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▶ サンガモ セラピューティクス，インコーポレイテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-07-17
(54)【発明の名称】ＩＬ－２３Ｒに特異的な抗原結合体及びその使用
(51)【国際特許分類】
C07K 16/28 20060101AFI20240709BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20240709BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20240709BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20240709BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20240709BHJP
C12N 15/85 20060101ALI20240709BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240709BHJP
C12N 5/0783 20100101ALI20240709BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20240709BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20240709BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20240709BHJP
A61P 1/04 20060101ALI20240709BHJP
A61P 37/02 20060101ALI20240709BHJP
A61P 19/02 20060101ALI20240709BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20240709BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20240709BHJP
A61P 19/08 20060101ALI20240709BHJP
A61P 17/06 20060101ALI20240709BHJP
A61P 21/04 20060101ALI20240709BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20240709BHJP
A61P 27/02 20060101ALI20240709BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240709BHJP
【ＦＩ】
C07K16/28 ZNA
C07K19/00
C12N15/13
C12N15/12
C12N15/62 Z
C12N15/85 Z
C12N5/10
C12N5/0783
A61K35/17
A61P29/00
A61P37/06
A61P1/04
A61P37/02
A61P29/00 101
A61P19/02
A61P25/00
A61P3/10
A61P19/08
A61P17/06
A61P21/04
A61P17/00
A61P27/02
A61P43/00 111
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023579361
(86)(22)【出願日】2022-06-24
(85)【翻訳文提出日】2024-01-19
(86)【国際出願番号】 US2022035028
(87)【国際公開番号】W WO2022272153
(87)【国際公開日】2022-12-29
(31)【優先権主張番号】21181801.8
(32)【優先日】2021-06-25
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(31)【優先権主張番号】63/214,950
(32)【優先日】2021-06-25
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】523443180
【氏名又は名称】サンガモ セラピューティクス，インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100114775
【弁理士】
【氏名又は名称】高岡 亮一
(74)【代理人】
【識別番号】100121511
【弁理士】
【氏名又は名称】小田 直
(74)【代理人】
【識別番号】100202751
【弁理士】
【氏名又は名称】岩堀 明代
(74)【代理人】
【識別番号】100208580
【弁理士】
【氏名又は名称】三好 玲奈
(74)【代理人】
【識別番号】100191086
【弁理士】
【氏名又は名称】高橋 香元
(72)【発明者】
【氏名】アベル，トビアス
(72)【発明者】
【氏名】デ ラ ロサ，マウルス
(72)【発明者】
【氏名】フェナルド，デイビッド
(72)【発明者】
【氏名】ガートナー－ダーデン，ジュリー
【テーマコード（参考）】
4B065
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA92X
4B065AA94X
4B065AA98X
4B065CA44
4C087BB37
4C087BB65
4C087CA05
4C087CA16
4C087NA14
4C087ZA02
4C087ZA33
4C087ZA66
4C087ZA89
4C087ZA91
4C087ZA94
4C087ZA96
4C087ZB05
4C087ZB08
4C087ZB11
4C087ZB15
4C087ZC35
4H045AA10
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045DA76
4H045EA22
4H045FA74
(57)【要約】
ＩＬ２３Ｒ過剰発現は、自己免疫疾患及び慢性炎症の発症及び維持に関与する病原性炎症細胞の共通の特徴として説明されている。本開示は、ＩＬ－２３Ｒを指向する新規の抗原結合体、該抗原結合体を含む組成物、及び該抗原結合体の使用に関する。本開示はさらに、該抗原結合体を含む融合タンパク質、例えばキメラ抗原受容体に関する。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
単離された抗ＩＬ－２３受容体（ＩＬ－２３Ｒ）抗体またはその抗原結合フラグメントであって、前記抗体またはフラグメントの重鎖可変領域（ＶＨ）が、それぞれ配列番号１～３を含む相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１～３、または配列番号１～３のうちの１つと少なくとも約９０％の同一性を共有するアミノ酸配列を有する任意のＨＣＤＲを含み、かつ
前記抗体またはフラグメントの軽鎖可変領域（ＶＬ）が、それぞれ配列番号４～６を含む相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１～３、または配列番号４～６のうちの１つと少なくとも約９０％の同一性を共有するアミノ酸配列を有する任意のＬＣＤＲを含む、
前記抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項2】
単離された抗ＩＬ－２３受容体（ＩＬ－２３Ｒ）抗体またはその抗原結合フラグメントであって、前記抗体またはフラグメントの重鎖可変領域（ＶＨ）が、それぞれ配列番号１～３を含む相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１～３を含み、かつ
前記抗体またはフラグメントの軽鎖可変領域（ＶＨ）が、それぞれ配列番号４～６を含む相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１～３を含む、
前記抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項3】
マウス及びヒトＩＬ－２３Ｒを結合することができる、請求項１に記載の単離された抗ＩＬ－２３Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項4】
４０ｎＭ未満のＥＣ５０でヒトＩＬ－２３Ｒアルファサブユニットに結合することができる、請求項１または３に記載の単離された抗ＩＬ－２３Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項5】
６０ｎＭ未満のＥＣ５０でマウスＩＬ－２３Ｒアルファサブユニットに結合することができる、請求項１～３のいずれか１項に記載の単離された抗ＩＬ－２３Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項6】
前記ＶＨが、配列番号７または配列番号７に対して少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、かつ前記ＶＬが、配列番号８または配列番号８に対して少なくとも約９０％同一である任意のアミノ酸配列を含む、
請求項１～５のいずれか１項に記載の単離された抗ＩＬ－２３Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項7】
前記ＶＨが配列番号７を含み、かつ前記ＶＬが配列番号８を含む、
請求項６に記載の単離された抗ＩＬ－２３Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項8】
配列番号１５または配列番号１５に対して少なくとも約９５％同一である任意のアミノ酸配列を含むｓｃＦｖである、請求項１～７のいずれか１項に記載の単離された抗ＩＬ－２３Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項9】
配列番号１５を含むｓｃＦｖである、請求項８に記載の単離された抗ＩＬ－２３Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項10】
（ｉ）請求項１～９のいずれか１項に記載の抗ＩＬ－２３Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントを含む細胞外ドメインと、（ｉｉ）膜貫通ドメインと、
（ｉｉｉ）細胞内シグナル伝達ドメインを含む細胞質ドメインと、
を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
【請求項11】
リーダー配列をさらに含む、請求項１０に記載のＣＡＲ。
【請求項12】
前記細胞外ドメインが、配列番号１５を含むｓｃＦｖを含む、請求項１０または１１に記載のＣＡＲ。
【請求項13】
前記細胞内シグナル伝達ドメインが、ヒトＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインであって、任意選択で、配列番号３２もしくは配列番号３２に対して少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含む前記ヒトＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメイン、及び／または
ヒトＣＤ３ゼータドメインであって、任意選択で、配列番号３０もしくは配列番号３０に対して少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含む前記ヒトＣＤ３ゼータドメイン
を含む、請求項１０～１２のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
【請求項14】
前記膜貫通ドメインがヒトＣＤ８に由来し、任意選択で、配列番号２２または配列番号２２に対して少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１０～１３のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
【請求項15】
前記リーダー配列が、ＣＤ８リーダー配列であって、任意選択で配列番号４０または配列番号４０に対して少なくとも約９５％（例えば約９６％、９７％、９８％または９９％）同一であるアミノ酸配列を含む前記ＣＤ８リーダー配列に由来するアミノ酸配列を含む、請求項１０～１４のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
【請求項16】
前記リーダー配列が、ＣＤ２５リーダー配列であって、任意選択で配列番号５８または配列番号５８に対して少なくとも約９５％（例えば約９６％、９７％、９８％または９９％）同一であるアミノ酸配列を含む前記ＣＤ２５リーダー配列に由来するアミノ酸配列を含む、請求項１０～１４のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
【請求項17】
（ｉ）抗ＩＬ－２３Ｒ ｓｃＦｖであって、任意選択で配列番号１５を含む、前記抗ＩＬ－２３Ｒ ｓｃＦｖと、（ｉｉ）ヒトＣＤ８由来のヒンジドメインであって、任意選択で配列番号２０を含む、前記ヒンジドメインと、
（ｉｉｉ）ヒトＣＤ８由来の膜貫通ドメインであって、任意選択で配列番号２２を含む、前記膜貫通ドメインと、
（ｉｖ）ヒトＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインであって、任意選択で配列番号３２を含む、前記細胞内シグナル伝達ドメイン、及びヒトＣＤ３ゼータドメインであって、任意選択で配列番号３０を含む、前記ヒトＣＤ３ゼータドメインと、
（ｖ）任意選択でタグ及び／またはリーダー配列と、
を含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
【請求項18】
（ｉ）抗ＩＬ－２３Ｒ ｓｃＦｖであって、任意選択で配列番号１５を含む、前記抗ＩＬ－２３Ｒ ｓｃＦｖと、（ｉｉ）ヒトＣＤ８由来のヒンジドメインであって、任意選択で配列番号２０を含む、前記ヒンジドメインと、
（ｉｉｉ）ヒトＣＤ８由来の膜貫通ドメインであって、任意選択で配列番号２２を含む、前記膜貫通ドメインと、
（ｉｖ）ヒトＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインであって、任意選択で配列番号３２を含む、前記細胞内シグナル伝達ドメイン、及びヒトＣＤ３ゼータドメインであって、任意選択で配列番号３０を含む、前記ヒトＣＤ３ゼータドメインと、
（ｖ）ＣＤ８に由来するリーダー配列であって、任意選択で配列番号４０を含む、前記リーダー配列と、
を含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
【請求項19】
（ｉ）抗ＩＬ－２３Ｒ ｓｃＦｖであって、任意選択で配列番号１５を含む、前記抗ＩＬ－２３Ｒ ｓｃＦｖと、（ｉｉ）ヒトＣＤ８由来のヒンジドメインであって、任意選択で配列番号２０を含む、前記ヒンジドメインと、
（ｉｉｉ）ヒトＣＤ８由来の膜貫通ドメインであって、任意選択で配列番号２２を含む、前記膜貫通ドメインと、
（ｉｖ）ヒトＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインであって、任意選択で配列番号３２を含む、前記細胞内シグナル伝達ドメイン、及びヒトＣＤ３ゼータドメインであって、任意選択で配列番号３０を含む、前記ヒトＣＤ３ゼータドメインと、
（ｖ）ＣＤ２５に由来するリーダー配列であって、任意選択で配列番号５８を含む、前記リーダー配列と、
を含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
【請求項20】
請求項１～９のいずれか１項に記載の抗体もしくは抗原結合フラグメントまたは請求項１０～１９のいずれか１項に記載のＣＡＲをコードする核酸分子。
【請求項21】
請求項２０に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項22】
請求項１０～１９のいずれか１項に記載のＣＡＲを発現する、または請求項２０に記載の核酸分子もしくは請求項２１に記載のベクターを含む、免疫細胞。
【請求項23】
請求項２０に記載の核酸分子または請求項２１に記載のベクターを含む細胞。
【請求項24】
免疫細胞である、請求項２３に記載の細胞。
【請求項25】
請求項２２に記載の免疫細胞、または請求項２３もしくは請求項２４に記載の細胞を含む、組成物。
【請求項26】
医薬として使用するための、請求項２２に記載の免疫細胞、請求項２２に記載の免疫細胞集団、請求項２３もしくは請求項２４に記載の細胞、または請求項２３もしくは２４に記載の細胞集団。
【請求項27】
治療を必要とする対象におけるＩＬ－２３Ｒ発現細胞によって媒介される疾患または障害の治療に使用するための、請求項２２に記載の免疫細胞、請求項２２に記載の免疫細胞集団、請求項２３もしくは請求項２４に記載の細胞、または請求項２３もしくは２４に記載の細胞集団であって、任意選択で前記疾患または障害が、自己免疫性または炎症性疾患または障害である、前記免疫細胞、前記免疫細胞集団、前記細胞、または前記細胞集団。
【請求項28】
前記疾患または障害が、炎症性腸疾患（任意選択でクローン病または潰瘍性大腸炎）、ループス（任意選択で全身性エリテマトーデス）、関節炎（任意選択で関節リウマチまたは若年性特発性関節炎）、シェーグレン症候群、全身性硬化症、多発性硬化症、強直性脊椎炎、１型糖尿病、自己免疫性甲状腺障害、重症筋無力症、乾癬、乾癬性関節炎、皮膚疾患、及びブドウ膜炎からなる群から選択され、さらに任意選択で前記疾患がクローン病である、請求項２７に記載の使用のための免疫細胞または細胞。
【請求項29】
治療を必要とする対象における疾患または障害を治療するための方法であって、患者に、請求項２２に記載の免疫細胞、請求項２２に記載の免疫細胞集団、請求項２３もしくは請求項２４に記載の細胞、または請求項２３もしくは２４に記載の細胞集団を投与することを含む、前記方法。
【請求項30】
前記疾患または障害が、治療を必要とする前記対象におけるＩＬ－２３Ｒ発現細胞によって媒介され、任意選択で、前記疾患または障害が自己免疫性または炎症性疾患または障害である、請求項２９に記載の方法。
【請求項31】
前記疾患または障害が、炎症性腸疾患（任意選択でクローン病または潰瘍性大腸炎）、ループス（任意選択で全身性エリテマトーデス）、関節炎（任意選択で関節リウマチまたは若年性特発性関節炎）、シェーグレン症候群、全身性硬化症、多発性硬化症、強直性脊椎炎、１型糖尿病、自己免疫性甲状腺障害、重症筋無力症、乾癬、乾癬性関節炎、皮膚疾患、及びブドウ膜炎からなる群から選択され、さらに任意選択で前記疾患がクローン病である、請求項２９または請求項３０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年６月２５日に両方とも出願された米国特許出願第６３／２１４，９５０号及び欧州特許出願第２１１８１８０１．８号の優先権を主張するものである。この両方の優先権主張出願の開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２１年６月２５日に両方とも出願された米国特許出願第６３／２１４，９５０号及び欧州特許出願第２１１８１８０１．８号の優先権を主張するものである。この両方の優先権主張出願の開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0002】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。２０２２年６月２４日に作成された当該ＡＳＣＩＩコピーは、０２５２９７＿ＷＯ０３８＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、４８，５７８バイトのサイズである。
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。２０２２年６月２４日に作成された当該ＡＳＣＩＩコピーは、０２５２９７＿ＷＯ０３８＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、４８，５７８バイトのサイズである。
【背景技術】
【0003】
ＩＬ－１２サイトカインファミリーのメンバーであるインターロイキン－２３（ＩＬ－２３）は、ｐ１９とｐ４０の２つのサブユニットで構成されている。ＩＬ－２３受容体（ＩＬ－２３Ｒ）は、ＩＬ－２３Ｒαサブユニットと、ＩＬ－１２受容体の共通のサブユニットでありチロシンキナーゼ２（Ｔｙｋ２）と相互作用するＩＬ－１２Ｒβ１サブユニットとの複合体からなる。
【0004】
ＩＬ－２３Ｒは、主に免疫細胞、特にＴ細胞（例えば、Ｔｈ１７及びγδＴ細胞）、マクロファージ、樹状細胞、及びＮＫ細胞上で発現する（Ｄｕｖａｌｌｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ Ｍｅｄ．（２０１１）４３（７）：５０３－１１）。ＩＬ－２３／ＩＬ－２３Ｒシグナル伝達経路は、ＩＬ－１７を分泌する免疫細胞、特にＣＤ４＋Ｔｈ１７細胞及びγδＴ細胞の増殖及び分化を促進するのに重要であると説明されている。ＩＬ２３Ｒ過剰発現は、自己免疫疾患及び慢性炎症の発症及び維持に関与する病原性炎症細胞の共通の特徴として説明されている。ＩＬ－２３Ｒの細胞表面発現は、ＩＬ－２３曝露によって誘導され、炎症レベルに応じて異なる。
【発明の概要】
【0005】
本明細書の発明者らは、炎症部位で過剰発現したＩＬ－２３Ｒの結合に基づいて、炎症部位で免疫細胞を活性化するための新規なツールを開発した。より具体的には、本発明者らは、ＩＬ－２３Ｒに結合可能な新規な抗体を本明細書に開示する。特に、本発明者らは、ＩＬ－２３Ｒに高親和性で結合可能な新規な抗体を本明細書に開示する。有利なことに、本発明のＩＬ－２３Ｒ結合抗体は、ヒト及びマウス両方のＩＬ－２３Ｒに結合可能であることが見出されている。免疫細胞の細胞表面上で発現するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）に当該抗体の抗原結合部分を含めることにより、ＩＬ－２３Ｒへ結合すると炎症部位においてこれらの細胞を活性化することが可能となる。本発明者らは、当該抗原結合部分の安定したシグナル伝達及び低バックグラウンドの活性化を開示する。理論に拘束されるものではないが、本発明者らは、本発明のＣＡＲの利点が、該ＣＡＲを発現する免疫細胞（例えばＴ細胞）においてトニックシグナル伝達を低減し、それによって細胞の治療能力を向上させる該ＣＡＲの能力に部分的に存在し得ると仮定する。したがって、これらの操作された免疫細胞は、自己免疫性及び／または炎症性疾患または障害を治療するための価値のある治療ツールとなり得る。
【0006】
一態様では、本開示は、単離された抗ＩＬ－２３受容体（ＩＬ－２３Ｒ）抗体またはその抗原結合フラグメントであって、該抗体またはフラグメントの重鎖可変領域（ＶＨ）が、それぞれ配列番号１～３を含む相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１～３、または配列番号１～３のうちの１つと少なくとも約９０％の同一性を共有するアミノ酸配列を有する任意のＣＤＲを含み、かつ該抗体またはフラグメントの軽鎖可変領域（ＶＬ）が、それぞれ配列番号４～６を含む相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１～３、または配列番号４～６のうちの１つと少なくとも約９０％の同一性を共有するアミノ酸配列を有する任意のＣＤＲを含む、該抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。一態様では、本開示は、単離された抗ＩＬ－２３受容体（ＩＬ－２３Ｒ）抗体またはその抗原結合フラグメントであって、該抗体またはフラグメントの重鎖可変領域（ＶＨ）が、それぞれ配列番号１～３と少なくとも約９０％の同一性を共有するアミノ酸配列を有する相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１～３を含み、かつ該抗体またはフラグメントの軽鎖可変領域（ＶＬ）が、それぞれ配列番号４～６と少なくとも約９０％の同一性を共有するアミノ酸配列を有する相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１～３を含む、該抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。一態様では、本開示は、単離された抗ＩＬ－２３受容体（ＩＬ－２３Ｒ）抗体またはその抗原結合フラグメントであって、該抗体またはフラグメントの重鎖可変領域（ＶＨ）が、それぞれ配列番号１～３を含む相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１～３を含み、かつ該抗体またはフラグメントの軽鎖可変領域（ＶＬ）が、それぞれ配列番号４～６を含む相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１～３を含む、該抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントは、マウス及びヒトＩＬ－２３Ｒを結合することができる。いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントは、４０ｎＭ未満のＥＣ５０でヒトＩＬ－２３Ｒアルファサブユニットに結合することができる。いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントは、６０ｎＭ未満のＥＣ５０でマウスＩＬ－２３Ｒアルファサブユニットに結合することができる。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号７または配列番号７に対して少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、かつＶＬは配列番号８または配列番号８に対して少なくとも約９０％同一である任意のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは配列番号７を含み、ＶＬは配列番号８を含む。特定の実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号１５または配列番号１５に対して少なくとも約９５％同一である任意のアミノ酸配列を含むｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号１５を含むｓｃＦｖである。
【0007】
本開示はまた、本明細書に記載の抗ＩＬ－２３Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントを含む細胞外ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインを含む細胞質ドメインと、を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、さらにリーダー配列を含む。いくつかの実施形態では、細胞外ドメインは、配列番号１５を含むｓｃＦｖを含む。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ヒトＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメイン（例えば、配列番号３２または配列番号３２に対して少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含む）及び／またはヒトＣＤ３ゼータドメイン（例えば、配列番号３０または配列番号３０に対して少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含む）を含む。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ヒトＣＤ８（例えば、配列番号２２または配列番号２２に対して少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含む）に由来する。特定の実施形態では、ＣＡＲは、該細胞外ドメイン、該膜貫通ドメイン、及び／または該細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、リーダー配列は、ＣＤ８リーダー配列であって、任意選択で配列番号４０または配列番号４０に対して少なくとも約９５％（例えば約９６％、９７％、９８％または９９％）同一であるアミノ酸配列を含むＣＤ８リーダー配列に由来するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、リーダー配列は、ＣＤ２５リーダー配列であって、任意選択で配列番号５８または配列番号５８に対して少なくとも約９５％（例えば約９６％、９７％、９８％または９９％）同一であるアミノ酸配列を含むＣＤ２５リーダー配列に由来するアミノ酸配列を含む。具体的な実施形態では、ＣＡＲは、抗ＩＬ－２３Ｒ ｓｃＦｖ（例えば、配列番号１５を含む）と、ヒトＣＤ８由来のヒンジドメイン（例えば、配列番号２０を含む）と、ヒトＣＤ８由来の膜貫通ドメイン（例えば、配列番号２２を含む）と、ヒトＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメイン（例えば、配列番号３２を含む）を含む細胞内シグナル伝達ドメインと、ヒトＣＤ３ゼータドメイン（例えば、配列番号３０を含む）と、を含む。ＣＡＲはまた、タグ及び／またはリーダー配列を含んでもよい。具体的な実施形態では、ＣＡＲは、抗ＩＬ－２３Ｒ ｓｃＦｖ（例えば、配列番号１５を含む）と、ヒトＣＤ８由来のヒンジドメイン（例えば、配列番号２０を含む）と、ヒトＣＤ８由来の膜貫通ドメイン（例えば、配列番号２２を含む）と、ヒトＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメイン（例えば、配列番号３２を含む）を含む細胞内シグナル伝達ドメインと、ヒトＣＤ３ゼータドメイン（例えば、配列番号３０を含む）と、ＣＤ８に由来するリーダー配列（例えば、配列番号４０を含む）と、を含む。具体的な実施形態では、ＣＡＲは、抗ＩＬ－２３Ｒ ｓｃＦｖ（例えば、配列番号１５を含む）と、ヒトＣＤ８由来のヒンジドメイン（例えば、配列番号２０を含む）と、ヒトＣＤ８由来の膜貫通ドメイン（例えば、配列番号２２を含む）と、ヒトＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメイン（例えば、配列番号３２を含む）を含む細胞内シグナル伝達ドメインと、ヒトＣＤ３ゼータドメイン（例えば、配列番号３０を含む）と、ＣＤ２５に由来するリーダー配列（例えば、配列番号５８を含む）と、を含む。
【0008】
一態様では、本開示は、本明細書に記載の抗体もしくは抗原結合フラグメントまたは本明細書に記載のＣＡＲをコードする核酸分子を提供する。本開示はまた、核酸分子を含むベクター（例えば、発現ベクター）を提供する。さらに、本開示は、本明細書に記載の核酸分子またはベクターを含む細胞を提供する。さらに、本開示は、本明細書に記載の核酸分子またはベクターを含む免疫細胞を提供する。
【0009】
本開示はまた、本明細書に記載の細胞を含む組成物を提供する。本開示はまた、本明細書に記載の免疫細胞を含む組成物を提供する。また、医薬として使用するための、本明細書に記載の細胞または細胞集団も提供される。また、医薬として使用するための、本明細書に記載の免疫細胞または免疫細胞集団も提供される。いくつかの実施形態では、細胞または免疫細胞集団は、治療を必要とする対象におけるＩＬ－２３Ｒ発現細胞によって媒介される疾患または障害の治療に使用するためのものである。いくつかの実施形態では、免疫細胞または免疫細胞集団は、治療を必要とする対象におけるＩＬ－２３Ｒ発現細胞によって媒介される疾患または障害の治療に使用するためのものである。本開示はまた、治療を必要とする対象における障害または疾患を治療するための方法であって、患者に本明細書に記載の細胞、または本明細書に記載の細胞集団を投与することを含む、方法を提供する。本開示はまた、治療を必要とする対象における障害または疾患を治療するための方法であって、患者に本明細書に記載の免疫細胞、または本明細書に記載の免疫細胞集団を投与することを含む、方法を提供する。疾患または障害は、治療を必要とする対象におけるＩＬ－２３Ｒ発現細胞によって媒介される疾患または障害であり得る。疾患または障害は、自己免疫性または炎症性疾患または障害であり得る。特定の実施形態では、疾患または障害は、自己免疫性または炎症性疾患または障害である。疾患または障害は、例えば、炎症性腸疾患（例えば、クローン病または潰瘍性大腸炎）、ループス（例えば、全身性エリテマトーデス）、関節炎（例えば、関節リウマチまたは若年性特発性関節炎）、シェーグレン症候群、全身性硬化症、多発性硬化症、強直性脊椎炎、１型糖尿病、自己免疫性甲状腺障害、重症筋無力症、乾癬、乾癬性関節炎、皮膚疾患、及びブドウ膜炎から選択され得る。具体的な実施形態では、疾患はクローン病である。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【図1】本開示の抗ＩＬ－２３Ｒキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）構築物（ＣＡＲ＃２）の概略図を表す。抗ＩＬ２３Ｒ ＣＡＲは、ヒト／マウス（ｈｍ）ＩＬ－２３Ｒ（αＩＬ－２３Ｒ；ＩＬ２３ＲＬａｍＳ４－Ｇ３）に対して指向するｓｃＦｖと、ヒンジドメイン（ＣＤ８リンカー）と、ヒトＣＤ８由来の膜貫通ドメイン（ＣＤ８ ＴＭ）と、ヒトＣＤ２８由来の細胞内シグナル伝達ドメイン（ＣＤ２８）と、ＣＤ３ゼータ（ＣＤ３ζまたはＣＤ３Ｚ）と、を含む。ＣＡＲ構築物は、さらにＧＦＰコード配列及びＨＡタグコード配列を含む。この構築物は、ｓｃＦｖ １４－１１－Ｄ０７に由来し、同様にＩＬ－２３Ｒを標的とするＣＡＲ＃１構築物と比較される。
【図2A】非形質導入細胞と、最初の増殖サイクルの終了時にＣＡＲ＃２またはＣＡＲ＃１を形質導入した細胞の制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）表現型をモニタリングしたグラフである。Ｔｒｅｇ細胞は、ヒトＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＤ１２７、及びＣＴＬＡ－４に対して指向する抗体で標識した。ＦＯＸＰ３及びＨｅｌｉｏｓ転写因子の検出のために、核内標識を行った（Ａ）。Ｈｅｌｉｏｓ及びＦＯＸＰ３も、１１日間のＣＡＲ結合後に評価した（Ｂ）。エラーバーは合計５つのＴｒｅｇドナーを含む３つの独立した実験からの平均±ＳＥＭを表す。
【図2B】非形質導入細胞と、最初の増殖サイクルの終了時にＣＡＲ＃２またはＣＡＲ＃１を形質導入した細胞の制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）表現型をモニタリングしたグラフである。Ｔｒｅｇ細胞は、ヒトＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＤ１２７、及びＣＴＬＡ－４に対して指向する抗体で標識した。ＦＯＸＰ３及びＨｅｌｉｏｓ転写因子の検出のために、核内標識を行った（Ａ）。Ｈｅｌｉｏｓ及びＦＯＸＰ３も、１１日間のＣＡＲ結合後に評価した（Ｂ）。エラーバーは合計５つのＴｒｅｇドナーを含む３つの独立した実験からの平均±ＳＥＭを表す。
【図3】合計５つのＴｒｅｇドナーを含む３つの独立した実験からの、活性化の非存在下（活性化なし）またはＣＡＲを通じた２４時間の刺激後（ＩＬ－２３Ｒ被覆ビーズの添加による；ＩＬ－２３Ｒ）もしくはＴＣＲを通じた２４時間の刺激後（抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８で被覆したビーズによる；３／２８）のいずれかのＴｒｅｇ活性化状態（ＧＦＰ発現でゲーティングしたＣＤ６９発現によって測定）を示すグラフである。
【図4】ＣＡＲ＃２を発現するＴｒｅｇ細胞が効率的なＣＡＲ媒介抑制活性を呈することを示すグラフの組み合わせである。活性化の非存在下（点線の曲線）またはＩＬ－２３Ｒにより誘導されるＣＡＲ活性化後（黒線）またはＴＣＲにより誘導される活性化後（灰色の曲線）のＩＬ－２３Ｒ－ＣＡＲによって媒介される接触依存的抑制を、フローサイトメトリーを用いて従来型Ｔ細胞（Ｔｃｏｎｖ）の増殖を測定することにより評価した。エラーバーは合計４つのＴｒｅｇドナーを含む３つの独立した実験からの平均±ＳＥＭを表す。
【図5】本開示の抗ＩＬ－２３Ｒキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）構築物のマウスバージョン（ｍＣＡＲ＃２ｂ）の概略図を表す。このマウスバージョンは、ヒト／マウスＩＬ－２３Ｒに対して指向するｓｃＦｖ（αＩＬ－２３Ｒ；ヒト／マウス交差反応性であるＩＬ２３ＲＬａｍＳ４－Ｇ３）、マウスヒンジ由来のＣＤ８膜貫通ドメイン（ｍＣＤ８ ＴＭ）、マウスＣＤ２８由来の細胞内ドメイン（ｍＣＤ２８）、及びマウスＣＤ３ゼータ（ｍＣＤ３Ｚ）を含む。この構築物を、ｍＣＡＲ＃２ｂに対応するがマウスＣＤ２８膜貫通ドメイン（ｍＣＤ２８ ＴＭ）を有するマウスＣＡＲ＃２ａ（ｍＣＡＲ＃２ａ）と、ＩＬ－２３Ｒを標的とする公開されたｓｃＦｖ（１４－１１－Ｄ０７）から誘導されたマウスＣＡＲ＃１（ｍＣＡＲ＃１）と比較する。
【図6A】デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）誘発性炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の短いモデルの設計を示す概略図を表す。
【図6B】グラフのセットは、腸間膜リンパ節（左）、結腸（中央）、及び脾臓（右）におけるＣＴＬＡ－４陽性Ｔｒｅｇ細胞の測定値を示す。
【図7】Ａは、ＤＳＳ誘発性ＩＢＤの有効性モデルの設計を示す概略図を表す。Ｂは、対照治療（生理食塩水）、非形質導入Ｔｒｅｇ細胞（「Ｐｏｌｙ Ｔｒｅｇ」）、またはＣＡＲ－Ｔｒｅｇ細胞（「ＣＡＲ＃２ｂ Ｔｒｅｇ」）を投与されたマウスの３つの群の疾患活動性指標の測定値を示すグラフを表す。
【図8】ＣＡＲ＃２、ＣＡＲ＃３、ＣＡＲ＃４、ＣＡＲ＃５、ＣＡＲ＃６、及びＣＡＲ＃７についての一貫した形質導入効率（約４０～５０％）を示すグラフである。結果は９つの異なるＴｒｅｇドナーの平均±ＳＥＭである。
【図9】ＣＡＲ＃２、ＣＡＲ＃３、ＣＡＲ＃４、ＣＡＲ＃５、ＣＡＲ＃６、及びＣＡＲ＃７についてのＣＡＲ－Ｔｒｅｇの一貫した生存率及び増殖倍率（ｆｏｌｄ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）を示すグラフを表す。結果は９つの異なるＴｒｅｇドナーの平均±ＳＥＭである。
【図10】ＣＡＲ＃２、ＣＡＲ＃３、ＣＡＲ＃４、ＣＡＲ＃５、ＣＡＲ＃６、及びＣＡＲ＃７についてのＣＡＲ－Ｔｒｅｇの活性化を示すグラフを表す。ＣＡＲ＃３は、活性化のバックグラウンドが最も低く、ＣＡＲ活性化後のシグナル対ノイズが最も高いことを示した。ＣＡＲ Ｔｒｅｇの活性化を、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８被覆ビーズ（灰色）を用いてＴＣＲを通じて（灰色）、あるいはＩＬ－２３Ｒ被覆ビーズまたは細胞表面で低レベルのＩＬ－２３Ｒを発現するＪｕｒｋａｔ（Ｊｕｒｋａｔ ５７２）もしくは細胞表面で高レベルのＩＬ－２３Ｒを発現するＪｕｒｋａｔ（Ｊｕｒｋａｔ ５７３）のいずれかを用いてＣＡＲを通じて活性化を誘導した２４時間後に、ＣＡＲ Ｔｒｅｇの細胞表面におけるＣＤ６９発現を測定することにより、フローサイトメトリーで評価した。結果は６つのＴｒｅｇドナーの平均±ＳＥＭである。二元配置分散分析及びＳｉｄａｋの多重比較試験。＊＝０．０５、＊＊＝０．０１、＊＊＊＝０．００１、及び＊＊＊＊＝０．０００１。
【図11A】ＣＡＲ＃２、ＣＡＲ＃３、ＣＡＲ＃４、ＣＡＲ＃５、ＣＡＲ＃６、及びＣＡＲ＃７のＣＡＲ媒介抑制活性を示すグラフを表す。ＣＡＲ Ｔｒｅｇによって媒介される抑制を、３日間の共培養後のＴｃｏｎｖ増殖の阻害を測定することによってフローサイトメトリーで評価した。ＣＡＲ Ｔｒｅｇは、共培養の２４時間前に、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８被覆ビーズ（黒丸）を用いてＴＣＲを通じて、あるいはＩＬ－２３Ｒ被覆ビーズ（黒四角）または細胞表面で高レベルのＩＬ－２３Ｒを発現するＪｕｒｋａｔ細胞株（Ｊｕｒｋａｔ ５７３、灰色四角）もしくは低レベルのＩＬ－２３Ｒを発現するＪｕｒｋａｔ細胞株（Ｊｕｒｋａｔ ５７２、白四角）のいずれかを用いてＣＡＲを通じて活性化される。結果は６つのＴｒｅｇドナーを含む４つの独立した実験からの平均±ＳＥＭである。二元配置分散分析及びＳｉｄａｋの多重比較試験。＊＝０．０５、＊＊＝０．０１。
【図11B】ＣＡＲ＃２、ＣＡＲ＃３、ＣＡＲ＃４、ＣＡＲ＃５、ＣＡＲ＃６、及びＣＡＲ＃７のＣＡＲ媒介抑制活性を示すグラフを表す。ＣＡＲ Ｔｒｅｇによって媒介される抑制を、３日間の共培養後のＴｃｏｎｖ増殖の阻害を測定することによってフローサイトメトリーで評価した。ＣＡＲ Ｔｒｅｇは、共培養の２４時間前に、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８被覆ビーズ（黒丸）を用いてＴＣＲを通じて、あるいはＩＬ－２３Ｒ被覆ビーズ（黒四角）または細胞表面で高レベルのＩＬ－２３Ｒを発現するＪｕｒｋａｔ細胞株（Ｊｕｒｋａｔ ５７３、灰色四角）もしくは低レベルのＩＬ－２３Ｒを発現するＪｕｒｋａｔ細胞株（Ｊｕｒｋａｔ ５７２、白四角）のいずれかを用いてＣＡＲを通じて活性化される。結果は６つのＴｒｅｇドナーを含む４つの独立した実験からの平均±ＳＥＭである。二元配置分散分析及びＳｉｄａｋの多重比較試験。＊＝０．０５、＊＊＝０．０１。
【図12】ＣＡＲ＃２及びＣＡＲ＃３のＣＡＲ媒介抑制活性についての曲線下面積（ＡＵＣ）を示す。ＡＵＣ計算は、Ｔｒｅｇが、細胞表面で高レベルのＩＬ－２３Ｒを発現するＪｕｒｋａｔ（Ｊｕｒｋａｔ ５７３）と結合している場合にはＣＡＲ＃３のみが同じＣＡＲ媒介抑制を示した一方で、ＣＡＲ Ｔｒｅｇが低レベルを発現するＪｕｒｋａｔ（Ｊｕｒｋａｔ ５７２）と結合している場合にはＣＡＲ媒介抑制が低いことを明らかにしている。この例示的な結果は、ＣＡＲ＃３によるオフターゲット効果の低減を支持するものである。
【図13】Ｔｒｅｇ表現型の表現型安定性を示すグラフを表す。主なＴｒｅｇマーカー（ＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＤ１２７、ＦｏｘＰ３、Ｈｅｌｉｏｓ及びＣＴＬＡ－４）をフローサイトメトリーにより測定した。結果は、９つの異なるＴｒｅｇドナーの平均±ＳＥＭである。
【図14】マウス及びヒトＩＬ２３Ｒに結合するＣＡＲ＃１及びＣＡＲ＃２の親和性（ＥＣ５０）の結果を示す。
【図15】異なる発現カセット（ＰＧＫまたはＥＦ１ａプロモーター、＋／－ＷＰＲＥ Ｍｕｔ６）で作製された４つの異なる構築物（ＣＡＲ＃８、ＣＡＲ＃９、ＣＡＲ＃１０及びＣＡＲ＃１１）を示す。
【図16】本開示の様々なＣＡＲ構築物を用いたｓｃＦｖシグナル伝達の安定性を示すグラフを表す。
【発明を実施するための形態】
【0011】
定義
本開示において、以下の用語は、以下の意味を有する。
本開示において、以下の用語は、以下の意味を有する。
【0012】
量、時を表す期間などの測定可能な値に言及する場合の「約」は、特定の値から±２０％、または場合によっては±１０％、または場合によっては±５％、または場合によっては±１％、または場合によっては±０．１％の変動を包含することを意味し、そのような変動は開示された方法を実行するのに適切である。
【0013】
「親和性」は、抗体－抗原複合体の強度を定義するために使用される。親和性は、エピトープと抗体上の抗原結合部位との間の相互作用の強度を示す。それは、親和定数Ｋａまたは解離定数ＫＤによって表され得る。ＫＤが１μΜ以下、好ましくは１００ｎＭ以下または１０ｎＭ以下の場合、抗体は抗原に特異的に結合すると言われる。ＫＤは、例えば表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）（ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標））またはバイオレイヤー干渉法によって、例えばＩＢＩＳ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＩＢＩＳ ＭＸ９６ ＳＰＲシステム、Ｂｉｏ－ＲａｄのＰｒｏｔｅＯｎ（登録商標）ＸＰＲ３６ ＳＰＲシステム、またはＦｏｒｔｅＢｉｏのＯｃｔｅｔ（登録商標）システムを使用して測定することができる。
【0014】
本明細書で使用される「抗体」または「免疫グロブリン」は、ジスルフィド結合により相互に接続された２つの重鎖及び２つの軽鎖を含む四量体を指す。各軽鎖は、軽鎖可変ドメインまたは領域（ＶＬ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）から構成され、カッパ（κ）軽鎖またはラムダ（λ）軽鎖であり得る。各重鎖は、重鎖可変ドメインまたは領域（ＶＨ）及び重鎖定常領域（ＣＨ）から構成される。ＣＨのアミノ酸配列に基づいて、抗体は、異なるアイソタイプ：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、またはＩｇＭに割り当てられ得る。ＩｇＧ及びＩｇＡアイソタイプは、さらにサブクラス：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２に分けられる。ＶＨ及びＶＬの対合は、単一の抗原結合部位を形成する。一実施形態では、本開示の抗ＩＬ－２３Ｒ抗体は、ＩｇＧ抗体である。
【0015】
「抗原結合フラグメント」は、本明細書で使用される場合、全抗体よりも少ないアミノ酸残基を含むが、依然として全抗体の抗原（例えば、ＩＬ－２３Ｒ）に結合することができる抗体の一部もしくは領域、または誘導体を指す。抗原結合フラグメントは、一本鎖抗体、Ｆｖ（例えば、ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ）’２、Ｆｄ、脱フコシル化抗体、ダイアボディ、トリアボディ、及びテトラボディを包含するが、これらに限定されない。
【0016】
「キメラ抗原受容体」または「ＣＡＲ」は、免疫細胞において発現される場合に、その細胞に標的リガンドに対する特異性及び細胞内シグナル生成をもたらす融合タンパク質などのタンパク質を指す。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、二量化分子が存在すると、ポリペプチドを互いに連結させることができる、例えば、リガンド結合ドメインを細胞内シグナル伝達ドメインに連結させることができる二量化スイッチを含むポリペプチドのセットを含む。一実施形態では、ＣＡＲは、Ｎ末端に任意選択のリーダー配列を含み、該リーダー配列は、細胞内プロセシング及び細胞膜へのキメラ抗原受容体の局在化の間に切断される。
【0017】
「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）内で見られる非連続的な抗原結合部位を意味する。所与のＣＤＲの正確なアミノ酸配列の境界は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，”５ｔｈ Ｅｄ．（１９９１）Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（「Ｋａｂａｔ」番号付けスキーム）、Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．，ＪＭＢ（１９９７）２７３：９２７－９４８（「Ｃｈｏｔｈｉａ」番号付けスキーム）に記載のもの、またはそれらの組み合わせを含む、いくつかの周知のスキームのいずれかを使用して決定することができる。より最近では、普遍的な番号付けシステムが開発されており、広く採用されている、ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）（Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９９９）２７：２０９－２１２）。一実施形態では、本明細書のＣＤＲ境界は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（１９９１）に従って定義されている。
【0018】
「共刺激分子」は、共刺激リガンドと特異的に結合し、それにより、増殖などであるがこれに限定されないＴ細胞による共刺激応答を媒介する、Ｔ細胞上の同族結合パートナーを指す。共刺激分子は、効率的な免疫応答に寄与する抗原受容体またはそのリガンド以外の細胞表面分子である。共刺激シグナル伝達ドメインは、共刺激分子の細胞内部分であり得る。共刺激分子は、以下のタンパク質ファミリーに代表され得る：ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭタンパク質）、及び活性化ＮＫ細胞受容体。
【0019】
「エピトープ」とは、抗体またはその抗原結合フラグメントが結合するタンパク質（複数可）上に位置するアミノ酸の特定の配列を指す。エピトープは、多くの場合、アミノ酸または糖側鎖などの化学的に活性な表面分子群からなり、かつ特定の三次元構造特性及び特定の電荷特性を有する。エピトープは、直鎖状（または連続性）であっても、構造的、すなわち、抗原の様々な領域に２つ以上のアミノ酸配列（必ずしも連続していなくてもよい）を含むものであってもよい。
【0020】
「発現ベクター」は、発現されるヌクレオチド配列に作動可能に連結された発現制御配列を含む組換えポリヌクレオチドを含むベクターを指す。発現ベクターは、発現のための十分なシス作用エレメントを含み、発現のための他のエレメントは、宿主細胞によってまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ発現系において供給され得る。発現ベクターには、組換えポリヌクレオチドを組み込むコスミド、プラスミド（例えば、ネイキッド、またはリポソームに含まれる）、及びウイルス（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス）を含む当該技術分野で既知の全てのものが含まれる。
【0021】
「Ｆｃドメイン」、「Ｆｃ部分」、及び「Ｆｃ領域」は、抗体重鎖のＣ末端フラグメント、例えば、ヒトガンマ重鎖の約２３０アミノ酸（ａａ）～約４５０ａａ、または他のタイプの抗体重鎖（例えば、ヒト抗体のα、δ、ε及びμ）もしくは天然に存在するそのアロタイプにおけるその対応配列を指す。
【0022】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び抗原結合部位を含む最小の抗体フラグメントである。このフラグメントは、１つの重鎖可変領域ドメインと１つの軽鎖可変領域ドメインが、非共有結合で緊密に会合した二量体からなる。これらの２つのドメインの折り畳みにより、６つの超可変ループ（Ｈ鎖及びＬ鎖からそれぞれ３つのループ）が生じ、抗原結合のためのアミノ酸残基を提供し、抗原結合特異性を抗体に与える。しかしながら、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）でさえも、全結合部位よりも低い親和性ではあるが、抗原を認識してそれに結合する能力を有する。
【0023】
「同一性」または「同一」は、２つ以上のアミノ酸配列間、または２つ以上の核酸配列間の関係を説明するために本明細書で使用される場合、比較される配列間の配列関係性の程度を指す。「同一性」は、より小さい２つ以上の配列間の同一性の一致の割合（％）を示し、特定の数学的モデルまたはコンピュータプログラム（すなわち、「アルゴリズム」）によってギャップアラインメント（存在する場合）が対処されている。関連するアミノ酸配列または核酸配列の同一性は、公知の方法によって容易に算出することができる。そのような方法には、以下に記載のものが含まれるが、それらに限定されない：Ｌｅｓｋ Ａ．Ｍ．（１９８８）．Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｓｏｕｒｃｅｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ：Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｓｍｉｔｈ Ｄ．Ｗ．（１９９３）．Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ ｇｅｎｏｍｅ ｐｒｏｊｅｃｔｓ．Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ｇｒｉｆｆｉｎ Ａ．Ｍ．＆Ｇｒｉｆｆｉｎ Ｈ．Ｇ．（１９９４）．Ｃｏｍｐｕｔｅｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄａｔａ，Ｐａｒｔ １．Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ：Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ；ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ Ｇ．（１９８７）．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ：ｔｒｅａｓｕｒｅ ｔｒｏｖｅ ｏｒ ｔｒｉｖｉａｌ ｐｕｒｓｕｉｔ．Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ：Ａｃａｄｅｍｉｃ ｐｒｅｓｓ；Ｇｒｉｂｓｋｏｖ Ｍ．Ｒ．＆Ｄｅｖｅｒｅｕｘ Ｊ．（１９９１）．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｐｒｉｍｅｒ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ：Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ；Ｃａｒｒｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，ＳＩＡＭ Ｊ Ａｐｐｌ Ｍａｔｈ．（１９８８）４８（５）：１０７３－８２。同一性を決定するための好ましい方法は、試験される配列間で最大の一致が得られるように設計される。同一性を決定する方法は、公開されているコンピュータプログラムに記載されている。２つの配列間の同一性を決定するための好ましいコンピュータプログラム方法としては、ＧＣＧプログラムパッケージ、例えばＧＡＰ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ；Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９８４）１２（１ Ｐｔ １）：３８７－９５）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、及びＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．（１９９０）２１５（３）：４０３－１０）が挙げられる。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、米国国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）及び他のソース（ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．ＮＣＢ／ＮＬＭ／ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．２０８９４）から公開されている。周知のＳｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用して、同一性を決定することもできる。
【0024】
本明細書で使用される「細胞内シグナル伝達ドメイン」とは、分子の細胞内部分を指す。細胞内シグナル伝達ドメインは、キメラ受容体含有細胞の免疫エフェクター機能を促進するシグナルを生成する。キメラ受容体－Ｔ細胞における免疫エフェクター機能の例は、細胞溶解活性、抑制活性、調節活性、及びヘルパー活性、例えばサイトカインの分泌が挙げられ得る。
【0025】
「対象」は、免疫応答が誘発され得る生物（例えば、哺乳動物、ヒト）を含むことが意図される。一実施形態では、対象は、「患者」、すなわち、温血動物、より好ましくは、ヒトであり得、医療を受けるのを待機しているもしくは医療を受けている、または医療処置の対象であった／対象である／対象となる、または標的とされる疾患もしくは状態、例えば炎症状態もしくは自己免疫状態の発症についてモニタリングされる。一実施形態では、対象は成体である（例えば、１８歳を超える対象）。別の実施形態では、対象は小児（例えば、１８歳未満の対象）である。一実施形態では、対象は男性である。別の実施形態では、対象は女性である。一実施形態では、対象は、自己免疫性及び／または炎症性疾患または障害に罹患しており、好ましくはそれと診断されている。一実施形態では、対象は、自己免疫性及び／または炎症性疾患または障害を発症するリスクがある。リスク因子の例としては、自己免疫性及び／または炎症性疾患または障害の遺伝的素因または家族歴が挙げられるが、これらに限定されない。
【0026】
「一本鎖Ｆｖ」は、「ｓＦｖ」または「ｓｃＦｖ」とも略され、軽鎖の可変領域を含む少なくとも１つの抗体フラグメントと重鎖の可変領域を含む少なくとも１つの抗体フラグメントとを含む融合タンパク質を指し、該軽鎖可変領域及び重鎖可変領域は、例えば、合成リンカー、例えば、短い可撓性ポリペプチドリンカーを介して連続的に連結され、一本鎖ポリペプチドとして発現されることができ、該ｓｃＦｖは、それが由来するインタクトな抗体の特異性を保持する。特に指定されない限り、本明細書で使用される場合、ｓｃＦｖは、例えばポリペプチドのＮ末端及びＣ末端に関して、いずれの順序でＶＬ可変領域及びＶＨ可変領域を有していてもよく、ｓｃＦｖは、ＶＬ－リンカー－ＶＨを含んでもよいし、ＶＨ－リンカー－ＶＬを含んでもよい。一実施形態では、本発明の抗原結合フラグメントは、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）である。
【0027】
「治療有効量」とは、標的に重大な負のまたは有害な副作用を引き起こすことなく、（１）疾患、障害、もしくは状態の発症を遅延もしくは予防すること、（２）疾患、障害、もしくは状態の１つ以上の症状の進行、増悪、もしくは悪化を減速もしくは停止すること、（３）疾患、障害、もしくは状態の症状の改善をもたらすこと、（４）疾患、障害、もしくは状態の重症度もしくは発生率を低下させること、または（５）疾患、障害、もしくは状態を治癒することを目的とする本明細書に記載の抗体のレベルまたは量を指す。治療有効量は、予防的または防止的作用のために、疾患、障害、または状態の発症前に投与され得る。あるいはまたはさらに、治療有効量は、治療作用のために、疾患、障害、または状態の開始後に投与され得る。
【0028】
「治療する」または「治療」または「軽減」は、治療的治療及び予防的または防止的処置の両方を指し、その目的は、標的とする病態または障害を予防するか、または減速（軽減）させることである。治療を必要とする者としては、すでにその障害を有する者、及びその障害を有しやすい者、またはその障害が予防されるべきである者が挙げられる。一実施形態では、本開示による治療量の抗体または細胞を投与された後に、対象が、以下：病原性細胞の数または割合（％）の減少、治療される疾患または障害に関連する１つ以上の症状のある程度の緩和、罹患率及び死亡率の低下、ならびに生活の質の問題の改善、のうちの少なくとも１つを示す場合、対象は、疾患または障害に対して奏功して「治療」されている。疾患における治療の奏功及び改善を評価するための上記のパラメータは、医師によく知られているルーチン手順によって容易に測定可能である。
【0029】
「ゼータ」またはあるいは「ゼータ鎖」、「ＣＤ３－ゼータ」、または「ＴＣＲ－ゼータ」は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＡＧ３６６６４．１として提供されるタンパク質、または非ヒト種、例えば、マウス、げっ歯類、サル、類人猿など由来の同等の残基として定義され、「ゼータ刺激ドメイン」またはあるいは「ＣＤ３ゼータ刺激ドメイン」または「ＴＣＲ－ゼータ刺激ドメイン」は、ゼータ鎖の細胞質ドメインからのアミノ酸残基、またはその機能的誘導体として定義され、これらは、Ｔ細胞の活性化に必要な初期シグナルを機能的に伝達するのに十分である。一実施形態では、ゼータの細胞質ドメインは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＡＧ３６６６４．１の残基５２～１６４、またはその機能的オルソログである、非ヒト種、例えばマウス、げっ歯類、サル、類人猿など由来の同等の残基を含む。
【0030】
Ｉ．抗体及び抗原結合フラグメント
本開示は、まず、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントに関し、該抗体またはその抗原結合フラグメントは、少なくとも１つのＩＬ－２３Ｒ（例えば、ＩＬ－２３Ｒアルファサブユニット）に結合する。
本開示は、まず、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントに関し、該抗体またはその抗原結合フラグメントは、少なくとも１つのＩＬ－２３Ｒ（例えば、ＩＬ－２３Ｒアルファサブユニット）に結合する。
【0031】
本明細書で使用される「単離された抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指すことを意図する（例えば、ＩＬ－２３Ｒに特異的に結合する単離された抗体は、ＩＬ－２３Ｒ以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。しかしながら、ＩＬ－２３Ｒに特異的に結合する単離された抗体は、他の種からのＩＬ－２３Ｒ分子などの他の抗原に交差反応性を有し得る。さらに、単離された抗体は、他の細胞材料及び／または化学物質、特に抗体の治療的使用を妨げ得るもの（酵素、ホルモン、及び他のタンパク質性もしくは非タンパク質性成分を含むがこれらに限定されない）を実質的に含まない場合がある。本明細書における単離された抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４抗体などのＩｇＧ抗体であり得る。
【0032】
Ｉ．１ 抗原特異性及び親和性
一実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントは、細胞表面上に発現したＩＬ－２３Ｒを認識し、それに結合することができる。
一実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントは、細胞表面上に発現したＩＬ－２３Ｒを認識し、それに結合することができる。
【0033】
別の実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントは、可溶性ＩＬ－２３Ｒ（すなわち、膜結合ではない）を認識し、それに結合することができる。
【0034】
有利なことに、本発明のＩＬ－２３Ｒ結合抗体または抗原結合フラグメントは、ヒト及びマウスの両方のＩＬ－２３Ｒに、特に高親和性で結合できることが見出されている（図１４）。この交差反応性は、マウスにおける前臨床試験の結果を、薬剤承認プロセスのためにヒト臨床試験に外挿するのに有益である。
【0035】
ある実施形態では、本発明の抗体または抗原結合フラグメント、例えば、本発明によるｓｃＦｖは、マウス及びヒトＩＬ－２３Ｒの両方を結合することができる（図１４）。したがって、マウス及びヒトＩＬ－２３ＲとのｓｃＦｖの交差反応性が有利な特徴である。
【0036】
一実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒトＩＬ－２３Ｒアルファサブユニットを認識し、それに結合する。好ましくは、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントは、高親和性でヒトＩＬ－２３Ｒアルファサブユニットに結合する（図１４）。ヒトＩＬ－２３Ｒアルファサブユニットは、１１個のエクソンを含む２．８ｋｂの長さのｍＲＮＡによってコードされるタンパク質（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿１４４７０１）である。
【0037】
一実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒトＩＬ－２３ＲのバリアントなどのＩＬ－２３Ｒバリアントを認識し、それに結合することができる。
【0038】
一実施形態では、ＩＬ－２３Ｒのバリアントは、元の（野生型）ＩＬ－２３Ｒと比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上のアミノ酸が欠失、付加、または置換されている改変されたＩＬ－２３Ｒを指す。
【0039】
ヒトＩＬ－２３Ｒのスプライスバリアントは、すでに同定されている（Ｋａｎ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（２００８）９（７）：６３１－６３９）。具体的には、ＩＬ－２３Ｒの２４の異なるアイソフォームが記載されている：アイソフォーム＿ｖ１（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＭ９９０３１３を有するｍＲＮＡによってコードされる）、アイソフォーム＿ｖ２（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＭ９９０３１４を有するｍＲＮＡによってコードされる）、アイソフォーム＿ｖ３（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＭ９９０３１５を有するｍＲＮＡによってコードされる）、アイソフォーム＿ｖ４（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＭ９９０３１６を有するｍＲＮＡによってコードされる）、アイソフォーム＿ｖ５（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＭ９９０３１７を有するｍＲＮＡによってコードされる）、アイソフォーム＿ｖ６（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＭ９９０３１８を有するｍＲＮＡによってコードされる）、アイソフォーム＿ｖ７（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＭ９９０３１９を有するｍＲＮＡによってコードされる）、アイソフォーム＿ｖ８（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＭ９９０３２０を有するｍＲＮＡによってコードされる）、アイソフォーム＿ｖ９（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＭ９９０３２１を有するｍＲＮＡによってコードされる）、アイソフォーム＿ｖ１０（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＭ９９０３２２を有するｍＲＮＡによってコードされる）、アイソフォーム＿ｖ１１（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＭ９９０３２３を有するｍＲＮＡによってコードされる）、アイソフォーム＿ｖ１２（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＭ９９０３２４を有するｍＲＮＡによってコードされる）、アイソフォーム＿ｖ１３（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＭ９９０３２５を有するｍＲＮＡによってコードされる）、アイソフォーム＿ｖ１４（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＭ９９０３２６を有するｍＲＮＡによってコードされる）、アイソフォーム＿ｖ１５（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＭ９９０３２７を有するｍＲＮＡによってコードされる）、アイソフォーム＿ｖ１６（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＭ９９０３２８を有するｍＲＮＡによってコードされる）、アイソフォーム＿ｖ１７（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＭ９９０３２９を有するｍＲＮＡによってコードされる）、アイソフォーム＿ｖ１８（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＭ９９０３３０を有するｍＲＮＡによってコードされる）、アイソフォーム＿ｖ１９（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＭ９９０３３１を有するｍＲＮＡによってコードされる）、アイソフォーム＿ｖ２０（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＭ９９０３３２を有するｍＲＮＡによってコードされる）、アイソフォーム＿ｖ２１（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＭ９９０３３３を有するｍＲＮＡによってコードされる）、アイソフォーム＿ｖ２２（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＭ９９０３３４を有するｍＲＮＡによってコードされる）、アイソフォーム＿ｖ２３（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＭ９９０３３５を有するｍＲＮＡによってコードされる）及びアイソフォーム＿ｖ２４（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＭ９９０３３６を有するｍＲＮＡによってコードされる）。
【0040】
したがって、一実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントは、アイソフォーム＿ｖ１、アイソフォーム＿ｖ２、アイソフォーム＿ｖ３、アイソフォーム＿ｖ４、アイソフォーム＿ｖ５、アイソフォーム＿ｖ６、アイソフォーム＿ｖ７、アイソフォーム＿ｖ８、アイソフォーム＿ｖ９、アイソフォーム＿ｖ１０、アイソフォーム＿ｖ１１、アイソフォーム＿ｖ１２、アイソフォーム＿ｖ１３、アイソフォーム＿ｖ１４、アイソフォーム＿ｖ１５、アイソフォーム＿ｖ１６、アイソフォーム＿ｖ１７、アイソフォーム＿ｖ１８、アイソフォーム＿ｖ１９、アイソフォーム＿ｖ２０、アイソフォーム＿ｖ２１、アイソフォーム＿ｖ２２、アイソフォーム＿ｖ２３、及びアイソフォーム＿ｖ２４を含む群から選択されるヒトＩＬ－２３Ｒのスプライスバリアントを認識し、それに結合することができる。
【0041】
さらに、ヒトＩＬ－２３Ｒのアルファサブユニットにおける一塩基多型がすでに記載されている（Ｋａｎ ｅｔ ａｌ，上記；及びＳｉｖａｎｅｓａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．（２０１６）２９１（１６）：８６７３－８５）。
【0042】
一実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントは、アルファサブユニット内の一塩基多型（ＳＮＰ）を含むヒトＩＬ－２３Ｒバリアントを認識し、それに結合することができ、該ＳＮＰは、Ｒ３８１Ｑ、Ｇ１４９Ｒ、Ｖ３６２Ｉ、及びそれらの組み合わせを含む群から選択される。
【0043】
一実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントは、マウスＩＬ－２３Ｒアルファサブユニットを認識し、それに結合する。好ましくは、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントは、高親和性でマウスＩＬ－２３Ｒアルファサブユニットに結合する（図１４）。マウスＩＬ－２３Ｒアルファサブユニットは、１１個のエクソンを含む２．５ｋｂの長さのｍＲＮＡによってコードされるタンパク質（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿１４４５４８）である。
【0044】
マウスＩＬ－２３Ｒのスプライスバリアントは、すでに同定されている。具体的には、ＩＬ－２３Ｒの７つの異なるアイソフォームが記載されている：アイソフォーム１（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ５ＶＷＫ５－１；ＮＭ＿１４４７０１．３）、アイソフォーム２（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ５ＶＷＫ５－２；ＸＰ＿００５２７０５７３）、アイソフォーム３（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ５ＶＷＫ５－３）、アイソフォーム４、（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ５ＶＷＫ５－４）、及びアイソフォーム５（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ５ＶＷＫ５－５）（Ｚｈａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ５７：９３４－９４３（２００６））、及びアイソフォーム６、（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ５ＶＷＫ５－６；ＸＰ＿００５２７０５７４）、及びアイソフォーム７（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ５ＶＷＫ５－７）（Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１４：２１２１－２１２７（２００４））。いくつかの実施形態では、本開示の抗ＩＬ２３Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントは、アイソフォーム１～７のうちの１つ以上に結合する。いくつかの実施形態では、本開示の抗ＩＬ２３Ｒ抗体または抗原結合フラグメントは、アイソフォーム１及びアイソフォーム３のうちの少なくとも一方１つに結合する。いくつかの実施形態では、本開示の抗ＩＬ２３Ｒ抗体または抗原結合フラグメントは、アイソフォーム４及びアイソフォーム６のうちの少なくとも一方に結合する。
【0045】
Ｉ．２．１ ＣＤＲ配列
一実施形態では、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ ＣＤＲ定義システムに従って決定される。
一実施形態では、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ ＣＤＲ定義システムに従って決定される。
【0046】
一実施形態では、本発明の抗体または抗原結合フラグメントの重鎖は、以下の重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ）：
ＨＣＤＲ１：ＳＳＮＹＹＷＧ（配列番号１）
ＨＣＤＲ２：ＧＳＩＹＹＳＧＮＴＹＹＮＰＳＬ（配列番号２）
ＨＣＤＲ３：ＲＥＷＳＰＹＥＳＥＧＦＤＹ（配列番号３）
のうちの少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、より好ましくは３つ全てを含む。
ＨＣＤＲ１：ＳＳＮＹＹＷＧ（配列番号１）
ＨＣＤＲ２：ＧＳＩＹＹＳＧＮＴＹＹＮＰＳＬ（配列番号２）
ＨＣＤＲ３：ＲＥＷＳＰＹＥＳＥＧＦＤＹ（配列番号３）
のうちの少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、より好ましくは３つ全てを含む。
【0047】
具体的な一実施形態では、本発明の抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号１～３の全てを含む。一実施形態では、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及び／またはＨＣＤＲ３のいずれかは、それぞれ配列番号１～３と比較して、１、２、３またはそれ以上のアミノ酸改変（例えば置換）を含み得る。一実施形態では、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及び／またはＨＣＤＲ３のいずれかは、それぞれ配列番号１～３と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の同一性を共有するアミノ酸配列を有する。
【0048】
一実施形態では、本発明の抗体または抗原結合フラグメントの軽鎖は、以下の軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ）：
ＬＣＤＲ１：ＴＧＳＳＳＮＩＧＡＧＹＤＶＨ（配列番号４）
ＬＣＤＲ２：ＧＮＮＮＲＰＳ（配列番号５）
ＬＣＤＲ３：ＱＳＹＤＴＧＬＳＡＷ（配列番号６）
のうちの少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、より好ましくは３つ全てを含む。
ＬＣＤＲ１：ＴＧＳＳＳＮＩＧＡＧＹＤＶＨ（配列番号４）
ＬＣＤＲ２：ＧＮＮＮＲＰＳ（配列番号５）
ＬＣＤＲ３：ＱＳＹＤＴＧＬＳＡＷ（配列番号６）
のうちの少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、より好ましくは３つ全てを含む。
【0049】
具体的な一実施形態では、本発明の抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号４～６の全てを含む。一実施形態では、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及び／またはＬＣＤＲ３のいずれかは、それぞれ配列番号４～６と比較して、１、２、３、４，５またはそれ以上のアミノ酸改変（例えば置換）を含み得る。一実施形態では、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及び／またはＬＣＤＲ３のいずれかは、それぞれ配列番号４～６と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の同一性を共有するアミノ酸配列を有する。
【0050】
本発明の抗体または抗原結合フラグメントの一実施形態では、そのＨＣＤＲ１～３のうちの少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、より好ましくは３つ全ては、それぞれ配列番号１～３を含み、かつそのＬＣＤＲ１～３のうちの少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、より好ましくは３つ全ては、それぞれ配列番号４～６を含む。
【0051】
一実施形態では、本発明の抗体または抗原結合フラグメントは、それぞれ配列番号１～６の配列を有するＨＣＤＲ１～３及びＬＣＤＲ１～３を含む。
【0052】
本発明の抗体または抗体結合フラグメントの一実施形態では、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及び／またはＨＣＤＲ３のいずれかは、それぞれ配列番号１～３と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の同一性を共有するアミノ酸配列を有し、かつＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及び／またはＬＣＤＲ３のいずれかは、それぞれ配列番号４～６と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の同一性を共有するアミノ酸配列を有する。
【0053】
Ｉ．２．２ ＶＨ及びＶＬ配列
一実施形態では、本発明の抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号７を含むか、またはそれからなるＶＨアミノ酸配列を有する。
一実施形態では、本発明の抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号７を含むか、またはそれからなるＶＨアミノ酸配列を有する。
【0054】
一実施形態では、ＶＨアミノ酸配列は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上のアミノ酸改変（例えば、置換）を有する配列番号７を含むか、またはそれからなる。
【0055】
一実施形態では、ＶＨアミノ酸配列は、上記のＨＣＤＲ（例えば配列番号１～３）を含み、かつ配列番号７と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の同一性を共有する。
【0056】
一実施形態では、本発明の抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号８を含むか、またはそれからなるＶＬアミノ酸配列を有する。
【0057】
一実施形態では、ＶＬアミノ酸配列は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上のアミノ酸改変（例えば、置換）を有する配列番号８を含むか、またはそれからなる。
【0058】
一実施形態では、ＶＬアミノ酸配列は、上記のＬＣＤＲ（例えば配列番号４～６）を含み、かつ配列番号８と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の同一性を共有する。
【0059】
一実施形態では、ＶＨは、配列番号７を含むか、またはそれからなり、及び／またはＶＬは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上のアミノ酸改変（例えば、置換）を有する配列番号８を含むか、またはそれからなる。
【0060】
一実施形態では、ＶＨ及びＶＬは、上記のＣＤＲ（例えば配列番号１～６）を含み、かつそれぞれ配列番号７及び８と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の同一性を共有する。
【0061】
一実施形態では、アミノ酸改変は、挿入、欠失または置換であり得る。一実施形態では、アミノ酸改変は、改変を含む抗体またはその抗原結合フラグメントの結合特性に有意に影響を及ぼさない。指定される可変領域及びＣＤＲ配列は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上のアミノ酸の挿入、欠失、及び／または置換を含み得る。
【0062】
一実施形態では、アミノ酸改変は、好ましくは保存的アミノ酸によるってなされる置換である。保存的アミノ酸とは、元のアミノ酸と同様の物理化学的性質を有する側鎖を持つアミノ酸である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基ファミリーは、当該技術分野において定義されている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が挙げられる。したがって、本発明の抗体または抗原結合フラグメントのＣＤＲ及び／または可変領域内の１つ以上のアミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリー由来の他のアミノ酸残基で置き換えることができ、改変された抗体または抗原結合フラグメントは、保持された機能（例えば、ＩＬ－２３Ｒへの結合）について、本明細書に記載されるアッセイを使用して試験することができる。別の実施形態では、本発明の抗体または抗原結合フラグメントのＣＤＲ及び／または可変領域内のアミノ酸のストリングは、側鎖ファミリーメンバーの順序及び／または組成が異なる構造的に類似したストリングで置き換えることができる。
【0063】
一実施形態では、本発明の抗体または抗原結合フラグメントは、以下：
－本明細書で定義される少なくとも１つ（好ましくは３つ）のＨＣＤＲを含み、かつ配列番号７または配列番号７に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＶＨと、
－本明細書で定義される少なくとも１つ（好ましくは３つ）のＬＣＤＲを含み、かつ配列番号８または配列番号８に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＶＬと、
を含む。
－本明細書で定義される少なくとも１つ（好ましくは３つ）のＨＣＤＲを含み、かつ配列番号７または配列番号７に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＶＨと、
－本明細書で定義される少なくとも１つ（好ましくは３つ）のＬＣＤＲを含み、かつ配列番号８または配列番号８に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＶＬと、
を含む。
【0064】
一実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号７を含むかまたはそれからなるＶＨと、配列番号８を含むかまたはそれからなるＶＬとを含む。
【0065】
Ｉ．２．３ リンカー
一実施形態では、本発明の抗原結合フラグメントは、そのＶＨ及びＶＬを連結するリンカーを含む。一実施形態では、抗原結合フラグメントは、Ｎ末端からＣ末端に、ＶＬ、リンカー、及びＶＨを含む。別の実施形態では、抗原結合フラグメントは、Ｎ末端からＣ末端に、ＶＨ、リンカー、及びＶＬを含む。
一実施形態では、本発明の抗原結合フラグメントは、そのＶＨ及びＶＬを連結するリンカーを含む。一実施形態では、抗原結合フラグメントは、Ｎ末端からＣ末端に、ＶＬ、リンカー、及びＶＨを含む。別の実施形態では、抗原結合フラグメントは、Ｎ末端からＣ末端に、ＶＨ、リンカー、及びＶＬを含む。
【0066】
一実施形態では、リンカーは、例えば２～２０または２～１５アミノ酸の範囲の長さを有するペプチドリンカーである。
【0067】
例えば、グリシン－セリンダブレットは、特に好適なリンカー（ＧＳリンカー）を提供する。一実施形態では、リンカーは、ＧＳリンカーである。ＧＳリンカーの例としては、ＧＳリンカー、Ｇ２Ｓリンカー（例えば、ＧＧＳ及び（ＧＧＳ）２）、Ｇ３Ｓリンカー、及びＧ４Ｓリンカーが挙げられるが、これらに限定されない。
【0068】
Ｇ３Ｓリンカーは、アミノ酸配列（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）ｎまたは（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号９）を含み、式中、ｎは、１以上の正の整数（例えば、ｎ＝１、ｎ＝２、ｎ＝３、ｎ＝４、ｎ＝５、ｎ＝６、ｎ＝７、ｎ＝８、ｎ＝９、またはｎ＝１０）である。Ｇ３Ｓリンカーの例としては、ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号１０）が挙げられるが、これに限定されない。
【0069】
Ｇ４Ｓリンカーの例としては、ＧＧＧＧＳ（配列番号１１）に対応する（Ｇｌｙ４－Ｓｅｒ）；ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１２）に対応する（Ｇｌｙ４－Ｓｅｒ）２；ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１３）に対応する（Ｇｌｙ４－Ｓｅｒ）３；及びＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１４）に対応する（Ｇｌｙ４－Ｓｅｒ）４が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、リンカーは、（Ｇ４Ｓ）３リンカー（配列番号１３）である。
【0070】
Ｉ．２．４ 抗体及びフラグメントの種類
一実施形態では、本開示による抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒト化抗体である。
一実施形態では、本開示による抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒト化抗体である。
【0071】
一実施形態では、本開示による抗体またはその抗原結合フラグメントは、抗体の抗原結合フラグメント、例えば、一本鎖抗体、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ）’２、Ｆｄ、脱フコシル化抗体、ダイアボディ、トリアボディ、またはテトラボディである。
【0072】
一実施形態では、本開示による抗体またはその抗原結合フラグメントは、高親和性でヒトＩＬ－２３Ｒアルファサブユニットに結合する。ある実施形態では、本開示による抗体またはその抗原結合フラグメントは、本明細書で定義されるＣＤＲを含み、かつ高親和性でヒトＩＬ－２３Ｒアルファサブユニットに結合する。
【0073】
一実施形態では、本開示による抗体またはその抗原結合フラグメントは、高親和性でマウスＩＬ－２３Ｒアルファサブユニットに結合する。一実施形態では、本開示による抗体またはその抗原結合フラグメントは、本明細書で定義されるＣＤＲを含み、かつ高親和性でマウスＩＬ－２３Ｒアルファサブユニットに結合する。
【0074】
一実施形態では、本開示による抗体またはその抗原結合フラグメントは、２００ｎＭ、１００ｎＭ、９０ｎＭ、８０ｎＭ、７０ｎＭ、６０ｎＭ、５０ｎＭ、４０ｎＭまたは３０ｎＭ未満、特に１００ｎＭ未満、特に４０ｎＭ未満のＥＣ５０でヒトＩＬ－２３Ｒアルファサブユニットに結合することができる。一実施形態では、本開示による抗体またはその抗原結合フラグメントは、２００ｎＭ、１００ｎＭ、９０ｎＭ、８０ｎＭ、７０ｎＭ、６０ｎＭ、５０ｎＭ、４０ｎＭまたは３０ｎＭ未満、特に１００ｎＭ未満、特に６０ｎＭ未満のＥＣ５０でマウスＩＬ－２３Ｒアルファサブユニットに結合することができる。
【0075】
一実施形態では、本開示による抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒト及びマウスの両方のＩＬ－２３Ｒと交差反応することができる。ある実施形態では、本開示による抗体またはその抗原結合フラグメントは、本明細書で定義されるＣＤＲを含み、かつヒト及びマウスの両方のＩＬ－２３Ｒと交差反応することができる。
【0076】
Ｉ．２．５ ｓｃＦｖ完全配列
一実施形態では、本発明の抗原結合フラグメントは、本明細書で定義されるＣＤＲを含むｓｃＦｖであり、配列番号１５または配列番号１５に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
一実施形態では、本発明の抗原結合フラグメントは、本明細書で定義されるＣＤＲを含むｓｃＦｖであり、配列番号１５または配列番号１５に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
【0077】
一実施形態では、ｓｃＦｖは、高親和性でヒトＩＬ－２３Ｒアルファサブユニットに結合する。ある実施形態では、ｓｃＦｖは、本明細書で定義されるＣＤＲを含み、高親和性でヒトＩＬ－２３Ｒアルファサブユニットに結合する。ある実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号１５または配列番号１５に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、高親和性でヒトＩＬ－２３Ｒアルファサブユニットに結合する。
【0078】
一実施形態では、ｓｃＦｖは、高親和性でマウスＩＬ－２３Ｒアルファサブユニットに結合する。ある実施形態では、ｓｃＦｖは、本明細書で定義されるＣＤＲを含み、高親和性でマウスＩＬ－２３Ｒアルファサブユニットに結合する。ある実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号１５または配列番号１５に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、高親和性でマウスＩＬ－２３Ｒアルファサブユニットに結合する。
【0079】
一実施形態では、本開示によるｓｃＦｖは、２００ｎＭ、１００ｎＭ、９０ｎＭ、８０ｎＭ、７０ｎＭ、６０ｎＭ、５０ｎＭ、４０ｎＭまたは３０ｎＭ未満、特に１００ｎＭ未満、特に４０ｎＭ未満のＥＣ５０でヒトＩＬ－２３Ｒアルファサブユニットに結合することができる。一実施形態では、本開示によるｓｃＦｖは、２００ｎＭ、１００ｎＭ、９０ｎＭ、８０ｎＭ、７０ｎＭ、６０ｎＭ、５０ｎＭ、４０ｎＭまたは３０ｎＭ未満、特に１００ｎＭ未満、特に６０ｎＭ未満のＥＣ５０でマウスＩＬ－２３Ｒアルファサブユニットに結合することができる。
【0080】
一実施形態では、ｓｃＦｖは、ヒト及びマウスの両方のＩＬ－２３Ｒと交差反応することができる。ある実施形態では、ｓｃＦｖは、本明細書で定義されるＣＤＲを含み、ヒト及びマウスの両方のＩＬ－２３Ｒと交差反応することができる。ある実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号１５または配列番号１５に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、ヒト及びマウスの両方のＩＬ－２３Ｒに結合する。
【0081】
Ｉ．３ 核酸
本開示の別の目的は、本発明の単離された抗ＩＬ－２３Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする単離された核酸である。
本開示の別の目的は、本発明の単離された抗ＩＬ－２３Ｒ抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする単離された核酸である。
【0082】
「単離された核酸」は、本明細書で使用される場合、他のゲノムＤＮＡ配列、ならびに天然配列に自然に付随するタンパク質または複合体、例えばリボソーム及びポリメラーゼから実質的に分離された核酸を指すことを意図する。この用語は、その天然に存在する環境から取り出された核酸配列を包含し、組換えまたはクローニングされたＤＮＡ単離物、及び化学的に合成された類似体、または異種系によって生物学的に合成された類似体を含む。実質的に純粋な核酸には、核酸の単離形態が含まれる。これは、元から単離された核酸を指し、単離された核酸に後に人工的に付加された遺伝子または配列を除外するものではない。
【0083】
一実施形態では、核酸は、本発明の抗体または抗原結合フラグメントの少なくともＶＨまたはＶＬをコードする。一実施形態では、核酸は、本発明の抗体または抗原結合フラグメントの重鎖または軽鎖の可変領域及び定常領域をコードする。一実施形態では、核酸は、抗体または抗原結合フラグメントの重鎖及び軽鎖の両方をコードする。
【0084】
一実施形態では、本明細書の核酸は、本発明の抗体または抗原結合フラグメントのＶＨをコードするヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなり、該ヌクレオチド配列は、配列番号１６または配列番号１６に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するヌクレオチド配列である。
【0085】
一実施形態では、本明細書の核酸は、本発明の抗体または抗原結合フラグメントのＶＬをコードする配列を含むか、またはそれからなり、該ヌクレオチド配列は、配列番号１７または配列番号１７に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するヌクレオチド配列である。
【0086】
一実施形態では、本明細書の核酸は、本発明の抗体または抗原結合フラグメントのＶＨ及びＶＬをコードするヌクレオチド配列を含む。さらなる実施形態では、本明細書の核酸は、配列番号１６及び１７を含む。
【0087】
一実施形態では、本明細書の核酸は、ＶＬコード配列とＶＨコード配列との間に、リンカーヌクレオチド配列をさらに含む。さらなる実施形態では、リンカーヌクレオチド配列は、配列番号１８を含むか、またはそれからなる。
【0088】
一実施形態では、本明細書の核酸は、配列番号１９または配列番号１９に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる。
【0089】
Ｉ．４．抗体及び抗原結合フラグメントの産生
本開示はまた、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントを発現するためのベクター、及び該抗体または抗原結合フラグメントを産生するためのベクターの使用方法を提供する。
本開示はまた、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントを発現するためのベクター、及び該抗体または抗原結合フラグメントを産生するためのベクターの使用方法を提供する。
【0090】
一般に、好適なベクターは、少なくとも１つの宿主生物において機能的な複製起点、プロモーター配列、好都合な制限エンドヌクレアーゼ部位、１つ以上の選択マーカー、及び任意選択でエンハンサーを含む。
【0091】
哺乳動物細胞用の発現ベクターに使用されるプロモーター及びエンハンサーの例としては、ＳＶ４０の初期プロモーター及びエンハンサー、モロニーマウス白血病ウイルスのＬＴＲプロモーター及びエンハンサー、ならびに免疫グロブリンＨ鎖のプロモーター及びエンハンサーが挙げられるが、これらに限定されない。転写調節配列のさらなる例については、以下のセクションＩＩも参照のこと。
【0092】
本開示の別の目的は、本明細書に記載される単離された抗体またはその抗原結合フラグメントを産生及び精製する方法である。一実施形態では、この方法は、以下：
－抗体または抗原結合フラグメントの発現カセットを含む発現ベクターを、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで、コンピテント宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞及びＮＳ０細胞などの哺乳動物細胞）に導入することと、
－形質転換された宿主細胞を、抗体またはその抗原結合フラグメントの発現に適した条件下でｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで培養することと、
－任意選択で、抗体または抗原結合フラグメントを発現及び／または分泌する細胞を選択することと、
－発現された抗体または抗原結合フラグメントを細胞培養物から回収することと、
－任意選択で、回収された抗体または抗原結合フラグメントを精製することと、
を含む。
－抗体または抗原結合フラグメントの発現カセットを含む発現ベクターを、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで、コンピテント宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞及びＮＳ０細胞などの哺乳動物細胞）に導入することと、
－形質転換された宿主細胞を、抗体またはその抗原結合フラグメントの発現に適した条件下でｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで培養することと、
－任意選択で、抗体または抗原結合フラグメントを発現及び／または分泌する細胞を選択することと、
－発現された抗体または抗原結合フラグメントを細胞培養物から回収することと、
－任意選択で、回収された抗体または抗原結合フラグメントを精製することと、
を含む。
【0093】
タンパク質、特に抗体または抗原結合フラグメントを精製する方法は、当該技術分野で周知であり、プロテインＡ－セファロース、ゲル電気泳動、及びクロマトグラフィー（例えばプロテインＬアガロース上での親和性クロマトグラフィーなどの親和性クロマトグラフィー）が挙げられるが、これらに限定されない。
【0094】
ＩＩ．融合タンパク質
本開示はさらに、本開示の抗体またはその抗原結合フラグメントを含む融合タンパク質に関する。一実施形態では、融合タンパク質は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。
本開示はさらに、本開示の抗体またはその抗原結合フラグメントを含む融合タンパク質に関する。一実施形態では、融合タンパク質は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。
【0095】
ＩＩ．１ ＣＡＲ
本開示の目的は、少なくとも１つのＩＬ－２３Ｒに特異的なＣＡＲである。ＣＡＲは、（ｉ）本明細書に記載の抗ＩＬ－２３Ｒ抗原結合フラグメントを含む細胞外結合ドメイン、（ｉｉ）任意選択で細胞外ヒンジドメイン、（ｉｉｉ）膜貫通ドメイン、（ｉｖ）細胞内シグナル伝達ドメイン、ならびに（ｖ）任意選択でタグ及び／またはリーダー配列を含み得る。一実施形態では、ＣＡＲは、１つ以上のポリペプチド、例えば２つのポリペプチドを含む。
本開示の目的は、少なくとも１つのＩＬ－２３Ｒに特異的なＣＡＲである。ＣＡＲは、（ｉ）本明細書に記載の抗ＩＬ－２３Ｒ抗原結合フラグメントを含む細胞外結合ドメイン、（ｉｉ）任意選択で細胞外ヒンジドメイン、（ｉｉｉ）膜貫通ドメイン、（ｉｖ）細胞内シグナル伝達ドメイン、ならびに（ｖ）任意選択でタグ及び／またはリーダー配列を含み得る。一実施形態では、ＣＡＲは、１つ以上のポリペプチド、例えば２つのポリペプチドを含む。
【0096】
ＩＩ．１．１．細胞外結合ドメイン
一実施形態では、ＣＡＲの細胞外結合ドメインは、本開示の抗原結合フラグメントを含むか、またはそれからなる。一実施形態では、抗原結合フラグメントは、それぞれ配列番号１～３を有するＨＣＤＲ１～３の少なくとも１つ、及び／またはそれぞれ配列番号４～６を有するＬＣＤＲ１～３の少なくとも１つを含む。さらなる実施形態では、ＣＡＲの細胞外結合ドメインにおける抗原結合フラグメントは、それぞれ配列番号１～６の配列を有するＨＣＤＲ１～３及びＬＣＤＲ１～３を含む。一実施形態では、ＣＡＲの細胞外結合ドメインは、配列番号７の配列または配列番号７に対して少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくはそれ以上の同一性を有する配列を有するＶＨと、配列番号８の配列または配列番号８に対して少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくはそれ以上の同一性を有する配列を有するＶＬと、を含む抗原結合フラグメントを含む。
一実施形態では、ＣＡＲの細胞外結合ドメインは、本開示の抗原結合フラグメントを含むか、またはそれからなる。一実施形態では、抗原結合フラグメントは、それぞれ配列番号１～３を有するＨＣＤＲ１～３の少なくとも１つ、及び／またはそれぞれ配列番号４～６を有するＬＣＤＲ１～３の少なくとも１つを含む。さらなる実施形態では、ＣＡＲの細胞外結合ドメインにおける抗原結合フラグメントは、それぞれ配列番号１～６の配列を有するＨＣＤＲ１～３及びＬＣＤＲ１～３を含む。一実施形態では、ＣＡＲの細胞外結合ドメインは、配列番号７の配列または配列番号７に対して少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくはそれ以上の同一性を有する配列を有するＶＨと、配列番号８の配列または配列番号８に対して少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくはそれ以上の同一性を有する配列を有するＶＬと、を含む抗原結合フラグメントを含む。
【0097】
一実施形態では、ＣＡＲの細胞外結合ドメインは、ＶＨとＶＬとの間にペプチドリンカーを有する抗ＩＬ－２３Ｒ ｓｃＦｖを含むか、またはそれからなり、該ペプチドリンカーは、配列番号１３または配列番号１３に対して少なくとも約９０％、９５％もしくはそれ以上の同一性を有する配列を含む。
【0098】
一実施形態では、ＣＡＲの細胞外結合ドメインは、配列番号１５または配列番号１５に対して少なくとも約９０％、９５％もしくはそれ以上の同一性を有する配列を含む抗ＩＬ－２３Ｒ ｓｃＦｖを含むか、またはそれからなる。
【0099】
ＩＩ．１．２．ヒンジドメイン
一実施形態では、細胞外ＩＬ－２３Ｒ結合ドメインは、ヒンジドメインによって膜貫通ドメインに接続されている。
一実施形態では、細胞外ＩＬ－２３Ｒ結合ドメインは、ヒンジドメインによって膜貫通ドメインに接続されている。
【0100】
一実施形態では、ヒンジドメインは、約２～約１００アミノ酸、例えば約２～約７５アミノ酸を含むか、またはそれらからなる。
【0101】
一実施形態では、ヒンジドメインは、本明細書に記載される、例えば２～２０または２～１５アミノ酸の範囲の長さを有するペプチドリンカーである。
【0102】
一実施形態では、ヒンジドメインは、ＣＤ８ヒンジに由来するアミノ酸配列（例えば、配列番号２０）または配列番号２０に対して少なくとも約９５％（例えば約９６％、９７％、９８％または９９％）の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。一実施形態では、ヒンジドメインは、配列番号２１または配列番号２１に対して少なくとも約９５％（例えば約９６％、９７％、９８％または９９％）の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされるＣＤ８ヒンジである。
【0103】
ＩＩ．１．３．膜貫通ドメイン
本発明のＣＡＲにおいて使用され得る膜貫通ドメインの例としては、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のα鎖またはβ鎖の膜貫通ドメイン；またはＣＤ２８、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＫＩＲＤＳ２、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＬＦＡ－１（ＣＤｌ ｌａ、ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＧＩＴＲ、ＣＤ４０、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦｌ）、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒ ａ、ＩＴＧＡ１、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＰＤ１、ＩＴＧＡＸ、ＣＤｌ１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴ ＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤＩＯＯ（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙｌ０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｄ、及びＮＫＧ２Ｃの膜貫通ドメインが挙げられるが、これらに限定されない。
本発明のＣＡＲにおいて使用され得る膜貫通ドメインの例としては、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のα鎖またはβ鎖の膜貫通ドメイン；またはＣＤ２８、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＫＩＲＤＳ２、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＬＦＡ－１（ＣＤｌ ｌａ、ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＧＩＴＲ、ＣＤ４０、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦｌ）、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒ ａ、ＩＴＧＡ１、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＰＤ１、ＩＴＧＡＸ、ＣＤｌ１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴ ＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤＩＯＯ（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙｌ０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｄ、及びＮＫＧ２Ｃの膜貫通ドメインが挙げられるが、これらに限定されない。
【0104】
一実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８膜貫通ドメインに由来するアミノ酸配列（例えば、配列番号２２）または配列番号２２に対して少なくとも約９５％（例えば約９６％、９７％、９８％または９９％）の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。一実施形態では、膜貫通ドメインは、配列番号２３または配列番号２３に対して少なくとも約９５％（例えば約９６％、９７％、９８％または９９％）の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされるＣＤ８膜貫通ドメインである。
【0105】
別の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ２８膜貫通ドメインに由来するアミノ酸配列（例えば、配列番号２４）または配列番号２４に対して少なくとも約９５％（例えば約９６％、９７％、９８％または９９％）の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。一実施形態では、膜貫通ドメインは、配列番号２５または配列番号２５に対して少なくとも約９５％（例えば約９６％、９７％、９８％または９９％）の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされるＣＤ２８膜貫通ドメインである。
【0106】
別の実施形態では、膜貫通ドメインは、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）膜貫通ドメインに由来するアミノ酸配列（例えば、配列番号２６）または配列番号２６に対して少なくとも約９５％（例えば約９６％、９７％、９８％または９９％）の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。一実施形態では、膜貫通ドメインは、配列番号２７または配列番号２７に対して少なくとも約９５（例えば、９６％、９７％、９８％または９９％）の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる４－１ＢＢ膜貫通ドメインである。
【0107】
別の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＴＮＦＲ２膜貫通ドメインに由来するアミノ酸配列（例えば、配列番号２８）または配列番号２８に対して少なくとも約９５％（例えば約９６％、９７％、９８％または９９％）の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。一実施形態では、膜貫通ドメインは、配列番号２９または配列番号２９に対して少なくとも約９５％（例えば約９６％、９７％、９８％または９９％）の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされるＴＮＦＲ２膜貫通ドメインである。
【0108】
一実施形態では、膜貫通ドメインは、完全に人工的なものであってもよく、例えば、主として疎水性アミノ酸、例えば、バリン及びロイシンを含んでもよい。
【0109】
ＩＩ．１．４．細胞内シグナル伝達ドメイン
一実施形態では、本発明のＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、それが由来する分子の細胞内部分全体、またはネイティブな細胞内シグナル伝達ドメイン全体、またはその機能的フラグメントもしくは誘導体を含み得る。
一実施形態では、本発明のＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、それが由来する分子の細胞内部分全体、またはネイティブな細胞内シグナル伝達ドメイン全体、またはその機能的フラグメントもしくは誘導体を含み得る。
【0110】
一実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞一次シグナル伝達ドメイン（またはそれから誘導された配列）と、任意選択でＴ細胞共刺激分子の１つ以上の細胞内ドメイン（またはそれから誘導された配列（複数可））とを含む。
【0111】
いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、一次シグナル伝達ドメインを含むか、またはそれからなる。
【0112】
一実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞共刺激分子の１つ以上の細胞内ドメインを含むか、またはそれからなる。一実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞共刺激分子の１つ以上の細胞内ドメインからなる。
【0113】
別の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、少なくとも１つの共刺激ドメインと、一次シグナル伝達ドメインとを含むか、またはそれらからなる。
【0114】
別の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、少なくとも２つの共刺激ドメインと、一次シグナル伝達ドメインとを含むか、またはそれらからなる。
【0115】
一実施形態では、Ｔ細胞一次シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータの機能的シグナル伝達ドメインを含むか、またはそれからなる。
【0116】
一実施形態では、Ｔ細胞一次シグナル伝達ドメインは、配列番号３０のＣＤ３ゼータ細胞内ドメインのアミノ酸配列、または配列番号３０に対して少なくとも約９５％（例えば９６％、９７％、９８％または９９％）の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。一実施形態では、ＣＤ３ゼータ一次シグナル伝達ドメインは、配列番号３０の少なくとも１つ、２つまたは３つの改変（ただし２０、１０または５つ以下の改変）を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
【0117】
一実施形態では、ＣＤ３ゼータ一次シグナル伝達ドメインは、配列番号３１または配列番号３１に対して少なくとも約９５（例えば約９６％、９７％、９８％または９９％）の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる。
【0118】
刺激的に作用するＴ細胞一次シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭＳ）として知られるシグナル伝達モチーフを含んでもよい。一実施形態では、Ｔ細胞一次シグナル伝達ドメインは、改変されたＩＴＡＭドメイン、例えば、ネイティブＩＴＡＭドメインと比較して変化した（例えば、増加または減少された）活性を有する変異ＩＴＡＭドメインを含む。一実施形態では、一次シグナル伝達ドメインは、改変されたＩＴＡＭ含有一次細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、最適化された及び／または切断されたＩＴＡＭ含有一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。ある実施形態では、一次シグナル伝達ドメインは、１つ、２つ、３つ、４つまたはそれ以上のＩＴＡＭモチーフを含む。
【0119】
一実施形態では、本発明のＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインと組み合わされたＴ細胞一次シグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン）を含む。
【0120】
共刺激シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞共刺激分子の細胞内ドメイン、または免疫細胞上で発現される他の細胞表面分子に由来し得る。共刺激シグナルドメインの例としては、ＣＤ２８、ＣＤ２７、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＭＨＣクラスＩ分子、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌリガンド受容体、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、リンパ球機能関連抗原１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンド、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＧＩＴＲ、ＡＲＨＲ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＣＤ１９、ＣＤ１９ａ、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２ｒａ、ＩＬ６Ｒａ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＬ－１３ＲＡ１／ＲＡ２、ＩＬ－３３Ｒ（ＩＬ１ＲＬ１）、ＩＬ－１０ＲＡ／ＲＢ、ＩＬ－４Ｒ、ＩＬ－５Ｒ（ＣＳＦ２ＲＢ）、ＩＬ－２１Ｒ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＣＴＬＡ－４（ＣＤ１５２）、ＣＤ９５、ＴＮＦＲ１（ＣＤ１２０ａ／ＴＮＦＲＳＦ１Ａ）、ＴＮＦＲ２（ＣＤ１２０ｂ／ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ）、ＴＧＦｂＲ１／２／３、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙｌ０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ－７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、共通ガンマ鎖、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンド、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｄ、及びこれらの任意の組み合わせの細胞内ドメイン由来のものであり得る。
【0121】
本開示の一実施形態では、本発明のＣＡＲは、ＣＤ２８、ＴＮＦＲ２、４－１ＢＢ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＯＸ４０、ＣＴＬＡ４及びＰＤ－１を含む群から選択されるＴ細胞共刺激分子の少なくとも１つの細胞内ドメインを含む。
【0122】
一実施形態では、Ｔ細胞共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８細胞内ドメインに由来するアミノ酸配列（例えば配列番号３２）または配列番号３２に対して少なくとも約９５％（例えば約９６％、９７％、９８％または９９％）の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。一実施形態では、Ｔ細胞共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号３２のアミノ酸配列の少なくとも１つ、２つまたは３つの改変（ただし２０、１０または５つ以下の改変）を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。一実施形態では、Ｔ細胞共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号３３または配列番号３３に対して少なくとも約９５％（例えば約９６％、９７％、９８％または９９％）の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる。
【0123】
一実施形態では、Ｔ細胞共刺激シグナル伝達ドメインは、４－１ＢＢ細胞内ドメインに由来するアミノ酸配列（例えば配列番号３４）または配列番号３４に対して少なくとも約９５％（例えば約９６％、９７％、９８％または９９％）の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。一実施形態では、Ｔ細胞共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号３４のアミノ酸配列の少なくとも１つ、２つまたは３つの改変（ただし２０、１０または５つ以下の改変）を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。一実施形態では、Ｔ細胞共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号３５または配列番号３５に対して少なくとも約９５％（例えば約９６％、９７％、９８％または９９％）の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる。
【0124】
一実施形態では、Ｔ細胞共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７細胞内ドメインに由来するアミノ酸配列（例えば配列番号３６）または配列番号３６に対して少なくとも約９５％（例えば約９６％、９７％、９８％または９９％）の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。一実施形態では、Ｔ細胞共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号３６のアミノ酸配列の少なくとも１つ、２つまたは３つの改変（ただし２０、１０または５つ以下の改変）を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。一実施形態では、Ｔ細胞共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号３７または配列番号３７に対して少なくとも約９５％（例えば約９６％、９７％、９８％または９９％）の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる。
【0125】
一実施形態では、Ｔ細胞共刺激シグナル伝達ドメインは、ＴＮＦＲ２細胞内ドメインに由来するアミノ酸配列（例えば配列番号３８）または配列番号３８に対して少なくとも約９５％（例えば約９６％、９７％、９８％または９９％）の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。一実施形態では、Ｔ細胞共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号３８のアミノ酸配列の少なくとも１つ、２つまたは３つの改変（ただし２０、１０または５つ以下の改変）を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。一実施形態では、Ｔ細胞共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号３９または配列番号３９に対して少なくとも約９５％（例えば約９６％、９７％、９８％または９９％）の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる。
【0126】
一実施形態では、本発明のＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、以下：
－配列番号３２のＣＤ２８細胞内ドメインのアミノ酸配列または配列番号３２に対して少なくとも約９５％（例えば約９６％、９７％、９８％または９９％）の同一性を有するアミノ酸配列と、
－配列番号３０のＣＤ３ゼータ細胞内ドメインのアミノ酸配列または配列番号３０に対して少なくとも約９５％（例えば約９６％、９７％、９８％または９９％）の同一性を有するアミノ酸配列と、
を含む。
－配列番号３２のＣＤ２８細胞内ドメインのアミノ酸配列または配列番号３２に対して少なくとも約９５％（例えば約９６％、９７％、９８％または９９％）の同一性を有するアミノ酸配列と、
－配列番号３０のＣＤ３ゼータ細胞内ドメインのアミノ酸配列または配列番号３０に対して少なくとも約９５％（例えば約９６％、９７％、９８％または９９％）の同一性を有するアミノ酸配列と、
を含む。
【0127】
一実施形態では、本発明のＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ランダムな順序でまたは特定の順序で互いに連結され得る少なくとも２つの異なるドメイン（例えば、一次シグナル伝達ドメイン及びＴ細胞共刺激分子の少なくとも１つの細胞内ドメイン）を含む。
【0128】
任意選択で、別個のシグナル伝達ドメインを接続するためにペプチドリンカーを使用してもよい。一実施形態では、好適なリンカーとしてグリシン－セリンダブレット（ＧＳ）が使用される。一実施形態では、単一のアミノ酸、例えば、アラニン（Ａ）またはグリシン（Ｇ）がリンカーとして使用される。ペプチドリンカーの他の例は、上記セクションＩに記載されている。
【0129】
いくつかの実施形態では、本発明のＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、２つ以上（例えば、２、３、４、５またはそれ以上）の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。一実施形態では、２つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインは、本明細書に記載されるようなペプチドリンカーによって分けられている。
【0130】
一実施形態では、本発明のＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータの一次シグナル伝達ドメイン（例えば配列番号３０）及びＣＤ２８の共刺激シグナル伝達ドメイン（例えば配列番号３２）を含む。
【0131】
ＩＩ．１．５．リーダー配列
一実施形態では、本開示のＣＡＲは、ＩＬ－２３Ｒ特異的細胞外結合ドメインに対してＮ末端に位置するリーダー配列をさらに含む。リーダー配列は、タンパク質がゴルジ複合体から分泌された後にＣＡＲタンパク質の細胞表面発現を可能とする。
一実施形態では、本開示のＣＡＲは、ＩＬ－２３Ｒ特異的細胞外結合ドメインに対してＮ末端に位置するリーダー配列をさらに含む。リーダー配列は、タンパク質がゴルジ複合体から分泌された後にＣＡＲタンパク質の細胞表面発現を可能とする。
【0132】
本発明のＣＡＲの好適なリーダー配列は、ＣＤ８リーダー配列、ＣＤ２５リーダー配列、またはＩｇｋリーダー配列を含む。
【0133】
リーダー配列の非限定的な例は、配列番号４０を含むかまたそれからなり得るＣＤ８のリーダー配列である。一実施形態では、リーダー配列は、ＣＤ８リーダー配列に由来するアミノ酸配列（例えば、配列番号４０）または配列番号４０に対して少なくとも約９５％（例えば約９６％、９７％、９８％または９９％）の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。好ましくは、リーダー配列は配列番号４０からなる。
【0134】
一実施形態では、リーダー配列をコードするヌクレオチド配列は、ＣＤ８リーダー配列（例えば配列番号４１）をコードするヌクレオチド配列または配列番号４１に対して少なくとも約９５％（例えば約９６％、９７％、９８％または９９％）の同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる。好ましくは、リーダー配列は、配列番号４１からなる配列によってコードされる。
【0135】
リーダー配列のさらなる非限定的な例は、配列番号５８を含むかまたそれからなり得るＣＤ２５のリーダー配列である。一実施形態では、リーダー配列は、ＣＤ２５リーダー配列に由来するアミノ酸配列（例えば、配列番号５８）または配列番号５８に対して少なくとも約９５％（例えば約９６％、９７％、９８％または９９％）の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。好ましくは、リーダー配列は配列番号５８からなる。
【0136】
一実施形態では、リーダー配列をコードするヌクレオチド配列は、ＣＤ２５リーダー配列（例えば配列番号５９）をコードするヌクレオチド配列または配列番号５９に対して少なくとも約９５％（例えば約９６％、９７％、９８％または９９％）の同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる。好ましくは、リーダー配列は配列番号５９からなる配列によってコードされる。
【0137】
ＩＩ．１．６．タグ
一実施形態では、ＣＡＲは、例えばｉｎ ｖｉｖｏでの品質管理、富化、及び追跡のためのタグをさらに含む。該タグは、ＣＡＲのＮ末端またはＣ末端に局在していても、ＣＡＲポリペプチドの内部に存在していてもよい。タグの例としては、ヘマグルチニンタグ、ポリアルギニンタグ、ポリヒスチジンタグ、Ｍｙｃタグ、Ｓｔｒｅｐタグ、Ｓ－タグ、ＨＡＴタグ、３×Ｆｌａｇタグ、カルモジュリン結合ペプチドタグ、ＳＢＰタグ、キチン結合ドメインタグ、ＧＳＴタグ、マルトース結合タンパク質タグ、蛍光タンパク質タグ、Ｔ７タグ、Ｖ５タグ、及びＸｐｒｅｓｓタグが挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態では、ＣＡＲは、例えばｉｎ ｖｉｖｏでの品質管理、富化、及び追跡のためのタグをさらに含む。該タグは、ＣＡＲのＮ末端またはＣ末端に局在していても、ＣＡＲポリペプチドの内部に存在していてもよい。タグの例としては、ヘマグルチニンタグ、ポリアルギニンタグ、ポリヒスチジンタグ、Ｍｙｃタグ、Ｓｔｒｅｐタグ、Ｓ－タグ、ＨＡＴタグ、３×Ｆｌａｇタグ、カルモジュリン結合ペプチドタグ、ＳＢＰタグ、キチン結合ドメインタグ、ＧＳＴタグ、マルトース結合タンパク質タグ、蛍光タンパク質タグ、Ｔ７タグ、Ｖ５タグ、及びＸｐｒｅｓｓタグが挙げられるが、これらに限定されない。
【0138】
一実施形態では、本開示のＣＡＲは、ＨＡタグ（配列番号４２）を含む。一実施形態では、タグは、配列番号４３または配列番号４３に対して少なくとも約９５％（例えば約９６％、９７％、９８％または９９％）の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる。
【0139】
ＩＩ．１．７．例示的なＣＡＲ
一実施形態によれば、本開示のＣＡＲは、ＩＬ－２３Ｒ結合ドメイン（例えば配列番号１５を含むかまたはそれからなるドメイン）、任意選択で細胞外ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、Ｔ細胞共刺激分子の単一の細胞内ドメイン、及びＴ細胞一次シグナル伝達ドメインを含む。好ましくは、本開示のＣＡＲは、さらにリーダー配列を含む。
一実施形態によれば、本開示のＣＡＲは、ＩＬ－２３Ｒ結合ドメイン（例えば配列番号１５を含むかまたはそれからなるドメイン）、任意選択で細胞外ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、Ｔ細胞共刺激分子の単一の細胞内ドメイン、及びＴ細胞一次シグナル伝達ドメインを含む。好ましくは、本開示のＣＡＲは、さらにリーダー配列を含む。
【0140】
一実施形態では、本開示のＣＡＲは、ＩＬ－２３Ｒ結合ドメイン（例えば、配列番号１５）、ＣＤ８の膜貫通ドメイン（例えば、配列番号２２）、ＣＤ２８の細胞内ドメイン（例えば、配列番号３２）、及びＣＤ３ゼータ一次シグナル伝達ドメイン（例えば、配列番号３０）を含む。一実施形態では、本開示のＣＡＲは、さらにリーダー配列を含む。
【0141】
一実施形態では、本開示のＣＡＲは、ＩＬ－２３Ｒ結合ドメイン（例えば、配列番号１５）、ＣＤ８のヒンジドメイン（例えば、配列番号２０）、ＣＤ８の膜貫通ドメイン（例えば、配列番号２２）、ＣＤ２８の細胞内ドメイン（例えば、配列番号３２）、及びＣＤ３ゼータ一次シグナル伝達ドメイン（例えば、配列番号３０）を含む。
【0142】
一実施形態では、本開示のＣＡＲは、ＩＬ－２３Ｒ結合ドメイン（例えば、配列番号１５）、ＣＤ８のヒンジドメイン（例えば、配列番号２０）、ＣＤ８の膜貫通ドメイン（例えば、配列番号２２）、ＣＤ２８の細胞内ドメイン（例えば、配列番号３２）、ＣＤ３ゼータ一次シグナル伝達ドメイン（例えば、配列番号３０）、及びリーダー配列を含む。一実施形態では、リーダー配列は、配列番号４０、配列番号５８、配列番号６０または配列番号６２を含むか、またはそれからなる。好ましくは、リーダー配列は、配列番号４０または配列番号５８を含むか、またはそれからなる。好ましくは、リーダー配列は配列番号５８を含むか、またはそれからなる。
【0143】
一実施形態では、本開示のＣＡＲは、抗ＩＬ－２３Ｒ ｓｃＦｖ（例えば配列番号１５を含むかまたはそれからなるｓｃＦｖ）、ＣＤ８のヒンジ領域、ヒトＣＤ８の膜貫通ドメイン、ヒトＣＤ２８の細胞内ドメイン、及びヒトＣＤ３ζの細胞内ドメインを含む。一実施形態では、本開示のＣＡＲは、さらにリーダー配列を含む。
【0144】
一実施形態では、該ＣＡＲは、配列番号４４または配列番号４４に対して少なくとも約９５％（例えば約９６％、９７％、９８％または９９％）の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
【0145】
本開示のＣＡＲは、マウス及びヒトＩＬ－２３Ｒを結合することができる新規な交差反応性ＣＡＲである（実施例３及び図１４）。これらの例示的な結果では、本開示のＣＡＲは、ＩＬ２３Ｒのヒトとマウスホモログ間で類似した結合プロファイルを呈する。これらの例示的な結果では、本開示のＣＡＲ＃２は、ヒトＩＬ２３ＲとマウスＩＬ２３Ｒ間の結合親和性の差が約１．４倍を示す一方で、ＣＡＲ＃１は、ヒトＩＬ２３ＲとマウスＩＬ２３Ｒ間の結合親和性の差が約３倍を示す。これらの例示的な結果は、本開示のＣＡＲ＃２が、ＣＡＲ＃１と比較してより類似した親和性で、ヒト及びマウスＩＬ２３Ｒに結合することを示している。この類似性は、マウス前臨床モデルにおけるＣＡＲ＃２の使用がヒトＩＬ２３Ｒとのその相互作用をより代表するものとなり得ることを示唆している。
【0146】
有利なことに、本開示のＣＡＲは、抗原結合部分の安定したシグナル伝達及び低バックグラウンドの活性化を示した（実施例４及び図１６）。
【0147】
ＩＩ．１．８．マウスＣＡＲ
本開示はまた、ＩＬ－２３Ｒ結合ドメイン（例えば配列番号１５を含むかまたはそれからなるドメイン）、任意選択で細胞外ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、Ｔ細胞共刺激分子の単一の細胞内ドメイン、及びＴ細胞一次シグナル伝達ドメインを含むマウスＣＡＲを提供する。
本開示はまた、ＩＬ－２３Ｒ結合ドメイン（例えば配列番号１５を含むかまたはそれからなるドメイン）、任意選択で細胞外ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、Ｔ細胞共刺激分子の単一の細胞内ドメイン、及びＴ細胞一次シグナル伝達ドメインを含むマウスＣＡＲを提供する。
【0148】
一実施形態では、本開示のマウスＣＡＲは、ＩＬ－２３Ｒ結合ドメイン（例えば、配列番号１５）、マウスＣＤ８の膜貫通ドメイン（例えば、配列番号５０）またはマウスＣＤ２８の膜貫通ドメイン（配列番号５２）、マウスＣＤ２８の細胞内ドメイン（例えば、配列番号５４）、及びマウスＣＤ３ゼータ一次シグナル伝達ドメイン（例えば、配列番号５６）を含む。特定の実施形態では、マウスＣＡＲは、マウスＣＤ８のヒンジドメイン（例えば配列番号４６）またはマウスＣＤ２８のヒンジドメイン（例えば配列番号４８）も含み得る。上述のドメインの任意の組み合わせを有するマウスＣＡＲが企図される。
【0149】
ＩＩ．２．ＣＡＲをコードする核酸
本開示はまた、本明細書に記載のＣＡＲをコードする核酸配列に関する。そのような核酸配列の例は、配列番号４５またはその縮重もしくはコドン最適化バージョンである。
本開示はまた、本明細書に記載のＣＡＲをコードする核酸配列に関する。そのような核酸配列の例は、配列番号４５またはその縮重もしくはコドン最適化バージョンである。
【0150】
ＩＩ．３．ＣＡＲを発現するためのベクター
本開示の別の目的は、本明細書のＣＡＲをコードする核酸を含む発現ベクターである。
本開示の別の目的は、本明細書のＣＡＲをコードする核酸を含む発現ベクターである。
【0151】
一実施形態では、ＣＡＲをコードする核酸はＤＮＡである。一実施形態では、ＣＡＲをコードする核酸はＲＮＡである。本開示において使用することができるベクターの例としては、ＤＮＡベクター、ＲＮＡベクター、プラスミド、エピソーム、ウイルスベクター（例えば、動物ウイルス）が挙げられるが、これらに限定されない。
【0152】
一実施形態では、発現ベクターは、宿主細胞において導入遺伝子（例えば、ＣＡＲ）を該発現ベクター上で発現させるまたは発現を誘導するための調節エレメント、例えばプロモーター、エンハンサー、及び転写ターミネーターを含み得る。ベクターはまた、１つ以上の選択可能なマーカーを含み得る。
【0153】
動物細胞用の発現ベクターに使用されるプロモーター及びエンハンサーの例としては、ＳＶ４０の初期プロモーター及びエンハンサー、モロニーマウス白血病ウイルスのＬＴＲプロモーター及びエンハンサー、免疫グロブリンＨ鎖のプロモーター及びエンハンサーなどが挙げられるが、これらに限定されない。好適な構成的プロモーターの他の例としては、前初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター配列、伸長因子ｌα（ＥＦ－ｌα）プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、ＦＯＸＰ３由来プロモーター、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）長末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン・バーウイルス前初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ならびにヒト遺伝子プロモーター、例えばアクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘモグロビンプロモーター、及びクレアチンキナーゼプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。
【0154】
好適な誘導性プロモーターの例としては、メタロチオニンプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター、ｃｕｍａｔｅプロモーター、及びテトラサイクリンプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。
【0155】
好適な双方向性プロモーターの例としては、ｉ）サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）またはマウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）ゲノムに由来する第１の最小プロモーター配列と、ｉｉ）動物遺伝子に由来する完全な効率的プロモーター配列とを含む双方向性プロモーターについて開示する、Ｌｕｉｇｉ Ｎａｌｄｉｎｉの米国特許第８，５０１，４６４号（参照により本明細書に組み込まれる）によって記載されているプロモーターを含むが、これらに限定されない。
【0156】
好適なベクターの例としては、ｐＡＧＥ１０７、ｐＡＧＥ１０３、ｐＨＳＧ２７４，ｐＫＣＲ、ｐＳＧ１ベータｄ２－４などが挙げられるが、これらに限定されない。
【0157】
プラスミドの例としては、複製起点を含む複製プラスミド、または組み込みプラスミド、例えばｐＵＣ、ｐｃＤＮＡ、ｐＢＲなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【0158】
哺乳動物細胞への遺伝子導入のために多くのウイルスベース系が開発されている。ウイルスベクターの例としては、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターが挙げられるが、これらに限定されない。
【0159】
レトロウイルスは、遺伝子送達系に好都合なプラットフォームを提供し得る。選択された遺伝子はベクターに挿入され、当該技術分野で既知の技術を使用してレトロウイルス粒子にパッケージングされ得る。次いで、組換えウイルスが単離され、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏのいずれかで対象の細胞に送達され得る。多くのレトロウイルス系が当該技術分野で既知である。
【0160】
いくつかの実施形態では、アデノウイルスベクターが使用される。多くのアデノウイルスベクターが当該技術分野で既知である。
【0161】
一実施形態では、レンチウイルスベクターが使用される。
【0162】
一実施形態では、ＡＡＶベクターが使用される。本明細書で使用される場合、「ＡＡＶ」という用語は、天然に存在する形態及び操作された形態の両方の全ての血清型及びバリアントを包含する。例えば、この用語は、ＡＡＶタイプ１（ＡＡＶ－１）、ＡＡＶタイプ２（ＡＡＶ－２）、ＡＡＶタイプ３（ＡＡＶ－３）、ＡＡＶタイプ４（ＡＡＶ－４）、ＡＡＶタイプ５（ＡＡＶ－５）、ＡＡＶタイプ６（ＡＡＶ－６）、ＡＡＶタイプ７（ＡＡＶ－７）、及びＡＡＶタイプ８（ＡＡＶ－８）、及びＡＡＶタイプ９（ＡＡＶ－９）を包含する。一実施形態では、ベクターはＡＡＶ６ベクターである。一実施形態では、ＡＡＶは、シュードタイプＡＡＶ、例えばＡＡＶ６キャプシドを有するＡＡＶ、及び別のＡＡＶ血清型（例えば、ＡＡＶ２由来のＩＴＲを有する）に由来する組換えゲノムである。
【0163】
組換えウイルスは、パッケージング細胞のトランスフェクション、またはヘルパープラスミドもしくはウイルスによる一過性のトランスフェクションなどの当該技術分野で既知の技術によって産生され得る。ウイルスパッケージング細胞の典型的な例としては、ＰＡ３１７細胞、ＰｓｉＣＲＩＰ細胞、ＧＰｅｎｖ＋細胞、２９３細胞、２９３Ｔ細胞などが挙げられる。そのような複製欠陥組換えウイルスを産生するための詳細なプロトコルは、当該技術分野において見出され得る。昆虫細胞もまた、組換えＡＡＶなどの組換えウイルスを産生するために使用され得る。
【0164】
ＩＩ．４ ＣＡＲを発現する細胞
本開示はさらに、本明細書に記載のＣＡＲを細胞表面上で発現するように操作された免疫細胞及び免疫細胞集団に関する。
本開示はさらに、本明細書に記載のＣＡＲを細胞表面上で発現するように操作された免疫細胞及び免疫細胞集団に関する。
【0165】
一実施形態では、免疫細胞は、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、またはＮＫ Ｔ細胞などのＴ細胞である。
【0166】
一実施形態では、免疫細胞は腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）である。
【0167】
本開示はまた、本明細書に記載されるＣＡＲを細胞表面上で発現するように操作された免疫細胞を含むか、またはそれからなる、単離された及び／または実質的に精製された免疫細胞集団、好ましくはＴ細胞集団に関する。
【0168】
一実施形態では、免疫細胞、好ましくはＴ細胞は、ＣＡＲによって認識されるＩＬ－２３Ｒをその表面上で発現する細胞に抑制性である。
【0169】
一実施形態では、免疫細胞、好ましくはＴ細胞は、ＣＡＲによって認識されるＩＬ－２３Ｒをその表面上で発現する細胞に細胞傷害性である。
【0170】
一実施形態では、免疫細胞集団、好ましくはＴ細胞集団は、Ｔｒｅｇ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、及び／またはＮＫ Ｔ細胞を含むか、またはそれらからなる。
【0171】
一実施形態では、本開示のＴ細胞はＴｒｅｇ細胞である。
【0172】
一実施形態では、本開示の細胞集団におけるＴｒｅｇ細胞は全て、本明細書に記載のＣＡＲを発現し、したがってＣＡＲ単一特異性であると定義することができる（すなわち、全てのＴｒｅｇ細胞が同じ抗原（ＩＬ－２３Ｒ）を認識する）。一実施形態では、Ｔｒｅｇ細胞集団は、ＴＣＲ単一特異性である（すなわち、全てのＴｒｅｇ細胞は、それらのＴＣＲと同じ抗原を認識する）。別の実施形態では、Ｔｒｅｇ細胞集団は、ＴＣＲ多特異性である（すなわち、Ｔｒｅｇ細胞は、それらのＴＣＲと異なる抗原を認識し得る）。
【0173】
一実施形態では、本開示のＣＡＲは、Ｔ（例えばＴｒｅｇ）細胞によって発現される場合、Ｔ細胞に、ＩＬ－２３Ｒをその細胞表面上で発現する細胞に結合し、ＩＬ－２３Ｒへの結合により活性化される能力を付与する。
【0174】
ＩＬ－２３Ｒを発現する細胞の例としては、Ｔｈ１７細胞、αβＴ細胞、好中球、γδＴ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫ Ｔ細胞、樹状細胞、及びマクロファージが挙げられるが、これらに限定されない。
【0175】
したがって、本開示の免疫細胞集団（例えば、本開示のＴ（例えば、Ｔｒｅｇ）細胞集団）は、リダイレクトされた免疫細胞集団として定義されてもよい。本明細書で使用される場合、「リダイレクトされた」という用語は、本明細書に記載のＣＡＲを保持する免疫細胞を指し、該免疫細胞が特異的であるもしくは特異的となったであろう、または該免疫細胞によって活性化されるリガンドとは異なるリガンドに結合し、それによって活性化される能力を免疫細胞に付与する。
【0176】
一実施形態では、本開示のＴｒｅｇ細胞は細胞傷害性ではない。別の実施形態では、本開示のＴｒｅｇ細胞は細胞傷害性である。
【0177】
一実施形態では、本開示のＴｒｅｇ細胞は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋Ｔｒｅｇ細胞、Ｔｒ１細胞、ＴＧＦ－β分泌Ｔｈ３細胞、制御性ＮＫ Ｔ細胞、制御性γδＴ細胞、制御性ＣＤ８＋Ｔ細胞、及び二重陰性制御性Ｔ細胞を含む群から選択され得る。
【0178】
一実施形態では、免疫細胞はＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞である。一実施形態では、Ｔｒｅｇは、胸腺由来Ｔｒｅｇまたは適応性もしくは誘導性Ｔｒｅｇである。一実施形態では、Ｔｒｅｇ細胞は、ＣＤ４＋ＦＯＸＰ３＋Ｔｒｅｇ細胞またはＣＤ４＋ＦＯＸＰ３－制御性Ｔ細胞（Ｔｒ１細胞）である。
【0179】
一実施形態では、免疫細胞はＣＤ８＋Ｔｒｅｇ細胞である。一実施形態では、ＣＤ８＋Ｔｒｅｇ細胞は、ＣＤ８＋ＣＤ２８－Ｔｒｅｇ細胞、ＣＤ８＋ＣＤ１０３＋Ｔｒｅｇ細胞、ＣＤ８＋ＦＯＸＰ３＋Ｔｒｅｇ細胞、ＣＤ８＋ＣＤ１２２＋Ｔｒｅｇ細胞、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。一実施形態では、制御性細胞は、ＩＮＦγ＋ＩＬ１０＋ＩＬ３４＋ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ細胞である。
【0180】
一実施形態では、本開示の免疫細胞はヒトＴｒｅｇ細胞である。
【0181】
一実施形態では、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞またはＴｒｅｇ細胞）は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）などの幹細胞に由来する。
【0182】
本明細書で使用される場合、「人工多能性幹細胞」または「ｉＰＳＣ」という用語は、脱分化またはリプログラミングによって非多能性細胞（例えば、成体の体細胞）から誘導された多能性幹細胞を指す。具体的には、多能性関連遺伝子の特定のセット（リプログラミング因子）を細胞に導入することによって、ｉＰＳＣを得ることができる。リプログラミング因子は、例えば、転写因子Ｏｃｔ４（Ｐｏｕ５ｆ１）、Ｓｏｘ２、ｃ－Ｍｙｃ、及びＫｌｆ４であり得る。
【0183】
一実施形態では、Ｔｒｅｇ細胞は、以下の表現型：ＣＤ４＋ＣＤ２５＋、例えばＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７－及びＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７－ＣＤ４５ＲＡ＋を有する。一実施形態では、Ｔｒｅｇ細胞は、以下の表現型：ＣＤ４＋ＣＤ２５＋、例えばＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏｗ及びＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏｗＣＤ４５ＲＡ＋を有する。一実施形態では、Ｔｒｅｇ細胞は、以下の表現型：ＣＤ４＋ＣＤ２５＋、例えばＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏｗ／－及びＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏｗ／－ＣＤ４５ＲＡ＋を有する。一実施形態では、Ｔｒｅｇ細胞は、以下の表現型：ＦＯＸＰ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋、例えばＦＯＸＰ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７－及びＦＯＸＰ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７－ＣＤ４５ＲＡ＋を有する。一実施形態では、Ｔｒｅｇ細胞は、以下の表現型：ＦＯＸＰ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋、例えばＦＯＸＰ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏｗ及びＦＯＸＰ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏｗＣＤ４５ＲＡ＋を有する。一実施形態では、Ｔｒｅｇ細胞は、以下の表現型：ＦＯＸＰ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋、例えばＦＯＸＰ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏｗ／－及びＦＯＸＰ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏｗ／－ＣＤ４５ＲＡ＋を有する。
【0184】
一実施形態では、Ｔｒｅｇ細胞は、以下の表現型：ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈ、例えばＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈＣＤ１２７－及びＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈＣＤ１２７－ＣＤ４５ＲＡ＋を有する。一実施形態では、Ｔｒｅｇ細胞は、以下の表現型：ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈ、例えばＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈＣＤ１２７ｌｏｗ及びＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈＣＤ１２７ｌｏｗＣＤ４５ＲＡ＋を有する。一実施形態では、Ｔｒｅｇ細胞は、以下の表現型：ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈ、例えばＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈＣＤ１２７ｌｏｗ／－及びＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈＣＤ１２７ｌｏｗ／－ＣＤ４５ＲＡ＋を有する。一実施形態では、Ｔｒｅｇ細胞は、以下の表現型：ＦＯＸＰ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈ、例えばＦＯＸＰ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈＣＤ１２７－及びＦＯＸＰ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈＣＤ１２７－ＣＤ４５ＲＡ＋を有する。一実施形態では、Ｔｒｅｇ細胞は、以下の表現型：ＦＯＸＰ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈ、例えばＦＯＸＰ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈＣＤ１２７ｌｏｗ及びＦＯＸＰ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈＣＤ１２７ｌｏｗＣＤ４５ＲＡ＋を有する。一実施形態では、Ｔｒｅｇ細胞は、以下の表現型：ＦＯＸＰ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈ、例えばＦＯＸＰ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈＣＤ１２７ｌｏｗ／－及びＦＯＸＰ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈＣＤ１２７ｌｏｗ／－ＣＤ４５ＲＡ＋を有する。
【0185】
一実施形態では、Ｔｒｅｇ細胞は、ＦＯＸＰ３遺伝子座のイントロン１内の保存領域であるＴｒｅｇ特異的脱メチル化領域（ＴＳＤＲ）における選択的脱メチル化及び／または低メチル化に関連する安定なＦＯＸＰ３発現を有する。
【0186】
分子の発現レベルは、フローサイトメトリー、免疫蛍光、または画像分析によって決定され得る。細胞内タンパク質を検出するために、フローサイトメトリー分析の前に細胞を固定化し、透過処理することができる。
【0187】
一実施形態では、細胞集団中の分子の発現レベルは、分子を発現する細胞集団の細胞の割合（％）によって示される（すなわち、分子に対して細胞「＋」）。分子を発現する細胞の割合（％）は、ＦＡＣＳにより測定され得る。目的の細胞マーカーの発現レベルは、このマーカーに特異的な蛍光標識抗体で染色された細胞集団からの細胞の蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）と、特異性は異なるが同じアイソタイプ、同じ蛍光プローブ、及び同じ種由来である蛍光標識抗体で染色された同じ細胞集団からの細胞（アイソタイプ対照と呼ばれる）の蛍光強度（ＦＩ）とを比較することによって決定することができる。このマーカーに特異的な蛍光標識抗体で染色され、かつアイソタイプ対照で染色された細胞と同等のＭＦＩまたは低いＭＦＩを示す集団からの細胞は、このマーカーを発現しておらず、（－）または陰性と表記される。このマーカーに特異的な蛍光標識抗体で染色され、かつアイソタイプ対照で染色された細胞を上回るＭＦＩ値を示す集団からの細胞は、このマーカーを発現しており、（＋）または陽性と表記される。
【0188】
「発現する」（すなわち「陽性」または「＋」）及び「発現しない」（すなわち「陰性」または「－」）という用語は、目的の細胞マーカーの発現レベルを指し、「＋」に対応する細胞マーカーの発現レベルは高いまたは中間（「＋／－」とも称される）であり、「－」に対応する細胞マーカーの発現レベルはゼロである。「ｌｏｗ」または「ｌｏ」または「ｌｏ／－」または「ｌｏｗ／－」という用語は、目的の細胞マーカーの発現レベルを、その細胞マーカーの発現レベルが、全体として分析される細胞集団におけるその細胞マーカーの発現レベルと比較して低いことを指す。より具体的には、「ｌｏ」という用語は、細胞マーカーを発現する別個の細胞集団が、１つ以上の他の別個の細胞集団よりも低レベルであることを指す。「ｈｉｇｈ」または「ｈｉ」または「ｂｒｉｇｈｔ」という用語は、目的の細胞マーカーの発現レベルを、その細胞マーカーの発現レベルが、全体として分析される細胞集団におけるその細胞マーカーの発現レベルと比較して高いことを指す。一般的に、染色強度の上位２、３、４、または５％の細胞は「ｈｉ」と表記され、集団の上半分に入る細胞は「＋」に分類される。蛍光強度の５０％を下回る細胞は「ｌｏ」細胞と表記され、５％を下回る細胞は「－」細胞と表記される。
【0189】
【0190】
本明細書で使用される「トニックシグナル伝達」という用語は、抗原非依存的な活性のバックグラウンドを指す。トニックシグナル伝達の測定方法は当業者に周知であり、ＣＡＲ発現細胞の代謝活性を測定すること、受容体によって認識される抗原による刺激の非存在下で細胞活性化の１つ以上の指標を測定すること、細胞老化（ｃｅｌｌ ａｇｉｎｇ）または細胞老化（ｃｅｌｌ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ）に関連する１つ以上の表現型変化を測定すること、抗原刺激の非存在下で細胞周期の進行を判定すること、及び受容体を発現する細胞のサイズを未改変細胞のサイズと比較して測定することが挙げられるが、これらに限定されない。
【0191】
ＣＡＲ Ｔｒｅｇ細胞によるＣＤ６９の自発的発現を、形質導入されていないＴｒｅｇ細胞と比較してモニタリングすることで、トニックシグナル伝達強度を決定することができる。
【0192】
本明細書で実証されるように、本発明のＣＡＲ構築物を発現する操作されたＴ細胞及び操作されたＴｒｅｇ細胞は低トニックシグナル伝達を示し、ＣＡＲ結合に続いて、操作されたＴｒｅｇ細胞はＴエフェクター細胞増殖に対して非常に効果的な抑制活性を示し、それにより細胞治療に対するこれらのＴｒｅｇ細胞の利点を実証している。
【0193】
一実施形態では、本開示のＣＡＲは、Ｔｒｅｇ細胞によって発現される場合、ＩＬ－２３Ｒを指向する他のＣＡＲ構築物と比較して、Ｔｒｅｇ細胞の活性化バックグラウンドの減少を可能にする。
【0194】
加えて、本開示のＣＡＲを発現する免疫細胞は、ＣＡＲ発現細胞が、高レベルのＩＬ－２３Ｒ発現と結合する場合、低レベルのＩＬ－２３Ｒ発現と結合する場合と比べて、より強力な抑制活性を有することが判明した（図１２）。したがって、本開示のＣＡＲは、オフターゲット活性を低下させることが予想される。
【0195】
一実施形態では、本開示のＣＡＲは、Ｔｒｅｇ細胞によって発現される場合、ＩＬ－２３Ｒを指向する他のＣＡＲ構築物と比較して、Ｔｒｅｇ細胞のオフターゲット活性の低下を可能にする。
【0196】
ＩＩＩ．組成物、医薬組成物、医薬
本開示の別の目的は、本明細書に記載のＩＬ－２３Ｒに結合する少なくとも１つの抗体、または該抗体の少なくとも１つの抗原結合フラグメント、または本開示による抗体もしくは該抗体の抗原結合フラグメントをコードする少なくとも１つの核酸もしくはベクターを含む、本質的にそれらからなる、またはそれらからなる組成物である。
本開示の別の目的は、本明細書に記載のＩＬ－２３Ｒに結合する少なくとも１つの抗体、または該抗体の少なくとも１つの抗原結合フラグメント、または本開示による抗体もしくは該抗体の抗原結合フラグメントをコードする少なくとも１つの核酸もしくはベクターを含む、本質的にそれらからなる、またはそれらからなる組成物である。
【0197】
本開示の別の目的は、本開示によるＣＡＲを含む少なくとも１つの免疫細胞または少なくとも１つの免疫細胞集団を含む、本質的にそれらからなる、またはそれらからなる組成物である。
【0198】
一実施形態では、該組成物は医薬組成物であり、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤をさらに含む。
【0199】
したがって、本開示の別の目的は、本開示によるＣＡＲを含む少なくとも１つの免疫細胞または少なくとも１つの免疫細胞集団と、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤とを含む、本質的にそれらからなる、またはそれらからなる医薬組成物である。
【0200】
本明細書で使用される場合、「本質的に～からなる」とは、組成物に関して、少なくとも１つの抗体もしくはその抗原結合フラグメント、核酸もしくは発現ベクター、または少なくとも１つの免疫細胞もしくは免疫細胞集団が、該組成物内に生物学的活性を有する唯一の治療剤または作用物質であることを意味する。
【0201】
「薬学的に許容される賦形剤」という用語は、溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、緩衝剤、等張化剤、安定化剤、防腐剤、吸収遅延剤などを指す。当該賦形剤は、ヒトなどの対象に投与された場合、副作用、アレルギー反応、または他の有害な反応を生じない。
【0202】
本開示の組成物に使用され得る薬学的に許容される賦形剤の例としては、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質（例えばヒトヒト血清アルブミン）、緩衝剤（例えば、リン酸）、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩または電解質（例えば、塩化ナトリウム、硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、及び亜鉛塩）、及びポリエチレングリコールが挙げられるが、これらに限定されない。
【0203】
一実施形態では、本開示による医薬組成物は、注射のために薬学的に適したビヒクルを含む。これらは、例えば、等張性の滅菌生理食塩水（例えばリン酸一ナトリウムもしくはリン酸二ナトリウム；塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムもしくは塩化マグネシウム；またはそれらの塩の混合物を含む）、または滅菌された水もしくは生理食塩水などの好適なキャリアを添加すると注射可能な溶液の構成を可能にする乾燥（例えば、凍結乾燥）組成物であり得る。
【0204】
本開示の別の目的は、本明細書に記載のＩＬ－２３Ｒに結合する少なくとも１つの抗体、または該抗体の少なくとも１つの抗原結合フラグメント、または本開示による抗体もしくは該抗体の抗原結合フラグメントをコードする少なくとも１つの核酸もしくはベクターを含む、本質的にそれらからなる、またはそれらからなる医薬である。
【0205】
本開示の別の目的は、本開示のＣＡＲを発現する免疫細胞の集団を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる医薬である。
【0206】
ＩＶ．投与経路
一実施形態では、本開示による組成物、医薬組成物、または医薬は、非経口的に、吸入スプレーにより、直腸的に、経鼻的に、または植込み型リザーバを介して投与される。
一実施形態では、本開示による組成物、医薬組成物、または医薬は、非経口的に、吸入スプレーにより、直腸的に、経鼻的に、または植込み型リザーバを介して投与される。
【0207】
一実施形態では、組成物、医薬組成物、または医薬は、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑液嚢内、胸骨内、髄腔内、肝内、病巣内、及び頭蓋内注射または注入技術を含むがこれらに限定されない注射によって投与される。
【0208】
注射に適した形態の例としては、溶液、例えば滅菌水溶液、ゲル、分散液、エマルション、懸濁液、使用前に液体を添加して溶液または懸濁液を調製するための使用に適した固体形態、例えば粉末、リポソーム形態などが挙げられるが、これらに限定されない。
【0209】
Ｖ．投与量
一実施形態では、本開示による単離された抗体もしくはその抗原結合フラグメント、核酸、発現ベクター、免疫細胞もしくは免疫細胞集団、組成物、医薬組成物、また医薬は、それを必要とする対象に治療有効量で投与される。
一実施形態では、本開示による単離された抗体もしくはその抗原結合フラグメント、核酸、発現ベクター、免疫細胞もしくは免疫細胞集団、組成物、医薬組成物、また医薬は、それを必要とする対象に治療有効量で投与される。
【0210】
しかしながら、治療有効量及び投与頻度は、合理的な医学的判断の範囲内で担当医師によって決定されることが理解されるであろう。任意の特定の患者のための特定の治療有効用量レベルは、治療される疾患及び疾患の重症度；使用される単離された抗体もしくはその抗原結合フラグメント、核酸、発現ベクター、または免疫細胞の活性；対象の年齢、体重、全般的な健康状態、性別、及び食事；使用される特定の治療剤の投与時間、投与経路、及び排泄速度；治療期間；使用される特定の治療剤と併用または同時に使用される薬剤；ならびに医療分野で周知である同様の因子を含む、様々な因子に依存し得る。例えば、化合物の投与を、所望の治療効果を得るのに必要な量よりも低いレベルから開始し、所望の効果が得られるまで徐々に投与量を増加させることは、当業者の技術範囲内である。各治療に必要な総用量は、複数回で投与しても、１回で投与してもよい。
【0211】
一実施形態では、対象（例えば、ヒト）は、本開示の免疫細胞または免疫細胞集団の単回投与を受ける。
【0212】
一実施形態では、対象（例えば、ヒト）は、本開示の免疫細胞または免疫細胞集団の少なくとも２回の投与を受ける。
【0213】
一実施形態では、免疫細胞集団は、対象に週１回、月１回、または年１回投与される。
【0214】
一実施形態では、対象に投与される免疫細胞の数は、約１０２個～約１０９個、約１０３個～約１０８個、約１０４個～約１０７個、または約１０５個～約１０６個の範囲である。
【0215】
一実施形態では、免疫細胞は、それを必要とする対象に、少なくとも１種の他の活性剤と組み合わせて投与される。一実施形態では、該活性剤は、ＩＬ－２３Ｒ関連疾患または障害を治療するために使用され得る薬剤である。他の活性剤の例としては、グルココルチコイド（デキサメタゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、ベタメタゾン、ベドメタゾン（ｂｅｄｏｍｅｔｈａｓｏｎｅ）、チキソコルトール、トリアムシノロン、ヒドロコルチゾン、ブデソニドまたはフルドロコルチゾンを含むが、これらに限定されない）、ヒトサイトカインまたは成長因子の抗体またはアンタゴニスト（例えばインフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブ、エタネルセプトなどの抗ＴＮＦ；抗ＩＬ１、抗ＩＬ－６、抗ＩＬ－１２、抗ＩＬ－１７及び抗ＩＬ－２３（例えばブラジクマブ、グセルクマブ、ミリキズマブ、リサンキズマブ）、抗ＩＬ－１２／ＩＬ－２３（例えばウステキヌマブ）；またはＩＬ－１受容体アンタゴニスト類似体（例えばアナキンラ）、細胞表面分子に対する抗体（例えば抗α４インテグリン（例えばナタリズマブ）、抗インテグリンβ７（例えばエトロリズマブ）、抗α４－β７インテグリン（例えばベドリズマブ）、抗ＣＤ２、抗ＣＤ３（例えば、ビシルズマブ（ｖｉｓｉｌｕｚｕｍａｂ））、抗ＣＣＲ９、抗ＬＦＡ１または抗ＩＣＡＭ１）；ＪＡＫ阻害剤（例えばフィルゴチニブ、ウパダシチニブ）、Ｓ１ＰＲモジュレーター（例えばエトラシモド、オザニモド）、５アミノサリチル酸及びその類似体（例えばメサラジン、スルファザリン（ｓｕｌｆａｚａｌｉｎｅ）、オルサラジン、またはバルサラジド）；プロバイオティクス（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂｏｕｌａｒｄｉｉ）、抗生物質（例えば、メトロニダゾールアンピシリン、シプロフロキサシン、ＲＨＢ－１０４）、免疫調節剤（例えば、タクロリムス、シクロスポリン、メトトレキサート、サリドマイド、レフルノミド、ならびにプリンの類似体、例えばアザチオプリン及び６－メルカプトプリン）、ならびに幹細胞療法（例えばダルバドストロセル）が挙げられるがこれらに限定されない。
【0216】
一実施形態では、本開示の免疫細胞または集団の投与は、対象が投与される少なくとも１種の他の活性剤の量を減少させることを可能にする。
【0217】
一実施形態によれば、少なくとも１つの免疫細胞集団は、少なくとも１種の他の活性剤の投与前に、投与と同時に、または投与後に投与される。
【0218】
ＶＩ．治療的使用
本開示はさらに、医薬として使用するための、または治療を必要とする対象における疾患、障害もしくは症状の治療に使用するための、本明細書に記載のＩＬ－２３Ｒに結合する少なくとも１つの単離された抗体または該抗体の少なくとも１つの抗原結合フラグメントに関する。
本開示はさらに、医薬として使用するための、または治療を必要とする対象における疾患、障害もしくは症状の治療に使用するための、本明細書に記載のＩＬ－２３Ｒに結合する少なくとも１つの単離された抗体または該抗体の少なくとも１つの抗原結合フラグメントに関する。
【0219】
本開示は、医薬として使用するための、または治療を必要とする対象における疾患、障害もしくは症状の治療に使用するための、本明細書に記載の少なくとも１つの核酸またはベクターに関する。
【0220】
本開示はさらに、本明細書に記載の単離された抗体もしくはその抗原結合フラグメント、核酸もしくはベクター、または組成物、医薬組成物、もしくは医薬を対象に投与することを含む、治療を必要とする対象における疾患、障害または症状を治療するための方法に関する。
【0221】
一実施形態では、本開示による単離された抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または核酸もしくはベクターは、治療を必要とする対象におけるＩＬ－２３Ｒ発現細胞によって媒介される疾患または障害（本明細書ではＩＬ－２３Ｒ関連疾患または障害とも呼ばれる）を治療するために使用され得る。
【0222】
本開示の別の目的は、治療を必要とする対象においてＩＬ－２３Ｒ発現細胞によって媒介される疾患または障害を治療するための細胞療法の方法であって、該方法が、本明細書に記載の免疫細胞、例えば本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞を対象に投与することを含む、方法である。
【0223】
一実施形態では、投与される免疫細胞は自家細胞であり、換言すれば、細胞療法は自家細胞療法である。本明細書で使用される場合、「自家」という用語は、後に再導入される個体と同じ個体に由来する任意の材料を指す。
【0224】
一実施形態では、細胞療法は他家細胞療法である。本明細書で使用される場合、「他家」という用語は、治療される対象に由来するのではなく、外部の供給源、例えば、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）または死体起源の細胞に由来する任意の材料を指す。
【0225】
一実施形態では、細胞療法は異種間である。本明細書で使用される場合、「異種」という用語は、材料が導入される対象とは異なる種の対象に由来する任意の材料を指す。
【0226】
別の実施形態では、投与される免疫細胞は同種異系細胞であり、換言すれば、細胞療法は同種異系細胞療法である。本明細書で使用される場合、「同種異系」という用語は、材料が導入される対象とは同じ種の異なる対象に由来する任意の材料を指す。２つ以上の対象は、１つ以上の遺伝子座の遺伝子が同一ではない場合、互いに同種異系であると言われる。さらなる実施形態では、免疫細胞は、健康なヒトドナーに由来する。
【0227】
いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子改変された免疫細胞は、同種異系免疫細胞であり得る。そのような場合には、細胞に対する宿主拒絶（移植片拒絶）及び／または宿主に対する細胞の潜在的な攻撃（移植片対宿主病）を低減するように細胞が操作され得る。例として、細胞は、以下：（ｉ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲアルファ鎖またはベータ鎖）；（ｉｉ）多型性主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩまたはＩＩ分子（例えば、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－ＢもしくはＨＬＡ－Ｃ；ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＯＡ、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ＨＬＡ－ＤＱもしくはＨＬＡ－ＤＲ；またはβ２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ））；（ｉｉｉ）抗原処理関連トランスポーター（例えばＴＡＰ－１またはＴＡＰ－２）；（ｉｖ）ＭＨＣクラスＩＩトランスアクチベーター（ＣＩＩＴＡ）；（ｖ）マイナー組織適合抗原（ＭｉＨＡ；例えばＨＡ－１／Ａ２、ＨＡ－２、ＨＡ－３、ＨＡ－８、ＨＢ－１ＨまたはＨＢ－１Ｙ）；及び（ｖｉ）それらの任意の組み合わせのうちの１つ以上の遺伝子型が欠損するように操作され得る。同種異系操作された細胞はまた、インバリアントＨＬＡまたはＣＤ４７を発現し、操作されたＴｒｅｇ細胞を宿主拒絶から保護し得る。これらのさらなる遺伝子改変は、当該技術分野で既知の遺伝子編集技術によって実施することができる。
【0228】
さらに編集された同種異系細胞は、適合性の問題なしに複数の患者で使用できるため、特に有用である。したがって、該同種異系細胞を「ユニバーサル」と呼ぶことができ、「オフ・ザ・シェルフ」で使用することができる。「ユニバーサル」細胞の使用は、採用した細胞療法の効率を大幅に改善し、コストを削減する。
【0229】
特定の実施形態では、同種異系免疫細胞は、その表面にいかなる機能的ＴＣＲも発現しないように操作するか、機能的ＴＣＲを含む１つ以上のサブユニットを発現しないように操作するか、またはその表面上で非常にわずかな機能的ＴＣＲしか生成しないように操作することができる。例えば、本明細書に記載の免疫細胞は、ＴＣＲ分子の細胞表面発現がダウンレギュレーションされるように操作され得る。あるいは、Ｔ細胞は、実質的に機能低下したＴＣＲを、例えばＴＣＲの１つ以上のサブユニットの変異型または切断型の発現により発現し得る。「実質的に機能低下したＴＣＲ」という用語は、このＴＣＲが宿主において有害な免疫反応を誘発しないことを意味する。
【0230】
特定の実施形態では、同種異系免疫細胞は、その表面に機能的ＨＬＡを発現しないように操作され得る。例えば、本明細書に記載の免疫細胞は、ＨＬＡ、例えば、ＨＬＡクラス１及び／またはＨＬＡクラスＩＩ及び／または非古典的ＨＬＡ分子の細胞表面発現がダウンレギュレーションされるように操作され得る。
【0231】
特定の実施形態では、Ｔ細胞は、機能的ＴＣＲならびに機能的ＨＬＡ、例えばＨＬＡクラスＩ及び／またはＨＬＡクラスＩＩを欠いてもよい。
【0232】
機能的ＴＣＲ及び／またはＨＬＡの発現を欠く改変された免疫細胞は、ＴＣＲ及び／またはＨＬＡの１つ以上のサブユニットのノックアウトまたはノックダウンを含む任意の適切な手段によって得ることができる。例えば、Ｔｒｅｇ細胞は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、クラスター化された規則的に間隔が空いた短い回文構造の繰り返し（ＣＲＩＳＰＲ）転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーエンドヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、メガヌクレアーゼ（ｍｎ、ホーミングエンドヌクレアーゼとしても知られる）、またはｍｅｇａＴＡＬ（ＴＡＬエフェクターとｍｎ切断ドメインとの組み合わせ）を用いた、ＴＣＲ及び／またはＨＬＡのノックダウンを含むことができる。
【0233】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＡＲをコードする核酸は、免疫細胞のゲノム内の特定の遺伝子座、例えば欠失される遺伝子の遺伝子座に挿入される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＡＲをコードする核酸は、ＴＣＲ及び／またはＨＬＡ遺伝子座内に挿入され、それによりＴＣＲ及び／またはＨＬＡ発現の阻害がもたらされる。
【0234】
本開示の別の目的は、治療を必要とする対象においてＩＬ－２３Ｒ関連疾患または障害を治療するための方法であって、本明細書に記載の少なくとも１つのＣＡＲまたは本明細書に記載のＣＡＲをコードする少なくとも１つの核酸もしくはベクターを対象に投与することを含む、方法である。一実施形態では、該方法は、遺伝子療法の方法である。
【0235】
ＶＩＩ．ＩＬ－２３Ｒ関連疾患
一実施形態では、ＩＬ－２３Ｒ関連疾患または障害は、炎症性細胞媒介性疾患もしくは障害、Ｔｈ１７媒介性疾患もしくは障害、またはγδＴ媒介性疾患もしくは障害である。
一実施形態では、ＩＬ－２３Ｒ関連疾患または障害は、炎症性細胞媒介性疾患もしくは障害、Ｔｈ１７媒介性疾患もしくは障害、またはγδＴ媒介性疾患もしくは障害である。
【0236】
一実施形態では、ＩＬ－２３Ｒ発現細胞媒介性疾患は、自己免疫性疾患もしくは障害及び／または炎症性疾患もしくは障害である。
【0237】
ＩＬ－２３Ｒ関連疾患の例としては、自己免疫性疾患または障害、炎症性疾患または障害、アレルギー性疾患または障害、及びがんが挙げられるが、これらに限定されない。
【0238】
一実施形態では、ＩＬ－２３Ｒ発現細胞媒介性疾患または障害は、炎症性腸疾患（例えば、クローン病及び潰瘍性大腸炎）、ループス（例えば、全身性エリテマトーデス）、関節炎（例えば、関節リウマチ及び若年性特発性関節炎）、シェーグレン症候群、全身性硬化症、強直性脊椎炎、１型糖尿病、自己免疫性甲状腺障害、多発性硬化症、重症筋無力症、乾癬性関節炎、皮膚疾患（例えば乾癬及びアトピー性皮膚炎）、またはブドウ膜炎から選択される。
【0239】
一実施形態では、ＩＬ－２３Ｒ発現細胞媒介性疾患または障害はクローン病である。
【0240】
ＶＩＩＩ．製造品
本開示の別の目的は、ＩＬ－２３Ｒ発現細胞によって媒介される疾患または障害の治療に有用な材料を含む製造品である。
本開示の別の目的は、ＩＬ－２３Ｒ発現細胞によって媒介される疾患または障害の治療に有用な材料を含む製造品である。
【0241】
製造品は、容器と、容器上のまたは容器に付随するラベルまたは添付文書とを含み得る。好適な容器としては、例えば、バッグ、ボトル、バイアル、シリンジ、パウチなどが挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチックなど様々な材料から形成され得る。
【0242】
製造品、ラベル、または添付文書は、本開示のＴｒｅｇ細胞集団を患者に投与するための説明資料をさらに含み得る。
【0243】
本開示は、本開示の少なくとも１つの免疫細胞集団を含むキットを提供する。「キット」とは、本開示の少なくとも１つのＴｒｅｇ細胞集団を含む任意の製造品（例えば、パッケージまたは容器）を意味することが意図されている。キットは、使用のための説明書を含んでもよい。
【0244】
本明細書で特に定義しない限り、本開示に関連して使用される科学用語及び技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。例示的な方法及び材料が以下に記載されているが、本明細書に記載のものと類似または同等の方法及び材料も、本開示の実施または試験に使用することができる。矛盾する場合には、定義を含めて本明細書が優先する。一般的に、本明細書に記載される心臓病学、医学、薬学及び創薬化学、細胞生物学、分子に関連して使用される命名法及びそれらの技術は、当該技術分野で周知であり、一般的に使用されるものである。さらに、文脈により別段の要求がない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は、単数形を含むものとする。本明細書及び実施形態全体を通して、用語「有する（ｈａｖｅ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、または「有する（ｈａｓ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、記載された整数または整数の群を包含することを意味するが、任意の他の整数または整数の群を除外することを意味するものではないことが理解されよう。本明細書で言及される全ての刊行物及び他の参考文献は、参照によってその全体が組み込まれる。いくつかの文献が本明細書で引用されているが、この引用は、これらの文献のいずれかが当該技術分野の一般的な知識の一部を形成することを認めるものではない。
【0245】
本明細書で使用される場合、目的の１つ以上の値に適用される「およそ」または「約」という用語は、明記された基準値と類似する値を指す。特定の実施形態では、該用語は、別途明記されない限りまたは別途文脈から明らかでない限り、明記された基準値のいずれかの方向（上回るまたは下回る）において、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％以下に含まれる値の範囲を指す。
【0246】
本開示がよりよく理解され得るように、以下の実施例を記載する。これらの実施例は、説明のみを目的とするものであり、いかなる方法でも本開示の範囲を限定するものとして解釈されない。
【実施例】
【0247】
本開示は以下の実施例によってさらに説明される。
【0248】
実施例１：ＩＬ－２３Ｒ－ＣＡＲリード候補の同定
材料及び方法
ＰＢＭＣ単離
健康なドナーの血液は、Ｅｔａｂｌｉｓｓｅｍｅｎｔ Ｆｒａｎｃａｉｓ ｄｕ Ｓａｎｇ（ＥＦＳ）によって収集された。採血の翌日、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＦｉｃｏｌｌ勾配遠心分離によってバッフィーコートから単離し、これにより、例えば顆粒球、血小板、及び残存する赤血球混入物などの血液製剤の望ましくない画分が除去できた。その後、目的の細胞集団を以下のように単離した。
材料及び方法
ＰＢＭＣ単離
健康なドナーの血液は、Ｅｔａｂｌｉｓｓｅｍｅｎｔ Ｆｒａｎｃａｉｓ ｄｕ Ｓａｎｇ（ＥＦＳ）によって収集された。採血の翌日、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＦｉｃｏｌｌ勾配遠心分離によってバッフィーコートから単離し、これにより、例えば顆粒球、血小板、及び残存する赤血球混入物などの血液製剤の望ましくない画分が除去できた。その後、目的の細胞集団を以下のように単離した。
【0249】
ＦＯＸＰ３ Ｔｒｅｇ及びＣＤ４＋ＣＤ２５－従来型Ｔ細胞の単離
ヒトＣＤ４＋ＣＤ１２７ｌｏｗＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞単離キット（＃１８０６３；ＳｔｅｍＣｅｌｌ）を製造元の指示に従って使用して、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏｗＴｒｅｇを単離した。簡潔に言えば、ＣＤ２５＋細胞を、まず４００～５００×１０６個のＰＢＭＣから、ＥａｓｙＳｅｐ（商標）Ｒｅｌｅａｓａｂｌｅ ＲａｐｉｄＳｐｈｅｒｅｓ（商標）を使用してカラムフリーの免疫磁気陽性選択により単離した。次に、ＥａｓｙＳｅｐ（商標）で単離したＣＤ２５＋細胞から結合した磁性粒子を除去し、不要な非Ｔｒｅｇを枯渇の標的とした。最終的に単離された画分には、高レベルのＦＯＸＰ３を発現する高度に精製されたＣＤ４＋ＣＤ１２７ｌｏｗＣＤ２５＋細胞が含まれ、直ちに下流のアプリケーションに使用した。ＣＤ４＋ＣＤ２５－従来型Ｔ細胞を、キット＃１８０６３（ＳｔｅｍＣｅｌｌ）からＣＤ４＋ＣＤ２５－レスポンダーＴ細胞を単離するための任意選択のプロトコルを選択することにより単離し、Ｔｒｅｇと並行して機能的研究に使用した。
ヒトＣＤ４＋ＣＤ１２７ｌｏｗＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞単離キット（＃１８０６３；ＳｔｅｍＣｅｌｌ）を製造元の指示に従って使用して、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏｗＴｒｅｇを単離した。簡潔に言えば、ＣＤ２５＋細胞を、まず４００～５００×１０６個のＰＢＭＣから、ＥａｓｙＳｅｐ（商標）Ｒｅｌｅａｓａｂｌｅ ＲａｐｉｄＳｐｈｅｒｅｓ（商標）を使用してカラムフリーの免疫磁気陽性選択により単離した。次に、ＥａｓｙＳｅｐ（商標）で単離したＣＤ２５＋細胞から結合した磁性粒子を除去し、不要な非Ｔｒｅｇを枯渇の標的とした。最終的に単離された画分には、高レベルのＦＯＸＰ３を発現する高度に精製されたＣＤ４＋ＣＤ１２７ｌｏｗＣＤ２５＋細胞が含まれ、直ちに下流のアプリケーションに使用した。ＣＤ４＋ＣＤ２５－従来型Ｔ細胞を、キット＃１８０６３（ＳｔｅｍＣｅｌｌ）からＣＤ４＋ＣＤ２５－レスポンダーＴ細胞を単離するための任意選択のプロトコルを選択することにより単離し、Ｔｒｅｇと並行して機能的研究に使用した。
【0250】
単離されたＴｒｅｇの活性化及び培養
単離されたＴｒｅｇ細胞を活性化し、９日間培養した。簡潔に言えば、０日目に、Ｔｒｅｇ細胞（０．５×１０６）を、ヒトトランスフェリン（ＯＺＹＭＥ）を含有する、１０００Ｕ／ｍｌのＩＬ－２（Ｅｕｒｏｍｅｄｅｘ）＋１００ｎＭのラパマイシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加したＸｖｉｖｏ１５無血清培地を有する２４ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）に培養した。次に、ＣＤ３／ＣＤ２８活性化を、Ｌｉｆｅ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙのＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）（ウェル当たり０．５×１０６ビーズ）を用いて行った。２日目、４日目、及び７日目に、１０００Ｕ／ｍｌのＩＬ－２を添加した新鮮な培養培地を細胞に与えた。最後に、９日目に、細胞を回収し、計数し、再活性化させた。
単離されたＴｒｅｇ細胞を活性化し、９日間培養した。簡潔に言えば、０日目に、Ｔｒｅｇ細胞（０．５×１０６）を、ヒトトランスフェリン（ＯＺＹＭＥ）を含有する、１０００Ｕ／ｍｌのＩＬ－２（Ｅｕｒｏｍｅｄｅｘ）＋１００ｎＭのラパマイシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加したＸｖｉｖｏ１５無血清培地を有する２４ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）に培養した。次に、ＣＤ３／ＣＤ２８活性化を、Ｌｉｆｅ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙのＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）（ウェル当たり０．５×１０６ビーズ）を用いて行った。２日目、４日目、及び７日目に、１０００Ｕ／ｍｌのＩＬ－２を添加した新鮮な培養培地を細胞に与えた。最後に、９日目に、細胞を回収し、計数し、再活性化させた。
【0251】
レンチウイルスベクターの産生及び滴定
ＣＡＲ発現レンチウイルスベクター（ＬＶ）は、古典的な４プラスミドレンチウイルス系を使用して産生作製した。簡潔に言えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（Ｌｅｎｔｉ－Ｘ，Ｏｚｙｍｅ）に、ＣＡＲ発現トランスファーベクター、ＨＩＶ－１ Ｇａｇ／ｐｏｌ（ｐＭＤＬｇ／ｐＲＲＥ）、ＨＩＶ－１ Ｒｅｖ（ｐＲＳＶ．Ｒｅｖ）、及びＶＳＶ－Ｇ糖タンパク質（ｐＭＤ２．Ｇ）を発現するプラスミド（Ｄｉｄｉｅｒ Ｔｒｏｎｏ，ＥＰＦＬ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）をトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、ウイルス上清を採取し、遠心分離により濃縮し、アリコートして長期保存のために－８０℃で凍結した。１ミリリットル当たりの形質導入単位（ＴＵ／ｍｌ）で表される感染力価は、ウイルス上清の段階希釈を用いてＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞株の形質導入後に得られ、形質導入効率は、ＧＦＰ発現をモニタリングすることにより４日後に評価した。
ＣＡＲ発現レンチウイルスベクター（ＬＶ）は、古典的な４プラスミドレンチウイルス系を使用して産生作製した。簡潔に言えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（Ｌｅｎｔｉ－Ｘ，Ｏｚｙｍｅ）に、ＣＡＲ発現トランスファーベクター、ＨＩＶ－１ Ｇａｇ／ｐｏｌ（ｐＭＤＬｇ／ｐＲＲＥ）、ＨＩＶ－１ Ｒｅｖ（ｐＲＳＶ．Ｒｅｖ）、及びＶＳＶ－Ｇ糖タンパク質（ｐＭＤ２．Ｇ）を発現するプラスミド（Ｄｉｄｉｅｒ Ｔｒｏｎｏ，ＥＰＦＬ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）をトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、ウイルス上清を採取し、遠心分離により濃縮し、アリコートして長期保存のために－８０℃で凍結した。１ミリリットル当たりの形質導入単位（ＴＵ／ｍｌ）で表される感染力価は、ウイルス上清の段階希釈を用いてＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞株の形質導入後に得られ、形質導入効率は、ＧＦＰ発現をモニタリングすることにより４日後に評価した。
【0252】
形質導入プロトコル
Ｔｒｅｇに活性化２日後にキメラ受容体（図１のＣＡＲ構築物の模式図を参照）を形質導入した。簡潔に言えば、各ウェルに２～５×１０６形質導入単位（ＴＵ）／ｍｌをロードすることにより形質導入を行った。３７℃で６時間後、ウイルス粒子を洗浄により除去した。次いで、このプレートを５％ＣＯ２で３７℃でインキュベートした。形質導入から５日後に形質導入効率を分析した：（ｉ）遺伝子導入効率を、フローサイトメトリーにおいてＧＦＰ陽性細胞の割合（％）を分析することにより測定し、（ｉｉ）細胞表面でＣＡＲを発現した形質導入細胞の割合（％）を、フローサイトメトリーにおいてヘマグルチニンＡ（ＨＡ）タグ発現またはプロテインＬ染色を分析することにより測定した。
Ｔｒｅｇに活性化２日後にキメラ受容体（図１のＣＡＲ構築物の模式図を参照）を形質導入した。簡潔に言えば、各ウェルに２～５×１０６形質導入単位（ＴＵ）／ｍｌをロードすることにより形質導入を行った。３７℃で６時間後、ウイルス粒子を洗浄により除去した。次いで、このプレートを５％ＣＯ２で３７℃でインキュベートした。形質導入から５日後に形質導入効率を分析した：（ｉ）遺伝子導入効率を、フローサイトメトリーにおいてＧＦＰ陽性細胞の割合（％）を分析することにより測定し、（ｉｉ）細胞表面でＣＡＲを発現した形質導入細胞の割合（％）を、フローサイトメトリーにおいてヘマグルチニンＡ（ＨＡ）タグ発現またはプロテインＬ染色を分析することにより測定した。
【0253】
形質導入に使用したＣＡＲ構築物
ＣＤ８膜貫通（ＴＭ）ドメインと、ＣＤ３ゼータの細胞内ドメインと連結したＣＤ２８の細胞内ドメインとから構成され、ＩＬ－２３Ｒに対して指向するｓｃＦｖと会合するＩＬ－２３Ｒ ＣＡＲを設計した。本試験で使用した構築物は図１に列挙され説明される。
ＣＤ８膜貫通（ＴＭ）ドメインと、ＣＤ３ゼータの細胞内ドメインと連結したＣＤ２８の細胞内ドメインとから構成され、ＩＬ－２３Ｒに対して指向するｓｃＦｖと会合するＩＬ－２３Ｒ ＣＡＲを設計した。本試験で使用した構築物は図１に列挙され説明される。
【0254】
形質導入Ｔｒｅｇの表現型分析
培養９日目に、Ｔｒｅｇ表現型を、表１に列挙したマーカーを用いてフローサイトメトリーによって分析した。
培養９日目に、Ｔｒｅｇ表現型を、表１に列挙したマーカーを用いてフローサイトメトリーによって分析した。
【表1】
【0255】
ＣＡＲの活性化アッセイ
活性化アッセイを、培養の９日目に行った。簡潔に言えば、０．０５×１０６個のＴｒｅｇを、９６ウェルＵ底プレート中に、単独で、または抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８被覆ビーズの存在下（１：１のＴｒｅｇ対ビーズ比）で、またはＩＬ－２３Ｒ被覆ビーズの存在下（１：１のＴｒｅｇ対ビーズ比）で、２００μＬの最終容量で播種した。３７℃、５％のＣＯ２で２４時間後、細胞をＣＤ４及びＣＤ６９について染色し、次いでフローサイトメトリーを用いて分析した。非形質導入Ｔｒｅｇ細胞と比較してＣＡＲ Ｔｒｅｇ細胞でのＣＤ６９自発的発現をモニタリングすることは、トニックシグナル伝達強度の決定を可能にする。
活性化アッセイを、培養の９日目に行った。簡潔に言えば、０．０５×１０６個のＴｒｅｇを、９６ウェルＵ底プレート中に、単独で、または抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８被覆ビーズの存在下（１：１のＴｒｅｇ対ビーズ比）で、またはＩＬ－２３Ｒ被覆ビーズの存在下（１：１のＴｒｅｇ対ビーズ比）で、２００μＬの最終容量で播種した。３７℃、５％のＣＯ２で２４時間後、細胞をＣＤ４及びＣＤ６９について染色し、次いでフローサイトメトリーを用いて分析した。非形質導入Ｔｒｅｇ細胞と比較してＣＡＲ Ｔｒｅｇ細胞でのＣＤ６９自発的発現をモニタリングすることは、トニックシグナル伝達強度の決定を可能にする。
【0256】
Ｔ細胞増殖の抑制アッセイ
抑制分析を、培養の９日目に行った。簡潔に言えば、Ｔｒｅｇを回収し、計数し、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８被覆ビーズ（１：１のＴｒｅｇ対ビーズ比）を用いてＴＣＲを通じて、もしくはＣＡＲ ＩＬ－２３Ｒ被覆ビーズ（１：１のＴｒｅｇ対ビーズ比）のいずれかを通じて活性化するか、または活性化せずに維持し、自発的抑制活性を評価した。並行して、同種異系Ｔｃｏｎｖを解凍し、Ｄｙｅ ４５０で染色し、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８被覆ビーズ（３：１のＴｃｏｎｖ対ビーズ比）で活性化させた。翌日、ビーズをＴｃｏｎｖから除去した後、未活性化または活性化Ｔｒｅｇ（非形質導入または形質導入）と共培養した。３日目に細胞を採取し、Ｔｃｏｎｖの増殖を、フローサイトメトリーによりｄｙｅ４５０希釈の測定を通じて評価した。Ｔｃｏｎｖ増殖の阻害率（％）は以下のように計算した。
抑制分析を、培養の９日目に行った。簡潔に言えば、Ｔｒｅｇを回収し、計数し、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８被覆ビーズ（１：１のＴｒｅｇ対ビーズ比）を用いてＴＣＲを通じて、もしくはＣＡＲ ＩＬ－２３Ｒ被覆ビーズ（１：１のＴｒｅｇ対ビーズ比）のいずれかを通じて活性化するか、または活性化せずに維持し、自発的抑制活性を評価した。並行して、同種異系Ｔｃｏｎｖを解凍し、Ｄｙｅ ４５０で染色し、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８被覆ビーズ（３：１のＴｃｏｎｖ対ビーズ比）で活性化させた。翌日、ビーズをＴｃｏｎｖから除去した後、未活性化または活性化Ｔｒｅｇ（非形質導入または形質導入）と共培養した。３日目に細胞を採取し、Ｔｃｏｎｖの増殖を、フローサイトメトリーによりｄｙｅ４５０希釈の測定を通じて評価した。Ｔｃｏｎｖ増殖の阻害率（％）は以下のように計算した。
【数1】
【0257】
動物
本試験に記載された全ての手順は、地域の倫理委員会（ＣＩＥＰＡＬ）によって審査及び承認されたものである。実験は、８週齢の雌ＬＹ５．１マウスで実施した。マウスを６匹ずつの群で飼育し、各マウスは一意に識別された。動物を、換気されたケージ（タイプＩＩ（１６×１９×３５ｃｍ、床面積＝５００ｃｍ２））に、以下の制御された条件下で収容した：（ｉ）室温（２２±２℃）、（ｉｉ）湿度（５５±１０％）、（ｉｉｉ）光周期（１２：１２時間の明暗サイクル７ａｍ：７ｐｍ）、ならびに（ｉｖ）水及び餌（参考文献２０１８，Ｈａｒｌａｎ Ｆｒａｎｃｅ）は自由摂取。実験開始前に、マウスを５日間環境に順応させた。
本試験に記載された全ての手順は、地域の倫理委員会（ＣＩＥＰＡＬ）によって審査及び承認されたものである。実験は、８週齢の雌ＬＹ５．１マウスで実施した。マウスを６匹ずつの群で飼育し、各マウスは一意に識別された。動物を、換気されたケージ（タイプＩＩ（１６×１９×３５ｃｍ、床面積＝５００ｃｍ２））に、以下の制御された条件下で収容した：（ｉ）室温（２２±２℃）、（ｉｉ）湿度（５５±１０％）、（ｉｉｉ）光周期（１２：１２時間の明暗サイクル７ａｍ：７ｐｍ）、ならびに（ｉｖ）水及び餌（参考文献２０１８，Ｈａｒｌａｎ Ｆｒａｎｃｅ）は自由摂取。実験開始前に、マウスを５日間環境に順応させた。
【0258】
ＤＳＳ誘発性急性大腸炎
ＤＳＳ（デキストラン硫酸ナトリウム、４０ｋＤａ、ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）を、０日目～５日目（Ｄ０～Ｄ５）に８週齢の雌ＬＹ５．１マウスに投与した。ＤＳＳ（２つの異なる濃度）を、２日ごとに新たに取り替えられる飲料水（自由摂取）に加えた。回復期（Ｄ５～Ｄ１５）にはＤＳＳを含まない新鮮な水を与えた。５日目に、１０週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの脾臓から単離した３００万個のＣＡＲ陽性Ｔｒｅｇを尾静脈注射した。マウスＴｒｅｇを形質導入するために使用されるＣＡＲは図５に記載されている。マウスを、以下の表２に示されるように、体重減少、便の硬さ、血液の有無、及び便採取時間の４つのパラメータに基づいて毎日スコアリングした。
ＤＳＳ（デキストラン硫酸ナトリウム、４０ｋＤａ、ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）を、０日目～５日目（Ｄ０～Ｄ５）に８週齢の雌ＬＹ５．１マウスに投与した。ＤＳＳ（２つの異なる濃度）を、２日ごとに新たに取り替えられる飲料水（自由摂取）に加えた。回復期（Ｄ５～Ｄ１５）にはＤＳＳを含まない新鮮な水を与えた。５日目に、１０週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの脾臓から単離した３００万個のＣＡＲ陽性Ｔｒｅｇを尾静脈注射した。マウスＴｒｅｇを形質導入するために使用されるＣＡＲは図５に記載されている。マウスを、以下の表２に示されるように、体重減少、便の硬さ、血液の有無、及び便採取時間の４つのパラメータに基づいて毎日スコアリングした。
【表2】
【0259】
便は炎症性マーカー分析のために採取した。１５日目に、マウスを頚椎脱臼により安楽死させ、臓器を採取してｅｘ ｖｉｖｏ分析を行った。
【0260】
ｅｘ ｖｉｖｏ分析
組織の消化
・結腸をＰＢＳ中で洗浄して糞便を除去し、次いでＰＢＳ ５ｍＭ ＥＤＴＡ中で３７℃で３０分間インキュベートした。結腸を、ＲＰＭＩ培地中で２ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼＤ及び２０μｇ／ｍＬのＤＮＡｓｅで３７℃で３０分間消化した。次いで、結腸をセルストレーナーを通して破砕し、単一細胞懸濁液を得た。次に、細胞を洗浄し、３ｍＬのＰＢＳ－２％ＦＣＳに再懸濁し、２００μＬを抗体染色のためにプレーティングした。
・脾臓及び腸間膜リンパ節を、セルストレーナーを通して破砕し、単一細胞懸濁液を得た。赤血球を１ｍＬの赤血球溶解緩衝液で２分間溶解させた。次いで、細胞を洗浄し、それぞれ５ｍＬ及び１ｍＬのＰＢＳ－２％ＦＣＳ中に再懸濁し、２００μＬを抗体染色のためにプレーティングした。
マウス糞便中のリポカリン検出のためのＥＬＩＳＡ
糞便を毎日回収し、－２０℃で凍結した。糞便試料を１ｍＬのＰＢＳ Ｔｗｅｅｎ ０．１％に再懸濁し、４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。上清を採取し、製造元の指示に従ってＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡマウスリポカリン２／ＮＧＡＬ（ＤＹ１８５７－０５）を使用して、リポカリン検出のために１／１０００でプレーティングした。
多色フローサイトメトリー分析
臓器内の細胞サブセットを、フローサイトメトリー分析のために以下のように染色した。
組織の消化
・結腸をＰＢＳ中で洗浄して糞便を除去し、次いでＰＢＳ ５ｍＭ ＥＤＴＡ中で３７℃で３０分間インキュベートした。結腸を、ＲＰＭＩ培地中で２ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼＤ及び２０μｇ／ｍＬのＤＮＡｓｅで３７℃で３０分間消化した。次いで、結腸をセルストレーナーを通して破砕し、単一細胞懸濁液を得た。次に、細胞を洗浄し、３ｍＬのＰＢＳ－２％ＦＣＳに再懸濁し、２００μＬを抗体染色のためにプレーティングした。
・脾臓及び腸間膜リンパ節を、セルストレーナーを通して破砕し、単一細胞懸濁液を得た。赤血球を１ｍＬの赤血球溶解緩衝液で２分間溶解させた。次いで、細胞を洗浄し、それぞれ５ｍＬ及び１ｍＬのＰＢＳ－２％ＦＣＳ中に再懸濁し、２００μＬを抗体染色のためにプレーティングした。
マウス糞便中のリポカリン検出のためのＥＬＩＳＡ
糞便を毎日回収し、－２０℃で凍結した。糞便試料を１ｍＬのＰＢＳ Ｔｗｅｅｎ ０．１％に再懸濁し、４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。上清を採取し、製造元の指示に従ってＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡマウスリポカリン２／ＮＧＡＬ（ＤＹ１８５７－０５）を使用して、リポカリン検出のために１／１０００でプレーティングした。
多色フローサイトメトリー分析
臓器内の細胞サブセットを、フローサイトメトリー分析のために以下のように染色した。
【表3】
【0261】
結果
形質導入効率及び細胞表面でのＣＡＲ発現
形質導入効率をＧＦＰ陽性細胞の割合（％）により評価し、ＣＡＲ発現を、組換えプロテインＬ、免疫グロブリンカッパ軽鎖結合タンパク質、またはＨＡタグに対して指向する抗体を用いてモニタリングした。形質導入効率のパーセンテージ及び細胞表面でＣＡＲを発現する形質導入細胞の割合（％）の結果が表４に提供される。両方の構築物は、細胞表面で９５％を超えるＣＡＲ発現をもたらした。さらに、細胞１個当たりのＣＡＲ数を表す平均蛍光強度（ＭＦＩ）も同程度であった。
形質導入効率及び細胞表面でのＣＡＲ発現
形質導入効率をＧＦＰ陽性細胞の割合（％）により評価し、ＣＡＲ発現を、組換えプロテインＬ、免疫グロブリンカッパ軽鎖結合タンパク質、またはＨＡタグに対して指向する抗体を用いてモニタリングした。形質導入効率のパーセンテージ及び細胞表面でＣＡＲを発現する形質導入細胞の割合（％）の結果が表４に提供される。両方の構築物は、細胞表面で９５％を超えるＣＡＲ発現をもたらした。さらに、細胞１個当たりのＣＡＲ数を表す平均蛍光強度（ＭＦＩ）も同程度であった。
【表4】
【0262】
安定なＴｒｅｇ表現型は新規な抗ＩＬ２３Ｒ ＣＡＲ＃２の存在下において観察される
一般に、操作されたＴ細胞に関する主な課題は、特にＣＡＲの高発現が望ましくない抗原非依存性ＣＡＲ活性化に関連していることが示されているため、所望の表現型の維持を確実にすることである（Ｆｒｉｇａｕｌｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１５）３（４）：３５６－６７）。Ｔｒｅｇ表現型が増殖及びＣＡＲ結合中に変化するかどうかを評価するために、Ｔｒｅｇ同定に関連するマーカーのパネルを分析した。Ｈｅｌｉｏｓ及びＦＯＸＰ３の発現の維持、ならびにＴｒｅｇ表現型に関連する他のマーカーを、ＦＯＸＰ３＋Ｔｒｅｇ上で評価した。ＩＬ－２３Ｒ ＣＡＲ－Ｔｒｅｇは、増殖後、９日目にＦＯＸＰ３及びＨｅｌｉｏｓの高い発現を維持し（図２Ａ）、ＩＬ－２３Ｒ被覆ビーズを用いたＣＡＲ結合の１１日後まで安定であった（図２Ｂ）。
一般に、操作されたＴ細胞に関する主な課題は、特にＣＡＲの高発現が望ましくない抗原非依存性ＣＡＲ活性化に関連していることが示されているため、所望の表現型の維持を確実にすることである（Ｆｒｉｇａｕｌｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１５）３（４）：３５６－６７）。Ｔｒｅｇ表現型が増殖及びＣＡＲ結合中に変化するかどうかを評価するために、Ｔｒｅｇ同定に関連するマーカーのパネルを分析した。Ｈｅｌｉｏｓ及びＦＯＸＰ３の発現の維持、ならびにＴｒｅｇ表現型に関連する他のマーカーを、ＦＯＸＰ３＋Ｔｒｅｇ上で評価した。ＩＬ－２３Ｒ ＣＡＲ－Ｔｒｅｇは、増殖後、９日目にＦＯＸＰ３及びＨｅｌｉｏｓの高い発現を維持し（図２Ａ）、ＩＬ－２３Ｒ被覆ビーズを用いたＣＡＲ結合の１１日後まで安定であった（図２Ｂ）。
【0263】
新規なｓｃＦｖ由来ＣＡＲはＣＡＲ特異的活性化を維持する
ＣＡＲ＃２構築物は、ＣＡＲ構築物対照（ＣＡＲ＃１）と比較してＴｒｅｇ細胞の活性化バックグラウンドを減少させた。図３に示されるように、活性化が存在しない場合のＣＤ６９＋ＩＬ－２３Ｒ ＣＡＲ－Ｔｒｅｇ細胞の割合（％）は、６０％のＣＤ６９＋細胞をもたらしたＣＡＲ＃１と比較してＣＡＲ＃２ではるかに低かった。さらに、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８被覆ビーズを使用したＩＬ－２３Ｒ ＣＡＲ－Ｔｒｅｇ細胞の活性化は、ＣＡＲ＃２ではＣＤ６９＋細胞の６．４１倍の増加をもたらし、ＣＡＲ＃１では１．５２倍増加するのみであった。
ＣＡＲ＃２構築物は、ＣＡＲ構築物対照（ＣＡＲ＃１）と比較してＴｒｅｇ細胞の活性化バックグラウンドを減少させた。図３に示されるように、活性化が存在しない場合のＣＤ６９＋ＩＬ－２３Ｒ ＣＡＲ－Ｔｒｅｇ細胞の割合（％）は、６０％のＣＤ６９＋細胞をもたらしたＣＡＲ＃１と比較してＣＡＲ＃２ではるかに低かった。さらに、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８被覆ビーズを使用したＩＬ－２３Ｒ ＣＡＲ－Ｔｒｅｇ細胞の活性化は、ＣＡＲ＃２ではＣＤ６９＋細胞の６．４１倍の増加をもたらし、ＣＡＲ＃１では１．５２倍増加するのみであった。
【0264】
最後に、ＩＬ－２３Ｒ被覆ビーズを使用したＩＬ－２３Ｒ ＣＡＲ－Ｔｒｅｇ細胞の活性化は、ＣＡＲ＃２では３．６倍増加したが、ＣＡＲ＃１では１．３３倍しか増加しなかった。これらの結果は、本開示のｓｃＦｖを含むＣＡＲ構築物を発現するＴｒｅｇ細胞の優れたＣＡＲ媒介活性化を示す。
【0265】
ＣＡＲ＃２は効率的なＣＡＲ媒介抑制活性を示す
ＣＡＲ＃２では、対照ｓｃＦｖを有するＩＬ－２３Ｒ ＣＡＲ構築物（ＣＡＲ＃１）と比較して、ＣＡＲ特異的な抑制活性の誘発が観察された（図４）。実際、図４に示すように、ＣＡＲ＃１発現Ｔｒｅｇ細胞（活性化なし条件）の自発的な抑制活性は、特異的ＴＣＲまたはＣＡＲ媒介抑制活性を示すには強すぎていた。対照的に、ＣＡＲ＃２発現Ｔｒｅｇ細胞の刺激は、ＴＣＲ結合後またはＩＬ－２３Ｒリガンドを用いたＣＡＲ＃２活性化後のいずれにおいても、強力な抑制活性をもたらした。これらの結果は、本開示のｓｃＦｖの優位性を示している。
ＣＡＲ＃２では、対照ｓｃＦｖを有するＩＬ－２３Ｒ ＣＡＲ構築物（ＣＡＲ＃１）と比較して、ＣＡＲ特異的な抑制活性の誘発が観察された（図４）。実際、図４に示すように、ＣＡＲ＃１発現Ｔｒｅｇ細胞（活性化なし条件）の自発的な抑制活性は、特異的ＴＣＲまたはＣＡＲ媒介抑制活性を示すには強すぎていた。対照的に、ＣＡＲ＃２発現Ｔｒｅｇ細胞の刺激は、ＴＣＲ結合後またはＩＬ－２３Ｒリガンドを用いたＣＡＲ＃２活性化後のいずれにおいても、強力な抑制活性をもたらした。これらの結果は、本開示のｓｃＦｖの優位性を示している。
【0266】
新規なｓｃＦｖ由来ＣＡＲを有するＴｒｅｇはｉｎ ｖｉｖｏで活性化され、ＤＳＳ誘発性ＩＢＤのマウスモデルにおいて疾患活動性指標を低下させる
マウスＴｒｅｇ細胞に、図５に記載の異なる構築物を形質導入した。新規なｓｃＦｖ（ヒト及びマウスと交差反応性である）を含むマウスＣＡＲ＃２ＣＤ２８（ｍＣＡＲ＃２）の２つのバージョン：（１）ｍＣＡＲ＃１と同じＴＭドメイン（マウスＣＤ２８ ＴＭ）を含むｍＣＡＲ＃２ａと、（２）マウスＣＤ８のＴＭドメインを含むｍＣＡＲ＃２ｂ（よりヒト構築物ＣＡＲ＃２に匹敵）を構築した。
マウスＴｒｅｇ細胞に、図５に記載の異なる構築物を形質導入した。新規なｓｃＦｖ（ヒト及びマウスと交差反応性である）を含むマウスＣＡＲ＃２ＣＤ２８（ｍＣＡＲ＃２）の２つのバージョン：（１）ｍＣＡＲ＃１と同じＴＭドメイン（マウスＣＤ２８ ＴＭ）を含むｍＣＡＲ＃２ａと、（２）マウスＣＤ８のＴＭドメインを含むｍＣＡＲ＃２ｂ（よりヒト構築物ＣＡＲ＃２に匹敵）を構築した。
【0267】
非形質導入（ＮＴ）、または対照ｓｃＦｖに由来するマウスＣＡＲ構築物（ｍＣＡＲ＃１）もしくは本開示のｓｃＦｖに由来するマウスＣＡＲ構築物（ｍＣＡＲ＃２ａ及び２ｂ）のいずれかを形質導入されたＩＬ－２３Ｒ－ＣＡＲマウスＴｒｅｇを、短いデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）誘発性炎症性腸疾患（ＩＢＤ）のマウスモデルに注射した（図６Ａ）。このモデルは、注射された細胞のｉｎ ｓｉｔｕでの活性化を測定するために開発され、有効性モデルではなく標的結合モデルである。図６Ｂに示されるように、本開示のｓｃＦｖを含むＩＬ－２３Ｒ ＣＡＲ Ｔｒｅｇ（ｍＣＡＲ＃２）は、結腸、腸間膜リンパ節、及び脾臓においてｉｎ ｖｉｖｏで見られる。これらのＴｒｅｇは、フローサイトメトリーを用いたＴｒｅｇ上でのＣＴＬＡ－４の発現によって測定されるように、炎症部位（結腸及び腸間膜リンパ節における）において非形質導入細胞よりも有意に活性化される。興味深いことに、ｍＣＡＲ＃２ｂ（ＣＤ２８細胞内シグナル伝達ドメインと会合したＣＤ８ ＴＭを含む）は、炎症を起こした臓器（結腸及び腸間膜リンパ節）でのみ有意な活性化を示し、炎症を起こしていない臓器（脾臓）では有意な活性化を示さなかった。
【0268】
【0269】
考察
ＣＡＲ＃２、ＩＬ－２３Ｒ－ＣＡＲリード候補（ＬａｍＳ４Ｇ３）を同定した。ＣＡＲ＃２は、ＣＤ８ＴＭ／ＣＤ２８／ＣＤ３ｚに融合された、１００個を超える潜在的なヒットを得た大規模なライブラリースクリーニングを通じて同定された抗ＩＬ－２３Ｒ－ｓｃＦｖから構成される第２世代ＣＡＲである。このＣＡＲは、トニックシグナル伝達は検出されずにＩＬ－２３Ｒに対して高い特異性を示し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで特異的なＣＡＲ依存的抑制活性を示した。
ＣＡＲ＃２、ＩＬ－２３Ｒ－ＣＡＲリード候補（ＬａｍＳ４Ｇ３）を同定した。ＣＡＲ＃２は、ＣＤ８ＴＭ／ＣＤ２８／ＣＤ３ｚに融合された、１００個を超える潜在的なヒットを得た大規模なライブラリースクリーニングを通じて同定された抗ＩＬ－２３Ｒ－ｓｃＦｖから構成される第２世代ＣＡＲである。このＣＡＲは、トニックシグナル伝達は検出されずにＩＬ－２３Ｒに対して高い特異性を示し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで特異的なＣＡＲ依存的抑制活性を示した。
【0270】
実施例２：最適化されたＩＬ－２３Ｒ ＣＡＲ構築物のヒトＴｒｅｇにおけるｉｎ ｖｉｔｒｏ選択
実施例１で同定したＣＡＲ＃２から出発して、プロモーター、リーダー配列、ヒンジ長、及びコドン最適化を変えることにより、いくつかの最適化が行われた。６つの異なる最適化構築物を、３２の構築物マトリックスから選択し、臨床準備が整ったバックボーン（ＨＡタグ及びＧＦＰなし）で産生した。
実施例１で同定したＣＡＲ＃２から出発して、プロモーター、リーダー配列、ヒンジ長、及びコドン最適化を変えることにより、いくつかの最適化が行われた。６つの異なる最適化構築物を、３２の構築物マトリックスから選択し、臨床準備が整ったバックボーン（ＨＡタグ及びＧＦＰなし）で産生した。
【0271】
本実施例では、これらの異なる構築物を、いくつかのパラメータ、例えば、生存力、増殖倍率、Ｔｒｅｇ表現型の安定性、ＣＡＲ媒介活性化、及びＣＡＲ媒介抑制に基づいて比較した。
【0272】
材料及び方法
Ｊｕｒｋａｔ細胞株を発現するＩＬ－２３Ｒの作製
Ｊｕｒｋａｔ ＩＬ２３Ｒ細胞株を、Ｊｕｒｋａｔ細胞においてピューロマイシン選択可能なレンチウイルスベクターを介してＩＬ２３Ｒを過剰発現することにより作製した。レンチウイルスベクターを産生し、Ｊｕｒｋａｔ細胞に形質導入した。
Ｊｕｒｋａｔ細胞株を発現するＩＬ－２３Ｒの作製
Ｊｕｒｋａｔ ＩＬ２３Ｒ細胞株を、Ｊｕｒｋａｔ細胞においてピューロマイシン選択可能なレンチウイルスベクターを介してＩＬ２３Ｒを過剰発現することにより作製した。レンチウイルスベクターを産生し、Ｊｕｒｋａｔ細胞に形質導入した。
【0273】
ｒｈｕＩＬ－２３Ｒを提示する人工ＡＰＣの作製
Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｍ－２７０ Ｅｐｏｘｙ；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、製造元の指示に従ってＤｙｎａｂｅａｄｓ抗体結合キット（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｔｈｅｒｍｏ ｆｉｓｈｅｒ，カタログ番号１４３１１Ｄ）を用いて組換えヒトＩＬ－２３Ｒ Ｆｃキメラタンパク質（Ｒ＆Ｄ、カタログ番号１４００－ＩＲ－０５０）と結合させた。
Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｍ－２７０ Ｅｐｏｘｙ；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、製造元の指示に従ってＤｙｎａｂｅａｄｓ抗体結合キット（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｔｈｅｒｍｏ ｆｉｓｈｅｒ，カタログ番号１４３１１Ｄ）を用いて組換えヒトＩＬ－２３Ｒ Ｆｃキメラタンパク質（Ｒ＆Ｄ、カタログ番号１４００－ＩＲ－０５０）と結合させた。
【0274】
ＰＢＭＣ及び制御性Ｔ細胞の単離
Ｔｒｅｇ及びＴｃｏｎｖを、ＥＦＳ（Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ）の健康なボランティアの血液から得たバフィーコートから新たに単離した。簡潔に言えば、供血の翌日、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＦｉｃｏｌｌ勾配遠心分離によりバフィーコートから単離した。ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋／ＣＤ１２７ｌｏｗ ｎＴｒｅｇ細胞を以下の手順で単離した：ＣＤ２５＋細胞を、ＥａｓｙＳｅｐ（商標）Ｒｅｌｅａｓａｂｌｅ ＲａｐｉｄＳｐｈｅｒｅｓ（商標）を用いてカラムフリー免疫磁気陽性選択により単離する。次に、ＥａｓｙＳｅｐ（商標）で単離したＣＤ２５＋細胞から結合した磁性粒子を除去し、不要な非Ｔｒｅｇを枯渇の標的とした。最終的に単離された画分には、高レベルのＦＯＸＰ３を発現する高度に精製されたＣＤ４＋ＣＤ１２７ｌｏｗＣＤ２５＋細胞が含まれた。
Ｔｒｅｇ及びＴｃｏｎｖを、ＥＦＳ（Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ）の健康なボランティアの血液から得たバフィーコートから新たに単離した。簡潔に言えば、供血の翌日、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＦｉｃｏｌｌ勾配遠心分離によりバフィーコートから単離した。ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋／ＣＤ１２７ｌｏｗ ｎＴｒｅｇ細胞を以下の手順で単離した：ＣＤ２５＋細胞を、ＥａｓｙＳｅｐ（商標）Ｒｅｌｅａｓａｂｌｅ ＲａｐｉｄＳｐｈｅｒｅｓ（商標）を用いてカラムフリー免疫磁気陽性選択により単離する。次に、ＥａｓｙＳｅｐ（商標）で単離したＣＤ２５＋細胞から結合した磁性粒子を除去し、不要な非Ｔｒｅｇを枯渇の標的とした。最終的に単離された画分には、高レベルのＦＯＸＰ３を発現する高度に精製されたＣＤ４＋ＣＤ１２７ｌｏｗＣＤ２５＋細胞が含まれた。
【0275】
形質導入
本試験で使用した構築物は表５に記載される。
本試験で使用した構築物は表５に記載される。
【表5】
【0276】
形質導入は、２４ウェルプレートで行った。簡潔に言えば、単離及び活性化の２日後に、各ウェルから培地の２／３を除去し、各構築物の２～５×１０Ｅ６ＴＵ／ｍｌを各ウェルに添加した。３７℃で６時間後、各ウェルに２／３の新鮮な培地を加え、各ウェルをホモジナイズし、チューブに回収し、遠心分離した。上清を除去し、各ペレットを１０００Ｕ／ｍｌのＩＬ－２を添加した新鮮な培地に再懸濁させた後に、新たなプレートに播種した。形質導入の４～５日後、フローサイトメトリーにおけるＩｇＧ＊陽性細胞の割合（％）の分析によって有効性を測定した。
【0277】
培養の９日目に、ＳＴＦ－ＴＲＢ－０１－Ｅ００９ Ｖ０２の手順に従ってＴｒｅｇ表現型を分析した。この分析に使用されるマーカーは、更新された表６に列挙されている。
【表6】
【0278】
活性化アッセイ
培養の１０日目に、活性化アッセイを行った。簡潔に言えば、０．０５×１０＾６個のＣＡＲ－Ｔｒｅｇを、ＰＬ９６Ｕ底に、単独で、または抗ＣＤ２８／抗ＣＤ３被覆ビーズの存在下（１：１のＴｒｅｇ対ビーズ比）、またはＩＬ－２３Ｒ被覆ビーズの存在下（１：１のＴｒｅｇ対ビーズ比）、または細胞表面に低レベルのＩＬ－２３Ｒを発現するＪｕｒｋａｔ（Ｊｕｒｋａｔ ５７２）もしくは高レベルのＩＬ－２３Ｒを発現するＪｕｒｋａｔ（Ｊｕｒｋａｔ ５７３）の存在下で播種した。３７℃、５％のＣＯ２で２４時間後、細胞をＣＤ４及びＣＤ６９について染色し、次いでフローサイトメトリーで分析した。
培養の１０日目に、活性化アッセイを行った。簡潔に言えば、０．０５×１０＾６個のＣＡＲ－Ｔｒｅｇを、ＰＬ９６Ｕ底に、単独で、または抗ＣＤ２８／抗ＣＤ３被覆ビーズの存在下（１：１のＴｒｅｇ対ビーズ比）、またはＩＬ－２３Ｒ被覆ビーズの存在下（１：１のＴｒｅｇ対ビーズ比）、または細胞表面に低レベルのＩＬ－２３Ｒを発現するＪｕｒｋａｔ（Ｊｕｒｋａｔ ５７２）もしくは高レベルのＩＬ－２３Ｒを発現するＪｕｒｋａｔ（Ｊｕｒｋａｔ ５７３）の存在下で播種した。３７℃、５％のＣＯ２で２４時間後、細胞をＣＤ４及びＣＤ６９について染色し、次いでフローサイトメトリーで分析した。
【0279】
抑制アッセイ
抑制アッセイを１０日目に行い、ＣＡＲ－Ｔｒｅｇを採取し、計数し、抗ＣＤ２８／抗ＣＤ３被覆ビーズ（２：１のＴｒｅｇ対ビーズ比）を用いてＴＣＲを通じて、あるいはＩＬ－２３Ｒ被覆ビーズを用いて（１：１のＴｒｅｇ対ビーズ比）、または細胞表面に低レベルのＩＬ－２３Ｒを発現するＪｕｒｋａｔ細胞株（Ｊｕｒｋａｔ ５７２）もしくは高レベルのＩＬ－２３Ｒを発現するＪｕｒｋａｔ細胞株（Ｊｕｒｋａｔ ５７３）を用いてＣＡＲを通じて活性化するか、または活性化せずに維持し、それらの機能活性についての基礎値を評価した。並行して、同種異系Ｔｃｏｎｖを解凍し、Ｄｙｅ ４５０で染色し、抗ＣＤ２８／抗ＣＤ３被覆ビーズ（３：１のＴｃｏｎｖ対ビーズ比）で活性化させた。翌日、ビーズをＴｃｏｎｖから除去した後、未活性化または活性化Ｔｒｅｇと共培養した。共培養の３日後、Ｔｃｏｎｖの増殖をフローサイトメトリーで分析した。
抑制アッセイを１０日目に行い、ＣＡＲ－Ｔｒｅｇを採取し、計数し、抗ＣＤ２８／抗ＣＤ３被覆ビーズ（２：１のＴｒｅｇ対ビーズ比）を用いてＴＣＲを通じて、あるいはＩＬ－２３Ｒ被覆ビーズを用いて（１：１のＴｒｅｇ対ビーズ比）、または細胞表面に低レベルのＩＬ－２３Ｒを発現するＪｕｒｋａｔ細胞株（Ｊｕｒｋａｔ ５７２）もしくは高レベルのＩＬ－２３Ｒを発現するＪｕｒｋａｔ細胞株（Ｊｕｒｋａｔ ５７３）を用いてＣＡＲを通じて活性化するか、または活性化せずに維持し、それらの機能活性についての基礎値を評価した。並行して、同種異系Ｔｃｏｎｖを解凍し、Ｄｙｅ ４５０で染色し、抗ＣＤ２８／抗ＣＤ３被覆ビーズ（３：１のＴｃｏｎｖ対ビーズ比）で活性化させた。翌日、ビーズをＴｃｏｎｖから除去した後、未活性化または活性化Ｔｒｅｇと共培養した。共培養の３日後、Ｔｃｏｎｖの増殖をフローサイトメトリーで分析した。
【0280】
結果
同程度の形質導入効率
ＬｏｗからＨｉｇｈまでのＣＡＲ発現レベルをカバーする選択されたＣＡＲは、検出可能なバックグラウンド／トニックシグナル伝達を有さず、異なる生物学的エレメント（シグナルペプチド／コドン／リンカー／ＷＰＲＥ）をカバーしている。その試験で使用した構築物は、臨床準備が整ったバックボーン（ＨＡタグ及びＧＦＰなし）で作製及び産生した。抗ＩｇＧ抗体を用いてＩｇＧが陽性である細胞の割合（％）を測定するフローサイトメトリーにおいて形質導入効率を評価し、細胞表面でのＣＡＲ発現レベルをＩｇＧ染色の平均蛍光強度（ＭＦＩ）によって評価した（図８）。異なる構築物を４０～５０％で形質導入した。
同程度の形質導入効率
ＬｏｗからＨｉｇｈまでのＣＡＲ発現レベルをカバーする選択されたＣＡＲは、検出可能なバックグラウンド／トニックシグナル伝達を有さず、異なる生物学的エレメント（シグナルペプチド／コドン／リンカー／ＷＰＲＥ）をカバーしている。その試験で使用した構築物は、臨床準備が整ったバックボーン（ＨＡタグ及びＧＦＰなし）で作製及び産生した。抗ＩｇＧ抗体を用いてＩｇＧが陽性である細胞の割合（％）を測定するフローサイトメトリーにおいて形質導入効率を評価し、細胞表面でのＣＡＲ発現レベルをＩｇＧ染色の平均蛍光強度（ＭＦＩ）によって評価した（図８）。異なる構築物を４０～５０％で形質導入した。
【0281】
異なる最適化構築物は、培養の最初のサイクル後に同じ生存率及び増殖倍率を示す
異なる変化が培養中のＣＡＲ－Ｔｒｅｇの挙動に及ぼす影響についても評価した。いかなる変化であっても、異なる構築物を形質導入されたＴｒｅｇは、９日目に同じ生存率レベル（図９、左側）と増殖倍率（図９、右側）を示した。
異なる変化が培養中のＣＡＲ－Ｔｒｅｇの挙動に及ぼす影響についても評価した。いかなる変化であっても、異なる構築物を形質導入されたＴｒｅｇは、９日目に同じ生存率レベル（図９、左側）と増殖倍率（図９、右側）を示した。
【0282】
ＣＡＲ＃３は、活性化のバックグラウンドが最も低く、ＣＡＲ活性化後のシグナル対ノイズが最も高いことを示した。
【0283】
異なる最適化がＣＡＲ－Ｔｒｅｇの活性化に及ぼす影響（図１０）を評価した。ＣＡＲ＃３、ＣＡＲ＃４、ＣＡＲ＃５、ＣＡＲ＃６、及びＣＡＲ＃７のＣＡＲ媒介活性化のプロファイルは、非最適化構築物（ＣＡＲ＃２）のものに近似していた。しかしながら、ＣＡＲ＃３の活性化のバックグラウンドは、最良のシグナル対ノイズを示すＣＡＲ＃２のものよりもわずかに低かった。
【0284】
有意なＣＡＲ媒介抑制
ＣＡＲ構築物のＣＡＲ媒介抑制活性を測定した（図１１）。ＣＡＲ結合を、人工ＡＰＣ（ＩＬ－２３Ｒ被覆ビーズ；ｂＩＬ－２３Ｒ）、または低発現（Ｊｕｒｋａｔ ５７２）もしくは高発現（Ｊｕｒｋａｔ ５７３）Ｊｕｒｋａｔ細胞株のいずれかを用いて誘導した。陽性対照として、ポリクローナル活性化（抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８被覆ビーズ；ビーズＣＤ３／２８）を使用した。自発的抑制は、いかなる活性化も伴わず（ｎｏｎｅ）に測定する。活性化データと同様に、ＣＡＲ＃３、ＣＡＲ＃４、ＣＡＲ＃５、ＣＡＲ＃６、及びＣＡＲ＃７のプロファイルは、非最適化構築物ＣＡＲ＃２のものに近似する。全ての構築物は、人工ＡＰＣ（図１１Ａ及び１１Ｂ）または高発現ＩＬ－２３Ｒ Ｊｕｒｋａｔ細胞株（図１１Ａ）を用いてＣＡＲが結合している場合に、ロバストなＣＡＲ媒介抑制活性を媒介することができる。全ての構築物は、非常に低い自発的抑制活性を示した。
ＣＡＲ構築物のＣＡＲ媒介抑制活性を測定した（図１１）。ＣＡＲ結合を、人工ＡＰＣ（ＩＬ－２３Ｒ被覆ビーズ；ｂＩＬ－２３Ｒ）、または低発現（Ｊｕｒｋａｔ ５７２）もしくは高発現（Ｊｕｒｋａｔ ５７３）Ｊｕｒｋａｔ細胞株のいずれかを用いて誘導した。陽性対照として、ポリクローナル活性化（抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８被覆ビーズ；ビーズＣＤ３／２８）を使用した。自発的抑制は、いかなる活性化も伴わず（ｎｏｎｅ）に測定する。活性化データと同様に、ＣＡＲ＃３、ＣＡＲ＃４、ＣＡＲ＃５、ＣＡＲ＃６、及びＣＡＲ＃７のプロファイルは、非最適化構築物ＣＡＲ＃２のものに近似する。全ての構築物は、人工ＡＰＣ（図１１Ａ及び１１Ｂ）または高発現ＩＬ－２３Ｒ Ｊｕｒｋａｔ細胞株（図１１Ａ）を用いてＣＡＲが結合している場合に、ロバストなＣＡＲ媒介抑制活性を媒介することができる。全ての構築物は、非常に低い自発的抑制活性を示した。
【0285】
曲線下面積をＣＡＲ＃２及びＣＡＲ＃３について計算した（図１２）。ＡＵＣ計算は、Ｔｒｅｇが、細胞表面で高レベルのＩＬ－２３Ｒを発現するＪｕｒｋａｔ（Ｊｕｒｋａｔ ５７３）と結合している場合に、ＣＡＲ＃３がＣＡＲ＃２と同じＣＡＲ媒介抑制を示したことを明らかにしている。しかしながら、ＣＡＲ＃３は、ＣＡＲ Ｔｒｅｇが低レベルを発現するＪｕｒｋａｔ（Ｊｕｒｋａｔ ５７２）と結合した場合、ＣＡＲ＃２よりも低いＣＡＲ媒介抑制を示した。このプロファイルは、オフターゲット効果を減少させるはずである。
【0286】
Ｔｒｅｇ安定性－全ての構築物はＴｒｅｇ表現型の良好な安定性を示した
可塑性は、Ｔｒｅｇの十分に記載された特徴である。Ｔｒｅｇ同定の主なマーカーは、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＴＬＡ－４、ＦｏｘＰ３及びＨｅｌｉｏｓである。ＣＡＲ Ｔｒｅｇの表現型安定性を測定するために、これらのマーカーの発現を、最初の増殖サイクルの終了時（９日目）にフローサイトメトリーによって分析した（図１３）。主なＴｒｅｇマーカーの変化は、異なるＣＡＲを使用した後に観察されなかった。
可塑性は、Ｔｒｅｇの十分に記載された特徴である。Ｔｒｅｇ同定の主なマーカーは、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＴＬＡ－４、ＦｏｘＰ３及びＨｅｌｉｏｓである。ＣＡＲ Ｔｒｅｇの表現型安定性を測定するために、これらのマーカーの発現を、最初の増殖サイクルの終了時（９日目）にフローサイトメトリーによって分析した（図１３）。主なＴｒｅｇマーカーの変化は、異なるＣＡＲを使用した後に観察されなかった。
【0287】
考察
異なる構築物間の差はごくわずかであり、このことは標準的なＣＡＲ＃２が異なる変化を引き受けるのに十分ロバストであることを示している。
異なる構築物間の差はごくわずかであり、このことは標準的なＣＡＲ＃２が異なる変化を引き受けるのに十分ロバストであることを示している。
【0288】
しかしながら、ＣＡＲ＃３構築物は、以下のパラメータに基づいて際立っていた：
－ＣＡＲ＃２よりも低いトニックシグナル伝達が、より高いシグナル対ノイズをもたらす（図１０）
－Ｔｒｅｇが細胞表面で高レベルのＩＬ－２３Ｒを発現するＪｕｒｋａｔと結合している場合にはＣＡＲ＃２とＣＡＲ媒介抑制が同じであるが、ＣＡＲ Ｔｒｅｇが低レベルのＩＬ－２３Ｒを発現するＪｕｒｋａｔと結合している場合にはＣＡＲ＃２よりもＣＡＲ媒介抑制が低い（図１２）。これは、オフターゲットを減少させるはずである。
－ＣＡＲ＃２よりも低いトニックシグナル伝達が、より高いシグナル対ノイズをもたらす（図１０）
－Ｔｒｅｇが細胞表面で高レベルのＩＬ－２３Ｒを発現するＪｕｒｋａｔと結合している場合にはＣＡＲ＃２とＣＡＲ媒介抑制が同じであるが、ＣＡＲ Ｔｒｅｇが低レベルのＩＬ－２３Ｒを発現するＪｕｒｋａｔと結合している場合にはＣＡＲ＃２よりもＣＡＲ媒介抑制が低い（図１２）。これは、オフターゲットを減少させるはずである。
【0289】
実施例３：ＩＬ２３Ｒ－ＣＡＲ：ｓｃＦｖ（ＬａｍＳ４Ｇ３）親和性の特性評価
材料及び方法
示されたｓｃＦＶを哺乳動物２９３ｔ細胞で産生し、精製してビオチン化した。次に、ビオチン化ｓｃＦｖを、ＰＢＳ中でマウスまたはヒトＩＬ２３Ｒａ被覆ビーズと共に２５℃で３０分間インキュベートした。低温洗浄後、結合したＩＬ２３Ｒ結合ｓｃＦＶがＡＰＣ標識ストレプトアビジンとのインキュベーションにより検出され、フローサイトメーターで試料を分析した。各条件からの蛍光強度中央値に基づいてＥＣ５０を計算した。計算、カーブフィッティング、及びＥＣ５０計算は、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍを介して行った。
材料及び方法
示されたｓｃＦＶを哺乳動物２９３ｔ細胞で産生し、精製してビオチン化した。次に、ビオチン化ｓｃＦｖを、ＰＢＳ中でマウスまたはヒトＩＬ２３Ｒａ被覆ビーズと共に２５℃で３０分間インキュベートした。低温洗浄後、結合したＩＬ２３Ｒ結合ｓｃＦＶがＡＰＣ標識ストレプトアビジンとのインキュベーションにより検出され、フローサイトメーターで試料を分析した。各条件からの蛍光強度中央値に基づいてＥＣ５０を計算した。計算、カーブフィッティング、及びＥＣ５０計算は、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍを介して行った。
【0290】
結果
結合実験により、ヒトＩＬ２３Ｒに対してはＥＣ５０が３７．６ｎＭと高い親和性で結合し、マウスＩＬ２３Ｒａに対してはＥＣ５０が５３．１ｎＭとほぼ同様の親和性であることが明らかになった。対照的に、基準ｓｃＦｖ（これもまた交差反応性である）は、ヒトＩＬ２３Ｒに対しては４．４Ｎｍの高い親和性で結合し、マウスＩＬ２３Ｒに対しては１３．１ｎＭと、より顕著な差が生じた（図１４）。
結合実験により、ヒトＩＬ２３Ｒに対してはＥＣ５０が３７．６ｎＭと高い親和性で結合し、マウスＩＬ２３Ｒａに対してはＥＣ５０が５３．１ｎＭとほぼ同様の親和性であることが明らかになった。対照的に、基準ｓｃＦｖ（これもまた交差反応性である）は、ヒトＩＬ２３Ｒに対しては４．４Ｎｍの高い親和性で結合し、マウスＩＬ２３Ｒに対しては１３．１ｎＭと、より顕著な差が生じた（図１４）。
【0291】
これらの例示的な結果では、本開示のＣＡＲは、ＩＬ２３Ｒのヒト及びマウスホモログ間で類似した結合プロファイルを呈する。これらの例示的な結果では、本開示のＣＡＲ＃２は、ヒトＩＬ２３ＲとマウスＩＬ２３Ｒ間の結合親和性の差が約１．４倍を示す一方で、ＣＡＲ＃１は、ヒトＩＬ２３ＲとマウスＩＬ２３Ｒ間の結合親和性の差が約３倍を示す。これらの例示的な結果は、本開示のＣＡＲ＃２が、ＣＡＲ＃１と比較してより類似した親和性で、ヒト及びマウスＩＬ２３Ｒに結合することを示している。この類似性は、マウス前臨床モデルにおけるＣＡＲ＃２の使用がヒトＩＬ２３Ｒとのその相互作用をより代表するものとなり得ることを示唆している。
【0292】
実施例４：ｓｃＦｖシグナル伝達の安定性
材料及び方法
４つの異なる構築物を、異なる発現カセット（ＰＧＫまたはＥＦ１ａプロモーター、＋／－ＷＰＲＥ Ｍｕｔ６）を用いて作製し、レンチウイルス形質導入によって初代ヒトＴｒｅｇに形質導入した（図１５）。
材料及び方法
４つの異なる構築物を、異なる発現カセット（ＰＧＫまたはＥＦ１ａプロモーター、＋／－ＷＰＲＥ Ｍｕｔ６）を用いて作製し、レンチウイルス形質導入によって初代ヒトＴｒｅｇに形質導入した（図１５）。
【0293】
結果
選択されたＩＬ－２３Ｒ ｓｃＦｖは、初代Ｔｒｅｇ細胞における類似の発現レベル下で、安定したシグナル伝達及び低バックグラウンドを示した（図１６）。
選択されたＩＬ－２３Ｒ ｓｃＦｖは、初代Ｔｒｅｇ細胞における類似の発現レベル下で、安定したシグナル伝達及び低バックグラウンドを示した（図１６）。
【0294】
発現の増加は、細胞表面でのＣＡＲの蓄積の増加と相関する。発現レベルが５倍変化した一方で、未改変の対照細胞（ＣＡＲトニックシグナル伝達グラフの濃い灰色の水平線）に対するバックグラウンドの違いは観察されなかった（図１６）。さらに、全てのＣＡＲ発現条件は、ＣＡＲ依存的活性化に対して、ならびにＣＤ３／ＣＤ２８ビーズによる対照活性化に対して同様に強く反応した（図１６）。
【表7】
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図6A】
【図6B】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図11A】
【図11B】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2024-02-29
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
【国際調査報告】