知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
▶ サンシャイン・グオジアン・ファーマシューティカル（シャンハイ）カンパニー・リミテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-07-17
(54)【発明の名称】三重特異性抗体、その調製方法および用途
(51)【国際特許分類】
C07K 16/46 20060101AFI20240709BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20240709BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240709BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20240709BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20240709BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240709BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240709BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20240709BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240709BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240709BHJP
【ＦＩ】
C07K16/46 ZNA
C12N15/13
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12P21/08
A61P35/00
A61K39/395 T
A61K39/395 E
A61K39/395 D
A61K39/395 U
A61K39/395 N
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023579715
(86)(22)【出願日】2022-06-21
(85)【翻訳文提出日】2024-02-14
(86)【国際出願番号】 CN2022100105
(87)【国際公開番号】W WO2023273958
(87)【国際公開日】2023-01-05
(31)【優先権主張番号】202110726683.9
(32)【優先日】2021-06-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】523029928
【氏名又は名称】サンシャイン・グオジアン・ファーマシューティカル（シャンハイ）カンパニー・リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100114188
【弁理士】
【氏名又は名称】小野 誠
(74)【代理人】
【識別番号】100119253
【弁理士】
【氏名又は名称】金山 賢教
(74)【代理人】
【識別番号】100124855
【弁理士】
【氏名又は名称】坪倉 道明
(74)【代理人】
【識別番号】100129713
【弁理士】
【氏名又は名称】重森 一輝
(74)【代理人】
【識別番号】100137213
【弁理士】
【氏名又は名称】安藤 健司
(74)【代理人】
【識別番号】100183519
【弁理士】
【氏名又は名称】櫻田 芳恵
(74)【代理人】
【識別番号】100196483
【弁理士】
【氏名又は名称】川嵜 洋祐
(74)【代理人】
【識別番号】100160749
【弁理士】
【氏名又は名称】飯野 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100160255
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 祐輔
(74)【代理人】
【識別番号】100219265
【弁理士】
【氏名又は名称】鈴木 崇大
(74)【代理人】
【識別番号】100203208
【弁理士】
【氏名又は名称】小笠原 洋平
(74)【代理人】
【識別番号】100146318
【弁理士】
【氏名又は名称】岩瀬 吉和
(74)【代理人】
【識別番号】100127812
【弁理士】
【氏名又は名称】城山 康文
(72)【発明者】
【氏名】ジャオ，ジエ
(72)【発明者】
【氏名】フアン，ハオミン
(72)【発明者】
【氏名】ズー，ジェンピン
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG27
4B064CA19
4B064CC24
4B064CE12
4B064DA01
4B065AA01X
4B065AA57X
4B065AA72X
4B065AA88X
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA25
4B065CA44
4C085AA13
4C085AA14
4C085BB31
4C085CC22
4C085CC23
4C085EE01
4C085EE03
4C085EE05
4C085GG01
4C085GG02
4C085GG03
4C085GG04
4C085GG06
4C085GG08
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA71
4H045BA72
4H045DA76
4H045EA20
4H045FA74
4H045GA26
(57)【要約】
６価三重特異性抗体を提供し、当該６価三重特異性抗体は、二つの単量体から形成される二量体であり、ここで、各単量体は、重鎖、第１の軽鎖および第２の軽鎖を含み、重鎖は、Ｎ末端からＣ末端まで、直列連結された第１の標的に対する抗体重鎖可変領域要素Ｚ１、第２の標的に対する抗体重鎖可変領域要素Ｚ２、第３の標的に対する抗体重鎖可変領域要素Ｚ３、および抗体重鎖定常領域Ｚ４を含み、第１の軽鎖は、Ｎ末端からＣ末端まで、直列連結された第１の標的に対する抗体軽鎖可変領域要素Ｚ５、および第２の標的に対する抗体軽鎖可変領域要素Ｚ６を含み、第２の軽鎖は、Ｎ末端からＣ末端まで、直列連結された第３の標的に対する抗体軽鎖可変領域要素Ｚ７、および抗体軽鎖定常領域Ｚ８を含み、第１の軽鎖および第２の軽鎖は、それぞれ重鎖と協働して、６価三重特異性抗体が第１の標的、第２の標的および第３の標的に特異的に結合するようにする。第１の標的、第２の標的および第３の標的は、ＰＤ－１、ＨＥＲ－２およびＬＡＧ－３であってもよい。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
６価三重特異性抗体であって、前記６価三重特異性抗体は、二つの単量体から形成される二量体であり、ここで、各単量体は、重鎖、第１の軽鎖および第２の軽鎖を含み、
前記重鎖は、Ｎ末端からＣ末端まで、直列連結された第１の標的に対する抗体重鎖可変領域要素Ｚ１、第２の標的に対する抗体重鎖可変領域要素Ｚ２、第３の標的に対する抗体重鎖可変領域要素Ｚ３、および抗体重鎖定常領域Ｚ４を含み、
前記第１の軽鎖および第２の軽鎖は、それぞれ前記重鎖と協働して、前記６価三重特異性抗体が第１の標的、第２の標的および第３の標的に特異的に結合するようにすることを特徴とする、前記６価三重特異性抗体。
【請求項2】
重鎖、第１の軽鎖および第２の軽鎖を含み、ここで、各前記重鎖は、以下の式Ｉの構造を有し、式（Ｉ）：Ｚ１－Ｚ２－Ｚ３－Ｚ４
Ｚ１は、第１の標的に対する重鎖可変領域要素であり、
Ｚ２は、第２の標的に対する重鎖可変領域要素であり、
Ｚ３は、第３の標的に対する重鎖可変領域要素であり、
Ｚ４は、抗体重鎖定常領域ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３であり、
「－」は、それぞれ独立して、結合またはリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）であり、
ここで、前記第１の軽鎖および第２の軽鎖は、それぞれ、重鎖と協働して、前記６価三重特異性抗体が第１の標的、第２の標的および第３の標的に特異的に結合するようにし、前記第１の軽鎖は、以下の式ＩＩの構造を有し、
式（ＩＩ）：Ｚ５－Ｚ６
ここで、Ｚ５は、第１の標的に対する軽鎖可変領域要素であり、Ｚ６は、第２の標的に対する軽鎖可変領域要素であり、
前記第２の軽鎖は、以下の式ＩＩＩの構造を有し、
式（ＩＩＩ）：Ｚ７－Ｚ８
ここで、Ｚ７は、第３の標的に対する軽鎖可変領域要素であり、Ｚ８は、軽鎖定常領域であることを特徴とする
請求項１に記載の６価三重特異性抗体。
【請求項3】
前記第１の標的、第２の標的および第３の標的は、ＰＤ－１、ＨＥＲ－２およびＬＡＧ－３であることを特徴とする請求項１または２に記載の６価三重特異性抗体。
【請求項4】
前記リンカーは、長さが１～３５個のアミノ酸であるペプチドリンカー、好ましくは６～３０個のアミノ酸であるペプチドリンカーであることを特徴とする請求項１～３のいずれか１項に記載の６価三重特異性抗体。
【請求項5】
前記６価三重特異性抗体は、二つの単量体を含み、各単量体は、重鎖および第１の軽鎖、および第２の軽鎖を含み、ここで、各単量体は、以下の式ＩＶの構造を有し、ＶＨＡ－Ｌ１－ＶＨＢ－Ｌ２－ＶＨＣ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３は、重鎖であり、
ＶＬＡ－Ｌ３－ＶＬＢは、第１の軽鎖であり、
ＶＬＣ－ＣＬは、第２の軽鎖であり、
ＶＨＡは、抗ＰＤ－１抗体の重鎖可変領域であり、
ＶＨＢは、抗ＨＥＲ－２抗体の重鎖可変領域であり、
ＶＨＣは、抗ＬＡＧ－３抗体の重鎖可変領域であり、
ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３は、それぞれ、抗体重鎖定常領域ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３であり、
ＶＬＡは、抗ＰＤ－１抗体の軽鎖可変領域であり、
ＶＬＢは、抗ＨＥＲ－２抗体の軽鎖可変領域であり、
ＶＬＣは、抗ＬＡＧ－３抗体の軽鎖可変領域であり、
ＣＬは、抗体の軽鎖定常領域であり、
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３は、それぞれ独立して、リンカー（ｌｉｎｋｅｒ）であり、
「－」は、それぞれ独立して、結合であり、
「～」は、ジスルフィド結合または共有結合を表わし、
ここで、前記６価三重特異性抗体は、ＰＤ－１、ＨＥＲ－２およびＬＡＧ－３に同時に結合することを特徴とする
請求項１～４のいずれか１項に記載の６価三重特異性抗体。
【請求項6】
前記リンカーは、柔軟性ペプチドリンカーであり、ここで、前記柔軟性ペプチドリンカーは、６～３０個のアミノ酸、好ましくは１０～２５個のアミノ酸を含むことを特徴とする請求項１～５のいずれか１項に記載の６価三重特異性抗体。
【請求項7】
前記６価三重特異性抗体は、二つの重鎖、二つの第１の軽鎖および二つの第２の軽鎖を含み、ここで、前記６価三重特異性抗体における重鎖、第１の軽鎖および第２の軽鎖のアミノ酸配列は、それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１４、１５および１３に示されたとおりであるか、または
前記６価三重特異性抗体における重鎖、第１の軽鎖および第２の軽鎖のアミノ酸配列は、それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１６、１７および１３に示されたとおりであるか、または
前記６価三重特異性抗体における重鎖、第１の軽鎖および第２の軽鎖のアミノ酸配列は、それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１８、１９および１３に示されたとおりであることを特徴とする
請求項１～６のいずれか１項に記載の６価三重特異性抗体。
【請求項8】
請求項１～７のいずれか１項に記載の６価三重特異性抗体をコードすることを特徴とする、単離された核酸分子。
【請求項9】
請求項８に記載の核酸分子を含むことを特徴とする、発現ベクター。
【請求項10】
請求項９に記載の発現ベクターを含むことを特徴とする、宿主細胞。
【請求項11】
請求項１～７のいずれか１項に記載の６価三重特異性抗体の調製方法であって、（ａ）発現条件下で、請求項１０に記載の宿主細胞を培養し、それによって前記６価三重特異性抗体を発現させる段階と、
（ｂ）（ａ）に記載の６価三重特異性抗体を分離および精製する段階とを含むことを特徴とする、前記調製方法。
【請求項12】
請求項１～７のいずれか１項に記載の６価三重特異性抗体および薬学的に許容されるベクターを含むことを特徴とする、医薬組成物。
【請求項13】
癌を治療するための薬物の調製における、請求項１～７のいずれか１項に記載の６価三重特異性抗体または請求項１２に記載の医薬組成物の用途。
【請求項14】
前記癌は、黒色腫、腎臓がん、前立腺がん、膵臓がん、乳がん、結腸がん、肺がん、食道がん、頭頚部扁平上皮がん、肝臓がん、卵巣がん、子宮頸がん、甲状腺がん、神経膠芽腫、神経膠腫および他の腫瘍性悪性疾患からなる群から選択されることを特徴とする請求項１３に記載の用途。
【請求項15】
（ａ）請求項１～７のいずれか１項中に記載の６価三重特異性抗体、および（ｂ）検出可能なマーカー、薬物、毒素、サイトカイン、放射性核種、または酵素からなる群から選択されるカップリング部分とを含むことを特徴とする、免疫コンジュゲート。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、抗体の分野に関し、具体的には、三重特異性抗体、その調製方法および用途に関する。
【背景技術】
【0002】
抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体は、広く使用された最初の癌免疫療法である。その後、二重特異性抗体は、癌免疫療法として人々に知られており、これらの抗体の一端は、癌細胞の表面の抗原に結合でき、他端は、Ｔ細胞の表面のＣＤ３に結合し、Ｔ細胞を動員および活性化して癌細胞を殺傷する（例えば、アムジェン社のブリナツモマブ（Ｂｌｉｎａｔｕｍｏｍａｂ））。ブリナツモマブは、癌細胞表面のＣＤ１９抗原およびＴ細胞表面のＣＤ３受容体を同時に標的とする二重特異性抗体であり、それが進行性Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）患者を治療する場合、患者の緩和率および生存期間を２倍にすることができる。この種類の二重特異性抗体は、Ｔ細胞の抗がん活性を効果的に活性化できる。
【0003】
しかしながら、通常、Ｔ細胞が活性化される場合、ＣＤ３媒介シグナル伝達経路だけでなく、ＣＤ２８と呼ばれる共刺激受容体媒介シグナル伝達経路も活性化される。このような二重活性化により、Ｔ細胞は、抗腫瘍活性を長期間維持することができる。最近Ｎａｔｕｒｅ Ｃａｎｃｅｒに掲載された研究（参照文献：Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，（２０１９）．Ｔｒｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｅｎｈａｎｃｅ ｔｈｅ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ｔｕｍｏｒ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｔｈｒｏｕｇｈ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｏ－ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ Ｃａｎｃｅｒ， ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４３０１８－０１９－０００４－ｚ）において、サノフィ（Ｓａｎｏｆｉ）社の研究開発チームは、三重特異性抗体を開発し、腫瘍関連抗原およびＴ細胞ＣＤ３に結合するだけでなく、Ｔ細胞表面のＣＤ２８にも結合でき、それによってＴ細胞の抗がん活性を増強する。ＣＤ２８受容体を活性化すると、Ｂｃｌ－ｘＬタンパク質の発現を刺激し、Ｂｃｌ－ｘＬは、Ｔ細胞のアポトーシスを防止し、それによってＴ細胞の活性を延長する。ＣＤ２８は、ＣＡＲ－Ｔ療法における共刺激受容体として使用されている。特定のＣＡＲ－Ｔ細胞によって発現された受容体は、ＣＤ３およびＣＤ２８の共刺激タンパク質ドメインを含む。インビトロ試験において、承認された抗ＣＤ３８モノクローナル抗体ダラツムマブ（Ｄａｒａｔｕｍｕｍａｂ）と比較して、三重特異性抗体によって溶解された癌細胞の比率は、３～４倍増加した。マウスの多発性骨髄腫モデルにおいて、この三重特異性抗体は、マウス体内に移植した腫瘍の大きさを用量依存的に縮小させることもできる。
【0004】
Ｔ細胞活性を刺激する癌免疫療法の一般的な副作用がサイトカイン放出症候群であるため、研究者は、この革新的な抗体の安全性を依然として検証する必要があり、これは、Ｔ細胞の過剰活性化によって引き起こされたものである。非ヒト霊長類モデルにおいて、この三重特異性療法は、制御可能な安全性を示しているが、その安全性は、ヒトおよびＭＭ（多発性骨髄腫）患者において検証される必要がある。
【0005】
「Ｎａｔｕｒｅ」に掲載されたコメント（参照文献：Ｇａｒｆａｌｌ ａｎｄ Ｊｕｎｅ．（２０１９）．Ｔｒｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｏｆｆｅｒ ａ ｔｈｉｒｄ ｗａｙ ｆｏｒｗａｒｄ ｆｏｒ ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｎａｔｕｒｅ， ｄｏｉ：１０．１０３８／ｄ４１５８６－０１９－０３４９５－３）によると、多発性骨髄腫患者は、常に新しい治療手段を必要とし、ＣＡＲ－Ｔのような効果的な治療手段でも、ほとんどの患者に一時的な症状の緩和しか期待できないからであることを示す。三重特異性抗体は、腫瘍の微小環境に基づいて免疫調節シグナルを正確に組み合わせて送達するための柔軟性プラットフォームを提供する可能性があり、それにより、三つの単一特異性抗体からなる併用療法よりも安全で効果的であることを示す。
【0006】
さらに、Ｎｕｍａｂは、ＵＳ２０１８０３５５０２４Ａ１中でその三重特異性抗体の設計方法を開示し、その特徴は、複数のＳｃＦｖ断片およびＦｖから構成されることである。Ｘｅｎｃｏｒ社は、ＵＳ２０１９０３５２４１６Ａ１中でその三重特異性抗体の設計方法を開示し、その特徴は、重鎖ヘテロ二量体化技術およびＳｃＦｖ断片を使用したことである。
【0007】
上記製品および関連企業に加えて、国際的に有名なジャーナルに掲載された最初の研究もいくつかある。２０１７年に「Ｓｃｉｅｎｃｅ」ジャーナルに掲載された研究（参照文献：Ｌｉａｎｇ Ｘｕ ｅｔ ａｌ．Ｔｒｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂｒｏａｄｌｙ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ＨＩＶ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｍｅｄｉａｔｅ ｐｏｔｅｎｔ ＳＨＩＶ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｍａｃａｑｕｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ：２０ Ｓｅｐ ２０１７， ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｎ８６３０．）によると、科学者らは、二つのヒト－サルキメラ免疫不全ウイルス（ＳＨＩＶ）株よる感染からサルを保護する三重特異性抗体を実験室で開発したことを示す。報告によると、このような三重特異性抗体は、ＨＩＶ抗体ＶＲＣ０１、ＰＧＤＭ１４００および１０Ｅ８ｖ４を広範囲に中和する独特の構造を組み合わせ、三種のＨＩＶ結合断片は、三種の天然抗体に由来し、各種の天然抗体は、多くのＨＩＶ株を強力に中和する。三重特異性抗体を使用して癌を治療することは、非常に重要な概念的な進歩である。三重特異性抗体は、柔軟なベクターであるため、腫瘍微小環境内で免疫調節シグナルの組み合わせを特異的に送達でき、これは、複数の特異的な免疫調節モノクローナル抗体の組み合わせよりも安全で効果的である可能性がある。従って、このような併用策略により、現在の免疫療法の精度および治療効果を向上させ、免疫療法を適用範囲をさらに拡大すると期待されている。三重特異性抗体は、三種の異なる標的に同時に結合することができ、ＨＩＶ感染、他の伝染病、自己免疫疾患および癌の治療法の開発に強力な基盤を提供すると期待されている。
【0008】
従って、当技術分野においては、新規且つ効果的な三重特異性抗体を開発する必要がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
本発明の標的は、三重特異性抗体、その調製方法および用途を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明の第１の態様は、６価三重特異性抗体を提供し、前記６価三重特異性抗体は、二つの単量体から形成される二量体であり、ここで、各単量体は、重鎖、第１の軽鎖および第２の軽鎖を含み、
前記重鎖は、Ｎ末端からＣ末端まで、直列連結された第１の標的に対する抗体重鎖可変領域要素Ｚ１、第２の標的に対する抗体重鎖可変領域要素Ｚ２、第３の標的に対する抗体重鎖可変領域要素Ｚ３、および抗体重鎖定常領域Ｚ４を含み、
前記第１の軽鎖および第２の軽鎖は、それぞれ前記重鎖と協働して、前記６価三重特異性抗体が第１の標的、第２の標的および第３の標的に特異的に結合するようにする。
前記重鎖は、Ｎ末端からＣ末端まで、直列連結された第１の標的に対する抗体重鎖可変領域要素Ｚ１、第２の標的に対する抗体重鎖可変領域要素Ｚ２、第３の標的に対する抗体重鎖可変領域要素Ｚ３、および抗体重鎖定常領域Ｚ４を含み、
前記第１の軽鎖および第２の軽鎖は、それぞれ前記重鎖と協働して、前記６価三重特異性抗体が第１の標的、第２の標的および第３の標的に特異的に結合するようにする。
【0011】
別の好ましい例において、前記第１の軽鎖は、Ｎ末端からＣ末端まで、直列連結された第１の標的に対する抗体軽鎖可変領域要素Ｚ５、および第２の標的に対する抗体軽鎖可変領域要素Ｚ６を含む。
【0012】
別の好ましい例において、前記第２の軽鎖は、Ｎ末端からＣ末端まで、直列連結された第３の標的に対する抗体軽鎖可変領域要素Ｚ７、および抗体軽鎖定常領域Ｚ８を含む。
【0013】
別の好ましい例において、前記抗体重鎖定常領域Ｚ４は、ＣＨ１領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域を含む。
【0014】
別の好ましい例において、前記第１の軽鎖は、抗体重鎖可変領域要素Ｚ１および抗体重鎖可変領域要素Ｚ２と協働し、前記第２の軽鎖は、抗体重鎖可変領域要素Ｚ３と協働する。
【0015】
別の好ましい例において、前記第２の軽鎖は、抗体重鎖定常領域Ｚ４におけるＣＨ１領域とさらに協働する。
【0016】
別の好ましい例において、前記抗体重鎖定常領域Ｚ４は、第１の標的を標的とする抗体、第２の標的を標的とする抗体、または第３の標的を標的とする抗体に由来する。
【0017】
別の好ましい例において、前記抗体重鎖可変領域要素Ｚ１、抗体重鎖可変領域要素Ｚ２、抗体重鎖可変領域要素Ｚ３および抗体重鎖定常領域Ｚ４は、それぞれ独立して、すべてヒトまたはヒト化である。
【0018】
別の好ましい例において、前記抗体軽鎖可変領域要素Ｚ５、抗体軽鎖可変領域要素Ｚ６、抗体軽鎖可変領域要素Ｚ７および抗体軽鎖定常領域Ｚ８は、それぞれ独立して、すべてヒトまたはヒト化である。
【0019】
別の好ましい例において、在前記抗体重鎖可変領域要素Ｚ１、抗体重鎖可変領域要素Ｚ２、抗体重鎖可変領域要素Ｚ３および抗体重鎖定常領域Ｚ４において二つの隣接する要素は、直接連結されるか、またはリンカーを介して連結されることができる。
【0020】
別の好ましい例において、前記抗体軽鎖可変領域要素Ｚ５および抗体軽鎖可変領域要素Ｚ６は、直接連結されるか、またはリンカーを介して連結されることができる。
【0021】
別の好ましい例において、前記抗体軽鎖可変領域要素Ｚ７および抗体軽鎖定常領域Ｚ８は、直接連結されるか、またはリンカーを介して連結されることができる。
【0022】
別の好ましい例において、前記リンカーは、柔軟性リンカーおよび剛性リンカーを含む。
【0023】
別の好ましい例において、前記リンカーは、長さが１～３５個のアミノ酸であるペプチドリンカー、好ましくは６～３０個のアミノ酸であるペプチドリンカーである。
【0024】
別の好ましい例において、前記第１の標的、第２の標的および第３の標的は、ＰＤ－１、ＨＥＲ－２およびＬＡＧ－３である。
【0025】
別の好ましい例において、第１の標的は、ＰＤ－１であり、第２の標的は、ＨＥＲ－２であり、第３の標的は、ＬＡＧ－３である。
【0026】
別の好ましい例において、第１の標的は、ＨＥＲ－２であり、第２の標的は、ＰＤ－１であり、第３の標的は、ＬＡＧ－３である。
【0027】
別の好ましい例において、第１の標的は、ＰＤ－１であり、第２の標的は、ＬＡＧ－３であり、第３の標的は、ＨＥＲ－２である。
【0028】
別の好ましい例において、第１の標的は、ＬＡＧ－３であり、第２の標的は、ＰＤ－１であり、第３の標的は、ＨＥＲ－２である。
【0029】
別の好ましい例において、第１の標的は、ＨＥＲ－２であり、第２の標的は、ＬＡＧ－３であり、第３の標的は、ＰＤ－１である。
【0030】
別の好ましい例において、第１の標的は、ＬＡＧ－３であり、第２の標的は、ＨＥＲ－２であり、第３の標的は、ＰＤ－１である。
【0031】
別の好ましい例において、前記６価三重特異性抗体は、重鎖、第１の軽鎖および第２の軽鎖を含み、ここで、各前記重鎖は、以下の式Ｉの構造を有し、
式（Ｉ）：Ｚ１－Ｚ２－Ｚ３－Ｚ４
Ｚ１は、第１の標的に対する重鎖可変領域要素であり、
Ｚ２は、第２の標的に対する重鎖可変領域要素であり、
Ｚ３は、第３の標的に対する重鎖可変領域要素であり、
Ｚ４は、抗体重鎖定常領域ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３であり、
「－」は、それぞれ独立して、結合またはリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）であり、
ここで、前記第１の軽鎖および第２の軽鎖は、それぞれ重鎖と協働して、前記６価三重特異性抗体が第１の標的、第２の標的および第３の標的に特異的に結合するようにする。
式（Ｉ）：Ｚ１－Ｚ２－Ｚ３－Ｚ４
Ｚ１は、第１の標的に対する重鎖可変領域要素であり、
Ｚ２は、第２の標的に対する重鎖可変領域要素であり、
Ｚ３は、第３の標的に対する重鎖可変領域要素であり、
Ｚ４は、抗体重鎖定常領域ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３であり、
「－」は、それぞれ独立して、結合またはリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）であり、
ここで、前記第１の軽鎖および第２の軽鎖は、それぞれ重鎖と協働して、前記６価三重特異性抗体が第１の標的、第２の標的および第３の標的に特異的に結合するようにする。
【0032】
別の好ましい例において、前記第１の軽鎖は、Ｚ１およびＺ２と協働し、第２の軽鎖は、Ｚ３と協働する。
【0033】
別の好ましい例において、前記第１の軽鎖は、ジスルフィド結合を介してＺ２に連結される。
【0034】
別の好ましい例において、前記第２の軽鎖は、Ｚ３およびＣＨ１と協働し、第２の軽鎖は、ジスルフィド結合を介してＣＨ１とさらに連結される。
【0035】
別の好ましい例において、前記第１の軽鎖は、以下の式ＩＩの構造を有し、
式（ＩＩ）：Ｚ５－Ｚ６
ここで、Ｚ５は、第１の標的に対する軽鎖可変領域要素であり、Ｚ６は、第２の標的に対する軽鎖可変領域要素である。
式（ＩＩ）：Ｚ５－Ｚ６
ここで、Ｚ５は、第１の標的に対する軽鎖可変領域要素であり、Ｚ６は、第２の標的に対する軽鎖可変領域要素である。
【0036】
別の好ましい例において、前記第２の軽鎖は、以下の式ＩＩＩの構造を有し、
式（ＩＩＩ）：Ｚ７－Ｚ８
ここで、Ｚ７は、第３の標的に対する軽鎖可変領域要素であり、Ｚ８は、軽鎖定常領域である。
式（ＩＩＩ）：Ｚ７－Ｚ８
ここで、Ｚ７は、第３の標的に対する軽鎖可変領域要素であり、Ｚ８は、軽鎖定常領域である。
【0037】
別の好ましい例において、第１の標的は、ＰＤ－１であり、第２の標的は、ＨＥＲ－２であり、第３の標的は、ＬＡＧ－３である。
【0038】
別の好ましい例において、第１の標的は、ＨＥＲ－２であり、第２の標的は、ＰＤ－１であり、第３の標的は、ＬＡＧ－３である。
【0039】
別の好ましい例において、第１の標的は、ＰＤ－１であり、第２の標的は、ＬＡＧ－３であり、第３の標的は、ＨＥＲ－２である。
【0040】
別の好ましい例において、第１の標的は、ＬＡＧ－３であり、第２の標的は、ＰＤ－１であり、第３の標的は、ＨＥＲ－２である。
【0041】
別の好ましい例において、第１の標的は、ＨＥＲ－２であり、第２の標的は、ＬＡＧ－３であり、第３の標的は、ＰＤ－１である。
【0042】
別の好ましい例において、第１の標的は、ＬＡＧ－３であり、第２の標的は、ＨＥＲ－２であり、第３の標的は、ＰＤ－１である。
【0043】
別の好ましい例において、前記第１の軽鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５、１７または１９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。
【0044】
別の好ましい例において、前記第２の軽鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３に示されるようなアミノ酸配列を有する。
【0045】
別の好ましい例において、前記重鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、１６または１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。
【0046】
別の好ましい例において、前記６価三重特異性抗体は、二量体である。
【0047】
別の好ましい例において、前記６価三重特異性抗体は、相同またはヘテロ二量体である。
【0048】
別の好ましい例において、前記６価三重特異性抗体は、二つの単量体を含み、各単量体は、重鎖および第１の軽鎖、および第２の軽鎖を含み、ここで、各単量体は、以下の式ＩＶの構造を有し、
式において、
ＶＨＡ－Ｌ１－ＶＨＢ－Ｌ２－ＶＨＣ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３は、重鎖であり、
ＶＬＡ－Ｌ３－ＶＬＢは、第１の軽鎖であり、
ＶＬＣ－ＣＬは、第２の軽鎖であり、
ＶＨＡは、第１の標的に対する重鎖可変領域であり、
ＶＨＢは、第２の標的に対する重鎖可変領域であり、
ＶＨＣは、第３の標的に対する重鎖可変領域であり、
ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３は、それぞれ、抗体重鎖定常領域ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３であり、
ＶＬＡは、第１の標的に対する軽鎖可変領域であり、
ＶＬＢは、第２の標的に対する軽鎖可変領域であり、
ＶＬＣは、第３の標的に対する軽鎖可変領域であり、
ＣＬは、抗体の軽鎖定常領域であり、
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３は、それぞれ独立して、リンカー（ｌｉｎｋｅｒ）であり、
「－」は、それぞれ独立して、結合であり、
「～」は、ジスルフィド結合または共有結合を表わし、
ここで、前記６価三重特異性抗体は、第１の標的、第２の標的および第３の標的に同時に結合する。
ＶＨＡ－Ｌ１－ＶＨＢ－Ｌ２－ＶＨＣ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３は、重鎖であり、
ＶＬＡ－Ｌ３－ＶＬＢは、第１の軽鎖であり、
ＶＬＣ－ＣＬは、第２の軽鎖であり、
ＶＨＡは、第１の標的に対する重鎖可変領域であり、
ＶＨＢは、第２の標的に対する重鎖可変領域であり、
ＶＨＣは、第３の標的に対する重鎖可変領域であり、
ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３は、それぞれ、抗体重鎖定常領域ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３であり、
ＶＬＡは、第１の標的に対する軽鎖可変領域であり、
ＶＬＢは、第２の標的に対する軽鎖可変領域であり、
ＶＬＣは、第３の標的に対する軽鎖可変領域であり、
ＣＬは、抗体の軽鎖定常領域であり、
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３は、それぞれ独立して、リンカー（ｌｉｎｋｅｒ）であり、
「－」は、それぞれ独立して、結合であり、
「～」は、ジスルフィド結合または共有結合を表わし、
ここで、前記６価三重特異性抗体は、第１の標的、第２の標的および第３の標的に同時に結合する。
【0049】
別の好ましい例において、第１の標的は、ＨＥＲ－２であり、第２の標的は、ＰＤ－１であり、第３の標的は、ＬＡＧ－３である。
【0050】
別の好ましい例において、第１の標的は、ＰＤ－１であり、第２の標的は、ＬＡＧ－３であり、第３の標的は、ＨＥＲ－２である。
【0051】
別の好ましい例において、第１の標的は、ＬＡＧ－３であり、第２の標的は、ＰＤ－１であり、第３の標的は、ＨＥＲ－２である。
【0052】
別の好ましい例において、第１の標的は、ＨＥＲ－２であり、第２の標的は、ＬＡＧ－３であり、第３の標的は、ＰＤ－１である。
【0053】
別の好ましい例において、第１の標的は、ＬＡＧ－３であり、第２の標的は、ＨＥＲ－２であり、第３の標的は、ＰＤ－１である。
【0054】
別の好ましい例において、前記６価三重特異性抗体は、二つの単量体を含み、各単量体は、重鎖および第１の軽鎖、および第２の軽鎖を含み、ここで、各単量体は、以下の式ＩＶの構造を有し、
式において、
ＶＨＡ－Ｌ１－ＶＨＢ－Ｌ２－ＶＨＣ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３は、重鎖であり、
ＶＬＡ－Ｌ３－ＶＬＢは、第１の軽鎖であり、
ＶＬＣ－ＣＬは、第２の軽鎖であり、
ＶＨＡは、抗ＰＤ－１抗体の重鎖可変領域であり、
ＶＨＢは、抗ＨＥＲ－２抗体の重鎖可変領域であり、
ＶＨＣは、抗ＬＡＧ－３抗体の重鎖可変領域であり、
ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３は、それぞれ、抗体重鎖定常領域ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３であり、
ＶＬＡは、抗ＰＤ－１抗体の軽鎖可変領域であり、
ＶＬＢは、抗ＨＥＲ－２抗体の軽鎖可変領域であり、
ＶＬＣは、抗ＬＡＧ－３抗体の軽鎖可変領域であり、
ＣＬは、抗体の軽鎖定常領域であり、
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３は、それぞれ独立して、リンカー（ｌｉｎｋｅｒ）であり、
「－」は、それぞれ独立して、結合であり、
「～」は、ジスルフィド結合または共有結合を表わし、
ここで、前記６価三重特異性抗体は、ＰＤ－１、ＨＥＲ－２およびＬＡＧ－３に同時に結合する。
ＶＨＡ－Ｌ１－ＶＨＢ－Ｌ２－ＶＨＣ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３は、重鎖であり、
ＶＬＡ－Ｌ３－ＶＬＢは、第１の軽鎖であり、
ＶＬＣ－ＣＬは、第２の軽鎖であり、
ＶＨＡは、抗ＰＤ－１抗体の重鎖可変領域であり、
ＶＨＢは、抗ＨＥＲ－２抗体の重鎖可変領域であり、
ＶＨＣは、抗ＬＡＧ－３抗体の重鎖可変領域であり、
ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３は、それぞれ、抗体重鎖定常領域ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３であり、
ＶＬＡは、抗ＰＤ－１抗体の軽鎖可変領域であり、
ＶＬＢは、抗ＨＥＲ－２抗体の軽鎖可変領域であり、
ＶＬＣは、抗ＬＡＧ－３抗体の軽鎖可変領域であり、
ＣＬは、抗体の軽鎖定常領域であり、
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３は、それぞれ独立して、リンカー（ｌｉｎｋｅｒ）であり、
「－」は、それぞれ独立して、結合であり、
「～」は、ジスルフィド結合または共有結合を表わし、
ここで、前記６価三重特異性抗体は、ＰＤ－１、ＨＥＲ－２およびＬＡＧ－３に同時に結合する。
【0055】
別の好ましい例において、前記リンカーは、柔軟性ペプチドリンカーである。
【0056】
別の好ましい例において、前記柔軟性ペプチドリンカーは、６～３０個のアミノ酸、好ましくは１０～２５個のアミノ酸を含む。
【0057】
別の好ましい例において、前記柔軟性ペプチドリンカーは、２～６個のＧ４Ｓを含む。
【0058】
別の好ましい例において、前記Ｌ１、Ｌ２またはＬ３は、それぞれ独立して、２～４個のＧ４Ｓである。
【0059】
別の好ましい例において、前記重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４抗体の重鎖定常領域であるか、またはそれに派生される。
【0060】
別の好ましい例において、前記重鎖定常領域は、ヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ４の重鎖定常領域から選択される。
【0061】
別の好ましい例において、前記ヒトＩｇＧ４の重鎖定常領域は、Ｓ２２８Ｐ突然変異を含む。
【0062】
別の好ましい例において、前記軽鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４抗体の軽鎖定常領域であるか、またはそれに派生される。
【0063】
別の好ましい例において、前記軽鎖定常領域は、ヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ４の軽鎖定常領域から選択される。
【0064】
別の好ましい例において、前記６価三重特異性抗体は、二つの重鎖、二つの第１の軽鎖および二つの第２の軽鎖を含み、
ここで、前記重鎖は、アミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、１６または１８に示される重鎖からなる群から選択され、
前記第１の軽鎖は、アミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５、１７または１９に示されるような第１の軽鎖からなる群から選択され、および／または
前記第２の軽鎖は、アミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３に示されるような第２の軽鎖からなる群から選択される。
ここで、前記重鎖は、アミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、１６または１８に示される重鎖からなる群から選択され、
前記第１の軽鎖は、アミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５、１７または１９に示されるような第１の軽鎖からなる群から選択され、および／または
前記第２の軽鎖は、アミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３に示されるような第２の軽鎖からなる群から選択される。
【0065】
別の好ましい例において、前記６価三重特異性抗体における重鎖、第１の軽鎖および第２の軽鎖のアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１４、１５および１３に示されたとおりである。
【0066】
別の好ましい例において、前記６価三重特異性抗体における重鎖、第１の軽鎖および第２の軽鎖のアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１６、１７および１３に示されたとおりである。
【0067】
別の好ましい例において、前記６価三重特異性抗体における重鎖、第１の軽鎖および第２の軽鎖のアミノ酸配列は、それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１８、１９および１３に示されたとおりである。
【0068】
本発明の第２の態様は、単離された核酸分子を提供し、前記核酸分子は、本発明の第１の態様に記載の６価三重特異性抗体をコードする。
【0069】
別の好ましい例において、前記核酸分子は、それぞれ前記重鎖および前記第１の軽鎖、第２の軽鎖をコードする。
【0070】
本発明の第３の態様は、発現ベクターを提供し、前記発現ベクターは、本発明の第２の態様に記載の核酸分子を含む。
【0071】
本発明の第４の態様は、宿主細胞を提供し、前記宿主細胞は、本発明の第３の態様に記載の発現ベクターを含む。
【0072】
本発明の第５の態様は、本発明の第１の態様に記載の６価三重特異性抗体の調製方法を提供し、前記方法は、
（ａ）発現条件下で、本発明の第４の態様に記載の宿主細胞を培養し、それによって前記６価三重特異性抗体を発現させる段階と、
（ｂ）（ａ）に記載の６価三重特異性抗体を分離および精製する段階とを含む。
（ａ）発現条件下で、本発明の第４の態様に記載の宿主細胞を培養し、それによって前記６価三重特異性抗体を発現させる段階と、
（ｂ）（ａ）に記載の６価三重特異性抗体を分離および精製する段階とを含む。
【0073】
本発明の第６の態様は、医薬組成物を提供し、前記医薬組成物は、本発明の第１の態様に記載の６価三重特異性抗体および薬学的に許容されるベクターを含む。
【0074】
別の好ましい例において、前記医薬組成物は、抗腫瘍剤も含む。
【0075】
別の好ましい例において、前記医薬組成物は、ユニット剤形である。
【0076】
別の好ましい例において、前記抗腫瘍剤は、前記三重特異性抗体と独立した包装に単独で存在できるか、または前記抗腫瘍剤は、前記三重特異性抗体とカップリングできる。
【0077】
別の好ましい例において、前記医薬組成物の剤形は、経口投与剤形または非経口投与剤形を含む。
【0078】
別の好ましい例において、前記非経口投与剤形は、静脈内注射、静脈内点滴、皮下注射、局所注射、筋肉注射、腫瘍内注射、腹腔内注射、頭蓋内注射、または腔内注射を含む。
【0079】
本発明の第７の態様は、癌を治療するための薬物の調製における、本発明の第１の態様に記載の６価三重特異性抗体または本発明の第６の態様に記載の医薬組成物の用途を提供する。
【0080】
別の好ましい例において、前記癌は、黒色腫、腎臓がん、前立腺がん、膵臓がん、乳がん、結腸がん、肺がん、食道がん、頭頚部扁平上皮がん、肝臓がん、卵巣がん、子宮頸がん、甲状腺がん、神経膠芽腫、神経膠腫および他の腫瘍性悪性疾患からなる群から選択される。
【0081】
本発明の第８の態様は、必要とする被験者に本発明の第１の態様に記載の６価三重特異性抗体、またはその免疫コンジュゲート、または本発明の第６の態様に記載の医薬組成物を投与する段階を含む、癌を治療する方法を提供する。
【0082】
別の好ましい例において、前記癌は、黒色腫、腎臓がん、前立腺がん、膵臓がん、乳がん、結腸がん、肺がん、食道がん、頭頚部扁平上皮がん、肝臓がん、卵巣がん、子宮頸がん、甲状腺がん、神経膠芽腫、神経膠腫および他の腫瘍性悪性疾患からなる群から選択される。
【0083】
本発明の第９の態様は、免疫コンジュゲートを提供し、前記免疫コンジュゲートは、
（ａ）本発明の第１の態様に記載の６価三重特異性抗体と、および
（ｂ）検出可能なマーカー、薬物、毒素、サイトカイン、放射性核種、または酵素からなる群から選択されるカップリング部分とを含む。
（ａ）本発明の第１の態様に記載の６価三重特異性抗体と、および
（ｂ）検出可能なマーカー、薬物、毒素、サイトカイン、放射性核種、または酵素からなる群から選択されるカップリング部分とを含む。
【0084】
別の好ましい例において、前記コンジュゲート部分は、蛍光または発光マーカー、放射性マーカー、ＭＲＩ（磁気共鳴画像法）またはＣＴ（コンピュータ化Ｘ線断層撮影法）造影剤、または検出可能な生成物を生成できる酵素、放射性核種、生物毒素、サイトカインから選択される。
【0085】
別の好ましい例において、前記免疫コンジュゲートは、抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を含む。
【0086】
別の好ましい例において、前記免疫コンジュゲートは、腫瘍を治療するための医薬組成物の調製に使用される。
【発明の効果】
【0087】
本発明の範囲内で、本発明の上記の各技術的特徴と以下（例えば、実施例）に具体的に説明される各技術的特徴との間を、互いに組み合わせることにより、新しいまたは好ましい技術的解決策を構成することができることに理解されたい。スペースに限りがあるため、ここでは繰り返さない。
【図面の簡単な説明】
【0088】
【図1】本発明の三重特異性抗体の構造模式図であり、ここで、ＶＨ－Ａは、第１の抗体の重鎖可変領域を表わし、ＶＨ－Ｂは、第２の抗体の重鎖可変領域を表わし、ＶＨ－Ｃは、第３の抗体の重鎖可変領域を表わし、ＶＬ－Ａは、第１の抗体の軽鎖可変領域を表わし、ＶＬ－Ｂは、第２の抗体の軽鎖可変領域を表わし、ＶＬ－Ｃは、第３の抗体の軽鎖可変領域を表わす。ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３は、重鎖定常領域の三つのドメインであり、ＣＬは、軽鎖定常領域である。二つの重鎖間の線分は、ジスルフィド結合を表わし、重鎖と軽鎖との間の線分も、ジスルフィド結合を表わし、ここで、ＶＨ－ＢとＶＬ－Ｂとの間の線分は、人工的に設計されたジスルフィド結合を表わす。ＶＨ－ＡとＶＨ－Ｂと、ＶＨ－ＢとＶＨ－Ｃと、およびＶＬ－ＡとＶＬ－Ｂとの間の線分は、人工的に設計されたリンカーを表わし、ＣＨ１とＣＨ２との間の線分は、抗体の天然リンカーおよびヒンジ領域を表わす（重鎖がヒトＩｇＧ４サブタイプの場合、ヒンジ領域は、Ｓ２２８Ｐ点突然変異を含む）。
【図2】本発明の三重特異性抗体のＥＬＩＳＡ結果である。ここで、図２Ａ、図２Ｂ、図２Ｃは、それぞれ、ＰＤ－１、ＨＥＲ－２およびＬＡＧ－３に対する本発明の三重特異性抗体の親和性をＥＬＩＳＡにより測定した結果である。
【図3】モノクローナル抗体６０９－ＩｇＧ４および本発明の三重特異性抗体のＨＰＬＣ－ＳＥＣスペクトルである。ここで、図３Ａは、モノクローナル抗体６０９－ＩｇＧ４のＨＰＬＣ－ＳＥＣスペクトルを表わし、図３Ｂは、６０９－３０２－１３４－ＩｇＧ４のＨＰＬＣ－ＳＥＣスペクトルを表わし、図３Ｃは、６０９－３０２－（４４ＣＣ）－１３４－ＩｇＧ４のＨＰＬＣ－ＳＥＣスペクトルを表わし、図３Ｄは、６０９－３０２－（１０５ＣＣ）－１３４－ＩｇＧ４のＨＰＬＣ－ＳＥＣスペクトルを表わす。
【図4】モノクローナル抗体６０９－ＩｇＧ４および本発明の三重特異性抗体のＨＰＬＣ－ＩＥＣスペクトルである。ここで、図４Ａは、モノクローナル抗体６０９－ＩｇＧ４のＨＰＬＣ－ＩＥＣスペクトルを表わし、図４Ｂは、６０９－３０２－（４４ＣＣ）－１３４－ＩｇＧ４のＨＰＬＣ－ＩＥＣスペクトルを表わし、図４Ｃは、６０９－３０２－（１０５ＣＣ）－１３４－ＩｇＧ４のＨＰＬＣ－ＩＥＣスペクトルを表わす。
【図5】モノクローナル抗体６０９－ＩｇＧ４および本発明の三重特異性抗体のＨＰＬＣ－ＩＥＣスペクトルである。ここで、図５Ａおよび図５Ｂは、それぞれ、モノクローナル抗体６０９－ＩｇＧ４のＮＲ－ＣＥ－ＳＤＳおよびＲ－ＣＥ－ＳＤＳスペクトルを表わし、図５Ｃおよび図５Ｄは、それぞれ、６０９－３０２－１３４－ＩｇＧ４のＮＲ－ＣＥ－ＳＤＳおよびＲ－ＣＥ－ＳＤＳスペクトルを表わし、図５Ｅおよび図５Ｆは、それぞれ、６０９－３０２－（４４ＣＣ）－１３４－ＩｇＧ４のＮＲ－ＣＥ－ＳＤＳおよびＮＲ－ＣＥ－ＳＤＳスペクトルを表わし、図５Ｇおよび図５Ｈは、それぞれ、６０９－３０２－（１０５ＣＣ）－１３４－ＩｇＧ４のＮＲ－ＣＥ－ＳＤＳおよびＲ－ＣＥ－ＳＤＳスペクトルを表わす。
【図6】免疫応答の刺激における本発明の三重特異性抗体の機能的活性を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0089】
本発明者らは、広範囲かつ綿密な研究および大量のスクリーニングにより、新規構造を有する抗ＰＤ－１、ＨＥＲ－２およびＬＡＧ－３の６価三重特異性抗体を初めて取得するのに成功した。本発明の６価三重特異性抗体は、二つの単量体から形成される二量体であり、ここで、各単量体は、重鎖、第１の軽鎖および第２の軽鎖を含む。具体的には、天然抗体の構造に基づいて、本発明の三重特異性抗体が抗ＰＤ－１、ＨＥＲ－２およびＬＡＧ－３の三重特異性を保持する同時にモノクローナル抗体と類似、さらにそれ以上優れた生物学的活性および物理的・化学的性質を有する、第１の軽鎖および重鎖の構造を設計および最適化した。これに基づいて、反発明を完成させた。
【0090】
用語
本発明において、「抗体（Ａｎｔｉｂｏｄｙ、略してＡｂ）」または「免疫グロブリン（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ、略してＩｇＧ）」という用語は、二つの同一の軽鎖（Ｌ）および二つの同一の重鎖（Ｈ）で構成される、同じ構造的特徴を有するヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は、一つの共有ジスルフィド結合によって重鎖に結合し、異なる免疫グロブリンアイソタイプ（ｉｓｏｔｙｐｅ）の重鎖間でのジスルフィド結合の数は、異なる。各重鎖および軽鎖には、規則的な間隔で配置された鎖内ジスルフィド結合もある。各重鎖の一端には、可変領域（ＶＨ）があり、その後には定常領域であり、重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３の三つのドメインで構成される。各軽鎖の一端には、可変領域（ＶＬ）があり、他端には、定常領域があり、軽鎖定常領域は、一つのドメインＣＬを含み、軽鎖の定常領域は、重鎖の定常領域のＣＨ１ドメインと対になり、軽鎖の可変領域は、重鎖の可変領域と対になる。定常領域は、抗体の抗原への結合に直接関与しないが、抗体依存性細胞媒介性細胞特性効果（ＡＤＣＣ，ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）等に関与するなど、様々なエフェクター機能を示す。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４サブタイプを含み、軽鎖定常領域は、κ（Ｋａｐｐａ）またはλ（Ｌａｍｂｄａ）を含む。抗体の重鎖と軽鎖とは、重鎖のＣＨ１ドメインと軽鎖のＣＬドメインとの間のジスルフィド結合によって共有結合され、抗体の二つの重鎖は、ヒンジ領域間に形成されるポリペプチド間ジスルフィド結合によって共有結合される。
本発明において、「抗体（Ａｎｔｉｂｏｄｙ、略してＡｂ）」または「免疫グロブリン（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ、略してＩｇＧ）」という用語は、二つの同一の軽鎖（Ｌ）および二つの同一の重鎖（Ｈ）で構成される、同じ構造的特徴を有するヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は、一つの共有ジスルフィド結合によって重鎖に結合し、異なる免疫グロブリンアイソタイプ（ｉｓｏｔｙｐｅ）の重鎖間でのジスルフィド結合の数は、異なる。各重鎖および軽鎖には、規則的な間隔で配置された鎖内ジスルフィド結合もある。各重鎖の一端には、可変領域（ＶＨ）があり、その後には定常領域であり、重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３の三つのドメインで構成される。各軽鎖の一端には、可変領域（ＶＬ）があり、他端には、定常領域があり、軽鎖定常領域は、一つのドメインＣＬを含み、軽鎖の定常領域は、重鎖の定常領域のＣＨ１ドメインと対になり、軽鎖の可変領域は、重鎖の可変領域と対になる。定常領域は、抗体の抗原への結合に直接関与しないが、抗体依存性細胞媒介性細胞特性効果（ＡＤＣＣ，ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）等に関与するなど、様々なエフェクター機能を示す。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４サブタイプを含み、軽鎖定常領域は、κ（Ｋａｐｐａ）またはλ（Ｌａｍｂｄａ）を含む。抗体の重鎖と軽鎖とは、重鎖のＣＨ１ドメインと軽鎖のＣＬドメインとの間のジスルフィド結合によって共有結合され、抗体の二つの重鎖は、ヒンジ領域間に形成されるポリペプチド間ジスルフィド結合によって共有結合される。
【0091】
本発明において、「三重特異性抗体（または三重抗体）」という用語は、同時に三種の抗原（標的）または三種のエピトープに特異的に結合できる抗体分子を指す。対称性に基づいて、三重特異性抗体は、構造的に対称分子および非対称分子に分類されることができる。結合部位の数に基づいて、三重特異性抗体は、３価、４価および多価分子に分類されることができる。
【0092】
本発明において、「モノクローナル抗体（ｍＡｂ）」という用語は、実質的に均一な集団から得られる抗体を指し、即ち、当該集団に含まれる個々の抗体は、いくつかの可能性のある自然に発生する突然変異を除いて同じである。モノクローナル抗体は、単一の抗原部位に対して非常に特異的である。また、従来のポリクローナル抗体製剤（通常、異なる抗原決定基に対する異なる抗体を有する混合物である）とは異なり、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に向けられる。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体の利点は、それらがハイブリドーマ培養によって合成されることができ、他の免疫グロブリンによって汚染されないことである。「モノクローナル」という修飾語は、抗体の実質的に均一な集団から得られる抗体の特性を表し、これは、抗体精製に特定の方法が必要であると解釈されるべきではない。
【0093】
本発明において、「ヒト化」という用語は、そのＣＤＲが非ヒト種（好ましくはマウス）の抗体に由来し、抗体分子の残りの部分（フレームワーク領域および定常領域を含む）は、ヒト抗体に由来することを指す。さらに、フレームワーク領域残基は、結合親和性を維持するように変更されることができる。
【0094】
本発明において、「Ｆａｂ」および「Ｆｃ」という用語は、パパインが抗体を二つの完全に同一のＦａｂセグメントおよび一つのＦｃセグメントに分解することができることを指す。Ｆａｂセグメントは、抗体の重鎖のＶＨおよびＣＨ１ならびに軽鎖のＶＬおよびＣＬドメインで構成される。Ｆｃセグメントは、抗体のＣＨ２およびＣＨ３ドメインで構成される、結晶化可能な断片（ｆｒａｇｍｅｎｔ ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｂｌｅ、Ｆｃ）である。Ｆｃセグメントは、抗原結合活性を有さず、抗体とエフェクター分子または細胞と相互作用する部位である。
【0095】
本発明において、「可変」という用語は、抗体の可変領域の特定の部分の配列が異なることを表し、それは、特定の抗原に対する様々な特定の抗体の結合および特異性を形成する。しかしながら、可変性は、抗体可変ドメイン全体に均等に分されていない。それは、重鎖可変領域および軽鎖可変領域の相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ－ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ、ＣＤＲ）または超可変領域と呼ばれる三つの断片に集中する。可変領域のより保存的な部分は、フレームワーク領域（ｆｒａｍｅ ｒｅｇｉｏｎ、ＦＲ）と呼ばれる。天然の重鎖および軽鎖の可変領域は、それぞれ、四つのＦＲ領域を含み、それらは、接続環を形成する三つのＣＤＲによって接続された大抵β－フォールディング構成にあり、場合によっては部分的なβフォールディング構造を形成することができる。各鎖のＣＤＲは、ＦＲ領域によって緊密に近接され、かつ別の鎖のＣＤＲとともに抗体の抗原結合部位を形成する（Ｋａｂａｔら、ＮＩＨ Ｐｕｂｌ．Ｎｏ．９１－３２４２、巻Ｉ、６４７～６６９ページ（１９９１）を参照する）。
【0096】
本明細書で使用されるように、「フレームワーク領域」（ＦＲ）という用語は、ＣＤＲ間に挿入されたアミノ酸配列、即ち、単一種の異なる免疫グロブリン間で比較的保存される免疫グロブリンの軽鎖および重鎖可変領域のそれらの部分を指す。免疫グロブリンの軽鎖および重鎖は、それぞれ、ＦＲ１－Ｌ、ＦＲ２－Ｌ、ＦＲ３－Ｌ、ＦＲ４－ＬおよびＦＲ１－Ｈ、ＦＲ２－Ｈ、ＦＲ３－Ｈ、ＦＲ４－Ｈと呼ばれる四つのＦＲを有する。対応的に、軽鎖可変ドメインは、（ＦＲ１－Ｌ）－（ＣＤＲ１－Ｌ）－（ＦＲ２－Ｌ）－（ＣＤＲ２－Ｌ）－（ＦＲ３－Ｌ）－（ＣＤＲ３－Ｌ）－（ＦＲ４－Ｌ）と呼ばれることができ、且つ重鎖可変ドメインは、（ＦＲ１－Ｈ）－（ＣＤＲ１－Ｈ）－（ＦＲ２－Ｈ）－（ＣＤＲ２－Ｈ）－（ＦＲ３－Ｈ）－（ＣＤＲ３－Ｈ）－（ＦＲ４－Ｈ）として表されることができる。好ましくは、本発明のＦＲは、ヒト抗体ＦＲまたはその誘導体であり、前記ヒト抗体ＦＲの誘導体は、天然に存在するヒト抗体ＦＲと実質的に同一であり、即ち、配列同一性は、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％に達する。
【0097】
ＣＤＲのアミノ酸配列を知ると、当業者は、フレームワーク領域ＦＲ１－Ｌ、ＦＲ２－Ｌ、ＦＲ３－Ｌ、ＦＲ４－Ｌおよび／またはＦＲ１－Ｈ、ＦＲ２－Ｈ、ＦＲ３－Ｈ、ＦＲ４－Ｈを容易に決定することができる。
【0098】
本明細書で使用されるように、「ヒトフレームワーク領域」という用語は、天然に存在するヒト抗体のフレームワーク領域と実質的に同一（約８５％またはそれ以上、具体的には、９０％、９５％、９７％、９９％または１００％である）であるフレームワーク領域である。
【0099】
本明細書で使用されるように、用語「リンカー」または「ペプチドリンカー」という用語は、軽鎖および重鎖のドメインが交換された二重可変領域免疫グロブリンにフォールディングするのに十分な可動性を提供するために、免疫グロブリンドメインに挿入された一つまたは複数のアミノ酸残基を指す。本発明において、好ましいリンカーとは、リンカーＬ１、Ｌ２およびＬ３を指し、ここで、Ｌ１は、第１の抗体の重鎖可変領域を第２の抗体の重鎖可変領域に接続し、Ｌ２は、第２の抗体の重鎖可変領域を第３の抗体の重鎖可変領域に接続し、Ｌ３は、第１の抗体的軽鎖可変領域を第２の抗体的軽鎖可変領域に接続する。
【0100】
適切なリンカーの例としては、モノグリシン（Ｇｌｙ）、またはセリン（Ｓｅｒ）残基を含み、リンカーのアミノ酸残基のマーカーおよび配列は、リンカーで達成する必要がある二次構造要素のタイプによって異なる。
【0101】
三重特異性抗体
本発明の三重特異性抗体は、抗ＰＤ－１抗体部分、抗ＨＥＲ－２抗体部分および抗ＬＡＧ－３抗体部分を含む、抗ＰＤ－１、ＨＥＲ－２およびＬＡＧ－３の６価三重特異性抗体である。
本発明の三重特異性抗体は、抗ＰＤ－１抗体部分、抗ＨＥＲ－２抗体部分および抗ＬＡＧ－３抗体部分を含む、抗ＰＤ－１、ＨＥＲ－２およびＬＡＧ－３の６価三重特異性抗体である。
【0102】
好ましくは、本発明の抗ＰＤ－１抗体の配列は、特許出願ＷＯ２０１８／１３７５７６Ａ１に記載されたとおりであり、当業者は、一つまたはいくつかのアミノ酸残基の付加、欠失および／または置換等の当技術分野で周知の技術を通じて、本発明の抗ＰＤ－１抗体を修飾または改変することにより、抗ＰＤ－１の親和性または構造安定性をさらに向上し、従来の測定方法を通じて、修飾または改変後の結果を取得することができる。
【0103】
本発明において、本発明の三重特異性抗体は、その保存的変異体をさらに含み、これは、本発明の三重特異性抗体のアミノ酸配列と比較して、最大で１０個、好ましくは最大で８個、より好ましくは最大で５個、最も好ましくは最大で３個のミノ酸が類似または同様のアミノ酸によって置換されてポリペプチドを形成することを指す。これらの保存的変異ポリペプチドは、好ましくは、表Ａによるアミノ酸によって置換されて生成される。
【0104】
【0105】
【0106】
別の好ましい例において、前記少なくとも一つのアミノ酸配列の付加、欠失、修飾および／または置換によって形成される配列は、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列である。
【0107】
本発明において、前記付加、欠失、修飾および／または置換されるアミノ酸の数は、通常、１、２、３、４または５個、好ましくは１～３個、より好ましくは１～２個、最も好ましくは１個である。
【0108】
本発明において、好ましい置換には、本発明の三重特異性抗体６０９ＶＨ－３０２ＶＨ－１３４－ＩｇＧ４において、３０２重鎖可変領域の４４番目のＧをＣに置き換えること、６０９ＶＬ－３０２ＶＬにおける３０２軽鎖可変領域の１００番目のＱをＣに突然変異すること、６０９ＶＨ－３０２ＶＨ－１３４－ＩｇＧ４における３０２重鎖可変領域の１０５番目のＱをＣに突然変異すること、６０９ＶＬ－３０２ＶＬにおける３０２軽鎖可変領域の４３番目のＱをＣに突然変異することが含まれる。
【0109】
本発明において、「抗」、「結合」および「特異的結合」という用語は、抗体とそれが標的とする抗原との間の反応等、二つの分子間の非ランダム結合反応を指す。通常、抗体は、約１０－７Ｍ未満、例えば約１０－８Ｍ、１０－９Ｍ、１０－１０Ｍ、１０－１１Ｍ未満、またはそれ以下の平衡解離定数（ＫＤ）で当該抗原に結合する。本発明において、「ＫＤ」という用語は、特定の抗体－抗原相互作用の平衡解離定数を指し、それは、抗体と抗原との間の結合親和性を表わすために使用される。平衡解離定数が小さいほど、抗体と抗原との結合は、強くなり、抗体と抗原との間の親和性は、高くなる。例えば，表面プラズモン共鳴（Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ、ＳＰＲと略す）を使用して、ＢＩＡＣＯＲＥ機器で抗原に対する抗体の結合親和性を測定するか、またはＥＬＩＳＡを使用して、抗体と抗原とを結合する相対親和性を測定する。
【0110】
本発明において、「価」という用語は、抗体分子内の指定された数の抗原結合部位の存在を指す。好ましくは、本発明の三重特異性抗体は、六つの抗原結合部位を有し、６価である。本発明において、抗原結合部位は、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。
【0111】
本発明において、「エピトープ」という用語は、抗体に特異的に結合するポリペプチド決定基を指す。本発明のエピトープは、抗体によって結合される抗原の領域である。
【0112】
本明細書で使用されるように、「第１の軽鎖」という用語は、異なる標的に対する抗体の軽鎖可変領域を含む軽鎖を指す。具体的には、前記「第１の軽鎖」は、第１の標的に対する抗体の軽鎖可変領域および第２の標的に対する抗体の軽鎖可変領域を含み、それは、第１の標的に対する抗体の重鎖可変領域および第２の標的に対する抗体の重鎖可変領域と対になって、第１の標的に特異的に結合する第１の結合部位および第２の標的に特異的に結合する第２の結合部位を形成する。
【0113】
好ましくは、本発明における「第１の軽鎖」は、リンカーによって、または直接連結された、異なる標的に対する二つの抗体軽鎖可変領域を含む。さらに、本発明における「第１の軽鎖」は、柔軟性リンカーまたは結合を介して異なる位置で重鎖と対になることができる。具体的には、本発明における「第１の軽鎖」は、非共有結合または共有結合を介して三重特異性抗体の重鎖と対になることができる。好ましくは、本発明における「第１の軽鎖」は、共有結合（例えば、ジスルフィド結合）を介して重鎖と対になる。
【0114】
本発明の三重特異性抗体は、単独で使用してもよいし、検出可能なマーカー（診断標的である）、治療剤、またはそれらの任意の物質の組み合わせと結合またはカップリングしてもよい。
【0115】
コード核酸および発現ベクター
本発明は、前記抗体またはそのフラグメントまたはその融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子をさらに提供する。本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ形態またはＲＮＡ形態であり得る。ＤＮＡ形態は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡを含む。ＤＮＡは、一本鎖または二本鎖であり得る。ＤＮＡは、コード鎖または非コード鎖であり得る。
本発明は、前記抗体またはそのフラグメントまたはその融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子をさらに提供する。本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ形態またはＲＮＡ形態であり得る。ＤＮＡ形態は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡを含む。ＤＮＡは、一本鎖または二本鎖であり得る。ＤＮＡは、コード鎖または非コード鎖であり得る。
【0116】
本発明において、「発現ベクター」という用語は、プラスミド、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、レトロウイルス）、ファージ、酵母プラスミドまたは他のベクター等、特定の標的タンパク質または他の物質を発見させるための発現カセットを携帯するベクターを指す。代表的な例としては、ｐＴＴ５、ｐＳＥＣｔａｇシリーズ、ｐＣＧＳ３シリーズ、ｐｃＤＮＡシリーズベクター等、および哺乳動物の発現系に使用される他のベクター等を含むが、これらに限定されない。発現ベクターは、適切な転写および翻訳調節配列に連結された融合ＤＮＡ配列を含む。
【0117】
関連する配列が得られたら、組換え法を使用して、関連する配列を大量に得ることができる。通常、これは、それを担体にクローニングし、次に細胞に形質転換し、次に従来の方法によって増殖した宿主細胞から関連する配列を単離することによって得られる。
【0118】
本発明は、前記適切なＤＮＡ配列および適切なプロモーターまたは制御配列を含むベクターにさらに関する。これらのベクターは、タンパク質を発現できるように適切な宿主細胞に形質転換するために使用されることができる。
【0119】
本発明において、「宿主細胞」という用語は、上記発現ベクターを発現するのに適した細胞を指し、真核細胞であり得、例えば、哺乳動物または昆虫の宿主細胞培養系は、すべて本発明の融合タンパク質の発現に使用されることができ、ＣＨＯ（チャイニーズハムスターの卵巣、Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ）、ＨＥＫ２９３、ＣＯＳ、ＢＨＫおよび上記細胞の派生細胞は、すべて本発明に適すことができる。
【0120】
医薬組成物および応用
本発明は、組成物をさらに提供する。好ましくは、前記組成物は、上記の抗体またはその活性断片またはその融合タンパク質、ならびに薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物である。通常、これらの物質を、毒性がなく、不活性で、薬学的に許容される水性ベクター媒体で処方することができ、ここで、ｐＨは、通常、約５～８、好ましくは、約６～８であり、ｐＨ値は、処方される物質の性質および治療される病症によって異なる。処方された医薬組成物は、従来の経路で投与されることができ、ここで、静脈内注射、静脈内点滴、皮下注射、局所注射、筋肉内注射、腫瘍内注射、腹腔内注射（腹膜内等）、頭蓋内注射、または腔内注射をふくむ（これらに限定されない）。
本発明は、組成物をさらに提供する。好ましくは、前記組成物は、上記の抗体またはその活性断片またはその融合タンパク質、ならびに薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物である。通常、これらの物質を、毒性がなく、不活性で、薬学的に許容される水性ベクター媒体で処方することができ、ここで、ｐＨは、通常、約５～８、好ましくは、約６～８であり、ｐＨ値は、処方される物質の性質および治療される病症によって異なる。処方された医薬組成物は、従来の経路で投与されることができ、ここで、静脈内注射、静脈内点滴、皮下注射、局所注射、筋肉内注射、腫瘍内注射、腹腔内注射（腹膜内等）、頭蓋内注射、または腔内注射をふくむ（これらに限定されない）。
【0121】
本発明において、「医薬組成物」という用語は、本発明の６価三重特異性抗体を薬学的に許容されるベクターと組み合わせて医薬製剤組成物を形成することにより、より安定的な治療効果を発揮することができることを指し、これらの制剤は、本発明で開示されたヒトＰＤ－１結合抗体もしくはその抗原結合断片または６価三重特異性抗体のアミノ酸コア配列のコンフォメーションの完全性を確保し、同時にタンパク質の多官能基を分解（縮合、脱アミノ化または酸化を含むがこれらに限定されない）から保護することができる。
【0122】
本発明の医薬組成物は、安全かつ有効な量（例えば、０．００１～９９ｗｔ％、好ましくは、０．０１～９０ｗｔ％、より好ましくは、０．１～８０ｗｔ％）の本発明の上記の６価三重特異性抗体（またはそのコンジュゲート）および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む。このようなベクターは、生理食塩水、緩衝液、グルコース、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。薬物製剤は、投与方法と一致する必要がある。本発明の医薬組成物は、例えば、生理食塩水またはグルコースと他のアジュバントとを含む水溶液を使用して、従来の方法によって注射の形態で調製することができる。注射剤および溶液等の医薬組成物は、無菌条件下で調製する必要がある。有効成分の投与量は、治療有效量であり、例えば、毎日の約１０μｇ／ｋｇ体重～約５０ｍｇ／ｋｇ体重である。さらに、本発明の６価三重特異性抗体は、他の治療剤とともに使用することもできる。
【0123】
医薬組成物を使用する場合、安全かつ有効な量の６価三重特異性抗体またはその免疫コンジュゲートを哺乳動物に投与し、ここで、当該安全かつ有効な量は、通常、少なくとも約１０μｇ／ｋｇ体重であり、ほとんどの場合、約５０ｍｇ／ｋｇ体重を超えなく、好ましくは、当該投与量は、約１０μｇ／ｋｇ体重～約１０ｍｇ／ｋｇ体重である。もちろん，具体的な投与量は、投与経路および患者の健康状態等の要因を考慮する必要があり、これらは、すべて熟練した医師のスキル範囲内にある。
【0124】
免疫コンジュゲート
本発明は、本発明の三重特異性抗体に基づく免疫コンジュゲートをさらに提供する。
本発明は、本発明の三重特異性抗体に基づく免疫コンジュゲートをさらに提供する。
【0125】
典型的には、前記免疫コンジュゲートは、前記抗体、およびエフェクター分子を含み、前記抗体は、前記エフェクター分子にカップリングし、好ましくは、化学カップリングである。ここで、前記エフェクター分子は、好ましくは治療活性を有する薬物である。さらに、前記エフェクター分子は、毒性タンパク質、化学療法薬、小分子薬または放射性核種のうちの一つまたは複数の種であり得る。
【0126】
本発明の三重特異性抗体は、カップリング剤を介して前記エフェクター分子にカップリングされることができる。前記カップリング剤の例としては、非選択的カップリング剤、カルボキシル基を用いたカップリング剤、ペプチド鎖、ジスルフィド結合を用いたカップリング剤のうちの任意の一つまたは複数の種であり得る。前記非選択的カップリング剤は、エフェクター分子と抗体とを共有結合させる化合物、例えば、グルタルアルデヒドなどを指す。前記カルボキシル基を用いたカップリング剤は、シスアコニット酸無水物カップリング剤（例えば、シスアコニット酸無水物）、アシルヒドラゾンカップリング剤（カップリング部位は、アシルヒドラゾンである）のうちの任意の一つまたは複数の種であり得る。
【0127】
抗体上の特定の残基（例えば、ＣｙｓまたはＬｙｓ等）は、様々な官能基と結合するために使用され、ここで、イメージング試薬（例えば、発色団および蛍光団）、診断試薬（例えば、ＭＲＩ造影剤および放射性同位体）、安定剤（例えば、グリコールポリマー）ならびに治療剤を含む。抗体は、機能剤にカップリングされて、抗体－機能剤のコンジュゲートを形成することができる。機能剤（例えば、薬物、検出試薬、安定剤）は、抗体にカップリング（共有結合）される。機能剤は、抗体に直接、またはリンカーを介して間接的に結合することができる。
【0128】
抗体は、薬物にカップリングされることにより、抗体薬物コンジュゲート（ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、ＡＤＣ）を形成することができる。典型的に、ＡＤＣは、薬物と抗体との間に位置するリンカーを含む。リンカーは、分解性または非分解性リンカーであり得る。分解性リンカーは、通常、細胞内環境、例えば、リンカーを分解する標的の部位で分解を受けやすく、それによって抗体から薬物を放出する。適切な分解性リンカーは、例えば、細胞内プロテアーゼ（例えば、リソソームプロテアーゼまたはエンドソームプロテアーゼ）によって分解可能なペプチジル含有リンカーを含む酵素的に分解可能なリンカー、またはグルクロニダーゼによって分解可能なグルクロニド含有リンカー等の糖リンカーを含む。ペプチジルリンカーは、例えば、バリン－シトルリン、フェニルアラニン－リジンまたはバリン－アラニンなどの二ペプチドを含むことができる。他の適切な分解性リンカーは、例えば、ｐＨ感受性リンカー（例えば、５．５未満のｐＨで加水分解するリンカー、例えば、ヒドラゾンリンカー）および還元条件下で分解できるリンカー（例えば、ジスルフィド結合リンカー）を含む。非分解性リンカーは、通常、抗体がプロテアーゼによって加水分解される条件下で薬物を放出する。
【0129】
抗体に結合される前に、リンカーは、特定のアミノ酸残基と反応できる活性な反応基を有し、結合は、活性な反応基を介して実現される。スルフヒドリル特異的活性な反応基が好ましく、マレイミド化合物、ハロゲン化アミド（例えば、ヨード、臭化または塩素化）、ハロエステル（例えば、ヨード、臭化または塩素化）、ハロメチルケトン（例えば、ヨード、臭化または塩素化）、ハロゲン化ベンジル（例えば、ヨード、臭化または塩素化）、ビニルスルホン、ピリジルジスルフィド、対イオンが酢酸塩、塩素イオンまたは硝酸塩である３，６－ビス－（水銀メチル）ジオキサン等の水銀誘導体、ならびにポリメチレンジメチルスルフィドチオスルホネートを含む。リンカーは、例えば、チオスクシンイミドを介して抗体に結合したマレイミドを含むことができる。
【0130】
薬物は、任意の細胞毒性、細胞成長阻害性または免疫阻害性の薬物であり得る。実施形態において、リンカーは、抗体および薬物と結合し、薬物は、リンカーと結合を形成できる官能基を有する。例えば、薬物は、リンカーと結合を形成できるアミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、ヒドロキシル基、またはケト基を有することができる。薬物がリンカーに直接結合される場合、薬物は、抗体に結合される前に、反応性活性基を有する。
【0131】
有用な薬物のクラスとしては、例えば、抗チューブリン薬、ＤＮＡ副溝結合試薬、ＤＮＡ複製阻害剤、アルキル化試薬、抗生物質、葉酸拮抗薬、代謝拮抗薬、化学増感剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ビン化アルカロイド等を含む。特に有用な細胞毒性薬の例としては、例えば、ＤＮＡ副溝結合試薬、ＤＮＡアルキル化試薬、およびチューブリン阻害剤を含み、典型的な細胞毒性薬としては、例えばオーリスタチン（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎｓ）、カンプトテシン（ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎｓ）、デュオカルマイシン／デュオカルマイシン（ｄｕｏｃａｒｍｙｃｉｎｓ）、エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅｓ）、メイタンシン（ｍａｙｔａｎｓｉｎｅｓ）およびメイタンシノイド（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄｓ）（例えばＤＭ１およびＤＭ４）、タキサン（ｔａｘａｎｅｓ）、ベンゾジアゼピン（ｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅｓ）またはベンゾジアゼピン含有薬物（ｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｄｒｕｇｓ）（例えばピロロ［１，４］ベンゾジアゼピン（ＰＢＤｓ）、インドリンベンゾジアゼピン（ｉｎｄｏｌｉｎｏｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅｓ）およびオキサゾリジノベンゾジアゼピン（ｏｘａｚｏｌｉｄｉｎｏｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅｓ））およびビンカアルカロイド（ｖｉｎｃａ ａｌｋａｌｏｉｄｓ）を含む。
【0132】
本発明において、薬物－リンカーは、一つの簡単安段階でＡＤＣを形成することができる。他の実施形態において、二官能性リンカー化合物は、２段階または多段階方法でＡＤＣを形成するために使用されることができる。例えば、システイン残基は、最初の段階でリンカーの反応活性部分と反応され、また、その後の段階で、リンカー上の官能基が薬物と反応されることにより、ＡＤＣを形成する。
【0133】
通常、リンカー上の官能基は、薬物部分上の適切な反応活性基との特定の反応を促進するために選択される。非限定的な例としては、アジドベースの部分を使用して、薬物部分の反応性アルキニル基と特異的に反応させることができる。薬物は、アジドとアルキニル基との間の１，３－双極性環状付加を介してリンカーに共有結合される。他の有用な官能基は、例えば、ケトンおよびアルデヒド（ヒドラジドおよびアルコキシアミンとの反応に適する）、ホスフィン（アジドとの反応に適する）、イソシアネートおよびイソチオシアネート、ならびにＮ－ヒドロキシスクシンイミジルエステルなどの活性化されるエステル（アミンおよびアルコールとの反応に適する）を含む。「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、第二版（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）に記載されるような、これらおよび他の結合策略は、当業者に周知である。当業者は、薬物部分およびリンカーの選択的反応については、反応性官能基の相補対が選択される場合、当該相補対の各メンバーは、リンカーおよび薬物の両方に使用されることができることを理解されたい。
【0134】
本発明は、抗体コンジュゲート（ＡＤＣ）を形成するのに十分な条件下で、抗体を薬物－リンカー化合物と結合させる段階をさらに含むことができる、ＡＤＣを調製するための方法を提供する。
【0135】
特定の実施形態において、本発明の方法は、抗体－リンカーコンジュゲートを形成するのに十分な条件下で、抗体を二官能性リンカー化合物と結合させる段階を含む。これらの実施形態において、本発明の方法は、リンカーを介して薬物部分を抗体に結合させるのに十分な条件下で、抗体リンカーコンジュゲートを薬物部分に結合させる段階をさらに含む。
【0136】
いくつかの実施形態において、抗体薬物コンジュゲートＡＤＣは、次のような分子式を有し、
ここで、
Ａｂは、抗体であり、
ＬＵは、リンカーであり、
Ｄは、薬物であり、
下付きｐは、１～８から選択される値である。
Ａｂは、抗体であり、
ＬＵは、リンカーであり、
Ｄは、薬物であり、
下付きｐは、１～８から選択される値である。
【0137】
本発明の主な利点は、次のとおりである。
【0138】
（１）本発明は、新規構造を有する６価三重特異性抗体を提供する。
【0139】
（２）本発明の三重特異性抗体は、Ｆｃ修飾を必要とせず、ミスマッチの問題を引き起こさず、調製方法が簡単である。
【0140】
（３）本発明の三重特異性抗体は、抗ＰＤ－１、ＨＥＲ－２およびＬＡＧ－３の三重特異性を保持しながら、モノクローナル抗体と類似、さらにそれ以上優れる生物学的活性および物理的・化学的性質を有する。
【0141】
以下、本発明は、具体的実施例と併せてされに説明される。これらの実施例は、本発明を説明するためにのみ使用され、本発明の範囲を限定するものではないことを理解されたい。以下の実施例において、詳細な条件を示さない実験方法は、通常、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、分子クローニング：実験マニュアル（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ＨａＲｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９）に記載される条件等の従来の条件、またはメーカーによって提案された条件に従う。特に明記されない限り、パーセンテージおよび部数は、重量によって計算される。
【0142】
実施例で使用されるタンパク質の発現および精製方法に対する説明は、次のとおりである。標的遺伝子を発現ベクターｐｃＤＮＡ３．４に構築し、ＰＥＩ（ポリエチレンイミン（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ））を使用して、構築した発現ベクターまたは発現ベクターの組み合わせをＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（登録商標）２９３－Ｆ Ｃｅｌｌｓ細胞（以下ＨＥＫ２９３Ｆと略称，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入される）に移入して、抗体または組換えタンパク質を発現させ、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞をＦｒｅｅ Ｓｔｙｌｅ ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入される）で５日間培養した後、細胞上清を収集し、次いでプロテイン（Ｐｒｏｔｅｉｎ）Ａアフィニティークロマトグラフィーで抗体を精製する。
【0143】
次の実施例で使用されるＥＬＩＳＡ検出方法に対する説明は、次のとおりである。対応する組換えタンパク質でマイクロウェルプレートをコーティングし、１％ウシ血清アルブミン含有ＰＢＳＴ（ＰＢＳＴは、０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０を含むリン酸塩緩衝液）でマイクロウェルプレートをブロックする。試験する抗体を勾配希釈し、次いで上記組換えタンパク質をコーティングしたマイクロウェルプレートに移し、室温で３０分間インキュベートした後プレートを洗浄し、適切に希釈したＨＲＰ（Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）標識ヤギ抗ヒト抗体（Ｆｃ ｓｐｅｃｉｆｉｃ、Ｓｉｇｍａから購入される）を加え、室温で３０分間インキュベートした後プレートを洗浄し、ＴＭＢ（３，３′，５，５′－テトラメチルベンジジン（Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ））を基質とする顕色液１００μｌを各ウェルに加え、室温で１～５分間インキュベートし、５０μｌの停止液（２Ｍ Ｈ２ＳＯ４）を加えて反応を停止させ、マイクロプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ １９０）でＯＤ４５０を読み取り、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ７を使用して、グラフ作成およびデータ分析を実行し、ＥＣ５０を計算する。
【0144】
次の実施例で使用される物理的・化学的性質の検出方法に対する説明は、次のとおりである。
【0145】
ＨＰＬＣ－ＳＥＣ
抗体は、高度に複雑な二次および三次構造を有する高分子量タンパク質である。翻訳後修飾、凝集および分解等の変化により、抗体は、生化学的および生物物理学的特性が不均一になる。分離技術で三重特異性抗体を分析する場合、通常、変異体、凝集体および分解断片が観察され、それらの存在により、安全性および有効性を損なう可能性がある。抗体の生産および保存中に、凝集体、分解断片および不完全に組み立てられた分子が発生する傾向がある。本発明は、高速液体クロマトグラフィー－サイズ排除クロマトグラフィー（Ｈｉｇｈ－ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ－ｓｉｚｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＨＰＬＣ－ＳＥＣ）を使用して、サンプル中の上記不純物の含有量を検出する。凝集体の分子量が単量体の分子量より大きいため、対応するピークの保持時間は、より短く、分解断片または不完全に組み立てられた分子の分子量が単量体の分子量より小さいため、対応するピークの保持時間は、より長い。ＨＰＬＣ－ＳＥＣで使用されるクロマトグラフは、Ｄｉｏｎｅｘ Ｕｌｔｉｍａｔｅ ３０００であり、移動相の調製方法は、次のとおりである。適量の２０ｍＭリン酸二水素ナトリウムストック溶液を取り、２０ｍＭリン酸二水素ナトリウムでＰＨを６．８±０．１に調節し、サンプルサイズ：２０μｇ、クロマトグラフィーカラムは、ＴＳＫ Ｇ３０００ＳＷＸＬであり、仕様は、７．８×３００ｍｍ ５μｍであり、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎ、溶出時間３０分間、カラム温度２５℃、サンプルチャンバー温度１０℃、検出波長２１４ｎｍ。
抗体は、高度に複雑な二次および三次構造を有する高分子量タンパク質である。翻訳後修飾、凝集および分解等の変化により、抗体は、生化学的および生物物理学的特性が不均一になる。分離技術で三重特異性抗体を分析する場合、通常、変異体、凝集体および分解断片が観察され、それらの存在により、安全性および有効性を損なう可能性がある。抗体の生産および保存中に、凝集体、分解断片および不完全に組み立てられた分子が発生する傾向がある。本発明は、高速液体クロマトグラフィー－サイズ排除クロマトグラフィー（Ｈｉｇｈ－ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ－ｓｉｚｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＨＰＬＣ－ＳＥＣ）を使用して、サンプル中の上記不純物の含有量を検出する。凝集体の分子量が単量体の分子量より大きいため、対応するピークの保持時間は、より短く、分解断片または不完全に組み立てられた分子の分子量が単量体の分子量より小さいため、対応するピークの保持時間は、より長い。ＨＰＬＣ－ＳＥＣで使用されるクロマトグラフは、Ｄｉｏｎｅｘ Ｕｌｔｉｍａｔｅ ３０００であり、移動相の調製方法は、次のとおりである。適量の２０ｍＭリン酸二水素ナトリウムストック溶液を取り、２０ｍＭリン酸二水素ナトリウムでＰＨを６．８±０．１に調節し、サンプルサイズ：２０μｇ、クロマトグラフィーカラムは、ＴＳＫ Ｇ３０００ＳＷＸＬであり、仕様は、７．８×３００ｍｍ ５μｍであり、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎ、溶出時間３０分間、カラム温度２５℃、サンプルチャンバー温度１０℃、検出波長２１４ｎｍ。
【0146】
ＨＰＬＣ－ＩＥＣ
多くの翻訳後修飾（例えばＮグリコシル化、Ｃ末端リジン残基修飾、Ｎ末端グルタミンまたはグルタミン酸環化、アスパラギンの脱アミド化、アスパラギン酸の異性化およびアミノ酸残基の酸化等）は、直接的または間接的に抗体の表面電荷の変化を引き起こし、電荷の不均一性の生成を引き起こす可能性がある。携帯した電荷に基づいて電荷変異体を分離および分析することができ、一般に使用される分析方法は、陽イオン交換クロマトグラフィー（ｃａｔｉｏｎ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＣＥＸ）および陰イオン交換クロマトグラフィー（ａｎｉｏｎｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＡＥＸ）を含む。クロマトグラフィーに基づく方法で分析する場合、酸性種（ａｃｉｄｉｃ ｓｐｅｃｉｅｓ）および塩基性種（ｂａｓｉｃ ｓｐｅｃｉｅｓ）は、メインピーク（ｍａｉｎ ｐｅａｋ）対する保持時間に基づいて定義される。酸性種は、ＣＥＸのメインピークより早く、またはＡＥＸのメインピークより遅く溶出された変異体であり、塩基性種は、ＣＥＸのメインピークより遅く、またはＡＥＸのメインピークより早く溶出された変異体である。酸性種および塩基性種に対応するピークは、それぞれ酸性ピークおよび塩基性ピークと呼ばれる。抗体の生産および保存中に電荷変異体が容易に生成される。ここでは、高速液体クロマトグラフィー－イオン交換クロマトグラフィー（Ｈｉｇｈ－ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ－ｉｏｎｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＨＰＬＣ－ＩＥＣ）を使用して、サンプルの電荷の不均一性を分析する。ＨＰＬＣ－ＩＥＣで使用されるクロマトグラフは、Ｄｉｏｎｅｘ Ｕｌｔｉｍａｔｅ ３０００であり、移動相Ａ：２０ｍＭ ＰＢ ｐＨ６．３、移動相Ｂ：２０ｍＭ ＰＢ＋２００ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ６．３、二種の移動相の混合比は、事前に設定されたプログラムに従って時間の経過とともに変化し、流速１．０ｍｌ／ｍｉｎであり、クロマトグラフィーカラム：Ｔｈｅｒｍｏ ＰｒｏｐａｃＴＭ ＷＣＸ－１０、カラム温度３０℃、サンプルチャンバー温度１０℃、サンプルサイズ：２０μｇ、検出波長：２１４ｎｍ。
多くの翻訳後修飾（例えばＮグリコシル化、Ｃ末端リジン残基修飾、Ｎ末端グルタミンまたはグルタミン酸環化、アスパラギンの脱アミド化、アスパラギン酸の異性化およびアミノ酸残基の酸化等）は、直接的または間接的に抗体の表面電荷の変化を引き起こし、電荷の不均一性の生成を引き起こす可能性がある。携帯した電荷に基づいて電荷変異体を分離および分析することができ、一般に使用される分析方法は、陽イオン交換クロマトグラフィー（ｃａｔｉｏｎ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＣＥＸ）および陰イオン交換クロマトグラフィー（ａｎｉｏｎｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＡＥＸ）を含む。クロマトグラフィーに基づく方法で分析する場合、酸性種（ａｃｉｄｉｃ ｓｐｅｃｉｅｓ）および塩基性種（ｂａｓｉｃ ｓｐｅｃｉｅｓ）は、メインピーク（ｍａｉｎ ｐｅａｋ）対する保持時間に基づいて定義される。酸性種は、ＣＥＸのメインピークより早く、またはＡＥＸのメインピークより遅く溶出された変異体であり、塩基性種は、ＣＥＸのメインピークより遅く、またはＡＥＸのメインピークより早く溶出された変異体である。酸性種および塩基性種に対応するピークは、それぞれ酸性ピークおよび塩基性ピークと呼ばれる。抗体の生産および保存中に電荷変異体が容易に生成される。ここでは、高速液体クロマトグラフィー－イオン交換クロマトグラフィー（Ｈｉｇｈ－ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ－ｉｏｎｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＨＰＬＣ－ＩＥＣ）を使用して、サンプルの電荷の不均一性を分析する。ＨＰＬＣ－ＩＥＣで使用されるクロマトグラフは、Ｄｉｏｎｅｘ Ｕｌｔｉｍａｔｅ ３０００であり、移動相Ａ：２０ｍＭ ＰＢ ｐＨ６．３、移動相Ｂ：２０ｍＭ ＰＢ＋２００ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ６．３、二種の移動相の混合比は、事前に設定されたプログラムに従って時間の経過とともに変化し、流速１．０ｍｌ／ｍｉｎであり、クロマトグラフィーカラム：Ｔｈｅｒｍｏ ＰｒｏｐａｃＴＭ ＷＣＸ－１０、カラム温度３０℃、サンプルチャンバー温度１０℃、サンプルサイズ：２０μｇ、検出波長：２１４ｎｍ。
【0147】
ＣＥ－ＳＤＳ
本発明は、ＣＥ－ＳＤＳ（Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ－Ｓｏｄｉｕｍ Ｄｏｄｅｃｙｌ Ｓｕｌｆａｔｅ）を使用して、サンプル中の分解断片または不完全に組み立てられた分子の含有量を分析する。ＣＥは、非還元型および還元型の２種類に分類され、前者で使用されるサンプルは、変性中に分子内のジスルフィド結合を破壊するために還元剤ＤＴＴを使用する必要はなく、後者で使用されるサンプルは、変性中に分子内のジスルフィド結合を破壊するために還元剤ＤＴＴを使用する必要がある。非還元および還元ＣＥ－ＳＤＳは、それぞれＮＲ－ＣＥ－ＳＤＳおよびＲ－ＣＥ－ＳＤＳと表される。使用したＭａｕｒｉｃｅ ＣＥ－ＳＤＳ分析システムは、ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅから購入され、ＵＶ２１４ｎｍ検出器を備えている。
本発明は、ＣＥ－ＳＤＳ（Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ－Ｓｏｄｉｕｍ Ｄｏｄｅｃｙｌ Ｓｕｌｆａｔｅ）を使用して、サンプル中の分解断片または不完全に組み立てられた分子の含有量を分析する。ＣＥは、非還元型および還元型の２種類に分類され、前者で使用されるサンプルは、変性中に分子内のジスルフィド結合を破壊するために還元剤ＤＴＴを使用する必要はなく、後者で使用されるサンプルは、変性中に分子内のジスルフィド結合を破壊するために還元剤ＤＴＴを使用する必要がある。非還元および還元ＣＥ－ＳＤＳは、それぞれＮＲ－ＣＥ－ＳＤＳおよびＲ－ＣＥ－ＳＤＳと表される。使用したＭａｕｒｉｃｅ ＣＥ－ＳＤＳ分析システムは、ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅから購入され、ＵＶ２１４ｎｍ検出器を備えている。
【0148】
実施例１．抗ＰＤ－１、ＨＥＲ－２およびＬＡＧ－３に対する三重特異性抗体の構築
実施例１．１．配列
ｍＡｂ１－２５－Ｈｕ（以下、６０９－ＩｇＧ４と略す）は、抗ＰＤ－１ヒト化モノクローナル抗体であり、その重鎖および軽鎖のアミノ酸配列は、ＷＯ２０１８／１３７５７６Ａ１のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０（即ち、本発明におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５および６）に由来する。６０９－ＩｇＧ４の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１および２に示されたとおりである。６０９－ＩｇＧ４重鎖定常領域は、ヒトＩｇＧ４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、ヒンジ領域は、Ｓ２２８Ｐ突然変異を含む）であり、軽鎖定常領域は、ヒトＫａｐｐａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）である。ここで、６０９－ＩｇＧ４重鎖および軽鎖のコード遺伝子をそれぞれ６０９－ＩｇＧ４－ＨＣおよび６０９－ＩｇＧ４－ＬＣと命名する。６０９－ＩｇＧ４－ＨＣおよび６０９－ＩｇＧ４－ＬＣ遺伝子をそれぞれｐｃＤＮＡ３．４発現ベクターに構築し、二種のベクターを組み合わせた後に抗体を発現および精製し、得られた抗体を６０９－ＩｇＧ４と命名する。
実施例１．１．配列
ｍＡｂ１－２５－Ｈｕ（以下、６０９－ＩｇＧ４と略す）は、抗ＰＤ－１ヒト化モノクローナル抗体であり、その重鎖および軽鎖のアミノ酸配列は、ＷＯ２０１８／１３７５７６Ａ１のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０（即ち、本発明におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５および６）に由来する。６０９－ＩｇＧ４の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１および２に示されたとおりである。６０９－ＩｇＧ４重鎖定常領域は、ヒトＩｇＧ４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、ヒンジ領域は、Ｓ２２８Ｐ突然変異を含む）であり、軽鎖定常領域は、ヒトＫａｐｐａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）である。ここで、６０９－ＩｇＧ４重鎖および軽鎖のコード遺伝子をそれぞれ６０９－ＩｇＧ４－ＨＣおよび６０９－ＩｇＧ４－ＬＣと命名する。６０９－ＩｇＧ４－ＨＣおよび６０９－ＩｇＧ４－ＬＣ遺伝子をそれぞれｐｃＤＮＡ３．４発現ベクターに構築し、二種のベクターを組み合わせた後に抗体を発現および精製し、得られた抗体を６０９－ＩｇＧ４と命名する。
【0149】
６０９－ＩｇＧ４重鎖可変領域のアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）：
ＥＶＫＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＡＦＳＳＹＤＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＲＬＥＷＶＡＴＩＳＧＧＧＲＹＴＹＹＰＤＴＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＨＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＦＣＡＳＰＹＧＧＹＦＤＶＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
６０９－ＩｇＧ４軽鎖可変領域のアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）：
ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＩＳＮＦＬＨＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＫＹＡＳＱＳＩＳＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＦＣＱＱＳＮＳＷＰＨＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
６０９－ＩｇＧ４重鎖定常領域のアミノ酸配列（（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）：
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ
６０９－ＩｇＧ４軽鎖定常領域のアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）：
ＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
６０９－ＩｇＧ４重鎖アミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）：
ＥＶＫＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＡＦＳＳＹＤＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＲＬＥＷＶＡＴＩＳＧＧＧＲＹＴＹＹＰＤＴＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＨＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＦＣＡＳＰＹＧＧＹＦＤＶＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ
６０９－ＩｇＧ４軽鎖アミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）：
ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＩＳＮＦＬＨＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＫＹＡＳＱＳＩＳＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＦＣＱＱＳＮＳＷＰＨＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
公開された文献（Ｍａｇｄｅｌａｉｎｅ－Ｂｅｕｚｅｌｉｎ Ｃ， Ｋａａｓ Ｑ， Ｗｅｈｂｉ Ｖ， ｅｔ ａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｏｆ ｔｈｅ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｐｐｒｏｖｅｄ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ［Ｊ］．Ｃｒｉｔｉｃａｌ ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ ｏｎｃｏｌｏｇｙ／ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ， ２００７， ６４（３）：２１０－２２５．）から、トラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）（抗ＨＥＲ－２ヒト化モノクローナル抗体）の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７および８）を取得する。当該重鎖可変領域および軽鎖可変領域は、それぞれヒトＩｇＧ１重鎖定常領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）およびヒトＫａｐｐａ軽鎖定常領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）に接続して、全長の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０および１１）を取得する。ここで、全長の重鎖および軽鎖のコード遺伝子をそれぞれ３０２－ＨＣおよび３０２－ＬＣと命名する。３０２－ＨＣおよび３０２－ＬＣのコード遺伝子をそれぞれｐｃＤＮＡ３．４発現ベクターに構築し、二種のベクターを組み合わせた後に抗体を発現および精製し、得られた抗体を３０２－ＩｇＧ１と命名する。
ＥＶＫＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＡＦＳＳＹＤＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＲＬＥＷＶＡＴＩＳＧＧＧＲＹＴＹＹＰＤＴＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＨＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＦＣＡＳＰＹＧＧＹＦＤＶＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
６０９－ＩｇＧ４軽鎖可変領域のアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）：
ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＩＳＮＦＬＨＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＫＹＡＳＱＳＩＳＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＦＣＱＱＳＮＳＷＰＨＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
６０９－ＩｇＧ４重鎖定常領域のアミノ酸配列（（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）：
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ
６０９－ＩｇＧ４軽鎖定常領域のアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）：
ＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
６０９－ＩｇＧ４重鎖アミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）：
ＥＶＫＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＡＦＳＳＹＤＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＲＬＥＷＶＡＴＩＳＧＧＧＲＹＴＹＹＰＤＴＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＨＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＦＣＡＳＰＹＧＧＹＦＤＶＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ
６０９－ＩｇＧ４軽鎖アミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）：
ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＩＳＮＦＬＨＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＫＹＡＳＱＳＩＳＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＦＣＱＱＳＮＳＷＰＨＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
公開された文献（Ｍａｇｄｅｌａｉｎｅ－Ｂｅｕｚｅｌｉｎ Ｃ， Ｋａａｓ Ｑ， Ｗｅｈｂｉ Ｖ， ｅｔ ａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｏｆ ｔｈｅ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｐｐｒｏｖｅｄ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ［Ｊ］．Ｃｒｉｔｉｃａｌ ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ ｏｎｃｏｌｏｇｙ／ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ， ２００７， ６４（３）：２１０－２２５．）から、トラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）（抗ＨＥＲ－２ヒト化モノクローナル抗体）の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７および８）を取得する。当該重鎖可変領域および軽鎖可変領域は、それぞれヒトＩｇＧ１重鎖定常領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）およびヒトＫａｐｐａ軽鎖定常領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）に接続して、全長の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０および１１）を取得する。ここで、全長の重鎖および軽鎖のコード遺伝子をそれぞれ３０２－ＨＣおよび３０２－ＬＣと命名する。３０２－ＨＣおよび３０２－ＬＣのコード遺伝子をそれぞれｐｃＤＮＡ３．４発現ベクターに構築し、二種のベクターを組み合わせた後に抗体を発現および精製し、得られた抗体を３０２－ＩｇＧ１と命名する。
【0150】
３０２－ＩｇＧ１重鎖可変領域のアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＮＩＫＤＴＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＲＩＹＰＴＮＧＹＴＲＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＳＲＷＧＧＤＧＦＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
３０２－ＩｇＧ１軽鎖可変領域のアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＮＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＲＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＨＹＴＴＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域のアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）：
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
３０２－ＩｇＧ１重鎖アミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＮＩＫＤＴＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＲＩＹＰＴＮＧＹＴＲＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＳＲＷＧＧＤＧＦＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
３０２－ＩｇＧ１軽鎖アミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＮＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＲＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＨＹＴＴＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
１３４－Ｈｕ－ＩｇＧ４－Ｃ９１Ｓ（以下、１３４－ＩｇＧ４と略す）は、抗ヒトＬＡＧ－３ヒト化モノクローナル抗体であり、その重鎖および軽鎖のアミノ酸配列は、ＷＯ２０２０／１７３３７８Ａ１のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６（即ち、本発明におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２および１３）に由来する。１３４－ＩｇＧ４モノクローナル抗体の重鎖定常領域は、ヒトＩｇＧ４（ヒンジ領域は、Ｓ２２８Ｐ突然変異を含む）であり、軽鎖定常領域は、ヒトＫａｐｐａである。ここで、１３４－ＩｇＧ４重鎖および軽鎖のコード遺伝子をそれぞれ１３４－ＩｇＧ４－ＨＣおよび１３４－ＩｇＧ４－ＬＣと命名する。１３４－ＩｇＧ４－ＨＣおよび１３４－ＩｇＧ４－ＬＣの遺伝子をそれぞれｐｃＤＮＡ３．４発現ベクターに構築し、二種のベクターを組み合わせた後に抗体を発現および精製し、得られた抗体を１３４－ＩｇＧ４と命名する。
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＮＩＫＤＴＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＲＩＹＰＴＮＧＹＴＲＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＳＲＷＧＧＤＧＦＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
３０２－ＩｇＧ１軽鎖可変領域のアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＮＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＲＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＨＹＴＴＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域のアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）：
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
３０２－ＩｇＧ１重鎖アミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＮＩＫＤＴＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＲＩＹＰＴＮＧＹＴＲＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＳＲＷＧＧＤＧＦＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
３０２－ＩｇＧ１軽鎖アミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＮＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＲＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＨＹＴＴＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
１３４－Ｈｕ－ＩｇＧ４－Ｃ９１Ｓ（以下、１３４－ＩｇＧ４と略す）は、抗ヒトＬＡＧ－３ヒト化モノクローナル抗体であり、その重鎖および軽鎖のアミノ酸配列は、ＷＯ２０２０／１７３３７８Ａ１のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６（即ち、本発明におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２および１３）に由来する。１３４－ＩｇＧ４モノクローナル抗体の重鎖定常領域は、ヒトＩｇＧ４（ヒンジ領域は、Ｓ２２８Ｐ突然変異を含む）であり、軽鎖定常領域は、ヒトＫａｐｐａである。ここで、１３４－ＩｇＧ４重鎖および軽鎖のコード遺伝子をそれぞれ１３４－ＩｇＧ４－ＨＣおよび１３４－ＩｇＧ４－ＬＣと命名する。１３４－ＩｇＧ４－ＨＣおよび１３４－ＩｇＧ４－ＬＣの遺伝子をそれぞれｐｃＤＮＡ３．４発現ベクターに構築し、二種のベクターを組み合わせた後に抗体を発現および精製し、得られた抗体を１３４－ＩｇＧ４と命名する。
【0151】
１３４ヒト化重鎖１３４－ＩｇＧ４－ＨＣのアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）：
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＬＴＡＹＹＭＮＷＶＲＱＡＰＧＱＳＬＥＷＩＧＶＩＮＰＹＮＧＤＳＳＹＮＱＫＦＫＧＲＡＴＬＴＶＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＤＧＹＹＲＷＹＦＤＶＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ（ここで、下線部は、重鎖相補性決定領域である）
１３４ヒト化軽鎖１３４－ＩｇＧ４－ＬＣのアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＩＧＳＲＬＮＷＬＱＱＫＰＧＫＳＩＫＲＬＩＹＡＴＳＳＬＥＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＲＳＧＳＤＹＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＳＧＳＳＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（ここで、下線部は、軽鎖相補性決定領域である）。
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＬＴＡＹＹＭＮＷＶＲＱＡＰＧＱＳＬＥＷＩＧＶＩＮＰＹＮＧＤＳＳＹＮＱＫＦＫＧＲＡＴＬＴＶＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＤＧＹＹＲＷＹＦＤＶＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ（ここで、下線部は、重鎖相補性決定領域である）
１３４ヒト化軽鎖１３４－ＩｇＧ４－ＬＣのアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＩＧＳＲＬＮＷＬＱＱＫＰＧＫＳＩＫＲＬＩＹＡＴＳＳＬＥＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＲＳＧＳＤＹＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＳＧＳＳＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（ここで、下線部は、軽鎖相補性決定領域である）。
【0152】
実施例１．２．三重特異性抗体の構築
６０９－ＩｇＧ４の重鎖可変領域を人工リンカー（直列連結された三つのＧＧＧＧＳ）を介して３０２－ＩｇＧ１の重鎖可変領域に接続してから、人工リンカー（直列連結された三つのＧＧＧＧＳ）を介してヒト１３４－ＩｇＧ４の重鎖（ヒンジ領域は、Ｓ２２８Ｐ突然変異を含む）に接続し、この手順によって構築された三つの重鎖可変領域を含む長い重鎖遺伝子を６０９ＶＨ－３０２ＶＨ－１３４－ＩｇＧ４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）と命名する。６０９の軽鎖可変領域を人工リンカー（直列連結された三つのＧＧＧＧＳ）を介して３０２－ＩｇＧ１の軽鎖可変領域に接続し、この手順によって構築された二つの軽鎖可変領域を含む長い軽鎖遺伝子を６０９ＶＬ－３０２ＶＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）と命名する。
６０９－ＩｇＧ４の重鎖可変領域を人工リンカー（直列連結された三つのＧＧＧＧＳ）を介して３０２－ＩｇＧ１の重鎖可変領域に接続してから、人工リンカー（直列連結された三つのＧＧＧＧＳ）を介してヒト１３４－ＩｇＧ４の重鎖（ヒンジ領域は、Ｓ２２８Ｐ突然変異を含む）に接続し、この手順によって構築された三つの重鎖可変領域を含む長い重鎖遺伝子を６０９ＶＨ－３０２ＶＨ－１３４－ＩｇＧ４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）と命名する。６０９の軽鎖可変領域を人工リンカー（直列連結された三つのＧＧＧＧＳ）を介して３０２－ＩｇＧ１の軽鎖可変領域に接続し、この手順によって構築された二つの軽鎖可変領域を含む長い軽鎖遺伝子を６０９ＶＬ－３０２ＶＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）と命名する。
【0153】
上記配列のコード遺伝子をそれぞれｐｃＤＮＡ３．４発現ベクターに構築し、６０９ＶＨ－３０２ＶＨ－１３４－ＩｇＧ４、６０９ＶＬ－３０２ＶＬおよび１３４－ＩｇＧ４－ＬＣの発現ベクターを組み合わせ、抗体を発現および精製し、得られた抗体を６０９－３０２－１３４－ＩｇＧ４と命名する。
【0154】
６０９ＶＨ－３０２ＶＨ－１３４－ＩｇＧ４アミノ酸配列：
ＥＶＫＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＡＦＳＳＹＤＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＲＬＥＷＶＡＴＩＳＧＧＧＲＹＴＹＹＰＤＴＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＨＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＦＣＡＳＰＹＧＧＹＦＤＶＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＮＩＫＤＴＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＲＩＹＰＴＮＧＹＴＲＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＳＲＷＧＧＤＧＦＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＬＴＡＹＹＭＮＷＶＲＱＡＰＧＱＳＬＥＷＩＧＶＩＮＰＹＮＧＤＳＳＹＮＱＫＦＫＧＲＡＴＬＴＶＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＤＧＹＹＲＷＹＦＤＶＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）
６０９ＶＬ－３０２ＶＬアミノ酸配列：
ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＩＳＮＦＬＨＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＫＹＡＳＱＳＩＳＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＦＣＱＱＳＮＳＷＰＨＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＮＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＲＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＨＹＴＴＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）
三重特異性抗体の安定性を増強するために、ここで６０９ＶＨ－３０２ＶＨ－１３４－ＩｇＧ４と６０９ＶＬ－３０２ＶＬとの間に一対のジスルフィド結合を導入する試みが行われる。文献（Ｃｈｏ， Ｈｙｕｎ－Ｓｏｏ ＆ Ｍａｓｏｎ， Ｋａｒｅｎ ＆ Ｒａｍｙａｒ， Ｋａｓｒａ ＆ Ｓｔａｎｌｅｙ， Ａｎｎ ＆ Ｇａｂｅｌｌｉ， Ｓａｎｄｒａ ＆ Ｄｅｎｎｅｙ， Ｄａｎ ＆ Ｌｅａｈｙ， Ｄａｎｉｅｌ．（２００３）．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ＨＥＲ２ ａｌｏｎｅ ａｎｄ ｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ Ｆａｂ．Ｎａｔｕｒｅ．４２１．７５６－６０．１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０１３９２．）で報告されたトラスツズマブの結晶構造（関連情報については、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ／ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ／１Ｎ８Ｚを参照する）によれば、ここではＶＨおよびＶＬの境界面にある空間的に近いアミノ酸残基のペアが選択され、且つシステインに突然変異し、これらの対のアミノ酸残基は、それぞれ、ＶＨの４４番目のアミノ酸およびＶＬの１００番目のアミノ酸、ＶＨの１０５番目のアミノ酸およびＶＬの４３番目のアミノ酸（上記アミノ酸残基は、Ｋａｂａｔルールに従ってコードされる）である。
ＥＶＫＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＡＦＳＳＹＤＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＲＬＥＷＶＡＴＩＳＧＧＧＲＹＴＹＹＰＤＴＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＨＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＦＣＡＳＰＹＧＧＹＦＤＶＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＮＩＫＤＴＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＲＩＹＰＴＮＧＹＴＲＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＳＲＷＧＧＤＧＦＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＬＴＡＹＹＭＮＷＶＲＱＡＰＧＱＳＬＥＷＩＧＶＩＮＰＹＮＧＤＳＳＹＮＱＫＦＫＧＲＡＴＬＴＶＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＤＧＹＹＲＷＹＦＤＶＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）
６０９ＶＬ－３０２ＶＬアミノ酸配列：
ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＩＳＮＦＬＨＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＫＹＡＳＱＳＩＳＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＦＣＱＱＳＮＳＷＰＨＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＮＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＲＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＨＹＴＴＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）
三重特異性抗体の安定性を増強するために、ここで６０９ＶＨ－３０２ＶＨ－１３４－ＩｇＧ４と６０９ＶＬ－３０２ＶＬとの間に一対のジスルフィド結合を導入する試みが行われる。文献（Ｃｈｏ， Ｈｙｕｎ－Ｓｏｏ ＆ Ｍａｓｏｎ， Ｋａｒｅｎ ＆ Ｒａｍｙａｒ， Ｋａｓｒａ ＆ Ｓｔａｎｌｅｙ， Ａｎｎ ＆ Ｇａｂｅｌｌｉ， Ｓａｎｄｒａ ＆ Ｄｅｎｎｅｙ， Ｄａｎ ＆ Ｌｅａｈｙ， Ｄａｎｉｅｌ．（２００３）．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ＨＥＲ２ ａｌｏｎｅ ａｎｄ ｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ Ｆａｂ．Ｎａｔｕｒｅ．４２１．７５６－６０．１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０１３９２．）で報告されたトラスツズマブの結晶構造（関連情報については、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ／ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ／１Ｎ８Ｚを参照する）によれば、ここではＶＨおよびＶＬの境界面にある空間的に近いアミノ酸残基のペアが選択され、且つシステインに突然変異し、これらの対のアミノ酸残基は、それぞれ、ＶＨの４４番目のアミノ酸およびＶＬの１００番目のアミノ酸、ＶＨの１０５番目のアミノ酸およびＶＬの４３番目のアミノ酸（上記アミノ酸残基は、Ｋａｂａｔルールに従ってコードされる）である。
【0155】
ここで、６０９ＶＨ－３０２ＶＨ－１３４－ＩｇＧ４の３０２重鎖可変領域の４４番目のＧをＣに突然変異し、得られた配列を６０９ＶＨ－３０２ＶＨ（４４Ｃ）－１３４－ＩｇＧ４と命名し、同時に６０９ＶＬ－３０２ＶＬの３０２軽鎖可変領域の１００番目のＱをＣに突然変異し、得られた配列を６０９ＶＬ－３０２ＶＬ（１００Ｃ）と命名し、
６０９ＶＨ－３０２ＶＨ（４４Ｃ）－１３４－ＩｇＧ４アミノ酸配列：
ＥＶＫＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＡＦＳＳＹＤＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＲＬＥＷＶＡＴＩＳＧＧＧＲＹＴＹＹＰＤＴＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＨＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＦＣＡＳＰＹＧＧＹＦＤＶＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＮＩＫＤＴＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＣＬＥＷＶＡＲＩＹＰＴＮＧＹＴＲＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＳＲＷＧＧＤＧＦＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＬＴＡＹＹＭＮＷＶＲＱＡＰＧＱＳＬＥＷＩＧＶＩＮＰＹＮＧＤＳＳＹＮＱＫＦＫＧＲＡＴＬＴＶＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＤＧＹＹＲＷＹＦＤＶＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６、ここで、下線は、突然変異部位である）
６０９ＶＬ－３０２ＶＬ（１００Ｃ）アミノ酸配列：
ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＩＳＮＦＬＨＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＫＹＡＳＱＳＩＳＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＦＣＱＱＳＮＳＷＰＨＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＮＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＲＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＨＹＴＴＰＰＴＦＧＣＧＴＫＶＥＩＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７、ここで、下線は、突然変異部位である）
ここで、６０９ＶＨ－３０２ＶＨ－１３４－ＩｇＧ４の３０２重鎖可変領域の１０５番目のＱをＣに突然変異し、得られた配列を６０９ＶＨ－３０２ＶＨ（１０５Ｃ）－１３４－ＩｇＧ４と命名し、同時に６０９ＶＬ－３０２ＶＬの３０２軽鎖可変領域の４３番目のＡをＣに突然変異し、得られた配列を６０９ＶＬ－３０２ＶＬ（４３Ｃ）と命名し、
６０９ＶＨ－３０２ＶＨ（１０５Ｃ）－１３４－ＩｇＧ４アミノ酸配列：
ＥＶＫＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＡＦＳＳＹＤＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＲＬＥＷＶＡＴＩＳＧＧＧＲＹＴＹＹＰＤＴＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＨＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＦＣＡＳＰＹＧＧＹＦＤＶＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＮＩＫＤＴＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＲＩＹＰＴＮＧＹＴＲＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＳＲＷＧＧＤＧＦＹＡＭＤＹＷＧＣＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＬＴＡＹＹＭＮＷＶＲＱＡＰＧＱＳＬＥＷＩＧＶＩＮＰＹＮＧＤＳＳＹＮＱＫＦＫＧＲＡＴＬＴＶＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＤＧＹＹＲＷＹＦＤＶＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８、ここで、下線は、突然変異部位である）
６０９ＶＬ－３０２ＶＬ（４３Ｃ）アミノ酸：
ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＩＳＮＦＬＨＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＫＹＡＳＱＳＩＳＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＦＣＱＱＳＮＳＷＰＨＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＮＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＣＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＲＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＨＹＴＴＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９、ここで、下線は、突然変異部位である）
上記配列のコード遺伝子をそれぞれｐｃＤＮＡ３．４発現ベクターに構築し、対応するベクターを組み合わせた後（６０９ＶＨ－３０２ＶＨ－１３４－ＩｇＧ４、６０９ＶＬ－３０２ＶＬおよび１３４－ＩｇＧ４－ＬＣの組み合わせ、６０９ＶＨ－３０２ＶＨ（４４Ｃ）－１３４－ＩｇＧ４、６０９ＶＬ－３０２ＶＬ（１００Ｃ）および１３４－ＩｇＧ４－ＬＣの組み合わせ、６０９ＶＨ－３０２ＶＨ（１０５Ｃ）－１３４－ＩｇＧ４、６０９ＶＬ－３０２ＶＬ（４３Ｃ）および１３４－ＩｇＧ４－ＬＣの組み合わせ）、抗体を発現および精製し、得られた抗体をそれぞれ６０９－３０２－１３４－ＩｇＧ４、６０９－３０２－（４４ＣＣ）－１３４－ＩｇＧ４および６０９－３０２－（１０５ＣＣ）－１３４－ＩｇＧ４と命名する。
６０９ＶＨ－３０２ＶＨ（４４Ｃ）－１３４－ＩｇＧ４アミノ酸配列：
ＥＶＫＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＡＦＳＳＹＤＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＲＬＥＷＶＡＴＩＳＧＧＧＲＹＴＹＹＰＤＴＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＨＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＦＣＡＳＰＹＧＧＹＦＤＶＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＮＩＫＤＴＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＣＬＥＷＶＡＲＩＹＰＴＮＧＹＴＲＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＳＲＷＧＧＤＧＦＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＬＴＡＹＹＭＮＷＶＲＱＡＰＧＱＳＬＥＷＩＧＶＩＮＰＹＮＧＤＳＳＹＮＱＫＦＫＧＲＡＴＬＴＶＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＤＧＹＹＲＷＹＦＤＶＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６、ここで、下線は、突然変異部位である）
６０９ＶＬ－３０２ＶＬ（１００Ｃ）アミノ酸配列：
ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＩＳＮＦＬＨＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＫＹＡＳＱＳＩＳＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＦＣＱＱＳＮＳＷＰＨＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＮＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＲＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＨＹＴＴＰＰＴＦＧＣＧＴＫＶＥＩＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７、ここで、下線は、突然変異部位である）
ここで、６０９ＶＨ－３０２ＶＨ－１３４－ＩｇＧ４の３０２重鎖可変領域の１０５番目のＱをＣに突然変異し、得られた配列を６０９ＶＨ－３０２ＶＨ（１０５Ｃ）－１３４－ＩｇＧ４と命名し、同時に６０９ＶＬ－３０２ＶＬの３０２軽鎖可変領域の４３番目のＡをＣに突然変異し、得られた配列を６０９ＶＬ－３０２ＶＬ（４３Ｃ）と命名し、
６０９ＶＨ－３０２ＶＨ（１０５Ｃ）－１３４－ＩｇＧ４アミノ酸配列：
ＥＶＫＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＡＦＳＳＹＤＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＲＬＥＷＶＡＴＩＳＧＧＧＲＹＴＹＹＰＤＴＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＨＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＦＣＡＳＰＹＧＧＹＦＤＶＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＮＩＫＤＴＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＲＩＹＰＴＮＧＹＴＲＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＳＲＷＧＧＤＧＦＹＡＭＤＹＷＧＣＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＬＴＡＹＹＭＮＷＶＲＱＡＰＧＱＳＬＥＷＩＧＶＩＮＰＹＮＧＤＳＳＹＮＱＫＦＫＧＲＡＴＬＴＶＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＤＧＹＹＲＷＹＦＤＶＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８、ここで、下線は、突然変異部位である）
６０９ＶＬ－３０２ＶＬ（４３Ｃ）アミノ酸：
ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＩＳＮＦＬＨＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＫＹＡＳＱＳＩＳＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＦＣＱＱＳＮＳＷＰＨＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＮＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＣＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＲＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＨＹＴＴＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９、ここで、下線は、突然変異部位である）
上記配列のコード遺伝子をそれぞれｐｃＤＮＡ３．４発現ベクターに構築し、対応するベクターを組み合わせた後（６０９ＶＨ－３０２ＶＨ－１３４－ＩｇＧ４、６０９ＶＬ－３０２ＶＬおよび１３４－ＩｇＧ４－ＬＣの組み合わせ、６０９ＶＨ－３０２ＶＨ（４４Ｃ）－１３４－ＩｇＧ４、６０９ＶＬ－３０２ＶＬ（１００Ｃ）および１３４－ＩｇＧ４－ＬＣの組み合わせ、６０９ＶＨ－３０２ＶＨ（１０５Ｃ）－１３４－ＩｇＧ４、６０９ＶＬ－３０２ＶＬ（４３Ｃ）および１３４－ＩｇＧ４－ＬＣの組み合わせ）、抗体を発現および精製し、得られた抗体をそれぞれ６０９－３０２－１３４－ＩｇＧ４、６０９－３０２－（４４ＣＣ）－１３４－ＩｇＧ４および６０９－３０２－（１０５ＣＣ）－１３４－ＩｇＧ４と命名する。
【0156】
本発明における抗体の名称は、表２に示されたとおりである。
【0157】
ここで、それぞれポリヒスチジンタグを有するＨＥＲ２細胞外セグメント組換えタンパク質（ＨＥＲ２－Ｈｉｓと表記、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ．から購入される）、ＰＤ－１細胞外セグメント組換えタンパク質（ＰＤ１－Ｈｉｓと表記、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ．から購入される）およびＬＡＧ－３細胞外セグメント組換えタンパク質（ＬＡＧ３－Ｈｉｓと表記、ＡＣＲＯＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入される）を使用してマイクロウェルプレートをコーティングし、コーティング濃度は、それぞれ２０ｎｇ／ウェル、２０ｎｇ／ウェルおよび１０ｎｇ／ウェルである。
【0158】
【0159】
【0160】
図３Ｂは、６０９－３０２－１３４－ＩｇＧ４のＨＰＬＣ－ＳＥＣスペクトルを示し、メインピークは、９８．２４％を占める。
【0161】
図３Ｃは、６０９－３０２－（４４ＣＣ）－１３４－ＩｇＧ４のＨＰＬＣ－ＳＥＣスペクトルを示し、メインピークは、９８．４％を占める。
【0162】
図３Ｄは、６０９－３０２－（１０５ＣＣ）－１３４－ＩｇＧ４のＨＰＬＣ－ＳＥＣスペクトルを示し、メインピークは、９８．０６％を占める。
【0163】
上記結果は、ワンステップのプロテインＡアフィニティークロマトグラフィー精製後、三重特異性抗体のＳＥＣ純度が９８％以上に達することができ、サイズの不均一性がモノクローナル抗体に近いことを示す。
【0164】
１．４．２．ＨＰＬＣ－ＩＥＣ
図４Ａは、モノクローナル抗体６０９－ＩｇＧ４のＨＰＬＣ－ＩＥＣスペクトルを示し、メインピークは、７１．４５％を占める。
図４Ａは、モノクローナル抗体６０９－ＩｇＧ４のＨＰＬＣ－ＩＥＣスペクトルを示し、メインピークは、７１．４５％を占める。
【0165】
図４Ｂは、６０９－３０２－（４４ＣＣ）－１３４－ＩｇＧ４のＨＰＬＣ－ＩＥＣスペクトルを示し、メインピークは、７１．６２％を占める。
【0166】
図４Ｃは、６０９－３０２－（１０５ＣＣ）－１３４－ＩｇＧ４のＨＰＬＣ－ＩＥＣスペクトルを示し、メインピークは、６６．１２％を占める。
【0167】
上記結果は、ワンステップのプロテインＡアフィニティークロマトグラフィー精製後、三重特異性抗体のＩＥＣメインピークが６６％以上に達することができ、電荷の不均一性がモノクローナル抗体に匹敵することを示す。
【0168】
１．４．３．ＣＥ－ＳＤＳ
図５Ａおよび図５Ｂは、それぞれ、モノクローナル抗体６０９－ＩｇＧ４のＮＲ－ＣＥ－ＳＤＳおよびＲ－ＣＥ－ＳＤＳスペクトルを示し、ＮＲ－ＣＥ－ＳＤＳスペクトル中のメインピークＰｅａｋ２．６７２は、９８．９％を占め、Ｒ－ＣＥ－ＳＤＳスペクトル中の二つのメインピークＰｅａｋ１．４９９（軽鎖に対応する）およびＰｅａｋ１．８８８（重鎖に対応する）は、それぞれ、３１．３％および６７．７％を占め、二つのメインピークの合計は、９９．０％である。
図５Ａおよび図５Ｂは、それぞれ、モノクローナル抗体６０９－ＩｇＧ４のＮＲ－ＣＥ－ＳＤＳおよびＲ－ＣＥ－ＳＤＳスペクトルを示し、ＮＲ－ＣＥ－ＳＤＳスペクトル中のメインピークＰｅａｋ２．６７２は、９８．９％を占め、Ｒ－ＣＥ－ＳＤＳスペクトル中の二つのメインピークＰｅａｋ１．４９９（軽鎖に対応する）およびＰｅａｋ１．８８８（重鎖に対応する）は、それぞれ、３１．３％および６７．７％を占め、二つのメインピークの合計は、９９．０％である。
【0169】
図５Ｃおよび図５Ｄは、それぞれ、６０９－３０２－１３４－ＩｇＧ４のＮＲ－ＣＥ－ＳＤＳおよびＲ－ＣＥ－ＳＤＳのスペクトルを示し、ＮＲ－ＣＥ－ＳＤＳスペクトル中の二つのメインピークＰｅａｋ１．５２５およびＰｅａｋ２．８９３は、それぞれ、１８．６％および８０．８％を占め、６０９－３０２－１３４－ＩｇＧ４分子では６０９ＶＬ－３０２ＶＬが６０９ＶＨ－３０２ＶＨ－１３４－ＩｇＧ４と共有ジスルフィド結合を形成しないため、Ｐｅａｋ１．５２５に対応するポリペプチドは、６０９ＶＬ－３０２ＶＬであると考えられ、Ｒ－ＣＥ－ＳＤＳスペクトル中の二つのメインピークＰｅａｋ１．５１８（軽鎖に対応する）およびＰｅａｋ２．１５８（重鎖に対応する）は、それぞれ、３４．８％および６２．５％を占め、二つのメインピークの合計は、９７．３％である。
【0170】
図５Ｅおよび図５Ｆは、それぞれ、６０９－３０２－（４４ＣＣ）－１３４－ＩｇＧ４のＮＲ－ＣＥ－ＳＤＳおよびＲ－ＣＥ－ＳＤＳのスペクトルを示し、ＮＲ－ＣＥ－ＳＤＳスペクトル中のメインピークＰｅａｋ３．０１８は、９６．４％を占め、Ｒ－ＣＥ－ＳＤＳスペクトル中の二つのメインピークＰｅａｋ１．５１５（軽鎖に対応する）およびＰｅａｋ２．１５９（重鎖に対応する）は、それぞれ、３４．９％および６２．０％を占め、二つのメインピークの合計は、９６．９％である。図５Ｇおよび図５Ｈは、それぞれ、６０９－３０２－（１０５ＣＣ）－１３４－ＩｇＧ４のＮＲ－ＣＥ－ＳＤＳおよびＲ－ＣＥ－ＳＤＳのスペクトルを示し、ＮＲ－ＣＥ－ＳＤＳスペクトル中のメインピークＰｅａｋ３．０２０は、９１．８％を占め、Ｒ－ＣＥ－ＳＤＳスペクトル中の二つのメインピークＰｅａｋ１．５０８（軽鎖に対応する）およびＰｅａｋ２．１４７（重鎖に対応する）は、それぞれ、３６．６％および５６．９％を占め、二つのメインピークの合計は、９３．５％である。
【0171】
上記結果は、ワンステップのプロテインＡアフィニティークロマトグラフィー精製後、三重特異性抗体６０９－３０２－（４４ＣＣ）－１３４－ＩｇＧ４のＮＲ－ＣＥ－ＳＤＳおよびＲ－ＣＥ－ＳＤＳの純度がすべて９６％以上に達することができ、モノクローナル抗体６０９－ＩｇＧ４に最も近いことを示す。
【0172】
実施例２．免疫応答の刺激における本発明の三重特異性抗体の機能的活性の測定
１０％ウシ胎児血清、１％ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（Ｎｏｎ－Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、１％ピルビン酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ Ｐｙｒｕｖａｔｅ）、１％ＨＥＰＥＳ、１‰２－メルカプトエタノール（２－Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）、１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）、１％ＧｌｕｔａＭＡＸ（上記培地および添加剤は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入される）をＲＰＭＩ１６４０に加える。上記ＲＰＭＩ１６４０完全培地を使用して、新たに分離したヒト末梢血単核球（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｂｌｏｏｄ Ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ Ｃｅｌｌ、ＰＢＭＣ。ＰＢＭＣは、Ａｌｌｃｅｌｌｓから購入され、製品番号：ＰＢ００５－Ｃ）を洗浄および再懸濁し、一定量のスーパー抗原である黄色ブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ Ｂ、ＳＥＢ）を加える。ＳＥＢは、実験室内部で調製され、配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔ（Ｅｎｔｒｙ：Ｐ０１５５２）に由来し、大腸菌で発現され、Ｎｉ－ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーで精製する。ＰＢＭＣ細胞懸濁液を丸底９６ウェル細胞培養プレートに、ウェルあたり１５０μｌの懸濁液および２０００００個の細胞を接種し、上記９６ウェルプレートに勾配希釈した５０μｌの関連抗体を加え、９６ウェルプレートを３７℃の細胞インキュベーターに置いて、４日間インキュベートする。９６ウェルプレートから適量の細胞培養上清を取る。二重抗体サンドイッチ法（ｓａｎｄｗｉｃｈ ＥＬＩＳＡ）を使用して、上清中のＩＬ－２（関連検出用の対の抗体は、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入される）を検出する。マイクロプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ１９０）でＯＤ４５０を読み取り、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ７でデータを分析し、グラフを作成し、ＥＣ５０を計算する。
１０％ウシ胎児血清、１％ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（Ｎｏｎ－Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、１％ピルビン酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ Ｐｙｒｕｖａｔｅ）、１％ＨＥＰＥＳ、１‰２－メルカプトエタノール（２－Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）、１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）、１％ＧｌｕｔａＭＡＸ（上記培地および添加剤は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入される）をＲＰＭＩ１６４０に加える。上記ＲＰＭＩ１６４０完全培地を使用して、新たに分離したヒト末梢血単核球（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｂｌｏｏｄ Ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ Ｃｅｌｌ、ＰＢＭＣ。ＰＢＭＣは、Ａｌｌｃｅｌｌｓから購入され、製品番号：ＰＢ００５－Ｃ）を洗浄および再懸濁し、一定量のスーパー抗原である黄色ブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ Ｂ、ＳＥＢ）を加える。ＳＥＢは、実験室内部で調製され、配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔ（Ｅｎｔｒｙ：Ｐ０１５５２）に由来し、大腸菌で発現され、Ｎｉ－ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーで精製する。ＰＢＭＣ細胞懸濁液を丸底９６ウェル細胞培養プレートに、ウェルあたり１５０μｌの懸濁液および２０００００個の細胞を接種し、上記９６ウェルプレートに勾配希釈した５０μｌの関連抗体を加え、９６ウェルプレートを３７℃の細胞インキュベーターに置いて、４日間インキュベートする。９６ウェルプレートから適量の細胞培養上清を取る。二重抗体サンドイッチ法（ｓａｎｄｗｉｃｈ ＥＬＩＳＡ）を使用して、上清中のＩＬ－２（関連検出用の対の抗体は、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入される）を検出する。マイクロプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ１９０）でＯＤ４５０を読み取り、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ７でデータを分析し、グラフを作成し、ＥＣ５０を計算する。
【0173】
【0174】
本発明で言及されたすべての文書は、あたかも各文書が個別に参照として引用されたかのように、本出願における参照として引用される。さらに、本発明の上記の教示内容を読んだ後、当業者は本発明に様々な変更または修正を加えることができ、これらの同等の形態も、本出願の添付の請求範囲によって定義される範囲に含まれる。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図5E】
【図5F】
【図5G】
【図5H】
【図6】
【配列表】
【国際調査報告】