特表 2024-526122 抗イヌＣＤ２０抗体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-07-17

(54)【発明の名称】抗イヌＣＤ２０抗体

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/28 20060101AFI20240709BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20240709BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240709BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20240709BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20240709BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240709BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240709BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20240709BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240709BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240709BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20240709BHJP

   A01K 67/0278 20240101ALN20240709BHJP

【ＦＩ】

C07K16/28 ZNA

C12N15/13

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12P21/08

A61K39/395 N

A61P35/00

A61P35/02

A01K67/0278

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023577850

(86)(22)【出願日】2022-06-17

(85)【翻訳文提出日】2024-02-09

(86)【国際出願番号】 GB2022051559

(87)【国際公開番号】W WO2022263864

(87)【国際公開日】2022-12-22

(31)【優先権主張番号】2108677.2

(32)【優先日】2021-06-17

(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB

(31)【優先権主張番号】2202635.5

(32)【優先日】2022-02-25

(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】522414327

【氏名又は名称】ペットメディックス・リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100118902

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 修

(74)【代理人】

【識別番号】100106208

【弁理士】

【氏名又は名称】宮前 徹

(74)【代理人】

【識別番号】100196508

【弁理士】

【氏名又は名称】松尾 淳一

(74)【代理人】

【識別番号】100135415

【弁理士】

【氏名又は名称】中濱 明子

(72)【発明者】

【氏名】ブラッドリー，アラン

(72)【発明者】

【氏名】ボーランド，ダニエル

(72)【発明者】

【氏名】ワン，ジュエシュエン

(72)【発明者】

【氏名】スタバニ，ラーチャ・ビージェイ

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG27

4B064CA19

4B064CC24

4B064CE12

4B064DA01

4B065AA01X

4B065AA57X

4B065AA72X

4B065AA88X

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA25

4B065CA44

4C085AA13

4C085AA14

4C085BB11

4C085DD62

4C085EE01

4C085GG02

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA70

4H045BA71

4H045BA72

4H045CA40

4H045DA76

4H045EA20

4H045FA74

4H045GA26

(57)【要約】

本開示は、イヌＣＤ２０に結合する抗体及びその抗原結合部分に関する。本開示はまた、イヌ対象におけるＢ細胞によって媒介される状態の治療のための組成物及び方法に関する。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

イヌＣＤ２０に結合する、単離されたイヌ抗体又はその抗原結合部分であって、前記抗体が、
ａ）配列番号２７を含むか若しくはそれからなるＨＣ ＣＤＲ１配列、又は配列番号２７と比較して１個若しくは２個のアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列、
ｂ）配列番号２８を含むか若しくはそれからなるＨＣ ＣＤＲ２配列、又は配列番号２８と比較して１個、２個、３個、若しくは４個のアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列、
ｃ）配列番号２９を含むか若しくはそれからなるＨＣ ＣＤＲ３配列、又は配列番号２９と比較して１個若しくは２個のアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列、
ｄ）配列番号３０を含むか若しくはそれからなるＬＣ ＣＤＲ１配列、又は配列番号３０と比較して１個のアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列、
ｅ）配列番号３１を含むか若しくはそれからなるＬＣ ＣＤＲ２配列、又は配列番号３１と比較して１個のアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列、及び
ｆ）配列番号３２を含むか若しくはそれからなるＬＣ ＣＤＲ３配列、又は配列番号３２と比較して１個若しくは２個のアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列を含む、抗体又はその抗原結合部分。

【請求項2】

前記抗体又はその抗原結合部分が、
ｉ）配列番号７を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ１配列、配列番号８を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ２配列、配列番号９を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ３配列、配列番号１０を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ１配列、配列番号１１を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ２配列、及び配列番号１２を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ３配列、
ｉｉ）配列番号１７を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ１配列、配列番号１８を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ２配列、配列番号１９を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ３配列、配列番号２０を含むＬＣ ＣＤＲ１配列、配列番号２１を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ２配列、及び配列番号２２を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ３配列、
ｉｉｉ）配列番号３７を含むＨＣ ＣＤＲ１配列、配列番号３８を含むＨＣ ＣＤＲ２配列、配列番号３９を含むＨＣ ＣＤＲ３配列、配列番号４０を含むＬＣ ＣＤＲ１配列、配列番号４１を含むＬＣ ＣＤＲ２配列、及び配列番号４２を含むＬＣ ＣＤＲ３配列、
ｉｖ）配列番号４７を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ１配列、配列番号４８を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ２配列、配列番号４９を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ３配列、配列番号５０を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ１配列、配列番号５１を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ２配列、及び配列番号５２を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ３配列、
ｖ）配列番号８２を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ１配列、配列番号８３を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ２配列、配列番号８４を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ３配列、配列番号８５を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ１配列、配列番号８６を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ２配列、及び配列番号８７を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ３配列、
ｖｉ）配列番号９２を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ１配列、配列番号９３を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ２配列、配列番号９４を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ３配列、配列番号９５を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ１配列、配列番号９６を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ２配列、及び配列番号９７を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ３配列、
ｖｉｉ）配列番号１０２を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ１配列、配列番号１０３を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ２配列、配列番号１０４を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ３配列、配列番号１０５を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ１配列、配列番号１０６を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ２配列、及び配列番号１０７を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ３配列、
ｖｉｉｉ）配列番号１１２を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ１配列、配列番号１１３を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ２配列、配列番号１１４を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ３配列、配列番号１１５を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ１配列、配列番号１１６を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ２配列、及び配列番号１１７を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ３配列、
ｉｘ）配列番号１２２を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ１配列、配列番号１２３を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ２配列、配列番号１２４を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ３配列、配列番号１２５を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ１配列、配列番号１２６を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ２配列、及び配列番号１２７を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ３配列、
ｘ）配列番号１３２を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ１配列、配列番号１３３を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ２配列、配列番号１３４を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ３配列、配列番号１３５を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ１配列、配列番号１３６を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ２配列、及び配列番号１３７を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ３配列、
ｘｉ）配列番号１４２を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ１配列、配列番号１４３を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ２配列、配列番号１４４を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ３配列、配列番号１４５を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ１配列、配列番号１４６を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ２配列、及び配列番号１４７を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ３配列、
ｘｉｉ）配列番号１５２を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ１配列、配列番号１５３を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ２配列、配列番号１５４を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ３配列、配列番号１５５を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ１配列、配列番号１５６を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ２配列、及び配列番号１５７を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ３配列、
ｘｉｉ）配列番号１６２を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ１配列、配列番号１６３を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ２配列、配列番号１６４を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ３配列、配列番号１６５を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ１配列、配列番号１６６を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ２配列、及び配列番号１６７を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ３配列、
ｘｉｉｉ）配列番号１７２を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ１配列、配列番号１７３を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ２配列、配列番号１７４を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ３配列、配列番号１７５を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ１配列、配列番号１７６を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ２配列、及び配列番号１７７を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ３配列、
ｘｉｖ）配列番号１８２を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ１配列、配列番号１８３を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ２配列、配列番号１８４を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ３配列、配列番号１８５を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ１配列、配列番号１８６を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ２配列、及び配列番号１８７を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ３配列、
ｘｖ）配列番号１９２を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ１配列、配列番号１９３を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ２配列、配列番号１９４を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ３配列、配列番号１９５を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ１配列、配列番号１９６を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ２配列、及び配列番号１９７を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ３配列、
ｘｖｉ）配列番号２０２を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ１配列、配列番号２０３を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ２配列、配列番号２０４を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ３配列、配列番号２０５を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ１配列、配列番号２０６を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ２配列、及び配列番号２０７を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ３配列、
ｘｖｉｉ）配列番号２１２を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ１配列、配列番号２１３を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ２配列、配列番号２１４を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ３配列、配列番号２１５を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ１配列、配列番号２１６を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ２配列、及び配列番号２１７を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ３配列、
ｘｖｉｉｉ）配列番号２２２を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ１配列、配列番号２２３を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ２配列、配列番号２２４を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ３配列、配列番号２２５を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ１配列、配列番号２２６を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ２配列、及び配列番号２２７を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ３配列、
ｘｉｘ）配列番号２３２を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ１配列、配列番号２３３を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ２配列、配列番号２３４を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ３配列、配列番号２３５を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ１配列、配列番号２３６を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ２配列、及び配列番号２３７を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ３配列を有する、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合部分。

【請求項3】

前記抗体又はその抗原結合部分が、配列番号２４を含むＨＣ可変領域配列、又はそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、若しくは９０％の配列同一性を有する配列、及び配列番号２６を含むＬＣ可変領域配列、又はそれに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、若しくは９５％の配列同一性を有する配列、例えば、配列番号５３、５４、５５、５６、５７、若しくは５８を含むＬＣ可変領域配列を含む、先行請求項に記載の抗体又はその抗原結合部分。

【請求項4】

前記抗体又はその抗原結合部分が、
ａ）配列番号４を含むＨＣ可変領域配列、及び配列番号６を含むＬＣ可変領域配列、
ｂ）配列番号１４を含むＨＣ可変領域配列、及び配列番号１６を含むＬＣ可変領域配列、
ｃ）配列番号３４を含むＨＣ可変領域配列、及び配列番号３６を含むＬＣ可変領域配列、
ｄ）配列番号４４を含むＨＣ可変領域配列、及び配列番号４６を含むＬＣ可変領域配列、
ｅ）配列番号７９を含むＨＣ可変領域配列、及び配列番号８１を含むＬＣ可変領域配列、若しくは配列番号２３８を含むＬＣ可変領域配列、
ｆ）配列番号８９を含むＨＣ可変領域配列、及び配列番号９１を含むＬＣ可変領域配列、若しくは配列番号２３９を含むＬＣ可変領域配列、
ｇ）配列番号９９を含むＨＣ可変領域配列、及び配列番号１０１を含むＬＣ可変領域配列、若しくは配列番号２４０を含むＬＣ可変領域配列、
ｈ）配列番号１０９を含むＨＣ可変領域配列、及び配列番号１１１を含むＬＣ可変領域配列、若しくは配列番号２４１を含むＬＣ可変領域配列、
ｉ）配列番号１１９を含むＨＣ可変領域配列、及び配列番号１２１を含むＬＣ可変領域配列、
ｊ）配列番号１２９を含むＨＣ可変領域配列、及び配列番号１３１を含むＬＣ可変領域配列、若しくは配列番号２４２を含むＬＣ可変領域配列、
ｋ）配列番号１３９を含むＨＣ可変領域配列、及び配列番号１４１を含むＬＣ可変領域配列、若しくは配列番号２４３を含むＬＣ可変領域配列、
ｌ）配列番号１４９を含むＨＣ可変領域配列、及び配列番号１５１を含むＬＣ可変領域配列、若しくは配列番号２４４を含むＬＣ可変領域配列、
ｍ）配列番号１５９を含むＨＣ可変領域配列、及び配列番号１６１を含むＬＣ可変領域配列、若しくは配列番号２４５を含むＬＣ可変領域配列、
ｎ）配列番号１６９を含むＨＣ可変領域配列、及び配列番号１７１を含むＬＣ可変領域配列、
ｏ）配列番号１７９を含むＨＣ可変領域配列、及び配列番号１８１を含むＬＣ可変領域配列、若しくは配列番号２４６を含むＬＣ可変領域配列、
ｐ）配列番号１８９を含むＨＣ可変領域配列、及び配列番号１９１を含むＬＣ可変領域配列、若しくは配列番号２４７を含むＬＣ可変領域配列、
ｑ）配列番号１９９を含むＨＣ可変領域配列、及び配列番号２０１を含むＬＣ可変領域配列 配列番号２４８を含むＬＣ可変領域配列、
ｒ）配列番号２０９を含むＨＣ可変領域配列、及び配列番号２１１を含むＬＣ可変領域配列 配列番号２４９を含むＬＣ可変領域配列、
ｓ）配列番号２１９を含むＨＣ可変領域配列、及び配列番号２２１を含むＬＣ可変領域配列、又は
ｔ）配列番号２２９を含むＨＣ可変領域配列、及び配列番号２３１を含むＬＣ可変領域配列 配列番号２５０を含むＬＣ可変領域配列を有する、請求項３に記載の抗体又はその抗原結合部分。

【請求項5】

前記その抗原結合部分が、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、重鎖又は単一ドメイン抗体である、先行請求項に記載の抗体又はその抗原結合部分。

【請求項6】

先行請求項に記載の抗体又はその抗原結合部分と競合するイヌＣＤ２０に結合する、単離されたイヌ抗体又はその抗原結合部分。

【請求項7】

前記抗体又はその抗原結合部分が、治療部分にコンジュゲートされる、先行請求項に記載の抗体又はその抗原結合部分。

【請求項8】

前記治療部分が、第２の抗体又はその抗原結合部分である、請求項７に記載の抗体又はその抗原結合部分。

【請求項9】

前記第２の抗体又はその抗原結合部分が、異なる標的に結合する、請求項８に記載の抗体又はその抗原結合部分。

【請求項10】

前記抗体又はその抗原結合部分が、半減期延長部分、標識、細胞毒素、リポソーム、ナノ粒子又は放射性同位体から選択される更なる部分にコンジュゲートされる、先行請求項に記載の抗体又はその抗原結合部分。

【請求項11】

前記抗体又はその抗原結合部分が、ａ－フコシル化されている、先行請求項に記載の抗体又はその抗原結合部分。

【請求項12】

先行請求項に記載の抗体又はその抗原結合部分を含む、医薬組成物。

【請求項13】

疾患の治療における使用のための、請求項１～１１のいずれか一項に記載の抗体若しくはその抗原結合部分、又は請求項１２に記載の医薬組成物。

【請求項14】

Ｂ細胞によって媒介される状態の治療を必要としているイヌ対象においてそれを行う方法であって、有効量の請求項１～１１のいずれか一項に記載の抗体若しくはその抗原結合部分、又は請求項１２に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。

【請求項15】

前記疾患が、Ｂ細胞によって媒介される疾患、例えば、Ｂ細胞リンパ腫、白血病、又は免疫媒介性疾患である、請求項１３に記載の抗体若しくはその抗原結合部分若しくは医薬組成物、又は請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

前記対象に、別の治療剤を別々に投与することを更に含む、請求項１３若しくは１５に記載の抗体若しくはその抗原結合部分若しくは医薬組成物、又は請求項１４若しくは１５に記載の方法。

【請求項17】

前記治療剤が、細胞毒性剤又は放射性毒性剤、免疫抑制剤又は免疫調節剤、例えば、サイトカイン又はケモカインである、請求項１６に記載の抗体若しくはその抗原結合部分若しくは医薬組成物、又は請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

請求項１～１１のいずれか一項に記載の抗体又はその抗体抗原結合部分をコードする、核酸配列。

【請求項19】

配列番号３、５、１３、１５、２３、２５、３３、３５、４３、４５、７８、８０、８８、９０、９８、１００、１０８、１１０、１１８、１２０、１２８、１３０、１３８、１４０、１４８、１５０、１５８、１６０、１６８、１７０、１７８、１８０、１８８、１９０、１９８、２００、２０８、２１０、２１８、２２０、２２８、２３０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、又は３０１から選択される配列を含む、請求項１８に記載の核酸配列。

【請求項20】

請求項１８又は１９に記載の核酸配列を含む、ベクター。

【請求項21】

請求項１８若しくは１９に記載の核酸配列、又は請求項２０に記載のベクターを含む、宿主細胞。

【請求項22】

請求項１～１１のいずれか一項に記載の抗体若しくはその抗原結合部分、又は請求項１２に記載の医薬組成物を含む、キット。

【請求項23】

前記抗体又はその抗原結合部分の検出のための試薬を更に含む、請求項２２に記載のキット。

【請求項24】

ＣＤ２０に結合するイヌ抗体を作製するための方法であって、請求項２１に記載の単離された宿主細胞を培養し、前記抗体を回収することを含む、方法。

【請求項25】

ＣＤ２０に結合するイヌ抗体を作製するための方法であって、
ａ）イヌ重鎖Ｖ遺伝子及びイヌ軽鎖Ｖ遺伝子を含む核酸構築物を発現するトランスジェニックマウスをＣＤ２０抗原で免疫化するステップと、
ｂ）前記マウスから抗体のライブラリを生成するステップと、
ｃ）前記ライブラリから抗体を単離するステップと、を含む、方法。

【請求項26】

イヌ対象からの生体試料中のＣＤ２０タンパク質又はＣＤ２０タンパク質の細胞外ドメインを検出するための方法であって、生体試料を、請求項１～１１のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合部分と接触させることを含み、前記抗体又はその抗原結合部分が、検出可能な標識に連結されている、方法。

【請求項27】

前記生体試料が、生検、組織、血液、血清、血漿、又はリンパ液試料である、請求項２６に記載の方法。

【請求項28】

腫瘍成長又は転移を阻害する方法であって、腫瘍細胞を、有効量の請求項１～１１のいずれか一項に記載の抗体若しくはその抗原結合部分、又は請求項１２に記載の医薬組成物と接触させることを含む、方法。

【請求項29】

ＣＤ２０を発現する腫瘍細胞を殺傷する方法であって、ＣＤ２０を発現する前記細胞の殺傷が生じるように、前記細胞を、請求項１～１１のいずれか一項に記載の抗体、又は請求項１２に記載の医薬組成物と接触させることを含む、方法。

【請求項30】

前記腫瘍細胞が、イヌ腫瘍細胞である、請求項２８に記載の方法。

【請求項31】

抗体又はその抗原結合部分であって、エピトープが、以下のアミノ残基ＥＮＬＮＬＩＫＡＰＭ（配列番号３０３、配列番号２におけるアミノ酸番号１５０～１５９）のうちの１つ以上のアミノ残基、例えば、１～１０個、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０個を含むか、又は以下のアミノ残基ＥＮＬＮＬＩＫＡＰＭ（配列番号３０３、配列番号２におけるアミノ酸番号１５０～１５９）からなる、抗体又はその抗原結合部分。

【請求項32】

以下のアミノ残基ＩＴＩＳＨＦＦＫＭＥＮＬＮＬＩＫＡＰＭ（配列番号３０２、配列番号２におけるアミノ酸番号１４１～１５９）のうちの１つ以上のアミノ残基、例えば１～１９個、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、若しくは１９個を含むか、又は以下のアミノ残基ＩＴＩＳＨＦＦＫＭＥＮＬＮＬＩＫＡＰＭ（配列番号３０２、配列番号２におけるアミノ酸番号１４１～１５９）からなるエピトープに結合する、請求項３１に記載の抗体又はその抗原結合部分。

【発明の詳細な説明】

【背景技術】

【0001】

イヌリンパ腫は、イヌにおいて診断される最も一般的ながんの１つであり、全てのがんのうちの約７～１４％を表す。ヒトと同様に、イヌリンパ腫には多くの異なる種類があり、急速に進行するがんから慢性疾患まで様々である。

【0002】

ＣＤ２０は、Ｂ細胞の増殖及び分化の制御に関与すると考えられる細胞表面タンパク質である。抗原は、４つの膜貫通スパニング領域を含み、正常及び悪性の両方のほぼ全てのＢ細胞の表面上に存在する。

【0003】

リツキシマブなどのヒトＣＤ２０を認識するヒト抗体は、過剰な数のＢ細胞、又は過活動若しくは機能不全Ｂ細胞によって特徴付けられるヒト疾患を治療するために使用される。これらの抗体はＢ細胞を破壊する。リツキシマブは、Ｂ細胞リンパ腫の治療における革命的な進歩とみなされている。

【0004】

２０年以上前にヒトに対するリツキシマブなどの抗体が開発されて以来、イヌＣＤ２０を認識する多数の抗体が文献に報告されている。しかしながら、現時点では、いずれも一般的な臨床使用ではない。したがって、異なる療法の必要性が依然として存在する。本発明は、この必要性に対処することを目的とする。

【発明の概要】

【0005】

第１の態様では、本発明は、イヌＣＤ２０に結合する、単離されたイヌ抗体又はその抗原結合部分に関し、当該抗体は、
ａ）配列番号２７を含むか若しくはそれからなるＨＣ ＣＤＲ１配列、又は配列番号２７と比較して１個若しくは２個のアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列、
ｂ）配列番号２８を含むか若しくはそれからなるＨＣ ＣＤＲ２配列、又は配列番号２８と比較して１個、２個、３個、若しくは４個のアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列、
ｃ）配列番号２９を含むか若しくはそれからなるＨＣ ＣＤＲ３配列、又は配列番号２９と比較して１個若しくは２個のアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列、
ｄ）配列番号３０を含むか若しくはそれからなるＬＣ ＣＤＲ１配列、又は配列番号３０と比較して１個のアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列、
ｅ）配列番号３１を含むか若しくはそれからなるＬＣ ＣＤＲ２配列、又は配列番号３１と比較して１個のアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列、及び
ｆ）配列番号３２を含むか若しくはそれからなるＬＣ ＣＤＲ３配列、又は配列番号３２と比較して１個若しくは２個のアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列を含む。

【0006】

本発明の別の態様又は第１の態様の実施形態では、抗体又はその抗原結合部分は、配列番号７を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ１配列、配列番号８を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ２配列、配列番号９を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ３配列、配列番号１０を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ１配列、配列番号１１を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ１配列、及び配列番号１２を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ１配列を有する。

【0007】

本発明の別の態様又は第１の態様の実施形態では、抗体は、配列番号１７を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ１配列、配列番号１８を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ２配列、配列番号１９を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ３配列、配列番号２０を含むＬＣ ＣＤＲ１配列、配列番号２１を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ２配列、及び配列番号２２を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ３配列を有する。

【0008】

本発明の別の態様又は第１の態様の実施形態では、抗体は、配列番号３７を含むＨＣ ＣＤＲ１配列、配列番号３８を含むＨＣ ＣＤＲ２配列、配列番号３９を含むＨＣ ＣＤＲ３配列、配列番号４０を含むＬＣ ＣＤＲ１配列、配列番号４１を含むＬＣ ＣＤＲ２配列、及び配列番号４２を含むＬＣ ＣＤＲ３配列を有する。

【0009】

本発明の別の態様又は第１の態様の実施形態では、抗体は、配列番号４７を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ１配列、配列番号４８を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ２配列、配列番号４９を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ３配列、配列番号５０を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ１配列、配列番号５１を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ２配列、及び配列番号５２を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ３配列を有する。

【0010】

本発明の別の態様又は第１の態様の実施形態では、抗体は、配列番号８２を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ１配列、配列番号８３を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ２配列、配列番号８４を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ３配列、配列番号８５を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ１配列、配列番号８６を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ２配列、及び配列番号８７を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ３配列を有する。

【0011】

本発明の別の態様又は第１の態様の実施形態では、抗体は、配列番号９２を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ１配列、配列番号９３を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ２配列、配列番号９４を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ３配列、配列番号９５を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ１配列、配列番号９６を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ２配列、及び配列番号９７を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ３配列を有する。

【0012】

本発明の別の態様又は第１の態様の実施形態では、抗体は、配列番号１０２を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ１配列、配列番号１０３を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ２配列、配列番号１０４を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ３配列、配列番号１０５を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ１配列、配列番号１０６を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ２配列、及び配列番号１０７を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ３配列を有する。

【0013】

本発明の別の態様又は第１の態様の実施形態では、抗体は、配列番号１１２を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ１配列、配列番号１１３を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ２配列、配列番号１１４を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ３配列、配列番号１１５を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ１配列、配列番号１１６を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ２配列、及び配列番号１１７を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ３配列を有する。

【0014】

本発明の別の態様又は第１の態様の実施形態では、抗体は、配列番号１２２を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ１配列、配列番号１２３を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ２配列、配列番号１２４を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ３配列、配列番号１２５を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ１配列、配列番号１２６を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ２配列、及び配列番号１２７を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ３配列を有する。

【0015】

本発明の別の態様又は第１の態様の実施形態では、抗体は、配列番号１３２を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ１配列、配列番号１３３を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ２配列、配列番号１３４を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ３配列、配列番号１３５を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ１配列、配列番号１３６を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ２配列、及び配列番号１３７を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ３配列を有する。

【0016】

本発明の別の態様又は第１の態様の実施形態では、抗体は、配列番号１４２を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ１配列、配列番号１４３を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ２配列、配列番号１４４を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ３配列、配列番号１４５を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ１配列、配列番号１４６を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ２配列、及び配列番号１４７を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ３配列を有する。

【0017】

本発明の別の態様又は第１の態様の実施形態では、抗体は、配列番号１５２を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ１配列、配列番号１５３を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ２配列、配列番号１５４を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ３配列、配列番号１５５を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ１配列、配列番号１５６を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ２配列、及び配列番号１５７を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ３配列を有する。

【0018】

本発明の別の態様又は第１の態様の実施形態では、抗体は、配列番号１６２を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ１配列、配列番号１６３を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ２配列、配列番号１６４を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ３配列、配列番号１６５を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ１配列、配列番号１６６を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ２配列、及び配列番号１６７を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ３配列を有する。

【0019】

本発明の別の態様又は第１の態様の実施形態では、抗体は、配列番号１７２を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ１配列、配列番号１７３を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ２配列、配列番号１７４を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ３配列、配列番号１７５を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ１配列、配列番号１７６を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ２配列、及び配列番号１７７を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ３配列を有する。

【0020】

本発明の別の態様又は第１の態様の実施形態では、抗体は、配列番号１８２を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ１配列、配列番号１８３を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ２配列、配列番号１８４を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ３配列、配列番号１８５を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ１配列、配列番号１８６を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ２配列、及び配列番号１８７を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ３配列を有する。

【0021】

本発明の別の態様又は第１の態様の実施形態では、抗体は、配列番号１９２を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ１配列、配列番号１９３を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ２配列、配列番号１９４を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ３配列、配列番号１９５を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ１配列、配列番号１９６を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ２配列、及び配列番号１９７を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ３配列を有する。

【0022】

本発明の別の態様又は第１の態様の実施形態では、抗体は、配列番号２０２を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ１配列、配列番号２０３を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ２配列、配列番号２０４を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ３配列、配列番号２０５を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ１配列、配列番号２０６を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ２配列、及び配列番号２０７を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ３配列を有する。

【0023】

本発明の別の態様又は第１の態様の実施形態では、当該抗体は、配列番号２１２を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ１配列、配列番号２１３を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ２配列、配列番号２１４を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ３配列、配列番号２１５を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ１配列、配列番号２１６を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ２配列、及び配列番号２１７を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ３配列を有する。

【0024】

本発明の別の態様又は第１の態様の実施形態では、抗体は、配列番号２２２を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ１配列、配列番号２２３を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ２配列、配列番号２２４を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ３配列、配列番号２２５を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ１配列、配列番号２２６を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ２配列、及び配列番号２２７を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ３配列を有する。

【0025】

本発明の別の態様又は第１の態様の実施形態では、抗体は、配列番号２３２を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ１配列、配列番号２３３を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ２配列、配列番号２３４を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ３配列、配列番号２３５を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ１配列、配列番号２３６を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ２配列、及び配列番号２３７を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ３配列を有する。

【0026】

一実施形態では、抗体又はその抗原結合部分は、配列番号２４を含むＨＣ可変領域配列、又はそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、若しくは９０％の配列同一性を有する配列、及び配列番号２６を含むＬＣ可変領域配列、又はそれに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、若しくは９５％の配列同一性を有する配列を含む。

【0027】

例えば、抗体又はその抗原結合部分は、
ａ）配列番号４を含むＨＣ可変領域配列、及び配列番号６を含むＬＣ可変領域配列、
ｂ）配列番号１４を含むＨＣ可変領域配列、及び配列番号１６を含むＬＣ可変領域配列、
ｃ）配列番号３４を含むＨＣ可変領域配列、及び配列番号３６を含むＬＣ可変領域配列、
ｄ）配列番号４４を含むＨＣ可変領域配列、及び配列番号４６を含むＬＣ可変領域配列、
ｅ）配列番号７９を含むＨＣ可変領域配列、及び配列番号８１を含むＬＣ可変領域配列、若しくは配列番号２３８を含むＬＣ可変領域配列、
ｆ）配列番号８９を含むＨＣ可変領域配列、及び配列番号９１を含むＬＣ可変領域配列、若しくは配列番号２３９を含むＬＣ可変領域配列、
ｇ）配列番号９９を含むＨＣ可変領域配列、及び配列番号１０１を含むＬＣ可変領域配列、若しくは配列番号２４０を含むＬＣ可変領域配列、
ｈ）配列番号１０９を含むＨＣ可変領域配列、及び配列番号１１１を含むＬＣ可変領域配列、若しくは配列番号２４１を含むＬＣ可変領域配列、
ｉ）配列番号１１９を含むＨＣ可変領域配列、及び配列番号１２１を含むＬＣ可変領域配列、
ｊ）配列番号１２９を含むＨＣ可変領域配列、及び配列番号１３１を含むＬＣ可変領域配列、若しくは配列番号２４２を含むＬＣ可変領域配列、
ｋ）配列番号１３９を含むＨＣ可変領域配列、及び配列番号１４１を含むＬＣ可変領域配列、若しくは配列番号２４３を含むＬＣ可変領域配列、
ｌ）配列番号１４９を含むＨＣ可変領域配列、及び配列番号１５１を含むＬＣ可変領域配列、若しくは配列番号２４４を含むＬＣ可変領域配列、
ｍ）配列番号１５９を含むＨＣ可変領域配列、及び配列番号１６１を含むＬＣ可変領域配列、若しくは配列番号２４５を含むＬＣ可変領域配列、
ｎ）配列番号１６９を含むＨＣ可変領域配列、及び配列番号１７１を含むＬＣ可変領域配列、
ｏ）配列番号１７９を含むＨＣ可変領域配列、及び配列番号１８１を含むＬＣ可変領域配列、若しくは配列番号２４６を含むＬＣ可変領域配列、
ｐ）配列番号１８９を含むＨＣ可変領域配列、及び配列番号１９１を含むＬＣ可変領域配列、若しくは配列番号２４７を含むＬＣ可変領域配列、
ｑ）配列番号１９９を含むＨＣ可変領域配列、及び配列番号２０１を含むＬＣ可変領域配列 配列番号２４８を含むＬＣ可変領域配列、
ｒ）配列番号２０９を含むＨＣ可変領域配列、及び配列番号２１１を含むＬＣ可変領域配列 配列番号２４９を含むＬＣ可変領域配列、
ｓ）配列番号２１９を含むＨＣ可変領域配列、及び配列番号２２１を含むＬＣ可変領域配列、又は
ｔ）配列番号２２９を含むＨＣ可変領域配列、及び配列番号２３１を含むＬＣ可変領域配列 配列番号２５０を含むＬＣ可変領域配列を有する。

【0028】

例えば、その抗原結合部分は、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、重鎖又は単一ドメイン抗体である。

【0029】

本発明はまた、上記の抗体又はその抗原結合部分と競合するイヌＣＤ２０に結合する、単離されたイヌ抗体又はその抗原結合部分に関する。

【0030】

例えば、抗体又はその抗原結合部分は、治療部分にコンジュゲートされる。

【0031】

例えば、治療部分は、第２の抗体又はその抗原結合部分である。

【0032】

例えば、第２の抗体又はその抗原結合部分は、異なる標的に結合する。

【0033】

例えば、抗体又はその抗原結合部分は、半減期延長部分、標識、細胞毒素、リポソーム、ナノ粒子又は放射性同位体から選択される更なる部分にコンジュゲートされる。

【0034】

例えば、当該抗体又はその抗原結合部分は、ａ－フコシル化されている。

【0035】

本発明はまた、上記の抗体又はその抗原結合部分を含む医薬組成物に関する。

【0036】

本発明は、Ｂ細胞によって媒介される状態の治療を必要としているイヌ対象においてそれを行う方法であって、有効量の上記の抗体若しくはその抗原結合部分、又は上記の医薬組成物を投与することを含む、方法に関する。

【0037】

例えば、Ｂ細胞によって媒介される状態は、Ｂ細胞リンパ腫又は白血病である。

【0038】

例えば、Ｂ細胞によって媒介される状態は、免疫媒介性疾患である。

【0039】

例えば、免疫媒介性疾患は、自己免疫疾患である。

【0040】

例えば、別の治療剤が対象に別々に投与され得る。

【0041】

例えば、治療剤は、細胞毒性剤又は放射性毒性剤である。

【0042】

例えば、治療剤は、免疫抑制剤である。

【0043】

例えば、治療剤は、サイトカイン又はケモカインなどの免疫調節剤である。

【0044】

本発明はまた、疾患の治療における使用のための、上記の抗体若しくは抗原結合部分、又は上記の医薬組成物に関する。

【0045】

例えば、疾患では、Ｂ細胞によって媒介される疾患である。

【0046】

例えば、Ｂ細胞によって媒介される疾患は、Ｂ細胞リンパ腫又は白血病である。

【0047】

例えば、Ｂ細胞によって媒介される疾患は、免疫媒介性疾患である。

【0048】

例えば、免疫媒介性疾患は、自己免疫疾患である。

【0049】

本発明はまた、腫瘍成長又は転移を阻害する方法であって、腫瘍細胞を、有効量の上記の抗体若しくはその抗原結合部分、又は上記の医薬組成物と接触させることを含む、方法に関する。

【0050】

本発明はまた、ＣＤ２０を発現する腫瘍細胞を殺傷する方法であって、ＣＤ２０を発現する細胞の殺傷が生じるように、細胞を、上記の抗体又は上記の医薬組成物と接触させることを含む、方法に関する。

【0051】

例えば、腫瘍細胞は、イヌ腫瘍細胞である。

【0052】

本発明はまた、上記の抗体又はその抗体抗原結合部分をコードする核酸配列に関する。

【0053】

例えば、核酸配列は、配列番号３、５、１３、１５、２３、２５、３３、３５、４３、４５、７８、８０、８８、９０、９８、１００、１０８、１１０、１１８、１２０、１２８、１３０、１３８、１４０、１４８、１５０、１５８、１６０、１６８、１７０、１７８、１８０、１８８、１９０、１９８、２００、２０８、２１０、２１８、２２０、２２８、２３０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、又は３０１から選択される配列を含む。

【0054】

本発明はまた、上記の核酸配列を含むベクターに関する。

【0055】

本発明はまた、上記の核酸配列、又は上記のもののベクターを含む、宿主細胞に関する。

【0056】

本発明はまた、上記の抗体若しくはその抗原結合部分、又は上記の医薬組成物を含む、キットに関する。

【0057】

例えば、抗体又はその抗原結合部分を検出するための試薬を更に含む。

【0058】

本発明はまた、ＣＤ２０に結合するイヌ抗体を作製するための方法であって、上記の単離された宿主細胞を培養し、当該抗体を回収することを含む、方法に関する。

【0059】

本発明はまた、ＣＤ２０に結合するイヌ抗体を作製するための方法であって、
ａ）イヌ重鎖Ｖ遺伝子及びイヌ軽鎖Ｖ遺伝子を含む核酸構築物を発現するトランスジェニックマウスをＣＤ２０抗原で免疫化するステップと、
ｂ）当該マウスから抗体のライブラリを生成するステップと、
ｃ）当該ライブラリから抗体を単離するステップと、を含む、方法に関する。

【0060】

本発明はまた、イヌ対象からの生体試料中のＣＤ２０タンパク質又はＣＤ２０タンパク質の細胞外ドメインを検出するための方法であって、生体試料を、上記の抗体又はその抗原結合部分と接触させることを含み、当該抗体又はその抗原結合部分が、検出可能な標識に連結されている、方法に関する。

【0061】

例えば、生体試料は、生検、組織、血液、血清、血漿、又はリンパ液試料である。

【0062】

本発明はまた、以下のアミノ残基ＥＮＬＮＬＩＫＡＰＭ（配列番号３０３、配列番号２におけるアミノ酸番号１５０～１５９）のうちの１つ以上のアミノ残基、例えば、１～１０個、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０個を含むか、又は以下のアミノ残基ＥＮＬＮＬＩＫＡＰＭ（配列番号３０３、配列番号２におけるアミノ酸番号１５０～１５９）からなるエピトープでイヌに結合する、抗体又はその抗原結合部分に関する。

【0063】

本発明は、以下の非限定的な図において更に記載される。

【図面の簡単な説明】

【0064】

【図1】イヌＣＤ２０免疫化Ｋｙ９マウスの抗体価。免疫化後の血清を連続希釈し（示されるように）、イヌＣＤ２０発現細胞に添加した。続いて、細胞をフルオロフォアコンジュゲート抗マウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ二次抗体とともにインキュベーションし、試料をフローサイトメーターで評価した。免疫化前の血清のイヌＣＤ２０発現細胞への結合を、プロット内の背景線として提示する。

【図2-1】（Ａ）ＰＭＸ００１、ＰＭＸ００２、ＰＭＸ００３、ＰＭＸ００４、及びＰＭＸ００５ ｍＡｂの可変領域のアミノ酸配列アライメント。シェーディングは、ｍＡｂの重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）配列の両方におけるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域を示す。（Ｂ）ｍＡｂのＨＣ及びＬＣ可変領域のアミノ酸配列アライメント。ボックスは、ｍＡｂの重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）配列の両方におけるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域を示す。

【図2-2】同上。

【図2-3】同上。

【図3-1】フローサイトメトリーを使用する抗イヌＣＤ２０ ｍＡｂの結合評価。ＰＭＸ００１、ＰＭＸ００２、ＰＭＸ００３、ＰＭＸ００４、ＰＭＸ００５、１Ｅ４－ｃＩＧＧＢ、４Ｅ１－７－ｃＩＧＧＢ（Ａを参照されたい）、及びＰＭＸ００６、ＰＭＸ００７、ＰＭＸ００８、ＰＭＸ００９、ＰＭＸ０１０、ＰＭＸ０１１（Ｂを参照されたい）、及びＰＭＸ００３、ＰＭＸ０６６、ＰＭＸ０６７、ＰＭＸ０６９、ＰＭＸ０７０、ＰＭＸ０７１、ＰＭＸ０７２、ＰＭＸ０７３、ＰＭＸ０７４、ＰＭＸ０７５、ＰＭＸ０７６、ＰＭＸ０７７、ＰＭＸ０７８、ＰＭＸ０７９、ＰＭＸ０８０、ＰＭＸ０８１、１Ｅ４－ｃＩＧＧＢ、４Ｅ１－７－ｃＩＧＧＢ（Ｃを参照されたい）を、１０μｇ／ｍｌにおけるｃＣＤ２０発現ＭＤＣＫ ＩＩ細胞に適用した。リツキシマブ－ｃＩＧＧＢ（灰色の陰影）をアイソタイプ対照として使用し、各プロット内に提示した。（Ｄ）ＰＭＸ００３、ＰＭＸ１１５、及びＰＭＸ０７０ ｍＡｂの親和性決定。１：２の連続的に希釈した抗体のｃＣＤ２０発現ＭＤＣＫ ＩＩ細胞への結合を結合アッセイにおいて評価し、フルオロフォアシグナルの平均値を決定した。平均蛍光強度（ＭＦＩ）対濃度のプロットは、非線形回帰を使用して結合のＥＣ５０を決定するために使用し、これは、細胞表面発現イヌＣＤ２０に結合する抗体の見かけのＫｄである。

【図3-2】同上。

【図3-3】同上。

【図3-4】同上。

【図3-5】同上。

【図4】抗イヌＣＤ２０抗体のＣＤＣ活性。ＣＤＣアッセイにおいて、天然及びａ－フコシル化フォーマットの抗体の両方を（示されるような）濃度の範囲で分析した。リツキシマブ－ｃＩＧＧＢキメラ抗体を「アイソタイプ対照」として使用した。「Ｆ」は、抗体のａ－フコシル化フォーマットを指す。

【図5-1】抗イヌＣＤ２０抗体のＡＤＣＣ活性。ＡＤＣＣアッセイにおいて、天然及びａ－フコシル化フォーマットの抗体の両方を（示されるような）濃度の範囲で分析した。リツキシマブ－ｃＩＧＧＢキメラ抗体を「アイソタイプ対照」として使用した。「Ｆ」は、抗体のａ－フコシル化フォーマットを指す。各抗体についてもＥＣ５０値を提示する。

【図5-2】同上。

【図6】全イヌ血液中の抗イヌＣＤ２０ ｍＡｂのＢ細胞枯渇効率。新たに採取したイヌの全血を培養培地で希釈し、１０μｇ／ｍｌのＰＭＸ００１、ＰＭＸ００３、１Ｅ４－ｃＩＧＧＢ、４Ｅ１－７－ｃＩＧＧＢ（Ａを参照されたい）、天然若しくはａ－フコシル化フォーマットのＰＭＸ００３及び４Ｅ１－７－ｃＩＧＧＢ抗体（Ｂを参照されたい）、ＰＭＸ００３、ＰＭＸ００６、ＰＭＸ００７、ＰＭＸ００８、ＰＭＸ００９、ＰＭＸ０１０、ＰＭＸ０１１（Ｃを参照されたい）とともに、又は抗体なしで２４時間インキュベーションした。リツキシマブ－ｃＩＧＧＢを「アイソタイプ対照」（Ｉｓｏ Ｃｔｒｌ）として使用した。「Ｆ」は、抗体のａ－フコシル化フォーマットを指す。

【図7-1】健康なビーグルにおける抗イヌＣＤ２０ ｍＡｂのＢ細胞枯渇効率。（Ａ～Ｂ）各試験群について３匹の健康なビーグルに、静脈内投与によって以下の抗体を与えた：アイソタイプ対照（リツキシマブ－ｃＩｇＧＢ、２．５ｍｇ／ｋｇ）、低用量のＰＭＸ００３（０．５ｍｇ／ｋｇ）、高用量のＰＭＸ００３（２．５ｍｇ／ｋｇ）、及び低用量のａ－フコシル化ＰＭＸ００３（０．５ｍｇ／ｋｇ）。「Ｆ」は、抗体のａ－フコシル化フォーマットを指す。リンパ球中のＣＤ２１＋Ｂ細胞（Ａ）及びＣＤ８＋Ｔ細胞（Ｂ）のパーセンテージを、０日目、１日目、２日目、５日目、７日目、１５日目、２７日目、及び４３日目にフローサイトメトリーを使用して分析した。ここに示されるデータは、４回の技術的反復の代表である。（Ｃ）各試験群について３匹の健康なビーグルに、静脈内投与によって以下の抗体を与えた：アイソタイプ対照（リツキシマブ－ｃＩｇＧＢ、２ｍｇ／ｋｇ）、低用量のＰＭＸ１１５（０．５ｍｇ／ｋｇ）、高用量のＰＭＸ１１５（２ｍｇ／ｋｇ）、低用量のＰＭＸ０７０（０．５ｍｇ／ｋｇ）、及び高用量のＰＭＸ０７０（２ｍｇ／ｋｇ）。リンパ球中のＣＤ２１＋Ｂ細胞のパーセンテージを、０日目、１日目、４日目、７日目、１４日目、２１日目、及び２８日目にフローサイトメトリーを使用して分析した。ここに示されるデータは、４回の技術的反復の代表である。

【図7-2】同上。

【図8】抗ＣＤ２０抗体についてのエピトープマッピング戦略。（Ａ）イヌＣＤ２０細胞外ドメイン配列を、ベクターＤＨ０１～ＤＨ０９内の等価位置でヒトＣＤ２０配列に変異させた。（Ｂ）イヌＣＤ２０細胞外ドメイン配列を、ベクターＤＭ０１～ＤＭ０９内の等価位置でマウスＣＤ２０配列に変異させた。（Ｃ）イヌＣＤ２０細胞外ドメインの小ループ内の全ての残基及び大ループ内の他の全ての残基をアラニンに変異させ、ベクターＳ０１～Ｓ０９及びＬ０１～Ｌ２５を生じさせた。変異した残基は太字でハイライトされる。

【図9】ＰＭＸ００３、ＰＭＸ１１５、及びＰＭＸ０７０ ｍＡｂの、イヌ－ヒトキメラＣＤ２０又はイヌ－マウスキメラＣＤ２０を発現するＭＤＣＫ細胞への結合を、フローサイトメトリーによって評価した。図中の０１～０９の黒い棒は、図８Ａに示されるＤＨ０１～ＤＨ０９配列への結合を表し、図中の０１～０９の灰色の棒は、図８Ｂに示されるＤＭ０１～ＤＭ０９配列への結合を表す。野生型イヌＣＤ２０を発現するＭＤＣＫ細胞を陽性対照として適用し、野生型ＭＤＣＫ細胞を陰性対照として使用した。

【発明を実施するための形態】

【0065】

表１．アミノ酸残基及び保存的アミノ酸置換の例
表２．配列
表３．ＶＨ及びＶＬ遺伝子の使用
表４．抗体についての機能データの概要
表５．抗体についての開発可能性プロファイル

【0066】

詳細な説明
これより、本発明の実施形態を更に記載する。以下の節では、異なる実施形態を記載する。そのように定義された各態様は、反対のことが明確に示されない限り、任意の他の態様又は態様と組み合わせることができる。

【0067】

一般に、本明細書に記載される細胞及び組織培養、病理学、腫瘍学、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、並びにタンパク質及び核酸の化学及びハイブリダイゼーションに関連して使用される命名法、及びそれらの技術は、当技術分野で周知であり、一般的に使用されるものである。別途示されない限り、本開示の方法及び技術は、一般に、当技術分野で周知の従来方法に従って実行され、本明細書全体を通じて引用され及び考察される様々な一般的及びより具体的な参照文献に記載されるように実行される。例えば、Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，４ｔｈ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２０１２）、Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｆｒｏｍ Ｂｅｎｃｈ ｔｏ Ｃｌｉｎｉｃ，Ｚｈｉｑｉａｎｇ Ａｎ（Ｅｄｉｔｏｒ），Ｗｉｌｅｙ，（２００９）、及びＡｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｖｏｌｓ １ ａｎｄ ２，Ｏｎｔｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｄｕｂｅｌ，ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ（２０１０）を参照されたい。

【0068】

酵素反応及び精製技術は、製造業者の仕様に従って、当技術分野で一般的に達成されるように、又は本明細書に記載されるように実行される。本明細書に記載される分析化学、合成有機化学、並びに医薬的及び薬学的化学に関連して使用される命名法、並びにそれらの実験室の手順及び技術は、当技術分野で周知であり、一般的に使用されるものである。標準的な技術は、化学合成、化学分析、薬学的調製、製剤、及び送達、並びに患者の治療に使用される。

【0069】

本発明者らは、イヌＣＤ２０に特異的に結合する完全イヌ抗体を開発している。これらの抗体は、イヌＶ、Ｄ、Ｊ遺伝子を発現するトランスジェニックげっ歯類において作製された。したがって、抗体は、イヌ化抗体又はキメラ抗体よりもイヌ対象への投与に対して免疫原性である可能性が低い。更に、これらの抗体がそれらの可変領域への更なる修飾なしに直接使用され得るため、親和性を低減させるか、又はそうでなければ抗体を損なうリスクはない。他の技術は、イヌ由来の抗体配列と別の種、典型的にはげっ歯類からの抗体配列のエクスビボでの組み合わせを通じて、開発又は有効性ライアビリティ（ｌｉａｂｉｌｉｔｉｅｓ）を導入するリスクがある。したがって、本発明は、イヌＣＤ２０に結合する、単離されたイヌ抗体又はその抗原結合部分に関する。

【0070】

本発明の抗体及びその抗原結合部分の特性は、本明細書に記載の治療方法及び使用、並びに医薬製剤において利用され得る。

【0071】

ＣＤ２０という用語は、Ｂリンパ球抗原ＣＤ２０を指す。抗体及びその抗原結合部分は、配列番号１（ヌクレオチド配列）及び配列番号２（アミノ酸配列）において定義される野生型イヌＣＤ２０に特異的に結合する。別途明記されない限り、本明細書で使用されるＣＤ２０という用語は、イヌＣＤ２０を指す。Ｂリンパ球抗原ＣＤ２０又はＣＤ２０は、全てのＢ細胞の表面上で発現され、プロＢ期（ＣＤ４５Ｒ＋、ＣＤ１１７＋）で始まり、成熟まで濃度が漸進的に上昇する。ヒト及びイヌでは、ＣＤ２０はＭＳ４Ａ１遺伝子によってコードされる。

【0072】

「ＣＤ２０結合分子／タンパク質／ポリペプチド／薬剤／部分」、「ＣＤ２０抗原結合分子分子／タンパク質／ポリペプチド／薬剤／部分」、「抗ＣＤ２０抗体」、「抗ＣＤ２０抗体又はその抗原結合部分」という用語は全て、イヌＣＤ２０抗原に特異的に結合することができる分子を指す。結合反応は、例えば、無関係の特異性の抗体を使用する陰性対照試験を参照して、標準的な方法によって示され得る。

【0073】

目的の抗原、すなわちイヌＣＤ２０に「結合する」又は「結合することができる」、本明細書に記載される多重特異性、例えば、二重特異性又は三重特異性の結合剤を含む本発明の抗体又はその抗原結合部分は、抗体又はその抗原結合部分が本明細書に記載の抗原ＣＤ２０を発現する細胞又は組織を標的とする際に治療剤として有用であるように十分な親和性で抗原に結合する、抗体又はその抗原結合部分である。

【0074】

本発明による抗体又はその抗原結合部分は、イヌＣＤ２０に特異的に結合する。言い換えれば、ＣＤ２０抗原への結合は、非特異的相互作用とは測定可能に異なる。特に、本明細書に記載される抗体は、マウスＣＤ２０と交差反応しない。

【0075】

本明細書で使用される特定のポリペプチド又は特定のポリペプチド標的上のエピトープに「特異的結合」又は「特異的に結合する」又は「特異的」であるという用語は、例えば、標的に対して少なくとも約１０^－６Ｍ、代替的には少なくとも約１０^－７Ｍ、代替的には少なくとも約１０^－８Ｍ、代替的には少なくとも約１０^－９Ｍ、代替的には少なくとも約１０^－１０Ｍ、代替的には少なくとも約１０^－１１Ｍ、代替的には少なくとも約１０^－１２Ｍ、又はそれ以下のＫＤを有する分子によって示され得る。一実施形態では、ＫＤは、少なくとも約１０^－８Ｍ～約１０^－９Ｍであり、例えば、一実施形態では、ＫＤは、ナノモル範囲にある。一実施形態では、「特異的結合」という用語は、分子が、任意の他のポリペプチド又はポリペプチドエピトープに実質的に結合することなく、特定のポリペプチド又は特定のポリペプチド上のエピトープに結合する結合を指す。ＫＤ及びＫ_Ｄという用語は、本明細書において互換的に使用される。

【0076】

本発明で使用される「抗体」という用語は、４つのポリペプチド鎖、２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖で構成される、任意の免疫グロブリン（Ｉｇ）分子若しくはその抗原結合部分、又はＩｇ分子の必須のエピトープ結合特徴を保持する、その任意の機能的断片、変異体、バリアント、若しくは誘導体を広く指す。

【0077】

全長抗体では、各重鎖は、重鎖可変領域又はドメイン（本明細書ではＨＣＶＲと略される）及び重鎖定常領域で構成される。重鎖定常領域は、３つのドメイン、Ｃ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２、及びＣ_Ｈ３で構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域又はドメイン（本明細書ではＬＣＶＲと略される）及び軽鎖定常領域で構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメインＣ_Ｌで構成される。

【0078】

重鎖及び軽鎖可変領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称される、より保存されている領域とともに散在した、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性の領域に更に細分化することができる。各重鎖及び軽鎖可変領域は、アミノ末端からカルボキシ末端へ、以下の順序で配置された３つのＣＤＲ及び４つのＦＲから構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。

【0079】

免疫グロブリン分子は、一般に、任意のアイソタイプ、クラス又はサブクラスのものであり得る。本発明の様々な態様によるＣ_Ｈ３ドメインは、イヌＩｇＧサブタイプ、例えば、ＩｇＧ－Ａ、ＩｇＧ－Ｂ、ＩｇＧ－Ｃ、及びＩｇＧ－ＤのＣ_Ｈ３ドメインである。

【0080】

イヌでは、Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤと称される４つのＩｇＧ重鎖が存在する。これらの重鎖は、ＩｇＧ－Ａ、ＩｇＧ－Ｂ、ＩｇＧ－Ｃ、及びＩｇＧ－Ｄと称される、イヌＩｇＧの４つの異なるサブクラスを表す。これらの４つの重鎖のＤＮＡ及びアミノ酸配列は、Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．（Ｖｅｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．８０：２５９－２７０（２００１））によって最初に特定された。これらの重鎖についてのアミノ酸及びＤＮＡ配列はまた、ＧｅｎＢａｎｋデータベースからも入手可能である（ＩｇＧＡ：受託番号ＡＡＬ３５３０１．１、ＩｇＧＢ：受託番号ＡＡＬ３５３０２．１、ＩｇＧＣ：受託番号ＡＡＬ３５３０３．１、ＩｇＧＤ：受託番号ＡＡＬ３５３０４．１）。イヌ抗体はまた、２つのタイプの軽鎖、カッパ及びラムダを含有する（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号カッパ軽鎖アミノ酸配列ＡＢＹ５７２８９．１、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢＹ５５５６９．１）。本明細書における抗体は、ラムダ又はカッパ軽鎖を有し得る。一実施形態では、軽鎖は、ラムダ軽鎖である。

【0081】

「ＣＤＲ」という用語は、抗体可変配列内の相補性決定領域を指す。重鎖及び軽鎖の可変領域の各々において、可変領域の各々について、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３と示される３つのＣＤＲが存在する。「ＣＤＲセット」という用語は、抗原に結合することができる単一の可変領域に生じる３つのＣＤＲの群を指す。これらのＣＤＲの正確な境界は、当技術分野で既知の異なるシステムに従って異なって定義され得る。

【0082】

Ｋａｂａｔ相補性決定領域（ＣＤＲ）は、配列の可変性に基づいており、最も一般的に使用される（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，（１９７１）Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１９０：３８２－３９１及びＫａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１－３２４２）。代わりに、Ｃｈｏｔｈｉａは、構造的ループの位置を指す（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７））。Ｋａｂａｔ番号付けシステムは、一般に、可変ドメイン内の残基（およそ、軽鎖の残基１～１０７及び重鎖の残基１～１１３）を指す場合に使用される。別のシステムは、ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）番号付けスキームである。ＩＭＧＴ番号付けスキームは、Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２９，１８５－２０３（２００５）に記載される。別途指定されない限り、ＩＭＧＴ番号付けスキームが本明細書で使用される。

【0083】

キメラ抗体は、１つの種、好ましくはげっ歯類又はヒト抗体に由来する抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む可変ドメインを含有する組換えタンパク質であり、一方、抗体分子の定常ドメインは、イヌ抗体の定常ドメインに由来する。

【0084】

本明細書で使用される場合、「イヌ化抗体」という用語は、イヌ及び非イヌ（例えば、マウス）抗体の両方からの配列を含有する組換え抗体の形態を指す。一般に、イヌ化抗体は、少なくとも１つ以上、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、超可変ループの全て又は実質的に全てが非イヌ免疫グロブリンのものに対応し、フレームワーク（ＦＲ）領域の全て又は実質的に全て（及び典型的には、残りのフレームの全て又は実質的に全て）がイヌ免疫グロブリン配列のものである。イヌ化抗体は、マウス又はヒト抗体からの３つの重鎖ＣＤＲ及び３つの軽鎖ＣＤＲＳの両方を、イヌフレーム又は修飾されたイヌフレームと一緒に含み得る。修飾されたイヌフレームは、例えば、その標的への結合を増加させるために、イヌ化抗体の有効性を更に最適化し得る１つ以上のアミノ酸変化を含む。例えば、超可変ループの非イヌ配列は、イヌ配列と更に比較され得、できるだけ多くの残基が本物のイヌ配列に類似するように変化され得る。

【0085】

対照的に、本発明の完全イヌ抗体は、イヌ可変領域を有し、別の種からの完全又は部分的なＣＤＲ又はＦＲを含まない。有利には、本明細書に記載の完全イヌ抗体は、イヌ免疫グロブリン配列を含むトランスジェニックマウスから得られている。これらの免疫化されたマウスにおいて産生された抗体は、インビボＶ（Ｄ）Ｊ組換え、インビボ接合多様化、重鎖及び軽鎖のインビボ対合、並びにインビボ超変異を含む天然親和性成熟を可能にするために、インビボＢ細胞シグナル伝達及び発達を通じて開発される。このようにして産生された完全イヌ抗体は、開発可能性のための最適な特性を有する抗体を生成し、大規模な産生前の長時間のリード最適化を最小限に抑える。有利には、そのような完全イヌ抗体は、患者動物に導入された場合に免疫原性の最も低い可能性のリスクを提示し、これにより、反復投薬レジームが容易になる。エクスビボでのｍＡｂ操作は、開発ライアビリティ、免疫原性、及び低減された親和性（上記で概説したように）を導入するリスクを冒すことを考慮すると、したがって、本発明の完全イヌ抗体は、臨床的文脈において有効な療法である可能性が最も高い。したがって、実施形態では、イヌ抗体という用語は、完全イヌ抗体を指す。

【0086】

本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、少量で存在し得る天然に存在する可能性のある変異及び／又は翻訳後修飾（例えば、異性化、アミド化、炭水化物付加）を除いて同一である。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原部位に対して指向している。典型的には異なる決定基（エピトープ）に対して指向した異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して指向している。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の免疫グロブリンによって汚染されないハイブリドーマ培養物によって合成されるという点で有利である。

【0087】

「抗原結合部位」という用語は、抗原に特異的に結合する領域を含む抗体又は抗体断片の部分を指す。抗原結合部位は、１つ以上の抗体可変ドメインによって提供され得る。抗原結合部位は、典型的には、抗体又は抗体断片の関連するＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ内に含まれる。

【0088】

「エピトープ」又は「抗原決定基」という用語は、免疫グロブリン、抗体又は抗体断片が特異的に結合する抗原の表面上の部位を指す。一般に、抗原は、いくつか又は多くの異なるエピトープを有し、多くの異なる抗体と反応する。この用語は、具体的には、直鎖状エピトープ及び立体配座エピトープを含む。タンパク質抗原内のエピトープは、タンパク質の三次的折り畳み（通常は、立体配座エピトープ）によって並置された隣接アミノ酸（通常は、直鎖状エピトープ）又は非隣接アミノ酸の両方から形成され得る。隣接アミノ酸から形成されるエピトープは、典型的には、常にではないが、変性溶媒への曝露時に保持されるのに対して、三次的折り畳みによって形成されるエピトープは、典型的には、変性溶媒での処理時に喪失される。エピトープは、典型的には、特有の空間立体配座内に、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５個のアミノ酸を含む。所与の抗体又は抗体断片によって結合されるエピトープを決定するための方法（すなわち、アラニンスキャニング変異誘発又はＰｅｐｓｃａｎによるエピトープマッピング）は、当技術分野で周知であり、例えば、免疫ブロット及び免疫沈降アッセイを含み、重複又は隣接ペプチドは、所与の抗体又は抗体断片との反応性について試験される。抗体は、２つの抗体が同一又は立体的に重複するエピトープを認識するとき、参照抗体と「本質的に同じエピトープ」に結合する。２つのエピトープが同一又は立体的に重複するエピトープに結合するかどうかを決定するための最も広く使用され、かつ迅速な方法は、競合アッセイであり、これは標識された抗原又は標識された抗体のいずれかを使用して、異なるフォーマットで構成され得る。

【0089】

一実施形態では、本明細書に記載の抗体又はその抗原結合部分は、以下のアミノ残基ＩＴＩＳＨＦＦＫＭＥＮＬＮＬＩＫＡＰＭ（配列番号３０２、配列番号２におけるアミノ酸番号１４１～１５９）のうちの１つ以上のアミノ残基、例えば１～１９個、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、若しくは１９個を含むか、又は以下のアミノ残基ＩＴＩＳＨＦＦＫＭＥＮＬＮＬＩＫＡＰＭ（配列番号３０２、配列番号２におけるアミノ酸番号１４１～１５９）からなるエピトープに結合する。一実施形態では、エピトープは、以下のアミノ残基ＥＮＬＮＬＩＫＡＰＭ（配列番号３０３、配列番号２におけるアミノ酸番号１５０～１５９）のうちの１つ以上のアミノ残基、例えば、１～１０個、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０個を含むか、又は以下のアミノ残基ＥＮＬＮＬＩＫＡＰＭ（配列番号３０３、配列番号２におけるアミノ酸番号１５０～１５９）からなる。

【0090】

一実施形態では、エピトープは、実施例に示されるような部位特異的変異誘発によって、例えば、アラニンスキャニングを使用して決定される。一実施形態では、エピトープは、直鎖状エピトープである。一実施形態では、エピトープは、立体配座エピトープである。一実施形態では、エピトープは、大ループ内に直鎖状エピトープを含む。一実施形態では、エピトープは、小ループ内に立体配座エピトープを更に含む。一実施形態では、抗体は、本明細書に記載のＰＭＸ００３若しくはその抗原結合部分、又は少なくとも８０％の配列同一性を有する抗体である。

【0091】

本発明の別の態様では、本発明はまた、以下のアミノ残基ＩＴＩＳＨＦＦＫＭＥＮＬＮＬＩＫＡＰＭ（配列番号３０２、配列番号２におけるアミノ酸番号１４１～１５９）のうちの１つ以上のアミノ残基、例えば１～１９個、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、若しくは１９個を含むか、又は以下のアミノ残基ＩＴＩＳＨＦＦＫＭＥＮＬＮＬＩＫＡＰＭ（配列番号３０２、配列番号２におけるアミノ酸番号１４１～１５９）からなるエピトープに結合する、抗体又はその抗原結合部分に関する。一実施形態では、エピトープは、以下のアミノ残基ＥＮＬＮＬＩＫＡＰＭ（配列番号３０３、配列番号２におけるアミノ酸番号１５０～１５９）のうちの１つ以上のアミノ残基、例えば、１～１０個、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０個を含むか、又は以下のアミノ残基ＥＮＬＮＬＩＫＡＰＭ（配列番号３０３、配列番号２におけるアミノ酸番号１５０～１５９）からなる。例えば、抗体又はその抗原結合部分は、本明細書に記載の配列を有し得る。

【0092】

本発明はまた、本明細書に記載の抗体又はその抗原結合部分と競合する抗体又はその抗原結合部分に関する。

【0093】

抗体のタンパク質分解消化は、Ｆｖ（断片可変）、Ｆａｂ（断片抗原結合）、及びＦｃ（断片結晶化）と称される異なる断片を放出する。Ｆｃ断片は、ジスルフィドによって一緒に保持される両方のＨ鎖のカルボキシ末端部分を含む。Ｆｃ断片の定常ドメインは、抗体のエフェクター機能を媒介することに関与する。

【0094】

本発明は、抗体の抗原結合部分又は抗原結合断片に及ぶ。「結合部分」及び「断片」という用語は、本明細書において互換的に使用される。抗体断片は、抗体、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、重鎖、軽鎖、可変重鎖（Ｖ_Ｈ）、可変軽鎖（Ｖ_Ｌ）ドメインなどの部分である。全長抗体の機能的断片は、全長抗体の標的特異性を保持する。したがって、組換え機能的抗体断片、例えば、Ｆａｂ（断片、抗体）、ｓｃＦｖ（一本鎖可変鎖断片）、及び単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）は、ｍＡｂに基づく治療薬に対して代替としての治療薬を開発するために使用されている。

【0095】

本発明はまた、本明細書に記載の配列を含む抗体模倣物にも及ぶ。

【0096】

「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び抗原結合部位を含有する最小限の抗体断片である。この断片は、密接な非共有性会合における、１つの重鎖可変領域ドメイン及び１つの軽鎖可変領域ドメインの二量体からなる。これらの２つのドメインの折り畳みから、抗原結合のためのアミノ酸残基に寄与し、抗体に抗原結合特異性を付与する６つの超可変ループ（Ｈ鎖及びＬ鎖から各々３つのループ）が発生する。しかしながら、単一可変ドメイン（又は抗原に対して特異的な３つのＨＶＲのみを含むＦｖの半分）であっても、結合部位全体よりも低い親和性にあるが、抗原を認識し、結合する能力を有する。

【0097】

「ｓＦｖ」又は「ｓｃＦｖ」とも略される「一本鎖Ｆｖ」は、単一のポリペプチド鎖に接続された２つの可変ドメイン、Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌからなる抗体断片ｓｃＦｖ断片（約２５ｋＤａ）である。自然に、Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌドメインは、疎水性相互作用を介して非共有結合的に会合し、解離する傾向がある。しかしながら、安定した断片は、ドメインを親水性可撓性リンカーと連結して一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を作製することによって操作することができる。

【0098】

最小の抗原結合断片は、単一の可変断片、すなわち、可変重鎖（Ｖ_Ｈ）又は可変軽鎖（Ｖ_Ｌ）ドメインである。Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌドメインはそれぞれ、抗原に結合することができる。それぞれ軽鎖／重鎖パートナーへの結合、又は実際には、完全な抗体の他の部分の存在は、標的結合に必要ではない。１つの単一ドメイン（Ｖ_Ｈ又はＶ_Ｌドメインに対応する）にサイズが低減された抗体の抗原結合実体は、一般に、「単一ドメイン抗体」又は「免疫グロブリン単一可変ドメイン」と称される。したがって、単一ドメイン抗体（約１２～１５ｋＤａ）は、Ｖ_Ｈ又はＶ_Ｌドメインのいずれかを有し、すなわち、それは完全な抗体の他の部分を有さない。「ドメイン抗体」に対する「ｄＡｂ」という用語は、一般に、抗原に特異的に結合する単一の免疫グロブリン可変ドメイン（Ｖ_Ｈ、Ｖ_ＨＨ、又はＶ_Ｌ）ポリペプチドを指す。

【0099】

「単離された」という用語は、その自然環境から単離される部分を指す。例えば、「単離された」という用語は、他の抗体、抗体又は抗体断片を実質的に含まない抗体又はその断片を指す。更に、単離された抗体は、他の細胞物質及び／又は化学物質を実質的に含み得ない。

【0100】

本明細書で使用される場合、「相同性」又は「同一性」という用語は、一般に、配列をアライメントした後、及びいくつかの実施形態では、必要に応じて、最大パーセントの相同性を達成するためにギャップを導入した後、配列同一性の一部として任意の保存的置換を考慮せずに、比較される参照ポリペプチドの残基と同一である配列中のアミノ酸残基のパーセンテージを指す。したがって、２つのアミノ酸配列間の相同性パーセントは、２つの配列間の同一性パーセントと等価である。Ｎ末端若しくはＣ末端の伸長、タグ、又は挿入のいずれも、同一性又は相同性を低減させると解釈されるべきではない。アライメントのための方法及びコンピュータプログラムは、周知である。２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、周知の数学的アルゴリズムを使用して決定することができる。

【0101】

本明細書における「アミノ酸」とは、特定の定義された位置に存在し得る２０個の天然に存在するアミノ酸又は任意の非天然類似体のうちの１つを意味する。アミノ酸は、天然に存在するアミノ酸及び合成アミノ酸の両方を包含する。ただし、ほとんどの場合、タンパク質が組換え的に産生される場合、天然に存在するアミノ酸のみが使用される。

【0102】

本明細書で使用される場合、本明細書に記載のヘテロ二量体タンパク質又はポリペプチドのアミノ酸配列（例えば、抗体）における別のアミノ酸残基による「アミノ酸残基の置換」は、別のアミノ酸残基による「アミノ酸残基を置き換えること」と等価であり、元の（例えば、野生型／生殖細胞系）アミノ酸配列における特定の位置での特定のアミノ酸残基が異なるアミノ酸残基によって置き換えられている（又は置換されている）ことを示す。これは、当業者に利用可能な標準的な技術、例えば、組換えＤＮＡ技術を使用して行うことができる。アミノ酸は、野生型（ｗｔ）における自然界に見出されるような天然の（野生型／生殖細胞系）配列と比較して変化するが、天然の配列と比較して他の変化を含有するＩｇＧ分子において作製され得る。本明細書における「野生型」又は「ＷＴ」又は「天然」とは、対立遺伝子変異を含む、自然界に見出されるアミノ酸配列又はヌクレオチド配列を意味する。ＷＴタンパク質、ポリペプチド、抗体、又は免疫グロブリンは、意図的に修飾されていないアミノ酸配列又はヌクレオチド配列を有する。

【0103】

本発明による抗体又はその抗原結合部分は、以下の特性のうちの１つ以上を有する。
ａ）イヌＣＤ２０に特異的に結合する、
ｂ）実施例で測定されるような、及び例えば図に示されるようなＫＤでイヌＣＤ２０に結合する、
ｃ）実施例で測定されるように、ＣＤ２０を発現するイヌリンパ腫細胞株における、ＣＤＣ及び／若しくはＡＤＣＣなどの細胞殺傷を示す、
ｄ）抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）を促進する、
ｅ）イヌ組織中のＣＤ２０陽性Ｂ細胞を効果的に枯渇させることができる、
ｆ）イヌＣＤ２０を発現する細胞に結合することができる、
ｇ）好適には、アポトーシスを介する直接細胞殺傷によって、イヌＣＤ２０を発現する細胞を枯渇させることができる、
ｈ）実施例に示されるように良好な安定性を提供する、
ｉ）以下のアミノ残基ＥＮＬＮＬＩＫＡＰＭ（配列番号３０３、配列番号２におけるアミノ酸番号１５０～１５９）、例えば、ＩＴＩＳＨＦＦＫＭＥＮＬＮＬＩＫＡＰＭ（配列番号３０２、配列番号２におけるアミノ酸番号１４１～１５９）のうちの１つ以上のアミノ残基、例えば、１～１０個、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０個を含むか、又は以下のアミノ残基ＥＮＬＮＬＩＫＡＰＭ（配列番号３０３、配列番号２におけるアミノ酸番号１５０～１５９）、例えば、ＩＴＩＳＨＦＦＫＭＥＮＬＮＬＩＫＡＰＭ（配列番号３０２、配列番号２におけるアミノ酸番号１４１～１５９）からなるエピトープに結合する、
ｊ）例えば、実施例に示されるように、ベンチマーク試験抗体１Ｅ４及び４Ｅ１－７よりも強いイヌＣＤ２０への結合能力（５～１０倍より高い）を有する、
ｋ）例えば、実施例及び表４に示されるように、ベンチマーク試験抗体１Ｅ４及び４Ｅ１－７よりも強いＡＤＣＣ及び／若しくはＣＤＣ活性を有する、並びに／あるいは
ｌ）例えば、示されるように、例えば、示されるように、ベンチマーク試験抗体１Ｅ４及び４Ｅ１－７ｍＡｂと比較して、全イヌ血液中のＢ細胞のより効率的な殺傷。

【0104】

一実施形態では、本発明による抗体又はその抗原結合部分は、上記の特性のうちの１つ以上、及び任意選択的に、以下の特性のうちの１つ以上を有する。
ａ）２０ｎＭ未満のＥＣ５０値を有するＣＤＣ活性を有する、
ｂ）０．３ｎＭ未満のＥＣ５０値を有するＡＤＣＣ活性を有する、
ｃ）１００ｕｇ／ｍｌ超の一過性発現収率を有する、
ｄ）５８℃超のＵｎｃｌｅによって決定されるＴｍ１を有する、
ｅ）約０．５ｍｇ／ｋｇ～２．５ｍｇ／ｋｇの用量でイヌにおけるインビボでの細胞殺傷を提供する、
ｆ）イヌにおけるインビボでのＢ細胞枯渇を低レベルで少なくとも１５日間維持する、及び／あるいは
ｇ）以下のアミノ残基ＥＮＬＮＬＩＫＡＰＭ（配列番号３０３、配列番号２におけるアミノ酸番号１５０～１５９）、例えば、ＩＴＩＳＨＦＦＫＭＥＮＬＮＬＩＫＡＰＭ（配列番号３０２、配列番号２におけるアミノ酸番号１４１～１５９）のうちの１つ以上のアミノ残基、例えば、１～１０個、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０個を含むか、又は以下のアミノ残基ＥＮＬＮＬＩＫＡＰＭ（配列番号３０３、配列番号２におけるアミノ酸番号１５０～１５９）、例えば、ＩＴＩＳＨＦＦＫＭＥＮＬＮＬＩＫＡＰＭ（配列番号３０２、配列番号２におけるアミノ酸番号１４１～１５９）からなるエピトープに結合する。

【0105】

これらの特性は、マウスモデル又はイヌにおけるインビボ研究を含む、実施例に開示される方法などの当技術分野で既知の方法によって測定することができる。

【0106】

特に、本発明者らは、抗体及びその抗原結合部分が、例えば、実施例で測定されるように、ＣＤ２０を発現するイヌリンパ腫細胞株における細胞殺傷によって実証されるような、ＣＤＣ及びＡＤＣＣ活性の両方を示すことを見出している。

【0107】

一態様では、本発明は、イヌＣＤ２０に結合する、単離されたイヌ抗体又はその抗原結合部分に関し、当該抗体は、
ａ）配列番号２７を含むか若しくはそれからなる重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ１配列、又はそれに対して少なくとも６０％、７０％、８０％、若しくは９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
ｂ）配列番号２８を含むか若しくはそれからなるＨＣ ＣＤＲ２配列、又はそれに対して少なくとも６０％、７０％、８０％、若しくは９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
ｃ）配列番号２９を含むか若しくはそれからなるＨＣ ＣＤＲ３配列、又はそれに対して少なくとも６０％、７０％、８０％、若しくは９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
ｄ）配列番号３０を含むか又はそれからなる軽鎖（ＬＣ）ＣＤＲ１配列それに対して少なくとも６０％、７０％、８０％、又は９０％の配列同一性、
ｅ）配列番号３１を含むか若しくはそれからなるＬＣ ＣＤＲ２配列、又はそれに対して少なくとも６０％、７０％、８０％、若しくは９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、及び
ｆ）配列番号３２を含むか若しくはそれからなるＬＣ ＣＤＲ３配列、又はそれに対して少なくとも６０％、７０％、８０％、若しくは９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0108】

本発明は、イヌＣＤ２０に結合する、単離されたイヌ抗体又はその抗原結合部分に関し、当該抗体は、
ａ）配列番号２７を含むか若しくはそれからなるＨＣ ＣＤＲ１配列
ｂ）配列番号２８を含むか若しくはそれからなるＨＣ ＣＤＲ２配列
ｃ）配列番号２９を含むか若しくはそれからなるＨＣ ＣＤＲ３配列
ｄ）配列番号３０を含むか若しくはそれからなるＬＣ ＣＤＲ１配列、
ｅ）配列番号３１を含むか若しくはそれからなるＬＣ ＣＤＲ２配列、及び
ｆ）配列番号３２を含むか若しくはそれからなるＬＣ ＣＤＲ３配列
又は上記のようなＣＤＲを有するが、上述されたＣＤＲ配列と比較して１個、２個、３個、若しくは４個のアミノ酸置換を有する１つ以上のＣＤＲを有する単離されたイヌ抗体若しくはその抗原結合部分を含む。

【0109】

したがって、本発明は、イヌＣＤ２０に結合する、単離されたイヌ抗体又はその抗原結合部分に関し、当該抗体は、
ａ）配列番号２７を含むか若しくはそれからなる重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ１配列、又は配列番号２７と比較して１個若しくは２個のアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列、
ｂ）配列番号２８を含むか若しくはそれからなるＨＣ ＣＤＲ２配列、又は配列番号２８と比較して１個、２個、３個、若しくは４個のアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列、
ｃ）配列番号２９を含むか若しくはそれからなるＨＣ ＣＤＲ３配列、又は配列番号２９と比較して１個若しくは２個のアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列、
ｄ）配列番号３０を含むか若しくはそれからなる軽鎖（ＬＣ）ＣＤＲ１配列、又は配列番号３０と比較して１個のアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列、
ｅ）配列番号３１を含むか若しくはそれからなるＬＣ ＣＤＲ２配列、又は配列番号３１と比較して１個のアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列、及び
ｆ）配列番号３２を含むか若しくはそれからなるＬＣ ＣＤＲ３配列、又は配列番号３２と比較して１個若しくは２個のアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列を含む。

【0110】

一実施形態では、抗体又はその抗原結合部分は、配列番号７を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ１配列、配列番号８を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ２配列、配列番号９を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ３配列、配列番号１０を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ１配列、配列番号１１を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ２配列、及び配列番号１２を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ３配列を有する。

【0111】

一実施形態では、抗体又はその抗原結合部分は、配列番号１７を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ１配列、配列番号１８を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ２配列、配列番号１９を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ３配列、配列番号２０を含むＬＣ ＣＤＲ１配列、配列番号２１を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ２配列、及び配列番号２２を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ３配列を有する。

【0112】

一実施形態では、抗体又はその抗原結合部分は、配列番号３７を含むＨＣ ＣＤＲ１配列、配列番号３８を含むＨＣ ＣＤＲ２配列、配列番号３９を含むＨＣ ＣＤＲ３配列、配列番号４０を含むＬＣ ＣＤＲ１配列、配列番号４１を含むＬＣ ＣＤＲ２配列、及び配列番号４２を含むＬＣ ＣＤＲ３配列を有する。

【0113】

一実施形態では、抗体又はその抗原結合部分は、配列番号４７を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ１配列、配列番号４８を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ２配列、配列番号４９を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ３配列、配列番号５０を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ１配列、配列番号５１を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ２配列、及び配列番号５２を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ３配列を有する。

【0114】

一実施形態では、抗体又はその抗原結合部分は、配列番号８２を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ１配列、配列番号８３を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ２配列、配列番号８４を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ３配列、配列番号８５を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ１配列、配列番号８６を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ２配列、及び配列番号８７を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ３配列を有する。

【0115】

一実施形態では、抗体又はその抗原結合部分は、配列番号９２を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ１配列、配列番号９３を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ２配列、配列番号９４を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ３配列、配列番号９５を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ１配列、配列番号９６を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ２配列、及び配列番号９７を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ３配列を有する。

【0116】

一実施形態では、抗体又はその抗原結合部分は、配列番号１０２を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ１配列、配列番号１０３を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ２配列、配列番号１０４を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ３配列、配列番号１０５を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ１配列、配列番号１０６を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ２配列、及び配列番号１０７を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ３配列を有する。

【0117】

一実施形態では、抗体又はその抗原結合部分は、配列番号１１２を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ１配列、配列番号１１３を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ２配列、配列番号１１４を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ３配列、配列番号１１５を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ１配列、配列番号１１６を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ２配列、及び配列番号１１７を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ３配列を有する。

【0118】

一実施形態では、抗体又はその抗原結合部分は、配列番号１２２を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ１配列、配列番号１２３を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ２配列、配列番号１２４を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ３配列、配列番号１２５を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ１配列、配列番号１２６を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ２配列、及び配列番号１２７を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ３配列を有する。

【0119】

一実施形態では、抗体又はその抗原結合部分は、配列番号１３２を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ１配列、配列番号１３３を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ２配列、配列番号１３４を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ３配列、配列番号１３５を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ１配列、配列番号１３６を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ２配列、及び配列番号１３７を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ３配列を有する。

【0120】

一実施形態では、抗体又はその抗原結合部分は、配列番号１４２を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ１配列、配列番号１４３を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ２配列、配列番号１４４を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ３配列、配列番号１４５を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ１配列、配列番号１４６を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ２配列、及び配列番号１４７を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ３配列を有する。

【0121】

一実施形態では、抗体又はその抗原結合部分は、配列番号１５２を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ１配列、配列番号１５３を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ２配列、配列番号１５４を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ３配列、配列番号１５５を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ１配列、配列番号１５６を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ２配列、及び配列番号１５７を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ３配列を有する。

【0122】

一実施形態では、抗体又はその抗原結合部分は、配列番号１６２を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ１配列、配列番号１６３を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ２配列、配列番号１６４を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ３配列、配列番号１６５を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ１配列、配列番号１６６を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ２配列、及び配列番号１６７を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ３配列を有する。

【0123】

一実施形態では、抗体又はその抗原結合部分は、配列番号１７２を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ１配列、配列番号１７３を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ２配列、配列番号１７４を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ３配列、配列番号１７５を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ１配列、配列番号１７６を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ２配列、及び配列番号１７７を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ３配列を有する。

【0124】

一実施形態では、抗体又はその抗原結合部分は、配列番号１８２を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ１配列、配列番号１８３を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ２配列、配列番号１８４を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ３配列、配列番号１８５を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ１配列、配列番号１８６を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ２配列、及び配列番号１８７を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ３配列を有する。

【0125】

一実施形態では、抗体又はその抗原結合部分は、配列番号１９２を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ１配列、配列番号１９３を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ２配列、配列番号１９４を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ３配列、配列番号１９５を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ１配列、配列番号１９６を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ２配列、及び配列番号１９７を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ３配列を有する。

【0126】

一実施形態では、抗体又はその抗原結合部分 配列番号２０２を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ１配列、配列番号２０３を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ２配列、配列番号２０４を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ３配列、配列番号２０５を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ１配列、配列番号２０６を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ２配列、及び配列番号２０７を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ３配列。

【0127】

一実施形態では、抗体又はその抗原結合部分は、配列番号２１２を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ１配列、配列番号２１３を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ２配列、配列番号２１４を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ３配列、配列番号２１５を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ１配列、配列番号２１６を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ２配列、及び配列番号２１７を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ３配列を有する。

【0128】

一実施形態では、抗体又はその抗原結合部分は、配列番号２２２を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ１配列、配列番号２２３を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ２配列、配列番号２２４を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ３配列、配列番号２２５を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ１配列、配列番号２２６を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ２配列、及び配列番号２２７を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ３配列を有する。

【0129】

一実施形態では、抗体又はその抗原結合部分は、配列番号２３２を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ１配列、配列番号２３３を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ２配列、配列番号２３４を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ３配列、配列番号２３５を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ１配列、配列番号２３６を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ２配列、及び配列番号２３７を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ３配列を有する。

【0130】

一実施形態では、抗体又はその抗原結合部分は、配列番号２４を含む重鎖（ＨＣ）可変領域配列、又はそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、若しくは９０％の配列同一性を有する配列、及び配列番号２６を含む軽鎖（ＬＣ）可変領域配列、又はそれに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、若しくは９５％の配列同一性を有する配列を含む。一実施形態では、抗体又はその抗原結合部分は、配列番号２４を含む重鎖（ＨＣ）可変領域配列、及び配列番号２６を含む軽鎖（ＬＣ）可変領域配列、又は配列番号２６を含むＬＣ可変領域配列を含み、ＬＣ可変領域のＦＲ１におけるＮＶＴ配列は修飾されており、例えば、ＦＲ１における１個、２個、又は３個のアミノ酸修飾を有するＬＣ可変領域、例えば、以下に記載の配列番号６０、６１、６２、６３、６４、若しくは６５を有するＦＲ１を含むＬＣ可変領域配列、又は配列番号５３、５４、５５、５６、５７、若しくは５８を含むＬＣ可変領域配列である。

【0131】

例えば、抗体又はその抗原結合部分は、
ａ）配列番号４を含むか若しくはそれからなるＨＣ可変領域配列、及び配列番号６を含むか若しくはそれからなるＬＣ可変領域配列、
ｂ）配列番号１４を含むか若しくはそれからなるＨＣ可変領域配列、及び配列番号１６を含むか若しくはそれからなるＬＣ可変領域配列、
ｃ）配列番号３４を含むＨＣ可変領域配列、及び配列番号３６を含むか若しくはそれからなるＬＣ可変領域配列、
ｄ）配列番号４４を含むか若しくはそれからなるＨＣ可変領域配列、及び配列番号４６を含むか若しくはそれからなるＬＣ可変領域配列、
ｅ）配列番号７９を含むＨＣ可変領域配列、及び配列番号８１を含むＬＣ可変領域配列、若しくは以下に記載のＮＶＴ配列が修飾されているＬＣ可変領域配列、例えば、配列番号２３８を含むＬＣ可変領域配列、
ｆ）配列番号８９を含むＨＣ可変領域配列、及び配列番号９１を含むＬＣ可変領域配列、若しくは以下に記載のＮＶＴ配列が修飾されているＬＣ可変領域配列、例えば、配列番号２３９を含むＬＣ可変領域配列、
ｇ）配列番号９９を含むＨＣ可変領域配列、及び配列番号１０１を含むＬＣ可変領域配列、若しくは以下に記載のＮＶＴ配列が修飾されているＬＣ可変領域配列、例えば、配列番号２４０を含むＬＣ可変領域配列、
ｈ）配列番号１０９を含むＨＣ可変領域配列、及び配列番号１１１を含むＬＣ可変領域配列、若しくは以下に記載のＮＶＴ配列が修飾されているＬＣ可変領域配列、例えば、配列番号２４１を含むＬＣ可変領域配列、
ｉ）配列番号１１９を含むＨＣ可変領域配列、及び配列番号１２１を含むＬＣ可変領域配列、
ｊ）配列番号１２９を含むＨＣ可変領域配列、及び配列番号１３１を含むＬＣ可変領域配列、若しくは以下に記載のＮＶＴ配列が修飾されているＬＣ可変領域配列、例えば、配列番号２４２を含むＬＣ可変領域配列、
ｋ）配列番号１３９を含むＨＣ可変領域配列、及び配列番号１４１を含むＬＣ可変領域配列、若しくは以下に記載のＮＶＴ配列が修飾されているＬＣ可変領域配列、例えば、配列番号２４３を含むＬＣ可変領域配列、
ｌ）配列番号１４９を含むＨＣ可変領域配列、及び配列番号１５１を含むＬＣ可変領域配列、若しくは以下に記載のＮＶＴ配列が修飾されているＬＣ可変領域配列、例えば、配列番号２４４を含むＬＣ可変領域配列、
ｍ）配列番号１５９を含むＨＣ可変領域配列、及び配列番号１６１を含むＬＣ可変領域配列、若しくは以下に記載のＮＶＴ配列が修飾されているＬＣ可変領域配列、例えば、配列番号２４５を含むＬＣ可変領域配列、
ｎ）配列番号１６９を含むＨＣ可変領域配列、及び配列番号１７１を含むＬＣ可変領域配列、
ｏ）配列番号１７９を含むＨＣ可変領域配列、及び配列番号１８１を含むＬＣ可変領域配列、若しくは以下に記載のＮＶＴ配列が修飾されているＬＣ可変領域配列、例えば、配列番号２４６を含むＬＣ可変領域配列、
ｐ）配列番号１８９を含むＨＣ可変領域配列、及び配列番号１９１を含むＬＣ可変領域配列、若しくは以下に記載のＮＶＴ配列が修飾されているＬＣ可変領域配列、例えば、配列番号２４７を含むＬＣ可変領域配列、
ｑ）配列番号１９９を含むＨＣ可変領域配列、及び配列番号２０１を含むＬＣ可変領域配列、若しくは以下に記載のＮＶＴ配列が修飾されているＬＣ可変領域配列、例えば、配列番号２４８を含むＬＣ可変領域配列、
ｒ）配列番号２０９を含むＨＣ可変領域配列、及び配列番号２１１を含むＬＣ可変領域配列、若しくは以下に記載のＮＶＴ配列が修飾されているＬＣ可変領域配列、例えば、配列番号２４９を含むＬＣ可変領域配列、
ｓ）配列番号２１９を含むＨＣ可変領域配列、及び配列番号２２１を含むＬＣ可変領域配列、又は
ｔ）配列番号２２９を含むＨＣ可変領域配列、及び配列番号２３１を含むＬＣ可変領域配列、若しくは以下に記載のＮＶＴ配列が修飾されているＬＣ可変領域配列、例えば、配列番号２５０を含むＬＣ可変領域配列を有する。

【0132】

一実施形態では、その抗原結合部分は、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、重鎖、軽鎖、可変重（Ｖ_Ｈ）ドメイン、又は可変軽（Ｖ_Ｌ）である。

【0133】

別の実施形態では、抗体又は抗原結合部分は、配列番号２７を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ１配列、配列番号２８を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ２配列、配列番号２９を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ３配列、配列番号３０を含むか又はそれからなるＬＣＤＲ１配列、配列番号３１を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ２配列、及び配列番号３２を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ３配列を含む。抗体又は抗原結合部分は、生殖細胞系配列（配列番号７４）と比較して、重鎖可変配列に５個のアミノ酸変化を有するフレームワーク領域、及び軽鎖可変配列（配列番号７６）に１個のアミノ酸変化を有するフレームワーク領域を有する。

【0134】

一実施形態では、抗体又はその抗原結合部分は、配列番号７を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ１配列、配列番号８を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ２配列、配列番号９を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ３配列、配列番号１０を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ１配列、配列番号１１を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ２配列、及び配列番号１２を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ３配列を有する。抗体又は抗原結合部分は、生殖細胞系配列（配列番号７４）と比較して、重鎖可変配列に２個のアミノ酸変化を有するフレームワーク領域、及び生殖細胞系配列（配列番号７６）と比較して軽鎖可変配列に３個のアミノ酸変化を有するフレームワーク領域を有する。

【0135】

一実施形態では、抗体又はその抗原結合部分は、配列番号１７を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ１配列、配列番号１８を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ２配列、配列番号１９を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ３配列、配列番号２０を含むＬＣ ＣＤＲ１配列、配列番号２１を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ２配列、及び配列番号２２を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ３配列を有する。抗体又は抗原結合部分は、生殖細胞系配列（配列番号７４）と比較して、重鎖可変配列に１０個のアミノ酸変化を有するフレームワーク領域、及び軽鎖可変配列（配列番号７６）にアミノ酸変化を有さないフレームワーク領域を有する。

【0136】

一実施形態では、抗体又はその抗原結合部分は、配列番号３７を含むＨＣ ＣＤＲ１配列、配列番号３８を含むＨＣ ＣＤＲ２配列、配列番号３９を含むＨＣ ＣＤＲ３配列、配列番号４０を含むＬＣ ＣＤＲ１配列、配列番号４１を含むＬＣ ＣＤＲ２配列、及び配列番号４２を含むＬＣ ＣＤＲ３配列を有する。抗体又は抗原結合部分は、生殖細胞系配列（配列番号７４）と比較して、重鎖可変配列に１２個のアミノ酸変化を有するフレームワーク領域、及び軽鎖可変配列（配列番号７６）にアミノ酸変化を有さないフレームワーク領域を有する。

【0137】

一実施形態では、抗体又はその抗原結合部分は、配列番号４７を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ１配列、配列番号４８を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ２配列、配列番号４９を含むか又はそれからなるＨＣ ＣＤＲ３配列、配列番号５０を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ１配列、配列番号５１を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ２配列、及び配列番号５２を含むか又はそれからなるＬＣ ＣＤＲ３配列を有する。抗体又は抗原結合部分は、生殖細胞系配列（配列番号７４）と比較して、重鎖可変配列に４個のアミノ酸変化を有するフレームワーク領域、及び軽鎖可変配列（配列番号７６）にアミノ酸変化を有さないフレームワーク領域を有する。

【0138】

実施形態では、抗体又は抗原結合部分は、生殖細胞系配列（配列番号７４）と比較して、重鎖可変配列に１～１０個のアミノ酸変化を有するフレームワーク領域を有する。例えば、抗体又は抗原結合部分は、生殖細胞系配列（配列番号７４）と比較して、重鎖可変配列に１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸変化を有し得るフレームワーク領域を有する。実施形態では、抗体又は抗原結合部分は、生殖細胞系配列（配列番号７６）と比較して、軽鎖可変配列に１～１０個のアミノ酸変化を有するフレームワーク領域を有する。例えば、抗体又は抗原結合部分は、生殖細胞系配列（配列番号７６）と比較して、軽鎖可変配列に１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸変化を有し得るフレームワーク領域を有する。

【0139】

本発明はまた、イヌＣＤ２０に結合する、単離されたイヌ抗体又はその抗原結合部分に関し、当該抗体は、
ａ）配列番号１１２を含むか若しくはそれからなるＨＣ ＣＤＲ１配列、又は配列番号１１２と比較して１個、２個、若しくは３個のアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列、
ｂ）配列番号１１３を含むか若しくはそれからなるＨＣ ＣＤＲ２配列、又は配列番号１１３と比較して１個、２個、３個、４個、若しくは５個のアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列、
ｃ）配列番号１１４を含むか若しくはそれからなるＨＣ ＣＤＲ３配列、又は配列番号１１４と比較して１個、２個、若しくは３個のアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列、
ｄ）配列番号１１５を含むか若しくはそれからなるＬＣ ＣＤＲ１配列、又は配列番号１２４と比較して１個のアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列、
ｅ）配列番号１１６を含むか若しくはそれからなるＬＣ ＣＤＲ２配列、又は配列番号１１６と比較して１個若しくは２個のアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列、及び
ｆ）配列番号１１７を含むか若しくはそれからなるＬＣ ＣＤＲ３配列、又は配列番号１１７と比較して１個若しくは２個のアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列を含む。

【0140】

本発明はまた、イヌＣＤ２０に結合する、単離されたイヌ抗体又はその抗原結合部分に関し、当該抗体は、
ａ）配列番号１２２を含むか若しくはそれからなるＨＣ ＣＤＲ１配列、又は配列番号１２２と比較して１個、２個、若しくは３個のアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列、
ｂ）配列番号１２３を含むか若しくはそれからなるＨＣ ＣＤＲ２配列、又は配列番号１２３と比較して１個、２個、３個、若しくは４個のアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列、
ｃ）配列番号１２４を含むか若しくはそれからなるＨＣ ＣＤＲ３配列、又は配列番号１２４と比較して１個、２個、３個、若しくは４個のアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列、
ｄ）配列番号１２５を含むか若しくはそれからなるＬＣ ＣＤＲ１配列、又は配列番号１２５と比較して１個のアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列、
ｅ）配列番号１２６を含むか若しくはそれからなるＬＣ ＣＤＲ２配列、又は配列番号１２６と比較して１個のアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列、及び
ｆ）配列番号１２７を含むか若しくはそれからなるＬＣ ＣＤＲ３配列、又は配列番号１２７と比較して１個、２個、若しくは３個のアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列を含む。

【0141】

本明細書で使用されるアミノ酸変化は、アミノ酸置換、付加、又は欠失から選択される。一実施形態では、アミノ酸変化は、アミノ酸置換である。

【0142】

一実施形態では、抗体は、実施例及び配列情報に示されるように、ＰＭＸ００１、ＰＭＸ００２、ＰＭＸ００３、ＰＭＸ００４、ＰＭＸ００５、ＰＭＸ００６、ＰＭＸ００７、ＰＭＸ００８、ＰＭＸ００９、ＰＭＸ０１０、ＰＭＸ０１１、ＰＭＸ０６６、ＰＭＸ０６７、ＰＭＸ０６８、ＰＭＸ０６９、ＰＭＸ０７０、ＰＭＸ０７１、ＰＭＸ０７２、ＰＭＸ０７３、ＰＭＸ０７４、ＰＭＸ０７５、ＰＭＸ０７６、ＰＭＸ０７７、ＰＭＸ０７８、ＰＭＸ０７９、ＰＭＸ０８０、ＰＭＸ０８１、ＰＭＸ１１２、ＰＭＸ１１３、ＰＭＸ１１４、ＰＭＸ１１５、ＰＭＸ１１６、ＰＭＸ１１７、ＰＭＸ１１８、ＰＭＸ１１９、ＰＭＸ１２０、ＰＭＸ１２１、ＰＭＸ１２２、ＰＭＸ１２３、又はＰＭＸ１２４である。一実施形態では、抗体は、ＰＭＸ００１、ＰＭＸ００２、ＰＭＸ００３、ＰＭＸ００４、ＰＭＸ００５、ＰＭＸ０６６、ＰＭＸ０６７、ＰＭＸ０６８、ＰＭＸ０６９、ＰＭＸ０７０、ＰＭＸ０７１、ＰＭＸ０７２、ＰＭＸ０７３、ＰＭＸ０７４、ＰＭＸ０７５、ＰＭＸ０７６、ＰＭＸ０７７、ＰＭＸ０７８、ＰＭＸ０７９、ＰＭＸ０８０、又はＰＭＸ０８１から選択される。一実施形態では、抗体は、ＰＭＸ００３、ＰＭＸ０６６、ＰＭＸ０６９、ＰＭＸ０７０、ＰＭＸ０７８、又はＰＭＸ０８１から選択される。一実施形態では、抗体は、ＰＭＸ０１０、ＰＭＸ１１２、ＰＭＸ１１５、ＰＭＸ１２２、又はＰＭＸ１２４から選択される。一実施形態では、抗体は、ＰＭＸ０６９、ＰＭＸ０７０、又はＰＭＸ１１５から選択される。

【0143】

したがって、一実施形態では、抗体は、対応するアミノ酸配列（配列番号４）をコードする重鎖可変領域ヌクレオチド配列（配列番号３）、及び対応するアミノ酸配列（配列番号６）をコードする軽鎖可変領域ヌクレオチド配列（配列番号５）を有する。生殖細胞系配列（配列番号７４）と比較して、重鎖可変配列には２個のアミノ酸変化があり、生殖細胞系配列（配列番号７６）と比較して、軽鎖可変配列には３個のアミノ酸変化がある。ＣＤＲ配列は以下のとおりである。重鎖可変領域のＣＤＲ１（配列番号７）、ＣＤＲ２（配列番号８）、及びＣＤＲ３（配列番号９）、並びに軽鎖可変領域のＣＤＲ１（配列番号１０）、ＣＤＲ２（配列番号１１）、及びＣＤＲ３（配列番号１２）。

【0144】

一実施形態では、抗体は、対応するアミノ酸配列（配列番号１４）をコードする重鎖可変領域ヌクレオチド配列（配列番号１３）、及び対応するアミノ酸配列（配列番号１６）をコードする軽鎖可変領域ヌクレオチド配列（配列番号１５）を有する。生殖細胞系配列（配列番号７４）と比較して、重鎖可変配列には１０個のアミノ酸変化があり、軽鎖可変配列（配列番号７６）にはアミノ酸変化はない。ＣＤＲは以下である。重鎖可変領域のＣＤＲ１（配列番号１７）、ＣＤＲ２（配列番号１８）、及びＣＤＲ３（配列番号１９）、並びに軽鎖可変領域のＣＤＲ１（配列番号２０）、ＣＤＲ２（配列番号２１）、及びＣＤＲ３（配列番号２２）。

【0145】

一実施形態では、抗体は、対応するアミノ酸配列（配列番号２４）をコードする重鎖可変領域ヌクレオチド配列（配列番号２３）、及び対応するアミノ酸配列（配列番号２６）をコードする軽鎖可変領域ヌクレオチド配列（配列番号２５）を有する。生殖細胞系配列（配列番号７４）と比較して、重鎖可変配列には５個のアミノ酸変化があり、軽鎖可変配列（配列番号７６）には１個のアミノ酸変化がある。ＣＤＲは以下である。重鎖可変領域のＣＤＲ１（配列番号２７）、ＣＤＲ２（配列番号２８）、及びＣＤＲ３（配列番号２９）、並びに軽鎖可変領域のＣＤＲ１（配列番号３０）、ＣＤＲ２（配列番号３１）、及びＣＤＲ３（配列番号３２）。

【0146】

一実施形態では、抗体は、対応するアミノ酸配列（配列番号３４）をコードする重鎖可変領域ヌクレオチド配列（配列番号３３）、及び対応するアミノ酸配列（配列番号３６）をコードする軽鎖可変領域ヌクレオチド配列（配列番号３５）を有する。生殖細胞系配列（配列番号７４）と比較して、重鎖可変配列には１２個のアミノ酸変化があり、軽鎖可変配列（配列番号７６）にはアミノ酸変化はない。ＣＤＲは、重鎖可変領域のＣＤＲ１（配列番号３７）、ＣＤＲ２（配列番号３８）、及びＣＤＲ３（配列番号３９）、並びに軽鎖可変領域のＣＤＲ１（配列番号４０）、ＣＤＲ２（配列番号４１）、及びＣＤＲ３（配列番号４２）である。

【0147】

一実施形態では、抗体は、対応するアミノ酸配列（配列番号４４）をコードする重鎖可変領域ヌクレオチド配列（配列番号４３）、及び対応するアミノ酸配列（配列番号４６）をコードする軽鎖可変領域ヌクレオチド配列（配列番号４５）を有する。生殖細胞系配列（配列番号７４）と比較して、重鎖可変配列には４個のアミノ酸変化があり、軽鎖可変配列（配列番号７６）にはアミノ酸変化はない。ＣＤＲは、重鎖可変領域のＣＤＲ１（配列番号４７）、ＣＤＲ２（配列番号４８）、及びＣＤＲ３（配列番号４９）、並びに軽鎖可変領域のＣＤＲ１（配列番号５０）、ＣＤＲ２（配列番号５１）、及びＣＤＲ３（配列番号５２）である。

【0148】

一実施形態では、抗体は、対応するアミノ酸配列（配列番号７９）をコードする重鎖可変領域ヌクレオチド配列（配列番号７８）、及び対応するアミノ酸配列（配列番号８１）をコードする軽鎖可変領域ヌクレオチド配列（配列番号８０）を有する。ＣＤＲは、重鎖可変領域のＣＤＲ１（配列番号８２）、ＣＤＲ２（配列番号８３）、及びＣＤＲ３（配列番号８４）、並びに軽鎖可変領域のＣＤＲ１（配列番号８５）、ＣＤＲ２（配列番号８６）、及びＣＤＲ３（配列番号８７）である。

【0149】

一実施形態では、抗体は、対応するアミノ酸配列（配列番号８９）をコードする重鎖可変領域ヌクレオチド配列（配列番号８８）、及び対応するアミノ酸配列（配列番号９１）をコードする軽鎖可変領域ヌクレオチド配列（配列番号９０）を有する。ＣＤＲは、重鎖可変領域のＣＤＲ１（配列番号９２）、ＣＤＲ２（配列番号９３）、及びＣＤＲ３（配列番号９４）、並びに軽鎖可変領域のＣＤＲ１（配列番号９５）、ＣＤＲ２（配列番号９６）、及びＣＤＲ３（配列番号９７）である。

【0150】

一実施形態では、抗体は、対応するアミノ酸配列（配列番号９９）をコードする重鎖可変領域ヌクレオチド配列（配列番号９８）、及び対応するアミノ酸配列（配列番号１０１）をコードする軽鎖可変領域ヌクレオチド配列（配列番号１００）を有する。ＣＤＲは、重鎖可変領域のＣＤＲ１（配列番号１０２）、ＣＤＲ２（配列番号１０３）、及びＣＤＲ３（配列番号１０４）、並びに軽鎖可変領域のＣＤＲ１（配列番号１０５）、ＣＤＲ２（配列番号１０６）、及びＣＤＲ３（配列番号１０７）である。

【0151】

一実施形態では、抗体は、対応するアミノ酸配列（配列番号１０９）をコードする重鎖可変領域ヌクレオチド配列（配列番号１０８）、及び対応するアミノ酸配列（配列番号１１１）をコードする軽鎖可変領域ヌクレオチド配列（配列番号１１０）を有する。ＣＤＲは、重鎖可変領域のＣＤＲ１（配列番号１１２）、ＣＤＲ２（配列番号１１３）、及びＣＤＲ３（配列番号１１４）、並びに軽鎖可変領域のＣＤＲ１（配列番号１１５）、ＣＤＲ２（配列番号１１６）、及びＣＤＲ３（配列番号１１７）である。

【0152】

一実施形態では、抗体は、対応するアミノ酸配列（配列番号１１９）をコードする重鎖可変領域ヌクレオチド配列（配列番号１１８）、及び対応するアミノ酸配列（配列番号１２１）をコードする軽鎖可変領域ヌクレオチド配列（配列番号１２０）を有する。ＣＤＲは、重鎖可変領域のＣＤＲ１（配列番号１２２）、ＣＤＲ２（配列番号１２３）、及びＣＤＲ３（配列番号１２４）、並びに軽鎖可変領域のＣＤＲ１（配列番号１２５）、ＣＤＲ２（配列番号１２６）、及びＣＤＲ３（配列番号１２７）である。

【0153】

一実施形態では、抗体は、対応するアミノ酸配列（配列番号１２９）をコードする重鎖可変領域ヌクレオチド配列（配列番号１２８）、及び対応するアミノ酸配列（配列番号１３１）をコードする軽鎖可変領域ヌクレオチド配列（配列番号１３０）を有する。ＣＤＲは、重鎖可変領域のＣＤＲ１（配列番号１３２）、ＣＤＲ２（配列番号１３３）、及びＣＤＲ３（配列番号１３４）、並びに軽鎖可変領域のＣＤＲ１（配列番号１３５）、ＣＤＲ２（配列番号１３６）、及びＣＤＲ３（配列番号１３７）である。

【0154】

一実施形態では、抗体は、対応するアミノ酸配列（配列番号１３９）をコードする重鎖可変領域ヌクレオチド配列（配列番号１３８）、及び対応するアミノ酸配列（配列番号１４１）をコードする軽鎖可変領域ヌクレオチド配列（配列番号１４０）を有する。ＣＤＲは、重鎖可変領域のＣＤＲ１（配列番号１４２）、ＣＤＲ２（配列番号１４３）、及びＣＤＲ３（配列番号１４４）、並びに軽鎖可変領域のＣＤＲ１（配列番号１４５）、ＣＤＲ２（配列番号１４６）、及びＣＤＲ３（配列番号１４７）である。

【0155】

一実施形態では、抗体は、対応するアミノ酸配列（配列番号１４９）をコードする重鎖可変領域ヌクレオチド配列（配列番号１４８）、及び対応するアミノ酸配列（配列番号１５１）をコードする軽鎖可変領域ヌクレオチド配列（配列番号１５０）を有する。ＣＤＲは、重鎖可変領域のＣＤＲ１（配列番号１５２）、ＣＤＲ２（配列番号１５３）、及びＣＤＲ３（配列番号１５４）、並びに軽鎖可変領域のＣＤＲ１（配列番号１５５）、ＣＤＲ２（配列番号１５６）、及びＣＤＲ３（配列番号１５７）である。

【0156】

一実施形態では、抗体は、対応するアミノ酸配列（配列番号１５９）をコードする重鎖可変領域ヌクレオチド配列（配列番号１５８）、及び対応するアミノ酸配列（配列番号１６１）をコードする軽鎖可変領域ヌクレオチド配列（配列番号１６０）を有する。ＣＤＲは、重鎖可変領域のＣＤＲ１（配列番号１６２）、ＣＤＲ２（配列番号１６３）、及びＣＤＲ３（配列番号１６４）、並びに軽鎖可変領域のＣＤＲ１（配列番号１６５）、ＣＤＲ２（配列番号１６６）、及びＣＤＲ３（配列番号１６７）である。

【0157】

一実施形態では、抗体は、対応するアミノ酸配列（配列番号１６９）をコードする重鎖可変領域ヌクレオチド配列（配列番号１６８）、及び対応するアミノ酸配列（配列番号１７１）をコードする軽鎖可変領域ヌクレオチド配列（配列番号１７０）を有する。ＣＤＲは、重鎖可変領域のＣＤＲ１（配列番号１７２）、ＣＤＲ２（配列番号１７３）、及びＣＤＲ３（配列番号１７４）、並びに軽鎖可変領域のＣＤＲ１（配列番号１７５）、ＣＤＲ２（配列番号１７６）、及びＣＤＲ３（配列番号１７７）である。

【0158】

一実施形態では、抗体は、対応するアミノ酸配列（配列番号１７９）をコードする重鎖可変領域ヌクレオチド配列（配列番号１７８）、及び対応するアミノ酸配列（配列番号１８１）をコードする軽鎖可変領域ヌクレオチド配列（配列番号１８０）を有する。ＣＤＲは、重鎖可変領域のＣＤＲ１（配列番号１８２）、ＣＤＲ２（配列番号１８３）、及びＣＤＲ３（配列番号１８４）、並びに軽鎖可変領域のＣＤＲ１（配列番号１８５）、ＣＤＲ２（配列番号１８６）、及びＣＤＲ３（配列番号１８７）である。

【0159】

一実施形態では、抗体は、対応するアミノ酸配列（配列番号１８９）をコードする重鎖可変領域ヌクレオチド配列（配列番号１８８）、及び対応するアミノ酸配列（配列番号１９１）をコードする軽鎖可変領域ヌクレオチド配列（配列番号１９０）を有する。ＣＤＲは、重鎖可変領域のＣＤＲ１（配列番号１９２）、ＣＤＲ２（配列番号１９３）、及びＣＤＲ３（配列番号１９４）、並びに軽鎖可変領域のＣＤＲ１（配列番号１９５）、ＣＤＲ２（配列番号１９６）、及びＣＤＲ３（配列番号１９７）である。

【0160】

一実施形態では、抗体は、対応するアミノ酸配列（配列番号１９９）をコードする重鎖可変領域ヌクレオチド配列（配列番号１９８）、及び対応するアミノ酸配列（配列番号２０１）をコードする軽鎖可変領域ヌクレオチド配列（配列番号２００）を有する。ＣＤＲは、重鎖可変領域のＣＤＲ１（配列番号２０２）、ＣＤＲ２（配列番号２０３）、及びＣＤＲ３（配列番号２０４）、並びに軽鎖可変領域のＣＤＲ１（配列番号２０５）、ＣＤＲ２（配列番号２０６）、及びＣＤＲ３（配列番号２０７）である。

【0161】

一実施形態では、抗体は、対応するアミノ酸配列（配列番号２０９）をコードする重鎖可変領域ヌクレオチド配列（配列番号２０８）、及び対応するアミノ酸配列（配列番号２１１）をコードする軽鎖可変領域ヌクレオチド配列（配列番号２１０）を有する。ＣＤＲは、重鎖可変領域のＣＤＲ１（配列番号２１２）、ＣＤＲ２（配列番号２１３）、及びＣＤＲ３（配列番号２１４）、並びに軽鎖可変領域のＣＤＲ１（配列番号２１５）、ＣＤＲ２（配列番号２１６）、及びＣＤＲ３（配列番号２１７）である。

【0162】

一実施形態では、抗体は、対応するアミノ酸配列（配列番号２１９）をコードする重鎖可変領域ヌクレオチド配列（配列番号２１８）、及び対応するアミノ酸配列（配列番号２２１）をコードする軽鎖可変領域ヌクレオチド配列（配列番号２２０）を有する。ＣＤＲは、重鎖可変領域のＣＤＲ１（配列番号２２２）、ＣＤＲ２（配列番号２２３）、及びＣＤＲ３（配列番号２２４）、並びに軽鎖可変領域のＣＤＲ１（配列番号２２５）、ＣＤＲ２（配列番号２２６）、及びＣＤＲ３（配列番号２２７）である。

【0163】

一実施形態では、抗体は、対応するアミノ酸配列（配列番号２２９）をコードする重鎖可変領域ヌクレオチド配列（配列番号２２８）、及び対応するアミノ酸配列（配列番号２３１）をコードする軽鎖可変領域ヌクレオチド配列（配列番号２３０）を有する。ＣＤＲは、重鎖可変領域のＣＤＲ１（配列番号２３２）、ＣＤＲ２（配列番号２３３）、及びＣＤＲ３（配列番号２３４）、並びに軽鎖可変領域のＣＤＲ１（配列番号２３５）、ＣＤＲ２（配列番号２３６）、及びＣＤＲ３（配列番号２３７）である。

【0164】

一実施形態では、抗体又はその抗原結合部分は、Ｆｃ領域、例えば、イヌＦｃ領域、例えば、イヌＩｇＧＢ Ｆｃ領域を含む。

【0165】

表２に示されるアミノ酸及びヌクレオチド配列（及び／又はその断片）を含むが、これらに限定されない、本明細書に記載される可変領域配列は、抗体分子の１つ以上の定常鎖（及び／又はその断片）をコードする１つ以上のアミノ酸配列及び／又はヌクレオチド配列と組み合わせて使用してもよい。例えば、表２に示される可変領域アミノ酸配列は、可変領域アミノ酸配列が由来するものと同じ又は異なる種（例えば、ヒト、ヤギ、ラット、ヒツジ、ニワトリ）の任意の抗体分子の定常領域に連結され得る。好ましくは、表２に示される可変領域アミノ酸配列は、イヌ抗体の定常領域に連結され、イヌＩｇＧ Ａ、Ｂ、Ｃ、又はＤのうちのいずれかからの定常領域であり得る。一実施形態では、定常領域は、イヌＩｇＧ Ｂ定常領域である。イヌＩＧＧＢ（配列番号６６）、イヌＩＧＫ（配列番号７３）、又はイヌＩＧＬＣ５（配列番号６７）定常領域を使用してもよい。

【0166】

また、上記の抗体及び抗原結合部分のバリアントも本発明の範囲内である。

【0167】

本明細書に記載の抗体又はその抗原結合部分のバリアントは、非バリアント分子に対して少なくとも８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する。一実施形態では、配列同一性は、少なくとも９５％である。一実施形態では、修飾は保存的配列修飾である。

【0168】

本明細書で使用される場合、「保存的配列修飾」という用語は、アミノ酸配列を含有する抗体の結合特徴に著しく影響しないか、又は著しく改変させないアミノ酸修飾を指すよう意図される。そのような保存的修飾は、アミノ酸置換、付加、及び欠失を含む。修飾は、部位特異的変異誘発及びＰＣＲを介する変異誘発などの当技術分野で既知の標準的な技術によって、本発明の抗体又はその抗原結合部分に導入することができる。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられているものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野で定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、ベータ分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。したがって、本発明の抗体のＣＤＲ領域内の１つ以上のアミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーからの他のアミノ酸残基と置き換えることができ、改変された抗体は、本明細書に記載される機能的アッセイを使用して、保持された機能（すなわち、ＣＤ２０結合）について試験することができる。

【0169】

したがって、これらのアミノ酸変化は、典型的には、ポリペプチドの生物学的活性、機能、又は抗原に対するその親和性若しくはその特異性などの他の所望の特性を改変させることなく行うことができる。一般に、ポリペプチドの非必須領域における単一アミノ酸置換は、生物学的活性を実質的に改変させない。更に、構造又は機能が類似しているアミノ酸の置換は、ポリペプチドの生物学的活性を破壊する可能性が低い。本明細書に記載されるポリペプチド及びペプチドを含むアミノ酸残基についての略語、並びにこれらのアミノ酸残基についての保存的置換は、以下の表１に示される。

【表1】

【0170】

いくつかの実施形態では、本発明は、１つ以上の配列修飾を含み、非修飾抗体又はその断片と比較して、結合親和性、特異性、熱安定性、発現レベル、エフェクター機能、グリコシル化、低減された免疫原性、又は溶解性などの特性のうちの１つ以上の改善を有する、例えば、配列番号３～６５又は配列番号７８～２３７から選択される本明細書に記載される配列と比較した抗体又はその抗原結合部分のバリアントである、抗体又はその抗原結合部分を提供する。

【0171】

抗体が大規模に首尾よく開発され得ることを示唆し得る特性を測定するための好適な方法には、親和性クロマトグラフィーのクロマトグラフィー（タンパク質Ａ：ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ ＬＸ）、アニオン交換クロマトグラフィー（Ｃａｐｔｏ Ｑ）、カチオン交換クロマトグラフィー（Ｃａｐｔｏ Ｓ）、及び緩衝液交換（Ｇ－２５Ｆｉｎｅ）などのクロマトグラフィーを使用する第１の精製、続いて、抗体が無傷のままであるかどうかの評価が含まれる（例えば、ＳＤＳ ＰＡＧＥ分析を使用して分子量を決定し、ＨＰＬＣ－ＳＥＣを使用してモノマーの％を計算し、凝集及び熱安定性（Ｔｍ）研究を評価する。

【0172】

例えば、タンパク質のアスパラギン連結グリコシル化のためのコンセンサス配列が除去され得る。ＰＭＸ００３（配列番号２６）の軽鎖のフレームワーク領域１（ＦＲ１）は、タンパク質のアスパラギン連結グリコシル化のためのコンセンサス配列であるＮＶＴシークオン（ｓｅｑｕｏｎ）を含有する。この部位に結合したグリカンを除去するために、ＰＭＸ００３ ｍＡｂのＦＲ１内のＮＶＴシークオンを、ＰＭＸ００６ ｍＡｂについてはＱＶＴ、ＰＭＸ００７ ｍＡｂについてはＡＶＴ、ＰＭＸ００８ ｍＡｂについてはＥＶＴ、ＰＭＸ００９ ｍＡｂについてはＮＶＡ、ＰＭＸ０１０ ｍＡｂについてはＳＶＴ、及びＰＭＸ０１１ ｍＡｂについてはＴＶＴに変異させた。そのような修飾は、本発明の範囲内である。

【0173】

ＰＭＸ００６ ｍＡｂ（配列番号５３）、ＰＭＸ００７ ｍＡｂ（配列番号５４）、ＰＭＸ００８ ｍＡｂ（配列番号５５）、ＰＭＸ００９ ｍＡｂ（配列番号５６）、ＰＭＸ０１０ ｍＡｂ（配列番号５７）、ＰＭＸ０１１ ｍＡｂ（配列番号５８）の得られた軽鎖可変領域アミノ酸配列、及びＰＭＸ００３（配列番号５９）、ＰＭＸ００６ ｍＡｂ（配列番号６０）、ＰＭＸ００７ ｍＡｂ（配列番号６１）、ＰＭＸ００８ ｍＡｂ（配列番号６２）、ＰＭＸ００９ ｍＡｂ（配列番号６３）、ＰＭＸ０１０ ｍＡｂ（配列番号６４）、ＰＭＸ０１１ ｍＡｂ（配列番号６５）のＦＲ１配列は、本発明の範囲内であり、配列表２に列挙されている。これらは、配列番号２６の代わりにＰＭＸ００３重鎖とともに使用してもよい。ＰＭＸ００３についてのＬＣ ＦＲ１配列は、配列番号５９において、修飾ＬＣ ＦＲ１配列は、配列番号６０、６１、６２、６３、６４、及び６５において示される。

【0174】

ＮＶＴシークオンは、ＰＭＸ００１～ＰＭＸ００５（配列番号６、配列番号１６、配列番号２６、配列番号３６、配列番号４６）、及びＰＭＸ０６６～ＰＭＸ００８１（配列番号８１、配列番号９１、配列番号１０１、配列番号１１１、配列番号１２１、配列番号１３１、配列番号１４１、配列番号１５１、配列番号１６１、配列番号１７１、配列番号１８１、配列番号１９１、配列番号２０１、配列番号２１１、配列番号２２１、配列番号２３１）の軽鎖のＦＲ１の残基位置１１～１３に見出される。ＰＭＸ００１～ＰＭＸ００５又はＰＭＸ０６６～ＰＭＸ０８１の軽鎖のＦＲ１の残基位置１１～１３に見出されるＮＶＴシークオンは、ＱＶＴ、ＡＶＴ、ＥＶＴ、ＮＶＡ、ＳＶＴ、ＴＶＴから選択される配列に変異され得る。実施形態では、ＰＭＸ００１～ＰＭＸ００５又はＰＭＸ０６６～ＰＭＸ０８１の軽鎖のＦＲ１の残基位置１１～１３に見出されるＮＶＴシークオンは、ＳＶＴに変異される。

【0175】

ＰＭＸ０６６（配列番号８１）、ＰＭＸ０６７（配列番号９１）、ＰＭＸ０６８（配列番号１０１）、ＰＭＸ０６９（配列番号１１１）、ＰＭＸ０７１（配列番号１３１）、ＰＭＸ０７２（配列番号１４１）、ＰＭＸ０７３（配列番号１５１）、ＰＭＸ０７４（配列番号１６１）、ＰＭＸ０７６（配列番号１８１）、ＰＭＸ０７７（配列番号１９１）、ＰＭＸ０７８（配列番号２０１）、ＰＭＸ０７９（配列番号２１１）、ＰＭＸ０８１（配列番号２３１）の軽鎖のフレームワーク領域１（ＦＲ１）は、タンパク質のアスパラギン連結グリコシル化のためのコンセンサス配列であるＮＶＴシークオンを含有する。この部位に結合したグリカンを除去するために、ＰＭＸ０６６、ＰＭＸ０６７、ＰＭＸ０６８、ＰＭＸ０６９、ＰＭＸ０７１、ＰＭＸ０７２、ＰＭＸ０７３、ＰＭＸ０７４、ＰＭＸ０７６、ＰＭＸ０７７、ＰＭＸ０７８、ＰＭＸ０７９、及びＰＭＸ０８１ ｍＡｂのＦＲ１におけるＮＶＴシークオンをＳＶＴに変異させて、それぞれ、ＰＭＸ１１２（配列番号２３８）、ＰＭＸ１１３（配列番号２３９）、ＰＭＸ１１４（配列番号２４０）、ＰＭＸ１１５（配列番号２４１）、ＰＭＸ１１６（配列番号２４２）、ＰＭＸ１１７（配列番号２４３）、ＰＭＸ１１８（配列番号２４４）、ＰＭＸ１１９（配列番号２４５）、ＰＭＸ１２０（配列番号２４６）、ＰＭＸ１２１（配列番号２４７）、ＰＭＸ１２２（配列番号２４８）、ＰＭＸ１２３（配列番号２４９）、及びＰＭＸ１２４（配列番号２５０）を産生した。そのような修飾は、本発明の範囲内であり、これらの軽鎖は、それらのそれぞれの重鎖対応物とともに使用され得、例えば、ＰＭＸ０６６（配列番号７９）のＨＣは、修飾ＬＣ（配列番号２３８）などとともに使用してもよい。

【0176】

ＰＭＸ１１２ ｍＡｂ（配列番号２３８）、ＰＭＸ１１３ ｍＡｂ（配列番号２３９）、ＰＭＸ１１４ ｍＡｂ（配列番号２４０）、ＰＭＸ１１５ ｍＡｂ（配列番号２４１）、ＰＭＸ１１６ ｍＡｂ（配列番号２４２）、ＰＭＸ１１７ ｍＡｂ（配列番号２４３）、ＰＭＸ１１８ ｍＡｂ（配列番号２４４）、ＰＭＸ１１９ ｍＡｂ（配列番号２４５）、ＰＭＸ１２０ ｍＡｂ（配列番号２４６）、ＰＭＸ１２１ ｍＡｂ（配列番号２４７）、ＰＭＸ１２２ ｍＡｂ（配列番号２４８）、ＰＭＸ１２３ ｍＡｂ（配列番号２４９）、及びＰＭＸ１２４ ｍＡｂ（配列番号２５０）の得られた軽鎖可変領域アミノ酸配列は、本発明の範囲内であり、配列表に列挙されている。

【0177】

当業者は、インビトロ及びインビボ発現ライブラリを含む、本明細書に記載の抗原結合分子を特定し、取得し、最適化するための異なる方法が存在することを知っているであろう。これは、実施例において更に記載される。ディスプレイ（例えば、リボソーム及び／又はファージディスプレイ）及び／又は変異誘発（例えば、エラーが発生しやすい変異誘発）などの当技術分野で既知の最適化技術が使用され得る。したがって、本発明はまた、本明細書に記載される抗体の配列最適化バリアントを含む。

【0178】

一実施形態では、修飾は、抗体の免疫原性を減少させるように行うことができる。例えば、１つのアプローチは、１つ以上のフレームワーク残基を対応するイヌ生殖細胞系配列に戻すことである。より具体的には、体細胞変異を受けている抗体は、抗体が由来する生殖細胞系配列とは異なるフレームワーク残基を含有し得る。そのような残基は、抗体フレームワーク配列を、抗体が由来する生殖細胞系配列と比較することによって特定され得る。一実施形態では、全てのフレームワーク配列は、生殖細胞系配列である。

【0179】

フレームワーク領域配列中のアミノ酸残基のうちの１つ以上をそれらの生殖細胞系構成に戻すために、体細胞変異は、例えば、部位特異的変異誘発又はＰＣＲを介する変異誘発によって生殖細胞系配列に「復帰変異」され得る。

【0180】

別のタイプのフレームワーク修飾は、フレームワーク領域内、又は１つ以上のＣＤＲ領域内の１つ以上の残基を変異させて、Ｔ細胞エピトープを除去し、それによって抗体の潜在的な免疫原性を低減させることを伴う。

【0181】

いくつかの実施形態では、本開示の抗原結合タンパク質、その断片及び誘導体、並びに融合タンパク質は、翻訳後修飾を受け、例えば、限定されないが、グルタミンは、環化され得るか、又はピログルタミン酸に変換され得、追加的又は代替的に、アミノ酸は、脱アミド化、異性化、グリケーション、及び／又は酸化を受けることができる。本開示のポリペプチドは、当技術分野で周知である部位で、グリコシル化、例えば、Ｎ連結又はＯ連結グリコシル化を含む、追加の翻訳後修飾を受けることができる。そのような改変を防止又は最小化するために、又はそのような処理が有益である状況でそれらを促進するために、ポリペプチドのアミノ酸配列に変化が加えられ得る。本開示のポリペプチドには、例えば、（１）タンパク質分解に対する感受性を低減させるために、（２）酸化に対する感受性を低減させるために、（３）タンパク質複合体を形成するための結合親和性を改変させるために、（４）結合親和性を改変させるために、及び（４）他の物理化学的又は機能的特性を付与又は修飾するために、修飾されているポリペプチドが含まれる。

【0182】

したがって、なお別の実施形態では、グリコシル化が修飾される。例えば、アグリコシル化（ａｇｌｙｃｏｓｌａｔｅｄ）抗体が作製され得る（すなわち、抗体がグリコシル化を欠いている）。一実施形態では、アグリコシル化抗体の軽鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８を含む。配列番号２３８、配列番号２３９、配列番号２４０、配列番号２４１、配列番号２４２、配列番号２４３、配列番号２４４、配列番号２４５、配列番号２４６、配列番号２４７、配列番号２４８、配列番号２４９、配列番号２５０。ＦＲ１配列は、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、又は配列番号６５として提供される。

【0183】

グリコシル化はまた、例えば、抗原に対する抗体の親和性を増加させるように改変され得る。そのような炭水化物修飾は、例えば、抗体配列内のグリコシル化の１つ以上の部位を改変させることによって達成され得る。例えば、１つ以上の可変領域フレームワークグリコシル化部位の排除をもたらし、それにより、その部位でのグリコシル化を排除する１つ以上のアミノ酸置換が行われ得る。そのようなアグリコシル化は、抗原に対する抗体の親和性を増加させ得る。

【0184】

いくつかの用途では、結合剤は、イヌＣＤ２０に結合し得るが、標準的な結合剤と比較してＦｃ受容体に結合する能力が改変されている。一例では、結合剤は、修飾されたグリコシル化パターンを有する抗体である。ＩｇＧ分子は、例えば、典型的には、Ｎ連結オリゴ糖、例えば、フコースを含有する。

【0185】

一実施形態では、抗体又はその抗原結合部分は、ａ－フコシル化されている。がん免疫療法では、抗体は、腫瘍細胞を枯渇させる主な作用様式として、Ｆｃ媒介性免疫エフェクター機能、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）に依存し得る。このエフェクター機能が、抗体のＦｃ領域におけるＮ連結グリコシル化によって調節されることは周知である。特に、Ｆｃ Ｎ－グリカン上のコアフコースの不在は、ナチュラルキラー細胞などの免疫エフェクター細胞上に存在するＦｃγＲＩＩＩａに対するＩｇＧ１ Ｆｃ結合親和性を増加させ、ＡＤＣＣ活性の向上をもたらすことが示されている。したがって、ａ－フコシル化抗体は、治療有効性を改善するのに有利であり得、フコースの不在／除去は、抗体がＦｃ受容体と相互作用する能力を向上させる。このタイプの抗体は、「ａ－フコシル化」と称され得る。そのような抗体は、本明細書に記載される技術及び／又は当技術分野で既知であり得る技術を使用して産生され得る。いくつかの実施形態では、抗体をコードする核酸配列は、修飾されたグリコシル化能力（例えば、欠失、修飾又はより少ない量のフコシルトランスフェラーゼ）を有し、典型的なフコース部分を添加することができない細胞株で発現され得る。

【0186】

一実施形態では、抗体又はその抗原結合部分は、０．９～４．５ｕｇ／ｍｌ（６～３０ｎＭ）の範囲、例えば、２０ｎＭ未満のＥＣ５０値を有するＣＤＣ活性を有する。

【0187】

一実施形態では、抗体又はその抗原結合部分は、０．３ｎＭ未満、例えば、０．０１３ｕｇ／ｍｌ（０．０９ｎＭ）のＥＣ５０値を有するＡＤＣＣ活性を有する。

【0188】

一実施形態では、本発明による抗体又はその抗原結合部分は、以下の特性のうちの１つ以上を有する。
ａ）２０ｎＭ未満のＥＣ５０値を有するＣＤＣ活性を有する、
ｂ）０．３ｎＭ未満のＥＣ５０値を有するＡＤＣＣ活性を有する、
ｃ）１００ｕｇ／ｍｌ超の一過性発現収率を有する、
ｄ）５８℃超のＵｎｃｌｅによって決定されるＴｍ１を有する、及び／又は
ｅ）約０．５ｍｇ／ｋｇ～２．５ｍｇ／ｋｇの用量でイヌにおけるインビボでの細胞殺傷を提供する
ｆ）イヌにおけるインビボでのＢ細胞枯渇を低レベルで少なくとも１５日間維持する、及び／あるいは
ｇ）以下のアミノ残基ＥＮＬＮＬＩＫＡＰＭ（配列番号３０３、配列番号２におけるアミノ酸番号１５０～１５９）、例えば、ＩＴＩＳＨＦＦＫＭＥＮＬＮＬＩＫＡＰＭ（配列番号３０２、配列番号２におけるアミノ酸番号１４１～１５９）のうちの１つ以上のアミノ残基、例えば、１～１０個、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０個を含むか、又は以下のアミノ残基ＥＮＬＮＬＩＫＡＰＭ（配列番号３０３、配列番号２におけるアミノ酸番号１５０～１５９）、例えば、ＩＴＩＳＨＦＦＫＭＥＮＬＮＬＩＫＡＰＭ（配列番号３０２、配列番号２におけるアミノ酸番号１４１～１５９）からなるエピトープに結合する。

【0189】

ＡＤＣＣ及びＣＤＣ活性は、実施例に記載されるように測定されてもよい。

【0190】

一実施形態では、抗体及びその抗原結合部分は、例えば、実施例で測定されるように、ＣＤ２０を発現するイヌリンパ腫細胞株における細胞殺傷によって実証されるような、ＣＤＣ及びＡＤＣＣ活性の両方を示す。

【0191】

一実施形態では、抗体又はその抗原結合部分は、上記に記載される特性のうちの１つ以上を有し、ＨＣ ＣＤＲ及びＬＣ ＣＤＲ、並びに／又はＰＭＸ０６９、ＰＭＸ１１５、若しくはＰＭＸ０７０のＨＣ及びＬＣ ＣＤＲＳを有する。一実施形態では、抗体又はその抗原結合部分は、ＰＭＸ０６９、ＰＭＸ１１５、又はＰＭＸ０７０から選択される。

【0192】

一実施形態では、抗体は、表４に記載される抗体又はその抗原結合部分であり、その表に示されるようなＡＤＣＣ又はＣＤＣについてのＥＣ５０値を有する。ＥＣ５０値は、実施例に記載されるように測定されてもよい。

【0193】

一実施形態では、抗体のＦｃ部分は修飾されてもよい。

【0194】

一実施形態では、バリアントにおける１つ以上の置換は、ＣＤＲ１、２、及び／又は３領域にある。例えば、ＣＤＲ１、２、及び／又は３領域内に１、２、３、４、５、又はそれ以上のアミノ酸置換があり得る。別の例では、１個又は２個のアミノ酸欠失があり得る。

【0195】

一実施形態では、１つ以上の置換は、フレームワーク領域にある。例えば、ＨＣ可変領域及び／又はＬＣ可変領域フレームワーク領域に１～２０個、例えば、１～１０個、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸置換があり得る。

【0196】

本発明の抗体は、好ましくは、ＫＤ、ＩＣ５０、及び／又はＥＣ５０値、例えば、実施例において本明細書に更に記載のＫＤを有する。好適には、ＫＤ値は、抗体が所望の生物学的効果を有するのに十分である。例えば、ＫＤは、少なくとも約１０ｐＭ～１００ｕＭ、約１００ｐＭ～１０ｎＭ以上であり得る。ＥＣ５０値は、表４のようなもの、例えば、０．１２～０．８９ｎＭであり得る。ＫＤ、ＩＣ５０、及び／又はＥＣ５０値は、実施例に記載されるように測定されてもよい。

【0197】

「ＫＤ」という用語は、「平衡解離定数」を指し、平衡での滴定測定で得られた値、又は解離速度定数（Ｋｏｆｆ）を会合速度定数（Ｋｏｎ）で除算することによって得られた値を指す。「ＫＡ」は、親和性定数を指す。会合速度定数、解離速度定数、及び平衡解離定数は、抗原に対する抗体の結合親和性を表すために使用される。会合速度定数及び解離速度定数を決定するための方法は、当技術分野で周知である。蛍光に基づく技術を使用することは、高感度を提供し、平衡での生理学的緩衝液中の試料を調べる能力を提供する。ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）ＳＰＲアッセイなどの他の実験的アプローチ及び機器が使用され得る。本発明はまた、上記の抗体又はその抗原結合部分と競合するイヌＣＤ２０に結合する、単離されたイヌ抗体又はその抗原結合部分に関する。本発明のＣＤ２０抗体のうちのいずれかと同じエピトープ又はイヌＣＤ２０上の重複するエピトープで、又はそれらの近くに結合する抗体、抗体断片、又は抗体模倣物は、ＣＤ２０に結合するために本発明の抗体のうちのいずれかと交差競合する能力を有する。したがって、本発明の抗体は、そのような交差反応性を評価するための参照抗体として使用され得る。そのような交差競合抗体は、標準的なＣＤ２０結合アッセイにおいて本明細書に記載される抗体と交差競合するそれらの能力に基づいて特定され得る。例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）分析、ＥＬＩＳＡアッセイ、又はフローサイトメトリーが、抗体との交差競合を実証するために使用され得る。

【0198】

核酸配列、ベクター、及び宿主細胞
本発明はまた、本明細書に記載の抗体又はその抗原結合部分のアミノ酸配列、例えば、ＨＣ可変領域又はＬＣ可変領域をコードする核酸配列に関する。例示的な配列を表２に記載する。一実施形態では、当該核酸は、配列番号３、５、１３、１５、２３、２５、３３、３５、４３、４５、７８、８０、８８、９０、９８、１００、１０８、１１０、１１８、１２０、１２８、１３０、１３８、１４０、１４８、１５０、１５８、１６０、１６８、１７０、１７８、１８０、１８８、１９０、１９８、２００、２０８、２１０、２１８、２２０、２２８、２３０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、若しくは３０１、又はそれに対して少なくとも７５％、８０％、若しくは９０％の配列相同性を有する核酸から選択される。一実施形態では、当該核酸配列は、第２の核酸配列にリンカーで連結されている。一実施形態では、当該第２の核酸は、追加の治療部分をコードする。一実施形態では、当該リンカーは、核酸リンカーである。例示的な核酸を以下に示す。しかしながら、当業者は、遺伝子コードの縮重に起因して、他の配列が想定されることを理解するであろう。

【0199】

配列番号６８及び６９を含む、コドン最適化ヌクレオチド配列も本発明の範囲内である。

【0200】

本発明による核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡを含み得、完全に若しくは部分的に合成され得るか、又は組換え的に産生され得る。本明細書に記載のヌクレオチド配列への言及は、別途文脈で必要とされない限り、特定の配列を有するＤＮＡ分子を包含し、ＵがＴに置換される特定の配列を有するＲＮＡ分子を包含する。

【0201】

更に、本発明は、上記で定義される少なくとも１つの核酸を含む核酸構築物に関する。構築物は、プラスミド、ベクター、転写、又は発現カセットの形態であってもよい。

【0202】

本発明はまた、本明細書に記載のＣＤ２０結合分子をコードする核酸を含むベクターに関する。「ベクター」という用語は、核酸配列が挿入又はクローニングされ得る核酸分子、好ましくは、例えば、プラスミド、バクテリオファージ、又はビムス（ｖｉｍｓ）に由来するＤＮＡ分子を指す。ベクターは、好ましくは、１つ以上の特有の制限部位を含有し、標的細胞若しくは組織又は前駆細胞若しくはその組織を含む定義された宿主細胞において自律複製することができてもよく、あるいはクローニングされた配列が再現可能であるように、定義された宿主のゲノムと統合可能であってもよい。したがって、ベクターは、自己複製ベクター、すなわち、染色体外実体として存在するベクターであり得、その複製は、染色体複製とは無関係であり、例えば、直鎖状若しくは閉じた環状プラスミド、染色体外エレメント、ミニ染色体、又は人工染色体である。ベクターは、自己複製を保証するための任意の手段を含有し得る。代替的には、ベクターは、宿主細胞に導入されると、ゲノムに統合され、それが統合されている染色体と一緒に複製されるものであり得る。ベクター系は、単一のベクター若しくはプラスミド、又は宿主細胞のゲノムに導入される全ＤＮＡを一緒に含有する２つ以上のベクター若しくはプラスミド、又はトランスポゾンを含み得る。ベクターの選択は、典型的には、ベクターが導入される宿主細胞とのベクターの適合性に依存する。ベクターはまた、好適な形質転換体の選択に使用され得る抗生物質耐性遺伝子などの選択マーカーを含み得る。そのような耐性遺伝子の例は、当業者に周知である。実施形態では、ベクターは、ＷＯ２０２１／１７６３６２に記載されるものなどのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。

【0203】

いくつかの実施形態は、核酸はまた、リーダー配列を含み得る。別の実施形態では、核酸は、リーダー配列を含まない。重鎖のための配列番号７１、ＰＭＸ００１～ＰＭＸ００５及びＰＭＸ０６６～ＰＭＸ０８１ ｍＡｂの軽鎖のための配列番号７２、又はＣａｍｐａｔｈリーダー配列（配列番号７０）（ＵＳ８，３６２，２０８Ｂ２を参照されたい）などの他の配列などの、天然免疫グロブリン生殖細胞系リーダー配列を含む任意の好適なリーダー配列を使用してもよく、タンパク質発現を向上させるために選択してもよい。

【0204】

いくつかの実施形態では、核酸はまた、シグナルペプチド、すなわち、分泌経路の第１の膜を通って分泌するために運命づけられたタンパク質の転座を媒介する分泌タンパク質（免疫グロブリンのような）のＮ末端上の短いアミノ酸配列（１３～３６個のアミノ酸）を含み得る。この配列は、成熟タンパク質には存在せず、同時翻訳事象で切断されるが、タンパク質の分泌及び正しい発現を媒介する。好適なシグナル配列は、組換えタンパク質の発現を最適化するために使用され得る。

【0205】

本発明はまた、上記の１つ以上の核酸構築物を含む単離された組換え宿主細胞に関する。本発明で有用な宿主細胞は、原核細胞、酵母細胞、又はより高い真核細胞であり、組換えバクテリオファージＤＮＡで形質転換された細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、抗体コード配列を含有するプラスミドＤＮＡ若しくはコスミドＤＮＡ発現ベクターなどの微生物；抗体コード配列を含有する組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ）；抗体コード配列を含有する、組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）を感染させた昆虫細胞系；抗体コード配列を含有する、組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）を感染させた植物細胞系、若しくは組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系；又は哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）若しくは哺乳動物ウイルスに由来するプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含有する組換え発現構築物を持つ哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、３Ｔ３細胞）が含まれるが、これらに限定されない。

【0206】

本発明における宿主細胞として有用な原核生物には、グラム陰性又はグラム陽性生物、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、及びＳｈｉｇｅｌｌａ、並びにＢａｃｉｌｌｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓが含まれる。１つのクローニング宿主は、Ｅ．ｃｏｌｉ ２９４（ＡＴＣＣ ３１，４４６）であるが、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ ３１，５３７）、及びＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ ２７，３２５）などの他の株が好適である。一実施形態では、本明細書に記載の抗ＣＤ２０抗体を作製する方法が提供され、本方法は、抗体をコードするポリヌクレオチドの発現に好適な条件下で宿主細胞を培養することと、抗体を単離することと、を含む。

【0207】

抗体をコードする核酸は、インビボでそのコードされたタンパク質を産生し、治療効果をもたらすために、抗体を個体に投与するために使用され得る。対象へのポリヌクレオチドの送達は、ポリヌクレオチド又は発現ベクターが、例えば、ｍＲＮＡ又はＤＮＡを細胞、例えば筋細胞に直接導入することによって個体に投与されるように、直接的であり得る。間接導入は、投与の前にポリヌクレオチドがインビトロで細胞に形質転換される場合も想定される。欠陥ウイルス又は減衰ウイルスなどのウイルスベクターもまた、使用され得る。

【0208】

一実施形態では、本明細書に記載の抗ＣＤ２０抗体を作製する方法が提供され、本方法は、抗体をコードするポリヌクレオチドの発現に好適な条件下で宿主細胞を培養することと、抗体を単離することと、を含む。

【0209】

本発明はまた、イヌＣＤ２０及び異なる種に由来する細胞株、例えばＨＥＫなどのヒト細胞株を含む異種アッセイ又は発現系に関する。

【0210】

アッセイは、イヌＣＤ２０を、異なる種に由来する細胞株、例えば、異なる哺乳動物からの細胞株、例えば、げっ歯類細胞株又はＨＥＫなどのヒト細胞株と接触させることを含む。例えば、細胞株は、安定又は一過性の様式でイヌＣＤ２０を発現するように、イヌＣＤ２０でトランスフェクションされる。

【0211】

免疫複合体及び他の結合剤
本発明は、本発明による抗体又はその抗原結合部分を含む、免疫複合体及び他の結合剤に関する。例えば、本発明による抗体又はその抗原結合部分は、治療部分又は非治療部分にコンジュゲートされ得る。

【0212】

一実施形態では、治療部分は、例えば、抗体若しくは抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、又は単一ドメイン抗体、例えば、Ｖ_Ｈ若しくはＶ_ＨＨドメイン）、又は抗体模倣タンパク質から選択される、目的の標的抗原に結合する結合分子である。

【0213】

一実施形態では、本明細書に記載のＣＤ２０及び第２の部分に結合する抗体又はその抗原結合部分を含むタンパク質又はポリペプチドは、融合タンパク質である。一実施形態では、本明細書に記載のＣＤ２０及び第２の部分に結合する抗体又はその抗原結合部分を含むタンパク質又はポリペプチドは、薬物コンジュゲートである。

【0214】

本明細書で使用される場合、「コンジュゲート」は、薬物に結合／コンジュゲートされる、本明細書に記載のＣＤ２０に結合する抗体を含む組成物を指す。

【0215】

そのようなコンジュゲートには、薬物が共有結合しているＣＤ２０に結合する抗体を含む「薬物コンジュゲート」、及び薬物が非共有結合しているＣＤ２０ ｍｉｎに結合する抗体を含む「非共有性薬物コンジュゲート」が含まれる。

【0216】

本明細書で使用される場合、「薬物コンジュゲート」は、薬物が共有結合している抗体を含む組成物を指す。薬物は、好適なリンカー部分を介して直接的又は間接的に抗体断片に共有結合され得る。薬物は、アミノ末端、カルボキシル末端などの任意の好適な位置で、又は好適なアミノ酸側鎖を介して抗体に結合され得る。

【0217】

一実施形態では、抗体は、２つの部位を接続するためにペプチドリンカー又は他の好適なリンカーで第２の部位に連結されている。

【0218】

「ペプチドリンカー」という用語は、１つ以上のアミノ酸を含むペプチドを指す。ペプチドリンカーは、１～５０個、例えば、１～２０個のアミノ酸を含む。ペプチドリンカーは当技術分野で既知であり、非限定的な例は本明細書に記載されている。好適な非免疫原性リンカーペプチドは、例えば、Ｇ及び／又はＳ残基、（Ｇ４Ｓ）ｎ、（ＳＧ４）ｎ、又はＧ４（ＳＧ４）ｎペプチドリンカーを含むリンカーであり、「ｎ」は一般に、１～１０、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０の数である。

【0219】

結合剤は、多重特異性、例えば二重特異性であり得る。

【0220】

一実施形態では、結合分子は二重特異性である。したがって、一態様では、本発明は、当該抗体とは異なる結合特異性を有する第２の部分に連結された、本明細書に記載される抗体を含む二重特異性分子に関する。したがって、第２の抗体は、異なる標的抗原、例えば、目的の標的に結合する。

【0221】

一実施形態では、結合分子、例えば、タンパク質又は構築物は、多重特異性であり、更なる、すなわち、第３、第４、第５などの部分を含む。

【0222】

治療部分はまた、半減期延長部分、細胞毒素、又は放射性同位体から選択され得る。

【0223】

非治療部分は、標識、リポソーム、又はナノ粒子から選択され得る。標識は、検出可能又は機能的である。標識は、フルオロフォア、蛍光体、放射性標識、酵素、化学発光体、核磁気共鳴活性標識、又は光増感剤を含むが、これらに限定されない、シグナルを産生するか、又はシグナルを産生するように誘導することができる任意の分子であり得る。したがって、結合は、蛍光又は発光、放射能、酵素活性、又は光吸光度を検出することによって検出及び／又は測定され得る。

【0224】

本発明によれば、１つの部分に連結されている抗体及び抗原結合部分は、別の部分に更に連結されてもよい。例えば、治療部分に連結されてもよく、非治療部分への更なる連結は、抗体又は部分のいずれかを介して提供されてもよい。

【0225】

一実施形態では、本発明による結合剤又は抗体若しくはその抗原結合部分は、半減期延長部分を含み得る。これは、イヌ血清アルブミンに結合する抗体又はその抗原結合部分から選択され得る。代替的には、延長された半減期は、ＰＥＧ化を通して付与され得る。

【0226】

使用される「半減期」という用語は、一般に、例えば、配列若しくは化合物の分解、及び／又は天然機構による配列若しくは化合物のクリアランス若しくは隔離に起因して、アミノ酸配列、化合物又はポリペプチドの血清濃度がインビボで５０％低減するのに要する時間を指すことができる。本発明のアミノ酸配列、化合物又はポリペプチドのインビボ半減期は、薬物動態分析などによって、それ自体が既知の任意の様式で決定することができる。好適な技術は、当業者には明白であろう。半減期は、ｔｌ／２－アルファ、ｔｌ／２－ベータ、及び曲線下面積（ＡＵＣ）などのパラメータを使用して表すことができる。半減期（ｔアルファ及びｔベータ）及びＡＵＣは、コンジュゲート又は融合の血清濃度の時間に対する曲線から決定することができる。したがって、本明細書で使用される「半減期」という用語は、特に、ｔｌ／２－ベータ又は末端半減期（ｔｌ／２－アルファ及び／若しくはＡＵＣ又はその両方が考慮されないようにされ得る）を指す。

【0227】

例えば、第１の相（アルファ相）では、薬物組成物（例えば、薬物コンジュゲート、非共有性薬物コンジュゲート、薬物融合）は、ある程度の排除を伴い、主に患者内に分布している。第２の相（ベータ相）は、薬物組成物（例えば、薬物コンジュゲート、非共有性薬物コンジュゲート、薬物融合物）が分布しており、薬物組成物が患者から除去されるにつれて血清濃度が減少している場合の末期相である。ｔアルファ半減期は、第１の相の半減期であり、ｔベータ半減期は、第２の相の半減期である。

【0228】

医薬組成物
別の態様では、本明細書に記載の抗体又は断片、及び任意選択的に、薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物が提供される。本明細書で使用される「医薬組成物」という用語は、獣医学的使用のためである、コンパニオン動物を治療するために使用される組成物、すなわち、獣医学的組成物を指す。好ましい実施形態では、治療される動物はイヌである。

【0229】

医薬組成物は、薬学的に許容される担体を任意選択的に含み得る。抗体、タンパク質、又は構築物、又は医薬組成物は、経口、局所、非経口、舌下、直腸、膣、眼、鼻腔内、肺、皮内、硝子体内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、脳内、経皮、経粘膜、吸入による、又は局所、特に耳、鼻、眼、又は皮膚に対して、又は吸入によるものを含むが、これらに限定されない、任意の便利な経路によって投与され得る。

【0230】

非経口投与は、例えば、静脈内、筋肉内、動脈内、腹腔内、鼻腔内、直腸、膀胱内、皮内、局所、又は皮下投与を含む。好ましくは、組成物は非経口投与される。

【0231】

薬学的に許容される担体又はビヒクルは、組成物が、例えば、錠剤又は粉末形態であるように、粒子状であり得る。「担体」という用語は、本発明の薬物抗体コンジュゲートとともに投与される希釈剤、アジュバント又は賦形剤を指す。そのような薬学的担体は、液体、例えば、水及び油であってもよく、石油、動物、植物又は合成由来のもの、例えば、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油などを含む。担体は、生理食塩水、アカシアガム、ゼラチン、デンプンペースト、タルク、ケラチン、コロイド状シリカ、尿素などであり得る。加えて、補助剤、安定化剤、増粘剤、潤滑剤、及び着色剤を使用してもよい。一実施形態では、動物に投与される場合、本発明の抗体又は組成物及び薬学的に許容される担体は、無菌である。水は、本発明の薬物抗体コンジュゲートが静脈内に投与される場合、好ましい担体である。生理食塩水溶液及びデキストロース水溶液及びグリセロール溶液もまた、液体担体として、特に注射用溶液に用いることができる。好適な薬学的担体には、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどの賦形剤も含まれる。所望な場合、本組成物はまた、少量の湿潤剤若しくは乳化剤、又はｐＨ緩衝剤を含有することができる。

【0232】

本発明の医薬組成物は、液体、例えば、溶液、エマルション、又は懸濁液の形態であり得る。液体は、注射、注入（例えば、ＩＶ注入）、又は皮下による送達に有用であり得る。経口投与を意図する場合、組成物は、好ましくは固体又は液体の形態であり、半固体、半液体、懸濁液及びゲル形態は、本明細書において固体又は液体のいずれかとして考慮される形態内に含まれる。

【0233】

経口投与用の固体組成物として、組成物は、粉末、顆粒、圧縮錠剤、ピル、カプセル、チューインガム、ウエハーなどの形態で製剤化され得る。そのような固体組成物は、典型的には、１つ以上の不活性希釈剤を含有する。加えて、以下のうちの１つ以上が存在し得る：カルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、微結晶セルロース、又はゼラチンなどの結合剤、デンプン、ラクトース、又はデキストリンなどの賦形剤、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、コーンスターチなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤、コロイド状二酸化ケイ素などの流動促進剤、スクロース又はサッカリンなどの甘味剤、ペパーミント、サリチル酸メチル、又はオレンジ風味などの風味剤、及び着色剤。組成物がカプセルの形態（例えば、ゼラチンカプセル）にある場合、それは、上記のタイプの材料に加えて、ポリエチレングリコール、シクロデキストリン又は脂肪油などの液体担体を含有することができる。

【0234】

組成物は、液体の形態、例えば、エリキシル、シロップ、溶液、エマルション又は懸濁液であり得る。この液体は、経口投与又は注射による送達に有用であり得る。経口投与を意図する場合、組成物は、甘味剤、保存剤、染料／着色剤、及び風味増強剤のうちの１つ以上を含み得る。注射による投与のための組成物において、界面活性剤、保存剤、湿潤剤、分散剤、懸濁剤、緩衝剤、安定剤、及び等張剤のうちの１つ以上も含まれ得る。

【0235】

組成物は、１つ以上の投薬単位の形態をとっていてもよい。特定の実施形態では、組成物を、治療を必要としている領域に局所的に、又は静脈内注射若しくは注入によって投与することが望ましい場合がある。

【0236】

疾患を治療する方法
本発明は、疾患の治療、本明細書に記載される医薬組成物若しくは製剤の投与、又は本発明の抗体若しくは抗原結合部分のための方法に更に及ぶ。また、疾患の治療における使用のための、本明細書に記載される医薬組成物若しくは製剤、又は本明細書に記載の抗体若しくはその抗原結合部分を含む結合分子若しくは融合タンパク質も想定される。

【0237】

特に、本発明は、Ｂ細胞によって媒介される状態の治療を必要としているイヌ対象においてそれを行う方法であって、有効量の本明細書に記載の抗体又はその抗原結合部分を投与することを含む、方法に関する。

【0238】

本発明の態様はまた、イヌ対象におけるＢ細胞によって媒介される状態の治療における使用のための、本明細書に記載の抗体若しくはその抗原結合部分又は医薬組成物である。

【0239】

例えば、抗体又はその抗原結合部分は、イヌの血液及び／又はＢ細胞リンパ腫細胞の組織を枯渇させるために使用してもよい。Ｂ細胞によって媒介される状態は、Ｂ細胞リンパ腫、（例えば、びまん性大細胞Ｂ細胞リンパ腫、ホジキン及び非ホジキンリンパ腫、濾胞性リンパ腫、粘膜関連リンパ組織リンパ腫（ＭＡＬＴ）、小細胞リンパ球性リンパ腫、慢性リンパ性白血病、マンテル細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、縦隔大Ｂ細胞リンパ腫、ワルデンストロームマクログロブリン血症、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫（ＮＭＺＬ）、脾性辺縁帯リンパ腫（ＳＭＺＬ）、血管内大Ｂ細胞リンパ腫、原発性滲出リンパ腫、リンパ腫様肉芽腫症）、白血病又は免疫媒介性疾患から選択される。免疫媒介性疾患は、自己免疫疾患であり得る。例には、自己免疫溶血性貧血、免疫媒介性血小板減少症、自己免疫水疱性疾患、免疫媒介性関節炎及びアトピー性皮膚炎、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、シェーグレン症候群、血管炎、多発性硬化症、グレーブス病、特発性血小板減少症、皮膚筋炎、免疫媒介性血小板減少症、多発性筋炎（ｐｏｌｙｍｙｏｃｙｔｏｓｉｓ）、天疱瘡、免疫媒介性溶血性貧血、及び水疱性天疱瘡が含まれ得るが、これらに限定されない。

【0240】

特定の障害又は状態の治療に有効／活性である治療薬の量は、障害又は状態の性質に依存し、標準的な臨床技術によって決定することができる。加えて、最適な投薬範囲を特定するのに役立つように、インビトロ又はインビボアッセイを任意選択的に用いてもよい。組成物において用いられる正確な用量はまた、投与経路、及び障害又は疾患の重篤度に依存し、医師の判断及び各患者の状況に従って決定されるべきである。年齢、体重、性別、食生活、投与時間、排泄速度、宿主の状態、薬物の組み合わせ、反応感受性、及び疾患の重症度などの要因を考慮する必要がある。

【0241】

典型的には、この量は、組成物の重量に対して、本発明の抗体又はその断片の少なくとも約０．０１％である。経口投与を意図する場合、この量は、組成物の約０．１重量％～約８０重量％の範囲で変化させることができる。好ましい経口組成物は、組成物の重量に対して、約４％～約５０％の本発明の抗体又はその断片を含み得る。

【0242】

非経口投薬単位が、約０．０１重量％～約２重量％の本発明の抗体又はその断片を含有するように、本発明の好ましい組成物を調製する。

【0243】

静脈内又は皮下注射などの注射による投与のために、組成物は、およそ典型的には、対象の体重の約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約２５０ｍｇ／ｋｇ、例えば、０．１ｍｇ／ｋｇ～約２５０ｍｇ／ｋｇ、例えば、動物の体重の約０．１ｍｇ／ｋｇ～約２０ｍｇ／ｋｇ、及びより好ましくは、動物の体重の約１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇを含み得るが、０．１ｍｇ／ｋｇ未満もまた想定される。一実施形態では、組成物は、約０．５～３０ｍｇ／ｋｇ、例えば、約５～２５ｍｇ／ｋｇ、約１０～２０ｍｇ／ｋｇ、約０．５～５ｍｇ／ｋｇ、約０．５～２．５ｍｇ／ｋｇ、約０．５～２．０ｍｇ／ｋｇ、又は約２若しくは３ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。一実施形態では、組成物は、２～５０ｍｇ／ｍｌの用量で投与される。一実施形態では、組成物は、０．５ｍｇ／ｍｌ～２．５ｍｇ／ｍｌ、又は０．５ｍｇ／ｍｌ～５ｍｇ／ｍｌの用量で投与される。投薬スケジュールは、例えば、週に１回から２、３、４週間に１回、又は用量間で最大８週間まで変化し得る。一実施形態では、組成物は、３～４週間毎に０．５ｍｇ／ｍｌ～２．５ｍｇ／ｍｌ、例えば、３～４週間毎に０．５ｍｇ／ｍｌ又は２．５ｍｇ／ｍｌの用量で投与される。好適には、用量は、用量間の３～４週間の間隔を可能にするように、ＣＤ２０陽性細胞の長期枯渇を与えるように選択される。複数回用量、好適には最大約６回以上の反復用量が投与されてもよい。

【0244】

一実施形態では、治療後、対象は、少なくとも７日間、又は少なくとも１４日間、又は少なくとも２１日間、又は少なくとも２８日間、又は少なくとも４０日間、又は少なくとも５０日間、又は少なくとも６０日間の疾患無増悪を有する。一実施形態では、治療後、対象は、少なくとも７日間、又は少なくとも１４日間、又は少なくとも２１日間、又は少なくとも２８日間、又は少なくとも４０日間、又は少なくとも５０日間、又は少なくとも６０日間の疾患無増悪を有する。

【0245】

一実施形態では、生存日数、無病日数、又は疾患無増悪日数は、少なくとも２ヶ月、又は少なくとも３ヶ月、又は少なくとも４ヶ月、例えば少なくとも５ヶ月、例えば少なくとも６ヶ月である。

【0246】

一実施形態では、生存日数、無病日数、又は疾患無増悪日数は、少なくとも９ヶ月、２００日、３００日、又は３年以上である。一実施形態では、それは、少なくとも１年、２年、３年、又はそれ以上である。本発明は、コンパニオン動物、例えば、イヌにおけるＣＤ２０媒介性疾患又は障害を治療又は予防する方法であって、それを必要としている動物に、有効量の本発明の抗体又は断片を投与することを含む、方法を提供する。

【0247】

本明細書で使用される場合、「治療する」、「治療すること」、又は「治療」は、疾患又は障害を阻害又は緩和することを意味する。例えば、治療は、疾患若しくは障害に関連する症状の発症の延期、及び／又は当該疾患とともに発症するであろう、又は予想されるそのような症状の重症度の低減を含み得る。これらの用語には、既存の症状の改善、追加の症状の予防、及びそのような症状の根底にある原因の改善又は予防が含まれる。したがって、これらの用語は、治療される哺乳動物、例えば、イヌ患者の少なくとも一部に有益な結果が付与されていることを示す。多くの医学的治療は、治療を受ける一部の患者に有効であるが、全ての患者に有効ではない。例えば、Ｂ細胞リンパ腫の治療では、症状の改善は、治療後にリンパ節を測定し、治療の成功の指標としてリンパ節サイズの低減を観察することによって評価され得る。

【0248】

「対象」又は「患者」という用語は、治療、観察、又は実験の対象であるイヌを指す。誤解を避けるために、ヒトの治療は除外される。

【0249】

本発明の分子又は医薬組成物は、単独の活性成分として、又は１つ以上の他の治療剤、例えば、がん療法と組み合わせて投与してもよい。治療剤は、疾患の治療に有用である化合物又は分子である。治療剤の例には、抗体、抗体断片、薬物、毒素、ヌクレアーゼ、ホルモン、免疫調節物質、プロアポトーシス剤、抗血管新生剤、ホウ素化合物、光活性剤若しくは染料、放射性同位体、免疫抑制剤、又はサイトカイン若しくはケモカインなどの免疫調節剤が含まれる。一例では、本発明の分子又は医薬組成物は、複数の注射用及び経口薬物（ラスパラギナーゼ、ビンクリスチン、シトキサン、プレドニゾン、及びドキソルビシン）を組み込む多剤、ＣＨＯＰベースの化学療法プロトコルと組み合わせて投与してもよく、数ヶ月の期間にわたって多かれ少なかれ週単位で与えられる。投与は、本発明の化合物の投与前又は投与後に同時であり得る。

【0250】

本発明はまた、腫瘍成長又は転移を阻害する方法であって、腫瘍細胞を、有効量の本明細書に記載の抗体若しくはその抗原結合部分、又は医薬組成物と接触させることを含む、方法に関する。本方法は、インビトロ、インビボ、又はエクスビボであり得る。

【0251】

本発明はまた、ＣＤ２０を発現する腫瘍細胞を殺傷する方法であって、ＣＤ２０を発現する細胞の殺傷が生じるように、細胞を、本明細書に記載の抗体又は医薬組成物と接触させることを含む、方法に関する。腫瘍細胞は、イヌ腫瘍細胞である。本方法は、インビトロ、インビボ、又はエクスビボであり得る。

【0252】

本明細書に記載の抗体又は医薬組成物を使用して、イヌＣＤ２０を発現する細胞を排除するための方法も提供される。本方法は、インビトロ、インビボ、又はエクスビボであり得る。

【0253】

キット
別の態様では、本発明は、例えば、本明細書に列挙されるような疾患若しくは免疫応答の治療若しくは予防のためのキット、並びに／又は本発明の抗体及び任意選択的に使用説明書を含む、疾患の診断、予後若しくはモニタリングのためのＣＤ２０を検出するためのキットを提供する。そのようなキットは、ＣＤ２０タンパク質の検出を補助するための他の構成成分、包装、説明書、又は材料を含有し得る。キットは、ＣＤ２０に結合する標識された抗体、又はＣＤ２０に結合する抗体及び標識を検出するための１つ以上の化合物を含む結合分子を含み得る。

【0254】

抗体を作製する方法
本明細書に記載される抗体は、ＣＤ２０抗原で刺激するとイヌ抗体を発現するトランスジェニック哺乳動物、例えば、げっ歯類から得ることができる。そのようなげっ歯類は、ＷＯ２００１８／１８９５２０及びＷＯ２０２０／０７４８７４に記載されている。

【0255】

したがって、本明細書に記載される抗体又は断片は、イヌＣＤ２０抗原で刺激すると抗体を発現する哺乳動物、例えば、げっ歯類、例えば、トランスジェニック動物から得ることができる。トランスジェニックげっ歯類、例えば、マウスは、内因性抗体遺伝子を発現する能力が低減してもよい。したがって、一実施形態では、げっ歯類は、内因性軽鎖及び／又は重鎖抗体遺伝子を発現する能力が低減している。したがって、げっ歯類、例えば、マウスは、例えば、以下で更に説明されるように、機能的なマウス軽鎖及び／又は重鎖が産生されないように、内因性カッパ及びラムダ軽鎖及び／又は重鎖抗体遺伝子の発現を破壊するための修飾を含み得る。そのようなトランスジェニックげっ歯類は、当技術分野で記載されており、これは以下の実施例で更に説明される。

【0256】

また、ＣＤ２０に結合することができるイヌ抗体を産生するための方法も本発明の範囲内であり、当該方法は、
ａ）トランスジェニックげっ歯類、例えば、マウスを、ＣＤ２０抗原で免疫化することであって、当該げっ歯類が、非再配列イヌＶ、Ｄ、及びＪ遺伝子を含む核酸構築物を発現する、免疫化することと、
ｂ）イヌ抗体を単離することと、を含む。

【0257】

また、イヌＣＤ２０に結合することができる抗体を産生するための方法も本発明の範囲内であり、当該方法は、
ａ）トランスジェニックげっ歯類、例えば、マウスを、ＣＤ２０抗原で免疫化することであって、当該げっ歯類が、非再配列イヌＶ、Ｄ、及びＪ遺伝子を含む核酸構築物を発現する、免疫化することと、
ｂ）当該げっ歯類、例えば、マウスから重鎖及び軽鎖配列を含む配列のライブラリを生成することと、
ｃ）当該ライブラリから重鎖及び軽鎖配列を含む抗体を単離することと、を含む。

【0258】

更なるステップは、例えば、実施例に示されるような機能的アッセイを使用することによって、ＣＤ２０に結合する抗体を特定することを含み得る。

【0259】

インビトロでの発現ライブラリを使用して、本明細書に記載されるポリペプチド、核酸、宿主細胞、産物、及び組成物を調製又は生成するための方法は、
ａ）アミノ酸配列をコードする核酸配列のセット、コレクション、又はライブラリを提供するステップと、
ｂ）ＣＤ２０に結合し得る／ＣＤ２０に対する親和性を有し得るアミノ酸配列についての当該セット、コレクション、又はライブラリをスクリーニングするステップと、
ｃ）ＣＤ２０に結合し得る／ＣＤ２０に対する親和性を有し得るアミノ酸配列を単離するステップと、を含み得る。

【0260】

上記の方法では、アミノ酸配列のセット、コレクション、又はライブラリは、例えば、スクリーニングを容易にするように、ファージ、ファージミド、リボソーム、又は好適な微生物（酵母など）上に表示され得る。アミノ酸配列（のセット、コレクション、又はライブラリ）を表示及びスクリーニングするための好適な方法、技術、及び宿主生物は、当業者には明白であろう（例えば、Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；１ｓｔ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｏｃｔｏｂｅｒ ２８，１９９６）Ｂｒｉａｎ Ｋ．Ｋａｙ，Ｊｉｌｌ Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊｏｈｎ ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙを参照されたい）。ライブラリ、例えばファージライブラリは、抗原特異的抗体又はその断片を発現する細胞又は組織を単離し、単離された細胞又は組織に由来する抗体又はその断片のｍＲＮＡをコードする配列をクローニングし、ライブラリを使用してコードされたタンパク質を表示することによって生成される。配列は、細菌、酵母、又は他の発現系において発現され得る。

【0261】

別の態様はまた、上記の方法によって得られるか、又は得ることが可能な単離された抗体に関する。

【0262】

他の方法及び使用
別の態様では、本明細書に記載の抗体又はその抗原結合部分は、診断試験及びアッセイなどの非治療目的で使用される。したがって、本発明はまた、イヌＣＤ２０を発現するイヌ細胞を検出するか、又はイヌ対象からの生体試料中のイヌＣＤ２０タンパク質を検出するための方法であって、生体試料を、本明細書に記載の抗体又はその抗原結合部分と接触させることを含み、当該抗体又はその抗原結合部分が、検出可能な標識に連結されている、方法に関する。生体試料は、生検、組織、血液、血清、血漿、又はリンパ液試料であり得る。

【0263】

ある特定の実施形態では、本方法は、試験生体試料中の結合の量を対照生体試料中の結合の量と比較することを含み得、対照生体試料と比較して試験生体試料への増加した結合は、試験生体試料中の１つ以上のリンパ腫細胞の存在を示し得る。いくつかの実施形態では、生体試料は、イヌの血液又は針吸引物である。これらの方法はまた、インビボ及び／又はインビトロのフォーマットでも提供される。

【0264】

診断目的のための抗体の修飾は、当技術分野で周知である。例えば、抗体は、ビオチンなどのリガンド基、又は蛍光基、放射性同位体、若しくは酵素などの検出可能なマーカー基で修飾され得る。本発明の化合物は、診断目的のために使用され得、例えば、従来の技術を使用して標識され得る。好適な検出可能な標識には、フルオロフォア、発色団、放射性原子、高電子密度の試薬、酵素、及び特異的結合パートナーを有するリガンドが含まれるが、これらに限定されない。

【0265】

別の態様では、本明細書に記載の抗体又はその抗原結合部分は、イヌＣＤ２０を発現する細胞又はこれらの結合剤と反応する細胞表面タンパク質を含有する細胞（例えば、Ｂ細胞、Ｂリンパ腫細胞、イヌＣＤ２０）の単離及び／又は特定に使用される。

【0266】

本明細書に記載の抗体又はその抗原結合部分はまた、ＣＤ２０発現のレベルを決定するためのアッセイで使用され得る。次いで、発現のレベルは、塩基（例えば、対照）レベルと相関して、特定の疾患が患者内に存在するかどうか、患者の予後、又は特定の治療レジメンが有効であるかどうかを決定し得る。

【0267】

別途本明細書で定義されない限り、本開示に関連して使用される科学用語及び技術用語は、当業者に一般的に理解される意味を有するものとする。前述の開示は、本開示の範囲内に包含される主題の一般的な説明を提供し、本開示を作製及び使用する方法、並びにその最良のモードを含むが、一方、以下の実施例は、当業者が本開示を実施することを更に可能にするために提供される。しかしながら、当業者であれば、これらの実施例の詳細が本発明を限定するものとして読まれるべきではないことを理解するであろう。本発明の範囲は、本開示に添付された特許請求の範囲及びその等価物から理解されるべきである。本開示の種々の更なる態様及び実施形態は、本開示を考慮して、当業者には明らかであろう。

【0268】

本明細書において言及される全ての文書は、参照により、遺伝子受託番号、科学刊行物、及び特許刊行物への参照文献を含む、その全体が本明細書に組み込まれる。

【0269】

「及び／又は」は、本明細書で使用される場合、他方を伴うか若しくは伴わない２つの特定の特徴又は構成成分の各々の具体的な開示としてみなされるべきである。例えば、「Ａ及び／又はＢ」は、各々が本明細書で個別に記載されるのと同様に、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂ、及び（ｉｉｉ）Ａ及びＢの各々の特定の開示とみなされるべきである。文脈が別途指示しない限り、上記の特徴の説明及び定義は、本発明の任意の特定の態様又は実施形態に限定されず、記載される全ての態様及び実施形態に等しく適用される。

【0270】

本発明は、以下の非限定的な実施例において更に例示される。

【実施例】

【0271】

実施例１：イヌＣＤ２０のクローニング
ＵＣＳＣゲノムブラウザを使用して、ＣＡＭＦＡＭ＿３．１ボクサー参照ゲノムの検索を実施した。ＣＤ２０についてのゲノム配列（ＭＳ４Ａ１）を、ｍＲＮＡ配列ＡＢ２１００８５．１とともにダウンロードした。この配列データを使用して、追加された配列を有するｃＤＮＡからのＣＤ２０の増幅を可能にして、シームレスクローニングを可能にするようにプライマーを設計した。これにより、イヌの血液中のＣＤ２０配列の確認及びｐｉｇｇｙＢａｃクローニングベクターへのシームレスクローニングが可能になった。

【0272】

イヌＣＤ２０ ｍＲＮＡの単離及びｃＤＮＡの生成
ビーグル全血をＥｎｖｉｇｏ ＲＭＳ（Ａｌｃｏｎｂｕｒｙ，Ｈｕｎｔｉｎｇｄｏｎ，ＵＫ）によって供給し、ＰＢＭＣをＦｉｃｏｌｌ勾配を使用して単離した。簡潔に述べると、１０ｍｌの全血を２５ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈し、１５ｍｌのＦｉｃｏｌｌ Ｐａｑｕｅ Ｐｌｕｓ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）上に層状にした後、８００ｒｃｆで１０分間、室温でゆっくりと加速し、ブレーキなしで遠心分離した。相間ディスクをＰＢＳ中に収集した。全ＲＮＡを、ＱＩＡＧＥＮ ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ，ＤＥ）及びオンカラムＤＮＡｓｅ消化による標準的な手順でＰＢＭＣから単離した。ｃＤＮＡ生成を、標準的な手順に従って、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＶ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ及びアンカーされたオリゴｄＴプライマー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳ）を使用して行った。

【0273】

細胞発現のための全長イヌＣＤ２０のヌクレオチド及びアミノ酸配列を以下に示す。
ヌクレオチド：
ＡＴＧＡＣＡＡＣＡＣＣＣＡＧＡＡＡＴＴＣＡＡＴＧＡＧＴＧＧＡＡＣＴＣＴＣＣＣＧＧＴＡＧＡＴＣＣＴＡＴＧＡＡＡＡＧＣＣＣＴＡＣＴＧＣＣＡＴＧＴＡＴＣＣＴＧＴＴＣＡＡＡＡＡＡＴＡＡＴＴＣＣＣＡＡＡＡＧＧＡＴＧＣＣＴＴＣＡＧＴＧＧＴＧＧＧＣＣＣＴＡＣＡＣＡＡＡＡＣＴＴＣＴＴＣＡＴＧＡＧＧＧＡＡＴＣＴＡＡＧＡＣＡＣＴＧＧＧＧＧＣＴＧＴＣＣＡＧＡＴＴＡＴＧＡＡＴＧＧＧＣＴＣＴＴＣＣＡＣＡＴＴＧＣＣＣＴＡＧＧＣＡＧＣＣＴＣＣＴＧＡＴＧＡＴＴＣＡＣＡＣＧＧＡＴＧＴＣＴＡＴＧＣＧＣＣＣＡＴＣＴＧＴＡＴＡＡＣＴＡＴＧＴＧＧＴＡＣＣＣＴＣＴＣＴＧＧＧＧＡＧＧＣＡＴＴＡＴＧＴＴＣＡＴＣＡＴＴＴＣＴＧＧＡＴＣＡＣＴＣＣＴＧＧＣＡＧＣＡＧＣＧＧＡＣＡＡＡＡＡＣＣＣＣＡＧＧＡＡＧＡＧＴＴＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＡＡＡＡＡＴＧＡＴＡＡＴＧＡＡＣＴＣＡＴＴＧＡＧＣＣＴＣＴＴＴＧＣＴＧＣＴＡＴＴＴＣＴＧＧＡＡＴＡＡＴＴＴＴＴＴＴＧＡＴＣＡＴＧＧＡＣＡＴＡＴＴＴＡＡＴＡＴＴＡＣＣＡＴＴＴＣＣＣＡＴＴＴＴＴＴＴＡＡＡＡＴＧＧＡＧＡＡＴＴＴＧＡＡＴＣＴＴＡＴＴＡＡＡＧＣＴＣＣＣＡＴＧＣＣＡＴＡＴＧＴＴＧＡＣＡＴＡＣＡＣＡＡＣＴＧＴＧＡＣＣＣＡＧＣＴＡＡＣＣＣＣＴＣＴＧＡＧＡＡＡＡＡＣＴＣＴＴＴＡＴＣＴＡＴＡＣＡＡＴＡＴＴＧＴＧＧＣＡＧＣＡＴＡＣＧＡＴＣＴＧＴＴＴＴＣＴＴＧＧＧＣＧＴＴＴＴＴＧＣＴＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＣＴＴＴＡＣＣＴＴＴＴＴＣＣＡＧＡＡＡＣＴＴＧＴＧＡＣＡＧＣＴＧＧＣＡＴＴＧＴＴＧＡＧＡＡＴＧＡＡＴＧＧＡＡＡＡＡＡＣＴＧＴＧＣＴＣＴＡＡＡＣＣＴＡＡＡＴＣＴＧＡＴＧＴＡＧＴＴＧＴＴＣＴＧＴＴＡＧＣＴＧＣＴＧＡＡＧＡＡＡＡＡＡＡＡＧＡＡＣＡＧＣＣＧＡＴＴＧＡＡＡＣＡＡＣＡＧＡＡＧＡＡＡＴＧＧＴＴＧＡＧＣＴＧＡＣＴＧＡＡＡＴＡＧＣＴＴＣＣＣＡＡＣＣＡＡＡＧＡＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＣＡＴＴＧＡＡＡＴＴＡＴＴＣＣＡＧＴＣＣＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＧＧＡＡＣＴＧＧＡＡＡＴＡＡＡＣＴＴＴＧＣＡＧＡＡＣＣＴＣＣＣＣＡＧＧＡＧＣＡＧＧＡＡＴＣＴＴＣＡＣＣＡＡＴＡＧＡＡＡＡＣＧＡＣＡＧＣＡＴＣＣＣＴＴＡＡ（配列番号１）
タンパク質：
ＭＴＴＰＲＮＳＭＳＧＴＬＰＶＤＰＭＫＳＰＴＡＭＹＰＶＱＫＩＩＰＫＲＭＰＳＶＶＧＰＴＱＮＦＦＭＲＥＳＫＴＬＧＡＶＱＩＭＮＧＬＦＨＩＡＬＧＳＬＬＭＩＨＴＤＶＹＡＰＩＣＩＴＭＷＹＰＬＷＧＧＩＭＦＩＩＳＧＳＬＬＡＡＡＤＫＮＰＲＫＳＬＶＫＧＫＭＩＭＮＳＬＳＬＦＡＡＩＳＧＩＩＦＬＩＭＤＩＦＮＩＴＩＳＨＦＦＫＭＥＮＬＮＬＩＫＡＰＭＰＹＶＤＩＨＮＣＤＰＡＮＰＳＥＫＮＳＬＳＩＱＹＣＧＳＩＲＳＶＦＬＧＶＦＡＶＭＶＩＦＴＦＦＱＫＬＶＴＡＧＩＶＥＮＥＷＫＫＬＣＳＫＰＫＳＤＶＶＶＬＬＡＡＥＥＫＫＥＱＰＩＥＴＴＥＥＭＶＥＬＴＥＩＡＳＱＰＫＫＥＥＤＩＥＩＩＰＶＱＥＥＥＥＥＬＥＩＮＦＡＥＰＰＱＥＱＥＳＳＰＩＥＮＤＳＩＰ（配列番号２）

【0274】

実施例２：イヌＣＤ２０の発現
ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞を、５％のＣＯ_２とともに、３７℃で、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中の単層として、９０ｍｍの円形組織培養プレート上で成長させた。ＨＥＫ２９３細胞を、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ ＭＡＸ：４０ｋＤａ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．、Ｅｐｐｅｌｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、ＣＤ２０ ｃＤＮＡ及びＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼと共トランスフェクションした。３０μｌのＰＥＩ ＭＡＸ（１ｍｇ ｍｌ^－１）、５μｇのｃＤＮＡ、及び１ｍｌのＤＭＥＭ／Ｆ１２を室温で１０分間インキュベーションし、７０～８０％のコンフルエントＨＥＫ２９３細胞の９０ｍｍプレートに滴加し、使用前に２日間インキュベーションした。安定してトランスフェクションされた細胞を、４８時間後に、好適な抗生物質を使用して選択した。

【0275】

マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）を、５％のＣＯ_２とともに、３７℃で、１０％のＦＢＳ、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、０．５ｍＭのβ－メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）、及び１％のＭＥＭ非必須アミノ酸（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を補充したＤＭＥＭ高グルコース（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中の単層として、９０ｍｍの円形組織培養プレート上で成長させた。細胞を、製造業者の推奨される説明書に従って、ＰＬＵＳ（商標）試薬を伴うＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、ＣＤ２０ ｃＤＮＡ及びＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼでトランスフェクションした。安定してトランスフェクションされた細胞を、４８時間後に、好適な抗生物質を使用して選択した。

【0276】

ＭＤＣＫ ＩＩ（Ｍａｄｉｎ－Ｄａｒｂｙイヌ腎臓）細胞を、５％のＣＯ２とともに、３７℃で、１０％のＦＢＳ、及び１％のＭＥＭ非必須アミノ酸（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を補充したＤＭＥＭ高グルコース（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中の単層として、表面処理された組織培養フラスコ（Ｔ２５／Ｔ７５／Ｔ１７５）上で成長させた。ＭＤＣＫ ＩＩ細胞を、推奨されるプロトコルに従って、ＰＬＵＳ（商標）試薬を伴うＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＬＴＸ試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、野生型又は変異体のイヌＣＤ２０ ｃＤＮＡ及びｐｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼと共トランスフェクションした。

【0277】

実施例３：ＤＮＡ及びＭＥＦを使用するマウスモデルの免疫化
例えば、ＷＯ２０１８／１８９５２０及びＷＯ２０２０／０７４８７４に実質的に記載されるように、Ｋｙ９（商標）マウスを免疫化した。トランスジェニックマウスは、イヌ免疫グロブリン可変遺伝子レパートリーをマウスゲノムの対応する遺伝子座に挿入することによって修飾されている。これにより、マウス定常領域（重鎖及びカッパ鎖の場合）又はイヌ定常領域（ラムダ鎖の場合）と組み合わせて、マウスにおけるイヌＤＮＡの発現に由来する可変抗体領域を含む抗体の産生が可能になる。そのようなキメラ抗体鎖の可変領域に関する情報、又はそのようなキメラ抗体鎖の可変領域を含む核酸は、完全イヌ抗体を生成するために使用され得る。

【0278】

ＤＮＡ免疫化のために、水力学的尾静脈注射（ＨＴＶＩ）を使用してプライム及びブーストレジームを実行し、組織を採取した。細胞ベースの免疫化のために、ＣＤ２０を安定して発現するＭＥＦ細胞を使用するプライム及びブーストレジームを実行し、組織を採取した。更なる免疫化レジームを、ＣＤ２０発現ＭＥＦ細胞ブースターと組み合わせたプライムに対するＨＴＶＩ ＤＮＡ免疫化を使用して実行した。

【0279】

血清力価の決定：
免疫化の前及びその後の各ブーストの１０日後に、マウスを出血させた。血清を、マイクロベット（ｍｉｃｒｏｖｅｔｔｅ）２００ Ｚゲルチューブ（Ｓｔａｒｓｔｅｄｔ ＡＧ＆Ｃｏ．ＫＧ、Ｇｅｒｍａｎｙ）中での遠心分離によって凝固血液から分離し、イヌＣＤ２０に対する抗体価をフローサイトメトリーによって評価した。血清を、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ＋３％のＦＢＳ）中で１：１０で連続希釈し、細胞の安定して発現するイヌＣＤ２０、又はイヌＣＤ２０陰性対照細胞に添加した。イヌＣＤ２０に対するマウス抗体を、ＢＢ７００コンジュゲート（ＢＤ Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ（商標）Ｂｌｕｅ７００、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）又はアイソタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂに対するＦＩＴＣコンジュゲート二次モノクローナル抗体（ＢＤ ＯｐｔｉＢｕｉｌｄ（商標）、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）のいずれかで検出した。ＢＤ Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６フローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ＮＪ，ＵＳＡ）又はＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＣｙｔｏＦＬＥＸを使用してデータを取得した。免疫化前の血清を使用して背景を決定した。抗体価を、背景を超えて陽性シグナルを示した最高希釈として決定した。図１は、５匹の免疫化されたＫｙ９マウスの抗体価を示す。

【0280】

実施例４：抗体産生細胞の単離、抗体配列決定、選択及び配列修飾
組織単離：マウスから脾臓、リンパ節及び骨髄を採取した。脾臓を断片に切断し、４０μｍの細胞ストレーナー（Ｆａｌｃｏｎ）を通してそれらをマッシュすることによって、氷上のＲＰＭＩ－１６４０（Ｌｏｎｚａ、Ｂａｓｅｌ，ＣＨ）＋１０％のＦＢＳですすぎながら、脾細胞を調製した。一般にプールされる脾臓及びリンパ節細胞を有するリンパ節からのリンパ球について、同様のプロセスを使用した。骨髄を、ＲＰＭＩ－１６４０で予め湿らせた４０μｍの細胞ストレーナーを通して、２５ゲージの針を使用してＲＰＭＩ－１６４０で骨髄を洗い流すことによって、大腿骨及び脛骨から採取した。全ての細胞型を３００ｇで５分間ペレット化し、フロー選別のために直接使用するか、又は－１５０℃で凍結する前にＦＢＳ＋１０％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に再懸濁した。

【0281】

細胞選別：一般に、抗原特異的脾臓Ｂ細胞は、細胞表面上で膜貫通抗体を優位的に発現するため、標識された抗原タンパク質プローブ（例えば、細胞外ドメイン）又は抗原ＶＬＰによって捕捉することができる。他方では、抗原特異的形質芽球又は形質細胞は、分泌抗体の優位な発現のために、タンパク質プローブ又はＶＬＰによって標識されにくいと考えられている。したがって、脾臓リンパ節試料又は骨髄から単離された形質芽球及び形質細胞を、これらの集団の抗原特異的サブセットを単離するために抗原プローブを使用することなく、抗体配列回収の次のステップに進めた。ＣＤ１３８及びＣＤ２６７（ＴＡＣＩ）の細胞表面共発現を使用して、形質芽球及び形質細胞の集団を特定した。１０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｃｈｒｏｍｉｕｍ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｅ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇのための形質芽球及び形質細胞のバルク選別のために、ＣＤ１３８形質細胞濃縮キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ｂｉｏｔｅｃｈ ＵＫ）を使用して、これらの希少細胞を濃縮した。脾臓及びリンパ節細胞からの抗原特異的細胞選別の前に、Ｂ細胞濃縮を、製造業者の説明書に従ってマウス汎Ｂ細胞単離キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＵＫ）を使用するか、又は製造業者の説明書に従って社内ビオチン化抗体カクテル及びストレプトアビジン急流球（ｒａｐｉｄｓｐｈｅｒｅｓ）（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＵＫ）を使用して行った。

【0282】

次いで、ＣＤ１９、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＣＤ１３８及びＣＤ２６７（ＴＡＣＩ）を含むマーカーを使用して、免疫化に応答する細胞内で濃縮されたアイソタイプスイッチＢ細胞を特定する。この集団内で、抗原特異的細胞を、その表面上に標的抗原を発現する標識されたタンパク質プローブ又はＶＬＰで染色し、フロー選別することによって捕捉することができる。ＶＬＰは、ＣＤ２０で安定してトランスフェクションされたＨＥＫ細胞から生成され、レトロウイルスｇａｇタンパク質はＥＧＦＰに融合し、ｇａｇ発現は、細胞からのＶＬＰ出芽を可能にし、ＥＧＦＰは、蛍光検出のためにＶＬＰを標識する。ＶＬＰ上の表面抗原は、精製又は修飾の任意のステップなしに組換え細胞から直接発現され、天然形態で提示される。チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）又はマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）などの他の哺乳動物細胞株も、ＶＬＰ産生に使用することができる。望ましくない細胞集団及び死細胞を特定するためのマーカー（Ｆ４／８０、Ｌｙ－６Ｃ／Ｇ、ＣＤ８ａ、ＣＤ４、ＣＤ１１ｃ、７ＡＡＤ、又はゾンビ－ＮＩＲ／ＦＶＤ ＥＦ７８０）は、これらの細胞を選別手順から除外するために、全ての染色パネルに含まれる。

【0283】

次世代配列決定及び候補の選択：
選別された細胞を、製造業者の説明書に従って、１０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｃｈｒｏｍｉｕｍ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｅ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇシステム及びＶ（Ｄ）Ｊキット（１０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）を使用して抗体プロファイリングのために調製した。１０Ｘについては、１０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓからの説明書に従って様々なＩｌｌｕｍｉｎａプラットフォーム機器を使用する。ｐＲＥＳＴＯ／Ｃｈａｎｇｅ－Ｏ（Ｙａｌｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）／ＩｇＢｌａｓｔ（ＮＣＢＩ、ＵＳＡ）／Ｅｎｃｌｏｎｅ（１０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）ソフトウェアに基づくカスタムツールを使用して配列を分析し、生殖細胞系配列及び超変異を予測する。

【0284】

可変免疫グロブリン領域は、重鎖遺伝子のための免疫グロブリンヌクレオチド配列のＶＤＪ領域、並びにＩｇκ及びＩｇλのための免疫グロブリンヌクレオチド配列のＶＪ領域を含む。クローンファミリー内には、免疫グロブリン遺伝子組換え及び体細胞超変異中に生じる、それらのＶ（Ｄ）Ｊセグメント内で共有された変異を有するサブファミリーがある。特有のＶ（Ｄ）Ｊセグメント使用を示す異なるクローンファミリーは、通常、異なる結合特徴を示す。組換え及び超変異中、抗体が抗原に対してより高い親和性を有する細胞が選択される。親和性は通常、更なる変異とともに増加し、例えば、クラスター化されたファミリーは、ＷＯ２０１５／０４０４０１の図６に示される。

【0285】

クローンファミリーは、一般に、２つ以上のクローン細胞の関連する免疫グロブリン重鎖及び軽鎖Ｖ（Ｄ）Ｊ配列によって定義される。関連する免疫グロブリンＶ（Ｄ）Ｊ配列は、Ｖ及びＪ遺伝子セグメントのそれらの共有される使用によって特定され得る。選別されたＡｇ特異的単一Ｂ細胞の抗体配列の分析の例は、ＷＯ２０１５／０４０４０１の図５に示され、重鎖Ｖ遺伝子ファミリーの使用によって配列され、クラスター化されて表示された系統樹を生成する抗体配列を示す。これらのような系統樹から候補クローンを選択する。

【0286】

例えば、抗イヌＣＤ２０ ｍＡｂ ＰＭＸ００１、ＰＭＸ００２、ＰＭＸ００３、ＰＭＸ００４、及びＰＭＸ００５は全て、同じ重鎖Ｖ遺伝子（ｃＩＧＨＶ３－５）、重鎖Ｊ遺伝子（ｃＩＧＨＪ４、配列番号７５に与えられる生殖細胞系配列を有する）、軽鎖Ｖ遺伝子（ｃＩＧＬＶ３－３）、及び軽鎖Ｊ遺伝子（ｃＩＧＬＪ３、配列番号７７に与えられる生殖細胞系配列を有する）によってコードされる。ＰＭＸ００１可変領域配列は、イヌＣＤ２０免疫化Ｋｙ９マウスから最初に特定された。それは、対応するアミノ酸配列（配列番号４）をコードする重鎖可変領域ヌクレオチド配列（配列番号３）、及び対応するアミノ酸配列（配列番号６）をコードする軽鎖可変領域ヌクレオチド配列（配列番号５）を有する。生殖細胞系配列（配列番号７４）と比較して、重鎖可変配列には２個のアミノ酸変化があり、生殖細胞系配列（配列番号７６）と比較して、軽鎖可変配列には３個のアミノ酸変化がある。重鎖可変領域のＣＤＲ１（配列番号７）、ＣＤＲ２（配列番号８）、及びＣＤＲ３（配列番号９）、並びに軽鎖可変領域のＣＤＲ１（配列番号１０）、ＣＤＲ２（配列番号１１）、及びＣＤＲ３（配列番号１２）は、ＩＭＧＴ Ｖ－ＱＵＥＳＴ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ＩＭＧＴ＿ｖｑｕｅｓｔ／ｉｎｐｕｔ）を使用して予測される。ＰＭＸ ｍＡｂの重鎖及び軽鎖のＣＤＲ３領域は、それぞれ、長さが５ａａ及び９ａａである。

【0287】

ＰＭＸ００１ ｍＡｂのＨｉｔ拡大を、後に、全てのイヌＣＤ２０免疫化マウスにおいて実行し、重鎖及び軽鎖の両方について同じＶＪ遺伝子使用及びＣＤＲ３長を共有する候補を、更なるスクリーニングのために選択した。ＰＭＸ００１ ｍＡｂと比較して、更なる変異が配列で生じ得る。例えば、ＰＭＸ００２、ＰＭＸ００３、ＰＭＸ００４、及びＰＭＸ００５ ｍＡｂは、他の免疫化コホートから選択され、したがって、ＰＭＸ００１ ｍＡｂが特定されたマウスとは異なる。それは、成功した遺伝子再配列の収束的な選択を示す。

【0288】

ＰＭＸ００２ ｍＡｂは、対応するアミノ酸配列（配列番号１４）をコードする重鎖可変領域ヌクレオチド配列（配列番号１３）、及び対応するアミノ酸配列（配列番号１６）をコードする軽鎖可変領域ヌクレオチド配列（配列番号１５）を有する。生殖細胞系配列（配列番号７４）と比較して、重鎖可変配列には１０個のアミノ酸変化があり、軽鎖可変配列（配列番号７６）にはアミノ酸変化はない。重鎖可変領域のＣＤＲ１（配列番号１７）、ＣＤＲ２（配列番号１８）、及びＣＤＲ３（配列番号１９）、並びに軽鎖可変領域のＣＤＲ１（配列番号２０）、ＣＤＲ２（配列番号２１）、及びＣＤＲ３（配列番号２２）は、ＩＭＧＴ Ｖ－ＱＵＥＳＴを使用して予測される。

【0289】

ＰＭＸ００３ｍＡｂは、対応するアミノ酸配列（配列番号２４）をコードする重鎖可変領域ヌクレオチド配列（配列番号２３）、及び対応するアミノ酸配列（配列番号２６）をコードする軽鎖可変領域ヌクレオチド配列（配列番号２５）を有する。生殖細胞系配列（配列番号７４）と比較して、重鎖可変配列には５個のアミノ酸変化があり、軽鎖可変配列（配列番号７６）には１個のアミノ酸変化がある。重鎖可変領域のＣＤＲ１（配列番号２７）、ＣＤＲ２（配列番号２８）、及びＣＤＲ３（配列番号２９）、並びに軽鎖可変領域のＣＤＲ１（配列番号３０）、ＣＤＲ２（配列番号３１）、及びＣＤＲ３（配列番号３２）は、ＩＭＧＴ Ｖ－ＱＵＥＳＴを使用して予測される。

【0290】

ＰＭＸ００４ ｍＡｂは、対応するアミノ酸配列（配列番号３４）をコードする重鎖可変領域ヌクレオチド配列（配列番号３３）、及び対応するアミノ酸配列（配列番号３６）をコードする軽鎖可変領域ヌクレオチド配列（配列番号３５）を有する。生殖細胞系配列（配列番号７４）と比較して、重鎖可変配列には１２個のアミノ酸変化があり、軽鎖可変配列（配列番号７６）にはアミノ酸変化はない。重鎖可変領域のＣＤＲ１（配列番号３７）、ＣＤＲ２（配列番号３８）、及びＣＤＲ３（配列番号３９）、並びに軽鎖可変領域のＣＤＲ１（配列番号４０）、ＣＤＲ２（配列番号４１）、及びＣＤＲ３（配列番号４２）は、ＩＭＧＴ Ｖ－ＱＵＥＳＴを使用して予測される。

【0291】

ＰＭＸ００５ ｍＡｂは、対応するアミノ酸配列（配列番号４４）をコードする重鎖可変領域ヌクレオチド配列（配列番号４３）、及び対応するアミノ酸配列（配列番号４６）をコードする軽鎖可変領域ヌクレオチド配列（配列番号４５）を有する。生殖細胞系配列（配列番号７４）と比較して、重鎖可変配列には４個のアミノ酸変化があり、軽鎖可変配列（配列番号７６）にはアミノ酸変化はない。重鎖可変領域のＣＤＲ１（配列番号４７）、ＣＤＲ２（配列番号４８）、及びＣＤＲ３（配列番号４９）、並びに軽鎖可変領域のＣＤＲ１（配列番号５０）、ＣＤＲ２（配列番号５１）、及びＣＤＲ３（配列番号５２）は、ＩＭＧＴ Ｖ－ＱＵＥＳＴを使用して予測される。

【0292】

図２は、ＰＭＸ抗体配列のアライメントを示す。

【0293】

配列修飾
ＰＭＸ００３（配列番号２６）の軽鎖のフレームワーク領域１（ＦＲ１）は、タンパク質のアスパラギン連結グリコシル化のためのコンセンサス配列であるＮＶＴシークオンを含有する。この部位に結合したグリカンを除去するために、ＰＭＸ００３ ｍＡｂのＦＲ１内のＮＶＴシークオンを、ＰＭＸ００６ ｍＡｂについてはＱＶＴ、ＰＭＸ００７ ｍＡｂについてはＡＶＴ、ＰＭＸ００８ ｍＡｂについてはＥＶＴ、ＰＭＸ００９ ｍＡｂについてはＮＶＡ、ＰＭＸ０１０ ｍＡｂについてはＳＶＴ、及びＰＭＸ０１１ ｍＡｂについてはＴＶＴに変異させた。

【0294】

ＰＭＸ００６ ｍＡｂ（配列番号５３）、ＰＭＸ００７ ｍＡｂ（配列番号５４）、ＰＭＸ００８ ｍＡｂ（配列番号５５）、ＰＭＸ００９ ｍＡｂ（配列番号５６）、ＰＭＸ０１０ ｍＡｂ（配列番号５７）、ＰＭＸ０１１ ｍＡｂ（配列番号５８）の得られた軽鎖可変領域アミノ酸配列、及びＰＭＸ００３（配列番号５９）、ＰＭＸ００６ ｍＡｂ（配列番号６０）、ＰＭＸ００７ ｍＡｂ（配列番号６１）、ＰＭＸ００８ ｍＡｂ（配列番号６２）、ＰＭＸ００９ ｍＡｂ（配列番号６３）、ＰＭＸ０１０ ｍＡｂ（配列番号６４）、ＰＭＸ０１１ ｍＡｂ（配列番号６５）のＦＲ１配列は、配列表に列挙されている。

【0295】

ＰＭＸ０６６（配列番号８１）、ＰＭＸ００６７（配列番号９１）、ＰＭＸ０６８（配列番号１０１）、ＰＭＸ００６９（配列番号１１１）、ＰＭＸ０７１（配列番号１３１）、ＰＭＸ０７２（配列番号１４１）、ＰＭＸ０７３（配列番号１５１）、ＰＭＸ０７４（配列番号１６１）、ＰＭＸ０７６（配列番号１８１）、ＰＭＸ０７７（配列番号１９１）、ＰＭＸ０７８（配列番号２０１）、ＰＭＸ０７９（配列番号２１１）、ＰＭＸ０８１（配列番号２３１）の軽鎖のフレームワーク領域１（ＦＲ１）は、ＮＶＴシークオンを含有する。この部位に結合したグリカンを除去するために、ＰＭＸ０６６、ＰＭＸ００６７、ＰＭＸ０６８、ＰＭＸ００６９、ＰＭＸ０７１、ＰＭＸ０７２、ＰＭＸ０７３、ＰＭＸ０７４、ＰＭＸ０７６、ＰＭＸ０７７、ＰＭＸ０７８、ＰＭＸ０７９、ＰＭＸ０８１ ｍＡｂのＦＲ１におけるＮＶＴシークオンをＳＶＴに変異させて、得られた軽鎖可変領域アミノ酸配列ＰＭＸ１１２（配列番号２３８）、ＰＭＸ１１３（配列番号２３９）、ＰＭＸ１１４（配列番号２４０）、ＰＭＸ１１５（配列番号２４１）、ＰＭＸ１１６（配列番号２４２）、ＰＭＸ１１７（配列番号２４３）、ＰＭＸ１１８（配列番号２４４）、ＰＭＸ１１９（配列番号２４５）、ＰＭＸ１２０（配列番号２４６）、ＰＭＸ１２１（配列番号２４７）、ＰＭＸ１２２（配列番号２４８）、ＰＭＸ１２３（配列番号２４９）、及びＰＭＸ１２４（配列番号２５０）をそれぞれ生成した。配列は表２に列挙されている。いくつかの抗体は、グリカンが抗体に結合されることをもたらさない、天然に存在する配列モチーフを含む。例えば、ＰＭＸ０７０及びＰＭＸ０７５は、軽鎖のＦＲ１における配列モチーフＳＶＴを含み、ＰＭＸ０８０は、軽鎖のＦＲ１における配列モチーフＴＶＴを含む。

【0296】

実施例５：単一細胞からのモノクローナル抗体の生成
選択された候補クローンの重鎖及び軽鎖Ｖ（Ｄ）Ｊ配列を合成し、それぞれ、イヌＩｇＧ定常領域及びイヌＩＧＫ又はＩＧＬ定常領域のゲノム配列を含有する発現ベクターにクローニングする。例えば、ＰＭＸ００１～ＰＭＸ００５可変配列を、イヌＩＧＧＢ（配列番号６６）及びイヌＩＧＬＣ５定常領域（配列番号６７）をコードするベクターにクローニングした。重鎖及び軽鎖をコードする発現ベクターを、ＣＨＯ細胞などの好適な哺乳類細胞株に共トランスフェクションして、安定した発現を得た。したがって、完全イヌ配列抗体を生成した。

【0297】

ＣＨＯ細胞における発現を容易にするために、例えば、ＰＭＸ００３ ｍＡｂの重鎖可変領域（配列番号６８）及び軽鎖可変領域（配列番号６９）のヌクレオチド配列に対して、コドン最適化を実行することができる。Ｃａｍｐａｔｈリーダー（配列番号７０）（ＵＳ８，３６２．２０８Ｂ２を参照されたい）は、ＰＭＸ００１～ＰＭＸ００５ ｍＡｂの天然リーダー（重鎖の場合は配列番号７１、軽鎖の場合は配列番号７２）を置き換えるために導入することができる。

【0298】

モノクローナル抗体１Ｅ４及び４Ｅ１－７もまた発現させた。１Ｅ４ヌクレオチド配列は、ＷＯ２０１３／０６３１８６から入手した。４Ｅ１－７アミノ酸配列は、Ｍｉｚｕｎｏ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ，１０，Ａｒｔｉｃｌｅ １１４７６（２０２０）（ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１５９８－０２０－６８４７０－９）から入手した。両方の抗体の可変領域を、イヌＩＧＧＢ（配列番号６６）及びイヌＩＧＫ（配列番号７３）定常領域をコードするベクターにクローニングした。リツキシマブ－ｃＩＧＧＢ対照ｍＡｂを、可変領域配列を合成することによって生成し（ＵＳ５，７３６，１３７を参照されたい）、イヌＩＧＧＢ（配列番号６６）及びイヌＩＧＬＣ５（配列番号６７）定常領域をコードするベクターにクローニングした。

【0299】

抗体のＦｃ部分に結合したＮ連結グリカン上のコアフコースは、Ｆｃ受容体と抗体のＦｃ領域との結合に影響を及ぼし、したがってＡＤＣＣ活性を低減させる可能性がある。ＡＤＣＣ殺傷活性を向上させるために、Ｙａｍａｎｅ－Ｏｈｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．２００４ Ｓｅｐ ５；８７（５）：６１４－２２．ｈｔｔｐｓ：／／ｐｕｂｍｅｄ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／１５３５２０５９／）に記載されるように、Ｆｕｔ８コード遺伝子のエクソン２を欠失させることにより、Ｆｕｔ８ノックアウト（ＫＯ）ＣＨＯ細胞をプールされたフォーマットにおいて生成した。ＫＯ細胞を、ＬＣＡ染色を使用して表現型的に選択した。

【0300】

抗体産生のために、６×１０^６個の選択されたＣＨＯ細胞又はＦｕｔ８ノックアウトＣＨＯ細胞を３ｍｌの培養培地中に播種し、２００ｒｐｍで振盪しながら３２℃、８％のＣＯ_２でインキュベーションした。４％のＨｙＣｌｏｎｅ Ｃｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ ７ａサプリメント＋０．４％のＨｙＣｌｏｎｅ Ｃｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ ７ｂサプリメント＋１％のグルコースを１、４、７、及び１０日目に培地に添加した。培養上清を１２日目に収集し、表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋ、Ｃｙｔｉｖａ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してＩｇＧ濃度を決定した。

【0301】

実施例６：結合アッセイ
フローサイトメトリーベースのアッセイ：
ＨＥＫ２９３細胞又はＭＤＣＫ ＩＩ細胞を、イヌＣＤ２０ ｃＤＮＡの全長をコードするベクターで安定してトランスフェクションした。フローサイトメトリーを使用して、これらの細胞に対する抗体の結合を評価した。要約すると、１～２×１０^５個のイヌＣＤ２０発現細胞を、結合アッセイのために１μｇ／ｍｌ又は１０μｇ／ｍｌの固定濃度で、及び親和性決定のためにある範囲の濃度（３０μｇ／ｍｌで開始する１２点１：２の連続希釈抗体、すなわち２００ｎＭ）で、＋４℃で１時間、候補ｍＡｂとともにインキュベーションし、続いて、５μｇ／ｍｌのＦＩＴＣコンジュゲート抗イヌＩｇＧ二次抗体（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で＋４℃で１時間インキュベーションした。抗イヌＩｇＧ ＦＩＴＣ二次抗体でインキュベーションされ、一次抗イヌＣＤ２０抗体なし、又はアイソタイプ対照一次抗体でインキュベーションされた細胞を陰性対照として使用した。データは、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＣｙｔｏＦＬＥＸ又はＢＤ Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６ Ｐｌｕｓフローサイトメーターのいずれかで取得し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して分析した。親和性決定のために、染色細胞を洗浄し、候補抗体とのインキュベーション後に、１％のパラホルムアルデヒド／３％のＦＢＳ／ＰＢＳで１５分間固定し、フローサイトメーターでのデータ取得前に、二次抗体とのインキュベーション後２４時間、再び固定した。抗体の濃度に対するＦＩＴＣチャネルの平均蛍光強度（ＭＦＩ）値を使用するグラフを、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（図３Ｄ）においてプロットした。細胞表面のイヌＣＤ２０に対する候補抗体の結合の見かけの親和性（Ｋｄ）を、ＣＤ２０発現細胞の５０％を染色したときの濃度、すなわち結合のＥＣ５０として、対数（アゴニスト）対応答－可変勾配（４つのパラメータ）についての方程式を使用して決定した。

【0302】

結合アッセイの結果を図３Ａ～Ｃに示す。これらは、ＰＭＸ抗体が、４Ｅ１－７抗体と等価であるＰＭＸ００２を除いて、単一濃度点（１０ｕｇ／ｍｌ）において、試験抗体１Ｅ４及び４Ｅ１－７よりも強いイヌＣＤ２０への結合能力を有したことを示す。

【0303】

ＥＬＩＳＡベースのアッセイ：
以下に記載のイヌＣＤ２０タンパク質の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）の大ループは、ＣＨＯ細胞において発現され、タンパク質Ａカラムを使用して精製する前に、ＣＡＧプロモーターの制御下で細胞外培地に分泌される。

【0304】

ＣＤ２０ ＥＣＤタンパク質をアッセイプレートにコーティングする。抗体をある範囲の濃度で添加し、ＥＬＩＳＡを使用して結合能力を決定する。

【0305】

ＳＰＲベースのアッセイ：
抗イヌＣＤ２０ ｍＡｂの親和性（Ｋ_ｄ）は、組換えマウスＦｃタグ付きＣＤ２０細胞外ドメインを使用して、ＳＰＲによって測定することができる。

【0306】

ｄＣＤ２０ＬＬ－Ｆｃと呼ばれるＣＤ２０の組換え細胞外ドメイン（ＥＣＤ）（大ループ）（ＷＯ２０１３／０６３１８６、３７ページ、配列番号６２を参照されたい）を、安定したＣＨＯ細胞からのマウスＩｇＧ２ａ Ｆｃタグを用いて分泌形態において発現させ、タンパク質Ａクロマトグラフィーを使用して、清澄化された上清から精製する。相互作用の二価アビディティに対応する見かけのＫ_ｄは、フローセル１にＮＨＳ／ＥＤＣ活性化／非活性化を加えたＣＭ５チップのフローセル２上にｄＣＤ２０ＬＬ－Ｆｃの１００～１５０ＲＵをアミンカップリングさせることによって導出される。ＨＢＳ－ＥＰ＋緩衝液中で候補ＩｇＧの２００ｎＭ～０．１ｎＭの濃度からの３倍希釈を行い、チップ表面上に３０μＬ／分で１８０秒間注射する。解離を３０μＬ／分で６００秒間モニタリングした後、１０ｍＭのグリシン－ＨＣｌ ｐＨ２．０の６０秒間のパルスで表面を再生成する。一価親和性に対応する一価Ｋ_ｄは、全長ＩｇＧのパパイン（又はＳｐｅＢ）消化によって生成された候補抗体Ｆａｂ断片を使用して上記のプロトコルを反復することによって導出される。実験を、ＨＢＳ－ＥＰ＋流動用緩衝液中で２５℃で実施する。全てのＳＰＲ実験をＢｉａｃｏｒｅ ８Ｋ機器上で行い、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｉｎｓｉｇｈｔ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを使用して、データを１：１の結合モデルに適合させることによってデータを分析した。

【0307】

実施例７：機能的アッセイ
補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性
イヌＣＤ２０を天然に発現するＣＬＢＬ－１イヌリンパ腫腫瘍細胞株（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｖｉｅｎｎａ）を、ＣＤＣアッセイの標的細胞株として使用した。９６ウェルプレート（透明底を有する白色）のウェル当たり１０，０００個のＣＬＢＬ－１細胞を、抗イヌＣＤ２０抗体及びイヌ補体保存血清（ＢｉｏＩＶＴ）の滴定（１１点１：３希釈、１０μｇ／ｍｌで開始）とともに３７℃、５％のＣＯ２で２時間、１：４の最終希釈でインキュベーションした。アッセイは、イヌ補体保存血清が補体の唯一の供給源となるように、熱不活性化血清を使用して作製した培地（ＲＰＭＩ＋１％のＬ－グルタミン＋２０％のウシ胎仔血清）を使用して設定した。リツキシマブ－ｃＩＧＧＢキメラ抗体を陰性アイソタイプ対照として使用した。

【0308】

次いで、アッセイプロトコルに従って、ＣｅｌｌＴｉｔｒｅ－Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して生細胞を定量した。このアッセイは、細胞生存率の指標として生細胞のＡＴＰ含有量を使用する。ＣＬＡＲＩＯｓｔａｒ（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）上で発光を測定した。データをＭＡＲＳソフトウェア（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）を使用して分析し、残存する生細胞の数を使用して、抗体のないウェルをベースラインとして使用して、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌを使用して抗体の存在下での殺傷のパーセンテージを計算した。グラフをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍにおいてプロットした。

【0309】

図４は、天然形態及びａ－フコシル化形態の両方において、ＰＭＸ００３でＣＤＣ活性を観察したことを示す。イヌ補体保存血清を使用する同じ実験設定下で、天然及びａ－フコシル化形態の１Ｅ４及び４Ｅ１－７試験抗体についてＣＤＣ活性は観察されなかった。表４は、抗体ＰＭＸ０６６～ＰＭＸ０８１についてのＣＤＣ活性をまとめたものである。

【0310】

抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性
ＭＤＣＫ ＩＩ細胞株（ＡＴＣＣ）などのイヌ細胞株を、イヌＣＤ２０タンパク質をコードする構築物及び蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ）を発現する構築物で安定してトランスフェクションした。蛍光タンパク質を発現するが抗原を発現しないＭＤＣＫ ＩＩ細胞株、又はアイソタイプ対照抗体のいずれかを実験のための陰性対照として使用した。

【0311】

イヌ末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ、Ｅｎｖｉｇｏ）をエフェクター細胞の供給源として使用した。ＰＢＭＣを、推奨されるプロトコルに従って、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ ｐｌｕｓ（Ｃｙｔｉｖａ、ＧＥ１７－１４４０－０２）密度勾配遠心分離を使用して、ヘパリンナトリウム抗凝固剤を用いて、新たに採取した全血から単離した。ＰＢＭＣを、５０ｎｇ／ｍｌの組換えイヌＩＬ－２（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を補充した培地（ＰＢＭＣ培地＝ＲＰＭＩ＋１０％の熱不活性化ウシ胎仔血清＋１％のペニシリン－ストレプトマイシン＋１％の非必須アミノ酸＋１％のＬ－グルタミン＋１％のピルビン酸ナトリウム＋２％のＨＥＰＥＳ）中に再懸濁し、３７℃で２４時間インキュベーションした後、ＡＤＣＣアッセイで使用した。

【0312】

ＡＤＣＣ活性を評価するために、１０，０００個のＭＤＣＫ ＩＩ細胞を、ＭＤＣＫ ＩＩ培地（ＤＭＥＭ＋１％のＬ－グルタミン＋１０％のウシ胎仔血清）及びＰＢＭＣ培地の１：１混合物中で、３７℃で２４時間、３５：１のエフェクター：標的比及び抗体の滴定（１１点１：３希釈、１０μｇ／ｍｌの抗体で開始）でＰＢＭＣと共培養した。リツキシマブ－ｃＩＧＧＢを陰性（アイソタイプ）対照抗体として使用した。

【0313】

ウェル当たりの生細胞の数に比例するＧＦＰシグナルを、２４時間のインキュベーションの終了時にウェルに残存する生細胞の数の尺度として使用した。ＧＦＰシグナルをＣＬＡＲＩＯｓｔａｒ（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）上で測定した。データをＭＡＲＳソフトウェア（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）を使用して分析し、抗体のないウェルをベースラインとして使用して、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌを使用して抗体の存在下での殺傷のパーセンテージを計算した。グラフをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍでプロットした。

【0314】

図５は、ＰＭＸ抗体の存在下でＡＤＣＣ活性を観察したことを示す。ＰＭＸ００３抗体は、天然及びａフコシル化形態の両方において、試験抗体１Ｅ４及び４Ｅ１－７よりも強いＡＤＣＣ活性を示す。表４は、抗体ＰＭＸ０６６～ＰＭＸ０８１について観察されたＡＤＣＣ活性をまとめたものである。

【0315】

抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）活性
ＡＤＣＰ活性を測定するための好適な方法は、Ｉｔｏ ｅｔ ａｌ．Ｌｅｕｋ Ｌｙｍｐｈｏｍａ．２０１５ Ｊａｎｕａｒｙ；５６（１）：２１９－２２５．

【0316】

直接殺傷活性／アポトーシスアッセイ
直接殺傷は、Ｍｉｚｕｎｏ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ，１０，Ａｒｔｉｃｌｅ １１４７６（２０２０）に記載されているように測定され得る。

【0317】

実施例８：エクスビボ－全血アッセイ
エクスビボでのイヌモデルにおけるＢ細胞枯渇効率を評価するために、１００μｌの新たに採取したイヌ全血をヘパリンで収集し、２００μｌのＲＰＭＩ１６４０＋１０％の熱不活性化ウシ胎仔血清＋１％のペニシリン／ストレプトマイシン／Ｌ－グルタミン＋１％の非必須アミノ酸＋１％のピルビン酸ナトリウム＋２％のＨＥＰＥＳ緩衝液で希釈した。希釈した血液を、１０μｇ／ｍｌの抗イヌＣＤ２０抗体の有無にかかわらず、３７℃で２時間、２４時間及び９６時間インキュベーションした。インキュベーション後、試料をＶｅｒｓａｌｙｓｅ溶液（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）とともに室温で１５分間インキュベーションして、赤血球（ＲＢＣ）を溶解させた。洗浄後、試料を抗イヌＣＤ２１抗体及び抗イヌＣＤ８抗体（両方ともＢｉｏＲａｄから）で染色し、ＣＤ２１＋Ｂ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞の数をＣｙｔｏＦＬＥＸ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）上で分析した。Ｂ細胞枯渇のパーセンテージは、非抗体対照と比較したＣＤ２１＋Ｂ細胞対ＣＤ８＋Ｔ細胞の比率の減少に基づいて計算した。図６Ａ～Ｂの結果は、ＰＭＸ００３ ｍＡｂが、１Ｅ４及び４Ｅ１－７ｍＡｂと比較して、全イヌ血液中のＢ細胞のより効率的な殺傷をもたらしたことを示す。表４は、抗体ＰＭＸ０６６～ＰＭＸ０８１について観察されたエクスビボでの特異的Ｂ細胞枯渇活性をまとめたものである。

【0318】

実施例９：インビボアッセイ
腫瘍マウスモデル
抗イヌＣＤ２０抗体のインビボでの腫瘍殺傷効率を評価するために、同系腫瘍マウスモデルを生成する。マウス１２９Ｓｖ ＥＳ細胞のゲノム配列を、相同リコンビニアリングによって、マウスＣＤ２０コード領域をイヌＣＤ２０コード領域に置き換えるように修飾する。標的化ベクターは、両側に４～４．５ｋｂのマウスゲノム配列が隣接するイヌＣＤ２０コード領域のゲノムＤＮＡ配列を含有する。微量注射及び生殖細胞系伝達の後、このように生成されたマウスをＢａｌｂ／ｃマウスと繁殖させて、混合した遺伝的背景のｍＣＤ２０／ｄＣＤ２０ヘテロ接合性子孫を産生する。

【0319】

Ｂａｌｂ／ｃ遺伝的背景のマウスリンパ腫細胞株Ａ２０もまた、イヌＣＤ２０を発現するように修飾される。マウスＣＤ２０コード領域は、線形化ＥＳ細胞標的化ベクターでＡ２０細胞株をトランスフェクションすることによって、イヌＣＤ２０コード配列によって置き換えられる。

【0320】

マウス腫瘍殺傷効率を評価するために、１００万個のイヌＣＤ２０ノックインＡ２０細胞（１００μｌのＰＢＳ中）を、ｍＣＤ２０／ｄＣＤ２０ヘテロ接合性マウス（６～８週齢）に皮下移植する。抗イヌＣＤ２０－ｍＩＧＧ２ａキメラ抗体（５００μｌのＰＢＳ中１５０μｇ）又はＰＢＳのみを、０日目に１回腹腔内注射する。腫瘍のサイズを毎日測定し、人道的エンドポイントに達したときにマウスを安楽死させる。

【0321】

インビボでのイヌ研究
イヌ研究１では、２～３歳及び体重８～１１ｋｇの１２匹の健康な雄ビーグル（試験群当たり３匹のイヌ）を、Ａｖｏｇａｄｒｏ ＬＳ、Ｆｒａｎｃｅで飼育した。研究の前に、それらのうちの全てが疾患又は他の臨床的異常を有さないことを検証した。ＰＭＸ００３抗体の天然フォーマットをＣＨＯ細胞において産生し、２つの試験群に投与し、一方の群は０．５ｍｇ／ｋｇの抗体を受け、他方の群は２．５ｍｇ／ｋｇの抗体を受けた。ａ－フコシル化バージョンのＰＭＸ００３抗体を、Ｆｕｔ８ ＫＯ ＣＨＯ細胞において発現させることによって産生し、０．５ｍｇ／ｋｇで１つの試験群に投与した。対照群は、２．５ｍｇ／ｋｇでアイソタイプ対照、リツキシマブ－ｃＩＧＧＢを受けた。全ての抗体を、３０分間にわたって単回用量の静脈内注入として０日目に投与した。抗体投与後の以下の日、０日目（投与前）、１日目、２日目、５日目、７日目、１５日目、２７日目、及び４３日目に、ＣＤ２１＋Ｂ細胞のパーセンテージをモニタリングし、分析した。Ｋ３ＥＤＴＡ抗凝固剤を用いて新たに採取した０．５ｍｌの血液を、１ｍｌの１ｘＲＢＣ溶解／固定溶液（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で、暗所で室温で３０分間固定し、次いで、１８ｍｌの１ｘＰＢＳで希釈した。固定及び希釈した血液試料を、保管及び英国への輸送を通して＋４℃で保持した。血液採取から４８時間以内に試料分析を実行した。各試料について、細胞を４００ｇで５分間ペレット化し、細胞ペレットを０．５ｍｌの緩衝液中に再懸濁し、５０μｌの細胞を各技術的複製物の染色に使用した。各複製物について、細胞を、ＡＦ６４７コンジュゲート抗イヌＣＤ２１抗体（ＢｉｏＲａｄ、１：１０）及びＰＥコンジュゲート抗イヌＣＤ８抗体（ＢｉｏＲａｄ、１：５０）で染色した。ＤＡＰＩ上で閾値を設定してデブリ及び非有核細胞を除外することによって、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＣｙｔｏＦＬＥＸを使用してデータを取得した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して、リンパ球集団におけるＣＤ２１＋Ｂ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを分析した。抗体投与後の評価の日のＣＤ２１＋Ｂ細胞のパーセンテージを、各イヌについての０日目（ベースライン）のパーセンテージと比較することによって、Ｂ細胞枯渇を決定した。ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージもまた評価し、内部対照として機能した。図７Ａ～Ｂは、ＰＭＸ及び対照抗体を投与された健康なビーグルにおけるＢ細胞枯渇の結果を示す。ＰＭＸ００３を天然及びａ－フコシル化形態で投与した場合、枯渇が観察された。ａ－フコシル化形態は、天然形態よりも有効であった。ＰＭＸ００３は、１Ｅ４を使用するイヌ研究で観察されたものよりもはるかに低い用量でＢ細胞殺傷を示した（Ｒｕｅ ｅｔ ａｌ．Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ １６４（２０１５），１４８－１５９。加えて、Ｂ細胞枯渇を低レベルで少なくとも１５日間維持し、これは、４Ｅ１－７についてのイヌ研究で観察されたものよりも長い（Ｍｉｚｕｎｏ ｅｔ ａｌ．）。

【0322】

イヌ研究２では、２～３歳及び体重８～１１ｋｇの１５匹の健康な雄ビーグル（試験群当たり３匹のイヌ）を、Ａｖｏｇａｄｒｏ ＬＳ、Ｆｒａｎｃｅで飼育した。研究の前に、それらのうちの全てが疾患又は他の臨床的異常を有さないことを検証した。ＰＭＸ０７０及びＰＭＸ１１５抗体の天然フォーマットをＣＨＯ細胞において産生し、抗体当たり２つの試験群に投与し、一方の群は０．５ｍｇ／ｋｇの抗体を受け、他方の群は２ｍｇ／ｋｇの抗体を受けた。対照群は、２ｍｇ／ｋｇでアイソタイプ対照、リツキシマブ－ｃＩＧＧＢを受けた。全ての抗体を、３０分間にわたって単回用量の静脈内注入として０日目に投与した。抗体投与後の以下の日、０日目（投与前）、１日目、４日目、７日目、１４日目、２１日目、及び２８日目に、ＣＤ２１＋Ｂ細胞のパーセンテージをモニタリングし、分析した。Ｋ３ＥＤＴＡ抗凝固剤を用いて新たに採取した１ｍｌの血液を、２ｍｌの１ｘＲＢＣ溶解／固定溶液（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で、暗所で室温で３０分間固定し、次いで、１２ｍｌの１ｘＰＢＳで希釈した。固定及び希釈した血液試料を、保管及び英国への輸送を通して＋４℃で保持した。血液採取から４８～７２時間に試料分析を実行した。各試料について、細胞を４００ｇで５分間ペレット化し、細胞ペレットを１ｍｌの緩衝液中に再懸濁し、５０μｌの細胞を各技術的複製物の染色に使用した。各複製物について、細胞を、ＡＦ６４７コンジュゲート抗イヌＣＤ２１抗体（ＢｉｏＲａｄ、１：１０）及びＰＥコンジュゲート抗イヌＣＤ８抗体（ＢｉｏＲａｄ、１：５０）で染色した。ＤＡＰＩ上で閾値を設定してデブリ及び非有核細胞を除外することによって、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＣｙｔｏＦＬＥＸを使用してデータを取得した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して、リンパ球集団におけるＣＤ２１＋Ｂ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを分析した。抗体投与後の評価の日のＣＤ２１＋Ｂ細胞のパーセンテージを、各イヌについての０日目（ベースライン）のパーセンテージと比較することによって、Ｂ細胞枯渇を決定した。ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージもまた評価し、内部対照として機能した。図７Ｃは、ＰＭＸ及び対照抗体を投与された健康なビーグルにおけるＢ細胞枯渇の結果を示す。枯渇は、０．５ｍｇ／ｋｇ及び２ｍｇ／ｋｇ用量でＰＭＸ０７０及びＰＭＸ１１５について観察され、ａ－フコシル化形態のＰＭＸ００３で観察された枯渇に相当した。

【0323】

薬物動態分析のために、ｍＡｂ薬物の血漿濃度を抗体投与後の以下の時間にモニタリングし、分析した：イヌ研究１における投与前、２時間、６時間、２４時間、４８時間、７２時間、１２０時間、１６８時間、３６０時間、２７日目及び４３日目、並びにイヌ研究２における投与前、２時間、６時間、２４時間、４日目、７日目、１４日目、２１日目及び２８日目。血液採取の直後に、リチウムヘパリン抗凝固剤を伴う新鮮な血液を氷上に置いた。血液チューブを２５００ｇで、＋５℃で１０分間遠心分離した。血漿をポリプロピレンチューブに収集し、－２０℃で保管するまで氷上に保持した。血漿を、ＥＬＩＳＡによる分析まで凍結した。ｍＡｂの濃度を、捕捉抗体としてのＰＭＸ ｍＡｂに対する抗イディオタイプポリクローナル抗体、及び検出抗体としての抗イヌＦｃ－ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ）又は抗イヌＦｃ－ビオチン（Ｓｉｇｍａ）＋ストレプトアビジン－ＨＲＰ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を使用して、ＥＬＩＳＡによって評価する。ＰＭＸ ｍＡｂに対する抗イディオタイプポリクローナル又はモノクローナル抗体は、ＰＭＸ Ｆａｂ断片によるウサギの免疫化、ハイブリドーマ細胞株の生成、及びＰＭＸ ｍＡｂに結合する抗イディオタイプ抗体の選択、続いて、アイソタイプ対照抗体に結合する任意の交差反応性抗体の除去によって、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔで作製される。

【0324】

免疫原性評価のために、凍結血漿中の抗薬物抗体（ＡＤＡ）の濃度を、候補ＰＭＸ抗体と抗薬物抗体との間の任意の予め形成された複合体の酸解離後にＥＬＩＳＡによって評価する。候補抗体のキメラバージョン、例えば、ＰＭＸ－マウスＦｃ又はＰＭＸ－ヒトＦｃを生成し、画分をビオチンで標識する。抗薬物抗体の存在及び濃度を、サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイフォーマットを使用して決定し、非標識キメラ抗体を捕捉試薬として使用し、ビオチン標識キメラ抗体をストレプトアビジン－ＨＲＰとともに検出に使用する。上記の薬物動態アッセイのために生成された抗イディオタイプポリクローナル抗体を陽性対照として使用し、標準曲線を生成する。

【0325】

実施例１０：エピトープマッピング
エピトープマッピングを実施して、抗体が特異的に結合するイヌＣＤ２０抗原上の部位を特定した。部位特異的変異誘発を使用して、イヌＣＤ２０の細胞外ドメインを９つの領域に分割し、イヌ配列における各領域をヒト配列における等価位置に置き換えることによって、イヌ－ヒトキメラＣＤ２０発現ベクターを生成した（図８Ａ）。同じ戦略を使用して、イヌ－マウスキメラＣＤ２０を生成した（図８Ｂ）。変異した全長ｃＤＮＡを、実施例２に記載されるように、ＭＤＣＫ細胞において発現させた。ＰＭＸ００３、ＰＭＸ１１５、及びＰＭＸ０７０のこれらのキメラ変異体への結合を野生型ＣＤ２０への結合と比較することによって、この位置での変異がフローサイトメトリー分析における結合の低減をもたらしたため、配列ＩＴＩＳＨＦＦＫＭＥＮＬＮＬＩＫＡＰＭ（配列番号３０３）を、ＰＭＸ００３、ＰＭＸ１１５、及びＰＭＸ０７０のエピトープとして特定した（図９）。「ＥＮＬＮＬＩＫＡＰＭ」（配列番号３０３、配列番号２におけるアミノ酸番号１５０～１５９）を、その配列内のコアエピトープとして特定した。このエピトープは、ベンチマーク１Ｅ４抗体のエピトープとして記載された「ＤＩＨＮＣＤ」とは異なる。エピトープを調査するための別の戦略は、アラニンスキャニングによるものであり、単一のアラニン変異が、小ループ内の全ての残基及び大ループ内の他の全ての残基において生成される（図８Ｃ）。

【0326】

実施例１１ 開発可能性基準
抗体の特徴付けには、以下を含むいくつかの態様がある。１）ＣＯＧＳ（売上原価）に影響を及ぼす最終的な安定した発現レベルに相関する小規模な抗体産生中の一過性発現レベル。２）凝集する傾向、及びより高い濃度の製剤との適合性を含む、いくつかの特性に相関する熱安定性。熱安定性は、タンパク質のうちの５０％が展開されるときの温度であるＴｍ１値、及び凝集温度であるＴａｇｇによって反映され得る。リード抗体のＴｍ１及びＴａｇｇ値を、ＵＮｃｌｅタンパク質安定性スクリーニングプラットフォーム（Ｕｎｃｈａｉｎｅｄ Ｌａｂｓ）を使用して測定した。３）サイズ及び純度。断片化及び凝集は、インビボでの有効性又は免疫原性との問題につながり得る。抗体のサイズを、非還元及び還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上で決定した。ＨＰＬＣ－ＳＥＣは、各候補産物が９５％を超えるモノマーで構成されていることを示した。粒子の直径を、凝集の潜在的な問題を検出することが可能なＵＮｃｌｅマシンを使用して検出した。ＰＭＸ００３、ＰＭＸ０６６、ＰＭＸ０６７、ＰＭＸ０６９、ＰＭＸ０７０、ＰＭＸ０７１、ＰＭＸ０７２、ＰＭＸ０７３、ＰＭＸ０７４、ＰＭＸ０７５、ＰＭＸ０７６、ＰＭＸ０７７、ＰＭＸ０７８、ＰＭＸ０７９、ＰＭＸ０８０、ＰＭＸ０８１、ＰＭＸ１１２、ＰＭＸ１１５、ＰＭＸ１２２、及びＰＭＸ１２４抗体の開発可能性パラメータを表５に示した。

【0327】

実施例１２ 脱グリコシル化抗体の分析
上記に加えて、インシリコ配列分析を使用して、配列ライアビリティの予測を実施した。Ｎ連結グリコシル化モチーフ（ＮＶＴ）を、ＰＭＸ００３ ｍＡｂにおける軽鎖のフレームワーク領域１（ＦＲ１）において特定し、リードパネルからの別の１２ｍＡｂ（ＰＭＸ０７０、ＰＭＸ０７５、及びＰＭＸ０８０を除く）においても特定した。この位置でのグリコシル化を予防することによってライアビリティを低減させるために、ＰＭＸ００３の軽鎖ＦＲ１内のＮＶＴシークオンを、ＱＶＴ（ＰＭＸ００６）、ＡＶＴ（ＰＭＸ００７）、ＥＶＴ（ＰＭＸ００８）、ＮＶＡ（ＰＭＸ００９）、ＳＶＴ（ＰＭＸ０１０）、及びＴＶＴ（ＰＭＸ０１１）に変異させた。脱グリコシル化は、変異体抗体の軽鎖のサイズを、還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上の元のＰＭＸ００３ ｍＡｂと比較することによって観察した。これに続いて、これらの変異の影響を評価するために、結合及び機能評価を実行した。フローサイトメトリー分析は、わずかに低減したＱＶＴ及びＡＶＴ変異体を除いて、イヌＣＤ２０発現細胞への結合能力が変化しないままであることを明らかにした（図３Ｂ）。同様に、インビトロＡＤＣＣアッセイ（図５Ｄ及び５Ｅ）、及びエクスビボ全血アッセイ（図６Ｃ）における殺傷効力は、これらの変異によって著しく影響されなかった。したがって、結合及び機能活性を損なうことなく、脱グリコシル化のためにＮＶＴモチーフを修飾することが可能である。
表２：配列

【表2-1】

【表2-2】

【表2-3】

【表2-4】

【表2-5】

【表2-6】

【表2-7】

【表2-8】

【表2-9】

【表2-10】

【表2-11】

【表2-12】

【表2-13】

【表2-14】

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【表2-16】

【表2-17】

【表2-18】

【表2-19】

【表2-20】

【表2-21】

【表2-22】

【表2-23】

【表2-24】

【表2-25】

【表2-26】

【表2-27】

【表2-28】

【表2-29】

【表2-30】

【表2-31】

【表2-32】

【表2-33】

【表2-34】

【表2-35】

【表3】

【表4】

【表5-1】

【表5-2】

【表5-3】

【図1】

【図2-1】

【図2-2】

【図2-3】

【図3-1】

【図3-2】

【図3-3】

【図3-4】

【図3-5】

【図4】

【図5-1】

【図5-2】

【図6】

【図7-1】

【図7-2】

【図8】

【図9】

【配列表】

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【国際調査報告】