特表2024-526175目的の分子を検出するための脱パラフィン細胞から出発する単一細胞ＥＬＩＳＡの使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-07-17
(54)【発明の名称】目的の分子を検出するための脱パラフィン細胞から出発する単一細胞ＥＬＩＳＡの使用
(51)【国際特許分類】
G01N 33/50 20060101AFI20240709BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20240709BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20240709BHJP
【ＦＩ】
G01N33/50 P
G01N33/53 M
G01N33/53 D
C12Q1/02
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023579121
(86)(22)【出願日】2022-06-23
(85)【翻訳文提出日】2024-01-26
(86)【国際出願番号】 IB2022055835
(87)【国際公開番号】W WO2022269534
(87)【国際公開日】2022-12-29
(31)【優先権主張番号】63/214,177
(32)【優先日】2021-06-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】509087759
【氏名又は名称】ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド
(74)【代理人】
【識別番号】100092783
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 浩
(74)【代理人】
【識別番号】100095360
【弁理士】
【氏名又は名称】片山 英二
(74)【代理人】
【識別番号】100093676
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 純子
(74)【代理人】
【識別番号】100120134
【弁理士】
【氏名又は名称】大森 規雄
(74)【代理人】
【識別番号】100227008
【弁理士】
【氏名又は名称】大賀 沙央里
(72)【発明者】
【氏名】カレイラ，ヴィニシウス
(72)【発明者】
【氏名】マレラ，マシュー
【テーマコード（参考）】
2G045
4B063
【Ｆターム（参考）】
2G045AA13
2G045BB23
2G045DA13
2G045DA14
2G045DA36
4B063QA01
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4B063QQ03
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4B063QQ52
4B063QQ79
4B063QS10
4B063QS32
4B063QS33
4B063QX01
(57)【要約】
本明細書において、患者の体液又は組織などの試料中の分子の存在を検出する方法であって、ａ．試料から細胞を得ることと、ｂ．細胞を固定剤で処理することと、ｃ．固定された細胞をパラフィン包埋することと、ｄ．細胞を脱パラフィンし懸濁して、単一細胞懸濁液を得ることと、ｅ．懸濁された細胞を、懸濁された細胞の少なくとも１つの分子に結合する第１の検出剤と接触させ、第１の検出剤に結合した細胞を、第２の検出剤と接触させることと、ｆ．試料の細胞に結合した第２の検出剤の存在を検出することと、を含み、試料に結合した第２の検出剤のバックグラウンドを超える量の検出が、試料中の少なくとも１つの分子の存在を示す、方法が提供される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
試料中の分子を検出する方法であって、ａ．試料から細胞を得ることと、
ｂ．前記細胞を固定剤で処理することと、
ｃ．固定された前記細胞をパラフィン包埋することと、
ｄ．前記細胞を脱パラフィンし懸濁して、単一細胞懸濁液を得ることと、
ｅ．懸濁された前記細胞を、前記懸濁された細胞の少なくとも１つの分子に結合する第１の検出剤と接触させ、
前記第１の検出剤に結合した前記細胞を、第２の検出剤と接触させることと、
ｆ．前記試料の前記細胞に結合した前記第２の検出剤の存在を検出することと、を含み、
前記試料に結合した前記第２の検出剤のバックグラウンドを超える量の検出が、前記試料中の少なくとも１つの分子の存在を示す、方法。
【請求項2】
前記分子が、核酸又はタンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記核酸が、ＲＮＡである、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記核酸が、ＤＮＡである、請求項２に記載の方法。
【請求項5】
前記方法が、前記懸濁された細胞を第１の検出剤と接触させた後に未結合細胞を更に除去する、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記方法が、前記第１の検出剤に結合した前記細胞を第２の検出剤と接触させた後に、未結合の前記第２の検出剤を除去することを更に含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記固定剤が、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、又は中性緩衝ホルマリンを含む群から選択される、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記固定剤が、中性緩衝ホルマリンである、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記中性緩衝ホルマリンが、１０％中性緩衝ホルマリンである、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
前記細胞を前記固定剤で処理するステップが、約３０分間～６０分間、１時間～２時間、２時間～３時間、３時間～４時間、４時間～５時間、５時間～６時間、６時間～７時間、７時間～８時間、８時間～９時間、９時間～１０時間、１０時間～１１時間、１１時間～１２時間、１２時間～１３時間、１３時間～１４時間、１４時間～１５時間、１５時間～１６時間、１６時間～１７時間、１７時間～１８時間、１８時間～１９時間、１９時間～２０時間、２０時間～２１時間、２１時間～２２時間、２２時間～２３時間、２３時間～２４時間、２４時間～３６時間、又は３６時間～４８時間続く、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
前記細胞を前記固定剤で処理するステップが、４℃、室温、４０℃、又は６０℃で行われる、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
前記細胞を前記固定剤で処理するステップが、室温で２４時間行われる、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
前記固定された細胞のパラフィン包埋が、ａ．前記細胞をエタノールと接触させることと、
ｂ．前記細胞をキシレンと接触させることと、
ｃ．前記細胞をパラフィンとともにインキュベートすることと、を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
前記細胞をエタノールと接触させるステップが、ａ．前記細胞を水中７０％エタノールと３０分間接触させることと、
ｂ．前記細胞を水中８０％エタノールと３０分間接触させることと、
ｃ．前記細胞を水中９５％エタノールと３０分間接触させることと、
ｄ．前記細胞を１００％エタノールと３０分間接触させることと、を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
前記細胞をキシレンと接触させるステップが、各々２０分間のキシレンの３回の交換を含む、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項16】
前記細胞をパラフィンとともにインキュベートするステップが、各々２０分間のパラフィンの４回の交換を含む、請求項１３～１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
前記細胞をパラフィンとともにインキュベートするステップが、６０℃で行われる、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
前記細胞をキシレンと接触させることによって前記細胞を脱パラフィンする、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項19】
前記細胞をキシレンと約５分間～１０分間、１０分間～１５分間、１５分間～２０分間、２０分間～３０分間、３０分間～６０分間、６０分間～９０分間、又は９０分間～１２０分間接触させる、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
前記細胞を、ａ．前記細胞を水中７０％エタノールと約１５～約３０分間接触させることと、
ｂ．前記細胞を水中９５％エタノールと約１５～約３０分間接触させることと、
ｄ．最後に、前記細胞を１００％エタノールと約１５～約３０分間接触させることと、を含む、連続エタノール勾配と更に接触させる、請求項１８又は１９に記載の方法。
【請求項21】
前記細胞が、抗原賦活化溶液に再懸濁される、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項22】
前記細胞が、９５℃で約３０分間更に加熱される、請求項２１に記載の方法。
【請求項23】
前記細胞が、マイクロ波放射によって加熱される、請求項２２に記載の方法。
【請求項24】
前記第１及び／又は第２の検出剤が、抗体又はその抗原結合フラグメントである、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項25】
前記第１及び／又は第２の検出剤が、ＲＮＡベースのバインダー分子である、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項26】
前記試料が、体液又は組織由来の細胞を含む、請求項１～２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項27】
前記体液が、血液、血清、又は血漿である、請求項２６に記載の方法。
【請求項28】
前記試料が、患者由来のものである、請求項１～２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項29】
前記患者が、哺乳動物である、請求項２８に記載の方法。
【請求項30】
前記哺乳動物が、ヒトである、請求項２９に記載の方法。
【請求項31】
前記試料が、不死化細胞株由来の細胞を含む、請求項１～３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項32】
請求項１～３１のいずれか一項に記載の方法を行うための、キット。
【請求項33】
請求項１～３１のいずれか一項に記載の方法により調製された、細胞の試料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
（関連出願の相互参照）
本出願は、参照により全体が本明細書に組み込まれる、２０２１年６月２３日に出願された米国特許出願公開第６３／２１４，１７７号の利益を主張するものである。
本出願は、参照により全体が本明細書に組み込まれる、２０２１年６月２３日に出願された米国特許出願公開第６３／２１４，１７７号の利益を主張するものである。
【0002】
（発明の分野）
本明細書において、患者の体液又は組織などの試料中の分子の存在を検出する方法が提供される。
本明細書において、患者の体液又は組織などの試料中の分子の存在を検出する方法が提供される。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0003】
一態様では、本明細書において、試料中の分子を検出する方法であって、試料から細胞を得ることと、細胞を固定剤で処理することと、固定された細胞をパラフィン包埋することと、細胞を脱パラフィンし懸濁して、単一細胞懸濁液を得ることと、懸濁された細胞を、懸濁された細胞の少なくとも１つの分子に結合する第１の検出剤と接触させ、第１の検出剤に結合した細胞を、第２の検出剤と接触させることと、試料の細胞に結合した第２の検出剤の存在を検出することと、を含み、試料に結合した第２の検出剤のバックグラウンドを超える量の検出が、試料中の少なくとも１つの分子の存在を示す、方法が提供される。
【0004】
いくつかの実施形態では、分子は、核酸又はタンパク質である。いくつかの実施形態では、核酸は、ＲＮＡである。いくつかの実施形態では、核酸は、ＤＮＡである。
【0005】
いくつかの実施形態では、方法は、懸濁された細胞を第１の検出剤と接触させた後に未結合細胞を更に除去する。いくつかの実施形態では、方法は、第１の検出剤に結合した細胞を第２の検出剤と接触させた後に、未結合の第２の検出剤を除去することを更に含む。
【0006】
いくつかの実施形態では、固定剤は、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、又は中性緩衝ホルマリンを含む群から選択される。いくつかの実施形態では、固定剤は、中性緩衝ホルマリンである。いくつかの実施形態では、中性緩衝ホルマリンは、１０％中性緩衝ホルマリンである。
【0007】
いくつかの実施形態では、細胞を固定剤で処理するステップは、約約３０分間～６０分間、１時間～２時間、２時間～３時間、３時間～４時間、４時間～５時間、５時間～６時間、６時間～７時間、７時間～８時間、８時間～９時間、９時間～１０時間、１０時間～１１時間、１１時間～１２時間、１２時間～１３時間、１３時間～１４時間、１４時間～１５時間、１５時間～１６時間、１６時間～１７時間、１７時間～１８時間、１８時間～１９時間、１９時間～２０時間、２０時間～２１時間、２１時間～２２時間、２２時間～２３時間、２３時間～２４時間、２４時間～３６時間、又は３６時間～４８時間続く。いくつかの実施形態では、細胞を固定剤で処理するステップは、４℃、室温、４０℃、又は６０℃で行われる。いくつかの実施形態では、細胞を固定剤で処理するステップは、室温で２４時間行われる。
【0008】
本明細書で提供される方法の一態様では、固定された細胞のパラフィン包埋は、細胞をエタノールと接触させることと、細胞をキシレンと接触させることと、細胞をパラフィンとともにインキュベートすることとを含む。
【0009】
いくつかの実施形態では、細胞をエタノールと接触させるステップは、細胞を水中７０％エタノールと３０分間接触させることと、細胞を水中８０％エタノールと３０分間接触させることと、細胞を水中９５％エタノールと３０分間接触させることと、細胞を１００％エタノールと３０分間接触させることとを含む。
【0010】
いくつかの実施形態では、細胞をキシレンと接触させるステップは、各々２０分間のキシレンの３回の交換を含む。
【0011】
いくつかの実施形態では、細胞をパラフィンとともにインキュベートするステップは、各々２０分間のパラフィンの４回の交換を含む。いくつかの実施形態では、細胞をパラフィンとともにインキュベートするステップは、６０℃で行われる。
【0012】
いくつかの実施形態では、細胞をキシレンと接触させることによって細胞を脱パラフィンする。いくつかの実施形態では、細胞をキシレンと約５分間～１０分間、１０分間～１５分間、１５分間～２０分間、２０分間～３０分間、３０分間～６０分間、６０分間～９０分間、又は９０分間～１２０分間接触させる。
【0013】
いくつかの実施形態では、細胞を、連続エタノール勾配と更に接触させる。いくつかの実施形態では、細胞を水中７０％エタノールと約１５～約３０分間接触させることと、細胞を水中９５％エタノールと約１５～約３０分間接触させることと、最後に、細胞を１００％エタノールと約１５～約３０分間接触させることとを含む、細胞を連続エタノール勾配と更に接触させる。
【0014】
本明細書で提供される方法の一態様では、細胞は、抗原賦活化溶液に再懸濁される。
【0015】
いくつかの実施形態では、細胞は、９５℃で約３０分間更に加熱される。いくつかの実施形態では、細胞は、マイクロ波放射によって加熱される。
【0016】
いくつかの実施形態では、第１及び／又は第２の検出剤は、抗体又はその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、第１及び／又は第２の検出剤は、ＲＮＡベースのバインダー分子である。
【0017】
本明細書で提供される方法の一態様では、試料は、体液又は組織由来の細胞を含む。いくつかの実施形態では、体液は、血液、血清、又は血漿である。いくつかの実施形態では、試料は、患者由来のものである。いくつかの実施形態では、患者は、哺乳動物である。いくつかの実施形態において、この哺乳動物はヒトである。いくつかの実施形態では、試料は、不死化細胞株由来の細胞を含む。
【0018】
別の態様では、本明細書において、本明細書で提供される実施形態のいずれか１つの方法を行うためのキットが提供される。
【0019】
別の態様では、本明細書において、本明細書で提供される実施形態のいずれか１つの方法により調製された細胞の試料が提供される。
【図面の簡単な説明】
【0020】
前述の「発明の概要」、並びに以下の、本出願の特定の実施形態の「発明を実施するための形態」は、添付図面とともに読んだときにより深く理解されるであろう。しかしながら、本出願は、図面に示される実施形態そのものに限定されないことを理解するべきである。
【図1】分子の検出及びスクリーニングの増強のための、本明細書で提供される方法の概略図を示す。
【図2】４５０ｎｍで測定した光学密度の形式での抗体結合を示す。各抗体結合を、ウェル当たり３０，０００個の細胞について２つ組みで試験した。「対照陰性」と名付けた条件は、抗体希釈剤のみとともにインキュベートした細胞に関するものであった。
【図3A】細胞ペレットブロックの４ｕｍ切片に対して様々な抗体溶液を用いて行った免疫組織化学（immunohistochemistry、「ＩＨＣ」）アッセイの結果を示す。図３Ａは、各抗体のＩＨＣ細胞ペレット染色を示す。図３Ｂは、染色した各ペレットのＨスコアを示す。染色した各ペレットのＨスコアを、細胞ペレットの全表面強度染色を計算する面積定量アルゴリズムに基づいて計算した。
【図3B】細胞ペレットブロックの４ｕｍ切片に対して様々な抗体溶液を用いて行った免疫組織化学（immunohistochemistry、「ＩＨＣ」）アッセイの結果を示す。図３Ａは、各抗体のＩＨＣ細胞ペレット染色を示す。図３Ｂは、染色した各ペレットのＨスコアを示す。染色した各ペレットのＨスコアを、細胞ペレットの全表面強度染色を計算する面積定量アルゴリズムに基づいて計算した。
【図4】本明細書で提供されるＥＬＩＳＡ様方法とＩＨＣ染色との間の相関評価を示す。ピアソン相関係数ｒ＝０．９２９（GraphPad Prism）は、ハイスループットＥＬＩＳＡ様方法により得られたスクリーニング結果と、ホルマリン固定パラフィン包埋（formalin fixed paraffin embedded、「ＦＦＰＥ」）組織試料に対して行われた従来のＩＨＣとの間の十分な比較可能性を示した。
【発明を実施するための形態】
【0021】
「背景技術」において、また、本明細書全体を通じて、各種刊行物、論文及び特許が引用又は記載され、これらの参照文献の各々はその全容が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に含まれる文書、操作、材料、デバイス、物品などの考察は、本発明の前後関係を与えるためのものである。そのような考察は、これらの事物のいずれか又は全てが、開示又は特許請求されるいずれかの発明に対する先行技術の一部を構成することを容認するものではない。
【0022】
特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般的に理解されるのと同じ意味を有する。そうでない場合、本明細書で使用される特定の用語は、本明細書に記載される意味を有する。
【0023】
本明細書に記載又は参照されている技法及び手順には、当業者が概ねよく理解しているもの、及び／又は当業者が従来の手法を用いて通常採用しているもの、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（３ｄ ｅｄ．２００１）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，２００３）、Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｆｒｏｍ Ｂｅｎｃｈ ｔｏ Ｃｌｉｎｉｃ（Ａｎ ｅｄ．２００９）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ａｌｂｉｔａｒ ｅｄ．２０１０）、及びＡｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｖｏｌｓ １ ａｎｄ ２（Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｄｕｂｅｌ ｅｄｓ．，２ｄ ｅｄ．２０１０）に記載されている広く利用されている手法などが含まれる。本明細書中で特に定義されていない限り、本明細書で使用されている技術用語及び科学用語は、当業者によって通常理解される意味を有する。この明細書を解釈するために、以下の用語の説明が適用され、必要に応じて、単数形で使用される用語は複数形も含まれ、その逆もまた同様である。記載された用語のいずれかの説明が、参照により本明細書に組み込まれるいずれかの文書と矛盾する場合、以下に記載された用語の説明が優先されるものとする。
【0024】
以下の参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる：米国特許出願公開第１０／８７２，４６２号、米国特許出願公開第１４／１１５，３２７号、米国特許出願公開第１３／５３６，０２１号、米国特許出願公開第１０／３２０，２１９号、米国特許出願公開第１１／３１９，１１８号、米国特許出願公開第１４／６５２，４０７号、米国特許出願公開第１３／５７１，８５４号、米国特許出願公開第１１／７７２，２８８号、ＭｃＧｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ；２０２１；２５４（４）；４０５－４１７）、Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．（ＰＬｏＳ ＯＮＥ；１６（２）ｅ０２４７２３８；２０２１）、Ｇｅｎｔｌｅｓ ｅｔ ａｌ．（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ２０２１；７４：４６９－４７４）、Ｗｉｌｇｅｎｂｕｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，２０２０（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ；９，２０－２５）、及びＭａｉｒａｖｉｌｌｅ ｅｔ ａｌ．（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ；２０２１，１０，４）。
【0025】
５．１．定義
本明細書において、本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈上特に明記されていない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。
本明細書において、本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈上特に明記されていない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。
【0026】
本明細書の用語について複数の定義が存在する場合、別段記述されない限り、本項の定義が優先される。
【0027】
「約」又は「およそ」という用語は、当業者によって決定される特定の値について許容される誤差を意味し、これは、値が測定又は決定される方法に部分的に依存する。特定の態様では、「約」又は「およそ」という用語は、１、２、３、又は４つ以内の標準偏差を意味する。特定の態様では、「約」又は「およそ」という用語は、所与の値又は範囲の５０％、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、又は０．０５％以内を意味する。
【0028】
別途記載のない限り、一連の要素に先行する用語「少なくとも」は、一連の全ての要素を指すと理解されるべきである。当業者であれば、単なる通常の実験手順を使用するだけで、本明細書に記載した本発明の特定の実施形態に対して多くの均等物を認識するか、又は確認することができよう。そのような均等物は、本発明によって包含されることが意図される。
【0029】
本明細書で使用するとき、用語「備える（comprises）、「備える（comprising）」、「含む（includes）」、「含む（including）」、「有する（has）」、「有する（having）」、「含有する（contains）」、若しくは「含有する（containing）」、又はこれらの任意の他の変形は、述べられている要素又は要素群を含むことが意図されるが、これら以外の他の要素又は要素群を除外するものではなく、非排他的又は非制限的であることが意図されることが理解されよう。例えば、一連の要素を含む組成物、混合物、プロセス、方法、物品、又は装置は、必ずしもそれらの要素のみに限定されるものではなく、明示的に列挙されない、又はそのような組成物、混合物、プロセス、方法、物品、若しくは装置に固有である他の要素を含んでもよい。更に、明示的に反対に明記されない限り、「又は」は包括的な「又は」を指すものであり、排他的な「又は」を指すものではない。例えば、条件Ａ又はＢは、Ａが真であり（又は存在する）かつＢが偽である（又は存在しない）場合、Ａが偽であり（又は存在しない）かつＢが真である（又は存在する）場合、並びにＡ及びＢの両方が真である（又は存在する）場合、のいずれか１つによって満たされる。
【0030】
本明細書で使用される場合、複数の列挙された要素間の「及び／又は」という接続的な用語は、個々の及び組み合わされた選択肢の両方を包含するものとして理解される。例えば、２つの要素が「及び／又は」によって接続される場合、第１の選択肢は、第２の要素なしに第１の要素が適用可能であることを指す。第２の選択肢は、第１の要素なしに第２の要素が適用可能であることを指す。第３の選択肢は、第１及び第２の要素が一緒に適用可能であることを指す。これらの選択肢のうちのいずれか１つは、意味に含まれ、したがって、本明細書に使用される場合、「及び／又は」という用語の要件を満たすことが理解される。選択肢のうちの２つ以上の同時適用性もまた、意味に含まれ、したがって、「及び／又は」という用語の要件を満たすことが理解される。
【0031】
本明細書で使用される場合、用語「からなる（consists of）」、又は「からなる（consist of）」若しくは「からなる（consisting of）」などの変形は、明細書及び特許請求の範囲全体にわたって使用されるとき、任意の列挙された要素又は要素群を包含するが、追加の要素又は要素群が、指定の方法、構造、又は組成物に追加されないことを示す。
【0032】
本明細書で使用されるとき、用語「から本質的になる（consists essentially of）」、又は「から本質的になる（consist essentially of）」若しくは「から本質的になる（consisting essentially of）」などの変形は、明細書及び特許請求の範囲全体にわたって使用されるとき、任意の列挙された要素又は要素群を包含し、任意選択で、指定の方法、構造、又は組成物の基本的又は新規の特性を実質的に変化させない任意の列挙された要素又は要素群も包含することを示す。Ｍ．Ｐ．Ｅ．Ｐ．§２１１１．０３を参照されたい。
【0033】
本明細書で使用される場合、「投与する」又は「投与」は、本明細書に記載されているか、又は当該技術分野において既知の、経口、粘膜、皮内、静脈内、筋肉内送達、及び／又は他の任意の物理的送達方法などによって、体外に存在する物質を患者に注射又は他の方法で物理的に送達する行為を指す。疾患又はその症状が治療される場合、物質の投与は、典型的には、疾患又はその症状の発症後に生じる。疾患又はその症状が予防される場合、物質の投与は、典型的には、疾患又はその症状の発症前に生じる。
【0034】
本明細書で使用するとき、用語「ポリヌクレオチド」は、同義的に「核酸分子」、「ヌクレオチド」、又は「核酸」とも称され、非修飾ＲＮＡ若しくはＤＮＡ又は修飾ＲＮＡ若しくはＤＮＡであってもよい、任意のポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドを指す。「ポリヌクレオチド」としては、一本鎖及び二本鎖ＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖の領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖ＲＮＡ、並びに一本鎖及び二本鎖の領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖若しくはより典型的には二本鎖、又は一本鎖及び二本鎖の領域の混合物であってもよいＤＮＡ及びＲＮＡを含むハイブリッド分子が挙げられるが、これらに限定されない。加えて、「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡ若しくはＤＮＡ又はＲＮＡ及びＤＮＡの両方を含む三本鎖領域を指す。ポリヌクレオチドという用語には、１つ又は２つ以上の修飾された塩基を含有するＤＮＡ又はＲＮＡ、及び安定性又は他の理由により修飾された骨格を有するＤＮＡ又はＲＮＡも含まれる。「修飾された」塩基は、例えば、トリチル化塩基及び異常な塩基、例えば、イノシンを含む。様々な修飾をＤＮＡ及びＲＮＡに行うことができる。したがって、「ポリヌクレオチド」は、典型的には天然に認められるポリヌクレオチドの化学的、酵素的又は代謝的に修飾された形態、並びにウイルス及び細胞のＤＮＡ及びＲＮＡの特徴を有する化学的形態を包含する。「ポリヌクレオチド」はまた、比較的短い核酸鎖（多くの場合、オリゴヌクレオチドと称される）も包含する。
【0035】
本明細書で使用するとき、用語「発現」は、遺伝子産物の生合成を指す。この用語は、遺伝子のＲＮＡへの転写を包含する。この用語はまた、ＲＮＡの１つ又は２つ以上のポリペプチドへの翻訳も包含し、全ての天然に存在する、転写後及び翻訳後修飾も更に包含する。発現される抗体は、宿主細胞の細胞質内、細胞培養物の成長培地などの細胞外環境中に存在し得るか、又は細胞膜に固定され得る。
【0036】
本明細書で使用するとき、用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、又は「タンパク質」は、アミノ酸から構成される分子を指すことができ、当業者によってタンパク質として認識され得る。本明細書では、アミノ酸残基の従来の１文字又は３文字コードが使用される。用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」は、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すために、本明細書において互換的に使用することができる。ポリマーは、直鎖又は分岐鎖であってもよく、修飾されたアミノ酸を含むことができ、かつ非アミノ酸により中断されてもよい。この用語はまた、天然に修飾されているか、又は介入によって修飾されているアミノ酸ポリマー、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、又は任意の他の操作若しくは修飾、例えば、標識成分とのコンジュゲートを包含する。また、例えば、アミノ酸の１つ又は２つ以上の類似体（例えば、非天然アミノ酸などを含む）を含有するポリペプチド、並びに当該技術分野において既知である他の修飾も定義内に含まれる。
【0037】
本明細書に記載のペプチド配列は、通常の慣習に従って記載され、ペプチドのＮ末端領域は左側にあり、Ｃ末端領域は右側にある。アミノ酸の異性体形態は既知であるが、別途明示的に示されない限り、示されるのはアミノ酸のＬ型である。
【0038】
「抗体」、「免疫グロブリン」、又は「Ｉｇ」という用語は、本明細書で互換的に使用され、最も広い意味で使用され、具体的には、例えば、モノクローナル抗体（アゴニスト、アンタゴニスト、中和抗体、完全長又はインタクトモノクローナル抗体を含む）、ポリエピトープ又はモノエピトープ特異性を有する抗体組成物、ポリクローナル又は一価抗体、多価抗体、少なくとも２つのインタクト抗体から形成された多重特異性抗体（例えば、所望の生物学的活性を示す限りにおいて、二重特異性抗体）、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体（例えば、ＶＨＨ）、及びそのフラグメント（例えば、ドメイン抗体）を包含する。抗体は、ヒト、ヒト化、キメラ、及び／又は親和性成熟されたものであり、また他の種、例えば、マウス、ウサギ、ラマなどからの抗体であり得る。「抗体」という用語は、特定の分子抗原に結合することができ、２つの同一の対のポリペプチド鎖で構成される、ポリペプチドの免疫グロブリンクラス内のＢ細胞のポリペプチド産物を含むことを意図しており、各対は、１つの重鎖（約５０～７０ｋＤａ）及び１つの軽鎖（約２５ｋＤａ）を有し、各鎖の各アミノ末端部分は、約１００～約１３０以上のアミノ酸の可変領域を含み、各鎖の各カルボキシ末端部分は、定常領域を含む。例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ ｅｄ．，２ｄ ｅｄ．１９９５）；、及びＫｕｂｙ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（３ｄ ｅｄ．１９９７）を参照。また、抗体としては、合成抗体、組換え産生抗体、ラクダ科種（例えば、ラマやアルパカ）由来などの単一ドメイン抗体又はそれらのヒト化変異体、体内抗体、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、及び上記のいずれかの機能的フラグメント（例えば、抗原結合フラグメント）が挙げられるが、これらに限定されるものではなく、フラグメントの由来となった抗体の結合活性の一部又は全部を保持する抗体重鎖又は軽鎖ポリペプチドの部分を指す。機能的フラグメント（例えば、抗原結合フラグメント）の非限定的な例としては、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）（例えば、単一特異性、二重特異性などを含む）、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、Ｆ（ａｂ）２フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｄｓＦｖ）、Ｆｄフラグメント、Ｆｖフラグメント、ダイアボディ、トライアボディ、テトラボディ、及びミニボディが挙げられる。特に、本明細書において提供される抗体は、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、例えば、抗原に結合する抗原結合部位（例えば、抗体の１つ又は２つ以上のＣＤＲ）を含有する抗原結合ドメイン又は分子を含む。そのような抗体フラグメントは、例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８９）、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（Ｍｙｅｒｓ ｅｄ．，１９９５）、Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ ２２：１８９－２２４、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ ａｎｄ Ｓｋｅｒｒａ，１９８９，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１７８：４９７－５１５、及びＤａｙ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２ｄ ｅｄ．１９９０）に見出すことができる。本明細書において提供される抗体は、免疫グロブリン分子の任意のクラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、及びＩｇＡ）又は任意のサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２）であり得る。抗体は、アゴニスト抗体又はアンタゴニスト抗体であり得る。抗体は、アゴニストでもなくアンタゴニストでもなくてもよい。
【0039】
「抗原」とは、抗体が選択的に結合することができる構造である。標的抗原は、ポリペプチド、炭水化物、核酸、脂質、ハプテン、又は他の天然に存在する化合物若しくは合成化合物であり得る。いくつかの実施形態では、標的抗原は、ポリペプチドである。特定の実施形態では、抗原は、細胞と関連し、例えば、細胞上又は細胞内に存在する。
【0040】
「抗原結合ドメイン」又は「抗原結合フラグメント」又は「抗原に結合するドメイン」は、抗原に特異的に結合する分子の一部を指す。抗原結合ドメインは、抗原に結合する免疫グロブリンの一部、例えば、重鎖可変ドメイン（heavy chain variable domain、ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（light chain variable domain、ＶＬ）、ＶＨ及びＶＬ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ及びＦｖフラグメント、１つのＶＨ又は１つのＶＬからなるドメイン抗体（domain antibodies、ｄＡｂ）、サメ可変ＩｇＮＡＲドメイン、ラクダ化ＶＨドメイン、ＶＨＨ、ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４部分などの抗体のＣＤＲを模倣するアミノ酸残基からなる最小認識ユニット、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及び／又はＨＣＤＲ３、並びにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及び／又はＬＣＤＲ３、並びに抗原に結合する非抗体足場を含み得る。
【0041】
本明細書で使用される場合、「エピトープ」とは、当該技術分野の用語であり、結合分子（例えば、一本鎖抗体配列を含む抗体）が特異的に結合することができる抗原の局在領域を指す。エピトープは、線状エピトープ又は立体構造エピトープ、非線状エピトープ、又は不連続エピトープであり得る。ポリペプチド抗原の場合、例えば、エピトープは、ポリペプチドの連続したアミノ酸（「線状」エピトープ）であり得るか、又はエピトープは、ポリペプチドの２つ又は３つ以上の非連続領域からのアミノ酸（「立体構造」、「非線状」、又は「不連続」エピトープ）を含み得る。概ね、線状エピトープは、二次、三次、又は四次構造に依存する場合もあれば、依存しない場合もあることが当業者によって理解されるであろう。例えば、いくつかの実施形態では、結合分子は、アミノ酸が天然の三次元タンパク質構造に折り畳まれているかどうかにかかわらず、アミノ酸の群に結合する。他の実施形態では、結合分子は、エピトープを認識して結合するために、エピトープを構成するアミノ酸残基が特定の立体構造（例えば、屈曲、ねじれ、回転、又は折り畳み）を示すことを必要とする。
【0042】
「インタクト」抗体とは、抗原結合部位、並びに軽鎖の定常ドメイン（constant domain of the light chain、ＣＬ）並びに少なくとも重鎖定常領域ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含むものである。定常領域には、ヒト定常領域又はそのアミノ酸配列の変異体が含まれ得る。特定の実施形態では、インタクト抗体は、１つ又は２つ以上のエフェクター機能を有する。
【0043】
「ｓＦｖ」又は「ｓｃＦｖ」とも略される「単鎖Ｆｖ」は、単一のポリペプチド鎖に接続されたＶＨ抗体ドメイン及びＶＬ抗体ドメインを含む抗体フラグメントである。好ましくは、ｓＦｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間に、ｓＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にするポリペプチドリンカーを更に含む。ｓＦｖについては、Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９－３１５（１９９４）のＰｌｕｃｋｔｈｕｎを参照されたい。
【0044】
本明細書で使用される「単一ドメイン抗体」又は「ｓｄＡｂ」は、単一の単量体可変抗体ドメインを指し、抗原結合が可能である。単一ドメイン抗体には、本明細書に記載のＶＨＨドメインが含まれる。単一ドメイン抗体の例としては、Ｃａｍｅｌｉｄａｅ種（例えば、ラマ）由来のものなどの軽鎖を自然に欠く抗体、従来の４本鎖抗体に由来する単一ドメイン抗体、操作された抗体、及び抗体に由来するもの以外の単一ドメイン足場が挙げられるが、これらに限定されない。単一ドメイン抗体は、マウス、ヒト、ラクダ、ラマ、ヤギ、ウサギ、及びウシを含むがこれらに限定されない任意の種に由来し得る。例えば、単一ドメイン抗体は、本明細書に記載されているように、ラクダ科種、例えばラクダ、ラマ、ヒトコブラクダ、アルパカ、及びグアナコで産生された抗体に由来し得る。ラクダ科以外の他の種でも、天然に軽鎖を持たない重鎖抗体を産生することがある。そのような他の種に由来するＶＨＨは、本開示の範囲内である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される単一ドメイン抗体（例えば、ＶＨＨ）は、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４の構造を有する。単一ドメイン抗体は、本明細書に記載されるように、別の分子（例えば、薬剤）に遺伝的に融合するか又は化学的にコンジュゲートし得る。単一ドメイン抗体は、より大きな結合分子（例えば、多重特異性抗体又は機能的外因性受容体）の一部であり得る。
【0045】
「結合」又は「結合すること」という用語は、例えば、複合体を形成することを含む分子間の相互作用を指す。相互作用は、例えば、水素結合、イオン結合、疎水性相互作用、及び／又はファンデルワールス相互作用を含む非共有相互作用であり得る。複合体には、共有結合若しくは非共有結合、相互作用、又は力によって一緒に保持された２つ又は３つ以上の分子の結合も含まれ得る。抗体の単一の抗原結合部位と、抗原などの標的分子の単一のエピトープとの間の非共有相互作用全体の強さが、そのエピトープに対する抗体又は機能的フラグメントの親和性である。一価の抗原に対する結合分子（例えば、抗体）の解離速度（ｋｏｆｆ）と会合速度（ｋｏｎ）との比（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）は、解離定数ＫＤであり、親和性とは逆の関係にある。ＫＤ値が低いほど、抗体の親和性は高くなる。ＫＤの値は、抗体及び抗原の異なる複合体によって様々であり、ｋｏｎ及びｋｏｆｆの両方に依存する。本明細書において提供される抗体の解離定数ＫＤは、本明細書において提供される任意の方法、又は当業者に周知である任意の他の方法を使用して決定することができる。１つの結合部位での親和性は、必ずしも抗体と抗原との間の相互作用の真の強さを反映するものではない。多価抗原などの複数の繰り返し抗原決定基を含有する複雑な抗原が、複数の結合部位を含む抗体と接触した場合、ある部位での抗体の抗原との相互作用は、第２部位での反応の確率を増加させるであろう。そのような多価抗体と抗原との間の複数の相互作用の強さは、親和力と呼ばれる。
【0046】
本明細書で使用される場合、「体液（body fluid）」又は「体液（bodily fluid）」という用語は、哺乳動物（例えば、ヒト）患者などの患者から得られる流体を指す。例えば、体液は、血液、脳脊髄液（cerebral spinal fluid、ＣＳＦ）、母乳、又は尿であり得る。体液はまた、細胞を除去するために分画された血液（すなわち、血漿）又は細胞及び凝固因子を除去するために分画された血液（すなわち、血清）であり得る。
【0047】
本明細書で使用される場合、「捕捉部分」又は「第１の抗体」という用語は、固体支持体に固定化された、例えば、結合された、又は別の方法で連結された別の組成物によって特異的に結合され得る組成物を指す。本明細書で提供される検出部分の多くは、結合事象が伴う限り、捕捉部分として使用することもできる。例えば、有用な捕捉部分としては、特異的かつ選択的なリガンドが利用可能である親和性標識（例えば、ビオチンとアビジン、グルタチオンとＧＳＴ）、抗血清又はモノクローナル抗体が利用可能であるハプテン及びタンパク質（例えば、ｃ－Ｍｙｃ）、標的に相補的な配列を有する核酸分子、並びに特異的かつ選択的なリガンドが利用可能であるペプチド（例えば、ヒスチジンタグとＮｉ）が挙げられる。クロマトグラフィー樹脂への結合特性に影響を及ぼす分子も想定される。固体支持体は、例えば、フィルタ、プレート、膜、クロマトグラフィー樹脂、又はビーズであり得る。
【0048】
本明細書で使用される場合、「カットポイント係数」又は「閾値」という用語は、概ね、ナイーブプールマトリックス（例えば、血清又は血漿）からのシグナルを数学的に操作して、陽性とみなされるために必要とされる試料かの最小シグナルを設定するために使用される値を指す。
【0049】
「誘導体」という用語は、本明細書で提供される方法で使用される抗体物質及びポリペプチドに関連して使用される場合、ユビキチン化、治療薬又は診断薬へのコンジュゲーション、標識（例えば、放射性核種又は様々な酵素による）、ペグ化などの共有ポリマー結合（すなわち、ポリエチレングリコールによる誘導体化）、及びヒトタンパク質では通常生じないオルニチンなどのアミノ酸の化学合成による挿入又は置換を含むがこれらに限定されない技法によって化学修飾されたポリペプチドを指す。誘導体は、非誘導体化分子の結合特性を保持することができる。
【0050】
本明細書で使用される場合、「検出可能な部分」、「検出部分」、又は「標識」という用語は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、化学的、又は他の物理的手段を含むがこれらに限定されない手段によって検出可能な組成物（例えば、ポリペプチド又は抗体）を指す。例えば、有用な検出可能な部分又は標識としては、ルテニウム（Ｒｕ）ベースの触媒、ユーロピウム、３２Ｐ、３５Ｓ、蛍光色素、高電子密度試薬、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡにおいて一般的に使用されるようなもの）、ビオチン－ストレプトアビジン、ジオキシゲニン、抗血清又はモノクローナル抗体が利用可能なハプテン及びタンパク質、並びに標的に相補的な配列を有する核酸分子が挙げられる。検出可能な部分又は標識は、多くの場合、試料中の結合した検出可能な部分又は標識の量を定量化するために使用することができる、放射性シグナル、発色シグナル、発光シグナル、又は蛍光シグナルなどの測定可能なシグナルを生成する。
【0051】
本明細書で使用される場合、「検出可能な抗体」という用語は、検出され得る任意の抗体を指す。いくつかの実施形態では、抗体は、検出可能な部分により直接標識される。特定の実施形態では、抗体は、検出可能な抗Ｉｇ抗体である。本明細書で使用される場合、「検出可能な抗Ｉｇ抗体」という用語は、検出され得る抗Ｉｇ抗体を指す。いくつかの実施形態では、抗Ｉｇ抗体は、Ｉｇ分子へのその固有の結合に加えて、検出可能な部分により直接標識される。Ｉｇ抗体は、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、又はＩｇＹアイソタイプのものであり得る。
【0052】
本明細書で使用される場合、「一次抗体」という用語は、目的の抗原に直接結合する抗体を指す。本明細書で使用される場合、「二次抗体」という用語は、検出標識にコンジュゲートされた抗体を指す。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される二次抗体は、一次抗体に直接結合する。他の実施形態では、本明細書に提供される二次抗体は、例えば、一次抗体を認識する別の抗体に結合することによって、一次抗体に間接的に結合する。
【0053】
ペプチド又はポリペプチドの文脈において、本明細書で使用される場合、「フラグメント」という用語は、完全長未満のアミノ酸配列を含むペプチド又はポリペプチドを指す。そのようなフラグメントは、例えば、アミノ末端での切断、カルボキシ末端での切断、及び／又はアミノ酸配列からの残基（複数可）の内部欠失から生じ得る。フラグメントは、例えば、選択的ＲＮＡスプライシング又はインビボプロテアーゼ活性から生じ得る。本明細書に開示されるペプチド又はポリペプチドの任意のフラグメントは機能的である。特定の実施形態では、フラグメントは、標的抗原に免疫特異的に結合する抗体のアミノ酸配列の少なくとも５個の連続したアミノ酸残基、少なくとも１０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも１５個の連続したアミノ酸残基、少なくとも２０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも２５個の連続したアミノ酸残基、少なくとも４０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも５０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも６０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも７０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも８０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも９０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも１００個の連続したアミノ酸残基、少なくとも１２５個の連続したアミノ酸残基、少なくとも１５０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも１７５個の連続したアミノ酸残基、少なくとも２００個の連続したアミノ酸残基、又は少なくとも２５０個の連続したアミノ酸残基のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。特定の実施形態では、標的抗原に免疫特異的に結合する抗体フラグメントは、抗体の少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの機能を保持する。
【0054】
２つ又は３つ以上のポリヌクレオチド又はポリペプチド配列の文脈における「同一である」又はパーセント「同一性」という用語は、配列比較アルゴリズムを使用して又は目視検査によって測定したとき、一致が最大になるように比較及び位置合わせさせた場合に同じである、又は特定のパーセントの同じであるヌクレオチド若しくはアミノ酸残基を有する、２つ又は３つ以上の配列又はサブ配列を指す。
【0055】
標的抗原と「免疫特異的に結合する抗体」という用語及び類似の用語は、本明細書において互換的に使用され、標的抗原又はエピトープのみに特異的に結合する抗体及びそのフラグメントを指す。更に他の実施形態では、本明細書に提供される抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡアイソタイプなどのＩｇに免疫特異的に結合する。
【0056】
本明細書で使用される場合、「干渉」という用語は、概ね、標的分析物の正確な検出及び測定を妨げる体液（例えば、血清又は血漿）試料中の物質の存在を指す。本明細書で使用される場合、干渉は、概ね、濃度－応答関係に対する遊離薬物の効果又はマトリックス（例えば、血清又は血漿）の効果を指す。例えば、マトリックスからの干渉は、７５～１２５％の相対精度の範囲を目標とするために、潜在的な干渉のない試料に対する相対精度として評価され得る。
【0057】
試料の文脈における「インビボ」という用語は、生物学的試料、例えば、生物学的若しくは体液、例えば、血液、血漿、血清、骨髄、髄液、脳液、又は組織、例えば、リンパ組織、薄層細胞学的試料、新鮮な凍結組織試料若しくは腫瘍組織を含む、対象、例えば、患者、例えばヒト患者から得られた試料を指す。「インビボ」という用語は、生きている生物の外で培養又は増殖された細胞若しくは細胞株、又は細胞の生体分子成分を包含する「インビトロ」という用語と区別されるべきである。
【0058】
「検出限界」、「ＬＯＤ」、又は「感度」という用語は、本明細書で使用される場合、概ね、検出され得るが必ずしも正確な値として定量されない体液（例えば、血清又は血漿）試料中の最低分析物濃度を指す。例えば、ＬＯＤは、プールされたナイーブマトリックス＋カットポイント係数の測定された平均応答よりも大きいシグナルを一貫して生成する分析物濃度として定義され得る。
【0059】
本明細書で使用される場合、「マトリックス（matrix）」又は「マトリックス（matrices）」という用語は、概ね、抗体が測定される生物学的バックグラウンドを指す。マトリックスの例としては、例えば、体液及び組織が挙げられる。
【0060】
「モノクローナル抗体」という用語は、均質又は実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指し、各モノクローナル抗体は、典型的には、抗原上の単一のエピトープを認識する。特定の実施形態では、本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」は、単一のハイブリドーマ又は他の細胞によって産生される抗体であり、抗体は、例えば、ＥＬＩＳＡ又は当該技術分野において既知の他の抗原結合アッセイ若しくは競合的結合アッセイによって決定されるように、酵素のみに免疫特異的に結合する。「モノクローナル」という用語は、抗体を作製するための特定の方法に限定されるものではない。例えば、本明細書で提供される方法において使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．；Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）に記載されているハイブリドーマ法によって作製され得るか、又は当該技術分野において既知の技法を使用してファージライブラリーから単離され得る。クローン細胞株及びそれによって発現されるモノクローナル抗体の調製のための他の方法は、当該該分野において周知である（例えば、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，（２００２）５ｔｈ Ｅｄ．，Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋの第１１章を参照されたい）。
【0061】
本明細書で使用される場合、「ポリクローナル抗体」は、多くのエピトープを有するタンパク質に対する免疫原性応答において生成される抗体集団を指し、したがって、タンパク質内の同じエピトープ及び異なるエピトープ向けられた様々な異なる抗体を含む。ポリクローナル抗体を産生するための方法は、当該技術分野において既知である（例えば、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，（２００２）５ｔｈ Ｅｄ．，Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋの第１１章を参照されたい）。
【0062】
本明細書で使用される場合、「精度」という用語は、概ね、分析者と日数との間のシグナルの変動性を指す。例えば、精度は、変動係数、値の範囲として、又はＡＮＯＶＡ統計を使用して評価され得る。
【0063】
本明細書で使用される場合、「予防する」、「予防すること」、及び「予防」という用語は、本明細書で提供される療法又は療法の組み合わせの投与から生じる、疾患及び／又はそれに関連する症状（例えば、患者におけるＰＫＵ又はがんなどのフェニルアラニンレベルの上昇に関連する疾患又はそれに関連する症状）の発生、再発、発症、又は拡大の全体的又は部分的な阻害を指す。
【0064】
本明細書で使用される場合、「試薬安定性」という用語は、概ね、試薬の調製の堅牢性及び貯蔵安定性を指す。例えば、試薬安定性は、新たに調製された試薬に対して７５～１２５％の精度内で値が測定されることを依然として可能にする条件によって確立され得る。
【0065】
本明細書で使用される場合、「堅牢性」という用語は、概ね、方法パラメータの小さな変動によって影響を受けないままであるアッセイの能力を指し、通常の実行条件中のアッセイの信頼性を示す。例えば、堅牢性は、公称条件に対して７５～１２５％の精度内で依然としてシグナルを生成する試薬濃度、試薬体積、又はインキュベーション時間のパーセント変化として評価することができる。
【0066】
本明細書で使用される場合、「試料」という用語は、概ね、本明細書で提供される方法において使用することができる、例えば、患者から採取された試験流体又は組織を指す。いくつかの実施形態では、試料は、インビボ試料、例えば、対象、例えば、患者、例えば、ヒト患者由来の体液（又は生物学的流体）である。そのような体液の非限定的な例としては、血液（例えば、ヒト末梢血（human peripheral blood、ＨＰＢ））、血液溶解物、血清、血漿、細針吸引物、管洗浄液、髄液、脳液、骨髄、腹水、又はそれらの任意の組み合わせが挙げられる。他の実施形態では、試料は、対象からの腫瘍組織などの生検組織、又は他の体組織若しくは臓器の薄層細胞学的試料から採取される。特定の実施形態では、試料は、末梢血試料、腫瘍組織又は疑わしい腫瘍組織、薄膜細胞学的試料、細針吸引試料、骨髄試料、リンパ節試料、尿試料、腹水試料、洗浄試料、食道ブラッシング試料、膀胱又は肺洗浄試料、髄液試料、脳液試料、管吸引試料、乳房分泌物試料、胸水試料、新鮮な凍結組織試料、パラフィン包埋組織試料を含む。他の実施形態では、試料は、末梢血試料、腫瘍組織若しくは疑わしい腫瘍組織、薄膜細胞学的試料、細針吸引試料、骨髄試料、尿試料、腹水試料、洗浄試料、食道ブラッシング試料、膀胱若しくは肺洗浄試料、髄液試料、脳液試料、管吸引試料、乳房分泌物試料、胸水試料、新鮮な凍結組織試料、又はパラフィン包埋組織試料のうちのいずれかからの抽出液であるか、又はそれから産生された処理された試料である。
【0067】
本明細書で提供されるいくつかの実施形態では、試料は、細胞株由来の細胞を含む。一実施形態では、細胞株は、Ｖｅｒｏ細胞、ＣＨＯ細胞、ＭＤＣＫ細胞、２９３ Ｔ細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ ２９３細胞、ＮＳ０細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、ＣＲＬ７Ｏ３Ｏ細胞、ＨｓＳ７８Ｂｓｔ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞、又は他の細胞株などの細胞株である。
【0068】
上記又は下記の実施形態のいずれか１つのいくつかの実施形態では、試料は、不死化細胞株由来の細胞を含む。
【0069】
本明細書で使用される場合、「不死化細胞株」は、正常な細胞老化を回避し、代わりに、変異（複数可）に起因して分裂を受け続けることができる細胞の集団を説明する。したがって、不死化細胞株由来の細胞は、インビトロで長期間成長することができる。不死性に必要な変異は、天然に生じ得るか、又は実験目的のために意図的に誘導され得る。不死化細胞は、分裂を停止しない腫瘍性／がん性細胞、又は無制限に増殖するように人工的に操作された細胞であってもよく、したがって、数世代にわたって培養することができる。限定するものではないが、不死化細胞株としては、例えば、気道内皮細胞、大動脈内皮細胞、バレット食道上皮細胞、気管支上皮細胞、呼吸上皮細胞、軟骨細胞線維芽細胞、皮膚微小血管内皮細胞（ＴＩＭＥ細胞を含む）、子宮内膜線維芽細胞、包皮ケラチノサイト、肺内皮細胞、乳腺上皮細胞、間葉系幹細胞、ＮＴＡＰシュワン細胞、膵管細胞、前立腺細胞、腎上皮細胞、網膜色素上皮細胞、及び皮膚線維芽細胞を挙げることができる。
【0070】
上記又は下記の実施形態のいくつかの実施形態では、試料が不死化細胞株由来の細胞を含む方法が提供される。不死化細胞株は、本明細書に記載される使用のために市販され得る。様々な不死化細胞株が周知であり、市販されている（ＡＴＣＣ（登録商標）、Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）。
【0071】
本明細書で使用される場合、「特異性」という用語は、概ね、特定のタンパク質と反応する抗体を検出するアッセイの能力を指す。例えば、特異性は、非特異的タンパク質に対する応答がＬＯＤ未満であるべきである一方で、特定の分析物との比例的な検出応答を指し得る。比例的な応答は、０．９８以上の相関係数Ｒ値に対して評価され得る。標的抗原を検出するために本明細書で提供される方法に関連して使用される場合、特異性は、特定のタンパク質と反応する抗原を検出する能力を指す。
【0072】
本明細書で使用される場合、「対象」及び「患者」という用語は互換的に使用される。本明細書で使用される場合、対象は、好ましくは非霊長類（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラットなど）又は霊長類（例えば、サル及びヒト）などの哺乳動物、最も好ましくはヒトである。一実施形態では、対象は、哺乳動物、好ましくはヒトである。本明細書で提供される方法及びキットのいくつかの実施形態では、患者は、疾患若しくは症状、又はがんを有する。本明細書で提供される方法及びキットの他の実施形態では、患者は、がん療法を受けている患者である。本明細書で提供される方法及びキットの更に他の実施形態では、患者は、妊婦又は乳児（例えば、０～約３６ヶ月齢）である。
【0073】
本明細書で使用される場合、「タグ」及び「標識」という用語は、互換的に使用され、抗体若しくはその抗原結合フラグメント、又は本明細書で提供される方法において使用される他のポリペプチドに結合される任意の種類の部分を指す。抗体又はタグに関する「検出可能な」又は「検出」という用語は、可視化することができる任意の抗体又はタグを指すか、あるいは抗体又はタグの存在を別の方法で決定及び／又は測定することができる（例えば、定量化によって）。検出可能なタグの非限定的な例としては、蛍光タグ又は他の化学発光タグ、及びＰＣＲを使用して増幅及び定量され得るタグが挙げられる。特定の実施形態では、本明細書で提供される方法において使用される二次抗体は、標識されたストレプトアビジンと組み合わせて使用されるビオチン化二次抗体である。
【0074】
本明細書で使用される場合、「療法」という用語は、疾患（又はそれに関連する症状）又はがんの予防、管理、治療、及び／又は寛解において使用され得る任意のプロトコル、方法、及び／又は薬剤を指す。特定の実施形態では、「療法（therapies）」及び「療法（therapy）」という用語は、医療関係者などの当業者に既知の疾患又はがんの予防、管理、治療、及び／又は寛解に有用な生物学的療法、支持療法、及び／又は他の療法を指す。
【0075】
本明細書で使用される場合、「組織」という用語は、哺乳動物、例えばヒトから得られる組織を指す。例えば、組織は、生検試料、外科的に除去された組織、又は死後収集物由来のものであり得る。更に、組織をホモジナイズし抽出して、組織から酵素又は抗体を単離することができる。
【0076】
本明細書で使用される場合、「治療する」、「治療」、及び「治療すること」という用語は、１つ又は２つ以上の療法を投与することによって生じる、疾患（それに関連する症状）又はがんの進行、重症度、及び／又は持続期間の減少又は寛解を指す。
【0077】
本明細書で使用される場合、「変異体」という用語は、元のポリペプチドコードドメインに対してコード領域に少なくとも１つのアミノ酸置換、欠失、又は挿入を含むポリペプチド配列を指す。変異体は、天然に存在するポリペプチドの生物学的活性を保持する。
【0078】
本明細書で使用される場合、「インサイチュハイブリダイゼーション」又は「ＩＳＨ」という用語は、供給源試料の形態を保存しながら、特定の標的核酸を局在化及び可視化するための技法を指す。
【0079】
本明細書で使用される場合、「免疫組織化学」又は「ＩＨＣ」という用語は、供給源試料の形態を保存しながら、抗体を利用して供給源試料中の目的のタンパク質を検出するための技法を指す。免疫蛍光（Immunofluorescence、ＩＦ）は、蛍光標識を指し、したがって、ＩＨＣという用語にも包含される。
【0080】
本明細書で使用される場合、「架橋」という用語は、２つ又は３つ以上の分子を一緒に結合するプロセスを指す。「架橋剤」又は均等物は、タンパク質及び他の分子に見られる官能基に自身を結合する２つ又は３つ以上の化学的に反応性の末端を含有する薬剤を指す。具体的には、架橋剤がホルムアルデヒド又はその均等物である場合、アミノ酸又は核酸塩基上の求核基は、ホルムアルデヒドと共有結合を形成し、これは、しばしば別の分子上の別の官能基を伴う第２のステップにおいて安定化され、メチレン架橋の形成をもたらす。架橋剤が酸化剤である場合、それはタンパク質及び他の生体分子の側鎖と反応することができ、組織構造を安定化させる架橋の形成を可能にする。
【0081】
本明細書で使用される場合、「固定」又は「固定すること」という用語は、ＩＨＣプロセスにおける試料の固定に関して行われる場合、例えば、自己分解又は腐敗による崩壊から試料を保護するための手順を指す。それは、任意の進行中の生化学反応を終結させ、また、処理された組織の機械的強度又は安定性を増加させ得る。
【0082】
本明細書で使用される場合、「検出すること」という用語は、概ね、任意の形態の測定を指し、要素が存在するか否かを決定することを含む。この用語は、定量的及び／又は定性的決定を含む。
【0083】
５．２ ＩＨＣ
ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織に対する免疫組織化学（ＩＨＣ）は、目的の標的タンパク質を発現する細胞を同定し、潜在的な毒性を予測することによる、Ｒ＆Ｄ治療キャンペーンにおける重要なステップである。堅牢なＩＨＣアッセイは、最適な特異性及び感度で標的を確実に認識する好適な一次抗体に依存する。ＦＦＰＥ組織は、しばしば、立体構造が変化した過剰固定タンパク質を提示し、これは、非ＩＨＣアッセイにおいて検証された抗体の再目的化を極めて不確実にする。組織調製及び保存プロセス中に、ホルマリンなどの架橋剤が使用される場合、ホルマリン固定は、エピトープをマスクし、免疫反応性の減少をもたらし得る（Ａｒｎｏｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ ７１：２２４－２３０（１９９６）を参照されたい）。ホルマリン固定は、固定時間の増加が平衡点までのタンパク質への連続したホルムアルデヒド基結合をもたらす時間依存性プロセスである（Ｆｏｘ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ ３３：８４５－８５３（１９８５）を参照されたい）。研究により、ホルマリン固定は、特に延長された場合、抗原性の減少をもたらすことが示されており（Ｂａｔｔｉｆｏｒａ ａｎｄ Ｋｏｐｉｎｓｋｉ，Ｊ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ ３４：１０９５－１１００（１９８６）を参照されたい）、これは、診断的ＩＨＣのためのホルマリン固定組織の使用を制限する（Ｒａｍｏｓ－Ｖａｒａ，Ｖｅｔ Ｐａｔｈｏｌ ４２：４０５－４２６（２００５）、Ｗｅｂｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．５７（８）：７５３－７６１（２００９）を参照されたい）。新しいＩＨＣ抗体の生成は、好適な試薬が市販されていない場合、関連する対照に対して多くの候補をスクリーニングすることを必要とする。
ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織に対する免疫組織化学（ＩＨＣ）は、目的の標的タンパク質を発現する細胞を同定し、潜在的な毒性を予測することによる、Ｒ＆Ｄ治療キャンペーンにおける重要なステップである。堅牢なＩＨＣアッセイは、最適な特異性及び感度で標的を確実に認識する好適な一次抗体に依存する。ＦＦＰＥ組織は、しばしば、立体構造が変化した過剰固定タンパク質を提示し、これは、非ＩＨＣアッセイにおいて検証された抗体の再目的化を極めて不確実にする。組織調製及び保存プロセス中に、ホルマリンなどの架橋剤が使用される場合、ホルマリン固定は、エピトープをマスクし、免疫反応性の減少をもたらし得る（Ａｒｎｏｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ ７１：２２４－２３０（１９９６）を参照されたい）。ホルマリン固定は、固定時間の増加が平衡点までのタンパク質への連続したホルムアルデヒド基結合をもたらす時間依存性プロセスである（Ｆｏｘ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ ３３：８４５－８５３（１９８５）を参照されたい）。研究により、ホルマリン固定は、特に延長された場合、抗原性の減少をもたらすことが示されており（Ｂａｔｔｉｆｏｒａ ａｎｄ Ｋｏｐｉｎｓｋｉ，Ｊ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ ３４：１０９５－１１００（１９８６）を参照されたい）、これは、診断的ＩＨＣのためのホルマリン固定組織の使用を制限する（Ｒａｍｏｓ－Ｖａｒａ，Ｖｅｔ Ｐａｔｈｏｌ ４２：４０５－４２６（２００５）、Ｗｅｂｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．５７（８）：７５３－７６１（２００９）を参照されたい）。新しいＩＨＣ抗体の生成は、好適な試薬が市販されていない場合、関連する対照に対して多くの候補をスクリーニングすることを必要とする。
【0084】
本明細書で提供される方法は、従来のプロトコルを修正することによって上述の課題を克服する。本明細書において、細胞ベースのＥＬＩＳＡアッセイに好適な単一細胞懸濁液として維持しながら、固定された細胞株（ＦＦＰＥ組織を模倣する）を使用してＦＦＰＥ ＩＨＣ品質抗体のスクリーニングを可能にする方法が提供される。このプロトコルは、ガラススライド上に載置された従来の対照を用いて適時に行うことが不可能である多くの抗体及び条件のハイスループット試験を可能にする。
【0085】
５．３ 分子の検出及びスクリーニングを増強するための方法
一態様では、本明細書において、試料中の分子を検出する方法であって、試料から細胞を得、次いで、細胞を固定剤で処理し、次いで固定された細胞をパラフィン包埋し、続いて細胞を脱パラフィンし懸濁して、単一細胞懸濁液を得、次いで懸濁された細胞を第１の検出剤と接触させ、次いで第１の検出剤に結合した細胞を第２の検出剤と接触させ、試料の細胞に結合した第２の検出剤の存在を検出する、方法が提供される。
一態様では、本明細書において、試料中の分子を検出する方法であって、試料から細胞を得、次いで、細胞を固定剤で処理し、次いで固定された細胞をパラフィン包埋し、続いて細胞を脱パラフィンし懸濁して、単一細胞懸濁液を得、次いで懸濁された細胞を第１の検出剤と接触させ、次いで第１の検出剤に結合した細胞を第２の検出剤と接触させ、試料の細胞に結合した第２の検出剤の存在を検出する、方法が提供される。
【0086】
好ましい実施形態では、試料は、方法のステップを行う前に対象から得られる。
【0087】
いくつかの実施形態では、第１及び／又は第２の検出剤は、懸濁された細胞の少なくとも１つの分子に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントを含む。
【0088】
いくつかの実施形態では、懸濁された細胞を第１の検出剤と接触させた後に未結合細胞を除去する。
【0089】
いくつかの実施形態では、第２の検出剤は、抗体又はそのフラグメントである。
【0090】
いくつかの実施形態では、第１の検出剤に結合した細胞を第２の検出剤と接触させた後に、未結合の第２の検出剤を除去する。
【0091】
本明細書で提供される方法の一態様では、試料に結合した第２の検出剤のバックグラウンドを超える量の検出は、試料中の少なくとも１つの分子の存在を示す。
【0092】
いくつかの実施形態では、細胞を固定剤で処理する前に、細胞をコロジオンバッグ中で培養し、ペレット化する。一実施形態では、コロジオンバッグは、ガラス円錐管の内面をコロジオン溶液でコーティングすることによって生成される。一態様では、コロジオン溶液を最初にガラス試験管に注ぎ、溶液を１時間放置し、管を旋回させながらコロジオンを注ぎ戻し、管を１時間逆さにして乾燥させ、次いで管に水道水を充填し、パラフィルムで覆い、使用するまで４℃の冷蔵庫に直立させて保管する。一態様では、コロジオンバッグは、Ｗｉｌｇｅｎｂｕｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，２０２０（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ；９，２０－２５）に記載されているように調製される。
【0093】
いくつかの実施形態では、分子は、核酸又はタンパク質である。いくつかの実施形態では、核酸は、ＲＮＡである。いくつかの実施形態では、核酸は、ＤＮＡである。
【0094】
一態様では、本明細書において、試料中のＲＮＡを検出する方法であって、試料から細胞を得、次いで、細胞を固定剤で処理し、次いで固定された細胞をパラフィン包埋し、続いて細胞を脱パラフィンし懸濁して、単一細胞懸濁液を得、次いで懸濁された細胞を第１の検出剤と接触させ、次いで第１の検出剤に結合した細胞を第２の検出剤と接触させ、試料の細胞に結合した第２の検出剤の存在を検出する、方法が提供される。
【0095】
一態様では、本明細書において、試料中のＤＮＡを検出する方法であって、試料から細胞を得、次いで、細胞を固定剤で処理し、次いで固定された細胞をパラフィン包埋し、続いて細胞を脱パラフィンし懸濁して、単一細胞懸濁液を得、次いで懸濁された細胞を第１の検出剤と接触させ、次いで第１の検出剤に結合した細胞を第２の検出剤と接触させ、試料の細胞に結合した第２の検出剤の存在を検出する、方法が提供される。
【0096】
一態様では、本明細書において、試料中のタンパク質を検出する方法であって、試料から細胞を得、次いで、細胞を固定剤で処理し、次いで固定された細胞をパラフィン包埋し、続いて細胞を脱パラフィンし懸濁して、単一細胞懸濁液を得、次いで懸濁された細胞を第１の検出剤と接触させ、次いで第１の検出剤に結合した細胞を第２の検出剤と接触させ、試料の細胞に結合した第２の検出剤の存在を検出する、方法が提供される。
【0097】
いくつかの実施形態では、固定剤は、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、又は中性緩衝ホルマリンを含む群から選択される。いくつかの実施形態では、固定剤は、ホルムアルデヒドである。いくつかの実施形態では、固定剤は、パラホルムアルデヒドである。いくつかの実施形態では、固定剤は、グルタルアルデヒドである。いくつかの実施形態では、固定剤は、中性緩衝ホルマリンである。
【0098】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、試料を固定剤の混合物である固定剤で処理することを含む。いくつかの実施形態では、固定剤は、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、パラホルムアルデヒド、中性緩衝ホルマリン、アクロレイン、四酸化オスミウム、過マンガン酸塩固定剤、二クロム酸塩固定剤、及びクロム酸のリストから選択される２つ又は３つ以上の固定剤の混合溶液である。一実施形態では、固定剤はブアン固定剤であり、これはピクリン酸、ホルムアルデヒド、及び酢酸の溶液である。一実施形態では、固定剤は、ホルムアルデヒドとグルタルアルデヒドとの混合物である。一実施形態では、固定剤は、ＦＡＡであり、これは、エタノール、酢酸、及びホルムアルデヒドの溶液である。一実施形態では、固定剤は過ヨウ素酸－リジン－パラホルムアルデヒド（periodate-lysine-paraformaldehyde、ＰＬＰ）であり、これは、パラホルムアルデヒド、Ｌ－リジン、及びＩＮａＯ４の溶液である。一実施形態では、固定剤は、リン酸緩衝ホルマリン（phosphate buffered formalin、ＰＢＦ）である。一実施形態では、固定剤は、ｆｏｒｍａｌ－カルシウムであり、これは、ホルムアルデヒド及び塩化カルシウムの溶液である。一実施形態では、固定剤は、ｆｏｒｍａｌ生理食塩水であり、これは、ホルムアルデヒド及び塩化ナトリウムの溶液である。一実施形態では、固定剤は、亜鉛ホルマリンであり、これは、ホルムアルデヒド及び硫酸亜鉛の溶液である。一実施形態では、固定剤は、ヘリー固定剤であり、これは、ホルムアルデヒド、二クロム酸カリウム、硫酸ナトリウム、及び塩化第二水銀の溶液である。一実施形態では、固定剤は、Ｈｏｌｌａｎｄｅ固定剤であり、これは、ホルムアルデヒド、酢酸銅、ピクリン酸、及び酢酸の溶液である。一実施形態では、固定剤は、ゲンドル溶液であり、これは、ホルムアルデヒド、エタノール、ピクリン酸、及び氷酢酸の溶液である。一実施形態では、固定剤は、アルコール性ホルマリンであり、これは、ホルムアルデヒド、エタノール、及び酢酸カルシウムの溶液である。一実施形態では、固定剤は、ｆｏｒｍｏｌ酢酸アルコールであり、これは、ホルムアルデヒド、氷酢酸、及びエタノールの溶液である。一実施形態では、固定剤は、固定剤の混合物であり、混合物の少なくとも１つの固定剤は、ホルムアルデヒド、中性緩衝ホルマリン、又はグルタルアルデヒドである。一実施形態では、固定剤は、同時にではなく、別個に、又は連続して使用される固定剤であり、少なくとも１つの固定剤は、ホルムアルデヒド、中性緩衝ホルマリン、又はグルタルアルデヒドである。
【0099】
いくつかの実施形態では、細胞を固定剤で処理するステップは、約３０分間～４８時間続く。いくつかの実施形態では、細胞を固定剤で処理するステップは、約６０分間～３６時間続く。いくつかの実施形態では、細胞を固定剤で処理するステップは、約２時間～２４時間続く。いくつかの実施形態では、細胞を固定剤で処理するステップは、約５時間～２０時間続く。いくつかの実施形態では、細胞を固定剤で処理するステップは、約１０時間～１５時間続く。いくつかの実施形態では、細胞を固定剤で処理するステップは、約３０分間～６０分間、１時間～２時間、２時間～３時間、３時間～４時間、４時間～５時間、５時間～６時間、６時間～７時間、７時間～８時間、８時間～９時間、９時間～１０時間、１０時間～１１時間、１１時間～１２時間、１２時間～１３時間、１３時間～１４時間、１４時間～１５時間、１５時間～１６時間、１６時間～１７時間、１７時間～１８時間、１８時間～１９時間、１９時間～２０時間、２０時間～２１時間、２１時間～２２時間、２２時間～２３時間、２３時間～２４時間、２４時間～３６時間、又は３６時間～４８時間続く。いくつかの実施形態では、細胞を固定剤で処理するステップは、約３０分間～６０分間続く。いくつかの実施形態では、細胞を固定剤で処理するステップは、約１時間～２時間続く。いくつかの実施形態では、細胞を固定剤で処理するステップは、約２時間～３時間続く。いくつかの実施形態では、細胞を固定剤で処理するステップは、約３時間～４時間続く。いくつかの実施形態では、細胞を固定剤で処理するステップは、約４時間～５時間続く。いくつかの実施形態では、細胞を固定剤で処理するステップは、約５時間～６時間続く。いくつかの実施形態では、細胞を固定剤で処理するステップは、約６時間～７時間続く。いくつかの実施形態では、細胞を固定剤で処理するステップは、約７時間～８時間続く。いくつかの実施形態では、細胞を固定剤で処理するステップは、約８時間～９時間続く。いくつかの実施形態では、細胞を固定剤で処理するステップは、約９時間～１０時間続く。いくつかの実施形態では、細胞を固定剤で処理するステップは、約１０時間～１１時間続く。いくつかの実施形態では、細胞を固定剤で処理するステップは、約１１時間～１２時間続く。いくつかの実施形態では、細胞を固定剤で処理するステップは、約１２時間～１３時間続く。いくつかの実施形態では、細胞を固定剤で処理するステップは、約１３時間～１４時間続く。いくつかの実施形態では、細胞を固定剤で処理するステップは、約１４時間～１５時間続く。いくつかの実施形態では、細胞を固定剤で処理するステップは、約１５時間～１６時間続く。いくつかの実施形態では、細胞を固定剤で処理するステップは、約１６時間～１７時間続く。いくつかの実施形態では、細胞を固定剤で処理するステップは、約１７時間～１８時間続く。いくつかの実施形態では、細胞を固定剤で処理するステップは、約１８時間～１９時間続く。いくつかの実施形態では、細胞を固定剤で処理するステップは、約１９時間～２０時間続く。いくつかの実施形態では、細胞を固定剤で処理するステップは、約２０時間～２１時間続く。いくつかの実施形態では、細胞を固定剤で処理するステップは、約２１時間～２２時間続く。いくつかの実施形態では、細胞を固定剤で処理するステップは、約２２時間～２３時間続く。いくつかの実施形態では、細胞を固定剤で処理するステップは、約２３時間～２４時間続く。いくつかの実施形態では、細胞を固定剤で処理するステップは、約２４時間～３６時間続く。いくつかの実施形態では、細胞を固定剤で処理するステップは、約３６時間～４８時間続く。
【0100】
いくつかの実施形態では、細胞を固定剤で処理するステップは、約３０分間、６０分間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、２４時間、２５時間、２６時間、２７時間、２８時間、２９時間、３０時間、３６時間、又は４８時間続く。いくつかの実施形態では、細胞を固定剤で処理するステップは、約３０分間続く。いくつかの実施形態では、細胞を固定剤で処理するステップは、約６０分間続く。いくつかの実施形態では、細胞を固定剤で処理するステップは、約２時間続く。いくつかの実施形態では、細胞を固定剤で処理するステップは、約３時間続く。いくつかの実施形態では、細胞を固定剤で処理するステップは、約４時間続く。いくつかの実施形態では、細胞を固定剤で処理するステップは、約５時間続く。いくつかの実施形態では、細胞を固定剤で処理するステップは、約６時間続く。いくつかの実施形態では、細胞を固定剤で処理するステップは、約７時間続く。いくつかの実施形態では、細胞を固定剤で処理するステップは、約８時間続く。いくつかの実施形態では、細胞を固定剤で処理するステップは、約９時間続く。いくつかの実施形態では、細胞を固定剤で処理するステップは、約１０時間続く。いくつかの実施形態では、細胞を固定剤で処理するステップは、約１１時間続く。いくつかの実施形態では、細胞を固定剤で処理するステップは、約１２時間続く。いくつかの実施形態では、細胞を固定剤で処理するステップは、約１３時間続く。いくつかの実施形態では、細胞を固定剤で処理するステップは、約１４時間続く。いくつかの実施形態では、細胞を固定剤で処理するステップは、約１５時間続く。いくつかの実施形態では、細胞を固定剤で処理するステップは、約１６時間続く。いくつかの実施形態では、細胞を固定剤で処理するステップは、約１７時間続く。いくつかの実施形態では、細胞を固定剤で処理するステップは、約１８時間続く。いくつかの実施形態では、細胞を固定剤で処理するステップは、約１９時間続く。いくつかの実施形態では、細胞を固定剤で処理するステップは、約２０時間続く。いくつかの実施形態では、細胞を固定剤で処理するステップは、約２１時間続く。いくつかの実施形態では、細胞を固定剤で処理するステップは、約２２時間続く。いくつかの実施形態では、細胞を固定剤で処理するステップは、約２３時間続く。いくつかの実施形態では、細胞を固定剤で処理するステップは、約２４時間続く。いくつかの実施形態では、細胞を固定剤で処理するステップは、約２５時間続く。いくつかの実施形態では、細胞を固定剤で処理するステップは、約２６時間続く。いくつかの実施形態では、細胞を固定剤で処理するステップは、約２７時間続く。いくつかの実施形態では、細胞を固定剤で処理するステップは、約２８時間続く。いくつかの実施形態では、細胞を固定剤で処理するステップは、約２９時間続く。いくつかの実施形態では、細胞を固定剤で処理するステップは、約３０時間続く。いくつかの実施形態では、細胞を固定剤で処理するステップは、約３６時間続く。いくつかの実施形態では、細胞を固定剤で処理するステップは、約４８時間続く。
【0101】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、０℃～１００℃の温度で試料を固定剤で処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、１℃～９０℃の温度で試料を固定剤で処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、２℃～８０℃の温度で試料を固定剤で処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、３℃～７０℃の温度で試料を固定剤で処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、４℃～６０℃の温度で試料を固定剤で処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、０℃～１０℃の温度で試料を固定剤で処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、１０℃～２０℃の温度で試料を固定剤で処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、２０℃～３０℃の温度で試料を固定剤で処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、３０℃～４０℃の温度で試料を固定剤で処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、４０℃～５０℃の温度で試料を固定剤で処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、５０℃～６０℃の温度で試料を固定剤で処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、６０℃～７０℃の温度で試料を固定剤で処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、７０℃～８０℃の温度で試料を固定剤で処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、８０℃～９０℃の温度で試料を固定剤で処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、９０℃～１００℃の温度で試料を固定剤で処理することを含む。
【0102】
いくつかの実施形態では、細胞を固定剤で処理するステップは、４℃、室温、４０℃、又は６０℃で行われる。いくつかの実施形態では、細胞を固定剤で処理するステップは、４℃で行われる。いくつかの実施形態では、細胞を固定剤で処理するステップは、室温で行われる。いくつかの実施形態では、細胞を固定剤で処理するステップは、４０℃で行われる。いくつかの実施形態では、細胞を固定剤で処理するステップは、６０℃で行われる。
【0103】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、試料を１％～２０％中性緩衝ホルマリンで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、試料を１％中性緩衝ホルマリンで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、試料を５％中性緩衝ホルマリンで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、試料を８％中性緩衝ホルマリンで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、試料を１０％中性緩衝ホルマリンで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、試料を１２％中性緩衝ホルマリンで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、試料を１５％中性緩衝ホルマリンで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、試料を２０％中性緩衝ホルマリンで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、試料を１％～５％中性緩衝ホルマリンで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、試料を５％～１０％中性緩衝ホルマリンで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、試料を１０％～１５％中性緩衝ホルマリンで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、試料を１５％～２０％中性緩衝ホルマリンで処理することを含む。
【0104】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、０℃～１００℃の温度で、試料を１％～２０％中性緩衝ホルマリンで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、１℃～９０℃の温度で、試料を１％～２０％中性緩衝ホルマリンで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、２℃～８０℃の温度で、試料を１％～２０％中性緩衝ホルマリンで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、３℃～７０℃の温度で、試料を１％～２０％中性緩衝ホルマリンで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、４℃～６０℃の温度で、試料を１％～２０％中性緩衝ホルマリンで処理することを含む。
【0105】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、０℃～２０℃の温度で、試料を１０％中性緩衝ホルマリンで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、２０℃～４０℃の温度で、試料を１０％中性緩衝ホルマリンで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、４０℃～６０℃の温度で、試料を１０％中性緩衝ホルマリンで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、６０℃～８０℃の温度で、試料を１０％中性緩衝ホルマリンで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、８０℃～１００℃の温度で、試料を１０％中性緩衝ホルマリンで処理することを含む。
【0106】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、０℃～１００℃の温度で、試料を１０％中性緩衝ホルマリンで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、１℃～９０℃の温度で、試料を１０％中性緩衝ホルマリンで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、２℃～８０℃の温度で、試料を１０％中性緩衝ホルマリンで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、３℃～７０℃の温度で、試料を１０％中性緩衝ホルマリンで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、４℃～６０℃の温度で、試料を１０％中性緩衝ホルマリンで処理することを含む。
【0107】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約１℃の温度で、試料を１０％中性緩衝ホルマリン（neutral buffered formalin、「ＮＢＦ」）で処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約２℃の温度で試料を１０％ＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約３℃の温度で試料を１０％ＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約４℃の温度で、試料を１０％ＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約５℃の温度で試料を１０％ＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約６℃の温度で試料を１０％ＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約７℃の温度で試料を１０％ＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約８℃の温度で試料を１０％ＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約９℃の温度で試料を１０％ＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約１０℃の温度で試料を１０％ＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約１１℃の温度で試料を１０％ＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約１２℃の温度で試料を１０％ＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約１３℃の温度で試料を１０％ＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約１４℃の温度で試料を１０％ＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約１５℃の温度で試料を１０％ＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約１６℃の温度で試料を１０％ＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約１７℃の温度で試料を１０％ＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約１８℃の温度で試料を１０％ＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約１９℃の温度で試料を１０％ＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約２０℃の温度で試料を１０％ＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約２１℃の温度で試料を１０％ＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約２２℃の温度で試料を１０％ＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約２３℃の温度で試料を１０％ＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約２４℃の温度で試料を１０％ＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約２５℃の温度で試料を１０％ＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約２６℃の温度で試料を１０％ＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約２７℃の温度で試料を１０％ＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約２８℃の温度で試料を１０％ＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約２９℃の温度で試料を１０％ＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約３０℃の温度で試料を１０％ＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約３５℃の温度で試料を１０％ＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約４０℃の温度で試料を１０％ＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約４５℃の温度で試料を１０％ＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約５０℃の温度で試料を１０％ＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約５５℃の温度で試料を１０％ＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約６０℃の温度で試料を１０％ＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約６５℃の温度で試料を１０％ＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約７０℃の温度で試料を１０％ＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約７５℃の温度で試料を１０％ＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約８０℃の温度で試料を１０％ＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約８５℃の温度で試料を１０％ＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約９０℃の温度で試料を１０％ＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約９５℃の温度で試料を１０％ＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約１００℃の温度で試料を１０％ＮＢＦで１０％ＮＢＦで処理することを含む。
【0108】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、０．１時間～４８時間、生物学的試料を１％～２０％ＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、０．１時間～３６時間、生物学的試料を１％～２０％ＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、０．１時間～２４時間、生物学的試料を１％～２０％ＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、０．２時間～２２時間、生物学的試料を１％～２０％ＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、０．２５時間～２０時間、生物学的試料を１％～２０％ＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、０．２５時間～１８時間、生物学的試料を１％～２０％ＮＢＦで処理することを含む。
【0109】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、０．１時間～４８時間、生物学的試料を１０％ＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、０．１時間～３６時間、生物学的試料を１０％ＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、０．１時間～２４時間、生物学的試料を１０％ＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、０．２時間～２２時間、生物学的試料を１０％ＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、０．２５時間～２０時間、生物学的試料を１０％ＮＢＦで処理することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、０．２５時間～１８時間、生物学的試料を１０％ＮＢＦで処理することを含む。
【0110】
いくつかの実施形態では、細胞を固定剤で処理するステップは、室温で２４時間行われる。いくつかの実施形態では、細胞を１０％ＮＢＦで処理するステップは、室温で２４時間行われる。
【0111】
いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、４℃の温度で１０時間超にわたって、生物学的試料を固定剤で処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、４℃の温度で５時間超にわたって、生物学的試料を固定剤で処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、４℃の温度で１時間超にわたって、生物学的試料を固定剤で処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、４℃の温度で約５時間、生物学的試料を固定剤で処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、４℃の温度で約６時間、生物学的試料を固定剤で処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、４℃の温度で約７時間、生物学的試料を固定剤で処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、４℃の温度で約８時間、生物学的試料を固定剤で処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、４℃の温度で約９時間、生物学的試料を固定剤で処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、４℃の温度で約１０時間、生物学的試料を固定剤で処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、４℃の温度で約１１時間、生物学的試料を固定剤で処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、４℃の温度で約１２時間、生物学的試料を固定剤で処理することを含む。
【0112】
いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、室温で６時間未満にわたって、生物学的試料を固定剤で処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、室温で３時間未満にわたって、生物学的試料を固定剤で処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、室温で１時間未満にわたって、生物学的試料を固定剤で処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、室温で０．５時間未満にわたって、生物学的試料を固定剤で処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、室温で約０．１時間、生物学的試料を固定剤で処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、室温で約０．１５時間、生物学的試料を固定剤で処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、室温で約０．２時間、生物学的試料を固定剤で処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、室温で約０．２５時間、生物学的試料を固定剤で処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、室温で約０．３時間、生物学的試料を固定剤で処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、室温で約０．３５時間、生物学的試料を固定剤で処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、室温で約０．４時間、生物学的試料を固定剤で処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、室温で約０．４５時間、生物学的試料を固定剤で処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、室温で約０．５時間、生物学的試料を固定剤で処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、室温で約０．５５時間、生物学的試料を固定剤で処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、室温で約０．６時間、生物学的試料を固定剤で処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、室温で約０．６５時間、生物学的試料を固定剤で処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、室温で約０．７時間、生物学的試料を固定剤で処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、室温で約０．７５時間、生物学的試料を固定剤で処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、室温で約０．８時間、生物学的試料を固定剤で処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、室温で約０．８５時間、生物学的試料を固定剤で処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、室温で約０．９時間、生物学的試料を固定剤で処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、室温で約１時間、生物学的試料を固定剤で処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、室温で約１．５時間、生物学的試料を固定剤で処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、室温で約２時間、生物学的試料を固定剤で処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、室温で約２．５時間、生物学的試料を固定剤で処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、室温で約３時間、生物学的試料を固定剤で処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、室温で約３．５時間、生物学的試料を固定剤で処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、室温で約４時間、生物学的試料を固定剤で処理することを含む。
【0113】
いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、４０℃の温度で６時間未満にわたって、生物学的試料を固定剤で処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、４０℃の温度で３時間未満にわたって、生物学的試料を固定剤で処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、４０℃の温度で１時間未満にわたって、生物学的試料を固定剤で処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、４０℃の温度で０．５時間未満にわたって、生物学的試料を固定剤で処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、４０℃の温度で約０．１時間、生物学的試料を固定剤で処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、４０℃の温度で約０．２５時間、生物学的試料を固定剤で処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、４０℃の温度で約０．５時間、生物学的試料を固定剤で処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、４０℃の温度で約０．７５時間、生物学的試料を固定剤で処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、４０℃の温度で約１時間、生物学的試料を固定剤で処理することを含む。
【0114】
いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、６０℃の温度で６時間未満にわたって、生物学的試料を固定剤で処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、６０℃の温度で３時間未満にわたって、生物学的試料を固定剤で処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、６０℃の温度で１時間未満にわたって、生物学的試料を固定剤で処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、６０℃の温度で０．５時間未満にわたって、生物学的試料を固定剤で処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、６０℃の温度で約０．１時間、生物学的試料を固定剤で処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、６０℃の温度で約０．２５時間、生物学的試料を固定剤で処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、６０℃の温度で約０．５時間、生物学的試料を固定剤で処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、６０℃の温度で約０．７５時間、生物学的試料を固定剤で処理することを含む。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、６０℃の温度で約１時間、生物学的試料を固定剤で処理することを含む。
【0115】
本明細書で提供される方法の一態様では、固定された細胞のパラフィン包埋は、細胞をエタノールと接触させ、次いで細胞をキシレンと接触させ、細胞をパラフィンとともにインキュベートすることを含む。
【0116】
いくつかの実施形態では、細胞をエタノールと接触させるステップは、細胞を１％～１００％エタノールと接触させることを含む。いくつかの実施形態では、細胞をエタノールと接触させるステップは、細胞を５％～９５％エタノールと接触させることを含む。いくつかの実施形態では、細胞をエタノールと接触させるステップは、細胞を１０％～９０％エタノールと接触させることを含む。いくつかの実施形態では、細胞をエタノールと接触させるステップは、細胞を１５％～８５％エタノールと接触させることを含む。いくつかの実施形態では、細胞をエタノールと接触させるステップは、細胞を２０％～８０％エタノールと接触させることを含む。いくつかの実施形態では、細胞をエタノールと接触させるステップは、細胞を２５％～７５％エタノールと接触させることを含む。いくつかの実施形態では、細胞をエタノールと接触させるステップは、細胞を３０％～７０％エタノールと接触させることを含む。いくつかの実施形態では、細胞をエタノールと接触させるステップは、細胞を３５％～６５％エタノールと接触させることを含む。いくつかの実施形態では、細胞をエタノールと接触させるステップは、細胞を４０％～６０％エタノールと接触させることを含む。
【0117】
いくつかの実施形態では、細胞をエタノールと接触させるステップは、細胞をエタノールと０．１時間～２時間接触させることを含む。いくつかの実施形態では、細胞をエタノールと接触させるステップは、細胞をエタノールと０．５時間～１．５時間接触させることを含む。いくつかの実施形態では、細胞をエタノールと接触させるステップは、細胞をエタノールと０．５時間～１時間接触させることを含む。いくつかの実施形態では、細胞をエタノールと接触させるステップは、細胞をエタノールと０．１時間～０．５時間接触させることを含む。いくつかの実施形態では、細胞をエタノールと接触させるステップは、細胞をエタノールと０．５時間～１時間接触させることを含む。いくつかの実施形態では、細胞をエタノールと接触させるステップは、細胞をエタノールと１時間～１．５時間接触させることを含む。いくつかの実施形態では、細胞をエタノールと接触させるステップは、細胞をエタノールと１．５時間～２時間接触させることを含む。
【0118】
いくつかの実施形態では、細胞をエタノールと接触させるステップは、細胞をエタノールと０．１時間接触させることを含む。いくつかの実施形態では、細胞をエタノールと接触させるステップは、細胞をエタノールと０．２時間接触させることを含む。いくつかの実施形態では、細胞をエタノールと接触させるステップは、細胞をエタノールと０．３時間接触させることを含む。いくつかの実施形態では、細胞をエタノールと接触させるステップは、細胞をエタノールと０．４時間接触させることを含む。いくつかの実施形態では、細胞をエタノールと接触させるステップは、細胞をエタノールと０．５時間接触させることを含む。いくつかの実施形態では、細胞をエタノールと接触させるステップは、細胞をエタノールと０．６時間接触させることを含む。いくつかの実施形態では、細胞をエタノールと接触させるステップは、細胞をエタノールと０．７時間接触させることを含む。いくつかの実施形態では、細胞をエタノールと接触させるステップは、細胞をエタノールと０．８時間接触させることを含む。いくつかの実施形態では、細胞をエタノールと接触させるステップは、細胞をエタノールと０．９時間接触させることを含む。いくつかの実施形態では、細胞をエタノールと接触させるステップは、細胞をエタノールと１時間接触させることを含む。いくつかの実施形態では、細胞をエタノールと接触させるステップは、細胞をエタノールと１．５時間接触させることを含む。いくつかの実施形態では、細胞をエタノールと接触させるステップは、細胞をエタノールと２時間接触させることを含む。
【0119】
いくつかの実施形態では、細胞をエタノールと接触させるステップは、細胞を６５％～７５％エタノールと接触させ、次いで細胞を水中７５％～８５％エタノールと接触させ、次いで細胞を水中９０％～１００％エタノールと３０分間接触させることを含む。いくつかの実施形態では、細胞をエタノールと接触させるステップは、複数の時間間隔で複数の濃度のエタノールを含む。
【0120】
いくつかの実施形態では、細胞をエタノールと接触させるステップは、細胞を水中７０％エタノールと３０分間接触させ、次いで細胞を水中８０％エタノールと３０分間接触させ、次いで細胞を水中９５％エタノールと３０分間接触させ、最後に細胞を１００％エタノールと３０分間接触させることを含む。
【0121】
いくつかの実施形態では、細胞をキシレンと接触させるステップは、キシレンの２回の交換を含む。いくつかの実施形態では、細胞をキシレンと接触させるステップは、キシレンの３回の交換を含む。いくつかの実施形態では、細胞をキシレンと接触させるステップは、キシレンの４回の交換を含む。いくつかの実施形態では、細胞をキシレンと接触させるステップは、キシレンの５回の交換を含む。
【0122】
いくつかの実施形態では、細胞をキシレンと接触させるステップは、各々５分間～４０分間のキシレンの２回の交換を含む。いくつかの実施形態では、細胞をキシレンと接触させるステップは、各々５分間のキシレンの２回の交換を含む。いくつかの実施形態では、細胞をキシレンと接触させるステップは、各々１０分間のキシレンの２回の交換を含む。いくつかの実施形態では、細胞をキシレンと接触させるステップは、各々１５分間のキシレンの２回の交換を含む。いくつかの実施形態では、細胞をキシレンと接触させるステップは、各々２０分間のキシレンの２回の交換を含む。いくつかの実施形態では、細胞をキシレンと接触させるステップは、各々２５分間のキシレンの２回の交換を含む。いくつかの実施形態では、細胞をキシレンと接触させるステップは、各々３０分間のキシレンの２回の交換を含む。いくつかの実施形態では、細胞をキシレンと接触させるステップは、各々３５分間のキシレンの２回の交換を含む。いくつかの実施形態では、細胞をキシレンと接触させるステップは、各々４０分間のキシレンの２回の交換を含む。
【0123】
いくつかの実施形態では、細胞をキシレンと接触させるステップは、各々５分間～４０分間のキシレンの３回の交換を含む。いくつかの実施形態では、細胞をキシレンと接触させるステップは、各々５分間のキシレンの３回の交換を含む。いくつかの実施形態では、細胞をキシレンと接触させるステップは、各々１０分間のキシレンの３回の交換を含む。いくつかの実施形態では、細胞をキシレンと接触させるステップは、各々１５分間のキシレンの３回の交換を含む。いくつかの実施形態では、細胞をキシレンと接触させるステップは、各々２０分間のキシレンの３回の交換を含む。いくつかの実施形態では、細胞をキシレンと接触させるステップは、各々２５分間のキシレンの３回の交換を含む。いくつかの実施形態では、細胞をキシレンと接触させるステップは、各々３０分間のキシレンの３回の交換を含む。いくつかの実施形態では、細胞をキシレンと接触させるステップは、各々３５分間のキシレンの３回の交換を含む。いくつかの実施形態では、細胞をキシレンと接触させるステップは、各々４０分間のキシレンの３回の交換を含む。
【0124】
いくつかの実施形態では、細胞をキシレンと接触させるステップは、各々５分間～４０分間のキシレンの４回の交換を含む。いくつかの実施形態では、細胞をキシレンと接触させるステップは、各々５分間のキシレンの４回の交換を含む。いくつかの実施形態では、細胞をキシレンと接触させるステップは、各々１０分間のキシレンの４回の交換を含む。いくつかの実施形態では、細胞をキシレンと接触させるステップは、各々１５分間のキシレンの４回の交換を含む。いくつかの実施形態では、細胞をキシレンと接触させるステップは、各々２０分間のキシレンの４回の交換を含む。いくつかの実施形態では、細胞をキシレンと接触させるステップは、各々２５分間のキシレンの４回の交換を含む。いくつかの実施形態では、細胞をキシレンと接触させるステップは、各々３０分間のキシレンの４回の交換を含む。いくつかの実施形態では、細胞をキシレンと接触させるステップは、各々３５分間のキシレンの４回の交換を含む。いくつかの実施形態では、細胞をキシレンと接触させるステップは、各々４０分間のキシレンの４回の交換を含む。
【0125】
いくつかの実施形態では、細胞をキシレンと接触させるステップは、各々５分間～４０分間のキシレンの５回の交換を含む。いくつかの実施形態では、細胞をキシレンと接触させるステップは、各々５分間のキシレンの５回の交換を含む。いくつかの実施形態では、細胞をキシレンと接触させるステップは、各々１０分間のキシレンの５回の交換を含む。いくつかの実施形態では、細胞をキシレンと接触させるステップは、各々１５分間のキシレンの５回の交換を含む。いくつかの実施形態では、細胞をキシレンと接触させるステップは、各々２０分間のキシレンの５回の交換を含む。いくつかの実施形態では、細胞をキシレンと接触させるステップは、各々２５分間のキシレンの５回の交換を含む。いくつかの実施形態では、細胞をキシレンと接触させるステップは、各々３０分間のキシレンの５回の交換を含む。いくつかの実施形態では、細胞をキシレンと接触させるステップは、各々３５分間のキシレンの５回の交換を含む。いくつかの実施形態では、細胞をキシレンと接触させるステップは、各々４０分間のキシレンの５回の交換を含む。
【0126】
いくつかの実施形態では、細胞をパラフィンとともにインキュベートするステップは、パラフィンの２回の交換を含む。いくつかの実施形態では、細胞をパラフィンとともにインキュベートするステップは、パラフィンの３回の交換を含む。いくつかの実施形態では、細胞をパラフィンとともにインキュベートするステップは、パラフィンの４回の交換を含む。いくつかの実施形態では、細胞をパラフィンとともにインキュベートするステップは、パラフィンの５回の交換を含む。
【0127】
いくつかの実施形態では、細胞をパラフィンとともにインキュベートするステップは、各々５分間～４０分間のパラフィンの２回の交換を含む。いくつかの実施形態では、細胞をパラフィンとともにインキュベートするステップは、各々５分間のパラフィンの２回の交換を含む。いくつかの実施形態では、細胞をパラフィンとともにインキュベートするステップは、各々１０分間のパラフィンの２回の交換を含む。いくつかの実施形態では、細胞をパラフィンとともにインキュベートするステップは、各々１５分間のパラフィンの２回の交換を含む。いくつかの実施形態では、細胞をパラフィンとともにインキュベートするステップは、各々２０分間のパラフィンの２回の交換を含む。いくつかの実施形態では、細胞をパラフィンとともにインキュベートするステップは、各々２５分間のパラフィンの２回の交換を含む。いくつかの実施形態では、細胞をパラフィンとともにインキュベートするステップは、各々３０分間のパラフィンの２回の交換を含む。いくつかの実施形態では、細胞をパラフィンとともにインキュベートするステップは、各々３５分間のパラフィンの２回の交換を含む。いくつかの実施形態では、細胞をパラフィンとともにインキュベートするステップは、各々４０分間のパラフィンの２回の交換を含む。
【0128】
いくつかの実施形態では、細胞をパラフィンとともにインキュベートするステップは、各々５分間～４０分間のパラフィンの３回の交換を含む。いくつかの実施形態では、細胞をパラフィンとともにインキュベートするステップは、各々５分間のパラフィンの３回の交換を含む。いくつかの実施形態では、細胞をパラフィンとともにインキュベートするステップは、各々１０分間のパラフィンの３回の交換を含む。いくつかの実施形態では、細胞をパラフィンとともにインキュベートするステップは、各々１５分間のパラフィンの３回の交換を含む。いくつかの実施形態では、細胞をパラフィンとともにインキュベートするステップは、各々２０分間のパラフィンの３回の交換を含む。いくつかの実施形態では、細胞をパラフィンとともにインキュベートするステップは、各々２５分間のパラフィンの３回の交換を含む。いくつかの実施形態では、細胞をパラフィンとともにインキュベートするステップは、各々３０分間のパラフィンの３回の交換を含む。いくつかの実施形態では、細胞をパラフィンとともにインキュベートするステップは、各々３５分間のパラフィンの３回の交換を含む。いくつかの実施形態では、細胞をパラフィンとともにインキュベートするステップは、各々４０分間のパラフィンの３回の交換を含む。
【0129】
いくつかの実施形態では、細胞をパラフィンとともにインキュベートするステップは、各々５分間～４０分間のパラフィンの４回の交換を含む。いくつかの実施形態では、細胞をパラフィンとともにインキュベートするステップは、各々５分間～１０分間のパラフィンの４回の交換を含む。いくつかの実施形態では、細胞をパラフィンとともにインキュベートするステップは、各々１０分間～１５分間のパラフィンの４回の交換を含む。いくつかの実施形態では、細胞をパラフィンとともにインキュベートするステップは、各々１５分間～２０分間のパラフィンの４回の交換を含む。いくつかの実施形態では、細胞をパラフィンとともにインキュベートするステップは、各々２０分間～２５分間のパラフィンの４回の交換を含む。いくつかの実施形態では、細胞をパラフィンとともにインキュベートするステップは、各々２５分間～３０分間のパラフィンの４回の交換を含む。いくつかの実施形態では、細胞をパラフィンとともにインキュベートするステップは、各々３０分間～３５分間のパラフィンの４回の交換を含む。いくつかの実施形態では、細胞をパラフィンとともにインキュベートするステップは、各々３５分間～４０分間のパラフィンの４回の交換を含む。
【0130】
いくつかの実施形態では、細胞をパラフィンとともにインキュベートするステップは、各々５分間のパラフィンの４回の交換を含む。いくつかの実施形態では、細胞をパラフィンとともにインキュベートするステップは、各々１０分間のパラフィンの４回の交換を含む。いくつかの実施形態では、細胞をパラフィンとともにインキュベートするステップは、各々１５分間のパラフィンの４回の交換を含む。いくつかの実施形態では、細胞をパラフィンとともにインキュベートするステップは、各々２０分間のパラフィンの４回の交換を含む。いくつかの実施形態では、細胞をパラフィンとともにインキュベートするステップは、各々２５分間のパラフィンの４回の交換を含む。いくつかの実施形態では、細胞をパラフィンとともにインキュベートするステップは、各々３０分間のパラフィンの４回の交換を含む。いくつかの実施形態では、細胞をパラフィンとともにインキュベートするステップは、各々３５分間のパラフィンの４回の交換を含む。いくつかの実施形態では、細胞をパラフィンとともにインキュベートするステップは、各々４０分間のパラフィンの４回の交換を含む。
【0131】
いくつかの実施形態では、細胞をパラフィンとともにインキュベートするステップは、各々５分間～４０分間のパラフィンの５回の交換を含む。いくつかの実施形態では、細胞をパラフィンとともにインキュベートするステップは、各々５分間のパラフィンの５回の交換を含む。いくつかの実施形態では、細胞をパラフィンとともにインキュベートするステップは、各々１０分間のパラフィンの５回の交換を含む。いくつかの実施形態では、細胞をパラフィンとともにインキュベートするステップは、各々１５分間のパラフィンの５回の交換を含む。いくつかの実施形態では、細胞をパラフィンとともにインキュベートするステップは、各々２０分間のパラフィンの５回の交換を含む。いくつかの実施形態では、細胞をパラフィンとともにインキュベートするステップは、各々２５分間のパラフィンの５回の交換を含む。いくつかの実施形態では、細胞をパラフィンとともにインキュベートするステップは、各々３０分間のパラフィンの５回の交換を含む。いくつかの実施形態では、細胞をパラフィンとともにインキュベートするステップは、各々３５分間のパラフィンの５回の交換を含む。いくつかの実施形態では、細胞をパラフィンとともにインキュベートするステップは、各々４０分間のパラフィンの５回の交換を含む。
【0132】
いくつかの実施形態では、細胞をパラフィンとともにインキュベートするステップは、５℃～１００℃で行われる。いくつかの実施形態では、細胞をパラフィンとともにインキュベートするステップは、１０℃～９０℃で行われる。いくつかの実施形態では、細胞をパラフィンとともにインキュベートするステップは、２０℃～８０℃で行われる。いくつかの実施形態では、細胞をパラフィンとともにインキュベートするステップは、３０℃～７０℃で行われる。いくつかの実施形態では、細胞をパラフィンとともにインキュベートするステップは、４０℃～６０℃で行われる。いくつかの実施形態では、細胞をパラフィンとともにインキュベートするステップは、０℃～１０℃で行われる。いくつかの実施形態では、細胞をパラフィンとともにインキュベートするステップは、１０℃～２０℃で行われる。いくつかの実施形態では、細胞をパラフィンとともにインキュベートするステップは、２０℃～３０℃で行われる。いくつかの実施形態では、細胞をパラフィンとともにインキュベートするステップは、３０℃～４０℃で行われる。いくつかの実施形態では、細胞をパラフィンとともにインキュベートするステップは、４０℃～５０℃で行われる。いくつかの実施形態では、細胞をパラフィンとともにインキュベートするステップは、５０℃～６０℃で行われる。いくつかの実施形態では、細胞をパラフィンとともにインキュベートするステップは、６０℃～７０℃で行われる。いくつかの実施形態では、細胞をパラフィンとともにインキュベートするステップは、７０℃～８０℃で行われる。いくつかの実施形態では、細胞をパラフィンとともにインキュベートするステップは、８０℃～９０℃で行われる。いくつかの実施形態では、細胞をパラフィンとともにインキュベートするステップは、９０℃～１００℃で行われる。
【0133】
いくつかの実施形態では、細胞をパラフィンとともにインキュベートするステップは、５℃で行われる。いくつかの実施形態では、細胞をパラフィンとともにインキュベートするステップは、１０℃で行われる。いくつかの実施形態では、細胞をパラフィンとともにインキュベートするステップは、１５℃で行われる。いくつかの実施形態では、細胞をパラフィンとともにインキュベートするステップは、２０℃で行われる。いくつかの実施形態では、細胞をパラフィンとともにインキュベートするステップは、２５℃で行われる。いくつかの実施形態では、細胞をパラフィンとともにインキュベートするステップは、３０℃で行われる。いくつかの実施形態では、細胞をパラフィンとともにインキュベートするステップは、３５℃で行われる。いくつかの実施形態では、細胞をパラフィンとともにインキュベートするステップは、４０℃で行われる。いくつかの実施形態では、細胞をパラフィンとともにインキュベートするステップは、４５℃で行われる。いくつかの実施形態では、細胞をパラフィンとともにインキュベートするステップは、５０℃で行われる。いくつかの実施形態では、細胞をパラフィンとともにインキュベートするステップは、５５℃で行われる。いくつかの実施形態では、細胞をパラフィンとともにインキュベートするステップは、６０℃で行われる。いくつかの実施形態では、細胞をパラフィンとともにインキュベートするステップは、６５℃で行われる。いくつかの実施形態では、細胞をパラフィンとともにインキュベートするステップは、７０℃で行われる。いくつかの実施形態では、細胞をパラフィンとともにインキュベートするステップは、７５℃で行われる。いくつかの実施形態では、細胞をパラフィンとともにインキュベートするステップは、８０℃で行われる。いくつかの実施形態では、細胞をパラフィンとともにインキュベートするステップは、８５℃で行われる。いくつかの実施形態では、細胞をパラフィンとともにインキュベートするステップは、９０℃で行われる。いくつかの実施形態では、細胞をパラフィンとともにインキュベートするステップは、９５℃で行われる。いくつかの実施形態では、細胞をパラフィンとともにインキュベートするステップは、１００℃で行われる。
【0134】
いくつかの実施形態では、細胞をキシレンと接触させることによって細胞を脱パラフィンする。いくつかの実施形態では、細胞をキシレンと約５分間～１２０分間接触させる。いくつかの実施形態では、細胞をキシレンと約５分間～１０分間、１０分間～１５分間、１５分間～２０分間、２０分間～３０分間、３０分間～６０分間、６０分間～９０分間、又は９０分間～１２０分間接触させる。いくつかの実施形態では、細胞をキシレンと約５分間接触させる。いくつかの実施形態では、細胞をキシレンと約１０分間接触させる。いくつかの実施形態では、細胞をキシレンと約１５分間接触させる。いくつかの実施形態では、細胞をキシレンと約２０分間接触させる。いくつかの実施形態では、細胞をキシレンと約２５分間接触させる。いくつかの実施形態では、細胞をキシレンと約３０分間接触させる。いくつかの実施形態では、細胞をキシレンと約３５分間接触させる。いくつかの実施形態では、細胞をキシレンと約４０分間接触させる。いくつかの実施形態では、細胞をキシレンと約４５分間接触させる。いくつかの実施形態では、細胞をキシレンと約５０分間接触させる。いくつかの実施形態では、細胞をキシレンと約５５分間接触させる。いくつかの実施形態では、細胞をキシレンと約６０分間接触させる。いくつかの実施形態では、細胞をキシレンと約９０分間接触させる。いくつかの実施形態では、細胞をキシレンと約１２０分間接触させる。
【0135】
いくつかの実施形態では、上述のように、細胞を、連続エタノール勾配と更に接触させる。
【0136】
本明細書で提供される方法の一態様では、細胞は、抗原賦活化溶液に再懸濁される。
【0137】
いくつかの実施形態では、細胞は、６０℃～１００℃で更に加熱される。いくつかの実施形態では、細胞は、６０℃～７０℃で更に加熱される。いくつかの実施形態では、細胞は、７０℃～８０℃で更に加熱される。いくつかの実施形態では、細胞は、８０℃～９０℃で更に加熱される。いくつかの実施形態では、細胞は、９０℃～１００℃で更に加熱される。いくつかの実施形態では、細胞は、６０℃で更に加熱される。いくつかの実施形態では、細胞は、６５℃で更に加熱される。いくつかの実施形態では、細胞は、７０℃で更に加熱される。いくつかの実施形態では、細胞は、７５℃で更に加熱される。いくつかの実施形態では、細胞は、８０℃で更に加熱される。いくつかの実施形態では、細胞は、８５℃で更に加熱される。いくつかの実施形態では、細胞は、９０℃で更に加熱される。いくつかの実施形態では、細胞は、９５℃で更に加熱される。いくつかの実施形態では、細胞は、１００℃で更に加熱される。
【0138】
いくつかの実施形態では、細胞は、６０℃で約１０分間～６０分間更に加熱される。いくつかの実施形態では、細胞は、６０℃で約１０分間～２０分間更に加熱される。いくつかの実施形態では、細胞は、６０℃で約２０分間～３０分間更に加熱される。いくつかの実施形態では、細胞は、６０℃で約３０分間～４０分間更に加熱される。いくつかの実施形態では、細胞は、６０℃で約４０分間～５０分間更に加熱される。いくつかの実施形態では、細胞は、６０℃で約５０分間～６０分間更に加熱される。いくつかの実施形態では、細胞は、６０℃で約１０分間更に加熱される。いくつかの実施形態では、細胞は、６０℃で約２０分間更に加熱される。いくつかの実施形態では、細胞は、６０℃で約３０分間更に加熱される。いくつかの実施形態では、細胞は、６０℃で約４０分間更に加熱される。いくつかの実施形態では、細胞は、６０℃で約５０分間更に加熱される。いくつかの実施形態では、細胞は、６０℃で約６０分間更に加熱される。
【0139】
いくつかの実施形態では、細胞は、６５℃で約１０分間～６０分間更に加熱される。いくつかの実施形態では、細胞は、６５℃で約１０分間～２０分間更に加熱される。いくつかの実施形態では、細胞は、６５℃で約２０分間～３０分間更に加熱される。いくつかの実施形態では、細胞は、６５℃で約３０分間～４０分間更に加熱される。いくつかの実施形態では、細胞は、６５℃で約４０分間～５０分間更に加熱される。いくつかの実施形態では、細胞は、６５℃で約５０分間～６０分間更に加熱される。いくつかの実施形態では、細胞は、６５℃で約１０分間更に加熱される。いくつかの実施形態では、細胞は、６５℃で約２０分間更に加熱される。いくつかの実施形態では、細胞は、６５℃で約３０分間更に加熱される。いくつかの実施形態では、細胞は、６５℃で約４０分間更に加熱される。いくつかの実施形態では、細胞は、６５℃で約５０分間更に加熱される。いくつかの実施形態では、細胞は、６５℃で約６０分間更に加熱される。
【0140】
いくつかの実施形態では、細胞は、７０℃で約１０分間～６０分間更に加熱される。いくつかの実施形態では、細胞は、７０℃で約１０分間～２０分間更に加熱される。いくつかの実施形態では、細胞は、７０℃で約２０分間～３０分間更に加熱される。いくつかの実施形態では、細胞は、７０℃で約３０分間～４０分間更に加熱される。いくつかの実施形態では、細胞は、７０℃で約４０分間～５０分間更に加熱される。いくつかの実施形態では、細胞は、７０℃で約５０分間～６０分間更に加熱される。いくつかの実施形態では、細胞は、７０℃で約１０分間更に加熱される。いくつかの実施形態では、細胞は、７０℃で約２０分間更に加熱される。いくつかの実施形態では、細胞は、７０℃で約３０分間更に加熱される。いくつかの実施形態では、細胞は、７０℃で約４０分間更に加熱される。いくつかの実施形態では、細胞は、７０℃で約５０分間更に加熱される。いくつかの実施形態では、細胞は、７０℃で約６０分間更に加熱される。
【0141】
いくつかの実施形態では、細胞は、８０℃で約１０分間～６０分間更に加熱される。いくつかの実施形態では、細胞は、８０℃で約１０分間～２０分間更に加熱される。いくつかの実施形態では、細胞は、８０℃で約２０分間～３０分間更に加熱される。いくつかの実施形態では、細胞は、８０℃で約３０分間～４０分間更に加熱される。いくつかの実施形態では、細胞は、８０℃で約４０分間～５０分間更に加熱される。いくつかの実施形態では、細胞は、８０℃で約５０分間～６０分間更に加熱される。いくつかの実施形態では、細胞は、８０℃で約１０分間更に加熱される。いくつかの実施形態では、細胞は、８０℃で約２０分間更に加熱される。いくつかの実施形態では、細胞は、８０℃で約３０分間更に加熱される。いくつかの実施形態では、細胞は、８０℃で約４０分間更に加熱される。いくつかの実施形態では、細胞は、８０℃で約５０分間更に加熱される。いくつかの実施形態では、細胞は、８０℃で約６０分間更に加熱される。
【0142】
いくつかの実施形態では、細胞は、８５℃で約１０分間～６０分間更に加熱される。いくつかの実施形態では、細胞は、８５℃で約１０分間～２０分間更に加熱される。いくつかの実施形態では、細胞は、８５℃で約２０分間～３０分間更に加熱される。いくつかの実施形態では、細胞は、８５℃で約３０分間～４０分間更に加熱される。いくつかの実施形態では、細胞は、８５℃で約４０分間～５０分間更に加熱される。いくつかの実施形態では、細胞は、８５℃で約５０分間～６０分間更に加熱される。いくつかの実施形態では、細胞は、８５℃で約１０分間更に加熱される。いくつかの実施形態では、細胞は、８５℃で約２０分間更に加熱される。いくつかの実施形態では、細胞は、８５℃で約３０分間更に加熱される。いくつかの実施形態では、細胞は、８５℃で約４０分間更に加熱される。いくつかの実施形態では、細胞は、８５℃で約５０分間更に加熱される。いくつかの実施形態では、細胞は、８５℃で約６０分間更に加熱される。
【0143】
いくつかの実施形態では、細胞は、９０℃で約１０分間～６０分間更に加熱される。いくつかの実施形態では、細胞は、９０℃で約１０分間～２０分間更に加熱される。いくつかの実施形態では、細胞は、９０℃で約２０分間～３０分間更に加熱される。いくつかの実施形態では、細胞は、９０℃で約３０分間～４０分間更に加熱される。いくつかの実施形態では、細胞は、９０℃で約４０分間～５０分間更に加熱される。いくつかの実施形態では、細胞は、９０℃で約５０分間～６０分間更に加熱される。いくつかの実施形態では、細胞は、９０℃で約１０分間更に加熱される。いくつかの実施形態では、細胞は、９０℃で約２０分間更に加熱される。いくつかの実施形態では、細胞は、９０℃で約３０分間更に加熱される。いくつかの実施形態では、細胞は、９０℃で約４０分間更に加熱される。いくつかの実施形態では、細胞は、９０℃で約５０分間更に加熱される。いくつかの実施形態では、細胞は、９０℃で約６０分間更に加熱される。
【0144】
いくつかの実施形態では、細胞は、９５℃で約１０分間～６０分間更に加熱される。いくつかの実施形態では、細胞は、９５℃で約１０分間～２０分間更に加熱される。いくつかの実施形態では、細胞は、９５℃で約２０分間～３０分間更に加熱される。いくつかの実施形態では、細胞は、９５℃で約３０分間～４０分間更に加熱される。いくつかの実施形態では、細胞は、９５℃で約４０分間～５０分間更に加熱される。いくつかの実施形態では、細胞は、９５℃で約５０分間～６０分間更に加熱される。いくつかの実施形態では、細胞は、９５℃で約１０分間更に加熱される。いくつかの実施形態では、細胞は、９５℃で約２０分間更に加熱される。いくつかの実施形態では、細胞は、９５℃で約３０分間更に加熱される。いくつかの実施形態では、細胞は、９５℃で約４０分間更に加熱される。いくつかの実施形態では、細胞は、９５℃で約５０分間更に加熱される。いくつかの実施形態では、細胞は、９５℃で約６０分間更に加熱される。
【0145】
いくつかの実施形態では、細胞は、１００℃で約１０分間～６０分間更に加熱される。いくつかの実施形態では、細胞は、１００℃で約１０分間～２０分間更に加熱される。いくつかの実施形態では、細胞は、１００℃で約２０分間～３０分間更に加熱される。いくつかの実施形態では、細胞は、１００℃で約３０分間～４０分間更に加熱される。いくつかの実施形態では、細胞は、１００℃で約４０分間～５０分間更に加熱される。いくつかの実施形態では、細胞は、１００℃で約５０分間～６０分間更に加熱される。いくつかの実施形態では、細胞は、１００℃で約１０分間更に加熱される。いくつかの実施形態では、細胞は、１００℃で約２０分間更に加熱される。いくつかの実施形態では、細胞は、１００℃で約３０分間更に加熱される。いくつかの実施形態では、細胞は、１００℃で約４０分間更に加熱される。いくつかの実施形態では、細胞は、１００℃で約５０分間更に加熱される。いくつかの実施形態では、細胞は、１００℃で約６０分間更に加熱される。
【0146】
いくつかの実施形態では、細胞は、マイクロ波放射によって加熱される。いくつかの実施形態では、細胞は、水浴中で加熱される。
【0147】
本明細書で提供される方法の一態様では、加熱は、抗原の賦活化をもたらす。
【0148】
いくつかの実施形態では、第１及び／又は第２の検出剤は、抗体又はその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、第１及び／又は第２の検出剤は、ＲＮＡベースのバインダー分子である。酵素活性又は非酵素標識がそれぞれ検出され得る限り、いくつかの酵素又は非酵素標識のいずれかが検出剤として利用され得る。それにより、酵素は検出可能なシグナルを産生し、これを利用して標的分子を検出することができる。特に有用な検出可能なシグナルは、発色シグナル又は蛍光発生シグナルである。そのような酵素は当業者に周知であり、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼなどが挙げられるが、これらに限定されない（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ（１９９６）を参照されたい）。周知の発色基質又は蛍光発生基質を有する他の酵素としては、様々なペプチダーゼが挙げられ、発色ペプチド基質又は蛍光発生ペプチド基質は、タンパク質分解切断反応を検出するために利用され得る。α－及びβ－ガラクトシダーゼ、β－グルクロニダーゼ、６－ホスホ－β－Ｄ－ガラクトシド６－ホスホガラクトヒドラーゼ、β－グルコシダーゼ、α－グルコシダーゼ、アミラーゼ、ノイラミニダーゼ、エステラーゼ、リパーゼなどを含む発色基質及び蛍光発生基質の使用もまた、細菌診断において周知であり（Ｍａｎａｆｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５５：３３５－３４８（１９９１））、既知の発色基質又は蛍光発生基質を有するそのような酵素は、本明細書で提供される方法における使用に容易に適合させることができる。
【0149】
検出可能なシグナルを産生するための様々な発色基質又は蛍光発生基質が当業者に周知であり、市販されている。検出可能なシグナルを産生するために利用することができる例示的な基質としては、西洋ワサビペルオキシダーゼには、３，３’－ジアミノベンジジン（3,3’-diaminobenzidine、ＤＡＢ）、３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine、ＴＭＢ）、クロロナフトール（4-CN(chloronaphthol)）（４－クロロ－１－ナフトール）、２，２’－アジノ－ビス（３－エチルベンゾチアゾリン－６－スルホン酸）（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid、ＡＢＴＳ）、ｏ－フェニレンジアミンジヒドロクロリド（o-phenylenediamine dihydrochloride、ＯＰＤ）、及び３－アミノ－９－エチルカルバゾール（3-amino-9-ethylcarbazole、ＡＥＣ）；アルカリホスファターゼには、５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリル－１－ホスフェート（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-1-phosphate、ＢＣＩＰ）、ニトロブルーテトラゾリウム（nitroblue tetrazolium、ＮＢＴ）、Ｆａｓｔ Ｒｅｄ（Ｆａｓｔ Ｒｅｄ ＴＲ／ＡＳ－ＭＸ）、及びｐ－ニトロフェニルホスフェート（p-nitrophenyl phosphate、ＰＮＰＰ）；β－ガラクトシダーゼには、１－メチル－３－インドリル－β－Ｄ－ガラクトピラノシド及び２－メトキシ－４－（２－ニトロビニル）フェニルβ－Ｄ－ガラクトピラノシド；β－グルコシダーゼには、２－メトキシ－４－（２－ニトロビニル）フェニルβ－Ｄ－グルコピラノシドが挙げられるが、これらに限定されない。例示的な蛍光発生基質としては、アルカリホスファターゼには、４－（トリフルオロメチル）ウンベリフェリルホスフェート；ホスファターゼには、４－メチルウンベリフェリルホスフェートビス（２－アミノ－２－メチル－１，３－プロパンジオール）、４－メチルウンベリフェリルホスフェートビス（シクロヘキシルアンモニウム）及び４－メチルウンベリフェリルホスフェート；西洋ワサビペルオキシダーゼには、ＱｕａｎｔａＢｌｕ（商標）及びＱｕｉｎｔｏｌｅｔ；β－ガラクトシダーゼには、４－メチルウンベリフェリルβ－Ｄ－ガラクトピラノシド、フルオレセインジ（β－Ｄ－ガラクトピラノシド）、及びナフトフルオレセインジ－（β－Ｄ－ガラクトピラノシド）；β－グルコシダーゼには、３－アセチルウンベリフェリルβ－Ｄ－グルコピラノシド及び４－メチルウンベリフェリル－β－Ｄ－グルコピラノシド；並びにα－ガラクトシダーゼには、４－メチルウンベリフェリル－α－Ｄ－ガラクトピラノシドが挙げられるが、これらに限定されない。検出可能なシグナルを産生するための例示的な酵素及び基質はまた、例えば、米国特許出願公開第２０１２／０１００５４０号に記載されている。様々な検出可能な酵素基質（発色基質又は蛍光発生基質を含む）が周知であり、市販されている（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ ＩＬ；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｌｌａｓ ＴＸ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ、４２ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ；Ｂｉｏｃａｒｅ）。概ね、基質は、標的核酸の部位に沈着する沈殿物を形成する生成物に変換される。他の例示的な基質としては、ＨＲＰ－Ｇｒｅｅｎ（４２ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｂｅｔａｚｏｉｄ ＤＡＢ、Ｃａｒｄａｓｓｉａｎ ＤＡＢ、Ｒｏｍｕｌｉｎ ＡＥＣ、Ｂａｊｏｒａｎ Ｐｕｒｐｌｅ、Ｖｉｎａ Ｇｒｅｅｎ、Ｄｅｅｐ Ｓｐａｃｅ Ｂｌａｃｋ（商標）、Ｗａｒｐ Ｒｅｄ（商標）、Ｖｕｌｃａｎ Ｆａｓｔ Ｒｅｄ（Ｂｉｏｃａｒｅ（Ｃｏｎｃｏｒｄ ＣＡ；ｂｉｏｃａｒｅ．ｎｅｔ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ／ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｓ）から）が挙げられるが、これらに限定されない。
【0150】
検出可能な標識として好適な例示的な希土類金属及び金属同位体としては、ランタニド（ＩＩＩ）同位体、例えば、１４１Ｐｒ、１４２Ｎｄ、１４３Ｎｄ、１４４Ｎｄ、１４５Ｎｄ、１４６Ｎｄ、１４７Ｓｍ、１４８Ｎｄ、１４９Ｓｍ、１５０Ｎｄ、１５１Ｅｕ、１５２Ｓｍ、１５３Ｅｕ、１５４Ｓｍ、１５５Ｇｄ、１５６Ｇｄ、１５８Ｇｄ、１５９Ｔｂ、１６０Ｇｄ、１６１Ｄｙ、１６２Ｄｙ、１６３Ｄｙ、１６４Ｄｙ、１６５Ｈｏ、１６６Ｅｒ、１６７Ｅｒ、１６８Ｅｒ、１６９Ｔｍ、１７０Ｅｒ、１７１Ｙｂ、１７２Ｙｂ、１７３Ｙｂ、１７４Ｙｂ、１７５Ｌｕ、及び１７６Ｙｂが挙げられるが、これらに限定されない。金属同位体は、例えば、飛行時間型質量分析（time-of-flight mass spectrometry、ＴＯＦ－ＭＳ）（例えば、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ Ｈｅｌｉｏｓ ａｎｄ Ｈｙｐｅｒｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍｓ、ｆｌｕｉｄｉｇｍ．ｃｏｍ／ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）を使用して検出することができる。
【0151】
ビオチン－アビジン（又はビオチン－ストレプトアビジン）は、２つの分子が互いに非常に高い親和性を有し、１つのアビジン／ストレプトアビジン分子が４つのビオチン分子を結合することができるという事実に基づく周知のシグナル増幅システムである。抗体は、免疫組織化学におけるシグナル増幅のために広く使用されている。チラミドシグナル増幅（Tyramide signal amplification、ＴＳＡ）は、ペルオキシダーゼ活性による多数のハプテン化チラミド分子の沈着に基づく。チラミンはフェノール化合物である。少量の過酸化水素の存在下で、固定化された西洋ワサビペルオキシダーゼ（horseradish peroxidase、ＨＲＰ）は、標識された基質を短寿命の非常に反応性の中間体に変換する。次いで、活性化された基質分子は、ペルオキシダーゼ結合部位の部位又はその付近で、チロシンなどのタンパク質の電子豊富部分と非常に迅速に反応し、共有結合する。このようにして、チラミドにコンジュゲートした多くのハプテン分子をハイブリダイゼーション部位にインサイチュで導入することができる。続いて、沈着したチラミド－ハプテン分子を直接又は間接的に可視化することができる。そのような検出システムは、例えば、米国特許出願公開第２０１２／０１００５４０号により詳細に記載されている。
【0152】
本明細書に記載される実施形態は、適切な発色基質又は蛍光発生基質を使用して検出可能なシグナルを生成するために酵素を利用することができる。あるいは、標識プローブは、標識プローブの核酸部分に直接結合された検出可能な標識を有し得ることが理解される。例示的な検出可能な標識は当業者に周知であり、発色標識又は蛍光標識を含むが、これらに限定されない（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ（１９９６）を参照されたい）。標識として有用な例示的なフルオロフォアとしては、ローダミン誘導体、例えば、テトラメチルローダミン、ローダミンＢ、ローダミン６Ｇ、スルホローダミンＢ、テキサスレッド（スルホローダミン１０１）、ローダミン１１０、及びそれらの誘導体、例えば、テトラメチルローダミン－５－（又は６）、リサミンローダミンＢなど；７－ニトロベンズ－２－オキサ－１，３－ジアゾール（7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazole、ＮＢＤ）；フルオロセイン及びその誘導体；ダンシル（５－ジメチルアミノナフタレン－１－スルホニル）などのナフタレン；７－アミノ－４－メチルクマリン－３－酢酸（7-amino-4-methylcoumarin-3-acetic acid、ＡＭＣＡ）、７－ジエチルアミノ－３－［（４’－（ヨードアセチル）アミノ）フェニル］－４－メチルクマリン（7-diethylamino-3-[(4’-(iodoacetyl)amino)phenyl]-4-methylcoumarin、ＤＣＩＡ）、Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ色素（Molecular Probes）などのクマリン誘導体；４，４－ジフルオロ－４－ボラ－３ａ，４ａ－ジアザ－ｓ－インダセン（ＢＯＤＩＰＹ（商標）及びその誘導体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ；Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）；８－メトキシピレン－１，３，６－トリスルホン酸などを含む、Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅ（商標）及びその誘導体などのピレン及びスルホン化ピレン；ピリジルオキサゾール誘導体及びダポキシル誘導体（Molecular Probes）；ルシファーイエロー（３，６－ジスルホネート－４－アミノ－ナフタルイミド）及びその誘導体；ＣｙＤｙｅ（商標）蛍光色素（Ａｍｅｒｓｈａｍ／ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ ＮＪ）、ＡＴＴＯ ３９０、ＤｙＬｉｇｈｔ ３９５ＸＬ、ＡＴＴＯ ４２５、ＡＴＴＯ ４６５、ＡＴＴＯ ４８８、ＡＴＴＯ ４９０ＬＳ、ＡＴＴＯ ４９５、ＡＴＴＯ ５１４、ＡＴＴＯ ５２０、ＡＴＴＯ ５３２、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ６Ｇ、ＡＴＴＯ ５４２、ＡＴＴＯ ５５０、ＡＴＴＯ ５６５、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ３Ｂ、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ１１、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ１２、ＡＴＴＯ Ｔｈｉｏ１２、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ１０１、ＡＴＴＯ ５９０、ＡＴＴＯ ５９４、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ１３、ＡＴＴＯ ６１０、ＡＴＴＯ ６２０、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ１４、ＡＴＴＯ ６３３、ＡＴＴＯ ６４３、ＡＴＴＯ ６４７、ＡＴＴＯ ６４７Ｎ、ＡＴＴＯ ６５５、ＡＴＴＯ Ｏｘａ１２、ＡＴＴＯ ６６５、ＡＴＴＯ ６８０、ＡＴＴＯ ７００、ＡＴＴＯ ７２５、ＡＴＴＯ ７４０、Ｃｙａｎ ５００ ＮＨＳ－Ｅｓｔｅｒ（ＡＴＴＯ－ＴＥＣＨ，Ｓｉｅｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）などが挙げられるが、これらに限定されない。例示的な発色団としては、フェノールフタレイン、マラカイトグリーン、ニトロフェニルなどのニトロ芳香族化合物、ジアゾ色素、ダブシル（４－ジメチルアミノアゾベンゼン－４’－スルホニル）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【0153】
それぞれの標的核酸に関連する発色シグナル、蛍光シグナル、又は金属検出可能シグナルを可視化するために、顕微鏡法、サイトメトリー（例えば、マスサイトメトリー、飛行時間型サイトメトリー（cytometry by time of flight、ＣｙＴＯＦ）、フローサイトメトリー）、又は分光法などの周知の方法を利用することができる。概ね、発色基質若しくは蛍光発生基質、又は発色標識若しくは蛍光発生標識、又は希土類金属同位体のいずれかは、異なる標識が同じアッセイにおいて使用される場合、特定のアッセイのために利用され、その結果、単一の型の機器が、同じ試料中の核酸標的の検出のために使用され得る。
【0154】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、標識された一次抗体を使用することを含み、したがって、他のＩＨＣステップを行う必要性を排除する。特定の実施形態では、一次抗体は、発色標識で標識される。特定の実施形態では、一次抗体は、蛍光標識で標識される。特定の実施形態では、一次抗体は、ポリヌクレオチド（複数可）で標識される。特定の実施形態では、一次抗体は、ＮＨＳ（スクシンイミジル）エステル法によって標識される。特定の実施形態では、一次抗体は、イソチオシアネート法によって標識される。特定の実施形態では、一次抗体は、カルボジイミド法によって標識される。特定の実施形態では、一次抗体は、２タグ法（触媒及びその基質）によって標識される。特定の実施形態では、一次抗体は、ペリオデート法によって標識される。一次抗体後の架橋は、Ｂａｓｅｓｃｏｐｅ（商標）シグナル増幅システムと組み合わせて（Ｂａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ ８：１９９８（２０１７）を参照されたい）、又は類似のプロトコルを使用する他の核酸検出方法と組み合わせて、蛍光ベースの検出とともに使用するために適合させることができる。
【0155】
本明細書で提供される方法の一態様では、試料は、体液又は組織由来の細胞を含む。いくつかの実施形態では、体液は、血液、血清、又は血漿である。一実施形態では、体液は、血液である。一実施形態では、体液は、血清である。一実施形態では、体液は、血漿である。一実施形態では、試料は、組織標本であるか、又は組織標本に由来する。一態様では、試料は、血液試料であるか、又は血液試料に由来する。一実施形態では、試料は、細胞学的試料であるか、又は細胞学的試料に由来する。一実施形態では、試料は、培養された細胞である。別の実施形態では、試料は、エキソソームを含有する試料である。上記又は下記の実施形態のいずれか１つのいくつかの実施形態では、試料は、不死化細胞株を含む。
【0156】
組織標本としては、例えば、組織生検試料が挙げられる。血液試料としては、例えば、診断目的で採取された血液試料が挙げられる。血液試料の場合、血液は、血液塗抹などで直接分析することができるか、又は血液は、本開示の方法によって分析される試料中の細胞が血液試料中にあるか、又は血液試料に由来するように、例えば、赤血球の溶解、ＰＢＭＣ又は白血球の単離、標的細胞の単離など、処理することができる。同様に、組織標本を処理することができ、例えば、組織標本を細かく切り刻み、物理的又は酵素的に処理して、組織を個々の細胞又は細胞クラスターに破壊することができる。更に、細胞学的試料は、所望する場合、細胞を単離するか又は細胞クラスターを破壊するために処理され得る。したがって、組織、血液、及び細胞学的試料は、当該技術分野において周知の方法を使用して得られ、処理され得る。本開示の方法は、病理を示すバイオマーカーである核酸標的の存在又は不在に基づいて、病的細胞の存在又は不在を同定するための診断用途において使用することができる。
【0157】
本明細書において提供される方法を使用して標的核酸及び標的タンパク質を検出するために、いくつかの好適な試料タイプのいずれかを使用することができることが当業者によって理解される。本明細書で提供される方法において使用するための試料は、概ね、生物学的試料又は組織試料である。そのような試料は、生物学的対象から得ることができ、これには、個体又は生物学的材料、例えば、生検、剖検、又は法医学的材料のいくつかの他の供給源から収集された生物学的組織又は流体起源の試料が含まれる。生物学的試料はまた、前がん性若しくはがん細胞若しくは組織を含有するか、又は含有する疑いのある生物学的対象の領域からの試料、例えば、細針吸引物、血液試料、又は細胞学的標本を含む組織生検を含む。そのような試料は、哺乳動物などの生物から単離された臓器、組織、組織画分、細胞、及び／又はエキソソームであり得るが、これらに限定されない。例示的な生物学的試料としては、細胞を含む細胞培養物、初代細胞培養物、細胞株、組織、臓器、オルガノイド、生物学的流体などが挙げられるが、これらに限定されない。更なる生物学的試料としては、皮膚試料、細針吸引物を含む組織生検、細胞学的試料、糞便、血液及び／又は血清試料を含む体液、唾液、精液などが挙げられるが、これらに限定されない。そのような試料は、医学的又は獣医学的診断目的のために使用され得る。
【0158】
本明細書で提供される方法による分析のための細胞学的試料の収集は、当該技術分野において周知である（例えば、Ｄｅｙ，「Ｃｙｔｏｌｏｇｙ Ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｏｃｕｒｅｍｅｎｔ，Ｆｉｘａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ」ｉｎ Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｃｙｔｏｌｏｇｙ ｐｐ．１２１－１３２，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ（２０１８）、「Ｎｏｎ－Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｙｔｏｌｏｇｙ Ｐｒａｃｔｉｃｅ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ」Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ａｄｏｐｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ＡＳＣ ｅｘｅｃｕｔｉｖｅ ｂｏａｒｄ Ｍａｒｃｈ ２，２００４）を参照されたい）。
【0159】
例えば、組織生検及び細胞学的試料を含む子宮頸部組織の分析のために試料を処理するための方法は、当該技術分野において周知である（例えば、Ｃｅｃｉｌ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｂｅｎｎｅｔｔ ａｎｄ Ｐｌｕｍ，ｅｄｓ．，２０ｔｈ ｅｄ．，ＷＢ Ｓａｕｎｄｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ（１９９６）、Ｃｏｌｐｏｓｃｏｐｙ ａｎｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｅｒｖｉｃａｌ Ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｎｅｏｐｌａｓｉａ：Ａ Ｂｅｇｉｎｎｅｒ’ｓ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｌｌｏｒｓ ａｎｄ Ｓａｎｋａｒａｎａｒａｙａｎａｎ，ｅｄｓ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ａｇｅｎｃｙ ｆｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｎ Ｃａｎｃｅｒ，Ｌｙｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ（２００３）、Ｋａｌａｆ ａｎｄ Ｃｏｏｐｅｒ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．６０：４４９－４５５（２００７）、Ｂｒｏｗｎ ａｎｄ Ｔｒｉｍｂｌｅ，Ｂｅｓｔ Ｐｒａｃｔ．Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎａｅｃｏｌ．２６：２３３－２４２（２０１２）、Ｗａｘｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．１２０：１４６５－１４７１（２０１２）、Ｃｅｒｖｉｃａｌ Ｃｙｔｏｌｏｇｙ Ｐｒａｃｔｉｃｅ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ＴＯＣ，Ａｐｐｒｏｖｅｄ ｂｙ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ（ＡＳＣ）Ｅｘｅｃｕｔｉｖｅ Ｂｏａｒｄ，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ １０，２０００）を参照されたい）。
【0160】
上記又は下記の実施形態のいずれか１つのいくつかの実施形態では、細胞は、不死化細胞株で構成される。
【0161】
別の態様では、本明細書において、本明細書で提供される実施形態のいずれか１つの方法を行うためのキットが提供される。別の態様では、本明細書において、本明細書で提供される実施形態のいずれか１つの方法により調製された細胞の試料が提供される。
【0162】
本明細書で提供される方法は、有益な研究ツール並びに診断ツールである。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、複合組織における空間的構成をマッピングするために使用される。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、細胞型及び新しい細胞型を同定するために使用される。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、細胞状態を同定するために使用される。他の特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、腫瘍微小環境における細胞型及び新たな細胞型を同定するために使用される。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、腫瘍微小環境における細胞状態を同定するために使用される。
【0163】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、自動化されたシステムにおいて使用され得る。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、自動化されたプロセスにおいて使用され得る。いくつかの実施形態では、自動化されたシステムは、固定された細胞のパラフィン包埋のために使用され得る。いくつかの実施形態では、自動化されたプロセスは、固定された細胞のパラフィン包埋のために使用され得る。いくつかの実施形態では、自動化されたシステムは、細胞の脱パラフィンのために使用され得る。いくつかの実施形態では、自動化されたプロセスは、細胞の脱パラフィンのために使用され得る。本明細書で提供される様々な方法のいくつかの実施形態では、各ステップは、独立して、手動又は自動化のいずれかであり得る。本明細書で提供される様々な方法のいくつかの実施形態では、いくつかのステップは手動で行われ、他のステップは自動化される。
【0164】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、罹患細胞及び組織における変化した遺伝子発現を検出するために使用される。いくつかの特定実施形態では、本明細書で提供される方法は、特定の細胞型における変化した遺伝子発現を局在化し、腫瘍不均一性を理解するために使用される。いくつかの特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、腫瘍－免疫細胞相互作用を研究するために使用される。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、がんの診断及び予後のためのバイオマーカーを検出するために使用される。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、がん治療のための治療標的を検出するために使用される。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、新規抗体の検証を容易にするために使用される。
【0165】
実施形態
本発明は、以下の非限定的な実施形態を提供する。
本発明は、以下の非限定的な実施形態を提供する。
【0166】
１組の実施形態では、以下が提供される。
１．試料中の分子を検出する方法であって、
ａ．試料から細胞を得ることと、
ｂ．細胞を固定剤で処理することと、
ｃ．固定された細胞をパラフィン包埋することと、
ｄ．細胞を脱パラフィンし懸濁して、単一細胞懸濁液を得ることと、
ｅ．懸濁された細胞を、懸濁された細胞の少なくとも１つの分子に結合する第１の検出剤と接触させることと、
ｆ．第１の検出剤に結合した細胞を、第２の検出剤と接触させることと、
ｇ．試料の細胞に結合した第２の検出剤の存在を検出することと、を含み、
試料に結合した第２の検出剤のバックグラウンドを超える量の検出が、試料中の少なくとも１つの分子の存在を示す、方法。
２．分子が、核酸又はタンパク質である、実施形態１に記載の方法。
３．核酸が、ＲＮＡである、実施形態２に記載の方法。
４．核酸が、ＤＮＡである、実施形態２に記載の方法。
５．方法が、懸濁された細胞を第１の検出剤と接触させた後に未結合細胞を更に除去する、実施形態１～４のいずれか１つに記載の方法。
６．方法が、第１の検出剤に結合した細胞を第２の検出剤と接触させた後に、未結合の第２の検出剤を除去することを更に含む、実施形態１～５のいずれか１つに記載の方法。
７．固定剤が、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、又は中性緩衝ホルマリンを含む群から選択される、実施形態１～６のいずれか１つに記載の方法。
８．固定剤が、中性緩衝ホルマリンである、実施形態７に記載の方法。
９．中性緩衝ホルマリンが、１０％中性緩衝ホルマリンである、実施形態８に記載の方法。
１０．細胞を固定剤で処理するステップが、約３０分間～６０分間、１時間～２時間、２時間～３時間、３時間～４時間、４時間～５時間、５時間～６時間、６時間～７時間、７時間～８時間、８時間～９時間、９時間～１０時間、１０時間～１１時間、１１時間～１２時間、１２時間～１３時間、１３時間～１４時間、１４時間～１５時間、１５時間～１６時間、１６時間～１７時間、１７時間～１８時間、１８時間～１９時間、１９時間～２０時間、２０時間～２１時間、２１時間～２２時間、２２時間～２３時間、２３時間～２４時間、２４時間～３６時間、又は３６時間～４８時間続く、実施形態１～９のいずれか１つに記載の方法。
１１．細胞を固定剤で処理するステップが、４℃、室温、４０℃、又は６０℃で行われる、実施形態１～１０のいずれか１つに記載の方法。
１２．細胞を固定剤で処理するステップが、室温で２４時間行われる、実施形態１～１１のいずれか１つに記載の方法。
１３．固定された細胞のパラフィン包埋が、
ａ．細胞をエタノールと接触させることと、
ｂ．細胞をキシレンと接触させることと、
ｃ．細胞をパラフィンとともにインキュベートすることと、を含む、実施形態１～１２のいずれか１つに記載の方法。
１４．細胞をエタノールと接触させるステップが、
ａ．細胞を水中７０％エタノールと３０分間接触させることと、
ｂ．細胞を水中８０％エタノールと３０分間接触させることと、
ｃ．細胞を水中９５％エタノールと３０分間接触させることと、
ｄ．細胞を１００％エタノールと３０分間接触させることと、を含む、実施形態１３に記載の方法。
１５．細胞をキシレンと接触させるステップが、各々２０分間のキシレンの３回の交換を含む、実施形態１３又は１４に記載の方法。
１６．細胞をパラフィンとともにインキュベートするステップが、各々２０分間のパラフィンの４回の交換を含む、実施形態１３～１５のいずれか１つに記載の方法。
１７．細胞をパラフィンとともにインキュベートするステップが、６０℃で行われる、実施形態１６に記載の方法。
１８．細胞をキシレンと接触させることによって細胞を脱パラフィンする、実施形態１～１７のいずれか１つに記載の方法。
１９．細胞をキシレンと約約５分間～１０分間、１０分間～１５分間、１５分間～２０分間、２０分間～３０分間、３０分間～６０分間、６０分間～９０分間、又は９０分間～１２０分間接触させる、実施形態１８に記載の方法。
２０．細胞を、細胞を水中７０％エタノールと約１５～約３０分間接触させることと、細胞を水中９５％エタノールと約１５～約３０分間接触させることと、最後に、細胞を１００％エタノールと約１５～約３０分間接触させることとを含む、連続エタノール勾配と更に接触させる、実施形態１８又は１９に記載の方法。
実施形態２１．細胞が、抗原賦活化溶液に再懸濁される、実施形態１～２０のいずれか１つに記載の方法。
２２．細胞が、９５℃で約３０分間更に加熱される、実施形態２１に記載の方法。
２３．細胞が、マイクロ波放射によって加熱される、実施形態２２に記載の方法。
２４．第１及び／又は第２の検出剤が、抗体又はその抗原結合フラグメントである、実施形態１～２３のいずれか１つに記載の方法。
２５．第１及び／又は第２の検出剤が、ＲＮＡベースのバインダー分子である、実施形態１～２３のいずれか１つに記載の方法。
２６．試料が、体液又は組織由来の細胞を含む、実施形態１～２５のいずれか１つに記載の方法。
２７．体液が、血液、血清、又は血漿である、実施形態２６に記載の方法。
２８．試料が、患者由来のものである、実施形態１～２７のいずれか１つに記載の方法。
２９．患者が、哺乳動物である、実施形態２８に記載の方法。
３０．哺乳動物が、ヒトである、実施形態２９に記載の方法。
３１．試料が、不死化細胞株由来の細胞を含む、実施形態１～３０のいずれか１つに記載の方法。
３２．実施形態１～３１のいずれか１つに記載の方法を行うための、キット。
３３．実施形態１～３１のいずれか１つに記載の方法により調製された、細胞の試料。
１．試料中の分子を検出する方法であって、
ａ．試料から細胞を得ることと、
ｂ．細胞を固定剤で処理することと、
ｃ．固定された細胞をパラフィン包埋することと、
ｄ．細胞を脱パラフィンし懸濁して、単一細胞懸濁液を得ることと、
ｅ．懸濁された細胞を、懸濁された細胞の少なくとも１つの分子に結合する第１の検出剤と接触させることと、
ｆ．第１の検出剤に結合した細胞を、第２の検出剤と接触させることと、
ｇ．試料の細胞に結合した第２の検出剤の存在を検出することと、を含み、
試料に結合した第２の検出剤のバックグラウンドを超える量の検出が、試料中の少なくとも１つの分子の存在を示す、方法。
２．分子が、核酸又はタンパク質である、実施形態１に記載の方法。
３．核酸が、ＲＮＡである、実施形態２に記載の方法。
４．核酸が、ＤＮＡである、実施形態２に記載の方法。
５．方法が、懸濁された細胞を第１の検出剤と接触させた後に未結合細胞を更に除去する、実施形態１～４のいずれか１つに記載の方法。
６．方法が、第１の検出剤に結合した細胞を第２の検出剤と接触させた後に、未結合の第２の検出剤を除去することを更に含む、実施形態１～５のいずれか１つに記載の方法。
７．固定剤が、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、又は中性緩衝ホルマリンを含む群から選択される、実施形態１～６のいずれか１つに記載の方法。
８．固定剤が、中性緩衝ホルマリンである、実施形態７に記載の方法。
９．中性緩衝ホルマリンが、１０％中性緩衝ホルマリンである、実施形態８に記載の方法。
１０．細胞を固定剤で処理するステップが、約３０分間～６０分間、１時間～２時間、２時間～３時間、３時間～４時間、４時間～５時間、５時間～６時間、６時間～７時間、７時間～８時間、８時間～９時間、９時間～１０時間、１０時間～１１時間、１１時間～１２時間、１２時間～１３時間、１３時間～１４時間、１４時間～１５時間、１５時間～１６時間、１６時間～１７時間、１７時間～１８時間、１８時間～１９時間、１９時間～２０時間、２０時間～２１時間、２１時間～２２時間、２２時間～２３時間、２３時間～２４時間、２４時間～３６時間、又は３６時間～４８時間続く、実施形態１～９のいずれか１つに記載の方法。
１１．細胞を固定剤で処理するステップが、４℃、室温、４０℃、又は６０℃で行われる、実施形態１～１０のいずれか１つに記載の方法。
１２．細胞を固定剤で処理するステップが、室温で２４時間行われる、実施形態１～１１のいずれか１つに記載の方法。
１３．固定された細胞のパラフィン包埋が、
ａ．細胞をエタノールと接触させることと、
ｂ．細胞をキシレンと接触させることと、
ｃ．細胞をパラフィンとともにインキュベートすることと、を含む、実施形態１～１２のいずれか１つに記載の方法。
１４．細胞をエタノールと接触させるステップが、
ａ．細胞を水中７０％エタノールと３０分間接触させることと、
ｂ．細胞を水中８０％エタノールと３０分間接触させることと、
ｃ．細胞を水中９５％エタノールと３０分間接触させることと、
ｄ．細胞を１００％エタノールと３０分間接触させることと、を含む、実施形態１３に記載の方法。
１５．細胞をキシレンと接触させるステップが、各々２０分間のキシレンの３回の交換を含む、実施形態１３又は１４に記載の方法。
１６．細胞をパラフィンとともにインキュベートするステップが、各々２０分間のパラフィンの４回の交換を含む、実施形態１３～１５のいずれか１つに記載の方法。
１７．細胞をパラフィンとともにインキュベートするステップが、６０℃で行われる、実施形態１６に記載の方法。
１８．細胞をキシレンと接触させることによって細胞を脱パラフィンする、実施形態１～１７のいずれか１つに記載の方法。
１９．細胞をキシレンと約約５分間～１０分間、１０分間～１５分間、１５分間～２０分間、２０分間～３０分間、３０分間～６０分間、６０分間～９０分間、又は９０分間～１２０分間接触させる、実施形態１８に記載の方法。
２０．細胞を、細胞を水中７０％エタノールと約１５～約３０分間接触させることと、細胞を水中９５％エタノールと約１５～約３０分間接触させることと、最後に、細胞を１００％エタノールと約１５～約３０分間接触させることとを含む、連続エタノール勾配と更に接触させる、実施形態１８又は１９に記載の方法。
実施形態２１．細胞が、抗原賦活化溶液に再懸濁される、実施形態１～２０のいずれか１つに記載の方法。
２２．細胞が、９５℃で約３０分間更に加熱される、実施形態２１に記載の方法。
２３．細胞が、マイクロ波放射によって加熱される、実施形態２２に記載の方法。
２４．第１及び／又は第２の検出剤が、抗体又はその抗原結合フラグメントである、実施形態１～２３のいずれか１つに記載の方法。
２５．第１及び／又は第２の検出剤が、ＲＮＡベースのバインダー分子である、実施形態１～２３のいずれか１つに記載の方法。
２６．試料が、体液又は組織由来の細胞を含む、実施形態１～２５のいずれか１つに記載の方法。
２７．体液が、血液、血清、又は血漿である、実施形態２６に記載の方法。
２８．試料が、患者由来のものである、実施形態１～２７のいずれか１つに記載の方法。
２９．患者が、哺乳動物である、実施形態２８に記載の方法。
３０．哺乳動物が、ヒトである、実施形態２９に記載の方法。
３１．試料が、不死化細胞株由来の細胞を含む、実施形態１～３０のいずれか１つに記載の方法。
３２．実施形態１～３１のいずれか１つに記載の方法を行うための、キット。
３３．実施形態１～３１のいずれか１つに記載の方法により調製された、細胞の試料。
【0167】
本発明の特定の実施形態が本明細書に記載される。前述の説明を読むと、開示された実施形態の変形形態は、当業者に明らかになり得、必要に応じてそのような変形形態を採用し得ることが予想される。したがって、本発明が、本明細書に具体的に記載されるもの以外の方法で実施されること、並びに本発明が、適用法によって許可されるように、本明細書に添付の特許請求の範囲に列挙される主題の全ての修正物及び均等物を含むことが意図される。更に、全ての可能性のあるこれらの変形形態における上記要素の任意の組み合わせは、本明細書において別途記載のない限り、又は文脈が明らかに矛盾しない限り、本明細書に包含される。本発明の多くの実施形態が説明されてきた。しかしながら、様々な修正が、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく実行され得ることが、理解されるであろう。したがって、実施例のセクションにおける説明は、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定するのではなく、例示することを意図するものである。
【実施例】
【0168】
以下は、試験に使用された様々な方法及び材料の説明であり、当業者に本開示の作製及び使用方法の完全な開示及び説明を提供するように記載されており、本発明者らがその開示とみなす範囲を限定することを意図しておらず、また、以下の実験が実施され、実施可能な実験の全てであることを表すことを意図していない。現在形で書かれた例示的な記述は、必ずしも実行されたものではなく、むしろ記述は、本開示の教示に関連するデータなどを生成するために実行できるものであることを理解されたい。使用される数値（例えば、量、パーセンテージなど）についての正確度を保証するための努力はなされているが、多少の実験誤差及び偏差が考慮に入れられるべきである。
【0169】
実施例１：組織ＩＨＣに適した抗体のためのハイスループットスクリーニング方法
試験した抗体を表１に示す。
試験した抗体を表１に示す。
【0170】
【表1】
【0171】
ＮＲＫ５２Ｅ細胞（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ、腎臓上皮細胞）を培養し、コロジオンバッグ中でペレット化した後、１０％ＮＢＦ中で、室温で２４時間固定した。コロジオンバッグは、１５ｍＬのガラス円錐管の内面全体をｌ溶液（Ｍａｃｒｏｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓカタログ番号４５６０－０４）でコーティングすることによって生成した。処理後、細胞の小ペレットをパラフィンブロックに包埋し、残りの細胞をコロジオンバッグから取り出し、キシレンに移した。キシレン中で３×１５分間洗浄した後（全ての目に見えるパラフィンが可溶化されるまで）、細胞を連続エタノール勾配により水和し、次いでペレット化した。細胞を抗原賦活化溶液に再懸濁し、マイクロ波放射により９５℃で３０分間加熱した。冷却後、それらをＰＢＳ中で洗浄し、計数し、９６ウェルプレート（３０，０００／ウェル）に分配した。フィルターインサートを備えるプレートもこのステップに使用することができ、市販されている（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）。例えば、フィルターインサートは、プレートの洗浄と遠心分離との間の細胞の損失を防ぐために０．４５ｕｍの孔径を有し得る。
【0172】
ＩｍｍＰＲＥＳＳ ＨＲＰ抗ウサギＩｇＧポリマー検出キット（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ、カタログ番号ＭＰ－７４５１）を使用した。攪拌しながら、細胞を抗体溶液とともに室温で６０分間インキュベートした。洗浄し、適切な二次抗体で検出した後、ウェル当たり５０ｕＬのＴＭＢ溶液を添加し、室温で３０分間インキュベートした。発色反応を停止し、各ウェルの光学密度を４５０ｎｍで測定した。図２は、４５０ｎｍで測定した光学密度の形式での抗体結合を示す。各抗体結合を、ウェル当たり３０，０００個の細胞について２つ組みで試験した。「対照陰性」と名付けた条件は、抗体希釈剤のみとともにインキュベートした細胞に関するものであった。
【0173】
直接比較のために、細胞ペレットブロックの４ｕｍ切片に対して同じ抗体溶液を用いてＩＨＣアッセイを行った（ＤＡＫＯ自動染色装置でＩＨＣ実験を行った）。染色した各ペレットのＨスコアを、細胞ペレットの全表面強度染色を計算する面積定量アルゴリズムに基づいて計算した（Ｈａｌｏ ｓｏｆｔｗａｒｅ，ＩｎｄｉｃａＬａｂｓ）。各ペレットのＨスコアを以下のように計算した：Ｈスコア＝（表面積％１＋）×１＋（表面積２＋）×２＋（％表面積％３＋）×３。図３Ａ～図３Ｂは、細胞ペレットブロックの４ｕｍ切片に対して様々な抗体溶液を用いて行った免疫組織化学（「ＩＨＣ」）アッセイの結果を示す。図３Ａは、各抗体のＩＨＣ細胞ペレット染色を示す。図３Ｂは、染色した各ペレットのＨスコアを示す。染色した各ペレットのＨスコアを、細胞ペレットの全表面強度染色を計算する面積定量アルゴリズムに基づいて計算した。
【0174】
図４は、本明細書で提供されるＥＬＩＳＡ様方法とＩＨＣ染色との間の相関評価を示す。ピアソン相関係数ｒ＝０．９２９（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ）は、ハイスループットＥＬＩＳＡ様方法により得られたスクリーニング結果と、ホルマリン固定パラフィン包埋（「ＦＦＰＥ」）組織試料に対して行われた従来のＩＨＣとの間の十分な比較可能性を示した。
【0175】
実施例２：ヒト細胞材料及び方法
ヒト細胞を得て、培養し、コロジオンバッグ中でペレット化した後、１０％ＮＢＦ中で、室温で２４時間固定する。コロジオンバッグは、１５ｍＬのガラス円錐管の内面全体をコロジオン溶液（Ｍａｃｒｏｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓカタログ番号４５６０－０４）でコーティングすることによって生成する。処理後、細胞の小ペレットをパラフィンブロックに包埋し、残りの細胞をコロジオンバッグから取り出し、キシレンに移した。キシレン中で３×１５分間洗浄した後（全ての目に見えるパラフィンが可溶化されるまで）、細胞を連続エタノール勾配により水和し、次いでペレット化する。細胞を抗原賦活化溶液に再懸濁し、マイクロ波放射により９５℃で３０分間加熱する。冷却後、それらをＰＢＳ中で洗浄し、計数し、９６ウェルプレート（３０，０００／ウェル）に分配し、いくつかのプレートはインサートを有さず、いくつかの例では、フィルターインサートを備えるプレートが使用され、その場合、プレートは０．４５ｕｍの孔径を有する。検出及び定量を実施例１のように行う。
ヒト細胞を得て、培養し、コロジオンバッグ中でペレット化した後、１０％ＮＢＦ中で、室温で２４時間固定する。コロジオンバッグは、１５ｍＬのガラス円錐管の内面全体をコロジオン溶液（Ｍａｃｒｏｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓカタログ番号４５６０－０４）でコーティングすることによって生成する。処理後、細胞の小ペレットをパラフィンブロックに包埋し、残りの細胞をコロジオンバッグから取り出し、キシレンに移した。キシレン中で３×１５分間洗浄した後（全ての目に見えるパラフィンが可溶化されるまで）、細胞を連続エタノール勾配により水和し、次いでペレット化する。細胞を抗原賦活化溶液に再懸濁し、マイクロ波放射により９５℃で３０分間加熱する。冷却後、それらをＰＢＳ中で洗浄し、計数し、９６ウェルプレート（３０，０００／ウェル）に分配し、いくつかのプレートはインサートを有さず、いくつかの例では、フィルターインサートを備えるプレートが使用され、その場合、プレートは０．４５ｕｍの孔径を有する。検出及び定量を実施例１のように行う。
【0176】
実施例３：非ヒト細胞材料及び方法
非ヒト細胞を得て、培養し、コロジオンバッグ中でペレット化した後、１０％ＮＢＦ中で、室温で２４時間固定する。コロジオンバッグは、１５ｍＬのガラス円錐管の内面全体をコロジオン溶液（Ｍａｃｒｏｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓカタログ番号４５６０－０４）でコーティングすることによって生成する。処理後、細胞の小ペレットをパラフィンブロックに包埋し、残りの細胞をコロジオンバッグから取り出し、キシレンに移した。キシレン中で３×１５分間洗浄した後（全ての目に見えるパラフィンが可溶化されるまで）、細胞を連続エタノール勾配により水和し、次いでペレット化する。細胞を抗原賦活化溶液に再懸濁し、マイクロ波において９５℃で３０分間加熱する。冷却後、それらをＰＢＳ中で洗浄し、計数し、９６ウェルプレート（３０，０００／ウェル）に分配し、いくつかのプレートはインサートを有さず、いくつかの例では、フィルターインサートを備えるプレートが使用され、その場合、プレートは０．４５ｕｍの孔径を有する。検出及び定量を実施例１のように行う。
非ヒト細胞を得て、培養し、コロジオンバッグ中でペレット化した後、１０％ＮＢＦ中で、室温で２４時間固定する。コロジオンバッグは、１５ｍＬのガラス円錐管の内面全体をコロジオン溶液（Ｍａｃｒｏｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓカタログ番号４５６０－０４）でコーティングすることによって生成する。処理後、細胞の小ペレットをパラフィンブロックに包埋し、残りの細胞をコロジオンバッグから取り出し、キシレンに移した。キシレン中で３×１５分間洗浄した後（全ての目に見えるパラフィンが可溶化されるまで）、細胞を連続エタノール勾配により水和し、次いでペレット化する。細胞を抗原賦活化溶液に再懸濁し、マイクロ波において９５℃で３０分間加熱する。冷却後、それらをＰＢＳ中で洗浄し、計数し、９６ウェルプレート（３０，０００／ウェル）に分配し、いくつかのプレートはインサートを有さず、いくつかの例では、フィルターインサートを備えるプレートが使用され、その場合、プレートは０．４５ｕｍの孔径を有する。検出及び定量を実施例１のように行う。
【0177】
実施例４：ヒト組織細胞材料及び方法
細胞を含むヒト組織を得て、組織由来の細胞を培養し、コロジオンバッグ中でペレット化した後、１０％ＮＢＦ中で、室温で２４時間固定する。コロジオンバッグは、１５ｍＬのガラス円錐管の内面全体をコロジオン溶液（Ｍａｃｒｏｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓカタログ番号４５６０－０４）でコーティングすることによって生成する。処理後、細胞の小ペレットをパラフィンブロックに包埋し、残りの細胞をコロジオンバッグから取り出し、キシレンに移した。キシレン中で３×１５分間洗浄した後（全ての目に見えるパラフィンが可溶化されるまで）、細胞を連続エタノール勾配により水和し、次いでペレット化する。細胞を抗原賦活化溶液に再懸濁し、マイクロ波放射により９５℃で３０分間加熱する。冷却後、それらをＰＢＳ中で洗浄し、計数し、９６ウェルプレート（３０，０００／ウェル）に分配し、いくつかのプレートはインサートを有さず、いくつかの例では、フィルターインサートを備えるプレートが使用され、その場合、プレートは０．４５ｕｍの孔径を有する。検出及び定量を実施例１のように行う。
細胞を含むヒト組織を得て、組織由来の細胞を培養し、コロジオンバッグ中でペレット化した後、１０％ＮＢＦ中で、室温で２４時間固定する。コロジオンバッグは、１５ｍＬのガラス円錐管の内面全体をコロジオン溶液（Ｍａｃｒｏｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓカタログ番号４５６０－０４）でコーティングすることによって生成する。処理後、細胞の小ペレットをパラフィンブロックに包埋し、残りの細胞をコロジオンバッグから取り出し、キシレンに移した。キシレン中で３×１５分間洗浄した後（全ての目に見えるパラフィンが可溶化されるまで）、細胞を連続エタノール勾配により水和し、次いでペレット化する。細胞を抗原賦活化溶液に再懸濁し、マイクロ波放射により９５℃で３０分間加熱する。冷却後、それらをＰＢＳ中で洗浄し、計数し、９６ウェルプレート（３０，０００／ウェル）に分配し、いくつかのプレートはインサートを有さず、いくつかの例では、フィルターインサートを備えるプレートが使用され、その場合、プレートは０．４５ｕｍの孔径を有する。検出及び定量を実施例１のように行う。
【0178】
実施例５：非ヒト組織細胞材料及び方法
細胞を含む非ヒト組織を得て、組織由来の細胞を培養し、コロジオンバッグ中でペレット化した後、１０％ＮＢＦ中で、室温で２４時間固定する。コロジオンバッグは、１５ｍＬのガラス円錐管の内面全体をコロジオン溶液（Ｍａｃｒｏｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓカタログ番号４５６０－０４）でコーティングすることによって生成する。処理後、細胞の小ペレットをパラフィンブロックに包埋し、残りの細胞をコロジオンバッグから取り出し、キシレンに移した。キシレン中で３×１５分間洗浄した後（全ての目に見えるパラフィンが可溶化されるまで）、細胞を連続エタノール勾配により水和し、次いでペレット化する。細胞を抗原賦活化溶液に再懸濁し、マイクロ波放射により９５℃で３０分間加熱する。冷却後、それらをＰＢＳ中で洗浄し、計数し、９６ウェルプレート（３０，０００／ウェル）に分配し、いくつかのプレートはインサートを有さず、いくつかの例では、フィルターインサートを備えるプレートが使用され、その場合、プレートは０．４５ｕｍの孔径を有する。検出及び定量を実施例１のように行う。
細胞を含む非ヒト組織を得て、組織由来の細胞を培養し、コロジオンバッグ中でペレット化した後、１０％ＮＢＦ中で、室温で２４時間固定する。コロジオンバッグは、１５ｍＬのガラス円錐管の内面全体をコロジオン溶液（Ｍａｃｒｏｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓカタログ番号４５６０－０４）でコーティングすることによって生成する。処理後、細胞の小ペレットをパラフィンブロックに包埋し、残りの細胞をコロジオンバッグから取り出し、キシレンに移した。キシレン中で３×１５分間洗浄した後（全ての目に見えるパラフィンが可溶化されるまで）、細胞を連続エタノール勾配により水和し、次いでペレット化する。細胞を抗原賦活化溶液に再懸濁し、マイクロ波放射により９５℃で３０分間加熱する。冷却後、それらをＰＢＳ中で洗浄し、計数し、９６ウェルプレート（３０，０００／ウェル）に分配し、いくつかのプレートはインサートを有さず、いくつかの例では、フィルターインサートを備えるプレートが使用され、その場合、プレートは０．４５ｕｍの孔径を有する。検出及び定量を実施例１のように行う。
【0179】
実施例６：細胞中のポリヌクレオチドの検出
細胞を得て、培養し、コロジオンバッグ中でペレット化した後、１０％ＮＢＦ中で、室温で２４時間固定する。コロジオンバッグは、１５ｍＬのガラス円錐管の内面全体をコロジオン溶液（Ｍａｃｒｏｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓカタログ番号４５６０－０４）でコーティングすることによって生成する。処理後、細胞の小ペレットをパラフィンブロックに包埋し、残りの細胞をコロジオンバッグから取り出し、キシレンに移した。キシレン中で３×１５分間洗浄した後（全ての目に見えるパラフィンが可溶化されるまで）、細胞を連続エタノール勾配により水和し、次いでペレット化する。細胞を抗原賦活化溶液に再懸濁し、マイクロ波放射により９５℃で３０分間加熱する。冷却後、それらをＰＢＳ中で洗浄し、計数し、９６ウェルプレート（３０，０００／ウェル）に分配し、いくつかのプレートはインサートを有さず、いくつかの例では、フィルターインサートを備えるプレートが使用され、その場合、プレートは０．４５ｕｍの孔径を有する。検出及び定量を実施例１のように行い、ポリヌクレオチドを検出する。
細胞を得て、培養し、コロジオンバッグ中でペレット化した後、１０％ＮＢＦ中で、室温で２４時間固定する。コロジオンバッグは、１５ｍＬのガラス円錐管の内面全体をコロジオン溶液（Ｍａｃｒｏｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓカタログ番号４５６０－０４）でコーティングすることによって生成する。処理後、細胞の小ペレットをパラフィンブロックに包埋し、残りの細胞をコロジオンバッグから取り出し、キシレンに移した。キシレン中で３×１５分間洗浄した後（全ての目に見えるパラフィンが可溶化されるまで）、細胞を連続エタノール勾配により水和し、次いでペレット化する。細胞を抗原賦活化溶液に再懸濁し、マイクロ波放射により９５℃で３０分間加熱する。冷却後、それらをＰＢＳ中で洗浄し、計数し、９６ウェルプレート（３０，０００／ウェル）に分配し、いくつかのプレートはインサートを有さず、いくつかの例では、フィルターインサートを備えるプレートが使用され、その場合、プレートは０．４５ｕｍの孔径を有する。検出及び定量を実施例１のように行い、ポリヌクレオチドを検出する。
【0180】
実施例７：細胞中の非ポリヌクレオチドの検出
細胞を得て、培養し、コロジオンバッグ中でペレット化した後、１０％ＮＢＦ中で、室温で２４時間固定する。コロジオンバッグは、１５ｍＬのガラス円錐管の内面全体をコロジオン溶液（Ｍａｃｒｏｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓカタログ番号４５６０－０４）でコーティングすることによって生成する。処理後、細胞の小ペレットをパラフィンブロックに包埋し、残りの細胞をコロジオンバッグから取り出し、キシレンに移した。キシレン中で３×１５分間洗浄した後（全ての目に見えるパラフィンが可溶化されるまで）、細胞を連続エタノール勾配により水和し、次いでペレット化する。細胞を抗原賦活化溶液に再懸濁し、マイクロ波放射により９５℃で３０分間加熱する。冷却後、それらをＰＢＳ中で洗浄し、計数し、９６ウェルプレート（３０，０００／ウェル）に分配し、いくつかのプレートはインサートを有さず、いくつかの例では、フィルターインサートを備えるプレートが使用され、その場合、プレートは０．４５ｕｍの孔径を有する。検出及び定量を実施例１のように行い、ポリヌクレオチドではない分子を検出する。
細胞を得て、培養し、コロジオンバッグ中でペレット化した後、１０％ＮＢＦ中で、室温で２４時間固定する。コロジオンバッグは、１５ｍＬのガラス円錐管の内面全体をコロジオン溶液（Ｍａｃｒｏｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓカタログ番号４５６０－０４）でコーティングすることによって生成する。処理後、細胞の小ペレットをパラフィンブロックに包埋し、残りの細胞をコロジオンバッグから取り出し、キシレンに移した。キシレン中で３×１５分間洗浄した後（全ての目に見えるパラフィンが可溶化されるまで）、細胞を連続エタノール勾配により水和し、次いでペレット化する。細胞を抗原賦活化溶液に再懸濁し、マイクロ波放射により９５℃で３０分間加熱する。冷却後、それらをＰＢＳ中で洗浄し、計数し、９６ウェルプレート（３０，０００／ウェル）に分配し、いくつかのプレートはインサートを有さず、いくつかの例では、フィルターインサートを備えるプレートが使用され、その場合、プレートは０．４５ｕｍの孔径を有する。検出及び定量を実施例１のように行い、ポリヌクレオチドではない分子を検出する。
【0181】
実施例８：不死化細胞材料及び方法
不死化細胞を得て、培養し、コロジオンバッグ中でペレット化した後、１０％ＮＢＦ中で、室温で２４時間固定する。コロジオンバッグは、１５ｍＬのガラス円錐管の内面全体をコロジオン溶液（Ｍａｃｒｏｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓカタログ番号４５６０－０４）でコーティングすることによって生成する。処理後、細胞の小ペレットをパラフィンブロックに包埋し、残りの細胞をコロジオンバッグから取り出し、キシレンに移した。キシレン中で３×１５分間洗浄した後（全ての目に見えるパラフィンが可溶化されるまで）、細胞を連続エタノール勾配により水和し、次いでペレット化する。細胞を抗原賦活化溶液に再懸濁し、マイクロ波放射により９５℃で３０分間加熱する。冷却後、それらをＰＢＳ中で洗浄し、計数し、９６ウェルプレート（３０，０００／ウェル）に分配し、いくつかのプレートはインサートを有さず、いくつかの例では、フィルターインサートを備えるプレートが使用され、その場合、プレートは０．４５ｕｍの孔径を有する。検出及び定量を実施例１のように行う。
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不死化細胞を得て、培養し、コロジオンバッグ中でペレット化した後、１０％ＮＢＦ中で、室温で２４時間固定する。コロジオンバッグは、１５ｍＬのガラス円錐管の内面全体をコロジオン溶液（Ｍａｃｒｏｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓカタログ番号４５６０－０４）でコーティングすることによって生成する。処理後、細胞の小ペレットをパラフィンブロックに包埋し、残りの細胞をコロジオンバッグから取り出し、キシレンに移した。キシレン中で３×１５分間洗浄した後（全ての目に見えるパラフィンが可溶化されるまで）、細胞を連続エタノール勾配により水和し、次いでペレット化する。細胞を抗原賦活化溶液に再懸濁し、マイクロ波放射により９５℃で３０分間加熱する。冷却後、それらをＰＢＳ中で洗浄し、計数し、９６ウェルプレート（３０，０００／ウェル）に分配し、いくつかのプレートはインサートを有さず、いくつかの例では、フィルターインサートを備えるプレートが使用され、その場合、プレートは０．４５ｕｍの孔径を有する。検出及び定量を実施例１のように行う。
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【0182】
当業者は、広い発明概念から逸脱することなく、上で説明される実施形態に変更を行うことができることを理解するであろう。したがって、本発明は、開示された特定の実施形態に制限されず、本明細書によって定義されるように本発明の趣旨及び範囲内の修正を包含することを意図するものと理解される。
【図1】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図4】
【国際調査報告】