(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-07-17
(54)【発明の名称】抗ＴＮＦ抗体組成物を製造するための製造方法
(51)【国際特許分類】
C07K 16/24 20060101AFI20240709BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20240709BHJP
【ＦＩ】
C07K16/24 ZNA
C12P21/02 C
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024500536
(86)(22)【出願日】2022-07-08
(85)【翻訳文提出日】2024-02-28
(86)【国際出願番号】 IB2022056342
(87)【国際公開番号】W WO2023281463
(87)【国際公開日】2023-01-12
(31)【優先権主張番号】63/219,901
(32)【優先日】2021-07-09
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】509087759
【氏名又は名称】ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド
(74)【代理人】
【識別番号】100092783
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 浩
(74)【代理人】
【識別番号】100095360
【弁理士】
【氏名又は名称】片山 英二
(74)【代理人】
【識別番号】100093676
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 純子
(74)【代理人】
【識別番号】100120134
【弁理士】
【氏名又は名称】大森 規雄
(74)【代理人】
【識別番号】100149010
【弁理士】
【氏名又は名称】星川 亮
(72)【発明者】
【氏名】ドンロン，アン
(72)【発明者】
【氏名】ゴードン，ゲリー
(72)【発明者】
【氏名】ゴーチェ，チャールズ エフ．
(72)【発明者】
【氏名】ヘイズ，ロナン
(72)【発明者】
【氏名】ジョンストン，ロビン
(72)【発明者】
【氏名】スティーンボーデン，ウィレム
(72)【発明者】
【氏名】トゥーミー，デニス
【テーマコード（参考）】
4B064
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG26
4B064CA10
4B064CA19
4B064CC24
4B064CD01
4B064DA01
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA53
4H045CA40
4H045DA75
4H045EA20
4H045FA74
4H045GA21
(57)【要約】
本発明は、抗ＴＮＦ抗体、例えば抗ＴＮＦ抗体ゴリムマブを産生するための製造方法、及び当該抗体の特定の医薬組成物に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
抗ＴＮＦ抗体であって、（ｉ）配列番号３６の重鎖アミノ酸配列、及び（ｉｉ）配列番号３７の軽鎖アミノ酸配列を含み、前記抗ＴＮＦ抗体のオリゴ糖プロファイルが、≧８２．０％～≦９４．４％の総中性オリゴ糖種、≧５．６％～≦１８．０％の総荷電オリゴ糖種、並びに≧２５．６％～≦４２．２％のＧ０Ｆ、≧３１．２％～≦４３．６％のＧ１Ｆ、及び≧５．６％～≦１４．２％のＧ２Ｆの個々の中性オリゴ糖種を含み、前記抗ＴＮＦ抗体が、前記抗ＴＮＦ抗体の前記オリゴ糖プロファイルを制御する製造方法によって生成され、前記製造方法が、真核細胞を、≧１０．０μｇ／リットル～≦３５．０μｇ／リットルのＭｎ２＋（マンガン）及び≧１．０μｇ／リットル～≦１．８μｇ／リットルのＣｕ２＋（銅）からなる特定の微量金属濃度のマンガン及び銅を含有するように制御された化学的に規定された培地において培養することと、前記真核細胞において前記抗ＴＮＦ抗体を発現させることとを含み、マンガン及び銅の前記濃度が、前記抗ＴＮＦ抗体の前記オリゴ糖プロファイルを制御するのに有効である、抗ＴＮＦ抗体。
【請求項2】
前記抗ＴＮＦ抗体がバイオ後続品である、請求項１に記載の抗ＴＮＦ抗体。
【請求項3】
（ｉ）配列番号３６の重鎖アミノ酸配列、及び（ｉｉ）配列番号３７の軽鎖アミノ酸配列を含む抗ＴＮＦ抗体を含む原薬（ＤＳ）又は製剤（ＤＰ）を製造するための製造方法であって、前記抗ＴＮＦ抗体のオリゴ糖プロファイルが制御され、前記抗ＴＮＦ抗体の前記オリゴ糖プロファイルが、≧８２．０％～≦９４．４％の総中性オリゴ糖種、≧５．６％～≦１８．０％の総荷電オリゴ糖種、並びに≧２５．６％～≦４２．２％のＧ０Ｆ、≧３１．２％～≦４３．６％のＧ１Ｆ、及び≧５．６％～≦１４．２％のＧ２Ｆの個々の中性オリゴ糖種を含み、前記抗ＴＮＦ抗体が、真核細胞を、≧１０．０μｇ／リットル～≦３５．０μｇ／リットルのＭｎ２＋（マンガン）及び≧１．０μｇ／リットル～≦１．８μｇ／リットルのＣｕ２＋（銅）からなる特定の微量金属濃度のマンガン及び銅を含有するように制御された化学的に規定された培地中で培養することと、前記真核細胞において前記抗ＴＮＦ抗体を発現させることとを含む製造方法によって製造され、マンガン及び銅の前記濃度が、前記抗ＴＮＦ抗体の前記オリゴ糖プロファイルを制御するのに有効である、製造方法。
【請求項4】
前記化学的に規定された培地中のマンガン及び銅の前記濃度が、誘導結合プラズマ質量分析（ＩＣＰ－ＭＳ）を使用して決定される、請求項３に記載の製造方法。
【請求項5】
前記化学的に規定された培地中のマンガン及び銅の前記濃度が、前記化学的に規定された培地に、マンガン及び銅の１つ又は２つ以上の供給源を補充することによって制御され、マンガンの前記１つ又は２つ以上の供給源が、ＭｎＣｌ２、ＭｎＳＯ４、ＭｎＦ２及びＭｎＩ２からなる群から選択され、銅の前記１つ又は２つ以上の供給源が、ＣｕＳＯ４、ＣｕＣｌ２及びＣｕ（ＯＡｃ）２からなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項6】
前記オリゴ糖種が、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって決定される、請求項３に記載の製造方法。
【請求項7】
前記真核細胞が、チャイニーズハムスター卵巣細胞（Chinese hamster vary cell）（ＣＨＯ細胞）、ヒト網膜細胞（ＰＥＲ．Ｃ６細胞）、及びマウス骨髄腫細胞（ＮＳ０細胞及びＳｐ２／０細胞）からなる群から選択される、請求項３に記載の製造方法。
【請求項8】
前記抗ＴＮＦ抗体がバイオ後続品を含む、請求項７に記載の製造方法。
【請求項9】
抗ＴＮＦ抗体を含む組成物であって、（ｉ）配列番号３６の重鎖アミノ酸配列、及び（ｉｉ）配列番号３７の軽鎖アミノ酸配列を含み、前記抗ＴＮＦ抗体のオリゴ糖プロファイルが制御され、前記抗ＴＮＦ抗体の前記オリゴ糖プロファイルが、≧８２．０％～≦９４．４％の総中性オリゴ糖種、≧５．６％～≦１８．０％の総荷電オリゴ糖種、並びに≧２５．６％～≦４２．２％のＧ０Ｆ、≧３１．２％～≦４３．６％のＧ１Ｆ、及び≧５．６％～≦１４．２％のＧ２Ｆの個々の中性オリゴ糖種を含み、前記抗ＴＮＦ抗体が、真核細胞を、≧１０．０μｇ／リットル～≦３５．０μｇ／リットルのＭｎ２＋（マンガン）及び≧１．０μｇ／リットル～≦１．８μｇ／リットルのＣｕ２＋（銅）からなる特定の微量金属濃度のマンガン及び銅を含有するように制御された化学的に規定された培地において培養することと、前記真核細胞において前記抗ＴＮＦ抗体を発現させることとを含む製造方法によって製造され、マンガン及び銅の前記濃度が、前記抗ＴＮＦ抗体の前記オリゴ糖プロファイルを制御するのに有効である、組成物。
【請求項10】
前記化学的に規定された培地中のマンガン及び銅の前記濃度が、誘導結合プラズマ質量分析（ＩＣＰ－ＭＳ）を使用して決定される、請求項９に記載の組成物。
【請求項11】
前記化学的に規定された培地中のマンガン及び銅の前記濃度が、前記化学的に規定された培地にマンガン及び銅の１つ又は２つ以上の供給源を補充することによって制御され、マンガンの前記１つ又は２つ以上の供給源が、ＭｎＣｌ２、ＭｎＳＯ４、ＭｎＦ２及びＭｎＩ２からなる群から選択され、銅の前記１つ又は２つ以上の供給源が、ＣｕＳＯ４、ＣｕＣｌ２及びＣｕ（ＯＡｃ）２からなる群から選択される、請求項９に記載の組成物。
【請求項12】
前記オリゴ糖種が、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって決定される、請求項９に記載の組成物。
【請求項13】
前記真核細胞が、チャイニーズハムスター卵巣細胞（Chinese hamster vary cell）（ＣＨＯ細胞）、ヒト網膜細胞（ＰＥＲ．Ｃ６細胞）、及びマウス骨髄腫細胞（ＮＳ０細胞及びＳｐ２／０細胞）からなる群から選択される、請求項９に記載の組成物。
【請求項14】
前記抗ＴＮＦ抗体がバイオ後続品を含む、請求項９に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
（電子的に提出された配列表の参照）
本出願は、ファイル名「ＪＢＩ６００４ ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ｘｍｌ」及び２０２２年６月２９日の作成日で、５７ｋｂのサイズを有するＸＭＬ形式の配列表として電子的に提出された、配列表を含む。提出された配列表は、本明細書の一部であり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、ファイル名「ＪＢＩ６００４ ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ｘｍｌ」及び２０２２年６月２９日の作成日で、５７ｋｂのサイズを有するＸＭＬ形式の配列表として電子的に提出された、配列表を含む。提出された配列表は、本明細書の一部であり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
（発明の分野）
本発明は、抗ＴＮＦ抗体、例えば抗ＴＮＦ抗体ゴリムマブを生成するための製造方法、及び当該抗体の特定の医薬組成物に関する。
本発明は、抗ＴＮＦ抗体、例えば抗ＴＮＦ抗体ゴリムマブを生成するための製造方法、及び当該抗体の特定の医薬組成物に関する。
【0003】
（発明の背景）
ＴＮＦαは、１７ｋＤのタンパク質サブユニットの可溶性ホモ三量体である。ＴＮＦの膜結合型の２６ｋＤの前駆体形態も存在する。
ＴＮＦαは、１７ｋＤのタンパク質サブユニットの可溶性ホモ三量体である。ＴＮＦの膜結合型の２６ｋＤの前駆体形態も存在する。
【0004】
単球又はマクロファージ以外の細胞もＴＮＦαを産生する。例えば、ヒト非単球腫瘍細胞株はＴＮＦα並びにＣＤ４＋及びＣＤ８＋末梢血Ｔリンパ球を産生し、いくつかの培養されたＴ及びＢ細胞株もＴＮＦαを産生する。
【0005】
ＴＮＦαは、軟骨及び骨の分解、接着分子の誘導、血管内皮細胞で凝血促進活性を誘導する、好中球及びリンパ球の接着を増大させる、並びにマクロファージ、好中球及び血管内皮細胞からの血小板活性化因子の放出を刺激するなど、組織損傷をもたらす炎症誘発作用を引き起こす。
【0006】
ＴＮＦαは、感染、免疫障害、腫瘍性病態、自己免疫病態及び移植片対宿主病態に関連している。ＴＮＦαとがん及び感染性病態との関連は、宿主の異化状態に関連していることが多い。がん患者は、通常食欲不振に関連する体重減少に悩まされる。
【0007】
がん及びその他の疾患に関連する大幅な衰弱は、「悪液質」として知られる。悪液質は、悪性腫瘍の成長に応答する、進行性の体重減少、食欲不振、及び除脂肪体重の持続的衰えを含む。悪液質状態は、多くのがん罹患率及び死亡率の原因となる。ＴＮＦαが、がん、感染性病態及びその他の異化状態における悪液質に関与するという証拠がある。
【0008】
ＴＮＦαは、発熱、倦怠感、食欲不振、及び悪液質を含む、グラム陰性敗血症及び内毒素ショックにおいて中心的な役割を果たすと考えられている。内毒素は、単球／マクロファージ生成並びにＴＮＦα及びその他のサイトカインの分泌を強く活性化する。ＴＮＦα及びその他の単球由来サイトカインは、内毒素に対する代謝及び神経ホルモン応答を媒介する。ヒトボランティアへの内毒素投与は、発熱、頻脈、増加した代謝速度、及びストレスホルモン放出など、インフルエンザのような症状を伴う急性疾病をもたらす。ＴＮＦαの循環が、グラム陰性敗血症に罹患した患者において増加する。
【0009】
したがって、ＴＮＦαは、炎症性疾患、自己免疫疾患、ウイルス、細菌及び寄生虫感染、悪性腫瘍、並びに／又は神経変性疾患に関連付けられており、関節リウマチ及びクローン病などの疾患における特定の生物学的治療に有用な標的である。炎症の抑制、並びに関節リウマチ及びクローン病における再発後の良好な再治療による有益な作用が、ＴＮＦαに対するモノクローナル抗体を用いた非盲検試験で報告されている。炎症の抑制による関節リウマチにおける有益な結果も無作為化二重盲検プラセボ対照試験で報告されている。
【0010】
ＴＮＦに対する中和抗血清又はｍＡｂは、ヒト以外の哺乳動物において、実験的内毒素血症及び菌血症における致死的攻撃後の有害な生理学的変化を抑止し、死亡を阻止することが示されている。この作用は、例えば、げっ歯類致死率アッセイ及び霊長類病理モデル系において示されている。
【0011】
ｈＴＮＦの推定受容体結合座位が開示されており、ＴＮＦのアミノ酸１１～１３、３７～４２、４９～５７及び１５５～１５７からなるＴＮＦαの受容体結合座位が開示されている。
【0012】
非ヒト哺乳動物、キメラ、ポリクローナル（例えば、抗血清）、及び／又はモノクローナル抗体（Ｍａｂ）並びに断片（例えば、タンパク質分解消化又はその融合タンパク質生成物）は、ある特定の疾患を処置する試みのために一部の事例において調査されている有力な治療薬である。しかしながら、かかる抗体又は断片は、ヒトに投与された場合、免疫応答を誘発する場合がある。かかる免疫応答は、血液循環からの抗体又は断片の免疫複合媒介クリアランスをもたらし、反復投与を、治療に適さないものとし得、それにより、患者に対する治療的利益が低減し、抗体又は断片の再投与が制限される。例えば、非ヒト部分を含む抗体又は断片の反復投与は、血清病及び／又はアナフィラキシをもたらし得る。これら及びその他の問題を回避するために、当該技術分野において周知のように、キメラ化及びヒト化を含む、かかる抗体及びその部分の免疫原性を低減するための多くのアプローチが取られてきた。しかしながら、これら及びその他のアプローチは尚も、多少の免疫原性、低親和性、低結合活性を有する、又は細胞培養、スケールアップ、生成及び／若しくは低収率における問題を伴う抗体又は断片をもたらし得る。したがって、かかる抗体又は断片は、治療用タンパク質としての製造又は使用に理想的にはあまり適していない可能性がある。
【0013】
したがって、ＴＮＦαによって媒介される疾患の治療用の治療薬として使用するための抗ＴＮＦ抗体又はそのフラグメントが提供されることが求められている。
【0014】
（発明の概要）
簡単にするために、参照により本明細書に組み込まれる、本明細書に添付の独立及び従属請求項によって、全般的及び好ましい実施形態がそれぞれ定義される。他の好ましい実施形態、特性、及び利点は、添付の図面と併せて、以下の発明を実施するための形態から明らかになるであろう。
簡単にするために、参照により本明細書に組み込まれる、本明細書に添付の独立及び従属請求項によって、全般的及び好ましい実施形態がそれぞれ定義される。他の好ましい実施形態、特性、及び利点は、添付の図面と併せて、以下の発明を実施するための形態から明らかになるであろう。
【0015】
ある特定の実施形態では、本発明は、抗ＴＮＦ抗体であって、（ｉ）配列番号３６の重鎖アミノ酸配列、及び（ｉｉ）配列番号３７の軽鎖アミノ酸配列を含み、抗ＴＮＦ抗体のオリゴ糖プロファイルが、≧８２．０％～≦９４．４％の総中性オリゴ糖種、≧５．６％～≦１８．０％の総荷電オリゴ糖種、並びに≧２５．６％～≦４２．２％のＧ０Ｆ、≧３１．２％～≦４３．６％のＧ１Ｆ、及び≧５．６％～≦１４．２％のＧ２Ｆの個々の中性オリゴ糖種を含み、抗ＴＮＦ抗体が、抗ＴＮＦ抗体のオリゴ糖プロファイルを制御する製造方法によって生成され、製造方法が、真核細胞を、≧１０．０μｇ／リットル～≦３５．０μｇ／リットルのＭｎ２＋（マンガン）及び≧１．０μｇ／リットル～≦１．８μｇ／リットルのＣｕ２＋（銅）からなる特定の微量金属濃度のマンガン及び銅を含有するように制御された化学的に規定された培地において培養することと、抗ＴＮＦ抗体を真核細胞において発現させることとを含む製造方法によって製造され、マンガン及び銅の濃度が、抗ＴＮＦ抗体のオリゴ糖プロファイルを制御するのに有効である、抗ＴＮＦ抗体を提供する。
【0016】
ある特定の実施形態では、本発明は、抗ＴＮＦ抗体であって、（ｉ）配列番号３６の重鎖アミノ酸配列、及び（ｉｉ）配列番号３７の軽鎖アミノ酸配列を含み、抗ＴＮＦ抗体のオリゴ糖プロファイルが、≧８２．０％～≦９４．４％の総中性オリゴ糖種、≧５．６％～≦１８．０％の総荷電オリゴ糖種、並びに≧２５．６％～≦４２．２％のＧ０Ｆ、≧３１．２％～≦４３．６％のＧ１Ｆ、及び≧５．６％～≦１４．２％のＧ２Ｆの個々の中性オリゴ糖種を含み、抗ＴＮＦ抗体が、バイオ後続品であり、抗ＴＮＦ抗体が、抗ＴＮＦ抗体のオリゴ糖プロファイルを制御する製造方法によって生成され、製造方法が、真核細胞を、≧１０．０μｇ／リットル～≦３５．０μｇ／リットルのＭｎ２＋（マンガン）及び≧１．０μｇ／リットル～≦１．８μｇ／リットルのＣｕ２＋（銅）からなる特定の微量金属濃度のマンガン及び銅を含有するように制御された化学的に規定された培地において培養することと、抗ＴＮＦ抗体を真核細胞において発現させることとを含む製造方法によって製造され、マンガン及び銅の濃度が、抗ＴＮＦ抗体のオリゴ糖プロファイルを制御するのに有効である、抗ＴＮＦ抗体を提供する。
【0017】
特定の実施形態では、本発明は、（ｉ）配列番号３６の重鎖アミノ酸配列、及び（ｉｉ）配列番号３７の軽鎖アミノ酸配列を含む抗ＴＮＦ抗体を含む原薬（ＤＳ）又は製剤（ＤＰ）を製造するための製造方法であって、抗ＴＮＦ抗体のオリゴ糖プロファイルが制御され、抗ＴＮＦ抗体のオリゴ糖プロファイルが、≧８２．０％～≦９４．４％の総中性オリゴ糖種、≧５．６％～≦１８．０％の総荷電オリゴ糖種、並びに≧２５．６％～≦４２．２％のＧ０Ｆ、≧３１．２％～≦４３．６％のＧ１Ｆ、及び≧５．６％～≦１４．２％のＧ２Ｆの個々の中性オリゴ糖種を含み、真核細胞を、≧１０．０μｇ／リットル～≦３５．０μｇ／リットルのＭｎ２＋（マンガン）及び≧１．０μｇ／リットル～≦１．８μｇ／リットルのＣｕ２＋（銅）からなる特定の微量金属濃度のマンガン及び銅を含有するように制御された化学的に規定された培地において培養することと、抗ＴＮＦ抗体を真核細胞において発現させることとを含む製造方法によって製造され、マンガン及び銅の濃度が、抗ＴＮＦ抗体のオリゴ糖プロファイルを制御するのに有効である、製造方法を提供する。
【0018】
特定の実施形態では、本発明は、（ｉ）配列番号３６の重鎖アミノ酸配列、及び（ｉｉ）配列番号３７の軽鎖アミノ酸配列を含む抗ＴＮＦ抗体を含む原薬（ＤＳ）又は製剤（ＤＰ）を製造するための製造方法であって、抗ＴＮＦ抗体が、バイオ後続品であり、抗ＴＮＦ抗体のオリゴ糖プロファイルが制御され、抗ＴＮＦ抗体のオリゴ糖プロファイルが、≧８２．０％～≦９４．４％の総中性オリゴ糖種、≧５．６％～≦１８．０％の総荷電オリゴ糖種、並びに≧２５．６％～≦４２．２％のＧ０Ｆ、≧３１．２％～≦４３．６％のＧ１Ｆ、及び≧５．６％～≦１４．２％のＧ２Ｆの個々の中性オリゴ糖種を含み、真核細胞を、≧１０．０μｇ／リットル～≦３５．０μｇ／リットルのＭｎ２＋（マンガン）及び≧１．０μｇ／リットル～≦１．８μｇ／リットルのＣｕ２＋（銅）からなる特定の微量金属濃度のマンガン及び銅を含有するように制御された化学的に規定された培地において培養することと、抗ＴＮＦ抗体を真核細胞において発現させることとを含む製造方法によって製造され、マンガン及び銅の濃度が、抗ＴＮＦ抗体のオリゴ糖プロファイルを制御するのに有効である、製造方法を提供する。
【0019】
特定の実施形態では、本発明は、（ｉ）配列番号３６の重鎖アミノ酸配列、及び（ｉｉ）配列番号３７の軽鎖アミノ酸配列を含む抗ＴＮＦ抗体を含む原薬（ＤＳ）又は製剤（ＤＰ）を製造するための製造方法であって、抗ＴＮＦ抗体のオリゴ糖プロファイルが制御され、抗ＴＮＦ抗体のオリゴ糖プロファイルが、≧８２．０％～≦９４．４％の総中性オリゴ糖種、≧５．６％～≦１８．０％の総荷電オリゴ糖種、並びに≧２５．６％～≦４２．２％のＧ０Ｆ、≧３１．２％～≦４３．６％のＧ１Ｆ、及び≧５．６％～≦１４．２％のＧ２Ｆの個々の中性オリゴ糖種を含み、真核細胞を、≧１０．０μｇ／リットル～≦３５．０μｇ／リットルのＭｎ２＋（マンガン）及び≧１．０μｇ／リットル～≦１．８μｇ／リットルのＣｕ２＋（銅）からなる特定の微量金属濃度のマンガン及び銅を含有するように制御された化学的に規定された培地において培養することと、抗ＴＮＦ抗体を真核細胞において発現させることとを含む製造方法によって製造され、マンガン及び銅の濃度が、抗ＴＮＦ抗体のオリゴ糖プロファイルを制御するのに有効であり、化学的に規定された培地中のマンガン及び銅の濃度が、誘導結合プラズマ質量分析（ＩＣＰ－ＭＳ）を使用して決定される、製造方法を提供する。
【0020】
特定の実施形態では、本発明は、（ｉ）配列番号３６の重鎖アミノ酸配列、及び（ｉｉ）配列番号３７の軽鎖アミノ酸配列を含む抗ＴＮＦ抗体を含む原薬（ＤＳ）又は製剤（ＤＰ）を製造するための製造方法であって、抗ＴＮＦ抗体のオリゴ糖プロファイルが制御され、抗ＴＮＦ抗体のオリゴ糖プロファイルが、≧８２．０％～≦９４．４％の総中性オリゴ糖種、≧５．６％～≦１８．０％の総荷電オリゴ糖種、並びに≧２５．６％～≦４２．２％のＧ０Ｆ、≧３１．２％～≦４３．６％のＧ１Ｆ、及び≧５．６％～≦１４．２％のＧ２Ｆの個々の中性オリゴ糖種を含み、真核細胞を、≧１０．０μｇ／リットル～≦３５．０μｇ／リットルのＭｎ２＋（マンガン）及び≧１．０μｇ／リットル～≦１．８μｇ／リットルのＣｕ２＋（銅）からなる特定の微量金属濃度のマンガン及び銅を含有するように制御された化学的に規定された培地において培養することと、抗ＴＮＦ抗体を真核細胞において発現させることとを含む製造方法によって製造され、マンガン及び銅の濃度が、抗ＴＮＦ抗体のオリゴ糖プロファイルを制御するのに有効であり、化学的に規定された培地中のマンガン及び銅の濃度が、化学的に規定された培地にマンガン及び銅の１つ又は２つ以上の供給源を補充することによって制御され、マンガンの１つ又は２つ以上の供給源が、ＭｎＣｌ２、ＭｎＳＯ４、ＭｎＦ２及びＭｎＩ２からなる群から選択され、銅の１つ又は２つ以上の供給源が、ＣｕＳＯ４、ＣｕＣｌ２及びＣｕ（ＯＡｃ）２からなる群から選択される、製造方法を提供する。
【0021】
特定の実施形態では、本発明は、（ｉ）配列番号３６の重鎖アミノ酸配列、及び（ｉｉ）配列番号３７の軽鎖アミノ酸配列を含む抗ＴＮＦ抗体を含む原薬（ＤＳ）又は製剤（ＤＰ）を製造するための製造方法であって、抗ＴＮＦ抗体のオリゴ糖プロファイルが制御され、抗ＴＮＦ抗体のオリゴ糖プロファイルが、≧８２．０％～≦９４．４％の総中性オリゴ糖種、≧５．６％～≦１８．０％の総荷電オリゴ糖種、並びに≧２５．６％～≦４２．２％のＧ０Ｆ、≧３１．２％～≦４３．６％のＧ１Ｆ、及び≧５．６％～≦１４．２％のＧ２Ｆの個々の中性オリゴ糖種を含み、真核細胞を、≧１０．０μｇ／リットル～≦３５．０μｇ／リットルのＭｎ２＋（マンガン）及び≧１．０μｇ／リットル～≦１．８μｇ／リットルのＣｕ２＋（銅）からなる特定の微量金属濃度のマンガン及び銅を含有するように制御された化学的に規定された培地において培養することと、抗ＴＮＦ抗体を真核細胞において発現させることとを含む製造方法によって製造され、マンガン及び銅の濃度が、抗ＴＮＦ抗体のオリゴ糖プロファイルを制御するのに有効であり、オリゴ糖種は高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって決定される、製造方法を提供する。
【0022】
特定の実施形態では、本発明は、（ｉ）配列番号３６の重鎖アミノ酸配列、及び（ｉｉ）配列番号３７の軽鎖アミノ酸配列を含む抗ＴＮＦ抗体を含む原薬（ＤＳ）又は製剤（ＤＰ）を製造するための製造方法であって、抗ＴＮＦ抗体のオリゴ糖プロファイルが制御され、抗ＴＮＦ抗体のオリゴ糖プロファイルが、≧８２．０％～≦９４．４％の総中性オリゴ糖種、≧５．６％～≦１８．０％の総荷電オリゴ糖種、並びに≧２５．６％～≦４２．２％のＧ０Ｆ、≧３１．２％～≦４３．６％のＧ１Ｆ、及び≧５．６％～≦１４．２％のＧ２Ｆの個々の中性オリゴ糖種を含み、真核細胞を、≧１０．０μｇ／リットル～≦３５．０μｇ／リットルのＭｎ２＋（マンガン）及び≧１．０μｇ／リットル～≦１．８μｇ／リットルのＣｕ２＋（銅）からなる特定の微量金属濃度のマンガン及び銅を含有するように制御された化学的に規定された培地において培養することと、抗ＴＮＦ抗体を真核細胞において発現させることとを含む製造方法によって製造され、マンガン及び銅の濃度が、抗ＴＮＦ抗体のオリゴ糖プロファイルを制御するのに有効であり、真核細胞が、チャイニーズハムスター卵巣細胞（Chinese hamster vary cell）（ＣＨＯ細胞）、ヒト網膜細胞（ＰＥＲ．Ｃ６細胞）、及びマウス骨髄腫細胞（ＮＳ０細胞及びＳｐ２／０細胞）からなる群から選択される、製造方法を提供する。
【0023】
特定の実施形態では、本発明は、組成物であって、（ｉ）配列番号３６の重鎖アミノ酸配列、及び（ｉｉ）配列番号３７の軽鎖アミノ酸配列を含む抗ＴＮＦ抗体を含み、抗ＴＮＦ抗体のオリゴ糖プロファイルが制御され、抗ＴＮＦ抗体のオリゴ糖プロファイルが、≧８２．０％～≦９４．４％の総中性オリゴ糖種、≧５．６％～≦１８．０％の総荷電オリゴ糖種、並びに≧２５．６％～≦４２．２％のＧ０Ｆ、≧３１．２％～≦４３．６％のＧ１Ｆ、及び≧５．６％～≦１４．２％のＧ２Ｆの個々の中性オリゴ糖種を含み、抗ＴＮＦ抗体が、真核細胞を、≧１０．０μｇ／リットル～≦３５．０μｇ／リットルのＭｎ２＋（マンガン）及び≧１．０μｇ／リットル～≦１．８μｇ／リットルのＣｕ２＋（銅）からなる特定の微量金属濃度のマンガン及び銅を含有するように制御された化学的に規定された培地において培養することと、抗ＴＮＦ抗体を真核細胞において発現させることとを含む製造方法によって製造され、マンガン及び銅の濃度が抗ＴＮＦ抗体のオリゴ糖プロファイルを制御するのに有効である、製造方法によって製造される、組成物を提供する。
【0024】
ある特定の実施形態では、本発明は、組成物であって、（ｉ）配列番号３６の重鎖アミノ酸配列、及び（ｉｉ）配列番号３７の軽鎖アミノ酸配列を含む抗ＴＮＦ抗体を含み、抗ＴＮＦ抗体がバイオ後続品であり、抗ＴＮＦ抗体のオリゴ糖プロファイルが制御され、抗ＴＮＦ抗体のオリゴ糖プロファイルが、≧８２．０％～≦９４．４％の総中性オリゴ糖種、≧５．６％～≦１８．０％の総荷電オリゴ糖種、並びに≧２５．６％～≦４２．２％のＧ０Ｆ、≧３１．２％～≦４３．６％のＧ１Ｆ、及び≧５．６％～≦１４．２％のＧ２Ｆの個々の中性オリゴ糖種を含み、抗ＴＮＦ抗体が、真核細胞を、≧１０．０μｇ／リットル～≦３５．０μｇ／リットルのＭｎ２＋（マンガン）及び≧１．０μｇ／リットル～≦１．８μｇ／リットルのＣｕ２＋（銅）からなる特定の微量金属濃度のマンガン及び銅を含有するように制御された化学的に規定された培地において培養することと、抗ＴＮＦ抗体を真核細胞において発現させることとを含む製造方法によって製造され、マンガン及び銅の濃度が、抗ＴＮＦ抗体のオリゴ糖プロファイルを制御するのに有効である、製造方法によって製造される、組成物を提供する。
【0025】
特定の実施形態では、本発明は、組成物であって、（ｉ）配列番号３６の重鎖アミノ酸配列、及び（ｉｉ）配列番号３７の軽鎖アミノ酸配列を含む抗ＴＮＦ抗体を含み、抗ＴＮＦ抗体のオリゴ糖プロファイルが制御され、抗ＴＮＦ抗体のオリゴ糖プロファイルが、≧８２．０％～≦９４．４％の総中性オリゴ糖種、≧５．６％～≦１８．０％の総荷電オリゴ糖種、並びに≧２５．６％～≦４２．２％のＧ０Ｆ、≧３１．２％～≦４３．６％のＧ１Ｆ、及び≧５．６％～≦１４．２％のＧ２Ｆの個々の中性オリゴ糖種を含み、抗ＴＮＦ抗体が、真核細胞を、≧１０．０μｇ／リットル～≦３５．０μｇ／リットルのＭｎ２＋（マンガン）及び≧１．０μｇ／Ｌ～≦１．８μｇ／ＬＣｕ２＋（銅）からなる特定の微量金属濃度のマンガン及び銅を含有するように制御された化学的に規定された培地において培養することと、抗ＴＮＦ抗体を真核細胞において発現させることとを含む製造方法によって製造され、マンガン及び銅の濃度が、抗ＴＮＦ抗体のオリゴ糖プロファイルを制御するのに有効であり、マンガン及び銅の濃度が、誘導結合プラズマ質量分析（ＩＣＰ－ＭＳ）を使用して決定される、製造方法によって製造される、組成物を提供する。
【0026】
特定の実施形態では、本発明は、組成物であって、（ｉ）配列番号３６の重鎖アミノ酸配列、及び（ｉｉ）配列番号３７の軽鎖アミノ酸配列を含む抗ＴＮＦ抗体を含み、抗ＴＮＦ抗体のオリゴ糖プロファイルが制御され、抗ＴＮＦ抗体のオリゴ糖プロファイルが、≧８２．０％～≦９４．４％の総中性オリゴ糖種、≧５．６％～≦１８．０％の総荷電オリゴ糖種、並びに≧２５．６％～≦４２．２％のＧ０Ｆ、≧３１．２％～≦４３．６％のＧ１Ｆ、及び≧５．６％～≦１４．２％のＧ２Ｆの個々の中性オリゴ糖種を含み、抗ＴＮＦ抗体が、真核細胞を、≧１０．０μｇ／リットル～≦３５．０μｇ／リットルのＭｎ２＋（マンガン）及び≧１．０μｇ／Ｌ～≦１．８μｇ／ＬのＣｕ２＋（銅）からなる特定の微量金属濃度のマンガン及び銅を含有するように制御された化学的に規定された培地において培養することと、抗ＴＮＦ抗体を真核細胞において発現させることとを含む製造方法によって製造され、マンガン及び銅の濃度が、抗ＴＮＦ抗体のオリゴ糖プロファイルを制御するのに有効であり、化学的に規定された培地中のマンガン及び銅の濃度が、化学的に規定された培地に１つ又は２つ以上のマンガン及び銅の供給源を補充することによって制御され、１つ又は２つ以上のマンガンの供給源が、ＭｎＣｌ２、ＭｎＳＯ４、ＭｎＦ２及びＭｎＩ２からなる群から選択され、１つ又は２つ以上の銅の供給源が、ＣｕＳＯ４、ＣｕＣｌ２及びＣｕ（ＯＡｃ）２からなる群から選択される、組成物を提供する。
【0027】
ある特定の実施形態では、本発明は、（ｉ）配列番号３６の重鎖アミノ酸配列、及び（ｉｉ）配列番号３７の軽鎖アミノ酸配列を含む抗ＴＮＦ抗体を含む組成物であって、抗ＴＮＦ抗体のオリゴ糖プロファイルが制御され、抗ＴＮＦ抗体のオリゴ糖プロファイルが、≧８２．０％～≦９４．４％の総中性オリゴ糖種、≧５．６％～≦１８．０％の総荷電オリゴ糖種、並びに≧２５．６％～≦４２．２％のＧ０Ｆ、≧３１．２％～≦４３．６％のＧ１Ｆ、及び≧５．６％～≦１４．２％のＧ２Ｆの個々の中性オリゴ糖種を含み、抗ＴＮＦ抗体が、真核細胞を、≧１０．０μｇ／リットル～≦３５．０μｇ／リットルのＭｎ２＋（マンガン）及び≧１．０μｇ／リットル～≦１．８μｇ／リットルのＣｕ２＋（銅）からなる特定の微量金属濃度のマンガン及び銅を含有するように制御された化学的に規定された培地において培養することと、抗ＴＮＦ抗体を真核細胞において発現させることとを含む製造方法によって製造され、マンガン及び銅の濃度が、抗ＴＮＦ抗体のオリゴ糖プロファイルを制御するのに有効であり、オリゴ糖種が、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって決定される、製造方法によって製造される、組成物を提供する。
【0028】
特定の実施形態では、本発明は、組成物であって、（ｉ）配列番号３６の重鎖アミノ酸配列、及び（ｉｉ）配列番号３７の軽鎖アミノ酸配列を含む抗ＴＮＦ抗体を含み、抗ＴＮＦ抗体のオリゴ糖プロファイルが制御され、抗ＴＮＦ抗体のオリゴ糖プロファイルが、≧８２．０％～≦９４．４％の総中性オリゴ糖種、≧５．６％～≦１８．０％の総荷電オリゴ糖種、並びに≧２５．６％～≦４２．２％のＧ０Ｆ、≧３１．２％～≦４３．６％のＧ１Ｆ、及び≧５．６％～≦１４．２％のＧ２Ｆの個々の中性オリゴ糖種を含み、抗ＴＮＦ抗体が、真核細胞を、≧１０．０μｇ／リットル～≦３５．０μｇ／リットルのＭｎ２＋（マンガン）及び≧１．０μｇ／Ｌ～≦１．８μｇ／ＬのＣｕ２＋（銅）からなる特定の微量金属濃度のマンガン及び銅を含有するように制御された化学的に規定された培地において培養することと、抗ＴＮＦ抗体を真核細胞において発現させることとを含む製造方法によって製造され、マンガン及び銅の濃度が、抗ＴＮＦ抗体のオリゴ糖プロファイルを制御するのに有効であり、真核細胞が、チャイニーズハムスター卵巣細胞（Chinese hamster vary cell）（ＣＨＯ細胞）、ヒト網膜細胞（ＰＥＲ．Ｃ６細胞）、及びマウス骨髄腫細胞（ＮＳ０細胞及びＳｐ２／０細胞）からなる群から選択される、製造方法によって製造される、組成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0029】
【図1】ハイブリドーマ細胞上清中のＴＮＶ ｍＡｂが組換えＴＮＦ受容体へのＴＮＦα結合を阻害する能力のアッセイを示すグラフ表示を示す。既知量のＴＮＶ ｍＡｂを含有する様々な量のハイブリドーマ細胞上清を、固定濃度（５ｎｇ／ｍＬ）の１２５Ｉと標識されたＴＮＦαと共にプレインキュベートした。混合物を、組換えＴＮＦ受容体／ＩｇＧ融合タンパク質ｐ５５－ｓｆ２で予めコーティングされた９６ウェルのＯｐｔｉｐｌａｔｅに移した。ｍＡｂの存在下でｐ５５受容体に結合したＴＮＦαの量は、未結合の材料を洗い流し、γ計数器を使用して計数した後に決定した。これらの実験において８つのＴＮＶ ｍＡｂ試料を試験したが、簡潔化のため、ＤＮＡ配列分析により、他のＴＮＶ ｍＡｂのうちの１つと同一であることを示したｍＡｂのうちの３つは、ここに示されていない。各試料を二重に試験した。示される結果は、２つの独立した実験を代表する。
【図2A】ＴＮＶ ｍＡｂ重鎖可変領域のＤＮＡ配列を示す。示される生殖系列遺伝子は、ＤＰ－４６遺伝子である。「ＴＮＶｓ」は、示される配列がＴＮＶ１４、ＴＮＶ１５、ＴＮＶ１４８、及びＴＮＶ１９６の配列であることを示す。ＴＮＶ配列の最初の３つのヌクレオチドは、翻訳開始Ｍｅｔコドンを定義する。ＴＮＶ ｍＡｂ遺伝子配列中の点線は、ヌクレオチドが生殖系列配列中のものと同じであることを示す。ＴＮＶ配列の最初の１９のヌクレオチド（下線付き）は、可変領域をＰＣＲ増幅するために使用されたオリゴヌクレオチドに対応する。成熟ｍＡｂで始まるアミノ酸翻訳（一文字表記）は、生殖系列遺伝子についてのみ示される。生殖系列アミノ酸翻訳における３つのＣＤＲドメインは、太字で示され、下線付きである。ＴＮＶ１４８（Ｂ）と標識された行は、示される配列がＴＮＶ１４８及びＴＮＶ１４８Ｂの両方に関することを示す。生殖系列ＤＮＡ配列（ＣＤＲ３）中のギャップは、その当時、知られていないか又は生殖系列遺伝子に存在しない配列に起因する。ＴＮＶ ｍＡｂ重鎖は、Ｊ６結合領域を使用する。
【図2B】ＴＮＶ ｍＡｂ重鎖可変領域のＤＮＡ配列を示す。示される生殖系列遺伝子は、ＤＰ－４６遺伝子である。「ＴＮＶｓ」は、示される配列がＴＮＶ１４、ＴＮＶ１５、ＴＮＶ１４８、及びＴＮＶ１９６の配列であることを示す。ＴＮＶ配列の最初の３つのヌクレオチドは、翻訳開始Ｍｅｔコドンを定義する。ＴＮＶ ｍＡｂ遺伝子配列中の点線は、ヌクレオチドが生殖系列配列中のものと同じであることを示す。ＴＮＶ配列の最初の１９のヌクレオチド（下線付き）は、可変領域をＰＣＲ増幅するために使用されたオリゴヌクレオチドに対応する。成熟ｍＡｂで始まるアミノ酸翻訳（一文字表記）は、生殖系列遺伝子についてのみ示される。生殖系列アミノ酸翻訳における３つのＣＤＲドメインは、太字で示され、下線付きである。ＴＮＶ１４８（Ｂ）と標識された行は、示される配列がＴＮＶ１４８及びＴＮＶ１４８Ｂの両方に関することを示す。生殖系列ＤＮＡ配列（ＣＤＲ３）中のギャップは、その当時、知られていないか又は生殖系列遺伝子に存在しない配列に起因する。ＴＮＶ ｍＡｂ重鎖は、Ｊ６結合領域を使用する。
【図3】ＴＮＶ ｍＡｂ軽鎖可変領域のＤＮＡ配列を示す。示される生殖系列遺伝子は、ヒトκ生殖系列可変領域遺伝子のＶｇ／３８Ｋファミリーの代表的なメンバーである。ＴＮＶ ｍＡｂ遺伝子配列中の点線は、ヌクレオチドが生殖系列配列中のものと同じであることを示す。ＴＮＶ配列の最初の１６のヌクレオチド（下線付き）は、可変領域をＰＣＲ増幅するために使用されたオリゴヌクレオチドに対応する。成熟ｍＡｂのアミノ酸翻訳（一文字表記）は、生殖系列遺伝子についてのみ示される。生殖系列アミノ酸翻訳における３つのＣＤＲドメインは、太字で示され、下線付きである。ＴＮＶ１４８（Ｂ）と標識された行は、示される配列がＴＮＶ１４８及びＴＮＶ１４８Ｂの両方に関することを示す。生殖系列ＤＮＡ配列（ＣＤＲ３）中のギャップは、知られていないか又は生殖系列遺伝子に存在しない配列のためである。ＴＮＶ ｍＡｂ軽鎖は、Ｊ３結合領域を使用する。
【図4】ＴＮＶ ｍＡｂ重鎖可変領域の推定アミノ酸配列を示す。示されるアミノ酸配列（一文字表記）は、非クローン化ＰＣＲ生成物及びクローン化ＰＣＲ生成物の両方から決定されたＤＮＡ配列から推定された。分泌シグナル配列（シグナル）、フレームワーク（ＦＷ）及び相補性決定領域（ＣＤＲ）ドメインに分割したアミノ配列が示される。ＤＰ－４６生殖系列遺伝子のアミノ酸配列は、各ドメインの上の行に示されている。点線は、ＴＮＶ ｍＡｂにおけるアミノ酸が生殖系列遺伝子と同一であることを示す。ＴＮＶ１４８（Ｂ）は、示される配列がＴＮＶ１４８及びＴＮＶ１４８Ｂの両方に関することを示す。「ＴＮＶ」は、異なる配列が示されない限り、示される配列が全てのＴＮＶ ｍＡｂに関することを示す。生殖系列配列（ＣＤＲ３）中の破線は、配列が知られていないか又は生殖系列遺伝子に存在しないことを示す。
【図5】ＴＮＶ ｍＡｂ軽鎖可変領域の推定アミノ酸配列を示す。示されるアミノ酸配列（一文字表記）は、非クローン化ＰＣＲ生成物及びクローン化ＰＣＲ生成物の両方から決定されたＤＮＡ配列から推定された。分泌シグナル配列（シグナル）、フレームワーク（ＦＷ）及び相補性決定領域（ＣＤＲ）ドメインに分割したアミノ配列が示される。Ｖｇ／３８Ｋ型軽鎖生殖系列遺伝子のアミノ酸配列は、各ドメインの上の行に示される。点線は、ＴＮＶ ｍＡｂにおけるアミノ酸が生殖系列遺伝子と同一であることを示す。ＴＮＶ１４８（Ｂ）は、示される配列がＴＮＶ１４８及びＴＮＶ１４８Ｂの両方に関することを示す。「Ａｌｌ」は、示される配列がＴＮＶ１４、ＴＮＶ１５、ＴＮＶ１４８、ＴＮＶ１４８Ｂ、及びＴＮＶ１８６に関することを示す。
【図6】ｒＴＮＶ１４８Ｂ発現Ｃ４６６細胞を作製するために使用された重鎖及び軽鎖発現プラスミドの概略図を示す。ｐ１７８３は重鎖プラスミドであり、ｐ１７７６は軽鎖プラスミドである。ｒＴＮＶ１４８Ｂ可変及び定常領域コードドメインは、黒色のボックスで示される。Ｊ－Ｃイントロンの免疫グロブリンエンハンサは、灰色のボックスで示される。関連する制限部位が示される。Ａｂ遺伝子の転写が時計方向に進むように配向されたプラスミドが示される。プラスミドｐ１７８３の長さは１９．５３ｋｂであり、プラスミドｐ１７７６の長さは１５．０６ｋｂである。両プラスミドの完全なヌクレオチド配列は既知である。ｐ１７８３の可変領域コード配列は、ＢｓｉＷＩ／ＢｓｔＢＩ制限断片を置き換えることにより、別の重鎖可変領域配列に容易に置き換えることができる。ｐ１７７６の可変領域コード配列は、ＳａｌＩ／ＡｆｌＩＩ制限断片を置き換えることにより、別の可変領域配列に置き換えることができる。
【図7】５つのｒＴＮＶ１４８Ｂ生成細胞株の成長曲線分析のグラフ表示を示す。３０ｍＬの容量中に１．０×１０５細胞／ｍＬの生存細胞密度を有するように、Ｔ７５フラスコ内のＩ５Ｑ＋ＭＨＸ培地に細胞を播種することにより、０日目に培養を開始した。これらの試験に使用された細胞培養物は、トランスフェクション及びサブクローニングが行われるため、連続培養であった。その後、Ｔフラスコ内の細胞を充分に再懸濁し、０．３ｍｌの培養物のアリコートを取り出した。成長曲線試験は、細胞計数が１．５×１０５細胞／ｍＬ未満に低下したときに終了した。アリコート中の生細胞数をトリパンブルー排除により決定し、残りのアリコートは後のｍＡｂ濃度決定のために保管された。ヒトＩｇＧのＥＬＩＳＡが、同じ時に全ての試料アリコートに対して行われた。
【図8】様々なＭＨＸ選択物濃度の存在下での細胞成長速度の比較のグラフ表示を示す。細胞サブクローンＣ４６６Ａ及びＣ４６６Ｂを、無ＭＨＸ培地（ＩＭＤＭ、５％ＦＢＳ、２ｍＭグルタミン）に解凍し、更に２日間培養した。次いで、両細胞培養物を、ＭＨＸ無し、０．２×ＭＨＸ又は１×ＭＨＸのいずれかを含有した３つの培養に分割した。１日後、新しいＴ７５フラスコに、１×１０５細胞／ｍＬの開始密度で培養物を播種し、細胞を１週間、２４時間間隔で計数した。最初の５日間の倍加時間は、ＳＯＰ ＰＤ３２．０２５の式を使用して計算し、バーの上に示す。
【図9】２つのｒＴＮＶ１４８Ｂ生成細胞株からの経時的なｍＡｂ生成の安定性のグラフ表示を示す。トランスフェクション及びサブクローニングを行った後、連続培養にあった細胞のサブクローンを使用して、２４ウェル培養皿中での長期連続培養を開始した。ＭＨＸ選択物を伴う又は伴わないＩ５Ｑ培地中で細胞を培養した。細胞を、４～６日ごとに培養物を分けることにより連続して継代して、新たな生存培養物を維持し、同時に前の培養物を消耗させた。消耗した細胞上清のアリコートは、培養物が消耗した直後に回収し、ｍＡｂ濃度が決定されるまで保管した。ヒトＩｇＧのＥＬＩＳＡが、同じ時に全ての試料アリコートに対して行われた。
【図10】実施例４の対照と比較した、本発明の抗ＴＮＦ抗体に応答した関節炎マウスモデルマウスＴｇ１９７の体重変化を示す。およそ４週齢のＴｇ１９７試験マウスを性別及び体重に基づき９つの処置群のうちの１つに割り当て、ＤｕｌｂｅｃｃｏのＰＢＳ（Ｄ－ＰＢＳ）、又は１ｍｇ／ｋｇ若しくは１０ｍｇ／ｋｇのいずれかの本発明の抗ＴＮＦ抗体（ＴＮＶ１４、ＴＮＶ１４８、又はＴＮＶ１９６）の単回腹腔内ボーラス投与で処置した。体重を投与前からの変化として分析したとき、１０ｍｇ／ｋｇのｃＡ２で処置した動物は、試験を通してＤ－ＰＢＳで処置した動物よりも一貫して高い体重増加を示した。この体重増加は、３～７週目で有意であった。１０ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４８で処置した動物も、試験の７週目に有意な体重増加を達成した。
【図11A】実施例４に示す関節炎指数に基づく疾患重症度の進行を表す。１０ｍｇ／ｋｇのｃＡ２処置群の関節炎指数は、３週目から始まり、残りの試験（７週目）を通して継続するＤ－ＰＢＳ対照群よりも低かった。１ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４で処置した動物及び１ｍｇ／ｋｇのｃＡ２で処置した動物は、Ｄ－ＰＢＳ処置群と比較したとき、３週目以降のＡＩにおいて有意な減少を示すことができなかった。各々を類似の用量のその他のものと比較したとき（１０ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４、１４８及び１９６と比較した１０ｍｇ／ｋｇのｃＡ２）、１０ｍｇ／ｋｇの処置群の間に有意差はなかった。１ｍｇ／ｋｇの処置群を比較したとき、１ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４８は、１ｍｇ／ｋｇのｃＡ２よりも３、４及び７週目で有意に低いＡＩを示した。１ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４８も、１ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４で処置した群よりも３及び４週目で有意に低かった。ＴＮＶ１９６は試験の６週目までＡＩにおいて有意な減少を示したが（Ｄ－ＰＢＳで処置した群と比較したとき）、ＴＮＶ１４８はこの試験の終了時に有意のままであった唯一の１ｍｇ／ｋｇ処置群であった。
【図11B】実施例４に示す関節炎指数に基づく疾患重症度の進行を表す。１０ｍｇ／ｋｇのｃＡ２処置群の関節炎指数は、３週目から始まり、残りの試験（７週目）を通して継続するＤ－ＰＢＳ対照群よりも低かった。１ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４で処置した動物及び１ｍｇ／ｋｇのｃＡ２で処置した動物は、Ｄ－ＰＢＳ処置群と比較したとき、３週目以降のＡＩにおいて有意な減少を示すことができなかった。各々を類似の用量のその他のものと比較したとき（１０ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４、１４８及び１９６と比較した１０ｍｇ／ｋｇのｃＡ２）、１０ｍｇ／ｋｇの処置群の間に有意差はなかった。１ｍｇ／ｋｇの処置群を比較したとき、１ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４８は、１ｍｇ／ｋｇのｃＡ２よりも３、４及び７週目で有意に低いＡＩを示した。１ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４８も、１ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４で処置した群よりも３及び４週目で有意に低かった。ＴＮＶ１９６は試験の６週目までＡＩにおいて有意な減少を示したが（Ｄ－ＰＢＳで処置した群と比較したとき）、ＴＮＶ１４８はこの試験の終了時に有意のままであった唯一の１ｍｇ／ｋｇ処置群であった。
【図11C】実施例４に示す関節炎指数に基づく疾患重症度の進行を表す。１０ｍｇ／ｋｇのｃＡ２処置群の関節炎指数は、３週目から始まり、残りの試験（７週目）を通して継続するＤ－ＰＢＳ対照群よりも低かった。１ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４で処置した動物及び１ｍｇ／ｋｇのｃＡ２で処置した動物は、Ｄ－ＰＢＳ処置群と比較したとき、３週目以降のＡＩにおいて有意な減少を示すことができなかった。各々を類似の用量のその他のものと比較したとき（１０ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４、１４８及び１９６と比較した１０ｍｇ／ｋｇのｃＡ２）、１０ｍｇ／ｋｇの処置群の間に有意差はなかった。１ｍｇ／ｋｇの処置群を比較したとき、１ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４８は、１ｍｇ／ｋｇのｃＡ２よりも３、４及び７週目で有意に低いＡＩを示した。１ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４８も、１ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４で処置した群よりも３及び４週目で有意に低かった。ＴＮＶ１９６は試験の６週目までＡＩにおいて有意な減少を示したが（Ｄ－ＰＢＳで処置した群と比較したとき）、ＴＮＶ１４８はこの試験の終了時に有意のままであった唯一の１ｍｇ／ｋｇ処置群であった。
【図12】実施例５の対照と比較した、本発明の抗ＴＮＦ抗体に応答した関節炎マウスモデルマウスＴｇ１９７の体重変化を示す。およそ４週齢のＴｇ１９７試験マウスを体重に基づき８つの処置群のうちの１つに割り当て、対照品（Ｄ－ＰＢＳ）、又は３ｍｇ／ｋｇの抗体（ＴＮＶ１４、ＴＮＶ１４８）（０週目）の腹腔内ボーラス投与で処置した。注射は１、２、３、及び４週目に全ての動物において繰り返された。群１～６は、試験品の有効性に関して評価された。群７及び８の動物から得られた血清試料は、２、３及び４週目のＴＮＶ１４又はＴＮＶ１４８の免疫応答誘導及び薬物動態クリアランスに関して評価された。
【図13A】関節炎指数に基づく実施例５の疾患の重症度の進行を表すグラフである。１０ｍｇ／ｋｇのｃＡ２で処置した群の関節炎指数は、２週目から始まり、残りの試験全体を通して（５週目）継続してＤ－ＰＢＳ対照群よりも有意に低かった。１ｍｇ／ｋｇ又は３ｍｇ／ｋｇのｃＡ２で処置した動物及び３ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４で処置した動物は、ｄ－ＰＢＳ対照群と比較したときに、試験を通して任意の時点でＡＩにおいて任意の有意な減少を達成することができなかった。３ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４８で処置した動物は、ｄ－ＰＢＳで処置した群と比較したとき、３週目から始まり、５週目まで継続する有意な減少を示した。１０ｍｇ／ｋｇのｃＡ２で処置した動物は、試験の４及び５週目でより低い用量の両ｃＡ２（１ｍｇ／ｋｇ及び３ｍｇ／ｋｇ）と比較したとき、ＡＩにおいて有意な減少を示し、又３～５週目で、ＴＮＶ１４で処置した動物よりも有意に低かった。３ｍｇ／ｋｇの処置群のいずれかの間に有意差はなかったようだが、３ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４で処置した動物に関するＡＩは、ある時点で１０ｍｇ／ｋｇよりも有意に高く、一方ＴＮＶ１４８で処置した動物は、１０ｍｇ／ｋｇのｃＡ２で処置した動物と有意に異ならなかった。
【図13B】関節炎指数に基づく実施例５の疾患の重症度の進行を表すグラフである。１０ｍｇ／ｋｇのｃＡ２で処置した群の関節炎指数は、２週目から始まり、残りの試験全体を通して（５週目）継続してＤ－ＰＢＳ対照群よりも有意に低かった。１ｍｇ／ｋｇ又は３ｍｇ／ｋｇのｃＡ２で処置した動物及び３ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４で処置した動物は、ｄ－ＰＢＳ対照群と比較したときに、試験を通して任意の時点でＡＩにおいて任意の有意な減少を達成することができなかった。３ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４８で処置した動物は、ｄ－ＰＢＳで処置した群と比較したとき、３週目から始まり、５週目まで継続する有意な減少を示した。１０ｍｇ／ｋｇのｃＡ２で処置した動物は、試験の４及び５週目でより低い用量の両ｃＡ２（１ｍｇ／ｋｇ及び３ｍｇ／ｋｇ）と比較したとき、ＡＩにおいて有意な減少を示し、又３～５週目で、ＴＮＶ１４で処置した動物よりも有意に低かった。３ｍｇ／ｋｇの処置群のいずれかの間に有意差はなかったようだが、３ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４で処置した動物に関するＡＩは、ある時点で１０ｍｇ／ｋｇよりも有意に高く、一方ＴＮＶ１４８で処置した動物は、１０ｍｇ／ｋｇのｃＡ２で処置した動物と有意に異ならなかった。
【図13C】関節炎指数に基づく実施例５の疾患の重症度の進行を表すグラフである。１０ｍｇ／ｋｇのｃＡ２で処置した群の関節炎指数は、２週目から始まり、残りの試験全体を通して（５週目）継続してＤ－ＰＢＳ対照群よりも有意に低かった。１ｍｇ／ｋｇ又は３ｍｇ／ｋｇのｃＡ２で処置した動物及び３ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４で処置した動物は、ｄ－ＰＢＳ対照群と比較したときに、試験を通して任意の時点でＡＩにおいて任意の有意な減少を達成することができなかった。３ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４８で処置した動物は、ｄ－ＰＢＳで処置した群と比較したとき、３週目から始まり、５週目まで継続する有意な減少を示した。１０ｍｇ／ｋｇのｃＡ２で処置した動物は、試験の４及び５週目でより低い用量の両ｃＡ２（１ｍｇ／ｋｇ及び３ｍｇ／ｋｇ）と比較したとき、ＡＩにおいて有意な減少を示し、又３～５週目で、ＴＮＶ１４で処置した動物よりも有意に低かった。３ｍｇ／ｋｇの処置群のいずれかの間に有意差はなかったようだが、３ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４で処置した動物に関するＡＩは、ある時点で１０ｍｇ／ｋｇよりも有意に高く、一方ＴＮＶ１４８で処置した動物は、１０ｍｇ／ｋｇのｃＡ２で処置した動物と有意に異ならなかった。
【図14】実施例６の対照と比較した、本発明の抗ＴＮＦ抗体に応答した関節炎マウスモデルマウスＴｇ１９７の体重変化を示す。およそ４週齢のＴｇ１９７試験マウスを性別及び体重に基づき６つの処置群のうちの１つに割り当て、３ｍｇ／ｋｇ又は５ｍｇ／ｋｇのいずれかの抗体（ｃＡ２又はＴＮＶ１４８）の単回腹腔内ボーラス投与で処置した。この試験は、Ｄ－ＰＢＳ及び１０ｍｇ／ｋｇのｃＡ２対照群を利用した。
【図15】実施例６に示す関節炎指数に基づく疾患の重症度の進行を表す。全ての処置群が初期の時点で多少の保護作用を示し、５ｍｇ／ｋｇのｃＡ２及び５ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４８は、１～３週目にＡＩにおいて有意な減少を示し、全ての処置群が２週目で有意な減少を示した。試験の後期に、５ｍｇ／ｋｇのｃＡ２で処置した動物は多少の保護作用を示し、４、６及び７週目で有意に減少した。低用量（３ｍｇ／ｋｇ）のｃＡ２及びＴＮＶ１４８は両方とも、６週目で有意な減少を示し、全ての処置群が７週目で有意な減少を示した。試験の終わりで（８週目）有意な減少を維持することができた処置群はなかった。任意の時点で処置群のいずれかの間（食塩水対照群は除く）に有意差はなかった。
【図16】実施例７の対照と比較した、本発明の抗ＴＮＦ抗体に応答した関節炎マウスモデルマウスＴｇ１９７の体重変化を示す。ＴＮＶ１４８（ハイブリドーマ細胞に由来する）及びｒＴＮＶ１４８Ｂ（トランスフェクトした細胞に由来する）の単回腹腔内投与の有効性を比較するために。およそ４週齢のＴｇ１９７試験マウスを性別及び体重に基づき９つの処置群のうちの１つに割り当て、ＤｕｌｂｅｃｃｏのＰＢＳ（Ｄ－ＰＢＳ）、又は１ｍｇ／ｋｇの抗体（ＴＮＶ１４８、ｒＴＮＶ１４８Ｂ）の単回腹腔内ボーラス投与で処置した。
【図17】実施例７に示す関節炎指数に基づく疾患重症度の進行を表す。１０ｍｇ／ｋｇのｃＡ２処置群の関節炎指数は、４週目から始まり、残りの試験（８週目）を通して継続するＤ－ＰＢＳ対照群よりも低かった。ＴＮＶ１４８で処置した群及び１ｍｇ／ｋｇのｃＡ２で処置した群は両方とも、４週目でＡＩにおける有意な減少を示した。以前の試験（Ｐ－０９９－０１７）は、ＴＮＶ１４８が単回の１ｍｇ／ｋｇの腹腔内ボーラス後の関節炎指数の減少にわずかにより効果的であることを示したが、この試験では、両バージョンのＴＮＶ抗体で処置した群からのＡＩがわずかに高いことを示した。１ｍｇ／ｋｇのｃＡ２で処置した群（６週目を除く）は、１０ｍｇ／ｋｇのｃＡ２群と比較したとき、有意に増加せず、ＴＮＶ１４８で処置した群は、７及び８週目で有意に高かったが、１ｍｇ／ｋｇのｃＡ２、１ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４８及び１ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４８Ｂの間には試験の任意の時点でＡＩにおいて有意差はなかった。
【図18】ゴリムマブ製造方法の９段階の概要を示す。
【図19】プロセス内管理及びプロセス監視試験を含む、前培養及び増殖工程のための段階１の製造方法のフロー図を示す。
【図20】プロセス内管理及びプロセス監視試験を含む、段階２の製造方法の工程のフロー図を示す。
【図21】蛍光検出を伴う順相アニオン交換ＨＰＬＣを使用したゴリムマブ参照標準の代表的なＨＰＬＣクロマトグラフィーを示す。異なる種に関連するピークにはラベルが付けられる。＊は、ゴリムマブに関連しないシステムピークを示す。
【図22】Ｃ、１、２、及び３と標識された４つの主要なピークと、Ｂと標識された１つの微小ピークを有する、ゴリムマブの代表的なｃＩＥＦエレクトロフェログラムプロファイルを示す。ｐＩ７．６及び９．５の内部標準にも標識される。ｃＩＥＦピークと減少する負電荷／シアリル化度との間の一般的な関係を表すグラフも示されている。
【図23】ゴリムマブの製造の段階２中の５００リットル及び１０００リットルのバイオリアクターにおける生存細胞濃度（ＶＣＤ）についての細胞培養性能の偏差を示す。履歴平均を濃い黒色の実線で示し、平均からの±２標準偏差を破線で示し、逸脱した細胞培養物を薄い灰色の線で示す。黒色及び灰色の矢印は、それぞれ、履歴平均及び逸脱バイオリアクターの「ショルダーリング」点を示す。
【図24】ゴリムマブの製造の段階２中の５００リットル及び１０００リットルのバイオリアクターにおける生存率％についての細胞培養性能の偏差を示す。履歴平均を濃い黒色の実線で示し、平均からの±２標準偏差を破線で示し、逸脱した細胞培養物を薄い灰色の線で示す。
【図25】ゴリムマブＩｇＧの主要なＮ－結合型オリゴ糖種のいくつかの概要を示す。グリコシル化成熟プロセスにおけるいくつかの酵素の役割及びいくつかの二価カチオン（例えば、補因子としてのＭｎ２＋及びＧａｌＴＩの阻害剤としてのＣｕ２＋）の役割も示される（例えば、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．２００７ Ｆｅｂ １５；９６（３）：５３８－４９；Ｃｕｒｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ．２００８ Ａｐｒ；９（４）：２９２－３０９；Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００２ Ｍａｙ ３１；３５（３）：３３０－６を参照のこと）。末端シアル酸を含む種（Ｓ１及びＳ２）は荷電種であり、末端シアル酸を含まない種（Ｇ０Ｆ、Ｇ１Ｆ、及びＧ２Ｆ）は中性種であるが、荷電種の生成は、ＧａｌＴ１酵素によって追加されたＧ１Ｆ及びＧ２Ｆのガラクトースの存在に依存することに注意されたい。
【図26】異なるバッチについて時系列順に表示されたゴリムマブのＡＧＴ（変更前）、変更後ＡＧＴ、及びＳＵＰ－ＡＧＴ３バッチにおける総中性及び総荷電オリゴ糖種を示す。過去の変更前のＡＧＴバッチについての平均％の合計を実線で示し、仕様上限及び下限を破線で示す。
【図27-1】異なるバッチについて時系列順に表示されたゴリムマブのＡＧＴ（変更前）、変更後ＡＧＴ、及びＳＵＰ－ＡＧＴ３バッチにおける個々の中性オリゴ糖種Ｇ０Ｆ（Ａ）、Ｇ１Ｆ（Ｂ）、及びＧ２Ｆ（Ｃ）についての合計の％を示す。過去の変更前のＡＧＴバッチの平均％値を実線で示し、仕様の上限及び下限を破線で示す。
【図27-2】異なるバッチについて時系列順に表示されたゴリムマブのＡＧＴ（変更前）、変更後ＡＧＴ、及びＳＵＰ－ＡＧＴ３バッチにおける個々の中性オリゴ糖種Ｇ０Ｆ（Ａ）、Ｇ１Ｆ（Ｂ）、及びＧ２Ｆ（Ｃ）についての合計の％を示す。過去の変更前のＡＧＴバッチの平均％値を実線で示し、仕様の上限及び下限を破線で示す。
【図28】Ｇ０Ｆ及びゴリムマブの総中性のレベルに対する銅濃度増加の効果を示す。
【図29】培地の異なるバッチのマンガンレベルを時系列順に示す。データは、使用される培地、例えば、変更前ＡＧＴ、変更後ＡＧＴ、及びＳＵＰ－ＡＧＴ３に基づいて識別される。過去の変更前ＡＧＴバッチの平均値を実線で示し、仕様の上限及び下限を破線で示す。
【図30】培地の異なるバッチのクロムレベルを時系列順に示す。データは、使用される培地、例えば、変更前ＡＧＴ、変更後ＡＧＴ、及びＳＵＰ－ＡＧＴ３に基づいて識別される。
【図31】培地の異なるバッチの銅レベルを時系列順に示す。データは、使用される培地、例えば、変更前ＡＧＴ、変更後ＡＧＴ、及びＳＵＰ－ＡＧＴ３に基づいて識別される。過去の変更前ＡＧＴバッチの平均値を実線で示し、仕様の上限及び下限を破線で示す。変更後のＡＧＴ及びＳＵＰ－ＡＧＴ３バッチの平均値も実線で示す。変更後ＡＧＴバッチの多くは、銅についてのアッセイについての検出の下限未満の値（＜１μｇ／Ｌ）を有し、１μｇ／Ｌとしてグラフで単純に表されることに留意されたい。
【図32】ゴリムマブの過去の変更前ＡＧＴバッチの平均（黒丸）及び変更後ＡＧＴバッチの平均（黒三角）と比較した、ＳＵＰ－ＡＧＴ３バッチの平均（灰色四角）についての細胞培養（段階２）生存細胞濃度（ＶＣＤ）プロファイルを示す。過去の変更前ＡＧＴバッチについては、±３ＳＤが破線として含まれる。
【図33】ゴリムマブの過去の変更前ＡＧＴバッチの平均（黒丸）及び変更後ＡＧＴバッチの平均（黒三角）と比較した、ＳＵＰ－ＡＧＴ３バッチの平均（灰色四角）についての細胞培養（段階２）生存率（％）を示す。過去の変更前ＡＧＴバッチについては、±３ＳＤが破線として含まれる。
【図34】ゴリムマブの過去の変更前ＡＧＴバッチの平均（黒四角）及び変更後ＡＧＴバッチの平均（黒丸）と比較した、ＳＵＰ－ＡＧＴ３バッチの平均（灰色三角）についての細胞培養（段階２）平均累積ＩｇＧレベルを示す。過去の変更前ＡＧＴバッチについては、±３ＳＤが破線として含まれる。
【0030】
（発明の記述）
本発明は、配列番号３６を含む重鎖（ＨＣ）及び配列番号３７を含む軽鎖（ＬＣ）を有する抗ＴＮＦ抗体を含む組成物、及びかかる抗ＴＮＦ抗体を生成するための製造プロセスを提供する。
本発明は、配列番号３６を含む重鎖（ＨＣ）及び配列番号３７を含む軽鎖（ＬＣ）を有する抗ＴＮＦ抗体を含む組成物、及びかかる抗ＴＮＦ抗体を生成するための製造プロセスを提供する。
【0031】
本明細書で使用するとき、「抗腫瘍壊死因子α抗体」、「抗ＴＮＦ抗体」、「抗ＴＮＦ抗体部分」若しくは「抗ＴＮＦ抗体断片」、及び／又は「抗ＴＮＦ抗体変異体」などは、本発明の抗体の中に組み込むことができる、重鎖若しくは軽鎖の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）若しくはそのリガンド結合部分、重鎖若しくは軽鎖可変領域、重鎖若しくは軽鎖定常領域、フレームワーク領域、又はこれらの任意の部分、あるいはＴＮＦ受容体又は結合タンパク質の少なくとも一つの部分などであるがこれらに限定されない免疫グロブリン分子の少なくとも一部分を含む分子を含む、任意のタンパク質又はペプチド含有分子を含む。かかる抗体は、任意選択的に、特定のリガンドに更に影響を及ぼし、これらに限定されないが、かかる抗体は、インビトロで、その場で、及び／又はインビボで、少なくとも１つのＴＮＦ活性若しくは結合、又はＴＮＦ受容体活性若しくは結合を調節、減少、増加、拮抗、作動、軽減、緩和、遮断、阻害、抑止、及び／又は干渉する。非限定的な例として、本発明の好適な抗ＴＮＦ抗体、特定された部分又は変異体は、少なくとも１つのＴＮＦ又はその特定された部分、変異体若しくはドメインに結合することができる。好適な抗ＴＮＦ抗体、特定された部分又は変異体は又、任意選択的に、ＲＮＡ、ＤＮＡ、若しくはタンパク質合成、ＴＮＦ放出、ＴＮＦ受容体シグナル伝達、膜ＴＮＦ切断、ＴＮＦ活性、ＴＮＦ生成、及び／又は合成などであるがこれらに限定されない、ＴＮＦ活性又は機能のうちの少なくとも１つに影響を及ぼすこともできる。「抗体」という用語は、更に、抗体、その消化断片、特定部分及び変異体を包含することを意図し、これには抗体模倣薬が挙げられ、あるいは抗体の構造及び／若しくは機能を模倣する抗体の部分若しくはその特定断片若しくは一部を含み、単鎖抗体及びその断片が挙げられる。機能断片としては、哺乳動物のＴＮＦに結合する抗原結合断片が挙げられる。例えば、Ｆａｂ（例えば、パパイン消化による）、Ｆａｂ’（例えば、ペプシン消化及び部分的還元による）及びＦ（ａｂ’）２（例えば、ペプシン消化による）、ｆａｃｂ（例えば、プラスミン消化による）、ｐＦｃ’（例えば、ペプシン又はプラスミン消化による）、Ｆｄ（例えば、ペプシン消化、部分的還元及び再集合による）、Ｆｖ又はｓｃＦｖ（例えば、分子生物学的技術による）断片が挙げられるがこれらに限定されない、ＴＮＦ又はその部分に結合することができる抗体断片が、本発明に包含される（例えば、上記のＣｏｌｌｉｇａｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙを参照のこと）。
【0032】
かかる断片は、当該技術分野において既知であるように、及び／又は本明細書に記載されるように、酵素切断、合成又は組換え技術により産生することができる。抗体は、天然の終止部位の上流に１つ又は２つ以上の終止コドンが導入された抗体遺伝子を使用して、様々な切断型でも産生され得る。例えば、Ｆ（ａｂ’）２重鎖部分をコードする遺伝子の組合せは、重鎖のＣＨ１ドメイン及び／又はヒンジ領域をコードするＤＮＡ配列を含むよう設計することができる。抗体の種々の部分を従来技術により化学的に結合することができ、又は遺伝子工学技術を使用して切れ目なく連続するタンパク質として調製することができる。
【0033】
本明細書で使用するとき、用語「ヒト抗体」は、実質的にタンパク質の全ての部分（例えば、ＣＤＲ、フレームワーク、ＣＬ、ＣＨドメイン（例えば、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）、ヒンジ（ＶＬ、ＶＨ））がヒトにおいて実質的に非免疫原性であり、有する配列の変化又は変異がごく軽微なものである抗体を指す。同様に、霊長類（サル、ヒヒ、チンパンジーなど）、げっ歯類（マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ハムスターなど）、及びその他の哺乳動物を指定された抗体は、かかる種、亜属、属、亜科、科に特異的な抗体を指す。更に、キメラ抗体は、上記の任意の組合せを含む。このような変化又は変異は、場合によりかつ好ましくは、修飾していない抗体に比べて、ヒト又はその他の種における免疫原性を保持するか、又は低減させる。したがって、ヒト抗体は、キメラ抗体又はヒト化抗体とは異なる。ヒト抗体は、機能的に再構成されたヒト免疫グロブリン（例えば、重鎖及び／又は軽鎖）遺伝子を発現することができる、ヒト以外の動物、又は原核若しくは真核細胞により産生され得ることが指摘される。更に、ヒト抗体が単鎖抗体である場合、天然のヒト抗体では見られないリンカペプチドを含むことができる。例えば、Ｆｖは、重鎖の可変領域と軽鎖の可変領域とを接続する２～約８個のグリシン又はその他のアミノ酸残基などのリンカペプチドを含むことができる。このようなリンカペプチドは、ヒト由来のものとみなされる。
【0034】
少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル、好ましくはヒト又はヒト化抗体である、二重特異的（例えば、ＤｕｏＢｏｄｙ（登録商標））、異種特異的、異種結合性、又は類似の抗体を使用してもよい。この場合では、結合特異性のうち一方は少なくとも１つのＴＮＦタンパク質に対するものであり、他方は任意のその他の抗原に対するものである。二重特異的抗体の製造方法は、技術分野において既知である。従来、二重特異的抗体の組換え体生成は、２種の免疫グロブリン重鎖－軽鎖対の共発現に基づくが、ここで２本の重鎖は異なる特異性を有する（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｃｕｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ ３０５：５３７（１９８３））。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の無作為な組合せのために、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は１０種の異なる抗体分子の可能な混合物を産生し、これらのうち１種のみが正しい二重特異的構造を有する。通常、親和性クロマトグラフィー工程によって行われる正しい分子の精製は、生成物の収率が低くて手間がかかるため、二重特異性抗体の生成を促進するための異なる手法が開発されている。
【0035】
完全長二重特異性抗体は、例えば、インビトロでの無細胞環境において又は共発現を使用して、異なる特異性を有する２つの抗体半分子のヘテロ二量体形成に好都合になるように各半分子における重鎖ＣＨ３界面に置換を導入することによって、２つの一特異性二価抗体間でのＦａｂアーム交換（又は半分子交換）を使用して生成され得る。Ｆａｂアーム交換反応は、ジスルフィド結合異性化反応及びＣＨ３ドメインの解離－会合の結果である。親単一特異性抗体のヒンジ領域における重鎖ジスルフィド結合は減少する。親単一特異性抗体のうち１つの得られた遊離システインは、第２の親単一特異性抗体分子のシステイン残基と重鎖内ジスルフィド結合を形成し、同時に、親抗体のＣＨ３ドメインは、解離－会合により解放及び再形成する。ＦａｂアームのＣＨ３ドメインは、ホモ二量体化よりもヘテロ二量体化に有利となるように操作され得る。得られた生成物は、それぞれ異なるエピトープに結合することができる、２つのＦａｂアーム又は半分子を有する二重特異性抗体である。
【0036】
本明細書で使用するとき、「ホモ二量体形成」は、同一のＣＨ３アミノ酸配列を有する２本の重鎖の相互作用を意味する。本明細書で使用するとき、「ホモ二量体」は、同一のＣＨ３アミノ酸配列を有する２本の重鎖を有する抗体を意味する。
【0037】
本明細書で使用するとき、「ヘテロ二量体形成」は、同一でないＣＨ３アミノ酸配列を有する２本の重鎖の相互作用を意味する。本明細書で使用するとき、「ヘテロ二量体」は、同一でないＣＨ３アミノ酸配列を有する２本の重鎖を有する抗体を意味する。
【0038】
「ノブインホール（knob-in-hole）」戦略（例えば、国際公開第２００６／０２８９３６号を参照のこと）を使用して、完全長二重特異性抗体を生成することができる。簡潔に述べると、ヒトＩｇＧにおけるＣＨ３ドメインの界面を形成する選択されたアミノ酸は、ヘテロ二量体形成を促進するように、ＣＨ３ドメイン相互作用に影響を及ぼす位置において変異され得る。小さな側鎖を有するアミノ酸（ホール）が、第１の抗原に特異的に結合する抗体の重鎖内に導入され、大きな側鎖を有するアミノ酸（ノブ）が、第２の抗原に特異的に結合する抗体の重鎖内に導入される。２つの抗体の共発現後に、ヘテロ二量体が、「ホール」を有する重鎖と「ノブ」を有する重鎖との優先的な相互作用の結果として形成される。ノブ及びホールを形成する例示的なＣＨ３置換の対は、Ｔ３６６Ｙ／Ｆ４０５Ａ、Ｔ３６６Ｗ／Ｆ４０５Ｗ、Ｆ４０５Ｗ／Ｙ４０７Ａ、Ｔ３９４Ｗ／Ｙ４０７Ｔ、Ｔ３９４Ｓ／Ｙ４０７Ａ、Ｔ３６６Ｗ／Ｔ３９４Ｓ、Ｆ４０５Ｗ／Ｔ３９４Ｓ、及びＴ３６６Ｗ／Ｔ３６６Ｓ＿Ｌ３６８Ａ＿Ｙ４０７Ｖである（第１の重鎖の第１のＣＨ３ドメインにおける修飾された位置／第２の重鎖の第２のＣＨ３ドメインにおける修飾された位置として表す）。
【0039】
他の戦略、例えば、１つのＣＨ３表面における正に荷電した残基及び第２のＣＨ３表面における負に荷電した残基を置換することによる静電的相互作用を使用する重鎖ヘテロ二量体形成の促進が、米国特許出願公開第２０１０／００１５１３３号、米国特許出願公開第２００９／０１８２１２７号、米国特許出願公開第２０１０／０２８６３７号、又は米国特許出願公開第２０１１／０１２３５３２号に記載されるように使用されてもよい。他の戦略では、ヘテロ二量体形成は、米国特許出願公開第２０１２／０１４９８７６号又は同第２０１３／０１９５８４９号に記載されるように、次の置換：Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３６６Ｉ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ／Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ／Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、Ｌ３５１Ｙ＿Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆ、Ｌ３５１Ｙ＿Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ｖ＿Ｋ４０９Ｆ、Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆ、又はＴ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗ（第１の重鎖の第１のＣＨ３ドメインにおける修飾された位置／第２の重鎖の第２のＣＨ３ドメインにおける修飾された位置として表す）により促進することができる。
【0040】
上述された方法に加えて、二重特異性抗体は、国際公開第２０１１／１３１７４６号に記載される方法に従って、インビトロでの無細胞環境において、２つの単一特異的ホモ二量体抗体のＣＨ３領域中に非対称な変異を導入し、ジスルフィド結合を異性化させる還元条件下において、２つの親単一特異性ホモ二量体抗体から二重特異性ヘテロ二量体抗体を形成することにより生成され得る。本方法において、第１の単一特異性二価抗体及び第２の単一特異性二価抗体は、ヘテロ二量体の安定性を促進するＣＨ３ドメインにおいてある特定の置換を有するように改変されるが、これらの抗体は、ヒンジ領域におけるシステインがジスルフィド結合を異性化させるために十分な還元条件下において一緒にインキュベートされ、それにより、Ｆａｂアーム交換により二重特異性抗体が生成される。インキュベート条件は、最適には、非還元条件に戻され得る。使用され得る例示的な還元剤は、２－メルカプトエチルアミン（２－ＭＥＡ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ジチオエリスリトール（ＤＴＥ）、グルタチオン、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、Ｌ－システイン、及びベータ－メルカプトエタノールであり、好ましくは、２－メルカプトエチルアミン、ジチオスレイトール、及びトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィンからなる群から選択される還元剤である。例えば、少なくとも２０℃の温度において、少なくとも２５ｍＭの２－ＭＥＡの存在下又は少なくとも０．５ｍＭのジチオスレイトールの存在下で、ｐＨ５～８、例えば、ｐＨ７．０又はｐＨ７．４において、少なくとも９０分のインキュベートが使用されてもよい。
【0041】
本発明の方法及び組成物において有用である抗ＴＮＦ抗体（ＴＮＦ抗体とも称される）は、ＴＮＦへの高親和性結合、並びに任意選択的に及び好ましくは低毒性を有することを任意選択的に特徴とし得る。具体的には、可変領域、定常領域、及びフレームワークなどの個々の構成要素が、個々に及び／又は集合的に、任意選択でかつ好ましくは、低い免疫原性を有する、本発明の抗体、その特定の断片、又は変異体が本発明において有用である。本発明で使用することができる抗体は、任意選択で、症状の測定可能な緩和並びに低い及び／又は許容できる毒性で、長期間患者を処置する能力を特徴とする。低い若しくは許容できる免疫原性、及び／又は高い親和性、並びに他の好適な特性が、得られる治療結果に寄与することができる。「低い免疫原性」は、本明細書では、処置される患者の約７５％未満、若しくは好ましくは約５０％未満で有意にＨＡＨＡ、ＨＡＣＡ、若しくはＨＡＭＡ応答が増加する、及び／又は、処置される患者において低い力価（二重抗原酵素免疫アッセイで測定したとき約３００未満、好ましくは約１００未満）が増加することとして定義される（Ｅｌｌｉｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ ３４４：１１２５－１１２７（１９９４）、これは参照により全体が本明細書に組み込まれる）。
【0042】
有用性：本発明の単離核酸は、細胞、組織、器官又は動物（哺乳類及びヒトを含む）において測定し、又は作用して、免疫障害若しくは疾患、循環器障害若しくは疾患、感染性、悪性及び／若しくは神経性障害又は疾患のうちの少なくとも１つから選択されるがこれらに限定されない、少なくとも１つのＴＮＦ状態を診断、監視、調節、処置、緩和、発生を予防するのを助ける、又はその症状を低減するために使用され得る、少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体又はその特定された変異体を生成するために使用され得る。
【0043】
かかる方法は、症状、作用、又は機序のかかる調節、処置、緩和、予防、若しくは低減を必要としている細胞、組織、器官、動物又は患者に、少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体を含む有効量の組成物又は医薬組成物を投与することを含み得る。有効量は、本明細書に記載される、又は関連分野で知られている、既知の方法を使用して行い決定して、単回（例えば、ボーラス）、複数回、若しくは持続投与当たり約０．００１～５００ｍｇ／ｋｇの量、又は単回、複数回、若しくは持続投与当たり０．０１～５０００μｇ／ｍＬの血清濃度を達成する量、又はこの中の任意の有効範囲若しくは値を含み得る。引用文献。本明細書で引用する全ての刊行物又は特許は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれ、本発明の時点での最高水準を示し、かつ／又は本発明の説明及び使用可能性を提供する。刊行物は、電子形式若しくは印刷形式で記録されたものを全て含む任意のメディア形式で利用可能な、任意の科学刊行物若しくは特許公報又は任意の他の情報を指す。以下の文献は、参照により全体が本明細書に組み込まれる：Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，ＮＹ（１９８７－２００１）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）、Ｃｏｌｌｉｇａｎ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ（１９９４－２００１）、Ｃｏｌｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ，ＮＹ，（１９９７－２００１）。
【0044】
本発明の抗体：配列番号１、２及び３の重鎖可変ＣＤＲ領域の全て、並びに／又は配列番号４、５及び６の軽鎖可変ＣＤＲ領域の全てを含む、本発明の少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体は、任意選択的に、当該技術分野において周知であるように、細胞株、混合細胞株、不死化細胞又は不死化細胞のクローン集団により産生され得る。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ、ＮＹ（１９８７～２００１）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）、Ｃｏｌｌｉｇａｎ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ（１９９４－２００１）、Ｃｏｌｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ，ＮＹ，（１９９７－２００１）を参照されたい。
【0045】
ヒトＴＮＦタンパク質又はその断片に特異的なヒト抗体は、単離された及び／若しくはＴＮＦタンパク質、又はそれらの一部分（合成ペプチドなどの合成分子を含む）などの適切な免疫原性抗原に対して生じ得る。その他の特異的な又は一般的な哺乳動物の抗体も又、同様に生じることができる。免疫原性をもつ抗原の調製及びモノクローナル抗体の生成は、任意の好適な技術を使用して行うことができる。
【0046】
１つのアプローチでは、ハイブリドーマは、適切な不死化細胞株（例えば、Ｓｐ２／０、Ｓｐ２／０－ＡＧ１４、ＮＳＯ、ＮＳ１、ＮＳ２、ＡＥ－１、Ｌ．５、＞２４３、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３、Ｓｐ２ ＳＡ３、Ｓｐ２ ＭＡＩ、Ｓｐ２ ＳＳ１、Ｓｐ２ ＳＡ５、Ｕ９３７、ＭＬＡ １４４、ＡＣＴ ＩＶ、ＭＯＬＴ４、ＤＡ－１、ＪＵＲＫＡＴ、ＷＥＨＩ、Ｋ－５６２、ＣＯＳ、ＲＡＪＩ、ＮＩＨ ３Ｔ３、ＨＬ－６０、ＭＬＡ １４４、ＮＡＭＡＩＷＡ、ＮＥＵＲＯ ２Ａなどであるがこれらに限定されない骨髄腫細胞株、又はヘテロミローマ（heteromylomas）、その融合産物、又はそれらに由来する任意の細胞若しくは融合細胞、又は当該技術分野において既知の任意の他の好適な細胞株を融合させることにより産生される。例えば、ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ、ｗｗｗ．ｌｉｆｅｔｅｃｈ．ｃｏｍ．などを参照のこと。単離若しくはクローニングされた脾臓、末梢血、リンパ、扁桃、又はその他の免疫細胞若しくはＢ細胞含有細胞などであるがこれらに限定されない抗体産生細胞、あるいは組換え若しくは内因性、ウイルス、細菌、藻類、原核生物、両生類、昆虫類、爬虫類、魚類、哺乳動物、げっ歯類、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ヒツジ、霊長類、真核生物、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｒＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ若しくはＲＮＡ、葉緑体ＤＮＡ若しくはＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、一本鎖、二本鎖若しくは三本鎖、ハイブリダイズなど、又はそれらの組合せのような、内因性若しくは異種の核酸のいずれかとして、重鎖若しくは軽鎖定常若しくは可変若しくはフレームワーク若しくはＣＤＲ配列を発現する任意のその他の細胞を有する。例えば、参照により全体が本明細書に組み込まれる、上記のＡｕｓｕｂｅｌ、及び上記のＣｏｌｌｉｇａｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙの第２章を参照されたい。
【0047】
抗体産生細胞は、目的の抗原で免疫されたヒト又は他の好適な動物の末梢血、又は好ましくは脾臓若しくはリンパ節から得ることもできる。任意のその他の好適な宿主細胞を使用して、本発明の抗体、特定の断片又はその変異体をコードする異種核酸若しくは内在核酸を発現させることもできる。融合細胞（ハイブリドーマ）又は組換え細胞は、選択的培養条件又はその他の好適な周知の方法を使用して単離し、限界希釈若しくは細胞選別又はその他の周知の方法によってクローニングすることができる。所望の特異性を有する抗体を産生する細胞は、好適なアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）によって選択することができる。
【0048】
ペプチド又はタンパク質ライブラリから組換え抗体を選択する方法が挙げられるがこれらに限定されない、必要とされる特異性を有する抗体を産生又は単離するのに好適なその他の方法を使用することができる（例えば、バクテリオファージ、リボソーム、オリゴヌクレオチド、ＲＮＡ、ｃＤＮＡなどのディスプレイライブラリであるがこれらに限定されるものではなく、例えば、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅｓｈｉｒｅ，ＵＫ、ＭｏｒｐｈｏＳｙｓ，Ｍａｒｔｉｎｓｒｅｉｄ／Ｐｌａｎｅｇｇ，ＤＥ、Ｂｉｏｖａｔｉｏｎ，Ａｂｅｒｄｅｅｎ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ，ＵＫ、ＢｉｏＩｎｖｅｎｔ，Ｌｕｎｄ，Ｓｗｅｄｅｎ、Ｄｙａｘ Ｃｏｒｐ．，Ｅｎｚｏｎ，Ａｆｆｙｍａｘ／Ｂｉｏｓｉｔｅ、Ｘｏｍａ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ、Ｉｘｓｙｓ．から入手可能である）。例えば、欧州特許第３６８，６８４号、国際出願第ＧＢ９１／０１１３４号、国際出願第ＧＢ９２／０１７５５号、国際出願第ＧＢ９２／００２２４０号、国際出願第ＧＢ９２／００８８３号、国際出願第ＧＢ９３／００６０５号、米国特許出願第０８／３５０２６０号（５／１２／９４）、国際出願第ＧＢ９４／０１４２２号、国際出願第ＧＢ９４／０２６６２号、国際出願第ＧＢ９７／０１８３５号、（ＣＡＴ／ＭＲＣ）、国際公開第９０／１４４４３号、国際公開第９０／１４４２４号、国際公開第９０／１４４３０号、国際出願第ＵＳ９４／１２３４号、国際公開第９２／１８６１９号、同第９６／０７７５４号（Ｓｃｒｉｐｐｓ）、欧州特許第６１４ ９８９号（ＭｏｒｐｈｏＳｙｓ）、国際公開第９５／１６０２７号（ＢｉｏＩｎｖｅｎｔ）、国際公開第８８／０６６３０号、国際公開第９０／３８０９号（Ｄｙａｘ）、米国特許第４，７０４，６９２号（Ｅｎｚｏｎ）、国際出願第ＵＳ９１／０２９８９号（Ａｆｆｙｍａｘ）、国際公開第８９／０６２８３号、欧州特許第３７１９９８号、欧州特許第５５０４００号、（Ｘｏｍａ）、欧州特許第２２９０４６号、国際出願第ＵＳ９１／０７１４９号（Ｉｘｓｙｓ）、又は確率論的に生成されるペプチド若しくはタンパク質－米国特許第５７２３３２３号、同第５７６３１９２号、同第５８１４４７６号、同第５８１７４８３号、同第５８２４５１４号、同第５９７６８６２号、国際公開第８６／０５８０３号、欧州特許第５９０６８９号（Ｉｘｓｙｓ、現在はＡｐｐｌｉｅｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ（ＡＭＥ）、各々は、参照により全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたく、又は当該技術分野において既知であり、かつ／又は本明細書に記載される、ヒト抗体のレパートリを生成することができるトランスジェニック動物の免疫に依存する（例えば、ＳＣＩＤマウス、Ｎｇｕｙｅｎら、「Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４１：９０１－９０７（１９９７）、Ｓａｎｄｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：９５－１１８（１９９６）；Ｅｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．９３：１５４－１６１（１９９８）、各々が参照によりその全体が組み込まれる）。このような技術には、リボソームディスプレイ（Ｈａｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４：４９３７－４９４２（Ｍａｙ １９９７）、Ｈａｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５：１４１３０－１４１３５（Ｎｏｖ．１９９８））、単一細胞抗体産生技術（例えば、選択リンパ球抗体方法（selected lymphocyte antibody method、「ＳＬＡＭ」）（米国特許第５，６２７，０５２号、Ｗｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７：８８７－８９２（１９８７）、Ｂａｂｃｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：７８４３－７８４８（１９９６））、ゲルマイクロドロップレット及びフローサイトメトリー（Ｐｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：３３３－３３７（１９９０）；Ｏｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ、Ｇｒａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍ．Ｍｅｔｈ．１８２：１５５－１６３（１９９５）、Ｋｅｎｎｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．１３：７８７－７９０（１９９５））、Ｂ細胞選択物（Ｓｔｅｅｎｂａｋｋｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｏｒｔｓ １９：１２５－１３４（１９９４）、Ｊｏｎａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｇｒｅｓｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｖｏｌ．５，Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，ｅｄ．，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｂ．Ｖ．，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ（１９８８））が挙げられるが、これらに限定されない。
【0049】
ヒト以外の抗体又はヒト抗体を操作又はヒト化する方法も同様に使用でき、当該技術分野において周知である。一般に、ヒト化又は操作された抗体は、例えば、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類、又はその他の哺乳動物などであるがこれらに限定されない、非ヒトの供給源からの１つ又は２つ以上のアミノ酸残基を有する。これらのヒトアミノ酸残基は、しばしば「インポート」残基と呼ばれ、典型的には既知のヒト配列の「インポート」可変領域、定常領域又はその他のドメインから採取される。周知のヒトＩｇ配列が、例えば以下に開示されており、これらは各々全体が参照により本明細書に組み込まれる：ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ｑｕｅｒｙ．ｆｃｇｉ、ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／ｐｈａｇｅ／ｈｄｂ．ｈｔｍｌ、ｗｗｗ．ｓｃｉｑｕｅｓｔ．ｃｏｍ／、ｗｗｗ．ａｂｃａｍ．ｃｏｍ／、ｗｗｗ．ａｎｔｉｂｏｄｙｒｅｓｏｕｒｃｅ．ｃｏｍ／ｏｎｌｉｎｅｃｏｍｐ．ｈｔｍｌ、ｗｗｗ．ｐｕｂｌｉｃ．ｉａｓｔａｔｅ．ｅｄｕ／～ｐｅｄｒｏ／ｒｅｓｅａｒｃｈ＿ｔｏｏｌｓ．ｈｔｍｌ、ｗｗｗ．ｍｇｅｎ．ｕｎｉ－ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｄｅ／ＳＤ／ＩＴ／ＩＴ．ｈｔｍｌ、ｗｗｗ．ｗｈｆｒｅｅｍａｎ．ｃｏｍ／ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ／ＣＨ０５／ｋｕｂｙ０５．ｈｔｍ、ｗｗｗ．ｌｉｂｒａｒｙ．ｔｈｉｎｋｑｕｅｓｔ．ｏｒｇ／１２４２９／Ｉｍｍｕｎｅ／Ａｎｔｉｂｏｄｙ．ｈｔｍｌ、ｗｗｗ．ｈｈｍｉ．ｏｒｇ／ｇｒａｎｔｓ／ｌｅｃｔｕｒｅｓ／１９９６／ｖｌａｂ／、ｗｗｗ．ｐａｔｈ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／～ｍｒｃ７／ｍｉｋｅｉｍａｇｅｓ．ｈｔｍｌ、ｗｗｗ．ａｎｔｉｂｏｄｙｒｅｓｏｕｒｃｅ．ｃｏｍ／、ｍｃｂ．ｈａｒｖａｒｄ．ｅｄｕ／ＢｉｏＬｉｎｋｓ／Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．ｈｔｍｌ．ｗｗｗ．ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙｌｉｎｋ．ｃｏｍ／、ｐａｔｈｂｏｘ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／～ｈｃｅｎｔｅｒ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｂｉｏｔｅｃｈ．ｕｆｌ．ｅｄｕ／～ｈｃｌ／、ｗｗｗ．ｐｅｂｉｏ．ｃｏｍ／ｐａ／３４０９１３／３４０９１３．ｈｔｍｌ、ｗｗｗ．ｎａｌ．ｕｓｄａ．ｇｏｖ／ａｗｉｃ／ｐｕｂｓ／ａｎｔｉｂｏｄｙ／、ｗｗｗ．ｍ．ｅｈｉｍｅ－ｕ．ａｃ．ｊｐ／～ｙａｓｕｈｉｔｏ／Ｅｌｉｓａ．ｈｔｍｌ、ｗｗｗ．ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ．ｃｏｍ／ｔａｂｌｅ．ａｓｐ、ｗｗｗ．ｉｃｎｅｔ．ｕｋ／ａｘｐ／ｆａｃｓ／ｄａｖｉｅｓ／ｌｉｎｋｓ．ｈｔｍｌ、ｗｗｗ．ｂｉｏｔｅｃｈ．ｕｆｌ．ｅｄｕ／～ｆｃｃｌ／ｐｒｏｔｏｃｏｌ．ｈｔｍｌ、ｗｗｗ．ｉｓａｃ－ｎｅｔ．ｏｒｇ／ｓｉｔｅｓ＿ｇｅｏ．ｈｔｍｌ、ａｘｉｍｔ１．ｉｍｔ．ｕｎｉ－ｍａｒｂｕｒｇ．ｄｅ／～ｒｅｋ／ＡＥＰＳｔａｒｔ．ｈｔｍｌ、ｂａｓｅｒｖ．ｕｃｉ．ｋｕｎ．ｎｌ／～ｊｒａａｔｓ／ｌｉｎｋｓ１．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｒｅｃａｂ．ｕｎｉ－ｈｄ．ｄｅ／ｉｍｍｕｎｏ．ｂｍｅ．ｎｗｕ．ｅｄｕ／、ｗｗｗ．ｍｒｃ－ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｉｍｔ－ｄｏｃ／ｐｕｂｌｉｃ／ＩＮＴＲＯ．ｈｔｍｌ、ｗｗｗ．ｉｂｔ．ｕｎａｍ．ｍｘ／ｖｉｒ／Ｖ＿ｍｉｃｅ．ｈｔｍｌ、ｉｍｇｔ．ｃｎｕｓｃ．ｆｒ：８１０４／；ｗｗｗ．ｂｉｏｃｈｅｍ．ｕｃｌ．ａｃ．ｕｋ／～ｍａｒｔｉｎ／ａｂｓ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ、ａｎｔｉｂｏｄｙ．ｂａｔｈ．ａｃ．ｕｋ／；ａｂｇｅｎ．ｃｖｍ．ｔａｍｕ．ｅｄｕ／ｌａｂ／ｗｗｗａｂｇｅｎ．ｈｔｍｌ、ｗｗｗ．ｕｎｉｚｈ．ｃｈ／～ｈｏｎｅｇｇｅｒ／ＡＨＯｓｅｍｉｎａｒ／Ｓｌｉｄｅ０１．ｈｔｍｌ、ｗｗｗ．ｃｒｙｓｔ．ｂｂｋ．ａｃ．ｕｋ／～ｕｂｃｇ０７ｓ／、ｗｗｗ．ｎｉｍｒ．ｍｒｃ．ａｃ．ｕｋ／ＣＣ／ｃｃａｅｗｇ／ｃｃａｅｗｇ．ｈｔｍ、ｗｗｗ．ｐａｔｈ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／～ｍｒｃ７／ｈｕｍａｎｉｓａｔｉｏｎ／ＴＡＨＨＰ．ｈｔｍｌ、ｗｗｗ．ｉｂｔ．ｕｎａｍ．ｍｘ／ｖｉｒ／ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ／ｓｔａｔ＿ａｉｍ．ｈｔｍｌ、ｗｗｗ．ｂｉｏｓｃｉ．ｍｉｓｓｏｕｒｉ．ｅｄｕ／ｓｍｉｔｈｇｐ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ、ｗｗｗ．ｃｒｙｓｔ．ｂｉｏｃ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／～ｆｍｏｌｉｎａ／Ｗｅｂ－ｐａｇｅｓ／Ｐｅｐｔ／ｓｐｏｔｔｅｃｈ．ｈｔｍｌ、ｗｗｗ．ｊｅｒｉｎｉ．ｄｅ／ｆｒ＿ｐｒｏｄｕｃｔｓ．ｈｔｍ、ｗｗｗ．ｐａｔｅｎｔｓ．ｉｂｍ．ｃｏｍ／ｉｂｍ．ｈｔｍｌ．Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ（１９８３）である（各々は、参照により全体が本明細書に組み込まれる）。
【0050】
このようなインポートされた配列は、免疫原性を低減させるため、あるいは、当該技術分野において周知のように、結合、親和性、結合速度定数、解離速度定数、結合活性、特異性、半減期、又は任意のその他の好適な特性を低減、増強又は改変するために使用することができる。一般に、非ヒト若しくはヒトＣＤＲ配列の一部又は全ては、可変及び定常領域の非ヒト配列がヒト若しくは他のアミノ酸に置き換えられる間も維持される。抗体は又、任意選択的に、抗原に対する高い親和性及び他の好ましい生物学的特性を保持したままで、ヒト化され得る。この目的を達成するために、任意選択的に、ヒト化抗体を、親配列及びヒト化配列の三次元モデルを使用した、親配列及び様々な概念的ヒト化産物の分析プロセスによって調製することが可能である。三次元の免疫グロブリンモデルが一般的に利用可能であり、当業者に周知である。選択された免疫グロブリン配列候補について確率の高い三次元立体構造を図示及び表示するコンピュータプログラムが利用可能である。これらの表示を調べることにより、免疫グロブリン配列候補の機能において残基が示す可能性の高い働きの解析、すなわち免疫グロブリン候補の抗原結合能に影響する残基の解析が可能となる。このようにして、標的抗原に対する親和性の増大など、望ましい抗体特性が達成されるように、コンセンサス配列及びインポート配列から、ＦＲ残基を選択し組み合わせることができる。概して、ＣＤＲ残基は、抗原結合に直接的にかつほとんど実質的に影響する。本発明の抗体のヒト化又は操作は、Ｗｉｎｔｅｒ（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２（１９８６）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３（１９８８）、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４（１９８８））、Ｓｉｍｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６（１９９３）、Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１（１９８７），Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：４２８５（１９９２）、Ｐｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２６２３（１９９３）、米国特許第５７２３３２３号、同第５９７６８６２号、同第５８２４５１４号、同第５８１７４８３号、同第５８１４４７６号、同第５７６３１９２号、同第５７２３３２３号、同第５，７６６８８６号、同第５７１４３５２号、同第６２０４０２３号、同第６１８０３７０号、同第５６９３７６２号、同第５５３０１０１号、同第５５８５０８９号、同第５２２５５３９号、同第４８１６５６７号、国際出願第ＵＳ９８／１６２８０号、同第ＵＳ９６／１８９７８号、同第ＵＳ９１／０９６３０号、同第ＵＳ９１／０５９３９号、同第ＵＳ９４／０１２３４号、国際出願第ＧＢ８９／０１３３４号、同第ＧＢ９１／０１１３４号、同第ＧＢ９２／０１７５５号、国際公開第９０／１４４４３号、同第９０／１４４２４号、同第９０／１４４３０号、欧州特許第２２９２４６号（各々、参照によりその全体が明細書に組み込まれ、その中に引用される文献を含む）に記載されるものなどであるがこれらに限定されない、任意の周知の方法を使用して行うことができる。
【0051】
抗ＴＮＦ抗体は、任意選択的に、本明細書に記載されかつ／又は当該技術分野において既知である、ヒト抗体のレパートリを生成することができるトランスジェニック動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、非ヒト霊長類など）の免疫により生成することもできる。ヒト抗ＴＮＦ抗体を産生する細胞をかかる動物から単離し、本明細書に記載される方法などの好適な方法を使用して不死化してもよい。
【0052】
ヒト抗原に結合するヒト抗体のレパートリを産生することができるトランスジェニックマウスは、既知の方法（例えば、これらに限定されないが、各々全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｌｏｎｂｅｒｇらに発行された米国特許第５，７７０，４２８号、同第５，５６９，８２５号、同第５，５４５，８０６号、同第５，６２５，１２６号、同第５，６２５，８２５号、同第５，６３３，４２５号、同第５，６６１，０１６号、及び同第５，７８９，６５０号、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓらの国際公開第９８／５０４３３号、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓらの国際公開第９８／２４８９３号、Ｌｏｎｂｅｒｇらの国際公開第９８／２４８８４号、Ｌｏｎｂｅｒｇらの国際公開第９７／１３８５２号、Ｌｏｎｂｅｒｇらの国際公開第９４／２５５８５号、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｅらの国際公開第９６／３４０９６号、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｅらの欧州特許第０４６３１５１（Ｂ１）号、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｅらの欧州特許０７１０７１９（Ａ１）号、Ｓｕｒａｎｉらの米国特許第５，５４５，８０７号、Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎらの国際公開第９０／０４０３６号、Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎらの欧州特許第０４３８４７４（Ｂ１）号、Ｌｏｎｂｅｒｇらの欧州特許第０８１４２５９（Ａ２）号、Ｌｏｎｂｅｒｇらの英国特許第２２７２４４０（Ａ）号、Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６－８５９（１９９４），Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６（４）５７９－５９１（１９９４），Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７：１３－２１（１９９４），Ｍｅｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５：１４６－１５６（１９９７），Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０（２３）：６２８７－６２９５（１９９２），Ｔｕａｉｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０（８）３７２０－３７２４（１９９３）、Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １３（１）：６５－９３（１９９５）、及びＦｉｓｈｗａｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １４（７）：８４５－８５１（１９９６））によって生成することができる。概して、これらのマウスは、機能的に再構成された、又は機能的な再構成を受けることができる少なくとも１つのヒト免疫グロブリン遺伝子座に由来するＤＮＡを含む、少なくとも１つの導入遺伝子を含む。このようなマウスの内因性免疫グロブリン遺伝子座を破壊又は欠失させて、マウスの、内因性遺伝子によりコードされている抗体の産生能を除去することができる。
【0053】
類似のタンパク質又は断片への特異的結合についての抗体のスクリーニングは、ペプチドディスプレイライブラリを使用して首尾よく達成することができる。この方法は、望ましい機能又は構造を持つ個々のメンバーについてペプチドの多数の試料採集をスクリーニングすることを伴う。ペプチドディスプレイライブラリの抗体スクリーニングは、当該技術分野において周知である。ディスプレイされたペプチド配列の長さは、３～５０００個又はそれ以上のアミノ酸であり、頻繁には５～１００個のアミノ酸長、多くは約８～２５個のアミノ酸長であることができる。ペプチドライブラリを作成する直接化学合成法に加えて、いくつかの組換えＤＮＡ方法も記述されている。１つのタイプは、バクテリオファージ又は細胞の表面上でのペプチド配列のディスプレイを含む。各バクテリオファージ又は細胞は、特定のディスプレイされたペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を含有する。このような方法は、国際出願第９１／１７２７１号、同第９１／１８９８０号、同第９１／１９８１８号、及び同第９３／０８２７８号に記載されている。ペプチドライブラリを作成するためのその他のシステムは、インビトロでの化学合成法及び組換え法の両方の態様を有する。国際出願第９２／０５２５８号、同第９２／１４８４３号、及び同第９６／１９２５６号を参照されたい。米国特許第５，６５８，７５４号及び同第５，６４３，７６８号も参照されたい。ペプチドディスプレイライブラリ、ベクタ、及びスクリーニングキットは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）及びＣａｍｂｒｉｄｇｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅｓｈｉｒｅ，ＵＫ）のような供給元から市販されている。例えば、Ｅｎｚｏｎに譲渡された米国特許第４７０４６９２号、同第４９３９６６６号、同第４９４６７７８号、同第５２６０２０３号、同第５４５５０３０号、同第５５１８８８９号、同第５５３４６２１号、同第５６５６７３０号、同第５７６３７３３号、同第５７６７２６０号、同第５８５６４５６号、Ｄｙａｘに譲渡された米国特許第５２２３４０９号、同第５４０３４８４号、同第５５７１６９８号、同第５８３７５００号、Ａｆｆｙｍａｘに譲渡された米国特許第５４２７９０８号、同第５５８０７１７号、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓに譲渡された米国特許第５８８５７９３号、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈに譲渡された米国特許第５７５０３７３号、Ｘｏｍａに譲渡された米国特許第５６１８９２０号、同第５５９５８９８号、同第５５７６１９５号、同第５６９８４３５号、同第５６９３４９３号、同第５６９８４１７号、上記のＣｏｌｌｉｇａｎ、上記のＡｕｓｕｂｅｌ、又は上記のＳａｍｂｒｏｏｋを参照されたい。上記特許及び刊行物の各々は、参照により全体が本明細書に組み込まれる。
【0054】
本発明の抗体は又、かかる抗体を乳中に産生するヤギ、ウシ、ウマ、ヒツジなどのトランスジェニック動物又は哺乳動物を提供するために、核酸をコードする少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体を使用して調製することもできる。このような動物は、周知の方法を使用して準備することができる。例えば、これらに限定されないが、米国特許第５，８２７，６９０号、同第５，８４９，９９２号、同第４，８７３，３１６号、同第５，８４９，９９２号、同第５，９９４，６１６号、同第５，５６５，３６２号、同第５，３０４，４８９号などを参照されたい（それらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【0055】
本発明の抗体は、植物部分又はそれから培養された細胞において、かかる抗体、特定された部分又は変異体を産生するトランスジェニック植物及び培養された植物細胞（例えば、タバコ及びトウモロコシであるが、これらに限定されない）を提供するために、少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体コード核酸を使用して更に調製することができる。非限定的な例として、例えば、誘導プロモータを用い、組換えタンパク質を発現するトランスジェニックタバコ葉をうまく使用して、大量の組換えタンパク質が提供されてきた。例えば、Ｃｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４０：９５～１１８（１９９９）及びその中で引用される文献を参照されたい。又、トランスジェニックトウモロコシは、その他の組換え系において生成されるタンパク質又は天然資源から精製されるタンパク質に等しい生物学的活性を有する哺乳動物タンパク質を、商業生成レベルで発現するために使用されてきた。例えば、Ｈｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．」第４６４：１２７～１４７（１９９９）及びその中で引用される文献を参照のこと。抗体は、タバコ種子及びポテト塊茎を含む、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）などの抗体断片を含むトランスジェニック植物種子からも大量に産生されてきた。例えば、Ｃｏｎｒａｄら、「Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．」３８：１０１～１０９（１９９８）及びその中で引用される文献を参照のこと。したがって、本発明の抗体は、既知の方法により、トランスジェニック植物を使用して産生することもできる。例えば、Ｆｉｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３０：９９－１０８（Ｏｃｔ．，１９９９）、Ｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３：５２２－７（１９９５）、Ｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０９：３４１－６（１９９５）、Ｗｈｉｔｅｌａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．２２：９４０－９４４（１９９４）、及びこれらの中で引用される文献も参照されたい。又、限定されないが、一般に抗体の植物発現についても参照のこと。上記文献の各々は、参照により全体が本明細書に組み込まれる。
【0056】
本発明の抗体は、広範囲にわたる親和性（ＫＤ）でヒトＴＮＦに結合することができる。好ましい実施形態では、本発明の少なくとも１つのヒトｍＡｂは、任意選択的にヒトＴＮＦに高い親和性で結合することができる。例えば、ヒトｍＡｂは、ヒトＴＮＦを約１０－７Ｍ以下、例えば０．１～９．９（又はその中の任意の範囲若しくは値）Ｘ１０－７、１０－８、１０－９、１０－１０、１０－１１、１０－１２、１０－１３又はその中の任意の範囲若しくは値など（ただしこれらに限定されない）のＫＤで結合することができる。
【0057】
抗原に対する抗体の親和性又は結合活性は、任意の好適な方法を用いて実験により求めることができる。（例えば、Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ，ｅｔ ａｌ．，「Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ａｎｔｉｇｅｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，」Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，Ｅｄ．，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９８４）、Ｋｕｂｙ，Ｊａｎｉｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９９２）、及び本明細書に記載される方法を参照されたい）。特定の抗体抗原相互作用について測定される親和性は、異なる条件（例えば、塩濃度、ｐＨ）下で測定された場合に異なることができる。したがって、親和性及び他の抗原結合パラメータ（例えば、ＫＤ、Ｋａ、Ｋｄ）の測定は、好ましくは、抗体及び抗原の標準化溶液、及び本明細書で記載される緩衝剤などの標準化緩衝剤を用いて行われる。
【0058】
核酸分子。配列番号１、２、３、４、５、６、７、８のうちの少なくとも１つの隣接アミノ酸の少なくとも７０～１００％をコードするヌクレオチド配列、特定された断片、変異体若しくはそれらのコンセンサス配列、又はこれらの配列のうちの少なくとも１つを含む寄託ベクタなどの本明細書に提供される情報を使用して、配列番号１、２及び３の重鎖可変ＣＤＲ領域の全て並びに／又は配列番号４、５及び６の軽鎖可変ＣＤＲ領域の全てを含む少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体をコードする本発明の核酸分子は、本明細書に記載される又は当該技術分において既知の方法を使用して得ることができる。
【0059】
本発明の核酸分子は、ｍＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｔＲＮＡ若しくは任意の他の形態のようなＲＮＡの形態、又はクローニングにより得られる若しくは合成的に産生されるｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡが挙げられるがこれらに限定されないＤＮＡの形態、又はこれらの任意の組合せであってもよい。ＤＮＡは、３本鎖、２本鎖若しくは１本鎖、又はこれらの任意の組合せであってもよい。ＤＮＡ又はＲＮＡの少なくとも１本の鎖の任意の部分は、センス鎖としても知られるコード鎖であってもよいし、又はアンチセンス鎖と呼ばれる、非コード鎖であってもよい。
【0060】
本発明の単離された核酸分子は、任意選択的に１つ又は２つ以上のイントロンを有するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、例えば、これらに限定されないが、少なくとも１つの重鎖（例えば、配列番号１～３）若しくは軽鎖（例えば、配列番号４～６）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び／又はＣＤＲ３のような、少なくとも１つのＣＤＲの少なくとも１つの特定された部分を含む核酸分子、抗ＴＮＦ抗体若しくは可変領域のコード配列（例えば、配列番号７、８）を含む核酸分子、並びに上述の核酸分子とは実質的に異なるが、遺伝子コードの縮重により、本明細書に記載されかつ／又は当該技術分野において既知である少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体を尚もコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含み得る。当然のことながら、遺伝子コードは、技術分野において周知である。したがって、当業者には、本発明の特定の抗ＴＮＦ抗体をコードする、かかる縮重核酸変異体を生成することは、日常的であろう。例えば、上記のＡｕｓｕｂｅｌらを参照されたい。このような核酸変異体は、本発明に含まれる。本発明の単離核酸分子の非限定的な例としては、それぞれ、ＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２、ＨＣ ＣＤＲ３、ＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２、ＬＣ ＣＤＲ３、のＨＣ可変領域及びＬＣ可変領域をコードする核酸の非限定的な例に対応する、配列番号１０、１１、１２、１３、１４、１５が挙げられる。
【0061】
本明細書に示されるように、抗ＴＮＦ抗体をコードする核酸を含む本発明の核酸分子としてとしては、それ自体で抗体断片のアミノ酸配列をコードするもの、抗体の全長若しくは抗体の一部をコードする配列、抗体、断片若しくは部分のコード配列、並びに追加の配列、例えば、少なくとも１つのイントロンなど、前述の追加のコード配列を伴って、又は伴わずに、非コード５’及び３’配列、例えば、スプライシング及びポリアデニル化シグナル（例えば、ｍＲＮＡのリボソーム結合及び安定性）を含む、転写、ｍＲＮＡプロセシングにおいて役割を果たす転写された非翻訳配列を含むがこれに限定されない追加の非コード配列と共に、少なくとも１つのシグナルリーダ若しくは融合ペプチドのコード配列、追加のアミノ酸、例えば、追加の機能を提供するアミノ酸をコードする追加のコード配列を挙げることができるが、これらに限定されない。したがって、抗体をコードする配列はマーカ配列に融合させることができ、例えば、マーカ配列は、これを融合させた抗体断片又は部分を含む抗体の精製を促進するペプチドをコードする配列である。
【0062】
本明細書に記載されるポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイズするポリヌクレオチド。本発明は、本明細書で開示されるポリヌクレオチドに対して、選択的なハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする単離核酸を提供する。したがって、本実施形態のポリヌクレオチドは、かかるポリヌクレオチドを含む核酸を単離、検出、及び／又は定量するために使用することができる。例えば、本発明のポリヌクレオチドを使用して、寄託されたライブラリにおける部分長又は完全長クローンを同定、単離、又は増幅することができる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、単離された、又はそうでなければヒト若しくは哺乳動物の核酸ライブラリのｃＤＮＡに相補的な、ゲノム配列又はｃＤＮＡ配列である。
【0063】
好ましくは、ｃＤＮＡライブラリは、完全長配列の少なくとも８０％、好ましくは完全長配列の少なくとも８５％又は９０％、及びより好ましくは完全長配列の少なくとも９５％を含む。このｃＤＮＡライブラリは、稀な配列の発現量を増大させるよう正規化することができる。相補配列に対する配列同一性が低い配列を使用する、低又は中ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件が典型的なものであるが、これに限定されない。同一性がより高い配列には、任意選択で、中及び高ストリンジェンシーの条件を使用することができる。低ストリンジェンシー条件は、約７０％の配列同一性をもつ配列の選択的ハイブリダイゼーションを可能にし、オーソロガス又はパラロガス配列を特定同定するために利用できる。
【0064】
任意選択的に、本発明のポリヌクレオチドは、本明細書に記載されているポリヌクレオチドによってコード化される抗体の少なくとも一部をコードすることになる。本発明のポリヌクレオチドは、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドに対する選択的ハイブリダイゼーションのために利用可能な核酸配列を包含する。例えば、各々全体が参照により本明細書に組み込まれる、上記のＡｕｓｕｂｅｌ、上記のＣｏｌｌｉｇａｎを参照されたい。
【0065】
核酸の構築。本発明の単離核酸は、当該技術分野にて周知のように、（ａ）組換え方法、（ｂ）合成技術、（ｃ）精製技術、又はこれらの組合せを使用して作製することができる。
【0066】
核酸には、本発明のポリヌクレオチドに加えて、都合よく配列を含ませることができる。例えば、１つ又は２つ以上のエンドヌクレアーゼ制限部位を含むマルチクローニングサイトを核酸に挿入して、ポリヌクレオチドの単離に役立てることができる。又、翻訳可能な配列を挿入して、本発明の翻訳されたポリヌクレオチドの単離に役立てることができる。例えば、ヘキサヒスチジンマーカー配列は、本発明のタンパク質を精製するのに便利な手段を提供する。本発明の核酸（コード配列を除く）は、任意選択的に、本発明のポリヌクレオチドのクローニング及び／又は発現のためのベクタ、アダプタ又はリンカである。
【0067】
かかるクローニング配列及び／又は発現配列に追加の配列を付加して、クローニング及び／又は発現におけるそれらの機能を最適化すること、ポリヌクレオチドの単離に役立てること、又は細胞へのポリヌクレオチドの導入を改善することができる。クローン化ベクタ、発現ベクタ、アダプタ、及びリンカの使用は、技術分野において周知である。（例えば、上記のＡｕｓｕｂｅｌ、又は上記のＳａｍｂｒｏｏｋを参照のこと）。
【0068】
核酸を構築するための組換え方法。ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、又はこれらの任意の組合せのような本発明の単離核酸組成物は、当業者に既知の任意の数のクローニング手順を用いて生物源から得ることができる。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下で選択的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブが、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡライブラリ内の望ましい配列の同定に使用される。ＲＮＡの単離、並びにｃＤＮＡ及びゲノムライブラリの構築は、当業者には周知である。（例えば、上記のＡｕｓｕｂｅｌ、又は上記のＳａｍｂｒｏｏｋを参照のこと）。
【0069】
核酸のスクリーニング及び単離方法。本明細書で開示されているような、本発明のポリヌクレオチドの配列に基づいたプローブを用いて、ｃＤＮＡ又はゲノムライブラリをスクリーニングすることができる。プローブを使用して、ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡ配列にハイブリダイズさせて、同じ又は異なる生体の相同遺伝子を単離することができる。当業者であれば、アッセイに様々な度合のハイブリダイゼーションストリンジェンシーを用いることができ、ハイブリダイゼーション又は洗浄媒質のいずれかをストリンジェントなものにできることを理解する。ハイブリダイゼーション条件がストリンジェントになるほど、二重鎖の形成が生じる際のプローブと標的との間の相補性の度合が大きくなるはずである。ストリンジェンシーの程度は、温度、イオン強度、ｐＨ、及びホルムアミドのような部分的に変性する溶媒の存在、のうちの１つ又は２つ以上によって制御され得る。例えば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、例えば、０％～５０％の範囲内でのホルムアミド濃度の操作により反応溶液の極性を変えることにより首尾よく変更される。検出可能な結合に必要とされる相補性（配列同一性）の程度は、ハイブリダイゼーション媒質及び／又は洗浄媒質のストリンジェンシーによって異なる。相補性の程度は、最適には１００％、又は７０～１００％、又はその中の任意の範囲若しくは値である。しかしながら、プローブ及びプライマ中の配列のわずかな違いは、ハイブリダイゼーション及び／又は洗浄媒質のストリンジェンシーを低減させることで埋め合わせることができることを理解すべきである。
【0070】
ＲＮＡ又はＤＮＡの増幅方法は技術分野において周知であり、本明細書で紹介する教示及び指針に基づいて、過度の実験無しに、本発明に従って使用可能である。
【0071】
ＤＮＡ又はＲＮＡ増幅の既知の方法としては、ポリメラーゼ連鎖反応（polymerase chain reaction、ＰＣＲ）及び関連する増幅プロセス（例えば、Ｍｕｌｌｉｓらの米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号、同第４，８００，１５９号、同第４，９６５，１８８号、Ｔａｂｏｒらの米国特許第４，７９５，６９９号及び同第４，９２１，７９４号、Ｉｎｎｉｓの米国特許第５，１４２，０３３号、Ｗｉｌｓｏｎらの米国特許第５，１２２，４６４号、Ｉｎｎｉｓの米国特許第５，０９１，３１０号、Ｇｙｌｌｅｎｓｔｅｎらの米国特許第５，０６６，５８４号、Ｇｅｌｆａｎｄらの米国特許第４，８８９，８１８号、Ｓｉｌｖｅｒらの米国特許第４，９９４，３７０号、Ｂｉｓｗａｓの米国特許第４，７６６，０６７号、Ｒｉｎｇｏｌｄの米国特許第４，６５６，１３４号を参照されたい）、及び二本鎖ＤＮＡ合成のためのテンプレートとして標的配列に対してアンチセンスＲＮＡを使用するＲＮＡ介在増幅（Ｍａｌｅｋらの米国特許第５，１３０，２３８号、商標名ＮＡＳＢＡを持つ）が挙げられるが、これらに限定されない（これらの文献の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる）。（例えば、上記のＡｕｓｕｂｅｌ、又は上記のＳａｍｂｒｏｏｋを参照されたい。）
【0072】
例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を用いて、ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリから直接、本発明のポリヌクレオチド及び関連する遺伝子の配列を増幅することができる。ＰＣＲ及び他のインビトロ増幅方法は又、例えば、発現すべきタンパク質をコードする核酸配列をクローニングすること、試料中の所望のｍＲＮＡの存在を検出するため、核酸の配列決定のため、又は他の目的のためのプローブとして用いる核酸を作製することに関し有用であり得る。インビトロでの増幅方法によって当業者を導くのに充分な技術の例は、上記のＢｅｒｇｅｒ、上記のＳａｍｂｒｏｏｋ、及び上記のＡｕｓｕｂｅｌ、並びにＭｕｌｌｉｓらの米国特許第４，６８３，２０２号（１９８７）、及びＩｎｎｉｓ，ｅｔ ａｌ．，ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）に見られる。ゲノムＰＣＲ増幅用の市販キットは技術分野において既知である。例えば、Ａｄｖａｎｔａｇｅ－ＧＣ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＰＣＲ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を参照されたい。加えて、例えば、Ｔ４遺伝子３２タンパク質（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いて、長いＰＣＲ産物の収率を改善することができる。
【0073】
核酸を構築するための合成方法。本発明の単離核酸は、既知の方法による直接化学合成によっても調製可能である（例えば、上記のＡｕｓｕｂｅｌらを参照）。化学合成は、概して、相補的配列とのハイブリダイゼーションによって、又は１本鎖をテンプレートとして使用するＤＮＡポリメラーゼとの重合によって、２本鎖ＤＮＡに変換可能な１本鎖オリゴヌクレオチドを産生する。当業者であれば、ＤＮＡの化学合成は約１００又はそれ以上の塩基の配列に限定され得るが、より長い配列は、より短い配列のライゲーションによって得ることができることを認識する。
【0074】
組換え発現カセット。本発明は、本発明の核酸を含む組換え発現カセットを更に提供する。本発明の核酸配列、例えば本発明の抗体をコードするｃＤＮＡ又はゲノム配列を用いて、少なくとも１つの所望の宿主細胞に導入できる組換え発現カセットを構築することができる。組換え発現カセットは、典型的には、意図される宿主細胞においてポリヌクレオチドの転写を導く、転写開始調節配列に機能的に連結される、本発明のポリヌクレオチドを含む。異種及び非異種（すなわち、内因性）プロモータの両方を使用して、本発明の核酸の発現を導くことができる。
【0075】
いくつかの実施形態では、プロモータ、エンハンサ、又は他の要素として機能する単離核酸を、本発明のポリヌクレオチドの発現を上方又は下方調節するために、本発明のポリヌクレオチドの非異種形の適切な位置（上流、下流、又はイントロン内）に導入することができる。例えば、変異、欠失、及び／又は置換により、インビボ又はインビトロで内因性プロモータを変化させることができる。
【0076】
ベクタ及び宿主細胞。本発明は、本発明の単離核酸分子を含むベクタ、組換えベクタで遺伝子操作された宿主細胞、及び当該技術分野において周知である組換え技術による少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体の生成にも関する。例えば、各々参照により全体が本明細書に組み込まれる、上記のＳａｍｂｒｏｏｋら、上記のＡｕｓｕｂｅｌらを参照されたい。
【0077】
ポリヌクレオチドは、任意選択で、宿主の増殖についての選択マーカを含有するベクタに結合することができる。概して、プラスミドベクタは、リン酸カルシウム沈殿物のような沈殿物内、又は荷電脂質との複合体内に導入される。ベクタがウイルスである場合は、適切なパッケージング細胞株を用いてインビトロでこれをパッケージングし、その後、宿主細胞内に形質導入することができる。
【0078】
ＤＮＡ挿入物は、適切なプロモータに機能的に連結されるべきである。発現コンストラクトは、転写開始部位、転写終結部位、及び転写された領域内では翻訳のためのリボソーム結合部位を更に含む。構築物により発現される成熟した転写産物のコード部分は、好ましくは、最初に翻訳開始部位を含み、翻訳されるｍＲＮＡの最後に終止コドン（例えば、ＵＡＡ、ＵＧＡ又はＵＡＧ）が適切に位置することになる。哺乳動物又は真核生物の細胞の発現ではＵＡＡ及びＵＡＧが好ましい。
【0079】
発現ベクタは、好ましくは少なくとも１つの選択マーカを含むが、これは任意選択である。かかるマーカは、例えば、真核細胞培養のためのメトトレキサート（ＭＴＸ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ、米国特許第４，３９９，２１６号、同第４，６３４，６６５号、同第４，６５６，１３４号、同第４，９５６，２８８号、同第５，１４９，６３６号、同第５，１７９，０１７号、アンピシリン、ネオマイシン（Ｇ４１８）、マイコフェノール酸又はグルタミンシンセターゼ（ＧＳ）（米国特許第５，１２２，４６４号、同第５，７７０，３５９号、同第５，８２７，７３９号）抵抗性遺伝子、並びにＥ．ｃｏｌｉ及び他の細菌又は原核生物における培養のためのテトラサイクリン又はアンピシリン抵抗性遺伝子を含むが、これらに限定されない（上記特許は、参照により全体が本明細書に組み込まれる）。上記の宿主細胞に対して適切な培養培地及び条件は、技術分野において周知である。好適なベクタは、当業者にとって容易に明白となる。宿主細胞へのベクタコンストラクトの導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストランを介在させたトランスフェクション、カチオン性脂質を介在させたトランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染又は他の周知の方法により達成することができる。このような方法については、上記のＳａｍｂｒｏｏｋ、第１～４章及び第１６～１８章、上記のＡｕｓｕｂｅｌ、第１、９、１３、１５、１６章などの技術分野に記載されている。
【0080】
本発明の少なくとも１つの抗体は、融合タンパク質などの修飾された形態で発現され得、分泌シグナルだけでなく、追加の異種機能領域も含み得る。例えば、追加アミノ酸の領域、特に荷電アミノ酸を抗体のＮ末端に追加して、精製中又は後続の処理及び保存中に、宿主細胞における安定性及び持続性を改善することができる。又、ペプチド部分を本発明の抗体に追加して、精製を促進することもできる。抗体又は少なくとも１つのその断片の最終調製前に、このような領域を除去することができる。このような方法は、上記のＳａｍｂｒｏｏｋ、第１７．２９～１７．４２章及び第１８．１～１８．７４章、上記のＡｕｓｕｂｅｌ、第１６、１７、及び１８章などの多くの標準的な実験室マニュアルに記載されている。
【0081】
当業者であれば、本発明のタンパク質をコードする核酸の発現に利用可能な多数の発現系について精通している。
【0082】
別の方法としては、本発明の核酸は、本発明の抗体をコードする内因性ＤＮＡを含む宿主細胞内で、（操作により）オン切換えすることにより、宿主細胞中で発現させることができる。このような方法は、米国特許第５，５８０，７３４号、同第５，６４１，６７０号、同第５，７３３，７４６号、及び同第５，７３３，７６１号に記載されているように、当該技術分野において周知であり、上記特許は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0083】
抗体、その特定の部分又は変異体の産生に有用な細胞培養物の一例は、哺乳動物細胞である。哺乳動物細胞系は、しばしば細胞からなる単層形態を取るが、哺乳動物細胞の懸濁液又はバイオリアクターも使用可能である。無傷なグリコシル化タンパク質を発現可能ないくつかの好適な宿主細胞株が当該技術分野において開発されており、これにはＣＯＳ－１（例えばＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５０）、ＣＯＳ－７（例えばＡＴＣＣ ＣＲＬ－１６５１）、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ２１（例えばＡＴＣＣ ＣＲＬ－１０）、ＣＨＯ（例えばＡＴＣＣ ＣＲＬ１６１０）及びＢＳＣ－１（例えばＡＴＣＣ ＣＲＬ－２６）細胞株、Ｃｏｓ－７細胞、ＣＨＯ細胞、ｈｅｐ Ｇ２細胞、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３、ＳＰ２／０－Ａｇ１４、２９３細胞、ＨｅＬａ細胞などが挙げられ、これらは例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ）（ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ）から容易に入手できる。好適な宿主細胞には、骨髄腫及びリンパ腫細胞などのリンパ系起源の細胞が挙げられる。特に好ましい宿主細胞は、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ－１５８０）及びＳＰ２／０－Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ－１８５１）である。特に好ましい実施形態では、組換え細胞は、Ｐ３Ｘ６３Ａｂ８．６５３又はＳＰ２／０－Ａｇ１４細胞である。
【0084】
これらの細胞の発現ベクタは、複製起点、プロモータ（例えば、後期又は初期ＳＶ４０プロモータ、ＣＭＶプロモータ（米国特許第５，１６８，０６２号、同第５，３８５，８３９号）、ＨＳＶ ｔｋプロモータ、ｐｇｋ（ホスホグリセレートキナーゼ）プロモータ、ＥＦ－１αプロモータ（米国特許第５，２６６，４９１号）、少なくとも１つのヒト免疫グロブリンプロモータ、エンハンサ、及び／又はリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位（例えば、ＳＶ４０ラージＴ Ａｇポリ付加部位）、並びに転写終結配列などのプロセシング情報部位などであるがこれらに限定されるものではない、発現制御配列のうちの１つ又は２つ以上を含むことができる。例えば、上記のＡｕｓｕｂｅｌら、上記のＳａｍｂｒｏｏｋらを参照されたい。本発明の核酸又はタンパク質の生成に有用なその他の細胞は周知である、並びに／あるいは例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ ａｎｄ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ（ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ）又はその他の周知の供給源若しくは商業的供給源から入手可能である。
【0085】
真核宿主細胞が利用される場合、典型的には、ベクタ内にポリアデニル化又は転写終結配列が組み込まれる。終結配列の一例は、ウシ成長ホルモン遺伝子からのポリアデニル化配列である。転写の正確なスプライシングのための配列も、同様に含むことができる。スプライシング配列の一例は、ＳＶ４０由来のＶＰ１イントロンである（Ｓｐｒａｇｕｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４５：７７３－７８１（１９８３））。加えて、当該技術分野において周知であるように、宿主細胞内の複製を制御するための遺伝子配列をベクタ内に組み込むことができる。
【0086】
抗体の精製。抗ＴＮＦ抗体は、プロテインＡ精製、硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸抽出、アニオン又はカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー及びレクチンクロマトグラフィーが挙げられるがこれらに限定されない周知の方法により、組換え細胞培養物から回収し、精製することができる。高速液体クロマトグラフィー（high performance liquid chromatography、「ＨＰＬＣ」）を精製に利用することもできる。例えば、各々参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｃｏｌｌｉｇａｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ又はＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ，ＮＹ（１９９７－２００１）の、例えば、第１、４、６、８、９、１０章を参照されたい。
【0087】
本発明の抗体には、天然に精製された生成物、化学合成手順の生成物、並びに例えば、酵母、高等植物、昆虫及び哺乳動物細胞を含む、真核宿主から組換え技法により産生された産物が含まれる。組換体産生手順に用いられる宿主に応じて、本発明の抗体は、グリコシル化されてもグリコシル化されなくてもよいが、グリコシル化されるのが好ましい。このような方法は、上記のＳａｍｂｒｏｏｋ、セクション１７．３７－１７．４２、上記のＡｕｓｕｂｅｌ、第１０、１２、１３、１６、１８、及び２０章、上記のＣｏｌｌｉｇａｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、第１２～１４章などの多くの標準的な実験室マニュアルに記載されており、全て参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0088】
抗ＴＮＦ抗体
本発明の単離された抗体であって、配列番号１、２及び３の重鎖可変ＣＤＲ領域の全て並びに／又は配列番号４、５及び６の軽鎖可変ＣＤＲ領域の全てを含む本発明の単離された抗体は、任意の好適なポリヌクレオチドによってコードされる本明細書で開示される抗体のアミノ酸配列、又は任意の単離又は調製された抗体を含む、単離された抗体。好ましくは、ヒト抗体又は抗原結合断片は、ヒトＴＮＦに結合し、それにより、タンパク質の少なくとも１つの生物学的活性を部分的又は実質的に中和する。少なくとも１つのＴＮＦタンパク質又は断片の少なくとも１つの生物学的活性を部分的に又は好ましくは実質的に中和する抗体又はその特定された部分若しくは変異体は、タンパク質又は断片に結合し、それによりＴＮＦのＴＮＦ受容体への結合を通して、又は他のＴＮＦ依存性若しくは介在性機序を通して介在される活性を阻害することができる。本明細書で使用するとき、「中和抗体」という用語は、アッセイに応じて約２０～１２０％、好ましくは少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％又はそれ以上、ＴＮＦ依存性活性を阻害することができる抗体を指す。ＴＮＦ依存性活性を阻害する抗ＴＮＦ抗体の能力は、好ましくは、本明細書に記載され、かつ／又は当該技術分野において既知の、少なくとも１つの好適なＴＮＦタンパク質又は受容体アッセイによって評価される。本発明のヒト抗体は、任意のクラス（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤなど）又はアイソタイプのものであってもよく、κ又はλ軽鎖を含み得る。一実施形態では、ヒト抗体は、ＩｇＧ重鎖又は規定された断片、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のうちの少なくとも１つのアイソタイプを含む。このタイプの抗体は、本明細書に記載されかつ／又は当該技術分野において既知の、少なくとも１つのヒト軽鎖（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ）及びＩｇＭ（例えば、γ１、γ２、γ３、γ４）導入遺伝子を含む、トランスジェニックマウス又は他のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を用いることによって調製することができる。別の実施形態では、抗ヒトＴＮＦヒト抗体は、ＩｇＧ１重鎖及びＩｇＧ１軽鎖を含む。
本発明の単離された抗体であって、配列番号１、２及び３の重鎖可変ＣＤＲ領域の全て並びに／又は配列番号４、５及び６の軽鎖可変ＣＤＲ領域の全てを含む本発明の単離された抗体は、任意の好適なポリヌクレオチドによってコードされる本明細書で開示される抗体のアミノ酸配列、又は任意の単離又は調製された抗体を含む、単離された抗体。好ましくは、ヒト抗体又は抗原結合断片は、ヒトＴＮＦに結合し、それにより、タンパク質の少なくとも１つの生物学的活性を部分的又は実質的に中和する。少なくとも１つのＴＮＦタンパク質又は断片の少なくとも１つの生物学的活性を部分的に又は好ましくは実質的に中和する抗体又はその特定された部分若しくは変異体は、タンパク質又は断片に結合し、それによりＴＮＦのＴＮＦ受容体への結合を通して、又は他のＴＮＦ依存性若しくは介在性機序を通して介在される活性を阻害することができる。本明細書で使用するとき、「中和抗体」という用語は、アッセイに応じて約２０～１２０％、好ましくは少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％又はそれ以上、ＴＮＦ依存性活性を阻害することができる抗体を指す。ＴＮＦ依存性活性を阻害する抗ＴＮＦ抗体の能力は、好ましくは、本明細書に記載され、かつ／又は当該技術分野において既知の、少なくとも１つの好適なＴＮＦタンパク質又は受容体アッセイによって評価される。本発明のヒト抗体は、任意のクラス（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤなど）又はアイソタイプのものであってもよく、κ又はλ軽鎖を含み得る。一実施形態では、ヒト抗体は、ＩｇＧ重鎖又は規定された断片、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のうちの少なくとも１つのアイソタイプを含む。このタイプの抗体は、本明細書に記載されかつ／又は当該技術分野において既知の、少なくとも１つのヒト軽鎖（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ）及びＩｇＭ（例えば、γ１、γ２、γ３、γ４）導入遺伝子を含む、トランスジェニックマウス又は他のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を用いることによって調製することができる。別の実施形態では、抗ヒトＴＮＦヒト抗体は、ＩｇＧ１重鎖及びＩｇＧ１軽鎖を含む。
【0089】
本明細書で使用するとき、「抗体」又は「複数の抗体」という用語は、２００９年のバイオロジクス価格競争・イノベーション法（ＢＰＣＩ Ａｃｔ）並びに同様の世界的な法律及び規則で承認されたバイオシミラ抗体分子を含む。ＢＰＣＩ Ａｃｔの下で、抗体は、臨床的に不活性な構成成分のわずかな違いにも関わらず、基準品と「非常に類似」しており、安全性、純度、効力の点で基準品と同等の臨床結果が得られると「予想される」ことをデータが示す場合、バイオシミラであることが実証され得る（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｐｒａｃｔｉｃｅ：２０１８年２月、第２４巻第２号第１９５～２０４頁）。これらのバイオシミラ抗体分子は、短縮された承認経路を提供し、それにより、出願人は、法的な承認を確保するために、イノベータの基準品の臨床データに依存している。臨床試験の成功に基づいてＦＤＡに承認されたオリジナルのイノベータ基準抗体と比較して、バイオシミラ抗体分子は、本明細書では、「バイオ後続品」と呼ばれる。本明細書に提示されるように、ＳＩＭＰＯＮＩ（登録商標）（ゴリムマブ）は、臨床試験の成功に基づいてＦＤＡに承認されたオリジナルのイノベータ参照抗ＴＮＦ抗体である。ゴリムマブは、２００９年から米国で販売されている。
【0090】
本発明の少なくとも１つの抗体は、少なくとも１つのＴＮＦタンパク質、サブユニット、断片、部分、又はそれらの任意の組合せに特異的な少なくとも１つの特定のエピトープに結合する。この少なくとも１つのエピトープは、このタンパク質の少なくとも一部を含む少なくとも１つの抗体結合領域を含むことができ、このエピトープは、好ましくは、このタンパク質の少なくとも１つの細胞外部分、可溶性部分、親水性部分、外部部分、又は細胞質顆粒部分から構成されている。少なくとも１つの特定されたエピトープは、配列番号９の隣接アミノ酸の特定された部分全体に対する少なくとも１～３個のアミノ酸の少なくとも１つのアミノ酸配列の任意の組合せを含むことができる。
【0091】
一般に、本発明のヒト抗体又は抗原結合断片は、少なくとも１つのヒト相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）又は少なくとも１つの重鎖可変領域の変異体、及び少なくとも１つのヒト相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）又は少なくとも１つの軽鎖可変領域の変異体を含む抗原結合領域を含む。非限定的な例として、抗体又は抗原結合部分若しくは変異体は、配列番号３のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３及び／又は配列番号６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３のうちの少なくとも１つを含み得る。特定の実施形態では、抗体又は抗原結合断片は、対応するＣＤＲ１、２及び／又は３のアミノ酸配列（例えば、配列番号１、２及び／又は３）を有する少なくとも１つの重鎖ＣＤＲ（すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３）の少なくとも一部を含む抗原結合領域を有することができる。別の特定の実施形態では、抗体又は抗原結合部分若しくは変異体は、対応するＣＤＲ１、２及び／又は３のアミノ酸配列（例えば、配列番号４、５、及び／又は６）を有する少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲ（すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３）の少なくとも一部を含む抗原結合領域を有することができる。好ましい実施形態では、抗体又は抗原結合断片の３つの重鎖ＣＤＲ及び３つの軽鎖ＣＤＲは、本明細書に記載される、ｍＡｂ ＴＮＶ１４８、ＴＮＶ１４、ＴＮＶ１５、ＴＮＶ１９６、ＴＮＶ１１８、ＴＮＶ３２、及びＴＮＶ８６のうちの少なくとも１つの対応するＣＤＲのアミノ酸配列を有する。このような抗体は、組換えＤＮＡ技術に関する従来技術を使用して抗体をコードする（すなわち、１つ又は２つ以上の）核酸分子を調製して発現させることによって、又は任意のその他の好適な方法を使用することによって、従来技術を使用して抗体の種々の部分（例えば、ＣＤＲ、フレームワーク）を一緒に化学的に結合させることにより調製できる。
【0092】
抗ＴＮＦ抗体は、規定されたアミノ酸配列を有する重鎖又は軽鎖可変領域のうちの少なくとも１つを含むことができる。例えば、好ましい実施形態では、抗ＴＮＦ抗体は、任意選択的に配列番号７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域及び／又は任意選択的に配列番号８のアミノ酸配列を有する少なくとも１つの軽鎖可変領域のうちの少なくとも１つを含む。ヒトＴＮＦに結合し、規定された重鎖又は軽鎖可変領域を含む抗体は、好適な方法、例えば、当該技術分野において既知でありかつ／又は本明細書に記載される、ファージディスプレイ（Ｋａｔｓｕｂｅ，Ｙ．ら、「Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ」１（５）：８６３－８６８（１９９８））又はトランスジェニック動物を採用する方法など、好適な方法を使用して調製することができる。例えば、機能的に再配列されたヒト免疫グロブリン重鎖導入遺伝子と、機能的な再配列を受けることが可能なヒト免疫グロブリン軽鎖遺伝子座からのＤＮＡを含む導入遺伝子と、を含むトランスジェニックマウスを、ヒトＴＮＦ又はその断片で免疫して抗体の生成を誘発することができる。所望する場合、抗体産生細胞を単離することができ、本明細書に記載されるように、かつ／又は技術分野において周知であるように、ハイブリドーマ又はその他の不死化させた抗体産生細胞を調製することができる。あるいは、抗体、特定の部分又は変異体は、好適な宿主細胞内で、コード核酸又はその一部分を使用して発現させることができる。
【0093】
本発明は又、本明細書に記載されるアミノ酸配列と実質的に同じである配列中のアミノ酸を含む抗体、抗原結合断片、免疫グロブリン鎖及びＣＤＲに関する。好ましくは、かかる抗体又は抗原結合断片及びかかる鎖若しくはＣＤＲを含む抗体は、高い親和性（例えば、ＫＤが約１０－９Ｍ以下）で、ヒトＴＮＦに結合することができる。本明細書に記載されている配列と実質的に同じであるアミノ酸配列としては、保存的アミノ酸置換並びにアミノ酸欠失及び／又は挿入を含む配列が挙げられる。保存的アミノ酸置換は、第１のアミノ酸を、第１のアミノ酸のものに類似する化学的及び／又は物理的特性（例えば、電荷、構造、極性、疎水性／親水性）を有する第２のアミノ酸で置換することを指す。保存的置換は、１個のアミノ酸を、以下の群内の別のアミノ酸で置き換えることを含む：リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）及びヒスチジン（Ｈ）；アスパラギン酸塩（Ｄ）及びグルタミン酸塩（Ｅ）；アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、チロシン（Ｙ）、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｄ、及びＥ；アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、プロリン（Ｐ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、メチオニン（Ｍ）、システイン（Ｃ）、及びグリシン（Ｇ）；Ｆ、Ｗ、及びＹ；Ｃ、Ｓ、及びＴ。
【0094】
アミノ酸コード。本発明の抗ＴＮＦ抗体を構成するアミノ酸は、略されることが多い。アミノ酸表記は、その１文字コード、その３文字コード、名称、又は３つのヌクレオチドコドン（複数可）によりアミノ酸を表記することにより示すことができ、当該技術分野においてよく理解されている（Ａｌｂｅｒｔｓ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｔｈｅ Ｃｅｌｌ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄ．，Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９４を参照のこと）。
【0095】
【表1】
【0096】
本発明の抗ＴＮＦ抗体は、本明細書で特定されるように、自然変異又はヒトによる操作のいずれかによる、１つ又は２つ以上のアミノ酸の置換、欠失、又は付加を含み得る。
【0097】
当然のことながら、当業者が行い得るアミノ酸置換の数は、上述のものを含む数多くの要因に依存する。概して、任意の所与の抗ＴＮＦ抗体、断片又は変異体についてのアミノ酸置換、挿入、又は欠失の数は、本明細書で特定されるように、４０、３０、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、例えば、１～３０、又はこの中の任意の範囲若しくは値を超えない。
【0098】
機能上不可欠である本発明の抗ＴＮＦ抗体内のアミノ酸は、部位特異的変異誘発又はアラニンスキャニング変異誘発などの、当該技術分野において既知の方法により特定することができる（例えば、上記のＡｕｓｕｂｅｌ、第８，１５章；Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ及びＷｅｌｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１－１０８５（１９８９））。後者の手順では、分子内の残基ごとに単個のアラニンによる変異を導入する。次いで、結果として得られたミュータント分子は、例えば、少なくとも１つのＴＮＦ中和活性などがあるがこれに限定されない生物学的活性について試験される。抗体結合にとってきわめて重要である部位も、結晶化、核磁気共鳴又は光親和性標識などの構造分析によって特定することができる（Ｓｍｉｔｈら、「Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．」２２４：８９９～９０４（１９９２）及びｄｅ Ｖｏｓら、「Ｓｃｉｅｎｃｅ」２５５：３０６～３１２（１９９２））。
【0099】
本発明の抗ＴＮＦ抗体は、配列番号１、２、３、４、５、６のうちの少なくとも１つの隣接アミノ酸のうちの１個～全てから選択された、少なくとも１つの部分、配列又は組合せを含むことができるが、これらに限定されない。
【0100】
抗ＴＮＦ抗体は更に、任意選択的に、配列番号７、８のうちの少なくとも１つの、隣接アミノ酸の７０～１００％の少なくとも１つのポリペプチドを含み得る。
【0101】
一実施形態では、免疫グロブリン鎖又はその一部分（例えば、可変領域、ＣＤＲ）のアミノ酸配列は、配列番号７、８のうちの少なくとも１つの対応する鎖のアミノ酸配列と、約７０～１００％の同一性（例えば、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、又はこの中の任意の範囲若しくは値）を有する。例えば、軽鎖可変領域のアミノ酸配列を、配列番号８の配列と比較することができ、又は重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列を配列番号７と比較することができる。好ましくは、７０～１００％のアミノ酸同一性（すなわち、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、又はこの中の任意の範囲若しくは値）は、当該技術分野において周知であるように、好適なコンピュータアルゴリズムを使用して決定される。
【0102】
例示的な重鎖及び軽鎖可変領域の配列は、配列番号７、８に示されている。本発明の抗体又はその特定された変異体は、本発明の抗体から任意の数の隣接アミノ酸残基を含み得、その数は、抗ＴＮＦ抗体における隣接残基数の１０～１００％からなる整数の群から選択される。任意選択的に、隣接アミノ酸のこの部分配列は、少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０又はそれ以上のアミノ酸長、又はその中の任意の範囲若しくは値である。更に、このような部分配列の数は、少なくとも２、３、４、又は５などの、１～２０からなる群から選択される任意の整数であることができる。
【0103】
当業者が認識しているように、本発明には、本発明の少なくとも１つの生物学的活性抗体が含まれている。生物学的活性抗体は、天然（非合成）、内因性又は関連する及び既知の抗体のものの、少なくとも２０％、３０％又は４０％、及び好ましくは少なくとも５０％、６０％又は７０％、及び最も好ましくは少なくとも８０％、９０％又は９５％～１０００％の比活性を有する。酵素活性及び基質特異性のアッセイ及び定量化測定の方法は、当業者には周知である。
【0104】
別の態様では、本発明は、有機部分の共有結合により修飾される、本明細書に記載されるヒト抗体及び抗原結合断片に関する。かかる修飾は、改善された薬物動態特性（例えば、増大したインビボでの血清半減期）を有する抗体又は抗原結合断片を産生することができる。有機部分は、直鎖又は分枝鎖親水性ポリマー基、脂肪酸基、又は脂肪酸エステル基であることができる。特定の実施形態では、親水性ポリマー基は、分子量が約８００～約１２０，０００ダルトンであって、ポリアルカングリコール（例えば、ポリエチレングリコール（polyethylene glycol、ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール（polypropylene glycol、ＰＰＧ））、炭水化物ポリマー、アミノ酸ポリマー又はポリビニルピロリドンであり得、脂肪酸基又は脂肪酸エステル基は、約８～約４０個の炭素原子を含むことができる。
【0105】
本発明の修飾された抗体及び抗原結合断片は、直接的又は間接的に抗体に共有結合される、１つ又は２つ以上の有機部分を含み得る。本発明の抗体又は抗原結合断片に結合される各有機部分は、独立して、親水性ポリマー基、脂肪酸基、又は脂肪酸エステル基であることができる。本明細書で使用する場合、「脂肪酸」という用語は、モノカルボン酸及びジカルボン酸を包含する。本明細書で使用する場合、「親水性ポリマー基」という用語は、オクタンよりも水に対する溶解度が高い有機ポリマーを意味する。例えば、ポリリシンは、オクタンよりも水に対する溶解度が高い。よって、ポリリシンの共有結合により修飾された抗体は、本発明に包含される。本発明の抗体を修飾するのに好適な親水性ポリマーは、直線状又は分岐状であることができ、例えば、ポリアルカングリコール（例えば、ＰＥＧ、モノメトキシ－ポリエチレングリコール（monomethoxy-polyethylene glycol、ｍＰＥＧ）、ＰＰＧなど）、炭水化物（例えば、デキストラン、セルロース、オリゴ糖、多糖など）、親水性アミノ酸のポリマー（例えば、ポリリシン、ポリアルギニン、ポリアスパラギン酸など）、ポリアルカンオキシド（例えば、ポリエチレンオキシド、ポリプロピレンオキシドなど）、及びポリビニルピロリドンを含む。好ましくは、本発明の抗体を修飾する親水性ポリマーは、個別の分子体として、約８００～約１５０，０００ダルトンの分子量を有する。例えば、ＰＥＧ５０００及びＰＥＧ２０，０００を使用することができ、下付き文字は、ポリマーの平均分子量（ダルトン）である。親水性ポリマー基は、１～約６個のアルキル基、脂肪酸基又は脂肪酸エステル基で置換することができる。脂肪酸又は脂肪酸エステル基で置換される親水性ポリマー類は、好適な方法を利用することによって調製することができる。例えば、アミン基を含むポリマーを、脂肪酸又は脂肪酸エステルのカルボン酸塩に連結させることができ、脂肪酸又は脂肪酸エステル上の活性化カルボン酸塩（例えば、Ｎ，Ｎ－カルボニルジイミダゾールで活性化されている）をポリマー上のヒドロキシル基に連結させることができる。
【0106】
本発明の抗体を修飾するために好適な脂肪酸及び脂肪酸エステルは、飽和されてもよいし、又は１つ若しくは２つ以上の不飽和単位を含有していてもよい。本発明の抗体を修飾するのに好適な脂肪酸としては、例えば、ｎ－ドデカン酸塩（Ｃ１２、ラウリン酸塩）、ｎ－テトラデカン酸塩（Ｃ１４、ミリスチン酸塩）、ｎ－オクタデカン酸塩（Ｃ１８、ステアリン酸塩）、ｎ－エイコサン酸塩（Ｃ２０、アラキジン酸塩）、ｎ－ドコサン酸塩（Ｃ２２、ベヘン酸）、ｎ－トリアコンタン酸塩（Ｃ３０）、ｎ－テトラコンタン酸塩（Ｃ４０）、シス－Δ９－オクタデカン酸塩（Ｃ１８、オレイン酸塩）、全てのシス－Δ５，８，１１，１４－エイコサテトラエン酸塩（Ｃ２０、アラキドン酸塩）、オクタンジオン酸、テトラデカンジオン酸、オクタデカンジオン酸、ドコサンジオン酸などが挙げられる。好適な脂肪酸エステルは、直鎖又は分枝鎖の低級アルキル基を含む、ジカルボン酸のモノエステルを含む。低級アルキル基は、１～約１２個、好ましくは１～約６個の炭素原子を含み得る。
【0107】
修飾ヒト抗体及び抗原結合断片は、１つ又は２つ以上の修飾剤と反応させることなどによって、好適な方法を使用して調製することができる。本明細書で使用されるとき、「修飾剤」という用語は、活性化基を含む好適な有機基（例えば、親水性ポリマー、脂肪酸、脂肪酸エステル）を意味する。「活性化基」とは、適切な条件下で第２の化学基と反応し、これにより修飾剤と第２の化学基との間に共有結合を形成することのできる、化学部分又は官能基である。例えば、アミン反応性活性化基は、トシル酸塩、メシル酸塩、ハロ（クロロ、ブロモ、フルオロ、ヨード）などの求電子性基、Ｎ－ヒドロキシスクシニミジルエステル（ＮＨＳ）などを含む。チオール類と反応可能な活性化基としては、例えば、マレイミド、ヨードアセチル、アクリロリル、ピリジルジスルフィド、５－チオール－２－ニトロ安息香酸チオール（ＴＮＢ－チオール）などが挙げられる。アルデヒド官能基は、アミン又はヒドラジド含有分子と連結することができ、アジド基は、三価リン基と反応してホスホルアミデート又はホスホルイミド結合を形成することができる。分子中に活性化基を導入するための好適な方法は、当該技術分野において既知である（例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ：Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９６）参照）。活性化基は、有機基（例えば、親水性ポリマー、脂肪酸、脂肪酸エステル）に直接的に、又はリンカ部分、例えば、二価のＣ１～Ｃ１２基（ここで、１つ又は２つ以上の炭素原子は酸素、窒素、又は硫黄などのヘテロ原子で置換され得る）を介して、結合することができる。好適なリンカ部分としては、例えば、テトラエチレングリコール、－（ＣＨ２）３－、－ＮＨ－（ＣＨ２）６－ＮＨ－、－（ＣＨ２）２－ＮＨ－、及び－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ－ＮＨ－が挙げられる。リンカ部分を含む修飾剤は、例えば１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）の存在下で、モノ－Ｂｏｃ－アルキルジアミン（例えば、モノ－Ｂｏｃ－エチレンジアミン、モノ－Ｂｏｃ－ジアミノへキサン）を脂肪酸と反応させることにより、遊離アミンと脂肪酸カルボキシレートとの間のアミド結合を形成することによって産生可能である。Ｂｏｃ保護基を、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）処理により生成物から除去して、記載されているように別のカルボン酸塩に連結し得る一級アミンを露出させることができ、あるいは、これを無水マレイン酸と反応させ、結果として得られた生成物を環化させて脂肪酸の活性化マレイミド誘導体を生成することができる。（例えば、参照により教示の全体が本明細書に組み込まれる、Ｔｈｏｍｐｓｏｎらの国際公開第９２／１６２２１号を参照のこと。）
【0108】
本発明の修飾された抗体は、ヒト抗体又は抗原結合断片を修飾剤と反応させることによって生成することができる。例えば、有機部分は、アミン反応性修飾剤、例えば、ＰＥＧのＮＨＳエステルを利用して、部位特異的なものではない方法で抗体に結合させることができる。抗体又は抗原結合断片のジスルフィド結合（例えば、鎖内ジスルフィド結合）を還元することによって、修飾されたヒト抗体又は抗原結合断片を調製することもできる。このとき、還元された抗体又は抗原結合断片をチオール反応性修飾剤と反応させて、本発明の修飾された抗体を産生することが可能である。本発明の抗体の特定の部位に結合される有機部分を含む修飾されたヒト抗体及び抗原結合断片は、逆タンパク質分解（Ｆｉｓｃｈら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，３：１４７－１５３（１９９２）、Ｗｅｒｌｅｎら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，５：４１１～４１７（１９９４）、Ｋｕｍａｒａｎら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．６（１０）：２２３３－２２４１（１９９７）、Ｉｔｏｈら，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２４（１号）：５９～６８（１９９６）、Ｃａｐｅｌｌａｓら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，５６（４）：４５６～４６３（１９９７））、及びＨｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ：Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９６）に記載される方法などの好適な方法を使用して調製することができる。
【0109】
抗ＴＮＦ抗体組成物に対する抗イディオタイプ抗体。モノクローナル又はキメラ抗ＴＮＦ抗体に加えて、本発明は、本発明のかかる抗体に特異的な抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体にも関する。抗Ｉｄ抗体は、一般に別の抗体の抗原結合領域に関連する固有の決定基を認識する抗体である。抗Ｉｄは、Ｉｄ抗体源と同じ種及び遺伝子型の動物（例えばマウス株）を、抗体又はそのＣＤＲ含有領域により免疫することによって調製することができる。免疫された動物は、免疫する抗体のイディオタイプ決定基を認識かつ応答し、抗Ｉｄ抗体を産生する。抗Ｉｄ抗体は、更に別の動物で免疫応答を誘導する「免疫原」としても使用され得、いわゆる抗－抗Ｉｄ抗体を生成する。
【0110】
抗ＴＮＦ抗体組成物。本発明は又、本明細書に記載され、かつ／又は当該技術分野において既知であるように、非自然発生組成物、混合物、又は形態で提供される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、又はそれ以上のその抗ＴＮＦ抗体を含む、少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体組成物も提供する。かかる組成物は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８の隣接アミノ酸の７０～１００％、又はその特定される断片、ドメイン若しくは変異体からなる群から選択される抗ＴＮＦ抗体のアミノ酸配列の少なくとも１つ又は２つの完全長、Ｃ及び／若しくはＮ末端欠失変異体、ドメイン、断片、又はその特定される変異体を含む非自然発生組成物を含む。好ましい抗ＴＮＦ抗体組成物は、配列番号１、２、３、４、５、６の７０～１００％の抗ＴＮＦ抗体、又はその特定された断片、ドメイン若しくは変異体の、少なくとも１つのＣＤＲ又はＬＢＲ含有部分として少なくとも１つ又は２つの完全長、断片、ドメイン、又は変異体を含む。更に好ましい組成物は、配列番号１、２、３、４、５、６の７０～１００％、又は特定された断片、ドメイン若しくはその変異体のうちの少なくとも１つを４０～９９％含む。このような組成物の百分率は、当該技術分野において既知であるように、又は本明細書に記載されるように、重量、体積、濃度、容量モル濃度、あるいは液体若しくは乾燥溶液、混合物、懸濁液、エマルジョン、又はコロイドとしての重量モル濃度によるものである。
【0111】
本発明の抗ＴＮＦ抗体組成物は、かかる調節、処置又は療法を必要としている細胞、組織、器官、動物又は患者に対する少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体を含み、任意選択的に、少なくとも１つのＴＮＦ拮抗薬（例えば、ＴＮＦ抗体若しくは断片、可溶性ＴＮＦ受容体若しくは断片、それらの融合タンパク質、又は小分子ＴＮＦ拮抗薬などであるが、これらに限定されない）、抗リウマチ薬（例えば、メトトレキサート、オーラノフィン、アウロチオグルコース、アザチオプリン、エタネルセプト、金チオリンゴ酸ナトリウム、硫酸ヒドロキシクロロキン、レフルノミド、スルファサラジン）、筋弛緩剤、麻酔薬（narcotic）、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、鎮痛剤、麻酔薬（anesthetic）、鎮静剤、局所麻酔薬、神経筋ブロッカ、抗菌剤（例えば、アミノグリコシド、抗真菌剤、駆虫薬、抗ウイルス剤、カルバペネム、セファロスポリン、フルオロキノロン、マクロライド、ペニシリン、スルホンアミド、テトラサイクリン、その他の抗菌剤）、抗乾癬剤、コルチコステロイド、アナボリックステロイド、糖尿病関連薬、ミネラル、栄養薬、甲状腺薬、ビタミン、カルシウム関連ホルモン、止瀉剤、鎮咳剤、制吐剤、抗潰瘍剤、緩下剤、抗凝固薬、エリスロポエチン（例えば、エポエチンα）、フィルグラスチム（例えばＧ－ＣＳＦ、Ｎｅｕｐｏｇｅｎ）、サルグラモスチム（ＧＭ－ＣＳＦ、Ｌｅｕｋｉｎｅ）予防接種、免疫グロブリン、免疫抑制薬（例えば、バシリキシマブ、シクロスポリン、ダクリズマブ）、成長ホルモン、ホルモン補充薬、エストロゲン受容体調節薬、散瞳薬、毛様筋調節薬、アルキル化剤、抗代謝剤、有糸分裂阻害剤、放射性医薬品、抗うつ薬、抗躁病薬、抗精神病薬、抗不安薬、催眠薬、交感神経作動薬、刺激薬、ドネペジル、タクリン、喘息薬、β作動薬、吸入ステロイド、ロイコトリエン阻害薬、メチルキサンチン、クロモリン、エピネフリン又は類似薬、ドルナーゼα（Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅ）、サイトカイン又はサイトカイン拮抗薬から選択される少なくとも１つを任意選択的に更に含む、好適かつ有効量の組成物又は医薬組成物のうち任意の少なくとも１つを更に含み得る。このようなサイトカインの非限定的な例としては、ＩＬ－１～ＩＬ－２３のいずれかが挙げられるが、これらに限定されない。好適な投与量は、技術分野において周知である。例えば、Ｗｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｐｐｌｅｔｏｎ ａｎｄ Ｌａｎｇｅ，Ｓｔａｍｆｏｒｄ，ＣＴ（２０００）、ＰＤＲ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ，Ｔａｒａｓｃｏｎ Ｐｏｃｋｅｔ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ ２０００，Ｄｅｌｕｘｅ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｔａｒａｓｃｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｌｏｍａ Ｌｉｎｄａ，ＣＡ（２０００）を参照されたい。
【0112】
このような抗がん剤又は抗感染薬は、本発明の少なくとも１つの抗体と関連、結合、同時処方、又は併用される毒素分子も含み得る。毒素は、病態細胞又は組織を選択的に死滅させるように、任意選択的に作用させることができる。病態細胞は、がん細胞又は他の細胞であり得る。このような毒素は、これらに限定するものではないが、例えば、リシン、ジフテリア毒素、ヘビ毒素、又は細菌毒素の少なくとも１つから選択される、毒素の少なくとも１つの機能的細胞傷害性ドメインを含む、精製若しくは組換え毒素又は毒素断片であり得る。毒素という用語は又、ヒト及び他の哺乳動物において、死に至り得る毒素性ショックを含む、任意の病態をもたらし得る任意の自然発生の、ミュータント、又は組換えの細菌又はウイルスによって産生される内毒素及び外毒素の両方を含む。かかる毒素としては、腸管毒素原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）熱不安定性エンテロトキシン（ＬＴ）、熱安定性エンテロトキシン（ＳＴ）、赤痢菌細胞毒素、アエロモナス属エンテロトキシン、毒素性ショック症候群毒素－１（ＴＳＳＴ－１）、ブドウ球菌エンテロトキシンＡ（ＳＥＡ）、Ｂ（ＳＥＢ）、又はＣ（ＳＥＣ）、連鎖球菌エンテロトキシンなどを挙げることができるが、これらに限定されない。かかる細菌としては、腸管毒素原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＥＴＥＣ）、腸管出血性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（例えば血清型０１５７の株：Ｈ７）、ブドウ球菌（Staphylococcus）種（例えば、黄色ブドウ球菌、スタフィロコッカス－ピオゲネス（Staphylococcus aureus））、赤痢菌（Shigella）種（例えば、志賀赤痢菌（Shigella dysenteriae）、フレクスナー赤痢菌（Shigella flexneri）、ボイド赤痢菌（Shigella boydii）及びソンネ赤痢菌（Shigella sonnei））、サルモネラ（Salmonella）種（例えば、腸チフス菌、サルモネラコレラ－スイス、サルモネラエンテリティディス）、クロストリジウム種（例えば、クロストリジウム－パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）、クロストリジウム－ディフィシル（Clostridium dificile）、クロストリジウム－ボツリヌス（Clostridium botulinum））、カンピロバクタ（Camphlobacter）種（例えば、カンピロバクタ－ジュジュニ（Camphlobacter jejuni）、カンピロバクタ－フィータス（Camphlobacter fetus））、ヘリコバクタ（Heliocbacter）種（例えば、ヘリコバクタ－ピロリ（Heliocbacter pylori））、アエロモナス（Aeromonas）種（例えば、アエロモナス－ソブリア（Aeromonas sobria）、アエロモナス－ハイドロフィラ（Aeromonas hydrophila）、アエロモナス－キャビエ（Aeromonas caviae））、プレシオモナス－シゲロイデス（Pleisomonas shigelloides）、腸炎エルシニア（Yersinia enterocolitica）、ビブリオ（Vibrio）種（例えば、コレラ菌（Vibrio cholerae）、ビブリオ－パラヘモリティカス（Vibrio parahemolyticus））、クレブシエラ（Klebsiella）種、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、及び連鎖球菌（Streptococci）の種の株が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Ｓｔｅｉｎ編、「ＩＮＴＥＲＮＡＬ ＭＥＤＩＣＩＮＥ」第３版第１～１３頁、Ｌｉｔｔｌｅ，Ｂｒｏｗｎ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｂｏｓｔｏｎ（１９９０）、Ｅｖａｎｓら編、「Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｈｕｍａｎｓ：Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ」第２版第２３９～２５４頁、Ｐｌｅｎｕｍ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂｏｏｋ Ｃｏ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９１）、Ｍａｎｄｅｌｌら、「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ」第３版、Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９０）、Ｂｅｒｋｏｗら編、「Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ」第１６版、Ｍｅｒｃｋ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｒａｈｗａｙ，Ｎ．Ｊ．（１９９２）、Ｗｏｏｄら、「ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」７６：１２１～１３４（１９９１）、Ｍａｒｒａｃｋら、「Ｓｃｉｅｎｃｅ」２４：８７０５～７１１（１９９０）を参照のこと（これらの文献の内容は、参照により全体が本明細書に組み込まれる）。
【0113】
本発明の抗ＴＮＦ抗体化合物、組成物又は混合物は更に、希釈剤、結合剤、安定剤、緩衝剤、塩、親油性溶媒、保存剤、アジュバントなどであるがこれらに限定されない、任意の好適な助剤のうちの少なくとも１つを含み得る。医薬的に許容される助剤が好ましい。かかる滅菌溶液を調製する方法及びその非限定例は、当該技術分野において周知であり、例えば、Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．（Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ）１９９０が挙げられるが、これに限定されない。当該技術分野において周知、又は本明細書に記載されるように、抗ＴＮＦ抗体、断片、又は変異体組成物の投与方法、溶解度、及び／又は安定性に好適な薬学的に許容できる担体を、日常的に選択することができる。
【0114】
本組成物において有用な製薬学的添加物及び添加剤は、これらに限定されないが、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質及び炭水化物（例えば、単糖類、二糖、三糖、四糖、及びオリゴ糖を含む糖類、アルジトール、アルドン酸、エステル化糖などの誘導体化糖、並びに多糖類又は糖ポリマー）を含み、これらは、単独で又は組み合わせて存在してよく、単独で又は組み合わせて１～９９．９９重量％又は体積％含まれる。例示的なタンパク質添加物には、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）などの血清アルブミン、組換えヒトアルブミン（ｒＨＡ）、ゼラチン、カゼインなどを含む。緩衝能においても機能し得る代表的なアミノ酸／抗体構成要素としては、アラニン、グリシン、アルギニン、ベタイン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、システイン、リシン、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、フェニルアラニン、アスパルテームなどが挙げられる。好ましいアミノ酸の１つはグリシンである。
【0115】
本発明に使用するのに好適な炭水化物添加物としては、例えば、フルクトース、マルトース、ガラクトース、グルコース、Ｄ－マンノース、ソルボースなどの単糖類、ラクトース、スクロース、トレハロース、セロビオースなどの二糖類、ラフィノース、メレジトース、マルトデキストリン、デキストラン、デンプン類などの多糖類、マンニトール、キシリトール、マルチトール、ラクチトール、キシリトールソルビトール（グルシトール）、ミオイノシトールなどのアルジトールが挙げられる。本発明で使用するのに好ましい炭水化物添加物は、マンニトール、トレハロース、及びラフィノースである。
【0116】
抗ＴＮＦ抗体組成物は、緩衝剤又はｐＨ調整剤も含み得、典型的には、緩衝剤は、有機酸又は塩基から調製される塩である。代表的な緩衝剤としては、クエン酸、アスコルビン酸、グルコン酸、炭酸、酒石酸、コハク酸、酢酸、又はフタル酸の塩などの有機酸塩、トリス、トロメタミン塩酸塩、又はリン酸緩衝剤が挙げられる。本組成物における使用に好ましい緩衝剤は、クエン酸塩などの有機酸塩である。
【0117】
加えて、本発明の抗ＴＮＦ抗体組成物は、ポリビニルピロリドン、フィコール（ポリマー糖）、デキストレート（例えば、２－ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリンなどのシクロデキストリン）、ポリエチレングリコール、着香剤、抗菌剤、甘味料、抗酸化剤、帯電防止剤、界面活性剤（例えば、「ＴＷＥＥＮ２０」及び「ＴＷＥＥＮ８０」などのポリソルベート）、脂質（例えば、リン脂質、脂肪酸）、ステロイド（例えば、コレステロール）、及びキレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）などのポリマー添加物／添加剤を含み得る。
【0118】
本発明による抗ＴＮＦ抗体、部分又は変異体組成物における使用に適したこれら及び追加の既知の製薬学的添加物及び／又は添加剤は、当該技術分野において既知であり、例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ」、１９ｔｈ ｅｄ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｌｉａｍｓ，（１９９５）、及び「Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ」、５２ｎｄ ｅｄ，Ｍｅｄｉｃａｌ Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ，Ｍｏｎｔｖａｌｅ，ＮＪ（１９９８）に列挙されており、これらの開示は、参照により全体が本明細書に組み込まれる。好ましい担体又は添加物材料は、炭水化物（例えば、単糖類及びアルジトール）及び緩衝剤（例えば、クエン酸）又はポリマー剤である。
【0119】
製剤。上述したとおり、本発明は、好ましくは、生理食塩水又は選択された塩を含むリン酸緩衝剤である安定した製剤、並びに保存剤を含有する保存溶液及び製剤、並びに薬学的に許容できる製剤中に少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体を含む薬剤学的又は獣医学的用途に好適な多用途保存製剤を提供する。保存製剤は、水性希釈剤中に、少なくとも１つのフェノール、ｍ－クレゾール、ｐ－クレゾール、ｏ－クレゾール、クロロクレゾール、ベンジルアルコール、硝酸フェニル水銀、フェノキシエタノール、ホルムアルデヒド、クロロブタノール、塩化マグネシウム（例えば、六水和物）、アルキルパラベン（メチル、エチル、プロピル、ブチルなど）、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、デヒドロ酢酸ナトリウム、及びチメロサール、又はそれらの混合物からなる群から任意選択で選択される、少なくとも１つの既知の保存剤を含む。当該技術分野において既知であるように、０．００１～５％、又は０．００１、０．００３、０．００５、０．００９、０．０１、０．０２、０．０３、０．０５、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４．、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．３、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、又はその中の任意の範囲若しくは値などであるがこれらに限定されない、その中の任意の範囲若しくは値の、任意の好適な濃度又は混合物が使用され得る。非限定的な実施例としては、保存剤無添加、０．１～２％のｍ－クレゾール（例えば、０．２、０．３．０．４、０．５、０．９、１．０％）、約０．１～３％のベンジルアルコール（例えば、０．５、０．９、１．１、１．５、１．９、２．０、２．５％）、０．００１～０．５％のチメロサール（例えば、０．００５、０．０１）、０．００１～２．０％のフェノール（例えば、０．０５、０．２５、０．２８、０．５、０．９、１．０％）、０．０００５～１．０％のアルキルパラベン（例えば、０．０００７５、０．０００９、０．００１、０．００２、０．００５、０．００７５、０．００９、０．０１、０．０２、０．０５、０．０７５、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．５、０．７５、０．９、１．０％）などが挙げられる。
【0120】
上述のとおり、本発明は、包装材と、任意選択的に水性希釈剤中に処方された緩衝剤及び／又は保存剤を伴う少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体の溶液を含む少なくとも１つのバイアルと、を含む製品を提供し、この包装材は、かかる溶液を１、２、３、４、５、６、９、１２、１８、２０、２４、３０、３６、４０、４８、５４、６０、６６、７２時間以上にわたり保持することができることを記したラベルを含む。本発明は、包装材と、凍結乾燥された少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体を含む第１のバイアルと、処方された緩衝剤又は保存剤の水性希釈剤を含む第２のバイアルと、を含む製品を更に含み、この包装材は、少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体を水性希釈剤で再構成して、２４時間以上にわたって保持することができる溶液を形成するように患者に指示するラベルを含む。
【0121】
本発明に従って使用される少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体は、本明細書に記載されるか又は当該技術分野において既知の、哺乳類細胞又はトランスジェニック調製物から産生することを含む組換え手段により産生してもよいし、又は他の生物源から精製してもよい。
【0122】
本発明の製品中に含まれる、少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体の範囲は、湿式／乾式系の場合、再構成時に約１．０μｇ／ｍｌ～約１０００ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度が得られる量で含まれるが、これより低い濃度及び高い濃度でも作業可能であり、これらの濃度は意図される送達ビヒクルによって決まり、例えば溶液製剤では、経皮パッチ、肺、経粘膜、又は浸透圧性若しくはマイクロポンプ方法とは異なる。
【0123】
好ましくは、水性希釈剤は、任意選択で、医薬的に許容される保存剤を更に含む。好ましい保存剤には、フェノール、ｍ－クレゾール、ｐ－クレゾール、ｏ－クレゾール、クロロクレゾール、ベンジルアルコール、アルキルパラベン（メチル、エチル、プロピル、ブチルなど）、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、デヒドロ酢酸ナトリウム、及びチメロサール、又はそれらの混合物からなる群から選択されるものが挙げられる。製剤中で使用される保存剤の濃度は、抗菌効果を生み出すのに充分な濃度である。このような濃度は選択された保存剤によって異なり、当業者により容易に決定される。
【0124】
他の添加物、例えば、等張剤、緩衝剤、抗酸化剤、保存剤エンハンサは、任意選択的に及び好ましくは希釈剤に添加することができる。グリセリンなどの等張剤が、既知の濃度で概して使用される。好ましくは、生理学的に耐性の緩衝剤を添加して、改善されたｐＨ制御を提供する。製剤は、約ｐＨ４～約ｐＨ１０、及び好ましくは約ｐＨ５～約ｐＨ９の範囲、及び最も好ましくは約６．０～約８．０の範囲などの、広範囲のｐＨ範囲を網羅とすることができる。好ましくは、本発明の製剤は、約６．８～約７．８のｐＨを有する。好適な緩衝剤には、リン酸塩緩衝剤を含み、最も好ましくは、リン酸ナトリウム、特にリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含む。
【0125】
他の添加剤、例えばＴｗｅｅｎ２０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート）、Ｔｗｅｅｎ４０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノパルミテート）、Ｔｗｅｅｎ８０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８（ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマー）、及びＰＥＧ（ポリエチレングリコール）などの、薬学的に許容できる可溶化剤、又はポリソルベート２０若しくは８０又はポロキサマー１８４若しくは１８８、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）ポリオールなどの非イオン性界面活性剤、その他のブロックコポリマー、並びにＥＤＴＡ及びＥＧＴＡなどのキレート剤を製剤又は組成物に任意選択的に添加することで、凝集を低減させることができる。これらの添加物は、製剤を投与するためにポンプ又はプラスチック容器が使用される場合に特に有用である。医薬的に許容される界面活性剤の存在により、タンパク質が凝集する傾向が軽減される。
【0126】
本発明の製剤は、少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体と、フェノール、ｍ－クレゾール、ｐ－クレゾール、ｏ－クレゾール、クロロクレゾール、ベンジルアルコール、アルキルパラベン（メチル、エチル、プロピル、ブチルなど）、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、デヒドロ酢酸ナトリウム、及びチメロサール又はこれらの混合物からなる群から選択される保存剤と、を水性希釈剤中で混合することを含むプロセスにより調製することができる。少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体と保存剤との水性希釈剤中での混合は、従来の溶解及び混合手順を使用して実施される。好適な製剤を調製するために、例えば、緩衝溶液中の一定量の少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体を、所望の濃度のタンパク質及び保存剤を提供するのに充分な量の緩衝溶液中で所望の保存剤と組み合わせる。本プロセスの変化形態は、当業者によって認識される。例えば、構成成分の添加順序、追加の添加剤の使用の有無、製剤調製時の温度及びｐＨは全て、使用する投与濃度及び投与手段に関して最適化することのできる因子である。
【0127】
特許請求される製剤は、透明な溶液として、又は水、保存剤及び／若しくは賦形剤、好ましくはリン酸塩緩衝剤及び／若しくは生理食塩水、並びに選択された塩を水性希釈剤中に含有する第２のバイアルで再構成される、凍結乾燥された少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体のバイアルを含むデュアルバイアル（dual vial）として患者に提供することができる。単一溶液バイアル又は再構成を必要とするデュアルバイアルはいずれも複数回再利用することができ、単一又は複数の患者処置サイクルを満たすことができ、したがって、現在使用できるよりも便利な処置レジメンを提供することができる。
【0128】
特許請求される本製品は、即時から２４時間以上の期間にわたる投与に有用である。したがって、本発明により特許請求される製品は、患者に大きな利益を提供する。本発明の製剤は、任意選択的に、約２～約４０℃の温度で安全に保存することができ、タンパク質の生物学的活性を長期間保持することができ、したがって、包装ラベルで、溶液を６、１２、１８、２４、３６、４８、７２、又は９６時間以上保持及び／又は使用し得ることを示すことができる。保存されている希釈剤を使用する場合には、このようなラベルは、最高１～１２か月、半年、１年半、及び／又は２年までの使用を含むことができる。
【0129】
本発明の少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体の溶液は、少なくとも１つの抗体を水性希釈剤中で混合することを含むプロセスにより調製することができる。混合は、従来の溶解及び混合手順を使用して実施される。好適な希釈剤を調製するために、例えば、水又は緩衝剤中の一定量の少なくとも１つの抗体を、所望の濃度のタンパク質、及び任意選択的に保存剤又は緩衝剤を提供するのに充分な量で組み合わせる。本プロセスの変化形態は、当業者によって認識される。例えば、構成成分の添加順序、追加の添加剤の使用の有無、製剤調製時の温度及びｐＨは全て、使用する投与濃度及び投与手段に関して最適化することのできる因子である。
【0130】
特許請求される製品は、透明な溶液として、又は水性希釈剤を含有する第２のバイアルで再構成される、凍結乾燥された少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体のバイアルを含むデュアルバイアルとして、患者に提供することができる。単一溶液バイアル又は再構成を必要とするデュアルバイアルはいずれも複数回再利用することができ、単一又は複数の患者治療サイクルを満たすことができ、したがって、現在使用できるよりも便利な治療レジメンを提供する。
【0131】
特許請求される製品は、透明な溶液、又は水性希釈剤を含有する第２のバイアルで再構成される、凍結乾燥された少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体のバイアルを含むデュアルバイアルを、薬局、診療所、又はその他のかかる機関及び施設に提供することによって、患者に対し間接的に提供することができる。この場合の透明溶液は最高１リットル又は更にはそれ以上の容量であってもよく、この大きな容器からより少量の少なくとも１つの抗体溶液を１回又は複数回取り出してより小さなバイアルに移し、かつ薬局又は診療所により顧客及び／又は患者に提供できる。
【0132】
これらの単一バイアルシステムを含む承認済みデバイスとしては、溶液を送達するためのこれらのペン型注射器デバイス、例えば、ＢＤ Ｐｅｎｓ、ＢＤ Ａｕｔｏｊｅｃｔｏｒ（登録商標）、Ｈｕｍａｊｅｃｔ（登録商標）、ＮｏｖｏＰｅｎ（登録商標）、Ｂ－Ｄ（登録商標）Ｐｅｎ、ＡｕｔｏＰｅｎ（登録商標）、及びＯｐｔｉＰｅｎ（登録商標）、ＧｅｎｏｔｒｏｐｉｎＰｅｎ（登録商標）、Ｇｅｎｏｔｒｏｎｏｒｍ Ｐｅｎ（登録商標）、Ｈｕｍａｔｒｏ Ｐｅｎ（登録商標）、Ｒｅｃｏ－Ｐｅｎ（登録商標）、Ｒｏｆｅｒｏｎ Ｐｅｎ（登録商標）、Ｂｉｏｊｅｃｔｏｒ（登録商標）、ｉｊｅｃｔ（登録商標）、Ｊ－ｔｉｐ Ｎｅｅｄｌｅ－Ｆｒｅｅ Ｉｎｊｅｃｔｏｒ（登録商標）、Ｉｎｔｒａｊｅｃｔ（登録商標）、Ｍｅｄｉ－Ｊｅｃｔ（登録商標）が挙げられ、例えば、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｅｎｓｅｎ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ、ｗｗｗ．ｂｅｃｔｏｎｄｉｃｋｅｎｓｏｎ．ｃｏｍ）、Ｄｉｓｅｔｒｏｎｉｃ（Ｂｕｒｇｄｏｒｆ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ、ｗｗｗ．ｄｉｓｅｔｒｏｎｉｃ．ｃｏｍ、Ｂｉｏｊｅｃｔ（Ｐｏｒｔｌａｎｄ，Ｏｒｅｇｏｎ（ｗｗｗ．ｂｉｏｊｅｃｔ．ｃｏｍ）、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｗｅｓｔｏｎ Ｍｅｄｉｃａｌ（Ｐｅｔｅｒｂｏｒｏｕｇｈ，ＵＫ，ｗｗｗ．ｗｅｓｔｏｎ－ｍｅｄｉｃａｌ．ｃｏｍ）、Ｍｅｄｉ－Ｊｅｃｔ Ｃｏｒｐ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ｗｗｗ．ｍｅｄｉｊｅｃｔ．ｃｏｍ）によって製造又は開発されている。デュアルバイアル系を含む承認済みデバイスとしては、ＨｕｍａｔｒｏＰｅｎ（登録商標）などの、再構成した溶液を送達するためのカートリッジ内で凍結乾燥された薬物を再構成するためのペン型注射器システムが挙げられる。
【0133】
ここで特許請求される製品は、包装材を含む。包装材は、規制当局によって必要とされる情報に加えて、製品を使用することができる条件を提供する。本発明の包装材は、少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体を水性希釈剤で再構成して溶液を形成し、２～２４時間以上の期間にわたって、この溶液を湿式／乾式の２つのバイアル製品に使用する、という指示を患者に提供する。単一バイアルの溶液製品の場合、ラベルは、この溶液が２～２４時間以上にわたって使用できることを示す。ここで特許請求される製品は、ヒト用医薬製品用途に有用である。
【0134】
本発明の製剤は、少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体及び選択された緩衝剤、好ましくは生理食塩水又は選択された塩を含有するリン酸塩緩衝剤を混合することを含むプロセスにより調製することができる。少なくとも１つの抗体と緩衝剤との水性希釈剤中での混合は、従来の溶解及び混合手順を使用して実施される。好適な製剤を調製するために、例えば、水又は緩衝剤中の一定量の少なくとも１つの抗体を、所望の濃度のタンパク質及び緩衝剤を提供するのに充分な量の水中で所望の緩衝剤と組み合わせる。本プロセスの変化形態は、当業者によって認識される。例えば、構成成分の添加順序、追加の添加剤の使用の有無、製剤調製時の温度及びｐＨは全て、使用する投与濃度及び投与手段に関して最適化することのできる因子である。
【0135】
特許請求される安定又は保存製剤は、透明な溶液として、又は水性希釈剤中に保存剤若しくは緩衝剤及び添加物を含有する第２のバイアルで再構成される、凍結乾燥された少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体のバイアルを含むデュアルバイアルとして、患者に提供することができる。単一溶液バイアル又は再構成を必要とするデュアルバイアルはいずれも複数回再利用することができ、単一又は複数の患者治療サイクルを満たすことができ、したがって、現在使用できるよりも便利な治療レジメンを提供する。
【0136】
本明細書に記載される安定若しくは保存製剤又は溶液のいずれかの少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体は、当該技術分野において周知のように、ＳＣ若しくはＩＭ注射、経皮、経肺、経粘膜、埋め込み、浸透圧ポンプ、カートリッジ、マイクロポンプ、又は当業者により理解されるその他の手段などの種々の送達方法を介して、本発明に従って患者に投与することができる。
【0137】
療法適用。本発明は、当該技術分野において既知である、又は本明細書に記載されるように、本発明の少なくとも１つの二重インテグリン抗体を使用して、細胞、組織、器官、動物又は患者における少なくとも１つのＴＮＦ関連疾患を調節又は処置するための方法も提供する。
【0138】
本発明は、肥満、免疫関連疾患、循環器疾患、感染症、悪性疾患又は神経学的疾患のうち少なくとも１つを含むがこれらに限定されない、細胞、組織、器官、動物又は患者における少なくとも１つのＴＮＦ関連疾患を調節又は処置するための方法も提供する。
【0139】
本発明は、関節リウマチ、若年性、全身性発症若年性関節リウマチ、強直性脊椎炎、強直性脊椎炎、胃潰瘍、血清反応陰性関節症、変形性関節炎、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、全身性エリテマトーデス、抗リン脂質症候群、虹彩毛様体炎／ブドウ膜炎／視神経炎、特発性肺線維症、全身性血管炎／ヴェグナー肉芽腫症、サルコイドーシス、精巣炎／精管切除修復術、アレルギー性／アトピー性疾患、喘息、アレルギー性鼻炎、皮膚炎、アレルギー性接触性皮膚炎、アレルギー性結膜炎、過敏性肺炎、移植、器官移植拒絶反応、移植片対宿主病、全身性炎症反応症候群、敗血症症候群、グラム陽性菌敗血症、グラム陰性菌敗血症、培養陰性敗血症、真菌敗血症、好中球減少性発熱、尿性敗血症、髄膜炎菌血症、外傷／出血、熱傷、電離放射線曝露、急性膵炎、成人呼吸窮迫症候群、アルコール性肝炎、慢性炎症性病変、サルコイドーシス、クローン病変、鎌状赤血球貧血症、糖尿病、ネフローゼ、アトピー性疾患、過敏性反応、アレルギー性鼻炎、枯草熱、通年性鼻炎、結膜炎、子宮内膜症、喘息、じん麻疹、全身性アナフィラキシ、皮膚炎、悪性貧血、溶血性疾患、血小板減少症、任意の器官又は組織の移植片拒絶反応、腎移植拒絶反応、心臓移植拒絶反応、肝臓移植拒絶反応、膵臓移植拒絶反応、肺移植拒絶反応、骨髄移植（ＢＭＴ）拒絶反応、皮膚同種移植拒絶反応、軟骨移植拒絶反応、骨移植片拒絶反応、小腸移植拒絶反応、胎児胸腺移植拒絶反応、副甲状腺移植拒絶反応、任意の器官又は組織の異種移植拒絶反応、同種移植拒絶反応、抗受容体過剰反応、グレーブス病、レイノー病、Ｂ型インスリン抵抗性糖尿病、喘息、重症筋無力症、抗体媒介性細胞障害、ＩＩＩ型過敏症反応、全身性エリテマトーデス、ＰＯＥＭＳ症候群（多発性神経障害、臓器肥大、内分泌障害、単クローン性免疫グロブリン血症、及び皮膚症状症候群）、多発性神経障害、臓器肥大、内分泌障害、単クローン性免疫グロブリン血症、皮膚症状症候群、抗リン脂質症候群、天疱瘡、強皮症、混合性結合組織病、特発性アジソン病、真性糖尿病、慢性活動性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、白斑、血管炎、ＭＩ後心臓切開術症候群、ＩＶ型過敏症、接触性皮膚炎、過敏性肺炎、同種移植拒絶反応、細胞内生物による肉芽腫、薬物過敏、代謝性／特発性ウィルソン病、ヘマクロマトーシス、α－１－アンチトリプシン欠乏症、糖尿病性網膜症、橋本甲状腺炎、骨粗鬆症、原発性胆汁性肝硬変、甲状腺炎、脳脊髄炎、悪液質、嚢胞性線維症、新生児慢性肺疾患、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、家族性血食組織のリンパ組織球増多症、皮膚科学的状態、乾癬症、脱毛症、ネフローゼ症候群、腎炎、糸球体腎炎、急性腎不全、血液透析、尿毒症、毒性、子癇前症、ｏｋｔ３療法、抗ｃｄ３療法、サイトカイン療法、化学療法、放射線療法（例えば、無力症、貧血、悪液質などが挙げられるがこれらに限定されない）、慢性サリチル酸塩中毒などの少なくとも１つが挙げられるがそれらに限定されない、細胞、組織、器官、動物又は患者における少なくとも１つの免疫関連疾患を調節又は治療するための方法も提供する。例えば、「Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ」第１２版～第１７版、Ｍｅｒｃｋ ＆ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｒａｈｗａｙ，ＮＪ（１９７２、１９７７、１９８２、１９８７、１９９２、１９９９）、「Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ」Ｗｅｌｌｓら編、第２版、Ａｐｐｌｅｔｏｎ ａｎｄ Ｌａｎｇｅ、Ｓｔａｍｆｏｒｄ，Ｃｏｎｎ．（１９９８、２０００）を参照されたく、それぞれは参照することにより全体が組み込まれる。
【0140】
本発明は、心機能不全症候群（cardiac stun syndrome）、心筋梗塞、うっ血性心不全、卒中、虚血発作、出血、動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、糖尿病性動脈硬化性疾患、高血圧、動脈性高血圧、腎血管性高血圧、失神、ショック、心血管系の梅毒、心不全、肺性心、原発性肺高血圧、不整脈、心房異所性拍動、心房粗動、心房細動（持続性又は発作性）、還流後症候群、心肺バイパス炎症応答、無秩序型又は多源性心房頻脈、規則的狭ＱＲＳ頻脈（regular narrow QRS tachycardia）、固有不整脈（specific arrhythmias）、心室細動、ヒス束不整脈（His bundle arrhythmias）、房室ブロック、脚ブロック、心筋虚血性疾患、冠動脈疾病、狭心症、心筋梗塞、心筋症、拡張型うっ血性心筋症、拘束型心筋症、心臓弁膜症、心内膜炎、心膜疾患、心臓腫瘍、大動脈瘤及び末梢動脈瘤、大動脈切開、大動脈の炎症、腹部大動脈及びその分岐の閉塞、末梢血管障害、閉塞性動脈障害、末梢アテローム性動脈硬化症、閉塞性血栓性血管炎、機能性末梢動脈障害、レイノー現象及び疾患、先端チアノーゼ、紅痛症、静脈性疾患、静脈血栓症、静脈瘤、動静脈瘻、リンパ浮腫、脂肪性浮腫、不安定狭心症、再灌流傷害、ポンプ後症候群（post pump syndrome）、虚血再灌流傷害などのうちの少なくとも１つを含むがこれらに限定されない、細胞、組織、器官、動物又は患者における、少なくとも１つの循環器疾患を調節又は治療するための方法も提供する。かかる方法は、少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体を含む有効量の組成物又は医薬組成物を、かかる調節、処置又は治療を必要としている細胞、組織、器官、動物又は患者に投与することを、任意選択的に含み得る。
【0141】
本発明は、急性又は慢性細菌感染、細菌、ウイルス及び真菌感染を含む急性及び慢性寄生又は感染プロセス、ＨＩＶ感染／ＨＩＶ神経障害、髄膜炎、肝炎（Ａ、Ｂ又はＣなど）、敗血症性関節炎、腹膜炎、肺炎、喉頭蓋炎、大腸菌０１５７：ｈ７、溶血性尿毒症性症候群／塞栓性血小板減少性紫斑病、マラリア、デング出血熱、リーシュマニア症、ハンセン病、中毒性ショック症候群、連鎖球菌筋炎、ガス壊疽、結核菌、マイコバクテリウム－アビウム－イントラセルラーレ、ニューモシスティスカリニ肺炎、骨盤内炎症性疾患、精巣炎／精巣上体炎、レジオネラ、ライム病、ａ型インフルエンザ、エプスタイン－バーウイルス、ウイルス関連血球貪食症候群、ウイルス性脳炎／無菌性髄膜炎などのうちの少なくとも１つを含むがこれらに限定されない、細胞、組織、器官、動物又は患者において少なくとも１つの感染症を調節又は処置するための方法も提供する。
【0142】
本発明は、白血病、急性白血病、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、Ｂ細胞、Ｔ細胞又はＦＡＢ ＡＬＬ、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、有毛細胞白血病、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、リンパ腫、ホジキン病、悪性リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、多発性骨髄腫、カポジ肉腫、直腸結腸がん、膵臓がん、鼻咽頭がん、悪性組織球増殖症、悪性の腫瘍随伴症候群／高カルシウム血症、固形腫瘍、腺がん、肉腫、悪性黒色腫、血管腫、転移性疾患、がん関連骨吸収、がん関連骨痛などのうちの少なくとも１つを含むがこれらに限定されない、細胞、組織、器官、動物又は患者における少なくとも１つの悪性疾患を調節又は処置するための方法も提供する。
【0143】
本発明は、神経変性疾患、多発性硬化症、片頭痛、エイズ痴呆症候群、脱髄疾患、例えば、多発性硬化症及び急性横断性脊髄炎、錐体外路及び小脳障害、例えば、皮質脊髄系の病変、大脳基底核の障害若しくは小脳障害、多動性運動障害、例えば、ハンチントン舞踏病及び老年性舞踏病、薬剤誘発性運動障害、例えば、ＣＮＳドーパミン受容体を遮断する薬物により誘発されるもの、運動低下性運動障害、例えば、パーキンソン病、進行性核上麻痺、小脳の構造病変、脊髄小脳変性症、例えば、脊髄性運動失調症、フリードライヒ失調症、小脳皮質変性症、多系統変性症（Ｍｅｎｃｅｌ、Ｄｅｊｅｒｉｎｅ－Ｔｈｏｍａｓ，Ｓｈｉ－Ｄｒａｇｅｒ及びＭａｃｈａｄｏ－Ｊｏｓｅｐｈ）、全身性疾患（レフスム病、無βリポタンパク血症、運動失調症、毛細血管拡張症、及びミトコンドリア多系統障害）、脱髄性コア障害（demyelinating core disorder）、例えば、多発性硬化症、急性横断性脊髄炎及び運動単位の障害、例えば、神経性筋萎縮症（前角細胞変性症、例えば、筋萎縮性側索硬化症、乳児脊髄性筋萎縮症及び若年性脊髄性筋萎縮症）、アルツハイマー病、中年層のダウン症候群、びまん性レヴィー小体病、レヴィー小体型の老人性痴呆症、ウェルニッケコルサコフ症候群、慢性アルコール中毒、クロイツフェルト－ヤコブ病、亜急性硬化性全脳炎、ハレルフォルデン－スパッツ病、並びにボクサー認知症などのうちの少なくとも１つを含むがこれらに限定されない、細胞、組織、器官、動物又は患者における少なくとも１つの神経学的疾患を調節又は処置するための方法も提供する。かかる方法は、任意選択的に、少なくとも１つのＴＮＦ抗体又は特定された部分又は変異体を含む有効量の組成物又は医薬組成物を、このような調節、処置又は治療を必要としている細胞、組織、器官、動物又は患者に対し投与する工程を含むことができる。例えば、「Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ」第１６版、Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｒａｈｗａｙ，ＮＪ（１９９２）を参照のこと。
【0144】
本発明のいずれの方法も、かかる調節、処置又は治療を必要としている細胞、組織、器官、動物又は患者に、少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体を含む有効量の組成物又は医薬組成物を投与することを含み得る。かかる方法は、任意選択的に、かかる免疫疾患の治療のための同時投与又は併用療法を更に含み得、この少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体、特定された部分又はその変異体の投与は、少なくとも１つのＴＮＦ拮抗薬（例えば、ＴＮＦ抗体若しくは断片、可溶性ＴＮＦ受容体若しくは断片、その融合タンパク質、又は低分子ＴＮＦ拮抗薬などであるが、これらに限定されない）、抗リウマチ薬（例えば、メトトレキサート、オーラノフィン、アウロチオグルコース、アザチオプリン、エタネルセプト、金チオリンゴ酸ナトリウム、硫酸ヒドロキシクロロキン、レフルノミド、スルファサラジン）、筋弛緩薬、麻薬、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、鎮痛薬、麻酔薬、鎮静薬、局所麻酔薬、神経筋ブロッカ、抗菌薬（例えば、アミノグリコシド、抗真菌薬、駆虫薬、抗ウイルス薬、カルバペナム、セファロスポリン、フルオロキノロン、マクロライド、ペニシリン、スルホンアミド、テトラサイクリン、他の抗菌薬）、抗乾癬剤、コルチコステロイド、アナボリックステロイド、糖尿病関連薬、ミネラル、栄養薬、甲状腺薬、ビタミン、カルシウム関連ホルモン、止瀉薬、鎮咳薬、制吐剤、抗潰瘍剤、緩下剤、抗凝固薬、エリスロポエチン（例えば、エポエチンα）、フィルグラスチム（例えば、Ｇ－ＣＳＦ、Ｎｅｕｐｏｇｅｎ）、サルグラモスチム（ＧＭ－ＣＳＦ、Ｌｅｕｋｉｎｅ）、予防接種、免疫グロブリン、免疫抑制薬（例えば、バシリキシマブ、シクロスポリン、ダクリズマブ）、成長ホルモン、ホルモン補充薬、エストロゲン受容体調節薬、散瞳薬、毛様筋麻痺薬、アルキル化剤、抗代謝剤、有糸分裂阻害剤、放射性医薬品、抗うつ薬、抗躁病薬、抗精神病薬、抗不安薬、催眠薬、交感神経作動薬、刺激薬、ドネペジル、タクリン、喘息薬、β作動薬、吸入ステロイド、ロイコトリエン阻害剤、メチルキサンチン、クロモリン、エピネフリン若しくは類似体、ドルナーゼα（Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅ）、サイトカイン若しくはサイトカイン拮抗薬から選択される少なくとも１つの前に、同時に、及び／又は後に投与することを更に含む。好適な投与量は、技術分野において周知である。例えば、Ｗｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｐｐｌｅｔｏｎ ａｎｄ Ｌａｎｇｅ，Ｓｔａｍｆｏｒｄ，ＣＴ（２０００）、ＰＤＲ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ，Ｔａｒａｓｃｏｎ Ｐｏｃｋｅｔ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ ２０００，Ｄｅｌｕｘｅ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｔａｒａｓｃｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｌｏｍａ Ｌｉｎｄａ，ＣＡ（２０００）を参照されたい。
【0145】
本発明の組成物、併用療法、同時投与、デバイス及び／又は方法（本発明の少なくとも１つの抗体、その特定された部分及びその変異体を更に含む）に好適なＴＮＦ拮抗薬は、抗ＴＮＦ抗体、その抗原結合断片、及びＴＮＦに特異的に結合する受容体分子、ＴＮＦ合成、ＴＮＦ放出若しくは標的細胞に対するその作用を阻止及び／又は阻害する化合物、例えば、サリドマイド、テニダプ、ホスホジエステラーゼ阻害剤（例えば、ペントキシフィリン及びロリプラム）、Ａ２ｂアデノシン受容体作動薬及びＡ２ｂアデノシン受容体エンハンサ、ＴＮＦ受容体シグナル伝達を阻止及び／又は阻害する化合物、例えば、マイトジェン活性化タンパク質（ＭＡＰ）キナーゼ阻害剤、膜ＴＮＦ切断を遮断及び／又は阻害する化合物、例えば、メタロプロテイナーゼ阻害剤、ＴＮＦ活性を遮断及び／又は阻害する化合物、例えば、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤（例えば、カプトプリル）、並びにＴＮＦ生成及び／又は合成を遮断及び／又は阻害する化合物、例えば、ＭＡＰキナーゼ阻害剤を含むが、これらに限定されない。
【0146】
本明細書で使用されるとき、「腫瘍壊死因子抗体」、「ＴＮＦ抗体」、「ＴＮＦα抗体」又は「断片」などは、インビトロ、その場で、及び／又は好ましくはインビボで、ＴＮＦα活性を減少、遮断、阻害、抑止又は干渉する。例えば、本発明の好適なＴＮＦヒト抗体は、ＴＮＦαに結合することができ、抗ＴＮＦ抗体、その抗原結合断片、及びＴＮＦαに特異的に結合する特定されたミュータント又はそのドメインを含む。好適なＴＮＦ抗体又は断片は、ＴＮＦ ＲＮＡ、ＤＮＡ、若しくはタンパク質合成、ＴＮＦ放出、ＴＮＦ受容体シグナル伝達、膜ＴＮＦ切断、ＴＮＦ活性、ＴＮＦ生成及び／又は合成を、減少、遮断、抑止、干渉、阻止及び／又は阻害することもできる。
【0147】
キメラ抗体ｃＡ２は、Ａ２と呼ばれる高親和性中和マウス抗ヒトＴＮＦαＩｇＧ１抗体の抗原結合可変領域及びヒトＩｇＧ１のκ免疫グロブリンの定常領域からなる。ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域は、同種の抗体のエフェクタ機能を改善し、循環血清半減期を増加させ、抗体の免疫原性を減少させる。キメラ抗体ｃＡ２の結合活性及びエピトープの特異性は、マウス抗体Ａ２の可変領域に由来する。特定の実施形態では、マウス抗体Ａ２の可変領域をコードする核酸の好ましい供給源は、Ａ２ハイブリドーマ細胞株である。
【0148】
キメラＡ２（ｃＡ２）は、天然及び組換えの両方のヒトＴＮＦαの細胞傷害性作用を用量依存的に中和する。キメラ抗体ｃＡ２と組換えヒトＴＮＦαとの結合アッセイから、キメラ抗体ｃＡ２の親和性定数は、１．０４ｘｌ０１０Ｍ－１であると計算された。競合阻害によるモノクローナル抗体の特異性及び親和性を決定するための好ましい方法は、Ｈａｒｌｏｗら、「ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）、Ｃｏｌｌｉｇａｎら編、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９２～２０００）、Ｋｏｚｂｏｒら、「Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ」４：７２～７９（１９８３）、Ａｕｓｕｂｅｌら編、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８７～２０００）、及びＭｕｌｌｅｒ、「Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．」９２：５８９～６０１（１９８３）に見ることができ、これらの参照文献は、参照により全体が本明細書に組み込まれる。
【0149】
特定の実施形態では、マウスモノクローナル抗体Ａ２は、ｃ１３４Ａと呼ばれる細胞株によって産生される。キメラ抗体ｃＡ２は、ｃ１６８Ａと呼ばれる細胞株によって産生される。
【0150】
本発明において使用することができるモノクローナル抗ＴＮＦ抗体の更なる例は、当該技術分野において記載されている（例えば、米国特許第５，２３１，０２４号、Ｍｏｌｌｅｒ，Ａ．ら、「Ｃｙｔｏｋｉｎｅ」２（３）：１６２－１６９（１９９０）、米国出願第０７／９４３，８５２号（１９９２年９月１１日出願）、Ｒａｔｈｊｅｎら、国際公開第９１／０２０７８号（１９９１年２月２１日公開）、Ｒｕｂｉｎら、ＥＰＯ特許公開第０ ２１８ ８６８号（１９８７年４月２２日公開）、Ｙｏｎｅら、ＥＰＯ特許公開第０ ２８８ ０８８号（１９８８年１０月２６日）、Ｌｉａｎｇら、「Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１３７：８４７－８５４（１９８６）、Ｍｅａｇｅｒら、「Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ」６：３０５～３１１（１９８７）、Ｆｅｎｄｌｙら、「Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ」６：３５９～３６９（１９８７）、Ｂｒｉｎｇｍａｎら、「Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ」６：４８９～５０７（１９８７）及びＨｉｒａｉら、「Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．９６：５７～６２（１９８７）を参照のこと。これらの参照文献は、参照により全体が本明細書に組み込まれる）。
【0151】
ＴＮＦ受容体分子。本発明に有用な好ましいＴＮＦ受容体分子は、ＴＮＦαに高い親和性で結合し（例えば、Ｆｅｌｄｍａｎｎら、国際公開第９２／０７０７６号（１９９２年４月３０日公開）、Ｓｃｈａｌｌら、「Ｃｅｌｌ」６１：３６１～３７０（１９９０）、及びＬｏｅｔｓｃｈｅｒら、「Ｃｅｌｌ」６１：３５１～３５９（１９９０）を参照のこと。これらの参照文献は、参照により全体が本明細書に組み込まれる）、任意選択的に低い免疫原性を有するものである。特に、５５ｋＤａ（ｐ５５ ＴＮＦ－Ｒ）及び７５ｋＤａ（ｐ７５ ＴＮＦ－Ｒ）のＴＮＦ細胞表面受容体は、本発明において有用である。受容体の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）又はその機能的部分を含むこれらの受容体の切断型（例えば、Ｃｏｒｃｏｒａｎら、「Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．」２２３：８３１～８４０（１９９４）を参照のこと）も本発明において有用である。ＥＣＤを含むＴＮＦ受容体の切断型は、尿及び血清中で、３０ｋＤａ及び４０ｋＤａのＴＮＦα阻害結合タンパク質として検出されている（Ｅｎｇｅｌｍａｎｎ，Ｈ．ら、「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」２６５：１５３１～１５３６（１９９０））。ＴＮＦ受容体多量体分子及びＴＮＦ免疫受容体融合分子、並びにそれらの誘導体及び断片又は部分は、本発明の方法及び組成物において有用であるＴＮＦ受容体分子の更なる例である。本発明に使用することができるＴＮＦ受容体分子は、症状の良好乃至優れた緩和及び低毒性で患者を長期間処置する能力を特徴とする。低い免疫原性及び／又は高い親和性並びにその他の未定義の特性は、得られる治療結果に寄与し得る。
【0152】
本発明において有用なＴＮＦ受容体多量体分子は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの、１つ又は２つ以上のポリペプチドリンカ又はその他の非ペプチドリンカを介して連結された２つ以上のＴＮＦ受容体のＥＣＤの全て又は機能的部分を含む。多量体分子は、多量体分子の発現をもたらすための分泌タンパク質のシグナルペプチドを更に含むことができる。これらの多量体分子及びそれらの生成方法は、米国出願第０８／４３７，５３３号（１９９５年５月９日出願）に記載されており、その内容は、参照により全体が本明細書に組み込まれる。
【0153】
本発明の方法及び組成物において有用なＴＮＦ免疫受容体融合分子は、１つ又は２つ以上の免疫グロブリン分子の少なくとも１つの部分及び１つ又は２つ以上のＴＮＦ受容体の全て又は機能的部分を含む。これらの免疫受容体融合分子は、単量体又はヘテロ若しくはホモ多量体として集合させることができる。免疫受容体融合分子は、一価であっても多価であってもよい。かかるＴＮＦ免疫受容体融合分子の例は、ＴＮＦ受容体／ＩｇＧ融合タンパク質である。ＴＮＦ免疫受容体融合分子及びそれらの生成方法は、当該技術分野において記載されている（Ｌｅｓｓｌａｕｅｒら、「Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．」２１：２８８３－２８８６（１９９１）、Ａｓｈｋｅｎａｚｉら、「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１０５３５－１０５３９（１９９１）、Ｐｅｐｐｅｌら、「Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４：１４８３－１４８９（１９９１）、Ｋｏｌｌｓら、「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ」９１：２１５～２１９（１９９４）、Ｂｕｔｌｅｒら、「Ｃｙｔｏｋｉｎｅ」６（６）：６１６～６２３（１９９４）；Ｂａｋｅｒら、「Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．」２４：２０４０～２０４８（１９９４）、Ｂｅｕｔｌｅｒら、米国特許第５，４４７，８５１号及び米国出願第０８／４４２，１３３号（１９９５年５月１６日出願）、これらの参照文献の各々は、参照により全体が本明細書に組み込まれる）。免疫受容体融合分子の生成方法は、Ｃａｐｏｎら、米国特許第５，１１６，９６４号、Ｃａｐｏｎら、米国特許第５，２２５，５３８号及びＣａｐｏｎら、「Ｎａｔｕｒｅ」３３７：５２５～５３１（１９８９）にも見ることができ、これらの参照文献は参照により全体が本明細書に組み込まれる。
【0154】
ＴＮＦ受容体分子の機能的等価物、誘導体、断片、又は領域は、本発明に使用することができるＴＮＦ受容体分子に機能的に類似するのに十分な大きさ及び配列のものである（例えば、ＴＮＦαに高い親和性で結合し、低い免疫原性を有する）、ＴＮＦ受容体分子の部分、又はＴＮＦ受容体分子をコード化するＴＮＦ受容体分子配列の部分を指す。ＴＮＦ受容体分子の機能的等価物は又、本発明に使用することができるＴＮＦ受容体分子に機能的に類似する（例えば、ＴＮＦαに高い親和性で結合し、低い免疫原性を有する）修飾されたＴＮＦ受容体分子も含む。例えば、ＴＮＦ受容体分子の機能的等価物は「ＳＩＬＥＮＴ」コドン、又は１つ又は２つ以上のアミノ酸置換、欠失、若しくは付加（例えば、１個の酸性アミノ酸を別の酸性アミノ酸の代わりに用いるか、又は同じ若しくは異なる疎水性アミノ酸をコードする１つのコドンを、疎水性アミノ酸をコードする別のコドンの代わりに用いる）を含有し得る。Ａｕｓｕｂｅｌら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８７～２０００）を参照のこと。
【0155】
サイトカインは、いかなる既知のサイトカインも包含する。例えば、ＣｏｐｅｗｉｔｈＣｙｔｏｋｉｎｅｓ．ｃｏｍを参照されたい。サイトカイン拮抗薬としては、任意の抗体、断片若しくは模倣薬、任意の可溶性受容体、断片若しくは模倣薬、任意の低分子拮抗薬、又はそれらの任意の組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
【0156】
療法による治療。本発明の任意の方法は、かかる調節、治療又は療法を必要としている細胞、組織、器官、動物又は患者に、少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体を含む有効量の組成物又は医薬組成物を投与することを含む、ＴＮＦ媒介障害を治療するための方法を含み得る。かかる方法は、任意選択的に、かかる免疫疾患の治療のための同時投与又は併用療法を更に含み得、この少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体、特定された部分又はその変異体の投与は、少なくとも１つのＴＮＦ拮抗薬（例えば、ＴＮＦ抗体若しくは断片、可溶性ＴＮＦ受容体若しくは断片、その融合タンパク質、又は低分子ＴＮＦ拮抗薬などであるが、これらに限定されない）、抗リウマチ薬（例えば、メトトレキサート、オーラノフィン、アウロチオグルコース、アザチオプリン、エタネルセプト、金チオリンゴ酸ナトリウム、硫酸ヒドロキシクロロキン、レフルノミド、スルファサラジン）、筋弛緩薬、麻薬、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、鎮痛薬、麻酔薬、鎮静薬、局所麻酔薬、神経筋ブロッカ、抗菌薬（例えば、アミノグリコシド、抗真菌薬、駆虫薬、抗ウイルス薬、カルバペナム、セファロスポリン、フルオロキノロン、マクロライド、ペニシリン、スルホンアミド、テトラサイクリン、他の抗菌薬）、抗乾癬剤、コルチコステロイド、アナボリックステロイド、糖尿病関連薬、ミネラル、栄養薬、甲状腺薬、ビタミン、カルシウム関連ホルモン、止瀉薬、鎮咳薬、制吐剤、抗潰瘍剤、緩下剤、抗凝固薬、エリスロポエチン（例えば、エポエチンα）、フィルグラスチム（例えば、Ｇ－ＣＳＦ、Ｎｅｕｐｏｇｅｎ）、サルグラモスチム（ＧＭ－ＣＳＦ、Ｌｅｕｋｉｎｅ）、予防接種、免疫グロブリン、免疫抑制薬（例えば、バシリキシマブ、シクロスポリン、ダクリズマブ）、成長ホルモン、ホルモン補充薬、エストロゲン受容体調節薬、散瞳薬、毛様筋麻痺薬、アルキル化剤、抗代謝剤、有糸分裂阻害剤、放射性医薬品、抗うつ薬、抗躁病薬、抗精神病薬、抗不安薬、催眠薬、交感神経作動薬、刺激薬、ドネペジル、タクリン、喘息薬、β作動薬、吸入ステロイド、ロイコトリエン阻害剤、メチルキサンチン、クロモリン、エピネフリン若しくは類似体、ドルナーゼα（Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅ）、サイトカイン若しくはサイトカイン拮抗薬から選択される少なくとも１つの前に、同時に、及び／又は後に投与することを更に含む。
【0157】
典型的には、病態の処置は、組成物中に含有される比活性に応じ、平均して、合計、１回の投与当たり患者の体重１ｋｇ当たり少なくとも約０．０１～５００ミリグラムの範囲の少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体、好ましくは、単回又は複数回投与当たり患者の体重１ｋｇ当たり少なくとも約０．１～１００ミリグラムの範囲の抗体の、少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体組成物の有効な量又は投与量を投与することにより達成される。あるいは、有効な血清濃度は、単回又は複数回投与当たり、０．１～５０００μｇ／ｍＬの血清濃度を含み得る。好適な投与量は、医療従事者には既知であり、当然のことながら、具体的な疾患状態、投与される組成物の比活性、及び処置を受けている具体的な患者に依存する。いくつかの場合では、望ましい治療量を達成するために、反復投与、すなわち特定の監視された用量又は計量された用量の反復個別投与を提供することが必要となる場合があり、この場合、個別投与は、所望の１日の投与量又は効果が得られるまで繰り返される。
【0158】
好ましい用量は、任意選択的に、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９及び／若しくは１００～５００ｍｇ／ｋｇ／投与、又はその任意の範囲、値若しくは分画を含むか、あるいは単回若しくは複数回投与当たり０．１、０．５、０．９、１．０、１．１、１．２、１．５、１．９、２．０、２．５、２．９、３．０、３．５、３．９、４．０、４．５、４．９、５．０、５．５、５．９、６．０、６．５、６．９、７．０、７．５、７．９、８．０、８．５、８．９、９．０、９．５、９．９、１０、１０．５、１０．９、１１、１１．５、１１．９、２０、１２．５、１２．９、１３．０、１３．５、１３．９、１４．０、１４．５、１５、１５．５、１５．９、１６、１６．５、１６．９、１７、１７．５、１７．９、１８、１８．５、１８．９、１９、１９．５、１９．９、２０、２０．５、２０．９、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９６、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００及び／若しくは５０００μｇ／ｍＬの血清濃度、又はその任意の範囲、値若しくは分画を得るように含み得る。
【0159】
あるいは、投与される用量は、特定の薬剤の薬力学的特徴並びにその投与方法及び経路、受容者の年齢、健康状態及び体重、症状の性質及び程度、同時治療の種類、処置頻度、並びに所望の作用などの周知の因子に応じて異なり得る。活性成分の投与量は、通常、体重１キログラム当たり約０．１～１００ミリグラムであり得る。通常、投与当たり１キログラム当たり０．１～５０、好ましくは０．１～１０ミリグラム又は徐放性形態が、望ましい結果を得るために有効である。
【0160】
非限定的な例として、ヒト又は動物の処置は、単回、注入又は反復投与を使用して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９若しくは４０日目のうちの少なくとも１日に、あるいは又は追加的に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１若しくは５２週目のうちの少なくとも１週に、あるいは又は追加的に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９若しくは２０年目のうちの少なくとも１年に、又はこれらの任意の組合せで、１日当たり０．１～１００ｍｇ／ｋｇ、例えば、０．５、０．９、１．０、１．１、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００ｍｇ／ｋｇの、本発明の少なくとも１つの抗体の１回又は周期的な投与量として提供され得る。
【0161】
体内投与に好適な剤形（組成物）は、一般に、１単位又は容器当たり約０．１ミリグラム～約５００ミリグラムの活性成分を含有する。これらの医薬組成物において、活性成分は、組成物の総重量に基づいて、通常、約０．５～９９．９９９重量％の量で存在する。
【0162】
非経口投与には、抗体は、薬学的に許容できる非経口ビヒクルと合わせて、又は別途供給される、溶液、懸濁液、エマルジョン若しくは凍結乾燥粉末として、処方することができる。このような溶剤の実施例は、水、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、及び１～１０％ヒト血清アルブミンである。リポソーム及び固定油などの非水性ビヒクルを使用することもできる。溶剤又は凍結乾燥粉末は、等張性及び化学安定性を維持する添加剤（例えば、等張性に関しては塩化ナトリウム、マンニトール、化学安定性に関しては緩衝剤及び保存剤）を含有することができる。製剤は、周知の又は好適な技術によって滅菌される。
【0163】
好適な医薬担体は、本分野での標準的参考書であるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ａ．Ｏｓｏｌの最新版に記載されている。
【0164】
代替的投与。製薬学的に有効な量の、本発明による少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体を投与するために、本発明により、多くの既知の及び開発された投与方法を使用することができる。以下の記述では経肺投与が使用されているが、本発明に従って他の投与方式を使用して、好適な結果を得てもよい。
【0165】
本発明のＴＮＦ抗体は、担体中で、溶液、エマルジョン、コロイド若しくは懸濁液として、又は乾燥粉末として、吸入によるか、又は本明細書に記載される若しくは当該技術分野において既知である他の方法による投与に適した様々なデバイス及び方法のいずれかを使用して、送達することができる。
【0166】
非経口製剤及び投与。非経口投与用製剤は、一般的な添加物として滅菌水又は生理食塩水、ポリエチレングリコールなどのポリアルキレングリコール、植物に由来する油、水素化ナフタレンなどを含有し得る。注射用の水性又は油性懸濁液は、周知の方法に従って、適切な乳化剤又は加湿剤及び懸濁剤を使用することによって調製可能である。注射剤は、例えば、水溶液、無菌注射液、又は溶媒中懸濁液などの非毒性の非経口投与可能な希釈剤であってよい。使用可能な溶剤又は溶媒としては、水、リンゲル液、等張生理食塩水などが許容され、通常の溶媒又は懸濁溶媒としては、無菌の不揮発性油を使用することができる。これらの目的では、天然又は合成若しくは半合成の、脂肪油又は脂肪酸、天然又は合成若しくは半合成の、モノグリセリド又はジグリセリド又はトリグリセリドを含む、あらゆる種類の不揮発性油及び脂肪酸を使用することができる。非経口投与は技術分野において周知であり、従来の注射手段、米国特許第５，８５１，１９８号に記載されているようなガス加圧式無針注射デバイス、及び米国特許第５，８３９，４４６号に記載されているようなレーザ穿孔機デバイスが挙げられるが、これらに限定されるものではなく、これらは参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
【0167】
代替的送達。本発明は更に、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、関節内、気管支内、腹内、包内、軟骨内、洞内、腔内、小脳内、脳室内、結腸内、頚管内、胃内、肝内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊髄内、滑液嚢内、胸郭内、子宮内、膀胱内、ボーラス、膣内、直腸、口腔内、舌下、鼻腔内、又は経皮手段による少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体の投与に関する。少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体組成物は、非経口（皮下、筋肉内又は静脈内）又は任意のその他の投与、特に、液体溶液若しくは懸濁液の形態で使用するために、特に、クリーム及び座薬などであるがこれらに限定されない半固体形態で、膣若しくは直腸の投与における使用のために、錠剤若しくはカプセルなどであるがこれらに限定されない形態で、口腔若しくは舌下投与用に、あるいは粉末、点鼻剤若しくはエアロゾル、又はある特定の薬剤などであるがこれらに限定されない形態で、鼻腔内に、あるいは皮膚構造を改変するか、又は経皮パッチ中の薬物濃度を増加させるかのいずれかのために、ジメチルスルホキシドなどの化学的促進剤を用いて（Ｊｕｎｇｉｎｇｅｒら、Ｉｎ「Ｄｒｕｇ Ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ」；Ｈｓｉｅｈ，Ｄ．Ｓ．（編）、５９～９０（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９９４、参照により全体が本明細書に組み込まれる）、又はタンパク質及びペプチドを含有する製剤の皮膚への適用を可能にする酸化剤を用いて（国際公開第９８／５３８４７号）、又はエレクトロポレーションなどの一過性の輸送経路を作り出すための、若しくはイオントフォレシスなどの皮膚を通して荷電薬物の移動度を増加させるための電界の適用、又は超音波導入などの超音波の適用（米国特許第４，３０９，９８９号及び同第４，７６７，４０２号）を用いて、ゲル、軟膏、ローション、懸濁液若しくはパッチ送達系などであるが、これらに限定されずに、経皮的に、調製することができる（上記の刊行物及び特許は、参照により全体が本明細書に組み込まれる）。
【0168】
経肺／鼻腔内投与。経肺投与のためには、好ましくは、少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体組成物は、肺の下気道又は洞に達するのに有効な粒径で送達される。本発明により、少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体は、吸入により治療薬を投与するための、当該技術分野において既知の様々な吸入又は鼻腔内デバイスのいずれかにより送達することができる。患者の洞腔又は肺胞内にエアロゾル化した製剤を被着させることができるこれらのデバイスとしては、定量吸入器、ネブライザ、乾燥粉末発生器、噴霧器などが挙げられる。抗体の経肺又は鼻腔内投与を目的とするのに適したその他のデバイスも、当該技術分野において既知である。かかるデバイスは全てエアロゾル中の抗体を分配するための投与に適した製剤を使用することができる。このようなエアロゾルは、溶液（水性及び非水性の両方）又は固体粒子のいずれかで構成されることができる。Ｖｅｎｔｏｌｉｎ（登録商標）定量吸入器のような定量吸入器は、典型的には噴射ガスを使用し、吸気時の作動を必要とする（例えば、国際公開第９４／１６９７０号、国際公開第９８／３５８８８号を参照のこと）。Ｔｕｒｂｕｈａｌｅｒ（商標）（Ａｓｔｒａ）、Ｒｏｔａｈａｌｅｒ（登録商標）（Ｇｌａｘｏ）、Ｄｉｓｋｕｓ（登録商標）（Ｇｌａｘｏ）、Ｓｐｉｒｏｓ（商標）吸入器（Ｄｕｒａ）、Ｉｎｈａｌｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓにより市販されているデバイス、及びＳｐｉｎｈａｌｅｒ（登録商標）粉末吸入器（Ｆｉｓｏｎｓ）などの乾燥粉末吸入器は、混合粉末の呼気作動を使用する（米国特許第４６６８２１８号（Ａｓｔｒａ）、欧州特許第２３７５０７号（Ａｓｔｒａ）、国際公開第９７／２５０８６号（Ｇｌａｘｏ）、国際公開第９４／０８５５２号（Ｄｕｒａ）、米国特許第５４５８１３５号（Ｉｎｈａｌｅ）、国際公開第９４／０６４９８号（Ｆｉｓｏｎｓ）、参照により全体が本明細書に組み込まれる）。ＡＥＲｘ（商標）Ａｒａｄｉｇｍ、ｔｈｅ Ｕｌｔｒａｖｅｎｔ（登録商標）ネブライザ（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ）、及びＡｃｏｒｎ ＩＩ（登録商標）ネブライザ（Ｍａｒｑｕｅｓｔ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）（米国特許第５４０４８７１号Ａｒａｄｉｇｍ、国際公開第９７／２２３７６号）などのネブライザ、（以上の参考文献は参照により全体が本明細書に組み込まれる）は溶液からエアロゾルを発生させるのに対し、定量吸入器、乾燥粉末吸入器などは小粒子エアロゾルを発生させる。市販の吸入デバイスのこれらの具体例は、本発明の実施に適した特定のデバイスを代表するものとして意図されており、本発明の範囲を制限するものとして意図されているものではない。好ましくは、少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体を含む組成物は、乾燥粉末吸入器又は噴霧器によって送達される。本発明の少なくとも１つの抗体を投与するための吸入デバイスには、複数の望ましい特徴が存在する。例えば、吸入デバイスによる送達は、有利に信頼性が高く、再現可能であり、かつ正確である。吸入デバイスは任意選択的に、うまく呼吸できるように、例えば、約１０μｍ未満、好ましくは約１～５μｍの小さな乾燥粒子を送達することができる。
【0169】
スプレーでのＴＮＦ抗体組成物の投与。ＴＮＦ抗体組成物タンパク質を含むスプレーは、少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体の懸濁液又は溶液に加圧下でノズルを通過させることにより生じさせることができる。ノズルの大きさ及び構成、適用される圧力並びに液体供給速度は、所望の出力及び粒径を達成するように選定することができる。例えば、キャピラリー又はノズルフィードと共に電界により電気スプレーを作製することができる。有利なことに、噴霧器により送達される少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体組成物タンパク質の粒子は、約１０μｍ未満、好ましくは約１μｍ～約５μｍ、最も好ましくは約２μｍ～約３μｍの範囲の粒径を有する。
【0170】
噴霧器で使用するのに適した少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体組成物タンパク質の製剤は、典型的には、水溶液中に、例えば、０．１、０．２．、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００ｍｇ／ｍＬ若しくは１００ｍｇ／ｇｍであるがこれらに限定されない、１ｍｌ若しくは１ｍｇ／ｇｍの溶液当たり約０．１ｍｇ～約１００ｍｇ、又はその中の任意の範囲若しくは値の少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体組成物タンパク質の濃度で抗体組成物タンパク質を含む。この製剤は、添加物、緩衝剤、等張剤、保存剤、界面活性剤、及び好ましくは亜鉛などの薬剤を含み得る。この製剤は、添加物、還元剤、バルクタンパク質又は炭水化物などの抗体組成物タンパク質を安定化させるための賦形剤又は薬剤も含み得る。抗体組成物タンパク質の処方において有用なバルクタンパク質には、アルブミン、プロタミンなどが挙げられる。抗体組成物タンパク質の処方において有用な典型的な炭水化物としては、ショ糖、マンニトール、乳糖、トレハロース、グルコースなどが挙げられる。抗体組成物タンパク質製剤は、エアロゾル形成時の溶液の霧化により引き起こされる抗体組成物タンパク質の表面誘発性の凝集を低減又は阻止することができる界面活性剤も含み得る。ポリオキシエチレン脂肪酸エステル及びアルコール、並びにポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステルのような様々な従来の界面活性剤を使用することができる。量は一般に、製剤の０．００１～１４重量％の範囲にわたる。本発明の目的上とりわけ好ましい界面活性剤は、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０などである。ＴＮＦ抗体又は特定された部分若しくは変異体などのタンパク質の製剤には、当該技術分野において既知の更なる薬剤も又製剤中に含むことができる。
【0171】
ネブライザによるＴＮＦ抗体組成物の投与。抗体組成物タンパク質は、ジェットネブライザ又は超音波ネブライザなどのネブライザにより投与することができる。典型的には、ジェットネブライザでは、オリフィスを通して高速の空気ジェットを作り出すのに圧縮空気供給源を使用する。ガスがノズルを超えて膨脹する際に低圧領域が作り出され、それが液体リザーバに接続された毛細管を通して抗体組成物タンパク質の溶液を引き出す。毛細管からの液体流は、それが管を出る際に不安定な糸状体及び液滴に剪断されてエアロゾルを作り出す。ある範囲の構成、流速及びバッフル型を、所定のジェットネブライザからの所望の性能の特徴を達成するのに使用することができる。超音波ネブライザにおいては、高周波電気エネルギーを使用して、典型的には圧電変換器を使用して、振動性の機械的エネルギーを作り出す。このエネルギーが、直接又はカップリング液を通じてのいずれかで抗体組成物タンパク質の製剤に伝播されて、抗体組成物タンパク質を含むエアロゾルを作り出す。有利なことに、ネブライザにより送達される抗体組成物タンパク質の粒子は、約１０μｍ未満、好ましくは約１μｍ～約５μｍ、最も好ましくは約２μｍ～約３μｍの範囲の粒径を有する。
【0172】
ジェット又は超音波のいずれかのネブライザでの使用に適した少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体の製剤は、典型的には、溶液１ｍｌ当たり約０．１ｍｇ～約１００ｍｇの少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体タンパク質の濃度を含む。この製剤は、添加物、緩衝剤、等張剤、保存剤、界面活性剤、及び好ましくは亜鉛などの薬剤を含み得る。この製剤は、緩衝剤、還元剤、バルクタンパク質、又は炭水化物などの少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体組成物タンパク質の安定化のための添加物又は薬剤も含み得る。少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体組成物タンパク質の処方において有用なバルクタンパク質には、アルブミン、プロタミンなどが挙げられる。少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体の処方において有用な典型的な炭水化物としては、ショ糖、マンニトール、乳糖、トレハロース、グルコースなどが挙げられる。少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体製剤は、エアロゾル形成時に溶液の霧化により引き起こされる少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体の表面誘発性の凝集を低減又は阻止し得る界面活性剤も含み得る。ポリオキシエチレン脂肪酸エステル及びアルコール、並びにポリオキシエチレンソルビタル脂肪酸エステルのような様々な従来の界面活性剤を使用することができる。量は、一般に製剤の０．００１～４重量％の範囲である。本発明の目的上とりわけ好ましい界面活性剤は、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０などである。抗体タンパク質などのタンパク質の製剤には、当該技術分野において既知の更なる薬剤も又製剤中に含むことができる。
【0173】
定量吸入器によるＴＮＦ抗体組成物の投与。定量吸入器（ＭＤＩ）では、噴射剤、少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体及び任意の添加物又はその他の添加剤が、液化圧縮ガスを含む混合物としてキャニスタ内に収容される。絞り弁の作動により、好ましくは、約１０μｍ未満、好ましくは約１μｍ～約５μｍ、最も好ましくは約２μｍ～３μｍの範囲のサイズの粒子を含有するエアロゾルとしての混合物が放出される。ジェット粉砕、噴霧乾燥、臨界点凝結などを含む、当業者に既知の様々な方法により産生された抗体組成物タンパク質の製剤を用いることにより、所望のエアロゾル粒径を得ることができる。好ましい定量吸入器としては、３Ｍ又はＧｌａｘｏにより製造されかつヒドロフルオロカーボン噴射剤を使用するものが挙げられる。
【0174】
定量吸入器デバイスで使用するための少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体の製剤は、一般に、少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体を、例えば、界面活性剤の助けを借りて噴射剤中に懸濁した非水性溶媒中の懸濁液として含有する微粉を含む。噴射剤は、トリクロロフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタノール及び１，１，１，２－テトラフルオロエタン、ＨＦＡ－１３４ａ（ヒドロフルオロアルカン－１３４ａ）、ＨＦＡ－２２７（ヒドロフルオロアルカン－２２７）などが挙げられる、クロロフルオロカーボン、ヒドロクロロフルオロカーボン、ヒドロフルオロカーボン、又は炭化水素のような本目的上使用される任意の従来の物質であることができる。好ましくは、噴射剤はヒドロフルオロカーボンである。界面活性剤は、少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体を噴射剤中の懸濁液として安定化させる、活性薬剤を化学的分解に対して保護するなどのために選択することができる。好適な界面活性剤には、ソルビタントリオレエート、ダイズレシチン、オレイン酸などが挙げられる。場合によっては、エタノールなどの溶媒を使用する溶液エアロゾルが好ましい。タンパク質の製剤には、当該技術分野で既知の更なる薬剤を製剤中に含んでもよい。
【0175】
当業者は、本発明の方法が、本明細書に記載されないデバイスを介する少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体組成物の経肺投与により達成され得ることを認識するであろう。
【0176】
経口製剤及び投与。経口のための製剤は、腸壁の浸透性を人工的に増加させるためのアジュバント（例えば、レゾルシノール、並びにポリオキシエチレンオレイルエーテル及びｎ－ヘキサデシルポリエチレンエーテルなどの非イオン性界面活性剤）の同時投与、並びに酵素的分解を阻害するための酵素阻害剤（例えば、膵トリプシン阻害剤、ジイソプロピルフルオロリン酸（ＤＦＦ）及びトラシロール）の同時投与による。経口投与のための固体型剤形の活性成分化合物は、ショ糖、乳糖、セルロース、マンニトール、トレハロース、ラフィノース、マルチトール、デキストラン、デンプン、寒天、アルギン酸塩、キチン、キトサン、ペクチン、トラガカントガム、アラビアゴム、ゼラチン、コラーゲン、カゼイン、アルブミン、合成又は半合成ポリマー、及びグリセリドなどの、少なくとも１つの添加剤と混合することができる。これらの剤形は又、他の種類の添加剤、例えば、不活性希釈剤、滑沢剤（ステアリン酸マグネシウムなど）、パラベン、保存剤（ソルビン酸、アスコルビン酸、α－トコフェロールなど）、抗酸化剤（システインなど）、崩壊剤、結合剤、増粘剤、緩衝剤、甘味剤、着香剤、香料などを含有し得る。
【0177】
錠剤及び丸剤は腸溶コーティング調製物に更に加工することができる。経口投与のための液体調製物には、医学的用途に許容できるエマルジョン、シロップ、エリキシル剤、懸濁剤及び溶液調製物が挙げられる。これらの調製物は、当該分野で通例に使用される不活性希釈剤、例えば水を含有することができる。リポソームはインスリン及びヘパリンの薬物送達系としても記述されている（米国特許第４，２３９，７５４号）。より最近では、混合アミノ酸の人工的ポリマーのミクロスフェア（プロテイノイド）が、医薬品を送達するために使用されている（米国特許第４，９２５，６７３号）。更に、米国特許第５，８７９，６８１号及び米国特許第５，５，８７１，７５３号に記載される担体化合物が、生物学的活性薬剤を経口で送達するのに使用されることは、当該技術分野において既知である。
【0178】
粘膜製剤及び投与。粘膜表面を通る吸収のため、少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体を投与するための組成物及び方法は、複数のサブミクロン粒子と、粘膜付着性巨大分子と、生物活性ペプチドと、エマルジョン粒子の粘膜付着を達成することにより粘膜表面を通る吸収を促進する水性連続相と、を含む、エマルジョンを含む（米国特許第５，５１４，６７０号）。本発明のエマルジョンの適用に適する粘膜表面には、角膜、結膜、口腔内、舌下、鼻、膣、肺、胃、腸、及び直腸投与経路を挙げることができる。膣又は直腸投与のための製剤、例えば座薬は、添加物として、例えば、ポリアルキレングリコール、ワセリン、カカオバターなどを含有し得る。鼻内投与のための処方は固体であってよく、添加物として、例えば乳糖を含有することができ、又は水性若しくは油性溶液の点鼻薬であることができる。口腔内投与のために、添加物として、糖、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、αデンプン（pregelinatined starch）などが挙げられる（米国特許第５，８４９，６９５号）。
【0179】
経皮製剤及び投与。経皮投与のために、少なくとも１つの抗ＴＮＦ抗体を、リポソーム若しくはポリマーナノ粒子、微小粒子、マイクロカプセル又はミクロスフェア（特に明示しない限り、集合的に微小粒子と称する）などの送達デバイス中にカプセル化する。ポリ乳酸、ポリグリコール酸及びそれらのコポリマーなどのポリヒドロキシ酸、ポリオルトエステル、ポリ無水物及びポリホスファゼンなどの合成ポリマー、並びにコラーゲン、ポリアミノ酸、アルブミン及びその他のタンパク質などの天然ポリマー、アルギン酸塩及びその他の多糖類並びにそれらの組合せから作製される微小粒子を含む多くの好適なデバイスが既知である（米国特許第５，８１４，５９９号）。
【0180】
長時間投与及び製剤。本発明の化合物を、単回投与により、長期間にわたり、例えば、１週～１年間、対象に送達することが時折望ましい場合がある。様々な徐放、デポー又は埋め込み剤形を利用することができる。例えば、剤形は、体液において溶解度が低い化合物の薬学的に許容できる非毒性塩、例えば、（ａ）リン酸、硫酸、クエン酸、酒石酸、タンニン酸、パモ酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンモノ－又はジスルホン酸、ポリガラクツロン酸などの多塩基酸との酸付加塩、（ｂ）亜鉛、カルシウム、ビスマス、バリウム、マグネシウム、アルミニウム、銅、コバルト、ニッケル、カドミウムなどの多価金属カチオン、又は例えば、Ｎ，Ｎ’－ジベンジル－エチレンジアミン若しくはエチレンジアミンから形成された有機カチオンを有する塩、あるいは（ｃ）（ａ）及び（ｂ）の組合せ、例えば、タンニン酸亜鉛塩を含有し得る。加えて、本発明の化合物、又は好ましくは前述したものなどの比較的不溶性の塩を、注射に好適な、例えばゴマ油と共に、例えば、モノステアリン酸アルミニウムゲルなどのゲル中に処方することができる。とりわけ好ましい塩は、亜鉛塩、亜鉛タンニン酸塩、パモ酸塩などである。別の種類の注射用徐放デポー製剤は、例えば米国特許第３，７７３，９１９号に記載されるポリ乳酸／ポリグリコール酸ポリマーなどのゆっくりと分解する非毒性の非抗原性ポリマー中にカプセル化されるために分散された化合物又は塩を含有する。化合物、又は好ましくは上述したものなどの比較的不溶性の塩は、特に動物での使用のために、コレステロールマトリックスのシラスティックペレット中に処方することもできる。更なる徐放デポー又は埋め込み製剤、例えば、ガス又は液体リポソームは、文献（米国特許第５，７７０，２２２号、及び「Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ」，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．，１９７８）で既知である。
【0181】
本発明を全般的に記述したことから、同様物は、具体的説明として提供されるが制限することを意図していない以下の実施例を参照することにより、より容易に理解されるであろう。
【0182】
実施例１：哺乳類細胞におけるＴＮＦ抗体のクローニング及び発現。
典型的な哺乳動物発現ベクタは、ｍＲＮＡの転写の開始を媒介する少なくとも１つのプロモータ要素、抗体コード配列、並びに転写の終結及び転写物のポリアデニル化に必要なシグナルを含む。付加的な要素には、エンハンサ、コザック配列並びにＲＮＡスプライシングのためのドナー及びアクセプタ部位に隣接している介在配列が含まれる。高効率の転写は、ＳＶ４０からの初期及び後期プロモータ、レトロウイルス、例えば、ＲＳＶ、ＨＴＬＶＩ、ＨＩＶＩからの長末端反復（ＬＴＲＳ）、及びサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の初期プロモータで達成することができる。しかしながら、細胞要素を使用することもできる（例えば、ヒトアクチンプロモータ）。本発明の実施において使用するのに好適な発現ベクタとしては、例えば、ｐＩＲＥＳ１ｎｅｏ、ｐＲｅｔｒｏ－Ｏｆｆ、ｐＲｅｔｒｏ－Ｏｎ、ＰＬＸＳＮ若しくはｐＬＮＣＸ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ Ｌａｂｓ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）、ｐｃＤＮＡ３．１（＋／－）、ｐｃＤＮＡ／Ｚｅｏ（＋／－）又はｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｙｇｒｏ（＋／－）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＰＳＶＬ及びＰＭＳＧ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）、ｐＲＳＶｃａｔ（ＡＴＣＣ ３７１５２）、ｐＳＶ２ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ ３７１４６）並びにｐＢＣ１２ＭＩ（ＡＴＣＣ ６７１０９）などのベクタが挙げられる。使用することができる哺乳動物の宿主細胞には、ヒトＨｅｌａ２９３、Ｈ９及びＪｕｒｋａｔ細胞、マウスＮＩＨ３Ｔ３及びＣ１２７細胞、Ｃｏｓ１、Ｃｏｓ７及びＣＶ１、ウズラＱＣ１－３細胞、マウスＬ細胞及びチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が含まれる。
典型的な哺乳動物発現ベクタは、ｍＲＮＡの転写の開始を媒介する少なくとも１つのプロモータ要素、抗体コード配列、並びに転写の終結及び転写物のポリアデニル化に必要なシグナルを含む。付加的な要素には、エンハンサ、コザック配列並びにＲＮＡスプライシングのためのドナー及びアクセプタ部位に隣接している介在配列が含まれる。高効率の転写は、ＳＶ４０からの初期及び後期プロモータ、レトロウイルス、例えば、ＲＳＶ、ＨＴＬＶＩ、ＨＩＶＩからの長末端反復（ＬＴＲＳ）、及びサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の初期プロモータで達成することができる。しかしながら、細胞要素を使用することもできる（例えば、ヒトアクチンプロモータ）。本発明の実施において使用するのに好適な発現ベクタとしては、例えば、ｐＩＲＥＳ１ｎｅｏ、ｐＲｅｔｒｏ－Ｏｆｆ、ｐＲｅｔｒｏ－Ｏｎ、ＰＬＸＳＮ若しくはｐＬＮＣＸ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ Ｌａｂｓ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）、ｐｃＤＮＡ３．１（＋／－）、ｐｃＤＮＡ／Ｚｅｏ（＋／－）又はｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｙｇｒｏ（＋／－）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＰＳＶＬ及びＰＭＳＧ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）、ｐＲＳＶｃａｔ（ＡＴＣＣ ３７１５２）、ｐＳＶ２ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ ３７１４６）並びにｐＢＣ１２ＭＩ（ＡＴＣＣ ６７１０９）などのベクタが挙げられる。使用することができる哺乳動物の宿主細胞には、ヒトＨｅｌａ２９３、Ｈ９及びＪｕｒｋａｔ細胞、マウスＮＩＨ３Ｔ３及びＣ１２７細胞、Ｃｏｓ１、Ｃｏｓ７及びＣＶ１、ウズラＱＣ１－３細胞、マウスＬ細胞及びチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が含まれる。
【0183】
あるいは、遺伝子を、染色体に組み込まれた遺伝子を含有する安定した細胞株において発現させることができる。ｄｈｆｒ、ｇｐｔ、ネオマイシン、又はハイグロマイシンなどの選択マーカとの共トランスフェクションは、トランスフェクトされた細胞の特定及び単離を可能にする。
【0184】
トランスフェクトされた遺伝子は又、大量のコード化された抗体を発現するために増幅され得る。ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸レダクターゼ）マーカは、目的の遺伝子の数百又は更には数千のコピーを有する細胞株を開発するのに有用である。別の有用な選択マーカは、酵素グルタミンシンターゼ（ＧＳ）である（Ｍｕｒｐｈｙら、「Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．」２２７：２７７～２７９（１９９１）、Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎら、「Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」１０：１６９～１７５（１９９２））。これらのマーカを使用して、哺乳動物細胞を選択的培地中で成長させ、最も高い耐性を有する細胞が選択される。これらの細胞株は、染色体に組み込まれた増幅遺伝子を含有する。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）及びＮＳＯ細胞が抗体の生成に使用されることが多い。
【0185】
発現ベクタｐＣ１及びｐＣ４は、ラウス肉腫ウイルスの強いプロモータ（ＬＴＲ）（Ｃｕｌｌｅｎら、「Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．」５：４３８～４４７（１９８５））に加え、ＣＭＶエンハンサ（Ｂｏｓｈａｒｔら、「Ｃｅｌｌ」４１：５２１～５３０（１９８５））の断片を含有する。例えば、制限酵素切断部位ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ及びＡｓｐ７ｌ８を伴う複数のクローニング部位は、目的の遺伝子のクローニングを容易にする。ベクタは更に、ラットプレプロインスリン遺伝子の３’イントロン、ポリアデニル化及び終結シグナルを含有する。
【0186】
ＣＨＯ細胞におけるクローニング及び発現。ベクタｐＣ４は、ＴＮＦ抗体の発現に使用される。プラスミドｐＣ４は、プラスミドｐＳＶ２－ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ受託番号３７１４６）の誘導体である。このプラスミドは、ＳＶ４０初期プロモータの制御下でマウスＤＨＦＲ遺伝子を含有する。これらのプラスミドでトランスフェクトされる、ジヒドロ葉酸活性を欠くチャイニーズハムスター卵巣細胞又はその他の細胞は、化学療法剤メトトレキサートを補充した選択的培地（例えば、α－ＭＥＭ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）中で細胞を成長させることによって選択することができる。メトトレキサート（ＭＴＸ）に耐性の細胞におけるＤＨＦＲ遺伝子の増幅は、充分に文書化されている（例えば、Ｆ．Ｗ．Ａｌｔら、「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」２５３：１３５７－１３７０（１９７８）、Ｊ．Ｌ．Ｈａｍｌｉｎ及びＣ．Ｍａ、「Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ」１０９７：１０７～１４３（１９９０）、及びＭ．Ｊ．Ｐａｇｅ及びＭ．Ａ．Ｓｙｄｅｎｈａｍ、「Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」９：６４～６８（１９９１）を参照のこと）。増大したＭＴＸ濃度において成長した細胞は、ＤＨＦＲ遺伝子の増幅の結果として、標的酵素であるＤＨＦＲの過剰生成により、薬物に対する耐性を発達させる。第２の遺伝子がＤＨＦＲ遺伝子に連結されている場合、通常、共増幅され、過剰発現される。このアプローチを使用して、増幅遺伝子の１，０００を超えるコピーを有する細胞株を開発することができることが、当該技術分野において知られている。続いて、メトトレキサートを回収する際、宿主細胞の１つ又は２つ以上の染色体に組み込まれた増幅遺伝子を含有する細胞株が得られる。
【0187】
プラスミドｐＣ４は、目的の遺伝子を発現するために、ラウス肉腫ウイルスの長末端反復（ＬＴＲ）の強いプロモータ（Ｃｕｌｌｅｎら、「Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．」５：４３８～４４７（１９８５））に加え、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の即初期遺伝子のエンハンサ（Ｂｏｓｈａｒｔら、「Ｃｅｌｌ」４１：５２１～５３０（１９８５））から単離された断片を含有する。プロモータの下流は、遺伝子の組み込みを可能にするＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ及びＡｓｐ７１８制限酵素切断部位である。これらのクローニング部位の後に、プラスミドは、ラットプレプロインスリン遺伝子の３’イントロン及びポリアデニル化部位を含有する。他の高効率のプロモータ、例えば、ヒトβアクチンプロモータ、ＳＶ４０初期若しくは後期プロモータ、又は他のレトロウイルス、例えばＨＩＶ及びＨＴＬＶＩからの長末端反復も発現のために使用することができる。ＣｌｏｎｔｅｃｈのＴｅｔ－Ｏｆｆ及びＴｅｔ－Ｏｎ遺伝子発現系、並びに類似の系を使用して、哺乳類細胞において調節された方法で、ＴＮＦを発現させることができる（Ｍ．Ｇｏｓｓｅｎ及びＨ．Ｂｕｊａｒｄ、「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ」８９：５５４７～５５５１（１９９２））。ｍＲＮＡのポリアデニル化のために、例えば、ヒト成長ホルモン又はグロビン遺伝子からの他のシグナルも使用することができる。染色体に組み込まれた目的の遺伝子を有する安定した細胞株は、ｇｐｔ、Ｇ４１８又はハイグロマイシンなどの選択マーカとの共トランスフェクションの際に選択することもできる。最初に１つを超える選択マーカ、例えばＧ４１８、に加えてメトトレキサートを使用するのが有利である。
【0188】
このプラスミドｐＣ４を制限酵素で消化した後に、当該技術分野において既知の手順により、子ウシ腸ホスファターゼを使用して脱リン酸化する。次に、ベクタは１％アガロースゲルから単離される。
【0189】
次に、単離された可変及び定常領域コードＤＮＡ及び脱リン酸化ベクタをＴ４ ＤＮＡリガーゼで連結する。次に、大腸菌ＨＢ１０１又はＸＬ－１ Ｂｌｕｅ細胞を形質転換し、例えば、制限酵素分析を使用して、プラスミドｐＣ４に挿入された断片を含有する細菌を特定する。
【0190】
トランスフェクションには、活性ＤＨＦＲ遺伝子が欠損しているチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が使用される。５μｇの発現プラスミドｐＣ４は、リポフェクチンを使用して、０．５μｇのプラスミドｐＳＶ２－ｎｅｏで共トランスフェクトされる。プラスミドｐＳＶ２－ｎｅｏは、優性の選択マーカである、Ｇ４１８を含む一群の抗生物質に対して耐性を付与する酵素をコードするＴｎ５からのｎｅｏ遺伝子を含有する。１μｇ／ｍＬのＧ４１８で補充したαマイナスＭＥＭに細胞を播種する。２日後、細胞をトリプシン処理し、ハイブリドーマクローニングプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中の、１０、２５、又は５０ｎｇ／ｍＬのメトトレキサート＋１μｇ／ｍＬのＧ４１８で補充したαマイナスＭＥＭに播種する。約１０～１４日後、単一クローンをトリプシン処理した後、異なる濃度のメトトレキサート（５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、４００ｎＭ、８００ｎＭ）を使用して、６ウェルペトリ皿又は１０ｍＬフラスコに播種する。次に、最高濃度のメトトレキサートで成長させているクローンを、更に高い濃度のメトトレキサート（１ｍＭ、２ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ）を含む新しい６ウェルプレートに移す。１００～２００ｍＭの濃度で成長するクローンが得られるまで同じ手順を繰り返す。所望の遺伝子生成物の発現は、例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットによって、又は逆相ＨＰＬＣ分析によって分析される。
【0191】
実施例２：トランスジェニックマウスを使用する、ヒトＴＮＦと反応する高親和性ヒトＩｇＧモノクローナル抗体の生成。
概要。ヒト重鎖及び軽鎖免疫グロブリン遺伝子を含有するトランスジェニックマウスを使用して、１つ又は２つ以上のＴＮＦ媒介性疾患の処置のための、ＴＮＦ作用を阻害するために治療的に使用することができる高親和性の完全ヒトモノクローナル抗体を生成する。重鎖及び軽鎖両方のヒト可変及び定常領域抗体導入遺伝子を含有する（ＣＢＡ／ＪｘＣ５７／ＢＬ６／Ｊ）Ｆ２ハイブリッドマウスをヒト組換えＴＮＦで免疫する（Ｔａｙｌｏｒら、「Ｉｎｔｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．」６：５７９－５９１（１９９３）、Ｌｏｎｂｅｒｇら、「Ｎａｔｕｒｅ」３６８：８５６～８５９（１９９４）、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．、「Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．」１４：８２６（１９９６）、Ｆｉｓｈｗｉｌｄら、「Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」１４：８４５～８５１（１９９６））。いくつかの融合物が完全ヒトＴＮＦ反応性ＩｇＧモノクローナル抗体の１つ又は２つ以上のパネルを生み出した。完全ヒト抗ＴＮＦ抗体を更に特徴付けする。全てはＩｇＧ１κである。かかる抗体は、およそ１ｘ１０９～９ｘ１０１２の親和性定数を有することが分かっている。これらの完全ヒトモノクローナル抗体の予期せぬ高親和性により、それらはＴＮＦ関連疾患、病態、又は障害における治療用途のための好適な候補となる。
概要。ヒト重鎖及び軽鎖免疫グロブリン遺伝子を含有するトランスジェニックマウスを使用して、１つ又は２つ以上のＴＮＦ媒介性疾患の処置のための、ＴＮＦ作用を阻害するために治療的に使用することができる高親和性の完全ヒトモノクローナル抗体を生成する。重鎖及び軽鎖両方のヒト可変及び定常領域抗体導入遺伝子を含有する（ＣＢＡ／ＪｘＣ５７／ＢＬ６／Ｊ）Ｆ２ハイブリッドマウスをヒト組換えＴＮＦで免疫する（Ｔａｙｌｏｒら、「Ｉｎｔｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．」６：５７９－５９１（１９９３）、Ｌｏｎｂｅｒｇら、「Ｎａｔｕｒｅ」３６８：８５６～８５９（１９９４）、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．、「Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．」１４：８２６（１９９６）、Ｆｉｓｈｗｉｌｄら、「Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」１４：８４５～８５１（１９９６））。いくつかの融合物が完全ヒトＴＮＦ反応性ＩｇＧモノクローナル抗体の１つ又は２つ以上のパネルを生み出した。完全ヒト抗ＴＮＦ抗体を更に特徴付けする。全てはＩｇＧ１κである。かかる抗体は、およそ１ｘ１０９～９ｘ１０１２の親和性定数を有することが分かっている。これらの完全ヒトモノクローナル抗体の予期せぬ高親和性により、それらはＴＮＦ関連疾患、病態、又は障害における治療用途のための好適な候補となる。
【0192】
略語。ＢＳＡ－ウシ血清アルブミン、ＣＯ２－二酸化炭素、ＤＭＳＯ－ジメチルスルホキシド、ＥＩＡ－酵素イムノアッセイ、ＦＢＳ－ウシ胎児血清、Ｈ２Ｏ２－過酸化水素、ＨＲＰ－西洋わさびペルオキシダーゼ、ＩＤ－皮内、Ｉｇ－免疫グロブリン、ＴＮＦ－組織壊死因子α、ＩＰ－腹腔内、ＩＶ－静脈内、Ｍａｂ又はｍＡｂ－モノクローナル抗体、ＯＤ－光学密度、ＯＰＤ－ｏフェニレンジアミン二塩酸塩、ＰＥＧ－ポリエチレングリコール、ＰＳＡ－ペニシリン、ストレプトマイシン、アンホテリシン、ＲＴ－室温、ＳＱ－皮下、ｖ／ｖ－単位容量当たりの容量、ｗ／ｖ－単位容量当たりの重量。
【0193】
材料及び方法
動物。ヒト抗体を発現し得るトランスジェニックマウスは、当該技術分野において既知であり、（例えば、ＧｅｎＰｈａｒｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ、Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｆｒｅｅｍｏｎｔ，ＣＡなどから）市販されており、これはヒト免疫グロブリンを発現するが、マウスＩｇＭ又はＩｇκを発現しない。例えば、かかるトランスジェニックマウスは、Ｖ（Ｄ）Ｊ結合、重鎖クラススイッチ及び体細胞変異を受けてヒト配列免疫グロブリンのレパートリを生成する、ヒト配列導入遺伝子を含有する（Ｌｏｎｂｅｒｇら、「Ｎａｔｕｒｅ」３６８：８５６～８５９（１９９４））。軽鎖導入遺伝子は、例えば、部分的に、生殖系列ヒトＶκ領域のほぼ半分を含む酵母人工染色体クローンに由来し得る。加えて、重鎖導入遺伝子は、ヒトμ及びヒトγ１の両方（Ｆｉｓｈｗｉｌｄら、「Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」１４：８４５～８５１（１９９６））並びに／又はγ３定常領域をコードすることができる。適切な遺伝子型系統由来のマウスを免疫付与及び融合プロセスにおいて使用して、ＴＮＦに対する完全ヒトモノクローナル抗体を生成することができる。
動物。ヒト抗体を発現し得るトランスジェニックマウスは、当該技術分野において既知であり、（例えば、ＧｅｎＰｈａｒｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ、Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｆｒｅｅｍｏｎｔ，ＣＡなどから）市販されており、これはヒト免疫グロブリンを発現するが、マウスＩｇＭ又はＩｇκを発現しない。例えば、かかるトランスジェニックマウスは、Ｖ（Ｄ）Ｊ結合、重鎖クラススイッチ及び体細胞変異を受けてヒト配列免疫グロブリンのレパートリを生成する、ヒト配列導入遺伝子を含有する（Ｌｏｎｂｅｒｇら、「Ｎａｔｕｒｅ」３６８：８５６～８５９（１９９４））。軽鎖導入遺伝子は、例えば、部分的に、生殖系列ヒトＶκ領域のほぼ半分を含む酵母人工染色体クローンに由来し得る。加えて、重鎖導入遺伝子は、ヒトμ及びヒトγ１の両方（Ｆｉｓｈｗｉｌｄら、「Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」１４：８４５～８５１（１９９６））並びに／又はγ３定常領域をコードすることができる。適切な遺伝子型系統由来のマウスを免疫付与及び融合プロセスにおいて使用して、ＴＮＦに対する完全ヒトモノクローナル抗体を生成することができる。
【0194】
免疫付与。１つ又は２つ以上の免疫付与スケジュールは、抗ＴＮＦヒトハイブリドーマを生成するために使用することができる。以下の例示的な免疫付与プロトコルに従って、最初のいくつかの融合を行うことができるが、他の類似の既知のプロトコルを使用することもできる。数匹の１４～２０週齢の雌及び／又は外科的に去勢した雄のトランスジェニックマウスに対して、最終容量１００～４００μＬ（例えば、２００）で等量のＴＩＴＥＲＭＡＸ又は完全フロイントアジュバントで乳化した１～１０００μｇの組換えヒトＴＮＦをＩＰ又はＩＤに接種する。各マウスは、任意選択的に、２ＳＱ部位の各々に１００μＬの生理学的生理食塩水中１～１０μｇを受けることもできる。その後、マウスは、１～７、５～１２、１０～１８、１７～２５及び／又は２１～３４日後にＩＰ（１～４００μｇ）及びＳＱ（１～４００μｇｘ２）により等量のＴＩＴＥＲＭＡＸ又は完全フロイントアジュバントで乳化したＴＮＦで、免疫化され得る。抗凝固薬無しで１２～２５及び２５～４０日後に眼窩後方穿刺によりマウスを出血させることができる。次に、血液を室温で１時間凝固させ、血清を回収し、既知の方法によりＴＮＦ ＥＩＡアッセイを使用して滴定する。反復注射が力価の増加を生じなければ、融合を行う。その際、マウスに、１００μＬの生理学的生理食塩水に希釈した１～４００μｇのＴＮＦの最終ＩＶブースタ注射を与えることができる。３日後、マウスを頸椎脱臼により安楽死させ、脾臓を無菌的に除去し、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン及び０．２５μｇ／ｍＬのアンホテリシンＢ（ＰＳＡ）を含有する、１０ｍＬの冷リン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に浸漬することができる。ＰＳＡ－ＰＢＳで脾臓を無菌灌流することにより、脾細胞を採取する。細胞を冷ＰＳＡ－ＰＢＳ中で１回洗浄し、トリパンブルー染料排除を使用して計数し、２５ｍＭヘペスを含有するＲＰＭＩ １６４０培地に再懸濁する。
【0195】
細胞融合。融合は、公知の方法に従って、例えば当技術分野で公知のように、１：１～１：１０のマウス骨髄腫細胞対生存脾臓細胞の比で行うことができる。非限定的な例として、脾臓細胞及び骨髄腫細胞は一緒にペレット化することができる。次に、３０秒かけてペレットを３７℃でゆっくり１ｍＬの５０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ／ＰＢＳ溶液（ＰＥＧ分子量１，４５０、Ｓｉｇｍａ）に再懸濁することができる。その後、１分かけて２５ｍＭヘペスを含有する１０．５ｍＬのＲＰＭＩ １６４０培地（３７℃）をゆっくり添加することによって、融合を停止させることができる。融合細胞を５分間５００～１５００ｒｐｍで遠心分離する。その後、細胞をＨＡＴ培地（２５ｍＭヘペス、１０％胎児クローンＩ血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、４ｍＭ Ｌ－グルタミン、１０μｇ／ｍＬのゲンタマイシン、２．５％Ｏｒｉｇｅｎ培養サプリメント（Ｆｉｓｈｅｒ）、１０％ ６５３調整ＲＰＭＩ１６４０／ヘペス培地、５０μＭ ２－メルカプトエタノール、１００μＭヒポキサンチン、０．４μＭアミノプテリン及び１６μＭチミジンを含有するＲＰＭＩ １６４０培地）に再懸濁した後、１５の９６ウェル平底組織培養プレートに２００μＬ／ウェルで平板培養する。次に、７～１０日間、５％ＣＯ２及び９５％空気を含有する加湿した３７℃のインキュベータにプレートを配置する。
【0196】
マウス血清におけるヒトＩｇＧ抗ＴＮＦ抗体の検出。固相ＥＩＡを使用して、ヒトＴＮＦに特異的なヒトＩｇＧ抗体についてマウス血清をスクリーニングすることができる。簡潔に、ＰＢＳ中２μｇ／ｍＬのＴＮＦで一晩プレートをコーティングすることができる。０．０２％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含有する０．１５Ｍ生理食塩水で洗浄した後、ウェルをＰＢＳ中１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、２００μＬ／ウェルで、室温で１時間遮断することができる。プレートは、直ちに使用するか、又は後に使用するために－２０℃で凍結する。マウス血清希釈物を、５０μＬ／ウェルでＴＮＦコーティングしたプレート上で、室温で１時間インキュベートする。プレートを洗浄した後、１％ＢＳＡ－ＰＢＳ中に１：３０，０００で希釈したＦｃ特異的な５０μＬ／ウェルのＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧにより、室温で１時間プローブした。プレートを再度洗浄することができ、１００μＬ／ウェルのクエン酸塩－リン酸塩基質溶液（０．１Ｍクエン酸及び０．２Ｍリン酸ナトリウム、０．０１％ Ｈ２Ｏ２及び１ｍｇ／ｍＬ ＯＰＤ）を１５分かけて室温で添加する。次に、２５μＬ／ウェルで反応停止溶液（４Ｎ硫酸）を添加し、自動プレート分光光度計により４９０ｎｍでＯＤを読み取る。
【0197】
ハイブリドーマ上清における完全ヒト免疫グロブリンの検出。好適なＥＩＡを使用して、完全ヒト免疫グロブリンを分泌する成長陽性ハイブリドーマを検出することができる。簡潔に、９６ウェルのポップアウトプレート（ＶＷＲ、６１０７４４）を、４℃で一晩、炭酸ナトリウム緩衝剤中１０μｇ／ｍＬのヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃでコーティングすることができる。プレートを洗浄し、３７℃で１時間、１％ＢＳＡ－ＰＢＳで遮断し、直ちに使用するか、又は－２０℃で凍結する。未希釈ハイブリドーマ上清を、プレート上で、３７℃で１時間インキュベートする。プレートを洗浄し、１％ＢＳＡ－ＰＢＳ中に１：１０，０００で希釈したＨＲＰ識ヤギ抗ヒトκにより、３７℃で１時間プローブする。次に、上述のように、プレートを基質溶液と共にインキュベートする。
【0198】
完全ヒト抗ＴＮＦ反応性の決定。上記のハイブリドーマは、好適なＲＩＡ又は他のアッセイを使用してＴＮＦに対する反応性について同時にアッセイすることができる。例えば、上記のように、上清をヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃプレート上でインキュベートし、洗浄した後、室温で１時間、ウェル当たり適切な計数で、放射線標識されたＴＮＦでプローブする。ウェルをＰＢＳで２回洗浄し、好適な計数器を使用して、結合した放射線標識されたＴＮＦを定量化する。
【0199】
ヒトＩｇＧ１κ抗ＴＮＦ分泌ハイブリドーマを細胞培養において拡張し、限定希釈により系列的にサブクローニングすることができる。結果として得られたクローン集団を拡張し、凍結培地（９５％ＦＢＳ、５％ＤＭＳＯ）中で凍結保存し、液体窒素中で保管する。
【0200】
アイソタイプ。抗体のアイソタイプの決定は、特定の滴定に対するマウス免疫血清をスクリーニングするために使用されたものと類似の形式のＥＩＡを使用して達成することができる。上述のように９６ウェルプレート上にＴＮＦをコーティングすることができ、２μｇ／ｍＬの精製された抗体を、室温で１時間、プレート上でインキュベートすることができる。プレートを洗浄し、１％ＢＳＡ－ＰＢＳ中に１：４０００で希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ１又はＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ３で、室温で１時間プローブする。プレートを再度洗浄し、上述のように基質溶液と共にインキュベートする。
【0201】
ヒトＴＮＦによるヒト抗ヒトＴＮＦ抗体の結合動力学。抗体の結合特徴は、例えば、ＴＮＦ捕捉ＥＩＡ及びＢＩＡｃｏｒｅ技術を使用して好適に評価することができる。精製されたヒトＴＮＦ抗体の段階的濃度は、上述のように、アッセイにおいて、２μｇ／ｍＬのＴＮＦでコーティングされたＥＩＡプレートへの結合について評価することができる。その後、相対結合効率を示す片対数プロットとしてＯＤを表すことができる。
【0202】
定量的結合定数は、例えば、以下のように、又は任意のその他の既知の好適な方法によって得ることができる。ＢＩＡｃｏｒｅ ＣＭ－５（カルボキシメチル）チップをＢＩＡｃｏｒｅ ２０００ユニットに配置する。ＨＢＳ緩衝剤（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％ｖ／ｖ Ｐ２０界面活性剤、ｐＨ７．４）を、安定したベースラインが得られるまで、５μｌ／分でチップのフローセル上に流す。２００μＬの水中１５ｍｇのＥＤＣ（Ｎ－エチル－Ｎ’－（３－ジメチル－アミノプロピル）－カルボジイミド塩酸塩）の溶液（１００μＬ）を、２００μＬの水中２．３ｍｇのＮＨＳ（Ｎ－ヒドロキシコハク酸イミド）の１００μＬの溶液に添加する。結果として得られた溶液の４０μＬをチップ上に注入する。６μＬのヒトＴＮＦの溶液（１０ｍＭ酢酸ナトリウム中１５μｇ／ｍＬ、ｐＨ４．８）をチップ上に注入し、約５００ＲＵの増加をもたらす。緩衝剤をＴＢＳ／Ｃａ／Ｍｇ／ＢＳＡ泳動緩衝剤（２０ｍＭトリス、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、２ｍＭ塩化カルシウム、２ｍＭ酢酸マグネシウム、０．５％トリトンＸ－１００、２５μｇ／ｍＬ ＢＳＡ、ｐＨ７．４）に変更し、一晩チップ上に流してそれを平衡化し、全ての未反応のコハク酸エステルを加水分解又はキャップする。
【0203】
３３．３３、１６．６７、８．３３、及び４．１７ｎＭで泳動緩衝剤中に抗体を溶解する。流量を３０μＬ／分に調整し、器具の温度を２５℃に調整する。１つはＴＮＦが固定化され（試料）、２つ目は非誘導化フローセル（ブランク）である、２つのフローセルを動態実行に使用する。各抗体濃度を１２０μＬ、フローセル上に３０μＬ／分で注入し（会合相）、続いて３６０秒間連続して緩衝剤を流す（解離相）。各３０μＬの２Ｍチオシアン酸グアニジンを２回順次注入することにより、チップの表面を再生する（組織壊死因子α／抗体複合体の解離）。
【0204】
データの分析は、当該技術分野において既知であるＢＩＡ評価３．０又はＣＬＡＭＰ２．０を使用して行われる。各抗体濃度について、ブランクセンソグラムを試料センソグラムから減ずる。解離（ｋｄ，ｓｅｃ－１）及び会合（ｋａ，ｍｏｌ－１ ｓｅｃ－１）の両方についてグローバルフィットを行い、解離定数（ＫＤ，ｍｏｌ）を算出する（ｋｄ／ｋａ）。抗体親和性が充分に高いため、捕捉された抗体のＲＵが＞１００である場合、抗体の追加希釈が実行される。
【0205】
結果と考察
抗ヒトＴＮＦモノクローナル抗体の生成。いくつかの融合を行い、ヒトＴＮＦに特異的な数十の抗体を生み出す各融合物を１５のプレート（１４４０ウェル／融合物）に播種する。これらのうち、いくつかは、ヒト及びマウスＩｇ鎖の組合せからなることが分かる。残りのハイブリドーマは、ヒト重鎖及び軽鎖のみからなる抗ＴＮＦ抗体を分泌（secret）する。ヒトハイブリドーマの全てがＩｇＧ１κであることが予想される。
抗ヒトＴＮＦモノクローナル抗体の生成。いくつかの融合を行い、ヒトＴＮＦに特異的な数十の抗体を生み出す各融合物を１５のプレート（１４４０ウェル／融合物）に播種する。これらのうち、いくつかは、ヒト及びマウスＩｇ鎖の組合せからなることが分かる。残りのハイブリドーマは、ヒト重鎖及び軽鎖のみからなる抗ＴＮＦ抗体を分泌（secret）する。ヒトハイブリドーマの全てがＩｇＧ１κであることが予想される。
【0206】
ヒト抗ヒトＴＮＦ抗体の結合動力学。ＥＬＩＳＡ分析は、これらのハイブリドーマのほとんど又は全てからの精製された抗体が、濃度依存的にＴＮＦに結合することを確認する。図１～２は、これらの抗体の相対的結合効率の結果を示す。この場合、抗体のその同族抗原（エピトープ）に対する結合活性度を測定する。ＴＮＦを直接ＥＩＡプレートに結合すると、タンパク質の変性を引き起こし得、見かけ上の結合親和性は、未変性タンパク質への結合を反映することができないことに留意するべきである。５０パーセントの結合が広範な濃度にわたって見られる。
【0207】
定量的結合定数はヒト抗体のＢＩＡｃｏｒｅ分析を使用して得られ、ヒトモノクローナル抗体のいくつかが１×１０－９～７×１０－１２の範囲のＫＤを有して非常に高い親和性であることを明らかにする。
【0208】
結論。
いくつかの融合は、ヒトＴＮＦで免疫化されるヒト可変及び定常領域抗体導入遺伝子を含有するハイブリッドマウスからの脾細胞を利用して行われる。ＩｇＧ１κアイソタイプのいくつかの完全ヒトＴＮＦ反応性ＩｇＧモノクローナル抗体のセットを生成する。完全ヒト抗ＴＮＦ抗体を更に特徴付けする。生成された抗体のうちのいくつかは、１×１０９～９×１０１２の親和性定数を有する。これらの完全ヒトモノクローナル抗体の予期せぬ高親和性により、それらはＴＮＦ依存疾患、病態又は関連状態における治療用途に好適なものとなる。
いくつかの融合は、ヒトＴＮＦで免疫化されるヒト可変及び定常領域抗体導入遺伝子を含有するハイブリッドマウスからの脾細胞を利用して行われる。ＩｇＧ１κアイソタイプのいくつかの完全ヒトＴＮＦ反応性ＩｇＧモノクローナル抗体のセットを生成する。完全ヒト抗ＴＮＦ抗体を更に特徴付けする。生成された抗体のうちのいくつかは、１×１０９～９×１０１２の親和性定数を有する。これらの完全ヒトモノクローナル抗体の予期せぬ高親和性により、それらはＴＮＦ依存疾患、病態又は関連状態における治療用途に好適なものとなる。
【0209】
実施例３：ヒトＴＮＦαに反応性のヒトＩｇＧモノクローナル抗体の生成。
概要。重鎖及び軽鎖両方のヒト可変及び定常領域抗体導入遺伝子を含有する（ＣＢＡ／ＪｘＣ５７ＢＬ／６Ｊ）Ｆ２ハイブリッドマウス（１～４）を組換えヒトＴＮＦαで免疫化した。ＧｅｎＴＮＶと命名された１つの融合が、固定化された組換えヒトＴＮＦαに結合する完全ヒトＩｇＧ１κモノクローナル抗体を８つ生み出した。特定直後、８つの細胞株は、更に特徴付けするためにＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙに譲渡された。これらＭａｂは配列が完全にヒトであるため、それらはヒトにおけるｃＡ２（Ｒｅｍｉｃａｄｅ）よりも免疫原性が低いと予想される。
概要。重鎖及び軽鎖両方のヒト可変及び定常領域抗体導入遺伝子を含有する（ＣＢＡ／ＪｘＣ５７ＢＬ／６Ｊ）Ｆ２ハイブリッドマウス（１～４）を組換えヒトＴＮＦαで免疫化した。ＧｅｎＴＮＶと命名された１つの融合が、固定化された組換えヒトＴＮＦαに結合する完全ヒトＩｇＧ１κモノクローナル抗体を８つ生み出した。特定直後、８つの細胞株は、更に特徴付けするためにＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙに譲渡された。これらＭａｂは配列が完全にヒトであるため、それらはヒトにおけるｃＡ２（Ｒｅｍｉｃａｄｅ）よりも免疫原性が低いと予想される。
【0210】
略語。ＢＳＡ－ウシ血清アルブミン、ＣＯ２－二酸化炭素、ＤＭＳＯ－ジメチルスルホキシド、ＥＩＡ－酵素イムノアッセイ、ＦＢＳ－ウシ胎児血清、Ｈ２Ｏ２－過酸化水素、ＨＣ－重鎖、ＨＲＰ－西洋わさびペルオキシダーゼ、ＩＤ－皮内、Ｉｇ－免疫グロブリン、ＴＮＦ－組織壊死因子α、ＩＰ－腹腔内、ＩＶ－静脈内、Ｍａｂ－モノクローナル抗体、ＯＤ－光学密度、ＯＰＤ－ｏフェニレンジアミン二塩酸塩、ＰＥＧ－ポリエチレングリコール、ＰＳＡ－ペニシリン、ストレプトマイシン、アンホテリシン、ＲＴ－室温、ＳＱ－皮下、ＴＮＦα－腫瘍壊死因子α、ｖ／ｖ－単位容量当たりの容量、ｗ／ｖ－単位容量当たりの重量。
【0211】
序論。ヒト重鎖及び軽鎖免疫グロブリン遺伝子を含有するトランスジェニックマウスを利用して、組換えヒトＴＮＦαに特異的な完全ヒトモノクローナル抗体を生成した。ｃＡ２（Ｒｅｍｉｃａｄｅ）は、血清半減期が増加し、免疫原性に関する副作用が減少する利益を有して、ＴＮＦα媒介性疾患に関与する炎症性プロセスを治療的に阻害するために使用されるため、これらの固有の抗体を使用することができると期待される。
【0212】
材料及び方法。
動物。ヒト免疫グロブリンを発現するが、マウスＩｇＭ又はＩｇκを発現しないトランスジェニックマウスは、ＧｅｎＰｈａｒｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌにより開発されてきた。これらのマウスは、Ｖ（Ｄ）Ｊ結合、重鎖クラススイッチ及び体細胞変異を受けて抗原特異的ヒト免疫グロブリン（１）のレパートリを生成する、機能性ヒト抗体導入遺伝子を含有する。軽鎖導入遺伝子は、部分的に、生殖系列ヒトＶκ遺伝子座のほぼ半分を含む酵母人工染色体クローンに由来する。いくつかのＶＨ遺伝子に加えて、重鎖（ＨＣ）導入遺伝子は、ヒトμ及びヒトγ１（２）、並びに／又はγ３定常領域の両方をコードする。本明細書に記載されるモノクローナル抗体を生成するための免疫付与及び融合プロセスにおいて、ＨＣｏ１２／ＫＣｏ５遺伝子型系統由来のマウスを使用した。
動物。ヒト免疫グロブリンを発現するが、マウスＩｇＭ又はＩｇκを発現しないトランスジェニックマウスは、ＧｅｎＰｈａｒｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌにより開発されてきた。これらのマウスは、Ｖ（Ｄ）Ｊ結合、重鎖クラススイッチ及び体細胞変異を受けて抗原特異的ヒト免疫グロブリン（１）のレパートリを生成する、機能性ヒト抗体導入遺伝子を含有する。軽鎖導入遺伝子は、部分的に、生殖系列ヒトＶκ遺伝子座のほぼ半分を含む酵母人工染色体クローンに由来する。いくつかのＶＨ遺伝子に加えて、重鎖（ＨＣ）導入遺伝子は、ヒトμ及びヒトγ１（２）、並びに／又はγ３定常領域の両方をコードする。本明細書に記載されるモノクローナル抗体を生成するための免疫付与及び融合プロセスにおいて、ＨＣｏ１２／ＫＣｏ５遺伝子型系統由来のマウスを使用した。
【0213】
ヒトＴＮＦαの精製。セファロース４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に連結されたＴＮＦα受容体－Ｆｃ融合タンパク質（ｐ５５－ｓｆ２）（５）を充填したカラムを使用して、アフィニティクロマトグラフィーにより、ヒトＴＮＦαを、Ｃ２３７Ａ細胞からの組織培養上清から精製した。細胞上清を、その容量の９分の１の１０ｘＤｕｌｂｅｃｃｏのＰＢＳ（Ｄ－ＰＢＳ）と混合し、４ｍＬ／分で、４℃でカラムを通過させた。次に、ＰＢＳでカラムを洗浄し、０．１Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ３．５でＴＮＦαを溶出し、２ＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８．５で中和した。精製されたＴＮＦαは、１０ｍＭトリス、０．１２Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７．５に緩衝剤交換され、０．２ｕｍのシリンジフィルタを通して濾過された。
【0214】
免疫付与。およそ１６週齢の雌のＧｅｎＰｈａｒｍマウスを、０、１２及び２８日目に等量のＴｉｔｅｒｍａｘアジュバントで乳化した合計１００μｇのＴＮＦα（ロットＪＧ１０２２９８又はＪＧ１０２０９８）で、ＩＰ（２００μＬ）及びＩＤ（尾の付け根にて１００μＬ）により免疫化した。抗凝固薬無しで２１及び３５日目に眼窩後方穿刺によりマウスを出血させた。血液を室温で１時間凝固させ、血清を回収し、ＴＮＦα固相ＥＩＡアッセイを使用して滴定した。２８日目の注射後、マウスを７週間休ませた後に、ＧｅｎＴＮＶと命名された融合を行った。その後、ＴＮＦαに対して１：１６０の特定のヒトＩｇＧ力価を有するマウスに、１００μＬの生理学的生理食塩水で希釈した５０μｇのＴＮＦαの最終ＩＶブースタ注射を与えた。３日後、マウスを頸椎脱臼により安楽死させ、脾臓を無菌的に除去し、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、及び０．２５μｇ／ｍＬのアンホテリシンＢ（ＰＳＡ）を含有する、１０ｍＬの冷リン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に浸漬した。ＰＳＡ－ＰＢＳで脾臓を無菌灌流することにより、脾細胞を採取した。細胞を冷ＰＳＡ－ＰＢＳ中で１回洗浄し、Ｃｏｕｌｔｅｒ計数器を使用して計数し、２５ｍＭヘペスを含有するＲＰＭＩ １６４０培地に再懸濁した。
【0215】
細胞株。Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（ＣＢＳ）グループは、９７年５月１４日に、Ｃｅｎｔｏｃｏｒ’ｓ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔグループから非分泌マウス骨髄腫融合パートナー６５３を受け取った。細胞株を、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ（Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｌａｂｓ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、０．１ｍＭ ＮＥＡＡ、２ｍＭ Ｌ－グルタミン（全てＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから）で補充したＲＰＭＩ培地（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中で拡張し、９５％ＦＢＳ及び５％ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ）中で凍結保存した後、ＣＢＳの蒸気相液体窒素冷凍庫に保管した。細胞バンクは無菌であり（Ｑｕａｌｉｔｙ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｃｅｎｔｏｃｏｒ，Ｍａｌｖｅｒｎ）、マイコプラズマ（Ｂｉｏｎｉｑｕｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）がなかった。細胞は融合まで対数増殖期培養物内で維持された。融合前に、それらをＰＢＳ中で洗浄し、計数し、トリパンブルー染料排除により生存率を決定した（＞９５％）。
【0216】
ヒトＴＮＦαは、組換え細胞株により産生され、Ｃ２３７Ａと命名され、ＣｅｎｔｏｃｏｒのＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙで産生された。細胞株を、５％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ（Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｌａｂｓ）、２ｍＭ Ｌ－グルタミン（全てＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから）及び０．５：ｇ／ｍＬのマイコフェノール酸で補充したＩＭＤＭ培地（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中で拡張し、９５％ＦＢＳ及び５％ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ）中で凍結保存した後、ＣＢＳ（１３）の蒸気相液体窒素冷凍庫に保管した。細胞バンクは無菌であり（Ｑｕａｌｉｔｙ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｃｅｎｔｏｃｏｒ，Ｍａｌｖｅｒｎ）、マイコプラズマ（Ｂｉｏｎｉｑｕｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）がなかった。
【0217】
細胞融合。細胞融合は、１：１の比率の６５３マウス骨髄腫細胞及びマウス生脾臓細胞を使用して行った。簡潔に、脾臓細胞及び骨髄腫細胞を一緒にペレット化した。３０秒間かけてペレットを３７℃でゆっくり１ｍＬの５０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ／ＰＢＳ溶液（ＰＥＧ分子量１，４５０ｇ／モル、Ｓｉｇｍａ）に再懸濁した。１分かけて１０．５ｍＬのＲＰＭＩ培地（添加剤無し）（ＪＲＨ）（３７℃）をゆっくり添加することにより、融合を停止させた。融合細胞を５分間７５０ｒｐｍで遠心分離した。その後、細胞をＨＡＴ培地（１０％ウシ胎児血清（ＪＲＨ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、１０μｇ／ｍＬのゲンタマイシン、２．５％Ｏｒｉｇｅｎ培養サプリメント（Ｆｉｓｈｅｒ）、５０μＭ ２－メルカプトエタノール、１％ ６５３調整ＲＰＭＩ培地、１００μＭヒポキサンチン、０．４μＭアミノプテリン及び１６μＭチミジンを含有するＲＰＭＩ／ＨＥＰＥＳ培地）に再懸濁した後、５つの９６ウェル平底組織培養プレートを２００μＬ／ウェルで平板培養した。次に、７～１０日間、５％ＣＯ２及び９５％空気を含有する加湿した３７℃のインキュベータにプレートを配置した。
【0218】
マウス血清におけるヒトＩｇＧ抗ＴＮＦα抗体の検出。固相ＥＩＡを使用して、ヒトＴＮＦαに特異的なヒトＩｇＧ抗体についてマウス血清をスクリーニングした。簡潔に、ＰＢＳ中１μｇ／ｍＬのＴＮＦαで一晩プレートをコーティングした。０．０２％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含有する０．１５Ｍ生理食塩水で洗浄した後、ウェルをＰＢＳ中１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、２００μＬ／ウェルで、室温で１時間遮断した。プレートは、直ちに使用するか、又は後に使用するために－２０℃で凍結されるかのいずれかにした。マウス血清を、５０μＬ／ウェルで、室温で１時間、２倍階段希釈法で、ヒトＴＮＦαコーティングされたプレート上でインキュベートした。プレートを洗浄した後、１％ＢＳＡ－ＰＢＳ中に１：３０，０００で希釈したＦｃ特異的（Ａｃｃｕｒａｔｅ）な５０μＬ／ウェルのＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧにより、室温で１時間プローブした。プレートを再度洗浄し、１００μＬ／ウェルのクエン酸塩－リン酸塩基質溶液（０．１Ｍクエン酸及び０．２Ｍリン酸ナトリウム、０．０１％ Ｈ２Ｏ２及び１ｍｇ／ｍＬ ＯＰＤ）を１５分かけて室温で添加した。次いで、２５μＬ／ウェルで反応停止溶液（４Ｎ硫酸）を添加し、自動プレート分光光度計を使用して４９０ｎｍでＯＤを読み取った。
【0219】
ハイブリドーマ上清における完全ヒト免疫グロブリンの検出。ＧｅｎＰｈａｒｍマウスは、マウス及びヒト免疫グロブリン鎖の両方を生成することができるため、２つの別個のＥＩＡアッセイを使用して、ヒト軽鎖及びヒト重鎖の両方の存在について成長陽性ハイブリドーマクローンを試験した。プレートを上述のようにコーティングし、未希釈のハイブリドーマ上清を３７℃で１時間、プレート上でインキュベートした。プレートを洗浄し、３７℃で１時間、１％ ＢＳＡ－ＨＢＳＳ中で１：１０，０００に希釈したＨＲＰ抱合ヤギ抗ヒトκ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）抗体、又は１％ ＢＳＡ－ＨＢＳＳ中で１：３０，０００に希釈したＨＲＰ抱合ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ特異的抗体のいずれかでプローブした。次に、上述のように、プレートを基質溶液と共にインキュベートした。抗ヒトκ及び抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ ＥＩＡ形式の両方で陽性シグナルをもたらさなかったハイブリドーマクローンは廃棄された。
【0220】
アイソタイプ。抗体のアイソタイプの決定は、特定の力価に対するマウス免疫血清をスクリーニングするために使用されたものと類似の形式のＥＩＡを使用して達成した。４ＥＣで一晩、炭酸ナトリウム緩衝剤中１０：ｇ／ｍＬのヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）でＥＩＡプレートをコーティングし、上述のように遮断した。２４ウェル培養物からの希釈無しの上清を、室温で１時間、プレート上でインキュベートした。プレートを洗浄し、１％ＢＳＡ－ＰＢＳ中に１：４０００で希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４（Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅ）で、室温で１時間プローブした。プレートを再度洗浄し、上述のように基質溶液と共にインキュベートした。
【0221】
結果及び考察。完全ヒト抗ヒトＴＮＦαモノクローナル抗体の生成。組換えヒトＴＮＦαタンパク質で免疫化されたＧｅｎＰｈａｒｍマウスから、ＧｅｎＴＮＶと命名された融合を１回行った。この融合から、１９６の成長陽性ハイブリッドがスクリーニングされた。ヒトＴＮＦαと反応性の完全ヒトＩｇＧ抗体を分泌した８つのハイブリドーマ細胞株を特定した。これらの８つの細胞株はそれぞれ、ヒトＩｇＧ１κアイソタイプの免疫グロブリンを分泌し、限界希釈により全てを２回サブクローニングして、安定した細胞株を得た（＞９０％均質）。細胞株名及びそれぞれのＣコード表記を表１に列挙する。細胞株の各々は、液体窒素中に保管された１２－バイアル研究細胞バンクにおいて凍結された。
【0222】
８つの細胞株の各々の２４ウェル培養皿のウェルから回収した親細胞は、トランスフェクション及び更なる特徴付けのために、１９９９年２月１８日にＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙグループに引き渡された。
【0223】
【表2】
【0224】
結論。
ＧｅｎＴＮＶ融合は、Ｃｅｎｔｏｃｏｒで調製された組換えヒトＴＮＦαで免疫化されたヒト可変及び定常領域抗体導入遺伝子を含有するハイブリッドマウスからの脾細胞を利用して行われた。ＩｇＧ１κアイソタイプの８つの完全ヒトＴＮＦα反応性ＩｇＧモノクローナル抗体を生成した。更なる特徴付け及び開発のために、親細胞株をＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙグループに移した。これらの新しいヒト抗体のうちの１つは、Ｒｅｍｉｃａｄｅと比較して、免疫原性及びアレルギー型合併症が減少する利益の可能性を有して、抗炎症に有用であり得る。
ＧｅｎＴＮＶ融合は、Ｃｅｎｔｏｃｏｒで調製された組換えヒトＴＮＦαで免疫化されたヒト可変及び定常領域抗体導入遺伝子を含有するハイブリッドマウスからの脾細胞を利用して行われた。ＩｇＧ１κアイソタイプの８つの完全ヒトＴＮＦα反応性ＩｇＧモノクローナル抗体を生成した。更なる特徴付け及び開発のために、親細胞株をＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙグループに移した。これらの新しいヒト抗体のうちの１つは、Ｒｅｍｉｃａｄｅと比較して、免疫原性及びアレルギー型合併症が減少する利益の可能性を有して、抗炎症に有用であり得る。
【0225】
実施例４：ヒト抗ＴＮＦα抗体を発現する細胞株のクローニング及び調製。
概要。ＴＮＶ表記の８つのヒトモノクローナル抗体（ｍＡｂ）のパネルは、明らかに高結合活性で固定化されたヒトＴＮＦαに結合することが認められた。８つのｍＡｂのうちの７つは、組換えＴＮＦ受容体へのヒトＴＮＦαの結合を効率的に遮断することを示した。７つのｍＡｂをコードするＤＮＡの配列分析は、全てのｍＡｂがヒトＶ領域を有していることを確認した。ＤＮＡ配列は、３対のｍＡｂが互いに同一であり、そのため８つのｍＡｂの元のパネルがＴＮＶ１４、ＴＮＶ１５、ＴＮＶ１４８、及びＴＮＶ１９６で表される４つの別個のｍＡｂのみを含有していることも明らかにした。ｍＡｂの推定アミノ酸配列の分析及びインビトロＴＮＦα中和データの結果に基づいて、ｍＡｂ ＴＮＶ１４８及びＴＮＶ１４を更なる試験のために選択した。
概要。ＴＮＶ表記の８つのヒトモノクローナル抗体（ｍＡｂ）のパネルは、明らかに高結合活性で固定化されたヒトＴＮＦαに結合することが認められた。８つのｍＡｂのうちの７つは、組換えＴＮＦ受容体へのヒトＴＮＦαの結合を効率的に遮断することを示した。７つのｍＡｂをコードするＤＮＡの配列分析は、全てのｍＡｂがヒトＶ領域を有していることを確認した。ＤＮＡ配列は、３対のｍＡｂが互いに同一であり、そのため８つのｍＡｂの元のパネルがＴＮＶ１４、ＴＮＶ１５、ＴＮＶ１４８、及びＴＮＶ１９６で表される４つの別個のｍＡｂのみを含有していることも明らかにした。ｍＡｂの推定アミノ酸配列の分析及びインビトロＴＮＦα中和データの結果に基づいて、ｍＡｂ ＴＮＶ１４８及びＴＮＶ１４を更なる試験のために選択した。
【0226】
ＴＮＶ１４８重鎖の位置７５（フレームワーク３）のプロリン残基がデータベース検索中同じサブグループの他のヒト抗体のその位置に見られなかったため、それを既知の生殖系列フレームワークｅ配列と一致させるために、部位特異的ＤＮＡ変異誘発を行って、その位置にセリン残基をコード化した。セリン修飾ｍＡｂはＴＮＶ１４８Ｂと表記された。ＴＮＶ１４８Ｂ及びＴＮＶ１４の重鎖及び軽鎖可変領域をコード化するＰＣＲ増幅ＤＮＡを、別のヒトｍＡｂ（１２Ｂ７５）の最近クローニングされた重鎖及び軽鎖遺伝子に基づいた（国際公開第０２／１２５００号として公開された、「ＩＬ－１２ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｕｓｅｓ」と題される、２０００年１０月７日出願の米国特許出願第６０／２３６，８２７号、参照により全体が本明細書に組み込まれる）、新しく調製した発現ベクタ内にクローニングした。
【0227】
Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３（６５３）細胞又はＳｐ２／０－Ａｇ１４（Ｓｐ２／０）マウス骨髄腫細胞を、それぞれの重鎖及び軽鎖発現プラスミドでトランスフェクトし、高レベルの組換えＴＮＶ１４８Ｂ及びＴＮＶ１４（ｒＴＮＶ１４８Ｂ及びｒＴＮＶ１４）ｍＡｂを生成する細胞株について２回のサブクローニングによりスクリーニングした。経時的なｍＡｂ産生の成長曲線及び安定性の評価は、６５３トランスフェクタントクローンＣ４６６Ｄ及びＣ４６６Ｃが使用済培養物において安定しておよそ１２５：ｇ／ｍＬのｒＴＮＶ１４８Ｂ ｍＡｂを産生し、一方Ｓｐ２／０トランスフェクタント１．７３－１２－１２２（Ｃ４６７Ａ）が使用済培養物において安定しておよそ２５：ｇ／ｍＬのｒＴＮＶ１４８Ｂ ｍＡｂを産生したことを示した。同様の分析が、Ｓｐ２／０トランスフェクタントクローンＣ４７６Ａが使用済培養物において１８：ｇ／ｍＬのｒＴＮＶ１４を産生したことを示した。
【0228】
序論。ヒトＴＮＦα免疫化ＧｅｎＰｈａｒｍ／Ｍｅｄａｒｅｘマウス（ＨＣｏ１２／ＫＣｏ５遺伝子型）由来の８つのｍＡｂのパネルは、ヒトＴＮＦαに結合しかつ完全ヒトＩｇＧ１κアイソタイプを有することを前に示した。単純な結合アッセイを使用して、ＴＮＦαが組換えＴＮＦ受容体に結合するのを遮断する能力を評価することにより、本発明の例示的なｍＡｂがＴＮＦα中和活性を有する可能性があるかどうかを決定した。これらの結果、ＤＮＡ配列結果、及びｍＡｂのいくつかのインビトロ特徴付けに基づいて、更に特徴付けされるｍＡｂとしてＴＮＶ１４８が選択された。
【0229】
ＴＮＶ１４８ ｍＡｂをコードするＤＮＡ配列をクローニングし、好適な定常領域をコードする遺伝子発現ベクタ内に合うように修飾し、充分に特徴付けされた６５３及びＳｐ２／０マウス骨髄腫細胞内に導入し、結果として得られたトランスフェクトされた細胞株を、元のハイブリドーマ細胞株の４０倍のｍＡｂを産生するサブクローンが特定されるまでスクリーニングした。
【0230】
材料及び方法。
試薬及び細胞。ＴＲＩＺＯＬ試薬はＧｉｂｃｏ ＢＲＬから購入した。プロテイナーゼＫはＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙから得た。逆転写酵素はＬｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．から得た。Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼはＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ又はＧｉｂｃｏ ＢＲＬのいずれかから得た。制限酵素はＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓから購入した。ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ＫｉｔはＱｉａｇｅｎから得た。ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ＫｉｔはＳｔｒａｔａｇｅｎｅから購入した。Ｗｉｚａｒｄプラスミドミニプレップキット及びＲＮａｓｉｎはＰｒｏｍｅｇａからであった。ＯｐｔｉｐｌａｔｅｓはＰａｃｋａｒｄから得た。１２５ＩｏｄｉｎｅはＡｍｅｒｓｈａｍから購入した。カスタムオリゴヌクレオチドはＫｅｙｓｔｏｎｅ／Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌから購入した。この作業で使用したオリゴヌクレオチドの名称、識別番号、及び配列を表２に示す。
試薬及び細胞。ＴＲＩＺＯＬ試薬はＧｉｂｃｏ ＢＲＬから購入した。プロテイナーゼＫはＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙから得た。逆転写酵素はＬｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．から得た。Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼはＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ又はＧｉｂｃｏ ＢＲＬのいずれかから得た。制限酵素はＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓから購入した。ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ＫｉｔはＱｉａｇｅｎから得た。ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ＫｉｔはＳｔｒａｔａｇｅｎｅから購入した。Ｗｉｚａｒｄプラスミドミニプレップキット及びＲＮａｓｉｎはＰｒｏｍｅｇａからであった。ＯｐｔｉｐｌａｔｅｓはＰａｃｋａｒｄから得た。１２５ＩｏｄｉｎｅはＡｍｅｒｓｈａｍから購入した。カスタムオリゴヌクレオチドはＫｅｙｓｔｏｎｅ／Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌから購入した。この作業で使用したオリゴヌクレオチドの名称、識別番号、及び配列を表２に示す。
【0231】
表２．ＴＮＶ ｍＡｂ遺伝子をクローニング、操作又は配列決定するために使用されたオリゴヌクレオチド。
オリゴヌクレオチド５’１４ｓ及びＨｕＨ－Ｊ６によりコード化されるアミノ酸を配列の上に示す。「Ｍ」アミノ酸残基は翻訳開始コドンを表す。オリゴヌクレオチド５’１４ｓ及びＨｕＨ－Ｊ６の下線付き配列は、それぞれ、ＢｓｉＷＩ及びＢｓｔＢＩ制限部位を示す。ＨｕＨ－Ｊ６の斜線はエクソン／イントロン境界に対応する。配列がマイナス鎖に対応するオリゴヌクレオチドは、３’－５’配向で書かれていることに留意する。
オリゴヌクレオチド５’１４ｓ及びＨｕＨ－Ｊ６によりコード化されるアミノ酸を配列の上に示す。「Ｍ」アミノ酸残基は翻訳開始コドンを表す。オリゴヌクレオチド５’１４ｓ及びＨｕＨ－Ｊ６の下線付き配列は、それぞれ、ＢｓｉＷＩ及びＢｓｔＢＩ制限部位を示す。ＨｕＨ－Ｊ６の斜線はエクソン／イントロン境界に対応する。配列がマイナス鎖に対応するオリゴヌクレオチドは、３’－５’配向で書かれていることに留意する。
【0232】
【表3】
【0233】
６５３マウス骨髄腫細胞の凍結バイアルを１つ得た。バイアルをその日に解凍し、Ｔフラスコ中のＩＭＤＭ、５％ＦＢＳ、及び２ｍＭグルタミン（培地）中で拡張させた。これらの細胞は、本明細書に記載される抗ＴＮＦ ＤＮＡで２～３週間後にトランスフェクトされるまで、連続培養において維持された。解凍した５日後に培養物のいくつかを採取し、遠心分離によりペレット化し、９５％ＦＢＳ、５％ＤＭＳＯに再懸濁し、３０のバイアルに等分し、凍結し、後に使用するために保管した。同様に、Ｓｐ２／０マウス骨髄腫細胞の凍結バイアルを１つ得た。バイアルを解凍し、上述のように新しい凍結物（freeze-down）を調製し、凍結バイアルをＣＢＣの冷凍庫ボックスＡＡ及びＡＢ内で保管した。これらの細胞を解凍し、本明細書に記載される全てのＳｐ２／０トランスフェクションに使用した。
【0234】
受容体へのＴＮＦの結合の阻害のためのアッセイ。ＴＮＶ ｍＡｂを含有するハイブリドーマ細胞上清を使用して、ｍＡｂが組換えＴＮＦ受容体融合タンパク質ｐ５５－ｓｆ２への１２５Ｉ標識ＴＮＦαの結合を遮断する能力についてアッセイした（Ｓｃａｌｌｏｎら（１９９５）「Ｃｙｔｏｋｉｎｅ」７：７５９～７７０）。３７℃で１時間インキュベートする際に、ＰＢＳ中０．５：ｇ／ｍＬで５０：Ｌのｐ５５－ｓｆ２をＯｐｔｉｐｌａｔｅｓに添加してウェルをコーティングした。ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡを希釈剤として使用して、８つのＴＮＶ細胞上清の系列希釈を、９６ウェル丸底プレートにおいて調製した。抗ＩＬ－１８ ｍＡｂを含有する細胞上清が陰性対照として含まれ、ｃＡ２（抗ＴＮＦキメラ抗体、Ｒｅｍｉｃａｄｅ、米国特許第５，７７０，１９８号、参照により全体が本明細書に組み込まれる）でスパイクされた同じ抗ＩＬ－１８上清が陽性対照として含まれた。最終ＴＮＦα濃度が５ｎｇ／ｍＬとなるように、１２５Ｉ標識ＴＮＦα（５８：Ｃｉ／：ｇ，Ｄ．Ｓｈｅａｌｙ）を１００：Ｌの細胞上清に添加した。混合物を室温で１時間プレインキュベートした。コーティングされたＯｐｔｉｐｌａｔｅｓを洗浄して未結合のｐ５５－ｓｆ２を除去し、５０：Ｌの１２５Ｉ－ＴＮＦα／細胞上清混合物をＯｐｔｉｐｌａｔｅｓに移した。室温で２時間後、ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎで３回、Ｏｐｔｉｐｌａｔｅｓを洗浄した。１００：ＬのＭｉｃｒｏｓｃｉｎｔ－２０を添加し、ＴｏｐＣｏｕｎｔ γ計数器を使用して結合したｃｐｍを決定した。
【0235】
Ｖ遺伝子の増幅及びＤＮＡ配列分析。ＲＮＡの調製のために、ハイブリドーマ細胞をＰＢＳで１回洗浄した後にＴＲＩＺＯＬ試薬を添加した。７×１０６～１．７×１０７の細胞を１ｍＬのＴＲＩＺＯＬに再懸濁した。２００μＬのクロロホルムの添加後に管を激しく振った。試料を４℃で１０分間遠心分離した。水相を新しいｍｉｃｒｏｆｕｇｅ管に移し、等量のイソプロパノールを添加した。管を激しく振り、室温で１０分間インキュベートした。次いで、試料を４℃で１０分間遠心分離した。ペレットを１ｍｌの７０％エタノールで１回洗浄し、真空乾燥機で短時間乾燥させた。ＲＮＡペレットを４０μＬのＤＥＰＣ処理水で再懸濁した。ＲＮＡ調製物の品質は、１％アガロースゲル中で０．５μＬを分画することによって決定された。ＲＮＡは使用するまで－８０℃の冷凍庫に保存した。
【0236】
重鎖及び軽鎖のｃＤＮＡを調製するために、１１．５μＬの容量に３μＬのＲＮＡ及び１μｇのオリゴヌクレオチド１１９（重鎖）又はオリゴヌクレオチド１１７（軽鎖）のいずれか（表１を参照のこと）を含む混合物を調製した。混合物を水浴中、７０℃で１０分間インキュベートし、次に氷上で１０分間冷却した。２．５μＬの１０×逆転写酵素緩衝剤、１０μＬの２．５ｍＭ ｄＮＴＰ、１μＬの逆転写酵素（２０単位）、及び０．４μＬのリボヌクレアーゼ阻害剤ＲＮａｓｉｎ（１単位）から構成される別個の混合物を調製した。１３．５μＬのこの混合物を、１１．５μＬの冷ＲＮＡ／オリゴヌクレオチド混合物に添加し、反応物を４２℃で４０分間インキュベートした。次に、ｃＤＮＡ合成反応物を、使用するまで－２０℃の冷凍庫に保存した。
【0237】
未精製の重鎖及び軽鎖のｃＤＮＡをテンプレートとして使用して、可変領域コード配列をＰＣＲ増幅した。重鎖ＤＮＡの増幅をプライムする能力について、５つのオリゴヌクレオチド対（３６６／３５４、３６７／３５４、３６８／３５４、３６９／３５４、及び３７０／３５４、表１）を同時に試験した。軽鎖ＤＮＡの増幅をプライムする能力について、２つのオリゴヌクレオチド対（３６２／２０８及び３６３／２０８）を同時に試験した。総容量５０μＬにおいて２単位のＰＬＡＴＩＮＵＭ（商標）高忠実度（ＨＩＦＩ）Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼを使用して、ＰＣＲ反応を行った。各反応物は、２μＬのｃＤＮＡ反応物、１０ピコモルの各オリゴヌクレオチド、０．２ｍＭのｄＮＴＰ、５μＬの１０×ＨＩＦＩ緩衝剤、及び２ｍＭの硫酸マグネシウムを含んでいた。サーマルサイクラプログラムは、９５℃で５分間、続いて３０サイクル（９４℃で３０秒間、６２℃で３０秒間、６８℃で１．５分間）であった。次に、６８℃で１０分間の最終インキュベーションを行った。
【0238】
直接ＤＮＡ配列決定のためのＰＣＲ生成物を調製するために、製造業者のプロトコルに従い、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（商標）ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用してそれらを精製した。５０μＬの減菌水を使用してスピンカラムからＤＮＡを溶出させた後、真空乾燥機を使用して１０μＬの容量まで乾燥させた。次に、総容量２０μＬの、１μＬの精製されたＰＣＲ生成物、１０μＭオリゴヌクレオチドプライマ、４μＬのＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）ｒｅａｄｙ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｉｘ、及び１４μＬの減菌水でＤＮＡ配列決定反応物を設定した。オリゴヌクレオチド対３６７／３５４で作製された重鎖ＰＣＲ生成物は、オリゴヌクレオチドプライマ１５９及び３６０を用いて配列決定された。オリゴヌクレオチド対３６３／２０８で作製された軽鎖ＰＣＲ生成物は、オリゴヌクレオチド３４及び１６３を用いて配列決定された。配列決定用のサーマルサイクラプログラムは、２５サイクル（９６℃で３０秒間、５０℃で１５秒間、６０℃で４分間）、続いて４℃で一晩であった。反応生成物は、ポリアクリルアミドゲルを介して分画され、ＡＢＩ ３７７ ＤＮＡシーケンサを使用して検出された。
【0239】
アミノ酸を変更するための部位特異的変異誘発。ＴＮＶ１４８ ｍＡｂにおいてＰｒｏ７５をセリン残基に置き換えるために、ＴＮＶ１４８重鎖可変領域ＤＮＡ配列の単一ヌクレオチドを変更した。相補的オリゴヌクレオチド３９９及び４００（表１）を設計し、製造業者により説明されるように、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（商標）部位特異的変異誘発法を使用して、この変更を起こさせた。１５％ポリアクリルアミドゲルにより２つのオリゴヌクレオチドを最初に分画し、主要バンドを精製した。１０ｎｇ又は５０ｎｇのいずれかのＴＮＶ１４８重鎖プラスミドテンプレート（ｐ１７５３）、５μＬの１０×反応緩衝剤、１μＬのｄＮＴＰミックス、１２５ｎｇのプライマ３９９、１２５ｎｇのプライマ４００、及び１μＬのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼを使用して、変異誘発反応物を調製した。減菌水を添加して総容量を５０μＬにした。次に、反応混合物を、９５℃で３０秒間インキュベートするようにプログラムされたサーマルサイクラでインキュベートし、次に、９５℃で３０秒間、５５℃で１分間、６４℃で１分間、６８℃で７分間、続いて３０℃で２分間（１サイクル）の一連のインキュベーションで１４回サイクルした。これらの反応物は、変異原性オリゴヌクレオチドを、その他の点では同一の新しく合成されたプラスミドに組み込むように設計された。元のＴＮＶ１４８プラスミドを除去するために、元のメチル化プラスミドのみを切断する１μＬのＤｐｎＩエンドヌクレアーゼを添加した後、試料を３７℃で１時間インキュベートした。次に、１μＬの反応物を使用して、標準的な熱ショック方法によりＥｐｉｃｕｒｉａｎ Ｃｏｌｉ ＸＬ１－Ｂｌｕｅスーパーコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））を形質転換し、ＬＢ－アンピシリン寒天プレート上で平板培養した後に形質転換された細菌を特定した。製造業者により説明されるＷｉｚａｒｄ（商標）キットを使用して、プラスミドミニプレップを調製した。Ｗｉｚａｒｄ（商標）カラムから試料を溶出した後、エタノールでプラスミドＤＮＡを沈殿させてプラスミドＤＮＡを更に精製し、その後２０μＬの減菌水に再懸濁した。次に、ＤＮＡ配列分析を行って、所望の塩基変更を有するプラスミドクローンを特定し、他の塩基変更が不注意にＴＮＶ１４８コード配列内に導入されなかったことを確認した。セクション４．３に記載される同じパラメータを使用して、１μＬのプラスミドを、３μＬのＢｉｇＤｙｅミックス、１μＬのｐＵＣ１９フォワードプライマ、及び１０μＬの減菌水で調製されたサイクル配列決定反応物に供した。
【0240】
１２Ｂ７５遺伝子からの発現ベクタの構築。いくつかの組換えＤＮＡ工程を行って、前にクローニングされた１２Ｂ７５コード重鎖及び軽鎖遺伝子のゲノムコピーから、それぞれ、新しいヒトＩｇＧ１発現ベクタ及び新しいヒトκ発現ベクタを調製した（これは、国際公開第０２／１２５００号として公開された、「ＩＬ－１２ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｕｓｅｓ」と題される、２０００年１０月７日出願の米国特許出願第６０／２３６，８２７号に開示されており、その全体は参照により本明細書に組み込まれる）。最終ベクタは、任意の適切に設計されたＰＣＲ増幅可変領域で、既存の可変領域配列の簡単な一工程置換を可能にするように設計された。
【0241】
プラスミドｐ１５６０の１２Ｂ７５重鎖遺伝子を修飾するために、プロモータ及び可変領域を含有する６．８５ｋｂのＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片をｐ１５６０からｐＵＣ１９に移してｐ１７４３を作製した。ｐ１５６０と比較してサイズがより小さいこのプラスミドは、製造業者のプロトコルに従い、翻訳開始部位のすぐ上流に固有のＢｓｉＷＩクローニング部位を導入するための、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（商標）変異誘発の使用（オリゴヌクレオチドＢｓｉＷＩ－１及びＢｓｉＷＩ－２を使用する）を可能にした。結果として得られたプラスミドはｐ１７４７と呼ばれた。ＢｓｔＢＩ部位を可変領域の３’端に導入するために、５’オリゴヌクレオチドプライマはＳａｌＩ及びＢｓｔＢＩ部位で設計された。このプライマをｐＵＣリバースプライマと共に使用してｐ１７４７から２．７５ｋｂの断片を増幅した。次に、この断片を１２Ｂ７５可変領域の自然に生じるＳａｌＩ部位及びＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングして戻し、それにより固有のＢｓｔＢ１部位を導入した。ｐ１７５０と表記される結果として得られた中間ベクタは、ＢｓｉＷＩ及びＢｓｔＢＩ端を有する可変領域断片を受容することができた。定常領域も１２Ｂ７５遺伝子に由来する重鎖ベクタのバージョンを調製するために、ｐ１７５０のＢａｍＨＩ－ＨｉｎｄＩＩＩインサートは、ＨｉｎｄＩＩＩ部位の下流にＥｃｏＲＩ部位を有するためにｐＢＲ３２２に移された。次に、結果として得られたプラスミドｐ１７６８を、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、ｐ１５６０からｐＢＣに大きなＢａｍＨＩ－ＢａｍＨＩ断片をクローニングすることによって得られたサブクローンであるｐ１７４４からの５．７ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ ＥｃｏＲＩ断片にライゲートした。次に、結果として得られたプラスミドｐ１７８４は、ＢｓｉＷＩ及びＢｓｔＢＩ端を有するＴＮＶ Ａｂ ｃＤＮＡ断片のベクタとして使用された。追加の作業は、１２Ｂ７５遺伝子からのＩｇＧ１定常領域を含み、１２Ｂ７５重鎖Ｊ－Ｃイントロンをどの程度含有するかによって互いに異なる、発現ベクタｐ１７８８及びｐ１７９８を調製するために行われた。
【0242】
プラスミドｐ１５５８の１２Ｂ７５軽鎖遺伝子を修飾するために、１２Ｂ７５プロモータ及び可変領域を含有する５．７ｋｂのＳａｌＩ／ＡｆｌＩＩ断片を、ｐ１５５８からプラスミドＬ２８のＸｈｏＩ／ＡｆｌＩＩ部位に移した。この新しいプラスミドｐ１７４５は、変異誘発工程のためのより小さなテンプレートを提供した。オリゴヌクレオチド（Ｃ３４０ｓａｌＩ及びＣ３４０ｓａｌ２）を使用して、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（商標）変異誘発により、可変領域の５’端に固有のＳａｌＩ制限部位を導入した。結果として得られた中間ベクタｐ１７４６は、可変領域断片がクローニングされ得る固有のＳａｌＩ及びＡｆｌＩＩ制限部位を有していた。ｐ１７４６にクローニングされた任意の可変領域断片は、軽鎖遺伝子の３’半分と結合されることが好ましいであろう。この目的のために使用され得る１２Ｂ７５軽鎖遺伝子の３’半分からの制限断片を調製するために、オリゴヌクレオチドＢＡＨＮ－１及びＢＡＨＮ－２を互いにアニールして、制限部位ＢｓｉＷ１、ＡｆｌＩＩ、ＨｉｎｄＩＩ、及びＮｏｔＩを含有し、ＫｐｎＩ及びＳａｃＩ部位にライゲートされ得る端部を含有する二本鎖リンカを形成した。このリンカをｐＢＣのＫｐｎＩ部位とＳａｃＩ部位との間にクローニングして、プラスミドｐ１７５７を得た。ｐ１５５８をＡｆｌＩＩで消化した後、ＨｉｎｄＩＩＩで部分的に消化することにより生成された、１２Ｂ７５軽鎖定常領域を含有する７．１ｋｂの断片を、ｐ１７５７のＡｆｌＩＩ部位とＨｉｎｄＩＩ部位との間にクローニングしてｐ１７６２を得た。この新しいプラスミドは、プロモータ及び可変領域を含有するＢｓｉＷＩ／ＡｆｌＩＩ断片が遺伝子の２つの半分を結合して移入できるＢｓｉＷＩ及びＡｆｌＩＩの固有の部位を含有していた。
【0243】
発現プラスミドのｃＤＮＡクローニング及びアセンブリ。ＤＮＡ端部を更に埋めるために、全てのＲＴ－ＰＣＲ反応物（上記を参照のこと）をＫｌｅｎｏｗ酵素で処理した。重鎖ＰＣＲ断片を制限酵素ＢｓｉＷＩ及びＢｓｔＢＩで消化した後、プラスミドＬ２８（１２Ｂ７５系中間ベクタｐ１７５０は未だ調製されていなかったため、Ｌ２８を使用した）のＢｓｉＷＩ部位とＢｓｔＢＩ部位との間にクローニングした。クローニングされたインサートのＤＮＡ配列分析は、結果として得られたコンストラクトが正しく、ＰＣＲ増幅中に誤差が導入されなかったことを示した。これらのＬ２８プラスミドコンストラクト（ＴＮＶ１４、ＴＮＶ１５、ＴＮＶ１４８、ＴＮＶ１４８Ｂ、及びＴＮＶ１９６）に割り当てられた識別番号を表３に示す。
【0244】
ＴＮＶ１４、ＴＮＶ１４８、及びＴＮＶ１４８Ｂ重鎖のＢｓｉＷＩ／ＢｓｔＢＩインサートは、Ｌ２８ベクタから新しく調製された中間ベクタｐ１７５０に移された。これらの中間プラスミドに割り当てられた識別番号を表２に示す。このクローニング工程及び後続の工程は、ＴＮＶ１５及びＴＮＶ１９６には行われなかった。次に、可変領域は、２つの異なるヒトＩｇＧ１発現ベクタ内に移された。制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩを使用して、可変領域を、Ｃｅｎｔｏｃｏｒの以前使用されたＩｇＧ１ベクタｐ１０４内に移した。Ｇｍ（ｆ＋）アロタイプのＩｇＧ１をコードする、結果として得られた発現プラスミドは、ｐ１７８１（ＴＮＶ１４）、ｐ１７８２（ＴＮＶ１４８）、及びｐ１７８３（ＴＮＶ１４８Ｂ）と表記された（表２を参照のこと）。可変領域は、１２Ｂ７５（ＧｅｎＰｈａｒｍ）遺伝子に由来するＩｇＧ１定常領域の上流にもクローニングされた。Ｇ１ｍ（ｚ）アロタイプのＩｇＧ１をコードするこれらの発現プラスミドも表３に列記される。
【0245】
【表4】
【0246】
軽鎖ＰＣＲ生成物を制限酵素ＳａｌＩ及びＳａｃＩＩで消化した後、プラスミドｐＢＣのＳａｌＩ部位とＳａｃＩＩ部位との間にクローニングした。１つのアミノ酸で異なる２つの異なる軽鎖バージョンは、ｐ１７４８及びｐ１７４９と表記された（表２）。ＤＮＡ配列分析により、これらのコンストラクトが正しい配列を有することが確認された。次に、ｐ１７４８及びｐ１７４９のＳａｌＩ／ＡｆｌＩＩ断片を、中間ベクタｐ１７４６のＳａｌＩ部位とＡｆｌＩＩ部位との間にクローニングして、それぞれｐ１７５５及びｐ１７５６を作製した。次に、軽鎖遺伝子のこれらの５’等分を、ＢｓｉＷＩ／ＡｆｌＩＩ断片をｐ１７５５及びｐ１７５６から新しく調製されたコンストラクトｐ１７６２に移すことにより遺伝子の３’等分に結合し、それぞれ最終発現プラスミドｐ１７７５及びｐ１７７６を作製した（表２）。
【0247】
細胞のトランスフェクション、スクリーニング及びサブクローニング。合計１５のマウス骨髄腫細胞のトランスフェクションを様々なＴＮＶ発現プラスミドで行った（結果及び考察セクションの表３を参照のこと）。これらのトランスフェクションは、（１）宿主細胞がＳｐ２／０又は６５３であるか、（２）重鎖定常領域がＣｅｎｔｏｃｏｒの以前のＩｇＧ１ベクタ又は１２Ｂ７５重鎖定常領域でコード化されたか、（３）ｍＡｂがＴＮＶ１４８Ｂ、ＴＮＶ１４８、ＴＮＶ１４、又は新しいＨＣ／ＬＣの組合せであったか、（４）ＤＮＡが、線形化プラスミド又は精製されたＡｂ遺伝子インサートであるかどうか、及び（５）重鎖遺伝子における完全なＪ－Ｃイントロン配列が存在又は不在であるかどうかにより区別された。加えて、トランスフェクションのいくつかは、多数のクローンをスクリーニングすることができる可能性を増大させるために繰り返された。
【0248】
Ｓｐ２／０細胞及び６５３細胞は各々、前に記載された標準条件下で（Ｋｎｉｇｈｔ ＤＭら（１９９３）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」３０：１４４３～１４５３）、エレクトロポレーションにより重鎖及び軽鎖ＤＮＡ（それぞれ８～１２：ｇ）の混合物でトランスフェクトされた。トランスフェクション番号１、２、３、及び１６に関して、トランスフェクション前に制限酵素で消化することにより、適切な発現プラスミドが線形化された。例えば、ＳａｌＩ及びＮｏｔＩ制限酵素は、それぞれＴＮＶ１４８Ｂ重鎖プラスミドｐ１７８３及び軽鎖プラスミドｐ１７７６を線形化するために使用された。残りのトランスフェクションに関して、ＢａｍＨＩで重鎖プラスミドを、そしてＢｓｉＷＩ及びＮｏｔＩで軽鎖プラスミドを消化することにより、ｍＡｂ遺伝子のみを含有するＤＮＡインサートをプラスミドベクタから分離した。次に、アガロースゲル電気泳動及びＱｉｅｘ精製樹脂により、ｍＡｂ遺伝子インサートを精製した。精製された遺伝子インサートでトランスフェクトされた細胞は、選択マーカ源として、３～５：ｇのＰｓｔＩ線形化ｐＳＶ２ｇｐｔプラスミド（ｐ１３）で同時にトランスフェクトされた。エレクトロポレーション後に、９６ウェル組織培養皿中のＩＭＤＭ、１５％ＦＢＳ、２ｍＭグルタミン中に細胞を播種し、５％ＣＯ２のインキュベータにおいて、３７℃でインキュベートした。２日後、等量のＩＭＤＭ、５％ＦＢＳ、２ｍＭグルタミン、２×ＭＨＸ選択物（１×ＭＨＸ＝０．５：ｇ／ｍＬのマイコフェノール酸、２．５：ｇ／ｍＬのヒポキサンチン、５０：ｇ／ｍＬのキサンチン）を添加し、コロニが形成される間、更に２～３週間プレートをインキュベートした。
【0249】
コロニを有するウェルから回収された細胞上清を、記載されるようにＥＬＩＳＡによりヒトＩｇＧについてアッセイした。簡潔に言うと、ポリクローナルヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ断片でコーティングされた９６ウェルＥＩＡプレート内で、様々な希釈の細胞上清をインキュベートした後、アルカリホスファターゼ抱合ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）及び適切な色基質を使用して結合ヒトＩｇＧを検出した。細胞上清において測定された同じ精製されたｍＡｂを標準として使用した標準曲線は、上清中のヒトＩｇＧの定量化を可能にするために各ＥＩＡプレートに含まれた。最もヒトＩｇＧを生成しているように見えたそれらのコロニ中の細胞を、使用済培養物における更なる生成判断のために２４ウェルプレート内に継代し、生成が最も高い親クローンを特定した。
【0250】
生成が最も高い親クローンをサブクローニングして、生成がより高いサブクローンを特定し、より均質な細胞株を調製した。９６ウェル組織培養プレートに、ＩＭＤＭ、５％ＦＢＳ、２ｍＭグルタミン、１×ＭＨＸの、ウェル当たり１つの細胞又はウェル当たり４つの細胞を播種し、コロニが現れるまで、１２～２０日間、５％ＣＯ２インキュベータにおいて３７℃でインキュベートした。ウェル当たり１つのコロニを含有するウェルから細胞上清を回収し、上述のようにＥＬＩＳＡにより分析した。選択したコロニを２４ウェルプレートに継代し、培養物を消耗させた後、それらの上清におけるヒトＩｇＧレベルを定量化することにより、生成が最も高いサブクローンを特定した。このプロセスは、選択された初回のサブクローンを２回目のサブクローニングに供したときに繰り返された。２回目の最良のサブクローンを開発の細胞株として選択した。
【0251】
細胞サブクローンの特徴付け。２回目の最良のサブクローンを選択し、成長曲線を行って、ｍＡｂの生成レベル及び細胞成長特徴を評価した。Ｔ７５フラスコに、３０ｍＬのＩＭＤＭ、５％ＦＢＳ、２ｍＭグルタミン、及び１×ＭＨＸ（又は無血清培地）中１×１０５細胞／ｍＬで播種した。３００μＬのアリコートを２４時間間隔で取り出し、生細胞密度を測定した。生細胞数が１×１０５細胞／ｍＬ未満になるまで分析を継続した。回収された細胞上清のアリコートは、存在する抗体の濃度についてアッセイされた。標準としてｒＴＮＶ１４８Ｂ又はｒＴＮＶ１４ ＪＧ９２３９９を使用して、ＥＬＩＳＡアッセイを行った。ポリクローナルヤギ抗ヒトＩｇＧ ＦｃでコーティングされたＥＬＩＳＡプレート上で試料を１時間インキュベートし、結合ｍＡｂを、１：１０００希釈のアルカリホスファターゼ抱合ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）で検出した。
【0252】
様々な量のＭＨＸ選択物の存在下での成長速度を比較する目的のため、２つの細胞株について異なる成長曲線分析も行われた。細胞株Ｃ４６６Ａ及びＣ４６６Ｂを、無ＭＨＸ培地（ＩＭＤＭ、５％ＦＢＳ、２ｍＭグルタミン）に解凍し、更に２日間培養した。その後、両細胞培養物を、ＭＨＸ無し、０．２×ＭＨＸ、又は１×ＭＨＸ（１×ＭＨＸ＝０．５：ｇ／ｍＬのマイコフェノール酸、２．５：ｇ／ｍＬのヒポキサンチン、５０：ｇ／ｍＬのキサンチン）のいずれかを含有する３つの培養物に分けた。１日後、新しいＴ７５フラスコに、１×１０５細胞／ｍＬの開始密度で培養物を播種し、細胞を１週間、２４時間間隔で計数した。ｍＡｂ生成のためのアリコートは回収されなかった。ＳＯＰ ＰＤ３２．０２５に提供される式を使用して、これらの試料についての倍加時間を算出した。
【0253】
経時的なｍＡｂ生成の安定性を評価するために、追加の試験が行われた。ＭＨＸ選択物を有する、又は有しないのいずれかで、２４ウェルプレート中のＩＭＤＭ、５％ＦＢＳ、２ｍＭグルタミン中で培養物を成長させた。培養物がコンフルエントになったら、新しい培養物に分割し、その後、古い培養物は消耗させた。この時、上清のアリコートを取り、４℃で保存した。５５～７８日の期間にわたって、アリコートを取り出した。この期間の終了時に、上に概説するように、抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ ＥＬＩＳＡにより、存在する抗体の量について上清を試験した。
【0254】
結果及び考察。
組換え受容体へのＴＮＦ結合の阻害。
ハイブリドーマ細胞上清に含有される８つのＴＮＶ ｍＡｂが、受容体へのＴＮＦα結合を阻害することができるかどうかを決定するために、簡単な結合アッセイが行われた。ヒトＩｇＧの標準ＥＬＩＳＡ分析により、それぞれの細胞上清におけるＴＮＶ ｍＡｂの濃度を最初に決定した。次に、組換えｐ５５ＴＮＦ受容体／ＩｇＧ融合タンパク質ｐ５５－ｓｆ２をＥＩＡプレート上にコーティングし、様々な量のＴＮＶ ｍＡｂの存在下で、１２５Ｉ標識ＴＮＦαをｐ５５受容体に結合させた。図１に示すように、８つのＴＮＶ ｍＡｂのうちの１つ（ＴＮＶ１２２）を除く全てが、ｐ５５受容体へのＴＮＦαの結合を効率的に遮断した。実際、ＴＮＶ ｍＡｂは、陰性対照ハイブリドーマ上清にスパイクされたｃＡ２陽性対照ｍＡｂよりもＴＮＦα結合を阻害するのにより有効であるように見えた。これらの結果は、ＴＮＶ ｍＡｂが細胞系アッセイ及びインビボでＴＮＦαの生物活性を遮断する可能性が高く、したがって、追加の分析が必要であることを示すと解釈された。
組換え受容体へのＴＮＦ結合の阻害。
ハイブリドーマ細胞上清に含有される８つのＴＮＶ ｍＡｂが、受容体へのＴＮＦα結合を阻害することができるかどうかを決定するために、簡単な結合アッセイが行われた。ヒトＩｇＧの標準ＥＬＩＳＡ分析により、それぞれの細胞上清におけるＴＮＶ ｍＡｂの濃度を最初に決定した。次に、組換えｐ５５ＴＮＦ受容体／ＩｇＧ融合タンパク質ｐ５５－ｓｆ２をＥＩＡプレート上にコーティングし、様々な量のＴＮＶ ｍＡｂの存在下で、１２５Ｉ標識ＴＮＦαをｐ５５受容体に結合させた。図１に示すように、８つのＴＮＶ ｍＡｂのうちの１つ（ＴＮＶ１２２）を除く全てが、ｐ５５受容体へのＴＮＦαの結合を効率的に遮断した。実際、ＴＮＶ ｍＡｂは、陰性対照ハイブリドーマ上清にスパイクされたｃＡ２陽性対照ｍＡｂよりもＴＮＦα結合を阻害するのにより有効であるように見えた。これらの結果は、ＴＮＶ ｍＡｂが細胞系アッセイ及びインビボでＴＮＦαの生物活性を遮断する可能性が高く、したがって、追加の分析が必要であることを示すと解釈された。
【0255】
ＤＮＡ配列の分析。
ＲＮＡがヒトｍＡｂをコードすることの確認。
受容体結合アッセイにおいてＴＮＦα遮断活性を示した７つのＴＮＶ ｍＡｂ（ＴＮＶ１４、ＴＮＶ１５、ＴＮＶ３２、ＴＮＶ８６、ＴＮＶ１１８、ＴＮＶ１４８、及びＴＮＶ１９６）を特徴付ける際の最初の工程として、これらのｍＡｂを産生する７つのハイブリドーマ細胞株から全ＲＮＡを単離した。次に、各ＲＮＡ試料を使用して、各ｍＡｂの完全なシグナル配列、完全な可変領域配列、及び定常領域配列の一部を含むヒト抗体重鎖又は軽鎖ｃＤＮＡを調製した。次に、これらのｃＤＮＡ生成物をＰＣＲ反応で増幅させ、最初に断片をクローニングすることなくＰＣＲ増幅ＤＮＡを直接配列決定した。配列決定した重鎖ｃＤＮＡは、マウスに存在する５つのヒト生殖系列遺伝子のうちの１つであるＤＰ－４６と＞９０％同一であった（図２）。同様に、配列決定した軽鎖ｃＤＮＡは、マウスに存在するヒト生殖系列遺伝子のうちの１つと１００％又は９８％のいずれかと同一であった（図３）。これらの配列結果は、ｃＤＮＡに転写され配列決定されたＲＮＡ分子がヒト抗体重鎖及びヒト抗体軽鎖をコード化したことを確認した。可変領域がシグナル配列コード配列の５’端にマッピングされるオリゴヌクレオチドを使用してＰＣＲ増幅されたため、シグナル配列の最初の数個のアミノ酸は元のＴＮＶ翻訳生成物の実際の配列ではない可能性があるが、組換えＴＮＶ ｍＡｂの実際の配列を表すことに留意するべきである。
ＲＮＡがヒトｍＡｂをコードすることの確認。
受容体結合アッセイにおいてＴＮＦα遮断活性を示した７つのＴＮＶ ｍＡｂ（ＴＮＶ１４、ＴＮＶ１５、ＴＮＶ３２、ＴＮＶ８６、ＴＮＶ１１８、ＴＮＶ１４８、及びＴＮＶ１９６）を特徴付ける際の最初の工程として、これらのｍＡｂを産生する７つのハイブリドーマ細胞株から全ＲＮＡを単離した。次に、各ＲＮＡ試料を使用して、各ｍＡｂの完全なシグナル配列、完全な可変領域配列、及び定常領域配列の一部を含むヒト抗体重鎖又は軽鎖ｃＤＮＡを調製した。次に、これらのｃＤＮＡ生成物をＰＣＲ反応で増幅させ、最初に断片をクローニングすることなくＰＣＲ増幅ＤＮＡを直接配列決定した。配列決定した重鎖ｃＤＮＡは、マウスに存在する５つのヒト生殖系列遺伝子のうちの１つであるＤＰ－４６と＞９０％同一であった（図２）。同様に、配列決定した軽鎖ｃＤＮＡは、マウスに存在するヒト生殖系列遺伝子のうちの１つと１００％又は９８％のいずれかと同一であった（図３）。これらの配列結果は、ｃＤＮＡに転写され配列決定されたＲＮＡ分子がヒト抗体重鎖及びヒト抗体軽鎖をコード化したことを確認した。可変領域がシグナル配列コード配列の５’端にマッピングされるオリゴヌクレオチドを使用してＰＣＲ増幅されたため、シグナル配列の最初の数個のアミノ酸は元のＴＮＶ翻訳生成物の実際の配列ではない可能性があるが、組換えＴＮＶ ｍＡｂの実際の配列を表すことに留意するべきである。
【0256】
固有の中和ｍＡｂ。
各ｍＡｂの重鎖及び軽鎖両方の可変領域全体のｃＤＮＡ配列の分析は、ＴＮＶ３２がＴＮＶ１５と同一であり、ＴＮＶ１１８がＴＮＶ１４と同一であり、ＴＮＶ８６がＴＮＶ１４８と同一であることを明らかにした。受容体結合アッセイの結果は、ＤＮＡ配列分析と一致していた、すなわち、ＴＮＶ８６及びＴＮＶ１４８の両方が、ＴＮＦ結合の遮断においてＴＮＶ１１８及びＴＮＶ１４の両方よりもおよそ４倍良好であった。したがって、後続の作業は、４つの固有のＴＮＶ ｍＡｂである、ＴＮＶ１４、ＴＮＶ１５、ＴＮＶ１４８、及びＴＮＶ１９６にのみ焦点を当てた。
各ｍＡｂの重鎖及び軽鎖両方の可変領域全体のｃＤＮＡ配列の分析は、ＴＮＶ３２がＴＮＶ１５と同一であり、ＴＮＶ１１８がＴＮＶ１４と同一であり、ＴＮＶ８６がＴＮＶ１４８と同一であることを明らかにした。受容体結合アッセイの結果は、ＤＮＡ配列分析と一致していた、すなわち、ＴＮＶ８６及びＴＮＶ１４８の両方が、ＴＮＦ結合の遮断においてＴＮＶ１１８及びＴＮＶ１４の両方よりもおよそ４倍良好であった。したがって、後続の作業は、４つの固有のＴＮＶ ｍＡｂである、ＴＮＶ１４、ＴＮＶ１５、ＴＮＶ１４８、及びＴＮＶ１９６にのみ焦点を当てた。
【0257】
４つのｍＡｂの関連性
ＤＮＡ配列結果は、４つのＴＮＶ ｍＡｂの重鎖をコード化する遺伝子が全て互いに高度に相同であり、全てが同じ生殖系列遺伝子ＤＰ－４６に由来するように見えることを明らかにした（図２）。加えて、重鎖ＣＤＲ３配列の各々が非常に類似し、同じ長さのものであること、及びそれらが全てＪ６エクソンを使用することを理由に、それらは、単一のＶＤＪ遺伝子再配列事象、続く各ｍＡｂを固有のものにする体細胞変化から生じたと思われた。ＤＮＡ配列分析は、４つのｍＡｂにおいて２つの別個の軽鎖遺伝子のみが存在したことを明らかにした（図３）。ＴＮＶ１４及びＴＮＶ１５における軽鎖可変領域コード配列は、互いに同一であり、ヒトκ鎖のＶｇ／３８Ｋファミリーの代表的な生殖系列配列と同一である。ＴＮＶ１４８及びＴＮＶ１９６軽鎖コード配列は、互いに同一であるが、２つのヌクレオチド位置での生殖系列配列が異なる（図３）。
ＤＮＡ配列結果は、４つのＴＮＶ ｍＡｂの重鎖をコード化する遺伝子が全て互いに高度に相同であり、全てが同じ生殖系列遺伝子ＤＰ－４６に由来するように見えることを明らかにした（図２）。加えて、重鎖ＣＤＲ３配列の各々が非常に類似し、同じ長さのものであること、及びそれらが全てＪ６エクソンを使用することを理由に、それらは、単一のＶＤＪ遺伝子再配列事象、続く各ｍＡｂを固有のものにする体細胞変化から生じたと思われた。ＤＮＡ配列分析は、４つのｍＡｂにおいて２つの別個の軽鎖遺伝子のみが存在したことを明らかにした（図３）。ＴＮＶ１４及びＴＮＶ１５における軽鎖可変領域コード配列は、互いに同一であり、ヒトκ鎖のＶｇ／３８Ｋファミリーの代表的な生殖系列配列と同一である。ＴＮＶ１４８及びＴＮＶ１９６軽鎖コード配列は、互いに同一であるが、２つのヌクレオチド位置での生殖系列配列が異なる（図３）。
【0258】
４つのｍＡｂの推定アミノ酸配列は、実際のｍＡｂの関連性を明らかにした。４つのｍＡｂは、４つの別個の重鎖（図４）を含有するが、別個の軽鎖は２つのみである（図５）。ＴＮＶ ｍＡｂ配列と生殖系列配列との間の差異は、大半はＣＤＲドメインに限定されていたが、ｍＡｂ重鎖のうちの３つもフレームワーク領域において生殖系列配列とは異なっていた（図４）。ＤＰ－４６生殖系列コードＡｂフレームワーク領域と比較して、ＴＮＶ１４は同一であり、ＴＮＶ１５は１つのアミノ酸が異なり、ＴＮＶ１４８は２つのアミノ酸が異なり、ＴＮＶ１９６は３つのアミノ酸が異なっていた。
【0259】
ｃＤＮＡのクローニング、部位特異的変異誘発、及び最終発現プラスミドのアセンブリ。ｃＤＮＡのクローニング。ＰＣＲ増幅可変領域のＤＮＡ配列に基づいて、クローニングされるコード配列を発現ベクタ内に適応させる目的のため、新しいオリゴヌクレオチドは別のＰＣＲ増幅を行うように命じられた。重鎖の場合、この２回目のＰＣＲの生成物は制限酵素ＢｓｉＷＩ及びＢｓｔＢＩで消化され、プラスミドベクタＬ２８（表２に示されるプラスミド識別番号）にクローニングされた。軽鎖の場合、２回目のＰＣＲ生成物はＳａｌＩ及びＡｆｌＩＩで消化され、プラスミドベクタｐＢＣにクローニングされた。次に、個々のクローンを配列決定して、それらの配列が、異種の可能性のある分子集団の各位置での最も豊富なヌクレオチドを明らかにするＰＣＲ生成物の直接配列決定から得られた前回の配列と同一であることを確認した。
【0260】
ＴＮＶ １４８を変化させる部位特異的変異誘発。ｍＡｂ ＴＮＶ１４８及びＴＮＶ１９６は、ＴＮＦα生理活性の中和において、次に最良のｍＡｂ（ＴＮＶ１４）よりも４倍強力であることが一貫して観察された。しかしながら、上述のように、ＴＮＶ１４８及びＴＮＶ１９６重鎖フレームワーク配列は、生殖系列フレームワーク配列とは異なる。ＴＮＶ１４８重鎖配列と他のヒト抗体との比較は、多くの他のヒトｍＡｂがフレームワーク１の位置２８でＩｌｅ残基を含有し（成熟配列のみ計数）、一方でフレームワーク３の位置７５でのＰｒｏ残基は、その位置では稀なアミノ酸であったことを示した。
【0261】
ＴＮＶ１９６重鎖の類似の比較は、フレームワーク３で生殖系列配列とは異なる３つのアミノ酸がヒトｍＡｂにおいて希であり得ることを示唆した。これらの差異は、ヒトに投与された場合、ＴＮＶ１４８及びＴＮＶ１９６を免疫原性にする可能性があった。ＴＮＶ１４８は、関心のアミノ酸残基を１個しか有しておらず、この残基はＴＮＦα結合に重要ではないと考えられているため、部位特異的変異誘発技術を使用して、生殖系列Ｓｅｒ残基が位置７５でＰｒｏ残基の代わりにコード化されるように、ＴＮＶ１４８重鎖コード配列（プラスミドｐ１７５３の）の単一のヌクレオチドを変更した。結果として得られたプラスミドはｐ１７６０と呼ばれた（表２を参照のこと）。結果として得られた遺伝子及びｍＡｂは、それを元のＴＮＶ１４８遺伝子及びｍＡｂと区別するためにＴＮＶ１４８Ｂと呼ばれた（図５を参照のこと）。
【0262】
最終発現プラスミドのアセンブリ。ゲノム断片として前にクローニングされた１２Ｂ７５重鎖及び軽鎖遺伝子に基づいた新しい抗体発現ベクタを調製した。異なるＴＮＶ発現プラスミドが調製されたが（表２を参照のこと）、それぞれの場合において、５’フランキング配列、プロモータ、及びイントロンエンハンサは、それぞれの１２Ｂ７５遺伝子に由来した。軽鎖発現プラスミドに関して、完全なＪ－Ｃイントロン、定常領域コード配列、及び３’フランキング配列も１２Ｂ７５の軽鎖遺伝子に由来した。最終生成細胞株（ｐ１７８１及びｐ１７８３、以下を参照のこと）をもたらした重鎖発現プラスミドに関して、ヒトＩｇＧ１定常領域コード配列は、Ｃｅｎｔｏｃｏｒの前に使用された発現ベクタ（ｐ１０４）に由来した。重要なことには、ここで報告される最終生成細胞株は、元のハイブリドーマ由来ＴＮＶ ｍＡｂ（Ｇ１ｍ（ｚ））とは異なるアロタイプ（Ｇｍ（ｆ＋））のＴＮＶ ｍＡｂを発現する。これは、ＧｅｎＰｈａｒｍマウスに由来する１２Ｂ７５重鎖遺伝子はＣＨ１ドメインのＣ末端部でＡｒｇ残基をコードするが、ＣｅｎｔｏｃｏｒのＩｇＧ１発現ベクタｐ１０４はその位置でＬｙｓ残基をコードするためである。Ｊ－Ｃイントロン、完全定常領域コード配列、及び３’フラランキング配列が１２Ｂ７５重鎖遺伝子に由来する他の重鎖発現プラスミド（例えば、ｐ１７８６及びｐ１７８８）が調製されたが、これらの遺伝子でトランスフェクトされた細胞株は、生成細胞株として選択されなかった。ベクタは、最終発現プラスミドをもたらす後のＰＣＲ増幅Ｖ領域の一工程クローニングを可能にするように慎重に設計された。
【0263】
ＰＣＲ増幅可変領域ｃＤＮＡは、Ｌ２８又はｐＢＣベクタから、プロモータ領域及びＪ－Ｃイントロンの一部を提供する中間段階の１２Ｂ７５系ベクタに移された（プラスミド識別番号に関しては表２を参照のこと）。次に、抗体遺伝子の５’半分を含有する制限断片を、これらの中間段階のベクタから、それぞれの遺伝子の３’半分を提供する最終発現ベクタに移して、最終発現プラスミド（プラスミド識別番号に関しては表２を参照のこと）を形成した。
【0264】
細胞のトランスフェクション及びサブクローニング。発現プラスミドは、制限消化によって線形化されたか、又は各プラスミド中の抗体遺伝子インサートがプラスミド骨格鎖から精製されたかのいずれかであった。Ｓｐ２／０及び６５３マウス骨髄腫細胞は、エレクトロポレーションにより重鎖ＤＮＡ及び軽鎖ＤＮＡでトランスフェクトされた。１５の異なるトランスフェクションが行われ、そのほとんどはＡｂで規定されるように固有であり、遺伝子が線形化された全プラスミド又は精製された遺伝子インサート上にあるかどうかに関わらずＡｂ遺伝子の特定の特徴であり、宿主細胞株であった（表４に要約される）。マイコフェノール酸に耐性のクローンからの細胞上清を、ヒトＩｇＧの存在についてＥＬＩＳＡによりアッセイし、精製されたｒＴＮＶ１４８Ｂを参照標準曲線として使用して定量化した。
【0265】
産生が最も高いｒＴＮＶ１４８Ｂ細胞株
ｒＴＮＶ１４８Ｂトランスフェクション２からの、産生が最高の６５３親株のうちの１０（使用済２４ウェル培養物において５～１０：ｇ／ｍＬを産生）をサブクローニングして、産生がより高い細胞株についてスクリーニングし、より均質な細胞集団を調製した。親株２．３２０、２．３２０－１７、及び２．３２０－２０のサブクローンのうちの２つは、使用済２４ウェル培養物においておよそ５０：ｇ／ｍＬを産生し、これは、それらの親株に対して５倍の増加であった。サブクローニングした株２．３２０－１７及び２．３２０－２０の２回目のサブクローニングがもたらした。
ｒＴＮＶ１４８Ｂトランスフェクション２からの、産生が最高の６５３親株のうちの１０（使用済２４ウェル培養物において５～１０：ｇ／ｍＬを産生）をサブクローニングして、産生がより高い細胞株についてスクリーニングし、より均質な細胞集団を調製した。親株２．３２０、２．３２０－１７、及び２．３２０－２０のサブクローンのうちの２つは、使用済２４ウェル培養物においておよそ５０：ｇ／ｍＬを産生し、これは、それらの親株に対して５倍の増加であった。サブクローニングした株２．３２０－１７及び２．３２０－２０の２回目のサブクローニングがもたらした。
【0266】
各ｍＡｂをコードする重鎖及び軽鎖プラスミドの識別番号を示す。精製されたｍＡｂ遺伝子インサートで行われたトランスフェクションの場合、ｇｐｔ選択マーカの供給源としてプラスミドｐ１３（ｐＳＶ２ｇｐｔ）が含まれた。重鎖定常領域は、Ｒｅｍｉｃａｄｅをコードするために使用された同じヒトＩｇＧ１発現ベクタ（「旧」）又は１２Ｂ７５（ＧｅｎＰｈａｒｍ／Ｍｅｄａｒｅｘ）重鎖遺伝子内に含有される定常領域（「新規」）のいずれかによりコード化された。Ｈ１／Ｌ２は、ＴＮＶ１４重鎖及びＴＮＶ１４８軽鎖で構成される「新規」ｍＡｂを指す。プラスミドｐ１７８３及びｐ１８０１は、それらの重鎖遺伝子がＪ－Ｃイントロンをどの程度含有するかによってのみ異なる。細胞クローンの遺伝子名の最初の数字を定義するトランスフェクション番号は右側に示される。本明細書に記載されるｒＴＮＶ１４８Ｂ生成細胞株Ｃ４６６（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）及びＣ４６７Ａは、それぞれトランスフェクション番号２及び１に由来した。ｒＴＮＶ１４生成細胞株Ｃ４７６Ａはトランスフェクション番号３に由来した。
【0267】
【表5】
【0268】
使用済の２４ウェル培養上清でのＥＬＩＳＡアッセイは、これらの２回目のサブクローンが全て９８～１２４：ｇ／ｍＬを産生したことを示し、これは初回のサブクローンに対して少なくとも２倍の増加であった。これらの６５３細胞株に、表５に示されるように、Ｃコード表記を割り当てた。
【0269】
ｒＴＮＶ１４８Ｂトランスフェクション１からの生成が最高のＳｐ２／０親株のうちの３つをサブクローニングした。親株１．７３の２回のサブクローニングは、使用済２４ウェル培養物において２５：ｇ／ｍＬを産生したクローンの特定につながった。このＳｐ２／０細胞株をＣ４６７Ａと表記した（表５）。
【0270】
［１５］産生が最も高いｒＴＮＶ１４細胞株
ｒＴＮＶ１４トランスフェクション３からの生成が最高のＳｐ２／０親株のうちの３つを１回サブクローニングした。サブクローン３．２７－１は、産生が１９：ｇ／ｍＬであり、使用済の２４ウェル培養物において最も高い生産体であることが分かった。この細胞株をＣ４７６Ａと表記した（表５）。
ｒＴＮＶ１４トランスフェクション３からの生成が最高のＳｐ２／０親株のうちの３つを１回サブクローニングした。サブクローン３．２７－１は、産生が１９：ｇ／ｍＬであり、使用済の２４ウェル培養物において最も高い生産体であることが分かった。この細胞株をＣ４７６Ａと表記した（表５）。
【0271】
【表6】
【0272】
サブクローニングされた細胞株の特徴付け
細胞株の成長特徴をより慎重に特徴付けし、大規模でｍＡｂ生成レベルを決定するために、Ｔ７５培養物を使用して成長曲線分析を行った。結果は、細胞株の４つのＣ４６６シリーズの各々が１．０×１０６～１．２５×１０６細胞／ｍＬのピーク細胞密度及び１１０～１４０：ｇ／ｍＬの最大ｍＡｂ蓄積レベルに達したことを示した（図７）。対照的に、生成が最高のＳｐ２／０サブクローンＣ４６７Ａは、２．０×１０６細胞／ｍＬのピーク細胞密度及び２５：ｇ／ｍＬの最大ｍＡｂ蓄積レベルに達した（図７）。成長曲線分析は、ｒＴＮＶ１４－生成細胞株Ｃ４７６Ａに対して行われなかった。
細胞株の成長特徴をより慎重に特徴付けし、大規模でｍＡｂ生成レベルを決定するために、Ｔ７５培養物を使用して成長曲線分析を行った。結果は、細胞株の４つのＣ４６６シリーズの各々が１．０×１０６～１．２５×１０６細胞／ｍＬのピーク細胞密度及び１１０～１４０：ｇ／ｍＬの最大ｍＡｂ蓄積レベルに達したことを示した（図７）。対照的に、生成が最高のＳｐ２／０サブクローンＣ４６７Ａは、２．０×１０６細胞／ｍＬのピーク細胞密度及び２５：ｇ／ｍＬの最大ｍＡｂ蓄積レベルに達した（図７）。成長曲線分析は、ｒＴＮＶ１４－生成細胞株Ｃ４７６Ａに対して行われなかった。
【0273】
更なる成長曲線分析を行って、異なる濃度のＭＨＸ選択物における成長速度を比較した。この比較は、ＭＨＸの不在下で培養されたＣ４６６細胞が、通常量のＭＨＸ（１×）で培養された同じ細胞よりも速く成長しているように思われる近年の観測によって促された。マイコフェノール酸などの化合物の細胞傷害性濃度は数桁の大きさ以上に測定される傾向にあるため、より低い濃度のＭＨＸを使用することにより、ｍＡｂ生成の安定性を犠牲にすることなく細胞の倍加時間を大幅に速くし得ることが可能であると考えられた。細胞株Ｃ４６６Ａ及びＣ４６６Ｂは、ＭＨＸ無し、０．２×ＭＨＸ、又は１×ＭＨＸのいずれかで培養された。生細胞の計数は、７日間、２４時間間隔で行われた。結果により、ＭＨＸ濃度依存性細胞成長率が明らかになった（図８）。細胞株Ｃ４６６Ａは、１×ＭＨＸにおいて２５．０時間の倍加時間を示したが、ＭＨＸ無しではわずか２０．７時間の倍加時間を示した。同様に、細胞株Ｃ４６６Ｂは、１×ＭＨＸにおいて３２．４時間の倍加時間を示したが、ＭＨＸ無しではわずか２２．９時間の倍加時間を示した。重要なことには、０．２Ｘ ＭＨＸにおける両細胞株の倍加時間は、１Ｘ ＭＨＸよりもＭＨＸ無しで観測されたものとより類似していた（図８）。この観測は、倍加時間が重要なパラメータであるバイオリアクターにおいて、増強された細胞性能がより少ないＭＨＸを使用することにより実現され得る可能性を示す。しかしながら、安定性試験結果（以下を参照のこと）は、細胞株Ｃ４６６ＤがＭＨＸの不在下でも少なくとも６０日間、ｒＴＮＶ１４８Ｂを安定して生成することが可能であることを示唆するが、安定性試験は又、ＭＨＸの不在と比較して、細胞がＭＨＸの存在下で培養されたとき、より高いｍＡｂ生成レベルも示した。
【0274】
およそ６０日の期間にわたって様々な細胞株からのｍＡｂの生成を評価するために、ＭＨＸ選択物を含有する又は含有しない、いずれかの培養物で安定性試験を行った。細胞株の全てが高ｍＡｂ生成を維持したわけではなかった。培養のちょうど２週間後、クローンＣ４６６Ａの生成は試験開始時よりもおよそ４５％少なかった。クローンＣ４６６Ｂからの生成も大幅に低下したように思われた。しかしながら、クローンＣ４６６Ｃ及びＣ４６６Ｄは、かなり安定した生成を維持し、Ｃ４６６Ｄは最も高い絶対生成レベルを示した（図９）。
【0275】
結論
ヒトＴＮＦαに対する８つのヒトｍＡｂの初期パネルから、タンパク質配列及びＴＮＦ中和効力を含むいくつかの基準に基づいて、ＴＮＶ１４８Ｂ並びにＴＮＶ１４が好ましいものとして選ばれた。１００：ｇ／ｍＬ超のｒＴＮＶ１４８Ｂ及び１９：ｇ／ｍＬ超のｒＴＮＶ１４を産生する細胞株を調製した。
ヒトＴＮＦαに対する８つのヒトｍＡｂの初期パネルから、タンパク質配列及びＴＮＦ中和効力を含むいくつかの基準に基づいて、ＴＮＶ１４８Ｂ並びにＴＮＶ１４が好ましいものとして選ばれた。１００：ｇ／ｍＬ超のｒＴＮＶ１４８Ｂ及び１９：ｇ／ｍＬ超のｒＴＮＶ１４を産生する細胞株を調製した。
【0276】
実施例５：単回ボーラス注射を使用した抗ＴＮＦ抗体及び対照を使用した関節炎マウスの試験
およそ４週齢のＴｇ１９７試験マウスを性別及び体重に基づき９つの処置群のうちの１つに割り当て、ＤｕｌｂｅｃｃｏのＰＢＳ（Ｄ－ＰＢＳ）、又は１ｍｇ／ｋｇ若しくは１０ｍｇ／ｋｇのいずれかの本発明の抗ＴＮＦ抗体（ＴＮＶ１４、ＴＮＶ１４８、又はＴＮＶ１９６）の単回腹腔内ボーラス投与で処置した。
およそ４週齢のＴｇ１９７試験マウスを性別及び体重に基づき９つの処置群のうちの１つに割り当て、ＤｕｌｂｅｃｃｏのＰＢＳ（Ｄ－ＰＢＳ）、又は１ｍｇ／ｋｇ若しくは１０ｍｇ／ｋｇのいずれかの本発明の抗ＴＮＦ抗体（ＴＮＶ１４、ＴＮＶ１４８、又はＴＮＶ１９６）の単回腹腔内ボーラス投与で処置した。
【0277】
結果：体重を投与前からの変化として分析したとき、１０ｍｇ／ｋｇのｃＡ２で処置した動物は、試験を通してＤ－ＰＢＳで処置した動物よりも一貫して高い体重増加を示した。この体重増加は、３～７週目で有意であった。１０ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４８で処置した動物も、試験の７週目に有意な体重増加を達成した。（図１０を参照のこと）。
【0278】
図１１Ａ～Ｃは、関節炎指数に基づく疾患の重症度の進行を表す。１０ｍｇ／ｋｇのｃＡ２処置群の関節炎指数は、３週目から始まり、残りの試験（７週目）を通して継続するＤ－ＰＢＳ対照群よりも低かった。１ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４で処置した動物及び１ｍｇ／ｋｇのｃＡ２で処置した動物は、Ｄ－ＰＢＳ処置群と比較したとき、３週目以降のＡＩにおいて有意な減少を示すことができなかった。各々を類似の用量のその他のものと比較したとき（１０ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４、１４８及び１９６と比較した１０ｍｇ／ｋｇのｃＡ２）、１０ｍｇ／ｋｇの処置群の間に有意差はなかった。１ｍｇ／ｋｇの処置群を比較したとき、１ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４８は、１ｍｇ／ｋｇのｃＡ２よりも３、４及び７週目で有意に低いＡＩを示した。１ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４８も、１ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４で処置した群よりも３及び４週目で有意に低かった。ＴＮＶ１９６は試験の６週目までＡＩにおいて有意な減少を示したが（Ｄ－ＰＢＳで処置した群と比較したとき）、ＴＮＶ１４８はこの試験の終了時に有意のままであった唯一の１ｍｇ／ｋｇ処置群であった。
【0279】
実施例６：複数ボーラス投与として抗ＴＮＦ抗体及び対照を使用した関節炎マウスの試験
およそ４週齢のＴｇ１９７試験マウスを体重に基づき８つの処置群のうちの１つに割り当て、対照品（Ｄ－ＰＢＳ）、又は３ｍｇ／ｋｇの抗体（ＴＮＶ１４、ＴＮＶ１４８）（０週目）の腹腔内ボーラス投与で処置した。注射は１、２、３、及び４週目に全ての動物において繰り返された。群１～６は、試験品の有効性に関して評価された。群７及び８の動物から得られた血清試料は、２、３及び４週目のＴＮＶ１４又はＴＮＶ１４８の免疫応答誘導及び薬物動態クリアランスに関して評価された。
およそ４週齢のＴｇ１９７試験マウスを体重に基づき８つの処置群のうちの１つに割り当て、対照品（Ｄ－ＰＢＳ）、又は３ｍｇ／ｋｇの抗体（ＴＮＶ１４、ＴＮＶ１４８）（０週目）の腹腔内ボーラス投与で処置した。注射は１、２、３、及び４週目に全ての動物において繰り返された。群１～６は、試験品の有効性に関して評価された。群７及び８の動物から得られた血清試料は、２、３及び４週目のＴＮＶ１４又はＴＮＶ１４８の免疫応答誘導及び薬物動態クリアランスに関して評価された。
【0280】
結果：体重を投与前からの変化として分析したとき、有意差は認められなかった。１０ｍｇ／ｋｇのｃＡ２で処置した動物は、試験を通してＤ－ＰＢＳで処置した動物よりも一貫して高い体重増加を示した。（図１２を参照のこと）。
【0281】
図１３Ａ～Ｃは、関節炎指数に基づく疾患の重症度の進行を表す。１０ｍｇ／ｋｇのｃＡ２で処置した群の関節炎指数は、２週目から始まり、残りの試験全体を通して（５週目）継続してＤ－ＰＢＳ対照群よりも有意に低かった。１ｍｇ／ｋｇ又は３ｍｇ／ｋｇのｃＡ２で処置した動物及び３ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４で処置した動物は、ｄ－ＰＢＳ対照群と比較したときに、試験を通して任意の時点でＡＩにおいて任意の有意な減少を達成することができなかった。３ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４８で処置した動物は、ｄ－ＰＢＳで処置した群と比較したとき、３週目から始まり、５週目まで継続する有意な減少を示した。１０ｍｇ／ｋｇのｃＡ２で処置した動物は、試験の４及び５週目でより低い用量の両ｃＡ２（１ｍｇ／ｋｇ及び３ｍｇ／ｋｇ）と比較したとき、ＡＩにおいて有意な減少を示し、又３～５週目で、ＴＮＶ１４で処置した動物よりも有意に低かった。３ｍｇ／ｋｇの処置群のいずれかの間に有意差はなかったようだが、３ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４で処置した動物に関するＡＩは、ある時点で１０ｍｇ／ｋｇよりも有意に高く、一方ＴＮＶ１４８で処置した動物は、１０ｍｇ／ｋｇのｃＡ２で処置した動物と有意に異ならなかった。
【0282】
実施例７：単回腹腔内ボーラス投与として抗ＴＮＦ抗体及び対照を使用した関節炎マウスの試験
およそ４週齢のＴｇ１９７試験マウスを性別及び体重に基づき６つの処置群のうちの１つに割り当て、３ｍｇ／ｋｇ又は５ｍｇ／ｋｇのいずれかの抗体（ｃＡ２又はＴＮＶ１４８）の単回腹腔内ボーラス投与で処置した。この試験は、Ｄ－ＰＢＳ及び１０ｍｇ／ｋｇのｃＡ２対照群を利用した。
およそ４週齢のＴｇ１９７試験マウスを性別及び体重に基づき６つの処置群のうちの１つに割り当て、３ｍｇ／ｋｇ又は５ｍｇ／ｋｇのいずれかの抗体（ｃＡ２又はＴＮＶ１４８）の単回腹腔内ボーラス投与で処置した。この試験は、Ｄ－ＰＢＳ及び１０ｍｇ／ｋｇのｃＡ２対照群を利用した。
【0283】
体重を投与前からの変化として分析したとき、全ての処置は似たような体重増加を達成した。３又は５ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４８又は５ｍｇ／ｋｇのｃＡ２のいずれかで処置した動物は、試験の早期（２及び３週目）に体重量が有意に増加した。ＴＮＶ１４８で処置した動物のみが後の時点において有意な体重増加を維持した。３及び５ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４８で処置した動物はどちらも、７週目で有意を示し、３ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４８で処置した動物は注射の８週間後に尚も有意に上昇した。（図１４を参照のこと）。
【0284】
図１５は、関節炎指数に基づく疾患の重症度の進行を表す。全ての処置群が初期の時点で多少の保護作用を示し、５ｍｇ／ｋｇのｃＡ２及び５ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４８は、１～３週目にＡＩにおいて有意な減少を示し、全ての処置群が２週目で有意な減少を示した。試験の後期に、５ｍｇ／ｋｇのｃＡ２で処置した動物は多少の保護作用を示し、４、６及び７週目で有意に減少した。低用量（３ｍｇ／ｋｇ）のｃＡ２及びＴＮＶ１４８は両方とも、６週目で有意な減少を示し、全ての処置群が７週目で有意な減少を示した。試験の終わりで（８週目）有意な減少を維持することができた処置群はなかった。任意の時点で処置群のいずれかの間（食塩水対照群は除く）に有意差はなかった。
【0285】
実施例８：抗ＴＮＦ抗体と修飾された抗ＴＮＦ抗体との間の単回腹腔内ボーラス投与として抗ＴＮＦ抗体及び対照を使用した関節炎マウスの試験
ＴＮＶ１４８（ハイブリドーマ細胞に由来する）及びｒＴＮＶ１４８Ｂ（トランスフェクトした細胞に由来する）の単回腹腔内投与の有効性を比較するために。およそ４週齢のＴｇ１９７試験マウスを性別及び体重に基づき９つの処置群のうちの１つに割り当て、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ＝Ｓ ＰＢＳ（Ｄ－ＰＢＳ）、又は１ｍｇ／ｋｇの抗体（ＴＮＶ１４８、ｒＴＮＶ１４８Ｂ）の単回腹腔内ボーラス投与で処置した。＝
ＴＮＶ１４８（ハイブリドーマ細胞に由来する）及びｒＴＮＶ１４８Ｂ（トランスフェクトした細胞に由来する）の単回腹腔内投与の有効性を比較するために。およそ４週齢のＴｇ１９７試験マウスを性別及び体重に基づき９つの処置群のうちの１つに割り当て、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ＝Ｓ ＰＢＳ（Ｄ－ＰＢＳ）、又は１ｍｇ／ｋｇの抗体（ＴＮＶ１４８、ｒＴＮＶ１４８Ｂ）の単回腹腔内ボーラス投与で処置した。＝
【0286】
体重を投与前からの変化として分析したとき、１０ｍｇ／ｋｇのｃＡ２で処置した動物は、試験を通してＤ－ＰＢＳで処置した動物よりも一貫して高い体重増加を示した。この体重増加は、１週目及び３～８週目で有意であった。１ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４８で処置した動物も、試験の５、６及び８週目に有意な体重増加を達成した。（図１６を参照のこと）。
【0287】
図１７は、関節炎指数に基づく疾患の重症度の進行を表す。１０ｍｇ／ｋｇのｃＡ２処置群の関節炎指数は、４週目から始まり、残りの試験（８週目）を通して継続するＤ－ＰＢＳ対照群よりも低かった。ＴＮＶ１４８で処置した群及び１ｍｇ／ｋｇのｃＡ２で処置した群は両方とも、４週目でＡＩにおける有意な減少を示した。以前の試験（Ｐ－０９９－０１７）は、ＴＮＶ１４８が単回の１ｍｇ／ｋｇの腹腔内ボーラス後の関節炎指数の減少にわずかにより効果的であることを示したが、この試験では、両バージョンのＴＮＶ抗体で処置した群からのＡＩがわずかに高いことを示した。１ｍｇ／ｋｇのｃＡ２で処置した群（６週目を除く）は、１０ｍｇ／ｋｇのｃＡ２群と比較したとき、有意に増加せず、ＴＮＶ１４８で処置した群は、７及び８週目で有意に高かったが、１ｍｇ／ｋｇのｃＡ２、１ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４８及び１ｍｇ／ｋｇのＴＮＶ１４８Ｂの間には試験の任意の時点でＡＩにおいて有意差はなかった。
【0288】
実施例９：ＳＩＭＰＯＮＩ（登録商標）（ゴリムマブ）の製造プロセス
ゴリムマブのバックグラウンド
抗ＴＮＦα剤を用いた治療は炎症性関節炎の治療に成功裏に使用されてきたが、初期の抗ＴＮＦα剤は安全性、投与計画、費用、及び／又は免疫原性に関して限界があった。いくつかの限界に対処するために、ＳＩＭＰＯＮＩ（登録商標）（ゴリムマブ）と表される完全ヒト抗抗ＴＮＦαｍＡｂが開発された。ゴリムマブ（ＣＮＴＯ１４８及びｒＴＮＶ１４８Ｂとしても既知である）は、免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１）重鎖アイソタイプ（Ｇ１ｍ［ｚ］アロタイプ）及びκ軽鎖アイソタイプを有する完全ヒトモノクローナル抗体である。ゴリムマブは、配列番号３６を含む重鎖（ＨＣ）及び配列番号３７を含む軽鎖（ＬＣ）を有する。ゴリムマブの分子量は、１４９，８０２～１５１，０６４ダルトンの範囲である。
ゴリムマブのバックグラウンド
抗ＴＮＦα剤を用いた治療は炎症性関節炎の治療に成功裏に使用されてきたが、初期の抗ＴＮＦα剤は安全性、投与計画、費用、及び／又は免疫原性に関して限界があった。いくつかの限界に対処するために、ＳＩＭＰＯＮＩ（登録商標）（ゴリムマブ）と表される完全ヒト抗抗ＴＮＦαｍＡｂが開発された。ゴリムマブ（ＣＮＴＯ１４８及びｒＴＮＶ１４８Ｂとしても既知である）は、免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１）重鎖アイソタイプ（Ｇ１ｍ［ｚ］アロタイプ）及びκ軽鎖アイソタイプを有する完全ヒトモノクローナル抗体である。ゴリムマブは、配列番号３６を含む重鎖（ＨＣ）及び配列番号３７を含む軽鎖（ＬＣ）を有する。ゴリムマブの分子量は、１４９，８０２～１５１，０６４ダルトンの範囲である。
【0289】
ゴリムマブは、高い親和性及び特異性を有し、ヒト腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）の可溶性の形態及び膜貫通型の生物活性形態の両方を有する高親和性の安定な複合体を形成し、この複合体は、ＴＮＦαの受容体への結合を防止し、ＴＮＦαの生理活性を中和する。他のＴＮＦαスーパーファミリーリガンドに対する結合は観察されなかった。具体的には、ゴリムマブは、ヒトリンパ球に結合しない、又は中和しない。ＴＮＦαは、自己会合して生物活性ホモトリマーを形成し、タンパク質分解によって細胞表面から急速に放出される膜貫通タンパク質として、主として活性化された単球、マクロファージ及びＴ細胞により合成される。ＴＮＦαのｐ５５又はｐ７５ ＴＮＦ受容体のいずれかへの結合により、受容体細胞質ドメインがクラスター化し、シグナル伝達が開始される。腫瘍壊死因子αは、様々な刺激に応答して産生され、続いて、カスパーゼ依存性アポトーシス経路並びに転写因子核内因子（ＮＦ）－κＢ及び活性化因子タンパク質－１（ＡＰ－１）の活性化による炎症応答を促進する、主要なセンチネルサイトカインとして特定された。腫瘍壊死因子αは又、胚中心での免疫細胞の組織化における役割を介して免疫応答を調節する。ＴＮＦαの発現の上昇は、リウマチ性関節炎（ＲＡ）などの慢性炎症性疾患、並びに乾癬性関節炎（ＰｓＡ）及び強直性脊椎炎（ＡＳ）などの脊椎関節症に関連しており、これらの疾患に特徴的な関節性炎症及び構造的損傷の重要なメディエーターである。
【0290】
ゴリムマブを用いた臨床経験
強直性脊椎炎（ＡＳ）を対象としたゴリムマブ皮下（ＳＣ）投与のグローバル無作為化二重盲検プラセボ対照第３相試験（試験Ｃ０５２４Ｔ０９）において、ゴリムマブは、強直性脊椎炎（ＡＳ）に罹患した被験者における徴候及び症状、身体機能、健康関連の生活の質（ＨＲＱＯＬ）の改善に有効であることが実証された。更に、安全性分析では、ＳＣゴリムマブは一般的に良好に忍容されることが示され、又他の抗ＴＮＦα剤で観察されたものと同様の安全性プロファイルを示された。
強直性脊椎炎（ＡＳ）を対象としたゴリムマブ皮下（ＳＣ）投与のグローバル無作為化二重盲検プラセボ対照第３相試験（試験Ｃ０５２４Ｔ０９）において、ゴリムマブは、強直性脊椎炎（ＡＳ）に罹患した被験者における徴候及び症状、身体機能、健康関連の生活の質（ＨＲＱＯＬ）の改善に有効であることが実証された。更に、安全性分析では、ＳＣゴリムマブは一般的に良好に忍容されることが示され、又他の抗ＴＮＦα剤で観察されたものと同様の安全性プロファイルを示された。
【0291】
ＳＣゴリムマブの既知の安全性及び有効性を考慮すると、ＩＶゴリムマブは、ＲＡ、ＰｓＡ、及びＡＳなどのリウマチ性疾患における他の抗ＴＮＦα剤と一致する許容可能な安全性プロファイルで有効であることが証明されると予想された。ゴリムマブの静脈内投与は、ＲＡ処置の承認の基礎となった第３相試験（ＣＮＴＯ１４８ＡＲＴ３００１）で確定的に試験された。ＣＮＴＯ１４８ＡＲＴ３００１試験は、同時メトトレキサート（ＭＴＸ）療法にもかかわらず活動性ＲＡを有する対象における、０週目、４週目、及びその後８週ごと（ｑ８ｗ）に３０±１０分にわたって注入されるゴリムマブ２ｍｇ／ｋｇのＩＶ投与の有効性及び安全性に関する、無作為化、二重盲検、プラセボ対照、多施設２群試験であった。ＭＴＸにもかかわらず活動性ＲＡを有する対象は、０週目、４週目、及び８週ごとに２４週まで２ｍｇ／ｋｇでプラセボ注入又はゴリムマブのＩＶ投与のいずれかを受けるように無作為化された。２４週目に開始して、１００週まで、全ての対象をＩＶゴリムマブで処置した。ＩＶゴリムマブは、ＲＡの徴候及び症状、身体機能、並びに健康関連の生活の質の改善、並びに構造的損傷の進行の抑制において実質的な利益を提供することが実証された。ＲＡの処置において静脈内投与されたゴリムマブ（ＣＮＴＯ１４８ＡＲＴ３００１）では、輸注反応の発生率は低く、ロバストな有効性及び許容される安全性プロファイルを示した。
【0292】
より最近では、活動性強直性脊椎炎（ＡＳ）及び活動性乾癬性関節炎（ＰｓＡ）に罹患した被験者の治療において、静脈内（ＩＶ）ゴリムマブの有効性及び安全性を評価するための２つの第３相試験が設計された。現在入手可能なＩＶ抗ＴＮＦα剤は免疫原性及び輸注反応に関して制限があり、ＩＶゴリムマブの３０±１０分間の注入と比較してより長い注入時間（６０～１２０分間）を有することから、被験者におけるＩＶ投与経路が評価される。患者は又、ＳＣ剤と比較してより頻繁な投与よりもＩＶゴリムマブの維持投与計画を好むかもしれない。
【0293】
製造プロセスの概要
Ｓｉｍｐｏｎｉ（ゴリムマブ）は、連続的な細胞の灌流培養、続いて精製を含む９段階のプロセスで製造される。製造プロセスの概要は、図１８に示される。
Ｓｉｍｐｏｎｉ（ゴリムマブ）は、連続的な細胞の灌流培養、続いて精製を含む９段階のプロセスで製造される。製造プロセスの概要は、図１８に示される。
【0294】
本明細書で使用するとき、用語「培養」、「培養する」、「培養された」、及び「細胞培養物」は、細胞集団の生存及び／又は増殖に好適な条件下で培地中に懸濁される細胞集団を指す。技術分野には文脈から明らかであるように、本明細書で使用されるこれらの用語は又、細胞集団及び集団が懸濁される培地を含む組合せを指す。細胞培養物は、例えば、バッチ、フェドバッチ又は灌流細胞培養法などによって増殖させた細胞を含む。特定の実施形態では、細胞培養物は、哺乳動物細胞培養物である。
【0295】
本発明で使用するための細胞株は、チャイニーズハムスター卵巣細胞（Chinese hamster vary cell）（ＣＨＯ細胞）、ヒト胚性腎細胞（ＨＥＫ細胞）、ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ細胞、マウス骨髄腫細胞（例えば、ＮＳ０細胞及びＳｐ２／０細胞）、及びヒト網膜細胞（例えば、ＰＥＲ．Ｃ６細胞）を含むがこれらに限定されない哺乳動物細胞株を含む。
【0296】
本明細書で使用するとき、「化学的に規定された培地（複数可）」という用語は、全ての成分の同一性及び濃度が既知である合成増殖培地を指す。合成培地、すなわち化学的に定義された培地は、細菌、酵母、動物、又は植物抽出物、動物血清又は血漿を含まないが、個々の植物又は動物由来の成分（例えば、タンパク質、ポリペプチドなど）を含んでも含まなくてもよい。化学的に定義された培地は、成長を支援するために必要なリン酸塩、硫酸塩などの無機塩を含んでもよい。炭素源が定義されており、通常、グルコース、ラクトース、ガラクトースなどの糖、又はグリセロール、乳酸、アセテートなどの他の化合物である。特定の化学的に定義された培地は又、バッファとしてリン酸塩を使用するが、クエン酸塩、トリエタノールアミンなどの他のバッファを使用してもよい。本明細書で使用するとき、化学的に規定された培地は、マイクロモル量以下の任意の金属イオンを含有する。市販の化学的に規定された培地の例としては、以下に限定されないが、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒのＣＤ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｍｅｄｉｕｍ及びＣＤ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ＡＧＴ（商標）Ｍｅｄｉｕｍ、様々なダルベッコ改変イーグル（ＤＭＥ）培地（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ；ＳＡＦＣ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｓｅｓ，Ｉｎｃ）、ハムの栄養混合液（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ；ＳＡＦＣ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｓｅｓ，Ｉｎｃ）、これらの組合せ等が挙げられる。化学的に規定された培地を調製する方法は、当該技術分野において既知であり、例えば、米国特許第６，１７１，８２５号及び同第６，９３６，４４１号、国際公開第２００７／０７７２１７号、並びに米国特許出願公開第２００８／０００９０４０号及び同第２００７／０２１２７７０号に既知である。
【0297】
本明細書で使用するとき、用語「バイオリアクター」は、細胞培養物の増殖に有用な任意の容器を指す。バイオリアクターは、細胞の培養に有用である限り、任意の大きさであってもよい。特定の実施形態では、このような細胞は哺乳動物細胞である。典型的には、バイオリアクターは、少なくとも１リットルであり、１０、１００、２５０、５００、１，０００、２，５００、５，０００、８，０００、１０，０００、１２，０００リットル以上、又はこれらの間の任意の体積であってもよい。培養期間中、ｐＨ及び温度を含むがこれらに限定されないバイオリアクターの内部条件を任意に制御することができる。バイオリアクターは、ガラス、プラスチック、又は金属を含む、本発明の培養条件下で培地中に懸濁された哺乳動物細胞培養物を保持するのに好適な任意の材料から構成することができる。本明細書で使用するとき、用語「産生バイオリアクター」は、対象とするポリペプチド又は糖タンパク質の産生に使用される最終バイオリアクターを指す。産生バイオリアクターの体積は、典型的には少なくとも５００リットルであり、１，０００、２，５００、５，０００、８，０００、１０，０００、１２，０００リットル以上、又はこれらの間の任意の体積であってもよい。当業者であれば、本発明を実施する際に使用するのに好適なバイオリアクターを選択することができるであろう。
【0298】
段階１及び２において、前培養、細胞増殖、及び細胞産生が行われる。段階１では、ゴリムマブのＨＣ及びＬＣ配列を発現しているトランスフェクトされたＳｐ２／０細胞の単一のワーキングセルバンクバイアルから前培養を開始し、培養フラスコ、使い捨て培養バッグ、及び内部スピンフィルタを備えた５０Ｌ灌流播種バイオリアクター又はオルタネーティング・タンジェンタル・フロー（alternating tangential flow）中空糸フィルタ（ＡＴＦ）細胞保持システムを備えた２００Ｌ灌流播種バイオリアクターのいずれかで細胞を増殖させる。５００Ｌ又は１０００Ｌの産生バイオリアクターの接種に必要な細胞密度及び体積が得られるまで細胞を培養する。段階２では、ＡＴＦシステムを使用して、５００Ｌ又は１０００Ｌの産生バイオリアクター内で細胞培養物を連続的に灌流する。細胞培養透過液（回収物）をＡＴＦシステムから回収し、細胞をバイオリアクターに戻し、培養物に新鮮培地を補充する。バイオリアクターから取り出したバイオマスを、ＡＴＦシステムから回収した回収物と組み合わせ、次いで、更なる処理のためにプールされた回収物を生成するために清澄化してもよい。
【0299】
細胞培養回収物からのゴリムマブの精製は、段階３～８において、親和性及びイオン交換クロマトグラフィー工程と、可能性のあるウイルス汚染を不活化又は除去する工程（溶媒／洗剤処理及びウイルス除去濾過）とを組み合わせて行われる。段階３では、回収及び／又はプールされた回収物を、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィーを使用して清澄化及び精製する。得られた直接生成物捕獲（ＤＰＣ）溶出液は、更なる処理まで凍結される。段階４で、解凍後、ＤＰＣ溶出液を濾過し、プールし、その後、段階５でトリ－ｎ－ブチルホスファート（ＴＮＢＰ）及びポリソルベート８０（ＰＳ８０）で処理して、存在する可能性があり脂質エンベロープを有する任意のウイルスを不活性化する。
【0300】
段階６では、陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて、ＴＮＢＰ及びＰＳ８０試薬並びに不純物をゴリムマブ生成物から除去する。ゴリムマブ生成物は、ＤＮＡ、存在する可能性のあるウイルス、及び不純物を除去するために、段階７において陰イオン交換クロマトグラフィーを使用して更に精製される。段階８では、精製したゴリムマブ生成物を希釈し、ウイルス捕捉性フィルタを通して濾過する。
【0301】
ゴリムマブの最終調製は、段階９で行われる。限外濾過工程はゴリムマブ生成物を濃縮し、透析濾過工程により、製剤賦形剤が添加され、プロセス中のバッファ塩が除去される。ＰＳ ８０を添加し、製剤化されたバルク（ＦＢ）として凍結保存するために、中間体をポリカーボネート容器に濾過する。
【0302】
製造方法における細胞培養の詳細な説明
段階１
前培養及び増殖
Ｓｉｍｐｏｎｉ（ゴリムマブ）の生成における第１の段階は、ゴリムマブのＨＣ及びＬＣ配列を発現するトランスフェクトされたＳｐ２／０細胞のＷｏｒｋｉｎｇ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ（ＷＣＢ）バイアルからの前培養の開始並びに培養フラスコ、使い捨て培養バッグ、及び５０又は２００Ｌの播種用バイオリアクターにおける細胞培養物のその後の増殖である。５００又は１０００Ｌの産生用バイオリアクターへの接種に必要な細胞密度及び体積が得られるまで細胞を培養する。プロセス内管理とプロセス監視試験を含む前培養と増殖工程を示す段階１のフロー図を図１９に示す。
段階１
前培養及び増殖
Ｓｉｍｐｏｎｉ（ゴリムマブ）の生成における第１の段階は、ゴリムマブのＨＣ及びＬＣ配列を発現するトランスフェクトされたＳｐ２／０細胞のＷｏｒｋｉｎｇ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ（ＷＣＢ）バイアルからの前培養の開始並びに培養フラスコ、使い捨て培養バッグ、及び５０又は２００Ｌの播種用バイオリアクターにおける細胞培養物のその後の増殖である。５００又は１０００Ｌの産生用バイオリアクターへの接種に必要な細胞密度及び体積が得られるまで細胞を培養する。プロセス内管理とプロセス監視試験を含む前培養と増殖工程を示す段階１のフロー図を図１９に示す。
【0303】
製造手順
ＷＣＢからのクライオバイアルを解凍し、６ｍＭのＬ－グルタミン、０．５ｍｇ／Ｌのミコフェノール酸、２．５ｍｇ／Ｌのヒポキサンチン、及び５０ｍｇ／Ｌのキサンチンを補充した化学的に規定された培地（ＣＤ－Ａ培地）で播種密度０．２～０．４×１０６個の生存細胞（ＶＣ）／ｍＬに希釈する。解凍時の培養物生存率は≧５０％なければならない。初期の継代は、温度とＣＯ２が制御された加湿ＣＯ２インキュベータ内の培養フラスコで維持される。培養物を、０．６× １０６ ＶＣ／ｍＬの最小細胞密度が得られるまで２～３日間インキュベートする。
ＷＣＢからのクライオバイアルを解凍し、６ｍＭのＬ－グルタミン、０．５ｍｇ／Ｌのミコフェノール酸、２．５ｍｇ／Ｌのヒポキサンチン、及び５０ｍｇ／Ｌのキサンチンを補充した化学的に規定された培地（ＣＤ－Ａ培地）で播種密度０．２～０．４×１０６個の生存細胞（ＶＣ）／ｍＬに希釈する。解凍時の培養物生存率は≧５０％なければならない。初期の継代は、温度とＣＯ２が制御された加湿ＣＯ２インキュベータ内の培養フラスコで維持される。培養物を、０．６× １０６ ＶＣ／ｍＬの最小細胞密度が得られるまで２～３日間インキュベートする。
【0304】
スケールアップは、培養フラスコ及び使い捨て培養バッグ内で培養物を連続的に増殖させることによって達成される。各継代は、ＣＤ－Ａ培地で希釈することにより、０．２～０．４×１０６ ＶＣ／ｍＬの細胞密度で開始される。各増殖工程で、継代培養を、０．６×１０６ ＶＣ／ｍＬの最小細胞密度が得られるまで２～３日間インキュベートする。使い捨て培養バッグで、≧０．８×１０６ ＶＣ／ｍＬ及び≧８０％の培養物生存率で十分な培養量が達成されたら、培養物を５０Ｌ又は２００Ｌの播種バイオリアクターに接種してもよい。
【0305】
各前培養継代を、生存細胞密度（ＶＳＤ）、培養物生存率、及び顕微鏡検査のためにサンプリングする。５０又は２００Ｌの播種バイオリアクターへの接種前に、前培養物をバイオバーデン測定のためにサンプリングする。前培養は、解凍後最大３０日間維持され得る。微生物汚染が検出されるか、又は最大持続時間を超過した場合、前培養を終了する。播種用バイオリアクターへの接種時にバックアップ用の前培養が保持されてもよく、又は当該前培養は、新しいＷＣＢバイアルを解凍して開始されてもよい。バックアップ用の前培養物は、上述のように増殖され、初代培養と同じプロセス内管理及び操作パラメータに供される。必要に応じて５０又は２００Ｌの播種用バイオリアクターに接種するために、バックアップ用の前培養物を維持し、使用することができる。
【0306】
前培養物が接種基準を満たす場合、使い捨て培養バッグの内容物を５０又は２００Ｌの播種用バイオリアクターに移し、≧０．３×１０６ ＶＣ／ｍＬの播種密度を達成する。５０又は２００Ｌの播種用バイオリアクターに、ＣＤ－Ａ培養培地を供給し、最大稼働量で灌流モードで操作する。培養物は、細胞増殖を支えるよう、ｐＨ、温度、及び溶存酸素濃度について制御される。５０又は２００Ｌの播種用バイオリアクターの培養物を、≧８０％培養物生存率で≧２．０×１０６ＶＣ／ｍＬの細胞密度が得られるまで増殖させる。５０又は２００Ｌ播種用バイオリアクターの培養物を、ＶＣＤ、培養物生存率、及び顕微鏡検査のためのプロセスを通してサンプリングする。５００又は１０００Ｌの産生用バイオリアクターの接種前に、５０又は２００Ｌの播種用バイオリアクターをバイオバーデン測定のためにサンプリングする。５０又は２００Ｌの播種用バイオリアクターのＶＣＤが≧２．０×１０６ＶＣ／ｍＬに達し、５００又は１０００Ｌの産生用バイオリアクターの接種の準備ができていない場合、５０Ｌの播種用バイオリアクターの接種後６日及び２００Ｌの播種用バイオリアクターの接種後７日を最大培養期間として、灌流モードで培養を継続することができる。微生物汚染が検出されるか、又は最大持続時間を超過した場合、５０又は２００Ｌの播種用バイオリアクターの操作を終了する。
【0307】
段階２
バイオリアクター産生
製造プロセスにおける第２段階は、５００Ｌ又は１０００Ｌの産生用バイオリアクターにおける、細胞の灌流培養である。オルタネーティング・タンジェンタル・フロー（ＡＴＦ）中空糸の細胞保持装置を介して細胞を保持しながら、産生用バイオリアクターから細胞培養物の透過液（permeate）（回収物）を回収し、培養物には新鮮な培地を補充する。５００Ｌ又は１０００Ｌの産生用バイオリアクタープロセスを示すフロー図を図２０に示す。
バイオリアクター産生
製造プロセスにおける第２段階は、５００Ｌ又は１０００Ｌの産生用バイオリアクターにおける、細胞の灌流培養である。オルタネーティング・タンジェンタル・フロー（ＡＴＦ）中空糸の細胞保持装置を介して細胞を保持しながら、産生用バイオリアクターから細胞培養物の透過液（permeate）（回収物）を回収し、培養物には新鮮な培地を補充する。５００Ｌ又は１０００Ｌの産生用バイオリアクタープロセスを示すフロー図を図２０に示す。
【0308】
製造手順
５００Ｌ又は１０００Ｌの産生用バイオリアクターの接種は、５０又は２００Ｌの播種用バイオリアクターの内容物を、６ｍＭのＬ－グルタミン、０．５ｍｇ／Ｌのミコフェノール酸、２．５ｍｇ／Ｌのヒポキサンチン、及び５０ｍｇ／Ｌのキサンチンを添加した既知組成培地（ＣＤＨ－Ａ培地）を含む５００又は１０００Ｌの産生用バイオリアクターに移すことによって行う。移される体積は、≧０．３×１０６生存細胞（ＶＣ）／ｍＬの播種密度をもたらすのに十分でなければならない。培養物を３４．０～３８．０℃の温度、６．８０～７．４０のｐＨ及び１０～８０％の溶存酸素濃度で維持する。生存細胞密度（ＶＣＤ）、培養物生存率、バイオバーデン、及び免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）濃度の測定のために、５００又は１０００Ｌの生産用プロセス全体を通してサンプリングを行う。
５００Ｌ又は１０００Ｌの産生用バイオリアクターの接種は、５０又は２００Ｌの播種用バイオリアクターの内容物を、６ｍＭのＬ－グルタミン、０．５ｍｇ／Ｌのミコフェノール酸、２．５ｍｇ／Ｌのヒポキサンチン、及び５０ｍｇ／Ｌのキサンチンを添加した既知組成培地（ＣＤＨ－Ａ培地）を含む５００又は１０００Ｌの産生用バイオリアクターに移すことによって行う。移される体積は、≧０．３×１０６生存細胞（ＶＣ）／ｍＬの播種密度をもたらすのに十分でなければならない。培養物を３４．０～３８．０℃の温度、６．８０～７．４０のｐＨ及び１０～８０％の溶存酸素濃度で維持する。生存細胞密度（ＶＣＤ）、培養物生存率、バイオバーデン、及び免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）濃度の測定のために、５００又は１０００Ｌの生産用プロセス全体を通してサンプリングを行う。
【0309】
接種後、培養物への培地の供給量は、最大供給量に達するまで、所定のスケジュールに従って増加される。最大供給量は、１日当たり０．８０～１．５０の反応器体積に制御される。バイオリアクターの最大稼働量に達したなら、ＡＴＦ系を使用して灌流を開始して、透過液から細胞を分離する。ＡＴＦフィルタを通して透過液を連続的に回収する一方で、細胞培養をＡＴＦ系とバイオリアクターとの間で循環させる。ＡＴＦ透過液は、バイオプロセス容器（ＢＰＣ）に回収される。
【0310】
ＶＣＤが≧８．５×１０６個ＶＣ／ｍＬに達したとき、ただし５００又は１０００Ｌの産生用バイオリアクターの接種後１５日目までに、バイオリアクターへの培地供給を、ＣＤ－Ａから、６ｍＭのＬ－グルタミン、０．５ｍｇ／Ｌのミコフェノール酸、２．５ｍｇ／Ｌのヒポキサンチン、５０ｍｇ／Ｌのキサンチン、及び１０ｍＭの酢酸ナトリウムを補充した化学的に規定された培地（ＣＤ－Ｂ培地）に切り替える。バイオリアクター内の生存細胞の密度は、培養物から可変量でバイオマス流を除去することによって、少なくとも１２．０×１０６個ＶＣ／ｍＬの目標値に制御される。
【0311】
バイオリアクターから除去されたバイオマスは、廃棄されてもよく、又はＡＴＦ透過液と共に組み合わせられて、濾過によって清澄化されてもよい。
【0312】
ＡＴＦ透過液は、回収物流と表される。エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を回収物流に５～２０ｍＭの濃度まで添加する。回収物は、バイオリアクターから回収した後、バイオプロセス容器（ＢＰＣ）にて、２～８℃の環境下で、最長２１日間保存される。直接的な生成物の捕集前に、各回収物のＢＰＣに対し、ＩｇＧ濃度、エンドトキシン、及びバイオバーデンの測定のためにサンプリングする（段階３）。
【0313】
５００又は１０００Ｌの産生用バイオリアクターにおける細胞の灌流培養操作は、接種後最大６０日間継続する。５００又は１０００Ｌの産生用バイオリアクターの稼働の最終日に、培養物をマイコプラズマ及び外来性ウイルスについての試験のためにサンプリングする。バイオリアクターのＩｇＧ濃度をモニタリングし、情報のみを報告する。
【0314】
製造管理戦略の導入
オリゴ糖プロファイルに関してゴリムマブの一貫した原薬（ＤＳ）及び製剤（ＤＰ）の特徴を維持するために、又、大規模商業製造の間に生存細胞密度（ＶＣＤ）、生存率（％）、及び生産性を制御するために、製造制御戦略を開発した。ゴリムマブのグリコシル化は、製造プロセスの段階９でプロセス内管理として監視され、総中性オリゴ糖％、総荷電オリゴ糖％、及び個々の中性オリゴ糖種Ｇ０Ｆ、Ｇ１Ｆ、及びＧ２Ｆの％の平均の代わりに仕様上限及び下限を用いる。本明細書で使用するとき、「原薬」（「ＤＳ」と略される）及び「製剤」（「ＤＰ」と略される）という用語は、例えば臨床試験における市販薬として使用するための又は市販薬物として使用するための組成物を指す。ＤＳは、病気の診断、治癒、緩和、治療、又は予防において薬理学的活性又は他の直接的な効果を提供すること、あるいは人体の構造又は機能に影響を与えることを目的とした有効成分である。製造ステップで製造される製剤化されたバルク（ＦＢ）は原薬（ＤＳ）である。ＤＰ（医薬品、薬、薬物、又は薬剤とも呼ばれる）は、病気の診断、治癒、緩和、治療、予防に使用される薬剤、又は人体の構造や機能に影響を与える薬剤である。ＤＰは、患者への販売及び／又は投与のための医薬品として調製されたＤＳである。本明細書で使用するとき、「製造管理戦略」、「製造戦略」、「管理戦略」、及び「製造方法」という用語は、例えば臨床試験において、又は市販薬として、商業的使用のためのＤＳ又はＤＰを生成するためのプロセスを指す。
オリゴ糖プロファイルに関してゴリムマブの一貫した原薬（ＤＳ）及び製剤（ＤＰ）の特徴を維持するために、又、大規模商業製造の間に生存細胞密度（ＶＣＤ）、生存率（％）、及び生産性を制御するために、製造制御戦略を開発した。ゴリムマブのグリコシル化は、製造プロセスの段階９でプロセス内管理として監視され、総中性オリゴ糖％、総荷電オリゴ糖％、及び個々の中性オリゴ糖種Ｇ０Ｆ、Ｇ１Ｆ、及びＧ２Ｆの％の平均の代わりに仕様上限及び下限を用いる。本明細書で使用するとき、「原薬」（「ＤＳ」と略される）及び「製剤」（「ＤＰ」と略される）という用語は、例えば臨床試験における市販薬として使用するための又は市販薬物として使用するための組成物を指す。ＤＳは、病気の診断、治癒、緩和、治療、又は予防において薬理学的活性又は他の直接的な効果を提供すること、あるいは人体の構造又は機能に影響を与えることを目的とした有効成分である。製造ステップで製造される製剤化されたバルク（ＦＢ）は原薬（ＤＳ）である。ＤＰ（医薬品、薬、薬物、又は薬剤とも呼ばれる）は、病気の診断、治癒、緩和、治療、予防に使用される薬剤、又は人体の構造や機能に影響を与える薬剤である。ＤＰは、患者への販売及び／又は投与のための医薬品として調製されたＤＳである。本明細書で使用するとき、「製造管理戦略」、「製造戦略」、「管理戦略」、及び「製造方法」という用語は、例えば臨床試験において、又は市販薬として、商業的使用のためのＤＳ又はＤＰを生成するためのプロセスを指す。
【0315】
簡潔に言うと、製造管理戦略は、≧１０．０μｇ／リットル～≦３５．０μｇ／リットルのＭｎ２＋（マンガン）及び≧１．０μｇ／リットル～≦１．８μｇ／リットルのＣｕ２＋（銅）からなる特定の微量元素濃度を含有するように制御された化学的に規定された培地中で細胞を培養することによって、ゴリムマブのオリゴ糖プロファイルが制御されることを確実にする。本明細書中で使用される場合、「特定の」という用語は、マンガン及び銅の濃度が必要条件であり、化学的に規定された培地において上限及び下限内に正確に制御されなければならないことを明確かつ確実に特定することを指す。本明細書で使用するとき、「制御される」という用語は、例えば、培地の製造中にマンガン及び銅を含有する原材料を他の手段によって注意深く調節、試験及び検証すること、例えば、注意深く秤量及び／又は測定すること、誘導結合プラズマ質量分析（ＩＰＣ－ＭＳ）又は他の方法を使用して化学的に規定された培地中のマンガン及び銅の最終濃度を測定すること、必要であれば、適切な量のマンガン及び銅を化学的に規定された培地に補充することによって濃度を調整することを指す。別の制御方法は、バッチのうちの１つ又は２つ以上が仕様外である場合に、指定された濃度を達成するために混合することができる化学的に規定された培地の２つ以上のバッチを特定することである。本発明の製造管理戦略を使用して製造されたゴリムマブＤＳ又はＤＰは、抗ＴＮＦ抗体を含み、抗ＴＮＦ抗体のオリゴ糖プロファイルは、≧８２．０％～≦９４．４％の総中性オリゴ糖種、≧５．６％～≦１８．０％の総荷電オリゴ糖種、及び≧２５．６％～≦４２．２％のＧ０Ｆ、≧３１．２％～≦４３．６％のＧ１Ｆ、及び≧５．６％～≦１４．２％のＧ２Ｆの個々の中性オリゴ糖種を含む。製造管理戦略は又、段階２のバイオリアクターにおける生存細胞密度（ＶＣＤ）、生存率％、及び生産性が、過去の値と比較して維持されることを確実にする。好ましい方法において、マンガン及び銅濃度は、ＩＣＰ－ＭＳを使用して決定され、オリゴ糖プロファイルは、ＨＰＬＣ法を使用して決定される。
【0316】
対照戦略は、２つの異なる製造現場でのゴリムマブ産生バイオリアクター性能についてのＶＣＤ及び生存率％における非典型的な傾向を認識した後に開始された。影響を受けた産生バイオリアクターバッチは、より低いＶＣＤでショルダーリングを示し（図２３）、過去の傾向と比較して、主に後期相の間に長期間にわたってより低い生存率％を示した（図２４）。加えて、影響を受けたゴリムマブバッチについてのオリゴ糖プロファイルは、過去の傾向と比較してシフトしたことが認識された。ゴリムマブの影響を受けたバッチでは、総中性及び総荷電オリゴ糖のレベルは、過去の平均よりもそれぞれ高い及び低い傾向にあったが、指定された限度内であった（図２６）。加えて、個々のオリゴ糖種の更なる評価（図２７）は、影響を受けたバッチの大部分が、末端ガラクトース含量の変更（例えば、アガラクト（Ｇ０Ｆ）並びに減少したモノガラクト（Ｇ１Ｆ）及びジガラクト（Ｇ２Ｆ）オリゴ糖種）を有し、同時にＮ－結合型オリゴ糖組成物中のシアル酸含量が減少する傾向があり、負に荷電したシアル化種の減少をもたらすことを実証した。
【0317】
厳密な調査の後、化学的に規定された培地の変更が、オリゴ糖プロファイルの変化及びＶＣＤ、生存率％のシフトの根本的原因であると結論付けられた。より具体的には、本調査により、驚くべきことに、オリゴ糖プロファイルのシフト並びにＶＣＤ及び生存率％のシフトの決定的な根本原因は、細胞培養培地成分のうちの１つ、ＦｅＣｌ３・６Ｈ２０（塩化第二鉄）だけの変更であることが実証された。特に、塩化第二鉄中のより低い微量金属濃度のＭｎ２＋（マンガン）が、オリゴ糖プロファイルの変更の主な根本原因であり、塩化第二鉄中のより低い微量金属濃度のＣｕ２＋（銅）が、ＶＣＤ、生存率％及び生産性のシフトの主な根本原因であることが決定された。又、銅がオリゴ糖プロファイルを決定する際に役割を果たすこと、及びオリゴ糖プロファイルが仕様内であることを確実にするためにマンガン及び銅濃度の両方を制御しなければならないことも決定された。
【0318】
塩化第二鉄の変更は、より高純度の鉄塩を生成することを意図して、塩化第二鉄を供給した供給業者による製造方法の変更のために導入されたものであり、調査により、この変更により、塩化第二鉄中に測定されない不純物として存在するマンガン、クロム及び銅のレベルがより低い微量レベルとなることが明らかになった。Ｍｎ２＋（マンガン）及びＣｒ３＋（クロム）による培地の補充は、ＶＣＤ及び生存率％のプロファイルを部分的に回復させたが、Ｃｕ２＋（銅）補充は、ＶＣＤ、生存率％及び生産性プロファイルを完全に回復させるために必要であった。当初は、Ｃｒ３＋（クロム）のレベルも又、オリゴ糖プロファイル、ＶＣＤ、及び／又は生存率％のシフトにおける主要な因子であり得ると推測されたが、その後の小規模研究では、マンガン濃度の変更がオリゴ糖プロファイルのシフトの主要な寄与因子であり、銅濃度も役割を果たすこと、並びに銅がＶＣＤ、生存率％、及び総生産性の関連する変化の主要な寄与因子であることが後に決定された。
【0319】
製造管理戦略は、化学的に規定された培地にＭｎ２＋（マンガン）及びＣｕ２＋（銅）を補充することによって、オリゴ糖プロファイル、ＶＣＤ、生存率％、及び生産性プロファイルの変化に関連する問題を改善した。製造管理戦略は、商業規模で２段階で実施した。まず、化学的に規定された培地にマンガン及びクロムのみを補充して、本明細書においてＳＵＰ－ＡＧＴと称される培地を生成した。その後、ＳＵＰ－ＡＧＴに、本明細書で変更前ＡＧＴと称される過去の商業規模の培地の分析に基づいて銅を補充し、多数の小規模研究では、特定の濃度のマンガン及び銅を用いて新しいＳＵＰ－ＡＧＴ３培地を生成した。
【0320】
方法
生存細胞密度（ＶＣＤ）と生存率を決定する方法
総細胞数／ｍｌ、生存細胞／ｍｌ（ＶＣＤ）、及び％生存率は、典型的には、メーカー提供のプロトコル、ソフトウェア、及び試薬を使用し、Ｂｅｃｋｍａｎ ＣｏｕｌｔｅｒＶｉ－ＣＥＬＬ－ＸＲ細胞生存率アナライザーで決定される。代替的には、ＣＥＤＥＸ自動細胞カウントシステムも使用される。しかし、ＶＣＤ及び％生存率を決定するための他の方法、例えば、血球計及びトリパンブルー排除を使用することは当業者によく知られることにも注意すべきである。
生存細胞密度（ＶＣＤ）と生存率を決定する方法
総細胞数／ｍｌ、生存細胞／ｍｌ（ＶＣＤ）、及び％生存率は、典型的には、メーカー提供のプロトコル、ソフトウェア、及び試薬を使用し、Ｂｅｃｋｍａｎ ＣｏｕｌｔｅｒＶｉ－ＣＥＬＬ－ＸＲ細胞生存率アナライザーで決定される。代替的には、ＣＥＤＥＸ自動細胞カウントシステムも使用される。しかし、ＶＣＤ及び％生存率を決定するための他の方法、例えば、血球計及びトリパンブルー排除を使用することは当業者によく知られることにも注意すべきである。
【0321】
オリゴ糖組成物を決定するための方法
ゴリムマブのオリゴ糖組成は、Ｃｈｅｍｓｔａｔｉｏｎ／Ｃｈｅｍｓｔｏｒｅソフトウェアを備えるＡｇｉｌｅｎｔ １１００／１２００ Ｓｅｒｉｅｓ ＨＰＬＣ Ｓｙｓｔｅｍを使用するＨＰＬＣ法を用いて決定される。グリカンの相対量を定量するために、まず、Ｎ－グリカナーゼ（ＰＮＧａｓｅ Ｆ）を用いて、還元及び変性された試験物質からＮ－結合型オリゴ糖を切断する。放出されたグリカンは、アントラニル酸を使用して標識され、０．４５μｍナイロンフィルタを使用した濾過によって精製され、蛍光検出を備えた順相陰イオン交換ＨＰＬＣによって分析される。ＨＰＬＣクロマトグラムは、試料ル中に存在するＮ－結合型オリゴ糖を同定及びその相対量を定量するために使用することができるマップとして機能する。グリカンは、オリゴ糖標準との共溶出と、広範な特性評価からの過去の結果に従った保持時間によって同定される。ゴリムマブ参照標準の代表的なＨＰＬＣクロマトグラムを図２１に示す。
ゴリムマブのオリゴ糖組成は、Ｃｈｅｍｓｔａｔｉｏｎ／Ｃｈｅｍｓｔｏｒｅソフトウェアを備えるＡｇｉｌｅｎｔ １１００／１２００ Ｓｅｒｉｅｓ ＨＰＬＣ Ｓｙｓｔｅｍを使用するＨＰＬＣ法を用いて決定される。グリカンの相対量を定量するために、まず、Ｎ－グリカナーゼ（ＰＮＧａｓｅ Ｆ）を用いて、還元及び変性された試験物質からＮ－結合型オリゴ糖を切断する。放出されたグリカンは、アントラニル酸を使用して標識され、０．４５μｍナイロンフィルタを使用した濾過によって精製され、蛍光検出を備えた順相陰イオン交換ＨＰＬＣによって分析される。ＨＰＬＣクロマトグラムは、試料ル中に存在するＮ－結合型オリゴ糖を同定及びその相対量を定量するために使用することができるマップとして機能する。グリカンは、オリゴ糖標準との共溶出と、広範な特性評価からの過去の結果に従った保持時間によって同定される。ゴリムマブ参照標準の代表的なＨＰＬＣクロマトグラムを図２１に示す。
【0322】
各グリカンの量は、ピーク面積の積分によって定量され、全グリカンピーク面積の百分率（ピーク面積％）として表される。結果は、Ｇ０Ｆ、Ｇ１Ｆ、Ｇ２Ｆ、総中性グリカン及び総荷電グリカンについて報告される。他の中性グリカンは、Ｇ０Ｆ、Ｇ１Ｆ、及びＧ２Ｆに対応するピークを除く、１７～３５分間の全ての統合ピークの合計である。全中性グリカンは、Ｇ０Ｆ、Ｇ１Ｆ、Ｇ２Ｆ、及び他の中性グリカンの合計である。全荷電グリカンは、４２～５５分間で溶出する全てのモノシアリル化グリカンピークと７８～９０分間で溶出する全てのジシアリル化グリカンピークの合計である。
【0323】
オリゴ糖標準の混合物（Ｇ０Ｆ、Ｇ２Ｆ、Ｇ２Ｆ＋Ｎ－アセチルノイラミン酸（ＮＡＮＡ）、及びＧ２Ｆ＋２ＮＡＮＡ）を、標識反応の陽性対照として、ピーク同定の標準として、そして、系の適合性の尺度として、並行して分析する。Ｐｒｏｚｙｍｅ、Ｇ０Ｆ（カタログ番号ＧＫＣ－００４３０１）、Ｇ２Ｆ（カタログ番号ＧＫＣ－０２４３０１）、ＳＡ１Ｆ（カタログ番号ＧＫＣ－１２４３０１）、及びＳＡ２Ｆ（カタログ番号ＧＫＣ－２２４３０１）からの再構成オリゴ糖、又は同等のものを参照標準として使用される。方法のブランク陰性対照及び予め標識されたＧ０Ｆ標準も、系の適合性の目的で実行される。有効な結果を得るには、オリゴ糖マッピング手順の実行中に、次のシステム適合性とアッセイ（試験品）の許容基準が適用される。
【0324】
システム適合性基準：
・オリゴ糖標準のＧ０ＦピークとＧ２Ｆピークの間の分解能（ＵＳＰ）は３．０以上でなければならない。
・オリゴ糖標準のＧ０Ｆピークの理論プレート数（接線法）は５０００以上でなければならない。
・ゴリムマブ参照標準の総グリカンピーク面積は、事前に標識されたＧ０Ｆの主要なグリカンピーク面積の１．５倍以上でなければならない。
・いずれかの参照標準グリカンのピークがスケール外の場合、参照標準はより少ない注入体積で再注入される
・ゴリムマブ参照標準のＧ０Ｆピークの保持時間は、オリゴ糖標準のＧ０Ｆ保持時間の０．４分間以内でなければならない。
・オリゴ糖標準のＧ０ＦピークとＧ２Ｆピークの間の分解能（ＵＳＰ）は３．０以上でなければならない。
・オリゴ糖標準のＧ０Ｆピークの理論プレート数（接線法）は５０００以上でなければならない。
・ゴリムマブ参照標準の総グリカンピーク面積は、事前に標識されたＧ０Ｆの主要なグリカンピーク面積の１．５倍以上でなければならない。
・いずれかの参照標準グリカンのピークがスケール外の場合、参照標準はより少ない注入体積で再注入される
・ゴリムマブ参照標準のＧ０Ｆピークの保持時間は、オリゴ糖標準のＧ０Ｆ保持時間の０．４分間以内でなければならない。
【0325】
アッセイの許容基準：
・方法ブランクは、ゴリムマブにおいて割り当てられたオリゴ糖ピークと共溶出する検出可能なピークを有してはならない。
・各試験品の総グリカンピーク面積は、事前に標識されたＧ０Ｆ標準の主要なグリカンピーク面積の１．５倍以上でなければならない。
・いずれかの試料のグリカンピークがスケール外の場合、その試料は、事前に標識されたＧ０Ｆ、オリゴ糖標準、方法ブランク、及び通常体積の参照標準と共に、より少ない注入体積で再注入される。
・各試験品のＧ０Ｆピークの保持時間は、オリゴ糖標準のＧ０Ｆピークの保持時間の０．４分間以内でなければならない。
・アッセイが任意の許容基準を満たさない場合、アッセイは無効にされる
・方法ブランクは、ゴリムマブにおいて割り当てられたオリゴ糖ピークと共溶出する検出可能なピークを有してはならない。
・各試験品の総グリカンピーク面積は、事前に標識されたＧ０Ｆ標準の主要なグリカンピーク面積の１．５倍以上でなければならない。
・いずれかの試料のグリカンピークがスケール外の場合、その試料は、事前に標識されたＧ０Ｆ、オリゴ糖標準、方法ブランク、及び通常体積の参照標準と共に、より少ない注入体積で再注入される。
・各試験品のＧ０Ｆピークの保持時間は、オリゴ糖標準のＧ０Ｆピークの保持時間の０．４分間以内でなければならない。
・アッセイが任意の許容基準を満たさない場合、アッセイは無効にされる
【0326】
誘導結合プラズマ質量分析（ＩＣＰ－ＭＳ）
誘導結合プラズマ質量分析（ＩＰＣ－ＭＳ）を使用して、ゴリムマブの様々なバッチを生成するために使用される化学的に規定された培地中の微量金属濃度を十億分率（ｐｐｂ、μｇ／リットル）で定量した。簡潔に言うと、この方法は、試料をＮｅｘＩＯＮ（登録商標）３５０Ｘ ＩＣＰ－ＭＳ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）などのＩＣＰ－ＭＳ機器に注入する前に、炭素に富む供給源を消化して二酸化炭素及び水にする酸消化手順からなる。湿式化学消化は、様々な酸及び酸化剤を利用する。好ましい組み合わせには、硝酸（ＨＮＯ３）、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、及び塩酸（ＨＣｌ）が含まれる。ＩＣＰ－ＭＳ以外の分析方法、例えば、フレーム原子吸光分析（ＦＬＡＡ）、誘導結合プラズマ原子発光分析（ＩＣＰ－ＡＥＳ）も使用することができる。分析手順、試料調製、及び機器による方法についての一般的な情報は、例えば、ＥＰＡ ｍｅｔｈｏｄ ３０５０Ｂ，「Ａｃｉｄ Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｅｄｉｍｅｎｔｓ，Ｓｌｕｄｇｅ，ａｎｄ Ｓｏｉｌｓ」，ＥＰＡ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ １９９６；ＥＰＡ ｍｅｍｏｒａｎｄｕｍ，「ｕｓｅ ｏｆ Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｃ Ａｃｉｄ（ＨＣＬ）ｉｎ ｄｉｇｅｓｔｓ ｆｏｒ ＩＣＰ－ＭＳ ａｎａｌｙｓｉｓ」，ＥＰＡ ｏｆｆｉｃｅ ｆｏｒ Ｓｏｌｉｄ Ｗａｓｔｅ ａｎｄ Ｅｍｅｒｇｅｎｃｙ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ，Ｊｕｌｙ ２６，２００３；及びＵｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ（ＵＳＰ）ｃｈａｐｔｅｒ＜２３３＞，Ｅｌｅｍｅｎｔａｌ Ｉｍｐｕｒｉｔｉｅｓ－Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓに見出すことができる。
誘導結合プラズマ質量分析（ＩＰＣ－ＭＳ）を使用して、ゴリムマブの様々なバッチを生成するために使用される化学的に規定された培地中の微量金属濃度を十億分率（ｐｐｂ、μｇ／リットル）で定量した。簡潔に言うと、この方法は、試料をＮｅｘＩＯＮ（登録商標）３５０Ｘ ＩＣＰ－ＭＳ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）などのＩＣＰ－ＭＳ機器に注入する前に、炭素に富む供給源を消化して二酸化炭素及び水にする酸消化手順からなる。湿式化学消化は、様々な酸及び酸化剤を利用する。好ましい組み合わせには、硝酸（ＨＮＯ３）、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、及び塩酸（ＨＣｌ）が含まれる。ＩＣＰ－ＭＳ以外の分析方法、例えば、フレーム原子吸光分析（ＦＬＡＡ）、誘導結合プラズマ原子発光分析（ＩＣＰ－ＡＥＳ）も使用することができる。分析手順、試料調製、及び機器による方法についての一般的な情報は、例えば、ＥＰＡ ｍｅｔｈｏｄ ３０５０Ｂ，「Ａｃｉｄ Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｅｄｉｍｅｎｔｓ，Ｓｌｕｄｇｅ，ａｎｄ Ｓｏｉｌｓ」，ＥＰＡ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ １９９６；ＥＰＡ ｍｅｍｏｒａｎｄｕｍ，「ｕｓｅ ｏｆ Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｃ Ａｃｉｄ（ＨＣＬ）ｉｎ ｄｉｇｅｓｔｓ ｆｏｒ ＩＣＰ－ＭＳ ａｎａｌｙｓｉｓ」，ＥＰＡ ｏｆｆｉｃｅ ｆｏｒ Ｓｏｌｉｄ Ｗａｓｔｅ ａｎｄ Ｅｍｅｒｇｅｎｃｙ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ，Ｊｕｌｙ ２６，２００３；及びＵｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ（ＵＳＰ）ｃｈａｐｔｅｒ＜２３３＞，Ｅｌｅｍｅｎｔａｌ Ｉｍｐｕｒｉｔｉｅｓ－Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓに見出すことができる。
【0327】
以下に示すのは、ＩＣＰ－ＭＳによって分析される化学的に規定された培地中の金属濃度を決定する際に使用するために開発されたカスタマイズされた消化方法である。本方法は、乾燥培地粉末又は水和培地試料（１ｇの試料＝１ｍＬの水和試料）に適合させることができる。
【0328】
消化方法
・約１ｇの乾燥試料（±０．５ｇ、重量を０．００１ｇ単位まで記録）又は約１ｍＬの溶液試料（±０．５ｍＬ、重量を０．００１ｇ単位まで記録）を消化容器に添加した（適用可能なスパイク溶液もこの時点で添加する）。
・５．０ｍＬの５０％ｖ／ｖＨＮＯ３（硝酸）及び２．５ｍＬの濃Ｈ２Ｏ２を試料に添加し、次いで、消化容器に、－Ｈ２Ｏ２をゆっくり添加して試料の泡立ちを避けながら、ポリプロピレン製時計皿で直ちに蓋をする
・試料を９５℃（±５℃）で３０分間加熱する
・試料を加熱解除し、放冷する
・２．５ｍＬの濃ＨＮＯ３を添加し、試料を９５℃（±５℃）で３０分間加熱する。ＨＮＯ３による試料の酸化を示す褐色の煙霧が生じた場合、試料による褐色の煙霧が出なくなるまで、この工程を何度も繰り返す。褐色の煙霧は、ＨＮＯ３による完全な酸化の指標である。
・試料を加熱解除し、放冷する
・２．５ｍＬの濃ＨＮＯ３及び５ｍＬの濃ＨＣｌを添加し、試料を９５℃（±５℃）で２時間加熱する
・試料を加熱解除し、放冷する
・試料の総体積を脱イオン水（ＤＩＷ）で５０ｍＬにし、次いで、試料の分析準備を整える
・約１ｇの乾燥試料（±０．５ｇ、重量を０．００１ｇ単位まで記録）又は約１ｍＬの溶液試料（±０．５ｍＬ、重量を０．００１ｇ単位まで記録）を消化容器に添加した（適用可能なスパイク溶液もこの時点で添加する）。
・５．０ｍＬの５０％ｖ／ｖＨＮＯ３（硝酸）及び２．５ｍＬの濃Ｈ２Ｏ２を試料に添加し、次いで、消化容器に、－Ｈ２Ｏ２をゆっくり添加して試料の泡立ちを避けながら、ポリプロピレン製時計皿で直ちに蓋をする
・試料を９５℃（±５℃）で３０分間加熱する
・試料を加熱解除し、放冷する
・２．５ｍＬの濃ＨＮＯ３を添加し、試料を９５℃（±５℃）で３０分間加熱する。ＨＮＯ３による試料の酸化を示す褐色の煙霧が生じた場合、試料による褐色の煙霧が出なくなるまで、この工程を何度も繰り返す。褐色の煙霧は、ＨＮＯ３による完全な酸化の指標である。
・試料を加熱解除し、放冷する
・２．５ｍＬの濃ＨＮＯ３及び５ｍＬの濃ＨＣｌを添加し、試料を９５℃（±５℃）で２時間加熱する
・試料を加熱解除し、放冷する
・試料の総体積を脱イオン水（ＤＩＷ）で５０ｍＬにし、次いで、試料の分析準備を整える
【0329】
＊注記：
－９５℃（±５℃）における加熱は全て、還流させながら、沸騰させることなく、試料にポリプロピレン製の時計皿で蓋をした状態で、予熱したホットブロック（例えば、Ｈｏｔｂｌｏｃｋ（登録商標））において行った。
－消化バイアルを５％／５％ ｖ／ｖ ＨＮＯ３／ＨＣＬ中に一晩浸漬し、使用前にＤＩＷで３回すすぐ。
－ポリプロピレン製の時計皿を５％／５％ ｖ／ｖ ＨＮＯ３／ＨＣＬ中に一晩浸漬し、使用前にＤＩＷで３回すすぐ。
－ピペッティングのためのプラスチックチップは、使用前に試薬で３回すすぐ。
－試料を、消化の２週間以内にＩＣＰ－ＭＳにより分析した。
－この方法は又、例えば、Ｖｕｌｃａｎ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ａｎｄ Ｗｏｒｋ－Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｑｕｅｓｔｒｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．）を使用して、自動化プロセスに適合させることもできる。
－９５℃（±５℃）における加熱は全て、還流させながら、沸騰させることなく、試料にポリプロピレン製の時計皿で蓋をした状態で、予熱したホットブロック（例えば、Ｈｏｔｂｌｏｃｋ（登録商標））において行った。
－消化バイアルを５％／５％ ｖ／ｖ ＨＮＯ３／ＨＣＬ中に一晩浸漬し、使用前にＤＩＷで３回すすぐ。
－ポリプロピレン製の時計皿を５％／５％ ｖ／ｖ ＨＮＯ３／ＨＣＬ中に一晩浸漬し、使用前にＤＩＷで３回すすぐ。
－ピペッティングのためのプラスチックチップは、使用前に試薬で３回すすぐ。
－試料を、消化の２週間以内にＩＣＰ－ＭＳにより分析した。
－この方法は又、例えば、Ｖｕｌｃａｎ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ａｎｄ Ｗｏｒｋ－Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｑｕｅｓｔｒｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．）を使用して、自動化プロセスに適合させることもできる。
【0330】
試薬及び標準物質
・１８．０ＭΩを超える金属を含まないことが試験された脱イオン水（ＤＩＷ）
・ＮＩＳＴ追跡可能な供給元からの微量金属スパイク標準
・ＨＮＯ３、試薬グレード以上、金属について試験
・５０％ＨＮＯ３溶液－５００ｍＬのＤＩＷ及び５００ｍＬのＨＮＯ３をゆっくりと添加し、溶液を６ヶ月間維持することができる
・濃ＨＣＬ、試薬グレード以上、金属について試験
・濃縮（３０％ｖ／ｖ）Ｈ２Ｏ２
・全てのＤＩＷ、ＨＮＯ３、及びＨＣＬは、汚染がないことを確認するために定期的に試験される
・１８．０ＭΩを超える金属を含まないことが試験された脱イオン水（ＤＩＷ）
・ＮＩＳＴ追跡可能な供給元からの微量金属スパイク標準
・ＨＮＯ３、試薬グレード以上、金属について試験
・５０％ＨＮＯ３溶液－５００ｍＬのＤＩＷ及び５００ｍＬのＨＮＯ３をゆっくりと添加し、溶液を６ヶ月間維持することができる
・濃ＨＣＬ、試薬グレード以上、金属について試験
・濃縮（３０％ｖ／ｖ）Ｈ２Ｏ２
・全てのＤＩＷ、ＨＮＯ３、及びＨＣＬは、汚染がないことを確認するために定期的に試験される
【0331】
キャピラリー等電点電気泳動
キャピラリー等電点電気泳動（ｃＩＥＦ）は、全体の電荷又は等電点（ｐＩ）に基づいてタンパク質を分離する。この方法は、ゴリムマブの電荷ベースのアイソフォームの分布を監視するために使用される。ゲルベースのＩＥＦ手順とは異なり、ｃＩＥＦは存在する荷電種の定量的測定を提供する。更に、ｃＩＥＦは、ゲルベースの方法と比較し、分解能、感度、及び再現性が向上する。ｃＩＥＦ手順では、Ｓｉｍｐｏｎｉ（ゴリムマブ）の４～６の電荷ベースのアイソフォームがほぼベースラインの分解能で分離されるが、ＩＥＦゲル分析では、４～５種のみが部分的分解能で分離される。ゴリムマブの代表的なｃＩＥＦエレクトロフェログラムを図２２に示し、４つの主要なピークがＣ、１、２、及び３と標識され、１つの微小ピークがＢと標識される。ｃＩＥＦピークと負電荷／シアリル化度の減少との一般的な関係を表す図も示される。
キャピラリー等電点電気泳動（ｃＩＥＦ）は、全体の電荷又は等電点（ｐＩ）に基づいてタンパク質を分離する。この方法は、ゴリムマブの電荷ベースのアイソフォームの分布を監視するために使用される。ゲルベースのＩＥＦ手順とは異なり、ｃＩＥＦは存在する荷電種の定量的測定を提供する。更に、ｃＩＥＦは、ゲルベースの方法と比較し、分解能、感度、及び再現性が向上する。ｃＩＥＦ手順では、Ｓｉｍｐｏｎｉ（ゴリムマブ）の４～６の電荷ベースのアイソフォームがほぼベースラインの分解能で分離されるが、ＩＥＦゲル分析では、４～５種のみが部分的分解能で分離される。ゴリムマブの代表的なｃＩＥＦエレクトロフェログラムを図２２に示し、４つの主要なピークがＣ、１、２、及び３と標識され、１つの微小ピークがＢと標識される。ｃＩＥＦピークと負電荷／シアリル化度の減少との一般的な関係を表す図も示される。
【0332】
ｃＩＥＦアッセイは、Ａｌｃｏｔｔオートサンプラー（ＧＰ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．）など、３０℃以下の周囲環境で１０．５℃以下の試料温度を維持できるオートサンプラーを備えた市販の画像化ｃＩＥＦアナライザーで実行される。分析では、外壁ポリイミドコーティング無しの内壁コーティングシリカキャピラリを使用し、カラム全体の検出を可能にする。更に、希リン酸とメチルセルロースの陽極液、水酸化ナトリウムとメチルセルロースの陰極液、及び広範囲（ｐＨ３～１０）と狭範囲（ｐＨ８～１０．５）の両性電解質の定義された混合物が使用される。このアッセイでは、試験品と参照標準（ＲＳ）の両方をカルボキシペプチダーゼＢ（ＣＰＢ）で前処理し、重鎖のＣ末端リジンを除去して複数のＣ末端変異体の存在によって生じる曖昧さを排除する。
【0333】
各分析の前に、オートサンプラーの温度設定点を４℃に設定し、オートサンプラーを少なくとも３０分間予冷し、実験室の周囲室温を３０℃以下に維持する。前処理された試験品とＲＳ、試料バイアル、バイアルインサート、精製水を含むアッセイで使用される試薬、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）（キャピラリー内での集束を最適化する）を含有する親溶液、両性電解質、内部標準のｐＩ ７．６及び９．５マーカ、並びにメチルセルロース（ＭＣ）は、試料調製を開始する前に少なくとも３０分間氷上に保持される。試料は氷上で調製され、親溶液の添加時間が記録され、ＴＥＭＥＤへの露出が制御される。この添加後１８０分間以内にアッセイを完了する必要がある。システム適合性対照は１回注入され、試験品及びＲＳは以下の配列表（表６）に従って２回注入される：
【0334】
【表7】
【0335】
シリンジポンプによって試料がキャピラリーに注入された後、電界（３ｋＶ）がキャピラリー全体に８分間印加され、ｐＨ勾配が形成され、ゴリムマブの電荷ベースのアイソフォームが等電点（ｐＩ）に従って分離される。キャピラリー内のタンパク質アイソフォームは、キャピラリー全体を２８０ｎｍで画像化することによって検出され、データは、ｐＩ値とＡ２８０の関数としてエレクトロフェログラムの形式で表示される。ｐＩの値は、機器ソフトウェアを使用して内部ｐＩ標準（ｐＩ ７．６及び９．５）と比較することによって割り当てられ、ピーク面積は標準データ取得ソフトウェアを使用してエレクトロフェログラムから決定される。ＬＯＱ以上の全てのピークの重複注入による平均ｐＩと平均ピーク面積のパーセンテージ、参照標準と比較したΔｐＩ値、並びにピークＣ、１、２、及び３の面積パーセントの合計が報告される。
【0336】
ゴリムマブｃＩＥＦアイソフォームの特性評価
ゴリムマブの参照ｃＩＥＦプロファイルは、代表的なエレクトロフェログラムに示されるように、Ｃ、１、２、及び３と標識された４つの主要なピークと微小ピークＢを含有する（図２２）。ゴリムマブの場合、ｃＩＥＦプロファイルの変動の主な原因は、重鎖アスパラギン４３（ＨＣ Ａｓｎ４３）の脱アミド化と異性化である。ｃＩＥＦの塩基性ピーク３は、脱アミド化されないＨＣ Ａｓｎ４３及び脱アミド化された重鎖イソアスパラギン酸４３（ＨＣ ｉｓｏＡｓｐ４３）を表し、より酸性のピークは、脱アミド化されたＨＣ Ａｓｐ４３及びシアリル化の程度を表す。様々なｃＩＥＦピークの予測される同一性を表７に示す。ｃＩＥＦアッセイをゴリムマブの電荷不均一性の一般的なモニターとして使用し、異なるアッセイを脱アミド化をモニターするための一次アッセイとして使用する。
ゴリムマブの参照ｃＩＥＦプロファイルは、代表的なエレクトロフェログラムに示されるように、Ｃ、１、２、及び３と標識された４つの主要なピークと微小ピークＢを含有する（図２２）。ゴリムマブの場合、ｃＩＥＦプロファイルの変動の主な原因は、重鎖アスパラギン４３（ＨＣ Ａｓｎ４３）の脱アミド化と異性化である。ｃＩＥＦの塩基性ピーク３は、脱アミド化されないＨＣ Ａｓｎ４３及び脱アミド化された重鎖イソアスパラギン酸４３（ＨＣ ｉｓｏＡｓｐ４３）を表し、より酸性のピークは、脱アミド化されたＨＣ Ａｓｐ４３及びシアリル化の程度を表す。様々なｃＩＥＦピークの予測される同一性を表７に示す。ｃＩＥＦアッセイをゴリムマブの電荷不均一性の一般的なモニターとして使用し、異なるアッセイを脱アミド化をモニターするための一次アッセイとして使用する。
【0337】
【表8】
【0338】
逸脱細胞培養プロファイル
細胞培養プロセスの段階２において、５００リットル又は１，０００リットルのバイオリアクターにおける生成持続期間は、連続６０日である。制御された製造プロセスにおいて、バイオリアクターは、１ｍＬ当たり３０万細胞以上の生存細胞密度（ＶＣＤ）で接種され、次いで、ＶＣＤは、１ｍＬ当たり１３～１４００万細胞まで指数関数的に増加する。この時点で、指数関数的細胞増殖は停止し、その後、より低速の細胞成長が続く。指数関数的増殖からより低速の増殖への移行（図２３の矢印を参照のこと）は、本明細書では「ショルダーリング」と呼ばれる。上記のように、ＶＣＤ及び培養生存率％は、それぞれ図２３及び図２４に示されるように、逸脱細胞培養バッチにおいてシフトする。
細胞培養プロセスの段階２において、５００リットル又は１，０００リットルのバイオリアクターにおける生成持続期間は、連続６０日である。制御された製造プロセスにおいて、バイオリアクターは、１ｍＬ当たり３０万細胞以上の生存細胞密度（ＶＣＤ）で接種され、次いで、ＶＣＤは、１ｍＬ当たり１３～１４００万細胞まで指数関数的に増加する。この時点で、指数関数的細胞増殖は停止し、その後、より低速の細胞成長が続く。指数関数的増殖からより低速の増殖への移行（図２３の矢印を参照のこと）は、本明細書では「ショルダーリング」と呼ばれる。上記のように、ＶＣＤ及び培養生存率％は、それぞれ図２３及び図２４に示されるように、逸脱細胞培養バッチにおいてシフトする。
【0339】
ＶＣＤシフトを有するバイオリアクターでは、ＶＣＤショルダーリングはプロセスの初期に起こった：細胞は８～１３００万細胞／ｍＬまで指数関数的に増殖し、次いでプロセスの初期にショルダーリングを開始した。加えて、ほとんどのバイオリアクターにおいて、初期のショルダーリングの後に、ＶＣＤプロファイルにおける深いディップが続いた。結果として、１６００万細胞／ｍＬの標的ＶＣＤは、バイオリアクター産生サイクルの後期、約４０～５０日目の段階で到達した。プロセスの後期に標的細胞密度に到達した結果として、バイオマス除去は後期に開始し、したがって、培養生存率％は、典型的な過去のバッチよりも生産サイクルの終了時に低かった。したがって、シフトされたバイオリアクターにおける生存率は、バイオリアクタープロセスの終了時に約２０～４０％のままであった（図２４を参照のこと）。しかしながら、培養生存率％のシフトを示すバイオリアクターはいずれも、終了基準（３日間連続で８％未満の生存率）に達しなかった。
【0340】
加えて、逸脱細胞培養バッチにおけるＶＣＤ及び培養生存率％の変化は、産生されたＩｇＧの累積量によって測定される生産性の低下をもたらした（図３４）。
【0341】
逸脱オリゴ糖プロファイル
ゴリムマブは、アスパラギン３０６の各重鎖の単一部位でＮ－グリコシル化される。これらのＮ－結合型オリゴ糖構造は、アスパラギン残基の第一級アミンを介してタンパク質に結合した二分岐オリゴ糖構造のグループのいずれでもかまわないが、ゴリムマブでは、主にガラクトースとシアル酸の不均一性を伴うビアンテンナルコアフコシル化種で構成される。個々のオリゴ糖種は、アシアロ、アガラクトコアフコシル化二分岐グリカンである「Ｇ０Ｆ」、アシアロ、モノガラクトコアフコシル化二分岐グリカンである「Ｇ１Ｆ」、及びアシアロ、ジガラクトコアフコシル化二分岐グリカンである「Ｇ２Ｆ」を含む。ゴリムマブのグリコシル化は、製造の段階９でプロセス内管理として監視され、総中性オリゴ糖、総荷電オリゴ糖、及び個々の中性オリゴ糖種Ｇ０Ｆ、Ｇ１Ｆ、及びＧ２Ｆの仕様が設定される。ゴリムマブＩｇＧの主要なＮ－結合型オリゴ糖種のいくつかの概略図を図２５に示す。これらの酵素プロセスにおけるいくつかの二価カチオン（例えば、Ｍｎ２＋及びＣｕ２＋）の役割を含む、グリコシル化成熟プロセスにおける酵素いくつかの役割も示される。
ゴリムマブは、アスパラギン３０６の各重鎖の単一部位でＮ－グリコシル化される。これらのＮ－結合型オリゴ糖構造は、アスパラギン残基の第一級アミンを介してタンパク質に結合した二分岐オリゴ糖構造のグループのいずれでもかまわないが、ゴリムマブでは、主にガラクトースとシアル酸の不均一性を伴うビアンテンナルコアフコシル化種で構成される。個々のオリゴ糖種は、アシアロ、アガラクトコアフコシル化二分岐グリカンである「Ｇ０Ｆ」、アシアロ、モノガラクトコアフコシル化二分岐グリカンである「Ｇ１Ｆ」、及びアシアロ、ジガラクトコアフコシル化二分岐グリカンである「Ｇ２Ｆ」を含む。ゴリムマブのグリコシル化は、製造の段階９でプロセス内管理として監視され、総中性オリゴ糖、総荷電オリゴ糖、及び個々の中性オリゴ糖種Ｇ０Ｆ、Ｇ１Ｆ、及びＧ２Ｆの仕様が設定される。ゴリムマブＩｇＧの主要なＮ－結合型オリゴ糖種のいくつかの概略図を図２５に示す。これらの酵素プロセスにおけるいくつかの二価カチオン（例えば、Ｍｎ２＋及びＣｕ２＋）の役割を含む、グリコシル化成熟プロセスにおける酵素いくつかの役割も示される。
【0342】
培養性能変化の影響の調査中に、総中性及び荷電オリゴ糖の変化並びにゴリムマブ分子の個々のオリゴ糖のレベルを評価した。生クロマトグラム及び更なるデータ分析は、逸脱するバッチについての製剤化バルク（ＦＢ）が、総中性オリゴ糖及び総荷電オリゴ糖の％についての仕様内であったが、バッチの大部分は、それぞれ総中性オリゴ糖及び総荷電オリゴ糖についての過去の平均よりも明らかに上及び下であったことを示した（図２６）。更に、仕様外である個々の中性オリゴ糖のレベルに有意なシフトがあった。実際、ＦＢの逸脱したバッチの大部分は、Ｇ０Ｆ、Ｇ１Ｆ及びＧ２Ｆ種について仕様外へのシフトを示した（図２７）。
【0343】
組換えモノクローナル抗体のオリゴ糖プロファイルの変化は抗体の生物学的機能に大きな影響を与え得るため、オリゴ糖プロファイルの変化の低減は重要である。例えば、生物学的研究では、Ｆｃ領域での様々なグリコフォームの分布が、抗体の有効性、安定性、及びエフェクタ機能に大きな影響を与え得ることが示されている（Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．２０１４ １１７（５）：６３９－６４４；Ｂｉｏ－Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｉｎｔ．２０１１，９（６）：４８－５３；Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１０，１０（５）：３４５－３５２）。特に、アフコシル化（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３６８：７６７－７７９）及びガラクトシル化（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２１：１６４４－１６５２）は、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）と補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）で大きな役割を果たすことができ、これらは、抗体が免疫機能を介して標的細胞の死滅を仲介する２つの重要なメカニズムである。更に、高いマンノースレベルは、抗体のクリアランスを増加させることによって有効性に悪影響を与え得ることが示されており（Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ．２０１１，２１（７）：９４９－９５９）、シアル酸含有量は抗炎症活性に影響を与え得る（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．２０１３ ２（３）：３９２－４１４）。オリゴ糖プロファイルの変化によるこれらの生物学的影響の結果として、規制当局は、一貫した安全で有効な製品のロット放出仕様を確実に順守するために、抗体のグリコシル化パターンを制御する必要がある。
【0344】
問題の特定
厳密かつ包括的な調査の後、化学的に規定された培地における変更が、オリゴ糖プロファイル、ＶＣＤ、生存率％及び生産性におけるシフトの根本的原因であると結論付けられた。この化学的に規定された培地は、先進造粒技術（ＡＧＴ）によって生成される粉末として得られ、本明細書では概してＡＧＴと呼ばれる。より具体的には、根本原因調査は、ＡＧＴ中の９０を超える成分のうちの１つである、ＦｅＣｌ３×６Ｈ２０（塩化第二鉄）の変更が、オリゴ糖プロファイル、ＶＣＤ生存率％及び生産性のシフトの決定的な根本原因であることを実証した。塩化第二鉄の供給業者が、より高純度の鉄塩を生成するという上述の意図でその製造方法を変更したことが決定された。更に、調査により、この変更により、塩化第二鉄中に測定されない不純物として存在するマンガン、クロム及び銅のレベルがより低い微量レベルとなることが明らかになった。マンガン、クロム及び銅は、測定された成分としてＡＧＴ配合物に添加されるが、塩化第二鉄と偶発的に関連する量は考慮されなかった。したがって、これらの状況は、ＡＧＴ中の全マンガン、クロム、及び銅レベルの低減をもたらした。
厳密かつ包括的な調査の後、化学的に規定された培地における変更が、オリゴ糖プロファイル、ＶＣＤ、生存率％及び生産性におけるシフトの根本的原因であると結論付けられた。この化学的に規定された培地は、先進造粒技術（ＡＧＴ）によって生成される粉末として得られ、本明細書では概してＡＧＴと呼ばれる。より具体的には、根本原因調査は、ＡＧＴ中の９０を超える成分のうちの１つである、ＦｅＣｌ３×６Ｈ２０（塩化第二鉄）の変更が、オリゴ糖プロファイル、ＶＣＤ生存率％及び生産性のシフトの決定的な根本原因であることを実証した。塩化第二鉄の供給業者が、より高純度の鉄塩を生成するという上述の意図でその製造方法を変更したことが決定された。更に、調査により、この変更により、塩化第二鉄中に測定されない不純物として存在するマンガン、クロム及び銅のレベルがより低い微量レベルとなることが明らかになった。マンガン、クロム及び銅は、測定された成分としてＡＧＴ配合物に添加されるが、塩化第二鉄と偶発的に関連する量は考慮されなかった。したがって、これらの状況は、ＡＧＴ中の全マンガン、クロム、及び銅レベルの低減をもたらした。
【0345】
補充されたＡＧＴ培地による改善
ＳＵＰ－ＡＧＴの開発
予備的な小規模研究は、マンガン及びクロムを培地に補充することが、オリゴ糖プロファイルを過去の基準に向かってシフトさせ得ることを示した（データは示さず）。これらの予備的な小規模研究に基づいて、ＡＧＴにマンガン及びクロムを補充することによって、マンガン及びクロムの過去のレベルを回復させてゴリムマブの商業的バッチを製造するための変更を実施した。培地に補充するために使用されるマンガン及びクロム塩は、すでに既存の培地配合の一部であったが、より低い濃度で添加されたので、指定限界のＭｎ２＋（マンガン）及びクロムを含有する化学的に規定された培地を生成するために、より多くのマンガン及びクロム塩を培地に補充することが問題であった。
ＳＵＰ－ＡＧＴの開発
予備的な小規模研究は、マンガン及びクロムを培地に補充することが、オリゴ糖プロファイルを過去の基準に向かってシフトさせ得ることを示した（データは示さず）。これらの予備的な小規模研究に基づいて、ＡＧＴにマンガン及びクロムを補充することによって、マンガン及びクロムの過去のレベルを回復させてゴリムマブの商業的バッチを製造するための変更を実施した。培地に補充するために使用されるマンガン及びクロム塩は、すでに既存の培地配合の一部であったが、より低い濃度で添加されたので、指定限界のＭｎ２＋（マンガン）及びクロムを含有する化学的に規定された培地を生成するために、より多くのマンガン及びクロム塩を培地に補充することが問題であった。
【0346】
マンガン及びクロムを補充したこのＡＧＴ培地は、本明細書ではＳＵＰ－ＡＧＴと称される。ＳＵＰ－ＡＧＴ培地粉末を大規模に生成し、続いて、５００リットル及び１０００リットルのバイオリアクター中の異なる製造現場で商業規模でゴリムマブを生成するために使用した。ＳＵＰ－ＡＧＴ培地を使用して生成されたゴリムマブのバッチの評価は、ＳＵＰ－ＡＧＴがＶＣＤ、生存率％、及び生産性を完全に回復させなかったが、過去のオリゴ糖プロファイル、例えば、Ｇ０Ｆ、Ｇ１Ｆ、Ｇ２Ｆのレベルを回復させるのに有効であったことを示した（データは示さず）。
【0347】
Ｇ０Ｆ、Ｇ１Ｆ、Ｇ２Ｆのレベルに対する効果は、β－１，４ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴＩ）活性、補因子Ｍｎ２＋、及びグリコシル化との確立された関係を示す現在の文献と一致する（図２５、及び例えば、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．２００７ Ｆｅｂ １５；９６（３）：５３８－４９及びＣｕｒｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ．２００８ Ａｐｒ；９（４）：２９２－３０９を参照のこと）。ＧａｌＴＩは、トランスゴルジ膜に位置する膜結合酵素である。ＧａｌＴＩは、グリコシル化カスケード内で機能するため、補因子としてのＭｎ２＋によって活性化される。このカスケードにおいて、ＧａｌＴＩは、コアオリゴ糖構造Ｇ０Ｆにガラクトース残基を付加する。反応生成物は、Ｇ０ＦのＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）末端に１つのガラクトース残基が付加された場合はＧ１Ｆであり、第２のガラクトース残基が付加された場合はＧ２Ｆである。ＳＵＰ－ＡＧＴを使用した荷電オリゴ糖基の増加は、観察されたＧ０Ｆの低減並びにＧ１Ｆ及びＧ２Ｆの増加と一致し、後者の２つは、ＳＡ１及びＳＡ２オリゴ糖の形成のための主な前駆体である。このシアリル化反応は、トランスゴルジにも位置する膜結合酵素であるβ－ガラクトシドα－２，６－シアリルトランスフェラーゼ（ＳＴ６ＧａｌＩＩ）（図２５）によって触媒される。Ｍｎ２＋は、Ｇ１Ｆ及びＧ２Ｆ形成の主な補因子のうちの１つであり、Ｇ１Ｆ及びＧ２Ｆ形成は、負に荷電したＳＡ１及びＳＡ２形成の主な前駆体であるので、Ｍｎ２＋の濃度の減少は、シアリル化及び荷電種の程度に対して付随的な効果を有し得る。この研究からの知見は、塩化第二鉄のより純粋な形態に関連する変更に起因するＡＧＴ中のＭｎ２＋濃度の変更が、オリゴ糖性能の変化／傾向の根本的原因であったという仮説を支持する。
【0348】
ＳＵＰ－ＡＧＴ３の開発
ゴリムマブオリゴ糖プロファイルのシフトは、より高濃度のマンガン及びクロムを含有するＳＵＰ－ＡＧＴ培地への変更を実施することによって首尾よく改善されたが、ＳＵＰ－ＡＧＴへの変更は、ＶＣＤ 生存率％及び生産性を過去の傾向の範囲内に完全に回復させなかった。調査中の分析は、低減されたＣｕ２＋（銅）レベルが、ＶＣＤ及び生存率％におけるシフトの最も可能性の高い根本原因であることを示したので、ＳＵＰ－ＡＧＴ培地に銅を補充する効果を評価するために、縮小スケールの研究を設計した。
ゴリムマブオリゴ糖プロファイルのシフトは、より高濃度のマンガン及びクロムを含有するＳＵＰ－ＡＧＴ培地への変更を実施することによって首尾よく改善されたが、ＳＵＰ－ＡＧＴへの変更は、ＶＣＤ 生存率％及び生産性を過去の傾向の範囲内に完全に回復させなかった。調査中の分析は、低減されたＣｕ２＋（銅）レベルが、ＶＣＤ及び生存率％におけるシフトの最も可能性の高い根本原因であることを示したので、ＳＵＰ－ＡＧＴ培地に銅を補充する効果を評価するために、縮小スケールの研究を設計した。
【0349】
銅を含有する微量元素溶液を使用して、０．３ｐｐｂ（０．３μｇ／リットル）、０．７５ｐｐｂ（０．７５μｇ／リットル）、及び１．５ｐｐｂ（１．５μｇ／リットル）のレベルで添加された銅でスパイクされたＳＵＰ－ＡＧＴを用いた一連の小規模研究実験を支持した。銅を補充していない対照も含まれた。標準非補充ＡＧＴ培地の目標銅濃度は０．８３ｐｐｂであった。縮小スケール研究は、用量依存的効果を示し、銅濃度の増加は、ＶＣＤ、生存率％、及び生産性の増加と関連した（データは示さず）。縮小スケール研究の結果も過去の標準と比較し、より高濃度の銅はＶＣＤ及び生存率（％）を改善する傾向があるが、０．３ｕｇ／リットルの銅によるＳＵＰ－ＡＧＴの補充は過去の平均に最も近い性能を示したことが決定された。
【0350】
オリゴ糖プロファイルに対する銅濃度の効果も小規模研究で評価し、これは、銅濃度が生成物グリコフォームプロファイルに対して有意な用量依存的効果を有し、濃度の増加がＧ０Ｆ及び総中性のレベルの増加（図２８）並びにＧ１Ｆ及びＧ２Ｆのレベルの低下と関連することを示した（データは示さず）。図２５に示されるように、銅は、β－１－４ガラクトシルトランスフェラーゼ活性に対して阻害効果を有し、したがって、グリコシル化に対して阻害効果を有し得ることが知られている（例えば、Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００２ Ｍａｙ ３１；３５（３）：３３０－６を参照のこと）。これは、濃度の増加に伴ってグリコシル化を増強し、Ｇ０Ｆ及び総中性のレベルの低下をもたらすことが実証されたマンガンの効果の反対であることに留意されたい。したがって、銅とマンガンの両方の濃度は、ゴリムマブのオリゴ糖プロファイルが維持されることを確実にする範囲内で制御する必要があるが、最適な細胞成長、生存率、及び生産性を支持するのに十分な銅でも制御する必要があると結論付けられた。
【0351】
更なる小規模研究及びマンガンと銅の両方の濃度を変更させる実験からの結果の重回帰分析を用いて、Ｇ０Ｆにおける変動及び総中性物における変動が、Ｘ変数としてマンガン及び銅を用いる回帰モデルによって説明され得ることが決定された。次いで、これらのデータを使用して、生成されたゴリムマブが仕様内のオリゴ糖プロファイルを有することを確実にし、又、ＶＣＤ、生存率％、及び生産性が過去の基準内であることを確実にするマンガン及び銅の最適濃度を見出した。化学的に規定された培地についての最適微量金属濃度は、≧１０．０μｇ／リットル～≦３５．０μｇ／リットルのＭｎ２＋（マンガン）及び≧１．０μｇ／リットル～≦１．８μｇ／リットルのＣｕ２＋（銅）であると決定された。
【0352】
培地の補充についての分析が完了したので、新しいバージョンのＡＧＴ培地が製造業者によって開発された。以前のバージョンの培地と比較して、新しい培地の製造プロセスは、ポリアミン及びエタノールアミン構成物の添加の順序に関して最適化され、貯蔵寿命安定性を改善する所望の効果を有することが報告された。この新しい培地は、本明細書ではＡＧＴバージョン３（ＡＧＴ３）と呼ばれ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｉｎｃ．によって次世代の培地とみなされている。しかしながら、この新しい培地は、塩化第二鉄の供給源に関して同じ特性を有する。その結果、これには、微量金属であるＭｎ２＋（マンガン）及び銅（Ｃｕ２＋）の濃度が低下するという同様の問題もある。したがって、ＳＵＰ－ＡＧＴ３は、特定かつ制御された濃度のＭｎ２＋（マンガン）及びＣｕ２＋（銅）を含有するように新しいＡＧＴ３培地を補充することによって作成した。
【0353】
マンガン及び銅のいくつかの異なる供給源を使用して、特定の限界を達成することができる。本発明での使用に適したマンガンの供給源としては、例えば、ＭｎＣｌ２、ＭｎＳＯ４、ＭｎＦ２及びＭｎＩ２のうちの１つ又は２つ以上が挙げられる。本発明での使用に適した銅の供給源としては、例えば、ＣｕＳＯ４、ＣｕＣｌ２、及びＣｕ（ＯＡｃ）２のうちの１つ又は２つ以上が挙げられる。マンガン及び銅のこれらの供給源は、無水形態又は水和形態（例えば、二水和物、四水和物、又は五水和物形態）であり得る。マンガンの好ましい供給源としては、ＭｎＣｌ２（塩化マンガン）とＭｎＳＯ４（硫酸マンガン）の組合せが挙げられる。好ましい銅の供給源は、ＣｕＳＯ４硫酸銅である。ＡＧＴ３中のサプリメントとしてＭｎＣｌ２、ＭｎＳＯ４、及びＣｕＳＯ４を使用する利点は、これらの成分がすでに低濃度でＡＧＴ３製剤の一部であり、したがって、新しい成分又は異なる成分がＳＵＰ－ＡＧＴ３製剤に添加されなかったことである。マンガン及び銅についての特定かつ制御された限界は、過去のデータ、及び多数の小規模研究に基づいて確立された。Ｍｎ２＋（マンガン）については、特定かつ制御された制御された限界値は≧１０．０μｇ／リットル～≦３５．０μｇ／リットルであり、Ｃｕ２＋（銅）については、限界値は≧１．０μｇ／リットル～≦１．８μｇ／リットルである。
【0354】
マンガン、クロム、及び銅レベルの評価
誘導結合プラズマ質量分析アッセイ（ＩＣＰ－ＭＳ）を使用して、ＳＵＰ－ＡＧＴ３、塩化第二鉄の変更前の過去の「変更前」ＡＧＴ培地、ゴリムマブの逸脱バッチの産生に使用した「変更後」ＡＧＴ培地、及びＳＵＰ－ＡＧＴを含む培地の異なるバッチにおけるマンガン、クロム、及び銅レベルを評価した。培地の異なるバッチについてのマンガン、クロム、及び銅レベルについての微量金属濃度についてのデータを、それぞれ図２９、図３０、及び図３１に示す。培地の個々のバッチが、大規模でのゴリムマブの産生のために培地の１つ又は２つ以上の他のバッチと組み合わされることに留意されたい。これは、培地のバッチ間変動のいくらかを均質化する一般的な効果を有するが、濃度が制御されない場合、マンガン及び銅の仕様外であるより大きな変動を補正しない可能性がある。
誘導結合プラズマ質量分析アッセイ（ＩＣＰ－ＭＳ）を使用して、ＳＵＰ－ＡＧＴ３、塩化第二鉄の変更前の過去の「変更前」ＡＧＴ培地、ゴリムマブの逸脱バッチの産生に使用した「変更後」ＡＧＴ培地、及びＳＵＰ－ＡＧＴを含む培地の異なるバッチにおけるマンガン、クロム、及び銅レベルを評価した。培地の異なるバッチについてのマンガン、クロム、及び銅レベルについての微量金属濃度についてのデータを、それぞれ図２９、図３０、及び図３１に示す。培地の個々のバッチが、大規模でのゴリムマブの産生のために培地の１つ又は２つ以上の他のバッチと組み合わされることに留意されたい。これは、培地のバッチ間変動のいくらかを均質化する一般的な効果を有するが、濃度が制御されない場合、マンガン及び銅の仕様外であるより大きな変動を補正しない可能性がある。
【0355】
全てのＳＵＰ－ＡＧＴ３バッチ中のマンガンの濃度は、全てのＳＵＰ－ＡＧＴ３バッチに適用された≧１０．０μｇ／Ｌ～≦３５．０μｇ／ＬのＭｎ２＋（マンガン）の特定かつ制御された限界内に十分にあり、過去の変更前ＡＧＴバッチの範囲内でもあった（図２９）。したがって、ＳＵＰ－ＡＧＴ３中のマンガン濃度は、十分に制御されており、過去の変更前ＡＧＴの範囲内であると結論付けられた。
【0356】
ＳＵＰ－ＡＧＴ３培地の２つの初期バッチを除いて、銅の濃度も又、≧１．０μｇ／Ｌ～≦１．８μｇ／ＬのＣｕ２＋（銅）の特定かつ制御された限界内に十分にあった（図３１）。ＳＵＰ－ＡＧＴ３培地の２つの影響を受けたバッチについての仕様外の状況は、これらのバッチをＳＵＰ－ＡＧＴ３培地の他の異なるバッチと混合して仕様内であるゴリムマブの製造に使用するための培地を得ることによって容易に改善された。したがって、ＳＵＰ－ＡＧＴ３の銅濃度は十分に制御されていると結論付けられた。仕様外であった過去の変更前ＡＧＴ培地の２つのバッチは、ルーチンの問題として培地の他のバッチと組み合わされ、したがって、組み合わされたバッチも又、過去の変更前ＡＧＴを用いたゴリムマブの生成中に仕様内であったことに留意されたい。又、変更後ＡＧＴバッチの多くは、銅についてのアッセイの検出限界（１μｇ／Ｌ）未満の値を有し、これらの値は、図３１においてμｇ／Ｌとしてグラフで表されていることに留意されたい。
【0357】
ＳＵＰ－ＡＧＴ３を用いた商業的バッチ製造
ＳＵＰ－ＡＧＴ３を仕様したオリゴ糖プロファイル
微量金属分析についての陽性結果に基づいて、ＳＵＰ－ＡＧＴ３を、５００リットル又は１０００リットルのバイオリアクターを使用して、異なる生成施設でゴリムマブの商業的製造プロセスに導入した。段階１（前培養及びシードバイオリアクター）から段階２（生成ババイオリアクタープロセス）までの全ての細胞培養工程にこの培地を使用し、異なるバイオリアクターに対して生成されたＤＰＣを使用して、３つの異なるバッチのゴリムマブを生成した。図２６及び図２７に示されるように（各図の最後の３つのデータ点）、ＳＵＰ－ＡＧＴ３を用いて生成されたゴリムマブは、≧８２．０％～≦９４．４％の総中性オリゴ糖種、≧５．６％～≦１８．０％の総荷電オリゴ糖種、並びに≧２５．６％～≦４２．２％のＧ０Ｆ、≧３１．２％～≦４３．６％のＧ１Ｆ、及び≧５．６％～≦１４．２％のＧ２Ｆの個々の中性オリゴ糖種を含む。
ＳＵＰ－ＡＧＴ３を仕様したオリゴ糖プロファイル
微量金属分析についての陽性結果に基づいて、ＳＵＰ－ＡＧＴ３を、５００リットル又は１０００リットルのバイオリアクターを使用して、異なる生成施設でゴリムマブの商業的製造プロセスに導入した。段階１（前培養及びシードバイオリアクター）から段階２（生成ババイオリアクタープロセス）までの全ての細胞培養工程にこの培地を使用し、異なるバイオリアクターに対して生成されたＤＰＣを使用して、３つの異なるバッチのゴリムマブを生成した。図２６及び図２７に示されるように（各図の最後の３つのデータ点）、ＳＵＰ－ＡＧＴ３を用いて生成されたゴリムマブは、≧８２．０％～≦９４．４％の総中性オリゴ糖種、≧５．６％～≦１８．０％の総荷電オリゴ糖種、並びに≧２５．６％～≦４２．２％のＧ０Ｆ、≧３１．２％～≦４３．６％のＧ１Ｆ、及び≧５．６％～≦１４．２％のＧ２Ｆの個々の中性オリゴ糖種を含む。
【0358】
段階２の細胞培養プロセスの性能及び生産性
ＳＵＰ－ＡＧＴ３バッチの生成産バイオリアクター性能を評価するために、異なるＳＵＰ－ＡＧＴ３バイオリアクターバッチのＶＣＤ、生存率％、及び累積ＩｇＧレベルを、変更前ＡＧＴバッチの平均及び変更後ＡＧＴバッチの平均と比較した。データは、ＳＵＰ－ＡＧＴ３を用いた生成が、ＶＣＤ及び生存率％を過去の平均近くまで回復させたことを示す（それぞれ、図３２及び図３３）。更に、ＳＵＰ－ＡＧＴ３によるゴリムマブの生成は、累積ＩｇＧによって測定される全体的な生成能を回復させた（図３４）。
ＳＵＰ－ＡＧＴ３バッチの生成産バイオリアクター性能を評価するために、異なるＳＵＰ－ＡＧＴ３バイオリアクターバッチのＶＣＤ、生存率％、及び累積ＩｇＧレベルを、変更前ＡＧＴバッチの平均及び変更後ＡＧＴバッチの平均と比較した。データは、ＳＵＰ－ＡＧＴ３を用いた生成が、ＶＣＤ及び生存率％を過去の平均近くまで回復させたことを示す（それぞれ、図３２及び図３３）。更に、ＳＵＰ－ＡＧＴ３によるゴリムマブの生成は、累積ＩｇＧによって測定される全体的な生成能を回復させた（図３４）。
【0359】
結論
したがって、上記に記載されているように、製造管理戦略は、オリゴ糖プロファイルに関してゴリムマブの一貫した原薬（ＤＳ）及び製剤（ＤＰ）特性を維持するために、又、大規模生産中の生存細胞密度（ＶＣＤ）、生存率％、及び生産性を制御するために開発された。本発明の方法によって生成されるＤＳ又はＤＰは、配列番号３６を含む重鎖（ＨＣ）及び配列番号３７を含む軽鎖（ＬＣ）を有する哺乳動物抗ＴＮＦ抗体を含み、抗ＴＮＦ抗体のオリゴ糖プロファイルは、≧８２．０％～≦９４．４％の総中性オリゴ糖種、≧５．６％～≦１８．０％の総荷電オリゴ糖種、及び≧２５．６％～≦４２．２％のＧ０Ｆ、≧３１．２％～≦４３．６％のＧ１Ｆ、及び≧５．６％～≦１４．２％のＧ２Ｆの個々の中性オリゴ糖種を含む。≧１０．０μｇ／リットル～≦３５．０μｇ／リットルのＭｎ２＋（マンガン）及び≧１．０μｇ／リットル～≦１．８μｇ／リットルのＣｕ２＋（銅）からなる微量金属濃度を含有するように特定かつ制御された化学的に規定された培地を使用することによって、ＤＳ及びＤＰのオリゴ糖プロファイルを制御する。更に、製造管理戦略は又、過去の基準と比較して、ゴリムマブ生成中の細胞の生存細胞濃度（ＶＣＤ）、生存率％、及び生産性を維持する。ＨＰＬＣ法を使用して、ゴリムマブオリゴ糖プロファイルを決定し、誘導結合プラズマ質量分析（ＩＣＰ－ＭＳ）を使用して、培地のマンガン及び銅の濃度を測定した。
したがって、上記に記載されているように、製造管理戦略は、オリゴ糖プロファイルに関してゴリムマブの一貫した原薬（ＤＳ）及び製剤（ＤＰ）特性を維持するために、又、大規模生産中の生存細胞密度（ＶＣＤ）、生存率％、及び生産性を制御するために開発された。本発明の方法によって生成されるＤＳ又はＤＰは、配列番号３６を含む重鎖（ＨＣ）及び配列番号３７を含む軽鎖（ＬＣ）を有する哺乳動物抗ＴＮＦ抗体を含み、抗ＴＮＦ抗体のオリゴ糖プロファイルは、≧８２．０％～≦９４．４％の総中性オリゴ糖種、≧５．６％～≦１８．０％の総荷電オリゴ糖種、及び≧２５．６％～≦４２．２％のＧ０Ｆ、≧３１．２％～≦４３．６％のＧ１Ｆ、及び≧５．６％～≦１４．２％のＧ２Ｆの個々の中性オリゴ糖種を含む。≧１０．０μｇ／リットル～≦３５．０μｇ／リットルのＭｎ２＋（マンガン）及び≧１．０μｇ／リットル～≦１．８μｇ／リットルのＣｕ２＋（銅）からなる微量金属濃度を含有するように特定かつ制御された化学的に規定された培地を使用することによって、ＤＳ及びＤＰのオリゴ糖プロファイルを制御する。更に、製造管理戦略は又、過去の基準と比較して、ゴリムマブ生成中の細胞の生存細胞濃度（ＶＣＤ）、生存率％、及び生産性を維持する。ＨＰＬＣ法を使用して、ゴリムマブオリゴ糖プロファイルを決定し、誘導結合プラズマ質量分析（ＩＣＰ－ＭＳ）を使用して、培地のマンガン及び銅の濃度を測定した。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11A】
【図11B】
【図11C】
【図12】
【図13A】
【図13B】
【図13C】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27-1】
【図27-2】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
【図34】
【配列表】
【国際調査報告】