特表 2024-526062 Ｖ型ＲＮＡプログラム可能エンドヌクレアーゼ系

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-07-17

(54)【発明の名称】Ｖ型ＲＮＡプログラム可能エンドヌクレアーゼ系

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/55 20060101AFI20240709BHJP

   C12N 9/22 20060101ALI20240709BHJP

   C12N 15/113 20100101ALI20240709BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20240709BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20240709BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240709BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240709BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20240709BHJP

【ＦＩ】

C12N15/55

C12N9/22 ZNA

C12N15/113 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12N15/09 110

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023575553

(86)(22)【出願日】2022-06-09

(85)【翻訳文提出日】2024-02-01

(86)【国際出願番号】 EP2022065691

(87)【国際公開番号】W WO2022258753

(87)【国際公開日】2022-12-15

(31)【優先権主張番号】21179011.8

(32)【優先日】2021-06-11

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(31)【優先権主張番号】21196182.6

(32)【優先日】2021-09-10

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】313006625

【氏名又は名称】バイエル・アクチエンゲゼルシヤフト

(74)【代理人】

【識別番号】100114188

【弁理士】

【氏名又は名称】小野 誠

(74)【代理人】

【識別番号】100119253

【弁理士】

【氏名又は名称】金山 賢教

(74)【代理人】

【識別番号】100124855

【弁理士】

【氏名又は名称】坪倉 道明

(74)【代理人】

【識別番号】100129713

【弁理士】

【氏名又は名称】重森 一輝

(74)【代理人】

【識別番号】100137213

【弁理士】

【氏名又は名称】安藤 健司

(74)【代理人】

【識別番号】100183519

【弁理士】

【氏名又は名称】櫻田 芳恵

(74)【代理人】

【識別番号】100196483

【弁理士】

【氏名又は名称】川嵜 洋祐

(74)【代理人】

【識別番号】100160749

【弁理士】

【氏名又は名称】飯野 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100160255

【弁理士】

【氏名又は名称】市川 祐輔

(74)【代理人】

【識別番号】100146318

【弁理士】

【氏名又は名称】岩瀬 吉和

(74)【代理人】

【識別番号】100127812

【弁理士】

【氏名又は名称】城山 康文

(72)【発明者】

【氏名】コーエン，アンドレ

(72)【発明者】

【氏名】リヒター，フロリアン

(72)【発明者】

【氏名】クニプハウセン，フィリップ

(72)【発明者】

【氏名】ニーリンクス，アンドレアス

(72)【発明者】

【氏名】マルケルト，サスキア・ダイアナ

(72)【発明者】

【氏名】ベドナルスキー，クリスティアン

(72)【発明者】

【氏名】トゥラン，ゾーレン

【テーマコード（参考）】

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B065AA01X

4B065AA01Y

4B065AA57X

4B065AA57Y

4B065AA72X

4B065AA72Y

4B065AA83X

4B065AA83Y

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA01

4B065CA44

4B065CA46

(57)【要約】

新規なＶ型Ｂ－Ｇｅｎ．１又はＢ－Ｇｅｎ．２ヌクレアーゼ及びそのバリアントを使用して、細胞又は無細胞環境においてＤＮＡを標的化、編集又は操作するための新規な系、並びにＤＮＡを操作するための方法及びキットが本明細書に記載される。さらに、新規かつ改良されたシングルガイドＲＮＡが開示される。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号：１又は配列番号：３９によるＢ－ＧＥｎ．１、及び配列番号：２によるＢ－ＧＥｎ．２の群から選択されるポリペプチド、上記のいずれかと少なくとも８０％同一であるいずれかのポリペプチド配列、又はそれらをコードするいずれかの核酸。

【請求項2】

請求項１に記載のポリペプチド及び配列番号：４０、４１、４２、４３、及び４５から選択される配列を含むｓｇＲＮＡを含む組成物。

【請求項3】

（ｉ）請求項１に記載のポリペプチド、及び
（ｉｉ）１つ若しくは複数のシングル異種ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）又はそのような１つ若しくは複数のｓｇＲＮＡのｉｎ ｓｉｔｕでの生成を可能にするＤＮＡ（複数可）であって、各ｓｇＲＮＡ又はｓｇＲＮＡをコードするＤＮＡが：
ａ．ポリヌクレオチド遺伝子座中の標的配列とハイブリダイズすることができる人工ＤＮＡ標的化セグメント、
ｂ．ｔｒａｃｒメイト配列、及び
ｃ．ｔｒａｃｒ ＲＮＡ配列
を含み、ここで、ｔｒａｃｒメイト配列がｔｒａｃｒ配列とハイブリダイズでき、さらにここで（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）が、５’から３’への方向に配置されているもの、
を含む、組成物。

【請求項4】

人工ＤＮＡ標的化セグメントが、その３’末端において、標的ＤＮＡセグメント上のＰＡＭ配列に直接隣接しているか、又はそのようなＰＡＭ配列が、標的ＤＮＡ配列の５’部分における一部であり、ここで、ＰＡＭ配列は配列モチーフ「ＤＴＴＮ」を有し、ここで「Ｄ」は「Ａ」又は「Ｔ」又は「Ｇ」を表し、さらに「Ｎ」はいずれかのヌクレオチドを表す、を含む、
請求項２又は３に記載の組成物。

【請求項5】

細胞又はｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて１又は複数の位置で標的ＤＮＡを標的化、編集、改変、又は操作する方法であって、本方法が、
（ｉ）請求項１に記載のポリペプチド又はそれをコードする核酸を、細胞内又はｉｎ ｖｉｔｒｏ環境内に導入するステップと；
（ｉｉ）１つ若しくは複数のシングル異種ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）又はそのような１つ若しくは複数のｓｇＲＮＡをコードするＤＮＡ（複数可）を細胞又はｉｎ ｖｉｔｒｏ環境に導入するステップであって、各ｓｇＲＮＡ又はｓｇＲＮＡをコードするＤＮＡが：
ａ．ＲＮＡを含み、ポリヌクレオチド遺伝子座中の標的配列とハイブリダイズできる人工ＤＮＡ標的化セグメント、
ｂ．ＲＮＡで構成されたｔｒａｃｒメイト配列、及び
ｃ．ＲＮＡで構成されたｔｒａｃｒ ＲＮＡ配列
を含み、ここでｔｒａｃｒメイト配列が、ｔｒａｃｒ配列とハイブリダイズし、さらにここで（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）は、５’から３’への方向に配置される、ステップと；
（ｉｉｉ）標的ＤＮＡにニック若しくはカット又は塩基編集を１つ又は複数創出するステップであって、ここで、Ｂ－ＧＥｎポリペプチドが、そのプロセシングされた形態又はプロセシングされていない形態のｓｇＲＮＡによって標的ＤＮＡに方向づけられる、ステップと、
を含む方法。

【請求項6】

ｉ．請求項１に記載のポリペプチド又はそれをコードする核酸；及び／又は
ｉｉ．１つ若しくは複数のシングル異種ガイドＲＮＡ（複数可）（ｓｇＲＮＡ）又はそのような１つ若しくは複数のｓｇＲＮＡのｉｎ ｓｉｔｕでの生成に好適なＤＮＡ（複数可）であって、それぞれが：
ａ．ＲＮＡで構成され、ポリヌクレオチド遺伝子座中のそのような標的配列とハイブリダイズできる人工ＤＮＡ標的化セグメント、
ｂ．ＲＮＡで構成されたｔｒａｃｒメイト配列、及び
ｃ．ＲＮＡで構成されたｔｒａｃｒ ＲＮＡ配列
を含み、ここでｔｒａｃｒメイト配列がｔｒａｃｒ配列とハイブリダイズし、さらにここで（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）が、５’から３’への方向に配置されるもの、
を含む組成物の使用であって、
細胞内又はｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、１つ又は複数の位置で標的ＤＮＡを標的化、編集、改変、又は操作するための、
組成物の使用。

【請求項7】

ｉ．請求項１に記載のポリペプチド又はそれをコードする核酸；及び
ｉｉ．１つ若しくは複数のシングル異種ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）又はそのような１つ若しくは複数のｓｇＲＮＡをｉｎ ｓｉｔｕで生成するのに好適なＤＮＡ（複数可）であって、それぞれが：
ａ．ポリヌクレオチド遺伝子座中の標的配列とハイブリダイズできる人工ＤＮＡ標的化セグメント、
ｂ．ｔｒａｃｒメイト配列、及び
ｃ．ｔｒａｃｒ ＲＮＡ配列
を含み、ここでｔｒａｃｒメイト配列がｔｒａｃｒ配列とハイブリダイズでき、さらにここで（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）が、５’から３’への方向に配置されるもの、
を有する細胞。

【請求項8】

Ｉ．請求項１に記載のＢ－ＧＥｎポリペプチドをコードする核酸であって、Ｂ－ＧＥｎをコードする核酸はプロモーターに作動可能に連結されているもの；及び
ＩＩ．１つ若しくは複数のシングル異種ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）又はそのような１つ若しくは複数のｓｇＲＮＡをｉｎ ｓｉｔｕで生成するのに好適なＤＮＡ（複数可）であって、各ｓｇＲＮＡが：
ａ．ポリヌクレオチド遺伝子座中の標的配列とハイブリダイズできる人工ＤＮＡ標的化セグメント、
ｂ．ｔｒａｃｒメイト配列、及び
ｃ．ｔｒａｃｒ ＲＮＡ配列
を含み、ここでｔｒａｃｒメイト配列がｔｒａｃｒ配列とハイブリダイズでき、さらにここで（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）が、５’から３’への方向に配置されるもの、
を含むキット。

【請求項9】

配列番号：４０～４４から選択される核酸又は配列番号：４０～４４から選択される核酸で構成された核酸。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は全体として分子生物学の分野に関し、特に遺伝子編集のための新規ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ ＲＮＡプログラム可能ＤＮＡエンドヌクレアーゼに関する。

【背景技術】

【0002】

ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系として集合的に知られる、クラスター化して規則的な間隔を有する短い回文配列反復（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ）（ＣＲＩＳＰＲ）及びＣＲＩＳＰＲ会合（Ｃａｓ）遺伝子は、現在、ファージ感染に対して細菌及び古細菌に免疫を提供すると理解されている。原核生物の適応免疫のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、遺伝子座構造と同様に、タンパク質エフェクター非コード要素の極めて多様な群であり、いくつかの例は、重要なバイオテクノロジーを生み出すように設計され、適応されている。

【0003】

宿主防御に関与する系の成分には、ＤＮＡ又はＲＮＡを改変することができる１つ又は複数のエフェクタータンパク質、及びファージＤＮＡ又はＲＮＡ上の特定の配列にこれらのタンパク質活性を標的化する役割を果たすＲＮＡガイドエレメントが含まれる。ＲＮＡガイドはＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）からなり、エフェクタータンパク質による標的核酸操作を可能にするために、さらなるトランス作用性ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を必要とするかもしれない。ｃｒＲＮＡは、エフェクタータンパク質へのｃｒＲＮＡの結合を担う「ダイレクトリピート（ｄｉｒｅｃｔ ｒｅｐｅａｔ）」と称されるセグメントと、所望の核酸標的配列に相補的である「スペーサー配列」と称されるセグメントとからなる。ＣＲＩＳＰＲ系は、ｃｒＲＮＡのスペーサー配列を改変することによって、別のＤＮＡ又はＲＮＡ標的を標的とするように再プログラムすることができる。

【0004】

ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は大きく２つのクラスに分類することができる：クラス１系は、ｃｒＲＮＡの周りに一緒になって複合体を形成する複数のエフェクタータンパク質からなり、クラス２系は、ｃｒＲＮＡガイドと複合体を形成してＤＮＡ又はＲＮＡ基質を標的とする単一のエフェクタータンパク質からなる。クラス２系の単量体サブユニットエフェクター組成物は、エンジニアリング及び適用のためのより単純なコンポーネントセットを提供し、これまでプログラム可能なエフェクターの重要な供給源であった。したがって、新規なクラス２系の発見、エンジニアリング、及び最適化は、ゲノムエンジニアリング及びそれ以降のための広範かつ強力なプログラム可能な技術をもたらし得る。ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化して規則的な間隔を有する短い回文配列反復（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｌｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ））－Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ会合タンパク質）のＲＮＡガイドＤＮＡ標的化原理を用いたゲノムの編集は、過去数年にわたって広く利用されてきた。５種類のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系（Ｉ型、ＩＩ型及びＩＩｂ型、Ｉｌｌ型、Ｖ型、及びＶＩ型）が記載されてきた。ゲノム編集のためのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓのほとんどの使用は、ＩＩ型系を用いたものであった。細菌ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系によってもたらされる主な利点は、プログラム可能なＤＮＡ干渉のための最小限の要件である：カスタマイズ可能なデュアルＲＮＡ構造によって誘導されるエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ９。ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）の元のＩＩ型系において最初に実証されたように、トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）は、前駆体ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡ）の不変反復に結合し、Ｃａｓ９の存在下でのＲＮａｓｅ ＩＩＩによるｃｒＲＮＡ同時成熟（ｃｏ－ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）、及びＣａｓ９による侵入ＤＮＡ切断の両方に必須であるデュアルＲＮＡを形成する。ストレプトコッカス・ピオゲネスにおいて示されるように、Ｃａｓ９は、成熟した活性化ｔｒａｃｒＲＮＡと標的化ｃｒＲＮＡとの間に形成される二本鎖によって誘導され、侵入同族ＤＮＡにおいて部位特異的二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）切断を導入する。Ｃａｓ９は、ＨＮＨヌクレアーゼドメインを使用して標的鎖（ｃｒＲＮＡのスペーサー配列に相補的であると定義される）を切断し、ＲｕｖＣ様ドメインを使用して非標的鎖を切断するマルチドメイン酵素である。

【0005】

ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ ９ヌクレアーゼに加えて、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｅ、Ｃａｓ１２ｆ、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂなどの多数の異なるＶ型ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓヌクレアーゼが記載されてきた（Ｋｏｏｎｉｎら、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１７年６月；３７：６７～７８、及びＭａｋａｒｏｖａら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０２０年２月；１８（２）：６７－８３）。これらの系のいくつかはｔｒａｃｒ ＲＮＡを必要としないが（Ｃａｓ １２ａ、Ｃａｓ １３ａ、ｃａｓ １３ｂ）、Ｃａｓ１２ｂは典型的にｔｒａｃｒ ＲＮＡを必要とする（Ｋｏｏｎｉｎら、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１７年６月；３７：６７～７８）。

【0006】

哺乳動物細胞におけるゲノム編集は、部分的には様々なＣａｓ９タンパク質のサイズによって制限されている。今日まで最も広く使用されている酵素であるスタフィロコッカス・ピオゲネス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（ＳｐｙＣａｓ９）由来のＣａｓ９は、約４．２ｋｂのＤＮＡ（ＷＯ２０１３／１７６７２２）を含み、同族シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）との直接的な組み合わせは、サイズをさらに増加させる。アデノ随伴ウイルスは、遺伝子治療用途におけるＣａｓ９酵素の送達に使用されるベクターの中にある。しかし、ＡＡＶカーゴサイズは約４．５ｋｂに制限されている。サイズの制約のために、Ｃａｓ９とそのｓｇＲＮＡ及び潜在的なＤＮＡ修復テンプレートの送達は、本方法の使用を妨げる可能性がある。より小さいＣａｓ９分子が特徴付けられているが、それらの大部分は、ＳｐｙＣａｓ９によって使用されるものと同様に定義されていないプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列に悩まされている。例えば、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）（ＳａｕＣａｓ９は、Ｒ＝Ａ又はＧである「ＮＮＧＲＲ（Ｔ）」配列を使用し、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）（Ｃｊａ）Ｃａｓ９は、それぞれ、Ｙ＝Ｔ又はＧである「ＮＮＮＡＣＡＣ」／「ＮＮＮＲＹＡＣ」ＰＡＭを使用する。ＰＡＭのあいまいさは、ＰＡＭに対して高い又は完全な配列同一性を有するオフターゲット配列における酵素の望ましくない活性の可能性を増加させる。類似部位を誤っての標的化（「オフターゲット」）は有害事象の可能性を増大させるので、これらの系の特異性は依然として懸念される。

【0007】

既存のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は一般に、以下の１つ又は複数の欠点を有する：
ａ）それらのサイズは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）のような確立された治療的に好適なウイルス送達系のゲノム内に運ばれるには大きすぎる。
ｂ）それらの多くは、非宿主環境、例えば真核細胞、特に哺乳動物細胞において、実質的に活性ではない。
ｃ）それらのヌクレアーゼは、スペーサー配列とプロトスペーサー配列との間のミスマッチが存在する場合、ＤＮＡ鎖切断を触媒することができ、例えば、それらを遺伝子治療用途又は高精度を必要とする他の用途に適さないものにする、望ましくないオフターゲット効果をもたらす。
ｄ）それらは、哺乳動物におけるイン・ビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）適用のためのそれらの使用を制限し得る免疫応答を誘発し得る。
ｅ）それらは、ＤＮＡ標的化セグメントの標的選択を制限する複雑な及び／又は長いＰＡＭを必要とする。
ｆ）それらは、プラスミド又はウイルスベクターからの発現が乏しい。
ｇ）それらは、活性であるために追加のＲＮＡ配列又はガイドＲＮＡの一部として追加のＲＮＡ配列を必要とする。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0008】

【特許文献1】国際公開第２０１３／１７６７２２号

【非特許文献】

【0009】

【非特許文献1】Ｋｏｏｎｉｎら、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１７年６月；３７：６７～７８

【非特許文献2】Ｍａｋａｒｏｖａら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０２０年２月；１８（２）：６７～８３

【発明の概要】

【0010】

本発明は、Ｂ－ＧＥｎ．１（配列番号：１）、Ｂ－Ｇｅｎ１．２（配列番号：３９）及びＢ－ＧＥｎ．２（配列番号：２）を含む、Ｂ－ＧＥｎと命名される新規なＶ型ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓヌクレアーゼ、又はいずれかの配列に対して少なくとも８０の同一性を有するいずれかのタンパク質、配列番号：１、２若しくは３９のいずれかの配列に対して、その全長にわたって、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、特に好ましくは少なくとも９９％、最も好ましくは少なくとも９９．５％のアミノ酸同一性を有するいずれかのタンパク質、又はそれらをコードするいずれかの核酸に関する。

【0011】

あるいは、本発明は、Ｂ－ＧＥｎ．１（配列番号：１）及びＢ－ＧＥｎ．２（配列番号：２）を含む、Ｂ－ＧＥｎと命名される新規なＶ型ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓヌクレアーゼ、又はいずれかの配列に対して少なくとも８０の同一性を有するいずれかのタンパク質、配列番号：１、２のいずれかの配列に対して、その全長にわたって、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、特に好ましくは少なくとも９９％、最も好ましくは少なくとも９９．５％のアミノ酸同一性を有するいずれかのタンパク質、又はそれらをコードするいずれかの核酸に関する。

【0012】

本発明はさらに、Ｂ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２、好適なガイドＲＮＡ（特に配列番号：４０～４４による）を含み、配列番号：３及び配列番号：４に含まれる配列、並びに標的ＤＮＡを含む、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系に関する。

【0013】

別の実施形態では、いずれかのＢ－Ｇｅｎ１．２（配列番号：３９）が、Ｂ－ＧＥｎ．１（配列番号：１）のための本明細書のいずれかの実施形態の下で、好適で機能的に同一の置換である。

【0014】

一態様では、本明細書で提供されるのは、細胞内又はイン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）において１つ又は複数の位置で標的ＤＮＡを標的化、編集、改変、又は操作する方法であり、前記方法は、（Ｉ）本明細書に開示される異種Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又は本明細書に開示されるＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２をコードする核酸を細胞内又はイン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）環境に導入するステップと；及び（ＩＩ）１つ又は複数の異種シングルガイドＲＮＡ（複数可）（ｓｇＲＮＡ）又はそのような１つ又は複数のｓｇＲＮＡをコードするＤＮＡを細胞又はイン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）環境に導入するステップであって、それぞれのｓｇＲＮＡ又はｓｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、（ａ）ＲＮＡを含み、ポリヌクレオチド遺伝子座中の標的配列にハイブリダイズすることができる人工ＤＮＡ標的化セグメント、（ｂ）ＲＮＡで構成されたｔｒａｃｒメイト（ｍａｔｅ）配列、及び（ｃ）ＲＮＡで構成されたｔｒａｃｒ ＲＮＡ配列を含み、ここで、ｔｒａｃｒメイト配列が、ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし、（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）が、５’から３’への方向に配置されているステップと；並びに（ＩＩＩ）標的ＤＮＡにおいて１つ又は複数のニック又はカット又は塩基編集を創出するステップであって、ここで、Ｂ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチドは、そのプロセシングされた形態又はプロセシングされていない形態のｓｇＲＮＡによって標的ＤＮＡに方向づけられるステップとを含む。

【0015】

一態様では、本明細書で提供されるのは、細胞内又はイン・ビトロにおいて１つ又は複数の位置で標的ＤＮＡを標的化、編集、改変、又は操作するための、（Ｉ）本明細書に開示されるＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそれらをコードする核酸；及び／又は（ＩＩ）１つ又は複数のシングル異種ガイドＲＮＡ（複数可）（ｓｇＲＮＡ）又はイン・サイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）で、そのような１つ又は複数のｓｇＲＮＡの生成に好適なＤＮＡ（複数可）であって、それぞれが、（ａ）ＲＮＡで構成され、ポリヌクレオチド遺伝子座中のそのような標的配列にハイブリダイズすることができる人工ＤＮＡ標的化セグメント、（ｂ）ＲＮＡで構成されたｔｒａｃｒメイト配列、及び（ｃ）ＲＮＡで構成されたｔｒａｃｒ ＲＮＡ配列を含み、ここで、ｔｒａｃｒメイト配列が、ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし、（ｃ）、（ｂ）及び（ａ）が、それぞれ５’から３’への方向に配置されているｓｇＲＮＡ又はＤＮＡ、を含む組成物の使用である。

【0016】

別の態様では、本明細書で提供されるのは、（Ｉ）本明細書で開示されるようなＢ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド、又は本明細書で開示されるＢ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチドをコードする核酸、及び（ＩＩ）１つ又は複数のシングル異種ガイドＲＮＡ（複数可）（ｓｇＲＮＡ）又はイン・サイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）で、そのような１つ又は複数のｓｇＲＮＡの生成に好適なＤＮＡ（複数可）であって、それぞれが、（ａ）ポリヌクレオチド遺伝子座中の標的配列にハイブリダイズすることができる人工ＤＮＡ標的化セグメント、（ｂ）ｔｒａｃｒメイト配列、及び（ｃ）ｔｒａｃｒ ＲＮＡ配列を含み、ここで、ｔｒａｃｒメイト配列が、ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズすることができ、（ｃ）、（ｂ）及び（ａ）が、それぞれ５’から３’への方向に配置されているｓｇＲＮＡ又はＤＮＡ、を含む細胞である。

【0017】

さらに別の態様では、本明細書で提供されるのは、（Ｉ）本明細書で開示されるようなＢ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチドをコードする核酸配列であって、ここで、Ｂ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２をコードする核酸配列が、プロモーターに作動可能に連結されている核酸配列；及び（ＩＩ）１つ又は複数のシングル異種ガイドＲＮＡ（複数可）（ｓｇＲＮＡ）又はイン・サイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）で、そのような１つ又は複数のｓｇＲＮＡの生成に好適なＤＮＡ（複数可）であって、それぞれのｓｇＲＮＡが、（ａ）ポリヌクレオチド遺伝子座中の標的配列にハイブリダイズすることができる人工ＤＮＡ標的化セグメント、（ｂ）ｔｒａｃｒメイト配列、及び（ｃ）ｔｒａｃｒ ＲＮＡ配列を含み、ここで、ｔｒａｃｒメイト配列は、ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズすることができ、（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）が、５’から３’への方向に配置されているｓｇＲＮＡ又はＤＮＡ、を含むキットである。

【0018】

別の態様では、５つの合成的に誘導され、最適化されたｓｇＲＮＡ（配列番号：４０～４４）配列も本明細書に開示される。これらの配列は、配列特異的ガイドを提供するそれらの３’末端に約２０ヌクレオチドの配列特異的ストレッチを必要とする。

【0019】

低活性標的に対するＢ－ＧＥｎ．１（配列番号：１）、及びまた潜在的に他のＶ型ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓヌクレアーゼの活性を改善するために、及び将来の治療プログラムのためのＲＮＡ合成負荷を低減するために、短縮された突然変異ｓｇＲＮＡが設計された。配列番号：４０～４４のｓｇＲＮＡ（複数可）は、特に編集が困難であり、有意に短くされた長さ（２０ヌクレオチドガイド配列で示される）を有する標的上で、改善された活性を示す：

【0020】

１．配列番号：４０：Ｂ－ＧＥｎ．１＿ｓｇＲＮＡ４、１１７ヌクレオチド
２．配列番号：４１：Ｂ－ＧＥｎ．１＿ｓｇＲＮＡ４．２、１０７ヌクレオチド
３．配列番号：４２：Ｂ－ＧＥｎ．１＿ｓｇＲＮＡ４．３、１０７ヌクレオチド
４．配列番号：４３：Ｂ－ＧＥｎ．１＿ｓｇＲＮＡ４．４、１０７ヌクレオチド
５．配列番号：４４：Ｂ－ＧＥｎ．１＿ｓｇＲＮＡ４．５、１０６ヌクレオチド

【0021】

別の態様において、本発明は、

【0022】

ａ）Ｂ－ＧＥｎ．１（配列番号：１）又はＢ－ＧＥｎ．１．２（配列番号：３９）、又はいずれかの配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するいずれかのタンパク質、配列番号：１、２によるいずれかの配列に対して、その全長にわたって、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、特に好ましくは少なくとも９９％、最も好ましくは少なくとも９９．５％のアミノ酸同一性を有するいずれかのタンパク質、又はそれらをコードするいずれかの核酸、及び

【0023】

ｂ）配列番号４０、４１、４２、４３、及び４５から選択される配列を含むｓｇＲＮＡ
の組合せに関する。

【0024】

典型的には、これらのｓｇＲＮＡ配列は、その３’末端に標的特異的配列を含み、典型的には約２０ヌクレオチドの長さを有する。

【0025】

ｓｇＲＮＡは、他のＶ型ＣＲＳＩＰＲ Ｃａｓヌクレアーゼにも使用することができる。

【0026】

本明細書で言及される各特許文献及び科学論文、並びにそれによって引用されるそれらの特許文献及び科学論文の開示全体は、全ての目的のために参照により本明細書に明示的に組み込まれる。

【0027】

本発明の追加の特徴及び利点は、以下でより詳細に説明される。

【図面の簡単な説明】

【0028】

【図1】図１は、スクリーニングアッセイ、並びにＣＲＩＳＰＲ ＣａｓエンドヌクレアーゼとしてのＢ－ＧＥｎポリペチドの活性を試験するために使用されたアッセイを示す。

【0029】

【図2】図２は、実験３の結果を示す。

【0030】

以下のｓｇＲＮＡ配列を有する：ｖ１ 配列番号：３；ｖ４ 配列番号：４０；ｖ４．２ 配列番号：４１；ｖ４．３ 配列番号：４２；ｖ４．４ 配列番号：４３；ｖ４．５ 配列番号：４４；及びｖ４．６、ｖ５、ｖ５．２、ｖ５．３、ｖ５．４、ｖ５．５、ｖ５．６は、より低活性又は非活性配列である。

【0031】

全てのｓｇＲＮＡは、それらの３’末端に実施例３による２３ヌクレオチド長のＴＣＲＡ配列特異的領域を含む。実線の棒はＴＣＲＡガイド１、斜線の棒はＴＣＲＡガイド２である。

【発明を実施するための形態】

【0032】

配列表の参照

【0033】

本明細書に開示される配列は、ＢＨＣ２１１０３７－ＦＣ＿ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿ｌｉｓｔｉｎｇ．ｘｍｌという名称の配列表に含まれる。配列番号：１（Ｂ－ＧＥｎ．１タンパク質）及び配列番号：２（Ｂ－ＧＥｎ．２タンパク質）の配列も印刷される。

【0034】

配列表に記載されている配列の概要

【0035】

【表1-1】

【表1-2】

【0036】

配列番号：１

【0037】

Met Thr Ile Arg Ser Met Lys Leu Lys Leu Lys Ile Tyr Ser Gly Arg
1 5 10 15
Ser Ala Pro Gln Leu Arg Gln Gly Leu Trp Arg Leu His Arg Leu Leu
20 25 30
Asn Glu Gly Thr Ala Tyr Tyr Met Asp Trp Leu Val His Met Arg Gln
35 40 45
Glu Ala Leu Pro Gly Lys Ser Lys Glu Glu Ile Arg Ala Glu Leu Glu
50 55 60
Arg Arg Val Arg Gln Gln Gln Glu Lys Asn Gly Val Gln Asn Asp Gln
65 70 75 80
Val Pro Met Asp Glu Val Leu Ser Ala Leu Arg Gln Leu Tyr Glu Leu
85 90 95
Leu Val Pro Ser Ala Val Asn Asn Ser Gly Asp Ala Gln Thr Leu Ser
100 105 110
Arg Lys Phe Leu Ser Pro Leu Val Asp Pro Asn Ser Glu Gly Gly Lys
115 120 125
Gly Thr Ser Asn Ala Gly Ala Lys Pro Gly Trp Arg Lys Lys Gln Glu
130 135 140
Ala Gly Asp Pro Ser Trp Glu Lys Asp Tyr Glu Arg Trp Leu Lys Arg
145 150 155 160
Lys Gln Ala Asp Pro Thr Ala Glu Ile Leu Gly Lys Leu Glu Thr Ala
165 170 175
Gly Leu Lys Pro Leu Phe Pro Leu Tyr Thr Asn Glu Val Lys Asp Ile
180 185 190
Arg Trp Met Pro Leu Thr Ser Lys Gln Tyr Val Arg Asn Trp Asp Arg
195 200 205
Asp Met Phe Gln Gln Ala Ile Glu His Leu Leu Ser Trp Glu Thr Trp
210 215 220
Asn Arg Lys Val Asn Glu Glu Arg Ala Lys Leu Lys Glu Thr Val Arg
225 230 235 240
Arg Phe Glu Glu Gln His Leu Ala Asn Gly Lys Asp Trp Leu Ser Pro
245 250 255
Leu Gln Ala Tyr Glu Ala Asn Arg Glu Gln Ala Leu Arg Asp Met Ala
260 265 270
Ile Ser Pro Ser Asp Arg Phe Arg Ile Thr Arg Arg Gln Ile Lys Gly
275 280 285
Trp Ser Glu Leu Tyr Glu Arg Trp Asn Lys Leu Ala Pro Thr Ala Ser
290 295 300
Val Glu Ala Tyr Met Gln Glu Val Arg His Val Gln Lys Lys Leu Gly
305 310 315 320
Gly Thr Phe Gly Asp Ala Asp Leu Tyr Arg Phe Leu Ala Lys Pro Glu
325 330 335
Asn Val His Ile Trp Arg Asp His Gln Glu Arg Leu His Tyr Tyr Ala
340 345 350
Ala Tyr Asn Asp Leu His Lys Arg Leu Met Ser Ala Lys Glu Gln Ala
355 360 365
Ala Phe Thr Leu Pro Asp Pro Val Ala His Pro Leu Trp Val Arg Phe
370 375 380
Asp Ala Arg Asp Gly Asn Leu Phe Thr Tyr Ile Leu Gln Ala Asp Ser
385 390 395 400
Ser Lys Gln Arg Ser Arg Arg Tyr Val Asn Phe Ser Arg Phe Leu Trp
405 410 415
Pro Val Glu Asp Gly Tyr Phe Glu Glu Thr Glu Asn Val Lys Val Glu
420 425 430
Leu Ala Leu Ser Lys Gln Phe Tyr Arg Gln Val Ile Val His Asp Asn
435 440 445
Pro Thr Gly Lys Gln Lys Ile Thr Phe Gln Asp Tyr Ser Ser Lys Glu
450 455 460
Ile Leu Glu Gly His Leu Gly Gly Ala Lys Leu Gln Leu Asp Arg Asn
465 470 475 480
Phe Leu Arg Lys Ser Gly Arg Asp Phe Glu Thr Gly Asp Phe Gly Pro
485 490 495
Ala Phe Leu Asn Val Val Leu Asp Leu Lys Pro Lys Gln Glu Val Lys
500 505 510
Asn Gly Arg Leu Gln Ser Pro Leu Gly Gln Ala Leu Leu Val Lys Ser
515 520 525
Arg Pro Asn Asp Ile Pro Lys Val Tyr Gly Tyr Lys Pro Asp Ala Leu
530 535 540
Ala Ala Trp Leu Glu Gln Ala Ser Gly Glu Glu Ser Leu Gly Ser Glu
545 550 555 560
Ser Leu Arg Gln Gly Phe Arg Val Met Ser Ile Asp Leu Gly Val Arg
565 570 575
Ser Ala Ala Ala Ile Ser Val Phe Ser Val Lys Gly Glu Lys Thr Arg
580 585 590
Glu Gly Asp Lys Val Cys Tyr Pro Val Gly Glu Thr Gly Leu Phe Ala
595 600 605
Val His Asp Arg Ser Phe Leu Leu Arg Leu Pro Gly Glu Ser Ser Glu
610 615 620
Lys Arg Val Asn Val Glu Arg Asp Lys Arg Lys Thr Glu Arg Met Gln
625 630 635 640
Ile Arg Tyr His Ile Arg Thr Leu Ala Arg Val Leu Arg Leu Ala Asn
645 650 655
Lys Ala Thr Pro Met Asp Arg Ile Lys Ala Val Gln Asp Val Leu Asn
660 665 670
Asp Ile Glu Ser Thr Arg Phe Met Asn Asp His Asp His His Val Tyr
675 680 685
Asn His Ala Leu Glu Thr Leu Arg Thr Tyr Ala Pro Asp His Gln Gly
690 695 700
Ile Trp Glu Glu Gln Val Ile Ala Ala His Arg Gln Leu Glu His His
705 710 715 720
Val Gly Val Ile Val Gly Glu Trp Arg Lys Asn Trp Gly Lys Asp Arg
725 730 735
Arg Gly Thr Val Gly Leu Ser Met Asp Asn Ile Glu Glu Leu Asp Glu
740 745 750
Met Arg Arg Leu Leu Ile Ser Trp Ser Arg Arg Ala Arg Tyr Pro Arg
755 760 765
Glu Ala Lys Pro Phe Gln Val Asn Glu Ser Asn Pro Val His Leu Leu
770 775 780
Arg His Leu Gln Asn Leu Lys Glu Asp Arg Leu Lys Gln Leu Ala Asn
785 790 795 800
Leu Ile Val Met Thr Ala Leu Gly Tyr Val Tyr Asp Ser Lys Glu Lys
805 810 815
Lys Trp Lys Ala Ala Tyr Pro Ala Cys Gln Leu Ile Leu Phe Glu Asp
820 825 830
Leu Gln Arg Tyr Arg Phe His Leu Asp Arg Ser Ala Arg Glu Asn Ser
835 840 845
Gln Leu Met Lys Trp Ala His Arg Ser Ile Pro Lys Tyr Val Trp Met
850 855 860
Gln Gly Glu Pro Tyr Gly Leu Gln Ile Gly Asp Val Trp Ala Gly Phe
865 870 875 880
Thr Ser Arg Tyr His Ala Lys Thr Gly Ala Pro Gly Ile Arg Cys Lys
885 890 895
Ala Leu Thr Glu Lys Asp Phe Gln Gln Gly Arg Leu Leu Glu Ser Leu
900 905 910
Val Ala Glu Gly Met Phe Thr Leu Gln Glu Val Gly Thr Leu Lys Pro
915 920 925
Gly Asp Ile Val Pro Ala Glu Gly Gly Glu Leu Phe Val Thr Leu Ala
930 935 940
Asp Asp Ser Gly Asp Arg Ile Val Ile Thr His Ala Asp Ile Asn Ala
945 950 955 960
Ala Gln Asn Val Gln Lys Arg Phe Trp Leu Ala Asn Ser Glu Arg Phe
965 970 975
Arg Val Ala Cys Arg Ser Val Gln Ile Ala Ser Gln Glu Cys Phe Ile
980 985 990
Pro Ser Ser Glu Ser Val Ala Lys Lys Met Gly Lys Gly Val Phe Val
995 1000 1005
Arg Asp Phe Ser Phe His Lys Asp Met Glu Val Tyr His Trp Asn Asn
1010 1015 1020
Gln Val Lys Leu Thr Ala Lys Asn Val Pro Thr Asp His Ser Asp Asp
1025 1030 1035 1040
Leu Gln Asp Leu Gln Asp Tyr Gln Ala Ile Leu Glu Glu Ala Arg Glu
1045 1050 1055
Ser Ser Ser Ser Tyr Lys Thr Leu Phe Arg Asp Pro Ser Gly Phe Phe
1060 1065 1070
Phe Pro Asp Asp Val Trp Val Pro Gln Asn Ile Tyr Trp Arg Glu Val
1075 1080 1085
Lys Lys Thr Ile Thr Ala Leu Leu Arg Lys Arg Ile Met Ser Thr
1090 1095 1100

【0038】

配列番号：２

【0039】

Met Pro Ile Arg Ser Phe Lys Leu Lys Leu Val Thr His Asn Gly Asp
1 5 10 15
Ser Thr Tyr Met Asp Lys Leu Arg Arg Gly Leu Trp Lys Thr His Val
20 25 30
Ile Ile Asn Arg Gly Ile Ala Tyr Tyr Met Asn Thr Leu Ala Leu Met
35 40 45
Arg Gln Glu Pro Tyr Gly Ser Lys Ser Arg Glu Glu Val Arg Leu Asp
50 55 60
Leu Leu Ser Thr Leu Arg Glu Gln Gln Arg Arg Asn Asn Trp Ser Glu
65 70 75 80
Gln Thr Gly Thr Asp Asp Glu Leu Leu Ser Leu Ser Arg Arg Val Tyr
85 90 95
Glu Leu Leu Val Pro Ser Ala Ile Gly Glu Lys Gly Asp Ala Gln Met
100 105 110
Leu Ser Arg Lys Phe Leu Ser Pro Leu Val Asp Pro Asn Ser Glu Gly
115 120 125
Gly Arg Gly Thr Ala Lys Ser Gly Arg Lys Pro Arg Trp Lys Lys Met
130 135 140
Met Glu Glu Gly His Pro Asp Trp Glu Lys Glu Lys Glu Lys Asp Ala
145 150 155 160
Ala Lys Lys Ala Glu Asp Pro Thr Ala Ser Ile Leu Ala Asp Leu Glu
165 170 175
Ala Val Gly Leu Leu Pro Leu Phe Pro Leu Phe Ser Asp Glu Gln Lys
180 185 190
Glu Ile Arg Trp Leu Pro Lys Lys Lys Arg Gln Phe Val Arg Thr Trp
195 200 205
Asp Arg Asp Met Phe Gln Gln Ala Leu Glu Arg Met Leu Ser Trp Glu
210 215 220
Ser Trp Asn Arg Arg Val Ala Glu Glu Tyr Leu Lys Leu Gln Ala Gln
225 230 235 240
Arg Asp Glu Val Tyr Ala Lys Tyr Leu Glu Asp Ala Gly Ser Trp Leu
245 250 255
Asn Asp Leu Gln Thr Phe Glu Lys Gln Arg Glu Glu Glu Leu Ala Glu
260 265 270
Val Ser Phe Glu Pro Asn Ser Glu Tyr Leu Ile Thr Arg Arg Gln Ile
275 280 285
Arg Gly Trp Lys Glu Val Tyr Glu Lys Trp Ser Lys Thr Ser Glu Asn
290 295 300
Ala Ser Gln Glu Gln Leu Trp Arg Met Val Ala Asp Val Gln Thr Ala
305 310 315 320
Met Ala Gly Ala Phe Gly Asp Pro Lys Val Tyr Gln Phe Leu Ser Gln
325 330 335
Pro Lys His His His Ile Trp Arg Glu His Pro Asn Arg Leu Phe Tyr
340 345 350
Tyr Ser Lys Tyr Asn Glu Val Arg Glu Lys Leu Asn Arg Ala Lys Lys
355 360 365
Gln Ala Ala Phe Thr Leu Pro Asp Pro Val Glu His Pro Leu Trp Thr
370 375 380
Arg Phe Asp Ala Arg Gly Gly Asn Ile His Asp Tyr Glu Ile Ser Lys
385 390 395 400
Val Gly Lys Gln Tyr His Val Thr Phe Ser Ser Leu Ile Leu Pro Glu
405 410 415
Ala Gln Ser Trp Val Glu Ile Glu Asn Val Thr Val Gly Ile Gly Asn
420 425 430
Ser Leu Gln Leu Lys Arg Gln Ile Arg Leu Asp Gly Tyr Ala Asp Lys
435 440 445
Lys Gln Lys Val Lys Tyr Tyr Asp Tyr Ser Ser Arg Phe Glu Leu Thr
450 455 460
Gly Val Leu Gly Gly Ala Lys Ile Gln Phe Asp Arg Lys His Leu Lys
465 470 475 480
Lys Ala Ala His Arg Leu Ala Glu Gly Glu Thr Gly Pro Ile Phe Leu
485 490 495
Asn Val Val Val Asp Val Glu Pro Phe Leu Glu Val Lys Asn Gly Arg
500 505 510
Leu Arg Thr Pro Leu Gly Gln Val Leu Gln Val Asn Thr Arg Asp Trp
515 520 525
Pro Lys Val Val Asp Tyr Lys Ala Lys Glu Leu Ser Val Leu Met Glu
530 535 540
Asn Thr Gln Ile Gly Asn Glu Asn Gly Val Ser Thr Ile Glu Ala Gly
545 550 555 560
Met Arg Ile Met Ser Ile Asp Leu Gly Gln Arg Thr Ala Ala Ala Val
565 570 575
Ser Ile Phe Glu Val Ile Ser Lys Lys Pro Asp Glu Lys Glu Thr Lys
580 585 590
Leu Phe Tyr Pro Ile Ala Asp Thr Asp Leu Tyr Ala Val His Arg Arg
595 600 605
Ser Leu Leu Leu Arg Leu Pro Gly Glu Glu Ile Ser Ser Lys Lys Met
610 615 620
Ile Glu Lys Arg Lys Glu Arg Ala Arg Ile Arg Ser Leu Val Arg Tyr
625 630 635 640
Gln Ile Arg Leu Leu Ser Glu Val Leu Arg Leu His Thr Gln Gly Thr
645 650 655
Ala Glu Gln Arg Arg Phe Lys Leu Asp Glu Leu Leu Val Ser Ile Gln
660 665 670
Lys Lys Leu Glu Leu Asp Gln Ser Glu Trp Ile Ser Glu Leu Glu Lys
675 680 685
Leu Phe Asp Tyr Ile Asp Glu Ser Ala Glu Lys Trp Lys Glu Ala Leu
690 695 700
Val Val Ala His Arg Thr Leu Glu Pro Ile Val Val Glu Ala Val Arg
705 710 715 720
Asn Trp Lys Lys Ser Leu Ser Lys Glu Asn Lys Asp Arg Arg Arg Ile
725 730 735
Ala Gly Ile Ser Ile Trp Ser Ile Glu Glu Leu Glu Glu Thr Arg Lys
740 745 750
Leu Leu Ile Ala Trp Ser Lys His Ser Arg Glu Pro Gly Ile Pro Lys
755 760 765
Arg Leu Glu Lys Glu Glu Thr Phe Ala Pro Glu His Leu Gln His Ile
770 775 780
Gln Asn Val Lys Asp Asp Arg Leu Lys Gln Met Ala Asn Leu Phe Val
785 790 795 800
Met Thr Ala Leu Gly Tyr Lys Tyr Asp Glu Gly Asn Lys Arg Trp Val
805 810 815
Glu Ala Tyr Pro Ala Cys Gln Val Ile Leu Phe Glu Asp Leu Ser Arg
820 825 830
Tyr Arg Phe Ala Leu Asp Arg Pro Arg Arg Glu Asn Asn Arg Leu Met
835 840 845
Lys Trp Ala His Arg Ser Ile Pro Arg Leu Thr Tyr Met Gln Ala Glu
850 855 860
Leu Phe Gly Ile Gln Val Gly Asp Val Tyr Ser Ala Tyr Thr Ser Arg
865 870 875 880
Phe His Ala Lys Thr Gly Ala Pro Gly Ile Arg Cys His Ala Leu Thr
885 890 895
Glu Ala Asp Leu Gln Ser Asn Ser Tyr Val Val Asn Gln Leu Ile Lys
900 905 910
Asp Lys Phe Ile Gln Asp Asn Gln Thr Glu Ile Leu Lys Ala Gly Gln
915 920 925
Ile Val Pro Trp Gln Gly Gly Glu Leu Phe Val Thr Phe Ala Asp Arg
930 935 940
Ser Gly Ala Ser Leu Ala Val Ile His Ala Asp Ile Asn Ala Ala Gln
945 950 955 960
Asn Leu Gln Lys Arg Phe Trp Gln His Asn Ser Glu Val Phe Arg Val
965 970 975
Pro Cys Lys Val Val Lys Gly Gly Leu Val Pro Val Tyr Glu Lys Met
980 985 990
Arg Lys Leu Phe Gly Lys Gly Leu Phe Val Asn Ile Asp Asp Pro Glu
995 1000 1005
Ser Lys Glu Val Tyr Arg Trp Glu His Ser Thr Lys Met Lys Ser Lys
1010 1015 1020
Thr Thr Pro Val Asp Leu Glu Ser Glu Asp Ile Asp His Glu Glu Leu
1025 1030 1035 1040
Ser Asp Glu Trp Glu Asp Met Gln Glu Gly Tyr Lys Thr Leu Leu Arg
1045 1050 1055
Asp Pro Ser Gly Phe Phe Trp Ser Ser Asp Ser Trp Ile Pro Gln Lys
1060 1065 1070
Asp Phe Trp Ile Arg Val Lys Ser Arg Ile Gly Lys Ser Leu Arg Glu
1075 1080 1085
Gln Ile Arg
1090

【0040】

発明の詳細な説明

【0041】

本出願は、新規のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼ及びそのようなヌクレアーゼに基づく遺伝子編集系を提供する。新規のヌクレアーゼは、本明細書において、Ｂ－ＧＥｎヌクレアーゼ又はＢ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２ヌクレアーゼと称される。

【0042】

一般に、Ｂ－ＧＥｎヌクレアーゼの群は以下のメンバーを含み、これらはテーブル１に記載されている：

【0043】

【表2】

【0044】

本発明による一実施形態は、配列番号：１、２、及び３９と比較してアミノ酸レベルで少なくとも８０％同一であるポリペプチド又はそれをコードする核酸である。

【0045】

本発明による１つの好ましい実施形態は、配列番号１、２、及び３９と比較してアミノ酸レベルで少なくとも８５％同一であるポリペプチド又はそれをコードする核酸である。

【0046】

本発明による１つのより好ましい実施形態は、配列番号１、２、及び３９と比較してアミノ酸レベルで少なくとも９０％同一であるポリペプチド又はそれをコードする核酸である。

【0047】

本発明による１つのさらにより好ましい実施形態は、配列番号１、２、及び３９と比較してアミノ酸レベルで少なくとも９５％同一であるポリペプチド又はそれをコードする核酸である。

【0048】

本発明による１つの特に好ましい実施形態は、配列番号１、２、及び３９と比較してアミノ酸レベルで少なくとも９９％同一であるポリペプチド又はそれをコードする核酸である。

【0049】

本発明による１つの非常に特に好ましい実施形態は、配列番号１、２、及び３９と比較してアミノ酸レベルで少なくとも９９．５％同一であるポリペプチド又はそれをコードする核酸である。

【0050】

本発明によるさらに別の実施形態は、以下のＢ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２のバリアントである：

【0051】

（Ｉ）配列番号１又は２のいずれかによる配列に対して、それらの全長にわたって、少なくとも８０％の、アミノ酸同一性の好ましい順位が増大するバリアント、例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％のアミノ酸同一性のバリアント。

【0052】

（ＩＩ）例えば、無細胞反応又は原核細胞だけでなく、植物又は動物のような生きた生物を含む真核細胞環境においても、Ｂ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２ ＣＲＩＳＰＲ系の適切な活性を得るための核局在化シグナルとしての追加の成分を含む（Ｉ）によるバリアント；

【0053】

（ＩＩＩ）Ｂ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２並びに（Ｉ）及び（ＩＩ）によるバリアントをコードする対応するポリヌクレオチド配列のコドン最適化バリアント。

【0054】

特に明記しない限り、用語Ｂ－ＧＥｎ及びＢ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２は、（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）で特定される全てのバリアントを含む。

【0055】

本発明によるさらに別の実施形態は、以下のアミノ酸交換：単独であるか、２つ又は好ましくは３つ全ての組み合わせでの、Ｌ２３５Ｑ、Ｋ６７３Ｒ、Ｄ１０３６Ｅ、を有するＢ－ＧＥｎ．１の以下のバリアント、特に配列番号：３９によるＢ－ＧＥｎ．１のバリアントである：

【0056】

（Ｉ）配列番号１又は３９のいずれかに記載の配列に対して、それらの全長にわたって、少なくとも８０％の、アミノ酸同一性の好ましい順位が増大するバリアント、例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％のアミノ酸同一性のバリアント。

【0057】

（ＩＩ）例えば、無細胞反応又は原核細胞だけでなく、植物又は動物のような生きた生物を含む真核細胞環境においても、Ｂ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．１．２ ＣＲＩＳＰＲ系の適切な活性を得るための核局在化シグナルとしての追加の成分を含む（Ｉ）によるバリアント；

【0058】

（ＩＩＩ）Ｂ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．１．２並びに（Ｉ）及び（ＩＩ）によるバリアントをコードする対応するポリヌクレオチド配列のコドン最適化バリアント。

【0059】

特に明記しない限り、用語Ｂ－ＧＥｎ及びＢ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２は、（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）で特定される全てのバリアントを含む。

【0060】

Ｂ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２に基づくＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系

【0061】

本発明による一実施形態は、組成物であって、以下の：
（ａ）Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド、又はそのようなＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２をコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）シングル異種ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）又はイン・サイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）でのそのようなｓｇＲＮＡの生成を可能にするＤＮＡであって：
ｉ．ＲＮＡで構成され、ポリヌクレオチド遺伝子座中の標的配列にハイブリダイズすることができる人工ＤＮＡ標的化セグメント、
ｉｉ．ＲＮＡで構成されたｔｒａｃｒメイト配列、及び
ｉｉｉ．ＲＮＡで構成されたｔｒａｃｒ ＲＮＡ配列を含み、
ここで、ｔｒａｃｒメイト配列が、ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし、（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）が５’から３’への方向に配置されているｓｇＲＮＡ又はＤＮＡ
を含む組成物を表す。

【0062】

ｓｇＲＮＡ内で、ｔｒａｃｒメイト配列及びｔｒａｃｒ配列は一般に、好適なループ配列によって連結され、ステム－ループ構造を形成する。

【0063】

Ｂ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２を含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系の使用のための好適なＰＡＭ配列

【0064】

Ｂ－ＧＥｎ．１及びＢ－ＧＥｎ．２の機能は、標的配列上の好適なプロトスペーサー隣接モチーフ（「ＰＡＭ」）配列を必要とする。

【0065】

好適なＰＡＭ配列をテーブル２に列挙し、ここで、人工ＤＮＡ標的化セグメントは、その３’末端において、標的ＤＮＡセグメント上のＰＡＭ配列に直接隣接しているか、又はそのようなＰＡＭ配列は、その５’部分における標的ＤＮＡ配列の一部である。

【0066】

テーブル２：対応するＢ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２エンドヌクレアーゼに好適なＰＡＭ配列

【0067】

【表3】

【0068】

ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系におけるＢ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２の使用に好適なｔｒａｃｒ配列

【0069】

ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系におけるＢ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２の使用に好適なｔｒａｃｒ配列をテーブル３に列挙する。あるいは、これらの配列のバリアントを用いることができる。バリアントは、そのような配列の部分又は切断型のいずれか、及び／又は配列の１つ又は複数の場所に塩基改変を有する配列を含むことができる。それぞれのＤＮＡ配列は、それぞれ、配列番号：５及び６に開示されている。

【0070】

テーブル３

【0071】

【表4】

【0072】

いくつかの実施形態において、Ｂ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２をコードするポリヌクレオチド及びｓｇＲＮＡは、細胞内又はイン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）環境における発現のための好適なプロモーター及び／又は好適な核局在化シグナルを含有する。

【0073】

本発明による別の実施形態は、細胞内又はイン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）での１つ又は複数の位置で標的ＤＮＡを標的化、編集、改変、又は操作する方法であって、以下の：

【0074】

（ａ）異種Ｂ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又は同じタンパク質をコードする核酸を細胞内又はイン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）環境に導入するステップと；及び

【0075】

（ｂ）シングル異種ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）又はイン・サイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）でのそのようなｓｇＲＮＡの生成に好適なＤＮＡを導入するステップであって：

【0076】

ｉ．ＲＮＡで構成され、ポリヌクレオチド遺伝子座中の標的配列にハイブリダイズすることができる人工ＤＮＡ標的化セグメント、

【0077】

ｉｉ．ＲＮＡで構成されたｔｒａｃｒメイト配列、及び

【0078】

ｉｉｉ．ＲＮＡで構成されたｔｒａｃｒ ＲＮＡ配列を含み、ここで、ｔｒａｃｒメイト配列が、ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズすることができ、（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）は、５’から３’への方向に配置されているステップと；

【0079】

（ｃ）：標的ＤＮＡにおいて１つ又は複数のカット、ニック又は編集を創出するステップであって、ここで、Ｂ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチドは、そのプロセシングされた形態又はプロセシングされていない形態のｇＲＮＡによって標的ＤＮＡに方向づけられるステップと
を含む方法を表す。

【0080】

本発明による別の実施形態は、細胞中又はイン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）での１つ又は複数の位置で標的ＤＮＡを標的化、編集、改変、又は操作するための組成物の使用であって、

【0081】

（ａ）Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド、又はそのようなＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２をコードするポリヌクレオチド；

【0082】

（ｂ）シングル異種ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）又はイン・サイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）でのそのようなｓｇＲＮＡの生成に好適なＤＮＡであって：

【0083】

ｉ．ＲＮＡで構成され、ポリヌクレオチド遺伝子座中のそのような標的配列にハイブリダイズすることができる人工ＤＮＡ標的化セグメント、

【0084】

ｉｉ．ＲＮＡで構成されたｔｒａｃｒメイト配列、及び

【0085】

ｉｉｉ．ＲＮＡで構成されたｔｒａｃｒ ＲＮＡ配列を含み、ここで、ｔｒａｃｒメイト配列が、ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし、（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）が、５’から３’への方向に配置されているｓｇＲＮＡ又はＤＮＡ
を含む組成物の使用である。

【0086】

本発明による別の実施形態は、エクス・ビボ（ｅｘ ｖｉｖｏ）又はイン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）の細胞であって：

【0087】

（ａ）異種Ｂ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそれをコードする核酸、

【0088】

（ｂ）シングル異種ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）又はイン・サイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）でそのようなｓｇＲＮＡの生成に好適なＤＮＡであって：

【0089】

ｉ．ＲＮＡで構成され、ポリヌクレオチド遺伝子座中のそのような標的配列にハイブリダイズすることができる人工ＤＮＡ標的化セグメント、

【0090】

ｉｉ．ＲＮＡで構成されたｔｒａｃｒメイト配列、及び

【0091】

ｉｉｉ．ＲＮＡで構成されたｔｒａｃｒ ＲＮＡ配列を含み、ここで、ｔｒａｃｒメイト配列が、ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし、（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）は、５’から３’への方向に配置されているｓｇＲＮＡ又はＤＮＡ
を含む細胞、又は上記（ａ）及び（ｂ）を用いてそのゲノムが標的化、編集、改変、又は操作されているそのような細胞である。

【0092】

本発明によるさらなる実施形態は、キットであって：

【0093】

（ａ）Ｂ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２をコードする核酸配列であって、ここで、Ｂ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２をコードする核酸配列が、プロモーター又はリボソーム結合部位に作動可能に連結されている核酸配列；

【0094】

（ｂ）シングル異種ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）又はイン・サイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）でそのようなｓｇＲＮＡの生成に好適なＤＮＡであって：

【0095】

ｉ．ＲＮＡで構成され、ポリヌクレオチド遺伝子座中のそのような標的配列にハイブリダイズすることができる人工ＤＮＡ標的化セグメント、

【0096】

ｉｉ．ＲＮＡで構成されたｔｒａｃｒメイト配列、及び

【0097】

ｉｉｉ．ＲＮＡで構成されたｔｒａｃｒ ＲＮＡ配列を含み、ここで、ｔｒａｃｒメイト配列が、ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし、（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）が、５’から３’への方向に配置されているｓｇＲＮＡ又はＤＮＡ
を含むキットであるか、
又は

【0098】

（ａ）Ｂ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２タンパク質；

【0099】

（ｂ）１つ又は複数のシングル異種ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であって、それぞれが：

【0100】

ｉｖ．ＲＮＡで構成され、ポリヌクレオチド遺伝子座中のそのような標的配列にハイブリダイズすることができる人工ＤＮＡ標的化セグメント、

【0101】

ｖ．ＲＮＡで構成されたｔｒａｃｒメイト配列、及び

【0102】

ｖｉ．ＲＮＡで構成されたｔｒａｃｒ ＲＮＡ配列を含み、ここで、ｔｒａｃｒメイト配列が、ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし、（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）が、５’から３’への方向に配置されているｓｇＲＮＡ
を含むキット。

【0103】

本発明によるさらに別の実施形態は、細胞中又はイン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）での１つ又は複数の位置で１つ又は複数の標的ＤＮＡを標的化、編集、改変、又は操作するための組成物及び方法であって：

【0104】

（ａ）Ｂ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２

【0105】

（ｂ）ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）又はイン・サイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）でのそのようなｇＲＮＡの生成に好適なＤＮＡであって：

【0106】

ｉ．ＲＮＡで構成され、ポリヌクレオチド遺伝子座中のそのような標的配列にハイブリダイズすることができる人工ＤＮＡ標的化セグメント、

【0107】

ｉｉ．ＲＮＡで構成されたｔｒａｃｒ ＲＮＡ配列を含み、ここで、（ｉ）及び（ｉｉ）が、１つのシングルＲＮＡ分子であり、（ｉｉｉ）が、別のＲＮＡ分子上にあるｇＲＮＡ又はＤＮＡ
を含む組成物及び方法を含む。

【0108】

マルチプレックス化

【0109】

別の態様では、本明細書で提供されるのは、細胞内の複数の位置においてＤＮＡを編集又は改変する方法であって、ｉ）Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチドをコードする核酸を細胞に導入するステップと；及びｉｉ）ＲＮＡとしての、又はＤＮＡとしてコードされ、１つのプロモーターの制御下の、２つ以上のプレ－ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（プレ－ｃｒＲＮＡ）を含むシングル異種核酸を細胞に導入するステップであって、各ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡが、リピートスペーサーアレイ又はリピートスペーサーを含むステップとから本質的になり、ここで、スペーサーが、ＤＮＡ中の標的配列に相補的な核酸配列を含み、リピートが、ステムループ構造を含み、Ｂ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチドが、ステムループ構造の上流にある２つ以上のプレ－ｃｒＲＮＡを切断し、２つ以上の中間体ｃｒＲＮＡを生成し、２つ以上の中間体ｃｒＲＮＡが、２つ以上の成熟ｃｒＲＮＡにプロセシングされ、２つ以上の成熟ｃｒＲＮＡが、Ｂ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチドをガイドして、２つ以上の二本鎖切断（ＤＳＢ）をＤＮＡにもたらす方法である。例えば、Ｂ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２の１つの利点は、導入時に、Ｂ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２によってプロセシングされるいくつかのリピートスペーサー単位を含む１つのみのプレｃｒＲＮＡのみを、ＤＮＡ上のいくつかの異なる配列を標的とする活性リピートスペーサー単位に導入することが可能であることである。

【0110】

別の態様では、本明細書で提供されるのは、細胞内の複数の位置でＤＮＡを編集又は改変する方法であって、本質的に、ｉ）エンドリボヌクレアーゼ活性が低下したＢ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２の形態を、ポリペプチド又はＢ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチドをコードする核酸として、細胞に導入するステップ；及びｉｉ）ＲＮＡとしての、又はＤＮＡとしてコードされ、１つ又は複数のプロモーターの制御下の、１つ又は複数のプレ－ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（プレ－ｃｒＲＮＡ）、中間体ｃｒＲＮＡ又は成熟ｃｒＲＮＡを含むシングル異種核酸を導入するステップであって、各ｃｒＲＮＡが、リピートスペーサーアレイを含み、スペーサーが、ＤＮＡ中の標的配列に相補的な核酸配列を含み、リピートが、ステムループ構造を含むステップとから本質的になり、ここで、Ｂ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチドが、エンドリボヌクレアーゼ活性が低下又は消失しており、シングル異種核酸中の１つ又は複数のスペーサー配列によって方向づけられように完全なエンドヌクレアーゼ有する１つ又は複数のシングル異種ＲＮＡに結合する方法。

【0111】

いくつかの実施形態では、シングル異種核酸中のプレ－ｃｒＲＮＡ配列は、特異的な位置、配向、配列で、又は特異的な化学的連結により一緒に連結されて、異なるｃｒＲＮＡ配列によって特定される部位のそれぞれにおいてＢ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２のエンドヌクレアーゼ活性を指向又は差次的に調節する。

【0112】

別の態様では、本明細書で提供されるのは、細胞内の複数の位置でＤＮＡの構造又は機能を編集又は改変するための一般的な方法の例であり、ｉ）ＲＮＡガイド化エンドヌクレアーゼ、例えばＢ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２を、ポリペプチド又はＲＮＡガイド化エンドヌクレアーゼをコードする核酸として、細胞に導入するステップ；及びｉｉ）ＲＮＡとしての、又はＤＮＡとしてコードされ、１つ又は複数のプロモーターの制御下の、２つ以上のガイドＲＮＡを含むか又はコードするシングル異種核酸を導入するステップから本質的になり、ここで、ＲＮＡガイド化エンドヌクレアーゼの活性又は機能は、シングル異種核酸中のガイドＲＮＡ配列によって方向づけられる、方法の例である。

【0113】

定義

【0114】

本明細書で互換的に使用される「ポリヌクレオチド」、「核酸」、及び「核酸」という用語は、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドのいずれかの長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。したがって、この用語は、一本鎖、二本鎖、若しくは多本鎖のＤＮＡ若しくはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド／三重ヘリックス、又はプリン塩基及びピリミジン塩基を含むか、若しくは他の天然、化学的若しくは生化学的に改変された、非天然の、若しくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーを含むが、これらに限定されない。

【0115】

「オリゴヌクレオチド」は一般に、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡの約５～約１００ヌクレオチドの間のポリヌクレオチドを指す。しかしながら、本開示の目的のために、オリゴヌクレオチドの長さに上限はない。オリゴヌクレオチドはまた、「オリゴマー」又は「オリゴ」としても知られ、遺伝子から単離され得るか、又は当技術分野で公知の方法によって化学的に合成され得る。「ポリヌクレオチド」及び「核酸」という用語は、記載されている実施形態に適用可能な場合、一本鎖（センス又はアンチセンスなど）及び二本鎖ポリヌクレオチドを含むと理解されるべきである。

【0116】

「ゲノムＤＮＡ」は、細菌、真菌、古細菌、原生生物、ウイルス、植物又は動物のゲノムのＤＮＡを含むが、これらに限定されない生物のゲノムのＤＮＡを指す。

【0117】

ＤＮＡを「操作する」という用語は、結合、１本鎖のニッキング、又は切断、例えば、ＤＮＡの両方の鎖の切断を包含するか、又はＤＮＡ若しくはＤＮＡに会合するポリペプチドを改変若しくは編集することを包含する。ＤＮＡを操作することは、ＤＮＡによってコードされるＲＮＡ若しくはポリペプチドの発現をサイレンシング、活性化、若しくは調節（増加若しくは減少する）することができ、又はポリペプチドのＤＮＡへの結合を防止若しくは増強することができる。

【0118】

「ステム－ループ構造」は、主に一本鎖ヌクレオチドの領域（ループ部分）によって一方の端で連結されている二本鎖（ステム部分）を形成することが知られているか又は予測される、ヌクレオチドの領域を含む二次構造を有する核酸を指す。用語「ヘアピン」及び「フォールドバック」構造はまた、ステムループ構造を指すために本明細書で使用される。そのような構造は当技術分野で周知であり、これらの用語は、当技術分野で周知の意味と一致して使用される。当技術分野で知られているように、ステムループ構造は、正確な塩基対合を必要としない。したがって、ステムは、１つ又は複数の塩基ミスマッチを含み得る。あるいは、塩基対合は正確であってもよく、例えば、いかなるミスマッチを含まなくてもよい。

【0119】

「ハイブリダイズ可能である」又は「相補的である」又は「実質的に相補的である」とは、核酸（例えば、ＲＮＡ又はＤＮＡ）が、適切な温度及び溶液イオン強度のイン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）及び／又はイン・ビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）条件下で、配列特異的で、逆平行で、様式（例えば、核酸が相補的な拡散に特異的に結合する）で、別の核酸に非共有結合すること、例えば、ワトソン・クリック塩基対及び／又はＧ／Ｕ塩基対を形成すること、「アニールする」、又は「ハイブリダイズする」ことを可能にするヌクレオチドの配列を含むことを意味する。当技術分野で知られているように、標準的なワトソン・クリック塩基対合には、以下が含まれる：アデニン（Ａ）とチミジン（Ｔ）の対合、アデニン（Ａ）とウラシル（Ｕ）の対合、及びグアニン（Ｇ）とシトシン（Ｃ）の対合［ＤＮＡ、ＲＮＡ］。加えて、２つのＲＮＡ分子間（例えば、ｄｓＲＮＡ）、グアニン（Ｇ）塩基対のウラシル（Ｕ）との間のハイブリダイゼーションについても、当技術分野で公知である。例えば、Ｇ／Ｕ塩基対合は、ｍＲＮＡ中のコドンとのｔＲＮＡアンチコドン塩基対合に関連する遺伝コードの縮重（例えば、冗長性）に部分的に関与する。本開示に関連して、ガイドＲＮＡ分子のタンパク質結合セグメント（ｄｓＲＮＡ二重鎖）のグアニン（Ｇ）は、ウラシル（Ｕ）に相補的であると考えられ、逆もまた同様である。したがって、Ｇ／Ｕ塩基対がガイドＲＮＡ分子のタンパク質結合セグメント（ｄｓＲＮＡ二重鎖）の所与のヌクレオチド位置で作製され得る場合、その位置は、非相補的であると見なされず、代わりに相補的であると見なされる。

【0120】

ハイブリダイゼーション及び洗浄条件は周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ （１９８９），特に、そのチャプター１１及び表１１．１；及びＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｗ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ（２００１）に例示されている。温度及びイオン強度の条件は、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。

【0121】

ハイブリダイゼーションは、塩基間のミスマッチが可能であるが、２つの核酸が相補的配列を含むことを必要とする。２つの核酸間のハイブリダイゼーションに適切な条件は、当技術分野で周知の変数である核酸の長さ及び相補性の程度に依存する。２つのヌクレオチド配列間の相補性の程度が大きいほど、それらの配列を有する核酸のハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）の値はより高くなる。短い一続きの相補性（例えば、３５以下、３０以下、２５以下、２２以下、２０以下、又は１８以下のヌクレオチドにわたる相補性）を有する核酸間のハイブリダイゼーションについては、ミスマッチの位置が重要になる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出、１１．７－１１．８を参照されたい）。一般に、ハイブリダイズ可能な核酸の長さは、少なくとも１０ヌクレオチドである。ハイブリダイズ可能な核酸の例示的な最小長は、少なくとも１５ヌクレオチド；少なくとも２０ヌクレオチド；少なくとも２２ヌクレオチド；少なくとも２５ヌクレオチド；及び少なくとも３０ヌクレオチドである。さらに、当業者は、温度及び洗浄溶液の塩濃度が相補領域の長さ及び相補の程度などの因子に従って必要に応じて調整され得ることを認識するのであろう。

【0122】

ポリヌクレオチドの配列は、特異的にハイブリダイズ可能であるために、その標的核酸の配列と１００％相補的である必要はないことが、当技術分野において理解されている。さらに、ポリヌクレオチドは、介在セグメント又は隣接セグメントがハイブリダイゼーション事象（例えば、ループ構造又はヘアピン構造）に関与しないように、１つ又は複数のセグメントにわたってハイブリダイズし得る。ポリヌクレオチドは、それらが標的とする標的核酸配列内の標的領域に対する少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％の配列相補性を含むことができる。例えば、アンチセンス化合物の２０個のヌクレオチドのうちの１８個が標的領域に相補的であり、したがって特異的にハイブリダイズするアンチセンス核酸は、９０パーセントの相補性を表し得る。この例では、残りの非相補的ヌクレオチドは、クラスター化又は相補的ヌクレオチドと散在されていてもよく、互いに又は相補的ヌクレオチドに連続している必要はない。核酸内の特定の核酸配列間の相補性のパーセントは、ＢＬＡＳＴプログラム（基本的な局所アラインメント検索ツール）及び当技術分野で公知のＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９０，２１５，４０３－４１０；Ｚｈａｎｇ ａｎｄ Ｍａｄｄｅｎ，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，１９９７，７，６４９－６５６）を用いて、又はＧａｐプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ，Ｍａｄｉｓｏｎ Ｗｉｓ．）を用いて、又はＳｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．１９８１（２）４８２－４８９）のアルゴリズムを使用するデフォルト設定を用いて、ルーチン的に決定することができる。

【0123】

用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」は、本明細書において互換的に使用され、コード化及び非コード化アミノ酸、化学的又は生化学的に改変又は誘導体化されたアミノ酸、並びに改変ペプチド骨格を有するポリペプチドを含み得る、いずれかの長さのアミノ酸のポリマー形態を指す。

【0124】

本明細書で使用される「結合」（例えば、ポリペプチドのＲＮＡ結合ドメインに関して）は、高分子間（例えば、タンパク質と核酸との間）の非共有結合的相互作用を指す。非共有相互作用の状態では、高分子が「会合している」又は「相互作用する」又は「結合する」と言われる（例えば、分子Ｘが分子Ｙと相互作用すると言われる場合、分子Ｘが非共有結合的に分子Ｙに結合することを意味する）。結合相互作用の全ての成分が配列特異的である必要はないが（例えば、ＤＮＡ骨格中のリン酸残基との接触）、結合相互作用の一部は配列特異的であり得る。結合相互作用は一般に、１０^－６Ｍ未満、１０^－７Ｍ未満、１０^－８Ｍ未満、１０^－９Ｍ未満、１０^－１０Ｍ未満、１０^－１１Ｍ未満、１０^－１２Ｍ未満、１０^－１３Ｍ未満、１０^－１４Ｍ未満、又は１０^－１５Ｍ未満の解離定数（Ｋｄ）で特徴づけられる。「親和性」は、結合の強度を指し、結合親和性の増加は、より低いＫｄと相関する。

【0125】

「結合ドメイン」とは、別の分子に非共有結合的に結合することができるタンパク質ドメインを意味する。結合ドメインは例えば、ＤＮＡ分子（ＤＮＡ結合タンパク質）、ＲＮＡ分子（ＲＮＡ結合タンパク質）及び／又はタンパク質分子（タンパク質結合タンパク質）に結合することができる。タンパク質ドメイン結合タンパクの場合、それ自身に結合することができ（ホモダイマー、ホモトリマーなどを形成する）、また／又は、別のタンパク質（単数又は複数）の１つ又は複数の分子に結合することができる。

【0126】

「保存的アミノ酸置換」という用語は、類似の側鎖を有するアミノ酸残基のタンパク質における互換性を指す。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンからなる；脂肪族－ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の群は、セリン及びトレオニンからなる；アミド含有側鎖を有するアミノ酸の群は、アスパラギン及びグルタミンからなる；芳香族側鎖を有するアミノ酸の群は、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンからなる；塩基性側鎖を有するアミノ酸の群は、リシン、アルギニン、及びヒスチジンからなる；酸性側鎖を有するアミノ酸の群は、グルタメート及びアスパルテートからなる；並びに硫黄含有側鎖を有するアミノ酸の群は、システイン及びメチオニンからなる。例示的な保存的アミノ酸置換基は、バリン－ロイシン－イソロイシン、フェニルアラニン－チロシン、リシン－アルギニン、アラニン－バリン、及びアスパラギン－グルタミンである。

【0127】

ポリヌクレオチド又はポリペプチドは、別のポリヌクレオチド又はポリペプチドに対して一定パーセントの「配列同一性」を有し、これは、アラインメントされたとき、塩基又はアミノ酸のそのパーセントが同じであり、２つの配列を比較するとき、同じ相対位置にあることを意味する。配列同一性は、いくつかの異なる方法で決定することができる。配列同一性を決定するために、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｌｉ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ，ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｔｃｏｆｆｅｅ，ｅｂｉ．Ａｃ．Ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｍｕｓｃｌｅ，ｍａｆｆｔ．ｃｂｒｃ／ａｌｉｇｎｍｅｎｔ／ｓｏｆｔｗａｒｅを含むサイトで世界中のウェブ上で入手可能な様々な方法及びコンピュータプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴ、Ｔ－ＣＯＦＦＥＥ、ＭＵＳＣＬＥ、ＭＡＦＦＴなど）を使用して配列をアライメントすることができる。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９０），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－１０を参照されたい。本開示のいくつかの実施形態では、別のＣａｓ９エンドヌクレアーゼにおけるアミノ酸残基「に対応する」Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントにおけるアミノ酸残基を決定するために、当技術分野において標準的な配列アラインメントが本開示に従って使用される。他のＣａｓ９エンドヌクレアーゼのアミノ酸残基に対応するＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントのアミノ酸残基は、配列のアラインメントにおいて同じ位置に現れる。

【0128】

特定のＲＮＡを「コードする」ＤＮＡ配列は、ＲＮＡに転写されるＤＮＡ核酸配列である。ポリデオキシリボヌクレオチドは、タンパク質に翻訳されるＲＮＡ（ｍＲＮＡ）をコードしてもよく、又はポリデオキシリボヌクレオチドは、タンパク質に翻訳されないＲＮＡ（例えば、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、又はガイドＲＮＡ；「非コード」ＲＮＡ又は「ｎｃＲＮＡ」とも呼ばれる）をコードしてもよい。「タンパク質コード配列」又は特定のタンパク質又はポリペプチドをコードする配列は、適切な調節配列の制御下に置かれた場合にイン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）又はイン・ビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）で、（ＤＮＡの場合）ｍＲＮＡに転写され、（ｍＲＮＡの場合）ポリペプチドに翻訳される核酸配列である。コード配列の境界は、５’末端の開始コドン（Ｎ末端）及び３’末端の翻訳終止ナンセンスコドン（Ｃ末端）によって決定される。コード配列は、原核生物又は真核生物ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、原核生物又は真核生物ＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、及び合成核酸を含むことができるが、これらに限定されない。転写終結配列は一般に、コード配列の３’に位置する。

【0129】

本明細書で使用される場合、「プロモーター配列」又は「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼに結合し、下流（３’方向）コード配列又は非コード配列の転写を開始することができるＤＮＡ調節領域である。本明細書で使用される場合、プロモーター配列は、転写開始部位によってその３’末端で結合され、上流（５’方向）に伸長して、バックグラウンドを超える検出可能なレベルで転写を開始するために必要な最小数の塩基又はエレメントを含む。プロモーター配列内には、転写開始部位、並びにＲＮＡポリメラーゼの結合に関与するタンパク質結合ドメインが見出される。真核生物プロモーターは常にではないが、多くの場合、「ＴＡＴＡ」ボックス及び「ＣＡＡＴ」ボックスを含む。誘導性プロモーターを含む、様々なプロモーターを使用して、本開示の様々なベクターを駆動することができる。プロモーターは構成的に活性なプロモーター（例えば、構成的に活性な「ＯＮ」状態であるプロモーター）であり得、それは、誘導性プロモーター（例えば、その状態、活性／「ＯＮ」又は不活性／「ＯＦＦ」）が、外部刺激、例えば、特定の温度、化合物、又はタンパク質の存在によって制御されるプロモーター）であり得、それは、空間的に限定されたプロモーター（例えば、転写制御エレメント、エンハンサーなど）（例えば、組織特異的プロモーター、細胞型特異的プロモーターなど）であり得、及びそれは、時間的に限定されたプロモーター（例えば、プロモーターは、胚発生の特定の段階の間、又は生物学的プロセス、例えば、マウスの毛包周期の特定の段階の間、プロモーターが「ＯＮ」状態又は「ＯＦＦ」状態にある）であり得る。好適なプロモーターは、ウイルスに由来することができ、したがって、ウイルスプロモーターと呼ぶことができ、又は原核生物若しくは真核生物を含むいずれかの生物に由来することができる。好適なプロモーターを使用して、いずれかのＲＮＡポリメラーゼ（例えば、ｐｏｌ Ｉ、ｐｏｌ ＩＩ、ｐｏｌ Ｉｌｌ）による発現を駆動することができる。例示的なプロモーターには、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルス長末端反復（ＬＴＲ）プロモーター；アデノウイルス主要後期プロモーター（Ａｄ ＭＬＰ）；単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、例えばＣＭＶ前初期プロモーター領域（ＣＭＶＩＥ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ヒトＵ６核内小分子プロモーター（Ｕ６）（Ｍｉｙａｇｉｓｈｉら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０，４９７－５００（２００２））、強化されたＵ６プロモーター（例えば、Ｘｉａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００３ Ｓｅｐ １；３１（１７））、ヒトＨ１プロモーター（Ｈ１）などが含まれるが、これらに限定されない。誘導性プロモーターの例としては、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、イソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）調節性プロモーター、ラクトース誘導性プロモーター、熱ショックプロモーター、テトラサイクリン調節性プロモーター、ステロイド調節性プロモーター、金属調節性プロモーター、エストロゲン受容体調節性プロモーターなどが挙げられるが、これらに限定されない。したがって、誘導性プロモーターは、限定されないが、ドキシサイクリン；ＲＮＡポリメラーゼ、例えば、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ；エストロゲン受容体；エストロゲン受容体融合体などを含む分子によって調節され得る。

【0130】

いくつかの実施形態において、プロモーターは、多細胞生物において、プロモーターが特異的細胞のサブセットにおいて活性（例えば、「ＯＮ」）であるような、空間的に限定されたプロモーター（例えば、細胞型特異的プロモーター、組織特異的プロモーターなど）である。空間的に限定されたプロモーターは、エンハンサー、転写制御エレメント、制御配列などとも称され得る。いずれかの好適な空間的に限定されたプロモーターを使用することができ、好適なプロモーター（例えば、脳特異的プロモーター、ニューロンのサブセットにおける発現を駆動するプロモーター、生殖系列における発現を駆動するプロモーター、肺における発現を駆動するプロモーター、筋肉における発現を駆動するプロモーター、膵臓の島細胞における発現を駆動するプロモーターなど）の選択は生物に依存する。例えば、様々な空間的に限定されたプロモーターが、植物、虫、線虫、哺乳動物、マウスなどについて知られている。したがって、空間的に限定されたプロモーターを使用して、生物に応じて、多種多様な異なる組織及び細胞型において部位特異的改変酵素をコードする核酸の発現を調節することができる。いくつかの空間的に限定されたプロモーターはまた、胚発生の特定の段階の間、又は生物学的プロセスの特定の段階（例えば、マウスにおける毛包周期）の間、プロモーターが「ＯＮ」状態又は「ＯＦＦ」状態にあるように、時間的に限定される。例示目的のために、空間的に限定されたプロモーターの例としては、ニューロン特異的プロモーター、脂肪細胞特異的プロモーター、心筋細胞特異的プロモーター、平滑筋特異的プロモーター、光受容体特異的プロモーターなどが挙げられるが、これらに限定されない。ニューロン特異的な空間的に限定されたプロモーターには、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター（例えば、ＥＭＢＬ ＨＳＥＮ０２、Ｘ５１９５６を参照）；芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）プロモーター；ニューロフィラメントプロモーター（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ ＨＵＭＮＦＬ、Ｌ０４１４７を参照）；シナプシンプロモーター（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ ＨＵＭＳＹＮＩＢ、Ｍ５５３０１を参照）；ｔｈｙ－１プロモーター（例えば、Ｃｈｅｎら、（１９８７）Ｃｅｌｌ ５１：７－１９；及びＬｌｅｗｅｌｌｙｎら、（２０１０）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１６（１０）：１１６１－１１６６）；セロトニン受容体プロモーター（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ Ｓ６２２８３を参照）；チロシンヒドロキシラーゼプロモーター（ＴＨ）（例えば、Ｏｈら、（２００９）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１６：４３７；Ｓａｓａｏｋａら、（１９９２）Ｍｏｌ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．１６：２７４；Ｂｏｕｎｄｙら、（１９９８）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１８：９９８９；及びＫａｎｅｄａら、（１９９１）Ｎｅｕｒｏｎ ６：５８３－５９４）；ＧｎＲＨプロモーター（例えば、Ｒａｄｏｖｉｃｋら、（１９９１） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：３４０２－３４０６を参照）；Ｌ７プロモーター（例えば、Ｏｂｅｒｄｉｃｋら、（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４８：２２３－２２６参照）；ＤＮＭＴプロモーター（例えば、Ｂａｒｔｇｅら、（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：３６４８－３６５２を参照）；エンケファリンプロモーター（例えば、Ｃｏｍｂら、（１９８８）ＥＭＢＯ Ｊ．１７：３７９３－３８０５を参照）；ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）プロモーター；Ｃａ２＋－カルモジュリン依存性プロテインキナーゼ１１－アルファ（ＣａｍＫＩＭ）プロモーター（例えば、Ｍａｙｆｏｒｄら、（１９９６）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：１３２５０；及びＣａｓａｎｏｖａら、（２００１）Ｇｅｎｅｓｉｓ ３１：３７）；ＣＭＶエンハンサー／血小板由来増殖因子－ｐプロモーター（例えば、Ｌｉｕら、（２００４）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １１：５２－６０を参照）が含まれるが、これに限定されない。

【0131】

本明細書において互換的に使用される用語「ＤＮＡ調節配列」、「制御エレメント」、及び「調節エレメント」は、非コード配列（例えば、ガイドＲＮＡ）又はコード配列（例えば、Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアント）の転写を提供及び／又は調節し、及び／又はコードされたポリペプチドの翻訳を調節する、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、ターミネーター、タンパク質分解シグナルなどの転写及び翻訳の制御配列を指す。

【0132】

核酸、ポリペプチド、細胞、又は生物に適用される、本明細書で使用される「天然に存在する」又は「非改変の」という用語は、天然に見出される核酸、ポリペプチド、細胞、又は生物を指す。例えば、天然の供給源から単離することができ、実験室においてヒトによって意図的に改変されていない生物（ウイルスを含む）中に存在するポリペプチド又はポリヌクレオチド配列は、天然に存在する。

【0133】

核酸又はポリペプチドに適用される、本明細書で使用される「キメラ」という用語は、異なる供給源に由来する構造から構成される１つの実体を指す。例えば、「キメラ」がキメラポリペプチド（例えば、キメラＢ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２タンパク質）に関連して使用される場合、キメラポリペプチドは、異なるポリペプチドに由来するアミノ酸配列を含む。キメラポリペプチドは、改変された又は天然に存在するポリペプチド配列（例えば、改変又は未改変Ｂ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２タンパク質由来の第１のアミノ酸配列；及びＢ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２タンパク質以外の第２のアミノ酸配列）のいずれかを含み得る。同様に、キメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関連して、「キメラ」は、異なるコード領域に由来するヌクレオチド配列（例えば、改変又は非改変Ｂ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列；及びＢ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２タンパク質以外のポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列）を含む。

【0134】

「キメラポリペプチド」という用語は天然には存在しない、例えば、ヒトの介入を介した２つ以上の別の方法で分離されたアミノ配列のセグメントの人工的な組合せ（例えば、「融合」）によって作製されるポリペプチドを指す。キメラアミノ酸配列を含むポリペプチドは、キメラポリペプチドである。いくつかのキメラポリペプチドは、「融合バリアント」と称することができる。

【0135】

「異種」は、本明細書で使用される場合、それぞれ、天然の核酸又はタンパク質中に見出されないヌクレオチド又はペプチドを意味する。本明細書に記載されるＢ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２融合タンパク質は、異種ポリペプチド配列（例えば、Ｂ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２以外のタンパク質由来のポリペプチド配列）に融合されたＢ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド（又はそのバリアント）のＲＮＡ結合ドメインを含み得る。異種ポリペプチドは、Ｂ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２融合タンパク質によっても示される活性（例えば、酵素活性）を示し得る（例えば、メチルトランスフェラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、キナーゼ活性、ユビキチン化活性など）。異種核酸は、融合ポリペプチドをコードする融合ポリヌクレオチドを生成するために、天然に存在する核酸（又はそのバリアント）に（例えば、遺伝子操作によって）連結され得る。別の例として、融合バリアントＢ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチドにおいて、バリアントＢ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチドは、異種ポリペプチド（例えば、Ｂ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２以外のポリペプチド）に融合され得て、それは、融合バリアントＢ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチドによっても示される活性を示す。異種核酸はバリアントＢ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチドに連結されて（例えば、遺伝子工学によって）、融合バリアントＢ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを生成し得る。「異種」は、本明細書で使用される場合、さらに、その天然細胞ではない細胞中のヌクレオチド又はポリペプチドを意味する。

【0136】

「同族の」という用語は、通常、天然において相互作用又は共存する２つの生体分子を指す。

【0137】

「組換え」とは、本明細書において使用される場合、特定の核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）又はベクターが、天然系において見出される内因性核酸と区別可能な構造コード配列又は非コード配列を有する構築物をもたらす、クローニング、制限、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及び／又はライゲーション工程の様々な組み合わせの産物であることを意味する。ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、ｃＤＮＡ断片から、又は一連の合成オリゴヌクレオチドから組み立てて、細胞又は無細胞転写及び翻訳系に含まれる組換え転写単位から発現することができる合成核酸を提供することができる。関連配列を含むゲノムＤＮＡはまた、組換え遺伝子又は転写単位の形成において使用され得る。非翻訳ＤＮＡの配列は、オープンリーディングフレームからの５’又は３’に存在してもよく、そのような配列は、コード領域の操作又は発現を妨害せず、実際に、様々な機構によって所望の産物の産生を調節するように作用し得る（以下の「ＤＮＡ調節配列」を参照されたい）。加えて、又は代わりに、翻訳されないＲＮＡ（例えば、ガイドＲＮＡ）をコードするＤＮＡ配列もまた、組換えと考えられ得る。したがって、例えば、用語「組換え」核酸は、天然に存在しない、例えば、ヒトの介入を介して配列の２つの他の分離されたセグメントの人工的な組み合わせによって作製される核酸を指す。この人工的な組み合わせは、しばしば、化学合成手段、又は核酸の単離されたセグメントの人工的操作、例えば、遺伝子工学技術のいずれかによって達成される。そのようなものは、一般に、コドンを、同じアミノ酸、保存的アミノ酸、又は非保存的アミノ酸をコードするコドンで置き換えるために行われる。加えて、又は代わりに、所望の機能の核酸セグメントを一緒に結合して、所望の機能の組み合わせを生成することが行われる。この人工的な組み合わせは、しばしば、化学合成手段、又は核酸の単離されたセグメントの人工的操作、例えば、遺伝子工学技術のいずれかによって達成される。組換えポリヌクレオチドがポリペプチドをコードする場合、コードされるポリペプチドの配列は、天然に存在する（「野生型」）ものであり得るか、又は天然に存在する配列のバリアント（例えば、突然変異体）であり得る。したがって、「組換え」ポリペプチドという用語は、配列が天然には存在しないポリペプチドを必ずしも意味しない。代わりに、「組換え」ポリペプチドは、組換えＤＮＡ配列によってコードされるが、ポリペプチドの配列は、天然に存在してもよく（「野生型」）又は天然に存在しなくてもよい（例えば、バリアント、突然変異体など）。したがって、「組換え」ポリペプチドは、ヒトの介入の結果であるが、天然に存在するアミノ酸配列であってもよい。「天然に存在しない」という用語は、化学的に改変又は突然変異した分子を含む、それらの天然に存在する対応物と著しく異なる分子を含む。

【0138】

「ベクター」又は「発現ベクター」は、プラスミド、ファージ、ウイルス、又はコスミドなどのレプリコンであり、これに、別のＤＮＡセグメント、例えば、「インサート」を付着させて、細胞中に付着セグメントの複製をもたらすことができる。

【0139】

「発現カセット」は、プロモーターに作動可能に連結されているＤＮＡコード配列を含む。「作動可能に連結されている」は、そのように記載された成分がそれらが意図された様式で機能することを可能にする関係にある並置を指す。例えば、プロモーターがその転写又は発現に影響を及ぼす場合、プロモーターは、コード配列に作動可能に連結されている。用語「組換え発現ベクター」又は「ＤＮＡ構築物」は、本明細書において互換的に使用され、ベクター及び少なくとも１つのインサートを含むＤＮＡ分子を指す。組換え発現ベクターは一般に、インサートを発現及び／又は増殖させる目的で、又は他の組換えヌクレオチド配列の構築のために生成される。核酸（複数可）は、プロモーター配列に作動可能に連結されていてもいなくてもよく、ＤＮＡ調節配列に作動可能に連結されていてもいなくてもよい。

【0140】

「作動可能に連結された」という用語は、本明細書で使用される場合、２つ以上の要素、例えば、ポリペプチド配列又はポリヌクレオチド配列の間の物理的又は機能的な連結を意味し、これらは、それらが意図される様式で作動することを可能にする。例えば、対象のポリヌクレオチドと調節配列（例えば、プロモーター）との間の作動可能な連結は、目的のポリヌクレオチドの発現を可能にする機能的連結である。この意味で、「作動可能に連結されている」という用語は、調節領域が目的のコード配列の転写又は翻訳を調節するのに有効であるように、転写される調節領域及びコード配列の位置付けを指す。本明細書に開示されるいくつかの実施形態では、「作動可能に連結されている」という用語は、制御配列がポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、ポリペプチド、及び／又は機能性ＲＮＡの発現又は細胞局在化を指令又は調節するように、制御配列がポリペプチド又は機能性ＲＮＡをコードする配列に対して適切な位置に配置される構成を示す。したがって、プロモーターは、核酸配列の転写を媒介することができる場合、核酸配列と作動可能に連結している。動作可能に連結された要素は、連続的又は非連続的であり得る。

【0141】

細胞は、外因性ＤＮＡ、例えば組換え発現ベクターが細胞内に導入されている場合、そのようなＤＮＡによって「遺伝子改変（ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ）」又は「形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ）」又は「トランスフェクト（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ）」されている。外因性ＤＮＡの存在は、永続的又は一過性の遺伝的変化をもたらす。形質転換ＤＮＡは、細胞のゲノムに組み込まれていても（共有結合されていても）、組み込まれていなくてもよい（共有結合されていなくてもよい）。

【0142】

例えば原核生物、イースト及び哺乳類細胞では、形質転換ＤＮＡはプラスミドのようなエピソームエレメント上で保持されていてもよい。真核細胞に関して、安定に形質転換された細胞は、染色体複製を介して娘細胞によって受け継がれるように形質転換ＤＮＡが染色体に組み込まれている細胞である。この安定性は、形質転換ＤＮＡを含有する娘細胞の集団を含む細胞系又はクローンを確立する真核細胞の能力によって実証される。「クローン」は、有糸分裂によって単一の細胞又は共通の祖先に由来する細胞の集団である。「細胞系」は、イン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で多くの世代にわたって安定な増殖が可能な初代細胞のクローンである。

【0143】

遺伝子改変（「形質転換」とも呼ばれる）の好適な方法には例えば、ウイルス又はバクテリオファージ感染、トランスフェクション、コンジュゲーション、プロトプラスト融合、リポフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）媒介トランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介トランスフェクション、リポソーム媒介トランスフェクション、パーティクルガン法、リン酸カルシウム沈殿、直接マイクロインジェクション、ナノ粒子媒介核酸送達（例えば、Ｐａｎｙａｍら、Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．２０１２ Ｓｅｐ １３．ｐｐ：Ｓ１６９－４０９Ｘ（１２）００２８３－９．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ａｄｄｒ．２０１２．０９．０２３を参照されたい）などが含まれるが、これらに限定されない。

【0144】

本明細書で使用される「宿主細胞」は、イン・ビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）又はイン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）真核細胞、原核細胞（例えば、細菌又は古細菌細胞）、又は単細胞実体として培養された多細胞生物（例えば、細胞系）由来の細胞を意味し、真核細胞又は原核細胞は、核酸のレシピエントとして使用され得るか、又は使用されており、核酸によって形質転換された元の細胞の子孫を含む。単一細胞の子孫は、天然の、偶発的な、又は意図的な突然変異のために、形態において、又はゲノム若しくは全ＤＮＡ相補体において、元の親と必ずしも完全に同一でなくてもよいことが理解される。「組換え宿主細胞」（「遺伝子改変宿主細胞」とも呼ばれる）は、異種核酸、例えば発現ベクターが導入された宿主細胞である。例えば、細菌宿主細胞は、外因性核酸（例えば、プラスミド又は組換え発現ベクター）の好適な細菌宿主細胞への導入によって遺伝子改変された細菌宿主細胞であり、真核宿主細胞は、外因性核酸の好適な真核宿主細胞への導入によって遺伝子改変された真核宿主細胞（例えば、哺乳動物生殖細胞）である。

【0145】

本明細書で使用される「標的ＤＮＡ」は、「標的部位」又は「標的配列」を含むポリデオキシリボヌクレオチドである。「標的部位」、「標的配列」、「標的プロトスペーサーＤＮＡ」、又は「プロトスペーサー様配列」という用語は、結合のための十分な条件が存在する場合、ガイドＲＮＡのＤＮＡ標的セグメント（「スペーサー」とも呼ばれる）が結合する標的ＤＮＡ中に存在する核酸配列を指すために、本明細書で互換的に使用される。例えば、標的ＤＮＡ内の標的部位（又は標的配列）５’－ＧＡＧＣＡＴＡＴＣ－３’は、ＲＮＡ配列５’－ＧＡＵＡＵＧＣＵＣ－３’によって標的化される（又はそれに結合される、又はそれとハイブリダイズする、又はそれに相補的である）。好適なＤＮＡ／ＲＮＡ結合条件は、細胞中に通常存在する生理学的条件を含む。他の好適なＤＮＡ／ＲＮＡ結合条件（例えば、無細胞系における条件）は当技術分野において公知である；例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、前出を参照されたい。ガイドＲＮＡに相補的であり、ガイドＲＮＡとハイブリダイズする標的ＤＮＡの鎖は、「相補鎖」と呼ばれ、「相補鎖」に相補的である（したがって、ガイドＲＮＡに相補的でない）標的ＤＮＡの鎖は「非相補鎖（ｎｏｎ－ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｓｔｒａｎｄ）」又は「非相補鎖（ｎｏｎ－ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｓｔｒａｎｄ）」と称される。

【0146】

「部位特異的改変酵素」又は「ＲＮＡ結合部位特異的改変酵素」とは、ＲＮＡに結合し、Ｂ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチドなどの特異的ＤＮＡ配列を標的とするポリペプチドを意味する。本明細書に記載の部位特異的改変酵素は、それが結合するＲＮＡ分子によって特定のＤＮＡ配列を標的とする。ＲＮＡ分子は、標的ＤＮＡ内の標的配列に結合する、ハイブリダイズする、又は相補的である配列を含み、したがって、結合したポリペプチドを標的ＤＮＡ（標的配列）内の特定の位置に標的化する。「切断」とは、ＤＮＡ分子の共有結合骨格の切断を意味する。切断は、ホスホジエステル結合の酵素的又は化学的加水分解を含むが、これらに限定されない様々な方法によって開始することができる。一本鎖切断及び二本鎖切断の両方が可能であり、二本鎖切断は、２つの異なる一本鎖切断事象の結果として起こり得る。ＤＮＡ切断は、平滑末端又は付着端のいずれかの生成をもたらし得る。特定の実施形態において、ガイドＲＮＡ及び部位特異的改変酵素を含む複合体は、標的化された二本鎖ＤＮＡ切断のために使用される。

【0147】

「ヌクレアーゼ」及び「エンドヌクレアーゼ」は、本明細書において互換的に使用され、ポリヌクレオチド切断のためのエンドヌクレアーゼ触媒活性を有する酵素を意味する。

【0148】

ヌクレアーゼの「切断ドメイン」又は「活性ドメイン」又は「ヌクレアーゼドメイン」とは、ＤＮＡ切断のための触媒活性を有するヌクレアーゼ内のポリペプチド配列又はドメインを意味する。切断ドメインは、単一のポリペプチド鎖に含まれ得るか、又は切断活性は、２つ（又はそれより多く）のポリペプチドの会合から生じ得る。単一のヌクレアーゼドメインは、所与のポリペプチド内の２つ以上の単離されたアミノ酸のストレッチからなり得る。

【0149】

「ガイド配列」又は「ＤＮＡ標的化セグメント」又は「ＤＮＡ標的化配列」又は「スペーサー」は、本明細書において「プロトスペーサー様」配列と称される標的ＤＮＡ（標的ＤＮＡの相補鎖）内の特定の配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む。タンパク質結合セグメント（又は「タンパク質結合配列」）は、部位特異的改変酵素と相互作用する。部位特異的改変酵素がＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２、又はＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２－関連ポリペプチドである場合（以下により詳しく説明する）、標的ＤＮＡの部位特異的な切断は、（ｉ）ガイドＲＮＡと標的ＤＮＡの間の塩基対合の相補性、及び（ｉｉ）標的ＤＮＡ中の短いモチーフ（プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と称される）の両方によって決定される位置で起こる。ガイドＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、部分的に、互いにハイブリダイズして二本鎖ＲＮＡ二重鎖（ｄｓＲＮＡ二重鎖）を形成するヌクレオチドの２つの相補的なストレッチを含む。いくつかの実施形態において、核酸（例えば、ガイドＲＮＡ、ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む核酸；部位特異的改変酵素をコードする核酸など）はさらなる望ましい特徴（例えば、改変又は調節された安定性；細胞内標的化；追跡、例えば、蛍光標識；タンパク質又はタンパク質複合体のための結合部位など）を提供する改変又は配列を含む。非限定的な例としては、５’キャップ（例えば、７－メチルグアニレートキャップ（ｍ７ｇ））；３’ポリアデニル化尾部（例えば、３’ポリ（Ａ）尾部）；リボスイッチ配列（例えば、タンパク質及び／又はタンパク質複合体による調節された安定性及び／又は調節された接近性を可能にするための）；安定性制御配列；ｄｓＲＮＡ二重鎖（例えば、ヘアピン）を形成する配列；ＲＮＡを細胞内位置（例えば、核、ミトコンドリア、葉緑体など）に標的化する改変又は配列；追跡を提供する改変又は配列（例えば、蛍光分子への直接コンジュゲーション、蛍光検出を容易にする部分へのコンジュゲーション、蛍光検出を可能にする配列など）；タンパク質（例えば、転写活性化因子、転写抑制因子、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡデメチラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼなどを含む、ＤＮＡに作用するタンパク質）のための結合部位を提供する改変又は配列、及びそれらの組み合わせが挙げられる。

【0150】

いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡが上記の特徴のいずれかを提供する追加のセグメントを５’又は３’末端のいずれかに含む。例えば、好適な第３のセグメントは、５’キャップ（例えば、７－メチルグアニレートキャップ（ｍ７ｇ））；３’ポリアデニル化尾部（例えば、３’ポリ（Ａ）尾部）；リボスイッチ配列（例えば、タンパク質及びタンパク質複合体による調節された安定性及び／又は調節された接近性を可能にするための）；安定性制御配列；ｄｓＲＮＡ二重鎖（例えば、ヘアピン）を形成する配列；ＲＮＡを細胞内位置（例えば、核、ミトコンドリア、葉緑体など）に標的化する配列；追跡を提供する改変又は配列（例えば、蛍光分子への直接コンジュゲーション、蛍光検出を容易にする部分へのコンジュゲーション、蛍光検出を可能にする配列など）；タンパク質（例えば、転写活性化因子、転写抑制因子、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡデメチラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼなどを含む、ＤＮＡに作用するタンパク質）のための結合部位を提供する改変又は配列、及びそれらの組み合わせを含むことができる。

【0151】

ガイドＲＮＡ及び部位特異的改変酵素、例えばＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントは、リボ核タンパク質複合体を形成し得る（例えば、非共有相互作用を介して結合する）。ガイドＲＮＡは、標的ＤＮＡの配列に相補的なヌクレオチド配列を含むことによって、複合体に標的特異性を提供する。複合体の部位特異的改変酵素は、エンドヌクレアーゼ活性を提供する。言い換えれば、部位特異的改変酵素は、ガイドＲＮＡのタンパク質結合セグメントとの会合により、標的ＤＮＡ配列（例えば、染色体核酸中の標的配列；染色体外核酸中の標的配列、例えば、エピソーム核酸、ミニサークルなど；ミトコンドリア核酸中の標的配列；葉緑体核酸中の標的配列；プラスミド中の標的配列など）に誘導される。ＲＮＡアプタマーは、当技術分野で公知であり、一般にリボスイッチの合成バージョンである。「ＲＮＡアプタマー」及び「リボスイッチ」という用語は、本明細書において互換的に使用され、それらが一部であるＲＮＡ分子の構造（したがって、特定の配列の利用可能性）の誘導性調節を提供する合成及び天然核酸配列の両方を包含する。ＲＮＡアプタマーは一般に、特定の構造（例えば、ヘアピン）に折り畳まれる配列を含み、それが特定の薬物（例えば、小分子）に特異的に結合する。薬物の結合は、ＲＮＡの折り畳みにおける構造変化を引き起こし、これは、アプタマーが一部である核酸の特徴を変化させる。非限定的な例として、（ｉ）アプタマーを有する活性化因子－ＲＮＡは、アプタマーが適切な薬物によって結合されない限り、同族のターゲターＲＮＡに結合することができない場合があり；（ｉｉ）アプタマーを有するターゲター－ＲＮＡは、アプタマーが適切な薬物によって結合されない限り、同族の活性化因子－ＲＮＡに結合することができない場合があり；及び（ｉｉｉ）それぞれが異なる薬物に結合する異なるアプタマーを含むターゲター－ＲＮＡ及び活性化因子－ＲＮＡは、両方の薬物が存在しない限り、互いに結合することができない場合がある。これらの実施例によって例示されるように、２分子ガイドＲＮＡは、誘導可能であるように設計され得る。

【0152】

アプタマー及びリボスイッチの例は例えば、Ｎａｋａｍｕｒａら、Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ．２０１２ Ｍａｙ；１７（５）：３４４－６４；Ｖａｖａｌｌｅら、Ｆｕｔｕｒｅ Ｃａｒｄｉｏｌ．２０１２ Ｍａｙ；８（３）：３７１－８２；Ｃｉｔａｒｔａｎら、Ｂｉｏｓｅｎｓ Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ．２０１２ Ａｐｒ １５；３４（１）：１－１１；及びＬｉｂｅｒｍａｎら、Ｗｉｌｅｙ ｌｎｔｅｒｄｉｓｃｉｐ Ｒｅｖ ＲＮＡ．２０１２ Ｍａｙ－Ｊｕｎ；３（３）：３６９－８４に見出され得る；これらは全て、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。

【0153】

遺伝子改変の方法の選択は一般に、形質転換される細胞のタイプ及び形質転換が行われる状況（例えば、イン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）、エクス・ビボ（ｅｘ ｖｉｖｏ）、又はイン・ビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ））に依存する。これらの方法の一般的な考察は、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第３版、Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、１９９５に見出すことができる。

【0154】

アプタマー及びリボスイッチの例は例えば、Ｎａｋａｍｕｒａら、Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ．２０１２ Ｍａｙ；１７（５）：３４４－６４；Ｖａｖａｌｌｅら、Ｆｕｔｕｒｅ Ｃａｒｄｉｏｌ． ２０１２ Ｍａｙ；８（３）：３７１－８２；Ｃｉｔａｒｔａｎら、Ｂｉｏｓｅｎｓ Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ．２０１２ Ａｐｒ １５；３４（１）：１－１１；及びＬｉｂｅｒｍａｎら、Ｗｉｌｅｙ ｌｎｔｅｒｄｉｓｃｉｐ Ｒｅｖ ＲＮＡ．２０１２ Ｍａｙ－Ｊｕｎ；３（３）：３６９－８４に見出すことができる；これらは全て、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。

【0155】

「幹細胞」という用語は、本明細書において、自己複製する能力及び分化細胞型を生成する能力の両方を有する細胞（例えば、植物幹細胞、脊椎動物幹細胞）を指すために使用される（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、（１９９７）Ｃｅｌｌ ８８：２８７－２９８を参照されたい）。細胞個体発生に関連して、形容詞「分化されている」又は「分化している」は、相対的な用語である。「分化細胞」は、それが比較される細胞よりも発生経路をさらに進行した細胞である。したがって、多能性幹細胞（以下に記載する）は、系列限定前駆細胞（例えば、中胚葉幹細胞）に分化することができ、それは次に、さらに限定されている細胞（例えば、ニューロン前駆細胞）に分化することができ、それは、最終段階の細胞（例えば、最終分化細胞、例えば、ニューロン、心筋細胞など）に分化することができ、それは、特定の組織型において特徴的な役割を果たし、さらに増殖する能力を保持しても保持しなくてもよい。幹細胞は、特定のマーカー（例えば、タンパク質、ＲＮＡなど）の存在及び特定のマーカーの非存在の両方によって特徴付けられ得る。幹細胞はまた、イン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）及びイン・ビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）の両方の機能アッセイ、特に幹細胞が複数の分化した子孫を生じさせる能力に関するアッセイによって同定され得る。

【0156】

目的の幹細胞は、多能性幹細胞（ＰＳＣ）を含む。「多能性幹細胞」又は「ＰＳＣ」という用語は、本明細書では生物の全ての細胞型を産生することができる幹細胞を意味するために使用される。したがって、ＰＳＣは、生物の全ての胚葉（例えば、脊椎動物の内胚葉、中胚葉、及び外胚葉）の細胞を生じさせることができる。多能性細胞は、奇形腫を形成することができ、生体内の外胚葉、中胚葉、又は内胚葉組織に寄与することができる。植物の多能性幹細胞は、植物の全ての細胞型（例えば、根、幹、葉などの細胞）を生じさせることができる。

【0157】

動物のＰＳＣは、多くの異なる方法で誘導することができる。例えば、胚性幹細胞（ＥＳＣ）は胚の内部細胞塊に由来し（Ｔｈｏｍｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９８ Ｎｏｖ ６；２８２（５３９１）：１１４５－７）、一方、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）は、体細胞に由来する（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｃｅｌｌ．２００７ Ｎｏｖ ３０；１３１（５）：８６１－７２；Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．２００７；２（１２）：３０８１－９；Ｙｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００７ Ｄｅｃ ２１；３１８（５８５８）：１９１７－２０．Ｅｐｕｂ ２００７ Ｎｏｖ ２０）。

【0158】

ＰＳＣという用語は、その派生にかかわらず多能性幹細胞を指すので、ＰＳＣという用語は、ＥＳＣ及びｉＰＳＣという用語、並びにＰＳＣの別の例である胚性生殖幹細胞（ＥＧＳＣ）という用語を包含する。ＰＳＣは、樹立細胞系の形態であってもよく、一次胚組織から直接得られてもよく、又は体細胞に由来してもよい。ＰＳＣは、本明細書に記載の方法の標的細胞であり得る。

【0159】

「胚性幹細胞」（ＥＳＣ）とは、胚から、一般に胚盤胞の内部細胞塊から単離されたＰＳＣを意味する。ＥＳＣ系は、ＮＩＨヒト胚性幹細胞登録（ＮＩＨ Ｈｕｍａｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｇｉｓｔｒｙ）に列挙されており、例えば、ｈＥＳＢＧＮ－０１、ｈＥＳＢＧＮ－０２、ｈＥＳＢＧＮ－０３、ｈＥＳＢＧＮ－０４（ＢｒｅｓａＧｅｎ，Ｉｎｃ．）；ＨＥＳ－１、ＨＥＳ－２、ＨＥＳ－３、ＨＥＳ－４、ＨＥＳ－５、ＨＥＳ－６（ＥＳ Ｃｅｌｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）；Ｍｉｚ－ｈＥＳ１（ＭｉｚＭｅｄｉ Ｈｏｓｐｉｔａｌ－Ｓｅｏｕｌ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）；ＨＳＦ－１、ＨＳＦ－６（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ａｔ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）；及びＨ１、Ｈ７、Ｈ９、Ｈ１３、Ｈ１４（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ａｌｕｍｎｉ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ（ＷｉＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ））である。目的の幹細胞はまた、アカゲザル幹細胞及びマーモセット幹細胞などの他の霊長類由来の胚性幹細胞を含む。幹細胞は、いずれかの哺乳動物種、例えばヒト、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、げっ歯動物、例えばマウス、ラット、ハムスター、霊長類などから得ることができる（Ｔｈｏｍｓｏｎら、（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５；Ｔｈｏｍｓｏｎら、（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：７８４４；Ｔｈｏｍｓｏｎら、（１９９６）Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．５５：２５４；Ｓｈａｍｂｌｏｔｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：１３７２６、１９９８）。培養において、ＥＳＣは一般に、大きな核－細胞質比、明確な境界及び顕著な核小体を有する平坦なコロニーとして増殖する。さらに、ＥＳＣは、ＳＳＥＡ－３、ＳＳＥＡ－４、ＴＲＡ－１－６０、ＴＲＡ－１－８１、及びアルカリホスファターゼを発現するが、ＳＳＥＡ－１は発現しない。ＥＳＣを生成し、特徴付ける方法の例は例えば、米国特許第７，０２９，９１３号、米国特許第５，８４３，７８０号、及び米国特許第６，２００，８０６号に見出すことができ、これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。未分化形態のｈＥＳＣを増殖させる方法は、ＷＯ９９／２０７４１、ＷＯ０１／５１６１６、及びＷＯ０３／０２０９２０に記載されている。「胚性生殖幹細胞」（ＥＧＳＣ）又は「胚性生殖細胞」又は「ＥＧ細胞」とは、生殖細胞及び／又は生殖細胞前駆細胞、例えば、始原生殖細胞、例えば、精子及び卵子となるものに由来するＰＳＣを意味する。胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）は、上記の胚性幹細胞と同様の特性を有すると考えられる。ＥＧ細胞を生成及び特徴付ける方法の例は例えば、米国特許第７，１５３，６８４号；Ｍａｔｓｕｉ，Ｙ．ら、（１９９２）Ｃｅｌｌ ７０：８４１；Ｓｈａｍｂｌｏｔｔ，Ｍ．ら、（２００１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８：１１３；Ｓｈａｍｂｌｏｔｔ，Ｍ．ら、（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５：１３７２６；及びＫｏｓｈｉｍｉｚｕ、Ｕ．ら、（１９９６）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、１２２：１２３５に見出すことができ、これらの記載は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0160】

「誘導多能性幹細胞」又は「ｉＰＳＣ」とは、ＰＳＣではない細胞（例えば、ＰＳＣと比較して分化した細胞）に由来するＰＳＣを意味する。ｉＰＳＣは、最終分化細胞を含む複数の異なる細胞型に由来し得る。ｉＰＳＣは、大きな核－細胞質比、定義された境界及び顕著な核を有する平坦なコロニーとして増殖するＥＳ細胞様形態を有する。加えて、ｉＰＳＣは、当業者に公知の、１つ又は複数の重要な多能性マーカーを発現し、アルカリホスファターゼ、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、ＴＲＡ１６０、ＴＲＡ１８１、ＴＤＧＦ １、Ｄｎｍｔ３ｂ、Ｆｏｘ０３、ＧＤＦ３、Ｃｙｐ２６ａｌ、ＴＥＲＴ、及びｚｆｐ４２を含むが、これらに限定されない。

【0161】

ｉＰＳＣを生成し、特徴付ける方法の例は例えば、米国特許出願公開第ＵＳ２００９００４７２６３、ＵＳ２００９００６８７４２、ＵＳ２００９０１９１１５９、ＵＳ２００９０２２７０３２、ＵＳ２００９０２４６８７５、及びＵＳ２００９０３０４６４６に見出すことができ、これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。一般に、ｉＰＳＣを生成するために、体細胞は、多能性幹細胞になるように体細胞を再プログラミングするために、当技術分野で公知の再プログラミング因子（例えば、Ｏｃｔ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ＭＹＣ、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８など）を提供される。

【0162】

「体細胞」とは、実験的操作の非存在下で、通常、生物において全てのタイプの細胞を生じさせない、生物におけるいずれかの細胞を意味する。言い換えれば、体細胞は、体の３つの胚葉全て、例えば、外胚葉、中胚葉及び内胚葉の細胞を自然に生成しないように十分に分化した細胞である。例えば、体細胞は、ニューロン及び神経前駆細胞の両方を含み、後者は、中枢神経系の全て又はいくつかの細胞型を自然に生じさせることができるが、中胚葉又は内胚葉系統の細胞を生じさせることはできない。

【0163】

「有糸分裂細胞」とは、有糸分裂を受けている細胞を意味する。

【0164】

「有糸分裂終了細胞」とは、有糸分裂を脱した細胞を意味し、例えば、それは「静止状態」であり、例えば、もはや分裂を行っていない細胞を意味する。この静止状態は一時的、例えば、可逆的であってもよく、又は永続的であってもよい。

【0165】

「減数分裂細胞」とは、減数分裂を受けている細胞を意味する。

【0166】

「組換え」とは、２つのポリヌクレオチド間の遺伝情報の交換プロセスを意味する。本明細書で使用される場合、「相同組換え修復（ＨＤＲ）」は例えば、細胞における二本鎖切断の修復中に起こる特殊形態のＤＮＡ修復を指す。このプロセスはヌクレオチド配列相同性を必要とし、「ドナー」分子を「標的」分子（例えば、二本鎖切断を経験したもの）の鋳型修復に使用し、ドナーから標的への遺伝情報の伝達をもたらす。相同組換え修復は、ドナーポリヌクレオチドが標的分子と異なり、ドナーポリヌクレオチドの配列の一部又は全部が標的ＤＮＡに組み込まれる場合、標的分子の配列の変更（例えば、挿入、欠失、突然変異）をもたらし得る。いくつかの実施形態において、ドナーポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチドの一部、ドナーポリヌクレオチドのコピー、又はドナーポリヌクレオチドのコピーの一部は、標的ＤＮＡに組み込まれる。

【0167】

「非相同末端結合（ＮＨＥＪ）」とは、（修復を誘導するために相同配列を必要とする相同組換え修復とは対照的に）相同鋳型を必要とせずに切断末端を互いに直接連結反応することによるＤＮＡ中の二本鎖切断の修復を意味する。ＮＨＥＪはしばしば、二本鎖切断部位付近のヌクレオチド配列の損失（欠失）をもたらす。

【0168】

用語「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ)」、「処置すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」などは本明細書で使用され、一般に、所望の薬理学的及び／又は生理学的効果を得ることを意味する。この効果は、疾患又はその症状を完全に又は部分的に予防するという点で予防的であり得、及び／又は疾患及び／又は疾患に起因する有害作用の部分的又は完全な治癒という点で治療的であり得る。「処置」は、本明細書で使用される場合、哺乳動物における疾患又は症状のいずれかの治療を包含し、（ａ）疾患又は症状を発症する素因はあるが、それを有するとまだ診断されていない対象において、疾患又は症状の発症を予防すること；（ｂ）疾患又は症状を抑制すること、例えば、その発症を阻止すること；又は（ｃ）疾患を緩和すること、例えば、疾患の退行を引き起こすことを含む。治療剤は、疾患又は傷害の発症前、発症中、又は発症後に投与することができる。進行中の疾患の処置であって、処置が対象の望ましくない臨床症状を安定化又は低減する処置は、特に興味深い。そのような処置は、望ましくは罹患組織における機能の完全な喪失の前に実施される。治療は、望ましくは疾患の症候段階の間、場合によっては疾患の症候段階の後に実施される。

【0169】

「個体」、「対象」、「宿主」、及び「患者」という用語は、本明細書において互換的に使用され、診断、処置、又は治療が望まれるいずれかの哺乳動物対象、特にヒトを指す。

【0170】

分子及び細胞生化学における一般的な方法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第３版（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ ２００１）；Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第４版（Ａｕｓｕｂｅｌら、編集、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ １９９９）；Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ（Ｂｏｌｌａｇら、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ １９９６）；Ｎｏｎｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（Ｗａｇｎｅｒら、編集、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９９）；Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ（Ｋａｐｌｉｆｔ ＆ Ｌｏｅｗｙ編集、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９５）；Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍａｎｕａｌ（１．Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ編集、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９７）；ａｎｄ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｄｏｙｌｅ ＆ Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ １９９８)のような標準的な教科書に見出すことができる。その開示は参照により本明細書に組み込まれる。

【0171】

値の範囲が提供される場合、文脈が別途明確に指示しない限り、その範囲の上限と下限との間の、下限の単位の１０分の１までの各介在値、及びその記載された範囲におけるいずれかの他の記載された値又は介在値は、本開示内に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限及び下限は、独立して、より小さい範囲に含まれてもよく、記載された範囲におけるいずれかの具体的に除外された限界に従うことを条件として、本開示内にも包含される。記載された範囲が限界の一方又は両方を含む場合、それらの含まれる限界のいずれか又は両方を除外する範囲も本開示に含まれる。

【0172】

「から本質的になる」という語句は、本明細書では指定された活性成分若しくは系の成分ではない、又は指定された活性部分若しくは分子の部分ではないいずれのものを除外することを意味する。

【0173】

特定の範囲は本明細書において、用語「約」が先行する数値と共に提示される。用語「約」は本明細書において、それが先行する正確な数、並びに用語が先行する数に近いか、又はおよそその数に対する文字通りのサポートを提供するために使用される。数が具体的に列挙された数に近いか、又は近似しているかどうかを決定する際に、近いか又は近似している引用されていない数は、それが提示される文脈において、具体的に列挙された数の実質的な等価物を提供する数であり得る。

【0174】

明確にするために別々の実施形態に関連して記載される本開示の特定の特徴は、単一の実施形態において組み合わせて提供されてもよいことが理解される。逆に、簡潔にするために単一の実施形態に関連して記載されている本開示の様々な特徴は別々に、又はいずれかの好適なサブコンビネーションで提供することもできる。本開示に関連する実施形態の全ての組み合わせは、本開示によって具体的に包含され、あたかもそれぞれ及び全ての組み合わせが個別にかつ明示的に開示されたかのように、本明細書に開示される。さらに、様々な実施形態及びその要素の全てのサブコンビネーションもまた、本開示によって具体的に包含され、あたかもそのようなサブコンビネーションのそれぞれ及び全てが本明細書で個別に明示的に開示されたかのように、本明細書で開示される。

【0175】

Ｂ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２融合ポリペプチド
Ｂ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２を使用して、Ｂ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２ヌクレアーゼと比較してさらなるドメイン及び活性を有する融合タンパク質を形成することができる。非限定的な例として、Ｆｏｋｌドメインは、Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントに融合することができ、それは、触媒活性エンドヌクレアーゼドメインを含むことができ、又はＦｏｋｌドメインは、Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントに融合することができ、それはＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２エンドヌクレアーゼドメインを不活性にするように改変されている。Ｂ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２との融合タンパク質を作製するために融合され得る他のドメインには、転写調節因子、エピジェネティック修飾因子、タグ及び他の標識又は造影剤、ヒストン、及び／又は遺伝子配列の構造又は活性を調節又は改変する当技術分野で公知の他のモダリティが含まれる。

【0176】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントは、転写活性化因子又は抑制因子、又はエピジェネティック修飾因子、例えば、メチラーゼ、デメチラーゼ、アセチラーゼ、又はデアセチラーゼに融合される。

【0177】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントは、検出、分子間相互作用、翻訳活性化、改変、又は当技術分野で公知のいずれかの他の操作のために、機能性タンパク質成分に融合される。

【0178】

例示的なＢ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２バリアントポリペプチド

【0179】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントは、ａ）標的部位に結合する能力を保持し、任意で、ｂ）その活性を保持する。いくつかの実施形態では、保持される活性は、エンドヌクレアーゼ活性である。特定の実施形態では、エンドヌクレアーゼ活性は、ｔｒａｃｒＲＮＡを必要としない。

【0180】

いくつかの実施形態では、Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントの活性部分が、改変される。いくつかの実施形態では、改変が、Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントのヌクレアーゼ活性を低減又は増加させるアミノ酸変化（例えば、欠失、挿入、又は置換）を含む。例えば、いくつかの実施形態において、改変Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントは、対応する非改変Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントの５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、又は１％未満のヌクレアーゼ活性を有する。いくつかの実施形態では、改変Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントは、実質的なヌクレアーゼ活性を有さない。いくつかの実施形態では、それは５０％、２倍、４倍、又は１０倍を超えるヌクレアーゼ活性を有し得る。

【0181】

いくつかの実施形態において、Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントの活性部分は、ＤＮＡ改変活性及び／又は転写因子活性及び／又はＤＮＡ会合ポリペプチド改変活性を有する異種ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、異種ポリペプチドは、ヌクレアーゼ活性を提供するＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントの一部を置換する。いくつかの実施形態において、Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントは、通常ヌクレアーゼ活性を提供するＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントの一部（及びその一部は完全に活性であり得るか、又は代わりに対応する未改変活性の１００％未満を有するように改変され得る）及び異種ポリペプチドの両方を含む。言い換えれば、いくつかの実施形態では、Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントは、通常ヌクレアーゼ活性を提供するＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントの部分と異種ポリペプチドの両方を含む融合ポリペプチドであり得る。

【0182】

例えば、Ｂ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２融合タンパク質において、Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントは、異種ポリペプチド配列（例えば、Ｂ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２以外のタンパク質由来のポリペプチド配列）に融合され得る。異種ポリペプチド配列は、Ｂ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２融合タンパク質によっても示される活性（例えば、酵素活性）を示し得る（例えば、メチルトランスフェラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、キナーゼ活性、ユビキチン化活性など）。異種核酸配列は、融合ポリペプチドをコードする融合ヌクレオチド配列を生成するために、別の核酸配列に（例えば、遺伝子工学によって）連結され得る。いくつかの実施形態において、Ｂ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２融合ポリペプチドは、Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントを、細胞内局在化（例えば、核への標的化のための核局在化シグナル（ＮＬＳ）；ミトコンドリアへの標的化のためのミトコンドリア局在化シグナル；葉緑体への標的化のための葉緑体局在化シグナル：ＥＲ保持シグナルなど）を提供する異種配列と融合させることによって生成される。いくつかの実施形態では、異種配列は、追跡又は精製を容易にするためのタグ（例えば、蛍光タンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＹＦＰ、ＲＦＰ、ＣＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏなど；ＨＩＳタグ、例えば、６ＸＨｉｓタグ；ヘマグルチニン（ＨＡ）タグ；ＦＬＡＧタグ；Ｍｙｃタグなど）を提供することができる。いくつかの実施形態において、異種配列は、安定性の増加又は減少を提供することができる。いくつかの実施形態において、異種配列は、結合ドメイン（例えば、Ｂ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２融合ポリペプチドの、目的の別のタンパク質、例えば、ＤＮＡ又はヒストン改変タンパク質、転写因子又は転写抑制因子、動員タンパク質などに結合する能力を提供する）又は目的のヌクレオチド（例えば、ヌクレオチド結合タンパク質のアプタマー又は標的部位）を提供することができる。

【0183】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＢ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチドバリアントのいずれかによれば、Ｂ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチドバリアントは、エンドデオキシリボヌクレアーゼ活性が低下している。例えば、本開示の転写調節方法における使用に好適なＢ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチドバリアントは、未改変Ｂ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチドの約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約１％未満、又は約０．１％未満のエンドデオキシリボヌクレアーゼ活性を示す。

【0184】

いくつかの実施形態において、バリアントＢ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチドは、検出可能なエンドデオキシリボヌクレアーゼ活性（ｄＢ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２）を実質的に有さない。いくつかの実施形態では、Ｂ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチドバリアントが低減された触媒活性を有する場合、ポリペプチドは、ガイドＲＮＡと相互作用する能力を保持する限り、部位特異的な様式で（ガイドＲＮＡによって依然として標的ＤＮＡ配列に誘導されるため）依然として標的ＤＮＡに結合することができる。いくつかの実施形態において、バリアントＢ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチドは、標的ＤＮＡの相補鎖を切断することができるが、標的ＤＮＡの非相補鎖を切断する能力が低下しているニッカーゼである。

【0185】

いくつかの実施形態において、バリアントＢ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチドは、標的ＤＮＡの非相補鎖を切断することができるが、標的ＤＮＡの相補鎖を切断する能力が低下しているニッカーゼである。

【0186】

いくつかの実施形態において、バリアントＢ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチドは、標的ＤＮＡの相補鎖及び非相補鎖の両方を切断する能力が低下している。例えば、アラニン置換が企図される。

【0187】

いくつかの実施形態において、バリアントＢ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチドは、融合ポリペプチド（「バリアントＢ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２融合ポリペプチド」）、例えば、ｉ）バリアントＢ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド；及びｉｉ）共有結合した異種ポリペプチド（「融合パートナー」とも呼ばれる）を含む融合ポリペプチドである。

【0188】

異種ポリペプチドは、バリアントＢ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２融合ポリペプチドによっても示される活性（例えば、酵素活性）を示し得る（例えば、メチルトランスフェラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、キナーゼ活性、ユビキチン化活性など）。異種核酸配列は、別の核酸配列に（例えば、遺伝子工学によって）連結され、融合ポリペプチドをコードする融合ヌクレオチド配列を生成することができる。いくつかの実施形態において、バリアントＢ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２融合ポリペプチドは、バリアントＢ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチドを、細胞内局在化を提供する異種配列と融合させることによって生成される（例えば、異種配列は、細胞内局在化配列、例えば、核への標的化のための核局在化シグナル（ＮＬＳ）；ミトコンドリアへの標的化のためのミトコンドリア局在化シグナル；葉緑体への標的化のための葉緑体局在化シグナル；ＥＲ保持シグナルなどである）。いくつかの実施形態において、異種配列は、追跡及び／又は精製を容易にするためのタグ（例えば、異種配列は、検出可能な標識である）を提供することができる（例えば、蛍光タンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＹＦＰ、ＲＦＰ、ＣＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏなど；ヒスチジンタグ、例えば、６ＸＨｉｓタグ；ヘマグルチニン（ＨＡ）タグ；ＦＬＡＧタグ；Ｍｙｃタグなど）。いくつかの実施形態において、異種配列は、安定性の増加又は減少を提供することができる（例えば、異種配列は、安定性制御ペプチド、例えば、いくつかの場合において制御可能であるデグロン（例えば、温度感受性又は薬物制御可能なデグロン配列、下記を参照））。いくつかの実施形態において、異種配列は、標的ＤＮＡからの転写の増加又は減少を提供することができる（例えば、異種配列は、転写調節配列、例えば、転写因子／活性化因子又はその断片、転写因子／活性化因子を動員するタンパク質又はその断片、転写抑制因子又はその断片、転写抑制因子を動員するタンパク質又はその断片、小分子／薬物応答性転写調節因子などである）。いくつかの実施形態において、異種配列は、結合ドメインを提供することができる（例えば、異種配列は例えば、融合ｄＢ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチドが目的の別のタンパク質、例えば、ＤＮＡ又はヒストン改変タンパク質、転写因子又は転写抑制因子、動員タンパク質などに結合する能力を提供するタンパク質結合配列である）。

【0189】

安定性の増加又は減少を提供する好適な融合パートナーとしてはデグロン配列が挙げられるが、これらに限定されない。デグロンは、それらが一部であるタンパク質の安定性を制御するアミノ酸配列であることが当業者によって容易に理解される。例えば、デグロン配列を含むタンパク質の安定性は、少なくとも部分的にデグロン配列によって制御される。いくつかの実施形態では、好適なデグロンは、デグロンが実験対照とは無関係にタンパク質安定性にその影響を及ぼすように構成的である（例えば、デグロンは、薬物誘導性、温度誘導性などではない）。いくつかの実施形態において、デグロンは、バリアントＢ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチドが所望の条件に応じて「オン」（例えば、安定）又は「オフ」（例えば、不安定、低下した）になり得るように、制御可能な安定性を有するバリアントＢ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチドを提供する。例えば、デグロンが温度感受性デグロンである場合、バリアントＢ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチドは、閾値温度（例えば、４２℃、４１℃、４０℃、３９℃、３８℃、３７℃、３６℃、３５℃、３４℃、３３℃、３２℃、３１℃、３０℃など）未満では機能的（例えば、「オン」、安定）であるが、閾値温度を超えると非機能的（例えば、「オフ」、低下した）であり得る。別の例として、デグロンが薬物誘導性デグロンである場合、薬物の存在又は非存在は、タンパク質を「オフ」（例えば、不安定）状態から「オン」（例えば、安定）状態に、又はその逆に切り替えることができる。例示的な薬物誘導性デグロンは、ＦＫＢＰ１２タンパク質に由来する。デグロンの安定性は、デグロンに結合する小分子の有無によって制御される。

【0190】

好適なデグロンの例としてはＳｈｉｅｌｄ－１、ＤＨＦＲ、オーキシン、及び／又は温度によって制御されるデグロンが挙げられるが、これらに限定されない。好適なデグロンの非限定的な例は、当技術分野で公知である（例えば、Ｄｏｈｍｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９４．２６３（５１５１）：ｐ．１２７３－１２７６：熱誘導性デグロン：温度感受性突然変異体の構築方法；Ｓｃｈｏｅｂｅｒら、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｎａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２００９ Ｊａｎ；２９６（１）：Ｆ２０４－１１：Ｓｈｉｅｌｄ－１を用いた多量体ＴＲＰＶ５チャネルの条件付き高速発現及び機能；Ｃｈｕら、Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ．２００８ Ｎｏｖ １５；１８（２２）：５９４１－４：ＦＫＢＰ由来の不安定化ドメインに関する最近の進歩；Ｋａｎｅｍａｋｉ、Ｐｆｌｕｇｅｒｓ Ａｒｃｈ．２０１２ Ｄｅｃ ２８：条件付きデグロンによるタンパク質発現制御の最前線；Ｙａｎｇら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．２０１２ Ｎｏｖ ３０；４８（４）：４８７－８：破壊への動機づけ：メチルデグロン；Ｂａｒｂｏｕｒら、Ｂｉｏｓｃｉ Ｒｅｐ．２０１３ Ｊａｎ １８；３３（１）．：チミジル酸シンターゼのユビキチン非依存性分解を制御する二部構成デグロンの特性評価；及びＧｒｅｕｓｓｉｎｇｒａ、Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ．２０１２ Ｎｏｖ １０；（６９）：デグロン（ｄｇｎ）不安定化緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）ベースのレポータータンパク質を用いた、生細胞中のユビキチン－プロテアソーム活性のモニタリング；これらの全ては、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。

【0191】

例示的なデグロン配列は、細胞及び動物の両方において十分に特徴付けられ、試験されている。したがって、Ｂ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２をデグロン配列に融合すると、「調整可能」かつ「誘導可能」なＢ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチドが生成される。本明細書に記載の融合パートナーのいずれも、いずれかの望ましい組み合わせで使用することができる。この点を説明するための１つの非限定的な例として、Ｂ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２融合タンパク質は、検出のためのＹＦＰ配列、安定性のためのデグロン配列、及び標的ＤＮＡからの転写を増加させるための転写活性化因子配列を含むことができる。さらに、Ｂ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２融合タンパク質において使用することができる融合パートナーの数は制限されない。いくつかの実施形態において、Ｂ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２融合タンパク質は、１つ又は複数（例えば、２つ以上、３つ以上、４つ以上、又は５つ以上）の異種配列を含む。

【0192】

好適な融合パートナーとしては、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、デアセチラーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、クロトニル化活性、脱クロトニル化活性、プロピオニル化活性、脱プロピオニル化活性、ミリストイル化活性、又は脱ミリストイル化活性を提供するポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されず、これらのいずれも、ＤＮＡを直接改変すること（例えば、ＤＮＡのメチル化）又はＤＮＡ会合ポリペプチド（例えば、ヒストン又はＤＮＡ結合タンパク質）を改変することを目的とすることができる。さらなる好適な融合パートナーとしては限定されないが、境界エレメント（例えば、ＣＴＣＦ）、末梢動員を提供するタンパク質及びその断片（例えば、ラミンＡ、ラミンＢなど）、並びにタンパク質ドッキングエレメント（例えば、ＦＫＢＰ／ＦＲＢ、Ｐｉｌ １／Ａｂｙ １など）が挙げられる。

【0193】

Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントはまた、従来の組換え合成方法に従って単離及び精製され得る。ライセートは、発現宿主から調製することができ、ライセートは、ＨＰＬＣ、排除クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、又は他の精製技術を使用して精製することができる。ほとんどの場合、使用される組成物は、生成物の調製方法及びその精製に関連する夾雑物に関して、少なくとも２０重量％の所望の生成物、少なくとも約７５重量％、少なくとも約９５重量％、及び治療目的のために、典型的には少なくとも９９．５重量％を含む。一般に、パーセンテージは、総タンパク質に基づく。ＤＮＡ切断及び組換え、又は標的ＤＮＡへのいずれかの所望の改変、又は標的ＤＮＡに会合するポリペプチドへのいずれかの所望の改変を誘導するために、ガイドＲＮＡ及び／若しくはＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアント及び／又はドナーポリヌクレオチドは、核酸又はポリペプチドとして導入されるかどうかにかかわらず、約３０分～約２４時間、例えば、１時間、１．５時間、２時間、２．５時間、３時間、３．５時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、１２時間、１６時間、１８時間、２０時間、又は約３０分～約２４時間のいずれかの他の期間、細胞に提供され、これは、約毎日～約４日毎、例えば、１．５日毎、２日毎、３日毎、又は約毎日～約４日毎のいずれかの他の頻度で反復され得る。薬剤（複数可）は、細胞に１回以上、例えば、１回、２回、３回、又は３回超、提供されてもよく、細胞は、各接触事象後、ある時間、例えば、１６～２４時間、薬剤とインキュベートされ、その後、培地は、新鮮な培地と交換され、細胞がさらに培養される。２つ以上の異なる標的化複合体が細胞に提供される場合（例えば、同じ又は異なる標的ＤＮＡ内の異なる配列に相補的である２つの異なるガイドＲＮＡ）、複合体は、同時に（例えば、２つのポリペプチド及び／又は核酸として）提供され得るか、又は同時に送達され得る。あるいは、それらは連続的に提供されてもよく、例えば、標的化複合体が最初に提供され、続いて第２の標的化複合体などが提供されてもよく、又はその逆であってもよい。

【0194】

核酸

【0195】

ガイドＲＮＡ／ｓｇＲＮＡ

【0196】

いくつかの実施形態において本明細書に記載される系、組成物、及び方法は、会合ポリペプチド（例えば、Ｂ－ＧＥｎ．１ポリペプチド若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアント）の活性を標的核酸内の特定の標的配列に向けることができるゲノム標的化核酸を使用する。いくつかの実施形態では、ゲノム標的化核酸は、ＲＮＡである。ゲノム標的化ＲＮＡは、本明細書において「ガイドＲＮＡ」又は「ｇＲＮＡ」と称される。ガイドＲＮＡは、目的の標的核酸配列及びＣＲＩＳＰＲ反復配列（そのようなＣＲＩＳＰＲ反復配列は、「ｔｒａｃｒメイト配列」とも称される）にハイブリダイズすることができる少なくともスペーサー配列を有する。ＩＩ型系では、ｇＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列と呼ばれる第２のＲＮＡも有する。ＩＩ型ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）において、ＣＲＩＳＰＲ反復配列及びｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、互いにハイブリダイズして二重鎖を形成する。Ｖ型ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）では、ｃｒＲＮＡは二重鎖を形成する。両方の系において、二重鎖は、ガイドＲＮＡ及び部位特異的ポリペプチドが複合体を形成するように部位特異的ポリペプチドに結合する。ゲノム標的化核酸は、部位特異的ポリペプチドとのその会合により、複合体に対する標的特異性を提供する。したがって、ゲノム標的化核酸は、部位特異的ポリペプチドの活動を指示する。

【0197】

いくつかの実施形態では、ゲノム標的化核酸は、二重分子ガイドＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ゲノム標的化核酸は、単一分子ガイドＲＮＡ又はシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である。二重分子ガイドＲＮＡは、２本のＲＮＡ鎖を有する。第１の鎖は５’から３’への方向に、任意のスペーサー伸長配列、スペーサー配列及び最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列を有する。第２の鎖は、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列に相補的）、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列及び任意のｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列を有する。ＩＩ型系における単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、５’から３’への方向に、任意のスペーサー伸長配列、スペーサー配列、最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列、単一分子ガイドリンカー、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列及び任意のｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列を有する。任意のｔｒａｃｒＲＮＡ伸長は、ガイドＲＮＡにさらなる機能性（例えば、安定性）を与えるエレメントを有し得る。単一分子ガイドリンカーは、最小ＣＲＩＳＰＲ反復及び最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を連結して、ヘアピン構造を形成する。任意のｔｒａｃｒＲＮＡ伸長は、１つ又は複数のヘアピンを有する。

【0198】

Ｖ型系における単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、５’から３’への方向に、最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列及びスペーサー配列を有する。あるいは、Ｖ型系における単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、５’から３’への方向に、任意のｔｒａｃｒ伸長配列、ｔｒａｃｒ ＲＮＡ配列、単一分子ガイドリンカー、最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列、スペーサー配列、及び任意のスペーサー伸長配列を有する。

【0199】

あるいは、Ｖ型系における単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、５’から３’への方向に、任意の伸長配列、最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列、スペーサー配列、及び任意のスペーサー伸長配列を有する。

【0200】

さらに別の代替法では、Ｖ型系における単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、５’から３’への方向に、任意の伸長配列、人工ヌクレアーゼ結合ＲＮＡ配列及びスペーサー配列、並びに任意のスペーサー伸長配列を含む。

【0201】

本発明によるＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓヌクレアーゼ、及び潜在的に他のＶ型ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓヌクレアーゼのための特に有用なｓｇＲＮＡは、配列番号：４０～４４に開示される配列である。

【0202】

【表5】

【0203】

これらは、それらの３’末端に好適な標的特異的配列を付加することを可能にする。

【0204】

例示的なゲノム標的化核酸は、例えば、ＷＯ２０１８００２７１９に記載されている。一般に、ＣＲＩＳＰＲ反復配列は、（１）対応するｔｒａｃｒ配列を含む細胞中のＣＲＩＳＰＲ反復配列に隣接するＤＮＡ標的化セグメントの切除；及び（２）標的配列でのＣＲＩＳＰＲ複合体の形成であって、ＣＲＩＳＰＲ複合体が、ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズしたＣＲＩＳＰＲ反復配列を含む形成、のうちの１つ以上を促進するために、ｔｒａｃｒ配列と十分な相補性を有するいずれかの配列を含む。一般に、相補性の程度は、ＣＲＩＳＰＲ反復配列及びｔｒａｃｒ配列の、２つの配列のうちの短い方の長さに沿った、最適なアラインメントを基準とする。最適なアラインメントは、いずれかの好適なアラインメントアルゴリズムによって決定することができ、さらに、ｔｒａｃｒ配列又はＣＲＩＳＰＲ反復配列内の自己相補性などの二次構造を考慮することができる。いくつかの実施形態では、最適にアライメントされたときの、ｔｒａｃｒ配列とＣＲＩＳＰＲ反復配列との間の、２つのうちの短い方の３０ヌクレオチド長に沿った相補性の程度は、約２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７．５％、９９％、又はそれ以上である。いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒ配列が約５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、１６以上、１７以上、１８以上、１９以上、２０以上、２５以上、３０以上、４０以上、５０以上、又はそれ以上のヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒ配列及びＣＲＩＳＰＲ反復配列は、２つの間のハイブリダイゼーションが、ヘアピンなどの二次構造を有する転写物を生成するように、単一の転写物内に含まれる。いくつかの実施形態では、転写物又は転写ポリヌクレオチド配列が少なくとも２つ以上のヘアピンを有する。

【0205】

ガイドＲＮＡのスペーサーは、標的ＤＮＡ中の配列に相補的なヌクレオチド配列を含む。言い換えれば、ガイドＲＮＡのスペーサーは、ハイブリダイゼーション（例えば、塩基対合）を介して、配列特異的な様式で標的ＤＮＡと相互作用する。そのようなものとして、スペーサーのヌクレオチド配列は、変化することができ、ガイドＲＮＡ及び標的ＤＮＡが相互作用する標的ＤＮＡ内の位置を決定する。ガイドＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントは、標的ＤＮＡ内のいずれかの所望の配列にハイブリダイズするように（例えば、遺伝子工学によって）改変することができる。

【0206】

いくつかの実施形態において、スペーサーは、１０ヌクレオチド～３０ヌクレオチドの長さを有する。いくつかの実施形態において、スペーサーは、１３ヌクレオチド～２５ヌクレオチドの長さを有する。いくつかの実施形態において、スペーサーは、１５ヌクレオチド～２３ヌクレオチドの長さを有する。いくつかの実施形態において、スペーサーは１８ヌクレオチド～２２ヌクレオチド、例えば、２０～２２ヌクレオチドの長さを有する。

【0207】

いくつかの実施形態では、スペーサーのＤＮＡ標的化配列と標的ＤＮＡのプロトスペーサーとの間の相補性パーセントは、２０～２２ヌクレオチドに対して、少なくとも６０％（例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％）である。

【0208】

いくつかの態様において、プロトスペーサーは、その３’末端上の好適なＰＡＭ配列に直接隣接するか、又はそのようなＰＡＭ配列は、その３’部分におけるＤＮＡ標的化配列の一部である。

【0209】

ガイドＲＮＡの改変は、ガイドＲＮＡ及びＣａｓエンドヌクレアーゼ、例えばＢ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２を含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓゲノム編集複合体の形成又は安定性を増強するために使用することができる。ガイドＲＮＡの改変はまた、又は代わりに、ゲノム中の標的配列とのゲノム編集複合体間の相互作用の開始、安定性又は動態を増強するために使用することができ、これは、例えば、オンターゲット活性を増強するために使用することができる。ガイドＲＮＡの改変はまた、又は代わりに、特異性、例えば、他の（オフターゲット）部位での効果と比較した、オンターゲット部位でのゲノム編集の相対速度を増強するために使用することができる。

【0210】

改変はまた、又は代わりに、例えば、細胞中に存在するリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）による分解に対するその耐性を増加させ、それによって細胞中のその半減期を増加させることによって、ガイドＲＮＡの安定性を増加させるために使用され得る。ガイドＲＮＡ半減期を増強する改変は、Ｂ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２などのＣａｓエンドヌクレアーゼが、Ｂ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２エンドヌクレアーゼを生成するために翻訳される必要があるＲＮＡを介して編集される細胞に導入される実施形態において特に有用であり得、それはエンドヌクレアーゼをコードするＲＮＡと同時に導入されるガイドＲＮＡの半減期を増加させることが、ガイドＲＮＡ及びコードされるＣａｓエンドヌクレアーゼが細胞中に共存する時間を増加させるために使用され得るからである。

【0211】

ドナーＤＮＡ又はドナー鋳型

【0212】

ＤＮＡエンドヌクレアーゼなどの部位特異的ポリペプチドは、核酸、例えばゲノムＤＮＡに二本鎖切断又は一本鎖切断を導入することができる。二本鎖切断は、細胞の内因性ＤＮＡ修復経路（例えば、相同組換え修復（ＨＤＲ）又は非相同末端結合若しくは代替的な非相同末端結合（Ａ－ＮＨＥＪ）又は微小相同性媒介末端結合（ＭＭＥＪ））を刺激することができる。ＮＨＥＪは、相同鋳型を必要とせずに、切断された標的核酸を修復することができる。これは、時には切断部位における標的核酸における小さな欠失又は挿入（インデル）をもたらし得、遺伝子発現の破壊又は変化をもたらし得る。相同組換え（ＨＲ）としても知られているＨＤＲは、相同修復鋳型又はドナーが利用可能である場合に起こり得る。

【0213】

相同ドナー鋳型は、標的核酸切断部位に隣接する配列に相同な配列を有する。姉妹染色分体は一般に、修復鋳型として細胞によって使用される。しかし、ゲノム編集の目的のために、修復鋳型は、プラスミド、二本鎖オリゴヌクレオチド、一本鎖オリゴヌクレオチド、二本鎖オリゴヌクレオチド、又はウイルス核酸などの外因性核酸として供給されることが多い。外因性ドナー鋳型では、追加の又は改変された核酸配列も標的遺伝子座に組み込まれるように、相同性の隣接領域間に追加の核酸配列（例えば、導入遺伝子）又は改変（例えば、単一又は複数の塩基の変更又は欠失）を導入することが一般的である。ＭＭＥＪは、小さな欠失及び挿入が切断部位で起こり得るという点で、ＮＨＥＪと同様の遺伝的結果をもたらす。ＭＭＥＪは、切断部位に隣接する数塩基対の相同配列を利用して、好ましい末端結合ＤＮＡ修復結果を駆動する。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼ標的領域における潜在的な微小相同性の分析に基づいて、可能性のある修復結果を予測することが可能であり得る。

【0214】

したがって、場合によっては、相同組換えを用いて、外因性ポリヌクレオチド配列を標的核酸切断部位に挿入する。外因性ポリヌクレオチド配列は、本明細書においてドナーポリヌクレオチド（又はドナー若しくはドナー配列又はポリヌクレオチドドナー鋳型）と称される。いくつかの実施形態では、ドナーポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチドの一部、ドナーポリヌクレオチドのコピー、又はドナーポリヌクレオチドのコピーの一部が標的核酸切断部位に挿入される。いくつかの実施形態では、ドナーポリヌクレオチドが外因性ポリヌクレオチド配列、すなわち、標的核酸切断部位に天然に存在しない配列である。

【0215】

外因性ＤＮＡ分子が、二本鎖切断が起こる細胞の核内に十分な濃度で供給される場合、外因性ＤＮＡは、ＮＨＥＪ修復プロセス中に二本鎖切断で挿入され得、したがって、ゲノムへの永続的な付加となり得る。これらの外因性ＤＮＡ分子は、いくつかの実施形態ではドナー鋳型と呼ばれる。ドナー鋳型が本明細書に記載される１つ又は複数の系構成要素のコード配列を、場合により、プロモーター、エンハンサー、ポリＡ配列及び／又はスプライスアクセプター配列などの関連する調節配列と一緒に含む場合、１つ又は複数の系構成要素は、ゲノム中の組み込まれた核酸から発現され得、細胞の寿命の間、永続的な発現をもたらす。さらに、ドナーＤＮＡ鋳型の組み込まれた核酸は、細胞が分裂するときに娘細胞に伝達され得る。

【0216】

二本鎖切断のいずれかの側のＤＮＡ配列と相同性を有する隣接ＤＮＡ配列を含むドナーＤＮＡ鋳型（相同性アームと呼ばれる）の十分な濃度の存在下で、ドナーＤＮＡ鋳型は、ＨＤＲ経路を介して組み込むことができる。相同性アームは、ドナー鋳型と二本鎖切断のいずれかの側の配列との間の相同組換えのための基質として作用する。これは、二本鎖切断のいずれかの側の配列が非改変ゲノム中の配列から変更されない、ドナー鋳型の誤りのない挿入をもたらし得る。

【0217】

ＨＤＲによる編集のための供給されたドナーは著しく変化するが、一般に、ゲノムＤＮＡへのアニーリングを可能にするために、小さな又は大きな隣接相同アームを有する意図された配列を含む。導入された遺伝的変化に隣接する相同性領域は、３０ｂｐ以下、又はプロモーター、ｃＤＮＡなどを含有し得るマルチキロ塩基カセット程度の大きさであり得る。一本鎖及び二本鎖オリゴヌクレオチドドナーの両方を使用することができる。これらのオリゴヌクレオチドはサイズが１００ｎｔ未満から多くのｋｂを超える範囲であるが、より長いｓｓＤＮＡを生成し、使用することもできる。ＰＣＲアンプリコン、プラスミド、及びミニサークルを含む二本鎖ドナーがしばしば使用される。一般に、ＡＡＶベクターはドナーテンプレートの送達の非常に有効な手段であるが見出されているが、個々のドナーのパッケージング限界は＜５ｋｂである。ドナーの活性転写は、ＨＤＲを３倍増加させ、プロモーターの包含が変換を増加させ得ることを示す。逆に、ドナーのＣｐＧメチル化は、遺伝子発現及びＨＤＲを減少させることができる。

【0218】

いくつかの実施形態では、ドナーＤＮＡが、ヌクレアーゼと共に、又は独立して、様々な異なる方法、例えばトランスフェクション、ナノ粒子、マイクロインジェクション、若しくはウイルス形質導入などによって供給され得る。いくつかの実施形態では、ＨＤＲのためのドナーの利用可能性を増加させるために、ある範囲のテザリングオプションを使用することができる。例としては、ドナーをヌクレアーゼに結合させること、近くに結合するＤＮＡ結合タンパク質に結合させること、又はＤＮＡ末端結合若しくは修復に関与するタンパク質に結合させることが挙げられる。

【0219】

ＮＨＥＪ又はＨＤＲによるゲノム編集に加えて、ＮＨＥＪ経路及びＨＲの両方を使用する部位特異的遺伝子挿入を行うことができる。組合せアプローチは、おそらくイントロン／エクソン境界を含む、特定の状況において適用可能であり得る。ＮＨＥＪは、イントロンにおけるライゲーションに有効であることを証明することができ、一方、エラーのないＨＤＲは、コード領域により適していることができる。

【0220】

ベクター

【0221】

別の態様では、本開示の実施形態を実施するために必要な、Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアント、ｇＲＮＡ、及び／又はいずれかの核酸又はタンパク質性分子をコードするコドン最適化ポリヌクレオチド配列を含む核酸が本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、そのような核酸は、ベクター（例えば、組換え発現ベクター）である。

【0222】

企図される発現ベクターとしては、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ＳＶ４０、単純ヘルペスウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、レトロウイルス（例えば、マウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、並びにラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、レンチウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、及び乳房腫瘍ウイルスなどのレトロウイルスに由来するベクター）に基づくウイルスベクター、及び他の組換えベクターが挙げられるが、これらに限定されない。真核生物標的細胞のために企図される他のベクターとしては、ベクターｐＸＴ１、ｐＳＧ５、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、及びｐＳＶＬＳＶ４０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）が挙げられるが、これらに限定されない。真核生物標的細胞のために企図されるさらなるベクターとしては、ベクターｐＣＴｘ－１、ｐＣＴｘ－２、及びｐＣＴｘ－３が挙げられるが、これらに限定されない。他のベクターは、それらが宿主細胞と適合性である限り、使用され得る。

【0223】

いくつかの実施形態において、ベクターは、１つ又は複数の転写及び／又は翻訳制御エレメントを有する。利用される宿主／ベクター系に応じて、構成的及び誘導性プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含む、多くの好適な転写及び翻訳制御エレメントのいずれかが、発現ベクターにおいて使用され得る。いくつかの実施形態では、ベクターは、ウイルス配列又はＣＲＩＳＰＲ機構の構成要素又は他のエレメントを不活性化する自己不活性化ベクターである。

【0224】

好適な真核生物プロモーター（すなわち、真核細胞において機能するプロモーター）の非限定的な例としては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ、初期及び後期ＳＶ４０、レトロウイルス由来の長末端反復（ＬＴＲ）、ヒト伸長因子－１プロモーター（ＥＦ１）、ニワトリ－β－アクチンプロモーター（ＣＡＧ）に融合したサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサーを有するハイブリッド構築物、マウス幹細胞ウイルスプロモーター（ＭＳＣＶ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ－１遺伝子座プロモーター（ＰＧＫ）、及びマウスメタロチオネイン－Ｉからのものが挙げられる。

【0225】

Ｃａｓエンドヌクレアーゼに関連して使用されるガイドＲＮＡを含む低分子ＲＮＡを発現させるために、例えばＵ６及びＨ１を含むＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターなどの様々なプロモーターが有利であり得る。そのようなプロモーターの記載及びその使用を増強するためのパラメーターは，当技術分野で公知であり、さらなる情報及びアプローチｈａ，定期的に記載されている；例えば、Ｍａ，Ｈｅｔ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ－Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ３、ｅ１６１（２０１４）ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔｎａ．２０１４．１２を参照されたい。

【0226】

発現ベクターはまた、翻訳開始のためのリボソーム結合部位及び転写ターミネーターを含むことができる。発現ベクターはまた、発現を増幅するための適切な配列を含むことができる。発現ベクターはまた、部位特異的ポリペプチドに融合され、したがって融合タンパク質をもたらす非天然タグ（例えば、ヒスチジンタグ、ヘマグルチニンタグ、緑色蛍光タンパク質など）をコードするヌクレオチド配列を含むことができる。

【0227】

いくつかの実施形態では、プロモーターは、誘導性プロモーター（例えば、熱ショックプロモーター、テトラサイクリン調節プロモーター、ステロイド調節プロモーター、金属調節プロモーター、エストロゲン受容体調節プロモーターなど）である。いくつかの実施形態において、プロモーターは、構成的プロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター、ＵＢＣプロモーター）である。いくつかの実施形態では、プロモーターは、空間的に限定された及び／又は時間的に限定されたプロモーター（例えば、組織特異的プロモーター、細胞型特異的プロモーターなど）である。いくつかの実施形態において、ベクターは、ゲノムに挿入された後、ゲノム中に存在する内因性プロモーターの下で、遺伝子が発現される場合、宿主細胞中で発現される少なくとも１つの遺伝子のためのプロモーターを有さない。

【0228】

核酸及びポリペプチドの改変

【0229】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは例えば、本明細書にさらに記載され、当技術分野において公知であるように、活性、安定性又は特異性を増強するため、送達を変更するため、宿主細胞における先天性免疫応答を低減するため、タンパク質サイズをさらに低減するため、又は他の増強のために使用され得る１つ又は複数の改変を含む。いくつかの実施形態において、そのような改変は、配列番号：２の配列に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＢ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチドをもたらす。

【0230】

コドン最適化

【0231】

特定の実施形態において、改変ポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲ－Ｂ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２系において使用され、ここで、ガイドＲＮＡ及び／又はＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントをコードするポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ又はＲＮＡは、以下に記載及び例示されるように改変され得る。そのような改変ポリヌクレオチドは、いずれかの１つ又は複数のゲノム遺伝子座を編集するために、ＣＲＩＳＰＲ－Ｂ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２系において使用することができる。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドにおけるそのような改変が、コドン最適化、例えば、コードされたポリペプチドが発現される特定の宿主細胞に基づくコドン最適化、を介して達成される。本開示のいずれかのヌクレオチド配列及び／又は組換え核酸は、目的のいずれかの種における発現のためにコドン最適化され得ることが、当業者によって理解される。コドン最適化は、当技術分野において周知であり、種特異的コドン使用頻度表を用いたコドン使用頻度バイアスのためのヌクレオチド配列の改変を伴う。コドン使用頻度表は、目的の種について最も高度に発現された遺伝子の配列分析に基づいて作成される。非限定的な例では、ヌクレオチド配列が核内で発現される場合、コドン使用頻度表は、目的の種についての高度に発現された核遺伝子の配列分析に基づいて作成される。ヌクレオチド配列の改変は、種特異的コドン使用頻度表を天然ポリヌクレオチド配列中に存在するコドンと比較することによって決定される。

【0232】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントは、コドン最適化ポリヌクレオチド配列から発現される。例えば、意図される標的細胞がヒト細胞である場合、Ｂ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２（又はＢ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２バリアント、例えば酵素的に不活性なバリアント）をコードするヒトコドン最適化ポリヌクレオチド配列が好適であろう。別の非限定的な例として、意図される宿主細胞がマウス細胞である場合、Ｂ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２（又はＢ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２バリアント、例えば酵素的に不活性なバリアント）をコードするマウスコドン最適化ポリヌクレオチド配列が好適であろう。

【0233】

コドン最適化のための戦略及び方法論は当技術分野で公知であり、酵母（Ｏｕｔｃｈｋｏｕｒｏｖら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ、２４（１）：１８－２４（２００２））及び大腸菌（Ｆｅｎｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３９（５０）：１５３９９－１５４０９（２０００））を含むがこれらに限定されない様々な系について記載されている。いくつかの実施形態では、コドン最適化は、ＧｅｎｅＧＰＳ（登録商標）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＡＴＵＭ）を使用し、製造業者が推奨の発現最適化アルゴリズムを使用することによって実施された。いくつかの実施形態において、本開示のポリヌクレオチドは、ヒト細胞における発現の増加のためにコドン最適化される。いくつかの実施形態において、本開示のポリヌクレオチドは、大腸菌細胞における発現の増加のためにコドン最適化される。いくつかの実施形態において、本開示のポリヌクレオチドは、昆虫細胞における発現の増加のためにコドン最適化される。いくつかの実施形態において、本開示のポリヌクレオチドは、Ｓｆ９昆虫細胞における発現の増加のためにコドン最適化される。いくつかの実施形態では、コドン最適化手順で使用される発現最適化アルゴリズムは、推定ポリＡシグナル（例えば、ＡＡＴＡＡＡ及びＡＴＴＡＡＡ）、並びにポリメラーゼスリップをもたらし得るＡの長い（４つを超える）ストレッチを回避するように定義される。

【0234】

当技術分野において十分に理解されるように、ヌクレオチド配列のコドン最適化は、天然ヌクレオチド配列に対して１００％未満の同一性（例えば、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％未満）を有するが、元の天然ヌクレオチド配列によってコードされるものと同じ機能を有するポリペプチドを依然としてコードしているヌクレオチド配列をもたらす。したがって、本開示の代表的な実施形態では、本開示のヌクレオチド配列及び／又は組換え核酸は、目的の特定の種における発現のためにコドン最適化され得る。

【0235】

いくつかの実施形態において、コドン最適化ポリヌクレオチド配列は、配列番号１に対して少なくとも９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．２％、９９．５％、９９．８％、９９．９％、又は１００％の配列同一性を有する。いくつかの態様において、本開示のポリヌクレオチドは、標的細胞におけるコードされたＢ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチドの発現の増加のためにコドン最適化される。いくつかの実施形態において、本開示のポリヌクレオチドは、ヒト細胞における発現の増加のためにコドン最適化される。一般に、本開示のポリヌクレオチドは、いずれかのヒト細胞における発現の増加のためにコドン最適化される。いくつかの実施形態において、本開示のポリヌクレオチドは、大腸菌細胞における発現の増加のためにコドン最適化される。いくつかの実施形態において、本開示のポリヌクレオチドは、昆虫細胞における発現の増加のためにコドン最適化される。一般に、本開示のポリヌクレオチドは、いずれかの昆虫細胞における発現の増加のためにコドン最適化される。いくつかの実施形態において、本開示のポリヌクレオチドは、Ｓｆ９昆虫細胞発現系における発現の増加のためにコドン最適化される。

【0236】

ポリアデニル化シグナルはまた、意図される宿主における発現を最適化するように選択され得る。

【0237】

その他の改変

【0238】

改変はまた、又は代わりに、細胞に導入されたＲＮＡが先天性免疫応答を誘発する可能性又は程度を低下させるために使用され得る。低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含む、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）に関連して十分に特徴付けられているこのような応答は、以下に及び当技術分野において記載されるように、ＲＮＡの半減期の減少及び／又は免疫応答に関連するサイトカイン若しくは他の因子の誘発に関連する傾向がある。

【0239】

１つ又は複数のタイプの改変も、細胞に導入されるＢ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２などのエンドヌクレアーゼをコードするＲＮＡに行うこともでき、それは、限定するものではないが、ＲＮＡの安定性を増強する改変（例えば、細胞中に存在するＲＮａｓｅによるその分解を減少させることによる）、得られる産物の翻訳を増強する改変（例えば、エンドヌクレアーゼ）、及び／又は細胞に導入されるＲＮＡが先天性免疫応答を誘発する可能性又は程度を減少させる改変を含む。前述及び他のものなどの改変の組み合わせも同様に使用することができる。ＣＲＩＳＰＲ－Ｂ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２の場合、例えば、ガイドＲＮＡ（上記で例示したものを含む）に１つ又は複数のタイプの改変を行うことができ、及び／又はＢ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２エンドヌクレアーゼ（上記で例示したものを含む）をコードするＲＮＡに１つ又は複数のタイプの改変を行うことができる。

【0240】

例として、ＣＲＩＳＰＲ－Ｂ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２系又は他のより小さなＲＮＡにおいて使用されるガイドＲＮＡは、化学的手段によって容易に合成することができ、以下に例示され、当技術分野において記載されるように、多数の改変を容易に組み込むことを可能にする。化学合成手順が絶えず拡大している一方で、高速液体クロマトグラフィー（ＰＡＧＥなどのゲルの使用を回避するＨＰＬＣ）などの手順によるそのようなＲＮＡの精製は、ポリヌクレオチド長が１００ヌクレオチド程度を超えて著しく増加することにつれて、より困難になる傾向がある。より長い長さの化学的に改変されたＲＮＡを生成するために使用される１つのアプローチは、一緒にライゲーションされる２つ以上の分子を生成することである。Ｂ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２エンドヌクレアーゼをコードするものなどのはるかに長いＲＮＡは、より容易に酵素的に生成される。より少ないタイプの改変は、酵素的に産生されたＲＮＡにおいて使用するために一般的に利用可能であるが、以下及び当技術分野においてさらに記載されるように、例えば、安定性を増強し、先天性免疫応答の可能性若しくは程度を低減し、及び／又は他の属性を増強するために使用され得る改変が依然として存在し、新規のタイプの改変が定期的に開発されている。様々なタイプの改変、特に、より小さい化学的に合成されたＲＮＡと共に頻繁に使用される改変の例として、改変は、糖の２’位で改変された１つ又は複数のヌクレオチド、いくつかの実施形態では２’－Ｏ－アルキル、２’－Ｏ－アルキル－Ｏ－アルキル又は２’－フルオロ改変ヌクレオチドを含むことができる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ改変は、ピリミジンのリボース上の２’－フルオロ、２’－アミノ、及び２’Ｏ－メチル改変、塩基性残基、又はＲＮＡの３’末端の逆方向塩基を含む。そのような改変は、オリゴヌクレオチドに日常的に組み込まれ、これらのオリゴヌクレオチドは、所与の標的に対する２’デオキシオリゴヌクレオチドよりも高いＴｍ（例えば、より高い標的結合親和性）を有することが示されている。

【0241】

多くのヌクレオチド及びヌクレオシド改変は、それらが組み込まれるオリゴヌクレオチドを、天然オリゴヌクレオチドよりもヌクレアーゼ消化に対してより耐性にすることが示されており；これらの改変オリゴヌクレオチドは、未改変オリゴヌクレオチドよりも長時間無傷に生存する。改変オリゴヌクレオチドの具体例としては、改変骨格を含むもの、例えば、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、短鎖アルキル若しくはシクロアルキル糖間結合、又は短鎖ヘテロ原子若しくは複素環糖間結合が挙げられる。いくつかのオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート骨格を有するオリゴヌクレオチド、ヘテロ原子骨格、特にＣＨ２－ＮＨ－Ｏ－ＣＨ２、ＣＨ、－Ｎ（ＣＨ３）－Ｏ－ＣＨ２（メチレン（メチルイミノ）又はＭＭＩ骨格として知られている）、ＣＨ２－Ｏ－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ２、ＣＨ２－Ｎ（ＣＨ３）－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ２及びＯ－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ２－ＣＨ２骨格；アミド骨格［Ｄｅ Ｍｅｓｍａｅｋｅｒ ら、Ａｃｅ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．、２８：３６６－３７４（１９９５）を参照］；モルホリノ骨格構造（Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ ａｎｄ Ｗｅｌｌｅｒ、米国特許第５，０３４，５０６号を参照）；ペプチド核酸（ＰＮＡ）骨格（ここで、オリゴヌクレオチドのホスホジエステル骨格は、ポリアミド骨格で置き換えられ、核酸は、直接又は間接的にポリアミド骨格のアザ窒素原子に結合され、Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９１、２５４、１４９７を参照）を有するものである。リン含有結合としては、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチル及び他のアルキルホスホネート（３’アルキレンホスホネート及びキラルホスホネートを含む）、ホスフィネート、ホスホラミデート（３’アミノホスホロアミデート及びアミノアルキルホスホロアミデートを含む）、チオノホスホロアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、及び正常な３’－５’結合を有するボラノホスフェート、これらの２’－５’結合アナログ、並びにヌクレオシド単位の隣接する対が３’－５’と５’－３’又は２’－５’と５’－２’で結合している極性が反転したものが挙げられるが、これらに限定されない；米国特許第３，６８７，８０８号；４，４６９，８６３号；４，４７６，３０１号；５，０２３，２４３号；５，１７７，１９６号；５，１８８，８９７号；５，２６４，４２３号；５，２７６，０１９号；５，２７８，３０２号；５，２８６，７１７号；５，３２１，１３１号；５，３９９，６７６号；５，４０５，９３９号；５，４５３，４９６号；５，４５５，２３３号；５，４６６，６７７号；５，４７６，９２５号；５，５１９，１２６号；５，５３６，８２１号；５，５４１，３０６号；５，５５０，１１１号；５，５６３，２５３号；５，５７１，７９９号；５，５８７，３６１号；及び５，６２５，０５０号を参照。

【0242】

モルホリノベースのオリゴマー化合物は、Ｂｒａａｓｃｈ ａｎｄ Ｃｏｒｅｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４１（１４）：４５０３－４５１０（２００２）；Ｇｅｎｅｓｉｓ，Ｖｏｌｕｍｅ ３０，Ｉｓｓｕｅ ３，（２００１）；Ｈｅａｓｍａｎ，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，２４３：２０９－２１４（２００２）；Ｎａｓｅｖｉｃｉｕｓら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，２６：２１６－２２０（２０００）；Ｌａｃｅｎｒａ ｅｔｃ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ／．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９７：９５９１－９５９６（２０００）；及び１９９１年７月２３日に発行された米国特許第５，０３４，５０６号に記載されている。シクロヘキセニル核酸オリゴヌクレオチド模倣体は、Ｗａｎｇら、Ｊ．Ａｍ，Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２２：８５９５－８６０２（２０００）に記載されている。

【0243】

その中にリン原子を含まない改変オリゴヌクレオチド骨格は、短鎖アルキル若しくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子及びアルキル若しくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、又は１つ若しくは複数の短鎖ヘテロ原子若しくは複素環式ヌクレオシド間結合によって形成される骨格を有する。これらには、モルホリノ結合（ヌクレオシドの糖部分から部分的に形成される）を有するもの；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシド及びスルホン骨格；ホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格；メチレンアセチル及びチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファメート骨格；メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ骨格；スルホネート及びスルホンアミド骨格；アミド骨格；並びに混合Ｎ、Ｏ、Ｓ及びＣＨ２成分部分を有する他のものが含まれ；米国特許第５，０３４，５０６号；５，１６６，３１５号；５，１８５，４４４号；５，２１４，１３４号；５，２１６，１４１号；５，２３５，０３３号；５，２６４，５６２号；５，２６４，５６４号；５，４０５，９３８号；５，４３４，２５７号；５，４６６，６７７号；５，４７０，９６７号；５，４８９，６７７号；５，５４１，３０７号；５，５６１，２２５号；５，５９６，０８６号；５，６０２，２４０号；５，６１０，２８９号；５，６０２，２４０号；５，６０８，０４６号；５，６１０，２８９号；５，６１８，７０４号；５，６２３，０７０号；５，６６３，３１２号；５，６３３，３６０号；５，６７７，４３７号；及び５，６７７，４３９号を参照されたし；これらのそれぞれは、参照により本明細書に組み込まれる。

【0244】

１つ又は複数の置換された糖部分も含めることができ、例えば、２’位に以下の：ＯＨ、ＳＨ、ＳＣＨ_３、Ｆ、ＯＣＮ、ＯＣＨ_３、ＯＣＨ_３ Ｏ（ＣＨ_２）_ｎ ＣＨ_３、Ｏ（ＣＨ_２）_ｎ ＮＨ_２又はＯ（ＣＨ_２）_ｎ ＣＨ_３（ここでｎは１～１０）；Ｃ_１からＣ_１０低級アルキル、アルコキシアルコキシ、置換低級アルキル、アルカリル又はアラルキル；Ｃｌ；Ｂｒ；ＣＮ；ＣＦ_３；ＯＣＦ_３；Ｏ－、Ｓ－、又はＮ－アルキル；Ｏ－、Ｓ－、又はＮ－アルケニル：ＳＯＣＨ_３；ＳＯ_２ＣＨ_３；ＯＮＯ_２；ＮＯ_２；Ｎ_３；ＮＨ_２；ヘテロシクロアルキル；ヘテロシクロアルカリル；アミノアルキルアミノ；ポリアルキルアミノ；置換シリル；ＲＮＡ切断基；レポーター基；インターカレーター；オリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を改善するための基；オリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改善するための基又は類似の特性を有する他の置換基のうちの１つを含むことができる。いくつかの実施形態において、改変は、２’－メトキシエトキシ（２’－Ｏ－ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_３、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）としても知られている）（Ｍａｒｔｉｎｅｔ ａ／，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９５，７８，４８６）を含む。他の改変には、２’－メトキシ（２’－Ｏ－ＣＨ_３）、２’－プロポキシ（２’－ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_３）及び２’－フルオロ（２’－Ｆ）が含まれる。同様の改変は、オリゴヌクレオチド上の他の位置、特に３’末端ヌクレオチド上の糖の３’位及び５’末端ヌクレオチドの５’位でもなされ得る。オリゴヌクレオチドはまた、ペントフラノシル基の代わりにシクロブチルなどの糖模倣体を有する可能性がある。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド単位の糖及びヌクレオシド間結合の両方、例えば、骨格が、新規な基で置き換えられる。塩基単位は、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。１つのそのようなオリゴマー化合物、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されているオリゴヌクレオチド模倣体は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と称される。ＰＮＡ化合物において、オリゴヌクレオチドの糖骨格はアミド含有骨格、例えば、アミノエチルグリシン骨格で置き換えられる。核酸塩基は、保持され、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接的又は間接的に結合する。ＰＮＡ化合物の調製を教示する代表的な米国特許には、米国特許第５，５３９，０８２；５，７１４，３３１；及び５，７１９，２６２号が含まれるが、これらに限定されない。ＰＮＡ化合物のさらなる教示は、Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５４：１４９７－１５００（１９９１）に見出すことができる。

【0245】

ガイドＲＮＡはまた、追加的又は代替的に、核酸塩基（当技術分野では単に「塩基」と称されることが多い）改変又は置換を含むことができる。本明細書で使用される場合、「非改変」又は「天然」核酸塩基には、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）及びウラシル（Ｕ）が含まれる。改変核酸塩基には、天然核酸ではまれにしか見つからない、又は一時的にしか見つからない核酸塩基、例えば、ヒポキサンチン、６－メチルアデニン、５－Ｍｅピリミジン、特に５－メチルシトシン（５－メチル－２’デオキシシトシンとも呼ばれ、当技術分野ではしばしば５－Ｍｅ－Ｃと称される）、５－ヒドロキシメチルシトシン（ＨＭＣ）、グリコシルＨＭＣ及びゲントビオシルＨＭＣ、並びに合成核酸塩基、例えば、２－アミノアデニン、２－（メチルアミノ）アデニン、２－（イミダゾリルアルキル）アデニン、２－（アミノアルキルアミノ）アデニン又は他のヘテロ置換アルキルアデニン、２－チオウラシル、２－チオチミン、５－ブロモウラシル、５－ヒドロキシメチルウラシル、８－アザグアニン、７－デアザグアニン、Ｎ６（６－アミノヘキシル）アデニン及び２，６－ジアミノプリンである。Ｋｏｒｎｂｅｒｇ，Ａ、ＤＮＡ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ｐｐ７５－７７（１９８０）；Ｇｅｂｅｙｅｈｕら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：４５１３（１９９７）。当技術分野で公知の「ユニバーサル」塩基、例えばイノシンも含めることができる。５－Ｍｅ－Ｃ置換は、核酸二重鎖の安定性を０．６～１．２℃増加させることが示されており（Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，ｉｎ Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，ｅｄｓ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，１９９３，ｐｐ．２７６－２７８）、塩基置換の実施形態である。

【0246】

改変核酸塩基には、他の合成及び天然核酸塩基、５－メチルシトシン（５－ｍｅ－Ｃ）、５－ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２－アミノアデニン、アデニン及びグアニンの６－メチル及び他のアルキル誘導体、アデニン及びグアニンの２－プロピル及び他のアルキル誘導体、２－チオウラシル、２－チオチミン及び２－チオシトシン、５－ハロウラシル及びシトシン、５－プロピニルウラシル及びシトシン、６－アゾウラシル、シトシン及びチミン、５－ウラシル（シュードウラシル）、４－チオウラシル、８－ハロ、８－アミノ、８－チオ、８－チオアルキル、８－ヒドロキシ及び他の置換アデニン及びグアニン、５－ハロ特に５－ブロモ、５－トリフルオロメチル及び他の５－置換ウラシル及びシトシン、７－メチルクアニン（７－ｍｅｔｈｙｌｑｕａｎｉｎｅ）、７－メチルアデニン、８－アザグアニン及び８－アザアデニン、７－デアザアデニン及び３－デアザグアニン及び３－デアザアデニンなどが含まれる。

【0247】

他の有用な核酸塩基には、米国特許第３，６８７，８０８号に開示されているもの、「Ｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」、８５８～８５９頁、Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ、Ｊ．ｌ．編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、１９９０に開示されているもの、Ｅｎｇｌｉｓｃｈら、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ、１９９１、３０、６１３頁に開示されているもの、及びＳａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．、Ｃｈａｐｔｅｒ １５、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、２８９－３０２頁、Ｃｒｏｏｋｅ．Ｔ．ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．ｅａ．，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９９３に開示されているものが含まれる。これらの核酸塩基のいくつかは、本開示のオリゴマー化合物の結合親和性を増加させるために特に有用である。これらには、５－置換ピリミジン、６－アザピリミジン並びにＮ－２、Ｎ－６及び－Ｏ－６置換プリン（２－アミノプロピルアデニン、５－プロピニルウラシル及び５－プロピニルシトシンを含む）が含まれる。５－メチルシトシン置換は、核酸二重鎖安定性を０．６－１．２ｏｃ増加させることが示されており（Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，ｅｄｓ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，１９９３，ｐｐ．２７６－２７８）及び、さらにより詳細には２’－Ｏ－メトキシエチル糖改変と組み合わせた場合に、塩基置換の実施形態である。改変された核酸塩基は、米国特許第３，６８７，８０８号；５，１３０，３０２号；５，１３４，０６６号；５，１７５，２７３号；５，１７６号；５，１７５，２６６号；５，４３２，２７２号；５，４５７，１８７号；５，４５９，２５５号；５，４８４，９０８号；５，５０２，１７７号；５，５２５，７１１号；５，５５２，５４０号に記載されている。

【0248】

所与のオリゴヌクレオチド中の全ての位置が均一に改変される必要はなく、実際には、上述の改変の２つ以上が単一のオリゴヌクレオチドに、又はオリゴヌクレオチド内の単一のヌクレオシド内に組み込まれてもよい。

【0249】

いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡ及び／又は本開示のＢ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２などのエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡは、ｍＣＡＰ、ＡＲＣＡ又は酵素キャッピング法などの現在のキャッピング法のいずれか１つを使用してキャッピングされ、生物学的に活性を維持し、自己／非自己細胞内応答を回避する生存可能なｍＲＮＡ構築物を作製する。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡ及び／又は本開示のＢ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２などのエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡは、ＣｌｅａｎＣａｐ（商標）（ＴｒｉＬｉｎｋ）共転写キャッピング法を使用することによってキャッピングされる。

【0250】

いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡ及び／又は本発明のエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡは、シュードウリジン、Ｎ^１－メチルシュードウリジン、及び５－メトキシウリジンからなる群より選択される１つ又は複数の改変を含む。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞（例えば、ヒト及びマウス）などの動物細胞におけるＲＮＡ安定性及び／又は蛋白質発現の増強及び免疫原性の低下を提供するために、１つ又は複数のＮ^１－メチルシュードウリジンが、ガイドＲＮＡ及び／又は本開示のエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡに組み込まれる。いくつかの実施形態において、Ｎ^１－メチルシュードウリジン改変は、１つ又は複数の５－メチルシチジンと組み合わせて組み込まれる。

【0251】

いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡ及び／又はＢ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２などのエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ（又はＤＮＡ）は、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布、又は細胞取り込みを増強する１つ又は複数の部分又はコンジュゲートに化学的に連結される。そのような部分は、コレステロール部分［Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ／．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：６５５３－６５５６（１９８９）］；コール酸［Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，４：１０５３－１０６０（１９９４）］；チオエーテル、例えばヘキシル－Ｓ－トリチルチオール［Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔａ／，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，６６０：３０６－３０９（１９９２）及びＭａｎｏｈａｒａｎら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，３．２７６５－２７７０（１９９３）］；チオコレステロール［Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０：５３３－５３８ （１９９２）］；脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオール又はウンデシル残基［Ｋａｂａｎｏｖら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，２５９：３２７－３３０（１９９０）及びＳｖｉｎａｒｃｈｕｋら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，７５：４９－５４（１９９３）］；リン脂質、例えば、ジ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロール又はトリエチルアンモニウム１、２－ジ－Ｏ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロ－３－Ｈ－ホスホナート［Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，３６：３６５１－３６５４（１９９５）及びＳｈｅａら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８：３７７７－３７８３（１９９０）］；ポリアミン又はポリエチレングリコール鎖［Ｍａｎｃｈａｒａｎ ｅｔｃ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１４：９６９－９７３（１９９５）］；アダマンタン酢酸［Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，３６：３６５１－３６５４（１９９５）］；パルミチル部分［Ｍｉｓｈｒａ ｅｔｃ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１２６４：２２９－２３７（１９９５）］；又はオクタデシルアミン又はヘキシルアミノ－カルボニル－ｔ オキシコレステロール部分［Ｃｒｏｏｋｅら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２７７：９２３－９３７（１９９６）］を含むが、これらに限定されない。米国特許第４，８２８，９７９号；４，９４８，８８２号；５，２１８，１０５号；５，５２５，４６５号；５，５４１，３１３号；５，５４５，７３０号；５，５５２，５３８号；５，５７８，７１７号、５，５８０，７３１号；５，５８０，７３１号；５，５９１，５８４号；５，１０９，１２４号；５，１１８，８０２号；５，１３８，０４５号；５，４１４，０７７号；５，４８６，６０３号；５，５１２，４３９号；５，５７８，７１８号；５，６０８，０４６号；４，５８７，０４４号；４，６０５，７３５号；４，６６７，０２５号；４，７６２，７７９号；４，７８９，７３７号；４，８２４，９４１号；４，８３５，２６３号；４，８７６，３３５号；４，９０４，５８２号；４，９５８，０１３号；５，０８２，８３０号；５，１１２，９６３号；５，２１４，１３６号；５，０８２，８３０号；５，１１２，９６３号；５，２１４，１３６号；５，２４５，０２２号；５，２５４，４６９号；５，２５８，５０６号；５，２６２，５３６号；５，２７２，２５０号；５，２９２，８７３号；５，３１７，０９８号；５，３７１，２４１、５，３９１，７２３号；５，４１６，２０３、５，４５１，４６３号；５，５１０，４７５号；５，５１２，６６７号；５，５１４，７８５号；５，５６５，５５２号；５，５６７，８１０号；５，５７４，１４２号；５，５８５，４８１号；５，５８７，３７１号；５，５９５，７２６号；５，５９７，６９６号；５，５９９，９２３号；５，５９９，９２８号及び５，６８８，９４１号を参照されたい。

【0252】

糖及び他の部分を使用して、カチオン性ポリソーム及びリポソームなどの、ヌクレオチドを含むタンパク質及び複合体を特定の部位に標的化することができる。例えば、肝細胞指向性移入はアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）を介して媒介され得る；例えば、Ｈｕら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｅｐｔ Ｌｅｔｔ．２１（１ ０）：１０２５－３０（２０１４）を参照されたい。当技術分野で公知であり、かつ定期的に開発された他の系を使用して、本ケースで使用される生体分子及び／又はその複合体を、目的の特定の標的細胞に標的化することができる。

【0253】

これらのターゲティング部分又はコンジュゲートは、第一級又は第二級ヒドロキシル基などの官能基に共有結合したコンジュゲート基を含むことができる。好適なコンジュゲート基としては、インターカレーター、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、オリゴマーの薬力学的特性を増強する基、及びオリゴマーの薬物動態学的特性を増強する基が挙げられる。典型的なコンジュゲート基としては、コレステロール、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸塩、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、及び色素が挙げられる。薬力学的特性を増強することができる基は取り込みを改善し、分解に対する耐性を増強し、及び／又は標的核酸との配列特異的ハイブリダイゼーションを増強する基を含む。薬物動態学的特性を増強することができる基には、本開示の化合物の取り込み、分布、代謝又は排泄を改善する基が含まれる。代表的なコンジュゲート基は、１９９２年１０月２３日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９１９６号及び米国特許第６，２８７，８６０号に開示されており、これらは参照により本明細書に組み込まれる。コンジュゲート部分には、脂質部分、例えばコレステロール部分、コール酸、チオエーテル、例えばヘキシル－５－トリチルチオール、チオコレステロール、脂肪族鎖、例えばドデカンジオール又はウンデシル残基、リン脂質、例えばジ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロール又はトリエチルアンモニウム１，２－ジ－Ｏ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロ－３－Ｈホスホネート、ポリアミン又はポリエチレングリコール鎖、又はアダマンタン酢酸、パルミチル部分、又はオクタデシルアミン又はヘキシルアミノ－カルボニル－オキシコレステロール部分が含まれるが、これらに限定されない。例えば、米国特許第４，８２８，９７９号；４，９４８，８８２号；５，２１８，１０５号；５，５２５，４６５号；５，５４１，３１３号；５，５４５，７３０号；５，５５２，５３８号；５，５７８，７１７号、５，５８０，７３１号；５，５８０，７３１号；５，５９１，５８４号；５，１０９，１２４号；５，１１８，８０２号；５，１３８，０４５号；５，４１４，０７７号；５，４８６，６０３号；５，５１２，４３９号；５，５７８，７１８号；５，６０８，０４６号；４，５８７，０４４号；４，６０５，７３５号；４，６６７，０２５号；４，７６２，７７９号；４，７８９，７３７号；４，８２４，９４１号；４，８３５，２６３号；４，８７６，３３５号；４，９０４，５８２号；４，９５８，０１３号；５，０８２，８３０号；５，１１２，９６３号；５，２１４，１３６号；５，０８２，８３０号；５，１１２，９６３号；５，２１４，１３６号；５，２４５，０２２号；５，２５４，４６９号；５，２５８，５０６号；５，２６２，５３６号；５，２７２，２５０号；５，２９２，８７３号；５，３１７，０９８号；５，３７１，２４１号、５，３９１，７２３号；５，４１６，２０３号、５，４５１，４６３号；５，５１０，４７５号；５，５１２，６６７号；５，５１４，７８５号；５，５６５，５５２号；５，５６７，８１０号；５，５７４，１４２号；５，５８５，４８１号；５，５８７，３７１号；５，５９５，７２６号；５，５９７，６９６号；５，５９９，９２３号；５，５９９，９２８号及び５，６８８，９４１号を参照のこと。

【0254】

化学合成の影響を受けにくく、一般に酵素合成によって生成されるより長いポリヌクレオチドも、様々な手段によって改変することができる。そのような改変には、例えば、特定のヌクレオチド類似体の導入、分子の５’又は３’末端における特定の配列又は他の部分の組み込み、及び他の改変が含まれ得る。例として、Ｂ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２をコードするｍＲＮＡは、約４ｋｂの長さであり、イン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）転写によって合成することができる。ｍＲＮＡに対する改変は例えば、その翻訳又は安定性を増加させる（例えば、細胞による分解に対するその耐性を増加させることによって）、又は外因性ＲＮＡ、特にＢ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２をコードするものなどのより長いＲＮＡの導入後に細胞においてしばしば観察される先天性免疫応答を誘発するＲＮＡの傾向を減少させるために適用することができる。

【0255】

多数のそのような改変が当技術分野で記載されており、例えば、ポリＡ尾部、５’キャップアナログ（例えば、アンチリバースキャップアナログ（ＡＲＣＡ）若しくはｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（ｍＣＡＰ））、改変された５’若しくは３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、改変された塩基（例えば、シュード－ＵＴＰ、２－チオ－ＵＴＰ、５－メチルシチジン－５’－トリホスフェート（５－メチル－ＣＴＰ）若しくはＮ６－メチル－ＡＴＰ）の使用、又は５’末端ホスフェートを除去するためのホスファターゼによる処理である。これら及び他の改変は当技術分野において公知であり、ＲＮＡの新しい改変は、定期的に開発されている。

【0256】

例えば、ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ａｘｏｌａｂｓ、Ｂｉｏ－Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｉｎｃ．，Ｄｈａｒｍａｃｏｎ及び多くの他のものを含む、改変ＲＮＡの多数の商業的供給者が存在する。ＴｒｉＬｉｎｋによって記載されるように、例えば、５－メチル－ＣＴＰを使用して、ヌクレアーゼ安定性の増加、翻訳の増加、又は先天性免疫受容体とイン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）転写ＲＮＡとの相互作用の減少などの望ましい特徴を付与することができる。５’－メチルシチジン－５’－トリホスフェート（５－メチル－ＣＴＰ）、Ｎ６－メチル－ＡＴＰ、並びにシュード－ＵＴＰ及び２－チオ－ＵＴＰはまた、以下に言及されるＫｏｎｍａｎｎら及びＷａｒｒｅｎらによる刊行物に示されるように、培養物及びイン・ビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）における先天性免疫刺激を低減する一方で、翻訳を増強することが示されている。

【0257】

イン・ビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）で送達される化学的に改変されたｍＲＮＡが、改善された治療効果を達成するために使用することができることが示されている；例えば、Ｋｏｒｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２９、１５４－１５７（２０１１）を参照されたい。そのような改変は例えば、ＲＮＡ分子の安定性を増加させ、及び／又はその免疫原性を低下させるために使用することができる。シュード－Ｕ、Ｎ６－メチル－Ａ、２－チオ－Ｕ及び５－メチル－Ｃなどの化学改変を用いて、ウリジン残基及びシチジン残基のわずか４分の１をそれぞれ２－チオ－Ｕ及び５－メチル－Ｃで置換することが、マウスにおけるｍＲＮＡのｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）媒介性認識を著しく減少させることが見いだされた。したがって、先天性免疫系の活性化を低減することによって、これらの改変を使用して、イン・ビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）でのｍＲＮＡの安定性及び寿命を効果的に増大させることができる；例えば、Ｋｏｎｍａｎｎら、前出を参照されたい。

【0258】

また、先天性抗ウイルス応答を迂回するように設計された改変を組み込んだ合成メッセンジャーＲＮＡの反復投与は、分化したヒト細胞を多能性に再プログラムすることができることも示されている。例えば、Ｗａｒｒｅｎら、Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，７（５）：６１８－３０（２０１０）を参照されたい。一次リプログラミングタンパク質として作用するそのような改変ｍＲＮＡは、複数のヒト細胞型をリプログラミングする効率的な手段であり得る。このような細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）と称され、５－メチル－ＣＴＰ、シュード－ＵＴＰ及び抗逆キャップアナログ（ＡＲＣＡ）を組み込んだ酵素的に合成されたＲＮＡが、細胞の抗ウイルス応答を効果的に回避するために使用され得ることが見出された；例えば、Ｗａｒｒｅｎら、前出を参照されたい。当技術分野において記載されるポリヌクレオチドの他の改変には、例えば、ポリＡ尾部の使用、５’キャップアナログ（例えば、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（ｍＣＡＰ））の付加、５’又は３’非翻訳領域（ＵＴＲ）の改変、又は５’末端リン酸を除去するためのホスファターゼによる処理が含まれ、新しいアプローチが定期的に開発されている。

【0259】

低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含む、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の改変に関連して、本明細書で使用するための改変ＲＮＡの生成に適用可能な多くの組成物及び技術が開発されている。ｓｉＲＮＡは、ｍＲＮＡ干渉を介した遺伝子サイレンシングに対するそれらの効果が一般に一過性であり、反復投与を必要とし得るため、イン・ビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）で特定の課題を提示する。さらに、ｓｉＲＮＡは、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）であり、哺乳動物細胞は、ウイルス感染の副産物であることが多いｄｓＲＮＡを検出及び中和するために進化した免疫応答を有する。このように、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ３、ＴＬＲ７及びＴＬＲ８など）が、そのような分子に応答してサイトカインの誘導を誘発することができるのと同様に、ｄｓＲＮＡに対する細胞応答を媒介することができる、ＰＫＲ（ｄｓＲＮＡ応答性キナーゼ）及び潜在的にレチノイン酸誘導性の遺伝子Ｉ（ＲＩＧ－Ｉ）などの哺乳類の酵素が存在する；例えば、Ａｎｇａｒｔら、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｂａｓｅｌ）６（４）：４４０－４６８（２０１３）；Ｋａｎａｓｔｙら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０（３）：５１３－５２４（２０１２）；Ｂｕｒｎｅｔｔら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｊ．６（９）：１１３０－４６（２０１１）；Ｊｕｄｇｅ及びＭａｃｌａｃｈｌａｎ、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １９（２）：１１１－２４（２００８）による概説；並びにそこで引用される参考文献を参照されたい。

【0260】

多種多様な改変が開発され、ＲＮＡ安定性を増強し、先天性免疫応答を低減し、及び／又は本明細書に記載されるようなポリヌクレオチドのヒト細胞への導入に関連して有用であり得る他の利益を達成するために適用されている；例えば、Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ ＫＡら、Ａｎｎｕａｌ ｒｅｖｉｅｗｓ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２：７７－９６（２０１１）；Ｇａｇｌｉｏｎｅ ａｎｄ Ｍｅｓｓｅｒｅ，Ｍｉｎｉ Ｒｅｖ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ， １０（７）：５７８－９５ （２０１０）；Ｃｈｅｒｎｏｌｏｖｓｋａｙａら、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．，１２（２）：１５８－６７（２０１０）；Ｄｅｌｅａｖｅｙら、Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍ Ｃｈａｐｔｅｒ １６：Ｕｎｉｔ １６．３（２００９）；Ｂｅｈｌｋｅ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １８（４）：３０５－１９ （２００８）：Ｆｕｃｉｎｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｔｈｅｒ ２２（３）：２０５－２１０（２０１２）；Ｂｒｅｍｓｅｎら、Ｆｒｏｎｔ Ｇｅｎｅｔ ３：１５４（２０１２）による概説を参照されたい。

【0261】

上記のように、改変ＲＮＡの多くの商業的供給者が存在し、その多くは、ｓｉＲＮＡの有効性を改善するように設計された改変に特化している。文献に報告されている様々な知見に基づいて、様々なアプローチが提供されている。例えば、Ｄｈａｒｍａｃｏｎは、Ｋａｌｅ、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ １１：１２５－１４０（２０１２）によって報告されているように、非架橋酸素を硫黄（ホスホロチオエート、ＰＳ）で置換することは、ｓｉＲＮＡのヌクレアーゼ耐性を改善するために広く使用されていると述べている。リボースの２’位の改変は、ヌクレオチド間リン酸結合のヌクレアーゼ耐性を改善する一方で、二重鎖安定性（Ｔｍ）を増加させることが報告されており、これはまた、免疫活性化からの保護を提供することが示されている。Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋら、Ｎａｔｕｒｅ ４３２：１７３－１７８ （２００４）によって報告されているように、中程度のＰＳ骨格改変と、小さな、忍容性の良好な２’－置換（２’－Ｏ－、２’－フルオロ、２’－ヒドロ）との組み合わせは、イン・ビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）での適用のための高度に安定なｓｉＲＮＡと関連している；及び２’－Ｏ－メチル改変は、Ｖｏｌｋｏｖ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １９：１９１－２０２（２００９）によって報告されているように、安定性の改善に有効であることが報告されている。先天性免疫応答の誘導の減少に関して、２’－Ｏ－メチル、２’－フルオロ、２’－ヒドロを用いて特異的配列を改変することは、ＴＬＲ７／ＴＬＲ８相互作用を減少させる一方で、一般にサイレンシング活性を保存することが報告されている；例えば、Ｊｕｄｇｅら、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１３：４９４－５０５（２００６）；及びＣｅｋａｉｔｅら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３６５：９０－１０８（２００７）を参照されたい。２－チオウラシル、シュードウラシル、５－メチルシトシン、５－メチルウラシル、及びＮ６－メチルアデノシンなどのさらなる改変も、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、及びＴＬＲ８によって媒介される免疫効果を最小限にすることが示されている；例えば、Ｋａｒｉｋｏら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２３：１６５－１７５（２００５）を参照されたい。

【0262】

また、当技術分野において公知であり、市販されているように、多数のコンジュゲートを、例えばコレステロール、トコフェロール及び葉酸、脂質、ペプチド、ポリマー、リンカー及びアプタマーを含む、細胞によるそれらの送達及び／又は取り込みを増強することができる、本明細書において使用するためのＲＮＡなどのポリヌクレオチドに適用することができる；例えば、Ｗｉｎｋｌｅｒ，Ｔｈｅｒ．Ｄｅｌｉｖ．４：７９１－８０９（２０１３）による総説及びその中で引用される参考文献を参照されたい。

【0263】

追加の配列

【0264】

いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、５’又は３’末端のいずれかに少なくとも１つの追加のセグメントを含む。例えば、好適な追加のセグメントは、５’キャップ（例えば、７－メチルグアニレートキャップ（ｍ７ｇ））；３’ポリアデニル化尾部（例えば、３’ポリ（Ａ）尾部）；リボスイッチ配列（例えば、タンパク質及びタンパク質複合体による調節された安定性及び／又は調節された接近性を可能にする）；ｄｓＲＮＡ二重鎖（例えば、ヘアピン）を形成する配列；ＲＮＡを細胞内位置（例えば、核、ミトコンドリア、葉緑体など）に標的化する配列；追跡を提供する改変又は配列（例えば、蛍光分子への直接コンジュゲーション、蛍光検出を容易にする部分への直接コンジュゲーション、蛍光検出を可能にする配列など）；タンパク質（例えば、転写活性化因子、転写抑制因子、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡデメチラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼなどを含む、ＤＮＡに作用するタンパク質）のための結合部位を提供する改変又は配列；増加した、減少した、及び／又は制御可能な安定性を提供する改変又は配列；並びにそれらの組み合わせを含む。

【0265】

安定性制御配列

【0266】

安定性制御配列は、ＲＮＡ（例えば、ガイドＲＮＡ）の安定性に影響を及ぼす。好適な安定性制御配列の非限定的な例は、転写ターミネーターセグメント（例えば、転写終結配列）である。ガイドＲＮＡの転写ターミネーターセグメントは、１０ヌクレオチド～１００ヌクレオチド、例えば、１０ヌクレオチド（ｎｔ）～２０ｎｔ、２０ｎｔ～３０ｎｔ、３０ｎｔ～４０ｎｔ、４０ｎｔ～５０ｎｔ、５０ｎｔ～６０ｎｔ、６０ｎｔ～７０ｎｔ、７０ｎｔ～８０ｎｔ、８０ｎｔ～９０ｎｔ、又は９０ｎｔ～１００ｎｔの全長を有することができる。例えば、転写ターミネーターセグメントは、１５ヌクレオチド（ｎｔ）～８０ｎｔ、１５ｎｔ～５０ｎｔ、１５ｎｔ～４０ｎｔ、１５ｎｔ～３０ｎｔ又は１５ｎｔ～２５ｎｔの長さを有することができる。

【0267】

いくつかの実施形態において、転写終結配列は、真核細胞において機能的である配列である。いくつかの実施形態において、転写終結配列は、原核細胞において機能的である配列である。

【0268】

安定性制御配列（例えば、転写終結セグメント、又は安定性の増加を提供するためのガイドＲＮＡのいずれかのセグメント）に含まれ得るヌクレオチド配列としては、例えば、Ｒｈｏ非依存性ｔｒｐ終結部位が挙げられる。

【0269】

模倣体

【0270】

いくつかの実施形態において、核酸は、核酸模倣体であり得る。ポリヌクレオチドに適用される「模倣体」という用語は、フラノース環のみ、又はフラノース環及びヌクレオチド間結合の両方が非フラノース基で置き換えられているポリヌクレオチドを含むことが意図され、フラノース環のみの置き換えは、当技術分野において糖サロゲートであるとも呼ばれる。複素環式塩基部分又は改変複素環式塩基部分は、適切な標的核酸とのハイブリダイゼーションのために維持される。そのような核酸の１つで優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されているポリヌクレオチド模倣体は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と称される。ＰＮＡにおいて、ポリヌクレオチドの糖骨格は、アミド含有骨格、特にアミノエチルグリシン骨格で置き換えられる。ヌクレオチドは保持され、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接的又は間接的に結合する。

【0271】

優れたハイブリダイゼーション特性を有することが報告されている１つのポリヌクレオチド模倣体は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）である。ＰＮＡ化合物中の骨格は、２つ以上の連結アミノエチルグリシン単位であり、これは、ＰＮＡにアミド含有骨格を与える。複素環式塩基部分は、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接的又は間接的に結合している。ＰＮＡ化合物の調製を記載する代表的な米国特許には、これらに限定されるものではないが、米国特許第５，５３９，０８２号；５，７１４，３３１号；及び５，７１９，２６２号が含まれる。

【0272】

研究されているポリヌクレオチド模倣体の別のクラスは、モルホリノ環に結合した複素環式塩基を有する連結モルホリノ単位（モルホリノ核酸）に基づく。モルホリノ核酸中のモルホリノモノマー単位を連結する多数の連結基が報告されている。連結基の１つのクラスは、非イオン性オリゴマー化合物を与えるように選択されている。非イオン性モルホリノ系オリゴマー化合物は、細胞タンパク質との望ましくない相互作用を有する可能性が低い。モルホリノベースのポリヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの非イオン性模倣体であり、細胞タンパク質と望ましくない相互作用を形成する可能性が低い（Ｄｗａｉｎｅ Ａ．Ｂｒａａｓｃｈ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｒ．Ｃｏｒｅｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００２，４１（１４），４５０３４５１０）。モルホリノベースのポリヌクレオチドは、米国特許第５，０３４，５０６号に開示されている。単量体サブユニットを連結する様々な異なる連結基を有する、ポリヌクレオチドのモルホリノクラス内の様々な化合物が調製されている。

【0273】

ポリヌクレオチド模倣体のさらなるクラスは、シクロヘキセニル核酸（ＧｅＮＡ）と称される。ＤＮＡ／ＲＮＡ分子中に通常存在するフラノース環は、シクロヘキセニル（ｃｙｄｏｈｅｘｅｎｙｌ）環で置き換えられる。ＧｅＮＡ ＤＭＴ保護ホスホラミダイトモノマーが調製され、古典的なホスホラミダイト化学に従ってオリゴマー化合物合成に使用された。ＧｅＮＡで改変された特定の位置を有する完全に改変されたＧｅＮＡオリゴマー化合物及びオリゴヌクレオチドが調製され、研究されている（Ｗａｎｇら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２０００、１２２、８５９５８６０２を参照）。一般に、ＤＮＡ鎖へのＧｅＮＡモノマーの組み込みは、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドのその安定性を増加させる。ＧｅＮＡオリゴアデニレートは、天然複合体と同様の安定性を有するＲＮＡ及びＤＮＡ複合体と複合体を形成した。天然核酸構造にＧｅＮＡ構造を組み込む研究は、ＮＭＲ及び円偏光二色性により、容易な立体配座適応を進めることが示された。

【0274】

さらなる改変は、２’－ヒドロキシル基が糖環の４’炭素原子に連結され、それによって２’－Ｃ，４’－Ｃ－オキシメチレン連結を形成し、それによって二環式糖部分を形成する、ロックド核酸（ＬＮＡ）を含む。連結は、２’酸素原子及び４’炭素原子を架橋するメチレン（－ＣＨ２－）基であり得、ここで、ｎは、１又は２である（Ｓｉｎｇｈら、Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９９８，４，４５５－４５６）。ＬＮＡ及びＬＮＡアナログは、相補的ＤＮＡ及びＲＮＡと非常に高い二重鎖熱安定性（Ｔｍ＝＋３～＋１０℃）、３’－エキソヌクレアーゼ分解に対する安定性及び良好な溶解特性を示す。ＬＮＡを含有する強力かつ非毒性のアンチセンスオリゴヌクレオチドが記載されている（Ｗａｈｌｅｓｔｅｄｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ、２０００、９７、５６３３－５６３８）。

【0275】

ＬＮＡモノマーであるアデニン、シトシン、グアニン、５－メチル－シトシン、チミン及びウラシルの合成及び調製は、それらのオリゴマー化及び核酸認識特性と共に記載されている（Ｋｏｓｈｋｉｎら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、１９９８、５４、３６０７－３６３０）。ＬＮＡ及びその調製は、ＷＯ９８／３９３５２及びＷＯ９９／１４２２６にも記載されている。

【0276】

改変糖部分

【0277】

核酸はまた、１つ又は複数の置換された糖部分を含むことができる。好適なポリヌクレオチドとしては、ＯＨ；Ｆ；Ｏ－、Ｓ－、又はＮ－アルキル；Ｏ－、Ｓ－、又はＮ－アルケニル；Ｏ－、Ｓ－又はＮ－アルキニル；又はＯ－アルキル－Ｏ－アルキルから選択される糖置換基が挙げられ、ここで、アルキル、アルケニル及びアルキニルは、置換又は非置換のＣ１～Ｃ１０アルキル又はＣ２～Ｃ１０アルケニル及びアルキニルであり得る。特に好適なのは、Ｏ（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨｚ）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、及びＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ（（ＣＨ２）ｎＣＨ３）２であり、ここで、ｎ及びｍは、１～約１０である。その他の好適なポリ核酸は、Ｃ１からＣ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル、アラルキル、Ｏ－アルカリル又はＯ－アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を改良するための基、又はオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改良するための基、及び同様の性質を有する他の置換基から選択される糖置換基を含む。好適な改変には、２’－メトキシエトキシ２’－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２ＯＣＨ３、－２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）又は２’－ＭＯＥとしても知られ（Ｍａｒｔｉｎら、Ｈｅｌｙ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ、１９９５、７８、４８６－５０４）、例えばアルコキシアルコキシ基が含まれる。さらなる好適な改変は、２’－ジメチルアミノオキシエトキシ、例えば、本明細書の以下の実施例に記載されるようなＯ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基（２’－ＤＭＡＯＥ）、及び２’－ジメチルアミノエトキシエトキシ（２’－Ｏ－ジメチル－アミノ－エトキシ－エチル又は２’－ＤＭＡＥＯＥとしても当技術分野において公知である）、例えば、２’－Ｏ－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－Ｎ（ＣＨ３）２を含む。

【0278】

他の好適な糖置換基としては、メトキシ（－Ｏ－ＣＨ３）、アミノプロポキシ（－Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、アリル（－ＣＨ２－ＣＨ＝ＣＨ２）、－Ｏ－アリル（－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ＝ＣＨ２）及びフルオロ（Ｆ）が挙げられる。２’－糖置換基は、アラビノ（ｕｐ）位又はリボ（ｄｏｗｎ）位にあり得る。好適な２’－アラビノ改変は、２’－Ｆである。同様の改変はまた、オリゴマー化合物上の他の位置、特に３’末端ヌクレオシド上又は２’－５’連結オリゴヌクレオチド中の糖の３’位及び５’末端ヌクレオチドの５’位に行うことができる。オリゴマー化合物はまた、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分などの糖模倣体を有し得る。

【0279】

塩基の改変及び置換

【0280】

核酸はまた、核酸塩基（当技術分野において単に「塩基」と称されることが多い）改変又は置換を含み得る。本明細書で使用される場合、「非改変」又は「天然」核酸塩基には、プリン塩基アデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）、並びにピリミジン塩基チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）及びウラシル（Ｕ）が含まれる。改変核酸塩基には、５－メチルシトシン（５－ｍｅ－Ｃ）、５－ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２－アミノアデニン、アデニン及びグアニンの６－メチル及び他のアルキル誘導体、アデニン及びグアニンの２－プロピル及び他のアルキル誘導体、２－チオウラシル、２－チオチミン及び２－チオシトシン、５－ハロウラシル及びシトシン、５－プロピニル（－Ｃ＝ＣＨ３）ウラシル及びシトシン並びにピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、６－アゾウラシル、シトシン及びチミン、５－ウラシル（シュードウラシル）、４－チオウラシル、８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキル、８－ヒドロキシル及び他の８－置換アデニン及びグアニン、５－ハロ特に５－ブロモ、５－トリフルオロメチル及び他の５－置換ウラシル及びシトシン、７－メチルグアニン及び７－メチルアデニン、２－Ｆ－アデニン、２－アミノ－アデニン、８－アザグアニン及び８－アザアデニン、７－デアザグアニン及び７－デアザアデニン及び３－デアザグアニン及び３－デアザアデニンなどの他の合成及び天然核酸塩基が含まれる。さらなる改変核酸塩基としては、三環式ピリミジン、例えば、フェノキサジンシチジン（１Ｈ－ピリミド（５，４－ｂ）（１，４）ベンゾオキサジン－２（３Ｈ）－オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ－ピリミド（５，４－ｂ）（１，４）ベンゾチアジン－２（３Ｈ）－オン）、Ｇ－クランプ、例えば、置換フェノキサジンシチジン（例えば、９－（２－アミノエトキシ）－Ｈ－ピリミド（５，４－（ｂ）（１，４）ベンゾオキサジン－２（３Ｈ）－オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ－ピリミド（４，５－ｂ）インドール－２－オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ－ピリド（３’，２’：４，５）ピロール（２，３－ｄ）ピリミジン－２－オン）が含まれる。

【0281】

複素環式塩基部分はまた、プリン又はピリミジン塩基が他の複素環、例えば、７－デアザ－アデニン、７－デアザグアノシン、２－アミノピリジン及び２－ピリドンで置き換えられているものを含んでもよい。さらなる核酸塩基には、米国特許第３，６８７，８０８号に開示されているもの、Ｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ Ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、８５８－８５９頁、Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ、Ｊ．１．、編集、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、１９９０に開示されているもの、Ｅｎｇｌｉｓｃｈら、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ、１９９１、３０、６１３によって開示されたもの、及びＳａｎｇｈｖｉ、Ｙ．Ｓ．、Ｃｈａｐｔｅｒ １５、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、２８９－３０２頁、Ｃｒｏｏｋｅ、Ｓ．Ｔ．ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ、Ｂ．編集、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、１９９３によって開示されたものが含まれる。これらの核酸塩基のいくつかは、オリゴマー化合物の結合親和性を増加させるのに有用である。これらには、５－置換ピリミジン、６－アザピリミジン並びにＮ－２、Ｎ－６及びＯ－６置換プリン（２－アミノプロピルアデニン、５－プロピニルウラシル及び５－プロピニルシトシンを含む）が含まれる。５－メチルシトシン置換は、核酸二重鎖の安定性を０．６－１．２ｏｃ増加させることが示されており（Ｓａｎｇｈｖｉら、編集、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、１９９３、２７６－２７８頁）、例えば、２’－Ｏ－メトキシエチル糖改変と組み合わせた場合に、好適な塩基置換である。

【0282】

「相補的」とは、天然又は非天然（例えば、上記のように改変された）塩基（ヌクレオシド）又はその類似体を含む２つの配列間で、塩基スタッキング及び特異的水素結合を介して対合する能力を指す。例えば、核酸の１つの位置の塩基が標的の対応する位置の塩基と水素結合することができる場合、塩基は、その位置で互いに相補的であると考えられる。核酸は、ユニバーサル塩基、又は水素結合に正又は負の寄与を与えない不活性脱塩基スペーサーを含むことができる。塩基対合は、標準的なワトソン・クリック塩基対合及び非ワトソン・クリック塩基対合（例えば、ゆらぎ塩基対合及びフーグスティーン塩基対合）の両方を含み得る。

【0283】

相補的塩基対合に関して、アデノシン型塩基（Ａ）は、チミジン型塩基（Ｔ）又はウラシル型塩基（Ｕ）に相補的であり、シトシン型塩基（Ｃ）は、グアノシン型塩基（Ｇ）に相補的であり、３－ニトロピロール又は５－ニトロインドールなどのユニバーサル塩基は、いずれかのＡ、Ｃ、Ｕ、又はＴにハイブリダイズすることができ、それらに相補的であると考えられることが理解される。Ｎｉｃｈｏｌｓら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９４；３６９：４９２－４９３及びＬｏａｋｅｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ、１９９４；２２：４０３９－４０４３を参照されたい。イノシン（Ｉ）はまた、当技術分野において、ユニバーサル塩基であると考えられており、いずれかのＡ、Ｃ、Ｕ、又はＴに相補的であると考えられている。Ｗａｔｋｉｎｓ ａｎｄ Ｓａｎｔａｌｕｃｉａ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００５；３３（１９）：６２５８－６２６７を参照されたい。

【0284】

コンジュゲート

【0285】

核酸の別の可能な改変は、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布又は細胞取り込みを増強する１つ又は複数の部分又はコンジュゲートをポリヌクレオチドに化学的に連結することを含む。これらの部分又はコンジュゲートは、第一級又は第二級ヒドロキシル基などの官能基に共有結合したコンジュゲート基を含むことができる。コンジュゲート基としては、インターカレーター、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、オリゴマーの薬力学的特性を増強する基、及びオリゴマーの薬物動態学的特性を増強する基が挙げられるが、これらに限定されない。好適なコンジュゲート基としては、コレステロール、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸塩、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、及び染料が挙げられるが、これらに限定されない。薬力学的特性を増強する基は、取り込みを改善し、分解に対する耐性を増強し、及び／又は標的核酸との配列特異的ハイブリダイゼーションを増強する基を含む。薬物動態学的特性を増強する基には、核酸の取り込み、分布、代謝又は排泄を改善する基が含まれる。

【0286】

コンジュゲート部分は、コレステロール部分（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９８９、８６、６５５３－６５５６）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｌｅｔ．、１９９４、４、１０５３－１０６０）、チオエーテル、例えばヘキシル－Ｓ－トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、１９９２、６６０、３０６－３０９；Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．、１９９３、３、２７６５－２７７０）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１９９２、２０、５３３－５３８）、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオール又はウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ－Ｂｅｈｍｏａｒａｓら、ＥＭＢＯ Ｊ．、１９９１、１０、１１１１－１１１８；Ｋａｂａｎｏｖら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．、１９９０、２５９、３２７－３３０；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ、１９９３、７５、４９－５４）、リン脂質、例えば、ジ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロール又はトリエチルアンモニウム１，２－ジ－Ｏ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロ－３－Ｈ－ホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．、１９９５、３６、３６５１－３６５４；Ｓｈｅａら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１９９０、１８、３７７７－３７８３）、ポリアミン又はポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、１９９５、１４、９６９－９７３）、又はアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．、１９９５、３６、３６５１３６５４）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１９９５、１２６４、２２９－２３７）、又はオクタデシルアミン又はヘキシルアミノ－カルボニル－オキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃａｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．、１９９６、２７７、９２３－９３７）を含むが、これらに限定されない。

【0287】

コンジュゲートは、「タンパク質形質導入ドメイン」又はＰＴＤ（ＣＰＰ細胞膜透過性ペプチドとしても知られる）を含み得、これは脂質二重層、ミセル、細胞膜、細胞小器官膜、又は小胞膜を通過することを促進するポリペプチド、ポリヌクレオチド、炭水化物、又は有機若しくは無機化合物を指し得る。別の分子に結合したＰＴＤは、小極性分子から大型巨大分子及び／又はナノ粒子に及ぶことができ、例えば細胞外空間から細胞内空間へ、又は細胞質ゾルから細胞小器官内へと分子が膜を通過することを促進する。いくつかの実施形態において、ＰＴＤは、外因性ポリペプチド（例えば、Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアント）のアミノ末端に共有結合される。いくつかの実施形態において、ＰＴＤは、外因性ポリペプチド（例えば、Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアント）のＣ末端又はＮ末端に共有結合される。いくつかの実施形態において、ＰＴＤは、核酸（例えば、ガイドＲＮＡ、ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントをコードするポリヌクレオチドなど）に共有結合される。例示的なＰＴＤは、これに限定されるものではないが、最小のウンデカペプチドタンパク質形質導入ドメイン（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲを含むＨＩＶ－１ ＴＡＴの残基４７－５７に対応する；細胞に直接侵入するのに十分な数のアルギニンを含むポリアルギニン配列（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１０－５０アルギニン）；ＶＰ２２ドメイン（Ｚｅｎｄｅｒら、（２００２）Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．９（６）：４８９－９６）；ショウジョウバエアンテナペディアタンパク質形質導入ドメイン（Ｎｏｇｕｃｈｉら、（２００３）Ｄｉａｂｅｔｅｓ ５２（７）：１７３２－１７３７）；短縮型（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）ヒトカルシトニンペプチド（Ｔｒｅｈｉｎら、（２００４）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２１：１２４８－１２５６）；ポリリシン（Ｗｅｎｄｅｒら、（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：１３００３－１３００８）である；いくつかの実施形態において、ＰＴＤは、活性化可能ＣＰＰ（ＡＣＰＰ）である（Ａｇｕｉｌｅｒａら、（２００９）ｌｎｔｅｇｒ Ｂｉｏｌ（Ｃａｍｂ）Ｊｕｎｅ；１（５－６）：３７１－３８１）。ＡＣＰＰは、切断可能なリンカーを介してマッチするポリアニオン（例えば、Ｇｌｕ９又は「Ｅ９」）に接続されたポリカチオン性ＣＰＰ（例えば、Ａｒｇ９又は「Ｒ９」）を含み、これは、正味の電荷をほぼゼロに減少させ、それによって、細胞への接着及び取り込みを阻害する。リンカーが切断されると、ポリアニオンが放出され、ポリアルギニン及びその固有の接着性を局所的にアンマスキングし、したがって、ＡＣＰＰを、膜を横断するように「活性化」する。いくつかの実施形態では、ＰＴＤが、ＰＴＤのバイオアベイラビリティを増加させるために化学的に改変される。例示的な改変は、Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．２００９ Ｎｏｖ；６（１１）：１１９５－２０５を参照のこと。

【0288】

ポリペプチド改変

【0289】

コドン最適化ポリヌクレオチド配列から発現されるＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントは、イン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で、又は真核細胞によって、原核細胞によって、又はイン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）転写及び翻訳（ＩＶＴＴ）によって産生され得、それは、アンフォールディング、例えば、熱変性、ＯＴＴ還元などによってさらに処理され得、当技術分野で公知の方法を使用してさらにリフォールディングされ得る。

【0290】

一次配列を変化させない目的の改変には、ポリペプチドの化学的誘導体化、例えばアシル化、アセチル化、カルボキシル化、アミド化などが含まれる。また、グリコシル化の改変、例えば、その合成及びプロセシングの間にポリペプチドのグリコシル化パターンを改変することによって、又はさらなるプロセシング工程において、例えば、哺乳動物のグリコシル化又は脱グリコシル化酵素などのグリコシル化に影響を及ぼす酵素にポリペプチドを曝露することによってなされる改変も含まれる。リン酸化されたアミノ酸残基、例えば、ホスホチロシン、ホスホセリン、又はホスホトレオニンを有する配列も包含される。

【0291】

いくつかの実施形態において、Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントは、タンパク質分解に対するそれらの耐性を改善し、標的配列特異性を変化させ、溶解性特性を最適化し、タンパク質活性（例えば、転写調節活性、酵素活性など）を変化させ、又はそれらを治療剤としてより適切にするために、通常の分子生物学的技術及び合成化学を用いて改変されている。このようなポリペプチドのアナログには、天然に存在するＬ－アミノ酸以外の残基、例えばＯ－アミノ酸又は非天然の合成アミノ酸を含有するものが含まれる。Ｄ－アミノ酸は、アミノ酸残基の一部又は全部が置換されていてもよい。Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントは、当技術分野で公知の従来の方法を使用して、イン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）合成によって調製することができる。様々な市販の合成装置、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．、Ｂｅｃｋｍａｎ等による自動合成装置が利用可能である。合成機を用いることにより、天然アミノ酸を非天然アミノ酸で置換することができる。特定の配列及び調製方法は、便宜性、経済性、必要とされる純度などによって決定され得る。

【0292】

必要に応じて、他の分子又は表面への連結を可能にする様々な基を、合成中又は発現中にペプチドに導入することができる。したがって、システインを、チオエーテル、金属イオン錯体に連結するためのヒスチジン、アミド又はエステルを形成するためのカルボキシル基、アミドを形成するためのアミノ基などを作製するために使用することができる。

【0293】

組換え細胞

【0294】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるコドン最適化Ｂ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２系は、真核生物、例えば哺乳動物細胞、例えばヒト細胞において使用され得る。いずれかのヒト細胞は、本明細書に開示されるコドン最適化Ｂ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２系との使用に適している。

【0295】

いくつかの実施形態では、細胞は、エクス・ビボ（ｅｘ ｖｉｖｏ）又はイン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で、（ａ）本明細書に記載のＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はバリアントをコードするコドン最適化ポリヌクレオチド配列を含む核酸、又は核酸から発現されるＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアント；及び（ｂ）ｇＲＮＡ又はｇＲＮＡをコードする核酸であって、ここで、ｇＲＮＡが、Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントを標的ポリヌクレオチド配列に誘導することができるｇＲＮＡ又は核酸を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、コドン最適化ポリヌクレオチド配列を含む核酸を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、ｇＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、細胞は、ｇＲＮＡをコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である。いくつかの実施形態では、細胞は、１つ又は複数のさらなるｇＲＮＡ又は１つ又は複数のさらなるｇＲＮＡをコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、ドナー鋳型をさらに含む。

【0296】

一態様では、本明細書に開示されるいくつかの実施形態は、本明細書に提供される核酸を動物細胞などの宿主細胞に導入するステップと、及び形質転換細胞を選択又はスクリーニングするステップとを含む、細胞を形質転換する方法に関する。用語「宿主細胞」及び「組換え宿主細胞」は、本明細書において互換的に使用される。そのような用語は、特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の子孫又は潜在的子孫も指すことが理解される。特定の改変は、突然変異又は環境の影響のいずれかにより後世に起こり得るので、そのような子孫は、実際には親細胞と同一でなくてもよいが、本明細書で使用される用語の範囲内に依然として含まれる。多種多様な上記宿主細胞及び種を形質転換するための技術は、当技術分野において公知であり、技術文献及び科学文献に記載されている。したがって、本明細書に開示される少なくとも１つの組換え細胞を含む細胞培養物もまた、本出願の範囲内である。細胞培養物を生成及び維持するのに好適な方法及び系は、当技術分野で公知である。

【0297】

関連する態様において、いくつかの実施形態は、組換え宿主細胞、例えば、本明細書に記載の核酸を含む組換え動物細胞に関する。核酸は、宿主ゲノムに安定的に組み込まれ得るか、又はエピソームで複製され得るか、又は安定的若しくは一過性発現のためのミニサークル発現ベクターとして組換え宿主細胞中に存在し得る。したがって、本明細書に開示されるいくつかの実施形態では、核酸は、エピソーム単位として組換え宿主細胞中で維持され、複製される。いくつかの実施形態では、核酸は、組換え細胞のゲノムに安定に組み込まれる。いくつかの実施形態において、核酸は、安定又は一過性発現のためのミニサークル発現ベクターとして組換え宿主細胞中に存在する。

【0298】

いくつかの実施形態において、宿主細胞は、例えば、宿主細胞のゲノムの一部に相同な核酸配列を含む相同組換えのためのベクターであり得る、又は目的の遺伝子のいずれか又は組合せの発現のための発現ベクターであり得る、本出願のベクター構築物を用いて遺伝子操作され得る（例えば、形質導入又は形質転換又はトランスフェクトされ得る）。ベクターは例えば、プラスミド、ウイルス粒子、ファージなどの形態であり得る。いくつかの実施形態において、目的のポリペプチドの発現のためのベクターはまた、例えば、相同組換えによって、宿主への組み込みのために設計され得る。

【0299】

いくつかの実施形態では、本開示は、遺伝子改変宿主細胞、例えば、単離された遺伝子改変宿主細胞であって、遺伝子改変宿主細胞が、１）外因性ガイドＲＮＡ；２）ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む外因性核酸；３）Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントをコードするコドン最適化ポリヌクレオチド配列を含む外因性核酸；４）コドン最適化ポリヌクレオチド配列を含む核酸から発現される外因性Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアント；又は５）上記のいずれかの組み合わせを含む細胞を提供する。いくつかの実施形態では、遺伝子改変細胞は、例えば：１）外因性ガイドＲＮＡ；２）ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む外因性核酸；３）Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントをコードするコドン最適化ポリヌクレオチド配列を含む外因性核酸；４）コドン最適化ポリヌクレオチド配列を含む核酸から発現される外因性Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアント；又は５）上記のいずれかの組み合わせで宿主細胞を遺伝子改変することによって生成される。

【0300】

上記のような標的細胞であるのに好適な全ての細胞はまた、遺伝子改変宿主細胞であるのに好適である。例えば、目的の遺伝子改変宿主細胞は、いずれかの生物由来の細胞、例えば、細菌細胞、古細菌細胞、単細胞真核生物の細胞、植物細胞、藻類細胞（ボツリオコッカス・ブラウニ（Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ ｂｒａｕｎｉｉ）、クラミドモナス・ラインハルティ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）、ナンノクロロプシス・ガディタナ（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｇａｄｉｔａｎａ）、クロレラ・ピレノイドサ（Ｃｈｌｏｒｅｌａ ｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａ）、ヤツマタモク（Ｓａｒｇａｓｓｕｍ ｐａｔｅｎｓ）（Ｃ．アガード（Ｃ．Ａｇａｒｄｈ））など）、真菌細胞（例えば、酵母細胞）、動物細胞、無脊椎動物由来の細胞（例えば、ショウジョウバエ、刺胞動物、棘皮動物、線虫など）、脊椎動物由来の細胞（例えば、魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳動物）、哺乳動物由来の細胞（例えば、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、げっ歯類、ラット、非ヒト霊長類、ヒトなど）である。いくつかの実施形態では、遺伝子改変宿主細胞は、ヒト由来のいずれかの細胞であり得る。

【0301】

いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子改変宿主細胞は、Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む外因性核酸で遺伝子改変されている。いくつかの実施形態では、遺伝子改変宿主細胞は、本明細書に記載のＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む外因性核酸で遺伝子改変されている。遺伝子改変宿主細胞のＤＮＡは、ガイドＲＮＡ（又は改変されるゲノム位置／配列を決定する、ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ）及び任意のドナー核酸を細胞内に導入することによって、改変のために標的化され得る。いくつかの実施形態において、Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントをコードするヌクレオチド配列は、誘導性プロモーター（例えば、熱ショックプロモーター、テトラサイクリン調節性プロモーター、ステロイド調節性プロモーター、金属調節性プロモーター、エストロゲン受容体調節性プロモーターなど）に作動可能に連結される。いくつかの実施形態において、Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントをコードするコドン最適化ヌクレオチド配列は、空間的に限定された及び／又は時間的に限定されたプロモーター（例えば、組織特異的プロモーター、細胞型特異的プロモーター、細胞周期特異的プロモーター）に作動可能に連結される。いくつかの態様において、Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントをコードするコドン最適化ヌクレオチド配列は、構成的プロモーターに作動可能に連結されている。

【0302】

いくつかの実施形態では、遺伝子改変宿主細胞は、イン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）である。いくつかの実施形態において、遺伝子改変宿主細胞は、イン・ビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）である。いくつかの実施形態では、遺伝子改変宿主細胞は、原核細胞であるか、又は原核細胞に由来する。いくつかの実施形態では、遺伝子改変宿主細胞は、細菌細胞であるか、又は細菌細胞に由来する。いくつかの実施形態において、遺伝子改変宿主細胞は、古細菌細胞であるか、又は古細菌細胞に由来する。いくつかの実施形態では、遺伝子改変宿主細胞は、真核細胞であるか、又は真核細胞に由来する。いくつかの実施形態では、遺伝子改変宿主細胞は、植物の細胞であるか、又は植物の細胞に由来する。いくつかの実施形態では、遺伝子改変宿主細胞は、動物の細胞であるか、又は動物の細胞に由来する。いくつかの実施形態では、遺伝子改変宿主細胞は、無脊椎動物の細胞であるか、又は無脊椎動物の細胞に由来する。いくつかの実施形態において、遺伝子改変宿主細胞は、脊椎動物の細胞であるか、又は脊椎動物の細胞に由来する。いくつかの実施形態では、遺伝子改変宿主細胞は、哺乳動物の細胞であるか、又は哺乳動物の細胞に由来する。いくつかの実施形態では、遺伝子改変宿主細胞は、げっ歯類の細胞であるか、又はげっ歯類の細胞に由来する。いくつかの実施形態では、遺伝子改変宿主細胞は、ヒト細胞であるか、又はヒト細胞に由来する。いくつかの実施形態では、遺伝子改変宿主細胞は、ヒト細胞であるか、又はヒト細胞に由来する。

【0303】

本開示は遺伝子改変細胞の子孫をさらに提供し、子孫は、それが由来した遺伝子改変細胞と同じ外因性核酸又はポリペプチドを含み得る。本開示は、いくつかの実施形態において、遺伝子改変宿主細胞を含む組成物をさらに提供する。

【0304】

いくつかの実施形態では、遺伝子改変宿主細胞が遺伝子改変幹細胞又は前駆細胞である。好適な宿主細胞としては、例えば、幹細胞（成体幹細胞、胚性幹細胞、ｉＰＳ細胞など）及び前駆細胞（例えば、心臓前駆細胞、神経前駆細胞など）が挙げられる。他の好適な宿主細胞としては、哺乳動物の幹細胞及び前駆細胞、例えば、げっ歯類の幹細胞、げっ歯類の前駆細胞、ヒト幹細胞、ヒト前駆細胞などが挙げられる。他の好適な宿主細胞としては、イン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）宿主細胞、例えば、単離された宿主細胞が挙げられる。いくつかの実施形態では、遺伝子改変宿主細胞は、外因性ガイドＲＮＡ核酸を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子改変宿主細胞は、ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む外因性核酸を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子改変宿主細胞は、コドン最適化ヌクレオチド配列から発現される外因性Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子改変宿主細胞は、Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントをコードするコドン最適化ヌクレオチド配列を含む外因性核酸を含む。いくつかの実施形態において、遺伝子改変宿主細胞は、１）ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列、及び２）Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントをコードするコドン最適化ヌクレオチド配列を含む外因性核酸を含む。

【0305】

非ヒト遺伝子改変生物

【0306】

いくつかの実施形態では、遺伝子改変宿主細胞は、Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントをコードするコドン最適化ヌクレオチド配列を含む外因性核酸で遺伝子改変されている。そのような細胞が真核生物の単一細胞生物である場合、改変された細胞は、遺伝子改変生物とみなすことができる。いくつかの実施形態において、非ヒト遺伝子改変生物は、Ｂ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２トランスジェニック多細胞生物である。

【0307】

いくつかの実施形態では、遺伝子改変非ヒト宿主細胞（例えば、Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントをコードするコドン最適化ヌクレオチド配列を含む外因性核酸で遺伝子改変された細胞）は、遺伝子改変非ヒト生物（例えば、マウス、魚、カエル、ハエ、線虫など）を生成することができる。例えば、遺伝子改変宿主細胞が、多能性幹細胞（例えば、ＰＳＣ）又は生殖細胞（例えば、精子、卵母細胞など）である場合、遺伝子改変生物全体は、遺伝子改変宿主細胞に由来することができる。いくつかの実施形態では、遺伝子改変宿主細胞は、遺伝子改変生物を生じ得る、イン・ビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）又はイン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）のいずれかの多能性幹細胞（例えば、ＥＳＣ、ｉＰＳＣ、多能性植物幹細胞など）又は生殖細胞（例えば、精子細胞、卵母細胞など）である。いくつかの実施形態では、遺伝子改変宿主細胞は、脊椎動物ＰＳＣ（例えば、ＥＳＣ、ｉＰＳＣなど）であり、遺伝子改変生物を作製するために使用される（例えば、ＰＳＣを胚盤胞に注入して、キメラ／モザイク動物を作製し、次いで、非キメラ／非モザイク遺伝子改変生物を作製するために交配することができる；植物の場合は移植することなどによって）。本明細書に記載の方法を含む、遺伝子改変生物を作製するためのいずれかの好適な方法／プロトコールは、Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントをコードするコドン最適化ヌクレオチド配列を含む外因性核酸を含む遺伝子改変宿主細胞を作製するのに適している。遺伝子改変生物を産生する方法は、当技術分野において公知である。例えば、Ｃｈｏら、Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２００９ Ｍａｒ；Ｃｈａｐｔｅｒ １９：Ｕｎｉｔ １９．１１：トランスジェニックマウスの作成；Ｇａｍａら、Ｂｒａｉｎ Ｓｔｒｕｃｔ Ｆｕｎｃｔ．２０１０ Ｍａｒ；２１４（２－３）：９１－１０９．Ｅｐｕｂ ２００９ Ｎｏｖ ２５：動物の遺伝子導入：概要；Ｈｕｓａｉｎｉら、ＧＭ Ｃｒｏｐｓ．２０１１ Ｊｕｎ－Ｄｅｃ；２（３）：１５０－６２．Ｅｐｕｂ ２０１１ Ｊｕｎ １：植物における遺伝子標的化及び標的化遺伝子発現のためのアプローチ、を参照されたい。

【0308】

いくつかの実施形態では、遺伝子改変生物は、本開示の方法のための標的細胞を含み、したがって、標的細胞の供給源とみなすことができる。例えば、Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントをコードするコドン最適化ヌクレオチド配列を含む外因性核酸を含む遺伝子改変細胞を使用して遺伝子改変生物を作製する場合、遺伝子改変生物の細胞は、Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントをコードするコドン最適化ヌクレオチド配列を含む外因性核酸を含む。いくつかのそのような実施形態では、細胞のＤＮＡ又は遺伝子改変生物の細胞は、細胞又は細胞（複数）にガイドＲＮＡ（又はガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ）及び任意にドナー核酸を導入することによって、改変のために標的化することができる。例えば、遺伝子改変生物の細胞（例えば、脳細胞、腸細胞、腎臓細胞、肺細胞、血液細胞など）のサブセットへのガイドＲＮＡ（又はガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ）の導入は、改変するためにそのような細胞のＤＮＡを標的化することができ、そのゲノム位置は、導入されたガイドＲＮＡのＤＮＡ標的化配列に依存する。

【0309】

いくつかの実施形態では、遺伝子改変生物は、本開示の方法のための標的細胞の供給源である。例えば、Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントをコードするコドン最適化ヌクレオチド配列を含む外因性核酸で遺伝子改変された細胞を含む遺伝子改変生物は、遺伝子改変細胞の供給源、例えば、ＰＳＣ（例えば、ＥＳＣ、ｉＰＳＣ、精子、卵母細胞など）、ニューロン、前駆細胞、心筋細胞などを提供することができる。

【0310】

いくつかの実施形態では、遺伝子改変細胞が、Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントをコードするコドン最適化ヌクレオチド配列を含む外因性核酸を含むＰＳＣである。したがって、ＰＳＣは、ＰＳＣのＤＮＡが、ガイドＲＮＡ（又はガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ）及び任意のドナー核酸をＰＳＣに導入することによる改変のために標的化され得るような、標的細胞であり得、改変のゲノム位置は導入されたガイドＲＮＡのＤＮＡ標的化配列に依存する。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法を使用して、遺伝子改変生物に由来するＰＳＣのＤＮＡを改変する（例えば、いずれかの所望のゲノム位置を欠失及び／又は置換する）ことができる。次いで、そのような改変ＰＳＣを使用して、（ｉ）Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントをコードするコドン最適化ヌクレオチド配列を含む外因性核酸と、（ｉｉ）ＰＳＣに導入されたＤＮＡ改変との両方を有する生物を作製することができる。

【0311】

いくつかの実施形態では、外因性核酸は、未知のプロモーターの制御下にある（例えば、作動可能に連結されている）ことができ（例えば、核酸が宿主細胞ゲノムにランダムに組み込まれている場合）、又は既知のプロモーターの制御下にある（例えば、作動可能に連結されている）ことができる。好適な公知のプロモーターは、いずれかの公知のプロモーターであり得、構成的に活性なプロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター）、誘導性プロモーター（例えば、熱ショックプロモーター、テトラサイクリン調節性プロモーター、ステロイド調節性プロモーター、金属調節性プロモーター、エストロゲン受容体調節性プロモーターなど）、空間的に限定された及び／又は時間的に限定されたプロモーター（例えば、組織特異的プロモーター、細胞型特異的プロモーターなど）などを含む。

【0312】

遺伝子改変生物（例えば、その細胞が、Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントをコードするコドン最適化ヌクレオチド配列を含む生物）は、例えば、植物；藻類；無脊椎動物（例えば、刺胞動物、棘皮動物、回虫（ｗｏｒｍ）、ハエなど）；脊椎動物（例えば、魚類（例えば、ゼブラフィッシュ、フグ、キンギョなど）、両生類（例えば、サラマンダー、カエルなど）、爬虫類、鳥類、哺乳動物など）；有蹄動物（例えば、ヤギ、ブタ、ヒツジ、ウシなど）；げっ歯類（例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット）；ウサギ目（ウサギなど）などを含むいずれかの生物であり得る。

【0313】

いくつかの実施形態では、活性部分は、ＲＮａｓｅドメインである。いくつかの実施形態では、活性部分は、ＤＮａｓｅドメインである。

【0314】

トランスジェニック非ヒト動物

【0315】

上記のように、いくつかの実施形態において、核酸（例えば、Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントをコードするコドン最適化ヌクレオチド配列）又は組換え発現ベクターを導入遺伝子として使用して、Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントを産生するトランスジェニック動物を作製する。したがって、本開示は、上記のようなＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントをコードするコドン最適化ヌクレオチド配列を含む核酸を含む導入遺伝子を含むトランスジェニック非ヒト動物をさらに提供する。いくつかの実施形態において、トランスジェニック非ヒト動物のゲノムは、Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントをコードするコドン最適化ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、トランスジェニック非ヒト動物は、遺伝子改変についてホモ接合型である。いくつかの実施形態では、トランスジェニック非ヒト動物は、遺伝子改変についてヘテロ接合型である。いくつかの実施形態では、トランスジェニック非ヒト動物は、脊椎動物、例えば、魚（例えば、ゼブラフィッシュ、キンギョ、フグ、ドウクツギョなど）、両生類（カエル、サラマンダーなど）、鳥（例えば、ニワトリ、シチメンチョウなど）、爬虫類（例えば、ヘビ、トカゲなど）、哺乳動物（例えば、有蹄動物、例えば、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジなど、ウサギ目（例えば、ウサギ）、げっ歯類（例えば、ラット、マウス）、非ヒト霊長類など）である。

【0316】

いくつかの実施形態において、核酸は、Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントをコードするコドン最適化ヌクレオチド配列を含む外因性核酸である。いくつかの実施形態では、外因性核酸は、未知のプロモーターの制御下にある（例えば、作動可能に連結されている）か（例えば、核酸が宿主細胞ゲノムにランダムに組み込まれる場合）、又は既知のプロモーターの制御下にある（例えば、作動可能に連結されている）ことができる。好適な公知のプロモーターは、いずれかの公知のプロモーターであり得、構成的に活性なプロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター）、誘導性プロモーター（例えば、熱ショックプロモーター、テトラサイクリン調節性プロモーター、ステロイド調節性プロモーター、金属調節性プロモーター、エストロゲン受容体調節性プロモーターなど）、空間的に限定された及び／又は時間的に限定されたプロモーター（例えば、組織特異的プロモーター、細胞型特異的プロモーターなど）などを含む。

【0317】

宿主細胞への核酸の導入

【0318】

いくつかの実施形態において、本開示の方法は、ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列及び／又はＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド若しくはそのバリアントをコードするコドン最適化ヌクレオチド配列を含む１つ又は複数の核酸を宿主細胞（又は宿主細胞の集団）に導入することを含む。いくつかの実施形態において、標的ＤＮＡを含む細胞は、イン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）である。いくつかの実施形態において、標的ＤＮＡを含む細胞は、イン・ビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）である。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡ及び／又はＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントをコードするヌクレオチド配列は、誘導性プロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡ及び／又はＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントをコードするヌクレオチド配列は、構成的プロモーターに作動可能に連結される。

【0319】

ガイドＲＮＡ、又はそれをコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、様々な周知の方法のいずれかによって宿主細胞に導入することができる。同様に、方法が、Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントをコードするコドン最適化ヌクレオチド配列を含む核酸を宿主細胞に導入することを含む場合、そのような核酸は、様々な周知の方法のいずれかによって宿主細胞に導入することができる。ガイドポリヌクレオチド（ＲＮＡ又はＤＮＡ）及び／又はＢ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２ポリヌクレオチド（ＲＮＡ又はＤＮＡ）は、当技術分野で公知のウイルス又は非ウイルス送達ビヒクルによって送達することができる。

【0320】

核酸を宿主細胞に導入する方法は、当技術分野で公知であり、いずれかの公知の方法を使用して、核酸（例えば、発現構築物）を幹細胞又は前駆細胞に導入することができる。好適な方法には、例えば、ウイルス又はバクテリオファージ感染、トランスフェクション、コンジュゲーション、プロトプラスト融合、リポフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）媒介トランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介トランスフェクション、リポソーム媒介トランスフェクション、パーティクルガン法、リン酸カルシウム沈殿、直接マイクロインジェクション、ナノ粒子媒介核酸送達（例えば、Ｐａｎｙａｍら、Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．２０１２ Ｓｅｐ １３．ｐｉｉ：５０１６９－４０９Ｘ（１２）００２８３－９．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ａｄｄｒ．２０１２．０９．０２３を参照されたい）などを含み、エクソソーム送達を含むがこれに限定されない。

【0321】

ポリヌクレオチドは、ナノ粒子、リポソーム、リボ核タンパク質、正に荷電したペプチド、小分子ＲＮＡコンジュゲート、アプタマー－ＲＮＡキメラ、及びＲＮＡ－融合タンパク質複合体を含むが、これらに限定されない非ウイルス送達ビヒクルによって送達され得る。いくつかの例示的な非ウイルス性送達ビヒクルは、Ｐｅｅｒ ａｎｄ Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、１８：１１２７－１１３３（２０１１）（他のポリヌクレオチドの送達にも有用であるｓｉＲＮＡのための非ウイルス性送達ビヒクルに焦点を当てている）に記載されている。

【0322】

遺伝子編集のために本開示の核酸（例えば、ｍＲＮＡ及びｓｇＲＮＡ）を送達するための好適な系及び技術には、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）が含まれる。本明細書で使用される場合、用語「脂質ナノ粒子」は、それらのラメラリティ、形状又は構造及びリポプレックスにかかわらず、細胞への核酸及び／又はポリペプチドの導入について記載されるような、リポソームを含む。これらの脂質ナノ粒子は、生物学的に活性な化合物（例えば、核酸及び／又はポリペプチド）と複合体化することができ、イン・ビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）送達ビヒクルとして有用である。一般に、当技術分野で公知のいずれかの方法を適用して、本開示の１つ又は複数の核酸を含む脂質ナノ粒子を調製し、生物学的に活性な化合物と前記脂質ナノ粒子との複合体を調製することができる。そのような方法の例は、例えば、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １９７９，５５７：９；Ｂｉｏｃｈｉｍ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １９８０，６０１：５５９；Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ：Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９０）；Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ Ａｃｔａ Ｈｅｌｖｅｔｉａｅ １９９５，７０：９５；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９５，６８：７１５；Ｐａｋｉｓｔａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １９９６，１９：６５；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２００９，４６４：３４３）に開示されている。本開示の１つ又は複数の核酸及び／又はポリペプチドを含むＬＮＰ製剤を調製するための特に好適な系及び技術としては、これらに限定されないが、Ｉｎｔｅｌｌｉａ（例えば、ＷＯ２０１７１７３０５４Ａ１を参照）、Ａｌｎｙｌａｍ（例えば、ＷＯ２０１４００８３３４Ａ１を参照）、Ｍｏｄｅｒｎａｔｘ（例えば、ＷＯ２０１７０７０６２２Ａ１及びＷＯ２０１７０９９８２３Ａ１を参照）、ＴｒａｎｓｌａｔｅＢｉｏ、Ａｃｕｉｔａｓ（例えば、ＷＯ２０１８０８１４８０Ａ１）、Ｇｅｎｅｖａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ａｒｂｕｔｕｓ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ、Ｔｅｋｍｉｒａ、Ａｒｃｔｕｒｕｓ、Ｍｅｒｃｋ（例えば、ＷＯ２０１５１３０５８４Ａ２を参照）、Ｎｏｖａｒｔｉｓ（例えば、ＷＯ２０１５０９５３４０Ａ１を参照）、及びＤｉｃｅｒｎａにより開発されたものを含み；これらは全て、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0323】

ガイドＲＮＡ及び／又はＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む好適な核酸は、発現ベクターを含み、ここで、発現ベクターは、ガイドをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、ウイルス構築物、例えば、組換えアデノ随伴ウイルス構築物（例えば、米国特許第７，０７８，３８７号を参照）、組換えアデノウイルス構築物、組換えレンチウイルス構築物、組換えレトロウイルス構築物などである。好適な発現ベクターには、以下に限定されないが、ウイルスベクター（例えば、ワクシニアウイルス；ポリオウイルス；アデノウイルス（例えば、Ｌｉら、Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ３５：２５４３ ２５４９，１９９４；Ｂｏｒｒａｓら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ６：５１５ ５２４，１９９９；Ｌｉ ａｎｄ Ｄａｖｉｄｓｏｎ，ＰＮＡＳ ９２：７７００ ７７０４，１９９５；Ｓａｋａｍｏｔｏら、Ｈ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ５：１０８８１０９７，１９９９；ＷＯ９４／１２６４９、ＷＯ９３／０３７６９；ＷＯ９３／１９１９１；ＷＯ ９４／２８９３８；ＷＯ ９５／１１９８４をよびＷＯ９５／００６５５を参照）；アデノ随伴ウイルス（例えば、Ａｌｉら、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ９：８１ ８６，１９９８，Ｆｌａｎｎｅｒｙら、ＰＮＡＳ ９４：６９１６ ６９２１，１９９７；Ｂｅｎｎｅｔｔら、Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ３８：２８５７ ２８６３，１９９７；Ｊｏｍａｒｙら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ４：６８３－６９０，１９９７，Ｒｏｌｌｉｎｇら、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １０：６４１ ６４８，１９９９；Ａｌｉら、Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ ５：５９１ ５９４，１９９６；Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ ｉｎ ＷＯ ９３／０９２３９，Ｓａｍｕｌｓｋｉら、Ｊ． Ｖｉｒ．（１９８９）６３：３８２２－３８２８；Ｍｅｎｄｅｌｓｏｎら、Ｖｉｒａｌ．（１９８８）１６６：１５４－１６５；及びＦｌｏｔｔｅら、ＰＮＡＳ（１９９３）９０：１０６１３－１０６１７を参照）；ＳＶ４０；単純ヘルペスウイルス；ヒト免疫不全ウイルス（例えば、Ｍｉｙｏｓｈｉら、ＰＮＡＳ ９４：１０３１９ ２３，１９９７；Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７３：７８１２ ７８１６，１９９９を参照）；レトロウイルスベクター（例えば、マウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、並びにラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、レンチウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、及び乳房腫瘍ウイルスなどのレトロウイルスに由来するベクター）に基づくウイルスベクター）などが含まれる。

【0324】

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）

【0325】

組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、送達のために使用され得る。当技術分野におけるｒＡＡＶ粒子を産生するための公知の技術は、２つのＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）の間に送達されるポリヌクレオチド、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、並びにヘルパーウイルス機能を細胞に提供することである。ｒＡＡＶの産生は、以下の成分が単一細胞（本明細書ではパッケージング細胞として示される）内に存在することを必要とする：２つのＩＴＲ間の目的のポリヌクレオチド、ＡＡＶゲノムから分離した（すなわち、中に存在しない）ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、並びにヘルパーウイルス機能。ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子は、組換えウイルスが誘導され得るいずれかのＡＡＶ血清型に由来し得、パッケージングされたポリヌクレオチド上のＩＴＲとは異なるＡＡＶ血清型に由来し得、これらに限定されないが、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３及びＡＡＶ ｒｈ．７４を含む。シュードタイプｒＡＡＶの産生は、例えば、ＷＯ０１／８３６９２に開示されている。

【0326】

【表6】

【0327】

パッケージング細胞を作製する方法は、ＡＡＶ粒子産生に必要な全ての成分を安定に発現する細胞系を作製することである。例えば、ＡＡＶ ＩＴＲの間の目的のポリヌクレオチド、ＡＡＶゲノムから分離したＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、並びにネオマイシン耐性遺伝子などの選択マーカーを含むプラスミド（又は複数のプラスミド）を、細胞のゲノムに組み込む。ＡＡＶゲノムは、ＧＣテーリング（Ｓａｍｕｌｓｋｉら、１９８２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７９：２０７７－２０８１）、制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含む合成リンカーの付加（Ｌａｕｇｈｌｉｎｒａ、１９８３、Ｇｅｎｅ、２３：６５－７３）などの手順によって、又は直接的な平滑末端ライゲーション（Ｓｅｎａｐａｔｈｙ ＆ Ｃａｒｔｅｒ、１９８４、Ｊ．Ｂｉｏｉ．Ｃｈｅｍ．，２５９：４６６１－４６６６）によって細菌プラスミドに導入された。次いで、パッケージング細胞系を、アデノウイルスなどのヘルパーウイルスに感染させる。この方法の利点は、細胞が選択可能であり、ｒＡＡＶの大規模生産に好適であることである。好適な方法の他の例は、ｒＡＡＶゲノム及び／又はｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をパッケージング細胞に導入するために、プラスミドではなくアデノウイルス又はバキュロウイルスを使用する。

【0328】

ｒＡＡＶ産生の一般原理は例えば、Ｃａｒｔｅｒ，１９９２，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５３３－５３９；及びＭｕｚｙｃｚｋａ，１９９２，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．ａｎｄ ｌｍｍｕｎｏｌ．，１５８：９７－１２９）に概説されている。様々なアプローチが、Ｒａｔｓｃｈｉｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２（１９８４）；Ｈｅｒｍｏｎａｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６４６６（１９８４）；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１（１９８５）；Ｍｃｌａｕｇｈｌｉｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６２：１９６３（１９８８）；及びＬｅｂｋｏｗｓｋｉら、１９８８ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７：３４９（１９８８）、Ｓａｍｕｌｓｋｉら（１９８９，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６３：３８２２－３８２８）；米国特許第５，１７３，４１４号；ＷＯ９５／１３３６５及び対応する米国特許第５，６５８．７７６号；ＷＯ９５／１３３９２；ＷＯ９６／１７９４７；ＰＣＴ／ＵＳ９８／１８６００；ＷＯ９７／０９４４１（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１４４２３）；ＷＯ９７／０８２９８（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１３８７２）；ＷＯ９７／２１８２５（ＰＣＴ／ＵＳ９６／２０７７７）；ＷＯ９７／０６２４３（ＰＣＴ／ＦＲ９６／０１０６４）；ＷＯ ９９／１１７６４；Ｐｅｒｒｉｎら（１９９５）Ｖａｃｃｉｎｅ １３：１２４４－１２５０；Ｐａｕｌら（１９９３）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：６０９－６１５；Ｃｌａｒｋら（１９９６）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：１１２４－１１３２；米国特許第５，７８６，２１１号；米国特許第５，８７１，９８２号；及び米国特許第６，２５８，５９５号に記載されている。

【0329】

形質導入に使用されるＡＡＶベクター血清型は、標的細胞型に依存する。例えば、以下の例示的な細胞型は、とりわけ、示されたＡＡＶ血清型によって形質導入されることが知られている。

【0330】

【表7】

【0331】

多数の好適な発現ベクターは、当業者に公知であり、多くが市販されている。以下のベクターは例えば、真核宿主細胞として提供される：ｐＸＴ１、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、及びｐＳＶＬＳＶ４０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。しかし、宿主細胞と適合性がある限り、いずれかの他のベクターを使用することができる。

【0332】

利用される宿主／ベクター系に応じて、構成的及び誘導性プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含む、多くの好適な転写及び翻訳制御エレメントのいずれかが、発現ベクターにおいて使用され得る（例えば、Ｂｉｔｔｅｒら（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１５３：５１６－５４４を参照されたい）。

【0333】

いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡ及び／又はＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントをＲＮＡとして提供することができる。そのような場合、ガイドＲＮＡ及び／又はＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントをコードするＲＮＡは、直接化学合成によって製造することができ、又はガイドＲＮＡをコードするＤＮＡからイン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で転写することができる。ＤＮＡ鋳型からＲＮＡを合成する方法は、当技術分野において周知である。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡ及び／又はＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントをコードするＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼ酵素（例えば、Ｔ７ポリメラーゼ、Ｔ３ポリメラーゼ、ＳＰ６ポリメラーゼなど）を用いてイン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で合成される。一旦合成されると、ＲＮＡは、標的ＤＮＡに直接接触し得るか、又は核酸を細胞に導入するための周知の技術（例えば、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、トランスフェクションなど）のいずれかによって細胞に導入され得る。

【0334】

ガイドＲＮＡ（ＤＮＡ又はＲＮＡとして導入される）及び／又はＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアント（ＤＮＡ又はＲＮＡとして導入される）及び／又はドナーポリヌクレオチドをコードするヌクレオチドは、十分に開発されたトランスフェクション技術を用いて細胞に提供され得る；例えば、Ａｎｇｅｌ及びＹａｎｉｋ（２０１０）ＰＬｏＳ ＯＮＥ ５（７）：ｅ １１７５６、並びにＱｉａｇｅｎからの市販のＴｒａｎｓＭｅｓｓｅｎｇｅｒ（登録商標）試薬、ＳｔｅｍｇｅｎｔからのＳｔｅｍｆｅｃｔ（商標）ＲＮＡトランスフェクションキット、及びＭｉｍｓ ＢｉｏからのＴｒａｎｓｉＴ（商標）－ｍＲＮＡトランスフェクションキットを参照されたい。Ｂｅｕｍｅｒら（２００８）Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅｎｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｉｎ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｂｙ ｄｉｒｅｃｔ ｅｍｂｒｙｏ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｚｉｎｃ－ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ．ＰＮＡＳ １０５（５０）：１９８２１－１９８２６も参照されたい。それに加えて、又はその代わりに、ガイドＲＮＡ及び／又はＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアント、及び／又はＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２融合ポリペプチド又はそのバリアント、及び／又はドナーポリヌクレオチドをコードする核酸を、ＤＮＡベクター上に提供することができる。核酸を標的細胞に移入するのに有用な多くのベクター、例えば、プラスミド、コスミド、ミニサークル、ファージ、ウイルスなどが利用可能である。核酸を含むベクターは、エピソーム的に、例えば、プラスミド、ミニサークルＤＮＡ、サイトメガロウイルス、アデノウイルスなどのウイルスとして維持されてもよく、又はそれらは、相同組換え又はランダム組込み、例えば、ＭＭＬＶ、ＨＩＶ－１、ＡＬＶなどのレトロウイルス由来ベクターを介して、標的細胞ゲノムに組込まれてもよい。

【0335】

ベクターは、細胞に直接提供され得る。言い換えれば、ベクターが細胞に取り込まれるように、細胞は、ガイドＲＮＡ及び／又はＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド若しくはそのバリアント及び／又はＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２融合ポリペプチド若しくはそのバリアント及び／又はドナーポリヌクレオチドをコードする核酸を含むベクターと接触させられる。エレクトロポレーション、塩化カルシウムトランスフェクション、マイクロインジェクション、及びリポフェクションを含む、プラスミドである核酸ベクターと細胞を接触させるための方法は、当技術分野において周知である。ウイルスベクター送達のために、細胞は、ガイドＲＮＡ及び／又はＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド若しくはそのバリアント及び／又はＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２融合ポリペプチド若しくはそのバリアント及び／又はドナーポリヌクレオチドをコードする核酸を含むウイルス粒子と接触させられる。レトロウイルス、例えばレンチウイルスは、本開示の方法に特に好適である。一般的に使用されるレトロウイルスベクターは、「欠損」であり、例えば、増殖性感染に必要なウイルスタンパク質を産生することができない。むしろ、ベクターの複製は、パッケージング細胞系における増殖を必要とする。目的の核酸を含むウイルス粒子を生成するために、核酸を含むレトロウイルス核酸は、パッケージング細胞系によってウイルスカプシドにパッケージングされる。異なるパッケージング細胞系は、カプシドに組み込まれる異なるエンベロープタンパク質（同種指向性、両指向性又は異種指向性）を提供し、このエンベロープタンパク質は、細胞に対するウイルス粒子の特異性を決定する（マウス及びラットについては同種指向性；ヒト、イヌ及びマウスを含むほとんどの哺乳動物細胞型については両指向性；マウス細胞を除くほとんどの哺乳動物細胞型については異種指向性）。適切なパッケージング細胞系は、細胞がパッケージングされたウイルス粒子によって標的化されることを確実にするために使用され得る。リプログラミング因子をコードする核酸を含むレトロウイルスベクターをパッケージング細胞系に導入する方法、及びパッケージング細胞系によって生成されるウイルス粒子を収集する方法は、当技術分野で周知である。核酸はまた、直接マイクロインジェクション（例えば、ゼブラフィッシュ胚へのＲＮＡの注入）によって導入され得る。

【0336】

ガイドＲＮＡ及び／又はＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアント及び／又はＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２融合ポリペプチド又はそのバリアント及び／又はドナーポリヌクレオチドをコードする核酸を細胞に提供するために使用されるベクターは一般に、目的の核酸の発現、すなわち転写活性化、を駆動するための好適なプロモーターを含む。言い換えれば、目的の核酸は、プロモーターに作動可能に連結される。これは、偏在的に（ｕｂｉｑｕｉｔｏｕｓｌｙ）活性なプロモーター、例えば、ＣＭＶ－１３－アクチンプロモーター、又は誘導性プロモーター、例えば、特定の細胞集団において活性であるか、又はテトラサイクリンなどの薬物の存在に応答するプロモーターを含み得る。転写活性化によって、転写は、標的細胞における基礎レベルを少なくとも１０倍、少なくとも１００倍、より典型的には少なくとも１０００倍上回って増加することが意図される。さらに、ガイドＲＮＡ及び／又はＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアント及び／又はＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２融合ポリペプチド又はそのバリアント及び／又はドナーポリヌクレオチドを細胞に提供するために使用されるベクターは、ガイドＲＮＡ及び／又はＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアント及び／又はＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２融合ポリペプチド又はそのバリアント及び／又はドナーポリヌクレオチドを取り込んだ細胞を同定するために、標的細胞内の選択マーカーをコードする核酸配列を含み得る。

【0337】

ガイドＲＮＡ及び／又はＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアント及び／又はＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２融合ポリペプチド又はそのバリアントを代わりに使用して、ＤＮＡと接触させるか、又はＲＮＡとして細胞に導入することができる。ＲＮＡを細胞に導入する方法は当技術分野において公知であり、例えば、直接インジェクション、トランスフェクション、又はＤＮＡの導入に使用されるいずれかの他の方法を含み得る。Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントは代わりに、ポリペプチドとして細胞に提供され得る。そのようなポリペプチドは場合により、生成物の溶解度を増加させるポリペプチドドメインに融合され得る。ドメインは、規定されたプロテアーゼ切断部位、例えば、ＴＥＶプロテアーゼによって切断される、ＴＥＶ配列、を介してポリペプチドに連結され得る。リンカーはまた、１つ又は複数の柔軟な配列、例えば、１～１０個のグリシン残基を含み得る。いくつかの実施形態では、融合タンパク質の切断が例えば、０．５～２Ｍの尿素の存在下、溶解度を増加させるポリペプチド及び／又はポリヌクレオチドの存在下など、生成物の溶解度を維持する緩衝液中で実施される。目的のドメインには、エンドソーム分解ドメイン、例えばインフルエンザＨＡドメイン；及び産生を補助する他のポリペプチド、例えばＩＦ２ドメイン、ＧＳＴドメイン、ＧＲＰＥドメインなどが含まれる。ポリペプチドは、改善された安定性のために製剤化され得る。例えば、ペプチドは、ＰＥＧ化されてもよく、この場合、ポリエチレンオキシ基は、血流中での寿命の向上を提供する。

【0338】

加えて、又は代わりに、Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントをポリペプチド浸透性ドメインに融合させて、細胞による取り込みを促進することができる。多数の浸透性ドメインが当技術分野において公知であり、ペプチド、ペプチド模倣体、及び非ペプチド担体を含む、本開示の非組み込みポリペプチドにおいて使用され得る。例えば、浸透性ペプチドは、アミノ酸配列ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（この配列は本特許出願の下では開示されていない）を含む、ペネトラチンと称されるキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）転写因子アンテナペディア（Ａｎｔｅｎｎａｐａｅｄｉａ）の第３のαヘリックスに由来し得る。別の例として、浸透性ペプチドは、ＨＩＶ－１ ｔａｔ塩基性領域アミノ酸配列を含み、これは、例えば、天然に存在するｔａｔタンパク質のアミノ酸４９～５７を含み得る。

【0339】

他の透過性ドメインとしては、ポリアルギニンモチーフ、例えば、ＨＩＶ－１ ｒｅｖタンパク質のアミノ酸３４～５６の領域、ノナアルギニン、アクタアルギニンなどが挙げられる。（例えば、Ｆｕｔａｋｉら（２００３）Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｅｐｔ Ｓｃｉ．２００３ Ａｐｒ；４（２）：８７－９ ａｎｄ ４４６；及びＷｅｎｄｅｒら（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．２０００ Ｎｏｖ．２１；９７（２４）：１３００３－８；米国特許出願公開第２００３０２２０３３４号；同第２００３００８３２５６号；同第２００３００３２５９３号；及び同第２００３００２２８３１号を参照されたい、ここで、転座ペプチド及びペプトイドの教示について参照により本明細書に具体的に組み込まれる）。ノナアルギニン（Ｒ９）配列は、特徴付けられたより効率的なＰＴＤの１つである（Ｗｅｎｄｅｒら、２０００；Ｕｅｍｕｒａら、２００２）。融合が行われる部位は、ポリペプチドの生物学的活性、分泌又は結合特性を最適化するために選択され得る。最適部位は、日常的な実験によって決定することができる。いくつかの実施形態では、ポリペプチド浸透性ドメインは、ＰＴＤのバイオアベイラビリティを増加させるために化学的に改変される。例示的な改変は、Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．２００９ Ｎｏｖ；６（１１）：１１９５－２０５を参照のこと。

【0340】

一般に、ガイドＲＮＡ及び／又はＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアント及び／又はドナーポリヌクレオチドの有効量は、標的改変を誘導するために標的ＤＮＡ又は細胞に提供される。ガイドＲＮＡ及び／又はＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアント及び／又はドナーポリヌクレオチドの有効量は、陰性対照、例えば、空のベクター又は無関係なポリペプチドと接触させた細胞と比較して、ｇＲＮＡで観察される標的化改変の量の２倍以上の増加を誘導する量である。すなわち、ガイドＲＮＡ及び／又はＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアント及び／又はドナーポリヌクレオチドの有効量又は用量は、標的ＤＮＡ領域で観察される標的改変の量の２倍の増加、３倍の増加、４倍の増加又はそれ以上を誘導し、いくつかの実施形態では観察される組換え量の５倍の増加、６倍の増加又はそれ以上、ときには７倍又は８倍以上の増加、例えば、いくつかの実施形態では観察される組換え量の１０倍、５０倍又は１００倍又はそれ以上の増加、いくつかの実施形態では観察される組換え量の２００倍、５００倍、７００倍又は１０００倍又はそれ以上の増加、例えば５０００倍又は１０，０００倍の増加を誘導する。標的改変の量は、いずれかの好適な方法によって測定することができる。例えば、相同配列に隣接するガイドＲＮＡのスペーサーに対する相補配列を含むスプリットレポーターコンストラクトであって、組換えられた場合、活性レポーターをコードする核酸を細胞に再構成することができるものは、細胞に同時トランスフェクトされ得、ガイドＲＮＡ及び／又はＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアント及び／又はドナーポリヌクレオチドとの接触後、例えば、ガイドＲＮＡ及び／又はＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアント及び／又はドナーポリヌクレオチドとの接触後２時間、４時間、８時間、１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、７２時間又はそれ以上で、レポータータンパク質の量が評価される。別の例として、より感度の高いアッセイ、例えば、標的ＤＮＡ配列を含む目的のゲノムＤＮＡ領域における組換えの程度は、ガイドＲＮＡ及び／又はＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアント及び／又はドナーポリヌクレオチドとの接触後、例えば、ガイドＲＮＡ及び／又はＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアント及び／又はドナーポリヌクレオチドとの接触後２時間、４時間、８時間、１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、７２時間以上で、領域のＰＣＲ又はサザンハイブリダイゼーションによって評価され得る。

【0341】

細胞をガイドＲＮＡ及び／又はＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアント及び／又はドナーポリヌクレオチドと接触させることは、細胞の生存を促進するいずれかの培養条件下で、いずれかの培養培地中で起こり得る。例えば、細胞は、ウシ胎児血清又は熱不活化ウシ胎児血清（約５～１０％）、Ｌ－グルタミン、チオール、特に２－メルカプトエタノール、及び抗生物質、例えばペニシリン及びストレプトマイシンを補充した、ｌｓｃｏｖｅの改変ＤＭＥＭ又はＲＰＭＩ１６４０などの適切な栄養培地中に懸濁され得る。培養物は、細胞が応答する増殖因子を含有する可能性がある。本明細書で定義される成長因子は、膜貫通型受容体に対する特異的効果を介して、培養物中又は無傷組織中のいずれかで、細胞の生存、成長及び／又は分化を促進することができる分子である。増殖因子には、ポリペプチド及び非ポリペプチド因子が含まれる。細胞の生存を促進する条件は、一般に、非相同末端結合及び相同組換え修復を許容する。ポリヌクレオチド配列を標的ＤＮＡ配列に挿入することが望ましい用途では、挿入されるドナー配列を含むポリヌクレオチドも細胞に提供される。「ドナー配列」又は「ドナーポリヌクレオチド」とは、Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントによって誘導される切断部位に挿入される核酸配列を意味する。ドナーポリヌクレオチドは、切断部位の隣接ゲノム領域に対する十分な配列相同性、例えば、切断部位に隣接するヌクレオチド配列との７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％の配列同一性、例えば、切断部位の約５０塩基以内、例えば、約３０塩基以内、約１５塩基以内、約１０塩基以内、約５塩基以内、又は切断部位に直ぐに隣接していることを含み、それと相同性を有するゲノム配列との間の相同組換え修復をサポートする。ドナーとゲノム配列との間の相同配列の約２５、５０、１００、若しくは２００ヌクレオチド、又は２００を超えるヌクレオチド（又は１０～２００ヌクレオチド以上のいずれかの整数値）は、相同組換え修復をサポートする。ドナー配列は、いずれかの長さ、例えば、１０ヌクレオチド以上、５０ヌクレオチド以上、１００ヌクレオチド以上、２５０ヌクレオチド以上、５００ヌクレオチド以上、１０００ヌクレオチド以上、５０００ヌクレオチド以上などであり得る。

【0342】

ドナー配列は一般に、それが置換するゲノム配列と同一ではない。むしろ、ドナー配列は、相同組換え修復をサポートするのに十分な配列同一性が存在する限り、ゲノム配列に関して少なくとも１つ又は複数の単一塩基置換、挿入、欠失、逆位、又は再配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ドナー配列は、標的ＤＮＡ領域と相同な２つの領域（相同アームとも呼ばれる）が隣接する非相同配列を含み、その結果、標的ＤＮＡ領域と２つの隣接相同アームとの間の相同組換え修復が、標的領域における非相同配列の挿入をもたらす。ドナー配列はまた、目的のＤＮＡ領域に相同ではなく、目的のＤＮＡ領域への挿入を意図しない配列を含有するベクター骨格を含んでもよい。一般的に、ドナー配列の相同領域は、組換えが望まれるゲノム配列に対して少なくとも５０％の配列同一性を有する。特定の実施形態では、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は９９．９％の配列同一性が存在する。ドナーポリヌクレオチドの長さに応じて、１％～１００％の配列同一性のいずれかの値が存在し得る。ドナー配列は、ゲノム配列と比較して特定の配列差異、例えば、制限部位、ヌクレオチド多型、選択マーカー（例えば、薬物耐性遺伝子、蛍光タンパク質、酵素など）を含んでもよく、これは切断部位でのドナー配列の成功した挿入を評価するために使用されてもよく、又は場合によっては他の目的（例えば、標的ゲノム遺伝子座での発現を示すために）のために使用されてもよい。いくつかの実施形態では、コード領域に位置する場合、そのようなヌクレオチド配列の相違は、アミノ酸配列を変化させないか、又はタンパク質の構造又は機能に実質的に影響を及ぼさないアミノ酸変化を生じさせる。あるいは、これらの配列の相違は、マーカー配列の除去のために後に活性化され得る、ＦＬＰ、ｌｏｘＰ配列などの隣接組換え配列を含み得る。

【0343】

ドナー配列は、一本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、又は二本鎖ＲＮＡとして細胞に提供され得る。それは、線形又は円形の形態で細胞に導入され得る。線形形態で導入される場合、ドナー配列の末端は当業者に公知の方法によって保護され得る（例えば、エキソヌクレアーゼ分解から）。例えば、１つ又は複数のジデオキシヌクレオチド残基が線形分子の３’末端に付加され、及び／又は自己相補的オリゴヌクレオチドが一方又は両方の末端にライゲーションされる。例えば、Ｃｈａｎｇら、（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：４９５９－４９６３；Ｎｅｈｌｓら、（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２：８８６－８８９を参照されたい。外因性ポリヌクレオチドを分解から保護するためのさらなる方法としては、末端アミノ基の付加、及び改変ヌクレオチド間結合、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロアミデート、及びＯ－メチルリボース又はデオキシリボース残基の使用が挙げられるが、これらに限定されない。線形ドナー配列の末端を保護する代わりに、組換えに影響を及ぼすことなく分解することができるさらなる長さの配列を相同性アームの外側に含めることができる。ドナー配列は、例えば、複製起点、プロモーター、及び抗生物質耐性をコードする遺伝子などのさらなる配列を有するベクター分子の一部として細胞に導入することができる。さらに、ガイドＲＮＡ及び／又はＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアント及び／又はドナーポリヌクレオチドをコードする核酸について上述したように、ドナー配列は、裸の（例えば、未改変の）核酸として、リポソーム又はポロキサマーなどの薬剤と複合体化した核酸として導入することができ、又はウイルス（例えば、アデノウイルス、ＡＡＶ）に送達され得る。

【0344】

上記の方法に続いて、目的のＤＮＡ領域は、エクス・ビボ（ｅｘ ｖｉｖｏ）で、切断及び改変、例えば、「遺伝子改変（ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ）」され得る。いくつかの実施形態では、選択マーカーが目的のＤＮＡ領域に挿入されたとき、遺伝子改変された細胞を残りの集団から分離することによって、遺伝子改変を含むものについて細胞集団を濃縮することができる。濃縮の前に、「遺伝子改変」細胞は、細胞集団の約１％又はそれ以上（例えば、２％又はそれ以上、３％又はそれ以上、４％又はそれ以上、５％又はそれ以上、６％又はそれ以上、７％又はそれ以上、８％又はそれ以上、９％又はそれ以上、１０％又はそれ以上、１５％又はそれ以上、又は２０％又はそれ以上）のみを構成し得る。「遺伝子改変」細胞の分離は、使用される選択マーカーに適したいずれかの好適な分離技術によって達成され得る。例えば、蛍光マーカーが挿入されている場合、細胞は、蛍光活性化細胞選別によって分離され得、一方、細胞表面マーカーが挿入されている場合、細胞は、アフィニティー分離技術、例えば、磁気分離、アフィニティークロマトグラフィー、固体マトリックスに結合したアフィニティー試薬を用いた「パンニング」、又は他の好適な技術によって、異種集団から分離され得る。正確な分離を提供する技術には、様々な程度に洗練された蛍光活性化細胞ソーターが含まれる。例えば、多色チャネル、低角度及び鈍角光散乱検出チャネル、インピーダンスチャネルなどである。細胞は、死細胞に会合する染料（例えば、ヨウ化プロピジウム）を用いることによって、死細胞に対して選択され得る。遺伝子改変された細胞の生存能力に過度に悪影響を及ぼさないいずれかの技術を用いることができる。改変ＤＮＡを含む細胞について高度に濃縮された細胞組成物は、このようにして達成される。「高度に濃縮された」とは、遺伝子改変された細胞が、細胞組成物の７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、例えば、細胞組成物の約９５％以上、又は９８％以上であることを意味する。言い換えれば、組成物は、遺伝子改変細胞の実質的に純粋な組成物であってもよい。

【0345】

本明細書に記載の方法によって産生された遺伝子改変細胞は、直ちに使用することができる。加えて、又は代わりに、細胞を液体窒素温度で凍結し、長期間保存し、解凍し、再利用することができる。そのような場合、細胞は一般に、１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、５０％血清、４０％緩衝培地、又はそのような凍結温度で細胞を保存するために当技術分野で一般に使用される他の溶液中で凍結され、凍結培養細胞を解凍するために当技術分野で一般に知られている方法で解凍される。

【0346】

遺伝子改変細胞は、様々な培養条件下でイン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で培養され得る。細胞は、例えば、その増殖を促進する条件下で増殖するなど、培養物中で増殖させることができる。培養培地は、例えば、寒天、メチルセルロースなどを含有する、液体又は半固体であり得る。細胞集団は、ウシ胎児血清（約５～１０％）、Ｌ－グルタミン、チオール、特に２－メルカプトエタノール、並びに抗生物質、例えばペニシリン及びストレプトマイシンを通常補充した、ｌｓｃｏｖｅの改変ＤＭＥＭ又はＲＰＭＩ １６４０などの適切な栄養培地中に懸濁され得る。培養物は、それぞれの細胞が応答する増殖因子を含有してもよい。本明細書で定義される成長因子は、膜貫通型受容体に対する特異的効果を介して、培養物中又は無傷組織中のいずれかで、細胞の生存、成長及び／又は分化を促進することができる分子である。増殖因子には、ポリペプチド及び非ポリペプチド因子が含まれる。このように遺伝子改変された細胞は、遺伝子治療などの目的のために、例えば、疾患を処置するために、又は抗ウイルス、抗病原性、若しくは抗癌治療薬として、農業において遺伝子改変生物の産生のために、又は生物学的研究のために、対象に移植され得る。対象は、新生児、若年者、又は成人であってもよい。特に興味深いのは、哺乳動物の対象である。本発明の方法で処置することができる哺乳動物の種には、イヌ科動物及びネコ科動物；ウマ；ウシ；ヒツジなど；及び霊長類、特にヒトが含まれる。動物モデル、特に小型哺乳動物（例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ目（例えば、ウサギ）など）を、実験研究のために使用することができる。

【0347】

細胞は単独で、又は、例えば、それらが移植されている組織におけるそれらの増殖及び／又は組織化をサポートするために、好適な基質又はマトリックスと共に、対象に提供され得る。一般に、少なくとも１×１０^３個の細胞、例えば、５×１０^３個の細胞、１×１０^４個の細胞、５×１０^４個の細胞、１×１０^５個の細胞、１×１０^６個又はそれ以上の細胞が投与される。細胞は、以下の経路：非経口、皮下、静脈内、頭蓋内、脊髄内、眼内、又は髄液内のいずれかを介して対象に導入され得る。細胞は、インジェクション、カテーテルなどによって導入することができる。局所送達の方法の例、すなわち損傷部位への送達には、例えば、オンマイヤーレザバー（Ｏｍｍａｙａ ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ）を介して、例えば、髄腔内送達のための（例えば、本明細書に参照として組み込まれている米国特許第５，２２２，９８２号及び第５，３８５，５８２号を参照）、ボーラス注射により、例えば、注射器、例えば、関節への注射；例えば、持続注入により、例えば、カニューレ挿入により、例えば、対流ありで（例えば、本明細書に参照により組み込まれている米国特許出願第２００７０２５４８４２号を参照）、又は細胞が可逆的に固定されている装置を移植することにより（例えば、本明細書に参照により組み込まれている米国特許出願第２００８００８１０６４号及び第２００９０１９６９０３号を参照）などがある。また、トランスジェニック動物（例えば、トランスジェニックマウス）を作製する目的で、胚（例えば、胚盤胞）に細胞を導入してもよい。

【0348】

いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡ及び／又はＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントをコードするヌクレオチド配列は、制御エレメント、例えば、プロモーターなどの転写制御エレメントに作動可能に連結される。転写制御エレメントは一般に、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞）などの真核細胞；又は原核細胞（例えば、細菌細胞又は古細菌細胞）のいずれかにおいて機能的である。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡ及び／又はＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントをコードするヌクレオチド配列は、原核細胞及び真核細胞の両方において、ガイドＲＮＡ及び／又はＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントをコードするヌクレオチド配列の発現を可能にする複数の制御エレメントに作動可能に連結される。

【0349】

プロモーターは、構成的に活性なプロモーター（例えば、活性な「ＯＮ」状態で構成的に存在するプロモーター）であり得、それは誘導性プロモーター（例えば、その状態、活性／「ＯＮ」又は不活性／「ＯＦＦ」、が、外部刺激、例えば、特定の温度、化合物、又はタンパク質の存在によって制御されるプロモーター）であり得、それは空間的に限定されたプロモーター（例えば、転写制御エレメント、エンハンサーなど）（例えば、組織特異的プロモーター、細胞型特異的プロモーターなど）であり得、及び、それは時間的に限定されたプロモーター（例えば、そのプロモーターは、胚発生の特定の段階の間、又は生物学的プロセスの特定の段階の間、例えば、マウスの毛包周期に、活性／「ＯＮ」又は不活性／「ＯＦＦ」状態である）。

【0350】

好適なプロモーターは、ウイルスに由来することができ、したがって、ウイルスプロモーターと称することができ、又は原核生物若しくは真核生物を含むいずれかの生物に由来することができる。好適なプロモーターを使用して、いずれかのＲＮＡポリメラーゼ（例えば、ｐｏｌ Ｉ、ｐｏｌ ＩＩ、ｐｏｌ ＩＩＩ）により発現を駆動することができる。例示的なプロモーターには、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルス長末端反復（ＬＴＲ）プロモーター；アデノウイルス主要後期プロモーター（Ａｄ ＭＬＰ）；単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、例えばＣＭＶ前初期プロモーター領域（ＣＭＶＩＥ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ヒトＵ６小核プロモーター（Ｕ６）（Ｍｉｙａｇｉｓｈｉら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０，４９７－５００（２００２））、強化されたＵ６プロモーター（例えば、Ｘｉａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００３ Ｓｅｐ １；３１（１７））、ヒトＨ１プロモーター（Ｈ１）などが含まれるが、これらに限定されない。

【0351】

誘導性プロモーターの例としては、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、イソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）調節性プロモーター、ラクトース誘導性プロモーター、熱ショックプロモーター、テトラサイクリン調節性プロモーター（例えば、ＴｅｔＯＮ、Ｔｅｔ－ＯＦＦなど）、ステロイド調節性プロモーター、金属調節性プロモーター、エストロゲン受容体調節性プロモーターなどが挙げられるが、これらに限定されない。したがって、誘導性プロモーターは、限定されないが、ドキシサイクリン；ＲＮＡポリメラーゼ、例えば、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ；エストロゲン受容体；エストロゲン受容体融合体などを含む分子によって調節され得る。

【0352】

いくつかの実施形態において、プロモーターは空間的に限定されたプロモーター（例えば、細胞型特異的プロモーター、組織特異的プロモーターなど）であり、その結果、多細胞生物において、プロモーターは特異的細胞のサブセットにおいて活性（例えば、「ＯＮ」）である。空間的に限定されたプロモーターは、エンハンサー、転写制御エレメント、制御配列などとも称され得る。いずれかの好適な空間的に限定されたプロモーターを使用することができ、好適なプロモーター（例えば、脳特異的プロモーター、ニューロンのサブセットにおける発現を駆動するプロモーター、生殖系列における発現を駆動するプロモーター、肺における発現を駆動するプロモーター、筋肉における発現を駆動するプロモーター、膵島細胞における発現を駆動するプロモーターなど）の選択は生物に依存する。例えば、様々な空間的に限定されたプロモーターは、植物、ハエ、寄生虫（ｗｏｒｍｓ）、哺乳動物、マウスなどについて知られている。したがって、空間的に限定されたプロモーターを使用して、生物に応じて、多種多様な異なる組織及び細胞型におけるＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントをコードする核酸の発現を調節することができる。いくつかの空間的に限定されたプロモーターはまた、胚発生の特定の段階の間、又は生物学的プロセスの特定の段階（例えば、マウスにおける毛包周期）の間、プロモーターが「ＯＮ」状態又は「ＯＦＦ」状態にあるように、時間的に限定される。

【0353】

例示目的のために、空間的に限定されたプロモーターの例としては、ニューロン特異的プロモーター、脂肪細胞特異的プロモーター、心筋細胞特異的プロモーター、平滑筋特異的プロモーター、光受容体特異的プロモーターなどが挙げられるが、これらに限定されない。ニューロン特異的な空間的に限定されたプロモーターには、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター（例えば、ＥＭＢＬ ＨＳＥＮ０２、Ｘ５１９５６を参照）；芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）プロモーター；ニューロフィラメントプロモーター（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ ＨＵＭＮＦＬ、Ｌ０４１４７を参照）；シナプシンプロモーター（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ ＨＵＭＳＹＮＩＢ、Ｍ５５３０１を参照）；ｔｈｙ－１プロモーター（例えば、Ｃｈｅｎら（１９８７）Ｃｅ／１５１：７－１９；及びＬｌｅｗｅｌｌｙｎら（２０１０）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１６（１０）：１１６１－１１６６を参照）；セロトニン受容体プロモーター（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ Ｓ６２２８３を参照）；チロシンヒドロキシラーゼプロモーター（ＴＨ）（例えば、Ｏｈら（２００９）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １６：４３７；Ｓａｓａｏｋａら（１９９２）Ｍｏｌ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．１６：２７４；Ｂｏｕｎｄｙら（１９９８）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１８：９９８９；及びＫａｎｅｄａら（１９９１）Ｎｅｕｒｏｎ ６：５８３－５９４を参照）；ＧｎＲＨプロモーター（例えば、Ｒａｄｏｖｉｃｋら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：３４０２－３４０６）；Ｌ７プロモーター（例えば、Ｏｂｅｒｄｉｃｋら（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４８：２２３－２２６を参照）；ＤＮＭＴプロモーター（例えば、Ｂａｒｔｇｅら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ／．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：３６４８－３６５２を参照）；エンケファリンプロモーター（例えば、Ｃｏｍｂら（１９８８）ＥＭＢＯ Ｊ．１７：３７９３－３８０５を参照）；ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）プロモーター；Ｃａ２＋－カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼ１１－α（ＣａｍＫＩＩａ）プロモーター（例えば、Ｍａｙｆｏｒｄら（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ／．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：１３２５０；及びＣａｓａｎｏｖａら（２００１）Ｇｅｎｅｓｉｓ ３１：３７を参照）；ＣＭＶエンハンサー／血小板由来増殖因子－０プロモーター（例えば、Ｌｉｕら（２００４）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １１：５２－６０を参照）などが挙げられるが、これらに限定されない。

【0354】

脂肪細胞特異的な空間的に限定されたプロモーターとしては、ａＰ２遺伝子プロモーター／エンハンサー、例えば、ヒトａＰ２遺伝子の－５．４ｋｂ～＋２１ｂｐの領域（例えば、Ｔｏｚｚｏら（１９９７）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１３８：１６０４；Ｒｏｓｓら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：９５９０；及びＰａｖｊａｎｉら（２００５）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１１：７９７を参照）；グルコース輸送体－４（ＧＬＵＴ４）プロモーター（例えば、Ｋｎｉｇｈｔら（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ／．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １００：１４７２５を参照）；脂肪酸トランスロカーゼ（ＦＡＴ／ＣＤ３６）プロモーター（例えば、Ｋｕｒｉｋｉら（２００２）Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．２５：１４７６；及びＳａｔｏら（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：１５７０３を参照）；ステアロイル－ＣｏＡデサチュラーゼ－１（ＳＣＤ１）プロモーター（例えば、Ｔａｂｏｒら（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２０６０３）；レプチンプロモーター（例えば、Ｍａｓｏｎら（１９９８）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１３９：１０１３；及びＣｈｅｎら（１９９９）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２６２：１８７を参照）；アディポネクチンプロモーター（例えば、Ｋｉｔａら（２００５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．３３１：４８４；及びＣｈａｋｒａｂａｒｔｉ（２０１０）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１５１：２４０８を参照）；アジプシンプロモーター（例えば、Ｐｌａｔｔら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ／．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：７４９０を参照）；レジスチンプロモーター（例えば、Ｓｅｏら（２００３）Ｍａｌｅｃ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１７：１５２２）；などが挙げられるが、これらに限定されない。

【0355】

心筋細胞特異的な空間的に限定されたプロモーターとしては以下の遺伝子に由来する制御配列が挙げられるが、これらに限定されない：ミオシン軽鎖－２、ａ－ミオシン重鎖、ＡＥ３、心臓トロポニンＣ、心臓アクチンなど。Ｆｒａｎｚら（１９９７）Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．３５：５６０－５６６；Ｒｏｂｂｉｎｓら（１９９５）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７５２：４９２－５０５；Ｌｉｎｎら（１９９５）Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．７６：５８４５９１；Ｐａｒｍａｃｅｋら（１９９４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４：１８７０－１８８５；Ｈｕｎｔｅｒら（１９９３）Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ ２２：６０８－６１７；及びＳａｒｔｏｒｅｌｌｉら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：４０４７－４０５１。

【0356】

平滑筋特異的な空間的に限定されたプロモーターとしては、ＳＭ２２ａプロモーター（例えば、Ａｋｙｉｌｒｅｋら（２０００）Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．６：９８３；及び米国特許第７，１６９，８７４号を参照）；スムースリンプロモーター（例えば、国際公開第２００１／０１８０４８号パンフレットを参照）；α－平滑筋アクチンプロモーターなどが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、２つのＣＡｒＧエレメントが存在する、ＳＭ２２ａプロモーターの０．４ｋｂ領域は、血管平滑筋細胞特異的発現を媒介することが示されている（例えば、Ｋｉｍら、（１９９７）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１７，２２６６－２２７８；Ｌｉら、（１９９６）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１３２，８４９－８５９；及びＭｏｅｓｓｌｅｒら、（１９９６）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２２、２４１５－２４２５を参照されたい）。

【0357】

光受容体特異的な空間的に限定されたプロモーターとしては、ロドプシンプロモーター；ロドプシンキナーゼプロモーター（Ｙｏｕｎｇら（２００３）Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．４４：４０７６）；βホスホジエステラーゼ遺伝子プロモーター（Ｎｉｃｏｕｄら（２００７）Ｊ．Ｇｅｎｅ．Ｍｅｄ．９：１０１５）；網膜色素変性症遺伝子プロモーター（Ｎｉｃｏｕｄら（２００７）上記のとおり）；光受容体間レチノイド結合タンパク質（ＩＲＢＰ）遺伝子エンハンサー（Ｎｉｃｏｕｄら（２００７）上記のとおり）；ＩＲＢＰ遺伝子プロモーター（Ｙｏｋｏｙａｍａら（１９９２）Ｅｘｐ Ｅｙｅ Ｒｅｓ．５５：２２５）；等が挙げられるが、これらに限定されない。

【0358】

ガイドＲＮＡを含む組成物

【0359】

いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡを含む組成物が本明細書で提供される。該組成物は、ガイドＲＮＡに加えて、１つ又は複数の：塩、例えば、ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ_２、ＫＣｌ、ＭｇＳＯ_４など；緩衝剤、例えば、トリス緩衝剤、Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－Ｎ’－（２－エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）、２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ＭＥＳナトリウム塩、３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ－トリス［ヒドロキシメチル］メチル－３－アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）など；可溶化剤；洗浄剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ－２０などの非イオン性洗浄剤など；ヌクレアーゼ阻害剤；などを含むことができる。例えば、いくつかの実施形態では、組成物は、ガイドＲＮＡ及び核酸を安定化するための緩衝剤を含む。

【0360】

いくつかの実施形態では、組成物中に存在するガイドＲＮＡは、純粋であり、例えば、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は９９％超純粋であり、ここで、「％純度」は、ガイドＲＮＡが、ガイドＲＮＡの産生中に存在し得る他の高分子又は夾雑物を含まない、記載されたパーセントであることを意味する。

【0361】

Ｂ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチドを含む組成物

【0362】

いくつかの実施形態では、コドン最適化ポリヌクレオチド配列から発現されるＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントを含む組成物が本明細書で提供される。Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントに加えて、１つ又は複数の：塩、例えば、ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ_２、ＫＣｌ、ＭｇＳＯ_４など；緩衝剤、例えば、トリス緩衝剤、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、ＭＥＳナトリウム塩、ＭＯＰＳ、ＴＡＰＳなど；可溶化剤；洗浄剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ－２０などの非イオン性界面活性剤など；プロテアーゼ阻害剤；還元剤（例えば、ジチオスレイトール）；などを含むことができる。

【0363】

いくつかの実施形態では、組成物中に存在するＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントは、純粋であり、例えば、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は９９％超純粋であり、ここで、「％純度」は、Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントが、Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントの産生中に存在し得る他のタンパク質、他の高分子、又は夾雑物を含まない記載されたパーセントであることを意味する。

【0364】

ガイドＲＮＡ及び部位特異的改変ポリペプチドを含む組成物

【0365】

いくつかの実施形態では、（ｉ）ガイドＲＮＡ又はガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチド；及び（ｉｉ）Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントをコードするコドン最適化ポリヌクレオチド配列を含む核酸、又は核酸から発現されるＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントを含む組成物が本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントは、標的ＤＮＡを改変する酵素活性を示す。いくつかの実施形態において、Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントは、標的ＤＮＡによってコードされるポリペプチドを改変する酵素活性を示す。いくつかの実施形態において、Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントは、標的ＤＮＡからの転写を調節する。

【0366】

いくつかの実施形態では、組成物の成分は、個々に純粋であり、例えば、成分のそれぞれは少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は少なくとも９９％純粋である。いくつかの実施形態では、組成物の個々の成分は、組成物に添加される前に純粋である。

【0367】

キット

【0368】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法を実施するためのキットが提供される。キットは、１つ又は複数の：例えば、コドン最適化ポリヌクレオチド配列から発現されるＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアント；ガイドＲＮＡ；ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む核酸、を含むことができる。キットは、２つ以上の：Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアント；Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントをコードするヌクレオチドを含む核酸；ガイドＲＮＡ；ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む核酸、を含む複合体を含むことができる。いくつかの実施形態において、キットは、Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアント、又はそれをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントの活性部分は、低下した又は不活性化したヌクレアーゼ活性を示す。いくつかの実施形態において、Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントは、Ｂ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２融合タンパク質である。

【0369】

いくつかの実施形態では、キットが、（ａ）Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントをコードするコドン最適化ポリヌクレオチド配列を含む核酸、又は核酸から発現されるＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアント；及び（ｂ）ｇＲＮＡ又はｇＲＮＡをコードする核酸を含み、ここで、ｇＲＮＡは、Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントを標的ポリヌクレオチド配列に誘導することができる。いくつかの実施形態では、キットは、コドン最適化ポリヌクレオチド配列を含む核酸を含む。コドン最適化ポリヌクレオチド配列から発現されるＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアント、又はコドン最適化ポリヌクレオチド配列を含む核酸を含むキットは、１つ又は複数のさらなる試薬をさらに含むことができ、ここで、そのようなさらなる試薬は、Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントを細胞に導入するための緩衝剤；洗浄緩衝剤；コントロール試薬；コントロール発現ベクター又はポリリボヌクレオチド；ＤＮＡからのＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントのイン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）産生のための試薬などから選択することができる。

【0370】

本明細書に記載のキットのいずれかのいくつかの実施形態では、キットは、ｓｇＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、キットは、２つ以上のｓｇＲＮＡを含む。

【0371】

本明細書に記載されるキットのいずれかのいくつかの実施形態において、ｇＲＮＡ（例えば、２つ以上のガイドＲＮＡを含む）はアレイ（ａｒｒａｙ）（例えば、ＲＮＡ分子のアレイ、ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ分子のアレイなど）として提供され得る。そのようなキットは、例えば、Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントを含む上記の遺伝子改変宿主細胞と組み合わせて使用するために有用であり得る。

【0372】

本明細書に記載のキットのいずれかのいくつかの実施形態では、キットは、所望の遺伝子改変をもたらすためのドナーポリヌクレオチドをさらに含む。

【0373】

キットの成分は、別々の容器中にあってもよく、又は単一の容器中に組み合わせてもよい。

【0374】

本明細書に記載されるキットのいずれも、１つ又は複数のさらなる試薬をさらに含むことができ、ここで、そのようなさらなる試薬は、希釈緩衝液；再構成溶液；洗浄緩衝液；コントロール試薬；コントロール発現ベクター又はポリリボヌクレオチド；ＤＮＡからのＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントのイン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）産生のための試薬、などから選択することができる。

【0375】

上述の成分に加えて、キットは、方法を実施するためにキットの成分を使用するための説明書をさらに含むことができる。本方法を実施するための説明書は一般に、適切な記録媒体に記録される。例えば、説明書は、紙又はプラスチックなどの基材上に印刷されてもよい。そのようなものとして、説明書は添付文書としてキット中に、キットの容器又はその成分（例えば、パッケージ又はサブパッケージに関連する）のラベリング中に存在し得る。いくつかの実施形態では、説明書は、好適なコンピュータ可読記憶媒体、例えば、ＣＤ－ＲＯＭ、ディスケット、フラッシュドライブなどに存在する電子記憶データファイルとして存在する。さらに他の実施形態では、実際の説明書がキット中に存在しないが、遠隔源から、例えばインターネットを介して、説明書を得るための手段が提供される。この実施形態の例は、説明書を閲覧することができ、及び／又は説明書をダウンロードすることができるウェブアドレスを含むキットである。説明書と同様に、説明書を得るためのこの手段は、好適な基材上に記録される。

【0376】

開示の方法

【0377】

標的ＤＮＡ及び／又は標的ＤＮＡによってコードされるポリペプチドを改変する方法

【0378】

いくつかの実施形態では、標的ＤＮＡ及び／又は標的ＤＮＡによってコードされるポリペプチドを改変するための方法が本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、本方法は、（ｉ）配列番号：１又はＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントをコードする配列番号：１と少なくとも９０％の配列同一性を有するそのバリアントをコードする核酸、又はその核酸から発現されるＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアント；及び（ｉｉ）ｇＲＮＡ又はｇＲＮＡをコードする核酸を提供することを含み、ここで、ｇＲＮＡは、Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド若しくはそのバリアントを標的ポリヌクレオチド配列に誘導することができ、その結果、Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアント及びｇＲＮＡを含む複合体（「標的化複合体」）が形成され、標的ポリヌクレオチド配列を含む標的ＤＮＡと接触するようになる。

【0379】

いくつかの実施形態において、本方法は、（ｉ）配列番号：２又はＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントをコードする配列番号：２と少なくとも９０％の配列同一性を有するそのバリアントをコードする核酸、又はその核酸から発現されるＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアント；及び（ｉｉ）ｇＲＮＡ又はｇＲＮＡをコードする核酸を提供することを含み、ここで、ｇＲＮＡは、Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントを標的ポリヌクレオチド配列に誘導することができ、その結果、Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアント及びｇＲＮＡを含む複合体（「標的化複合体」）が形成され、標的ポリヌクレオチド配列を含む標的ＤＮＡと接触するようになる。

【0380】

いくつかの実施形態において、本方法は、（ｉ）配列番号：３又はＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントをコードする配列番号：３と少なくとも９０％の配列同一性を有するそのバリアントをコードする核酸、又はその核酸から発現されるＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアント；及び（ｉｉ）ｇＲＮＡ又はｇＲＮＡをコードするその核酸を提供することを含み、ここで、ｇＲＮＡは、Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントを標的ポリヌクレオチド配列に誘導することができ、その結果、Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアント及びｇＲＮＡを含む複合体（「標的化複合体」）が形成され、標的ポリヌクレオチド配列を含む標的ＤＮＡと接触するようになる。

【0381】

いくつかの実施形態では、本方法は、（ｉ）配列番号：４又はＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントをコードする配列番号：４と少なくとも９０％の配列同一性を有するそのバリアントをコードする核酸、又はその核酸から発現されるＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアント；及び（ｉｉ）ｇＲＮＡ又はｇＲＮＡをコードする核酸を提供することを含み、ここで、ｇＲＮＡは、Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントを標的ポリヌクレオチド配列に誘導することができ、その結果、Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアント及びｇＲＮＡを含む複合体（「標的化複合体」）が形成され、標的ポリヌクレオチド配列を含む標的ＤＮＡと接触するようになる。

【0382】

いくつかの実施形態では、本方法は、（ｉ）配列番号：５又はＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントをコードする配列番号：５と少なくとも９０％の配列同一性を有するそのバリアントをコードする核酸、又はその核酸から発現されるＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアント；及び（ｉｉ）ｇＲＮＡ又はｇＲＮＡをコードする核酸を提供することを含み、ここで、ｇＲＮＡは、Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントを標的ポリヌクレオチド配列に誘導することができ、その結果、Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアント及びｇＲＮＡを含む複合体（「標的化複合体」）が形成され、標的ポリヌクレオチド配列を含む標的ＤＮＡと接触するようになる。

【0383】

いくつかの実施形態では、本方法は、（ｉ）配列番号：６又はＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントをコードする配列番号：６と少なくとも９０％の配列同一性を有するそのバリアントをコードする核酸、又はその核酸から発現されるＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアント；及び（ｉｉ）ｇＲＮＡ又はｇＲＮＡをコードする核酸を提供することを含み、ここで、ｇＲＮＡは、Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントを標的ポリヌクレオチド配列に誘導することができ、その結果、Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアント及びｇＲＮＡを含む複合体（「標的化複合体」）が形成され、標的ポリヌクレオチド配列を含む標的ＤＮＡと接触するようになる。

【0384】

いくつかの実施形態では、本方法は、（ｉ）配列番号：７又はＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントをコードする配列番号：７と少なくとも９０％の配列同一性を有するそのバリアントをコードする核酸、又はその核酸から発現されるＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアント；及び（ｉｉ）ｇＲＮＡ又はｇＲＮＡをコードする核酸を提供することを含み、ここで、ｇＲＮＡは、Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントを標的ポリヌクレオチド配列に誘導することができ、その結果、Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアント及びｇＲＮＡを含む複合体（「標的化複合体」）が形成され、標的ポリヌクレオチド配列を含む標的ＤＮＡと接触するようになる。

【0385】

いくつかの実施形態では、本方法は、（ｉ）配列番号：８又はＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントをコードする配列番号：８と少なくとも９０％の配列同一性を有するそのバリアントをコードする核酸、又はその核酸から発現されるＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアント；及び（ｉｉ）ｇＲＮＡ又はｇＲＮＡをコードする核酸を提供することを含み、ここで、ｇＲＮＡは、Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントを標的ポリヌクレオチド配列に誘導することができ、その結果、Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアント及びｇＲＮＡを含む複合体（「標的化複合体」）が形成され、標的ポリヌクレオチド配列を含む標的ＤＮＡと接触するようになる。

【0386】

いくつかの実施形態では、本方法は、（ｉ）配列番号：９又はＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントをコードする配列番号：９と少なくとも９０％の配列同一性を有するそのバリアントをコードする核酸、又はその核酸から発現されるＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアント；及び（ｉｉ）ｇＲＮＡ又はｇＲＮＡをコードする核酸を提供することを含み、ここで、ｇＲＮＡは、Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントを標的ポリヌクレオチド配列に誘導することができ、その結果、Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアント及びｇＲＮＡを含む複合体（「標的化複合体」）が形成され、標的ポリヌクレオチド配列を含む標的ＤＮＡと接触するようになる。

【0387】

いくつかの実施形態では、本方法は、（ｉ）配列番号：１３３又はＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントをコードする配列番号：１３３と少なくとも９０％の配列同一性を有するそのバリアントをコードする核酸、又はその核酸から発現されるＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアント；及び（ｉｉ）ｇＲＮＡ又はｇＲＮＡをコードする核酸を提供することを含み、ここで、ｇＲＮＡは、Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントを標的ポリヌクレオチド配列に誘導することができ、その結果、Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアント及びｇＲＮＡを含む複合体（「標的化複合体」）が形成され、標的ポリヌクレオチド配列を含む標的ＤＮＡと接触するようになる。

【0388】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、細胞又はイン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）環境中の１つ又は複数の位置で標的ＤＮＡを標的化、編集、改変、又は操作する方法であって、（ａ）例えば、Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド若しくはそのバリアントをコードするコドン最適化ポリヌクレオチド配列を含む核酸、又はその核酸から発現されるＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアント；及び（ｂ）ｇＲＮＡ又はｇＲＮＡをコードする核酸を細胞又はイン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）環境に導入することを含み、ここで、ｇＲＮＡは、Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントを標的ＤＮＡ中の標的ポリヌクレオチド配列に誘導することができる。いくつかの実施形態では、本方法は、コドン最適化ポリヌクレオチド配列を含む核酸を細胞又はイン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）環境に導入することを含む。いくつかの実施形態において、本方法は、核酸から発現されるＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントを細胞又はイン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）環境に導入することを含む。いくつかの実施形態において、Ｂ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチドは、配列番号：１～９又は１３３のアミノ酸配列を含む（又はそれからなる）。いくつかの実施形態では、本方法は、ｇＲＮＡを細胞又はイン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）環境に導入することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、ｇＲＮＡをコードする核酸を細胞又はイン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）環境に導入することを含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である。いくつかの実施形態において、本方法は、標的ＤＮＡを標的化する１つ又は複数のさらなるｇＲＮＡ又は１つ又は複数のさらなるｇＲＮＡをコードする核酸を、細胞又はイン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）環境に導入することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、細胞又はイン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）環境にドナー鋳型を導入することをさらに含む。

【0389】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、細胞又はイン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）環境中の１つ又は複数の位置で標的ＤＮＡを標的化、編集、改変、又は操作する方法であって、（ａ）Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントをコードする核酸、又はそのような核酸から発現されるＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド若しくはそのバリアント；及び（ｂ）ｇＲＮＡ又はｇＲＮＡをコードする核酸を細胞又はイン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）環境中に導入することを含み、ここで、ｇＲＮＡは、Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントを標的ＤＮＡ中の標的ポリヌクレオチド配列に誘導することができる。いくつかの態様において、本方法は、核酸から発現されるＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントを細胞又はイン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）環境に導入することを含む。いくつかの実施形態において、Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントは、配列番号：１～９、若しくは１３３のアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、ｇＲＮＡを細胞又はイン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）環境に導入することを含む。いくつかの実施形態において、本方法は、ｇＲＮＡをコードする核酸を細胞又はイン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）環境に導入することを含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である。いくつかの実施形態において、本方法は、標的ＤＮＡを標的化する１つ又は複数のさらなるｇＲＮＡ又は１つ又は複数のさらなるｇＲＮＡをコードする核酸を、細胞又はイン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）環境に導入することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、細胞又はイン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）環境にドナー鋳型を導入することをさらに含む。

【0390】

上記のように、ｇＲＮＡ又はｓｇＲＮＡ及びＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントは、リボ核タンパク質複合体を形成し得る。ガイドＲＮＡは、標的ＤＮＡの配列に相補的なヌクレオチド配列を含むことによって、複合体に標的特異性を提供する。複合体のＢ－ＧＥｎ．１ｍしくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントは、エンドヌクレアーゼ活性を提供する。いくつかの実施形態では、複合体は、標的ＤＮＡを改変し、例えば、ＤＮＡ切断、ＤＮＡメチル化、ＤＮＡ損傷、ＤＮＡ修復などをもたらす。いくつかの実施形態では、複合体は、標的ＤＮＡ（例えば、ヒストン、ＤＮＡ結合タンパク質など）と会合した標的ポリペプチドを改変し、例えば、ヒストンメチル化、ヒストンアセチル化、ヒストンユビキチン化などをもたらす。標的ＤＮＡは例えば、イン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）での裸の（例えば、ＤＮＡ会合タンパク質によって結合されていない）ＤＮＡ、イン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）での細胞中の染色体ＤＮＡ、イン・ビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）での細胞中の染色体ＤＮＡなどであり得る。

【0391】

本明細書に記載されるＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントのヌクレアーゼ活性は、標的ＤＮＡを切断して二本鎖切断を生じ得る。次いで、これらの切断は、２つの方法：非相同末端結合、及び相同組換え修復のうちの１つで、細胞によって修復される。非相同末端結合（ＮＨＥＪ）において、二本鎖切断は、切断末端を互いに直接連結することによって修復される。このプロセスにおいて、数個の塩基対が切断部位に挿入又は欠失され得る。相同組換え修復では、切断された標的ＤＮＡ配列に対して相同性を有するドナーポリヌクレオチドが、切断された標的ＤＮＡ配列の修復のための鋳型として使用され、ドナーポリヌクレオチドから標的ＤＮＡへの遺伝情報の移動をもたらす。そのようなものとして、新たな核酸材料が、その部位に挿入／コピーされ得る。いくつかの実施形態では、標的ＤＮＡは、ドナーポリヌクレオチドと接触される。いくつかの実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、細胞に導入される。ＮＨＥＪ及び／又は相同組換え修復による標的ＤＮＡの改変は、例えば、遺伝子補正、遺伝子置換、遺伝子タグ付け、導入遺伝子挿入、ヌクレオチド欠失、ヌクレオチド挿入、遺伝子破壊、遺伝子突然変異、配列置換などをもたらす。したがって、Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントによるＤＮＡの切断は、標的ＤＮＡ配列を切断し、外因的に提供されたドナーポリヌクレオチドの非存在下で細胞が配列を修復することを可能にすることによって、標的ＤＮＡ配列から核酸材料を欠失させるために（例えば、細胞を感染に感受性にする遺伝子（例えば、ＨＩＶ感染に感受性にするＣＣＲＳ又はＣＸＣＲ４遺伝子）を破壊するため）、ニューロンにおける疾患を引き起こすトリヌクレオチド反復配列を除去するため、研究における疾患モデルとして遺伝子ノックアウト及び変異を作製するためなどに使用され得る。したがって、本方法は、遺伝子をノックアウトするため（転写／翻訳の完全な欠如又は転写／翻訳の変化をもたらす）、又は遺伝物質を標的ＤＮＡ中の選択された遺伝子座にノックインするために使用することができる。

【0392】

それに加えて、又はその代わりに、ガイドＲＮＡ及びＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントが、標的ＤＮＡ配列と少なくとも相同性を有するセグメントを含むドナーポリヌクレオチド配列と共に細胞に同時投与される場合、主題の方法は、標的ＤＮＡ配列に核酸材料を付加するため、例えば、挿入又は置き換えするため（例えば、タンパク質、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなどをコードする核酸を「ノックイン」するために）、タグを付加するために（例えば、６ｘＨｉｓ、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、など）、ヘマグルチニン（ＨＡ）、ＦＬＡＧ、など）、遺伝子に調節配列を付加するために（例えば、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、内部リボソーム侵入配列（ＩＲＥＳ）、２Ａペプチド、開始コドン、終止コドン、スプライスシグナル、局在化シグナル、など）、核酸配列を改変するために（例えば、突然変異を導入する）、などのために使用され得る。したがって、ガイドＲＮＡ及びＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントを含む複合体は、疾患を処置するため、例えば、遺伝子治療などで使用されるように、又は抗ウイルス、抗病原性、若しくは抗癌治療剤として又は農業における遺伝子改変生物の産生、治療、診断、又は研究目的のための細胞によるタンパク質の大規模産生、ｉＰＳ細胞の誘導、生物学的研究、欠失又は置換のための病原体の遺伝子の標的化などのように、「標的化された」方法で、例えば、遺伝子ノックアウト、遺伝子ノックイン、遺伝子編集、遺伝子タグ付け、配列置換などで、部位特異的にＤＮＡを改変することが望ましいいずれかのイン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）又はイン・ビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）適用に有用である。

【0393】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、異種配列（例えば、Ｂ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２融合ポリペプチド）を含むＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントを使用する。いくつかの実施形態において、異種配列は、Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアント（例えば、核への標的化のための核局在化シグナル（ＮＬＳ）；ミトコンドリアへの標的化のためのミトコンドリア局在化シグナル；葉緑体への標的化のための葉緑体局在化シグナル；ＥＲ保持シグナルなど）の細胞内局在化を提供することができる。いくつかの実施形態では、異種配列は、追跡又は精製を容易にするためのタグ（例えば、蛍光タンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＹＦＰ、ＲＦＰ、ＣＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏなど）；ヒスチジンタグ、例えば、６ＸＨｉｓタグ；ヘマグルチニン（ＨＡ）タグ；ＦＬＡＧタグ；Ｍｙｃタグなど）を提供することができる。いくつかの実施形態において、異種配列は、増加又は減少した安定性を提供することができる。

【0394】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、標的細胞における遺伝子発現を遮断するための誘導系として使用されるガイドＲＮＡ及びＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントを使用する。いくつかの実施形態では、適切なガイドＲＮＡ及び／又は適切なＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントをコードする核酸は、標的細胞の染色体に組み込まれ、誘導性プロモーターの制御下にある。ガイドＲＮＡ及び／又はＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントが誘導される場合、標的ＤＮＡは、目的の位置（例えば、別のプラスミド上の標的遺伝子）で切断され（又はその他の方法で改変され）、ガイドＲＮＡ及びＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントの両方が存在する場合、複合体を形成する。したがって、いくつかの実施形態において、標的細胞は、ゲノム中の適切なＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントをコードする核酸配列及び／又はプラスミド上の適切なガイドＲＮＡを含むように操作され（例えば、誘導性プロモーターの制御下で）、いずれかの標的遺伝子の発現（株に導入された別のプラスミドから発現した）が、ガイドＲＮＡ及びＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントの発現を誘導することにより制御され得る実験を可能にする。いくつかの実施形態において、Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントは、二本鎖切断を導入する以外の方法で標的ＤＮＡを改変する酵素活性を有する。標的ＤＮＡを改変するために使用され得る目的の酵素活性（例えば、酵素活性を有する異種ポリペプチドをＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントに融合させ、それによってＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２融合ポリペプチド又はそのバリアントを生成することによって）は、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、ＤＮＡ修復活性、ＤＮＡ損傷活性、脱アミノ活性、ジスムターゼ活性、アルキル化活性、脱プリン活性、酸化活性、ピリミジン二量体形成活性、インテグラーゼ活性、トランスポザーゼ活性、リコンビナーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、フォトリアーゼ活性又はグリコシラーゼ活性を含むが、これらに限定されない。メチル化及び脱メチル化は、当技術分野において、エピジェネティック遺伝子調節の重要な様式として認識されているが、ＤＮＡ損傷の修復は、細胞生存及び環境ストレスに応答した適切なゲノム維持に不可欠である。したがって、本明細書の方法は、標的ＤＮＡのエピジェネティックな改変における使用を見出し、ガイドＲＮＡのスペーサー領域に所望の配列を導入することによって、標的ＤＮＡのいずれかの位置で標的ＤＮＡのエピジェネティックな改変を制御するために使用され得る。本明細書の方法はまた、標的ＤＮＡ内のいずれかの所望の位置におけるＤＮＡの意図的及び制御された損傷における使用を見出す。本明細書の方法はまた、標的ＤＮＡ内のいずれかの所望の位置におけるＤＮＡの配列特異的かつ制御された修復における使用を見出す。ＤＮＡ改変酵素活性を標的ＤＮＡの特定の位置に標的化する方法は、研究及び臨床用途の両方における使用を見出す。

【0395】

いくつかの実施形態では、複数のガイドＲＮＡは、同じ標的ＤＮＡ上又は異なる標的ＤＮＡ上の異なる位置を同時に改変するために使用される。いくつかの実施形態では、２つ以上のガイドＲＮＡは、同じ遺伝子又は転写物又は遺伝子座を標的とする。いくつかの実施形態において、２つ以上のガイドＲＮＡは、異なる非関連遺伝子座を標的とする。いくつかの実施形態では、２つ以上のガイドＲＮＡは、異なるが関連する遺伝子座を標的とする。

【0396】

いくつかの実施形態において、Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントは、タンパク質として直接提供される。１つの非限定的な例として、真菌（例えば、酵母）は、スフェロプラスト形質転換を用いて外因性タンパク質及び／又は核酸で形質転換され得る（Ｋａｗａｉら、Ｂｉｏｅｎｇ Ｂｕｇｓ．２０１０ Ｎｏｖ－Ｄｅｃ；１（６）：３９５－４０３：“ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｆｕｎｇｉ： ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ”；及びＴａｎｋａら、Ｎａｔｕｒｅ．２００４ Ｍａｒ １８；４２８（６９８０）：３２３－８：“Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ ｉｎ ａｎ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｐｒｉｏｎ ｓｔｒａｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ”を参照；それらの両方は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。したがって、Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントは、スフェロプラスト（ガイドＲＮＡをコードする核酸を含むか又は含まずに、ドナーポリヌクレオチドを含むか又は含まずに）に組み込まれ得、スフェロプラストは、酵母細胞に内容物を導入するために使用され得る。Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントは、いずれかの好適な方法によって細胞に導入され得（細胞に提供され得）；そのような方法は当業者に公知である。別の非限定的な例として、Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントは細胞（例えば、ガイドＲＮＡをコードする核酸を含むか又は含まずに、ドナーポリヌクレオチドを含むか又は含まずに）、例えば、ゼブラフィッシュ胚の細胞、受精マウス卵母細胞の前核などに直接注射することができる。

【0397】

転写を調節する方法

【0398】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、宿主細胞中の標的核酸の転写を調節する方法である。この方法は一般に、標的核酸を酵素的に不活性なＢ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド及びガイドＲＮＡと接触させることを含む。これらの方法は、様々な用途において有用であり、また提供される。

【0399】

本開示の転写調節方法は、ＲＮＡｉを伴う方法の欠点のいくつかを克服する。本開示の転写調節方法は、研究用途、創薬（例えば、ハイスループットスクリーニング）、標的バリデーション、工業用途（例えば、作物工学；微生物工学など）、診断用途、治療用途、及び撮像技術を含む、多種多様な用途における使用を見出す。

【0400】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、宿主細胞、例えば、ヒト細胞における標的ＤＮＡの転写を選択的に調節する方法である。本方法は一般に、ａ）宿主細胞に、ｉ）ガイドＲＮＡ、又はガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む核酸、及びｉｉ）Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアント、又はＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を導入するステップであって、ここで、Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントが、低下したエンドデオキシリボヌクレアーゼ活性を示すステップを含む。ガイドＲＮＡ及びＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントは、宿主細胞において複合体を形成し；複合体が宿主細胞における標的ＤＮＡの転写を選択的に調節する。

【0401】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、Ｂ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２タンパク質の改変型を用いる。いくつかの態様において、Ｂ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２タンパク質の改変型は、Ｂ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２タンパク質のヌクレアーゼ活性を低下させるアミノ酸変化（例えば、欠失、挿入、又は置換）を含む。例えば、いくつかの実施形態において、Ｂ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２タンパク質の改変型は、対応する非改変Ｂ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチドのヌクレアーゼ活性の５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、又は１％未満を有する。いくつかの実施形態において、Ｂ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチドの改変型は、実質的なヌクレアーゼ活性を有さない。Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントが、実質的なヌクレアーゼ活性を有さないＢ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチドの改変型である場合、それは、「ｄＢ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２」と称することができる。

【0402】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載される転写調節方法は、宿主細胞における標的核酸の選択的調節（例えば、減少又は増加）を可能にする。例えば、標的核酸の転写の「選択的」減少は、ガイドＲＮＡ／Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントの複合体の非存在下での標的核酸の転写のレベルと比較して、標的核酸の転写を少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は９０％超減少させる。標的核酸の転写の選択的減少は、標的核酸の転写を減少させるが、非標的核酸の転写を実質的に減少させない、例えば、非標的核酸の転写は、ガイドＲＮＡ／Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントの複合体の非存在下での非標的核酸の転写レベルと比較して、たとえ減少したとしても１０％未満減少する。

【0403】

いくつかの実施形態において、Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントは、標的ＤＮＡの転写を調節する活性を有する（例えば、Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２融合ポリペプチド又はそのバリアントの場合など）。いくつかの実施形態において、転写を増加又は減少させる能力を示す異種ポリペプチド（例えば、転写活性化因子又は転写抑制因子ポリペプチド）を含むＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２融合ポリペプチド又はそのバリアントは、ガイドＲＮＡのスペーサーによって誘導される、標的ＤＮＡ中の特定の位置における標的ＤＮＡの転写を増加又は減少させるために使用される。転写調節活性を有するＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２融合ポリペプチド又はそのバリアントを提供するための供給源ポリペプチドの例としては、光誘導性転写調節因子、小分子／薬物応答性転写調節因子、転写因子、転写リプレッサーなどが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、本方法は、標的遺伝子コードＲＮＡ（タンパク質コードｍＲＮＡ）及び／又は標的非コードＲＮＡ（例えば、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｌｏｎｇ ｎｃＲＮＡなど）の転写を制御するために使用される。いくつかの実施形態において、Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントは、ＤＮＡに会合するポリペプチド（例えば、ヒストン）を改変する酵素活性を有する。いくつかの実施形態において、酵素活性は、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、デアセチラーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性（例えば、ユビキチン化活性）、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性、脱ミリストイル化活性、グリコシル化活性（例えば、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼからの）又は脱グリコシル化活性である。本明細書に列挙される酵素活性は、タンパク質への共有結合改変を触媒する。そのような改変は、標的タンパク質の安定性又は活性を変化させることが当技術分野で公知である（例えば、キナーゼ活性によるリン酸化は、標的タンパク質に応じてタンパク質活性を刺激又はサイレンシングすることができる）。タンパク質標的として特に興味深いのは、ヒストンである。ヒストンタンパク質はＤＮＡに結合し、ヌクレオソームとして知られる複合体を形成することが当技術分野で知られている。ヒストンを（例えば、メチル化、アセチル化、ユビキチン化、リン酸化によって）改変して、周囲のＤＮＡにおける構造変化を誘発することができ、したがって、転写因子、ポリメラーゼなどの相互作用因子へのＤＮＡの潜在的に大きな部分のアクセス可能性を制御する。単一のヒストンは、多くの異なる方法及び多くの異なる組み合わせで改変することができる（例えば、ヒストン３のリジン２７のトリメチル化、Ｈ３Ｋ２７は、抑制された転写のＤＮＡ領域と会合し、一方で、ヒストン３のリジン４のトリメチル化、Ｈ３Ｋ４は、活性転写のＤＮＡ領域と会合する）。したがって、ヒストン改変活性を有するＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２融合ポリペプチド又はそのバリアントは、染色体構造の部位特異的制御における使用を見出し、標的ＤＮＡの選択された領域におけるヒストン改変パターンを変更するために使用することができる。このような方法は、研究及び臨床用途の両方における使用を見出す。

【0404】

増加された転写

【0405】

標的ＤＮＡの「選択的」増加転写は、ガイドＲＮＡ／Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントの複合体の非存在下での標的ＤＮＡからの転写のレベルと比較して、標的ＤＮＡからの転写を少なくとも１．１倍（例えば、少なくとも１．２倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．４倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、少なくとも１．８倍、少なくとも１．９倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１２倍、少なくとも１５倍、又は少なくとも２０倍）増加させることができる。標的ＤＮＡの転写の選択的増加は、標的ＤＮＡからの転写を増加させるが、非標的ＤＮＡの転写を実質的に増加させず、例えば、非標的ＤＮＡの転写は、ガイドＲＮＡ／Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントの複合体の非存在下での非標的ＤＮＡの転写のレベルと比較して、あったとしても約５倍未満である（例えば、約４倍未満、約３倍未満、約２倍未満、約１．８倍未満、約１．６倍未満、約１．４倍未満、約１．２倍未満、又は約１．１倍未満）。

【0406】

非限定的な例として、増加された転写は、ｄＢ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２を異種配列に融合することによって達成することができる。好適な融合パートナーには、標的ＤＮＡ又は標的ＤＮＡに会合するポリペプチド（例えば、ヒストン又は他のＤＮＡ結合タンパク質）に直接作用することによって転写を間接的に増加させる活性を提供するポリペプチドが含まれるが、これらに限定されない。好適な融合パートナーとしては、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、デアセチラーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、クロトニル化、脱クロトニル化、プロピオニル化、脱プロピオニル化、ミリストイル化活性、又は脱ミリストイル化活性を提供するポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。

【0407】

さらなる好適な融合パートナーには、標的核酸（例えば、転写活性化因子又はその断片、転写活性化因子を動員するタンパク質又はその断片、小分子／薬物応答性転写調節因子など）の転写の増加を直接提供するポリペプチドが含まれるが、これらに限定されない。

【0408】

原核生物における転写を増加させるためにｄＢ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２融合タンパク質を使用する方法の非限定的な例としては、細菌ワンハイブリッド（Ｂ１Ｈ）又はツーハイブリッド（Ｂ２Ｈ）系の改変が挙げられる。Ｂ１Ｈ系では、ＤＮＡ結合ドメイン（ＢＤ）は、細菌転写活性化ドメイン（ＡＤ、例えば、大腸菌ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡＰａ）のαサブユニット）と融合される。したがって、ｄＢ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２は、ＡＤを含む異種配列に融合され得る。ｄＢ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２融合タンパク質が、プロモーター（ガイドＲＮＡによって標的化される）の上流領域に到達すると、ｄＢ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２融合タンパク質のＡＤ（例えばＲＮＡＰａ）は、ＲＮＡＰホロ酵素を動員し、転写活性化をもたらす。Ｂ２Ｈ系では、ＢＤは、ＡＤに直接融合されず、その代わりに、それらの相互作用はタンパク質－タンパク質相互作用（例えば、ＧＡＬ１１Ｐ－ＧＡＬ４相互作用）によって媒介される。本方法で使用するためのそのような系を改変するために、ｄＢ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２を、タンパク質－タンパク質相互作用を提供する第１のタンパク質配列（例えば、酵母ＧＡＬ１１Ｐ及び／又はＧＡＬ４タンパク質）に融合させることができ、ＲＮＡａを、タンパク質－タンパク質相互作用を完成させる第２のタンパク質配列（例えば、ＧＡＬ１１ＰｉｓがｄＢ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２に融合した場合はＧＡＬ４、ＧＡＬ４がｄＢ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２に融合した場合はＧＡＬ１１Ｐなど）に融合させることができる。ＧＡＬ１１ＰとＧＡＬ４との間の結合親和性は、結合効率及び転写発火速度を増加させる。

【0409】

真核生物における転写を増加させるためにｄＢ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２融合タンパク質を使用する方法の非限定的な例としては、ｄＢ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２の活性化ドメイン（ＡＤ）（例えば、ＧＡＬ４、ヘルペスウイルス活性化タンパク質ＶＰ１６又はＶＰ６４、ヒト核因子ＮＦ－ＫＢ ｐ６５サブユニットなど）への融合が挙げられる。系を誘導性にするために、ｄＢ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２融合タンパク質の発現は、誘導性プロモーター（例えば、Ｔｅｔ－ＯＮ、Ｔｅｔ－ＯＦＦなど）によって制御することができる。ガイドＲＮＡは、既知の転写応答エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）、既知の上流活性化配列（ＵＡＳ）、標的ＤＮＡの発現を制御できることが疑われる未知又は既知の機能の配列などを標的とするように設計することができる。

【0410】

さらなる融合パートナー

【0411】

増加又は減少した転写を達成するための融合パートナーの非限定的な例としては、転写活性化因子及び転写リプレッサードメイン（例えば、Ｋｒｕｅｐｐｅｌ関連ボックス（ＫＲＡＢ又はＳＫＤ）；Ｍａｄ ｍＳＩＮ３相互作用ドメイン（ＳＩＤ）；ＥＲＦリプレッサードメイン（ＥＲＤ）など）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかのそのような場合において、ｄＢ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２融合タンパク質は、ガイドＲＮＡによって標的ＤＮＡ中の特定の位置（例えば、配列）に標的化され、プロモーターへのＲＮＡポリメラーゼ結合の遮断（転写活性化因子機能を選択的に阻害する）及び／又は局所クロマチン状態の改変（例えば、標的ＤＮＡを改変するか、又は標的ＤＮＡに会合するポリペプチドを改変する、融合配列が使用される場合）などの遺伝子座特異的制御を発揮する。いくつかの実施形態において、変化は、一過性（例えば、転写抑制又は活性化）である。いくつかの実施形態において、変化は、遺伝性である（例えば、エピジェネティックな改変が標的ＤＮＡ又は標的ＤＮＡに化合するタンパク質、例えば、ヌクレオソームヒストンに対してなされる場合）。いくつかの実施形態において、異種配列は、ｄＢ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチドのＣ末端に融合され得る。いくつかの実施形態において、異種配列は、ｄＢ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチドのＮ末端に融合され得る。いくつかの実施形態において、異種配列は、ｄＢ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチドの内部部分（例えば、Ｎ末端又はＣ末端以外の部分）に融合され得る。ｄＢ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２融合タンパク質を使用する方法の生物学的効果は、任意の好適な方法（例えば、遺伝子発現アッセイ；クロマチンベースのアッセイ、例えば、クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）、クロマチンイン・ビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）アッセイ（ＣｉＡ）など）によって検出することができる。

【0412】

いくつかの実施形態では、方法は、２つ以上の異なるガイドＲＮＡの使用を含む。例えば、２つの異なるガイドＲＮＡを単一の宿主細胞において使用することができ、ここで、２つの異なるガイドＲＮＡは、同じ標的核酸中の２つの異なる標的配列を標的とする。いくつかの実施形態では、同じ標的核酸中の２つの異なる標的配列を標的とする２つの異なるガイドＲＮＡの使用が、標的核酸の転写の増加された調節（例えば、減少又は増加）を提供する。

【0413】

別の例として、２つの異なるガイドＲＮＡを単一の宿主細胞において使用することができ、ここで、２つの異なるガイドＲＮＡは、２つの異なる標的核酸を標的とする。したがって、例えば、転写調節方法は、第２のガイドＲＮＡ、又は第２のガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を宿主細胞に導入することをさらに含むことができる。

【0414】

いくつかの実施形態において、核酸（例えば、ガイドＲＮＡ、例えば、単一分子ガイドＲＮＡ；ドナーポリヌクレオチド；Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントをコードする核酸など）は、さらなる望ましい特徴（例えば、改変又は調節された安定性；細胞内標的化；追跡、例えば、蛍光標識；タンパク質又はタンパク質複合体の結合部位など）を提供する改変又は配列を含む。非限定的な例としては、５’キャップ（例えば、７－メチルグアニレートキャップ（ｍ ７Ｇ））；３’ポリアデニル化尾部（例えば、３’ポリ（Ａ）尾部）；リボスイッチ配列又はアプタマー配列（例えば、タンパク質及び／又はタンパク質複合体による調節された安定性及び／又は調節された接近性を可能にするための）；ターミネーター配列；ｄｓＲＮＡ二重鎖（例えば、ヘアピン）を形成する配列；ＲＮＡを細胞下位置（例えば、核、ミトコンドリア、葉緑体など）に標的化する改変又は配列；追跡を提供する改変又は配列（例えば、蛍光分子への直接コンジュゲーション、蛍光検出を容易にする部分へのコンジュゲーション、蛍光検出を可能にする配列など）；タンパク質（例えば、転写活性化因子、転写リプレッサー、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡデメチラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼなどを含むＤＮＡに作用するタンパク質）の結合部位を提供する改変又は配列；このようなＲＮＡの構造を変化させ、結果としてＢ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２リボ核タンパク質とするＲＮＡの改変；及びそれらの組み合わせが挙げられる。

【0415】

複数の同時ガイドＲＮＡ

【0416】

いくつかの実施形態において、複数のガイドＲＮＡは、同じ標的ＤＮＡ上又は異なる標的ＤＮＡ上の異なる位置で同時に転写を調節するために、同じ細胞において同時に使用される。いくつかの実施形態では、２つ以上のガイドＲＮＡが、同じ遺伝子又は転写物又は遺伝子座を標的とする。いくつかの実施形態において、２つ以上のガイドＲＮＡは、異なる非関連遺伝子座を標的とする。いくつかの実施形態では、２つ以上のガイドＲＮＡが、異なるが関連する遺伝子座を標的とする。

【0417】

ガイドＲＮＡは、小型で堅牢であるので、それらは、同じ発現ベクター上に同時に存在することができ、所望であれば、同じ転写制御下にあってもよい。いくつかの実施形態では、２つ以上（例えば、３つ以上、４つ以上、５つ以上、１０以上、１５以上、２０以上、２５以上、３０以上、３５以上、４０以上、４５以上、又は５０以上）のガイドＲＮＡが標的細胞において（同じ又は異なるベクターから／同じ又は異なるプロモーターから）同時に発現される。いくつかの実施形態において、複数のガイドＲＮＡは、ターゲター（ｔａｒｇｅｔｅｒ）ＲＮＡの天然に存在するＣＲＩＳＰＲアレイを模倣するアレイにおいてコードされ得る。標的化セグメントは、約３０ヌクレオチド長の配列（約１６～約１００ｎｔであり得る）としてコードされ、ＣＲＩＳＰＲ反復配列によって分離される。アレイは、ＲＮＡをコードするＤＮＡによって、又はＲＮＡとして、細胞に導入され得る。

【0418】

複数のガイドＲＮＡを発現させるために、Ｃｓｙ４エンドリボヌクレアーゼによって媒介される人工ＲＮＡプロセシング系を使用することができる。例えば、複数のガイドＲＮＡを、前駆体転写物（例えば、Ｕ６プロモーターから発現される）上のタンデムアレイに連結し、Ｃｓｙ４特異的ＲＮＡ配列によって分離することができる。共発現されたＣｓｙ４タンパク質は、前駆体転写物を複数のガイドＲＮＡに切断する。ＲＮＡプロセシング系を使用するための利点は第１に、複数のプロモーターを使用する必要がないこと、第２に、全てのガイドＲＮＡが前駆体転写物からプロセシングされるので、それらの濃度は、類似のｄＢ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２結合について正規化されることを含む。

【0419】

Ｃｓｙ４は、細菌である緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）に由来する小エンドリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）タンパク質である。Ｃｓｙ４は、最小１７ｂｐのＲＮＡヘアピンを特異的に認識し、迅速（＜１分）かつ高効率（＞９９．９％）のＲＮＡ切断を示す。ほとんどのＲＮａｓｅとは異なり、切断されたＲＮＡ断片は安定であり、機能的に活性である。Ｃｓｙ４ベースのＲＮＡ切断は、人工ＲＮＡプロセシング系に再利用することができる。この系では、１７ｂｐのＲＮＡヘアピンが、単一のプロモーターからの前駆体転写物として転写される複数のＲＮＡ断片の間に挿入される。Ｃｓｙ４の共発現は、個々のＲＮＡ断片を生成するのに有効である。

【0420】

宿主細胞

【0421】

いくつかの実施形態では、本開示の方法は、有糸分裂細胞又は有糸分裂後細胞における転写調節をイン・ビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）及び／又はエクス・ビボ（ｅｘ ｖｉｖｏ）及び／又はイン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で誘導するために使用され得る。いくつかの実施形態では、本開示の方法は、有糸分裂細胞又は有糸分裂後細胞におけるＤＮＡ切断、ＤＮＡ改変、及び／又は転写調節をイン・ビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）及び／又はエクス・ビボ（ｅｘ ｖｉｖｏ）及び／又はイン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で誘導するために使用され得る（例えば、個体に再導入され得る遺伝的に改変された細胞を産生するために）。

【0422】

ガイドＲＮＡは、標的ＤＮＡにハイブリダイズすることによって特異性を提供するので、有糸分裂細胞及び／又は有糸分裂後細胞は、さまざまな宿主細胞のいずれかであり得、ここで、宿主細胞には、細菌細胞；古細菌細胞；単細胞真核生物；植物細胞；藻類細胞、例えば、ボツリオコッカス・ブラウニ（Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ ｂｒａｕｎｉｉ）、クラミドモナス・ラインハルティ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）、ナンノクロロプシス・ガディタナ（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｇａｄｉｔａｎａ）、クロレラ・ピレノイドサ（Ｃｈｌｏｒｅｌａ ｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａ）、ヤツマタモク（Ｓａｒｇａｓｓｕｍ ｐａｔｅｎｓ）、Ｃ．アガード（Ｃ．Ａｇａｒｄｈ）など；真菌細胞；動物細胞；無脊椎動物由来の細胞（例えば、昆虫、刺胞動物、棘皮動物、線虫など）；真核寄生虫（例えば、マラリア原虫、例えば、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｋｉｐａｒｕｍ）；蠕虫など）；脊椎動物由来の細胞（例えば、魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳動物など）；哺乳動物細胞、例えば、げっ歯類細胞、ヒト細胞、非ヒト霊長類細胞などが含まれるが、これらに限定されない。好適な宿主細胞には、天然に存在する細胞；遺伝子改変された細胞（例えば、実験室で、例えば、「ヒトの手」によって遺伝子改変された細胞）；及び任意の方法でイン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で操作された細胞が含まれる。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、単離される。

【0423】

任意のタイプの細胞（例えば、幹細胞、例えば、胚性幹（ＥＳ）細胞、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、生殖細胞；体細胞、例えば、線維芽細胞、造血細胞、ニューロン、筋肉細胞、骨細胞、肝細胞、膵臓細胞；任意の基、例えば、１細胞期、２細胞期、４細胞期、８細胞期等のイン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）又はイン・ビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）胚性細胞、ゼブラフィッシュの胚；等）が対象であり得る。細胞は確立された細胞系由来であってもよく、又はそれらは初代細胞であってもよく、ここで、「初代細胞」、「初代細胞系」、及び「初代培養物」は、本明細書において互換的に使用され、対象に由来し、培養物の限られた数の継代、例えば、分裂の間、イン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で増殖させた細胞及び細胞培養物を指す。例えば、初代培養物は、０回、１回、２回、４回、５回、１０回、又は１５回継代されている可能性があるが、十分な回数が危機段階を通過していない培養物を含む。初代細胞系は、イン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で１０継代未満維持することができる。標的細胞は、いくつかの実施形態では、単細胞生物であるか、又は培養物中で増殖される。

【0424】

細胞が初代細胞である場合、そのような細胞は、任意の好適な方法によって個体から採取され得る。例えば、白血球は、アフェレーシス、白血球アフェレーシス、密度勾配分離などによって適切に採取され得、一方、皮膚、筋肉、骨髄、脾臓、肝臓、膵臓、肺、腸、胃などの組織からの細胞は、生検によって最も好適に採取される。回収された細胞の分散又は懸濁には、適切な溶液を使用することができる。そのような溶液は一般に、平衡塩溶液、例えば、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ハンクス平衡塩溶液などであり、これらは、低濃度、例えば、５～２５ｍＭ、の許容される緩衝液と併せて、ウシ胎児血清又は他の天然に存在する因子が好適に補充されている。好適な緩衝液としては、ＨＥＰＥＳ、リン酸緩衝液、乳酸緩衝液などが挙げられる。細胞は、直ちに使用されてもよく、又は長期間保存、凍結されていてもよく、解凍して再利用が可能である。そのような場合、細胞は一般に、１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、５０％血清、４０％緩衝培地、又はそのような凍結温度で細胞を保存するために当技術分野で一般に使用される他の溶液中で凍結され、凍結培養細胞を解凍するために当技術分野で一般に知られている方法で解凍される。

【0425】

使用

【0426】

本開示による転写を調節するための方法は、様々な用途での使用を見出し、これもまた提供される。用途には、研究用途、診断用途、工業用途、及び治療用途が含まれる。

【0427】

研究用途には、例えば、標的核酸の転写を減少又は増加させる効果を、例えば、発生、代謝、下流遺伝子の発現などに対して決定することが含まれる。ハイスループットゲノム分析は、ガイドＲＮＡのスペーサーのみを変化させる必要があるが、タンパク質結合セグメント及び転写終結セグメントは（場合によっては）一定に保つことができる転写調節法を用いて実施することができる。ゲノム分析に使用される複数の核酸を含むライブラリーは、ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターを含み、各核酸は、共通のタンパク質結合セグメント、異なるスペーサー、及び共通の転写終結セグメントを含む。チップは、５×１０^４を超える固有のガイドＲＮＡを含むことができる。用途は、大規模表現型決定、遺伝子－機能マッピング、及びメタゲノム分析を含む。

【0428】

本明細書に開示される方法は、代謝工学の分野において用途を見出す。転写レベルは本明細書に開示されるように、適切なガイドＲＮＡを設計することによって効率的かつ予測可能に制御され得るので、代謝経路（例えば、生合成経路）の活性は、目的の代謝経路内の特定の酵素のレベルを制御することによって（例えば、増加又は減少した転写を介して）、正確に制御及び調整され得る。目的の代謝経路には、化学物質（ファインケミカル、燃料、抗生物質、毒素、アゴニスト、アンタゴニストなど）及び／又は薬物生産のために使用されるものが含まれる。

【0429】

目的の生合成経路には、（１）メバロン酸経路（例えば、ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼ経路）（アセチル－ＧｏＡをジメチルアリルピロリン酸（ＤＭＡＰＰ）及びイソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）に変換する）、これらは、テルペノイド／イソプレノイドを含む多種多様な生体分子の生合成に使用される）、（２）非メバロン酸経路（例：「２－Ｃ－メチル－Ｄ－エリスリトール ４－リン酸／１－デオキシ－Ｄ－キシルロース ５－リン酸経路」又は「ＭＥＰ／ＤＯＸＰ経路」又は「ＤＸＰ経路」）（また、ＤＭＡＰＰ及びＩＰＰ、代わりに、メバロン酸経路の代替経路を介してピルビン酸及びグリセルアルデヒド ３－リン酸をＤＭＡＰＰ及びＩＰＰに変換することによる）、（３）ポリケチド合成経路（種々のポリケチド合成酵素を介して様々なポリケチドを生成する。ポリケチドは、化学療法に使用される天然の小分子（例えば、テトラサイクリン、及びマクロライド）を含み、工業的に重要なポリケチドとしては、ラパマイシン（免疫抑制剤）、エリスロマイシン（抗生物質）、ロバスタチン（抗コレステロール薬）、エポチロンＢ（抗癌剤）が挙げられる）、（４）脂肪酸合成経路、（５）ＤＡＨＰ（３－デオキシ－Ｄ－アラビノヘプツロソン酸？－リン酸）合成経路、（６）潜在的バイオ燃料（短鎖アルコール及びアルカン、脂肪酸メチルエステル及び脂肪アルコール、イソプレノイドなど）を生成する経路などが含まれるが、これらに限定されない。

【0430】

ネットワークとカスケード

【0431】

本明細書に開示される方法は、制御の統合ネットワーク（例えば、カスケード又は複数のカスケード）を設計するために使用することができる。例えば、ガイドＲＮＡ及びＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントを使用して、別のＤＮＡターゲティングＲＮＡ又は別のＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントの発現を制御（例えば、調節、例えば、増加、減少）することができる。例えば、第１のガイドＲＮＡは、第１のＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントとは異なる機能（例えば、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、デアセチラーゼ活性など）を有する第２の融合ｄＢ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチドの転写の調節を標的とするように設計され得る。いくつかの実施形態では、第２の融合ｄＢ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチドは、第１のガイドＲＮＡと相互作用しないように選択され得る。いくつかの実施形態では、第２の融合ｄＢ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチドは、第１のガイドＲＮＡと相互作用するように選択され得る。いくつかのそのような場合、２つ（又はそれ以上）のｄＢ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２タンパク質の活性は（例えば、ポリペプチドが反対の活性を有する場合）競合し得るか、又は（例えば、ポリペプチドが類似又は相乗活性を有する場合）相乗し得る。同様に、上記のように、ネットワーク中の複合体（例えば、ガイドＲＮＡ／ｄＢ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド）のいずれも、他のガイドＲＮＡ又はｄＢ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチドを制御するように設計され得る。ガイドＲＮＡ及びＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントは、いずれかの所望のＤＮＡ配列を標的とすることができるので、本明細書に記載の方法を使用して、いずれかの所望の標的の発現を制御及び調節することができる。設計され得る統合ネットワーク（例えば、相互作用のカスケード）は非常に単純から非常に複雑までの範囲であり、限定されない。

【0432】

２つ以上の成分（例えば、ガイドＲＮＡ及びｄＢ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド）がそれぞれ別のガイドＲＮＡ／ｄＢ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド複合体の調節制御下にあるネットワークにおいて、ネットワークの１つの成分の発現レベルは、ネットワークの別の成分の発現レベルに影響を及ぼし得る（例えば、発現を増加又は減少させ得る）。この機構を介して、１つの成分の発現は、同じネットワークにおける異なる成分の発現に影響を及ぼし得、ネットワークは、他の成分の発現を増加させる成分の混合物、並びに他の成分の発現を減少させる成分を含み得る。当業者によって容易に理解されるように、１つの成分の発現レベルが１つ又は複数の異なる成分の発現レベルに影響を及ぼし得る上記の例は、例示目的のためであり、限定するものではない。１つ又は複数の成分が操作可能であるように（例えば、実験制御、例えば、温度制御；薬物制御、例えば、薬物誘導制御；光制御などの下で）改変される場合、追加の複雑な層が、任意選択でネットワークに導入され得る。

【0433】

１つの非限定的な例として、第１のガイドＲＮＡは、標的治療／代謝遺伝子の発現を制御する第２のガイドＲＮＡのプロモーターに結合することができる。そのような場合、第１のガイドＲＮＡの条件的発現は、治療／代謝遺伝子を間接的に活性化する。このタイプのＲＮＡカスケードは例えば、リプレッサーを活性化因子に容易に変換するために有用であり、標的遺伝子の発現のロジック又はダイナミクスを制御するために使用することができる。

【0434】

転写調節方法はまた、創薬及び標的検証のために使用することができる。

【0435】

疾患又は状態を処置する方法

【0436】

本開示のいくつかの態様では、ガイドＲＮＡ及び／又はＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアント及び／又はドナーポリヌクレオチドは、遺伝子治療などの目的のために、例えば、疾患を処置するために、又は抗ウイルス、抗病原性、若しくは抗癌治療剤として、農業における遺伝子改変生物の産生のために、又は生物学的研究のために、イン・ビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）で細胞ＤＮＡを改変するために用いられる。これらのイン・ビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）実施形態において、（ｉ）ガイドＲＮＡ又はｇＲＮＡをコードする核酸；（ｉｉ）Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントをコードするコドン最適化ポリヌクレオチド配列を含む核酸、又はその核酸から発現されるＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアント；及び／又は（ｉｉｉ）ドナーポリヌクレオチドを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｂ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２系の成分は、個体に投与される。投与は、被験体へのペプチド、小分子及び核酸の投与のための当技術分野で周知のいずれかの方法によるものであり得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｂ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２系の成分は、様々な製剤に組み込むことができる。より具体的には、本開示のＣＲＩＳＰＲ／Ｂ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２系の成分が、適切な薬学的に許容される担体又は希釈剤と組み合わせることによって医薬組成物に製剤化することができる。

【0437】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるものは、（ｉ）ガイドＲＮＡ又はｇＲＮＡをコードする核酸；（ｉｉ）Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントをコードするコドン最適化ポリヌクレオチド配列を含む核酸、又はその核酸から発現されるＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアント；及び／又は（ｉｉｉ）薬学的に許容されるビヒクル中に存在するドナーポリヌクレオチドを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｂ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２系の成分を含む医薬調製物又は組成物である。「薬学的に許容されるビヒクル」は、ヒトなどの哺乳動物における使用のために、連邦若しくは州政府の規制当局によって承認された、又は米国薬局方若しくは他の一般的に認識されている薬局方に列挙されたビヒクルであり得る。用語「ビヒクル」は、哺乳動物への投与のために本開示の化合物と製剤化される希釈剤、アジュバント、賦形剤、又は担体を指す。そのような薬学的ビヒクルは、脂質、例えばリポソーム、例えばリポソームデンドリマー；液体、例えば水及び油、例えばピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油などの石油、動物、植物又は合成由来のもの、生理食塩水；アカシアゴム、ゼラチン、デンプンペースト、タルク、ケラチン、コロイダルシリカ、尿素などであり得る。さらに、補助剤、安定化剤、増粘剤、潤滑剤及び着色剤を使用することができる。医薬組成物は、固体、半固体、液体又は気体の形態、例えば、錠剤、カプセル、粉末、顆粒、軟膏、溶液、坐剤、注射剤、吸入剤、ゲル、ミクロスフェア、及びエアロゾルの製剤に製剤化することができる。したがって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｂ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２系の成分の投与は、経口、口腔、直腸、非経口、腹腔内、皮内、経皮、気管内、眼内などの投与を含む様々な方法で達成することができる。活性薬剤は投与後に全身性であってもよく、又は局所投与、壁内投与、又は移植部位で活性用量を保持するように作用するインプラントの使用によって局在化されてもよい。活性薬剤は、即時活性のために製剤化されてもよく、又は持続放出のために製剤化されてもよい。

【0438】

いくつかの状態、特に中枢神経系の状態については、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過する薬剤を製剤化することが必要であり得る。ＢＢＢを介する薬物送達のための１つの戦略は、マンニトール又はロイコトリエンなどの浸透圧手段によるか、又はブラジキニンなどの血管作用物質の使用による生化学的のいずれかによるＢＢＢの破壊を伴う。脳腫瘍に対する特異的薬剤を標的とするためにＢＢＢ開口を使用する可能性もまた、選択肢である。ＢＢＢ破壊剤は、組成物が血管内注射によって投与される場合、本開示の治療組成物と同時投与することができる。ＢＢＢを通過させるための他の戦略は、カベオリン－１媒介性トランスサイトーシス、グルコース及びアミノ酸担体などの担体媒介性輸送体、インスリン又はトランスフェリンの受容体媒介性トランスサイトーシス、並びにａｓｐ－糖タンパク質などの活性排出輸送体を含む、内因性輸送系の使用を伴い得る。活性輸送部分はまた、血管の内皮壁を横切る輸送を容易にするために、本開示において使用するための治療化合物にコンジュゲートされ得る。加えて、又は代替的に、ＢＢＢの背後への治療薬の薬物送達は、局所送達、例えばクモ膜下腔内送達による、例えば、オンマヤ（Ｏｍｍａｙａ）リザーバを通して（例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，２２２，９８２号及び第５３８５５８２号を参照されたい）；ボーラス注射、例えば、注射器による、例えば、硝子体内又は頭蓋内に；持続注入、例えば、カニューレ挿入による、例えば、対流ありで（例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第２００７０２５４８４２号を参照されたい）；又は薬剤が可逆的に固定されたデバイスを移植することによる（例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第２００８００８１０６４号及び第２００９０１９６９０３号を参照されたい）ことができる。

【0439】

一般に、（ｉ）ガイドＲＮＡ又はｇＲＮＡをコードする核酸；（ｉｉ）Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントをコードするコドン最適化ポリヌクレオチド配列を含む核酸、又はその核酸から発現されるＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアント；及び／又は（ｉｉｉ）ドナーポリヌクレオチドを含む、ＣＲＩＳＰＲ／Ｂ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２系の成分の有効量が提供される。エクス・ビボ（ｅｘ ｖｉｖｏ）方法に関して上述したように、イン・ビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）でのＣＲＩＳＰＲ／Ｂ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２系の成分の有効量又は有効用量は、陰性対照、例えば、空のベクター又は無関係なポリペプチドと接触させた細胞と比較して、２つの相同配列間で観察される組換えの量の２倍以上の増加を誘導する量である。組換えの量は、いずれかの好適な方法によって、例えば、上記に記載され、当技術分野で知られているように、測定することができる。投与されるべきＣＲＩＳＰＲ／Ｂ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２系の成分の有効量又は有効用量の計算は、当業者の技術の範囲内であり、当業者には日常的であろう。投与される最終量は、投与経路、及び処置される障害又は状態の性質に依存する。

【0440】

特定の対象に与えられる有効量は、様々な要因に依存し、そのうちのいくつかは、対象ごとに異なる。有能な臨床医は、必要に応じて疾患状態の進行を停止又は逆転させるために対象に投与する治療剤の有効量を決定することができる。ＬＤ５０動物データ、及び薬剤に利用可能な他の情報を利用して、臨床医は、投与経路に応じて、個体のための最大安全用量を決定することができる。例えば、治療用組成物が投与される体液の量が多いことを考慮すると、静脈内投与される用量は、髄腔内投与される用量よりも多くてもよい。同様に、身体から迅速に除去される組成物は、治療濃度を維持するために、より高い用量で、又は反復用量で投与され得る。通常の技術を利用して、有能な臨床医は、日常的な臨床試験の過程で特定の治療薬の投薬量を最適化することができる。

【0441】

薬剤に含めるために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｂ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２系の成分は、好適な商業的供給源から得ることができる。一般的な命題として、用量あたり非経口的に投与されるＣＲＩＳＰＲ／Ｂ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２系の成分の薬学的に有効な総量は、用量応答曲線によって測定することができる範囲内である。

【0442】

ＣＲＩＳＰＲ／Ｂ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２系の成分に基づく治療、例えば、（ｉ）ガイドＲＮＡ又はｇＲＮＡをコードする核酸；（ｉｉ）Ｂ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアントをコードするコドン最適化ポリヌクレオチド配列を含む核酸、又はその核酸から発現されるＢ－ＧＥｎ．１若しくはＢ－ＧＥｎ．２ポリペプチド又はそのバリアント；及び／又は（ｉｉｉ）ドナーポリヌクレオチドの治療的投与に使用される調製物は、無菌でなければならない。無菌性は、無菌濾過膜（例えば、０．２マイクロメートルの膜）を通した濾過によって容易に達成される。治療用組成物は、無菌取出口を有する容器、例えば皮下注射針によって貫通可能な栓を有する静注液バッグ又はバイアルに入れられる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｂ－ＧＥｎ．１又はＢ－ＧＥｎ．２系の成分に基づく治療は、ユニット又は多用量容器、例えば、密封アンプル又はバイアル中に、水溶液として、又は再構成のための凍結乾燥製剤として保存することができる。凍結乾燥製剤の例として、１０ｍｌバイアルを５ｍｌの無菌濾過された化合物の１％（ｗ／ｖ）水溶液で満たし、得られた混合物を凍結乾燥する。輸液は、静菌注射用水を用いて凍結乾燥化合物を再構成することによって調製される。

【0443】

医薬組成物は、所望の製剤に応じて、動物又はヒト投与のための医薬組成物を製剤化するために一般に使用されるビヒクルとして定義され、薬学的に許容される、希釈剤の非毒性担体を含むことができる。希釈剤は、組み合わせの生物学的活性に影響を与えないように選択される。そのような希釈剤の例は、蒸留水、緩衝水、生理食塩水、ＰＢＳ、リンゲル液、デキストロース溶液、及びハンクス溶液である。さらに、医薬組成物又は製剤は、他の担体、アジュバント、又は非毒性、非治療的、非免疫原性安定剤、賦形剤などを含むことができる。組成物はまた、ｐＨ調整剤及び緩衝剤、毒性調整剤、湿潤剤、並びに洗剤などの、生理学的条件に近い追加の物質を含むことができる。

【0444】

組成物はまた、例えば抗酸化剤などの様々な安定化剤のいずれかを含むことができる。医薬組成物がポリペプチドを含む場合、ポリペプチドは、ポリペプチドのイン・ビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）安定性を増強するか、又はそうでなければその薬理学的特性を増強する（例えば、ポリペプチドの半減期を増加させ、その毒性を低下させ、溶解性又は取り込みを増強する）様々な周知の化合物と複合体化することができる。そのような修飾剤又は錯化剤の例としては、硫酸塩、グルコン酸塩、クエン酸塩及びリン酸塩が挙げられる。組成物の核酸又はポリペプチドはまた、それらのイン・ビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）属性を増強する分子と複合体化され得る。そのような分子としては、例えば、炭水化物、ポリアミン、アミノ酸、他のペプチド、イオン（例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、マンガン）、及び脂質が挙げられる。

【0445】

様々な種類の投与に適した製剤に関するさらなるガイダンスは、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．，第２０版（２００３）及びＴｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ：Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ （ＵＳＰ ２４ ＮＦ１９）１９９９年に出版、に見出すことができる。薬物送達のための方法の簡単な概説については、Ｌａｎｇｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７－１５３３（１９９０）を参照されたい。

【0446】

医薬組成物は、予防的及び／又は治療的処置のために投与することができる。活性成分の毒性及び治療有効性は例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に対して致死的な用量）及びＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効な用量）を決定することを含む、細胞培養物及び／又は実験動物における標準的な薬学的手順に従って決定することができる。毒性及び治療効果の用量比は治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比として表すことができる。大きな治療指数を示す治療が一般に好ましい。

【0447】

細胞培養及び／又は動物研究から得られたデータは、ヒトのための用量の範囲を処方する際に使用することができる。活性成分の投与量は一般に、低毒性のＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。投薬量は、用いられる剤形及び利用される投与経路に応じて、この範囲内で変動し得る。医薬組成物を製剤化するために使用される成分は一般に高純度であり、潜在的に有害な夾雑物を実質的に含まない（例えば、少なくとも国家食品（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｏｏｄ）（ＮＦ）グレード、一般に少なくとも分析グレード、より典型的には少なくとも医薬グレード）。さらに、イン・ビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）での使用を意図した組成物は、一般に無菌である。所与の化合物を使用前に合成する必要がある限り、得られる生成物は一般に、合成又は精製プロセス中に存在し得る、いずれかの潜在的に有毒な薬剤、特にいずれかのエンドトキシンを実質的に含まない。非経口投与のための組成物も、無菌であり、実質的に等張であり、ＧＭＰ条件下で製造される。

【0448】

特定の対象に与えられる治療用組成物の有効量は様々な要因に依存し、そのうちのいくつかは、対象ごとに異なる。有能な臨床医は、必要に応じて疾患状態の進行を停止又は逆転させるために対象に投与する治療剤の有効量を決定することができる。ＬＤ５０動物データ、及び薬剤に利用可能な他の情報を利用して、臨床医は、投与経路に応じて、個体のための最大安全用量を決定することができる。例えば、治療用組成物が投与される体液の量が多いことを考慮すると、静脈内投与される用量は、髄腔内投与される用量よりも多くてもよい。同様に、身体から迅速に除去される組成物は、治療濃度を維持するために、より高い用量で、又は反復用量で投与され得る。通常の技術を利用して、有能な臨床医は、日常的な臨床試験の過程で特定の治療薬の投薬量を最適化することができる。

【0449】

対照への処置の投与の数は変動し得る。遺伝子改変細胞を対象に導入することは１回限りの事象であり得るが、特定の状況ではそのような処置が限られた期間の間、改善を誘発し得、継続的な一連の反復処置を必要とし得る。特定の状況では、効果が観察される前に、遺伝子改変細胞の複数回投与が必要とされ得る。正確なプロトコールは、疾患又は状態、疾患の段階、及び治療される個々の対象のパラメーターに依存する。

【0450】

同等物

【0451】

全ての技術的特徴は、そのような特徴の全ての可能な組み合わせにおいて個々に組み合わせることができる。

【0452】

本発明は、その精神又は本質的特性から逸脱することなく、他の特定の形態内で実施されてもよい。したがって、前述の実施形態は、本明細書に記載される本発明を限定するのではなく、全ての点で例示的であると考えられるべきである。

【実施例】

【0453】

以下の非限定的な実施例は、本明細書に記載される本発明の実施形態をさらに例示する。

【0454】

実施例１：

【0455】

新規Ｖ型ヌクレアーゼの実験的特徴付け

【0456】

可能性のあるエフェクター配列を、社内微生物データベースのゲノム解析から同定した。Ｂ－ＧＥｎ．１及びＢ－ＧＥｎ．２のＤＮＡシークエンスを合成し（Ｔｗｉｓｔ）、ＮｄｅＩ及びＸｈｏＩを用いてｐＥＴ２９ベースのカスタマイズされた発現ベクター（ｐＢＬＲ１０７）にクローニングした（配列番号：７は、このベクターにＢ－ＧＥｎ．１の完全なプラスミドシークエンスを表し、その結果得られたプラスミドは、Ｂ－ＧＥｎ．１＿ｆｕｌｌ＿ｐｌａｓｍｉｄ＿ｐＢＬＲ３７３と命名され、配列番号：８は、このベクターにＢ－ＧＥｎ．２の完全なプラスミドシークエンスを表し、その結果得られたプラスミドは、Ｂ－ＧＥｎ．２＿ｆｕｌｌ＿ｐｌａｓｍｉｄ＿ｐＢＬＲと命名される）。ｔｒａｃｒ含有ＤＮＡを得るために、エフェクターＯＲＦを取り囲む遺伝子内領域を連結し、ＲＮＡ分子の発現のためにカスタマイズされたＣｏｌＥ１含有ベクター（任意で順方向及び逆方向のＴ７配向を有し、それぞれｐＢＬＲ１５０及びｐＢＬＲ１５１と呼ばれる）にクローニングした。プラスミドベースのスクリーニングのために、２つの合成スペーサー配列（ＰＡＭライブラリープラスミドと一致する）をＣＲＩＳＰＲリピート領域に隣接させ、ｓｓＤＮＡオリゴマーとして順序付け、その後、Ｔ７プロモーターの制御下でｐＢＬＲ１０７にクローニングした。この系は、図１にも示されている。

【0457】

活性についてスクリーニングするために、ＲＴＳ（商標）１００ Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＹ Ｋｉｔ（Ｂｉｏｒａｂｂｉｔ）を用いて、無細胞発現系においてプラスミドを発現させた。簡単に説明すると、各プラスミド２５０ｎｇを、サーモサイクラー中、３０℃で６時間、２０μｌの総試料容量で製造業者の指示に従って発現させた。２μｌの発現試料と、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、１００ｍＭ ＮａＣｌ及び５０ｍＭ ＭｇＣｌ_２で緩衝化した５０ｎＭ ＰＡＭライブラリープラスミドを用いて、３７℃で４時間、全量１０μｌで、プラスミドＤＮＡのＰＡＭ依存性切断を行った。続いて、ＳＰＲＩビーズ（ＳｐｅｅｄＢｅａｄｓ（商標）磁性カルボキシレート改変粒子；Ｓｉｇｍａ）を用いてプラスミドＤＮＡを試料から精製し、ＥＢ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて１０μｌ中に溶出した。スタガードカット線形化プラスミドの末端修復のために、５μｌの溶出液を、製造業者の指示に従って、ＮＥＢ Ｎｅｘｔ Ｕｌｔｒａ ＩＩ Ｅｎｄ Ｒｅｐａｉｒ／ｄＡ－Ｔａｉｌｉｎｇ Ｍｏｄｕｌｅ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）と共に２０℃で３０分間インキュベートした。続いて、ＳＰＲＩビーズ（ＳｐｅｅｄＢｅａｄｓ（商標）磁性カルボキシレート改変粒子；Ｓｉｇｍａ）を用いてＤＮＡを再び精製し、ＥＢ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて１０μｌ中に溶出した。最後に、Ｋａｒｖｅｌｉｓ及び同僚（ＤＯＩ １０．１１８６／ｓ１３０５９－０１５－８１８－７）によって記載されているように、アダプターライゲーションを、総容量１２μｌの１ｘＢｌｕｎｔ ＴＡ Ｌｉｇａｓｅ Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ（ＮＥＢ）中の１μＭ二本鎖アダプターを使用して行った。切断されたプラスミド配列を得るために、３μｌのアダプターライゲーションサンプルを、１．２５μｌの１０ｕＭバーコード化フォワード及びリバースプライマー、並びに１２．５ｕｌのＱ５ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ２ｘ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＮＥＢ）及び７．５ｕｌの水と混合した。増幅のために、以下の設定を使用した：初期変性（９８℃で３０秒）、増幅のための３０ｘサイクル（９８℃で１０秒、６６℃で３０秒及び７２℃で３０秒）及び最終伸長（７２℃で２分）。プライマーは、５’末端に５個の追加のヌクレオチドを付加することによってバーコードされた。その後、全てのＰＣＲ反応物をプールし、製造業者の指示に従ってＳＰＲＩビーズを１：１の比で使用して精製した。次世代シーケンシングのために、２ｕｇのバーコード化及び精製されたアンプリコンを、ライブラリー調製（Ｐｒｅｐ．）のための入力として使用した。アンプリコンプールは、末端修復され、ｄＡ－尾部化され（ＮＥＢＮｅｘｔ Ｕｌｔｒａ ＩＩ Ｒｅｐａｉｒ／ｄＡ－Ｔａｉｌｉｎｇ Ｍｏｄｕｌｅ、ＮＥＢ）、続いてＩｌｌｕｍｉｎａバーコードライゲーションされた（Ｂｌｕｎｔ／ＴＡ Ｌｉｇａｓｅ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、ＮＥＢ）。正しいアンプリコンサイズをゲル電気泳動（Ｅ－ｇｅｌ ＥＸ ２％、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）によってチェックした。ライブラリーの濃度は、ｄｓＤＮＡ ＨＳ Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いてＱｕｂｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で測定した。５％ＰｈｉＸスパイクインを含む１０ｐＭライブラリーを、ＭｉＳｅｑ ３００ＰＥ ｖ２ケミストリー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用する次世代シークエンシングのための入力として使用した。

【0458】

バイオインフォマティクス分析

【0459】

ＰＡＭ配列を決定するために、アダプター配列由来のモチーフ及び標的部位の上流のプラスミド配列由来のモチーフの両方を含む全てのＮＧＳリードを分析した。最初に、両方のモチーフを含む全ての読み取りについて、２つのモチーフ間の介在配列の長さを決定した。次いで、最も頻繁に生じる介在配列長を有するリードのサブセットを別々に分析した。このリードのサブセットについて、８Ｎ－ＰＡＭライブラリーセグメント上で観察された全てのユニークな配列を、それらのリードカウントと共に決定した。最も頻繁に生じる１００個の配列を使用して、配列モチーフを作製した。結果を用いてテーブル２を作成した。

【0460】

実施例２：

【0461】

哺乳動物細胞におけるヌクレアーゼ活性を検出するためのスクリーニング方法

【0462】

細胞培養

【0463】

ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－３２１６（商標））を、１０％ＦＢＳ及び１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐを含有するＤＭＥＭ中で培養した。細胞をＴ７５フラスコ中で培養し、２～３日毎に分割した。

【0464】

トランスフェクション

【0465】

トランスフェクションの１日前に、細胞を、ポリ－Ｄ－リシン被覆９６ウェルプレート（Ｐｏｌｙ－Ｄ－Ｌｙｓｉｎｅ ＣＥＬＬＣＯＡＴ（登録商標）；Ｇｒｅｉｎｅｒ）に、ウェル当たり１２．０００細胞の密度で播種した。翌日、培地を交換し、ＬｉｐｏＤ２９３（商標）Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ ＤＮＡトランスフェクション試薬（ＳｉｇｎａＧｅｎ）を製造業者の指示に従って用いて、細胞を１４０ｎｇのヌクレアーゼプラスミド及び６０ｎｇのｓｇＲＮＡプラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクション混合物を翌日交換し、標準培地と交換した。トランスフェクションの３日後、細胞を下流ＤＮＡ抽出のために回収した。

【0466】

粗ＤＮＡ抽出及び増幅

【0467】

回収した細胞を１００ｕｌのＰＢＳに再懸濁し、６０ｕｌを新しい９６ウェルプレートに移し、ペレット化した。その後、上清を除去し、２５μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加した０．０５％ＳＤＳを含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．０の６０μｌを各ウェルに添加し、十分に混合した。粗ＤＮＡ試料を３７°Ｃで１時間インキュベートし、８０°Ｃで３０分間加熱し、３．５μｌの粗ＤＮＡを１．２５μｌの１０ｕＭバーコード化フォワード及びリバースプライマー並びに１２．５ｕｌのＱ５ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ２ｘ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＮＥＢ）及び６．５ｕｌの水と混合した。増幅のために、以下の設定を全てのアンプリコンに使用した：初期変性（９８℃で３０秒）、増幅のための３０ｘサイクル（９８℃で１０秒、６６℃で３０秒及び７２℃で３０秒）及び最終伸長（７２℃で２分）。プライマーは、５’末端に５個の追加のヌクレオチドを付加することによってバーコードされた。その後、全てのＰＣＲ反応物をプールし、製造業者の指示に従ってＳＰＲＩビーズを１：１の比で使用して精製した。

【0468】

ライブラリー調製と次世代シーケンシング

【0469】

２ｕｇのバーコード化及び精製されたアンプリコンを、ライブラリー調製のための入力として使用した。アンプリコンプールは、末端修復され、ｄＡ－尾部化され（ＮＥＢＮｅｘｔ Ｕｌｔｒａ ＩＩ Ｒｅｐａｉｒ／ｄＡ－Ｔａｉｌｉｎｇ Ｍｏｄｕｌｅ、ＮＥＢ）、続いてＩｌｌｕｍｉｎａバーコードライゲーションした（Ｂｌｕｎｔ／ＴＡ Ｌｉｇａｓｅ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、ＮＥＢ）。正しいアンプリコンサイズをゲル電気泳動（Ｅ－ｇｅｌ ＥＸ２％、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）によってチェックした。ライブラリーの濃度は、ｄｓＤＮＡ ＨＳ Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いてＱｕｂｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で測定した。５％ＰｈｉＸスパイクインを含む１０ｐＭライブラリーを、ＭｉＳｅｑ ３００ＰＥ ｖ２ケミストリー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用する次世代シークエンシングのための入力として使用した。

【0470】

ＮＧＳ分析

【0471】

生のｆａｓｔｑリードは、カットアダプトバージョン１．１８（ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１４８０６／ｅｊ．１７．１．２００）を使用して、Ｑ３０の最低クオリティスコアで、クオリティトリミングした。フィルタリングされたリードを、ｆａｓｔｑ－ｊｏｉｎバージョン１．３．１（ｄｏｉ：１０．２１７４／１８７５０３６２０１３０７０１０００１）を使用して結合し、及びＮａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．２０２１ Ｊｕｌ ９；１２（１）：４２１９．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１４６７－０２１－２４４５４－５，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ Ｍａｔｅｒｉａｌ，Ｓｅｃｔｉｏｎ ｅｎｔｉｔｌｅｄ：“Ａｍｐｌｉｃｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ＡｍｐＳｅｑ） ｆｏｒ ｏｎ－ ａｎｄ ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ＮＧＳ ａｎａｌｙｓｉｓ”に記載されているカスタム逆多重化スクリプトを使用して逆多重化した。その後、逆多重化されたｆａｓｔｑファイルをＣＲＩＳＰＲｅｓｓｏ ｖ １．０．１３（ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３５８３）で分析した。この分析の結果をテーブル４に示す（一方、平均活性は、３つの個々の実験から得られ、Ｂ－ＧＥｎ．１を有するｐＢＬＲ７０９及びＢ－ＧＥｎ．２を有するｐＢＬＲ７１０）。

【0472】

テーブル４

【0473】

【表8】

【0474】

実施例３：

【0475】

新規ｓｇＲＮＡ設計を用いた哺乳動物細胞におけるヌクレアーゼ活性を検出するためのスクリーニング方法

【0476】

配列番号：４０～４４に従った新規なｓｇＲＮＡ設計及び７つの追加のより少ない又は非活性の設計の活性を試験するために（実施例２による実験は、これらのｓｇＲＮＡ配列を用いて実施した）。２つの異なる標的遺伝子座を用いた：
ＴＣＲＡ＿ガイド１：ＮＣＢＩ参照配列：ＮＣ＿００００１４．９ ＲＥＧＩＯＮ：２１７２４０６０．．２１７２４０８２（逆相補体は、標的特異的ガイド配列を表す）。
ＴＣＲＡ＿ガイド４：ＮＣＢＩ参照配列：ＮＣ＿００００１４．９ ＲＥＧＩＯＮ：２１７２４１５７．．２１７２４１７９（逆相補体は標的特異的ガイド配列を表す）。

【0477】

いずれも２０２２年６月８日のｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／５６８８１５５８４より評価。

【0478】

結果を図２に示す。

【図1】

【図2】

【配列表】

2024526062000001.app

【国際調査報告】