特表 2024-526214 脂質ナノ粒子及びその製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-07-17

(54)【発明の名称】脂質ナノ粒子及びその製造方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 9/16 20060101AFI20240709BHJP

   A61K 47/34 20170101ALI20240709BHJP

   A61K 47/18 20170101ALI20240709BHJP

   A61K 47/22 20060101ALI20240709BHJP

   A61K 47/28 20060101ALI20240709BHJP

   A61K 47/24 20060101ALI20240709BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20240709BHJP

   A61K 38/02 20060101ALI20240709BHJP

   A61K 31/713 20060101ALI20240709BHJP

   A61K 31/7105 20060101ALI20240709BHJP

   A61K 31/711 20060101ALI20240709BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240709BHJP

【ＦＩ】

A61K9/16

A61K47/34

A61K47/18

A61K47/22

A61K47/28

A61K47/24

A61K45/00

A61K38/02

A61K31/713

A61K31/7105

A61K31/711

A61P43/00 105

A61P43/00 111

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023579558

(86)(22)【出願日】2022-06-23

(85)【翻訳文提出日】2024-02-21

(86)【国際出願番号】 KR2022008941

(87)【国際公開番号】W WO2022270941

(87)【国際公開日】2022-12-29

(31)【優先権主張番号】10-2021-0082361

(32)【優先日】2021-06-24

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(31)【優先権主張番号】10-2022-0076212

(32)【優先日】2022-06-22

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】523483577

【氏名又は名称】セルナ セラピューティクス

【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥＲＮＡ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ

(74)【代理人】

【識別番号】100139594

【弁理士】

【氏名又は名称】山口 健次郎

(72)【発明者】

【氏名】イ テウ

(72)【発明者】

【氏名】ペク ユミ

(72)【発明者】

【氏名】リュ ジウォン

(72)【発明者】

【氏名】チャン ダヘ

【テーマコード（参考）】

4C076

4C084

4C086

【Ｆターム（参考）】

4C076AA31

4C076DD49

4C076DD52

4C076DD59

4C076DD60

4C076DD63

4C076DD70

4C076EE23

4C084AA03

4C084AA17

4C084BA44

4C084NA10

4C084ZB211

4C084ZC411

4C086AA01

4C086EA16

4C086MA03

4C086MA05

4C086MA41

4C086NA10

4C086ZB21

4C086ZC41

(57)【要約】

本発明は、脂質ナノ粒子及びその製造方法に関し、より詳細には、イオン化脂質（ｉｏｎｉｚａｂｌｅ ｌｉｐｉｄ）とポリエチレングリコール誘導体モイエティ（ＰＥＧ ｍｏｉｅｔｙ）－分解可能連結官能基－脂質（ｌｉｐｉｄ）コンジュゲート（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を含む粒子であり、生体内副作用を最小化し、ナノ粒子をターゲット細胞に効果的に伝達して薬理効能物質を細胞質に効率的に運搬することを特徴とする。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

次を含む脂質ナノ粒子：
（ａ）イオン化脂質及びポリエチレングリコールモイエティ（ＰＥＧ ｍｏｉｅｔｙ）－分解可能官能基－脂質（ｌｉｐｉｄ）コンジュゲートを含む脂質配合物；及び
（ｂ）前記脂質配合物内に封入された薬物、核酸又はこれらの組合せ。

【請求項2】

前記ポリエチレングリコールモイエティ（ＰＥＧ ｍｏｉｅｔｙ）－分解可能官能基－脂質（ｌｉｐｉｄ）コンジュゲートは、化学式１で表されることを特徴とする、請求項１に記載の脂質ナノ粒子。

【化1】

化学式１で、
ａは、０又は１であり、
Ｌは、ターゲッティングリガンド（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｌｉｇａｎｄ）であり、
Ｍは、Ｈ、ＯＨ、単結合、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、ＮＨＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＯＣ（Ｏ）又はＣ（Ｏ）Ｏであり、
Ｐは、ＣＨ_２Ｏ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）ｑＣＨ_２又はＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）ｑＣＨ_２であり、ここで、ｑは、２～１２０の整数であり、
Ｌ_６は、Ｃ（Ｏ）ＮＨ－Ｎ＝ＣＲ_４、Ｒ_４Ｃ＝Ｎ－ＮＨＣ（Ｏ）、ＮＨ－Ｎ＝ＣＲ_４、Ｒ_４Ｃ＝Ｎ－ＮＨ、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、Ｏ－Ｎ＝ＣＲ_４、Ｒ_４Ｃ＝Ｎ－Ｏ、Ｓ－Ｓ、Ｓ又はｔｒａｎｓ－シクロオクテン（ｔｒａｎｓ－ｃｙｃｌｏｏｃｔｅｎｅ）、又は

【化2】

であり、ここで、Ｒ_４は、Ｈ、Ｃ_１－Ｃ_２０アルキル、Ｃ_２－Ｃ_２０アルケニル、Ｃ_２－Ｃ_２０アルキニル、Ｃ_３－Ｃ_１０シクロアルキル、Ｃ_６－Ｃ_２０アリール、又はフッ素、酸素、硫黄及び窒素の中から選ばれるヘテロ原子を含有するラジカルであるヘテロサイクルであり、Ｚは、ＮＨ、Ｏ又はＳであり、ｄは、１～１０の整数であり、ｅは、１～１０の整数であり、
Ｔは、単結合又は１，４－Ｃ_６Ｈ_４Ｏ－であり、
Ｒ_１及びＲ_３はそれぞれ独立に－Ｙ－Ｒであり、Ｒ_２は、－ＣＨ_２－Ｙ－Ｒであり、ここで、Ｙは、単結合、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、又はＮＨＣ（Ｏ）であり、Ｒは、Ｈ、Ｃ_１０～Ｃ_２０アルキル、アルケニル又はステロールである。

【請求項3】

前記ターゲッティングリガンドＬは、化学式２で表されることを特徴とする、請求項２に記載の脂質ナノ粒子。

【化3】

化学式２で、
ａ、ｂ及びｃは０又は１であるが、ａ、ｂ及びｃのうち一つ以上は必ず１であり、
Ｘ_１、Ｘ_２及びＸ_３は、ターゲッティングリガンドであり、
Ｌ_１、Ｌ’_１及びＬ”_１は、単結合、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、ＮＨＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＯＣ（Ｏ）又はＣ（Ｏ）Ｏであり、
Ｌ_２、Ｌ’_２及びＬ”_２は、（ＣＨ_２）_ｎ又は（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）ｍであり、ここで、ｎは、１～２０の整数であり、ｍは、１～１０の整数であり、
Ｌ_３、Ｌ’_３及びＬ”_３は、単結合、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、ＮＨＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＯＣ（Ｏ）又はＣ（Ｏ）Ｏであり、
Ｌ_４、Ｌ’_４及びＬ”_４は、（ＣＨ_２）_ｎであり、ここで、ｎは、１～２０の整数であり、
Ｌ_５、Ｌ’_５及びＬ”_５は、単結合、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、ＮＨＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＯＣ（Ｏ）又はＣ（Ｏ）Ｏである。

【請求項4】

前記Ｘ_１、Ｘ_２及びＸ_３は、Ｎ－アセチル－Ｄ－ガラクトサミン（Ｎ－ａｃｅｔｙｌ－Ｄ－ｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ，ＧａｌＮＡｃ）、Ｎ－アセチル－Ｄ－ガラクトース（Ｎ－ａｃｅｔｙｌ－Ｄ－ｇａｌａｃｔｏｓｅ）、Ｄ－ガラクトース（Ｄ－ｇａｌａｃｔｏｓｅ）、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン（Ｎ－ａｃｅｔｙｌ－Ｄ－ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ）、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン、Ｄ－グルコース、Ｄ－マンノース、Ｌ－フコース、炭水化物誘導体、葉酸（ｆｏｌａｔｅ）、トランスフェリン（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ）、ＲＧＤペプチド、サイクリックＲＧＤペプチド、ＴＡＴペプチド、Ｒ９ペプチド、ＣＡＤＹペプチド、ＨＡ２ペプチド、モノクローナル抗体、抗原結合断片（ａｎｔｉｇｅｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｆｒａｇｍｅｎｔ）又は抗体断片、一本鎖可変断片（ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ．ｓｃＦｖ）及びアプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項３に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項5】

前記ポリエチレングリコールモイエティ（ＰＥＧ ｍｏｉｅｔｙ）－分解可能官能基－脂質（ｌｉｐｉｄ）コンジュゲートは、化学式３で表されることを特徴とする、請求項１に記載の脂質ナノ粒子。

【化4】

化学式３で、ｎは、２～１２０の整数である。

【請求項6】

前記ポリエチレングリコールモイエティ（ＰＥＧ ｍｏｉｅｔｙ）－分解可能官能基－脂質（ｌｉｐｉｄ）コンジュゲートは、化学式４で表されることを特徴とする、請求項１に記載の脂質ナノ粒子。

【化5】

化学式４で、ｎは、２～１２０の整数である。

【請求項7】

前記ポリエチレングリコールモイエティ（ＰＥＧ ｍｏｉｅｔｙ）－分解可能官能基－脂質（ｌｉｐｉｄ）コンジュゲートは、化学式１においてａが０である化合物とａが１である化合物との混合物であることを特徴とする、請求項２に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項8】

前記ａが０である化合物とａが１である化合物のモル比は、０．０１～９９．９：０．０１～９９．９であることを特徴とする、請求項７に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項9】

前記脂質ナノ粒子において前記ポリエチレングリコールモイエティ－分解可能官能基－脂質コンジュゲートの含有量は、脂質ナノ粒子を構成する全脂質成分の０．５～５０モル％であることを特徴とする、請求項１に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項10】

前記脂質ナノ粒子のサイズは、２０～２００ｎｍであることを特徴とする、請求項１に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項11】

前記イオン化脂質は、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル４－（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）、［（４－ヒドロキシブチル）アザンジイル］ジ（ヘキサン－６，１－ジイル）ビス（２－ヘキシルデカノエート）（ＡＬＣ－０３１５）、８－［（２－ヒドロキシエチル）［６－オキソ－６－（ウンデシルオキシ）ヘキシル］アミノ］－オクタン酸（ＳＭ－１０２）、１－リノレオイル－２－リノレイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－２－ＤＭＡＰ）、１，２－ジリノレイルカルバモイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－Ｃ－ＤＡＰ）、１，２－ジリノレオイル－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－ＤＡＰ）、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－（２－ジメチルアミノエチル）－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、１，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）、Ｎ，Ｎ－ジメチル－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）、ジオクタデシルアミドグリシルカルボキシスペルミン（ＤＯＧＳ）、スペルミンコレステリルカルバメート（ＧＬ－６７）；ビス－グアニジニウム－スペルミジン－コレステロール（ＢＧＴＣ）、３β－（Ｎ－（Ｎ’，Ｎ’－ジメチルアミノエタン）－カルバモイル）コレステロール（ＤＣ－Ｃｈｏｌ）、１，１’－（２－（４－（２－（（２－（ビス（２－ヒドロキシデシル）アミノ）エチル）（２－ヒドロキシデシル）アミノ）エチル）ピペラジン－１－イル）エチルアザンジイル）ジドデカン－２－オール（Ｃ１２－２００）、Ｎ－ｔ－ブチル－Ｎ’－テトラデシルアミノ－プロピオンアミジン（ジＣ１４－アミジン）；ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ－（１，２－ジミリスチルオキシプロプ－３－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）、Ｎ，Ｎ－ジオレイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、ジオレイルオキシプロピル－３－ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＯＲＩＥ）、Ｎ－（１－（２，３－ジオレイルオキシル）プロピル）－Ｎ－２－（スペルミンカルボキサミド）エチル）－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）、１，２－ジオレオイルトリメチルアンモニウムプロパンクロリド（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ－（１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、及びアミノプロピル－ジメチル－ビス（ドデシルオキシ）－プロパンアミニウムブロミド（ＧＡＰ－ＤＬＲＩＥ）からなる群から１種以上選択されることを特徴とする、請求項１に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項12】

ステロール脂質と中性脂質をさらに含む、請求項１に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項13】

前記ステロール脂質は、コレステロール又はコレステリルエステルであることを特徴とする、請求項１２に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項14】

前記中性脂質は、リン脂質又はスフィンゴ脂質であることを特徴とする、請求項１２に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項15】

前記リン脂質は、ＤＯＰＥ（ｄｉｏｌｅｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）、ＤＳＰＣ（ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、ＰＯＰＣ（ｐａｌｍｉｔｏｙｌｏｌｅｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、ＥＰＣ（ｅｇｇ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、ＤＯＰＣ（ｄｉｏｌｅｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、ＤＰＰＣ（ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、ＤＯＰＧ（ｄｉｏｌｅｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ）、ＤＰＰＧ（ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ）、ＤＳＰＥ（ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）、ＰＥ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）、ＤＰＰＥ（ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）、ＤＯＰＥ（１，２－ｄｉｏｌｅｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）、ＰＯＰＥ（１－ｐａｌｍｉｔｏｙｌ－２－ｏｌｅｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）、ＰＯＰＣ（１－ｐａｌｍｉｔｏｙｌ－２－ｏｌｅｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ）、ＤＯＰＳ（１，２－ｄｉｏｌｅｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－［ｐｈｏｓｐｈｏ－Ｌ－ｓｅｒｉｎｅ］）、セラミド（ｃｅｒａｍｉｄｅ）、スフィンゴミエリン（ｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎ）及びその混合物からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１４に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項16】

前記薬物は、ペプチド、タンパク質薬物、タンパク質－核酸構造体、及び陰イオン性生体高分子－薬物接合体からなる群から選ばれる１種以上であることを特徴とする、請求項１に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項17】

前記核酸は、一本鎖（ｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ）ｓｉＲＮＡ、二本鎖（ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ）ｓｉＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、プラスミド（ｐｌａｓｍｉｄ）、アプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、ｓａＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム（ｒｉｂｏｚｙｍｅ）、ＰＮＡ、及びＤＮＡｚｙｍｅからなる群から選ばれる１種以上であることを特徴とする、請求項１６に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項18】

次の段階を含む請求項１の脂質ナノ粒子の製造方法：
（ａ）イオン化脂質及びポリエチレングリコールモイエティ（ＰＥＧ ｍｏｉｅｔｙ）－分解可能官能基－脂質（ｌｉｐｉｄ）コンジュゲートを含む脂質配合物を含有する有機溶液と、薬物、核酸、又はその組合せを含有するバッファ溶液とを混合してｐＨを調整する段階；及び
（ｂ）前記混合溶液の溶媒を除去する段階。

【請求項19】

前記有機溶液と前記バッファ溶液の混合比は、１：１～１～１００の体積比であることを特徴とする、請求項１８に記載の脂質ナノ粒子の製造方法。

【請求項20】

前記ポリエチレングリコールモイエティ（ＰＥＧ ｍｏｉｅｔｙ）－分解可能官能基－脂質（ｌｉｐｉｄ）コンジュゲートは、化学式１で表されることを特徴とする、請求項１８に記載の脂質ナノ粒子の製造方法。

【化6】

化学式１で、
ａは、０又は１であり、
Ｌは、ターゲッティングリガンド（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｌｉｇａｎｄ）であり、
Ｍは、Ｈ、ＯＨ、単結合、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、ＮＨＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＯＣ（Ｏ）又はＣ（Ｏ）Ｏであり、
Ｐは、ＣＨ_２Ｏ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）ｑＣＨ_２又はＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）ｑＣＨ_２であり、ここで、ｑは、２～１２０の整数であり、
Ｌ_６は、Ｃ（Ｏ）ＮＨ－Ｎ＝ＣＲ_４、Ｒ_４Ｃ＝Ｎ－ＮＨＣ（Ｏ）、ＮＨ－Ｎ＝ＣＲ_４、Ｒ_４Ｃ＝Ｎ－ＮＨ、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、Ｏ－Ｎ＝ＣＲ_４、Ｒ_４Ｃ＝Ｎ－Ｏ、Ｓ－Ｓ、Ｓ又はｔｒａｎｓ－シクロオクテン（ｔｒａｎｓ－ｃｙｃｌｏｏｃｔｅｎｅ）、又は

【化7】

であり、ここで、Ｒ_４は、Ｈ、Ｃ_１－Ｃ_２０アルキル、Ｃ_２－Ｃ_２０アルケニル、Ｃ_２－Ｃ_２０アルキニル、Ｃ_３－Ｃ_１０シクロアルキル、Ｃ_６－Ｃ_２０アリール、又はフッ素、酸素、硫黄及び窒素の中から選ばれるヘテロ原子を含有するラジカルであるヘテロサイクルであり、Ｚは、ＮＨ、Ｏ又はＳであり、ｄは、１～１０の整数であり、ｅは、１～１０の整数であり、
Ｔは、単結合又は１，４－Ｃ_６Ｈ_４Ｏ－であり、
Ｒ_１及びＲ_３はそれぞれ独立に－Ｙ－Ｒであり、Ｒ_２は、－ＣＨ_２－Ｙ－Ｒであり、ここで、Ｙは、単結合、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、又はＮＨＣ（Ｏ）であり、Ｒは、Ｈ、Ｃ_１０～Ｃ_２０アルキル、アルケニル又はステロールである。

【請求項21】

前記ターゲッティングリガンドＬは、化学式２で表されることを特徴とする、請求項２０に記載の脂質ナノ粒子の製造方法。

【化8】

化学式２で、
ａ、ｂ及びｃは０又は１であるが、ａ、ｂ及びｃのうち一つ以上は必ず１であり、
Ｘ_１、Ｘ_２及びＸ_３は、ターゲッティングリガンドであり、
Ｌ_１、Ｌ’_１及びＬ”_１は、単結合、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、ＮＨＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＯＣ（Ｏ）又はＣ（Ｏ）Ｏであり、
Ｌ_２、Ｌ’_２及びＬ”_２は、（ＣＨ_２）_ｎ又は（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）ｍであり、ここで、ｎは、、１～２０の整数であり、ｍは、１～１０の整数であり、
Ｌ_３、Ｌ’_３及びＬ”_３は、単結合、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、ＮＨＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＯＣ（Ｏ）又はＣ（Ｏ）Ｏであり、
Ｌ_４、Ｌ’_４及びＬ”_４は、（ＣＨ_２）_ｎであり、ここで、ｎは、１～２０の整数であり、
Ｌ_５、Ｌ’_５及びＬ”_５は、単結合、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、ＮＨＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＯＣ（Ｏ）又はＣ（Ｏ）Ｏである。

【請求項22】

前記Ｘ_１、Ｘ_２及びＸ_３は、Ｎ－アセチル－Ｄ－ガラクトサミン（Ｎ－ａｃｅｔｙｌ－Ｄ－ｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ，ＧａｌＮＡｃ）、Ｎ－アセチル－Ｄ－ガラクトース（Ｎ－ａｃｅｔｙｌ－Ｄ－ｇａｌａｃｔｏｓｅ）、Ｄ－ガラクトース（Ｄ－ｇａｌａｃｔｏｓｅ）、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン（Ｎ－ａｃｅｔｙｌ－Ｄ－ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ）、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン、Ｄ－グルコース、Ｄ－マンノース、Ｌ－フコース、炭水化物誘導体、葉酸（ｆｏｌａｔｅ）、トランスフェリン（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ）、ＲＧＤペプチド、サイクリックＲＧＤペプチド、ＴＡＴペプチド、Ｒ９ペプチド、ＣＡＤＹペプチド、ＨＡ２ペプチド、モノクローナル抗体、抗原結合断片（ａｎｔｉｇｅｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｆｒａｇｍｅｎｔ）又は抗体断片、一本鎖可変断片（ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ．ｓｃＦｖ）及びアプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項２１に記載の脂質ナノ粒子の製造方法。

【請求項23】

前記ポリエチレングリコールモイエティ（ＰＥＧ ｍｏｉｅｔｙ）－分解可能官能基－脂質（ｌｉｐｉｄ）コンジュゲートは、化学式３で表されることを特徴とする、請求項１８に記載の脂質ナノ粒子の製造方法。

【化9】

化学式３で、ｎは２～１２０の整数である。

【請求項24】

前記ポリエチレングリコールモイエティ（ＰＥＧ ｍｏｉｅｔｙ）－分解可能官能基－脂質（ｌｉｐｉｄ）コンジュゲートは、化学式４で表されることを特徴とする、請求項１８に記載の脂質ナノ粒子の製造方法。

【化10】

化学式４で、ｎは、２～１２０の整数である。

【請求項25】

前記ポリエチレングリコールモイエティ（ＰＥＧ ｍｏｉｅｔｙ）－分解可能官能基－脂質（ｌｉｐｉｄ）コンジュゲートは、化学式１においてａが０である化合物とａが１である化合物との混合物であることを特徴とする、請求項２０に記載の脂質ナノ粒子の製造方法。

【請求項26】

前記ａが０である化合物とａが１である化合物のモル比は、０．０１～９９．９：０．０１～９９．９であることを特徴とする、請求項２５に記載の脂質ナノ粒子の製造方法。

【請求項27】

前記脂質ナノ粒子において前記ポリエチレングリコールモイエティの含有量は、脂質ナノ粒子を構成する全脂質成分の０．５～５０モル％であることを特徴とする、請求項１８に記載の脂質ナノ粒子の製造方法。

【請求項28】

前記脂質ナノ粒子のサイズは、２０～２００ｎｍであることを特徴とする、請求項１８に記載の脂質ナノ粒子の製造方法。

【請求項29】

前記イオン化脂質は、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル４－（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）、［（４－ヒドロキシブチル）アザンジイル］ジ（ヘキサン－６，１－ジイル）ビス（２－ヘキシルデカノエート）（ＡＬＣ－０３１５）、８－［（２－ヒドロキシエチル）［６－オキソ－６－（ウンデシルオキシ）ヘキシル］アミノ］－オクタン酸（ＳＭ－１０２）、１－リノレオイル－２－リノレイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－２－ＤＭＡＰ）、１，２－ジリノレイルカルバモイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－Ｃ－ＤＡＰ）、１，２－ジリノレオイル－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－ＤＡＰ）、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－（２－ジメチルアミノエチル）－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、１，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）、Ｎ，Ｎ－ジメチル－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）、ジオクタデシルアミドグリシルカルボキシスペルミン（ＤＯＧＳ）、スペルミンコレステリルカルバメート（ＧＬ－６７）；ビス－グアニジニウム－スペルミジン－コレステロール（ＢＧＴＣ）、３β－（Ｎ－（Ｎ’，Ｎ’－ジメチルアミノエタン）－カルバモイル）コレステロール（ＤＣ－Ｃｈｏｌ）、１，１’－（２－（４－（２－（（２－（ビス（２－ヒドロキシデシル）アミノ）エチル）（２－ヒドロキシデシル）アミノ）エチル）ピペラジン－１－イル）エチルアザンジイル）ジドデカン－２－オール（Ｃ１２－２００）、Ｎ－ｔ－ブチル－Ｎ’－テトラデシルアミノ－プロピオンアミジン（ジＣ１４－アミジン）；ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ－（１，２－ジミリスチルオキシプロプ－３－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）、Ｎ，Ｎ－ジオレイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、ジオレイルオキシプロピル－３－ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＯＲＩＥ）、Ｎ－（１－（２，３－ジオレイルオキシル）プロピル）－Ｎ－２－（スペルミンカルボキサミド）エチル）－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）、１，２－ジオレオイルトリメチルアンモニウムプロパンクロリド（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ－（１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、及びアミノプロピル－ジメチル－ビス（ドデシルオキシ）－プロパンアミニウムブロミド（ＧＡＰ－ＤＬＲＩＥ）からなる群から１種以上選択されることを特徴とする、請求項１８に記載の脂質ナノ粒子の製造方法。

【請求項30】

ステロール脂質と中性脂質をさらに含む、請求項１８に記載の脂質ナノ粒子の製造方法。

【請求項31】

前記ステロール脂質は、コレステロール又はコレステリルエステルであることを特徴とする、請求項３０に記載の脂質ナノ粒子の製造方法。

【請求項32】

前記中性脂質は、リン脂質であることを特徴とする、請求項３０に記載の脂質ナノ粒子の製造方法。

【請求項33】

前記リン脂質は、ＤＯＰＥ（ｄｉｏｌｅｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）、ＤＳＰＣ（ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、ＰＯＰＣ（ｐａｌｍｉｔｏｙｌｏｌｅｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、ＥＰＣ（ｅｇｇ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、ＤＯＰＣ（ｄｉｏｌｅｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、ＤＰＰＣ（ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、ＤＯＰＧ（ｄｉｏｌｅｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ）、ＤＰＰＧ（ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ）、ＤＳＰＥ（ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）、ＰＥ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）、ＤＰＰＥ（ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）、ＤＯＰＥ（１，２－ｄｉｏｌｅｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）、ＰＯＰＥ（１－ｐａｌｍｉｔｏｙｌ－２－ｏｌｅｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）、ＰＯＰＣ（１－ｐａｌｍｉｔｏｙｌ－２－ｏｌｅｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ）、ＤＯＰＳ（１，２－ｄｉｏｌｅｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－［ｐｈｏｓｐｈｏ－Ｌ－ｓｅｒｉｎｅ］）、セラミド（ｃｅｒａｍｉｄｅ）、又はスフィンゴミエリン（ｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎ）及びその混合物からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項３２に記載の脂質ナノ粒子の製造方法。

【請求項34】

前記薬物はペプチド、タンパク質薬物、タンパク質－核酸構造体、及び陰イオン性生体高分子－薬物接合体からなる群から選ばれる１種以上であることを特徴とする、請求項１８に記載の脂質ナノ粒子の製造方法。

【請求項35】

前記核酸は、一本鎖（ｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ）ｓｉＲＮＡ、二本鎖（ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ）ｓｉＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、プラスミド（ｐｌａｓｍｉｄ）、アプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、ｓａＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム（ｒｉｂｏｚｙｍｅ）、ＰＮＡ、及びＤＮＡｚｙｍｅからなる群から選ばれる１種以上であることを特徴とする、請求項３４に記載の脂質ナノ粒子の製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、脂質ナノ粒子及びその製造方法に関し、より詳細には、イオン化脂質（ｉｏｎｉｚａｂｌｅ ｌｉｐｉｄ）とポリエチレングリコール誘導体モイエティ（ＰＥＧ ｍｏｉｅｔｙ）－分解可能連結官能基－脂質（ｌｉｐｉｄ）コンジュゲート（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を含むことにより、生体内副作用を最小化し、ナノ粒子をターゲット細胞に効果的に伝達して薬理効能物質を細胞質に効率的に運搬する、脂質ナノ粒子及びその製造方法に関する。

【0002】

【背景技術】

【0003】

同一の薬物であっても、伝達する方法によって効能は千差万別である。このように、医薬品の副作用を最小化する上にも、効能及び効果を極大化させて必要な量の薬物を効率的に伝達する投与経路と薬の形態を、薬物伝達システム（ＤＤＳ，Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ）という。医薬製剤産業において薬物伝達システムは、新薬開発に立ち並ぶほどの経済的利益を創出できるとともに成功可能性が大きい高付加価値の中核技術であるといえる。

【0004】

薬物伝達システムの中核技術の一つである薬物吸収促進技術に属する難溶性薬物の可溶化技術は、新薬物質の開発コストを低減しながらも医薬品の付加価値を上げ得る最も合理的な方法とされている。特に、韓国のように新薬開発環境が悪い状況では薬物の可溶化技術の開発による改良新薬の開発は、低コストで莫大な付加価値を創出することができる。

【0005】

近年、様々な薬物伝達システムの中でも、遺伝子薬物伝達システムを用いた遺伝子治療法の開発が拡大されつつある傾向である。遺伝子治療法を成功的に且つ安全に行うためには、遺伝子又は遺伝子調節因子を所望の組織に伝達することが重要である。このような遺伝子又は遺伝子調節因子の代表としてｍＲＮＡとｓｉＲＮＡなどを挙げることができる。ｍＲＮＡなどの核酸は、特定タンパク質を発現させる機能を有するので、遺伝的要因によって欠乏しているタンパク質を補完する機能が可能である。のみならず、癌標識子、ウイルスの表面タンパク質を発現させるｍＲＮＡを使用することで、生体内の免疫反応を活性化させる方式の抗ガン剤及びワクチンなどの開発が可能である。また、ｓｉＲＮＡなどの核酸は、生体内で特定タンパク質の発現を抑制させ得る物質で、癌、遺伝病、感染疾病、自己免疫疾患などの治療に重要なツールとして脚光を浴びている。しかし、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡのような核酸は細胞内に直接伝達することが困難であり、血液内で酵素によって分解しやすくなるため、これを克服するための研究が多く行われている。

【0006】

【0007】

陽イオン性リポソーム又は陽イオン性ポリマーベースのナノ粒子の特性及び限界

【0008】

このような物質を効果的に伝達するために、陽イオン性リポソーム及び重合体のような非ウイルス性遺伝子担体が開発され、これは、向上した安定性プロファイル及び重合体伝達体の製造及び操作の容易性により、効果的で安全な遺伝子伝達用の非毒性及び生分解性重合体担体のデザイン及び合成に対する研究を加速化させた。ポリ（Ｌ－リジン）、ポリエチレンイミン（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ）、スターバースト（ｓｔａｒｂｕｒｓｔ）、ポリアミドアミン（ｐｏｌｙａｍｉｄｏａｍｉｎｅ）デンドリーマー及び陽イオン性リポソームなどは陰イオン性のオリゴと結合して独自で自己組立可能であり、プラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）をエンドサイトーシスによって細胞に取り込ませるのに十分に小さな構造で圧縮できることから、非ウイルス性遺伝子伝達体として広く研究されてきた。

【0009】

しかしながら、陽イオン性リポソーム方式又は陽イオン性ポリマーを使用する方式によって製造されたナノ粒子は、治療剤として開発するには適合しないという限界があった。この方式の特徴は、陽イオンのリポソーム又はポリマーを陰イオンのオリゴと混合して静電気的引力による密集方式でナノ粒子を製造するため、安定した粒子を製造するためには、陰イオン電荷量に比して過量の陽イオン物質を使用しなければならない。同じモル比の陽イオンと陰イオンを使用してはナノ粒子が形成されず、少なくは数倍から多くは数十倍の陽イオンを過量で使用することになる。このため、このような方式で製造されたナノ粒子は、陰イオンとの相互作用によって中和して残った陽イオンがナノ粒子に相変らず過量で存在するため、生成されたナノ粒子は陽イオン電荷を常時維持する。しかし、陽性電荷を帯びるナノ粒子は、生体内で免疫細胞を含む様々な細胞との不要な相互作用によって副作用を誘発するという短所が広く知られており、このようなナノ粒子を用いて治療剤を開発することは困難である。

【0010】

【0011】

イオン化脂質を使用する脂質ナノ粒子の特性及びその製造方法

【0012】

近年、このような陽イオン性ナノ粒子の短所を克服する非ウイルス性遺伝子伝達体として新しい形態の脂質ナノ粒子を用いて効果的な治療剤が開発された（非特許文献１～９）。脂質ナノ粒子は、生体内に存在する物質であるリン脂質とコレステロールなどを使用するため、生体利用率及び親和度が高く、薬物の放出及び制御が可能であり、酵素などによる分解に対して高い安定性を有する粒子性薬物伝達体である。特に、このような脂質ナノ粒子が既存の陽イオン性ナノ粒子と区別される本質的な差異点は、イオン化脂質を構成成分として含むことであるといえる。イオン化脂質は、酸性ｐＨでは陽イオン状態であるが、中性ｐＨでは電気的に中性状態を維持する特徴がある。したがって、イオン化脂質を用いて製造されたナノ粒子は、中性ｐＨ状態の血流において電気的に中性状態であるため、陽イオン性ポリマー又は陽イオン性リポソームの陽イオン性質によって発生する生体内の副作用を画期的に除去できる。

【0013】

もう一つの差異点は脂質ナノ粒子の製造方法にある。より具体的に脂質ナノ粒子の製造方法について述べると、次の通りである。脂質ナノ粒子は、有機相に溶解された脂質成分とバッファ水溶液に溶解されたオリゴを混合する方式で製造する。有機相と水溶液が混合されながら溶媒の極性が変わるため、有機相に含まれた脂質成分は、混合溶液相で独自で粒子を形成する。この時、有機相に含まれたイオン化脂質が、オリゴを含む酸性条件のバッファ水溶液と混合されると、イオン化脂質が陽イオン状態に転移するので、陽イオンのイオン化脂質と陰イオンのオリゴとが静電気的引力によって結合しつつオリゴを含入したナノ粒子を形成する。

【0014】

イオン化脂質を使用する脂質ナノ粒子のさらに他の特徴は、ナノ粒子を製造する際に、ナノ粒子凝集防止用脂質を有機相に含めて製造するということである。凝集防止用脂質は、脂質成分と親水性の物質とが結合した形態の分子構造を有する。親水性物質としては、炭水化物、タンパク質などの生物学的物質を使用することができ、ポリオール、ＰＥＧなどの合成物質を使用できるが、代表的には、ＰＥＧ－脂質コンジュゲート形態の物質を使用する。ＰＥＧ－脂質コンジュゲート物質において脂質成分は疎水性であるため、脂質ナノ粒子を形成する際に粒子の内部に向かうし、ＰＥＧ部分は親水性であるため、脂質ナノ粒子の表面に位置して粒子の外部に向かう（非特許文献１１及び１２）。万一、この過程でナノ粒子の表面を構成するＰＥＧ－脂質コンジュゲートのような粒子凝集防止用脂質を構成成分として含めないと、ナノ粒子が互いに持続して凝集する現象が発生する。このため、ナノ粒子を比較的均一なサイズに製造することが非常に難しく、不均一なナノ粒子によって効能も期待し難い。

【0015】

凝集防止用脂質の親水性物質として代表的にＰＥＧを使用する他の理由は、脂質ナノ粒子の表面を構成するＰＥＧが脂質ナノ粒子の生物学的特性にも影響を及ぼすためである。一般に、ナノ粒子を生体内に注入すると、血流中のタンパク質、脂質、免疫成分との吸着による大食細胞の食作用によって損失するなどの短所がある。このような短所を克服するために、生体親和性に優れた親水性高分子であるＰＥＧを表面に修飾することが知られている（米国登録特許ＵＳ９，９９９，６７３ Ｂ２号；韓国公開特許第１０－２０１８－００３２６５２号公報、ＷＯ ２０２０／０６１２８４）。ＰＥＧは、生体に副作用がなく、容易に脂質ナノ粒子及びその他の薬物伝達体に適用できることから、最も代表的に用いられている（非特許文献１０）。

【0016】

【0017】

ＰＥＧ－脂質コンジュゲート使用の短所及び既存解決方案の限界点

【0018】

ＰＥＧは、脂質ナノ粒子の製造過程において必須の構成成分であるとともに、生体内でナノ粒子と他の物質との非特異的相互作用を抑制することによって多くの副作用を軽減させ得るという明確な長所があるが、根本的な限界を持っている。ＰＥＧが生体内でナノ粒子と他の生体構成物質との非特異的相互作用を減少させるということは、結局としてナノ粒子とターゲット細胞との相互作用も抑制する結果を招く。このため、ＰＥＧは、ナノ粒子をターゲット細胞中に伝達することを難しくし、その結果、薬理効率も顕著に低下させる（非特許文献１３～１５）。

【0019】

ＰＥＧがナノ粒子とターゲット細胞との相互作用を抑制させており、この問題を解決するために、２つの方法が考案されている。第一の方法は、ナノ粒子が生体内に注入された後にＰＥＧを脂質ナノ粒子から分離されるようにする方法である。一般に、ＰＥＧ－脂質コンジュゲートの脂質成分は２本の脂肪酸で構成されるが、脂肪酸を構成する炭素の個数を少なくして脂肪酸の疎水性の性質を減少させると、ナノ粒子が生体内で循環する間にナノ粒子からＰＥＧ－脂質コンジュゲートが分離され、容易に除去される。結果的に、ＰＥＧによる妨害効果が除去されるため、ナノ粒子の効率を維持できる。万一、脂肪酸を構成する炭素の個数が増加すると、ナノ粒子からＰＥＧ－脂質コンジュゲートが除去されず、効能が減少することが知られている（非特許文献１４～１６）。しかし、このような方式でナノ粒子構成要素であるＰＥＧ－脂質コンジュゲートを除去すると、粒子自体が不安定になって、粒子を構成する他の要素も失われる短所がある（非特許文献１７）。

【0020】

ＰＥＧによって脂質ナノ粒子がターゲット細胞に伝達される効能が低下する問題を解決するための第二の方法は、ＰＥＧの一方の末端に細胞受容体と結合し得るリガンドを連結して使用することである（非特許文献１６）。ＰＥＧ末端のリガンドが特定細胞の受容体と結合するので、リガンドを含むナノ粒子は受容体によって細胞内のエンドソームに伝達され得る。しかし、リガンドを用いてナノ粒子を細胞内のエンドソームまで効果的に伝達できるとしても、薬理効能を発生させるためには、ナノ粒子に含まれている薬理効能物質である核酸などがエンドソームから細胞質内に伝達される必要がある。そのためには脂質ナノ粒子とエンドソーム脂質膜との相互作用による融合過程が必要であるが、ナノ粒子外部を包んでいるＰＥＧがこれを妨害してしまう。結果的に、ＰＥＧの末端にリガンドを付着すると、ターゲット細胞のエンドソーム内にへナノ粒子を伝達することはできるが、エンドソームから細胞質に効能物質を伝達し難いため、効能改善の側面では大きな効果が期待できない（非特許文献１６）。

【0021】

【0022】

ＰＥＧ－分解可能官能基－脂質コンジュゲートのイオン化脂質ナノ粒子への適用

【0023】

エンドソーム内でのＰＥＧによる効能低下を解決するために、通常、エンドソーム内で脂質粒子表面を包んでいるＰＥＧを除去する方法を用いている。エンドソームの内部は、ｐＨが酸性を帯びるので、ＰＥＧを脂質成分と連結する部位に、酸性条件で加水分解され得る官能基を含むようにＰＥＧ－分解可能官能基－脂質コンジュゲート形態の物質を構成要素として含むわけである。これにより、エンドソーム内でナノ粒子の表面を構成するＰＥＧが効果的に除去され得ることが知られている（非特許文献１８及び１９）。

【0024】

しかしながら、酸性条件で分解される分解可能官能基を含むＰＥＧ－分解可能官能基－脂質コンジュゲート形態の物質を構成成分として使用可能なナノ粒子の製造条件は制限的である。なぜなら、ＰＥＧ－分解可能官能基－脂質コンジュゲートの分解可能官能基は酸性条件では不安定であるため、ナノ粒子の製造条件が、中性ｐＨ又はアルカリ性条件で製造するナノ粒子にのみ適用できるためである。ところが、最近に様々なオリゴ別治療剤開発に広く使用している脂質ナノ粒子は、イオン化脂質を構成成分としており、前述したように、イオン化脂質を使用してオリゴ成分を含む脂質ナノ粒子を製造する時には必ず酸性ｐＨで製造しなければならない。このような理由で、イオン化脂質成分を含む脂質ナノ粒子を製造するとき、酸性条件で加水分解される官能基を含む形態、すなわちＰＥＧ－分解可能官能基－脂質コンジュゲートを構成成分として使用することは、本質的に不可能であるとされており、現在まで試みられたことがない。

【0025】

そこで、本発明者らは上記の問題点を解決するために鋭意努力した結果、イオン化脂質成分を一つの構成成分とする脂質ナノ粒子を製造するとき、ポリエチレングリコールモイエティ（ＰＥＧ ｍｏｉｅｔｙ）－分解可能官能基－脂質（ｌｉｐｉｄ）コンジュゲートを使用して粒子を安定して製造できることを確認した。特に、ＰＥＧモイエティ－分解可能官能基－脂質コンジュゲートは、脂質ナノ粒子を製造する酸性条件の工程では安定的に保持されるが、エンドソームの酸性条件では効果的に加水分解されることでエンドソーム脂質膜と脂質ナノ粒子との融合を促進させる役割を担い、その結果としてオリゴ伝達効率を画期的に向上させ、このような脂質ナノ粒子を製造して治療剤として使用する場合に、ナノ粒子の構成成分による生体内副作用を最小化し、ナノ粒子をターゲット細胞に効果的に伝達し、ターゲット細胞内のエンドソームを効率的に脱皮して核酸などの薬理効能物質を細胞質に運搬することに適することを確認し、本発明を完成するに至った。

【0026】

【0027】

【0028】

【先行技術文献】

【特許文献】

【0029】

【特許文献1】米国登録特許第９，９９９，６７３ Ｂ２号公報

【0030】

【特許文献2】韓国公開特許第１０－２０１８－００３２６５２号公報

【0031】

【特許文献3】国際公開特許ＷＯ２０２０／０６１２８４号公報

【0032】

【0033】

【非特許文献】

【0034】

【非特許文献1】Moss, K.H., Popova, P., Hadrup, S.R., Astakhova, K. & Taskova, M. Lipid Nanoparticles for Delivery of Therapeutic RNA Oligonucleotides. Mol Pharm 16, 2265-2277 (2019).

【0035】

【非特許文献2】Kulkarni, J.A., Witzigmann, D., Chen, S., Cullis, P.R. & van der Meel, R. Lipid Nanoparticle Technology for Clinical Translation of siRNA Therapeutics. Acc Chem Res 52, 2435-2444 (2019).

【0036】

【非特許文献3】Buck, J., Grossen, P., Cullis, P.R., Huwyler, J. & Witzigmann, D. Lipid-Based DNA Therapeutics: Hallmarks of Non-Viral Gene Delivery. ACS Nano 13, 3754-3782 (2019).

【0037】

【非特許文献4】Akinc, A. et al.The Onpattro story and the clinical translation of nanomedicines containing nucleic acid-based drugs. Nat Nanotechnol14, 1084-1087 (2019).

【0038】

【非特許文献5】Springer, A.D. & Dowdy, S.F. GalNAc-siRNA Conjugates: Leading the Way for Delivery of RNAi Therapeutics. Nucleic Acid Ther 28, 109-118 (2018).

【0039】

【非特許文献6】Kulkarni, J.A., Cullis, P.R. & van der Meel, R. Lipid Nanoparticles Enabling Gene Therapies: From Concepts to Clinical Utility. Nucleic Acid Ther 28, 146-157 (2018).

【0040】

【非特許文献7】Rietwyk, S. & Peer, D. Next-Generation Lipids in RNA Interference Therapeutics. ACS Nano 11, 7572-7586 (2017).

【0041】

【非特許文献8】Fang, Y. et al.Cleavable PEGylation: a strategy for overcoming the "PEG dilemma" in efficient drug delivery. Drug Deliv 24, 22-32 (2017).

【0042】

【非特許文献9】Cullis, P.R. & Hope, M.J. Lipid Nanoparticle Systems for Enabling Gene Therapies. Mol Ther 25, 1467-1475 (2017).

【0043】

【非特許文献10】Kumar, V. et al.Shielding of Lipid Nanoparticles for siRNA Delivery: Impact on Physicochemical Properties, Cytokine Induction, and Efficacy. Mol Ther Nucleic Acids 3, e210 (2014).

【0044】

【非特許文献11】Belliveau, N.M. et al.Microfluidic Synthesis of Highly Potent Limit-size Lipid Nanoparticles for In Vivo Delivery of siRNA. Mol Ther Nucleic Acids 1, e37 (2012).

【0045】

【非特許文献12】Sato, Y. et al.Elucidation of the physicochemical properties and potency of siRNA-loaded small-sized lipid nanoparticles for siRNA delivery. J Control Release 229, 48-57 (2016).

【0046】

【非特許文献13】Bao, Y. et al.Effect of PEGylation on biodistribution and gene silencing of siRNA/lipid nanoparticle complexes. Pharm Res 30, 342-51 (2013).

【0047】

【非特許文献14】Mui, B.L. et al. Influence of Polyethylene Glycol Lipid Desorption Rates on Pharmacokinetics and Pharmacodynamics of siRNA Lipid Nanoparticles. Mol Ther Nucleic Acids2, e139 (2013).

【0048】

【非特許文献15】Chen, S. et al.Development of lipid nanoparticle formulations of siRNA for hepatocyte gene silencing following subcutaneous administration. J Control Release 196, 106-12 (2014).

【0049】

【非特許文献16】Akinc, A. et al.Targeted delivery of RNAi therapeutics with endogenous and exogenous ligand-based mechanisms. Mol Ther 18, 1357-64 (2010).

【0050】

【非特許文献17】Chen, S. et al.Influence of particle size on the in vivo potency of lipid nanoparticle formulations of siRNA. J Control Release235, 236-244 (2016).

【0051】

【非特許文献18】Bargh, J.D., Isidro-Llobet, A., Parker, J.S. & Spring, D.R. Cleavable linkers in antibody-drug conjugates. Chem Soc Rev 48, 4361-4374 (2019).

【0052】

【非特許文献19】Zhao, G. et al. Smart pH-sensitive nanoassemblies with cleavable PEGylation for tumor targeted drug delivery. Sci Rep 7, 3383 (2017).

【0053】

【0054】

【発明の概要】

【0055】

本発明の目的は、ナノ粒子の構成成分による生体内副作用を最小化し、ナノ粒子をターゲット細胞に効果的に伝達し、ターゲット細胞内のエンドソームを脱皮して核酸などの薬理効能物質を細胞質に効率的に運搬する脂質ナノ粒子を提供することにある。

【0056】

上記の目的を達成するために、本発明は、（ａ）イオン化脂質及びポリエチレングリコールモイエティ（ＰＥＧ ｍｏｉｅｔｙ）－分解可能官能基－脂質（ｌｉｐｉｄ）コンジュゲートを含む脂質配合物；及び、（ｂ）前記脂質配合物内に封入された薬物、核酸又はこれらの組合せを含む、脂質ナノ粒子を提供する。

【0057】

本発明は、また、（ａ）イオン化脂質及びポリエチレングリコールモイエティ（ＰＥＧ ｍｏｉｅｔｙ）－分解可能官能基－脂質（ｌｉｐｉｄ）コンジュゲートを含む脂質配合物を含有する有機溶液と、薬物、核酸又はその組合せを含有するバッファ溶液とを混合して、ｐＨを調整する段階；及び、（ｂ）前記混合溶液の溶媒を除去する段階を含む、前記脂質ナノ粒子の製造方法を提供する。

【0058】

【図面の簡単な説明】

【0059】

【図1】本発明の一実施例によって、ＰＥＧ２Ｋ－Ｈｚ－ＤＳＧ又はＰＥＧ２Ｋ－ＰＥ－ＤＳＧを、ナノ粒子構成全脂質に対して１、２、５モル％を含む脂質ナノ粒子を製造し、ＤＬＳでサイズを測定したグラフ（Ａ）及びこれを数値化したグラフ（Ｂ）である。

【0060】

【図2】本発明の一実施例によって、脂質ナノ粒子にルシフェラーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）をターゲットとするｓｉＲＮＡ含めて製造し、ルシフェラーゼを常時発現する細胞に処理し、ルシフェラーゼ発現抑制効能を測定したグラフである。ＡはＰＥＧ２Ｋ－Ｈｚ－ＤＳＧ又はＰＥＧ２Ｋ－ＰＥ－ＤＳＧを、ＢはＰＥＧ１Ｋ－Ｈｚ－ＤＳＧ又はＰＥＧ１Ｋ－ＰＥ－ＤＳＧをそれぞれ１、２、５モル％を含む脂質ナノ粒子を使用し、Ｃは、ＰＥＧ６００－Ｈｚ－ＤＳＧを１、２、５、１０、２０、３０、４０モル％を含む脂質ナノ粒子を使用して測定したグラフである。

【0061】

【図3】本発明の一実施例によって、脂質ナノ粒子に含まれたＰＥＧ含有量が細胞のアップテーク（ｕｐｔａｋｅ）効率に及ぼす影響を測定した図である。Ａは、ＰＥＧ－ＤＭＧを全脂質に対して２、５、１０モル％比率の含有量別に含む脂質ナノ粒子を使用して細胞アップテーク効率を流細胞分析機（ＦＡＣＳ）で分析した図であり、Ｂは、ＰＥＧ－ＤＭＧをそれぞれ０、０．１、０．２、０．５、１、２、５、１０モル％含むナノ粒子にルシフェラーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）をターゲットとするｓｉＲＮＡ含めて製造し、ルシフェラーゼを常時発現する細胞に処理してルシフェラーゼ発現抑制効能を測定したグラフである。Ｃ、Ｄは、ＰＥＧ－ＤＭＧ又はＰＥＧ６００－Ｈｚ－ＤＳＧをそれぞれ１、２、５、１０モル％含む脂質ナノ粒子を製造し、互いに異なる細胞株でルシフェラーゼ発現抑制効能を測定したグラフであり、Ｅ、Ｆは、ＥＣ５０を求めた資料である。

【0062】

【図4】本発明の一実施例によって、ＰＥＧ－ＤＭＧ １．５モル％（Ａ）又はＰＥＧ６００－Ｈｚ－ＤＳＧ １０モル％（Ｂ）を含む脂質ナノ粒子のサイズを酸性条件で時間別に測定した資料である。

【0063】

【図5】本発明の一実施例によって、ＰＥＧ６００－Ｈｚ－ＤＳＧを５又は１０モル％含む脂質ナノ粒子を製造し、ｐＨ４又は７で前処理後に細胞株に処理してルシフェラーゼ発現抑制効能を測定したグラフである。

【0064】

【図6】本発明の一実施例によって、それぞれＰＥＧ６００－Ｈｚ－ＤＳＧ、ＰＥＧ６００－Ｅｓｔｅｒ－ＤＳＧ、又はＰＥＧ６００－ＰｈＨｚ－ＤＳＧを１、２、５、１０モル％含む脂質ナノ粒子を製造して細胞株に処理し、ルシフェラーゼ発現抑制効能を測定したグラフ（Ａ）と、当該脂質ナノ粒子のサイズを中性又は酸性条件で測定した資料（Ｂ）である。

【0065】

【図7】本発明の一実施例によって、ＰＥＧ６００－Ｈｚ－ＤＳＧ １０モル％又はＰＥＧ－ＤＭＧ １．５モル％と蛍光染料を含む脂質ナノ粒子を製造し、該当のｐＨ条件でリポソーム脂質膜との融合強度を測定した資料（Ａ）と、ＧａｌＮＡｃ－ＰＥＧ６００－Ｈｚ－ＤＳＧ又はＰＥＧ－ＤＭＧを５又は１０モル％含有する脂質ナノ粒子を使用してｐＨ４．５とｐＨ７．４条件で溶血反応（ｈｅｍｏｌｙｓｉｓ）を測定した資料（Ｂ）である。

【0066】

【図8】本発明の一実施例によって、ＰＥＧ－ＤＭＧを全脂質に対して各１．５モル％、５モル％を含む脂質ナノ粒子とＧａｌＮＡｃ－ＰＥＧ２Ｋ－Ｈｚ－ＤＳＧを全脂質に対して５モル％を含む脂質ナノ粒子を製造する時にＦＲＥＴ蛍光染料を含めて製造し、これをラットの血漿に担持して、ナノ粒子に含まれた蛍光強度変化を時間別に測定した資料である。

【0067】

【図9】ＧａｌＮＡｃ－ＰＥＧ６００－Ｈｚ－ＤＳＧを１０モル％含む脂質ナノ粒子を、ラットから分離した末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）と混合し、サイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）の相対的発生量をｑ－ＰＣＲで分析した資料である。

【0068】

【図10】本発明の一実施例によって、ＰＥＧ２Ｋ－ＰＥ－ＤＳＧ又はＰＥＧ２Ｋ－Ｈｚ－ＤＳＧを含む脂質ナノ粒子をマウスに投与し、血清のＦａｃｔｏｒ ７の含有量を測定した資料である。

【0069】

【図11】本発明の一実施例によって、ＰＥＧ６００－Ｈｚ－ＤＳＧ １０モル％又はＰＥＧ６００－Ｈｚ－ＤＳＧ ９．５モル％とＧａｌＮＡｃ－ＰＥＧ２Ｋ－Ｈｚ－ＤＳＧ ０．５モル％混合脂質を含む脂質ナノ粒子をマウスに投与し、血清のＦａｃｔｏｒ ７の含有量を測定した資料である。

【0070】

【図12】本発明の一実施例によって、ＰＥＧ－ＤＭＧ又はＰＥＧ－Ｈｚ－ＤＳＧを含む脂質ナノ粒子を各細胞株に処理し、細胞株の相対的生存率を測定した資料である。

【0071】

【0072】

【発明を実施するための形態】

【0073】

特に断らない限り、本明細書で使われる全ての技術的及び科学的用語は、本発明の属する技術の分野における熟練した専門家によって通常理解されるのと同じ意味を有する。一般に、本明細書における命名法及び以下に記述する実験方法は、本技術分野でよく知られており、通常用いられるものである。

【0074】

【0075】

本発明は、化学式１のポリエチレングリコール誘導体モイエティ－分解可能官能基－脂質とイオン化脂質を構成成分として含む脂質ナノ粒子を製造して治療剤として使用する場合に、ナノ粒子の構成成分による生体内副作用を最小化し、ナノ粒子をターゲット細胞に効果的に伝達し、ターゲット細胞内のエンドソームを効率的に脱皮して核酸などの薬理効能物質を細胞質に運搬するのに適合することを確認した。

【0076】

したがって、本発明は、一観点において、（ａ）イオン化脂質及びポリエチレングリコールモイエティ（ＰＥＧ ｍｏｉｅｔｙ）－分解可能官能基－脂質（ｌｉｐｉｄ）コンジュゲートを含む脂質配合物；及び、（ｂ）前記脂質配合物内に封入された薬物、核酸又はこれらの組合せを含む、脂質ナノ粒子に関する。

【0077】

【0078】

本発明は、他の観点において、また、（ａ）イオン化脂質及びポリエチレングリコールモイエティ（ＰＥＧ ｍｏｉｅｔｙ）－分解可能官能基－脂質（ｌｉｐｉｄ）コンジュゲートを含む脂質配合物を含有する有機溶液と、薬物、核酸又はその組合せを含有するバッファ溶液とを混合して、ｐＨを調整する段階；及び、（ｂ）前記混合溶液の溶媒を除去する段階を含む、前記脂質ナノ粒子の製造方法に関する。

【0079】

【0080】

以下、本発明を詳細に説明する。

【0081】

本願に使われる用語、「ポリエチレングリコール」、「ＰＥＧ」、「ＰＥＧモイエティ」及び「ＰＥＧ誘導体は、ポリエチレングリコールに該当する官能基を含むもので、互いに置換可能な概念で使われてよい。本願において特に表示されないか又は文脈において明確に矛盾しない限り、全ての可能な変形において前述の要素の組合せが含まれる。

【0082】

本発明に係る脂質ナノ粒子は、（ａ）イオン化脂質及びＰＥＧモイエティ－分解可能官能基－脂質コンジュゲートを含む脂質配合物；及び、（ｂ）前記脂質配合物内に封入された薬物、核酸又はこれらの組合せを含む。

【0083】

本発明において、前記ＰＥＧモイエティ－分解可能官能基－脂質コンジュゲートは、化学式１で表示されてよい。

【0084】

［化学式１］

【0085】

【0086】

化学式１で、

【0087】

ａは、０又は１であり、

【0088】

Ｌは、ターゲッティングリガンド（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｌｉｇａｎｄ）であり、

【0089】

Ｍは、Ｈ、ＯＨ、単結合、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、ＮＨＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＯＣ（Ｏ）又はＣ（Ｏ）Ｏであり、

【0090】

Ｐは、ＣＨ_２Ｏ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）ｑＣＨ_２又はＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）ｑＣＨ_２であり、ここで、ｑは、２～１２０の整数であり、

【0091】

Ｌ_６は、Ｃ（Ｏ）ＮＨ－Ｎ＝ＣＲ_４、Ｒ_４Ｃ＝Ｎ－ＮＨＣ（Ｏ）、ＮＨ－Ｎ＝ＣＲ_４、Ｒ_４Ｃ＝Ｎ－ＮＨ、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、Ｏ－Ｎ＝ＣＲ_４、Ｒ_４Ｃ＝Ｎ－Ｏ、Ｓ－Ｓ、Ｓ又はｔｒａｎｓ－シクロオクテン（ｔｒａｎｓ－ｃｙｃｌｏｏｃｔｅｎｅ）、

【0092】

又は、

であり、ここで、Ｒ_４はＨ、Ｃ_１－Ｃ_２０アルキル、Ｃ_２－Ｃ_２０アルケニル、Ｃ_２－Ｃ_２０アルキニル、Ｃ_３－Ｃ_１０シクロアルキル、Ｃ_６－Ｃ_２０アリール、又はフッ素、酸素、硫黄及び窒素の中から選ばれるヘテロ原子を含有するラジカルであるヘテロサイクルであり、Ｚは、ＮＨ、Ｏ又はＳであり、ｄは、１～１０の整数であり、ｅは、１～１０の整数であり、

【0093】

Ｔは、単結合又は１，４－Ｃ_６Ｈ_４Ｏ－であり、

【0094】

Ｒ_１及びＲ_３はそれぞれ独立に－Ｙ－Ｒであり、Ｒ_２は、－ＣＨ_２－Ｙ－Ｒであり、ここで、Ｙは、単結合、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、又はＮＨＣ（Ｏ）であり、Ｒは、Ｈ、Ｃ_１０～Ｃ_２０アルキル、アルケニル又はステロールである。

【0095】

【0096】

また、本発明は、ＰＥＧモイエティ－分解可能官能基－脂質コンジュゲートの一方の末端にリガンドを含んでよい。

【0097】

前記ＰＥＧモイエティ－分解可能官能基－脂質コンジュゲートのリガンド（Ｌ）は、下記化学式２で表示されてよい。

【0098】

［化学式２］

【0099】

【0100】

化学式２で、

【0101】

ａ、ｂ及びｃは０又は１であるが、ａ、ｂ及びｃのうち一つ以上は必ず１であり、

【0102】

Ｘ_１、Ｘ_２及びＸ_３は、ターゲッティングリガンドであり、

【0103】

Ｌ_１、Ｌ’_１及びＬ”_１は、単結合、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、ＮＨＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＯＣ（Ｏ）又はＣ（Ｏ）Ｏであり、

【0104】

Ｌ_２、Ｌ’_２及びＬ”_２は、（ＣＨ_２）_ｎ又は（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｍであり、ここで、ｎは、１～２０の整数であり、ｍは、１～１０の整数であり、

【0105】

Ｌ_３、Ｌ^’ _３及びＬ^” _３は、単結合、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、ＮＨＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＯＣ（Ｏ）又はＣ（Ｏ）Ｏであり、

【0106】

Ｌ_４、Ｌ’_４及びＬ”_４は、（ＣＨ_２）_ｎであり、ここで、ｎは、１～２０の整数であり、

【0107】

Ｌ_５、Ｌ’_５及びＬ”_５は、単結合、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、ＮＨＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＯＣ（Ｏ）又はＣ（Ｏ）Ｏである。

【0108】

本発明において、前記Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３は、Ｎ－アセチル－Ｄ－ガラクトサミン（Ｎ－ａｃｅｔｙｌ－Ｄ－ｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ，ＧａｌＮＡｃ）、Ｎ－アセチル－Ｄ－ガラクトース（Ｎ－ａｃｅｔｙｌ－Ｄ－ｇａｌａｃｔｏｓｅ）、Ｄ－ガラクトース（Ｄ－ｇａｌａｃｔｏｓｅ）、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン（Ｎ－ａｃｅｔｙｌ－Ｄ－ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ）、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン、Ｄ－グルコース、Ｄ－マンノース、Ｌ－フコース、炭水化物誘導体、葉酸（ｆｏｌａｔｅ）、トランスフェリン（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ）、ＲＧＤペプチド、サイクリックＲＧＤペプチド、ＴＡＴペプチド、Ｒ９ペプチド、ＣＡＤＹペプチド、ＨＡ２ペプチド、モノクローナル抗体、抗原結合断片（ａｎｔｉｇｅｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｆｒａｇｍｅｎｔ）又は抗体断片、一本鎖可変断片（ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ，ｓｃＦｖ）及びアプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）からなる群から選ばれてよい。ここで、抗体の抗原結合断片又は抗体断片は、抗原結合機能を保有している断片を意味し、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖなどを含む。

【0109】

本発明において、リガンドとして使用可能な抗体の例示には、ａｎｔｉ－ＣＤ３、ａｎｔｉ－ＣＤ１９、ａｎｔｉ－ＣＤ２０、ａｎｔｉ－ＣＤ２２、ａｎｔｉ－ＣＤ３３、ａｎｔｉ－ＣＤ３８、ａｎｔｉ－ＣＤ５４、ａｎｔｉ－ＣＤ７４、ａｎｔｉ－ＣＤ１３８、ａｎｔｉ－ＣＤ１６６、ａｎｔｉ－ＣＤ２０９、ａｎｔｉ－ｃＭＥＴ、ａｎｔｉ－ＥＧＦＲ、ａｎｔｉ－ＨＥＲ２、ａｎｔｉ－ＨＩＶ－ｇｐ１２０、ａｎｔｉ－ＨＬＡ－ＤＲ、ａｎｔｉ－ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＴｆＲｓｃＦｖ）などがあるが、これに限定されるものではない。

【0110】

本発明において、前記ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）モイエティ－分解可能官能基－脂質（ｌｉｐｉｄ）コンジュゲートは、好ましくは、下記化学式３（ＰＥＧ－Ｈｚ－ｌｉｐｉｄ）で表示されてよい。

【0111】

［化学式３］

【0112】

【0113】

化学式３で、ｎは、２～１２０の整数である。

【0114】

本発明において、前記ＰＥＧモイエティ－分解可能官能基－脂質コンジュゲートは、好ましくは、リガンド－ＰＥＧモイエティ－分解可能官能基－脂質コンジュゲート（化学式１で、ａが１である。）であり、より好ましくは、化学式４（ＧａｌＮＡｃ－ＰＥＧ－Ｈｚ－Ｌｉｐｉｄ）で表示されてよい。

【0115】

［化学式４］

【0116】

【0117】

化学式４で、ｎは、２～１２０の整数である。

【0118】

【0119】

本発明において、前記ポリエチレングリコールモイエティ組成として、ＰＥＧモイエティ－分解可能官能基－脂質コンジュゲート（化学式１で、ａが０である。）とリガンド－ＰＥＧモイエティ－分解可能官能基－脂質コンジュゲート（化学式１で、ａが１である。）との混合物を使用することができる。

【0120】

本発明において、化学式１でａが０である化合物とａが１である化合物のモル比は、（０．０１～９９．９）：（０．０１～９９．９）、好ましくは（５０～９９．９）：（０．０１～５０）、より好ましくは（７０～９９）：（１～３０）、最も好ましくは（９０～９５）：（５～１０）であってよい。すなわち、前記リガンド－ＰＥＧモイエティ－分解可能官能基－脂質コンジュゲートは、リガンド－ＰＥＧモイエティ－分解可能官能基－脂質コンジュゲートとＰＥＧモイエティ－分解可能官能基－脂質コンジュゲート混合物の０．０１～１００モル％、好ましくは０．０１～２０モル％、より好ましくは５～１０モル％を構成できる。このとき、リガンド－ＰＥＧモイエティ－分解可能官能基－脂質コンジュゲートは、結合されるリガンドによって変わってよい。本発明の実施例に使用したＮ－アセチル－Ｄ－ガラクトサミン（Ｎ－ａｃｅｔｙｌ－Ｄ－ｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ，ＧａｌＮＡｃ）は、その量（５～１０モル％）を少なく含めて使用しても脂質ナノ粒子の効能を示すことができる。

【0121】

本発明において、前記脂質ナノ粒子のサイズは、２０～２００ｎｍ、好ましくは３０～２００ｎｍであってよい。

【0122】

本発明に係るＰＥＧモイエティ－分解可能官能基－脂質コンジュゲートにおいてＰＥＧモイエティの構造的な特徴は次の通りである。

【0123】

１．ＰＥＧモイエティは、１００～５０００の分子量を有し、単一又は分岐状の化学構造を有する。前記ＰＥＧモイエティの含有量は、脂質ナノ粒子を構成する全脂質成分の０．５～５０モル％、好ましくは０．５～４０モル％、より好ましくは０．５～３０モル％であってよい。前記ＰＥＧモイエティの含有量が０．５モル％未満である場合には、脂質ナノ粒子を製造するとき、均一なサイズのナノ粒子が得難い点と、ナノ粒子を構成する他の脂質成分が表面に露出されて非特異的な相互作用を誘発し易い問題点があり、５０モル％を超える場合には、ＰＥＧモイエティ－分解可能官能基－脂質コンジュゲート成分が脂質ナノ粒子に含まれずに独立したミセル（ｍｉｃｅｌｌｅ）を形成する問題点がある。また、ＰＥＧ分子量と脂質ナノ粒子含有量は、互いに逆の相関関係にある。５０００付近の大きい分子量のＰＥＧを使用する場合に、脂質ナノ粒子に含まれる含有量は２０モル％以下であるが、ＰＥＧ分子量が１００である場合は、脂質ナノ粒子に含まれる含有量が５０モル％まで増加させることが可能である。分子量のサイズが増加するほど、ＰＥＧによる立体妨害効果（ｓｔｅｒｉｃ ｅｆｆｅｃｔ）によって均一な脂質ナノ粒子の形成がし難く、その上、親水性であるＰＥＧ部分が疎水性である脂質部分に比べてより増加するため、脂質ナノ粒子と結合せずに独立したミセルを形成しようとする傾向が強いためである。

【0124】

２．ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）モイエティ－分解可能官能基－脂質（ｌｉｐｉｄ）コンジュゲートの一部又は全部を、ＰＥＧモイエティの一方の末端に、細胞の受容体に結合可能なリガンドと結合して使用することができる。リガンドは、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ａｃｅｔｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ）、グルコース（ｇｌｕｃｏｓｅ）、マンノース（ｍａｎｎｏｓｅ）、フコース（ｆｕｃｏｓｅ）などから構成された糖又は炭水化物の形態、ＲＧＤなどを含むペプチド形態、葉酸（ｆｏｌａｔｅ）などの小さい分子形態、アプタマーなどの核酸形態、抗体又は抗原認識部分抗体などのタンパク質形態などで特定細胞に発現している受容体と選択的に結合し得るリガンドを含む。より具体的には、Ｎ－アセチル－Ｄ－ガラクトサミン（Ｎ－ａｃｅｔｙｌ－Ｄ－ｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ，ＧａｌＮＡｃ）、Ｎ－アセチル－Ｄ－ガラクトース（Ｎ－ａｃｅｔｙｌ－Ｄ－ｇａｌａｃｔｏｓｅ）、Ｄ－ガラクトース（Ｄ－ｇａｌａｃｔｏｓｅ）、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン（Ｎ－ａｃｅｔｙｌ－Ｄ－ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ）、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン、Ｄ－グルコース、Ｄ－マンノース、Ｌ－フコース、炭水化物誘導体、葉酸（ｆｏｌａｔｅ）、トランスフェリン（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ）、ＲＧＤペプチド、サイクリックＲＧＤペプチド、ＴＡＴペプチド、Ｒ９ペプチド、ＣＡＤＹペプチド、ＨＡ２ペプチド、モノクローナル抗体、抗原結合断片（ａｎｔｉｇｅｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｆｒａｇｍｅｎｔ）又は抗体断片、一本鎖可変断片（ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ，ｓｃＦｖ）又はアプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）などを含む。

【0125】

３．ＰＥＧモイエティの他方の末端はリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）で連結されるが、リンカーは、特定条件で分解される化学官能基又は生物学的加水分解酵素の基質（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）を含む。例えば、－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－Ｎ＝ＣＲ－、－ＲＣ＝Ｎ－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－、－ＮＨ－Ｎ＝ＣＲ－、－ＲＣ＝Ｎ－ＮＨ－、－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－、－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｎ＝ＣＲ－、－ＲＣ＝Ｎ－Ｏ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｓ－又は－ｔｒａｎｓ－ｃｙｃｌｏｏｃｔｅｎｅ－を含む。ここで、Ｒは、Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、ヘテロサイクルなどである。

【0126】

４．リンカーは、脂肪酸形態の脂質（ｌｉｐｉｄ）又はステロールなどの疎水性物質と連結されている。

【0127】

【0128】

本発明に係る脂質ナノ粒子の構成要素のうちイオン化脂質は、脂質成分と結合されたイオン化可能な化合物で、薬物（例えば、陰イオン性薬物及び／又は核酸）との静電気的相互作用により、前記薬物が脂質ナノ粒子内に高い効率で封入されるようにする役割を担うことができる。イオン化脂質は、中性ｐＨでは中性電荷を帯び、酸性ｐＨでは陽電荷を帯びる。

【0129】

本発明において、前記イオン化脂質は、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル４－（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）、［（４－ヒドロキシブチル）アザンジイル］ジ（ヘキサン－６，１－ジイル）ビス（２－ヘキシルデカノエート）（ＡＬＣ－０３１５）、８－［（２－ヒドロキシエチル）［６－オキソ－６－（ウンデシルオキシ）ヘキシル］アミノ］－オクタン酸（ＳＭ－１０２）、１－リノレオイル－２－リノレイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－２－ＤＭＡＰ）、１，２－ジリノレイルカルバモイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－Ｃ－ＤＡＰ）、１，２－ジリノレオイル－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－ＤＡＰ）、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－（２－ジメチルアミノエチル）－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、１，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）、Ｎ，Ｎ－ジメチル－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）、ジオクタデシルアミドグリシルカルボキシスペルミン（ＤＯＧＳ）、スペルミンコレステリルカルバメート（ＧＬ－６７）；ビス－グアニジニウム－スペルミジン－コレステロール（ＢＧＴＣ）、３β－（Ｎ－（Ｎ’，Ｎ’－ジメチルアミノエタン）－カルバモイル）コレステロール（ＤＣ－Ｃｈｏｌ）、１，１’－（２－（４－（２－（（２－（ビス（２－ヒドロキシデシル）アミノ）エチル）（２－ヒドロキシデシル）アミノ）エチル）ピペラジン－１－イル）エチルアザンジイル）ジドデカン－２－オール（Ｃ１２－２００）、Ｎ－ｔ－ブチル－Ｎ’－テトラデシルアミノ－プロピオンアミジン（ジＣ１４－アミジン）；ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ－（１，２－ジミリスチルオキシプロプ－３－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）、Ｎ，Ｎ－ジオレイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、ジオレイルオキシプロピル－３－ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＯＲＩＥ）、Ｎ－（１－（２，３－ジオレイルオキシル）プロピル）－Ｎ－２－（スペルミンカルボキサミド）エチル）－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）、１，２－ジオレオイルトリメチルアンモニウムプロパンクロリド（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ－（１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、及びアミノプロピル－ジメチル－ビス（ドデシルオキシ）－プロパンアミニウムブロミド（ＧＡＰ－ＤＬＲＩＥ）からなる群から１種以上選択されてよい。

【0130】

好ましくは、化学式５（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）、化学式６（ＡＬＣ－０３１５）又は化学式７（Ｌｉｐｉｄ Ｈ（ＳＭ－１０２））で表される化合物であってよい。

【0131】

［化学式５］

【0132】

【0133】

［化学式６］

【0134】

【0135】

［化学式７］

【0136】

【0137】

【0138】

本発明に係る脂質ナノ粒子は、ステロール脂質と中性脂質をさらに含むことができる。

【0139】

本発明に係る脂質ナノ粒子の構成要素のうち中性脂質は、脂質ナノ粒子内でイオン化脂質及び薬物が相互作用して形成されたコアを包んで保護する役割を担い、ターゲット細胞の脂質二重層と結合して、薬物の細胞内への伝達時に細胞膜通過及びエンドソーム脱出を容易にする。本発明に係る脂質ナノ粒子の構成要素のうち前記中性脂質は、脂質粒子の融合を促進し得るリン脂質又はスフィンゴ脂質（ｓｐｈｉｎｇｏｌｉｐｉｄｓ）であればいずれも使用可能であり、好ましくは、ＤＯＰＥ（ｄｉｏｌｅｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）、ＤＳＰＣ（ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、ＰＯＰＣ（ｐａｌｍｉｔｏｙｌｏｌｅｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、ＥＰＣ（ｅｇｇ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、ＤＯＰＣ（ｄｉｏｌｅｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、ＤＰＰＣ（ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、ＤＯＰＧ（ｄｉｏｌｅｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ）、ＤＰＰＧ（ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ）、ＤＳＰＥ（ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）、ＰＥ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）、ＤＰＰＥ（ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）、ＤＯＰＥ（１，２－ｄｉｏｌｅｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）、ＰＯＰＥ（１－ｐａｌｍｉｔｏｙｌ－２－ｏｌｅｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）、ＰＯＰＣ（１－ｐａｌｍｉｔｏｙｌ－２－ｏｌｅｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ）、ＤＯＰＳ（１，２－ｄｉｏｌｅｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－［ｐｈｏｓｐｈｏ－Ｌ－ｓｅｒｉｎｅ］）、セラミド（ｃｅｒａｍｉｄｅ）、又はスフィンゴミエリン（ｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎ）であってよい。

【0140】

本発明に係る脂質ナノ粒子の構成要素のうちステロール脂質は、脂質ナノ粒子内で脂質充填に形態的側面において堅固性を付与し、ナノ粒子のコア及び表面に分散されてナノ粒子の安定性を向上させる役割を担うが、コレステロール、コレステリルエステルを含むコレステロール誘導体を使用することができる。

【0141】

【0142】

本発明において、前記薬物は、ペプチド、タンパク質薬物、タンパク質－核酸構造体、及び陰イオン性生体高分子－薬物接合体からなる群から選ばれる１種以上であってよい。

【0143】

本発明において、前記核酸は、一本鎖（ｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ）ｓｉＲＮＡ、二本鎖（ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ）ｓｉＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、プラスミド（ｐｌａｓｍｉｄ）、アプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、ｓａＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム（ｒｉｂｏｚｙｍｅ）、ＰＮＡ、及びＤＮＡｚｙｍｅからなる群から選ばれる１種以上であってよい。

【0144】

本発明において、ｓｉＲＮＡは、非アルコール性脂肪肝炎を含む代謝性疾患のＡＣＡＣＡ、ＡＮＧＰＴＬ３、ＡＯＣ３、ＭＡＰ３Ｋ５、ＣＣＲ２、ＣＣＲ５、ＤＧＡＴ２、ＤＰＰ４、ＦＡＳＮ、ＨＳＤ１７Ｂ１３、ＫＨＫ、ＬＧＡＬＳ３、ＬＯＸＬ２、ＭＥＴＡＰ２、ＭＰＣ、ＮＯＸ１、ＮＯＸ４、ＰＮＰＬＡ３、ＳＣＤ、ＳＧＬＴ１、ＳＧＬＴ２などの遺伝子、ウイルス疾患の例としてＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）のＨＢＶ－Ｓ、ＨＢＶ－Ｐ、ＨＢＶ－Ｘなどの遺伝子、ＴＴＲ媒介アミロイド症（ＴＴＲ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｍｙｌｏｉｓｏｓｉｓ）疾患のＴＴＲ遺伝子、急性肝ポルフィリア（Ａｃｕｔｅ ｈｅｐａｔｉｃ ｐｏｒｐｈｙｒｉａｓ）疾患のＡＬＡＳ１遺伝子、原発性水酸過剰尿症（ｐｒｉｍａｒｙ ｈｙｐｅｒｏｘａｌｕｒｉａ）疾患のＨＡＯ１遺伝子、過コレステロール血症（ｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉａ）疾患のＰＣＳＫ９遺伝子、血友病（ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ）のＡＴ遺伝子、補体媒介疾患（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｉｓｅａｓｅ）のＣ５遺伝子、Ａｌｐｈａ－１肝疾患のＡＡＴ遺伝子、高血圧のＡＧＴ遺伝子、Ａｌｐｈａ－１抗トリプシン（ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ）欠乏疾患のＡＡＴ遺伝子、高中性脂質血症（ｈｙｐｅｒｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅｍｉａ）疾患のＡＰＯＣ３遺伝子、高中性脂質血症（ｈｙｐｅｒｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅｍｉａ）疾患のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子、心血管疾患のＬＡ遺伝子、特発性肺線維化症疾患のＨＳＰ４７遺伝子、原発性水酸過剰尿症（ｐｒｉｍａｒｙ ｈｙｐｅｒｏｘａｌｕｒｉａ）疾患のＬＤＨＡ遺伝子、気候性及びケロイド瘢痕疾患のＣＴＧＦ、癌疾患のＣＴＮＮＢ１、ＨＳＰ９０、ＫＲＡＳ、ＥＰＨＡ２、ＢＣＬ２Ｌ１２、ＰＫＮ３、ＨＩＦ－２ａｌｐｈａ遺伝子、嚢胞性線維症（ｃｙｓｔｉｃ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）疾患のａｌｐｈａＥＮａＣ遺伝子などをターゲットとするが、これに限定されるものではない。

【0145】

本発明において、前記ｍＲＮＡは、抗原を発現するｍＲＮＡ使用するワクチン、抗体を発現するｍＲＮＡを使用する免疫治療剤、遺伝子の変異などによる欠乏タンパク質を発現するｍＲＮＡ、特定ＤＮＡ遺伝子編集のためのＣＲＩＳＰＲ技術を適用するＣａｓタンパク質及びガイド（ｇｕｉｄｅ）ＲＮＡを発現するｍＲＮＡ及びｓｇＲＮＡなどがある。ワクチン開発のための抗原発現ｍＲＮＡの例示として、狂犬病ワクチンのための狂犬病ウイルスの糖タンパク質（ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）ｍＲＮＡ、呼吸器細胞融合ウイルス（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉｃａｌ ｖｉｒｕｓ）ワクチンの糖タンパク質（ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）ｍＲＮＡ、安定化融合前（ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ ｐｒｅｆｕｓｉｏｎ）Ｆタンパク質ｍＲＮＡ、ジカウイルスワクチンのジカウイルス構造タンパク質ｍＲＮＡ、チクングニアウイルスワクチンのウイルス抗原タンパク質ｍＲＮＡ、巨大細胞ウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）ワクチンのペタメリックウイルス抗体（ｐｅｔａｍｅｒｉｃ ｖｉｒａｌ ａｎｔｉｇｅｎ）、ｇＢタンパク質ｍＲＮＡ、インフルエンザー（ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）ワクチンのＨＡタンパク質ｍＲＮＡ、ＨＩＶワクチンのＴ細胞活性発生のためのＨＩＶ免疫原（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ）タンパク質ｍＲＮＡなどがある。抗ガン剤又は抗癌ワクチン開発のためのｍＲＮＡの例示として、患者由来の特定過発現タンパク質抗原を発現するｍＲＮＡ、前立腺癌のＰＡＰ、ＰＳＡ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＳＴＥＡＰ１などを含む抗原発現ｍＲＮＡ、腎癌（Ｒｅｎａｌ ｃａｎｃｅｒ）のＭＵＣ１、ＣＥＡ、Ｈｅｒ－２ｎｅｕ、テロメラーゼ（ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ）、サバイビン（ｓｕｒｖｉｖｉｎ）、ＭＡＧＥ－Ａ１ｍ ＲＮＡ、黒色腫のＭｅｌａｎ－Ａ、チロシナーゼ（ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ）、ｇｐ１００、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ３、サバイビン（ｓｕｒｖｉｖｉｎ）ｍＲＮＡ、そして様々な固形癌又は血液癌ワクチン又は治療剤としてＩＬ－２３、ＩＬ－３６、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＮＦ－ａｌｐｈａ、ＩＬ－７、ＩＬ－２などを含むサイトカインｍＲＮＡなどがある。また、抗体を発現するｍＲＮＡを用いて生体内で抗体を直接発現するｍＲＮＡの例示として、チクングニアウイルス中和単一クローン（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ）抗体を発現するｍＲＮＡなどが例示されているが、これに限定されるものではない。

【0146】

本発明に係る前記脂質ナノ粒子は、（ａ）イオン化脂質及びポリエチレングリコールモイエティ（ＰＥＧ ｍｏｉｅｔｙ）－分解可能官能基－脂質（ｌｉｐｉｄ）コンジュゲートを含む脂質配合物を含有する有機溶液と、薬物、核酸又はその組合せを含有するバッファ溶液とを混合して、ｐＨを調整する段階；及び、（ｂ）前記混合溶液の溶媒を除去する段階を行うことによって製造されてよい。

【0147】

本発明に係る脂質ナノ粒子は、有機相に溶解された脂質成分とバッファ水溶液に溶解されたオリゴとを混合する方式で製造できる。有機相科水溶液とが混合されながら溶媒の極性が変わるので、有機相に含まれた脂質成分は混合溶液相で独自で粒子を形成する。このとき、有機相に含まれたイオン化脂質が、オリゴを含む酸性条件のバッファ水溶液と混合されると、イオン化脂質が陽イオン状態に転移するので、陽イオンのイオン化脂質と陰イオンのオリゴとが静電気的引力によって結合しながら脂質ナノ粒子内にオリゴを封入したナノ粒子を形成する。

【0148】

本発明に係る脂質ナノ粒子の製造方法において前記有機溶液と前記バッファ溶液の混合比（体積比）は、１：１～１～１００であってよい。

【0149】

【0150】

脂質ナノ粒子に含まれたＰＥＧ含有量による効率

【0151】

脂質ナノ粒子を製造する時に、ＰＥＧ－脂質コンジュゲート成分を１～２モル％の割合で含めて製造するのが一般的である。ＰＥＧを含めずに脂質ナノ粒子を製造すると、生成される粒子同士が互いに凝集する現象が発生してしまい、これを抑制するために、一定量のＰＥＧ－脂質コンジュゲート成分を含めて製造しなければならない。含まれたＰＥＧ－脂質コンジュゲートの脂質部分は、生成されるナノ粒子の内部を構成する疎水性環境に配置され、親水性であるＰＥＧ部分は、粒子の表面に配置されてナノ粒子間の凝集現象を抑制する。一方、ＰＥＧ含有量が多すぎるナノ粒子も、粒子表面に露出されたＰＥＧの立体的（ｓｔｅｒｉｃ）効果によって脂質ナノ粒子と細胞との相互作用を抑制する。その結果、脂質ナノ粒子は細胞中に効果的に伝達されない副作用が発生する。

【0152】

脂質ナノ粒子製造に一般的に多く使用されるＰＥＧ－脂質コンジュゲートであるＰＥＧ－ＤＭＧ（１，２－ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌ－３－ＰＥＧ－ｇｌｙｃｅｒｏｌ）を用いて脂質ナノ粒子を製造すると、ＰＥＧ含有量が増加する場合に、細胞にアップテーク（ｕｐｔａｋｅ）される効率が減少し、ｓｉＲＮＡによるｍＲＮＡ分解能も低下する。しかし、本発明に係るＰＥＧモイエティ－分解可能官能基－脂質コンジュゲートの一部又は全部は、特定細胞に発現した受容体に特異的に結合するリガンドをＰＥＧの一方の末端に含んでいるので、本発明に係るＰＥＧモイエティ－分解可能官能基－脂質コンジュゲートを用いて製造された脂質ナノ粒子は、ＰＥＧモイエティ－分解可能官能基－脂質コンジュゲートの含有量に関係なく細胞のアップテーク効率が高いことが確認できる。すなわち、ＰＥＧの立体的効果による細胞アップテーク阻害を、リガンドを使用して克服できることが分かる。

【0153】

【0154】

脂質ナノ粒子のＰＥＧ除去確認

【0155】

脂質ナノ粒子が核酸などの効能物質を細胞内に伝達して効能を発生させるためには、２段階の伝達過程を経る必要がある。第一に、脂質ナノ粒子が細胞のアップテーク過程によって細胞のエンドソームに進入しなければならない。第二に、効能物質を効果的にエンドソームから脱出させて細胞質に伝達することが必須である。脂質ナノ粒子は、細胞との相互作用によって細胞のエンドソームに取り込まれ、脂質ナノ粒子の脂質成分がエンドソームを構成する脂質膜と融合を進行すると同時に効能物質を細胞質に伝達できるということは広く知られた事実である。ところが、脂質ナノ粒子表面がＰＥＧで包まれていると、エンドソーム脂質膜との相互作用が抑制され、細胞質への伝達が難しくなる。したがって、脂質ナノ粒子表面のＰＥＧは、細胞との相互作用を阻害して脂質ナノ粒子の細胞アップテーク効率を低下させる他、エンドソームに成功的に取り込まれたナノ粒子とエンドソーム脂質膜間の相互作用も妨害する働きをするため、ナノ粒子の効率側面ではＰＥＧは粒子の効率を二重に阻害する要素となる。

【0156】

したがって、エンドソーム脂質膜と脂質ナノ粒子との効果的な相互作用のために、エンドソーム内でＰＥＧを除去することが有利である。しかし、一般的に多く使用するＰＥＧ－ＤＭＧのようなＰＥＧ－脂質コンジュゲートを使用するナノ粒子は、ＰＥＧを除去できる官能基がないため、エンドソーム内でもＰＥＧが粒子表面に相変らず存在することになる。これに対し、本発明で述べるＰＥＧモイエティ－分解可能官能基－脂質コンジュゲートは、ＰＥＧと脂質との間に、酸性条件で加水分解される化学的官能基を含んでいる。例えば、化学式３に提示されたＰＥＧモイエティ－分解可能官能基－脂質コンジュゲートは、２本の脂質とＰＥＧがヒドラゾン（ｈｙｄｒａｚｏｎｅ）官能基（－Ｃ＝ＮＮＨ－）で連結されている。ヒドラゾン官能基は、中性ｐＨでは安定的であるが、酸性条件では加水分解される性質がある。本発明に係るＰＥＧモイエティ－分解可能官能基－脂質コンジュゲートを使用して製造した脂質ナノ粒子のサイズを、酸性条件で時系列変化を観察すれば、ヒドラゾン官能基が加水分解されながら粒子表面のＰＥＧが除去され、粒子を構成する脂質成分の融合現象によってサイズが次第に増加することが分かる。また、粒子間の融合現象は持続して経時進行され、サイズが次第に増加することが分かる。これは、酸性条件でヒドラゾン官能基が成功的に加水分解されて粒子間の融合を触発する現象であり、これはまた、エンドソーム脂質膜とナノ粒子との融合を円滑に誘引する要因としても働く。

【0157】

【0158】

脂質ナノ粒子の溶血反応（ｈｅｍｏｌｙｓｉｓ）誘発

【0159】

脂質ナノ粒子とエンドソーム脂質膜との相互作用を評価するための方法として、ナノ粒子を赤血球と接触させて赤血球が破壊される程度、すなわち、溶血する程度を測定する方法はよく知られている。ここで、赤血球細胞膜は、エンドソームの脂質膜代用として見なされる。溶血現象が多く発生することは、脂質ナノ粒子がより効率的にエンドソーム脂質膜と融合したと解釈できる。

【0160】

脂質ナノ粒子の構成成分の一つであるイオン化脂質（ｉｏｎｉｚａｂｌｅ ｌｉｐｉｄ）は、エンドソーム脂質膜との相互作用に中核的な役割を担うものと知られている。イオン化脂質は、中性ｐＨでは電荷を帯びず、エンドソーム内の環境である酸性条件では陽電荷を帯びるようにアミン基（ａｍｉｎｅ ｇｒｏｕｐ）を含む場合が多いが、アミン基の最適ｐＫａは、５～７未満程度が適当であると知られている。したがって、脂質ナノ粒子がエンドソーム脂質膜と融合する程度を調べるために、アミン基のｐＫａよりも低いｐＨ条件で赤血球とナノ粒子とを混合して溶血反応を測定して評価する。本実施例に使用されたイオン化脂質は、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡであるが、この物質のアミン基ｐＫａは略６．５であり、ｐＨ４条件ではアミン基が陽電荷を帯びることになる。陽電荷は、エンドソームの脂質膜の陰電荷と静電気的引力によってより容易に融合が進行されるように助ける。しかし、ナノ粒子の表面にＰＥＧが分布すると、静電気的引力をＰＥＧが弱化させる遮り効果を発生させるだけでなく、ナノ粒子の表面とエンドソームの脂質膜との直接接触も妨害する不具合がある。

【0161】

したがって、分解可能官能基を含まない一般的なＰＥＧ－ＤＭＧを構成成分として含む脂質ナノ粒子は、ＰＥＧの含有量が増加するほど溶血反応が抑制されるのに対し、ＰＥＧモイエティ－分解可能官能基－脂質コンジュゲートは酸性条件で加水分解によってＰＥＧが除去されるので、ＰＥＧモイエティ－分解可能官能基－脂質コンジュゲートを構成成分として含む脂質ナノ粒子は、ＰＥＧモイエティ－分解可能官能基－脂質コンジュゲートの含有量に関係なく溶血反応を効果的に誘発する。

【0162】

【0163】

ＰＥＧモイエティ－分解可能官能基－脂質コンジュゲートを構成する脂質の長さと脂質ナノ粒子の構造的安定性との関係

【0164】

脂質ナノ粒子表面を取り囲んでいるＰＥＧは、脂質ナノ粒子製造過程では必要であるが、薬理的効能側面では不利に作用する。したがって、脂質ナノ粒子が生体内で血流に乗って循環する間にＰＥＧが脂質ナノ粒子から自ずから除去され易いように、ＰＥＧに連結された脂質は一般的に、炭素数が１４個で構成されたミリスチン酸（ｍｙｒｉｓｔａｔｅ）などを使用する。脂質部分の炭素数が少ないほど、脂質ナノ粒子を構成する他の脂質成分との相互作用大きさが減り、生体内で比較的容易に脂質ナノ粒子からＰＥＧ－脂質コンジュゲートが分離されて除去されるためである。パルミチン酸（ｐａｌｍｉｔａｔｅ、炭素数１６個）、ステアリン酸（ｓｔｅａｒａｔｅ、炭素数１８個）など、脂肪酸の長さが相対的に長い物質を用いて製造された脂質ナノ粒子は、血流による循環過程でＰＥＧ除去が円滑でないため、細胞のエンドソーム進入が難しく、結果として効能が低下する。

【0165】

しかしながら、このように、循環過程中にＰＥＧを除去する方式は、脂質ナノ粒子の構造的安定性側面からは、非常に不安定な要素として作用する。脂質ナノ粒子からＰＥＧ－－脂質が分離されて除去され始めると、粒子自体の安定性低下によって、脂質ナノ粒子を構成している他の脂質成分まで流失し始めるためである。脂質ナノ粒子が適切な効率を有するためにはＰＥＧを除去することが必須であるが、このように脂肪の長さが短いＰＥＧを使用して製造された脂質ナノ粒子は、粒子の安定性が弱化する。

【0166】

一方、本発明で述べるＰＥＧモイエティ－分解可能官能基－脂質コンジュゲートは、酸性条件でＰＥＧを除去する分解可能官能基を含んでいるので、相対的に長い炭化水素、例えば、炭素数１８個で構成された脂質を使用することができる。分解官能基が分解され得るエンドソームの酸性条件に到達するまではＰＥＧモイエティ－分解可能官能基－脂質コンジュゲートがナノ粒子の構成成分に残っているので、血流による循環過程中に粒子の安定性を維持できる。

【0167】

【0168】

脂質ナノ粒子の免疫反応誘発

【0169】

脂質ナノ粒子を構成するイオン化脂質（ｉｏｎｉｚａｂｌｅ ｌｉｐｉｄ）は、免疫細胞を刺激して免疫反応を誘発するものと知られている。脂質ナノ粒子のＰＥＧ含有量を増加させると、免疫細胞と脂質ナノ粒子間の直接的な相互作用を抑制し、脂質成分による免疫副作用を最小化させることができる。しかし、ＰＥＧ含有量の増加は必然的に細胞によるナノ粒子のアップテーク効率と細胞内のエンドソーム脱出を深刻に阻害することにつながるため、ＰＥＧ含有量を必要最小量以上に増加させることは困難である。

【0170】

しかしながら、本発明のＰＥＧモイエティ－分解可能官能基－脂質コンジュゲートを含む脂質ナノ粒子は、リガンドを使用して細胞アップテーク効率を増加させることができ、エンドソーム内でＰＥＧを除去できる分解可能官能基を含んでいる。したがって、本発明で提示するＰＥＧモイエティ－分解可能官能基－脂質コンジュゲートを使用すると、ＰＥＧ含有量を増加させても、製造された脂質ナノ粒子は効能が低下せず、同時に免疫反応誘発も抑制させることができる。したがって、ＰＥＧモイエティ－分解可能官能基－脂質コンジュゲートを使用した脂質ナノ粒子を末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）と混合し、脂質ナノ粒子がサイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）を誘発する程度を測定すれば、陰性対照群として使用したＰＢＳ緩衝溶液処理群と類似のレベルであることが分かる。

【0171】

【0172】

以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は、単に本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例によって限定されるものと解釈されないことは、当業界における通常の知識を有する者にとって明らかであろう。

【0173】

【0174】

【0175】

［実施例］

【0176】

実施例１：ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）モイエティ－分解可能官能基－脂質（ｌｉｐｉｄ）コンジュゲートの合成

【0177】

実施例１－１：２－（２－（２－アジドエトキシ）エトキシ）エタノール

【0178】

【0179】

２－（２－（２－アジドエトキシ）エトキシ）エタノール（２．００ｇ、１１．８６ｍｍｏｌ）水溶液（４０ｍＬ）にアジ化ナトリウム（１．５４ｇ、２３．７２ｍｍｏｌ）を添加して９０℃で１８時間撹拌した。反応物をジクロロメタンで３回抽出して硫酸マグネシウム及び減圧で乾燥させ、化合物（２．２２ｇ）を９８．５％収率で得た。

【0180】

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 3.75-3.70 (m, 2H), 3.69-3.65 (m, 6H), 3.63-3.59 (m, 2H), 3.42-3.36 (m, 2H), 2.31 (s, 1H).

【0181】

【0182】

実施例１－２：２－メチル－３，４，５－トリ－Ｏ－アセチル－１，２－デオキシ－アルファ－Ｄ－ガラクトピラノ［２，１，ｄ］－２－オキサゾリン

【0183】

【0184】

ＤＣＥ（２２ｍＬ）に溶かした過アセチル化ガラクトサミン（４００ｍｇ、１．０３ｍｍｏｌ）溶液に、トリメチルシリルトリフルオロメタンスルホン酸塩（０．２ｍＬ、１．１３ｍｍｏｌ）を常温で添加した後、５０℃で４時間撹拌した。反応温度を常温に下げ、トリエチルアミンを徐々に添加した後、１５分間撹拌した。反応が終わった後、水とＣＨ_２Ｃｌ_２を加えて抽出した有機溶媒層を、硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過した後に減圧蒸留した。減圧蒸留して得られた混合物は、カラムクロマトグラフィー（ＣＨ_２Ｃｌ_２：ＭｅＯＨ＝４０：１）で分離し、所望の化合物（２６０ｍｇ、０．７７ｍｍｏｌ）を７８％収率で得た。

【0185】

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 5.99 (d, J = 6.8 Hz, 1H), 5.46 (t, J = 3.0 Hz, 1H), 4.90 (dd, J = 7.5, 3.3 Hz, 1H), 4.26-4.08 (m, 3H), 3.99 (m, 1H), 2.12 (s, 3H), 2.07 (s, 3H), 2.07 (s, 3H), 2.05 (d, J = 1.2 Hz, 3H).

【0186】

【0187】

実施例１－３：５－アセトアミノ－２－（アセトキシメチル）－６－（２－（２－（２－アジドエトキシ）エトキシ）エトキシ）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－３，４－ジイルジアセテート

【0188】

【0189】

ＤＣＥ（７．２ｍＬ）に溶かした２－メチル－３，４，５－トリ－Ｏ－アセチル－１，２－デオキシ－アルファ－Ｄ－ガラクトピラノ［２，１，ｄ］－２－オキサゾリン（３９０ｍｇ、１．１８ｍｍｏｌ）と２－（２－（２－アミノエトキシ）エトキシ）エタノール（２２８ｍｇ、１．３０ｍｍｏｌ）との混合溶液に、４Å分子体（１９０ｍｇ）を入れて５分撹拌した。トリメチルシリルトリフルオロメタンスルホン酸塩（１０４μＬ、０．５９ｍｍｏｌ）を常温で添加した後、１６時間撹拌した。反応が終わった後に濾過して４Å分子体を除去し、水とＣＨ_２Ｃｌ_２を加えて抽出した有機溶媒層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過した後に減圧蒸留した。減圧蒸留して得られた混合物はカラムクロマトグラフィー（ＥＡ：ＭｅＯＨ＝９：１）で分離し、所望の化合物（４６０ｍｇ、０．９１ｍｍｏｌ）を７７％収率で得た。

【0190】

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ6.14 (d, J = 9.3 Hz, 1H), 5.32 (dd, J = 3.4, 1.1 Hz, 1H), 5.05 (dd, J = 11.2, 3.4 Hz, 1H), 4.78 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 4.22 (dt, J= 11.2, 8.9 Hz, 1H), 4.19-4.10 (m, 2H), 3.93-3.83 (m, 3H), 3.76-3.65 (m, 4H), 3.63 (dd, J = 7.1, 3.2 Hz, 4H), 3.51-3.39 (m, 2H), 2.15 (s, 3H), 2.04 (s, 3H), 1.99 (s, 3H), 1.98 (s, 3H).

【0191】

【0192】

実施例１－４：２－（２－（２－アミノエトキシ）エトキシ）エチル２－アセトアミノ－３，４，６－トリ－Ｏ－アセチル－２－ジオキシ－α－Ｄ－ガラクトピラノシド

【0193】

【0194】

ＴＨＦ（１０ｍＬ）に溶かした５－アセトアミノ－２－（アセトキシメチル）－６－（２－（２－（２－アジドエトキシ）エトキシ）エトキシ）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－３，４－ジイルジアセテート（２４０ｍｇ、０．４７６ｍｍｏｌ）溶液にＰＰｈ_３（１５０ｍｇ、０．５７１ｍｍｏｌ）を常温で添加した後、４８時間撹拌した。Ｈ_２Ｏ（２６μＬ、１．４２７ｍｍｏｌ）を添加した後、２４時間撹拌した。その後、トルエン（１０ｍＬ）を添加し、トリフルオロ酢酸（７３μＬ、０．９５１ｍｍｏｌ）を添加して塩を生成した。水とＣＨ_２Ｃｌ_２を加えて抽出した水層を減圧蒸留し、所望の化合物（２７０ｍｇ、０．９１ｍｍｏｌ）を９８％収率で得た。

【0195】

¹H NMR (400 MHz, CD₃OD): δ5.35 (d, J = 3.2 Hz, 1H), 5.05 (dd, J = 11.2, 3.2 Hz, 1H), 4.58 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 4.16-3.96 (m, 4H), 3.64-3.74 (m, 10H), 3.24 (m, 2H), 2.14 (s, 3H), 2.03 (s, 3H), 1.95 (s, 3H), 1.94 (s, 3H).

【0196】

【0197】

実施例１－５：トリス｛［２－（ターシャリーブトキシカルボニル）エトキシ］メチル｝メチルアミン

【0198】

【0199】

ＤＭＳＯ（２．０ｍＬ）に溶かしたトリス（１．２１ｇ、１０．００ｍｍｏｌ）溶液に５．０Ｍ水酸化ナトリウム（０．２ｍＬ）を１５℃で添加した後、５分間撹拌した。Ｔｅｒｔ－ブチルアクリレート（５．０ｍＬ、３４ｍｍｏｌ）を徐々に滴加した。次に、水（０．２ｍＬ）を添加した後、アルゴン下、常温で２４時間撹拌した。反応が終わった後、減圧蒸留して得られた混合物はカラムクロマトグラフィー（ＥＡ：Ｈｅｘ＝２：１）で分離し、所望の化合物（２．５ｇ、５．００ｍｍｏｌ）を５０％収率で得た。

【0200】

¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz): δ3.65 (t, J = 6.0 Hz, 6H), 3.32 (s, 6H), 2.46 (t, J = 6.0 Hz, 6H), 1.45 (s, 27H).

【0201】

【0202】

実施例１－６：（Ｒ）－（（２，３－ｂｉｓ（オクタデシロキシ）プロポキシ）メチル）ベンゼン

【0203】

【0204】

トルエン（２．５ｍＬ）に溶かした（Ｒ）－３－ベンジロキシ－１，２－プロパンジオール（１０６ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）溶液に、１－ブロモオクタデカン（７３２ｍｇ、２．２０ｍｍｏｌ）、水酸化カリウム（１２３ｍｇ、２．２０ｍｍｏｌ）を常温で添加した後、１１０℃で２４時間還流させた。反応が終わった後に水とＣＨ_２Ｃｌ_２を加えて抽出した有機溶媒層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過した後に減圧蒸留した。減圧蒸留して得られた混合物はカラムクロマトグラフィー（Ｈｅｘ：ＥＡ＝１０：１）で分離し、所望の化合物（３００ｍｇ、０．４４ｍｍｏｌ）を８０％収率で得た。

【0205】

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.32-7.21 (m, 5H), 4.55 (s, 2H), 3.64-3.48 (m, 7H), 3.43 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 1.61-1.51 (m, 4H), 1.39-1.21 (m, 60H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 6H).

【0206】

【0207】

実施例１－７．（Ｓ）－２，３－ｂｉｓ（オクタデシロキシ）プロパン－１－オール

【0208】

【0209】

ＣＨ_２Ｃｌ_２（４ｍＬ）に（Ｒ）－（（２，３－ｂｉｓ（オクタデシロキシ）プロポキシ）メチル）ベンゼン（５０ｍｇ、０．０７ｍｍｏｌ）を溶解させた後、Ｐｄ／Ｃ（１０ｍｇ）を滴加した。水素下、常温で２０時間撹拌した。反応が終わった後、セライト５４５を使用してエチルアセテート溶媒で濾過した後に減圧蒸留し、所望の化合物（４０ｍｇ、０．０７ｍｍｏｌ）を９２％収率で得た。

【0210】

¹H NMR (CDCl₃) δ 3.75-3.37 (m, 9H), 2.17 (m, 1H), 1.55 (m, 4H), 1.38-1.21 (m, 60H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 6H).

【0211】

【0212】

実施例１－８：（Ｒ）－２，３－ｂｉｓ（オクタデシロキシ）プロパンアル

【0213】

【0214】

ＣＨ_２Ｃｌ_２（３．７ｍＬ）に溶かしたデス-マーチンペルヨージナン（８８ｍｇ、０．２０６ｍｍｏｌ）溶液を、ＣＨ_２Ｃｌ_２（１．３ｍＬ）に溶かした（Ｓ）－２，３－ｂｉｓ（オクタデシロキシ）プロパン－１－オール（１１０ｍｇ、０．１８４ｍｍｏｌ）溶液に０℃で徐々に滴加した後、常温で２時間撹拌した。反応が終わった後に水とＣＨ_２Ｃｌ_２、炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて有機溶媒層を抽出し、水とＣＨ_２Ｃｌ_２、チオ硫酸ナトリウムを加えて抽出した有機溶媒層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過した後に減圧蒸留した。減圧蒸留して得られた混合物はカラムクロマトグラフィー（Ｈｅｘ：ＥＡ＝２０：１）で分離し、所望の化合物（８３ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）を８０％収率で得た。

【0215】

¹H NMR (CDCl₃) δ 3.81-3.37 (m, 9H), 1.65-1.51 (m, 4H), 1.38-1.21 (m, 60H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 6H).

【0216】

【0217】

実施例１－９：３，６－ジオキソ－１－フェニル－２，８，１１，１４－テトラオキサ－４，５－ジアザヘキサデカン－１６－オイックアシドＭ_ｎ＝６００

【0218】

【0219】

ＤＭＦ（５．８ｍＬ）にポリ（エチレングリコール）ビスカルボキシメチル）エーテル（１ｇ、１．７２ｍｍｏｌ）を溶解させた後、０℃でＣｂｚＮＨＮＨ_２（３００ｍｇ、１．８１ｍｍｏｌ）、ヒドロキシベンゾトリアゾル（２４４ｍｇ、１．８１ｍｍｏｌ）、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（３２０μＬ、１．８１ｍｍｏｌ）を滴加した。アルゴン下、常温で１８時間撹拌した。反応が終わった後、水とＣＨ_２Ｃｌ_２、炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて水層として抽出した後、再び水とＣＨ_２Ｃｌ_２、Ｈ_３ＰＯ_４を加えて抽出した有機層を減圧蒸留して得られた生成物を４０％収率で得た。

【0220】

¹H NMR (400 MHz, CD₃OD) δ 7.39-7.30 (m, 5H), 5.15 (s, 2H), 4.13 (s, 2H), 4.10 (s, 2H), 3.73-3.60 (m, 70H).

【0221】

【0222】

実施例１－１０：１－ベンジル２１－（ｔｅｒｔ－ブチル）１６，１６－ｂｉｓ（（３－（ｔｅｒｔ－ブトキシ）－３オキソプロポキシ）メチル）－４，１４－ジオキソ－６，９，１２，１８－テトラオキサ－２，３，１５－トリアザヘニコサンジオエートＭ_ｎ＝６００

【0223】

【0224】

ＤＭＦ（４ｍＬ）に３，６－ジオキソ－１－フェニル－２，８，１１，１４－テトラオキサ－４，５－ジアザヘキサデカン－１６－オイックアシド混合物（８７０ｍｇ、１．１６ｍｍｏｌ）、トリス｛［２－（ターシャリーブトキシカルボニル）エトキシ］メチル｝メチルアミン（５２６ｍｇ、１．０４ｍｍｏｌ）を溶解させた後、０℃でヒドロキシベンゾトリアゾル（１５７ｍｇ、１．１６ｍｍｏｌ）、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（２４８μＬ、１．４０ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルエチルアミン（２４３μＬ、１．４０ｍｍｏｌ）を滴加した。アルゴン下、常温で１８時間撹拌した。反応が終わった後、水とＣＨ_２Ｃｌ_２、リン酸を加えて有機溶媒層を抽出した。抽出した有機溶媒層に水とＣＨ_２Ｃｌ_２、炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて抽出した有機溶媒層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過した後に減圧蒸留した。減圧蒸留して得られた混合物はカラムクロマトグラフィー（ＣＨ_２Ｃｌ_２：ＭｅＯＨ＝１５：１）で分離し、所望の化合物を４０％収率で得た。

【0225】

¹H NMR (400 MHz; CD₃OD) δ 7.38-7.31 (m, 5H), 5.16 (s, 2H), 4.30-4.13 (m, 3H), 4.13 (s, 2H), 3.90 (s, 2H), 3.77-3.60 (m, 70H), 2.46 (t,J = 6.0 Hz, 6H), 1.46 (s, 27H).

【0226】

【0227】

実施例１－１１：１８，１８－ｂｉｓ（（２－カルボキシエトキシ）メチル）－３，６，１６－トリオキソ－１－２，８，１１，１４，２０－ペンタオキサ－４，５，１７－トリアザトリコサン－２３－オイックアシドＭ_ｎ＝６００

【0228】

【0229】

１－ベンジル２１－（ｔｅｒｔ－ブチル）１６，１６－ｂｉｓ（（３－（ｔｅｒｔ－ブトキシ）－３オキソプロポキシ）メチル）－４，１４－ジオキソ－６，９，１２，１８－テトラオキサ－２，３，１５－トリアザヘニコサンジオエートＭ_ｎ＝６００（５７０ｍｇ、０．４６ｍｍｏｌ）を８５％ギ酸（４．０ｍＬ）に溶かし、常温で１８時間撹拌した。反応が終わった後、５０℃で減圧蒸留し、所望の化合物を９９％収率で得た。

【0230】

¹H NMR (CD₃OD) δ 7.38-7.30 (m, 5H), 5.15 (s, 2H), 4.30-4.17 (m, 3H), 4.13 (s, 2H), 3.90 (s, 2H), 3.78-3.63 (m, 70H), 2.53 (t, J = 6.0 Hz, 6H).

【0231】

【0232】

実施例１－１２：トリ－アセチルガラク－ＰＥＧ６００－Ｃｂｚヒドラジド

【0233】

【0234】

ＤＭＦ（４．４ｍＬ）に１８，１８－ｂｉｓ（（２－カルボキシエトキシ）メチル）－３，６，１６－トリオキソ－１－２，８，１１，１４，２０－ペンタオキサ－４，５，１７－トリアザトリコサン－２３－オイックアシド、トリス｛［２－（ターシャリーブトキシカルボニル）エトキシ］メチル｝メチルアミン（１．５８ｍｍｏｌ）を溶解させた後、０℃でヒドロキシベンゾトリアゾル（２１４ｍｇ、１．５８ｍｍｏｌ）、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（２８０μＬ、１．５８ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルエチルアミン（５５０μＬ、３．１６ｍｍｏｌ）を滴加した。アルゴン下、常温で１８時間撹拌した。さらにアルゴン下、常温でジイソプロピルエチルアミン（５５０μＬ、３．１６ｍｍｏｌ）を滴加し、常温で２４時間撹拌した。反応が終わった後、水、ＣＨ_２Ｃｌ_２、リン酸を加えて有機溶媒層を抽出した。抽出した有機溶媒層を水とＣＨ_２Ｃｌ_２、炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて有機溶媒層を抽出した後に硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過した後に減圧蒸留した。残留混合物はカラムクロマトグラフィー（ＣＨ_２Ｃｌ_２：ＭｅＯＨ＝１０：１）で分離し、所望の化合物を２３％収率で得た。

【0235】

¹H NMR (400 MHz, CD₃OD) δ 7.40-7.31 (m, 5H), 5.34 (d, J = 3.0 Hz, 3H), 5.07 (dd, J = 11.2, 3.3 Hz, 3H), 5.16 (s, 2H), 4.64 (t, J = 8.5 Hz, 3H), 4.16-4.02 (m, 16H), 3.95-3.91 (m, 6H), 3.77-3.61 (m, 106H), 3.55 (t, J = 5.6 Hz, 6H), 3.38 (t, J = 5.6 Hz, 6H), 2.45 (t, J= 6.0 Hz, 6H), 2.14 (s, 9H), 2.03 (s, 9H), 1.95 (s, 9H), 1.93 (s, 9H).

【0236】

【0237】

実施例１－１３：トリ－アセチルガラク－ＰＥＧ６００－ヒドラジド

【0238】

【0239】

ＭｅＯＨ（２ｍＬ）にトリ－アセチルガラク－ＰＥＧ６００－Ｃｂｚヒドラジド（３７３ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）を溶解させた後、Ｐｄ／Ｃ（１３ｍｇ）、酢酸（２８μＬ、０．４８ｍｍｏｌ）を滴加した。水素下、常温で２０時間撹拌した。反応が終わった後、セライト５４５を使用してメタノール溶媒で濾過した後に減圧蒸留し、所望の化合物（１２０ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）を９９％収率で得た。

【0240】

¹H NMR (400 MHz, CD₃OD) δ 1.94 (s, 9H), 5.34 (d, J = 3.0 Hz, 3H), 5.07 (dd, J = 11.2, 3.4 Hz, 3H), 4.64 (d, J= 8.5 Hz, 3H), 4.17-3.91 (m, 16H), 3.77-3.61 (m, 106H), 3.56 (t, J = 5.5 Hz, 6H), 3.39 (t, J = 5.5 Hz, 6H), 2.46 (t, J = 5.9 Hz, 6H), 2.15 (s, 9H), 2.03 (s, 9H), 1.95 (s, 9H), 1.94 (s, 9H).

【0241】

【0242】

実施例１－１４：ジオクタデシルオキシ－プロピリデントリ－アセチルガラク－ＰＥＧ６００－アシルヒドラゾン

【0243】

【0244】

ＥｔＯＨ（１ｍＬ）、ＣＨ_２Ｃｌ_２（０．１ｍＬ）混合溶液にトリ－アセチルガラク－ＰＥＧ６００－ヒドラジド（０．０５ｍｍｏｌ）、（Ｒ）－２，３－ｂｉｓ（オクタデシロキシ）プロパンアル（３９ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ）を溶解させた後、アルゴン下、常温で３時間撹拌した。反応が終わった後、減圧蒸留した。減圧蒸留して得られた混合物はカラムクロマトグラフィー（ＣＨ_２Ｃｌ_２：ＭｅＯＨ＝１０：１）で分離し、所望の化合物を２６％収率で得た。

【0245】

¹H NMR (CDCl₃) δ 9.92 (s, 1H), 7.43 (d, J= 6.9 Hz, 1H), 7.19 (m, 2H), 7.03 (s, 1H), 6.6 (s, 1H), 5.32 (d, J = 3.0 Hz, 3H), 5.16 (dd, J = 11.3, 3.0 Hz, 3H), 4.78 (d, J = 8.5 Hz, 3H), 4.15-3.40 (m, 134H), 2.45 (t, J = 5.9 Hz, 6H), 2.13 (s, 9H), 2.03 (s, 9H), 1.98 (s, 9H), 1.94 (s, 9H), 1.54-1.48 (m, 4H), 1.24 (m, 60H), 0.86 (t, J = 6.8 Hz, 6H).

【0246】

【0247】

実施例１－１５：ジオクタデシルオキシ－プロピリデントリ－ガラク－ＰＥＧ６００－アシルヒドラゾン（ＧａｌＮＡｃ－ＰＥＧ６００－Ｈｚ－ＤＳＧ）

【0248】

【0249】

【0250】

ＭｅＯＨ（１ｍＬ）、ＣＨ_２Ｃｌ_２（０．１ｍＬ）混合溶液に、ジオクタデシルオキシ－プロピリデントリ－アセチルガラク－ＰＥＧ６００－アシルヒドラゾン（０．０１３ｍｍｏｌ）を溶解させた後、メトキシドナトリウム（０．７ｍｇ、０．０１３ｍｍｏｌ）を滴加した。アルゴン下、常温で２時間撹拌した。反応が終わった後、アンバーライトＩＲ－１２０イオン交換樹脂で処理後に減圧蒸留し、所望の化合物を２６％収率で得た。

【0251】

¹H NMR (CDCl₃) δ 9.97(s, 1H), 8.54 (s, 1H), 7.90(m, 2H), 7.72 (m, 1H), 4.47 (m, 3H), 4.15-3.44 (m, 144H), 2.47 (t, J= 5.9 Hz, 6H), 2.00 (s, 9H), 1.55 (m, 4H), 1.24 (m, 60H), 0.87 (t, J = 6.8 Hz , 6H).

【0252】

【0253】

実施例１－１６：３，６－ジオキソ－１－フェニル－２，８，１１，１４－テトラオキサ－４，５－ジアザヘキサデカン－１６－オイックアシドＭ_ｎ＝２０００

【0254】

【0255】

実施例１－９と同じ方法により、収得率４０％で所望の化合物を得た。

【0256】

¹H NMR (400 MHz, CD₃OD) δ 7.39-7.30 (m, 5H), 5.15 (s, 2H), 4.13 (s, 2H), 4.10 (s, 2H), 3.73-3.68 (m, 190H).

【0257】

【0258】

実施例１－１７：１－ベンジル２１－（ｔｅｒｔ－ブチル）１６，１６－ｂｉｓ（（３－（ｔｅｒｔ－ブトキシ）－３オキソプロポキシ）メチル）－４，１４－ジオキソ－６，９，１２，１８－テトラオキサ－２，３，１５－トリアザヘニコサンジオエートＭ_ｎ＝２０００

【0259】

【0260】

実施例１－１０と同じ方法により、収得率３０％で所望の化合物を得た。

【0261】

¹H NMR (400 MHz; CD₃OD) δ 7.38-7.31 (m, 5H), 5.16 (s, 2H), 4.30-4.13 (m, 3H), 4.13 (s, 2H), 3.90 (s, 2H), 3.77-3.60 (m, 190H), 2.46 (t, J= 6.0 Hz, 6H), 1.46 (s, 27H).

【0262】

【0263】

実施例１－１８：１８，１８－ｂｉｓ（（２－カルボキシエトキシ）メチル）－３，６，１６－トリオキソ－１－２，８，１１，１４，２０－ペンタオキサ－４，５，１７－トリアザトリコサン－２３－オイックアシドＭ_ｎ＝２０００

【0264】

【0265】

実施例１－１１と同じ方法により、収得率９９％で所望の化合物を得た。

【0266】

¹H NMR (CD₃OD) δ 7.38-7.30 (m, 5H), 5.15 (s, 2H), 4.12 (s, 4H), 3.78-3.96 (m, 190H), 2.53 (t, J = 6.0 Hz, 6H).

【0267】

【0268】

実施例１－１９：トリ－アセチルガラク－ＰＥＧ２Ｋ－Ｃｂｚヒドラジド

【0269】

【0270】

実施例１－１２と同じ方法により、収得率３０％で所望の化合物を得た。

【0271】

¹H NMR (400 MHz, CD₃OD) δ 7.40-7.31 (m, 5H), 5.34 (d, J = 3.0 Hz, 3H), 5.16 (s, 2H), 5.07 (dd, J = 11.2, 3.3 Hz, 3H), 4.64 (t, J = 8.5 Hz, 3H), 4.16-4.02 (m, 16H), 3.95-3.91 (m, 6H), 3.77-3.61 (m, 226H), 3.55 (t, J = 5.6 Hz, 6H), 3.38 (t, J= 5.6 Hz, 6H), 2.45 (t, J = 6.0 Hz, 6H), 2.14 (s, 9H), 2.03 (s, 9H), 1.95 (s, 9H), 1.93 (s, 9H).

【0272】

【0273】

実施例１－２０：トリ－アセチルガラク－ＰＥＧ２Ｋ－ヒドラジド

【0274】

【0275】

実施例１－１３と同じ方法により、収得率９９％で所望の化合物を得た。

【0276】

¹H NMR (400 MHz, CD₃OD) δ 5.34 (d, J = 3.0 Hz, 3H), 5.07 (dd, J = 11.2, 3.4 Hz 3H), 4.64 (d, J = 8.5 Hz, 3H), 4.17-3.91 (m, 16H), 3.77-3.60 (m, 226H), 3.56 (t, J = 5.5 Hz, 6H), 3.39 (t, J = 5.5 Hz, 6H), 2.46 (t, J = 5.9 Hz, 6H), 2.15 (s, 9H), 2.03 (s, 9H), 1.95 (s, 9H), 1.94 (s, 9H).

【0277】

【0278】

実施例１－２１：ジオクタデシルオキシ－プロピリデントリ－アセチルガラク－ＰＥＧ２Ｋ－アシルヒドラゾン

【0279】

【0280】

実施例１－１４と同じ方法により、収得率３７％で所望の化合物を得た。

【0281】

¹H NMR (CDCl₃) δ 9.95 (s, 1H), 7.43 (d, J= 6.9 Hz, 1H), 7.19 (m, 2H), 7.03 (s, 1H), 6.6 (s, 1H), 5.32 (d, J = 3.0 Hz, 3H), 5.16 (dd, J = 11.3, 3.0 Hz, 3H), 4.78 (d, J = 8.5 Hz, 3H), 4.15-3.40 (m, 226H), 2.45 (t, J = 5.9 Hz, 6H), 2.13 (s, 9H), 2.03 (s, 9H), 1.98 (s, 9H), 1.94 (s, 9H), 1.54-1.48 (m, 4H), 1.24 (m, 60H), 0.86 (t, J = 6.8 Hz, 6H).

【0282】

【0283】

実施例１－２２：ジオクタデシルオキシ－プロピリデントリ－ガラク－ＰＥＧ２Ｋ－アシルヒドラゾン（ＧａｌＮａｃ－ＰＥＧ２Ｋ－Ｈｚ－ＤＳＧ）

【0284】

【0285】

実施例１－１５と同じ方法により、収得率２６％で所望の化合物を得た。

【0286】

¹H NMR (CDCl₃) δ 9.93 (s, 1H), 8.54 (s, 1H), 7.90 (m, 2H), 7.72 (m, 1H), 4.47 (m, 3H), 4.15-3.44 (m, 236H), 2.47 (t, J= 5.9 Hz, 6H), 2.00 (s, 9H), 1.55 (m, 4H), 1.24 (m, 60H), 0.87 (t, J = 6.8 Hz, 6H).

【0287】

【0288】

実施例１－２３．ベンジル４－オキソ－６，９，１２－トリオキサ－２，３－ジアザトリデカノエート－ＰＥＧ６００

【0289】

【0290】

２．７ｍＬ ＤＭＦに２－（２－（２－メトキシエトキシ）エトキシ）酢酸（１５０ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）を溶解させた後、ＣｂｚＮＨＮＨ_２（５０ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）、ＥＤＣＩ（５８μＬ、０．３３ｍｍｏｌ）及びＨＯＢｔ（４４ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）を０℃で添加し、室温で一日撹拌した。反応終結後に反応物をＤＣＭ（４０ｍＬ）に移し、希釈したＨ_３ＰＯ_４（１Ｍ、４０ｍＬ）、ＮａＨＣＯ_３（１Ｍ、４０ｍＬ）水溶液（４０ｍＬ）で洗浄した後、硫酸マグネシウムで乾燥させた。反応物をシリカゲルカラムにおいてＤＣＭ／メタノール（１０／１，ｖ／ｖ）で分離し、化合物１７５ｍｇを９１％収率で得た。

【0291】

¹H NMR (400 MHz, MeOH-d₄) δ 7.39-7.30 (m, 5H), 5.16 (s, 2H), 4.20 (s, 2H), 3.68-3.52 (m, 50H). 3.37 (s, 3H)

【0292】

【0293】

実施例１－２４：２－（２－（２－メトキシエトキシ）エトキシ）アセトヒドラジド－ＰＥＧ６００

【0294】

【0295】

メタノール（２．８ｍＬ）にＣｂｚヒドラジド（１７５ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）を溶解させ、Ｐｄ／Ｃ（１８ｍｇ、１０ｗ／ｗ％）を添加して、水素下で２０時間撹拌した。反応終結後にセライト５４５で濾過し、化合物１４７ｍｇを９５％収率で得た。

【0296】

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 4.14-4.01 (m, 2H), 3.61 (m, 50 H), 3.34 (s, 3H)

【0297】

【0298】

実施例１－２５：ジオクタデシルオキシ－プロピリデンＰＥＧ６００－アシルヒドラゾン（ＰＥＧ６００－Ｈｚ－ＤＳＧ）

【0299】

【0300】

１．３ｍＬエタノールに実施例１－２４の結果物（７９ｍｇ、０．１２７ｍｍｏｌ）を溶解し、実施例１－８の結果物アルデヒド（１１３ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ）を添加した。混合物は５０℃で１８時間撹拌し、反応を終結させた。反応物をカラムで精製し、化合物１２３ｍｇを８５％の収率で得た。

【0301】

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 9.97(s, 1H), 7.38 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 4.15 (m, 3 H), 3.65-3.40 (m, 56 H), 3.36(s, 3H), 1.52(m, 4H), 1.23 (m, 60 H), 0.86 (t, J = 6.4 Hz, 3H).

【0302】

【0303】

実施例１－２６：ベンジル４－オキソ－６，９，１２－トリオキサ－２，３－ジアザトリデカノエート－ＰＥＧ２Ｋ

【0304】

【0305】

実施例１－２３と同じ方法により、化合物１６０ｍｇを９５％収率で得た。

【0306】

¹H NMR (400 MHz, MeOH-d₄) δ 7.39-7.30 (m, 5H), 5.16 (s, 2H), 4.20 (s, 2H), 3.68-3.52 (m, 190H). 3.36 (s, 3H)

【0307】

【0308】

実施例１－２７：２－（２－（２－メトキシエトキシ）エトキシ）アセトヒドラジド－ＰＥＧ２Ｋ

【0309】

【0310】

実施例１－２４と同じ方法により、化合物１１０ｍｇを７５％収率で得た。

【0311】

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 4.14-4.01 (m, 2H), 3.61 (m, 190 H), 3.34 (s, 3H)

【0312】

【0313】

実施例１－２８：ジオクタデシルオキシ－プロピリデンＰＥＧ２Ｋ－アシルヒドラゾン（ＰＥＧ２Ｋ－Ｈｚ－ＤＳＧ）

【0314】

【0315】

実施例１－２５と同じ方法により、化合物５７ｍｇを５３％収率で得た。

【0316】

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 9.95(s, 1H), 7.36 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 4.14 (m, 3 H), 3.60-3.40 (m, 200 H), 3.34(s, 3H), 1.51(m, 4H), 1.21 (m, 60 H), 0.84 (t, J = 6.4 Hz, 3H).

【0317】

【0318】

実施例１－２９：（Ｒ）－１－（４－（２，３－ビス（オクタデシルオキシ）プロポキシ）フェニル）エタン－１－オン

【0319】

【0320】

２ｍＬ ＴＨＦに実施例１－７の結果物（５９．８ｍｇ、１００ｕｍｏｌ）を溶解し、４－ヒドロキシアセトフェノン（１５．０ｍｇ、１１０ｕｍｏｌ）、ＰＰｈ_３（３９．４ｍｇ、１５０ｕｍｏｌ）、ＤＩＡＤ（３０ｕＬ，１５０ｕｍｏｌ）を０℃で添加した。混合物を室温で１２時間撹拌して反応を終結させた。反応物をジクロロメタンで３回抽出し、塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、減圧で乾燥させた。シリカクロマトグラフィーで結果物を精製し、結果物５５．０ｍｇを７７％の収率で得た。

【0321】

¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.92 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 6.95 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 4.19-4.05 (m, 2H), 3.79 (quin, J = 5.1 Hz, 1H), 3.64-3.57 (m, 4H), 3.46 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 2.55 (s, 3H), 1.61-1.50 (m, 4H), 1.32-1.21(m, 60H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz).

【0322】

【0323】

実施例１－３０：（Ｒ，Ｅ）－Ｎ’－（１－（４－（２，３－ｂｉｓ（オクタデシルオキシ）プロポキシ）フェニル）エチリデン）－２－（２－メトキシエトキシ）アセトヒドラジド（ＰＥＧ６００－ＰｈＨｚ－ＤＳＧ）

【0324】

【0325】

エタノール（４ｍＬ）にｍ－ＰＥＧ－ヒドラジドＭ_ｎ＝５５０（ＣｒｅａｔｉｖｅＰＥＧｗｏｒｋｓ）（２００ｍｇ、３６４ｕｍｏｌ）を溶解し、実施例１－２９の結果物（２６０ｍｇ、３６４ｕｍｏｌ）、酢酸（１００ｕＬ、３．６４ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を８５℃で１６時間撹拌した。反応物をカラム精製方式で精製し、結果物２６５ｍｇを６６％収率で得た。

【0326】

【0327】

実施例１－３１：（２Ｒ）－２，３－ビス（オクタデシルオキシ）プロピル２－（メトキシポリエチレングリコール５５０）アセテート（ＰＥＧ６００－Ｅｓｔｅｒ－ＤＳＧ）

【0328】

【0329】

ＤＣＭ（３０．０ｍＬ）に２－（メトキシポリエチレングリコール５５０）カルボン酸（１００ｍｇ、０．１５６ｍｍｏｌ）を溶解させた後、（Ｓ）－２，３－ビス（オクタデシルオキシ）プロパン－１－オール（１８７ｍｇ、０．３１２ｍｍｏｌ）、４－ジメチルアミノピリジン（２３ｍｇ、０．１８７ｍｍｏｌ）及びジシクロヘキシルカルボジイミド（３７ｍｇ、０．１８０ｍｍｏｌ）を滴加した。窒素下、常温で２４時間撹拌した。反応が終わった後、反応物をセライト５４５でフィルターした後、水とＣＨ_２Ｃｌ_２を加えて有機層として３回抽出した後、抽出した有機溶媒層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過した後に減圧蒸留した。減圧蒸留して得られた混合物はカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ：ＭｅＯＨ＝２０：１）で分離し、所望の化合物（６８ｍｇ、０．６４ｍｍｏｌ）を４１％収率で得た。

【0330】

¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 4.24 (t, 2H), 3.60-3.70 (m, 33H), 3.42 (s, 2H), 1.96-1.98 (d, 3H), 1.75-1.76 (d, 3H), 1.29 (s, 60H), 0.92 (t, 6H)

【0331】

【0332】

実施例２：脂質ナノ粒子の製造

【0333】

本発明で述べるＰＥＧモイエティ－分解可能官能基－脂質コンジュゲート、すなわち、酸性条件で分解される性質がある官能基を含むＰＥＧ誘導体が、脂質ナノ粒子を製造する酸性条件で安定してナノ粒子を形成できるかを確認するために、２種類のナノ粒子を製造した。その一つは、酸性条件で加水分解されるヒドラゾン（ｈｙｄｒａｚｏｎｅ）官能基を含むＰＥＧ２Ｋ－Ｈｚ－ＤＳＧ（化学式３）を含み、もう一つは、酸性条件で加水分解されないＰＥＧ２Ｋ－ＰＥ－ＤＳＧ（１，２－ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ－Ｎ－［ｍｅｔｈｏｘｙ（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）］－２０００，Ａｖａｎｔｉ）を使用するナノ粒子を製造した。イオン化脂質を含むナノ粒子を製造する通常の方法によって製造するために２種の溶液を準備した。一つは、脂質成分を含有する有機溶液であり、エタノールに脂質ナノ粒子を構成する脂質成分を溶解させて準備した。ＰＥＧ２Ｋ－Ｈｚ－ＤＳＧ又はＰＥＧ２Ｋ－ＰＥ－ＤＳＧ １モル％を含む脂質ナノ粒子を製造するために、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、ＤＳＰＣ（ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、コレステロール、ＰＥＧ２Ｋ－Ｈｚ－ＤＳＧ又はＰＥＧ２Ｋ－ＰＥ－ＤＳＧをそれぞれ、５０：１０：３９：１モル比を維持しつつ総４．５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように準備した。ＰＥＧ２Ｋ－Ｈｚ－ＤＳＧ又はＰＥＧ２Ｋ－ＰＥ－ＤＳＧをそれぞれ２モル％、５モル％の割合で含む脂質ナノ粒子の製造のためには、前記ＰＥＧ１モル％脂質ナノ粒子の製造に使用されたＰＥＧ含有量の２倍、５倍のＰＥＧを含めて溶液を準備した。

【0334】

一方、ｓｉＲＮＡをｐＨ ４のクエン酸緩衝溶液に０．０４６ｍｇ／ｍＬの濃度となるように準備した。マイクロミキサーチップ又はＴ－ｌｉｎｅチップを用いてエタノール溶液とバッファ水溶液を３：１の体積比で混合して脂質ナノ粒子を製造するが、混合溶液の流速は４ｍＬ／ｍｉｎとなるようにした。チップを通過して出た溶液にさらに、１：１の体積比でバッファを混合し、ｐＨ ７に変更させた後、これをｐＨ ７．５ ＰＢＳ緩衝溶液で２４時間透析させた。製造された脂質ナノ粒子を動的光散乱（Ｄｙｎａｍｉｃ Ｌｉｇｈｔ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ，ＤＬＳ）装置を用いて、粒子のサイズを測定した。万一、ＰＥＧ２Ｋ－Ｈｚ－ＤＳＧのヒドラゾン（ｈｙｄｒａｚｏｎｅ）が、脂質ナノ粒子を製造する酸性条件でＰＥＧと脂質（ＤＳＧ）で加水分解されると、ＰＥＧモイエティ－分解可能官能基－脂質コンジュゲートを含まないナノ粒子の製造と同様に、脂質成分が不均一なサイズの沈殿物として析出されるべきである。しかし、図２から分かるように、ＰＥＧ２Ｋ－Ｈｚ－ＤＳＧを構成成分として含むナノ粒子は、ＰＥＧ２Ｋ－ＰＥ－ＤＳＧを含むナノ粒子と同様に均一なサイズのナノ粒子を形成し、ＰＥＧ含有量が増加するほど、小さいサイズのナノ粒子を形成することが分かる。この実施例から、酸性条件で分解される性質がある官能基を含むＰＥＧモイエティ－分解可能官能基－脂質コンジュゲートが、脂質ナノ粒子を製造する酸性条件で分解されずに安定してナノ粒子を形成できることを確認した。

【0335】

【0336】

実施例３：ＰＥＧ－Ｈｚ－ＤＳＧ又はＰＥＧ－ＰＥ－ＤＳＧを含む脂質ナノ粒子の効能比較

【0337】

ＰＥＧ－Ｈｚ－ＤＳＧ又はＰＥＧ－ＰＥ－ＤＳＧを含む脂質ナノ粒子の効能を確認するために、ルシフェラーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）をターゲットとするｓｉＲＮＡを含めて実施例２に記載の方式で脂質ナノ粒子を製造した。これを、ルシフェラーゼを常時発現する細胞株にｓｉＲＮＡ濃度基準で様々な濃度で脂質ナノ粒子を処理し、ルシフェラーゼ活性抑制程度を評価した。

【0338】

脂質ナノ粒子に含まれるＰＥＧの分子量と含有量が効能に及ぼす影響を確認するために、ＰＥＧ２０００（ＰＥＧ２Ｋ－Ｈｚ－ＤＳＧ又はＰＥＧ２Ｋ－ＰＥ－ＤＳＧ）又はＰＥＧ１０００（ＰＥＧ１Ｋ－Ｈｚ－ＤＳＧ又はＰＥＧ１Ｋ－ＰＥ－ＤＳＧ）をそれぞれ１、２、５モル％含むように製造した。ＰＥＧ６００－Ｈｚ－ＤＳＧの場合は、より様々な含有量を含むように１、２、５、１０、２０、３０、４０モル％含む脂質ナノ粒子も製造して評価した。

【0339】

ＰＥＧ－ＰＥ－ＤＳＧを含む脂質ナノ粒子は、ＰＥＧ含有量に関係なく効能がないか（図２Ａ）、含有量が増加するほど効能が低下する（図２Ｂ）ことが分かるが、ＰＥＧ－Ｈｚ－ＤＳＧは含有量に関係なく効果的にルシフェラーゼ発現を抑制できることを確認した。特に、ＰＥＧ６００－Ｈｚ－ＤＳＧを含む脂質ナノ粒子は、含有量が２０モル％に到達するまでより効果的にルシフェラーゼの発現を抑制し、効能が向上することが確認できた。

【0340】

【0341】

実施例４：脂質ナノ粒子に含まれたＰＥＧ含有量による細胞アップテーク（ｕｐｔａｋｅ）及びターゲット阻害効率比較確認

【0342】

脂質ナノ粒子製造に一般的に多く使用されるＰＥＧ－ＤＭＧを用いて脂質ナノ粒子を製造すれば、ＰＥＧ含有量が増加する場合に、細胞にアップテークされる効率が減少することが知られている。これを確認するために、ＰＥＧ－ＤＭＧをそれぞれ２、５、１０モル％含有する脂質ナノ粒子を製造する際に、蛍光染料ＤｉＩ（１，１’－Ｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌ－３，３，３’，３’－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｉｎｄｏｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅ ｐｅｒｃｈｌｏｒａｔｅ）を０．２モル％含めて製造した後、ＨｅｐＧ２細胞株に２４時間処理した。ナノ粒子の細胞アップテーク効率を流細胞分析機（ＦＡＣＳ）で分析した結果、ＰＥＧ含有量が増加するほど、細胞のアップテークが低下することが確認できる（図３Ａ）。

【0343】

低下したアップテーク（ｕｐｔａｋｅ）の結果は、脂質ナノ粒子の効能低下を招く。前記ＰＥＧ－ＤＭＧをそれぞれ０、０．１、０．２、０．５、１、２、５、１０モル％の含有量別に含む脂質ナノ粒子を製造する際に、ルシフェラーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）をターゲットとするｓｉＲＮＡを含めて製造した。これを、ルシフェラーゼを常時発現する細胞に処理し、ルシフェラーゼの活性度を測定した。図３のＢグラフから確認できるように、ＰＥＧの含有量が０．５～２モル％の区間で最も優れた効率を示した。０～０．２モル％のＰＥＧを含む脂質ナノ粒子では効能が観察されておらず、２モル％以上の区間では、ＰＥＧの含有量が増加するほど、ルシフェラーゼの活性阻害効率が減少することが分かる。非常に低いＰＥＧを含むと粒子形成自体が不均一になり、ＰＥＧ含有量が一定レベルを超えると、細胞へのアップテーク（ｕｐｔａｋｅ）及びエンドソーム脱出を難しくするためである。

【0344】

ＰＥＧ－ＤＭＧとＰＥＧ６００－Ｈｚ－ＤＳＧを含有量別に含む脂質ナノ粒子の効能を直接に比較するために、該当ＰＥＧモイエティ－分解可能官能基－脂質コンジュゲート成分をそれぞれ１、２、５、１０モル％とし、ルシフェラーゼをターゲットとするｓｉＲＮＡ含む脂質ナノ粒子を製造した。脂質ナノ粒子を、ルシフェラーゼを常時発現するＨＥＰＧ２とＨＥＫ２９３細胞株に処理し、２４時間後にルシフェラーゼ発現量を測定した結果、ＰＥＧ－ＤＭＧを含む脂質ナノ粒子は、ＰＥＧの含有量が増加するほど効率が減少するのに対し、ＰＥＧ６００－Ｈｚ－ＤＳＧを含む脂質ナノ粒子は、ＰＥＧ含有量が増加する際に効率に変動がないか、却って向上することが確認できた（図３Ｃ及び図３Ｄ）。この資料に基づいてＥＣ５０を計算した結果を図３Ｅ及び図３Ｆに示したが、ＨＥＰＧ２細胞株においてＰＥＧ－ＤＭＧとＰＥＧ６００－Ｈｚ－ＤＳＧを１０％ずつ含む脂質ナノ粒子のＥＣ５０はそれぞれ８．９ｎＭと０．２ｎＭであって、約４５倍の差が出たし、ＨＥＫ２９３細胞株ではそれぞれ２６ｎＭと０．７２ｎＭであって、約３６倍の差があることが確認できた。

【0345】

【0346】

実施例５：脂質ナノ粒子のＰＥＧ除去確認

【0347】

脂質ナノ粒子が細胞のエンドソーム内に進入した後には、エンドソーム脂質膜と脂質ナノ粒子の効果的な相互作用のために、エンドソーム内でＰＥＧを除去することが効率側面で有利である。分解可能官能基がない一般的なＰＥＧ－脂質コンジュゲートを使用する脂質ナノ粒子は、エンドソームの内部環境を摸写する酸性条件で粒子の構造が相対的に安定している。これに対し、ＰＥＧ－Ｈｚ－ＤＳＧのように酸性条件で分解される官能基を含む脂質ナノ粒子は、酸性条件でＰＥＧが除去されて不安定になる。これを確認するために、通常の脂質ナノ粒子製造比率である１．５モル％ＰＥＧ－ＤＭＧを含むナノ粒子と本発明で使用するＰＥＧ６００－Ｈｚ－ＤＳＧを１０モル％含む脂質ナノ粒子を、ｐＨ ７．４、５．５、５．０、４．５の緩衝溶液でサイズ変化を測定した。

【0348】

ＰＥＧ－ＤＭＧを使用して製造されたナノ粒子をそれぞれ、ｐＨ条件で粒子サイズの変化を時系列で観察すれば、大きい変化がないことが分かる（図４Ａ）。一方、ＰＥＧ６００－Ｈｚ－ＤＳＧを含む脂質ナノ粒子のサイズは、中性条件であるｐＨ ７．４では安定したサイズを保持するが、酸性ｐＨ環境では粒子間の融合が活性化されることが分かる（図４Ｂ）。のみならず、各酸性条件では、粒子間の融合現象が持続して経時進行してサイズが益々増加することが分かる。すなわち、ナノ粒子表面を構成しているＰＥＧが酸性条件で効果的に除去されることが分かる。

【0349】

したがって、ヒドラゾンのように酸性条件で加水分解される官能基を含むＰＥＧ－Ｈｚ－ＤＳＧは、脂質ナノ粒子を製造する時の酸性条件（ｐＨ ４、エタノール２０～４０％緩衝溶液）では構造的安定性を維持するが（図１）、エタノールを除去した後には酸性ｐＨでヒドラゾンが速く加水分解され、ＰＥＧと脂質部分とが分離されたことが確認できる。

【0350】

【0351】

実施例６：分解可能官能基の加水分解時点確認

【0352】

脂質ナノ粒子表面のＰＥＧを除去する時点によって効能差が発生するか否かを確認するために、ＰＥＧ６００－Ｈｚ－ＤＳＧを５又は１０モル％含有する脂質ナノ粒子を製造する際に、ルシフェラーゼをターゲットとするｓｉＲＮＡを含めて製造した。脂質ナノ粒子をｐＨ ７又は４緩衝溶液で２４時間処理した後、ルシフェラーゼを常時発現する細胞株に７２時間処理してルシフェラーゼ発現量を測定した。

【0353】

ｐＨ ７の緩衝溶液で前処理された脂質ナノ粒子は、効果的にルシフェラーゼ発現を抑制できるが、ｐＨ ４緩衝溶液でＰＥＧが除去された脂質ナノ粒子は効能が全く観察されなかった（図５）。すなわち、脂質ナノ粒子が細胞のエンドソーム内に進入した後にＰＥＧが除去されてこそ効能が発生するが、細胞にアップテークされる前にＰＥＧが除去されたナノ粒子は効能を喪失するということが分かった。

【0354】

【0355】

実施例７：分解可能官能基の化学構造が効能に及ぼす影響評価

【0356】

ＰＥＧモイエティ－分解可能官能基－脂質コンジュゲート成分において分解可能官能基をなす化学的構造によって、酸性条件での加水分解半減期に差異が発生する。酸性条件での加水分解敏感度が脂質ナノ粒子の効能に及ぼす影響を確認するために、分解可能官能基をエステル（ＰＥＧ６００－Ｅｓｔｅｒ－ＤＳＧ、化学式８）又はアリールヒドラゾン（ＰＥＧ６００－ＰｈＨｚ－ＤＳＧ、化学式９）とするＰＥＧ誘導体を１、２、５、１０モル％含む脂質ナノ粒子を製造した。

【0357】

［化学式８］

【0358】

【0359】

［化学式９］

【0360】

【0361】

該当脂質ナノ粒子にルシフェラーゼをターゲットとするｓｉＲＮＡ含めて製造し、ルシフェラーゼを常時発現する細胞株に２４時間処理後に、ルシフェラーゼ活性を測定した（図６Ａ）。

【0362】

ＰＥＧ６００－Ｈｚ－ＤＳＧとＰＥＧ６００－Ｅｓｔｅｒ－ＤＳＧの含有量が増加するほど、脂質ナノ粒子の効率が向上することが分かったし、ヒドラゾン官能基がエステル官能基に比べて優れた効率を示すことが確認できた。

【0363】

このような結果と各官能基の酸性条件加水分解敏感度との相関関係を確認するために、該当ＰＥＧモイエティ－分解可能官能基－脂質コンジュゲートを１０モル％含有する脂質ナノ粒子を、ＰＢＳ ｐＨ７．４又はクエン酸ｐＨ ４．５緩衝溶液に移した後、粒子のサイズ変化を動的光散乱方式で測定した（図６Ｂ）。ヒドラゾン、エステル、アリールヒドラゾンの官能基順に粒子のサイズが増加したが、これは、各官能基が前記の順に酸性条件でよく加水分解されるということを意味する。すなわち、活発に加水分解されてＰＥＧが効果的に除去されるほど、優れた効率を示すということが、図６Ａ及び図６Ｂから確認できた。

【0364】

【0365】

実施例８：脂質ナノ粒子の脂質膜融合及び溶血反応（ｈｅｍｏｌｙｓｉｓ）誘発評価

【0366】

脂質ナノ粒子がエンドソーム脂質膜と融合する程度を調べるために、イオン化脂質のｐＫａよりも低いｐＨ条件でリポソーム脂質膜又は赤血球とナノ粒子とを混合し、脂質膜融合反応又は溶血反応を測定して評価した。本実施例に使用されたイオン化脂質は、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡであるが、この物質のアミン基ｐＫａは約６．５であり、ｐＨ ４条件ではアミン基が陽電荷を帯びる。陽電荷は、エンドソームの脂質膜の陰電荷と静電気的引力によってより容易に融合が進行するように助ける。しかし、ナノ粒子の表面にＰＥＧが分布すると、静電気的引力をＰＥＧが弱化させる遮り効果を発生させる他にも、ナノ粒子の表面とエンドソームの脂質膜との直接接触を妨害する効果がある。

【0367】

脂質ナノ粒子とエンドソーム脂質膜との融合効率を評価するために、ＰＥＧ６００－Ｈｚ－ＤＳＧ １０モル％又は脂質ナノ粒子の製造に通常使用されるＰＥＧ－ＤＭＧ １．５モル％を含む脂質ナノ粒子を製造したが、このとき、各ナノ粒子に、１８：１ ＮＢＤ ＰＥ（１，２－ｄｉｏｌｅｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ－Ｎ－（７－ｎｉｔｒｏ－２－１，３－ｂｅｎｚｏｘａｄｉａｚｏｌ－４－ｙｌ）（ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓａｌｔ））と１８：１ Ｌｉｓｓ Ｒｈｏｄ ＰＥ（１，２－ｄｉｏｌｅｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ－Ｎ－（ｌｉｓｓａｍｉｎｅ ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｂ ｓｕｌｆｏｎｙｌ）（ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓａｌｔ））を０．５モル％含めた。

【0368】

エンドソーム脂質膜を摸写するためにリポソームを製造して使用した。Ｓｏｙ ＰＳ：ＤＯＰＣ：ＤＯＰＥを２５：２５：５０モル％の割合でクロロホルムに総１ｍＭ濃度となるように溶解させ、丸底フラスコにおいてクロロホルムを減圧乾燥方式で除去した。ここに１ｍＬのＰＢＳを投入し、ソニケーションを行ってリポソームを生成した。

【0369】

ｐＨ ７．４、６．５、６．０、５．５、５．０、４．５緩衝溶液において各脂質ナノ粒子とリポソームとを混合した。脂質ナノ粒子に含まれたＮＢＤとＬｉｓｓ Ｒｈｏｄが近接した位置にある時には蛍光信号が測定できないが、ナノ粒子がリポソームの脂質膜と融合して蛍光脂質の相対的距離が遠ざかると、ＮＢＤの蛍光信号が増加するため、これを用いて脂質膜融合効率が測定できる。ｅｘ ４７５／ｅｍ ５４０波長条件でＮＢＤの蛍光信号を測定してナノ粒子の脂質膜融合効率を測定した。

【0370】

蛍光信号発生を測定し、ＰＥＧ－ＤＭＧ又はＰＥＧ６００－Ｈｚ－ＤＳＧを含む脂質ナノ粒子が酸性条件でリポソームの脂質膜と融合することが確認できた（図７Ａ）。特に、ＰＥＧを１．５％含むＰＥＧ－ＤＭＧ脂質ナノ粒子に比べて高い含有量である１０％ ＰＥＧ６００－Ｈｚ－ＤＳＧを含む脂質ナノ粒子において相対的により高いｐＨで脂質膜と融合を始め、より強い蛍光信号を発生することを確認した。すなわち、両ナノ粒子とも同一イオン化脂質を使用したため、イオン化脂質の陽電荷による効果は同一であるが、ＰＥＧ－ＤＭＧ脂質ナノ粒子のＰＥＧは粒子表面にそのまま存在するのに対し、ＰＥＧ６００－Ｈｚ－ＤＳＧのＰＥＧはヒドラゾン基の加水分解によって除去されるため、相対的に優れた脂質膜融合効率を示すことを確認した。

【0371】

脂質ナノ粒子と脂質膜との融合効率は、赤血球を使用した溶血実験からも確認できる。図７Ｂは、脂質ナノ粒子製造に一般的に使用するＰＥＧ－ＤＭＧをそれぞれ５、１０モル％含む脂質ナノ粒子を製造し、これを使用してｐＨ ４．５又は７．４の条件で溶血誘発反応を測定した結果を示す。ＰＥＧの含有量が５％から１０％に増加すると、溶血反応が抑制されることが確認できる。すなわち、ＰＥＧ含有量が増加すると、ＰＥＧによる遮り効果によって脂質膜融合能力が阻害されることが分かる。一方、リガンドを含むＰＥＧ６００－Ｈｚ－ＤＳＧを使用して製造した脂質ナノ粒子は、酸性条件で加水分解によってＰＥＧが除去されるため、ＰＥＧ誘導体の含有量が１０％に増加した脂質ナノ粒子も溶血反応を効果的に誘発することが分かる。

【0372】

参考として、ｐＨ７．４の中性条件ではイオン化脂質のアミン基が電気的に中性状態であるため、２種類の脂質ナノ粒子とも溶血反応を誘発しないことが分かる。すなわち、 中性状態のｐＨでは、脂質ナノ粒子周囲の他の細胞と相互作用を進行しないが、脂質ナノ粒子がエンドソームに到達した場合は、ＰＥＧ誘導体を含む脂質ナノ粒子が相対的に容易にエンドソーム脂質膜と融合過程を発生させることが分かる。

【0373】

【0374】

実施例９：ＰＥＧモイエティ－分解可能官能基－脂質コンジュゲートを構成する脂質の長さと脂質ナノ粒子の構造的安定性との関係

【0375】

上記の実施例から確認したように、脂質ナノ粒子表面を取り囲んでいるＰＥＧは、脂質ナノ粒子製造過程では必要であるが、薬理的効能側面では不利に作用する。したがって、脂質ナノ粒子が生体内で血流に乗って循環する間にＰＥＧが脂質ナノ粒子から自ずから除去されやすいように、ＰＥＧを炭素数が１４個で構成されたミリスチン酸（ｍｙｒｉｓｔａｔｅ）などの炭化水素脂肪に連結した物質であるＰＥＧ－ＤＭＧを一般的に使用する。パルミチン酸（ｐａｌｍｉｔａｔｅ、炭素数１６個）、ステアリン酸（ｓｔｅａｒａｔｅ、炭素数１８個）など、脂肪酸の長さが相対的に長い物質を使用して製造された脂質ナノ粒子は、血流による循環過程でＰＥＧ除去が円滑でないため、細胞のエンドソーム進入が難しく、結果して効能が低下する。

【0376】

しかしながら、脂肪酸の長さが短いＰＥＧ－脂質コンジュゲートを使用して循環過程中にＰＥＧ除去する方式は、脂質ナノ粒子の構造的安定性の側面では、非常に不安定な要因として作用する。脂質ナノ粒子からＰＥＧ－脂質コンジュゲートが分離されて除去され始めると、粒子自体の安定性が低下するため、脂質ナノ粒子を構成している他の脂質成分も流失され始める。これを確認するために、ＰＥＧ－ＤＭＧ（脂質の炭素長１４）を１．５％又は５％含有する脂質ナノ粒子と、脂肪酸の長さが１８と構成されたＰＥＧモイエティ－分解可能官能基－脂質コンジュゲート（化学式４）５％を含有する脂質ナノ粒子の構造的安定性を比較した。

【0377】

脂質ナノ粒子を製造する時に、蛍光を帯びる１８：１ ＮＢＤ ＰＥと１８：１ Ｌｉｓｓ Ｒｈｏｄ ＰＥをそれぞれ１モル％含めた。脂質ナノ粒子を３７℃のラット血漿に入れ、指定された時刻に試料を採取してＮＢＤの蛍光強度を測定した（図８）。粒子が安定的に維持された場合は、両蛍光染料がナノ粒子内で比較的近接した距離にあるため、ＮＢＤ蛍光染料の蛍光信号が小さく測定される。万一、ナノ粒子構造が不安定になると、ナノ粒子の構成成分の流出を誘発し、この場合、各蛍光染料が標識された脂肪酸も流出されながら蛍光信号が増加する。資料に見られるように、脂肪酸の長さが短いＰＥＧ－ＤＭＧを使用して製造された脂質ナノ粒子は、粒子の安定性に脆弱であるため、短時間で蛍光信号が増加するのに対し、脂肪酸の長さが長いＰＥＧモイエティ－分解可能官能基－脂質コンジュゲートは、蛍光信号増加が相対的に遅いことが分かる。すなわち、脂質ナノ粒子からＰＥＧを除去するために、意図的に、短い長さの脂肪酸からなるＰＥＧ－脂質コンジュゲートを使用する脂質ナノ粒子は、血流による循環過程でＰＥＧが除去されると同時に他の脂質成分も速く流失されるが、本発明で述べるＰＥＧモイエティ－分解可能官能基－脂質コンジュゲートを使用して製造された脂質ナノ粒子は、比較的安定した構造を保持できることが分かる。

【0378】

【0379】

実施例１０：脂質ナノ粒子の免疫反応誘発測定

【0380】

脂質ナノ粒子を構成するイオン化脂質は、免疫細胞との相互作用によって不要な免疫反応を誘発することがある。このような副作用を最小化するためにＰＥＧを使用できるが、上記の実施例に見られるように、ＰＥＧ含有量の増加は、不要な相互作用を抑制して免疫反応を効果的に軽減させることができるが、必然的に細胞によるナノ粒子のアップテーク効率と細胞内のエンドソーム脱出を深刻に阻害することにつながるため、ＰＥＧ含有量を必要最小量以上に増加させることは困難である。

【0381】

一方、本発明で述べるＰＥＧモイエティ－分解可能官能基－脂質コンジュゲートを含む脂質ナノ粒子は、リガンドを使用して細胞アップテーク効率を増加させることができ、エンドソーム内でのＰＥＧを除去できる化学官能基を含んでいる。したがって、ＰＥＧモイエティ－分解可能官能基－脂質コンジュゲートを使用すると、ＰＥＧ含有量を増加させても、製造された脂質ナノ粒子は効能が低下せず、同時に免疫反応誘発を抑制させることができる。これを確認するために、リガンドを含むＰＥＧモイエティ－分解可能官能基－脂質コンジュゲート１０モル％を使用した脂質ナノ粒子を、ラットから抽出した末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）と混合して、脂質ナノ粒子がサイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）を誘発する程度を測定した。図９に示すように、ＰＥＧモイエティ－分解可能官能基－脂質コンジュゲートを使用した脂質ナノ粒子の免疫反応誘発程度は、陰性対照群として使用したＰＢＳ緩衝溶液処理群と類似のレベルであることが分かる。

【0382】

【0383】

実施例１１：動物を用いた脂質ナノ粒子の効能評価

【0384】

細胞実験において効能を示す脂質ナノ粒子を用いて、生体内での効果を確認するために動物実験を行った。そのために、ＰＥＧ２Ｋ－ＰＥ－ＤＳＧ又はＰＥＧ２Ｋ－Ｈｚ－ＤＳＧを５モル％含む脂質ナノ粒子を製造したし、各脂質ナノ粒子は、Ｆａｃｔｏｒ ７をターゲットとするｓｉＲＮＡを含めた。８週齢のＣ５７ＢＬ／６雌マウス（ラオンバイオ）にＰＢＳ又は各脂質ナノ粒子を、ｓｉＲＮＡ基準で０．３又は１ｍｇ／ｋｇ容量を静脈注射方式（Ｉ．Ｖ．ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）で注入した。注入時に、物質の投与体積は１０ｍＬ／ｋｇを維持した。注入して４８時間後に、血清内のＦａｃｔｏｒ ７の含有量をＦａｃｔｏｒ ７分析キット（Ａｂｃａｍ）で定量し、ＰＢＳを投入した陰性対照群対比の含有量を測定した（図１０）。

【0385】

細胞を用いた実験結果（図２Ａ）と類似に、分解可能官能基であるヒドラゾンを含んでいる脂質ナノ粒子では、容量依存的にＦａｃｔｏｒ ７の発現を抑制したが、分解可能官能基を含んでいない脂質ナノ粒子では、効能が確認できなかった。

【0386】

【0387】

実施例１２：リガンドを含む脂質ナノ粒子の効能評価

【0388】

特定受容体を発現する組織にナノ粒子を選択的に伝達するために、該当受容体と特異的に結合するリガンドを脂質ナノ粒子に含めて製造することができる。リガンドを含む脂質ナノ粒子の効果を確認するために、ＰＥＧ６００－Ｈｚ－ＤＳＧを１０モル％含む脂質ナノ粒子と、肝組織に特異的な伝達のために０．５モル％のＧａｌＮａｃ－ＰＥＧ２Ｋ－Ｈｚ－ＤＳＧと９．５モル％のＰＥＧ６００－Ｈｚ－ＤＳＧを混合使用した脂質ナノ粒子をそれぞれ製造した。ｓｉＲＮＡ基準で０．１ｍｇ／ｋｇの容量をマウスに投与したが、実施例１１に記載の方式と同一にして動物実験を行った。

【0389】

結果として、肝特異的なリガンドを含む脂質ナノ粒子が、リガンドを含まない脂質ナノ粒子に比べてより優れた効能を示すことが分かった（図１１）。

【0390】

【0391】

実施例１３：脂質ナノ粒子の細胞毒性評価

【0392】

通常使用されるＰＥＧ－ＤＭＧを含む脂質ナノ粒子と、本発明で使用するＰＥＧモイエティ－分解可能官能基－脂質コンジュゲートを含む脂質ナノ粒子との相対的毒性を評価した。そのために、ＰＥＧ－ＤＭＧを１．５モル％含む脂質ナノ粒子と、ＧａｌＮＡｃ－ＰＥＧ２Ｋ－Ｈｚ－ＤＳＧとＰＥＧ６００－Ｈｚ－ＤＳＧがそれぞれ１モル％及び９モル％である混合物を含む脂質ナノ粒子を製造した。脂質ナノ粒子に含まれたｓｉＲＮＡ濃度を基準にＨｅｐＧ２、ＨＥＫ２９３、Ｈ４６０、Ａ５４９などの細胞株に処理し、７２時間後に各細胞株の活性をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏキット（プロメガ）で測定した（図１２）。

【0393】

ＰＥＧ－ＤＭＧを含む脂質ナノ粒子を高濃度で細胞に処理すると、細胞が多く死滅するのに対し、本発明で使用するＰＥＧモイエティ－分解可能官能基－脂質コンジュゲートを１０モル％含む脂質ナノ粒子は、相対的に細胞の死滅を誘発しないことを確認し、毒性が非常に低いということが分かった。

【0394】

【0395】

本発明に係る脂質ナノ粒子を用いた治療剤は、ナノ粒子の構成成分による生体内副作用を最小化し、ナノ粒子をターゲット細胞に効果的に伝達し、ターゲット細胞内のエンドソームを脱皮して核酸などの薬理効能物質を細胞質に効率的に運搬できる。

【0396】

本発明に係る脂質ナノ粒子は、粒子の外部がＰＥＧでコートされているので、非特異的な相互作用を抑制させることができる。また、ＰＥＧ末端にリガンドを付着して標的細胞にのみ伝達できる。リガンドと細胞の受容体によってエンドソーム内取り込まれた脂質ナノ粒子は、エンドソーム内で分解可能官能基が分解され、ナノ粒子外部のＰＥＧが除去されるため、脂質ナノ粒子の表面とエンドソーム脂質膜との相互作用を増加させることができる。また、ＰＥＧを連結する脂肪成分に、相対的に長さの長い鎖の脂肪酸を含めることができるので、脂質ナノ粒子に構造的安定性を付与し、細胞への処理中に粒子が安定して維持される効果がある。

【0397】

【0398】

以上、本発明内容の特定の部分を詳細に記述したが、当業界における通常の知識を有する者にとって、このような具体的記述は単に好ましい実施態様であるだけで、これによって本発明の範囲が制限されるものでない点は明らかであろう。したがって、本発明の実質的な範囲は、請求項とそれらの等価物によって定義されると言えよう。

【図1A】

【図1B】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図3E】

【図3F】

【図4A】

【図4B】

【図5】

【図6A】

【図6B】

【図7A】

【図7B】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【手続補正書】

【提出日】2024-02-21

【手続補正1】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１８２

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0182】

実施例１－２：２－メチル－３，４，６－トリ－Ｏ－アセチル－１，２－デオキシ－アルファ－Ｄ－ガラクトピラノ［２，１，ｄ］－２－オキサゾリン

【手続補正2】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１８９

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0189】

ＤＣＥ（７．２ｍＬ）に溶かした２－メチル－３，４，６－トリ－Ｏ－アセチル－１，２－デオキシ－アルファ－Ｄ－ガラクトピラノ［２，１，ｄ］－２－オキサゾリン（３９０ｍｇ、１．１８ｍｍｏｌ）と２－（２－（２－アジドエトキシ）エトキシ）エタノール（２２８ｍｇ、１．３０ｍｍｏｌ）との混合溶液に、４Å分子体（１９０ｍｇ）を入れて５分撹拌した。トリメチルシリルトリフルオロメタンスルホン酸塩（１０４μＬ、０．５９ｍｍｏｌ）を常温で添加した後、１６時間撹拌した。反応が終わった後に濾過して４Å分子体を除去し、水とＣＨ_２Ｃｌ_２を加えた。有機溶媒層を分離し、硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過した後に減圧蒸留した。減圧蒸留して得られた混合物はカラムクロマトグラフィー（ＥＡ：ＭｅＯＨ＝９：１）で分離し、所望の化合物（４６０ｍｇ、０．９１ｍｍｏｌ）を７７％収率で得た。

【手続補正3】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１９４

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0194】

ＴＨＦ（１０ｍＬ）に溶かした５－アセトアミノ－２－（アセトキシメチル）－６－（２－（２－（２－アジドエトキシ）エトキシ）エトキシ）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－３，４－ジイルジアセテート（２４０ｍｇ、０．４７６ｍｍｏｌ）溶液にＰＰｈ_３（１５０ｍｇ、０．５７１ｍｍｏｌ）を常温で添加した後、４８時間撹拌した。Ｈ_２Ｏ（２６μＬ、１．４２７ｍｍｏｌ）を添加した後、２４時間撹拌した。その後、トルエン（１０ｍＬ）を添加し、トリフルオロ酢酸（７３μＬ、０．９５１ｍｍｏｌ）を添加して塩を生成した。水とＣＨ_２Ｃｌ_２を加えた後に、抽出した水層を減圧蒸留し、所望の化合物（２７０ｍｇ、０．９１ｍｍｏｌ）を９８％収率で得た。

【手続補正4】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１９７

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0197】

実施例１－５：トリス｛［２－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）エトキシ］メチル｝メチルアミン

【手続補正5】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１９９

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0199】

ＤＭＳＯ（２．０ｍＬ）に溶かしたトリス（１．２１ｇ、１０．００ｍｍｏｌ）溶液に５．０Ｍ水酸化ナトリウム（０．２ｍＬ）を１５℃で添加した後、５分間撹拌した。ｔ－ブチルアクリレート（５．０ｍＬ、３４ｍｍｏｌ）を徐々に滴加した。次に、水（０．２ｍＬ）を添加した後、アルゴン下、常温で２４時間撹拌した。反応が終わった後、減圧蒸留して得られた混合物はカラムクロマトグラフィー（ＥＡ：Ｈｅｘ＝２：１）で分離し、所望の化合物（２．５ｇ、５．００ｍｍｏｌ）を５０％収率で得た。

【手続補正6】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０２０４

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0204】

トルエン（２．５ｍＬ）に溶かした（Ｒ）－３－ベンジロキシ－１，２－プロパンジオール（１０６ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）溶液に、１－ブロモオクタデカン（７３２ｍｇ、２．２０ｍｍｏｌ）、水酸化カリウム（１２３ｍｇ、２．２０ｍｍｏｌ）を常温で添加した後、１１０℃で２４時間還流させた。反応が終わった後に水とＣＨ_２Ｃｌ_２を加えた。抽出した有機溶媒層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、減圧蒸留した。減圧蒸留して得られた混合物はカラムクロマトグラフィー（Ｈｅｘ：ＥＡ＝１０：１）で分離し、所望の化合物（３００ｍｇ、０．４４ｍｍｏｌ）を８０％収率で得た。

【手続補正7】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０２１４

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0214】

ＣＨ_２Ｃｌ_２（３．７ｍＬ）に溶かしたデス-マーチンペルヨージナン（８８ｍｇ、０．２０６ｍｍｏｌ）溶液を、ＣＨ_２Ｃｌ_２（１．３ｍＬ）に溶かした（Ｓ）－２，３－ｂｉｓ（オクタデシロキシ）プロパン－１－オール（１１０ｍｇ、０．１８４ｍｍｏｌ）溶液に０℃で徐々に滴加した後、常温で２時間撹拌した。反応が終わった後に水とＣＨ_２Ｃｌ_２、炭酸水素ナトリウム水溶液を加えた。抽出した有機溶媒層、チオ硫酸ナトリウム溶液で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、減圧蒸留した。減圧蒸留して得られた混合物はカラムクロマトグラフィー（Ｈｅｘ：ＥＡ＝２０：１）で分離し、所望の化合物（８３ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）を８０％収率で得た。

【手続補正8】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０２１７

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0217】

実施例１－９：カルボキシメチル－ＰＥＧ６００－Ｃｂｚ－ヒドラジド（Ｍ _ｎ ｏｆ ＰＥＧ＝６００）

【手続補正9】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０２１９

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0219】

ＤＭＦ（５．８ｍＬ）にポリ（エチレングリコール）ビスカルボキシメチル）エーテル（Ｍ _ｎ ＝６００）（１ｇ、１．７２ｍｍｏｌ）を溶解させた後、０℃でＣｂｚＮＨＮＨ_２（３００ｍｇ、１．８１ｍｍｏｌ）、ヒドロキシベンゾトリアゾル（２４４ｍｇ、１．８１ｍｍｏｌ）、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（３２０μＬ、１．８１ｍｍｏｌ）を滴加した。アルゴン下、常温で１８時間撹拌した。反応が終わった後、水とＣＨ_２Ｃｌ_２、炭酸水素ナトリウム水溶液を加えた。分離した水相は、Ｈ _３ ＰＯ _４ で酸性化し、そしてＣＨ _２ Ｃｌ _２ で抽出した。そして有機層を減圧蒸留して得られた生成物を４０％収率で得た。

【手続補正10】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０２２２

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0222】

実施例１－１０：トリス｛［２－（ｔ－ブトキシカルボニル）エトキシ］メチル｝メチルアミド－ＰＥＧ６００－Ｃｂｚ－ヒドラジド（Ｍ _ｎ ｏｆ ＰＥＧ＝６００）

【手続補正11】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０２２４

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0224】

ＤＭＦ（４ｍＬ）にカルボキシメチル－ＰＥＧ６００－Ｃｂｚ－ヒドラジド（Ｍ _ｎ ＝６００）（８７０ｍｇ、１．１６ｍｍｏｌ）、トリス｛［２－（ｔ－ブトキシカルボニル）エトキシ］メチル｝メチルアミン（５２６ｍｇ、１．０４ｍｍｏｌ）を溶解させた後、０℃でヒドロキシベンゾトリアゾル（１５７ｍｇ、１．１６ｍｍｏｌ）、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（２４８μＬ、１．４０ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルエチルアミン（２４３μＬ、１．４０ｍｍｏｌ）を滴加した。アルゴン下、常温で１８時間撹拌した。反応が終わった後、水とＣＨ_２Ｃｌ_２、Ｈ _３ ＰＯ _４ を加えた。抽出した有機溶媒層は、ＮａＨＣＯ _３ 液で洗浄した。有機溶媒層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過した後に減圧蒸留した。減圧蒸留して得られた混合物はカラムクロマトグラフィー（ＣＨ_２Ｃｌ_２：ＭｅＯＨ＝１５：１）で分離し、所望の化合物を４０％収率で得た。

【手続補正12】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０２２７

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0227】

実施例１－１１：トリス｛［２－（カルボキシメチル）エトキシ］メチル｝メチルアミド－ＰＥＧ６００－Ｃｂｚ－ヒドラジド（Ｍ _ｎ ｏｆ ＰＥＧ＝６００）

【手続補正13】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０２２９

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0229】

トリス｛［２－（ｔ－ブトキシカルボニル）エトキシ］メチル｝メチルアミド－ＰＥＧ６００－Ｃｂｚ－ヒドラジド（５７０ｍｇ、０．４６ｍｍｏｌ）を８５％ギ酸（４．０ｍＬ）に溶かし、常温で１８時間撹拌した。反応が終わった後、５０℃で減圧蒸留し、所望の化合物を９９％収率で得た。

【手続補正14】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０２３２

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0232】

実施例１－１２：トリ－（パラセチル－ＧａｌＮＡｃ）－ＰＥＧ６００－Ｃｂｚヒドラジド

【手続補正15】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０２３４

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0234】

ＤＭＦ（４．４ｍＬ）にトリス｛［２－（カルボキシメチル）エトキシ］メチル｝メチルアミド－ＰＥＧ６００－Ｃｂｚ－ヒドラジド（０．５ｍｍｏｌｅ）、２－（２－（２－アミノエトキシ）エトキシ）エチル ２－アセトアミノ－３，４，６－トリ－Ｏ－アセチル－２－デオキシ－α－Ｄ－ガラクトピラノシド（１．５８ｍｍｏｌ）を溶解させた後、０℃でヒドロキシベンゾトリアゾル（２１４ｍｇ、１．５８ｍｍｏｌ）、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（２８０μＬ、１．５８ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルエチルアミン（５５０μＬ、３．１６ｍｍｏｌ）を滴加した。アルゴン下、常温で１８時間撹拌した。さらにアルゴン下、常温でジイソプロピルエチルアミン（５５０μＬ、３．１６ｍｍｏｌ）を滴加し、常温で２４時間撹拌した。反応が終わった後、水、ＣＨ_２Ｃｌ_２、Ｈ _３ ＰＯ _４ を加えた。抽出した有機溶媒層は、分離し、ＮａＨＣＯ _３ 液で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過した後に減圧蒸留した。得られた混合物はカラムクロマトグラフィー（ＣＨ_２Ｃｌ_２：ＭｅＯＨ＝１０：１）で分離し、所望の化合物を２３％収率で得た。

【手続補正16】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０２３７

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0237】

実施例１－１３：トリ－（パラセチル－ＧａｌＮＡｃ）－ＰＥＧ６００－ヒドラジド

【手続補正17】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０２３９

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0239】

ＭｅＯＨ（２ｍＬ）にトリ－（パラセチル－ＧａｌＮＡｃ）－ＰＥＧ６００－Ｃｂｚヒドラジド（３７３ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）を溶解させた後、Ｐｄ／Ｃ（１３ｍｇ）、酢酸（２８μＬ、０．４８ｍｍｏｌ）を滴加した。水素下、常温で２０時間撹拌した。反応が終わった後、セライト５４５を使用してメタノール溶媒で濾過した後に減圧蒸留し、所望の化合物（１２０ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）を９９％収率で得た。

【手続補正18】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０２４２

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0242】

実施例１－１４：トリ－（パラセチル－ＧａｌＮＡｃ）－ＰＥＧ６００－(ジオクタデシルオキシ-プロピリデン)－アシルヒドラゾン

【手続補正19】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０２４４

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0244】

ＥｔＯＨ（１ｍＬ）、ＣＨ_２Ｃｌ_２（０．１ｍＬ）混合溶液にトリ－（パラセチル－ＧａｌＮＡｃ）－ＰＥＧ６００－ヒドラジド（０．０５ｍｍｏｌ）、（Ｒ）－２，３－ｂｉｓ（オクタデシロキシ）プロパンアル（３９ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ）を溶解させた後、アルゴン下、常温で３時間撹拌した。反応が終わった後、減圧蒸留した。得られた混合物はカラムクロマトグラフィー（ＣＨ_２Ｃｌ_２：ＭｅＯＨ＝１０：１）で分離し、所望の化合物を２６％収率で得た。

【手続補正20】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０２４７

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0247】

実施例１－１５：トリ－（ＧａｌＮＡｃ）－ＰＥＧ６００－(ジオクタデシルオキシ-プロピリデン)－アシルヒドラゾン（３ＧａｌＮＡｃ－ＰＥＧ６００－Ｈｚ－ＤＳＧ）

【手続補正21】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０２５０

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0250】

ＭｅＯＨ（１ｍＬ）、ＣＨ_２Ｃｌ_２（０．１ｍＬ）混合溶液に、トリ－（パラセチル－ＧａｌＮＡｃ）－ＰＥＧ６００－(ジオクタデシルオキシ-プロピリデン)－アシルヒドラゾン（０．０１３ｍｍｏｌ）を溶解させた後、メトキシドナトリウム（０．７ｍｇ、０．０１３ｍｍｏｌ）を滴加した。アルゴン下、常温で２時間撹拌した。反応が終わった後、アンバーライトＩＲ－１２０イオン交換樹脂で処理後に減圧蒸留し、所望の化合物を２６％収率で得た。

【手続補正22】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０２５３

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0253】

実施例１－１６：カルボキシメチル－ＰＥＧ２０００－Ｃｂｚ－ヒドラジド（Ｍ _ｎ ｏｆ ＰＥＧ＝２０００）

【手続補正23】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０２５８

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0258】

実施例１－１７：トリス｛［２－（ｔ－ブトキシカルボニル）エトキシ］メチル｝メチルアミド－ＰＥＧ２０００－Ｃｂｚ－ヒドラジド（Ｍ _ｎ ｏｆ ＰＥＧ＝２０００）

【手続補正24】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０２６３

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0263】

実施例１－１８：トリス｛［２－（カルボキシメチル）エトキシ］メチル｝メチルアミド－ＰＥＧ２０００－Ｃｂｚ－ヒドラジド（Ｍ _ｎ ｏｆ ＰＥＧ＝２０００）

【手続補正25】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０２６８

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0268】

実施例１－１９：トリ－（パラセチル－ＧａｌＮＡｃ）－ＰＥＧ２Ｋ－Ｃｂｚヒドラジド

【手続補正26】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０２７３

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0273】

実施例１－２０：トリ－（パラセチル－ＧａｌＮＡｃ）－ＰＥＧ２Ｋ－ヒドラジド

【手続補正27】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０２７８

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0278】

実施例１－２１：トリ－（パラセチル－ＧａｌＮＡｃ）－ＰＥＧ２Ｋ－(ジオクタデシルオキシ-プロピリデン)－アシルヒドラゾン

【手続補正28】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０２８３

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0283】

実施例１－２２：トリ－（ＧａｌＮＡｃ）－ＰＥＧ２Ｋ－(ジオクタデシルオキシ-プロピリデン)－アシルヒドラゾン（３ＧａｌＮＡｃ－ＰＥＧ２Ｋ－Ｈｚ－ＤＳＧ）

【手続補正29】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０２８８

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0288】

実施例１－２３．メチル－ＰＥＧ６００－Ｃｂｚヒドラジド（Ｍ _ｎ ｏｆ ＰＥＧ＝６００）

【手続補正30】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０２９０

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0290】

２．７ｍＬ ＤＭＦにα-メチル-ω-カルボキシメチル-ポリ(エチレングリコール)エーテル（Ｍ _ｎ ｏｆ ＰＥＧ＝６００）（１５０ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）を溶解させた後、ＣｂｚＮＨＮＨ_２（５０ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）、ＥＤＣＩ（５８μＬ、０．３３ｍｍｏｌ）及びＨＯＢｔ（４４ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）を０℃で添加し、室温で一日撹拌した。反応終結後に反応物をＤＣＭ（４０ｍＬ）に移し、希釈したＨ_３ＰＯ_４（１Ｍ、４０ｍＬ）、ＮａＨＣＯ_３（１Ｍ、４０ｍＬ）水溶液（４０ｍＬ）で洗浄した後、硫酸マグネシウムで乾燥させた。反応物をシリカゲルカラムにおいてＤＣＭ／メタノール（１０／１，ｖ／ｖ）で分離し、化合物１７５ｍｇを９１％収率で得た。

【手続補正31】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０２９３

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0293】

実施例１－２４：メチル－ＰＥＧ６００－ヒドラジド（Ｍ _ｎ ｏｆ ＰＥＧ＝６００）

【手続補正32】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０２９５

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0295】

メタノール（２．８ｍＬ）にメチル－ＰＥＧ６００－Ｃｂｚヒドラジド（１７５ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）を溶解させ、Ｐｄ／Ｃ（１８ｍｇ、１０ｗ／ｗ％）を添加して、水素下で２０時間撹拌した。反応終結後にセライト５４５で濾過し、化合物１４７ｍｇを９５％収率で得た。

【手続補正33】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０２９８

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0298】

実施例１－２５：メチル－ＰＥＧ６００－（ジオクタデシルオキシ－プロピリデン）アシルヒドラゾン（ｍＰＥＧ６００－Ｈｚ－ＤＳＧ）

【手続補正34】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０３００

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0300】

１．３ｍＬエタノールに実施例１－２４の結果物（７９ｍｇ、０．１２７ｍｍｏｌ）を溶解し、実施例１－８の結果物アルデヒド（１１３ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ）を添加した。混合物は５０℃で１８時間撹拌し、反応を終結させた。反応物をカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物１２３ｍｇを８５％の収率で得た。

【手続補正35】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０３０３

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0303】

実施例１－２６：メチル－ＰＥＧ２Ｋ－Ｃｂｚ－ヒドラジド（Ｍ _ｎ ｏｆ ＰＥＧ＝２０００）

【手続補正36】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０３０８

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0308】

実施例１－２７：メチル－ＰＥＧ２Ｋ－ヒドラジド（Ｍ _ｎ ｏｆ ＰＥＧ＝２０００）

【手続補正37】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０３１３

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0313】

実施例１－２８：メチル－ＰＥＧ２Ｋ－（ジオクタデシルオキシ－プロピリデン）－アシルヒドラゾン（ｍＰＥＧ２Ｋ－Ｈｚ－ＤＳＧ）

【手続補正38】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０３２０

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0320】

２ｍＬ ＴＨＦに実施例１－７の結果物（５９．８ｍｇ、１００ｕｍｏｌ）を溶解し、４－ヒドロキシアセトフェノン（１５．０ｍｇ、１１０ｕｍｏｌ）、ＰＰｈ_３（３９．４ｍｇ、１５０ｕｍｏｌ）、ＤＩＡＤ（３０ｕＬ，１５０ｕｍｏｌ）を０℃で添加した。混合物を室温で１２時間撹拌して反応を終結させた。反応物をジクロロメタンで３回抽出し、塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、減圧で乾燥させた。シリカゲルクロマトグラフィーで結果物を精製し、結果物５５．０ｍｇを７７％の収率で得た。

【手続補正39】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０３２３

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0323】

実施例１－３０：メチル－ＰＥＧ６００－（２，３－ジオクタデシルオキシプロポキシ）フェニル－アセトヒドラゾン（ｍＰＥＧ６００－ＰｈＨｚ－ＤＳＧ）

【手続補正40】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０３２７

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0327】

実施例１－３１：メチル－ＰＥＧ６００－（２，３－ジオクタデシルオキシプロポキシ）カルボニル－メチルエーテル（ｍＰＥＧ６００－Ｅｓｔｅｒ－ＤＳＧ）

【手続補正41】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０３２９

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0329】

ＤＣＭ（３０．０ｍＬ）にω－（メトキシポリエチレングリコール）カルボン酸（Ｍ _ｎ ＝６００）（１００ｍｇ、０．１５６ｍｍｏｌ）を溶解させた後、（Ｓ）－２，３－ビス（オクタデシルオキシ）プロパン－１－オール（１８７ｍｇ、０．３１２ｍｍｏｌ）、４－ジメチルアミノピリジン（２３ｍｇ、０．１８７ｍｍｏｌ）及びジシクロヘキシルカルボジイミド（３７ｍｇ、０．１８０ｍｍｏｌ）を滴加した。窒素下、常温で２４時間撹拌した。反応が終わった後、反応物をＣＨ _２ Ｃｌ _２ とセライト５４５でフィルターした。有機溶媒層を水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過した後に減圧蒸留した。減圧蒸留して得られた混合物はカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ：ＭｅＯＨ＝２０：１）で分離し、所望の化合物（６８ｍｇ、０．６４ｍｍｏｌ）を４１％収率で得た。

【国際調査報告】