特表 2024-526189 予防および治療のためのＧ－四重鎖含有オリゴヌクレオチド

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-07-17

(54)【発明の名称】予防および治療のためのＧ－四重鎖含有オリゴヌクレオチド

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/113 20100101AFI20240709BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20240709BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240709BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20240709BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20240709BHJP

   A61P 31/04 20060101ALI20240709BHJP

   A61P 31/12 20060101ALI20240709BHJP

   A61P 31/14 20060101ALI20240709BHJP

   A61P 31/16 20060101ALI20240709BHJP

   A61P 31/18 20060101ALI20240709BHJP

【ＦＩ】

C12N15/113 Z ZNA

C12N15/113 100Z

A61K31/7088

A61K48/00

A61P11/00

A61P29/00

A61P31/04

A61P31/12

A61P31/14

A61P31/16

A61P31/18

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023579237

(86)(22)【出願日】2022-06-23

(85)【翻訳文提出日】2024-02-20

(86)【国際出願番号】 EP2022067290

(87)【国際公開番号】W WO2022269013

(87)【国際公開日】2022-12-29

(31)【優先権主張番号】21181596.4

(32)【優先日】2021-06-24

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

２．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】519417610

【氏名又は名称】ヨハン ヴォルフガング ゲーテ－ウニヴェルズィテート フランクフルト

(74)【代理人】

【識別番号】110002077

【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人

(72)【発明者】

【氏名】キッペンベルガー， シュテファン

(72)【発明者】

【氏名】シュタインホルスト， カチヤ

(72)【発明者】

【氏名】シナトル， インドリッヒ

(72)【発明者】

【氏名】ボイコヴァ， デニサ

(72)【発明者】

【氏名】ケーニヒ， ヴェローニカ

(72)【発明者】

【氏名】クレーマン， ヨハンネス

【テーマコード（参考）】

4C084

4C086

【Ｆターム（参考）】

4C084AA13

4C084MA13

4C084MA28

4C084MA52

4C084MA55

4C084MA58

4C084MA59

4C084MA60

4C084NA14

4C084ZA591

4C084ZA592

4C084ZB111

4C084ZB112

4C084ZB261

4C084ZB262

4C084ZB331

4C084ZB332

4C084ZB351

4C084ZB352

4C084ZC611

4C084ZC612

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA01

4C086MA04

4C086MA13

4C086MA28

4C086MA52

4C086MA55

4C086MA58

4C086MA59

4C086MA60

4C086NA14

4C086ZA59

4C086ZB11

4C086ZB26

4C086ZB33

4C086ZB35

4C086ZC61

(57)【要約】

本発明は、１０～２０個のヌクレオチド残基を含む少なくとも１つのＧ－カルテット形成モチーフを含む１０～５０個のヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド分子であって、前記Ｇ－カルテット形成モチーフ形成残基の少なくとも６０％がグアノシン残基またはデオキシグアノシン残基であり、該分子が哺乳動物細胞における腫瘍増殖および／またはウイルスもしくは細菌の複製を阻害し、かつ／または抗炎症作用を発揮する、オリゴヌクレオチド分子に関する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

１０～２０個のヌクレオチド残基を含む少なくとも１つのＧ－カルテット形成モチーフを含む１０～５０個のヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド分子であって、前記Ｇ－カルテット形成モチーフ形成残基の少なくとも６０％がグアノシン残基またはデオキシグアノシン残基であり、分子が腫瘍増殖および／またはサル痘ウイルスの複製を阻害する、オリゴヌクレオチド分子。

【請求項2】

１０～２０個のヌクレオチド残基を含む少なくとも１つのＧ－カルテット形成モチーフを含む１０～５０個のヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド分子であって、前記Ｇ－カルテット形成モチーフ形成残基の少なくとも６０％がグアノシン残基またはデオキシグアノシン残基であり、分子が哺乳動物細胞におけるウイルスもしくは細菌の複製を阻害し、かつ／または抗炎症作用を発揮する、オリゴヌクレオチド分子。

【請求項3】

残基の７０％超がグアノシン残基またはデオキシグアノシン残基である、請求項１または２に記載のオリゴヌクレオチド分子。

【請求項4】

オリゴヌクレオチドがデオキシヌクレオチドから合成される、請求項１から３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド分子。

【請求項5】

グアノシン残基またはデオキシグアノシン残基の少なくとも１つが化学修飾されている、請求項１から４のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド分子。

【請求項6】

化学修飾がリン酸骨格修飾である、請求項５に記載のオリゴヌクレオチド分子。

【請求項7】

チオホスホリル置換がホスホロチオエートまたはホスホロジチオエートから選択され、チオホスホリル置換がオリゴヌクレオチド分子の糖－リン酸骨格中のホスホジエステル結合の少なくとも３５％を置換する、請求項６に記載のオリゴヌクレオチド分子。

【請求項8】

オリゴヌクレオチドが、グアノシン残基またはデオキシグアノシン残基の少なくとも４つの連続するトリプレットを含む、請求項１から７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド分子。

【請求項9】

分子が、配列番号１から４に記載の配列、および／または少なくとも１ヌクレオチドによってトランケートされた配列番号１から４の配列、のいずれか１つを含む、請求項１から８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド分子。

【請求項10】

薬学的に許容される添加物、担体、アジュバントまたはそれらの組合せの少なくとも１つと組み合わされた、請求項１から９のいずれか一項に記載の少なくとも１つのオリゴヌクレオチド分子を含む薬学的組成物。

【請求項11】

請求項１から９のいずれか一項に記載の少なくとも１つのオリゴヌクレオチド分子を含むキット。

【請求項12】

腫瘍、ウイルスまたは細菌感染によって引き起こされる疾患および／またはそれに関連する炎症の治療における使用のための、請求項１から９のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド分子、請求項１０に記載の薬学的組成物または請求項１１に記載のキット。

【請求項13】

オリゴヌクレオチド分子が、哺乳動物細胞における腫瘍増殖および／またはウイルス複製の阻害を誘導する、請求項１２に記載の使用。

【請求項14】

ウイルス感染が、ＨＳ－１ウイルス、ＨＣＮウイルス、アデノウイルス、ジカウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ウエストナイルウイルス、インフルエンザウイルス、ＲＳＶウイルス、パラミクソウイルス、ＨＩＶウイルス、コロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２およびＭＥＲＳ－ＣｏＶを含む群から選択されるウイルスによって引き起こされる、請求項１３に記載の使用。

【請求項15】

疾患が気道のウイルス感染症である、請求項１３に記載の使用。

【請求項16】

ウイルス性疾患または細菌性疾患に関連する炎症および／または腫瘍増殖の治療が、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）および／またはＩＩ型ＩＦＮ経路の干渉から、またはインターロイキン媒介シグナル伝達による抑制からもたらされる、請求項１２に記載の使用。

【請求項17】

オリゴヌクレオチド分子において、グアノシン残基またはデオキシグアノシン残基の少なくとも１つが化学修飾され、化学修飾がリン酸骨格修飾であり、オリゴヌクレオチドがグアノシン残基またはデオキシグアノシン残基の少なくとも４つの連続するトリプレットを含む、請求項１２に記載の使用。

【請求項18】

分子が、経口、非経口、経腸、眼もしくは鼻経路、または局所およびそれらの組合せからなる群から選択される薬学的に許容される経路で投与される、請求項１２に記載の使用（他の適用経路、例えば、クリームまたはローションとして（ＨＳＶ感染の治療のため）、スプレーとして、シャンプーとして、点眼薬として、坐剤、経皮パッチ、マニキュアとしての局所経路も考慮されるべきである。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、請求項１および２の主題に記載のオリゴヌクレオチド分子に関する。本発明はまた、請求項１０の主題に記載の薬学的組成物、請求項１１の主題に記載の本発明のオリゴヌクレオチド分子を含むキット、および本発明のオリゴヌクレオチド分子の治療的使用に関する。

【背景技術】

【0002】

腫瘍細胞は、プログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）を発現することによって、身体の免疫防御をしばしば回避する。Ｔ細胞の表面に存在する受容体（ＰＤ１）と結合すると、免疫応答が減弱する。遮断抗体（例えば、ペムブロリズマブ、Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標）；ニヴロマブ（ｎｉｖｕｌｏｍａｂ）、Ｏｐｄｉｖｏ（登録商標）；アベルマブ、Ｂａｖｅｎｃｉｏ（登録商標））によってこの相互作用を阻害すると、Ｔ細胞が活性化する。活性化されたＴ細胞は、自己免疫の増加を媒介し、特に腫瘍細胞に効果的である。この手法の臨床的有効性は、特に転移性黒色腫における、大規模試験で顕著に証明されている（Ｒｏｂｅｒｔ Ｃ、Ｓｃｈａｃｈｔｅｒ Ｊ、Ｌｏｎｇ ＧＶら、（２０１５）Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ ｖｅｒｓｕｓ Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ ｉｎ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍｅｌａｎｏｍａ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３７２：２５２１～３２；Ｓｃｈａｃｈｔｅｒ Ｊ、Ｒｉｂａｓ Ａ、Ｌｏｎｇ ＧＶら、（２０１７）Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ ｖｅｒｓｕｓ ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ ｆｏｒ ａｄｖａｎｃｅｄ ｍｅｌａｎｏｍａ： ｆｉｎａｌ ｏｖｅｒａｌｌ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ａ ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｒｅ， ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ， ｏｐｅｎ－ｌａｂｅｌ ｐｈａｓｅ ３ ｓｔｕｄｙ （ＫＥＹＮＯＴＥ－００６）． Ｌａｎｃｅｔ ３９０：１８５３～６２）。

【0003】

ウイルスや細菌によって引き起こされる疾患などの感染性疾患は、患者や医療システムに重大な健康問題をもたらす。例えば、季節性の呼吸器系ウイルス性疾患は何千年も前から知られており、風邪やインフルエンザの毎年の流行は、冬の季節に温帯地域に住む人々に影響を及ぼしている。新たに出現したウイルス感染症は、世界の公衆衛生に大きな脅威を与え続けている。最近、高病原性鳥インフルエンザＡ（Ｈ５Ｎ１）ウイルスや他の鳥インフルエンザＡウイルス亜型（Ｈ７Ｎ９、Ｈ９Ｎ２、Ｈ７Ｎ３）がヒトの疾患に関連していることが判明し、家禽や家畜に循環するＡ型インフルエンザウイルス亜型がヒトに伝播する可能性によるパンデミックの懸念が高まっている。重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）は、非定型肺炎に関係し、２００２年から２００３年にかけて広東省（中国）で最初に発生し、２００３年には全世界で８００人が死亡している。コウモリはＳＡＲＳ－ＣｏＶ様ウイルスの自然貯蔵庫であることが確認されている。２０１２年には、同じコロナウイルスグループに属する中東呼吸器症候群コロナウイルスがサウジアラビアで確認された。２０１９年後半、武漢市（中国）の患者においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ２感染に関連した肺炎が出現し、ＣＯＶＩＤ－１９の流行状態につながり、世界中で数百万人が感染し、数百万人が死亡した。

【0004】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶウイルスはベータコロナウイルスファミリーに属し、約３０Ｋｂの大きなＲＮＡゲノムを持つプラス一本鎖（ｓｓ）ＲＮＡウイルスである。他のコロナウイルスと同様に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ゲノムは２７のタンパク質をコードする１４のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む。ゲノムの５’末端領域のＯＲＦ１とＯＲＦ２は、ウイルス複製に重要な１５の非構造タンパク質をコードしている。ゲノムの３’末端領域には、構造タンパク質、特にスパイクタンパク質（Ｓ）、エンベロープタンパク質（Ｅ）、膜タンパク質（Ｍ）、ヌクレオカプシドタンパク質（Ｎ）、さらに８種類のアクセサリータンパク質がコードされている。

【0005】

新興ウイルス性疾患、特にコロナウイルス感染症の治療に有効な薬物やワクチンが求められている。低分子阻害剤は化合物ライブラリーから容易に同定できる。しかしながら、低分子阻害剤の作用は、標的の小さな表面領域に限定されるため、標的の単一のアミノ酸変化によって、低分子阻害剤の効果が著しく低下する可能性がある。特定の標的分子に結合するオリゴヌクレオチド分子（「アプタマー」）は、ＳＥＬＥＸ（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ ＥＸｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）を用いて単離することができ、診断や治療目的のためのアフィニティープローブや分子認識要素として機能する。これらのアプタマーは、合成一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡであり、三次元形状で標的分子に高い親和性で結合し、分析、生体分析、イメージング、診断および治療分野で広く応用されている。本発明は、オリゴヌクレオチド分子を用いて、ウイルスまたは細菌感染によって引き起こされる疾患を治療するための効果的な薬物の必要性に対処するものである。

【発明の概要】

【0006】

第１の態様では、本発明は、１０～２０個のヌクレオチド残基を含む少なくとも１つのＧ－カルテット形成モチーフを含む１０～５０個のヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド分子であって、残基の少なくとも６０％がグアノシン残基またはデオキシグアノシン残基であり、分子が哺乳動物細胞におけるウイルスもしくは細菌の複製を阻害し、かつ／または抗炎症作用を発揮する、オリゴヌクレオチド分子に関する。

【0007】

本発明によれば、「オリゴヌクレオチド分子」という用語は、オリゴマーとしても知られる短いＤＮＡまたはＲＮＡ分子を指すと理解される。最も一般的には、ＤＮＡオリゴヌクレオチドは固相化学合成により一本鎖分子として合成され、人工遺伝子合成、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ＤＮＡ配列決定、分子クローニング、分子プローブとして使用される。ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、ｉｎ ｖｉｖｏでは小さなＲＮＡ分子として存在し、遺伝子発現の調節に関与している（例えば、マイクロＲＮＡ）、または大きな核酸分子の分解に由来する分解中間体である。特定の標的分子に結合するオリゴヌクレオチドは「アプタマー」と呼ばれ、アプタマーはオリゴヌクレオチド分子であってもペプチド分子であってもよい。本発明の文脈において、「アプタマー」という用語はオリゴヌクレオチド分子を指し、「オリゴヌクレオチド分子」および「アプタマー」という用語は、本出願を通して互換的かつ同義的に使用される。

【0008】

本発明の文脈では、「Ｇ－カルテット形成モチーフ」とは、グアニン残基が豊富な高次核酸構造である。Ｇ－カルテットは、フーグスティーンＨ－結合を介して結合した４つのＧ－塩基によって形成され、各Ｇ－塩基が隣接するＧ－塩基と２つのＨ－結合を作るような正方形の平面構造を形成する。Ｇ－四重鎖（Ｇ４）を形成するためには、２つまたはそれ以上のＧ－カルテットが重なり、多型構造を形成する。したがって、折り畳まれた分子内Ｇ－四重鎖は、コアとループの２つの主要な要素から構成され、コアは１つまたは複数の積み重なったＧ－Ｇ－Ｇ－Ｇ四分子（またはＧ－カルテット）の層を含み、ループはＧ－四重鎖コアの鎖をつなぐリンカー配列である。したがって、Ｇ－四重鎖構造は、鎖の相対的な配向とループの種類によって、非常に多型である。Ｇ－リッチオリゴヌクレオチドの配列にもよるが、これらのＧ－カルテットの安定性は、Ｋ＋やＮａ＋のような一価の陽イオンの存在、存在するＧ－リッチオリゴヌクレオチドの濃度、使用されるＧ－リッチオリゴヌクレオチドの配列など、いくつかの要因に関係している。

【0009】

本発明のオリゴヌクレオチド分子は、ウイルスまたは細菌の複製を阻害することができ、ウイルスまたは細菌ゲノムの複製は、感染細胞中のウイルスまたは細菌の複数コピーの産生をもたらす。本発明のオリゴヌクレオチド分子は、ウイルスまたは細菌のヘリカーゼを標的とすることが好ましい。ヘリカーゼは二重鎖核酸の鎖を分離する酵素であり、通常はＡＴＰの加水分解を利用して必要なエネルギーを供給する。二本鎖ＤＮＡに作用するヘリカーゼに加えて、ＤＮＡ－ＲＮＡまたはＲＮＡ－ＲＮＡ二重鎖をほどくヘリカーゼもある。細菌の複製に関しては、本発明のオリゴヌクレオチド分子が、原核生物のＤＮＡ複製に関与する主要な酵素複合体である細菌のＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素を標的とすることも好ましい。ウイルスの複製は主として宿主細胞の代謝機能に依存するので、本発明のオリゴヌクレオチド分子は有利にはウイルス複製機構におけるウイルス特異的ステップを標的とし、宿主細胞の機能はそのまま残す。異なるウイルスポリメラーゼ、すなわち、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、ウイルス複製およびウイルスゲノムの転写において中心的な役割を果たし、一般に、ウイルス複製に関連する複数の機能を遂行することができる単一のタンパク質として活性である。ウイルス複製を阻害するために使用する場合、本発明のオリゴヌクレオチド分子は、１つまたは複数のウイルスポリメラーゼを標的とすることも好ましい。

【0010】

「炎症」という用語は、例えばウイルスや細菌の病原体などの有害な刺激に対する、１つまたは複数の組織の複雑な生物学的反応を指す。この反応は、組織細胞を保護するために、細胞傷害の最初の原因を除去する役割を果たす。哺乳動物において、急性炎症反応は、一般的に有益と考えられている、限定された特異性を持つ即時的な適応反応である。しかし、敗血症性ショックに見られるように、制御されないと有害になる可能性がある。炎症経路は、インデューサー、センサー、メディエーター、エフェクターが関与する一連の事象から構成されている。分子や物質の「抗炎症作用」とは、例えば、前記インデューサー、センサー、メディエーター、エフェクターの１つまたは複数と前記分子との特異的相互作用によって、炎症を軽減する性質を指す。

【0011】

驚くべきことに、本発明のオリゴヌクレオチド分子は、残基の少なくとも８０％がグアノシン残基またはデオキシグアノシン残基であり、複製の阻害を介して、強い抗ウイルス活性または抗菌活性を示すことが見出された。さらに、この分子は哺乳動物細胞における抗炎症作用を示すことも見出された。有利なことに、本発明のオリゴヌクレオチド分子は、化学合成により比較的容易に低コストで合成できる短い分子である。抗体と比較して、オリゴヌクレオチド分子は免疫原性が低く、安定性が高いという特徴がある。さらに、オリゴヌクレオチド分子は、有機分子、タンパク質、ウイルス、細菌、全細胞および組織を含む様々な標的に結合することができる。

【0012】

さらなる実施形態では、本発明に記載のオリゴヌクレオチド分子は、残基の７０％超がグアノシン残基またはデオキシグアノシン残基であるオリゴヌクレオチド分子であってもよい。グアノシン残基の数を増加させると、スクランブル配列または混合配列と比較して、本発明のオリゴヌクレオチドは有意に増加した抗ウイルス活性または抗菌活性を示す。オリゴヌクレオチド分子のすべての残基がグアノシン残基であることが特に好ましい。

【0013】

代替的な実施形態では、オリゴヌクレオチド分子はデオキシヌクレオチドから合成される。個々のヌクレオチドは、核酸塩基、炭素数５の糖（リボースまたはデオキシリボース）、および１～３個のリン酸からなるリン酸基の３つのサブユニット分子から構成される。核酸塩基と糖部分は一緒になってヌクレオシドを形成する。ＤＮＡでは、グアニン、アデニン、シトシン、チミンが核酸塩基として使用され、ＲＮＡではチミンの代わりにウラシルが使用される。ＲＮＡでは、糖－リン酸骨格の糖はリボースであり、ＤＮＡはその代わりにデオキシリボースが存在することを特徴とする核酸ポリマーである。有利なことに、オリゴヌクレオチド分子は、加水分解に対する感受性がはるかに低いＤＮＡ分子である。

【0014】

本発明のオリゴヌクレオチド分子のさらなる有利な実施態様では、グアノシン残基またはデオキシグアノシン残基の少なくとも１つは化学的に修飾されていてもよい。オリゴヌクレオチド分子はＤＮＡまたはＲＮＡ分子であり、より高い結合親和性および／または特異性、ヌクレアーゼ分解に対するより低い感受性、増強されたｉｎ ｖｉｖｏ安定性、より長いｉｎ ｖｉｖｏ半減期、腎濾過を介した排泄に対するより低い感受性などの異なる効果を達成するために、骨格または２’糖位置で化学的に修飾されてもよい。一般的な化学修飾には、ヌクレアーゼ（それぞれの末端に最初に結合する）に対する耐性と腎クリアランスをそれぞれ向上させるために、逆位チミジンによる３’末端のキャッピングやＰＥＧ化など、核酸の末端の修飾が含まれる。さらなる修飾は、ホスホジエステル結合、糖環（例えば、リボフラノース環の２’Ｏ位をフルオロ（－Ｆ）、アミノ（－ＮＨ２）、アジド（－Ｎ３）またはメトキシ／ＯＭｅ（－ＯＣＨ３）基で置換する）、および核酸塩基（例えば、プリン修飾、２，６－ジアミノプリン、３－デアザ－アデニン、７－デアザ－グアニンおよび８－アジド－アデニン、またはピリミジン修飾、２－チオ－チミジン、５－カルボキサミド－ウラシル、５－メチル－シトシンおよび５－エチニル－ウラシル）が含まれる。

【0015】

オリゴヌクレオチド分子の特に好ましい実施態様では、化学修飾はリン酸骨格修飾であってもよい。リン酸骨格の修飾は、定義によりホスホジエステル結合に影響し、リン酸基は原子置換により変化し、中性、アニオン性またはカチオン性の修飾をもたらす。例えば、酸素原子の１個または２個をそれぞれ１個または２個の硫黄原子で置換すると、ホスホロチオエート基またはホスホロジチオエート基が得られる。リン酸基の１つの酸素原子を非荷電メチル基で置換すると、メチルリン酸骨格が得られる。カチオン性修飾は、１つの酸素原子をグアニジノプロピルホスホロアミデートのような正に荷電した基と置換することを含む。好ましくは、オリゴヌクレオチド分子のホスホジエステル結合は、骨格Ｏ原子がメチル基で置換されるか、または１つもしくは複数の骨格Ｏ原子が１つもしくは複数の硫黄原子で置換されるように、メチルホスホネートまたはホスホロチオエートアナログで置換される。有利なことに、この修飾は、細胞外または細胞内のヌクレアーゼに対する抵抗性の向上、より高い熱安定性、標的結合親和性の向上、および／または原形質膜を介した細胞内部への送達の向上をもたらす。

【0016】

チオホスホリル置換がホスホロチオエートまたはホスホロジチオエートから選択される場合は特に好ましく、チオホスホリル置換がオリゴヌクレオチド分子の糖－リン酸骨格中のホスホジエステル結合の少なくとも３５％を置換する。オリゴヌクレオチドのすべてのホスホジエステル結合をチオホスホリル基で置換すると、ヌクレアーゼに対する耐性が著しく向上する。標的結合特異性が向上したオリゴヌクレオチド分子を得るために、ホスホジエステル結合のチオホスホリル置換は、３５％から完全置換の範囲で滴定することができる。さらに、部分的な置換によって分子内のいくつかのホスホジエステル結合を保存することにより、完全な置換と関連して見出されることもある毒性の増強を回避することができる。チオホスホリル置換が糖－リン酸骨格中のホスホジエステル結合の少なくとも３５％を置換するオリゴヌクレオチド分子において、グアノシン残基の数が増加する場合、本発明のオリゴヌクレオチド分子は、スクランブル配列または混合配列と比較して、有意に増加した抗ウイルス活性または抗菌活性を示す。前記ＰＴＯオリゴヌクレオチド分子のすべての残基がグアノシン残基であることが特に好ましい。

【0017】

さらなる実施形態では、オリゴヌクレオチド分子は、少なくとも４個の連続するグアノシンまたはデオキシグアノシン残基のトリプレットを含んでいてもよい。有利なことに、少なくとも４個の連続するグアノシン残基のトリプレットを含むオリゴヌクレオチド分子は、より短いオリゴヌクレオチド分子と比較して、より強い抗ウイルス効果を示すことが見出され、ウイルス複製を阻害する有効性は分子の長さに依存することが示唆された。

【0018】

本発明のオリゴヌクレオチドは、有利には配列番号１から４に記載される配列を含み、ここで配列番号１：５’－ＧＧＧ ＧＧＧ ＧＧＧ ＧＧＧ ＧＧＧ ＧＧＧ ＧＧ －３’、配列番号２：５’－ＧＧＧ ＧＧＧ ＧＧＧ ＧＧＧ ＧＧ －３’、配列番号３；５’ ＧＧｇ ｇｔｃ ａａｇ ｃｔｔ ｇａＧ ＧＧＧ Ｇｇ および配列番号４：ＧＧＴ ＧＧＴ ＧＧＴ ＧＧＴ ＴＧＴ ＧＧＴ ＧＧＴ ＧＧＴ ＧＧである。大文字はホスホロチオエート結合（ＰＴＯ）を表し、小文字は古典的なホスホジエステル結合を表す。より短い配列は、わずかに低下した複製の阻害と関連することが多い。これらの配列を含むオリゴヌクレオチドは、自発的にＧ－カルテットやＧ－四重鎖（Ｇ４）を形成する。

【0019】

第２の態様では、本発明は、薬学的に許容される添加物、担体、アジュバントまたはそれらの組合せの少なくとも１つと組み合わされた、少なくとも１つのオリゴヌクレオチド分子を含む薬学的組成物に関する。

【0020】

本発明に記載の薬学的に許容される添加物には、所望される特定の剤形に適した任意のおよびすべての溶媒、分散媒、希釈剤、または他の液体ビヒクル、分散体または懸濁補助剤、表面活性剤、等張剤、防腐剤、固体結合剤などが含まれる。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２３版、Ａ． Ａｄｅｊａｒｅ（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、Ｍｄ．、２０２０）には、薬学的組成物の製剤化に使用される様々な添加物およびその調製のための公知技術が開示されている。薬学的に許容される添加物は、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の純度であってよい。薬学的組成物の製造に使用される薬学的に許容される添加物としては、不活性希釈剤、分散剤および／または顆粒化剤、界面活性剤および／または乳化剤、崩壊剤、結合剤、防腐剤、緩衝剤、潤滑剤、および／または油が挙げられるが、これらに限定されない。

【0021】

第３の態様では、本発明は、前述のように少なくとも１つのオリゴヌクレオチド分子を含むキットに関する。

【0022】

第４の態様では、本発明は、記載されるようなオリゴヌクレオチド分子、ウイルスまたは細菌感染によって引き起こされる疾患および／またはそれに関連する炎症の治療における使用のためのオリゴヌクレオチド分子を含む薬学的組成物またはキットに関する。

【0023】

好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチド分子は、哺乳動物細胞におけるウイルス複製の阻害を誘導することができる。

【0024】

さらに好ましい実施形態では、ウイルス感染は、ＨＳ－１ウイルス、ＨＣＮウイルス、アデノウイルス、ジカウイルス、ＢまたはＣ型肝炎ウイルス、ウエストナイルウイルス、インフルエンザウイルス、ＲＳＶウイルス、パラミクソウイルス、ＨＩＶウイルス、コロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２およびＭＥＲＳ－ＣｏＶを含む群から選択されるウイルスによって引き起こされることがある。

【0025】

代替的な実施形態では、疾患は気道のウイルス感染症である。

【0026】

別の実施態様では、ウイルス性疾患または細菌性疾患に関連する炎症の治療は、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）および／またはＩＩ型ＩＦＮ経路の干渉から、またはインターロイキン媒介シグナル伝達の抑制からもたらされることがある。本発明の文脈では、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）とは、感染細胞によって分泌されるポリペプチドを指す。次のような機能はＩ型ＩＦＮに関連する。感染病原体、特にウイルス病原体の拡散を制限するための、感染細胞および隣接細胞における細胞固有の抗菌状態の誘導；炎症促進性経路およびサイトカイン産生を抑制しつつ、抗原提示およびナチュラルキラー細胞機能を促進するための、バランスのとれた自然免疫応答の調節；高親和性抗原特異的ＴおよびＢ細胞応答ならびに免疫記憶の発達を促進するための、適応免疫系の活性化。Ｉ型ＩＦＮは、構造的に類似したサイトカイン群からなり、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－ε、ＩＦＮ－κ、ＩＦＮ－ω、ＩＦＮ－δ、ＩＦＮ－ζ、ＩＦＮ－τとともに、ＩＦＮ－αの１３～１４亜型を含む。ＩＦＮ－γとして知られるＩＩ型ＩＦＮは、異なる受容体を介してシグナルを伝達し、Ｉ型ＩＦＮとは独立した作用を持つ。ＩＦＮ－γシグナル伝達は、マクロファージの活性化を促進し、抗原プロセシングと提示分子の発現を上方制御し、Ｔｈ１細胞の発達と活性化を促進し、ナチュラルキラー細胞の活性を増強し、Ｂ細胞の機能を調節し、炎症部位へのエフェクター細胞の輸送を促進するケモカインの産生を誘導することにより、宿主防御において重要な役割を果たしている。有利なことに、オリゴヌクレオチド分子は、ウイルス性疾患の異なる段階、例えばＳＡＲＳ－Ｃｏｖ２感染の亜急性状態（「ＣＯＶＩＤの後遺症」）での治療に用いることができる。

【0027】

さらなる実施形態では、治療目的で使用されるオリゴヌクレオチド分子において、グアノシン残基またはデオキシグアノシン残基の少なくとも１つが化学修飾されてもよく、化学修飾はリン酸骨格修飾であり、オリゴヌクレオチドはグアノシン残基またはデオキシグアノシン残基の少なくとも４つの連続するトリプレットを含む。

【0028】

代替的な実施形態では、分子は、経口、非経口、経腸、眼もしくは鼻経路、または局所およびそれらの組合せからなる群から選択される薬学的に許容される経路で投与されてもよい。局所適用は、クリーム、フォーム、ゲル、ローション、軟膏、ペースト、粉末、振盪ローション、固形、スポンジ、テープ、チンキ、局所溶液、マニキュア、経皮パッチ、蒸気としての適用が含まれる。

【0029】

本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上明らかにそうでないと指示しない限り、複数形の参照対象を含むことに注意しなければならない。例えば、「オリゴヌクレオチド分子」という用語は、１つまたは複数のオリゴヌクレオチド分子、すなわち、単一のオリゴヌクレオチド分子および複数のオリゴヌクレオチド分子を指す。さらに、特許請求の範囲は、任意の要素を除外するように起草できることに注意しなければならない。したがって本言明は、特許請求の範囲の要素の記述に関連して「もっぱら（ｓｏｌｅｌｙ）」および「のみ（ｏｎｌｙ）」などの排他的な用語を用いること、または、「否定的な（ｎｅｇａｔｉｖｅ）」限定を用いることの前提的根拠となることを意図している。

【0030】

他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明の説明が対象とする当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本発明を実施するために、本明細書に記載したものと類似または同等の方法および材料を使用することができるが、好適な方法および材料を以下に記載する。加えて、本明細書に記載された材料、方法、および例は、例示的なものであるに過ぎず、限定を意図するものではない。

【0031】

本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかであり、またこれらによって包含されるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0032】

【図1】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染Ｃａｌｕ－３ヒト肺がん細胞における抗ウイルス効果について、異なるヌクレオチド配列を比較した図である。ｎＣｐＧ－６－ＰＴＯがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を阻害することを示す。

【図2】ｎＣｐＧ－６－ＰＴＯがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の複製を阻止するが、標的細胞へのウイルス侵入には影響しないことを示す図である。

【図3】抗ウイルス有効性が分子の長さに依存することを示す図であり、長い分子が短い分子よりもウイルス感染に対して強い効果を示すことが強調されている。

【図4】ホスホジエステル骨格（ｎＣｐＧ－６－ＰＤＥ）またはホスホロチオエート骨格（ｎＣｐＧ－６－ＰＴＯ）を持つ同じ長さのオリゴヌクレオチドの比較によって、抗ウイルス効果がＯＤＮ骨格に依存することを示す図である。

【図5】ｎＣｐＧ－６－ＰＴＯと、抗がん療法で使用されている周知のアプタマーＡＳ１４１１の有効性を比較する図である。ウイルス阻害アッセイに用いたところ、ＡＳ１４１１－ＰＤＥはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対して有効性を示さなかったが、ＡＳ１４１１－ＰＴＯはＣｐＧ－６－ＰＴＯと同等に効果的であることが見出された。

【図6】ｎＣｐＧ－６－ＰＴＯは０．５、１、２、４μＭの範囲の濃度でＨＳＶ－１による細胞病原性作用を完全に抑制することを示す図である。

【図7】Ｇ４特異的抗体であるＢＧ４を用いて、ｎＣｐＧ－６－ＰＴＯからの四重鎖（Ｇ４）構造の形成を示す図である。

【図8】ヘリカーゼアッセイを用いて、ｎＣｐＧ－６－ＰＴＯがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヘリカーゼを阻害することを示す結果を示す図である。

【図9】Ｇ４形成ＰＴＯ－ＯＤＮ（ｎＣｐＧ－６－ＰＴＯおよびＡＳ１４１１－ＰＴＯ）がＩＦＮβ媒介シグナル伝達分子を阻害する可能性を示す図である。図９Ａは、Ｉ型インターフェロンシグナル伝達の経路を模式的に示す（Ｇｏｎｚａｌｅｚ－Ｃａｏら、２０１８より）。ウエスタンブロット解析（図９Ｂ）により、ｎＣｐＧ－６－ＰＴＯおよびＡＳ１４１１－ＰＴＯによる、正準シグナル伝達分子ｐ－Ｓｔａｔ１およびｐＳｔａｔ２のチロシンリン酸化の強い下方制御が示される。

【図10】Ｇ４形成ＰＴＯ－ＯＤＮ（ｎＣｐＧ－６－ＰＴＯおよびＡＳ１４１１－ＰＴＯ）がＩＦＮｙ媒介シグナル伝達分子を阻害することを実証する図である。図１０Ａは、ＩＩ型インターフェロンシグナル伝達の経路を模式的に示す（Ｇｏｎｚａｌｅｚ－Ｃａｏら、２０１８より）。ウエスタンブロット解析（図１０Ｂ）により、ｎＣｐＧ－６－ＰＴＯおよびＡＳ１４１１－ＰＴＯによる、正準シグナル伝達分子ｐ－ＪＡＫ２およびｐＳｔａｔ２のチロシンリン酸化の強い下方制御が示される。

【図11】Ｇ４形成ＰＴＯ－ＯＤＮ（ｎＣｐＧ－６－ＰＴＯおよびＡＳ１４１１－ＰＴＯ）はインターロイキン６（ＩＬ－６）を媒介するＳＴＡＴ３リン酸化を阻害する可能性を示す図である。図１１Ａは、ＩＬ６シグナル伝達の経路を模式的に示す（Ｊｉｎら、２０１７より）。ウエスタンブロット解析（図９Ｂ）（Ｆｉｇ． ９Ｂ）により、ｎＣｐＧ－６－ＰＴＯおよびＡＳ１４１１－ＰＴＯによる、Ｓｔａｔ３のチロシンリン酸化の強い下方制御が示される。さらに、ｐ－Ｓｔａｔ１に対する抑制効果も認められた。

【図12】例示的なデータはｎＣｐＧ－６－ＰＴＯが分割皮膚モデルにおいてＨＳＶ－１感染を抑制することを示す図である。ＣＰＥ減少によって示される、ｎＣｐＧ－６－ＰＴＯがｉｎ ｖｉｔｒｏ培養包皮線維芽細胞においてＨＳＶ－１感染を抑制した実施例６（図６）に加え、抗ウイルス有効性を分割皮膚試料においても試験した。創傷被覆に使用されなかった大腿部の余剰分割皮膚は、外科ユニットから提供された。皮膚試料をＰＢＳに入れ、ダーマローラー（Ｓｅｇｍｉｎｉｓｍａｒｔ（登録商標）、Ｎｉｃｏｓｉａ、Ｃｙｐｒｕｓ）を使用して（Ｔａｊｐａｒａ Ｐ、Ｍｉｌｄｎｅｒ Ｍ、Ｓｃｈｍｉｄｔ Ｒら、Ａ Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ Ｓｔｕｄｙｉｎｇ Ｈｅｒｐｅｓ Ｓｉｍｐｌｅｘ Ｖｉｒｕｓ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ． Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ １３９：６７３～８２、２０１９）に記載されたように実施した。継続的に皮膚を３×３ｍｍに切断した。それぞれの断片を２４ウェルＭＳの１ウェルに入れ、５００μｌのＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ、１％Ｐ／Ｓ）で覆った。皮膚試料を１０^６ ＨＳＶ－１コピー／ｍｌ ＋／－ ４μＭ ｎＣｐＧ－６－ＰＴＯ （ＧＱ２０－ＰＴＯ）で２日間処理した（３７℃）。次いで、組織試料を固定し、標準プロトコールを用いて４μｍの厚さの切片に切断した。抗ＨＳＶ－１（１：１０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ：ＰＡ１－２９２１０）およびペルオキシダーゼ基質としてＨｉｓｔｏＧｒｅｅｎ（Ｈｉｓｔｏ Ｇｒｅｅｎ Ｋｉｔ、Ｌｉｎａｒｉｓ、Ｅ１０９）を用いてＨＳＶ－１を検出した。

【図13】ｎＣｐＧ－６－ＰＴＯがサル痘ウイルスに有効であることを示す図である。

【図14】腫瘍形成におけるチェックポイント分子の作用を模式的に示す図である。上図：抗原提示細胞は腫瘍抗原とＢ７分子を提示することによってＴ細胞を活性化する。Ｔ細胞が腫瘍を認識するとＩＦＮ－γが産生され、腫瘍細胞や抗原提示細胞上のＰＤ－１リガンドが上方制御される。Ｔ細胞上のＰＤ－１とＰＤ－１リガンドとの結合は、Ｔ細胞の活性化を阻害し、結果として抗腫瘍免疫応答を減弱させる。下図：ニボルマブ（またはペムブロリズマブなどの別の抗体）によるＰＤ－１の封鎖は、Ｔ細胞の阻害を逆転させ、抗腫瘍免疫応答を再活性化する。（Ｂｒａｈｍｅｒ ＪＲ、Ｈａｍｍｅｒｓ Ｈ、Ｌｉｐｓｏｎ ＥＪ （２０１５） Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ： ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＰＤ－１ ｔｏ ｂｏｌｓｔｅｒ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｉｔｙ． Ｆｕｔｕｒｅ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ １１：１３０７～２６より抜粋）。本発明は、チェックポイント封鎖の代替概念を導入するものである。Ｇ４の添加により、腫瘍細胞におけるＩＦＮγシグナル伝達カスケードが阻害され、結果としてＰＤ－Ｌ１が阻害される。

【図15】ＩＦＮγシグナル伝達とＰＤ－Ｌ１発現との間の関係を示す図である。ＩＦＮγシグナル伝達は腫瘍細胞の「免疫回避」を引き起こす。この図式は、ＩＦＮγが炎症性メディエーターのカスケード（Ｊａｋ－１、Ｊａｋ－２、Ｓｔａｔ－１）を活性化し、それが続いてＩＲＦ－１（インターフェロン制御因子－１）の発現を刺激することを示している。転写因子ＩＲＦ１はＰＤ－Ｌ１プロモーターの中心的要素である。ＰＤ－Ｌ１とＰＤ－１との間の相互作用は免疫応答の阻害につながるＧａｒｃｉａ－Ｄｉａｚ Ａ、Ｓｈｉｎ ＤＳ、Ｍｏｒｅｎｏ ＢＨら、（２０１７） Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｐａｔｈｗａｙｓ Ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ＰＤ－Ｌ１ ａｎｄ ＰＤ－Ｌ２ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ． Ｃｅｌｌ ｒｅｐｏｒｔｓ １９：１１８９～２０１）。 ＳＡＲＳコロナウイルス－２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）は、他の多くのウイルス（例えば、ハンタおよびエボラ）と同様に、大量のＩＦＮγ誘導を引き起こし、ＰＤ－Ｌ１やＰＤ－Ｌ２などのチェックポイント分子の発現を介してＴ細胞の枯渇と破壊を引き起こす（Ａｇｈｂａｓｈ ＰＳ、Ｅｓｌａｍｉ Ｎ、Ｓｈａｍｅｋｈ Ａら、 （２０２１） ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ： Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１ ａｎｄ ＣＴＬＡ－４ ａｘｉｓ． Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ２７０：１１９１２４～）。このことにより、続いて、ウイルスに対する免疫応答が低下する。したがって、ＣＯＶＩＤ－１９を治療するために、前述のチェックポイント阻害剤を併用することも考えられている。しかし、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染後、チェックポイント阻害薬で治療したがん患者が重症化することが観察されている（Ｒｏｂｉｌｏｔｔｉ ＥＶ、Ｂａｂａｄｙ ＮＥ、Ｍｅａｄ ＰＡら、（２０２０） Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ ｏｆ ＣＯＶＩＤ－１９ ｄｉｓｅａｓｅ ｓｅｖｅｒｉｔｙ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｃａｎｃｅｒ． Ｎａｔ Ｍｅｄ ２６：１２１８～２３）。これは副作用（ステロイド）のためである可能性もあるし、阻害剤によって引き起こされるサイトカインカスケードが原因である可能性もある。したがって、２０２１年のＡｇｈｂａｓｈらの研究では、ＣＯＶＩＤ－１９に対するＰＤ－１ベースの治療の必要性が要求されている：「ＣＯＶＩＤ－１９の治療とＰＤ－１を標的とした治療において重要な点は、炎症カスケードと疲弊したＴ細胞の形成を同時に低減および除去できる方法を採用することである」。Ｇ４の有効性に関する本発明の結果は、ここに抗ウイルス性、抗炎症性、および免疫賦活性の両方のメカニズムがあることを示唆している。

【図16】オリゴヌクレオチドがＰＤ－Ｌ１とＰＤ－Ｌ２のタンパク質発現を抑制することを示す図である。

【図17】ｎＣｐＧ－６－ＰＴＯおよびＣｐＧ－１－ＰＴＯによるＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２の抑制と、濃度および分子長の影響を示す図である。

【図18】リアルタイムＲＴ－ＰＣＲによるＰＤ－Ｌ１とＰＤ－Ｌ２の発現解析を示す図である。

【図19】プロモーター機能解析を示す図である。

【図20】インターフェロン受容体シグナル伝達タンパク質のウエスタンブロット解析を示す図である。

【図21】ｎＣｐＧ－６－ＰＴＯがＧ－四重鎖（Ｇ４）を形成し、ＩＦＮＧＲ２に結合することを示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0033】

実施例１
Ｇ－リッチＰＴＯ－ＯＤＮは抗ウイルス活性を提示し、ｎＣｐＧ－６－ＰＴＯは特に強力である。
ウイルスの調製
ウイルスの調製は記載された通りに行った（Ｂｏｊｋｏｖａら、２０２０）。簡単に述べると、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントはヒト結腸癌細胞株Ｃａｃｏ－２を用いて単離した。実験に使用したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ストックは、Ｃａｃｏ－２細胞上で最大３継代を経ており、－８０℃で保存した。ウイルス力価は、９６ウェルマイクロタイタープレートのコンフルエント細胞におけるＴＣＩＤ_５０／ｍｌとして決定した。

【0034】

抗ウイルスアッセイ
９６ウェルプレート中のＣａｌｕ－３細胞のコンフルエント層をＭＯＩ ０．０１でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染させた。「ＭＯＩ」という用語は「感染多重度」を表し、感染標的（例えば、細胞）に対する病原体（例えば、ウイルス、細菌）の比率を指す。ウイルスはオリゴヌクレオチドと同時に添加し、１％ＦＢＳ添加ＭＥＭ中でインキュベートした。抗ウイルス効果は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓに対する抗体（１：１５００、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、Ｅｓｃｈｂｏｒｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いたウイルス特異的抗原の免疫組織化学的検出により、２日後に評価した。定量的検出は、Ｂｉｏｒｅａｄｅｒ（登録商標）７０００－Ｆ－Ｚ－Ｉｍｉｃｒｏ（Ｂｉｏｓｙｓ）を用いて行った。

【0035】

使用したオリゴヌクレオチド分子（ＯＤＮ）
１．ＣｐＧ－１－ＰＴＯ：５’－ＴＣＣ ＡＴＧ ＡＣＧ ＴＴＣ ＣＴＧ ＡＣＧ ＴＴ－３’
２．ｎ－ＣｐＧ－６－ＰＴＯ：５’－ＧＧＧ ＧＧＧ ＧＧＧ ＧＧＧ ＧＧＧ ＧＧＧ ＧＧ－３’
３．ｎ－ＣｐＧ－３Ａ－ＰＴＯ：５’－ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ－３’
４．ｎ－ＣｐＧ－５－ＰＴＯ：５’－ＣＣＣ ＣＣＣ ＣＣＣ ＣＣＣ ＣＣＣ ＣＣＣ ＣＣ－３’
５．スクランブル－ＣｐＧ－１－ＰＴＯ：５’－ＣＴＣ ＴＡＧ ＧＡＣ ＴＣＴ ＣＴＧ ＧＡＣ ＴＴ－３’
６．Ｇ３１３９ Ｇｅｎａｓｅｎｓｅ（オブリマーセン）：５’－ＴＣＴＣＣＣＡＧＣＧＴＧＣＧＣＣＡＴ－３’
７．ＣｐＧ－２１１８（ＫｏｎＡ）：５’－ＧＧｇ ｇｔｃ ａａｇ ｃｔｔ ｇａＧ ＧＧＧ Ｇｇ－３’

【0036】

大文字はホスホロチオエート結合（ＰＴＯ）を表し、小文字は古典的なホスホジエステル結合を表す（ＣｐＧ－２１１８）。本明細書で使用される場合、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドは、シトシン三リン酸デオキシヌクレオチド（「Ｃ」）に続いてグアニン三リン酸デオキシヌクレオチド（「Ｇ」）を含む短い一本鎖合成ＤＮＡ分子であり、ここで「ｐ」は連続するヌクレオチド間のホスホジエステル結合を指す。アクロニム「ｎ－ＣｐＧ」は、非ＣｐＧ－ＯＤＮであるオリゴヌクレオチドを指す。異なる濃度（０．２５、０．５、１、２、４ｍＭ）で試験した。オブリマーセン（商品名：Ｇｅｎａｓｅｎｓｅ）は、慢性リンパ性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、乳がんを含むいくつかのタイプのがんの可能性のある治療法として研究されているアンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオチドである。ＣｐＧ－２１１８（ＫｏｎＡ）は、末端がＰＴＯ結合で保護されたグアニンリッチ分子であり、マウスＴＬＲ９リガンドであるＯＤＮ１５８５のコントロールとして機能する合成オリゴヌクレオチドである。

【0037】

結果は図１に示されており、ｎＣｐＧ－６－ＰＴＯがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を阻害することが示されている。

【0038】

実施例２
ｎＣｐＧ－６－ＰＴＯはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の「侵入」ではなく「複製」を阻害する。
材料および方法
ｎＣｐＧ－６－ＰＴＯがウイルスの細胞内への吸着と内部移行を防ぐのか（侵入）、それともウイルスの複製を防ぐのか（複製）を識別するために、添加時間実験を行った。

【0039】

添加時間実験設定
侵入：異なる濃度のｎＣｐＧ－６－ＰＴＯ（０．２５、１、４ｍＭ）をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（０．０１ＭＯＩ）とともに添加し、１時間インキュベートした。１時間後、ウイルスと処理を洗い流し、培地を新しくした。

【0040】

複製：Ｃａｌｕ－３細胞にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を１時間感染させた（０．０１ ＭＯＩ）。１時間後、ウイルス接種液を除去し、細胞を洗浄して、細胞に浸透しなかったウイルス粒子を確実に洗い流した。連続して異なる濃度のｎＣｐＧ－６－ＰＴＯを添加した。

【0041】

どちらの設定でも、ウイルスタンパク質の検出は上記のように２日後に行った（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓに対する抗体を用いたウイルス特異的抗原の免疫組織化学的検出）。

【0042】

結果は図２に示されており、ｎＣｐＧ－６－ＰＴＯはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の複製を阻止するが（三角）、標的細胞へのウイルス侵入には影響しないことが示されている（円）。

【0043】

実施例３
抗ウイルス効果は長さに依存する
ｎＣｐＧ－６－ＰＴＯ欠失突然変異体の比較。実施例１および２（図１および２）では、ｎＣｐＧ－６－ＰＴＯの抗ウイルス有効性が示された。実施例３は、分子の長さと抗ウイルス効果との間に相関関係があることを示している。この目的のために、ｎＣｐＧ－６－ＰＴＯの欠失突然変異体が用いられた。

【0044】

手順は実施例１に記載したように行った。以下の異なる長さのオリゴヌクレオチド分子を濃度０．５、１、２、４μＭ ＯＤＮとして使用した。

【0045】

【0046】

図３に示すように、抗ウイルス有効性は分子の長さに明らかに依存し、長い分子は短い分子よりもウイルス感染に対して強い効果を示した。ＩＣ５０はｎＣｐＧ－６－ＰＴＯ（０．５ｍＭ、黒円）を用いた場合に最も低く、６Ｇ ＯＤＮ ｎＣｐＧ－６Ｇ－ＰＴＯ（１．５ｍＭ、薄い灰色円）を用いた場合にはより低い有効性へとシフトした。濃度は対数スケールで描かれていることに注意。

【0047】

実施例４
抗ウイルス効果はＯＤＮ骨格に依存する。
ＯＤＮ骨格の影響を、ホスホジエステル骨格を持つｎＣｐＧ－６（ｎＣｐＧ－６－ＰＤＥ、薄い灰色円）とホスホロチオエート骨格を持つｎＣｐＧ－６（ｎＣｐＧ－６－ＰＴＯ、黒円）を比較することによって試験した。処理：ｎＣｐＧ－６－ＰＴＯまたはｎＣｐＧ－６－ＰＤＥをそれぞれ０．５、１、２、４μＭの濃度で適用した。手順は実施例１に記載したように行った。

【0048】

図４は、ＰＴＯ結合が抗ウイルス効果を伝える可能性を示している。

【0049】

実施例５
ｎＣｐＧ－６－ＰＴＯ、ＡＳ１４１１－ＰＴＯおよびＡＳ１４１１－ＰＤＥのウイルス阻害の比較
実施例５は、本発明のｎＣｐＧ－６－ＰＴＯと、よく知られたアプタマーＡＳ１４１１の２つの形態、すなわちＡＳ１４１１－ＰＴＯとＡＳ１４１１－ＰＤＥを用いた複製阻害を比較したものである。

【0050】

ＡＳ１４１１（ＡＧＲＯ１００としても知られている）は、ホスホジエステル結合（ＰＤＥ）を持つＧ－リッチオリゴヌクレオチドであり、強力な抗がんアプタマーとして長い間確立されてきた。構造的には、ＡＳ１４１１はおそらく複数の異なるＧ－四重鎖コンフォメーションで存在し、複数のＧ－四重鎖コンフォメーションをとりうる単一オリゴヌクレオチドの例となっている。処理は以下の濃度で行った：それぞれ０．５、１、２、４μＭのｎＣｐＧ－６－ＰＴＯ（黒円）、ＡＳ１４１１－ＰＴＯ（灰色円）、ＡＳ１４１１－ＰＤＥ（薄い灰色円）。手順は実施例１に記載したように行った。

【0051】

【0052】

図５に示すように、ｎＣｐＧ－６－ＰＴＯは高い抗ウイルス有効性を示した。抗ウイルス薬として試験中のＡＳ１４１１－ＰＤＥは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対して有効性を示さなかった。骨格をＰＴＯ結合に置き換えた場合にのみ、ｎＣｐＧ－６－ＰＴＯに匹敵する抗ウイルス有効性が明らかになった。

【0053】

実施例６
ｎＣｐＧ－６－ＰＴＯは単純ヘルペス１（ＨＳＶ－１）に対しても抗ウイルス有効性を示す。
ｎＣｐＧ－６－ＰＴＯまたはｎＣｐＧ－６－ＰＤＥをＨＳＶ－１とともにヒト包皮線維芽細胞に適用した。２日後、ＨＳＶ－１感染の細胞病原性効果（ＣＰＥ）を目視によるスコアリングによって決定した。処理は以下の濃度で行った：０．５、１、２、４μＭ。

【0054】

図６では、ｎＣｐＧ－６－ＰＴＯは試験した濃度範囲でＨＳＶ－１によって引き起こされるＣＰＥを完全に抑制することが示されている（黒色棒）。注目すべきは、ｎＣｐＧ－６－ＰＤＥもＨＳＶ－１のＣＰＥの抑制を示したことである（灰色棒）、ただし、１μＭ以上の濃度でのみである。

【0055】

実施例７
ｎＣｐＧ－６－ＰＴＯは四重鎖（Ｇ４）を形成する
可能性のある作用機序を解明するために、低ナノモル親和性でＤＮＡおよびＲＮＡのＧ－四重鎖構造を高い選択性で認識する特異的抗体を用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏで本発明のオリゴヌクレオチド分子の二次構造形成を調べた。

【0056】

５’－Ｃｙ５標識ｎＣｐＧ－６－ＰＴＯ（２μｇ）を、Ｇ４二次構造に特異的な抗体であるＢＧ４（Ｂｉｏｚｏｌ ＡＢＡ－ＡＢ００１７４－１．１、Ｅｃｈｉｎｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）の２００ｎｇまたは４００ｎｇと、室温で１５分間混合した。１０％非変性ネイティブＰＡＧＥ（１００Ｖ、１４．７Ｖ／ｃｍに相当）、０．５×ＴＢＥで分離した後、蛍光をＬＩ－ＣＯＲ Ｏｄｙｓｓｅｙ Ｇｅｌドキュメンテーションシステム（Ｂａｄ Ｈｏｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて捕捉した。ＢＧ４と５’－Ｃｙ５標識ｎＣｐＧ－６－ＰＴＯを含むＧ４との滴定により、抗体がＧ４形成ＤＮＡに結合することが示された（図７Ａ、レーン２、３）。ＢＧ４抗体の非存在下では、複合体の形成は検出されなかった（最初のレーン）。

【0057】

細胞レベルでＧ４構造を表示するために、Ａ３７５細胞（ヒト悪性黒色腫細胞株）を、４μＭｎＣｐＧ－６－ＰＴＯの存在下または非存在下で、ガラスカバースリップ上で２４時間培養した。２％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳで固定した後、細胞を透過処理し、ＰＢＳ中の０．１％ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００／５％正常ヤギ血清でブロックした。一次抗体ＢＧ４（ＢＳＡ中０．５μｇ／ｍｌ）を、室温で９０分間細胞に適用した；マウスＩｇＧ１抗体（Ｄａｋｏ）がコントロールとして機能した。Ａｌｅｘａ ４８８に結合した抗マウスＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とインキュベートした後、Ｚｅｉｓｓ顕微鏡を用いて代表的な画像を撮影した。調べたすべての細胞は、一次ＢＧ４抗体非存在下（図７、左パネル、コントロール）では観察されなかった点状の核染色（図７Ｂ、右パネル、実験条件：４μＭ ｎＣｐＧ－６－ＰＴＯの矢印）を示した。

【0058】

実施例８
ｎＣｐＧ－６－ＰＴＯはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヘリカーゼを阻害する。
ヘリカーゼアッセイは、Ａｄｅｄｅｊｉらの方法（Ａｄｅｄｅｊｉら、２０１２）にしたがって実施した。簡単に言うと、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来のヘリカーゼであるｎｓｐ１３を、Ｑｕｅｎｃｈ２：５’－ＣＧＣＡＧＴＣＴＴＣＴＣＣＴＧＧＴＧＣＴＣＧＡＡＣＡＧＴＧＡＣ－３’－ＢＨＱ１およびＦｌｕ２：Ｃｙ３－５’－ＧＴＣＡＣＴＧＴＴＣＧＡＧＣＡＣＣＡ－３’からなるハイブリダイゼーションプライマーとインキュベートした。ヘリカーゼ活性は、プライマーＦｌｕ２の蛍光がこれ以上消光しないようにハイブリッドを分離する。捕捉プローブとして過剰のＣａｐｔｕｒｅＱ２：５’－ＧＴＣＡＣＴＧＴＧＴＧＴＧを加えると、Ｆｌｕ２がＱｕｅｎｃｈ２に再アニーリングすることを防止される。図８の上段は、アッセイの原理を表した図式である。ヘリカーゼアッセイは、比較のために漸増濃度のｎＣｐＧ－６－ＰＴＯまたはｎＣｐＧ－６－ＰＤＥ（０．２、１、４ｍＭ）を用いて行った。生成物は６％非変性ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）で分離した（図８、下段）。漸増濃度のｎＣｐＧ－６－ＰＴＯを加えると、ｎｓｐ１３が阻害され、これは消光したハイブリッドの量が増加することによって示された（コントロール、レーン２に対して、レーン５、６を参照）。同濃度のｎＣｐＧ－６－ＰＤＥを加えても、ヘリカーゼ活性を同様に阻害することはできず、これはコントロールに匹敵する蛍光一本鎖の存在によって示された。

【0059】

実施例９
ｎＣｐＧ－６－ＰＴＯはＩＦＮ Ｉ型（ＩＦＮβ）に誘導されるＳＴＡＴリン酸化を抑制する
Ｉ型インターフェロンシグナル伝達経路の図式を図９Ａに示す（Ｇｏｎｚａｌｅｚ－Ｃａｏら、２０１８）。Ｃａｌｕ－３細胞を４μＭ ｎＣｐＧ－６－ＰＤＥ、ｎＣｐＧ－６－ＰＴＯ、ＡＳ１４１１－ＰＴＯ、ＡＳ１４１１－ＰＤＥで１時間処理し、次いでＩＦＮβ（２０ｎｇ／ｍｌ）で刺激した。関節リウマチ治療薬であり、ヤヌスキナーゼ亜型、ＪＡＫ１およびＪＡＫ２のよく知られた阻害剤であるバリシチニブを対照として用いた（１ｍＭ）。１０分後、細胞を、プロテアーゼ阻害剤とホスファターゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を添加したＳｔｒａｗｎ Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ［ｐＨ７．５］、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ １００、１０％グリセロール）で超音波処理し、５分間煮沸し、次いでＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲルで分離した。連続して、タンパク質をＰＶＤＦ膜にイムノブロットした。膜をブロッキングバッファー（ＴＢＳ［ｐＨ７．６］、０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０、５％脱脂乾燥乳）で少なくとも１時間、ＲＴでブロッキングした後、以下の一次抗体とインキュベートした：ｐ－Ｓｔａｔ－１（Ｔｙｒ７０１）、ｐ－Ｓｔａｔ－２（Ｔｙｒ６９０）、ｐ－Ｓｔａｔ－３（Ｔｙｒ７０５）、すべてＣＳＴ（Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）より、および等量のローディングのコントロールとして抗バクチン（ＳａｎｔａＣｒｕｚ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）。結合した一次抗体は、ウサギ抗ヤギＩｇＧ－ホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲート（Ｄａｋｏ、Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて検出し、ＬｕｍｉＧｌｏ検出システム（ＣＳＴ）で可視化した。図９Ｂに示す結果は、ｎＣｐＧ－６－ＰＴＯによるＳｔａｔ１およびＳｔａｔ２のリン酸化の阻害を明確に示しているが、ｎＣｐＧ－６－ＰＤＥによる阻害は示していない；同様に、Ｇ－リッチ四重鎖を形成するＡＳ１４１１のＰＴＯ型は、Ｓｔａｔ１およびＳｔａｔ２の両方のチロシンリン酸化を十分に抑制したが、ＰＤＥ型はそうすることができなかった。

【0060】

実施例１０
ｎＣｐＧ－６－ＰＴＯはＩＦＮ ＩＩ型（ＩＦＮｇ）に誘導されるＪＡＫ２およびＳＴＡＴリン酸化を抑制する
ＩＩ型インターフェロンシグナル伝達経路の図式を図１０Ａに示す（Ｇｏｎｚａｌｅｚ－Ｃａｏら、２０１８）。実験設定については、上記、実施例９を参照のこと：Ｃａｌｕ－３細胞を４μＭ ｎＣｐＧ－６－ＰＤＥ、ｎＣｐＧ－６－ＰＴＯ、ＡＳ１４１１－ＰＴＯ、ＡＳ１４１１－ＰＤＥで１時間処理し、次いでＩＦＮｇ（２０ｎｇ／ｍｌ）で刺激した。ＳＤＳページで分離した後、ｐ－Ｓｔａｔ－１（Ｔｙｒ７０１）、ｐ－Ｓｔａｔ－２（Ｔｙｒ６９０）、ｐ－Ｓｔａｔ－３（Ｔｙｒ７０５）およびｐ－ＪＡＫ２（Ｔｙｒ１００７／Ｔｙｒ１００８）抗体、すべてＣＳＴ（Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）より、および等量のローディングのコントロールとして抗バクチン（ＳａｎｔａＣｒｕｚ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてリン酸化を検出した。

【0061】

ウエスタンブロット解析、図１０Ｂは、正準シグナル伝達分子ｐ－ＪＡＫ２およびｐＳｔａｔ１のチロシンリン酸化の強い下方制御を示す。また、ｐＳｔａｔ２／３に対する抑制効果も認められ、Ｉ型とＩＩ型のシグナル伝達経路が部分的に重複していることが確認されたＧａｒｃｉａ－Ｄｉａｚ Ａ、Ｓｈｉｎ ＤＳ、Ｍｏｒｅｎｏ ＢＨら、（２０１７） Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｐａｔｈｗａｙｓ Ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ＰＤ－Ｌ１ ａｎｄ ＰＤ－Ｌ２ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ． Ｃｅｌｌ ｒｅｐｏｒｔｓ １９：１１８９～２０１）。

【0062】

実施例１１
ｎＣｐＧ－６－ＰＴＯはインターロイキン６（ＩＬ－６）を媒介するＳＴＡＴ－３のリン酸化を抑制する
インターロイキン６（ＩＬ－６）のシグナル伝達経路の図式を図１１Ａに示す（Ｊｉｎら、２０１７）。実験設定については、上記、実施例９を参照のこと：Ｃａｌｕ－３細胞を４μＭ ｎＣｐＧ－６－ＰＤＥ、ｎＣｐＧ－６－ＰＴＯ、ＡＳ１４１１－ＰＴＯ、ＡＳ１４１１－ＰＤＥで１時間処理し、ＩＬ－６（２０ｎｇ／ｍｌ）で刺激した。ＳＤＳページで分離した後、ｐ－Ｓｔａｔ－１（Ｔｙｒ７０１）、ｐ－Ｓｔａｔ－２（Ｔｙｒ６９０）、ｐ－Ｓｔａｔ－３（Ｔｙｒ７０５）抗体、すべてＣＳＴ（Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）より、および等量のローディングのコントロールとして抗バクチン（ＳａｎｔａＣｒｕｚ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてリン酸化を検出した。

【0063】

ウエスタンブロット解析、図１１Ｂは、チロシンリン酸化の強い下方制御を示す。ウエスタンブロット解析は、ｐＳｔａｔ３の下方制御を示す。また、ｐＳｔａｔ１に対する抑制効果も認められた。

【0064】

実施例１２
以下では、ホスホロチオエートを介して結合した２０個のグアノシンからなるオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）、ｎＣｐＧ－６－ＰＴＯが、黒色腫細胞におけるＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２の発現を阻害することを示す。

【0065】

以下のＯＤＮが実験に供された。大文字はホホロチオエート（ｐｈｏｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ）結合（ＰＴＯ）を表し、小文字は古典的なホスホジエステル結合を表す（ＣｐＧ－２１１８）。
表1

【0066】

図１６は、オリゴヌクレオチドがＰＤ－Ｌ１とＰＤ－Ｌ２のタンパク質発現を抑制することを示している。

【0067】

ＩＦＮγ（２０ｎｇ／ｍｌ）で１時間前刺激したＡ３７５黒色腫細胞を、異なるオリゴヌクレオチド（４μＭ）に曝露した。骨格と配列に関するオリゴの特徴を表１に示す。（Ａ）２４時間後に総タンパク質を抽出し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離した。ブロットしたタンパク質を抗ＰＤ－Ｌ１および抗ＰＤ－Ｌ２で探索した。抗ベータアクチンを用いた探索はローディングコントロールとして機能した。画像は代表的な結果を示す。（Ｂ）Ａ３７５細胞において４μＭ ＣｐＧ－１－ＰＴＯおよび４μＭ ｎＣｐＧ－６－ＰＴＯで処理した後のＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２に対するＦＡＣＳスキャンの結果の一例。４μＭのＣｐＧ－１－ＰＴＯまたはｎＣｐＧ－６－ＰＴＯで処理した（Ｃ）Ａ３７５細胞および（Ｄ）ＳＫ－Ｍｅｌ－２８細胞を用いた９回の独立したＦＡＣＳ実験のまとめ。標準偏差を示す。データは参照ポジティブコントロール（ＩＦＮγ）と関係していた。＊ｐ＜０．０５。

【0068】

結果：ｎＣｐＧ－６－ＰＴＯはＡ３７５およびＳＫ－Ｍｅｌ－２８黒色腫細胞のＰＤ－Ｌ１／２発現を阻害する。

【0069】

図１７は、ｎＣｐＧ－６－ＰＴＯおよびＣｐＧ－１－ＰＴＯによるＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２の抑制、濃度および分子長の影響を示している。

【0070】

ＩＦＮγで刺激したＡ３７５細胞を漸増濃度の（Ａ）ｎＣｐＧ－６－ＰＴＯ（１、２、４μＭ）または（Ｂ）ＣｐＧ－１－ＰＴＯ（４、６、８μＭ）で処理した。同様に、ＳＫ－Ｍｅｌ－２８細胞は漸増濃度の（Ｃ）ｎＣｐＧ－６－ＰＴＯまたは（Ｄ）ＣｐＧ－１－ＰＴＯで処理した。さらに、ＯＤＮの長さの影響も調べた。ＩＦＮγ刺激Ａ３７５細胞を、（Ｅ）４μＭ ｎＣｐＧ－６－ＰＴＯおよび参照欠失突然変異体（ｎＣｐＧ－６Ｂ／６Ｄ／６Ｇ－ＰＴＯ）、または（Ｆ）４μＭ ＣｐＧ－１－ＰＴＯおよび参照欠失突然変異体（ＣｐＧ－１４／１２／９－ＰＴＯ）で処理した。同様に、ＳＫ－Ｍｅｌ－２８細胞を（Ｇ）ｎＣｐＧ－６－ＰＴＯ、または（Ｈ）ＣｐＧ－１－ＰＴＯおよびその欠失突然変異体で処理した。２４時間後、ＰＤ－Ｌ１とＰＤ－Ｌ２の発現をＦＡＣＳで測定した。各バーは６回の独立した実験の平均を示す。標準偏差を示す。データは参照ポジティブコントロール（ＩＦＮγ）と関係していた。＊ｐ＜０．０５。

【0071】

結果：ｎＣｐＧ－６－ＰＴＯは低濃度（１μＭ）で作用する。効果は長さ依存的で、すでに１つの６－ｍｅｒ（ｎＣｐＧ－６Ｇ－ＰＴＯ）が有効である。

【0072】

図１８は、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲによるＰＤ－Ｌ１とＰＤ－Ｌ２の発現解析を示す。

【0073】

Ａ３７５メラノーマ細胞をＩＦＮγで１時間刺激した後、ＣｐＧ－１－ＰＴＯまたはｎＣｐＧ－６－ＰＴＯで３、６、２４時間インキュベートした。続いて、総ＲＮＡを抽出し、記載したように定量的ＲＴ－ＰＣＲを行った。（Ａ）ＰＤ－Ｌ１および（Ｂ）ＰＤ－Ｌ２の結果が表示されている。各列は３つの独立した実験の平均を示す。標準偏差を示す。統計解析は、ＩＦＮγ単独で処理したコントロールとの関係で行った。＊ｐ＜０．０５。

【0074】

結果：ｎＣｐＧ－６－ＰＴＯはＰＤ－Ｌ１ＲＮＡ発現を阻害する。

【0075】

図１９は、プロモーター機能解析を示す。

【0076】

（Ａ）ＰＤ－Ｌ１および（Ｂ）ＰＤ－Ｌ２プロモーターの一過性ルシフェラーゼレポーターアッセイ。Ａ３７５黒色腫細胞に、関連する転写結合部位の欠失を含むＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２プロモーターコンストラクトをトランスフェクトした。２０ｎｇ／ｍｌのＩＦＮγで１時間刺激した後、細胞を４μＭのＣｐＧ－１－ＰＴＯまたはｎＣｐＧ－６－ＰＴＯで１６時間処理した。（Ｃ）４μＭ ＣｐＧ－１－ＰＴＯまたはｎＣｐＧ－６－ＰＴＯで１時間前処理し、沈殿のためにＩＲＦ１抗体を用いて６時間連続ＩＦＮγ刺激した後のＣｈＩＰアッセイ。ＰＤ－Ｌ１または（Ｄ）ＰＤ－Ｌ２プロモーター特異的プライマーを用いてＰＣＲを行った。各列は３回の実験の平均を表す。統計解析は、ＩＦＮγ単独で処理したコントロールとの関係で行った。＊ｐ＜０．０５。

【0077】

結果：ｎＣｐＧ－６－ＰＴＯはＰＤ－Ｌ１／２プロモーターを阻害する。ＩＲＦ－１（ＣｈＩＰ）とＳｔａｔ－１／３を介した作用。

【0078】

図２０は、インターフェロン受容体シグナル伝達タンパク質のウエスタンブロット解析を示す。

【0079】

Ａ３７５細胞を４μＭＣｐＧ－１－ＰＴＯまたは４μＭ ｎＣｐＧ－６－ＰＴＯで、それ以上刺激せずに（基礎活性化、１～３行目）、またはＩＦＮγで２つの時間（ｔ１およびｔ２）追加刺激した。タンパク質抽出物をウエスタンブロットに供し、ＩＲＦ１（ｔ１：６０分、ｔ２：３時間）、ｐ－ＪＡＫ－１（ｔ１：１０分；ｔ２：３０分）、ｐ－ＪＡＫ－２（ｔ１：１０分；ｔ２：３０分）、ｐ－ＳＴＡＴ－１（ｔ１：１０分；ｔ２：３０分）、ｐ－ＳＴＡＴ－２（ｔ１：１０分；ｔ２：３０分）、ｐ－ＳＴＡＴ－３（ｔ１：１０分；ｔ２：３０分）の発現を試験した。リン酸化タンパク質の全形態に対する抗体を用いて、またはＩＲＦ１の場合はＧＡＰＤＨによって、等量のローディングをモニターした（右側のブロット）。ブロットは代表的な結果を示す（ｎ＝３）。ｐ－、ホスホ。

【0080】

結果：ｎＣｐＧ－６－ＰＴＯはＩＦＮγシグナル伝達経路を阻害する。

【0081】

図２１は、ｎＣｐＧ－６－ＰＴＯがＧ－四重鎖（Ｇ４）を形成し、ＩＦＮＧＲ２に結合することを示す。

【0082】

（Ａ）５’－Ｃｙ５標識ＣｐＧ－１－ＰＴＯおよびｎＣｐＧ－６－ＰＴＯ（２μｇ）を、Ｇ４二次構造を特異的に認識する抗体であるＢＧ４の２００ｎｇおよび４００ｎｇと混合した。画像はＰＡＧＥ後の蛍光を示す。（Ｂ）４μＭ ＣｐＧ－１－ＰＴＯ、４μＭ ｎＣｐＧ－６－ＰＴＯまたは１μＭ ピリドスタチン（Ｇ４を安定化する）で２４時間処理したＡ３７５－細胞を固定し、ＢＧ４抗体で染色した。ＢＧ４反応性は、ｎＣｐＧ－６－ＰＴＯで処理した細胞の細胞外腔にも見られた（矢印参照）。示した画像は代表的な切片である。（Ｃ）５’－Ｃｙ５標識ＣｐＧ－１－ＰＴＯおよびｎＣｐＧ－６－ＰＴＯ（２μｇ）を２００ｎｇおよび４００ｎｇのＩＦＮＧＲ１またはＩＦＮＧＲ２と混合し、ＰＡＧＥで分離した。画像はＰＡＧＥ後の蛍光を示す。

【0083】

結果：ｎＣｐＧ－６－ＰＴＯはＧ４を形成する。ｎＣｐＧ－６－ＰＴＯはＩＦＮγ受容体のシグナル伝達サブユニット（ＩＦＮＧＲ２］に結合する。

【0084】

結論
ｎＣｐＧ－６－ＰＴＯはＧ４を形成する（図２１Ａ、Ｂ）。
ｎＣｐＧ－６－ＰＴＯはＰＤ－Ｌ１とＰＤ－Ｌ２の発現を阻害する（タンパク質／ｍＲＮＡ／プロモーター；図１６～１９）。
ｎＣｐＧ－６－ＰＴＯはＩＦＮγ受容体のシグナル伝達サブユニット（ＩＦＮＧＲ２）に結合する（図２１Ｃ）。
ｎＣｐＧ－６－ＰＴＯは、ＩＦＮγ依存性シグナル伝達分子（ＪＡＫ－１／２、Ｓｔａｔ１、２、３、およびＩＲＦ１）を阻害する（図２０）。

【0085】

ＩＲＦ１の阻害は、ＰＤ－Ｌ１プロモーターの活性化を阻害する（図１５）。

【0086】

Ｇ４形成ＯＤＮは、ＰＤ－Ｌ１（およびＰＤ－Ｌ２）の発現を阻害することによってＴ細胞を活性化し、内因性の抗腫瘍反応を増強するため、単剤療法または併用療法としての免疫療法に有用である。これは、腫瘍疾患だけでなく、ウイルス関連疾患（ＣＯＶＩＤ－１９など）の治療にも有用である。Ｇ４形成ＯＤＮは炎症性メディエーター（ＪＡＫ、Ｓｔａｔ）を阻害するのにも有用である。特に有効なＧ４形成ＯＤＮはｎＣｐＧ－６－ＰＴＯである。

【0087】

抗体によってＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１などのチェックポイント分子の相互作用を標的とすることで、Ｔ細胞の機能を活性化し、それによって腫瘍細胞の免疫認識からの回避を阻止することが証明されている。チェックポイント阻害剤の臨床的有用性は、黒色腫や非小細胞肺がんなどの様々な腫瘍で十分に確立されている。さらに、肝臓がん、腎がん、ホジキン病、結腸直腸がん、乳がんなどの治療にも成功している。

【0088】

最近、高病原性鳥インフルエンザＡ（Ｈ５Ｎ１）ウイルスや他の鳥インフルエンザＡウイルス亜型（Ｈ７Ｎ９、Ｈ９Ｎ２、Ｈ７Ｎ３）がヒトの疾患に関連していることが判明し、家禽や家畜に循環するＡ型インフルエンザウイルス亜型がヒトに伝播する可能性によるパンデミックの懸念が高まっている。

【0089】

ここで導入したＧ４によるＰＤ－Ｌ１／２の下方制御という治療概念は、チェックポイント分子を標的とする他の治療法と組み合わせることができる。ここで挙げるのは、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、アベルマブ、セミピリマブ、ＢＭＳ－２０２など、ＰＤ－１やＰＤ－Ｌ１を標的とする抗体ベースの薬物である。また、イピリムマブ（ＣＴＬＡ－４に対する）のような他のチェックポイント分子を標的とする化合物も考えられる。さらに、Ｇ４オリゴヌクレオチドは、化学療法、低分子、放射線照射などの他の抗腫瘍治療と組み合わせることができる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【配列表】

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【国際調査報告】