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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-07-17
(54)【発明の名称】抗ユビキチン化抗体および使用方法
(51)【国際特許分類】
C07K 16/18 20060101AFI20240709BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20240709BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20240709BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20240709BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240709BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240709BHJP
C12M 1/34 20060101ALI20240709BHJP
C40B 40/10 20060101ALI20240709BHJP
C07K 17/00 20060101ALI20240709BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20240709BHJP
【ＦＩ】
C07K16/18 ZNA
C12N15/13
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12M1/34 F
C40B40/10
C07K17/00
G01N33/53 D
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023577515
(86)(22)【出願日】2022-06-16
(85)【翻訳文提出日】2024-02-14
(86)【国際出願番号】 US2022072995
(87)【国際公開番号】W WO2022266659
(87)【国際公開日】2022-12-22
(31)【優先権主張番号】63/212,075
(32)【優先日】2021-06-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＵＮＩＸ
(71)【出願人】
【識別番号】509012625
【氏名又は名称】ジェネンテック， インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110002077
【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人
(72)【発明者】
【氏名】カークパトリック， ドナルド エス．
(72)【発明者】
【氏名】ケルバー， ジェームズ ティー．
(72)【発明者】
【氏名】デイヴィス， クリストファー ダブリュ．
【テーマコード（参考）】
4B029
4B065
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B029AA07
4B029BB15
4B029CC01
4B029FA15
4B029GA03
4B029GA08
4B029GB06
4B029GB10
4B065AA01X
4B065AA90X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA25
4B065CA46
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA40
4H045DA76
4H045EA50
4H045FA74
4H045GA26
(57)【要約】
Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体およびそのような抗体をスクリーニングする方法が本明細書に提供される。Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドを検出または濃縮するために、そのような抗体を使用する検出および濃縮方法も本明細書に提供される。
【選択図】図１Ｄ
【選択図】図１Ｄ
【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体であって、ペプチドのＮ末端のアミノ酸配列ＧＧＸに結合し、分岐ジグリシン（Ｋ－ε－ＧＧ）を含むアミノ酸配列に結合しない抗体。
【請求項2】
ＧＧＡ、ＧＧＥ、ＧＧＦ、ＧＧＧ、ＧＧＨ、ＧＧＩ、ＧＧＬ、ＧＧＭ、ＧＧＮ、ＧＧＱ、ＧＧＳ、ＧＧＴ、ＧＧＶおよびＧＧＷからなる群から選択されるＮ末端配列を含むペプチドに結合する、請求項１に記載の抗体。
【請求項3】
ＧＧＡのＮ末端配列を含むペプチド、ＧＧＥのＮ末端配列を含むペプチド、ＧＧＦのＮ末端配列を含むペプチド、ＧＧＧのＮ末端配列を含むペプチド、ＧＧＨのＮ末端配列を含むペプチド、ＧＧＩのＮ末端配列を含むペプチド、ＧＧＬのＮ末端配列を含むペプチド、ＧＧＭのＮ末端配列を含むペプチド、ＧＧＮのＮ末端配列を含むペプチド、ＧＧＱのＮ末端配列を含むペプチド、ＧＧＳのＮ末端配列を含むペプチド、ＧＧＴのＮ末端配列を含むペプチド、ＧＧＶのＮ末端配列を含むペプチド、およびＧＧＷのＮ末端配列を含むペプチドに結合する、請求項１または請求項２に記載の抗体。
【請求項4】
ウサギ抗体、齧歯類抗体またはヤギ抗体である、請求項１から３のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項5】
完全長抗体またはＦａｂ断片である、請求項１から４のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項6】
検出可能な標識にコンジュゲートしている、請求項１から５のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項7】
標識が、ビオチン、ジゴキシゲニンおよびフルオレセインからなる群から選択される、請求項６に記載の抗体。
【請求項8】
固体支持体上に固定化されている、請求項１から７のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項9】
ビーズ上に固定化されている、請求項８に記載の抗体。
【請求項10】
Ｋａｂａｔに従ってナンバリングして、一方の側の３５位にＡｓｎ、３７位にＶａｌ、９３位にＴｈｒ、１０１位にＡｓｎおよび１０３位にＴｒｐを含む可変重鎖（ＶＨ）と、３４位にＡｌａ、３６位にＴｙｒおよび４９位にＴｙｒを含む可変軽鎖（ＶＬ）とを含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項11】
抗体が、可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）を含み、抗体が、アミノ酸配列ＸＸＸＭＮ（配列番号３５）を含むＣＤＲＨ１と、アミノ酸配列ＸＸＸＸＸＧＸＸＹＹＡＴＷＡ（配列番号３６）を含むＣＤＲＨ２と、アミノ酸配列ＤＤＸＸＸＸＮＸ（配列番号３７）を含むＣＤＲＨ３とを含み、抗体が、アミノ酸配列ＱＳＸＸＳＶＹＸＸＮＸＬＸ（配列番号３８）を含むＣＤＲＬ１と、アミノ酸配列ＸＡＳＴＬＸＳ（配列番号３９）を含むＣＤＲＬ２と、アミノ酸配列ＬＧＸＸＤＣＸＳＸＤＣＸＸ（配列番号４０）を含むＣＤＲＬ３とを含み、Ｘが任意のアミノ酸である、請求項１から９のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項12】
ＶＨが、配列番号３３に記載のアミノ酸を含み、ＶＬが、配列番号３４に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載の抗体。
【請求項13】
抗体が、可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）を含み、抗体が、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むＶＨのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３と、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むＶＬのＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３とを含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項14】
配列番号３に記載のＣＤＲＨ１アミノ酸配列と、配列番号４に記載のＣＤＲＨ２アミノ酸配列と、配列番号５に記載のＣＤＲＨ３アミノ酸配列と、配列番号６に記載のＣＤＲＬ１アミノ酸配列と、配列番号７に記載のＣＤＲＬ２アミノ酸配列と、配列番号８に記載のＣＤＲＬ３アミノ酸配列とを含む、請求項１３に記載の抗体。
【請求項15】
ＶＨが、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ＶＬが、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載の抗体。
【請求項16】
抗体が、重鎖および軽鎖を含み、重鎖が、配列番号５２に記載のアミノ酸配列を含み、軽鎖が、配列番号５３に記載のアミノ酸を含む、請求項１３から１５のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項17】
抗体が、可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）を含み、抗体が、配列番号９に記載のアミノ酸配列を含むＶＨのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３と、配列番号１０に記載のアミノ酸配列を含むＶＬのＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３とを含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項18】
配列番号１１に記載のＣＤＲＨ１アミノ酸配列と、配列番号１２に記載のＣＤＲＨ２アミノ酸配列と、配列番号１３に記載のＣＤＲＨ３アミノ酸配列と、配列番号１４に記載のＣＤＲＬ１アミノ酸配列と、配列番号１５に記載のＣＤＲＬ２アミノ酸配列と、配列番号１６に記載のＣＤＲＬ３アミノ酸配列とを含む、請求項１７に記載の抗体。
【請求項19】
ＶＨが、配列番号９に記載のアミノ酸配列を含み、ＶＬが、配列番号１０に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１８に記載の抗体。
【請求項20】
抗体が、重鎖および軽鎖を含み、重鎖が、配列番号５４に記載のアミノ酸配列を含み、軽鎖が、配列番号５５に記載のアミノ酸を含む、請求項１７から１９のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項21】
抗体が、可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）を含み、抗体が、配列番号１７に記載のアミノ酸配列を含むＶＨのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３と、配列番号１８に記載のアミノ酸配列を含むＶＬのＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３とを含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項22】
配列番号１９に記載のＣＤＲＨ１アミノ酸配列と、配列番号２０に記載のＣＤＲＨ２アミノ酸配列と、配列番号２１に記載のＣＤＲＨ３アミノ酸配列と、配列番号２２に記載のＣＤＲＬ１アミノ酸配列と、配列番号２３に記載のＣＤＲＬ２アミノ酸配列と、配列番号２４に記載のＣＤＲＬ３アミノ酸配列とを含む、請求項２１に記載の抗体。
【請求項23】
ＶＨが、配列番号１７に記載のアミノ酸を含み、ＶＬが、配列番号１８に記載のアミノ酸を含む、請求項２２に記載の抗体。
【請求項24】
抗体が、重鎖および軽鎖を含み、重鎖が、配列番号５６に記載のアミノ酸配列を含み、軽鎖が、配列番号５７に記載のアミノ酸を含む、請求項２１から２３のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項25】
抗体が、可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）を含み、抗体が、配列番号２５に記載のアミノ酸配列を含むＶＨのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３と、配列番号２６に記載のアミノ酸配列を含むＶＬのＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３とを含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項26】
配列番号２７に記載のＣＤＲＨ１アミノ酸配列と、配列番号２８に記載のＣＤＲＨ２アミノ酸配列と、配列番号２９に記載のＣＤＲＨ３アミノ酸配列と、配列番号３０に記載のＣＤＲＬ１アミノ酸配列と、配列番号３１に記載のＣＤＲＬ２アミノ酸配列と、配列番号３２に記載のＣＤＲＬ３アミノ酸配列とを含む、請求項２５に記載の抗体。
【請求項27】
ＶＨが、配列番号２５に記載のアミノ酸配列を含み、ＶＬが、配列番号２６に記載のアミノ酸配列を含む、請求項２６に記載の抗体。
【請求項28】
抗体が、重鎖および軽鎖を含み、重鎖が、配列番号５８に記載のアミノ酸配列を含み、軽鎖が、配列番号５９に記載のアミノ酸を含む、請求項２５から２７のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項29】
請求項１から２８のいずれか一項に記載の抗体をコードする核酸。
【請求項30】
請求項２９に記載の核酸を含む宿主細胞。
【請求項31】
Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体をスクリーニングする方法であって、抗体が、ペプチドのＮ末端のアミノ酸配列ＧＧＸに結合し、抗体が、分岐ジグリシン（Ｋ－ε－ＧＧ）を含むアミノ酸配列に結合せず、前記方法が、ｉ）抗体ライブラリーを提供すること、
ｉｉ）Ｎ末端にアミノ酸配列ＧＧＸ（Ｘは任意のアミノ酸である）を含むペプチドに結合する抗体を正に選択すること、および
ｉｉｉ）アミノ酸配列Ｋ－ε－ＧＧを含むペプチドに結合する抗体を負に選択することを含み、
それによって、Ｎ末端にアミノ酸ＧＧＸを含むペプチドに特異的に結合し、アミノ酸配列Ｋ－ε－ＧＧに結合しない抗体を産生することを含む、方法。
【請求項32】
工程ｉｉ）では、Ｎ末端にアミノ酸配列ＧＧＭを含むペプチドに結合する抗体が正に選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項33】
アミノ酸配列Ｋ－ε－ＧＧを含むペプチドに結合する抗体を負に選択することが、工程ｉｉ）と同時に行われる、請求項３１または３２に記載の方法。
【請求項34】
工程ｉｉ）の前または後に、アミノ酸配列Ｋ－ε－ＧＧを含むペプチドに結合する抗体を負に選択する、、請求項３１または３２に記載の方法。
【請求項35】
ライブラリーが、ファージライブラリーまたは酵母ライブラリーである、請求項３１から３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項36】
ライブラリーが、Ｎ末端にアミノ酸配列ＧＧＭを含むペプチドを含むペプチドライブラリーを用いて哺乳動物を免疫化することによって生成される、請求項３１から３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項37】
哺乳動物が、ウサギまたはマウスである、請求項３６に記載の方法。
【請求項38】
工程ｉｉ）～ｉｉｉ）が、２回以上繰り返される、請求項３１から３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項39】
請求項３１から３８のいずれか一項に記載の方法によって産生される抗体。
【請求項40】
ペプチドの混合物を含む試料中のＮ末端ユビキチン化タンパク質のペプチドを濃縮する方法であって、ｉ）試料を、Ｎ末端ユビキチン化タンパク質のペプチドに結合する抗体と接触させることと、
ｉｉ）試料から抗体結合ペプチドを選択することとを含み、抗体が、Ｎ末端のアミノ酸配列ＧＧＸに結合し、抗体が、分岐ジグリシン（Ｋ－ε－ＧＧ）を含むアミノ酸配列に結合しない、方法。
【請求項41】
試料が細胞溶解物である、請求項４０に記載の方法。
【請求項42】
細胞内のデユビキチナーゼを欠失させることと、細胞を溶解して細胞溶解物を生成することとをさらに含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項43】
細胞内でユビキチンリガーゼを過剰発現させることと、細胞を溶解して細胞溶解物を生成することとをさらに含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項44】
細胞溶解物が、ペプチドを生成するために、トリプシンとインキュベートされる、請求項４１から４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項45】
細胞溶解物が、ペプチドを生成するために、細菌プロテアーゼまたはウイルスプロテアーゼとインキュベートされる、請求項４１から４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項46】
溶解物生成の前に、かつトリプシンとのインキュベーションの前または細菌プロテアーゼもしくはウイルスプロテアーゼとのインキュベーションの前に、プロテアソーム阻害剤または脱ユビキチン化阻害剤によって細胞を処理することをさらに含む、請求項４２から４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項47】
選択された抗体結合ペプチドを検出することをさらに含む、請求項４０から４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項48】
抗体結合ペプチドが、質量分析によって検出される、請求項４７に記載の方法。
【請求項49】
抗体結合ペプチドが、タンパク質配列決定によって検出される、請求項４７に記載の方法。
【請求項50】
抗体結合ペプチドが、Ｎ末端ユビキチン化タンパク質のペプチドに結合する抗体に結合する二次抗体を使用して検出される、請求項４７に記載の方法。
【請求項51】
請求項４０から５０のいずれか一項に記載の方法によって産生されたＮ末端ユビキチン化タンパク質のペプチドのライブラリー。
【請求項52】
ペプチドの混合物を含む試料中のＮ末端ユビキチン化タンパク質のペプチドを検出する方法であって、ｉ）試料を酵素とインキュベートして、ペプチドを生成すること、
ｉｉ）ペプチドを、Ｎ末端ユビキチン化タンパク質のペプチドに結合する抗体と接触させること、および
ｉｉｉ）ペプチドを検出することを含み、抗体が、Ｎ末端のアミノ酸配列ＧＧＸに結合し、抗体が、分岐ジグリシン（Ｋ－ε－ＧＧ）を含むアミノ酸配列に結合しない、方法。
【請求項53】
ペプチドが、Ｎ末端ユビキチン化タンパク質のペプチドに結合する抗体に結合する二次抗体を使用して検出される、請求項５２に記載の方法。
【請求項54】
試料が細胞溶解物である、請求項５２または５３に記載の方法。
【請求項55】
細胞内のデユビキチナーゼを欠失させることと、細胞を溶解して細胞溶解物を生成することとをさらに含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項56】
細胞内でユビキチンリガーゼを過剰発現させることと、細胞を溶解して細胞溶解物を生成することとをさらに含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項57】
細胞溶解物が、ペプチドを生成するために、細菌プロテアーゼまたはウイルスプロテアーゼとインキュベートされる、請求項５４から５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項58】
溶解物生成の前に、かつ細菌プロテアーゼまたはウイルスプロテアーゼとのインキュベーションの前に、プロテアソーム阻害剤または脱ユビキチン化阻害剤によって細胞を処理することをさらに含む、請求項５５から５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項59】
Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体と、使用説明書とを含む、試料中のＮ末端ユビキチン化タンパク質のペプチドを検出するためのキットであって、抗体が、Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合し、抗体が、Ｎ末端のアミノ酸配列ＧＧＸに結合し、抗体が、分岐ジグリシン（Ｋ－ε－ＧＧ）を含むアミノ酸配列に結合しない、キット。
【請求項60】
抗体が、検出可能な標識にコンジュゲートしている、請求項５９に記載のキット。
【請求項61】
検出可能な標識が、ビオチン、ジゴキシゲニンおよびフルオレセインからなる群から選択される、請求項６０に記載のキット。
【請求項62】
抗体が、固体支持体上に固定化されている、請求項５９から６１のいずれか一項に記載のキット。
【請求項63】
抗体が、ビーズ上に固定化されている、請求項６２に記載のキット。
【請求項64】
プロテアーゼをさらに含む、請求項５９から６３のいずれか一項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年６月１７日に出願された米国仮特許出願第６３／２１２，０７５号に対する優先権の利益を主張するものであり、上記仮特許出願の内容全体は、参照により本明細書に援用される。
本出願は、２０２１年６月１７日に出願された米国仮特許出願第６３／２１２，０７５号に対する優先権の利益を主張するものであり、上記仮特許出願の内容全体は、参照により本明細書に援用される。
【0002】
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの配列表の提出
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの以下の提出物の内容は、参照によりその全体が本明細書に援用される：コンピュータ可読形態（ＣＲＦ）の配列表（ファイル名：１４６３９２０５２３４０ＳＥＱＬＩＳＴ．ＴＸＴ、記録日：２０２２年５月２６日、サイズ：４２，５８４バイト）。
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの以下の提出物の内容は、参照によりその全体が本明細書に援用される：コンピュータ可読形態（ＣＲＦ）の配列表（ファイル名：１４６３９２０５２３４０ＳＥＱＬＩＳＴ．ＴＸＴ、記録日：２０２２年５月２６日、サイズ：４２，５８４バイト）。
【0003】
本発明は、Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体およびその使用方法に関する。
【背景技術】
【0004】
タンパク質ユビキチン化は、タンパク質ホメオスタシス、ＤＮＡ損傷応答、自然免疫および適応免疫、細胞周期ならびに炎症シグナル伝達を含む多様な細胞機能を調節する複雑な翻訳後修飾である（Ｋｏｍａｎｄｅｒ，Ｄ．＆Ｒａｐｅ，Ｍ．Ａｎｎｕｌ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ８１，２０３－２２９（２０１２）；Ｙａｕ，Ｒ．＆Ｒａｐｅ，Ｍ．Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １８，５７９－５８６（２０１６）；Ｓｗａｔｅｋ，Ｋ．Ｎ．＆Ｋｏｍａｎｄｅｒ，Ｄ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ ２６，３９９－４２２（２０１６）；Ｄｉｔｔｍａｒ，Ｇ．＆Ｗｉｎｋｌｈｏｆｅｒ，Ｋ．Ｆ．Ｆｒｏｎｔ Ｃｈｅｍ ７，９１５（２０２０））。タンパク質基質へのユビキチン（Ｕｂ）の共有結合は、３つの酵素、すなわち、Ｅ１ Ｕｂ活性化酵素、Ｅ２ Ｕｂ結合酵素（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ）およびＥ３ Ｕｂリガーゼの協調活性によって起こる（Ｄｅｓｈａｉｅｓ，Ｒ．Ｊ．＆Ｊｏａｚｅｉｒｏ，Ｃ．Ａ．Ｐ．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ７８，３９９－４３４（２００９）；Ｓｃｈｕｌｍａｎ，Ｂ．Ａ．＆Ｈａｒｐｅｒ，Ｊ．Ｗ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ １０，３１９－３３１（２００９）；Ｙｅ，Ｙ．＆Ｒａｐｅ，Ｍ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ １０，７５５－７６４（２００９））。Ｕｂ自体は、７つのリジン残基（Ｋ６、Ｋ１１、Ｋ２７、Ｋ２９、Ｋ３３、Ｋ４８およびＫ６３）とＮ末端とを有し、これらはいずれもコンジュゲーションに適している（Ｋｏｍａｎｄｅｒ，Ｄ．＆Ｒａｐｅ，Ｍ．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ８１，２０３－２２９（２０１２））。Ｋ４８およびＫ６３結合ポリユビキチン鎖は最もよく試験されており、従来の見解は、Ｋ４８結合Ｕｂ鎖はプロテアソーム分解のためにタンパク質をマークするが、Ｋ６３結合Ｕｂ鎖はタンパク質スカフォールディングの役割を有するというものである（Ｓｗａｔｅｋ，Ｋ．Ｎ．＆Ｋｏｍａｎｄｅｒ，Ｄ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ ２６，３９９－４２２（２０１６）；Ｈｅｒｓｈｋｏ，Ａ．＆Ｃｉｅｃｈａｎｏｖｅｒ，Ａ．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ６７，４２５－４７９（１９９８）；Ｃｈｅｎ，Ｚ．Ｊ．＆Ｓｕｎ，Ｌ．Ｊ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ３３，２７５－２８６（２００９））。さらに、試験では、混合結合と分岐Ｕｂ鎖とが存在し、同型（ｈｏｍｅｏｔｙｐｉｃ）Ｋ４８またはＫ－６３結合Ｕｂ鎖よりも強力な機能的シグナルとして機能し得ることが示されている（Ｋｉｒｋｐａｔｒｉｃｋ，Ｄ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ８，７００－７１０（２００６）；Ｅｍｍｅｒｉｃｈ，Ｃ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ １１０，１５２４７－１５２５２（２０１３）；Ｍｅｙｅｒ，Ｈ．Ｊ．＆Ｒａｐｅ，Ｍ．Ｃｅｌｌ １５７，９１０－９２１（２０１４））。リジン残基のε－アミノ基へのＵｂのコンジュゲーションは、ユビキチン化の最も一般的な形態である。このタイプのコンジュゲーションは、ＵｂペプチドのＣ末端グリシン残基（「ＧＧ」）がリジンのε－アミノ基（「Ｋ－ε」）に結合するＫ－ε－ＧＧモチーフを形成する。Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、および基質Ｎ末端のα－アミノ基などの他のアクセプター残基が同定されており、非カノニカルなユビキチン化標的であると考えられている（Ｃａｄｗｅｌｌ，Ｋ．＆Ｃｏｓｃｏｙ，Ｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０９，１２７－１３０（２００５）；Ｗａｎｇ，Ｘ．ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １７７，６１３－６２４（２００７）；Ｃｉｅｃｈａｎｏｖｅｒ，Ａ．＆Ｂｅｎ－Ｓａａｄｏｎ，Ｒ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １４，１０３－１０６（２００４））。これらの非カノニカルなユビキチン化の生物学的重要性は十分に理解されていない。
【0005】
Ｎ末端Ｕｂは、その最初の発見時に、タンパク質分解シグナルとして機能すると考えられた（Ｂｒｅｉｔｓｃｈｏｐｆ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｍｂｏ Ｊ １７，５９６４－５９７３（１９９８）；Ｂｌｏｏｍ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １１５，７１－８２（２００３）；Ｃｏｕｌｏｍｂｅ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２４，６１４０－６１５０（２００４））。これらの試験では、リジン残基を欠く操作されたタンパク質、または天然に存在する、リジンを有しないタンパク質が、依然としてプロテアソーム分解を受けることが示され、Ｎ末端Ｕｂが分解シグナルとして間接的に暗示された。その後の研究では、Ｎ末端ユビキチン化タンパク質はプロテアソーム阻害時に顕著に蓄積しないことが実証され、Ｎ末端ユビキチン化が、プロテアソーム媒介分解を促進すること、例えば、新生ポリペプチドのフォールディングを支援すること（Ｆｉｎｌｅｙ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３８，３９４－４０１（１９８９））を超える追加の役割を有し得ることが示唆された（Ａｋｉｍｏｖ，Ｖ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２５，６３１－６４０（２０１８））。ＬＵＢＡＣによって形成された直鎖ポリユビキチン鎖を除いて、ＵＢＥ２Ｗは、ＵｂのＣ末端Ｇｌｙ－７６と基質タンパク質Ｎ末端のα－アミノ基との間にペプチド結合を形成すると報告されている唯一のＥ２ Ｕｂ結合酵素またはＥ３リガーゼ酵素である（Ｓｃａｇｌｉｏｎｅ，Ｋ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８８，１８７８４－１８７８８（２０１３）；Ｋｉｒｉｓａｋｏ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｅｍｂｏ Ｊ ２５，４８７７－４８８７（２００６））。現在のデータでは、ユビキチンリガーゼと協調して、ＵＢＥ２ＷがそれらのＮ末端でタンパク質基質を厳密にモノユビキチン化することが示唆されている。これらのプライミング修飾は、他のＥ２／Ｅ３複合体によってＮ末端結合ポリユビキチン鎖に同化され得る（Ｔａｔｈａｍ，Ｍ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ４５３，１３７－１４５（２０１３））。興味深いことに、ＵＢＥ２Ｗは、本質的に無秩序なＮ末端を有する基質の認識にとって重要な部分的に無秩序なＣ末端を含有する（Ｖｉｔｔａｌ，Ｖ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ １１，８３－８９（２０１５））。Ｎ末端ユビキチン化、ならびにＵＢＥ２Ｗの構造的特性および生化学的特性の理解が高まっているにもかかわらず、同定されているのはＮ末端ユビキチン化ＵＢＥ２Ｗ基質の小さなセットのみである。したがって、この修飾の生理的結果をさらに解明するために、Ｎ末端ユビキチン化タンパク質を同定するための新たな戦略が必要とされている。
【0006】
特に、質量分析と適合するＮ末端ユビキチン化タンパク質を全体的にプロファイリングする戦略がとりわけ有益であろう。質量分析（ＭＳ）は、アミノ酸残基レベルでの基質特異的ユビキチン化を同定および解明するための強力な分析ツールである（Ｐｅｎｇ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２１，９２１－９２６（２００３）；Ｋｉｍ，Ｗ．ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ４４，３２５－３４０（２０１１）；Ｗａｇｎｅｒ，Ｓ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ １０，Ｍ１１１．０１３２８４（２０１１））。１つの手法が、酵素的切断時に生成されたＵｂ Ｃ末端レムナントを有するペプチドを特異的に濃縮するツールの生成であった。例えば、リジンの側鎖に結合したイソペプチド結合ジグリシン（Ｋ－ε－ＧＧ）からなるトリプシン性Ｕｂレムナントを認識するモノクローナル抗体の開発により、ユビキチン化部位の全体的なプロファイリングが可能になった（Ｋｉｍ，Ｗ．ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ４４，３２５－３４０（２０１１）；Ｘｕ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２８，８６８－８７３（２０１０）；Ｂｕｓｔｏｓ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ １１，１５２９－１５４０（２０１２））。さらに近年では、Ｕｂの伸長したＬｙｓＣ生成レムナントを認識し、Ｕｂにコンジュゲートされた基質と、ＮＥＤＤ８およびＩＳＧ１５などの他のＵｂ様タンパク質とを区別するためのモノクローナル抗体が生成された（Ａｋｉｍｏｖ，Ｖ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２５，６３１－６４０（２０１８））。他の親和性ベースの濃縮、または遺伝子タグ付け系も開発されている（Ａｋｉｍｏｖ，Ｖ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２５，６３１－６４０（２０１８）；Ｐｅｎｇ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２１，９２１－９２６（２００３）；Ａｋｉｍｏｖ，Ｖ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ １７，２９６－３０４（２０１７）；Ｋｌｉｚａ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ １４，５０４－５１２（２０１７）；Ｄａｎｉｅｌｓｅｎ，Ｊ．Ｍ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ １０，Ｍ１１０．００３５９０（２０１１）；Ｈｊｅｒｐｅ，Ｒ．ｅｔ ａｌ，．Ｅｍｂｏ Ｒｅｐ １０，１２５０－１２５８（２００９）；Ａｋｉｍｏｖ，Ｖ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｂｉｏｓｙｓｔ ７，３２２３－３２３３（２０１１））。特に、これらの戦略のいくつかは、カノニカルなＫ－ε－ＧＧペプチドだけでなく、Ｎ末端ユビキチン化に対応するペプチドも検出する（Ａｋｉｍｏｖ，Ｖ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２５，６３１－６４０（２０１８）；Ａｋｉｍｏｖ，Ｖ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ １７，２９６－３０４（２０１７））。以前の定量的プロテオミクスデータは、典型的なタンパク質内のリジンの頻度、およびタンパク質の約８０～９０％がそれらのＮ末端でアセチル化され、Ｎ末端ユビキチン化を妨げることができるという事実を考慮すると、Ｎ末端Ｕｂ結合の相対存在量が基礎条件下では極めて低いことを示唆している（Ａｋｉｍｏｖ，Ｖ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２５，６３１－６４０（２０１８）；Ａｒｎｅｓｅｎ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ １０６，８１５７－８１６２（２００９）；Ａｋｓｎｅｓ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ １０，１３６２－１３７４（２０１５））。したがって、当技術分野では、Ｎ末端ユビキチン化タンパク質に固有のペプチドを特異的に検出し濃縮することができる抗体が必要とされている。
【発明の概要】
【0007】
一態様では、本発明は、Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体であって、ペプチドのＮ末端のアミノ酸配列ＧＧＸに結合し、分岐ジグリシン（Ｋ－ε－ＧＧ）を含むアミノ酸配列に結合しない抗体を提供する。
【0008】
いくつかの実施形態では、抗体は、ＧＧＡ、ＧＧＥ、ＧＧＦ、ＧＧＧ、ＧＧＨ、ＧＧＩ、ＧＧＬ、ＧＧＭ、ＧＧＮ、ＧＧＱ、ＧＧＳ、ＧＧＴ、ＧＧＶおよびＧＧＷからなる群から選択されるＮ末端配列を含むペプチドに結合する。
【0009】
いくつかの実施形態では、抗体は、ＧＧＡのＮ末端配列を含むペプチド、ＧＧＥのＮ末端配列を含むペプチド、ＧＧＦのＮ末端配列を含むペプチド、ＧＧＧのＮ末端配列を含むペプチド、ＧＧＨのＮ末端配列を含むペプチド、ＧＧＩのＮ末端配列を含むペプチド、ＧＧＬのＮ末端配列を含むペプチド、ＧＧＭのＮ末端配列を含むペプチド、ＧＧＮのＮ末端配列を含むペプチド、ＧＧＱのＮ末端配列を含むペプチド、ＧＧＳのＮ末端配列を含むペプチド、ＧＧＴのＮ末端配列を含むペプチド、ＧＧＶのＮ末端配列を含むペプチド、およびＧＧＷのＮ末端配列を含むペプチドに結合する。
【0010】
いくつかの実施形態では、抗体は、ウサギ、齧歯類、またはヤギ抗体である。
【0011】
いくつかの実施形態では、抗体は、完全長抗体またはＦａｂ断片である。
【0012】
いくつかの実施形態では、抗体は、検出可能な標識にコンジュゲートしている。
【0013】
いくつかの実施形態では、標識は、ビオチン、ジゴキシゲニンおよびフルオレセインからなる群から選択される。
【0014】
いくつかの実施形態では、抗体は、固体支持体上に固定化されている。
【0015】
いくつかの実施形態では、抗体は、ビーズ上に固定化されている。
【0016】
いくつかの実施形態では、抗体は、Ｋａｂａｔに従ってナンバリングして、一方の側の３５位にＡｓｎ、３７位にＶａｌ、９３位にＴｈｒ、１０１位にＡｓｎおよび１０３位にＴｒｐを含む可変重鎖（ＶＨ）と、３４位にＡｌａ、３６位にＴｙｒおよび４９位にＴｙｒを含む可変軽鎖（ＶＬ）とを含む。
【0017】
いくつかの実施形態では、抗体は、可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）を含み、抗体は、アミノ酸配列ＸＸＸＭＮ（配列番号３５）を含むＣＤＲＨ１と、アミノ酸配列ＸＸＸＸＸＧＸＸＹＹＡＴＷＡ（配列番号３６）を含むＣＤＲＨ２と、アミノ酸配列ＤＤＸＸＸＸＮＸ（配列番号３７）を含むＣＤＲＨ３とを含み、抗体は、アミノ酸配列ＱＳＸＸＳＶＹＸＸＮＸＬＸ（配列番号３８）を含むＣＤＲＬ１と、アミノ酸配列ＸＡＳＴＬＸＳ（配列番号３９）を含むＣＤＲＬ２と、アミノ酸配列ＬＧＸＸＤＣＸＳＸＤＣＸＸ（配列番号４０）を含むＣＤＲＬ３とを含み、Ｘは任意のアミノ酸である。
【0018】
いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号３３に記載のアミノ酸を含み、ＶＬは、配列番号３４に記載のアミノ酸配列を含む。
【0019】
いくつかの実施形態では、抗体は、可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）を含み、抗体は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むＶＨのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３と、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むＶＬのＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３とを含む。
【0020】
いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号３に記載のＣＤＲＨ１アミノ酸配列と、配列番号４に記載のＣＤＲＨ２アミノ酸配列と、配列番号５に記載のＣＤＲＨ３アミノ酸配列と、配列番号６に記載のＣＤＲＬ１アミノ酸配列と、配列番号７に記載のＣＤＲＬ２アミノ酸配列と、配列番号８に記載のＣＤＲＬ３アミノ酸配列とを含む。
【0021】
いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む。
【0022】
いくつかの実施形態では、抗体は、可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）を含み、抗体は、配列番号９に記載のアミノ酸配列を含むＶＨのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３と、配列番号１０に記載のアミノ酸配列を含むＶＬのＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３とを含む。
【0023】
いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１１に記載のＣＤＲＨ１アミノ酸配列と、配列番号１２に記載のＣＤＲＨ２アミノ酸配列と、配列番号１３に記載のＣＤＲＨ３アミノ酸配列と、配列番号１４に記載のＣＤＲＬ１アミノ酸配列と、配列番号１５に記載のＣＤＲＬ２アミノ酸配列と、配列番号１６に記載のＣＤＲＬ３アミノ酸配列とを含む。
【0024】
いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号９に記載のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号１０に記載のアミノ酸配列を含む。
【0025】
いくつかの実施形態では、抗体は、可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）を含み、抗体は、配列番号１７に記載のアミノ酸配列を含むＶＨのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３と、配列番号１８に記載のアミノ酸配列を含むＶＬのＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３とを含む。
【0026】
いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１９に記載のＣＤＲＨ１アミノ酸配列と、配列番号２０に記載のＣＤＲＨ２アミノ酸配列と、配列番号２１に記載のＣＤＲＨ３アミノ酸配列と、配列番号２２に記載のＣＤＲＬ１アミノ酸配列と、配列番号２３に記載のＣＤＲＬ２アミノ酸配列と、配列番号２４に記載のＣＤＲＬ３アミノ酸配列とを含む。
【0027】
いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号１７に記載のアミノ酸を含み、ＶＬは、配列番号１８に記載のアミノ酸を含む。
【0028】
いくつかの実施形態では、抗体は、可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）を含み、抗体は、配列番号２５に記載のアミノ酸配列を含むＶＨのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３と、配列番号２６に記載のアミノ酸配列を含むＶＬのＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３とを含む。
【0029】
いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号２７に記載のＣＤＲＨ１アミノ酸配列と、配列番号２８に記載のＣＤＲＨ２アミノ酸配列と、配列番号２９に記載のＣＤＲＨ３アミノ酸配列と、配列番号３０に記載のＣＤＲＬ１アミノ酸配列と、配列番号３１に記載のＣＤＲＬ２アミノ酸配列と、配列番号３２に記載のＣＤＲＬ３アミノ酸配列とを含む。
【0030】
いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号２５に記載のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号２６に記載のアミノ酸配列を含む。
【0031】
別の態様では、段落［０００６］～［００２９］のいずれか１つの抗体をコードする核酸が提供される。
【0032】
別の態様では、段落［００３０］の核酸を含む宿主細胞が提供される。
【0033】
別の態様では、本発明は、Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体をスクリーニングする方法であって、抗体が、ペプチドのＮ末端のアミノ酸配列ＧＧＸに結合し、抗体が、分岐ジグリシン（Ｋ－ε－ＧＧ）を含むアミノ酸配列に結合せず、
ｉ）抗体ライブラリーを提供すること、
ｉｉ）Ｎ末端にアミノ酸配列ＧＧＸ（Ｘは任意のアミノ酸である）を含むペプチドに結合する抗体を正に選択すること、および
ｉｉｉ）アミノ酸配列Ｋ－ε－ＧＧを含むペプチドに結合する抗体を負に選択し、
それによって、Ｎ末端にアミノ酸ＧＧＸを含むペプチドに特異的に結合し、アミノ酸配列Ｋ－ε－ＧＧに結合しない抗体を産生することを含む、方法を提供する。
ｉ）抗体ライブラリーを提供すること、
ｉｉ）Ｎ末端にアミノ酸配列ＧＧＸ（Ｘは任意のアミノ酸である）を含むペプチドに結合する抗体を正に選択すること、および
ｉｉｉ）アミノ酸配列Ｋ－ε－ＧＧを含むペプチドに結合する抗体を負に選択し、
それによって、Ｎ末端にアミノ酸ＧＧＸを含むペプチドに特異的に結合し、アミノ酸配列Ｋ－ε－ＧＧに結合しない抗体を産生することを含む、方法を提供する。
【0034】
いくつかの実施形態では、工程ｉｉ）では、Ｎ末端にアミノ酸配列ＧＧＭを含むペプチドに結合する抗体が正に選択される。
【0035】
いくつかの実施形態では、アミノ酸配列Ｋ－ε－ＧＧを含むペプチドに結合する抗体を負に選択することが、工程ｉｉ）と同時に行われる。
【0036】
いくつかの実施形態では、工程ｉｉ）の前または後に、アミノ酸配列Ｋ－ε－ＧＧを含むペプチドに結合する抗体を負に選択する。
【0037】
いくつかの実施形態では、ライブラリーはファージライブラリーまたは酵母ライブラリーである。
【0038】
いくつかの実施形態では、ライブラリーは、Ｎ末端にアミノ酸配列ＧＧＭを含むペプチドを含むペプチドライブラリーを用いて哺乳動物を免疫化することによって生成される。
【0039】
いくつかの実施形態では、哺乳動物はウサギまたはマウスである。
【0040】
いくつかの実施形態では、工程ｉｉ）～ｉｉｉ）は２回以上繰り返される。
【0041】
別の態様では、段落［００３２］～［００３９］のいずれか１つの方法によって産生される抗体が提供される。
【0042】
別の態様では、本発明は、ペプチドの混合物を含む試料中のＮ末端ユビキチン化ペプチドを濃縮する方法であって、
ｉ）試料を、Ｎ末端ユビキチン化タンパク質のペプチドに結合する抗体と接触させることと、
ｉｉ）試料から抗体結合ペプチドを選択することとを含み、抗体が、Ｎ末端のアミノ酸配列ＧＧＸに結合し、抗体が、分岐ジグリシン（Ｋ－ε－ＧＧ）を含むアミノ酸配列に結合しない、方法を提供する。
ｉ）試料を、Ｎ末端ユビキチン化タンパク質のペプチドに結合する抗体と接触させることと、
ｉｉ）試料から抗体結合ペプチドを選択することとを含み、抗体が、Ｎ末端のアミノ酸配列ＧＧＸに結合し、抗体が、分岐ジグリシン（Ｋ－ε－ＧＧ）を含むアミノ酸配列に結合しない、方法を提供する。
【0043】
いくつかの実施形態では、試料は細胞溶解物である。
【0044】
いくつかの実施形態では、方法は、細胞内のデユビキチナーゼを欠失させることと、細胞を溶解して細胞溶解物を生成することとをさらに含む。
【0045】
いくつかの実施形態では、方法は、細胞内でユビキチンリガーゼを過剰発現させることと、細胞を溶解して細胞溶解物を生成することとをさらに含む。
【0046】
いくつかの実施形態では、細胞溶解物は、ペプチドを生成するために、トリプシンとインキュベートされる。
【0047】
いくつかの実施形態では、細胞溶解物は、ペプチドを生成するために、細菌プロテアーゼまたはウイルスプロテアーゼとインキュベートされる。
【0048】
いくつかの実施形態では、方法は、溶解物生成の前に、かつトリプシンとのインキュベーションの前または細菌プロテアーゼもしくはウイルスプロテアーゼとのインキュベーションの前に、プロテアソーム阻害剤または脱ユビキチン化阻害剤によって細胞を処理することをさらに含む。
【0049】
いくつかの実施形態では、方法は、選択された抗体結合ペプチドを検出することをさらに含む。
【0050】
いくつかの実施形態では、抗体結合ペプチドは、質量分析によって検出される。
【0051】
いくつかの実施形態では、抗体結合ペプチドは、タンパク質配列決定によって検出される。
【0052】
いくつかの実施形態では、抗体結合ペプチドは、Ｎ末端ユビキチン化タンパク質のペプチドに結合する抗体に結合する二次抗体を使用して検出される。
【0053】
別の態様では、段落［００４１］～［００５１］のいずれか１つの方法によって生成されたＮ末端ユビキチン化ペプチドのライブラリーが提供される。
【0054】
別の態様では、本発明は、ペプチドの混合物を含む試料中のＮ末端ユビキチン化ペプチドを検出する方法であって、
ｉ）試料を酵素とインキュベートして、ペプチドを生成すること、
ｉｉ）ペプチドを、Ｎ末端ユビキチン化タンパク質のペプチドに結合する抗体と接触させること、および
ｉｉｉ）Ｎ末端ユビキチン化ペプチドを検出することを含み、抗体が、Ｎ末端のアミノ酸配列ＧＧＸに結合し、抗体が、分岐ジグリシン（Ｋ－ε－ＧＧ）を含むアミノ酸配列に結合しない、方法を提供する。
ｉ）試料を酵素とインキュベートして、ペプチドを生成すること、
ｉｉ）ペプチドを、Ｎ末端ユビキチン化タンパク質のペプチドに結合する抗体と接触させること、および
ｉｉｉ）Ｎ末端ユビキチン化ペプチドを検出することを含み、抗体が、Ｎ末端のアミノ酸配列ＧＧＸに結合し、抗体が、分岐ジグリシン（Ｋ－ε－ＧＧ）を含むアミノ酸配列に結合しない、方法を提供する。
【0055】
いくつかの実施形態では、Ｎ末端ユビキチン化ペプチドは、Ｎ末端ユビキチン化タンパク質のペプチドに結合する抗体に結合する二次抗体を使用して検出される。
【0056】
いくつかの実施形態では、試料は細胞溶解物である。
【0057】
いくつかの実施形態では、方法は、細胞内でユビキチンリガーゼを過剰発現させることと細胞を溶解して細胞溶解物を生成することとをさらに含む。
【0058】
いくつかの実施形態では、方法は、細胞内のデユビキチナーゼを欠失させることと、細胞を溶解して細胞溶解物を生成することとをさらに含む。
【0059】
いくつかの実施形態では、細胞溶解物は、ペプチドを生成するために、細菌プロテアーゼまたはウイルスプロテアーゼとインキュベートされる。
【0060】
いくつかの実施形態では、方法は、溶解物生成の前に、かつ細菌プロテアーゼまたはウイルスプロテアーゼとのインキュベーションの前に、プロテアソーム阻害剤または脱ユビキチン化阻害剤によって細胞を処理することをさらに含む。
【0061】
別の態様では、本発明は、Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体と、使用説明書とを含む、試料中のＮ末端ユビキチン化ペプチドを検出するためのキットであって、Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体、抗体が、Ｎ末端のアミノ酸配列ＧＧＸに結合し、抗体が、分岐ジグリシン（Ｋ－ε－ＧＧ）を含むアミノ酸配列に結合しない、キットを提供する。
【0062】
いくつかの実施形態では、Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体は、検出可能な標識にコンジュゲートしている。
【0063】
いくつかの実施形態では、検出可能な標識は、ビオチン、ジゴキシゲニンおよびフルオレセインからなる群から選択される。
【0064】
いくつかの実施形態では、抗体は、固体支持体上に固定化されている。
【0065】
いくつかの実施形態では、抗体は、ビーズ上に固定化されている。
【0066】
いくつかの実施形態では、キットは、プロテアーゼをさらに含む。
【図面の簡単な説明】
【0067】
【図1A】抗ＧＧＸモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を生成するために使用される免疫化およびファージパニング戦略の模式的概要を示す。
【図1B】Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｍｅｔペプチド（ＧＧＭ；上）およびＫ－ε－ＧＧペプチド（下）の化学構造を示す。
【図1C】ストレプトアビジンを対照として用いて、ウサギ８匹の各々由来のポリクローナル抗体（ｐＡｂ）がＧＧＭペプチドおよびＫ－ε－ＧＧペプチドに結合する能力を測定する酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）から得られたデータを提供する。ウサギの同一性をｘ軸上に示し、個々のバーは、各ウサギについて左から右に、ＧＧＭペプチド、Ｋ－ε－ＧＧペプチドおよびストレプトアビジンへの結合レベルを表す。６５０ｎｍでの光学濃度をｙ軸上に示す。
【図1D】モノクローナル抗体１Ｃ７、２Ｈ２、２Ｅ９および２Ｂ１２の軽鎖可変領域（上）および重鎖可変領域（下）のアミノ酸配列アライメントを示す。軽鎖可変領域アライメントは、上から下に、１Ｃ７（配列番号２）、２Ｈ２（配列番号２６）、２Ｅ９（配列番号１８）および２Ｂ１２（配列番号１０）を含む。重鎖可変領域アライメントは、上から下に、１Ｃ７（配列番号１）、２Ｈ２（配列番号２５）、２Ｅ９（配列番号１７）および２Ｂ１２（配列番号９）を含む。Ｋａｂａｔによるアミノ酸位置のナンバリング、およびＣＤＲの位置を各アライメントの上に示す。
【図1E】対照としてニュートラアビジンを用いて、１Ｃ７、２Ｂ１２、２Ｅ９、２Ｈ２および抗Ｋ－ε－ＧＧ ｍＡｂがＧＧＭペプチドおよびＫ－ε－ＧＧペプチドに結合する能力を測定するＥＬＩＳＡからのデータを示す。抗体の同一性をｘ軸上に示し、個々のバーは、各抗体について左から右に、ＧＧＭペプチド、Ｋ－ε－ＧＧペプチドおよびニュートラアビジンへの結合レベルを表す。６５０ｎｍでの光学濃度をｙ軸上に示し（ｎ＝３）、エラーバーは標準偏差を示す。
【図1F】１Ｃ７、２Ｂ１２、２Ｅ９および２Ｈ２がＧＧＸペプチドに結合する能力を測定するＥＬＩＳＡからのデータを示す。ｙ軸上に示されるように、システインを除く２０個のアミノ酸全部が「Ｘ」位で置換された。抗体の同一性をｘ軸上に示す。陰影が濃くなるほど良好な結合に対応し（すなわち、右側のスケールに示すように、６５０ｎｍでの光学濃度が高くなる）、ブランク行はストレプトアビジン対照であり、ｎ＝３である。
【図2A】ＧＧＭペプチド（スティック線図（ｓｔｉｃｋ ｄｉａｇｒａｍ）として示す）に結合した１Ｃ７ Ｆａｂの表面表現を示す。１Ｃ７ ＣＤＲの位置が標識されている。
【図2B】１σで輪郭付けした、電子密度メッシュ内に包まれた、ＧＧＭペプチド（スティック線図として示す）に結合した１Ｃ７ Ｆａｂのカートーン表現を示す。
【図2C】水素結合ネットワーク、ならびに軽鎖および重鎖の両方との接触を示す、ジグリシンと１Ｃ７ Ｆａｂとの間の相互作用の詳細図を示す。ＧＧＭペプチドは、空間充填図によって囲まれたスティック線図として示されている。重鎖残基をＧＧＭペプチドの上に示し、軽鎖残基をＧＧＭペプチドの下に示す。抗体およびＧＧＭペプチド上のアミノ酸残基が標識されている。
【図2D】疎水性残基および親水性残基の混合物を含有する、軽鎖－重鎖接触面に位置するメチオニン認識ポケットの詳細図を示す。重鎖残基を上に示し、軽鎖残基を下に示す。アミノ酸残基が標識されている。
【図2E】１Ｃ７ Ｆａｂの構造にモデリングしたＧｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＧＧＰ）ペプチド（スティック線図として示す）を示し、抗体への結合を妨げる可能性が高い立体的衝突を強調している。
【図2F】Ｔｒｐ側鎖に結合し得る、２Ｂ１２のポケットのモデルを示し、ＨＣ Ｔｈｒ９３Ｖａｌ残基およびＬＣ Ｌｅｕ９６Ａｓｎ残基が示されている。
【図3A】ＧＧＸペプチドの免疫親和性濃縮および質量分析（ＭＳ）（ＧＧＸ－ＩＡＰ－ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）のためのワークフローの概略図を示す。
【図3B】抗Ｋ－ε－ＧＧ抗体、抗ＧＧＸ抗体２Ｂ１２および抗ＧＧＸ抗体１Ｃ７免疫親和性濃縮ＭＳ実験におけるＫ４８およびＫ６３ Ｋ－ε－ＧＧポリユビキチン鎖結合ペプチドＬＩＦＡＧＫＧＧＱＬＥＤＧＲ（配列番号４１；左）およびＴＬＳＤＹＮＩＱＫＧＧＥＳＴＬＨＬＶＬＲ（配列番号４２；右）に関する抽出イオンクロマトグラム（＋／－１０ｐｐｍ）を示す。ｘ軸は分単位の時間を示し、ｙ軸はペプチドの存在量を示す。
【図3C】抗Ｋ－ε－ＧＧ抗体、抗ＧＧＸ抗体２Ｅ９および抗ＧＧＸ抗体２Ｈ２免疫親和性濃縮ＭＳ実験におけるＫ４８およびＫ６３ Ｋ－ε－ＧＧポリユビキチン鎖結合ペプチドＬＩＦＡＧＫＧＧＱＬＥＤＧＲ（配列番号４１；左）およびＴＬＳＤＹＮＩＱＫＧＧＥＳＴＬＨＬＶＬＲ（配列番号４２；右）に関する抽出イオンクロマトグラム（＋／－１０ｐｐｍ）を示す。ｘ軸は分単位の時間を示し、ｙ軸はペプチドの存在量を示す。
【図3D】抗Ｋ－ε－ＧＧ抗体、抗ＧＧＸ抗体２Ｂ１２および抗ＧＧＸ抗体１Ｃ７免疫親和性濃縮ＭＳ実験における内部ＧＧＸペプチドＧＧＭＬＴＮＡＲ（配列番号４３；左）およびＧＧＭｏｘＡＬＡＬＡＶＴＫ（配列番号４４；右）に関する抽出イオンクロマトグラム（＋／－１０ｐｐｍ）を示す。ｘ軸は分単位の時間を示し、ｙ軸はペプチドの存在量を示す。
【図3E】抗Ｋ－ε－ＧＧ抗体、抗ＧＧＸ ２Ｅ９抗体および抗ＧＧＸ ２Ｈ２抗体免疫親和性濃縮ＭＳ実験における内部ＧＧＸペプチドＧＧＬＡＴＦＨＧＰＧＱＬＬＣＨＰＶＬＤＬＲ（配列番号４５；左）およびＧＧＭＴＳＴＹＧＲ（配列番号４６；右）に関する抽出イオンクロマトグラム（＋／－１０ｐｐｍ）を示す。ｘ軸は分単位の時間を示し、ｙ軸はペプチドの存在量を示す。
【図3F】Ｘ位に様々なアミノ酸残基を有する免疫親和性濃縮内部ＧＧＸペプチドの数を示す。ｘ軸はＸ位のアミノ酸残基を示し、ｙ軸はペプチドの数を示す。
【図3G】抗ＧＧＸ ｍＡｂ １Ｃ７（左上）、２Ｈ２（右上）、２Ｂ１２（左下）および２Ｅ９（右下）によって濃縮された内部ＧＧＸペプチドの配列多様性を表すＷｅｂＬｏｇｏを示す。
【図3H】抗Ｋ－ε－ＧＧ抗体、抗ＧＧＸ抗体２Ｂ１２および抗ＧＧＸ抗体１Ｃ７免疫親和性濃縮ＭＳ実験におけるＮ末端ＧＧＸペプチドＧＧＭＦＧＳＡＰＱＲＰＶＡＭＴＴＡＱＲ（配列番号４７）に関する抽出イオンクロマトグラム（＋／－４ｐｐｍ）を示す。ｘ軸は分単位の時間を示し、ｙ軸はペプチドの存在量を示す。
【図3I】三重荷電６５４．９９３８ｍ／ｚ Ｎ末端ＧＧＸ修飾ペプチドＧＧＭＦＧＳＡＰＱＲＰＶＡＭＴＴＡＱＲ（配列番号４７）のＭＳ／ＭＳスペクトル同定を示す。検出されたｂイオンおよびｙイオンが標識されている。
【図4A】ドキシサイクリン処理の２４時間後の安定なドキシサイクリン誘導性ＵＢＥ２Ｗ ＨＥＫ２９３細胞のウエスタンブロットを示す。下に、チューブリンのウエスタンブロットを対照として示す。
【図4B】無標識ＧＧＸ－ＭＳ実験におけるＵＢＥ２Ｗ過剰発現（ＵＢＥ２Ｗｏｅ）対対照条件に関する差次的なＮ末端タンパク質ユビキチン化データを示すボルケーノプロットを示す。ｘ軸はｌｏｇ２倍率変化（ＦＣ）を示し、ｙ軸は－ｌｏｇ１０（Ｐ値）を示す。各データ点は１つのタンパク質を表し、示されているタンパク質名の代表的なセット。ｌｏｇ２倍率変化（ＦＣ）＞１．０および－ｌｏｇ１０ Ｐ値＞１．３（Ｐ＜０．０５）に設定されたタンパク質レベルカットオフを破線で示す。
【図4C】ドキシサイクリン処理の２４時間後の安定なドキシサイクリン誘導性ＵＢＥ２Ｗ／ＲＮＦ４ ＨＥＫ２９３細胞のウエスタンブロットを示す。
【図4D】タンデム質量タグ付け（ｔａｎｄｅｍ ｍａｓｓ ｔａｇｇｉｎｇ）（ＴＭＴ）１１－ｐｌｅｘ ＧＧＸ－ＩＡＰ－ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ実験における、ＵＢＥ２Ｗ過剰発現対対照（ＵＢＥ２Ｗｏｅ－ｃｔｒｌ）およびコンボ対ＲＮＦ４過剰発現（コンボ－ＲＮＦ４ｏｅ）の対比における差次的なＮ末端タンパク質ユビキチン化を有するタンパク質を示す散布図を示す。ｘ軸はＵＢＥ２Ｗ過剰発現対対照のｌｏｇ２倍率変化（ＦＣ）を示し、ｙ軸は、コンボ対ＲＮＦ４過剰発現のｌｏｇ２倍率変化（ＦＣ）を示す。データ点のサイズは、Ｐ値によってスケーリングされている。破線は、両対比において－ｌｏｇ１０ Ｐ値＞１．３（Ｐ＜０．０５）のものに対応する。複製物（対照ｎ＝３、ＵＢＥ２Ｗのみｎ＝３、ＲＮＦ４のみｎ＝２、およびコンボｎ＝３）を用いて全実験を行った。
【図4E】無標識ＧＧＸ－ＭＳ実験における、ＵＢＥ２Ｗ過剰発現対対照（ＵＢＥ２Ｗｏｅ－Ｃｔｒｌ；左）、コンボ対対照（コンボ－Ｃｔｒｌ；中央）およびコンボ対ＲＮＦ４過剰発現（コンボ－ＲＮＦ４ｏｅ；右）条件に関する差次的なＮ末端タンパク質ユビキチン化データを示すボルケーノプロットを示す。各プロットでは、ｘ軸はｌｏｇ２倍率変化（ＦＣ）を示し、ｙ軸は－ｌｏｇ１０（Ｐ値）を示す。各データ点は１つのタンパク質を表す。破線で示された、ｌｏｇ２倍率変化＞１．０および－ｌｏｇ１０ Ｐ値＞１．３（Ｐ＜０．０５）に設定されたタンパク質レベルカットオフ。
【図4F】無標識ＧＧＸ－ＭＳ実験における、ＵＢＥ２Ｗ過剰発現対対照およびコンボ対ＲＮＦ４過剰発現の対比における差次的なＮ末端タンパク質ユビキチン化を有するタンパク質を示す散布図を示す。ｘ軸はＵＢＥ２Ｗ過剰発現対対照（ＵＢＥ２Ｗｏｅ－ｃｔｒｌ）のｌｏｇ２倍率変化（ＦＣ）を示し、ｙ軸は、コンボ対ＲＮＦ４過剰発現（コンボ－ＲＮＦ４ｏｅ）のｌｏｇ２倍率変化（ＦＣ）を示す。データ点のサイズは、Ｐ値によってスケーリングされている。破線は、両対比において－ｌｏｇ１０ Ｐ値＞１．３（Ｐ＜０．０５）のものに対応する。
【図4G】３つのＭＳ実験の各々からの同定された推定ＵＢＥ２Ｗ基質の数を比較する面積比例ベン図を示す。第１の無標識定量（ＬＦＱ）実験（ＬＦＱ＿１）は左上の円であり、第２のＬＦＱ実験（ＬＦＱ＿２）は左下の円であり、ＴＭＴ実験は右の円である。数字は、各実験内で同定された、または複数の実験間で共有された基質の数を表す。ＢｉｏＶｅｎｎウェブアプリケーション（Ｈｕｌｓｅｎ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ９，４８８（２００８））を使用してベン図を生成した。
【図4H】相対的なＮ末端ユビキチン化存在量を示すヒストグラムを示し、個々のバーは、生物学的複製物に対応する個々のＴＭＴ－１１ｐｌｅｘチャネルの値を示す。各バーは、技術的複製物（ｎ＝２）の平均を表す。左から右に、ＲＳ７、ＭＩＰ１８およびＱＫＩの結果を示す。各プロットでは、ｘ軸は実験から得られた試料を表し、ｙ軸は相対存在量を示す。
【図4I】推定ＵＢＥ２Ｗ基質のリジンを有しない変異体５つをコードするコンストラクトによってトランスフェクトされた野生型、ドキシサイクリン誘導性ＵＢＥ２Ｗ／ＲＮＦ４およびドキシサイクリン誘導性ＵＢＥ２ＷＷ１４４Ｅ／ＲＮＦ４安定ＨＥＫ２９３細胞のウエスタンブロットを示す。抗ＨＡタグ抗体を使用して、タンパク質検出用の各コンストラクトのＣ末端にＨＡタグを融合した。矢印は、各基質の修飾型を示す。結果は、３つの独立した実験の代表である。各ブロットの下に、チューブリンのウエスタンブロットを対照として示す。
【図4J】イニシエーターメチオニンの後の免疫親和性濃縮ＵＢＥ２Ｗ基質の２番目の位置の分析を示す。ｘ軸はイニシエーターメチオニンの後のＸ位のアミノ酸残基を示し、ｙ軸はペプチドの数を示す。
【図5A】ＧＧＸ－ＩＡＰ－ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ実験からの対照（ＣＴＬＲ；上部プロット）およびＵＢＥ２Ｗ過剰発現（ＵＢＥ２Ｗ ｏｅ；下部プロット）条件における、それぞれＵＣＨＬ１（左）およびＵＣＨＬ５（右）のＮ末端トリプシン性ＧＧＸペプチドＧＧＭＱＬＫＰＭＥＩＮＰＥＭＬＮＫ（配列番号４８）およびＧＧＭＴＧＮＡＧＥＷＣＬＭＥＳＤＰＧＶＦＴＥＬＩＫ（配列番号４９）に関する抽出イオンクロマトグラム（＋／－１０ｐｐｍ）を示す。ｘ軸は分単位の時間を示し、ｙ軸はペプチドの存在量を示す。
【図5B】Ｎ末端トリプシン性ＧＧＸ修飾ペプチドＧＧＭＱＬＫＰＭＥＩＮＰＥＭＬＮＫ（配列番号４８）（三重荷電、６４３．９９０７ｍ／ｚ；左）およびＧＧＭＴＧＮＡＧＥＷＣＬＭＥＳＤＰＧＶＦＴＥＬＩＫ（配列番号４９）（三重荷電、９００．４０９４ｍ／ｚ；右）のＭＳ／ＭＳスペクトル同定を示す。検出されたｂイオンおよびｙイオンが標識されている。
【図5C】ＧＧＸ－ＩＡＰ－ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ実験からの対照（ＣＴＬＲ；上部プロット）およびＵＢＥ２Ｗ過剰発現（ＵＢＥ２Ｗｏｅ；下部プロット）条件における、それぞれＵＣＨＬ１（左）およびＵＣＨＬ５（右）のＮ末端半トリプシン性（ｓｅｍｉ－ｔｒｙｐｔｉｃ）ＧＧＸペプチドＧＧＭＱＬＫＰＭＥ（配列番号５０）およびＧＧＭＴＧＮＡＧＥＷＣＬＭＥ（配列番号５１）に関する抽出イオンクロマトグラム（＋／－１０ｐｐｍ）を示す。ｘ軸は分単位の時間を示し、ｙ軸はペプチドの存在量を示す。
【図5D】Ｎ末端半トリプシン性ＧＧＸ修飾ペプチドＧＧＭＱＬＫＰＭＥ（配列番号５０）（二重荷電、４９５．７４０６ｍ／ｚ；左）およびＧＧＭＴＧＮＡＧＥＷＣＬＭＥ（配列番号５１）（二重荷電、７５６．７９９４ｍ／ｚ；右）のＭＳ／ＭＳスペクトル同定を示す。検出されたｂイオンおよびｙイオンが標識されている。
【図5E】リジンを有しない触媒的に不活性なＵＣＨＬ１（上）およびＵＣＨＬ５（下）に対して行ったｉｎ ｖｉｔｒｏユビキチン化アッセイの結果を示す。ＵＢＥ２Ｗの非存在下（レーン１および２）およびＵＢＥ２Ｗの存在下（レーン３～５）で２時間の反応を行った。ユビキチンを用いて（レーン２）または用いずに（レーン５）、全反応物をＥ１、Ｅ３（ＲＮＦ４）、ＡＴＰ／ＭｇＣｌ２とインキュベートした。結果は、３つの独立した実験の代表である。
【図5F】ドキシサイクリン処理の２４時間後のドキシサイクリン誘導性ＵＢＥ２Ｗ／ＲＮＦ４およびＵＢＥ２ＷＷ１４４Ｅ／ＲＮＦ４ ＨＥＫ２９３細胞のウエスタンブロットを示す。抗ＵＣＨＬ１抗体を用いて、内因性ＵＣＨＬ１発現を分析した。結果は、３つの独立した実験の代表である。
【図5G】ドキシサイクリン処理の２４時間後のドキシサイクリン誘導性ＵＢＥ２Ｗ／ＲＮＦ４ ＨＥＫ２９３細胞のウエスタンブロットを示す。細胞採取前に、ボルテゾミブ（１０μＭ、５時間）によって細胞をさらに処理した。
【図5H】ドキシサイクリン処理の２４時間後のドキシサイクリン誘導性ＵＢＥ２Ｗ／ＲＮＦ４ ＨＥＫ２９３細胞のウエスタンブロットを示す。細胞採取前に、シクロヘキシミド（１０μｇ／ｍｌ）によって、示された時間にわたって細胞をさらに処理した。
【図6A】Ｂｉｏ－Ｌａｙｅｒ干渉法（ＢＬＩ）実験の概略図を示す。ストレプトアビジン（ＳＡ）バイオセンサー上の固定化ビオチン－ユビキチン（Ｕｂ）を使用して、ＵＣＨＬ１およびＵＣＨＬ５相互作用を測定し、遊離ＵＣＨＬ１またはＵＣＨＬ５およびＵｂ－ＵＣＨＬ１またはＵＣＨＬ５とＵｂ表面との会合を測定した。
【図6B】（最高応答から最低応答までの）ＵＣＨＬ１、ＵｂＧ７６Ｖ－ＵＣＨＬ１、ＵｂＩ４４Ａ，Ｇ７６Ｖ－ＵＣＨＬ１、ＵＣＨＬ５、ＵｂＧ７６Ｖ－ＵＣＨＬ５、およびＵｂＩ４４Ａ，Ｇ７６Ｖ－ＵＣＨＬ５に関する組み合わされた定常状態結合曲線を示す。ｘ軸は被分析物の濃度をｎＭ単位で示し、ｙ軸は被分析物の各濃度に関するＲｍａｘ値をｎｍ単位で示す。各アッセイを３重で行った。
【図6C】野生型ＵＣＨＬ１（上）、Ｎ末端ユビキチン化模倣物（ＵｂＧ７６Ｖ－ＵＣＨＬ１；中央）またはＵｂＩ４４Ａ，Ｇ７６Ｖ－ＵＣＨＬ１（下）へのＵｂの結合を示す代表的なセンサーグラムを示す。
【図6D】野生型ＵＣＨＬ５（上）、Ｎ末端ユビキチン化模倣物（ＵｂＧ７６Ｖ－ＵＣＨＬ５；中央）またはＵｂＩ４４，ＡＧ７６Ｖ－ＵＣＨＬ５（下）へのＵｂの結合を示す代表的なセンサーグラムを示す。
【図6E】ユビキチン－Ｒｈｏ１１０およびＵＣＨＬ１コンストラクト（左）およびＵＣＨＬ５コンストラクト（右）を用いて行った活性アッセイの結果を示す。ＵＣＨＬ１およびＵＣＨＬ５については、試料は、野生型タンパク質（丸として示す）、触媒的に死滅した変異体（Ｃ９０ＳまたはＣ８８Ｓ；白四角として示す）、Ｎ末端ユビキチン化模倣物（ＵｂＧ７６Ｖ；黒四角として示す）、またはＵｂＩ１４４，ＡＧ７６Ｖ（上向き三角形）を含んでいた。各プロットでは、ｘ軸はユビキチン－Ｒｈｏ１１０の濃度をμＭ単位で示し、ｙ軸は反応速度をμＭ ｓ－１単位で示す。データは、非線形回帰フィットからの標準誤差を伴う最良適合値として報告されている。結果は、２つの独立した実験の代表である。
【図6F】ユビキチンビニルスルホンアッセイの結果を示す。示された時点（０、５、１５または３０分）にわたって、ＵＣＨＬ１、そのＮ末端ユビキチン化模倣物、ＵｂＧ６７Ｖ－ＵＣＨＬ１、およびＵｂＩ４４Ａ，Ｇ６７Ｖ－ＵＣＨＬ１（左）、ならびにＵＣＨＬ５、そのＮ末端ユビキチン化模倣物、ＵｂＧ６７Ｖ－ＵＣＨＬ５、およびＵｂＩ４４Ａ，Ｇ６７Ｖ－ＵＣＨＬ５（右）を、自殺プローブ（ｓｕｉｃｉｄｅ ｐｒｏｂｅ）であるユビキチン－ビニルスルホン（Ｕｂ－ＶＳ）と反応させた。矢印は、ＨＡ－Ｕｂ－ＶＳと反応するＮ末端ユビキチン化模倣物に関連するバンドを示す。結果は、３つの独立した実験の代表である。
【図6G】左から右に、ドキシサイクリン処理の２４時間後の、空のベクター、野生型ＵＣＨＬ１、ＵｂＧ７６Ｖ－ＵＣＨＬ１、ＵＣＨＬ１Ｃ９０Ｓ（触媒的に不活性な変異体）、ＵｂＧ７６Ｖ－ＵＣＨＬ１Ｃ９０Ｓ、またはＵＣＨＬ１Ｄ３０Ｋ（非Ｕｂ結合変異体）によってトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞のウエスタンブロットを示す。矢印によってモノユビキチンを示す。結果は、２つの独立した実験の代表である。チューブリンのウエスタンブロットを対照として示す。
【図7A】プロテアソーム阻害剤ボルテゾミブによる処理を用いた、または用いない、ＵＢＥ２Ｗ過剰発現を有する、または有しない、試料中のユビキチンレベルおよびＵＢＥ２Ｗレベルのウエスタンブロットを示す。チューブリンのウエスタンブロットを対照として示す。
【図7B】ＵＢＥ２Ｗ過剰発現対Ｃｔｒｌ（左）、およびコンボ対ボルテゾミブ処理（コンボ－Ｂｔｚ；左）に関する差次的なＮ末端タンパク質ユビキチン化データを示すボルケーノプロットを示す。各プロットでは、ｘ軸はｌｏｇ２倍率変化（ＦＣ）を示し、ｙ軸は－ｌｏｇ１０（Ｐ値）を示す。各データ点は１つのタンパク質を表す。
【図7C】ｘ軸に沿って左から右に、対照の２つの複製物、ボルテゾミブ（Ｂｔｚ）処理の２つの複製物、ＵＢＥ２Ｗ過剰発現の２つの複製物、およびＲＮＦ４／ＵＢＥ２Ｗの組合せの２つの複製物に関する無標識ピーク面積を示すヒートマップを示す。ｙ軸は、示されたタンパク質のレベルを示す。
【図7D】対照の２つの複製物、ボルテゾミブ（Ｂｔｚ）処理の２つの複製物、ＵＢＥ２Ｗ過剰発現の２つの複製物、およびＲＮＦ４／ＵＢＥ２Ｗの組合せの２つの複製物の間の相関を示す試料相関表を示す。
【発明を実施するための形態】
【0068】
Ｉ．定義
本明細書で使用される「ＧＧＸ」は、Ｎ末端にアミノ酸配列（Ｎ末端からＣ末端）Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｘを含むペプチドを指し、ここで、Ｘは任意のアミノ酸である。
本明細書で使用される「ＧＧＸ」は、Ｎ末端にアミノ酸配列（Ｎ末端からＣ末端）Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｘを含むペプチドを指し、ここで、Ｘは任意のアミノ酸である。
【0069】
本明細書で使用される「抗ＧＧＸ抗体」は、Ｎ末端にＧＧＸペプチドを含むポリペプチドに結合する抗体を指す。
【0070】
本明細書で使用される「Ｋ－ε－ＧＧ」は、リジン残基（「Ｋ－ε」）のε－アミノ基に結合した２つのグリシン残基（「ＧＧ」）を指す。Ｋ－ε－ＧＧは、ユビキチン化の最も一般的な形態である、リジン残基のε－アミノ基へのユビキチンのコンジュゲーションのシグネチャーである。ユビキチンの３つのＣ末端残基はＡｒｇ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙであり、カノニカルなユビキチン化では、Ｃ末端グリシン残基は、標的ポリペプチド内のリジン残基にコンジュゲートしている。トリプシンによって消化すると、ユビキチンはアルギニン残基の後で切断され、コンジュゲートされたリジン上にＧｌｙ－Ｇｌｙジペプチドレムナントが生じる。したがって、トリプシン消化ポリペプチド内のＫ－ε－ＧＧペプチド（「Ｋ－ε－ＧＧジ－グリシンレムナント」または「分岐ジグリシン」とも呼ばれる）の存在は、ポリペプチド内のリジン残基のε－アミノ基へのユビキチンの事前のコンジュゲーションを示す。Ｋ－ε－ＧＧの化学構造を図１Ｂに示す。
【0071】
「抗体」という用語は、本明細書では最も広い意味で用いられ、限定はしないが、それらが所望の抗原結合活性を呈する限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、および抗体断片を含めた、様々な抗体構造を包含する。
【0072】
「抗体断片」とは、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部を含む、インタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例には、限定するものではないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、直鎖状抗体、単鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）；および抗体断片から形成された多重特異性抗体が挙げられる。抗体のパパイン消化により、各々単一の抗原結合部位を有する「Ｆａｂ」断片と、容易に結晶化するその能力を反映して命名された残りの「Ｆｃ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片が産生される。ペプシン処理は、２つの抗原結合部位を有し、依然として抗原を架橋し得るＦ（ａｂ’）２断片をもたらす。
【0073】
本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体を指し、すなわち、例えば、天然に存在する変異を含有するか、またはモノクローナル抗体調製物の産生中に生じる可能性のあるバリアント抗体（例えば、そのようなバリアントは一般に微量で存在する）を除いて、集団を構成する個々の抗体は同一であり、および／または同じエピトープに結合する。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を通常含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基を対象とする。したがって、修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の製造を必要とするものとして解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、およびヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部または一部を含むトランスジェニック動物を利用する方法を含むがこれらに限定されない種々の手法によって作製され得、モノクローナル抗体を作製するためのこのような方法および他の例示的な方法は、本明細書中に記載される。
【0074】
「ネイキッド抗体」は、異種部分（例えば、細胞傷害性部分）または放射性標識にコンジュゲートしていない抗体を指す。ネイキッド抗体は、薬学的製剤中に存在してもよい。
【0075】
「天然抗体」は、様々な構造を有する天然に生じる免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然ＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合している２つの同一の軽鎖および２つの同一の重鎖から構成される約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端に向かって、各重鎖は、可変重鎖ドメインまたは重鎖可変ドメインとも呼ばれる、可変領域（ＶＨ）、それに続く３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３）を有する。同様に、Ｎ末端からＣ末端ｊにかけて、各軽鎖は、可変領域（ＶＬ）（可変軽ドメインまたは軽鎖可変ドメインとも呼ばれる）と、それに続く１つの定常軽（ＣＬ）ドメインとを有する。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる２つのタイプのうちの１つに割り当てられ得る。
【0076】
抗体の「クラス」とは、その重鎖が有する定常ドメインまたは定常領域のタイプのことを指す。抗体には５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭがあり、これらのうちのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２にさらに分類され得る。免疫グロブリンの異なるクラスに相当する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。
【0077】
「ヒト抗体」は、ヒトもしくはヒト細胞により産生された抗体の、またはヒト抗体レパートリーを利用する非ヒト源に由来する抗体のアミノ酸配列、あるいは他のヒト抗体をコードする配列に対応するアミノ酸配列を有する抗体である。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特に除外する。
【0078】
用語「キメラ」抗体は、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の起源または種に由来し、その重鎖および／または軽鎖の残りの部分が、異なる起源または種に由来する抗体のことを指す。
【0079】
「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンＶＬまたはＶＨフレームワーク配列の選択において最も一般的に生じるアミノ酸残基を表すフレームワークである。一般に、ヒト免疫グロブリンＶＬ配列またまたはヒト免疫グロブリンＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループから行われる。一般に、配列のサブグループは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１－３２４２，Ｂｅｔｈｅｓｄａ ＭＤ（１９９１），ｖｏｌｓ．１－３にあるようなサブグループである。一実施形態では、ＶＬについて、サブグループは上記のＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．にあるようなサブグループカッパＩである。一実施形態では、ＶＨについて、サブグループは上記のＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．にあるようなサブグループＩＩＩである。
【0080】
「ヒト化」抗体とは、非ヒトＣＤＲ由来のアミノ酸残基と、ヒトＦＲ由来のアミノ酸残基とを含むキメラ抗体を指す。特定の実施形態では、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ＣＤＲの全てまたは実質的に全てが非ヒト抗体のＣＤＲに対応し、ＦＲの全てまたは実質的に全てがヒト抗体のＦＲに対応する。ヒト化抗体は、任意に、ヒト抗体由来の抗体定常領域の少なくとも一部分を含んでよい。抗体、例えば、非ヒト抗体の「ヒト化形態」は、ヒト化を受けた抗体を指す。
【0081】
「可変領域」または「可変ドメイン」という用語は、抗体の抗原への結合に関与する抗体の重鎖または軽鎖のドメインを指す。天然抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨおよびＶＬ）は、類似の構造を一般に有し、各ドメインは、４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）とを含む。（例えば、Ｋｉｎｄｔ ｅｔ ａｌ．Ｋｕｂｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６ｔｈ ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，ｐａｇｅ ９１（２００７）を参照）。抗原結合特異性を付与するには、単一のＶＨドメインまたはＶＬドメインで十分であり得る。さらに、特定の抗原に結合する抗体を、その抗原に結合する抗体のＶＨドメインまたはＶＬドメインを用いて単離し、相補的なＶＬドメインまたはＶＨドメインそれぞれのライブラリーをスクリーニングしてもよい。例えば、Ｐｏｒｔｏｌａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：８８０－８８７（１９９３）；Ｃｌａｒｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４－６２８（１９９１）を参照されたい。
【0082】
例示的なＣＤＲ（ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３）は、Ｌ１のアミノ酸残基２４～３４、Ｌ２の５０～５６、Ｌ３の８９～９７、Ｈ１の３１～３５Ｂ、Ｈ２の５０～６５、およびＨ３の９５～１０２に存在する。（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）．）ＶＨにおけるＣＤＲ１を除き、ＣＤＲは、概して、超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。ＣＤＲは、「特異性決定領域」、すなわち「ＳＤＲ」も含み、それは、抗原と接触する残基である。ＳＤＲは、略語－ＣＤＲ、すなわちａ－ＣＤＲと呼ばれるＣＤＲの領域内に含まれる。例示的なａ－ＣＤＲ（ａ－ＣＤＲＬ１、ａ－ＣＤＲＬ２、ａ－ＣＤＲＬ３、ａ－ＣＤＲＨ１、ａ－ＣＤＲＨ２およびａ－ＣＤＲＨ３）は、Ｌ１のアミノ酸残基３１～３４、Ｌ２の５０～５５、Ｌ３の８９～９６、Ｈ１の３１～３５Ｂ、Ｈ２の５０～５８、およびＨ３の９５～１０２に存在する。（Ａｌｍａｇｒｏ ａｎｄ Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９－１６３３（２００８）を参照。）別途指示がない限り、可変ドメイン内のＣＤＲ残基および他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、本明細書では上記のＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．に従ってナンバリングされる。
【0083】
「Ｆａｂ」断片は、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含有し、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）も含有する。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域由来の１つ以上のシステインを含む、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端における少数の残基の付加によって、Ｆａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’－ＳＨは、定常ドメインの１つまたは複数のシステイン残基が、遊離チオール基を持つＦａｂ’の本明細書での呼称である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、元来、間にヒンジシステインを有する一対のＦａｂ’断片として生成された。抗体断片の他の化学的カップリングも既知である。
【0084】
本明細書中の用語「Ｆｃ領域」は、定常領域の少なくとも一部分を含む免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。この用語は、天然配列Ｆｃ領域およびバリアントＦｃ領域を包含する。特定の実施形態では、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６またはＰｒｏ２３０から、重鎖のカルボキシル末端に及ぶ。しかしながら、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は存在しても存在しなくてもよい。本明細書で特に明記されない限り、Ｆｃ領域または定常領域におけるアミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１に記載されるような、ＥＵ番号付けシステム（ＥＵインデックスとも呼ばれる）に従う。
【0085】
「フレームワーク」または「ＦＲ」は、ＣＤＲ残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、４つのＦＲドメイン：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４から一般になる。したがって、ＣＤＲ配列およびＦＲ配列は、ＶＨ（またはＶＬ）では、以下の配列で一般に現れる：ＦＲ１－ＣＤＲＨ１（Ｌ１）－ＦＲ２－ＣＤＲＨ２（Ｌ２）－ＦＲ３－ＣＤＲＨ３（Ｌ３）－ＦＲ４。
【0086】
用語「完全長抗体」、「インタクトな抗体」、および「全抗体」は、本明細書中で交換可能に使用され、天然型抗体構造と実質的に類似の構造を有するか、または本明細書で定義されるＦｃ領域を含む重鎖を有する抗体を指す。
【0087】
「宿主細胞」、「宿主細胞株」および「宿主細胞培養物」という用語は、交換可能に使用され、外因性の核酸が導入された細胞を指し、そのような細胞の子孫を含む。宿主細胞には、「形質転換体」および「形質転換細胞」が含まれ、これらは、継代数によらず、一次形質転換細胞およびそれに由来する子孫を含む。子孫は、核酸の含有量が親細胞と完全に同一でなくてもよく、変異を含んでいてもよい。元の形質転換細胞においてスクリーニングまたは選択されたのと同じ機能または生物活性を有する変異子孫が、本明細書に含まれる。
【0088】
「イムノコンジュゲート」とは、細胞傷害剤を含むがこれに限定されない、１種以上の異種分子にコンジュゲートされた抗体である。
【0089】
「単離」抗体は、その天然環境の成分から分離されたものである。いくつかの実施形態では、抗体は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、等電点電気泳動法（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）またはクロマトグラフ（例えば、イオン交換または逆相ＨＰＬＣ）によって決定される場合、９５％超または９９％超の純度まで精製される。抗体純度を評価する方法の概要については、例えば、Ｆｌａｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ ８４８：７９－８７（２００７）を参照されたい。
【0090】
「単離された」核酸は、その天然環境の成分から分離された核酸分子を指す。単離された核酸には、通常核酸分子を含有する細胞内に含有される核酸分子が含まれるが、核酸分子は、染色体外、またはその天然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。
【0091】
「添付文書」という用語は、治療用製品の市販パッケージに通例含まれる説明書であって、そのような治療用製品の使用に関する適応症、用法、用量、投与、併用療法、禁忌および／または警告についての情報を含む説明書を指すために使用される。
【0092】
基準となるポリペプチド配列に関する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、配列同一性最大パーセントが得られるように、配列をアライメントし、必要に応じてギャップを導入した後に、いかなる保存的置換も配列同一性の一部として考慮せずに、基準となるポリペプチド配列におけるアミノ酸残基と同一である、候補配列におけるアミノ酸残基の割合として定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的のための整列は、当技術分野における技術の範囲内にある種々の方法において、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア等の公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して達成することができる。当業者であれば、比較される配列の完全長にわたる最大のアライメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列をアライメントするための適切なパラメータを決定することができる。しかしながら、本明細書での目的のために、アミノ酸配列同一性％値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ－２を使用して生成される。ＡＬＩＧＮ－２配列比較コンピュータプログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．が作成したものであり、ソースコードは、使用者用書類とともに、米国著作権局、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．、２０５５９に提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７として登録されている。ＡＬＩＧＮ－２プログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．（Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から公的に入手可能であるか、またはそのソースコードからコンパイルされ得る。ＡＬＩＧＮ－２プログラムは、デジタルＵＮＩＸ Ｖ４．０Ｄを含む、ＵＮＩＸオペレーティングシステムでの使用のためにコンパイルされるべきである。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ－２プログラムによって設定されており、変わらない。
【0093】
ＡＬＩＧＮ－２がアミノ酸配列比較に用いられる状況では、所与のアミノ酸配列Ｂに対する、アミノ酸配列Ｂとの、またはアミノ酸配列Ｂとの対照での、所与のアミノ酸配列Ａのアミノ酸配列同一性％（あるいは、所与のアミノ酸配列Ｂに対し、アミノ酸配列Ｂと、またはアミノ酸配列Ｂとの対照で、特定のアミノ酸配列同一性％を有するかもしくは含む、所与のアミノ酸配列Ａとして記述することができる）は、以下のように計算される：
１００×分数Ｘ／Ｙ
ここで、Ｘは配列アライメントプログラムＡＬＩＧＮ－２により、ＡとＢのそのプログラムのアライメントにおいて同一と一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。別途明記しない限り、本明細書で使用される全ての％アミノ酸配列同一性値が、ＡＬＩＧＮ－２コンピュータプログラムを使用し、直前の段落で説明したように、得られる。
１００×分数Ｘ／Ｙ
ここで、Ｘは配列アライメントプログラムＡＬＩＧＮ－２により、ＡとＢのそのプログラムのアライメントにおいて同一と一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。別途明記しない限り、本明細書で使用される全ての％アミノ酸配列同一性値が、ＡＬＩＧＮ－２コンピュータプログラムを使用し、直前の段落で説明したように、得られる。
【0094】
本明細書で使用される「ベクター」という用語は、それが連結された別の核酸を増殖させることのできる核酸分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造体としてのベクター、およびそれが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。ある種のベクターは、それが作動可能に連結されている核酸の発現を誘導することができる。そのようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と呼ばれる。
【0095】
本明細書で使用される場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、別途指示がない限り、複数への言及を含む。
【0096】
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、この技術分野の当業者であれば容易に理解する、それぞれの値の通常の誤差範囲を指す。本明細書における「約」に続く値またはパラメータへの言及は、その値またはパラメータ自体を対象とする実施形態を含む（且つ説明する）。
【0097】
本明細書に記載の本発明の態様および実施形態が、態様および実施形態「を含む」、「からなる」、および「から本質的になる」を含むことが理解される。
【0098】
ＩＩ．組成物および方法
一態様では、本開示は、Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのエピトープなどの領域と相互作用するか、または他の方法で結合する抗体を提供する。
一態様では、本開示は、Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのエピトープなどの領域と相互作用するか、または他の方法で結合する抗体を提供する。
【0099】
Ａ．Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体
１．Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチド
本開示は、Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドを特異的に検出し濃縮することができる抗体の開発に部分的に基づく。実施例１に記載されるように、本発明者らは、潜在的なＮ末端ユビキチン化ポリペプチドのかなりの部分が、トリプシン消化の際に開始メチオニン残基の前にジグリシン修飾を有するペプチドを生じる、アセチル化されていないインタクトなイニシエーターメチオニンを有する新生ポリペプチドであると予測した。したがって、Ｎ末端にジグリシン配列を含有するトリプシン性ペプチドを選択的に濃縮することができる抗体を同定するための選択を設計した（図１Ａおよび実施例１を参照）。本明細書に詳細に記載されるように、ウサギ免疫ファージ戦略を使用して、Ｎ末端ジグリシンモチーフを有するペプチドを選択的に認識するが、ユビキチンコンジュゲートリジンのトリプシン消化によって生成された分岐ジグリシンレムナントは認識しない新規抗体を生成した（Ｋ－ε－ＧＧ；図１Ａおよび実施例１を参照）。生化学的方法と構造的方法との組合せを使用して、本明細書では、これらの抗体が、第３のアミノ酸に対する緩和された選択性を伴ってＮ末端ジグリシンを主に認識し、これらのｍＡｂが広範囲のペプチド配列に結合することを可能にすることが示される（実施例２を参照）。
１．Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチド
本開示は、Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドを特異的に検出し濃縮することができる抗体の開発に部分的に基づく。実施例１に記載されるように、本発明者らは、潜在的なＮ末端ユビキチン化ポリペプチドのかなりの部分が、トリプシン消化の際に開始メチオニン残基の前にジグリシン修飾を有するペプチドを生じる、アセチル化されていないインタクトなイニシエーターメチオニンを有する新生ポリペプチドであると予測した。したがって、Ｎ末端にジグリシン配列を含有するトリプシン性ペプチドを選択的に濃縮することができる抗体を同定するための選択を設計した（図１Ａおよび実施例１を参照）。本明細書に詳細に記載されるように、ウサギ免疫ファージ戦略を使用して、Ｎ末端ジグリシンモチーフを有するペプチドを選択的に認識するが、ユビキチンコンジュゲートリジンのトリプシン消化によって生成された分岐ジグリシンレムナントは認識しない新規抗体を生成した（Ｋ－ε－ＧＧ；図１Ａおよび実施例１を参照）。生化学的方法と構造的方法との組合せを使用して、本明細書では、これらの抗体が、第３のアミノ酸に対する緩和された選択性を伴ってＮ末端ジグリシンを主に認識し、これらのｍＡｂが広範囲のペプチド配列に結合することを可能にすることが示される（実施例２を参照）。
【0100】
Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドを生成することができる２つの酵素が、当技術分野では知られている。第１に、ユビキチン結合酵素ＵＢＥ２Ｗは、Ｎ末端ユビキチンを有することが報告されている（Ｓｃａｇｌｉｏｎｅ，Ｋ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８８，１８７８４－１８７８８（２０１３））。第２に、ユビキチンリガーゼである線状ユビキチン鎖集合体複合体（「ＬＵＢＡＣ」）は、Ｎ末端ユビキチン鎖を含むことが報告されている（Ｋｉｒｉｓａｋｏ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｍｂｏ Ｊ ２５，４８７７－４８８７（２００６））。したがって、いくつかの実施形態では、Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドはＵＢＥ２Ｗである。いくつかの実施形態では、Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドはＬＵＢＡＣである。
【0101】
一態様では、本開示の抗体を使用して、Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドを同定した（実施例３～４を参照）。いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、細胞溶解物（例えば、ＨＥＫ２９３細胞溶解物、または誘導可能なＵＢＥ２Ｗ発現を有するＨＥＫ２９３細胞の溶解物）からＮ末端ユビキチン化ポリペプチドを選択的に濃縮する。いくつかの実施形態では、Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドは、イニシエーターメチオニンまたはネオＮ末端（ｎｅｏ－Ｎ－ｔｅｒｍｉｎｕｓ）にジグリシンを含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ポリペプチドのＮ末端にアミノ酸配列ＧＧＸを含む。いくつかの実施形態では、濃縮は、実施例３または実施例４に記載されるように計算される。いくつかの実施形態では、抗体は、細胞溶解物からのポリペプチドを１ｌｏｇ２（倍率変化）を超える（例えば、１、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９または１０ｌｏｇ２（倍率変化）を超える）レベルまで濃縮する。いくつかの実施形態では、抗体は、細胞溶解物からのポリペプチドをｐ＜０．０５（例えば、ｐ＜０．０５、ｐ＜０．０４、ｐ＜０．０３、ｐ＜０．０２、ｐ＜０．０１、ｐ＜０．００５、ｐ＜０．００１、ｐ＜０．０００１またはｐ＜０．００００１）である統計学的有意性まで濃縮する。いくつかの実施形態では、濃縮は、Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体と接触していない細胞溶解物中のポリペプチドの存在量に対して計算される。誘導可能なＵＢＥ２Ｗ発現を有するＨＥＫ２９３細胞の溶解物からポリペプチドが選択的に濃縮されるいくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ＵＢＥ２Ｗ発現の誘導時に濃縮される。いくつかの実施形態では、Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドは、表７または表８に列挙されたポリペプチドのいずれか１つである。いくつかの実施形態では、Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドは、ヒトＤＣＴＰ１、ヒトＦ１３Ａ、ヒトＨＮＲＰＫ、ヒトＰＵＲ９、ヒトＲＦＡ１、ヒトＲＰＢ７、ヒトＳ１１ＩＰおよびヒトＵＣＨＬ５からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドは、ヒトＡＡＡＴ、ヒトＡＥＳ、ヒトＡＩＧ１、ヒトＡＲＦ１、ヒトＡＲＬ５Ｂ、ヒトＢＡＢＡ２、ヒトＢＵＢ３、ヒトＣ１ＴＣ、ヒトＣ２ＡＩＬ、ヒトＣ９Ｊ４７０、ヒトＣＤ８１、ヒトＣＤＣ４５、ヒトＤＣＴＰ１、ヒトＤＨＲＳＸ、ヒトＤＭＫＮ、ヒトＥ２ＡＫ１、ヒトＥＦ１Ｂ、ヒトＦ１３Ａ、ヒトＦＡ６０Ａ、ヒトＦＢＲＬ、ヒトＦＬＯＴ１、ヒトＧＣＹＢ１、ヒトＧＯＴ１Ｂ、ヒトＧＰＡＡ１、ヒトＨＩＫＥＳ、ヒトＨＮＲＰＫ、ヒトＩＭＰＡ３、ヒトＬＡＴ３、ヒトＬＡＴ４、ヒトＬＲＷＤ１、ヒトＭＥＤ２５、ヒトＭＦＳ１２、ヒトＭＩＰ１８、ヒトＭＭＧＴ１、ヒトＭＯＯＮＲ、ヒトＮＡＲＲ、ヒトＮＤＵＢ６、ヒトＮＥＮＦ、ヒトＮＯＬ６、ヒトＮＯＰ１０、ヒトＮＵＤＣ、ヒトＰ１２１Ａ、ヒトＰＩＧＣ、ヒトＰＬＢＬ２、ヒトＰＲＤＸ１、ヒトＰＲＤＸ２、ヒトＰＵＲ９、ヒトＱＫＩ、ヒトＲＡＤ２１、ヒトＲＣＡＳ１、ヒトＲＥＥＰ１、ヒトＲＦＡ１、ヒトＲＰＢ１、ヒトＲＰＢ７、ヒトＲＳ２９、ヒトＲＳ７、ヒトＳ１１ＩＰ、ヒトＳＧＭＲ１、ヒトＴ１７９Ｂ、ヒトＴＡＦ１、ヒトＴＣＰＧ、ヒトＴＦ３Ｃ４、ヒトＴＭ１２７、ヒトＴＭＭ９７、ヒトＴＭＸ２、ヒトＴＳＮ１３、ヒトＴＳＮ３、ヒトＴＴＣ２７、ヒトＵＢＡＣ１、ヒトＵＢＡＣ２、ヒトＵＣＨＬ１、ヒトＵＣＨＬ５、ヒトＶＫＯＲ１、ヒトＶＲＫ３、ヒトＺＤＨ１２、ヒトＺＮ２５３およびヒトＺＮ６７２からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドはヒトＵＣＨＬ１である。いくつかの実施形態では、Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドはヒトＵＣＨＬ５である。いくつかの実施形態では、Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドは、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ１５７５８、Ｑ０８１１７、Ｑ９ＮＶＶ５、Ｐ８４０７７、Ｑ９６ＫＣ２、Ｑ９ＮＸＲ７、Ｏ４３６８４、Ｐ１１５８６、Ｑ９６ＨＱ２、Ｃ９Ｊ４７０、Ｐ６００３３、Ｏ７５４１９、Ｑ９Ｈ７７３、Ｑ８Ｎ５Ｉ４、Ｑ６Ｅ０Ｕ４－８、Ｑ９ＢＱＩ３、Ｐ２４５３４、Ｐ００４８８、Ｑ９ＮＰ５０、Ｐ２２０８７、Ｏ７５９５５、Ｑ０２１５３、Ｑ９Ｙ３Ｅ０、Ｏ４３２９２、Ｑ５３ＦＴ３、Ｐ６１９７８、Ｑ９ＮＸ６２、Ｏ７５３８７、Ｑ８Ｎ３７０、Ｑ９ＵＦＣ０、Ｑ７１ＳＹ５、Ｑ６ＮＵＴ３、Ｑ９Ｙ３Ｄ０、Ｑ８Ｎ４Ｖ１、Ｑ２ＫＨＭ９、Ｐ０ＤＩ８３、Ｏ９５１３９、Ｑ９ＵＭＸ５、Ｑ９Ｈ６Ｒ４、Ｑ９ＮＰＥ３、Ｑ９Ｙ２６６、Ｑ９６ＨＡ１、Ｑ９２５３５、Ｑ８ＮＨＰ８、Ｑ０６８３０、Ｐ３２１１９、Ｐ３１９３９、Ｑ９６ＰＵ８、Ｏ６０２１６、Ｏ００５５９、Ｑ９Ｈ９０２、Ｐ２７６９４、Ｐ２４９２８、Ｐ６２４８７、Ｐ６２２７３、Ｐ６２０８１、Ｑ８Ｎ１Ｆ８、Ｑ９９７２０、Ｑ７Ｚ７Ｎ９、Ｐ２１６７５、Ｐ４９３６８、Ｑ９ＵＫＮ８、Ｏ７５２０４、Ｑ５ＢＪＦ２、Ｑ９Ｙ３２０、Ｏ９５８５７、Ｏ６０６３７、Ｑ６Ｐ３Ｘ３、Ｑ９ＢＳＬ１、Ｑ８ＮＢＭ４、Ｐ０９９３６、Ｑ９Ｙ５Ｋ５、Ｑ９ＢＱＢ６、Ｑ８ＩＶ６３、Ｑ９６ＧＲ４、Ｏ７５３４６およびＱ４９９Ｚ４からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドは、無秩序なＮ末端を含む。
【0102】
２．Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体
Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、抗体は、ペプチドのＮ末端のアミノ酸配列ＧＧＸに結合し、抗体は、分岐ジグリシン（Ｋ－ε－ＧＧ）を含むアミノ酸配列に結合しない。いくつかの実施形態では、Ｘは任意のアミノ酸である。
Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、抗体は、ペプチドのＮ末端のアミノ酸配列ＧＧＸに結合し、抗体は、分岐ジグリシン（Ｋ－ε－ＧＧ）を含むアミノ酸配列に結合しない。いくつかの実施形態では、Ｘは任意のアミノ酸である。
【0103】
Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体であって、ペプチドのＮ末端のアミノ酸配列ＧＧＸに結合し、分岐ジグリシン（Ｋ－ε－ＧＧ）を含むアミノ酸配列に結合しない抗体が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、抗体は、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によって決定される場合、ペプチドのＮ末端のアミノ酸配列ＧＧＸに結合する。いくつかの実施形態では、抗体は、ＥＬＩＳＡによって決定される場合、分岐ジグリシン（Ｋ－ε－ＧＧ）を含むアミノ酸配列に結合するよりも大きい程度まで、ペプチドのＮ末端のアミノ酸配列ＧＧＸに結合する。いくつかの実施形態では、抗体は、ペプチドのＮ末端のアミノ酸配列ＧＧＸに、分岐ジグリシン（Ｋ－ε－ＧＧ）を含むアミノ酸配列への抗体の結合レベルの２、３、４、５、６、７、８、９または１０倍を超える（これらの値の間の任意の値または範囲を含む）結合レベルで結合する。いくつかの実施形態では、抗体は、ペプチドのＮ末端のアミノ酸配列ＧＧＸに、対照試料（例えば、ニュートラアビジンまたはストレプトアビジン）への抗体の結合レベルの２、３、４、５、６、７、８、９または１０倍を超える（これらの値の間の任意の値または範囲を含む）結合レベルで結合する。いくつかの実施形態では、ペプチドのＮ末端のアミノ酸配列ＧＧＸはＧＧＭである。結合を測定する例示的な方法は、実施例１（「モノクローナル抗体ＥＬＩＳＡ」を参照）および図１Ｅに提供されている。
【0104】
いくつかの実施形態では、Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体は、対照抗体がペプチドに結合するよりも高い親和性で、ペプチドのＮ末端のアミノ酸配列ＧＧＸに結合する。いくつかの実施形態では、対照抗体は、アイソタイプ対照である。いくつかの実施形態では、対照抗体は、抗Ｋ－ε－ＧＧ抗体（例えば、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（登録商標）ＰＴＭＳｃａｎ（登録商標）Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｒｅｍｎａｎｔ Ｍｏｔｉｆ抗体）である。いくつかの実施形態では、抗体は、ウエスタンブロットでは、Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、抗体は、ペプチドのＮ末端にアミノ酸配列ＧＧＸを含むペプチドを免疫沈降することができる。いくつかの実施形態では、抗体は、ペプチドのＮ末端にアミノ酸配列ＧＧＸを含むペプチドと共結晶化することができる。いくつかの実施形態では、抗体は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイでは、Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに特異的に結合する。
【0105】
いくつかの実施形態では、抗体は、１００、１０、１または０．１μＭ未満の解離定数（Ｋｄ）でＮ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する。いくつかの実施形態では、抗体は、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、５０、７５または１００μＭ（これらの値の間の任意の値または範囲を含む）であるＫｄでＮ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する。いくつかの実施形態では、抗体は、１００、１０または１ｎＭ未満のＫｄでＮ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する。いくつかの実施形態では、抗体は、約５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２５０、５００、７５０または１０００ｎＭであるＫｄ（これらの値の間の任意の値または範囲を含む）でＮ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する。いくつかの実施形態では、Ｋｄは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して測定される。いくつかの実施形態では、Ｋｄは、ＧＧＭペプチドへの結合を測定することによって測定される。
【0106】
分岐ジグリシン（Ｋ－ε－ＧＧ）を含むアミノ酸配列に結合しない抗体が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、抗体は、分岐ジグリシン（Ｋ－ε－ＧＧ）を含むアミノ酸配列に結合せず、抗体の結合は、バックグラウンドを超えて検出することができないか、または陰性対照と同じレベル（例えば、非特異的結合のレベル、または結合ニュートラアビジンのレベル）である。いくつかの実施形態では、分岐ジグリシン（Ｋ－ε－ＧＧ）を含むアミノ酸配列への抗体の結合は、検出することができない（例えば、ＥＬＩＳＡ、ＳＰＲアッセイ、ウエスタンブロットおよび／または免疫沈降法によって検出することができない）。
【0107】
いくつかの実施形態では、抗体は、Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドへの抗体の結合レベルの５０％、４０％、３０％、２０％、１０％未満のレベル（これらの値の間の任意の値または範囲を含む）で、分岐ジグリシン（Ｋ－ε－ＧＧ）を含むアミノ酸配列に結合し、抗体は、ペプチドのＮ末端のアミノ酸配列ＧＧＸに結合する。いくつかの実施形態では、抗体は、抗体がニュートラアビジンに結合するのと同じ程度に、分岐ジグリシン（Ｋ－ε－ＧＧ）を含むアミノ酸配列に結合する。いくつかの実施形態では、抗体は、抗体がストレプトアビジンに結合するのと同じ程度に、分岐ジグリシン（Ｋ－ε－ＧＧ）を含むアミノ酸配列に結合する。いくつかの実施形態では、分岐ジグリシン（Ｋ－ε－ＧＧ）を含むアミノ酸配列への抗体の結合レベルは、陰性対照試料への結合レベル（例えば、ニュートラアビジンまたはストレプトアビジンへの結合レベル）の１．１、１．２、１．３、１．４または１．５倍以下である。いくつかの実施形態では、分岐ジグリシン（Ｋ－ε－ＧＧ）を含むアミノ酸配列への抗体の結合レベルは、陰性対照試料への結合レベル（例えば、ニュートラアビジンまたはストレプトアビジンへの結合レベル）と統計的に有意に異ならない。
【0108】
いくつかの実施形態では、Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体は、ＧＧＡ、ＧＧＥ、ＧＧＦ、ＧＧＧ、ＧＧＨ、ＧＧＩ、ＧＧＬ、ＧＧＭ、ＧＧＮ、ＧＧＱ、ＧＧＳ、ＧＧＴ、ＧＧＶおよびＧＧＷからなる群から選択されるＮ末端配列を含むペプチドに結合する。いくつかの実施形態では、抗体は、Ｎ末端ＧＧＡ配列を含むペプチドに結合する。いくつかの実施形態では、抗体は、Ｎ末端ＧＧＥ配列を含むペプチドに結合する。いくつかの実施形態では、抗体は、Ｎ末端ＧＧＦ配列を含むペプチドに結合する。いくつかの実施形態では、抗体は、Ｎ末端ＧＧＧ配列を含むペプチドに結合する。いくつかの実施形態では、抗体は、Ｎ末端ＧＧＨ配列を含むペプチドに結合する。いくつかの実施形態では、抗体は、Ｎ末端ＧＧＩ配列を含むペプチドに結合する。いくつかの実施形態では、抗体は、Ｎ末端ＧＧＬ配列を含むペプチドに結合する。いくつかの実施形態では、抗体は、Ｎ末端ＧＧＭ配列を含むペプチドに結合する。いくつかの実施形態では、抗体は、Ｎ末端ＧＧＮ配列を含むペプチドに結合する。いくつかの実施形態では、抗体は、Ｎ末端ＧＧＱ配列を含むペプチドに結合する。いくつかの実施形態では、抗体は、Ｎ末端ＧＧＳ配列を含むペプチドに結合する。いくつかの実施形態では、抗体は、Ｎ末端ＧＧＴ配列を含むペプチドに結合する。いくつかの実施形態では、抗体は、Ｎ末端ＧＧＶ配列を含むペプチドに結合する。いくつかの実施形態では、抗体は、Ｎ末端ＧＧＷ配列を含むペプチドに結合する。いくつかの実施形態では、抗体は、ＧＧＡ、ＧＧＥ、ＧＧＦ、ＧＧＧ、ＧＧＨ、ＧＧＩ、ＧＧＬ、ＧＧＭ、ＧＧＮ、ＧＧＱ、ＧＧＳ、ＧＧＴ、ＧＧＶおよびＧＧＷのＮ末端配列を含むペプチドに結合する。いくつかの実施形態では、抗体は、ＧＧＡのＮ末端配列を含むペプチド、ＧＧＥのＮ末端配列を含むペプチド、ＧＧＦのＮ末端配列を含むペプチド、ＧＧＧのＮ末端配列を含むペプチド、ＧＧＨのＮ末端配列を含むペプチド、ＧＧＩのＮ末端配列を含むペプチド、ＧＧＬのＮ末端配列を含むペプチド、ＧＧＭのＮ末端配列を含むペプチド、ＧＧＮのＮ末端配列を含むペプチド、ＧＧＱのＮ末端配列を含むペプチド、ＧＧＳのＮ末端配列を含むペプチド、ＧＧＴのＮ末端配列を含むペプチド、ＧＧＶのＮ末端配列を含むペプチド、およびＧＧＷのＮ末端配列を含むペプチドに結合する。
【0109】
いくつかの実施形態では、抗体は、ペプチドの任意の組合せを含む、ＧＧＡ、ＧＧＥ、ＧＧＦ、ＧＧＧ、ＧＧＨ、ＧＧＩ、ＧＧＬ、ＧＧＭ、ＧＧＮ、ＧＧＱ、ＧＧＳ、ＧＧＴ、ＧＧＶおよびＧＧＷからなる群から選択されるＮ末端配列を含む１つ以上のペプチドに結合する。いくつかの実施形態では、抗体は、Ｎ末端ＧＧＡ配列を含むペプチド、Ｎ末端ＧＧＥ配列を含むペプチド、Ｎ末端ＧＧＦ配列を含むペプチド、Ｎ末端ＧＧＧ配列を含むペプチド、Ｎ末端ＧＧＨ配列を含むペプチド、Ｎ末端ＧＧＩ配列を含むペプチド、Ｎ末端ＧＧＬ配列を含むペプチド、Ｎ末端ＧＧＭ配列を含むペプチド、Ｎ末端ＧＧＮ配列を含むペプチド、Ｎ末端ＧＧＱ配列を含むペプチド、Ｎ末端ＧＧＳ配列を含むペプチド、Ｎ末端ＧＧＴ配列を含むペプチド、およびＮ末端ＧＧＶ配列を含むペプチドに結合する。いくつかの実施形態では、抗体は、Ｎ末端ＧＧＡ配列を含むペプチド、Ｎ末端ＧＧＦ配列を含むペプチド、Ｎ末端ＧＧＩ配列を含むペプチド、Ｎ末端ＧＧＬ配列を含むペプチド、Ｎ末端ＧＧＭ配列を含むペプチド、Ｎ末端ＧＧＶ配列を含むペプチド、およびＮ末端ＧＧＷ配列を含むペプチドに結合する。いくつかの実施形態では、抗体は、Ｎ末端ＧＧＡ配列を含むペプチド、Ｎ末端ＧＧＦ配列を含むペプチド、Ｎ末端ＧＧＩ配列を含むペプチド、Ｎ末端ＧＧＬ配列を含むペプチド、Ｎ末端ＧＧＭ配列を含むペプチド、Ｎ末端ＧＧＮ配列を含むペプチド、およびＮ末端ＧＧＱ配列を含むペプチド、Ｎ末端ＧＧＳ配列を含むペプチド、およびＮ末端ＧＧＴ配列を含むペプチドに結合する。いくつかの実施形態では、抗体は、Ｎ末端ＧＧＡ配列を含むペプチド、Ｎ末端ＧＧＥ配列を含むペプチド、Ｎ末端ＧＧＦ配列を含むペプチド、Ｎ末端ＧＧＧ配列を含むペプチド、Ｎ末端ＧＧＨ配列を含むペプチド、Ｎ末端ＧＧＩ配列を含むペプチド、Ｎ末端ＧＧＬ配列を含むペプチド、Ｎ末端ＧＧＭ配列を含むペプチド、Ｎ末端ＧＧＮ配列を含むペプチド、Ｎ末端ＧＧＱ配列を含むペプチド、Ｎ末端ＧＧＳ配列を含むペプチド、Ｎ末端ＧＧＴ配列を含むペプチド、およびＮ末端ＧＧＶ配列を含むペプチドに結合する。いくつかの実施形態では、抗体は、Ｎ末端ＧＧＡ配列を含むペプチド、Ｎ末端ＧＧＥ配列を含むペプチド、Ｎ末端ＧＧＦ配列を含むペプチド、Ｎ末端ＧＧＧ配列を含むペプチド、Ｎ末端ＧＧＨ配列を含むペプチド、Ｎ末端ＧＧＩ配列を含むペプチド、Ｎ末端ＧＧＬ配列を含むペプチド、Ｎ末端ＧＧＭ配列を含むペプチド、Ｎ末端ＧＧＮ配列を含むペプチド、Ｎ末端ＧＧＱ配列を含むペプチド、Ｎ末端ＧＧＳ配列を含むペプチド、Ｎ末端ＧＧＴ配列を含むペプチド、Ｎ末端ＧＧＶ配列を含むペプチド、およびＮ末端ＧＧＷ配列を含むペプチドに結合する。例示的な抗体の特異性を図１Ｆに示す。
【0110】
いくつかの実施形態では、抗体は、ウサギ抗体、齧歯類抗体またはヤギ抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ウサギもしくはウサギ細胞によって産生される抗体、またはウサギ抗体レパートリーもしくは他のウサギ抗体コード配列を利用する非ウサギ供給源に由来する抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有するウサギ抗体である。いくつかの実施形態では、抗体はウサギに由来する。いくつかの実施形態では、抗体は、ニュージーランド白ウサギに由来する。いくつかの実施形態では、抗体は齧歯類に由来する。いくつかの実施形態では、抗体はヤギに由来する。いくつかの実施形態では、抗体は、ウサギ抗体、ヤギ抗体または齧歯類抗体に由来するＦｃ領域を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、ウサギ、ヤギ、または齧歯類抗体由来の抗体断片を含む。
【0111】
本発明のさらなる態様では、上記の実施形態のいずれかによるＮ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体を含むモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体は、抗体断片、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ダイアボディまたはＦ（ａｂ’）２断片である。別の実施形態では、Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体は、完全長抗体、例えば、インタクトなＩｇＧ１抗体、または本明細書で定義される他の抗体クラスもしくはアイソタイプである。いくつかの実施形態では、抗体は完全長抗体、Ｆａｂ断片またはｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、またはＩｇＭクラスの抗体である。いくつかの実施形態では、抗体はＩｇＧクラスのものである。いくつかの実施形態では、抗体はＩｇＧクラスのものであり、ＩｇＧ１アイソタイプ、ＩｇＧ２アイソタイプ、ＩｇＧ３アイソタイプまたはＩｇＧ４アイソタイプを有する。いくつかの実施形態では、抗体はＩｇＡクラスのものであり、ＩｇＡ１アイソタイプまたはＩｇＡ２アイソタイプを有する。
【0112】
本発明のさらなる態様では、上記の実施形態のいずれかによる、または本明細書に記載されるＮ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体は、異種部分、薬剤または標識にコンジュゲートしている。適切な標識の例は、蛍光色素標識、化学発光標識、放射性標識などの直接検出され得る部分と、検出されるために反応させなければならないかまたは誘導しなければならない酵素などの部分とを含む、イムノアッセイにおける使用のために知られている多数の標識である。そのような標識の例には、色素前駆体、例えば、ＨＲＰ、ラクトペルオキシダーゼまたはミクロペルオキシダーゼを酸化するために過酸化水素を使用する酵素、ビオチン（例えば、アビジン、ストレプトアビジン、ストレプトアビジン－ＨＲＰ、およびストレプトアビジン－β－ガラクトシダーゼとＭＵＧによって検出可能）、スピン標識、バクテリオファージ標識、安定フリーラジカルなどと結合される放射性同位体３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈおよび１３１Ｉ、フルオロフォア、例えば、希土類キレートまたはフルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシフェラーゼ、例えば、ホタルルシフェラーゼおよび細菌ルシフェラーゼ（米国特許第４，７３７，４５６号）、ルシフェリン、２，３－ジヒドロフタラジンジオン類、ＨＲＰ、アルカリホスファターゼ、ベータガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖類オキシダーゼ、例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、およびグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ、複素環式オキシダーゼ、例えば、ウリカーゼおよびキサンチンオキシダーゼが挙げられる。いくつかの実施形態では、標識は、ビオチン、ジゴキシゲニンおよびフルオレセインからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、上記の実施形態のいずれかによるＮ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体は、ビオチンにコンジュゲートしている。
【0113】
いくつかの実施形態では、抗体は、固体支持体上に固定化されている。いくつかの実施形態では、抗体は、ビーズ上に固定化されている。いくつかの実施形態では、固定化は、非水溶性マトリックスもしくは表面への吸着（米国特許第３，７２０，７６０号）、もしくは非共有結合もしくは共有結合カップリング（例えば、米国特許第３，６４５，８５２号またはＲｏｔｍａｎｓ ｅｔ ａｌ．；Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，５７：８７－９８（１９８３）に記載されているような硝酸および還元剤などによる支持体の事前の活性化の有無にかかわらず、グルタルアルデヒドまたはカルボジイミド系架橋剤を使用する）によって、またはその後、例えば、免疫沈降法によって抗体を不溶化することによって達成される。固定化に使用される固体支持体は、本質的に非水溶性な任意の不活性支持体または担体であってよく、例えば、表面、粒子、多孔性マトリックスなどの形態の支持体を含む。一般に使用される固体支持体の例には、小さなシート、ＳＥＰＨＡＤＥＸ（登録商標）ゲル、ポリ塩化ビニル、プラスチックビーズ、およびポリエチレン、ポリプロピレン、およびポリスチレンなどから製造されるアッセイプレートまたは試験管が含まれ、これには、９６ウェルマイクロタイタープレート、ならびにろ紙、アガロース、架橋デキストラン、およびその他多糖類といった粒子材料が含まれる。
【0114】
いくつかの実施形態では、Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体は、一方の側の３５位にＡｓｎ、３７位にＶａｌ、９３位にＴｈｒ、１０１位にＡｓｎ、および１０３位にＴｒｐを含む可変重鎖（ＶＨ）を含む。いくつかの実施形態では、Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体は、Ｋａｂａｔに従ってナンバリングして、３４位にＡｌａ、３６位にＴｙｒ、および４９位にＴｙｒを含む可変軽鎖（ＶＬ）を含む。
【0115】
いくつかの実施形態では、Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体は、可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）を含み、抗体は、アミノ酸配列ＸＸＸＭＮ（配列番号３５）を含むＣＤＲＨ１と、アミノ酸配列ＸＸＸＸＸＧＸＸＹＹＡＴＷＡ（配列番号３６）を含むＣＤＲＨ２と、アミノ酸配列ＤＤＸＸＸＸＮＸ（配列番号３７）を含むＣＤＲＨ３とを含み、抗体は、アミノ酸配列ＱＳＸＸＳＶＹＸＸＮＸＬＸ（配列番号３８）を含むＣＤＲＬ１と、アミノ酸配列ＸＡＳＴＬＸＳ（配列番号３９）を含むＣＤＲＬ２と、アミノ酸配列ＬＧＸＸＤＣＸＳＸＤＣＸＸ（配列番号４０）を含むＣＤＲＬ３とを含み、Ｘは任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号３３に記載のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬは、配列番号３４に記載のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号３３に記載のアミノ酸を含み、ＶＬは、配列番号３４に記載のアミノ酸配列を含む。
【0116】
いくつかの実施形態では、Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体は、表２Ａおよび表２Ｂに示されるように、抗体１Ｃ７の１、２、３、４、５または６つのＣＤＲを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、表３に示されるように、抗体１Ｃ７のＶＨおよび／またはＶＬを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、表４に示されるように、抗体１Ｃ７の重鎖および／または軽鎖を含む。
【0117】
いくつかの実施形態では、Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体は、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列を含む。ある特定の実施形態では、ＶＨ配列は、配列番号１のアミノ酸配列と比較して置換（例えば、保存的置換）、挿入または欠失を含有するが、配列番号１を含む抗体としてＮ末端ユビキチン化ポリペプチドに結合する能力を保持する。ある特定の実施形態では、配列番号１では合計１～１３個のアミノ酸が置換、挿入および／または欠失されている。ある特定の実施形態では、置換、挿入または欠失は、ＣＤＲの外側の領域で（すなわち、ＦＲで）生じる。特定の実施形態では、ＶＨは、（ａ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、および（ｃ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３からなる群から選択される１、２または３つのＣＤＲを含む。
【0118】
別の態様では、Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体であって、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む抗体が提供される。ある特定の実施形態では、ＶＬ配列は、配列番号２のアミノ酸配列と比較して置換（例えば、保存的置換）、挿入または欠失を含有するが、配列番号２を含む抗体としてＮ末端ユビキチン化ポリペプチドに結合する能力を保持する。ある特定の実施形態では、配列番号２では合計１～１１個のアミノ酸が置換、挿入および／または欠失されている。ある特定の実施形態では、置換、挿入または欠失は、ＣＤＲの外側の領域で（すなわち、ＦＲで）生じる。特定の実施形態では、ＶＬは、（ａ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１、（ｂ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２、および（ｃ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３からなる群から選択される１、２または３つのＣＤＲを含む。
【0119】
一実施形態では、Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体は、配列番号２のアミノ酸配列を含むＶＬと、配列番号１のアミノ酸配列を含むＶＨとを含む。
【0120】
別の態様では、Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体であって、配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、および配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３を含むＶＨと、配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１、配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２、および配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含むＶＬとを含む抗体が提供される。
【0121】
別の態様では、Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体であって、配列番号１に記載の配列を有するＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２およびＶＨ ＣＤＲ３と、配列番号２に記載の配列を有するＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３とを含む抗体が提供される。
【0122】
いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号５２のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する重鎖を含む。ある特定の実施形態では、重鎖配列は、配列番号５２のアミノ酸配列と比較して置換（例えば、保存的置換）、挿入または欠失を含有するが、配列番号５２を含む抗体としてＮ末端ユビキチン化ポリペプチドに結合する能力を保持する。ある特定の実施形態では、配列番号５２では合計１～２０個のアミノ酸が置換、挿入および／または欠失されている。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号５２に記載のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。
【0123】
いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号５３のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する軽鎖を含む。ある特定の実施形態では、軽鎖配列は、配列番号５３のアミノ酸配列と比較して置換（例えば、保存的置換）、挿入または欠失を含有するが、配列番号５３を含む抗体としてＮ末端ユビキチン化ポリペプチドに結合する能力を保持する。ある特定の実施形態では、配列番号５３では合計１～２０個のアミノ酸が置換、挿入および／または欠失されている。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号５３に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【0124】
いくつかの実施形態では、Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体は、表２Ａおよび表２Ｂに示されるように、抗体２Ｂ１２の１、２、３、４、５または６つのＣＤＲを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、表３に示されるように、抗体２Ｂ１２のＶＨおよび／またはＶＬを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、表４に示されるように、抗体２Ｂ１２の重鎖および／または軽鎖を含む。
【0125】
いくつかの実施形態では、Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体は、配列番号９のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列を含む。ある特定の実施形態では、ＶＨ配列は、配列番号９のアミノ酸配列と比較して置換（例えば、保存的置換）、挿入または欠失を含有するが、配列番号９を含む抗体としてＮ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する能力を保持する。ある特定の実施形態では、配列番号９では合計１～１３個のアミノ酸が置換、挿入および／または欠失されている。ある特定の実施形態では、置換、挿入または欠失は、ＣＤＲの外側の領域で（すなわち、ＦＲで）生じる。特定の実施形態では、ＶＨは、（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、（ｂ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、および（ｃ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３からなる群から選択される１、２または３つのＣＤＲを含む。
【0126】
別の態様では、Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体であって、配列番号１０のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む抗体が提供される。ある特定の実施形態では、ＶＬ配列は、配列番号１０のアミノ酸配列と比較して置換（例えば、保存的置換）、挿入または欠失を含有するが、配列番号１０を含む抗体としてＮ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する能力を保持する。ある特定の実施形態では、配列番号１０では合計１～１１個のアミノ酸が置換、挿入および／または欠失されている。ある特定の実施形態では、置換、挿入または欠失は、ＣＤＲの外側の領域で（すなわち、ＦＲで）生じる。特定の実施形態では、ＶＬは、（ａ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１、（ｂ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２、および（ｃ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３からなる群から選択される１、２または３つのＣＤＲを含む。
【0127】
一実施形態では、Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体は、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＶＬと、配列番号９のアミノ酸配列を含むＶＨとを含む。
【0128】
別の態様では、Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体であって、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、および配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３を含むＶＨと、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２、および配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含むＶＬとを含む抗体が提供される。
【0129】
別の態様では、Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体であって、配列番号９に記載の配列を有するＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２およびＶＨ ＣＤＲ３と、配列番号１０に記載の配列を有するＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３とを含む抗体が提供される。
【0130】
いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号５４のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する重鎖を含む。ある特定の実施形態では、重鎖配列は、配列番号５４のアミノ酸配列と比較して置換（例えば、保存的置換）、挿入または欠失を含有するが、配列番号５４を含む抗体としてＮ末端ユビキチン化ポリペプチドに結合する能力を保持する。ある特定の実施形態では、配列番号５２では合計１～２０個のアミノ酸が置換、挿入および／または欠失されている。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号５４に記載のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。
【0131】
いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号５５のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する軽鎖を含む。ある特定の実施形態では、軽鎖配列は、配列番号５５のアミノ酸配列と比較して置換（例えば、保存的置換）、挿入または欠失を含有するが、配列番号５５を含む抗体としてＮ末端ユビキチン化ポリペプチドに結合する能力を保持する。ある特定の実施形態では、配列番号５５では合計１～２０個のアミノ酸が置換、挿入および／または欠失されている。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号５５に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【0132】
いくつかの実施形態では、Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体は、表２Ａおよび表２Ｂに示されるように、抗体２Ｅ９の１、２、３、４、５または６つのＣＤＲを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、表３に示されるように、抗体２Ｅ９のＶＨおよび／またはＶＬを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、表４に示されるように、抗体２Ｅ９の重鎖および／または軽鎖を含む。
【0133】
いくつかの実施形態では、Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体は、配列番号１７のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列を含む。ある特定の実施形態では、ＶＨ配列は、配列番号１７のアミノ酸配列と比較して置換（例えば、保存的置換）、挿入または欠失を含有するが、配列番号１７を含む抗体としてＮ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する能力を保持する。ある特定の実施形態では、配列番号１７では合計１～１３個のアミノ酸が置換、挿入および／または欠失されている。ある特定の実施形態では、置換、挿入または欠失は、ＣＤＲの外側の領域で（すなわち、ＦＲで）生じる。特定の実施形態では、ＶＨは、（ａ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、（ｂ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、および（ｃ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３からなる群から選択される１、２または３つのＣＤＲを含む。
【0134】
別の態様では、Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドのペプチドに結合する抗体であって、配列番号１８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む抗体が提供される。ある特定の実施形態では、ＶＬ配列は、配列番号１８のアミノ酸配列と比較して置換（例えば、保存的置換）、挿入または欠失を含有するが、配列番号１８を含む抗体としてＮ末端ユビキチン化ポリペプチドに結合する能力を保持する。ある特定の実施形態では、配列番号１８では合計１～１１個のアミノ酸が置換、挿入および／または欠失されている。ある特定の実施形態では、置換、挿入または欠失は、ＣＤＲの外側の領域で（すなわち、ＦＲで）生じる。特定の実施形態では、ＶＬは、（ａ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１、（ｂ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２、および（ｃ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３からなる群から選択される１、２または３つのＣＤＲを含む。
【0135】
一実施形態では、Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体は、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＶＬと、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＶＨとを含む。
【0136】
別の態様では、Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体であって、配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、および配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３を含むＶＨと、配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２、および配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含むＶＬとを含む抗体が提供される。
【0137】
別の態様では、Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体であって、配列番号１７に記載の配列を有するＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２およびＶＨ ＣＤＲ３と、配列番号１８に記載の配列を有するＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３とを含む抗体が提供される。
【0138】
いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号５６のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する重鎖を含む。ある特定の実施形態では、重鎖配列は、配列番号５６のアミノ酸配列と比較して置換（例えば、保存的置換）、挿入または欠失を含有するが、配列番号５６を含む抗体としてＮ末端ユビキチン化ポリペプチドに結合する能力を保持する。ある特定の実施形態では、配列番号５６では合計１～２０個のアミノ酸が置換、挿入および／または欠失されている。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号５６に記載のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。
【0139】
いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号５７のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する軽鎖を含む。ある特定の実施形態では、軽鎖配列は、配列番号５７のアミノ酸配列と比較して置換（例えば、保存的置換）、挿入または欠失を含有するが、配列番号５７を含む抗体としてＮ末端ユビキチン化ポリペプチドに結合する能力を保持する。ある特定の実施形態では、配列番号５３では合計１～２０個のアミノ酸が置換、挿入および／または欠失されている。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号５７に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【0140】
いくつかの実施形態では、Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体は、表２Ａおよび表２Ｂに示されるように、抗体２Ｈ２の１、２、３、４、５または６つのＣＤＲを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、表３に示されるように、抗体２Ｈ２のＶＨおよび／またはＶＬを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、表４に示されるように、抗体２Ｈ２の重鎖および／または軽鎖を含む。
【0141】
いくつかの実施形態では、Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドのペプチドに結合する抗体は、配列番号２５のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列を含む。ある特定の実施形態では、ＶＨ配列は、配列番号２５のアミノ酸配列と比較して置換（例えば、保存的置換）、挿入または欠失を含有するが、配列番号２５を含む抗体としてＮ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する能力を保持する。ある特定の実施形態では、配列番号２５では合計１～１３個のアミノ酸が置換、挿入および／または欠失されている。ある特定の実施形態では、置換、挿入または欠失は、ＣＤＲの外側の領域で（すなわち、ＦＲで）生じる。特定の実施形態では、ＶＨは、（ａ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、（ｂ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、および（ｃ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３からなる群から選択される１、２または３つのＣＤＲを含む。
【0142】
別の態様では、Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体であって、配列番号２６のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む抗体が提供される。ある特定の実施形態では、ＶＬ配列は、配列番号２６のアミノ酸配列と比較して置換（例えば、保存的置換）、挿入または欠失を含有するが、配列番号２６を含む抗体としてＮ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する能力を保持する。ある特定の実施形態では、配列番号２６では合計１～１１個のアミノ酸が置換、挿入および／または欠失されている。ある特定の実施形態では、置換、挿入または欠失は、ＣＤＲの外側の領域で（すなわち、ＦＲで）生じる。特定の実施形態では、ＶＬは、（ａ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１、（ｂ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２、および（ｃ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３からなる群から選択される１、２または３つのＣＤＲを含む。
【0143】
一実施形態では、Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体は、配列番号２６のアミノ酸配列を含むＶＬと、配列番号２５のアミノ酸配列を含むＶＨとを含む。
【0144】
別の態様では、Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体であって、配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、および配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３を含むＶＨと、配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１、配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２、および配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含むＶＬとを含む抗体が提供される。
【0145】
別の態様では、Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体であって、配列番号２５に記載の配列を有するＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２およびＶＨ ＣＤＲ３と、配列番号２６に記載の配列を有するＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３とを含む抗体が提供される。
【0146】
いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号５８のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する重鎖を含む。ある特定の実施形態では、重鎖配列は、配列番号５８のアミノ酸配列と比較して置換（例えば、保存的置換）、挿入または欠失を含有するが、配列番号５８を含む抗体としてＮ末端ユビキチン化ポリペプチドに結合する能力を保持する。ある特定の実施形態では、配列番号５８では合計１～２０個のアミノ酸が置換、挿入および／または欠失されている。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号５８に記載のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。
【0147】
いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号５９のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する軽鎖を含む。ある特定の実施形態では、軽鎖配列は、配列番号５９のアミノ酸配列と比較して置換（例えば、保存的置換）、挿入または欠失を含有するが、配列番号５９を含む抗体としてＮ末端ユビキチン化ポリペプチドに結合する能力を保持する。ある特定の実施形態では、配列番号５９では合計１～２０個のアミノ酸が置換、挿入および／または欠失されている。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号５９に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【0148】
別の態様では、Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体であって、上に提供される実施形態のいずれかのようなＶＨと、上に提供される実施形態のいずれかのようなＶＬとを含む抗体が提供される。
【0149】
別の態様では、上記の実施形態のいずれかによる、または本明細書に記載されるＮ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体のうちの１つ以上を含む組成物が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、抗体のうちの１つ以上を含む組成物は、薬学的に許容される担体を含む。
【0150】
本明細書に記載のＮ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体を産生する方法も本明細書に提供される。
【0151】
３．抗体バリアント
ある特定の実施形態では、本明細書に提供されるＮ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体のアミノ酸配列バリアントが企図される。例えば、抗体の結合親和性および／または他の生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。抗体のアミノ酸配列バリアントは、抗体をコードするヌクレオチド配列中に適切な修飾を導入することによって、またはペプチド合成によって調製されてもよい。このような修飾としては、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、および／または抗体のアミノ酸配列内の残基への挿入、および／または抗体のアミノ酸配列内の残基の置換が挙げられる。最終コンストラクトが所望の特性、例えば、Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドへの結合を有する限り、最終コンストラクトに到達するために、欠失、挿入および置換の任意の組合せを行うことができる。
ある特定の実施形態では、本明細書に提供されるＮ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体のアミノ酸配列バリアントが企図される。例えば、抗体の結合親和性および／または他の生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。抗体のアミノ酸配列バリアントは、抗体をコードするヌクレオチド配列中に適切な修飾を導入することによって、またはペプチド合成によって調製されてもよい。このような修飾としては、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、および／または抗体のアミノ酸配列内の残基への挿入、および／または抗体のアミノ酸配列内の残基の置換が挙げられる。最終コンストラクトが所望の特性、例えば、Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドへの結合を有する限り、最終コンストラクトに到達するために、欠失、挿入および置換の任意の組合せを行うことができる。
【0152】
ある特定の実施形態では、１種以上のアミノ酸置換を有する抗体バリアントが提供される。置換変異誘発に関心のある部位には、ＣＤＲおよびＦＲが含まれる。好ましい保存的置換は、「好ましい置換」という見出しの下に表１に示される。さらに実質的な変化は、「例示的な置換」という見出しの下に表１に提供され、アミノ酸側鎖クラスを参照して以下にさらに記載される通りである。アミノ酸置換を目的の抗体に導入し、その産物を所望の活性、例えば抗原結合の保持／改善、免疫原性の低下またはＡＤＣＣもしくはＣＤＣの改善についてスクリーニングすることができる。
【0153】
アミノ酸は、共通する側鎖の特性に従って以下のように分類することができる。
・疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
・中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
・酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
・塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
・鎖配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
・芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
・疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
・中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
・酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
・塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
・鎖配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
・芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【0154】
非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーを別のクラスと交換することを伴う。
【0155】
ある種の置換バリアントは、親抗体（例えば、ヒト化抗体またはヒト抗体）の１つ以上の超可変領域残基またはＣＤＲ残基を置換することを伴う。一般に、さらなる試験のために選択される得られたバリアントは、親抗体と比較して特定の生物学的特性に修飾（例えば、改良）（例えば、親和性の増加、免疫原性の低下）を有する、および／または親抗体の特定の生物学的特性を実質的に保持する。例示的な置換バリアントは、アフィニティ成熟した抗体であり、例えば、本明細書に記載されるようなファージディスプレイに基づくアフィニティ成熟技術を用い、簡便に作成されてもよい。要約すると、１つ以上のＣＤＲ残基を変異させ、バリアント抗体をファージ上に提示し、特定の生物活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングする。
【0156】
例えば、抗体親和性を改善するために、ＣＤＲにおいて変更（例えば、置換）が行われ得る。そのような改変は、ＣＤＲ「ホットスポット」、すなわち、体細胞成熟過程中に高頻度で変異を経るコドンによってコードされた残基（例えば、Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｆｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０７：１７９－１９６（２００８）を参照）、および／またはＳＤＲ（ａ－ＣＤＲ）に対して行われてもよく、得られたバリアントＶＨまたはＶＬが結合親和性について試験される。二次ライブラリーを構築し、それから再選択することによる親和性成熟が、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １７８：１－３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，（２００１）．）に記載されている。親和性成熟のいくつかの実施形態では、様々な方法（例えば、エラープローンＰＣＲ、鎖シャッフリング、またはオリゴヌクレオチド指定突然変異）のいずれかによって、成熟のために選択される可変遺伝子に多様性が導入される。次いで、二次ライブラリーが作成される。次いで、このライブラリーをスクリーニングして、所望の親和性を持つ任意の抗体バリアントを同定する。多様性を導入する別の方法は、いくつかのＣＤＲ残基（例えば、一度に４～６残基）をランダム化するＣＤＲ指定手法を伴う。抗原結合に関与するＣＤＲ残基は、例えば、アラニンスキャニング突然変異誘発またはモデル化を使用して特異的に同定され得る。特に、ＣＤＲＨ３およびＣＤＲＬ３が多くの場合標的とされる。
【0157】
特定の実施形態において、置換、挿入、または欠失は、そのような改変が抗原に結合する抗体の能力を実質的に低下させない限り、１以上のＣＤＲ内で生じ得る。例えば、結合親和性を実質的に低減しない保存的改変（例えば、本明細書に提供される保存的置換）がＣＤＲに対して行われ得る。そのような変更は、ＣＤＲ「ホットスポット」またはＳＤＲの範囲外であり得る。上記で提供された変異体ＶＨおよびＶＬ配列の特定の実施形態では、各ＣＤＲは、改変されていないか、または１以上、２以上、または３以上のアミノ酸置換を含まない。
【0158】
突然変異誘発の標的となり得る、抗体の残基または領域を同定するための有用な方法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１－１０８５に記載されているように「アラニンスキャニング突然変異誘発」と呼ばれる。この方法では、抗体と抗原との相互作用が影響を受けるかどうかを決定するために、標的残基のうちのある残基または群（例えば、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、ＬｙｓおよびＧｌｕなどの荷電残基）が同定され、中性または負に荷電したアミノ酸（例えばアラニンまたはポリアラニン）によって置き換えられる。更なる置換が、最初の置換に対する機能的感受性を示すアミノ酸の位置に導入され得る。
【0159】
これに代えて、またはこれに加えて、抗体と抗原との間の接点を同定するための抗原－抗体複合体の結晶構造。そのような接触残基および隣接残基は、置換の候補として、標的化または排除され得る。バリアントをスクリーニングして、所望の特性を含むかどうかを決定することができる。
【0160】
アミノ酸配列挿入物には、１個の残基から１００個以上の残基を含むポリペプチドまでの長さの範囲のアミノ末端および／またはカルボキシル末端融合体、ならびに単一または多数のアミノ酸残基の配列内挿入物が含まれる。末端挿入物の例には、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体が含まれる。抗体分子の他の挿入バリアントには、酵素（例えば、ＡＤＥＰＴのための）またはポリペプチドへの抗体のＮ末端もしくはＣ末端への融合が含まれ、これは抗体の血清半減期を増加させる。
【0161】
Ｂ．核酸、ベクター、宿主細胞
Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体をコードする核酸も本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、核酸は、本明細書中に記載される抗体のいずれかをコードする。
Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体をコードする核酸も本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、核酸は、本明細書中に記載される抗体のいずれかをコードする。
【0162】
いくつかの実施形態では、核酸は、Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体をコードし、抗体は、可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）を含み、抗体は、アミノ酸配列ＸＸＸＭＮ（配列番号３５）を含むＣＤＲＨ１と、アミノ酸配列ＸＸＸＸＸＧＸＸＹＹＡＴＷＡ（配列番号３６）を含むＣＤＲＨ２と、アミノ酸配列ＤＤＸＸＸＸＮＸ（配列番号３７）を含むＣＤＲＨ３とを含み、抗体は、配列番号ＱＳＸＸＳＶＹＸＸＮＸＬＸ（配列番号３８）に記載のＣＤＲＬ１配列と、アミノ酸配列ＸＡＳＴＬＸＳ（配列番号３９）を含むＣＤＲＬ２と、アミノ酸配列ＬＧＸＸＤＣＸＳＸＤＣＸＸ（配列番号４０）を含むＣＤＲＬ３とを含み、Ｘは任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号３３に記載のアミノ酸を含むＶＨを含む抗体をコードする。いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号３４に記載のアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体をコードする。いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号３３に記載のアミノ酸を含むＶＨと、配列番号３４に記載のアミノ酸配列を含むＶＬとを含む抗体をコードする。
【0163】
いくつかの実施形態では、核酸は、Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体をコードし、抗体は、表２Ａおよび表２Ｂに示されるように、抗体１Ｃ７の１、２、３、４、５または６つのＣＤＲを含む。いくつかの実施形態では、核酸は、表３に示されるように、抗体１Ｃ７のＶＨおよび／またはＶＬを含む抗体をコードする。いくつかの実施形態では、核酸は、表４に示されるように、抗体１Ｃ７の重鎖および／または軽鎖を含む抗体をコードする。
【0164】
いくつかの実施形態では、核酸は、Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体をコードし、抗体は、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列を含む。ある特定の実施形態では、核酸は、配列番号１のアミノ酸配列と比較して置換（例えば、保存的置換）、挿入または欠失を含有するが、配列番号１を含む抗体としてＮ末端ユビキチン化ポリペプチドに結合する能力を保持するＶＨ配列をコードする。ある特定の実施形態では、配列番号１では合計１～１３個のアミノ酸が置換、挿入および／または欠失されている。ある特定の実施形態では、置換、挿入または欠失は、ＣＤＲの外側の領域で（すなわち、ＦＲで）生じる。特定の実施形態では、核酸は、（ａ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、および（ｃ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３からなる群から選択される１、２または３つのＣＤＲを含むＶＨを含む抗体をコードする。
【0165】
別の態様では、Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体をコードする核酸が提供され、抗体は、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。ある特定の実施形態では、核酸は、配列番号２のアミノ酸配列と比較して置換（例えば、保存的置換）、挿入または欠失を含有するが、配列番号２を含む抗体としてＮ末端ユビキチン化ポリペプチドに結合する能力を保持するＶＬ配列を含む抗体をコードする。ある特定の実施形態では、配列番号２では合計１～１１個のアミノ酸が置換、挿入および／または欠失されている。ある特定の実施形態では、置換、挿入または欠失は、ＣＤＲの外側の領域で（すなわち、ＦＲで）生じる。特定の実施形態では、核酸は、（ａ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１、（ｂ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２、および（ｃ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３からなる群から選択される１、２または３つのＣＤＲを含むＶＬを含む抗体をコードする。
【0166】
一実施形態では、核酸は、Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体をコードし、抗体は、配列番号２のアミノ酸配列を含むＶＬと、配列番号１のアミノ酸配列を含むＶＨとを含む。
【0167】
別の態様では、Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体をコードする核酸が提供され、抗体は、配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、および配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３を含むＶＨと、配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１、配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２、および配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含むＶＬとを含む。
【0168】
別の態様では、Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体をコードする核酸が提供され、抗体は、配列番号１に記載の配列を有するＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２およびＶＨ ＣＤＲ３と、配列番号２に記載の配列を有するＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３とを含む。
【0169】
いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号５２のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する重鎖を含む抗体をコードする。ある特定の実施形態では、重鎖配列は、配列番号５２のアミノ酸配列と比較して置換（例えば、保存的置換）、挿入または欠失を含有するが、配列番号５２を含む抗体としてＮ末端ユビキチン化ポリペプチドに結合する能力を保持する。ある特定の実施形態では、配列番号５２では合計１～２０個のアミノ酸が置換、挿入および／または欠失されている。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号５２に記載のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。
【0170】
いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号５３のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する軽鎖を含む抗体をコードする。ある特定の実施形態では、軽鎖配列は、配列番号５３のアミノ酸配列と比較して置換（例えば、保存的置換）、挿入または欠失を含有するが、配列番号５３を含む抗体としてＮ末端ユビキチン化ポリペプチドに結合する能力を保持する。ある特定の実施形態では、配列番号５３では合計１～２０個のアミノ酸が置換、挿入および／または欠失されている。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号５３に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【0171】
いくつかの実施形態では、核酸は、Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体をコードし、抗体は、表２Ａおよび表２Ｂに示されるように、抗体２Ｂ１２の１、２、３、４、５または６つのＣＤＲを含む。いくつかの実施形態では、核酸は、表３に示されるように、抗体２Ｂ１２のＶＨおよび／またはＶＬを含む抗体をコードする。いくつかの実施形態では、核酸は、表４に示されるように、抗体２Ｂ１２の重鎖および／または軽鎖を含む抗体をコードする。
【0172】
いくつかの実施形態では、核酸は、Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体をコードし、抗体は、配列番号９のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列を含む。ある特定の実施形態では、核酸は、配列番号９のアミノ酸配列と比較して置換（例えば、保存的置換）、挿入または欠失を含有するが、配列番号９を含む抗体としてＮ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する能力を保持するＶＨ配列を含む抗体をコードする。ある特定の実施形態では、配列番号９では合計１～１３個のアミノ酸が置換、挿入および／または欠失されている。ある特定の実施形態では、置換、挿入または欠失は、ＣＤＲの外側の領域で（すなわち、ＦＲで）生じる。特定の実施形態では、核酸は、（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、（ｂ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、および（ｃ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３からなる群から選択される１、２または３つのＣＤＲを含むＶＨを含む抗体をコードする。
【0173】
別の態様では、Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体をコードする核酸が提供され、抗体は、配列番号１０のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。ある特定の実施形態では、核酸は、配列番号１０のアミノ酸配列と比較して置換（例えば、保存的置換）、挿入または欠失を含有するが、配列番号１０を含む抗体としてＮ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する能力を保持するＶＬ配列を含む抗体をコードする。ある特定の実施形態では、配列番号１０では合計１～１１個のアミノ酸が置換、挿入および／または欠失されている。ある特定の実施形態では、置換、挿入または欠失は、ＣＤＲの外側の領域で（すなわち、ＦＲで）生じる。特定の実施形態では、核酸は、（ａ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１、（ｂ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２、および（ｃ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３からなる群から選択される１、２または３つのＣＤＲを含むＶＬを含む抗体をコードする。
【0174】
一実施形態では、核酸は、Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体をコードし、抗体は、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＶＬと、配列番号９のアミノ酸配列を含むＶＨとを含む。
【0175】
別の態様では、Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体をコードする核酸が提供され、抗体は、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、および配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３を含むＶＨと、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２、および配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含むＶＬとを含む。
【0176】
別の態様では、Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体をコードする核酸が提供され、抗体は、配列番号９に記載の配列を有するＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２およびＶＨ ＣＤＲ３と、配列番号１０に記載の配列を有するＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３とを含む。
【0177】
いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号５４のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する重鎖を含む抗体をコードする。ある特定の実施形態では、重鎖配列は、配列番号５４のアミノ酸配列と比較して置換（例えば、保存的置換）、挿入または欠失を含有するが、配列番号５４を含む抗体としてＮ末端ユビキチン化ポリペプチドに結合する能力を保持する。ある特定の実施形態では、配列番号５４では合計１～２０個のアミノ酸が置換、挿入および／または欠失されている。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号５４に記載のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。
【0178】
いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号５５のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する軽鎖を含む抗体をコードする。ある特定の実施形態では、軽鎖配列は、配列番号５５のアミノ酸配列と比較して置換（例えば、保存的置換）、挿入または欠失を含有するが、配列番号５５を含む抗体としてＮ末端ユビキチン化ポリペプチドに結合する能力を保持する。ある特定の実施形態では、配列番号５５では合計１～２０個のアミノ酸が置換、挿入および／または欠失されている。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号５５に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【0179】
いくつかの実施形態では、核酸は、Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体をコードし、抗体は、表２Ａおよび表２Ｂに示されるように、抗体２Ｅ９の１、２、３、４、５または６つのＣＤＲを含む。いくつかの実施形態では、核酸は、表３に示されるように、抗体２Ｅ９のＶＨおよび／またはＶＬを含む抗体をコードする。いくつかの実施形態では、核酸は、表４に示されるように、抗体２Ｅ９の重鎖および／または軽鎖を含む抗体をコードする。
【0180】
いくつかの実施形態では、核酸は、Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体をコードし、抗体は、配列番号１７のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列を含む。ある特定の実施形態では、核酸は、配列番号１７のアミノ酸配列と比較して置換（例えば、保存的置換）、挿入または欠失を含有するが、配列番号１７を含む抗体としてＮ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する能力を保持するＶＨ配列を含む抗体をコードする。ある特定の実施形態では、配列番号１７では合計１～１３個のアミノ酸が置換、挿入および／または欠失されている。ある特定の実施形態では、置換、挿入または欠失は、ＣＤＲの外側の領域で（すなわち、ＦＲで）生じる。特定の実施形態では、核酸は、（ａ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、（ｂ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、および（ｃ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３からなる群から選択される１、２または３つのＣＤＲを含むＶＨを含む抗体をコードする。
【0181】
別の態様では、Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドのペプチドに結合する抗体をコードする核酸が提供され、抗体は、配列番号１８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。ある特定の実施形態では、核酸は、配列番号１８のアミノ酸配列と比較して置換（例えば、保存的置換）、挿入または欠失を含有するが、配列番号１８を含む抗体としてＮ末端ユビキチン化ポリペプチドに結合する能力を保持するＶＬ配列を含む抗体をコードする。ある特定の実施形態では、配列番号１８では合計１～１１個のアミノ酸が置換、挿入および／または欠失されている。ある特定の実施形態では、置換、挿入または欠失は、ＣＤＲの外側の領域で（すなわち、ＦＲで）生じる。特定の実施形態では、核酸は、（ａ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１、（ｂ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２、および（ｃ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３からなる群から選択される１、２または３つのＣＤＲを含むＶＬを含む抗体をコードする。
【0182】
一実施形態では、核酸は、Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体をコードし、抗体は、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＶＬと、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＶＨとを含む。
【0183】
別の態様では、Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体をコードする核酸が提供され、抗体は、配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、および配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３を含むＶＨと、配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２、および配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含むＶＬとを含む。
【0184】
別の態様では、Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体をコードする核酸が提供され、抗体は、配列番号１７に記載の配列を有するＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２およびＶＨ ＣＤＲ３と、配列番号１８に記載の配列を有するＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３とを含む。
【0185】
いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号５６のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する重鎖を含む抗体をコードする。ある特定の実施形態では、重鎖配列は、配列番号５６のアミノ酸配列と比較して置換（例えば、保存的置換）、挿入または欠失を含有するが、配列番号５２を含む抗体としてＮ末端ユビキチン化ポリペプチドに結合する能力を保持する。ある特定の実施形態では、配列番号５６では合計１～２０個のアミノ酸が置換、挿入および／または欠失されている。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号５６に記載のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。
【0186】
いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号５７のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する軽鎖を含む抗体をコードする。ある特定の実施形態では、軽鎖配列は、配列番号５７のアミノ酸配列と比較して置換（例えば、保存的置換）、挿入または欠失を含有するが、配列番号５７を含む抗体としてＮ末端ユビキチン化ポリペプチドに結合する能力を保持する。ある特定の実施形態では、配列番号５７では合計１～２０個のアミノ酸が置換、挿入および／または欠失されている。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号５７に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【0187】
いくつかの実施形態では、核酸は、Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体をコードし、抗体は、表２Ａおよび表２Ｂに示されるように、抗体２Ｈ２の１、２、３、４、５または６つのＣＤＲを含む。いくつかの実施形態では、核酸は、表３に示されるように、抗体２Ｈ２のＶＨおよび／またはＶＬを含む抗体をコードする。いくつかの実施形態では、核酸は、表４に示されるように、抗体２Ｈ２の重鎖および／または軽鎖を含む抗体をコードする。
【0188】
いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号２５のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列を含む、Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドのペプチドに結合する抗体をコードする。ある特定の実施形態では、核酸は、配列番号２５のアミノ酸配列と比較して置換（例えば、保存的置換）、挿入または欠失を含有するが、配列番号２５を含む抗体としてＮ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する能力を保持するＶＨ配列を含む抗体をコードする。ある特定の実施形態では、配列番号２５では合計１～１３個のアミノ酸が置換、挿入および／または欠失されている。ある特定の実施形態では、置換、挿入または欠失は、ＣＤＲの外側の領域で（すなわち、ＦＲで）生じる。特定の実施形態では、核酸は、（ａ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、（ｂ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、および（ｃ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３からなる群から選択される１、２または３つのＣＤＲを含むＶＨを含む抗体をコードする。
【0189】
別の態様では、Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体をコードする核酸が提供され、抗体は、配列番号２６のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。ある特定の実施形態では、核酸は、配列番号２６のアミノ酸配列と比較して置換（例えば、保存的置換）、挿入または欠失を含有するが、配列番号２６を含む抗体としてＮ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する能力を保持するＶＬ配列を含む抗体をコードする。ある特定の実施形態では、配列番号２６では合計１～１１個のアミノ酸が置換、挿入および／または欠失されている。ある特定の実施形態では、置換、挿入または欠失は、ＣＤＲの外側の領域で（すなわち、ＦＲで）生じる。特定の実施形態では、核酸は、（ａ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１、（ｂ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２、および（ｃ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３からなる群から選択される１、２または３つのＣＤＲを含むＶＬを含む抗体をコードする。
【0190】
一実施形態では、核酸は、Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体をコードし、抗体は、配列番号２６のアミノ酸配列を含むＶＬと、配列番号２５のアミノ酸配列を含むＶＨとを含む。
【0191】
別の態様では、Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体をコードする核酸が提供され、抗体は、配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、および配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３を含むＶＨと、配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１、配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２、および配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含むＶＬとを含む。
【0192】
別の態様では、Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体をコードする核酸が提供され、抗体は、配列番号２５に記載の配列を有するＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２およびＶＨ ＣＤＲ３と、配列番号２６に記載の配列を有するＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３とを含む。
【0193】
いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号５８のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する重鎖を含む抗体をコードする。ある特定の実施形態では、重鎖配列は、配列番号５８のアミノ酸配列と比較して置換（例えば、保存的置換）、挿入または欠失を含有するが、配列番号５８を含む抗体としてＮ末端ユビキチン化ポリペプチドに結合する能力を保持する。ある特定の実施形態では、配列番号５８では合計１～２０個のアミノ酸が置換、挿入および／または欠失されている。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号５８に記載のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。
【0194】
いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号５９のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する軽鎖を含む抗体をコードする。ある特定の実施形態では、軽鎖配列は、配列番号５９のアミノ酸配列と比較して置換（例えば、保存的置換）、挿入または欠失を含有するが、配列番号５９を含む抗体としてＮ末端ユビキチン化ポリペプチドに結合する能力を保持する。ある特定の実施形態では、配列番号５９では合計１～２０個のアミノ酸が置換、挿入および／または欠失されている。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号５９に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【0195】
別の態様では、Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体をコードする核酸が提供され、抗体は、上に提供される実施形態のいずれかのようなＶＨと、上に提供される実施形態のいずれかのようなＶＬとを含む。
【0196】
本明細書に記載の核酸のいずれか１つを含むベクターも本明細書に提供される。ベクター、および／または本明細書に記載の核酸のいずれか１つを含む宿主細胞も本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、宿主細胞は単離または精製される。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、細胞培地中にある。
【0197】
抗体産生のために、本明細書に記載の核酸を含むベクターは、例えば、ＮＳ０細胞などの当技術分野で公知の適切な産生細胞株に導入され得る。発現ベクターの導入は、エレクトロポレーションまたは当技術分野で利用可能な任意の他の適切な形質転換技術による同時トランスフェクションによって達成され得る。次いで、抗体産生細胞株を選択し、増殖させ、ヒト化抗体を精製し得る。次いで、精製された抗体を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥなどのカノニカルな技術によって分析し得る。
【0198】
Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体をコードする核酸を含む宿主細胞も提供される。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、本明細書に記載の抗体のいずれかをコードする核酸を含む。抗体をコードするベクターのクローニングまたは発現のための適切な宿主細胞には、本明細書に記載の原核細胞または真核細胞が含まれる。例えば、特に、グリコシル化およびＦｃエフェクター機能が必要ない場合には、抗体は細菌内で産生されてもよい。細菌内の抗体断片およびポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第５，６４８，２３７号、米国特許第５，７８９，１９９号および米国特許第５，８４０，５２３号を参照されたい。（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内の抗体断片の発現を記載しているＣｈａｒｌｔｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００３），ｐｐ．２４５－２５４も参照。）発現後、抗体は、可溶性画分中の細菌細胞ペーストから単離されてもよく、さらに精製され得る。
【0199】
抗体をコードするベクターのクローニングまたは発現宿主としては、原核生物に加えて、糸状菌や酵母などの真核微生物が適しており、その中にはグリコシル化経路が「ヒト化」されており、結果として部分的または完全にヒトのグリコシル化パターンを有する抗体を産生する真菌株や酵母株も含まれる。Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２２：１４０９－１４１４（２００４）、およびＬｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２４：２１０－２１５（２００６）を参照されたい。
【0200】
また、グリコシル化抗体を発現させるのに適した宿主細胞は、多細胞生物（無脊椎動物および脊椎動物）に由来する。無脊椎動物細胞の例には、植物細胞および昆虫細胞が含まれる。昆虫細胞と組み合わせて、特にヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞のトランスフェクションに使用され得るバキュロウイルス株が数多く同定されている。
【0201】
植物細胞培養物も、宿主として利用することができる。例えば、（トランスジェニック植物において抗体を産生するためのＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ（商標）技術を記載している）米国特許第５，９５９，１７７号、米国特許第６，０４０，４９８号、米国特許第６，４２０，５４８号、米国特許第７，１２５，９７８号および米国特許第６，４１７，４２９号を参照されたい。
【0202】
脊椎動物細胞も、宿主として使用される。例えば、懸濁液中で増殖するように適合されている哺乳動物細胞株は有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ－７）によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株、ヒト胚腎臓系統（例えば、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７）に記載される２９３または２９３細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスセルトリ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３－２５１（１９８０）に記載されるＴＭ４細胞）、サル腎臓細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６）、ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）、マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２）、例えば、Ｍａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ｎ Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４－６８（１９８２）に記載されるＴＲＩ細胞、ＭＲＣ ５細胞、およびＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株には、ＤＨＦＲ－ＣＨＯ細胞（Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６（１９８０））を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ならびに骨髄腫細胞株、例えば、Ｙ０、ＮＳ０およびＳｐ２／０が含まれる。抗体産生に適した特定の哺乳動物宿主細胞株の概説については、例えば、Ｙａｚａｋｉ ａｎｄ Ｗｕ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ），ｐｐ．２５５－２６８（２００３）を参照されたい。
【0203】
モノクローナル抗体（本明細書に記載されるように、ペプチドのＮ末端のアミノ酸配列ＧＧＸに結合する抗体であって、分岐ジグリシン（Ｋ－ε－ＧＧ）を含むアミノ酸配列に結合しない抗体を含む）は、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）によって最初に記載されたハイブリドーマ法を使用して作製され得るか、または組換えＤＮＡ法（米国特許第４，８１６，５６７号）によって作製され得る。
【0204】
ハイブリドーマ法では、マウスまたは他の適切な宿主動物、例えば、ハムスターまたはマカクザルが、本明細書に上記されるように免疫化されて、免疫化のために使用されるタンパク質に特異的に結合する抗体を産生するか、または産生することができるリンパ球が誘発される。あるいは、リンパ球をｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫化してもよい。次いで、ポリエチレングリコールなどの好適な融剤を使用してリンパ球を骨髄腫細胞と融合させて、ハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９－１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８６））。そのように調製されたハイブリドーマ細胞は、融合されていない親骨髄腫細胞の成長または生存を阻害する１つ以上の物質を好ましくは含有する好適な培養培地に播種され、成長する。例えば、親骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠く場合、ハイブリドーマ用の培養培地は、典型的には、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン（ＨＡＴ培地）を含み、これらの物質は、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の成長を阻害する。
【0205】
好ましい骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定した高レベルの産生を支持し、ＨＡＴ培地等の培地に感受性があるものである。これらのうち、好ましい骨髄腫細胞株は、マウス骨髄腫株、例えば、Ｓａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＵＳＡから入手可能なＭＯＰＣ－２１およびＭＰＣ－１１マウス腫瘍、ならびにＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ ＵＳＡから入手可能なＳＰ－２またはＸ６３－Ａｇ８－６５３細胞由来のものである。ヒト骨髄腫およびマウス－ヒトヘテロ骨髄腫細胞株も、ヒトモノクローナル抗体の産生について記載されている（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．ｌｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１－６３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７））。
【0206】
ハイブリドーマ細胞が増殖している培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の産生についてアッセイする。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されたモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降法によって、またはｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイ、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）もしくは酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によって決定される。
【0207】
所望の特異性、親和性および／または活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が同定された後、限界希釈手順によってクローンをサブクローニングし、標準的な方法によって増殖させてもよい（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９－１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８６））。この目的に好適な培養培地としては、例えば、Ｄ－ＭＥＭ培地またはＲＰＭＩ－１６４０培地が挙げられる。加えて、ハイブリドーマ細胞は、動物の腹水腫瘍としてｉｎ ｖｉｖｏで増殖させてもよい。
【0208】
サブクローンによって分泌されるモノクローナル抗体は、従来の免疫グロブリン精製手順、例えば、プロテインＡ－セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析またはアフィニティークロマトグラフィーなどによって、培地、腹水または血清から好適に分離される。
【0209】
抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）容易に単離され、配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、そのようなＤＮＡの好ましい供給源として機能する。単離されると、ＤＮＡは発現ベクター内に配置され得、これは次いで、宿主細胞、例えば、大腸菌細胞、シミアンＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または免疫グロブリンタンパク質を産生しない骨髄腫細胞にトランスフェクトされて、組換え宿主細胞内のモノクローナル抗体の合成体が得られる。
【0210】
ＤＮＡはまた、例えば、相同マウス配列の代わりにヒト重鎖定常ドメインおよびヒト軽鎖定常ドメインのコード配列を置換することによって（米国特許第４，８１６，５６７号、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１（１９８４））、または非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全部もしくは一部を免疫グロブリンコード配列に共有結合することによって修飾され得る。
【0211】
典型的には、かかる非免疫グロブリンポリペプチドは、抗体の定常ドメインの代わりに置換されるか、またはそれらは、抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインの代わりに置換されて、抗原に対して特異性を有する１つの抗原結合部位、および異なる抗原に対して特異性を有する別の抗原結合部位を含むキメラ二価抗体を作製する。
【0212】
Ｃ．スクリーニング方法
Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体であって、ペプチドのＮ末端のアミノ酸配列ＧＧＸに結合し、分岐ジグリシン（Ｋ－ε－ＧＧ）を含むアミノ酸配列に結合しない抗体をスクリーニングする方法も本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、Ｘは任意のアミノ酸である。
Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体であって、ペプチドのＮ末端のアミノ酸配列ＧＧＸに結合し、分岐ジグリシン（Ｋ－ε－ＧＧ）を含むアミノ酸配列に結合しない抗体をスクリーニングする方法も本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、Ｘは任意のアミノ酸である。
【0213】
いくつかの実施形態では、方法は、ｉ）抗体ライブラリーを提供すること、ｉｉ）Ｎ末端にアミノ酸配列ＧＧＸ（Ｘは任意のアミノ酸である）を含むペプチドに結合する抗体を正に選択すること、およびｉｉｉ）アミノ酸配列Ｋ－ε－ＧＧを含むペプチドに結合する抗体を負に選択し、それによって、Ｎ末端にアミノ酸配列ＧＧＸを含むペプチドに特異的に結合し、アミノ酸配列Ｋ－ε－ＧＧに結合しない抗体を産生することを含む。いくつかの実施形態では、工程ｉｉ）では、Ｎ末端にアミノ酸配列ＧＧＭを含むペプチドに結合する抗体が正に選択される。いくつかの実施形態では、工程ｉｉ）では、Ｎ末端にＧＧＡ、ＧＧＥ、ＧＧＦ、ＧＧＧ、ＧＧＨ、ＧＧＩ、ＧＧＬ、ＧＧＭ、ＧＧＮ、ＧＧＱ、ＧＧＳ、ＧＧＴ、ＧＧＶおよびＧＧＷからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドに結合する抗体が正に選択される。
【0214】
いくつかの実施形態では、方法は、抗体ライブラリーを提供することと、Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドのＮ末端のアミノ酸配列ＧＧＸに結合する抗体を正に選択することとを含む。いくつかの実施形態では、ファージディスプレイライブラリーが提供される。いくつかの実施形態では、酵母ディスプレイライブラリーが提供される。いくつかの実施形態では、細菌ディスプレイライブラリーが提供される。
【0215】
本明細書に提供される抗体ライブラリーは、様々な供給源由来の抗体を含み得る。例えば、いくつかの実施形態では、合成抗体のライブラリーが提供される。いくつかの実施形態では、ヒトナイーブ抗体のライブラリーが提供される。いくつかの実施形態では、ラクダ抗体のライブラリーが提供される。いくつかの実施形態では、マウス抗体ライブラリーが提供される。いくつかの実施形態では、ウサギ抗体のライブラリーが提供される。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体のライブラリーが提供される。
【0216】
いくつかの実施形態では、ライブラリーは、Ｎ末端にアミノ酸配列ＧＧＭを含むペプチドを含むペプチドライブラリーを用いて哺乳動物を免疫化することによって生成される。いくつかの実施形態では、ライブラリーは、免疫された哺乳動物から抗体をクローニングすることによって作製される。いくつかの実施形態では、免疫化された哺乳動物は、齧歯類（例えば、マウス）またはウサギである。いくつかの実施形態では、哺乳動物をペプチドライブラリーで免疫する。いくつかの実施形態では、哺乳動物は、Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのライブラリーによって免疫化される。いくつかの実施形態では、哺乳動物は、ペプチドのＮ末端にアミノ酸配列ＧＧＸを含むペプチドを含むＮ末端ユビキチン化ポリペプチドによって免疫化される。いくつかの実施形態では、哺乳動物は、ペプチドのＮ末端にアミノ酸配列ＧＧＭを含むペプチドを含むＮ末端ユビキチン化ポリペプチドによって免疫化される。
【0217】
Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドのＮ末端のアミノ酸配列ＧＧＸに結合する抗体を産生および／またはスクリーニングするために使用され得るペプチドライブラリーも本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、Ｘは任意のアミノ酸である。
【0218】
いくつかの実施形態では、抗体ライブラリーは、Ｎ末端にアミノ酸配列ＧＧＭを含むペプチドに結合する抗体について正に選択される。いくつかの実施形態では、抗体ライブラリーは、ファージパニングによって正に選択される。いくつかの実施形態では、抗体ライブラリーは、固体支持体に結合した、Ｎ末端にアミノ酸配列ＧＧＭを含む１つ以上のペプチドとともにインキュベートされる。いくつかの実施形態では、未結合抗体を洗浄によって除去し、結合抗体をＨＣｌで溶出する。いくつかの実施形態では、ライブラリーは、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、または５回超正に選択される。いくつかの実施形態では、抗体ライブラリーは、実施例１（例えば、実施例１、材料および方法、ファージライブラリーの生成および選択を参照）に記載の方法に従って正に選択される。
【0219】
いくつかの実施形態では、抗体ライブラリーは、１つ以上のＮ末端ユビキチン化ポリペプチドとインキュベートすることによって正に選択される。いくつかの実施形態では、抗体ライブラリーは、Ｎ末端にアミノ酸配列ＧＧＭを含む１つ以上のペプチドとインキュベートすることによって正に選択される。
【0220】
いくつかの実施形態では、複数回の正の選択が、各回に異なるペプチドを用いて行われる。いくつかの実施形態では、複数ラウンドの正の選択は、各ラウンドにおいて同じペプチドを用いて行われる。
【0221】
いくつかの実施形態では、抗体ライブラリーは、アミノ酸配列Ｋ－ε－ＧＧを含むペプチドに結合する抗体について負に選択される。いくつかの実施形態では、負の選択は、アミノ酸配列Ｋ－ε－ＧＧを含むペプチドとともに抗体ライブラリーをインキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、負の選択は、固体基質に結合した、アミノ酸配列Ｋ－ε－ＧＧを含むペプチドとともに抗体ライブラリーをインキュベートし、上清を保持し、結合した抗体を廃棄することを含む。いくつかの実施形態では、負の選択は、アミノ酸配列Ｋ－ε－ＧＧを含む遊離ペプチドとともに抗体ライブラリーをインキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、負の選択は、実施例１（例えば、実施例１、材料および方法、ファージライブラリーの生成および選択を参照）に記載の方法に従って行われる。
【0222】
いくつかの実施形態では、正の選択および負の選択は同時に行われる。いくつかの実施形態では、抗体ライブラリーは、固体支持体に結合した、Ｎ末端にアミノ酸配列ＧＧＭを含む１つ以上のペプチドとともにインキュベートされ、アミノ酸配列Ｋ－ε－ＧＧを含む１つ以上の未結合ペプチドとともにインキュベートされる。いくつかの実施形態では、固体基質に結合した抗体が選択される。
【0223】
いくつかの実施形態では、正の選択および負の選択は同時に行われる。いくつかの実施形態では、抗体ライブラリーは、Ｎ末端にアミノ酸配列ＧＧＭを含む１つ以上の未結合ペプチドとともにインキュベートされ、固体支持体に結合した、アミノ酸配列Ｋ－ε－ＧＧを含む１つ以上のペプチドとともにインキュベートされる。いくつかの実施形態では、固体基質に結合していない抗体が選択される。
【0224】
いくつかの実施形態では、正の選択および負の選択は連続的である。例えば、いくつかの実施形態では、抗体ライブラリーは、Ｎ末端にアミノ酸配列ＧＧＭを含むペプチドに結合する抗体について最初に正に選択され、次いで、アミノ酸配列Ｋ－ε－ＧＧを含むペプチドに結合する抗体について負に選択される。いくつかの実施形態では、抗体ライブラリーは、アミノ酸配列Ｋ－ε－ＧＧを含むペプチドに結合する抗体について最初に負に選択され、次いで、Ｎ末端にアミノ酸配列ＧＧＭを含むペプチドに結合する抗体について正に選択される。
【0225】
いくつかの実施形態では、正の選択および負の選択の工程は、２回以上繰り返される。例えば、いくつかの実施形態では、正の選択および負の選択は、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、または少なくとも５回繰り返される。
【0226】
いくつかの実施形態では、選択された抗体は、ペプチドのＮ末端にアミノ酸配列ＧＧＸを含むペプチドに結合するが、Ｋ－ε－ＧＧを含むアミノ酸配列には結合しないことを確認するためにアッセイされる。いくつかの実施形態では、抗体は、ＥＬＩＳＡまたはＳＰＲを使用してアッセイされる。いくつかの実施形態では、抗体は、実施例１（例えば、実施例１、材料および方法、ｐＡｂ ＥＬＩＳＡおよびモノクローナル抗体ＥＬＩＳＡを参照）に記載の方法に従ってアッセイされる。いくつかの実施形態では、抗体は、ユビキチン化アッセイでアッセイされる。例示的なユビキチン化アッセイ方法は、実施例５に記載されている。
【0227】
本明細書に記載のスクリーニング方法によって産生される抗体も本明細書に提供される。
【0228】
Ｄ．試料中のＮ末端ユビキチン化ペプチドを濃縮する方法
ペプチドの混合物を含む試料中のＮ末端ユビキチン化ペプチドを濃縮する方法も本明細書に提供される。さらに、Ｎ末端ユビキチン化ペプチドのライブラリーが提供される。
ペプチドの混合物を含む試料中のＮ末端ユビキチン化ペプチドを濃縮する方法も本明細書に提供される。さらに、Ｎ末端ユビキチン化ペプチドのライブラリーが提供される。
【0229】
１．濃縮方法
ペプチドの混合物を含む試料中のＮ末端ユビキチン化ペプチドを濃縮する方法が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、方法は、ｉ）試料を、Ｎ末端ユビキチン化タンパク質のペプチドに結合する抗体と接触させること、およびｉｉ）試料から抗体結合ペプチドを選択することを含み、抗体は、Ｎ末端のアミノ酸配列ＧＧＸに結合し、抗体は、分岐ジグリシン（Ｋ－ε－ＧＧ）を含むアミノ酸配列に結合しない。いくつかの実施形態では、Ｘは任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、抗体は、本明細書に記載のＮ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体のいずれか１つである。いくつかの実施形態では、１つ以上の抗体、例えば、抗体の等モル混合物が使用される。いくつかの実施形態では、１Ｃ７、２Ｂ１２、２Ｅ９および２Ｈ２の等モル混合物が使用される。
ペプチドの混合物を含む試料中のＮ末端ユビキチン化ペプチドを濃縮する方法が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、方法は、ｉ）試料を、Ｎ末端ユビキチン化タンパク質のペプチドに結合する抗体と接触させること、およびｉｉ）試料から抗体結合ペプチドを選択することを含み、抗体は、Ｎ末端のアミノ酸配列ＧＧＸに結合し、抗体は、分岐ジグリシン（Ｋ－ε－ＧＧ）を含むアミノ酸配列に結合しない。いくつかの実施形態では、Ｘは任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、抗体は、本明細書に記載のＮ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体のいずれか１つである。いくつかの実施形態では、１つ以上の抗体、例えば、抗体の等モル混合物が使用される。いくつかの実施形態では、１Ｃ７、２Ｂ１２、２Ｅ９および２Ｈ２の等モル混合物が使用される。
【0230】
いくつかの実施形態では、試料は細胞溶解物である。いくつかの実施形態では、試料はヒト細胞溶解物である。いくつかの実施形態では、試料はＨＥＫ２９３細胞溶解物である。いくつかの実施形態では、試料は、誘導可能なユビキチン結合酵素Ｅ２（ＵＢＥ２Ｗ）発現を有するＨＥＫ２９３細胞に由来する細胞溶解物である。いくつかの実施形態では、試料は、誘導可能なＵＢＥ２Ｗ発現および誘導可能なＲＮＦ４発現を有するＨＥＫ２９３細胞に由来する細胞溶解物である。
【0231】
いくつかの実施形態では、方法は、細胞内のデユビキチナーゼを欠失させることと、細胞を溶解して細胞溶解物を生成すること（例えば、デユビキチナーゼをコードする遺伝子をノックアウトすることによって）とをさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、細胞内のデユビキチナーゼを欠ダウンレギュレートすること、および細胞を溶解して細胞溶解物を生成することをさらに含む。いくつかの実施形態では、デユビキチナーゼは、ＵＣＨＬ１またはＵＣＨＬ５である。理論に拘束されることを望むものではないが、デユビキチナーゼを欠失させるかまたはダウンレギュレートすると、Ｎ末端Ｕｂ部位の数が増加すると考えられる。
【0232】
いくつかの実施形態では、方法は、細胞内でユビキチンリガーゼを過剰発現させること、および細胞を溶解して細胞溶解物を生成することをさらに含む。いくつかの実施形態では、ユビキチンリガーゼはＮ末端ユビキチンリガーゼである。いくつかの実施形態では、ユビキチンリガーゼはユビキチン結合酵素Ｅ２（ＵＢＥ２Ｗ）である。いくつかの実施形態では、細胞内のユビキチンリガーゼの過剰発現は、ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）誘導性発現系を使用して達成される。いくつかの実施形態では、細胞内のユビキチンリガーゼの過剰発現は、実施例４（例えば、実施例４、材料および方法を参照）に記載される方法に従って達成される。
【0233】
いくつかの実施形態では、細胞溶解物は、ペプチドを生成するために、プロテアーゼとインキュベートされる。いくつかの実施形態では、プロテアーゼはトリプシンである。トリプシンは、どちらかの残基の後にプロリン残基が続く場合を除いて、リジンアミノ酸残基またはアルギニンアミノ酸残基のカルボキシル側でポリペプチド鎖を切断するセリンプロテアーゼである。トリプシン消化は、質量分析による検出に適した平均サイズ（約７００～１５００ダルトン）であり、リジン残基またはアルギニン残基の存在に起因して荷電されるペプチドを生成する（例えば、Ｌａｃｋａｙ，Ｕ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ．２０１３ Ｄｅｃ ６；１２（１２）：５５５８－６９を参照）。したがって、トリプシン消化は、質量分析に基づくプロテオミクス実験の前に典型的に行われる。細胞溶解物をトリプシンとインキュベートしてペプチドを生成するいくつかの実施形態では、選択された抗体結合ペプチドは、質量分析を使用して検出される。
【0234】
いくつかの実施形態では、細胞溶解物は、ペプチドを生成するために、細菌プロテアーゼまたはウイルスプロテアーゼとインキュベートされる。いくつかの実施形態では、細胞溶解物は、ペプチドを生成するために、ウイルスプロテアーゼとインキュベートされる。いくつかの実施形態では、ウイルスプロテアーゼは口蹄疫ウイルスリーダープロテアーゼである。いくつかの実施形態では、ウイルスプロテアーゼはＬｂｐｒｏである。Ｌｂｐｒｏは口蹄疫ウイルスリーダープロテアーゼである。ユビキチン化を試験するためのＬｂｐｒｏの使用は、例えば、いずれも参照によりその全体が本明細書に援用されるＳｗａｔｅｋ，Ｋ．Ｎ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２０１９ Ａｕｇ １；５７２（７７７０）：５３３－５３７、およびＳｗａｔｅｋ，Ｋ．Ｎ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｏｃｏｌ Ｅｘｃｈａｎｇｅ ２０１９ Ａｕｇ ２２；１０．２１２０３／ｒｓ．２．１０８５０／ｖ１に記載されている。Ｌｂｐｒｏは、Ｇｌｙ－Ｇｌｙモチーフに先行するペプチド結合、例えば、結合したユビキチンのＣ末端グリシン残基を特異的に切断する。したがって、Ｌｂｐｒｏによる消化は、基質からユビキチンを不完全に除去し、基質のユビキチン化残基に結合したシグネチャーＣ末端Ｇｌｙ－Ｇｌｙジペプチドを残す。いくつかの実施形態では、ウイルスプロテアーゼは、操作されたウイルスプロテアーゼ、例えば、操作された口蹄疫ウイルスリーダープロテアーゼである。いくつかの実施形態では、操作されたウイルスプロテアーゼはＬｂｐｒｏ＊である。Ｓｗａｔｅｋ，Ｋ．Ｎ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２０１９ Ａｕｇ １；５７２（７７７０）：５３３－５３７に記載されているように、Ｌｂｐｒｏ＊は、ユビキチン切断活性の増強を示すＬ１０２Ｗアミノ酸置換を有する、Ｌｂｐｒｏのバリアントである。ユビキチン化部位を示すＧｌｙ－Ｇｌｙモチーフを有するポリペプチドを生成するためのＬｂｐｒｏ／Ｌｂｐｒｏ＊の使用は、「Ｕｂクリッピング」と呼ばれている。いくつかの実施形態では、プロテアーゼ切断によって生成される（例えば、Ｌｂｐｒｏ／Ｌｂｐｒｏ＊を使用して）ペプチドは、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ残基を含む。
【0235】
いくつかの実施形態では、細胞溶解物は、ペプチドを生成するためにプロテアーゼとインキュベートされ、プロテアーゼは、ユビキチン化ポリペプチドを特異的に切断する。いくつかの実施形態では、細胞溶解物は、ペプチドを生成するためにプロテアーゼとインキュベートされ、プロテアーゼは、Ｇｌｙ－Ｇｌｙモチーフに先行するペプチド結合でポリペプチドを切断する。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、ＬｂｐｒｏまたはＬｂｐｒｏ＊である。リジンアミノ酸残基またはアルギニンアミノ酸残基のカルボキシル側でペプチド鎖を主に切断するトリプシンと比較して、ＬｂｐｒｏおよびＬｂｐｒｏ＊の方が、大きな配列特異性でタンパク質を選択的に切断する。したがって、そのようなプロテアーゼと細胞溶解物とのインキュベーションは、トリプシンなどの低特異性プロテアーゼとのインキュベーションと比較して、ユビキチン化基質由来のペプチドが濃縮されたペプチドプールをもたらすことが予測される。いくつかの実施形態では、ユビキチン化ポリペプチドを特異的に切断するプロテアーゼとのインキュベーションは、Ｎ末端ユビキチン化ペプチドの濃縮レベルを改善する。
【0236】
いくつかの実施形態では、方法は、溶解物生成の前、およびプロテアーゼ（例えば、トリプシン、ＬｂｐｒｏまたはＬｂｐｒｏ＊）とのインキュベーションの前に、プロテアソーム阻害剤または脱ユビキチン化阻害剤によって細胞を処理することをさらに含む。いくつかの実施形態では、プロテアソーム阻害剤は、ラクタシスチン、ジスルフィラム、エピガロカテキン－３－ガレート、マリゾミブ（サリノスポラミドＡ）、オプロゾミブ（ＯＮＸ－０９１２）、デランゾミブ（ＣＥＰ－１８７７０）、エポキソミシン、ＭＧ１３２、ベータ－ヒドロキシベータ－メチルブチレート、およびボルテゾミブからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、プロテアソーム阻害剤はボルテゾミブである。
【0237】
いくつかの実施形態では、方法は、選択された抗体結合ペプチドを検出することをさらに含む。いくつかの実施形態では、抗体結合ペプチドは、質量分析によって検出される。質量分析用試料の調製は、公知の技術（例えば、"Ｍｏｄｅｍ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｓｐｅｃｔｓ"，Ｈｏｗａｒｄ，Ｇ．Ｃ．ａｎｄ Ｂｒｏｗｎ，Ｗ．Ｅ．，Ｅｄｓ．（２００２）ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａを参照）に従って一般に行われ得る。高い質量精度、高感度、および高分解能が可能な様々な質量分析システムが当技術分野で公知であり、本発明の方法に使用され得る。そのような質量分析計の質量分析器には、限定するものではないが、四重極（Ｑ）、飛行時間（ＴＯＦ）、イオントラップ、磁気セクタもしくはＦＴ－ＩＣＲまたはそれらの組合せが含まれる。質量分析計のイオン源は、試料分子イオン、または疑似分子イオン、および特定の特徴的な断片イオンを主にもたらすはずである。そのようなイオン源の例には、大気圧イオン化源、例えば、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）および大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）ならびにＭａｔｒｉｘ Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｌａｓｅｒ Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ（ＭＡＬＤＩ）が挙げられる。ＥＳＩおよびＭＡＬＤＩは、質量分析のためにタンパク質をイオン化するために最も一般的に使用される２つの方法である。ＥＳＩおよびＡＰＣＩは、ＬＣ／ＭＳによる小分子の分析に最も一般的に使用されるイオン源技術である（Ｌｅｅ，Ｍ．"ＬＣ／ＭＳ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ"（２００２）Ｊ．Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。いくつかの実施形態では、抗体結合ペプチドは、タンデム質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）を用いた液体クロマトグラフィーによって検出される。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを行うための例示的な方法を実施例３に記載する。いくつかの実施形態では、抗体結合ペプチドは、ｎａｎｏＡｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ）を使用する液体クロマトグラフィーによって分離される。いくつかの実施形態では、液体クロマトグラフィー後、分離されたペプチドは、エレクトロスプレーイオン化によってＯｒｂｉｔｒａｐ Ｅｌｉｔｅ（商標）またはＱ Ｅｘａｃｔｉｖｅ（商標）ＨＦ質量分析計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）に導入される。いくつかの実施形態では、抗体結合ペプチドは、無標識定量（ＬＦＱ）質量分析によって検出される。いくつかの実施形態では、抗体結合ペプチドは、タンデム質量タグ（ＴＭＴ）質量分析によって検出される。いくつかの実施形態では、抗体結合ペプチドは、タンパク質配列決定によって検出される。
【0238】
いくつかの実施形態では、抗体結合ペプチドは、Ｎ末端ユビキチン化タンパク質のペプチドに結合する抗体に結合する二次抗体を使用して検出される。いくつかの実施形態では、二次抗体は、抗ウサギ二次抗体、抗齧歯類二次抗体または抗ヤギ二次抗体である。いくつかの実施形態では、二次抗体は、検出可能な標識にコンジュゲートしている。
【0239】
２．Ｎ末端ユビキチン化ペプチドのライブラリー
Ｎ末端ユビキチン化ペプチドのライブラリーが本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、ライブラリーは、上記の濃縮方法のいずれか１つによって生成される。いくつかの実施形態では、ライブラリーは、表７または表８に列挙されたポリペプチドのうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、ライブラリーは、ヒトＡＡＡＴ、ヒトＡＥＳ、ヒトＡＩＧ１、ヒトＡＲＦ１、ヒトＡＲＬ５Ｂ、ヒトＢＡＢＡ２、ヒトＢＵＢ３、ヒトＣ１ＴＣ、ヒトＣ２ＡＩＬ、ヒトＣ９Ｊ４７０、ヒトＣＤ８１、ヒトＣＤＣ４５、ヒトＤＣＴＰ１、ヒトＤＨＲＳＸ、ヒトＤＭＫＮ、ヒトＥ２ＡＫ１、ヒトＥＦ１Ｂ、ヒトＦ１３Ａ、ヒトＦＡ６０Ａ、ヒトＦＢＲＬ、ヒトＦＬＯＴ１、ヒトＧＣＹＢ１、ヒトＧＯＴ１Ｂ、ヒトＧＰＡＡ１、ヒトＨＩＫＥＳ、ヒトＨＮＲＰＫ、ヒトＩＭＰＡ３、ヒトＬＡＴ３、ヒトＬＡＴ４、ヒトＬＲＷＤ１、ヒトＭＥＤ２５、ヒトＭＦＳ１２、ヒトＭＩＰ１８、ヒトＭＭＧＴ１、ヒトＭＯＯＮＲ、ヒトＮＡＲＲ、ヒトＮＤＵＢ６、ヒトＮＥＮＦ、ヒトＮＯＬ６、ヒトＮＯＰ１０、ヒトＮＵＤＣ、ヒトＰ１２１Ａ、ヒトＰＩＧＣ、ヒトＰＬＢＬ２、ヒトＰＲＤＸ１、ヒトＰＲＤＸ２、ヒトＰＵＲ９、ヒトＱＫＩ、ヒトＲＡＤ２１、ヒトＲＣＡＳ１、ヒトＲＥＥＰ１、ヒトＲＦＡ１、ヒトＲＰＢ１、ヒトＲＰＢ７、ヒトＲＳ２９、ヒトＲＳ７、ヒトＳ１１ＩＰ、ヒトＳＧＭＲ１、ヒトＴ１７９Ｂ、ヒトＴＡＦ１、ヒトＴＣＰＧ、ヒトＴＦ３Ｃ４、ヒトＴＭ１２７、ヒトＴＭＭ９７、ヒトＴＭＸ２、ヒトＴＳＮ１３、ヒトＴＳＮ３、ヒトＴＴＣ２７、ヒトＵＢＡＣ１、ヒトＵＢＡＣ２、ヒトＵＣＨＬ１、ヒトＵＣＨＬ５、ヒトＶＫＯＲ１、ヒトＶＲＫ３、ヒトＺＤＨ１２、ヒトＺＮ２５３およびヒトＺＮ６７２からなるポリペプチドの群に由来する１つ以上のペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ライブラリーは、ヒトＤＣＴＰ１、ヒトＦ１３Ａ、ヒトＨＮＲＰＫ、ヒトＰＵＲ９、ヒトＲＦＡ１、ヒトＲＰＢ７、ヒトＳ１１ＩＰおよびヒトＵＣＨＬ５を含む。いくつかの実施形態では、ライブラリーは、ヒトＵＣＨＬ１に由来するペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ライブラリーは、ヒトＵＣＨＬ５に由来するペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ライブラリーは、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ１５７５８、Ｑ０８１１７、Ｑ９ＮＶＶ５、Ｐ８４０７７、Ｑ９６ＫＣ２、Ｑ９ＮＸＲ７、Ｏ４３６８４、Ｐ１１５８６、Ｑ９６ＨＱ２、Ｃ９Ｊ４７０、Ｐ６００３３、Ｏ７５４１９、Ｑ９Ｈ７７３、Ｑ８Ｎ５Ｉ４、Ｑ６Ｅ０Ｕ４－８、Ｑ９ＢＱＩ３、Ｐ２４５３４、Ｐ００４８８、Ｑ９ＮＰ５０、Ｐ２２０８７、Ｏ７５９５５、Ｑ０２１５３、Ｑ９Ｙ３Ｅ０、Ｏ４３２９２、Ｑ５３ＦＴ３、Ｐ６１９７８、Ｑ９ＮＸ６２、Ｏ７５３８７、Ｑ８Ｎ３７０、Ｑ９ＵＦＣ０、Ｑ７１ＳＹ５、Ｑ６ＮＵＴ３、Ｑ９Ｙ３Ｄ０、Ｑ８Ｎ４Ｖ１、Ｑ２ＫＨＭ９、Ｐ０ＤＩ８３、Ｏ９５１３９、Ｑ９ＵＭＸ５、Ｑ９Ｈ６Ｒ４、Ｑ９ＮＰＥ３、Ｑ９Ｙ２６６、Ｑ９６ＨＡ１、Ｑ９２５３５、Ｑ８ＮＨＰ８、Ｑ０６８３０、Ｐ３２１１９、Ｐ３１９３９、Ｑ９６ＰＵ８、Ｏ６０２１６、Ｏ００５５９、Ｑ９Ｈ９０２、Ｐ２７６９４、Ｐ２４９２８、Ｐ６２４８７、Ｐ６２２７３、Ｐ６２０８１、Ｑ８Ｎ１Ｆ８、Ｑ９９７２０、Ｑ７Ｚ７Ｎ９、Ｐ２１６７５、Ｐ４９３６８、Ｑ９ＵＫＮ８、Ｏ７５２０４、Ｑ５ＢＪＦ２、Ｑ９Ｙ３２０、Ｏ９５８５７、Ｏ６０６３７、Ｑ６Ｐ３Ｘ３、Ｑ９ＢＳＬ１、Ｑ８ＮＢＭ４、Ｐ０９９３６、Ｑ９Ｙ５Ｋ５、Ｑ９ＢＱＢ６、Ｑ８ＩＶ６３、Ｑ９６ＧＲ４、Ｏ７５３４６およびＱ４９９Ｚ４からなるポリペプチドの群に由来する１つ以上のペプチドを含む。
Ｎ末端ユビキチン化ペプチドのライブラリーが本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、ライブラリーは、上記の濃縮方法のいずれか１つによって生成される。いくつかの実施形態では、ライブラリーは、表７または表８に列挙されたポリペプチドのうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、ライブラリーは、ヒトＡＡＡＴ、ヒトＡＥＳ、ヒトＡＩＧ１、ヒトＡＲＦ１、ヒトＡＲＬ５Ｂ、ヒトＢＡＢＡ２、ヒトＢＵＢ３、ヒトＣ１ＴＣ、ヒトＣ２ＡＩＬ、ヒトＣ９Ｊ４７０、ヒトＣＤ８１、ヒトＣＤＣ４５、ヒトＤＣＴＰ１、ヒトＤＨＲＳＸ、ヒトＤＭＫＮ、ヒトＥ２ＡＫ１、ヒトＥＦ１Ｂ、ヒトＦ１３Ａ、ヒトＦＡ６０Ａ、ヒトＦＢＲＬ、ヒトＦＬＯＴ１、ヒトＧＣＹＢ１、ヒトＧＯＴ１Ｂ、ヒトＧＰＡＡ１、ヒトＨＩＫＥＳ、ヒトＨＮＲＰＫ、ヒトＩＭＰＡ３、ヒトＬＡＴ３、ヒトＬＡＴ４、ヒトＬＲＷＤ１、ヒトＭＥＤ２５、ヒトＭＦＳ１２、ヒトＭＩＰ１８、ヒトＭＭＧＴ１、ヒトＭＯＯＮＲ、ヒトＮＡＲＲ、ヒトＮＤＵＢ６、ヒトＮＥＮＦ、ヒトＮＯＬ６、ヒトＮＯＰ１０、ヒトＮＵＤＣ、ヒトＰ１２１Ａ、ヒトＰＩＧＣ、ヒトＰＬＢＬ２、ヒトＰＲＤＸ１、ヒトＰＲＤＸ２、ヒトＰＵＲ９、ヒトＱＫＩ、ヒトＲＡＤ２１、ヒトＲＣＡＳ１、ヒトＲＥＥＰ１、ヒトＲＦＡ１、ヒトＲＰＢ１、ヒトＲＰＢ７、ヒトＲＳ２９、ヒトＲＳ７、ヒトＳ１１ＩＰ、ヒトＳＧＭＲ１、ヒトＴ１７９Ｂ、ヒトＴＡＦ１、ヒトＴＣＰＧ、ヒトＴＦ３Ｃ４、ヒトＴＭ１２７、ヒトＴＭＭ９７、ヒトＴＭＸ２、ヒトＴＳＮ１３、ヒトＴＳＮ３、ヒトＴＴＣ２７、ヒトＵＢＡＣ１、ヒトＵＢＡＣ２、ヒトＵＣＨＬ１、ヒトＵＣＨＬ５、ヒトＶＫＯＲ１、ヒトＶＲＫ３、ヒトＺＤＨ１２、ヒトＺＮ２５３およびヒトＺＮ６７２からなるポリペプチドの群に由来する１つ以上のペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ライブラリーは、ヒトＤＣＴＰ１、ヒトＦ１３Ａ、ヒトＨＮＲＰＫ、ヒトＰＵＲ９、ヒトＲＦＡ１、ヒトＲＰＢ７、ヒトＳ１１ＩＰおよびヒトＵＣＨＬ５を含む。いくつかの実施形態では、ライブラリーは、ヒトＵＣＨＬ１に由来するペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ライブラリーは、ヒトＵＣＨＬ５に由来するペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ライブラリーは、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ１５７５８、Ｑ０８１１７、Ｑ９ＮＶＶ５、Ｐ８４０７７、Ｑ９６ＫＣ２、Ｑ９ＮＸＲ７、Ｏ４３６８４、Ｐ１１５８６、Ｑ９６ＨＱ２、Ｃ９Ｊ４７０、Ｐ６００３３、Ｏ７５４１９、Ｑ９Ｈ７７３、Ｑ８Ｎ５Ｉ４、Ｑ６Ｅ０Ｕ４－８、Ｑ９ＢＱＩ３、Ｐ２４５３４、Ｐ００４８８、Ｑ９ＮＰ５０、Ｐ２２０８７、Ｏ７５９５５、Ｑ０２１５３、Ｑ９Ｙ３Ｅ０、Ｏ４３２９２、Ｑ５３ＦＴ３、Ｐ６１９７８、Ｑ９ＮＸ６２、Ｏ７５３８７、Ｑ８Ｎ３７０、Ｑ９ＵＦＣ０、Ｑ７１ＳＹ５、Ｑ６ＮＵＴ３、Ｑ９Ｙ３Ｄ０、Ｑ８Ｎ４Ｖ１、Ｑ２ＫＨＭ９、Ｐ０ＤＩ８３、Ｏ９５１３９、Ｑ９ＵＭＸ５、Ｑ９Ｈ６Ｒ４、Ｑ９ＮＰＥ３、Ｑ９Ｙ２６６、Ｑ９６ＨＡ１、Ｑ９２５３５、Ｑ８ＮＨＰ８、Ｑ０６８３０、Ｐ３２１１９、Ｐ３１９３９、Ｑ９６ＰＵ８、Ｏ６０２１６、Ｏ００５５９、Ｑ９Ｈ９０２、Ｐ２７６９４、Ｐ２４９２８、Ｐ６２４８７、Ｐ６２２７３、Ｐ６２０８１、Ｑ８Ｎ１Ｆ８、Ｑ９９７２０、Ｑ７Ｚ７Ｎ９、Ｐ２１６７５、Ｐ４９３６８、Ｑ９ＵＫＮ８、Ｏ７５２０４、Ｑ５ＢＪＦ２、Ｑ９Ｙ３２０、Ｏ９５８５７、Ｏ６０６３７、Ｑ６Ｐ３Ｘ３、Ｑ９ＢＳＬ１、Ｑ８ＮＢＭ４、Ｐ０９９３６、Ｑ９Ｙ５Ｋ５、Ｑ９ＢＱＢ６、Ｑ８ＩＶ６３、Ｑ９６ＧＲ４、Ｏ７５３４６およびＱ４９９Ｚ４からなるポリペプチドの群に由来する１つ以上のペプチドを含む。
【0240】
Ｅ．試料中のＮ末端ユビキチン化ペプチドを検出する方法
ペプチドの混合物を含む試料中のＮ末端ユビキチン化ペプチドを検出する方法も本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、方法は、ｉ）試料を酵素とインキュベートして、ペプチドを生成すること、ｉｉ）ペプチドを、Ｎ末端ユビキチン化タンパク質のペプチドに結合する抗体と接触させること、およびｉｉｉ）Ｎ末端ユビキチン化ペプチドを検出することを含み、抗体は、Ｎ末端のアミノ酸配列ＧＧＸに結合し、抗体は、分岐ジグリシン（Ｋ－ε－ＧＧ）を含むアミノ酸配列に結合しない。いくつかの実施形態では、Ｘは任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、抗体は、本明細書に記載のＮ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体のいずれか１つである。
ペプチドの混合物を含む試料中のＮ末端ユビキチン化ペプチドを検出する方法も本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、方法は、ｉ）試料を酵素とインキュベートして、ペプチドを生成すること、ｉｉ）ペプチドを、Ｎ末端ユビキチン化タンパク質のペプチドに結合する抗体と接触させること、およびｉｉｉ）Ｎ末端ユビキチン化ペプチドを検出することを含み、抗体は、Ｎ末端のアミノ酸配列ＧＧＸに結合し、抗体は、分岐ジグリシン（Ｋ－ε－ＧＧ）を含むアミノ酸配列に結合しない。いくつかの実施形態では、Ｘは任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、抗体は、本明細書に記載のＮ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体のいずれか１つである。
【0241】
いくつかの実施形態では、Ｎ末端ユビキチン化ペプチドは、血液試料、血漿試料、血清試料、尿試料、唾液試料、痰試料、肺滲出液試料または組織試料中で検出される。いくつかの実施形態では、試料はヒト試料である。いくつかの実施形態では、試料は細胞溶解物である。いくつかの実施形態では、試料はＨＥＫ２９３細胞溶解物である。いくつかの実施形態では、試料は、誘導可能なユビキチン結合酵素Ｅ２（ＵＢＥ２Ｗ）発現を有するＨＥＫ２９３細胞に由来する細胞溶解物である。いくつかの実施形態では、試料は、誘導可能なＵＢＥ２Ｗ発現および誘導可能なＲＮＦ４発現を有するＨＥＫ２９３細胞に由来する細胞溶解物である。
【0242】
いくつかの実施形態では、Ｎ末端ユビキチン化ペプチドは、Ｎ末端ユビキチン化タンパク質のペプチドに結合する抗体に結合する二次抗体を使用して検出される。いくつかの実施形態では、二次抗体は、抗ウサギ二次抗体、抗齧歯類二次抗体または抗ヤギ二次抗体である。いくつかの実施形態では、二次抗体は、検出可能な標識にコンジュゲートしている。
【0243】
いくつかの実施形態では、Ｎ末端ユビキチン化ペプチドは、細胞溶解物中で検出される。いくつかの実施形態では、方法は、細胞内でユビキチンリガーゼを過剰発現させること、および細胞を溶解して細胞溶解物を生成することをさらに含む。いくつかの実施形態では、ユビキチンリガーゼはユビキチン結合酵素Ｅ２（ＵＢＥ２Ｗ）である。いくつかの実施形態では、細胞内のユビキチンリガーゼの過剰発現は、ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）誘導性発現系を使用して達成される。いくつかの実施形態では、細胞内のユビキチンリガーゼの過剰発現は、実施例４（例えば、実施例４、材料および方法を参照）に記載される方法に従って達成される。いくつかの実施形態では、方法は、細胞内のデユビキチナーゼを欠失させることと、細胞を溶解して細胞溶解物を生成すること（例えば、デユビキチナーゼをコードする遺伝子をノックアウトすることによって）とをさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、細胞内のデユビキチナーゼを欠ダウンレギュレートすること、および細胞を溶解して細胞溶解物を生成することをさらに含む。いくつかの実施形態では、デユビキチナーゼは、ＵＣＨＬ１またはＵＣＨＬ５である。理論に拘束されることを望むものではないが、デユビキチナーゼを欠失させるかまたはダウンレギュレートすると、Ｎ末端Ｕｂ部位の数が増加すると考えられる。
【0244】
いくつかの実施形態では、細胞溶解物は、ペプチドを生成するために、ウイルスプロテアーゼとインキュベートされる。いくつかの実施形態では、ウイルスプロテアーゼは口蹄疫ウイルスリーダープロテアーゼである。いくつかの実施形態では、ウイルスプロテアーゼはＬｂｐｒｏである。いくつかの実施形態では、ウイルスプロテアーゼは、操作されたウイルスプロテアーゼ、例えば、操作された口蹄疫ウイルスリーダープロテアーゼである。いくつかの実施形態では、操作されたウイルスプロテアーゼはＬｂｐｒｏ＊である。いくつかの実施形態では、ウイルスプロテアーゼは、Ｇｌｙ－Ｇｌｙモチーフに先行するペプチド結合でポリペプチドを切断する。いくつかの実施形態では、プロテアーゼ切断によって生成される（例えば、Ｌｂｐｒｏ／Ｌｂｐｒｏ＊を使用して）ペプチドは、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ残基を含む。
【0245】
いくつかの実施形態では、方法は、溶解物生成の前、およびウイルスプロテアーゼ（例えば、ＬｂｐｒｏまたはＬｂｐｒｏ＊）とのインキュベーションの前に、プロテアソーム阻害剤または脱ユビキチン化阻害剤によって細胞を処理することをさらに含む。いくつかの実施形態では、プロテアソーム阻害剤は、ラクタシスチン、ジスルフィラム、エピガロカテキン－３－ガレート、マリゾミブ（サリノスポラミドＡ）、オプロゾミブ（ＯＮＸ－０９１２）、デランゾミブ（ＣＥＰ－１８７７０）、エポキソミシン、ＭＧ１３２、ベータ－ヒドロキシベータ－メチルブチレート、およびボルテゾミブからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、プロテアソーム阻害剤はボルテゾミブである。
【0246】
検出は、任意の好適な方法、例えば、質量分析、免疫蛍光顕微鏡法、フローサイトメトリー、光ファイバ走査サイトメトリーまたはレーザスキャンサイトメトリーに基づく方法によって行われ得る。いくつかの実施形態では、検出はイムノアッセイである。いくつかの実施形態では、検出は、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）またはラジオイムノアッセイである。いくつかの実施形態では、イムノアッセイは、イムノブロッティング、免疫拡散、免疫電気泳動または免疫沈降を含む。いくつかの実施形態では、Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドは、Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体を用いたブロット法によって検出される。
【0247】
Ｆ．キット
本発明のスクリーニング方法、濃縮方法および検出方法は、キットの形態で提供され得る。いくつかの実施形態では、スクリーニング、濃縮または検出のためのそのようなキットは、本明細書に記載のＮ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体、またはＮ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体を含む組成物を含む。抗体は、本明細書に記載のＮ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体のいずれか１つであり得る。いくつかの実施形態では、抗体は、可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）を含み、抗体は、アミノ酸配列ＸＸＸＭＮ（配列番号３５）を含むＣＤＲＨ１と、アミノ酸配列ＸＸＸＸＸＧＸＸＹＹＡＴＷＡ（配列番号３６）を含むＣＤＲＨ２と、アミノ酸配列ＤＤＸＸＸＸＮＸ（配列番号３７）を含むＣＤＲＨ３とを含み、抗体は、アミノ酸配列ＱＳＸＸＳＶＹＸＸＮＸＬＸ（配列番号３８）を含むＣＤＲＬ１と、アミノ酸配列ＸＡＳＴＬＸＳ（配列番号３９）を含むＣＤＲＬ２と、アミノ酸配列ＬＧＸＸＤＣＸＳＸＤＣＸＸ（配列番号４０）を含むＣＤＲＬ３とを含み、Ｘは任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号３３に記載のアミノ酸を含むＶＨを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号３４に記載のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号３３に記載のアミノ酸を含むＶＨと、配列番号３４に記載のアミノ酸配列を含むＶＬとを含む。様々な実施形態では、Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体は、本明細書に記載される抗体のうちの１つ以上（例えば、１Ｃ７、２Ｂ１２、２Ｅ９または２Ｈ２）である。
本発明のスクリーニング方法、濃縮方法および検出方法は、キットの形態で提供され得る。いくつかの実施形態では、スクリーニング、濃縮または検出のためのそのようなキットは、本明細書に記載のＮ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体、またはＮ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体を含む組成物を含む。抗体は、本明細書に記載のＮ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体のいずれか１つであり得る。いくつかの実施形態では、抗体は、可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）を含み、抗体は、アミノ酸配列ＸＸＸＭＮ（配列番号３５）を含むＣＤＲＨ１と、アミノ酸配列ＸＸＸＸＸＧＸＸＹＹＡＴＷＡ（配列番号３６）を含むＣＤＲＨ２と、アミノ酸配列ＤＤＸＸＸＸＮＸ（配列番号３７）を含むＣＤＲＨ３とを含み、抗体は、アミノ酸配列ＱＳＸＸＳＶＹＸＸＮＸＬＸ（配列番号３８）を含むＣＤＲＬ１と、アミノ酸配列ＸＡＳＴＬＸＳ（配列番号３９）を含むＣＤＲＬ２と、アミノ酸配列ＬＧＸＸＤＣＸＳＸＤＣＸＸ（配列番号４０）を含むＣＤＲＬ３とを含み、Ｘは任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号３３に記載のアミノ酸を含むＶＨを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号３４に記載のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号３３に記載のアミノ酸を含むＶＨと、配列番号３４に記載のアミノ酸配列を含むＶＬとを含む。様々な実施形態では、Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体は、本明細書に記載される抗体のうちの１つ以上（例えば、１Ｃ７、２Ｂ１２、２Ｅ９または２Ｈ２）である。
【0248】
いくつかの実施形態では、Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体であって、本明細書に記載されるように、ペプチドのＮ末端のアミノ酸配列ＧＧＸに結合し、分岐ジグリシン（Ｋ－ε－ＧＧ）を含むアミノ酸配列に結合しない抗体をスクリーニングする方法に使用するためのキットが提供される。いくつかの実施形態では、Ｘは任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体をスクリーニングする方法に使用するためのキットは、本明細書に記載のＮ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体のいずれか（例えば、１Ｃ７、２Ｂ１２、２Ｅ９または２Ｈ２）を含む。いくつかの実施形態では、Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体をスクリーニングする方法に使用するためのキットは、本明細書に記載されるように、正の選択（例えば、Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドに結合するための選択）または負の選択（例えば、アミノ酸配列Ｋ－ε－ＧＧに結合しないための選択）を行うための説明書を提供する。いくつかの実施形態では、Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体をスクリーニングする方法に使用するためのキットは、Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体を産生および／またはスクリーニングするために使用され得るペプチドライブラリーを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドライブラリーは、Ｎ末端にアミノ酸配列ＧＧＸ（例えば、Ｎ末端にアミノ酸配列ＧＧＭ）を含むペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体をスクリーニングする方法に使用するためのキットは、負の選択に使用され得るペプチドライブラリーを含む。いくつかの実施形態では、負の選択用のペプチドライブラリーは、アミノ酸配列Ｋ－ε－ＧＧを含むペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体をスクリーニングする方法に使用するためのキットは、Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドへの抗体の結合を検出するための試薬を提供する。いくつかの実施形態では、Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体をスクリーニングする方法に使用するためのキットは、ペプチドライブラリー（例えば、Ｎ末端にアミノ酸配列ＧＧＸを含むペプチド）への抗体の結合を検出するための試薬を提供する。いくつかの実施形態では、Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体をスクリーニングする方法に使用するためのキットは、負の選択用のペプチドライブラリーへの抗体の結合を検出するための試薬を提供する。いくつかの実施形態では、ペプチドライブラリーへの抗体の結合、または負の選択のためのペプチドライブラリーはＥＬＩＳＡによって検出される。いくつかの実施形態では、キットはＥＬＩＳＡのための説明書または試薬を提供する。いくつかの実施形態では、Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体をスクリーニングする方法に使用するためのキットは、標準としてＮ末端ユビキチン化ペプチド（例えば、ＵＢＥ２Ｗおよび／またはＬＵＢＡＣ）を含む。
【0249】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＮ末端ユビキチン化ペプチドを濃縮する方法に使用するためのキットが提供される。いくつかの実施形態では、Ｎ末端ユビキチン化ペプチドを濃縮する方法に使用するためのキットは、本明細書に記載のＮ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体のいずれか（例えば、１Ｃ７、２Ｂ１２、２Ｅ９または２Ｈ２）を含む。いくつかの実施形態では、Ｎ末端ユビキチン化ペプチドを濃縮する方法に使用するためのキットは、試料を抗体と接触させるための試薬を含む。いくつかの実施形態では、試料を抗体と接触させるための試薬は、適切な緩衝液である。いくつかの実施形態では、Ｎ末端ユビキチン化ペプチドを濃縮する方法に使用するためのキットは、試料から抗体結合ペプチドを選択するための試薬を含む。いくつかの実施形態では、試料から抗体結合ペプチドを選択するための試薬は、上記の捕捉試薬である。いくつかの実施形態では、Ｎ末端ユビキチン化ペプチドを濃縮する方法に使用するためのキットは、選択された抗体結合ペプチドを検出するための説明書を提供する。いくつかの実施形態では、Ｎ末端ユビキチン化ペプチドを濃縮する方法に使用するためのキットは、選択された抗体結合ペプチドを検出するための試薬を提供する。いくつかの実施形態では、抗体結合ペプチドは、タンパク質配列決定によって検出される。いくつかの実施形態では、Ｎ末端ユビキチン化ペプチドを濃縮する方法に使用するためのキットは、タンパク質配列決定のための説明書を提供する。いくつかの実施形態では、Ｎ末端ユビキチン化ペプチドを濃縮する方法に使用するためのキットは、標準としてＮ末端ユビキチン化ペプチド（例えば、ＵＢＥ２Ｗおよび／またはＬＵＢＡＣ）を含む。
【0250】
いくつかの実施形態では、Ｎ末端ユビキチン化ペプチドを濃縮する方法に使用するためのキットは、プロテアーゼ（例えば、トリプシン、細菌プロテアーゼまたはウイルスプロテアーゼ）をさらに含む。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、ＬｂｐｒｏまたはＬｂｐｒｏ＊である。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、Ｇｌｙ－Ｇｌｙモチーフに先行するペプチド結合でポリペプチドを切断する。いくつかの実施形態では、Ｎ末端ユビキチン化ペプチドを濃縮する方法に使用するためのキットは、例えば、Ｓｗａｔｅｋ，Ｋ．Ｎ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｏｃｏｌ Ｅｘｃｈａｎｇｅ ２０１９ Ａｕｇ ２２；１０．２１２０３／ｒｓ．２．１０８５０／ｖ１に記載されているように、プロテアーゼを細胞溶解物とともにインキュベートするための試薬および説明書を提供する。いくつかの実施形態では、Ｎ末端ユビキチン化ペプチドを濃縮する方法に使用するためのキットは、細胞溶解物を「Ｕｂクリッピング」するための試薬および説明書を提供する。いくつかの実施形態では、Ｎ末端ユビキチン化ペプチドを濃縮する方法に使用するためのキットは、例えば、以下に記載される検出キットに従って、Ｎ末端ユビキチン化ペプチドを検出するための試薬および説明書をさらに含む。特定の実施形態では、濃縮されたＮ末端ユビキチン化ペプチドは、ウエスタンブロットを使用して検出される。いくつかの実施形態では、キットは、二次抗体を含む。
【0251】
一態様では、試料中のＮ末端ユビキチン化ペプチドを検出するためのキットが提供される。いくつかの実施形態では、検出するためのキットは、Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体と、使用説明書とを含み、Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体、抗体は、Ｎ末端のアミノ酸配列ＧＧＸに結合し、抗体は、分岐ジグリシン（Ｋ－ε－ＧＧ）を含むアミノ酸配列に結合しない。いくつかの実施形態では、Ｘは任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、Ｎ末端ユビキチン化ペプチドを検出するためのキットは、抗体を用いてＮ末端ユビキチン化ポリペプチドを検出するための説明書を提供する。いくつかの実施形態では、Ｎ末端ユビキチン化ペプチドを検出するためのキットは、Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体と、抗体を検出する方法とを提供する。例えば、いくつかの実施形態では、Ｎ末端ユビキチン化ペプチドを検出するためのキットは、標識にコンジュゲートしているＮ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体を提供する。いくつかの実施形態では、抗体は、ビオチン、ジゴキシゲニンまたはフルオレセインで標識される。いくつかの実施形態では、Ｎ末端ユビキチン化ペプチドを検出するためのキットは、抗体を用いてＮ末端ユビキチン化ポリペプチドを検出するための試薬を提供する。いくつかの実施形態では、Ｎ末端ユビキチン化ペプチドを検出するためのキットは、抗体を用いてＮ末端ユビキチン化ポリペプチドを検出するためのＥＬＩＳＡのための試薬を提供する。いくつかの実施形態では、Ｎ末端ユビキチン化ペプチドを検出するためのキットは、抗体を用いたウエスタンブロットでＮ末端ユビキチン化ポリペプチドを検出するための試薬を提供する。いくつかの実施形態では、Ｎ末端ユビキチン化ペプチドを検出するためのキットは、抗体を用いてＮ末端ユビキチン化ポリペプチドを検出するためのＳＰＲアッセイのための試薬を提供する。いくつかの実施形態では、Ｎ末端ユビキチン化ペプチドを検出するためのキットは、免疫沈降法で抗体を用いてＮ末端ユビキチン化ポリペプチドに試薬を提供する。いくつかの実施形態では、Ｎ末端ユビキチン化ペプチドを検出するためのそのようなキットは、Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体から構成された捕捉試薬と、本明細書に記載のＮ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する検出可能な（標識または非標識の）抗体と、これらの試薬を使用してアッセイ方法を行う方法に関する説明書との基本要素を含むパッケージされた組合せである。これら基本要素は、上記に定義されている。Ｎ末端ユビキチン化ペプチドを検出するためのキットは、別個の要素として提供され得るか、または捕捉試薬が既に固定化されている、捕捉試薬のための固体支持体をさらに含み得る。したがって、キット中の捕獲抗体は、固体支持体に固定化されていても、またはキットに含まれるかもしくはキットとは別に提供されるこのような支持体に固定化されていてもよい。いくつかの実施形態では、捕捉試薬は、固体材料（例えば、マイクロタイタープレート、ビーズまたは櫛）上にコートまたは付着されている。検出可能な抗体は、直接検出される標識抗体であってもよいし、異なる種で産生した非標識抗体に対する標識抗体によって検出される非標識抗体であってもよい。標識が酵素である場合、キットは通常、酵素が必要とする基質および補助因子を含み；標識がフルオロフォアである場合、検出可能な発色団を提供する色素前駆体を含み；標識がビオチンである場合、アビジン、ストレプトアビジン、ＭＵＧを用いてＨＲＰまたはβ－ガラクトシダーゼにコンジュゲートさせたストレプトアビジンなどのアビジンを含む。Ｎ末端ユビキチン化ペプチドを検出するためのキットはまた、標準としてのＮ末端ユビキチン化ペプチド（例えば、ＵＢＥ２Ｗおよび／またはＬＵＢＡＣ）、ならびに他の添加剤、例えば、安定剤、洗浄バッファーおよびインキュベーションバッファーなども典型的に含有する。
【0252】
いくつかの実施形態では、Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体は、検出可能な標識にコンジュゲートしている。いくつかの実施形態では、検出可能な標識は、ビオチン、ジゴキシゲニンおよびフルオレセインからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、抗体は、固体支持体上に固定化されている。いくつかの実施形態では、抗体は、ビーズ上に固定化されている。いくつかの実施形態では、Ｎ末端ユビキチン化ペプチドを検出するためのキットは、プロテアーゼ（例えば、トリプシン、細菌プロテアーゼまたはウイルスプロテアーゼ）をさらに含む。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、ＬｂｐｒｏまたはＬｂｐｒｏ＊である。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、Ｇｌｙ－Ｇｌｙモチーフに先行するペプチド結合でポリペプチドを切断する。いくつかの実施形態では、Ｎ末端ユビキチン化ペプチドを検出するためのキットは、プロテアーゼを使用するための、例えば、Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体を使用して検出する前の試料の消化のための説明書を含む。
【0253】
実施形態
１．Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体であって、ペプチドのＮ末端のアミノ酸配列ＧＧＸに結合し、分岐ジグリシン（Ｋ－ε－ＧＧ）を含むアミノ酸配列に結合しない抗体。
２．ＧＧＡ、ＧＧＥ、ＧＧＦ、ＧＧＧ、ＧＧＨ、ＧＧＩ、ＧＧＬ、ＧＧＭ、ＧＧＮ、ＧＧＱ、ＧＧＳ、ＧＧＴ、ＧＧＶおよびＧＧＷからなる群から選択されるＮ末端配列を含むペプチドに結合する、実施形態１の抗体。
３．ＧＧＡのＮ末端配列を含むペプチド、ＧＧＥのＮ末端配列を含むペプチド、ＧＧＦのＮ末端配列を含むペプチド、ＧＧＧのＮ末端配列を含むペプチド、ＧＧＨのＮ末端配列を含むペプチド、ＧＧＩのＮ末端配列を含むペプチド、ＧＧＬのＮ末端配列を含むペプチド、ＧＧＭのＮ末端配列を含むペプチド、ＧＧＮのＮ末端配列を含むペプチド、ＧＧＱのＮ末端配列を含むペプチド、ＧＧＳのＮ末端配列を含むペプチド、ＧＧＴのＮ末端配列を含むペプチド、ＧＧＶのＮ末端配列を含むペプチド、およびＧＧＷのＮ末端配列を含むペプチドに結合する、実施形態１または実施形態２の抗体。
４．ウサギ抗体、齧歯類抗体またはヤギ抗体である、実施形態１から３のいずれか１つの抗体。
５．完全長抗体またはＦａｂ断片である、実施形態１から４のいずれか１つの抗体。
６．検出可能な標識にコンジュゲートしている、実施形態１から５のいずれか１つの抗体。
７．標識が、ビオチン、ジゴキシゲニンおよびフルオレセインからなる群から選択される、実施形態６の抗体。
８．固体支持体上に固定化されている、実施形態１から７のいずれか１つの抗体。
９．ビーズ上に固定化されている、実施形態８の抗体。
１０．Ｋａｂａｔに従ってナンバリングして、一方の側の３５位にＡｓｎ、３７位にＶａｌ、９３位にＴｈｒ、１０１位にＡｓｎおよび１０３位にＴｒｐを含む可変重鎖（ＶＨ）と、３４位にＡｌａ、３６位にＴｙｒおよび４９位にＴｙｒを含む可変軽鎖（ＶＬ）とを含む、実施形態１から９のいずれか１つの抗体。
１１．抗体が、可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）を含み、抗体が、アミノ酸配列ＸＸＸＭＮ（配列番号３５）を含むＣＤＲＨ１と、アミノ酸配列ＸＸＸＸＸＧＸＸＹＹＡＴＷＡ（配列番号３６）を含むＣＤＲＨ２と、アミノ酸配列ＤＤＸＸＸＸＮＸ（配列番号３７）を含むＣＤＲＨ３とを含み、抗体が、アミノ酸配列ＱＳＸＸＳＶＹＸＸＮＸＬＸ（配列番号３８）を含むＣＤＲＬ１と、アミノ酸配列ＸＡＳＴＬＸＳ（配列番号３９）を含むＣＤＲＬ２と、アミノ酸配列ＬＧＸＸＤＣＸＳＸＤＣＸＸ（配列番号４０）を含むＣＤＲＬ３とを含み、Ｘが任意のアミノ酸である、実施形態１から９のいずれか１つの抗体。
１２．ＶＨが、配列番号３３に記載のアミノ酸を含み、ＶＬが、配列番号３４に記載のアミノ酸配列を含む、実施形態１１の抗体。
１３．抗体が、可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）を含み、抗体が、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むＶＨのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３と、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むＶＬのＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３とを含む、実施形態１から９のいずれか１つの抗体。
１４．配列番号３に記載のＣＤＲＨ１アミノ酸配列と、配列番号４に記載のＣＤＲＨ２アミノ酸配列と、配列番号５に記載のＣＤＲＨ３アミノ酸配列と、配列番号６に記載のＣＤＲＬ１アミノ酸配列と、配列番号７に記載のＣＤＲＬ２アミノ酸配列と、配列番号８に記載のＣＤＲＬ３アミノ酸配列とを含む、実施形態１３の抗体。
１５．ＶＨが、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ＶＬが、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む、実施形態１３の抗体。
１６．抗体が、重鎖および軽鎖を含み、重鎖が、配列番号５２に記載のアミノ酸配列を含み、軽鎖が、配列番号５３に記載のアミノ酸を含む、実施形態１３から１５のいずれか１つの抗体。
１７．抗体が、可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）を含み、抗体が、配列番号９に記載のアミノ酸配列を含むＶＨのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３と、配列番号１０に記載のアミノ酸配列を含むＶＬのＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３とを含む、実施形態１から９のいずれか１つの抗体。
１８．配列番号１１に記載のＣＤＲＨ１アミノ酸配列と、配列番号１２に記載のＣＤＲＨ２アミノ酸配列と、配列番号１３に記載のＣＤＲＨ３アミノ酸配列と、配列番号１４に記載のＣＤＲＬ１アミノ酸配列と、配列番号１５に記載のＣＤＲＬ２アミノ酸配列と、配列番号１６に記載のＣＤＲＬ３アミノ酸配列とを含む、実施形態１７の抗体。
１９．ＶＨが、配列番号９に記載のアミノ酸配列を含み、ＶＬが、配列番号１０に記載のアミノ酸配列を含む、実施形態１８の抗体。
２０．抗体が、重鎖および軽鎖を含み、重鎖が、配列番号５４に記載のアミノ酸配列を含み、軽鎖が、配列番号５５に記載のアミノ酸を含む、実施形態１７から１９のいずれか１つの抗体。
２１．抗体が、可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）を含み、抗体が、配列番号１７に記載のアミノ酸配列を含むＶＨのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３と、配列番号１８に記載のアミノ酸配列を含むＶＬのＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３とを含む、実施形態１から９のいずれか１つの抗体。
２２．配列番号１９に記載のＣＤＲＨ１アミノ酸配列と、配列番号２０に記載のＣＤＲＨ２アミノ酸配列と、配列番号２１に記載のＣＤＲＨ３アミノ酸配列と、配列番号２２に記載のＣＤＲＬ１アミノ酸配列と、配列番号２３に記載のＣＤＲＬ２アミノ酸配列と、配列番号２４に記載のＣＤＲＬ３アミノ酸配列とを含む、実施形態２１の抗体。
２３．ＶＨが、配列番号１７に記載のアミノ酸を含み、ＶＬが、配列番号１８に記載のアミノ酸を含む、実施形態２２の抗体。
２４．抗体が、重鎖および軽鎖を含み、重鎖が、配列番号５６に記載のアミノ酸配列を含み、軽鎖が、配列番号５７に記載のアミノ酸を含む、実施形態２１から２３のいずれか１つの抗体。
２５．抗体が、可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）を含み、抗体が、配列番号２５に記載のアミノ酸配列を含むＶＨのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３と、配列番号２６に記載のアミノ酸配列を含むＶＬのＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３とを含む、実施形態１から９のいずれか１つの抗体。
２６．配列番号２７に記載のＣＤＲＨ１アミノ酸配列と、配列番号２８に記載のＣＤＲＨ２アミノ酸配列と、配列番号２９に記載のＣＤＲＨ３アミノ酸配列と、配列番号３０に記載のＣＤＲＬ１アミノ酸配列と、配列番号３１に記載のＣＤＲＬ２アミノ酸配列と、配列番号３２に記載のＣＤＲＬ３アミノ酸配列とを含む、実施形態２５の抗体。
２７．ＶＨが、配列番号２５に記載のアミノ酸配列を含み、ＶＬが、配列番号２６に記載のアミノ酸配列を含む、実施形態２６の抗体。
２８．抗体が、重鎖および軽鎖を含み、重鎖が、配列番号５８に記載のアミノ酸配列を含み、軽鎖が、配列番号５９に記載のアミノ酸を含む、実施形態２５から２７のいずれか１つの抗体。
２９．実施形態１から２８のいずれか１つの抗体をコードする核酸。
３０．実施形態２９の核酸を含む宿主細胞。
３１．Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体をスクリーニングする方法であって、抗体が、ペプチドのＮ末端のアミノ酸配列ＧＧＸに結合し、抗体が、分岐ジグリシン（Ｋ－ε－ＧＧ）を含むアミノ酸配列に結合せず、該方法が、
ｉ）抗体ライブラリーを提供すること、
ｉｉ）Ｎ末端にアミノ酸配列ＧＧＸ（Ｘは任意のアミノ酸である）を含むペプチドに結合する抗体を正に選択すること、および
ｉｉｉ）アミノ酸配列Ｋ－ε－ＧＧを含むペプチドに結合する抗体を負に選択することを含み、
それによって、Ｎ末端にアミノ酸ＧＧＸを含むペプチドに特異的に結合し、アミノ酸配列Ｋ－ε－ＧＧに結合しない抗体を産生する、方法。
３２．工程ｉｉ）では、Ｎ末端にアミノ酸配列ＧＧＭを含むペプチドに結合する抗体が正に選択される、実施形態３１の方法。
３３．アミノ酸配列Ｋ－ε－ＧＧを含むペプチドに結合する抗体を負に選択することが、工程ｉｉ）と同時に行われる、実施形態３１または３２の方法。
３４．工程ｉｉ）の前または後に、アミノ酸配列Ｋ－ε－ＧＧを含むペプチドに結合する抗体を負に選択する、実施形態３１または３２の方法。
３５．ライブラリーが、ファージライブラリーまたは酵母ライブラリーである、実施形態３１から３４のいずれか１つの方法。
３６．ライブラリーが、Ｎ末端にアミノ酸配列ＧＧＭを含むペプチドを含むペプチドライブラリーを用いて哺乳動物を免疫化することによって生成される、実施形態３１から３５のいずれか１つの方法。
３７．哺乳動物が、ウサギまたはマウスである、実施形態３６の方法。
３８．工程ｉｉ）～ｉｉｉ）が、２回以上繰り返される、実施形態３１から３７のいずれか１つの方法。
３９．実施形態３１から３８のいずれか１つの方法によって産生される抗体。
４０．ペプチドの混合物を含む試料中のＮ末端ユビキチン化ペプチドを濃縮する方法であって、
ｉ）試料を、Ｎ末端ユビキチン化タンパク質のペプチドに結合する抗体と接触させること、および
ｉｉ）試料から抗体結合ペプチドを選択することを含み、抗体が、Ｎ末端のアミノ酸配列ＧＧＸに結合し、抗体が、分岐ジグリシン（Ｋ－ε－ＧＧ）を含むアミノ酸配列に結合しない、方法。
４１．試料が細胞溶解物である、実施形態４０の方法。
４２．細胞内のデユビキチナーゼを欠失させることと細胞を溶解して細胞溶解物を生成することとをさらに含む、実施形態４１の方法。
４３．細胞内でユビキチンリガーゼを過剰発現させることと細胞を溶解して細胞溶解物を生成することとをさらに含む、実施形態４１の方法。
４４．細胞溶解物が、ペプチドを生成するために、トリプシンとインキュベートされる、実施形態４１から４３のいずれか１つの方法。
４５．細胞溶解物が、ペプチドを生成するために、細菌プロテアーゼまたはウイルスプロテアーゼとインキュベートされる、実施形態４１から４３のいずれか１つの方法。
４６．溶解物生成の前に、かつトリプシンとのインキュベーションの前または細菌プロテアーゼもしくはウイルスプロテアーゼとのインキュベーションの前に、プロテアソーム阻害剤または脱ユビキチン化阻害剤によって細胞を処理することをさらに含む、実施形態４２から４５のいずれか１つの方法。
４７．選択された抗体結合ペプチドを検出することをさらに含む、実施形態４０から４６のいずれか１つの方法。
４８．抗体結合ペプチドが、質量分析によって検出される、実施形態４７の方法。
４９．抗体結合ペプチドが、タンパク質配列決定によって検出される、実施形態４７の方法。
５０．抗体結合ペプチドが、Ｎ末端ユビキチン化タンパク質のペプチドに結合する抗体に結合する二次抗体を使用して検出される、実施形態４７の方法。
５１．実施形態４０から５０のいずれか１つの方法によって産生されたＮ末端ユビキチン化ペプチドのライブラリー。
５２．ペプチドの混合物を含む試料中のＮ末端ユビキチン化ペプチドを検出する方法であって、
ｉ）試料を酵素とインキュベートして、ペプチドを生成すること、
ｉｉ）ペプチドを、Ｎ末端ユビキチン化タンパク質のペプチドに結合する抗体と接触させること、および
ｉｉｉ）Ｎ末端ユビキチン化ペプチドを検出することを含み、抗体が、Ｎ末端のアミノ酸配列ＧＧＸに結合し、抗体が、分岐ジグリシン（Ｋ－ε－ＧＧ）を含むアミノ酸配列に結合しない、方法。
５３．Ｎ末端ユビキチン化ペプチドが、Ｎ末端ユビキチン化タンパク質のペプチドに結合する抗体に結合する二次抗体を使用して検出される、実施形態５２の方法。
５４．試料が細胞溶解物である、実施形態５２または５３の方法。
５５．細胞内のデユビキチナーゼを欠失させることと、細胞を溶解して細胞溶解物を生成することとをさらに含む、実施形態５４の方法。
５６．細胞内でユビキチンリガーゼを過剰発現させることと細胞を溶解して細胞溶解物を生成することとをさらに含む、５４の方法。
５７．細胞溶解物が、ペプチドを生成するために、細菌プロテアーゼまたはウイルスプロテアーゼとインキュベートされる、実施形態５４から５６のいずれか１つの方法。
５８．溶解物生成の前、かつ細菌プロテアーゼまたはウイルスプロテアーゼとのインキュベーションの前に、プロテアソーム阻害剤または脱ユビキチン化阻害剤によって細胞を処理することをさらに含む、実施形態５５から５７のいずれか１つの方法。
５９．Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体と、使用説明書とを含む、試料中のＮ末端ユビキチン化ペプチドを検出するためのキットであって、Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体、抗体が、Ｎ末端のアミノ酸配列ＧＧＸに結合し、抗体が、分岐ジグリシン（Ｋ－ε－ＧＧ）を含むアミノ酸配列に結合しない、キット。
６０．Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体が、検出可能な標識にコンジュゲートしている、実施形態５９のキット。
６１．検出可能な標識が、ビオチン、ジゴキシゲニンおよびフルオレセインからなる群から選択される、実施形態６０のキット。
６２．抗体が、固体支持体上に固定化されている、実施形態５９から６１のいずれか１つのキット。
６３．抗体が、ビーズ上に固定化されている、実施形態６２のキット。
６４．プロテアーゼをさらに含む、実施形態５９から６３のいずれか１つのキット。
１．Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体であって、ペプチドのＮ末端のアミノ酸配列ＧＧＸに結合し、分岐ジグリシン（Ｋ－ε－ＧＧ）を含むアミノ酸配列に結合しない抗体。
２．ＧＧＡ、ＧＧＥ、ＧＧＦ、ＧＧＧ、ＧＧＨ、ＧＧＩ、ＧＧＬ、ＧＧＭ、ＧＧＮ、ＧＧＱ、ＧＧＳ、ＧＧＴ、ＧＧＶおよびＧＧＷからなる群から選択されるＮ末端配列を含むペプチドに結合する、実施形態１の抗体。
３．ＧＧＡのＮ末端配列を含むペプチド、ＧＧＥのＮ末端配列を含むペプチド、ＧＧＦのＮ末端配列を含むペプチド、ＧＧＧのＮ末端配列を含むペプチド、ＧＧＨのＮ末端配列を含むペプチド、ＧＧＩのＮ末端配列を含むペプチド、ＧＧＬのＮ末端配列を含むペプチド、ＧＧＭのＮ末端配列を含むペプチド、ＧＧＮのＮ末端配列を含むペプチド、ＧＧＱのＮ末端配列を含むペプチド、ＧＧＳのＮ末端配列を含むペプチド、ＧＧＴのＮ末端配列を含むペプチド、ＧＧＶのＮ末端配列を含むペプチド、およびＧＧＷのＮ末端配列を含むペプチドに結合する、実施形態１または実施形態２の抗体。
４．ウサギ抗体、齧歯類抗体またはヤギ抗体である、実施形態１から３のいずれか１つの抗体。
５．完全長抗体またはＦａｂ断片である、実施形態１から４のいずれか１つの抗体。
６．検出可能な標識にコンジュゲートしている、実施形態１から５のいずれか１つの抗体。
７．標識が、ビオチン、ジゴキシゲニンおよびフルオレセインからなる群から選択される、実施形態６の抗体。
８．固体支持体上に固定化されている、実施形態１から７のいずれか１つの抗体。
９．ビーズ上に固定化されている、実施形態８の抗体。
１０．Ｋａｂａｔに従ってナンバリングして、一方の側の３５位にＡｓｎ、３７位にＶａｌ、９３位にＴｈｒ、１０１位にＡｓｎおよび１０３位にＴｒｐを含む可変重鎖（ＶＨ）と、３４位にＡｌａ、３６位にＴｙｒおよび４９位にＴｙｒを含む可変軽鎖（ＶＬ）とを含む、実施形態１から９のいずれか１つの抗体。
１１．抗体が、可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）を含み、抗体が、アミノ酸配列ＸＸＸＭＮ（配列番号３５）を含むＣＤＲＨ１と、アミノ酸配列ＸＸＸＸＸＧＸＸＹＹＡＴＷＡ（配列番号３６）を含むＣＤＲＨ２と、アミノ酸配列ＤＤＸＸＸＸＮＸ（配列番号３７）を含むＣＤＲＨ３とを含み、抗体が、アミノ酸配列ＱＳＸＸＳＶＹＸＸＮＸＬＸ（配列番号３８）を含むＣＤＲＬ１と、アミノ酸配列ＸＡＳＴＬＸＳ（配列番号３９）を含むＣＤＲＬ２と、アミノ酸配列ＬＧＸＸＤＣＸＳＸＤＣＸＸ（配列番号４０）を含むＣＤＲＬ３とを含み、Ｘが任意のアミノ酸である、実施形態１から９のいずれか１つの抗体。
１２．ＶＨが、配列番号３３に記載のアミノ酸を含み、ＶＬが、配列番号３４に記載のアミノ酸配列を含む、実施形態１１の抗体。
１３．抗体が、可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）を含み、抗体が、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むＶＨのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３と、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むＶＬのＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３とを含む、実施形態１から９のいずれか１つの抗体。
１４．配列番号３に記載のＣＤＲＨ１アミノ酸配列と、配列番号４に記載のＣＤＲＨ２アミノ酸配列と、配列番号５に記載のＣＤＲＨ３アミノ酸配列と、配列番号６に記載のＣＤＲＬ１アミノ酸配列と、配列番号７に記載のＣＤＲＬ２アミノ酸配列と、配列番号８に記載のＣＤＲＬ３アミノ酸配列とを含む、実施形態１３の抗体。
１５．ＶＨが、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ＶＬが、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む、実施形態１３の抗体。
１６．抗体が、重鎖および軽鎖を含み、重鎖が、配列番号５２に記載のアミノ酸配列を含み、軽鎖が、配列番号５３に記載のアミノ酸を含む、実施形態１３から１５のいずれか１つの抗体。
１７．抗体が、可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）を含み、抗体が、配列番号９に記載のアミノ酸配列を含むＶＨのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３と、配列番号１０に記載のアミノ酸配列を含むＶＬのＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３とを含む、実施形態１から９のいずれか１つの抗体。
１８．配列番号１１に記載のＣＤＲＨ１アミノ酸配列と、配列番号１２に記載のＣＤＲＨ２アミノ酸配列と、配列番号１３に記載のＣＤＲＨ３アミノ酸配列と、配列番号１４に記載のＣＤＲＬ１アミノ酸配列と、配列番号１５に記載のＣＤＲＬ２アミノ酸配列と、配列番号１６に記載のＣＤＲＬ３アミノ酸配列とを含む、実施形態１７の抗体。
１９．ＶＨが、配列番号９に記載のアミノ酸配列を含み、ＶＬが、配列番号１０に記載のアミノ酸配列を含む、実施形態１８の抗体。
２０．抗体が、重鎖および軽鎖を含み、重鎖が、配列番号５４に記載のアミノ酸配列を含み、軽鎖が、配列番号５５に記載のアミノ酸を含む、実施形態１７から１９のいずれか１つの抗体。
２１．抗体が、可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）を含み、抗体が、配列番号１７に記載のアミノ酸配列を含むＶＨのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３と、配列番号１８に記載のアミノ酸配列を含むＶＬのＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３とを含む、実施形態１から９のいずれか１つの抗体。
２２．配列番号１９に記載のＣＤＲＨ１アミノ酸配列と、配列番号２０に記載のＣＤＲＨ２アミノ酸配列と、配列番号２１に記載のＣＤＲＨ３アミノ酸配列と、配列番号２２に記載のＣＤＲＬ１アミノ酸配列と、配列番号２３に記載のＣＤＲＬ２アミノ酸配列と、配列番号２４に記載のＣＤＲＬ３アミノ酸配列とを含む、実施形態２１の抗体。
２３．ＶＨが、配列番号１７に記載のアミノ酸を含み、ＶＬが、配列番号１８に記載のアミノ酸を含む、実施形態２２の抗体。
２４．抗体が、重鎖および軽鎖を含み、重鎖が、配列番号５６に記載のアミノ酸配列を含み、軽鎖が、配列番号５７に記載のアミノ酸を含む、実施形態２１から２３のいずれか１つの抗体。
２５．抗体が、可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）を含み、抗体が、配列番号２５に記載のアミノ酸配列を含むＶＨのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３と、配列番号２６に記載のアミノ酸配列を含むＶＬのＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３とを含む、実施形態１から９のいずれか１つの抗体。
２６．配列番号２７に記載のＣＤＲＨ１アミノ酸配列と、配列番号２８に記載のＣＤＲＨ２アミノ酸配列と、配列番号２９に記載のＣＤＲＨ３アミノ酸配列と、配列番号３０に記載のＣＤＲＬ１アミノ酸配列と、配列番号３１に記載のＣＤＲＬ２アミノ酸配列と、配列番号３２に記載のＣＤＲＬ３アミノ酸配列とを含む、実施形態２５の抗体。
２７．ＶＨが、配列番号２５に記載のアミノ酸配列を含み、ＶＬが、配列番号２６に記載のアミノ酸配列を含む、実施形態２６の抗体。
２８．抗体が、重鎖および軽鎖を含み、重鎖が、配列番号５８に記載のアミノ酸配列を含み、軽鎖が、配列番号５９に記載のアミノ酸を含む、実施形態２５から２７のいずれか１つの抗体。
２９．実施形態１から２８のいずれか１つの抗体をコードする核酸。
３０．実施形態２９の核酸を含む宿主細胞。
３１．Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体をスクリーニングする方法であって、抗体が、ペプチドのＮ末端のアミノ酸配列ＧＧＸに結合し、抗体が、分岐ジグリシン（Ｋ－ε－ＧＧ）を含むアミノ酸配列に結合せず、該方法が、
ｉ）抗体ライブラリーを提供すること、
ｉｉ）Ｎ末端にアミノ酸配列ＧＧＸ（Ｘは任意のアミノ酸である）を含むペプチドに結合する抗体を正に選択すること、および
ｉｉｉ）アミノ酸配列Ｋ－ε－ＧＧを含むペプチドに結合する抗体を負に選択することを含み、
それによって、Ｎ末端にアミノ酸ＧＧＸを含むペプチドに特異的に結合し、アミノ酸配列Ｋ－ε－ＧＧに結合しない抗体を産生する、方法。
３２．工程ｉｉ）では、Ｎ末端にアミノ酸配列ＧＧＭを含むペプチドに結合する抗体が正に選択される、実施形態３１の方法。
３３．アミノ酸配列Ｋ－ε－ＧＧを含むペプチドに結合する抗体を負に選択することが、工程ｉｉ）と同時に行われる、実施形態３１または３２の方法。
３４．工程ｉｉ）の前または後に、アミノ酸配列Ｋ－ε－ＧＧを含むペプチドに結合する抗体を負に選択する、実施形態３１または３２の方法。
３５．ライブラリーが、ファージライブラリーまたは酵母ライブラリーである、実施形態３１から３４のいずれか１つの方法。
３６．ライブラリーが、Ｎ末端にアミノ酸配列ＧＧＭを含むペプチドを含むペプチドライブラリーを用いて哺乳動物を免疫化することによって生成される、実施形態３１から３５のいずれか１つの方法。
３７．哺乳動物が、ウサギまたはマウスである、実施形態３６の方法。
３８．工程ｉｉ）～ｉｉｉ）が、２回以上繰り返される、実施形態３１から３７のいずれか１つの方法。
３９．実施形態３１から３８のいずれか１つの方法によって産生される抗体。
４０．ペプチドの混合物を含む試料中のＮ末端ユビキチン化ペプチドを濃縮する方法であって、
ｉ）試料を、Ｎ末端ユビキチン化タンパク質のペプチドに結合する抗体と接触させること、および
ｉｉ）試料から抗体結合ペプチドを選択することを含み、抗体が、Ｎ末端のアミノ酸配列ＧＧＸに結合し、抗体が、分岐ジグリシン（Ｋ－ε－ＧＧ）を含むアミノ酸配列に結合しない、方法。
４１．試料が細胞溶解物である、実施形態４０の方法。
４２．細胞内のデユビキチナーゼを欠失させることと細胞を溶解して細胞溶解物を生成することとをさらに含む、実施形態４１の方法。
４３．細胞内でユビキチンリガーゼを過剰発現させることと細胞を溶解して細胞溶解物を生成することとをさらに含む、実施形態４１の方法。
４４．細胞溶解物が、ペプチドを生成するために、トリプシンとインキュベートされる、実施形態４１から４３のいずれか１つの方法。
４５．細胞溶解物が、ペプチドを生成するために、細菌プロテアーゼまたはウイルスプロテアーゼとインキュベートされる、実施形態４１から４３のいずれか１つの方法。
４６．溶解物生成の前に、かつトリプシンとのインキュベーションの前または細菌プロテアーゼもしくはウイルスプロテアーゼとのインキュベーションの前に、プロテアソーム阻害剤または脱ユビキチン化阻害剤によって細胞を処理することをさらに含む、実施形態４２から４５のいずれか１つの方法。
４７．選択された抗体結合ペプチドを検出することをさらに含む、実施形態４０から４６のいずれか１つの方法。
４８．抗体結合ペプチドが、質量分析によって検出される、実施形態４７の方法。
４９．抗体結合ペプチドが、タンパク質配列決定によって検出される、実施形態４７の方法。
５０．抗体結合ペプチドが、Ｎ末端ユビキチン化タンパク質のペプチドに結合する抗体に結合する二次抗体を使用して検出される、実施形態４７の方法。
５１．実施形態４０から５０のいずれか１つの方法によって産生されたＮ末端ユビキチン化ペプチドのライブラリー。
５２．ペプチドの混合物を含む試料中のＮ末端ユビキチン化ペプチドを検出する方法であって、
ｉ）試料を酵素とインキュベートして、ペプチドを生成すること、
ｉｉ）ペプチドを、Ｎ末端ユビキチン化タンパク質のペプチドに結合する抗体と接触させること、および
ｉｉｉ）Ｎ末端ユビキチン化ペプチドを検出することを含み、抗体が、Ｎ末端のアミノ酸配列ＧＧＸに結合し、抗体が、分岐ジグリシン（Ｋ－ε－ＧＧ）を含むアミノ酸配列に結合しない、方法。
５３．Ｎ末端ユビキチン化ペプチドが、Ｎ末端ユビキチン化タンパク質のペプチドに結合する抗体に結合する二次抗体を使用して検出される、実施形態５２の方法。
５４．試料が細胞溶解物である、実施形態５２または５３の方法。
５５．細胞内のデユビキチナーゼを欠失させることと、細胞を溶解して細胞溶解物を生成することとをさらに含む、実施形態５４の方法。
５６．細胞内でユビキチンリガーゼを過剰発現させることと細胞を溶解して細胞溶解物を生成することとをさらに含む、５４の方法。
５７．細胞溶解物が、ペプチドを生成するために、細菌プロテアーゼまたはウイルスプロテアーゼとインキュベートされる、実施形態５４から５６のいずれか１つの方法。
５８．溶解物生成の前、かつ細菌プロテアーゼまたはウイルスプロテアーゼとのインキュベーションの前に、プロテアソーム阻害剤または脱ユビキチン化阻害剤によって細胞を処理することをさらに含む、実施形態５５から５７のいずれか１つの方法。
５９．Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体と、使用説明書とを含む、試料中のＮ末端ユビキチン化ペプチドを検出するためのキットであって、Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体、抗体が、Ｎ末端のアミノ酸配列ＧＧＸに結合し、抗体が、分岐ジグリシン（Ｋ－ε－ＧＧ）を含むアミノ酸配列に結合しない、キット。
６０．Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドのペプチドに結合する抗体が、検出可能な標識にコンジュゲートしている、実施形態５９のキット。
６１．検出可能な標識が、ビオチン、ジゴキシゲニンおよびフルオレセインからなる群から選択される、実施形態６０のキット。
６２．抗体が、固体支持体上に固定化されている、実施形態５９から６１のいずれか１つのキット。
６３．抗体が、ビーズ上に固定化されている、実施形態６２のキット。
６４．プロテアーゼをさらに含む、実施形態５９から６３のいずれか１つのキット。
【実施例】
【0254】
特許請求される本開示の範囲をいかなる意味でも限定することを意図しない以下の実施例において、本開示についてさらに詳細に説明する。添付図面は、本明細書および本開示の記載に欠くことのできない一部として考慮されることを意図している。以下の実施例は、特許請求される開示を例示するために供与されるのであって、限定するために供与されているのではない。
【0255】
実施例１：新規抗ＧＧＸモノクローナル抗体の生成
以下の実施例は、Ｎ末端にジグリシン配列を含有するトリプシン性ペプチドを選択的に濃縮することができる抗体の生成を記載する。
以下の実施例は、Ｎ末端にジグリシン配列を含有するトリプシン性ペプチドを選択的に濃縮することができる抗体の生成を記載する。
【0256】
材料および方法
抗体選択の設計
Ｎ末端にジグリシン配列を含有するトリプシン性ペプチドを選択的に濃縮することができる抗体を同定するための選択を設計した（図１Ａを参照）。理論に拘束されることを望むものではないが、潜在的基質のかなりのプールは、トリプシン消化の際に、開始メチオニンの前にジグリシン修飾を有するペプチドを生じる、アセチル化されていないインタクトなイニシエーターメチオニンを有する新生ポリペプチドであると仮定された（Ｗａｌｌｅｒ，Ｊ．－Ｐ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ７，４８３－ＩＮ１（１９６３））。したがって、ウサギはペプチドおよび小型ハプテンに対する高親和性抗体を生成することが知られているため（Ｗｅｂｅｒ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ Ｍｏｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ４９，ｅ３０５－ｅ３０５（２０１７））、ウサギ免疫化のための抗原としてＧｌｙ－Ｇｌｙ－Ｍｅｔ（ＧＧＭ）ペプチドを使用した（以下のウサギ免疫化方法を参照）。重要なことに、ポリクローナル抗体（ｐＡｂ）血清の精製後、同一のジグリシン配列特徴を共有するにもかかわらず、従来の比較的豊富なＫ－ε－ＧＧペプチドに対する交差反応性が最小限であるモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を同定するために選択を行った（以下のファージライブラリーの生成および選択方法を参照；図１ＢのＧＧＭペプチドおよびＫ－ε－ＧＧペプチドの構造を参照）。
抗体選択の設計
Ｎ末端にジグリシン配列を含有するトリプシン性ペプチドを選択的に濃縮することができる抗体を同定するための選択を設計した（図１Ａを参照）。理論に拘束されることを望むものではないが、潜在的基質のかなりのプールは、トリプシン消化の際に、開始メチオニンの前にジグリシン修飾を有するペプチドを生じる、アセチル化されていないインタクトなイニシエーターメチオニンを有する新生ポリペプチドであると仮定された（Ｗａｌｌｅｒ，Ｊ．－Ｐ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ７，４８３－ＩＮ１（１９６３））。したがって、ウサギはペプチドおよび小型ハプテンに対する高親和性抗体を生成することが知られているため（Ｗｅｂｅｒ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ Ｍｏｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ４９，ｅ３０５－ｅ３０５（２０１７））、ウサギ免疫化のための抗原としてＧｌｙ－Ｇｌｙ－Ｍｅｔ（ＧＧＭ）ペプチドを使用した（以下のウサギ免疫化方法を参照）。重要なことに、ポリクローナル抗体（ｐＡｂ）血清の精製後、同一のジグリシン配列特徴を共有するにもかかわらず、従来の比較的豊富なＫ－ε－ＧＧペプチドに対する交差反応性が最小限であるモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を同定するために選択を行った（以下のファージライブラリーの生成および選択方法を参照；図１ＢのＧＧＭペプチドおよびＫ－ε－ＧＧペプチドの構造を参照）。
【0257】
ウサギ免疫化
動物において免疫応答を誘発するために、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）担体タンパク質またはオボアルブミン（ＯＶＡ）担体タンパク質のいずれかにコンジュゲートしたＧｌｙ－Ｇｌｙ－Ｍｅｔペプチドによって、ニュージーランド白ウサギ８匹を免疫化した。ＣＦＡアジュバントと混合した５００μｇのＫＬＨ結合ペプチドによってウサギをプライミングし、続いて、ウサギに皮内注射した。ＩＦＡアジュバント中のペプチド抗原２５０μｇを用いて、４回の隔週ブーストを行った。Ｂ細胞応答が担体タンパク質ではなくペプチドに向けられることを確実にするために、担体と各ブーストとを交互に交代した。最後のブーストの後、５～１０ｍＬの血液を各ウサギから採取し、プロテインＡ精製ｐＡｂ血清を生成して、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によって免疫応答をモニタリングした。力価が最良であったウサギ４匹を安楽死させ、脾臓と腸関連リンパ組織（ＧＡＬＴ）とを採取した。
動物において免疫応答を誘発するために、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）担体タンパク質またはオボアルブミン（ＯＶＡ）担体タンパク質のいずれかにコンジュゲートしたＧｌｙ－Ｇｌｙ－Ｍｅｔペプチドによって、ニュージーランド白ウサギ８匹を免疫化した。ＣＦＡアジュバントと混合した５００μｇのＫＬＨ結合ペプチドによってウサギをプライミングし、続いて、ウサギに皮内注射した。ＩＦＡアジュバント中のペプチド抗原２５０μｇを用いて、４回の隔週ブーストを行った。Ｂ細胞応答が担体タンパク質ではなくペプチドに向けられることを確実にするために、担体と各ブーストとを交互に交代した。最後のブーストの後、５～１０ｍＬの血液を各ウサギから採取し、プロテインＡ精製ｐＡｂ血清を生成して、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によって免疫応答をモニタリングした。力価が最良であったウサギ４匹を安楽死させ、脾臓と腸関連リンパ組織（ＧＡＬＴ）とを採取した。
【0258】
ファージライブラリーの生成および選択
ウサギの脾臓および腸関連リンパ組織から抽出した全ＲＮＡを使用して、可変重（ＶＨ）レパートリーおよび可変軽（ＶＬ）レパートリーを別個に増幅した。標準的なＧｉｂｓｏｎクローニング法を使用して、ＶＨレパートリーおよびＶＬレパートリーを一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）形式に構築し、ファージディスプレイベクターにクローニングした。選択に使用したペプチド抗原は、ＢＳＡコンジュゲートＧＧＭペプチドまたはＣ末端ビオチン化ＧＧＭペプチド、および対抗選択のためのビオチン化Ｋ－ε－ＧＧペプチド（ＡＡＡ｛Ｋ－ε－ＧＧ｝ＡＡＡ）のいずれかであった。結合したファージを１００ｍＭ ＨＣｌによって溶出し、中和し、Ｍ１３－ＫＯ７ヘルパーファージ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を加えて大腸菌ＸＬ１－ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）で増幅する３回のプレートベースの選択を行った。選択後、個々のファージクローンを採取し、カルベニシリンおよびＭ１３－ＫＯ７の存在下で２×ＹＴ増殖培地を含む９６ウェルのディープウェルブロックで増殖させた。ペレット化後、培養上清をファージＥＬＩＳＡに使用して特異性をスクリーニングした。
ウサギの脾臓および腸関連リンパ組織から抽出した全ＲＮＡを使用して、可変重（ＶＨ）レパートリーおよび可変軽（ＶＬ）レパートリーを別個に増幅した。標準的なＧｉｂｓｏｎクローニング法を使用して、ＶＨレパートリーおよびＶＬレパートリーを一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）形式に構築し、ファージディスプレイベクターにクローニングした。選択に使用したペプチド抗原は、ＢＳＡコンジュゲートＧＧＭペプチドまたはＣ末端ビオチン化ＧＧＭペプチド、および対抗選択のためのビオチン化Ｋ－ε－ＧＧペプチド（ＡＡＡ｛Ｋ－ε－ＧＧ｝ＡＡＡ）のいずれかであった。結合したファージを１００ｍＭ ＨＣｌによって溶出し、中和し、Ｍ１３－ＫＯ７ヘルパーファージ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を加えて大腸菌ＸＬ１－ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）で増幅する３回のプレートベースの選択を行った。選択後、個々のファージクローンを採取し、カルベニシリンおよびＭ１３－ＫＯ７の存在下で２×ＹＴ増殖培地を含む９６ウェルのディープウェルブロックで増殖させた。ペレット化後、培養上清をファージＥＬＩＳＡに使用して特異性をスクリーニングした。
【0259】
ｐＡｂ ＥＬＩＳＡ
ＰＢＳ中１０μｇ／ｍＬで、ニュートラアビジンＥＬＩＳＡプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上にビオチン化ＧＧＭペプチドまたはＫ－ε－ＧＧペプチドを３重で４℃で一晩コーティングした。使用前に、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０（ＰＢＳＴ）溶液を含むＰＢＳによってプレートを洗浄した。１００μｇ／ｍＬで開始するプロテインＡ精製ｐＡｂの段階希釈物を２５℃で１～２時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴによって洗浄した。洗浄後、抗ウサギＦｃ特異的ＨＲＰ ２°抗体（ｖｅｎｄｏｒ）を２５℃で１時間かけて加えた。プレートを洗浄し、３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質を用いて５分間発色させ、６５０ｎｍで検出した（図１Ｃを参照）。
ＰＢＳ中１０μｇ／ｍＬで、ニュートラアビジンＥＬＩＳＡプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上にビオチン化ＧＧＭペプチドまたはＫ－ε－ＧＧペプチドを３重で４℃で一晩コーティングした。使用前に、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０（ＰＢＳＴ）溶液を含むＰＢＳによってプレートを洗浄した。１００μｇ／ｍＬで開始するプロテインＡ精製ｐＡｂの段階希釈物を２５℃で１～２時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴによって洗浄した。洗浄後、抗ウサギＦｃ特異的ＨＲＰ ２°抗体（ｖｅｎｄｏｒ）を２５℃で１時間かけて加えた。プレートを洗浄し、３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質を用いて５分間発色させ、６５０ｎｍで検出した（図１Ｃを参照）。
【0260】
モノクローナル抗体ＥＬＩＳＡ
ＰＢＳ中１μｇ／ｍＬで、ニュートラアビジンＥＬＩＳＡプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上にビオチン化ペプチド（ＧＧＭおよびＫ－ε－ＧＧ）を３重で４℃で一晩コーティングした。使用前に、プレートをＰＢＳＴによって洗浄した。１μｇ／ｍＬのＧＧＸ ｍＡｂまたはＫ－ε－ＧＧ ｍＡｂ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）の段階希釈物を２５℃で１～２時間かけて加えた。プレートを洗浄し、上記のようにさらに発色させた（図１Ｅを参照）。
ＰＢＳ中１μｇ／ｍＬで、ニュートラアビジンＥＬＩＳＡプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上にビオチン化ペプチド（ＧＧＭおよびＫ－ε－ＧＧ）を３重で４℃で一晩コーティングした。使用前に、プレートをＰＢＳＴによって洗浄した。１μｇ／ｍＬのＧＧＸ ｍＡｂまたはＫ－ε－ＧＧ ｍＡｂ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）の段階希釈物を２５℃で１～２時間かけて加えた。プレートを洗浄し、上記のようにさらに発色させた（図１Ｅを参照）。
【0261】
ビオチン化ＧＧＸペプチドを合成し、ＰＢＳ中１μｇ／ｍＬで、ニュートラアビジンＥＬＩＳＡプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上に３重で４℃で一晩コーティングした。プレートを洗浄し、１μｇ／ｍＬで開始するＧＧＸ ｍＡｂの段階希釈物を２５℃で１～２時間かけて加えた。ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳＴによって洗浄し、上記のように発色させた（図１Ｆを参照）。
【0262】
ＦａｂおよびＩｇＧの産生
Ｆａｂの細菌発現用構築物を遺伝子合成によって作製した。続いて、Ｆａｂを以前に記載されたように発現させ、精製した（Ｓｉｍｍｏｎｓ，Ｌ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２６３，１３３－１４７（２００２）；Ｌｏｍｂａｎａ，Ｔ．Ｎ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐ（２０１５）ｄｏｉ：ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓｒｅｐ１７４８８）。ウサギＩｇＧの哺乳動物発現のためのコンストラクトを遺伝子合成によって生成した。ＬＣおよびＨＣをコードするプラスミドを２９３個の細胞に同時トランスフェクトし、カノニカルな方法（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（商標），ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ニュージャージー州ピスカタウェイ、米国）を使用してアフィニティークロマトグラフィー、引き続いてＳＥＣで精製した。
Ｆａｂの細菌発現用構築物を遺伝子合成によって作製した。続いて、Ｆａｂを以前に記載されたように発現させ、精製した（Ｓｉｍｍｏｎｓ，Ｌ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２６３，１３３－１４７（２００２）；Ｌｏｍｂａｎａ，Ｔ．Ｎ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐ（２０１５）ｄｏｉ：ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓｒｅｐ１７４８８）。ウサギＩｇＧの哺乳動物発現のためのコンストラクトを遺伝子合成によって生成した。ＬＣおよびＨＣをコードするプラスミドを２９３個の細胞に同時トランスフェクトし、カノニカルな方法（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（商標），ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ニュージャージー州ピスカタウェイ、米国）を使用してアフィニティークロマトグラフィー、引き続いてＳＥＣで精製した。
【0263】
ＤＮＡコンストラクト
全ＤＮＡコンストラクトをカスタム遺伝子合成（ＧｅｎｅＳｃｒｉｐｔ）によって得て、ＮｃｏＩ部位およびＸｈｏＩ部位を使用してドキシサイクリン誘導性ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンプラスミド（ＢＨ１．２、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）にサブクローニングした。
全ＤＮＡコンストラクトをカスタム遺伝子合成（ＧｅｎｅＳｃｒｉｐｔ）によって得て、ＮｃｏＩ部位およびＸｈｏＩ部位を使用してドキシサイクリン誘導性ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンプラスミド（ＢＨ１．２、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）にサブクローニングした。
【0264】
モノクローナル抗体配列決定
当技術分野で標準的な技術を使用して、抗体１Ｃ７、２Ｂ１２、２Ｅ９および２Ｈ２のアミノ酸配列を決定した（図１Ｄおよび表２～４を参照）。
当技術分野で標準的な技術を使用して、抗体１Ｃ７、２Ｂ１２、２Ｅ９および２Ｈ２のアミノ酸配列を決定した（図１Ｄおよび表２～４を参照）。
【0265】
結果
精製ポリクローナル抗体（ｐＡｂ）を用いたＥＬＩＳＡにより、ＧＧＭペプチドに対する堅牢な免疫応答が確認され、Ｋ－ε－ＧＧを有するペプチドに対する交差反応性は驚くほど最小限であった（図１Ｃ）。強いｐＡｂシグナルに基づいて、ファージディスプレイを行って、所望の特異性を有するｍＡｂを直接選択した。いくつかの一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）ディスプレイライブラリーを個々のウサギから構築し、Ｋ－ε－ＧＧペプチドに対する対抗選択によって、ＧＧＭペプチドに対して３回のプレートベースのバイオパニングを行った（図１Ａ）。ファージＥＬＩＳＡによる一次スクリーニング後、ヒットを配列決定し、固有のクローンをＩｇＧに再フォーマットした。４つの固有の抗体クローン（１Ｃ７、２Ｂ１２、２Ｅ９および２Ｈ２と呼ばれる）を同定した。４つのクローンは、高い配列類似性を有したが、複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）に多様性が生じた（Ｘ位での縮重認識を示す図１Ｄを参照）。ＧＧＭペプチドおよびＫ－ε－ＧＧペプチドに対するＥＬＩＳＡによってｍＡｂを特性評価し、４つのクローンがいずれも、Ｋ－ε－ＧＧペプチドではなくＧＧＭペプチドに選択的に結合することが見出された（図１Ｅ）。
精製ポリクローナル抗体（ｐＡｂ）を用いたＥＬＩＳＡにより、ＧＧＭペプチドに対する堅牢な免疫応答が確認され、Ｋ－ε－ＧＧを有するペプチドに対する交差反応性は驚くほど最小限であった（図１Ｃ）。強いｐＡｂシグナルに基づいて、ファージディスプレイを行って、所望の特異性を有するｍＡｂを直接選択した。いくつかの一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）ディスプレイライブラリーを個々のウサギから構築し、Ｋ－ε－ＧＧペプチドに対する対抗選択によって、ＧＧＭペプチドに対して３回のプレートベースのバイオパニングを行った（図１Ａ）。ファージＥＬＩＳＡによる一次スクリーニング後、ヒットを配列決定し、固有のクローンをＩｇＧに再フォーマットした。４つの固有の抗体クローン（１Ｃ７、２Ｂ１２、２Ｅ９および２Ｈ２と呼ばれる）を同定した。４つのクローンは、高い配列類似性を有したが、複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）に多様性が生じた（Ｘ位での縮重認識を示す図１Ｄを参照）。ＧＧＭペプチドおよびＫ－ε－ＧＧペプチドに対するＥＬＩＳＡによってｍＡｂを特性評価し、４つのクローンがいずれも、Ｋ－ε－ＧＧペプチドではなくＧＧＭペプチドに選択的に結合することが見出された（図１Ｅ）。
【0266】
潜在的なｍＡｂ標的の最大プールは、真核生物のメチオニンから主に始まる新生ポリペプチドであるが、遊離Ｎ末端のいくつかの他の供給源が存在する。これらの供給源は、アミノペプチダーゼによるＭｅｔクリッピング、シグナルペプチド除去、および内部タンパク質分解から生じる。Ｍｅｔアミノペプチダーゼ（ＭｅｔＡＰ）によるクリッピングの場合、切断は、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌ残基の前に典型的に起こる（Ｓｈｅｒｍａｎ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ ３，２７－３１（１９８５））。ｍＡｂがこれらの潜在的なＮ末端ユビキチン化部位からトリプシン性ペプチドも認識するかどうかを調査するために、システインを除く２０個のアミノ酸の各々により進行するジグリシンを含有するペプチドを評価した。本明細書では、これらは「ＧＧＸ」ペプチドと呼ばれ、Ｘは、Ｎ末端から延びるＧＧ配列付加を含有するポリペプチド配列内の初期アミノ酸を表す。注目すべきことに、ｍＡｂ １Ｃ７および２Ｈ２は同様のセットのＧＧＸペプチドを認識したが、２Ｅ９および２Ｂ１２は異なる特異性を示した。まとめると、これらの４つのｍＡｂは１９個のＧＧＸペプチドのうちの１４個に結合し、ＭｅｔＡＰクリッピング（Ｓｈｅｒｍａｎ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ ３，２７－３１（１９８５））、ＧＧＧ、ＧＧＡ、ＧＧＳ、ＧＧＴおよびＧＧＶ（図１Ｆ）に対して易反応性であり得るいくつかのアミノ酸に対する強い優先性を示した。
【0267】
ＣＤＲ、重鎖可変領域および軽鎖可変領域、および１Ｃ７、２Ｂ１２、２Ｅ９および２Ｈ２の完全長重鎖および完全長軽鎖のアミノ酸配列、ならびにコンセンサス配列を図１Ｄならびに以下の表２Ａ、表２Ｂ、表３および表４に示す。表２Ａ、表２Ｂおよび表３に示すコンセンサス配列の場合、Ｘは任意のアミノ酸を表す。
【0268】
全体として、これらのデータから、３番目の位置（ＧＧＸ）で広範囲な特異性を有するトリプシン性ジグリシン含有直鎖ペプチドを選択的に認識し、カノニカルなユビキチン化部位に対応するイソペプチド結合ジグリシン修飾リジン含有ペプチドに対する交差反応性を欠く４つの新規抗ＧＧＸ ｍＡｂが生成されたことが明らかにされた。
【0269】
実施例２：ＧＧＸペプチド認識の構造的基礎
以下の実施例は、ＧＧＭペプチドに結合した１Ｃ７抗ＧＧＸ ＦａｂのＸ線結晶構造の決定を記載する。
以下の実施例は、ＧＧＭペプチドに結合した１Ｃ７抗ＧＧＸ ＦａｂのＸ線結晶構造の決定を記載する。
【0270】
材料および方法
結晶化条件および構造決定
タンパク質：ウェル溶液の比が１：１であるハンギングドロップ法を使用して、結晶化について１Ｃ７ Ｆａｂ－ＧＧＭ複合体をスクリーニングした。結晶は複数の条件で観察され、最良の条件は２Ｍ硫酸アンモニウムおよび０．１Ｍ ＴＲＩＳ ｐＨ７．５であった。最適化すると、２Ｍ硫酸アンモニウムおよび０．１Ｍ ＭＥＳ ｐＨ６．５では、単結晶は約２００ｍｍに成長した。結晶を２週間にわたって成熟させ、２Ｍ硫酸アンモニウム中２０％（ｖ／ｖ）エチレングリコールと、０．１Ｍ ＭＥＳ ｐＨ６．５とを用いて急速凍結した。Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｌｉｇｈｔ Ｓｏｕｒｃｅ（ＡＬＳ）ビームライン５．０．２で１００Ｋの温度で回折データを収集した。ＨＫＬ２０００（Ｏｔｗｉｎｏｗｓｋｉ，Ｚ．＆Ｍｉｎｏｒ，Ｗ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２７６，（１９９７））を用いてデータを２．８５Å分解能に処理し、モデルウサギＦａｂ（ＰＤＢ：４ＺＴＰ）による分子置換によってＰＨＥＮＩＸを用いて相を得た。ＣＯＯＴ（Ｅｍｓｌｅｙ，Ｐ．＆Ｃｏｗｔａｎ，Ｋ．Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｓｅｃｔ Ｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ ６０，２１２６－２１３２（２００４））を使用して構造を構築し、ＰＨＥＮＩＸ（Ａｄａｍｓ，Ｐ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｓｅｃｔ Ｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ ６６，２１３－２２１（２０１０））を使用して精密化した。ＧＧＭペプチド、水分子およびバッファー分子を加えた後に最終モデルを生成した（図２Ａ～図２Ｅおよび表５を参照）。
結晶化条件および構造決定
タンパク質：ウェル溶液の比が１：１であるハンギングドロップ法を使用して、結晶化について１Ｃ７ Ｆａｂ－ＧＧＭ複合体をスクリーニングした。結晶は複数の条件で観察され、最良の条件は２Ｍ硫酸アンモニウムおよび０．１Ｍ ＴＲＩＳ ｐＨ７．５であった。最適化すると、２Ｍ硫酸アンモニウムおよび０．１Ｍ ＭＥＳ ｐＨ６．５では、単結晶は約２００ｍｍに成長した。結晶を２週間にわたって成熟させ、２Ｍ硫酸アンモニウム中２０％（ｖ／ｖ）エチレングリコールと、０．１Ｍ ＭＥＳ ｐＨ６．５とを用いて急速凍結した。Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｌｉｇｈｔ Ｓｏｕｒｃｅ（ＡＬＳ）ビームライン５．０．２で１００Ｋの温度で回折データを収集した。ＨＫＬ２０００（Ｏｔｗｉｎｏｗｓｋｉ，Ｚ．＆Ｍｉｎｏｒ，Ｗ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２７６，（１９９７））を用いてデータを２．８５Å分解能に処理し、モデルウサギＦａｂ（ＰＤＢ：４ＺＴＰ）による分子置換によってＰＨＥＮＩＸを用いて相を得た。ＣＯＯＴ（Ｅｍｓｌｅｙ，Ｐ．＆Ｃｏｗｔａｎ，Ｋ．Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｓｅｃｔ Ｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ ６０，２１２６－２１３２（２００４））を使用して構造を構築し、ＰＨＥＮＩＸ（Ａｄａｍｓ，Ｐ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｓｅｃｔ Ｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ ６６，２１３－２２１（２０１０））を使用して精密化した。ＧＧＭペプチド、水分子およびバッファー分子を加えた後に最終モデルを生成した（図２Ａ～図２Ｅおよび表５を参照）。
【0271】
結果
直鎖ジグリシン含有ペプチドに対する抗ＧＧＸ ｍＡｂの選択性に関する洞察を得るために、ＧＧＭペプチドに結合した１Ｃ７ ＦａｂのＸ線結晶構造を２．８５Å分解能で決定した。以下の表５は、１Ｃ７ Ｆａｂ ＧＧＭペプチド共結晶構造に関するデータ収集および精密化統計を提供し、括弧内の値は最高分解能シェルに関する。
直鎖ジグリシン含有ペプチドに対する抗ＧＧＸ ｍＡｂの選択性に関する洞察を得るために、ＧＧＭペプチドに結合した１Ｃ７ ＦａｂのＸ線結晶構造を２．８５Å分解能で決定した。以下の表５は、１Ｃ７ Ｆａｂ ＧＧＭペプチド共結晶構造に関するデータ収集および精密化統計を提供し、括弧内の値は最高分解能シェルに関する。
【0272】
非対称単位内には２つのＦａｂ－ＧＧＭ複合体が存在し、重鎖（ＨＣ）ＣＤＲおよび軽鎖（ＬＣ）ＣＤＲの接触面のポケットに結合するＧＧＭペプチドについて明確に定義された電子密度を有した（図２Ａ、図２Ｂ）。ＧＧＭペプチドとＦａｂとの相互作用は、２４７．５Å２の埋没表面積を有する。興味深いことに、ＬＣ－ＨＣ接触面にあるこのポケットは、ハプテンを認識するために抗体によって一般的に使用される（Ｆｉｎｌａｙ，Ｗ．Ｊ．Ｊ．＆Ａｌｍａｇｒｏ，Ｊ．Ｃ．Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３，３４２（２０１２））。Ｆａｂ－ペプチド複合体の詳細な検査により、ペプチドのジグリシン部分の認識を容易にする一連の水素結合が明らかにされた。ＨＣ Ａｓｐ９５およびＬＣ Ｇｌｕ４６の側鎖は、アミノ末端および２つのアミドを含む、ジグリシンの骨格と５つの水素結合を作り出す（図２Ｃ）。２つのカルボキシレートの負電荷は、アミノ末端の正電荷を中和するように見え、アミノ末端の正電荷は、Ｆａｂ残基によって取り囲まれ、溶媒から除外された。さらに、ＬＣ Ａｌａ３４、ＬＣ Ｔｙｒ３６およびＬＣ Ｔｙｒ４９に対するジグリシンの緊密なパッキングは、ペプチドの最初の２つの位置のいずれかで非Ｇｌｙ残基の認識を立体的にブロックした可能性が高い。この結合様式は、ＨＣ Ａｓｐ９５側鎖とＭｅｔの骨格アミンとの間の水素結合によってさらに安定化された（図２Ｃ）。
【0273】
Ｍｅｔ結合ポケットの検査により、この位置での所望の縮重アミノ酸特異性の構造的基礎が明らかにされた。このポケットは、一方の側ではＨＣ残基Ａｓｎ３５、Ｖａｌ３７、Ｔｈｒ９３、Ａｓｎ１０１およびＴｒｐ１０３、他方の側ではＬＣ残基Ｔｙｒ３６、Ｌｅｕ８９、Ｌｅｕ９６およびＰｈｅ９８によって裏打ちされていた（図２Ｄ）。メチオニン側鎖との最も近い接触は、硫黄原子とＨＣ Ｔｈｒ９３との間の３．１Åの水素結合である（図２Ｃ）。この分析から、疎水性および親水性の両方の特徴を有するゆるくパッキングされたポケットが示され、これにより、理論に拘束されることを望むものではないが、広範囲のアミノ酸の認識が可能になると考えられる。Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、ＴｙｒおよびＡｒｇの認識の欠如は、このポケットを裏打ちする複数の側鎖との立体的衝突によって容易に説明された。Ｐｒｏの場合、抗体内のＨＣ Ａｓｐ９５側鎖およびＬＣ Ｔｙｒ３５側鎖とペプチド内のＰｒｏ側鎖との間の複数の衝突が起こる（図２Ｅ）。
【0274】
この抗体の重要な特徴は、高度に類似したＫ－ε－ＧＧペプチドの認識の欠如であった。したがって、ＧＧ認識の様式がＧＧＭペプチドの場合と同じであると仮定して、Ｋ－ε－ＧＧペプチドがどのようにＦａｂと相互作用するかを分析した。リジン側鎖はＧＧＭの主鎖と同様の軌跡をたどることができるが、Ｌｙｓ Ｃα位置での分岐（すなわち、ペプチド内のＬｙｓの前および後の残基）はＣＤＲＨ３およびＨＣ Ｔｙｒ３３と立体的に衝突し、ｍＡｂへの結合を妨げると仮定された。
【0275】
２Ｅ９ ｍＡｂおよび２Ｂ１２ ｍＡｂはともに１Ｃ７に対する配列類似性を有したが、変化した認識プロファイルを示したため、この結果の潜在的な構造的基礎を調査した。ＧＧＭ結合ポケット内では、２Ｅ９は、Ｍｅｔポケットを圧縮し、理論に拘束されることを望むものではないが、広範囲の残基の認識を妨げる可能性が高い２つの相違点（ＬＣ Ｔｈｒ９１ＧｌｕおよびＬｅｕ９６Ｐｈｅ）を有した（図２Ｄ）。２Ｂ１２では６つの残基の相違点により、Ｍｅｔポケットがさらになお劇的に再形成される。例えば、ＬＣ Ｔｈｒ９１ＬｅｕおよびＨＣ Ｔｈｒ９３Ｖａｌはポケットの疎水性を増加させ、これにより、他のｍＡｂと比較してＧＧＷに結合する固有の能力が説明され得る（図２Ｄ）。Ｔｒｐ側鎖に結合し得る、２Ｂ１２のポケットのモデルを図２Ｆに提供し、ＨＣ Ｔｈｒ９３Ｖａｌ残基およびＬＣ Ｌｅｕ９６Ａｓｎ残基を示す。
【0276】
まとめると、本明細書に記載される構造的試験により、これらの抗体が、高度に類似するＫ－ε－ＧＧの認識を回避しながら、どのようにＧＧＸの縮重認識を達成するかが解明された。
【0277】
実施例３：抗ＧＧＸ ｍＡｂは、細胞溶解物由来のＧＧＸペプチドを選択的に濃縮する
以下の実施例は、複合細胞溶解物由来のペプチドの抗ＧＧＸモノクローナル抗体による免疫親和性濃縮を調査する実験を記載する。具体的には、ＨＥＫ２９３細胞溶解物中の抗ＧＧＸ抗体によって結合されたタンパク質を同定するために、免疫親和性濃縮とそれに続く質量分析を行った。
以下の実施例は、複合細胞溶解物由来のペプチドの抗ＧＧＸモノクローナル抗体による免疫親和性濃縮を調査する実験を記載する。具体的には、ＨＥＫ２９３細胞溶解物中の抗ＧＧＸ抗体によって結合されたタンパク質を同定するために、免疫親和性濃縮とそれに続く質量分析を行った。
【0278】
材料および方法
試薬選択性を実証するパイロット質量分析実験
４０ｍｇのタンパク質溶解物をコンフルエントなＨＥＫ２９３ Ｔ細胞から調製し、トリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって消化した。トリプシン性ペプチドのＰＴＭＳｃａｎ（登録商標）ＩＡＰバッファー（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）溶液を８０μｇの抗ＧＧＸ ｍＡｂまたは抗Ｋ－ε－ＧＧ ｍＡｂ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（登録商標））と４℃で３０分間インキュベートした（図３Ａを参照）。続いて、抗体－ペプチド混合物に、８０μＬのプロテインＧアガローススラリーを４℃でさらに３０分間かけて加えた。４つのＧＧＸ ｍＡｂをプールしてペプチド免疫親和性濃縮に使用したＭＳ実験では、５０μｇの各ｍＡｂを一緒に混合した後、トリプシン消化ペプチドおよび脱塩ペプチドと接触させた。
試薬選択性を実証するパイロット質量分析実験
４０ｍｇのタンパク質溶解物をコンフルエントなＨＥＫ２９３ Ｔ細胞から調製し、トリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって消化した。トリプシン性ペプチドのＰＴＭＳｃａｎ（登録商標）ＩＡＰバッファー（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）溶液を８０μｇの抗ＧＧＸ ｍＡｂまたは抗Ｋ－ε－ＧＧ ｍＡｂ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（登録商標））と４℃で３０分間インキュベートした（図３Ａを参照）。続いて、抗体－ペプチド混合物に、８０μＬのプロテインＧアガローススラリーを４℃でさらに３０分間かけて加えた。４つのＧＧＸ ｍＡｂをプールしてペプチド免疫親和性濃縮に使用したＭＳ実験では、５０μｇの各ｍＡｂを一緒に混合した後、トリプシン消化ペプチドおよび脱塩ペプチドと接触させた。
【0279】
質量分析
再懸濁した試料を、１２０分の総実行時間法でＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって分析した。ペプチドをｎａｎｏＡｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ）を用いて分離し、エレクトロスプレーイオン化によってＯｒｂｉｔｒａｐ Ｅｌｉｔｅ（商標）またはＱ Ｅｘａｃｔｉｖｅ（商標）ＨＦ質量分析計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）に導入した。各試料の３０～４０パーセントを１００μｍ×１００ｍｍ Ｗａｔｅｒｓ １．７μｍ ＢＥＨ－１３０ Ｃ１８カラムにロードし、９０分間にわたって適用される二段階直線勾配を使用して、１μｌ／分の流速で低ｐＨ逆相クロマトグラフィー（溶媒Ａ：０．１％ＦＡ／９８％水／２％ＡＣＮ、溶媒Ｂ：０．１％ＦＡ／９８％ＡＣＮ／２％水）によって分離した。第１の段階では溶媒Ｂを８５分間にわたって２％から２５％に増加させ、続いて、第２の段階では溶媒Ｂを５分間にわたって２５％から４０％に増加させた。Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｅｌｉｔｅ（商標）およびＱ Ｅｘａｃｔｉｖｅ（商標）ＨＦ質量分析計の両方をデータ依存モードで操作し、ＭＳ２フラグメンテーションについてそれぞれ上位１５および上位１０の最も豊富なイオンを選択した。各機器のために最適化した、分析に使用した質量分析計の特定の設定は、以下の通りであった。
再懸濁した試料を、１２０分の総実行時間法でＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって分析した。ペプチドをｎａｎｏＡｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ）を用いて分離し、エレクトロスプレーイオン化によってＯｒｂｉｔｒａｐ Ｅｌｉｔｅ（商標）またはＱ Ｅｘａｃｔｉｖｅ（商標）ＨＦ質量分析計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）に導入した。各試料の３０～４０パーセントを１００μｍ×１００ｍｍ Ｗａｔｅｒｓ １．７μｍ ＢＥＨ－１３０ Ｃ１８カラムにロードし、９０分間にわたって適用される二段階直線勾配を使用して、１μｌ／分の流速で低ｐＨ逆相クロマトグラフィー（溶媒Ａ：０．１％ＦＡ／９８％水／２％ＡＣＮ、溶媒Ｂ：０．１％ＦＡ／９８％ＡＣＮ／２％水）によって分離した。第１の段階では溶媒Ｂを８５分間にわたって２％から２５％に増加させ、続いて、第２の段階では溶媒Ｂを５分間にわたって２５％から４０％に増加させた。Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｅｌｉｔｅ（商標）およびＱ Ｅｘａｃｔｉｖｅ（商標）ＨＦ質量分析計の両方をデータ依存モードで操作し、ＭＳ２フラグメンテーションについてそれぞれ上位１５および上位１０の最も豊富なイオンを選択した。各機器のために最適化した、分析に使用した質量分析計の特定の設定は、以下の通りであった。
【0280】
分解能６０，０００、自動利得制御（ＡＧＣ）目標１×１０６、および最大注入時間２００ｍｓで、Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｅｌｉｔｅ（商標）フーリエ変換質量分析（ＦＴＭＳ１）スキャンを収集した。正規化衝突エネルギー３５％に設定した衝突誘起解離（ＣＩＤ）、自動利得制御（ＡＧＣ）目標１×１０３、および最大注入時間１００ｍｓを使用して、イオントラップ質量分析（ＩＴＭＳ２）を行った。
【0281】
分解能６０，０００、ＡＧＣ目標３×１０６、および最大注入時間６０ｍｓで、Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ（商標）ＨＦ ＦＴＭＳ１スキャンを収集した。ＦＴＭＳ２を、正規化衝突エネルギー３０％に設定した高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）を使用して行い、分解能１５，０００、ＡＧＣ目標１×１０５、および最大注入時間７５ｍｓで収集した。
【0282】
データ分析
Ｍａｓｃｏｔ（Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して、Ｕｎｉｐｒｏｔヒト配列（２０１７年８月ダウンロード）および共通夾雑物配列を含有する標的デコイデータベースに対してデータファイルを検索した。２５ｐｐｍのプリカーサイオン質量公差、０．８Ｄａ（ＩＴＭＳ２）または０．０２Ｄａ（ＦＴＭＳ２）の断片イオン公差（ｆｒａｇｍｅｎｔ ｉｏｎ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）、および半トリプシン性酵素特異性を使用した。カルバミドメチル化システイン（＋５７．０２１５Ｄａ）を固定修飾として設定し、メチオニン酸化（１５．９９４９Ｄａ）、Ｋ－ε－ＧＧ（＋１１４．０４２９）およびＮ末端ＧＧ（＋１１４．０４２９）を可変修飾と考えた。線形判別分析を使用して、５パーセントの偽発見率までペプチドスペクトル一致をペプチドレベルでフィルタリングし、続いて、調査されている生物学に関連する配列特徴に基づいてフィルタリングした。
Ｍａｓｃｏｔ（Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して、Ｕｎｉｐｒｏｔヒト配列（２０１７年８月ダウンロード）および共通夾雑物配列を含有する標的デコイデータベースに対してデータファイルを検索した。２５ｐｐｍのプリカーサイオン質量公差、０．８Ｄａ（ＩＴＭＳ２）または０．０２Ｄａ（ＦＴＭＳ２）の断片イオン公差（ｆｒａｇｍｅｎｔ ｉｏｎ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）、および半トリプシン性酵素特異性を使用した。カルバミドメチル化システイン（＋５７．０２１５Ｄａ）を固定修飾として設定し、メチオニン酸化（１５．９９４９Ｄａ）、Ｋ－ε－ＧＧ（＋１１４．０４２９）およびＮ末端ＧＧ（＋１１４．０４２９）を可変修飾と考えた。線形判別分析を使用して、５パーセントの偽発見率までペプチドスペクトル一致をペプチドレベルでフィルタリングし、続いて、調査されている生物学に関連する配列特徴に基づいてフィルタリングした。
【0283】
結果
非刺激ＨＥＫ２９３細胞由来の溶解物をトリプシンによって消化し、４つの抗ＧＧＸ ｍＡｂの各々を個別に使用してＧＧＸペプチドについて免疫親和性濃縮を行った。得られたペプチドプールを液体クロマトグラフィー－タンデム質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）によって分析した（図３Ａ）。並行して、対照として抗Ｋ－ε－ＧＧ ｍＡｂを用いて免疫親和性濃縮を行った。これらの溶解物中に存在するＫ４８結合Ｕｂ鎖およびＫ６３結合Ｕｂ鎖の存在量が高いことを考慮して、これらの標的ペプチドを使用して、豊富なＫ－ε－ＧＧペプチドに対するＧＧＸペプチドの免疫親和性濃縮のための新規ｍＡｂの選択性を確認した。抗ＧＧＸ濃縮試料および抗Ｋ－ε－ＧＧ濃縮試料のＬＣ－ＭＳデータから、Ｋ４８結合Ｕｂ鎖およびＫ６３結合Ｕｂ鎖に対応する代表的なペプチドイオンの抽出イオンクロマトグラム（ＸＩＣ）を作成して、それらのレベルを比較した。イソペプチド結合Ｋ４８ Ｕｂペプチドおよびイソペプチド結合Ｋ６３ Ｕｂペプチドの強い濃縮を示した抗Ｋ－ε－ＧＧ ｍＡｂと比較して、４つの抗ＧＧＸ ｍＡｂのいずれかを濃縮に使用した場合、シグナルは検出されなかった（図３Ｂ、図３Ｃ）。
非刺激ＨＥＫ２９３細胞由来の溶解物をトリプシンによって消化し、４つの抗ＧＧＸ ｍＡｂの各々を個別に使用してＧＧＸペプチドについて免疫親和性濃縮を行った。得られたペプチドプールを液体クロマトグラフィー－タンデム質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）によって分析した（図３Ａ）。並行して、対照として抗Ｋ－ε－ＧＧ ｍＡｂを用いて免疫親和性濃縮を行った。これらの溶解物中に存在するＫ４８結合Ｕｂ鎖およびＫ６３結合Ｕｂ鎖の存在量が高いことを考慮して、これらの標的ペプチドを使用して、豊富なＫ－ε－ＧＧペプチドに対するＧＧＸペプチドの免疫親和性濃縮のための新規ｍＡｂの選択性を確認した。抗ＧＧＸ濃縮試料および抗Ｋ－ε－ＧＧ濃縮試料のＬＣ－ＭＳデータから、Ｋ４８結合Ｕｂ鎖およびＫ６３結合Ｕｂ鎖に対応する代表的なペプチドイオンの抽出イオンクロマトグラム（ＸＩＣ）を作成して、それらのレベルを比較した。イソペプチド結合Ｋ４８ Ｕｂペプチドおよびイソペプチド結合Ｋ６３ Ｕｂペプチドの強い濃縮を示した抗Ｋ－ε－ＧＧ ｍＡｂと比較して、４つの抗ＧＧＸ ｍＡｂのいずれかを濃縮に使用した場合、シグナルは検出されなかった（図３Ｂ、図３Ｃ）。
【0284】
次に、抗ＧＧＸ ｍＡｂによって濃縮されたペプチド配列を調査した。プロテオーム内のグリシン残基、リジン残基およびアルギニン残基の頻度を考慮すると、多くのＧＧＸペプチドは、トリプシン切断部位（Ｒ／ＫＧＧＸＸＸＸ）が先行する天然に存在する内部ＧＧＸ配列モチーフを含有するタンパク質に由来して、プロテオームにコードされる。予測されたように、この実験では多くのそのようなペプチドが検出された。注目すべきことに、各濃縮試料にわたって適用された代表的な内部ＧＧＸ配列の抽出イオンクロマトグラムは、抗ＧＧＸ ｍＡｂ濃縮試料では特異的シグナルを示したが、抗Ｋ－ε－ＧＧ ｍＡｂによる免疫親和性濃縮後には特異的シグナルを示さなかった。ＥＬＩＳＡデータと組み合わせると、これらの結果から、標的化される配列に対する抗ＧＧＸ ｍＡｂの選択性が実証された（図３Ｄ、図３Ｅ）。
【0285】
Ｎ末端ユビキチン化タンパク質と同様に、内部ＧＧＸペプチドは、トリプシン切断後にのみ露出され、各ｍＡｂの配列優先傾向に関する貴重な洞察を提供する。これらの内部ペプチドを使用して、３番目の位置のアミノ酸優先傾向を決定した。パンニング戦略、ＥＬＩＳＡおよび構造データと一致して、３番目の位置ではメチオニンおよびロイシンに対する強い優先傾向が観察され、次に最も優勢なアミノ酸はフェニルアラニンおよびグルタミンであった（図３Ｆ）。配列特異性をさらにプロファイリングするために、各抗ＧＧＸ ｍＡｂについて配列ロゴを生成した（図３Ｇ）（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｔ．Ｄ．＆Ｓｔｅｐｈｅｎｓ，Ｒ．Ｍ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １８，６０９７－６１００（１９９０））。ここでも、配列ロゴは、３番目の位置のメチオニンおよびロイシンに対する包括的な優先傾向を示すが、重要なことに、３～６位の他のアミノ酸の多様性を示す（図３Ｇ）。これらのデータから、特に４～６位の相違点を考慮した場合、各ｍＡｂが個々のｍＡｂ間で部分的重複を有する固有のペプチドのセットを濃縮したことを示すＥＬＩＳＡの結果が再確認された（表６）。これらのデータに基づいて、可能性のあるペプチドの最も広いカバレッジを確実にするために、その後のＭＳ実験のために４つの抗ＧＧＸ ｍＡｂの等モル混合物を使用してＰＴＭｓｃａｎ（登録商標）プロトコールを確立した（実施例４を参照）。
【0286】
Ｎ末端ユビキチン化の部位に注目して、データを手動で検査し、イニシエーターメチオニンまたはネオＮ末端にジグリシンレムナントを有するものについて、ペプチドスペクトル一致（ＰＳＭ）をフィルタリングした。ジグリシンの質量に対応する１１４．０４２９Ｄａの質量付加を有するペプチドを同定し、次いで、該ゲノムによってコードされたポリペプチド配列が、トリプシン感受性Ｒ／Ｋ残基が直前に先行するジグリシン配列を含有しないことが確認された。厳密なフィルタリングの後、推定Ｎ末端ユビキチン化部位を有する６つ超のタンパク質が同定された（表７）。一例は、以前に記載されているいくつかの部位（Ａｋｉｍｏｖ，Ｖ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２５，６３１－６４０（２０１８））に加えて、セリン／スレオニン－プロテインキナーゼ１１相互作用タンパク質（ＳＴＫ１１ＩＰ）上で観察された推定Ｎ末端ユビキチン化部位（図３Ｈ、図３Ｉ）であった。
【0287】
全体として、この試験では、トリプシン消化によって露出された、ゲノムによってコードされた内部ＧＧＸペプチド配列、およびＮ末端ユビキチン化に由来するＧＧＸペプチドの広範囲なパネルを濃縮するこれらの抗ＧＧＸ ｍＡｂの選択的能力が実証された。このパイロットＭＳ実験では、抗ＧＧＸ ｍＡｂの有用性が検証されたが、内因性ＨＥＫ２９３細胞から得られた推定Ｎ末端ユビキチン化基質は１２個未満であった。この結果は既存の文献と一致し、Ｎ末端ユビキチン修飾の基底レベルが低いことが確認された（Ａｋｉｍｏｖ，Ｖ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２５，６３１－６４０（２０１８））。
【0288】
実施例４：推定ＵＢＥ２Ｗ基質のプロテオミクス同定
以下の実施例は、ユビキチン結合酵素Ｅ２をコードする遺伝子であるＵＢＥ２Ｗのドキシサイクリン（Ｄｏｘ）誘導性発現によるＨＥＫ２９３細胞株の生成を記載する。さらに、免疫親和性濃縮ＭＳ実験では、Ｄｏｘ誘導性ＵＢＥ２Ｗ ＨＥＫ２９３細胞株を使用して、抗ＧＧＸ ｍＡｂによって結合されたペプチドを同定した。
以下の実施例は、ユビキチン結合酵素Ｅ２をコードする遺伝子であるＵＢＥ２Ｗのドキシサイクリン（Ｄｏｘ）誘導性発現によるＨＥＫ２９３細胞株の生成を記載する。さらに、免疫親和性濃縮ＭＳ実験では、Ｄｏｘ誘導性ＵＢＥ２Ｗ ＨＥＫ２９３細胞株を使用して、抗ＧＧＸ ｍＡｂによって結合されたペプチドを同定した。
【0289】
材料および方法
質量分析による無標識定量（ＬＦＱ）分析のためのＵＢＥ２Ｗ発現細胞由来のＧＧＸペプチドおよびＫ－ε－ＧＧペプチドの免疫親和性濃縮
ユビキチン結合酵素Ｅ２（ＵＢＥ２Ｗ）を誘導的に発現するＨＥＫ２９３細胞と、適合させた対照（すなわち、Ｅ３ユビキチン－タンパク質リガーゼＲＮＦ４、またはＵＢＥ２ＷおよびＲＮＦ４の両方を発現する細胞）とを完全変性条件（８Ｍ尿素、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ８．０、１ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム、２．５ｍＭピロリン酸ナトリウム、１ｍＭ β－グリセロリン酸）下で溶解した。溶解物を氷上でマイクロチップ超音波処理し（２×３０秒）、高速超遠心分離（１８，０００×ｇ、１５分）によって清澄化した。４０ｍｇの各溶解物を還元（４．１ｍＭジチオスレイトール、３７℃で６０分）、アルキル化（９．１ｍＭヨードアセトアミド、室温で１５分）、４倍希釈し、次いで、リジルエンドペプチダーゼ（Ｗａｋｏ）と配列決定グレードのトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ）との組合せを用いて、１：１００の酵素対タンパク質比で一晩消化し、後者を前者とのインキュベーションの４時間後に加えた。消化したペプチドをＴＦＡによって最終濃度１％に酸性化し、遠心分離（１８，０００×ｇ、１５分）によって清澄化し、Ｓｅｐ－Ｐａｋ（登録商標）Ｃ１８重力流固相抽出（Ｗａｔｅｒｓ）によって脱塩し、４８時間凍結乾燥させた。乾燥ペプチドを１ｍＬの１×ＩＡＰバッファー（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）中で再構成し、その後の免疫親和性濃縮のために高速遠心分離（１８，０００×ｇ、１０分）によって清澄化した。
質量分析による無標識定量（ＬＦＱ）分析のためのＵＢＥ２Ｗ発現細胞由来のＧＧＸペプチドおよびＫ－ε－ＧＧペプチドの免疫親和性濃縮
ユビキチン結合酵素Ｅ２（ＵＢＥ２Ｗ）を誘導的に発現するＨＥＫ２９３細胞と、適合させた対照（すなわち、Ｅ３ユビキチン－タンパク質リガーゼＲＮＦ４、またはＵＢＥ２ＷおよびＲＮＦ４の両方を発現する細胞）とを完全変性条件（８Ｍ尿素、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ８．０、１ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム、２．５ｍＭピロリン酸ナトリウム、１ｍＭ β－グリセロリン酸）下で溶解した。溶解物を氷上でマイクロチップ超音波処理し（２×３０秒）、高速超遠心分離（１８，０００×ｇ、１５分）によって清澄化した。４０ｍｇの各溶解物を還元（４．１ｍＭジチオスレイトール、３７℃で６０分）、アルキル化（９．１ｍＭヨードアセトアミド、室温で１５分）、４倍希釈し、次いで、リジルエンドペプチダーゼ（Ｗａｋｏ）と配列決定グレードのトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ）との組合せを用いて、１：１００の酵素対タンパク質比で一晩消化し、後者を前者とのインキュベーションの４時間後に加えた。消化したペプチドをＴＦＡによって最終濃度１％に酸性化し、遠心分離（１８，０００×ｇ、１５分）によって清澄化し、Ｓｅｐ－Ｐａｋ（登録商標）Ｃ１８重力流固相抽出（Ｗａｔｅｒｓ）によって脱塩し、４８時間凍結乾燥させた。乾燥ペプチドを１ｍＬの１×ＩＡＰバッファー（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）中で再構成し、その後の免疫親和性濃縮のために高速遠心分離（１８，０００×ｇ、１０分）によって清澄化した。
【0290】
２００μｇの抗ＧＧＸ抗体カクテル（すなわち、１Ｃ７、２Ｂ１２、２Ｅ９および２Ｈ２の等モル混合物）または２００μｇの抗Ｋ－ε－ＧＧ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）抗体のいずれかに結合したＰｒｏＰｌｕｓ樹脂２０μＬを充填したＰｈｙｔｉｐｓ（Ｐｈｙｎｅｘｕｓ）１ｍＬを使用して、ＰｈｙＮｅｘｕｓ ＭＥＡ２自動精製システムを用いて、いずれも４℃で行った２回の連続した免疫親和性濃縮にペプチドを供した。ジグリシン修飾Ｎ末端（ＧＧＸ）を含有するペプチドに対する抗ＧＧＸ ＩＰ、およびジグリシン修飾リジン残基（Ｋ－ε－ＧＧ）を含有するペプチドに対する抗Ｋ－ε－ＧＧ ＩＰの順序で濃縮を行った。
【0291】
ＰｈｙＮｅｘｕｓ ＭＥＡ２を用いた免疫親和性濃縮を以前に記載されたように行った（Ｐｈｕ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ７７，１１０７－１１２３．ｅ１０（２０２０））。要約すると、Ｐｈｙｔｉｐカラムを、ペプチドと接触させる前に１×ＩＡＰバッファー１ｍＬによって２サイクルにわたって（１サイクル＝吸引および分注、０．９ｍＬ、０．５ｍＬ／分）平衡化し、１６サイクルの捕捉のためにペプチドとインキュベートし、６サイクルにわたって洗浄した（１×ＩＡＰバッファー１ｍＬによって２回、続いて水１ｍＬによって４回）。捕捉したペプチドを６０μＬの０．１５％ＴＦＡによって８サイクルで溶出し、吸引／分注した体積を０．０６ｍＬに調整した。続いて、溶出したペプチドをＣ１８ステージチップ（Ｒａｐｐｓｉｌｂｅｒ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ ２，１８９６－１９０６（２００７））を使用して脱塩し、Ｓｐｅｅｄ－Ｖａｃ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）によって完全に乾燥させた。
【0292】
濃縮したＧＧＸペプチドを２％アセトニトリル（ＡＣＮ）／０．１％ギ酸（ＦＡ）中で再構成し、１．７μｍ ＢＥＨ－１３０ Ｃ１８樹脂（Ｗａｔｅｒｓ）を充填した１００μｍ×２５０ｍｍ ＰｉｃｏＦｒｉｔ（Ｎｅｗ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ）カラムを使用して、Ｄｉｏｎｅｘ ＵｌｔｉＭａｔｅ ３０００ ＲＳＬＣ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）に連結したＯｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏ（商標）Ｌｕｍｏｓ（商標）質量分析計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって２連で（各４０％注入）分析した。９６分の２段階直線勾配で４５０ｎＬ／分で低ｐＨ逆相分離（溶媒Ａ：０．１％ＦＡ／９８％水／２％ＡＣＮ、溶媒Ｂ：０．１％ＦＡ／９８％ＡＣＮ／２％水）を行い、溶媒Ｂを１０２分かけて２％から３５％に増加させ、次いで、２分かけて３５％から５０％に増加させ、総実行時間は１２０分であった。Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ（商標）Ｌｕｍｏｓ（商標）をデータ依存モードで動作させ、それにより、ＡＧＣ目標１×１０６および最大注入時間５０ｍｓでＦＴＭＳ１スキャンを分解能２４０，０００で収集した。正規化衝突エネルギー３０％、ＡＧＣ目標２．０×１０４および最大注入時間１１ｍｓでＨＣＤフラグメンテーションを有するイオントラップでは、２～４の電荷状態を有する上位１５の最も強いプリカーサに対するＭＳ２スキャンを収集した。
【0293】
２連注入では、ＭＳ２スペクトルをイオントラップではなくＯｒｂｉｔｒａｐで分析した。ＯＴＭＳ２ ＡＧＣ目標は２．０×１０５に設定し、最大注入時間は５４ｍｓであった。
【0294】
ＬＣ－ＭＳ分析のためのＵＢＥ２Ｗおよび／またはＲＮＦ４発現細胞由来のＧＧＸペプチドおよびＫ－ε－ＧＧペプチドの免疫親和性濃縮
以下の修飾を用いて、上に詳述したように、非誘導性（Ｎ＝３）、またはＥ３ユビキチン－タンパク質リガーゼＲＮＦ４（Ｎ＝２）、ＵＢＥ２Ｗ（Ｎ＝３）もしくはその組合せ（Ｎ＝３）を誘導的に発現するＨＥＫ２９３細胞のそれぞれ４０ｍｇから得られたＧＧＸペプチドおよびＫ－ε－ＧＧペプチドの免疫親和性濃縮を行った。
以下の修飾を用いて、上に詳述したように、非誘導性（Ｎ＝３）、またはＥ３ユビキチン－タンパク質リガーゼＲＮＦ４（Ｎ＝２）、ＵＢＥ２Ｗ（Ｎ＝３）もしくはその組合せ（Ｎ＝３）を誘導的に発現するＨＥＫ２９３細胞のそれぞれ４０ｍｇから得られたＧＧＸペプチドおよびＫ－ε－ＧＧペプチドの免疫親和性濃縮を行った。
【0295】
２００μｇの抗ＧＧＸ抗体カクテルまたは２００μｇの抗Ｋ－ε－ＧＧ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）抗体のいずれかによるＭＥＡ２自動精製システム（Ｐｈｙｎｅｘｕｓ）を用いて上記のようにいずれも行った、３回の連続した免疫親和性濃縮にペプチドを供した。ジグリシン修飾Ｎ末端（ＧＧＸ）を含有するペプチドに対する抗ＧＧＸ ＩＰ、ジグリシン修飾リジン残基（Ｋ－ε－ＧＧ）を含有するペプチドに対する抗Ｋ－ε－ＧＧ ＩＰ、続いて、もう一度ＧＧＸに対する抗ＧＧＸ ＩＰの順序で濃縮を行った。
【0296】
続いて、以前に記載されたように（Ｒｏｓｅ，Ｃ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｙｓｔ ３，３９５－４０３．ｅ４（２０１６）；Ｐｈｕ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ７７，１１０７－１１２３．ｅ１０（２０２０））、タンデム質量タグ付け（ＴＭＴ－１１）多重化定量分析のために、１回目（ＧＧＸ）および２回目（Ｋ－ε－ＧＧ）の免疫沈降法から得られた濃縮ペプチドを調製したのに対して、無標識定量質量分析のために、３回目から得られた濃縮ＧＧＸペプチドを調製した。
【0297】
ＴＭＴ－１１多重化試料調製
濃縮ＧＧＸペプチドまたは濃縮Ｋ－ε－ＧＧペプチドを含有する溶出液を、Ｃ１８ステージチップを使用して脱塩し、ＳｐｅｅｄＶａｃによって完全に乾燥させ、その後の１１－ｐｌｅｘタンデム質量タグ付け（ＴＭＴ）試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）による等圧標識化のために２５μＬの２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ８．０中で再構成した。ＴＭＴ試薬の各バイアルを室温で５分間解凍し、ベンチトップ遠心分離機を使用して遠心し、４１μＬの無水アセトニトリル（ＡＣＮ）に再懸濁した。２９％の最適標識反応最終ＡＣＮ濃度に達するように、各溶出液に２μＬのＡＣＮとともに８μＬのＴＭＴ試薬を加えた。室温で１時間インキュベートした後、４μＬの５％ヒドロキシルアミンを１５分間加えることによって反応をクエンチした。標識ペプチドを合わせ、真空遠心分離によって乾燥させた。
濃縮ＧＧＸペプチドまたは濃縮Ｋ－ε－ＧＧペプチドを含有する溶出液を、Ｃ１８ステージチップを使用して脱塩し、ＳｐｅｅｄＶａｃによって完全に乾燥させ、その後の１１－ｐｌｅｘタンデム質量タグ付け（ＴＭＴ）試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）による等圧標識化のために２５μＬの２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ８．０中で再構成した。ＴＭＴ試薬の各バイアルを室温で５分間解凍し、ベンチトップ遠心分離機を使用して遠心し、４１μＬの無水アセトニトリル（ＡＣＮ）に再懸濁した。２９％の最適標識反応最終ＡＣＮ濃度に達するように、各溶出液に２μＬのＡＣＮとともに８μＬのＴＭＴ試薬を加えた。室温で１時間インキュベートした後、４μＬの５％ヒドロキシルアミンを１５分間加えることによって反応をクエンチした。標識ペプチドを合わせ、真空遠心分離によって乾燥させた。
【0298】
ＴＭＴ標識ＧＧＸペプチドを溶媒Ａ（２％アセトニトリル（ＡＣＮ）／０．１％ギ酸（ＦＡ））に再懸濁し、４０％と６０％との２つの部分に分割し、前者にはさらに操作することなくＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析を予定し、後者は、０．１％トリエチルアミン／アセトニトリル系溶出バッファーを使用するＡｓｓａｙＭａｐ（Ａｇｉｌｅｎｔ）のＲＰＳカートリッジを使用して追加のオフライン高ｐＨ逆相断片化に供した。６つの画分を収集した（Ｆ１：１２％ＡＣＮ、Ｆ２：１７％％ＡＣＮ、Ｆ３：２２％ＡＣＮ、Ｆ４：２７％ＡＣＮ、Ｆ５：３２％ＡＣＮ、Ｆ６：８０％ＡＣＮ）。その後、断片化ＧＧＸペプチドを凍結乾燥させ、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析のために溶媒Ａに再懸濁した。
【0299】
ＴＭＴ標識Ｋ－ε－ＧＧペプチドについて、市販のキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して高ｐＨ逆相断片化を行った。０．１５％ＴＦＡに再溶解後、１１画分を収集し（Ｆ１：１３．５％ＡＣＮ、Ｆ２：１５％ＡＣＮ、Ｆ３：１６．２５％ＡＣＮ、Ｆ４：１７．５ ＡＣＮ、Ｆ５：２０％ＡＣＮ、Ｆ６：２１．５％ＡＣＮ、Ｆ７：２２．５％ＡＣＮ、Ｆ８：２３．７５％ＡＣＮ、Ｆ９：２５％ＡＣＮ、Ｆ１０：２７．５％ＡＣＮおよびＦ１１：３０％ＡＣＮ）、次いで、６画分（Ｆ１＋Ｆ６、Ｆ２＋Ｆ７、Ｆ８、Ｆ３＋Ｆ９、Ｆ４＋Ｆ１０、Ｆ５＋Ｆ１１）に合わせた改変溶出スキームを用いて、製造業者のプロトコールに従って断片化を行った。ペプチドを凍結乾燥させ、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析のために１０μＬの溶媒Ａに再懸濁した。
【0300】
１．７ｕＭのＢＥＨ－１３０ Ｃ１８（Ｗａｔｅｒｓ）を充填した１００μｍ×２５０ｍｍ ＰｉｃｏＦｒｉｔ（登録商標）カラム（Ｎｅｗ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ）を備えたＮａｎｏＡｃｑｕｉｔｙ（登録商標）ＵＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ）システムに連結したＦｕｓｉｏｎ（商標）Ｌｕｍｏｓ（商標）質量分析計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて、未断片化ＧＧＸ試料のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析を行った。１６３分の２段階直線勾配で５００ｎＬ／分で低ｐＨ逆相分離（溶媒Ａ：０．１％ＦＡ／９８％水／２％ＡＣＮ、溶媒Ｂ：０．１％ＦＡ／９８％ＡＣＮ／２％水）を行い、溶媒Ｂを１５８分かけて２％から３０％に増加させ、次いで、５分かけて３０％から７５％に増加させ、総実行時間は１８０分であった。分解能１２０，０００、ＡＧＣ目標１×１０６および最大注入時間５０ｍｓで、Ｆｕｓｉｏｎ（商標）Ｌｕｍｏｓ（商標）ＦＴＭＳ１スキャンを収集した。正規化衝突エネルギー３５％、ＡＧＣ目標５．０×１０４および最大注入時間２００ｍｓでのＣＩＤフラグメンテーションを用いて、分解能１５，０００で、２～６の電荷状態を有するプリカーサに対するＦＴＭＳ２スキャンを収集した。正規化衝突エネルギー５５％、ＡＧＣ目標１．５×１０５および最大注入時間４００ｍｓでＨＣＤフラグメンテーションに供されたＭＳ２スペクトルにおける上位８つの最も強いイオンを用いて、分解能５０，０００でＯｒｂｉｔｒａｐで同期プリカーサ選択（ｓｙｎｃｈｒｏｎｏｕｓ－ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ－ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）（ＳＰＳ）ＭＳ３スキャンを分析した。
【0301】
以下の例外を除いて上記のように、断片化されたＧＧＸペプチドに対するＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析を行った。Ｄｉｏｎｅｘ Ｕｌｔｉｍａｔｅ ３０００ ＲＳＬＣ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して、３００ｎＬ／分の流速を低下させ、溶媒Ｂを１３５分かけて２％から３０％に増加させ、１５分かけて３０％から５０％に増加させる改変した勾配で実行するＡｕｒｏｒａ Ｓｅｒｉｅｓ ２５ｃｍ×７５μｍ Ｉ．Ｄ．カラム（ＩｏｎＯｐｔｉｃｋｓ）を用いて、液体クロマトグラフィーを行った。
【0302】
断片化されたＫ－ε－ＧＧペプチドに対するＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析を、フラグメンテーションのために選択されたプリカーサイオンを電荷状態３～６を有するものに制限するＭＳ法に対する改変を伴って、未断片化ＧＧＸ試料について記載されるように正確に行った。
【0303】
ＴＭＴ分析では、データ依存法の性能に影響を及ぼすと思われる一連の大きな予想外の特徴がＭＳ１データに観察された。これらの特徴は、クロマトグラムにわたって溶出する一連の強いピークを含み、これは１１個の試料の各々に存在する豊富な内部ＧＧＸペプチドの複合シグナルとして同定された。このシグナルは、１１個の試料のサブセットのみ（ＵＢＥ２Ｗのみ、コンボ）に存在すると予測される目的のＮ末端ユビキチン化ＧＧＸペプチドからの低強度シグナルを覆い隠すと仮定された。シグナルに関する高存在量の内部ＧＧＸペプチドの競合を最小限に抑え、不明瞭になっている可能性がある追加の同定を回復させるための試みでは、上記のように、ＴＭＴ標識実験からのフロースルーペプチドを使用した免疫親和性濃縮、およびそれらの濃縮ペプチドを無標識定量（ＬＦＱ）分析のためにＬＣ－ＭＳに供した。ＴＭＴ多重化データについては、Ｍａｓｃｏｔを使用して、共通夾雑物配列を含有するＵｎｉＰｒｏｔヒト標的デコイデータベース（２０１７年８月ダウンロード）に対して、ｐｐｍプリカーサイオン質量公差２５ｐｐｍ、断片イオン公差０．０２Ｄａ、および半トリプシン性酵素特異性を用いて生のＭＳデータを検索した。カルバミドメチル化システイン残基（＋５７．０２１５Ｄａ）およびＴＭＴ標識ｎ末端（＋２２９．１６２９）を固定修飾として設定し、メチオニン酸化（１５．９９４９Ｄａ）、Ｋ－ε－ＧＧ（＋１１４．０４２９）およびＮ末端ＧＧ（＋１１４．０４２９）を可変修飾と考えた。ＬＤＡを使用して、各実行に関するペプチドスペクトル一致を理論的プリカーサｍ／ｚからＦＤＲ３％およびｐｐｍ質量公差－５～４にフィルタリングした。Ｍｏｊａｖｅ（Ｚｈｕａｎｇ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｓｉｇｎａｌ ６，ｒａ２５－ｒａ２５（２０１３））を使用してＴＭＴ－ＭＳ３定量を行った。オープンソースＲ／ＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒパッケージであるＭＳｓｔａｔｓＴＭＴ ｖ１．６．３を使用して、ＴＭＴプロテオミクスデータの定量および統計試験を行った（Ｈｕａｎｇ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ １９，ｍｃｐ．ＲＡ１２０．００２１０５（２０２０））。ＭＳｓｔａｔｓＴＭＴ分析の前に、ＰＳＭが（１）デコイタンパク質由来である場合、（２）７未満の長さを有するペプチド由来である場合、（３）５０％未満の単離特異性を有する場合、（４）２５６未満のレポーターイオン強度を有する場合、または（５）３０，０００未満の合計レポーターイオン強度（全１１チャネルにわたって）を有する場合、さらなる分析からフィルタリングした。ペプチドおよびチャネル当たりの最大レポーターイオン強度を最初に取得し、次いで、各ＰＳＭについて最大レポーターイオン強度を有する画分を選択することによって、冗長なＰＳＭ（すなわち、同じペプチドにマッピングされる１回のＭＳ実行中の複数のＰＳＭ）を要約した。次に、ＭＳｓｔａｔｓＴＭＴにより、Ｔｕｋｅｙ中央値洗練集計（ｍｅｄｉａｎ ｐｏｌｉｓｈ ｓｕｍｍａｒｉｚａｔｉｏｎ）（ＴＭＰ）を使用して、ペプチドをタンパク質修飾部位レベルに要約した。タンパク質当たりの線形混合効果モデルに基づいてＭＳｓｔａｔｓＴＭＴによって、条件間の示差的存在量分析を計算した。経験的Ｂａｙｅｓ収縮を適用することによって推論手順を調整し、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ手順による多重仮説検定のために、得られたｐ値を調整した。
【0304】
プールされたＴＭＴ試料では、内部ＧＧＸペプチドが、Ｎ末端ユビキチン化ＧＧＸレムナントと比較して不釣り合いに高いシグナルを示すことが観察された。この作用を克服し、追加のＵＢＥ２Ｗ基質を捕捉するための試みでは、対照（ｄｏｘなし）、ＵＢＥ２Ｗのみ、ＲＮＦ４のみ、およびＲＮＦ４／ＵＢＥ２Ｗ（コンボ）試料に対して追加の免疫親和性濃縮実験および無標識ＭＳ分析を行った。
【0305】
２つの条件のＬＦＱ実験と同様に、液体クロマトグラフィーおよびデータ取得に以下のわずかな改変を加えて、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを行った。Ａｕｒｏｒａ Ｓｅｒｉｅｓ ２５ｃｍ×７５μｍ Ｉ．Ｄ．カラム（ＩｏｎＯｐｔｉｃｋｓ）を用いて、流速４５０ｎＬ／分で低ｐＨ逆相分離を行った。９１分かけて２から３５パーセント溶媒Ｂまで増加させ、５分かけて３５から７５パーセントまで増加させるように二段階勾配を改変した。全注入について、ＭＳ２スペクトルをイオントラップで分析した。
【0306】
これらのＭＳデータは、Ｍａｓｃｏｔ（Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して、ＵｎｉＰｒｏｔヒト配列および共通夾雑物配列を含有する標的デコイデータベース（２０１７年８月ダウンロード）に対して、プリカーサイオン質量公差２５ｐｐｍ、断片イオン公差０．８Ｄａ、および半トリプシン性酵素特異性を使用して検索した。カルバミドメチル化システイン（＋５７．０２１５Ｄａ）を固定修飾として設定し、メチオニン酸化（１５．９９４９Ｄａ）、Ｋ－ε－ＧＧ（＋１１４．０４２９）およびＮ末端ＧＧ（＋１１４．０４２９）を可変修飾と考えた。３パーセントの偽発見率での線形判別分析を使用して、ペプチドレベルでペプチドスペクトル一致をフィルタリングした。正確なプリカーサイオン質量および保持時間を利用して実行全体にわたってペプチドを定量する、直接ＰＳＭによって導かれるアルゴリズムであるＸＱｕａｎｔを使用して、全データファイルにわたるＮ末端ＧＧペプチドの無標識定量を行った（Ｋｉｒｋｐａｔｒｉｃｋ，Ｄ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ １１０，１９４２６－１９４３１（２０１３））。オープンソースＲ／ＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒパッケージであるＭＳｓｔａｔｓ ｖ３．２０．０を使用して、無標識プロテオミクスデータの定量および統計試験を行った（Ｃｈｏｉ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ３０，２５２４－２５２６（２０１４））。ＭＳｓｔａｔｓ分析の前に、ＰＳＭが（１）デコイタンパク質由来である場合、（２）７未満の長さを有するペプチド由来である場合、（３）７１未満のＶｉｓｔａＱｕａｎｔ信頼度スコアを有した場合、または（４）ピーク面積が２５６未満である場合、さらなる分析から除外した。実行ごとに最大強度をとることによって、冗長なＰＳＭ（すなわち、同じペプチドにマッピングされる１回のＭＳ実行中の複数のＰＳＭ）を要約した。次に、ＭＳｓｔａｔｓにより、Ｔｕｋｅｙ中央値洗練集計（ＴＭＰ）を使用して、ペプチドをタンパク質修飾部位レベルに要約した。タンパク質当たりの線形混合効果モデルに基づいてＭＳｓｔａｔｓによって、条件間の示差的存在量分析を計算した。Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ手順を使用することによって、多重仮説検定のために、線形混合効果モデルからのＰ値を調整した。
【0307】
細胞培養
ＨＥＫ２９３細胞株は、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈの細胞株コア施設ｇＣｅｌｌから入手した。１０％ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ－グルタミンおよび５０Ｕ／ｍｌペニシリン－ストレプトマイシンを補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で細胞を維持した。全細胞株を３７℃／５％ＣＯ２の加湿インキュベーター内で培養し、培地を１日おきに交換した。必要に応じて、示された時間にわたって、ビヒクルＤＭＳＯ（カタログ番号Ｄ２６５０、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）および１μｇ／ｍｌドキシサイクリン（カタログ番号Ｄ９８９１、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）によって細胞を処理した。
ＤＮＡコンストラクト、トランスフェクションおよびウエスタンブロット法
ＨＥＫ２９３細胞株は、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈの細胞株コア施設ｇＣｅｌｌから入手した。１０％ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ－グルタミンおよび５０Ｕ／ｍｌペニシリン－ストレプトマイシンを補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で細胞を維持した。全細胞株を３７℃／５％ＣＯ２の加湿インキュベーター内で培養し、培地を１日おきに交換した。必要に応じて、示された時間にわたって、ビヒクルＤＭＳＯ（カタログ番号Ｄ２６５０、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）および１μｇ／ｍｌドキシサイクリン（カタログ番号Ｄ９８９１、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）によって細胞を処理した。
ＤＮＡコンストラクト、トランスフェクションおよびウエスタンブロット法
【0308】
全ＤＮＡコンストラクトをカスタム遺伝子合成（ＧｅｎｅＳｃｒｉｐｔ）によって得て、ＮｃｏＩ部位およびＸｈｏＩ部位を使用してドキシサイクリン誘導性ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンプラスミド（ＢＨ１．２、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）にサブクローニングした。一過性発現のために、ＨＥＫ２９３細胞を６ウェルプレートに播種し、ＤＭＥＭ培地中で約５０％コンフルエンスまで増殖させた。次いで、製造業者の指示に従って１０μｌのＦｕｇｅｎｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用することによって、細胞を１μｇのｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンプラスミドによってトランスフェクトした。安定な細胞株生成のために、１０μｌのＦｕｇｅｎｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、２５０ｎｇのｐｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼプラスミド（ｐＢＯ、Ｔｒａｎｓｐｏｓａｇｅｎ）および７５０ｎｇのｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンプラスミドによって細胞を同時トランスフェクトした。トランスフェクションの３日後、細胞を、１μｇ／ｍＬのピューロマイシンを含有する選択培地に分割し、１０日間選択した。次いで、ウエスタンブロット分析によって、タンパク質発現について、安定なまたは一過性のトランスフェクト細胞をアッセイした（例えば、図４Ａ、図４Ｃ、図４Ｉを参照）。１μｇ／ｍＬのＤｏｘによって処理した２日後、細胞を変性溶解バッファー（９Ｍ尿素、ＲＩＰＡバッファー）によって溶解し、超音波処理し、１３，０００ｒｐｍで１０分間、４℃で遠心分離した。１５～５０μｇのタンパク質を１×ＳＤＳローディングバッファー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）および１×還元剤（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）中で調製し、５分間かけて９０℃に加熱し、１２％Ｔｒｉｓ－グリシンゲル（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）中で泳動させた。Ｔｒａｎｓ－Ｂｌｏｔ Ｔｕｒｂｏ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用して２３Ｖで７分間かけて、ゲルをニトロセルロースメンブレンに転写した。メンブレンを、０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０（ＰＢＳ－Ｔ）を含むＰＢＳで希釈した５％脱脂乳によって３０分間ブロックし、ＰＢＳ－Ｔによって短時間３回すすぎ、５％ＢＳＡを含むＰＢＳ－Ｔ中の一次抗体とともに４Ｃで一晩インキュベートした。ブロットをＰＢＳ－Ｔ中で５分間にわたって３回洗浄し、次いで、５％ＢＳＡを含むＰＢＳ－Ｔ中で二次抗体と室温で１時間インキュベートした。ブロットを前述のように洗浄し、Ｓｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ Ｆｅｍｔｏ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて検出を行った。抗体は、１：５０００ウサギ抗ベータチューブリン（カタログ番号ａｂ６０４６；Ａｂｃａｍ）、１：１０００ウサギ抗ＵＢＥ２Ｗ（カタログ番号ＰＡ５－６７５４７；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、１：２，０００ウサギ抗ＵＣＨＬ１（カタログ番号ＨＰＡ００５９９３；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、１：５００マウス抗ユビキチン（カタログ番号ＶＵ－１；ＬｉｆｅＳｅｎｓｏｒｓ）、ならびに１：１０，０００ヤギ抗マウスＩｇＧ ＨＲＰおよびヤギ抗ウサギＩｇＧ ＨＲＰ（カタログ番号３１４６０および３１４３０、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）であった。
【0309】
結果
ユビキチン結合酵素Ｅ２（ＵＢＥ２Ｗ）は、Ｎ末端ユビキチン化を媒介することが知られている唯一のＥ２ Ｕｂ結合酵素であり、ＵＢＥ２Ｗ発現レベルはＨＥＫ２９３細胞では低いため、理論に拘束されることを望むものではないが、ＵＢＥ２Ｗの外因性発現が内因性基質のＮ末端ユビキチン化を刺激し得ると推論された。したがって、ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）誘導性ＵＢＥ２Ｗ ＨＥＫ２９３細胞株を生成し、実施例３に記載されているように、パイロットＭＳ実験と同様の免疫親和性濃縮およびＭＳワークフローを行うために使用した。
ユビキチン結合酵素Ｅ２（ＵＢＥ２Ｗ）は、Ｎ末端ユビキチン化を媒介することが知られている唯一のＥ２ Ｕｂ結合酵素であり、ＵＢＥ２Ｗ発現レベルはＨＥＫ２９３細胞では低いため、理論に拘束されることを望むものではないが、ＵＢＥ２Ｗの外因性発現が内因性基質のＮ末端ユビキチン化を刺激し得ると推論された。したがって、ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）誘導性ＵＢＥ２Ｗ ＨＥＫ２９３細胞株を生成し、実施例３に記載されているように、パイロットＭＳ実験と同様の免疫親和性濃縮およびＭＳワークフローを行うために使用した。
【0310】
ＵＢＥ２Ｗ基質を、ＵＢＥ２Ｗ発現時にそのＮ末端のＧＧＸペプチドの存在量が増加したタンパク質として同定することを目的として、ＭＳ１ピーク強度の無標識定量（ＬＦＱ）を使用して、ＤＯＸ＋ＵＢＥ２Ｗ発現を対照ＤＯＸ－条件と比較した（図４Ａ）。実施例３に記載したのと同様の手法を適用して、イニシエーターメチオニンまたはネオＮ末端のいずれかでのジグリシン結合に対応するタンパク質Ｎ末端配列についてペプチドスペクトル一致（ＰＳＭ）をフィルタリングした。合計で、１０９個のタンパク質に由来する１５２個の固有のＧＧＸ ＰＳＭが、それぞれ０．８０％および３．６７％のペプチド偽発見率およびタンパク質偽発見率で同定された。ＰＳＭに関するｌｏｇ２倍率変化（ｌｏｇ２ ＦＣ）＞１およびｐ＜０．０５の基準を使用して、この実験では、３３個のＵＢＥ２Ｗ基質が同定された（図４Ｂ、表８）。
【0311】
大部分のＥ２ Ｕｂ結合酵素はＥ３リガーゼと協同的に作用し（例えば、ＲＮＦ４）、以前の研究では、ＵＢＥ２Ｗがいくつかの基質のＲＮＦ４依存性ユビキチン化を示すことが報告された（Ｔａｔｈａｍ，Ｍ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ４５３，１３７－１４５（２０１３））。したがって、次のＤｏｘ誘導性ＲＮＦ４およびバイシストロニック（ＲＮＦ４／ＵＢＥ２Ｗ、「コンボ」）発現ベクターを生成し、安定なＨＥＫ２９３細胞株を調製するために使用した（図４Ｃ）。ここでは、上記のＬＦＱ手法に加えて、抗Ｋ－ε－ＧＧ ｍＡｂについて記載されているように（Ｒｏｓｅ，Ｃ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｙｓｔ ３，３９５－４０３．ｅ４（２０１６））、タンデム質量タグ付け（ＴＭＴ）による等圧多重化と協調して抗ＧＧＸ ｍＡｂ免疫親和性濃縮を行った。ＴＭＴ分析では、単一の多重化実験で各条件のいくつかの複製物を互いに比較することが可能であった：対照（ｄｏｘなし）、ＵＢＥ２Ｗのみ、ＲＮＦ４のみ、およびＲＮＦ４／ＵＢＥ２Ｗ（コンボ）。試料のこのセットにより、基質のＮ末端ユビキチン化におけるＵＢＥ２ＷとＲＮＦ４との間の潜在的なＥ２／Ｅ３相乗作用を評価することが可能になった。このパラダイムでは、ＵＢＥ２Ｗ基質は、ＵＢＥ２Ｗ－対照およびコンボ－ＲＮＦ４という２つの対比で表される。対比とは、同定および定量された特徴のリストにわたって比較される一対の条件を指す。ＴＭＴ分析では、９９個のタンパク質に由来する１４１個の固有のＮ末端ユビキチン化ＧＧＸ ＰＳＭが、それぞれ０．８０％および２．０２％のペプチド偽発見率およびタンパク質偽発見率で同定された。データを大まかに調査すると、ＲＮＦ４過剰発現は、ＲＮＦ４のみの試料でも、またはＵＢＥ２Ｗと共発現した場合に相乗的にも（すなわち、コンボ試料）、Ｎ末端ユビキチン化レベルに顕著に影響を及ぼさなかったことが明らかにされた。これらの条件の各々は、それぞれ対照条件およびＵＢＥ２Ｗのみの条件と同様の定量的データをもたらした。複数の条件から出現するヒットを探すために、コンボ－ＲＮＦ４対比のｌｏｇ２ＦＣをＵＢＥ２Ｗ－対照のものと比較し、複数の条件にわたってｌｏｇ２ＦＣ＞１およびｐ＜０．０５を有する６０個のＵＢＥ２Ｗ基質の高信頼度セットを得た。（図４Ｄ、表８）。
【0312】
対応するＬＦＱ分析では、１２０個のタンパク質に由来する１８６個の固有のＮ末端ユビキチン化ＧＧＸ ＰＳＭが、１．３８％のペプチド偽発見率で同定された。このデータセットのタンパク質偽発見率は、ペプチドレベルでの反復同定の頻度に起因して、１３．３３％と異常に高かった。Ｎ末端ユビキチン化レベルがＵＢＥ２Ｗのみ対対照、コンボ対ＲＮＦ４のみ、およびコンボ対対照では増加した（ｌｏｇ２ＦＣ＞１およびｐ＜０．０５）タンパク質に着目すると、このデータから、ＴＭＴ分析と部分的に重複する３８個のＵＢＥ２Ｗ基質がもたらされた（図４Ｅ）。ＵＢＥ２Ｗ－対照およびコンボ－ＲＮＦ４のみの対比ではｌｏｇ２ＦＣ＞１およびｐ＜０．０５を要求することによる最高信頼度ヒットのフィルタリングにより、２８個の高信頼度ＵＢＥ２Ｗ基質タンパク質ヒットが得られた（図４Ｆ）。
【0313】
本明細書に記載される全ＭＳ実験データを統合することにより、個々の実験の各々で同定された固有の基質のサブセットとの、同定された基質における顕著な重複が明らかにされた（図４Ｇ）。さらなる検査により、大部分（約５３％）がＵＢＥ２Ｗ単独とＵＢＥ２Ｗ／ＲＮＦ４コンボ条件との間で共有されることが明らかにされ、ＲＮＦ４の外因性発現がｉｎ ｖｉｖｏでＵＢＥ２Ｗの活性を増強しないことが確認された（図４Ｅ、表８）。
【0314】
３つの定量的免疫親和性濃縮実験、すなわち、ＵＢＥ２Ｗ過剰発現対対照を調査するＬＦＱ、ＵＢＥ２ＷおよびＲＮＦ４過剰発現を個別におよび組み合わせて対照と比較するＴＭＴ分析、ならびに追跡ＬＦＱ実験からまとめて、７４個のＵＢＥ２Ｗ基質が統計学的有意性に達したと報告されている（以下の表８の概要を参照）。ＴＭＴ実験から生じる定量的データでは、対照と比較して、ＵＢＥ２Ｗを発現する試料からのいくつかのタンパク質についてシグナルの増加が一定してもたらされたため、これらが実際にＵＢＥ２Ｗの基質であることが示された（図４ＨのＲＳ７、ＭＩＰ１８およびＱＫＩの結果を参照）。
【0315】
次に、ＵＢＥ２Ｗ、または細胞内でユビキチン結合を減少させる変異体であるＵＢＥ２ＷＷ１４４Ｅを用いて、リジンを有しないＣ末端ＨＡタグ付きタンパク質を異所的に発現させることによって、新たに同定された基質を検証した（Ｖｉｔｔａｌ，Ｖ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ １１，８３－８９（２０１５））。Ｎ末端ＨＡタグがＵＢＥ２Ｗによって認識および修飾され得る本質的に無秩序な配列を表すという以前の観察結果を考慮すると、Ｃ末端タグ化基質を使用することは重要である（Ｖｉｔｔａｌ，Ｖ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ １１，８３－８９（２０１５））。同定されたＵＢＥ２Ｗ基質の大部分は、モノユビキチン化形態の濃縮を示したが、いくつかの例では、理論に拘束されることを望むものではないが、他の酵素の作用を介してＮ末端ユビキチン化の後に生じると考えられるポリユビキチン化と一致して高分子量バンドを検出することができた（図４Ｉ）。重要なことに、これらの基質のモノユビキチン化種は変異体ＵＢＥ２ＷＷ１４４Ｅを発現する細胞に蓄積せず、これらの基質がＵＢＥ２Ｗユビキチン結合、およびその後の標的タンパク質アミノ末端への移行に依存することが確認された（図４Ｉ）。実験にわたって同定された基質の検査により、Ｎ末端ユビキチン化が翻訳開始メチオニン上でのみ起こったことが明らかにされた。これらの同じタンパク質の多くが２番目の位置に小さい疎水性アミノ酸を示し、これにより、ＭｅｔＡＰ３９によるＮ末端Ｍｅｔの除去が引き起こされる傾向があるため、これは驚くべきことであった（免疫親和性濃縮ＵＢＥ２Ｗ基質の２番目の位置の分析が、イニシエーターメチオニンの後にグリシン、アラニン、バリンまたはフェニルアラニンを含有するペプチドの優先的濃縮を示す図４Ｊを参照）。ＵＢＥ２Ｗは無秩序なＮ末端を有するタンパク質を優先的にユビキチン化することが知られているため（Ｖｉｔｔａｌ，Ｖ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ １１，８３－８９（２０１５））、タンパク質予測ソフトウェアを使用して、これらの推定基質が実際に無秩序なＮ末端を有するかどうかを評価した。Ｐｒｏｔｅｉｎ ＤｉｓＯｒｄｅｒ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＰｒＤＯＳ）（Ｉｓｈｉｄａ，Ｔ．＆Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ，Ｋ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３５，Ｗ４６０－Ｗ４６４（２００７））を使用すると、これらのタンパク質のうち６２個が、予測された無秩序なＮ末端を有することが見出された（表８、右列）。
【0316】
まとめると、ＵＢＥ２Ｗの７４個の細胞基質が同定された。ＵＢＥ２Ｗ基質、ならびに実施例３に記載のパイロット免疫親和性濃縮およびＭＳ実験で同定された推定Ｎ末端ユビキチン化部位を有するタンパク質の概要を以下の表８に示す。表８では、「Ｘ」は、タンパク質が、対応するＭＳ実験で同定されたか、または無秩序なＮ末端を有すると予測されたことを示す。
【0317】
実施例５：ＵＣＨＬ１およびＵＣＨＬ５はＵＢＥ２Ｗの基質であり、Ｎ末端ユビキチン化はＵＣＨＬ１およびＵＣＨＬ５のデユビキチナーゼ活性を調節する
以下の実施例は、ユビキチンＣ末端ヒドロラーゼ（ＵＣＨ）ファミリーのデユビキチナーゼの２つのメンバー、ＵＢＥ２Ｗ基質ＵＣＨＬ１およびＵＣＨＬ５を特性評価する実験を記載する。具体的には、ＵＣＨＬ１およびＵＣＨＬ５は、ｉｎ ｖｉｔｒｏユビキチン化アッセイでは、ＵＢＥ２ＷによってＮ末端ユビキチン化されることが実証された。さらに、Ｎ末端ユビキチン化は、ＵＣＨＬ１およびＵＣＨＬ５のデユビキチナーゼ活性を調節することが示された。
以下の実施例は、ユビキチンＣ末端ヒドロラーゼ（ＵＣＨ）ファミリーのデユビキチナーゼの２つのメンバー、ＵＢＥ２Ｗ基質ＵＣＨＬ１およびＵＣＨＬ５を特性評価する実験を記載する。具体的には、ＵＣＨＬ１およびＵＣＨＬ５は、ｉｎ ｖｉｔｒｏユビキチン化アッセイでは、ＵＢＥ２ＷによってＮ末端ユビキチン化されることが実証された。さらに、Ｎ末端ユビキチン化は、ＵＣＨＬ１およびＵＣＨＬ５のデユビキチナーゼ活性を調節することが示された。
【0318】
材料および方法
細胞培養
ＨＥＫ２９３細胞株およびＣＯＳ－７細胞株は、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈの細胞株コア施設ｇＣｅｌｌから入手した。１０％ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ－グルタミンおよび５０Ｕ／ｍｌペニシリン－ストレプトマイシンを補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で細胞を維持した。全細胞株を３７℃／５％ＣＯ２の加湿インキュベーター内で培養し、培地を１日おきに交換した。必要に応じて、示された時間にわたって、ビヒクルＤＭＳＯ（カタログ番号Ｄ２６５０、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、１μｇ／ｍｌドキシサイクリン（カタログ番号Ｄ９８９１、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、１μＭボルテゾミブ（カタログ番号２２０４、ＣＳＴ）および１０μｇ／ｍｌシクロヘキシミド（カタログ番号２１１２、ＣＳＴ）によって細胞を処理した。
細胞培養
ＨＥＫ２９３細胞株およびＣＯＳ－７細胞株は、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈの細胞株コア施設ｇＣｅｌｌから入手した。１０％ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ－グルタミンおよび５０Ｕ／ｍｌペニシリン－ストレプトマイシンを補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で細胞を維持した。全細胞株を３７℃／５％ＣＯ２の加湿インキュベーター内で培養し、培地を１日おきに交換した。必要に応じて、示された時間にわたって、ビヒクルＤＭＳＯ（カタログ番号Ｄ２６５０、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、１μｇ／ｍｌドキシサイクリン（カタログ番号Ｄ９８９１、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、１μＭボルテゾミブ（カタログ番号２２０４、ＣＳＴ）および１０μｇ／ｍｌシクロヘキシミド（カタログ番号２１１２、ＣＳＴ）によって細胞を処理した。
【0319】
ユビキチン化アッセイ
ユビキチン化アッセイのために、１００ｎＭ Ｅ１（カタログ番号Ｅ－３０５、Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）と、４μＭ ＵＢＥ２Ｗ（カタログ番号Ｅ２－７４０、Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）と、１μＭ ＵＣＨＬ１－Ｋ０およびＵＣＨＬ５－Ｋ０（自社製）と、１μＭ ＲＮＦ４（カタログ番号Ｅ３－２１０、Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）と、２５０μＭ Ｕｂ（カタログ番号Ｕ－１００Ｈ、Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）との混合物を使用した。全反応を、４０μｌのユビキチン化バッファー（５０ｍＭトリスｐＨ７．５、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ ＫＣＬ、および０．２ｍＭ ＤＴＴ）中、３７℃で２時間行った。反応を３ｍＭ ＡＴＰによって開始し、Ｌａｅｍｍｌｉバッファーを加えることによって停止させ、９０℃に加熱し、続いて、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによってタンパク質を分離し、適切な抗体による免疫ブロット法によって可視化した。
ユビキチン化アッセイのために、１００ｎＭ Ｅ１（カタログ番号Ｅ－３０５、Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）と、４μＭ ＵＢＥ２Ｗ（カタログ番号Ｅ２－７４０、Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）と、１μＭ ＵＣＨＬ１－Ｋ０およびＵＣＨＬ５－Ｋ０（自社製）と、１μＭ ＲＮＦ４（カタログ番号Ｅ３－２１０、Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）と、２５０μＭ Ｕｂ（カタログ番号Ｕ－１００Ｈ、Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）との混合物を使用した。全反応を、４０μｌのユビキチン化バッファー（５０ｍＭトリスｐＨ７．５、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ ＫＣＬ、および０．２ｍＭ ＤＴＴ）中、３７℃で２時間行った。反応を３ｍＭ ＡＴＰによって開始し、Ｌａｅｍｍｌｉバッファーを加えることによって停止させ、９０℃に加熱し、続いて、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによってタンパク質を分離し、適切な抗体による免疫ブロット法によって可視化した。
【0320】
Ｂｉｏｌａｙｅｒ干渉法アッセイ
３８４傾斜ウェルプレートを使用して、Ｏｃｔｅｔ Ｒｅｄ ３８４（Ｆｏｒｔｅ Ｂｉｏ）プラットフォームを用いてＢＬＩアッセイを実行した。全実験を２５℃、１０００ＲＰＭ振盪、６０μＬウェル容量で行い、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ７．５、１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０、および１ｍＭ ＴＣＥＰを含有するバッファーを使用した。ブランクバッファー中での各ローディング、会合または解離工程に、６０秒間のベースラインまたは洗浄工程が先行した。３００秒間のローディング工程にわたる１ｎＭの応答のために、ストレプトアビジンバイオセンサー（カタログ番号１８－５０１９、Ｆｏｒｔｅ Ｂｉｏ）上で、ビオチン化ユビキチン（カタログ番号ＵＢ－５７０、Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）の固定化を１８ｎＭ（０．１５６μｇ／μＬ）に最適化した。野生型またはユビキチン融合タンパク質の会合を行った、５μＭから開始してタンパク質の４倍希釈。会合工程を１８０秒間測定し、解離工程を３００秒間測定した。ビオチン－ユビキチンがロードされていないストレプトアビジンチップを使用して、チップ表面との各タンパク質希釈物の非特異的結合を測定し、カーブフィッティングの前に生データ測定値からデータを差し引いた。プリズムにおける１：１結合モデルを使用して会合曲線および解離曲線をフィッティングし、ＫＤを速度定数および定常状態測定値から決定した（図６Ａ、図６Ｂ、図６Ｃおよび図６Ｄを参照）。
３８４傾斜ウェルプレートを使用して、Ｏｃｔｅｔ Ｒｅｄ ３８４（Ｆｏｒｔｅ Ｂｉｏ）プラットフォームを用いてＢＬＩアッセイを実行した。全実験を２５℃、１０００ＲＰＭ振盪、６０μＬウェル容量で行い、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ７．５、１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０、および１ｍＭ ＴＣＥＰを含有するバッファーを使用した。ブランクバッファー中での各ローディング、会合または解離工程に、６０秒間のベースラインまたは洗浄工程が先行した。３００秒間のローディング工程にわたる１ｎＭの応答のために、ストレプトアビジンバイオセンサー（カタログ番号１８－５０１９、Ｆｏｒｔｅ Ｂｉｏ）上で、ビオチン化ユビキチン（カタログ番号ＵＢ－５７０、Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）の固定化を１８ｎＭ（０．１５６μｇ／μＬ）に最適化した。野生型またはユビキチン融合タンパク質の会合を行った、５μＭから開始してタンパク質の４倍希釈。会合工程を１８０秒間測定し、解離工程を３００秒間測定した。ビオチン－ユビキチンがロードされていないストレプトアビジンチップを使用して、チップ表面との各タンパク質希釈物の非特異的結合を測定し、カーブフィッティングの前に生データ測定値からデータを差し引いた。プリズムにおける１：１結合モデルを使用して会合曲線および解離曲線をフィッティングし、ＫＤを速度定数および定常状態測定値から決定した（図６Ａ、図６Ｂ、図６Ｃおよび図６Ｄを参照）。
【0321】
Ｕｂ－ローダミン１１０酵素アッセイ
Ｕｂ－ローダミン１１０（カタログ番号Ｕ－５５５、Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）をＤＭＳＯに溶解し、１０μｌの反応バッファー（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、５０ｍＭ ＫＣｌ、５％グリセロール、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、５ｍＭ ＤＴＴ、０．１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、および０．００５％Ｔｗｅｅｎ－２０）中０．５μＭの基質（Ｕｂ－Ｒｈｏ１１０）を含む１ｎＭの精製酵素を使用して活性アッセイを決定した。実験を、黒色３８４ウェル非結合面低フランジプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）内３７℃で行い、ＥｎＶｉｓｉｏｎ（登録商標）２１０５ Ｍｕｌｔｉｍｏｄｅ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で、それぞれ３５０ｎｍおよび４５０ｎｍの励起波長および発光波長を使用してモニタリングした。１２０分間にわたって６０秒ごとに測定を行った（図６Ｅを参照）。
Ｕｂ－ローダミン１１０（カタログ番号Ｕ－５５５、Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）をＤＭＳＯに溶解し、１０μｌの反応バッファー（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、５０ｍＭ ＫＣｌ、５％グリセロール、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、５ｍＭ ＤＴＴ、０．１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、および０．００５％Ｔｗｅｅｎ－２０）中０．５μＭの基質（Ｕｂ－Ｒｈｏ１１０）を含む１ｎＭの精製酵素を使用して活性アッセイを決定した。実験を、黒色３８４ウェル非結合面低フランジプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）内３７℃で行い、ＥｎＶｉｓｉｏｎ（登録商標）２１０５ Ｍｕｌｔｉｍｏｄｅ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で、それぞれ３５０ｎｍおよび４５０ｎｍの励起波長および発光波長を使用してモニタリングした。１２０分間にわたって６０秒ごとに測定を行った（図６Ｅを参照）。
【0322】
ユビキチンビニルスルホンアッセイ
精製タンパク質（５０ｎＭ）を１μＭ ＵｂビニルスルホンＨＡタグ付きプローブ（Ｕｂ－ＶＳ－ＨＡ）（カタログ番号Ｕ－２１２、Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）による酵素反応に供した。全反応を４０μｌのデユビキチナーゼ（ＤＵＢ）バッファー（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、５０ｍＭ ＫＣｌ、５％グリセロール、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、５ｍＭ ＤＴＴ、０．１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、および０．００５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０）中、３７℃で３０分間行った。適切な抗体による免疫ブロット法によって、部位特異的ＨＡ－Ｕｂ－ＶＳプローブによる酵素の修飾を検出した（図６Ｆを参照）。
精製タンパク質（５０ｎＭ）を１μＭ ＵｂビニルスルホンＨＡタグ付きプローブ（Ｕｂ－ＶＳ－ＨＡ）（カタログ番号Ｕ－２１２、Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）による酵素反応に供した。全反応を４０μｌのデユビキチナーゼ（ＤＵＢ）バッファー（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、５０ｍＭ ＫＣｌ、５％グリセロール、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、５ｍＭ ＤＴＴ、０．１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、および０．００５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０）中、３７℃で３０分間行った。適切な抗体による免疫ブロット法によって、部位特異的ＨＡ－Ｕｂ－ＶＳプローブによる酵素の修飾を検出した（図６Ｆを参照）。
【0323】
タンパク質の発現および精製
全ての完全長野生型および変異体タンパク質、ならびにＮ末端融合Ｕｂを、カスタム遺伝子合成（ＧｅｎｅＳｃｒｉｐｔ）によって得、大腸菌内の発現のために単一タンパク質発現ベクターにサブクローニングした。全配列をそれらのＣ末端で６－Ｈｉｓタグによってタグ付けした。タンパク質を、ＢＬ２１－Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）細胞内で１８℃で１８時間発現させ、次いで、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ７．５、５％グリセロール、および１ｍＭ ＴＣＥＰを含有する溶解バッファー中での遠心分離によって採取した。アフィニティークロマトグラフィー（Ｎｉ－ＮＴＡ Ａｇａｒｏｓｅ、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）、続いて、サイズ排除クロマトグラフィー（１６／６００ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によってタンパク質を精製した。タンパク質試料を濃縮し、ＧＦバッファー（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ７．５、１ｍＭ ＴＣＥＰ）中で凍結した。
全ての完全長野生型および変異体タンパク質、ならびにＮ末端融合Ｕｂを、カスタム遺伝子合成（ＧｅｎｅＳｃｒｉｐｔ）によって得、大腸菌内の発現のために単一タンパク質発現ベクターにサブクローニングした。全配列をそれらのＣ末端で６－Ｈｉｓタグによってタグ付けした。タンパク質を、ＢＬ２１－Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）細胞内で１８℃で１８時間発現させ、次いで、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ７．５、５％グリセロール、および１ｍＭ ＴＣＥＰを含有する溶解バッファー中での遠心分離によって採取した。アフィニティークロマトグラフィー（Ｎｉ－ＮＴＡ Ａｇａｒｏｓｅ、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）、続いて、サイズ排除クロマトグラフィー（１６／６００ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によってタンパク質を精製した。タンパク質試料を濃縮し、ＧＦバッファー（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ７．５、１ｍＭ ＴＣＥＰ）中で凍結した。
【0324】
結果
ＵＣＨＬ１およびＵＣＨＬ５はＵＢＥ２Ｗの基質である
ＵＢＥ２Ｗ基質リストの中で注目すべきは、ユビキチンＣ末端ヒドロラーゼ（ＵＣＨ）ファミリーのデユビキチナーゼの２つのメンバー、ＵＣＨＬ１およびＵＣＨＬ５であった（図５Ａ、図５Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、表８）。ＵＣＨＬ１は、３つのＬＣ－ＭＳ実験のうちの１つで推定基質として同定されたが、ＵＣＨＬ５は３つ全てで同定された。データ依存性ショットガン配列決定のイディオシンクラティックな性質のために、これらの実験は、ＴＭＴ試料中のＵＣＨＬ１のＮ末端ユビキチン化を実証するデータをもたらさなかった。各々の半トリプシン性形態および完全トリプシン性形態を表す、Ｎ末端ユビキチン化ＵＣＨＬ１ペプチドおよびＮ末端ユビキチン化ＵＣＨＬ５ペプチドの２つの異なる形態が同定され、それぞれの同定の信頼性をさらに高めた。以前に、ＵＣＨＬ１はＮ末端ユビキチン化されていることが示唆されていたが、この修飾に関与する酵素は不明であった（Ｍｅｒａｙ，Ｒ．Ｋ．＆Ｌａｎｓｂｕｒｙ，Ｐ．Ｔ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８２，１０５６７－１０５７５（２００７））。これらの２つのデユビキチナーゼが実際にＮ末端ユビキチン化されたことを検証するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏユビキチン化アッセイを精製タンパク質を用いて行ったところ、ＵＢＥ２Ｗが、リジンを有しないバージョンのＵＣＨＬ１およびＵＣＨＬ５の両方をモノユビキチン化できることが観察された（図５Ｅ）。これらのデータを裏付けて、内因性ＵＣＨＬ１は、細胞内のＵＢＥ２Ｗの発現時にモノユビキチン化された（図５Ｆ）。重要なことに、ＵＢＥ２ＷＷ１４４Ｅ発現は、Ｕｂ－ＵＣＨＬ１の形成を裏付けなかった（図５Ｆ）。残念ながら、ＵＣＨＬ５の修飾は、ウエスタンブロット実験では検出されなかった（データは示さず）。
ＵＣＨＬ１およびＵＣＨＬ５はＵＢＥ２Ｗの基質である
ＵＢＥ２Ｗ基質リストの中で注目すべきは、ユビキチンＣ末端ヒドロラーゼ（ＵＣＨ）ファミリーのデユビキチナーゼの２つのメンバー、ＵＣＨＬ１およびＵＣＨＬ５であった（図５Ａ、図５Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、表８）。ＵＣＨＬ１は、３つのＬＣ－ＭＳ実験のうちの１つで推定基質として同定されたが、ＵＣＨＬ５は３つ全てで同定された。データ依存性ショットガン配列決定のイディオシンクラティックな性質のために、これらの実験は、ＴＭＴ試料中のＵＣＨＬ１のＮ末端ユビキチン化を実証するデータをもたらさなかった。各々の半トリプシン性形態および完全トリプシン性形態を表す、Ｎ末端ユビキチン化ＵＣＨＬ１ペプチドおよびＮ末端ユビキチン化ＵＣＨＬ５ペプチドの２つの異なる形態が同定され、それぞれの同定の信頼性をさらに高めた。以前に、ＵＣＨＬ１はＮ末端ユビキチン化されていることが示唆されていたが、この修飾に関与する酵素は不明であった（Ｍｅｒａｙ，Ｒ．Ｋ．＆Ｌａｎｓｂｕｒｙ，Ｐ．Ｔ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８２，１０５６７－１０５７５（２００７））。これらの２つのデユビキチナーゼが実際にＮ末端ユビキチン化されたことを検証するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏユビキチン化アッセイを精製タンパク質を用いて行ったところ、ＵＢＥ２Ｗが、リジンを有しないバージョンのＵＣＨＬ１およびＵＣＨＬ５の両方をモノユビキチン化できることが観察された（図５Ｅ）。これらのデータを裏付けて、内因性ＵＣＨＬ１は、細胞内のＵＢＥ２Ｗの発現時にモノユビキチン化された（図５Ｆ）。重要なことに、ＵＢＥ２ＷＷ１４４Ｅ発現は、Ｕｂ－ＵＣＨＬ１の形成を裏付けなかった（図５Ｆ）。残念ながら、ＵＣＨＬ５の修飾は、ウエスタンブロット実験では検出されなかった（データは示さず）。
【0325】
Ｎ末端ユビキチン化は、タンパク質分解のシグナルであると提案されている（Ｃｉｅｃｈａｎｏｖｅｒ，Ａ．＆Ｂｅｎ－Ｓａａｄｏｎ，Ｒ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １４，１０３－１０６（２００４）；Ｂｒｅｉｔｓｃｈｏｐｆ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｍｂｏ Ｊ １７，５９６４－５９７３（１９９８）；Ｂｌｏｏｍ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １１５，７１－８２（２００３）；Ｃｏｕｌｏｍｂｅ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２４，６１４０－６１５０（２００４））。ただし、近年、Ｎ末端ユビキチン化タンパク質はプロテアソーム阻害剤の存在下ではわずかにしか蓄積しないことが示され、Ｎ末端ユビキチン化がタンパク質分解以外の役割を有する可能性があることが示唆された（Ａｋｉｍｏｖ，Ｖ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２５，６３１－６４０（２０１８））。そのため、Ｎ末端ユビキチン化が細胞アッセイでＵＣＨＬ１の分解を促進するかどうかを評価した。これを試験するために、ＵＢＥ２Ｗを発現させ、ＨＥＫ２９３細胞をプロテアソーム阻害剤ボルテゾミブによって処理した。ボルテゾミブによって処理した細胞には高分子量ユビキチン化タンパク質が蓄積したが、Ｕｂ－ＵＣＨＬ１の蓄積は観察されなかった（図５Ｇ）。ＵＣＨＬ１のＮ末端モノユビキチン化がその分解を引き起こさないことを再確認するために、シクロヘキシミド追跡実験を行った。不安定なタンパク質ｐ２１は、ＵＢＥ２Ｗを発現し、シクロヘキシミドによって処理した細胞内で迅速に分解されたが、Ｕｂ－ＵＣＨＬ１は安定なままであった。その後の時点（５時間）でのみ、ＵＣＨＬ１タンパク質レベルが低下し始めた（図５Ｈ）。全体として、これらの結果から、細胞内のＵＢＥ２ＷによるＮ末端モノユビキチン化がＵＣＨＬ１の分解を引き起こさないことが示唆された。
【0326】
Ｎ末端ユビキチン化はＵＣＨＬ１およびＵＣＨＬ５のデユビキチナーゼ活性を調節する
Ｎ末端ユビキチン化は細胞ベースのアッセイではＵＣＨＬ１分解を促進しなかったため、次に、Ｎ末端ユビキチン化がＵＣＨＬ１およびＵＣＨＬ５のデユビキチナーゼ機能を調節するかどうかを評価した。これを評価するために、野生型（ＵＣＨＬ１ＷＴおよびＵＣＨＬ５ＷＴ）、触媒的に不活性な変異体（ＵＣＨＬ１Ｃ９０ＳおよびＵＣＨＬ５Ｃ８８Ｓ）、Ｎ末端ユビキチン化模倣物（ＵｂＧ７６Ｖ－ＵＣＨＬ１およびＵｂＧ７６Ｖ－ＵＣＨＬ５）、およびユビキチン変異体（ＵｂＩ４４Ａ，Ｇ７６Ｖ－ＵＣＨＬ１およびＵｂＩ４４Ａ，Ｇ７６Ｖ－ＵＣＨＬ５）を含む多数のＵＣＨＬ１バリアントおよびＵＣＨＬ５バリアントを生成した。模倣物については、ユビキチンのＣ末端をデユビキチナーゼの最初のメチオニンに融合し、ユビキチンの最後のグリシンをバリンに変異させて、ＵＣＨ自己触媒活性を介したユビキチンの除去を防止した。
Ｎ末端ユビキチン化は細胞ベースのアッセイではＵＣＨＬ１分解を促進しなかったため、次に、Ｎ末端ユビキチン化がＵＣＨＬ１およびＵＣＨＬ５のデユビキチナーゼ機能を調節するかどうかを評価した。これを評価するために、野生型（ＵＣＨＬ１ＷＴおよびＵＣＨＬ５ＷＴ）、触媒的に不活性な変異体（ＵＣＨＬ１Ｃ９０ＳおよびＵＣＨＬ５Ｃ８８Ｓ）、Ｎ末端ユビキチン化模倣物（ＵｂＧ７６Ｖ－ＵＣＨＬ１およびＵｂＧ７６Ｖ－ＵＣＨＬ５）、およびユビキチン変異体（ＵｂＩ４４Ａ，Ｇ７６Ｖ－ＵＣＨＬ１およびＵｂＩ４４Ａ，Ｇ７６Ｖ－ＵＣＨＬ５）を含む多数のＵＣＨＬ１バリアントおよびＵＣＨＬ５バリアントを生成した。模倣物については、ユビキチンのＣ末端をデユビキチナーゼの最初のメチオニンに融合し、ユビキチンの最後のグリシンをバリンに変異させて、ＵＣＨ自己触媒活性を介したユビキチンの除去を防止した。
【0327】
以前の構造研究では、Ｕｂ結合がＵＣＨＬ１活性部位残基を触媒的に適格な配置に再配列させることが示された（Ｂｏｕｄｒｅａｕｘ，Ｄ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ １０７，９１１７－９１２２（２０１０））。しかし、ＵＣＨＬ１の活性部位付近の内部リジンのモノユビキチン化は、その基質の結合をブロックすることが示されている（Ｍｅｒａｙ，Ｒ．Ｋ．＆Ｌａｎｓｂｕｒｙ，Ｐ．Ｔ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８２，１０５６７－１０５７５（２００７））。さらに、ＵＣＨＬ５の活性は、基質親和性のレベルで調整される（Ｙａｏ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ８，９９４－１００２（２００６））。したがって、Ｎ末端ユビキチン化がＵＣＨＬ１およびＵＣＨＬ５のユビキチン結合親和性を調節するかどうかを試験した。Ｂｉｏ－Ｌａｙｅｒ干渉法（ＢＬＩ）を使用して、ＵＣＨＬ１ＷＴ、ＵＣＨＬ５ＷＴ、ＵｂＧ７６Ｖ－ＵＣＨＬ１、ＵｂＧ７６Ｖ－ＵＣＨＬ５、ＵｂＩ４４Ａ，Ｇ７６Ｖ－ＵＣＨＬ１、およびＵｂ Ｉ４４Ａ，Ｇ７６Ｖ－ＵＣＨＬ５のモノユビキチン結合能を調査した（図６Ａ）。以前の報告と一致して（Ｌａｒｓｅｎ，Ｃ．Ｎ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ－ｕｓ ３７，３３５８－３３６８（１９９８）；Ｏｓａｋａ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ １２，１９４５－１９５８（２００３））、モノユビキチンとＵＣＨＬ１ＷＴとの間に強い相互作用が観察された。ただし、モノユビキチンとＵｂＧ７６Ｖ－ＵＣＨＬ１との間では、高いモノユビキチン濃度（５μＭ）でのみ結合が観察された（図６Ｂ、図６Ｃ）。ＵＣＨＬ５についても同様の傾向が見られたが、モノユビキチンに対する親和性は、ＵＣＨＬ１と比較してはるかに低下した（図６Ｂ、図６Ｄ）。興味深いことに、ＵｂＩ４４Ａ，Ｇ７６Ｖ－ＵＣＨＬ１は、ＵｂＧ７６Ｖ－ＵＣＨＬ１と比較して結合の約３倍の増加を示し、ＵＣＨＬ１がそのＮ末端Ｕｂ修飾とシスで相互作用することができることが示唆された。対照的に、Ｉ４４Ａの付加は、ＵｂＧ７６Ｖ－ＵＣＨＬ１のＵｂ結合に影響を及ぼさなかった。したがって、Ｎ末端ユビキチン化は、ＵＣＨＬ１およびＵＣＨＬ５がモノユビキチンに結合するのを妨げるとの結論が下された。
【0328】
次に、ユビキチン－ローダミン１１０（Ｕｂ－Ｒｈｏ１１０）を使用してデユビキチナーゼ活性アッセイを行うことによって、ＵＣＨＬ１およびＵＣＨＬ５のデユビキチナーゼ活性がＮ末端ユビキチン化時に変化するかどうかを調査した。ＵＣＨＬ１ＷＴおよびＵＣＨＬ５ＷＴの動態は以前の報告と一致し（Ｂｏｕｄｒｅａｕｘ，Ｄ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ １０７，９１１７－９１２２（２０１０）；Ｙａｏ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ８，９９４－１００２（２００６））、予測通り、触媒的に死滅したＵＣＨＬ１Ｃ９０ＳおよびＵＣＨＬ５Ｃ８８Ｓから活性は検出できなかった（図６Ｅおよび表９）。驚くべきことに、ＵＣＨＬ１およびＵＣＨＬ５のＮ末端ユビキチン化は、それらのそれぞれのデユビキチナーゼ活性に対して反対の効果を付与した。ＵｂＧ７６Ｖ－ＵＣＨＬ１およびＵｂＩ４４Ａ，Ｇ７６Ｖ－ＵＣＨＬ１は、ＵＣＨＬ１ＷＴと比較して顕著に低下した活性を示したが、ＵｂＧ７６Ｖ－ＵＣＨＬ５およびＵｂＩ４４Ａ，Ｇ７６Ｖ－ＵＣＨＬ５は、ＵＣＨＬ５ＷＴと比較して顕著に増強された活性を有した（図６Ｅおよび表９）。Ｕｂ－Ｒｈｏ１１０アッセイを裏付けるために、自殺プローブユビキチン－ビニルスルホン（Ｕｂ－ＶＳ）を使用した（Ｂｏｒｏｄｏｖｓｋｙ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｍｂｏ Ｊ ２０，５１８７－５１９６（２００１））。ＵＣＨＬ１ＷＴはＵｂ－ＶＳと容易に反応し、３０分後に完了に近づいたが、ＵｂＧ７６Ｖ－ＵＣＨＬ１は大部分が非修飾のままであった（図６Ｆ）。逆に、ＵＣＨＬ５ＷＴは３０分の時点で部分的にしか修飾されなかったが、ＵｂＧ７６Ｖ－ＵＣＨＬ５はＵｂ－ＶＳと迅速に反応した（図６Ｆ）。まとめると、これらのデータでは、Ｎ末端ユビキチン化はＵＣＨＬ１およびＵＣＨＬ５の両方のデユビキチナーゼ活性を調節したが、反対方向であったことが実証されている。
【0329】
最後に、以前の報告では、ＵＣＨＬ１デユビキチナーゼ活性が細胞内の遊離モノユビキチンプールを調節することが示されている（Ｏｓａｋａ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ １２，１９４５－１９５８（２００３））。Ｎ末端ユビキチン化はｉｎ ｖｉｔｒｏでＵＣＨＬ１活性を負に調節したため、細胞内のこの修飾の生理的結果を調査した。ＣＯＳ－７細胞を対象とした以前の研究と一致して（Ｍｅｒａｙ，Ｒ．Ｋ．＆Ｌａｎｓｂｕｒｙ，Ｐ．Ｔ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８２，１０５６７－１０５７５（２００７））、ＵＣＨＬ１ＷＴの外因性発現は、遊離モノユビキチンのレベルを顕著に増加させた（図６Ｇ、レーン１と比較したレーン２）。ただし、ＵｂＧ７６Ｖ－ＵＣＨＬ１の発現は、遊離モノユビキチンの蓄積をバックグラウンドレベルまで減少させた（図６Ｇ、レーン３）。この結果は、ＵｂＧ７６Ｖ－ＵＣＨＬ１がモノユビキチンに結合できないことを示すｉｎ ｖｉｔｒｏ生化学的観察結果を裏付けている（図６Ｂ、図６Ｃ）。ＵＣＨＬ１Ｃ９０Ｓ発現は、ＵＣＨＬ１ＷＴと同様に遊離モノユビキチンの蓄積を引き起こした（図６Ｇ、レーン４をレーン２と比較）。ただし、ＵｂＧ７６Ｖ－ＵＣＨＬ１Ｃ９０Ｓを発現する細胞、および非Ｕｂ結合ＵＣＨＬ１変異体（ＵＣＨＬ１Ｄ３０Ｋ）は、基礎レベルの遊離モノユビキチンを示した（図６Ｇ、レーン５および６）。
【0330】
まとめると、本明細書に提示されるデータは、ＵＣＨＬ１の触媒活性ではなくＵｂ結合活性が、細胞内の遊離モノユビキチンのプールを調節したことを示した。さらに、これらの結果は、ＵＣＨＬ１のＮ末端ユビキチン化がＵｂ結合をブロックし、その細胞機能を阻害することを実証した。
【0331】
結論
要約すると、本明細書に記載される研究は、Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドを包括的にプロファイリングするための新しい抗体ツールキットを確立し、この非カノニカルな形態のユビキチン化の新しい役割を同定する。この翻訳後修飾の合成に関与する重要な酵素が特徴付けられており、基質がそれらのＮ末端でどのように修飾されるかに関する洞察が提供されている。
実施例６：Ｎ末端ユビキチン化がプロテアソーム分解とは独立して機能することの実証
要約すると、本明細書に記載される研究は、Ｎ末端ユビキチン化ポリペプチドを包括的にプロファイリングするための新しい抗体ツールキットを確立し、この非カノニカルな形態のユビキチン化の新しい役割を同定する。この翻訳後修飾の合成に関与する重要な酵素が特徴付けられており、基質がそれらのＮ末端でどのように修飾されるかに関する洞察が提供されている。
実施例６：Ｎ末端ユビキチン化がプロテアソーム分解とは独立して機能することの実証
【0332】
以下の実施例は、Ｎ末端ユビキチン化が大きなセットの基質のプロテアソーム分解をもたらすかどうかを試験する実験を記載する。データは、ＵＣＨＬ１がＮ末端ユビキチン化時にプロテアソーム分解の標的とされなかったことを実証したが、既存のデータは、Ｎ末端ユビキチン化とプロテアソーム分解とのさらに広範囲な関連を排除しなかった。この関連を体系的に評価するために、今回はプロテアソーム阻害剤ボルテゾミブ（Ｂｔｚ）の存在下および非存在下で、ＵＢＥ２Ｗ Ｄｏｘ誘導性過剰発現モデルを使用した。
【0333】
材料および方法
実施例４に記載されているように、無標識定量を使用して実験を行った。１０μＭのプロテアソーム阻害剤ボルテゾミブ（Ｂｔｚ）によって細胞を２時間さらに処理した後、細胞を採取した。
実施例４に記載されているように、無標識定量を使用して実験を行った。１０μＭのプロテアソーム阻害剤ボルテゾミブ（Ｂｔｚ）によって細胞を２時間さらに処理した後、細胞を採取した。
【0334】
結果
対照（Ｄｏｘ（－）／Ｂｔｚ（－））、Ｂｔｚプロテアソーム阻害単独（Ｄｏｘ（－）／Ｂｔｚ（＋））、ＵＢＥ２Ｗ過剰発現単独（Ｄｏｘ（＋）／Ｂｔｚ（－））、およびコンボ（Ｄｏｘ（＋）／Ｂｔｚ（＋））の４つの個々の試料を生物学的２連で生成した（図７Ａ）。以前のＭＳ実験と同じフィルタリングおよびカットオフを使用して、ＧＧＸ濃縮ペプチドの無標識定量的データを調査して、プロテアソーム阻害時にＮ末端ユビキチン化が増加するかどうかを調査した。以前のＲＮＦ４実験と同様に、ＵＢＥ２Ｗ－Ｃｔｒｌ（左、図７Ｂ）およびコンボ－Ｂｔｚ（右、図７Ｂ）の対比によって表されるように、Ｂｔｚ処理の非存在下および存在下の両方でＵＢＥ２Ｗ依存性基質を同定した。興味深いことに、ＧＧＸ濃縮ペプチド存在量は、広範囲の基質にわたるプロテアソーム阻害によって体系的に変化せず（図７Ｃ）、プロテアソーム分解がＮ末端ユビキチン化の主要な結果ではないという仮説が確認された。この観察と一致して、ＵＢＥ２Ｗ過剰発現条件間に強い相関があったが（すなわち、ＵＢＥ２Ｗおよびコンボ）、Ｂｔｚ処理試料は対照とよく似ていた（図７Ｄ）。ただし、コンボ－ＵＢＥ２Ｗおよびコンボ－Ｂｔｚの対比ではＬｏｇ２ＦＣ＞２によって表されるように、２３６個のＧＧＸペプチドのうち１２個（約５％）が、Ｂｔｚ処理単独またはＵＢＥ２Ｗ過剰発現のいずれかと比較して、コンボ試料における存在量の協調的増加を示した。まとめると、本明細書に記載の無標識プロテオミクス分析では、ＵＢＥ２ＷによるＮ末端ユビキチン化が大部分の基質でプロテアソーム分解を引き起こすのに十分ではないことが確認された。
対照（Ｄｏｘ（－）／Ｂｔｚ（－））、Ｂｔｚプロテアソーム阻害単独（Ｄｏｘ（－）／Ｂｔｚ（＋））、ＵＢＥ２Ｗ過剰発現単独（Ｄｏｘ（＋）／Ｂｔｚ（－））、およびコンボ（Ｄｏｘ（＋）／Ｂｔｚ（＋））の４つの個々の試料を生物学的２連で生成した（図７Ａ）。以前のＭＳ実験と同じフィルタリングおよびカットオフを使用して、ＧＧＸ濃縮ペプチドの無標識定量的データを調査して、プロテアソーム阻害時にＮ末端ユビキチン化が増加するかどうかを調査した。以前のＲＮＦ４実験と同様に、ＵＢＥ２Ｗ－Ｃｔｒｌ（左、図７Ｂ）およびコンボ－Ｂｔｚ（右、図７Ｂ）の対比によって表されるように、Ｂｔｚ処理の非存在下および存在下の両方でＵＢＥ２Ｗ依存性基質を同定した。興味深いことに、ＧＧＸ濃縮ペプチド存在量は、広範囲の基質にわたるプロテアソーム阻害によって体系的に変化せず（図７Ｃ）、プロテアソーム分解がＮ末端ユビキチン化の主要な結果ではないという仮説が確認された。この観察と一致して、ＵＢＥ２Ｗ過剰発現条件間に強い相関があったが（すなわち、ＵＢＥ２Ｗおよびコンボ）、Ｂｔｚ処理試料は対照とよく似ていた（図７Ｄ）。ただし、コンボ－ＵＢＥ２Ｗおよびコンボ－Ｂｔｚの対比ではＬｏｇ２ＦＣ＞２によって表されるように、２３６個のＧＧＸペプチドのうち１２個（約５％）が、Ｂｔｚ処理単独またはＵＢＥ２Ｗ過剰発現のいずれかと比較して、コンボ試料における存在量の協調的増加を示した。まとめると、本明細書に記載の無標識プロテオミクス分析では、ＵＢＥ２ＷによるＮ末端ユビキチン化が大部分の基質でプロテアソーム分解を引き起こすのに十分ではないことが確認された。
【0335】
実施例７：ユビキチン化ポリペプチドを検出するための抗ＧＧＸ抗体の使用
以下の実施例は、プロテアーゼＬｂｐｒｏ＊による細胞溶解物の消化、および消化された細胞溶解物中のＧｌｙ－Ｇｌｙモチーフを有するペプチドを検出するための抗ＧＧＸ抗体の使用を記載する。Ｌｂｐｒｏ＊は、Ｇｌｙ－Ｇｌｙアミノ酸残基に先行するペプチド結合を切断する。したがって、リジンアミノ酸残基またはアルギニンアミノ酸残基のカルボキシル側でペプチド鎖を主に切断するトリプシンと比較して、Ｌｂｐｒｏ＊の方が、大きな配列特異性でタンパク質を選択的に切断する。Ｇｌｙ－Ｇｌｙモチーフを欠くタンパク質はＬｂｐｒｏ＊によって切断されないため、細胞溶解物を消化するためにＬｂｐｒｏ＊を使用すると、消化ペプチド、またはユビキチン化基質由来のペプチドが濃縮された修飾タンパク質のプールがもたらされると考えられる。
以下の実施例は、プロテアーゼＬｂｐｒｏ＊による細胞溶解物の消化、および消化された細胞溶解物中のＧｌｙ－Ｇｌｙモチーフを有するペプチドを検出するための抗ＧＧＸ抗体の使用を記載する。Ｌｂｐｒｏ＊は、Ｇｌｙ－Ｇｌｙアミノ酸残基に先行するペプチド結合を切断する。したがって、リジンアミノ酸残基またはアルギニンアミノ酸残基のカルボキシル側でペプチド鎖を主に切断するトリプシンと比較して、Ｌｂｐｒｏ＊の方が、大きな配列特異性でタンパク質を選択的に切断する。Ｇｌｙ－Ｇｌｙモチーフを欠くタンパク質はＬｂｐｒｏ＊によって切断されないため、細胞溶解物を消化するためにＬｂｐｒｏ＊を使用すると、消化ペプチド、またはユビキチン化基質由来のペプチドが濃縮された修飾タンパク質のプールがもたらされると考えられる。
【0336】
Ｌｂｐｒｏ＊の調製、およびＵｂクリッピング
Ｌｂｐｒｏ＊は、Ｓｗａｔｅｋ，Ｋ．Ｎ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｏｃｏｌ Ｅｘｃｈａｎｇｅ ２０１９ Ａｕｇ ２２；１０．２１２０３／ｒｓ．２．１０８５０／ｖ１に記載されているプロトコールに従って発現および精製される。さらに、「Ｕｂクリッピング」は、細胞溶解物全体を使用して行われる（同書）。具体的には、細胞溶解物をＬｂｐｒｏとインキュベートして、ユビキチン化部位にＧＧ付加を含有する修飾タンパク質を生成する。
Ｌｂｐｒｏ＊は、Ｓｗａｔｅｋ，Ｋ．Ｎ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｏｃｏｌ Ｅｘｃｈａｎｇｅ ２０１９ Ａｕｇ ２２；１０．２１２０３／ｒｓ．２．１０８５０／ｖ１に記載されているプロトコールに従って発現および精製される。さらに、「Ｕｂクリッピング」は、細胞溶解物全体を使用して行われる（同書）。具体的には、細胞溶解物をＬｂｐｒｏとインキュベートして、ユビキチン化部位にＧＧ付加を含有する修飾タンパク質を生成する。
【0337】
ユビキチン化ポリペプチドの検出。
次いで、本明細書に提供される抗ＧＧＸ抗体を使用したウエスタンブロットによって、細胞溶解物中のユビキチン化ポリペプチドを検出する。具体的には、Ｌｂｐｒｏ＊によって消化した細胞溶解物全体をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルにロードし、分離し、当技術分野で標準的な技術を使用してメンブレンに転写する。あるいは、Ｌｂｐｒｏ＊によって消化した細胞溶解物全体を抗ＧＧＸ抗体による免疫沈降法に供してから、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルにロードすることができる。メンブレンを１つ以上の抗ＧＧＸ抗体とインキュベーションする。ＧＧＸ抗体は、二次抗体、例えば、抗ウサギ抗体を使用して標識または検出され得る。
次いで、本明細書に提供される抗ＧＧＸ抗体を使用したウエスタンブロットによって、細胞溶解物中のユビキチン化ポリペプチドを検出する。具体的には、Ｌｂｐｒｏ＊によって消化した細胞溶解物全体をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルにロードし、分離し、当技術分野で標準的な技術を使用してメンブレンに転写する。あるいは、Ｌｂｐｒｏ＊によって消化した細胞溶解物全体を抗ＧＧＸ抗体による免疫沈降法に供してから、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルにロードすることができる。メンブレンを１つ以上の抗ＧＧＸ抗体とインキュベーションする。ＧＧＸ抗体は、二次抗体、例えば、抗ウサギ抗体を使用して標識または検出され得る。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図1E】
【図1F】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図2E】
【図2F】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図3E】
【図3F】
【図3G-3H】
【図3I】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図4E】
【図4F】
【図4G】
【図4H】
【図4I】
【図4J】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図5E】
【図5F】
【図5G】
【図5H】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図6D】
【図6E-6F】
【図6G】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図7D】
【配列表】
【国際調査報告】