特表 2024-526188 ウイルス核酸を単離及び検出するための装置及び方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-07-17

(54)【発明の名称】ウイルス核酸を単離及び検出するための装置及び方法

(51)【国際特許分類】

   C12M 1/00 20060101AFI20240709BHJP

   C12Q 1/6806 20180101ALI20240709BHJP

   C12Q 1/6813 20180101ALI20240709BHJP

   C12Q 1/6816 20180101ALI20240709BHJP

   C12Q 1/6818 20180101ALI20240709BHJP

【ＦＩ】

C12M1/00 A

C12Q1/6806 Z

C12Q1/6813 Z

C12Q1/6816 Z

C12Q1/6818 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023579236

(86)(22)【出願日】2022-06-23

(85)【翻訳文提出日】2024-02-01

(86)【国際出願番号】 US2022034636

(87)【国際公開番号】W WO2022271895

(87)【国際公開日】2022-12-29

(31)【優先権主張番号】63/215,002

(32)【優先日】2021-06-25

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

２．ＭＡＴＬＡＢ

(71)【出願人】

【識別番号】508144129

【氏名又は名称】ユニバーシティ オブ ロチェスター

(74)【代理人】

【識別番号】110002077

【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人

(72)【発明者】

【氏名】ミラー， ベンジャミン エル．

(72)【発明者】

【氏名】ビアード， ジェフリー ダブリュ．

【テーマコード（参考）】

4B029

4B063

【Ｆターム（参考）】

4B029AA09

4B029AA23

4B029BB11

4B029BB13

4B029BB20

4B029CC01

4B029DG08

4B029GB02

4B029GB03

4B029GB05

4B029HA05

4B063QA01

4B063QA18

4B063QQ03

4B063QQ42

4B063QQ52

4B063QR55

4B063QS34

4B063QX02

(57)【要約】

本発明は、ウイルス溶解及び単離、並びにヘアピンカスケード反応（ＨＣＲ）に基づく簡便で使い捨ての非酵素的ウイルス負荷アッセイのための、新規な装置及び方法に関する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

流体試料からウイルスの核酸を分離するための装置であって、
流体試料を受容し前記流体試料中の細胞を保持するように適合された試料受容領域を有する、第１の層と、
前記第１の層の下に積層され、前記試料受容領域と少なくとも部分的に重なる様式で位置決めされたウイルス溶解領域を有する第２の層であって、前記ウイルス溶解領域はウイルス溶解試薬を含む、第２の層と、
前記第２の層の下に積層され、前記ウイルス溶解領域と流体連通するｐＨ調節領域を有する第３の層であって、前記ｐＨ調節領域はｐＨ調節試薬を含む、第３の層と、
前記第３の層の下に積層され、前記ｐＨ調節領域と流体連通する核酸受容領域を有する、第４の層と、を備える、装置。

【請求項2】

ウィッキングパッドを有する第５の層を更に備える、請求項１に記載の装置。

【請求項3】

前記試料受容領域は、（ｉ）前記流体試料を受容し、細胞の第１の集団を保持するように適合された、上部フィルタパッドと、（ｉｉ）前記上部フィルタパッドの下に積層され、細胞の第２の集団を保持するように適合された、下部フィルタパッドと、を備える、先行請求項のいずれか一項に記載の装置。

【請求項4】

前記ウイルス溶解領域は、（ｉｉｉ）前記溶解試薬を含む溶解試薬パッドを備える、先行請求項のいずれか一項に記載の装置。

【請求項5】

前記ウイルス溶解領域は、（ｉｖ）前記溶解試薬パッドの下に積層されたインキュベーションパッドを更に備える、請求項４に記載の装置。

【請求項6】

前記溶解試薬パッド又は前記インキュベーションパッドは、
前記溶解試薬パッドと少なくとも部分的に重なる様式で位置決めされた始端と、
前記始端から所定のウィッキング距離で横方向に延在する終端であって、前記終端が前記ｐＨ調節領域と流体連通している、終端と、を有するインキュベーションチャネルを備える、請求項４又は５に記載の装置。

【請求項7】

前記ウイルス溶解領域は、分解性フィルムによって前記第３の層から分離されている、先行請求項のいずれか一項に記載の装置。

【請求項8】

前記ｐＨ調節領域は、前記ｐＨ調節試薬を保持し、
前記第３の層における前記ウイルス溶解領域と流体連通する入口端と、
前記第４の層における前記核酸受容領域と流体連通する出口端と、を有するｐＨチャネルを備える、先行請求項のいずれか一項に記載の装置。

【請求項9】

前記核酸受容領域は、官能基化されている、先行請求項のいずれか一項に記載の装置。

【請求項10】

前記流体試料は、血液試料、喀痰試料、尿試料、尿スワブ試料、又は唾液試料を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の装置。

【請求項11】

前記核酸は、ＲＮＡ又はＤＮＡを含む、先行請求項のいずれか一項に記載の装置。

【請求項12】

前記ウイルスは、ＨＩＶ、デング熱、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、又はエボラ出血熱である、先行請求項のいずれか一項に記載の装置。

【請求項13】

前記ウイルス溶解試薬は、乾燥Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の装置。

【請求項14】

前記ｐＨ調節試薬は、酢酸ナトリウムを含む、先行請求項のいずれか一項に記載の装置。

【請求項15】

前記第５の層は、セルロースを含む、請求項２に記載の装置。

【請求項16】

前記溶解試薬パッドは、繊維ガラスを含む、請求項４に記載の装置。

【請求項17】

前記第１の層から前記第２の層への前記流体試料の通過を制御するように適合された制御部材を更に備える、先行請求項のいずれか一項に記載の装置。

【請求項18】

前記制御部材は、前記第１の層から前記第２の層への前記流体試料の前記通過を解放するための第１のユーザ動作を受けるように構成されている、請求項１７に記載の装置。

【請求項19】

前記第１のユーザ動作は、第１のタイマを作動させ、第１の所定の期間の間、前記流体試料が前記ウイルス溶解試薬と接触することを可能にする、請求項１８に記載の装置。

【請求項20】

前記制御部材は、第２のユーザ動作を受けるように構成され、前記第２のユーザ動作は、第２のタイマを作動させ、第２の所定の期間の間、前記核酸受容領域中の前記核酸が検出剤と接触することを可能にする、請求項１７に記載の装置。

【請求項21】

請求項１～２０のいずれか一項に記載の装置と、前記核酸の標的配列に相補的な配列を有するプローブと、を備える、キット。

【請求項22】

流体試料からウイルスの核酸を分離するための方法であって、
流体試料を備えることと、
請求項１～２０のいずれか一項に記載の装置の前記第１の層における前記試料受容領域に、前記流体試料を接触させることと、
前記流体試料の流体部分が前記第１の層、前記第２の層、及び前記第３の層を通過し、前記第４の層に到達することを可能とする条件下で、前記流体試料を前記装置においてインキュベートし、それによって前記ウイルスの前記核酸を得ることと、を含む、方法。

【請求項23】

流体試料中のウイルスの核酸を検出するための方法であって、
請求項２２の方法によって得られた前記第４の層を備えることと、
前記核酸受容領域を反応混合物と接触させることと、
前記核酸と前記反応混合物との間の反応を検出することと、を含む、方法。

【請求項24】

前記反応混合物は、前記核酸の標的配列に相補的な配列を有するプローブを含む、請求項２３に記載の方法。

【請求項25】

前記反応混合物は、ハイブリダイゼーション連鎖反応（ＨＣＲ）混合物である、請求項２４に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年６月２５日に出願された米国特許仮出願第６３／２１５，００２号に対する３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．１１９（ｅ）に基づく優先権を主張するものである。前述の出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれたものとする。

【0002】

連邦政府支援研究に関する声明
本発明は、米国国立衛生研究所によるＥＢ０２７０４９の政府支援を受けてなされたものである。政府は、本発明において一定の権利を有する。

【0003】

本発明は、一般的に、ウイルス核酸を単離又は検出するための装置及び方法に関する。

【背景技術】

【0004】

ウイルスは様々な障害を引き起こし、世界中に急速に広がり得るものである。例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に感染して生活している人は世界中で約３，７９０万人おり、毎年１００万人を超える新たな感染がある。ＨＩＶに感染して生活する人々の数の増加に伴い、この疾患に関連した経済的で利用しやすい臨床試験を開発することが不可欠となっている。ウイルス負荷アッセイは、患者の血液中のＨＩＶビリオンの数を測定するために使用され、ＨＩＶ患者の健康及び感染の状態を追跡するための最も効果的な方法である。抗レトロウイルス療法（ＡＲＴ）を受けている患者は、米国では３ヵ月毎に、ＷＨＯの世界基準を満たすためには６～１２ヵ月毎に、ウイルス負荷試験を受けることが推奨されている。定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ｑＰＣＲ）は、ＨＩＶウイルス負荷を決定するための最も代表的な試験である。米国等の先進国には、頻繁なウイルス負荷及びＣＤ４カウント試験を行う余裕があるが、世界のＨＩＶ陽性者の大多数は、これらのアッセイを実行するために必要な資金、消耗品及び検査室へのアクセスが制約されている。低～中所得国（ＬＭＩＣ）は、ウイルス負荷試験の最も大きな必要性を有し、世界のＨＩＶ感染者の６５％よりも多くを占めているが、この最も代表的な試験は高価であり、労力がかかり、実行するための検査室も必要とする。これらの重要な試験を受けることができなければ、ＬＭＩＣにおける患者にとってＡＲＴの有効性が損なわれ、潜在的にＨＩＶ関連死の増加に導き得る。

【0005】

ＲＴ－ｑＰＣＲ技術は、ＬＭＩＣにおけるウイルス負荷アッセイの必要性の高まりに対応するため、分散型ポイントオブケア（ＰＯＣ）試験に適応されている。ＰＯＣ試験はアッセイ時間を短縮するものであり、ワークフローを簡素化し得るが、従来のＲＴ－ｑＰＣＲ試験よりも高価な、精巧な装置を必要とするものでもある。ＣｅｐｈｅｉｄによるＧｅｎｅＸｐｅｒｔ（登録商標）及びＡｂｂｏｔｔによるｍ－ＰＩＭＡ（商標）ＨＩＶ－１／２ウイルス負荷試験等のウイルス負荷ＰＯＣ装置は、ＰＣＲに関連する複雑なワークフローの多くを排除している。しかしながら、これらの装置は高価であり（器具に１５，０００ドル～１８，０００ドル、消耗品毎に１５ドル～２５ドル）、最も代表的な試験と同じ温度に敏感な試薬の多くを使用し、かさばる器具を必要とする。このコストは、これらの試験を最も必要とする地域の要件とは相容れない：アフリカには、１日の所得が１．９０ドル未満と定義される極度の貧困状態にある世界人口の約８７％が住んでいる。

【0006】

ＨＩＶ試験の分野の現状に関連する更なる課題は、既存のアッセイが「シングルプレックス」であり、ウイルス負荷の測定を超えて拡張可能でないことを含む。理想的なアッセイプラットフォームは、モジュール式で拡張性があり、ＨＩＶに関連する合併症と全身の健康状態を示す標準的な血清マーカとの同時の試験を可能とする。ここでもまた、Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）システムを含むマルチプレックス臨床アッセイは、複雑な設備、高価な消耗品、及び複雑なワークフローを必要とする。

【0007】

ＰＯＣの実装に適した最も単純なアッセイ形式の１つは、側方流動アッセイである。これらのアッセイは非常に成功しているが、一般的に定性的であるか又はせいぜい半定量的で、多重化が困難なものである。紙ベースのアッセイに流体チャネルをパターン化するための方法の導入は、ＬＦＡのような多重試験の開発を簡素化し、この分野の急速な拡大に導いたが、これらのアッセイは依然として、有用なＨＩＶウイルス負荷試験に必要な感度を欠いている。

【0008】

かくして、費用対効果が高く、堅固で効率的な形式で、ＰＯＣ ＨＩＶ及びその他のウイルスのウイルス負荷測定を可能にする、新規な装置及び方法に対する喫緊の必要性が存在する。

【発明の概要】

【0009】

この開示は、ウイルス核酸の単離及び検出のための装置及び方法を提供することによって、上述した必要性に対処する。一態様においては、本開示は、流体試料からウイルスの核酸を分離するための装置を提供する。いくつかの実施形態においては、本装置は、（ｉ）流体試料を受容し流体試料中の細胞を保持するように適合された試料受容領域を有する、第１の層と、（ｉｉ）第１の層の下に積層され、試料受容領域と少なくとも部分的に重なる様式で位置決めされたウイルス溶解領域を有する第２の層であって、ウイルス溶解領域はウイルス溶解試薬を含む、第２の層と、（ｉｉｉ）第２の層の下に積層され、ウイルス溶解領域と流体連通するｐＨ調節領域を有する第３の層であって、ｐＨ調節領域はｐＨ調節試薬を含む、第３の層と、（ｉｖ）第３の層の下に積層され、ｐＨ調節領域と流体連通する核酸受容領域を有する、第４の層と、を備える。いくつかの実施形態においては、本装置は、ウィッキングパッドを有する第５の層を更に含む。

【0010】

いくつかの実施形態においては、第１の層の試料受容領域は、（ａ）流体試料を受容し、細胞の第１の集団を保持するように適合された、上部フィルタパッドと、（ｂ）上部フィルタパッドの下に積層され、細胞の第２の集団を保持するように適合された、下部フィルタパッドと、を備える。

【0011】

いくつかの実施形態においては、第２の層のウイルス溶解領域は、溶解試薬を含む溶解試薬パッドを備える。いくつかの実施形態においては、ウイルス溶解領域は、溶解試薬パッドの下に積層されたインキュベーションパッドを更に備える。

【0012】

いくつかの実施形態においては、溶解試薬パッド又はインキュベーションパッドは、インキュベーションチャネルを備える。いくつかの実施形態においては、インキュベーションチャネルは、溶解試薬パッドと少なくとも部分的に重なる様式で位置決めされた始端と、始端から所定のウィッキング距離で横方向に延在する終端と、を備える。いくつかの実施形態においては、終端は、ｐＨ調節領域と流体連通している。

【0013】

いくつかの実施形態においては、ウイルス溶解試薬は、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（例えば乾燥Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）を含む。いくつかの実施形態においては、溶解試薬パッドは、繊維ガラスを含む。

【0014】

いくつかの実施形態においては、ウイルス溶解領域は、分解性フィルムによって第３の層から分離されている。

【0015】

いくつかの実施形態においては、第３の層のｐＨ調節領域は、ｐＨ調節試薬を保持するｐＨチャネルを含む。いくつかの実施形態においては、ｐＨチャネルは、第３の層におけるウイルス溶解領域と流体連通する入口端と、第４の層における核酸受容領域と流体連通する出口端と、を備える。いくつかの実施形態においては、ｐＨ調節試薬は、酢酸ナトリウムを含む。

【0016】

いくつかの実施形態においては、第４の層の核酸受容領域は、官能基化されている。

【0017】

いくつかの実施形態においては、流体試料は、血液試料、喀痰試料、尿試料、尿スワブ溶出液試料、鼻スワブ溶出液試料、又は唾液試料を含む。いくつかの実施形態においては、核酸は、ＲＮＡ又はＤＮＡを含む。いくつかの実施形態においては、ウイルスは、ＨＩＶ、デング熱、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、及びエボラ出血熱のうちのいずれか１つを含む。

【0018】

いくつかの実施形態においては、第５の層は、セルロースを含む。

【0019】

いくつかの実施形態においては、本装置は、第１の層から第２の層への流体試料の通過を制御するように適合された制御部材を更に備える。いくつかの実施形態においては、制御部材は、第１の層から第２の層への流体試料の通過を解放するための第１のユーザ動作を受けるように構成される。いくつかの実施形態においては、第１のユーザ動作は、第１のタイマを作動させ、第１の所定の期間の間、流体試料がウイルス溶解試薬と接触することを可能にする。

【0020】

いくつかの実施形態においては、制御部材は、第２のユーザ動作を受けるように構成される。いくつかの実施形態においては、第２のユーザ動作は、第２のタイマを作動させ、第２の所定の期間の間、核酸受容領域内の核酸が検出剤と接触することを可能にする。

【0021】

別の態様においては、本開示は更に、以上に説明された装置と、核酸の標的配列に相補的な配列を有する１つ以上のプローブと、を備える、キットを提供する。

【0022】

別の態様においては、本開示はまた、流体試料からウイルスの核酸を分離するための方法を提供する。いくつかの実施形態においては、本方法は、（ｉ）流体試料を備えることと、（ｉｉ）以上に説明された装置の第１の層における試料受容領域に、流体試料を接触させることと、（ｉｉｉ）流体試料の流体部分が第１の層、第２の層、及び第３の層を通過し、第４の層に到達することを可能とする条件下で、流体試料を本装置においてインキュベートし、それによってウイルスの核酸を得ることと、を含む。

【0023】

更に別の態様においては、本開示は、流体試料中のウイルスの核酸を検出するための方法を更に提供する。いくつかの実施形態においては、本方法は、（ａ）以上に説明された方法によって得られた第４の層を備えることと、（ｂ）核酸受容領域を反応混合物と接触させることと、（ｃ）核酸と反応混合物との間の反応を検出することと、を含む。

【0024】

いくつかの実施形態においては、反応混合物は、核酸の標的配列に相補的な配列を有するプローブを含む。いくつかの実施形態においては、反応混合物は、ハイブリダイゼーション連鎖反応（ＨＣＲ）混合物を含む。

【0025】

以上の要約は、本開示の全ての態様を定義することを意図されたものではなく、追加的な態様が、以下の詳細な説明等の他の節において説明される。本明細書の全体は、統一された開示として関連付けられることを意図されたものであり、特徴の組み合わせが本明細書の同じ文、段落、又は節において一緒に見出されない場合であっても、本明細書に説明された特徴の全ての組み合わせが企図されることは、理解されるべきである。本発明の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明から明らかとなるであろう。しかしながら、本開示の趣旨及び範囲内での様々な変更及び修正が、この詳細な説明から当業者には明らかになるので、詳細な説明及び具体的な実施例は、本開示の具体的な実施形態を示しながらも、例示のためにのみ与えられるものであることは、理解されるべきである。

【図面の簡単な説明】

【0026】

【図1A-E】ウイルス核酸を単離及び検出するための装置例を示す模式的な図のセットである。

【図2】ウイルス核酸を単離及び検出するための装置例のワークフローを示す。

【図3】ＦＲＥＴ誘導蛍光出力を有するハイブリダイゼーション連鎖反応（ＨＣＲ）を介したインサイチュ増幅を示す模式図である。

【図4】様々な濃度の合成ＨＩＶ ＤＮＡ及びＲＮＡ配列を用いてインキュベートされたＨＣＲの生成物を示す３％アガロースゲルである。レーン２、４、及び６においては、５００ｎＭのＨ１とＨ２とのカクテルが、それぞれ１００ｎＭ、５０ｎＭ、及び１０ｎＭの濃度の合成ＤＮＡトリガを用いて１時間インキュベートされた。レーン３、５、及び７においては、５００ｎＭのＨ１とＨ２とのカクテルが、それぞれ１００ｎＭ、５０ｎＭ、及び１０ｎＭの濃度の合成ＲＮＡトリガを用いて１時間インキュベートされた。レーン８は、トリガ配列の非存在下でのＨＣＲ反応（１時間インキュベートされたもの）を含み、レーン１は、１００塩基対のＤＮＡラダーを含む。

【図5A-D】紙マイクロ流体のロールツーロール製造を示す図のセットである。

【図6A-D】キトサンを用いて官能基化されたＦｕｓｉｏｎ５フィルタを使用したオリゴヌクレオチドの捕捉を示す図のセットである。図６Ａは、経験的に０．９、３．５、及び６．１μｇのＤＮＡ捕捉（明るい領域）を示すために、緩衝化ＤＮＡをフィルタに通した後の、ＳｙｂｒＳａｆｅを用いた染色を示す。図６Ｂは、フィルタされたＤＮＡの質量に対する、捕捉されたＤＮＡの絶対質量を示している。図６Ｂの斜線領域は、９５％信頼区間である。図６Ｃは、５０μＬの１μＭ酵母ｔＲＮＡを使用した、種々のｐＨ緩衝液における捕捉効率を示す。図６Ｄは、５０μＬの１０μＭを使用したＤＮＡの捕捉効率を示す。いずれのデータ点も、ｎ＝３（ｎ＝２である図６Ｄにおける「官能基化されていないもの」は除く）の平均値であり、標準偏差は縦線で表され、ＪＭＰ Ｐｒｏ １６を使用して分析された。

【図7】合成プロウイルスＤＮＡを使用したＦｕｓｉｏｎ５フィルタ紙（Ｃｙｔｉｖｉａ）上でのＨＣＲ－ＦＲＥＴ生成物のビニングされたＦＲＥＴ強度を示すグラフである。合成ＨＩＶプロウイルスＤＮＡが、Ｆｕｓｉｏｎ５フィルタ紙上で乾燥させられた。次いで、５μＬのＨＣＲ溶液が定着液滴としてフィルタ紙に塗布され、完全に乾燥することを可能にされ、蛍光顕微鏡を用いてフィルタ紙が撮像された。生の蛍光顕微鏡画像が、右側に示されている。画像強度はＩｍａｇｅＪを使用して定量化され、データは平均値として表され、標準偏差は縦線で表され、ＪＭＰ Ｐｒｏ １６を使用して分析された。

【図8】合成ＨＩＶ ＲＮＡを使用したＦｕｓｉｏｎ５フィルタ紙（Ｃｙｔｉｖａ）上でのＨＣＲ－ＦＲＥＴ生成物のビニングされたＦＲＥＴ強度を示すグラフである。合成ＨＩＶ ＲＮＡが、Ｆｕｓｉｏｎ５フィルタ紙上で乾燥させられた。次いで、５μＬのＨＣＲ溶液が定着液滴としてフィルタ紙に塗布され、完全に乾燥することを可能にされ、蛍光顕微鏡を用いてフィルタ紙が撮像された。生の蛍光顕微鏡画像が、右側に示されている。画像強度はＩｍａｇｅＪを使用して定量化され、データは平均値として表され、標準偏差は縦線で表され、ＪＭＰ Ｐｒｏ １６を使用して分析された。

【図9A-C】ヌクレオチドを検出するための装置例及びワークフロー例を示す図のセットである。図９Ａは、統合された検出システムを備えた、全血からのウイルス核酸の単離及び検出のための装置設計を示す。ペンはスケールのためのものである。図９Ｂは、血漿分離、ウイルス溶解、及びＲＮＡ捕捉のための層を含む、受動的核酸単離のために設計された装置の、内部の多孔質媒体ベースの構成要素を示す。図９Ｃは、装置のワークフロー例（ステップ１～４）を示す。

【発明を実施するための形態】

【0027】

ウイルス負荷を測定するための既存の方法は複雑で高価であり、資源が限られた環境又はポイントオブケア（ＰＯＣ）には適していない。ＰＯＣ対応の手法に対する必要性に対処するために、本開示は、ウイルス溶解及び単離のための新規な装置及び方法、並びに、ヘアピンカスケード反応又はトーホールドトリガストランド置換反応（ＴＳＤＲ）等の適切な反応に基づく、簡便で使い捨ての非酵素的ウイルス負荷アッセイを提供する。

【0028】

Ａ．ウイルス核酸を単離及び検出するための装置
したがって、一態様においては、本開示は、流体試料からウイルスの核酸を分離するための装置を提供する。いくつかの実施形態においては、本装置は、（ｉ）流体試料を受容し流体試料中の細胞又は細胞成分を保持するように適合された試料受容領域を有する、第１の層と、（ｉｉ）第１の層の下に積層され、試料受容領域と少なくとも部分的に重なる様式で位置決めされたウイルス溶解領域を有する第２の層であって、ウイルス溶解領域はウイルス溶解試薬を含む、第２の層と、（ｉｉｉ）第２の層の下に積層され、ウイルス溶解領域と流体連通するｐＨ調節領域を有する第３の層であって、ｐＨ調節領域はｐＨ調節試薬を含む、第３の層と、（ｉｖ）第３の層の下に積層され、ｐＨ調節領域と流体連通する核酸受容領域を有する、第４の層と、を備える。いくつかの実施形態においては、本装置は、追加的に及び／又は任意に、ウィッキングパッドを有する第５の層を備えてもよい。

【0029】

第１の層
いくつかの実施形態においては、本装置の第１の層は、流体試料から１つ以上の成分を分離すること等の、流体試料の前処理のために使用されてもよい。一例においては、全血試料については、第１の層は、白血球及び／又は赤血球、又はそれらの成分（例えば細胞破片）から血漿を分離するために使用されてもよい。いくつかの実施形態においては、白血球及び／又は赤血球、又はそれらの成分の分離は、１つ以上のフィルタパッドを使用して実施されてもよい。

【0030】

いくつかの実施形態においては、フィルタパッドは、フィルタとして機能し、例えば、細胞（例えば白血球若しくは赤血球）又はその細胞成分の流れを制限する平均孔径を有してもよい。一例においては、フィルタパッドは、白血球又はその細胞成分の流れを制限する平均孔径を有してもよい。いくつかの実施形態においては、フィルタパッドは、約８μｍ～約１４μｍ（例えば８μｍ、９μｍ、１０μｍ、１１μｍ、１２μｍ、１３μｍ、１４μｍ）の平均孔径を有する。別の例においては、フィルタパッドは、赤血球又はその細胞成分の流れを制限する平均孔径を有してもよい。いくつかの実施形態においては、フィルタパッドは、約０．２μｍ～約８μｍ（例えば０．５μｍ、１μｍ、２μｍ、３μｍ、４μｍ、５μｍ、６μｍ、７μｍ、８μｍ）の平均細孔径を有するか、又は記載された孔径の任意の組み合わせにおいて孔径が減少する勾配を含む単一層を有する。

【0031】

いくつかの実施形態においては、第１の層の試料受容領域は、流体試料から１つ以上の成分を分離するための１つ以上のフィルタパッドを含んでもよい。例えば、第１の層の試料受容領域は、流体試料を受容し、細胞の第１の集団を保持するように適合された、上部フィルタパッドと、上部フィルタパッドの下に積層され、細胞の第２の集団を保持するように適合された、下部フィルタパッドと、を備える。いくつかの実施形態においては、細胞の第１の集団は、白血球を含んでもよい。いくつかの実施形態においては、細胞の第２の集団は、赤血球を含んでもよい。いくつかの実施形態においては、血液試料から白血球及び赤血球、又はそれらの成分を分離するために、第１の層の試料受容領域は、白血球の流れを制限する平均孔径（例えば約８μｍ～約１４μｍ）を有する上部フィルタパッドを含んでもよい。第１の層の試料受容領域は、上部フィルタパッドの下に積層され、赤血球の流れを制限する平均孔径（例えば約０．２μｍ～約８μｍ）を有する下部フィルタパッドを更に含んでもよい。

【0032】

いくつかの実施形態においては、試料受容領域は、様々な幾何学的形状及びサイズを有する１つ以上の開口部を有してもよい。例えば、開口部は、円形、半円形、三角形、正方形、長方形、五角形、又は六角形の形状を有してもよい。いくつかの実施形態においては、試料受容領域は、円形の形状を有する開口部を有する。いくつかの実施形態においては、円形の形状を有する開口部は、例えば約０．５ｃｍ～約１０ｃｍ（例えば１ｃｍ、２ｃｍ、３ｃｍ、４ｃｍ、５ｃｍ、６ｃｍ、７ｃｍ、８ｃｍ、９ｃｍ、１０ｃｍ）の直径を有してもよい。

【0033】

いくつかの実施形態においては、試料受容領域の開口部は、１つ以上のフィルタパッドを受容するように構成される。したがって、いくつかの実施形態においては、フィルタパッドは、試料受容領域の開口部と実質的に同じサイズ及び形状を有してもよい。例えば、フィルタパッドは、円形、半円形、三角形、正方形、長方形、五角形、又は六角形の形状を有してもよい。いくつかの実施形態においては、フィルタパッドは円形の形状を有する。いくつかの実施形態においては、円形の形状を有するフィルタパッドは、例えば約０．５ｃｍ～約１０ｃｍ（例えば１ｃｍ、２ｃｍ、３ｃｍ、４ｃｍ、５ｃｍ、６ｃｍ、７ｃｍ、８ｃｍ、９ｃｍ、１０ｃｍ）の直径を有してもよい。

【0034】

いくつかの実施形態においては、フィルタパッドは、試料受容領域の開口部のサイズよりも大きいサイズを有してもよい。いくつかの実施形態においては、１つ以上のフィルタパッド及び第１の層の残りは、一体型ユニットとして又は別個の部分として形成されてもよい。

【0035】

試料受容領域に適用される流体試料の量は、所望の毛細管流及びアッセイの操作性を提供するのに十分である限り、様々なものとなり得る。いくつかの実施形態においては、本開示の装置は、例えば０．５μＬ～５ｍＬのような、少量の試料に適合される。

【0036】

試料は、例えばスポイト、ピペット、及びシリンジ等を介してのような、任意の便利なプロトコルを使用して、試料適用部位に適用されてもよい。これに加えて、流体試料は、フィルタパッドを通る適切な流体の流れを提供するために、例えば緩衝液のような任意の適切な液体とともに試料受容領域に適用されてもよい。任意の適切な液体の例は、限定するものではないが、緩衝液、細胞培養培地（例えばＤＭＥＭ）等を含み得る。緩衝液の例は、限定するものではないが、トリス、トリシン、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＭＥＳ、ＰＢＳ、及びＴＢＳ等を含む。一例においては、適切な液体は、試料受容領域に適用される前に、流体試料と混合されてもよい。別の例においては、適切な液体は、流体試料を適用するのと同時に、適用する前に、又は適用した後に、試料受容領域に適用されてもよい。

【0037】

本明細書で使用される用語「試料」は、生物学的物質を含む試料を含む。試料は、例えば流体試料（例えば血液試料）又は組織試料（例えば頬スワブ）であってもよい。試料は、より大きな試料の一部であってもよい。いくつかの実施形態においては、流体試料は、血液（例えば全血）、血漿、喀痰、尿、汗、尿スワブ、精液、唾液、頬スワブ、又はそれらの組み合わせ等の生物学的流体を含む。試料は、法医学的試料であってもよいし、又は環境試料であってもよい。

【0038】

試料は、システムに導入される前に前処理されてもよい。いくつかの実施形態においては、前処理は、システムに適合しない物質からの抽出、細胞、ＤＮＡ、ＲＮＡ、若しくはその他の生体高分子若しくは分子の量の定量化、試料の濃縮、上皮細胞からの精子等の細胞タイプの分離、若しくはビーズ処理若しくはその他の濃縮方法、又はその他の試料の操作を含んでもよい。

【0039】

試料は、ＤＮＡ又はＲＮＡ等の核酸を有する生物学的試料であってもよい。いくつかの実施形態においては、核酸はウイルスのＲＮＡ又はＤＮＡである。ウイルスの非限定的な例は、ノーウォーク、ロタウイルス、ポリオウイルス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、ラッサウイルス、ハンタウイルス、狂犬病、インフルエンザ、黄熱ウイルス、コロナウイルス、ＳＡＲＳ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、西ナイルウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）及びＥ型肝炎ウイルス、デング熱ウイルス、トガ（例えば風疹）、Ｒｈａｂｄｏ（例えば狂犬病及びＶＳＶ）、ピコルナ（ポリオ及びライノウイルス）、ミクソ（例えばインフルエンザ）、レトロ（例えばＨＩＶ、ＨＴＬＶ）、ブンヤ、コロナ、並びにＤ型肝炎ウイルス及び植物ＲＮＡウイルスのようなウイロイド様ウイルスと、Ｔｏｂｕｓウイルス、ルテオウイルス、トバモウイルス、ポテクスウイルス、トブラウイルス、コモウイルス、ネポウイルス、アルモウイルス、ククモウイルス、ブロモウイルス、及びイラルウイルス等のウイロイドとを含む、ヒトの健康に重大な影響を及ぼすレオウイルスのうちのいずれか１を含む。

【0040】

いくつかの実施形態においては、除去されるべき流体試料中の１つ以上の成分は、細胞を含んでもよい。生物学的試料の文脈において使用される用語「細胞」は、限定するものではないが、小胞（リポソーム等）、細胞、ビリオン、及びビーズ、ナノ粒子、又は微小球等の小粒子に結合した実体を含む、一般的に個々の細胞と同様のサイズの試料を包含する。いくつかの実施形態においては、細胞は、血液細胞、臍帯血細胞、骨髄細胞、赤血球、白血球（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ）、リンパ球、上皮細胞、幹細胞、がん細胞、腫瘍細胞、循環腫瘍細胞、前駆細胞、細胞前駆体、臍帯血幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、脂肪幹細胞、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞、臍帯由来細胞、脂肪組織由来細胞、羊水中の間質血管細胞群（ＳＶＦ）中のマトリクス細胞、月経血中の細胞、脳脊髄液中の細胞、尿中の細胞、骨髄幹細胞、末梢血幹細胞、ＣＤ３４＋細胞、コロニー形成細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、神経細胞、免疫細胞、樹状細胞、巨核球、固定化骨髄細胞、血小板、精子、卵子、卵母細胞、微生物、細菌、カビ、酵母、原虫、ウイルス、細胞小器官、核、核酸、ミトコンドリア、ミセル、脂質、タンパク質、タンパク質複合体、細胞残屑、寄生虫、脂肪滴、多細胞生物、胞子、藻類、クラスタ、以上の凝集体、工業用粉末、ポリマー、粉体、エマルション小滴、粉塵、球状粒子（例えばミクロスフェア）、微粒子、及びコロイド状のもの（例えばコロイド）を含んでもよい。

【0041】

第２の層
いくつかの実施形態においては、本開示の装置は、第１の層の下に積層され、試料受容領域と少なくとも部分的に重なる様式で位置決めされたウイルス溶解領域を有する、第２の層を備える。

【0042】

いくつかの実施形態においては、第２の層のウイルス溶解領域は、溶解試薬パッドを備える。いくつかの実施形態においては、溶解試薬パッドは、溶解試薬を含んでもよい。

【0043】

いくつかの実施形態においては、溶解試薬は、化学的又は生化学的溶解試薬及び洗浄剤／界面活性剤を含んでもよい。バイロンの溶解及び／又はバイロンからの核酸の抽出のために使用され得る化学的溶解試薬の非限定的な例は、グアニジニウム塩（例えばグアニジニウムチオシアネート及びグアニジニウム塩酸塩）及び尿素を含む。いくつかの実施形態においては、洗浄剤／界面活性剤は、双性イオン洗浄剤／界面活性剤及び／又は非イオン性洗浄剤／界面活性剤を含む。双性イオン洗浄剤／界面活性剤の例は、限定するものではないが、３－［（３－コラミドプロピリル）ジメチルアンモニオ］－１－プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）、コカミドプロピルヒドロキシスルタイン、及びコカミドプロピルベタインを含む。非イオン性洗浄剤／界面活性剤の非限定的な例は、ポリオキシエチレングリコールアルキルエーテル（例えばオクタエチレングリコールモノドデシルエーテル及びペンタエチレングリコールモノドデシルエーテル）、ポリオキシプロピレングリコールアルキルエーテル、ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとのブロック共重合体（例えばポロキサマー（Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ））、ポリオキシエチレングリコールオクチルフェノールエーテル（例えばＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００及びＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１１４等のＴｒｉｔｏｎ）、ポリオキシエチレングリコールアルキルフェノールエーテル（例えばＮＰ－４０及びＮｏｎｏｘｙｎｏｌ－９）、ポリオキシエチレングリコールソルビタンアルキルエステル（例えばＰｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ／Ｔｗｅｅｎ２０等のポリソルベート／Ｔｗｅｅｎ）、ソルビタンアルキルエステル（例えばモノラウリン酸ソルビタン）、グリセロールアルキルエステル（例えばラウリン酸グリセリル）、並びにグルコシドアルキルエーテル（例えばデシルグルコシド、ラウリルグルコシド、及びオクチルグルコシド）を含む。イオン性洗浄剤の非限定的な例は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ドデシル硫酸リチウム（ＬＤＳ）、又はデオキシコール酸塩（ＤＯＣ）を含む。いくつかの実施形態においては、溶解試薬は、グアニジニウム塩（例えばグアニジニウムチオシアネート又はグアニジニウム塩酸塩）、Ｔｒｉｔｏｎ洗浄剤／界面活性剤（例えばＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００又はＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１１４）、及びＣＨＡＰＳを含む。

【0044】

いくつかの実施形態においては、溶解試薬は、化学的又は生化学的溶解試薬、洗浄剤／界面活性剤、及び緩衝剤を含む。いくつかの実施形態においては、緩衝剤は、塩基性ｐＨ範囲（例えば約ｐＨ８～ｐＨ１１、約ｐＨ８～ｐＨ１０、約ｐＨ１０～ｐＨ１１、約ｐＨ９～ｐＨ１０、又は約ｐＨ８～ｐＨ９）での緩衝を提供する。塩基性ｐＨ範囲で緩衝を提供する緩衝剤の非限定的な例は、ホウ酸塩、Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）グリシン（ビシン）、Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン（トリシン）、トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミン（トリス）、３－アミノ－１－プロパンスルホン酸、４－（シクロヘキシルアミノ）－１－ブタンスルホン酸（ＣＡＢＳ）、３－（シクロヘキシルアミノ）－１－プロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）、３－（シクロヘキシルアミノ）－２－ヒドロキシ－１－プロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）、２－（シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－Ｎ’－（３－プロパンスルホン酸）（ＥＰＰＳ）、及び３－｛［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アミノ｝－プロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）を含む。

【0045】

いくつかの実施形態においては、溶解試薬は、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（例えば乾燥／凍結乾燥Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）を含んでもよい。いくつかの実施形態においては、溶解効率は、溶解試薬のアルカリ度を操作することによって改善されてもよい。いくつかの実施形態においては、溶解試薬は、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００及び水酸化ナトリウムを含んでもよい。いくつかの実施形態においては、溶解試薬は、ＳＤＳ及び／又はＴｗｅｅｎ２０を含んでもよい。

【0046】

いくつかの実施形態においては、溶解試薬は、プロテアーゼを更に含んでもよい。本明細書で使用される用語「プロテアーゼ」、「ペプチダーゼ」、又は「プロテイナーゼ」は、タンパク質分解、すなわち、より小さいポリペプチド又は単一のアミノ酸へのタンパク質の分解を触媒する（速度を増大させる）酵素を指す。プロテアーゼは、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、スレオニンプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、アスパラギンペプチドリアーゼ、及びそれらの組み合わせのうちのいずれか１つであってもよい。

【0047】

いくつかの実施形態においては、溶解剤は、水性、乾燥、初期乾燥、固体、又はゲルの形態であってもよい。

【0048】

いくつかの実施形態においては、溶解試薬パッドは、いずれの適切な物質で形成されてもよい。いくつかの実施形態においては、溶解試薬パッドは、繊維ガラス、合成繊維、又はそれらの組み合わせを含む。

【0049】

いくつかの実施形態においては、溶解試薬パッドは、１つ以上のインキュベーションチャネルを含んでもよい。いくつかの実施形態においては、インキュベーションチャネルは、溶解試薬パッドと少なくとも部分的に重なる様式で位置決めされた始端と、始端から所定のウィッキング距離で横方向に延在する終端と、を含んでもよく、このとき終端は、ｐＨ調節領域と流体連通している。

【0050】

他の実施形態においては、ウイルス溶解領域は、溶解試薬パッドの下に積層されたインキュベーションパッドを更に含む。いくつかの実施形態においては、インキュベーションパッドは、１つ以上のインキュベーションチャネルを含む。いくつかの実施形態においては、インキュベーションチャネルは、溶解試薬パッドと少なくとも部分的に重なる様式で位置決めされた始端と、始端から所定のウィッキング距離で横方向に延在する終端と、を含んでもよく、このとき終端は、ｐＨ調節領域と流体連通している。

【0051】

インキュベーションチャネルは、試料と溶解試薬との混合物が溶解試薬パッド又はインキュベーションパッドからウィッキングするための流体経路を提供し、同時にビリオンが溶解される時間を確保する。したがって、ウィッキング距離、チャネル形状、及びチャネル幅を含む、インキュベーション流路の寸法は、溶解試薬が試料中のビリオンの少なくとも一部（例えば少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％）を溶解するのに必要とされるインキュベーション時間に基づいて、決定されてもよい。いくつかの実施形態においては、インキュベーションチャネルの寸法は、開示される層の物質の１つ以上の特性（例えば多孔質物質、平均孔径、孔径分布、多孔度、厚さ、及びウィッキング速度）に基づいて選択される。

【0052】

いくつかの実施形態においては、インキュベーションチャネルは、様々な幾何学的形状及びサイズを有し得る。例えば、インキュベーションチャネルは、蛇行形状のチャネル、直線状又は実質的に直線のチャネル、ジグザグ形状のチャネル、又はそれらの組み合わせであってもよい。

【0053】

本明細書で使用される用語「ウィッキング」は、多孔質媒体の細孔において生じる毛細管力の結果として、多孔質媒体を通る流体の移動を指す。典型的には、多孔質媒体は、例えば、小さい直径の細孔又は繊維の近接によって作り出される毛細管力により、流体が媒体を通って移動する程度に、ある程度の毛細管性を有する。用語「ウィッキング速度」は、単位時間当たりの流体の動き、すなわち、指定された期間に流体がどれだけ移動したかを指す。

【0054】

いくつかの実施形態においては、ビリオンを溶解するために必要とされるインキュベーション時間は、そのウイルス溶解領域の下に分解性フィルムを含ませて第３の層から分離することによって達成されてもよい。分解性フィルムは、流体試料中の液体と接触した後、ある期間で分解され、それに続いて流体を第３の層に放出することができる。本明細書で使用される用語「フィルム」は、長方形、正方形、又はその他の望ましい形状を含む任意の形状の、薄いフィルム及びシートを含む。本明細書で記載されるフィルムは、いずれの望ましい厚さ及びサイズのものであってもよい。例えば、フィルムは、約０．１μｍ～約１ｍｍの比較的薄い厚さを有してもよい。フィルムは、単層であってもよいし、又は多層であってもよい。

【0055】

いくつかの実施形態においては、フィルムは、水溶性ポリマーマトリクスを含んでもよい。本明細書で使用される用語「水溶性」は、限定するものではないが水を含む溶媒に少なくとも部分的に溶解可能な実体を指す。水溶性ポリマーの例は、限定するものではないが、ポリエチレンオキシド、プルラン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルアルコール、アルギン酸ナトリウム、ポリエチレングリコール、キサンタンガム、トラガカントガム、グアーガム、アカシアガム、アラビアガム、ポリアクリル酸、メチルメタクリレート共重合体、カルボキシビニル共重合体、デンプン、ゼラチン、及びそれらの組み合わせを含む。有用な水不溶性ポリマーの例は、限定するものではないが、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルエチルセルロース、セルロースアセテートフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、及びそれらの組み合わせを含む。

【0056】

第３の層
いくつかの実施形態においては、本開示の装置は、第２の層の下に積層され、ウイルス溶解領域と流体連通するｐＨ調節領域を有する、第３の層を備える。

【0057】

いくつかの実施形態においては、第３の層のｐＨ調節領域は、ｐＨチャネルを含んでもよい。ｐＨチャネルは、第３の層のウイルス溶解領域と流体連通する入口端と、第４の層の核酸受容領域と流体連通する出口端と、を含んでもよい。

【0058】

いくつかの実施形態においては、ｐＨチャネルは、ｐＨ調節試薬を更に含んでもよい。例えば、ｐＨ調節試薬は、例えばｐＨ５．０まで、ｐＨ６．５までのように、流体の酸性度を増大させるために提供されてもよい。ｐＨ調節試薬の非限定的な例は、酢酸、ホウ酸、クエン酸、乳酸、リン酸、塩酸、又はそれらに由来する塩を含み得る。いくつかの実施形態においては、ｐＨ調節試薬は、酢酸ナトリウムを含んでもよい。いくつかの実施形態においては、ｐＨ調節試薬は、水性、乾燥、初期乾燥、固体、又はゲルの形態であってもよい。

【0059】

いくつかの実施形態においては、ｐＨチャネルは、様々な幾何学的形状及びサイズを有し得る。例えば、ｐＨチャネルは、蛇行形状のチャネル、直線又は実質的に直線のチャネル、ジグザグ形状のチャネル、又はそれらの組み合わせであってもよい。

【0060】

第４の層
いくつかの実施形態においては、本開示の装置は、第３の層の下に積層され、ｐＨ調節領域と流体連通する核酸受容領域を有する、第４の層を更に備える。

【0061】

いくつかの実施形態においては、核酸受容領域は、バルク溶液が通過することを可能にしつつ、ウイルス核酸分子を吸着することが可能な、核酸吸着パッドを更に含んでもよい。核酸吸着パッドは、いずれの適切な物質で形成されてもよい。例えば、核酸吸着パッドは、紙、布、織布、又は不織セルロース基材で形成されてもよい。いくつかの実施形態においては、核酸吸着パッドは、市販のフィルタ紙（例えばワットマン紙、ニトロセルロース、又は繊維ガラス）等の紙で形成されてもよい。

【0062】

いくつかの実施形態においては、核酸吸着パッドを含む核酸受容領域は、核酸の付着を促進するように官能基化されてもよい。例えば、核酸受容領域は、例えばキトサン又はポリエチレンイミン（ＰＥＩ）で正に帯電させられるように官能基化されてもよい。

【0063】

本明細書で使用される用語「官能基化された」又は「化学的に官能基化された」とは、化学反応によって物質の表面に官能基を付加することを意味する。当業者には容易に理解されるように、官能基化は、生体適合性及び湿潤性等の望ましい表面特性を達成するために、物質の表面修飾のために採用され得る。

【0064】

いくつかの実施形態においては、第４の層は、必要に応じて切り離されるように、第３の層の下に取り外し可能に積層される。例えば、第４の層が切り離された後、１つ以上の検出試薬が、核酸受容領域に添加されて、ウイルス核酸の検出（例えばインサイチュ検出）を可能にするか又は容易化してもよい。いくつかの実施形態においては、検出試薬は、ＨＣＲ混合物を含んでもよい。

【0065】

第５の層
いくつかの実施形態においては、本開示の装置は、追加的に及び／又は任意に、流体試料のバルク溶液が第４の層の核酸受容領域を通過するのを容易化して、例えば血漿試料が第４の層の核酸受容領域を通って引き込まれることを確実にする手段（例えばウィッキングパッド、遠心分離、真空）を有する第５の層を備えてもよい。

【0066】

いくつかの実施形態においては、第５の層は、ウィッキングパッドを含んでもよい。いくつかの実施形態においては、ウィッキングパッドは、紙、綿、セルロース、硝酸セルロース、セルロース繊維誘導体、ナイロン（例えばナイロンウール）、焼結ガラス、繊維ガラス、焼結ポリマー、焼結金属、及び合成ポリマーから選択される少なくとも１つの吸収性物質で形成されてもよい。いくつかの実施形態においては、第５の層は、セルロースを含む。

【0067】

いくつかの実施形態においては、以上に説明された第１、第２、第３、第４、及び第５の層は、紙、綿、セルロース、硝酸セルロース、セルロース繊維誘導体、ナイロン（例えばナイロンウール）、焼結ガラス、繊維ガラス、焼結ポリマー、焼結金属、及び合成ポリマー等の、いずれの適切な物質で形成されてもよい。いくつかの実施形態においては、以上の層はまた、膜（例えばニトロセルロース、ポリフッ化ビニリデン、ナイロン、及びポリスルホン）、ガラス、プラスチック（例えばポリエチレンテレフタレート、ポリプロピレン、ポリスチレン、及びポリカーボネート）、シリコン、金属、及び金属酸化物を含んでもよい。

【0068】

いくつかの実施形態においては、以上に説明された第１、第２、第３、第４、及び第５の層は、いずれの適切な固定手段によって一緒に保持されてもよい。例えば、これらの層は、接着剤（例えば糊）を用いて一緒に保持されてもよい。いくつかの実施形態においては、本開示の装置は、第１、第２、第３、第４、及び／又は第５の層の間に位置決めされた１つ以上の接着剤層を含んでもよい。いくつかの実施形態においては、以上に説明された層のうちの２つ以上は、単一部品として作製されてもよい。

【0069】

いくつかの実施形態においては、本開示の装置は、筐体内に収容されてもよい。いくつかの実施形態においては、筐体は、カセット又はカートリッジであってもよい。いくつかの実施形態においては、筐体は、第１の層の試料受容領域にアクセスするための開口部を含んでもよい。いくつかの実施形態においては、筐体は、核酸受容領域上で吸収されたウイルス核酸が更なる分析の対象となり得るように、第４の層が他の層から切り離されることを可能にする。

【0070】

いくつかの実施形態においては、本装置は、第１の層から第２の層の中への流体試料の通過を制御するように適合された、制御部材を更に備える。例えば、制御部材は、図９Ｃ（「開始ボタン」）に示されるように、ボタンであってもよい。いくつかの実施形態においては、制御部材は、使用者による容易なアクセスのために筐体上に配置されてもよい。

【0071】

いくつかの実施形態においては、制御部材は、第１の層から第２の層の中への流体試料の通過を解放するための第１のユーザ動作を受けるように構成される。いくつかの実施形態においては、第１のユーザ動作は、第１のタイマを作動させ、第１の所定の期間の間、流体試料がウイルス溶解試薬と接触することを可能にする。例えば、ユーザは、押下動作によって制御部材（例えばボタン）を作動させて、流体試料の第１の層から第２の層への流れを開始させてもよい。制御部材は有利にも、溶解ステップをいつ開始するか等の、検出プロセスの開始時間をユーザが制御することを可能にする。これに加えて、制御部材を通して、第１のユーザ動作は、流体試料及び溶解試薬のインキュベーションの継続時間（第１の所定の期間）を制御する内部タイマを作動させてもよい。第１の所定の期間は、細胞又はウイルスが十分に溶解され、核酸が捕捉及び検出のために放出され得るように、溶解試薬を用いた流体試料のインキュベーションに適した期間である。いくつかの実施形態においては、第１の所定の期間は、１０分、２０分、３０分、４０分、５０分、又は６０分であってもよい。

【0072】

いくつかの実施形態においては、制御部材は、第２のユーザ動作を受けるように構成される。いくつかの実施形態においては、第２のユーザ動作は、第２のタイマを作動させ、第２の所定の期間の間、核酸受容領域中の核酸が検出剤と接触することを可能にする。例えば、第２のユーザ動作は、捕捉された核酸を、検出剤（例えばＨＣＲ混合物）を用いてインキュベートする継続時間（第２の所定の期間）を制御する内部タイマを開始させる、押下動作であってもよい。いくつかの実施形態においては、第２の所定の期間は、３０分、４５分、６０分、又は７５分であってもよい。

【0073】

また本開示において提供されるものは、ウイルス核酸を単離及び／又は検出するためのキットである。いくつかの実施形態においては、キットは、以上に説明されたような装置を含んでもよい。いくつかの実施形態においては、キットは、１つ以上の検出試薬を更に含んでもよい。いくつかの実施形態においては、検出試薬は、ＨＣＲ混合物を含んでもよい。いくつかの実施形態においては、ＨＣＲ混合物は、ウイルス核酸を検出するための１つ以上のプローブを含んでもよい。いくつかの実施形態においては、プローブは、ウイルス核酸の標的配列に相補的な配列を有してもよい。

【0074】

いくつかの実施形態においては、キットはまた、検出試薬と同じ容器又は異なる容器に収容された１つ以上の追加的な薬剤を含む。例えば、キットは、追加薬剤とは別個の容器又は別個の区画において備えられる検出試薬を含んでもよい。

【0075】

いくつかの実施形態においては、キットは任意に、試料（例えば生物学的試料）を採取するための機器を含んでもよい。いくつかの実施形態においては、試料を採取するための機器は、限定するものではないが、毛細管、ピペット、シリンジ、針、ポンプ、及びスワブを含んでもよい。いくつかの実施形態においては、キットは、情報マテリアルを含んでもよい。情報マテリアルは、本明細書で説明される装置及び／又はその使用の方法に関連する説明的な、指示的な、マーケティング的な、又はその他のマテリアルであってもよい。

【0076】

ここで図１Ａを参照すると、装置１００は、試料前処理（例えば血漿分離）のための第１の層１１０（層１）、バイアル溶解のための第２の層１２０（層２）、ｐＨ調節のための第３の層１３０（層３）、核酸捕捉のための第４の層１４０（層４）を備える。いくつかの実施形態においては、装置１００は、ウィッキングパッドを含んでもよい第５の層１５０（層５）を更に含んでもよい。

【0077】

いくつかの実施形態においては、第１の層１１０は、流体試料を受容し、流体試料中の細胞又は細胞成分を保持するように適合された、試料受容領域を備える。いくつかの実施形態においては、第２の層１２０は、第１の層１１０の下に積層され、試料受容領域と少なくとも部分的に重なる様式で位置決めされたウイルス溶解領域を有し、ウイルス溶解領域は、ウイルス溶解試薬を含む。いくつかの実施形態においては、第３の層１３０は、第２の層１２０の下に積層され、ウイルス溶解領域と流体連通するｐＨ調節領域を有し、ｐＨ調節領域は、ｐＨ調節試薬を含む。いくつかの実施形態においては、第４の層１４０は、第３の層１３０の下に積層され、ｐＨ調節領域と流体連通する核酸受容領域を有する。いくつかの実施形態においては、追加的な又は任意の第５の層１５０は、第４の層１４０の下に積層され、第４の層１４０の核酸受容領域を通過する流体を受容する。

【0078】

ここで図１Ｂを参照すると、流体試料が全血試料であるシナリオにおいて、第１の層１１０は、血漿分離用のために適合されている。図１Ｂに示されるように、第１の層１１０は、例えば、細胞又はその細胞成分の流れがフィルタパッドを通過するのを制限することによって、流体試料から細胞又はその細胞成分（例えば細胞残屑）を保持するのに適した平均孔径を有する、１つ以上のフィルタパッド（例えばフィルタパッド１１１及び１１３）を含んでもよい。

【0079】

例えば、フィルタパッド１１１は、白血球等の細胞又はその細胞成分の第１の集団を保持するように適合されてもよい。フィルタパッド１１３は、赤血球等の細胞又はその細胞成分の第２の集団を保持するように適合されてもよい。

【0080】

いくつかの実施形態においては、フィルタパッドは接着剤層の開口部に嵌装されてもよい。例えば、フィルタパッド１１１及び１１３は、それぞれ接着剤層１１７ａの開口部１１５ａ及び接着剤層１１７ｂの開口部１１５ｂに嵌装されてもよい（図１Ｂ）。

【0081】

いくつかの実施形態においては、第１の層１１０は、一方を他方の上に積層した、直径約１ｃｍ～約６ｃｍ（例えば３ｃｍ）の２つの円形フィルタパッド（すなわちフィルタパッド１１１及び１１３）を使用して、全血試料から血漿を分離する。一例においては、全血の試料（例えば約２５０μＬ～約２０００μＬ）が、最も上のパッド（Ｌｅｕｋｏｓｏｒｂ、Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）（すなわちフィルタパッド１１１）に適用され、赤血球及び血漿が、次のパッド（すなわちフィルタパッド１１３）へと通過し、白血球が、パッド（すなわちフィルタパッド１１１）に保持される。第２のパッド（すなわちフィルタパッド１１３）（ＣｙｔｏＳｅｐ １６６８ ＨＶ＋、Ａｈｌｓｔｒｏｍ－Ｍｕｎｋｓｊｏ）（すなわちフィルタパッド１１３）は、赤血球を捕捉して保持し、血漿及びその小さな成分（例えばビリオン）が通過することを可能にする。

【0082】

ここで図１Ｃを参照すると、第１の層１１０の下に積層された第２の層１２０は、第１の層１１０の試料受容領域と少なくとも部分的に重なる様式で位置決めされたウイルス溶解領域を含んでもよい。いくつかの実施形態においては、ウイルス溶解領域は、溶解試薬パッド１２１を含んでもよく、溶解試薬パッド１２１は、接着剤層１２９ａ上の開口部１２２によって受容されてもよい。

【0083】

いくつかの実施形態においては、溶解試薬パッド１２１は、溶解試薬を含んでもよい。いくつかの実施形態においては、溶解試薬は、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（例えば乾燥／凍結乾燥Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）を含んでもよい。いくつかの実施形態においては、溶解試薬は、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００及び水酸化ナトリウムを含んでもよい。いくつかの実施形態においては、溶解試薬は、水性、乾燥、初期乾燥、固体、又はゲルの形態であり得る。いくつかの実施形態においては、溶解試薬パッド１２１は、いずれの適切な物質で形成されてもよい。いくつかの実施形態においては、溶解試薬パッド１２１は、繊維ガラス、合成繊維、又はそれらの組み合わせを含む。

【0084】

他の実施形態においては、ウイルス溶解領域は、溶解試薬パッドの下に積層されたインキュベーションパッド１２５ａを更に含む。いくつかの実施形態においては、インキュベーションパッド１２５ａは、インキュベーションチャネル１２５ｂを含む。いくつかの実施形態においては、インキュベーションチャネルは、蛇行形状、直線若しくは実質的に直線、若しくはジグザグ形状、又はそれらの組み合わせ等の、様々な形状を有し得る。いくつかの実施形態においては、インキュベーションチャネル１２５ｂは、蛇行形状のチャネルである。

【0085】

インキュベーションパッド１２５ａ及びインキュベーションチャネル１２５ｂは、例えば、紙（例えばＡｈｌｓｔｒｏｍ－ＭｕｎｋｓｊｏのＧｒａｄｅ３１９クロマトグラフィー紙）、綿、セルロース、硝酸セルロース、セルロース繊維誘導体、ナイロン（例えばナイロンウール）、焼結ガラス、繊維ガラス、焼結ポリマー、焼結金属、及び合成ポリマー等の、いずれの適切な物資の基板１２３上に嵌装されてもよい。

【0086】

いくつかの実施形態においては、第２の層１２０は、液体が第３の層１３０へと通過することを可能にする開口部１２７を有する接着剤層１２９ｂを介して、第３の層１３０の上に積層される。

【0087】

第１の層１１０において白血球及び赤血球が除去され、血漿は残されて第２の層１２０を、毛細管現象を介して移動する。いくつかの実施形態においては、第２の層１２０の構成要素は、約１ｍｍ～約６ｍｍ（例えば３ｍｍ）の溶解試薬パッド１２１（例えば繊維ガラスで形成されたもの）及びインキュベーションパッド１２５ａ（例えばＧｒａｄｅ３１９、Ａｈｌｓｔｒｏｍ－Ｍｕｎｋｓｊｏ）を含んでもよい。一例においては、溶解試薬パッド１２１は、乾燥溶解試薬（例えばＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）を含んでもよい。血漿は、溶解試薬パッド１２１を通過し、溶解試薬を再水和させ、かくして血漿を溶解のために調製する。血漿溶解液は、インキュベーションパッド１２５ａを通り、インキュベーションチャネル１２５ｂ（例えば蛇行チャネル）中をウィッキングすることとなり、ビリオンが溶解される時間を確保する。ビリオンを溶解するのに要する時間（例えば約２０分～約３０分）は、予測可能なウィッキング速度（例えば毎分約１０ｍｍ～約３０ｍｍ）と組み合わせて、インキュベーションパッド１２５ａのインキュベーションチャネル１２５ｂの寸法及び長さを決定するために使用され得る。いくつかの実施形態においては、インキュベーションチャネル１２５ｂは、ボロン酸ポリマーを使用して疎水性障壁を用いて更にパターン化され、ロールツーロールスタンピング法を使用して適用されてもよい。

【0088】

ここで図１Ｄを参照すると、第２の層１２０の下に積層された第３の層１３０は、ウイルス溶解領域と流体連通するｐＨ調節領域を含んでもよい。いくつかの実施形態においては、ｐＨ調節領域は、ｐＨチャネル１３１を含む。いくつかの実施形態においては、ｐＨチャネル１３１は、ｐＨ調節試薬を更に含んでもよい。例えば、ｐＨ調節試薬は、流体の酸性度を増大させるために提供されてもよい。ｐＨ調節試薬の非限定的な例は、酢酸、ホウ酸、クエン酸、乳酸、リン酸、塩酸、又はそれらに由来する塩を含み得る。いくつかの実施形態においては、ｐＨ調節試薬は、酢酸ナトリウムを含んでもよい。いくつかの実施形態においては、ｐＨ調節試薬は、水性、乾燥、初期乾燥、固体、又はゲルの形態であってもよい。

【0089】

いくつかの実施形態においては、第３の層１３０は、試料の酸性度を増大させる（例えばｐＨ５．５～６．０）ことによって、ＲＮＡ捕捉のための溶解された血漿試料を調製するように適合される。一例においては、第３の層１３０は、血漿がそこを通過する際に再水和して混合することとなる、乾燥試薬（例えば酢酸ナトリウム）を含む親水性チャネルを有する紙（例えばＧｒａｄｅ３１９、Ａｈｌｓｔｒｏｍ－Ｍｕｎｋｓｊｏ）で形成されてもよい。

【0090】

いくつかの実施形態においては、第３の層１３０は、流体が第４の層１４０へと通過することを可能にする開口部１３５を有する接着剤層１３３を更に含んでもよい。

【0091】

ここで図１Ｅを参照すると、第３の層１３０の下に積層された第４の層１４０は、第３の層１３０のｐＨ調節領域と流体連通する核酸受容領域を含む。いくつかの実施形態においては、核酸受容領域は、バルク溶液が通過することを可能にしつつ、ウイルス核酸分子を吸収することが可能な核酸吸収パッド１４１を更に含んでもよい。核酸吸収パッド１４１は、紙、布、織布、又は不織セルロース基材で形成されてもよい。いくつかの実施形態においては、核酸吸収パッド１４１は、市販のフィルタ紙（例えばワットマン紙）等の紙で形成されてもよい。いくつかの実施形態においては、核酸受容領域、例えば核酸吸収パッド１４１は、官能基化されてもよい。例えば、核酸受容領域は、キトサン又はポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を用いて官能基化されてもよい。

【0092】

いくつかの実施形態においては、核酸吸収パッド１４１は、２つの積層された接着剤層、すなわち１４３ａと１４３ｂとの間に嵌装されてもよい。

【0093】

いくつかの実施形態においては、第４の層１４０は、キトサンを用いて官能基化された市販のフィルタ紙（例えばＷｈａｔｍａｎ Ｆｕｓｉｏｎ５、Ｃｙｔｉｖｉａ）の小さなディスク（例えば直径約２ｍｍ～５ｍｍ）の形をとる、核酸吸収パッド１４１を含んでもよい。酸性血漿溶液が第４の層１４０を通ってウィッキングされるとき、キトサンがプロトン化される。負に帯電したウイルスＲＮＡは、試料中の他の全ての核酸とともに、バルク溶液が通過する間に核酸吸収パッド１４１に静電吸着される。

【0094】

Ｂ．ウイルス核酸を単離及び検出するための方法
別の態様においては、本開示はまた、流体試料からウイルスの核酸を分離するための方法を提供する。いくつかの実施形態においては、本方法は、（ｉ）流体試料を備えることと、（ｉｉ）以上に説明された装置の第１の層中の試料受容領域に、流体試料を接触させることと、（ｉｉｉ）流体試料の流体部分が第１の層、第２の層、及び第３の層を通過し、第４の層に到達することを可能とする条件下で、流体試料を本装置においてインキュベートし、それによってウイルスの核酸を得ることと、を含む。

【0095】

更に別の態様においては、本開示は、流体試料中のウイルスの核酸を検出するための方法を更に提供する。いくつかの実施形態においては、本方法は、（ａ）以上に説明された方法によって得られた第４の層を備えることと、（ｂ）核酸受容領域を反応混合物と接触させることと、（ｃ）核酸と反応混合物との間の反応を検出することと、を含む（図２）。

【0096】

いくつかの実施形態においては、生物学的試料中の１つ以上のウイルス核酸を検出することは、図３に示されるように、ハイブリダイゼーション連鎖反応（ＨＣＲ）と呼ばれる核酸増幅の非酵素的方法に基づいてインサイチュで実施される。この手法においては、ＨＩＶ ＲＮＡの単一のコピーが、二重鎖形成を介してプローブＤＮＡヘアピン（Ｈ１）の開鎖をトリガし、これが次いで第２のヘアピン（Ｈ２）の開鎖をトリガする。これが次いでＨ１の２番目の分子に結合し、カスケードが続く。各ヘアピンは、その末端を蛍光体－消光体対において標識されることができ、かくして、カスケードが進行するにつれて、各ヘアピンの結合及び開鎖は、蛍光の消光を引き起こし、例えばスマートフォンのカメラのような撮像装置による、又はフェルスター共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）による、定量化のための信号の増大を引き起こし、共鳴エネルギーが蛍光体Ａの電子から蛍光体Ｂに移動させられ、蛍光体Ａによって放出される光子よりも長い波長を有する光子として放出される。

【0097】

いくつかの実施形態においては、反応混合物は、ＨＣＲ混合物を含む。いくつかの実施形態においては、反応混合物は、核酸の標的配列に相補的な配列を有する、１つ以上のプローブ（例えばプローブセット）を含む。ＨＣＲプローブの配列例が、以下の表１に示される。

【0098】

「ＨＣＲプローブセット」又は「ＨＣＲ開始剤／ヘアピンセット」は、核酸ヘアピン等の１つ以上の準安定ＨＣＲモノマーとともに、ハイブリダイゼーション連鎖反応ポリマーを形成することが可能な、核酸の１つ以上の開始剤ストランドを含んでもよい。ＨＣＲプローブは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、Ｉｏｗａ）、Ｗ．Ｍ．Ｋｅｃｋ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ Ｏｌｉｇｏ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ（Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ、Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ）、又はＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｐａｓａｄｅｎａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）等の商用の供給源を含む、化学的核酸合成等の標準的な方法を使用して、合成されてもよい。代替としては、ＨＣＲプローブは、ＰＣＲに続く一方のストランドのラムダエキソヌクレアーゼ消化によりｓｓＤＮＡを得ること（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２０１４）：１４－２３参照、参照によりその全体が本明細書に組み込まれたものとする）、又はインビトロ転写に続く逆転写によりｓｓＤＮＡを得ること（例えばＣｈｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４８：６２３３（２０１５）：ａａａ６０９０参照、参照によりその全体が本明細書に組み込まれたものとする）等の、標準的な酵素法を使用して、合成及び／又は増幅されてもよい。

【0099】

試料は、例えばスポイト、ピペット、及びシリンジ等を介してのような、任意の便利なプロトコルを使用して、試料適用部位に適用されてもよい。これに加えて、流体試料は、フィルタパッドを通る適切な流体の流れを提供するために、例えば緩衝液のような任意の適切な液体とともに試料受容領域に適用されてもよい。任意の適切な液体の例は、限定するものではないが、緩衝液、細胞培養培地（例えばＤＭＥＭ）等を含む。緩衝液の例としては、トリス、トリシン、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＭＥＳ、ＰＢＳ、及びＴＢＳ等を含む。一例においては、適切な液体は、試料受容領域に適用される前に、流体試料と混合されてもよい。別の例においては、適切な液体は、流体試料を適用するのと同時に、適用する前に、又は適用した後に、試料受容領域に適用されてもよい。

【0100】

また本開示において提供されるものは、ウイルスに感染した患者又はウイルス感染が疑われる患者を同定するための方法である。いくつかの実施形態においては、本方法は、（ｉ）患者の試料（例えば血液試料）を得ることと、（ｉｉ）以上に説明された方法によって、血液試料中のウイルス負荷のレベル（例えばＨＩＶ ＲＮＡのレベル）を決定することと、（ｉｉｉ）決定されたウイルス負荷のレベルを対照レベルと比較し、決定されたレベルが対照レベルと比較して上昇しているか否かを決定することと、（ｉｖ）決定されたウイルス負荷のレベルが対照レベルと比較して上昇している場合、患者をウイルス感染症であると決定することと、を含んでもよい。

【0101】

用語「患者」、「個体」、及び「対象」という用語は、相互に交換可能に使用され、一般的に、本明細書に記載される診断又はモニタリング方法を実行するために、開示される方法論が体液試料を得るために利用される、任意の生体を指す。患者は、ヒト等の動物であってもよい。患者はまた、飼育動物又は家畜であってもよい。「患者」又は「個体」は、対象とも呼ばれ得る。

【0102】

本明細書で使用される場合、ウイルス負荷の「対照」レベルとは、いくつかの実施形態においては、例えばＨＩＶ感染等のウイルス感染のような、調査において対象となる疾患又は障害に罹患していない１体以上の個体から得られた試料から得られたウイルス負荷のレベルを指す。このレベルは、個体単位毎に測定されてもよいし、又は平均値等のように集合毎に測定されてもよい。「対照」レベルはまた、疾患又は障害を有してはいるが、疾患又は障害の急性期を経験していない、個体の集団の分析によって決定されてもよい。かかる「対照」レベルを得るために、「対照」試料が使用されてもよい。「対照」試料は、調査における対象となる疾患又は障害に罹患していない１体以上の個体から得られてもよい。「対照」試料はまた、疾患又は障害を有してはいるが、疾患又は障害の急性期を経験していない個体の集団から得られてもよい。いくつかの実施形態においては、「対照」レベルは、診断が求められている、又はその状態がモニタリングされている個体と同じ個体からのものであるが、異なる時間に得られたものである。特定の実施形態においては、「対照」レベル又は試料は、同じ患者から、より早い時期に、例えば、数週間、数ヶ月、又は数年前に得られた、レベル又は試料を指し得る。

【0103】

本明細書で使用される「決定されたレベルが対照レベルと比較して上昇している」とは、対照レベルからの値の正の変化を指す。

【0104】

Ｃ．定義
本開示による組成物及び方法の詳細な説明の理解を助けるために、本開示の様々な態様の明確な開示を容易化するよう、いくつかの明示的な定義が提供される。別段の定義がされない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属する分野における当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。

【0105】

本明細書で使用される用語「接触する」は、成分の任意のセットに関して使用される場合、接触させられる成分が同じ混合物中に混合される（例えば同じ区画又は溶液に添加される）任意のプロセスを含み、言及された成分間の実際の物理的接触を必ずしも必要とするものではない。言及された成分は、任意の順序又は任意の組み合わせ（又はサブ組み合わせ）で接触させられてもよく、任意に他の言及された成分の添加に先立って、１つ又はいくつかの言及された成分が後続して混合物から除去される状況も含み得る。例えば、「ＡをＢ及びＣと接触させる」とは、（ｉ）ＡがＣと混合され、次いでＢが混合物に添加される状況、（ｉｉ）Ａ及びＢが混合物に混合され、Ｂが混合物から除去され、次いでＣが混合物に添加される状況、及び（ｉｉｉ）ＢとＣとの混合物にＡが添加される状況、のうちのいずれか及び全てを含む。

【0106】

本明細書で使用される用語「疾患」は、いずれも、正常な機能を損ない、典型的には明瞭な徴候及び症状によって明らかとなり、ヒト又は動物の生命の継続時間又は質を低下させる、ヒト若しくは動物の身体又はその一部の異常な状態を反映するという点で、（医学的状態における）「障害」及び「状態」という用語と一般的に同義であることが意図され、相互に交換可能に使用される。

【0107】

本明細書で使用される用語「インビトロ」は、多細胞生物内ではなく、例えば試験管又は反応容器の中、細胞培養等のような、人工的な環境において起きる事象を指す。

【0108】

本明細書で使用される用語「インビボ」は、ヒト以外の動物等の多細胞生物内で起きる事象を指す。

【0109】

本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈が明らかにそうでないことを示していない限り、複数の参照を含むことに留意されたい。

【0110】

用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、又は「有する（ｈａｖｉｎｇ）」及びそれらの語形変化は、別段の言及がない限り、その後に列挙されたアイテム及びその等価物並びに追加的な主題を包含することが意図されている。

【0111】

語句「一実施形態において」、「様々な実施形態において」、及び「いくつかの実施形態において」等は、繰り返し使用される。かかる語句は、必ずしも同じ実施形態を指すとは限らないが、文脈が明らかにそうでないことを示していない限り、同じ実施形態を指してもよい。

【0112】

用語「及び／又は」又は「／」は、この用語が関連するアイテムのいずれか１つ、アイテムのいずれかの組み合わせ、又はアイテムの全てを意味する。

【0113】

用語「実質的に」は、「完全に」を除外するものではなく、例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを完全に含まなくてもよい。必要な場合には、用語「実質的に」は、本開示の定義から省略されてもよい。

【0114】

本明細書で使用される場合、対象となる１つ以上の値に適用される用語「およそ」又は「約」は、言及された基準値と同等の値を指す。いくつかの実施形態においては、用語「およそ」又は「約」は、別段の言及がない限り、又は文脈からそうでないことが明らかでない限り（かかる数がとり得る値の１００％を超える場合を除く）、いずれかの方向（より大きい又はより小さい）において、言及された基準値の２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、又はそれ未満に収まる値の範囲を指す。本明細書において別段の示唆がない限り、用語「約」は、個々の成分、組成物、又は実施形態の機能性の観点から同等である、言及された範囲に近接した値、例えば重量パーセントを含むことが意図されている。

【0115】

本明細書において値及び範囲が提供される場合には、これらの値及び範囲に包含される全ての値及び範囲が、本開示の範囲内に包含されることを意図されていることは、理解されるべきである。更に、これらの範囲内に収まる全ての値、及び値の範囲の上限値又は下限値も、本出願によって企図されるものである。

【0116】

本明細書で使用される用語「各」は、アイテムの集合に関連して使用される場合、集合の中の個々のアイテムを特定することを意図されているが、必ずしも集合の中の全てのアイテムを指すものではない。明示的な開示又は文脈が明確にそうでないことを示す場合には、例外が生じ得る。

【0117】

本明細書で提供される任意の及び全ての例、又は例示的な言語（例えば「等の」）の使用は、単に本発明をより良く説明することを意図されたものであり、別段の主張がない限り、本開示の範囲に対して限定を与えるものではない。本明細書中のいかなる文言も、請求されていない要素が本発明の実施に必須であることを示すものとして解釈されるべきではない。本明細書において使用される場合、用語「例示的な」は、「一例として」を意味することを意図されており、特定の例示的なアイテムが好ましい又は必要とされることを示すことを意図されていない。

【0118】

本明細書で記載される全ての方法は、本明細書で別段の示唆がない限り、又は文脈によって明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実行される。提供される方法のいずれかに関して、方法のステップは、同時に起きてもよいし、又は順次起きてもよい。方法のステップが順次起きる場合、別段の言及がない限り、ステップはいずれの順序で起きてもよい。

【0119】

方法がステップの組み合わせを含む場合においては、本明細書で別段の言及がない限り、ステップのそれぞれの及び全ての組み合わせ又はサブ組み合わせは、本開示の範囲内に包含される。

【0120】

本明細書で引用される各出版物、特許出願、特許、及びその他の参考文献は、本開示と矛盾しない程度に、参照によりその全体が組み込まれたものとする。本明細書で開示される出版物は、本開示の出願日前の開示についてのみ提供される。本明細書のいかなる内容も、本発明が先行発明によるかかる出版物に先行する権利を有しないことを認めるものとして、解釈されるべきではない。更に、提供された刊行物の公開日は、実際の公開日と異なり得るものであり、独立に確認する必要される必要があり得る。

【0121】

本明細書で記載された実施例及び実施形態は、単に例示の目的のためのものであり、当業者には、それを考慮した様々な修正又は変更が示唆され、本願の趣旨及び範囲、並びに添付される特許請求の範囲に含まれるべきものであることが理解される。

【実施例】

【0122】

Ｄ．実施例
実施例１
この実施例は、以下の後続の実施例において使用される物質及び方法を説明する。

【0123】

物質
Ｕｌｔｒａｐｕｒｅ Ａｇａｒｏｓｅ及びＳｙｂｒ ＳａｆｅのＤＮＡ染色剤が、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）から購入された。１００ＢＰ ＤＮＡラダーが、ＶＷＲ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｒａｄｎｏｒ、ＰＡ、ＵＳＡ）から購入された。ＡＴＴＯ ５５０及びＡＴＴＯ ６４７Ｎと結合したＤＮＡヘアピンを含む、全てのＤＮＡ及びＲＮＡオリゴが、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ、ＵＳＡ）から購入された。１０Ｘ ＴＢＥ及びＣｈｅｍｉＤｏｃ ＸＲＳゲル撮像器が、Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）から購入された。クエン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ｔｗｅｅｎ ２０、ブロモフェノールブルー－キシレンシアノール、スクロース、及びジエチルピロカーボネートが、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）から購入された。Ｆｌｕｏｒｏｍａｘ－４蛍光スペクトロメーターが、Ｈｏｒｉｂａ（Ｋｙｏｔｏ、Ｋｙｏｔｏ、Ｊａｐａｎ）から購入された。アガロースゲルキャスト、コーム、ＭｉｇｈｔＳｌｉｍ ＳＸ２５０ Ｐｏｗｅｒ Ｓｕｐｐｌｙ、及びＨＥ ３３ ｍｉｎｉホリゾンタルサブマリンユニットが、全てＨｏｅｆｅｒ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）から購入された。アニーリングのために、Ｃｏｌ－Ｐａｒｍｅｒ（Ｖｅｒｎｏｎ Ｈｉｌｌｓ、ＩＬ、ＵＳＡ）のＡｍｐｌｉｔｒｏｎ ＩＩサーモサイクラが使用された。蛍光顕微鏡法が、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＸ６０（Ｓｈｉｎｊｕｋｕ、Ｊａｐａｎ）及びＳｐｏｔ Ｉｍａｇｉｎｇ（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＭＩ、ＵＳＡ）のＳｐｏｔ Ｆｌｅｘカメラを使用して行われた。３Ｄ印刷された物質は全て、ＳｏｌｉｄＷｏｒｋｓ ２０１８－２０１９ Ｓｔｕｄｅｎｔ Ｅｄｉｔｉｏｎにおいて設計され、ポリ乳酸（ＰＬＡ）及びＰｒｕｓａ（Ｐｒａｇｕｅ、Ｃｚｅｃｈ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ）から購入されたＰｒｕｓａ ｉ３ ＭＫ３Ｓを使用して印刷された。

【0124】

アガロースゲル電気泳動
３％アガロースゲルを作り出すため、１．２グラムのアガロースが４０ｍＬの１Ｘ ＴＢＥ緩衝液に添加され、アガロースが完全に溶解するまで３０秒単位でマイクロ波加熱され、溶融アガロース溶液中に混合された。４μＬのＳｙｂｒＳａｆｅが溶融アガロースに添加され、穏やかに混合され、次いでゲルキャストの中に注がれ、１時間の間、固まることを可能にされた。Ｈ１及びＨ２ヘアピンが、９５℃まで５分間加熱し、３０分かけて室温まで冷却することによって、アニーリングされた。ヘアピンは次いで、５Ｘ ＳＳＣＴにおいて１．５μＭの濃度にまで希釈された。合成ＤＮＡ及びＲＮＡトリガが、３００ｎＭ、１５０ｎＭ、及び３０ｎＭの濃度にまで希釈された。ヘアピン及びトリガは、１：１：１の割合でキュベットに添加され、最終トリガ濃度を１００ｎＭ、５０ｎＭ、１０ｎＭのＤＮＡ又はＲＮＡとし、最終ヘアピン濃度を５００ｎＭとし、５００ｎＭのヘアピン濃度及び等しい割合の５Ｘ ＳＳＣＴのみを含む０ｎＭのトリガ対照群とした。混合物を混合され、室温で１時間インキュベートされて、次いで５μＬの各混合物が、１０μＬの１Ｘのローディング緩衝液（１００：１の割合の、Ｎａｎｏｐｕｒｅ中の１％スクロース及びブロモフェノールブルー－キシレンシアノール）と混合し、１５０Ｖで１時間アガロースゲル中を通過させられた。ゲルが次いで、ＣｈｅｍｉＤｏｃゲル読み取り器を用いて読み取られた。

【0125】

ＨＣＲ－ＦＲＥＴ
蛍光体結合Ｈ１及びＨ２が、５Ｘ ＳＳＣＴ中で合成ＲＮＡトリガと混合され、７５０μＬの最終体積、各ヘアピンについて５ｎＭの最終濃度、及び０ｎＭ、１ｎＭ、２ｎＭ、３ｎＭ、５ｎＭ、及び７ｎＭのトリガ濃度として、１．５ｍＬキュベット中で、ホイル中で２時間、室温でインキュベートされた。ＨＣＲ反応が石英キュベットに加えられ、Ｆｌｕｏｒｏｍａｘ－４分光蛍光光度計を使用してスキャンされた。スペクトルが次いで、Ｍａｔｌａｂ ２０２０ｂを使用して作り出されたカスタムスクリプトを使用して分析された。

【0126】

実施例２
ＨＩＶウイルス負荷アッセイは、１）全血からのＨＩＶ標的の精製、及び２）定量可能なレベルまでの検体の増幅の、２つの主要な構成要素で構成される。血液試料は、試験に先立って除去されていない場合、核酸増幅アッセイを妨害することとなる、タンパク質及び酵素を含んでいる。これらの汚染物質を除去するために、ウイルスＲＮＡの単離は典型的には、全血からビリオンを分離し、ビリオンを溶解し、ウイルスＲＮＡを精製するように設計された、精巧な手順を含む。ＲＮＡを精製した後、ウイルス信号の増幅は、最も一般的には、ＲＴ－ｑＰＣＲを使用して達成される。これらの方法は効果的ではあるが、複雑なワークフロー、高価な試薬、及び高価で不安定な器具を動作させることを含む。

【0127】

既存の方法の欠点に対処するために、この開示は、ＨＩＶウイルス負荷の簡便で酵素を使用しない検出に適したハンドヘルド診断技術を記載する。しかしながら、この開示は、ウイルス負荷決定に限定されるものではない。開示される装置及び方法は、ＣＤ４カウントの決定、ＨＩＶに関連する併存疾患（例えば結核との重感染）の決定、及び炎症のタンパク質マーカ等の、他の用途にも適している。

【0128】

図１Ａ～１Ｅに示されるように、本明細書で開示される装置は、安価で使い捨てのアッセイストリップを含んでもよい。このアッセイストリップは、ＨＩＶウイルス負荷決定のための３つの新規な開発を活用している。これらのうちの第１のものは、蛍光消光を伴うＨＣＲを使用した、ＨＩＶゲノムＲＮＡの増幅であり、核酸検出に対する酵素を用いないＤＮＡナノテクノロジーによる手法である。図３に示されるように、ＨＣＲは、ＤＮＡナノ構造を生成するために、開始配列（標的ＨＩＶ ＲＮＡ）の、２つのヘアピンＨ１及びＨ２との反応に依存している。Ｈ１及びＨ２は、その末端がＦＲＥＴドナー－アクセプタ対で標識されており、ＨＣＲプロセスが進行すると、ヘアピンが展開し、アクセプタ蛍光体の蛍光信号の増大をもたらす。開始配列は、Ｈ１のトーホールド領域に結合し、Ｈ１を展開させ、かくしてＨ２のトーホールド領域に相補的な配列を出現させる。Ｈ２が結合すると、展開して、Ｈ１のトーホールド領域に相補的な配列を出現させる。このことは、反応が「カスケード」することを可能にし、より多くのＨ１及びＨ２のコピーを、容易に検出可能な蛍光ＤＮＡナノ構造に組み込む。ヘアピンＤＮＡカスケードは、ＲＮＡ信号を著しく増幅することが可能であり、酵素的核酸増幅並びにそれに伴う高感度な試薬及び器具の必要性を回避する。

【0129】

この実施例において例証されるように、プローブ設計法を使用するＨＣＲは、ＨＩＶから合成核酸配列を首尾よく検出することができる（図４）。図４は、アガロースゲル中で撮像されたヘアピンカスケード反応の結果を示す。ＤＮＡはＳＹＢＲ Ｓａｆｅ色素を用いて可視化された。レーン２、４、及び６においては、５００ｎＭのＨ１及びＨ２のカクテルが、それぞれ１００ｎＭ、５０ｎＭ、及び１０ｎＭの濃度の合成ＤＮＡトリガを用いて１時間インキュベートされた。レーン３、５、及び７においては、５００ｎＭのＨ１及びＨ２のカクテルが、それぞれ１００ｎＭ、５０ｎＭ、及び１０ｎＭの濃度の合成ＲＮＡトリガを用いて１時間インキュベートされた。レーン８は、トリガ配列の非存在下でのＨＣＲ反応（１時間インキュベートされたもの）を含み、レーン１は、１００塩基対のＤＮＡラダーを含む。大きな分子量のバンドが、１００ｎＭ及び５０ｎＭのＤＮＡ及びＲＮＡのレーンに見られ、２７以上のヘアピンを含むＨＣＲ生成物を示している。ＤＮＡ及びＲＮＡトリガの存在下でハイブリダイゼーション鎖を形成するＨＣＲの能力は、この手法の実現可能性についての強い支持を提供するものである。

【0130】

これに加えて、開示される装置及び方法は、セルロース結合ボロン酸ポリマーを使用して紙中にマイクロ流体チャネルをパターン化することを更に採用してもよく、このことは、堅固で、ロールツーロール製造に適合し、アッセイ消耗品の単一ステップ生成を可能とする（図５Ａ～５Ｄ）。アッセイ結果の撮像及び分析は、内蔵されたスマートフォンアプリケーションを有する標準的なスマートフォンのカメラ等の、いずれの適切な検出手段を使用して実行されてもよい。

【0131】

実施例３
官能基化Ｆｕｓｉｏｎ５フィルタ紙を用いたオリゴヌクレオチドの捕捉を試験するため、Ｆｕｓｉｏｎ５フィルタ（Ｃｙｔｉｖａ）が、ロータリシェーカ上で０．２ＭのＮａＯＨで５分間洗浄された。ＮａＯＨ溶液は吸引され、フィルタがロータリシェーカ上で、脱イオン水で３回、５分間洗浄された。フィルタは、５０℃で、真空下で乾燥され、次いで、０．１Ｍの酢酸に溶解された０．２５％ｗ／ｖのキトサン溶液（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）中で１６時間、室温で、ロータリシェーカ上でインキュベートされた。フィルタは、脱イオン水を使用して３回、５分間洗浄され、５０℃で、真空下で乾燥された。その結果の官能基化されたＦｕｓｉｏｎ５フィルタは、使用されるまで４℃で保存された。

【0132】

標準的な０．２２ミクロンの遠心フィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）からのフィルタが取り外され、１／４インチ四方の官能基化されたＦｕｓｉｏｎ５フィルタと交換された。ストックＤＮＡ又はＲＮＡ（３０ヌクレオチドＤＮＡ及び酵母ｔＲＮＡ）が１ｘのＰＢＳ（５、６又は７のｐＨ）で希釈され、フィルタを通して１３００ｘｇで遠心分離された。Ｎａｎｏｄｒｏｐ Ｌｉｔｅ （Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、遠心分離の前後で核酸濃度が測定された。図６Ａにおいては、フィルタが１ｘのＳｙｂｒＳａｆｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で１０分間染色され、ＣｈｅｍｉＤｏｃ ＭＰ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用して撮像された。図６Ｂ、６Ｃ、及び６Ｄからのデータは、ＪＭＰ Ｐｒｏ １６を使用して分析された。

【0133】

オリゴヌクレオチドを捕捉する官能基化されたＦｕｓｉｏｎ５フィルタ紙の能力が、図６Ａ～６Ｄに示されている。図６Ａは、使用されたフィルタ上で捕捉された核酸を経験的に示し、図６Ｂは、質量による捕捉能力を示す。図６Ｃ～６Ｄは、短い配列のヌクレオチドを静電吸着するための官能基化の必要性を例示している。図６Ｃは、キトサンがその約６．４のｐＫａ未満のｐＨでプロトン化することを示している。図６Ｄは、プロトン化キトサンで官能基化されない限り、短いＤＮＡ及びｔＲＮＡがフィルタを通過することとなることを示している。

【0134】

実施例４
捕捉された核酸がフィルタ上で直接検出されることができるか否かを試験するため、Ｆｕｓｉｏｎ５フィルタ紙から直径１．５ｍｍのパッドが切り出され、１．５ｍｍのＰＤＭＳ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）台座に付着させられて、親水性材料上での定着液滴の形成を可能にした。合成トリガＤＮＡ又はＲＮＡがＤＩ水を使用して希釈され、紙パッド上へと乾燥させられた。Ｈ１及びＨ２ヘアピンの５ｎＭのＨＣＲ溶液が、ＤＮＡハイブリダイゼーション緩衝液（７５ｍＭの塩化ナトリウム、１５ｍＭのクエン酸ナトリウム、１０ｍＭの塩化マグネシウム、及び０．１％のＴｗｅｅｎ２０（いずれもＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ））、又はＲＮＡハイブリダイゼーション緩衝液（３７．５ｍＭの塩化ナトリウム、１５ｍＭのクエン酸ナトリウム、１０ｍＭの塩化マグネシウム、及び０．１％のＴｗｅｅｎ２０）中で作成され、５μＬが定着液滴として各台座に塗布され、乾燥剤（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に囲まれた密閉環境において完全に乾燥することを可能にされた。乾燥させられた紙は次いで、ＦＲＥＴキューブを有する蛍光顕微鏡使用して撮像され、ＩｍａｇｅＪ及びＪＭＰ Ｐｒｏ １６を使用して分析された。全てのｐ値が、両側のＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定を使用して算出された（ｎ＝３）。全てのＤＮＡ及びＲＮＡは、ＩＤＴから得られた。図７及び８におけるＦｕｓｉｏｎ５フィルタは、キトサン
Ｈ１：５’－ＧＧＧＧＡＡＧＡＧＡＣＡＡＧＧＴＴＴＴＧＴＣＴＣＴＴＣＣＣＣＡＡＡＣＣＴ－３’－Ｃｙ３（配列番号１１）、
Ｈ２：Ｃｙ５－５’－ＡＡＡＣＣＴＴＧＴＣＴＣＴＴＣＣＣＣＡＧＧＴＴＴＧＧＧＧＡＡＧＡＧＡＣＡ－３’（配列番号１２）、
ＤＮＡ及びＲＮＡトリガ：ＡＧＧＴＴＴＧＧＧＧＡＡＧＡＧＡＣＡ（配列番号１３）及びＡＧＧＵＵＵＧＧＧＧＡＡＧＡＧＡＣＡ（配列番号１４） で官能基化されていない。

【0135】

図７及び８に示されるように、ＤＮＡ及びＲＮＡのトリガ配列はいずれも、定着液滴の形でインキュベートされ、蛍光顕微鏡を使用して撮像された、ハイブリダイゼーション連鎖反応を使用して、フェムトモル領域において、酵素を含まないＦｕｓｉｏｎ５フィルタ紙上で直接検出されることができる。

【0136】

実施例５
この実施例は、ヌクレオチドを検出するための装置例（図９Ａ～９Ｂ）及びワークフロー例（図９Ｃ）を例示する。ステップ１（図９Ｃ）において、血液試料をロードするために、全血（例えば１５０μＬ）の毛細管が装置に挿入された。血液は、毛細管現象によって毛細管から装置の中へと引き込まれ、次いで図９Ｃ（ステップ２）において説明されたようにボタンが押下され、装置内の内部タイマを作動させた。第１の層においては、全血から血漿が分離され、再び毛細管現象によって溶解層の中へと引き込まれた。内部タイマが切れたときに、洗浄緩衝液を含むブリスタパックが自動的に穿刺され、その内容物を装置の溶解層の中へと放出し、溶解された試料を、ＲＮＡ捕捉層を通して流した。全ての液体は、毛細管ポンプ層によって装置を通してウィッキングされた。次いで、エンドユーザがプルタブを引くことによって、ＲＮＡ捕捉層が、他の層から装置の検出ゾーンへと取り外された（図９Ｃ；ステップ３）。タブが引かれると、ＨＣＲ溶液が同時に、定着液滴の形でＲＮＡ捕捉パッド上へと放出された。次いで、エンドユーザが再びボタンを押下し（図９Ｃ；ステップ３）、別の内部タイマを作動させた。タイマが切れたときに、装置がＬＥＤレーザ及びフォトダイオードを使用して検出ゾーンを撮像し、アッセイの結果をＬＣＤスクリーンに表示した（図９Ｃ；ステップ４）。

【0137】

開示された核酸試験の設計の利点は、トレーニングを必要としない使いやすい形式で、複雑な試料から回答までの核酸試験を実行することである。この設計は、いずれもスケーリングされる製造が可能である安価な構成要素を使用する。電子構成要素は安価であり、標準的なデジタル妊娠試験において使用されているものと同様である。

【0138】

以上の実施例及び好ましい実施形態の説明は、特許請求の範囲によって定義されるものに本発明を限定するものではなく、説明するものとしてみなされるべきである。容易に理解されるように、特許請求の範囲に規定される本発明から逸脱することなく、以上に規定された特徴の多数の変形及び組み合わせが利用され得る。かかる変形は、本発明の範囲から逸脱するものとはみなされず、全てのかかる変形は、以下の特許請求の範囲内に含まれることが意図される。本明細書で引用された全ての参考文献は、その全体が本明細書に組み込まれたものとする。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図1E】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5A-D】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図6D】

【図7】

【図8】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【配列表】

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【国際調査報告】