特表2024-526114チャネルをねじ込みで通る負に荷電したポリマーを有する操作されたナノポア
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-07-17
(54)【発明の名称】チャネルをねじ込みで通る負に荷電したポリマーを有する操作されたナノポア
(51)【国際特許分類】
C07K 19/00 20060101AFI20240709BHJP
G01N 27/00 20060101ALI20240709BHJP
C12Q 1/6869 20180101ALI20240709BHJP
C07K 14/31 20060101ALN20240709BHJP
【ＦＩ】
C07K19/00
G01N27/00 Z ZNA
C12Q1/6869
C07K14/31
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023577673
(86)(22)【出願日】2022-06-15
(85)【翻訳文提出日】2024-02-07
(86)【国際出願番号】 EP2022066284
(87)【国際公開番号】W WO2022263496
(87)【国際公開日】2022-12-22
(31)【優先権主張番号】63/202,624
(32)【優先日】2021-06-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】591003013
【氏名又は名称】エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー
【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ－ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ
(74)【代理人】
【識別番号】100099759
【弁理士】
【氏名又は名称】青木 篤
(74)【代理人】
【識別番号】100123582
【弁理士】
【氏名又は名称】三橋 真二
(74)【代理人】
【識別番号】100117019
【弁理士】
【氏名又は名称】渡辺 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100141977
【弁理士】
【氏名又は名称】中島 勝
(74)【代理人】
【識別番号】100138210
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 達則
(74)【代理人】
【識別番号】100203828
【弁理士】
【氏名又は名称】喜多村 久美
(72)【発明者】
【氏名】ソン－ホ シン
(72)【発明者】
【氏名】メン シー．タイン
【テーマコード（参考）】
2G060
4B063
4H045
【Ｆターム（参考）】
2G060AA15
2G060AA19
2G060AD06
2G060AF20
2G060AG03
2G060AG11
2G060JA07
2G060KA09
4B063QA13
4B063QQ42
4B063QR48
4B063QR82
4B063QS36
4B063QS39
4B063QX04
4H045AA10
4H045AA30
4H045AA40
4H045BA10
4H045BA41
4H045BA50
4H045CA11
4H045CA40
4H045EA61
4H045FA74
(57)【要約】
荷電ポリマーが連結されたナノポアが提供される。荷電ポリマーの少なくとも一端は、荷電ポリマーがチャネルに入ることを可能にする位置で、ナノポアのチャネルの一端またはその近くに固定される。荷電ポリマーは、任意にねじ込み構成で固定されてもよい。荷電ポリマーは、ねじ込み構成である場合、他のポリマー（核酸またはタグ付きヌクレオチドのポリマータグなど）がナノポアのチャネルを通って流れることを依然として可能にしながら、ナノポアの導電性を高める。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ナノポア形成タンパク質であって、以下：入口側および出口側を有するチャネルと、
前記チャネルにねじ込みで通された荷電ポリマーと
を含み、前記荷電ポリマーは、以下：
前記チャネルの入口側の定位置に固定された第１の末端と、
任意に定位置に固定された、チャネルの出口側に配置された第２の末端と、
前記第１の末端と前記第２の末端との間に配置され、前記チャネルの実質的に全長にわたって延在する負に荷電した領域と
を含む、ナノポア形成タンパク質。
【請求項2】
前記チャネルが７つのモノマーサブユニットによって形成され、各モノマーサブユニットが配列番号１と少なくとも７５％の配列同一性を有し、前記第１の末端が前記７つのモノマーサブユニットのうちの１つに共有結合している、請求項１に記載のナノポア形成タンパク質。
【請求項3】
前記荷電ポリマーの前記第２の末端がビオチンまたはビオチン誘導体を含み、前記ビオチンまたはビオチン誘導体が、前記チャネルの前記出口側に配置されたアビジン、ストレプトアビジン、または脱グリコシル化アビジンに固定されている、請求項１または２に記載のナノポア形成タンパク質。
【請求項4】
前記荷電ポリマーの前記第２の末端が抗体エピトープを含み、前記抗体エピトープが、前記チャネルの前記出口側に配置された抗体に固定されている、請求項１または２に記載のナノポア形成タンパク質。
【請求項5】
前記負に荷電した領域が、少なくとも１０個のホスホジエステル結合を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載のナノポア形成タンパク質。
【請求項6】
前記ホスホジエステル結合が、ヌクレオチドおよび／または脱塩基部位を連結する、請求項５に記載のナノポア形成タンパク質。
【請求項7】
前記負に荷電した領域が、少なくとも１０個の脱塩基部位を含む、請求項６に記載のナノポア形成タンパク質。
【請求項8】
前記負に荷電した領域が、少なくとも２０個の脱塩基部位を含む、請求項６に記載のナノポア形成タンパク質。
【請求項9】
前記脱塩基部位が、以下の構造：【化1】
を有する、請求項６から８のいずれか一項に記載のナノポア形成タンパク質。
【請求項10】
前記７つのサブユニットのうちの少なくとも６つが、配列番号１とアラインメントしたときに、Ｄ１１１、Ｍ１１３およびＫ１４７を含む、請求項２から９のいずれか一項に記載のナノポア形成タンパク質。
【請求項11】
ナノポアに基づく配列決定を行うためのシステムであって、複数のナノポア配列決定複合体を含むチップと、前記ナノポア配列決定複合体の１つ以上の電気的特性の変化を記録するように適合されたコンピューティングシステムとを含み、各ナノポア配列決定複合体が、（ａ）前記チップの表面に配置された電気化学抵抗性障壁であって、シス側およびトランス側を有する、電気化学抵抗性障壁と；
（ｂ）前記障壁の前記シス側の第１の電解液と；
（ｃ）前記障壁の前記トランス側の第２の電解液と；
（ｄ）前記チャネルが前記第１の電解液と前記第２の電解液との間のイオン交換を可能にするように、前記チャネルの前記入口側が前記障壁の前記シス側にあり、前記チャネルの前記出口側が前記障壁の前記トランス側にある、請求項１から９のいずれか一項に記載のナノポア形成タンパク質と、
（ｅ）前記コンピューティングシステムと電子通信する少なくとも１つの電極であって、分子による前記ナノポアの占有に関連する前記ナノポア配列決定複合体の少なくとも１つの電気的特性の変化を検出し、前記検出された変化を前記コンピューティングシステムに送信するように配置されている、少なくとも１つの電極と
を含む、システム。
【請求項12】
請求項１１に記載のシステムで鋳型核酸を配列決定する方法であって、－複数の活性ナノポア配列決定複合体を生成することであって、各活性ナノポア配列決定複合体が、前記ナノポアの前記チャネルに挿入された一本鎖核酸鋳型を含む、生成することと；
－各活性配列決定複合体において、前記一本鎖核酸鋳型に力を加えることであって、前記力が、前記一本鎖核酸を前記入口側から前記出口側に前記チャネルを通って移動させ、前記核酸の各ヌクレオチドまたはヌクレオチドの配列が、前記ナノポアの電気的特性に固有の変化を引き起こす、力を加えることと；
－前記チャネルを占有する前記ヌクレオチドまたはヌクレオチドの配列によって引き起こされる前記ナノポアの前記電気的特性の変化を検出し、前記コンピュータシステムに前記変化を記録することと；
－記録された各変化を、前記チャネルを占有する前記ヌクレオチドまたはヌクレオチドの配列と相関させ、それにより、その電極で前記一本鎖鋳型核酸の配列を生成することと
を含む、方法。
【請求項13】
合成による配列決定（ＳＢＳ）核酸配列決定を実行するためのシステムであって、複数のナノポア配列決定複合体を含むチップと、前記ナノポア配列決定複合体の１つ以上の電気的特性の変化を記録するように適合されたコンピューティングシステムとを含み、各ナノポア配列決定複合体が、（ａ）前記チップの表面に配置された電気化学抵抗性障壁であって、シス側およびトランス側を有する、電気化学抵抗性障壁と；
（ｂ）前記障壁の前記シス側の第１の電解液と；
（ｃ）前記障壁の前記トランス側の第２の電解液と；
（ｄ）チャネルが前記第１の電解液と前記第２の電解液との間のイオン交換を可能にするように、前記チャネルの入口側が前記障壁の前記シス側にあり、前記チャネルの出口側が前記障壁の前記トランス側にある、請求項１から９のいずれか一項に記載のナノポア形成タンパク質と；
（ｅ）前記コンピューティングシステムと電子通信する少なくとも１つの電極であって、分子による前記ナノポアの占有に関連する前記ナノポア配列決定複合体の少なくとも１つの電気的特性の変化を検出し、前記検出された変化を前記コンピューティングシステムに送信するように配置されている、少なくとも１つの電極と；
（ｆ）前記障壁の前記シス側の前記ナノポアと会合した核酸ポリメラーゼと；
（ｇ）前記第１の電解液中に配置されたポリマータグ付きヌクレオシド－５’－オリゴホスフェート（Ｎ５ＯＰ）のセットと
を含む、システム。
【請求項14】
請求項１３に記載のシステムで鋳型核酸を配列決定する方法であって、－複数の活性ナノポア配列決定複合体を生成することであって、各活性ナノポア配列決定複合体が、
－前記核酸ポリメラーゼと複合体を形成した一本鎖核酸鋳型と；
－前記鋳型核酸にハイブリダイズしたプライマーと；
－前記ポリメラーゼと会合した少なくとも１つのタグ付きＮ５ＯＰの前記セット
とを含む、生成することと、
－各活性配列決定複合体において、前記核酸ポリメラーゼによって触媒される鋳型依存性核酸増幅反応によって前記タグ付きＮ５ＯＰを前記プライマーに反復的に連結することであって、前記タグ付きＮ５ＯＰの前記ポリマータグが、前記タグ付きＮ５ＯＰが相補的核酸に連結されると、前記ナノポアの前記チャネル内または前記チャネルに近接して移動し、前記チャネル内または前記チャネルに近接した前記ポリマータグの移動が、前記ナノポアの電気的特性を変化させる、連結することと；
－前記ポリマータグによって引き起こされる前記ナノポアの前記電気的特性の変化を検出し、前記変化を前記コンピュータシステムに記録することと；
－記録された各変化を前記タグ付きＮ５ＯＰの１つと相関させ、それによってその電極で生成された前記相補的核酸の配列を生成することと
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
発明の背景
技術分野
ナノポア構築物および核酸配列決定のためのそれらの使用。
技術分野
ナノポア構築物および核酸配列決定のためのそれらの使用。
【背景技術】
【0002】
関連技術の説明
それらの最も基本的なナノポア配列決定システムは、ナノポアの近くに配置された検出電極を含み、検出電極は、ナノポアを通って流れるイオンの電気化学的特性を検出および記録することができる。比較的大きな分子がナノポアを占有すると、検出電極によって検出される電気化学的特性が変化する。次いで、ナノポアを占有する分子の同一性を、ナノポアを通って流れる電流の変化または測定された電圧の減衰などの電気化学的特性の変化に基づいて決定することができる。ナノポアに基づく配列決定システムの概要は、Ｗａｎｇ ＩおよびＦｅｎｇにおいて見出すことができる。
それらの最も基本的なナノポア配列決定システムは、ナノポアの近くに配置された検出電極を含み、検出電極は、ナノポアを通って流れるイオンの電気化学的特性を検出および記録することができる。比較的大きな分子がナノポアを占有すると、検出電極によって検出される電気化学的特性が変化する。次いで、ナノポアを占有する分子の同一性を、ナノポアを通って流れる電流の変化または測定された電圧の減衰などの電気化学的特性の変化に基づいて決定することができる。ナノポアに基づく配列決定システムの概要は、Ｗａｎｇ ＩおよびＦｅｎｇにおいて見出すことができる。
【0003】
これらの配列決定システムで使用されるナノポアは、典型的には、生物学的ナノポア、固体ナノポア、およびハイブリッドナノポアの３つのフレーバーのうちの１つである。生物学的ナノポアは、天然に存在するポア形成分子、特にタンパク質、例えばポリン、ヘモリシンなどである。一般的に使用されるポア形成タンパク質には、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）由来のα－ヘモリシン（αＨＬ）タンパク質、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来の外膜タンパク質Ｇ（ｏｍｐＧ）、およびマイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）由来のポリンＭｓｐＡ（ＭｓｐＡ）が含まれる。場合によっては、ｏｍｐＧの場合と同様に、ポアはタンパク質の単一サブユニットから形成される。他の場合では、αＨＬおよびＭｓｐＡと同様に、ポアはポア形成タンパク質のマルチサブユニット集合体である。例えば、αＨＬは七量体ポア構造を形成し、ＭｓｐＡは八量体ポア構造を形成する。これらのタンパク質に基づく例示的な操作されたナノポアは、例えば、国際公開第２０１６／０６９８０６号（αＨＬ）、国際公開第２０１７／０５０７２８号（αＨＬ）、国際公開第２０１７／１８４８６６号（αＨＬ）、国際公開第２０１８／００２１２５号（αＨＬ）、国際公開第２０１２／１７８０９７号（αＨＬ）、Ｇａｒｉ（ｏｍｐＧ）、国際公開第２０１７／０５０７２２号（ｏｍｐＧ）、米国特許出願公開第２０１５－００８０２４２号明細書（ｏｍｐＧ）、Ｍａｎｒａｏ（ＭｓｐＡ）、Ｐａｖｌｅｎｏｋ（ＭｓｐＡ）、国際公開第２０１３／０９８５６２号（ＭｓｐＡ）、米国特許出願公開第２０１４－０３０９４０２号明細書（ＭｓｐＡ）、米国特許出願公開第２０１３－０１４６４５７号明細書（ＭｓｐＡ）およびＷａｎｇ ＩＩ（様々）に見出すことができる。固体ナノポアは、例えば、合成膜にナノメートルサイズの孔を形成することによって合成材料から製造されたポア構造である。固体ナノポアを形成することができる例示的な材料としては、窒化ケイ素、シリカ、アルミナ、グラフェン、窒化ホウ素、および二硫化モリブデンが挙げられる。固体ナノポアは、Ｃｈｅｎ、Ｌｅｅ、Ｗａｓｆｉ、Ｗａｎｇ ＩおよびＦｅｎｇによって総説されている。ハイブリッドナノポアは、生物学的ナノポアと固体ナノポアの両方を組み込んでいる。例えば、生物学的ナノポア（αＨＬナノポアなど）を固体ナノポアに挿入することができる。ハイブリッドナノポアは、Ｌｅｅ、ＷａｓｆｉおよびＦｅｎｇによって総説されている。
【0004】
ナノポアに基づく核酸配列決定のための１つのアプローチは、一本鎖核酸をポアに直接ねじ込みで通すことを含む（本明細書では「直接配列決定」と呼ばれる）。各ヌクレオチド（またはヌクレオチドの固有の組み合わせ）は、ポアの少なくとも１つの電気化学的特性に固有の変化を生じる。これらのシステムは、核酸がポアを通って移動する速度を制御する手段、例えば酵素をポアにテザリングする手段（ポリメラーゼおよびヘリカーゼを含む）、負に荷電した残基をポアチャネルから除去し、正に荷電した残基をポアチャネルに付加する手段、および二本鎖領域を一本鎖核酸に付加する手段を頻繁に使用する。例示的な直接配列決定アプローチは、例えば、Ｆｅｎｇ、ＭａｎｒａｏおよびＷａｎｇ Ｉによって論じられている。
【0005】
別の方法は、タグ付きヌクレオチドポリリン酸分子を有するナノポアの開口部付近でポリメラーゼ触媒増幅反応を行うことによる合成による配列決定（ＳＢＳ）アプローチを含む。各タグ付きヌクレオチドポリホスフェートは、それがナノポア内またはその近くに存在する場合に固有の電気化学的シグネチャを生成する別個のタグ部分を含む。タグ付きヌクレオチドポリホスフェートがアンプリコンに組み込まれると、タグはナノポア内またはその近くを通過し、タグの電気化学的シグネチャが記録される。アンプリコンの配列は、タグ部分がナノポアに入る順序に由来する。そのような方法を実施するための例示的なタグに基づくＳＢＳアプローチおよび材料は、例えば、国際公開第２０１２－０８３２４９号、国際公開第２０１３／１５４９９９号、米国特許出願公開第２０１４／０３０９１４４号明細書、米国特許第９，０１７，９３７号明細書、国際公開第２０１５／１４８４０２号、国際公開第２０１６／０６９８０６号、国際公開第２０１６／１４４９７３号、米国特許出願公開第２０１６／０２２２３６３号明細書、米国特許出願公開第２０１６／０３３３３２７号明細書、国際公開第２０１７／０５０７２８号、国際公開第２０１７／１８４８６６号、国際公開第２０１７／０５０７２２号、米国特許出願公開第２０１７／０２６７９８３号明細書、米国特許出願公開第２０１８／０２４５１４７号明細書、米国特許出願公開第２０１８／００９４２４９号明細書、国際公開第２０１８／００２１２５号、およびＫｕｍａｒに記載されている。そのようなシステムで使用するために、ポリペプチド（ポリリジンタグなど）およびポリヌクレオチドに基づくタグを含む様々なタグが提案されている。例えば、米国特許第８，６５２，７７９号明細書および国際公開第２０１７０４２０３８号を参照されたい。
【発明の概要】
【0006】
発明の概要
本明細書では、ナノポアのチャネルをねじ込みで通る荷電ポリマーを有する操作されたナノポア、ならびにナノポアに基づく配列決定システムおよび方法におけるそれらの使用が開示される。荷電ポリマーを含めることにより、ポアのコンダクタンスが有意に増加し、それによって配列決定操作中にポアを占有する異なる分子（ヌクレオチドまたはポリマータグの群など）の識別を補助することが発見された。
本明細書では、ナノポアのチャネルをねじ込みで通る荷電ポリマーを有する操作されたナノポア、ならびにナノポアに基づく配列決定システムおよび方法におけるそれらの使用が開示される。荷電ポリマーを含めることにより、ポアのコンダクタンスが有意に増加し、それによって配列決定操作中にポアを占有する異なる分子（ヌクレオチドまたはポリマータグの群など）の識別を補助することが発見された。
【0007】
一実施形態では、荷電ポリマー連結ナノポア（ＣＰＬナノポア）が提供され、ＣＰＬナノポアは、入口側および出口側を有するチャネルと、チャネルをねじ込みで通る荷電ポリマーとを含み、荷電ポリマーは、チャネル内に配置され、チャネルの実質的に全長にわたって延在する負に荷電した領域を含む。いくつかの実施形態では、荷電ポリマーの第１の末端は、チャネルの入口側の近くの定位置に固定され、荷電ポリマーの第２の末端は、チャネルの出口側の近くの定位置に固定される。例示的なナノポアとしては、α－ヘモリシン（αＨＬ）、外膜ポリンＧ（ＯｍｐＧ）、マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）ポリンＡ（ＭｓｐＡ）、ロイコシジンナノポア、外膜ポリンＦ（ＯｍｐＦ）ナノポア、細胞溶解素Ａ（ＣｌｙＡ）ナノポア、外膜ホスホリパーゼＡナノポア、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）自己輸送体リポタンパク質（ＮａｌＰ）ナノポア、ＷＺＡナノポア、ノカルジア・ファルシニカ（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｆａｒｃｉｎｉｃａ）ＮｆｐＡ／ＮｆｐＢカチオン選択性チャネルナノポア、ライセニンナノポア、エロリジンおよびＣｕｒｌｉｎ ｓｉｇｍａ Ｓ依存性増殖サブユニットＧ（ＣｓｇＧ）ナノポアに基づくものが挙げられる。例示的な実施形態では、生物学的ナノポアは、αＨＬに基づく七量体ナノポアであり、七量体ナノポアは、７つのモノマーサブユニットを含み、各モノマーサブユニットは、配列番号１と少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0008】
別の実施形態では、ナノポアに基づく核酸配列決定を行うためのシステムが提供される。システムは、一般に、本明細書に開示されるＣＰＬ－ナノポアと、ナノポアを占有する分子とを区別するのに有用な他の要素とを含む。
【0009】
別の実施形態では、ＣＰＬ－ナノポアを使用して、ナノポアに基づく核酸配列決定を行う方法が提供される。
【0010】
他の詳細および発明は、本明細書に詳細に記載されている。
【図面の簡単な説明】
【0011】
図面の簡単な説明
【図1A】ナノポアに結合した荷電ポリマーを示す図。
【図1B】放出された配置で第１の末端のみでナノポアに結合した荷電ポリマーを示す図。
【図1C】挿入された配置で第１の末端のみでナノポアに結合した荷電ポリマーを示す図。
【図1D】挿入された構成において、ナノポアチャネルの入口側付近の第１の末端およびナノポアの出口側付近の第２の末端に結合した荷電ポリマーを示す図。
【図1E】挿入された構成において、ナノポアチャネルの入口側付近の第１の末端およびナノポアの出口側付近の外部実体に第２の末端で結合した荷電ポリマーを示す図。
【図1F】挿入された構成で荷電ポリマーをナノポアに固定する例示的な方法を示す図。第１の末端はナノポアに共有結合しており、第２の末端はナノポアの外側に連結している。
【図1G】挿入された配置で荷電ポリマーをナノポアに連結する例示的な方法を示す図。荷電ポリマーの第２の末端はナノポアに共有結合しており、第１の末端はナノポアの外側に連結している。
【図2】様々な電圧レベルでの、荷電ポリマー連結ナノポア（黒い四角）対荷電ポリマーを含まないナノポア（灰色の円）のコンダクタンスのグラフ。
【図3】様々な領域が示されている、七量体α－ヘモリシンナノポアの断面図。
【図4】チャネルをねじ込みで通る荷電ポリマーを有する七量体α－ヘモリシンナノポアの断面図。荷電ポリマーは、第１の末端でナノポアのＮ１７Ｃ置換に連結され、第２の末端に位置するビオチン部分を介してストレプトアビジンに連結される。
【図5】本明細書に開示される荷電ポリマー連結ナノポアを含む例示的なナノポア配列決定複合体を示す図。
【図6】本明細書に開示される荷電ポリマー連結ナノポアを含む例示的なナノポアセンサチップの上面図。
【図7】本明細書に開示される荷電ポリマー連結ナノポアを含むナノポア配列決定複合体を含む例示的なナノポアセルを示す図。
【図8】タグに基づくＳＢＳ核酸配列決定法を行う活性配列決定複合体の例示的な実施形態を示す図。
【図9】直接配列決定法を行う活性配列決定複合体の例示的な実施形態を示す図。
【図10】荷電ポリマーの特定の実施形態を示す図。
【図11】１つのモノマーにＮ１７Ｃ置換およびＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ部分を有する１：６α－ヘモリシンナノポアのカチオン交換クロマトグラフィー精製の結果を示す図。
【図12】図１１に示すカチオン交換クロマトグラフィー精製１：６ナノポアのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分離の画像。レーン０：分子量標準。レーン１：ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ－ＧＦＰの非存在下でのカチオン交換由来のピークＰ１。レーン２：ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ－ＧＦＰと混合したカチオン交換由来のピークＰ１。レーン３：ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ－ＧＦＰの非存在下でのカチオン交換由来のピークＰ２。レーン４：ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ ＧＦＰと混合したカチオン交換由来のピークＰ２。
【図13】荷電ポリマー連結α－ヘモリシンナノポアによる一連の捕捉事象の結果を示す図。荷電ポリマー連結α－ヘモリシンナノポアは、最初に、荷電ポリマーが第１の末端でナノポアにのみ連結している状態で記録した（矢印の左）。その後、ストレプトアビジンを障壁のトランス側のチップ上に流し、記録を再開した（矢印の右側）。
【発明を実施するための形態】
【0012】
発明の詳細な説明
ここで、以下の定義および実施例を使用して、本発明を参照のみによって詳細に説明する。そのような特許および刊行物内に開示される全ての配列を含む、本明細書で言及される全ての特許および刊行物は、参照により明示的に組み込まれる。
ここで、以下の定義および実施例を使用して、本発明を参照のみによって詳細に説明する。そのような特許および刊行物内に開示される全ての配列を含む、本明細書で言及される全ての特許および刊行物は、参照により明示的に組み込まれる。
【0013】
別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら、ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ、第２版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９４年）、およびＨａｌｅ＆Ｍａｒｈａｍ，ＴＨＥ ＨＡＲＰＥＲ ＣＯＬＬＩＮＳ ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｈａｒｐｅｒ Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ、ＮＹ（１９９１年）は、本発明で使用される多くの用語の一般的な辞書を当業者に提供している。専門家は、当技術分野の定義および用語については、特にＳａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年およびＡｕｓｕｂｅｌ ＦＭら、１９９３年を対象とする。本発明は、記載される特定の方法、プロトコル、および試薬に限定されず、これらは変化し得ることを理解されたい。
【0014】
別段示されない限り、核酸は、５’から３’方向に左から右へ書かれる。アミノ酸配列は、それぞれアミノからカルボキシ方向に左から右へ書かれる。
【0015】
本明細書で提供される見出しは、本明細書全体を参照することによって有することのできる本発明の種々の態様または実施形態の限定ではない。したがって、以下に定義される用語は、明細書全体を参照することによって更に詳細に定義される。
【0016】
Ｉ．用語
α－ヘモリシン：本明細書で使用される場合、「α－ヘモリシン（ａｌｐｈａ－ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ）」、「α－ヘモリシン（α－ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ）」、および「αＨＬ」は互換的に使用され、七量体の水で満たされた膜貫通チャネル（すなわち、ナノポア）に自己集合するモノマータンパク質を指す。文脈に応じて、この用語はまた、７つのモノマータンパク質によって形成される膜貫通チャネルを指し得る。
α－ヘモリシン：本明細書で使用される場合、「α－ヘモリシン（ａｌｐｈａ－ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ）」、「α－ヘモリシン（α－ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ）」、および「αＨＬ」は互換的に使用され、七量体の水で満たされた膜貫通チャネル（すなわち、ナノポア）に自己集合するモノマータンパク質を指す。文脈に応じて、この用語はまた、７つのモノマータンパク質によって形成される膜貫通チャネルを指し得る。
【0017】
塩基対（ｂｐ）：本明細書で使用される場合、塩基対は、二本鎖核酸中のアデニン（Ａ）とチミン（Ｔ）との、アデニン（Ａ）とウラシル（Ｕ）との、またはシトシン（Ｃ）とグアニン（Ｇ）とのパートナー関係を指す。
【0018】
捕捉事象：検出電極によって変化が検出可能であるように、ナノポアを通って流れるイオン電流の特性に変化を生じさせるのに十分な分子のナノポアへの挿入。
【0019】
相補的：本明細書で使用される場合、「相補的」という用語は、塩基対合を介した２つのポリヌクレオチド鎖の領域間または２つのヌクレオチド間の配列相補性の広い概念を指す。アデニンヌクレオチドは、チミンまたはウラシルであるヌクレオチドと特異的な水素結合（「塩基対合」）を形成し得ることが知られている。同様に、シトシンヌクレオチドは、グアニンヌクレオチドと塩基対合することができることが知られている。
【0020】
単離された：「単離された」分子は、例えばその自然環境において、それが通常会合している少なくとも１つの他の分子から分離されている生体分子である。
【0021】
モノマーサブユニット：多量体タンパク質複合体の構造サブユニット。例えば、七量体α－ヘモリシンポアは、７つのα－ヘモリシンモノマーサブユニットを含む。多量体サブユニットにオリゴマー化されていないモノマーサブユニットは、本明細書では「非オリゴマー化モノマーサブユニット」と呼ばれる。
【0022】
モノマー単位：ポリマーの構造サブユニット。
【0023】
突然変異：本明細書で使用される場合、「突然変異」という用語は、置換、挿入、および／または欠失（切断を含む）を含むがこれらに限定されない、親配列に導入された変化を指す。突然変異の結果としては、親配列によってコードされるタンパク質には見られない新しい特徴、性質、機能、表現型または形質の生成が挙げられるが、これらに限定されない。
【0024】
ナノポア：本明細書で使用される「ナノポア」という用語は、一般に、イオン電流が通過し得る電気抵抗性障壁（脂質膜、シリコン層、ポリマー層、またはグラフェン層など）に形成されるか、そうでなければ設けられるポア、チャネルまたは通路を指す。特に明記しない限り、一般用語「ナノポア」は、生物学的ナノポア、固体ナノポア、およびハイブリッドナノポアを含むものとする。
【0025】
ナノポア配列決定複合体：一般に、少なくとも（ａ）チャネルを通る電流フローを確立し、対象の分子（核酸またはタグ付きヌクレオチドのポリマータグなど）がチャネルに入ることを可能にするように構成されたナノポア、ならびに（ｂ）ナノポア配列決定複合体の特徴（例えば、抵抗、静電容量、電圧減衰、およびイオン電流フローなど）を検出するように構成された電極または電極のセットとを含む、ナノポアに基づく配列決定方法が行われ得る部位。
【0026】
ネイティブアミノ酸：参照アミノ酸配列とアラインメントしたときに、参照配列の対応する位置を占有するアミノ酸と同じであるアミノ酸配列の任意のアミノ酸。
【0027】
非ネイティブ部分：参照構造には見られない部分を有するナノポアの成分。例えば、ナノポアがポリペプチドを含む場合、「非ネイティブアミノ酸」は、参照アミノ酸配列に対して特定の位置での置換または挿入を表すか、またはネイティブアミノ酸の側鎖の化学修飾を表す側鎖を有する任意のアミノ酸である。
【0028】
核酸分子：「核酸分子」という用語は、ＲＮＡ、ＤＮＡおよびｃＤＮＡ分子を含む。遺伝暗号の縮重の結果として、α－ヘモリシンおよび／またはその変異体などの所与のタンパク質をコードする多数のヌクレオチド配列が産生され得ることが理解されよう。本発明は、あらゆる可能な変異体ヌクレオチド配列を企図する。
【0029】
ペプチド：「ペプチド」および「ペプチド連結」という用語は、１つのアミノ酸またはアミノ酸類似体のカルボン酸部分と第２のアミノ酸またはアミノ酸類似体のアミノ基との間の縮合反応から生じる２つのアミノ酸および／またはアミノ酸類似体間の任意の骨格連結を指すものとする。文脈から他に明らかでない限り、これらの用語は、すべての場合において、α－アミノ酸、β－アミノ酸、γ－アミノ酸、δ－アミノ酸、およびそれらの組み合わせの間の連結、ならびに骨格カルボン酸部分と側鎖アミノ部分との間の連結（例えば、ε連結リジンを有する）を包含する（がこれらに限定されない）ものとして理解されるものとする。
【0030】
ペプチド鎖：「ペプチド鎖」という用語は、ペプチド連結によって連結された２つ以上のアミノ酸および／またはアミノ酸類似体の任意の配列を指すものとする。
【0031】
ペプチド模倣：「ペプチド模倣」および「ペプチド模倣連結」という用語は、２つのアミノ酸類似体間またはアミノ酸とアミノ酸類似体との間の骨格連結を指すものとし、ペプトイド（側鎖がアミノ基に連結しているアミノ酸）、アザペプチド（α－炭素を窒素で置換）、オリゴウレア（尿素連結で置換されたペプチド連結）、アリールアミド、オリゴヒドラジドなどを含むが、これらに限定されない。
【0032】
ペプチド模倣鎖：「ペプチド模倣鎖」という用語は、ペプチド模倣骨格連結によって連結された２つ以上のアミノ酸および／またはアミノ酸類似体の任意の配列を指すものとする。
【0033】
相同性パーセント：「相同性％」という用語は、本明細書では「同一性％」という用語と互換的に使用され、配列アラインメントプログラムを使用してアラインメントした場合の、本発明のポリペプチドのいずれか１つをコードする核酸配列または本発明のポリペプチドのアミノ酸配列間の核酸またはアミノ酸配列同一性のレベルを指す。例えば、本明細書で使用される場合、８０％の相同性は、定義されたアルゴリズムによって決定される８０％の配列同一性と同じことを意味し、したがって、所与の配列のホモログは、所与の配列の長さにわたって８０％を超える配列同一性を有する。例示的なレベルの配列同一性には、所与の配列、例えば、本明細書に記載される本発明のポリペプチドのいずれか１つのコード配列に対する８０、８５、９０、９５、９８％またはそれを超える配列同一性が含まれるが、これらに限定されない。２つの配列間の同一性を決定するために使用され得る例示的なコンピュータプログラムには、インターネット上で公的に入手可能なＢＬＡＳＴプログラム、例えばＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸおよびＴＢＬＡＳＴＸ、ＢＬＡＳＴＰおよびＴＢＬＡＳＴＮが含まれるが、これらに限定されない。Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０年およびＡｌｔｓｃｈｕｌら、１９９７年も参照されたい。配列検索は、典型的には、所与の核酸配列をＧｅｎＢａｎｋ ＤＮＡ配列および他の公開データベース中の核酸配列と比較して評価するときにＢＬＡＳＴＮプログラムを使用して行われる。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、すべての読み枠で翻訳された核酸配列を、ＧｅｎＢａｎｋタンパク質配列および他の公開データベース中のアミノ酸配列に対して検索するために使用され得る。ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＸの両方は、１１．０のオープンギャップペナルティおよび１．０の拡張ギャップペナルティのデフォルトパラメータを使用して実行され、ＢＬＯＳＵＭ－６２マトリックスを利用する。（例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５巻、３３８９～３４０２頁、１９９７年を参照されたい。）特に明記しない限り、２つのアミノ酸配列のアラインメントへの言及は、ＢＬＯＳＵＭ ６２マトリックス、ＧＡＰ ＯＰＥＮ設定１０、ＧＡＰ ＥＸＴＥＮＤ設定０．５、ＥＮＤ ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ設定「ｆａｌｓｅ」、ＥＮＤ ＧＡＰ ＯＰＥＮ設定１０、およびＥＮＤ ＧＡＰ ＥＸＴＥＮＤ設定０．５（ＥＭＢＬ－ＥＢＩから入手可能）を有するＥＭＢＯＳＳ Ｎｅｅｄｌｅ ｐａｉｒｗｉｓｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔツールを使用して得られるアラインメントを指すものとする。
【0034】
ポリペプチド：特に明記しない限り、または本開示の文脈に基づいて特に明確でない限り、「ポリペプチド」という語句は、その最も広い意味で理解されるものとし、ペプチド連結および／またはペプチド模倣連結によって連結された２つ以上のアミノ酸および／またはアミノ酸類似体の任意の配列を包含するものとする。
【0035】
精製：本明細書で使用される場合、「精製」とは、分子が、それが含まれる試料の少なくとも９５重量％または少なくとも９８重量％の濃度で試料中に存在することを意味する。
【0036】
タグ：本明細書で使用される場合、「タグ」という用語は、原子もしくは分子、または原子もしくは分子の集合体であり得るナノポア検出可能部分を指す。標識は、光学的、電気化学的、磁気的、または静電的（例えば、誘導性、容量性）の署名を提供し得、このシグネチャは、ナノポアを使用して検出され得る。典型的には、ヌクレオチドがタグに結合すると、このタグは、「タグ付きヌクレオチド」と呼ばれる。
【0037】
変異体：本明細書で使用される場合、参照ポリペプチドまたは核酸の「変異体」という用語は、参照分子に対して少なくとも１つの分子変化を含む任意のそのような分子である。
【0038】
ＩＩ．荷電ポリマーおよびポリマー連結ナノポアの生成
本明細書では、荷電ポリマーをナノポアのチャネルにねじ込みで通すことを可能にする配置で、荷電ポリマーが結合した生物学的ナノポアが開示される。
本明細書では、荷電ポリマーをナノポアのチャネルにねじ込みで通すことを可能にする配置で、荷電ポリマーが結合した生物学的ナノポアが開示される。
【0039】
図１Ａに示すように、荷電ポリマー１００は、少なくとも、（ａ）高密度の負電荷を有する負に荷電した領域１０１、（２）荷電ポリマー１００の第１の末端１０２またはその付近の、ナノポアのチャネルへの入口またはその付近でのナノポアへの結合を容易にする実体を含む。いくつかの実施形態では、荷電ポリマー１００は、荷電ポリマー１００の第２の末端１０３に、ナノポアまたはナノポアの外側に配置された実体のいずれかへの結合を容易にする実体をさらに含む。「第１の末端」および「第２の末端」という用語は、荷電ポリマーの末端モノマー単位に形成された結合物を包含するが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、負に荷電した部分１０１が依然としてチャネルにねじ込まれ、チャネルのコンダクタンスを増加させることができる限り、第１の末端１０２を形成する結合物は、荷電ポリマー１００の内部部分に配置することができる。いくつかの実施形態では、第１の末端１０２および第２の末端１０３を形成する結合物は、負に荷電した部分１０１が依然としてチャネル内にねじ込むことができ、チャネルのコンダクタンスを増加させ、第２の末端１０３が依然としてチャネルの出口または出口付近に固定されることができるように、荷電ポリマー１００の内部部分に配置することができる。
【0040】
負に荷電した領域１０１は、他のポリマー（核酸またはタグ付きヌクレオチドのポリマータグなど）がナノポアのチャネルを通って流れることを可能にしながら、ナノポアの導電性を高めるのに十分な高密度の負に荷電したモノマー単位を含む。負に荷電した領域のモノマー単位の少なくとも一部は、中性ｐＨで負の電荷を有する。さらに、負に荷電した領域は、嵩高い側鎖を有する相当な数のモノマー単位を有さない。例示的なモノマー単位には、ホスホジエステル結合を形成することができるホスフェート基（例えば、ヌクレオチド、ヌクレオチド誘導体およびアルキルグリコールホスフェート（例えば、エチレングリコールホスフェート））、負に荷電したポリペプチド（例えば、高濃度のアスパラギン酸またはグルタミン酸を含有するポリペプチド、明示的にポリアスパラギン酸およびポリグルタミン酸を含む）を含むモノマー単位が含まれる。一実施形態では、負に荷電した領域は、ヌクレオチド、ヌクレオチド誘導体、脱塩基部位（アルキルグリコールホスフェートから形成されたポリマーを含む）、およびそれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない、ホスホジエステル結合によって連結されたモノマー単位のポリマー鎖を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。さらなる実施形態では、負に荷電した領域は、以下の構造
（式中、Ｒ１は、２から１０個の炭素長のアルキル鎖である）による脱塩基部位を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。別の実施形態では、Ｒ１は、２個の炭素長である。別の実施形態では、Ｒ１は、２個の炭素長である。別の実施形態では、Ｒ１は、３個の炭素長である。別の実施形態では、Ｒ１は、４個の炭素長である。別の実施形態では、Ｒ１は、５個の炭素長である。別の実施形態では、Ｒ１は、６個の炭素長である。別の実施形態では、Ｒ１は、７個の炭素長である。別の実施形態では、Ｒ１は、８個の炭素長である。別の実施形態では、Ｒ１は、９個の炭素長である。別の実施形態では、Ｒ１は、１０個の炭素長である。別の実施形態では、荷電ポリマーは、以下の構造
（式中、ａは、荷電ポリマーの長さが、それが接続しているナノポアのチャネルの長さと少なくとも同じ長さであるように選択された整数であり、Ｒ１は、２から１０個の炭素の長さのアルキル鎖（その間のすべての整数を含む）であり、Ｒ２およびＲ３はヌクレオチドであり、ｂは０から１０であり、ｃは０から１０であり、Ｒ４およびＲ５の一方は第１の末端であり、Ｒ４およびＲ５の他方は第２の末端である）を有する。いくつかの実施形態では、ａは、１０～１００である。いくつかの実施形態では、ａは、１０～９０である。いくつかの実施形態では、ａは、１０～８０である。いくつかの実施形態では、ａは、１０～７０である。いくつかの実施形態では、ａは、１０～６０である。いくつかの実施形態では、ａは、１０～５０である。いくつかの実施形態では、ａは、２０～１００である。いくつかの実施形態では、ａは、２０～９０である。いくつかの実施形態では、ａは、２０～８０である。いくつかの実施形態では、ａは、２０～７０である。いくつかの実施形態では、ａは、２０～６０である。いくつかの実施形態では、ａは、２０～５０である。
【化1】
【化2】
【0041】
図１Ｂ、図１Ｃ、図１Ｄ、および図１Ｅは、荷電ポリマーが結合したナノポア１０４の断面を示す。ナノポア１０４は、ナノポアの本体を貫通し、分子がナノポアの一方の側から他方の側へ通過することができる経路を形成するチャネル１０５を含む。核酸または別の分子を配列決定するために使用される場合、検出される分子が入るチャネルの側はチャネル入口１０５ａと呼ばれ、チャネルの反対側はチャネル出口１０５ｂと呼ばれる。ポリマーコンジュゲート化ポアは、第１の末端１０２をチャネル入口１０４の近くの定位置に固定することによって形成される。次いで、荷電ポリマー１００をナノポアによって捕捉することができ、負に荷電した部分１０２をチャネルをねじ込みで通し、必要に応じてチャネル出口１０５ｂを越えて通すことができる。第１の末端１０２のみが定位置に固定されている構成（図１Ｂおよび図１Ｃ）では、荷電ポリマー１００は、以下の２つの構成を占有することができる。負に荷電した部分１０１がチャネル１０５の実質的に外側にある「排出された」構成（図１Ｂ）、負に荷電した部分１０１が、チャネル１０５および必要に応じてチャネル出口１０５ｂを越えてねじ込みで通る「挿入された」構成（図１Ｃ）。そのような結合を生成する任意の方法が使用され得る。例えば、結合は、第１の末端１０２上の反応性部分とナノポア上またはナノポアの外側および入口付近に配置された表面上の別の反応性部分との間の共有結合によって形成され得る。例えば、第１の末端１０２はＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）またはスルホ－ＮＨＳを含んでもよく、これをナノポアまたはポアの入口付近の別の表面（ナノポアが挿入されているウェルのビーズまたは壁など）に配置された第１級アミンと反応させることができる。別の例として、第１の末端１０２は、マレイミド、ヨードアセチル基、またはピリジルジスルフィドを含んでもよく、これらは、ナノポアまたはポアの入口付近の別の表面（ナノポアが挿入されているウェルのビーズまたは壁など）に配置されたスルフヒドリル（システインなど）と反応し得る。別の例として、第１の末端１０２は、第１級アミンを含んでいてもよく、これは、ナノポアまたはポアの入口付近の別の表面（ナノポアが挿入されているウェルのビーズまたは壁など）に配置されたカルボキシル基と（ＥＤＣと組み合わせて）反応することができる。他の多くの結合化学が当技術分野で公知であり、同様に使用され得る。あるいは、第１の末端１０２は、ナノポアに、またはナノポアの外側および入口付近に配置された表面上に結合した特異的結合対の第２の部材と相互作用する特異的結合対の第１の部材を含み得る。例示的な特異的結合対としては、ビオチン／アビジン、ビオチン／ストレプトアビジン、および抗体／エピトープが挙げられる。一実施形態では、第１の末端１０２はビオチンを含み、ビオチンは、ナノポアまたはポアの入口付近の別の表面（ナノポアが挿入されているウェルのビーズまたは壁など）にテザリングされたアビジンまたはストレプトアビジンによって結合される。別の実施形態では、第１の末端１０２はエピトープタグ（ハプテン、ＦＬＡＧタグ、ＨＡタグ、Ｈｉｓタグ、Ｍｙｃタグ、Ｖ５タグ、Ｘｐｒｅｓｓタグ、Ｔｈｒｏｍｂｉｎタグ、ＢＡＤタグ、Ｆａｃｔｏｒ Ｘａタグ、ＶＳＶＧタグ、ＳＶ４０ ＮＬＳタグ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃタグ、Ｓタグ、ＯｎｅＳｔｒａｐタグ、ＳＢ１タグなど）を含み、エピトープタグは、ナノポアまたはポアの入口付近の別の表面（ナノポアが挿入されているウェルのビーズまたは壁など）にテザリングされた抗エピトープタグ抗体または抗体断片によって結合される。
【0042】
いくつかの構成では、荷電ポリマー１００は、チャネル出口１０５ｂもしくはその付近（図１Ｄ、ナノポア１０４と第２の末端１０３との間の破線によって示されている）、またはチャネル出口１０５ｂの外側で、抗体もしくはストレプトアビジン分子などの結合実体１０６（図１Ｅ）に固定されている第２の末端１０３をさらに含む。第２の末端１０３が定位置に固定されると、荷電ポリマーは挿入された構成のみを占有する。そのような結合を生成する任意の方法が使用され得る。例えば、第２の末端１０３は、荷電ポリマーの反応性部分と、ナノポア上またはナノポアの外側の表面上の別の反応性部分との間の共有結合によって形成されてもよい。例えば、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）およびスルホ－ＮＨＳは、第１級アミンに標識を共有結合させるために一般的に使用される。マレイミド、ヨードアセチル基およびピリジルジスルフィドは、スルフヒドリル（システインなど）に標識を共有結合させるために一般的に使用される。ＥＤＣと組み合わせた第１級アミンは、カルボキシル基（アスパラギン酸側鎖、グルタミン酸側鎖またはカルボキシ末端など）に標識を共有結合させるために一般的に使用される。ヒドラジンおよびアルコキシアミンは、糖タンパク質に標識を共有結合的に結合させるために一般的に使用される。別の例として、荷電ポリマー１００は、チャネルの出口側付近に位置する特異的結合対の第２の部材と相互作用する特異的結合対の第１の部材に結合されてもよい。例示的な特異的結合対としては、ビオチン／アビジン、ビオチン／ストレプトアビジン、および抗体／エピトープが挙げられる。一実施形態では、第２の末端１０３はビオチンを含み、ビオチンは、チャネルの出口側付近でナノポアにテザリングされたアビジンまたはストレプトアビジンによって結合されるか、またはウェルもしくはチャネルの出口側の外側の表面上に配置される。別の実施形態では、第２の末端１０３はエピトープタグ（ハプテン、ＦＬＡＧタグ、ＨＡタグ、Ｈｉｓタグ、Ｍｙｃタグ、Ｖ５タグ、Ｘｐｒｅｓｓタグ、Ｔｈｒｏｍｂｉｎタグ、ＢＡＤタグ、Ｆａｃｔｏｒ Ｘａタグ、ＶＳＶＧタグ、ＳＶ４０ ＮＬＳタグ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃタグ、Ｓタグ、ＯｎｅＳｔｒａｐタグ、ＳＢ１タグなど）を含み、エピトープタグは、チャネルの出口側付近でナノポアにテザリングされた抗エピトープタグ抗体もしくは抗体断片によって結合されるか、またはウェル内もしくはチャネルの出口側の外側の表面上に配置される。
【0043】
図１Ｆは、第１の末端１０２が反応性部分１０２ａを含み、第２の末端１０３が特異的結合対１０３ａの第１の部材を含む実施形態を示す。反応性部分１０２ａは、ナノポア１０４ａ上の反応性部分と反応して、第１の末端１０２とナノポア１０４との間に共有結合１０７を形成する（矢印Ｉ）。特異的結合対の第２の部材を捕捉剤として使用するアフィニティークロマトグラフィーによって、反応生成物を分画して、ポリマーコンジュゲート化ナノポアを非コンジュゲート化ナノポアから分離する（図示せず）。次いで、精製されたポリマーコンジュゲート化ナノポアは、バイオチップ上の電気化学的抵抗性障壁１０８に挿入される（矢印ＩＩ）。チャネル１０５は、障壁１０８を通るイオン流のための経路を生成し、チャネル入口１０５ａは障壁の第１の側に配置され、チャネル出口１０５ｂは障壁の第２の側に配置される。特異的結合対１０６の第２の部材は、チャネル出口１０５ｂに近接した障壁の第２の側に配置される。障壁にわたり電位が確立され（矢印ＩＩＩ）、第２の末端１０３がチャネル１０５をねじ込みで通ってチャネル出口１０５ｂから出るようにし、そこで特異的結合対１０３ａの第１の部材が特異的結合対１０６の第２の部材と相互作用し、それによって第２の末端１０３を定位置に固定する。この構成により、負に荷電した部分１０１がチャネル内の挿入位置に保持される。
【0044】
図１Ｇは、第１の末端１０２が特異的結合対１０３ａの第１の部材を含み、第２の末端１０３が反応性部分１０２ａを含む実施形態を示す。反応性部分１０２ａは、ナノポア１０４ａ上の反応性部分と反応して、第２の末端１０３とナノポア１０４との間に共有結合１０７を形成する（矢印Ｉ）。特異的結合対の第２の部材を捕捉剤として使用するアフィニティークロマトグラフィーによって、反応生成物を分画して、ポリマーコンジュゲート化ナノポアを非コンジュゲート化ナノポアから分離する（図示せず）。次いで、精製されたポリマーコンジュゲート化ナノポアは、バイオチップ上の電気化学的抵抗性障壁１０８に挿入される（矢印ＩＩ）。チャネル１０５は、障壁１０８を通るイオン流のための経路を生成し、チャネル入口１０５ａは障壁の第１の側に配置され、チャネル出口１０５ｂは障壁の第２の側に配置される。特異的結合対１０６の第２の部材は、チャネル入口１０５ａに近接した障壁の第１の側に配置される。障壁を横切って電位が確立され（矢印ＩＩＩ）、第１の末端１０２がチャネル１０５をねじ込みで通ってチャネル入口１０５ａから出るようにし、そこで特異的結合対１０３ａの第１の部材が特異的結合対１０６の第２の部材と相互作用し、それによって第１の末端１０２を定位置に固定する。この構成により、負に荷電した部分１０１がチャネル内の挿入位置に保持される。
【0045】
図２に示すように、荷電ポリマーが挿入構成にあるとき、ポアのコンダクタンスは実質的に増加する。理論に束縛されるものではないが、この増強されたコンダクタンスは、チャネルを通る対イオンの輸送を容易にする大きな対イオン雲を担持するポリマーに起因し得る。
【0046】
Ｂ．α－ヘモリシンナノポア
一実施形態では、ナノポアは、α－ヘモリシン（αＨＬ）に基づく生物学的ナノポアを含む。αＨＬナノポアは、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）由来のαＨＬポリペプチドの７つのモノマーサブユニットから形成された七量体構造である。例示的なαＨＬナノポアの断面を図３に示す。αＨＬナノポアはキャップ領域３０１およびベータバレル領域３０２を有し、チャネル３０３はキャップ領域およびステム領域を通って軸方向に延在する。チャネル３０３は、入口３０４、狭窄部位３０５、ベータバレル本体３０６、およびベータバレル出口３０７に分けることができる。
一実施形態では、ナノポアは、α－ヘモリシン（αＨＬ）に基づく生物学的ナノポアを含む。αＨＬナノポアは、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）由来のαＨＬポリペプチドの７つのモノマーサブユニットから形成された七量体構造である。例示的なαＨＬナノポアの断面を図３に示す。αＨＬナノポアはキャップ領域３０１およびベータバレル領域３０２を有し、チャネル３０３はキャップ領域およびステム領域を通って軸方向に延在する。チャネル３０３は、入口３０４、狭窄部位３０５、ベータバレル本体３０６、およびベータバレル出口３０７に分けることができる。
【0047】
本明細書における「ベータバレル領域」への言及は、各々、狭窄部位３０５、ベータバレル本体３０６、およびベータバレル出口３０７を含む。本明細書における「αＨＬナノポア」への言及は、７つのαＨＬモノマーサブユニットの七量体ポアを指すものとする。野生型αＨＬモノマーサブユニットに対応するアミノ酸配列は、配列番号１に見出すことができる。別段示されない限り、αＨＬモノマーサブユニットに関する全てのアミノ酸ナンバリングは、配列番号１を参照する。「位置＃に置換を含む」または「置換Ｘ＃Ｙを含む」αＨＬモノマーサブユニットに言及する場合、モノマーサブユニットアミノ酸配列が、配列番号１とアラインメントさせた場合に、配列番号１の列挙された位置に対応する位置に置換を有することを意味すると理解されるものとする。本明細書で使用される場合、「非ネイティブアミノ酸」は、配列番号１とアラインメントした場合に置換または挿入を表すモノマーサブユニットアミノ酸配列の位置のアミノ酸である。一実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１と少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９１％の同一性、少なくとも９２％の同一性、少なくとも９３％の同一性、少なくとも９４％の同一性、または少なくとも９５％の同一性を有する少なくとも１つのαＨＬモノマーサブユニットを含む。
【0048】
表１は、配列番号１からなるモノマーサブユニットが、３７℃の２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０、２００ｍＭのＮａＣｌの水溶液中のＤＰｈＰＣの存在下でホモ七量体αＨＬナノポアに自己集合した場合に、入口３０４、狭窄領域３０５、またはベータバレル３０６に位置する溶媒に面するアミノ酸残基を列挙している。「＃」は配列番号１内の位置を示し、「ＡＡ」は配列番号１の列挙された位置のアミノ酸を示し、「位置」はアミノ酸が位置するαＨＬナノポアのサブ領域を示す。
【0049】
【表1】
【0050】
これらの部位は、一般に、ナノポアの様々な特性を修飾するために修飾（例えば、置換、挿入または欠失によって）され得る。本発明で有用な例示的な操作されたαＨＬナノポアは、例えば、Ａｙｕｂ、Ｗａｎｇ ＩＩ、国際公開第２０１４／１００４８１号、国際公開第２０１６／０６９８０６号、国際公開第２０１７／０５０７１８号、国際公開第２０１７／１８４８６６号および国際公開第２０１８／００２１２５号（それぞれが参照により組み込まれる）に見出すことができる。
【0051】
ナノポアのαＨＬモノマーサブユニットは、ポアに特定の特徴を付与する修飾を含み得る。一例には、非オリゴマー化モノマーサブユニットが自己オリゴマー化する能力を制御する置換が含まれる。例えば、Ｈ３５に置換を有するαＨＬモノマーサブユニット（例えば、Ｈ３５Ｇ／Ｌ／Ｄ／Ｅ置換）は、室温以下（例えば２５℃以下）であれば実質的にオリゴマー化しないが、より高温（例えば３５℃）に昇温すると安定的にオリゴマー化する。例示的な実施形態では、αＨＬモノマーサブユニットは、Ｈ３５Ｇ／Ｌ／Ｄ／Ｅ置換をさらに含む。自己オリゴマー化を制御するためおよび／またはオリゴマー化の特定のパターンを指示するための置換戦略の他の例は、例えば国際公開第２０１７／０５０７１８号に開示されている。別の例は、モノマーサブユニットを発現するために使用される組換え細胞におけるαＨＬモノマーサブユニットの発現レベルを改善する置換を含む。他の例としては、Ｄ２２７Ｎなど、ポアの到達速度の変動係数（ＣＶ）を減少させる置換が挙げられる。
【0052】
いくつかの実施形態では、ナノポアは狭いポアである。本明細書における「狭い」ポアへの言及は、ポアの少なくとも６つのモノマーサブユニットがＥ１１１、Ｍ１１３、およびＫ１４７を含むか、またはナノポアがＥ１１１、Ｍ１１３、およびＫ１４７を含むポアの６つのモノマーサブユニットを有するナノポアと比較して狭窄部位を狭めるのに十分なＥ１１１、Ｍ１１３、および／またはＫ１４７での置換を含むことを意味するものとする。他の実施形態では、ナノポアは、狭窄部位を広げる置換を含む。これらの置換は、狭窄部位を形成するアミノ酸の側鎖を、より短いおよび／またはより嵩の低い側鎖を有するアミノ酸で置き換える。例としては、Ｅ１１１Ａ／Ｓ、Ｍ１１３Ａ／Ｓ、およびＫ１４７Ａ／Ｓ／Ｎ置換が挙げられる。一例では、αＨＬナノポアの少なくとも３つのモノマーサブユニットは、Ｅ１１１Ａ／Ｓ、Ｍ１１３Ａ／ＳおよびＫ１４７Ａ／Ｓ／Ｎからなる群から選択される１つ以上の置換を含む。一例では、αＨＬナノポアの少なくとも４つのモノマーサブユニットは、Ｅ１１１Ａ／Ｓ、Ｍ１１３Ａ／ＳおよびＫ１４７Ａ／Ｓ／Ｎからなる群から選択される１つ以上の置換を含む。一例では、αＨＬナノポアの少なくとも５つのモノマーサブユニットは、Ｅ１１１Ａ／Ｓ、Ｍ１１３Ａ／ＳおよびＫ１４７Ａ／Ｓ／Ｎからなる群から選択される１つ以上の置換を含む。一例では、αＨＬナノポアの少なくとも６つのモノマーサブユニットは、Ｅ１１１Ａ／Ｓ、Ｍ１１３Ａ／ＳおよびＫ１４７Ａ／Ｓ／Ｎ（６：１モノマーサブユニットを含み、「６」の成分は、Ｅ１１１Ａ／Ｓ、Ｍ１１３Ａ／Ｓ、およびＫ１４７Ａ／Ｓ／Ｎに対応する置換を有する）からなる群から選択される１つ以上の置換を含む。
【0053】
αＨＬナノポアの各モノマーサブユニットは、同じ一次アミノ酸配列を有し得るか（「ホモ七量体」と呼ばれる）、または七量体の少なくとも１つのモノマーサブユニットは、他のモノマーサブユニットのアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有し得る（「ヘテロ七量体」と呼ばれる）。ヘテロ七量体αＨＬナノポアは、本明細書では、ナノポアに使用される異なるモノマーサブユニットの種の比によって言及され得る。例えば、「６：１ αＨＬナノポア」は、同じアミノ酸配列を有する６つのモノマーサブユニットおよび異なるアミノ酸配列を有する１つのモノマーサブユニットを有する。そのような例では、「６」の成分への言及は、各々の６つの同一のモノマーサブユニットを意味するものとし、「１」の成分への言及は、異なるアミノ酸配列を有する１つのモノマーサブユニットを意味するものとする。いくつかの実施形態では、αＨＬナノポアの各モノマーサブユニットは、追加のモノマーサブユニットを含有しないポリペプチド中に配置される（本明細書では「非オリゴマー化モノマーサブユニット」と呼ばれる）。非オリゴマー化モノマーサブユニットからホモ七量体およびヘテロ七量体を作製する例示的な方法は、米国特許出願公開第２０１７－００８８８９０号明細書に開示されている。例えば、２つの異なるモノマー調製物（例えば、モノマーが、ポリメラーゼに結合するために使用され得る実体およびそのような修飾を含有しない別の実体で修飾されているもの）を混合することによって、６：１ヘテロ七量体を生成することができる。得られた七量体が過剰であると意図される実体を、膜の存在下で他の七量体に対してモル過剰で提供し、混合物を水溶液（例えば、２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０、２００ｍＭのＮａＣｌまたは２０ｍＭのクエン酸ナトリウムｐＨ３、４００ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＴＷＥＥＮ（登録商標） ２０＋０．２ＭのＴＭＡＯ）中で３７℃で一晩インキュベートする。次いで、得られた七量体をカチオン交換クロマトグラフィーによって精製する。いくつかの実施形態では、オリゴマー化は、０．１～５ＭのＴＭＡＯ、１～４ＭのＴＭＡＯなどのトリメチルアミンＮ－オキシド（ＴＭＡＯ）の存在下で行われる。一実施形態では、Ｈ３５Ｇ置換を含む、配列番号１に対する置換のセットを有するαＨＬモノマーサブユニットを、３７℃で０．１から５ＭのＴＭＡＯを含む水性緩衝液の存在下でオリゴマー化する。別の実施形態では、Ｈ３５Ｇ置換を含む、配列番号１に対する置換のセットを有するαＨＬモノマーサブユニットを、３７℃で０．２から４ＭのＴＭＡＯを含む水性緩衝液の存在下でオリゴマー化する。別の実施形態では、Ｈ３５Ｇ置換を含む、配列番号１に対する置換のセットを有するαＨＬモノマーサブユニットを、３７℃で約０．２Ｍから約３ＭのＴＭＡＯを含む水性緩衝液の存在下でオリゴマー化する。他の実施形態では、ナノポアは、連結されたモノマーサブユニットの少なくとも１つのセットを含む。αＨＬモノマーサブユニットの連結モノマーサブユニットからαＨＬナノポアを作製する例示的な方法は、例えばＨａｍｍｅｒｓｔｅｉｎおよび米国特許出願公開第２０１７－００８８８９０号明細書に開示されている。いくつかの実施形態では、αＨＬナノポアは６：１ナノポアであり、荷電ポリマーは「１」の成分に結合している。さらなる実施形態では、「１」の成分は、「１」のサブユニットへの荷電ポリマーの結合を容易にするためにＮ１７Ｃ置換を含む。さらに別の実施形態では、「１」のサブユニットはＮ１７Ｃ置換を含み、荷電ポリマーの第１の末端または第２の末端のいずれかは、荷電モノマーの「１」のサブユニットへの結合を容易にするためにマレイミドを含む。さらに別の実施形態では、「１」のサブユニットはＮ１７Ｃ置換を含み、荷電ポリマーの第１の末端または第２の末端のいずれかは、「１」のサブユニットへの荷電モノマーの結合を容易にするためにマレイミドを含み、第１および第２の末端の他方は、特異的結合対の第１の部材（ビオチンまたはエピトープタグなど）を含む。図４は、Ｎ１７Ｃ置換を有する１つのαＨＬモノマーサブユニットを含む実施形態を示す図であり、荷電ポリマーは、システイン側鎖と荷電ポリマーの第１の末端に配置されたマレイミド部分との反応を介してＮ１７Ｃに結合し、さらに第２の末端は、荷電ポリマーの第２の末端に配置されたビオチン分子とストレプトアビジンビーズとの結合を介してチャネルの出口側の外側の定位置に固定されている。
【0054】
本明細書に記載のαＨＬナノポアはまた、それに結合したポリメラーゼを含み得る。そのような実施形態は、タグに基づくＳＢＳ法を行うのに特に有用である。一実施形態では、単一のポリメラーゼはαＨＬナノポアに結合している。例示的なポリメラーゼには、ＤＮＡポリメラーゼクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）ファージｐｈｉＣＰＶ４（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＹＰ＿００６４８８６２によって記載され、本明細書では「Ｐｏｌ６」と呼ばれる）、ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＤＮＡ ｐｏｌ、Ｔ４ ＤＮＡ ｐｏｌ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡ ｐｏｌ １、クレノウ断片、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＲＮＡポリメラーゼ、ならびに関連するサブユニットおよび補因子に由来するものが含まれる。一実施形態では、ポリメラーゼは、Ｐｏｌ６由来のＤＮＡポリメラーゼである。ナノポアに基づく配列決定に有用な例示的なＰｏｌ６誘導体は、例えば、米国特許出願公開第２０１６／０２２２３６３号明細書、米国特許出願公開第２０１６／０３３３３２７号明細書、米国特許出願公開第２０１７／０２６７９８３号明細書、米国特許出願公開第２０１８／００９４２４９号明細書および米国特許出願公開第２０１８／０２４５１４７号明細書に開示されている。ポリメラーゼをαＨＬナノポアに結合させる例示的な方法としては、ＳｐｙＴａｇ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒペプチドシステム（Ｚａｋｅｒｉら、ＰＮＡＳ １０９：Ｅ６９０－Ｅ６９７ ２０１２）、ネイティブな化学ライゲーションシステム（Ｔｈａｐａら、Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ 第１９巻：１４４６１～１４４８３頁、２０１４年）、ソルターゼシステム（ＷｕおよびＧｕｏ、Ｊ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ Ｃｈｅｍ 第３１巻：４８～６６頁、２０１２年；Ｈｅｃｋら、Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、第９７巻：４６１～４７５頁、２０１３年））、トランスグルタミナーゼシステム（Ｄｅｎｎｌｅｒら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ、第２５巻：５６９ ５７８頁、２０１４年）、ホルミルグリシン連結システム（Ｒａｓｈｉｄｉａｎら、Ｂｉｏ ｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ、第２４巻：１２７７～１２９４頁、２０１３年）、クリックケミストリー連結システム、または当技術分野で公知の他の化学ライゲーション技術が挙げられる。さらに他の実施形態では、１つのαＨＬモノマーサブユニットはポリメラーゼとの融合タンパク質として発現される。一実施形態では、ポリメラーゼは、１つのモノマーサブユニットのアミノ酸側鎖に結合している。一実施形態では、αＨＬナノポアは５：１：１ナノポアであり、ポリメラーゼは１つの「１」の成分に結合しており、荷電ポリマーが他の「１」の成分に結合している。特定の実施形態では、５：１：１ナノポアが提供され、ここで、１つの「１」の成分は、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ／ＳｐｙＴａｇ結合システムの部材を含み、他の「１」の成分は、Ｎ１７Ｃ置換を含む。別の実施形態では、αＨＬナノポアは６：１ナノポアであり、ポリメラーゼおよび荷電ポリマーは「１」の成分に結合しており、ポリメラーゼはＤＮＡポリメラーゼである。
【0055】
Ｃ．代替ナノポア
一実施形態では、ナノポアは、αＨＬではない生物学的ナノポアを含む。例示的な非αＨＬ生物学的ナノポアとしては、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ７６０４５－１に開示されている標準的な完全長非プロセシング配列）由来の外膜ポリンＧ（ＯｍｐＧ）ナノポア、マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）ポリンＡ（ＭｓｐＡ）（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ａ０ＱＲ２９－１に開示されている標準的な全長非プロセシング配列）、バクテリオファージｐｈｉ２９ ＤＮＡパッケージングモーター（Ｐｈｉ２９）由来の十二量体コネクタチャネル、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）保護抗原、ＰＡ６３（ＰＡ６３）、ロイコシジンナノポア、外膜ポリンＦ（ＯｍｐＦ）ナノポア、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のヒドロキサメート第２鉄取り込み成分Ａ（ｆｅｒｒｉｃ ｈｙｄｒｏｘａｍａｔｅ ｕｐｔａｋｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ａ）（ＦｈｕＡ）、サイトリシンＡ（ＣｌｙＡ）ナノポア、外膜ホスホリパーゼＡナノポア、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）自己輸送リポタンパク質（ＮａｌＰ）ナノポア、ＷＺＡナノポア、ノカルジア・ファルシニカ（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｆａｒｃｉｎｉｃａ）ＮｆｐＡ／ＮｆｐＢカチオン選択性チャネルナノポア、ライセニンナノポア、エロリジン、バクテリオファージＳＰＰ１（ＳＰＰ１）のＤＮＡパッケージングモーター、およびＣｕｒｌｉｎ ｓｉｇｍａ Ｓ依存性増殖サブユニットＧ（ＣｓｇＧ）ナノポアが挙げられる。様々なナノポアタンパク質の使用の総説は、例えば、Ｇａｒｉ（ＯｍｐＧ）、Ｈａｑｕｅら（ＭｓｐＡおよびＰｈｉ２９）、およびＷａｎｇ ＩＩ（Ｐｈｉ２９、ＭｓｐＡ、ＣｓｇＧ、ＰＡ６３、ＣｌｙＡ、ＦｈｕＡ、ＳＰＰ１）に見出すことができる。
一実施形態では、ナノポアは、αＨＬではない生物学的ナノポアを含む。例示的な非αＨＬ生物学的ナノポアとしては、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ７６０４５－１に開示されている標準的な完全長非プロセシング配列）由来の外膜ポリンＧ（ＯｍｐＧ）ナノポア、マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）ポリンＡ（ＭｓｐＡ）（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ａ０ＱＲ２９－１に開示されている標準的な全長非プロセシング配列）、バクテリオファージｐｈｉ２９ ＤＮＡパッケージングモーター（Ｐｈｉ２９）由来の十二量体コネクタチャネル、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）保護抗原、ＰＡ６３（ＰＡ６３）、ロイコシジンナノポア、外膜ポリンＦ（ＯｍｐＦ）ナノポア、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のヒドロキサメート第２鉄取り込み成分Ａ（ｆｅｒｒｉｃ ｈｙｄｒｏｘａｍａｔｅ ｕｐｔａｋｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ａ）（ＦｈｕＡ）、サイトリシンＡ（ＣｌｙＡ）ナノポア、外膜ホスホリパーゼＡナノポア、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）自己輸送リポタンパク質（ＮａｌＰ）ナノポア、ＷＺＡナノポア、ノカルジア・ファルシニカ（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｆａｒｃｉｎｉｃａ）ＮｆｐＡ／ＮｆｐＢカチオン選択性チャネルナノポア、ライセニンナノポア、エロリジン、バクテリオファージＳＰＰ１（ＳＰＰ１）のＤＮＡパッケージングモーター、およびＣｕｒｌｉｎ ｓｉｇｍａ Ｓ依存性増殖サブユニットＧ（ＣｓｇＧ）ナノポアが挙げられる。様々なナノポアタンパク質の使用の総説は、例えば、Ｇａｒｉ（ＯｍｐＧ）、Ｈａｑｕｅら（ＭｓｐＡおよびＰｈｉ２９）、およびＷａｎｇ ＩＩ（Ｐｈｉ２９、ＭｓｐＡ、ＣｓｇＧ、ＰＡ６３、ＣｌｙＡ、ＦｈｕＡ、ＳＰＰ１）に見出すことができる。
【0056】
ＩＩＩ．核酸配列決定システムおよび方法
開示されたナノポアを使用して核酸配列決定を行うためのシステムおよび方法が提供される。ナノポアに基づく核酸配列決定のためのシステムは、一般に、本明細書に開示される荷電ポリマー連結ナノポアを含む複数のナノポア配列決定複合体を有するチップと、ナノポア配列決定複合体の１つ以上の電気的特性の変化を記録するように適合されたコンピューティングシステムとを含む。
開示されたナノポアを使用して核酸配列決定を行うためのシステムおよび方法が提供される。ナノポアに基づく核酸配列決定のためのシステムは、一般に、本明細書に開示される荷電ポリマー連結ナノポアを含む複数のナノポア配列決定複合体を有するチップと、ナノポア配列決定複合体の１つ以上の電気的特性の変化を記録するように適合されたコンピューティングシステムとを含む。
【0057】
図５は、例示的なナノポア配列決定複合体５００を示す。電気化学的抵抗性障壁５０１は、第１の電解液５０２を第２の電解液５０３から分離する。障壁の第１の電解液が配置される側を障壁のシス側と呼び、第２の電解液が配置される側をトランス側と呼ぶ。本明細書に記載の荷電ポリマーが結合したナノポア５０４が障壁５０１に挿入され、チャネル５０５が第１の電解液と第２の電解液との間のイオン交換を可能にするように、チャネルの入口側および荷電ポリマーの第１の末端は障壁のシス側に向けられ、チャネルの出口側および荷電ポリマーの第２の末端は障壁のトランス側に向けられる。作用電極５０６および対電極５０７は、信号源５０８に動作可能に接続されている。信号源５０８は、電圧信号を、作用電極５０６と対電極５０７との間に印加する。ナノポア５０４は、ナノポアの少なくとも１つの電気的特性の変化が検出され、コンピューティングシステムに送信され得るように、電極に対して配置される。システムが合成による配列決定方法に使用される場合、システムは、（ｆ）障壁のシス側のナノポアに会合した核酸ポリメラーゼ５０７、および（ｇ）第１の電解液中に配置されたポリマータグ付きヌクレオシド－５’－オリゴホスフェート（Ｎ５ＯＰ）５１０のセットをさらに含む。
【0058】
水の膜貫通流を可能にするが、イオンまたは他の浸透圧調節物質の流れに対する透過性がないものに限定される任意の半透膜は、本明細書に記載のナノポアを挿入することができる限り、電気化学的抵抗性障壁として使用され得る。例えば、開示された方法およびシステムは、ポリマーである膜と共に使用することができる。いくつかの実施形態では、膜は、コポリマーである。いくつかの実施形態にでは、膜は、トリブロックコポリマーである。例示的な実施形態では、膜はＡ－Ｂ－Ａトリブロックコポリマーであり、「Ａ」はポリ－ｂ－（メチルオキサゾリン）であり、「Ｂ」はポリ（ジメチルシロキサン）－ポリ－ｂ－（メチルオキサゾリン）である（Ｐｍｏｘａ－ＰＤＭＳ－Ｐｍｏｘａ膜）。他の実施形態では、電気化学的抵抗性障壁は、脂質二重層であってもよい。脂質二重層を形成するために使用される例示的な材料としては、例えば、ジフィタノイル－ホスファチジルコリン（ＤＰｈＰＣ）、１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１，２－ジ－Ｏ－フィタニル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰｈＰＣ）、パルミトイル－オレオイル－ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、ジオレオイル－ホスファチジル－メチルエステル（ＤＯＰＭＥ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、スフィンゴミエリン、１，２－ジ－Ｏ－フィタニル－ｓｎ－グリセロール、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－３５０］、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－５５０］、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－７５０］、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－１０００］、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－７０００］、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－ラクトシル、ＧＭ１ガングリオシド、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）、またはこれらの任意の組み合わせから選択されるリン脂質が挙げられる。
【0059】
電気化学抵抗性障壁５０１は、障壁のトランス側の第２の電解液５０３を、障壁のシス側の第１の電解液５０２から分離する。第１の電解質５０２および第２の電解質５０３は、最適なイオン濃度に緩衝された水溶液であり、ナノポアを開き障壁を可能な限り無傷に保つために最適なｐＨに維持される。第１の電解液は、（障壁に挿入する前の）遊離ナノポア、対象の核酸、および対象の核酸を配列決定するために必要な任意の補助試薬（ＳＢＳ配列決定法のためのプライマー核酸およびＮ５ＯＰなど）を含むことができる。第１および第２の電解液は、１つ以上の塩化リチウム（ＬｉＣｌ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、グルタミン酸リチウム、グルタミン酸ナトリウム、グルタミン酸カリウム、酢酸リチウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）、塩化ストロンチウム（ＳｒＣｌ２）、塩化マンガン（ＭｎＣｌ２）、および塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）をさらに含み得る。
【0060】
単一の遊離ナノポア（図示せず）は、電圧信号により引き起こされるエレクトロポレーションプロセスにより、障壁５０１に挿入することができ、それによって障壁５０１にナノポア５０４を形成する。チャネル５０５は、障壁５０１を横切り、第一の電解質５０２から作用電極５０６へのイオン流の唯一の経路を提供する。
【0061】
いくつかの実施形態では、作用電極５０６は、金属電極である。非ファラデー性伝導について、作用電極５０６は、例えば、白金、金、窒化チタン、および黒鉛などの、腐食および酸化に耐性のある金属または他の材料製とすることができる。例えば、作用電極５０６は、白金が電気めっきされた白金電極とすることができる。別の例では、作用電極５０６は、窒化チタン（ＴｉＮ）作用電極とすることができる。作用電極５０６は、多孔質とすることができ、それによって、その表面積が広くなり、作用電極５０６に関連する静電容量をもたらす。ナノポア配列決定複合体の作用電極は別のナノポア配列決定複合体の作用電極から独立している可能性があるため、本開示では作用電極をセル電極と呼ぶことができる。
【0062】
対電極（ＣＥ）５０７は、電気化学的な電位センサとすることができる。いくつかの実施形態では、対電極５０７は、複数のナノポア配列決定複合体の間にて共有されており、したがって、共通電極と呼ばれることができる。共通電極は、共通電位を、ナノポア５０４に接触する第１の電解質５０２に印加するように構成されることができる。対電極５０７および作用電極５０６は、障壁５０１にわたって電気的刺激（例えば、電圧バイアス）を提供するために、信号源５０８に接続されることができ、障壁５０１の電気的特性（例えば、抵抗、静電容量、電圧減衰、およびイオン電流フロー）を感知するために使用することができる。信号源５０８は、電圧信号を、作用電極５０６と対電極５０７との間に印加することができる。
【0063】
図６は、ナノポアセル６５０のアレイ６４０を有するナノポアセンサチップ６００の例示的な実施形態の上面図であり、各ナノポアセルは単一のナノポア配列決定複合体５００を含む。各ナノポアセル６５０は、ナノポアセンサチップ６００のシリコン基板上に集積された制御回路を含み得る。いくつかの実施形態では、各々のグループが、特性評価のために、異なるサンプルを受け取ることができるように、ナノポアセル６５０のグループを分離するために側壁６３６がアレイ６４０に含まれる。各々のナノポアセルは、核酸を配列決定するために使用することができる。いくつかの実施形態では、ナノポアセンサチップ６００は、カバープレート６３０を含む。いくつかの実施形態では、ナノポアセンサチップ６００はまた、コンピュータプロセッサなどの他の回路とインターフェースする複数のピン６１０も含む。
【0064】
いくつかの実施形態では、ナノポアセンサチップ６００は、同じパッケージに複数のチップを含み、例えば、マルチチップモジュール（ＭＣＭ）またはシステムインパッケージ（ＳｉＰ）を構成する。チップは、例えば、メモリ、プロセッサ、フィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、データコンバータ、高速Ｉ／Ｏインターフェース、などを含むことができる。
【0065】
いくつかの実施形態では、ナノポアセンサチップ６００は、本明細書に開示される、プロセスの様々な実施形態を実行する（例えば、自動的に実行する）ための様々な構成要素を含むことができる、ナノチップワークステーション６２０に接続される（例えば、ドッキングされる）。これらのプロセスは、例えば、脂質懸濁液、または、他の膜構造懸濁液、分析物溶液、および／または、他の液体、懸濁液、または固体を供給するための、ピペットなどの、分析物デリバリメカニズムを含むことができる。ナノチップワークステーションの構成要素は、ロボティックアーム、１つ以上のコンピュータプロセッサ、および／またはメモリをさらに含むことができる。複数のポリヌクレオチドが、ナノポアセル６５０のアレイ６４０上にて検出されることができる。いくつかの実施形態では、各々のナノポアセル６５０は、個々にアドレス可能である。
【0066】
図７は、ナノポア配列決定複合体を含むナノポアセルの例示的な実施形態を示す。ナノポアセル７００は、誘電体層７０１および７０４から形成されたウェル７０５と、ウェル７０５の上に形成された障壁７１４；障壁７１４によってウェル７０５から分離されたサンプルチャンバ７１５とを含むことができる。ウェル７０５は、ある体積の第２の電解質７０６を含むことができ、サンプルチャンバ７１５は、ナノポアを含む第１の電解質７０８、および対象分析物（例えば、配列決定される核酸分子）を保持することができる。ナノポアセル７００は、ウェル７０５の底にある作用電極７０２と、サンプルチャンバ７１５内に配置された対電極７１０と、を含むことができる。信号源７２８は、電圧信号を、作用電極７０２と対電極７１０との間に印加することができる。単一のナノポアは、電圧信号によって引き起こされるエレクトロポレーションプロセスにより障壁７１４に挿入することができ、それによって障壁７１４内にナノポア７１６を形成する。アレイ内の障壁（例えば、脂質二分子層７１４または他の膜構造）は、化学的にも電気的にも互いに接続されないものとすることができる。したがって、アレイにおける各々のナノポアセルは、対象分析物に作用し、さもなければ不浸透性の障壁を通してイオン電流を変調するナノポアに関連付けられた、単一のポリマー分子に固有のデータを生成する、独立した配列決定マシンとすることができる。
【0067】
図７に示すように、ナノポアセル７００は、シリコン基板などの基板７３０上に形成されることができる。誘電体層７０１は、基板７３０上に形成されることができる。誘電体層７０１を形成するために使用される誘電材料は、例えば、ガラス、酸化物、窒化物などを含むことができる。電気的刺激を制御することと、ナノポアセル７００から検出される信号を処理することとのための電気回路７２２は、基板７３０上、および／または、誘電体層７０１内に形成されることができる。例えば、複数のパターン化された金属層（例えば、金属１から金属６）が、誘電体層７０１内に形成されることができ、複数のアクティブデバイス（例えば、トランジスタ）が、基板７３０上に作られることができる。いくつかの実施形態では、信号源７２８は、電気回路７２２の一部として含まれる。電気回路７２２は、例えば、アンプ、積分器、アナログ－デジタルコンバータ、ノイズフィルタ、フィードバック制御ロジック、および／または様々な他の構成要素、などを含むことができる。電気回路７２２は、メモリ７２６に接続されたプロセッサ７２４にさらに接続されることができ、ここで、プロセッサ７２４は、配列決定データを分析し、アレイにおいて配列決定されたポリマー分子の配列を決定することができる。
【0068】
作用電極７０２は、誘電体層７０１上に形成されることができ、ウェル７０５の底の一部を少なくとも形成することができる。
【0069】
誘電体層７０４は、誘電体層７０１の上に形成されることができる。誘電体層７０４は、ウェル７０５を取り囲む壁を形成する。誘電体層７０４を形成するために使用される誘電材料としては、例えば、ガラス、酸化物、一窒化シリコン（ＳｉＮ）、ポリイミド、または他の好適な疎水性絶縁材料などを含むことができる。誘電体層７０４の上面は、シラン処理されることができる。シラン処理は、誘電体層７０４の上面の上方に疎水層７２０を形成することができる。いくつかの実施形態では、疎水層７２０は、約１．５ナノメートル（ｎｍ）の厚さを有する。
【0070】
誘電体層壁７０４によって形成されたウェル７０５は、作用電極７０２と接触する第２の電解質７０６を含む。いくつかの実施形態では、第２の電解質７０６は、約３ミクロン（μｍ）の厚さを有する。
【0071】
障壁７１４は、誘電体層７０４の上に形成され、ウェル７０５にまたがることがある。障壁７１４は、本明細書に開示されるように、荷電ポリマーが結合した単一のナノポア７１６で埋め込まれている。ナノポア７１６は、対象分析物の少なくとも一部位、荷電ポリマー、および／または、小さいイオン（例えば、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｃａ２＋、Ｃｌ－）を、障壁７１４の２つの側の間に通すのに十分な大きさとすることができる。サンプルチャンバ７１５は、障壁７１４のシス側に配置され、特性評価対象分析物の溶液を保持することができる。
【0072】
いくつかの実施形態では、較正の一部として、ナノポアセルの生成中に、様々なチェックが行われる。ナノポアセルが生成されると、例えば、所望に作動しているナノポアセル（例えば、セル内の１つのナノポア）を識別するために、さらなる較正ステップが行われることができる。そのような較正チェックは、物理的チェック、電圧較正、オープンチャネル較正、および単一のナノポアを有するセルの識別を含むことができる。
【0073】
使用時に、複数のナノポア配列決定複合体で活性配列決定複合体が生成され、分子がナノポアのチャネルに侵入して、ナノポア配列決定複合体の１つ以上の電気的特性の変化を引き起こし、変化が検出され、コンピューティングシステムに送信され、コンピューティングシステムが関連付ける。ＳＢＳ配列決定法では、チャネルに入る分子はタグ付きＮ５ＯＰのポリマータグである。直接配列決定法では、チャネルに入る分子は対象の核酸である。
【0074】
図８は、タグに基づくＳＢＳ核酸配列決定を行うための活性配列決定複合体８００の例示的な実施形態を示す。電気抵抗性障壁８０１は、第１の電解液８０２を第２の電解液８０３から分離する。ナノポア８０４は電気抵抗性障壁８０１内に配置され、ナノポア８０５のチャネルは、イオンが第１の電解質８０２と第２の電解質８０３との間を流れることができる経路を提供する。作用電極８０６は、第２の電解質８０３を含む電気抵抗性障壁８０１の側（電気抵抗性障壁の「トランス側」と呼ばれる）に配置され、ナノポア８０４の近くに配置される。対電極８０７は、第１の電解質８０２を含む電気抵抗性障壁８０１の側（電気抵抗性障壁の「シス側」と呼ばれる）に配置される。信号源８０８は、電圧信号を、作用電極８０６と対電極８０７との間に印加するのに適している。ポリメラーゼ８０９はナノポア８０４と会合し、プライミングされた鋳型核酸８１０はポリメラーゼ８０９と会合する。第１の電解質８０２は、４つの異なるポリマータグ付きヌクレオシドオリゴホスフェート８１１（タグは８１１ａとして示されている）を含む。ポリメラーゼ８０９は、鋳型のアンプリコンへのポリマータグ付きヌクレオチド８１１の組み込みを触媒する。ポリマータグ付きヌクレオシドオリゴホスフェート８１１がポリメラーゼ８０９と正確に複合体化されると、タグ８１１ａは、電気抵抗性障壁８０１および／またはナノポア８０４にわたって印加される電圧によって生成される電場の存在下で生成される力などの電気力によってナノポア内に引き込まれ（例えば、ロードされ）得る。タグ８１１ａはナノポア８０４のチャネルを占有するが、ナノポア８０４を通るイオンの流れに影響を及ぼし、それによってイオン遮断信号８１２を生成する。各ヌクレオチド８１１は、タグ８１１ａの異なる化学構造および／またはサイズに起因して固有のイオン遮断信号を生成する固有のポリマータグ８１１ａを有する。固有のイオン遮断信号８１２を識別することにより、固有のタグ８１１ａ（したがって、それが会合しているヌクレオチド８１０）の同一性を識別することができる。このプロセスは、各ヌクレオチド８１１がアンプリコンに組み込まれた状態で反復的に繰り返される。そのような方法を実施するための例示的なタグに基づくＳＢＳアプローチおよび材料は、例えば、国際公開第２０１２－０８３２４９号、国際公開第２０１３／１５４９９９号、米国特許出願公開第２０１４／０３０９１４４号明細書、米国特許第９，０１７，９３７号明細書、国際公開第２０１５／１４８４０２号、国際公開第２０１６／０６９８０６号、国際公開第２０１６／１４４９７３号、米国特許出願公開第２０１６／０２２２３６３号明細書、米国特許出願公開第２０１６／０３３３３２７号明細書、国際公開第２０１７／０５０７２８号、国際公開第２０１７／１８４８６６号、国際公開第２０１７／０５０７２２号、米国特許出願公開第２０１７／０２６７９８３号明細書、米国特許出願公開第２０１８／０２４５１４７号明細書、米国特許出願公開第２０１８／００９４２４９号明細書、国際公開第２０１８／００２１２５号、およびＫｕｍａｒに記載されている（それぞれが参照により本明細書に組み込まれる）。そのようなシステムで使用するために、ポリペプチド（ポリリジンタグなど）、ポリヌクレオチド、およびポリエチレングリコールに基づくタグを含む様々なタグが提案されている。例えば、米国特許第８，６５２，７７９号明細書および国際公開第２０１７０４２０３８号（それぞれが参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【0075】
図９は、直接配列決定を行うための活性配列決定複合体９００の例示的な実施形態を示す。電気抵抗性障壁９０１は、第１の電解液９０２を第２の電解液９０３から分離する。ナノポア９０４は電気抵抗性障壁９０１内に配置され、ナノポア９０５のチャネルは、イオンが第１の電解質９０２と第２の電解質９０３との間を流れることができる経路を提供する。作用電極９０６は、第２の電解質９０３を含む電気抵抗性障壁９０１の側（電気抵抗性障壁の「トランス側」と呼ばれる）に配置され、ナノポア９０４の近くに配置される。対電極９０７は、第１の電解質９０２を含む電気抵抗性障壁９０１の側（電気抵抗性障壁の「シス側」と呼ばれる）に配置される。信号源９０８は、電圧信号を、作用電極９０６と対電極９０７との間に印加するのに適している。第１の電解質９０２は、対象の核酸９１０を含む。対象の核酸９１０は、電気抵抗性障壁９０１および／またはナノポア９０４にわたって印加される電圧によって生成される電場の存在下で生成される力などの電気力によってナノポア内に引き込まれ（例えば、ロードされ）得る。ヌクレオチドまたはヌクレオチドの配列がナノポア９０４のチャネルを占有すると、それらはナノポア９０４を通るイオンの流れに影響を及ぼし、それによってイオン遮断信号を生成する。チャネル９０５を占有する各ヌクレオチドまたはヌクレオチドの配列によって、異なるイオン遮断信号を生成することができる。このプロセスは、対象の核酸９１０がチャネルを通過するときに反復的に繰り返され、対象の核酸９１０の配列は、Ｆｅｎｇ、Ｍａｎｒａｏ、およびＷａｎｇ Ｉによって記録されたイオン遮断信号の固有の配列に基づいて外挿される。
【0076】
ＩＶ．実施例
タンパク質ナノポアの内部に合成ポリマーをテザリングすることにより、より狭いイオン通路で高いコンダクタンスを有するα－ＨＬポアが生成された。ナノポアが薄く非常に負に荷電したポリマーを捕捉する場合、ナノポアは、捕捉されたポリマーが存在しない場合よりも高いコンダクタンスを示す。理論に束縛されるものではないが、観察されたコンダクタンスの向上の機構は、大きな対イオン雲を担持するポリマーに起因し得る。ナノポア内へのこれらのポリマーの捕捉は、これらの対イオンの輸送を促進し、その結果、より狭い通路にもかかわらず、コンダクタンス状態の向上が観察される。
タンパク質ナノポアの内部に合成ポリマーをテザリングすることにより、より狭いイオン通路で高いコンダクタンスを有するα－ＨＬポアが生成された。ナノポアが薄く非常に負に荷電したポリマーを捕捉する場合、ナノポアは、捕捉されたポリマーが存在しない場合よりも高いコンダクタンスを示す。理論に束縛されるものではないが、観察されたコンダクタンスの向上の機構は、大きな対イオン雲を担持するポリマーに起因し得る。ナノポア内へのこれらのポリマーの捕捉は、これらの対イオンの輸送を促進し、その結果、より狭い通路にもかかわらず、コンダクタンス状態の向上が観察される。
【0077】
Ａ．荷電ポリマーの合成
図１０に開示される構造を有する荷電ポリマーを、標準的な固相ホスホラミダイト化学プロトコルを使用してＡＢＩ ３９００ ＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒで合成した。得られたポリマーを、濃水酸化アンモニウム処理によって樹脂から切断した。生成物をＳＰＥＥＤＶＡＣ真空濃縮器（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で濃縮し、次いで逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）で精製して純粋な化合物を得た。保護されたマレイミドを、乾燥トルエン中、９０℃で３時間加熱することによって除去した。生成物を更に精製することなく使用した。マレイミド基を青色で強調し、ビオチン基を緑色で強調する。
図１０に開示される構造を有する荷電ポリマーを、標準的な固相ホスホラミダイト化学プロトコルを使用してＡＢＩ ３９００ ＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒで合成した。得られたポリマーを、濃水酸化アンモニウム処理によって樹脂から切断した。生成物をＳＰＥＥＤＶＡＣ真空濃縮器（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で濃縮し、次いで逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）で精製して純粋な化合物を得た。保護されたマレイミドを、乾燥トルエン中、９０℃で３時間加熱することによって除去した。生成物を更に精製することなく使用した。マレイミド基を青色で強調し、ビオチン基を緑色で強調する。
【0078】
Ｂ．αＨＬナノポアの発現および精製
野生型α－ＨＬ－６Ｘ－Ｈｉｓ（配列番号２）およびα－ＨＬ－Ｎ１７Ｃ＿６Ｘ－Ｈｉｓ（配列番号３）の両方を、ＭＡＧＩＣ ＭＥＤＩＡ大腸菌（ｅ．ｃｏｌｉ）発現培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で２５℃で一晩増殖させたＢＬ２１ ＤＥ３ Ｓｔａｒ ｐＬｙｓ－Ｓ大腸菌（ｅ．ｃｏｌｉ）細胞において発現させた。配列番号３は、Ｃ末端付近にＳｐｙＴａｇを含む。それぞれを２５ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０、３００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのイミダゾール中での超音波処理によって溶解した。それらの両方をＴＡＬＯＮカラムで精製し、１５０ｍＭのイミダゾールを含む同じ緩衝液で溶出した。ＷＴ α－ＨＬ－６Ｘ－ＨｉｓのｈｉｓタグをＴＥＶプロテアーゼで切断し、ＷＴ α－ＨＬを生成した（配列番号１）。
野生型α－ＨＬ－６Ｘ－Ｈｉｓ（配列番号２）およびα－ＨＬ－Ｎ１７Ｃ＿６Ｘ－Ｈｉｓ（配列番号３）の両方を、ＭＡＧＩＣ ＭＥＤＩＡ大腸菌（ｅ．ｃｏｌｉ）発現培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で２５℃で一晩増殖させたＢＬ２１ ＤＥ３ Ｓｔａｒ ｐＬｙｓ－Ｓ大腸菌（ｅ．ｃｏｌｉ）細胞において発現させた。配列番号３は、Ｃ末端付近にＳｐｙＴａｇを含む。それぞれを２５ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０、３００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのイミダゾール中での超音波処理によって溶解した。それらの両方をＴＡＬＯＮカラムで精製し、１５０ｍＭのイミダゾールを含む同じ緩衝液で溶出した。ＷＴ α－ＨＬ－６Ｘ－ＨｉｓのｈｉｓタグをＴＥＶプロテアーゼで切断し、ＷＴ α－ＨＬを生成した（配列番号１）。
【0079】
Ｃ．ポア集合および精製
１つのα－ＨＬ－Ｎ１７Ｃ－ＳｐｙＴａｇ－６Ｘ－Ｈｉｓ（配列番号３）、および６つのＷＴ α－ＨＬ（配列番号１）を有する１：６オリゴマー、精製α－ＨＬ－Ｎ１７Ｃ－ＳｐｙＴａｇ－６Ｘ－Ｈｉｓ（Ｇ１２４）モノマーとｈｉｓタグ切断ＷＴ α－ＨＬ（Ｇ１４７１）モノマーとを１：８（ｗ／ｗ）の比で混合した。脂質１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰｈＰＣ）を、脂質の最終濃度が５ｍｇ／ｍＬになるまで添加した。混合物を３７℃で一晩インキュベートした。脂質小胞を、５％（ｗ／ｖ）ｎ－オクチル－β－Ｄ－グルコシド（β－ＯＧ）を含有する緩衝液に可溶化した。オリゴマーを、２０ｍＭの酢酸ナトリウム（ＮａＡｃ）緩衝液、ｐＨ４．８、３０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＴｗｅｅｎ ２０、１ｍＭのトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）中、ＲＥＳＯＵＲＣＥ Ｓカラムでのカチオン交換クロマトグラフィーによって精製した。結合したタンパク質を、２０ｍＭのＮａＡｃ緩衝液、ｐＨ４．８、２ＭのＮａＣｌ、０．１％のＴｗｅｅｎ ２０、１ｍＭのトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）の直線勾配で溶出した。図１１に見られるように、２つの主要なピーク、ピーク１（Ｐ１）およびピーク２（Ｐ２）が得られた。ピーク１は０：７オリゴマーに対応し、ピーク２は１：６オリゴマーに対応した。
１つのα－ＨＬ－Ｎ１７Ｃ－ＳｐｙＴａｇ－６Ｘ－Ｈｉｓ（配列番号３）、および６つのＷＴ α－ＨＬ（配列番号１）を有する１：６オリゴマー、精製α－ＨＬ－Ｎ１７Ｃ－ＳｐｙＴａｇ－６Ｘ－Ｈｉｓ（Ｇ１２４）モノマーとｈｉｓタグ切断ＷＴ α－ＨＬ（Ｇ１４７１）モノマーとを１：８（ｗ／ｗ）の比で混合した。脂質１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰｈＰＣ）を、脂質の最終濃度が５ｍｇ／ｍＬになるまで添加した。混合物を３７℃で一晩インキュベートした。脂質小胞を、５％（ｗ／ｖ）ｎ－オクチル－β－Ｄ－グルコシド（β－ＯＧ）を含有する緩衝液に可溶化した。オリゴマーを、２０ｍＭの酢酸ナトリウム（ＮａＡｃ）緩衝液、ｐＨ４．８、３０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＴｗｅｅｎ ２０、１ｍＭのトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）中、ＲＥＳＯＵＲＣＥ Ｓカラムでのカチオン交換クロマトグラフィーによって精製した。結合したタンパク質を、２０ｍＭのＮａＡｃ緩衝液、ｐＨ４．８、２ＭのＮａＣｌ、０．１％のＴｗｅｅｎ ２０、１ｍＭのトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）の直線勾配で溶出した。図１１に見られるように、２つの主要なピーク、ピーク１（Ｐ１）およびピーク２（Ｐ２）が得られた。ピーク１は０：７オリゴマーに対応し、ピーク２は１：６オリゴマーに対応した。
【0080】
１：６オリゴマー（Ｐ２）は、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ－ＧＦＰタンパク質を添加し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲルを泳動することによって確認した。結果を図１２に示す。ピークＰ１は、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ－ＧＦＰとインキュベートした場合に電気泳動移動度シフトを示さず、０：７オリゴマーであることを示す。ピークＰ２は、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ－ＧＦＰとインキュベートした場合に電気泳動移動度シフトを示し、１：６オリゴマーであることを示す。
【0081】
Ｄ．１：６ポアと荷電ポリマーとの化学的コンジュゲーション
１：６オリゴマーを、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．０１％のＴｗｅｅｎ ２０中、１：１０（ｍｏｌ：ｍｏｌ）の比でポリマータグと混合し、続いて室温で４時間インキュベートした。コンジュゲートポアをＭａｇＳｔｒｅｐ「タイプ３」ＸＴビーズに結合させ、溶出緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．００１％のＴｗｅｅｎ ２０、８％（ｗ／ｖ）のトレハロース、２ｍＭのｄ－ビオチン）で溶出した。
１：６オリゴマーを、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．０１％のＴｗｅｅｎ ２０中、１：１０（ｍｏｌ：ｍｏｌ）の比でポリマータグと混合し、続いて室温で４時間インキュベートした。コンジュゲートポアをＭａｇＳｔｒｅｐ「タイプ３」ＸＴビーズに結合させ、溶出緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．００１％のＴｗｅｅｎ ２０、８％（ｗ／ｖ）のトレハロース、２ｍＭのｄ－ビオチン）で溶出した。
【0082】
Ｅ．単一チャネル記録
平面二重層を、「Ｍｏｎｔａｌ－Ｍｕｌｌｅｒ」アプローチによってポリテトラフルオロエチレン膜の約１００ｕｍの開口部にわたって形成した。このアプローチでは、開口部を最初に１０％ヘキサデカン／ペンタンの液滴で処理した。１０ｍｇ／ｍＬのＤＰｈＰＣ（１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロホスホコリン）ペンタン溶液の液滴（約５μＬ）を各チャンバーの緩衝溶液（２００ｍＭのＫＧｌｕ、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５）の上面に適用し、溶媒が蒸発するとすぐに脂質単層が生成され、次いで開口の両側で緩衝溶液上の脂質単層を上昇させることによって二重層を作製した。
平面二重層を、「Ｍｏｎｔａｌ－Ｍｕｌｌｅｒ」アプローチによってポリテトラフルオロエチレン膜の約１００ｕｍの開口部にわたって形成した。このアプローチでは、開口部を最初に１０％ヘキサデカン／ペンタンの液滴で処理した。１０ｍｇ／ｍＬのＤＰｈＰＣ（１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロホスホコリン）ペンタン溶液の液滴（約５μＬ）を各チャンバーの緩衝溶液（２００ｍＭのＫＧｌｕ、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５）の上面に適用し、溶媒が蒸発するとすぐに脂質単層が生成され、次いで開口の両側で緩衝溶液上の脂質単層を上昇させることによって二重層を作製した。
【0083】
一対のＡｇ／ＡｇＧｌｕ電極を準備した。接地電極をシス区画に接続し、作用電極をトランス側に接続した。精製した１：６オリゴマーをシス側に付加した。電流は、一対のＡｇ／ＡｇＧｌｕ電極を用いて検出し、ＨＵＭＭＳＩＬＥＮＣＥＲ技術（ＡＸＯＮ ＡＸＯＰＡＴＣＨ ２００Ｂ微小電極アンプ、Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を備えたパッチクランプアンプで増幅し、１ｋＨｚの折点周波数を有する低域通過型ベッセルフィルタ（８０ｄＢ／ディケード）でフィルタリングし、次いでＤＩＧＩＤＡＴＡ １２００Ａ／Ｄ変換器（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で５ｋＨｚのサンプリング周波数でデジタル化した。データサンプルをＰＣコンピュータのハードディスクに保存した。
【0084】
第１の捕捉事象のセットを、第１の末端でのみテザリングされた荷電ポリマーを用いて記録した。次いで、ストレプトアビジンを二重層のトランス側に流し、次いで追加の記録セットを生成した。結果を図１３に示す。変動する電流が２つのレベルで観察され、これはテザリングされたポリマーが２つの状態、すなわち１）チャネルに挿入され、２）チャネルから排出される状態を占有することを示唆している。ストレプトアビジンをトランス側に付加すると、２つのレベル間のコンダクタンスがより高くなった。これは、ポリマーの末端のビオチンがストレプトアビジンによって固定され、したがってポリマーが永久的にねじ込み位置に留まることを示している（図４）。
【0085】
次いで、様々な電圧で荷電ポリマーコンジュゲート化／ストレプトアビジン捕捉ナノポアについてコンダクタンスを測定し、荷電ポリマーを含まない同じポアと比較した。結果を図２に示す。図から分かるように、荷電ポリマーコンジュゲート化ポア（正方形のハッチマークを有する線）は、荷電ポリマーを含まない同じポアよりも一貫して大きなコンダクタンスレベルを有していた。
【0086】
Ｖ．参考文献
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２．Ｃｈｅｎ＆Ｌｉｕ、Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｓｏｌｉｄ－Ｓｔａｔｅ Ｎａｎｏｐｏｒｅｓ、２０１９年、Ｓｅｎｓｏｒｓ、第１９巻、第８号、Ｅ１８８６。
３．Ｆｅｎｇら、Ｎａｎｏｐｏｒｅ－ｂａｓｅｄ Ｆｏｕｒｔｈ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２０１５年、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ＆Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、第１３巻、第１号、４～１６頁。
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５．Ｈａｍｍｅｒｓｔｅｉｎら、Ｓｕｂｕｎｉｔ ｄｉｍｅｒｓ ｏｆα－ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ ｅｘｐａｎｄｅｓ ｔｈｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｔｏｏｌｂｏｘ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｎａｎｏｐｏｒｅｓ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２８６巻、第１６号、１４３２４頁～３４頁。
６．Ｈａｑｕｅら、Ｓｏｌｉｄ－Ｓｔａｔｅ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｎａｎｏｐｏｒｅ ｆｏｒ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ Ｓｅｎｓｉｎｇ ｏｆ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ＤＮＡ、Ｎａｎｏ Ｔｏｄａｙ（２０１３年２月）、第８巻、第１号、５６～７４頁。
７．Ｋｕｍａｒら、ＰＥＧ－ｌａｂｅｌｅｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｎａｎｏｐｏｒｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ｓｉｎｇｌｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、２０１２年、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ、第２巻、Ａｒｔ．６８４。
８．Ｌｅｅら、Ｒｅｃｅｎｔ ｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｉｎ ｓｏｌｉｄ－ｓｔａｔｅ ｎａｎｏｐｏｒｅｓ、２０１８年、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ、第３０巻、第４２号。
９．Ｍａｎｒａｏら、Ｒｅａｄｉｎｇ ＤＮＡ ａｔ ｓｉｎｇｌｅ－ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａ ｍｕｔａｎｔ ＭｓｐＡ ｎａｎｏｐｏｒｅ ａｎｄ ｐｈｉ２９ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、２０１２年、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第３０巻、３４９～５３頁。
１０．ＰａｖｌｅｎｏｋおよびＮｉｅｄｅｒｗｅｉｓ、Ｈｅｔｅｒｏ－ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ ＭｓｐＡ ｐｏｒｅｓ ｉｎ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ、２０１６、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ、第３６３巻、第７号、ｆｎｗ０４６。
１１．Ｗａｎｇら、Ｔｈｅ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｎａｎｏｐｏｒｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、２０１５年、Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、第５巻、Ａｒｔ．４４９（「Ｗａｎｇ Ｉ」）。
１２．Ｗａｎｇら、Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｎａｎｏｐｏｒｅｓ ｆｏｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｎｓｉｎｇ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ、２０１８年、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第５１巻、８０～８９頁（「Ｗａｎｇ ＩＩ」）。
１３．Ｗａｓｆｉら、Ｇｒａｐｈｅｎｅ－ｂａｓｅｄ ｎａｎｏｐｏｒｅ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｆｏｒ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：Ａ ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ ｒｅｖｉｅｗ、２０１８年、Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ ａｎｄ Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ、第１１９巻、１９１頁～２０３頁。
１．Ａｙｕｂら、Ｎｕｃｌｅｏｂａｓｅ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｂｙ Ｔｒｕｎｃａｔｅｄα－Ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ Ｐｏｒｅｓ、ＡＣＳ Ｎａｎｏ、２０１５、第９巻、第８号、７８９５～７９０３頁。
２．Ｃｈｅｎ＆Ｌｉｕ、Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｓｏｌｉｄ－Ｓｔａｔｅ Ｎａｎｏｐｏｒｅｓ、２０１９年、Ｓｅｎｓｏｒｓ、第１９巻、第８号、Ｅ１８８６。
３．Ｆｅｎｇら、Ｎａｎｏｐｏｒｅ－ｂａｓｅｄ Ｆｏｕｒｔｈ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２０１５年、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ＆Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、第１３巻、第１号、４～１６頁。
４．Ｇａｒｉら、Ｑｕｉｅｔ Ｏｕｔｅｒ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ（ＯｍｐＧ）Ｎａｎｏｐｏｒｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｓｅｎｓｉｎｇ、ＡＣＳ Ｓｅｎｓｏｒｓ、２０１９年４月１４日、第４巻、１２３０～３５頁。
５．Ｈａｍｍｅｒｓｔｅｉｎら、Ｓｕｂｕｎｉｔ ｄｉｍｅｒｓ ｏｆα－ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ ｅｘｐａｎｄｅｓ ｔｈｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｔｏｏｌｂｏｘ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｎａｎｏｐｏｒｅｓ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２８６巻、第１６号、１４３２４頁～３４頁。
６．Ｈａｑｕｅら、Ｓｏｌｉｄ－Ｓｔａｔｅ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｎａｎｏｐｏｒｅ ｆｏｒ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ Ｓｅｎｓｉｎｇ ｏｆ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ＤＮＡ、Ｎａｎｏ Ｔｏｄａｙ（２０１３年２月）、第８巻、第１号、５６～７４頁。
７．Ｋｕｍａｒら、ＰＥＧ－ｌａｂｅｌｅｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｎａｎｏｐｏｒｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ｓｉｎｇｌｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、２０１２年、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ、第２巻、Ａｒｔ．６８４。
８．Ｌｅｅら、Ｒｅｃｅｎｔ ｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｉｎ ｓｏｌｉｄ－ｓｔａｔｅ ｎａｎｏｐｏｒｅｓ、２０１８年、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ、第３０巻、第４２号。
９．Ｍａｎｒａｏら、Ｒｅａｄｉｎｇ ＤＮＡ ａｔ ｓｉｎｇｌｅ－ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａ ｍｕｔａｎｔ ＭｓｐＡ ｎａｎｏｐｏｒｅ ａｎｄ ｐｈｉ２９ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、２０１２年、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第３０巻、３４９～５３頁。
１０．ＰａｖｌｅｎｏｋおよびＮｉｅｄｅｒｗｅｉｓ、Ｈｅｔｅｒｏ－ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ ＭｓｐＡ ｐｏｒｅｓ ｉｎ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ、２０１６、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ、第３６３巻、第７号、ｆｎｗ０４６。
１１．Ｗａｎｇら、Ｔｈｅ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｎａｎｏｐｏｒｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、２０１５年、Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、第５巻、Ａｒｔ．４４９（「Ｗａｎｇ Ｉ」）。
１２．Ｗａｎｇら、Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｎａｎｏｐｏｒｅｓ ｆｏｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｎｓｉｎｇ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ、２０１８年、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第５１巻、８０～８９頁（「Ｗａｎｇ ＩＩ」）。
１３．Ｗａｓｆｉら、Ｇｒａｐｈｅｎｅ－ｂａｓｅｄ ｎａｎｏｐｏｒｅ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｆｏｒ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：Ａ ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ ｒｅｖｉｅｗ、２０１８年、Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ ａｎｄ Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ、第１１９巻、１９１頁～２０３頁。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図1E】
【図1F】
【図1G】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【配列表】
【国際調査報告】