＲ１抗体）を、本明細書に記載する動物に投与することと、疾患又は状態における抗ＴＦＲ１抗体の効果を測定することとを伴うことができる。
【0162】
いくつかの実施形態では、治療剤が血液脳関門を通過する送達効率を測定するために、本明細書に記載する遺伝子組換え動物を使用することができる。本方法は、治療剤（例えば、抗ＴＦＲ１抗体若しくはその抗原結合断片；又は抗ＴＦＲ１二重特異性若しくは多重特異性抗体若しくはその抗原結合断片を含む）を動物に投与することと、動物の脳及び／又は血清における、経時的な治療剤の濃度（例えば、薬物動態）を測定することとを伴うことができる。いくつかの実施形態では、治療剤は、抗ＴＦＲ１抗体又はその抗原結合断片を含む。いくつかの実施形態では、剤は、抗ＴＦＲ１抗体又はその抗原結合断片（例えば、抗ＴＦＲ１抗体のＣ末端）に結合する。いくつかの実施形態では、抗ＴＦＲ１二重特異性又は多重特異性抗体又はその抗原結合断片は、第２の抗原もまた標的にすることができる。いくつかの実施形態では、第２の抗原は、アルツハイマー病で示唆されるタンパク質（例えば、ＢＡＣＥ１又はアミロイドβ）である。
【0163】
いくつかの実施形態では、治療剤が中枢神経系での疾患を治療する有効性を測定するために、本明細書に記載する遺伝子組換え動物を使用することができる。本方法は、治療剤（例えば、抗ＴＦＲ１抗体若しくはその抗原結合断片；又は抗ＴＦＲ１二重特異性若しくは多重特異性抗体若しくはその抗原結合断片を含む）を動物に投与することと、疾患における剤の効果を測定することと、を伴うことができる。
【0164】
いくつかの実施形態では、投与時、抗ＴＦＲ１抗体の濃度（例えば、本明細書に記載する単一特異的、二重特異的、又は多重特異的抗ＴＦＲ１抗体又はその抗原結合断片のいずれか）は、動物の脳内の対照抗体（例えば、ヒトＩｇＧ）の濃度よりも、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも１００％高い。いくつかの実施形態では、投与時、抗ＴＦＲ１抗体の濃度（例えば、本明細書に記載する単一特異的、二重特異的、又は多重特異的抗ＴＦＲ１抗体又はその抗原結合断片のいずれか）は、動物の血清中の対照抗体（例えば、ヒトＩｇＧ）の濃度の、９５％未満、９０％未満、８５％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満、５０％未満、４５％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、又は２０％未満である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載する治療剤（例えば、本明細書に記載する単一特異的、二重特異的、又は多重特異的抗ＴＦＲ１抗体又はその抗原結合断片のいずれか）の濃度は、少なくとも５時間、少なくとも１０時間、少なくとも１５時間、少なくとも２０時間、又は少なくとも２５時間にわたって測定される。特定の時点（例えば、投与の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０時間後）において、脳内での抗体濃度の、血清中での抗体濃度に対する比率を計算することができる。場合によっては、比率は、本明細書に記載する治療剤（例えば、本明細書に記載する単一特異的、二重特異的、又は多重特異的抗ＴＦＲ１抗体又はその抗原結合断片のいずれか）に対して、少なくとも０．５、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、又は少なくとも２０である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載する治療剤に対する比率は、対照抗体（例えば、ヒトＩｇＧ）に対する比率と比較して、少なくとも５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、又は１００倍である。
【0165】
本開示は、ヒト細胞の免疫付与プロセスと関連する生成物の開発、ヒト抗体の製造、又は、薬理学、免疫学、微生物学、及び医学における研究用モデルシステムにおける、本明細書に記載する方法により生成される動物モデルの使用にもまた関する。
【0166】
いくつかの実施形態では、本開示は、ヒト細胞を伴う免疫付与プロセスの動物実験疾患モデルの製造及び利用、病原体の研究、又は、新しい診断方法及び／若しくは治療方法の開発における、本明細書に記載する方法により生成される動物モデルの使用を提供する。
【0167】
本開示は、ＴＦＲ１遺伝子機能、ヒトＴＦＲ１抗体、ヒトＴＦＲ１標的部位用の薬剤；ヒトＴＦＲ１標的部位に対する薬剤又は有効性；免疫関連疾患用薬剤及び抗腫瘍薬剤のスクリーニング、認証、評価、又は研究における、本明細書に記載する方法により生成される動物モデルの使用にもまた関する。
【0168】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＴＣＲ－Ｔ、ＣＡＲ－Ｔ、及び／又は、他の免疫療法（例えば、Ｔ細胞養子移植療法）のインビボ有効性を検証する方法を提供する。例えば、方法は、ヒト腫瘍細胞を本明細書に記載する動物に移植することと、ヒトＣＡＲ－Ｔを、ヒト腫瘍細胞を有する動物に適用することとを含む。ＣＡＲ－Ｔ療法の有効性を測定及び評価することができる。いくつかの実施形態では、動物は、本明細書に記載の方法により調製されるＴＦＲ１遺伝子ヒト化非ヒト動物、本明細書に記載するＴＦＲ１遺伝子ヒト化非ヒト動物、本明細書に記載の方法により生成される二重又は多重ヒト化非ヒト動物（若しくはその子孫）、ヒト若しくはヒト化ＴＦＲ１タンパク質を発現する非ヒト動物、又は、本明細書に記載する腫瘍を有する動物モデル若しくは炎症性動物モデルから選択される。いくつかの実施形態では、ＴＣＲ－Ｔ、ＣＡＲ－Ｔ、及び／又は他の免疫療法は、本明細書に記載するＴＦＲ１関連疾患を治療することができる。いくつかの実施形態では、ＴＣＡ－Ｔ、ＣＡＲ－Ｔ、及び／又は他の免疫療法は、本明細書に記載するＴＦＲ１関連疾患を治療するための調査方法を提供する。
【0169】
２つ以上のヒト又はキメラ遺伝子を有する遺伝子組換え動物モデル
本開示はさらに、２つ以上のヒト又はキメラ遺伝子を有する遺伝子組換え動物モデルの生成方法に関する。動物は、ヒト又はキメラＴＦＲ１遺伝子、及び、追加のヒト又はキメラタンパク質をコードする配列を含むことができる。
本開示はさらに、２つ以上のヒト又はキメラ遺伝子を有する遺伝子組換え動物モデルの生成方法に関する。動物は、ヒト又はキメラＴＦＲ１遺伝子、及び、追加のヒト又はキメラタンパク質をコードする配列を含むことができる。
【0170】
いくつかの実施形態では、追加のヒト又はキメラタンパク質は、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）、プログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）、細胞毒性Ｔ－リンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー４（ＯＸ４０）、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）、Ｔ細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン含有３（ＴＩＭ－３）、又はＣＤ７３であることができる。
【0171】
２つ以上のヒト又はキメラ遺伝子（例えば、ヒト化遺伝子）を含む遺伝子組換え動物モデルの生成方法は、
（ａ）本明細書に記載するヒトＴＦＲ１遺伝子又はキメラＴＦＲ１遺伝子を導入する方法を用いて、遺伝子組換え非ヒト動物を入手するステップと、
（ｂ）遺伝子組換え非ヒト動物を別の遺伝子組換え非ヒト動物と交配させた後、子孫を配列決定して、２つ以上のヒト又はキメラ遺伝子を有する遺伝子組換え非ヒト動物を得るステップと、
を含むことができる。
（ａ）本明細書に記載するヒトＴＦＲ１遺伝子又はキメラＴＦＲ１遺伝子を導入する方法を用いて、遺伝子組換え非ヒト動物を入手するステップと、
（ｂ）遺伝子組換え非ヒト動物を別の遺伝子組換え非ヒト動物と交配させた後、子孫を配列決定して、２つ以上のヒト又はキメラ遺伝子を有する遺伝子組換え非ヒト動物を得るステップと、
を含むことができる。
【0172】
いくつかの実施形態では、方法のステップ（ｂ）において、遺伝子組換え動物を、ヒト又はキメラＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＯＸ４０、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ３、又はＣＤ７３を有する遺伝子組換え非ヒト動物と交配させることができる。これらの遺伝子組換え非ヒト動物のいくつかは、例えば、それぞれの全体が本明細書に参照により組み込まれている、ＰＣＴ／ＣＮ２０１８／１１００６９、ＰＣＴ／ＣＮ２０１７／０９０３２０、ＰＣＴ／ＣＮ２０１７／０９９５７４、ＰＣＴ／ＣＮ２０１７／０９９５７７、ＰＣＴ／ＣＮ２０１７／０９９５７５、ＰＣＴ／ＣＮ２０１７／１１０４３５、ＰＣＴ／ＣＮ２０１９／１２７０８４、ＰＣＴ／ＣＮ２０１７／１１０４９４、及びＰＣＴ／ＣＮ２０１９／１１９７９３に記載されている。
【0173】
いくつかの実施形態では、ＴＦＲ１ヒト化は、ヒト又はキメラＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＯＸ４０、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ３、又はＣＤ７３遺伝子を有する遺伝子組換え動物において直接行われる。
【0174】
これらのタンパク質は異なるメカニズムを有し得るため、これらのそのタンパク質の２つ以上を標的にする併用療法が、より効果的な治療であり得る。実際、関連する多くの臨床試験が進行中であり、良好な効果を示している。これらのタンパク質の２つ以上を標的にする併用療法の有効性、例えば、抗ＴＦＲ１抗体と、癌治療用の追加の治療剤との有効性を測定するために、２つ以上のヒト又はヒト化遺伝子を有する遺伝子組換え動物モデルを使用することができる。本方法は、抗ＴＦＲ１抗体及び追加の治療剤を動物に投与することであって、動物が腫瘍を有する、上記投与することと、腫瘍に対する併用治療の阻害効果を測定することとを含む。いくつかの実施形態では、追加の治療剤は、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＯＸ４０、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ３、又はＣＤ７３に特異的に結合する抗体である。いくつかの実施形態では、追加の治療剤は、抗ＣＴＬＡ４抗体（例えば、イピリムマブ）、抗ＰＤ－１抗体（例えば、ニボルマブ）、又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体である。
【0175】
いくつかの実施形態では、動物は、ヒト若しくはヒト化ＰＤ－１をコードする配列、ヒト若しくはヒト化ＰＤ－Ｌ１をコードする配列、又は、ヒト若しくはヒト化ＣＴＬＡ－４をコードする配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、追加の治療剤は、抗ＰＤ－１抗体（例えば、ニボルマブ、ペムブロリズマブ）、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、又は抗ＣＴＬＡ－４抗体である。いくつかの実施形態では、腫瘍は、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＰＤ－Ｌ１、及び／又はＰＤ－Ｌ２を発現する１つ以上の腫瘍細胞を含む。
【0176】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載する様々な癌、例えば、黒色腫、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、膀胱癌、前立腺癌（例えば、転移性ホルモン不応性前立腺癌）、進行性乳癌、進行性卵巣癌、及び／又は、進行性不応性充実性腫瘍を治療するために、併用治療が設計される。いくつかの実施形態では、転移性充実性腫瘍、ＮＳＣＬＣ、黒色腫、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫、結腸直腸癌、及び多発性骨髄腫を治療するために、併用治療が設計される。いくつかの実施形態では、黒色腫、癌腫（例えば、膵臓癌）、中皮腫、血液悪性腫瘍（例えば、非ホジキンリンパ腫、リンパ腫、慢性リンパ性白血病）、又は充実性腫瘍（例えば、進行性充実性腫瘍）を治療するために、併用治療が設計される。いくつかの実施形態では、乳癌、大腸癌、子宮頸癌、線維肉腫、肝癌、肺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、黒色腫、卵巣癌、腎癌、皮膚癌、形質細胞腫、リンパ腫、及び／又は白血病を治療するために、併用治療が設計される。
【0177】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法を使用して、いくつかの他の方法との併用治療を評価することができる。単独で、又は、本明細書に記載する方法と組み合わせて使用可能な癌の治療方法としては、例えば、化学療法、例えば、カンプトテシン、ドキソルビシン、シスプラチン、カルボプラチン、プロカルバジン、メクロレタミン、シクロホスファミド、アドリアマイシン、イホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、ニトロソウレア、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン、マイトマイシン、エトポシド、ベランピル、ポドフィロトキシン、タモキシフェン、タキソール、ｔｒａｎｓ白金、５－フルオロウラシル、ビンクリスチン、ビンブラスチン、及び／又はメトトレキサートによる被験体の治療が挙げられる。あるいは、またはさらに、方法は、被験体で手術を行い、癌の少なくとも一部分を除去すること、例えば、患者から、腫瘍の一部又は全てを除去することを含むことができる。
【実施例】
【0178】
実施例
本発明を以下の実施例でさらに説明し、これらは、特許請求の範囲に記載する本発明の範囲を限定するものではない。
本発明を以下の実施例でさらに説明し、これらは、特許請求の範囲に記載する本発明の範囲を限定するものではない。
【0179】
材料及び方法
以下の材料を、以下の実施例で用いた。
以下の材料を、以下の実施例で用いた。
【0180】
ＤｒａＩＩＩ、ＥｃｏＲＶ、及びＡｓｅＩ制限酵素を、ＮＥＢから購入した（カタログ番号：それぞれ、Ｒ３５１０Ｖ、Ｒ３１９５Ｖ、及びＲ０１０１Ｍ）。
【0181】
Ｃ５７ＢＬ／６マウス及びＦｌｐトランスジェニックマウスは、中国食品及び薬剤研究機関国立げっ歯類実験動物センターから購入した。
【0182】
精製抗マウスＣＤ１６／３２抗体は、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄから購入した（カタログ番号：１０１３０２）。
【0183】
Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ５１０ＴＭ抗マウスＣＤ４５抗体は、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄから購入した（カタログ番号：１０３１３８）。
【0184】
ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５抗マウスＴＣＲβ抗体は、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄから購入した（カタログ番号：１０９２２８）。
【0185】
ＦＩＴＣ抗マウスＣＤ１９抗体は、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄから購入した（カタログ番号：１１５５０６）。
【0186】
Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ６０５ＴＭ抗マウスＴＥＲ－１１９／赤血球細胞抗体は、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄから購入した（カタログ番号：１１６２３９）。
【0187】
ＰＥ抗マウスＣＤ４３抗体は、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄから購入した（カタログ番号：１４３２０５）。
【0188】
ＡＰＣ抗ヒトＣＤ４３抗体は、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄから購入した（カタログ番号：３４３２０５）。
【0189】
ＡＰＣ抗ヒトＣＤ７１抗体は、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄから購入した（カタログ番号：３３４１０７）。
【0190】
Ｚｏｍｂｉｅ ＮＩＲＴＭＦｉｘａｂｌｅ ＶｉａｂｉｌｉｔｙキットはＢｉｏＬｅｇｅｎｄから購入した（カタログ番号：４２３１０６）。
【0191】
Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ６０５ＴＭ抗マウスＴＥＲ－１１９／赤血球細胞抗体は、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄから購入した（カタログ番号：１１６２３９）。
【0192】
ＰＥ抗マウスＣＤ７１抗体は、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄから購入した（カタログ番号：１１３８０７）。
【0193】
実施例１：ヒト化ＴＦＲ１遺伝子を有するマウスの生成
非ヒト動物（例えば、マウス）のゲノムを組み換えて、遺伝子組換え非ヒト動物がヒト又はヒト化ＴＦＲ１タンパク質を発現することができるように、ヒトＴＦＲ１タンパク質の全て又は一部をコードする核酸配列を含めることができる。マウスＴＦＲ１遺伝子（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：２２０４２、一次資料：ＭＧＩ：９８８２２、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ：Ｑ６２３５１）は、染色体１６（ＮＣ＿００００８２．７）の３２４２７７１４～３２４５１６１２に位置し、ヒトＴＦＲ１遺伝子（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：７０３７、一次資料：ＨＧＮＣ：１１７６３１、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ：Ｐ０２７８６）は、染色体３（ＮＣ＿０００００３．１２）の１９６０１８６９４～１９６０８２１２３に位置する。マウスＴＦＲ１転写物はＮＭ＿０１１６３８．４であり、対応するタンパク質配列のＮＰ＿０３５７６８．１は配列番号１に示される。ヒトＴＦＲ１転写物はＮＭ＿００３２３４．４であり、対応するタンパク質配列のＮＰ＿００３２２５．２は配列番号２に示される。マウス及びヒトＴＦＲ１遺伝子座位を図１に示す。
非ヒト動物（例えば、マウス）のゲノムを組み換えて、遺伝子組換え非ヒト動物がヒト又はヒト化ＴＦＲ１タンパク質を発現することができるように、ヒトＴＦＲ１タンパク質の全て又は一部をコードする核酸配列を含めることができる。マウスＴＦＲ１遺伝子（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：２２０４２、一次資料：ＭＧＩ：９８８２２、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ：Ｑ６２３５１）は、染色体１６（ＮＣ＿００００８２．７）の３２４２７７１４～３２４５１６１２に位置し、ヒトＴＦＲ１遺伝子（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：７０３７、一次資料：ＨＧＮＣ：１１７６３１、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ：Ｐ０２７８６）は、染色体３（ＮＣ＿０００００３．１２）の１９６０１８６９４～１９６０８２１２３に位置する。マウスＴＦＲ１転写物はＮＭ＿０１１６３８．４であり、対応するタンパク質配列のＮＰ＿０３５７６８．１は配列番号１に示される。ヒトＴＦＲ１転写物はＮＭ＿００３２３４．４であり、対応するタンパク質配列のＮＰ＿００３２２５．２は配列番号２に示される。マウス及びヒトＴＦＲ１遺伝子座位を図１に示す。
【0194】
ヒトＴＦＲ１タンパク質をコードするヌクレオチド配列の全て又は一部を、マウス内因性ＴＦＲ１座位に導入し、マウスがヒト又はヒト化ＴＦＲ１タンパク質を発現するようにすることができる。具体的には、マウスＴＦＲ１遺伝子制御エレメントの制御下で、ヒトＴＦＲ１タンパク質をコードするヌクレオチド配列を使用して、遺伝子編集技術を用いて対応するマウス配列を置き換え、図２に示すヒト化ＴＦＲ１遺伝子座位を得ることで、マウスＴＦＲ１遺伝子をヒト化した。
【0195】
図３の標的方法の概略図に示すとおり、標的化ベクターは、マウスＴＦＲ１遺伝子の上流及び下流の相同アーム配列、並びに、ヒトＴＦＲ１遺伝子のＤＮＡ配列を含有する「Ａ断片」を含有する。具体的には、上流相同アームの配列（５’相同アーム、配列番号３）は、ＮＣＢＩ受託番号ＮＣ＿００００８２．７の、３２４２９７９４～３２４３４０３６のヌクレオチド配列と同一であり、下流相同アームの配列（３’相同アーム、配列番号４）は、ＮＣＢＩ受託番号ＮＣ＿００００８２．７の、３２４４９１５５～３２４５３４４５のヌクレオチド配列と同一である。ＴＦＲ１遺伝子由来のヒトゲノムＤＮＡ配列（配列番号５）は、ＮＣＢＩ受託番号ＮＣ＿０００００３．１２の、１９６０５１９４２～１９６０７４０９９のヌクレオチド配列と同一である。
【0196】
標的化ベクターは、ポジティブクローンスクリーニング用の抗生物質耐性遺伝子（ネオマイシンリン酸転移酵素遺伝子、又はＮｅｏ）、及び、Ｎｅｏカセットを形成した抗生物質耐性遺伝子に隣接する、２つのＦｒｔ組換え部位もまた含む。Ｎｅｏカセットの５’末端とヒト配列との接続は、５’－ＴＡＧＣＣＴＣＣＴＴＴＡＧＡＡＴＴＴＴＡＡＣＣＴＴＡＧＡＡＧＡＴＴＡＧＣＡＴＴＡＧＣＣＡＡＴＴＧＣＡＴＣＴＧＧＣＧＡＡＴＣＧＧＡＣＣＣＡＣＡＡＧＡＧＣＡＣＴＧＡＧＧＴＣＧＧＡＡＧＴＴＣＣＴＡＴＴＣＴＣＴＡＧＡＡＡ－３’（配列番号６）として設計され、式中、配列「ＡＴＴＡＧＣ」中の「Ｃ」は、ヒト配列の最後のヌクレオチドであり、配列「ＣＡＡＴＴ」中の「Ｃ」は、Ｎｅｏカセットの最初のヌクレオチドである。Ｎｅｏカセットの３’末端とヒト配列との接続は、５’－ＴＣＡＴＣＡＧＴＣＣＡＧＧＡＴＡＣＡＴＡＧＡＴＴＡＣＣＡＣＡＡＣＴＣＣＧＡＧＣＣＴＧＧＴＴＣＴＣＡＧＣＡＴＴＣＴＴＴＴＴＴＣＣＴＴＡＣＴＣＴＧＣＴＡＴＡＧＡＡＡ－３’（配列番号７）として設計され、式中、配列「ＣＧＡＧＣ」中の「Ｃ」は、Ｎｅｏカセットの最後のヌクレオチドであり、配列「ＣＴＧＧＴ」中の「Ｃ」は、ヒト配列の最初のヌクレオチドである。加えて、ネガティブ選択可能なマーカーを有するコード遺伝子（ジフテリア毒素Ａサブユニット（ＤＴＡ）をコードする遺伝子）もまた、標的化ベクターの３’相同アームの下流に構築した。ヒト化後の、組換えマウスＴＦＲ１のｍＲＮＡ配列、及びその、コードされたタンパク質配列は、それぞれ配列番号８及び配列番号９に示す。
【0197】
例えば、制限酵素消化及びライゲーションにより、標的化ベクターを構築した。構築した標的化ベクター配列を予め、制限酵素消化により確認し、その後、配列決定により検証した。電気穿孔法により、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの胚幹細胞に正しい標的化ベクターをトランスフェクトした。ポジティブ選択可能なマーカー遺伝子を用いて細胞をスクリーニングし、外来性遺伝子の組み込みを、ＰＣＲ（ＰＣＲプライマーを下表に示す）及びサザンブロットにより確認した。
【0198】
【表3】
【0199】
具体的には、マウス胚幹細胞に標的化ベクターをトランスフェクトした後、ＰＣＲにより陽性と同定されたクローンを、サザンブロットにより検証し（細胞ＤＮＡをそれぞれ、ＤｒａＩＩＩ、ＥｃｏＲＶ、及びＡｓｅＩにより消化し、３つのプローブでハイブリダイズし）、正しい陽性クローン細胞をスクリーニングした。制限酵素、プローブ、及び標的断片のサイズを下表に示す。サザンブロットの検出結果を図４に示す。４つのＰＣＲ陽性胚幹細胞（ＥＳ－１～ＥＳ－４）が、無作為な挿入を伴わずに陽性クローンとして検証されたことを、結果は示す。
【0200】
【表4】
【0201】
以下のプライマーを、サザンブロット同定に用いた：
Ａプローブ：
Ａプローブ-Ｆ：５’－ＧＧＴＧＡＧＡＡＧＡＡＡＣＴＡＡＡＣＴＡＴＧＣＣＡ －３’（配列番号１４）、
Ａプローブ-Ｒ：５’－ＴＣＴＧＧＴＴＣＡＣＣＣＡＧＧＴＴＡＧＡＧＣ －３’（配列番号１５）；
Ｎｅｏプローブ：
Ｎｅｏプローブ－Ｆ：５’－ＧＧＡＴＣＧＧＣＣＡＴＴＧＡＡＣＡＡＧＡＴ－３’（配列番号１８）、
ＮｅｏプローブＲ：５’－ＣＡＧＡＡＧＡＡＣＴＣＧＴＣＡＡＧＡＡＧＧＣ－３’（配列番号１９）。
Ａプローブ：
Ａプローブ-Ｆ：５’－ＧＧＴＧＡＧＡＡＧＡＡＡＣＴＡＡＡＣＴＡＴＧＣＣＡ －３’（配列番号１４）、
Ａプローブ-Ｒ：５’－ＴＣＴＧＧＴＴＣＡＣＣＣＡＧＧＴＴＡＧＡＧＣ －３’（配列番号１５）；
Ｎｅｏプローブ：
Ｎｅｏプローブ－Ｆ：５’－ＧＧＡＴＣＧＧＣＣＡＴＴＧＡＡＣＡＡＧＡＴ－３’（配列番号１８）、
ＮｅｏプローブＲ：５’－ＣＡＧＡＡＧＡＡＣＴＣＧＴＣＡＡＧＡＡＧＧＣ－３’（配列番号１９）。
【0202】
スクリーニングした陽性クローン（黒色マウス）を、単離した胚盤胞（白色マウス）に導入し、得られたキメラ胚盤胞を短期間培養用培地に移し、その後、レシピエントである母（白色マウス）の卵管に移植して、Ｆ０キメラマウス（黒及び白）を作製した。Ｆ０世代のキメラマウスを野生型マウスと戻し交配させることでＦ１世代のマウスを得た後、Ｆ１世代のヘテロ接合マウス同士を交配させることにより、Ｆ２世代のホモ接合マウスを入手した。陽性マウスを、Ｆｌｐトランスジェニックマウスともまた交配させて、ポジティブ選択可能なマーカー遺伝子を除去し（概略図を図５に示す）、その後、ヘテロ接合マウス同士を交配させることにより、ヒト化ＴＦＲ１遺伝子を含むヒト化ホモ接合マウスを得た。
【0203】
ＴＦＲ１遺伝子ヒト化マウスの遺伝子型を、下表に示すプライマーを用いるＰＣＲにより検証した。例示的なＦ１世代のマウス（Ｎｅｏカセットを除去した）の同定結果を図６Ａ～６Ｄに示し、Ｆ１－０１及びＦ１－０２の番号を付けた２匹のマウスを、陽性ヘテロ接合マウスと同定した。用いたＰＣＲプライマーを下表に示す。
【0204】
【表5】
【0205】
例えば、フローサイトメトリー又は蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）により、陽性マウスでのヒト化ＴＦＲ１タンパク質の発現を確認することができる。具体的には、７週齢のメスＣ５７ＢＬ／６野生型マウスを１匹、及び、７週齢のメスＴＦＲ１遺伝子ヒト化ヘテロ接合マウスを１匹選択した。頚椎脱臼による安楽死の後、骨髄組織を収集し、細胞を、精製抗マウスＣＤ１６／３２抗体（抗マウスＣＤ１６／３２抗体）；Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ５１０ＴＭ抗マウスＣＤ４５抗体（抗マウスＣＤ４５抗体）；ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５抗マウスＴＣＲβ抗体（抗マウスＴＣＲβ抗体）；ＦＩＴＣ抗マウスＣＤ１９抗体（抗マウスＣＤ１９抗体）；Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ６０５ＴＭ抗マウスＴＥＲ－１１９／赤血球細胞抗体（抗マウスＴＥＲ－１１９抗体）；ＰＥ抗マウスＣＤ４３抗体（抗マウスＣＤ４３抗体）；ＡＰＣ抗ヒトＣＤ４３抗体（ｈＣＤ４３－ＰＥ；抗ヒトＣＤ４３抗体）；ＰＥ抗マウスＣＤ７１抗体（ｍＴＦＲ１；抗マウスＴＦＲ１抗体）；及び、ＡＰＣ抗ヒトＣＤ７１抗体（ｈＴＦＲ１；抗ヒトＴＦＲ１抗体）で染色した後、フローサイトメトリー検出を行った。
【0206】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスの脾臓内のＢ細胞（ｍＣＤ４５＋ｍＣＤ１９＋を特徴とする）の５０．６％が、ｍＴＦＲ１陽性（ｍＣＤ４５＋ｍＣＤ１９＋ｍＴＦＲ１＋を特徴とする）であり、０．２０％がｈＴＦＲ１陽性（ｍＣＤ４５＋ｍＣＤ１９＋ｈＴＦＲ１＋を特徴とする）であることを、結果は示した。ＴＦＲ１遺伝子ヒト化ヘテロ接合マウスの脾臓内では、Ｂ細胞の３２．９％がｍＴＦＲ１陽性（ｍＣＤ４５＋ｍＣＤ１９＋ｍＴＦＲ１＋を特徴とする）であり、１１．３％がｈＴＦＲ１陽性（ｍＣＤ４５＋ｍＣＤ１９＋ｈＴＦＲ１＋を特徴とする）であった。ヒト化ＴＦＲ１ではなく、マウスＴＦＲ１の発現が野生型マウスの脾細胞で検出された；一方で、マウスＴＦＲ１及びヒト化ＴＦＲ１の両方の発現が、ＴＦＲ１遺伝子ヒト化ヘテロ接合マウスにおいてインビボで検出されたことを、結果は示した。ＴＦＲ１は、ＴＦＲ１遺伝子ヒト化マウスにおいて正常に発現することができることを、上記実験結果は示している。
【0207】
Ｆ２世代のＴＦＲ１遺伝子ヒト化ホモ接合マウスを、Ｆ１世代のヘテロ接合マウスを交雑することにより入手した。ＴＦＲ１遺伝子ヒト化ホモ接合マウスにおけるｍＲＮＡの転写を、ＲＴ－ＰＣＲにより検出した。具体的には、７週齢のメスＣ５７ＢＬ／６野生型マウスを１匹、及び、ＴＦＲ１遺伝子ヒト化ホモ接合マウス（本明細書に記載の方法を用いて生成される）を１匹選択した。頚椎脱臼による安楽死の後、マウス脾細胞を収集した。ＴＲＩｚｏｌＴＭキットの取扱説明書に従い細胞ＲＮＡを抽出した。次に、抽出した細胞ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、その後、以下に示すプライマーを用いるＲＴ－ＰＣＲにより検出した。図７Ａ～７Ｃに示すとおり、ヒト化ＴＦＲ１ ｍＲＮＡではなく、マウスＴＦＲ１ ｍＲＮＡのみが、Ｃ５７ＢＬ／６野生型マウスにて検出された。対称的に、マウスＴＦＲ１ ｍＲＮＡではなく、ヒト化ＴＦＲ１ ｍＲＮＡのみが、ＴＦＲ１遺伝子ヒト化ホモ接合マウスにて検出された。
【0208】
以下のプライマーを、ＲＴ－ＰＣＲ検出において用いた：
ＰＣＲ－Ｆ１：５’－ＣＴＣＴＧＣＴＴＴＧＣＡＧＣＴＡＴＴＧＣＡＣ－３’（配列番号２７）、
ＰＣＲ－Ｒ１：５’－ＣＡＧＧＡＴＴＣＴＣＣＡＣＣＡＧＧＴＡＡＡＣＡ－３’（配列番号２８）、
ＰＣＲ－Ｆ２：５’－ＧＴＴＣＧＡＧＡＧＴＣＡＣＣＡＣＧＣＴＧＡＧ－３’（配列番号２９）、
ＰＣＲ－Ｒ２：５’－ＧＧＣＡＡＣＣＣＴＧＡＴＧＡＣＴＧＡＧＡＴＧ－３’（配列番号３０）；
ＧＡＰＤＨ－Ｆ：５’－ＴＣＡＣＣＡＴＣＴＴＣＣＡＧＧＡＧＣＧＡＧＡ－３’（配列番号１６）、
ＧＡＰＤＨ－Ｒ：５’－ＧＡＡＧＧＣＣＡＴＧＣＣＡＧＴＧＡＧＣＴＴ－３’（配列番号１７）。
ＰＣＲ－Ｆ１：５’－ＣＴＣＴＧＣＴＴＴＧＣＡＧＣＴＡＴＴＧＣＡＣ－３’（配列番号２７）、
ＰＣＲ－Ｒ１：５’－ＣＡＧＧＡＴＴＣＴＣＣＡＣＣＡＧＧＴＡＡＡＣＡ－３’（配列番号２８）、
ＰＣＲ－Ｆ２：５’－ＧＴＴＣＧＡＧＡＧＴＣＡＣＣＡＣＧＣＴＧＡＧ－３’（配列番号２９）、
ＰＣＲ－Ｒ２：５’－ＧＧＣＡＡＣＣＣＴＧＡＴＧＡＣＴＧＡＧＡＴＧ－３’（配列番号３０）；
ＧＡＰＤＨ－Ｆ：５’－ＴＣＡＣＣＡＴＣＴＴＣＣＡＧＧＡＧＣＧＡＧＡ－３’（配列番号１６）、
ＧＡＰＤＨ－Ｒ：５’－ＧＡＡＧＧＣＣＡＴＧＣＣＡＧＴＧＡＧＣＴＴ－３’（配列番号１７）。
【0209】
上述のフローサイトメトリーを用いる、同様の方法を用いて、ＴＦＲ１遺伝子ヒト化ホモ接合マウスにおける、ヒト化ＴＦＲ１タンパク質の発現を検出することができる。具体的には、７週齢のメスＣ５７ＢＬ／６野生型マウスを１匹、及び、７週齢のメスＴＦＲ１遺伝子ヒト化ホモ接合マウスを１匹選択した。頚椎脱臼による安楽死の後、骨髄組織を収集し、細胞を、精製抗マウスＣＤ１６／３２抗体（抗マウスＣＤ１６／３２抗体）；Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ６０５ＴＭ抗マウスＴＥＲ－１１９／赤血球細胞抗体（抗マウスＴＥＲ－１１９抗体）；ＰＥ抗マウスＣＤ７１抗体（ｍＴＦＲ１；抗マウスＴＦＲ１抗体）；及び、ＡＰＣ抗ヒトＣＤ７１抗体（ｈＴＦＲ１；抗ヒトＴＦＲ１抗体）で染色した後、フローサイトメトリー検出を行った。Ｃ５７ＢＬ／６マウスの骨髄中の赤血球細胞（ｍＴｅｒ１１９＋を特徴とする）の１４．２％がｍＴＦＲ１陽性（ｍＴｅｒ１１９＋ｍＴＦＲ１＋を特徴とする）であり、０．０８７％がｈＴＦＲ１陽性（ｍＴｅｒ１１９＋ｈＴＦＲ１＋を特徴とする）であったことを、結果は示した。ＴＦＲ１遺伝子ヒト化ホモ接合マウスの骨髄において、赤血球細胞の０．０４％がｍＴＦＲ１陽性であり、１０．１％がｈＴＦＲ１陽性であった。本明細書に記載の方法を用いて生成したＴＦＲ１遺伝子ヒト化マウスは、ヒト化ＴＦＲ１タンパク質をインビボで上手く発現することができることを、結果は示す。
【0210】
さらに、野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウス及びＴＦＲ１遺伝子ヒト化ホモ接合マウスの、脾臓、リンパ節、及び末梢血中での白血球及びＴ細胞を、フローサイトメトリーによる免疫表現型検出のために収集した。日常的な血液検査及び生化学試験もまた、行った。白血球の亜型（Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、顆粒球、樹状細胞（ＤＣ細胞）、マクロファージ、単球を含む）、並びに、Ｔ細胞の亜型（ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、及びＴｒｅｇ細胞を含む）の割合、加えて、ＴＦＲ１遺伝子ヒト化ホモ接合マウスの各組織試料における、日常的な血液検査及び生化学試験は、Ｃ５７ＢＬ／６野生型マウスにおいて検出されたものと基本的には同じであることを、結果は示した。ＴＦＲ１遺伝子のヒト化は、マウスにおける、白血球及びＴ細胞の分化；脾臓、リンパ組織、及び末梢血における白血球及びＴ細胞の成長及び分布に著しく影響を及ぼさなかったことを、結果は示す。
【0211】
実施例２：マウスにおける、抗ヒトＴＦＲ１抗体の薬物動態（ＰＫ）検出
マウスの脳組織及び血清における、抗ヒトＴＦＲ１抗体のＰＫプロセスを、以下のとおり検出した。ＴＦＲ１遺伝子ヒト化ホモ接合マウスを選択し、無作為に対照群と治療群に分けた。対照群のマウスには、１０ｍｇ／ｋｇの対照ヒトＩｇＧ１（ｈＩｇＧ）を注射し、治療群マウスには、等モル量（１０．９ｍｇ／ｋｇ）の、抗ヒトＴＦＲ１抗体Ａｂを、尾静脈から注射した。マウスの脳組織及び血清試料を収集し、マウスの脳組織及び血清試料における、抗ヒトＴＦＲ１抗体Ａｂの濃度を、抗ヒトＦｃ抗体を用いるＥＬＩＳＡにより測定した。図８Ａ～８Ｃに示すように、治療群マウスの脳組織でのＡｂの濃度は、実験期間中、高レベルで維持され（図８Ａ）；血清中でのＡｂの濃度は時間とともに低下し（図８Ｂ）；治療群マウスの、脳組織中の、血清中に対するＡｂ濃度比は、対照群マウスの濃度比よりも著しく高かった（図８Ｃ）。ＴＦＲ１遺伝子ヒト化マウスの脳は、静脈内投与された抗ヒトＴＦＲ１抗体を取り込むことができることを、結果は示す。したがって、本明細書に記載するＴＦＲ１遺伝子ヒト化マウスを、タンパク質治療薬の、中枢神経系（ＣＮＳ）への効果的な送達を評価する、及び有効性を評価する動物モデルとして用いることができる。
マウスの脳組織及び血清における、抗ヒトＴＦＲ１抗体のＰＫプロセスを、以下のとおり検出した。ＴＦＲ１遺伝子ヒト化ホモ接合マウスを選択し、無作為に対照群と治療群に分けた。対照群のマウスには、１０ｍｇ／ｋｇの対照ヒトＩｇＧ１（ｈＩｇＧ）を注射し、治療群マウスには、等モル量（１０．９ｍｇ／ｋｇ）の、抗ヒトＴＦＲ１抗体Ａｂを、尾静脈から注射した。マウスの脳組織及び血清試料を収集し、マウスの脳組織及び血清試料における、抗ヒトＴＦＲ１抗体Ａｂの濃度を、抗ヒトＦｃ抗体を用いるＥＬＩＳＡにより測定した。図８Ａ～８Ｃに示すように、治療群マウスの脳組織でのＡｂの濃度は、実験期間中、高レベルで維持され（図８Ａ）；血清中でのＡｂの濃度は時間とともに低下し（図８Ｂ）；治療群マウスの、脳組織中の、血清中に対するＡｂ濃度比は、対照群マウスの濃度比よりも著しく高かった（図８Ｃ）。ＴＦＲ１遺伝子ヒト化マウスの脳は、静脈内投与された抗ヒトＴＦＲ１抗体を取り込むことができることを、結果は示す。したがって、本明細書に記載するＴＦＲ１遺伝子ヒト化マウスを、タンパク質治療薬の、中枢神経系（ＣＮＳ）への効果的な送達を評価する、及び有効性を評価する動物モデルとして用いることができる。
【0212】
実施例３：インビボでの有効性検証
本明細書で生成したＴＦＲ１遺伝子ヒト化マウスを用いて、ヒトＴＦＲ１を標的にする調節物質の有効性を評価することができる。例えば、本明細書に記載するＴＦＲ１遺伝子ヒト化ホモ接合マウスに、マウス大腸癌細胞ＭＣ３８を皮下播種することができる。腫瘍が約１００ｍｍ３まで成長したら、マウスを腫瘍サイズに基づいて、対照群、及びいくつかの治療群に、無作為に分けた。治療群マウスを無作為に選択し、ヒトＴＦＲ１を標的にする薬剤（例えば、抗体）を投与することができ、対照群には、等体積の生理食塩水を投与することができる。マウスの腫瘍体積及び体重を測定することができ、結果を用いて、例えば、マウスの腫瘍体積と体重の変化を比較することにより、薬剤のインビボ安全性及び有効性を効率的に評価することができる。
本明細書で生成したＴＦＲ１遺伝子ヒト化マウスを用いて、ヒトＴＦＲ１を標的にする調節物質の有効性を評価することができる。例えば、本明細書に記載するＴＦＲ１遺伝子ヒト化ホモ接合マウスに、マウス大腸癌細胞ＭＣ３８を皮下播種することができる。腫瘍が約１００ｍｍ３まで成長したら、マウスを腫瘍サイズに基づいて、対照群、及びいくつかの治療群に、無作為に分けた。治療群マウスを無作為に選択し、ヒトＴＦＲ１を標的にする薬剤（例えば、抗体）を投与することができ、対照群には、等体積の生理食塩水を投与することができる。マウスの腫瘍体積及び体重を測定することができ、結果を用いて、例えば、マウスの腫瘍体積と体重の変化を比較することにより、薬剤のインビボ安全性及び有効性を効率的に評価することができる。
【0213】
実施例４：二重又は多重遺伝子ヒト化マウスの生成
本明細書に記載の方法を用いて生成したＴＦＲ１遺伝子ヒト化マウスを用いて、二重又は多重遺伝子ヒト化マウスモデルもまた生成することができる。例えば、実施例１において、胚盤胞マイクロインジェクション用の胚幹（ＥＳ）細胞を、組換え（例えば、ヒト又はヒト化）ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＯＸ４０、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、及び／又はＣＤ７３遺伝子などの、他の遺伝子組換えを含むマウスから選択することができる。あるいは、本明細書に記載するヒト化ＴＦＲ１マウス由来の胚幹細胞を単離することができ、遺伝子組換え標的化技術を用いて、ＴＦＲ１及び他の遺伝子組換えの、二重遺伝子又は多重遺伝子組換えマウスモデルを得ることができる。さらに、本明細書に記載の方法により入手したホモ接合又はヘテロ接合ＴＦＲ１遺伝子ヒト化マウスを、他の遺伝子組換えホモ接合又はヘテロ接合マウスと交配させることができ、かつ、子孫をスクリーニングすることができる。メンデルの法則によれば、組換え（例えば、ヒト又はヒト化）ＴＦＲ１遺伝子及び他の遺伝子組換えを含む、二重遺伝子又は多重遺伝子組換えヘテロ接合マウスを生成することが可能である。次に、ヘテロ接合マウス同士を交配させて、ホモ接合二重遺伝子又は多重遺伝子組換えマウスを得ることができる。これらの二重遺伝子又は多重遺伝子組換えマウスを、ヒトＴＦＲ１及び他の遺伝子を標的にする遺伝子制御因子の、インビボ検証のために用いることができる。
本明細書に記載の方法を用いて生成したＴＦＲ１遺伝子ヒト化マウスを用いて、二重又は多重遺伝子ヒト化マウスモデルもまた生成することができる。例えば、実施例１において、胚盤胞マイクロインジェクション用の胚幹（ＥＳ）細胞を、組換え（例えば、ヒト又はヒト化）ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＯＸ４０、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、及び／又はＣＤ７３遺伝子などの、他の遺伝子組換えを含むマウスから選択することができる。あるいは、本明細書に記載するヒト化ＴＦＲ１マウス由来の胚幹細胞を単離することができ、遺伝子組換え標的化技術を用いて、ＴＦＲ１及び他の遺伝子組換えの、二重遺伝子又は多重遺伝子組換えマウスモデルを得ることができる。さらに、本明細書に記載の方法により入手したホモ接合又はヘテロ接合ＴＦＲ１遺伝子ヒト化マウスを、他の遺伝子組換えホモ接合又はヘテロ接合マウスと交配させることができ、かつ、子孫をスクリーニングすることができる。メンデルの法則によれば、組換え（例えば、ヒト又はヒト化）ＴＦＲ１遺伝子及び他の遺伝子組換えを含む、二重遺伝子又は多重遺伝子組換えヘテロ接合マウスを生成することが可能である。次に、ヘテロ接合マウス同士を交配させて、ホモ接合二重遺伝子又は多重遺伝子組換えマウスを得ることができる。これらの二重遺伝子又は多重遺伝子組換えマウスを、ヒトＴＦＲ１及び他の遺伝子を標的にする遺伝子制御因子の、インビボ検証のために用いることができる。
【0214】
他の実施形態
本発明をその詳細な説明と併せて説明してきたが、上記の説明は例示を目的とするものであり、添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の範囲を限定するものではないことを理解されたい。他の態様、利点、及び修正は、以下の特許請求の範囲内である。
本発明をその詳細な説明と併せて説明してきたが、上記の説明は例示を目的とするものであり、添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の範囲を限定するものではないことを理解されたい。他の態様、利点、及び修正は、以下の特許請求の範囲内である。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6A-6D】
【図7A-7C】
【図8A-8C】
【図9-1】
【図9-2】
【図10-1】
【図10-2】
【配列表】
【国際調査報告】